Brevet FR2622454A1 — publié le 19890505

La présente invention est relative à une fraction protéique isolée de plasma séminal humain, et douée d'activité immunosuppressive. De nombreux travaux réalisés in vitro sur des lymphocytes périphériques humains ou sur des splénocytes murins ont montré que le plasma séminal humain (SP) présente une activité immunosuppressive. Différentes activités immunosuppressives ont été décrites, notamment sur les lymphocytes T, les cellules tueuees naturelles (NK), les macrophages et les polymorphonucléaires humains et sur les cellules B murines. Le but de la plupart de ces travaux était d'expliquer la raison pour laquelle il ne se produit pas de réactions immunitaires contre les spermatozoides présents dans les organes génitaux féminins et plus récemment d'établir les modalités d'apparition du syndrome d'immunodéfi- cience acquise chez les homosexuels masculins. Les Inventeurs ont, dans une étude récente (C.R. cad. Sc. Paris, 302, Série III, NO 7, 1986, p. 233-238) mis en évidence une activité immunosuppressive in vitro du sperme de porc sur des lymphocytes de souris. Des fractions immunosuppressives ont été isolées d'éjaculats de porcs par centrifugation pendant 15 minutes à 20 000 g, traitement du liquide spermatique par du sulfate d'ammonium à 40 %, puis à 60 % de saturation, dialyse, chromatographie du précipité sur "Sephadex" G-200 ou DE-T2, puis refractionnement sur "Sephacryl" S-200 ou S-300, suivie d'une oonoentra- tion et d'une dialyse et de leur conservation à -300C en vue de déterminer leur activité inhibitrice de la transformation blastique de préparations enrichies en lymphocytes T ou B d'origine murine en présence d'un initogene T (PHA) ou B (LPS). Deux fractions actives, non dialysables, ont été trouvées, à savoir une fraction de poids moléculaire 100 110 KD et une fraction de poids.moléculaire supérieur à 500 KD. L'hypothèse avancée pour le rôle physiologique de ces fractions immunosuppressives spermatiques était qu'ils étaient probablement nécessaires à la protection locale des spermatozoïdes vis-à-vis du système immunitaire femelle, mais que leur pénétration dans l'organisme général à travers la muqueuse rectale pourrait entraîner une diminution des défenses locales ou générales vis-à-vis de certains virus, comme celui du LAV ou de l'hépatite B, l'hy pothèse avancée requérant cependant, pour être vérifiée, une expérimentation in vivo. I1 est cependant clair que dans la mesure où l'on cherche à développer un agent thérapeutique présentant une activité immunosuppressive spécifique vis-à-vis de l'homme, il serait préférable d'identifier la ou les fraction(s) immunosuppressive(s) présente(s) dans le plasma séminal humain et de déterminer si elles exercent une activité immunosuppressive sur des cellules humaines. La présente invention a pour objet un facteur immunosuppresseur qui est caractérisé en ce qu'ilestcons- titué par une protéine non dialysable, dont le poids moléculaire est de 180 KD + 10 %, dont le point isoélectrique est compris entre 5 et 6 et qui a une activité de suppression sélective de la prolifération des lymphocytes B, notamment d'origine humaine. Les standards de poids moléculaires utilisés pour l'obtention du poids moléculaire de la protéine 180 KD, qui sont sur une colonne HPLC, sont les suivants IgM humain 1 000 KD IgG humain 150 KD Albumine humaine 67 KD Ovalbumine de poule - 45 KD Conformément à l'invention, ledit facteur immunosuppresseur est isolé de plasma séminal humain. La présente invention a également pour objet un procédé d'isolation par purification du facteur immunosuppresseur défini plus haut. Conformément à l'invention, du plasma séminal humain est centrifugé à 20 000 g et les surnageants sont traites par des inhibiteurs de protéases, puis dialysés contre du PBS, précipités par du sulfate d'ammonium à 40 %, puis à 60 % de saturation, après quoi les précipités sont purifiés par gel-filtrations, puis la fraction immunosuppressive isolée est concentrée, dialysée contre du PBS et conservée à -300C. Conformément à l'invention, l'activité mmunosup- pressive de la fraction ainsi obtenue a été contrôlée in vitro sur des