Brevet FR2616445A1 — publié le 19881216

La présente invention concerne un procédé pour la production d'éthanol au moyen de souches de microorganisme å résistance élevée. Plus particulièrement, l'invention se réfère i un procédé de production d'éthanol par voie de fermentation dans lequel on utilise une souche particulière de Saccharomyces cerevisiae obtenue au- moyen de plusieurs cycles de sélection, de mutagénèse, de ségrégation génétique, souche qui est en mesure de résister å d'importantes concentrations d'éthanol et de ne pas être inhibée par des teneurs élevées de glucose du bouillon de fermentation, de manière å pouvoir fournir un produit plus concentré en alcool par rapport aux procédés actuellement en usage. L'invention comprend en outre la nouvelle souche de microorganisme élaborée. On sait que l'éthanol peut être produit par voie de fermentation a partir de substrats sucrés qui sont élaborés å partir de levures avec production d'alcool éthylique et d'acide carbonique , comme substrats, on peut utiliser avantageusement des sous-produits ou des déchets agricoles qui doivent, en général, être soumis å une hydrolyse préliminaire afin de séparer les différentes substances sucrées, cellulosiques ou amylacées des monomères de base correspondants. Les sous-produits actuellement proposés comme matières de départ pour les fermentations alcooliques sont de manière prépondérante les excédents céréaliers et les résidus ligneux et cellulosiques dont, apurés hydrolyse appropriée, le sucre monomère de base est le glucose. La production industrielle d'éthanol par voie de fermentation est d'autant plus rentable qu'est plus élevé le niveau final d'éthanol susceptible d'être atteint i bref délai dans le milieu de fermentation, et ceci a depuis toujours constitué un problème difficilement soluble, car les saccharomycetes, qui sont les microorganismes de choix & utiliser dans la fermentation alcoolique, ne résistent pas d des concentrations d'éthanol supérieures å 7 à & 8 % p/v, rendant ainsi impossible toute augmentation ultérieure de la teneur en alcool du produit final. En outre, même la concentration en sucres du substrat pouvant être fermenté est soumise å d'importantes limitations, car des teneurs trop élevées constituent un facteur d'inhibition pour l'activité de fermentation des levures. En tenant compte du fait que le rendement théorique maximal de la fermentation alcoolique å partir du glucose est de 48 % en poids, pour obtenir de l'éthanol å 15 % p/v (même en faisant abstraction des limites de tolérance de ce dernier), il serait nécessaire de fournir un substrat à des teneurs en glucose de 30 % p/v, concentration qui, en général, inhibe le processus de fermentation. Par conséquent, les inconvénients typiques des procédés actuels, avec lesquels on ne dépasse pas 15 % p/v de glucose dans le substrat de départ et 7 & 8 % p/v d'éthanol dans le produit final, sont ceux liés å la dilution excessive des fluides en jeu : nécessité de disposer d'installations de fermentation et de stockage de grands volumes, pour pouvoir atteindre de bonnes valeurs de productivité ou, inversement, quantité réduite de substrats traités par unité de temps et faible productivité en éthanol. En outre, plus le flux d'éthanol à la sortie est dilué d'autant plus élevées sont les dépenses en énergie pour la distillation ultérieure. Le but de la présente invention est donc de proposer un procédé de production d'éthanol par voie de fermentation, dans lequel on utilise des concentrations sucrées de substrat plus élevées que celles utilisées normalement, et qui permet d'obtenir un produit plus riche en éthanol par rapport aux possibilités antérieures. Lés recherches effectuées ont tenté de résoudre ce problème en obtenant des souches de Saccharomyces cerevisiae très résistantes et hautement productives, et en mettant au point des compositions optimales du bouillon de fermentation. La souche de levure objet de la présente invention présente en effet la caractéristique de ne pas être inhibée à des concentrations de glucose allant jusqu'à 30 â p/v et de pouvoir