Brevet FR2623205A1 — publié le 19890519

"Réceptacle pour substances biologiques et procédé de fécondation utilisant un tel réceptacle" La présente invention concerne des réceptacles en forme de paillettes du genre de celles utilisées pour la conservation de petites quantités de substances biologiques en particulier les paillettes universellement connues à ce jour sous la dénomination "paillettes françaises". La demande de brevet français N 87 10359 divulgue notamment une paillette se composant d'un segment de tube, muni à l'intérieur d'un bouchon tripartite, initialement perméable aux gaz et constitué par deux tampons d'une substance fibreuse qui enserrent une poudre susceptible de se transformer au contact d'un liquide en une pâte ou gel imperméable adhérant à la paroi du tube en créant un bouchon étanche ; cette paillette se caractérise par la disposition vers l'une des extrémités du tube, dite première extrémité, d'un premier bouchon en élastomère et vers l'autre extrémité du tube, dite seconde extrémité, d'un-deuxième bouchon en élastomère, ces bouchons en élastomère obturant le tube d'une manière étanche, même après une ou plusieurs piqûres d'une aiguille creuse amovible. Cette paillette possède de nombreux avantages. En particulier elle permet à une aiguille perçant le bouchon en élastomère situé le plus près du bouchon tripartite d'aspirer en toute sécurité des liquides biologiques dangereux qui ne dépassent pas le bouchon tripartite, car ils transforment la poudre en pâte ou gel imperméable. Ainsi l'aiguille d'aspiration n'est pas polluée par les liquides biologiques et peut resservir sans nettoyage et désinfection entre les différentes aspirations successives. De même cette paillette permet d'aspirer en toute sécurité des solides biologiques, notamment des pollens, qui seront arrêtés par le filtre tripartite grâce à la substance fibreuse et à la poudre qui agissent ensemble comme un filtre. Cette combinaison du bouchon tripartite, déjà connu par le brevet français N 995 878, avec des éléments caractéristiques constitués par les bouchons en élastomère décrits dans la demande de brevet français N 87 10359, présente cependant certains inconvénients. Le bouchon tripartite occupe un certain volume intérieur du tube, et la capacité.de stockage de cette paillette est à peu près égale au volume du segment intérieur du tube compris entre le bouchon tripartite et le bouchon en élastomère le plus éloigné de celui-ci. Le bouchon tripartite ne se laisse traverser facilement que par des gaz. Ainsi si l'on veut remplir la paillette d'un liquide ou d'un solide, ceux-ci ne devront être introduits que d'un seul côté du tube au travers du bouchon le plus éloigné du bouchon tripartite. Avec un diamètre intérieur de l'ordre du millimètre, les paillettes ont un comportement de nature capillaire. Ce phénomène n'est pas gênant si le liquide introduit est homogène et unique. Cependant, on peut dans certaines applications chercher à réaliser un remplissage de plusieurs liquides différents sans les mélanger. Sachant que ces liquides transforment le bouchon tripartite à leur contact, cela nécessite obligatoirement une série de glissements successifs des segments cylindriques à partir de l'extrémité d'injection de ces liquides. En effet, il n'est même pas possible à l'aide d'aiguilles de grande longueur de positionner un segment d'un tel liquide au contact du bouchon tripartite, car celui ci se transformerait et bloquerait toute possibilité d'aspiration des segments de liquide suivants. La série de glissements successifs aurait pour conséquence la possibilité d'une contamination dès le départ d'une substance par une autre. Cette possibilité de contamination dès l'injection d'une substance par une autre est, pour certaines applications, à éviter. La présente invention propose, à cet effet, une paillette du genre ci-dessus évoqué composée d'un segment de tube, ne comportant pas de bouchon tripartite, mais conservant à chacune de ses extrémités, un bouchon en élastomère, ces deux bouchons obturant le tube d'une manière étanche, même après une ou plusieurs piqûres d'une aiguille creuse amovible. Les élastomères sont du type de ceux décrits dans la demande de brevet français N 87 10359. Ils sont choisis non-cytatoxiques et sans propriété de relargage ni d'absorbtion à l'égard du milieu biologique, dans le tube, notamment l'élastomère vulcanisant à froid, à bi-composant Silbione RTV (RHONE-POULENC). Il a été trouvé que l'élastomère constituant le bouchon peut avoir une dureté finale Shore comprise entre 20 et 50. De même chaque bouchon en élastomère peut, comme dans cette dernière demande de brevet, être maintenu par les mêmes ourlets et étranglements circulaires qui viennent ajouter leur effet à l'adhérence de l'élastomère à la paroi interne cylindrique de révolution du tube. De même, les bouchons sont mis en place dans le tube de la même manière que dans cette dernière demande de brevet. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation de la paillette dans un procédé de fécondation in-vitro d'au moins un gamète femelle par un gamète mâle, issu d'un groupe de gamètes mâles, les gamètes étant de provenance humaine ou animale. Ce procédé consiste à former dans le tube une pluralité de segments liquides jointifs respectivement adaptés à constituer de part et d'autre d'une zone intermédiaire de liaison des zones de chargement de gamètes mâles d'un côté et femelles de l'autre. Ce procédé a l'avantage d'être biomimétique, dans la mesure où les spermatozoldes doivent parcourir une certaine distance dans un tube de faible diamètre avant d'atteindre les ovocytes pour en assurer la fécondation. Les gamètes femelles ou ovocytes sont atteints en premier par les spermatozoïdes les plus mobiles et les plus vigoureux. Ce procédé présente donc l'avantage d'une sélection naturelle des spermatozoïdes. Cette fécondation in-vitro est naturellement effectuée à une température appropriée variable selon les espèces concernées. Le clivage de l'oeuf fécondé peut être observé par l'utilisation d'une loupe binoculaire, si l'on utilise un tube transparent de qualité cristal de la Société IMV. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront d'ailleurs de la description qui va suivre à titre d'exemple. Exemple de fécondation de gamètes humains à l'aide de la Paillette selon l'invention. On prend une paillette de qualité cristal, d'une. longueur de 133mm et d'un diamètre interne de 2 mm, obturée à ses deux extrémités par des bouchons en élastomère, et qui a été au préalable stérilisée par irradiation aux rayons gamma. Un des bouchons, soit A, est percé par une aiguille creuse biseautée qui sert d'orifice d'échappement. L'autre bouchon, soit B, est percé par une aiguille montée en bout d'une seringue et remplie sans air d'.un liquide milieu de culture, comme par exemple le milieu B2 de Menezo. On remplit alors tout l'intérieur du tube du liquide rose de Menezo, sans présence d'une phase gazeuse, car la pointe de l'aiguille d'injection de ce milieu sort à peine du bouchon B. L'aiguille d'injection est retirée du bouchon B. A l'aide d'une autre aiguille en bout d'une autre seringue remplie sans air d'un milieu dilueur par exemple milieu F1 ou Tris contenant des spermatozoïdes, on pique de nouveau le bouchon B en faisant dépasser cette fois l'aiguille d'environ 15mm, et on injecte un segment du milieu dilueur d'environ lOmm de longueur ; ceci provoque la sortie par l'aiguille d'échappement du bouchon A d'un volume correspondant du milieu de Menezo. Toutes les aiguilles sont enlevées. On reperce alors le bouchon B à l'aide d'une aiguille creuse biseautée dans la pointe dépasse à peine le bouchon. Avec une aiguille et une seringue de petite capacité, on injecte par le bouchon A quelques gouttes d'un dilueur contenant un ou plusieurs ovocytes. L'excès de liquide s'échappe par l'aiguille creuse du bouchon B. Cette introduction d'ovocyte(s) dans le tube peut être contrôlée par examen à la loupe binoculaire. Toutes les aiguilles sont enlevées. Le tube ainsi rempli est maintenu horizontal à une température voisine de 37-C, et le clivage des ovocytes est contrôlé par examen visuel. Lorsque les embryons atteignent le stade de division 4 ou 8, on les recueille dans une boite de Petri en coupant le tube par un outil tranchant d'une manière perpendiculaire à l'axe du tube, soit dans une zone située en dehors du bouchon voisin des embryons, soit dans une zone en regard du bouchon. Chaque embryon recueilli peut être directement implanté chee une femme receveuse, ou congelé pour conservation dans une paillette française dans un milieu contenant un cryoprotecteur, comme le glycérol, l'éthylène glycol ou le propylène glycol. Pour ce faire l'embryon peut être transféré dans une paillette, selon la présente invention, à l'aide d'aiguilles creuses amovibles. On place l'embryon dans son milieu nourricier contenant le cryoprotecteur et l'on s'arrange, par des injections successives, pour que l'embryon se retrouve à l'intérieur du tube dans son milieu sous la forme d'un segment de liquide entouré de chaque côté d'une bulle d'air.Les bulles d'air jouent le rôle d'amortisseurs lors des changements de volumes entraînés par les transitions de phase liquide-solide et solide-liquide lors de la congélation et de la décongélation. De plus ces bulles d'air servent de séparateur entre différents segments de liquide différents que l'on ne désire pas mélanger au départ. I1 est ainsi possible de prévoir à côté du milieu mourricier contenant l'embryon et le cryoprotecteur, un autre milieu liquide dit de décongélation, ces deux milieux étant dans le tube séparés par une bulle d'air. La paillette est ensuite congelée pour conservation. A la décongélation, les différents milieux repassant à l'état liquide peuvent être mélangés en secouant la paillette de façon à ramener les bulles d'air à une extrémité de la paillette, le milieu de décongélation produisant son effet sur l'embryon avant le transfert de celui-ci. REVENDICATIONS 1) Réceptacle pour substances biologiques, constitué par une paillette composée d'un segment de tube et caractérisée par le fait qu'elle comporte, à chacune de ses extrémités, un bouchon en élastomère, ces deux bouchons obturant le tube d'une manière étanche, même après une ou plusieurs piqûres d'une aiguille creuse amovible. 2) Procédé de fécondation humaine ou animale in-vitro par utilisation de la paillette selon la revendication 1, dans lequel on forme dans le tube une pluralité de segments liquides jointifs respectivement adaptes à constituer de part et d'autre d'une zone intermédiaire de liaison des zones de chargement de gamètes mâles d'un côté et femelles de l'autre.