Brevet FR2611274A1 — publié le 19880826

La présente invention se rapporte à la détection et au traitement de maladies virales, et en particulier à celle du SIDA (syndrome immunodéficitaire acquis). Le SIDA est provoqué par un rétrovirus qui est trans- mis principalement par le sang et des composants du sang. Aux Etats-Unis par exemple, la maladie se manifeste de pré- férence dans-certains groupes: homosexuels, Haitiens, rece- veurs de transfusions sanguines et drogués par voie intravei- neuse. Les épidémiologistes pensent maintenant que la maladie est plus infectante et plus répandue qu'on ne le croyait jusqu'ici. Les patients, immunopositifs au regard du virus du SIDA, désigné ci-après par HIV (Virus d'immunodéficience humaine) ne présentent pas tous de symptômes. En effet, bien souvent le virus n'est pas décelé chez des patients qui sont immunopositifs vis-à-vis de l'HIV. C'est pourquoi le clini- cien a besoin d'un moyen permettant une détermination rapide des risques d'un patient qui se révèle immunopositif au regard de l'HIV. Le virus du SIDA a été identifié et largement caractéri- sé. La publication "Science", Volume 224, (1984)> comporte qua- tre articles sur l'identification d'un produit d'isolation de l'HIV, identifié ici comme HTLV-III. Le génome viral a été complètement établi. Une représen- tation développée figure dans la publication "Nature", 313; 277-284 (1985). L'HIV est un rétrovirus, c'est-à-dire un virus qui utilise l'ARN au lieu de l'ADN comme matériel génétique, et qui doit produire un équivaient ADN du gène ARN pour sa répli- cation. En raison de ce mode de réplication inhabituel, le virus doit coder pour une enzyme qui est la transcriptase in- verse. La transcriptase inverse est une enzyme qui transcrit le code génétique de l'ARN viral dans l'ADN viral, à l'in- térieur de l'hôte cellulaire. Cela constitue un stade néces- saire au cours du cycle de réplication du virus. La transcriptase inverse pour l'HTLV-III/LAV est décri- te dans "Science", Vol. 231, page 1289 (1986). La publication "Virology", Vol. 147, pages 326-335 (1985), caractérise la transcriptase inverse et décrit les conditions optimales pour la déceler. La transcriptase inverse pour l'HIV provoque habituelle- ment une forte réponse immune chez les humains en bonne santé. On a maintenant découvert qu'il était possible d'effectuer une détermination des risques concernant l'évolution future de la maladie chez un patient donné, connu pour être immunoposi- tif au regard de l'HIV, grâce à la détection d'anticorps qui inhibent l'action de la transcriptase inverse. Lorsque ces anticorps inhibant la transcriptase inverse sont présents, la détermination est bonne. Cependant, lorsque l'individu ne possède pas d'anticorps pour la transcriptase inverse, la détermination est sombre. Un tel individu peut présenter la gamme entière de symptômes relatifs au SIDA, qui peuvent con- duire à la mort de l'individu. La présente invention se rapporte à un ensemble pour la détection de l'éventuelle tendance d'un patient immunopositif à l'égard de l'HIV à avoir le SIDA. Cet ensemble ou trousse comprend: 1) une solution de transcriptase inverse de l'HIV; 2) une matrice appropriée d IARN amorcé; 3) un triphosphate de nucléoside pour la synthèse de l'ADN; 4) un témoin de sérum positif, renfermant une quanti- té connue d'anticorps inhibant la transcriptase in- verse de l'HIV; et ) un témoin de sérum négatif ne renfermant pas d'an- ticorps de l'HIV. L'invention concerne également un procédé de dépista- ge chez un patient connu pour être immunopositif vis-à-vis de l'HIV, comprenant la détection quantitative d'un anticorps inhibiteur de la transcriptase inverse de l'HIV dans le flui- de corporel du patient. Elle se rapporte en outre à une com- position thérapeutique contre le SIDA qui comprend une quanti- té pharmaceutiquement acceptable d'un anticorps de transcrip- tase inverse de l'HIV applicable à des individus présentant des symptômes de maladie provoqués par l'HIV. Le virus qui provoque le SIDA et les symptômes cor- respondants, tel qu'entendu ici, est identifié comme le vi- rus de leimmunodéficience humaine (HIV). L'HTLV-III et le LAV peuvent être considérés comme des produits spécifiques d'iso- lation de l'HIV. En dépit de confusion dans la nomenclature, la plupart des chercheurs sont convaincus que les virus identifiés par ces différentes désignations sont, en fait, des variantes du même virus et provoquent tous le SIDA. Tel qu'utilisé ici, le terme "SIDA" (Syndrome Immuno. déficitaire Acquis) se réfère à la maladie cliniquement définissable, définie par la présence d'infections opportunis- tes, comme