Brevet FR2616803A1 — publié le 19881223

2616B03 La présente invention concerne un procédé de fermentation d'hydrates de carbone pour L'obtention d'un poLysaccharide de type xanthane au moyen de microorganismes du type Xanthomonas, et le polysaccharide obtenu par ce procédé. On sait que la culture aérobie de bactéries du type Xanthomonas dans des milieux aqueux de pH compris entre 6 et 8,5 contenant au moins une source de carbone, une source d'azote, des ions phosphates et des oligoéléments permet d'obtenir une composition de polysaccharide du type xanthane. La source de carbone est généralement constituée par des hydrates de carbone tandis qu'on a décrit l'utilisation comme source d'azote de dresches sèches de distillerie dans US 3.000.790,de peptones dans TAPPI 5 p. 442445 de M.O. BAGBY, I.A. WOLFF et M.C. CADMUS, d'extraits de levure dans Biotechnol. Bioeng (1971) 13 p. 381 de R.A. MORAINE et P. ROGOVIN, de liqueurs de macération dans US 3.335.447 ou de farines de soja dans US 3. 271.267; des farines de céréales comme celles des sorgho apportent à la fois la source de carbone et celle d'azote comme décrit dans US 3.271.267. Les produits couramment utilisés comme source d'azote introduisent dans le milieu des impuretés insolubles ce qui rend difficile la stérilisation du milieu. En outre ces impuretés se retrouvent dans le polysaccharide isolé en fin de fermentation ce qui implique, pour certaines des applications du polysaccharide, de traiter le produit obtenu par divers procédés tels que par exemple filtration ou floculation pour éliminer ces impuretés insolubles qui conduisent à la formation de troubles dans les solutions aqueuses de polysaccharides. Par ailleurs, le xanthane est utilisé, pour son pouvoir épaississant pratiquement indépendant de la température et du pH, dans la récupération assistée du pétrole, comme additif alimentaire dans des formulations pharmaceutiques ou cosmétiques, ou dans la préparation de textiles ou d'explosifs et il est particulièrement important d'avoir une qualité de xanthane à fort pouvoir épaississant, c'est-à-dire dont les solutions aqueuses présentent une forte viscosité. La présente invention concerne un procédé de fermentation qui, grâce à l'utilisation d'une source d'azote convenablement choisie, permet d'obtenir un xanthane à fort pouvoir épaississant, contenant peu d'insolubles, et dont les solutions aqueuses limpides sont très peu colorées, ce qui est avantageux pour de nombreuses applications. Selon l'invention, on utilise comme source d'azote soluble en milieu aqueux, de la gélatine et plus particulièrement une gélatine de faible masse moléculaire. On sait qu'il existe deux types de gélatine: la gélatine de type A qui est obtenue par hydrolyse acide, par exemple par l'acide sulfurique, du collagène présent dans les peaux ou dans les os de porcs et de bovins, et La gélatine de type B qui est obtenue par hydrolyse basique, notamment par Ca(OH)2, du collagène. Les gélatines courantes, de masse moléculaire supérieure ou égale à 20 000 sont des sources d'azote connues, mais qui ne permettent pas d'obtenir les résultats avantageux de l'invention. Il est souhaitable d'utiliser des gélatines de masse moléculaire moyenne inférieure à 5 000 et les gélatines hydrolysées de masse moléculaire comprise entre 1 500 et 2 500 sont particulièrement préférées. On peut introduire dans le milieu de culture une gélatine préalablement hydrolysée soit par chauffage en milieu acide aqueux à un pH action d'une protéase comme décrit dans le brevet FR. 1.501.821. Mais, la gélatine peut aussi être hydrolysée, au moins partiellement, au cours de la stérilisation du milieu de culture, avant l'introduction des microorganismes si le pH, la température et la durée du chauffage, sont convenablement choisis; dans ce cas on préfère introduire au départ des gélatines dont la masse moléculaire, avant la stérilisation hydrolysante, n'est pas supérieure à 10 000. Lorsque la stérilisation est effectuée à un pH sensiblement neutre ou à pH faiblement acide, pendant des temps très courts, inférieurs à 5 minutes, la gélatine mise en oeuvre devra avoir une masse moléculaire inférieure à 3 000. La quantité de gélatine introduite dans le miLieu de fermentation est choisie pour obtenir une teneur en azote total de 0,1 g/L à 1 g/L. Le milieu contient aussi de 5 g/Il à 50 g/l d'hydrates de OS carbone, tels que le glucose, les amidons natifs ou hydrolysés, le saccharose, le lévulose, le fructose, le maltose, les mélasses de betterave ou de canne à sucre, ainsi que de 0,10 à 20 g/l, et de préférence 0,5 à 5 g/L de phosphates, tel que K2HP04, et un ou plusieurs