Brevet FR2619576A1 — publié le 19890224

ADJUVANTS POUR LA PRODUCTION ET LA CULTURE D'HYBRIDOMES L'invention a pour objet des adjuvants pour la production et la culture d'hybridomes. On sait que la culture d'hybridomes est utili- sée pour produire des anticorps monoclonaux. La technique classique d'hybridation lymphocy- taire comprend la fusion, en présence d'un agent fusogène tel que le polyéthylène glycol, de cellules spléniques d'une souris préalablement immunisée avec un antigène, avec des cellules myelomateuses. L'utilisation d'un milieu sélectif permet d'éliminer les cellules non hybrides. Les hybridomes pro- ducteurs des anticorps monoclonaux, les facteurs recher- chés, sont clones et sélectionnés à partir d'une tech- nique de criblage immunologique appropriée et sont mis en culture. Des milieux de culture particulièrement utili- sés sont élaborés à partir de sérums, plus spécialement du sérum de veau foetal, qui est très largement mis en oeuvre pour la culture de toute cellule. On connait, cependant, l'intérêt de disposer pour ce type de culture de sérums de grande spécificité, adaptés à ces hybridomes. Les travaux des Inventeurs dans ce domaine les ont conduits à constater que certains épanchements liqui- diens peuvent être utilisés avec avantage comme adjuvants de milieux de culture d'hybridomes. L'invention a donc pour but de fournir des ad- juvants particulièrement adaptés à la culture des hybri- domes, permettant d'améliorer le rendement dès l'étape de fusion et capables d'agir sur la multiplication cellu- laire dès le premier stade de multiplication. Ces adjuvants sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'un épanchement, dans un espace liquidien d'un organisme animal, tel qu'obtenu par greffe, dans une paroi délimitant cet espace, de l'une des lignées cel- lulaires utilisées pour l'obtention de l'hybridome à cultiver. Avantageusement, la lignée cellulaire utilisée pour la greffe est une lignée cellulaire myélomateuse de même espèce que celle utilisée pour l'obtention de l'hy- bridome à cultiver. L'espace liquidien est constitué soit par l'es- pace péritonéal compris entre l'intestin et la paroi ab- dominale, soit par l'espace intra-pleural, situé entre les poumons et la paroi thoracique, ou encore par l'es- pace péricardique, compris entre le coeur et le sac i5 péricardique qui l'enveloppe. D'une manière avantageuse, la greffe effectuée produit, dans l'espace liquidien utilisé, une accumula- tion de liquide capable de favoriser dans un procédé de fusion et de culture, la fusion et la prolifération des hybridomes tout en assurant un taux de secrétion élevé d'immunoglobulines. Les adjuvants de l'invention favorisent notam- ment la production d'anticorps monoclonaux d'origines diverses. Ces anticorps sont produits par des cellules de rate d'animaux immunisés, sensibilisés à des antigènes viraux, bactériens, cellulaires (cellules entières d'ori- gine humaine). Selon un mode préféré de réalisation de l'in- vention, l'adjuvant est constitué par un liquide d'as- cite. Il s'agit d'un adjuvant de grande stabilité, permettant d'améliorer la croissance, puis la secrétion des hybridomes en culture. Ce liquide est ponctionné de la cavité orga- nique, débarrassé, par exemple par centrifugation, des cellules et autres impuretés, telles qu'agrégats molé- culaires et autres particules solides en suspension, et conditionné en vue de son utilisation comme adjuvant. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. Exemple 1: Culture d'hybridomes de souris provenant de la fusion de lignées cellulaires SpO2 de souris et de rate de souris immunisées: On réalise la culture avec, à titre comparatif, un milieu classique (milieu 1) et, dans une autre expé- rience, avec un milieu selon l'invention (milieu 2). Les milieux présentent respectivement les compositions sui- vantes: milieu 1: RPMI (Roswell Park Medium Institute) + 1 % glutamine + 0,3 % glucose + 1 % pyruvate de sodium + 7 % de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté-(c'est-à-dire chauffé au bain-marie 1 heure à 55'C pour détruire les protéines du système complémentaire à réaction immunogène. milieu 2: sa composition est identique à celle du milieu 1 mais le sérum de veau décomplémenté est remplacé par du liquide d'ascite purifié obtenu par greffe dans le péri- toine de souris de cellules Sp02, cellules myélomateuses de souris. On ensemence des boîtes de culture 1 et 2 avec 64.000 cellules et on ajoute dans chacune 6 ml soit de milieu 1, soit de milieu 2. Les observations effectuées après 24, 48 et 72 heures de culture conduisent aux résultats suivants: 24 heures 48 heures 72 heures nombre de cellules dans boîte 1: 800.000 1.400.000 3.640.000 nombre de cellules dans boîte 2: 1.200.000 2.300.000 4.000.000 Ces résultats mettent en évidence l'effet avan- tageux de l'adjuvant selon l'invention pour la culture de l'hybridome. Exemple 2: On compare le nombre de clones obtenus avec une culture d'hybridome réalisée avec un milieu classique contenant du SVF, et une autre culture dans laquelle est mis en oeuvre l'adjuvant de l'invention de l'exemple 1. On prépare des microplaques en ensemençant des cellules de rate de souris fusionnées à des cellules SpO2 à raison de 100 pl par puit, d'une solution contenant en moyenne une cellule par puit. Le milieu de culture utili- sé ne renferme ni SVF ni adjuvant selon l'invention. On compte les cellules d'hybridomes et on dilue afin d'obtenir 10 cellules par microplaque. On répartit ensuite les cellules dans les microplaques avec les mi- lieux à tester renfermant différentes concentrations de SVF ou d'adjuvant. On rapporte ci-dessous le nombre de clones par microplaques: SVF Adjuvant de l'invention 1 O 5 2,5 % O 6 % 1 6 L'examen de ces résultats montre l'intérêt des adjuvants de l'invention. Pour obtenir 6 clones avec un milieu classique renfermant du SVF, il est en effet né- cessaire d'ajouter 20 % de SVF au milieu de culture, alors qu'un tel résultat est obtenu avec l'invention en utilisant seulement 2,5 % d'adjuvant. L'invention fournit donc des milieux de culture simples, économiques et aisés à commercialiser sous forme liquide ou lyophilisée. Ces milieux favorisent la crois- sance d'hybridomes d'origines variées (souris, rat, hom- me...) ainsi que leur production d'anticorps monoclonaux. REVENDICATIONS 1. Adjuvant pour la production et la culture d'hybridomes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épan- chement dans un espace liquidien d'un organisme animal, tel qu'obtenu par greffe, dans une paroi délimitant cet espace, de l'une des lignées cellulaires utilisées pour l'obtention de l'hybridome à cultiver. 2. Adjuvant selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la lignée cellulaire utilisée pour la greffe est une lignée cellulaire myélomateuse de même espèce que celle utilisée pour l'obtention de l'hybridome à cultiver. 3. Adjuvant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'espace liquidien est constitué, soit par l'espace péritonéal compris entre l'intestin et la paroi abdominale, soit par l'espace intra-pleural, situé entre les poumons et la paroi thoracique, ou encore par l'espace péricardique, compris entre le coeur et le sac péricardique qui l'enveloppe. 4. Adjuvant selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un liqui- de d'ascite. 5. Adjuvant selon la revendication 4, caracté- risé en ce que le liquide d'ascite est tel qu'obtenu par greffe dans le péritoine de souris, de cellules de lignée cellulaire de souris utilisée dans l'étape de fusion de l'hybridome, récupération du liquide formé, et purifica- tion. 6. Milieu de culture élaboré à partir d'un adjuvant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.