Brevet FR2620732A1 — publié le 19890324

La présente invention a trait au titrage des teneurs en magnésium dans des liquides aqueux. Plus particulièrement, la présente invention concerne des procédés visant à déterminer la teneur en magnésium du serum en utilisant pour cela l'oxydase d'n-glycérophosphate. Une détermination rapide et précise des quantités et des niveaux d'activité des différents enzymes et minéraux dans le sérum sanguin cons- titue un outil important dans le diagnostic médical. Le magnésium est le second cation intracellulaire le plus abondant dans le corps humain et sert d'activeur pour de nombreux enzymes importants. Son importance dans la physiologie humaine est bien établie. Ainsi, un titrage précis du ma- gnésium sérique constitue un outil inestimable dans un diagnostique. De nombreuses méthodes techniques spectrophotométriques visant à ti- trer le magnésium ont été mises au point en utilisant de la calmagite, du bleu de méthylthymol, du jaune de titane ou du sulfonate de Magon. Ces pro- cédés sont cependant d'une précision limitée, attendu qu'ils sont basés sur des réactions par chélation et par conséquent sujets à des degrés va- riables d'interférence par d'autres cations présents dans l'échantillon. L'absorption atomique et l'analyse par activation de neutrons sont exemptes de telles erreurs, mais elles sont très complexes et atteignent des coûts prohibitifs pour la plupart des laboratoires cliniques courants. On a constaté que le magnésium s'associe au diphosphate d'adénosine (ADP) ou au triphosphate d'adénosine (ATP) pour former un complexe molécu- laire. Ainsi qu'il est relaté dans 31 Clinical Chemistry, pp.703 - 705 (1985), Tabata et al ont mis au point une analyse du magnésium enzymique qui utilise l'hexokinase et la déhydrogenase de glucose-6-phosphate d'en- zymes. Dans leur analyse à réaction bloquée, on détermine la quantité de (NAD(P)H) produite sur une période de 15 minutes en arrêtant la réaction d'hexokinase avec de l'EDTA de tétrasodium et en mesurant l'absorbance à 340 nm. Cette absorbance finale dépendant du taux est proportionnelle à la quantité de triphosphate d'adénosine (ATP) complexe présente et, par consé- quent, à la concentration en magnésium sérique. Cette méthode d'analyse du magnésium enzymique nécessite une pré-incubation de l'échantillon et une période prolongée de réaction qui la rendent impropre à une analyse instru- mentale automatisée. La méthode Tabata présente un certain nombre de limitations inhéren- tes. Premièrement, elle exige l'usage de spectrophotomàtres à bande étroite, qui sont relativement onéreux, capables de mesurer dans la zone de l'ultra- violet pour obtenir l'absorbance réelle de l'indicateur de co-enzyme. Deu- xièmement, l'analyse souffre d'une interférence significative de la part 2 - de lipémies car les effets de diffraction de la lunmière produits par cette substance sont énormément accrus à des longueurs d'onde inférieures à 400 nh.Troisièmement, la sensibilité de l'analyse est limitée en raison de l'absorbtivité molaire relativement faible de la substance indicatrice utilisée. Quatrièmement, les analyses sont faussées par des essais à blanc à forte réaction. Cinquièmement, la nécessité d'arrêter brutalement la ré- action réduit la possibilité d'automatiser le processus. Dans ces conditions, il serait souhaitable de mettre au point un pro- cédé qui permettrait de déterminer de façon rapide et précise la teneur en magnésium du sérum sanguin. Il est également souhaitable de prévoir un pro- cédé qui conduirait à une détermination colorimétrique avec une sensibilité accrue. Il est également souhaitable de pouvoir appliquer un procédé qui assure l'obtention de résultats détectables à une longueur d'onde supé- rieure à 340 nm afin de réduire au minimum les effets de diffraction de la lumière dûs au trouble du sérum qui se produit dans les échantillons lipé- miques. La présente invention propose un procédé et une composition y asso- ciée pour déterminer la quantité de magnésium présente dans un milieu aqueux. Ce milieu aqueux peut être n'importe quelle substance d'origine bio- logique ou non-biologique. Des exemples-types de ces substances sont le sang entier, le plasma, le sérum sanguin, des solutions tampon, etc. L'invention