Brevet FR2615528A1 — publié le 19881125

-({ 2615528 PROCEDE DE PRODUCTION D'UN POLYPEPTIDE AYANT DES PROPRIETES CHOISIES DETERMINEES, DANS UN ORGANISME-HOTE TRANSFORME PAR UN ADN RECOMBINANT CONTENANT DES SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR CE POLYPEPTIDE ET POUR UNE PROTEINE AFFINE D'OSE L'invention est relative à un procédé de produc- tion d'un polypeptide ou d'une protéine ayant des pro- priétés choisies déterminées, par culture d'un organis- me-hôte préalablement transformé par un ADN recombinant contenant des séquences codant pour ce polypeptide et pour une protéine affine d'ose. Une forme préférée du procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire de purification de ce polypeptide comprenant la mise en contact de ce peptide avec un ose insolubilisé. Plusieurs techniques ont été décrites pour faire produire un polypeptide ou une protéine par des organis- mes-hôtes préalablement transformés par un vecteur appro- prié lui-même modifé par une séquence d'insertion conte- nant un acide nucléique codant pour cette enzyme ou cette. protéine, convenablement placée sous le contrôle d'élé- ments de régulation, notamment d'un promoteur, autorisant l'expression de cet acide nucléique dans l'organisme hôte transformé. Une fois le gène (ou le vecteur le contenant) mis au point, il devient une source permanente de poly- peptides. Cette approche génétique pour la conception de nouveaux polypeptides possède plusieurs inconvénients: le polypeptide peut être dégradé in vivo, être toxique pour la cellule-hôte ou difficile à purifier à partir d'ex- traits bactériens. Il a déjà été proposé de contourner le problème de la dégradation, notamment lorsque l'hôte cellulaire choisi est F. coli, en fusionnant le polypep- tide étranger à une protéine stable, par exemple à la 0-galactosidase, qui sert de vecteur. La fusion d'un polypeptide à une protéine vecteur, via leurs gènes codants, peut également faciliter la purification de ce polypeptide si la protéine vecteur conserve son activité dans l'hybride, et si elle est facile à purifier, par exemple au moyen d'une chromatographie d'affinité. La P-galactosidase, la protéine A de S. aureus et des immunoglobulines ont été utilisées à cette fin. L'in- troduction, à la jonction, entre les deux séquences nucléiques, de séquences spécifiques, permet le clivage du polypeptide greffé après purification de la protéine hybride. D'autres solutions ont également été proposées. On citera pour mémoire les techniques dans lesquelles la sé- quence codant pour le polypeptide étranger a été fusionnée à une séquence signal visant à permettre l'exportation du polypeptide étranger hors du cytoplasme de l'hôte cellu- laire, pour éviter l'effet toxique possible du polypeptide étranger à l'égard de l'hôte cellulaire. Il a également été proposé d'obvier à l'effet toxique possible du poly- peptide étranger, en plaçant le gène codant sous le contrôle d'un promoteur normalement réprimé, ce promoteur étant ensuite déréprimé dans la phase terminale de crois- sance de la culture cellulaire pour alors induire la synthèse du polypeptide étranger. Une autre difficulté souvent rencontrée réside dans la conservation de l'activité du polypeptide étranger ainsi produit, par exemple lorsque ce polypeptide consiste en une enzyme. A cet égard, la technique susmentionnée consistant à fusionner la séquence codant pour le polypep- tide étranger avec une séquence signal a également, dans certains cas, été proposée pour obtenir le repliement normal du polypeptide étranger dans un milieu moins ré- ducteur que le cytoplasme cellulaire, notamment lorsque l'hôte cellulaire utilisé appartient à une espèce bacté- rienne. Mais jusqu'à ce jour, il n'a pas souvent été possible de remédier à ces difficultés, surtout lorsque le polypeptide étranger s'avérait être d'une taille très importante. Enfin les tentatives de promouvoir le transport d'une protéine cytoplasmique, à partir du cytoplasme vers la région périplasmique des bactéries transformées dans les conditions susindiquées, a en général toujours échoué, la protéine cytoplasmique restant coincée ou bloquée dans les membranes mêmes des bactéries. De même, les purifications finales ont jusqu'à-ce jour été difficiles à réaliser. Par exemple, dans le cas de protéines hybrides, il n'est pas toujours facile de séparer les protéines hybrides correctement repliées et actives - des protéines hybrides non correctement repliées et inactives qui ont pu être produites simultanément par le même organisme-hôte. En outre, dans le cas des purifications de protéi- nes produites par des techniques de chromatographie ou analogue, mettant en jeu des molécules affines pour les protéines à purifier, fixées sur un support solide adé- quat, il n'est pas toujours exclu que certaines de ces molécules affines ne soient pas séparées en même temps que les protéines sélectivement retenues, au cours des opéra- tions d'élution finale. Même si les proportions de molé- cules affines ainsi séparées peuvent n'être qu'extrêmement faibles, elles peuvent contribuer à "souiller" le produit final de façon néfaste, eu égard aux applications dont les protéines ainsi purifiées peuvent ensuite être l'objet. On conçoit aussi que la préparation des colonnes d'affinités elles-mêmes, pour ces purifications, sera souvent délicate et coûteuse, surtout lorsque la réduction à un minimum des inconvénients précédemment mentionnés s'avérera constituer un impératif essentiel. L'invention a pour but de fournir un procédé de génie génétique qui permette de remédier, mieux qu'il n'est souvent possible à ce jour, aux difficultés plus particulièrement rappelées