Brevet FR2621317A1 — publié le 19890407

1i 2621317 La présente invention concerne des tripeptides utiles à la fois comme immunostimulants et dans la prévention de métastases. On sait que l'interaction entre les cellules des tumeurs et la matrice extracellulaire, causée et favorisée par la fibronectine, est inhibée par l'adminis- tration intraveineuse du pentapeptide synthétique Gly- Arg-Gly-Asp-Ser, dont la séquence est la môme que celle du site liant les cellules de la fibronectine (Humphries M.J. et coll. Science 233: 467, 1986). Ruoslahti et Pierschbacher (Cell 44:517, 1986) ont avancé l'hypothèse que l'activité biologique de ce pentapeptide pourrait être attribuée à la séquence tri- peptide Arg-Gly-Asp qu'il contient, sans cependant éva- luer l'activité de cette dernière. Lam et coll. (J. Biol Chem. 262: 947, 1987) ont, au jeu de celà, prouvé que Arg-Gly-Asp est capable de lier les glycoprotéines à la surface de certaines plaquettes suggérant ainsi une possible action biologique de ce tripeptide comme inhibiteur des réactions d'adhé- sion des plaquettes. En partant de la connaissance résultant de l'é- tat de la technique précédemment mentionné, la demanderes- se a synthétisé quelques tripeptides appartenant à la formule générale XGly-Y o X est L-Arg ou D-Arg et Y est L-Asp ou D-Asp, en évaluant alors leur efficacité dans des tests expérimentaux d'activité antimétastatique. Les résultats ont confirmé leur efficacité comme agents antimétastatique, mais ils ont aussi montré de façon surprenante leur notable activité immunostimula- trice, que l'on ne pouvait pas prévoir sur la base des connaissances actuelles. Cet effet immunostimulateur a été observé in vitro sur de la murine expérimentale de môme que sur - 2 - 2621317 des modèles humains et consiste à la fois en une matura- tion des lymphocytes T manquant de maturité et en un accroissement de la fonction cellule T. Un comportement immunostimulant analogue a été décrit pour les tripepti- des Arg-Lys-Glu (Demande de brevet US N 035 045 du 6 avril 1987), ArgAla-Arg ( demande de brevet US N 035 044 du 6 avril 1987) et Arg-Lys-Asp (demande de brevet européen N 67425 du 22 décembre 1982). De plus, les tripeptides, objets de la présente invention, on montré de la stabilité dans le suc gastri- que simulé: sur la base de ce qui avait été observé dans le cas des peptides Arg-Lys-Glu et Arg-Ala-Arg, dont la stabilité en milieu gastrique stimulé était couplée à l'activité après l'administration orale aux animaux, il est possible d'attribuer aux tripeptides, objets de la présente invention, une activité immunosti- mulatrice après administration orale, en plus de l'ad- ministration parentérale. Ceci représente un avantage remarquable dans l'emploi thérapeutique, en particulier pour les enfants et d'autres patients qui ne supportent pas l'adminis- tration parentérale, et aussi en tenant compte d'une meilleure acceptation par les patients. En se basant sur ce qui a été mentionné précé- demment, ces produits se trouvent être très utiles pour la prévention de la métastatisation dans les patients néoplastiques, après ablation chirurgicale de la tumeur, ainsi que dans la stimulation simultanée du système immunitaire, qui a été affaibli à la fois par les traite- ments de radiochimiothérapie, et par l'opération elle- même: ces deux facteurs sont en fait notablement immu- nodépressifs. De plus, la disponibilité de médicaments que l'on peut administrer par voie orale représente, pour 3 - la thérapie de ces patients, un autre avantage certain. La présente invention décrit la synthèse et les caractéristiques autant chimiques que biologiques d'une nouvelle classe de tripeptides, définie par la formule générale X-Gly-Y ou X est L-Arg ou D-Arg et Y est L- Asp ou D-Asp. Ces produits sont caractérisés par le fait qu'ils jouissent de propriétés antimétastatiques, que l'on a observé dans le test de métastases expérimentales de mélanome murine, et d'une