est basée sur la découverte que l'absorbance finale pro- duite par suite de la réaction basique dans laquelle du glycol est phos- phorylé et mis en réaction en présence d'oxydase d'X-glycérophosphate est fonction du taux, et peut être rendue proportionnelle à la quantité d'un complexe formé entre l'ATP et le magnesium. Le procédé utilisé pour déterminer les niveaux de magnésium dans des échantillons aqueux comprend les phases suivantes: I. On met une quantité mesurée de l'échantillon en contact.avec une quantité mesurée de: soit a) une solution réactive, soit b) dessolutions contenant des réactifs et des enzymes pour déclencher une réaction conti- nue qui, en dernier lieu, formera une espèce détectable telle qu'un chro- mogène, et II. On mesure l'espèce détectable ainsi obtenue. La composition suivant la présente invention contient de l'oxydase d'Y-glycérophosphate, de la péroxydase, de la glycérokinase, du 5'triphos- phate d'adénosine (ATP), du glycérol et des co-substrats indicateurs spé- cifiques. Il a été constaté qu'en mettant un échantillon en contact avec les réactifs énumérés ci-dessus et avec la composition d'enzymes on dé- -3- clenche une série organisée de réactions qui, en dernier lieu, sont fonc- tion du taux de concentration de magnésium présent dans la solution-échan- tillon. La séquence ordonnée de réactions se déroule de la façon suivante: A - Le magnésium présent dans l'échantillon entre en réaction avec 1'ATP provenant de la solution de réactif pour former un complexe magné- sium-ATP (Mg-ATP); B - Le Mg-ATP phosphorylate de glycérol catalysé par la kinase glycé- rolée pour former du glycérol-3-phosphate et un complexe magnésium5'diphos- phate d'adénosine (Mg.ADP), le glycérol ainsi que le glycérol-kinase étant apportés par la composition suivant la présente invention; C - Le glycérol-3-phosphate ainsi produit réagit avec l'oxygène en- vironnant pour produire du péroxyde d'hydrogène dans une réaction catalysée par l'oxydase d'"-glycérophosphate présente dans la composition de la pré- sente invention, et D - Le peroxyde d'hydrogène produit peut être mesuré directement par des techniques classiques ou réagit ultérieurement avec des co-substrats indicateurs dans une réaction catalysée par la péroxydase afin de former un chromogène visuellement détectable; les co- substrats et la péroxydase )sont présents dans la composition suivant la présente invention. Afin de permettre une compréhension plus complète de l'invention, on se référera maintenant à la description détaillée qui suit ainsi qu'aux exemples qui l'accompagnent. L'invention est basée sur la découverte du fait que le magnésium pré- sent dans des fluides biologiques a une affinité pour, et forme des com- plexes avec, les polyphosphates d'adénosine. Il a également été constaté que le taux de la séquence réactionnelle définie dans le Tableau I dépen- dait de la complexation du magnésium avec i'ATP, et non pas simplement de la présence de i'ATP. Ainsi, le complexe Mg-ATP constitue le réactif limi- ) teur dans la formation de glycérol-3-phosphate et dans toutes les réactions ultérieures de la série. Ainsi, le procédé de détermination des teneurs en magnésium dans un échantillon aqueux comprend les phases qui consistent à: I - Mettre une quantité mesurée d'échantillon en contact avec une quantité prédéterminée de: soit a), une solution réactive, soit b), des solutions contenant des réactifs et des enzymes pour déclencher la réac- tion continue qui, finalement, forme une espèce détectable telle qu'un chromogène, et II - Mesurer l'espèce détectable ainsi formée. -4 - La séquence ordonnée de réactions se déroule de telle sorte que le magnésium présent dans l'échantillon forme un complexe avec l'ATP. Le com- plexe Mg.