Brevet FR2623206A1 — publié le 19890519

La présente invention a trait à la Biologie et concerla production d'oiseaux par un procédé d'injection d'embryons darus des oeufs non fécondés et plus précisément, le procédé associe les étapes suivantes qui sont:l'utilisation-d'embryons d'oiseaux pouvant être d'origines diverses, en vue de leur croissance "In Vitro", l'injection d'un ou plusieurs embryons par oeuf spécialement choisi et préparé pour servir de matrice réceptacle,la poursuite du développement embryonnaire par incu bati--n naturelle ou artificielle jusqu'à éclosion. L'invention peut être appliquée dans les domaines de l'Agriculture pour la multiplication rapidede de souches de vo- lailles obtenues par croisement ou manipulation génétique, dans les domaines de l'Aviculture et la Protection des Oiseaux pour la multiplicatin rapide d'oiseaux rares et/ouen jazz voie de dis- parition. Les prélèverents et transferts d'embryons ont été réalisés depuis très longtemps chez les mammifères et avec l'avènement des procédés de fécondaticn "In Vitro", ceux-ci sont maintena-t réalisés couramment chez les hommes. L'utilisation de tels procédés chez les oiseaux s'est heurtée à la différence fondamentale de Physiologie de la Repro- duction entre les oiseaux et les mammifères. L'ovule mature d'un oiseau est ce que l'on appelle le jaune d'oeuf et l'oeuf possède en lui-même tous les éléments nutritifs qui sont apportés chez les mammifères par l'utérus, pour assurer le développement de l'embryon. Ce jaune ou ovule possède deux parties bien distinctes: Le disque germinatif qui possède les informaticns génétiques, et le jaune proprement dit qui correspond au cytoplasme de la cellule dans lequel se sont accumulés les éléments essentiels à la nutrition future de l'embryon. Après la ponte ovarienne, l'ovule se trouve successivement entouré d'albumine puis d'une coquille au cours de son passage dans l'oviducte pour donner l'oeuf d'oiseau. Si l'oeuf n'est pas fécondé juste après la ponte ovarienne, le cycle se poursuit de la mere façon, mais l'information génépi. que conterue dans le disque germinatif aura dégénéré au moment de la ponte. L'objet de la présente invention est d'utiliser CES oeufs non fécondés contenant toutes les matières nutritives destinées au développement de l'embryon itdeleur injecter très précisé-ent un ou plusieurs embryons étrangers. Un embryon au premier stade de son développement est représenté par une cellule dite totipotentielle possédant la faculté de se diviser pour former un individu complet dans les conditions adéquates Dans les premiers stades de division, I'ebryor constitue une masse pleine appelée Morula, dct les cellules sont appelées Blastomères Le passage au stade Blastula se caractérise par le début de creusement d'une cavité. Les embryons utilisés dans la présente inventin peu vet être produits: par mutation génétique, par isolement et culture des cellules totipotentielles recueillies dans le disque germinatif d'un ouf fécondé non incubé ou incubé quelques heures, par féc~ndati-n "In Vitro" d'ovocytes par des spermatozoides par transplantati.n de noyaux de cellules embryonnaires ou de cellules germinales primordiales dans des cellulestotipotentielles embryonnaires cultivées ensuite "In Vitro", par séparation et reculture de ?,lastomères jusqu'au stade Morula ou Blastula.Selon l'inventicn, un grand nombre d'embryons, de quelques dizaines à plusieures centaines, d'origine décrite ci-dessus, possédant soit le même code génétique; scit des codes génétiques différents et provenant de rutation ou non, peuvent être utilisés en quelques heures t quelques jours. Selon l'invention, les embryons sont prélevés, sous microscope, du milieu qui les contient à l'aide d'une micropipette contée sur un micromanipulateur et chaque embryon est isolé dars le puits d'une boite multitrous pour culture cellulaire, puis tris en culture entre 37 Celcius et 410 Celcius jusqu'à l'obtention du stade Morula ou Blastula. L'oeuf réceptacle impliqué dans le procédé d'invention aura des qualités particulières: Il devra être fraichement pondu ou conservé autour de 150 Celcius dans un lieu aéré et il pourra appartenir ou non à l'espèce ou à la famille génératrice de l'embryon. Dans le cas où l'oeuf appartiendrait à une espèce ou famille différente, il convient de choisir cette espèce ou famille la plus proche possible phylogénétiquement de celle de l'embryon . Si cela n'est pas réalisable le choix de l'espèce fournissant les oeufs réceptacles est fait en fonction des caractères physicochimiques des oeufs les plus approchants entre les deux espèces ou les deux familles, particulièrement le poids et le volume. L.'iraention se caractérise donc par le fait qu'il est possible d'utiliser pour la production d'oiseaux d'espèces rares des oeufs appartenant à des espèces courantes. Selon l'invention, après avoir été soigneuserent lavée, la coquille.