Brevet FR2617867A1 — publié le 19890113

La présente invention concerne une apatite sur laquelle est immobilisée de la glucanase, et un procédé d'immobilisation de la glucanase dans de l'apatite. "Glucanase", qui est un terme général pour les enzymes décomposant le glucane, couvre diverses enzymes. Il est à noter cependant que le terme "glucanase" désigne ici la levanase qui décompose le levane, la dextranase qui décompose le dextrane et la mutanase qui décompose le muta- ne. En outre, le terme "apatite" désigne à la fois l'hydro- xyapatite et la fluoro-apatite. Il est bien connu que l'apparition de caries den- taires est due à la plaque dentaire formée par l'action de polysaccharides tels que le levane, le dextrane et le mu- tane, qui sont produits par diverses bactéries de la bouche. En conséquence, on pense que les polysaccharides produits par ces bactéries devraient être éliminés pour sup- primer l'apparition de la plaque dentaire en vue de prévenir la caries dentaire. La présente invention concerne une apati- te sur laquelle sont immobilisées des enzymes pour la décompo- sition de polysaccharides associés à la carie dentaire,et un procédé pour préparer cette apatite. Dans la technique antérieure, divers procédés ont été mis au point pour éeminer la plaque dentaire en vue de pré venir la carie dentaire. Ces procédés comprennent l'élimina- tion par grattage de la plaque dentaire en utilisant un agent de polissage tel qu'une zéolite, du carbonate de calcium, de l'alumine et de la silice, en utilisant de la dextranase en même temps qu'un stabilisant, etc... Jusqu'à présent, cepen- dant, il n'existait pas de procédé d'immobilisation d'une en- zyme qui soit capable de décomposer un polysaccharide respon- sable de l'apparition de la carié dentaire tel que la levana- se, la mutanase et la dextranase, avec de l'apatite, et il n'existait pas d'apatite dans laquelle ces enzymes soient im- mobilisées,comme il est envisagé dans la présente invention. La glucanase est une enzyme et elle est relative- ment instable. En conséquence, lorsque de la glucanase est mélangée à un dentifrice sans être modifiée, son activité di- minue avec le temps et finalement disparaît. La dextranase est aujourd'hui utilisée avec le dentifrice, et divers sta- bilisants sont préparés pour empêcher sa désactivation. Par exemple, des combinaisons de dextranase avec de l'oxyde d'alu- minium, de la carvone ou du e-menthol, et de la gélatine ou de la peptone,sont proposées dans les spécifications des de- mandes de brevets japonais N 56-63915 et 56-110609 et dans le brevet japonais N 52-49005. Comme le dentifrice est desti- né à être utilisé dans la bouche, diverses limitations sont imposées, parmi lesquelles des considérations concernant l'in- fluence sur l'organisme humain et la demande d'une sensation rafraîchissante après utilisation. Comme il est évident que ces limitations sont imposées auxstabilisantsutilisés, le choi. des stabilisants pose des problèmes difficiles. L'utilisation d'enzymes autres que la dextranase pose les mêmes problèmes que l'utilisation de dextranase. A la suite d'études poussées et de grande ampleur effectuées sur la stabilisation du glucose, on a trouvé que l'immobilisation de la glucanase avec de l'apatite, qui est utilisée comme agent de polissage, donne une glucanase qui n'exige pas de stabilisant et qui présente une activité sur une période prolongée. La présente invention fournit une apa- tite sur laquelle est immobilisée de la glucanase, et un pro- cédé pour préparer cette apatite. Il est bien connu qu'il existe un procédé d'immobi- lisation des enzymes basé sur le fait que l'hydroxyapatite, le carbone actif, la kaolinite, le kaolin etc... absorbent physiquement des enzymes pour l'immobilisation, et il est généralement connu que les enzymes immobiliséessont tellement stables qu'elles présentent une modification d'activité avec le temps plus