Brevet FR2611214A1 — publié le 19880826

La présente invention concerne un procédé de protection et de conservation de bactéries d'intérêt agroalimentaire, notamment de bactéries lactiques, ainsi qu'un produit à base de telles bactéries enrobées par de l'argile, utilisable dans l'industrie agroal imentaire et en particulier dans l'industrie laitière. L'invention concerne en outre l'utilisation de ce produit comme levain industriel. Le recours aux ferments lactiques par l'homme, pour conserver les aliments, remonte à une tradition plus de deux fois millénaire dans les coutumes alimenta ires extremes-orientales. En effet, les bactéries lactiques, en acidifiant leur milieu de croissance, inhibent la plupart des bactéries impliquées dans les processus de pu tréfaction. De plus, le produit de leur activité, l'acide lactique, s'avère etre un puissant antiseptique (ALAIS, C. 1974. Les bactéries lactiques et. les levains in "Science du lait. Principe des Techniques Laitières". Société d'Edition et de Publicité Agricole, Industrielle et Commerciale, Ed., 339-382). A ce titre, les ferments lactiques sont utilisés dans l'industrie laitière pour la fabrication de très nombreux produits comme le lait caillé, les yoghourts, le kéfir et la plupart des fromages, pour les salaissons dans les produits fermentés à à base de végétaux pour l'alimentation humaine, choucroute et préparations orientales à base de graines germées de céréales ou de lé- gumineuses (soja) ou pour la nutrition animale (ensila ges). Par ailleurs, I'utilisation des ferments lactiques en thérapeutique intestinale humaine ou animale présente aussi un intérêt non négligeable (ALAIS, C. op. cit.; DUCLUZEAU, R. et RAIBAUD, P., 1979. Ecologie Microbienne du tube digestif. (INRA et M4SSON, Ed., 93 p.). Or, les bactéries lactiques présentent une certaine labilité liée à leur incapacité à sporuler et el les sont soumises aux processus I yt i ques qui limitent la durée de leur conservation. Un certain nombre de procédés de stabilisation de ces bactéries ont été proposés. Les plus anciens, pratiquement abandonnés en raison de leur manque de fiabilité, consistaient soit à conserver les ferments lactiques désséchés en présence d'un excès de lactose, soit, après dess icat ion à bonne température, à enrober les bactéries dans du phosphocaséinate de calcium. Actuellement, le marché des bactéries lactiques est dominé par deux méthodes de stabilisation, d'une part la lyophi- lisation, la plus largement répandue, et d'autre part la congélation qui exige une channe froide pour la distribution . Ces deux procédés donnent des résultats très satisfaisants (durée optimale de stockage des lyophilisats de 3 à 6 mois) mais ils sont très croûteux. Par ail leurs , on constate dans tous les secteurs agroal imentaîres qui recourent à l'utilisation des ferments lactiques (industrie laitière, charcuterie, ensilages ...) une progression du marché des levains industriels destinés à l'ensemencement direct. Le brevet français N 76 32 722 décrit un procédé de protection et de conservation des microorganismes avec des argiles en vue de leur application en agronomie en particulier pour le traitement des sols, des végétaux, des insectes, c'est-à-dire un traitement en relation avec l'exploitation des ressources naturelles. Les mi croorgani smes soumis à ce procédé sont soit des agents symbiotiques soit des souches hypovirulentes, soit des agents entomopathogènes. Ce procédé consiste à mélanger une prépa rection aqueuse de ces microorganismes avec une suspension aqueuse d'argile, à agiter le mélange résultant et à él i- miner l'eau en excès jusqu'à l'obtention d'une composition dans laquelle le microorganisme est enrobé par l'argile. La présente invention a pour but de propo ser un produit répondant à la demande croissante sur le marché de levains industriels destinés à l'ensemencement direct et de résoudre les problèmes de conservation des bactéries dans l'industrie agroal imentaire. Ceci est ren du possible par l'adaptation du procédé décrit dans le brevet français n076 32 722 utilisé dans une autre catégorie d'industrie et permet une très bonne conservation des bactéries, par une solution beaucoup moins onéreuse que les procédés