Brevet FR2614315A2 — publié le 19881028

FR 2614315 A2 19881028 FR 8705691 A 19870422 La présente addition concerne la mise en évidence d'une activité enzymatique de glutathion-S-transférase de la protéine P28 recombinante. Les glutathion-S-transférases sont des enzymes très largement distribuées, présentes aussi bien chez les végétaux que chez les animaux et qui jouent un rôle dans la détUxifi- cation de diverses molécules (composés électrophiles hydrophobes, superoxydes endogènes, agents alkylants, herbicides ...). Le travail de Smith et al. (1986) montre que le parasite Schistosoma japonicum synthétise une glutathion-Stransférase qui pourrait jouer un rôle dans la protection du parasite contre les radicaux libres produits par les cellules effectrices de l'immunité de l'hôte infecté. La présente addition concerne plus particulièrement. la mise en évidence d'une activité de glutathion-S-transférase de la protéine P28 dérivée du Schistosoma mansoni et synthétisée dans E. coli ou S. cerevisiae, et dont l'intérêt comme antigène vaccinal a été montré dans le brevet principal. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'application d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 du brevet principal à titre d'agent présentant une activité glutathion-S-transférase telle que la protéine P28. La présente addition concerne également l'application des cellules selon l'une des revendications 9 à 12 à titre d'agent présentant une activité glutathion-S-transférase. Ces protéines et ces cellules peuvent être utilisées comme agent de conversion dans un procédé de conversion microbiologique mettant en oeuvre une activité glutathion-Stransférase. Exemple 1 L'activité glutathion-S-transférase a été mise en évidence dans les extraits de E. coli TGE90l/pTG54 et de s. cerevisiae TGY2spl3b/pTG2800 exprimant la protéine P28 de Schistosoma mansoni (pTG2800 ne diffère du pTG1894 décrit dans le brevet principal que par une délétion de 170 pb dans la région promoteur du gène ura3). Les cultures sont centrifugées et les culots sont remis en suspension dans du tampon (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT). Les levures sont broyées avec des billes de verre les bactéries sont traitées aux ultra-sons. Les extraits sont centrifugés pour éliminer les débris cellulaires et l'activité est mesurée dans le surnageant (selon les techniques pu bliées. par t*Ioore et al. 1986 et Habig et al. 1974). On mélange, dans une cuvette à spectrophotomètre, de 40 à 100 ul d'extrait brut, 10 41 de réactif CDNB 100 mM (1 chloro-2,4 dinitrobenzène en solution dans l'éthanol 100 %) eut 1 ml de KH2PO44 100 mM (pH 6.5)/glutathion réduit 2,5 mM. On a utilisé, comme témoin positif, de la glutathion S-transférase de rat (fournie par Sigma) à une concentration finale de 9 g et 6 g par test. On a utilisé, comme témoins négatifs, un extrait de E. coli TGE901/pTG959 portant un vecteur sans séquence P28 et un extrait de S. cerevisiae TGY2spl3b et TGY2spl3b/pTG84S, portant un vecteur sans séquence P28. Tous les extraits de bactéries et de levures sont ajustés à une concentration en protéines totales de 0,33 mg/ml. Une couleur jaune apparait.dans les cuvettes où existe une activité glutathion-transférase. Le changement de D.O. est mesuré au spectrophotomètre à 340 nm, toutes les minutes pendant 15 minutes. Les résultats présentés dans la figure l montrent que les extraits de E. coli et S. cerevisiae qui contiennent la protéine P23 recombinante présentent une forte activité glutathion-S-transférase. Sur la figure 1, les courbes représentées sont les suivantes - GT de foie de rat (# 9 g .6 ssg) - extraits bruts de E. coli, témoin (o) et TGE901/pTG54 par un plasmide vecteur (h) et TGY2sp13b/pTG2800 (+) REFERENCES Habig, W.H., Pabst, M.J. & Jakoby, W.B. J. Biol. Chem. 249, 7130 (1974). Moore, R.E., Davies, M.S., O'Connell, K.M., Harding, E.I., Wiegand, R.C. & Tiemeier, D.C. Nucl. Ac. Res. 14, 7227 (1986). Smith, D.B., Davern, R.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G. & Mitchell, G.F. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 83, 8703 (19.86) REVENDICATIONS I) Application d'une protéine selon l'une des revendications I à 5 du brevet principal à titre d'agent présentant une activité glutathion-Stransférase. 2) Application selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine p28. 3) Application des cellules selon l'une des revendications 9 à 12 du brevet principal à titre d'agent présentant une activité glutathion-Stransférase. 4) Procédé de conversion microbiologique mettant en oeuvre une activité glutathion-S-transférase, caractérisé en ce qu'on utilise à titre d'agent de conversion une protéine selon l'une des revendications l et 2 ou une cellule selon la revendication 3.