Brevet FR2617170A1 — publié le 19881230

La présente invention concerne de nouveaux dérivés peptidiques ayant une activité antiagrégante, leur procédé de préparation et leurs applications en thérapeutique et comme agents de diagnostic. De façon plus précise, elle concerne des analogues peptidiques d'une séquence du fibrinogène utilisables notamment comme antagonistes du fibrino- gène vis à vis des plaquettes sanguines. On sait qu'au cours de l'hémostase les pla- quettes sanguines adhèrent au sous-endothélium du vaisseau lésé, secrètent leur contenu granulaire après stimulation et agrègent les unes aux autres pour for- mer un thrombus plaquettaire. L'agrégation dépend des contacts qui s'établissent entre membranes de plaquet- tes adjacentes. Cette réaction est nécessaire pour l'arrêt d'un saignement. Elle a cependant de nombreu- ses déviations pathologiques, notamment dans les cas de thromboses veineuses ou artérielles, au cours du développement d'une plaque d'athérome, ou de la for- mation de microthrombi qui peuvent obstruer la micro- circulation périphérique ou cérébrale. Le contrôle et la régulation de l'agrégation plaquettaire sont donc un objectif majeur dans la prévention de la thrombose et de l'athérosclérose et de nombreuses études sont consacrées à la recherche et au développement de molé- cules aux propriétés antiagrégantes. Dans ce phénomène, le fibrinogène a un rôle important. Ainsi dans le plasma de malades atteints d'afibrinogènémie congénitale, l'agrégation plaquet- taire est fortement diminuée ou absente et ce défaut est corrigé par l'injection de fibrinogène. De mime en l'absence de fibrinogène, des plaquettes lavées n'agrègent pas à l'ADP ou à l'épinéphrine. La présence de fibrinogène est donc une nécessité pour le dévelop- 26171F" 2 6 1 7 i 70;- pement normal d'un thrombus plaquettaire. La partici- pation du fibrinogène à l'agrégation est due à l'in- duction d'un récepteur spécifique pour cette protéine sur la membrane de la plaquette activée. Tous les stimuli physiologiques de laplaquette induisent une classe unique de récepteur et l'interaction du fibri- nogène avec ce récepteur régule l'agrégation plaquet- taire. Il existe donc un mécanisme de l'agrégation plaquettaire, commun à tous les inducteurs, qui dépend de l'interaction entre le fibrogène et son récepteur. L'importance physiologique de cette voie de l'agréga- tion plaquettaire dépendante du fibrinogène est at- testée par l'étude des thrombasthénies de Glanzmann dont les plaquettes ne fixent pas le fibrinogène et n'agrègent pas en réponse à tous les stimuli physiolo- giques de la cellule. En résumé, le récepteur du fibrinogène n'est pas exprimé sur la plaquette circulante, il est induit dès que la cellule est stimulée. Cette induction peut être dépendante ou indépendante de la réaction de sé- crétion. Tous les stimuli expriment le même récepteur et l'interaction entre le fibrinogène et le récepteur conduit directement à l'agrégation. La dissociation du fibrinogène lié à la plaquette a pour conséquence la désagrégation des plaquettes. Dans ce contexte il est clair que si l'inte- raction entre le fibrinogène et son récepteur plaquet- taire pouvait être régulée, ceci constituerait un moy- en pour contrôler l'agrégation in vitro et in vivo. La présente invention vise précisément à fournir de nouveaux agents qui permettent d'inhiber, de réguler ou de mesurer sélectivement la voie de l'agrégation dépendante du fibrinogène. Deux séquences peptidiques issues de la mo- lécule de fibrinogène ont déjà été identifiées comme inhibant la fixation de cette protéine sur les pla- quettes et bloquant ainsi leur agrégation: - une séquence Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)* présente dans la chaine du fibrinogène (E. Plow et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. USAC 82 8057, 1985) - un dodécapeptide H12 (H-H-L-G-G-A-K-Q-A-G-D-V) re- présentant l'extrémité C-tèrminale de la chaine du fibrinogène (E. Plow et coll. 3. Biol. Chem., 259-, 5388,1984). - La