Brevet FR2613728A1 — publié le 19881014

La présente invention a trait au domaine de l'isolement et de l'identification de souches appartenant à l'ensemble des Candida. Plus précisément elle concerne un milieu sélectif pour ces souches, en tant que produit industriel nouveau, son procédé de préparation et son utilisation en tant que moyen sûr et rapide de diagnostic des infections provoquées par lesdites souches. On sait que l'on a déjà proposé dans le passé des-milieux pour cultiver les Candida en vue de les isoler et de les identifier. Parmi ceux qui ont été exploités on connait le milieu de Nickerson qui comprend en association avec de l'eau un mélange d'agar (en tant que moyen gélifiant), de glucose, de glycocolle (en tant que source d'azote), d'un extrait de levure (en tant que source d'azote, de vitamines et d'oligoéléments, riche en fer - la teneur en Fe du milieu de Nickerson est de l'ordre de 20 à 200 P g/l), d'un sel de bismuth (le citrate de bismuth ammoniacal) et de sulfite de sodium, à un pH de 6,8. Or il se trouve que le milieu de Nickerson n'est pas suffisamment (i) sélectif, dès lors qu'il ne permet pas la culture et l'isolation de Candida pathogènes tels que C. guilliermondii, (ii) spécifique des Candida, car il permet la croissance de bactéries et de champignons différents des Candida, tels que les Saccharomyces qui ont besoin de plusieurs vitamines pour se développer, et (iii) stable dans le temps - les ions sulfite libres nécessaires pour la sélectivité du milieu sont instables à pH voisin de la neutralité ; en pratique le milieu de Nickerson n'est jamais conservé par l'homme du métier, il est utilisé dès qu'il a été préparé. On connait également le milieu de Bernard-Cator qui comprend les ingrédients susénoncés du milieu de Nickerson avec en plus des phosphates, à savoir : (NH4)2HP02PO 4, et du chloramphénicol. Ce milieu présente les inconvénients susvisés du milieu de Nickerson avec la différence que la présence de chloramphénicol empèche de façon substantielle le développement des bactéries. Sa stabilité maximale lors du stockage est de 15 jours à 40C. Suivant l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour résoudre le problème de l'isolement et de itidentification des Candida qui offre l'avantage de pallier les inconvénients précités et assure un diagnostic sûr et rapide des candidoses. Cette nouvelle solution technique repose essentiellement sur 1 uti- lisation d'un milieu aqueux d'isolement et d'identification contenant une source monovitaminique, une teneur en fer faible de préférence inférieure ou égale à 10 P g/l, et un mélange complexe comprenant un hydroxypolysulfite de bismuth et des ions sulfite libres et obtenu par traitement à chaud du citrate de bismuth ammoniacal avec le sulfite de métal alcalin dans de l'acide HC1 0,1 N. La source monovitaminique et la teneur en fer faible est obtenue notamment en remplaçant l'extrait de levure source polyvitaminique et source de fer) par de la biotine et une source d'azote principalement constituée par des aminoacides. Le milieu d'isolement et d'identification de souches pathogènes de Candida suivant l'invention, qui comporte, en association avec de l'eau, de 1'agar, du glucose, une source d'azote principalement constituée par des aminoacides, des oligoéléments, une source monovitaminique, un sel de bismuth, des ions sulfite libres et une source de phosphate de métal alcalin, est caractérisé en ce qu'il comprend, à un pH compris entre 6,9 et 7,3 1. 10 à 30g/l de biotine en tant que source monovitaminique, 2. une teneur en fer inférieure ou égale à 1028 g/l, 3. 6 à 8 g/l d'un hydrolysat acide de caséine en tant que source d'azote principalement constituée d'aminoacides et source d'oligoéléments ; et 4. 