Brevet FR2621039A1 — publié le 19890331

rives non toxiques de l'acide n-butyrique pré.-'n.nt les actions thérapeutiques retardées". La présente invention a pour objet la préparation d'esters et/ou, de polyesters de l'acide n-butyrique, présentant des actions thérapeutiques retardées grace à la combinaison chimique du-dit acide n-butyrique par des liaisons covalentes biodégradables avec des dérivés polyhydroxylés non toxiques. Il est connu que les sels de l'acide n-butyrique, et tout particulièrement le butyrate de sodium, possèdent des actions inhibitrices intéressantes sur la croissance des fibroblastes par suite d'actions sur les histones et la structure de la chromatine des noyaux cellulaires. Cette action inhibitrice de la division cellulaire s'est révélée parti culièrement importante à exploiter en cancérologie, notamment pcur le traitement de diverses leucémies ou de sarcomes et carcinomes divers. Outre ces actions antimitotiques au niveau des noyaux cellulaires, des actions antivirales du butyrate de sodium ont été également caractérisées, notamment par l'un des auteurs de la présente invention (F. PIERI) pour le virus de l'herpès. Les activités pharmacologiques du butyrate de sodium caractérisées par ailleurs sont donc particulièrement intéressantes et prometteuses. Cependant, il est connu également à la suite des-tests pharmacocinétiques que les sels minéraux de l'acide n-butyrique ont une durée de vie in vive qui est extrêmement brève. Pour tenter d'accroître ia demi-vie du produit injecté, on a proposé par ailleurs d'autres dérivés comme par exemple, le butyrate d'arginine (Ch. CHANY et coll., int. -J. Cancer, 1982, 30, 489 et ibid. 1983, 32, 379). Comme le montre le tableau ci-après qui présente le résultat de tests pharmacocinétiques sur le lapin, on voit que ces dérivés ne permettent pas d'obtenir une curée de vie in vivo suffisante pour une action pharmacologique satisfaisante. Ces dérivés ioniques sont métabolisés très rapidement après l'adminis- tration par voie injectable. PHARMACOCINETIQUE DU BUTYRATE DE SODIUM SUR LE LAPIN PHARMACOCINETIQUE DU BUTYRATE D'iRCNINE SUR LE LAPIN Butyrate sodium Butyrate arginine Quantité iniectée : 0,12 g/Kg Q^antité injectée : 0,25 g/Kg CS (en Ac. Butyrique) mmol/l CMS (en Ac. Butyrioue) mmol/l 2 min 1,66 2 .in. 1,36 5 min............... 0,87 5 min.............. 0,23 18 min............... 0,03 30 min.............. 0,06 30 min............... 0,02 60 min.............. 0 Il est donc particulièrement important de rechercher des dérivés de l'acide n-butyrique qui présentent une action retard in vitro pour atteindre une période de demi-vie significativement supérieure aux butyrates décrits jusqu'alors. C'est l'objet de la présente invention dont les fondements sont les suivants - Les conclusions actuellement admises à partir des études réalisées jusqu'alors tendent à admettre que c'est la forme libre de l'acide n-butyrique qui agit au niveau du métabolisme des noyaux cellulaires au moment des processus de déclenchement des mitoses. - Par injection in vivo de cette forme ionisée du produit actif, le métabolisme général du receveur tend à cataboliser très rapidement la molécule libre. Sa disparition quasi totale s'effectue sur environ 30 mn, même pour le butyrate d'arginine (toutes corrections faites). - Il convient donc de chercher des formes de condensation de l'acide n-butyrique avec des molécules non toxiques permettant de créer des liaisons chimiques covalentes métabolisables par les enzymes du receveur avec une cinétique plus lente au niveau du système général. I1 convient également de chercher des molécules associées à l'acide butyrique dont les polarités lipophiles et