ci-dessus, tout en étant d'une application aisée, relativement peu coûteuse et très efficace, pour produire un polypeptide contenant une chaine peptidique possédant ellemême des propriétés choisies, susceptibles d'être ensuite complètement exprimées. Le procédé de fabrication et de purification selon l'invention, qui comprend une étape consistant à provoquer l'expression dans un organisme-hôte approprié transformé et mis en culture à cet effet, d'un acide nucléique recom- binant codant pour un polypeptide hybride dont une pre- mière partie consiste en un polypeptide vecteur et une seconde partie en la susdite chaîne peptidique, une étape de récupération du polypeptide hybride exprimé sous la forme d'une solution à partir du susdit hôte cellulaire et une étape de purification, est caractérisé en ce que le polypeptide vecteur est une protéine affine pour au moins un ose déterminé, en ce que l'étape de purification com- prend la mise en contact de la solution du polypeptide hybride avec cet ose sous une forme insolubilisée compa- tible avec la préservation de l'affinité mutuelle de la protéine affine et de l'ose et en ce que l'on récupère, après séparation des produits non fixés sur l'ose, le polypeptide ayant les susdites propriétés choisies, à partir des produits fixés sur l'ose. Un polypeptide vecteur particulièrement préféré est constitué par la protéine MalE, particulièrement lorsque l'on souhaite effectuer la fabrication du poly- peptide choisi dans E. coli. La protéine MalE est une protéine de 370 acides aminés qui est codée par le gène malE d'E. coli. Son promoteur, malEP, est un promoteur fort qui est activé par la protéine MalT en présence de l'inducteur maltose et réprimé par le glucose. Ces contrôles opèrent encore lors- que malE et son promoteur sont portés par un plasmide à copies multiples, comme pPD1, dont la fabrication a été décrite dans (1). MalE est une protéine abondante. Elle est exportée dans le périplasme bactérien par l'intermédiaire d'un peptide signal N-terminal qui est clivé durant peptide signal N-terminal qui est clivé durant l'exportation (2). MalE est une protéine affine du maltose et des maltodextrines, qui est nécessaire au transport de ces sucres à travers l'enveloppe bactérienne. MalE, de même que son précurseur, peut être purifié en une étape par chromatographie d'affinité sur amylose pontée par traitement à l'épichlorohydrine. La protéine est éluée par compétition avec du maltose 10 mM (3). Il a également été montré que cette protéine pouvait être modifiée en certains de ses sites, sans pour autant perdre certaines de ses activités. On se reportera notamment à l'article de DUPLAY et coll. (4). Cet article et tous les autres documents identifiés à la fin de ce texte doivent être considérés comme faisant partie inté- grante de cette description, pour autant que leurs conte- nus respectifs servent à la compléter, quant à la nature et à la structure des matières premières à partir des- quelles l'invention a été produite. A cet égard, il est rappelé que DUPLAY et coll. ont inséré au hasard un adaptateur ("linker") BamHI dans le gène malE d'un plasmide pPD1 qui le contenait. Deux des plasmides modifiés par ces insertions, malE91 et malE140, changent le cadre de lecture et conduisent à la synthèse de protéines modifiées possédant 362 (respectivement 369) acides aminés N-terminaux de MalE et une extension C-ter- minale de 12 (respectivement 27) acides aminés. Une troi- sième insertion, malE127, dans la séquence signal, empêche l'exportation de la protéine MalE dans le périplasme (4). L'invention fournit donc un procédé particulière- ment efficace pour produire par génie génétique et puri- fier toute protéine déterminée, et ceci grâce à un vecteur recombinant obtenu par construction, dans lequel une sé- quence nucléique codant pour ladite protéine a été placée en aval de la séquence codante de la protéine MalE, elle- même placée sous le contrôle d'un promoteur efficace. Avantageusement, l'organisme-hôte utilisé pour cette fabrication consiste en une bactérie E. coli, cas dans lequel il est avantageux d'avoir recours au gène malE lui-même, lequel comprend alors également le promoteur endogène correspondant malEp. Dans l'hypothèse qui pré- cède, l'étape de purification comprendra la mise en con- tact avec l'ose insolubilisé correspondant à la protéine MalE, avantageusement une maltodextrine insolubilisée ou une amylose pontée obtenues dans les conditions déjà rappelées plus haut. L'utilisation du couple de carac- téristiques: 1. production de la protéine recherchée à l'aide d'un vecteur contenant la séquence codante fu- sionnée au gène malE - 2. purification par mise en contact avec du maltose ou du glucose amené à l'état polymérisé, est avantageuse à bien des égards. Au niveau de la production, on met à profit la capacité du gène malE à s'exprimer de façon abondante dans E. coli et simulta- nément la capacité du glucose ou du maltose insolubilisé à permettre la séparation des seules protéines hybrides ayant conservé la capacité affine de la protéine MalE naturelle ou "sauvage". Il est remarquable que l'on peut grâce à ces vecteurs également obtenir une protéine hybride, dans laquelle la partie correspondant à la protéine recherchée conserve l'activité de cette dernière, cette activité se manifestant directement ou après restitution, comme cela sera montré dans les exemples décrits plus loin, avec des protéines déterminées de grande taille, telles que des nucléases (150 aminoacides) et le fragment Klenow d'une polymérase (650 aminoacides) utilisés à titre de modèles expérimentaux. Il importe naturellement que la séquence nucléique codant pour