Brevet FR2612930A1 — publié le 19880930

La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux, ainsi que leur application, notamment à titre de sondes permettant la détection d'une séquence définie d'ADN ou d'ARN. Les composés chimiques selon la présente invention sont constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides possédant la configuration anomérique non naturelle a par opposition à la configuration anomérique naturelle ss. Ainsi sont représentés par les formules (a) et (b) respectivement des nucléosides a et ss (a) et (b) représentent des nucléosides, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotides. L'emploi d'oligonucléotides naturels ss comme sonde, c'est-à-dire dans toutes applications faisant intervenir leur appariement avec une séquence d'oligonucléotides complémentaire à des fins pharmacologiques est connu. Cependant, l'emploi d'oligonucléotides naturels ss se heurte à certaines difficultés. Une première difficulté réside dans le fait qu'il est nécessaire de prévoir des séquences suffisamment longues pour que ces séquences d'hybrident avec leur séquence cible complémentaire, de manière suffisamment stable. Pour réduire cette longueur, il est necessaire d'adjoindre à l'oligonucléotide, comme l'ont proposé pour la première fois C. HELENE et ses collaborateurs, une chaîne portant un agent intercalant, tel l'acridine. Ces molécules se fixent plus fortement sur leurs séquences complémentaires, grâce à l'excès d'énergie produit par l'intercalation de la tête covalente dans l'hybride formé. Une deuxième difficulté majeure de l'utilisation d'oligonucléotides naturels ss consiste en la fragilité métabolique de nombreuses séquences oligonucléotidiques vis-à-vis de certaines enzymes. Or, on sait que tous les organismes vivants contiennent de nombreuses nucléases souvent très actives. Comme il est montré par la suite, les composés, selon la présente invention, comportent des séquences d'oligonucléotides a qui permettent de pallier à ces inconvénients. En effet, ils offrent la propriété intéressante de s'apparier de manière parallèle avec une séquence d'oligonucléotides ss naturels complémentaire, alors que deux séquences a complémentaires ou deux séquences ss complémentaires s'apparient anti-parallèlement, et cet appariement parallèle est beaucoup plus stable. En outre, ces oligonucléotides a manifestent une résistance très élevée aux enzymes, notamment aux nucléases. Dans ces conditions, de multiples utilisations à finalités biologiques et même pharmacologiques déjà connues pour les oligomères ss peuvent être envisagées et ceci avec plus d'efficacité. Parmi les composés, selon la présente invention, il faut donc citer plus particulièrement les composés oligomères a de formule dans laquelle les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique a non naturelle les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O un thioanion S # , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle;; R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-z Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi avec U = O, N ou S. ou bien un radical -Y"-O-Y'- où Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y E peut avoir les mêmes significations que X ; J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy Z est un radical correspondant à un agent effecteur n est un nombre entier y compris O L représente un atome d'oxygène un atome de soufre ou un groupe -NH-. Dans cette formule I, on utilise la représentation condensée des nucléosides suivante qui correspond à la formule développée sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5'). I1 convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de nucléotides qui peuvent être identiques ou différents, n indiquant simplement le nombre de nucleotides compris dans la molécule ; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence encore entre 1 et 25. Les radicaux effecteurs correspondent à des agents effecteurs qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques. Il s'agit par exemple des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN. Ces agents d'intercalation sont, en général, constitués par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroline, la phénanthridinium, les prophyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a : 3', 2'-d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés. Ces agents effecteurs peuvent aussi être des radicaux chimiques réactifs tels que des radicaux chimiques de scission, c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une chaîne de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique. Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, des dérivés de composés tels que l'acide éthylène-diamine-tétracétique, 1' acide diéthylène-triamine-pentaacétique, les porphyrines, la 1,10-phénanthroline , le psoralène et autres groupes aromatiques absorbant les radiations du proche U.V. et du visible. Ces groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur, induisent des cououres dans des sequences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage. Le radical B est constitué par une base d'un acide nucléique liéeà la partie sucre du nucléotide par une configuration anomérique a. Ce peut être la thymine, l'adénine, la cytosine, la guanine ou l'uracile. Mais il est également possible d'utiliser des bases d'acides nucléiques modifiées, notamment halogénées ou azidées, par exemple la 5-bromo-uracile ou la 8-azidoadénine ; ou des dérivés aminés comme la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, par exemple sur le N6 par un groupe aminoalkylène ou par un groupe azido6 phénylalkylène ; ou la guanine substituée sur le O par exemple par un groupe (U-alkylène)-9-acridine ou la 8-(U-aminoalkyl)-amino-adénine et ses dérivés substitués sur le NH2 en U par un groupe acridine. Selon la présente invention, sont donc considérées les bases usuelles, ainsi que la possibilité d'introduction de bases modifiées. Des bases "effectrices", susceptibles de se lier par covalence à un brin ss complémentaire, pourront être introduites. Ainsi, la fonctionnalisation de C ou T par un groupement aziridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2 -CH2 entre les deux brins complémentaires sur respectivement G et A. Donc, plus particulièrement, le radical B est choisi parmi la thymine, l'adénine, la cytosine, la guanine, la 4-azido-cytosine ou la 4-azido-thymine et la 8-azido-adénine, l'uracile, la 5 bromo-uracile. Le radical X, bien qu'il représente de préférence un oxoanion, peut avoir d'autres significations lorsque le radical X représente un groupement alkyle, il s'agit de préférence d'un groupement alkyle inférieur en C1 à C7 et, par exemple, les groupements éthyle, méthyle ou propyle ; lorsque le radical X représente un groupe alcoxy, il s'agit de préférence d'un groupement alcoxy inférieur en C1 à C7, par exemple e groupement méthoxy ou éthoxy ; lorsque X représente un groupement amino-alkyle ou amino-alcoxy, il peut s'agir d'un groupement amino-alkyle mono-substitué, disubstitué ou bien d'un radical amino sous forme de sel d'ammonium quaternaire.Dans ces conditions, les substituants sont, de préférence, des radicaux alkyles inférieurs comme définis précédemment ; quant à la chaîne alkyle ou alcoxy reliant le radical amino au phosphore, il s'agit de prference d'une chaîne droite ou ramifiée comportant de 1 à 10 atomes de carbone. Lorsque le radical alkyle ou alcoxy est substitué par un hétérocycle azoté, il s'agit notamment de cycle saturé à 5-6 chaînons comportant un atome d'azote qui peut être quaternaire. Enfin, lorsque le radical X est un radical thioalkyle, il s'agit de préférence d'un radical thioalkyle inférieur, c'est-à-dire qui comporte entre 1 et 7 atomes de carbone. Le radical -alk- est-de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone. En particulier, à partir des fonctions alcool terminales 3' ou 5' de l'oligomère a, l'effecteur peut donc être introduit via une chaîne (CH2) liée à une fonctionnalisation Z' de natures diverses à la partie osidique de l'oligomère. A partir de la formule 31 ou -O-Z'-(CH2)n-effecteur (Z) 51 on obtiendra, selon ce que représente Z', par exemple @ un phosphate ou méthyl phosphonate de formule ou CH3 U = O, N ou S un éther de formule générale 3' ou - O @ CH2 # # CH2#n-1 Z 51 , un ester de formule générale -O# CO # CH2#n Z ou encore @ un carbamate de formule générale -O #CO NH # CH2#n Z La présente invention concerne également les composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et les composés sous forme racémique, ou sous forme d'isomères R ou S optiques purifiés ou en mélange. La présente invention concerne également les composés précédents dans les séries D ou L. En fait, tout l'intérêt des composés selon la présente invention, constitues d'une chaîne d'oligonucléotides a, est de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles substances oligonucléotides assurent la reconnaissance de la séquence d'acide nucléique complémentaire avec une stabilité très accrue ; la fonction de l'agent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n'est plus obligatoire. Cependant, un agent intercalant augmentera encore la stabilité du complexe dthyDridation et un groupe réactif conduira par activation à une hydrolyse de la chaîne d'acide nucléique complémentaire ; ce système permettant donc de couper avec une grande efficacité une chaîne d'acides nucléiques en un site préalablement choisi. Les composés selon l'invention, par leur grande affinité spécifique pour les séquences nucléiques complémentaires, sont donc supérieurs aux oligonucléotides actuels dont l'affinité pour les séquences complémentaires est beaucoup plus faible. Les composés, selon la présente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mais également comme composants de purification pour des séquences déterminées d'ADN ou d'ARN. Ces composés peuvent également être utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efficace. L'objet de la présente invention est également l'application de ces composés pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites). Les composés de la présente invention, par leur propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acides nucléiques en ce site, sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences. Ils peuvent être utilisés comme réactifs en biologie moléculaire ou en génie génétique. Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à titre de médicaments. Les composés selon la présente invention peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on applique des synthèses au phosphodiester, au phosphotriester, au phosphoramidite ou à l'hydrogénophosphonate classiques pour des anomères B. Pour la méthode au phosphotriester, les dérivés anucléotides de guanine sont éventuellement protégés en position o 6 par un groupe supplémentaire, de préférence de N, N-diphénylcarbamoyl. Dans les procédés, on prépare tout d'abord la chaîne de nucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenir les produits recherchés. Ce procédé a permis d'obtenir, pour la première fois, des oligonucléotides a comprenant toutes les bases usuelles. Cette approche permet d'obtenir des oligonucléotides a de longueurs désirées. Les composés de l'invention peuvent également être préparés par des méthodes semi-synthétiques, en particulier en utilisant des fragments d'ADN ou d'ARN préparés par des méthodes de génie chimique sur lesquelles sont ensuite fixés des agents effecteurs. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. L'exemple V est illustré par les figures 1 et 2. Les résistances aux enzymes nucléase S1 et phosphodiesterase respectivement, pour les anomères a et ss sont représentées. EXEMPLE I: Synthèse d'&alpha;-[d(CATGCG)] et a-Ld(CGCATG); par une méthode au phosphotriester en solution améliorée (voir schémas I et II ci-après) Les deux hexadéoxyribonucléotides non naturels a-[d(CATGCG)l et &alpha;-[d(CGCATG)] comprenant seulement des unités de nucléotide à configuration anomérique &alpha; ont été obtenus par un procédez au phosphotriester en solution amélioré . Les produits de départ étaient les 4-soxyribonucléosides3a-d (voir schéma I ci-après). Les a-désoxynucléosides 3a et 3b (pyrimidine) ont été préparés par des réactions d'autoanomérisation suivi des protections sélectives des groupes hydroxyles, tandis que les deux déoxynucléotides 3c et 3d (purine) ont été préparés par des réactions de transglycosylation. Dans le cas des dérivés a-nucléoside de guanine un groupe supplémentaire protégeant la base a été introduit en position O dans le but d'éviter des réactions secondaires pendant l'assemblage de l'oligonucléotide. Ce groupe était le N,N-diphénylcarbamoyle. La N-benzoyl-4 di-O-acétyl-3',5' désoxy-2' cytidine a été choisie comme donneur de sucre et a été mise en réaction avec l'adénine protégée en N et la guanine protégée en N en présence d'un acide de Lewis le triméthylsilyle trifluorométhanesulfonate, dans de l'acétonitrile à 700C. Après avoir fait réagir le donneur de sucre avec la N-benzoyl-6 adénine l'anomère a 1c, en dépit du fait qu'il était le produit nucléosidique majo ritaire, n'était pas séparé de l'anomère correspondant ss. En conséquence, ce mélange anomérique a été traité avec de l'ammoniac méthanolique et de l'a désoxy 2' adénosine (2c) a été obtenu dans un rendement de 27 % après purification par chromatographie sur colonne Dowex 1. Ensuite, le dérivé (2c) a désoxy-2' adénosine a été converti dans le dérivé (3c) 6-N-benzoylé dans un rendement de 70 %. De la même manière, la réaction de trans glycosylation a été tentée avec le N-acétyl-2 guanine. Toutefois, des rendements très faibles de dérivés nucléo sidiques de la N-acétyl-2 guanine ont été obtenus, vrai semblablement à cause de la faible solubilité de ces déri vés dans des solvants organiques. Un meilleur rendement en îd a été obtenu lorsque l'on utilise dans la réaction de transglycosylation le composé N-palmitoyl-2 guanine qui est plus lipophile. Après 50 mn de réaction à 700C, une analyse TLC du mélange de réaction indiquait la formation d'isomères N-7 comme produits majoritaires. En poursuivant le chauffage, une transformation douce des isomères N-7 en isomères N-9 a été observée après 6 heures de chauffage. Le dérivé a-désoxy guanosine îd recherché a été isolé dans un rendement de 26,6 % après chromatographie sur colonne de gel de silice et par cristallisation fractionnée. La fonction lactame énolisable des restes guanine perturbe la synthèse d'oligodésoxynucléotide par la méthode phosphotriester à cause de réactions secondaires des fragments guanine qui entraînent une baisse de rendement dans l'élongation des chaînes contenant de la guanine. Il est donc nécessaire de protéger la fonction lactame de la guanine. Le N,N-diphénylcarbamoyle a été choisi comme groupe protecteur de la position o6. Il peut être facilement introduit en une étape sur le dérivé de départ îd et peut être éliminé à la fin de la synthèse au phosphotriester, sans étape de déprotection supplémentaire. La réaction entre le chlorure de diphénylcarbamoyle et la diisopropyléthylamine et le produit la dans de la pyridine suivie par une addition d'hydroxide de sodium aqueux, fournie après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice du Npalmitoyl-2 0-diphénylcarbamoyl-6 a-désoxy-2' guanosine (3d) sous forme de composé cristallin dans un rendement de 77 %. Ensuite, la conversion des produits 3c et 3d; dont seule la base est protégée, dans les nucléotides-a 4c et 4d entièrement protégés correspondants (schéma II ci-après) a nécessité un protocole en deux étapes incluant une tritylation sélective de l'hydroxyle 5' par du chlorure diméthoxy-4,4' trityl (1,5 équivalent molaire) et une phosphorylation de l'hydroxyle-3' avec du (chloro-2-trityl-4 phényl) (cyano-2 éthyl) phosphate de triéthylammonium (1,1 équivalent molaire), du chlorure de mésitylènesulfonyle (2,2 équivalent molaires) et du méthyl-1 imidazole. Cette dernière étape permet d'introduire le chloro-2-trityl-4 phényle comme groupe protecteur de phosphate.Grâce à ses propriétés lipophiles, ce groupe protecteur a été choisi pour faciliter la purification et accroître les rendements des intermédiaires entièrement protégés pendant la synthèse d'oligonucléotides selon la méthode au phosphotriester en solution. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice, les deux dérivés nucléotides a 4c et 4d ont été isolés sous forme de mélanges diastéréoisomériques respectivement dans des rendements de 92 et 53 %. Comme les deux hexa-mères cibles présentent une guanine terminale en 3' dans leur séquence de base, la seule unité terminale en 3' pour leurs synthèses est le dérivé O-benzoyl-3' a-déoxy guanosine 5d. La diméthoxytritylation sélective de 3d, suivie par une benzoylation et une détritylation fournit le dérivé 5'-OH 5d dans un rendement global de 81 %. La synthèse des oligodésoxynucléotides a entièrement protégés a-Ed(CATGCG)j et a-Ld(CGCATG)3 a été accomplie par la répétition d'un cycle de synthèse consistant essentiellement en trois étapes principales. L'étape (a) est une déprotection de l'hydroxyle 5' par traitement d'un nucléotide ou d'un oligonucléotide intermédiaire entièrement protégé avec de l'acide benzènesulfonique 2 % dans un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol (7/3) à OOC pendant 15 à 40 mn. L'étape (b) est la déprotection du phosphodiester 3' par élimination du groupe cyanoéthyle à partir d'un nucléotide ou d'un oligonucléotide entièrement protégé, avec de la ter-butylamine 10 % dans de la pyridine anhydre pendant 15 à 25 mn. L'étape (c) est la condensation entre les produits de l'étape (a) et de l'étape (b) (-10 à 15 % dans un excès molaire) en présence d'un agent de couplage : le 1-(mésitylène-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4- triazole suivi par la purification des produits par chromatographie sur colonne de gel de silice.Les conditions et résultats des réactions de couplage sont résumés dans le tableau suivant. A) a-d(CATGCG) composante composante durée ren 3'-phosphodlaster 5'-hydroxy MSNT (mmol) (mm) Produit dem (mmol.) (mmol.) Dmtr-Ap#p HO-T#p-Cne 0,38 45 Dmtr-A#pT#p-Cne 90 (0.152) (0.1381 Dmtr-C#T#p HO-AE#pT##p-Cne 0,35 40 Dmtr-C##pA##pT##p-Cne 92 (0,138) (0,124) Dmtr-C##p HO-G#-Bz 0,35 50 Dmtr-C##pG-Bz 95 (0.137) (0.125) Dmtr-G##p HO-C##pG#-Bz 0,33 70 Dmtr-G##pC##pG#-Bz 89 (0,131) (0.119) Dmtr-C##pA##pT##p HO-G##pC##pG#-Bz 0,57 60 Dmtr-C##pA##p#T#pG##pC##pG#-Bz 97 (0.113) (0.096) B) a-s(CGCATG) composante composante durée ren 3-phosphodlester 5'-hydroxyl MSNT (mmol) (mm) Produit dement (mmol.) (mmol.) Dmtr-C##p HO-C##p-Cne 0,39 55 Dmtr-C##pC##p-Cne 80 (0.154) (0.1401 Dmtr-C##p HO-G##pC##-Cne 0,31 60 Dmtr-C##pG##pC##p-Cne 96 (0.124) (0.1121 Dmtr-T##p HO-G#-Bz 0,34 45 Dmtr-T##pC-Bz 95 (0,137) (0,125) Dmtr-A##p HO-T##pG#-Bz 0,28 60 Dmtr-A##pT##pG#-Bz 90 (0,112) (0,102) Dmtr-C##pG##pC##p HO-A##pT##pC#-Bz 