classiques de lyophilisation ou de congélation. A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé de conservation et de protection des bactéries d'intérêt agroal imentaire comprenant l'étape de mise directe en contact intime d'argile, notamment de montmorillonite et d'un milieu aqueux contenant lesdites bactéries, conduisant à un mélange bactéries-argile. Au sens de la présente description, I'expression "milieu aqueux contenant lesdites bactéries" signifie aussi bien les bactéries avec leur milieu de culture que les cellules bactériennes isolées en phase humide. Selon une autre caractéristique de l'invention les bactéries utilisées sont des bactéries lactiques. De plus, de façon avantageuse, le mélange bactéries-argile est réalisé dans des proportions correspondant à des rapports pondéraux allant de 1/10 à 10/1, exprimés en matière sèche, notamment de 1/5 à 5/1. Afin de parvenir à des produits finis d'hydratation différente, le procédé selon l'invention peut comprendre des étapes de concentration du mélange bactéries-argile ou même une déshydratation totale de ce mélange. L'invention a aussi pour objet un produit à base de bactéries d' intérêt agroal imentaire, consistant en un mélanye intime desdites bactéries avec de l'argile, notamment de la montmorillonite. Les proportions pondérales du mé lange bsctéries/argile varient entre 10/1 et 1/10, notamment 5/1 à 1/5 et ce produit a, soit la forme d'un liquide ou d'une pàte ayant une teneur en matière sèche de 5% à 80%, soit la forme d'une poudre. Les bactéries utilisées de préférence sont des bactéries lactiques. L'invention concerne en outre l'applica- tion de ce produit comme levain industriel Mais l'invention sera encore il lustrée, sans être aucunement limitée, par la description détaillée suivante des caractéristiques du procédé de conservation et du produit obtenu. Ce procédé de protection et de conservation consiste à mettre en contact de l'argile, sous forme de poudre ou sous forme de solution aqueuse, directement avec un milieu aqueux contenant les bactéries. Après agitation, on obtient un mélange bactéries-argile, dans lequel les bactéries sont enrobées par l'argile. Cet enrobage protège les bactéries contre les différents agents extérieurs susceptibles de leur être préjudiciables (température, rayons ultra-violets, autres bactéries, enzymes ...... Les bactéries auxquelles on peut appliquer ce procédé sont les bactéries ayant un intérêt agroalimenta ire et plus particulièrement les bactéries lactiques: lactobacil laceae et streptococcaceae. Plusieurs types d'argiles commercialisées peuvent etre utilisées, toutefois on note que les montmorillonites donnent de meilleurs résultats que les kaol ini- tes et surtout que les illites. Les montmorillonites calciques ou sodiques sont des phyl losi I icates dont les feuillets présentent des surfaces d'échange et d'adsorption particulièrement développées (-786 m2 /g pour une montmorillonite du Wyoming contre seulement 12 m2 /g pour la kaolinite de St Austell, in C. CHENU, 1985. Etude expérimentale des interactions argiles-polysaccharides neutres. Contribution à la connaissance des phénomènes d'agrégation d'origine biologique dans les sols. Thèse Doctorat es. Sciences Naturelles, Université de Paris VI, INRA Ed.,p. 185).Les montmorillonites naturellement sodiques et les montmorillonites calciques activées sodiques (telles que le Clarsol KC2 de C.E.C.A.) peuvent être pré férées pour leur aptitude- à la remise en suspension après déshydratation partielle ou poussée. L'argile est stérilisée avant emploi à l'état de poudre (chaleur sèche ou humide, gaz désinfectant, rayonnements ionisants, ....) ou sous forme colloi- dale (autoclavage ....). Le mélange avec la suspension aqueuse de bactéries permet l'enrobage de celles-ci, I'eau jouant un r61e de vecteur dans les espaces interfo linaires. La suspension aqueuse et notamment le milieu de culture utilisé peut être quelconque mais doit être sous forme liquide ou pâteuse afin de permettre un contact aisé entre les bactéries et l'argile et de réaliser un bon enrobage. L'introduction directe de l'argile pulvérulente stérilisée dans le milieu contenant les bactéries est facilitée par l'absence de coagulum, ce