Brevet FR2622195A1 — publié le 19890428

La présente invention est relative à de nouveaux isopolypeptides d'acides diamino-monocarboxyliques, a leurs sels, leurs isomères optiques et leurs racémates. De plus, l'invention concerne un procédé pour préparer ces composés. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux isopolypeptides d'acides diamino-monocarboxyliques représentés par la formule générale (1) : R R6 R /R H HIN-C C C C CO OH I t1\ I I,, R15' R t / 14H; RN/n R dans laquelle R4, R5, R7, F, R, et R10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Cl1_4 (par la suite alkyle inférieur), r est une valeur moyenne entre 10 et 400, à est un entier de O à 10, et n est un entier de 0 à 10. La signification des substituants correspondants dans les membres individuels peut être identique ou différente. On sait que les isopolypeptides d'acides diamino- monocarboxyliques apparaissent rarement dans la nature: dans certains antibiotiques peptidiques, dans la paroi cellulaire des bactérles, dans la réticulation de plusieurs protéines et dans les clavicépamines. Certains d'entre eux présentent un effet biologique et peuvent être produits par des méthodes microbiologiques également. Selon des recherches japonaises, un polymère de L-lysine consistant en 25 à 30 unités monomeères associées les unes aux autres par des liaisons isopeptides est produit par 2622 1 9 5 Streptomyces albulus [Shima et Sakai: Rgric. Biol. Che". 45, 2503 (1981)]. Cette poly-e-L-lysine inactive divers bactériophages [Shima et col.: Rgric. Biol. Che. i46, 1917 (1982)] et un moyen biosynthétique a été appliqué pour sa production [Sima et coll.: Nippon Nogekagaku Kaishi 57, 221-226 (1983)]. Les clavicépamines sont des protéines de base riches en lysine isolées à partir de la culture saprophyte de l'ergot (Claviceps purpurea) et ayant une importance pharmocologique humaine. Ces protéines pouvaient être fractionnées en composés de PM 2.000-17.000 D avec une forte teneur en lysine comprise entre 30 et 95%. Des études biologiques ont montré qu'elles ont un effet retardateur sur la prolifération cellulaire, si bien que ces produits inhibent la croissance de tumeurs animales, pratiquement sans effets secondaires toxiques (Tyihak: Dissertation, 1978). R partir des déterminations de structure, il a été démontré que des (poly) peptides de e-lysine sont les unités structurelles fondamentales des clavicépamines [Szokan, Kelemen et T6rôk: J. Chromatogr. 366, 283 (1986)]. On ne connait pas encore le rôle des unités structurelles de polylsolysine dans l'effet biologique prometteur des clavicépamines. L'activité antivirale des poly-L-isolysines de synthèse, de leurs dérivés acylés avec des aminoacides, et de l'acide poly-p-L--x,pdiaminopropionique a été mesurée par des chercheurs indiens. On a trouvé que l'activité antivirale de ces polypeptides est associée à leur aptitude à induire des facteurs antiviraux ressemblant à l'interféron dans des cultures CRA [Indian J. Exper. Biology 20, 227 (1982); Indian J. Chem 218, 483 (1982)]. Pour étudier la relation entre la structure chimique et l'effet biologique, l'invention a eu pour but de produire des isopeptides d'acides L-diamino-monocarboxyliques, ayant des PM donnés et une faible polydispersion, consistant en 10 à 400 unités, à l'échelle industrielle également. On a aussi besoin que les produits créés aient une pureté élevée, une faible polydispersion et une grande pureté stéréochimique. Il est bien connu que l'effet des biopolymères est 2622 1 9 5 fortement influencé par la distribution de leur poids moléculaire. La configuration des aminoacides est très importante parce que les différents isomères optiques peuvent avoir des effets biologiques opposés et tout-à-fait autres; par exemple, la croissance d'une tumeur animale est inhibée par la D-arginine, -et elle stimulée par la L-arginine [Szende et Tyihak: Lancet 7546, 624 (1968); Szende: Dissertation, 1974]. Des mélanges racémiques ou des polymères racémisés ne présentent pas les intéressants effets biologiques d'origine. Ces polypeptides devaient présenter ô la fois une haute pureté et une faible polydispersion. La méthode synthétique a été choisie pour résoudre ce problème. On a polymérisé un ester actif de lysine -Z-protégée (OPcp) selon la méthode de Hull [Biopolymgers 17, 2427 (1978)] et un ester pentachlorophénylique de lysine o.-BOC-protégée selon le procède de Gangopadhyay et Mathur [Indian J. Chem. 218, 483 (1982). Selon la méthode de Nishi [Int. J. Biol. Macromol. 2, 53 (1980)], I'c-Z-Lys-OH a été polymérisé par le diphénylphosphorylazide (DPPA). Les auteurs des articles précédents n'ont publié aucune donnée concernant le PM, la distribution de PM et la pureté optique de leurs produits. Les expériences de la Demanderesse ont montré qu'on n'obtenait que des produits de faible PM (maximum de 2500) et de haute polydispersion avec des rendements bas, sans effet biologique. Les méthodes synthétiques de Kushawa et coll. [Biopolymers 19, 219 (1980)] et de Mathur et col. [Int. J. Peptide Prot. Res. 17, 189 (1981)] semblaient les plus aptes à fournir des produits de faible dispersion. Ils ont synthétisé une c-poly-lysine et. une &-poly-ornithine. Le principe de la méthode était le mème pour les deux composants: on faisait réagir l'ester méthylique d'un aminoacide protégé avec un ester actif protégé ou un azide, pour obtenir d'abord un ester méthylique de tripeptide. Après hydrolyse alcaline, le tripeptide-acide était activé en une forme ester active (il était transformé en son ester pentachlorophénylique). Rprès déprotection du groupe w-amino terminal, le tripeptide était prêt et actif pour une polycondensation. Enfin, les groupes -amino 2622 1 9 5 protecteurs étaient éliminés et l'isopeptide isolé. Dans ces procédures, on utilisait des groupes amino protecteurs BOC en position a et Z en position w. Leur élimination était effectuée par traitement avec un acide fort et par hydrogénation catalytique respectivement. Dans les publications ci-dessus, les polymères ne sont pas caractérisés par un PM, une distribution de PM ou des données de pureté optique. On a utilisé les abréviations recommandées par la Commission IUPRC-IUB sur la Nomenclature Biochimique, J. Biol. l1 Chem. 247, 977 (1972), ainsi que quelques autres noms, dont certains sont indiqués ci-après: Z benzyloxycarbonyle BOC t-butoxycarbonyle -ONp pnitrophényle -OSn N-nitro-succinimidyle -OPcp pentachlorophényle -OPfp pentafluorophényle -OBt N-hydroxy-benzotriazolyle BuOCO isobutyloxycarbonyle EtOCO éthyloxycarbonyle N3 azido EEDQ Néthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroisoquinoléine EtORc acétate d'éthyle IIDQ N-isobutoxycarbonygi-2-isobutoxy-1,2-dihydroisoquinoléine THF tétrahydrofuranne DMF diméthylformamide HPLC chromatographie liquide haute performance OPTLC chromatographle sur couche mince ô surpression IEF électrofocalisation SM spectrométrie de masse RMN spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ZC02 groupe Z mesuré à partir du C02 libéré PM poids moléculaire TLC chromatographie sur couche mince 2622 1 95 DuOH butanol RcOH acide acétique. On a observé et expérimenté plusieurs inconvénients en reproduisant ces procédés: - pour préparer des oligomères, on protégeait toujours leurs groupes carboxy par un ester méthylique, si bien que I'oligomère obtenu n'était pas directement utilisable pour une polycondensation. Pour obtenir un intermédiaire actif, il fallait libérer le groupe carboxy en soumettant l'ester méthylique correspondant