8,5 à 9,5 g/l d'un mélange d'hydroxypolysulfite de bismuth et d'ions sulfite libres obtenu par réaction à 65-850C pendant 1 à 5 minutes d'une composition dans HC1 0,lN de 4,75 à 5,25 parties en poids de citrate de bismuth ammoniacal et 3,75 à 4,25 parties en poids de sulfite de sodium ou de potassium, ledit mélange étant préalablement homogénéisé avant d'être introduit sous agitation de façon homogène dans ledit milieu d'isolement et d'identification. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à faire appel à un milieu d'isolement et d'identification homogénéisé comprenant 1. en tant qu éléments nutritifs" - 17 à 19 g/l (et mieux 18 g/l) d'agar, - l1 à 13 g/l (et mieux 12 g/l) de glucose, - 6 à 8 g/l (et mieux 7 g/l) d'hydrolysat acide de caséine ayant une faible teneur en fer (la teneur en Fe dans le milieu selon l'invention étant inférieure ou égale à 10/rg/l), - 10 à 30flg/l (et mmieux 20flg/1) de biotine, - 1,8 à 2,2 g/l (et mieux 2 g/l) de K2HFO4 - 0,8 à 1,2 g/l (et mieux 1 g/l) de KH2P04, - environ 0,05 g/l de chloramphénicol, et 2. en tant que "réactif" - le mélange homogénéisé obtenu par réaction à 65-850C (de préfé rence 800C environ) pendant 1 à 5 minutes (de préférence 1,5 minu tes) de 4,75 à 5,25 g/l (et mieux 5 g/l) de citrate de bismuth ammoniacal avec 3,75 à 4,25 g/l (et mieux 4 g/l) de sulfite de sodium dans 4,2 à 4,8 g/l (et mieux 4,5 g/l) d'une solution aqueuse d'acide HC1 0,1 N. Quand on conserve séparément pendant au moins deux ans l'ensemble des éléments dits "nutritifs" par commodité, d'une part, et le mélange citrate de bismuth ammoniacal/sulfite de sodium sans leur solvant CHCl 0,1 N, d'autre part, on n'observe aucune perte d'activité après avoir préparé le mélange dit "réactif" par incorporation de HC1 0,1 N puis combiné et homogénéisé l'ensemble desdits éléments nutritifs et dudit mélange réactif. Le milieu résultant ainsi obtenu peut être conservé pendant au moins 21 jours à 40C (dans une ambiance non déshydratante) sans perte notable d'activité. Le pouvoir sélectif du milieu suivant l'invention résulte de la présence d'ions sulfite libres et de la réduction de l'hydroxypoly- sulfite de bismuth. Pour renforcer la sélectivité par rapport aux milieux de Nickerson et de Bernard-Cator on a augmenté la teneur en ions sulfite libres. Le complexe insoluble, de couleur blanche, formé par la réaction à chaud du citrate de bismuth ammoniacal et du sulfite de sodium n'est pas stable et sa composition dépend des conditions opératoires mises en oeuvre. La méthodologie exposée ci-dessus conduit à un complexe de composition définie nécessaire pour la spécificité du milieu, ainsi qu à un excès précis d'ions sulfites libres nécessaire pour la spécificité du milieu, ainsi qu'à un excès précis d'ions sulfites libres nécessaire pour la sélectivité dudit milieu. Les besoins vitaminiques des Candida pathogènes sont essentiellement limités à la biotine (et à l'acide nicotinique pour les souches de Candida pseudotropicalis). La suppression de l'extrait de levure de l'art antérieur et son remplacement par la biotine permet de rendre le milieu suivant l'invention sélectif de la plupart des Candida par rapport aux levures qui exigent plusieurs vitamines pour leur développement, en particulier les Saccharomyces, la biotine limitant ou empêchant substantiellement la croissance desdites levures. L'hydrolysat acide de caséine constitue une source d'azote, de sels minéraux et d'oligoéléments. Comme indiqué ci-dessus ledit hydrolysat a une faible teneur en fer. Parmi les hydrolysats disponibles dans le commerce et qui conviennent selon l'invention on peut notamment cités le produit comprenant l'ensemble non-autoclavé des aminoacides connu sous la dénomination commerciale de "Vitamin Assay Casamino-acids" de la société dite. L'hydrolysat acide de caséine, en présence de K2HP04 et KH2P04 (phosphates jouant un rôle important dans la croissance des levures, permet aux souches de Candida guilliermondii de sécréter abondamment dans le milieu un composé vert jaune fluorescent sous U.V., et aux souches de Candida tropicalis et Candida Krusei de développer, en liaison, avec le mélange hydroxypolysulfite de bismuth/ions sulfite