Brevet FR2615865A1 — publié le 19881202

La présente invention concerne un test de génotypage de poulet. Actuellement, il est très intéressant, pour les sélectionneurs et éleveurs de poulets, de pouvoir effectuer le génotypage des poulets par une méthode fiable et dont les résultats soient clairement exploitables. Actuellement, ce typage est effectué par des méthodes sérologiques qui sont peu fiables. L'utilisation du test selon la présente invention permet le génotypage des poulets de façon claire et fiable. Ce test met en oeuvre la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de l'ADN génomique (RFLP) Dans le cas présent, ce test utilise une sonde moléculaire provenant d'une chaîne béta d'un antigène de classe II (ou B-L) du complexe majeur dthistocompatibilité du poulet (ou complexe B). Plus particulièrement, il s'agit d'un test de génotypage de poulets par la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de l'ADN génomique, caractérisé en ce que, après prélèvement de l'ADN de haut poids moléculaire des érythrocytes nucléés du sang du poulet testé, on soumet cet ADN à une fragmentation par au moins une enzyme de restriction et on hybride les fragments obtenus avec une sonde moléculaire provenant d'une chaîne codant pour une chaîne béta d'un antigène de classe II du complexe majeur dthistocompatibilaté du poulet. On identifie les fragments hybridés et leur taille pour affecter un génotype au poulet. La sonde utilisée provint donc d'un gène codant pour la chaîne Béta d'un antigène de classe II ou complexe B de poulet, il peut s'agir de différents clones, soit le clone 14 qui code pour la majeure partie de chaîne béta, ou bien de sous-clones, par exemple le sous-clone codant pour le domaine béta 2 qui sera appelé p250. Les techniques de prélèvement, d'hybridation et d'identification des fragments sont des techniques connues en elles-mêmes, de même que les opérations de génotypage. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence certaines caractéristiques du procédé selon l'invention ainsi que certains avantages liés à sa mise en oeuvre. Les exemples ci-après comportent tout d'abord la préparation de la sonde et des sous-clones correspondants ainsi que l'étude de sa structure et son utilisation dans des tests de génotypage. Sur les figures annexées - la figure I schématise le fragment d'ADN Sacl-EcoRI de 496 bp provenant du clone de cADN pli Béta-l (Larhammar et al., 1980), les extrémités GC qui proviennent du clonage sont représentées par des éléments hachurés, - SP - peptide signal Béta-l, Béta-2 - premier et second domaine extracellulaire CP, TM, CY - peptide de connection, domaine transmembranaire, domaine cytoplasmique 3'UT - extrémité 3' non traduite - la figure 2 est une carte de restriction partielle montrant la stratégie de séquençage du gène B-LBéta - la figure 3 représente la séquence des exons Béta-2 et transmembranaire du gène B-LBéta, la séquence d'ADN déterminée est représentée avec sa séquence traduite et sa comparaison directe avec la séquence de la sonde HLA-DQBéta (ligne inférieure), les nucléotides identiques présentent un astérisque, le numérotage part à gauche du site Psti de la séquence B-LBéta et est conforme à celui de pII Béta-l pour la séquence HLA-DQBéta. Structure du gène B-LBéta de poulet Par analyse de restriction enzymatique et analyse "Southern blot", il apparaît que les clones isolés représentent 3 à 5 gènes indépendants dans chaque librairie. L'un des clones d'une librairie LambdaL47, LambdaBL-Béta-612, qui a été choisi pour des analyses plus complètes, contient le segment d'hybridation sur un fragment d'ADN Hindlil de 3,2 kb qui a été ensuite sous-cloné et analysé en détail par séquençage d'ADN. La carte de restriction et les séquences obtenues de même que la comparaison directe avec la séquence de la sonde sont indiquées dans les figures 2 et 3. Il existe clairement deux régions homologues dans lesquelles aucune interruption n'existe.La première correspond à un exon Béta 2 typique et est séparée