-ATP fournit un groupe de phosphates dans la phosphorylation du glycérol catalysée par la kinase glycérolée en glycérol-3-phosphate. Le glycérol-3-phosphate en présence de l'oxygène environnant et de l'oxydase d'"-glycérophosphate réagit pour former du peroxyde d'hydrogène que l'on peut transformer en un chromogène détectable par réduction catalysée par la péroxydase. Pour mettre en oeuvre le procédé de la présente invention, on pré- voit une composition réactive qui contient tous les réactifs et enzymes nécessaires pour former un complexe de l'échantillon de magnésium afin d'amorcer et d'entretenir la réaction continue suivant le Tableau I. La composition réactive peut 9tre une solution à une ou plusieurs parts, à volonté, La composition réactive se compose essentiellement de: a) kinase glycérolée, b) oxydase d'X-glycérophosphate, c) un composé ayant une activité de péroxydase, d) 5'-triphosphate d'adénosine, e) glycérol, f) un co-substrat oxydable par péroxydase, g) un indicateur-coupleur de cosubstrats, h) un tampon capable de maintenir le pH de la solution entre environ 6,0 et environ 8,0, et i) eau. Il entre dans l'esprit de l'invention d'ajouter des substances chimi- ques et des enzymes soit individuellement, soit dans toute combinaison pro- pre à déclencher la réaction continue définie sur le Tableau I. Ainsi, en alternative, plusieurs substances chimiques et plusieurs enzymes peuvent être maintenus dans des solutions distinctes, tamponnées et utilisées dans la mesure nécessaire. Dans un mode particulier de réalisation, on maintient le glycérol et le co-substrat indicateur dans une solutiontampon séparée d'une solution tamponnée contenant les constituant restants. Dans ce mode de réalisation, la solution contenant les constituants restants est mélan- gée à l'échantillon afin de permettre la formation du complexe Mg-ATP. Les réactifs et l'échantillon sont maintenus en réaction à une température com- prise entre environ 250C et environ 45 C pendant une période comprise entre environ cinq secondes et environ dix minutes. Pour assurer un contact inti- me, on peut agiter la solution. La solution tamponnée de glycérol est en- suite ajoutée au mélange. L'addition de glycérol déclenche la réaction con- - 5 - tinue ordonnée et permet d'analyser la concentration de magnésium dans l'échantillon. TABLEAU I kinase glycérolée glycérol + Mg.ATP - " glycérol-3-phosphate + Mg-ADP l oxydase glycérol-phosphatée glycérol-3-phosphate + oxygène - dihydroxyacétone phosphate + H202 péroxydase 2 H202 + co-substrates indicateurs - chromogène color6 + H20 r0 on 2 2 2 ru g' -7 - Après avoir mélangé la totalité des composants avec l'échantillon, on con- trôle l'absorbance du mélange résultant pendant une période de temps com- prise entre environ 5 et environ 15 minutes, à une longueur d'onde spéci- fiée, comprise entre environ 450 et environ 650 nm, et de préférence à une longueur d'onde d'environ 510 nm, selon le type de co-substrats indicateurs utilisés. Un témoin réactif contenant une quantité mesurée d'eau peut éga- lement être préparé afin de déterminer l'absorbance de base de l'eau utili- sée dans la préparation des solutions réactives. Le changement d'absorbance par rapport au temps (. A/min) est proportionnel à la concentration en ma- gnésium de l'échantillon. La composition de la présente invention contient de i'ATP à une con- centration comprise entre environ 0,05 et environ 2,0 millimoles par litre. L'ATP compris dans cette gamme de concentrations forme un complexe avec le magnésium présent dans l'échantillon de fluide biologique afin de fournir une détermination efficace des teheurs de magnésium de l'échantillon jus- qu'à environ 2,5 millimoles de magnésium par litre. Des concentrations de magnésium supérieures à 2,5 millimoles/litre peuvent 9tre déterminées par la dilution mesurée de l'échantillon avec des solutions salines normales et classiques, exemptes de magnésium, et par une analyse répétée. On trou- ve dans le commerce de l'ATP approprié, par exemple chez Signa Chemical Corp. St. Louis, MO (USA). Une fois que le complexe Mg.ATP a été formé dans la solution aqueuse, le contact avec le glycérol en presence de kinase glycéroléé se traduit par la phosphorylation du glycérol pour former du glycérol-3-phosphate et du Mg-ATP. Dans le procédé et la composition suivant la présente invention, on utilise le glycérol dans une concentration comprise entre environ 0,05 et environ 20 millimoles par litre, des concentrations comprises entre en- viron 0,2 et environ 7 millimoles par litre étant cependant préférées. On trouve du glycérol dans le commerce et notamment chez Sigma Chemical Co, déjà cité. En général, on peut utiliser de la kinase glycérolée provenant de toute source adéquate pour la mise en oeuvre réussie de la