hydrophiles favorise= les perméabilités au niveau des membranes cellulaires pour permettre des transferts rapides vers les cellules dérégulées en phase mitotique activée. Sur ces fondements, la présente Invention est caractérisée par, la préparation selon des opérations connues de dérivés de l'acide n-hutyrique, répondant à la formu)c générale suivante avec les désignations ci-dessous représente des molécules unitaires d'acide n-butyrique dont les fonctions carboxyliques sont totalement estérifiées et liées par covalence avec les molécules de type R(OH)x représente des dérivés polyhydroxylés non toxiques dont tout c partie des fonctions hydroxyles sont estérifiées par des molécules d'acide n-butyrique. représente des liaisons covalentes de type ester entre les fonctions hydroxyles des molécules polyhydroxylées de type R - (0) et les fonctions carboxyliques des résidus d'acide n-butyrique de type - (CO - But) n * Il est expressément défini que la nature de R est retenue de telle sorte que le dérivé final ne soit pas toxique et qu'il soit métabolisable après libération des résidus d'acide n-butyrique par hydrolyse naturelle in vivo des liaisons esters. R peut correspondre à des monoalcools primaires ou secondaires (x = 1) ou à des polyols divers (X 2) ; R peut être indifféremment aliphatique, cyclique, hétérocyclique ou polycyclique. Sans qu'en aucun cas cela puisse être considéré comme limitatif, on peut citer à titre d'exemple, le glycérol, le sorbitol, des oses ou osides divers, comme notamment le glucose ou le saccharose, ou encore des dérivés divers d'oses ou osides, comme notamment des osamines (acétylés ou non). Dans le cas des polyols, des oses et osides et leurs dérivés, ils peuvent être substitués totalement ou partiellement par des molécules d'acide n-butyrique, de telle sorte qu'on puisse faire varier l'e nombre de résidus d'acide n-butyrique et le nombre de fonctions hydroxyles restant libres par molécule de produit fini. Par un enchaînement judicieux d'opérations connues, on peut également préparer à partir de polyols des esters mixtes dont la formule générale selon cette variante serait la suivante Y peut correspondre à un ou plusrurs types de molécules de nature très diverses, à condition qu'elles ne soient pas toxiques. Selcn la nature des groupements X et leur nombre Y par molécule de produit fini on pourra avantageusement modifier le poids moléculaire, les polarités, les propriétés diffusionnelles in vivo, la demi-vie et, selon la valeur de n, les activités pharmacologiques du produit fini. Selon une dernière variante, on pourra également selon la nature de R ou de X, préparer des dérivés mixtes esters-sels de l'acide n-butyrique si R ou X portent des fonctions basiques ionisables, par exemple de type amine. Sans être limitatif, on peut citer le cas simple où r- est un hydroxyaminoacide comme la sérine. On obtient ainsi le dérivé mixte suivant Si selon la variante précédente (polyol hétérosubstitué), X est pareillement ionisable, on obtient des dérivés polysubstitués esters-sels dont les poids moléculaires et les teneurs en acide n-butyrique seront variables, de la forme générale suivante (But COO-)x Selon les valeurs de x et de y on modifie ainsi les proportions relatives des formes ionisées (action immédiate) et esters (action retardée). A titre d'exemple, et sans que cela soit considéré comme limitatif, on décrit ci-dessous la préparation et les caractéristiques pharacocinétiques de deux types de dérivés en rapport avec la présente invention. Exemple 1 : Préparation et effet retard du O - butanoyle - 3 di - 0 - isopropylidène 1,2 : 5,6 a - D - glucofurannose (dérivé PJ.120). Dans un flacon tricol, on