produire de l'éthanol jusqu'à 15% p/v sans subir de mortalité. Le procédé par lequel on a obtenu la nouvelle souche de Saccharomyces cerevisiae est décrit ci-après. Dix souches indépendantes de moûts de vin à haute concentration d'alcool ont été isolées. On a procédé å une première sélection en éliminant les souches qui, au bout de 24 heures, n'avaient pas produit au moins-4 % d'éthanol à partir de glucose à 30%. Sur les 4 souches restantes, on a opéré une sélection drastique concernant la résistance à l'éthanol; de cette procédure est sortie la souche sélectionnée comme étant définitive & laquelle on a donné le sigle MI 831. La caractérisation génétique de la souche NI 831 a été effectuée en contrôlant sa capacité de sporification, positive, et en disséquant ensuite 20 tétrades au micro-manipulateur. La survie des spores n'a jamais dépassé le rapport 2 vivants:2 morts/tétrade indiquant que la souche est hétérozygote en raison de la présence d'un gène léthal récessif. L'analyse du phénotype des clones dérivant de ces spores a démontré que la souche doit être considérée comme complètement sauvage pour ce qui concerne les exigences nutritionnelles. Les caractères de la capacité de fermentation et de la résistance ê l'éthanol présentent une ségrégation de mode complexe, ce qui indique que ces phénotypes sont liés à des systèmes polygéniques. Tous les clones dérivés de spores sont en mesure de sporifier.La survie des spores en tétrades à partir de ces souches est du type 4 vivants:O mort, ce qui indique qu'il s'agit de diploides balancés et que MI 831 et tous les clones dérivés de ce dernier sont des diploides homothalles. Parmi les clones dérivés de spores de la souche MI 831, on a choisi la souche MI 861 qui présentait une bonne capacité de fermentation et une bonne résistance à l'éthanol. La souche MI 861 a été rendue mutagène au moyen d'irradiations ultraviolettes. Après deux cycles de division mitotique 20 cultures indépendantes ont été transférées- dans le milieu de sporulation. L'efficacité de la sporulation a été réduite de 80 % par rapport aux témoins. On a isolé deux tétrades de chaque échantillon et les spores survivants (survie 40 %) ont été analysés pour ce qui concerne leur capacité à fermenter le glucose à 30 % (valeurs relevées après 24 heures). Enfin, on a choisi la souche dénommée MI 861/10a qui, dans les conditions décrites, a produit 14% d'éthanol p/v. La souche de Saccharomyces cerevisiae MI 861/lOa a été déposée le 28 mai 1987 à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen de Gôttingen, en République Fédérale d'Allemagne, sous le numéro de dépôt DSM 4128. Par conséquent, l'objet spécifique de la présente invention est un procédé pour la production d'éthanol au moyen de souches de microorganisme à résistance élevée, caractérisé par le fait que le bouillon de fermentation constituant la matière de départ est traité par des microorganismes appartenant & une souche diploide homothalle- de Saccharomyces cerevisiae, obtenue après passage par des cycles de sélection, un traitement mutagène préméiotique destiné i introduire une variabilité génétique, et des sélections successives ayant la caractéristique de résister & des concentrations élevées d'éthanol, de ne pas être inhibée à des concentrations de glucose allant jusqu'à 30 % p/v et de produire de l'éthanol A des concentrations allant jusqu'à 15 % p/v. En particulier, cette souche est le Saccharomyces cerevisiae MI 861/lOa déposée sous le numéro DSM 4128. Conformément A l'invention, on propose également d'utiliser comme milieu de fermentation un bouillon contenant jusqu'd 30 % p/v de glucose et, en outre, de la mélasse, laquelle, comme on le sait, est le sous-produit de l'extraction du sucre de la betterave ou de la canne. En effet, on a considéré que la mélasse contient des sels minéraux, des vitamines et en général des substances qui constituent des impuretés à éliminer par l'industrie sucrière, mais qui sont également des éléments nutritifs utiles pour le développement des microorganismes. Une addition de mélasse complète donc le substrat sucré de base, en améliorant la cinétique de la réaction de fermentation et conduisant à des augmentations sensibles du rendement à certains niveaux de concentration. En particulier, on a constaté de manière surprenante que, en traitant avec le microorganisme objet de l'invention des substrats contenant du glucose jusqu'à environ 30 % et de la mélasse entre 7,5 et 10 % p/v, on peut atteindre une efficacité de transformation du glucose égale i 100 % de la valeur théorique. