Brevet FR2614306A1 — publié le 19881028

La présente invention concerne un nouveau dérivé de D.25, son procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques le contenant. Le produit dénommé D.25 est le polysaccharide extrait des protéoglycanes membranaires bactériens, composé essentiellement d'unités galactose et ayant un poids moléculaire de 30 + 10 KD. Ce polysaccharide a été décrit en détail dans le brevet français n 84.13844 déposé le 10 Septembre 1984. Ce polysaccharide possède des propriétés immunostimulantes, notamment vis- à-vis de l'induction d'interféron endogène et de l'activa- tion des cellules NK (Natural Killer). Ce polysaccharide est préférentiellement isolé d'une souche non capsulée et non pathogène de Klebsiella pneumoniae biotype a, déposée à la Collection Nationale de l'Institut Pasteur sous le numéro 145.I.IP. La présente invention concerne un dérivé original du D.25 dans lequel au moins une partie des résidus' galacto-furannose (Galf) de la chaîne polysaccharidique linéaire du D.25 ont été transformés en arabinose, sans aucune autre modification du produit initial. En particu- lier, les résidus galacto-pyranose (Galp) sont conservés. Selon une caractéristique particulière de l'in- vention, le dérivé dans lequel tous les résidus galacto- furannose de la chaîne polysaccharidique linéaire ont été transformés en arabinose, est défini par le monomère suivant: > Ga]pr 3 aJ P a c'.a 1,31.3P 1.3 1.3 1.3 -> 0 OGa1 -- o, Ara -1- P Galp -3 o Ga1p 1.31.3' 1.3 1,3 P 1,3P a3 -- dans lequel Galp signifie galacto py- 1,3 1,3 ranose (formesO et) Ara signifie arabinose (formesO et) 26 1 4J3 Un procédé d'obtention du dérivé de la présente invention est caractérisé en ce que l'on soumet le D.25 à une oxydation periodique puis à une réduction. L'oxydation est préférentiellement mise en oeuvre à l'aide de métaperiodate de sodium. La réduction peut être mise en oeuvre à l'aide de NaBH4 éventuellement en excès. Le nouveau dérivé du D.25 présente des propriétés immunostimulantes remarquables et une absence de cytoxicité. C'est pourquoi la présente invention concerne aussi l'utilisation du dérivé à titre d'agent immunostimu- lant ainsi qu'une composition pharmaceutique comportant au moins un dérivé conforme à la présente demande. L'invention concerne aussi des dérivés d'hémisynthèse du composé décrit précédemment. En particu- lier, il s'agit de dérivés de type amide, ester, éther, sel, ou dérivé d'ammonium quaternaire avec des acides, amines, amides ou alcools. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre. Exemple 1: Isolement du protéoglycane membranaire brut. La biomasse de la souche de Klebsiella pneumoniae 145.I.IP est dispersée dans du tampon Tris-HCl (10 mM-pH7/0 glacé contenant NaCl (0,15 M), puis soumise à un bro- yage mécanique destiné à rompre les parois cellulaires. Le lysat bactérien est clarifié par centrifugation conti- nue à 15.000 g et le surnageant est recueilli. Le surna- geant est traité par addition d'acide acétique jusqu'à pH 4,2, à froid, pour éliminer par précipitation les impuretés (acides nucléiques, grosses protéines). Le précipité d'impuretés est éliminé par centrifugation continue à 15.000 g. Le surnageant limpide est recueilli puis neutralisé par NaOH. La solution est alors dialysée puis concentrée par ultrafiltration sur membrane coupant à 10.000 dal- tons. La solution concentrée, obtenue à ce stade correspond au protéoglycane membranaire brut. Exemple 2: Isolement de la fraction polysaccharidique brute. Cela consiste en une hydrolyse alcaline ména- gée destinée à dépolymériser le protéoglycane membra- naire brut pour libérer la