faible que l'enzyme non traitéeet sont commodes à manipuler. Il est donc connu depuis longtemps que l'apatite absorbe solidement un certain type de protéines et se lie à elles. Compte-tenu du fait que l'immobilisation de la glucanase peut conduire à une réduction de la variation d'activité avec le temps, on suppose que si de la glucanase était immobiliséeavec de l'apatite utilisée comme agent de polissage pour le denti- frice par le procédé d'adsorption physique, une glucanase im- mobilisée pourrait être aisément obtenue, et il pourrait alors être possible d'obtenir une substance dentifrice intéressante qui associe une capacité de polissage à une capacité de décom- position des polysaccharides, et dispense de tout choix de ca- talyseur. A la suite d'études effectuées sur cette présomption, on a trouvé que l'adsorption et l'immobilisation de la glucana- se sur apatite ne sont pas réalisables en raison du fait que l'adsorption de la glucanase surl'apatite est extrêmement limi- tée. Pour cette raison, d'autres études ont été effectuées sur l'immobilisation de la glucanase au moyen d'une protéine qui est solidement adsorbée sur l'apatite et liée à celle-ci,et à la suite de celles-ci, on a trouvé une apatite sur laquelle est immo- bilisée de la glucanase et un procédé pour la préparer. La présente invention fournit une apatite dans laque le est immobilisée de la glucanase et un procédé d'immobilisa- tion de la glucanase dans l'apatite en même temps qu'un cer- tain type de protéines qui est solidement adsorbé sur l'apatite. L'apatite est rise en suspension dans une solution aqueuse ou dans une solution de tampon phosphate ayant une con centration de 0,01 à 0,05 mole, dans laquelle la glucanase et la protéine présentant une forte adsorption sur apatite et n'ayant pas d'effet nuisible sur l'organisme humain sont dis- soutes, puis un aldéhyde bifonctionnel est ajouté goutte-à- goutte,en agitant énergiquement,à la suspension obtenue, au- dessous de la température ambiante. La protéine utilisépeut être choisie parmi l'albumine, la caséine, le lysosyme, le cytochrome C etc... Suivant le type de protéine, il existe une différence dans le titre de l'enzyme immobilisée obtenue et dans la force de liaison pour l'apatite. Comme on le cons- tatera d'après les résultats de l'essai d'élution qui seront donnés ci-après, cependant, on préfère le lysosyme, le cyto- chrome C etc... La glucanase utilisée peut être choisie arbi- trairement parmi la levanase, la dextranase et la mutanase, comme il a déjà été indiqué. Si on le désire, on peut utili- ser des mélanges de ces enzymes. La réaction impliquée s'ef- fectue à un pH pour lequel il ne se produit aucune décomposi- tion de l'apatite, c'est-à-dire à un pH de 5,6 ou davantage. Cependant, comme un pH plus élevé exerce une influence défa- vorable sur l'adsorption de protéines, un pH supérieur à 9,0 n'est pas préféré. Le pH préféré est aux environs de 7,0. Il est souhaitable que la taille de particules de l'apatite utilisée soit aussi uniforme que possible, cepen- dant, les particules d'apatite généralement utilisées comme agent de polissage pour les dentifrices conviennent pour cet- te application particulière. On préfère une apatite ayant une taille de particulesde 2 à 200 microns, car elle est facile à manipuler. La quantité d'apatite utilisée est 10 à 100 fois supérieure à la quantité de protéine. Pour une agitation ef- ficace, il est souhaitable d'utiliser une plus grande quantité d'eau par rapport à la quantité d'apatite utilisée. La quanti- té d'eau est ajustée de telle manière que la teneur en matières solidesdans la phase réactionnelle s'élève à 4 à 20 %. Il est préférable d'utiliser des quantités pratiquement équivalentes de protéine et de glucanase. Une forte différence dans la quantité des deux constituants, en particulier l'utilisation de la glucanase dans une quantité plus faible par rapport à la