0.54 45 Dmtr-C##pG##pC##pA##pT##pG#-Bz 100 (0.108) (0.082) a abréviations : Dmtr : diméthoxy-4,4' trityl, C* : N benzoyl-4 &alpha; désoxy-2' cytidine, T* : &alpha; thymidine, A* : N-benzoyl-6 a désoxy-2' adénosine, G* : N palmitoyl-2 0-diphényl-6 carbamoyl a désoxy-2' guanosine, p : chloro-2 trityl-4 phénylphosphate, MSNT : 1-(mésitylène-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4 triazole, Cne : 2-cyanoéthyl, Bz : benzoyle. Au cours du processus d'élongation des oligonucléotides a entièrement protégés, aucune différence marquante (durée de réaction, formation de produits secondaires, etc.) n'a été détectée par rapport à celui des oligonucléotides ss naturels. En d'autres termes, aucun effet anomérique notable n'est apparu par la méthode phosphotriester. La déprotection totale des hexa-mères a protégés a été effectuée comme suit : traitement des 6-mères a entièrement protégés avec du Nl,Nl,N3,N3- tétraméthylguanidinium, 2-pyridine-carboxaldoximate 1M dans un mélange dioxanne-eau (7/1, v/v) à 700C pendant 24 heures, puis avec de l'ammoniaque concentré aqueux. Il a résulté de ce traitement l'élimination simultanée des groupes diphénylcarbamoyle et des groupes chloro-2trityl-4 phényle, et des groupes benzoyle et palmitoyle. Les oligonucléotides 5'-diméthoxytrityl résultants ont été ensuite traités avec de. l'acide acétique pendant 15 mn à température ambiante. Ensuite, on a effectué une purification par chromatographie sur colonne à échange d'ion. Les deux oligonucléotides a déprotégés a-Ed(CATGCG)] et c'-Ed(CGCATG)] ont été obtenus dans des rendements respectifs de 59 et 52 %. Ainsi, la méthode au phosphotriester en solution a pu être appliquée avec succès à la synthèse d'oligonucléotides a contenant les quatre bases usuelles. Le schéma I ci-après reproduit la synthèse des quatre dioxy-2' nucléosides a ayant leur base protégée (sauf T). Les conditions réactionnelles étaient les suivantes pour les différentes étapes de (a) à (h). Synthèse d'a-nucléosides protégés : conditions de réactions. (a) trifluorométhanesulfonate de triméthylsilyle N,O-bis (triméthylsilyle) acétamide/acétonitrile (b) méthoxyde desodium/méthanol ou hydroxyde de sodium aqueux/eau/tétrahydrofuranne /métiianol (c) trifluorométhanesulfonate de triméthylsilyle, N,O-bis(triméthylsilyle)acétamide, 6-N-benzoyl adénine/acétonitrile (d) ammoniaque méthanolique (e) chlorure de triméthylsilyle/pyridine, chlorure de benzoyle, solution concentrée d'ammoniaque (f) trifluorométhanesulfonate de triméthylsilyle, N,O bis(triméthylsilyle)acétamide, N-palmitoyl-2 guanine/ acétonitrile (g) chlorure- de diphénylcarbamoyle/pyridine (h) hydroxyde de sodium aqueux/éthanol. Ro)É a RO Â;É b HO la B:; TCbz -o Co ! Rg Abz A e o 8 , I I rT t À I P ss = n Rss HO pal pa,dpc JL pal dpc + 9-'4- anomer I C t 2d m1 n i el E L cl o c E o e m o c > OAU X O O ts7 > O 07N u c O T: Thymine. Cbz: 4-N-Benzoylcytosine. Abz: 6-N-Benzoyladenine. Gpal,dpc: 2-N-Palmitoyl-6-0-diphenylcarbamoylguanine. Schéma I Le schéma II ci-après reproduit la synthèse des quatre désoxy-2' nucléosides a, ayant leur base protégée (sauf T). Les conditions réactionnelles étaient les suivantes dans les étapes (a) à (d) (a) chlorure de diméthoxy-4,4' trityle/pyridine (b) (trityl-4 chloro-2 phényl) (cyano-2 éthyl) phosphate de triéthylammonium/chlorure de mésitylène-2 sulfonyle (c) chlorure de benzoyle/pyridine (d) acide benzènesulfonique 2 %/chlorure de méthylène méthanol (7:3, v/v). Abz: 6-N-Benzoyladenine Gpal,dpc: 2-n-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoyl- 5d B = Gpal,dpc guanine Tr: Triphenylmethyl Schéma II 1) Préparation de l'a désoxy-2' adénosine (2c) (schéma I) Ce composé a été préparé comme décrit par T. Yamaguchi et Cal. dans Chem. Pharm. Bull. 32, 1441 (1984). On a obtenu ce composé dans un rendement de 27,3 % pour un point de fusion de 212,5 - 2130C. 2) Préparation dela N-benzoyl-6 a désoxy-2' adénosine (3c) (schéma II) En utilisant un procédé en trois étapes simi laires à celui décrit pour les anomères ss correspondants par exemple dans Journal Amer. Chem. Soc., 104, 1316 (1982), ce produit a été préparé à partir de (2c) (2,01 g , 8 mmoles). A la fin de la troisième étape c'est-à-dire après traitement avec l'ammoniaque aqueux pèndant 30 mn suivi de l'évaporation, le résidu a été dissous dans de l'eau (200 ml). La solution a été lavée avec de l'éther diéthylique (2 x 70 ml) et évaporée jusqu'à siccité. Le résidu restant a été mélangé avec du méthanol (50 ml) puis filtré, et le filtrat a été évaporé jusqu'à siccité. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne gel de silice (100g). Les fractions appropriées ont été combinées et évaporées.Le résidu a été cristallisé à partir d'éthanol-acétone. La filtration a donné 1,99 g (70 %) de 2. Le point de fusion est 163-1640C. Les résultats analytiaues étaient les suivants : Anal. calc. pourc17H17O4N5 : c. 57.46; n, 4.82; N, 19.71;obtenu : C, 57.30: H, 4.56; N, 19.75. UV #maxH2O (nm(#)): 280 (21.500); #maxpH2.1 (nm(#)): 253 (10.900), 284 (24.000), [&alpha;[D20 + 59@ (c=1, DMF). 1H-NMR (DMSO-d6) @ 2.44 (m,1H,H2"); 2.8 (m, lH,H2'); 3.49(m,2H,H5, and H5#); 4.21 (m,1H,H4,); 4.37 (m,1H,H3,); 4.86 (t,1H,OH5,); 5.54 (d,1H,OH3,); 6.50 (dd,1H,H1., J-2.58 et 7.57 Hz); 7.52-8.06 (m,5H,Ar-N); 8.69 det 8.74 (2s,2H,H2 et Hg); 11.14 (br s,1H,NH). Les spectres RMN du proton ont été obtenus sur un appareil Bruker WBUM 360. 3) Préparation de la Di-O-acétyl-3',5' N-palmitoyl-2 a désoxy-2' guanosine (id) (schéma I) Du bis-triméthylsilylacétamide (7,4 ml, 300 mmoles) a été ajouté à une solution de di-O-acétyl3',5' N-benzoyl-4 désoxy-2' cytidine (15 g, 36 mmoles) et N-palmitoyl-2 guanine (37,4 g, 96 mmoles) dans de l'acétonitrile anhydre (220 ml). Le mélange a été chauffé à 700C pendant une heure et du triflate de triméthylsilyle (8 ml, 47 mmoles) a été ajouté. Le mélange a été agité à 700C pendant six.heures. Le solvant a été éliminé à pression réduite et le résidu a été dissous avec du chlorure de méthylène (750 ml). De l'hydrogènocarbonate de sodium aqueux froid (70 ml) a été ajouté et après agitation vigoureuse, le mélange a été filtré par aspiration. La couche organique a été séparée et séchée avec du sulfate de sodium anhydre et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu (Rf 0.44 et 0.57, silica gel TLC, CH2Cl2-CH3OH 9:1, v/v) a été chromato graphité sur colonne silica gel (250 g) en utilisant des proportions croissantes (0-5 %) de méthanol dans le chloroforme comme éluant. Des fractions contenant de la matière avec un Rf de 0,44 (isomères N-9 a et ss ) ont été réunies et évaporées jusqu'à siccité. Le résidu a été dissous dans de l'éthanol chaud et refroidi, l'anomère ald a été cristallisé pour donner 5,655 g (26,6 %) de cristaux incolores ; point de fusion 129-1300C. Anal. Calc. pourC30H47N5O7: c, 61.10; H, 8.03; N, ll.Bs;Obtenu C, 60.96; H, 8.19; N, 12.06. UV #max @@@ (mn(#)); 258 (18.300); 279 (13,900). [&alpha;]D20 + 19@ (c = 1, DMF) 1H-MHR (CDCl3) # 0.86 (t,3H, (CH2)14-CH3); 1.20-1.40 (m, 24H,-(CH2)12-CH3); 1.71 (m,2H, C(=o)-CH2-CH2- ; 2.03 et 2.1 (2s,6H,2CH3-C(=o)-); 2,48 (t,2H, C(=)-CH2-(CH2)13-); 2.56 (m,1H,H2@); 2.84 (m,1H,H2,); 4.18-4.28 (m,2H,H5, et H5@); 4,52 (m,1H,H4,); 5.28 (m,1H,H3,); 6,23 (dd,1H,H1.,J=1,89 et 7.47 Hz); 7.92 (s,1H,H8); 8.77 et 12 (2br s,2H,2 NH). 4) Préparation de la N-palmitoyl-2 O-diphénylcarbamoyl 6 a désoxy-2' guanosine (3d) (schéma I) Du chlorure de diphénylcarbamoyle (2,192 g, 9,46 mmoles) et de la diisopropyléthylamine (1,23 ml, 7,1 mmoles) ont été ajoutés à une solution de id (2,536 g, 4,3 mmoles) dans de la pyridine anhydre (11 ml). Le mélange résultant a été agité pendant 2,75 heures à température ambiante et (41 ml) de pyridine et (21,5 ml) d'éthanol ont été ajoutés. Le mélange de réaction a été agité pendant 10 mn à OOC. Une solution d'hydroxyde de sodium aqueuse 2 N (21,5 ml) a été ajoutée et après une agitation supplémentaire de 10 mn à 0 C le mélange de réaction a été neutralisé avec de l'acide acétique (2,65 ml). Ensuite, le mélange de réaction a été versé dans de l'eau (150 ml) et les produits ont été extraits avec du chlorure de méthylène (4 x 50 ml).Les couches organiques réunies ont été évaporées jusqu'à siccité sous pression réduite et le résidu a été fractionné par chromatographie sur colonne de gel de silice (50g). Des fractions contenant du 3d pur ont été réunies et évaporées jusqu'à siccité. Le résidu a été cristallisé à partir d'éthylacétate (2,323 g, 77%), point de fusion 134-1350C. Anal. Calc. pour C39H52N6O6: C, 66,83; H, 7.48; N, 11.99; obtenu C, 66.53; H, 7.66; N, 11.70. [&alpha;]D20 + 33- (c=l, DMF). UV #maxETOH(nm(#)) 225 (37,900), 277 (13,900), 257 (shoulder). 1H-NMR (DMSO-d6) O 0.8S (t,3H, (CH2)14-CH3); 1.18-1.35 (m,24H, (CH2)12-CH3); 1.58 (m,2H,,C(=o)-CH2-CH2-); 2.41-2.48 (m,3H,H2 and (CH2)13); 2.76 (m,1H,H2,); 3.48 (m,2H,H5, and H5@); 4.21 (m,2H,H4,); 4.35 (m,1H,H3,); 4.86 (t,1H,OH5,); 5.43 (d,1H,OH3,); 6.33 (dd,1H,H1.,J=2.36 and 7.67 Hz); 7.30-7.51 (m,10H,ArH); 8,66 (s,1H,H8); 10.65 (s,1H,C(=o)-NH-). 