sarcome de Kaposi, pneumonie pneumocystis carinii et similaires. Tel qu'utilisé ici, le terme "pré-SIDA" se rapporte à une réponse immune, fortement déprimée chez des patients positifs au regard de l'HIV, mais pas assez grave pour abou- tir à un diagnostic de SIDA. Le terme "transcriptase inverse de l'HIV", employé ici, désigne l'enzyme qui est produite par le virus naturel pour transcrire l'ARN viral en ADN. "Transcriptase inverse de l'HIV" est utilisé ici pour désigner cette enzyme, sans considération de sa source. Toute variante de transcriptase inverse de l'HIV, par exemple une transcriptase inverse similaire, pouvant avoir une ou plusieurs substitutions d'amino-acide, peut être considérée comme une transcriptase inverse de l'HIV, si le vires qui la produit est considéré comme une variante de l'HIV. Cette enzyme peut être produite naturellement par le virus, ou artificiellement par des techniques du génie génétique, ou similaires. L'appellation "anticorps inhibant la transcriptase in- verse de l'HIV" représente ici tout anticorps de transcrip- tase inverse de l'HIV, qui arrête ou inhibe l'action enzyma- tique de la transcriptase inverse de l'HIV. Il est à remar- quer que de nombreux anticorps différents peuvent être pro- duits par la réponse immune humaine à la transcriptase in- verse de l'HIV, mais la plupart des anticorps produits n'inhi- bent pas l'action de la transcriptase inverse de l'HIV. La présente invention ne se rapporte qu'aux anticorps qui inhi- bent le mode d'action de la transcriptase inverse de l'HIV. On notera également que de nombreux anticorps spécifiques, différents, peuvent inhiber la transcriptase inverse de l'HlV. Tous ces anticorps, ainsi que toutes leurs combinaisons, font partie de la présente invention. "Immunopositif au re- bard de i'HIV", signifie ici qu'un patient donné présente des quantités décelables d'anticorps de l'HIV dans son sang, sans se préoccuper de savoir si on peut isoler le virus de son sang, ou s'il présente des symptômes manifestes de la maladie. Le terme "ensemble", tel qu'utilisé ici, se rapporte à un ensemble ou trousse de réactifs simplement emballés et d'utilisation facile pour déceler la présence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV. Le nombre précis des tubes de réaction, leurs supports, et ainsi de suite, constituent des choix qui peuvent être aisément faits par l'homme de l'art. Le terme "matrice d'ARN", utilisé ici, se réfère à un polymère ARN utilisable dans l'appareil et le procédé selon l'invention. La matrice préférée d'ARN est l'acide polyadény- lique (ci-après désigné par "poly rA". Le Poly rA amorcé, en présence de transcriptase inverse et de triphosphate-5' de thymidine (désigné ciaprès par dTTP), et en l'absence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, produit de l'acide polythymidylique (ci-après appelé "poly dT"). Dans la présente description, "matrice d'ARN amorcé" se rapporte à un long brin d'ARN comportant un brin complémen- taire court d'ADN à l'extrémité des OH-3. De manière caracté- ristique, l'ADN est long d'environ 12 à 18 bases. Un modèle d'ARN amorcé, particulièrement préféré, est l'acide polyadé- nylique/acide oligothymidylique (ci-après désigné par "poly rA. oligo dT"). Tel qu'utilisé ici, le "triphosphate de nucléoside pour la synthèse d'ADN"peut être tout triphosphate de désoxyribo- nucléosite qui aboutit à la détection de la transcriptase in- verse de l'HIV. Un triphosphate de nucléosite préféré, et le seul qui opère si la matriced'ARN est le poly rA, est le dTTP. Ce dTTP peut être radio-marqué avec du tritium ou avec toute autre substance qui détecte le produit ADN, comme l'enzyme biotine-avidine. Au cours de la détection selon la présente invention, l'absence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV peut être indiquée par la synthèse et la présence de poly dT radio-marqué. Inversement, la présence de l'anticorps peut être indiquée par l'absence de synthèse et d'existence de poly dT radio-marqué. Dans la présente description, un "témoin de sérum posi- tif" est une solution avec une quantité connue d'anticorps inhibant la transcriptase inverse, et un"témoin de sérum négatif" est du sérum humain normal, sans anticorps de protéines dues à l'HIV. Par "fluide corporel", on entend tout fluide contenu dans, ou produit par, le corps humain qui a des anticorps. Le fluide corporel préféré est le sérum sanguin. La présente invention s'avère intéressante pour élaborer une détection de risques pour des patients connus pour être immunopositifs au regard de l'HIV. Le dépistage selon l'in- vention permet une détermination précoce de