activité immunostimulatrice, montré in vitro dans les tests de maturation de lympho- cytes de rate murine (induction de marqueur de membrane Thy 1.2) et dans des essais concernant l'activation de la fonction des lymphocytes humains, à maturité (produc- tion de facteurs de croissance, synthèse de DNA et RNA après stimulus mitogénique, augmentation des mitoses). De plus, des tests in vitro effectués en ambiance gastrique simulée, ont montré la stabilité de ces pep- tides, de telle sorte qu'il est possible de prévoir leur activité même après administration orale. Ainsi, les produits, objets de la présente inven- tion, peuvent être employés, grâce à leur combinaison unique d'activités antimétastatique et immunostimulatrices comme remèdes pour des patients qui subissent l'ablation chirurgicale de tumeurs, pour éviter la formation de métastases, et, en même temps pour aider à améliorer l'état immunitaire. Les figures 1 et 2 représentent respectivement les profils HPLC des tripeptides Arg-Gly-Asp et Arg- Gly-D-Asp obtenus conformément aux procédés décrits dans l'exemple 2. L'invention sera mieux comprise par les exemples suivants dans lesquels les abréviations suivantes sont utilisées: - 4 - Arg: L-arginine Gly: Glycine Asp: acide L- aspartique Asx: acide L-aspartique, acide Daspartique ou asparagine D-Asp: acide D-aspartique Boc: butyloxycarbonyle N: substitution sur l'azote guanoisine de Arg EXEMPLE 1: SYNTHESES Synthèse de l'acide L-Arjginyl-glycyl-L-aspartique l.Ester diebznyl de l'acide t-butyloxycarbonyl-glycyl- L-aspartique. La t-Butyloxycarbonyl-glycine (7,lg) a été dis- soute dans de l'acétate d'éthyle (50ml), on 1 a refroidie entre -10 et 15"C sous agitation et on l'a traitée avec de la N-méthylmorpholine (5,6ml) puis de l'isobutylchlo- roformate (5,18ml). Le mélange a été agité à -15 C pen- dant 10 minutes. Pendant ce temps, on a dissout le sel p-tosylate de l'ester dibenzylique de l'acide L-asparti- que (2,lg) dans le diéthylformamide (80ml), on a refroi- di à -100C et on a neutralisé par addition de N-méthyl- morpholine (5,6ml). On a ajouté cette solution à la solu- tion précédente de l'anhydride mixte préformé et on a laissé le mélange réactionnel se réchauffer lentement à la température ambiante en agitant pendant trois heures. On a alors dilué le mélange réactionnel avec de l'acétate d'éthyle (300ml) et on a lavé la solution avec de l'eau salée (deux fois) puis par du bicarbonate de sodium aqueux à 4% de l'eau, de l'acide citrique aqueux à 5 % et enfin avec de l'eau jusqu'à la neutralité. On a séché la phase organique (sulfate de magnésium) et on l'a alors évaporée pour obtenir une huile. Rende- ment: 20g. Le produit était homogène par TLC (système chloroforme: méthanol: acide acétique, 360:32:8; RF = 0,8). --5 -- 2. ester dibenzylique de l'acide tribenzyloxycarbonyl- L-arginyl-glycyl-L-aspartique. Le produit de l'étape précédente (20g) a été traité avec de l'acide trifluoracétique à 50 % dans le chlorure de méthylène (125ml) pendant 25 minutes à la température ambiante, et les solvants ont été évaporés sous pression réduite. On a évaporé à nouveau le résidu à partir du toluène, puis on l'a séché sous vide. On a dissout le sel résultant trifluoroacétate du dipeptide dans le diméthylformamide (75ml), on a refroidi à -10 C et on a neutralisé par traitement avec la N-méthylmor- pholine (5,6ml). Pendant ce temps, la tribenzyloxycarbonyl -L-arginine (23,lg) a étéc transformée en anhydride mixte par dissolution dans le tétrahydrofuranne (0lml), par refroidissement entre -10 et -15 C et par traitement avec la N-méthylmorpholine (5,6ml) puis par du chloro- formate d'isobutyle (5,18ml) comme décrit plus haut. La solution préalablement refroidie du dipeptide neutrali- sé a été ajoutée à la solution de l'anhydride mixte et on a agité le mélange pendant trois heures, en réchauf- fant lentement à la température ambiante. Pendant la réaction, le mélange s'est solidifié et on a ajouté