la protéine recherchée soit insérée dans une région convenable du gène malE, pour que soient conservées au sein de la structure de cette dernière les propriétés affines pour la maltose de la protéine MalE et l'activité recherchée pour la protéine déterminée devant être synthé- tisée. A cette fin, il est avantageux que la séquence nu- cléique codant pour la protéine déterminée soit placée en cléique codant pour la protéine déterminée soit placée en aval de la séquence codant pour la protéine MalE vis-à-vis du sens de la transcription du gène recombinant. Cette condition n'est cependant nullement imposée. La détermina- tion de la localisation la plus avantageuse de l'insertion de la séquence codant pour la protéine recherchée dans le gène malE peut être déterminée, notamment par la technique d'insertion au hasard de la séquence codante décrite dans la demande de brevet européen n' 87.400504.4 déposée le 6 mars 1987 ou les demandes de brevet correspondantes dépo- sées dans d'autres pays et dans (11). A la capacité de purification tout à fait remar- quable que permet le système selon l'invention, s'ajoute encore la très grande souplesse des vecteurs préférés en- visagés ci-dessus, en ce que l'on peut choisir la région dont la bactérie dans laquelle la protéine hybride pro- duite est transportée, soit dans le cytoplasme, soit dans le périplasme (du moins lorsque la nature même de la protéine hybride n'interdit pas le transport dans cette dernière région). Ce choix sous le contrôle de l'utili- sateur, grâce à la possibilité qu'il a de s'assurer à volonté du transport de la protéine hybride formée, soit dans le périplasme (pour autant que ce transport soit possible pour les raisons évoquées ci-dessus) en mettant à profit les propriétés spécifiques à cet égard de la séquence signal normalement intercalée dans le gène malE entre la séquence codante et le promoteur, soit en s'assurant que de toute façon la protéine hybride ne sera pas transportée au-delà de la région cytoplasmique, grâce à l'introduction d'une mutation dans cette séquence signal, mutation dont l'effet sera précisément d'empêcher l'exportation de la protéine hybride dans le périplasme. Dans le premier cas, la protéine hybride pourra être aisément récupérée à partir du périplasme, notamment en soumettant les bactéries transformées à un choc osmotique, par exemple dans les conditions décrites dans (4). Dans l'autre cas, la protéine hybride sera récupérée à partir à l'introduction d'une mutation dans cette séquence signal, mutation dont l'effet sera précisément d'empêcher l'exportation de la protéine hybride dans le périplasme. Dans le premier cas, la protéine hybride pourra être aisément récupérée à partir du périplasme, notamment en soumettant les bactéries transformées à un choc osmotique, par exemple dans les conditions décrites dans (4). Dans l'autre cas, la protéine hybride sera récupérée à partir du cytoplasme après rupture complète des parois bacté- riennes, par exemple à l'issue d'un traitement avec des détergents ou à l'aide de moyens mécaniques ou enzyma- tiques bien connus de l'homme du métier. Cette deuxième alternative certes d'emploi moins pratique sera néanmoins préférée, dès lors que l'on souhaitera protéger la bac- térie contre le "stress" qui pourrait être engendré du fait de la tendance naturelle au transport de la protéine hybride dans le périplasme sous l'effet de la séquence signal non mutée, quand bien même ce transport s'avèrerait difficile en raison même de la structure hybride. De façon remarquable, le procédé selon l'invention permet - pour celles des protéines qui sont effectivement transportables à travers la membrane bactérienne séparant les régions cytoplasmique et périplasmique de l'organisme- hôte - l'exportation dans le périplasme de protéines nor- malement cytoplasmiques, donc avec un grand coefficient de purification, avant toute mise en contact avec l'ose in- solubilisé, ou mise en oeuvre de toute autre technique de purification supplémentaire. A cet égard l'invention concerne donc plus parti- culièrement, à titre de variante, le procédé de production et de purification sus-défini, dans lequel l'étape de pu- rification par contact avec l'ose-insolubilisé est omise, et ce plus particulièrement lorsque la chaine peptidique recherchée consiste en tout ou partie d'une protéine cytoplasmique, autrement dit en une protéine non excrétée par son hôte naturel; et ce plus particulièrement dans le cas o l'organisme-hôte est une bactérie. Un autre avantage encore du système préféré décrit ci-dessus réside dans le caractère inductible ou répri- mable à volonté du promoteur malEp, dont les capacités d'activation en présence de l'inducteur maltose et de répression en présence de glucose ont déjà été rappelées plus haut. Il est en particulier avantageux de réaliser la croissance des cultures bactériennes préalablement trans- formées en présence de doses de glucose n'interférant pas avec la capacité de développement des cultures, néanmoins suffisantes à éviter l'expression du gène recombinant, la culture étant ensuite soustraite à l'action du glucose, lorsqu'elle a atteint le stade de développement voulu et que l'expression du gène recombinant, avec pour consé- quence la production de la protéine hybride, devient souhaitée. Dans ces conditions, on protège la culture bactérienne en cours de développement contre l'éventuel effet toxique de la protéine hybride formée, celle-ci n'étant produite en quantités importantes qu'au terme du stade de développement d'abord recherché de la culture. Il est d'ailleurs avantageux de réaliser toutes ces opérations à une température inférieure à 37'C, no- tamment