Brevet FR2621488A1 — publié le 19890414

L'invention concerne un produit renfermant à titre de principes actifs - a/. un peptide ayant une activité de celle de l'interféron gamma humain, - b/. l'hydroxyurée. L'hydroxyurée est un anti-métabolite utilisé dans le traitement de la leucémie myéloide chronique qui agit en inhibant La ribonucléotide diphospho réductase et en bloquant les cellules en phase G1 /S (Cancer Res. 28 p 1559 (1968) ; J. Biol. Chem. 254 p 253 (1979). D'autre part, l'interféron gamma humain possède des propriétés de différenciation, à savoir qu'il pousse les cellules promyélocytaires dans une voie de différenciation vers les monocytes et macrophages et non vers les polynucléaires. Des travaux ont suggéré l'intérêt potentiel de cette substance dans le traitement de la leucémie myéloide chronique (Leukemia, 1, No1 (J anuary) 1987 p 52-57). De nombreux produits cytostatiques, autres que l'hydroxyurée, ont été associés à l'interféron gamma recombinant humain pour mesurer l'effet anti-prolifératif de ces associations sur des lignées cellulaires d'origine non Leucémique mais issues d'autres cancers. Les résultats obtenus avec de telles associations sont très divers. En effet, on observe une inhibition cellulaire soit supérieure, soit inférieure à celle observée avec chacun des produits étudiés séparément. Par exemple, l'effet antiprolifératif combiné de l'interféron gamma et de la 5-fluoro uracile ou du méthotrexate a été étudié sur des lignées cellulaires provenant de différents cancers (Int. - J. Cancer (1984), Oct. 15, Vol. 34, p. 495-500). On peut citer également l'association difluorométhylornithine interféron gamma dont l'effet a été mesuré sur des lignées cellulaires provenant de mélanomes ou de cancers du sein (J. Biol. Response Mod. 1985 Aug. Vol. 4 p. 391-5). Les études réalisées sur des lignées cellulaires d'origine leucémique, notamment sur les cellules leucémiques promyélocytaires de type HL60, concernent l'interféron-gamma combiné dans le milieu de culture avec d'autres substances pour lesquelles des propriétés de différenciation sont aussi décrites, à savoir qu'elles poussent les cellules promyélocytaires dans une voie de différenciation vers les granulocytes ou monocytes plus matures de cette lignée. Ces différentes substances sont par exemple l'acide rétinoique (Blood, Vol. 69, No2 Fev, 1987 p. 501-507) ou la 1,25-dihydroxy vitamine D3 (Exp. Hematol. 14 : 998-1005, (1986)). De même, le "tumor necrosis factor" ou TNF a été associé également avec l'interféron-gamma (J. Exp. Med, Vol. 64, octobre (1986) p. 1206 1225). Ces études montrent une coopération, voire même une synergie entre l'effet de différenciation de l'interféron-gamma et celui de ces différentes substances. Cependant, aucune de ces associations décrites ne peut être comparée à l'association de la présente demande, puisque l'hydroxyurée n'est en aucun cas un agent de différenciationcellulaire, mais seulement un agent cytostatique ou même cytotoxique. Par ailleurs, l'hydroxyurée étant un antimétabolite intervenant dans la synthèse d'ADN, le résultat prévisible de l'effet de l'association de l'invention sur différentes lignées de cellules leucémiques est une inefficacité de l'interféron gamma. Or, contre toute attente, le résultat visible sur différents critères de différenciation de cellules tumorales de type promyélocytaire HL-60 n'est jamais cette absence d'effet attendue. En effet, les résultats obtenus montrent tout au contraire que l'hydroxyurée favorise l'action de l'interféron gamma sur les différents critères de différenciation. Ces critères sont l'apparition des récepteurs Fc sur Les cellules différenciées et la capacité de ces cellules à produire des ions supéroxydes (test NBT) et à synthétiser des estérases non spécifiques. L'apparition des antigènes d'histocompatibilité de classe II est un critère également retenu. De plus, un effet additif et même synergique, est même clairement démontré, notamment lorsque sont mesurées l'apparition du récepteur Fc et l'augmentaion de L'expression des antigènes de classe II (HLA-DR). Par ailleurs, l'effet très important de l'hydroxyurée dans l'arrêt de la croissance cellulaire, n'est absolument pas modifié par la présence de l'interféron gamma et aucune augmentation de toxicité n'est observée. Toutes ces études réalisées sur des cellules leucémiques promyélocytaires (HL-60) sont tout à fait représentatives de l'état de non différenciation des cellules dans La Leucémie myéloide chronique. Les propriétés de l'association hydroxyurée interféron- gamma humain démontrées par Les résultats très favorables donnés plus loin dans la partie expérimentale sur ce modèle, rendent ladite association apte à être utilisée dans le traitement de la leucémie myéloide chronique. L'invention concerne donc