Brevet FR2611912A1 — publié le 19880909

Procédé de détection et de dénombrement d'antigènes particulaires, dans un échantillon liquide; notamment de spores de Clostridium tyrobutyricum dans le lait. La présente invention a pour objet un procédé de détection et de dénombrement d'antigènes particulaires dans un échantillon liquide. La précision dudit dénombrement et son seuil de sensibilité le rendent particulièrement intéressant. Dans la présente demande, on entend par antigène particulaire, toute entité qui se présente sous forme de O10 particule, qui est elle-même un antigène ou qui porte de tels antigènes. On citera à titre d'exemples les spores, les bactéries, les cellules, des billes de matière synthétique sur lesquelles sont fixés des antigènes... La mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet la détection et le dénombrement, avec une sensibilité remarquable, de telles entités. Ledit procédé est une technique immunoenzymatique visant à créer des taches représentatives de l'antigène. Ces taches sont visibles par des moyens simples: à l'oeil nu ou à l'aide d'une loupe binoculaire ou d'un microscope photonique de faible grossissement (x 100). Le procédé selon l'invention s'est notamment révélé particulièrement intéressant pour la détection et le dénombrement de spores de Clostridium tyrobutyricum dans les laits. Il répond dans cette application à un besoin de l'industrie fromagère. En effet, le problème de la contamination des laits par les spores de Clostridium tyrobutyricum a pris une importance grandissante depuis les années 70, années à partir desquelles l'alimentation des vaches laitières à partir d'ensilage a été pratiquée. Cette contamination est fortement dommageable pour l'industrie fromagère. L'utilisation de laits pollués ou contaminés par lesdites spores entraîne au cours du processus d'affinage des pâtes fromagères des phénomènes dits "de fermentation tardive" ou "gonflements butyriques" qui provoquent de graves défauts de texture pouvant aller jusqu'à l'éclatement des 2611 9 12 meules et la dévalorisation- ou la perte des fromages correspondants. Les moyens dont disposent actuellement les laitiers pour tenter de faire face à cette pollution des laits sont peu nombreux ou inefficaces. On citera: la bactofugation, centrifugation poussée du lait qui permet de séparer les bactéries des autres constituants du lait. Cette opération est très onéreuse et dénature quelque peu le lait; l'emploi de nitrates, inhibiteurs du développement de Clostridium tyrobutyricum. Leur emploi est interdit par la législation; - la pasteurisation. Cette opération est sans effet car les spores de Clostridium tyrobutyricum sont thermorésistantes. On a également pensé, pour résoudre le problème, au triage des laits, afin de n'utiliser pour la fabrication des fromages que des laits exempts de cette pollution bactériologique. Malheureusement, il n'existe encore sur le marché aucun test de détection rapide. Les méthodes actuelles demandent 7 à 8 jours et dans l'intervalle, le lait a déjà été utilisé. De plus, ces méthodes sont fastidieuses et peu sûres... Des recherches ont donc été entreprises pour mettre au point des tests, à la fois rapides, simples et efficaces, qui permettraient de déterminer l'étendue de la contamination du lait, notamment des tests basés sur des principes immunochimiques. La technique de type E.L.I.S.A. a été essayée (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay = E.L.I.S.A.). Cette technique est par exemple présentée dans Journal of Clinical Pathology, 1978, (31), 507-580. Elle s'est révélée, dans ce cas particulier, insatisfaisante. Sa limite de sensibilité, aux environs de O10 000 spores/ml, l'écartait de toute utilisation dans un test. Selon l'invention, il est proposé un procédé de détection et de dénombrement des spores de Clostridium tyrobutyricum, très sensible. Son seuil de sensibilité permet la détection de 30 spores par ml d'échantillon. Ledit procédé selon l'invention n'est nullement limité à la détection et au dénombrement de cet antigène particulaire spécifique, comme cela va ressortir de manière évidente de ses caractéristiques, présentées ci-après. Le procédé de détection et de dénombrement d'antigènes particulaires dans un échantillon liquide selon l'invention, consiste à: a) coupler lesdits antigènes avec un ou plusieurs anticorps, dont l'un au moins est conjugué à un premier enzyme; b) déposer les complexes antigènes-anticorps ainsi formés sur un gel contenant le substrat du premier enzyme et un deuxième enzyme dont le substrat est le produit de la première réaction enzymatique; ledit gel contenant