Brevet FR2617502A1 — publié le 19890106

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'anhydro-1,5 D-fructose. Elle comprend, en tant que nouveau produit, cet anhydro-fructose purifié, ainsi que son application à la production d'un antibiotique. Jusqu'à présent, l'anhydro-1,5D-fructose n'a veillé aucun intérêt industriel. Alors qu'on a étudié l'oxydation enzymatique, à l'aide de certains Pseudomonas, de l'anhydro-1,5 D-glucitol en le fructose correspondant, celui-ci n'a même pas été isolé et fut caractérisé seulement par sa dinitro-2,4 phénylhydrazone (NARM4URA et coll. J. Biochem, 1986, 99, 609-613). D'ailleurs, le glucitol étant une forme désoxy-1 du glucopyranose ne pourrait pas constituer une matière première économique, pour la prodiction d'anhydro-1,5D-fructose. D'autre part, on connaît un procédé chimique de préparation d'anhydro-1,5 cétohexoses, classe à laquelle appartient l'anhydro-fructose ; il consiste en l'hydroxylaminolyse d'esters de l'hydroxy-2 glycal, suivie de la désacylation et désoximation (LICHTEN HALER et coll. Tetrahedron Letters, 1980, 21, 1429-1432). Cependant, la désacylation entraîne des complications et les auteurs n'ont pu obtenir l'anhydro-1,5D-fructose autrement que sous la forme de son oxime. Ce procédé connu serait donc difficilement applicable à une production industrielle. Or, depuis la découverte, par les auteurs de la présente invention, du rôle de précurseur que joue l'anhydro-1,5D-fructose dans la production de l'antibiotique microthécine (publication de la demande de brevet japonais nO 79,122796), il est devenu fort intéressant de pouvoir obtenir ce fructose de façon économique. D'après le-procédé japonais, la microthécine est obtenuepar la culture aérobie des Micromycètes, Microthecium ou Melanospora, sur une solution de fécule de pomme de terre etc qlucose ; l'action de ces champignons est exceptionnelle, puisque cent autres Micromycètes ne l effectuent pas. La présente invention part des faits inattendus que la microthécine peut être obtenue plus avantaaeusement, si l'on prépare d'abord l'anhydro-1,5D-fructose (désigné ci-après par l'abréviation AF) pour le transformer ensuite en microthécine, et que cette conversion peut s'effectuer avec l'aide de certains Macro-Ascomycètes et de Discomycètes. Le procédé suivant l'invention consiste à soumettre une solution aqueuse d'un glucane alpha 1-4, ou d'un produit de sa dégradation, à'l'action d'une enzyme produite par un champignon Macro-Ascomycète ou Discomycète. L'enzyme peut notamment provenir d'un champignon de l'un des deux groupes suivants a) espèces allant jusqu'au stade de la microthécine Discina perlata Discina parma Gyromitra gigas Gyromitra infula Mitrophora hybrida Morchella conica Morchella costata Morchella elata Morchella hortensis Morchella rotunda Morchella vulgaris Peziza aurantia Peziza badia Sarcosphaera eximia b) espèces s'arrêtant au stade de l'AF Disciotis venosa Gyromitra esculenta Helvella crispa Helvella lacunosa Leptopodia elastica Certaines souches de Morchella Verpa digitaliformis Dans les cas d'enzymes issues du groupe (a) il convient d'arrêter la réaction au stade AF, ce qui peut être obtenu par l'action de l'E.D.T.A; (acide éthylène diamine tétracétique). Les glucanes i A-1-4, servant de matière première, c' est-à-dire de substrat de la réaction enzymatique suivant l'invention, peuvent être tels qu'amidon, soit amylose et amylopectine, glycogène, et leurs produits de dégradation partielle, en particulier dextrines, dextrines hydrogénées, maltotriose, etc. Ainsi peut-on employer des matières premières beaucoup plus aisément accessibles que celles de l'art antérieur mentionné plus haut. Bien qu'il soit possible d'effectuer le procédé de l'invention par culture directe de la souche appropriée e.champignon sur une solution de glucane, la forme d'exécution préférée consiste à extraire d'abord l'enzyme voulue d'une culture de champignon, la purifier, et l'utiliser ensuite à la production de l'AF à partir de la solution de glucane, dans des conditions optimales, déterminées. La préparation proprement dite de l'AF, suivant