à une température comprise entre 28C et 35'C, par exemple voisine de 30C. L'effet toxique éventuel de la protéine hybride se trouve alors amoindri. Bien qu'il soit avantageux d'avoir recours au gène malE naturel pour la construction de l'ADN recombinant, il apparaîtra immédiatement à l'homme du métier que ces con- ditions ne sont nullement limitatives. En particulier, le promoteur malEp peut être remplacé par construction par tout autre promoteur efficace reconnu par la bactérie. En particulier, on peut avoir recours à tout promoteur fort dont l'activité constitutive peut être réprimée ou encore à tout promoteur fort inductible par le réglage approprié des conditions de culture des bactéries transformées. A titre d'exemple de promoteurs qui pourraient ainsi être substitués par construction au promoteur malEp, pour obtenir une expression dans E. coli, on mentionnera à titre d'exemples les promoteurs PL et PR du phage A, les promoteur de l'opéron lactose, de l'opéron tryptophane, des promoteurs mixtes dérivés des précédents, etc.. Tout autre hôte utilisable dans les techniques du génie génétique peut ainsi être utilisé, dès lors que les vecteurs utilisables pour la transformation sont dispo- nibles ou peuvent être conçus. On mentionnera à titre d'exemple d'autres types de bactéries dont l'utilisation a été décrite, par exemple B. subtilis ou les corynebactéries ou encore des levures ou des cellules eucaryotes supérieures, notamment de mammifères. Natu- i5 rellement la séquence codant pour la protéine MalE devra dans chaque cas être placée par construction sous le contrôle d'un promoteur approprié à son expression dans l'organisme-hôte. Dans chaque cas, l'opération de purification qui suit permet de séparer efficacement les protéines hybrides recherchées, grâce à leur affinité pour l'ose insolubilisé correspondant. Il est entendu que l'expression "séquence codant pour la protéine MalE" doit être considérée comme concer- nant aussi bien la séquence codant pour la protéine sau- vage que pour des protéines MalE modifiées, sous réserve que l'affinité caractéristique pour l'ose correspondant soit conservé. Il est tout aussi clair que cette expres- sion concerne également les séquences d'acides nucléiques qui différeraient des précédentes, par des substitutions de nucléotides n'altérant pas la structure de la protéine correspondante. De ce point de vue l'invention concerne également l'utilisation des séquences d'acides nucléiques produites partiellement ou totalement de façon synthéti- que, en mettant en jeu la dégénérescence du code génétique. Dans ce qui précède, l'invention a été décrite plus particulièrement en rapport avec la séquence nu- cléique codant pour une protéine MalE. L'invention n'est cependant pas limitée à l'utilisation de vecteurs recombinants incluant une séquence nucléique codant pour cette protéine. L'invention s'étend également à l'utili- sation de toute autre protéine-vecteur, dès lors qu'elle présente une affinité marquée pour un ose. On mentionnera à titre d'exemple l'utilisation pour la production des ADNs recombinants nécessaires à la production de la protéine déterminée recherchée des séquences nucléiques codant pour les protéines affines de l'arabinose, -du galactose, du ribose, etc., les opérations de purification correspondantes comprenant alors la mise en contact ulté- rieure des protéines hybrides ainsi produites avec les oses respectivement amenés dans un état insolubilisé, notamment par polymérisation, le cas échéant à l'aide d'un agent de réticulation, tel que l'épichlorhydrine ou tout autre agent permettant à la fois la réalisation de cette polymérisation et la préservation des affinités mutuelles de l'ose et de la protéine affine de cet ose. A cet égard, il faut encore souligner l'avantage essentiel que représente l'utilisation de colonnes d'ose insolubilisé, alors fonctionnelles comme colonnes de chromatographie affine, au niveau - de l'innocuité postérieure.des produits qui peuvent en être séparés par des techniques d'élution usuelles, après avoir été au préalable fixés de façon sélective sur ces colonnes. Les produits constitutifs de ces colonnes sont normalement dépourvus de toute toxicité et leur utilisation sera d'un intérêt tout particulier pour la production de protéines ou de polypeptides ayant des applications en médecine humaine ou vétérinaire. En outre la capacité de rétention sélective de ces colonnes est très importante puisque c'est la matrice même des produits insolubilisés mis en oeuvre qui possède l'affinité pour le polypeptide vecteur sélectivement lié au produit recherché, contrairement aux colonnes de chro- matographie d'affinité classiques, dans lesquelles la ma- tière constitutive de la colonne est formée d'un matériau support, normalement inerte à l'égard des protéines ou polypeptides à isoler, sur lequel ont au préalable été fixées des molécules ou produits présentant l'affinité requise vis-à-vis du produit à séparer. Les protéines hybrides peuvent ensuite être récupérées à partir de l'ose insolubilisé, notamment par élution à l'aide d'une solution combinant un principe permettant leur déplacement. Cette solution contient de préférence l'ose soluble correspondant, en l'occurrence du maltose, lorsque le polypeptide vecteur est dérivé de la protéine MalE. Dans la description qui précède il n'a été évoqué que le cas de la purification des protéines hybrides con- tenant le polypeptide ou la protéine recherchés. Il faut d'ailleurs souligner que la protéine hy- bride peut former elle-même le polypeptide recherché, chaque fois que l'on souhaitera bénéficier de la conser- vation de propriétés propres du