5) Préparation de N-palmitoyl-2 O-diphénvlcarbamovl-6 0-benzoyl-3' &alpha; désoxy-2' quanosine (5d) (schéma II) Du chlorure de diméthoxy-4,4' trityl (0,39 g) 1,15 mmole), a été ajouté à une solution de 3d (0,7 g, 1 mmole) dans de la pyridine sèche (3,5 ml). Le mélange résultant a été agité pendant deux heures à température ambiante et du chlorure de benzoyle (0,152 ml, 1,3 mmole) a été ajouté. Le mélange a été agité pour une période additionnelle de 4,4 heures et 1 ml d'eau a été ajouté. Après cinq minutes d'agitation, le mélange de réaction a été versé dans de l'hydrogénocarbonate de sodium aqueux saturé (40 ml) et les produits ont été extraits avec du chlorure de méthylène (4 x 30 ml). Les couches organiques combinées ont été évaporées jusqu a siccité sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du chlorure de méthylène-méthanol (7/3, v/v, 20 ml). A la solution refroidie (0 C) résultante, a été ajouté une solution refroidie d'acide benzène sulfonique 10 % (p/v) dans le terme mélanqe (5ml). Après 14 mn d'agitation à OOC, le mélange de réaction a été neutra lisé avec de l'hydrogénocarbonate de sodium aqueux (20 ml) et partagé entre l'hydrogénocarbonate de sodium aqueux saturé (40 ml) et du chlorure de méthylène (4 x 30 ml). Les couchers organiques combinées ont été évaporées jusqu a siccité et le résidu a été fraction né par chromatographie sur colonne de gel de silice (30g). Des fractions contenant du produit 5d pur ont été combinées et évaporées. Le résidu a été cristallisé à partir de méthanol pour donner des cristaux incolores (0,65 g, 81 %), point defusion 144-146 C.Anal.Calc.pourC46H56N6O7: C, 68,64; H. 7.01; N, 10.44; obtenu c, 65.37: H, 7.04; N. 10.35. @H-NHR (CDCl3) @ 0.87 (t, 3H, (CH2)14-CH3); 1.18-1.36 (m,24H, (CH2)12-CH3); 1.66-1.74 (m,2H,C(=o)CH2=CH2-); 2.67 (pseudo t,2H,C (=o)-CH2 (CH2)13); 2.96-3.03 (m,3H,H2.,H2- et OH5.); 3.87-3.90 (m,2H,H5. et H5@); 4.56 (m,1H,H4,); 5.61 (m,1H,H3,); 6.53 (pseudo t,1H,H1.,Japp=4.3 Hz); 7.21-7.68 (m,15H,ArH); 8.22 (s,1H,NH); 8.27 (s,1H,H8). 6) Méthode générale de préparation de 0-diméthoxytrityl-5' a désoxyribonucléoside 3'-0- (2-chloro-4-tritvl- phényl) (2-cyanoéthyl) phosphates Du chlorure dediméthoxy-4,4' trityl (1,091 g, 3,22 mmoles) a été ajouté à une solution de a-desoxyribonucléoside dont la base est protégée (2,8 mmoles) dans de la pyridine sèche (7 ml) et le mélange a été agité à température ambiante jusqu'à disparition complète du matériau nucléosidique de départ (2 à 2,5 h). Ensuite, du (chloro-2 trityl-4 phénylj (cyano-2 éthyl) phosphate de triéthylammonium (2,06 g, 3,5 mmoles), du chlorure de mésitylène-2-sulfonyle (1,531 g, 7 mmoles) et du N-méthylimidazole (0,56 ml, 7 mmoles) ont été successivement ajoutés. Le mélange de réaction a été agité à température ambiante pendant une heure et un mélange d'eau (2 ml) et de pyridine (5 ml) a été ajouté. Après une agitation supplémentaire de 15 mn, le mélange de réaction a été versé dans du dihydrogénophosphate de sodium aqueux 0, 2 M (150 ml) et extrait avec du chlorure de méthylène (3 x 60 ml). Les couches orga niques réunies ont été lavées successivement avec du dihydrogénophosphate de sodium aqueux 0,2 M (75 ml) et de l'hydrogénocarbonate d'ammonium aqueux 0,6 M (1 % par rapport au chlorure de sodium, 75 ml). La couche organique a été évaporée jusqu'à siccité sous pression réduite et le résidu a été fractionné par chromatographie sur colonne de gel de silice (60g). Les fractions appropriées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité et lvophilisées à partir du benzène. Pour le O-diméthoxytrityl-5' N-benzovl-6 a désoxy-2' adénosine 3'- (chloro-2 trityl-4 phénvl) (cyano-2 éthyl) phosphate (4c). Le rendement en mélange diastéréoisomérique était de 92 %,Anal. talc. pour C66H56ClN609P, 0.5 H2O: C. 68.77: H. 4.98; N, 7.29; obtenu C,68.85; H. 4.99: N, 7.35. @lp-NMR (CDC13) d -7.88 et -7.96. 1H NMR (CDC13) O 2.58-2.65 (m,2H,CH2-CN); 2.95 (m,1H,H2-); 3.08 (m,lH,H2,); 3.22-3.47 (m,2H,H5, et- H5@); 3.76 et-- 3.77 (2s,6H,2 O-CH3); 4.05-4.16 (m,2H,P-O-CH2-); 4.71 et 4.83 (2 pseudo t,lH,H4.); 5.33 (m,1H,H3,); 6.71 (pseudo t,1H,H1.,Japp" 4.9 Hz); 5.8-8 (m,36H,ArH); 8,28 et 8.30 (2s,1H,H2 or H8);,8.74 et 8.79 (2s,1H,H8) or H-): 8.97 et s (2s,1H,NH). Pour le O-diméthoxytrityl-5' N-palmitoyl-2 O-diphénylcarbamoyl-6 a désoxy-2' guanosine 3'-[(chloro- 2-trityl-4 phényl) (cyano-2 éthyl)3phosphate (4d). Le rendement en mélange diastéréoisomérique était de 53 %, filai. Calc. pour C88H91ClN7O11P : C, 70.98; H, 6.16 N, 6.58; obtenu C, 71.26; H, 6.18; N, 6.47. 31p-NMR (CDCl3) @ -8.15 et -8.52. 1H-NMR (CDCl3) @ 0.87 (t,3H,(CH2)14-CH3); 1.15-1.33 (m,24H,(CH2)12-CH3); 1.68-1.73 (m,2H,C(=o)-CH2-CH2-); 2.41-2.48 (m,2H,CH2-CN); 2.652.74 (m,2H,C(=o)-CH2-CH2-); 3.03 (m,2H,H2, et H2-); 3.19-3.46 (m,2H,H5, et H5@); 3.75 et 3.76 (2S,6H,20-CH3); 3.83-3.95 (m,2H,P-O-CH2-): 4.65 et 4.82 (2 pseude t, 1H,H4,); 5.31 (m,1H,H3,); 6.56 (pseudo t,1H,H1.,Japp" 3.3 Hz); 6.80-7.43 (m,41H,ArH); 7.91 et 7.97 (2s,1H,NH); 8.17 et 8.23 (2s,1H,H8). 7) Méthode générale d'assemblage d'oligodésoxyribonucléo tides a Les oligonucleotides cr entièrement protégés ont été assembl-és par répétition d'un cycle de réactions sélectives comprenant une détritylation, une décyanoéthyla- tion et une condensation, ces étapes sont classiques. 8) Méthode générale de déprotection des oligodésoxyribonu cléotides a contenant des résidus G protégés. Une solution d'oligonucléotide a entièrement protégé (0,058 mmole) du 2-pyridinealdoxime (1,117 g, 9,15 mmoles) et du N1,N1,N31N3-tétraméthylguanidine (1,15 ml, 9,15 mmoles) dans un mélange dioxanne-eau (7:1, v/v, volume final ajusté à 9,15 ml) a été chauffée à 700C pendant 24 heures. La solution a été évaporée et le résidu a été dissous dans de l'ammoniaque aqueux à 500C pendant 5 heures. Ensuite, la solution a été évaporée et le résidu a été dissous dans de l'acide acétique 80 % (16 ml). Après un traitement acide de 15 mn, la solution a été lavée avec du chlorure de méthylène (5 x 20 ml). La solution aqueuse a été évaporée jusqu'à siccité et les produits ont été chromatographiés sur une colonne (2,25 cm) de DEAE-Séphadex A25 (HCO3-) utilisant un tampon d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (pH 7,5 gradient linéaire de 0,001 M à 1M sur 1000 ml) comme éluant. Des fractions de 9 ml ont été recueillies et les fractions appropriées ont été combinées et évaporées. Le résidu restant a été traité avec une Dowex 50 W (Na+) donnant l'oligonucléotide a recherché sous forme de sel de sodium. Les deux oligonucléotides a a-Fd(CATGCG) et a-Ed(CGCATG) ont été obtenus respectivement dans des rendements de 59 à 52 %. L'analyse HPLC sur colonne C18 indiquait des puretés supérieures à 98 %. EXEMPLE II : Synthèse de l'hexaribonucléotide a-CpUpCp CpCpU par la méthode au phosphotriester (voir schémas III et IV ci-après) REFERENCES 1. S.S. JONES, B. RAYNER, C.B. REESE, A. UBASAWA and M. UBASAWA, Tetrahedron, 36, 3075 (1980). 2. R.A. SANCHEZ and L.E. ORGEL, J. Mol. Biol., 47, 531 (1970). 3. W.T. MARKIEWICZ, J. Chem. Res., Synop. 24 (1979) et J. Chem. Res. Miniprint, 181 (1979). 4. J.B. CHATTOPADHYAYA and C.B. REESE, Tet. Letters, 5059 (1979). La synthèse de l'hexaribonucléotide a CpUpCpCpCpU décrite dans ce qui suit a été effectuée selon la méthode au phosphotriester en solution. Elle est similaire à celle décrite par C.B. REESE et col. (1) pour la série naturelle B. Elle a nécessité la préparation du synthon nucléosidique a constituant l'extrémité 3' de l'oligonucléotide, des synthons a et Sb pour l'extension de la chaîne oligonucléotidique et du synthon 7b constituant l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. Les deux triribonucléotides partiellement protégés 12 et 16 ont été préparés selon le schéma IV, puis assemblés pour produire l'hexaribonucléotide entièrement protégé 17. Après déprotection, I'hexaribonucléotide a-CpUpCpCpCpU a été purifié et caractérisé. a B : CYTOSINE a B' : N-BENZOYL-4 CYTOSINE (CBz) b B : URACILE b B' : URACILE (U) THP : TETRARYDROPYRANYL-2 SCHEMAIII Dmtr : DIMETHOXY-4,4' TRITYL Ar : CHLORO-2 PHENYL Bz : BENZOYL THP : TETRANYDROPYRANMYL-2 Dmtr : DINETMOXY-4,4' TRITYL Bz : BENZOYL Ar : CNLO@O-2-PNEMYL Et : ETHYL i) O-CMLOROPNEMYL PMOSPNORO@L-(TRIAZOL-1,2,4 IDE)/ACETONIYRILE/PYRI@INE PUIS EAU/TRLETHYLAMIME/PYRIDINE ii) MESITYLENESULFONYL-1 NITRO-3 TRIAZOLE-1,2,4 (MSNT)/PYRIDINE. iii) ACIDE TRIFLUDNOACETIOUE 0,5 % / DICHLORONETHANE A 0 C OU ACIDEBENZENESULFONIOUE 2 % / DICHLONOMETRANE METNANOL A 0 C SCHEMA IV 1) Préparation des synthons nucléosidiques 5a, 5b, 6a et 7b Ils ont été préparés à partir des ribonucléosides a 1a et 1b obtenus selon des méthodes décrites dans la littérature (2). L'introduction sélective du groupement protecteur acido-labile tétrahydropyrannyl-2 (THP) a été effectuée selon la méthode suivante (3) (Voir schéma III). Après traitement du composé 1b par le tétraisopropyl-1,1,3,3 dichloro-1,3 disiloxane dans un mélange diméthylformamide-pyridine, le dérivé obtenu 2b est traité par le tétrahydropyranne en présence d'acide trifluoroacétique pour donner 3b.Après purification, ce dernier est soumis à un traitement par une solution 1t1 de fluorure de tétrabutylammonium dans le tétrahydrofuranne. La protection tétraisopropyl-1,1,3,3 disilyle est ainsi sélectivement ôtée et on obtient le composé 5b. La cytidine &alpha; est traitée de façon analogue à celle précédemment décrite avec cependant la modification suivante qui permet d'introduire une protection benzoyle en position 4 de la base cytosine. Après introduction du groupement tétrahydropyrannyle, le composé 3a est traité par le chlorure de benzoyle dans une solution de pyridine et le composé résultant 4a est traité par une solution 1M de fluorure de tétrabutylammonium dans le tétrahydrofuranne pour donner, après purification, le composé désiré 5a. Le dérivé nucléosidique 6a a été obtenu après tritylation de a par le chlorure de diméthoxy-4,4' trityle en milieu pyridine. Enfin, le synthon nucléosidique zb, constituant l'extrémité 3' de l'oligonucléotide, a été obtenu en trois étapes à partir de la cytosine a. Ces trois étapes sont : a) tritylation sélective de l'hydroxyle-5' par le chlorure de diméthoxy-4,4' trityle, puis b) benzoylation de pcsitions 2' et 3' par le chlorure de benzoyle et enfin c) déprotection sélective de l'hydroxyle-5' par un traitement à l'acide benzènesulfonique à 2 % dans un mélange dichlorométhane-méthanol (7/3, v/v). Le rendement global de ces trois étapes est de 67 %. 