l'invention, est donc en général précédée d'une opération de culture de la souche choisie, activée subséquemment par un traitement plasmolytique qui démasque les enzymes présentes dans les cellules du champignon. Un tel traitement peut consister en l'élévation de la température de la culture à la température optimale de croissance, en l'action de vapeurs de solvants organiques, tels que par exemple chloroforme, éther, acétone, acétate d'éthyle, etc. ou en l'aqitation du milieu aqueux avec un hydrocarbure aromatique, en particulier le toluène ; d'autres moyens peuvent être la congélation suivie de décongélation ou un broyage poussé. Il peut d'ailleurs être bon d'appliquer plusieurs de ces traitements à la fois, par exemple congélation puis fusion du milieu aqueux, suivies d'un broyage. L'action de l'enzyme sur la solution de glucane, en vue de l'obtention de l'AF, selon l'invention, est en général conduite dans un milieu aqueux de pH d'environ 4 à 8 et de préférence 5 à 7, à une température de 250 à 400C ou mieux entre 300 et 370C. Les marges préférées, sùsifl- diquées, conviennent particulièrement bien,par exemple, lorsqu'on utilise un extrait enzymatique de Morchella vulgaris avec de l'amidon. Lorsqu'on procède à la purification de l'AF préparé par le procédé décrit plus haut, on obtient un anhydro1,5D-fructose qui n'a jamais été préparé sous cette forme, ni utilisé, dans le passé. C'est un solide blanc, amorphe, très soluble dans l'eau, stable à la chaleur, non toxique pour la souris, par voie orale, à la dose de 5gJkg. Goût faiblement sucré en solution aqueuse. Non métabolisé par la levure de boulangerie. En.solution aqueuse,ce fructose donne lieu à un équilibre entre au moins deux formes forme pyrannique forme pontez carbonylée en 2 en 2-6 Suivant un trait de la présente invention, c'est cet AF purifié qui est appliqué à la production de l'antibiotique, la microthécine.Pour cela, à une solution aqueuse odrganique d'AF on ajoute une enzyme produite par une des souches de groupe (a) indiquées plus haut, ou bien l'enzyme de Microthécium ou deMélanospora selon la publication de brevet japonais 79-122796, pour faire transformer l'AF en l'antibiotique. Celui-ci est alors obtenu avec un rendement bien meilleur que par le procédé du brevet japonais ; il est également plus pur et il est plus aisé de pousser davantage sa purification finale. Les avantages de cette application suivant l'invention résultent, entre autres, de ce que celle-ci rend possible d'utiliser un milieu beaucoup plus pur, grâce à la purification de l'AF employé, et plus concentré en ce dernier. L'invention est illustr-ée non limitativement par les exemples qui suivent, et dont les principales caractéristiques, mais non exclusives, sont donnéesci-après. Nature de la souche : n'importe laquelle des espèces ou souches (a) et (b), mentionées plus haut, constitue une source potentielle d'activité enzymatique. Mode de culture : sur milieu gélosé ou en milieu liquide. Préparation de l'extrait enzymatique actif : la plasmolyse activatrice de la souche, nécessaire, est réalisée ici par une combinaison de congélation-décongélation, broyage et agitation en milieu aqueux, additionné de toluène. Le degré de purification de l'extrait peut être variable selon l'objectif visé ; avec l'extrait brut, l'expérience montre qu'une préparation même grossière peut convenir. Pour obtenir un extrait semi-brut, l'activité enzymatique intéressante est précipitée par le polyéthylène glycol (P.E.C.) ou par le sulfate d'ammonium à partir d'une suspension de broyat cellulaire dans un tampon. Nature du substrat de la réaction enzymatique : amidons de différentes origines botaniques, notamment blé, mais, riz, amylopectine, amylose, amidon soluble, maltodextrines, glycogène, etc. Réalisation de la réaction enzymaticNle et purification de l'AF : on incube le substrat préalablement solubilisé avec l'extrait enzymatique, on peut opérer en présence d'un antibiotique,par exemple le chloramphénicol à 0,1%, pour inhiber les proliférations microbiennes. Pour éliminer le glucose, qui accompagne l'AF, on peut faire agir la