Brevet FR2621487A1 — publié le 19890414

La présente invention a trait à des procédés pour induire une réponse immunologique chez les vertébrés, y compris les vertébrés non aviaires, en utilisant un virus avipox recombinant de synthèse. Plus particulièrement, L'invention a trait à un procédé pour induire une réponse immunologique chez un vertébré, en particulier un mammi- fère, à un pathogène des vertébrés, en inoculant le verté- bré à L'aide d'un virus avipox recombinant de synthèse contenant de l'ADN qui code pour les déterminants antigé- niques dudit pathogène et qui les exprime, et à des vac- cins comprenant un tel virus avipox modifié. En outre, l'invention a trait à un virus avipox modifié, aux pro- cédés pour le préparer et pour l'utiliser, et à certaines séquences d'ADN obtenues ou impliquées en tant qu'intermé- diaires dans La production de virus avipox modifié et aux procédés pour préparer de telles séquences. t2D ANTECEDENTS DE L'INVENTION L'avipox ou l'avipoxvirus est un genre de virus de la vérole ou variole étroitement apparentés. qui infectent La voLaille. Le genre avipox inctut les espèces "fowLpox" vérole des volailles, "canarypox" vérole du canari, "juncopox" vérole du passereau, "pigeonpox" vérole du pigeon, "quai Lpox" vérole de La caille, "sparrowpox" vérole du moineau, "starlingpox" vérole de l'étourneau, et "turkeypox" vérole du dindon. L'espèce vérole ou variole des volailles infecte les poulets "chickens" et it ne faut pas la confondre avec la maladie humaine appelée varicelle "chickenpox" (La confusion n'est pas possible en français.) Le genre avipox partage de nombreuses caractéristiques avec d'autres virus de la vérole - 2 - et est un membre de la même sous-famille, les virus de la vérole des vertébrés, comme la vaccine. Les virus de la vérole, y compris la vaccine et L'avipox, se répliquent au sein de cellules h8tes eucaryotes. Ces virus se distinguent par leur grande taille, leur complexité et par le site de réplication cytoplasmique. Toutefois, la vac- cine et l'avipox sont des genres différents et ils se distinguent par leur poids moléculaire respectif, leurs déterminants antigéniques, et leurs espèces hôtes, comme il est rapporté dans Intervirology Vol. 17, pages 42-44, "Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses" (Quatrième Rapport du Comité International sur la Taxonomie des Virus) (1982). Les virus avipox n'infectent pas de manière pro- ductive les vertébrés non aviaires comme les mammifères, y compris les humains. En outre, l'avipox ne se propage pas lorsqu'il est inoculé dans des cultures de cellules mammi- fères (y compris humaines). Dans de telles cultures de cellules de mammifères inoculées à l'aide d'avipox, les cellules mourront à cause d'un effet cytotoxique, mais elles ne montreront aucun signe d'infection virale productive. L'inoculation d'un vertébré non aviaire tel qu'un mammifère à l'aide d'avipox vivant a pour résultat la formation d'une lésion au site d'inoculation qui ressemble à une inoculation de vaccine. Toutefois, aucune infec- tion virale productive n'en résulte. Néanmoins, on a maintenant trouvé qu'un mammifère inoculé ainsi répond de manière immunologique au virus avipox. Ceci est un résultat inattendu. Les vaccins composés de pathogène tué ou de compo- sants antigéniques purifiés de tels pathogènes doivent être injectés en plus grandes quantités que les vaccins de virus vivant pour obtenir une réponse immunologique efficace. Ceci est dO au fait que l'inoculation par un virus vivant est une méthode de vaccination beaucoup plus efficace. Un inoculum relativement petit peut entraÂner une réponse immunologique efficace parce que l'antigène en cause est amplifié pendant la réplication du virus. D'un point de vue médical, les vaccins de virus vivant fournissent une immunité qui est plus efficace et plus durable que n'en donne une inoculation à l'aide d'un pathogène tué ou de vaccin d'antigène purifié. Ainsi, les vaccins composés de patho- gène tué ou de composants antigéniques purifiés de tels patho- gènes exigent La productions de plus grandes quantités de matériau de vaccin que ce dont on a besoin avec un virus vivant. Il est clair d'après la discussion précédente qu'il y a des avantages médicaux et économiques à utiliser des vaccins de virus vivant. Un tel vaccin de virus vivant comprend du virus vaccine. Ce virus est connu dans la technique anté- rieure comme étant un virus utile dans lequel on peut insérer de l'ADN représentant les séquences génétiques d'antigènes de pathogènes de mammifères par des méthodes d'ADN recombinant. Ainsi, des procédés ont été mis au point dans la technique antérieure, qui permettent la création de virus vaccine recombinants par l'insertion d'ADN provenant d'une source quelconque, (comme par exemple virale, pro- caryote, eucaryote, de synthèse) dans une région non essentielle du génome de vaccine, y compris des séquences d'ADN codant pour Les déterminants antigéniques d'un organisme pathogène. Certains virus vaccine recombinants créés par ces méthodes ont été utilisés pour induire une immunité spécifique chez les mammifères à une variété de pathogènes de mammifères, tous tels qu'il sont décrits dans le brevet U.S. No. 4.603. 112, qui est intégré ici à titre de référence. Le virus vaccine non modifié a une longue his- toire d'usage relativement sûr et efficace pour l'inocu- lation contre la variole. Toutefois, avant l'éradication de la variole, lorsque la vaccine était administrée de manière générale, il existait un risque modeste mais réel de complications sous forme d'infection généralisée par la vaccine, en particulier chez ceux souffrant d'eczéma ou - 4 - d'immunodépression. Une autre complication rare mais possible pouvant résulter d'une inoculation à la vaccine était l'encéphalite postérieure à la vaccination. La plupart de ces réactions résultaient de l'inoculation d'individus ayant des maladies cutanées comme de l'eczéma, ou des système immunitaires défectueux, ou des individus dans des foyers o d'autres personnes avaient de l'eczéma ou des réponses immunologiques défectueuses. La vaccine est un virus vivant qui est normalement inoffensif pour un individu sain. Toutefois, il peut être transmis d'un individu à l'autre pendant plusieurs semaines après l'ino- culation. Si un individu souffrant d'un défaut de rép- onse immunologique normale est infecté, soit par inocu- lation soit par transmission contagieuse à partir d'un individu inoculé récemment, les conséquences peuvent être graves. Ainsi, on appréciera qu'un procédé qui confère à la technique les avantages d'une inoculation au virus vivant, mais qui diminue ou élimine les problèmes discutés auparavant, constituerait un progrès-extrimement désirable par rapport à l'état actuel de la technique. Ceci est encore plus important aujourd'hui avec la progression de La maladie connue sous le nom de Syndrome Immuno-Déficience Acquis (SIDA). Les victimes de cette maladie souffrent de troubles immunologiques graves et pourraient être atteints aisément par une préparation de virus vivant autrement inoffensive, s'ils venaient en contact avec un tel virus, soit directement, soit par contact avec une personne immunisée récemment à l'aide d'un vaccin comprenant un tel virus vivant. BUTS DE L'INVENTION La présente invention a pour objet de fournir un vaccin qui est capable d'immuniser des vertébrés contre un organisme pathogène, vaccin qui a les avantages d'un vaccin de virus vivant et qui a peu ou aucun des inconvé- nients, soit d'un vaccin de virus vivant soit d'un vaccin de virus tué, comme on les a énumérés ci-dessus, en -5 2- particutier lorsqu'il est utilisé pour immuniser des vertébrés non aviaires. Cette invention a pour autre but de fournir des virus adipox recombinants de synthèse à employer dans de tels vaccins. Cette invention a pour autre objet de fournir un procédé pour induire une réponse immunologique à un anti- gène chez les vertébrés aviaires et non aviaires, en ino- culant vertébré à l'aide d'un virus avipox recombinant de synthèse qui, dans le cas des vertébrés non aviaires comme les mammifères, ne peut pas se répliquer de manière productive dans l'animal avec La production de virus infectieux. Dans ce cas, Le virus est auto-Limitant, ce qui réduit la possibilité de propagation à des h8tes non vaccinés. L'invention a encore pour autre but de fournir un procédé pour induire une réponse immunologique à un anti- gène chez un vertébré, lequel procédé comprend l'inocula- tion du vertébré à l'aide d'un vaccin contenant -le virus avipox recombinant de synthèse qui comprend et exprime le déterminant antigénique d'un pathogène pour ledit vertébré. L'invention a pour autre but de fournir un procédé pour exprimer un produit de gène chez un vertébré en inoculant le vertébré à l'aide d'un virus recombinant contenant de l'ADN qui code pour Le produit de gène et qui exprime ce dernier sans réplication productive du virus chez le vertébré. L'invention a pour autre but de fournir un procédé pour induire une réponse immunologique à un antigène chez un vertébré en inoculant le vertébré à l'aide d'un virus recombinant contenant de l'ADN qui code pour l'antigène et exprime ce dernier sans réplication productive du virus chez le vertébré. DESCRIPTION DE L'INVENTION Selon l'un de ses aspects, la présente invention a trait à un procédé pour induire une réponse immunologique à un pathogène chez un vertébré, en inoculant le vertébré à - 6 - 262621487 - 6 -- l'aide d'un virus avipox recombinant de synthèse, modifié par La présence, dans une région non essentielle du génome de l'avipox, d'ADN provenant d'une source queLconque qui code pour un antigène du pathogène et qui l'exprime. Selon un aspect supplémentaire, la présente invention est centrée sur un procédé pour exprimer un produit de gène ou induire une réponse immunologique à un antigène chez un vertébré à l'aide d'un virus recombinant qui ne se réplique pas de manière productive dans les cellules du vertébré mais qui exprime bien le produit du gène ou l'antigène dans ces celluLes. Selon un aspect supplémentaire, la présente invention est centrée sur un virus avipox recombinant de synthèse, modifié par l'insertion, à l'intérieur de celui-ci, d'ADN provenant d'une source quelconque et en particuLier d'une source non avipox, dans une région non essentielle du génome de l'avipox. Des recombinants du virus avipox modifiés par synthèse portant des gènes exogènes (c'est-à- dire non avipox) codant pour un antigène et l'exprimant, lesquels recombinants provoquent la production par un h8te vértébré de réponses immunologiques à l'antigène et donc au pathogène exogène, sont utilisés selon l'invention pour créer de nouveaux vaccins qui évitent les inconvénients des vaccins classiques utilisant des organismes tués ou des organismes vivants atténués, en particulier lorsqu'on Les utilise pour inoculer des vertébrés non aviaires. Il faut remarquer de nouveau que Les virus avipox ne peuvent se répliquer de manière productive ou être transmis que par L'intermédiaire d'espèces aviaires ou de Lignées de cellules aviaires. Les virus avipox recombi- nants récoltés à partir de celluLes aviaires hôtes, lorsqu'iLs ont été inoculés dans un vertébré non aviaire comme un mammifère d'une manière analogue à L'inoculation de mammifères par le virus vaccine, produisent une Lésion d'inoculation sans réplication productive du virus avipox. Malgré l'échec du virus avipox à se répliquer de manière productive chez un tel vertébré non aviaire inocuLé, iL se _ 7 _ 6 2621487 produit une expression suffisante du virus pour que L'animaL inoculé réponde de manière immunologique aux déterminants antigéniques du virus avipox recombinant et aussi aux déterminants antigéniques codés dans les gènes exogènes de celui-ci. Lorsqu'il est utilisé pour inoculer des espèces aviaires, un tel virus avipox recombinant de synthèse produit non seulement une réponse immunologique aux antigènes codés par L'ADN exogène provenant d'une source quelconque qui peut être présent à l'intérieur de celui-ci, mais il résulte également en une réplication productive du virus chez l'hôte avec l'évocation d'une réponse immunologique attendue au vecteur avipox en soi. Plusieurs chercheurs ont proposé la création d'une vérole des volailles recombinante, en particulier de virus, à employer en tant que vaccins vétérinaires pour la protection des élevages de volaille. Boyle et Coupar, J. Gen. Virol. 67, 1591-1600 (1986), et Binns et coll., Isr. J. Vet. Med. 42, 124-127 (1986). Ni projets ni rapports réels centrés sur l'emploi de virus avipox recombinants en tant que procédé pour induire une immunité particulière chez les mammifères, n'ont été publiés. Stickl et Mayer, Fortschr. Med. 97(40), pages 1781-1788 (1979) décrivent l'injection d'avipox, en parti- culier de virus de la vérole des volailles chez les humains. Toutefois, ces études n'ont trait qu'à l'emploi de vérole des volailles ordinaire pour renforcer une immunité non spécifique chez les patients souffrant des effets secondaires de la chimiothérapie du cancer. On ne se sert d'aucune technique d'ADN recombinant. Il n'y a pas d'enseignement concernant avipox dans lequel de L'ADN codant pour les antigènes de pathogènes de vertebrés a été in- séré, ni d'un procédé pour induire une immunité spécifique chez les vertebrés. A la place, La technique anté- rieure dépendait d'un effet tonique général et non spécifique sur l'hôte humain. Une discussion plus complète de la base de la -- 8 --2621 recombinaison génétique pourrait aider à comprendre comment les virus recombinants modifiés de la présente invention sont créés. La recombinaison génétique est en général l'échange de sections homologues d'acide désoxyribo- nucléique (ADN) entre deux brins d'ADN. (Dans certains virus, de l'acide ribonucléique EARNJ peut remplacer l'ADN) . Des section homologues d'acide nucléique sont des sections d'acide nucléique (ARN ou ADN) qui ont la mime séquence de bases de nucleotides. Une recombinaison génétique peut survenir naturel- lement pendant la réplication ou la fabrication de nou- veaux génomes viraux au sein de La cellule h8te infectée. Ainsi, une recombinaison génétique entre des gènes viraux peut survenir pendant le cycle de réplication virale qui a lieu dans une cellule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres constructions géné- tiques. Une section d'ADN d'un premier génome est utilisée de manière interchangeable pour construire la section du génome d'un second virus coinfectant dans lequel l'ADN est homologue de celui du premier génome viral. Toutefois, une recombinaison peut également sur- venir entre des sections d'ADN dans différents génomes qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une telle section provient d'un premier génome homologue avec une section d'un autre génome sauf pour la présence à l'intérieur de la première section, par exemple, d'un marqueur génétique ou d'un gêne codant pour un déterminant antigénique inséré dans une portion de l'ADN homologue, la recombinaison peut encore avoir lieu et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gêne. Une expression réussie de la séquence génétique d'ADN insérée par le virus infectieux modifié exige deux conditions. D'abord, l'insertion doit se faire dans une région _ 9 _ non essentielle du virus afin que le virus modifié reste viable. Ni la vérole des volailles ni les autres virus avipox n'ont démontré jusqu'à maintenant des régions non essentielles analogues à celles qui ont été décrites pour le virus vaccine. Par conséquent, pour la présente in- vention, on a découvert des régions non essentielles de la vérole des volailles en clivant le génome de la vérole des volailles en fragments, puis en séparant les fragments par taille et en insérant ces fragments dans des constructions de plasmides en vue d'une amplification. (Les plasmides sont de petites molécules d'ADN circulaires trouvées en tant qu'éléments extra-chromosomiques dans de nombreuses bactéries y compris E. coli. Les procédés pour insérer de séquences d'ADN telles que les gênes pour les déterminants antigéniques ou d'autre marqueurs génétiques dans les plasmides sont bien connues dans la technique et décrites en détails par Maniatis et coll.., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," (Clonage Moléculaire: Un Manuel de Laboratoire), Cold Spring Harbor Laboratory, New York [19823). Ceci a été suivi par l'insertion de marqueurs génétiques et/ou de gènes codant pour les antigènes dans les fragments de véroles des volailles clones. Les frag- ments qui dirigeaient une recombinaison réussie, comme il a été prouvé par une récupération réussie du marqueur génétique ou des antigènes, étaient ceux qui comprenaient de l'ADN inséré dans une région non essentielle du génome de la vérole des volailles. La seconde condition pour l'expression de l'ADN inséré est la présence d'un promoteur en relation conve- nable avec l'ADN inséré. Le promoteur doit être placé de manière qu'il soit situé en amont de la séquence d'ADN à exprimer. Comme les virus avipox ne sont pas bien carac- térisés et que les promoteurs d'avipox n'ont pas encore été identifiés dans la technique, des promoteurs connus pour d'autres virus de la vérole sont insérés de manière utile en amont de l'ADN à exprimer en tant que partie de la présente invention. Bien entendu, on comprendra que, - 10 - une fois que les promoteurs de la vérole des volailles auront été identifiéet on pourra les utiliser avec succès pour mettre en oeuvre les procédés et fabriquer Les produits de l'invention. Les promoteurs de La vérole des volailles peuvent également être utilisés avec succès pour mettre les procédés à exécution et fabriquer les produits de l'invention. Selon la présente invention, on a trouvé que les promoteurs de la vérole des volailles, les promoteurs de la vaccine et les promoteurs de la vérole des insectes promouvaient la transcription dans le virus de la vérole recombinant. Boyle et Coupar, J. gen. Virol. 