place 26 g (0,1 mole) de di - 0 isopropylidène - 1,2 : 5,6 a- . D - glucofurannose préparé par ailleurs selon des procédés connus. On introduit 100 ml d'un solvant approprié, puis 19 ml (0,1 mole) de tripropylamine. On chauffe l'ensemble sous agitation jusqu'à reflux et on ajoute alors goutte à goutte 10 ml de chlorure de butanoyle (0,1 mole) en solution dans le n-heptane (50 ml). Un poursuit le reflux pendant 60 mn après la fin de l'addition. Après retour du mélange réactionnel à la température ambiante, ce dernier est filtré afin d'éliminer les cristaux de chlorhydrate de tripropylamine formés et les restes éventuels de di - O - isopropylidène gl ucofurannose. Le filtrat recueilli est évaporé sous pression réduite. Le produit obtenu (31,69 g) est un liquide pâteux jaune de pouvoir rotatoire [&alpha;]22 = -28 (éthanol). D L'analyse C.P.V. (OV17 ~ 1 m - 2000 C - 1,7 bar temps de rétention 3 mn) indique une pureté de l'ordre de 98 %. La totalité du produit est ensuite chromatographiée sur silice (Kielselgel 60) (150 g) à l'aide d'un gradient n heptane/ ether éthylique (fraction 90/20). Le produit purifié (26,75 g) se présente sous la forme d'un liquide visqueux jaune très pâle de pouvoir rotatoire [&alpha;]D22 = - 32,67 (éthanol), d'indice de réfraction n = 1,477 à 23 C. Le rendement global est de 81 % en produit ainsi purifié. Les spectres RMN 1H et 13C sont donnés en annexe. Les tests pharmacocinétiques sur lapin sont réalisés dans les conditions suivantes On prépare une solution contenant 0,600 g du produit préparé comme ci-dessus, dans 2 ml de glycérol formal (mélange de dioxanne - 1,3 ol-5 et de dioxolanne - 1,3 méthanol - 4). On procède sur les lapins d'expérience , à une injection préalable (0,1 ml/Kg) d'une solution d'héparine à la concentration de 5000 U.I./ml dans la veine marginale de l'oreille , l'aiguille est laissée en place permettant d'administrer, deux minutes plus tard, une dose de 0,1 ml/Kg (soit 23 mg/Kg) de la solution préparée ci-dessus. Des prélèvements sanguins de 1 cm3 échelonnés dans le temps sont effectués au niveau de la veine marginale de l'autre oreille. Le sang est centrifugé (2 000 tours/mn durant 3 mn) et le sérum est recueilli. La concentration en acide butyrique potentiel sérique est déterminée par chromatographie en phase gazeuse à l'aide d'une colonne de CHROMOSORB 101 ou de CARBOPACK C. L'échantillon à analyser est préparé de la manière suivante - 80 Ul de sérum - 10 ijl d'acide formique pur - 10 Ul d'acide valérique (étalon interne) à la concentration de 50 mg/l. La quantification se fait par comparaison des surfaces respectives de l'acide butyrique et de l'acide valérique, les coefficients de réponse ayant été déterminés préalablement. Les toxicités aiguës (chez la souris) et chroniques (chez le rat) sont déterminées selon les protocoles normalisés habituels. Ce dérivé monobutyrate 3 - di isopropylidène glucose est insoluble dans l'eau. Les résultats de toxicité et de tests pharmocinétiques pour ce dérivé désigné PJ 120 sont les suivants Toxicités : DL. 50 chez la souris - en intrapéritonéale : 1,75 + 0,39 g/Kg - par voie orale : 8 g/Kg Toxicité chronique chez le rat : 1,12 g/Kg L'administration journalière de 1,12 g/Kg pendant un mois ne provoque pas la mort des animaux d'expérience. Tests pharmacocinétiques : Concentration sérique (en mmole) d'acide butyrique Expérience 1 Expérience 2 quantité injectée quantité injectée 0,003 g/KS 0,005 g/Kg 60 mn 0,360 0,228 6H O, 136 24 H 0,080 0,026 48 H 0,040 0,023 72 H O O On voit donc que le dérivé, bien qu'insoluble dans l'ea', n'est a toxique.En outre, par comparaison avec les résultats pharmacocinétiques obtenus avec le butyrate de sodium et