levure de boulanger qui ne métabolise pas ce dernier. Plusieurs possibilités s'offrent ensuite, parmi lesquelles : pratiquer une dialyse qui sépare les produits de la réaction, c'est-à-dire AF et dextrines de faible poids moléculaire, des macromolécules du milieu réactionnel, soit substrat non transformé, l'enzyme et des éléments figurés, levures, particules provenant éventuellement du substrat, etc. centrifuger pour éliminer les éléments figurés, puis -évaporer à sec et reprendre le résidu du méthanol, qui dissout l'AF mais aussi d'autres composés. Une purifcation plus poussée de l'AF est réalisable par chromatographie sur colonne soit sur support dé gel-filtration, soit sur support d'échange d'ions, avec élution par l'eau, ce qui donne un produit pur à environ 958; pourob- tenir l'AF pur à pratiquement 100%, on termine par une chromatographie en couche préparative sur gel de silice. La détection et le dosage de l'AF peuvent être effectués par C.C.M., C.L.H.P. La C.C.M. peut être réalisée sur plaque de silice Macherey-Nagel Sil G/UV254, avec élution par le mélange chloroforme-méthanol 70 : 30 et révélation par chauffage de 10 mn, à 1000C après pulvérisation du réactif à l'anisaldéhyde (anisaldéhyde, 0,5 ml ; acide sulfurique, 0,5 ml; éthanol, 9 mol) ; le Rf est de 0,5. On peut effectuer la-détection et le dosage par la C.L.H.P. sur colonne Partisil Carbohydrate 10 de 25 cm x 4,6 mm (Whatnan),avec le mélange acétonitrile-eau 80:20 au débit de 1,5 ml/mn, avec détection réfractométrique. Le temps de rétention est de 4,4 mn. EXEMPLE. 1 Obtention d'un extrait enzymatique brut à partir d'une souche microthécine-négative de Morchella vulgaris, cultivée sur milieu gélosé. Les mycéliums du champignon sont cultivés à 24-250C dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre,ren- fermant 20 ml de milieu glucosé gélosé à l'extrait de levure ; glucose, 20 g ; extrait de levure Mérieux, 5 g gélose, 20 g ; eau distillée, q.s.p. I 1, recouvert d'un film de cellophane stérile qui facilite la récupération ultérieure du mycélium. L'inoculation se fait par dépôt au centre de la boite d'une rondelle mycélienne de 0,5cm de diamètre, prélevée avec un emporte-pièce stérile dans une culture en cours de croissance. Au bout d'une dizaine de jours, lorsque les mycéliums occupent la totalité de la surface des boîtes de Petri, ils sont récoltés et congelés. Au moment de l'emploi, ils sont mis à décongeler par macération, à la température ambiante et pendant 1 heure, dans de l'eau distillée (5 ml par rondelle de mycélium) l'eau de macération, qui entraîne diverses- impuretés, est rejetée. Les mycéliums sont alors essorés et broyés dans du tampon phosphate de sodium 0,05 M de pH 6(5 ml par mycélium), en présence de 10 Al de toluène par mycélium. Le broyat est centrifuté 30 minutes à 20 000 g, et le surnageant constitue le réactif enzymatique. On peut effectuer, avant cette centrifugation, une congélation-décongélation du broyat ; cette opération, de même que la présence de toluène, n'est pas indispensable,mais elle améliore le rendement en AF en parachevant le démasquage des enzymes provoqué par la congélation-décongélation des mycéliums et par le broyage lui-même. EXEMPLE 2 Obtention d'un extrait enSymatique semi-brut à partir du même matériel que dans l'exemple 1. Le surnageant de centrifugation, obtenu selon l'exemple 1, est iditionné de polyéthylène-glycol 6000 à raison de 3 g/10 ml. Le précipité qui se forme est recueilli par une nouvelle centrifugation de 30 minutes, à 20 000g, et repris par du tampon phosphate de sodium 0,05 M'de pH 61 rendu 0,2 M en NaCl, soit 1/10 du volume du surnageant initial, c'est-à-dire environ 0,5 ml par rondelle de mycélium. Après une nouvelle centrifugation dans les mêmes conditions, une deuxième précipitation est réalisée par le même P.E.G. à la concentration de zig/10 ml.Le précipité est recueilli par centrifugation comme ci-dessus et repris par du tampon phosphate de sodium 0,05 M de pH 6 (1/20 du volume du surnageant de départ, soit environ 0,25 ml par mycélium) ; cette solution constitue le réactif enzymatique. EXEMPLE 3 