(1).de l'oeuf receptacle est percée d'un trc.u(2) à l'aide d'une miniperceuse munie d'une minimeule sans traverser la membrane coqiilère(3), Le trou, de 1 mm à 3 mm de diamètre est fait préférentiellement au niveau de la zone équatoriale de l'oeuf. Un cache possédant une ouverture de 5 mm de diamètre est apiqué contre la coquille et une solution de plastique liquide est vaporisée sur l'ouverture. Loeuf est ensuite rosis à sécher verticalement pôle le plus large vers le haut. Selon le procédé d'invention, le dispositif d'injec tîcn est composé d'un micromanipulateur, d'un jeu de deux ai guilles(4) enfilées l'une dans l'autre et d'un micrcinjecteur. Le jeu d'aiguilles se compose d'une aiguille en acier(5) de diamètre intérieur compris entre 0,4 mm et 1 mm, de longeur comprise entre 1 cm et 15 cm dont une extrémité est affutée en biseau; d'une aiguille en verre(6) de diamètre intérieur entre 0,2 mm et 0,8 mm et dont le diamètre extérieur lui permet de coulisser à l'intérieur de l'aiguille en acier. L'extrémité sortant du coté du biseau de l'aiguille. en acier est fermée et arrondie(7), une ouverture de 0,2 mm à 0,8 mm de diamètre est pratiquée sur la face latérale de l'extrémité inférieure de cette aiguille en verre (8). Les deux aiguilles enfilées l'une dans l'autre sont fixées par deux points d'attache distincts(9)(10) à un dispositif permettant un déplacement linéaire de ces deux aiguilles l'une par rapport à l'autre(11). Ce dispositif est fixé sur le bras d'un micromanipulateur(12) de façon à ce qu'il puisse se déplacer dans les trois axes. l'aiguille en verre est reliée au microinjecteur par une tubulure en polyethylêne remplie de paraffine liquide stérile et est remplie de milieu de culture stérile. L'injection des oeufs selon. l'invention est réalisée de la façon suivante: La boite contenant les embryons prèts à être injectés est placée sous le microscope, le micromanipulateur est fixé sur un des cotés du microscope et équipé des aiguail les o--me décrit précéderent. L'oeuf réceptacle est poséeur unpDrtoir réglable en hauteur, pôle le plus large en haut, à coté des e- bryons. Ouverture préparée comme décrit précédemment faisant face au micromanipulateur. L'extrémité de l'aiguille en verre est dégagée de l'extrémité de l'autre aiguille et un ou plusieurs embryons sont aspirés sous contrôle de la vue dans un volume de 0,001 ml à 0,02 ml.L'aiguille en verre est alors rentrée sous la protec tion du biseau de l'aiguille en acier et l'ensemble est positioné en face de l'ouverture del'oeuf(2) suivant un angle à peu près horizontal.Les deux aiguilles sont alors introduites déli catement & travers la membrane coquillère(3)(FIG 1) puis à travers la membrane vitellj.ne(13).L'extrémité de l'aiguille en verre (6) est alors sortie du biseau de l'aiguille en acier(5) et la course des deux aiguilles poursuivie. jusqu'à la rencontre de la face interne de a embraye vitelline(FIG 2). Sa situation est appréciée en fonction des longeurs d'aiguilles introduites dans l'oeuf et du diamètre moyen du jaune. Un appui important contre cette membrane sera sans conséquences graves car l'extrémité arrondie de l'aiguille en verre(7) n'aura pour effet que de déformer la membrane en la touchant, sans la percer. Selon l'invention le ou les embryons sont injectés délicatement dans l'oeuf contre la face interne de la membrane vitelline(14) ou dans toute autre partie de jaune, dans un volume de C,001 ml à 0,02 ml. Les aiguilles sont retirées suivant le trajet initial et l'orifice de la coquille(2) est immédiatement scellé par une goutte de mastic de silicone ou de paraffine de bougie liquéfiée à la chaleur. L'exemple suivant illustre la mise en oeuvre du procédé selon l'invention à partir du disque germinatif d'un oeuf de poule fécondé. Les oeufs de poule utilisés comme réceptacle qui selon l'invention auront été sélectionés comme décrit précédemment sont soigneusement lavés à l'eau et brossés pour éliminer toute trace de souillure, séchés puis désinfectés à l'alcool. L'orifice est préparé comme décrit précédemment. l'oeuf fécondé utilisé est nettoyé et stérilisé de la même fa çon que les oeufs réceptacles. Il est ouvert de façon stérile au dessus d'une boite de Pétri stérile et le contenu y est transféré. A l'aide de