cellules sanguines mononucléaires humaines stimulées par des mitogènes et in vivo~sur des souris Bald/c. Conformément à l'invention, la fraction immunosuppressive isolée de plasma séminal humain présente une activité de suppression des réponses immunes humaine (in vitro) et murine (in vivo). Le procédé conforme à la présente invention a permis de diviser les activités innuncsuppressives du plasma séminal humain observées in vitro, en deux facteurs distincts, savoir : (i) un agent B-spécifique non-d alysable, qui est précipité par le sulfate d'ammonium (ii) un (ou plusieurs) inhibiteur(s) T-spécifique(s) dialysable(s). Dans les tests in vitro, le mitogène Ti mis en oeuvre a été le mitogene de cellules délipidées de Nocardia (Noc) et l'activité suppressive a été observée sur des cellules lymphocytaires humaines B, permettant ainsi de dér,on- trer que les fractions actives isolées de plasma séminal humain peuvent supprimer la prolifération des lymphocytes B humains. De plus, les résultats obtenus avec des préparations appauvries en cellules T ou en présence de sérum humain autologue ont à la fois confirmé la B-spécificité du mitogene susdit et démontré que la présence de sérum de veau foetal n'est pas nécessaire pour qu 'il se produise une inhibition de la prolifération des lymphocytes R.Les tests réalisés dans le cadre de'la présente invention ont, en outre, permis de démontrer que l'activité de suppression des cellules T est dialysable en sorte qu'elle correspond à de petites molécules telles que les prostaglandines et/ou les polyamines. In vivo, l'activité imnunosuppressive a été confirmée pratiquement exclusivement sur des réponses Ti (réponses d'anticorps à des antigènes T-indépendants). Les activités i.çmvunosurpressives du plasma séminal natif (SP) et-des fractions immunosuppressives (ils) ont été testées sur 3 types de réponses d'anticorps, chez la souris. La réponse Td (réponse d'anticorps à des antigènes T-dépendantsj à l'égard de cultures de cellules de rates stimulées par des érythrocytes de moutons (GRM) n'a pas été supprime par des traitements préliminaires par le SP ou des petites molécules isolées du SP, bien que ces préparations inhibent les réponses T-dépendantes in vitro (cf. figure 1 annexée). Une légère suppression par ce grosses molécules isolées au SP a été observée uniquement sur le titre anti-eRM mais pas sur la réponse PFC (cellules formant des plaques). Contrairement à cela une activité immunosuppressive élevée a été observée sur les réponses Ti-l à l'égard du TNP-LPS (lipopolysaccharide trinitrophénylé) et sur la réponse Ti-2 PCF à l'égard du TNP-Ficc.ll après des traitements par le SP ou de grosses molécules isolées du SP (cf. figures 2 et 3 annexées). Cepencant, la diminution des réponses des anticorps à l'égard de l'antigène Ti-2 s'est avérée faible bien que statistiquement significative (P Une comparaison des fractions immunosuppressives isolées de plasma séminal humain et de plasma séminal de porc, a permis de mettre en évidence un certain nombre de différences : bien que les deux SP soient immunosuppresseurs dans des systèmes hétérologues, les fractions 15 qui sont isolées respectivement de l'un et de l'autre diffèrent tant par leur taille que par leur spécificité. ra fraction IS isolée de porc, de poids moléculaire 1.10 KD, est active in vivo à la fois sur les réponses Td et Ti, alors que la fraction IS isolée de SP humain présente un poids moléculaire de 180 KD et inhibe spécifiquement les cellules B, ce qui laisse à penser que ces deux fractions ont des rôles biologiques différents dans leurs espèces respectives. La fig. 1 représente par un graphique les réponses T dépendantes de souris BaLb/c traitées par du SP humain ou par des fractions isolées de celui-ci et innunisées par des GRM (cellules d'érythrocytes de mouton) . Aucun traitement n'a induit une dimi nution de la réponse PFC. Seules de grosses molé cules isolées de SP (dSP) ont légèrement diminué le titre en anticorps des GRM par comparaison avec des souris témoins non traitées (C). SP : plasma séminal ; dial. : dialysat de SP (petite molécule isolée de SP) ; PCF : nombre de cellules de rate formant