Brevet FR2618680A1 — publié le 19890203

La présente invention est relative à l'identifica- tion des antigènes excrétés-secrétés par les tachyzoltes de Toxoplasma gondii (TG) et d' antigènes communs aux tachy- zoOtes et aux bradyzoïtes de ce parasite, aux produits de traduction de ces antigènes et aux applications desdits anti- gènes et produits de traduction, notamment pour l'immunopro- tection contre les tachyzoltes de TG et pour le diagnostic précoce de la toxoplasmose, plus particulièrement de la toxoplasmose congénitale. Le protozoaire parasite Toxoplasma gondii, membre de la classe des Sporozoa et de l'ordre des Coccidia est un parasite intracellulaire qui se reproduit dans une grande va- riété de types de cellules à l'intérieur de ses hôtes, qui sont des mammifères. Chez l'être humain, l'atteinte la plus significative causée par cet organisme a pour siège le foetus en développement et les patients présentant un déficit immu- nitaire (SIDA, etc...). La toxoplasmose est responsable d'at- teintes oculaires et cérébrales sévères et même mortelles chez les nouveau-nés contaminés par voie transplacentaire, ainsi que chez les patients immunodéficients. Chez l'homme, deux formes du parasite ont été dé- crites: le "tachyzoïte", qui est la forme multiplicative rencontrée au cours de la phase aiguë de la maladie, et le bradyzoïte", forme résistante qui persiste enkystée dans les tissus nerveux et est.vraisemblablement responsable de l'en- tretien d'une immunité durable à la réinfection. Ce parasite est un pathogène important, non seule- ment chez l'homme mais également en médecine vétérinaire et il est très largement répandu géographiquement, à telle en- seigne qu'on a pu établir que près de 500 millions de person- nes dans le monde entier présenteraient une réaction séro- logique positive à l'infection. HUGHES, "CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY", Vol. 120 (1985), SPRINGER Ed., pages 105-139, passe en revue les différents tests de sérodiagnostic dispo- nibles: test de coloration de SABIN et FELDMAN, standardisé par BEVERLY et BEATTLE (1958) et perfectionné par FELDMAN et LAMB (1966), WALDELAND (1976) et BALFOUR et Al. (1982), qui requiert des parasites vivants, de grandes quantités de sérum humain normal et des spécialistes bien entraînés pour sa réa- lisation; test de détection d'anticorps par immunofluores- cence, qui présente les mêmes inconvénients que le test de coloration et qui a été mis au point par REMINGTON (1968) et perfectionné par KARIM et LUDLAM (1975); les tests d'hémag- glutination, dont les résultats sont trop tardifs, notamment pour la détermination de la présence du parasite chez la femme enceinte; test ELISA pour la détection d'anticorps de Toxoplasma, par isolement d'IgM in situ sur la microplaque de test (WIELAARD et Ai., 1983). Cependant, dans les tests séro- logiques utilisant des antigènes solubles, ces derniers sont obtenus par simple extraction (lyse a l'eau, congélation et décongélation ou éclatement par ultra-sons de tachyzoïtes de Toxoplasma). Ces techniques n'assurent la présence d'anti- gènes de membrane dans le système de test que s'ils sont aisément solubles dans l'eau ou le tampon ou si l'étape finale de centrifugation ne laisse subsister que peu de fragments de membrane en suspension dans la solution. Les différents tests mis en oeuvre reposent sur la formation d'anticorps pour la détection de différents anti- gènes, d'o l'importance de l'identification desdits anti- gènes dans le but d'améliorer la fiabilité et la sensibilité des tests. Trois antigènes de Toxoplasma avaient pu être identifiés par CHORDI et A1. CJ. IMMUNOL., 93 (1964) pages 1034-1044), puis confirmés par HUGHES et BALFOUR (PARASITE ItMMUNOL., 3,(1981), pages 235-248) et leur origine intra- cellulaire établie. L'analyse de polypeptides de Toxoplasma, provenant d'organismes traités par ultra-sons, par SDS - PAGE et par fixation de concanavaline marquée A 1'125I, a montré l'existence de 9 polypeptides intracellulaires d'origine parasitaire, de poids moléculaires compris entre 20 000 et -3- 98 000, dont aucun n'est glycosylé. Il a été montré ultérieu- rement que 10 polypeptides obtenus par sonication, puis pré- cipitation par de l'immun-sérum de souris, présentaient des propriétés antigéniques. La technique de KOHLER et MILSTEIN d'hybridation avec des cellules lymphoïdes a permis de développer des anti- corps monoclonaux pour sonder la structure antigênique de Toxoplasma. HUGHES [ (1985) loc. cité _ mentionne qu'à la date de sa Publication 32 anticorps monoclonaux avaient été décrits et réagissent contre des antigènes de membrane de Toxoplasma. Tous ont été définis du point de vue sérologi- que; 4 présentent une réactivité à la fois contre les composants de la membrane et du cytoplasme et 28 sont positifs uniquement dans des tests de reconnaissance des antigènes de membrane. Les tests d'immunoprécipitation et de SDS - PAGE appliques à ces anticorps monoclonaux ont montré que la majorité d'entre eux réagissent contre des antigènes de poids moléculaires 35KD, 27KD et 14KD. Les anticorps résultant des clones 3E6 et 2Gll précipitent tous deux les antigènes de P. M. 35KD et 14KD CHANDMAN et Al. J. IMMUNOL., (1980) pages 2578-25837, de même que les anticorps monoclonaux FMC 18, FMC 22, FMC 23 développés par JOHNSON et A1.(J. EXP. BIOL. MED. SCI, 59 (1981), pages 303-3063, tous ces anticorps étant spécifiques aux membranes des tachyzoltes, KASPER et Ai. [J. IMMUNOL. (1982), 129, pages 1694-1699 et (1983) 130, pages 2407- 24127 ont récemment décrit deux antigènes précipitables de poids moléculaires 22KD (P22) et 30KD (P30). De plus, JOHNSON et A1. [J. PROTOZOOL (1983), 30, pages 351-356] ont montré que des anticorps monoclonaux qui réagissent contre le même antigène de membrane peuvent recon- naître différents épitopes et HUGHES suggère en relatant ces derniers travaux (Page 11, loc. cité) que des études similai- res pourraient être effectuées sur d'autres anticorps mono- clonaux qui reconnaissent un antigène commun et pourraient -4- permettre de définir la structure moléculaire des épitopes concernés. Dans sa revue apparemment exhaustive (loc. cité), HUGHES souligne également l'importance de la détection des antigènes circulants dans les fluides corporels: alors que l'infection par Toxoplasma gondii conduit normalement à une réponse humorale rapide démontrable par des tests sérologi- ques tels que ceux énumérés plus haut, ceux-ci peuvent ne pas être suffisants pour le clinicien lorsqu'il faut diagnosti- quer rapidement et avec précision la présence d'une infection aiguë à partir d'un échantillon unique de sérum. Ceci est particulièrement important dans le cas d'un patient immunodé- ficient qui représente un danger de dissémination ou en cas d'hypogammaglobulinémie sous-jacente.Si la détection d'une antigénémie permet de confirmer dans ces cas comme pendant la phase aiguë de l'infection, la présence d'une infection acti- ve, dans la toxoplasmose congénitale, la détection d'antigè- nes dans des fluides corporels tels que le liquide amniotique ou le liquide céphalorachidien, peut également fournir une indication au sujet de la gravité de l'infection par Toxo- plasma et permettre, par conséquent, de prendre des décisions sur le plan de la thérapeutique et du pronostic à adopter. Des études de double diffusion ont montré qu'un an- tigène circulant détecté dans du sérum de souris atteintes de toxoplasmose aiguë, présente des composants communs avec des extraits de Toxoplasma lysés par de l'eau, est une protéine thermolabile (56'C/30 minutes) et son poids moléculaire (obtenu après l'avoir isolé par chromatographie d'affinité) est supérieur à 100 000, de même que des antigènes circulants présents dans du sérum de rats infectés. Les antigènes circulants peuvent être libérés de deux façons: soit par secrétion active par le parasite, soit par immunolyse. Il a été montré que les antigènes circulants ne présentent pas d'identité immunologique avec de simples extraits aqueux ou des lavages péritonéaux, ce qui implique que l'antigénémie n'est pas simplement un résultat de para- --5- sites mourants ou de la libération d'antigènes de cellules infectées. Toutefois l'antigène présent dans les immuncom- plexes circulants récemment décrits par SIEGEL et REMINGTON [CLIN. EXP. IMMUNOL. (1983) 52, pages 157-1633 n'a pas encore été identifié. Par ailleurs JOHNSON /PATHOLOGY (1985), 17, pages 9-19/ souligne que la plupart des travaux sur le sujet ont utilisé la forme "tachyzoïte, du parasite comme source d'an- tigène, alors que la voie naturelle de transmission de la to- xoplasmose est l'ingestion orale soit des sporozoltes présents dans les oocystes (qui ne se trouvent que chez le chat), soit des bradyzoltes dans les kystes des tissus. Il a été démontré qu'il existe un antigène commun aux 5 formes (schizonte, gamétocyte, sporozoïte, tachyzoïte, bradyzolte) du cycle vital de Toxoplasma et qu'un antisérum marqué à la fluorescéine, produit contre le tachyzoYte, réagit spécifi- quement avec les 4 autres formes. Or, d'autres Auteurs ZLUNDE et JACOBS, J. PARASITOL. (1983) 69, 806-8083 ont montré qu'il y a des différences antigéniques entre les tachyzoltes et les bradyzoltes: de l'antisérum anti-bradyzoîtes, marqué à la fluorescéine, ne réagit que contre les bradyzoltes, alors que l'anti-sérum anti-tachyzoltes réagit aussi bien contre les tachyzoltes que contre les bradyzoltes. De même, les essais effectués par KASPER et Al. [J. IMMUNOL. (1984), 132, pages 443-4497 ont corroboré ce résultat, encore que les différen- ces antigéniques qu'ils ont montrées entre les sporozoltes et les tachyzoltes puissent permettre d'envisager la possibilité du développement de tests