fraction polysaccharidique. La solution concentrée et dialysée de protéoglycane membra- naire brut obtenue précédemment est additionnée de NaOH pour avoir une concentration finale de 0,5 M en NaOH. On hydrolyse ensuite pendant 1 heure à 56 C. Après refroi- dissement rapide, la solution est neutralisée par HC1. La solution neutralisée est clarifiée par fil- tration sur filtre-presse puis concentrée par ultrafiltra- tion sur membrane coupant à 10 000 daltons. Exemple 3: Purification de la fraction polysaccharidique Le concentrat obtenu à l'exemple précédent est soumis à un premier traitement enzymatique par le lysozyme, destiné à détruire les résidus de muréine pouvant subsister dans la préparation. l'hydrolyse est faite pendant 2 heures à température ambiante, en tampon Tris-HCL(lOmM-pH 8,O) contenant: EDTA, Na2 (4 mM) et 0,1 mg/ml de lysozyme. Après action du lysozyme, les protéines conta- minantes sont éliminées par protéolyse dans les condi- tions suivantes: le pH de la solution est ajusté à pH 7,0 puis on ajoute 0,1 mg/ml de protéinase K. On poursuit l'incubation 2 heures à 37 C sous agitation. Le polysaccharide est ensuite isolé par préci- pitation alcoolique. Trois volumes d'alcool éthylique sont ajoutés à température ambiante. Après 30 minutes d'agitation, le précipité est recueilli par filtration. Le précipité est repris en solution dans l'eau distillée et la solution filtrée sur membrane de porosité 0,45 gm. Les contaminants résiduels du polysaccharide provenant des hydrolyses enzymatiques sont éliminés par chromatographie de tamisage moléculaire sur une colonne industrielle Pharmacia moulée avec du gel SEPHACRYL S200 HR. Le volume d'échantillon déposé représente 5% du volume de gel. L'élution est faite avec de l'eau distillée à un débit linéaire de 5 cm/heure. Le pic de polysaccharide purifié, détecté par mesure en continu de l'indice de réfraction est recueilli et concentré par ultrafiltration sur membrane coupant à 10 000 daltons, au 1/5è du volume initial. La solution concentrée obtenue à ce stade correspond au polysaccharide purifié D.25. Exemple 4: Obtention du nouveau polysaccharide La solution précédente est diluée afin d'obte- nir 20 g de polysaccharide par litre de solution. On ajoute alors de l'acétate de sodium 0,1 M et le pH est ajusté à 3,8. On ajoute ensuite 15 g de métaperiodate de sodium par litre de solution puis on maintient sous agitation pendant 48 heures à l'obscurité et à température 15 C. L'excès de métaperiodate est ensuite éliminé par précipitation avec de l'hydroxyde de Baryum. Sous forme d'une solution concentrée ajoutée progressivement sous agitation jusqu'à fin de précipitation. Le précipité ainsi formé est éliminé par simple filtration. Au filtrat précédent, on ajoute alors 21,6 g de NaBH4 puis on laisse réagir pendant 18 heures à tempéra-. ture ambiante. L'excès de NaBH4 est ensuite détruit par addition d'acide acétique jusqu'à neutralité. La solution obtenue est dialysée, concentrée sur membrane coupant à 10. 000 Daltons puis lyophilisée. Le lyophilisat ainsi obtenu constitue le nouveau dérivé de D.25 de la présente invention. Exemple 5: Contrôle de l'absence de cytotoxicité La cytotoxicité est mesurée par incubation in vitro de différentes concentrations du dérivé de la présente invention dans une culture de cellules YAC-1 marquées au 51Cr. Après 4 heures d'incubation, le taux de 1Cr libéré par la lyse des cellules est mesuré dans le surnageant. On exprime les résultats par le pour- centage de cellules lysées par rapport à une culture témoin. La lyse spontanée dans la culture témoin est d'environ 5%. Les résultats sont répertoriés