Brevet FR2611909A1 — publié le 19880909

Méthode et nécessaire pour rechercher la présence de catala- se dans le lait La présente invention concerne une méthode pour rechercher la présence de catalase dans un échantillon de lait. De façon plus particulière, la présente invention procure une méthode extrêmement sensible et un nécessaire d'analyse pour la détection rapide de catalase dans un échantillon de lait en provenance de vaches atteintes de mammite. Comme on le sait, la nammite bovine est, de loin, la ma- ladie la plus importante des vaches laitières, compte tenu de sa fréquence et derson importance économique. Le Brevet Israélien 36496 publié en Juin 1974 décrit et revendique une méthode-pour rechercher la présence de cellules organiques dans un liquide, cette méthode consis- tant à briser ces cellules dans un échantillon du liquide par l'action combinée d'une protéase et d'un détergent compatible avec cette protéase, ce qui libère l'acide désoxyribonucléique (ADN) non dégradé et des enzymes ac- tives, et à rechercher ensuite dans cet échantillon la présence de l'ADN et/ou d'une enzyme libérée. Dans des réalisations préférées de ce brevet, le liquide est le lait, les cellules sont des cellules somatiques, et l'enzyme libérée recherchée est la catalase. La recherche dans ce brevet est basée sur le principe connu que le lait en provenance de pis atteints de mam- mite contient des leucocytes en grand nombre, excédant cellules/ml. La rupture des leucocytes libère l'ADN et des enzymes intra-cellulaires, par exemple la catalase, qui ne sont normalement pas détectables dans un lait sain. Si la rupture des leucocytes est effectuée par l'action combinée d'une protéase et d'un détergent compatible avec celle-ci, l'ADN n'est pas dégradé et les enzymes libérées 2 6 1 t 9 0 9 sont activées pendant la période de l'essai. L'ADN libé- ré peut, en conséquence, être aisément détecté par l'ac- croissement de la viscosité de l'échantillon de lait. En variante et, en outre, on peut détecter les enzymes libérées par un système de tests approprié. Un test particulièrement approprié est la formation de bulles par réaction de l'enzyme libérée avec le perokyde d'hy- drogène. La combinaison d'une protéase (par exemple subtilisine) et d'un détergent compatible avec elle constitue une pré- paration de rupture stable et efficace, qui provoque la libération rapide de macromolécules intactes et ne dé- grade pas 1'ADN. Le principe de base du présent test est simiiaire h celui décrit dans ce brevet. Dans ce test, la recherche de l'activité de catalase suit le traitement de l'échan- tillon avec une préparation de rupture de cellules. Le traitement vise à éliminer les barrières d'accessibilité éventuelles entre la catalase présente à l'intérieur des cellules et son substrat. La présence de ces barrières ralentit la réaction catalytique et gêne ainsi la détec- tion de la catalase. La rupture des cellules est ainsi prévue pour rendre instantanément détectable la teneur totale en catalase de l'échantillon. Tel que décrit et expliqué dans ce brevet, bien que la rupture des cellules somatiques puisse être effectuée par plusieurs procédures bien connues, aucune de celles- ci n'est acceptable pour le but que l'on se propose ac- tuellément. Les méthodes connues exigent habituellement de la maind'oeuvre et du temps, ou autrement elles ne sont pas efficaces. Les méthodes de rupture les plus fiables dépendent de l'utilisation d'un équipement coû- teux (par exemple désintégrateur mécanique, sonique ou ultrasonique). En utilisant la méthode de la présente invention, on élimine complètement la nécessité de l'incubation et, de ce fait, les difficultés impliquées par elle. Tel que décrit ci-après, le test est simple, rapide et direct. Il n'exige ni préparation, ni habileté particulière, ni équipement et peut être effectué à la ferme et même sous forme de test qu'on peut effectuer à côté de la vàche. L'addition de la protéase et du détergent à un échantil- ion de lait provoque la libération maximale des enzymes intracellulaires présentes dans cet échantillon, en trois minutes à la