polypeptide vecteur ou encore, dans le cas de polypeptides ou de protéines immu- nogènes, de l'effet adjuvant d'immunité que peut apportée la partie MalE. Cet aspect est d'un intérêt tout parti- culier lorsque le polypeptide recherché présente un poids moléculaire relativement faible, incompatible avec une immunogénicité suffisante in vivo dudit polypeptide re- cherché. A cet égard il pourra là encore être fait usage de la technique décrite dans la demande de brevet européen n' 87.4005044 ou dans (11) pour déterminer le site approprié d'introduction de la séquence codant pour le polypeptide recherché dans la séquence codante du gène malE, de façon à simultanément conserver dans la protéine hybride les propriétés affines de la protéine MalE pour l'ose insolubilisé et assurer l'exposition convenable du polypeptide recherché au sein de la protéine hybride, pour que celle-ci possède les propriétés immunogènes recher- chées du polypeptide. L'invention n'est nullement limitée à la purifi- cation de protéines ou polypeptides hybrides. En particulier, la purification peut être conduite dans des conditions permettant la séparation de la protéine recherchée du polypeptide placé en amont dans la protéine hybride, vis-à-vis du sens de traduction, voire même la récupération de la seule protéine recherchée, dès lors qu'elle se trouverait placée entièrement en aval de la Orprotéine MalE (ou de la protéine affine correspondante pour un autre ose), dans la mesure o par construction une courte séquence nucléique codant pour un peptide spécifi- quement clivable par une enzyme déterminée ou un procédé chimique avait auparavant été intercalée dans l'acide nucléique recombinant, entre la séquence codant pour la protéine affine et la séquence codant pour la protéine recherchée. L'opération d'élution de la protéine recher- chée comprend alors le traitement de l'ose insolubilisé sur lequel a au préalable été fixée la protéine hybride par le traitement clivant spécifiquement ladite séquence d'aminoacides, la partie MalE de la protéine correspon- dante restant alors fixée sur l'ose. En variante l'hybride purifié peut être clivé en solution, puis la portion malE sélectivement retenue sur la colonne d'ose insolubilisé, la protéine recherchée se retrouvant pure dans le facteur qui n'est pas retenu sur la colonne. Il va de soi que le polypeptide recherché peut également être séparé de la protéine hybride, même s'il se trouve incorporé entre deux fragments de la protéine MalE au sein de l'hybride. Cela peut être le cas si l'acide nucléique recombinant avait antérieurement été construit de façon à prévoir la présence de deux sites clivables dans les conditions susindiquées, de part et d'autre de la séquence codant pour le polypeptide recherché. A titre d'exemple de séquence nucléique suscep- tible d'être insérée, notamment entre les première et seconde parties de la séquence codante, on mentionnera par exemple la séquence: ATCGAGGGTAGG IleGluGlyArg laquelle est clivable sélectivement par le facteur Xa, dont l'intervention dans la coagulation du sang est bien connue. Il va de soi que l'utilisation de cette séquence particulière ne peut être envisagée qu'à condition que la protéine recherchée ne contienne pas de séquence tétrapep- tidique supplémentaire. On mentionnera encore à titre d'autre exemple de séquences d'aminoacides ainsi sélecti- vement clivables, les séquences qui apparaissent dans le tableau I qui suit et dans lequel ont été citées des sé- quences caractéristiques ainsi que les enzymes permettant leur clivage au niveau de l'acide aminé repéré à l'aide d'une petite flèche verticale. \ TABLEAU I côté de l'acide aminé C-terminal Entérokinase Asp Asp Asp Lys Collagénase Pro XIGly Pro YI(Pro ValiGly Pro) Trypsine Lys et Argi Clostridiopeptidase B Argi(Lys) Protéase staphy- lococcique 5p et Gltx Thermolysine Leu, Ile, Phe et Val (et autres) Chymotrypsine Phe,Trp et Tyr Pepsine Phel, Trpi et Tyri (et autres) On peut également avoir recours à de clivages chimiques spécifiques au niveau des acides aminés ou des dipeptides qui suivent. TABLEAU II côté de l'acide aminé C-terminal Bromure de cyanogène Met C Acide formique AspSPro J Amine hydroxyle Asn Gly Réactifs oxydants Trpt 2-Nitro-5-thiocya- nobenzoate Cys Le choix de la séquence mise en oeuvre dépendra de la structure même du polypeptide dont l'intégrité devra être conservée à l'issue de cette opération de purification. Des caractéristiques préférées de l'invention aparaitront encore au cours de la description qui suit de constructions préférées de l'invention, schématiquement représentées dans les fig. 1 et 2 du dessin, sans que celles-ci puissent être considérées comme ayant un carac- tère limitatif. Les plasmides qui ont été mis en oeuvre dans ces constructions ont déjà fait l'objet de descriptions an- térieures. On se reportera notamment: - à la publication de VIERA et MESSING, 1982, pour ce qui est du plasmide pUC9, - à la publication de WILLIAMS et NEUBERGER, 1986, pour la description du fragment BamHI-PolAK-BamHI qui code pour le fragment de Klenow de l'ADN polymériase I, - à l'article de NEUBERGER et al, 1984, pour la descrip- tion du phage M13Mp8 recombinant qui contient le gène nuc de la nucléae de S. aureus, - à la publication de P. DUPLAY et al, J. Mol. Biol., 194, 663-673, 1987, pour ce qui est des plasmides pPD91, pP127 et pPD140, dont il sera question ci-après. 