également un révélateur - par formation d'un précipité - de la deuxième réaction enzymatique; c) observer et/ou dénombrer les taches apparues sur le gel. L'étape a) du procédé selon l'invention (couplage selon les techniques classiques de simple ou multiples couches ou les systèmes biotine-avidine) peut-être réalisée avant ou après toute technique de concentration-séparation des antigènes particulaires de l'échantillon. On citera notamment, les techniques de filtration, de centrifugation, d'adsorption sur un support solide (par exemple sur des billes, magnétiques ou non, sur des gels...) de gradient de densité, de séparation biphasique par affinité... Le procédé selon l'invention, comme indiqué ci-dessus est basé sur la révélation d'une réaction immunoenzymatique, révélation qui se manifeste sous la forme de taches sur le gel. Ladite réaction immunoenzymatique doit engendrer un signal visible, net. C'est pourquoi, on choisit selon l'invention, des révélateurs agissant par formation d'un précipité. Ledit précipité doit être localisé autour de la particule. Cette localisation est doe à la consistance du milieu réactionnel (gel). La diffusion des réactifs est ainsi limitée. De plus, le signal obtenu est visible, puisqu'il a été amplifié par diffusion-précipitation, par 1' intervention du système bi-enzymatique. La taille des taches de précipité est augmentée, elle peut même être multipliée par 100.Il est en effet parfois possible de coupler deux anticorps, dont l'un au moins est conjugué au premier enzyme; le premier spécifique de la spord, le second spécifique du premier. Les réactions immunoenzymatiques mises en jeu sont du type de celles, 'illustrées ci-après dans le cas o l'on utilise à l'étape a) du procédé selon l'invention, des anticorps couplés à la glucose oxydase et à l'étape b) un gel contenant du glucose, de la péroxydase et un révélateur de la péroxydase: Glucose oxydase D(+) glucose 4 t -D-gluconolactone + H202 Péroxydase Révélateur + H202 H20 + précipité La révélation de la seconde réaction immunoenzymatique doit engendrer un précipité. On pourra donc utiliser comme révélateur toute substance compatible avec le milieu, qui engendre un précipité par oxydation et notamment une amine aromatique, telle l'aminoéthylcarbazole. Avantageusement le révélateur utilisé dans le procédé selon l'invention sera la diaminobenzidine. Par oxydation, elle génère un précipité brun. Comme précisé ci-dessus, la révélation a lieu dans un gel pour engendrer un signal ponctuel, lbcalisé sur les antigènes à observer, à dénombrer. La diffusion des produits de la réaction et des réactifs dissous doit être limitée. Elle doit toutefois pouvoir avoir lieu pour engendrer des taches. Ledit gel peut être obtenu à partir de gélatineux type agar-agar, agarose, gélatine d'osséime. L'optimisation de la concentration des réactifs - péroxydase, substrat glucose oxydase: glucose, révélateur - dans ledit gel permet d'influer sur la taille du signal, qui consiste en une tache, une zone de coloration. Avantageusement, le gel contient, outre les réactifs, un agent contrastant et/ou un anti-oxydant. A titre d'agent contrastant, on peut utiliser le chlorure de nickel (NiCl2). L'intervention d'un agent anti-oxydant en faible quantité est souhaitable. Elle permet la conservation du gel et évite que le révélateur ne s'oxyde de lui-même. Il n'interfère pas dans la réaction immunoenzymatique. On peut utiliser le bisulfite de sodium (Na2S205). Le dénombrement des antigènes est pratiqué par comptage des taches apparues sur le gel. Lesdites taches sont observées à l'oeil nu ou à l'aide d'une loupe binoculaire ou d'un microscope de faible grossissement (X 100). Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre pour la détection et le dénombrement de spores de Clostridium tyrobutyricum dans le lait. Dans cette application particulière, on procède de la façon suivante: a) on concentre par filtration les spores sur une membrane de composition chimique compatible avec les réactions immunoenzymatiques, intervenant à l'étape c) et qui retient lesdits antigènes; b) on couple lesdits antigènes avec un ou plusieurs anticorps, dont l'un au moins est conjugué à la glucose oxydase; c) on dépose les complexes antigènesanticorps ainsi formés sur un gel contenant du glucose et de la péroxydase, en posant directement la face supérieure de la membrane sur le gel; ledit gel contenant également un révélateur - par formation d'un précipité - de la seconde réaction enzymatique; d) on observe et/ou démontre les taches apparues sur le gel. On concentre préalablement les antigènes sur une membrane par