2) Assemblage de l'hexaribonucléotide entièrement pro tégé a-CpUpCpCpCpU Le triribonucléoside diphosphate 16 et le triribonucléoside triphosphate 12 ont été préparés selon le schéma III. Chaque cycle d'assemblage comprend une étape de phosphorylation permettant d'introduire un groupement phosphodiester en position 3' d'un dérivé nucléosidique ou nucléotidique partiellement protégé et une étape de couplage entre le composé phosphodiester-3' obtenu à l'étape précédente et un dérivé nucléosidique ou nucléotidique dont la fonction OH-5' est libre. Dans certains cas (voir schéma II), une étape supplémentaire de détritylation est nécessaire pour déprotéger cette fonction OH-5'. Les étapes de phosphorylation en 3' ont été effectuées par traitement avec de l'O-chlorophénylphosphorodi-(triazol-1,2,4-ide) (4) d'un dérivé OH-3' en solution dans un mélange acétonitrile-pyridine anhydre, suivi d'une hydrolyse en présence de triéthylamine. Ainsi, les dérivés O-arylphosphate-3' 8a, 10 et 12 ont été obtenus avec des rendements supérieurs à 90 %. Les étapes de couplage entre un dérivé O-arylphosphate-3' et un dérivé nucléosidique ou nucléotidique 5'-OH ont été effectuées en solution dans la pyridine anhydre en présence d'agent de couplage : le mésitylènesulfonyl-1 nitro-3-triazole-1,2,4 (MSNT) (1). Ainsi, à titre d'exemple, à une solution de triribonucléoside triphosphate 12 (0,334 mmole) et de triribonucléoside diphosphate 16 (6,278 mmoles) dans de la pyridine anhydre (2 ml), onajoute du MSNT (1,67 mmole). Le mélange est agité pendant 55 minutes à température ambiante, puis est versé sur une solution d'hydrogénocarbonate de sodium (50 ml). Le mélange obtenu est extrait avec du dichlorométhane (3 x 30 ml). Les phases organiques sont rassemblées et évaporées sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : dichlorométhaneméthanol). Les fractions contenant le produit désiré 17 sont rassemblées, évaporées sous pression réduite et le résidu est précipité avec de l'éther de pétrole (rendement 58 %). 3) Déprotection, purification et caractérisation de lthexaribonucléotide aCpUpCpCpCpU L'hexaribonucléotide entièrement protégé 17 a été soumis aux traitements suivants . nitro-4 benzaldoximate de tétraméthylguanidinium 1M dans un mélange dioxanne-eau (1/1, v/v) pendant 18 heures. . ammoniaque concentrée pendant 5 heures à 50"C. . acide chlorhydrique (pH 2) pendant 4 jours à tempéra ture ambiante. Au terme de ces traitements, l'oligonucléotide déprotégé a-CpUpCpCpCpU a été purifié par chromatographie sur colonne échangeuse d'anions DEAE-Sephadex (forme HCO3- > en utilisant comme éluant une solution d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (gradient linéaire 0,01M # 1M sur 1000 ml). Le rendement de la déprotection a été de 56 %. Une fraction (environ 5 unités de DOaoo ) de l'oligoribonucléotide a-CpUpCpCpCpU a été soumise à dégradation enzymatique par la phosphodiestérase de venin de serpent et la phosphate alcaline. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des produits de la digestion a indiqué une dégradation complète en auridine et a-cytidine dans un rapport 1/2,1. EXEMPLE III Synthèse supportée d'oligodésoxyribonucléotides a La synthèse supportée d'a-oligodésoxyribonucléotides, qui est décrite ci-après, procède selon la méthode au phosphoroamidite. Elle est similaire à celle décrite pour la série naturelle ss par Caruthers et col. (S.L. Beaucage et M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981) et L.J. McBride and M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 24, 245-248 (1983)). Elle a nécessité la préparation (1) des synthons a-désoxynucléoside-phosphoramidites 2a-d correspondant aux quatre bases T, C, A et G selon le schéma suivant Les abreviations ont les significations suivantes a B= T = Thymine b B= CBZ = N-benzoyl-4 cytosine c B= ABZ = N-benzoyl-6 adénine d B= Pal d B = N-palmitoyl2 guanine. Dmtr : Diméthoxy-4,4'-trityl iPr . isopropyl Bz : benzoyl Cette synthèse a également nécessité la fonctionnalisation d'un support solide (2) incorporant undérivé a-désoxyribonucléosidique. Dans un deuxième temps, l'élongation de la chaîne oligonucléotidique (3) aétéeffectuéedl'aide d'un synthétiseur manuel ou automatique. Enfin, au terme du nombre reauis de cycles de synthèse, l'oliaonucléotide a été décroché du support, déprotégé et purifie. Préparation des -désoxyribonucléoside-phosphoramidites 2a-d. Les quatre a-désoxyribonucléoside-phosphorami- dites N-protégés 2a-d ont été obtenus à partir des O-diméthoxytrityl-5' a-désoxyribonucléosides N-protégés correspondants 1a-d . Le dérivé nucléosidique 1 a été traité par du chloro N,N-diisopropylamino phosphoramidite de méthyle (2,5 équivalents molaires) en présence de N,N,N-diisopropyléthylamine (DIEA) dans le dichloro méthane, sous atmosphère inerte. Le dérivé phosphoramidite obtenu 2 a été purifié par chromatographie sur gel de silice et isolé avec des rendements variant de 79 % à 95 %. L'analyse des quatre dérivés phosphoramidites 2a-d par 31P-RMN indique une pureté supérieure à 97 %. La méthode générale de préparation des dérivés N,N-diisopropylamino hosphoramidite-3' de a-désoxy-2 '- nucléosides 2a-d a été la suivante. A une solution de O-diméthoxytrityl-5' N protégé &alpha;-désoxynucléoside 1 (1 mmole) et de N,N,N-diiso propyléthylamine (4 mmoles) dans du dichlorométhane anhydre (3 ml), on ajoute, sous argon et par l'intermé diaire d'une seringue, le chloro N,N-diisopropylamino phosphoramidite de méthyle (2,5 mmoles). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 10 mn, puis est transféré dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyle (35 ml). Le mélange est extrait avec de la saumure (4 x 80 ml) et la phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite. Le résidu d'évaporation est purifié par chromatographie sur gel de silice (10 g) en utilisant comme éluant un mélange hexane-dichlorométhane contenant 1 % de triéthylamine.Les fractions contenant le produit pur sont rassemblées et évaporées sous pression réduite. Le résidu est précipité dans du n-hexane (50 ml) froid (- 780) à partir d'une solution dans le toluène (5 ml) ou lyophilisé à partir d'une solution dans le benzène (15 ml). Des composés 2a-d sont obtenus sous forme de poudres blanches et conservés sous argon à - 200. Les résultats d'analyses des quatre dérivés phosphoramidites2a-d par 31P-RMN sont les suivants 2a : rendement 88% 31P-RMN # 150,9 1H-RMN 6 8,19 (large s, 1H, H-N3) ; 7,60 et 7,57 (2d, 1H, H6) ; 7,46-6,79 (m, 13H, ArH) ; 6,34 (pseudo d, 1H, H1, , Japp. = 7,5 Hz) ; 4,63-4,45 (m, 2H, H3, et H4,) ; 3,80 (s, 6H, CH3-OAr) ; 3,68-3,42 (m, 2H , H5, et H5") ; 3,32 et 3,31 (2d, 3H, CH3-0-P, J = 13,3 Hz) ; 3,25 (m, 2H, N(CH-(CH3)2@2); 2,86-2,65 (m, 1H, H2,) ; 2,30-2,14 (m, 1H, H2") ; 1,92 (s, 3H, (H3C)5); 1,17-1,01 Cm, 12H, (CcH3)2-cH)2N). 2b : rendement 79% . 31P-RMN # 150,42 et 151,7 1H-RMN 5 8,62 (large s, 1H, H-N4) ; 8,12 et 8,11 (2 d, 1H, H6 J5 6 = 7,2 Hz) ; 7,90 (d, 1H, H5) ; 7,66-6,82 (m, 18H, ArH) ; 6,35 (pseudo t, 1H, H1, t api. = 5,5 Hz) ; 4,72 et 4,63 (2 pseu do t, 1H, H3,) ; 4,54-4,47 (m, 1H, H4,) ; 3,80 (s, 6H, CH3-0 Ar) ; 3,52-3,35 (m, 2H, H5, et H5,,) ; 3,29 et 3,23 2d, 3H, CH3-0-P, J = 13,3 Hz) ; 3,29-3,10 (m, 2H, N(CH-(CH3)2)2); 2,93-2,71 (m, 1H, H2,) ; 2,53-2,36 (m, 1H, H2,.) ; 1,12-0,98 Cm, 12H, t(CH3)2-CH32N). 2c : rendement 95% . 31P-RMN # 150,81 et 150,91 1H-RMN 6 8,9i (s, 1H, NH) ; 8,84 et 8,59 (2d, 2H, H et H8) 8,04-6,81 (m, 18H, ArH) ; 6,74-6,68 (m, 1H, H1,) ; 4,67 -4,56 (m, 2H, H3, et H4,) ; 3,80 (s, 6H, CH3-OAr) ; 3,61-3,43 (m, 2H, H5, et H5.,) ; 3,28 et 3,26 (2d, 3H, CH3-O-P, J = 13 Hz) ; 3,40-3,16 (m, 2H, N(CH-(CH3)2)2) ; 3,0-2,9 (m, 1H, H2,) ; 2,72-2,53 (m, 1H, H2,,) ; 1,16-1,01 (m, 12H, t(CH3)2-CH)2N). : : rendement 87% 31P-RMN # 150,76 et 150,97 H-RMN # 11,88 (large s, 1H, NH) ; 8,28 et 8,24 (2 s, 1H, H8) ; 7,46-6,82 (m, 14H,NH et ArH) ; 6,28 (pseudo t, 1H, H1, , Japp. = 7,8 Hz) ; 4,70-4,44 (m, 2H, H3, et H4,) ; 3,80 (s, 6H, CH3-0 Ar) ; 3,76-3,41 (m, 2H, H5, et H5,,) ; 3,31 et 3,25 (2d, 3H, CH3-0-P, J = 13,5 H) ; 3,36-3,12 (m, 2H, N(CH-(CH3)2)2); 2,94-2,80 Xm, 1H, H2,) ; 2,61-2,36 (m, 3H, H2,, et (CH2)13-CH2-C(=o)) ; 1,70 (m, 2H, CH2- CH2-C(=0)) ; 1,25 (m, 24H, CH3-(CH2)12 ) ; 1,17-1,08 (m, 12H, ((CH3)2-CH)2N) ; 0,88 (m, 3H, CH3-(CH2)14). (2) Fonctionnalisation du support solide Elle a été effectuée par l'établissement d'un lien succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé N-acyl -O-diméthoxytrityl-5' a-désoxynucléoside 1 et le groupe amino du support solide selon le schéma suivant DCC : dicyclohexylcarbodiimide DMAP : diméthylaminopyridine (catalyseur) Le composé 1 a préalablement été transformé en dérivé pentachlorophényl succinate-3' 4 et ensuite mis en réaction avec le groupement amino de la longue chaîne alkylamine fixée sur billes de verre poreuses (LCA-CPG) (S.P. Adams, K.S. Kavka, E.J. Wykes, S.B. Holder and G.R. Galluppi, J. Am. Cher. Soc., ic, 