Brevet FR2611744A1 — publié le 19880909

La présente invention a pour objet une composition utilisable comme réactif de détection des systèmes enzymatiques du type catalase, ainsi qu'un procédé de détection d'une telle activité enzymatique à l'aide de ce réactif. On sait que la recherche de la catalase est un test important dans le domaine de l'identification bactérienne. En effet, la production d'oxygénée par un microorganisme ou par des cellules, ou encore par des solutions enzymatiques mises en présence d'eau oxygénée (peroxyde d'hydrogene) est sous la dépendance de divers systèmes enzymatiques dont le plus commun est la catalase. La catalase est une protéine porphyrinique ferrique (hydrogène-peroxydase-oxydo-réductase) présente chez la plupart des bactéries à métabolisme respiratoire. La mise en présence d'eau oxygénée avec une bactérie produisant la catalase donne lieu à un dégagement d'oxygène naissant. La réaction avec l'eau oxygénée conduit à l'apparition de bulles d'oxygène dans le liquide. Les bulles d'oxygène sont le témoin le plus classiquement utilisé pour détecter la présence des catalases ou des pseudo-catalases. La décomposition de l'eau oxygénée correspond à la réaction L'oxygène naissant se dégage rapidement et peut servir de témoin à la réaction. La réaction étant exergonique, elle peut aussi être détectée par la production de chaleur à l'aide d'un microcalorimètre ou de sondes détectant les flux de chaleur. La mise en évidence du dégagement d'oxygène est classiquement rattachée à la présence de catalase. Les techniques employées en microbiologie pour mettre en évidence les systèmes enzymatiques de ce type sont rappelées ci-après. Selon une première technique (en tube), un tube est rempli sur une hauteur de 1 à 3cm d'eau oxygénée à 10 volumes. Le microorganisme à tester est prélevé à l'aide d'une pipette Pasteur ou analogue sur une culture effectuée le plus souvent en milieu solide, et la particule de culture est plongée dans le tube. La réaction est considérée comme positive si on observe un dégagement plus ou moins abondant de bulles qui vont rapidement éclater à la surface de la solution de réactif. La réaction est brève (quelques secondes au maximum, et parfois beaucoup moins) et seule une observation attentive, en s'aidant d'une illumination transversale du tube, permet d'éviter les erreurs par défaut. La réaction est d'autant plus brève que la production ou l'activité de la catalase est intense, sauf si l'on disperse progressivement les cellules des microorganismes.La lecture ne peut etre effectuée que par une seule personne, ce qui favorise les erreurs d'interprétation de caractère subjectif. La rapidité de la réaction empêche toute comparaison de l'activité enzymatique de plusieurs souches bactériennes ou fongiques. Selon une autre méthode (en tube), on introduit, dans un tube contenant une solution d'eau oxygénée, un fragment de papier-filtre sur lequel on a préalablement déposé et étalé un fragment de culture du microorganisme étudié. Le papier, initialement déposé au fond du tube, va remonter à la surface et s'y maintenir tant que la production gazeuse est suffisante. Cette technique permet la visualisation prolongée de la réaction et donc la lecture par plusieurs personnes, mais conduit à des erreurs par défaut si la production d'oxygène est peu abondante. La remontée du papier-test est parfois lente (durant parfois 30 secondes ou plus) et irrégulière car de grosses bulles peuvent s'échapper et alors le papier peut rester au fond du tube.Par ailleurs, cette méthode implique un risque infectieux important car elle comporte la manipulation de fragments de papier très petits et imprégnés de germes éventuellement pathogènes. Selon une autre technique (sur lame), on dépose une goutte d'eau oxygénée sur une lame de verre. Un fragment de culture bactérienne ou fongique, prélevé comme précédemment, est plongé dans la goutte. Le dégagement rapide des bulles formées ne permet pas la visualisation des réactions faibles. La lecture de la réaction est difficile car la durée des bulles n'excède pas une seconde, et la réaction est souvent encore plus