présente invention a pour objet des ana- logues peptidiques de l'extrémité C-terminale de la chaine du fibrinogène qui présentent un effet inhibi- teur de la liaison fibrinogène-plaquette et de l'agré- gation plaquettaire. Ces dérivés peptidiques répondent à la for- mule générale suivante: X - Lys -Gln - Y - Gly - Asp - Z - W ( dans laquelle X représente l'hydrogène, un résidu d'a- cide aminé, un groupement de formule DE-o D représen- te un groupe N-protecteur physiologiquement accepta- ble, ou l'hydrogène, et o E représente une simple liaison ou un résidu d'acide aminé, Y représente un résidu L-arginyle, ou D- arginyle, Z représente un résidu L-valyle, D-valyle, L-phénylalanyle, D-phénylalanyle, L-séryle, ou D-séry- le, W représente un groupe OH, NH2, O-R1 avec R1 représentant un radical alkyle en C1 à C4 NHR avec R représentant un radical alkyle en C1 à C4, ou un résidu d'acide aminé. * La signification des symboles et abréviations utili- sées est donnée en annexe. Dans les groupes X et W les résidus d'acides aminés susceptibles d'étre utilisés sont notamment les radicaux O ou L-pyroglutamyle, L ou D-alanyle, -ala- nyle, glycyle, L ou D-prolyle, L ou D-valyle, L ou D-phénylalanyle, L ou D-homocystéyle, L ou D-asparty- le, L ou D-glutamyle, L ou D-hystidyle, L ou D-méthi- onyle, L ou D-thréonyle, L ou D-séryle, L ou D-cysté- yle, L ou D-leucyle, L ou D-arginyle, L ou D-trypto- phanyle, L ou D-tyrosyle, L ou D-lysyle et L ou D-ornithyle. Les groupes N-protecteurs physiologiquement acceptables sont notamment les groupes protecteurs de l'attaque en N-terminal des enzymes exopeptidases. Comme exemples de tels groupes on peut citer les grou- pes acyles tels que les groupes t-butyloxycarbonyle (Boc), tert-amyl-oxycarbonyle (+Aoc), benzyloxycar- bonyle, benzoyle, acétyle, formyle, propanoyle, buta- noyle, phénylacétyle, phenylpropanoyle, cyclo pentyl- carbonyle. La présente invention englobe également les équivalents des dérivés peptidiques de formule I dans lesquels chaque liaison peptidique (-CO-NH-) entre deux résidus d'acide aminé de la formule générale I est remplacée par les structures suivantes: - CO-N(CH3)-; -CO-O-; -CH2-NH-; -CS-NH-; 3 2 - CO-CH2; CH2-S-; -CHOH-CH2-; -HN-CO-; - CH=CH-; CH2-CH2-. ou dans lesquels le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que des groupes -CH2-, -NH-, -0-. Un dérivé peptidique préféré est un dérivé de formule H-L La-Lys-LGlnLArg-Gly-LAsp- Val-OH La présente invention a également pour objet - une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un dérivé peptidique de formule I - un agent de diagnostic comprenant un dérivé de pep- tidique de formule I Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être préparés de manière classique par synthèse pepti- dique en phase liquide ou solide par couplages succes- sifs des différents résidus d'acides aminés à incor- porer (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-ter- minale vers l'extrémité N-terminale en phase solide) et dont les extrémités N-terminales et les chaines latérales réactives sont préalablement bloquées par des groupements tels que ceux mentionnés cidessous: 1) Extrémité N-terminale protégée par: Boc Bpoc Fmoc 2) Groupement bloquant Résidu la cfihaine latérale Alanyle H Arginyle tosyle Asparagyle H,xanthyle Aspartyle O-benzyle Cystéyle acétamidométhyle(Acm), 4-méthylbenzyle (Meb), 4-méthoxybenzyle(Mob), S-ben- zyle Glutamyle 0-benzyle Glutaminyle xanthyle Glycyle H Histydyle tosyle, 2-4-dinitrophényle(Dnp) Isoleucyle H Leucyle H Lysyle 2-chlorobenzyloxycarbonyle(Clz), tri- fluoroacétyle(TFA), formyle(For), ben- zyloxycarbonyle(Z) Méthionyle H Norleucyle H Ornithyle benzyloxycarbonyle Phénylalanyle H Propyle H Pyroglutamyle H Sarcosyle H Séryle O-benzyle Thréonyle H. O-benzyle Tryptophanyle H, formyle Tyrosyle H. 2-6-dichlorobenzyle(dcb), 2-bromo- benzyloxycarbonyle Valyle H On peut utiliser différentes méthodes de couplage: 1. Couplage des résidus par un carbodiimide (ex: DCC, EDC) avec ou sans catalyse (ex: HOBT) ou autre agent couplant (ex: EEDQ) 2. Utilisation des acides aminés sous forme d'anhydri- des symétriques préformés 3. Utilisation des acides aminés sous formed'esters activés (ex:-p-nitrophénylester, HOBT ester) et cou- plage par l'intermédiaire de DCC. En synthèse en phase solide (SPPS) le tab- leau I ci-dessous mentionne les différents types de résine utilisable ainsi que les protections et mé- thodes adéquates pour les différentes étapes. 