pincettes stériles, le jaune est déplacé jusqu'à amener le disque germinatif à son sommet. Le disque est alors séparé du jaune avec ciseau et pincette stériles et placé dans une boite de Pétri contenant du milieu de culture stérile. Le milieu de culture utilisé ici est du TC 199 contenant L Glutamine 0,2 :, sérum de pculet inactivé 15%, Pénicilline 100 UI/ml, pH 7,4, 280 mosm. Le disque germinatif est dilacéré mécaniquement à l'aide d'aiguilles stériles et les cellules sont examinées au microscope. Les cellules embryonnaires totipototielles sont repérées par leur taille allant de 0,021 mm à 0,027 mm de diamètre avec un cytoplasme très dense et granuleux. Ces cellules sont séparées comme décrit précédeMent et mises à incuber entre 370 Celcius et 410 Celcius pendant 1 heure à 6 heures en étuve de culture sous 95% air, 5% C02 . Les embryons qui se sont développés sont alors récupérés avec une micropîpette et l'aide d'un micromanipulateur, regroupés par 5 ou 6 dans une boite de Pétri cob tenant du milieu neuf et laissé à -température ambiante. Un ou plusieurs embryons sont injectés dans chaque oeuf réceptacle comme décrit précédemrent et l'oeuf, une fois refermé, est placé horizontalement dans un incubateur entre 400 Celcius et 410 Celcius, orifice en bas, pendant 6 heures,puis dans un incubateur assurant une rotation de l'oeuf de 8 à 10 tours par heure pendant 18 heures à la même température. Après ce délai, l'oeuf est sorti et peut être conservé comme un classique oeuf fécondé à 150 Celcius ou placé directement en incubateur classique à 370 Celcius pendant la durée nécéssaire au développement complet de l'embryon. REVENDICATIONS 1. Procédé d'injection d'embryons d'oiseaux dans des oeufs d'oiseaux réceptacles, destiné à la multiplication rapide de souches de volailles obtenues par croisement ou manipulatin génétiques, ou d'oiseaux appartenant à des espèces rares et/ou en voie de disparition, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a, isolement et croissance "In Vitro" d'embryons obtenus par mutation génétique, par utilisation des cellules totipotentielles d'un disque germinatf fécondé, par fécondation "In Vitro" d'ovocytes, par transplantation nucléaire entre deux embryons, par séparation et reculture "In Vitro" de Blastodermes appartenant à un embryon. b, transplantation des embryons dans des oeufs réceptacles non fécondés appartenant ou non à l'espèce ou à la famille de l'embryon injecté. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le stade de développement des embryons impliqués dans l'invention va du stade Norula au stade Blastula. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les oeufs réceptacles appartenant à une espèce ou famil- le étrangère à l'embryon injecté ont des caractéristiques physicochimiques les plus approchantes de celles des oeufs appartenant à l'espèce de l'embryon, particulièrement au niveau du poids et du volume. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé.par le fait que les oeufs réceptacles utilisés sont percés, avant l'injection,d'une ouverture dans la coquille sans ouverture de la membrane coquillère(2). 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dispositif d'injection des embryons est composé de deux aiguilles(4) activées par un micromanipulateur permettant le prélèvement des embryons dans leur milieu de culture et leur injection dans le jaune, à proximité directe de la face interne de la membrane vitelline(14) ou à tout autre endroit du jaune de l'oeuf réceptacle. 6. Procédé selon les revendications 1 ou 5, caractérisé par le fait que le dispositif d'injection comprend deux aiguilles enfilées l'une dans l'autre(4). 7. Procédé selon l'une des revendications 1,5 ou 6, caractérisé par le fa-t que l'aiguille en acier(5) comprend une extrémité affutée en biseau destinée au percement des membranes. 8. Procédé selon li'une des revendications 1,5 ou 6, caractérisé par le fait que l'aiguille en verre(6) est fermée et arrondie à son extrémité inférieure(7), et possède à cette même extrémité un orifice latéral(8) par lequel l'embryon peut circuler. 9. Procédé selon l'une des revendications 1,5 ou 6, caractérisé par le fait que l'extrémité de l'aiguille en verre peut être indifféremment couverte et découverte par l'extrémité de l'aiguille en acier. 1C. Procédé selon l'une des revendications 1, 5 ou 6, caractérisé par le fait que les deux aiguilles sont fixées en deux points distincts(9)(10) sur un dispositif(11) assurant un déplacement linéaire des deux aiguilles l'une par rapport à l'autre, fixé lui-même sur le bras d'un micromanipulateur(12).