du diméthylformamide (50ml) pour faciliter l'agitation. On a évaporé le tétrahydrofuranne sous pression réduite et on a dilué le résidu avec de l'acétate d'éthyle (500 mL). On a lavé cette solution avec du chlorure de sodium aqueux saturé, et au cours de ce lavage un solide blanc a précipité. On a séparé ce solide par filtration, on l'a lavé avec de l'acétate d'éthyle et on l'a séché pour obtenir le tripeptide protégé. Rendement: 25g. La chromatographie à fine couche (système: chloroforme méthanol: acide acétique, 85:10:5) a montré une légère contamination par la tribenzyloxycarbonyl-arginine non - 6 - 2621317 réagie. Le produit (14g) a donc été purifié par dissolu- tion dans le chloroforme: méthanol (98:2) et on l'a mis en contact avec une colonne de gel de silice (600g) On a élué la colonne en augmentant progressivement les quantités de méthanol dans le chloroforme pour obtenir le tripeptide pur protégé. Rendement: 10g. 3. Acide L-arginyl-glycyl-L-aspartique Le tripeptide protégé de l'étape précédente (10g) a été hydrogéné à 50 psi dans un système méthanol- acide acétique-eau (60:20:20, 300ml) pendant 72 heures avec du palladium sur du carbone (5%, 3g), lorsque la réaction était terminée par TLC. On a séparé le cataly- seur par filtration, on a évaporé le méthanol à pression réduite et on a lyophilisé le résidu pour obtenir le tripeptide sous forme d'une poudre blanche. Rendement 3g. Le produit était homogène par chromatographie à fine couche (systèmes: A, isopropanol: ammoniac, 1:1: B, n-butanol-acide acétique:eau:pyridine, 60:12:40:48 Synthèse de l'acide L-Arginyl-glycyl-D aspartique. 1. Préparation de résines de l'acide Boc-0-benzyl-D- Aspartique. Du polystyrène chlorométhylé (1% réticulé; 200- 400 mesh) a été placé dans un flacon à fond rond, et on l'a gonflé dans du diméthylformamide (environ 8-10 ml par g de résine) puis on l'a traité avec l'acide Boc- -benzyl-D-aspartique (1 mmole par gramme de résidu) puis par du fluorure de potassium ( 2 mmole par gramme de résine). Le flacon était équipé d'un agitateur mécani- que, et d'un condenseur et on l'a chauffé sous vide jus- qu'à ce qu'une petite quantité (5-10 ml) du solvant ait distillé. On a enlevé la source de vide et on a chauffé le mélange à 80-100 C pendant 16 à 18 heures. Lors du refroidissement, la résine a été filtrée, on l'a lavée avec du diméthylformamide, du diméthylformamide: eau ? _ (1:1), de l'eau, de l'éthanol, du dichlorométhane et du méthanol, puis on a séché sous vide. Substitution (calculée par le gain de poids): 0,6 mmole par gramme. 2. Procédure de synthèse. Une quantité de 17,6 grammes de la résine acide Boc-3-benzyl-D-aspartique a été placée dans un récipient de réaction en verre muni d'un agitateur mécanique, d'une base en verre fritté et d'une source de vide pour la filtration. On a traité successivement la résine à la température ambiante (20-25 C) avec les solvants ou réactif suivants: a. chlorure de méthylène b. 50% acide trifluoroacétique: chlorure de méthylène (v/v) c. 50% acide trifluoroacétique: chlorure de méthylène pendant 25 minutes. d. chlorure de méthylène (3 fois) e. isopropanol f. 10% triéthylamine: chlorure de méthylène (v/v)(deux fois) g. chlorure de méthylène h. méthanol (deux fois) i. chlorure de méthylène (deux fois) On a accordé un temps de contact de 3-5 minutes pour chaque traitement. On a utilisé environ 10-15 ml de solvant ou de mélange réactif-solvant par gramme de résine dans chaque étape. j. On a agité la résine avec une solution de Boc-glycine (3 équivalents) dans le chlorure de méthylène, et on a ajouté à cela du dicyclohexylcarbodiimide (3 équiva- lents) dans le chlorure de méthylène. Le temps de réaction pour le couplage était au minimum de 2-4 heures, mais pouvait durer jusqu'au lendemain (16-18 heures). La 8 - résine-peptide était filtrée et lavée avec du chlorure de méthylène, du méthanol et du chlorure de méthylène, et on a vérifié l'accomplissement du couplage