fugace. La lecture ne peut donc etre effectuée que par une seule personne qui doit saisir l'apparition des bulles en un instant très bref. La comparaison de l'activité enzymatique de deux souches de microorganismes est impossible avec cette méthode car les deux réactions ne peuvent pas être lues simultanément.En outre, la goutte d'eau oxygénée a tendance à s'étaler sur la surface de la lame, ce qui comporte des risques d'infection pour le manipulateur. On connatt encore une autre technique, semi-quantitative, dont l'emploi est limité à certains germes particuliers tels que les mycobactéries. La bactérie est cultivée dans un tube, et lorsque la culture est assez abondante, elle est recouverte d'un mélange d'eau oxygénée et d'un agent moussant (par exemple Tween 80) réalisé extemporanément. Dans le cas où la bactérie est productrice de catalase, une mousse abondante est produite et la mesure de la hauteur de mousse permet une quantification approximative de la production. La réaction est lente et la lecture s'en trouve retardée. Cette technique nécessite une culture préalable, de sorte que son emploi ne s'est pas généralisé depuis sa publication. I1 existe donc, en particulier dans les laboratoires de microbiologie, un besoin d'un réactif pratique à utiliser, permettant une lecture rapide, et pendant un temps prolongé, de façon à permettre des comparaisons entre manipulateurs et entre différentes souches de microorganismes, ce réactif étant stable à la température ambiante pendant au moins plusieurs semaines, et permettant de limiter au maximum les risques infectieux. I1 apparaissait difficile, sans remanier totalement la méthode de mise en évidence de l'enzyme recherché, d'améliorer la détection de la catalase des microorganismes et des cellules, car les inconvénients des tests classiques tenaient avant tout à l'instabilité du phénomène détecté. On pouvait envisager d'accroitre et/ou prolonger la production de gaz, mais la solution permettant d'arriver à un tel résultat est loin d'être évidente. Par ailleurs, la modification du réactif devait autant que possible apporter une limitation du risque de contamination du personnel technique. L'amélioration de tels réactifs se heurtait à plusieurs problèmes. I1 résulte de ltobservation que l'oxygène libéré s'échappe du liquide en formant des bulles dont le diamètre est grossièrement proportionnel à l'activité enzymatique. Plus le microorganisme a une activité de type catalase importante, plus les bulles sont grosses et visibles, mais alors elles sont instables et tendent à disparaître très rapidement. Dans le cas de systèmes faiblement producteurs de l'enzyme, les bulles sont très fines et la visualisation est délicate. I1 semble alors logique d'augmenter la surface de contact entre le germe étudié et le réactif pour accrottre la production. Toutefois, on a constaté que l'agitation, dans ce cas, n'améliore ni la production de gaz, ni sa détection, car les bulles deviennent trop fines et ne sont plus visualisées, ou bien disparaissent encore plus rapidement du fait de l'agitation. On se trouve donc devant une double difficulté : plus l'enzyme est active, plus les bulles sont grosses, mais elles disparaissent rapidement moins l'enzyme est active, plus la détection visuelle est difficile. Une solution possible étair l'utilisation de la méthode en tube avec l'emploi d'une hauteur importante de liquide, car on pouvait ainsi ralentir la disparition des bulles qui devaient parcourir toute 1a veiné liquide pour émerger à la surface du liquide. Mais, la nécessité de manipuler l'eau oxygénée et de préparer un tube pour chaque expérience est une source de contre-temps incompatible avec les pratiques actuelles des laboratoires. L'évacuation d'un tube ainsi contaminé nécessitait son bouchage puis son autoclavage ou encore une incinération. De plus, chaque expérience aurait nécessité l'utilisation de quantités importantes de réactif. La méthode qui augmentait notamment le délai pendant lequel la réaction est lisible est celle utilisant le papier filtre, mais au prix d'une perte de sensibilité importante : il faut en effet que les gaz allègent