protéine, doit être évitée, car il se produira une baisse du titre de l'enzyme immobilisée obtenue. En général, on préfè- re utiliser comme aldéhyde bifonctionnel le glutaraldéhyde. La quantité d'aldéhyde bifonctionnel utilisée est le facteur qui exerce la plus grande influence sur le titre de l'enzyme immo- bilisée. Une quantité trop faible du glutaraldéhyde devant être ajouté a généralement pour résultat que l'enzyme immobi- sée présente une faible force de liaison pour l'apatite et éprouve une désactivation considérable au cours du temps. Une forte quantité de glutaraldéhyde conduit à une réduction du titre de l'enzyme immobilisée obtenue, et une augmentation sup- plémentaire de la quantité de celui-ci conduit à une désactiva- tion de cette enzyme. Bien que la quantité de glutaraldéhyde utilisée soit légèrement différente suivant le type de gluca- nase et de protéine, en général, la quantité de glutaraldéhy- de utilisée est de 3 à 60 mg, de préférence de 6 à 20 mg par gramme de protéine utilisée. La réaction mise en jeu est effec- tuée à une température ne dépassant pas la température ambian- te, de préférence aux environs de 5 C. Tout en agitant énergi- quement une suspension dans laquelle coexistent la protéine, la glucanase et l'apatite, on lui ajoute lentement,goutte-à- goutte,une solution aqueuse de glutaraldéhyde. Après l'addi- tion goutte-à-goutte, on effectue l'agitation à la même tempé- rature pendant plusieurs heures pour achever la réaction. Lofs- que la réaction est terminée, on filtre. L'apatite obtenue est abondamment lavée à l'eau ou avec la solution tampon utilisée pour l'élimination de la protéine et de l'enzyme entrâinées, puis elle est maintenue à une température plus basse ou lyophili sée pour la solidification, puis conservée à la température an biante. Cette apatite immobilisée conformément à la présentE invention peut également être préparée de la manière suivante. De l'apatite est ajoutée,sous agitation suffisante,à une solu- tion aqueuse ou à une solution tampon dans laquelle la protéi- ne est dissoute, de sorte que la protéine est adsorbée sur 1'E tite pour la saturation. Ensuite, on recueille l'apatite qui E adsorbé la protéine et on l'ajoute à de l'eau ou à une solutic tampon dans laquelle du glutaraldéhyde est dissous. Tout en agitant énergiquement la solution obtenue, on y ajoute goutte- à-goutte,lentement,une solution aqueuse de glutaraldéhyde. La température et les autres conditions utilisées à cette fin soi les mêmes que précédemment. L'apatite sur laquelle est immobilisée de la glucani se obtenue de cette manière est stable, elle éprouve moins de variations avec le temps et elle est facile à manipuler. Il a été établi que l'apatite absorbe bien un cer- tain type de protéines. Il est également connu que le gluta- raldéhyde est utilisé comme agent de réticulation pour l'immo bilisation des enzymes. Bien que le mécanisme par lequel l'im. mobilisation de la glucanase avec l'apatite est réalisée reste obscur, on suppose que l'adsorption d'une protéine qui est ai: sément adsorbée par l'apatite sur l'apatite, s'effectue en même temps que la réticulation de la protéine et de la gluca- nase, donnant ainsi l'apatite immobilisée. Pour une meilleure compréhension de l'invention, et pour montrer comme celle-ci peut être mise en pratique, on se référera à titre d'exemple à l'exemple de travail suivant. EXEMPLE 1 - Immobilisation de la levanase sur hydroxyapatite. On dissout 100 mg de lysozyme et 100 mg de levanase dans 50 ml d'eau pure et on ajoute à la solution obtenue 2 g d'hydroxyapatite comme agent de polissage, après quoi on re- froidit à 4 C. Tout en maintenant la température à 4 C et en agitant énergiquement, on ajoute goutte-à-goutte,lentement, 2 ml d'une solution contenant 28 mg de glutaraldéhyde dans ml d'eau. Lorsque l'addition goutte-à-goutte est termi- née, on effectue l'agitation pendant 2 heures tout en