de la seconde qui correspond à un exon transmembranaire de chaîne Béta par 674 nucléotides, une distance du même ordre est observée dans les gènes de la chaîne Béta 2 de classe II humaine ou murine. Ces deux exons contiennent une phase de lecture ouverte qui peut être rattachée par épissage en utilisant les signaux typiques qui sont trouvés aux extrémités. Il doit être noté que ces limites intron/exon provoquent l'interruption du cadre de lecture entre les premières et secondes bases, comme cela est observé dans tous les gènes MHC et autres éléments de la famille des supergènes immunoglobuline. MATERIEL ET METHODE DETERMINATION DE LA SONDE HLA-DQBETA Un fragment d'ADN SacI-EcoRI de 496 bp provenant du clone HLA-DQBéta cADN plIBéta-l (Larhammar et al. 1982) a été sous-cloné dans PUC12 (Vieira et Messing, 1982). Le plasmide ADN a été préparé à partir d'une culture de E. coli saturée pendant une nuit avec extraction par alkali/SDS (Birnboim et Doly, 1979) suivie par une séparation sur deux gradients successifs de CsCl/bromure d'éthidium, restriction avec EcoRI-SacI et isolement du fragment 496 bp après électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 % par électro-élution et chromatographie sur cellulose DEAE. Le fragment isolé est marqué par "nick translation" avec une activité spécifique de 2 à 4.108 cpmlpg (Rigby et al., 1977). La sélection des librairies d'ADN génomiques de poulet est faite à partir d'une librairie génomique de phage Lambda Charon 4A (Dodgson et al. 1979) et une librairie génomique Lambda L47 (Ballivet et al. 1983) qui sont criblés avec la sonde HLA-DQBéta sur filtres dupliqués comme cela a été décrit par Maniatis et al., 1982). Les filtres nitrocellulose (Millipore HAHY) sont prélavés 2 heures à 42"C dans 50 mM Tris pH 8,0, 1M NaCI, 1M EDTA, 0,1 % SDS, préhybridés 4 heures à 420C dans 50 % de formamide, SxDenhardt, 5x SSPE, 0,1 % dans SDS, 1 Ciglml de poly (A), I lig/ml de poly (C), 100 pg/ml d'ADN de spermes de saumon dénaturés.La sonde ayant subi la "nick translation" est alors ajoutée au même tampon et l'hybridation est effectuée pendant 24 heures à 42"C et 24 heures à 37"C, lavée deux fois I heure à 450C et deux fois I heure à 550C dans 2x SSC, 0,1 SDS, puis les filtres sont exposés à un film aux rayons X pendant 3 à 7 jours avec deux écrans d'intensification. Les clones positifs sont purifiés par recriblage dans les mêmes conditions d'hybridation. Les phages d'ADN sont préparés comme cela est décrit par Maniatis et al. 1982. Une carte de restriction des phages recombinants est déterminée en utilisant l'approche digestion partielle oligo/cos (Rackwitz et al., 1984) et un fragment d'ADN de 3,2 kb Hindi1 hybridant la sonde HLA-DQBéta est mise en évidence par "Southern blot" en utilisant une membrane de nylon Genescreen (Southern et al., 1975). Ce fragment d'ADN est sous-cloné dans pUC9 (Vieira et Messing, 1982), pour donner le sousclone p14 et de nouveau analysé par restriction en utilisant des digestions simples ou doubles et le "Southern blot" comme cela est décrit précédemment.Deux fragments PstI de 450 bp et 250 bp de longueur s'hybrident à la sonde HLA-DQBéta, de même que les fragments PstI voisins sont sousclonés dans pUC9. p14 et les sous-clones PstI résultant p250, p450 et p650 qui ont été intégrés dans deux fragments contingus de 500 bp et 150 bp en longueur sont utilisés comme séquence d'ADN de détermination en utilisant le processus de dégradation chimique (Maxam et Gilbert, 1980). Les produits de séquençage sont analysés sur. des gels fins de polyacrylamide d'urée (Sanger et Coulson, 1978). EXEMPLE I ISOLEMENT DE CLONE GENOMIQUE DE POULET Comme cela ressort des la figure 1, on choisit une sonde de 496 bp, fragment -Sacl-EcoRI, dérivé d'un clone HLA-DQBéta (Larhammar et al., 1982). Tout d'abord, on détermine les conditions d'hybridation dans lesquelles cette sonde humaine pourrait détecter une séquence homologue chez le poulet. La sonde DQBéta marquée avec une très haute activité spécifique par "nick translation" est