Brevet FR2614907A1 — publié le 19881110

PROCEDE D'INCORPORATION DE TEXTILES LORS DE LA COPOLYMERISATION D'ACRVLAMIDE ET D'UN AGENT DE COPOLYMERISATION POUR LA TECHNIQUE D'ELECTROPHORESE EN PLAQUES La présente invention concerne un procédé pour incorporer une matière fibreuse à un copolymère. Il est bien connu que les gels résultant de la polymérisation de l'acrylamide en présence d'un copolymère le N, N'-Méthylène-bisacrylamide par exemple, forment des pores, dont la taille dépend des concentrations respectives des 2 substances. Deux paramètres permettent de caractériser un gel: T= a+b b C= a+b pour 100 ml de solution a= acrylamide (g) b= bisacrylamide (g) T représente le poids total (g) d'acrylamide et de copolymère N, N'-Méthylène-bisacrylamide et C est le rapport de N, N'-Méthylène-bisacrylamide sur la quantité total T (9/9) exprimée en pour cent. - La présente invention est axée sur un gel dit "mou", dont la porosité large est destinée à l'analyse électrophorétique des protéines de haut poids moléculaire, et dont ltétude de l'activité biologique se fait après transfert électrique des protéines du gel de polyacrylamide en plaque sur une membrane de transfert, le gel et la membrane étant en contact étroit lors de cette électroélution. Par l'introduction d'un textile polyester, ou de nature. différente présentant une structure de tissage à trame sans orientation et un aspect soyeux, la présente invention consiste à rendre maniables des gels mous et facilement déchirables lors de toutes les opérations: démoulage des gels de leur cellule après électrophorèse, coloration, décoloration séchage au cours duquel des déformations peuvent subvenir lors du positionnement sur des feuilles de papier filtre ou cellophane des sécheurs de gel, et surtout lors du transfert électrique. En effet le positionnement du gel sur une membrane de transfert de type nitrocellulose ou autre est particulièrement délicat; de plus, le contact par pression papier filtre-membrane de transfert-gel-papier filtre est de rigueur dans tous les dispositifs de transfert électrique. La présente invention modifie les solutions classiques de renforcement des gels mous par l'introduction d'un textile polyester ou autre dont le réseau de fibres peut être de taille variable et non orienté. Le tissage de ces fibres est lâche,il s'intègre comme nous l'examinerons sans controle particulier de la température alors que celle-ci doit être parfaitement contrôlée dans la fabrication de gels mous rigidifiés sous forme de gels mixtes d'acrylamide-agarose.Le procédé décrit ici est également axé vers la préservation de la structure native des molécules et donc de la fonction biologique, en ce sens qu'elle évite tout procédé chimique pouvant faciliter le transfert des molécules soit pardigestion enzymatique de la molécule de haut poids moléculaire étudiée sur le gel après l'électrophorèse, soit par utilisation de copolymères de l'acrylamide chimiquement clivables après l'électrophorèse. Les matières fibreuses qui peuvent être utilisées dans la présente invention peuvent être de plusieurs types, si l'on se place du point de vue de la maniabilité des gels.Ce tissu doit être fin, collé contre une des plaques de verre, de manière à ne pas gêner la migration des échantillons. Cependant, la recherche d'un textile adapté à l'électrophorèse verticale nécessite la présence d'alvéoles ou un tissage lâche permettant l'adhérence du gel sur la plaque de verre de la cellule verticale et évitant ainsi au gel de glisser. Des textiles, sans trame ni chaîne orientées, constitués par une distribution au hasard de fibres textiles sont utilisés ici.Deux tissus ont été testés: l'un en matière fibreuse inorganique constitué de fibres de verre, avec lesquels l'introduction d'un peigne destiné à faire polymériser la partie supérieure du gel sous forme d'alvéoles destinées au dépôt des échantillons, a nécessité d'avoir un peigne plus fin que celui utilisé dans la technique classique, donc une perte pondérale de l'échantillon déposé. Par contre, cette étape se déroule de manière parfaite avec un tissu constitué par exemple par un réseau de fibres organiques 100% polyester ultra-mince et permettant à un peigne de même épaisseur que l'espace compris entre les deux plaques de verre de passer. L'aspect soyeux de ce textile a été particulièrement recherché pour l'introduction du peigne destiné à former les alvéoles d'acrylamide, réalisant ainsi les canaux dtentrée des échantillons. Les textiles de type pelucheux sont à éviter pour l'électrophorèse verticale, le peigne pouvant décoller le tissu, mais sont utilisables en électrophorèse horizontale. Le choix de la matière fibreuse la plus adaptée aux problèmes de transfert doit être envisagée. Bien que les gels soient rendus plus forts avec de la fibre de verre, bien que le transfert des protéines se fasse dans les deux cas, la meilleure image du point de vue