1) Fabrication d'un plasmide codant Pour la protéine hybride MalE91Klenow, exprimant à la fois l'activité de MalE et l'activité de l'enzyme Klenow. L'hybride entre malE et PolAK a été construit de la façon suivante. Le fragment BamHI-polAK décrit dans NEUBERGER 1986, repris à partir du plasmide pUC9 recombinant obtenu, a été inséré dans le plasmide pPD91, plus particulièrement dans le linker BamHI de celui-ci, lui-même contenu dans le gène malE, au niveau du triplet codant pour le 362ème acide aminé de MalE. Cette insertion devait donc avoir pour résultat de placer le gène polAK en aval de la plus grande partie du gène malE. L'orientation de polAK dans les plasmides recombinants obtenus a été déterminée par double digestion BglII-SacI. Celui des plasmides dans lequel polAK se trouvait correctement orienté a été * dénommé pHB11. Celui-ci code pour la protéine MalE91- Klenow. Le plasmide pHB11 est schématiquement représenté dans la fig. 1. Le site BamHI, représenté dans la partie droite de la figure, sépare la partie du gène codant pour la partie distale de MalE91 et la partie proximale du gène volA codant pour l'enzyme Klenow. A partir de pHBII, il a été obtenu un plasmide pHB12 portant une mutation dans la séquence signal du gène malE. A cet effet, on a effectué un échange par recombi- naison génétique entre les fragments PstI-BglII de pHB11, qui comportait cette séquence néanmoins dépourvue de mutation avec la séquence PstI-BglII correspondante issue du plasmide pPD127 décrit dans (4), qui contenait une telle mutation. pHB12 code pour la protéine hybride malE127/91-Klenow. 2) Fabrication d'un plasmide codant pour une protéine hybride MalE140-Nuc, exprimant à la fois une activité MalE et une activité de nucléase. Un fragment (BamHI-nuc-SalI) codant pour la nu- cléase de S. aureus a été excisé du phage MP8 recombinant décrit dans NEUBERGER et al, 1984, et substitué, par ligation dans pBR322, en lieu et place du fragment BamHI-SalI initialement contenu dans celui-ci. Le plasmide obtenu a été dénommé pHB13. Par échange du fragment EcoRI-BamHI de pHB13, im- médiatement en amont du fragment (BamHI-nuc-SalI), avec le fragment (EcoRI-(malEp-malE)-BamHI) du plasmide pDP140, on a obtenu le plasmide pHB14, dans lequel le gène nuc était alors placé en aval du gène malE. Ces deux gènes ont été mis en phase: - par remplissage des extrémités cohésives du site unique BamHI contenu dans pHB14, en présence des quatre déoxynu- cléotides et de polymérase de Klenow. pHB15 code alors pour une protéine hybride MalE140-nucléase. 3) Production et purification des protéines hybrides MalE91-Klenow et MalE140-Nucléase par des cultures de E. coli transformées au préalable par les plasmides pHB11, pHB12 et pHB15, respectivement. La souche PD28, un dérivé AmalE444, malTc1, recA::tn10 de MC4100 de E. coli (4) a été utilisée comme hôte pour l'expression des gènes hybrides. La délétion AmalE444 du gène malE, qui est non polaire sur l'expres- sion des gènes distaux de l'opéron malE-malF-malG, évite l'expression de la protéine MalE sauvage à- partir du chromosome bactérien et sa copurification avec les hybrides sur MalE. AmalE444 rend la souche PD28 défective pour le transport du maltose. La mutation malTc 1 permet l'activation constitutive du promoteur malEp en l'absence de maltose inducteur. Pour éviter le risque de léthalité de l'expression constitutive de protéines hybrides pour la cellule, on a fait croître tous les dérivés de PD28 en milieu complet additioné de 0,4 à 2 % de glucose. Dans ces conditions le promoteur malEp est fortement réprimé, sans que soit entravé le développement de la culture sur un milieu complet. Un lavage des cellules et leur mise en culture dans un milieu complet dépourvu de glucose, éven- tuellement additionné de maltose, permet alors d'obtenir l'expression de MalE ou de protéines hybrides à partir de ces plasmides dès la première génération. On effectue toutes les croissances à 30'. Des expériences de contrôle ont montré que l'expression ou l'exportation en grande quantité de MalE à partir d'un plasmide sont abolies à 42 ' Quand ils sont introduits dans la souche PD28, les plasmides pPD1, pPD91, pPD140 et pHB15 provoquent l'ex- pression, en quantité importante, des protéines MalE, MalE91, MalE140 et de l'hybride MalE140-Nucléase. On trouve ces quatre protéines dans la fraction cellulaire libérée à partir du périplasme, lorsque les bactéries productrices sont soumies à un traitement visant à provoquer un choc osmotique. Les plasmides pPD127, pHB11 et pHB12 provoquent l'expression, en quantités importantes, de la protéine MalE127 et des hybrides MalE91- Klenow et MalE127/91-Klenow dans la fraction cellulaire soluble. Il est à remarquer qu'une certaine proportion de MalE91-Klenow a également été exportée dans le périplasme (produite par le plasmide pHB11 qui ne portait aucune mutation dans la séquence signal du gène malE). Les protéines MalE sauvage, MalE91, MalE140 et MalE127 (protéines témoins) et les protéines hybrides MalE140-Nucléase, MalE91-Klenow et MalE127/91Klenow, respectivement obtenues à partir des cultures bactériennes correspondantes, ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur amylose pontée dans les conditions décrites dans (4). Dans les cas de MalE sauvage, MalE140-Nucléaze et MalE91-Klenow, cette purification a été faite à partir d'extraits périplasmiques. Dans les cas de MalE127 et MalE127-Klenow, la purification a été faite à partir d'un extrait soluble de cellules entières. Dans chaque cas, on a traité une culture de 500 ml ensemencée à une densité optique, mesurée à 600 nm, égale à 0,1 et récoltée à une densité égale à 1. Chacun des ex- traits (environ 140 mg de protéine pour les extraits so- lubles, obtenue à partir des bactéries entières, et envi- ron 14 mg pour les extraits périplasmiques), étant repris dans 25 ml d'un tampon (par exemple 50 mM Tris-Cl pH 7,5; 2,5 mM P-mercapto-éthanol; 0,1 PMSF, ont