présente inven- tion, bien que de la kinase glycérolée dérivée du Streptomyces canus (E.C. 2.7.1.30) soit préférée. Cette kinase glycérolée peut être obtenue chez Finnsugar Biochemicals, Inc. à Elk Grove Village, dans l'Illinois (USA). Dans la présente méthode, on utilisera avantageusement de la kinase glycérolée en quantités comprises entre 10 U et environ 150 U par litre de tampon. Le glycérol-3-phosphate produit, par exemple à partir de la réaction -8- (catalysée par enzymes) de Mg.ATP avec du glycol, réagit en présence de l'enzyme oxydase d'"-glycérophosphate pour former du dihydroacétone et du péroxyde d'hydrogène. L'oxydase d'a-glycérophosphate utilisé peut être dérivé de plusieurs espèces microbiennes que l'on peut obtenir de différentes sources. Les pro- priétés de cette enzyme dérivée de certaines sources sont plus favorables que celles d'enzymes dérivées d'autres sources dans le procédé de la pré- sente invention. L'enzyme obtenue à partir de l'Aérococcus viridans est préférable car elle exerce une plus grande activité sur une plus large gamme de pH que l'enzyme obtenue à partir d'autres sources. Les oxydases d'_-glycérophosphate obtenuesde cette source peuvent 9tre utilisées avec succès dans la présente invention en quantités comprises entre environ 2,0 kU et environ 10,0 kU par litre. Pour faciliter la manipulation, l'O- glycérophosphate peut être présent dans la solution initiale contenant l'ATP. Pour quantifier les produits obtenus par la réaction continue dé- clenchée initialement par la kinase créatinique, on peut soit mesurer di- rectement le peroxyde d'hydrogène produit, soit le faire réagir ultérieure- ment pour obtenir un chromogène détectable dans une réaction catalysée par une péroxydase ou une substance ayant une activité péroxydase. Les péroxydases sont des protéines conjuguées qui contiennent de la porphyrine ferreuse. La péroxydase, que l'on trouve dans le raifort, la pomme de terre, la sève de figuier, le navet, le lait, les globules blancs du sang et d'autres microorganismes, peut 9tre employée avec succès dans la présente invention. Certaines péroxydases synthétiques, telles que cel- les décrites par Théorell et Machly dans Acta Chem. Scand., Vol. 4, pp. 422-424 (1950), sont également satisfaisantes. Moins satisfaisantes sont des substances telles que l'hémine, la méthémoglobine, l'oxyhémoglobine, l'hémoglobine, 1' hemochromogène, l'hématine alcaline, les dérivatifs hémi- niques, et certains autres composés qui possèdent une activité péroxydative ou analogue à celle de la péroxydase, à savoir, la capacité de catalyser l'oxydation d'une autre substance à l'aide de péroxyde d'hydrogène et d'au- tres peroxydes. D'autres substances qui ne sont pas des enzymes mais qui possèdent un pouvoir analogue à celui de la péroxydase utilisable dans la présente invention sont: le sulfocyanate de fer, le tannate de fer, le ferrocyanure ferreux, les sels chromiques (tels que le sulfate chronique de potassium) absorbé dans un gel de silice, etc.). Ces substances ne sont pas aussi sa- tisfaisante que la péroxydase elle-même mais elles ont une utilité analogue. - 9 - Dans le procédé de la présente invention, il est préférable d'utili- ser de la péroxydase dérivée du raifort (E.C. 1.11.1.7) que l'on peut se procurer chez Finnsuger Biochemicals. Dans le procédé de la présente inven- tion, on peut utiliser des quantités d'enzymes de péroxydase comprises en- tre environ 0,5 kU et environ 20 kU par litre. Lorsque le péroxyde d'hydrogène produit est réduit immédiatement en présence d'une péroxydase, il réagit avec un substrat ou co-substrat oxy- dable par la péroxydase et avec un co-substrat-coupleur afin de produire un chromogène détectable. La péroxydase et le co-substrat oxydable par la péroxydase sont de préférence présents dans la solution d'ATP tamponnée. Le co-substrat-coupleur peut 9tre présent dans la solution contenant du glycérol afin de réduire au minimum l'auto-couplage non-spécifique ou l'auto-oxydation pendant le stockage. Les co-substrats oxydables par la péroxydase que l'on peut utiliser avec succès sont en général ceux qui réagissent de façon à former un chro- mogène détectable. Le co-substrat oxydable par la péroxydase est capable de subir une condensation par oxydation avec