le produit comprenant à titre, de principes actifs a/. un peptide ayant une activité du type de celle de l'interféron gamma humain, b/. l'hydroxyurée en tant que produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, dans une méthode de traitement de la Leucémie myéloide chronique et des syndromes apparentés. Le polypeptide ayant une activité d'interféron gamma humain est notamment celui comportant 143 acides aminés correspondant à L'interféron gamma naturel ou obtenu par recombinaison génétique, ce dernier ayant une méthionine du côté N-terminal. Cette structure est décrite dans Rinderknecht et al. Journal of Biological Chemistry Vol. 259, Na11, 1984 p. 6790-6797. L'invention englobe toutes Les associations renfermant des peptides dont La séquence en acides aminés est dérivée de celle de l'interféron gamma humain naturel à 143 acides aminés par suppresion, remplacement ou addition d'un ou plusieurs acides aminés. L'invention concerne notamment Le produit de combinaison caractérisé en ce qu'il renferme de l'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique, ayant une séquence identique à celle de L'interféron gamma naturel. Cet interféron est nommé rHu-IFN-g ci-après dans Le texte. Les syndromes apparentés à la leucémie myéloide chronique sont par exemple La splénomégalie myéloide, La thrombocytémie essentielle et les syndromes myélodysplasiques. L'invention concerne particulièrement le produit de combinaison caractérisé en ce que Le rHu-IFN-g est administré par voie parentérale et l'hydroxyurée par voie orale. L'invention a plus particulièrement pour objet Le produit de combinaison caractérisé en ce que le rHu-IFN-g est administré à La dose de 10 à 50 x 106 U par jour ou trois fois par semaine par voie intraveineuse ou sous-cutanée et en ce que L'hydroxyurée est administrée à La dose de 30 à 60 mg/Kg/24 h. L'hydroxyurée et l'interféron gamma humain recombinant peuvent être administrés soit simultanément, soit séparément par des voies différentes, soit de manière étalée dans le temps par exemple dans la même journée ou à un intervalle allant de quelques jours à quelques semaines, voire quelques mois. Dans ce dernier cas, parmi les nombreux schémas thérapeutiques pouvant être envisagés, on peut choisir de débuter le traitement uniquement avec de l'hydroxyurée à une dose de 30 à 60 mg/Kg/jour par voie orale, puis de diminuer cette posologie jusqu'à une dose de 15 à 30 mg/kg/jour, et d'associer ensuite une injection d'interféron gamma recombinant humain de 20 x 106 unités /jour pendant plusieurs semaines ou plusieurs mois. La dose d'hydroxyurée pourra être diminuée en fonction de la formule sanguine et notamment de la leucocytose. L'invention concerne tout particulièrement le produit de combinaison caractérisé en ce que le rHu-IFN-g et l'hydroxyurée sont administrés simultanément. Dans ce cas, les doses utilisées pour les deux produits de l'association varient en fonction de l'état du malade. Elles sont par exemple de 15 à 30 mg/kg/jour pour l'hydroxyurée par voie orale et de 20 x 106 unités/jour de rHu-IFN-g par voie sous-cutanée ou intraveineuse. Par ailleurs, l'invention concerne aussi une composition pharmaceutique sous forme de kit renfermant - un soluté injectable renfermant une quantité active de rHu-IFN-g, - un comprimé renfermant une quantité active d'hydroxyurée. Les exemples donnés ci-après illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Etude concernant la différenciation de cellules tumorales promyélocytaires HL-60 par l'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique ayant une séquence identique à celle de l'interféron gamma naturel (rHu-IFN-g) associé à l'hydroxyurée. Mis e e n cu lt ur es des ce llu les Les cellules sont mises en culture dans du milieu RPMI 1640 (Seromed, BIOPRO) enrichi avec 10 X du sérum de veau foetal (Irvine Scientific, Cliniscience) du tampon HEPES et de la glutamine, ainsi que des antibiotiques (pénicilline/streptomycine et gentamycine)/ Les cellules après comptage (compte viable à l'aide de bleu trypan) sont mises en culture à 5.105 ceLLules/mL en présence de différentes quantités d'rHu-IFN-g et d'hyroxyurée ajoutés en même temps dans Le milieu de culture. Au bout de 3 à 5 jours de stimulation, Les cellules sont comptées et observées au microscope afin de vérifier Leur état de différenciation d'un point de vue morphologique. En même temps, différentes expériences sont réalisées afin de connaître La différenciation des cellules au niveau fonctionnel. Quatre critères ont été retenus - apparition des antigènes d'histocompatibilité de classe II (HLA-DR) ; - apparition des récepteurs Fe ; - capacité à produire des ions supéroxydes (test Nitro Blue tétrazolium : NBT) ; - capacité à synthétiser des estérases non spécifiques. 