main- tenant la température à 4 C. Une centrifugation ultérieure donne un produit solide, qui est lavé tour à tour,en agitant, trois fois avec 50 ml d'eau pure pour obtenir une hydroxyapa- tite immobilisée à l'état non séché. (Si on le désire, ce produit peut être utilisé tel quel). La lyophilisation donne 2,05 g d'une poudre. A 1 g de cette poudre, on ajoute 10 ml d'une solution tampon phosphate de potassium ayant un pH de 6,8 et une concentration d'une mole. On effectue l'agitation pendant 1 heure, puis on centrifuge pour recueillir le fil- trat. On répète deux fois la même opération avec le résidu. On réunit les filtrats obtenus pour déterminer la teneur en protéine par la méthode de Lowry. Apres lavage à l'eau, on sèche le résidu pour le peser. On trouve que 11,7 mg de pro- téines sont liées par gramme d'hydroxyapatite. La mesure de l'activité de levanase de l'hydroxyapatite immobilisée à l'état non séché, par la méthode suivante, indique que 0,47 g de levane sont décomposés par gramme de protéine liée à l'hydroxyapatite. EXEMPLE 2-Immobilisation de la levanase sur fluoro-apatite On opère dans les conditions que.dans l'exemple 1, excepté qu'on utilise de la fluoro-apatite à la place de l'hydroxyapatite, et l'on obtient 2,05 g d'un produit lyophi- lisé. La mesure de la protéine liée, effectuée de la même ma- nière que dans l'exemple 1, indique que 13,4 mg de protéine sont liés par gramme de fluoro-apatite. Les résultats de la mesure de l'activité de levanase de la fluoro-apatite non séchée indiquent également que 0,54 g de levane sont décompo- sés par gramme de la protéine liée. EXEMPLE 3 - Immobilisation de la mutanase sur hydroxyapatite On opère dans les mêmes conditions que dans l'exem- ple 1, excepté que l'on utilise de la mutanase à la place de la levanase, pour obtenir une hydroxyapatite immobilisée. La décomposition est effectuée de la même manière que dans l'exem ple 1. On confirme que 15,0 mg de protéine sont liés par gram- me d'hydroxyapatite. L'activité de mutanase du produit est me- surée par la méthode de mesure de l'activité de la mutanase qui sera décrite ci-après. On trouve que 0,48 g de mutane sont décomposés par gramme de la protéine liée à l'hydroxyapatite. EXEMPLE 4 - immobilisation de la mutanase sur fluoro-apatite. On opère dans les mêmes conditions que dans l'exem- ple 2, excepté que l'on utilise de la mutanase à la place de la levanase, pour obtenir une fluoro-apatite immobilisée. Les résultats de l'analyse et de la mesure du titre de celle-ci, effectuée de la même manière que dans l'exemple 3, indiquent que 17 mg de protéine sont liés par gramme de fluoro-apatite, et que 0,45 g de mutane sont décomposés par gramme de la pro- téine liée. EXEMPLE 5 - Immobilisation de la dextranase sur hydroxyapatitE On ajoute 5 g d'hydroxyapatite utilisée comme agent de polissage et 50 ml d'une solution tampon phosphate de potaE sium ayant une concentration de 0,05 mole et un pH de 6,8 à ui mélange de 50 mg de lysozyme avec 50 mg de dextranase. On re- froidit le produit obtenu à 4 C et on l'agite énergiquement. Tout en maintenant cette température, on ajoute goutte-à-gout- te 125 pl d'une solution aqueuse à 0,2 % de glutaraldéhyde, en agitant, après quoi on effectue une agitation supplémen- taire pendant 5 heures. On recueille par filtration le pro- duit de la réaction et on le lave trois fois avec 100 ml de la solution tampon ci-dessus pour obtenir une hydroxyapatite immobilisée à l'état non séché. La lyophilisation donne 5,07 g de dextranase immobilisée sur hydroxyapatite pulvérulente. On centrifuge 1 ml de l'hydroxyapatite immobilisée pour obtenir un précipité. On ajoute au précipité 2 ml d'une solution tampon phosphate de potassium ayant une concentration de 1 mole et un pH de 6,8, et on agite la solution obtenue pendant 3 heu- res pour la désorption de la protéine liée, puis on centrifuge. On répète la même opération avec le