par la réaction de ninhydrine. Si le couplage était incomplet, le même aminoacide était à nouveau accouplé en utilisant la moitié de la quantité des réactifs. g On a répété le cycle pour la Boc-N -tosyl-L-arginine (dans le diméthylformamide). Après avoir enlevé le groupe Boc N-Terminal, la résine-peptide était lavée avec soin et séchée sous vide. Rendement de résine-peptide: 21,0g. Le peptide a été séparé de la résine et on a enlevé sa protection de façon concomitante par traitement avec lefluorure d'hydrogène liquide anhydre (environ 10 ml par gramme de résine-peptide), contenant de 1' anisol (10% v/v) pendant 1 heure à 0 C. Après évaporation du fluorure d'hydrogène sous pression réduite, le peptide brut a été extrait par lavage de la résine avec de 1' acide acétique dilué aqueux et on a isolé le produit par lyophilisation. Rendement de peptide brut: 3,9g. 3. Purification du peptide brut. Le peptide brut pouvait être purifié par HPLC préparatrice à phase inversée utilisant de la silice C18-dérivée en employant, par exemple, un appareil Waters Prep 500. En utilisant une colonne 5x30cm, équilibrée avec le tampon aqueux approprié, tel que l'acide trifluoro- acétique 0,1% aqueux, le peptide brut (environ 2 grammes) était mis en contact avec la colonne et on effectuait une élution avec un gradient contenant des quantités croissantes d'acétonitrile. Les fractions étaient com- mandées par HPLC analytique, et celles qui contenaient le produit au niveau désiré de pureté (>97%) étaient réunies et lyophilisées. Enfin, le produit purifié était -9- transformé en son sel désiré par traitement avec la forme de sel désiré d'une résine échangeuse d'ions. Rendement de peptide purifié sous forme du sel acétate: 2,5g. EXEMPLE 2: CARACTERISTIQUES CHIMIQUES Arg-Gly-Asp Les données montrées ici concernent un lot unique du tripeptide et ne doivent pas être considérées de façon restrictive. Poids moléculaire: 346,4 Aspect: poudre blanche Analyse des aminoacides Aminoacide théorie trouvé Asx 1,00 1, 00 Arg 1 00 0,98 Gly 1 00 1,02 Teneur en peptide: 78,5% Pureté du peptide:96% Humidité: 6,56 TLC: isopropanol:NH (1:1) pureté 99%, Rf=0,75 HPLC: l'analyse a été effectuée selon les méthodes dé- crites ci-après et le profil est indiqué à la figure 1: solvants: A = KH2P04 0,05 M B = 60% CH3CN+40% A Gradient: de O à 10% B en 20 minutes Colonne: ultrasphère ODS (Altex) Sensibilité: 0,2 AUFS Longueur d'ondes: 210nm Vitesse d'écoulement: l, 5ml/minute Surface minimum: 10 - 10 - 2621317 Arg-Gly-D-Asp les données indiquées ici concernent un lot unique du tripeptide et ne doivent pas être considérées comme res- trictives. Poids moléculaire: 346,4 Aspect: poudre blanche Analyse des aminoacides: aminoacides théorie trouvé Asx 1,00 0,94 Arg 1,00 1,05 Gly 1, 00 1,02 Teneur en peptide: 80,5 % Pureté du peptide: >98% HPLC: L'analyse a été effectuée selon les méthodes décri- tes ci-après et le profil est donné à la figure 2: solvants: A = NaH2PO425m, 50nM NaCL04, pH 3,0 avec H3PO4 B = H20: MeCN 1:1 Gradient: de 0 à 30%B en 15 minutes, linéaire de 30 à 70%B en 10 minutes, linéaire Colonne: Deltapack C18 (5 ôm, 100 A) 3,9 x mm Sensibilité: 0,2 AUFS Longueur d'ondes: 220nm Vitesse d'écoulement: 0,7ml/minute Surface minimum: 10 EXEMPLE 3: CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES Stabilité en milieu gastrique simulé in vitro Le tripeptide Arg-Gly-Asp s'est révélé stable à 37 C pendant 3 heures, en milieu gastrique simulé in vitro en utilisant la solution de suc gastrique simulé USP XXI (HCL + pepsine) Activité antimétastatique La capacité du tripeptide Arg-Gly-Asp d'inhiber - Il - 2621317 la colonisation pulmonaire par les cellules de mélanomes murines B16-BL6 inoculées dans la souris femelle C57BL/6 ayant un corps de poids moyen de 20g (10 animaux par groupe) a été évaluée. A-g-Gly-Asp a été administré à la dose de 3 mg/sou- ris par injection intraveineuse, avec 2xl0 cellules de mélanome. Quatorze jours plus