suffisamment la pastille de papier et donc que la production soit abondante. L'utilisation de la technique spécifique aux mycobactéries, fort ancienne, est restée limitée du fait de la lenteur des réactions et de l'emploi impératif d'une culture effectuée en tube, de sorte que cette technique n'a jamais été utilisée en dehors des laboratoires spécialisés. Sur la base des techniques connues, il apparaissait donc impossible d'imaginer une amélioration conciliant la sensibilité de la réaction et la persistance de sa lisibilité, cela étant encore plus vrai dans les cas où la réaction avait lieu sur un support solide (lame) où l'épaisseur de liquide était très faible. L'emploi de méthodes plus complexes comme le dosage par retour de l'eau oxygénée après action de l'enzyme, ou par calorimétrie, ne serait pas compatible avec les besoins, pour les laboratoires, d'une méthode simple et directe. Du point de vue de la sécurité, les réactifs utilisés classiquement sont des dilution de peroxyde d'hydrogène dans l'eau et sont donc liquides. I1 faut éviter les contact entre le manipulateur et le microorganisme étudié, souvent pathogène. Or l'emploi de tubes ou de bottes dans lesquels la réaction serait effectuée est peu répandu, car peu rapide et peu pratique, et la réaction a lieu le plus souvent sur un support tenu à la main, par exemple une lame de verre pour microscopie. La goutte étant mobile sur le support, les risques de contamination des mains du personnel technique des laboratoires sont importants, d'autant plus que sous sa présentation classique, le réactif a tendance à s'étendre sur une large surface.Aucune solution n' a été trouvée jusqu a présent pour accroStre la sécurité de ce type de manipulation. Conformément à la présente invention, l'ensemble de ces problèmes a été résolu par l'emploi d'une solution visqueuse ou sirupeuse d'eau oxygénée. L'accroissement de la viscosité s'oppose à la montée rapide des bulles d'oxygène jusqu'à la surface et réduit la vitesse de déplacement des bulles formées, et cela d'autant plus que le liquide est plus visqueux et que les bulles sont plus fines. En dessous d'un certain diamètre, la poussée d'Archimède est insuffisante pour provoquer la remontée des bulles car les forces antagonistes sont trop importantes. Plus la viscosité est élevée, plus les bulles de gros diamètre sont stabilisées. Un facteur vient toutefois limiter l'effet de la viscosité : plus le mélange est visqueux, moins il est facile de le distribuer et d'éviter la formation spontanée de bulles d'air persistantes lors des manipulations de la solution de réactif. Le réactif ayant une forte viscosité est utilisable sans risque pour le personnel qui manipule en tenant à la main la lame où est effectué le test, car le réactif n'a pas tendance à se répandre sur toute la surface du support utilisé (lame). Ainsi se trouvent résolus conjointement les problèmes de sécurité et les problèmes d'une détection sensibilisée et prolongée. En outre, or. a constaté que le réactif de l'invention est stable au stockage. Il peut être conservé par exemple à température ambiante (18-250C). La présente invention a donc pour objet une composition à base d'une solution d'eau oxygénée, utilisable comme réactif de détection d'un système enzymatique du type catalase, caractérisée par le fait que ladite solution contient en outre un agent épaississant. Dans des modes de réalisation particuliers, la composition de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison : - la solution d'eau oxygénée est une solution aqueuse ; - ledit agent épaississant est présent en quantité suffisante pour que ladite composition ait une viscosité permettant de freiner le déplacement des bulles gazeuses produites. La viscosité de la composition ne doit bien entendu pas atteindre des valeurs pour lesquelles le réactif serait difficilement manipulable et difficilement débarrassé des bulles d'air introduites accidentellement.Généralement, on utilise une composition ayant une viscosité pouvant aller de 50.10 3 à 200.10 3 Pa.s, et en particulier de 80.10 à 120.10 Pa.s ; - ledit agent épaississant est bien entendu un agent