hybridée sur un "Northern blot" et, après lavage dans 2X SSC à 50"C, on détecte une série de bandes dans le mARN de rate de poulet.Parmi celles-ci une bande de 1 200 nucléotides, qui est absente des mARN de foie de poulet, et qui migre légèrement plus vite que l'ARNm mature de 1 300 nucléotides correspondant à la sonde humaine DQBéta, constitue un bon candidat pour un transcript de poulet de classe il. II est probable que les trois autres bandes correspondent à I'ARN ribosomal 185 et 285 et à un produit de dégradation de l'ARN de 28s. Des résultats très similaires sont obtenus après lavage dans 0,2X SSC à 35 C. Puis on utilise la sonde DQBéta pour sélectionner une librairie d'ADN génomique de poulet dans des conditions similaires, aux conditions 6 décrites précédemment. On a étudié 106 plaques de phages de deux librai- ries indépendantes (Dodgson et al., 1979 ; Ballivet et al., 1983). On a obtenu 19 clones à partir de la première librairie et 11 clones à partir de la seconde qui s'hybrident sur des filtres dupliqués qui ont été ensuite purifiés par sélections successives. De façon à vérifier que les clones isolés contiennent les gènes qui ont les caractéristiques attendues pour un gène MHC de classe II on a utilisé un phage total marqué pour resonder le même "Northern blot" qui avait été hybridé précédemment avec la sonde DQBéta. La bande de 1 200 nucléotides s'hybride très fortement avec la sonde de poulet dans les ARN de rate de poulet et l'ARNn de HLA-DQBéta de 1 30-0 nucléotides est détecté seulement sous forme d'une bande très faible. Ces résultats montrent de façon très claire qu'il s'agit bien de gènes de B-LBéta de poulet qui ont été isolés. EXEMPLE 2 TEST DE GENOTYPAGE Le génotypage est effectué de - la façon suivante Le test est basé sur la méthode d'hybridation moléculaire sur filtre d'après Southern ("Southern Blot"?. de 1'ADN de haut poids moléculaire est extrait dSérythrocytes nucléés de 1 ml de sang prélevé sur des animaux consanguins homozygotes pour le complexe B et représentant 4 allèles (haplotypes) de ce complexe : B4, B12,. B14 et B19. L'ADN purifié par extraction phénolique est clivé par les enzymes de restriction BamHI, HindIII, EcoRI et PvuII. Les fragments de restriction sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, transférés sur filtre de nylon qui sert ensuite de support d'hybridation avec les sondes moléculaires décrites ci-dessus. L'hybridation avec la sonde p14 révèle un ensemble de 5 à 15 bandes d'intensité variable. Certains fragments, en particulier ceux produits par digestion avec les enzymes BamHI et Pvull, ont une taille variable et sont associés de façon spécifique avec l'un ou plusieurs des haplotypes du complexe B. La sonde p250 peut être utilisée pour définir ceux de ces fragments qui contiennent l'exon Béta 2. On réitère le processus précédent pour effectuer le génotypage des poulets afin de déterminer les filiations de chaque individu et de contrôler la stabilisation du génotype. REVENDICATIONS I ) Test de génotypage de poulet par la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de 1'ADN génomique, caractérisé en ce que - après prélèvement de 1'ADN de haut poids moléculaire des érythrocytes du sang du poulet testé, - on soumet cet ADN à une fragmentation par au moins une enzyme de restriction, et - on hybride les fragments obtenus avec une sonde moléculaire provenant d'une chaîne codant pour une chaîne Béta d'un antigène de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité du poulet, - on identifie les fragments hybridés et leur taille. pour affecter un génotype au poulet. 2) Test Selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sonde utilisée correspond à la séquence codant pour le domaine Béta 2 de la chaîne Béta. 3) Test selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la sonde moléculaire est soit le clone pl4, soit le clone p250. 4) Test selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les enzymes de restriction sont choisis parmi BamHI, HindlII, EcoRI et PvuII.