précipité obtenu. On réu- nit les filtrats pour mesurer la quantité de la protéine qui est contenue par la méthode Lowry, on lave les précipités à l'eau,puis on les sèche pour les peser. On observe que 13,8 mg de protéine sont liés par gramme d'hydroxyapatite. Les résul- tats de la mesure de l'activité de la dextranase par une mé- thode de mesure de l'activité de la dextranase qui sera décri- te ci-après indiquentque 0,415 g de dextrane sont décomposés par gramme de la protéine liée. EXEMPLE 6 - immobilisation de la dextranase sur fluoro-apatite On utilise le même procédé de préparation, la même analyse et la même mesure de titre que dans l'exemple 5, excep- té qu'on utilise de la fluoro-apatite à la place de l'hydroxy- apatite, ce qui donne 5,08 g de fluoro-apatite immobilisée dans laquelle 15,2 mg de protéine sont liés par gramme de fluoro-apatite, et 0,43 g de dextrane sont décomposés par gram- me de la protéine liée. Les résultats obtenus dans divers conditions sont donnés dans le tableau 1. Les conditions de traitement sont les mêmes que dans les exemples précédents. Mesure des titres des enzymes. On ajoute 1 ml de l'apatite immobilisée non séchée obtenue dans chaque expérience à 10 ml d'une solution à 1 % du substrat correspondant. Apres avoir agité la solution ob- tenue à 37 C pendant 2 heures, on mesure la quantité du mono- mère qui y est formée.Par ailleurs, la protéine liée à 1 ml de l'apatite immobilisée non séchée est déterminée par la mé- thode ci-dessus. Le titre de chaque enzyme immobilisée est alors exprimé par la quantité du monomère par gramme de la protéine liée à chaque apatite. Les substrats utilisés ont été le dextrane pour la dextranase, le mutane pour la mutanase et le levane pour la levanase. Les quantités de dextranase et de mutanase ont été déterminées à partir du glucose obtenu par décomposition par la méthode à la glucose oxydase, et la quantité de levanase a été déterminée à partir du fluctose obtenu par décomposition en utilisant une chromatographie liquide à haute performance (colonne: sugar pack I) de la manière habituelle. Essai d'élution de la prctéine liée. L'apatite immobilisée obtenue est introduite dans une colonne et lavée avec diverses concentrations d'une solu- tion tampon pour déterminer la concentration pour l'élution de la protéine liée. La force de liaison de la protéine sur l'apatite est alors exprimée par le résultat obtenu. Le ta- bleau 2 donne les résultats obtenus avec l'hydroxyapatite sur laquelle est immobilisée de la dextranase. L'éluat utilisé était une solution tampon phosphate de potassium ayant une concentration de 1 millimole à 1 mole et un pH de 6,8, et le témoin utilisé était une hydroxyapatite à laquelle était liée uniquement de la dextranase. Les résultats indiquent que le support préféré est le lysozyme. Activité des enzymes immobilisées au cours du temps. On a examiné les variations d'activité au cours du temps de plusieurs échantillons d'apatite immobilisée obtenus conformément à la présente invention. Les échantillons utili- sés étaient tous des produits immobilisés non séchés. L'acti- vité de chaque échantillon a été mesurée par la méthode qui précède. Les résultats sont donnés dans le tableau 3. On a trouvé que les apatites immobilisés obtenues voyaient toutes leur activité augmenter avec le temps et présentaient un maxi- mum d'activité au bout d'un certain temps, après quoi il se produisait une baisse progressive d'activité. Conformément à la présente invention, la glucanase peut être immobilisée dans de l'apatite par une opération très simple. L'apatite immobilisée est facile à manipuler, elle est stable et elle éprouve moins de variations avec le temps. En outre, l'apatite de la présente invention réunit les proprié- tés polissantes de l'apatite avec une capacité de décomposer les polysaccharides responsables de la carie dentaire. En con. -11 séquence, l'utilisation