66 (1,83,). La quantité de nucléoside fixé sur le support solide a été déterminée par dosage spectrophotométrique du cation diméthoxytrityle libéré par un traitement avec une solution à 10 % d'acide trichloroacétique dans le dichlorométhane. Le degré de fonctionnalisation varie de 25 à 38 moles par gramme suivant la nature de la base nucléosidique. (3) Synthèse de&alpha;-d(T A C G G C C A G T) La décanucléotide a-d(TACGGCCAGT) a été synthétisé manuellement. La 0-diméthoxytrityl-5'&alpha;-thymidine liée de façon covalente au support LCA-CPG (1 ssmole environ) est introduite dans un petit réacteur. L'élongation de cet oligonucléotide a été effectuée par une succession de neuf cycles de synthèse (voir tableau III) ci-après). Outre les lavages, chaque cycle comprend une détritylation (étape 4), une condensation (étape 12), une acétylation (étape 13) et une oxydation (étape 15). Au terme du nombre de cycles requis, le support a été traité par mélange thiophénol/triéthylamine/ dioxane (1/2/3, v/v/v) pendant une heure pour enlever le groupement méthyle des phosphates. Puis le support a été traité avec de l'ammoniaque concentré à 600 pendant douze heures, afin d'enlever les groupements protecteurs des amines hétérocycliques et détacher les produits nucléotidiques du support solide. L'oligonucléotide désiré, portant encore le groupement diméthoxytrityl à son extrémité 5', a été purifié par chromatographie liquide haute performance sur colonne de phase greffée Cla avec un rendement de 20 %. Un traitement par de l'acide acétique à 80 % a permis de déprotéger son extrémité 5'.Enfin, le décanucléotide purifié a été soumis à dégradation enzymatique par la phosphodiestérase de venin de serpent et la phosphatase alcaline. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des produits de la digestion a indiqué une dégradation complète en a-thymidine, a-désoxy-2'-cytidine, a-désoxy-2'-adénosine et a-désoxy-2'-guanosine dans un rapport 2,1/3,2/1,8/3,3 (Rapport théorique : 2/3/2/3). Ces résultats montrent que des oligodésoxyribonucléotides comprenant uniquement des unités nucléotidiques de configuration anomérique a peuvent être rapidement synthétisés par la méthode au phosphoramidite sur support solide. Le protocole pour la synthèse manuelle d'a-oligonucléotides sur billes de verre poreux (CPG) a été le suivant. Le réacteur était chargé avec 30 mg de support fonctionnalisé (25-38 ssmoles/g)-. Le volume correspondant à chaque étape est de 1 ml, sauf indication contraire. TABLEAU III Etape Réactif ou Solvants Temps 1, 2, 3 CH2CLz 10 s par étape 4 DCA/CH2CL2 (1/50, v/v) 3 mn 5, 6 CH2 CL2 10 s par étape 7, 8, 9, 10, 11 CH3CN 10 s par étape 12 0,1M phosphoramidite * 5 mn (0,2 ml) et 0,4M tétra zole (0,2 ml) dans acé tonitrile 13 DMAP/THF/lutidine 2 mn (6/90/10, p/v/v), puis 0,1 ml d'anhydride acé tique 14 THF/lutidine/H2O 2/2/1, 1 mn v/v/v) 15 0,1M l2 dans THF/lutidi 30 s ne/H2O (2/2/12, v/v/v) 16, 17, 18, 19 CH3 CN 10 s par étape * Dans le cas de G et pour des raisons de solubilité, une solution 0,05 M de phosphoramide est utilisée. Dans ce cas, l'étape 12 est effectuée une seconde fois avant de passer à l'étape 13. EXEMPLE IV : Synthèse automatique d'oligodésoxyribo nucléotides a Un synthétiseur de gènes, modèle 380 d'Ap?lied Biosystems, a été utilisé. En raison de la faible solubilité du dérivé phosphoramidite de G dans l'acétonitrile, une solution 0,05M de ce phosphoramidite, maintenue en permanence à 370C, a été utilisée. Le programme standard de synthèse a été modifié de façon à répéter les étapes correspondant à l'incorporation de G et à assurer un haut rendement de couplage (supérieur à 98 %). L 'oligonucléotide a-d(TAAAAGGGTGGGAATC) a ainsi été obtenu (62 unités de DO260). Sa pureté et sa taille ont été vérifiées par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes. EXEMPLE V : Stabilité enzymatique des oligonucléotides a- et ss-[d(CATGCG)] vis-à-vis de certains nucléases. Trois nucléases ont été utilisées : une endonucléase, la nucléase S1 qui est spécifique des ADN monobrins ; une 5'-exonucléase, la phosphodiesterase de rate de veau ; et une 3'-exonucléase, la phosphodiesterase de venin de serpent. L'hyperchromicité à 260 mm et l'HPLC ont été utilisés pour suivre l'hydrolyse enzymatique. Aucun changement significatif dans l'absorbance n'est apparue en 20 mn quand l'oligomère a a été incubé avec la nucléase S1, tandis que l'oligomère ss donnait une augmentation d'absorbance avec la durée. L'absorption W ne permet pas une comparaison quantitative entre les oligomères ss et a s'agissant de leur dégradation. Nous avons donc confirmé ces résultats par une analyse HPLC. La disparition du pic correspondant à l'hexanucléotide a été enregistrée pendant des incubations avec la nucléase S1 à 370C. Il n'y avait plus d'hexamères 3 après 10 mn d'incubation, tandis que seulement 7 % de l'hexamère a étaient dégradés (Tableau 11). La stabilité comparative des deux hexamères a et ss par rapport à l'hydrolyse par la phosphodiesterase de ratede veau est illustrée au Tableau II ci-après. La différence entre les deux oligomères anomériques est frappante : aucun changement de l'oligomère a est apparu en 10 mn, tandis que 89 % de l'oligomère ss était hydrolysé dans le même temps. TABLEAU II Hydrolyse de[d(CATGCT) a- ou S- t166 mmoles chacun) en fonction du temps par la nucléase S1 (93 unités/ml) et la phosphodiesterase de rate de veau (0,013 unité/ml) à 370C. Fraction d'hexamère restant après 1 ou 10 mn. Nucléase S1 Phosphodiesterase durée (min.) de rate de veau durée (min.) 0 1 10 0 10 ss-[d(CATGCG)] 100% 1.3% 0 100% 11% &alpha;-[d(CATGCG)] 100% 98% 93% 100% 104% La stabilité des deux hexamères anomériques vis-àvis de l'hydrolyse par la phosphodiesterase de venin de serpent a été étudiée en suivant l'absorbance UV à 260 mm. A de faibles concentrations en enzyme , l'oligonucléotide a a été hydrolysé lentement, tandis que la dégradation de l'oligonucléotide ss correspondant était très nette. 1) Comparaison des substrats Ed(CATGCG)] a- et f3- par rapport à différentes nucléases. Analyse HPLC : L'appareil HPLC était un Waters Associates et était équipé avec une colonne C 18 Bondapak. L'élution isocratique a été effectuée avec le système suivant : de l'acétonitrile 27 % dans de l'acétate ammonium 20 mM a) Nucléase S1. Cette nucléase était de marque GIBCO BRL. Une unité solubilise à 1 g d'ADN dénaturé en 1 mn à 370C. Une solution d'oligonucléotide a- ou d'oligonucléotide -ss- (50 nmol.) dans de l'eau (30 sl) a été mélangée avec le tampon suivant (30 l) : acétate de sodium 0,5 M (pH 4,7), chlorure de sodium 3 M, acétate de zinc 0,1 M. Ce volume a été complété avec 300 l d'eau. La nucléase S1 (28 unités, 3 al) a été ensuite ajoutée. Le mélange a été incubé à 370C et les aliquots (20 l) ont été prélevés en temps voulu et mélangés avec le tampon bloquant : phosphate de potassium 20 mM (pH 6,5, 180 l), avant d'être chauffés à 1000C pendant 5 minutes. Un traitement similaire a été fait pour les expériences de contrôle. Des volumes de 50 wl étaient injectés. b) Phosphodiesterase de rate de veau. Une procédure similaire à celle décrite cidessus a été suivie, si ce n'est qu'on a additionné ladite phosphodiesterase (4.10-3 unités, 1 ssl) à la place de la nucléase S1 dans 0,1 M d'acétate d'ammonium (pH 6,5). La phosphodiesterase de rate de veau était fournie par BOEHRINGER (MANNHEIN). Une unité hydrolyse 1 mol. de thymidine-3'-nitrophénylphosphate en une minute à 250C. La réaction a été arrêtée dans de l'eau àla place d'une solution de phosphate de potassium. Spectrophotométrie UV. Un spectrophotomètre Uvikon à 810 équipé avec un système thermostaté opérant à 370C a été utilisé. Le volume total de réaction était de 1 ml. Les oligonucléotides (60 nmol.) ont été ajoutés et l'absorbance à 260 nm a été ajustée à zéro. La nucléase S1 (1 ssl, 9,3 unités) a été ajoutée et on a enregistré l'absorbance à 260 nm en fonction du temps. La procédure analogue a été utilisée avec la phosphodiesterase de venin de serpent également fournie par BOEHRINGER -0 (1 iil, 3.10 unités). La figure 1 represente les courbes d'absorbance UV à 260 nm en fonction du temps pour respectivement les oligonucléotides Ud(CATGCG)] R- et a- . Une solution tampon était constituée d'acétate de sodium 0,05 M (PH 4,7), de chlorure in sodium 0,3 M et d'acétate de zinc 0,01 M. At=0 la nucléase Sî (0,3 unité/ml) a été ajoutée à 60 aM d'hexa mère &alpha;- ou 6-- La figure 2 représente l'absorbance UV à 260 nm en fonction da temps. La solution tampon a été constituée de tris-HCl 0,1 M (pH 9) et de chlorure de magnésium 0,01 M.Au temps t=0 mn de la phosphodiesterase de vénin de serpent (3.10- unités/ml) a été ajoutée à 66 M d'hexamère a- ou S- à 370C. EXEMPT VI : Appariement parallèle de deux brins a et ss A partir des séquences a synthétisées, comprenant les quatre bases, les résultats ci-après prouvent que les séquences a et ss sont parallèlement appariées, alors que deux séquences a complémentaires s'apparient anti-parallèlement. D'autre part, l'appariement a ss est beaucoup plus stable que l'appariement ss En effet, le spectre RMN des protons imino à 40C de ces solutions dans D2O-H2O révèle que a) la séquence &alpha;-[d(CATGCG)] présente deux pics bien dé finis à 12,57 et 14,17 ppm d'intensité : 1) pro venant de l'appariement anti-parallèle b) la séquence ss-[d(GTACGC)] présente deux pics plus larges à 13,65 et 12,58 ppm.Là encore, l'intensité relative et des considérations de symétrie