qui est suscepti- ble d'avoir le SIDA et de qui n'est pas susceptible d'être affecté par des symptômes évidents. A mesure que se répand la recherche de la présence de l'HIV dans le sang, un nombre croissant de personnes souffrent de tensions psychologiques, lorsqu'elles savent qu'elles sont positives à l'HIV, mais ne savent pas si elles présentent les symptômes de la maladie. Le pronostic précoce peut également permettre une intervention clinique précoce, dans un cas.qui peut n'avoir pas évolué vers des symptômes de pré-SIDA. L'ensemble de la présente invention comprend un immuno- essai pour déterminer la quantité d'anticorps humains dans le sérum d'un patient, inhibant la transcriptase inverse de l'HIV. Cet ensemble comprend: a) une solution de transcriptase inverse de l'HIV; b) une matrice appropriée d'ARN amorcé; c) des triphosphates de nucléoside appropriés, pour la synthèse de l'ADN, notamment au moins un triphosphate de nucléoside radio-marqué; d) un sérum positif témoin; et e) un sérum négatif témoin. La matrice d'ARN amorcé convenable est normalementle poly rA/oligo dT. Le triphosphate de nucléoside approprié pour la synthèse de l'ADN est normalement du dTTP tritié. Ce triphosphate de nucléoside doit être naturellement le complément du modèle de l'ARN amorcé. Lorsqu'on utilise de l'ARN naturel comme amorce, il s'agit d'un brin naturel d'ARN fait des quatre bases, et alors les quatre triphosphates de désoxyriboside sont présents. Lorsqu'on utilise le poly rA comme matrice, le précurseur doit être le dTTP. Le poly dT, complément de poly rA est ensuite produit au cours du proces- sus de transcription inverse. Le poly rA est amorcé avec un brin court d'oligo dT ayant environ 12 à 18 nucléotides à l'extrémité OH-3 du brin d'ARN. Les triphosphates de nucléoside, la matrice amorcée et la transcriptase inverse sont dans un tampon de réaction enzymatique. Un tampon de réaction approprié est constitué par: 50 mM de Tris-HCl, pH 7,9, 5 mM de dithiotreitol, 0,3 mM de glutation réduit, 5 mM de chlorure de magnésium, 150 mM de chlorure de potassium, 0,5 mM d'acide éthylène glycol-bis- (aminoéthyléther) N,N'-tétraacétique (ci-après EGTA), 0,05% de triton X100, 2% d'éthylène glycol, 2,5 microgrammes de matrice amorce, et 20 microcuries de dTTP tritié radio- marqué. Le sérum positif témoin est un étalon ayant une con- centration connue d'un anticorps inhibant la transcriptase in- verse. Le sérum négatif témoin est du sérum humain normal, ne présentant pas d'anticorps de HIV. Les témoins de sérum positif et de sérum négatif, sont utilisés pour former une ligne de base. La quantité d'anticorps peut être déterminée par la comparaison de la radioactivité provenant de l'incon- nu avec celles que l'on décèle à partir des deux témoins. On met à incuber à environ 30 à 370C, de préférence à 37 C, pendant 24 à 48 heures, de préférence environ 48 heu- res, la solution de transcriptase inverse, la matrice d'ARN amorcé et le triphosphate de nucléoside. La période d'incu- bation permet la formation d'ADN à partir des triphosphates de nucléoside sur la matrice d'ARN amorcé en présence de la transcriptase inverse. La présente invention nécessite un moyen pour itoler, s'il se forme, le brin d'ADN marqué. Un procédé préféré con- siste à précipiter l'ADN. L'ADN, produit dans la forme de réalisation préférée de l'invention, est le poly rA/poly dT. On peut faire passer la solution incubée à travers un filtre microporeux qui permet le passage de dTTP, mais non celui de l'ADN. Convient notamment, comme filtre microporeux, le fil- tre en microfibre de verre GF/A de WHATMAN. On peut ensuite analyser la radioactivité retenue par ce filtre. Une fois l'ADN isolé par tout moyen connu de l'homme de l'art, la radioactivité retenue est décelée quantitative- ment. La quantité de radiation décelée est alors comparée avec la quantité décelée lorsqu'on utilise, au lieu d'un échantillon de patient, les témoins positif et négatif. Dans la pratique, un échantillon de sérum du patient est essayé quant à la présence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, par sa mise en contact avec les réactifs de l'ensemble. Lorsque le sérum du patient renferme un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, la formation de poly dT est inribée ou empêchée. La quantité d'anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, dans le sérum du patient, peut être mesurée par comparaison avec le témoin sérum positif qui renferme une quantité connue d'anticorps de transcriptase inverse. Lorsque le sérum du patient ne contient pas d'anticorps inhibant la transcripta- se inverse, la formation d'acide