qui est le cas avec les milieux semi-synthétiques enrichis ou non à base de lait reconstitué exempt de caséine, qui sont en usage actuellement. Le temps de brassage du mélange dépend du matériel utilisé et de la concentration en matière sèche visée, mais dans les conditions normales il n'excède pas quelques minutes. Le mélange, biomasse bactérienne-argile, est réalisé dens la plupart des cas dans des proportions correspondant à un rapport en matières sèches de 1/1. Toutefois, certaines applications pourraient justifier des rapports différents mais restant dans l'intervalle pondé ral de 1/10 à 10/1, notamment 1/5 à 5/1. Il a été montré que le pH initial du mélange argile-bactéries n'est pas déterminant, mais on pourra avoir avantage à introduire un tampon autour de pH 5,5. Cet ajustement du pH peut autre réalisé en introduisant le tampon pendant la phase de brassage. Par ail - leurs, on peut souligner que pendant cette opération les qualités d'enrobage de l'argile ne s'exercent pas seulement à l'égard des bactéries, mais aussi de certains de leurs métabolites. Le mélange bactéries-argile ainsi obtenu pourra être conservé en l'état mais le conditionnement préféré dans le procédé présentement revendiqué, vise les produits enrobés dans l'argile sous forme concentrée hydratée. Pour ce faire, la suspension aqueuse du mélange: bactéries lactiques-argile est concentrée par centrifugation (séparateurs centrifuges en usage dans l'industrie laitière, centrifugeuses du type "Sharples"...) ou par tout autre moyen physique. Suivant leurs taux de matière sèche, les produits obtenus ont des consistances qui vont du lait argileux (5 à 25% de matière sèche ), de la crème (25% à 60% de matière sèche), à la patte semi-solide (60 à 80% de matière sèche). Les pâtes de bactéries lactiques enrobées par l'argile suivant ce procédé, sont conservées sous toute forme de conditionnement étancha. Même en présence. d'air, l'enrobage par l'argile protège les bactéries lactiques sous forme non déshydratée mais il est possible de les conditionner sous vide partiel ou sous gaz neutre. Les différents produits obtenus par le procédé objet de l'invention diffèrent donc d'une part, par le taux de matière sèche et d'autre part, par les pro portions pondérales correspondant à des rapports bactéries/argile. Ces produits, constitués de bactéries "protégées", peuvent être directement utilisables coince levains industriels. De façon avantageuse, la forme "pains de levain frais "pourrait être un produit à humidité intermédiaire particulièrement intéressant. La formule paite enrobée peut conduire à des formes de déshydratation moins coûteuses que la lyophilisation, telles que le séchage particulaire ou le séchage en lit fluidisé, ou autres. Ainsi, à partir du mélange aqueux, argilebactéries lactiques, on a réalisé le conditionnement sous forme pulvérulente par séchage particulaira. L'argile utilisée peut etre une montmorillonite activée sodique. Quel le quelle soit, l'argile améliore le rendement du spray en germes viables de 10 à 100 fois et elle permet d'éviter l'adhésion du produit aux parois de la tour d'atomisation et le colmatage. Atomisée à température relativement peu élevée, la suspension argileuse a donné une poudre (plus de 90% de matière sèche) qui a été conditionnée sous atmosphère à humidité relativement faible (inférieure à 40%) en sachets étanches. Le produit ainsi obtenu est remarquablement stable, puisqu'on n'observe pas de baisse significative du nombre de germes viables par g de poudre après plus de 6 mois de conservation à 5DC, 20OC et à 30 C. L'atmosphère dans laquelle est conditionnée la poudre peut cotre régulée à une pression de vapeur d'eau appropriée en fonction de l'activité de l'eau du produit. Cette poudre peut aussi etre conservée sous forme de granulés ou comprimés. Un des avantages essentiels de la présente invention réside dans le fait que, contrairement au procédé appliqué aux inoculums microbiens destinés aux bio préparations insecticides (brevet FR N076 32 722 le lavage prdalable des bactéries lactiques n'est absolument pas nécessaire. Ainsi le mélange de la biomasse et de l'argile peut etre réalisé dans le milieu de culture liquide, on supprime