inerte vis-à-N-is de l'eau oxygénée et de l'enzyme responsable de la production d'oxygène. Il est choisi par exemple parmi le polyéthylèneglycol, la polyvinylpyrrolydone, la méthylcellulose, etc... - ladite composition contient de l'eau oxygénée à raison de 2 à 30% en poids, et en particulier de 2,5 à 6%. Selon un autre mode de réalisation, le réactif de l'invention peut en outre contenir un agent coloriant, de préférence un agent colorant sombre, grâce auquel les bulles peuvent être observées plus facilement sur un fond coloré. Le colorant utilisé est de préférence soluble dans le milieu réactionnel. L'addition d'un colorant dans le réactif ne modifie pas le mode d'utilisation, mais assure un confort de lecture notable pour le personnel utilisateur. Bien entendu, les colorants utilisables sont des colorants stables en présence de l'eau oxygénée. Parmi les colorants utilisables, on peut citer notamment le vert malachite, le rouge neutre, le bleu d'Evans, etc... La quantité de colorant utilisé est une quantité suffisante pour améliorer le confort de lecture du test. Cette quantité peut être facilement déterminée pour chaque colorant, par des expériences de routine. L'invention a également pour objet un procédé de détection d'une activité enzymatique de type catalase dans une matière organique, caractérisé par le fait que l'on met en contact ladite matière organique avec une composition telle que définie précédemment, et que l'on observe le dégagement éventuel de bulles gazeuses signalant la formation d'oxygène par décomposition enzymatique de l'eau oxygénée. Le dégagement gazeux est observé au bout de quelques secondes (généralement en moins de 5 secondes). Dans des modes d'exécution particuliers, le procédé peut encore présenter les caractéristiques suivantes - la matière organique est notamment un milieu de culture de microorganismes ou de cellules - on dépose une goutte du réactif sur un support solide, par exemple une lame de verre, on prélève avec la pointe d'un instrument approprié (par exemple pipette, oese, fil, etc...) un fragment du matériau organique solide, dans lequel on recherche la présence d'une activité catalasique (par exemple un fragment de culture de microorganisme), puis l'on dépose ledit fragment sur la goutte de réactif. La présence de catalase se traduit par un dégagement presque immédiat de bulles d'oxygène qui forment dans la masse du réactif une mousse blanchâtre persistante pendant plusieurs minutes.Selon un mode d'exécution préféré, on déplace dans la goutte de réactif avec la pointe de l'instrument chargé du matériau organique. Lorsque la réaction est positive, on observe une tralnée blanche persistante qui est bien visible, en particulier si on observe sur un fond sombre. Dans le cas où le réactif est coloré, on observe des bulles blanches qui se détachent sur le fond coloré du réactif. Il est préférable dans ce cas d'observer sur un fond clair. - selon un autre mode de réalisation, on dépose une goutte de réactif sur une culture de microorganismes, de préférence au niveau de colonies isolées. En cas de réaction positive, le dégagement de petites bulles d'oxygène, à partir des colonies en contact avec le réactif, est visible au bout de quelques secondes et le demeure pendant plusieurs minutes. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un agent épaississant en combinaison avec l'eau oxygénée pour préparer un réactif de détection d'une activité enzymatique du type catalase, et en particulier l'utilisation d'un agent épaississant en combinaison avec un colorant, selon les modalités décrites ci-dessus. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 On a préparé un réactif ayant la composition suivante - Méthylcellulose (Tylose MH 300 commercialisée par Hoechst) 20g - Bleu d'Evans RAL................ ................... RAL 0,0125 g - Eau oxygénée à 3%................. 