à une hydrolyse alcaline. Cette étape aboutit à une racémisation et à d'autres réactions secondaires, ce qui diminue le rendement. Malheureusement, les polymères synthétisés présentaient aussi un polydispersion élevée. De plus, l'application d'un groupe protecteur benzyloxycarbonyle pour une fonction w-amino était désavantageuse en raison de son élimination par hydrogénation catalytique. Malheureusement, les polymères ainsi préparés étaient inefficaces dans les tests biologiques de la Demanderesse. L'invention a pour but d'éliminer les inconvénients mentionnés plus haut par la mise au point d'un nouveau procédé, qui n'a jamais été appliqué dans la production d'isopeptides d'acides diamino-monocarboxyliques. L'invention repose sur la constation selon laquelle le but ci-dessus peut être atteint si des oligomères actifs directement applicables pour une polycondensation sont d'abord préparés dans un procédé, dans lequel les groupes carboxy sont protégés par des groupes esters actifs et le couplage des peptides est effectué à une vitesse beaucoup grande que l'aminolyse du groupe ester actif protecteur. Cette méthode de couplage fournit un degré d'activation supérieur à celui de la méthode à l'ester actif. On a constaté que la méthode d'activation par 'dégagement' est bien applicable pour préparer des isopeptides et des sels consistant en acides diaminocarboxyliques. Il convient d'utiliser un ester p-nitrophénylique pour la protection temporaire et l'activation simultanée des groupes COOH, et la méthode à l'anhydride mixte pour 2622 1 9 5 le couplage des peptides, avec une protection par BOC pour les groupes amino dans les dernières liaisons amide et avec un groupe Z pour des groupes aoino ne prenant pas part à la réaction. On a établi que de cette fa9on, on peut synthétiser des homo-isopeptides ou des isopeptides en séquence d'un quelconque acide diamino-carboxylique. De plus, on a trouvé que des isopeptides de faible dispersion peuvent être obtenus de fa9on reproductible avec des Pi entre de larges limites. Les produits intermédiaires et finaux sont des substances bien cristallisables de haute pureté et ils peuvent être facilement isolés. De plus, I'invention repose sur la constatation selon laquelle les esters p-nitrophényliques sont les groupes les plus favorables pour une protection temporaire et une activation simultanée des groupes carboxy dans le cas des acides diaminocarboxyliques, la méthode à l'anhydride mixte est optimale ici pour le couplage peptidique, et des groupes Z et BOC peuvent être choisis pour la protection des autres. Enfin, l'invention repose sur la constatation selon laquelle les homoisopeptides ou les isopeptides en séquence d'un quelconque acide diaminomonocarboxylique peuvent être synthétisés par le procédé ci-dessus sans racémisation, c'est-à-dire avec conservation de leur configuration. A partir de ce qui précède, I'invention concerne des isopolypeptides, leurs sels, leurs isomères optiques et leurs racémates ayant la formule générale (1), dans laquelle les substituants sont tels que définis plus haut. Selon la présente invention, les composés de formule générale (1) et leurs sels, sont préparés par couplage d'un monomère ou d'un oligomère de formule générale (1) 4 6 1 R5 R7ln NRR n (z 7 9 L - 21HR q 2622 1 9 5 - dans laquelle q = 1 à 9, R1 est un groupe amino protecteur (dans des oligomères, tous les R1 sont les mêmes), R3 est un groupe ester actif pour des groupes carboxy convenable pour la protection et l'activation simultanée, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, a et n sont tels que définis plus haut - avec un monomeère de formule générale (111) R4 /R \i R/R8\ R2 1(1_ C m- A,7Ox - dans laquelle R2 est un groupe amino protecteur différent de R1, qui peut être éliminé sélectivement par rapport à R1, X est un groupe activant la fonction carboxy à condition que le groupe -COX soit plus actif que le groupe COOR3, R1, R4, R5, R6, R7, RI, R9, R10iO met n sont tels que définis plus haut. Le groupe protecteur R2 est enlevé a partir du composé de formule générale (Iv) ainsi obtenu R4R R /R 2 1 1 10 1R. R, HN.. - CO OR R 15V7 1 V1OR (IV) 7 R R 1NHR R - dans laquelle les substituants sont tels que définis plus haut et s est un entier de 2 à 10 - puis, si s i 9, le composé résultant 2 6 2 2 1 9 5 est traité avec un composé de formule générale (111) ou il est polycondensé de façon connue. Les groupes protecteurs R1 sont ensuite enlevés des produits. Si le composé obtenu de formule générale (1) est sous la forme de base libre, il peut être transformé en un sel acceptable du point de vue pharmaceutique, ou s'il est un sel, il peut être transformé en une base libre ou en un autre sel. On peut préparer des isomères optiques en utilisant les isomères correspondants comme substances de départ. Si des polymères racémiques doivent être préparés, les racémates des monomères doivent être utilisés comme matières de départ. Dans le procédé de l'invention, R1 et R2 sont des groupes protecteurs pouvant être éliminés de façon sélective, bien connus dans la chimie des peptides. R1 est de préférence un groupe benzyloxycarbonyle (Z) et R2 est de préférence un groupe t-butyloxycarbonyle (BOC). Le groupe -OR3 est un groupe ester actif servant à la fois à la protection et à l'activation, par exemple -ONp, -OSn, -OPcp, -OPfp, -0Bt; X peut être BuiOCO-, EtOCO-, N3, -OSn, -OPcp, -OPfp, en fonction des conditions de réaction et de la signification de R3, par exemple il est un groupe BuiOCO-, EtOCO. Selon le mode de réalisation le plus avantageux de la présente invention, dans le monomère de formule générale (11) utilisé comme matière de départ, R1 est Z, R2 est BOC et R3 est -ONp. Le groupe BOC est éliminé par acidolyse, puis l'acide diaminocarboxylique protégé (R1 = Z, R2 = BOC) est couplé selon la méthode à l'anhydride mixte. Après élimination du groupe protecteur BOC, le dipeptide ainsi obtenu est polycondensé ou il est couplé à nouveau avec l'aminoacide protégé suivant tel que ci-dessus, les étapes étant répétées jusqu'à obtention d'un décapeptide. La meilleure méthode consiste à répéter les couplages jusqu'au tripeptide et à transformer l'oligomère obtenu directement convenable pour la polycondensation, en isopolypeptide ayant le nombre de résidus aminoacides prévu. L'élimination du groupe protecteur Z (c'est-à-dire la déprotection) est de préférence réalisée par HBr dans l'acide acétique, et le produit final est 2622 1 9 5 isolé Les conditions de la procédure la plus avantageuse de la méthode de couplage à l'anhydride mixte sont les suivantes: a) solvant: acétonitrile, THF, DMF, dichiorométhane; b) réactif formant l'anhydride: chloroformate d'éthyle, chloroformate d'isobutyle, EEDQ, IIDQ; base tertiaire: triéthylamine, diisopropyl-éthylamine, N-méthyl-morpholine; c) temps d'activation et température: 10 à 30 minutes, entre -10 C et -20 C; d) neutralisation du sel du composant amino: avec la triéthylamine ou la diisopropyl- éthylamine dans le mélange réactionnel. Rendement en produits finaux purs: 60 à 0%X. R la fois les homo-isopolypeptides et des isopeptides en séquence peuvent être préparés par le procédé de l'invention. On a utilisé des techniques de séparation actuelles, comme HPLP, OPTLC, IEF et des méthodes de détermination de structure comme IR, SM, RMN, pour analyser les isopeptides préparés. Les produits étudiés et les témoins ont mis les structures en évidence. Les substances purifiées de la façon décrite dans les exemples ont été utilisées pour l'étude des