des agents coupleurs tels que ceux qui contiennent des groupes phénoliques. Des exemples-types de tels composés oxydables sont le benzidène et ses homologues, les p-phénylène- diamines, les p-aminophénols, la 4-amino-antipyrine, l'hydrazone 3-méthyl- 2-benzothiazolimone, etc., ainsi que des mélanges de ces substances. On choisira le co-substrat-coupleur dans le groupe qui comprend l'am- maniaque ou le sel de métal alcalin de 2-hydroxy-3,5-dichlorobenzènesulfo- nate (HDCBS), ou d'autres alcools aromatiques, amines et leurs mélanges. De préférence, le co-substrat-coupleur est l'HDCBS présent dans une con- centration comprise entre environ 0,1 millimoles et environ 5,0 millimoles par litre. Le chromogène qui résulte du couplage de HDCBS avec du 4-aminoanti- pyrène est une molécule stable, de couleur rouge, ayant une absorbance com- )prise entre environ 450 et environ 425 et 525, et un maximum de 510 nm. Il-a été constaté que l'absorptivité molaire du chromogène résultant est quatre fois celle des indicateurs classiques. L'usage d'une plus grande longueur d'onde présente en outre l'avantage de réduire au minimum les effets de la diffraction de la lumière qui est due à l'état trouble des échantillons lipémiques. La séquence de réactions se produit au mieux à un pH compris entre environ 5,5 et environ 9,2. Ainsi, dans la composition de la présente in- vention, on peut utiliser des agents tampons afin de maintenir le pH dans cette gamme souhaitable et de préférence entre environ 6,5 et environ 7,2. - 10 - L'agent-tampo4 ne doit produire aucune interférence avec la séquence de réaction du Tableau I. Parmi les tampons qui conviennent on peut citer l'acide N,B-bis-(2-hydroxyéthyle)-2-amino-éthane-sulfonique (BES); l'aci- de 3-(N-morpholino)-2-hydroxypropane-sulfonique (MOPSO); l'acide 3-N-mor- pholinopropane-sulfonique (MOPS); l'acide N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES); l'acide pipérazine-N,N-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES) ; 1,3-bis [tris(hydroxyméthyl) méthylamino] propane (bis-trispropane), tris (hydroxyméthyl-aminouiéthanechlorhydrique (Tris/HC1), l'acide imidazole/ chlorhydrique, l'alcali phosphate, l'acide imidazolechlorhydrique ou des mélanges de ces acides. De préférence, on utilisera du Tris/HC1 à une con- centration propre à fournir entre environ 0,01 et environ 1,0 moles par litre dans la composition de la présente invention. Pour permettre de mieux comprendre la présente invention, les exem- ples suivants sont donnés à titre explicatif et non-limitatif. EXEMPLE 1 Détermination de la concentration en magnésium On a préparé une série d'échantillons ayant des concentrations res- pectivement de 0,5, 1,0, 1,5 et 2,0 mmol/litre par dilution appropriée d'une solution stable d"acétate de magnésium. Pour établir un graphique de la concentration de Mg++ par rapport au changement d'absorbance dans le temps, on a analysé chaque solution de travail en appliquant la méthode suivante: On a introduit une fraction de 0,9 ml du réactif Mg ATP précisé sur le Tableau IIA dans une éprouvette de 12 x 75 mm en laisant incuber dans un bain d'eau à 370C pendant 2 à 3 minutes. Une quantité égale à 5,0 litre de la solution à analyser a été introduite dans l'éprouvette et mé- langée par tourbillonnement. Une fraction de 0,1 ml de la solution glycé- rolée indiquée sur le Tableau 11B (préchauffée à 37oC) a ensuite été ajou- tée et mélangée par tourbillonnement. Le contenu a ensuite été transféré dans une cuvette et l'on a mesuré le changement d'absorbance à 510 nm pendant 1 à 10 minutes par rapport à un témoin réactif contenant 5,0 pl d'eau. Les absorbances ont été mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre Gilford modèle 300-N à passage direct. Les témoins restants ainsi que les échantillons ont éte analysés de la même manière et le changement d'absorbance par rapport au temps est re- présenté sur le diagramme de la Figure 2. L'analyse de la régression liné- aire de la courbe standard typique de la Figure 2 relative à quatre té- moins en triplicata pour O à 2 mmol/1Mg++ a donné l'équation suivante: y = 0,0195x + 0,00125, r = 0,9988 - 11 - EXEMPLE II On a recueilli des échantillons de sérum que l'on a ensuite préparés pour une analyse dans les 24 heures suivantes. On