oligo-éléments dont du magnésium à la concentration de 0,025 à 1 g/l de magnésium sous forme d'un sel de magnésium soluble, tel que le sulfate, l'acétate, le chlorure et le nitrate de magnésium. Les bactéries qui permettent d'obtenir un xanthane par fermentation dans ces milieux sont en général du genre Xanthomonas, elle peuvent appartenir à différentes espèces comme Xanthomonas begoniae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas campestris et Xanthomonas phaesoli et autres espèces bien connues de l'homme du métier; on utilise généralement des souches de Xanthomonas campestris. La fermentation est effectuée à un pH qui peut être compris entre 5,5 et 9, et de préférence entre 6,5 et 8, à une température comprise entre 25eC et 35 C et de préférence entre 270C et 32*C. Le milieu est agité et aéré de façon classique; dans ces conditions la durée de la fermentation est de 1 à 6 jours. De façon classique, le procédé mis en oeuvre pour obtenir le polysaccharide selon l'invention comporte plusieurs étapes: 1/ Préparation d'un inoculum à partir d'une souche de Xanthomonas qui pouvait être congelée ou lyophilisée; 2/ éventuellement, croissance des microorganismes dans un milieu de préculture; 3/ production du polysaccharide dans le milieu de fermentation, qui a été inoculé avec les milieux obtenus à l'étape 1 ou 2; 4/ et isolement du polysaccharide. L'isolement du polysaccharide se fait en général par Z616803 précipitation, en introduisant dans le milieu de fermentation un solvant dans lequel le polysaccharide est insoluble. Parmi les solvants généralement utilisés, on peut citer les alcools inférieurs, tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et le OS butanol, ou l'acétone; on préfère l'isopropanol. On peut avant l'étape de précipitation, chauffer le milieu réactionnel à une température comprise entre 80 C et 130 C, pendant 1 à 40 minutes pour détruire les bactéries. On peut aussi traiter avant, ou après la stérilisation, le milieu par un dialdéhyde aliphatique, tel que le glyoxal, moyen connu pour améliorer la dispersibilité aqueuse des polysaccharides; le xanthane est ensuite précipité dans le milieu, isolé par filtration, lavé avec le solvant précipitant puis séché et broyé si nécessaire. On utilise dans ce cas de 0,1 à 1 % en poids de glyoxal par rapport au poids de xanthane sec et en général environ 2 %. Il peut aussi être traité par un dialdéhyde, après son isolement, si l'opération n'a pas été effectuée dans le mitieu de fermentation. Un procédé avantageux consiste à humidifier la poudre de xanthane par une solution de glyoxal dans l'isopropanol aqueux, préparée par mélange de 7 ml de solution aqueuse de glyoxal à 30 % avec 150 ml d'isopropanol; après 20 à 40 minutes de contact, les solvants sont éliminés par chauffage et le polysaccharide sec peut alors être stocké pour être ultérieurement utilisé dans ses applications classiques. Pour améliorer les conditions de fermentation, et notamment diminuer la viscosité du milieu, on peut aussi effectuer La fermentation sur gélatine en émulsion, en présence d'une huile et d'un tensioactif selon un procédé décrit dans EP-A-58364 mettant en oeuvre une émulsion eau dans l'huile et dans EP-A-187092 pour une émulsion huile dans l'eau. Un autre objet de l'invention est la composition de polysacharide du type xanthane obtenue par le procédé de fermentation selon l'invention. Ce polysaccharide est constitué comme tous les produits de ce type, d'unités saccharidiques de type mannose, glucose, et 26 16803 acide glucuronique salifié; certains des groupes hydroxyles sont estérifiés par l'acide acétique et de l'acide pyruvique est lié, par une fonction acétal, à certaines unités mannose. La masse molé- culaire du xanthane selon l'invention est supérieure à 2 000 000, comme pour les xanthanes obtenus à partir d'autres sources azotées. Ses solutions aqueuses ont une viscosité particulièrement élevée, supérieure à celle des solutions de xanthane produit par fermentation dans un milieu contenant de la farine de soja ou des liqueurs de macération du mais, comme source d'azote. Ainsi une solution aqueuse contenant 1 % en poids de KCl et 0,2 % en poids du polysaccharide de l'invention a une viscosité de 200 mPa.s, au moins, mesurée au viscosimètre Brookfield à 240C, alors que, dans les mêmes conditions, celle d'une solution aqueuse du polysaccharide obtenue par fermentation sur farine de soja est de 160 mPa.s environ. Dans ce qui suit, on décrit un exemple de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE a) Préparation de l'inoculum: On ensemence-avec 3 ml de bactéries décongelées de la souche de Xanthomonas