activités biologiques. La purification a été effectuée par précipitation, chromatographie sur colonne et sur gel. R partir des études biologiques, on a trouvé que parmi les poly-Lisolysines (degré de polymérisation (dip.) de 10-400) préparées par le procédé de l'invention, les polymères ayant un d.p. de 40 à 200 (Pl 5.500 - 20.300 D) présentent un effet retardateur sur la prolifération cellulaire, c'est-à-dire une activité anti-tumeur in vitro et in vivo, et ils inhibent la formation des métastases tumorales. Les produits ayant un PM de 10.200 à 15.400 D (d.p. de 80 à 120) ont la plus forte acivité. On a trouvé que les autres substances préparées jusqu'à maintenent étaient inefficaces, principalement en raison d'une forte 2622 1 9 5 1O polydispersion des produits finaux et d'une racémisation pendant la production dans les méthodes de Kushawa ou de Mathur. On a constaté que les poly-L-lysines ayant un d.p. de à 120 produites par la méthode de Kushawa ou de Hull, ne présentent pas d'activité antivirale. Les principaux avantages de la synthèse de la présente invention par rapport aux procédures connues, sont les suivants: - Des produits ayant un effet biologique prometteur peuvent être obtenus avec une forte reproductibilité. - Des oligomères directement applicables pour la polycondensation peuvent être obtenus, si bien que l'étape d'hydrolyse mentionnée plus haut est éliminée et que la racémisation qui est très dangereuse du point de vue de l'effet biologique, peut être évitée. - Des produits ayant une distribution de PM favorable (c'est-a-dire une faible polydispersion) peuvent être obtenus entre de larges limites de PM, ce qui est aussi avantageux pour avoir l'effet biologique désiré (par exemple dans le cas du polymère SZTP-14 PM: 12.700 200; polydispersion: 3,7). Les rendements sont supérieurs, la pureté des produits intermédiaires et finaux est plus grande. Ces deux substances sont bien cristallisables et elles peuvent être facilement isolées, La reproduction des étapes ne pose pas de difficultés. - Les étapes de couplage des peptides requièrent de durées de réaction plus courtes. - La déprotection par hydrogénation catalytique peut être éliminée par la combinaison selon l'invention des groupes aminoprotecteurs. Ceci implique d'autres avantages dans la production à l'échelle industrielle. - Le plus grand avantage du procédé de l'invention est la réalisation des étapes de réaction sans racémisation. Comme cela a été mentionné plus haut, les produits obtenus jusqu'à maintenant sesont révélés inefficaces dans les tests effectués par la Demanderesse. D'un autre côté, des polymères synthétisés par le procédé de l'invention présentent des activités biologiques très prometteuses. 2622 1 9 5 1 1 Parmi les composés de formule générale (I) préparés selon le procédé de l'invention, les composés suivants dans lesquels les substituants sont tels que définis ci-après, sont nouveaux: R4, R5, R6, R7 et R10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 10 à 400, a est 0, 1, 2 ou 3, et n est O. Dans un groupe de composés avantageux: R4, R5, R6, R7 et R10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 40 à 200, à est 3, et n est O. Dans un autre groupe de composés avantageux: R4, R5, R6, R7 et R10 représentent chacun un atome d'hydrogène, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 80 à 120, a est 3, et n est O. Dans un autre groupe de composés avantageux: R4, R5, R6, R7 et RO10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 10 à 120, 262 2 1 95 à est 2, et n est O. Dans un autre groupe de composés avantageux: R4, R5, R6, R7 et R10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 10 à 400, à est 1, et n est 0. Dans un groupe d'autres composés avantageux: R4, R5, et R10 représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, R6, R7, R8 et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 10 à 400, m et n ont la valeur 0. Les stéréoisomères L des isopolypeptides de formule générale (1) et leurs sels se sont révélés très efficaces contre des tumeurs et des infections virales. L'activité biologique des polyisolysines préparées par le procédé de l'invention a été étudiée in vitro et in vivo. Les activités prometteuses sont mises en évidence dans la partie suivante. L'activité anti-tumeur a été mesurée sur des souches tumorales animales et l'activité antivirale a été étudiée contre des virus de végétaux. On a constaté que dans les expériences effectuées, les isopoly-L-lysines ayant un Pl de 5.500 à 25.600 avaient une activité surprenante, parmi lesquelles les composés ayant un Pl de 10.200 à 15.400 étaient les meilleurs. La substance SZTP-14 était la plus efficace dans les deux mesures. 2622 1 9 5 Elle a été caractérisée de la façon suivante: )?sp Uiscosité du polymère Z-protégé: = 31,92 cw3/g ZCO02: 16,8% (calc.), 16,3% (trouvée). Le polymère libre était disponible en tant que bromhydrate (HBr). Teneur en Br: 37,7% (calcI.), 36,8% (trouvée). R254 = 0 (c'est-à-dire pas d'absorption UV). Elle a été purifiée par précipitation dans l'alcool avec de l'éther. [f]20D = +32,4 (c = 2;' eau) Pl = 12.700 D 200. Etude de l'activité anti-tumeur L'effet des composés qui peuvent influencer la prolifération des cellules est généralement étudié in vitro avec des cultures cellulaires, et in vivo avec des tumeurs animales transplantables. Rinsi, les composés selon l'invention ont été testés sur une lignée de cellules d'érythroleucémie humaine (K-562, Karolinska Institut, Stockholm) et sur quatre tumeurs de souris transplantables (leucémie lymphoide L1210, tumeur dérivée du macrophage P380, carcinome d'Ehrlich, tumeur du poumon de Lewis). Dans le cas des tumeurs L1210 et P380 et du carcinome d'Ehrlich, la survie des animaux a été utilisée comme indicateur de l'effet. Dans le cas de la LLT, le nombre et la dimension des métastases ont été déterminés dans le poumon ou le foie de souris traitées et non-traitées. Les expériences ont été effectuées avec la solution d'injection suivante: 50 mg du composé dissous dans 10 mi de solution saline physiologique. Les composés étudiés ont été désignés comme suit: SZTP: polyiso-L-lysines produites par le procédé de l'invention SZTP-14: bromhydrate de polyiso-Llysine, Pl calculé sur des bases libres: 12.700 200, polydispersion: 3, 7 (moyenne en nombre/moyenne en poids) SZTP-15: bromhydrate de polyiso-Llysine, P' calculé sur des bases 26 2 2 1 9 5 libres: 11.600 200. SZTP-16: bromhydrate de polyiso-L-lysine, PM calculé sur des bases libres: 13.400 200. SZTP-17: bromhydrate de polyiso-L-lysine, PM calculé sur des bases libres: 14.500 200. SZTD: polyiso-L-ornithine produite par le procédé selon l'invention SZTD-18: bromhydrate de polyiso-L-ornithine, PM calculé sur des bases libres: 8.900 200. H-17: polyisolysine produite selon Hull et coil. K-17: polyisolysine produite selon Kushawa et coi. A-3: c-polylysine. Résumé des expériences sur la prolifération des cellules tumorales Les composés produits selon l'invention réduisaient in vitro en fonction de la dose, le nombre de cellules tumorales par rapport à celui du témoin. Cet effet se traduisait par une stagnation du nombre de cellules dans le cas des faibles doses, des doses élevées provoquant la mort des cellules. H-17 et K-17 étaient inefficaces et l'm-polylysine (R-3) ne provoquait qu'une stagnation du nombre de cellules. Selon les expériences in vivo de la Demanderesse, le traitement par SZTP se traduisait par la survie accrue des animaux traités. Dans le cas de la tumeur d'Ehrlich, le traitement