du produit comme dentifrice est préfé- rée compte tenu du désir de prévenir la carie dentaire. Pour ces raisons, l'invention est extrêmement avantageuse pour main- tenir une bonne hygiène orale. TABLEAU 1 Type et quantité de Type et quantité de Type et quantité Glutar- A B N protéine glucanase d'apatite aldéhyde 7 lysozyme 0,1g lévanase 0 lg hydroxyapatite 2g 1,12mg 10,3mg 0.47g 8 lysozyme Olg mutanase lig fluoroapatite 2g l12mg 14,7mg 0,47g 9 lysozyme Olg lévanase Oflg hydroxyapatite 2g 0,56mg 9,7mg 0,42g caséinc Oelg lévanase Ojlg hydroxyapatite 2g 0,56mg 103mg OJ44g 11 cytochrome C OQlg l1vanase Ojlg hydroxyapatite 2g 0,56mg 13,2mg OJ49g 12 lysozyme Oflg l1vanase Olg fluoroapatite 2g 2 24mg 13,7mg O045g 13 lysozyme O/lg l1vanase Ojlg hydroxyapatite 2g 4,48mg 15,3mg OJ32g 14 lysozyme 0O1 mutanase OJlg hydroxyapatite 2g 8,96mg 16,4mg OJ13g lysozyme 0,lg lévanase Olg fluoroapatite 2g 18.Omg 19,Omg OO4g 16 lysozyme O,lg mutanase Olg hydroxyapatite 2g 18>0mg 17 4mg Oj02g 17 lysozyme 0,2g dextranase 0O2g hydroxyapatite 5g. 0 31,4mg 0O40g 18 albumine 0,05g dextranase 0O05g hydroxyapatite 5g 1,Omg 10,9mg Oj51g 19 lysozyme 0,05g dextranase 0,2g hydroxyapatite 5g 0,5mg 9,94mg OJ62g lysozyme 0,05g dextranase 0,2g hydroxyapatite 5g 10mg 15,2mg 0,46g 21 lysozyme 0,025g dextranase 0O025g hydroxyapatite 2j5g 50mg 8,75mg 0,06g 22 lysozyme 0,0125g dextranase 0, 0125g hydroxyapatite 2_5g 50mg 12,37mg 0 23 lysozyme 0,05g dextranase 0, 05g fluoroapatite 5g Oj5mg 10.5mg 0,50g 24 cytochrome C 0O05g dextranase 0,05g hydroxyapatite 5g 0,135mg 12,16mg 0,46g lysozyme 0,05g dextranase 0, 05g fluoroapatite 5g 1,Omg 12,3mg 0/53g A: Protéine liée totale/gramme d'apatite; B: Quantité de substrat décomposée/gramme de protéine co TABLEAU 2 Force d'immobilisation de l'hydroxyapatite pour la dextranase Support Concentration d'élution Témoin 0,08 mole Lysozyme 0,18 mole Albumine 0,12 mole Caséine 0,15 mole TABLEAU 3 Variation de l'activité enzymatique de l'apatite immobilisée avec le temps (activité spécifique) Aussitôt après N la préparation 4 C - 20 jours 4 C - 60 jours 36"C - 20 jours 360C - 60 jours 0;0 154 0 705 1 100 213j 6 98.0 154, 0 7 0J 5 2 100 303, 3 110,4 136,7 57/2 3 100 278 8 121, 9 150, 6 68J4 4 100 241, 6 95 8 15530 70165 100 293.,o 02, 9 3271o 126,8 6 100 287J4 108/7 320;4 120/8 A 100 - - 68,4 27,3 B 100 - - 65, 3 25,' C 100 - - 58 7 20, 3 A: Levanase seulement; B: Mutanase seulement; C: Dextranase seulement; toutes conservées sous forme de solution aqueuse. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de varian- tes qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1. Apatite sur laquelle est immobilisée de la gluca- nase. 2. Procédé de préparation d'une apatite sur laquelle est immobilisée de la gluzanase, qui consiste à ajouter goutte- à-goutte du glutaraldéhyde à une solution aqueuse dans laquelle la glucanase, la protéine et l'apatite sont présentes à l'état mélangé. 3. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel la protéine utilisée est le lysozyme. 4. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel la solution aqueuse utilisée est une solution tampon ayant un pH de 5,6 à 9,0. 5. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel la quantité de glutaraldéhyde est de 0,3 à 6 % par rapport à la protéine. 6. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel l'apatite a une taille de particules de 2 à 200 microns. 7. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel on se procure une suspension dans une solution tampon, laquel- le solution tampon a un pH de 5,6 à 9,0 et contient des quan- tités équivalentes de lysozyme et de glutanase, et une apati- te ayant une taille de particules de 2 à 200 microns dans une quantité 10 à 1OO fois supérieure à la quantité de lysozyme, et on y ajoute goutte-à-goutte du glutaraldéhyde dans une quan- tité de 0,3 % à 6 % par rapport au lysozyme, en refroidissant et en agitant.