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le bouillon de fermentation contient donc du glucose en concentration égale å environ 30 % p/v et de la mélasse entre 7,5 et 10 % p/v. De toute évidence, il est d'un grand intérêt dans l'application pratique de pouvoir combiner le substrat avec un sous-produit de faible coût tel que la mélasse, augmentant ainsi le rendement de la production jusqu'd 13 % par rapport å la normale. Dans la pratique, le procédé objet de l'invention, selon un mode de réalisation préféré, consiste h cultiver préalablement le Saccharomyces cerevisiae MI 861/10a dans un milieu de culture, dans des conditions d'aérobiose, et pour l'inoculer ensuite dans un milieu de fermentation contenant du glucose à 30 % p/v environ et de la mélasse en une concentration comprise entre 7,5 et 10 % p/v, en développant la fermentation dans des conditions d'anaérobiose ou de micro-aerophilie, å des températures comprises entre 25 et 35il, et enfin en séparant la biomasse du produit liquide résultant. On peut ainsi obtenir une concentration finale d'éthanol de 15 % p/v, égale å environ le double de celle que l'on obtient au moyen des procédés actuellement connus. Comme mentionné ci-dessus, ceci offre l'avantage de pouvoir traiter des flux, tant concernant le substrat de départ que le produit final, plus concentrés, et donc de pouvoir utiliser des installations de volumes moins importants avec des réductions importantes des coûts d'investissement ; ou bien avec des volumes utiles de même importance, on a l'avantage de pouvoir traiter des quantités supérieures de substrat et d'atteindre des productivités en éthanol plus élevées. En outre, les coûts de la purification consécutive sont réduits en raison de la plus faible quantité d'eau å éliminer. Un autre objet de la présente invention est une souche diploide, homothalle de Saccharomyces cerevisiae, obtenue après passage par des cycles de sélection, un traitement mutagène préméiotique destiné à introduire une variabilité génétique, et des sélections successives, souche qui présente la caractéristique de résister à des concentrations élevées d'éthanol, de ne pas être inhibée à des concentrations de glucose allant jusqu'à 30 % p/v et de produire de l'éthanol à des concentrations jusqu'à 15 % p/v. En particulier, cette souche est Saccharomyces cerevisiae MI 861/lOa, déposée sous le numéro DSn 4128. La présente invention sera maintenant décrite å titre illustratif mais non limitatif, en référence å un mode de réalisation spécifique. EXEMPLE On inocule dans un échantillon contenant un milieu de culture complet la souche de Saccharomyces cerevisiae MI 861/10a et on fait incuber pendant 48 heures i 30xi. La biomasse produite est mise en suspension dans 5 ml de solution physiologique et cette suspension est utilisée pour inoculer un milieu de culture liquide dans un rapport de 1:100. Les milieux de culture préférés sont YEPS (extrait de levure 0,5 %, bactopeptone 1 %, saccharose 2 %) et YEPD (extrait de levure 0,5 %, bactopeptone 1 %, glucose 2 %). Les cultures sont placées & 30*C dans un incubateur tournant i 240 t/mn pendant 18 heures. La biomasse produite est ensuite séparée du bouillon de culture par centrifugation et récupérée avec le milieu de fermentation de manière å obtenir une concentration finale de 109 cellules/ml. La suspension est recueillie en vue de la fermentation, dans une boite munie d'un bouchon i fermeture hermétique et d'un évent pour le gaz généré et placée i 28iC sous une rotation de 240 t/mn. La consommation de glucose et la production d'éthanol sont mesurées à des intervalles de 2 heures