donc cette étape de préparation préalable du milieu bactérien et on diminue par le fait même le court du procédé de conservation. De plus, il est remarquable de constater que l'enrobage par l'argile constitue une protection efficaca des levains conditionnés sous forme pâteuse non seu lement à 50C mais aussi à 200C. Par conséquent, le conditionnement des bactéries lactiques et des levains industriels sous forme de pâtes offre une alternative peu coûteuse au marché des ferments lyophilisés ou congelés. En effet, le potentiel 'inoculum des ferments enrobés dans l'argile est maintenu pendant le transport à la température ambiante et pendant la conservation en installa- tion frigorifique normale (5 à 80C). La voie humide présente un autre avantage: I'absence de choc physique lié à la déshydratation ou à la congélation. Ainsi, on constate que l'usage de la lyophilisation a orienté la sélection des souches de bactéries lactiques, il s'ensuit qu'un certain nombre de souches supportant mal ce traitement physique ont été abandonnées malgré des qualités intrinsèques reconnues par ail leurs. L'alternative proposée permet donc d'élargir la gamne des ferments lactiques disponibles sur le marché. Les exemples suivants servent à illustrer le procédé de l'invention sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLES 1 et 2 Dans les deux premiers exemples l'enrobage des bactéries lactiques, Streptococcus sp., S. faecium et Diacetylact is sp. est réalisé par mélange avec une montmo rillonita sodique, qui est introduite dans le milieu de culture après avoir été préalablement stérilisée par auto cavage. Les meilleures conditions de conservation à 20 C, sont obtenues en effectuant le mélange, argi la-biomasse bactérienne, dans la proportion l/l, la pâte étant conditionnée dans des sacs étanches (tableaux I et 2). Parallèlement aux données des numérations sur milieu M.R.S.*, les tests d'acidification, en milieu M.R.S. liquide ou dans du lait, ont montré que l'activité des inocul ums n'est pas ralentie après 6 semaines. * M.R.S.: M 43 qualité bactériologique du lait et des produits laitiers D. PETRANSXIENNE et L. LAPIED ouvrage de référence édité par technique et do cumentation PARIS. TABLEAU 1 Effet de L'argile (montmorillonite activée sodique de type Clarsol KC2) sur la conservation à 200C des bactéries lactiques, Streptococcus sp. conditionnées sous forme pateuse: nombre de bactéries par gramme de poids sec établi par numérations sur milieu M.R.S. Conditionnement des bactéries Temps en frais, non enrobés dans l'argile inoculum de semaines enrobés sous forme pâteuse référence lyophilisé (a) (b) 1 1,5 x 109 5 x 1010 5 x 1010 7 x 109 3 3 x 108 8 x 109 NC NC 6 107 1010 2 x 1010 7 x 109 (a, b) mélange 1/1 obtenu suivant la technique décrite, conservé sous forme pâteuse soit en tubes aérés (a) soit en sachets hermétiques (b). TABLEAU 2 Effet de la concentration en argile (Clarsol KC2) sur la conservation à 200C des bactéries lactiques, Diacetylactis sp. et Streptococcus faecium conditionnées sous forme pâteuse en sachets étanches : nombre de bactéries par gramne de poids sec établi par numération sur milieu M.R. S. Temps de Conditionnement des bactéries conserva- inoculum inoculums humides(a) tion en lyophilisé 1/1 10/1 100/1 semaines Diacetyl- 0 3 x 10 10 5 x 10 4 x 10 actis sp. 6 2 x 10 5 x 10 2 x 1010 2 x 108 Strepto- 0 2 x 1011 1013 5 x 1012 6 x 1012 coccus 6 6 x 1011 8 x 1012 2 x 1010 5 x 1012 faec i um (a) Rapport biomasse bactérienne/argile. EXEMPLE 3 Dans ce troisième exemple, concernant l'espèce Streptococcus thermophilus les germes sont enrobés suivant le procédé proposé avec respectivement de la montmorillonite calcique, activée sodique (Clarsol KC2), de la montmorillonite naturel lament sodique du Wyoming et du gel de silice. Le pH de ces gels a été ajusté à 5,5, le meilleur tampon s'avèrant l'acétate de sodium. Les pâtes (mélange bactéries-support dans les proportions l/ì) ont été réparties dans des piluliers en verre stériles, I'étanchéité étant assurée par un bouchon en caoutchouc surmonté d'une capsule en aluminium sertie. La conservation a été suivie à 50C et à 20 C. Les numérations sur milieu M.R.S. gélosé, montrent un excellent maintien du