campestris déposée sous le n NRRL.B 1459, un milieu MY de culture de revitalisation constitué de: Glucose 10,0 g Pentone 0,5 g Extrait de levure 0,3 g Extrait de malt 3,0 g Eau distillée 1000 g préalablement stérilisé par chauffage durant 20 min à 1200C. Après ensemencement, le milieu est mis à incuber sous agitation à 300C pendant 12 à 18 heures. b) Préculture: La croissance des microorganismes de ltinoculum a lieu ensuite dans un fermenteur de préculture contenant 10 I du milieu constitué de: Glucose 150,0 g Gélatine 20,0 g K2HPO4 8,0 g Mg S04 1,8 g Antimousse 0 à 3,0 g Eau qsp 10 l. Le glucose est préalablement stérilisé par chauffage à pH 4, tandis que les autres constituants du milieu sont stérilisés en mélange, par exemple par chauffage à pH 4,5 et à 1200C pendant 30 minutes. La préculture est poursuivie pendant 20 heures avant de servir à ensemencer le milieu de fermentation. c) Fermentation et production du polysaccharide: Le milieu de fermentation pour un fermenteur de volume utile de 100 l est constitué de: Glucose 3 kg Gélatine 200 g K2HPO4 80 g MgS04 18 g Antimousse O à 30 g Eau qsp 100 l Le glucose est stérilisé seul à pH 4 comme précédemment, les autres constituants sont stérilisés à 120 C pendant 30 minutes, à différents pH, ce qui conduit à des gélatines de masse moléculaire différentes. Avant l'ensemencement avec l'inoculum préparé dans l'étape B le pH du milieu est ajusté à pH 7, et maintenu autour de cette valeur pendant toute la durée de la fermentation. De façon classique, le milieu est agité et aéré pendant toute la fermentation. On indique dans le tableau I, les résultats obtenus en utilisant deux gélatines de type A de masse moléculaire 5 000, de force en gelée et point isoélectrique 6,3 et 6,6 hydrolysées lors de la stérilisation à différents pH. La gélatine 1 est commercialisée par la CieRousselot sous la référence ASF, et la gélatine 2 sous la référence HP50. A titre de comparaison, on a aussi effectué une fermentation en utilisant de la farine de soja comme source d'azote. Le xanthane a été précipité à la fin de la fermentation par introduction de 200 l d'isopropanol dans le milieu; il a été ensuite séparé par filtration et séché par chauffage sous courant d'air. TABLEAU 1 : Source: pH de sté-: Masse: Durée de: Poids de: Producti-: Viscosité: Densité: ::: molécu-: la fermen-: xanthane: vité: de la so-: optique: : d'azote: rilisation: laire: tation: g/kg: g/L/h: lution (a): (b): :: :::milieu:: mPa.s: -... . ...........:....... À -..--- -----------.........: : Farine de: : ::: :: : :soja: 7:: 47 h: 19,2: 0,40: 160: 0,35: :Gélatine: 7:5 000: 70 h: 5: 0,071: -: -: :: 4:4 000: 63 h: 20: 0,32: 230: 0,2: :: 2: 2 000: 55 h: 22,6: 0,41: 205: 0,194: : Gélatine 2: 4: 2 500: 54 h: 22,5: 0,42: 220: 0,168: :: 2:2 000: 53 h: 22,7: 0,43: 225: 0, 174: a) concentration 0,2 g/100mL dans solution aqueuse de KCl à lg/100 ml; mesurée au viscosimètre BrookfieLd à T = 24 C. b) en soLution aqueuse à 0,2 g/100ml et mesuré à une longeur d'onde de 620 nm. 0% o' cb W, 261-6803 REVENDICATIONS 1. Procédé de fermentation d'hydrates de carbone par des bactéries du genre Xanthomonas pour la production d'un polysaccharide du type xanthane, caractérisé en ce que la source d'azote est constituée d'une gélatine de masse moléculaire inférieure à 5 000. 2. Procédé de fermentation selon la revendication 1, caractérisé en ce que La gélatine a une masse moléculaire comprise entre 1 500 et 2 500. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les bactéries appartiennent à l'espèce Xanthomonas campestris. 4. Procédé de fermentation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu comprend de 5g/l à 50g/l d'hydrates de carbone, de 0,5 g/L à 5 g/L de K2HP04, de 0, 025 g/L à 1 g/l de magnésium et une quantité suffisante de gélatine dépolymérisée pour apporter de 0,1 g/L à 1 g/L d'azote total. 5. Procédé de fermentation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la gélatine est hydrolysée au moins partiellement, au cours de la stérilisation du milieu de fermentation. 6. Procédé d'obtention d'un polysaccharide du type. xanthane qui consiste à: a) préparer un inoculum de bactéries du genre Xanthomonas; b) fermenter des hydrates de carbone par lesdites bactéries par le procédé selon l'une des revendications 1 à 5; c) et à isoler le polysaccharide obtenu. 7. Composition de polysaccharide du type xanthane obtenue par Le procédé selon la revendication 6, dont les solutions aqueuses à 0,2 g/100 ml en présence de KCl ont une viscosité supérieure à 200 mPa.s et dont les solutions aqueuses à 0,2 g/100 ml ont une densité optique mesurée à 620 nm inférieure ou égale à 0,2.