a provoqué une très longue période sans tumeur et la croissance de la tumeur n'a été observée qu'après l'arrêt du traitement. Le traitement par SZTP a empêché complétement la formation de métastases dans le foie lorsque la tumeur a été inoculée dans la rate et a diminué le nombre et la dimension des métastases du poumon lorsque la tumeur était inoculée dans le muscle. En conséquence, les polyisolysines et les polyisoornithines produites selon l'invention se sont révélées être des inhibiteurs de la prolifération des cellules tumorales. Parmi ces composés, des poly-isolysines ont présenté un effet inhibiteur étonnamment fort. Cet effet peut être facilement comparé à l'effet produit par les meilleurs médicaments cytostatiques connus en ce qui concerne la survie des animaux. L'effet antimétastatique étonnamment bon des composés de l'invention est évident. Les composés de l'invention ont un avantage supplémentaire en ce qu'ils présentent une faible toxicité, qui est bien inférieure à celle des médicaments cytostatiques appliqués jusqu'à maintenant. Les études biologiques de la Demanderesse ont montré dose tolérable maximale par exemple que l'indice thérapeutique dose efficace minimale a une valeur supérieure à 10, alors que cette valeur est généralement bien en dessous de 10 dans le cas de la plupart des médicaments cytostatiques connus. On n'a observé aucune différence entre la réponse biologique des mâles et des femelles à ce propos, ce qui est aussi un avantage. Les données suivantes illustrent l'effet anti-tumeur. Expériences in vitro Les Tableaux la à lc montrent l'effet des polyisolysines produites par divers procédés, des polyisoornithines produites par le procédé de l'invention et de l'-polylysine sur la prolifération des cellules K-562. Les paramètres expérimentaux étaient les suivants: Cellules: la lignée de cellules d'érythroleucémie humaine K-562 (Karolinska Institute, Stockholm) a été utilisée. Nombre de cellules: 5x104/ml, dans des tubes à essais en verre contenant 5-6 mI de milieu. Hombre de sondes: 3 tubes à essais par dose. nilieu: Parkers n-199 complété avec 10%X de sérum bovin foetal (Flow Laboratories, Irvine, Scotland). Température, atmosphère: 37 C, 5% de C02 + 95% d'air. 2622 1 95 Dose: 1-10-100 pg/ml. Evaluation: comptage de cellules 24, 40, 72 et 96 heures après la dilution des cultures, avec une chambre de Buerker. Nombre d'expériences: 2/composé. Le Tableau la montre que des traitements par SZTP-14, SZTP-15, SZTP-16, SZTP-17 et SZTP-18, mais surtout SZTP-14, ont abouti à une notable inhibition dépendant de la dose, de la prolifération des cellules. Il est remarquable que même un traitement par 1 pg/ml a provoqué un effet antiprolifération bien défini. Le Tableau lb cependant montre qu'au contraire, H-17 et K-17 n'avaient pas d'influence sur la prolifération des cellules K-562. Le Tableau lc montre que l'-polylysine a provoqué la stagnation du nombre des cellules par rapport à ce qui est observé dans le témoin, mais qu'elle ne provoque pas de diminution du nombre de cellules même à une dose élevée (100 pg/ml). Les valeurs montrées dans les Tableaux indiquent le nombre de cellules évalué à des moments donnés dans le temps. Les cellules ont été comptées dans 3 tubes à essais pour chacune des doses et dans 3 tubes à essais à titre de témoin, à chaque moment dans le temps. Tableau la Il montre l'effet des composés préparés selon l'invention (SZTP-14-15-16-17-18) sur la lignée cellulaire K-562, in vitro. Traitement: 1-10-100 pg/mg, 24 heures après la dilution de la culture. Tabl eau la Nombre de cellules x 103/mel de liquide nutritif SZTP-14 48h 72h 96h 100 /ug/ml 0 0 0 /ug/ml 90 90 150 80 120 80 140 1 /ug/ml 80 170 180 180 190 120 150 Témoin 130 220 260 230 230 110 220 230 SZTP-15 /ug/ml 40 10 10 20 10 10 20 10 /ug/ml 80 100 160 120 110 100 140 1 /ug/mî 120 150 200 140 190 120 120 210 Témoin 140 210 270 190 250 190 280 Tableau la (suite) 48h 72h 96h SZTP-16 /ug/ml 100 160 160 120 120 140 140 140 /ug/ml 120 160 220 160 240 180 240 1 /ug/ml 140 180 260 210 280 240 250 Témoin 140 220 280 200 260 140 200 270 SZTP-17 /ug/Ml 110 180 200 190 210 200 200 10 /ug/ml 120 200 260 200 260 190 280 Témoin 150 260 280 210 280 130 210 260 Control 140 250 280 220 280 220 260 Tableau la (fin) 48h 72h 96h SZTP-18 /ug/ml 100 160 180 130 180 130 160 10 /ug/ml 120 180 220 160 230 190 230 1 1 1ug/Ml 140 200 280 210 260 220 280 Témoin- 140 220 280 Témoin 230 280 *230 270 Tableau lb Il montre l'effet d'un traitement par H-17 et K-17 sur la prolifération des cellules K-562 in vitro. Traitement: 1-10-100 pg/ml, 24 heures après la dilution de la culture. Tabl eau lb Nombre de cellules x 103/ml de liquide nutritif 48h 72h 96h H-17 /ug/m1 125 230 280 210 270 210 280 /ug/ml 120 220 290 240 280 210 220 1 /ug/mî 130 240 290 240 290 220 270 K-17 100 /ug/ml 120 220 280 210 290 220 270 /ug/ml 125 240 290 240 290 210 270 1 /ug/ml 140 240 290 220 280 230 280 Témoin 120 210 290 200 280 120 220 285 Tableau lc Il montre l'effet d'un traitement par R-3 sur la lignée cellulaire K-562, in vitro. Traitement: 1-10-100 pg/mg, 24 heures après la dilution de la culture. Tableau 1l Nombre de cellules x 103/ml de liquide nutritif 48h 72h 96h /ug/ml 110 110 100 120 110 100 120 110 /ug/ml 130 120 120 110 110 120 120 110 1 /ug/ml 110 110 100 110 110 120 110 Témoin 120 250 300 240 290 125 240 290 Etudes in vivo a) Tumeur L1210, étude de SZTP-14 Origine de la tumeur: Chester Beatty Institute, Londres. Souche animale: DBR/2 consanguine, élevage personnel. Poids et sexe des animaux: 20-23 g, femelles, 5 animaux par groupe. Nombre de cellules tumorales: 105 par animal, par voie intrapéritonéale. Traitement: 50 mg/kg, par voie intrapéritonéale, 24 heures après l'inoculation de la tumeur, une fois par jour pendant 8 jours. Groupe témoin: solution saline physiologique, 0,2 ml, par voie intrapéritonéale. Evaluation: survie des animaux. Résultats: comme le montre le Tableau 2, la survie des animaux traités dépassait celle des témoins. Dix jours après l'inoculation de la tumeur, aucune souris du groupe témoin n'était en vie. En même temps, tous les animaux traités étaient en vie. Le premier animal traité mourait 13 jours et le dernier 15 jours après I'inoculation de la tumeur. Tableau 2 Effet d'un traitement quotidien à raison de 50 mg/kg sur la survie de souris DBR/2 inoculées avec une tumeur L1210 Jours après inoculation Témoins vivants Souris traitées vivantes 9 3 5 - 5 11 - 5 12 - 5 13 - 4 14 - - 3 - 2622 1 95 b) Tumeur ascitique P-366, traitement avec SZTP-14 Souche animale: hybride BDF/1, élevage personnel. Poids et sexe des animaux: 20-23 g, mâles, 5 souris par groupe. Nombre de cellules tumorales: 2,8xl06 par animal, par voie intrapéritonéale. Traitement: 10 mg/kg, par voie intrapéritonéale, il a commencé 24 heures après l'inoculation de la tumeur, une fois par jour. Groupe témoin: 0,2 mi de solution saline physiologique, une fois par jour, par voie intrapéritonéale. Evaluation: survie des animaux. Résultats: le Tableau 3 montre le nombre d'animaux survivants. Toutes les souris traitées ont survéçu aux animaux du groupe témoin. Tableau 3 Effet d'un traitement quotidien avec 10 mg/kg de SZTP-14 sur la survie des souris BDF/1 inoculées avec une tumeur ascitique P-388 Jours après inoculation Témoins vivants Souris traitées vivantes 9 4 5 10 - 5 ll - 5 12 - 5 13 - 5 14 - 5 15 - 16 - 2 17 - 1 2622 1 9 5 c) Tumeur ascitique d'Ehrlich, traitement avec SZTP-14 Souche animale: suisse, non consanguine, élevage personnel. Poids