des plaques anti- GRM Les lignes horizontales dans les quadrilatères correspondent à des moyennes. Les points inclus dans les quadriltères correspondent à 50 % des valeurs individuelles. La Fig. 2 représente par un graphique les réponses T-indépendantes de type 1 (Ti-l) de sourisSalb/c traitées par du SP ou des fractions isolées de SP (humain) et immunisées par du TNP-LPS. Les suppressions des réponses PCF (pu0,001) et d'anticorps (P deux groupes traités respectivement par du SP ou par de grosses molécules (dSP) isolées du SP, sont significatives. Mêmes légendes que dans la fig. 1 sauf pour PFC = cellules de rate formant plaques antis-TNP-GRM. La Fig. 3 représente par un graphique les réponses T-indépendantes de type 2 (Ti-2) de souris Balb/c traitées par de grosses molécules isolées de SP (humain) et immunisées par du TNP-Ficoll. La suppression (P apres traitement par de grosses molécules isolées de SP (dSP) est significative . ta diminution de la réponse des anticorps est faible, mais signifi cative (P 10 mg/ml Se sérum-albumine bovine (SAB) . Autres légendes comme dans la fig. 2. Outre les dispositions qui précèdent l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se refère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple I - Préparation d'une fraction immunosuppressive (ils) Des éjaculats de SP provenant de donneurs normaux, ont été collectés et centrifugés immédiatement après collecte, à 20 000 g et les surnageants ont été conservés à -300C s'ils n'étaient pas immédiatement utilisés. De "grosses" molécules ont été obtenues par dialyse contre du PBS et les "petites" molécules sont constituées par le dialysat d'un volume de SP contre un volume de PBS. Les "grosses" molécules ont été ensuite précipitées par du sulfate d'ammonium entre 40 et 60 8 de saturation, après avoir été traitées par des inhibiteurs de protéases.Le précipité. de sulfate d'ammonium a éte fracticnné à travers une série de 3 colonnes de "SEPHACRYL" S-30Q (2,5 x 100 cm) équilibré par de l'azide contenant du PBS. Apyres concentration, la fraction la plus active (tbe 2 ) a été filtrée à travers une colonne de"SUPEROSE" TM 12 (PHARMACIA")en utilisant un système de chromatographie en phase liquide haute pression (HPLC) avec un intégrateur SHIY2DZU, et a été collectée sous forme de fractions de 500 l. Après chaque étape de purification, on a procédé a des dialyses et on a testé l'activité immunosuppressive des fractions dialysées. Exemple II - Identification de la fraction IS. 1. Analyse électrophorétique. L'électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) a été effectuée en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) comme décrit par LAEMMLI [NATURE, 227 (1970) p. 680] pour déterminer le poids molé culaire de la fraction IS isolée comme décrit à l'Exemple T. Les gradientsde polyacrylamide ont été formés à l'aide d'une pompe péristaltique à 3 canaux. La coloration a été réalisée soit avec du bleu brillant de Coomassie R250, soit avec de l'argent conformément à la méthode MORRISSEY ANAL. BIOCHEM., 117, (1980), p. 307] 2. Isofocalisation préparative. Le précipité de sulfate d'ammonium et le tube 2 ont été dialysés contre une solution saline phy siologique et 60 ml de chaque solution ont été soumis à des isofocalisations dans un gel granulé ("ULTRODEX, LKB") à pH 4 à 9, en utilisant un appareil "MULTIPHOR" de LKB pour déterminer le point isoélectrique de la fraction IS. Des bandes de gel ont été isolées et les fractions, éluées par du tampon phosphate 0,3M, pH7,5 ont été dia lyses contre du PBS et leur activité 15 contre lée. L'isofocalisation préparative a montré que l'activité B-suppressive est localisée dans la zone du pH comprise entre 5 et 6. 