de diagnostic aptes à différencier les deux voies d'infection par Toxoplasma. Selon HUGHES (loc. cité), la vaccination contre la toxoplasmose ne pourra être envisagée avec les anticorps monoclonaux, avec plus de succès que les tentatives anté- rieures (vaccins utilisant des organismes tués ou des orga- nismes atténués) que dans la mesure o il pourra être établi que les antigènes isolés par chromatographie d'affinité en - 6- utilisant les anticorps FMCl9 et FMC22 isolés par JOHNSON et A1. (loc. cité), sont protecteurs et qu'ils sont aptes à induire une réponse humorale. En effet, les résultats rappor- tés jusqudalors ne sont pas suffisamment probants à ce sujet, Aà ce jour: JOHNSON et A1. (1983, loc. cité) ont trouvé que les anticorps monoclonaux FMCl9 et FMC22 peuvent induire une protection contre des souches virulentes et très virulentes de Toxoplasma, en réagissant contre les antigènes de PM 35KD et 14KD; cependant, d'autres anticorps monoclonaux qui pré- cipitent les mêmes antigènes, à l'analyse par SDS - PAGE, ne procurent pas le même degré de protection, en sorte que les Auteurs ont supposé qu'ils reconnaissaient des épitopes dif- férents sur le même antigène. Les deux anticorps monoclonaux qui induisent une protection sont des isotypes IgG3 et IgGl respectivement. Les deux anticorps monoclonaux qui n'indui- sent pas de protection significative sont respectivement des isotypes IgGl (FMC23) et IgG2a (2Gll). Si, en ce qui concerne FMC23, l'absence de. protection serait effectivement à rappor- ter à la différence entre les épitopes reconnus par rapport à FMC 19 ou FMC 22, en ce qui concerne 2Gll elle pourrait éga- lement être due aux particularités différentes de la sous- classe IgG2a par rapport aux sous-classes IgGl et IgG3. KASPER et Al. [J. IMMUNOL. (1985) 134, pages 3426-3431] ont décrit des tentatives d'immunisation de souris par une protéine de membrane de tachyzoltes de Toxoplasma gondii purifiée, la protéine P 30, et un anticorps monoclonal dirigé contre cet antigène; ils ont observé chez les souris traitées une augmentation statistiquement significative de la mortalité par rapport à des souris témoins non-immunisées et, chez les souris vaccinées, un nombre accru de kystes tissu- laires intercérébraux par rapport à un groupe témoin. Des ré- sultats similaires ont été obtenus avec une immunisation pas- sive par transfert, à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène P 30. Comme les bradyzoltes ne contiennent -7- ni l'antigène P30, ni l'antigène P22, il n'est pas exclu, selon les Auteurs, que cet échec soit dû à la résistance des parasites aux anticorps anti-tachyzoltes. Les travaux les plus récents dans ce domaine ont fait l'objet d'Abstracts publiés dans la Revue "MOLECULAR STRATEGIES OF PARASITIC INVASION" éditée par 1' UCLA en Jan- vier 1986: - BOOTHROYD, BURG, NAGEL, OSSORIO, PERELMAN, KASPER, WARE, PRINCE, SHARMA et REMINGTON (Abstract C19) ont utilisé les techniques mettant en oeuvre l'ADN recombinant et les anti- corps monoclonaux dans le but de mieux comprendre les pro- priétés biologiques et les propriétés inductrices de la toxoplasmose; à cet effet, ils ont utilisé les anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre les principaux antigènes de surface du parasite, pour isoler et caractéri- ser leurs gènes respectifs. Ils ont produit des séquences partielles ou complètes de nucléotides de certains de ces gènes et ils ont aussi cloné et partiellement séquencé les gènes d'ô(- et de B-tubulines qui ne sont présents chacun qu'en un seul exemplaire dans Toxoplasma gondii. Ces der- niers ont fait l'objet d'une caractérisation plus poussée rapportée dans l'Abstract C 59 par NAGEL et BOOTHROYD. - BURG, PERELUAN et BOOTHROYD (Abstract C 85) décrivent 1'é- laboration d'une banque d'expression dans le phage kGtll en utilisant l'ADN génomique de Toxoplasma gondii et l'isole- ment à partir de cette banque, A l'aide d'immun-sérums de souris infectées par Toxoplasma gondii, d'une séquence possédant un potentiel codant pour un déterminant antigénique majeur du parasite, qui est le gène TgBl. Cette séquence semble spécifique à Toxoplasma gondii et le déterminant antigénique produit dans le clone TgBl gtll est reconnu par de l'immun-sérum de souris, de rat et d'homme. Ces Auteurs décrivent également le criblage d'une banque d'expression de l'ADNc du Toxoplasma (également cons- - 8 - truite à l'aide du phage gtll) pour isoler des séquences codant pour les antigènes présents sur la surface du para- site, à l'aide d'antisérum polyclonal dirigé contre les protéines antigéniques de surface P 30 et P 22 purifiées. En utilisant 1' ADNc de l'antigène P 22 comme sonde dans un immunotransfert de Northern, ils ont détecté une seule espèce d'ARN comprenant environ 1600 nucléotides. - PRINCE, REMINGTON et SHARMA (Abstract C 106) ont caractéri- sé un antigène de Toxoplasma gondii reconnu par un anti- corps monoclonal (mab)F3G3 dont ils ont déterminé qu'il procure A des souris une immunité protectrice de longue du- rée (supérieure à 9 mois). Le clonage des gènes codant pour les antigènes de Toxoplasma gondii a été obtenu en élabo- rant une banque d' ADNc de tachyzoYtes dans le vecteur d'expression gtll, puis criblage de celle-ci à l'aide d'un anticorps polyclonal de souris dirigé contre l'antigène F3G3. Des clones recombinants isolés par criblage A l'ai- de de la sonde anticorps monospécifique, contiennent un in- sert d' ADN de Toxoplasma gondii qui code pour 1/6e de la protéine intacte et l'antigène recombinant qui résulte de ces clones est également reconnu par (mab)F3G3. Les travaux effectués dans le domaine de la Toxo- plasmose ont largement démontré: - la nécessité d'identi- fier des antigènes du stade tachyzoïte et du stade brady- zoïte présentant des épitopes communs, pour permettre l'établissement d'une immunité concomitante; - la nécessi- té de l'identification des antigènes excrétés-sécrétés par les tachyzoltes et de l'évaluation de l'importance de leur rôle dans l'immunité protectrice - et la nécessité de la mise en évidence du r8le des anticorps de classe IgE dans l'immunité protectrice contre la toxoplasmose. La présente invention a pour objet des antigènes de Toxoplasma gondii (TG) caractérisés en ce qu'ils sont cons- titués par des antigènes d'excrétion-sécrétion (ES) des tachyzoltes de TG. Dans le cadre de leurs recherches dans le domaine des maladies parasitaires humaines et plus particulièrement de la toxoplasmose, les Inventeurs sont parvenus à identifier les mécanismes effecteurs et immunorégulateurs de ces affec- tions et ils ont notamment pu établir 1'importance des anti- gènes excrétés-secrétés dans l'élaboration de la réponse im- munoprotectrice, alors que les antigènes de membrane sont plus particulièrement impliqués dans l'induction d'isotypes aussi bien effecteurs que bloquants. Ces découvertes ont conduit les Inventeurs à cher- cher à isoler lesdits antigènes excrétés-secrétés, dans le but, notamment, de la mise au point d'un vaccin contre la toxoplasmose. Conformément à l'invention, les antigènes ES isolés des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii sont caractérisés en ce qu'ils constituent un groupe d'antigènes dont les 20 majeurs qui ont été détectés, présentent des poids moléculaires res- pectifs de 185KD, 170KD, 155KD, 105KD, 98KD, 84KD, 68KD, 57KD, 53KD, 45KD, 43KD, 39KD, 35KD, 34KD, 31KD, 30KD, 26KD, KD, 24KD et 20KD environ. Selon une disposition avantageuse de l'invention, les antigènes de poids moléculaires 185KD, 170KD, KD,105KD, 57KD, 53KD, 45KD, 43KD, 39KD, 35KD, 34KD, 31KD, 30KD, 26KD, 25KD et 24KD sont reconnus au cours de la phase chronique. Selon une autre disposition avantageuse de l'inven- tion, l'antigène de poids moléculaire 105KD est identifié comme un marqueur de la phase chronique. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, l'antigène de poids moléculaire 84KD est identi- fié comme un marqueur transitoire de la phase chronique. Selon une autre disposition avantageuse de l'inven- tion, l'antigène de poids moléculaire 24KD est identifié com- me un marqueur tardif de la phase chronique, également mar- 261&680 - 10 - queur d'immunité protectrice. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, l'antigène de poids moléculaire 98KD est identi- fié comme un marqueur de la phase aiguë. Selon une autre disposition avantageuse de l'inven- tion, l'antigène de poids moléculaire 68KD est identifié com- me un marqueur de la phase aiguë, cependant moins spécifique que l'antigène 98KD. Selon une disposition avantageuse de l'invention, les antigènes ES de TG sont isolés de surnageants recueillis aprèsincubation d'une suspension de tachyzoïtes de Toxoplasma gondii pendant environ 3 heures dans un milieu RPMI 1640 con- tenant 10 % de sérum décomplémenté d'origine humaine ou ani- male et centrifugation puis ultrafiltration des surnageants recueillis, éventuellement suivie d'une étape de concentra- tion et d'une nouvelle étape de centrifugation, ainsi que d'un traitement de congélation à -70 C, lesquels antigènes ES sont capables d'induire une réponse humorale protectrice con- tre la toxoplasmose. Egalement conformément à l'invention, les antigènes de Toxoplasma gondii sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des antigènes des brazizoïtes de Toxoplasma gondii. Selon une disposition particulièrement avantageuse de l'objet de l'invention, les antigènes de Toxoplasma gondii sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des antigènes communs aux tachyzoltes et aux bradyzoltes de Toxoplasma gondii. Conformément à l'invention, ces derniers sont iden- tifiés par immunoprécipitation de sérums de mammifères, no- tamment de sérums humains ou animaux, reconnus