été déposés sur une colonne de 6 ml de résine; les colonnes ont été la- vées avec environ 5 volumes de tampon, puis les protéines ont été éluées au moyen de maltose 10 mM. Les quantités retenues et éluées ont été égales à 1,76 mg pour MalE sauvage, 1,64 mg pour l'hybride MalE140- Nucléase, et 1,16 mg pour MalE127. Les colonnes n'étaient pas saturées puisque MalE et l'hybride MalE140-Nucléase n'ont pas été retrouvés dans les fractions qui avaient passé au travers des colonnes sans être retenues. En revanche seule une faible proportion (68 pg) de l'hybride MalE127/91Klenow devait être retenue sur la colonne dans les mêmes conditions, ce qui suggère que, dans le cas particulier de cette protéine hybride, la portion polymérase de Klenow perturbe le' repliement cor- rect de la portion malE de celle-ci. On a obtenu 172 pg de protéine hybride MalE91- Klenow purifiée à partir de l'extrait périplasmique, après chromatographie d'affinité dans les conditions sus-indi- quées. On a trouvé que l'activité de l'hybride MalE140- Nucléase était égale à 2100 unités nucléase/mg d'hybride, c'est-à-dire 8942 u/mg de la portion nucléase de l'hy- bride. Par comparaison, l'activité d'une préparation commerciale de nucléase (Boehringer) était égale à 2580 u/mg. Par conséquent, la nucléase a sa pleine activité dans l'hybride. La souche PD28 (pHB15) a un phénotype Mal sur milieu MacConkey maltose à 30'. Par conséquent, le gène hybride malE140-nuc est capable de compléter la délétion AmalE444 pour la fermentation du maltose et l'hybride MalE140-Nucléase est au moins partiellement actif pour le transport du maltose. En résumé, l'hybride MalE140-Nucléase est exporté dans le périplasme et con- serve les activités de ses deux partenaires. On a trouvé que l'activité de l'hybride MalE127/91-Klenow était égale à 4514 unités polymérase/mg d'hybride, c'est-à-dire 7431 u/mg de la portion fragment de Klenow de l'hybride. Par comparaison, l'activité d'une préparation commerciale de fragment de Klenow (Boehringer) était égale à 9445 u/mg. Par conséquent, le fragment de Klenow a sa pleine activité dans l'hybride. En résumé, l'hybride MalE127/91-Klenow est une protéine cytoplasmique qui possède l'activité polymérase et au moins certaines des propriétés de MalE. On a trouvé que l'activité de l'hybride MalE91- Klenow était égale à 3100 unités polymérase par mg d'hybride, c'est-àdire 5100 unités/mg de la portion fragment de Klenow de l'hybride. Par conséquent, le fragment de Klenow conserve également son activité dans l'hybride MalE91-Klenow. En résumé l'hybide MalE91-Klenow peut être repor- tée dans le périplasme, tout en conservant l'activité po- lymérase et certaines des propriétés de malE. Les préparations de protéines étaient pures à 95 %, comme l'ont montré des analyses par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS. L'homme de métier appréciera que ces protéines auraient pu être purifiées davantage encore, par des moyens classiques, par exemple par dia- lyse. En conclusion, MalE possède plusieurs avantages comme protéine vecteur sur les autres systèmes existants. C'est une protéine bactérienne; elle est de taille moyenne et monomérique, à volonté périplasmique ou cytoplasmique, facilement purifiable par chromatographie d'affinité sur un support d'affinité très peu coûteux; on peut l'éluer de la résine dans des conditions physiolo- giques, compatibles avec la conservation de pleines acti- vités des polypeptides ou protéines synthétisés. De plus elle permet d'exporter dans l'espace périplasmique des protéines normalement cytoplasmiques. La capacité de ces dernières à être transportées dans la région périplasmique pourra être chaque fois appréciée expérimentalement. Il peut encore être souligné que la capacité de transport dans cette région peut être interprétée comme tenant à la très grande efficacité à cet effet de la protéine MalE et à la possibilité que ce transport est peut-être effectué avant même que le replie- ment correct de la protéine ait été achevé. Les plasmide pHB11 et pHB15 ont été déposés à la Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes (CNCM) de l'INSTITUT PASTEUR de Paris, le 18 mai 1987, sous les n' 1-662 et 1-663 respectivement.. BIBLIOGRAPHIE 1. DUPLAY, P., BEDOUELLE, H., FOWLER, A., ZABIN, I., SAURIN, W., HOFNUNG, M. 1984, J. Biol. Chem., 259, 10606-10613. 2. BEDOUELLE, H., BASSFORD, P.J., Jr., FOWLER, A.V., ZABIN, I., BECKWITH, J. et HOFFNUNG, M. 1980, Nature, 285, 78-81. 3. FERENCI, T. et KLOTZ, U. 1978, F.E.B.S. Letters, 94, 213-217. 4. DUPLAY, P., SZMELCMAN, S., BEDOUELLE, H. et HOFNUNG, M. 1987, J. Mol. Biol., 194, 663-673. 7. JOYCE, C.R.-et GRINDLEY, N.D.F. 1984. J. Bacteriol., 158, 636-643. 8. VIEIRA, J. et MESSING, J. 1982, Gene, 19, 259-268. 9. NEUBERGER, M.S., WILLIAMS, G.T. et FOX, R.O. 1984. 10.WILLIAMS G.I. et NEUBERGER M.S. 1986, Gene 43, 319-324. 11.CHARBIT, A. et al, 1986, Embo J., vol. 5, n 11, 3029-3037. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication et de purification d'un polypeptide contenant une chaine peptidique déterminé possédant elle-même des propriétés choisies, susceptibles d'être exprimées, qui comprend une étape consistant à provoquer l'expression dans un organisme-hôte approprié transformé et mis en culture à cet effet, d'un acide nucléique recombinant codant pour un polypeptide hybride dont une première partie consiste en un polypeptide vecteur et une seconde partie en la susdite chaîne peptidique, une étape de récupération du polypeptide hybride exprimé sous la forme d'une solution à partir du susdit hôte cellulaire et une étape de purification, caractérisée en ce que le polypeptide vecteur est une protéine affine pour au moins un ose déterminé, en ce que l'étape de purification comprend la mise en contact de la solution du polypeptide hybride avec un ose correspondant sous une forme insolubilisée compatible avec l'affinité mutuelle de la protéine affine et de l'ose, notamment un ose polymérisé, et en ce que l'on récupère, après séparation des produits non fixés sur l'ose, le polypeptide ayant les susdites propriétés choisies, à partir des produits fixés sur l'ose. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique recombinant contient une sous-séquence codant pour une séquence d'aminoacides sélectivement clivable par une enzyme spécifique ou un traitement chimique spécifique et placée entre les parties de l'acide nucléique recombinant codant respectivement pour le susdit polypeptide vecteur et ladite chainc pepti- dique, et en ce que l'on récupère le polypeptide ayant les susdites propriétés choisies à partir des produits fixés sur l'ose, par traitement de ces derniers avec l'enzyme spécifique ou le traitement chimique spécifique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique recombinant contient une sous-séquence codant pour une séquence d'aminoacides sélectivement clivable par une enzyme spécifique ou un traitement chimique spécifique et placée entre les parties de l'acide nucléique recombinant codant respectivement pour le susdit polypeptide vecteur et ladite chaîne pepti- dique et, le cas échéant, une séquence semblable en aval de la séquence codant pour ladite chaîne peptidique, et en ce que, après récupération du polypeptide hybride à partir de l'ose insolubilisé, on traite le polypeptide hybride en solution par l'enzyme spécifique ou le traitement chimique spécifique, en ce que l'on remet en contact les produits de clivage de la protéine hybride avec l'ose insolubilisé et en ce que l'on récupère le polypeptide alors non fixé conistant essentiellement en la chaîne d'acides aminés recherchée. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le polypeptide vecteur est constitué par une protéine affine de maltose et en ce que l'ose insolubilisé est un polymère insoluble de "(1-4) glucose ou de l'amylose. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que la susdite séquence d'acide nucléique est sous le contrôle d'un promoteur réprimable par un composé susceptible d'être apporté de l'extérieur à l'organisme-hôte, notamment dans son milieu de culture, et en ce que l'on réalise dans un premier temps la culture de l'organisme-hôte préalablement transformé avec la susdite séquence nucléique en présence de ce composé, avant de soustraire la culture à l'action de ce composé dans des conditions permettant l'expression de la susdite séquence nucléique. 6. Procédé selon la revendication 3 ou la reven- dication 5, caractérisé en ce que le polypeptide vecteur est la protéine affine de maltose de E. coli (malE). 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'organismehôte utilisé pour la production du polypeptide hybride est E. coli, de préférence un E. coli dont le génome comporte une mutation interdisant l'ex- pression du gène malE endogène. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence nucléique contenant la partie codant pour malE comprend tout ou partie du gène malE de E. coli, y inclus le promoteur malEp qui normalement contrôle l'expression de ladite partie d'acide nucléique dans E. coli, et en ce que l'on récupère ensuite le polypeptide hybride à partir du périplasme bactérien. 9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la séquence nucléique contenant la partie codant pour malE comprend tout ou partie du gène malE de E. coli, y inclus le promoteur malEp et la séquence signal précédant la séquence malE, caractérisé en ce que cette séquence signal comporte elle-même une mutation dont l'effet est d'empê- cher l'exportation de la protéine MalE dans le périplasme, et que l'on récupère le polypeptide hybride à partir du cytoplasme des bactéries cultivées. 10. Procédé selon la revendication 4, prise seule ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications à 9, caractérisé en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine affine de maltose est toute entière en aval de la séquence codant pour la chaine polypeptidique. 11. Procédé selon la revendication 3, prise seule ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications à 10, caractérisé en ce que les organismes-hôtes trans- formés sont maintenus en culture et à une température inférieure à 37C, notamment de 28 à 35 'C. 12. Procédé de fabrication et de purification d'un polypeptide contenant une chaîne peptidique déterminée possédant elle-même des propriétés choisies, susceptibles d'être exprimées, qui comprend une étape consistant à provoquer l'expression dans un organisme-hôte approprié transformé et mis en culture à cet effet, d'un acide nucléique recombinant codant pour un polypeptide hybride dont une première partie consiste en un polypeptide vecteur et une seconde partie en la susdite chaine peptidique et une étape de purification du polypeptide hybride exprimé sous la forme d'une solution à partir du susdit hôte cellulaire, caractérisé en ce que le poly- peptide vecteur est une protéine affine pour au moins un ose déterminé. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le polypeptide vecteur est la protéine affine de maltose de E. coli (malE). 14. Procédé selon la revendication 12 ou la reven- dication 13, caractérisé en ce que l'organisme-hôte est une bactérie, plus particulièrement E. coli, et en ce que la chaîne peptidique possédant des propriétés choisies est - constituée par une protéine cytoplasmique ou par une partie de celle-ci.