tard, on a sacrifié les ani- maux, on a retiré les poumons et on les a examinés après fixation de formaline, pour la présence des colonies de mélanome en surface, un groupe d'animaux témoins a seulement été traité avec la suspension de cellules de tumeur. Tandis que dans les témoins, le nombre moyen de métastases était supérieur à 500/souris, cette valeur a été réduite dans les animaux traités, ou il était de 173/souris. En administrant 7 x 10 cellules tumorales, le nombre moyen de métastases dans les témoins était de 21,6, il a été réduit à 6,8 dans les animaux traités avec 3mg/souris i.v de Arg-Gly-Asp (-69%). Induction de l'antigène THY 1.2 dans les cellules de la rate de souris normales. La capacité du tripeptide Arg-Gly-Asp à provoquer in vitro la différenciation des précurseurs de cellules T en lymphocytes, en exprimant les marqueurs de cellules T a été évalué en mettant en évidence l'induction de l'antigène de membrane Thyl.2 PREPARATION DES CELLULES Des cellules de rate de souris normales ont été utilisées comme source de cellules "zéro". Les souris ont été tuées par dislocation cervicale. On a enlevé les rates de façon aseptique et on les a hachées finement avec des forceps dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (Gibco Ltd, Paisley, - 12 - 2621317 Ecosse). On a obtenu une suspension des cellules isolées par filtration sur un tamis de fils à mailles fines. Les cellules mononucléaires (MNC) ont été isolées par centrifugation différentielle sur lymphoprep (Nyegaard, Oslo, Norvège.) avec un gradient continu de densité pen- dant 20 minutes à 450g. Après 3 lavages dans HBSS, les MNC ont été sus- pendues à une concentration de 5 x 10 cellules/ml dans le milieu 199 (199 medium, Gibco Ltd) avec en plus 1% de BSA (Cohn Fr. V. Sigma, St Louis), L-glutamine 2mM et 10mcg/ml de sulfate de gentamycine (Schering, KLWORTH, NJ, USA) (TC 199-BSA). on a utilisé les cellules lorsque leur viabilité était supérieure à 95% au test d'exclusion Bleu Trypan. THY 1.2 BIOESSAI D'INDUCTION ANTIGENE: On a mélangé deux cents e1 de la suspension MNC de rate avec le même volume du tripeptide dilué de façon appropriée avec le milieu TC 199-BSA. les cellules témoins ont été seulement traitées avec le milieu TC 199-BSA. On a incubé toutes les cellules pendant 18 heures à 37 C en atmosphère humide contenant 5% de COa, puis on les a lavées deux fois avec HBSS contenant 5% de serum de veau neonatal rendu inactif par la chaleur (Gibco) (HBSSS- CS) et on les a enfin remises en suspension dans le même milieu à une concentration de 10 cellules/ml. IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE (IF): L'expression de l'antigène Th 1.2 a été analysée par IF en utilisant un anticorps anti-Thy 1.2 monoclonal, associé à la fluorescéine (Bio-Yeda, fourni par Techno- genetics, S. Mauro Torinese Italie), à la concentration de 2mcg/10 cellules. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps pendant 30 minutes à 4 C. Après trois lavages dans HBSS, les cellules ont été remises en suspension dans le même milieu et on les - 13 - 2621317 a observées avec un microscope Leitz Orthomat équipé avec éclairage incident. On a compté au moins 300 cellules à chaque évalua- tion. RESULTATS: Comme montré dans le tableau, le tripeptide Arg- Gly-Asp est actif in vitro pour l'induction de Thy 1.2 à des concentrations variant de 1 à 200 eg/ml, la con- centration optimale étant de 10mcg/ml. CONCENTRATION DE HEURES D' THY 1.2 + VARIAT:Cr; ARG-GLY-ASP INCUBATION CELLULES - 322}2 - 011 3 25j3 3 3 j. 3 2>1 5 >1 3 29,4 5 711 !0o 3 3 2,9 -8 1- 18 21 7 - 14 - 22621317 - 14 - Synthèse de RNA dans les lymphocytes T humains stimulés par PHA in vitro. Les lymphocytes T humains, incubés in vitro pen- dant 24 heures en présence de 0,5% de phytohemagglutinine (PHA) et de différentes concentrations des tripeptides examinés, ont été analysées pour synthèse RNA (activation des cellules) au moyen d'indicateur 3H-uridine. Les résultats, montrés dans le tableau, mettent en évidence qu'à la fois Arg-Gly-Asp et Arg-Gly-D-Asp sont capables d'augmenter l'activation de lymphocytes T humains stimulés par PHA. CONCENTRATION CONCENTRAT ION | ARG-3LY-AS? ARG-GLY-D-AS r DE PEPTIDE c.p.m. c.p.m. mcg/ml ----------------------------------------- I X..