67, 1591 (1986) ont publié une spéculation que "l'on pouvait s'attendre à ce que les promoteurs du vaccinia fonctionnent dans le virus (de la vérole des volaille)". Les auteurs ont repéré et cloné un gêne TK de la vérole des volailles (Boyle et coll., Virology 156, 355-365 E19873) et l'ont inséré dans un virus vaccine. Ce gêne TK a été exprimé, sans doute à cause de la reconnaissance de la séquence promoteur TK de la vérole des volailles par les fonc- tions polymérases de la vaccine. Toutefois, malgré leur spéculation, les auteurs n'ont inséré aucun promoteur de la vaccine dans un virus de vérole des volailles et ils n'ont observé aucune expression d'une séquence d'ADN étrangère présente dans un génome de vérole des volailles. On ne savait pas, avant la présente invention, que des promoteurs provenant d'autres virus de vérole, comme les promoteurs de la vaccine, pourraient en fait promouvoir un gène dans un génome avipox. DESCRIPTION DE CERTAINS MODES DE REALISATION PREFERES Les virus de vérole des volailles et de vérole du canari ont été utilisés en particulier selon La présente invention en tant qu'espèces d'avipox préférées à modifier par recombinaison en incorporant de l'ADN exogéne à l'intérieur de ceux-ci. La vérole des volailles est une espèce d'avipox 262 1 487 - 1 1 - qui infecte les poulets en particulier, mais qui n'infecte pas les mammifères. La souche de vérole des volailles désignée ici par FP-5 est une souche de vaccin du virus de vérole de volaille commerciale d'origine d'embryon de poulet, disponible auprès d'American Scientific Laboratories (Division de Schering Corp.) Madison, WI, Licence Vétérinaire des EtatsUnis No. 165, No. de série 30321. La souche de vérole de volaille désignée ici par FP-1 est une souche Duvette modifiée pour être utilisée en tant que vaccin chez des poussins d'un jour. La souche es une souche commerciale de vaccin de virus de vérole des volailles désignée par 0 DCEP 25/CEP67/2309 d'octobre 1980 et elle est disponible auprès de l'Institut Mérieux, Inc. La vérole du canari est une autre espèce d'avipox. De manière analogue à la vérole des volaille, la vérole du canari infecte en particulier les canaris, mais elle n'infecte pas les mammifères. La souche de vérole du canari désignée ici par CP est une souche commerciale de vaccin de vérole du canari désigné par LF2 CEP 524 24 10 et elle est disponible auprès de l'Institut Mérieux, Inc. Les séquences génétique d'ADN insérées dans ces virus avipox par recombinaison génétique selon la présente Z5 invention incluent le gène Lac Z, d'origine procaryote; le gène de la glycoprotéine (G) de la rage, un antigène d'un pathogène non aviaire (spécifiquement mammifère); le gène de l'hémagglutinine de la grippe du dindon, l'antigène d'un virus aviaire pathogène autre qu'un virus avipox; le gène de l'enveloppe gp51,30 du virus de la leucémie bovine, un virus de mammifère; le gène de fusion des protéines (souche Texas) du virus de la maladie de Newcastle, un virus aviaire; Le gène FeLV enveloppe du virus de la Leucémie féLine, un virus de mammifère; Le gène 1-RAV env du virus associé au Rous qui est une maladie de virus aviaire/volaiLLe; Le gène de nucléoprotéine (NP) du virus de la grippe des poulets Chicken /PennsyLvania/1/83, un virus - 12 - 2621487 aviaire; le gène de la matrice du virus et Le gène péplomére de La bronchite infectieuse (souche de Mass 41), un virus aviaire; le gène NP du virus de la grippe aviaire; et le gène D de La glycoprotéine (gD) du virus herpes simplex, un virus de mammifère. L'isolation du gène Lac Z est décrite par Casadaban et coll., "Methods in Enzymology" (Méthodes en EnzymoLogie) , 293-308 (1983). La structure du gène G de la rage est décrite, par exemple, par AniLionis et colL., Nature 294, - 275-278 (1981). Son incorporation dans la vaccine et son expression dans ce vecteur sont discutées par Kieny et coll., Nature 312, 163-166 (1984). Le gène de l'hémagglutinine de l'grippe du dindon est décrit par Kawaoku et colt., Virology (Virologie) 158, 218-227 (1987). Le gène gp5l,30 env du virus de la leucémie bovine a été décrit par Rice et coll., Virology (Virologie) 138, 82-93 (1984). Le gène de fusion du virus de la maladie de Newcastle (souche du Texas) est disponible auprès de l'Institut Mérieux, Inc., en tant que plasmide pNDV 108. Le gène env du virus de la leucémie féline a été décrit par Guilhot et coLL., Virology (Virologie) 161, 252-258 (1987). Le virus associé au Rous du type 1 est disponible auprès de l'Institut Mérieux, Inc., sous forme de deux clones, penVRVIPT et mp19env (190). Le gène NP de l'grippe du poulet est disponible auprès de Toshihiro Kawaoka au "St. Jude Children's Research Hospital" en tant que plasmide pNP 33. Un clone d'ADNc du virus de La bronchite infec- tieuse du gène de matrice Mass 41 1BV et un gène péplomère sont disponibles auprès de l'Institut Mérieux, Inc. en tant que plasmide pIBVM 63. Le gène gD du virus herpes simplex est décrit dans Watson et coll., Science 218, 381-384 (1982). Les virus avipox recombinants décrits en plus grand détail ci-dessous incorporent l'un des trois promoteurs de la vaccine. Le promoteur Pi, provenant de la région Ava I H de la vaccine, est décrit par Wachsman et coll., J. of Inf. _ 13 _ 2621487 -13 2- Dis. 155, 1188-1197 (1987). Plus particulièrement, ce promoteur est dérivé du fragment Ava I H (Xho I G) de la souche de vaccine WR variante L, dans lequel le promoteur dirige la transcription de droite à gauche. La situation sur la carte du promoteur est d'environ 1,3 Kpb (kilopaires de bases) à partir de l'extrémité de gauche de Ava 1H, d'environ 12,5 Kpb à partir de L'extrémité de gauche du génome de La vaccine, et d'environ 8, 5 Kpb à gauche de la jonction Hind III C/N. La séquence du promoteur est: (GGATCCC) -ACTGTAAATAGAAACTATAA.CATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTA GGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG- (AATTC), dans laquelle les symboles entre parenthèses sont des séquences de "linker" (Liaison). Le promoteur Hind II H (également "HH" et "H6) ici) a été défini par des techniques de mappage transcri ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAA TAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATT ATTT CATTATCGCGATATCCGT TAAGTTTGTATCGTAATG. La séquence est identique à celle qui a été décrite comme étant en amont du cadre de lecture ouverte H6, par Rosel et coll., J. Virol. 60, 436-449 (1986). Le promoteur 11K est tel qu'iL est décrit par Wittek, J. Virol. 49, 371378 (1984) et BerthoLet, C. et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985). Les virus avipox recombinants de la présente invention sont construits en deux étapes connues dans la technique et analogues à celles qui sont décrites dans le brevet mentionné ci-dessus U.S. No. 4.603.112 pour créer des recombinants de synthèse du virus vaccine. D'abord, la séquence de gène d'ADN à insérer dans le virus est placée dans une construction de plasmide d'E. coli dans laquelle de l'ADN homologue d'une section d'ADN non essentielle du virus avipox a été inséré. Séparément, La séquence de gène d'ADN à insérer est Liée à un promoteur. La liaison promoteur-gène est alors insérée dans La 262 1 487 - 14 - construction de plasmide, de manière que la Liaison promoteur-gène soit flanquée aux deux extrémités par de l'ADN homologue à une région non essentielle de l'ADN de l'avipox. La construction de plasmide résultante est ensuite amplifiée par croissance au sein de bactéries E. coli. (L'ADN du plasmide est utilisé pour transporter et amplifier du matériau génétique exogéne et ce procédé est bien connu dans la technique. Par exemple, ces techniques de plasmide sont décrites par Clewell, J. Bactériol. 110, 667-676 (1972). Les techniques d'isolation du plasmide amplifié à partir de l'h8te E. coli sont également bien connues dans la technique et sont décrites, par exemple, par Clewell et coLL. dans Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 62, 1159-1166 (1969). Le matériau de plasmide amplifié isolé après la croissance au sein de E. coli est ensuite utilisé pour la deuxième étape. C'est-à-dire que le plasmide contenant la séquence de gènes d'ADN à insérer est transfecté dans une culture de cellules, comme par exemple des fibroblastes d'embryon de poulet FEP, en même temps que le virus d'avipox (tel que la souche de vérole des volailles FP-1 ou FP- ). Une recombinaison entre l'ADN de vérole des volail- les homologue dans le plasmide et le génome viral respec- tivement donne un virus avipox modifié par la présence, dans une régionnon essentielle de son génome, de séquences d'ADN non vérole-des-volailles. On gagnera une meilleure compréhension de la présente invention et de ses nombreux avantages à la lec- ture des exemples suivants, qui sont donnés à titre illustratif. Exemple 1 - ESSAIS D'EXPRESSION TRANSIENTE DEMONTRANT LA RECONNAISSANCE DES PROMOTEURS DE LA VACCINE PAR LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION DE L'ARN DE VEROLE DES VOLAILLES On a réalisé un certain nombre de constructions de plasmides contenant la séquence de codage de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBSAg) liée aux _ 15 2 2621487 séquences du promoteur du virus vaccine. 50 ug de chaque plasmide ont été transfectés dans des ceLlules FEP infectées à une dose de 10 pfu par cellule avec le virus de vérole des volailles ou Le virus vaccine. On a Laissé l'infection se dérouler pendant 24 heures et Les cellules ont ensuite été lysées par trois cycles successifs de congélation et décongélation. La quantité de HBSAg dans le lysat a été estimée en utilisant le kit 125I AUSRIA II disponible dans le commerce auprès de la Division Diagnostic d'Abbott Laboratories, la présence ou L'absence de HBSAg est exprimée sous forme d'un rapport des comptes nets (échantillon moins bruit de fond) de l'inconnu à une valeur de coupure négative prédéterminée par le fabricant. Ceci résulte en un rapport P/N (positif/ négatif). Les résultats sont exposés au tableau I. - 16 - TABLEAU I Plasmide Virus Description Rapport P/ pMP 131piR2 vérole des SAg liée au 1,8 volailles promoteur Pi vaccine 9,1 pMPK 22,13S vérole des SAg liée au 14 volailles promoteur 11K vaccine 2 pPDK 22,5 vérole des SAg Liée au 92,6 volailles promoteur 11K vaccine 5,6 pRW 668 vérole des SAg liée au 77 volailles promoteur HH vaccine 51,4 (pas de vérole des 1,1 plasmide) volailles pas de vaccine 1,3 plasmi de) pMKP 22,13S(u.c) (pas de virus) 1,3 - 17 - On a utilisé trois séquences de promoteur de vaccine différentes: Le promoteur Pi, identifié a un stade précoce de L'infection à la vaccine avant la réplication l'ADN; Le promoteur 11K, identifié tard dans L'infection à la vaccine après Le début de La réplication de l'ADN; et le promoteur Hind III H (HH) identifié à la fois t8t et tard dans l'infection à la vaccine. Ces promoteurs ont été décrit auparavant ici. Les données indiquent que le HBSAg produit dans les Lysats des cellules infectées est le résultat de la reconnaissance des promoteurs de la vaccine par les facteurs transcriptionnels soit de vérole des volailles soit de la vaccine. Exemple 2 - CONSTRUCTION DU VIRUS vFP-1 RECOMBINANT DE VEROLE DES VOLAILLES CONTENANT LE GENE LAC Z Un fragment dans une région non essentielle du virus de véroLe des voLaiLLes a été LocaLisé et isolé comme suit. La nucLéase BaL 31 a été utiLisée pour éliminer les boucLes en épingle à cheveux terminales à brin unique de L'ADN FP-5. Le (grand) fragment de KLenow de La poLymérase I de L'ADN (fragment Klenow) a été utilisé pour créer des extrémités franches. A la suite de l'élimination des boucles, Les fragments ont été générés par digestion à l'endonucléase de restriction à l'aide de BgL II. Cette digestion a produit une série de fragments FP-5 qui ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Un fragment BglII à extrémités franches de 8,8 kpb a été isolé et Lié dans un plasmide disponible dans Le commerce, Le pUC 9, qui avait été cLivé à L'aide de Bam HI et de Sma I. Le plasmide résultant a été désigné par pRW - 698. Pour diminuer la taille du fragment de vérole des volailles, ce plasmide a été clivé à l'aide de Hind III pour créer deux nouveaux fragments. Un fragment de 6,7 Kpb a été rejeté et le fragment de 4,7 Kpb restant a - 18 -1487 été lié à lui-mime pour former un nouveau pLasmide désigné par pRW 699. Pour incorporer un gêne Lac Z promu au 11K dans ce plasmide, le pRW 699 a été découpé à l'aide d'EcoRV, qui clive le plasmide à un seul site. Le segment Lac Z promu au 11K a ensuite été inséré en tant que fragment à extrémités franches de PstI-Bam HI, en créant un nouveau plasmide désigné par pRW 702. Le clone Lac Z provient de pMC 1871, tel qu'il a été décrit par Casadaban et colt., ref. cit. Le promoteur 11K a été Lié au huitième codon du gène Lac Z par L'intermédiaire d'un agent de Liaison Bam HI. A l'aide de techniques de recombinaison telles que celles qui ont été enseignées pour la vaccine dans le brevet U.S. No. 4.603.112, le plasmide pRW 702 a été ensuite recombiné avec Le virus de vérole des volailles FP5 croissant sur des fibroblastes d'embryon de poulet (FEP) en utilisant les procédures suivantes pour générer le vFP-1. On a mélangé cinquante ug d'ADN pRW 702 dans un volume final de 100 ut avec 0,5 ug d'ADN de vérole des volailles à génome complet. On a ajouté à cela 10 ut de CaCl2 2,5 M et 110 ul de tampon 2 x HEBS (pH7) préparé à partir de: mM de Hepes 300mM de NaCL 1,4mM de Na2HPO4 mM de KCI 12mM de dextrose Après 30 minutes à la température ambiante, on a ajouté 200 ut d'un réservoir de virus de vérole des volailles dilués pour donner 5 pfu/ceLlule et on a inoculé le mélange dans des bottes de 60 mu contenant une monocouche de FEP primaires. On a également ajouté 0,7 ml de mitieu d'Eagles contenant 2% de sérum de foetus de veau (SFV) à ce moment-là. On a fait incuber les plaques à 37 C pendant 2 heures, à la suite de quoi on a ajouté 3 ml supplé- mentaires de milieu d'Eagles contenant 2% de SFV, et les _ 1 9 _ _ 2621487 - 19 - plaques ont été incubées pendant 3 jours. Les cellules ont été lysées par trois cycles successifs de congélation et décongélation et on a ensuite dosé le virus descendant pour la présence de recombinants. On a obtenu la preuve d'une insertion réussie par recombinaison du gène Lac Z promu au 11K dans le génome du virus de vérole des volailles FP-5 en testant pour L'expression du gène Lac Z. Le gène Lac Z code pour l'enzyme Béta-galactosidase, qui clive Le substrat chromo- gène bromo-5 chloro-4 indolyl-3 Béta-D-galactoside (X-gal) en libérant un dérivé indolyle bleu. Les plaques bleues ont été sélectionnées en tant que recombinants positifs. L'insertion réussie du Lac Z dans Le génome du virus de vérole des volailles FP-5 et son expression ont aussi été confirmées par immunoprécipitation de la pro- téine Béta-galactosidase à l'aide d'antisérums disponibles dans le commerce et de techniques standard utilisant des FEP BSC infectées au vFP1 (lignée de cellules de rein de singe - ATCC CCL26),VERO (lignée de cellules de rein de singe - ATCC CCL81), et MRC-5 (lignée de cellules diploides de poumon humain - ATCC CCL171). L'expression de la Béta-galactosidase par le virus * recombinant vFP-1 a été confirmée en outre in vivo en ino- culant des Lapins et des souris à l'aide du virus et en mesurant avec succès une augmentation, à la suite de l'ino- culation, des titres des anticorps dirigés contre La protéine Bétagalactosidase dans le sérum des animaux inoculés. En particulier, le vFP1 recombinant a été purifié à partir des contaminants des cellules hôtes et inoculé en intradermique à deux endroits de chaque c8té de deux lapins. Chaque lapin a reçu un total de 108 pfu. Les animaux ont été saignés à intervalles heb- domadaires et les sérum utilisés dans un dosage ELISA utilisant une préparation disponible dans le commerce de Béta-galactosidase purifiée en tant que source d'antigène. Aussi bien les lapins que les souris inoculés à - 20 - L'aide du vFP-1 recombinant ont donné une réponse immuno- Logique à La protéine Béta-galactosidase comme on L'a détectée dans un dosage ELISA. Chez les deux espèces, la réponse était détectable à la fin d'une semaine à la suite de L'inoculation. Example 3 - CONSTRUCTION A PARTIR DU VIRUS FP-5 DE LA VEROLE DES VOLAILLES DU VIRUS vFP-2 RECOMBINANT CONTENANT LE GENE G DE LA RAGE ET LE GENE LAC Z On a obtenu un fragment Pvu II de 0.9 Kpb à partir du FP-5 et on L'a inséré par des techniques standard entre Les deux sites Pvu II dans le pUC 9. La construction résultante, désignée par pRW 688,2, possède deux sites Hinc II, à une distance d'environ 30 pb, asymétriques au sein du fragment Pvu II et formant ainsi un bras Long et un bras court du fragment. On a inséré des adapteurs oligonucLéotides entre ces deux sites Hinc II en utilisant des techniques connues pour introduire des sites Pst I et Bam HI, en créant ainsi le plasmide pRW 694. Ce plasmide a ensuite été cLivé à l'aide de Pst I et de Bam HI et le gène Lac Z étant lié à un promoteur 11K de vaccine décrit ci-dessus, a été inséré pour créer le nouveau plasmide pRW 700. Pour créer un gène G de la rage promu au Pi, le site Bgl II qui est proximal-5' du gène de La rage (cf. Kieny et