Brevet FR2611913A1 — publié le 19880909

La présente invention concerne un procédé de dosage des formes solubles sériques circulantes des récepteurs Fc gamma de faible affinité, en particulier du récepteur Fc soluble sérique humain; elle concerne également un coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procéde; elle concerne enfin les applications de ce procédé pour le diagnostic de pathologies dans lesquelles sont impliqués les récepteurs sus-indiqués, comme les maladies infectieuses, les maladies auto-immunes, les rejets de greffes, les maladies des complexes humains et les cancers, pour le suivi thérapeutique de l'évolution de ces pathologies, ainsi que pour l'étude des polymorphismes humains. A la surface de nombreuses cellules, notamment les cellules du système immunitaire (macrophages, lymphocytes B, polynucléaires, cellules NK etc.) , existent des récepteurs qui permettent une relation entre les anticorps ou immuno- globulines et ces cellules de l'immunité. Ces récepteurs ont une affinité pour le fragment Fc des anticorps (FcR). Ce fragment Fc correspond à la partie non pourvue d'activité anticorps des immunoglobulines. L'importance de ces récepteurs est considérable, car c'est par leur inter- médiaire que peuvent se faire la reconnaissance des antigènes étrangers (virus, cellules tumorales, etc.) et l'initiation d'une réaction cytotoxique par les lymphocytes T ou humorale avec sécrétion d'anticorps spécifiques par les lymphocytes B; la phagocytose, c'est-à-dire l'extraction des tissus et du sang des particules reconnues comme étrangères par les cellules du système réticulo-endothélial (monocytes, macrophages); les coopérations cellulaires entre les différentes cellules de l'immunité; le transfert transplacentaire des anticorps de la mère vers le foetus; et la clairance des complexes immuns dont on sait le rôle pathogène dans de nombreuses affections. 2 6 11 9 13 L'exixtence d'une sécrétion de ces recepteurs pour le fragment Fc (FcR) par des cultures de cellules T de souris, activees par un activateur spec1fique a tee mise en évidence. Ces molécules de récepteur Fc, sécrétées i. vitro, dans des conditions très particulières d'activation et de culture (notamment en milieu dépourvu de tout sérum entrainant une souffrance des cellules en culture) possèdent encore la capacité de lier, par leur fragment Fc, les immunoglobulines et elles ont donc été baptisées "immunoglobulin binding-factor") type d'IBF a été démontrée pour trois classes d'immuno- globulines IgG, IgA, IgE, à savoir les facteurs IgGBF, IgABF et IgEBF. Il a par ailleurs été démontré que ces molécules d'IBF sont capables, lorsqu'elles sont en contact avec des lymphocytes B en culture, voire même des cellules myélomateuses in vitro, d'inhiber totalement l'activation de ces cellules et, par là même, la sécrétion d'immuno- globulines par ces cellules B ou myélomateuses. Il s'agit donc de molécules sécrétées par des cellules appartenent au système immunitaire dans des conditions artificielles de culture in vitro, mais douées néanmoins d'une capacité fonctionnelle à lier les anticorps et à entrainer une supression importante de l'activation du système lymphocytaire B (lymphokine). L'existence d'un récepteur Fc pour les immuno- globulines IgG de souris (FcR) dans le sérum de souris a été démontrée. Ces molécules ont été définies, à la fois par leur capacité à être reconnues par un anticorps monoclonal spécifique des récepteurs Fc gamma de souris (anticorps monoclonal 2.4G2) et leur capacité fonctionnelle à être purifiées à partir de fragments Fc d'immunoglobuline. Cette découverte est extrêmement intéressante, car cette lymphokine est sécrétée avec un taux qui croit en fonction de l'age (taux nul à la naissance, apparaissant vers le cinquième Jour chez les souriceaux nouveau-nés et devenant systématiquement détectable vers le septiëme jour) , que ce taux est d'autant plus grand qu'il existe des infections ou, d'une iaçon plus générale, que le système immunitaire est stimulé (les souris étant maintenues en milieu exempt de microbes ayant des taux strictement nuls tout au long de leur vie), ce taux étant par ailleurs relativement déterminé par des facteurs génétiques au sein d'une population de souris homozygotes. En outre, on a maintenant découvert, dans le sérum humain, l'existence d'une lymphokine ayant la capacité de se fixer sur les fragments Fc d'immunoglobuline, à savoir la forme soluble sérique circulante des récepteurs Fc gamma de faible affinité, désignée aussi par l'abréviation Fc-gamma RLo. La présente invention porte sur un procédé de détection et de dosage de ces lymphokines ayant la capacité de se fixer sur les fragments Fc d'immunoglobuline, notamment du récepteur Fc soluble sérique humain. Le procédé selon la présente invention pour le dosage de la forme soluble sérique circulante des récepteurs Fc gamma de faible affinité, est caractérisé par le fait qu'il consiste à: (a) fixer, sur une phase solide, un premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel du récepteur Fc gamma à doser; (b) laver ladite phase solide pour éliminer ledit premier anticorps non couplé; (c) mettre à incuber l'échantillon renfermant le récepteur Fc gamma à doser en présence de la phase solide