a extrait les sérums de flocons pendant les 10 minutes de centrifugation pour empocher une fausse iélévation du taux de magnésium dans le sérum à partir d'érythrocytes sé- questrés. Les échantillons de sérum visiblement hémolisés ont été négligés. Chaque échantillon a été analysé conformément au processus exposé dans l'Exemple I. Le changement d'absorbance dans le temps a été calculé pour chaque échantillon en partant de la partie linéaire de la courbe. On a constaté que, après une phase ralentie d'une durée de 2 à 3 minutes, les taux de réaction étaient linéaires pendant au moins 10 minutes. L'analyse proprement dite était linéaire jusqu'à une concentration de magnésium d'au moins 2,0 mmol/l. Des concentrations de magnésium supérieures peuvent être diluées avec des concentrations salines normales exemptes de magnésium, et ré-analysées avec succès. TABLEAU II Composants présents dans des réactifs pour la détermination de la concentration en magnésium Composé Concentration A - Réactif Mg.ATP Tampon Tris/HC1 100 mmol/litre 4-aminoantipyrène 1,0 mmol/litre '- triphosphate d'adénosine 0,3 mmol/litre Glycérophosphate d'oxydase 5 kU Péroxydase 1 kU Kinase glycérolée 25 U Eau complément B - Réactif glycérolé Tampon Tris/HC1 100 mmol/litre 2-hydroxy-3,5dichloro- benzènesulfonate de sodium 1,0 mmol/litre glycérol 5 mmol/litre eau complément - 13 - EXEMPLE III On a analysé cent échantillons de sérum de patients tant par le présent procédé que par un procédé au bleu de méthylthymol tel qu'il s'ap- plique à l'analyseur DuPont ACA et à une méthode manuelle au sulfonate de magon, telle qu'elle est définie dans Baginski et al. Magnesium in Biological Fluids, Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol. 19 (1982) pp. 277-281, et Baginski et al. Microdétermination of Magnesium in Biological Fluids, 27 Microchem (1982) pp.141-150, documents auxquels il convient de se référer. O On a comparé les données des échantillons. On a obtenu une excellente corrélation de données avec les deux procédés exposés en se référant à la Figure 3. Voici des données appropriées de régression linéaire: (y) proposé = O,981(ACA) - O,01(mmol/litre),(r=O,961) (Y) proposé = 1,007(magon) - O,03(immol/litre),(r=0,952). REVENDICATIONS 1 - Composition pour déterminer la teneur en magnésium d'un fluide aqueux, caractérisée en ce qu'elle contient de l'oxydase d' i - glycéro- phosphate, une substance dont l'activité est analo. gue à celle de la péroxydase, de la glycérokinase, du 5'triphosphate d'adénosine (ATP), du glycérol, un co-substrat oxydable à la péroxydase, un co-sub- IO strat coupleur - indicateur, un tampon capable de maintenir le pH d'une solution entre 5,5 et 9,2, et enfin de l'eau 2 - Composition suivant.la revendica- tion 1, caractérisée en-ce que le tampon est l'a- cide tris (hydroxyméthyl) - aminométhane chlorydri- que 3 - Composition suivant la revendica- tion 2, caractérisée en ce qu'elle comprend deux solutions aqueuses réactives, dont la première con- tient essentiellement: - entre environ O, 01 et 1,0 moles de tampons par litre d'eau; - entre environ 0,05 et 2,0 mil- limoles de 5' - triphosphate d'adénosine; - entre environ 0,05 et 10,0 mil- limoles par litre d'eau de co- substrat oxydable par la péro- xydase; - entre environ lkU et 10 kU d' oxydase d' par litre d'eau,de la substan- ce ayant une activité de péro- xydase; et: - entre environ 10 U, et 150 U de kinase glycérolée par li- tre d'eau. - 15 - 4. La composition selon la Revendication 3, caractérisée en ce que la seconde solution réactive se compose essentiellement de: a) entre environ 0,05 et environ 1 mole de tampon par litre d'eau; b) entre environ 0,01 et environ 5,0 millimoles du co-substrat- coupleur indicateur par litre d'eau, et c) entre environ 0,05 et environ 20,0 millimoles de glycérol par litre d'eau. 5. La composition selon la Revendication 1, caractérisée en ce que le cosubstrat oxydable de péroxydase est choisi dans le groupe comprenant o le benzidène, les p-phénylènediamines, les p-aminophénols, le 4-amino- antipyrène, le 3-méthyl-2-benzothiazolimone, et des mélanges de ces subs- tances. 