polythymidylique se fait à un taux proche de celui du témoin de sérum négatif. Il est connu de l'homme de l'art que les anticorps de transcriptase inverse de l'HIV peuvent être décelés par de nombreuses autres méthodes connues des spécialistes. Par exem- ple, des complexes antigène/anticorps peuvent être formés et détectés au moyen de techniques comme le test ELISA, le Western Blot, et similaires. Cependant, seules les techniques qui déterminent l'inhibition de la transcriptase inverse de HIV peuvent être utilisées pour déceler un anticorps inhibant cette enzyme. La présente invention concerne également une composition thérapeutique pour individus positifs vis-à-vis de l'HIV, mais négatifs vis-à-vis d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV. Ce médicament contient, en tant qu'agent actif, une quantité appropriée d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV. L'administration de ce médi- cament procure artificiellement l'anticorps nécessaire pour combattre une maladie ultérieure due à l'HIV. Elle peut être avantageusement utilisée pour le traitement du SIDA et du pré-SIDA. La transcriptase inverse de l'HIV, utilisable dans l'ensemble ci-dessus, peut être fournie soit en l'isolant de cellules infectées par l'HIV, soit par des techniques du génie génétique. Un anticorps, inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, peut être obtenu par isolation à partir d'individus connus pour produire cet anticorps à partir de leur sérum sanguin. Des anticorps intéressants peuvent être également produits au moyen de techniques utilisant un anticorps mono- clonal. REVENDICATIONS 1. Ensemble ou trousse de réactifs pour la détection de l'éventuelle tendance d'individus immunopositifs vis-à-vis du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) à avoir le SIDA (syndrome immunodéficitaire acquis), caractérisé en ce qu'il comprend: (1) une solution de transcriptase inverse de l'HIV; (2) une matrice appropriée d'ARN amorcé; (3) un triphosphate de nucléoside, pour la synthèse de l'ADN; (4) un témoin de sérum positif, renfermant une quantité connue d'anticorps inhibiteur de la transcriptase inverse de l'HIV; et (5) un témoin négatif de sérum ne contenant pas d'anti- corps de l'HIV. 2. Ensemble suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la matrice amorcée est l'acide polyadénylique: acide oligothymidylique ( poly rA: oligo dT). 3. Ensemble suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le triphosphate de nueléoside est le thymidine 5'-triphos- phate tritié (dTTP) et en ce que l'acide polyadénylique (poly rA): acide polythymidylique (poly dl) est sous la forme d'ADN synthétisé. 4. Ensemble suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour précipiter le poly-rA: poly dT. 5. Ensemble selon la revendication 4, caractérisé en ce que les moyens pour ladite précipitation sont constitués par un filtre microporeux qui laisse passer le dTTP et non pas le poly-rA: poly dT. 6. Ensemble suivant l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour la détection quantitative de la radioactivité émise par l'acide polythymi- dylique tritié. 7. Procédé pour la détermination des risques de SIDA (syndrome immunodéficitaire acquis) pour un individu humain, immunopositif vis-àvis du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), caractérisé en ce que l'on détecte quantitati- vement, dans un fluide corporel de l'individu,notamment dans son sang, la présence d'un anticorps inhibiteur de la trans- criptase inverse de l'HIV. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend: la mise en contact du fluide de l'individu avec une solution de transcriptase inverse de l'HIV, une matri- ce d'ARN amorcé et un précurseur de nueléotide marqué, complé- mentaire de ladite matrice; l'incubation du mélange résultant, pendant un temps suffisant; et la détection quantitative de poly-rA: poly-dT (acide polyadénylique: acide polythymidyli- que) marqué, formé. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'on sépare le précurseur marqué de nucléotide, qui n'a pas réagi, de tous polymèresformés. 10. Procédé suivant la revendication.8 ou 9, caracté- risé en ce qu'il comprend la comparaison de la quantité de poly-rA: poly-dT marqué, détectée dans le fluide de l'indi- vidu, avec celle d'un échantillon renfermant une quantité connue d'un anticorps inhibiteur de la transcriptase inverse de l'HIV. 11. Composition thérapeutique contre le SIDA (syndro- me immunodéficitaire acquis), caractérisée en ce que sa ma- tière active est constituée par des anticorps inhibiteurs de la transcriptase inverse du virus de l'immunodéficience humai- ne (HIV).