1/. Antigènes HLA-DR - une technique d'essai radio immunologique a été utilisée avec un anticorps monoclonal (Becton Dickinson, réf. 7360) incubé au 1/80 avec 106 cellules stimulées pendant 1 heure à 4aC. La révélation de La fixation se fait avec un anticorps anti-Ig de souris marqué à L'iode 125. On mesure L'expression membranaire des antigènes de classe II exprimés par le système majeur d'histocompatibilité. Le résultat est exprimé en pourcentage d'augmentation de cellules positives. 2/. Récepteurs Fe Les récepteurs pour La partie Fe des immunoglobulines ont été mis en évidence par La méthode des rosettes utilisant des globules rouges de mouton recouverts d'immunoglobulines (rosettes E.A.) suivant la méthode dérivée de celle décrite en détails dans Parant M., Vinit M. A., Damais C., Riveau G. et Chedid L., Exp. HematoL., 1985, 13, 221. On mesure Le pourcentage de cellules présentant Les récepteurs Fe. 3/. Test NBT La technique utilisée est dérivée de celle décrite dans Pick E., Charon J., et Mizel D., J. Reticuloendoth. Soc., 1981, J 581. Les cellules stimulées ou non sont incubées pendant 30 minutes avec du 4 béta -phorbol 12-myristate 13-acétate (Sigma) à 200 nM et du NBT à la dilution de 1 mg/ml. Le pourcentage de cellules positives est évalué après étalement des cellules sur Lame réalisé à L'aide d'une cytocentrifugeuse. On mesure un pourcentage de cellules positives dont Le cytoplasme est rempli de précipités bleus de NBT réduit sous forme de formazan. 4/. Mise en évidence des estérases non spécifiques La technique utilisée est dérivée de celle décrite dans Li C.Y Lam K.W., et Yam L.T., J. Histochem. Cytochem., 1973, 21, 1. On utilise un kit Sigma avec de L'alpha-naphtyl acétate comme substrat sur Les cellules différenciées après étalement sur Lame réalisé à l'aide d'une cytocentrifugeuse. On mesure un pourcentage de cellules positives dont Le cytoplasme apparaît noir. La figure I montre L'effet de 1000U rHu-IFN-g/mL associé à 150 rM d'hydroxyurée sur La croissance des cellules HL-60. La dose de 150 rM est choisie car cette dose est celle qui assure une inhibition suffisante de la croissance des cellules HL-60 sans être toxique. La figure I met en évidence que l'IFN-g ne modifie absolument pas L'effet propre de L'hydroxyurée sur L'arrêt de La croissance cellulaire. Les figures II, III, IV, et V montrent L'effet de L'association sur Les différents critères de différenciation. Cet effet est toujours au moins égal à celui obtenu avec le rHu-IFN-g ou l'hydroxyurée ajoutés seuls dans le milieu de culture. Par ailleurs, un effet additif et même synergique a pu être mis, en évidence. REVENDICATIONS 1/. Produit comprenant à t it re de principes act ifs a/. un peptide ayant une activité du type de celle de L'interféron gamma humain, b/. L'hydroxyurée en tant que produit de combinaison, pour une ut i Lisat ion simult anée, séparée ou étalée dans Le temps, dans une méthode de traitement de la leucémie myéloïde chronique et des syndromes apparentés par exemple La splénomégalie myéloïde. 2/. Produit selon La revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme de l'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique ayant une séquence identique à celle de L'interféron gamma naturel (= rHu-IFN-g). 3/. Produit selon Les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que L'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique ayant une séquence identique à celle de l'interféron gamma naturel est renfermé dans une composition pharmaceutique destinée à une adminis tration parentérale et en ce que l'hydroxyurée est renfermée dans une composition pharmaceutique destinée à L'administration par voie orale. 4/. Produit selon Les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique, ayant une séquence identique à celle de l'interféron gamma naturel est renfermé dans une composition pharmaceutique destinée à être adminis trée par voie intraveineuse ou sous-cutanée de préférence à La dose de 10 à 50 x 106 U par jour ou trois fois par semaine par voie intraveineuse ou sous-cutanée. 5/. Produit selon Les revendications 1 et 4, caractérisé en ce que l'hydroxyurée est renfermée dans une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie orale, de préférence à La dose de 30 à 60 mg/kg/24 h. 6/. Produit selon Les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique ayant une séquence identique à celle de l'interféron gamma naturel et l'hydroxyurée sont renfermés dans des compositions pharmaceutiques destinées à être administrées simultanément. 7/. Composition pharmaceutique sous forme de kit renfermant - un soluté injectable renfermant une quantité active d'interféron gamma humain obtenu par recombinaison génétique ayant une séquence identique celle de l'interféron gamma naturel. - un comprimé renfermant une quantité active d'hydroxyurée.