suggèrent que ceci est dû à l'appa:iement anti-parallèle c) le mélange des séquences des ard(CATGCG) et ss-[d(GTACGC)] (1:1) présente six pics imino à 14,22 , 13,83 , 13,23 , 13,02 , 12,73 and 12,57 ppm et un large pic à 13,66 ppm. Puisque les déplacements chimiques du premier ensemble de six signaux sont tous différents de ceux observés in (a) et (b) (excepté pour 6 = 12,57 lequel est présent à la fois pour les séquences a- et ss-), il semble raisonnable d'associer ces six pics à ceux des protons imino prove nant de l'appariement de &alpha;-[d(CATGCG)]-ss-[d(GTACGC)]. Le nombre des signaux de protons imino observés est plus en accord avec un appariement parallèle (A, qu'avec un appariement anti-parallèle (B) EXEMPLE VII : Association d'un tétramère de thymidine a avec un agent d'intercalation Un tétramère de thymidine a, lié de façon covalente par l'intermédiaire d'une chaîne pentaméthylène à un dérivé de 2-N -méthyl-9-hydroxyellipticinium acétate, a été synthétisé en trois étapes selon le schéma suivant Dmtr-a (T-T-T- t Dmtr-NH(CH, ) COOH étape 1 DCC, DMAP Dmtr-a(T-T-T-T)çC,(CH2) NH-Dmtr ri s étape 2 j AcOH 80 % fl P a T-T-T-T-OC(CH,) NH, étape 3 CH3 + / CH3 H202, péroxidase HO CH3 a T4C5OPC H CH3 a T4CsoPC - Etape 1 : Liaison du bras pentaméthylène sur le tétramère de thymidine a. La terminaison OH 3' du tétramère protégé en 5' avec un groupe diméthoxytrityle (Dnttr) est esterifiée avec un acide aminocaproique, dont le résidu ter minal est bloqué avec Dmtr. La réaction est exécutée à température ambiante dans de la pyridine avec du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) comme agent de couplage et du diméthylaminopyridine (DMAP) comme catalyseur. La réaction est complète après trois heures. - blape 2 : Déprotection. Les groupes Dmtr sont éliminés avec de l'acide acétique à 80 %. Le produit résultant ainsi obtenu, est purifié à travers une colonne en phase inverse. A ce point, le rendement des réactions (1+2) est égal à 65 %. - Etape 3 : Liaison du dérivé ellipticine avec le tétramère modifié. Dans cette étape, nous avons utilisé un système enzymatique : péroxydase de raifort -HzO,. Le dérivé ellipticine N-méthyl-2 hydroxy-9 elligticinium (NMHE) est oxydé par cette réaction enzymatique, conduisant à un dérivé O-quinone de NMHE. Cet intermédiaire électrophile ensuite subit l'attaque de la fonction amino portée par le tétramère modifié. Un noyau oxazole est ainsi créé, conduisant au composé fluorescent de formule suivante a T4CnOPC La réaction est effectuée dans un tampon Phosphate pH 7 et le produit final est purifié sur une colonne C 18 en phase inverse et par HPLC. 1) Préparation de O-benzovl-3' a-thymidine 389,7 mg (1,15 mmole) de 4-4'-diméthoxytritylchlorure ont été ajoutés à une solution de 2'-a-thymidine (1 mmole et 242,2 mg) dans de la pyridine anhydride (2,5 ml). Le mélange résultant a été agité pendant trois heures, à température ambiante, et on a ajouté du méthanol (1 ml). Après une agitation additionnelle de 15 mn, le mélanae a été versé dans 40 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux saturé et extrait avec du chlorure de méthylène (3 x 20 ml). Les couches organiques mélangées ont été évaporées jusqu'à siccité et le résidu a été fractionné par chromatographie en utilisant comme éluant un mélange acétone-chlorure méthylène (0 à 40 %).Les fractions contenant du O-diméthoxvtrityl- 5' a-thymidine pur ont été rassemhlles et évaporées jusqu'à siccité. Le résidu a été précipité à partir de l'éther (inférieur à 400C) (514,6 mg 94,5 %). 42,2 mg de (0,30 mmole) de chlorure de benzoyl ont été ajoutés à une solution de 5'-O-diméthoxytrityla-thymidine (0,25 mmole 0,136 g) dans de la pyridine anhydre (1 ml). La solution a été agitée pendant une heure à température ambiante et on a ajouté 0,5 ml d'eau. Après 15 mn d'agitation, le mélange de réaction a été versé dans 20 ml dthydrogénocarbonate de sodium aqueux saturé et extrait avec du chlorure de méthylène (3 x 10 ml). Les couches organiques ont été évaporées jusqu'à siccité. Le résidu a été dissous dans du chlorure de méthylène-méthanol (7-3 v/v ; 5 ml) et 10 % (v/v) d'acide benzènesulfonique dans du chlorure de méthylene ont été également ajoutés.Après 17 mn d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel a été neutralisé avec 2 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux saturé et réparti entre 20 ml d'hydrogénocarbonate de sodium-aqueux saturé et (3 x 15 ml) de chlorure de méthylène.Les phases organiques rassemblées ont été évaporées jusqu'à siccité et le résidu a été fractionné par chromatographie (10 g). Les fractions contenant du dérivé 3'-O-benzoyl-a-thymidine ont été réunies et évaporées. Le résidu a été précipité à partir d'éther (inférieur à 400C) pour donner une poudre amorphe incolore (0,075 g, 87 %). 2) Préparation de 5'-0-diméthoxytrityl-&alpha;- F(Tp) T A 0,393 g (0,15 mmole) d'une solution de Dmtr-a-(TP)3T-Bz protégée dans de l'eau-dioxane (1/7, v/v, 5 ml) était ajouté 0,6106 g ( 5mmoles) de pyridine2-aldoxime et 0,627 ml (5 mmoles) de N1,N1,N3,N3-tétraméthylguanidine. La solution résultante a été chauffée à 70 C pendant 9,5 h, puis refroidie et évaporée jusqu'à siccité.Le résidu a été dissous dans de l'hydrogéno- carbonate de tétrylammonium (TEAB, 50 ml, 50 mmoles) et a été lavée avec du diéthyléther (2 x 25 ml). La solution aqueuse a été évaporée jusqu'à siccité et le résidu a été chromatographié sur une colonne de Cla de silica gel en phase inverse (1,2 x 10 cm) en utilisant un gradient de méthanol (0 à 50 %) dans de l'eau (0,1 M par rapport à TEAB). Les fractions appropriées ont été réunies et évaporées jusqu'à siccité. La lyophilisation du résidu a donné le composé souhaité sous forme de poudre incolore (0,223 g) dans un rendement de 84 %. 3) Préparation de composé &alpha;-(Tp)3T 3'-0-#-aminohexanoate A une solution de 58-O-diméthoxytryl-a-(TP)3T (0,223 mg , 0,13 mmole) et d'acide N-diméthoxytrityl #-aminohexanoïque (0,281 g , 0,65 mole), dans de la pyridine anhydre (3 ml) ont été ajoutés 0,2678 g (1,3 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide et 0,0793 mg (0,65 mmole) de N,N-diméthylamino-4-pyridine. La solution résultante a été agitée pendant trois heures et demie à température ambiante. 1 ml d'eau a ensuite été ajouté et le mélange a été filtré. Le filtrat a été évaporé jusqu'à siccité et le résidu a été précipité à partir de diéthyléther (cette dernière opération a été répétée trois fois).Le précipité a été dissous dans de l'acide acétique à 80 % (5 ml) et la solution a été gardée à température ambiante pendant 20 mn. Le mélange a été extrait avec du diéthyléther, évaporé jusqu'à siccité. Au résidu on a ajouté du toluène et le mélange résultant a été évaporé jusqu'à siccité là encore. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne Cie silica gel en phase inverse (1,2 x 10 cm) en utilisant un gradient étagé de méthanol de (0 à 40 %) dans l'eau. Les fractions contenant le produit ont été évaporées jusqu'à siccité et le résidu a été lyophilisé . Le composé recherché a été obtenu sous forme de poudre incolore (0,130 g) pour un rendement de 65 %. 4) Préparation de Les quantités de réactif mises en oeuvre étaient les suivantes. Pour 130 mg (0,082 mmole de a-(Tp)3T-3'O-E- aminohexanoate et 11 mg (0,032 mmole) de 2-méthyl, 9hydroxyellipticinium acétate ont été dissous dans 50 ml d'un tampon phosphate 0,02 M pH 7. La solution a été maintenue et sous agitation continue à température ambiante. 0,8 mg de péroxydase (raifort > ont été ajoutés au mélange. Après la dissolution de l'enzyme, 1,5 ml d'une solution de H202 20 mM ont été ajoutés goutte à goutte. La solution a été filtrée et évaporée jusqu'à siccité. Le résidu a été ensuite prépurifié par chromatographie sur colonne Lighrosorbe RP 18 en phase inverse (0 à 60 %) dans l'eau. Les fractions appropriées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité. La purification du produit a été accomplie par HPLC. Le produit a été passé à travers une colonne Dowex 50 W (NH4+ forme).Après lyophilisation, le composé final obtenu était une poudre jaune de (2,7 mg; en un rendement de 5 %. EXEMPLE VIII : Appariement de a-T4-C5-OPC avec un Polv(rA) L'interaction entre a-T4-Cs-OPC et poly(rA) a été étudiée en utilisant l'absorption W et la fluorescence. Le spectre W de a-T4-C5-OPC présente deux maximums à 271 nm et 317 nm. En outre, ce composé est fluorescent avec excitation et émission maximum respectivement à 318 nm et 525 nm. En présence de quantitéscroissantesde poly(rA), le spectre de a-T4-Cs-OPC (0,05 mM dans du cacodylate de sodium 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7) est modifié. Une hypochromicité apparaît entre 260 nm et 320 nm et correspond à l'association de a-T4-C5-OPC avec la séquence poly(rA). A 270 nm, on peut suivre la formation du duplex entre la channe tétra-a-thymidilate et poly(rA), tandis qu'à 310 nm, on suit l'interaction du fracment oxazolopyridocarbazole.Par le rapport de l'absorbance del'a-T4-Cs-OPC libre sur l'absorbance initiale de l' a-T4-C5-OPC, en fonction du rapport de la concentration de poly(rA) exprimée en nucléotides, sur la concentration de dérivé oxazolopyridocarbazole, on peut déduire la stoechiométrie de l'interaction, laquelle correspond à une molécule de a-T4-C5-OPC liée pour 4 résidus adénine. Dans les mêmes conditions, aucune association entre a-T4 et poly(rA) a été détectée. On peut également étudier l'association de l'&alpha;-T4-C5-OPC avec poly La température