reproductivité des bandes est obtenue avec le gel coulé sur textile polyester ou des tissus à structure analogue. D'autre part, des évaluations de rendement de transfert nécessitant quelquefois de colorer le gel d'acrylamide après transfert, exigent de tester les colorations les plus utilisées: par exemple la coloration au bleu de Coomassie R-250 et la coloration à l'argent. Ces tissus type polyester permettent de colorer les protéines sans coloration du fond alors qu'un très important bruit de fond est maintenu sur la fibre de verre. Ces éléments permettent donc de sélectionner préférentiellement un textile 100 polyester d'aspect soyeux pour notre exemple, mais un textile ayant les mêmes propriétés pourrait également convenir. Le mode opératoire est ainsi réalisé: Le dispositif est constitué d'un moule de 2 plaques en verre espacées grâce à deux baguettes dites "espaceurs" positionnés latéralement et quelque soit l'épaisseur des espaceurs déterminant l'épaisseur du gel. -La figure 1 represente en position verticale la vitre sur laquelle est placée le textile (1) qui est qualifiée de vitre "arrière" (2). Les espaceurs sous forme de baguettes (3) sont l'un à gauche, l'autre à droite. Au milieu, le tissu non tissé 100 polyester dans notre exemple est mouillé par la solution d'acrylamide dégazée et sans détergent à ce stade, de manière à ne pas emprisonner de bulles d'air. Il adhère parfaitement à la vitre arrière et dépasse de celle-ci de quelques centimètres, pour le tenir pendant l'introduction du peigne au moment de la polymérisation.La figure 2 représente la fin du montage, la vitre avant (4) étant placée sur les espaceurs (3). Le moule est alors positionné verticalement sur son support de quelque type qu'il soit pour la polymérisation du gel. Le tissu ne se détache pas de la plaque en position verticale. La figure 3 représente en coupe, vue de face, le moule avec le gel polymérisé suivant le mode opératoire suivant Le gel de séparation (5) est coulé dans le dispositif contenant le textile (1) de manière à avoir les dimensions voulues. Ses caractéristiques sont dans notre exemple 3,5Au T 2,6 C dans un tampon 0,4 M Tris-HCl pH 8,3 contenant 0,1% de sodium dodécylsulfate (SDS).La polymérisation est amorcée par 200 pl de solution de persulfate d'ammonium à 10% et 50 pl de N,N, N' ,N'-Tetramethylethylénediamine pour 100 ml de solution d'acrylamide par exemple. La solution est recouverte d'eau durant la polymérisation. Le gel de concentration (6) est alors coulé sur le gel de séparation, une fois l'eau enlevée. Il correspond dans notre exemple aux caractéristiques 3,5% T, 2,6% C dans un tampon 0,075 M Tris-HCl pH 6,8 contenant 0,1% SDS et polymérisé dans les mêmes conditions. Un peigne dont le nombre de dents peut être variable est introduit entre le tissu et la plaque avant afin de pouvoir former dans le gel de concentration des alvéoles (7) destinées au dépôt de l'échantillon. La figure 4 représente en coupe longitudinale vue de profil, l'emplacement du gel d'acrylamide (5, 6) entre la vitre avant (4) et le textile (1) placé sur la vitre arrière (2). Puis le tissu est coupé au niveau de la plaque de verre arrière. L'électrophorèse se fait dans un appareil de type vertical, par exemple dans du tampon de migration 50 mM Tris, 384 mM Glycine pH 8,3 contenant 0,1% SDS à 10 mA/plaque pendant la nuit jusqu'à ce que le colorant de repère tel que le Bleu de Bromophénol atteigne l'extrémité de la plaque. Après électrophorèse, le gel est démoulé de sa cellule en verre, soutenu par le textile, il est équilibré dans le tampon de transfert. Le textile contenu entre les alvéoles du gel supérieur permet de le soulever très facilement sans le déchirer. Au bout d'un temps relativement court nécessaire à l'équilibration du gel et au cours duquel le gel n'est soumis à aucune modification de taille, il est placé pour le transfert face avant contre la membrane de transfert, le textile étant sur la face arrière du gel. La figure 5 représente l'ordre des éléments assurant le contact pendant le transfert : électrode (8) + éponge (9) + papier filtre (10) + feuille de nitrocellulose ou tout autre type de membrane de transfert (11) + gel (5) face avant contre la nitrocellulose + papier filtre + éponge (9) + électrode (8).La superposition indiquée ci-dessus est réalisée de manière à assurer le contact étroit des différents éléments puis l'ensemble est positionné dans une cuve de transfert en présence d'un tampon 25 mM Tris-HCl 150 mM Glycine pH 8,3, 2050 méthanol (v/v), 0,1% SDS par exemple. Le transfert électrique est réalisé dans les mêmes conditions que les autres protéines selon le voltage nécessaire. L'exemple d'ap#plication est choisi pour l'enzyme membranaire de plus haut poids moléculaire connu dans la membrane de la bordure en brosse de cortex rénal de lapin: la Maltase-Glucoamylase, enzyme hydrolysant le maltose et appartenant à la classe des