comme séro- positifs (soit de phase aiguë contenant des IgM spécifiques, soit de phase subaiguë contenant A la fois des IgM et des IgG, soit de phase chronique contenant des IgG), par des antigènes de tachyzoltes et de bradyzoïtes et/ou le cas échéant par des produits de traduction de ces antigènes, con- formes a la présente invention, de préférence préalablement - il - radiomarqués, puis dissociation des immunoprécipités formés, suivie d'une électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS- PAGE), d'une autoradiographie des gels et de leur révélation. Selon une modalité avantageuse de cette disposi- tion, un antigène de Toxoplasma gondii commun aux tachyzoltes et aux bradyzoltes, excrété-secrété par les tachyzoltes, iso- lé de manière appropriée, se caractérise par son poids molé- culaire d'environ 43KD, par le fait qu'il est de nature gly- coprotéique et par le fait qu'il est reconnu par des sérums anti-ES, par des sérums de souris anti-bradyzoXtes et par des sérums humains prélevés chez des malades. Selon une autre modalité de cette disposition, un antigène de Toxoplasma gondii commun aux tachyzoïtes et aux bradyzoïtes, excrété-secrété par les tachyzoïtes, isolé de manière appropriée, se caractérise par un poids moléculaire d'environ 25KD-24KD et par le fait que sa localisation dans les tachyzoïtes est confirmée par immunoprécipitation par les sérums anti-bradyzoltes. Conformément à l'invention, les antigènes de brady- zoïtes de Toxoplasma gondii sont isolés de kystes récupérés de broyats de tissus de mammifères, tels que souris notam- ment, infectés par la forme chronique de Toxoplasma gondii, lesquels kystes sont purifiés sur un gradient approprié, so- niqués puis broyés a l'état congelé et centrifugés pour re- cueillir un surnageant contenant les antigènes cytoplasmiques (fraction S1) et le culot dont on libère les antigènes mem- branaires (fraction S2) à l'aide d'un détergent approprié. La présente invention a également pour objet des produits de traduction d'ARNm de tachyzoïtes qui sont carac- térisés en ce qu'ils portent les épitopes reconnus par les antigènes ES de Toxoplasma gondii. Selon une disposition avantageuse de l'invention, ces produits de traduction sont obtenus par précipitation d'ARN à partir de lysats de tachyzoïtes centrifugés dont le - 12 - culot est extrait par des agents d'extraction appropriés pour précipiter 'ARN, purification des ARN messagers par sépara- tion des ARN poly A+ de 'ARN total par chromatographie, puis traduction in vitro des ARNm dans du lysat de réticulocytes en présence d'un mélange d'amino-acides dépourvu de.L- méthionine et comprenant la 35S-méthionine, en milieu tampon- né, et synthèse d' ADNc à partir de l'ARNm de tachyzoïtes précédemment obtenu, par action de la transcriptase reverse d'AMV, la banque d'ADNc ainsi formée étant ensuite criblée pour identifier les phages recombinants dont l'insertion d' ADNc dirige la synthèse d'une protéine ou fraction de pro- téine portant les épitopes reconnus par les anticorps anti-ES et y sélectionner les clones ES reconnus par des sérums hu- mains, les clones retenus étant caractérisés par sélection d'anticorps. La présente invention a également pour objet des sérums riches en anticorps IgE propres à conférer une protec- tion significative -contre la toxoplasmose et en particulier * contre les tachyzoltes, caractérisés en ce qu'ils sont obte- nus à partir d'animaux immunisés par des antigènes ES. La présente invention a en outre pour objet des an- ticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils sont produits par des cultures d'hybridomes résultant de la fusion de cellules d'animaux immunisés par les antigènes ES, avec des cellules tumorales. La présente invention a, de plus, pour objet des vaccins propres A procurer une protection significative con- tre la toxoplasmose, caractérisés en ce qu'ils contiennent en tant que constituant actif des anticorps polyclonaux ou mono- clonaux anti-ES. La présente invention a également pour objet des compositions thérapeutiques pour le traitement de la toxo- plasmose, caractérisées en ce qu'elles contiennent en tant que constituant actif, des antigènes ES, et plus particuliè- rement des antigènes ES présentant des épitopes et des déter- - 13 - minants communs aux tachyzoltes et aux bradyzoïtes. La présente invention a en outre pour objet des produits de diagnostic de la toxoplasmose, y compris de la toxoplasmose congénitale, caractérisés en ce qu'ils contien- nent en tant que constituants actifs, des antigènes ES. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exem- ples de préparation d'antigènes de Toxoplasma gondii, et plus particulièrement d'antigènes ES, de caractérisation de ceux- ci et de préparation d'anticorps anti-ES. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exem- ples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE i - Préparation d'antigènes d'excrétion-sécrétion des tachyzoites (antigènes ES) a) Conditions d'excrétion: La viabilité des parasites est évaluée par un test préalable de survie à l'érythrosine B: 30 microlitres de la suspension de tachyzoïtes et 30 microlitres d'une solu- tion d'érythrosine B A 4 milligrammes par millilitre en tam- pon PBS 0,01 M pH 7,2.sont mis en contact sur un bain de gla- ce pendant 5 minutes exactement avant observation microsco- pique. On détermine alors le pourcentage de tachyzoites vi- vants, respectés par le colorant et apparaissant réfringents, et de tachyzoltes morts, pénétrés par l'érythrosine et colo- rés en rose. Ce test de survie a permis d'établir que les conditions de survie optimales correspondent à une excrétion active, sans libération d'antigènes cytoplasmiques par lyse des parasites. Les antigènes ES sont obtenus en incubant pendant 3 - 14 - heures les tachyzoltes (à raison de 1,8 x 108 tachyzoïdes par tube de 1,5 millilitre de milieu d'excrétion) dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum décomplémenté d'origine hu- maine ou animale. La comparaison de la cinétique d'excrétion en présence de sérums de diverses origines a montré que les meilleurs résultats sont obtenus par ordre décroissant avec des sérums humains, de veau foetal, de lapin, de rat et de souris. Les antigènes excrétés en présence de cesdifférents sérums sont qualitativement identiques. A la fin des 3 heures d'incubation, une cen- trifugation A 2800 tours par minute pendant 10 minutes permet de séparer les surnageants contenant les antigènes ES. Ces surnageants sont ensuite filtrés sur membrane Millipore (0,22 pm) puis concentrés 10 fois par centrifugation à 5000 tours par minute pendant 40 minutes en tubes Centricon 10 (Ami- con). Ces préparations d'antigènes ES sont conservées par congélation à - 70 C après addition d'une solution d'inhibi- teurs de protéases présentant la composition suivante: - pour 100 ml de PBS 10 mM pH 7,2 = - Fluorure de Phénylméthylsulfonyl (PMSF) (Sigma): 100 M1 d'une solution A 40 mM dans l'éthanol absolu - N p Tosyl-L-lysinechlorométhylcétone (TLCK), (Sigma) = 7,3 mg - Acide Ethylène diamine tétraacétique, sel disodique (EDTA) (Prolabo) = 75 mg - N Tosyl-LPhénylalanine-chlorométhylcétone (TPCK) (Sigma) = 7 mg b) Marquage métabolique par la méthionine 35S: Après filtration sur membrane Nuclepore (3pm) et lavages en milieu RPMI, les tachyzoltes sont mis en sus- pension, à raison de 1,2.108 tachyzoïtes/ml dans du milieu RPMI 1640 sans méthionine ni cystine, contenant 10 % de sérum décomplémenté par chauffage A 56C pendant 30 minutes: ce 26 18680 - 15 - sérum a été préalablement dialysé une nuit à +4*C contre une solution de NaCl 9 0/oo et filtré sur membrane Millipore (0,22 Im). La suspension de tachyzoltes est répartie sous un volume de 1,5 millilitre dans des tubes à hémolyse placés à 37C et soumis pendant 30 minutes à une agitation douce. On ajoute ensuite au milieu de cette culture la méthionine marquée (225 microcuries par tube) et on réin- cube à 37'C sous agitation douce. Au bout d'une heure, on ajoute dans chaque tube 15 microlitres de méthionine et 15 microlitres de cystine froide du Kit RPMI (Difco) avant de replacer les tubes à 37'C sous agitation pendant 1 h.30. Après centrifugation à 2800 tours par minute, pendant 10 mi- nutes, on sépare pour les traiter différemment les surna- geants contenant les antigènes ES, des culots constitués des parasites entiers. Après filtration sur membrane Millipore (0,22pm), puis passage sur colonnes de Sephadex G25 M (PD 10 de Pharmacia) pour éliminer la méthionine libre, les surna- geants sont concentrés 10 fois par centrifugation à 5000 tours par minutes, pendant 40 minutes, en tubes Centricon 10 (Amicon). Les antigènes ES sont conservés par congélation à -70-C après addition d'inhibiteurs de protéases tels que décrits plus haut. c) Marquage des antigènes contenus dans le culot, par la méthionine 35S: Les culots obtenus ci-dessus sont lavés deux fois en PBS 0,01 M pH 7,2 et repris par de l'eau distillée avant d'être soumis à 6 cycles de congélation (en azote li- quide) et décongélation (en bain-marie à 37C) successifs. Une nouvelle centrifugation (2800 tours par minute pendant 10 minutes) permet de séparer les surnageants (contenant les antigènes cytoplasmiques), des culots, à par- tir desquels seront extraits les antigènes membranaires. L'extraction et la solubilisation des anti- 2 6 18 680 - 16 - gènes membranaires est obtenue par traitement au Nonidet P 40 ou au CHAPS( /(3 cholamido-propyl) diméthylammonio/-propane- sulfonate) (FLUKA), suivi d'une centrifugation à 5000 tours/mn pendant 30 minutes: les antigènes membranaires so- lubilisés sont contenus dans le surnageant. Les antigènes cytoplasmiques et membranaires sont conservés par congélation à -70*C en présence d'une so- lution d'inhibiteurs de protéases. d) Marquage des antigènes membranaires des tachy- zoOtes par 125I (Iodogen): La méthode de marquage utilisée est une modi- fication de la méthode utilisant 1'IODO-GEN décrite par HOWARD et Al.