Brevet FR2621393A1 — publié le 19890407

Le domaine technique de l'invention est celui des tests biologiques rapides utilisant le principe de la reaction Antigene-Anticorps pour reveler par coloration d'un substrat,la presence de substances en quantites infinitesimales ( inferieure au nanogramme soit le milliardieme de gramme) Cette invention est destinee au depistage de nombreuses affections mettant en cause un agent ( l'Antigene ) et la reaction de l'organisme a cet agent,c'est a dire la revelation et le dosage des Anticorps contre cet agent, a partir d'une goutte de tout liquide provenant du corps humain ( Sang,serum, plasma,urines,salive,larmes,liquide cephalo-rachidien,humeurs uretrales,vaginales, lait maternel,liquides preleves en per-operatoire ou sur des organes a greffer pour detecter le Sida par exemple ),etc.. La detection peut egalement se faire a partir de fragments de solides quelconques solubilises au prealable ou simplement agites avec un peu d'eau. Cette invention s'applique aussi au monde animal ( en particulier medecine veterinaire pour le depistage d'infections ou le dosage d'hormones par exemple Y. Elle s'applique aussi au domaine agroalimentaire chaque fois qu'il sagit de depister ou doser toutes substances chimiques ( par exemple des toxines ) ou toutes substances biologiques ( germes,teneur en vitamines par exemple ) Cette invention s'applique aussi a l'Agriculture pour tous microdosages. Elle s'applique egalement dans un contexte plus general a tout ce qui concerne les microdosages necessaires pour des enquetes,recherches,traitement des eaux,ecologie ( Diagnostic de maladies chez des especes en voie de disparition par exemple Y. Les precedentes bandelettes de diagnostic ne contenaient qu'un petit carre de cellulose colle a l'extremite et s'adressaient uniquement a une detectiondans les urines. Plus tard des bandelettes de meme aspect pouvaient doser le glucose a partir d'une goutte de sang deposee sur le carre de cellulose,maintenue une minute puis lavee pour lire la reaction coloree. Il existe egalement des dispositifs de detection immuno-enzymatique utilisant des antigenes ou des Anticorps mais necessitant d'une part du personnel pour prise de sang,manipulations et d'autre part utilisant un systeme complexe,couteux et surtout tres long ( 3 heures ) en raison de lavages repetes suivant des periodes d'incubation d'une demi-heure entre chaque phase. Le dispositif selon l'invention permet de remedier a ces inconvenients et de mettre a la disposition de patients,de medecins,de petits Centres de Soins, de Transfusion,de Services d'Urgences,etc.. toute une gamme de tests rapides, puisque ce dispositif qui ne necessite qu'une goutte de liquide a analyser, deposee dessus,permet un diagnostic dans les quelques minutes suivantes sans aucune intervention humaine,en lisant simplement la coloration d'une pastille de substrat situee sous le dispositif,d'ou son cout reduit et et la grande facilite de son usage. Une description detaillee va etre effectuee ci-apres,en reference d'un mode de realisation non limitatif,illustre sur les figures jointes qui representent respecti vement: fig (1): Une vue en coupe longitudinale du dispositif Fig (2): : Une vue en perspective Fig (3): Une vue de dessus Fig (4): Une vue de dessous. Ce dispositif est constitue d'elements superposes (1) a ( 5 ),tous de meme longueur,par exemple 100 mm,et la meme largeur,par exemple 20 mm,tous perfores au meme endroit d'une ou plusieurs decoupes circulaires ( Reservoirs R1 R2 et R3 ) variant de 5 a 20 mm de diametre selon les diagnostics demandes, mais d'epaisseurs differentes,a savoir respectivement de haut en bas ( 1): Une pellicule de plastique transparent ou opaque de 0,5 a 5 mm d'epaisseur destinee a recevoir en R1 la goutte de liquide a analyser. ( 2 ): Une membrane de gelatine et fibre de verre d'epaisseur de 0.5 a 1.5 mm et supportant a sa face superieure une fine couche de reactif ( A ), destine a reagir immediatement avec la goutte de liquide a analyser. Les reactifs seront detailles ci-dessous. ( 3): Une Pellicule de plastic transparent