-S.E.! X | S.E. 0 3835 --- 335 -- ! 1 108'! 108 0.000! 3703 3 I - 198 2!2 * I î- 1 0.001 3741 -2 I 1-' 168 9! 0.01 I 259 - il 283 2 I.92. 2.2.-a |O. t] tE191 '! 1S4 I ' 0.!. 4516 { 18 aTT 2 I 127: 1i0 068 + 6 i682 i 2- 278 i56 I.0 i o 9! I 241..C13 i Id - 15 - 2621317 Synthèse de DNA dans les lymphocytes T humains stimulés *dans PHA in vitro. Les lymphocytes T humains, incubés in vitro pen- dant 72 heures en présence de 0,5% PHA et de différentes concentrations des tripeptides examinés, ont été analysés pour synthèse DNA (prolifération de cellules) au moyen d'indicateur 3H-thymidine. Les résultats, montrés dans le tableau, mettent en évidence qu'à la fois Arg-Gly-Asp et Arg-Gly-D-Asp sont capables d'augmenter la prolifération de lymphocytes T humains induits par PHA. CONCENTRATION ARG-GLY-ASP ARG-GLY-D-ASP DE PEPTIDE l-------------------------- -------------------------- DE PEPTIDE mcg/mî! c.p.m. c.p.m. mcg/ml I S.E. A S.. I I _ _ _ _ _! __ _ _!_ I i__ __ _ _ _ _ _ _ 1 0 I 22612 --- 22ea2 3688! 0.0001 22002 - 3 21898 - 3 3383 391 2 01 0.! 23519 i 23029 3712 3225 0.01 21034 +6 24155! 8 I 3625 3322 0.1 25814! 17 6C090; _93 3a3! !f 251 5--212 26170 j- ' 1 3805 I 600 1 in 24111.e6 ú4570 _ i-! -t3537 42C1 ! _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I TI! - 16 - 2621317 Effet sur le cycle cellulaire. Les lymphocytes T humains ont été incubés pendant 72 heures en présence de PHA et des tripeptides étudiés (1 eg/ml). Le DNA a été alors coloré avec l'iodure de propidium et on a analysé les cellules avec un cytomètre à écoulement. PHASES CELLULAIRES Go-Gl S G2 + M ------__ -----____-__ -- -______ _____ ____ I %% I % CELLULES CETLULES CELLULES T + DRA 63.36 - 30.61i 6.02 - T + PHA+ ARG-GLY-ASP 57.69 -s5.67 29.46 -1.15 12.14 +6.12 T - FHA + AERG-LYS-ASP 60.79 -2.57 30C..6 +C.02 9.n2 +3.4C } II. Ii I T TPHA ARG-LYS-GLU 56.15 -7.21 2E8.64 -1.97 1l.35 8. _ _ _ _ I!__ _ !_ _ I__ __ _ _ '____ _ Go = cellules restantes Gi - intervalle entre mitose et synthèse DNA S = synthèse DNA G2 - intervalle entre synthèse DNA et mitose M = mitose - 17 - Stimulation de production de lymphokine in vitro. Les lymphocytes T humains ont été incubés avec PHA, avec ou sans les peptides examinés, pendant 24 heures (dans le cas de IL-2) ou 72 heures (dans le cas de BCGF). On a rassemblé les produits qui surnageaient, on a filtré ( 0,2 em) et testé pour la présence d'activi- té IL-2 ou BCGF, en les ajoutant, sous différentes concen- trations, à des lymphocytes T frais ou à des cellules B mises en culture à long terme. L'activité de proliféra- tion de ces cellules, dépendant de la présence du facteur de croissance respectif, a été évaluée par incorporation de 3H-thymidine. les résultats mettent en évidence un effet marqué de stimulation de la production du facteur de croissance par Arg-Gly-Asp, légèrement inférieur à celui de Arg- Lys-Glu, mais supérieur à celui que l'on obtient avec Arg-Lys-Asp. ACTIVITE BCGF (COMPTAGES PAR MINUTE) AU POURCENTAGE DU PRODUIT SURNAGEANT II T i I| Ic f3.125 6.25 12.5 I 25 50 ________ I.... I ______ I ___ I ______ I ___ I ____ _ I ___ I ____ _ I ___ I ____ _ I ___ I SURNAGEANT DE: |X_ S.E. |% XF S.E. A % X _ S.E. A% | X+ S.E. A% | + S.E. _4 % _ I I I I I I I I 1. I, T I.PIIA. 2. 