Obtention d'un extrait enzymatique semi-brut à partir d'une souche microthécine-négative de Morchella vulgaris cultivée en milieu liquide. Préculture La souche est cultivée à 24-250C sous forme de mycéliums dans des tubes renfermant 15 ml de gélose inclinée de même formule que dans l'exemple 1. Le grattage dans de l'eau dis- tillée stérile d'un tube fournit des débris mycéliens qui servent à inoculer une fiole d'Erlenmeyer de 250ml renfermant 50 ml du milieu de même formule que le précédent, exception faite de la gélose. Ces fioles sont incubées sur un agitateur-incubateur rotatif à la température de 260C, à lavitesse de 50 tours/mn, pendant 4 jours. Dans ces conditions, le champignon croît en produisant, dans chaque fiole, une pelote mycélienne unique ou un petit nombre de pelotes. Le broyage de cette préculture sert d'inoculum pour la culture proprement dite. Culture proprement dite Elle est réalisée dans 25 fioles de 250 ml renfermant 100ml du milieu de formule suivante : amindon soluble, 20 g; liqueur de corn-steep, 10 ml ; K2HPO4, 1 g ; MgSO4, 7 H20, 0,5 g ; eau distillée, 1 litre. Chaque fiole est inoculée avec 2 ml du broyat précédent, puis les fioles sont incubées sur un agitateur-incubateur rotatif à la température de 26"C, à la vitesse de 140 t/mn, pendant 8 jours. Dans ces conditions, le champignon se développe sous forme de petites pelotes d'environ 4 mm de diamètre qui sont recueillies par décantation et congelées jusqu'à l'utilisation. Préparation de l'extrait enzyrmatique La biomasse mycélienne précédente est décongelée, puis broyée dans 100 ml de tampon phosphate de sodium 0,05 M de pH 6.La suite des opérations, centrifugations et précipitations par le polyéthylèneglycol, est effectuée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2. EXEMPLE 4 Préparation d'AF à partir d'amidon soluble Merck 1253 et d'un extrait enzymatique obtenu selon le procédé de l'exemple 1, avec intervention d'une dialyse, d'une chromatographie sur colonne d'échange d'ions et d'une purification finale sur chromatoplaque. On dissout 1 g d'amidon soluble dans 40 ml d'eau contenant 40 mg de chloramphénicol ; on fait incuber pendant 24 heures à 35"C en présence de 2 ml de l'extrait enzymatique, puis on ajoute environ 400 mg de levure de boulangerie ; après 24 heures de contact d la même température, on pratique trois dialyses successives contre de l'eau distillée ; l'ensemble des dialysats (environ 1 1) est évaporé à sec. On reprend le résidu par 2 ml d'eau distillée et l'on introduit cette solution au sommet d'une colonne de 16 mm x 1 m contenant 180g de résine Dowex 50 W X 4 (granulométrie AFNOR 17 à 20) ; l'élution est réalisée par de l'eau distillée au débit de 0,4 ml/mn et l'on recueille des fractions de 4 ml.Le contrôle CLflP des fractions montre que l'AF est contenu dans les fractions 30 à 40 ;on les réunit et lyophilise,ce qui donne 500 mg de produit blanc. Ce résidu est repris par 2 ml de méthanol et la solution est répartie en bandes sur des plaques de gel de silice préparatives (Kieselgel Merck 60 PF254) à raison de 0,5 ml par plaque. Le développement chromatographique est réalisé par le mélange chloroforme-méthanol 70:30 ; les bandes contenant l'AF, repérées visuellement par leur aspect blanc mat ou par réduction, sur une bande témoin, du'triphénylté- trazolium ( chlorure de triphényltétrazolium, 2 g ; NaOH 0,5 N, 100 ml), sont grattées et la poudre obtenue est épuisée par le même solvant. Après évaporation à sec, le résidu est repris par de'l'eau distillée ; cette solution est filtrée sur membrane de porosité 0,22 Am, puis lyophilisée, ce qui fournit environ 300 mg d'AF pur à pratiquement 100%. EXEMPLE 5 Préparation d'AF à partir d'un amidon de blé brut et d'un extrait enzymatique brut obtenu selon le procédé de l'exemple 1, avec intervention d'une éyaporation à sec, d'une reprise par le méthanol et d'une chromatographie sur colonne de gel-filtration. On met en suspension îg d'amidon dans 40 ml d'eau contenant 40 mg de chloramphénicol et l'on porte à l'ébullition pendant 2 mn. Après refroidissement, cet empois est additionné de 2 ml de l'extrait