le butyrate d'arginine (cf. le tahleau précédent), on voit que pour des quantités injectées de 50 fois inférieures le temps de disparition de l'acide butyrique circulant dans le sérum passe de 60 mn (butyrate d'arginine) à plus de 48 H (PJ 120). Exemple 2 Préparation et effet retard du O - butanoyle 3 - O - isspropylidène 5,6 a - D -glucofurannose (dérivé J.P. 12). Dans cet exemple, on prépare le dérivé mono-isopropylidène à partir du dérivé di-isopropylidêne préparé dans les conditions de l'exemple 1. On place 33g(l/lomole)de O - butanoyle - 3 di - 0 - iscpropylidène 1,2 : 5,6 aD glucofurannose (butyrate - 3 de diacétone glucose) dans une enceinte thermostatée à 700 C contenant 500 mml d'H2504 0,1 N dans un mélange isopropanol/eau (95/5). Au bout d'une heure, on constate en C.P.V. la disparition du pic de butyrate - 3 de disopropylidène glucose et la solution est neutralisée pas de la tripropylamine dont le sulfate est insoluble dans le milieu. Le solvant est éliminé sous pression réduite. La fraction brute obtenue est purifiée par chromatographie liquide sur silice (Kielselgel 60 Merck 9585, 230 - 400 mesh) (150 g) à l'aide d'un gradient heptane/acétone (fraction 80/20). Après évaporation sous pression réduite on obtient 20,20 g d'un liquide légèrement jaunâtre dont le pouvoir rotatoire est de 22 [&alpha;]D - @ 17,34 (chlorororme). Le dérivé, parfaitement caractérisé en spectroscopie RMN, est soluble dans l'eau. Les tests de toxicité et les tests pharmacocinétiques sont réalisés dans les mêmes conditions que précédemment à l'exemple 1. Les résultats sont les suivants Toxicité : DL 50 chez la souris - en intrapéritonéale 4,2 + 0,41 g/Kg - par voie orale : 8 g/Kg Tests pharmacocindtiques Quantités injectées : 0,005 g/Kg Concentration en ac - butyrique dans le sérum (en mmole/l) 1 H 0,141 6 H 0,126 24 H 0,076 48 H 0,063 72 H 0,054 Pour une quantité injectée 50 fois inférieure aux produits de référence, ce dérivé soluble dans l'eau libère de l'ac - butyrique circulant encore plus lentement que le dérivé PJ 120 décrit à l'exemple 2 puisque les concentrations décelables après 72 H sont supérieures à celles du dérivé PJ 120 après 24 H. TABLEAU : Spectre @@@ de @@@@ @@@@ @@@@ @@ Tableau 1 : Spectre de RMN 1H du 0- butanoyl- 3 di-0 isopropylidène 1,2:5,6 &alpha;D glucofurannose. Nature : o en ppm/T(iS rormule : Protons : du : dans Signal ------------------ : CDCl ) 3 : H1 doublet (1) . 5,87 ) : H3 : doublet (1) 5,32 3 a. . H2 z doublet (1) . 4,47 ) 0 H4-H5-H6-K6, : Ú 1 t i p 1 e t ( ) . -4 Hg-Hg : = multiplet ) 2 22\ 0,10' = triplet (2) 2,32 H11, H quadruplet (2): 1,67 . Me . ll' : : singulet (3): 1,52 9 1C 1C' 11,11 '2.12'.12" 4 H : singulet (3): 1,40 ) G - C - Cíl2 - CH2 - CE3 = m - singulet (6) : 1,32 ) n H t'ipiet (3) : ojss , o H12 12 12" triplet (3) : Oj95 ) Tableau 2 : Spectre de RMN 13C du 0 - butanoyl- 3 di-O-isopropylidi 1,2:5,6 &alpha;D glucofurannose (P.J 120). ( Ô 6 en ppm/Tt1S formule = Carbones . dans CDCl3 ) ( : . ( : : ) ( : C9 : 172,00 ) ( Me O : ) ( t,Se - 5 . . C7 - C8 . 112,23 - 109,34 ) Me O s 7 8 ( 4 C X 1 C 105,41 ) ( B c HX 2 ' 2 3 4 C5 .83,48-79,98-75 85 72 49) C = 67,35 ) Me 6 67,35 ) m ( : C1O : 36,13 ) ( 9 lo il 12 : ) ( 8 2 2 - c - cii2 - cii2 - cii3 : 4{Cn] :26,89-26,78-26,24-25,27) ( o : C : 18,44 ) 1 1 ( : Cl2 : 13,61 ) 12 ) ( ~~~~~ ) Tableau 3 : Spectre de RMN 1H du 0- butanoyl- 3 O-isopropylidène-1,2 &alpha;D glucofurannose (O.P 12). : * : ) : : ltature du :f en ppm/T:1 Formule : Protons : signal :dans CDCl ) - ~~~~~~~ . . . ) : H; : doublet (1) . 5,95 ) : H : doublet (1) : 5,32 ) HO - H3 ;. doublet (1) : 5,32 ) HO s : H : doublet (1) , 4,57 ) H 2 ) : H X H4 . multiplet (1) . 4,20 ) B . 