et sexe des animaux: 20 9, 5 mâles et 5 femelles par groupe. Nombre de cellules tumorales: 106 par animal. Traitement: 50 mg/kg et 75 mg/kg, par voie intrapéritonéale, il a commencé 24 heures après l'inoculation de la tumeur, une fois par jour pendant 20 jours. Groupe témoin: 0,2 ai de solution saline physiologique, par voie intrapéritonéale. Evaluation: mesure du poids corporel, tous les jours de survie. Les animaux vivants 55 après l'inoculation de la tumeur ont été tués, autopsiés, la quantité d'ascites a été mesurée et la formation d'une tumeur solide dans la cavité péritonéale a été enregistrée. Résultats: Le Tableau 4 montre le poids corporel des souris à partir du 16ème jour suivant l'inoculation de la tumeur. Les animaux du groupe témoin mouraient entre le 17ème et le 22ème jour. L'excès de poids indique la formation d'ascites tumorales. Dans chaque groupe traité, les animaux étaient vivants (à l'exception d'un par groupe) 55 jours après l'inoculation de la tumeur, Les animaux ont été tués ensuite. Le Tableau 5 montre la quantité d'ascites et la présence de tumeur solide dans la cavité péritonéale. Ceci signifie qu'on n'a trouvé aucun animal dépourvu de tumeur, mais sur souris traitées, 16 étaient vivantes 33 jours après la mort de la dernière souris du groupe témoin. 2622 1 95 Tableau 4 Effet d'un traitement intrapéritonéal par 50 mg/kg et 75 mg/kg de SZTP-14 (pendant 20 jours) sur le poids corporel et la survie de souris suisses males et femelles inoculées avec une tumeur ascitique d'Ehrlich. Poids corporel avant l'inoculation de la tumeur: 20 g. 0 = mort en raison de la tumeur; + = mort pour d'autres raisons. Jour après inoculation Témoin Témoin o 75 mg/kg de tumeur 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 16. 43 37 41 46 40 40 34 40 35 41 17 22 24 21 22 17. 44 39 42 46 41 40 35 0 35 42 17 23 24 25 22 18. 45 42 43 47 49 42 35 0 35 43 18 23 24 21 24 19. 0 43 43 50 0 0 36 0 0 44 19 23 24 21 24 20. 0 46 0 42 0 0 42 0 0 46 16 21 23 20 21 21. 0 46 0 43 0 47 0 047 18 23 25 25 22 22. 0 0 0 0 0 0 000 0 51 19 25 26 25 24 24. 0 0 0 00 0 0 0 0 0 1924262425 25. 20 24 26 24 26 26. 20 24 27 24 25.5 27. 21 25 28 25 26 28. 21 25 28 25 26 29. 21 25 28 25 26 33. 22 25 28 25 26 34. 22 25 28 25 26 42. 23 26 27 25 28 50. 24 27 27 25 28 55. 26 29 0 27 32 Tableau 4 (fin) Jour après inoculation 75 mg/kg c? 50 mg/kg 50 mg/kg o de tumeur 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 16. 28 23 28 25 29 18 19 22 23 + 29 30 31 26 27 17. 28 23 28 24 28 18 19 22 23 + 28 30 31 26 28 18. 29 24 27 25 30 19 20 23 23 + 29 30 32 27 29 19. 29 24 28 26 30 20 20 23 23 + 29 30 32 28 29 20. 27 22 25 24 27 17 18 21 21 + 27 28 30 24 27 21. 29 23 27 27 29 18 18 22 22 + 27 30 29 25 27 22. 29 24 28 27 30 20 20 24 22 + 29 30 32 25 29 24. 29 25 29 28 31 2020 24 23 + 29 30 32 26 30 25. 30 26 30 29 31 21 21 24 24 + 30 30 32 26 31 26. 30 25 30 29 31 22 22 24 25 + 30 31 32 26 31 27. 30.526 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 32 25 32 28. 31 26 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 31 25 32 29. 31 26 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 32 26 32 33. 30 27 32 31 32 23 22 27 26 + 28 32 30 24 33 34. 30 27 32 31 32 23 22 30 26 + 28 32 30 24 33 42. 32 29 33 34 28 24 25 30 31 + 27 33 30 26 35 50. 34 30 35 37 24 24 26 30 36 0 34 30 26 36 55. 33 32 38 0 37 26 28 32 43 + 0 36 31 27 38 2622 1 9 5 Tableau 5 Rscites et tumeur solide dans la cavité péritonéale de souris suisses inoculées avec une tumeur ascitique d'Ehrlich, traitées avec 50 mg/kg et 75 mg/kg de SZTP-14 et tuées 55 jours après lI'inoculation de la tumeur. Traitement mg/kg 75 mg/kg 50 mg/kg 50 mg/kg Q 09 0 Rscites mli - - 0 - 4 1 6 - O- - 5 2 4 0 - 1 -4 0 Tumeur solide dans la cavité + + 0 + + +++ 0 + + + + O. + 0 abdominale O: l'animal mourait plus tôt +: tumeur solide dans la cavité abdominale. Inhibition des métastases tumorales avec SZTP-14 a) Tumeur du poumon de Lewis (LLT), inoculation dans la rate Souche animale: C57B1 consanguine, LRTI, Gôdôllo, Hongrie. Poids et sexe des animaux: 20 à 23 g, femelles (6 témoins et 4 traitées). Nombre de cellules tumorales: 5x106 cellules LLT inoculées dans la rate. Traitement: 75 mg/kg, pendant 8 jours, il a commencé 24 heures après l'inoculation de la tumeur. Evaluation: Les animaux ont été tués et les métastases du foie ont été dénombrées 9 jours après l'inoculation de la tumeur. Résultats: Le Tableau 6 montre le nombre de métastases. On n'a trouvé aucune métastase dans le foie après le traitement par SZTP-14. 2622 1 9 5 Tableau 6 Effet d'un traitement par SZTP-14 (75 mg/kg par voie intrapéritonéale pendant 8 jours) sur le nombre de métastases du foie chez des souris C57B1 inoculées avec LLT dans la rate Nombre de métastases du foie Témoin 31 20 63 36 38 56 (x = U0,66; s = 16,02; n = 6) SZTP-14 0 0 0 0 (n = 4) b) Tumeur du poumon de Lewis (LLT), inoculation dans le muscle de la cuisse droite Souche animale: C57B1 consanguine, LRTI, G6dôllo, Hongrie. Poids et sexe des animaux: 20 à 22 g, femelles. Nombre d'animaux: 5 par groupe. Nombre de cellules tumorales: 5x105 cellules/animal par voie intramusculaire dans les muscles de la cuisse du membre inférieur droit. Dix jours après l'inoculation de la tumeur, l'extrémité affectée de tumeurs a été enlevée. Rprès l'opération, entre le 11ème et le 17ème jour suivant l'inoculation de la tumeur, on a administré le traitement suivant: tous les jours 50 mg/kg de SZTP-14 par voie intrapéritonéale. Des témoins ont reçu 0,2 ml de solution saline physiologique tous les jours par voie intrapéritonéale, Evaluation: Les animaux ont été tués le 18ème jour suivant l'inoculation de la tumeur. Les nombre et volume moyens des métastases du poumon ont été déterminés au stéréomicroscope. Résultats: Le Tableau 7 montre les nombre et volume moyens des métastases du poumon. Le traitement par SZTP- 14 a réduit notablement les nombre et volume moyens des métastases du poumon. 2622 19 5 Tableau 7 Effet d'un traitement par SZTP-14 (50 mg/kg chaque jour, par voie intrapéritonéale entre les 11ème et 17ème jours après l'inoculation de la tumeur) sur les nombre et volume moyens de métastases du poumon chez des souris C7B1 inoculées par voie intramusculaire avec une tumeur du poumon de Lewis. Traitement Nombre de métastases Uolume des métastases en moyenne (mm3) en moyenne Témoin 63,13 + 27,53 49,45 29,07 SZTP-14 26,29 + 18,87 20,10 35,38 Démontration de l'effet antiviral Réduction dans la synthèse du virus de la mosaîque du tabac Des plants de tabac intacts (Nicotiana tabacum cv. Samsun), sensibles à I'infection par le virus de la mosaïque du tabac (TMU), ont été inoculés de façon mécanique. De la poudre de carborundum (dimension particulaire: 500 mesh) a été utilisée comme abrasif. L'inoculum contenait 200 pig de virus de la mosaïque du tabac purifié TMi (souche TMilU U1) dans du tampon au phosphate de Sôrensen 0,1 M (pH 7,2). Des feuilles intactes ont été traitées avec une solution de SZTP-14 en pulvérisation foliaire 3 jours après l'inoculation. Les traitements ont été répétés trois jours consécutifs. La gravité des symptômes a été évaluée deux semaines après l'inoculation. Des échantillons de feuilles ont été aussi prélevés Il jours après l'inoculation à partir de toutes les séquences de feuilles des plants inoculés, c'est-à-dire de feuilles de différentes hauteurs et d'âge varié. La concentration en virus a été mesurée à partir d'un gramme des échantillons congelés. Des échantillons de feuilles ont été homogénéisés dans 4 mi de tampon au