35 q.s.p 1.000ml Ce mélange est disposé dans un flacon muni d'un bouchon compte-gouttes. EXEMPLE 2 On a préparé un réactif ayant la composition suivante - Polyéthylèneglycol 6000 (Serva) 500g - Eau oxygénée à 3% q.s.p l.000ml EXEMPLE 3 On a préparé un réactif ayant la composition suivante - Polyvinylpyrrolidone (Prolabo) 400g - Eau oxygénée à 37 q.s.p 1.000ml EXEMPLE 4 : Réalisation d'un test sur lame. Le test a été réalisé avec diverses colonies bactériennes obtenues sur les milieux d'isolement suivants : gélose Trypcase-soja, gélose au sang, BCP (bromocrésol pourpre). On dépose sur la lame, à l'aide d'un compte-gouttes, une goutte de la composition de l'exemple 1. On disperse soigneusement une à deux colonies prélevées à l'aide d'une pipette Pasteur ou d'une anse de platine. La présence de catalase se traduit par le dégagement, en moins de 5 secondes, de bulles d'oxygène qui forment une mousse persistante. On a pu ainsi observer une réaction positive avec diverses espèces des genres Staphylococcus, Corynebacterium et Listeria. On a même pu observer une activité catalasique faiblement positive avec certaines souches de Streptococcus du groupe D, ce qui montre la sensibilité du test. Toutefois, l'intensité de la réaction est très inférieure à celle observée avec les staphylocoques. On a effectué d'autres essais avec une composition de réactif analogue, mais contenant 30% d'eau oxygénée. La réaction est encore plus intense. EXEMPLE 5 : Réalisation d'un test sur milieu de culture. On dépose une goutte de la composition de l'exemple 1 sur la culture étudiée, au niveau de colonies bien isolées. Ici encore, la présence de catalase se traduit par le dégagement, en moins de 5 secondes, de bulles formant une mousse persistante. Les colonies et milieux de culture étudiés étaient les mêmes qu'à l'exemple 4 et les résultats observés étaient identiques. Il faut cependant noter que dans le cas d'une recherche directe sur gélose au sang, une réaction plus tardive et non limitée à l'endroit de la colonie ne doit pas être prise en compte, car il s'agit alors de la mise en évidence de l'activité catalasique des érythrocytes. REVENDICATIONS 1. Composition à base d'une solution d'eau oxygénée, utilisable comme réactif de détection d'un système enzymatique du type catalase, caractérisée par le fait que ladite solution contient en outre un agent épaississant. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit agent épaississant est présent en quantité suffisante pour que ladite composition ait une viscosité permettant de freiner le déplacement des bulles gazeuses éventuellement produites. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que ladite solution a une viscosité pouvant aller de 50.10 3 à 200.10 3 Pa.s. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que l'agent épaississant est choisi parmi le polyéthylèneglycol, la polyvinylpyrrolidone et la méthylcellulose. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ladite composition contient de l'eau oxygénée à raison de 2 à 30% en poids. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la solution contient en outre un agent colorant. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée par le fait que ledit agent colorant est choisi parmi le vert malachite, le rouge neutre et le bleu d'Evans. 8. Procédé de détection d'une activité enzymatique de type catalase dans une matière organique, caractérisé par le fait que l'on met en contact ladite matière organique avec une composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, et que l'on observe le dégagement éventuel de bulles gazeuses signalant la formation d'oxygène par décomposition enzymatique de l'eau oxygénée. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on dépose une goutte de réactif sur un support solide, que l'on dépose un fragment de ladite matière organique sur ladite goutte, et que l'on observe un dégagement éventuel de bulles gazeuses. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on dépose une goutte de réactif sur une culture de microorganismes, et que l'on observe un dégagement éventuel de bulles gazeuses. 11. Utilisation d'un agent épaississant en mélange avec de liteau oxygénée pour préparer un réactif de détection d'une activité enzymatique du type catalase. 12. Utilisation selon la revendication 14, caractérisé par le fait que ledit agent épaississant est employé en combinaison avec un colorant.