correspondant à 50 % de dissociation du complexe est égale à 24,50C à 270 nm et 260C à 310 nm. Ce résultat pourrait être comparé à celui observé pour des complexes formés entre 6-T4-Cs-OPC et poly(rA). Dans ce dernier cas, la température de dissociation du complexe, dans les mêmes conditions, était de 160C. La fluorescence du fragment OPC de la molécule ss-T4-C5-OPC n'est pas changée après formation du complexe avec poly(rA). Ceci suggère que ce fragment est probablement non intercalé entre les paires de base nouvellement formées. Ceci constitue une autre différence entre les a- et S-T4-Cs-OPC, dans la mesure où,dans le dernier cas, l'interaction entre la substance et le poly(rA) provoque une augmentation de fluorescence. En outre, en variant la concentration de a-T4-Cs-OPC, et en mesurant la température Tm correspondante (Tm représente la température de dissociation à 50 % du complexe), les paramètres thermodynamiques de son interaction avec poly(rA) ont été déterminés. Ces paramètres se déduisent de l'éauation suivante : 1/Tm = S/ H + 2,3R/ H logCm équation dans laquelle Tm représente la température de demi-dissociation du complexe, Cm représente la concentration de a-T4-C5-OPC libre t = Tm et R est égal à 2 calories/mole/K. Tm a été mesuré à 270 nm et 310 nm, et les valeurs suivantes ont été obtenues à 270 nm : AH = - 38,7 kcal/mole, AS = 105,3 cal/mole et AG à 2980K = - 7,2 kcal/mole. à 310 nm : AH = - 36,8 kcal/mole, AS = 98,8 cal/mole et AG à 2980K = - 7,4 kcal/mole. En conclusion, il a été possible de synthétiser une nouvelle molécule : a-T4-C5-OPC, dans laquelle un agent d'intercalation potentiel ayant une structure oxazolopyridocarbazole est lié de façon covalente par l'intermédiaire d'un bras pentaméthylène à une tétrathymidilate non naturelle consistant exclusivement d'unités nucléotide a-anomérique. L'absorption UV et la fluorescence indiquent que le fragment oligonucléotide fournit les éléments de reconnaissance nécessaires pour se lier sélectivement à la séquence complémentaire par appariez ment de base. En comparaison avec l'anomère S- on constate deux différences significatives a) la configuration anomérique a- conduit à un effet de stabilisation supplémentaire dans la formation du complexe avec poly(rA) b) le résidu oxazolopyridocarbazole ne semble pas s'inter caler dans le duplex formé par appariement de base entre l'oligonucléotide a- et poly(rA). EXEMPLE IX : Résistance des substrats &alpha;-T4-C5-OPC vis-à-vis d'un nucléase S1. La dégradation par l'endonucléase S1 a été étudiée comparativement sur les a- et ss-T4-C5-OPC par HPLC. L'intensité du pic a été suivie en fonction du temps de réaction avec nucléase S1 à 370C. Après 20 mn de réaction, le composé a complètement disparu quand la configuration anomérique de la chaîne oligonucléotide est ss, tandis qu'il est encore intact après 30 mn quand la configuration anomérique est a. L'analyse HPLC a été entreprise sur une colonne C18 -Bondapak. L'élution isocratique a été exécutée avec le système suivant : acétonitrile 31 % dans de l'acétate d'ammonium 20 mM (pH 6,5 ; 5 mM par rapport au tétrabutylammonium chlorure). La détection UV a été effectuée à 270 nm. Conditions d'analyse: une solution d'a- ou ss-T4-Cs-OPC (33 nmol.) dans de l'eau (8 al) a été mélangée avec le tampon suivant : acétate de sodium 0,5 M (pH 4,7), chlorure de sodium 3 M et acétate de zinc 0,1 M. Le volume du mélange réactionnel a été complété jusqu'd 300 ml avec de l'eau et ensuite la nucléase S1 (Gibco BRL, 28 unités, 3 Al) a été ajoutée. Le mélange a été incubé à 370C et des aliquotes (20 ssl) ont été retirés à différents moments, mais immédiatement mélangés avec un tampon bloquant : phosphate de sodium 20 mM (pH 6,5, 180 l) et chauffés à 1000C pendant 5 minutes. Des traitements similaires ont été exécutés pour chaque expérience de contrôle. Pour chaque analyse HPLC, un volume de 50 l a été injecté. REVENDICATIONS 1. Composés chimiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodéoxynucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de nucléotides à configuration anomérique non naturelle a. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'enchaînement de nucléotides a est lié par liaison covalente à un agent effecteur, notamment à un radical intercalant ou à un radical chimique réactif ou photoactivable. 3. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils ont pour formule dans laquelle les- radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique a non naturelle les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion un thioanion S (3 , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle;; R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi avec U = O, S ou N ou bien un radical -Y"-O-Y'- où Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y E peut avoir les mêmes significations que X ; J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy Z est un radical correspondant à un agent effecteur n est un nombre entier y compris O L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-. 4. Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que fYE représente un radical choisi parmi avec U = O, S ou N 5. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que Z est un radical intercalant dérivé des composés polycycliques ayant une configuration plane. 6. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que le radical inter calant est dérivé de l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroline, le phénanthridi nium, les porphyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a : 3', 2'-d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellip- ticinium et les dérivés de ces agents intercalants. 7. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que les groupes chimiques réactifs sont choisis parmi les dérivés de l'acide éthylènediamine-tétraacétique, de 1' acide diéthylènetriamine-pentaacétique, des porphyrines, de la 1,10phénanthroline, le psoralène. 8. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que le radical B est choisi parmi la thymine, l'adénine, la cytosine, la guanine, la 4-azido-cytosine ou la 4-azido-thymine et la 8-azido-adénine, l'uracile, la 5-bromo-uracile. 9. Composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils consistent en un oligonucléotide a, lié de façon covalente, notamment par l'intermédiaire d'une chaîne pentaméthylène à un dérivé 2-N-méthyl-9-hydroxy ellipticinium acétate. 10. Procédé de préparation ou d'oligonucléotide a, selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on applique des synthèses au phos ohodiester, phosphotriester, phosphoramîde ou hydrogéno phosphonate classiques pour des anomères ss, mais en partant de nucléosides a. 11. Procédé de préparation d'oligonucléotide a, selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on applique la synthèse au phosphotriester classique pour des anomères ss, mais dans laquelle les dérivés a-nucléotides de guanine sont protégés en position 06 par un groupe supplémentaire, de préférence le N ,N-diphénylcarbamoyl. 12. Procédé de synthèse des composés sans agent effecteur selon l'une des revendications prédé dentes, caractérisé en ce qu'on réalise un synthèse supportée selon la méthode au phosphoroamidite compor tant - une protection en 3' et 5' des nucléotides ou oligo nucléotides de départ avec par exemple du diméthoxy trityl en 5' et du diisopropylaminophosphoramidite de méthyle en 3', - la fonctionnalisation d'un support solide incorporant un dérivé a nucléosidique par un lien par exemple succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé a nucléosidique et un groupement amino du support solide, - l'élongation de la chaîne oligonucléotidique dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purifica tion de l'oligonucléotide prolonqé. 13. Procédé de synthese de composés incorporant un agent effecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on part d'un oligonucléotide sans agent effecteur protégé en 5', dont on fait réagir la terminaison OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont la deuxième fonction est protégée et après déprotection du produit résultant, on lie ledit produit à l'agent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel. 14 . Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la terminaison OH 3' de l'oligomère protégé en 5' est estérifiée avec un acide aminohexanolque, dont la fonction amine est protégée. 15. Application des composés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'ils s'apparient parallèlement à une séquence d 'oligonucléotide ss complémentaire. 16. Application des composés selon la revendication 15 , caractérisée en ce que lesdits composés sont utilisés à titre de sondes d'hybridation ou comme composants de purification pour des séquences déterminées d'ADN ou d'ARN. 17. Application des composés selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce que les composés sont utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN. 18. Application des composés selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que ces composés sont utilisés pour réaliser le blocage spécifique de gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis, tels que des virus, bactéries ou des parasites. 19. Application des composés selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce qu'ils sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences. 20. A titre de médicaments, des composés selon l'une des revendications précédentes.