filtration. La membrane utilisée doit évidemment avoir sa porosité adaptée à la taille des spores à filtrer. On utilise généralement dans le cas des spores de Clostridium tyrobutyricum des membranes présentant un porosité de 0,45 p. De plus, ladite membrane doit avoir une composition chimique compatible avec les réactions immunoenzymatiques mises en jeu. Par exemple, on utilise des membranes en fluorure de polyvinylidène. A titre de révélateur de la seconde réaction enzymatique, on utilise avantageusement la diaminobenzidine. Le précipité qui se forme dans le gel est coloré en brun. Le gel utilisé est du type de ceux décrits ci-dessus. Il est préparé à partir d'une solution tampon et contient avantageusement pour 100 ml: 1000 mg d'agarose; mg de péroxydase; 1500 mg de glucose; 15. 50 mg de diaminobenzidine; mg de NiCl2; mg de Na2S205. Le procédé selon l'invention peut être schématisé de la façon suivante: Anticorps 2em couche lère coeèr e mairaJbrane (D anticorps lère cc:xie filtrante O anticorps 2em coucihe couple à la glucose Filtration oxydase (GO) Traitement de la eimbrane Péroxydase + substrat glucose oxyd ase particulaires colorés ':-:;'"''"&:'":-' A ntigenes particulaires colorés + 7777777777777777777777 Gel révélateur L1 no tn Co Ln o u1 O ré vI N N1 X té> Selon l'invention, on a donc mis au point un procédé de dosage d'antigènes particulaires extrêmement sensible. Comme indiqué ci-dessus, il permet notamment le dosage des spores de Clostridium tyrobutyricum. La sensibilité atteinte de ce dosage est de 30 spores/ml. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exemple ci-après. Un échantillon de lait contenant des spores de Clostridium tyrobutyricum est filtré sur une membrane de type Durapore hydrophile 0,45 pu (Millipore O). Après cette filtration, la membrane est incubée dans l'appareil de filtration en présence d'une solution d'anticorps, préparés chez le lapin, dirigés contre l'antigène particulaire (dans le cas présent les spores); puis en présence d'un anticorps dirigé contre les immunoglobulines de lapin, couplé à la glucose oxydase. Le filtre ainsi traité est déposé sur un gel contenant les éléments nécessaires au développement de la réaction enzymatique: glucose, péroxydase, diaminobenzidine. On peut ainsi détecter jusqu'à 102 particules par filtre. 6 11 912 REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et de dénombrement d'antigènes particulaires dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) coupler lesdits antigènes avec un ou plusieurs anticorps, dont l'un au moins est conjugué à un premier enzyme; b) déposer les complexes antigènesanticorps ainsi formés sur un gel contenant le substrat du premier enzyme et un deuxième enzyme dont le substrat est le produit de la première réaction enzymatique; ledit gel contenant également un révélateur - par formation d'un précipité - de la deuxième réaction enzymatique; c) observer et/ou dénombrer les taches apparues sur le gel. 2. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée avant ou après toute technique de concentration-séparation des antigènes particulaires de l'échantillon. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on utilise dans l'étape a) des anticorps conjugués à la glucose-oxydase; et dans l'étape b) un gel contenant du glucose, de la péroxydase et un révélateur de la péroxydase. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit révélateur est une amine aromatique, tels la diaminobenzidine ou l'aminoéthylcarbazole. 5. Procédé selon la revendication l, pour la détection et le dénombrement de spores de Clostridium tyrobutyricum dans le lait, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) concentrer par filtration les spores sur une membrane de composition chimique compatible avec les réactions immunoenzymatiques, intervenant à l'étape c) et qui retient lesdits antigènes; b) coupler lesdits antigènes avec un ou plusieurs anticorps, dont l'un au moins est conjugué à la glucose oxydase; io c) déposer les complexes antigènes-anticorps ainsi formés sur un gel contenant du glucose et de la péroxydase, en posant directement la face supérieure de la membrane sur le gel; ledit gel contenant également un révélateur - par formation d'un précipité - de la seconde réaction enzymatique; d) observer et/ou démontrer les taches apparues sur le gel. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le révélateur est la diaminobenzidine. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que le gel employé contient, pour 100 ml: 1000 mg d'agarose; mg de péroxydase; 1500 mg de glucose; 15. 50 mg de diaminobenzidine; mg de NiCl2; mg de Na2S205.