[ HOWARD, R.J., KAVSHAL, D.C., CARTER, R., J. PROTOZOOL., (1982) 22, 114 7. Les tachyzoïtes obtenus par lavages péritonéaux de souris infectées par la souche R.H. de T. gondii sont lavés deux fois par du PBS 0.01 M pH 7,2 après filtration sur filtres Nuclépore 3pm. On dissout 1 milligramme d'IODO-GEN (PIERCE Chemical co., Rockford, IL) dans 10 millilitres de chloro- forme et on transfère 625 microlitres de cette solution dans un tube en verre. On évapore alors le solvant sous courant d'azote et on ajoute 108 tachyzoïtes. Après 10 minutes de contact A 4 C avec 500 pc d'125I, on transfère le mélange dans un autre tube contenant du PBS 0,1 M, pH 7,2, NaI 10 mM pour arrêter la réaction. On lave ensuite trois fois les tachyzoïtes en PBS 0,1 M, pH 7,2. Les antigènes membranaires sont ensuite extraits par le Nonidet P40 ou le CHAPS EXEMPLE 2 - Préparation d'antigènes des bradyzo!tes: a) Production de bradyzoYtes; extraction des antigènes: Les bradyzoïtes, stade enkysté du toxoplasme, sont produits en infectant par voie intrapéritonéale des souris SWISS avec environ 30 kystes de la souche "chroniqueu 76 K de Toxoplasma gondii. Après 4 A 6 semaines, les souris infectées présentent de 1000 à 2000 kystes intracérébraux. 2618680u - 17 - Les kystes, récupérés A partir de broyats de cer- veaux de souris infectées, ont été tout d'abord purifiés sur gradient de gomme arabique, selon la technique de Nakabayashi et Motomura (1968). La technique d'extraction des antigènes des bradyzoltes- (présents dans les kystes) choisie est la suivante: les kystes sont soumis aux ultra-sons (quatre fois 1 minute), puis broyés à l'état congelé par 17 passages à la X-Presse. Après centrifugation à 32000 g pen-dant 2 heures a +4'C, le surnageant contenant les antigènes cytoplasmiques (fraction Si) est recueilli et le culot est traité par le dé- tergent CHAPS qui libère les antigènes membranaires (fraction S2). Les différentes étapes sont effectuées en présence d'une solution d'inhibiteurs de protéases. b) Marquage des antigènes des bradyzoïtes par 125I: Le marquage est réalisé suivant la technique de HUNTER & GREENWOOD (chloramine T) [(1962) Nature, London, 194, 495-496]. Les fractions Si et S2 (contenant de 250 a 500 lg de protéines) sont placées dans un faible volume de tampon phosphate de sodium 0,5 M final, pH 7,4 (300 à 400 Pi). La réaction de marquage est identique dans les deux cas: - addition de 500 pCi Na125I (Amersham) + 100 Pl d'une solution A 2 mg/ml de chloramine T (Merck) - incubation 1 min. 30 à température ambiante sous agitation douce - addition de 100 pl d'une solution A 4 mg/ml de métabi- sulfite de sodium (Prolabo) - dialyse sur une colonne PD10 (Pharmacia) contre du PBS pour éliminer l'Iode libre. 261u8680 - 18 - EXEMPLE 3 - Isolement par iminunoprécipitation et &lectro- phorèse SDS-PAGE, des antigènes ES présentant des épitopes communs aux tachyzottes et aux bradyzoltes s a) Immunisation par les antigènes d'excrétion- secrétion des tachyzoïtes: - Rats Fischer Immunisation par 4 injections sous-cutanées réalisées avec des intervalles de 10 à 14 jours. Produit injecté: antigènes ES obtenus a l'Exemple 1 correspondant A l'excrétion de 108 tachyzoltes sous un volume de 300 pl, additionnés de 300 pl d'adjuvant incomplet de Freund. - Souris Balb/C Immunisation par 4 injections sous-cutanées réalisées à 10 jours d'intervalle. Produit injecté: antigènes ES obtenus à l'Exemple 1 correspondant à l'excrétion de 0,5 x 108 tachy- zoïtes sous un volume de 100 pi, additionnés de 100 pi d'ad- juvant incomplet de Freund. - Lapins Les lapins ont été immunisés selon la techni- que de Vaitukaitis et A1./J. Clin. Endocr.(1971), 33, 988- 991/: 40 injections intradermiques sont réalisées avec 1 ml d'antigènes ES (correspondant a l'excrétion de 8.108 tachy- zoïtes additionnés d'l ml d'adjuvant complet de Freund) + 1 injection intramusculaire de 1 ml de vaccin anti-coquelu- cheux (Vaxicoq, Institut Mérieux). Des rappels avec 1/10e de la dose de départ sont réalisés toutes les trois semaines à partir de 1 mois par voie intra-musculaire. b) Immunisation par les antigènes des bradyzoltes: - Rats Fischer 4 injections sous-cutanées avec des interval- les de 10 à 14 jours. - Antigènes solubles (S1) 2618 68u - 19 - Par injection: environ 60 mg d'antigènes solubles (Sl) obte- nus à l'Exemple 2 dans 300 p1 de PBS 10mM pH 7,2 + 300 p1 d'adjuvant incomplet de Freund. - Antigènes membranaires (S2) Par injection: 130 pg d'antigènes membranaires (obtenus à l'Exemple 2) dans 300 pi d'adjuvant incomplet de Freund. - Souris Balb/C 4 injections sous-cutanées à 10 jours d'intervalle. - Antigènes solubles (S1) Par injection: 15 pg d'antigènes (obtenus à l'Exemple 2) dans 75 pi de PBS 10 mM pH 7,2 + 75 pi d'adjuvant incomplet de Freund. - Antigènes membranaires (S2) Par injection: 60 pg d'antigènes membranaires (obtenus à l'Exemple 2) dans 75 pi de PBS 10 nM pH 7,2 + 75 pi d'adju- vant incomplet de Freund. c) Immunisation par les antigènes de cerveau de souris Swiss (productrices des kystes): Un cerveau de souris Swiss a été broyé, puis soumis de la mê- me façon que les bradyzoïtes à 17 passages à la X-Press. L'immunisation de rats Fisher et de souris Balb/c par l'ex- trait soluble a été réalisée de la même façon qu'avec les antigènes Sl des bradyzoltes. d) Protocole d'infection de rats et de souris: Infection de rats Fischer Infection par voie intrapèritonéale par 105 ou 107 tachyzol- tes de la souche RH dans 500 pi de PBS 10 mM pH 7,2. Infection de rats Nu/Nu (cf SANTORO et al., (C.R. ACAD. SCI. (1987), 304, 297-300)] Infection de souris Balb/C Infection par voie intrapéritonéale à raison de 5 à 30 kystes de la souche "chronique' 76 K dans 250 pi de PBS 10 mM, pH 7,2. e) Sérums humains 741 sérums, recueillis au Laboratoire Saint- 2 618 68 0 - 20 - Camille à Lille, aux fins de diagnostic, ont été caractérisés par les tests sérologiques classiques: agglutination directe avant et après traitement par le mercapto-2-éthanol (techni- que de COUZINEAU) et immunofluorescence indirecte à l'aide d'un sérum de chèvre anti-immunoglobulines humaines G-A-1 (IPP réf. n', technique de WELLER et COONS) et d'un sérum de chèvre anti IgM humaines (IPP réf. n, technique de REMINGTON). Les Inventeurs ont ainsi répertorié 139 sérums "aigus", caractérisés par la présence d'IgM spécifiques re- connues par au moins deux méthodes sur les trois utilisées, 462 sérums "chroniques", dépourvus d'IgM spécifiques, et 140 sérums négatifs par toutes les techniques. f) Immunoprécipitation des antigènes f).l - Les échantillons sériques, préalable- ment stérilisés par filtration sur membrane Millipore (0,22 micromètre), sont aliquotes par 10 microlitres en tubes sili- conés (Eppendorf). On ajoute dans ces tubes 500 microlitres de tampon d'adsorption (Tris 10 mM, EDTA 2 mM, NaCl 0,15 M, Nonidet P40 0,5 %, contenant 100 unités Kallikréine d'aproti- nine par millilitre et ajusté à pH 7,4), puis la dose adé- quate d'antigène marqué calculée en fonction du nombre de cpm dans la préparation initiale (40 000 cpm pour les ES marqués à la méthionine 35S, 250 000 cpm pour les antigènes cytoplas- miques ou membranaires marqués A la méthionine 35S, 400 000 cpm pour les antigènes des tachyzoltes et des bradyzoltes marqués à 125I et 60 000 cpm pour les produits de traduction marqués à la méthionine 35S). On laisse ensuite en agitation à température ambiante pendant trois heures. f).2 - On prépare d'autre part une suspension de protéine A-Sépharose (Pharmacia): on laisse gonfler une heure le protéine A-Sépharose dans le tampon d'adsorption, à raison de 10 milligrammes de produit par échantillon a analy- ser. On répartit la suspension dans une nouvelle série de tu- 2 6 18680v - 21 - bes silicones qui sont séparés en deux groupes s le premier ne subit pas de manipulation dans l'immédiat et correspond aux échantillons pour lesquels la protéine A ne doit pas être prétraitée, tandis que le second correspond aux échantillons dans lesquels on veut capter, outre les anticorps de classe IgG qui se fixent d'eux-mêmes sur la protéine A, les anti- corps de classe IgM dont la capture nécessite un artifice. Les tubes de ce second groupe sont donc centrifugés (1000 tours pendant 1 minute) et le surnageant éliminé. On Ajouteau culot 200 microlitres de tampon d'adsorption et 50 micro- grammes d'un anticorps de classe IgG et de spécificité anti- IgM. La fixation de cet anticorps est assurée par un temps de contact d'une heure sous agitation a température ambiante. Les billes de protéine A-Sépharose sont ensuite lavées deux fois dans le tampon d'adsorption. Juste avant utilisation, les tubes des deux groupes sont centrifugés et le surnageant éliminé. On transfère dans ces tubes les immunoprécipités et on laisse en contact pendant une nuit à 4'C sous agitation douce. Un cycle de 8 lavages par 1 millilitre de tampon d'adsorption est alors effectué. On vérifie la qua- lité des lavages en mesurant la radioactivité du 8ème surna- geant; de nouveaux lavages sont effectués si celle-ci est trop élevée. On ajoute alors à tous les culots 60 microlitres d'un tampon TRIS 125 mM, SDS 3 %, saccharose 20 %, bleu de bromophénol 0,1 % et 0-mercaptoéthanol 20 %. Après agitation, les tubes sont soumis à deux ébullitions successives de 1 min. 30, séparées par un nouveau temps d'agitation énergique (Vortex). On centrifuge ensuite tous les tubes à 3000 tours par minute pendant 15 minutes et on transfère les surnageants contenant les immunoprécipités dissociés, dans