3. Digestion par la pronase. Le contenu du tube 2 a été incubé pendant 1 heure à 370C avec de la pronase à raison d'un rapport enzyme/protéine de 1/50. La digestion a été suivie d'une dialyse. L'activité B-suppressive du contenu du tube 2 a considérablement diminué (22 140 cpm) par comparaison au témoin non-digéré (3340 cpm). Exemple III - Purification de l'inhibiteur à réponse T indépendante. Le précipité de sulfate d'ammonium a été fractionné sur du "SEPHACRYL" 5-300 (cf. Ex. I). Comme 1 montre la figure 3A, l'activité maximale a été observée dans le creux entre les deux premiers pics. (tube 2). Ce tube contenait un grand nombre de protéines, un compcsant majeur et plusieurs composants mineurs (cf. fig. 4B annexée). L'étape supplémentaire de purification du tube 2 par passage sur une colonne d'HPLC (cf. Ex. I) a permis de localiser la fraction active à un volume d'exclusion cor respondant à 180 KD (fig. 5A, 5B). L'analyse SDS-PAGÉ de cette fraction active isolée par HPLC (Fig. 5C,5D) a fait apparaitre un petit nombre de molécules différentes. L'élu- tion de l'une de ces protéines (flèche, fig. 5D) est en bonne corrélation avec celle de l'activité IS. La figure 4 représente le fractionnement du SP. La figure 4A représente par un graphique la filtration du précipité de sulfate d'arr,onium à 40-60 % à travers une colonne de "SEPHACRYL" S-300. OD = Densité optique à 280 nm ; % inhibition activité suppressive de dilutions au 1/100è des tubes pl - p5 sur la prolifération induite par Nocardia. La figure 4B représente l'analyse SDS-PAGE dans un gel gradient 3-12,5 8 (coloration à l'argent). P60 : précipité de sulfate d'ammonium à 40-60 %. Les nombres 14-1000 indiquent les migrations respectives de Tnarqueurs de poids moléculaires de 14 à 1000 KD. La Figure 5 représente la purification de la fraction immunosuppressive B-spécifique. La fig. 5A représente le fractionnement du tube 2 à travers une colonne de "SUPEROSE" TM12. ta courbe claire correspond à l'absorbance aux U.V. La courbe énoncée correspond au pourcentage d'inhibi- tion ( une dilution d'1/50 ). Les nombres 1-5 désignent les fractions actives. La fig. 5B représente l'estimation du poids moléculaire des protéines qui éluent dans la fraction 3. Les fig. 5C et 5D représentent l'analyse SDS-PAGE des fractions 1-5. Les protéines ont été révélées soit par du bleu brillant de Coomassie R250 (fig. 5C) soit par de l'argent (fig. 5D). La flèche de a fig. 5D désigne une bande de protéine oui pourrait correspondre au facteur immunosuppres seur conforme à l'invention. Exemple IV - Test d'inhibition in vitro de la prolifération de cellules induite par un mitogène. Les suppressions de réponses prolifératives ont été testées sur des cellules mononucléaires sanguines pé riphériques stimulées par des mitogènes. Les cellules ont été cultivées en triple, à une concentration de 3 x 105 par 0,2 ml dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10 % de sérum de veau foetal (SVF), de la glutamine et des antibiotiques. Dans certaines expériences, le SVF a été remplacé par du sérum humain autologue.tes mitogènes Td mis en oeuvre ont été la phytohémagglutinine (PHA) à une concentration finale de 10g/ml, ou un anticorps monoclonal anti-CDR3 à 10 ng/ml.Le mitogène -de cellules délipidées de Nocardia (Noc) a été utilisé à une concentration finale de 50 r/m. Au jour 0, des dilutions de fractions séminales ont été ajoutées à chaque puits et les proliférations ont été testées au jour 3 après une incubation de 18 heures avec de la 3H-thymidine. Des témoins sans inhibiteur ou sans mitogène ont permis d'étab3ir le degré de suppression. Dans certaines expériences, on a utilisé des préparations pauvres en cellules T. Des mononucléaires ont été incubés à deux reprises avec des cellules d'érythrocytes de mouton traitées par de la neuraminidase (GRM) et les cellules formant des rosettes ont été éliminées par centrifugation sur un gradient "Ficoll"-"Hypaque" : ces préparations ont été utilisées à une concentration finale de 5 x 10 par 0,2 ml et stimulées par Noc. Les "grosses" molécules isolées de SP par dialyse et précipitation par 40-60 % de sulfate d'ammonium ont supprimé la prolifrat-on des cellules B induite par:;oc. La B-spécificité de ces résultats a été confirmée en utilisant des préparations appauvries en cellules T qui ont été supprimées de la même manière.. Toutefois, ces fractions n'ont pas supprimé les T-proliférations induites par PHA ou par l'anti-CD3. De façon symétrique, les "petites" molécules isolées de SP ont supprimé les proliférations Tspécifiques et non les proliférations B-spécifiques. Les