6. La composition selon la Revendication 1, caractérisée en ce que le co-substrat-coupleur indicateur est choisi dans le groupe comprenant les sels d'ammoniaque de 2-hydroxy-3,5-dichlorobenzène- sulfonate, les sels de métaux alcalins de 2-hydroxy-3,5-dichloro-benzène- sulfonate, et les mélanges de ces substances. 7. La composition selon la Revendication 1, caractérisée en ce que la kinase glycérolée est un magnésium dépendant et dérivé des Streptomyces o canus. 8. La composition selon la Revendication 1, caractérisée en ce que la kinase glycérolée est un magnésium dépendant dérivé du Bacillus Stearo- themophilis. 9. La composition selon la Revendication 1, caractérisée en ce que l'oxydase d'c-glycérophosphate est dérivée de l'Aerococcus viridans. 10. Procédé pour déterminer le taux de magnésium dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les phases qui consistent à: a) mettre un échantillon du liquide aqueux en contact avec une composition essentiellement composée de: o 1) kinase glycérolée; 2) oxydase glycérolée; 3) péroxydase; 4) 5'-triphosphate d'adénosine; ) glycérol; 6) un co-substrat oxydable par la péroxydase; 7) un co-substratcoupleur indicateur; 8) un tampon capable de maintenir L3 pH d'une solution entre environ 6,0 et environ 8,0, et 9) eau, et -I6- b) détecter quantitativement la présence d'un produit de réaction obtenu suivant a). 11. Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le pro- duit de la réaction est le péroxyde d'hydrogène. 12. Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le pro- duit de la réaction est un chromogène coloré. 13. Procédé selon la Revendication 12, caractérisé en ce que le chro- mogène obtenu a une absorbance comprise entre environ 450 et environ 650 nm. 14. Procédé selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il com- prend en outre la phase qui consiste à observer la formation du produit réactionnel sur une période comprise entre environ 5 et environ 15 minutes. 15. Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que la pha- se de mise en contact se produit à un pH situé entre environ 6,5 et environ 7,5. 16. Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que la com- position utilisée dans la phase de contact est une solution réactive en deux parties qui consiste en: a) une première solution réactive essentiellement composée de ki- nase glycérolée, de 5'triphosphate d'adénosine, d'un co-substrat oxydable par la péroxydase, d'oxydase d'"-glycérophosphate, la substance ayant eu antérieurement une activité de péroxydase, de kinase glycérolée, d'eau et d'un tampon capable de maintenir le pH entre environ 6,0 et environ 8,0 et b) une seconde solution réactive essentiellement composée du co- substrat-coupleur indicateur, de glycérol, d'eau et d'un tampon capable de maintenir le pH de la solution entre 6,0 et 8,0. 17. Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que la pre- mière solution réactive se compose essentiellement: a) d'eau; b) de 5'-triphosphate d'adénosine en quantité comprise entre envi- ron 0,1 et environ 1,0 millimole par litre d'eau; c) de 4-aminoantipyrène en quantité comprise entre environ 0,5 et environ 2,0 millimoles par litre d'eau; d) d'oxydase d'c-glycérophosphate en quantité comprise entre envi- ron 2,0 et environ 10 U/litre; e) de péroxydase en quantité comprise entre environ 0,5 kU et en- viron 2 kU/litre; f) de kinase glycérolée en quantité comprise entre environ 10 U et environ 35 U/litre, et g) d'un agent tampon en quantité suffisante pour maintenir le pH entre environ 6,0 et environ 8,0. 18. Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en ce que la se- conde solution réactive se compose essentiellement: a) d'eau; b) de 2hydroxy-3,5-dichlorobenzène-sulfonate de sodium en quan- tité comprise entre environ 0,05 et environ 2,0 millimoles par litre d'eau; c) de glycérol en quantité comprise entre environ 0,2 et environ millimoles par litre, et d) d'un agent tampon en quantité suffisante pour maintenir le pH entre environ 6,0 et environ 8,0. 19. Procédé selon la Revendication 18, caractérisé en ce que la pha- se de mise en contact consiste à: a) faire incuber une fraction mesurée de la première solution ré- active à une température comprise entre environ 20 C et environ 45OC; b) ajouter un échantillon mesuré du liquide à analyser; c) mélanger les deux matières, et d) ajouter une fraction mesurée de la seconde solution réactive.