température ambiante. L'agent de rupture à base de protéase et de détergent agit rapidement dans les conditions physiologiques de pH et de température et ne gêne pas la détection de la cata- lase libérée par le traitement. Des études initiales résumées dans ce brevet ont confir- mé que la rupture accroît la sensibilité de la détection de la catalase à un point tel qu'on peut l'utiliser pour le dépistage rapide de la mammite. Dans des tests ulté- rieurs sur le terrain, il apparut toutefois que la réali- sation préférée, à savoir des tampons d'ouate imprégnés, indiqués à titre d'exemple dans ce brevet (exemple 2), ne donne pas de résultats homogènes. Dans le test décrit dans ce brevet (exemple 2),des réac- tions positives furent enregistrées pour des échantillons de lait contenant 0,8-3,4 x 105 cellules/ml, tandis qu'une réaction négative fut enregistrée pour un échantillon de lait ne contenant pas de leucocytes. Dans des tests ulté- rieurs sur le terrain, on trouva toutefois que la plu- part des échantillons rencontrés contenaient quelques cellules somatiques et qu'en conséquence, ils ne donnaient pas de réaction négative même si il n'y avait pas de mammite. La valeurdiagnostique de ce test doit donc dépen- dre d'une distinction bien nette entre un niveau signifi- catif et un niveau non significatif d'activité de catala- se. Tel qu'il est décrit dans le document précédent, le test ne procure pas cette distinction. En outre, après une étude soigneuse et détaillée de ce brevet, il apparut qu'il n'y avait aucune indication dans ce document aidant à exposer les bases du problème ou suggérant une solution. En conséquence, ce procédé et ce brevet furent abandonnés. C'est seulement dix ans plus tard que cette méthode fut à nouveau considérée; toutefois, du fait que le brevet ne fournissait aucune indication quant à une solution évidente du problème, ce qui avait conduit à son abandon initial, d'autres recherches furent nécessaires et furent dirigées sur la mise au point d'une méthode modifiée et d'une troussede tests qui donneraient des résultats non ambi- gus. Les buts spécifiques de la recherche ultérieure fu- rent: a) augmentation de la sensibilité, de façon à assurer une réponse claire des échantillons positifs; b) élimination de la formation de mousse caractérisant les échantillons positifs, de façon à éviter des répon- ses fausses dans les échantillons négatifs. On a passé en revue une grande série de combinaisons po- tentiellement utiles de protéaseset de détergentscompa- tibles.Cette série comportait à la fois des préparations du commerce toutes prêtes et des combinaisons expérimen- tales de préparationsd'enzymes de qualité technique et de détergents.Il est apparu que les spécifications pour l'obtention d'une préparation efficace de rupture de cel- lules imposaient de sévères limitations au choix des réac- tifs. Des préparations de laboratoire étaient invariable- ment moins bonnes que les préparations du commerce, prin- cipalement pour des raisons d'incompatibilité entre l'en- zyme et le détergent. A la suite de cette recherche extensive, on a trouvé, et c'est le but de la présente invention, une méthode pour rechercher la présence de la catalase dans un échantillon de lait, consistant à combiner cet échantillon de lait avec un détergent enrichi en une protéase al- caline pratiquement dépourvue de catalase pour briser les cellules bactériennes et somatiques contenant de la catalase présentes dans l'échantillon et pour en libérer la catalase active en présence d'un sel tampon de pH ayant une concentration d'au. moins 20 mM dans la solution de l'échantillon résultante, à amener cette solution à un pH compris entre environ 7,0 et 8,0, et à rechercher ensuite dans cet échantillon la présence de catalase. Dans les réalisations préférées de la présente invention, la catalase est détectée par addition de H202, d'o il ré- sulte que l'oxygène créant de la mousse est libéré dans la solution; la méthode est, de préférence, mise en oeuvre en ajoutant d'autres solutés à la solution, en plus du tampon, d'o il résulte que le tampon et le soluté additionnel