enzymatique préparé selon l'exemple 1 et l'incubation est réalisée avec agitation pendant 24 heures à 35"C. On ajoute alors environ 400 mg de levure de boulangerie ; après 24 heures de contact à la même température, on centrifuge pendant 20 minutes à 15 000 t/mn. Le surnageant est évaporé à sec et le-résidu est extrait par agitation avec 2 x 20 ml de méthanol ; après évaporation de ce solvant, le nouveau résidu est dissous dans 2 ml d'eau distillée. La solution est alors introduite au sommet d'une colonne de 26 mm x 1 m garnie avec une suspension de Fractogel TSK HW-40 (F)Merck (réf. 14982). L'élution est réalisée par de l'eau distillée au débit de 0,5 ml/mn et l'on collecte des fractions de 5 ml. Leur contrôle montre que l'AF est contenu dans les fract ons 42 à 48, qui sont réunies et évaporées à sec. On obtient ainsi environ 400 mg d'AF pur à environ 90%. Revendications 1. Procédé de préparation de l'anhydre -1,5D-fructose par voie enzymatique à partir d'un hydrate de carbone, caractérisé en ce que l'on fait incuber une solution aqueuse d'un glucane alpha 1-4, ou d'un produit de dégradation d'un tel glucane, avec une enzyme produite par un champignon Macro-Ascomycète ou Discomycète, l'anhydro-1,5D-fructose formé étant ensuite séparé de la solution et purifié. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est produite par une des souches Disciotis venosa, Gyromitra esculenta, Helvella crispa, Helvella lacunosa, Leptopodia elastica, certaines souches de Morchella, Verpa digitaliformis. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est produite par une des souches Discina perlata,-Discina parma, Gyromitra gigas, Gyromitra infula, Mitrophora hybrida, Morchella conica, Morchella costata, Morchella elata, Morchella hortensis, Morchella rotunda, Morchella vulgaris, Peziza aurantia, Peziza badia, Sarcosphaera eximia, mais son activité de conversion de l'anhydro-1,5D-fructose en microthécine est préalablement inhibée, notamment à l'aide d'E.D.T.A. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le glucane alpha 1-4 est amidon, glycogène, dextrine ou maltotriose. 5. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'incubation a lieudans un milieu aqueux de pH 4 à 8, de préférence 5 à 7, à une température de 250 à 400C, préférablement entre 300 et 370C. 6. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue d'abord une culture du champignon susceptible de produire l'enzyme à utiliser, on soumet le champignon à un traitement plasmolytique, puis on extrait l'enzyme de la culture et on l'introduit dans la solution de glucane alpha 1-4 ou d'un pro duit de dégradation d'un tel glucane. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le traitement plasmolytique comprend la congélation puis décongélation-du milieu de culture, l'élévation de la température au-dessus de la température normale de croissance du champignon, l'action de vapeurs d'un solvant organique, agitation du milieu aqueux avec un hydrocarbure aromatique, ou/et un broyage poussé. 8. Anhydro-1,5D-fructose , caractérisé en ce qu'il est constitué par un solide blanc, amorphe, très soluble dans l'eau, stable à la chaleur, non métabolisé par la levure de boulangerie, donnant une forme pyrannique, car tonylée en 2, et une forme pontée en 2-8, lorsqu'il est en solution dansl'eau. 9. Application de l'anhydro-1,5D-fructose suivant la revendication 8 à la production de l'antibiotique, micro thécine, caractérisée en ce qu'une solution de ce fructose est soumise à l'action d'une enzyme extraite de la culture d'un champignon d'une des souches Discina perlata, Discina parma, Gyromitra gigas, Gyromitra infula, Mitrophora hybrida, Morchella conica, Morchella costata, Morchella elata, Morchella hortensis, Morchella rotunda, Morchella vulgaris, Peziza aurantia, Peziza badia, Sarcosphaera eximia. 10. Application de l'anhydro-1,5D-fructose suivant la revendication 8 à la production de l'antibiotique, microthécine, caractérisée en ce qu'une solution de ce fructose est soumise à l'action d'une enzyme extraite de la culture d'un champignon d'une des souches Microthecium ou Melanospora.