phosphate (pH 7,2), puis centrifugés dans une centrifugeuse Eppendorf (environ 10.000 tpm 2622 1 9 5 pendant 5 minutes). On a utilisé 15 pl de surnageant pour des mesures quantitatives. Une immunoélectrophorèse à fusées a été employée pour l'estimation de la teneur en virus avec des sérums anti-TlU (U1) spécifiques (1 pl d'immunoglobuline/1 cm). Du tampon au barbiturate de sodium (0,2 M, pH 6,6) a été utilisé comme tampon courant, La teneur en virus a été calculée à partir de la hauteur des pics de précipitation, avec une courbe d'étalonnage standard. Tableau 8 Exemple pour l'estimation de l'effet antiviral Traitement par SZTP-14 Teneur en virus mg/I 11 mg/ml 20 mg/I 24,6 mg/ml 2 mg/1 29,3 mg/ml Témoin 51,3 mg/ml Les isopolypeptides selon l'invention sous la forme de la base libre et des sels non-toxiques, peuvent être utilisés dans des préparations pharmaceutiques en tant que substances efficaces. R ce propos, ils sont mélangés à des supports et des agents auxiliaires couramment utilisés dans l'industrie pharmaceutique et ils sont donc transformés en produits pharmaceutiques. De plus, les composés selon l'invention peuvent être mis en oeuvre à la fois sous la forme de base libre et de sel pour augmenter la résistance des plantes à l'infection virale, après mélange avec des agents auxiliaires couramment utilisés dans la protection des végétaux. Les sels qui sont acceptables en pharmacie, sont par exemple des sels d'addition acides comme un chlorhydrate, un bromhydrate, un iodhydrate, un sulfate, un phosphate, un nitrate, un oxalate, un fumarate, un gluconate, un tartrate, un maléate, un acétate, un citrate, un benzoate, un ascorbate, un lactate, un alginate, etc. Les produits pharmaceutiques contenant les composés selon l'invention comme agents actifs, peuvent être des solutions injectables, des comprimés, des dragées, des suppositoires, des suspensions, des solutions à boire, des mélanges pulvérulents, etc. La quantité efficace du point de vue pharmaceutique des composés selon l'invention dépend du mode d'application et de l'état du malade. En général, une dose quotidienne de 0,02-20 mg/kg de poids corporel est administrée en doses réparties en 2 à 4 prises par jour. Les doses sont supérieures dans le cas d'une administration orale. Des formes avantageuses de médicament sont les solutions à injecter qui peuvent être administrées par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire. Pour préparer des solutions injectables, on utilise une solution de NaCI isotonique, éventuellement avec un tampon au phosphate, un stabilisant à I'acide ascorbique, etc. Les substances actives peuvent être adminitrées sous forme de préparations médicamenteuses solides et liquides. Dans le cas de formes liquides, on peut ajouter des agents édulcorants et/ou des parfums. Des unités solides avantageuses à administrer par voie orale sont par exemple des comprimés, des dragées et des capsules. Pour préparer ces produits, on mélange l'agent actif avec des supports pharmaceutiques et on presse le mélange en comprimés, on le transforme en dragées ou on l'introduit dans des capsules. Les additifs et agents de remplissage classiques sont utilisés comme supports, par exemple le lactose, le stéarate de magnésium, le saccharose, le talc, I'acide stéarique, la gélatine, I'agar-agar, la pectine, la gomme adragante, le gel de silice colloïdal, I'amidon de mais, I'acide algénique, etc. Le beurre de cacao est avantageusement employé pour préparer des suppositoires. Le traitement des plantes est commodément effectué par transformation des composés selon l'invention avec des agents auxiliaires usuels, comme des matières humidifiantes et des supports solides, de préférence le kaolin, en préparations solides ou liquides, de préférence en association avec d'autres substances 2622 1 9 5 actives. On prépare une solution ou une suspension contenant le composé selon l'invention à une concentration de 1 à 50 ppm à partir de la préparation ainsi obtenue, et on l'applique de façon connue à des plantes, de préférence à raison de 0,5 à 5 g/ha. L'invention est davantage illustrée en référence aux exemples non-limitatifs suivants. EXEMPLE 1 Bromhydrate de poly-L-lysine a) Chlorhydrate de l'ester p-nitrophénylique de N-a -benzyloxycarbonyl-L-lysine. On a dissous 10 g d'ester p-nitrophénylique de N-a- benzyloxycarbonyl -(N-E-ter-butyloxycarbonyl) -L-lysine dans 40 ml d'acide trifluoroacétique et ajouté une quantité équivalente de HCI 2N dans EtOAc. Rprès un repos d'une heure à la température ambiante, la solution a été évaporée sous vide à un volume moitié, puis de l'éther a été ajouté et la solution a été cristallisée. Rendement: 8,3 g (96,06X); p.f. 83-86 6C; TLC Rf = 0,68 (n-butanol-acide acétique-eau 4:1:1). b) Ester p-nitrophénilique de N-a-benzyloxycarbonyl-N-ú- (N'-a-benzyloxycarbonyl-N'-s-ter-butyloxycarbonyl -L- lysil)-L-lysine On a dissous 7,69 g (20 moles) de N-a- benzyloxycarbonyl- (N-e-ter- butyloxycarbonyl) -L- lysine dans de I'acétonitrile absolu. On a ajouté goutte-a-goutte 2,8 mi (20 mmoles) de triéthylamine et ensuite 2, 8 ml de chloroformate d'isobutyle, sous agitation vigoureuse. Après 20 minutes d'activation, on a ajouté 9 g du sel de l'étape a), puis goutte-àgoutte une solution froide de 2,8 mli de triéthylamine dans 5 ml d'acétonitrile. L'agitation a été poursuivie pendant 2 heures à -10 C. Le mélange a été dilué avec 300 si de HCI 0,5 M. Le produit solide a été collecté, séché et recristallisé à partir d'un mélange 1:1 d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole. Rendement: 12,9 g (89,02X); p.f,:128-131 C. Rnalyse: teneur en -ONp: 99,8X. TLC Rf = 0,64 (EtOAc-cyclohexane 3:1). Rf = 0,91 (n-butanol-acide 2622 1 9 5 acétique-eau 4:1-1); HPLC tr. = 8,8 min. (k' = 2,2); colonne: ODSHypersil-6 (125x4 ms); éluant: neOH-CH3CN-tampon de NaORc 0,02 M (pH 4) 40:30:30 en v/v; débit: 1 ml/minute; détection: UU 254 nm. 0c) Chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique de h- c-benzyloxycarbonyl-N-ú- (N '-ac-benzylocarbonyl-L-lysine) - L-lysine On a préparé 10,25 g du sel à partir de 10,5 g d'ester p-n i trophényl ique de N-a-benzylocarbonyl-N-s- (N'-t- benzyloxy- carbonyl-N' -c-ter-butyloxycarbonyl-L-lysil)-L-lysine selon la procédure de l'étape a). P.f.: 109-113 C. TLC Rf = 0,70 (n-BuOH-RcOH-eau 4:1:1). d) Ester p-nitrophényl ique de N-e-ter-butyloxy- carbony I -t r i-N-c-benzyloxycarbonyl-L-lysine) On a transformé 5,71 g (15 &moles) de N-a-benzyloxy- carbonyl -( -s-ter-butyloxycarbonyl)-L-lysine en anhydrile mixte selon la procédure de l'étape b), avec de la triéthylamine, du chloroformate d'isobutyle dans de l'acétonitrile. On a ajouté 10,5 g de chlorhydrate de I 'ester p-nitrophénylique de N-a- benzyloxycarbonyl-N-E- (N'-a-benzylocarbonyl- L-lysil) -L- I ysine en présence de triéthylamine. On a préparé 13,9 g de produit (85,4%X) selon la procédure de l'étape b). Il a été cristallisé à partir d'acétonitrile et d'éther. P.f.: 145-150 C. Analyse: teneur en ONp 99,6%; TLC Rf = 0,98 (n-BuOH-RcOH-eau 4:1:1); HPLC tr. = 18,2 min. (k' = 8,1); colonne: ODSHypersil-6 (125x4 mm); éluant: MeOH-CH3CN-tampon de NaORc 0,02 M (pH 4) 40:30:30 en v/v; débit: 1 ml/minute; détection: UU 254 nm. e) Chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique de tri-(N- a-benzyloxycarbonyl-L-lysine) On a traité 12,2 g d'ester préparé dans l'étape d) selon la procédure de l'étape a). On a ainsi obtenu 12,1 g (95, 4X) du sel; p.f.: 108-125 C. TLC Rf = 0,71 (n-BuOH-RcOH-eau 4:1:1). f) Pol y--N-- benzyloxycarbonyl-L-lysine On a condensé 23 g (24 muoles) de chlorhydrate d'ester P-nitrophénylique de tri-(N-a-benzyloxycarbonyl-Llysine) dans 60 ml 26 2 2 1 95 de diméthylsulfoxyde, en présence de 4,5 ml de triéthylamine jusqu'à formation d'un gel. On a isolé le polymère en le versant dans une solution aqueuse de Ha2CO3 à 5%. Rendement: 16,8 g (89,6%). Rnalyse: ZC02: 16,8% (calc.), 16,3% (trouvée); [qsp]/ = 31,92 cm3/g (c = 4,95 g/l, acide dichloroacétique). g) Brothydrate de poly-c-L-lysine On a dissous 16 g du polymère protégé de l'étape f) dans 100 al d'acide trifluoroacétique et ajouté 100 al de HBr 4N/RcOH. Le produit final a été précipité dans de l'éther. Rendement: 14,7 g (91,6%). Analyse: Br: 37,7% (calc.), 36,8% (trouvée); R251 ne = O. Chromatographie sur papier: W1 23x62, éluant: n-BuOH-AcOHPyr.