une nouvelle série de tubes. On mesure sur 5 microlitres la radioactivité de chacun des surnageants, ce qui donne une idée approximative de la quantité piégée par les anticorps - 22 - sériques. L'ensemble des échantillons est alors soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide. f) Electrophorèse (SDS-PAGE) des immunopréci- pités et autoradiographie. Les électrophorèses en gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) ont été réalisés selon le protocole décrit par LAEMMLI [(1970) Nature (London) 256, 495-4977 dans un appa- reil à électrophorèse vertical BioRad. Les échantillons traités sont séparés dans un gel homogène de polyacrylamide 10 % (dimensions: 14 x 16 cm). L'électrophorèse s'effectue sous un courant de 7mA durant 16 à 18 heures dans un tampon TRIS-glycine pH 8,3 con- tenant 1 % de SDS. Après fixation des protéines par un mélange de méthanol et d'acide acétique, le gel est déshydraté sur papier Whatman (Amplify AMERSHAM). L'autoradiographie des gels se fait contre un film Kodak X-Omat RP et les films sont révélés après une exposition de 3 (antigènes marqués à 125I) à 6 (antigènes marqués A la méthionine 35S) jours A - 70'C. g) Calcul des masses moléculaires des antigènes. Les gels sont étalonnés grâce A un mélange de protéines précolorées de masse moléculaire connue (commercia- lisé par BRL, USA). on mesure la distance parcourue dans le gel par ces protéines au cours de l'électrophorèse. Les va- leurs obtenues permettent d'établir la droite d'étalonnage d = f(log MM) et donc de déterminer la masse moléculaire des protéines présentes dans les échantillons analysés. Les masses moléculaires des antigènes mention- nés dans le tableau qui va suivre représentent une moyenne établie à partir d'une trentaine de gels. 26 18680 - 23 - TABLEAU I ANTIGENES ES RECONNUS AU COURS DE LA TOXOPLASMOSE HUMAINE Masse moléculaire Spécificité 185 000 000 Reconnus au cours de la phase chronique 000 000. marqueur de la phase chronique "doublet"caracté- 98 000 > marqueur de la phase AIGUE* risant la phase chronique 84 000 marqueur transitoire de la phase chronique marqueur de la phase aiguë, 68 000 de spécificité moindre que la 95 kD car faiblement reconnue par les sérums négatifs *57 000 53 000 000 43 000 39 000 000 Reconnus au cours de la phase chronique 34 000 31 000 000 26 000 000 marqueur tardif de la phase chronique; 24 000. marqueur d'immunité protectrice 100 * La 98 kD, présente tout au long de l'évolution de la maladie, est le premier antigène étroitement spécifique à être reconnu. - 24 - EXEMPLE 4 - Mise en évidence de la reconnaissance des Antigènes ES par des sérums d'animaux. Des antigènes ES marqués à la 35S-méthionine (comme décrit à l'Exemple l. b) immunoprécipités par différents sérums d'animaux sont reconnus par ceux-ci comme indiqué dans le Tableau 2 ci-après. Dans ce Tableau, les chiffres soulignés correspondent à des bandes majeures. Les chiffres qui figurent dans ledit Tableau se rapportent aux masses moléculaires, en daltons, des antigènes ES reconnus. \ 2 618 680 - 25 - Tableau II BILAN DES ESA (S35Met) RECONNUS PAR DES SERuKS HUMAIN SOURIS SOURIS RAT RAT RAT NUDE Chronique Chronique anti-ES INFECTE Anti-ES INFECTE 000 185 000 185 000 000 170 000 170 000 170 000 000 155 000 155 000 98-105000 98-105000 / 98-105000 98-105000 98-105000 (doublet) 84 000 84 000 84 000 84 000 84 000 68 000 68 000 68 000 68 000 68 000 68 000 (faible) 000 62 000 62 000 57 000 57 000 56 000 55 000 55 000 53 000 53 000 000 45 000 45 000 43 000 43 000 42 000 42 000 42 000 39 000 39 000 39 000 000 35 000 35 000 35 000 35 000 34 000 34 000 34 000 34 000 34 000 31 000 31 000 31 000 31 000 31 000 (faible) 30 000 26 000 000 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000 (faible) 24 000 24 000 24 000 24 000 20 100 Antigènes membranaires majeurs des tachyzoltes (125I)reconnus par des sérums de rats et de souris immunisés par les antigènes ES 43 000 30 000 2 618 68 0 - 26 - EXEMPLE 5 - Induction d'anticorps de classe IgE et leur r8le dans la, tozoplasmose expérimentale du rat. Chez le rat Fischer normal, comme chez la plupart des h8tes mammifères non-immunocompromis, l'infection par Toxoplasma gondii induit une immunité permanente. Les mécanismes de la mémoire immunitaire.sont connus pour être T-dépendants et nécessitent pour être entretenus la persistance de formes enkystées (bradyzoites) cérébrales. Cependant, l'ensemble des mécanismes responsables de l'induction de cette immunité permanente sont mal connus. Chez le rat Fischer Nu/Nu, qui représente un modèle de terrain immunocompromis, 105 tachyzoltes de la souche RH de Toxoplasma gondii injectés I.P. sont suffisants pour tuer 100 % des animaux en 12 à 15 jours. Des rats Fischer de 10-12 semaines ont été infectés par 107 tachyzoïtes de la souche RH de Toxoplasma gondii. De façon à mieux cerner le r8le des antigènes excrétés/sécrétés (ES), les animaux ont été inoculés soit par des tachyzoïtes vivants, soit par des tachyzoïtes irradiés (10 000 rads délivrés en 10 mn), soit par des antigènes ES préparés comme décrit précédemment. L'augmentation du taux d'IgE spécifiques dans le sérum (mesuré par radioallergosorbent test ou RAST) et à la surface de certaines cellules sanguines (analysé par cytométrie de flux) a été suivie à intervalles réguliers. De plus, le pouvoir protecteur de ces IgE spécifiques a été étudié par transfert chez les rats immunodéprimés Nu/Nu avant infection par 105 Toxoplasma gondii. La figure 1 annexée montre la cinétique d'apparition des IgE sériques chez les rats Fischer normaux après différents traitements. Les tachyzoltes vivants induisent une réponse IgE spécifique. Cette réponse est extrêmement précoce et peut 26 1868 0 - 27 - être détectée dès le 7ème jour après l'infection. La réponse maximum est observée au 21ème jour. L'injection d'antigènes ES à des rats normaux entraîne également une réponse IgE significative. On peut noter que les antigènes ES induisent le même type de réponse mais moins intense. Néanmoins, après injection de rappel un mois après la première injection, l'augmentation des IgE spécifiques est beaucoup plus importante. On peut noter que l'utilisation d'adjuvants de la réponse IgE (Bordetella pertussis) avec les ES induit une augmentation significative des IgE au cours de la réponse primaire alors que l'injection de l'adjuvant seul n'entraîne pas de réponse spécifique. La figure 2 annexée montre le résultat des transferts des différents types de sérums chez les rats Fischer Nu/Nu. Tous les sérums utilisés ont été prélevés pendant la réponse primaire au 2e jour. Lorsque les animaux recoivent 2 ml de sérums riches en IgE spécifiques provenant de rats normaux infectés par des tachyzoïtes vivants ou immunisés par des antigènes ES, on peut noter que l'augmentation du délai de survie est significative par rapport aux animaux qui ont reçu des sérums provenant de rats immunisés par des tachyzoltes irradiés ou ayant reçu du sérum physiologique. Cette augmentation de survie est effectivement due aux IgE car leur dépletion par immunoadsorption ramène la durée de survie à des valeurs proches de celles des contrôles. La figure 3 annexée montre que des plaquettes provenant d'animaux infectés par des tachyzoltes vivants ou immunisés par les ES confèrent aux rats Nu/Nu le même type de protection que des sérums des animaux correspondants. On peut également noter que les plaquettes provenant d'animaux immunisés par des tachyzoltes irradiés ne protègent pas significativement les rats Nu/Nu. 2 61868o0 - 28 - La figure 4 annexée montre que la cinétique d'apparition des IgE à la surface des plaquettes est comparable A celle des IgE sériques. Les taux d'IgE à la surface des plaquettes varient suivant le type d'antigène utilisé de la même façon que les IgE sériques. Le délai de survie est dose-dépendant et une dose de 5 x 107 cellules est suffisante pour entraPner une protection significative. La protection conférée par les plaquettes apparaît être liée A des phénomènes de type antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC). En effet (cf. figure 5 annexée), on peut observer que des plaquettes provenant d'animaux normaux infectés par des tachyzoïtes vivants ou immunisés par des ES, mais non par des tachyzo tes tués, sont capables de détruire des tachyzoltes in vitro. Les mécanismes de cette destruction ne sont pas encore élucidés. EXEMPLE 6 - Réponse humorale contre les antigènes ES au cours des phases aiguë, subaiguë et chronique de la toxoplasmose humaine. Technique utilisée: radioimmunoprécipitation et analyse des immunoprécipités en SDS-PAGE (gel de polyacrylamide 10 %). Antigènes: antigènes ES, cytoplasmiques et membranaires des tachyzoltes marqués par la méthionine 35S. Sérums utilisés: sérums humains prélevés au cours des différentes périodes de la maladie: aiguë, subaiguë, chronique. Les résultats obtenus sont représentés A la figure 6 annexée. - Les antigènes ES marqués ont été immunoprécipités par des sérums humains prélevés: en phase aiguë (piste 1) 30. en phase subaiguë (piste 2) en phase chronique (pistes 3 et 4) et par des sérums négatifs (pistes 7 et 8). - Des antigènes cytoplasmiques (extrait soluble de tachyzoltes lysés par l'eau) et membranaires (extraits par le NP40) ont à titre comparatif été immunoprécipités par des - 29 - sérums chroniques: piste 5: antigènes cytoplasmiques piste 6: antigènes membranaires - Les premiers antigènes qui sont reconnus sont les antigènes 68 et 98 KD, présents en phases aiguë et subaiguë (partie A) - En période chronique (partie B), les sérums de patients reconnaissent des antigènes de masse approximative 105, 84, 57, 45, 39, 35, 25 et 24 KD. La bande 105 KD forme avec la bande 98 KD un doublet' spécifique