14i -- 2156 5402 -- 15030 -- 17297/ -- 627 193 290 229,'1 16503 I I I I I I I I I I I I.. 1T F PIIA 2 5377 300 10125. +370 18143 F236 21977/ 46 22666 F3l CD + AR(;-LYS-GLIJ | | 2459 4503 3006 2702 3930 ' r F PIIA 2 48(0 F257 8611 t299 16550 20)6 186,15 t24 2)50 t 19 i A[ft-(LY--ASP 2377: 1875 2312 2489 36t8 I _I. 1 1_ I I I I, I I_ _1 I TI P, j 2 | 36,Z4 +169 6455 i199 12219 J i126 16554 I I 1(/ t, - 7( i AR(; - l.YS- A, P j 706 2328 13i6 4076t 129 I _ ___I I___ I _I_ _I I I I __l _I_ __ I _ I. -'a ACTIVITE TCGF: I II I I I I t I I I I I ï | T F '11A 2 1564 | '.I?2.1(012 7824 -- 10tii) - | :3.'9 643 I 1 136 2657 32.1 | __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ _ __ _ __ I__ _ __ _ I _ __ ___ __ I I _ l _ _ __ _ _ __ _ I __ __ _ I _ _ _ _ _ __ _ I _ _ ____ I _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ I II I I. I I I I I I I I T l'IIA 2 451ht | l':9 10213 | 290 1,1609 | 314 20695 i -165! 13.151 431. I t AI I_____ ____ I_ _._ I 1_________ __I ____ __I ______I_ _________I I___ ___ I_ _ 1,____1_.___ - 20 - Stimulation de la lymphokine in vitro par lymphocytes T humains purs sans macrophages. La production de lymphokine par lymphocytes hu- mains T purifiés par passage sur colonne de laine de nylon a été évaluée avec les mêmes méthodes que dans l'essai précédent. La pureté des cellules T était supérieure à 95%, tandis que les macrophages/monocytes ainsi que les cellu- les B étaient inférieures à 1%. Pour remédier au manque de macrophages, on a ajouté le recombinant IL-12 (Genzyme) à la concentration de 25 unités/ml. Les résultats obtenus, à la fois pour IL-2 et BCGF, montrent que l'effet de Arg-Gly-Asp est comparable à celui des autres composés de référence, parmi lesquels on a aussi utilisé la fraction 5 de thymosine, dérivé thymique partiellement purifié. ACTIVITE BCGF AU POURCENTAGE DU PRODUIT SURNAGEANT . 12 3.125 I 6. '5 12.! I 25 I w J surnageant de: - -J-- I-----i _.,___n. _|___ C_-. ,"'j. m a I -!."!--.A I rt-PlA IIrL-1 31.8 -- 582 -- 1104 -- 250 1 -- 5056 -- I I I I.... I TtPIIAFII.-1iAR(G-IYS-GLiU (lmcg/rnl)349| 10 | 564 - 3 i 2866 t160 4622 i 84 100:9 10() TiPIIA+[L-] IAIH(-I.YS-GLIJ (]O mcng/nl)622 - 96 | 784 | 353196 it-189 7187 +187 13863 '174 __ _ _ _.___ _ _ _ _ _ _ _ t_ _ __t_ _. I_ _ _t___ t_ _ _t_ _ _ t __ _t _ __ _ I T. TPIIAlîI.-llA-I{I-AI.A-A[R(l (liîcg/îî[L)j496 I1 56 [516 t - 1l 123497 i 113 3987 F 59 71'l: 11 i1 T I, PIIA 1II,-I. iAI (; -AI.A -AI 1 _ _ I _ 1 _ _ I I 1 I 1 _I_.I I>llA il -l A-I{( G-L[,YS-AAS'l ( liicg/inl)326 F 3 370 - 36 1839 | 67 3186 t. 27 8942' | /7 I 'PIIAI.-I iAH(I-IYS-ASP ( oinmcg/m].)421 t 32 462 - 21 1847 F 67 2946 |F i 6().) | + 15 | 1,_ ____I_ I I__I I I I_ I I__, I_. I I I I I I t I I I I I r T|I'IlIAFi-I ITIIYM(0S.F5 ( I)Olicg/ml)418 F 31 921 t 58 1796 + 63 3127 j 25 I 115t,1 IH "F I TP'IA, 1.--1 'IIIYM(;.[,5 (2 ();g/miîl)716| t 125 566 - 3 1308 - t 18I 21:32 - 15 (7'1 I i' - I_._ I _ ___ _ I _ I _,._I I I __i__,_, I _, , _I _ I,, _, I,..,1 ACTIVITE TCGF: 3. 12 5 6.25 1I2.5 25 I 50 I surnageant de:------------------------------------------------------------------------------- ______________________________.P. c.pi. '.p.,,., C.p.m. |% | c.m. i n I-I I I I I I I I. . 1 1 T+PIIA'+IL-1 1696 -- 2817 3663 -- 4812 -- 6297 -- I 1 1. 1II I 1 1 1 1 | T*PHAiIL-ltARG-LYS-G(IU (lincg/mnl) 2516 F 48 8218 +192 14932 +308 17148 | 256 16293 | 159 TFIPIIAill.-I.iARG;-I.YS-GLIJ (10 incg/nil)2873 | 69.7192 |155 1]5264 +317 16887 +251 12246 j 94 I I1,1 I I I I 1 I I | 'I'IPIIAil.-IiAl(IG-AI.A-AlIG (imcg/nm])| 2085 23 ' 5679 +102 11728 j 220 12692 i 164 | 1 378 i 81 r r l'IA i Il.-I,AIi(;-AI.A-Ali(; ( I) imcg/nml)31412 8 85 644'7 +129 I 13629 272 I 151-13 +215 j IOt?5 I 73 N TI,PIIA, rL-I IAItG-G(LY-ASI' (lmcg/fiJ)1984 F 17 6893 i +145 1 3147 + 259 14862 +209 15654 +149 TPIIA] I.-I f AR(-GLY-ASP(lOrnmcg/ilil) 1736 | 2 6342 +125 13874,I +279 10968 | t128 13,127 113 I _ I 1 1 I 1 1 1 _ i 1 1 TtPIIAuIL-IiARG(-LYS-ASP (lmcg/mnl) 2274 i 34 5216 + 85 8969 +145 10421 i 117 98H8'7 57 rPIIA+ tII.-IA IlI(;-I.YS-ASP ( lOincg/iil)2769 i t- 63 6143 I 118 7245 i + 98 7963 | 65 81 4. 3 29 I _ _ _ _ _ _ _ _ I _ _ I I I I I I. 1I 1 If.. I II I I I I I I I I Ir Tl'lIIA+11.-I tTIYMOS.F5 (I100imcg/tiil)2374 | i. 40 7286 +159 15637 +327 1314-12 f173 |]3835 120 _. I 'PlIAFII.