26 1 7170 Tableau I Système SPPS Liaison Protection réactif de protection réactif de utilisé peptide-résine en alpha déprotection chaine latérale clivage Classique Benzyl ester Boc lFA_ HCl Benzyl HF, HBr Stabl ePa alongue chaine)Pam Boc TFA, HCl Benzyl HF, HBr (loBenzyl ester Bpoc TF dilué Benyl HFaine) Benzyl ester Bpoc TFA dilué t-DBenutyl HF Benzyl ester Bpoc IFA dilué t- Butyl HF Labile Ether résine Bpoc TFA dilué t-Butyl TFA 1 O Orthogonal Ether résine Fmoc Piperidine t-Butyl TFA Synthèse de Ether résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA segment t-Butyl résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA Hydrazide résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA 1 5 Assemblement Benzyl ester Fmoc Piperidine Benzyl HF de segments Peptides amidesMBHA, BHA Boc TFA, HC1 Benzyl HF Peptides alcoolsBenzyl ester Boc TFA, HCl Benzyl LiBH4 En synthèse en phase solide le 1er a.cide aminé (extrémité C-terminale) à fixer sur la résine peut être soit acquis commercialement déjà attaché au support soit fixé par l'intermédiaire de sel de césium (méthode de Gisin), . d'un sel de tétraméthylammonium (méthode de Loffet) ou d'un carbodiimide. Les exemples suivants illustrent la prépara- tion des dérivés peptidiques de formule I Exemple 1: Synthèse du peptide H-Ala-Lys-Gln-Arg-Gly-Asp-Val-OH (ou A K Q R G D V. également dénommé A (R4 7 (4) Ce peptide a-été synthétisé en phase solide en utilisant les méthodes suivantes: - support: résine Merrifield chlorométhylée (0.7 mmol Cl/g) à 2Z de divinylbenzéne. Préparation de Boc-Phe-résine: mmoles (2g) de Boc-Valine solubilisées dans 10 ml d'éthanol ont été additionnées de 5 mmoles (1,63g) de Cs2CO3 dans 2 ml d'eau. L'ester de césium formé (Boc- Val-OCs, 10 mmol) après quelques minutes d'agitation a été évaporé à sec et mis au dessicateur sous vide pen- dant 48 h. Il a été ensuite resolubilisé par 40 ml de DMF et mélangé à 15g de résine (10,5 mmol Cl). La réaction a été réalisée en 24 h. sous agitation dans un bain chauffant à 50C. La résine dérivatisée (Boc- Val-résine) a été ensuite filtrée et lavée par DMF, DMF/H20, DMF, EtOH, puis séché sous vide pendant 3 h. Le taux de substitution de la résine a été calculé par analyse d'acide aminé après hydrolyse à 150'C, pendant 3 h., par le mélange HCl/acide propionique (50/50). La substitution obtenue a été de 0,34 mmol Val/g résine. - couplage: Tous les dérivés aminés incorporés ont été couplés par la méthode du carbodiimide DCC en présence de catalyseur HOBT (2 équivalents Val en acide aminé, en DCC et en HOBT). Les dérivés protégés utilisés et le-ur milieu de solubilisation ont été les suivants Dérivés Solvants Boc-Asp-O-Bzl DCM Boc-Gly DCM Boc-Arg(Tos) DMF Boc-Gln(Xab) DMF Boc-Lys(Clz) DCM Boc-Ala DMC Les couplages ont été réalisés en 2 h. dans du DCM. Les déprotections -par TFA et les couplages ont tous été contrôlés par un test de Kaiser. - clivage: Le clivage du peptide synthétisé a été effectué par HF (10 ml/g résine) en présence d'anisol (1 ml/g rés.) pendant 1 h. à O'C. Après lavage à l'éther, le peptide a été ensuite extrait par de l'acide acétique à 15Z et lyophilisé. - purification: sur colonne de Sephadex G10 éluée par de l'acide acétique à 10Z - contrôle: analyse d'acide aminé: après hydrolyse pendant 30 mn à 150C par HCl/acide propionique 50/50 chromatographie sur couche mince de silice éluant: CH30H/CHC13/NH40H 25Z (60/40/20) ]5 détection: phénantrène quinone (Arg) ninhydrine (NH2) TDOM (NH) Rf = 0,22 -HPLC: sur colonne analytique de phase inverse C18 éluant: gradient H 20/acétonitrile (100/O à (20/80) en 