coll., réf. cit.) a été pourvu d'une extrémité franche et lié au site Eco RI rempli du promoteur Pi décrit auparavant. Cette construction a été insérée au site Pst I du pRW 700 pour créer le plasmide pRW 735, 1 ayant à L'intérieur la séquence de gènes étrangers Pirage G-11K-Lac Z. Cet insert est orienté de telle façon à l'intérieur du plasmide que le bras long Pvu II-Hinc II de la séquence des donneurs FP-5 est en 3' du gène Lac Z. La construction finale résultant a été recombinée - au virus FP-5 de vérole des volailles par infection/trans- fection de fibroblastes d'embryon de poulet par Les - 21 - 2621487 -21 - méthodes décrites auparavant pour créer le virus vFP-2 recombinant de vérole des volailles. Ce virus recombinant a été sélectionné par coloration X-gal. L'insertion et l'expression correctes aussi bien du gène marqueur Lac Z que du gène G de la rage ont été vérifiées par un certain nombre de méthodes supplémentaires décrites ci-dessous. La localisation immunofluorescente de l'antigène de La rage par des anticorps spécifiques a démontré avec succès l'expression de l'antigène de la rage à la surface de cellules aviaires et non aviaires infectées à l'aide du virus vFP-2. Comme auparavant, L'expression de l'antigène de la rage et de la Bétagalactosidase par des cellules aviaires et non aviaires infectées à l'aide du virus vFP-2 a été confirmée par la méthode d'immunoprécipitation. Une preuve supplémentaire que le mode de réalisation du vFP-2 de cette invention est un virus recombinant réussi portant les gènes de la rage G et de la Béta-galactosidase a été obtenue en inoculant deux lapins à l'aide du virus vFP-2. Les deux lapins ont été inoculés en intradermique avec 1 x 108 pfu de vFP-2 par lapin. Les lapins ont tous deux produit des lésions de vérole typiques. Les lapins ont été saignés à intervalles hebdomadaires et les sérums ont été testés par ELISA pour détecter la présence d'anti- corps spécifiques de la glycoprotéine de la rage et de la protéine Béta-galactosidase. Comme il est rapporté au tableau II ci-dessous, le Lapin 205 a montré des niveaux détectables d'anticorps anti-Béta-galactosidase par le test d'ELISA une semaine après l'inoculation. Celui-ci est monté à deux semaines à un titre de 1 pour 4000 qui s'est maintenu pendant cinq semaines après l'inoculation. En utilisant L'essai de capture d'antigènes ELISA, les sérums du lapin 205 ont montré des niveaux détectables d'anticorps anti-rage, de 3 à 10 semaines après l'inoculation. - 22 - 262148? TABLE II Production d'anticorps par le Lapin 205 contre l'antigène de la rage et la protéine Béta-Galactosidase Temps Titre des anticorps (Réciproque de la dilution du sérum) Présaignée anti-B-galactosidase O Semaine 1 500 Semaines 2-5 (chacune) 4000 Semaine 6 500 Semaine 9 250 Présaignée antirage O Semaine 3 200 Semaine 6 200 Semaine 10 100 Example 4A CONSTRUCTION A PARTIR DU VIRUS FP-1 DE VEROLE DES VOLAILLES DU VIRUS vFP-3 RECOMBINANT CONTENANT LE GENE G DE LA RAGE PROMU Ce mode de réalisation démontre que le gène G de la rage est exprimé entièrement par les souches de vérole des volailles autres que FP-5, particulièrement par une autre souche de virus de vérole des volailles désignée par FP-1. Comme à L'exempLe 3, on a obtenu un fragment Pvu II de 0,9 Kpb à partir de FP-1, en supposant que, comme pour FP-5, le fragment contiendrait une région non essentielLe. Ce fragment a été inséré entre les deux sites Pvu II de pUC 9, en générant un plasmide désigné par pRW 731,15R. Ce plasmide possède deux sites Hinc II, possède une distance d'environ 30 pb, asymétriques au sein du fragment Pvu II et formant ainsi un bras long et un bras court du fragment. Un agent de liaison Pst disponible dans le - 23 - commerce (5') - CCTGCAGG - (3') a été inséré entre Les deux sites Hinc II en créant un plasmide pRW 741. Un gêne G de la rage promu au HH a été inséré dans ce plasmide au site Pst I pour générer le nouveau plasmide pRW 742B. Par recombinaison de ce plasmide avec FP-1 par infection/transfection de ceLLules FEP, on a obtenu du virus vFP-3. Le codon initiateur de traduction ATG du cadre de Lecture ouverte promu par Le promoteur HH a été super- posé sur Le codon d'initiation du gène G de La rage en utilisant un oligonucléotide de synthèse recouvrant Le site EcoRV dans Le promoteur HH et le site Hind III dans Le gène G de la rage. L'extrémité 5' de.ce gêne de La rage promu au HH a été modifiée par des techniques connues pour contenir un site Pst I, et la construction a ensuite été Liée dans le site Pst I du pRW 741 pour créer le pRW 742B. L'orienta- tion de la construction dans le plasmide est la mime que dans Le pRW 735,1 discuté auparavant à l'exemple 3. On a effectué la recombinaison comme elle est décrite à l'exempLe 2. Le recombinant résultant est appeLé vFP-3. L'expression de l'antigène de la rage aussi bien par Les celLules aviaires que non aviaires infectées par Le virus vFP-3 a été confirmée par Les techniques d'immuno- précipitation et d'immunofLuorescence décrites auparavant. Une preuve supplémentaire que Le mode de réaLisa- tion vFP-3 de cette invention est un virus recombinant réussi exprimant Les gênes pour La rage G, a été obtenue en inoculant en intradermique des paires de Lapins avec Le virus recombinant. Deux Lapins ont été inocuLés en intra- dermique à L'aide de 1 x 108 pfu de vFP-3 par lapin. Ces lapins ont tous deux produits des Lésions de vérole typiques, atteignant des taiLLes maximales 5 à 6 jours après L'inoculation. Les Lapins ont été saignés à - 24 - intervalles hebdomadaires, et les sérums ont été testés par ELISA pour détecter la présence d'anticorps spécifiques de la gLycoprotéine de la rage. Chaque rat d'un groupe de cinq a également été inoculé en intradermique à l'aide de 5 x 107 pfu de vFP-3. Il en est résulté des lésions chez tous les animaux. Aussi bien les lapins que les rats ont produit des de niveaux détectables d'anticorps spécifiques de la rage, deux semaines après l'inoculation. Deux tapins témoins inoculés en intradermique avec le virus FP-1 parent ne présentaient pas de niveaux détect- ables d'anticorps anti-rage. Pour exclure la possibilité que la réponse d'anti- corps était due à l'introduction de l'antigène de rage trans- porté accidentellement avec le virus inoculum ou intégré dans La membrane du virus recombinant de vérole des volailles plut8t que d'avoir été provoquée par la synthèse de novo de l'antigène de la rage par le virus recombinant dans l'animal comme celaa été proposé, le virus vFP-3 a été inactivé chimiquement et inoculé à des lapins. Le virus purifié a été inactivé pendant la nuit à 4 C en présence de 0, 001% de béta-propiolactone et ensuite pastillé par centrifugation. Le virus pastillé a été collecté dans 10 mM d'une solution saline tamponnée au Tris, traité aux ultrasons et titré pour s'assurer qu'il ne restait pas de virus infectieux. Deux lapins ont été inoculés en intradermique à l'aide de vFP-3 inactivé et deux autres avec une quantité équivalente de recombinant non traité. On a mesuré les tailles des lésions. Les deux lapins qui ont reçu du vFP-3 non traité ont développé des lésions de vérole typique estimées comme 4-5+, 5 jours après l'inoculation. Les lapins inoculés avec du virus inactivé ont également développé des lésions, mais celles-ci ont été estimées à 2+, 5 jours après l'inoculation. Les lapins ont été saignés à intervalles hebdomadaires et Les sérums testés par ELISA pour la 2262 1 487 - 25 - présence d'anticorps spécifiques de la rage et d'anticorps spécifiques de la véroles des volailles. Les résultats sont exposés au tableau III ci-dessous. TABLEAU III vFP-3 vivant vFP-3 inactivé Lapin: No. 295 No. 318 No. 303 No. 320 Anticorps Rage FP Rage FP Rage FP Rage FP testé: Semaine Après.I. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000 Dans ce test, le point de fin de titrage (exprimé comme la réciproque de la dilution du sérum) a été posé arbitrairement à 0,2 après que l'on ait soustrait les valeurs d'absorbance de tous les sérums avant le chal- lenge. Les deux lapins 295 et 318 qui ont reçu le virus vivant ont développé une réponse immunologique à la glycoprotéine de la rage et aux antigènes du virus de la vérole des volailles. Les lapins 303 et 320 ont également développé une réponse immunologique aux antigènes du virus de la vérole des volailles bien que le titre soit plus bas. Ni l'un ni l'autre de ces lapins n'a développé de réponse détectable à la glycoprotéine de la rage. Cette constatation signifie que la réponse obtenue chez le lapin est due à l'expression de novo du gène de la glycoprotéine de la rage transporté dans le virus re- combinant et qu'elle n'est pas une réponse à aucune glyco- protéine transportée accidentellement dans le virus d'inoculum. b621487 - 26 - Exemple 4B - CONSTRUCTION A PARTIR DU VIRUS FP-1 DE LA VEROLE DES VOLAILLE DU VIRUS RECOMBINANT vFP-5 CONTENANT LE GENE DE LA RAGE G NON PROMU L'expression d'un gène étranger inséré par recom- binaison dans le génome du virus de la vérole des volail- les exige la présence d'un promoteur. Ceci a été démontré par la création d'un recombinant supplémentaire, le vFP-5, identique au vFP-3 sauf pour l'omission du promoteur HH. La présence du gêne de la rage dans ce recombinant a été confirmée par hybridation de l'acide nucléique. Toute- fois, aucun antigène de la rage n'a été détecté dans les cultures de cellules de FEP infectées par le virus. Exemple 5 - EXPERIENCES DE PASSAGE IN VITRO POUR DETERMINER SI LE VIRUS DE LA VEROLE DES VOLAILLES SE REPLIQUE CHEZ LES CELLULES NON AVIAIRES On a effectué une expérience dans laquelle trois systèmes de cellules, un aviaire et deux non aviaires, ont été inoculés à l'aide de la souche parentale FP-1 ou du recombinant vFP-3. Deux boîtes, contenant toutes deux des FEP, respectivement au MRC-5 et au VERO, ont été inoculées à l'aide de FP-1 ou de vFP-3 à une multiplicité d'injec- tions de 10 pfu par cellule. A trois jours, on a récolté une botte de chaque. Le virus a été libéré par trois cycles successifs de con- gélation et décongélation et réinoculé sur une monocouche franche de la mime lignée de cellules. Ceci a été répété pendant six passages séquentiels et, à la fin de l'expé- rience, des échantillons de chaque passage ont été titrés en vue de l'infectiosité du virus sur les monocouches de FEP. Les résultats sont exposés au Tableau IVA et indiquent que le passage en série aussi bien de FP-1 que de vFP-3 est possible chez les cellules FEP, mais qu'il n'est pas possible chez l'une ou l'autre des deux lignées de cellules non aviaires. Le virus infectieux n'est pas - 27 - détectable après 3 ou 4 passages dans les cellules VERO ou MRC-5. On s'est servi de la seconde botte pour déterminer si le virus, qui n'était pas détectable par titrage direct, pouvait être détecté après amplification dans les cellules FEP permissives. A trois jours, on a récolté des cellules sur la deuxième botte par grattage, et un tiers des cellules ont été lysées et inoculées sur une mono- couche franche de FEP. Lorsque l'on a atteint un effet cytopathique (ECP) complet, ou à 7 jours après l'infection, les cellules ont été lysées et leur rendement en virus titré. Les résultats sont exposés au Tableau IVB. Lorsque l'on s'est servi d'un passage dans des cellules FEP pour amplifier un virus quelconque présent, le virus n'a pas pu être détecté après quatre ou cinq passages. Des tentatives pour implanter des cellules infectées de manière persistante ont échoué. Dans une tentative supplémentaire pour détecter une preuve d'une expression virale continue chez des cellules non aviaires, les échantillons utilisés pour le titrage viral ci-dessus ont été utilisés dans un essai d'"immuno- dot" (immunopoint) standard dans lequel on s'est servi d'anticorps antivérole des volailles et d'anticorps anti-rage pour détecter la présence des antigènes respec- tifs. Les résultats de ces essais confirment les résultats de titrage. - 28 - TABLE IVA Expérience de Passage Virus d'inoculum FP-1 vFP-3 Type de cellule FEP VERO MRC-5 FEP VERO MRC-5 Passage 1 6.6a 4.8 4.9 6.6 5.4 6.2 2 6.7 2.9 3.7 6.5 4.2 5.1 3 6.4 1.4 1.0 6.4 1.7 4.4 4 6.1 N.Db N.D 6.2 N.D 1.0 6.4 N.D N.D 6.3 N.D N.D 6 5.7 N.D N.D 5.9 N.D N.D a - titre du virus exprimé en log10 pfu par ml. b - non détectable TABLE IVB Expérience d'Amplification Virus d'inoculum FB-1 vFP-3 Type de cellule FEP VERO MRC-5 FEP VERO MRC-5 Passage 1 6.4a 6.2 6.4 6.5 6.3 6.4 2 7.5 6.3 6.0 6.5 6.3 5.5 3 6.2 6.7 5.3 5.9 6.1 6.3 4 5.6 4.6 3.9 5.7 4.8 5.8 6.3 4.1 N.D 6.1 4.7 4.7 6 6 6.2 N.Db N.D 6.2 N.D N.D a - titre du virus exprimé en log10 de pfu par ml. b - non détectable. Exemple 6 - RECOMBINANTS SUPPLEMENTAIRES DU FP-1 DE LA VEROLE DES VOLAILLES: vFP-6, vFP-7, vFP-8, ET vFP-9 Les virus recombinants vFP-6 et vFP-7 ont été construits par la procédure suivante. Un fragment Pvu II de 5,1 Kpb de FP-1 a été inséré - -9 2621487 - 29 - entre les deux sites Pvu II dans le pUC 9 pour créer Le plasmide pRW 731, 13. Ce plasmide a ensuite été découpé à un site Hinc II unique et un gène de la rage G promu au HH aux extrémités franches a été inséré pour créer des plasmides pRW 748A et B, représentant des orientations opposées de l'insert. Les plasmides pRW 748A et B ont ensuite été utilisés séparément pour continuer à transfecter des cellules FEP ainsi que du virus FP-1 pour produire du vFP-6 et du vFP-7, respectivement, par recombinaison. Ce locus est maintenant désigné par locus f8. Un fragment de Pvu-II de 10 Kpb de FP-1 a été inséré entre les deux sites Pvu II du pUC9 pour créer le pRW 731,15. Ce plasmide a ensuite été découpé à un site Bam HI unique et ensuite un fragment de gène Lac Z promu au 11K a été inséré, en générant les pRW 749A et B, représentant des orientations opposées de l'insert. La recombinaison de ces plasmides donneurs avec du FP-1 a résulté en du vFP-8 et du vFP-9, respectivement. Ce locus est maintenant désigné par locus f8. vFP-8 et vFP-9 exprimaient le gène Lac Z tel qu'il a été détecté par Xgal. vFP-6 et vFP-7 exprimaient le gène de la rage G tel qu'il a été détecté par l'antisérum spécifique de la rage. Exemple 7 - IMMUNISATION A L'AIDE DE vFP-3 POUR PROTEGER LES ANIMAUX CONTRE UNE PROVOCATION AVEC DU VIRUS DE LA RAGE VIVANT Des groupes de 20 souris femelles SPF, de 4 à 6 semaines, ont été inoculés à l'aide de 50 ul de vFP-3 dans le coussinet du pied à des doses allant de 0,7 à 6,7 DICT50 par souris. (La DICT50 ou dose infectieuse pour culture de tissu est la dose à laquelle 50 pour cent des cellules de la culture de tissu souffrent d'un effet cytopathique). A 14 jours après la vaccination, on a sacrifié 10 souris dans chaque groupe et on a collecté des échantillons de sérum pour un dosage par le test RFFI. Les 10 dernières souris ont été provoquées par - 30 - 2621487 - 30 - inoculation de 10 fois La DL50 d'une souche CVS de rage par La voie intracérébrale et on a compté Les survivants à 14 jours après La provocation. Les résultats sontexprimés au Tableau VA ci-dessus. TABLE VA Titre de L'anticorps Dose de vFP-3 de la rage, dilution* Taux de Log10 de DICT50 Log10 survie 6,7 1,9 8/10 4,7 1,8 0/10 2,7 0,4 0/10 0,7 0,4 0/10 * Telle que mesurée par le RFFI "Rapid Fluorescent Focus Inhibition" (Test d'Inhibition Rapide du Focus Fluorescent), "Laboratory Techniques in Rabies" (Techniques de Laboratoire pour la Rage), 3ème Ed. 354- 357, OMS, Genève. L'expérience a été répétée avec 12,5 DL50 de virus de la rage de provocation. Les résultats sont exposés au Tableau VB ci-dessous. TABLE VB Titre de l'anticorps Dose de vPF-3 de la rage, dilution* Taux de Log10 de DICT50 Log10 survie 6,7 2,8 5/10 4,7 2,1 2/10 2,7 0,6 0/8 0,7 0,6 0/8 * Telle que mesurée dans le RFFI "Rapid Fluorescent focus Inhibition" (Test d'Inhibition Rapide du Focus Fluorescent), "Laboratory Techniques in Rabies" (Techniques de Laboratoire pour la Rage), 3ème Ed. 354-357, OMS, Genève. -31- - 31 - 2621487 Deux chiens et deux chats ont été immunisés à l'aide d'une inoculation sous-cutanée unique de 8 Log10 DICT50 du vFP-3 recombinant. De plus, deux chiens et quatre chats d'ige et de poids équivalents ont été gardés en tant que témoins non vaccinés. Tous les animaux ont été saignés à des intervalles hebdomadaires. Au jour 94, tous Les chiens ont été provoqués par inoculation dans le muscle temporal à l'aide de deux doses de 0,5 mL d'un homogénat de glande salivaire de la souche NY du virus de la rage disponible auprès de l'Institut Mérieux, Inc. La dose totale correspondait à 10.000 DL50 souris par une voie intracérébrale. Les six chats ont été provoqués de manière similaire par inoculation dans le muscle de la nuque à l'aide de deux doses de 0,5 ml de la même suspen- sion de virus. La dose totale par animal correspondait à 40.000 DL50 souris par voie intracérébrale. Les animaux ont été observés de manière journalière. Tous les animaux non vaccinés sont morts au jour indiqué au Tableau VI avec des sympt6mes de rage. Les animaux vaccinés ont survécu à la provocation et ont été observés pendant trois semaines après la mort du dernier animal témoin. Les résultats sont exposés au Tableau VI cidessous: TABLEAU VI Taux de Animal Vaccination Titre aux jours après survie/date l'inoculation de la mort 0 14 21 28 94 Chat 7015 vFP-3a 0 2,2b 2,4 2,4 1,5 + 7016 vFP-3 0 1,7 1,9 2,0 1,3 + 8271 tc 0 0 0 O 0 m/13d T10 t 0 0 0 0 0 m/12 T41 t 0 0 0 0 0 m/13 T42 t 0 0 0 0 0 m/12 Chien 426 vFP-3 0 0,8 1,0 1,1 1,2 + 427 vFP-3 0 1,5 2,3 2,2 1,9 + t 0 0 0 0 0 m/15 8240 t 0 0 0 0 0 m/16 2 6 2621487 - 32 - a - Aussi bien les chats que Les chiens vaccinés au vFP-3 ont reçu 8 Log10 de DICT50 par voie sous-cutanée. b - Titre exprimé