au moyen de prélèvements effectués de manière stérile (comme toutes les opérations décrites précédemment) et en des volumes tels, de manière å ne pas appauvrir, globalement, le volume total de fermentation de plus de 2,5 %. Les analyses des échantillons sont effectuées pour ce qui concerne les solvants par chromatographie en phase gazeuse et pour ce qui concerne les sucres par chromatographie en phase liquide à haute pression et réaction enzymatique spécifique pour le glucose (Analyseur de Glucose, Beckman). En suivant la procédure décrite, on a soumis à fermentation plusieurs substrats de composition différente, afin de comparer les résultats. Certaines des données recueillies sont indiquées dans le tableau suivant, dans lequel on peut voir clairement les valeurs élevées de concentration d'éthanol atteintes grâce à la présente invention et l'influence positive de l'addition de mélasse. TABLEAU Fermentation au moyen de la souche Saccharomyces cerevisiae MI 861/10a Milieu Glucose 30% p/v Gluc. 30% + Gluc.30 % + mélasse 7,5% Mel. 10 % p/v p/v 6h 0 24h 6h 8h 24h 6h 24h % éthanol (p/v) 6,25 10 10 7,5 10 13 7,5 15 Efficacit de trans formation en % 1,6 66,6 66,6 50 66,6 86,6 50 100 Volume de fermentation : 100 ml Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'exemple de réalisation que l'on vient de décrire et on peut apporter A celui-ci de nombreuses modifications sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'éthanol au moyen de souches de microorganisme à haute résistance, caractérisé en ce que le bouillon de fermentation constituant la matière de départ est traité par des microorganismes appartenant å une souche diploide homothalle de Saccharomyces cerevisiae, obtenue par passage à travers des cycles de sélection, un traitement mutagène préméiotique destiné & introduire une variabilité génétique et des sélections successives, cette souche ayant la caractéristique de résister à des concentrations élevées d'éthanol, de ne pas être inhibée i des concentrations de glucose allant jusqu'a 30 % p/v et de produire de l'éthanol å des concentrations allant jusqu'a 15 % p/v. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on utilise la soucheSaccharomyces cerevisiae MI 861/10a et déposée sous le No. DSM 4128 å la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen de Göttingen, République Fédérale d'Allemagne. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel ledit bouillon de fermentation contient du glucose à environ 30 % p/v et de la mélasse. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ladite mélasse est contenue dans le bouillon de fermentation å des concentrations supérieures å 2,5 t p/v. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite mélasse est contenue dans le bouillon de fermentation å des concentrations comprises entre 7,5 et 10 %. 6. Procédé pour la production d'éthanol au moyen de souches de microorganisme à résistance élevée, dans lequel on cultive préalablement le Saccharomyces cerevisiae MI 861/10a déposé sous le No. DSM 4128 sur un milieu de culture en état d'aérobiose, en l'inoculant ensuite dans un milieu de fermentation contenant du glucose å environ 30 % p/v et de la mélasse en des concentrations comprises entre 7,5 et 10% p/v èn réalisant la fermentation dans des conditions d'anaérobiose ou de microaérophyllie, å des températures comprises entre 25 et 35C, et enfin en séparant la biomasse du produit liquide résultant. 7. Souche de Saccharomyces cerevisiae diploide homothalle, obtenue par passage par des cycles de sélection, un traitement mutagène préméiotique afin d'introduire une variabilité génétique et des sélections successives ayant la caractérisque de résister i des concentrations élevées d'éthanol, de ne pas être inhibée à des concentrations de glucose jusqu'à 30 % p/v et de produire de l'méthanol å des concentrations allant jusqu'à 15 % p/v. 8. Souche selon la revendication 7, constituée par le Saccharomyces Cerevisiae MI 861/10a, déposée sous le No. DSM 4128 å la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen de Göttingen, République Fédérale d'Allemagne.