glycoprotéines. Dans l'exemple d'application, l'enzyme est sous sa forme native extraite de la membrane- par un détergent non ionique. Cet exemple est illustré par la figure 6 dans laquelle l'épaisseur des bandes sur le dessin est en relation avec l'intensité des colorations obtenues.L'enzyme est étalonnée sur le gel 3,5% T 2,6% C par exemple par des protéines marqueurs de poids moléculaire compris entre 80 et 669 kDa (12). Son poids moléculaire est voisin de 600 kDa dans l'analyse électrophorétique en milieu sodium dodecylsul fate de l'extrait membranaire en détergent non ionique.Le gel. de l'extrait membranaire coloré au Bleu de Coomassie est représenté sur la figure 6 (13). Au bout d'une heure de transfert, l'activité enzymatique de l'enzyme Maltase-Glucoamylase en présence de son substrat peut être détectée sur la membrane de transfert (14) en présence d'un chromogène se fixant au niveau du site actif sur le produit de la réactionpermettant ainsi d'identifier la bande protéique du gel de polyac#rylamide correspondant à l'enzyme étudié. Au bout de ce même temps de transfert les protéines des extraits membranaires de bordure en brosse de cortex rénal de lapin sont colorées plus ou moins intensément sur la membrane de transfert par une coloration à l'encre de chine par exemple (15). Le procédé permet donc de transférer une protéine de haut poids moléculaire, sans détruire son activité biologique en un temps de transfert comparable à celui de petites molécules. Le gel après transfert d'une heure ne contient aucune trace de protéine (16). Toute autre protéine de haut poids moléculaire est traitable par ce procédé. Tout autre type d'identification peut#être également réalisé, par exemple reconnaissance par un anticorps, par une lectine, etc... Le fait que le gel immobilisé sur le'textile ne modifie pas sa taille au cours des différents bains de coloration, décoloration, et transfert offre la possibilité de relier très facilement l'activité biologique dépistée sur la membrane de transfert à une bande du gel d'électrophorèse.La comparaison de deux parties du même gel polymérisé sur textile est également envisageable avec beaucoup plus de précision, lorsqu'il faut éluer l'enzyme du gel après avoir identifié la zone à éluer par comparaison avec une partie du même gel coloré. Cette facilité de repérage d'une zone à éluer est valable quelle que soit la protéine, quelle que soit la valeur de T et de C et quel que soit le système de tampon utilisé. REVENDICATIONS 1. Procédé pour incorporer une matière fibreuse à un copolymère caractérisé en ce qu'un textile composé d'un réseau de fibres non orientées à tissage lâche et suffisamment soyeux permet une adhérence parfaite du textile (1) à l'une des plaques de verre (2),sur une surface délimitée par les espaceurs (3) du moule dans lequel polymérise le mélange d'acrylamide et d'un agent de copolymérisation et de ce fait ne perturbe pas le champ électrique lors de la technique d'électrophorèse en plaque. 2. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que le textile est adapté à la technique complémentaire d'analyse des protéines qui est le transfert des molécules sur une membrane de transfert (11) du fait de la pénétrabilité du courant électrique à travers le textile. 3. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est appliqué à des gels "mous" à faible porosité utilisé pour l'étalonnage de protéines de haut poids moléculaire (12), et permettant leur transfert complet (16) en un temps comparable à celui des petites molécules. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par l'immobilisation du gel de séparation (5) et de concentration (6) sur le textile lui permettant de garder sa taille de départ quelles qu'en soient les opérations suivant l'électrophorèse: coloration, décoloration, équilibration du gel dans le tampon de transfert et évitant ainsi toute déformation des bandes protéiques lors du transfert. 5. Procédé suivant la revendication.4, caractérisé par une reproduction fidèle du positionnement des bandes protéiques apurez transfert (15) à celles d'un gel non transféré de même taille (13) et donc permettant de relier par comparaison directe une activité biologique dépistée sur la membrane de transfert (14) ou tout autre type d'identification à une bande protéique d'un gel non transféré (13). 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par son aptitude à pouvoir être traité par les colorations par exemple: Bleu de Coomassie R. 250 et coloration-argentine sans bruit de fond. 7. Procédé suivant la revendication 4 caractérisé par une localisation plus aisée d'une bande d'électrophorèse à éluer après comparaison à une partie du gel coloré de même taille. 8. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé par son application à tous les types de gels quelle qu'en soient les dimensions et donc applicable à la manipulation plus difficile des gels minces.