libres, une diffusion extracellulaire importante et caractéristique. L'apport de chloramphénicol, antibiotique essentiellement stable et à large spectre permet ici d'inhiber, pendant toute la durée d'activité du milieu suivant l'invention, la croissance de la plupart des bactéries susceptibles d'être rencontrées dans les échantillons à tester. Le milieu suivant l'invention convient à la plupart des souches pathogènes de Candida, notamment celles de C. albicans, C. tropicalis, C. Krusei, C. guilliermondii, C. parapsilosis et C. stellatoidea. Comme indiqué ci-dessus, ledit milieu ne convient pas pour l'isolement et par suite l'identification de C. pseudotropicalis qui requiert pour son développement la présence d'acide nicotinique. Le procédé de préparation du milieu d'isolement et d'identification, que l'on préconise ici est caractérisé en ce que 1. on fait réagir 4,75 à 5,25 g/l de citrate de bismuth ammoniacal avec 3,75 à 4,25 g/l de sulfite de sodium dans une solution aqueuse d'acide HC1 0,1 N, pendant 1 à 5 minutes, à une température comprise entre 650C puis, on homogénéise le milieu réactionnel ainsi obtenu, 2. on incorpore ledit milieu réactionnel ainsi homogénéisé dans une com position aqueuse liquifiée des autres ingrédients dudit milieu d'iso lement et d'identification maintenu à une température d'environ 450C, puis, homogénéise le milieu résultant. Suivant un mode préféré de mise en oeuvre de ce procédé, 1. on liquéfie l'ensemble aqueux des éléments nutritifs du point (1) ci dessus à 65-850C, de préférence au bain-marie bouillant, puis main tient ledit ensemble à 450C, 2. on introduit HC1 0,lN dans le mélange sec du citrate de bismuth ammoniacal avec le bisulfite de sodium, et porte le milieu réactionnel à 65-850C-, de préférence au bain-marie bouillant pendant 1-5 minutes, de préférence 1,5 minutes, puis on homogénéise le milieu réactionnel ainsi obtenu, 3. on introduit dans l'ensemble aqueux des éléments nutritifs maintenu à 450C le milieu réactionnel obtenu au stade (2), puis on homogénéise le milieu résultant.De façon encore plus avantageuse le milieu suivant l'invention tel qu'obtenu homogénéisé au stade (3) est élaboré à par tir de 95 volumes de l'ensemble aqueux des éléments nutritifs et de 4,5 à 5 volumes du milieu réactionnel homogénisé obtenu au stade (2). Dans le tableau comparatif I donné ci-après, on a représenté les compositions des milieux préférés antérieurement connus et celle du milieu préféré suivant l'invention. TABLEAU I Ingrédients Nilieu A Milieu B Milieu C NICKERSON BERNARD-CATOR Suivant l'invention Agar 20 g/l 20 g/l 18 g/l Glucose 10 g/l 10 g/l 12 g/l Glycocolle 10 g/l lO g/l 12 g/l Extrait de levure lg /1 2 g/l Hydrolysat acide - - 7 g/l de caséine Biotine - - 20tg/1 (NH4)2HPo4 1,4 g/l K2HP04 - - 2 g/l RH2P04 - 0,4 g/l 1 g/1 Chloramphénicol - 1 g/1 0,05 g/l Citrate de Bismuth 5 g/l 5 g/l 5 g/l ammoniacal Sulfite de sodium 3 g/l 3,6 g/l 4 g/l HC1 0,1 N 4,5 g/l NOTES (a) milieu à utiliser de façon extemporanée (b) milieu conservé à 4 degrés C dans une ambiance non déshydrogénante On préconise enfin une utilisation du milieu suivant l'invention pour l'isolement et l'identification des Candida essentiellement pathogènes dont les besoins vitaminiques sont limités à la biotine, ladite utilisation étant caractérisée en ce que ledit milieu ensemencé avec un échantillon comprenant au moins une souche de Candida est soumis à une incubation à une température à laquelle la production de riboflavine par ladite souche n'est pas inhibée. En pratique l'incubation est effectuée à une température supérieure à 280C et inférieure ou égale à 370C pendant 24 à 72 heures. L'importance de la production de riboflavine est explicitée ciaprès. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEMPLE 1 Préparation du milieu d'isolement et d'identification de Candida préféré suivant l'invention. La formulation est celle du milieu C du Tableau I. On liquifie 95 ml de l'ensemble aqueux des éléments nutritifs, au moyen d'un bain-marie bouillant, puis maintient ledit ensemble à 450C. On casse l'ampoule contenant 4,5 ml de solvant (HCl 0,1 N) dans un tube contenant le mélange sec de citrate de bismuth amoniacal et de sulfite de sodium. On agite pour dissoudre à froid, puis chauffe ledit tube contenant le milieu réactionnel au moyen d'un bain-marie bouillant pendant 1,5 minutes, en homogénéisant soigneusement (notamment sous agitation) le précipité blanc formé. Le milieu réactionnel résultant est aussitôt incorporé à l'ensemble aqueux des éléments nutritifs maintenu à 450C sous agitation. On homogénéise le milieu résultant. Ce dernier, qui a un pH de 7,1, est alors réparti aseptiquement dans 10 boites de Pétri stériles de 50-60 mn de diamètre à raison de 10 ml/boite. Le milieu, ainsi reconstitué peut être utilisé extemporanément ou conservé à + 40C pendant trois semaines à l'abri de la déshydratation. Dans le cas de cultures pures, une anse prélevée sur milieu Sabouraud, est émulsionnée dans 10 ml d'eau distillée stérile, puis le milieu au sulfite de bismuth est ensemencé en stries serrées avec une anse d'émulsion. L'incubation du milieu se fait à la température optimale de 320C pendant 24 à 96 heures. Les prélèvements pathologiques sont directement ensemencés sur le milieu. EXEMPLE 2 Identification du composé vert-iaune fluorescent sécrété par Candida nuilliermondii Au bout de 4 jours d'incubation à 32 C, le milieu de l'exemple 1 ensemencé avec Candida guilliermondii devient vert sous, et autour de la culture. Examiné en lumière U.V. à 360 nm, il montre une fluorescence intense vert jaune. Cette substance n'a pas pour origine le complexe sulfitique de bismuth puisque le même phénomène se produit dans le milieu fait d'éléments nutritifs. Ce composé est hydrosoluble, insoluble dans l'éther, le chloroforme, l'alcool et l'acétone. Certains microorganismes, en particulier des levures du genre Candida et des champignons synthétisent rapidement de grandes quantités de vitamine B2 (riboflavine), ce qui laissait penser que le composé vert sécrété par Candida guilliermondii pouvait être de la riboflavine. Une analyse chromatographique du pigment sur plaque de cellulose dans l'éluant de Partridge (n-butanol-acide acétique pur-eau : 4-1-5), après purification par la méthode de Crammer (concentration des solutions aqueuses de flavines grâce à leur extractibilité par le phénol et réextraction des flavines en milieu aqueux par addition d'éther à la phase phénolée), montre, effectivement, une tache fluorescente vert jaune de même Rf (0,17) que le témoin de riboflavine-5'-phosphate. Le spectre d'absorption IR du composé purifié a fait apparaître trois pics caractéristiques de la riboflavine à 440 nm, 370 nm, et 265 nm. La quantité de riboflavine excrétée dans le milieu de base après 4-5 jours d'incubation à 320C est de l'ordre de 10 mg/l de milieu (mesure de l'absorption de la lumière à 444 nm après extraction et purification). La synthèse de la riboflavine est en relation avec la concentration de fer dans le milieu. Pour Candida guilliermondii, la quantité optimale est de l'ordre de lOtg/l, une concentration supérieure inhibe la synthèse de vitamine B2 ; dans le milieu de Nickerson où la source d'azote est constituée par de l'extrait de levure riche en fer, la flavinogenèse n a pas lieu. RESULTATS EXPERIMENTAUX L'expérimentation avec des souches pures et des prélèvements pathologiques a montré que le milieu de l'exemple 1 était sélectif et spécifique des Candida pathogènes. La protection est totale vis à vis des bactéries et des champignons. La sélectivité vis à vis des autres levures a été considérablement améliorée . les Saccharomyces ne cultivent pas. La spécificité du milieu pour les Candida pathogènes permet une identification facile (seul Candida pseudotropicalis ne cultive pas, le milieu étant déficient en acide nicotinique). La composition du milieu favorise le dimorphisme des Candida. On note en