diminuent la solubilité de l'oxygène libéré dans la solution, augmentant ainsi la génération de mousse. De préférence, ce tampon est une solution d'un tampon phosphaté ayant un pH de 7,0-8,0 et il est amené à une concentration comprise entre 20 et 50 mM, suffisante pour diminuer la solubilité de l'oxygène dans le lait. Par ailleurs, la présente invention procure également un nécessaire d'analyse détecter la présence de catalase dans du lait, comprenant un détergent enrichi en protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase, et 20 à 400 micromoles d'un tampon de pH, seul ou en combinaison avec tout autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait, pour amener la solution de lait résultante à un pH compris entre environ 7,0 et 8,0. Le brevet US 3 926 732 décrit une méthode pour analyser un lait, consistant à ajouter de la galactose oxydase et un pigment leuco pour indiquer une mammite. Le brevet US 3 764 479 décrit un disque en papier filtre contenant de l'acétylcholine, du bicarbonate de sodium et un tampon à base de carbonate de sodium. Le disque comporte en outre une catalase et du peroxyde d'hydrogène. En outre, le brevet US 4 065 357 décrit l'utilisation de peroxyde d'hydrogène dans une méthode pour détecter la catalase. Toutefois, aucun de ces brevets n'enseigne,ni ne suggère la méthode et le nécessaire de la présente invention pour la détection rapide de catalase dans un échantillon de lait provenant de pis atteints de mammite. Comme solutés additionnels, on peut utiliser plusieurs sels inorganiques extrêmement solubles (par exemple sul- fate d'ammonium, chlorures de sodium, de potassium ou de magnésium, etc), ainsi que des composés organiques solubles (par exemple urée, sucrose, etc) ou des tampons, à des concentrations suffisamment élevées pour expulser l'oxygène dissous à la place ou en plus de ces tampons. On a ainsi découvert que, contrairement aux enseignements de ce brevet, il ne suffit pas d'utiliser l'activité de rupture des cellules d'une protéase et d'un détergent compatible avec cette protéase et que même la poudre à laver enrichie en enzyme préférée, vendue sous la marque commerciale BIOOR(R) par Shemen Ltd, Halfa Israël, prise à titre d'exemple dans ce brevet, ne donne pas, en fait, de résultats satisfaisants. En fait, on doit sélectionner et utiliser un détergent enrichi en protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase,et seule la poudre à laver enrichie en enzyme vendue sous la marque BIOMAT(R) par Witco Chemical Ltd, p.o. 975, Halfa Israël, a, jusqu'ici, satisfait ce cri- tère. On a en outre découvert qu'un phosphate 0,01 M, comme indiqué dans les exemples de ce brevet, ne convient pas pour réduire la solubilité de l'oxygène dans l'échantil- lon. En outre, du fait qu'on ajoute au moins le double et de préférence jusqu'au quintuple, de ce tampon, seul ou en combinaison avec tout autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait, la sen- sibilité du test est accrue, davantage du fait que tout l'oxygène dégagé par la réaction de la catalase entre dans le processus de génération de mousse. On a en outre trouvé que l'utilisation de tampons impré- gnés empêchait l'utilisation d'un point de coupure visuel bien défini, permettant une distinction non ambiguë entre des échantillons de lait sain et des échantillons de lait suspect, dérivés de cas "sous-cliniques" de mammites. Dans le présent test, les réactifs sont distribués sous une forme soluble ou dissoute. Ainsi, aucun élément solide n'est introduit dans l'échantillon de lait et, de ce fait, il n'y a rien qui puisse interférer avec l'enregistrement visuel direct des résultats. Bien que l'invention va maintenant être décrite en liai- son avec certaines réalisations préférées dans les exem- ples suivants, de façon que ses aspects puissent être plus complètement appréciés, il est entendu que l'invention n'est pas limitée à ces réalisations particulières. Au contraire, elle couvre d'autres variantes, modifications et équivalents pour autant qu'ils puissent être à l'inté- rieur de la portée de l'invention définie par les