en Log10 de la dilution du sérum La plus forte donnant plus de 50% de réduction dans le nombre de puits fluorescents dans un test de RFFI. c - Animaux témoins non vaccinés. d - Animal mort/jour de la mort après la provocation. Dans des expériences ultérieures, les virus recombinants vFP-2 et vFP-3 ont été inoculés à du bétail par plusieurs voies différentes. Les animaux inoculés ont été testés en vue de l'anticorps anti-rage aux jours 6, 14, 21, 28 et 35. Comme cela est exposé au tableau VIIA suivant, tous les animaux ont montré une réponse sérologique à l'antigène de la rage. TABLEAU VIIA Titres des anticorps chez les mammifères inoculés au vFP-3 Anticorps neutralisants anti-rages Test RFFI Dilut. Log10 Jour 0 6 14 21 28 35 No. d'animal 7,3 log910 de DICT50 1420 (intraderm) NEG 0,6 2 1,7 1,8 1,7 8 log10 DICT50 1419 (sous-cut.) NEG 1,6 2,2 2.1 2,1 1,9 8 log10 DICT50 1421 (intramusc.) NEG 0,9 2,2 2,2 1,8 1,7 7,3 log910 DICT50 1423 (intramusc.) NEG 0,9 1.1+ 1+ 1+ 1,1+ + Non significatif Tout le bétail a été revacciné à l'aide de 8 log10 de DICT50 au jour 55 après l'inoculation et a montré une réponse anamnésique à l'antigène de la rage. Dans la revaccination de rappel, tout le bétail a été inoculé en sous-cutanée sauf le no. 1421 qui a été de nouveau inoculé 262 1 487 - 33 - en intramusculaire. Les titres RFFI ont été déterminés aux jours 55, 57, 63, 70, 77, et 86. Les résultats sont exposés au Tableau VIIB. *TABLEAU VIIB Jour 55 57 63 70 77 86 No. d'animal 1419 1,7 1,5 2,9 2,9 2,6 2,9 1420 1,0 0,5 1,9 2,3 2,2 2,0 1421 1,3 1,2 2,9 2,7 2,5 2,5 1423 1,0 0,7 2,4 2,5 2,5 2,2 Toutes les données sont pour le vFP-3 sauf pour l'animal 1423, qui représente le vFP-2. Du bétail, des chats et des lapins ont également été inoculés en intradermique avec des quantités connues de virus de vérole des volailles et on a collecté des croûtes des animaux après environ une semaine. Celles-ci ont été broyées, mises en suspension dans une solution saline et titrées pour déterminer les taux de virus. On n'a pu récupérer que des quantités résiduelles de virus infectieux. Ceci démontre qu'aucune infection productive ne s'est déroulée in vivo. Exemple 8 - INOCULATION DE POULETS A L'AIDE DE vFP-3 Le virus de vérole des volailles recombinant vFP-3 a été inoculé à des poulets pour démontrer l'expres- sion d'ADN étranger par un virus de vérole des volailles recombinant dans un système permettant une réplication productive du vecteur. Des poulets Leghorn blancs ont été inoculés en intramusculaire à l'aide de 9 Log10 de DICT50 de vFP-3 ou de 3 Log10 de DICT50 de vFP-3 par transfixion de l'aile. On a prélevé des échantillons de sang en vue d'un test RFFI en vue d'un titrage d'anticorps de la rage, 21 jours après la vaccination. Les titres au jour 21 chez les poulets inoculés étaient significativement plus éLevés que les titres au jour 21 chez les témoins. C'est-à-dire que le titre moyen chez les témoins non infectés était de 0,6; la moyenne chez les oiseaux inoculés en intramusculaire - 34 - 2621487 était de 1,9; celltte chez Les oiseaux transfixés était de 1,2. Exempte 9 - vFP-11 DE VEROLE DES VOLAILLES RECOMBINANT EXPRIMANT L'ANTIGENE H5 HA DE LA GRIPPE DES DINDONS Les espèces aviaires peuvent être immunisées contre les pathogènes aviaires en utitisant Les virus avipox recombinants de L'invention. Ainsi, le nouveau plasmide pRW 759 (décrit ci- dessous), dérivé du virus FP-1 de la vérole des volailles et contenant te gène de l'hémagglutinine promu au Hind III H (H5) de A/turkey (dindon) /IrLande/1378/83 (TYHA), a été utilisé pour transfecter des cellules FEP concurramment infectées par Le virus parent FP-1. Le virus vFP-11 recombinant de la vérole des volailles a été obtenu par les techniques décrites auparavant ici. La synthèse d'une molécule d'hémagglutinine par les celLules infectées au vFP-11 a été confirmée par immunoprécipitation à partir de lysats de cellules infectées, radiomarquées métaboliquement, en utilisant un anticorps anti-H5 spécifique et des techniques standard. L'immunoprécipitation spécifique de l'hémagglutinine précurseur ayant un poids moléculaire d'environ 63 kd (kilodaltons) et deux produits de clivage ayant des poids moléculaires de 44 et de 23 kd a été démontrée. Aucune protéine de ce genre n'a été précipitée à partir d'un lysat de cellules PEF non infectées ou de cellules infectées par le virus parental, FP-1. Afin de déterminer que la molécule HA obtenue dans les cellules infectées par le vFP-11 recombinant de la vérole des volailles, était exprimée à la surface de la cellule, on a effectué des études d'immunofluorescence. Les cellules FEP infectées par le virus recombinant de la vérole des volailles, vFP-11, ont montré des taches fluorescentes intenses en surface. Chez les cellules infectées par le virus parental, FP-1, on a détecté aucune fluorescence. - 35 - Le plasmide pRW 759 a été créé comme suit: Du pRW 742B (cf. Exemple 4) est Linéarisé par digestion partielle à L'aide de Pst I et Le fragment est redécoupé à l'aide d'EcoRV pour éliminer Le gène de la rage G, en Laissant le promoteur HH sur le fragment restant d'environ 3,4 Kpb. Celui- ci est traité à l'aide de phosphatase alcaline et un oligonucléotide de synthèse a été inséré pour relier le promoteur HH à TYHA en ATG pour générer le pRW 744. Ce plasmide a été Linéarisé par digestion partielle à l'aide de Dra I, le fragment linéaire a été découpé à l'aide de Sal I et le plus grand fragment a été réisolé et traité à l'aide de phosphatase alcaline. Finalement, le pRW 759 a été généré en insérant dans le vecteur pRW 744, la séquence codant Sal I-Dra I isolée de TYHA décrite par Kawaoka et coLL. , Virology 158, 218-227 (1987). Exemple 10 - IMMUNISATION A L'AIDE DE vFP-11 POUR PROTEGER LES OISEAUX CONTRE UNE PROVOCATION PAR UN VIRUS VIVANT DE LA GRIPPE Dans le but de déterminer l'immunogénicité du virus recombinant de vérole des volailles vFP-11, on a effectué des expériences de vaccination et de provocation chez des poulets et des dindons. Des poulets blancs Leghorn dépourvus de pathogènes spécifiques ont été vaccinés aux iges de 2 jours et de 5 semaines par ponction de la membrane de l'aile à l'aide d'une aiguille double utilisée pour la vaccination com- merciale de la volaille à l'aide du virus de la vérole des voLailles. On a administré environ 2 ul contenant 6 x pfu de vPF-11 à chaque oiseau. Les oiseaux les plus vieux ont été saignés avant la vaccination et tous les oiseaux ont été saignés avant la provocation et deux semaines plus tard. A des fins comparatives, un second groupe de poulets a été vacciné à l'aide d'un vaccin classique HS constitué d'une souche H5N2 inactivé dans une émulsion -36- eau dans l'huile. On a préparé du vaccin H5N2 inactivé à partir du virus de la grippe A/Mallard (canard col-vert)/NY/189/82 (H5N2) cultivé dans des oeufs de poulet embryonnés de 11 jours. Le fluide allantoique infecté avec un titre en HA de 800/0,1 mL et un titre d'infectiosité de 108,5/0,1 ml a été inactivé à L'aide de propiolactone 0,1X et mis en suspension dans une émulsion eau dans L'huile comme il est décrit par Stone et coLL., Avian Dis. 22,666-674 (1978) et par Brugh et col., "Proc. Second Inter. Sym. on Avian Influenza" (Compte-rendu du Deuxième Symposium Interna- tional sur la Grippe Aviaire), 283-292 (1986). Le vaccin dans un volume de 0,2 mL a été administré à des poulets blancs Leghorn SPF igés de 2 jours et de 5 semaines par la voie sous-cutanée sous la peau de l'inté- rieur du muscle de la cuisse. Un troisième et un quatrième groupe de poulets ont reçu du virus parental FP-1 ou pas de vaccin, respective- ment. Les poulets ont été provoqués avec environ 103 DL50 du virus de la grippe A/Turkey (dindon)/Irlande/ 1378/83 (H5N8) ou A/Chick (poulet) /Pennsylvanie/1370/83 (H5N2) par administration de 0,1 mL dans les narines de chaque oiseau. Les oiseaux iges de deux jours ont été provoqués 6 semaines après la vaccination et les oiseaux gés de 5 semaines ont été provoqués 5 semaines après la vaccination. Les oiseaux ont été observés quotidiennement en vue de sympt8mes de La maladie indiqués par un gonfle- ment et une cyanose de la face et la crite et une hémor- ragie des jambes (de tels oiseaux ne pouvaient souvent pas se tenir debout), une paralysie et un décès. La plupart des décès ont eu lieu entre 4 et 7 jours après l'infec- tion. On a prélevé des frottis trachéaux et cloacaux de chaque poulet vivant trois jours après l'infection et on les a passé au screening pour le virus par inoculation dans des oeufs embryonnés. Les poulets inoculés avec soit le virus de la vérole des volailles de type sauvage ou le - 37 - 2621487 TABLEAU VIII Protection de Poulets au moyen de H5 Exprimé dans la vérole des volailles Virus de Age des Protection Virus détecté provocation Vaccin Poulets Malade/Mort/Total Trachée Cloaque Ty(dindon)/ Vérole des 2 jours 0/0/10 0/10 0/10 Irlande volailles H5 5 semaines 0/0/5 0/5 0/5 (H5N8) (vFP-11) Inactivé 2 jours 0/0/9 0/9 0/9 H5N2 5 semaines 0/0/5 0/5 0/5 Vérole des 2 jours 10/9/10 2/6 3/6 volailles 5 semaines 4/3/5 0/5 4/5 témoin Aucun 2 jours 10/9/10 2/7 5/7 2 jours* 211/2 2/2 2/2 semaines 2/2/5 0/5 1/5 Ck (poulet)/ Vérole des 2 jours 0/0/10 8/10 0/10 Penn CHSN2) volailles H5 5 semaines 0/0/6 5/6 2/6 (vFP-11) Inactivé 2 jours 0/0/8 2/8 0/8 H5N2 5 semaines 0/0/5 3/5 0/5 Vérole des 2 jours 10/1/10 10/10 10/10 volailles 5 semaines 5/0/15 5/5 5/5 témoins Aucun 2 jours 9/3/9 9/9 9/9 2 jours* 2/2/2 2/2 2/2 semaines 5/2/5 5/5 51/5 * Quatre oiseaux non vaccinés ont été mis dans la même cage et élevés avec le groupe de 10 oiseaux traités au virus de la vérole des volaiLLes-HS pour tester la propagation du virus de la vérole des voLailles-HS. TAtBLEAU IX Réponse sérotogique Induite par Inoculation à l'aide de vFP11 ou d'un vaccin du virus de ta Grippe Inactive Titre HI a: (a) Neutralisation de l'infectiosite Virus de Age des Ty/Irlande Poul./Penn Ty/Irlande Poul./Penn provocation Vaccin poulets Apres 1 Apres 2 Aprés-1 Apres 2 Aprés 1 Apres 2 Aprés 1 Aprés 2 Ty/Irlande Vérole des 2 jours 15(C 156 c: Les tests d'inhibition de l'himaglutination (HI) ont été effectues sur des plages microtitres en utilisant des sérums recep- teurs-destructeurs-d'enzymes-traités des units H4 du virus Ty/Ir, et des erythrocytes de poulet de 0,5% tels que décrits dans Palmer et coll., Immun.Series No.6, 51-52, U.S. Dept.Health, Education & Welfare (Ministère de la santé, de l'éducation et des Affaires sociales) (1975). Les dosages de neutralisation de l'infectiositi ont eté effectués par incubation de 103 EID50 de virus Ty/Ir à l'aide de dilutions de serums pendant 30 minutes à temperature ambiante, suivi de l'inoculation d'aliquots dans des oeufs embryonnés La croissance du virus a été déterminé par des dosages d'hémaglutination après incubation des oeufs pendant 2 jours a 33 C. Co -NI - 39 - 2621487 virus recombinant ont développé des lésions typiques sur la membrane de l'aile. Des pustules se sont formées dés le troisième jour à l'endroit de chaque piqure d'aiguille. Une infiltration cellulaire a suivi avec formation de croûtes et récupération au bout de 7 jours. Il n'y a pas eu de lésions secondaires formées et il n'y a pas eu de preuves de propagations aux poulets nonvaccinés par contact. Les résultats de l'expérience de provocation sont exposés au tableau XIII et les résultats sérologiques associés au tableau IX. Les poulets inoculés avec le recombinant vérole des volailles H5 (vFP-11) ou le vaccin de la grippe H5N2 inactivé dans un adjuvant étaient protégés de la provocation à l'aide du virus de la grippe homologue Ty/Ire (dindon/Irlande) (H5N8) et avec le virus de la grippe apparenté mais distinctible Ck/Penn (poulet/- Pennsylvanie) (H5N2). Par contraste, la majorité des oiseaux inoculés à l'aide du vFP parental ou qui n'avaient pas reçu de vaccin montraient des sympt8mes cliniques de grippe extrêmement pathogène y compris un gonflement et une cyanose de la face et de la crête, une hémorragie des jambes et une paralysie. La majorité de ces oiseaux sont morts. Les oiseaux vaccinés n'ont pas donné de niveaux détectables de Ty/Ire mais ont donné du Ck/Penn. Aussi bien les vaccins inactivés que les vaccins recombinants ont induit des anticorps HI et neutralisants au Ty/Ire mais les niveaux d'anticorps induits par le recombinant vérole des volailles H5, vFP-11, avant la pro- vocation n'a pas inhibé HA ni neutralisé le Ck/Penn H5 hétérologue. Dans tout les cas, les poulets étaient protégés de La provocation aussi bien des virus de la grippe Ty/Ire que Ck/Penn. L'immunité vis-à-vis de la grippe H5 induite par la vaccination vFP-11 a duré pendant au moins 4 à 6 semaines et était à réaction croisée. Pour étudier encore plus la durée et la spécificité de la réponse, un groupe de poulets 8gés de 4 semaines a été inoculé dans la TABLEAU X Protection de dindons par L'intermédiaire de HS-HA exprimé dans Le vFP-11 Anticorps HI Log10 danti- Vaccin Age des Protection Détection du Virus Ty/Ire corps neutra- oiseaux maLade/mort/totaL trachée cloaque Apres 1 Apres 2 Lisé à Ty/Ire Après 1 Après 2 Recombi- 2 jours 1/1/5 5/5 3/5 10 160 1 4,32 nant 4 semaines 2/1/6 2/6 0/6 10 640 1.05 4.16 vFP-11. Témoins 2 jours 2/2/2 2/2 2/2 10 mort 1 mort de con- 4 semaines 2/2/2 2/2 2/2 10 mort 1 mort tact membrane de l'aile à l'aide de vFP-11 comme on L'a décrit auparavant et provoqué à intervaLLes mensuels par Le virus à réaction croisée Ck/Penn. Ici encore, aucun anticorps HI n'était détectable avant La provocation. Néanmoins, les oiseaux étaient protégés au-delà de trois mois. Le H5 exprimé par le vFP-11 induit également une réponse immunologique protectrice chez les dindons. Des dindons blancs exogames ont été vaccinés aux ges de 2 jours à 4 semaines par inoculation dans la membrane de L'aile comme il a été décrit auparavant. Les résultats sont exposés au Tableau X.- On a observé un taux de survie important contre La provocation avec Le virus Ty/Ire homologue chez les deux groupes d'5ge. Les oiseaux témoins de contact non vaccinés ont été mis dans les mêmes cages que les oiseaux vaccinés pour tester la propagation du virus recombinant. Ces oiseaux n'ont pas survécu à la provocation. Exemple 11 - CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP 12 DU VIRUS FP-1 DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LE GENE DE NUCLEOPROTEINE (NP) LA GRIPPE DU POULET Le plasmide pNP 33 contient un clone d'ADNc du gêne de nucléoprotéine du virus de la grippe Chicken (poulet)/ Pennsylvania (Pennsylvanie)/1/83 (NP) . SeuLes les extrémités 5' et 3' du gène pNP, d'environ 1,6 Kpb ont été séquencées. NP a été transporté du pNP 33 dans le pUC 9 Sma I en tant que fragment à extrémités franches 5' Cla I-Xho I 3', avec le site pUC9 Eco RI à l'extrémité 3', pour générer le pRW 714. Le codon initiateur de traduc- tion (ATG) du NP contient le site souligné Aha II suivant: ATGGCGTC. Le promoteur H6 de la vaccine, décrit aupara- vant, a été joint au NP à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse à double brin. L'oligonucléotide de synthèse contenait la séquence H6 depuis le site Eco RV jusqu'à son ATG et dans la séquence de codage NP au site Aha II. L'oligonucLéotide a été synthétisé avec des extrémités compatibles avec Bam HI et Eco RI pour son insertion dans -4t, - le pUC 9 pour générer le pRW 755. En commençant à l'extrémité compatible avec Bam HI, avec L'ATG souligné, La séquence de l'oligonucliotide de synthèse à double brin est: GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA Le produit de digestion partielle linéaire par Aha Il du PRW 755 a été isolé et recoupé à l'aide d'Eco RI. Le fragment pRW 755 contenant une simple coupe Aha II à l'ATG et recoupé à l'aide d'Eco RI a été isolé, traité à la phosphatase, et utilisé en tant que vecteur pour le produit de digestion du pRW 714 ci-dessous. Le produit de digestion partielle linéaire par Aha II du pRW 714 a été redécoupé à l'aide de Eco RI. Un frag- ment isolé Aha Il-Eco RI d'environ 1,6 Kpb, contenant la séquence codante du NP, a été inséré dans le vecteur pRW 755 ci-dessus pour générer le pRW 757. Le promoteur H6 complet a été formé en ajoutant les séquences en amont (5') du site Eco RV. Le plasmide pRW 742 B (décrit à l'exemple 4) avait la séquence H6 en aval (3') du site Eco RV retirée en mime temps que les séquences jusqu'au site Nde I du pUC 9. Le fragment Eco RV-Nde I du pRW 7428, traité à la phosphatase, a été utilisé en tant que vecteur pour le fragment pRW 757 ci- dessous. Le produit de digestion partielle linéaire par Eco RV, isolé du pRW 757 a été réisolé après digestion à l'aide de Nde I; ce fragment contient le promoteur H6 depuis Le site Eco RV en passant par NP jusqu'au site Nde I du pUC 9. Le fragment pRW 757 a été inséré dans le vecteur pRW 7428 pour former le pRW 758. Le fragment Eco RI provenant du pRW 758, contenant le NP tout entier promu au H6, a été rendu aux extrémités franches à l'aide de polymérase I de Klenow, et inséré dans le site Hinc Il du pRW 731,13 en générant Le pRW 760. Le site Hinc II du pRW 731,13 est le locus FP-1 utilisé à l'exemple 6 pour la construction de vFP-6 et de vFP-7. En utilisant le FP-1 de la vérole des volailles en tant que virus de sauvetage, on s'est servi du plasmide pRW 760 dans un test de recombinaison in vitro. Les plaques de -43 2- 62621487 la descendance ont été testées et Les plaques ont été puri- fiées en utilisant une hybridation sur plaque in situ. L'expression du gène a été confirmée par des études d'immu- noprécipitation en utilisant un antisérum polyclonal de chèvre anti-NP. La taille de la protéine précipitée spéci- fiquement à partir d'un