de la phase chronique. EXEMPLE 7 - Mise en évidence (après marquage par 125I) d'un antigène 43 KD commun aux tachyzoites et aux bradyzoites,excrété-sécrété par les tachyzoXtes. Antigènes immunoprécipités: - extrait membranaire de tachyzoltes marqué par 125I (Iodo-Gen) - antigènes solubles de bradyzoltes (Sl) marqués par 125I (chloramine T) - antigènes membranaires de bradyzoltes (S2) extraits par le CHAPS, puis marqués par 125I (chloramine T). Sérums utilisés: - sérum de lapin immunisé par les antigènes ES - sérum de souris Balb/C immunisée par les antigènes membranaires (S2) des bradyzoltes - sérum de souris Balb/C immunisée par des antigènes de cel- lules de cerveau de souris Swiss (les bradyzoites, prove- nant de souris Swiss, sont contaminés par des cellules de cerveau). Les résultats obtenus sont représentés à la figure 7 annexée: Pistes 1 et 2: Immunoprécipitation par un sérum de lapin anti-ES: - d'antigènes membranaires de tachyzoltes (piste 1) - d'antigènes membranaires (S2) de bradyzoYtes (piste 2) Pistes 3 à 5: Immunoprécipitation par un sérum de souris 2618 68 0 - 30 - Balb/C anti-bradyzoites (fraction S2) - d'un extrait membranaire de tachyzoïtes (piste 3) - d'un extrait soluble (fraction S1) de bradyzoltes (piste 4) - d'un extrait membranaire (fraction S2) de bradyzoltes (piste 5) Pistes 6 à 8: Immunoprécipitation par un sérum de souris Balb/C anticerveau - d'un extrait soluble (Sl) de bradyzoïtes (piste 6) - d'un extrait membranaire (S2) de bradyzoïtes (piste 7) - d'un extrait membranaire de tachyzoltes (piste 8). L'antigène 43 KD des tachyzoltes et des bradyzo tes reconnu par les sérums anti-ES et anti-bradyzoïtes l'est également par les sérums humains. L'antigène d'environ 55 KD, reconnu par les sérums de souris anti-cerveau ne semble pas spécifique des bradyzoïtes. EXEMPLE 8 - Mise en évidence (après marquage par la Met 35S) d'un antigène d'environ 25 KD commun aux tachyzoites et aux bradyzoltes, excrété-sécrété par les tachyzoltes. - Antigènes immunoprécipités (marqués par la méthionine 35S) - Antigènes ES - Antigènes cytoplasmiques des tachyzoïtes (fraction H20) - Antigènes totaux des tachyzoïtes (traitement par le CHAPS des parasites entiers). - Sérums utilisés - sérums de souris Balb/C immunisées par les antigènes solubles (S1) ou membranaires (S2) des bradyzoïtes - sérum de souris Balb/C immunisées par un extrait de cellules de cerveau de souris Swiss sérum de rats Fischer immunisés par les antigènes solubles (Sl) ou membranaires (S2) des bradyzoïtes. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 8 annexée. - Pistes 1 à 3: Immunoprécipitation par un sérum de souris Balb/C antibradyzoltes (fraction S2) - 31 - - d'antigènes ES (piste 1) - d'antigènes cytoplasmiques (fraction H20) des tchyzoîtes (piste 2) - d'antigènes totaux (fraction CHAPS) des tachyzoltes piste 3). - Pistes 4 à 6: Immunoprécipitation par un sérum de souris Balb/C anti-bradyzoltes (fraction Si) - d'antigènes ES (piste 4) d'antigènes cytoplasmiques des tachyzoites (piste 5) - d'antigènes totaux des tachyzoltes (piste 6). - Pistes 7 à 9: Immunoprécipitation par un sérum de souris Balb/c anticellules de cerveau de souris Swiss - d'antigènes ES (piste 7) d'antigènes cytoplasmiques des tachyzoltes (piste 8) - d'antigènes totaux des tachyzoltes (piste 9). - Pistes 10 a 12: Immunoprécipitation par un sérum de rat Fischer antibradyzoltes (fraction S2) - d'antigènes totaux de tachyzoïtes (piste 10) d'antigènes cytoplasmiques de tachyzo tes (piste 11) - d'antigènes ES (piste 12). EXEIPLE 9 - Mise en évidence de la nature glycoprotéique de l'antigène 43 KD. Les antigènes de surface des tachyzoYtes marqués par 125I (Iodo-Gen) ont été absorbés sur ConA-Sepharose ou sur WGA-Ultrogel en procédant comme suit: La fixation sur lectines a été réalisée suivant le protocole décrit par COLMAN et A1. [(1981) EUR. J. BIOCHEM., 113, 339-3483 Tampon de couplage 150 mM NaCl 0,7 mM MgC12 1 mM dithiothreitol 0,7 mM MnCl2 0,7 mM CaCl2 0,05 % sodium dodécyl sulfate 2 618 680 - 32 - mM Tris/HCl, pH 7,5 Lectines: Concanavaline A: ConA-Sepharose (Pharmacia) Wheat germ agglutinine = WGA-Ultrogel (IBF) Antigènes: 1) extrait membranaire (NP40) de tachyzoYtes marqués par I (Iodogen) 2) extrait H20 de tachyzoltes marqués par la méthionine 35S 3) extrait membranaire (CHAPS) de tachyzoltes marqués par la méthionine 35S. Technique utilisée Les réactions sont effectuées dans des tubes Eppendorf. - Addition à 150 il d'extrait 1) ou à 200 pl des extraits 2) et 3) de: 1 ml de tampon de couplage - 250 pil de gel (ConA-Sepharose ou WGA-Ultrogel) pré équilibré dans le tampon de fixation. Après 15 mn de contact à température ambiante avec des agitations fréquentes, les tubes sont centrifugés. Le surnageant contient les antigènes non retenus. Le culot est ensuite lavé 3 fois dans le tampon de couplage, puis extrait par 3 x 200 p1 de tampon de couplage contenant soit 0,4 M de O-Méthyl-A-D-mannopyranoside (IBF), dans le cas de la fixation sur Concanavaline A, soit 0,2 M de N-acétyl-glucosamine (Sigma) dans le cas de la WGA. Ces trois extractions successives constituent les éluats 1, 2 et 3. La radioactivité est comptée dans les divers échantillons, puis les antigènes non traités, les fractions non retenues et les éluats (1+2) sont immunoprécipités par différents sérums. Les antigènes de départ ainsi que les fractions retenues sur les deux lectines (éluats) ont été immunoprécipités par un sérum de lapin sain et un sérum de lapin anti-ES. La figure 9 montre: - pistes 1, 3 et 5: Immunoprécipitation par un sérum de lapin anti-ES. - pistes 2, 4 et 6: Immunoprécipitation par un sérum de lapin sain. 2 6 18680 - 33 - - pistes 1 et 2: antigènes membranaires de tachyzoltes, avant traitement. - pistes 3 et 4: éluat ConA-Sépharose (antigènes fixés). - piste 5 et 6: éluat WGA-Ultrogel. Les pistes 3 et 5 montrent que l'antigène 43 kD se fixe sur la concavaline A et (faiblement) sur la WGA (agglutinine de germe de blé), démontrant ainsi sa nature glycoprotéique. EXEmPLE 10 - Préparation des produits de traduction des ARNs messagers de tachyzoltes. a) Extraction de l'ARN total: On utilise la méthode de AUFFRAY et ROUGEON /(1980) Eur. J. Biochem, 107, 303/. Les tachyzoltes sont lysés par l'addition (10 fois le volume du culot parasitaire) d'une solution de LiCl 3M, Héparine 200 Mg/ml; acétate de Na 10 mM, pH 5; SDS 0,1 %. Après homogénéisation au Potter et conservation à + 4 C toute la nuit pour précipiter les ARNs, le lysat est centrifugé à 16 300 g pendant 40 minutes à + 4-C. Le culot est lavé deux fois par resuspension dans une solution de LiCl 4M, Urée 8M, puis de nouveau centrifugé à 16 300 g pendant 40 minutes à + 4 C. Le culot est ensuite dissous dans de l'H20 RNAse-free. Cette solution est amenée à 0,1 M en acétate de sodium pH 5, SDS 0,1 %, pour être extraite successivement par un volume de phénol saturé en H20, par un volume de phénol-chloroforme. La phase aqueuse est finalement amenée à 0,2 M en acétate de sodium pH 5 pour précipiter 'ARN par 2,5 volumes d'éthanol absolu à - 20-C pendant une nuit. b) Purification des ARNs messagers: On utilise la méthode de ARNEMANN et A1. [(1977), Nucl. Acids Res. 4, 4023-4026]. Cette méthode consiste à séparer les ARNs poly A+ de 'ARN total par 2 chromatographies successives sur oligo (dT) cellulose. 2 18680 - 34 - c) Traduction in vitro des ARNs m dans le lysat de réticulocytes de lapin rPELHAM et JACKSON, (1986), Eur. J. Biochem, 67, 2473. Les ARNs m (0,5 mg) sont traduits dans 30 p1 de lysat de réticulocytes (N150 AMERSHAM), en présence d'acétate de potassium (110 mM), d'acétate de magnésium (lnmM), d'un cocktail d'aminoacides sans L-méthionine (50 mM) et de 50 pCi de 35S méthionine (AMERSHAM). d) Immunoprécipitation des produits de traduction L'immunoprécipitation est réalisée comme décrit à l'Ex. 3-d) ci-dessus; brièvement, après incubation de produits de traduction (60 00Ocpm) avec les sérums (10p1), les immuncomplexes sont adsorbés sur 10 mg de protéine A-Sépharose (Pharmacia), puis élués pour être analysés en SDS-PAGE CLAEMMLI, 1970, NATURE, 227, 680). EXEMPLE 11 - ITmmunoprécipitation des produits de traduction d'ARNm de tachyzoYtes. Les ARNm sont préparés par la méthode décrite à l'Exemple 10 ci-dessus (pistes 1 et 3 de la figure 11 annexée) ou par la méthode de CHIRGWIN et A1. [(1978) Biochemistry, 18, 5294-5299] (pistes 2 et 3 de la figure 11). Cette figure montre également les profils des produits de traduction immunoprécipités par le sérum humain de la phase chronique de l'infection (pistes 3 et 4). Les produits de traduction 24 kD, 37 kD et 80 kD reconnus par les deux sérums sont indiqués par une flèche. L'immunoprécipitation des produits de traduction par une série de sérums humains des phases chronique et aiguë est en outre représentée comparativement à la figure 12 anne- xée; en particulier leur immunoprécipitation: - par une série de sérums humains de la phase chronique (IgG) (pistes 1, 3, 4, 5, 6), - par un sérum humain en fin de phase aiguë (IgG + IgM) (piste 2), - par un sérum humain négatif (piste 7). - 35 - La reconnaissance des produits de traduction 24 kD et 37 kD par tous les sérums chroniques est symbolisée par une flèche. Ces deux antigènes ne sont pas reconnus par le sérum de la phase aiguë. EXEMPLE 12 - Caractérisation de l'antigène 24 kD. Mise en évidence de la nature protéique de l'antigène 24 KD. Un extrait total de tachyzoftes (extraction CHAPS) marqués par la méthionine 35S a été adsorbé sur ConA-Sépharose ou sur WGA-Ultrogel. L'extrait de départ ainsi que les éluats des deux lectines ont été immunoprécipités par un sérum de lapin anti-ES. Les résultats obtenus sont représentés A la figure A annexée. Aucun antigène marqué par la méthonine 35S n'a été retenu sur WGA. Piste 1: Immunoprécipité de l'extrait total de tachyzoltes, Piste 2: Immunoprécipité de l'éluat ConA-Sépharose. Certains antigènes (notamment ceux de masse environ 170 kD, 39 kD et 25 kD) ont des groupements glycosylés qui se fixent à la Concanavaline A. L'antigène 24 kD n'est par contre pas retenu. Figure 10B: cette figure met en évidence l'identité de masse moléculaire entre l'antigène ES de 24 kD et le produit de traduction majeur des ARNm de tachyzoïtes. Piste 1: Immunoprécipitation d'antigènes ES marqués par la méthionine 35S, par un sérum de souris anti-ES. Piste 2: Immunoprécipitation des produits de traduction marqués par la méthionine 35S par un sérum de lapin anti-ES. Etant donné d'une part la nature protéique de l'antigène 24 kD (Fig. 10A) et, d'autre part, sa migration voi sine de celle du produit de traduction, l'identité des deux molécules est fortement présumée. 