reven- dications jointes. Ainsi, les exemples suivants, qui se rapportent à des réalisations préférées, servent à illus- trer la mise en oeuvre de l'invention, étant bien entendu que les cas particuliers représentés ne le sont qu'à ti- tre d'exemple et à des fins d'illustration des réalisa- tions préférées de la présente invention et qu'ils sont présentés pour procurer ce qu'on pense être la descrip- tion la plus utile et la plus aisément compréhensible des procédures de formulation, ainsi que des principes et aspects conceptuels de l'invention. EXEMPLE 1 DETECTION DE MAMMITES MATERIAUX Tubes h essai: polystyrène, 7xllmm, Nunc 3-40339 Peroxyde d'hydrogène (30 %) en provenance de BDH Chemical Ltd Amido Black (Bleu noir d'Aniline) en provenance d'Analco, Bethesda, Md Poudre BM (BIOMAT)* vendue par WITCO Chemical Ltd, POB 975, Halfa 31009 * (Poudre de lavage enrichie aux enzymes. L'enzyme est une protéase alcaline produite par une souche Carlsberg de Bacillus subtilis et vendue sous le nom d'Alcalase ou de Subtilisine). REACTIFS BMP: la poudre BM est broyée avec un poids égal de K2HPO4 et est stockée à température ambiante sous forme d'un mélange de poudre (BMP). Solvant: (mélangé journellement) Tampon phosphaté 1 M, pH 7,3-5,0 ml Amido Black, 2 mg/ml -2,0 ml Peroxyde d'hydrogène, 30 t -1,5 ml Eau distillée -1,5 ml Réactif: (préparé journellement) 1,0 g de BMP, dissous dans 10 ml du mélange solvant précité. PROCEDURE 1. - Placer 1,0 ml de lait dans un tube à essais et ajou- ter 0,1 ml de réactif. 2. - Mélanger le contenu en tapotant le fond du tube, et placer dans un ratelier pendant trois minutes. 3. - Enregistrer les résultats comme suit: Anneau de mousse: négatif Hauteur de mousse: positif (la hauteur est propor- tionneile à la quantité de catalase dans l'échantil- lon). COMMENTAIRES La détermination visuelle de la réaction positive est facilitée par: 1. - Le détergent qui participe à la rupture des cellu- les, et convient également pour procurer une couche de mousse qui se forme lorsque l'oxygène est libéré du peroxyde d'hydrogène par l'action de la catalase; et 2. - Le pigment (Amido Black) qui procure un fond noir contre lequel la mousse (réaction positive) est clairement visible. La formule ci-dessus satisfait donc les exigences pour une recherche rapide et fiable de la catalase dans le lait. En outre, l'addition de phosphatesà la fois solide et dissous a un double but. Ils agissent comme tampons, de sorte que tous les échantillons de lait sont examinés au pH optimal. Le sel dissous sert également à réduire la solubilité de l'oxygène dégagé par la réaction de la catalase et à augmenter ainsi la sensibilité du test. Le test fut évalué avec des échantillons de lait recueil- li à la ferme Netiv Halamed Heh, le 11 novembre 1986. Les échantillons furent testés dans les quatre heures et testés à nouveau après un stockage d'une nuit à 4 . Les résultats furent identiques dans les deux tests. L'éva- luation suivante est basée sur la comparaison des résul- tats avec le présent nécessaire (BMP) et ceux obtenus en parallèle avec le Californian Mastitis Test standard (CMT) qui a servi de système de référence. TABLEAU 1 Nombre total 93 % Positifs vrais 23 Sensibilité 88,5 Positifs faux 13 Spécificité 80,6 Négatifs vrais 54 Valeur positive prévue 63,9 Négatifs faux 3 Valeur négative prévue 94,7 EXEMPLE 2 DETECTION DE MAMMITES Tous les détails sont identiques à eux de l'exemple 1, sauf en ce qui suit: 1. - Le solvant fut préparé le 16 décembre 1986 et stocké dans une bouteille noire à la température ambiante. Cette préparation fut ultérieurement utilisée pour tous les tests énumérés ci-après. 