25 mn à ml/mn détection: absorption optique à 210 mn T = 0,6 mn Exemple 2 Synthèse du peptide H-Lys-Gln-Arg-Gly-Asp-Val-OH (ou K O R G D V, égale- ment dénommé K6 (R4). Ce peptide a été synthétisé, purifié et analysé selon les mêmes méthodes que le peptide de l'exemple 1. Ses caractéristiques analytiques sont les suivantes chromatographie sur couche mince de silice éluant 1:CH30H/CHCl3/NH40H 25X (60/40/20) Rf = 0, 12 éluant 2: 2-butanone/CH3COOH/H2 O (10/30/25) 3 2 Rf = 0,69 -HPLC: T = 1,2 mn r Exemple 3: Synthèse du peptide H-Lys-Gln-Arg-Gly-Asp-Phe-OH (ou K Q R G D F. égale- ment dénommé K6(R4F1)). Ce peptide a été synthétisé, purifié et ana- lysé selon les mêmes méthodes que le peptide de l'ex- emple 1. Ces caractéristiques en chormatographie en couche mince sont les suivantes: éluant 1 = CH 3OH/HCl3/NH40H 25% (60/40/20) Rf = 0,51 éluant 2 = 2-butanone/CH 3COOH/H 2O ('10/30/25) Rf = 0,75 On donnera ci-après des résultats des études pharmacologiques mettant en évidence les propriétés des dérivés peptidiques d.e formule I 1. Inhibition de la liaison plaquette-fibrinogène Préparation des plaquettes Les plaquettes sont isolées à partir de 60 ml de sang humain prélevé sur un tampon anticoagulant, l'ACD, à raison d'l1 volume d'ACD pour 6 volumes de sang. L'ACD a la composition suivante Citrate trisodique 5 H20 5,95 g Acide citrique 3,41 g Dextrose 5 9 H20 qsp 250 ml Le sang est ensuite centrifugé 20 mn à 1000 t/mn (centrifugeuse JOUAN E 96) à température ambi- ante. 1 1 Le PRP (plasma riche en plaquettes) est décanté et additionné de PGE1 0,1 uM puis centrifugé mn à 2000 t/mn. Les plaquettes obtenues dans le culot sont alors reprises par 1 ml de tampon Tyrode-albumine pH 7,2 préparé selon la composition suivante Tampon Tyrode (solution mère) NaCl 1,3 M KCl 0,026 M NaHCO3 0,12 M Tampon Tyrode-albumine: solution mère 1/10 M D-glucose 0,0055 M albumine 2Z HCI 1M qsp pH 7,2 Les plaquettes sont lavées sur une colonne de Sépharose CL 2B par du tampon tyrode-albumine pH 7,2 puis les plaquettes recueillies sont diluées à la concentration de 2.108 pl./ml. Les essais sont réalisés sur 4.10 plaquet- tes en présence de CaCl (0,5 mm), de 125I-fibrinogène (0,1 pM) et de différentes concentrations de peptide, et la stimulation des plaquettes est provoquée par de l'ADP (5 pM). Apres 15 mn d'incubation et dépôt sur une solution de saccharose à 15% le complexe 125I-fi- brinogène-plaquette est isolé par centrifugation à 12000 t/mn pendant 2 mn. Les résultats pour deux peptides de formule I et les peptides voisins sont donnés sous forme de C150 dans le tableau II. Ce tableau donne également la séquence des peptides. La Fig. 1 donne les résultats obtenus avec le peptide A7 (R4) de formule I et le peptide de référence A7. Ces résultats mettent en évidence que les deux peptides de formule I ont une activité inhibi- trice sur la liaison plaquette fibrogène bien supé- rieure à celle du peptide connu H12 et à celle du pep- tide A très voisin du peptide A? (R 7 4. 2. Inhibition de l'agrégation plaquettaire L'effet des peptides synthétiques sur l'agrégation plaquettaire a été étudié sur des pla- quettes isolées comme précédemment pour l'étude de la liaison au fibrinogène. La stimulation des plaquettes est également obtenue par l'ADP 5 VM et l'essai réa- lisé en présence de fibrinogène 1,1 pH et de CaCl2 0,5 pM. Les résultats sont donnés dans le tableau II et mettent en évidence une activité inhibitrice sur l'agrégation plaquettaire des peptides de formule I nettement supérieure à c-elle des peptides H12 et A7. Tableau I1 'Peptide Nomencl rêature Ftxltlo. du Agréat Ito, litiÀ lii. LeuGlyGlyAI&LysGI.All. Ciy. AspVal ll 150 s 50 AhI --------------------------- - Val A 7 5001700 AI&.........Arg........... ValAT(R4I 20 100/200 Lys --- Arg ---------- Val KS(R&) 20 100/200 Lya ----. Arg - Pli.- K(RitF). 