effet, après 96 heures dtincubation, l'apparition d'un pseudomycélium à la périphérie de la culture (effet Langeron) chez certaines souches de Candida albicans, chez Candida tropicalis et Candida stellatoidea. La filamentation n'apparaît pas chez Candida guilliermondii et Candida parapsilosis. Après 24 heures d'incubation à 320C, apparaissent les colonies brunes de Candida albicans et Candida tropicalis (avec diffusion extracellulaire légère). Après 48 heures d'incubation Candida albicans, Candida tropicalis et Candida Krusei forment des colonies caractéristiques. On retiendra l'as- pect lisse et la couleur noire de Candida albicans, la couleur noire argentée et la diffusion extracellulaire de Candida tropicalis, la couleur brun rouge foncé et l'aspect mat de Candida krusei. Après 72-96 heures d'incubation à 320C, Candida krusei prend un aspect rugueux, gris métallisé avec développement mycélien et donne une diffusion extracellulaire à reflet doré. Candida guilliermondii forme des colonies brun noir et synthétise de la riboflavine. Candida parapsilosis cultive en donnant des colonies brun noir très brillantes, lisses ou rugueuses avec centre plus foncé. Candida stellatoidea forme des colonies brun foncé, granuleuses, radiées, d'aspect mat et métallisé. La température d'incubation joue un rôle important dans la spécificité du milieu, en effet à 280C, température préconisée par Nickerson, la flavinogenèse n'a pas lieu chez Candida guilliermondii et la diffusion extracellulaire n'apparait plus chez Candida tropicalis. Elle joue aussi un rôle fondamental dans la sélectivité du milieu. En effet, à 370C, la sélectivité se limite à Candida albicans et Candida tropicalis , Candida les plus fréquement retrouvés dans les prélèvements pathologiques ; une réponse peut alors être donnée en 24 heures, les deux espèces se différenciant par l'apparition d'une diffusion extracellulaire chez Candida tropicalis. Le tableau II ci-après regroupe les aspects morphologiques et culturaux des différents Candida pathogènes aprèS 48 heures et 72-96 heures d'incubation à 320C. INCUBATION 48 heures 72 - 96 heures 32 degrés C CANDIDA Colonies 1 mm de diamètre Colonies 2-3 mm de diamètre AIBICANS noires, lisses, bombées. noires, lisses, brillantes, coniques, proéminence centrale CANDIDA Colonies 1 mm de diamètre Colonies 2-3 mm de diamètre TROPICALIS noires, lisses, bombées, noires, luisantes, à reflet bords argentés, diffusion argenté, coniques, proéminence extracellulaire : milieu centrale noire diffusion devenant brun et argenté extracellulaire : argenté en surface en surface CANDIDA Colonies 0,5-lmm de Colonies 2-3 mm de diamètre KRUSEI diamétre, brun rouge foncé brun rouge foncé mattes d'aspect mat, aplaties rugueuses, couronne gris métallisé, avec centre surélevé centre foncé surélevé, bords aplatis mycélium incolore diffusion extra cellulaire : milieu brun à reflet doré en surface CANDIDA Petites colonies de Colonies 1 mm de diamètre brun GUILLIERMONDII 0,25 mm de diamètre, brun foncé à noires, d'aspect jaune, d'aspect mat mat, coniques, diffusion de riboflavine colorant le milieu vert jaune fluorescent CANDIDA Colonies 0,5 mm de Colonies 1-2 mm de PARAPSILOSIS de diamètre brunes, lisses diamètre, brun noir, ou rugueuses, bombées, lisses, très brillantes brillantes, bords plus (ou rugueuses), coniques, clairs avec centre plus foncé CANDIDA Petites colonies de Colonies 1 min de diamètre, STELLATOIDEA 0,25 min de diamétre, brun, brun foncé, d'aspect rouge, d'aspect mat métallisées, granuleuses, aplaties, avec bords, radiés Le milieu suivant l'invention qui est sélectif, spécifique et stable, apporte une aide précieuse dans le diagnostic rapide des candidoses, surtout au niveau des laboratoires non spécialisés en mycologie. REVENDICATIONS 1) Milieu d'isolement et d'identification de souches pathogènes de Candida, ledit milieu, qui comporte, en association avec de l'eau, de l'agar, du glucose, une source d'azote principalement constituée