-eau 30:6:24:20. Rendement en résumé: 36,82% (à partir du monomère protégé); 18,85% (à partir de la lysine libre). PM = 5.500 - 20.300 3. h) Purification du produit final brut On a dissous 250 g du polymère obtenu dans l'étape g) dans de l'eau et on l'a ensuite chromatographié sur une colonne Sephadex G-50 (fine). Eluant: eau distillée, solution de NaCi à 0,9% ou solution de HCI 0,1 N. Détection pour does fractions (1 ml) à UV 220 nm. i) Purification du produit final brut On a dissous 2 g du bromhydrate de poly-e-L-lysine préparé dans l'étape g) dans 2 mi d'eau, puis ajouté 20 al d'éthanol. Le polymère a été précipité par 80 mI d'éther diéthylique. Après 24 heures de repos à 5 C, il a été filtré, lavé et séché. Rendement: 1,26 g (83%) (57,7% lorsqu'il est calculé pour le tripeptide protégé de départ). La substance ainsi obtenue est dénommée SZTP-14; PM = 12.700; [t]200 = +32,4 (c = 2; eau); polydispersion = 3,7. Les substances suivantes ont été préparées de façon analogue: SZTP-15 PM = 11.600 200 []20D = +31,9 SZTP-16 PM = 13.400 200 [x]20o = +32,6 SZTP-17 PM = 14.500 200 [1]20 = +32,1 EXEMPLE 2 Chlorhydrate de poly-c-L-lysine Une solution de 1 g du polymère préparé selon la procédure de l'exemple 1 dans 40 mi d'une solution de NaCI 2M, a été dialysée contre une solution de NaCI 2M, puis de l'eau. Après * lyophilisation, on a recueilli 0,85 g du polymère. EXEMPLE 3 Poly-c-L-lysine (base libre) Une colonne d'échange d'ion (40 al) a été préparée à partir d'une résine échangeuse d'anion Dowex 1-OH. La solution dans mI d'eau, de 1 g du polymère préparé selon la procédure de l'exemple 1, a été chromatographiée à un débit de 1 cm3/min. Les fractions ont été analysées, collectées et lyophilisées. On a isolé 0,65 9 de polymère. EXEMPLE 4 Bromhydrate de poly-e-D-lysine On a répété la procédure de l'exemple 1 à partir de 10 g de l'ester p-nitrophénylique de N-a-benzyloxycarbonyl- (N-s--ter-butyloxycarbonyl)-D-lysine. On a obtenu 1,3 g du polymère. PM = 86.900; [0]25D = -47,08 (c = 0,92; eau). EXEMPLE 5 Poly-6-L-ornithine On a répété la procédure de l'exemple I ô partir de 10 g de Il'ester p-nitrophény i que de N-a-benzyloxycarbonyl- (N-6-ter-butyloxycarbonyl)-L- ornithine et obtenu 7,9 g de chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique de N-a-benzyloxycarbonyl- L-ornithine. P.f.: 87-90 C. Ce sel a été couplé de la façon décrite dans l'étape lb) avec la N-a-benzyloxycarbonyl- (N-6-ter-butyloxycarbonyl)-L-ornithine et a donné un dipeptide, l'ester p-nitrcphénylique de N-a-Z-N-6-(N'-a-Z-N'-6-ter-butyloxy- carbonyl-L-ornithyl)-L-ornithine (12,1 g); p.f.:133-136 C. En répétant l'étape la) à partir du dipeptide, on a préparé le 2622 1 9 5 chl orhydrate de l'ester p-nitophénylique de N-a-Z-N-6-(N'-a-ZN'-6- L-ornithyl)-L-ornithine (11,99 g; p.f.:115-119 C), à partir duque I l'ester p-nitrophénilique de N-6-Boe-tri(N-c-Z-L-ornithine) (14,8 g; p.f. : 150-153 C) a été obtenu par couplage selon la méthode de l'étape lb). Le sel p-nitrophénylique de tri(f.-a-Z-L-ornithine) a été préparé selon la méthode de l'étape le), p.f.: 115-130 C. On a polycondensé 22 g de ce produit selon la procédure de l'étape lf), ce qui a fourni 15,4 g de 8poly-lf--a-benzyloxycarbonyl-L-ornithine (87,6%). On a isolé à partir de ce produit, 13,1 g (93X) de bromhydrate de poly-6-l-ornithine selon la méthode de l'étape lg). EXEMPLE 6 Broehydrate de poly-6-D-ornithine On a répété la procédure de l'exemple 5 à partir de 1 g de l'ester p-nitrophénylique de NLa-benzyloxycarbonyl- (N-6-ter-butyloxycarbonyl)-D-ornithine. On a obtenu 1,2 g (689%) de bromhydrate de poly-6-D-ornithine. EXEMPLE 7 Rcide poly-y-L-(c,y-diami nobutyrique) On a répété la procédure de l'exemple 1 pour obtenir 6,9 g de chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique d'acide f -ca-benzyloxycarbonyl-L--a,y-diaminobutyrique à part ir de 9,8 g d'ester p-nitrophénylique d'acide N-a -benzyloxycarbonyl- H-y-ter-butyloxycarbonyl-L-a,y-diaminobutyrique, p.f.: 67-70 C. Ce sel a été couplé avec l'acide N-a-benzyloxycarbonyl-N-y-ter- butyloxycarbonyl-L-x,y-diaminobutyrique par la méthode de l'étape lb) en un dipeptide, l'ester p-nitrophénylique d'acide N-ct-Z-N- /-(N'-a--Z - N'-y- ter-butyloxycarbonyl-c,y-diaminobutyrylI)-c,y-di- aminobutyrique (10,8 9, p.f.:125-127 C). En répétant la procédure de l'exemple la), on a synthétisé 10,35 g de chlorhydrate d'ester p-nitrophénglique a'acide N-a-Z-N-Y-(N'- a - Z-L-c,y-diaminobutyryl)- L-u,y-diaminobutyrique à partir du dipeptide, p.f.:108-112 C. R partir de ce sel, on a obtenu 13,7 g d'ester p-nitrophénylique d'acide N-y-BOC-tri(N-a-Z-L-acy-dianminobutyrique) en effectuant un couplage selon la procédure de l'étape lb), p.f.:143-145C. On a préparé à partir de ce produit, 10,5 g d'ester p-nitrophénylique d'acide tri-(N-a-Z-L-x,ydiaminobutyrique) selon la méthode de l'étape le), p.f.: 105-110 C. Ce produit a été polycondensé dans du diméthylsulfoxyde selon la procédure de l'étape lif) pour donner 7,8 g (86,5%) d'acide poly-Y-N-a-benzyloxycarbonyI-L--,y-diamino- butyrique. Le polymère protégé a été traité selon la méthode décrite dans l'étape lg) pour donner 6,2 g (90,5%) de bromhydrate d'acide poly-y-L-(c,y-diaminobutyrique). EXEMPLE 8 Rcide poly-p-L-(ccp-diamtinopropionique) On a répété la procédure de l'exemple 1 à partir de 9,6 g d'ester p-nitrophénylique d'acide N-a-benzyloxycarbonyl-N-8- ter-butyloxycarbonyI-L-op-diaminopropionique, pour obtenir 7,1 9g de chlorhydrate d'ester p-nitrophényl ique d'acide N-a -benzy loxycarbonyl-L-, p-diaminopropionique p.f.: 65-67 0C. Ce sel a été couplé avec l'acide N-a-benzyloxycarbonyl-N-B- ter-butyloxy- carbonyl-L-%p4-diaminopropionique par la méthode de l'étape lb) et a donné 11,0 g de dipeptide, l'ester p-nitrophénylique d'acide N- a-Z-N-'-(N'-a-Z-N'-S-ter-butyloxycarbonyl -, p-d i ai noprop i ongl)-c, jp- diaminopropionique, p.f.:11l9-122 C). En répétant la procédure de l'exemple la), on a synthétisé 10,85 g de chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique d'acide N-a-Z-N-e- (N' -a-Z-L-a, e-diaminopropionyl) - L-cp-diaminopropionique à partir du dipeptide; rendement: 10,85 g, p.f.:102-105 C. R partir de ce sel, on a obtenu 12,6 g d'ester p-nitrophénylique d'acide N-a-BOC-tri-( N- a - Z-L-xP3-diamino- propionique) en effectuant un couplage selon la procédure de l'étape lb), p.f.:138-140 C. On a préparé a partir de ce produit, 12,4 -9 d'ester p-nitrophénylique d'acide tri-(N-ca -Z-L-c,p-diamino- propionique) selon la méthode de l'étape le), p.f.: 102-106 C. Ce produit a été polycondensé dans du diméthylsulfoxyde selon la procédure de l'étape lf) pour donner 8,7? g (90,2%) d'acide poly-p- e-a-benzyloxycarbonyl-L-a,Ii-diaminopropionique. Le polymère protégé 2622 1 95 a