potentiel d'inoculum de ces pâtes, les argiles étant des supports légèrement plus performants que la silice à 200C (tableau 3). Les pâtes ont aussi été soumises à des tests d'acidification dans du lait en conditions normalisées (température à 42 C...) de manière à suivre la potentialité de reprise des bactéries en cours de conservation. On a comparé les points d'inflexion des courbes d'acidification des échantillons des différentes variantes représentées (3 supports et 2 températures). On constate les faits suivants: le point d'inflexion des pâtes fralchement préparées se situe autour de 3,3 heures; après 8 semaines de conservation à 5 C il garde la même valeur pour les échantillons enrobés par l'argile mais il est décalé d'environ I heure (4,1 heures) dans le cas des échantillons enrobés dans le gel de silice: après un mois de conservation à 200C, le décalage n'est que de t à 2 heures avec l'argile alors outil atteint 5 heures avec le gel de silice. De toute façon, à la température ambiante, on note que dans les trois types d'enrobage, I'activité des bactéries lactiques n'est pas ralentie si- gnificativement après I ou 2 semaines. Le taux élevé de survie de S.thermophilus enrobé dans l'argile sous forme humide à 50C comme à 200C, et le maintien de son activité métabolique à température ambiante pendant 2 semaines, démontrent l'intérêt de cette nouvelle voie de conditionnement pour le transport et la conservant tion des levains industriel s. TABLEAU 3 Effet de la nature du support (gel de silice, Clarsol KC2 et montmorillonite naturelle sodique du wyaming)a sur la conservation à 5 C et à 20 C des bactéries lactiques, Streptococcus thermophilus, conditionnées sous forme pâteuse: nombre de bactéries par gramme de poids humide établi par numérations sur milieu M.R.S. Temps de conser- Température de Conditionnement des bactéries vation en conservation gel de sili- Clarsol KC2 montmorillonite semaines ce Wyoming 5 C 1,2 x 109 3,4 x 109 3,5 x 109 0 20 C 1,2 x 109 3,4 x 109 3,5 x 109 1 5 C 2.0 x 109 4,4 x 109 5,7 x 109 20 C 1,7 x 109 2,0 x 109 3,6 x 109 2 5 C 1,1 x 109 7,5 x 109 3,4 x 109 20 C 0,6 x 109 5,8 x 109 2,5 x 109 4 5 C 1,4 x 109 4,5 x 109 3,3 x 109 20 C 0,2 x 109 0,3 x 109 0,1 x 109 8 5 C 1,4 x 109 1,6 x 109 1,4 x 109 20 C 1,5 x 104 4,8 x 108 3,6 x 107 a) mélange bactéries-support minéral dans la proportion 1/1 suivant la technique décrite, pH ajusté à 5,5 avec un tampon acétate de sodium, conservation en piluliers hermétiquement fermés. REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation et de protection de bac tories d'intérêt agroalimentaire, comprenant l'étape de mise directe en contact intime d'argile, notamment de montmorillonite et d'un milieu aqueux contenant lesdites bactéries, conduisant à un mélange bactéries-argile. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les bactéries utilisées sont des bactéries lactiques. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications I ou 2, caractérisé par le fait que le mélange bactériesargile est réalisé dans des proportions pondérales correspondant à des rapports bactéries/argile, allant de 1/10 à 10/1, notamment 1/5 à 5/1, exprimées en matière sèche. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé par le fait que le mélange bactériesargile est concentré. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé par le fait que le mélange bactériesargile est déshydraté. 6. Produit à base de bactéries d'intérêt agroalimenta ire consistant en un mélange intime desdites bactéries avec de l'argile, notamment de la montmorillonite, dans lequel les bactéries sont enrobées par l'argile. 7. Produit salon la revendication 6, caractérisé par le fait que les proportions pondérales du mélange bactéries-argile varient entre 10/1 et /10, notamment entre 5/let 1/5. 8. Produit selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7,caractérisé en ce qu'il a la forme d'un liquide ou d'une pâte ayant une teneur en matière sèche de 5 à 80% en poids, ou d'une poudre. 9. Produit selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que les bactéries sont des bactéries lactiques. i0. Application du produit selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, comme levains industriels.