2. - Les échantillons de lait furent recueillis comme précédemment différents jours (voir tableau 2 ci- après) et évalués exactement comme dans l'exemple 1. TABLEAU 2 SERIE I I SERIE II SERIE III (23 décembre 1986) (28 décembre 86)(5 janvier 87) Nombre total 110 56 106 Positifs vrais 10 3 34 Positifs faux 19 2 12 Négatifs vrais 80 50 58 Négatifs faux 1 -1 2 Sensibilité 90,1% 75,0 % 94,4 % Spécificité 80,0 % 96,2 % 82,9 % Valeur positive prévue34,5 % 60,0 % 73,9 % Valeur négative pzévue98,8 % 98,0. % 96,7 % EXEMPLE 3 COMPARAISON DES NECESSAIRES DE LA PRESENTE INVENTION (BMP) ET STANDARD (CMT) Tous les détails sont identiques à ceux de l'exemple 2, sauf en ce qui suit: 1. - Les échantillons recueillis, le 5 janvier 1987, et stockés à 4 pendant 24 heures furent rassemblés, de telle sorte que chaque échantillon rassemblé contenait des volumes égaux de 4 échantillons individuels des 4 trayons d'un pis individuel. Ainsi, chaque échan- tillon rassemblé maintenant testé représente le lait produit par chaque vache (au lieu d'être celui de chaque trayon). 2. - Chaque échantillon rassemblé fut testé par le CMT et par la méthode du présent brevet (BMP). Les résultats sont résumés sur le tableau 3. TABLEAU 3 Echantillons CMT BMP rassemblés Positif Négatif Positif*Négatif (positif*: total 0/4 0 9 0 9 1/4 2 6 8[3-4) 0 2/4 4 0 4[5-7] 0 3/4 6 0 6[> 7] o * Nombre de trayons infectés comme déterminé par le test CMT avant rassemblement. ** Les figures entre-parenthèses donnent la hauteur (en mm) de la colonne de mousse. La méthode et le nécessaire d'analysede la présente invention ont ainsi les avantages suivants: 1. - La combinaison tamponnée d'enzymes et de détergent utilisés ici ne détruit pas l'activité de la catalase 2. - Elle est pratiquement dépourvue de catalase; 3. - Les solutés assurent un tamponnage correct et le dégagement de l'oxygène, produit de la réaction de la catalase, de la solution; et 4. - La mousse formée est stable pendant 1 à 2 heures ou davantage, empêchant ainsi le dégagement de l'oxygène dans l'air. Il est évident à l'homme de l'art que l'invention n'est pas limitée aux détails des exemples précédents, et que la présente invention peut être mise en oeuvre sous d'au- tres formes spécifiques sans s'écarter de ses concepts essentiels; il est en conséquence souhaité que les pré- sentes réalisations-et exemples soient considérés, à tous égards, comme donnés à titre d'illustration et non à ti- tre de limitation. Revendications 1. - Méthode pour rechercher la présence de catalase dans un échantillon de lait, caractérisée en ce qu'on combine cet échantillon de lait avec un détergent enrichi par une protéase alcaline pratiquement dépourvue'de catalase pour briser les cellules somatiques contenant la catalase qui se trouvent dans cet échantillon et pour en libérer la catalase active en présence d'un sel tampon de pH ayant une concentration d'au moins 20 mM dans la solution de l'échantillon obtenue, en ce qu'on amène cette solution à un pH compris entre 7,0-8,0 et en ce qu'on recherche, après, la présence de catalase dans cet échantillon. 2. - Méthode pour rechercher la présence de catalase dans un échantillon de lait selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la catalase est détectée par l'addition de H202, d'o il résulte que l'oxygène générateur de mousse est libéré dans la solution. 3. - Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on ajoute un autre soluté à la solution, en plus du tampon, d'o il résulte que le tampon et le soluté additionnel réduisent la solubilité de l'oxygène dégagé dans la solution et augmentent ainsi la production de mousse. 4. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le tampon est une solution de phosphate à pH 7,0-8,0. 5. - Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la concentration du tampon est comprise entre et 50 mM pour réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait. 6. - Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéase est la subtilisine. 7. - Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéase et le détergent se présentent sous la forme d'une poudre à laver enrichie par des enzymes du commerce et dépourvue de catalase. 8. - Nécessaire pour détecter la présence de catalase dans du lait, caractérisé en ce qu'il contient un déter- gent enrichi par une protéase alcaline pratiquement dé- pourvue de catalase et 20 à 400 micromoles d'un tampon de pH seul ou en combinaison avec un autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait et d'amener la solution de lait résultante à un pH compris entre 7,0-8,0.