été traité selon la méthode décrite dans l'étape lg) pour donner ,6 g (88,7%) de broahydrate d'acide poly-p-L--o,p-diamino- propionique. EXEMPLE 9 Solution d'injection 500 mg de poly-L-lysine,HBr sont dissous dans 10 mi de solution de NaCI physiologique. Cette solution d'injection est filtrée pour être stérilisée. La dose s'élève à 1-100 mg/kg/jour, en fonction de l'état du malade. EXEMPLE 10 Préparation de comprimés Des comprimés sont préparés à partir des composants suivants: g poly-L-lysine,HCI g lactose 16 g saccharose g amidon de mais 2 g stéarate de magnésium 2 g acide alginique Ces matières sont homogénéisés et 100 comprimés sont pressés à partir du mélange. EXEMPLE 11 Procédé pour augmenter la résistance des plantes à une infection virale. On prépare une solution aqueuse à partir de 5 g de polyiso-L-lysine avec 100 I d'eau. Le pH de la solution est fixé à 7,0-7,2 avec une solution de NaOH, puis I ml de Tween 20 est ajouté. Cette solution est appliquée sur une surface de 1 ha, sur des plantes à protéger alors qu'elles sont en post-émergence. REUENDICRTIOhS 1.Composé ayant la formule générale (1) 6 1 8 R R R R H HN-C! C C CO OH 17 I I9 M1 R R/m NH \R/n r - dans laquelle R4, R5, R6, R7 et - RiO représentent indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyj-Ie, alcoyle en C1_4. RB et R9 sont chacun un atome d'hydrogène, r est un entier de 10 à 400, a est 0, 1, 2 ou 3, et n est 0 - leurs sels, leurs racémates et leurs isomères optiques. 2. Composés ayant la formule générale (1) - dans laquelle R4, R5, R6, R7 et R10 représentent un atome d'hydrogène, r aune valeur de 10 à 400, m est 0, 1, 2 ou 3 et nest 0 - et leurs sels, leurs racémates et leurs isomères optiques. 3. Polyisolysine ayant un poids moléculaire moyen de 5.500 à 25.600. 4. PoyiYsoornithine ayant un poids moléculaire moyen de 4.400 à 13.500. 5. Préparations pharmaceutiques ayant un effet anti-tumeur et un effet antiviral, comprenant comme agent actif un composé de formule générale (1) dans laquelle R4, R5, R6, R7, R3, R9 et R10 représentent un atome d'hydrogène, r a une valeur de 40 à , a est 0, 1, 2 ou 3 et n est 0 et les groupes amino ont une configuration L, en mélange avec des supports et/ou des additifs couramment utilisés dans l'industrie pharmaceutique. 2622 1 9 5 6 Préparations pharmaceutiques suivant la revendication 5, dans lesquelles l'agent actif est une polyisolysine ayant un PM moyen de 5.500 à 22.500. 7. Procédé pour préparer des acides polgisodlaminocarboxyliques ayant la formule générale (1) - dans laquelle R4, R5, R6, R7, R8, R9 et R10 sont identiques ou différents et peuvent représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CI_4, r est un entier de 10 et 400, * est un entier de 0 à 10, et n est un entier de 0 à 10 - leurs sels, racémates et isomères optiques, par couplage des monomeères correspondants et polycondensation des oligomères obtenus de cette fa9on, caractérisé en ce qu'un monomère ou un oligomère de formule générale (11), 4 6H [0 0 R R \ R [ I|I _ 1 H Hi'I-C C- Cc CO OR) 7 1, 1 9 (II) R5YR7 ' NHR\R Rq - dans laquelle q est un entier de 1 à 9, R1 est un groupe amino protecteur et tous les R1 sont les mêmes dans des oligomères, R3 est un groupe ester actif protecteur pour des groupes carboxy, convenable pour la protection et l'activation simultanée, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, a et n sont tels que définis plus haut, et dans le cas des oligomères, les substituants peuvent être Identiques ou différents - est couplé avec un monomère de formule générale (111) 2622 1 95 R2 Hll C- - C C O RLHN CO/\ 1 5 17 I R PR NH C C- - dans laquelle R2 est un groupe amino protecteur différent de R1, qui peut être éliminé sélectivement par rapport à R1, X est un groupe activant la fonction carboxy à condition que le groupe -COX soit plus actif que le groupe COOR3, R1, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, à et n sont tels que définis plus haut - et ô partir du composé de formule générale (IVU) ainsi obtenu 4- 6 0 / 2 HN -C C C C - OR3 R HN-C HLi R CO OR R R - dans laquelle les substituants sont tels que définis plus haut et s est un entier de 2 à 10 - le groupe protecteur R2 est éliminé, puis, si s des acides polyisodiaminocarboxyliques de formule générale (1) - dans laquelle R4, R5, R6, R7, R10 et r sont tels que définis dans 2622 1 95 la revendication 1, a est 3 et n est O - et leurs sels, caractérisé en ce qu'un monomère ou un oligomère de formule générale (11), - dans laquelle R1, RI, R5, R6, R7, R10 et q sont tels que définis dans la revendication 1, et a et n sont tels que définis plus haut - est traité avec un monomère de formule générale (111) - dans laquelle R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 et X sont tels que définis dans la revendication 1 et à et n sont tels que définis plus haut - et à partir du composé de formule générale (IU) ainsi obtenu - dans laquelle les substituants sont tels que définis plus haut et s est tel que défini dans la revendication 1 - le groupe protecteur R2 est éliminé, puis, si cela est désiré, lorsque s 9, le composé obtenu est traité avec un monomère de formule générale (111) ou il est polycondensé de façon connue. 9. Procédé suivant la revendication 7 pour produire des acides polyisodiaminocarboxyliques de formule générale (1) - dans laquelle R1, R3, Ri4, R5, R6, R7, R10 et q sont tels que définis dans la revendication 1, a et n sont tels que définis plus haut - et leurs sels, caractérisé en ce qu'un monomère ou un oligomère de formule générale (11) - dans laquelle R1, R3, R4, R5, R6, R7, R10 et q sont tels que définis dans la revendication 1, et m et n sont tels que définis plus haut - est traité avec un monomère de formule générale (111) - dans laquelle R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 et X sont tels que définis dans la revendication 1 et à et n sont tels que définis plus haut - puis à partir du composé de formule générale (1U) ainsi obtenu - dans laquelle les substituants sont tels que définis plus haut et s est tel que défini dans la revendication 1 - le groupe protecteur R2 est éliminé et, si cela est désiré, lorsque s i 9, le composé obtenu est traité avec un composé de formule générale (111) ou il est polycondensé de façon connue. 10. Procédé suivant la revendication 7 pour préparer des polyiso-Llysines et leurs sels, caractérisé en ce que le chlorhydrate d'ester pnitrophénylique de N-a-Z-L-Lysine et la N-a -Z-N-e -BOC-L-lysine, transformés en anhydride mixte avec le chloroformate d'isobutyle, sont utilisés comte matières de départ. 2622 1 95 11. Procédé suivant la revendication 7 pour préparer des polyiso-Lornithines et leurs sels, caractérisé en ce que le chlorhydrate d'ester pnitrophénilique de N--Z-L-ornithine et la N-a -Z-N--BOC-L-ornithine, transformés en anhydride mixte avec le chloroformate d'isobutyle, sont utilisés comme matières de départ. 12. Procédé suivant la revendication 7 pour préparer des polyiso-D-lysines et leurs sels, caractérisé en ce que le chlorhydrate d'ester p-nitrophénylique de N-a-z-D-lys1vine et la N-c- -Z-N-t -BDOC-D-lysine, transformés en anhydride mixte avec le chloroformate d'isobutyle, sont utilisés comme matières de départ. 13. Procédé suivant la revendication 7 pour préparer des polyiso-Dornithines et leurs sels, caractérisé en ce que le chlorhydrate d'ester pnitrophénylique de N-a-Z-D-ornithine et la N-a-Z-N-B-BOC-D-ornithine, transformes en anhydride mixte avec le chloroformate d'isobutyle, sont utilisés comme matières de départ.