4 0 50 Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être utilisés notamment pour le traitement et la pré- vention des thromboses, en particulier dans les états préthrombotiques pour bloquer l'agrégation plaquet-- taire. Les dérivés peptidiques de formule I se sont avérés en outre exercer un effet inhibiteur sur le dé- veloppement des métastases. Inhibition du développement des métastases du poumon. On a utilisé la tumeur M4, une sous-lignée obtenue par sélection d'un sarcome induit par le benzopyrène chez la souris C578L/6 (Mantovani Int. 3. Cancer, 22, 741, 1978). Les cellules M4 ont été désagrégées avec de la DNAse et de la collagènase pendant 30 minutes à 37'C. On a lavé les cellules deux fois avec du PBS et on les a remis en suspension dans le même tampon à la concentration de 106 cellules/ml. On a injecté lente- ment dans le veine de la queue de souris C578L/6 0,2 ml de PBS contenant différentes concentrations de peptide et 10 cellules M /souris. Au bout de 15 jours on a tué les souris et excisé les poumons, et- on les a fixés avec une solu- tion de Bouin. On a compté visuellement les colonies. Les résultats obtenus avec le peptide KQRGDF sont don- nés dans le tableau suivant. K Q R G D F Nombre de mg/souris colonie 3,0 0 1,5 0,2 0,75 25,3 + 9,4 PBS 117,5 14,4 Ces résultats mettent en évidence une pro- tection contre le développement des métastases. Les dérivés peptidiques de formule I peuvent également exercer un effet inhibiteur sur - l'adhésion des plaquettes sanguines aux cellules endothéliales des parois vasculaires ou du sous endothélium. l'athérogénèse - la réponse inflammatoire Les compositions thérapeutiques selon l'in- vention peuvent être administrées à l'homme ou aux animaux par voie orale ou parentérale. Elles peuvent être sous la forme de prépara- tion solides, semi-solides ou liquides. Comme exem- ples, on peut citer les comprimés, les gélules, les solutions ou les suspensions injectables. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les compositions thérapeutiques peuvent con- tenir notamment de 1 à 60X en poids de -principe actif. La quantité de principe actif administrée dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Elle est généralement de 1 à 500 mg. ' ANNEXE Abréviations usuelles de la chimie des peptides BHA: benzylhydrylamine (résine) Boc: tert-butyloxycarbonyle Bpoc: 2-(4-biphénylyl)propyl(-2) oxycarbonyle Bzl: benzyle Clz: 2-chlorobenzyloxycarbonyle DCC: dicyclohexylcarbodiimide DCM: dichlorométhane DMF: diméthylformamide EDC: N-ethyl-N'-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide EEDQ: N-ethyloxycarbonyl-2-ethyloxy-1,2- dihydroquinoline Fmoc: 9-fluorénylméthyloxycarbonyle HOBT 1hydroxybenzotriazole MBHA: 4-méthylbenzhydrylamine (résine) TDM: N,N,N',N',tétraméthyl-4,4'-diaminodiphé- nylméthane TFA: acide trifluoroacétique Tos: tosyle Xan xanthyle Svmboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Glu glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thrkonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr. tyrosine REVENDICATIONS 1. Dérivés peptidiques de formule X - Lys -Gln - Y- Gly - Asp- Z -W (1) dans laquelle X représente l'hydrogène, un résidu d'acide aminé, un groupement de formule DE- o D représente un groupe N-protecteur physiologiquement acceptable, ou l'hydrogène, et o E représente une simple liaison ou un résidu d'acide aminé. Y représente un résidu L-arginyle ou D-arginyle; Z représente un résidu Lvalyle, D-valyle, L-phénylalanyle, D-phénylalanyle, L-séryle ou D-sé- ryle. i 1 W représente un groupe OH, NH2 O-R avec R représentant un radical alkyle en C1 à C NHR2 avec R2 représentant un radical alkyle en C1 à C4, ou un résidu d'acide aminé. 2. Peptide de formule H - Ala - Lys - Gln - Arg - Gly - Asp - Val - OH 3. Peptide de formule H - Lys - Gln - Arg - Gly - Asp - Val - OH 4. Peptide de formule H - Lys - Gln - Arg - Gly - Asp - Phe - OH 5. Composition thérapeutique, caractérisé en ce qu'elle contient à titre de principe actif un déri- vé peptidique selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4. 6. Agent de diagnostic, caractérisé en ce qu'il contient un dérivé peptidique selon l'une quel- conque des revendications 1 a 4.