par des aminoacides, des oligoéléments, une source monovitaminique, un sel de bismuth, des ions sulfite libres et une source de phosphate de métal alcalin, est caractérisé en ce qu'il comprend, à un pH compris entre 6,9 et 7,3 a) 10 à 30/ b) une teneur en fer inférieure ou égale à 10/lg/l, c) 6 à 8 g/l d'un hydrolysat acide de caséine en tant que source d'azote principalement constituée d'aminoacides et source d'oligoéléments et d) 8,5 à 9,5 g/l d'un mélande d'hydroxypolysulfite de bismuth et d'ions sulfite libres obtenu par réaction à 65-850C pendant 1 à 5 minutes d'une composition dans HCl 0,1 N de 4,75 à 5,25 parties en poids de citrate de bismuth ammoniacal et 3,75 à 4,25 parties en poids de sulfite de sodium ou de potassium, ledit mélange étant préalablement homogénéisé avant d'être introduit sous agitation de façon homogène dans ledit milieu d'isolement et d'identification. 2) Milieu suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend 1. en tant qu'éléments nutritifs - 17 à 19 g/l d'agar, - 11 à 13 g/l de glucose, - 6 à 8 g/l d'hydrolysat acide de caséine ayant une faible teneur en fer (la teneur en Fe dans le milieu selon l'invention étant in férieure ou égale à - 10 à 30ftg/1 de biotine, - 1,8 à 2,2 g/l de K2HP04 - 0,8 à 1,2 g/l de KH2PO4, - environ 0,05 g/l de chloramphénicol, et 2. en tant que réactif - le mélange homogénéisé obtenu par réaction à 65-850C (de préfé rence 800C environ) pendant 1 à 5 minutes de 4,75 à 5,25 g/l de citrate de bismuth ammoniacal avec 3,75 à 4,25 g/l de sulfite de sodium dans 4,2 à 4,8 gjl d'une solution aqueuse d'acide HC1 0,1N. 3) Milieu suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend 1. en tant qu'éléments nutritifs - 18 g/l d'agar, - 12 g/l de glucose - 7 g/l d'hydrolysat acide de caséine ayant une teneur en fer telle que la teneur en Fe dans ledit milieu d'isolement et d'iden tification soit inférieure ou égale à 1OJlgll, - g/l de biotine, - 0 > 05 g/l de chloramphénicol et 2. en tant que réactif, le mélange homogénéisé obtenu par réaction au bain-marie bouillant pendant 1,5 minute de 5 g/l de citrate de bismuth ammoniacal avec 4 g/l de sulfite de sodium dans 4,5 g/l d'une solution aqueuse d'acide HC1 0,1 N. 4) Procédé de préparation d'un milieu d'isolement et d'identification de Candida pathogènes suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que 1. on fait réagir 4,75 à 5,25 g/l de citrate de bismuth ammoniacal avec 3,75 à 4,25 g/l de sulfite de sodium dans une solution aqueuse d'acide HCl 0,1 N, pendant 1 à 5 minutes, à une température comprise entre 65 et 850C, puis, on homogénéise le milieu réactionnel ainsi obtenu, 2. on incorpore ledit milieu réactionnel ainsi homogénéisé dans une com position aqueuse liquéfiée des autres ingrédients dudit milieu d'iso lement et d'identification maintenu à une température d'environ 450C, puis on homogénéise le milieu résultant. 5) Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que 1. On liquéfie l'ensemble aqueux des éléments nutritifs au bain-marie bouillant, puis on maintient ledit ensemble à 45 0C, 2. On introduit HC1 0,1N dans le mélange sec du citrate de bismuth réactionnel à 65-850C, de préférence au bain-marie bouillant pendant 1-5 minutes, de préférence 1,5 minutes, puis on homogénéise le milieu réactionnel ainsi obtenu. 3. On introduit dans l'ensemble aqueux des éléments nutritifs maintenu à 450C le milieu réactionnel obtenu au stade 2, puis on homogénéise le milieu résultant. 6) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 et 5 caractérisé en ce qu'on fait réagir 5 g/l de citrate de bismuth ammoniacal avec 4 g/l de sulfite de sodium et 4,5 g/l d'une solution aqueuse d'acide HC1 0,1N, puis on homogénéise le milieu réactionnel ainsi obtenu, puis l'on incorpore le milieu fonctionnel ainsi homogénéisé dans une composition aqueuse liquéfiée comprenant 18 g/l de l'agar, 12 g/l de glucose, 7 g/l d'hydrolysat acide de caséine, 20/g/1 de biotine et 0,05 g/l de chloramphénicol.