4. ) Me H -H' H massif (3) ) 3,75 , 3 : s 6 6' ) O Me H -H : triplet (2) . . . m E 9,9' io,ic' 11,11',11* 2 H : pics relargis (1+1): 3,2 - 2,55) o - c - CH2 - CE2 - CH3 : : : H10-H10,: multiplet (2) = 1,67 ) : Hz : 2 singulets (6) : 1;50 - 1,32) triplet J triplet (3) 0,97 O z ) WEVDCATONS : 1 - Dérivés non toxiques de l'acide n - butyrique présentant des actions thérapeutiques retardées, caractérisés par des liaisons de nature covalente entre une ou plusieurs molécules du-dit acide n - butyrique et des dérivés mono- ou polyhydroxylés, substitués ou non. 2 - Dérivés, selon la revendication 1, présentant la formule générale suivante : dans lesquels n, résidus d'acide n - butyrique désignés par (CO - But) sont greffés par des liaisons esters figurées par la flèche à double sens avec x fonctions hydroxylées d'une molécule hydroxylée, les valeurs de n et de x pouvant être égales ou inférieures à 1 sans limitation supérieure, et le nombre y de fonctions non estérifiées par l'acide n - butyrique peut être égal ou supérieur à zéro, X étant de l'hydrogène ou tout groupement de nature quelconque quand y est supérieur ou égal à 1. Quand Y est supérieur à 1, X peut correspondre indifféremment à un mélange d'hydrogène et de résidus différents de natures diverses formant des dérivés hétéropolysubstitués plus ou moins multipolaires. 3 - Dérivés selon les revendications 1 et 2 caractérisés par le fait que R et X sont choisis de telle sorte que le produit final soit non toxique et que ses produits d'hydrolyse soient métabolisables. 4 - Dérivés selon les revendications 1 et 2 caractérisés par le fait que les laisons entre R et X peuvent être indifféremment des liaisons esters ou ethers, selon la nature de X. 5 - Dérivés selon les revendications 1 et 2 caractérisés par le fait que X peut correspondre à une ou plusieurs molécules portant des fonctions ionisées acides ou basiques susceptibles de former avec l'acide n - butyrique des liaisons supplémentaires de type ionique. 6 - Dérivés selon les revendications 1 et 2 caractérisés par le fait que R est un ose simple ou un oside, estérifié par un ou plusieurs résidus d'acide n - butyrique sur des hydroxyles primaires ou secondaires, tout ou partie des autres fonctions hydroxyles étant substituées par des résidus X quelconques sous forme de mono- ou poly - esters ou de mono ou poly - ethers. 7 - 'rivéc sel or les revendications 1, 2 et i, caractérisés par le fait que R est du glucose estérifié en 3 par l'acide n - butyrique, les hydroxyles 1, 2 et 5, 6 étant substitués par un ou deux groupements isopropylidènes. 8 - Dérivés selon les revendications 1 et 2 caractérisés par le fait que R est une amine hydroxylée ou un hydroxyaminoacide quelconque, le fonction hydroxyle étant estérifiée par un résidu d'acide n - butyrique et le groipei:ent a - amine lié à un deuxième résidu d'acide n - butyrique par une liaison ionique ou amide. 9 - Dérivés selon es revendications 1, 2 et 8, caractérisés par le fait que R est la sérine ou l'homosérine. 10 - Dérivés selon les revendications 1, 2 et 8, caractérisés par le fait que R est une amine polyhydroxylée ou une hydroxy-polyamine métabolisable et non toxique. 11 - Dérivés selon les revendications 1 et 2, caractérisés par le fait que R est un polyol de longueur de chaîne quelconque, cyclisé ou non. 12 - Dérivés selon les revendications 1, 2 et 11 caractérisés par le fait que R est du clycérol ou du sorbitol. 13 - Dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisés par le fait que la concentration d'acide n - butyrique décelable dans le sérum de lapin 48 H après l'injection d'un maximum de 5 mg de produit par Kg d'animal reste supérieure ou égale à 0,04 mmole/l.