ou opaque de 1 a 5 mm d'epaisseur et destinee a recevoir en R2 le serum provenant de la filtration de la goutte a travers la membrane ( 2 Y.Ce serum va entrer en contact avec le reactif ( B Y dans le reservoir ( R2 ) ( 4 Y : Membrane identique a la precedente filtrant le serum apres son contact avec le reactif ( B Y. ( 5 ): Pellicule de plastique transparente ou opaque de 0.5 a 2 mm d'epaisseur dont la de coupe forme le reservoir ( R3 ) contenant une pastille de cellulose ou tout autre support susceptible de contenir le reactif ( C Y. Ce dernier,au contact du serum issu de la membrane ( 4 ) va presenter une coloration differente selon que la substance recherchee est presente ou non dans le liquide a analyser.La lecture de la reaction se fera donc en retournant simplement le dispositif au bout de une a trois minutes selon les differentes analyses. ( 6 ): Un film adhesif opaque de protection recouvre R1 au dessus et R3 en desous. Selon une variante,il peut exister plusieurs reservoirs pour detecter plusieurs substances differentes.Par exemple,il serait interessant pour le test diagnostic d'une hepatite d'associer une evaluation rapide des transaminases. De meme en cas d'lnfarctus,l'evaluation du taux des enzymes cardiaques donne une indication tres precieuse sur le pronostic et la gravite des lesions. De meme,la sero-positivite du SIDA ne suffisant pas,elle peut etre completee sur la meme bandelette par un test immunologique capable d'indiquer la qualite et le nombre de Lymphocytes T,et permettre ainsi le suivi des sero-positifs. Selon une autre variante,les reservoirs peuvent etre carres ou rectangles ou ovales. Selon une autre variante,le nombre de pellicules peut etre superieur ou inferieur aux trois decrites ci dessus. Le dispositif selon l'invention servira a doser le taux d'antigenes de certains cancers,resolvant le dramatique probleme des patients traites chez lesquels il est pratiquement impossible de savoir suffisamment tot s'ils font des rechutes,des metastases,revelees par la reaction coloree des que le taux d'Antigenes depasse une certaine limite. Il est egalement destine a la detection precoce et rapide de nombreuses affections (Syphillis,SIDA,Hepatites,.. )et a obtenir des indications biologiques rapides telles les groupages sanguins,l'evaluation d'Enzymes circulants et enfin le diagnostic d'affections difficiles a apprecier ( Rage,Paludisme,..). Des que la proteine responsable de la Maladie d'Alzheimer sera decouverte, il sera aise de depister sur une grande echelle cette affection de diagnostic tres difficile et qui atteint en France deux a trois millions de personnes. Une liste non exhaustive des affections concernees par l'invention est jointe a ce dossier.Elles sont classees de la facon suivante: I - Diagnostic des affections virales II - Diagnostic des affections microbiennes III- Dosages enzymatiques IV - Maladies auto-immunes et Maladie d'Alzheimer. V - Groupages sanguins rapides VI - Depistage de cancers VII- Dosage de medicaments circulants VIII-Detection d'allergenes.Diagnostic d'allergies IX - Dosages des recepteurs membranaires X - Dosages d'hormones XI - Dosages divers ( Anions Cations de L'ionogramme,metaux, et d'une maniere generale tous les elements de la Classification de Mendeleieff. MODE D'EXECUTION 1 - Une goutte de liquide est deposee dans le reservoir R1, 2 - Au bout d'une minute le serum a reagi avec le reactif (A) et la gelatine de la membrane (2) se dissout pour laisser filtrer a travers la fibre de verre, le serum. 