-l*I'IIYMOS.F15 (200,icg/ml)I 2156 F 27 5218 + 85 12143 + 232 10874 | 126 | 121 9 93 I _ I___ _ _ I_ _ I__I I I I I I 1 j-., - 23 - EXEMPLE 4: ESSAIS TOXICOLOGIQUES Arg-Gly-Asp Le tripeptide Arg-Gly-Asp présente un LD50 supérieur à 1000 mg/kg i.p. dans les souris. EXEMPLE 5: EMPLOI CLINIQUE Les exemples précédents 3 et 4 ont montré que les tripep- tides objets de la présente invention sont actifs in vitro comme agents immunostimulants pour des modèles expérimentaux à la fois animaux et humains, et in vivo comme produits antimétastatiques sur les animaux de labo- ratoire, en plus du fait qu'ils sont dépourvus de toxici- té. On peut ainsi prédire très raisonnablement qu'ils seront utiles cliniquement pour prévenir la métastatisa- tion chez les patients qui subissent une ablation chirur- gicale d'une tumeur, et, en même temps, pour améliorer les défenses immunitaires de l'organisme grâce à leurs propriétés immunostimulatrices. SELS DES TRIPEPTIDES Les exemples cités précédemment concernent le sel acétate des tripeptides. Cependant, il est possible d'obtenir des résultats analogues avec d'autres sels d'acides organiques et inorganiques, tels que par exemple un tri- fluoroacétate, un hydrochlorure, un sulfate. - 24 - REVENDICATIONS 1. Tripeptides selon la formule générale H-Gly-Y dans lesquels X = L-Arg ou D-Arg et Y = L-Asp ou D-Asp, et leurs sels d'acides organiques et inorganiques, tels par exemple que l'acétate, le trifluoroacétate, l'hydro- chlorure, le sulfate. 2. Tripeptides selon la revendication 1 ayant les séquences suivantes: Arg-Gly-Asp D-Arg-Gly-Asp Arg-Gly-D-Asp D-Arg-Gly-D-Asp. 3. Tripeptides selon la revendication 1, en particulier Arg-Gly-Asp et Arg-Gly-D-Asp. 4. Tripeptides selon l'une des revendications 1 à 3, carac- térisés par le fait qu'ils sont doués d'une activité anti- métastatique et/ou immunostimulatrice. 5. Emploi de tripeptides selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation de médicaments doués d'une activité antimétastatique après administration parentérale. 6. Emploi de tripeptides selon l'une des revendications 1 à 3, pour la -préparation de médicaments doués d'activité anti- métastatique après administration orale. 7. Préparations pharmaceutiques selon la revendication 4, pour administration orale. 8. Préparations pharmaceutiques selon la revendication 4, pour administration parentérale. - 25 - 9. Emploi destripeptides selon les revendications 1 et 4 pour la préparation de médicaments doués d'activité immuno- stimulatrice. 10. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent des sels pharmaceutiquement acceptables destri- peptides selon les revendications 1 et 4 à 8 comme remèdes pour les patients qui subissent un ablation chirurgicale d'une tumeur, pour prévenir la formation de métastases et en même temps pour contribuer à améliorer les conditions immunitaires. 11. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 10, caractérisées en ce que les sels pharmaceutiquement accepta- bles destripeptides qu'elles contiennent sont des sels acétates. 12. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 10, caractérisées en ce que les sels pharmaceutiquement accepta- bles des tripeptides qu'elles contiennent sont des sels tri- fluoroacétates. 13. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 10, caractérisées en ce que les sels pharmaceutiquement accep- tables des tripeptides qu'elles contiennent sont des sels hydrochlorates. 14. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 10, caractérisées en ce que les sels pharmaceutiquement accep- tables des tripeptides qu'elles contiennent sont des sels sulfates. 15. Procédé pour la préparation des tripeptides selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comporte les phases suivantes: - préparation de l'ester t-butyloxycarbonyl- Gly-Asp dibenzyle -préparation, à partir du composé ainsi obtenu, de l'ester tribenzyloxycarbonyl-Arg-Gly-Asp dibenzyle -ensuite hydrogénation catalytique pour obtenir le tripeptide Arg-Gly-Asp.