lysat de cellules FEP infectées au vFP-12 était d'environ 55 KD, à l'intérieur de l'inter- vaLLe publié des nucléoprotéines de virus de grippe. Exemple 12 - PRODUCTION D'UN DOUBLE RECOMBINANT vFP-15 DU VIRUS DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LES GENES DE L'HEMAGGLUTININE (HA) ET DE LA NUCLEOPROTEINE (NP) DE LA GRIPPE AVIAIRE Le gène de l'hémagglutinine (HA) provenant de A/Ty (dindon)/Ire/1378/83 a été décrit auparavant pour la construction de vFP-11 (exemple 9). Lors de la préparation d'un double recombinant, le gêne HA a d'abord été déplacé vers le locus f8 vers le locus stable f8 défini auparavant à la construction de vFP-8 en utilisant le plasmide pRW- 731,15. Le plasmide utilisé dans la construction du vFP-11 était le pRW 759. Le gêne de l'hémagglutinine lié au promoteur H6 a été retiré de ce plasmide par une digestion partielle au Pst I. On a ensuite rendu les extrémités de ce fragment franches à l'aide du fragment de Klenow de la polymérase I de l'ADN et on l'a inséré dans le site Bamn HI aux extrémités franches du pRW 731,15 pour créer le pRW 771. Le plasmide pRW 771 a ensuite été utilisé dans un test de recombinaison in vitro utilisant le vFP-12 en tant que virus de sauvetage. Le virus recombinant vFP-12 contient le gène de nucléoprotéine lié au promoteur H6 au locus f7 défini dans le plasmide pRW 731,13. Les plaques recombinantes contenant maintenant Les deux insertions ont été sélectionnées et purifiées par une hybridation in situ et une expression à la surface de l'hémagglutinine con- firmée par un dosage immunologique lié à la Protéine-A- Béta-galactosidase. L'expression des deux gènes est 4i - 2621487 confirmée par immunoprécipitation à partir de lysats de cellules infectées au vFP-15. Exemple 13 - CONSTRUCTION DES VIRUS DE LA VEROLE DU CANARI RECOMBINANTS L'exemple qui suit démontre l'identification de quatre locus d'insertion non-essentiels dans le génome de la vérole du canari et la construction de quatre virus de la vérole du canari recombinants vCP-16, vCP-17, vCP- 19, et vCP-20. Le recombinant de la vérole du canari vCP-16 a été construit comme suit: On a cloné un fragment d'ADN de la vérole du canari Pvu II de 3,4 Kpb dans un pUC 9 pour obtenir un pRW 764,2. On a trouvé un site Eco RI unique situé de manière asymétrique à l'intérieur du fragment avec un bras court de 700 pb et un bras long de 2,7 Kpb. Le plasmide a été digéré à l'aide d'Eco RI et transformé à extrémités franches au moyen du fragment Klenow de la polymérase I de l'ADN. Le gène de la rage G H6 à extrémités franches a été lié dans ce site et utilisé pour transformer E. coli. Le plasmide résultant pRW 775 a été utilisé dans un test de recombinaison in vitro. On a sélectionné les plaques de descendance positives sur un immunoécran et on les a purifiées à la plaque. Le recombinant résultant a été désigné par vCP-16 et le locus d'insertion par C3. Le plasmide pRW 764.2 utilisé dans la construction ci-dessus contenait également un site Bgl II unique à approximativement 2,4 Kpb du site Eco RI. En utilisant la mime stratégie de clonage, le gène H6/de la rage G a été lié dans le plasmide pRW 764,2 à ce site pour obtenir un pRW 774. Ce plasmide a été utilisé dans la construction de vCP-17 recombinant avec le Locus d'insertion désigné par C4. Le plasmide pRW 764,5 contient un fragment Pvu II 780 pb d'ADN de la vérole du canari avec un site BgL II unique asymétrique au sein du fragment à 400 pb d'un terminus. En utilisant la mime stratégie de clonage décrite auparavant, le gène de la rage G lié au promoteur - 45 - H6 a été inséré à ce site pour obtenir le pRW 777. Le virus recombinant stable obtenu a été désignépar vCP-19 et le locus d'insertion par C5. Le plasmide pRW 764,7 contient un fragment Pvu II de 1,2 Kpb avec un site Bgl Il unique à 300 bases d'un terminus. Le plasmide a été digéré à L'aide de Bgl II et ses extrémités rendues franches à l'aide du fragment de Klenou de la polymérase I de L'ADN. Le gène Lac Z promu au 11K à extrémités franches a été inséré pour obtenir le plasmide pRW 778. Le virus recombinant stable obtenu au moyen de ce plasmide a été désigné par vCP-20 et le locus d'insertion désigné par C6. Exemple 14 - CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP-29 DU VIRUS DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LA PROTEINE DE FUSION DU VIRUS DE LA MALADIE DE NEWCASTLE Le plasmide pNDV 108, le clone d'ADNc du gène de fusion de la souche NDV Texas, a été constitué d'un fragment d'ADNc Hpa I d'environ 3,3 Kpb contenant la séquence codant pour la protéine de fusion ainsi que des séquences codant pour la NDV supplémentaires clonées dans le site Sca I du pBR 322. Les étapes de la production du plasmide d'insertion sont décrites ci-dessous. (1) Création du plasmide pCE 11 Un vecteur d'insertion FPV, Le pCE 11, a été cons- truit en insérant des "polylinkers" (agents de liaisons multiples) au site Hinc II du pRW 731,13 (désigné par Locus f7). Le pRW 731,13 contient un fragment Pvu II de 5,1 Kpb d'ADN FP-1. Un Locus non essentiel a été défini auparavant au site Hinc II par la construction du recombinant stable vFP-6 décrit auparavant à l'exemple 6. Les "polylinkers" (agents de Liaisons multiples) insérés au site Hinc II contiennent Les sites d'enzyme de restriction suivants: Nru I, Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Xba 1, Hinc II, Sal I, Acc I, Pst I, Sph I, Hind III et Hpa I. (2) Création du plasmide pCE 19 Ce plasmide est une modification supplémentaire du - 46 - pCE 11, dans lequel le signal d'arrêt transcriptionnel du virus de la vaccine ATTTTTNT (dans lequel N dans ce cas est un A) a été inséré entre les sites Sac I et Eco RI du pCE 11 avec la perte conséquente du site Eco RI. (3) Insertion des séquences codantes du NDV Un fragment Bam HI purifié sur gel de 1,8 Kpb, contenant tous les nucleotides sauf 22 à partir de l'extrémité 5' du gêne de la proteine de fusion, a été inséré dans le site Bam HI du pUC 18 pour former le pCE 13. Ce plasmide a été digéré à l'aide de Sal I qui coupe dans le vecteur 12 les bases en amont de l'extrémité 5' de la séquence de codage. Les extrémités ont été remplies à l'aide du fragment de Klenow de la polymérase I de l'ADN et le pLasmide a été digéré encore plus à l'aide de Hind III qui coupe 18 bases en amont du site Sal I. Un fragment Sma I Hind III de 146 bases, purifié sur gel dans les modes de réalisation préférés ainsi que des séquences poLy- linkers (agents de Liaison multiples) à chaque terminaison F, contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine, décrit auparavant, a été Lié au vecteur et inséré pour transformation dans des cellules de E. coli. Le plasmide résultant a été désigné par pCE 16. Dans le but d'aligner le codon ATG initiateur du gêne de la protéine de fusion NDV avec l'extrémité 3' du promoteur H6 et de remplacer les 22 nucleotides manquants provenant de l'extrémité 5' de NDV dans le pCE 16, on a crée des oligonucléotides complémentaires de synthèse finissant par les sites Eco RV et Kpn I. La séquence d'oligonucLéo- tides était 5' TC-CGT- TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-_AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTAC 3 La construction pCE 16 a ensuite été digérée à l'aide d'Eco RV et de KpnI. Le site Eco RV se trouve dans le promoteur H6,24 bases en amont de L'ATG initiateur. Le site Kpn I se trouve dans La sequence codante du NDV, à 29 bases en aval de L'ATG. Les oligonucléotides ont été appariés, phosphoryLés - 4 - et liés au plasmide lindarisé et l'ADN résultant utilisé pour transformer des cellules d'E. coli. Ce plasmide a été désigné par pCE 18. Dans le but d'insérer la séquence codante du NDV dans un vecteur d'insertion FPV, un fragment du pCE 18 Sma I - Hind III de 1,9 Kpb, purifié sur gel (en coupant dans la région du "polylinker" (agent de liaison)) a été lié à un fragment Sma I - Hind III de 7,8 Kpb du pCE 19 décrit ci-dessus. Le signal d'arrêt transcriptionnel survient à 16 bases en aval du site Sma I. Le plasmide résultant a été désigné par pCE 20. Le plasmide pCE 20 a été utilisé dans un test de recombinaison in vitro en utilisant le virus de vérole des volailles FP-1 en tant que virus de sauvetage. La descend- ance résultante a été déposée sur des plaques de monocouches de FEP et les plaques ont été soumises à un immunoécran de protéine A liée à la Béta-galactosidase en utilisant un sérum de poulet anti-NDV polyclonal. Les plaques donnant une coloration positive ont été sélectionnées et soumises à quatre cycles de purification des plaques pour obtenir une population homogène. Le recombinant a été désigné par vFP-29. Exemple 15 CONSTRUCTION DES RECOMBINANTS VIRUS AVIPOX EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE DE L'ENVELOPPE (ENV) DU VIRUS DE LA LEUCEMIE FELINE (FeLV) Le gène env FeLV contient les séquences qui codent pour la polyprotéine p70 + plSE. Ce gène était initialement inséré dans le plasmide pSD467vC avec le pro- moteur de la vaccine H6 juxtaposé en 5' au gène env FeLV. Le plasmide pSD467vC a été dérivé en insérant premièrement un fragment de 1802 pb Sal I/Hind III contenant le gène de l'hémagglutinine de la vaccine (HA) dans un vecteur pUC18. L'emplacement du gène HA a été défini auparavant (Shida, Virology 150, 451-462, t19883). La majorité cadres de lecture ouverte codant pour le produit du gène HA était éliminé (nucléotide 443 à nucleotide 1311) et un site au clonage multiple a été inséré contenant les sites - 4 - 2621487 d'endonucléase de restriction Bgl II, Sma I, Pst I, et Eag I. Le plasmide resultant pSD467vC contient des bras flanquants de la vaccine de 442 pb. en amont des sites de clonage multiple et de 491 pb en aval de ces sites de restriction. Ces bras flanquants permettent au matériel génétique inséré dans la région de clonage multiple d'être recombiné dans la région HA de la souche de Copenhagen du virus de la vaccine. La descendance résultante recombinante est HA négative. Le promoteur H6 a été synthétisé en recuisant quatre oligonucléotides se chevauchant qui ensemble com- prenait la séquence complète décrite plus haute dans les modes de réalisation préférés. Le fragment résultant de 132 pb contenait un site de restriction Bgl II à l'extré- mité 5' et un site Sma I à l'extrémité 3'. Ceci a été in- séré dans le pSD467vC par l'intermédiaire du site de res- triction Bgl II et Sma I. Le plasmide résultant a été dé- signé par pPT15. Le gène env FeLV a été inséré dans le site unique Pst I de pPT15 qui est situé juste en aval du promoteur H6. Le plasmide résultant a été désigné par pFeLV1A. Pour la construction du recombinant FP-1, les séquences env H6/FeLV de 2, 4 Kpb ont été excisés du pFeLViA par digestion avec Bgl II et par digestion partielle avec Pst I. Le site Bgl II est à la bordure 5' de la séquence du promoteur H6. Le site Pst I est situé à 420 pb en aval du signal terminateur de traduction pour le cadre de lecture ouverte de la glycoprotéine de l'enveloppe. La séquence env H6/FeLV de 2,4 Kpb a été insérée dans le pCE 11 digéré à l'aide du Bam HI et de Pst I. Le vecteur d'insertion FP-1, pCE11, a été dérivé de pRW 731,13 par insertion d'un site de clonage multiple dans site non-essentiel Hinc II. Ce vecteur d'insertion permet la génération de recombinants FP-1 accueillant des gênes étrangers dans le locus f7 du génome FP-1. Le plasmide d'insertion FP-1/FeLV recombinant a alors été désigné par pFeLVF1. La construction ne fournit pas de substitution - 49 - 22621487 parfaite ATG pour ATG. Pour obtenir La construction parfaite ATG:ATG, un fragment Nru!/Sst II d'approximativement 1,4 Kpb était dérivé du vecteur d'insertion du virus de la vaccine, pFeLV1C. Le site Nru 1 se trouve à L'intérieur du promoteur H6 à une position 24 pb en amont de l'ATG. Le site Sst II est situé à 1,4 Kpb en aval de L'ATG 1 Kpb en amont du signal terminateur de traduction. Ce fragment Nru I/Sst II était ligué à un fragment de 9,9 Kpb qui était généré par digestion avec du Sst II et par digestion partielle avec du Nru I. Ce fragment de 9,9 Kpb contient les bras flanquants de 5,5 Kpb de FP-1, les séquences vecteur pUC, 1,4 Kpb de séquence FeLV correspondant aux portions en aval du gène env, et La séquence La plus en 5' (approx. 100 pb) du promoteur H6. Le plasmide résultant a été désigné par pFeFLVF2. La construction ATG pour ATG était confirmé par l'analyse de la séquence nucLéotidique. Un vecteur d'insertion supplémentaire FP-1, pFeLVF3, était dérivé de pFeLVF2 en éliminant les séquences FeLV env correspondant à la région immunode- pressive putative (Cianciolo et aI., Science 230, 453-455 [19853) (nucléotide 1548 à 1628 de séquence codante). Ceci a été accompli en isolant un fragment Sst II/Pst I (sites décrits cidessus) d'environ I Kpb à partir du vecteur pFeLV1D de l'insertion du virus de la vaccine. Le plasmide pFeLVID est identique au pFeLV1C mis à part le fait que les séquences env correspondant à la région immunodepressive (nucléotide 1548 à 1628) ont été éliminé par la mutagénése dirigée par oligonucléotide (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 [19873). Le fragment de I Kpb Sst II/Pst I manquant les nucléotides 1548 à 1628 était inséré dans un fragment de 10,4 Kpb Sst II/Pst I contenant Le gène env H6:FeLV restant dérivé du pFeLVF2. Les plasmides d'insertion, pFeLVF2 et pFeLVF3, ont été utilisé dans des tests de recombinaison in vitro avec du FP-1 en tant que virus de sauvetage. La descendance de la recombinaison a été étalée sur des demonocouches FEP et le virus recombinant sectionné par hybridation sur plages sur monocouches de FEP. La descendance des recombinaisons, identifiée par l'analyse d'hybridation, a été sélectionnée et soumise à quatre cycles de purification par plage pour obtenir une population modèle. Un recombinant SP-1 accueillant le gène env FeLV entier a été désigné par vFP-25 et un recombinant FP-1 contenant le gêne entier moins la région immunodepressive a été désigné par vFP-32. On a montré que les deux recombinants expriment le produit de gène approprié par immunoprécipitation en se servant d'un sérum bovin anti- FeLV (Antibodies, Inc., Davis, CA). De manière significa- tive, ces recombinants FP-1 expriment le gène env FeLV étranger dans la ligne de cellules CRFK (ATCC CCL94), qui est d'origine féline. Pour la construction des recombinants de la vérole du canari (CP), un fragment de 2,2 Kpb contenant des séquences env H6:FeLV a été excisé à partir du pFeLVF2 par digestion avec du Sma I et du HpaI. Le site Sma I est à la bordure 5' de la séquence du promoteur H6. Le site Hpa I est situé à 180 pb en aval du signal de terminaison de traduction pour le cadre de lecture ouverte de la glycoprotéine de l'enveloppe. La séquence env H6/FeLV de 2,2 Kpb a été insérée dans le site Eco RI non essentiel du plasmide d'insertion pRW764,2 après que l'on ait rendu franches les extrémités du site Eco RI. Ce vecteur d'insertion permet la généra- tion de recombinants CP accueillant des gènes étrangers dans le locus C4 du génome CP. Le plasmide d'insertion CP recombinant alors était désigné par pFeLVCP2. Cette construction fournit une substitution AT6 pour ATG parfaite. Le plasmide d'insertion, pFeLVCP2, a été utilisé dans un test de recombinaison in vitro avec CP en tant que virus de sauvetage. La descendance du recombinant a été - 5 -2 étalée sur des monocouches FEP et le virus recombinant sélectionné au moyen d'un immunoécran de protéine A lié à la bétagalactosidase en utilisant un sérum polyclonal commercial anti-FeLV bovin (Antibodies, Inc. , Davis, CA.) Les plages donnant une coloration positive ont été sélectionnées et mises à quatre cycles de purification par plage pour obtenir une population homogène. Un recombinant exprimant le gène env FeLV entier a été désigné par vCP-36. Exemple 16 CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP-22 DU VIRUS DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LE GENE D'ENVELOPPE CENV) DE TYPE 1 (RAV-1) DU VIRUS ASSOCIE AU ROUS Le clone penvRV1PT du gène d'enveloppe RAV-1 contient 1,1 Kpb de séquence codant l'ADN RAV-1 env clonée en tant que fragment Kpn I-Sac I dans le M13mp18. Ce frag- ment est intact à l'extrémité 5' mais il lui manque une partie de la séquence 3' et on l'a utilisé dans la manipula- tion suivante. Un fragment Eco Ri-Pst I de 1,1 Kpb, purifié sur gel provenant de penvRVIPT a été inséré dans les sites Eco Ri et Pst I du pUC 9 pour former le pRW 756. Ce plasmide a ensuite été digéré à l'aide de Kpn I et de Hind III qui ont découpé le vecteur à 59 bases en amont de l'ATG. Un fragment Kpn I - Hind III de 146 paires de bases, contenant le promoteur H6 de la vaccine décrit auparavant, a été inséré pour construire le plasmide pCE6. Dans le but de s'assurer que l'ATG initiateur du gêne RAV env était adjacent à l'extrémité 3' du promo- * teur H6 avec les séquences externes effacées, on a construit deux oligonucléotides de synthèse complémentaires avec des sites Eco RV et Ban II aux extrémités. La séquence d'oligonucléotides était 5' ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC- 3 ' Le plasmide pCE 6 a été digéré à l'aide d'Eco RV qui découpe le promoteur H6 à 24 bases en amont de l'ATG et de Ban II qui découpe la séquence de codage de RAV env à 7 bases en aval de l'ATG. Les segments de l'ADN ont été liés et utilisés pour transformer les celluLes de E. coli. - 54 - Le plasmide résultant, pCE 7, a fourni le promoteur H6 et la séquence 5' correcte pour la construction finale. Le clone mp19env (190), a été trouvé par mappage de restriction comme contenant le gène RAV-1 env tout entier. Un fragment Kpn I-Sac I de 1,9 Kpb du