dans le Tableau I ci-dessous. TABLEAU I Concentration en g/ml % de lyse cellulaire 0,05 - 0,2 O,1 1,0 0,5 0,3 1,0 - 1,0 ,0 0,3 ,0 - 0,4 ,0 - 0,1 ,0 - 1,3 Les résultats montrent clairement l'absence totale de cytotoxicité du produit. Exemple 6: Activation des cellules NK in vitro Des cellules effectrices (cellules spléniques de souris) sont préincubées pendant 6 heures dans un milieu RPMI-1640 contenant 5% de sérum foetal de veau avec diffé- rentes concentrations de dérivé à tester. La mesure de l'activité NK est faite sur 000 cellules cibles YAC-1 marquées au 51Cr dans chaque puits, avec un rapport cellules effectrices/cellules ci- bles égal à 100/1. Après 4 heures d'incubation, la quantité de 51Cr libérée dans le surnageant par la lyse des cellules est mesurée avec un compteur gamma. Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous TABLEAU II Concentration en gg/ml % de lyse des cellules ci- bles YAC-1 0-témoin 18,4 0,1 21,6 1,0 31,6 47,4 40,8 Les résultats confirment le très grand pouvoir stimulant du dérivé sur l'activité des cellules NK "in vitro". Exemple 7: Activation des cellules NK "in vitro" chez la souris. Comparaison avec le polysaccharide D.25. Des souris CBA/H âgées de 6 à 8 semaines reçoi- vent une injection intrapéritonéale de 100 gg du dérivé de la présente invention un jour ou trois jours avant la mesure de l'activité de leurs cellules NK spléniques. La mesure de l'activité NK est ensuite faite comme précédemment pour l'essai "in vitro". Les résultats sont présentés dans le Tableau III ci-dessous TABLEAU III % de lyse des cellules cibles Produit injecté à J + 1 à J + 3 PBS témoins 25,2 18,2 D.25 (100 gg) 20,0 22,0 PS dérivé (100 gg) 32,6 26,8 Les résultats présentés dans le Tableau mon- trent que le nouveau polysaccharide possède une capacité de stimulation des cellules NK supérieure à celle du D.25. Cette activité se manifeste dès le premier jour après l'injection et se prolonge à J + 3 tandis que, dans les mêmes conditions, l'activité du D. 25 n'apparaît qu'à J + 3. REVENDICATIONS 1 - Dérivé polysaccharidique caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé de D.25 dans lequel les résidus galactofurannose (Galf) de la chatne poly- saccharidique linéaire ont été transformés, au moins en partie, en arabinose. 2 - Dérivé polysaccharidique selon la revendi- cation 1, défini par le monomère c' e Fka _Aai 0G(a 2) Gail 1.3 ' 1,3]3. 3P > ( Ara) Ga3 -> GAra Ga Gia] ].31.3 ['3. 1,3 1,3 F a] Y.... 1,3 13 dans lequel Galp signifie galactopyranose (sous forme P c et) Ara signifie arabinose (sous forme Y et). 3 - Procédé d'obtention d'un dérivé conforme à l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que a) on soumet le D.25 à une oxydation periodique, b) on soumet le composé issu de a) à une réduction. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite oxydation périodique est mise en oeuvre à l'aide de métaperiodate, éventuellement en excès. - Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce qu'il s'agit de métaperiodate de sodium. 6 - Procédé selon l'une des revendications 3 à , caractérisé en ce que ladite réduction est mise en oeuvre à l'aide de NaBH4, éventuellement en excès. 7 - Utilisation d'un dérivé conforme à l'une des revendications 1 et 2, à titre d'agent immuno- stimulant. 8 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un dérivé selon l'une des revendications 1 et 2. 9 - Dérivé polysaccharidique caractérisé en ce qu'il s'agit d'un amide, d'un ester, d'un éther, d'un sel ou d'un dérivé d'ammonium quaternaire du composé conforme à l'une des revendications 1 ou 2 avec une amine, un amide, un acide ou un alcool.