2 618 68 0 - 36 - EXEMPLE 13 - Immnocompétition entre les produits de traduction du tachyzolte et l'antigène bradyzolte extrait au SDS 2 % vis-à-vis d'un sérum de lapin anti-ES. Cette immunocompétition est représentée à la figure 13 annexée dans laquelle: - la piste 1: Immunoprécipitation des produits de traduction en présence de 50 pg d'extrait de bradyzoltes. - la piste 2: Immunoprécipitation des produits de traduction en présence de 50 mg d'extrait de S. mansoni. - la piste 3: Immunoprécipitation des produits de traduction seuls. L'antigène bradyzolte est capable de diminuer la fixation des produits de traduction 24 KD et 37 KD par des anticorps anti-ES. D'autre part, une étude à visée diagnostique a été réalisée à l'aide d'une sérothèque de 350 sérums bien caracté- risés dont certains ont été prélevés au cours des différentes phases de la toxoplasmose et montrent une séroconversion d'autres, plus tardifs, permettent le suivi de la réponse anti- corps; d'autres encore, correspondant à des "couples" maman- bébé, ont été prélevés pendant les périodes pré-, péri- et post-natales. L'immunoprécipitation par ces sérums des antigènes ES (marqués par la méthionine 35S) a permis d'établir la cinétique d'apparition des anticorps et de mettre notamment en évidence: - que les sérums de phase aiguë (IgM) reconnaissent les antigè- nes ES de façon beaucoup plus intense que les antigènes somati- ques ou membranaires; - que deux antigènes ES, de masse environ 98000 et 68000, reconnus de façon majeure et très précoce, pourraient être uti- lisés comme marqueurs de séroconversion; - que d'autres antigènes, reconnus de façon beaucoup plus tar- dive, notamment celui de masse 24000, semblent au contraire constituer de réels marqueurs de l'immunité dans la toxo- plasmose. - 37 - Cet antigène de masse 24000, qui ne semble pas glycosylé (pas de fixation sur la Concanavaline A et le WGA) semble corres- pondre au produit de traduction d'ARN de tachyzoïtes de masse 24. Ce produit de traduction est en effet &galement immunopré- cipité par les sérums tardifs d'infection humaine et non par les sérums précoces (IgM+IgG). * EXEMPLE 14 - Clonage des produits de traduction. a) Préparation de la banque d'ADNc à partir de l'ARm de tachyzoltes La synthèse de l'ADNc est réalisée selon la mé- thode de GUBLER et HOFFMAN ((1983) GENE, 25, 263]. Le premier brin d'ADN complémentaire est synthétisé par l'action de la transcriptase reverse de AMV. L'ADN, rendu double brin par l'action conjointe de la RNAse H et de la polymérase I, est ensuite traité à la T4 DNA polymérase pour rendre ses extré- tés franches. Après méthylation par l'enzyme EcoRI méthylase, on ajoute des "linkers" EcoRI aux extrémités des ADNc par l'action de la T4 DNA ligase. Les ADNc sont ensuite digérés par l'enzyme EcoRI et sont purifiés par chromatographie sur une colonne ACA34 (0,2 x 0,30 cm) [WATSON, C.J. et JACKSON, J.F. (1985) In Glover DM ed.: "DNA cloning" vol. I. A practical approach: Oxford, Washington: IRL Press, p. 49]. On insère ensuite les ADNc (500 à 7000 pb) dans le site EcoRI du phage GTll (HUYNH et Al.; (1985) In Glover D.M., ed. "DNA Cloning' vol. I. A practical approach: Oxford, Washington: IRL Press, p. 497. Après ligation, les phages recombinants sont empaquetés in vitro. Une banque de 3x106 phages est ainsi constituée. b) Criblage de la banque et sélection des candidats ES' Le dérivé du phage GTll permet l'expression de gènes étrangers sous le contr8le du promoteur Lac, après fusion de l'ADNc avec le gène de la B-galactosidase de E. coli (Young and Davis, 1983). - 38- Un échantillon de la banque en GTll est inoculé sur la souche de E. coli Y1090 à une dilution représentant 1.104 phages/boîte de 90 mm de diamètre. L'induction de l'expression de la protéine sous contr8le du promoteur Lac est déclenchée à 42C en présence d'isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Les protéines synthétisées sont absorbées sur filtre de nitrocellulose pour être incubées en présence d'anticorps de lapin anti-ES (obtenus comme décrit i l'Ex. 3.a) ci-dessus). Les anticorps fixés sont détectés par un second anticorps anti-IgG de lapin marqué à la péroxydase; ce complexe est ensuite révélé par une coloration avec le 4 chloro-l-naphtol en présence de H202. Cette détection permet d'identifier les phages recombinants dont l'insertion d' ADNc dirige la synthèse d'une protéine ou fraction de protéine portant les épitopes reconnus par les anticorps anti-ES. Une première sélection a conduit à l'isolement de 100 clones (ES). Après purification, 20 d'entre eux ont été recriblés différentiellement par deux sérums humains (voir figure 7): un sérum IgG18 reconnaissant les produits de traduction de 24 et 37 kD; l'autre IgG20 ne les reconnaissant pas. 3 clones ES8, ES10 et ESll sont isolés pour leur reconnaissance par le sérum IgG18. c) Caractérisation des clones ES8, ES1O, ESll par sélection d'anticorps La méthode de sélection d'anticorps utilisée est celle décrite par Olmsted C1981), J. BIOL. CHEM., 226, 11955. Un échantillon de chaque clone est inoculé sur la souche Y1090 de E. coli à raison de 104 à 105 phages/botte de mm de diamètre. L'induction de l'expression est réalisée à 42'C, en présence d'IPTG et les protéines synthétisées sont absorbées sur filtres de nitrate de cellulose. Les filtres sont incubés 2 618680u - 39 - avec un sérum de lapin anti-ES (1/125) pendant 3 heures à la température ambiante. Après 3 lavages, les anticorps fixés spécifique- ment aux protéines de fusion sont décrochés en présence de tam- pon glycocolle-HCl pH 2,8; 0,1 M; NaCl 0,15 M pendant 3 minutes. La solution est rapidement neutralisée par du Tris 1M. Les anticorps sélectionnés sont concentrés sur 10 mg de protéine A-Sépharose (Pharmacia) et utilisés pour l'immu- noprécipitation des produits de traduction. Les anticorps sélectionnés par les protéines de fusion des 3 clones reconnaissent le produit de traduction 24 kD, ainsi que cela ressort de la figure 14 annexée qui représente l'immunoprotection des produits de traduction par des anticorps sélectionnés par les clones ES8, ES10 et ESll. Piste 1: Anticorps d'un sérum de lapin anti-ES sélectionnés par le clone ESil. Piste 2: Anticorps d'un sérum de lapin hyperimmun sélection- nés par le clone ESll. Piste 3: Anticorps d'un sérum de lapin anti-ES sélectionnés par le clone ES10. Piste 4: Anticorps d'un sérum de lapin anti-ES sélectionnés par le clone ES-8. EXMDPLE 15 - Sous-clonage des inserts' des clones ES 8, 10 11 dans le vecteur pUC13 1) Obtention de l'ADN phagique ( GT11) Les bactériophages correspondant à chacun des clones sont adsorbés sur E. coli Y1090 20 minutes à température ambiante. L'incubat est ensuite étalé sur des bottes d'agarose en présence d'ampicilline (à raison de 20.000 pfU/boîte). Après une nuit à 37*C, les bactériophages sont élués dans ddu SM (NaCl 100 mM; MgSO4 7H20 8mM; Tris 50 mM pH 7,5; Gélatine 0,01 %). L'éluat est d'abord traité au chloroforme puis par 2 618680 - 40 - de la DNAase et de la RNAase (1 pg/ml) pour éliminer les cons- tituants bactériens. Les phages sont ensuite précipités dans du PEG 10 % et NaCl 1,25 M a 4'C. Une ultracentrifugation A l'équilibre en gradient de CsCl est effectuée pendant 24 heures A 108.000 g (Beckman L8 70 rotor SW 55 Ti). La bande phagique est récupérée à l'aide d'une aiguille et la solution de phages est dialysée deux fois pen- dant 1 heure contre du Tampon Tris 10 mM pH 7,4; MgCl2 20 mM NaCl 0,15 M. L'ADN phagique est ensuite obtenu par traitement au Tris HC1 10 mM, EDTA 1 mM et SDS 0,1 % et purifié par une extraction au phénol/chloroforme. Les "inserts" sont ensuite séparés de l'ADN phagique par une digestion EcoRI et migration sur gel d'agarose à bas point de fusion 1,2 %. Après coloration du gel dans une solution de bromure d'éthidium (10 pg/ml), les fragments de digestion, sont visualisés aux ultraviolets. On peut ainsi déterminer selon la distance de migration la taille des différents "inserts": l'insert ES8 est de 900 paires de bases, l'insert ES10 est de 1900 paires de bases, l'insert ESll est de 1300 paires de bases. Les "inserts" sont ensuite extraits de l'agarose par la technique du "GENECLEAN" (BiolOl). 2) Sous-clonage dans pUC13 Le plasmide pUC13 (PHARMACIA) linéarisé par digestion EcoRI possède des extrêmités 5'phosphorylées pour minimiser la recirculation du plasmide. La réaction de ligation entre le pUC13 et l'insert est effectuée en utilisant 1 unité d'ADN ligase du phage T4 (Genofit). Le rapport molaire vecteur/insert doit être de l'ordre de 1. Le mélange de ligation est ensuite utilisé pour la transformation de la souche E. coli JM103, selon la méthode classique de HANAHAN (J. Mol. Biol. , (1983), 166, 553]. Les cellules transformées sont étalées sur des boites de LB agar en présence d'ampicilline, de XGal et d'IPTG. Les colonies blanches sont celles qui ont intégré les 2618680u - 41 - plasmides recombinants. Pour chacun des clones ES8, ES10 et ESll, nous avons sélectionné une colonie blanche: pUC13 ES8.10, ES10.2,ES 11.7. Carte de restriction des 3 clones pUC13 ES 8.10, ES 10.2, ES 11.7 1) Préparation de l'ADN plasmidique Cette -étape permet de séparer l'ADN plasmidique de l'ADN bactérien. Elfe est réalisée par centrifugation en gradient isopycnique de CsCl selon la méthode de BULHER et TREICH (telle que mise en oeuvre au Service de Biochimie). 