mp19env (190) contenant le gêne tout entier a été inséré aux sites Kpn I et Sac I du pUC 18 pour former le pCE 3. Ce plas- mide a été digéré à l'aide de Hpa I qui coupe à 132 bases en aval de l'ATG initiateur dans la séquence codant RAV-I, et de Sac I qui coupe à l'extrémité 3' du gêne. Le vecteur d'insertion FPV pCE 11, décrit précédemment, a été digéré à l'aide de Sma I et de Sac I en découpant le plasmide dans la région du "polylinker" (agent de liaison multiple). Le fragment Hpa I - Sac I du pCE 3 a été lié au pCE 11 pour former le pCE 14. Le plasmide pCE 7 a ensuite été digéré à l'aide de Xho I et de Hind III pour fournir un fragment de 332 paires de base contenant le promoteur H6 et la séquence '. Le plasmide pCE14 a été digéré à l'aide de Hind III en découpant dans la région du "polylinker" (agent de liaison multiple) du vecteur et à l'aide de Xho I en découpant dans la séquence de codage. Cet ADN a été lié au fragment HIND III - Xho I obtenu à partir du pCE 7 pour former le pCE 15, la construction de gêne d'enveloppe RAV-1 finale. Ce plasmide a été utilisé dans un test de recombin- aison in vitro avec le FP-1 de la vérole des volailles en tant que virus de sauvetage. La descendance de la recomb- inaison a été déposée sur des plaques de monocouches de FEP et les plaques ont été passées au screening par un dosage immunologique de Protéine A liée à la Béta-galactosidase en utilisant un sérum polyclonal anti-RAV-1. Les plaques donnant une coloration positive ont été sélectionnées et soumises à quatre cycles de purification de plaques pour obtenir une population homogène. Le recombinant obtenu a été désigné par vFP-22. Des expériences d'immunoprécipitation en utilisant - 53 - des lysats FEP infectés au vFP-22 ont démontré la précipi- tation spécifique de deux protéines avec des poids molécu- laires apparents de 76,5 Kd et de 30 Kd correspondant aux deux produits de gène du gène de L'enveloppe. Aucun produit de gène précurseur n'était apparent. Dans les tests préliminaires une réponse immunitaire a été induite vis-à-vis du produit de gène d'enveloppe RAV-I chez des poulets inoculés avec vFP-22. Exemple 17 - CONSTRUCTION DES RECOMBINANTS DU VIRUS AVIPOX EXPRIMANT LE GENE D'ENVELOPPE (ENV) GP51,30 DU VIRUS DE LA LEUCEMIE BOVINE (BLV) (1) Construction de pBLVF 1 et de pBLVF 2 Les plasmides, pBLVF 1 et pBLVF 2, contiennent le gène gpS1,30 env du BLV. Chez les deux plasmides, le gêne env du BLV est sous le contr6le transcriptionnel du promoteur H6 du virus de la vaccine et il est cloné entre les bras flanquants de la vérole des volailles (locus f7). La séquence de nucléotides des deux plasmides est identique, sauf aux positions de codons 268 et 269. (le pBLVF 1 code un protéine contenant les acides aminés Arg-Ser à ces deux positions, tandis que le pBLVF 2 code une protéine contenant les acides aminés Gln-Thr). Le pBLVF 1 et le pBLVF 2 ont été construits par la procédure suivante. Le plasmide pNS97-1, un plasmide contenant le gène env du BLV tout entier, a été découpé à l'aide de Bam HI et partiellement découpé à l'aide de Mst II. Le fragment de 2,3 Kpb contenant le gène gp5l,30 tout entier a été isolé sur un gel d'agarose, et les extrémités cohésives remplies à l'aide dela polymérase I de l'ADN de E. coli (fragment de Klenow). Les "linkers" (agents de liaison) Pst I ont ensuite été liés aux extrémités du fragment qui après digestion au Pst 1, a été lié dans le site Pst I du pTP 15 (Exemple 15). Ceci place le gène du BLV à c8té du promoteur H6 de la vaccine. (Le pTP15 contient le promoteur H6 de la vaccine cloné à un locus non-essentiel dans le génome de la vaccine). Ce plasmide a ensuite été découpé à l'aide d'Eco - 5 - RV et partiellement découpé à l'aide d'Ava II. Le fragment de 5,2 Kpb a été isolé et les oligonucléotides '- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3' et 5'GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTAACGGAT-3' utilisés pour recircuLariser le plasmide. Ceci élimine les bases inutiles entre le gène BLV et le promoteur H6. Le plasmide résultant a été découpé à l'aide de Pst I et partiellement découpé à l'aide de Bgl II et le fragment de 1,7 Kpb contenant le gène du BLV promu au H6 a été cloné dans le site Bam HI-Pst I du pCE 11, le vecteur d'insertion du virus de la vérole des volailles décrit auparavant en utilisant le locus f7. Ceci place le gêne du BLV promu au H6 entre les bras flanquants du virus de la vérole des volailles. Ce plasmide a été désigné par pBLVF 1. On s'est servi d'une procédure identique pour construire le pBLVF 2, sauf que l'on a effectué une étape supplémentaire de mutagénèse in vitro avant le clonage du gène du BLV promu au H6 dans le pCE 11. Cette mutagénèse a été effectuée par la procédure suivante. Le plasmide pNS97-1 a été découpé avec le Xma I et partiellement découpé à l'aide de Stu I. Le fragment de 5,2 Kpb a été isolé et l'oligonucléotide 5,-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCl- GACCTTAGG-3' et 5' -CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3' utilisé pour recirculariser le plasmide. Ceci change la séquence de nucleotides des codons 268 et 269 de CGC-AGT à CAA-ACT. (2) Construction des virus recombinants Les plasmides pBLVF 1 et pBLVF 2 ont été utilisés dans un test de recombinaison in vitro utilisant le FP-1 en tant que virus de sauvetage. La descendance recombinante a été sélectionnée par hybridation sur plaques in situ, et lorsque la population a été jugée pure par ce critère, on a soumis les plaques à un screening dans un dosage immunologique à la Protéine A -Béta- galactosidase en utilisant une préparation d'anticorps monoclonaux spécifiques du BLV gp. Les deux recombinants vFP 23 et vFP 24 obtenus à partir des plasmides pBLVF 1 et pBLVF2 respectivement ont montré une coloration positive à l'immunoécran, indiquant qu'une glycoprotéine reconnaissable immunologiquement était exprimée à la surface des cellules infectées. Les plasmides pBLVK 4 et pBLVK 6 contiennent le gène gp51,30 d'env du BLV et le gène du BLV gp51,30 moins le clivage, respectivement. Les deux gènes sont clones dans le site Eco RI unique du pRW 764,2 (locus C3) (pRW 764,2 est décrit à l'exemple 13) et ils sont sous le contrôle transcriptionnel du promoteur H6 de la vaccine. Les plasmides ont été dérivés par la procédure suivante: le pBLVF 1 et le pBLVF 2 ont été découpés avec l'enzyme de restriction Hind III. L'oligonucLéotide BKL 1 (AGCTTGAATTCA) a été cloné dans ce site, en générant ainsi un site Eco RI en 3' du gène du BLV. Comme il existe également un site Eco RI en 5' du gène du BLV, ces plasmides (pBLVK 1 et pBLVK 2) ont été découpés à l'aide d'Eco RI et le fragment contenant le gène du BLV promu au H6 a été cloné dans le site Eco RI du pRW 764,2. Les plasmides résul- tants ont été désignés par pBLVK 4 et pBLVK 6. Ces plasmides ont été utilisés dans un test de recombinaison in vitro avec le virus de la vérole du canari en tant que virus de sauvetage. Les recombinants ont été sélectionnés et purifiés sur la base de l'expression en surface de la glycoprotéine comme on la détecte dans un dosage immunologique. Les recombinants ont été désignés par vCP-27 et vCP-28 en provenance des plasmides pBLK 4 et pBVLK respectivement. Les recombinants de la vérole des volailles vFP23 et vFP24 ont été inoculés dans des moutons et des bovins par des voies différentes. On a donné aux animaux deux inoculations, la deuxième 45 jours après la première. Des échantillons de sérum ont été prélevés 5 semaines après la première inoculation et deux semaines après la second inoculation. L'anticorps contre gp51 a été mesuré grâce à un test ELISA compétitif et le titre exprimé en tant que 56 - 2 62621487 - 56$- l'inverse de la dilution du sérum donnant une réduction de % de la compétition. Les résultats sont montrés à la table XI. Aucun des espèces testés n'a montré une réponse immunitaire détectable après l'inoculation primaire. Les moutons et les bovins ont tous démontrés une augmentation significatif des anticorps après l'inoculation secondaire. TABLE XI Inoculation des Moutons et des Bovins à l'aide de vFP23 et vFP24 Animal Virus Dose et voie ELISA Titre 2' le 2 ,S8 Ba 8 M5 FP-1 ID souscut. M91 O O BE 2 P2 3 8 E8 8 0 E63 vFP-23 10 +10 1+10 80 M83 vFP-23 ID souscut. 80 M84 vFP-23 500 M5 vF-2 3 100 O 0 B52 vY424 8 8 8 8 20C B53 vFP-24 108 10 10 +108 O 0 M83 ID 6 HE:7 vFP-24 souscut. 20z M92 vFP-24 20 *9 vFP-24 0 20 2 5 X93 vr-24 0 20 o a Les injections intradermiques ont été effectué à deux points b Le titre exprimé en tant que l'inverse de la dilution donnant 50% de compétition - 5 - Exemple 18 - CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP-26 DU VIRUS FP-1 DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LE GENE DE MATRICE MASS 41 DU VIRUS DE LA BRONCHITE INFECTIEUSE S - Le pLasmide pIBVM63 contient un clone d'ADNC du virus de La bronchite infectieuse (%BV) du gène matrice de la souche Mass 41. Un fragment Eco RI du pIBVM63 de 8Kpb contient le gène matrice ave Le gêne péplomêre en amont (5') et, encore plus en amont, iL y a un site Eco RV. Le plasmide pRW 715 a un "Linker" (agent de liaison) Eco RI qui relie Lesc deux sites Pvu II du pUC 9. Le fragment Eco RI I 8 Kpb provenant du pI8VM63 a été inséré dans Le site Eco RI du pRW 715 pour générer Le pRW 763. Le plasmide pRW 766 a été créé pour effacer le site Eco(RI)5' dans Le pRW 763, en Laissant un site Eco RI unique en aval (3') du gêne matrice. Le produit de digestion partielle linéaire Eco RI, isolé du pRW 763, a été recoupé à L'aide d'Eco RV. Le plus grand fragment a été isolé, rendu à extrémités franches à l'aide de poLymérase I de fragment d'ADN de Klenow et Lié à Lui-minme pour générer Le pRW 776. La construction pRW 776 avait Le péplomére IBV completet Les gênes matrices suivis par un site Eco R! unique. Seules Les extrémités 5'et 3' du gène matrice d'environ 0,8 Kpb ont été séquencées. La séquence 5' du gêne matrice, commençant au codon initiateur de traduction (ATG), contient Le site Rsa I souligné suivant: ATGTCCAAC6A6ACAAATTGTAC. Le promoteur H6 décrit auparavant a été reLié au gène matrice à L'aide d'un oLigonuctiotide de synthèse. L'oLigonucLéotide de synthèse contenait La séquence H6 depuis son site Eco RV jusqu'au site AT6 et dans La séquence de codage de matrice & travers Le premier site Rsa %. L'oLigonucLéotide a été synthétisé avec des extrémités compatibles BAM HI et Eco RI en vue de son insertion dans Le pUC 9 pour générer Le pRW 772. L'extrémité Eco RI est en 3' du site Rsa I. En commençant i L'extrémité compatible Bam HI, avec L'ATG souligné, La séquence de L'oLigonucLéotide de synthèse I double brin est: _ A_ -5- Le produit de digestion partielle linéaire au Rsa I du pRW 772 a été isolé et recoupé à l'aide d'Eco RI. Le fragment pRW 772 contenant une coupe unique au site Rsa I ci-dessus et recoupé à l'aide d'Eco RI a été isolé, traité à la phosphatase et utilisé comme vecteur pour le produit de digestion du pRW 776 ci-dessous. Le produit de digestion partielle linéaire au Rsa I isolé du pRW 776 a été recoupé à l'aide d'Eco RI. Eco RI se trouve juste au-delà de l'extrémité 3' du gène matrice. Un fragment isolé Rsa I-Eco RI d'environ 0,8 Kpb, contenant la séquence codant la matrice à partir du site Rsa I ci- dessus, a été inséré dans le vecteur pRW 772 ci-dessus pour générer le pRW 783. Le promoteur H6 complet a été formé en ajoutant les séquences en 5' du site Eco RV. L'extrémité 5' du promoteur H6 était un site Hinf I à extrémités franches dans le site Sal I du pUC 9 pour créer un site Eco RI; en ' du promoteur H6 se trouve le site Hind III du pUC 9. Le fragment Hind III-Eco RV contenant le promoteur H6 en 5' a été inséré entre les sites Hind III et Eco RV du pRW 783 pour générer le pRW 786. Le fragment Eco RI du pRW 786, contenant le gêne matrice promu au H6 complet, était rendu à extrémités franches à l'aide de polymérase I de fragment d'ADN de Klenow et inséré dans le site Bam HI à extrémités franches du pRW 731,15 (locus f8) pour générer le pRW 789. Le site Bam HI du pRW 731,15 est le locus FP-1 utilisé à l'exemple 6 pour la construction du vFP-8. Le plasmide pRW 789 a été utilisé dans la construction du vFP-26. On a sélectionné les plaques recombinantes et on les a traitées par hybridation sur plaque in situ. Dans des tests préliminaires, une réponse immunologique à la protéine matrice de IBV a été induite chez des poulets inoculés à l'aide de vFP-26. - S5 - ExempLe 19 - CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP-31 DU VIRUS DE LA VEROLE DES VOLAILLES FP-1 EXPRIMANT LE PEPLOMERE DU VIRUS DE LA BRONCHITE INFECTIEUSE (18V) Le clone pIBVM 63 et son sous-clone pRW 776 d'ADNc Mass 41 du virus de La bronchite infectieuse (IBV) ont été décrits pour La construction du vFP-26 à l'exemple 21. Le sous-clone pRW 776 contient Le gène péplomére IBV de 4 Kpb suivi par le gène matrice avec un site Eco RI --ique à l'extrémité 3'. Seules les extrémités 5' et i' du gène péplomére IBV d'environ 4 Kpb ont été seo.ncées. Un site Xba I unique sépare les deux gènes. L' xtrémité 5' du gène péplomére, commençant au codon initiateur de traduction (ATG), contient le site Rsa I souligné suivant: ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC. Le promoteur H6 décrit auparavant a été relié au gène péplomére à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse. L'oligonucléotide de synthèse contient la séquence du promoteur H6 depuis son site Nru 1 à l'ATG et dans la séquence codant pour le péplomêre en passant par son premier site Rsa I. L'oligo- nucléotide a été synthétisé avec des extrémités compatibles Sam HI et Eco RI en vue de son insertion dans le pUC 9 pour générer le pRW 768. L'extrémité Eco RI est en 3' du site Rsa I. En commençant à l'extrémité compatible de Bam HI, avec l'ATG souligné, la séquence de l'oligonucléotide de synthèse à double brin est la suivante: GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAACCATTGTGGAGAA TTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG AATGATCACTGAGAAAACACACATGCTTAA Le produit de digestion partielle du pRW 768 à l'aide de Rsa Z, qui est linéaire et isolé, a été redécoupé à L'aide d'Eco RI. Le fragment pRW 768 contenant une coupe simple au site Rsa I ci-dessus et redécoupé à l'aide d'Eco RI a été isolé, traité à la phosphatase, et utilisé en tant que vecteur pour le produit de digestion du pRW 776 ci-dessous. Le produit de digestion partielle du pRW 776 à l'aide de Rsa I, qui est linéaire et isolé, a été redécoupé à l'aide d'Eco RI. Le fragment de pRW 776 de 5 Kpb, conte- nant une coupe unique au site Rsa I ci-dessus jusqu'au site Eco RI a été isolé. Le fragment contient des séquences d'IBV depuis le site Rsa I du péplomére ci-dessus jusq'au site Eco RI à l'extrémité 3' du gène matrice. L'insertion du fragment de pRW 776 dans le vecteur pRW 768 ci-dessus a généré le pRW 788. Le gène matrice a été retiré au site Xba I noté ci-dessus. Le promoteur H6 5' a été ajouté au site Nru I par insertion du fragment Nru I-Xba I de 4 Kpb de pRW 788, aux extrémités franches dans le vecteur de pRW 760 Nru I-Bam HI, aux extrémités franches, pour générer le pRW 790. Le vecteur pRW 760 est décrit à l'exemple 11; en bref, c'est une nucléoprotéine de grippe promue au H6 de la vaccine, flanquée par un locus f7 FP-1 non essentiel. Le vecteur pRW 760 a été fabriqué en retirant les séquences H6 3' du site Nru I à travers l'extrémité de la nucléoprotéine en Bam HI. Le pRW 790 est le péplomére d'IBV promu au H6 dans le site Hinc II du pRW 731,13. La recombinaison du plasmide donneur pRW 790 avec FP-1 a résulté en vFP-31. Des expériences d'immunoprécipitation en se servant de lysats FEP préparés à partir des cellules infectées au vFP-31 ont démontré une précipitation spécifique d'une petite quantité de protéines précurseur avec un poids moléculaire d'approximativement 180 Kd et des produits de clivage de 90 Kd. Exemple 20 -CONSTRUCTION DU RECOMBINANT vFP-30 DU VIRUS FP-1 DE LA VEROLE DES VOLAILLES EXPRIMANT LE gD DU VIRUS HERPES SIMPLEX Le gêne de glycoprotéine D (gD) de la souche KOS de type 1 du virus herpes simplex (HSV) a été cloné dans le site Bam HI du pUC 9 en tant que fragment Bam HI 5' lié au Hpa 11 au Bam HI 3' lié au Nru I; l'extrémité 5' est voisine du site Pst I du pUC 9. La séquence 5' du gD de l'HSV, commençant au codon initiateur de traduction (ATG), contient le site Nco I souligné suivant: ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTG- GGCCTCCATGG. - -- Le promoteur H6 de La vaccine décrit auparavant a été lié au gène gD de l'HISV à l'aide d'un oLigonucléotide de synthèse. L'oligonucléotide de synthèse contient La portion 3' du promoteur H6 depuis Nru I jusqu'à L'ATS dans La séquence codant gD en passant par Le site Nco I. L'oLigonuclétotide a été synthétisé avec une extrémité 5' compatible au Pst I. Le clone de gD dans le pUC 9 a été découpé à l'aide de Pst I et de Nco I, et La séquence HSV ' retirée, pour son remplacement à L'aide de l'oligonucléotide de synthèse, ce qui résulte en Le pRY 787. L'oligonucléotide de synthèse a des changements de paires de bases seulement dans gD (pas de changements dans le promoteur H6) qui ne changent pas la séquence protéinique. La séquence de l'oLigonuctéotide de synthèse à double brin est La suivante: GTiCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC- CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC GTCGATCTAATCCACGACAATAAAATAAACATCAATATCATCCTGAGGTAC La digestion du pRW 787 à l'aide de Nru I et de Sam HI génère un fragment d'environ 1,3 Kpb contenant le promoteur H6 3', depuis Le site Nru I, à travers La séquence codant gD d'HSV jusqu'au site Bam HI. Le vecteur pRW 760, découpé à L'aide de Nru I et de Bam HI, a été décrit à L'exemple 11. L'insertion du fragment de 1,3 Kpb dans Le vecteur pRW 760 a généré Le pRW 791. Le vecteur pRW 791 contient le gêne gD de L'HSV promu au H6 de ta vaccine au complet, dans Le site FP-1 Hinc II non essentiel dans Le pRW 731,13 (locus f7). La recombinaison du plasmide donneur pRW 791 avec le FP-1 a résulté en le vFP-30. Une expression de surface - (6.