résultats obtenus sont illustrés dans le Tableau I ciaprès. TABLEAU I Activités immunosuppressives in vitro de fractions isolées de SP Prolifération* Expériences Inhibiteur par un mitoqene Nocardia PHA N 1 SP dialysé(+) 1/100 8.900 83 100 1/200 11 100 84 900 dialysat de SP (#)1/100 32 200 8 500 pas d'inhibiteur 33 600 63 000 N 2 SP dialysé 1/100 10 400 99 100 Précipité d'AS l/lOO 6 000 62 500 Surnageant d'AS l/lOO 29 900 101 100 pas d'inhibiteur 27 000 66 000 (*)compte par minute (bruit de fond des cellules déduit) (+) "grosses" molécules t) "petites" molécules.As: sulfate d'ammonium à 40-608 Pour démontrer que le SVF ne joue aucun rôle dans 1a suppression de la prolifération induite par le Noc, des expériences ont été réalisées avec du sérum humain autologue. Dans ces conditions, la réponse mitogénique vis-à-vis du Noc a été plus faible (5200 cpm) mais néanmoins réduite (1530 cpm). Exemple V - Expérimentation in vivo. On a injecté par voie intrapéritonéale à des souris Balb/c mâles, 3 fois par semaine, 0,5 ml de SP ou de fractions isolées par dialyse du SP. Deux groupes témoins ont reçu l'un 5 ng de SAB, 3 fois par semaine, l'autre rien. Au bout de 2 semaines, les souris ont été immunisées soit oar 5 x107 GRM, soit par 5 pg de TNP-LPS, soit 25 pg de TNP-Ficoll. Les traitements ont été poursuivis après les immunisations. On a testé les souris immunisées au GRM au jour 7 pour vérifier leurs réponses PFC et d'anticorps hémagglutinants. Les souris immunisées par TNP-LPS ou TNP-Ficoll ont été testées au jour 3 (pour le TNP-LPS) ou au jour 7 (pour le TNP-Fvcolls pour vérifier leurs réponses anti-TNP-PFC et d'anticorps, en utilisant des ZiP-GRM connue cellules-cibles. Les résultats ont été comparés a l'aide du test de Wilcoxon. I1 n'a pas été observé d'immunosuppression brutale chez les souris traitées contrôlées par PFC pour déterminer leur antigène Td de GRM (cf. figure i, annexée). Un seul traitement (par de "grosses"molécules isolées de SP) a induit une diminution mineure du titre en anticorps GRM cor respondant à une différence d'une dilution (P Ti.l (cf. fig. 2 annexée). Aussi bien le SP que les grosses molécules isolées du SP ont supprimé de façon significative les réponses PFC anti-TNP (P TNP (P 0,000i) . Le traitement par des petites molécules isolées du SP a semblé légèrement augmenter à la fois la réponse PFC (non significatif) et la réponse des anticorps (P TNP-Ficoll (un antigène Ti-2). Bien que cette inhibition ait té plus faible sur la production d'anticorps que sur les PFC (cf. fig. 3 annexée), les différences entre les souris traitées par des grosses molécules isolées de SP et les deux groupes témoins sont statistiquement significatives pour les deux tests (P REVENDICATIONS 1. Facteur immunosuppresseur caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine non dialysable, dont le poids moléculaire est de 180 KD + 10 %,dont le point iso- électrique est compris entre 5 et 6 et qui a une activité de suppression sélective de la prolifération des lymphocytes B, notamment d'origine humaine. 2. Facteur immunosuppresseur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est isolé de plasma séminal humain. 3. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une quantité thérapeutiquement active de la fraction immunosuppressive selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4. Procédé d'isolation par purification du facteur immunosuppresseur selon la revendication 2, carac térisé en ce que du plasma séminal humain est centrifugé à 20 000 g et les surnageants sont traités par des inhibiteurs de protéases, puis dialysés contre du PBS, précipités par du sulfate d'ammonium à 40 %, puis à 60 % de saturation. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les précipités obtenus par traitement par le sulfate d'ammonium sont purifiés par gel-filtrations, puis la fraction immunosuppressive isolée est concentrée, dialysée contre du PBS et essentiellement conservée à basse température, inférieure à -200C. 6. Fraction immunosuppressive caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 4. 7. Fraction immunosuppressive caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 5.