3 - Ce dernier entre en contact avec les microbilles en R2 et recouvertes par le reactif (B).Apres une minute,la seconde membrane de gelatine (4) se dissout,de nouveau filtration a travers la fibre de verre et 4 - Arrivee du serum sur le reactif (C) dans le resrvoir R3 pour montrer immediatement une coloration en fonction du resultat. PRINCIPE DU TEST Recherche d'antigene : Reaction positive: l'antigene se lie a l'anticorps (A) en R1, traverse R2 sans etre retenu par les billes et arrive en R3 pour colorer le substrat. Reaction negative : Pas d'antigene;l'anticorps marque (A) sera retenu par ltantigene des microbilles et ne colorera donc pas le substrat. Recherche d'anticorps : Meme principe sauf que (A) sera un antigene marque et que sur les microbilles est fixe un anticorps pour retenir cet antigene marque en l'absence d'anticorps dans le serum. Dosages semi-quantitatifs : en (A) sont fixes des anticorps libres fixant par exemple 10 nanogr/ml d'antigene.Si le serum en contient plus,il sera plus tard fixe sur des anticorps niarques enfermes dans des liposomes qui s'ouvrent apres une minute. Meme principe pour le dosage semi-quantitatif des Anticorps. Revendications 1 ) Dispositif pour detecter la presence dans tout milieu biologique solide ou liquide la presence de substances microdosees, et caracterisé en ce qu'il comporte Une pellicule en plastique opaque ou transparente ( 1 ) perforee pour former un reservoir superieur ( R1 ) destiné à recevoir la goutte à analyser, Caracterise en ce que le reactif ( A Y recouvre la face superieure de la membrane ( 2 ) de gelatine et fibre de verre separant le reservoir R1 du reservoir R2, Caracterise en ce que le fluide depose en R1 se lie immediatement au reactif ( A ) Caracterise en ce que le fluide provenant de cette première reaction,arrive plus tard dans le reservoir ( R2 ) de la pellicule (3) pour reagir avec le reactif ( B ) Caracterise en ce qu'il comporte une seconde membrane ( 4 Y de gelatine et fibre de verre,separant R1 de R2, Caracterise en ce qu'il comporte un reservoir ( R3 ) dans la pellicule (5) contenant le reactif C destine a presenter une coloration au contact du produit des dites reactions provenant de R2 apures dissolution de la membrane ( 4 ) au bout d'un certain temps bien defini à l'avance. 2 ) Dispositif selon la revendication 1 caracterise par les reactifs suivants: Reactif ( A ) : Anticorps ou Antigène lyophilise marque par tout marqueur possible, comme les enzymes,la fluorescence ou la radioactivite,etc.. Membrane (2Y : Gelatine sur fibre de verre avec porosite variant de 0.2 a 50 microns selon les diagnostics recherchés,et supportant à sa face superieure le reactif ( A ). Membrane ( 4 ): Gelatine sur fibre de verre de porosite comprise entre 0.2 et 50 microns. Reactif ( B ) : Microbilles de diamètre variable de 10 a 250 microns, Reactif (cl : Tout substrat de l'enzyme qui marque l'anticorps ou l'antigène. 3 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,caracterise en ce que le reservoir R1 contient,dans le cas de dosages semi-quantitatifs, une quantité bien definie a l'avance d'anticorps libres non marques,correspondant à la valeur normale de la substance recherchée dans le liquide à analyser, l'excedent de la dite substance se liant plus tard aux anticorps marques contenus dans des liposomes,de sorte que la revelation n'a lieu que si le liquide analysé contient une quantite de substance superieure à la normale admise, permettant ainsi une évaluation semi-quantitative. 4 - Dispositif de determination qualitative et semi-quantitative rapide de la presence d'une substance dans un liquide a. analyser,caracterise en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon de liquide est mis en contact avec un reactif marque,notemment tel qu'un antigène ou un anticorps marque. dans un zone temporairement isolee de la zone dans laquelle ont lieu les etapes ulterieures du dispositif,pendant un temps suffisant pour permettre à la reaction reactif marque - substance recherche de se produ ire, temps au bout duquel l'isolement du reservoir R1 dans lequel a eu lieu la dite reaction,est rompu, pour permettre au produit de la reaction d'entrer en contactfau cours d'une deuxieme etape,avec les reactifs du reservoir R2.Apre.s un temps defini a l'avance, la membrane separant R1 de R2 devient permeable,permettant le passage du produit des reactions qui ont eu lieu en R1 et R2,vers R3 pour la revelation de la presence ou de l'absence de la substance que l'on cherche à detecter. 5 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 a 4,caracetrise en ce qu'il comporte un film adhesif de protection ( 6 ) å la surface du reservoir R1.