2) Digestion par les endonucléases L'ADN plasmidiqẻ purifié est ensuite digéré par dif- férentes enzymes de restriction (EcoRI, AccI, PsTI, PvUII et SacI). Après analyse des fragments de digestion sur gel d'aga- rose 1,2 %, les cartes de restriction des trois inserts ont été établies et représentées à la figure 15 annexée qui montre le sous-clonage des inserts des 3 clones de TG, ES 8.10 (900 pb), ES 10.2 (1900 pb), ES 11.7 (1300 pb) dans le site EcoRI du vec- teur plasmidique pUC13 (2700 pb). Dans cette figure, A = AccI, E = EcoRI, P = PstI, Pv = PvuII, S = SacI. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre,de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. 2 618 680 - 42 - REVENDICATIONS 1') Antigènes de Toxoplasma gondii (TG) caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des antigènes d'excrétion-sé- crétion (ES) des tachyzoltes de TG. 2') Antigènes ES isolés des tachyzoïtes, selon la Re- vendication 1, caractérisés en ce qu'ils constituent un groupe d'antigènes dont les 20 majeurs qui ont été détectés, présen- tent des poids moléculaires respectifs de 185KD, 170KD, 155KD, KD, 98KD, 84KD, 68KD, 57KD, 53KD; 45KD, 43KD, 39KD, 35KD, 34KD, 31KD, 30KD, 26KD, 25KD, 24KD et 20KD environ. 3') Antigènes ES selon la Revendication 2, caractéri- sés en ce que les antigènes de poids moléculaires 185KD, 170KD, KD, 105KD, 57KD, 53KD, 45KD, 43KD, 39KD, 35KD, 34KD, 31KD, KD, 26KD, 25KD et 24KD sont reconnus au cours de la phase chronique. 4*) Antigène ES selon la Revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène de poids moléculaire 105KD est identifié comme un marqueur dé la phase chronique. ') Antigène ES selon la Revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène de poids moléculaire 84KD est identifié comme un marqueur transitoire de la phase chronique. 6e) Antigène ES selon la Revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène de poids moléculaire 24KD est identifié comme un marqueur tardif de la phase chronique, également mar- queur d'immunité protectrice. 7') Antigène ES selon la Revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène de poids moléculaire 98 KD est identifié comme un marqueur de la phase aiguë. 8') Antigène ES selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène de poids moléculaire 68 KD est. identifié comme un marqueur de la phase aiguë, cependant moins spécifi- que que l'antigène 98 KD. 9') Antigènes selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisés en ce qu'ils sont isolés de surna- geants recueillis après incubation d'une suspension de tachy- 2 618680 - 43 - zoOtes de Toxoplasma gondii pendant environ 3 heures dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum décomplémenté d'origi- ne humaine ou animale, et centrifugation, puis ultrafiltration des surnageants recueillis, éventuellement suivie d'une étape de concentration et d'une nouvelle étape de centrifugation, ainsi que d'un traitement de congélation à -70'C, lesquels antigènes ES sont capables d'induire une réponse humorale pro- tectrice contre la toxoplasmose. e)- Antigènes de TG caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des antigènes des bradyzoltes de Toxoplasma gondii. 11*) Antigènes de TG selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 9, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des antigènes communs aux tachyzoYtes et aux bradyzoltes de Toxoplasma gondii. 12') Antigène selon la revendication 11, caractérisé par son poids moléculaire d'environ 43 KD, par le fait qu'il est de nature glycoprotéique et par le fait qu'il est reconnu par des sérums anti-ES, par des sérums de souris anti-bradyzol- tes et par des sérums humains prélevés chez des malades. 13-) Antigène selon la revendication 11, caractérisé par un poids moléculaire d'environ 25KD-24KD et par le fait que sa localisation dans les tachyzoltes est confirmée par immuno- précipitation par les sérums anti-bradyzoltes. 14e) Antigènes selon l'une quelconque des revendica- tions 11 à 13, caractérisés en ce qu'ils sont identifiés par immunoprécipitation de sérums de mammifères, notamment de sé- rums humains ou animaux, reconnus comme séropositifs (soit de phase aiguë contenant des IgM spécifiques, soit de phase sub- aiguë contenant à la fois des IgM et des IgG, soit de phase chronique contenant des IgG), par des antigènes de tachyzoltes et de bradyzoltes et/ou le cas échéant par des produits de tra- duction de ces antigènes, de préférence préalablement radio- marqués, puis dissociation des immunopré-cipités formés, suivie d'une électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), d'une 2 618 68 0 - 44 - autoradiographie des gels et de leur révélation. ') Antigènes de TG selon l'une quelconque des re- vendications 10 à 14, caractérisés en ce qu'ils sont isolés de kystes récupérés de broyats de tissus de mammifères, tels que souris notamment, infectés par la forme chronique de Toxo- plasma gondii, lesquels kystes sont purifiés sur un gradient approprié, soniqués puis broyés A l'état congelé et centrifugés pour recueillir un surnageant contenant les antigènes cyto- plasmiques (fraction S1) et le culot dont on libère les anti- gènes membranaires (fraction S2) à l'aide d'un détergent appro- prié. 16') Produits de traduction d'ARNm de tachyzoïtes ca- ractérisés en ce qu'ils portent les épitopes reconnus par les antigènes ES de Toxoplasma gondii. 17e) Produits de traduction d'ARNm de tachyzoïtes ca- ractérisés en ce qu'ils sont obtenus par précipitation d'ARN à partir de lysats de tachyzoïtes centrifugés dont le culot est extrait par des agents d'extraction appropriés pour précipiter l'ARN, purification des ARN messagers par séparation des ARN poly A+ de 'ARN total par chromatographie, puis traduction in vitro des ARNm dans du lysat de réticulocytes en présence d'un mélange d'amino-acides dépourvu de Lméthionine et comprenant la 35S-méthionine, en milieu tamponné, et synthèse d' ADNc à partir de l'ARNm de tachyzoites précédemment obtenu, par action de la transcriptase révèrse d'AMV, la banque d' ADNc ainsi for- mée étant ensuite criblée pour identifier les phages recombi- nants dont l'insertion d'ADNc dirige la synthèse d'une pro- téine ou fraction de protéine portant les épitopes reconnus par les anticorps anti-ES et y sélectionner les clones ES reconnus par des sérums humains, les clones retenus étant caractérisés par sélection d'anticorps. 18') Sérums riches en anticorps IgE propres à confé- rer une protection significative contre la toxoplasmose et en particulier contre les tachyzoltes, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'animaux immunisés par des antigènes ES - 45 - selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 19') Anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils sont produits par des cultures d'hybridomes résultant de la fu- sion de cellules d'animaux immunisés par les antigènes ES, avec des cellules tumorales. >) Vaccins propres à procurer une protection signi- ficative contre la toxoplasmose, caractérisés en ce qu'ils con- tiennent en tant que constituant actif des anticorps poly- clonaux ou monoclonaux anti-ES, selon l'une quelconque des Re- vendications 1 à 17. 21>) Compositions thérapeutiques pour le traitement de la toxoplasmose, caractérisées en ce qu'elles contiennent en tant que constituant actif, des antigènes ES selon l'une quel- conque des revendications 1 à 17, et plus particulièrement des antigènes ES présentant des épitopes et des déterminants com- muns aux tachyzoïtes et aux bradyzoïtes. 22-) Produits de diagnostic de la toxoplasmose, y compris de la toxoplasmose congénitale, caractérisés en ce qu'ils contiennent en tant que constituants actifs, des antigè- nes ES selon l'une quelconque des revendications 1 a 17. 23>) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il con- tient un inserat d' ADNc de tachyzoltes qui dirige la synthèse d'une protéine ou d'une fraction de protéine portant un ou des épitopes reconnus par les anticorps anti-ES. 24') Vecteur recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il porte l'information génétique nécessai- re a la synthèse d'une protéine ou d'une fraction de protéine portant un ou des épitopes reconnus par les anticorps anti-ES, selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 25') Plasmides recombinants selon la revendication 24, caractérisés en ce qu'ils dirigent la synthèse de l'anti- gène 24 KD et ont été déposés sous les Ne 1-675, 1-676 et 1-677 en date du 16 Juillet 1987 auprès de la CNCM. 26') Plasmides recombinants selon la Revendication 25 reconnus par des sérums humains contenant des IgG, isolés par - 46 - criblage et sélection par des moyens appropriés. 27') Produit de diagnostic selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend l'antigène ES 105 KD pour le marquage de la phase chronique d'une infection par TG. 28*) Produit de diagnostic selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend l'antigène ES 98 KD pour le marquage de la phase aiguë d'une infection par TG. 29') Produit de diagnostic selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend l'antigène ES 24 KD pour le marquage de l'immunité protectrice.