-_ 2621487 de la glycoprotéine a été détectée dans les plaques recombinantes en utilisant un dosage immunologique lié à la Protéine-A-Béta-galactosidase et des sérums spécifiques HSV-1. Exemple 21 EMPLOI DES PROMOTEURS DE LA VEROLE DES INSECTES POUR LA REGULATION DE L'EXPRESSION DES GENES ETRANGERS DANS LES VECTEURS DES POXVIRUS a) Historique. Les poxvirus des insectes (entomopox) sont classés de manière courante dans la sousfamille des Entomopoxvirinae qui est sousdivisée encore plus dans trois genres (A, B, et C) correspondant aux entomopoxvirus isolés à partir des ordres des insectes Coléoptère, Lépidoptère, et Orthoptère respectivement. Les virus de la vérole des insectes ont une gamme étroite d'h8te dans la nature, et que l'on sache, ne se replique chez aucune espèce de vertébré. Le virus de la vérole des insectes utilisé dans ces études a été isolé à l'origine à partir de larves infectées d'Amsacta moorei (Lepidotpera arctildae) en provenance d'Inde. (Roberts and Granados, J. Invertebr. Pathol. 12, 141-143 [1968)). Le virus, désigné par AmEPV, est l'espèce type du genre B. Un AmEPV du type sauvage a été obtenu d'après Dr. R. Granados (Boyce Thompson Institute, Cornell University) comme hémolymphe infectieux à partir de larves infectées d'Estigmene acrea. On a trouvé que le virus se repliquait dans une ligne de cellules d'invertébré, IPLBLD652Y, dérivée de tissus ovariens du Lymantria dispar (papillon gitan) (décrit par Goodwin et coll., In Vitro 14, 485-494 ú19783). On a cultivé les cellules dans des milieux IPL- 528 supplémentés par 4X de sérum fêtal de veau et 4X de sérum de poulet à 28 C. Le virus de type sauvage a été dosé par plage sur des cellules LD652Y et une plage, désigné par V1, a été sélectionné pour des expériences supplémentaires. Cet isolat produit de nombreux corps d'occlusion (CO) dans le - 63 - 22621487 cytoplasme des cellules infectées tard dans le cycle infectieux. (b) L'identification des promoteurs. L'identifica- tion et la cartographie d'un promoteur AmEPV ont été menées à bien de la façon suivante. Un ARN total à partir de cellules LD652Y infectées-tard (48 heures après L'in- fection) a été isolé et utilisé pour fabriquer de l'ADNc de premier brin marqué au 32P. L'ADNc a été alors utilisé pour sonder des empreintes contenant des substances issues de digestion par restriction du génome AmEPV. Cet empreinte Southern a détecté un signal fort sur un fragment de 2,6 kb CLa I, indiquant que le fragment codait un gène exprimé fortement. Le fragment a été cloné dans un vecteur plasmide et sa séquence ADN déterminée. L'analyse des données de la séquence a révélé un cadre de lecture ouverte capable de coder pour un polypéptide de 42 Kd. La traduction in vitro du total ARN à 48 heures après l'infection et la séparation des produits par SDS-PAGE a révélé un polypéptide d'environ 42 Kd. (c) Construction d'un virus de la vaccine recombinant avec expresion d'un gène étranger sous le contr8le d'un promoteur de la vérole des insectes. Afin de déterminer si un promoteur de vérole des insectes fonctionnerait dans un système de poxvirus de vertébré, le plasmide suivant a été construit. Un oligonucléotide a été synthésisé chimiquement, lequel contenant les 107 bases en 5' du signal initiateur de la traduction du gène 42K (auquel on réfère ci-après en tant que promoteur AmEPV 42K) flanquées par un site Bgl II à l'extrémité 5' et les 14 premières bases de la région codante pré-S2 du virus de l'hépatite B, qui termine dans un site Eco RI, a l'éxtrémité 3'. La séquence du promoteur AmEPV 42K est décrite ci-dessous. TCAAAkA.TATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAA ATTGAAAATATATAATTACAATATAA.TG - 6 - Le promoteur AmEPV 42K a été ligué à l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBVsAg) comme suit. Un plasmide pUC a été construit contenant l'antigène de surface et la région codante pré-S2 du virus de l'hépatite B (type ayw décrit par Galibert et coll., Nature 281, 646- 650 C1979]) flanqués par les bras du virus de la vaccine dans la région non essentielle du génome du virus de la vaccine qui code pour la molécule de l'hémaggluti- nine (HA) (les bras HA décrits dans l'exemple 15; la région HA décrite par Shida, Virologie 150, 451-462 E1986]). L'oligonucléotide décrit ci- dessus a été inséré dans ce plasmide en utilisant le site unique EcoR I dans la région codant pour HBVsAg et un site Bgl II unique dans le bras de la vaccine HA. Le virus de la vaccine recombinant résultant a été désigné par vP 547. L'expression de la séquence codant pour HBVsAg insérée sous le contrôle du promoteur 42K vérole des insectes a été confirmé en se servant d'un dosage immuno- logique. Des cultures équivalentes de la ligne de cellules de mammifères BSC-40 ont été infectées avec le virus de la vaccine parentale ou avec le recombinant vP 547. 24 heures après l'infection les cellules ont été lysées et des lysats appliqués en dilution par série sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a tout d'abord été incubée avec un sérum antiHBV de chèvre et puis avec la protéine A-I125. Après lavage, la membrane a été exposée à un roentgen-film. Des signaux positifs ont été détectés dans des cultures infectées au vP547 mais non pas dans des cultures infectées au virus parental, indiquant la reconnaissance des promoteurs AmEPV 42K par le virus de la vaccine dans des cellules de mammifères. Les résultats ci-dessus ont été vérifiés en se servant d'un dosage Ausria (voir Exemple 1 pour les détails) pour détecter du HBVsAg dans des cellules infec- tées de mammifère. Les recombinants du virus de la vac- cine contenant le gène HBsAg couplées au AmiEPV 42K ou au promoteur H6 du virus de la vaccine ont été utilisés pour infecter les cellules BSC-40 et Le niveau d'expression du sAG a été dosé par le test Ausria. Ainsi qu'il est représenté par le tableau XII, les données montrent que le niveau d'expression du HBsAg en se servant du promoteur 42K était significatif. TABLEAU XII Expression du HBVaAg dans le Virus de la Vaccine Recombinant Ausria Virus recombinant Promoteur rapport PIN vP410 Controle 1.O VP48) iH 6 24.3 vP54 42K 44.9 Les expériences supplémentaires ont été conduites pour établir la nature temporelle de la régulation du promoteur AmEPV 42K dans un fond de poxvirus de vertébré. Des cultures équivalentes des cellules BSC-40 ont été infectées à l'aide de vP 547 en présence ou en l'absence de 40 ug/ml de cytosine arabinoside, un inhibiteur de la réplication d'ADN qui par consequent bloque La trans- cription virale tardive. Les niveaux d'expression 24 heures après L'infection ont été dosés dans un test Ausria. Les résultats indiquaient que le promoteur 42K était reconnu en tant que promoteur précoce dans un système de réplication des virus de la vaccine. On notera que l'emploi d'un promoteur AmEPV 42K pour L'expression de gènes étrangers dans un système de mammifère est clairement distincte de l'emptoi du promoteur de la polyhédrine NPV Autographa californica pour l'expression du gène dans des systèmes d'invertébré (Luckow and Summers, Biotechnology 6, 47-55 [19883). Le promoteur de La polyhédrine n'est pas reconnue par L'appareil transcriptionnel dans Les ceLLttules de mammifères (TjLa et coll., ViroLogie 125, 107-117 [1983>). L'emploi du promoteur AmEPV 42K dans des cellules de - 66 - 26 4 mammifères marque la première fois qu'un promoteur de virus d'insecte a été utilisé pour l'expression de gènes étrangers dans un vecteur viral non insecte dans des cellules de non invertébrés. Afin de déteminer si les virus de la vérole aviaire reconnaîtrait également le promoteur de la vérole des insectes 42K, l'expérience suivante a été effectué. Des cultures identiques de cellules FEP ont été inoculées à raison de 10 ufp par cellule avec soit le virus de la vérole des volailles soit le virus de la vérole de canari soit le virus de la vaccine, et simultanément transfectées à l'aide 25 ug de l'un, des plasmides suivants: 1) le plasmide 42K.17 contenant la séquence HBV pré-S2 + sAg liée au promoteur 42K, ou 2) le plasmide pMP15.spsP contenant la séquence identique codant pour HBVsAg liée au promoteur H6 du virus de la vaccine décrit précédemment. Apres 24 heures les cultures ont été congelées, les cellules lysées et le lysat analysé pour la présence de HBVsAg en utilisant un test Ausrai (cf. Exemple 1). Les résultats montrés au tableau XIII devraient être examinés dans un sens qualitatif. Ils indiquent que l'appareil transcriptionnel à la fois de la vérole des volailles et de la vérole du canari est capable de reconnaître le promoteur 42K et permet la transcription de la séquence codant pour HBVsAg liée. Bien que des niveaux d'expression soit plus bas que ceux obtenus avec le promoteur H6 du virus de la vaccine, les niveaux sont bien au-dessus des niveaux de fond obtenus avec les témoins négatifs. TABLEAU XIII Reconnaissance du Promoteur de la Vérole des Insectes 42K par les Virus Avipox Virus Promoteur Rapport P/N Vérole des volailles 422 39.1 H6 356.8 VéroLe du canari 4 J: 90.2 H6 222.2 Vaccine 422 369.4 1H6 366.9 Aucun 42K 7.8 Aucun 116 7.2 7.2 Vaccine Exemple 22 IMMUNISATION A L'AIDE DE VCP-16 POUR PROTEGER LES SOURIS CONTRE LA PROVOCATION A L'AIDE DE VIRUS DE LA RAGE VIVANT Des groupes de 20 souris agés de quatre à six semaines ont été inoculés dans le coussinet de la patte à l'aide de 50 à 100 ul d'un éventail de dilutions de l'un des deux recombinants suivants: (a) vFP-6- le recombinant de la rage de la vérole des volailles décrit dans l'exem- pLe 6 et (b) vCP-16- le recombinant de la rage de la vérole des canaris décrit dans l'exemple 13. A 14 jours, 10 souris de chaque groupe ont été sacrifiés et le sérum recueilli. Le titre antirage dans le sérum a été calculé en se servant des tests RFFI décrit précédemment dans l'exemple 7. Les 10 souris restantes dans chaque groupe ont été provoqués par inoculation intracérébrale à l'aide de la souche CVS du virus de la rage utilisée dans l'exemple 7. Chaque souris a reçu 30 ul correspondant à 16 fois la DL50 chez la souris. A 28 jours, les souris survivantes ont été évaluées et la dose protectrice 50 (DP50) calculée. Les résultats sont montrés au tableau XIV. - 6 - Le niveau de protection des souris trouvé par l'inoculation au vFP6 confirme le résultat trouvé lors de l'inoculation du recombinant de la vérole des volailles vFP-3 discuté dans l'exemple 7. Le niveau de protection autorisé par l'inoculation vCP-16 est considérablement plus haut. Sur la base du DP50 calculée, le. recombianant rage-vérole du canari est 100 fois plus efficace dans la protection contre la provocation par la rage que ne l'est le recombinant rage-vérole de la volaille. TABLEAU XIV Immunité Protectrice à la Provocation par le virus de la rage élicitée par deux recombinants rage-vérole aviaire vFP-6 de la vérole vCP-16 de la vérole des volailles du canari Dose d'ino- Titre Rapport Dose d'ino- Titre Rapport culum RFFI de survie culum RFFI de survie 7.5a 2.3b 7/10 6. 5 2.5 10l10 5.5 1.9 5/10 4.5 1.9 8/10 3.5 0.7 0/10 2.5 1.1 1/10C 1.5 0.6 0/10 0.5 0.4 0/10 ii 5 I I'D 50 "..17 1 PD 50 a 4. 18 a Les titres du virus exprimés en tant que log10 TCID50 b Le titre RFFI exprimé en tant que Log10 de la plus haute dilution du sérum donnant plus de 50% de réduction dans le nombre des puits présentant fluorescence dans un test RFFI. - 69 - Exempte 23 EMPLOI DES ELEMENTS PROMOTEURS DE LA VEROLE DES VOLAILLES POUR EXPRIMER LES GENES ETRANGERS I. Identification du gène de la vérole des volailles codant pour un produit de gène de 25,8 kilodaltons(KD). La visualisation des espèces de protéine présentes dans les lysats FEP infectés à la vérole des volailles (FP-1) par des colorations à bleu brillant de Coomassie des gels de polyacrylamide SDS révélait une abondante espèce avec un poids moléculaire apparent de ,8KD. Cette protéine n'était pas présente dans les lysats des cellules non infectées. Des expériences pul- sées en utilisant de la méthionine 35S pour radiomarquer les protéines synthétisées à des moments spécifiques après l'infection ont montré encore l'abondance de la proteine induite par le FP-1 et ont montré qu'elle est synthétisée à partir de 6 heures jusqu'à 54 heures après l'infection. A son niveau de pointe cette protéine FP-1 de 25,8KD représente environ 5% à 10% du total de la protéine présente dans le lysat cellulaire. L'abondance de la protéine 25,8KD induite au FP-1 a suggéré que le gène codant pour ce produit de gène est régulé par un élément promoteur FP-1 fort. Afin de loca- liser cet élément promoteur pour un emploi postérieur dans l'expression des gènes étrangers dans les recombinants du poxvirus, une préparation polysome a éte obtenue à partir des cellules FEP infectées au FP-1 54 heures après l'in- fection. L'ARN a été isolé à partir de cette préparation polysome et, lorsqu'il était utilisé pour programmer un system de traduction in vitro réticulocytaire de lapin, a généré de manière prédominante la protéine FP1 de ,8KD. Le RNA polysome a été également utilisé en tant que matrice pour la synthèse d'ADNc premier brin en utilisant l'oligo (dt) 12-18 en tant qu'amorceur. L'ADNc premier brin a été utilisé en tant que sonde d'hybridation dans des analyses d'empreinte Southern avec des substances - 'O - digérées génomiques FP-1. Les résultats à partir de ces analyses d'hybridation ont suggéré que le gène codant pour la protéine de 25,8 KD était contenu dans un fragment Hind III de 10,5 Kpb. Le fragment Hind III génomique a été postérieurement isolé et ligué dans un vecteur commercial, pBS (Stratagene, La Jolla, CA.), et le clone a été désigné par pFP23k-1. Des analyses d'hybridation supplémentaires en utilisant l'ADNc premier brin pour sonder les subs- tances digérées du pFP23k-1 ont localisé le gène 25,8 KD à un sousfragment Eco RV de 3,2 Kpb. Le fragment a été souscloné dans un pBS et désigné par pFP23k-2. Environ 2,4 Kpb de ce fragment Eco RV FP-1 a été séquencé par le procédé de terminaison de chaîne didéoxy de Sanger (Sanger et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 E1977]). L'analyse de la séquence révèle un cadre de lecture ouvert (CLO) qui code pour un produit de gène avec un poids moléculaire de 25,8KD. Un essai de transcription in vitro de ce CLO par polymérase T7 de bactériophage (Stratagene, La Jolla, CA) dans un vecteur pBS génère une espèce de ARN qui, lorsqu'elle est utilisé pour programmer un système de traduction in vitro réticulocytaire de lapin (Promega Biotec, Madison, WI) donne une espèce de polypeptide avec un poids moléculaire apparent de 25,8KD. Ce polypeptide migre conjointement avec la protéine abondante de 25,8KD observé dans les lysats à partir des FEP infectés au FP-1 sur un gel de polyacrylamide SDS. Ces résultats suggèrent que celui-ci est le gène codant pour l'abondant produit de gène de ,8KD induit au FP-1. II. Emploi des éléments de promoteur en amont du gène 25,8KD de FP-1 pour exprimer le gène env du virus de la leucémie féline (FeLV) dans des recombinants de - vaccine et de FP-1. Un fragment de 270 pb Eco RV/Eco RI contenant la région régulatrice du gène 25,8KD de FP-1 (promoteur FP25,8K) et 21 pb de la séquence codante du gène 25,8KD a été isolé à partir du pFP23k-2. Ci-dessous est présentée la séquence nucléotidique de la région du promoteur FP 25,8K utilisée pour dériver te pFELV25,8F1 et le pFeLV25, 81A. Cette séquence 270 nucléotides fournit 249 nucléotides de la région en amont du codon d'initia- tion (ATG) pour le produit du gène 25,8KD et Les premiers 21pb de la séquence codante. '-GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAATGCAATA- 7 ATATATGAA>CTCACTCCGATAGATACTTACCACAGCTATTATACCTTeATGTATGTT- CATATATTTAAA. ACAGAC.AAkAACGGCATA.TAAGTTTATATGATGTCTATATTATAGTGA- GTA''TTATGTATCG.:ATACTTTGTTTAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTA".- 1 T -ATAA-.AACGGATAGCATAAATGAATTC-3' Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches et on a inséré ce dernier dans un vecteur d'insertion FP-1 digéré au Sma I (pFeLV1; voir exemple 15) contenant les séquences env FeLV. Ce vecteur d'insertion a permis la recombinaison avec le locus f7 du génome FP-1. L'insertion des séquences en amont du promoteur FP25,8K en 5' du gène env FeLV et dans l'orientation correcte a été confirmée par l'analyse de la séquence. Cette inser- * tion ne fournit pas une substitution ATG pour ATG parfaite mais L'ATG fournit par le gène 25,8KD est hors de phase vis- à-vis de l'ATG env FeLV, et donc aucune protéine de fusion n'est formée. Le plasmide d'insertion FP-1 contenant le promoteur FP25,8KD en amont du gène env FeLV a été désigné par pFeLV25,8F1. Une construction analogue a été préparée en utilisant le vecteur d'insertion du virus de la vaccine, pFeLV1A, accueillant le gène FeLV (voir l'exemple 15). Le promoteur H6 a été excisé du pFELVIA par digestion à l'aide de Bgl II et de Sma I. Après avoir rendu franches les extrémités du site de restriction Bgl II, le fragment à extrémités franches de 270 pb Eco RV/Eco RI contenant le promoteur FP25,BK a été inséré juxtaposé en 5' du gène env FeLV. Cette construction a été confirmé par l'analyse de la séquence. Il n'y a pas de substitution parfaite ATG pour ATG dans ce recombinant non plus mais l'ATG à partir du gène 25,8KD n'est pas en phase vis-à-vis de l'ATG à partir du gène FeLV. Le vecteur d'insertion de la vaccine 7Z- 7- 2621487 (souche Copenhagen) accueillant la région en amont 25,8KD juxtaposé en 5' du gène FeLV a été désigné par pFELV25,81A. Les plasmides d'insertion, pFeLV25,8F1 et pFeLV25,81A, ont été utilisés pour une recombinaison in vitro avec FP-1 (pFeLV25,8F1) et la souche Copenhagen du virus de la vaccine (pFeLV25,8F1) en tant que virus de sauvetage. La descendance de la recombinaison a été étalée sur des monocouches de cellules appropriées et le virus recombinant sélectionné au moyen d'un immunoécran de protéine A lié à la bétagalactosidase et un sérum anti- FeLV bovin (Antibodies, Inc., Davis, CA.). Les résultats préliminaires suggèrent que le promoteur FP25,8K peut réguler l'expression des gènes étrangers dans les recombinants du poxvirus. Exemple 24 INOCUITE ET EFFICACITE DU VFP-6 ET DU VCP-16 DANS LA VOLAILLE Les deux recombinants de la vérole des volailles vFP-6 et vCP-16 (décrits dans les exemples 6 et 13) ont été inoculés dans des embryons de poulet de 18 jours, des poulets de 1 jour et des poulets de 28 jours et la réponse des oiseaux évaluée selon 3 critères 1) les effets de la vaccination sur la capacité d'éclosion, les réactions vaccinales et la mortalité 2) la réponse immunitaire induite à la glycoprotéine de la rage et 3) la réponse immunitaire induite aux antigènes de la vérole des volailles. Les expériences effectuées sont décrite ci- dessous. A. Tests d'inocuité. Des groupes de vingt embryons âges de 18 jours ont été inoculés dans la cavité allantoique à l'aide de 3,0 ou de 4, 0 log10 TCID50 soit de vFP-6 soit de vCP-16. Apres éclosion les poulets ont été observés pendant 14 jours, moment auquel ils ont été saignés individuellement et les sérums recueillis. Les deux recombinants inoculés dans les embryons de poulets n'ont eu aucun effect sur la capacité d'éclosion des oeufs et les poulets sont restés en bonne santé pendant la - 73 - période de 14 jours d'observation. Des groupes de 10 poulets SPF igés de 1 jour ont été inoculés à l'aide de 3,0 log10 TCID50 par voie intra- musculaire. Les poulets ont été observés pendant 28 jours et Les échantillons de sérum ont été prélevés au quator- zième au vingt-huitième jour après l'inoculation. Aucune réaction vaccinale n'a été observé au site de l'inoculation avec l'un ou l'autre des recombinants et les poulets sont demeurés en bonne santé pendant toute la période d'observation de 28 jours. Des groupes de 10 poulets igés de 28 jours ont été inoculés avec chacun des virus recombinants recevant soit 3,0 log10 TCID50 par voie intramusculaire soit 3,0 log10 TCID50 par voie cutanée (membrane de l'aile). Les poulets ont été observé pendant 28 jours et des échantillons de sérum prélevés au 14ème et au 28ème jour après l'inocula- tion. Aucune réaction n'a été observée après l'inocula- tion par voie intramusculaire avec l'un ou l'autre des recombinants. L'inoculation cutanée a résulté en une réaction vaccinale très minime au virus de la vérole, les lésions étant hétérogène en taille. L'inoculation de la vérole du canari a conduit à la production d'une lésion cutanée normale au site de L'inoculation. Toutes les lésions avaient régressé à la fin de l'expérience. B. Réponse immunitaire. Le test RFFI décrit précédemment à l'exemple 7 a été utilisé pour établir les niveaux d'anticorps contre la glycoprotéine de la rage. Pour chaque groupe les résultats ont été exprimés en titre moyen géométrique du sérum individuel converti en unité internationales (UI) selon un sérum standard qui contenait 23,4 UI. Le niveau de positivité minimal a été fixé à une UI et a été utilisé pour déterminer le pourcentage d'oiseaux positifs. Les anticorps contre les virus avipox ont été testés à l'aide de La méthode ELISA en utilisant la souche du virus de la vérole des volailles en tant qu'antigène. Chaque échantillon de sérum a été dilué à 1/20 et 1/80. Une courbe d'étalonnage a été construite en - 74 - 2621487 utilisant des sérums positifs et négatifs. Le niveau de positivité minimal a été calcuLé grace à la moyenne des valeurs différentes des sérums négatifs ajoutés aux deux écart-types. Les résultats des études sérologiques sont représentés au tableau XV pour le vFP-6 et au tableau XVI pour le vCP-16. Une réponse sérologique limitée a été observé chez les embryons inoculés avec soit le vFP-6 soit le vCP-16 pour à la fois les antigènes de la rage et de la vérole des volailles. Le vecteur de La vérole des volailles a induit une réponse sérologique aux deux antigènes dans un plus grand nombre d'oiseaux que ne l'a fait le virus de la vérole du canari mais la réponse était encore hétérogène. Les poulets inoculés à l'ige d'un jour à l'aide du vFP-6 ont montré une bonne réponse sérologique, tous les oiseaux étant séropositifs aux antigènes de la rage et de la vérole des volailles au plus tard environ 28 jours après l'inoculation. La réponse à l'inoculation du vFP-6 a été beaucoup plus basse, 40% des oiseaux étant séroposi- tifs pour la glycoprotéine de la rage à 28 jours et 10% séropositifs pour les antigènes de l'avipox. Les poulets inoculés à l'aide de vFP-6 par voie intramusculaire à l'ige de 28 jours ont montré 100% de séroconversion pour les deux antigènes au plus tard 14 jours après l'inoculation. Bien que la majorité des oiseaux se soit également séroconvertie après l'inocula- tion cutanée, les titres obtenus étaient plus bas pour les deux antigènes de la rage et de l'avipox. Comme précédem- ment les poulets inoculés à la fois par voie intramuscu- laire et par voie cutanée à l'aide de vCP-16 ont montré une réponse variable avec un maximum de séroconversion de % à la rage par inoculation par voie intramusculaire. Le faible niveau de séroconversion pour les antigènes de l'avipox après l'inoculation de la vérole du canari traduit peut-être le degré de parenté sérologique entre - ? - les virus. Les résultats indiquent que le vFP-6 et Le vCP-16 sont tous deux inoffensifs pour l'inoculation des poulets d'âge différent. Le vecteur de la vérole des volailles vFP-6 semble être plus efficace dans l'induction d'une réponse immunitaire chez les poulets. De manière significative, cependant, on a montré que les deux virus avipox recombinant, vérole des volailles et vérole du canari, sont utiles pour l'immunisation in ovum. _- 76 - 2621487 TABLEAU XV Réponse Immunologique contre la Glycoprotéine de la Vérole des Volailles/de la Rage (vFP-6) chez des Poulets à des Ages Différentes. Anticorps Groupes Dose Temps après Glycoprotéine de la rageVérole des volailles (TCID50) l'inoculationTitre UI% des oiseaux/DO Elisa% positif (jours) moyen 1 UI moyen Embryons 10 Embryons1 3 +14 0.2A8 15% 0.125 54% figés de10 3 1 14 0.87 30% 0.129 0,129 46t 18 jours Poulets âgés de I 203 àg de10 14 1.8 90% 0.109 jour 28 4.2 90% B.24 100% 0. % vole IM Poulets gés de 28 10 14 3.7 100% 0.317 lOC jours28 2.7 100% 0. 378 10 jours voie IM Poulets Igés de 28 jours 11.6 100% 0119 % 14.161 voie 1328 0.54 90% transfixion _7r _ 26 21487 TABLEAU XVI Réponse ImmunoLogique contre La Glycoprotéine de La Vérole du Canari/ de La Rage (vCP-16) chez des Poulets à des Ages Différents Anticorps Groupes Dose Dose après Glycoprotéine de La rage Vérole du canari (TCID60) L'inoculation Titre UI X d'oiseaux/ DO ELISA Z positif (jours) moyen 1 UI moyen Embryons 3Embryons03 + 14 0.14 0% 0.068 25% âgés de 104 3 + 14 0.19 8% 0.059 25% 18 jours Poulets àgés de 1 10 14 0.18 10% 0.027 C jour 28 0.21 40% 0.059 lot1 voie IM Poulets Agés de 28 jours 13 14 0.61 70 0.093 60% voie IM 28 0.24 30% 0.087 30% PouLets Sgés de 28 3 jours 10 14 0.34 40% 0.07, 0 jorise o 28 0.11 lot 0.06 10 vnoiÀe t ransfixion - 79 - Exemple 25 INOCUITE ET IMMUNOGENICITE DE L'INOCULATION DU vFP-6 CHEZ LE PORCELET Deux groupes de trois porcelets ont été inoculés à l'aide du vFP6 recombinants par l'une des deux voies: a) trois animaux ont reçu 8,1 log10 TCID50 par inoculation par voie intramusculaire; et b) trois animaux ont reçu la même dose par inoculation par voie orale. Tous les animaux ont été saignés à intervalles hebdomadaires et ont reçu une inoculation de rappel de la mime dose par la même voie le 35ème jour. Les porcelets ont été observés chaque jour pour des signes cliniques. Les sérums ont été testés pour les anticorps anti-véroles des volailles par un test ELISA et un test de neutrali- sation du sérum. Les anticorps contre la rage ont été dosés dans un test RFFI. Tous les porcelets sont demeurés en bonne santé et aucune lésion n'a été observée après l'inoculation. Les courbes de température étaient normales, aucune différence apparaissant entre les animaux inoculés et les animaux non inoculés. Les porcelets inoculés tant par voie intra- musculaire que par voie orale ont développé une réponse sérologique aux antigènes de la vérole des volailles ainsi que mesurée par ELISA et par la neutralisation de la sérum. Une réponse secondaire était évident après l'inoculation de rappel (les résultats ne figurent pas ici). Tous les porcelets ont également développés une réponse immuno- logique à la glycoprotéine de la rage telle que mesurée dans un test RFFI et un effet de rappel est évident par les deux voies. Ces résultats figurent ci-dessus au tableau XVII. Les résultats indiquent que L'inoculation d'un recombinant de la vérole des volailles/rage est inoffensif chez des porcelets et que le recombinant est capable de produire une réponse immunitaire significative vis-à-vis de la glycoprotéine de la rage par inoculation par voie orale - 2 6 262 1487 ou intramusculaire. TABLEAU XVII Anticorps à la Glycoprotéine de la Rage Produit chez Les Porcelets Innoculés à l'aide du vFP-6 Voie de No. de Anticorps Rage aux Jours (Titre RFFI) vaccination l'animal 14 21 28 35 42 49 984 2.4a 2.2 2.1 2.2 3 3 I.M. 985 2.5 2.7 2.6 2.4 3 3 985 2.5 2.7 2.6 2.4 3 3 986 2.2 2.0 2.1 2.3 3 3 987 3 2 2.1 2 3 3 Orale Orale 988 2.9 2.4 2.2 2.4 2.7 2.5 989 2.8 2 1.7 1.8 2.4 2,5 a Titre exprimé en tant que log10 de la dilution la plus élevé du sérum donnant une réduction de plus de % dans le nombre des puits présentant une fluorescence dans un test RFFI. b Animaux ayant reçu une seconde inoculation au 35ème jour - O - REVENDICATIONS: 1. Procédé pour exprimer un produit de gène chez un vertébré, lequel procédé comprend l'inoculation du vertébré à l'aide d'un virus recombinant comprenant de l'ADN qui code pour le produit de gène et exprime ce dernier sans réplication productive du virus chez le vertébré. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus est un poxvirus. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit virus est un virus avipox. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit virus avipox est sélectionné à partir du groupe constitué par le virus de la vérole des volailles et par le virus de la vérole du canari. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le vertébré est inoculé en introduisant le virus dans le vertébré par voie sous- cutanée, intradermique, intramusculaire, orale ou in ovum. 6. Procédé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis d'un antigène chez un vertébré, lequel procédé comprend l'inoculation du vertébré à l'aide d'un virus recombinant comprenant de l'ADN qui code pour l'antigène et expriment ce dernier sans réplication productive du virus chez le vertébré. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit virus est un poxvirus. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit virus est un virus avipox. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit virus avipox est sélectionné parmi le groupe constitué par le virus de la vérole des volailles et par le virus de la vérole du canari. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vertébré est inoculé en introduisant le virus dans le vertébré par voie souscutanée, intradermique, intramusculaire, orale ou in ovum. - 8, - 2621487 11. Procédé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis d'un pathogène de vertébré chez un vertébré, lequel procédé comprend l'inoculation du vertébré à l'aide d'un virus recombinant comprenant de l'ADN qui code pour un antigène du pathogène et exprime cet antigène sans réplication productive du virus chez le vertébré. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit virus est un poxvirus. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit virus est un virus avipox. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit virus avipox est sélectionné à partir du groupe constitué par le virus de la vérole des volailles et par le virus de la vérole du canari. 15. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit vertébré est un mammifère et en ce que ledit pathogène du vertébré est un pathogène de mammifère. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'antigène est sélectionné à partir du groupe constitué par l'antigène G de la rage, par l'antigène de l'enveloppe gp51, 30 du virus de la leucémie bovine, par l'antigène de l'enveloppe du virus de la leucémie féline FeLV et par l'antigène de la glycoprotéine D du virus herpes simplex. 17 Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la mammifère est sélectionné à partir du groupe constitué par le chien, le chat, la souris, le lapin, Le bétail, le mouton et le cochon. 18. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le vertébré est inoculé en introduisant le virus dans Le vertébré par voie souscutanée, intradermique, intramusculaire, orale ou in ovum. 19. Procédé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis d'un pathogène de vertébré chez un vertébré, lequel procédé comprend l'inoculation du vertebré à l'aide d'un virus avipox recombinant comprenant de l'ADN qui code pour un antigène du pathogène et exprime cet antigène. - 2 6 2621487 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit vertébré est un mammifère et en ce que ledit pathogène de vertébré est un pathogène de mammifère. 21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'antigène est sélectionné à partir du groupe constitué par l'antigène G de la rage, par l'antigène de l'enveloppe gp51,30 du virus de la leucémie bovine, par l'antigène de l'enveloppe du virus de la leucémie féline FeLV et par l'antigène de la glycoprotéine D du virus herpes simplex. 22. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit vertébré est un oiseau et en ce que ledit pathogène de vertébré est un pathogène aviaire. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit antigène est sélectionné à partir du groupe constitué par l'antigène de l'hémagglutinine de la grippe aviaire, par un antigène de la protéine de fusion du virus de la maladie de Newcastle, par un antigène de l'enveloppe RAV-1 du virus associé au Rous, par l'antigène de la nucléoprotéine du virus de la grippe aviaire, par un antigène matrice du virus de la bronchite infectieuse et par un antigène péplomére du virus de la bronchite infectieuse. 24. Virus avipox recombinant contenant à l'intérieur de l'ADN à partir d'une source non avipox dans une région non essentielle du génome de l'avipox. 25. Virus selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il contient en outre un promoteur non avipox pour exprimer ledit ADN. 26. Virus selon la revendication 25, caractérisé en ce que le promoteur non avipox est un promoteur de la vaccine. 27. Virus selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit promoteur de la vaccine est sélectionné à partir du groupe constitué du HH, 11K, et Pi. 28. Virus selon la revendication 25, caractérisé en ce que le promoteur non avipox est un promoteur entomopox. -83 - 2621487 29. Virus selon La revendication 24 qui contient en outre un promoteur avipox pour exprimer ledit ADN. 30. Virus selon La revendication 24, caractérisé en ce que Ledit ADN code pour un antigène d'un pathogène de mammifère. 31. Virus selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'antigène est sélectionné à partir du groupe constitué par l'antigène de la rage, par l'antigène G de la rage, par l'antigène de l'enveloppe gpS1,30 des virus de la leucémie bovine, par l'antigène de l'enveloppe du virus de la leucémie féline FeLV et par l'antigène de La glycoprotéine D du virus herpes simplex. 32. Virus selon la revendication 24, caractérisé en ce que Ledit ADN code pour un antigène d'un pathogène aviaire. 33. Virus selon la revendication 32, caractérisé en ce que ledit antigène est sélectionné à partir du groupe constitué par l'antigène de l'hémagglutinine de la grippe aviaire, par un antigène de la protéine de fusion du virus de la maladie de Newcastle, par l'antigène de l'enveloppe RAV-1 du virus associé au Rous, par l'antigène de la nucléoprotéine du virus de La grippe aviaire, par un antigène matrice du virus de La bronchite infectieuse et par un antigène péplomère du virus de La bronchite infectieuse. 34. Virus selon la revendication 24, caractérisé en ce que ledit virus avipox est un virus de la vérole des volaiLLes. 35. Virus selon La revendication 24, caractérisé en ce que Ledit virus avipox est un virus de la vérole du canari. 36. Poxvirus recombinant contenant à l'intérieur de l'ADN provenant de n'importe queLLe source et un promoteur entomopox pour exprimer Ledit ADN. 37. Virus selon La revendication 36, caractérisé en ce que Ledit virus est un virus avipox. 38. Virus selon la revendication 36, caractérisé en ce - 81 - 2621487 que Ledit virus est un virus de La vaccine. 39. Virus de La vaccine recombinant contenant à L'intérieur de l'ADN provenant de n'importe quelle source et un promoteur avipox pour exprimer Ledit ADN.