revêtue dudit premier anticorps; 2 6 1 1 9 1 3 catégorie de récepteurs Fc mais par un épitope totalement différent; (f) laver pour éliminer ledit second anticorps non spécifiquement fixé; (g) mettre a incuber, en présence de la phase solide résultante, un troisième anticorps, qui est un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit second anticorps; (h) laver pour éliminer le troisième anticorps non spécifiquement fixé; et, (i) doser le troisième anticorps fixé et en déduire la quantité de récepteur Fc initialement présente dans l'échantillon. A l'étape (a), on utilise notamment, comme premier anticorps, l'anticorps monoclonal 3G8. A l'étape (e), on utilise notamment, comnme second anticorps, une IgK de souris consistant en l'anticorps monoclonal anti-Leu llb. A l'étape (g) on utilise, notamment, comme troisieme anticorps, un anticorps polyclonal, à savoir un anticorps de chèvre anti-IgM de souris. Conformément à un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé selon l'invention, à l'étape (g), on met en oeuvre un troisième anticorps marqué par une enzyme et, à l'étape (i), on ajoute un substrat colorimetrique de ladite enzyme, et, après avoir fait cesser la réaction colorimétrique, par exemple en ajoutant une solution aqueuse d'acide sulfurique, on lit la variation colorimétrique, de laquelle on déduit la quantité de récepteur Fc recherchée. En effet, la variation colorimétrique est proportionnelle à la quantité du troisième anticorps, et, de ce fait, proportionnelle à la quantité de deuxième anticorps, et donc de récepteur Fc présent initialement dans l'échantillon. De préférence, l'enzyme est la peroxydase, notamment la peroxydase de raifort, et le substrat colorimétrique de la peroxydase est l'orthophénylènediamine, en présence d'eau oxygénée, la lecture colorimétrique étant effectueée à 492 nm. L'incubation de l'étape (a) pour la fixation du premier anticorps sur la phase solide, est effectuée, par exemple, à une température de l'ordre de 4 C, pendant une période de temps allant de 8 à 12 heures. Quant aux incubations des étapes (c), (e.) et (g>, elles sont effectuées notamment à la température ambiante sur une période de temps allant de 1 à 4 heures. I0 Le schéma ci-annexé explique le dosage selon l'invention. La lymphokine recherchée, qui est dosée spécifiquement par ce procédé, comporte un premier site de capture par le premier anticorps (3G8), et un deuxième site de détection par la séquence aLeu llb-anticorps de chèvre anti-IgM de souris et peroxydase. La présente invention a également pour objet le coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé, ce coffret comprenant: un support solide, notamment une plaque de microtitration, pourvu d'un premier anticorps qui est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel du récepteur Fc gamma à doser; - un second anticorps, qui est un anticorps monoclonal anti-récepteur Fc, reconnaissant la même catégorie de récepteurs Fc mais par un épitope totalement différent; - un troisième anticorps, qui est un anticorps capable de reconnaître spécifiquement le second anticorps; - un système de dosage dudit troisième anticorps. Ces trois anticorps de même que le système de dosage du troisième anticorps ont été définis ci-dessus. Comme détecteur de bruit de fond, c'est-à-dire, comme contrôle négatif, on utilise des sérums xénogéniques (veau foetal, cheval, chèvre). Comme standard permettant d'assurer un contrôle positif qualitatif de la méthode, on utilise un sérum connu positif et, pour pouvoir quantifier la méthode, on utilise un extrait de polynucléaires humains. Ces polynucléaires sont purifiés selon les techniques classiques de purification, ils sont comptes et ils sont ensuite lyses par un détergent doux ne détruisant pas les structures conformationnelles des récepteurs de polynucléaires qui ne pourraient plus, par la suite, être reconnus au cours du test par l'anticorps 3G8, et, sachant le nombre de récepteurs Fc par polynucléaire, le nombre de polynucléaires au départ et les différentes dilutions auxquelles ces polynucléaires sont testés, il est possible, par une relation simple, de déterminer la correspondance en récepteurs Fc solubles des sérums testés par rapport à un nombre théorique de récepteurs Fc de polynucléaires détectés dans le lysat cellulaire. On utilise notamment un lysat de polynucléaires humains, purifié selon les techniques classiques, lysGes uniquement avec une solution aqueuse d'octylthio bêta d-glucoside 30 mM + 5 mM de DFP à 4 'C. Les applications de ce procédé sont essen- tiellement des applications diagnostiques et de suivi de l'utilisation thérapeutique de ces lymphokines. Celles-ci sont en effet des substances don-z les variations sort liées à l'activation fine du système lymphocytaire B et/ou du système macrophagique, et dont la variation du taux permet de déterminer l'état de stimulation de ce système. Ceci est d'un intérêt majeur dans les maladies infectieuses, les maladies auto-immunes, les rejets de greffes et les cancers. Par ailleurs, après injection de la lymphokine (récepteur Fc humain), il est possible, grâce à ce test, de doser l'évolution des taux sériques et, par la même, de gérer avec plus d'efficacité et moins de toxicité les possibilités thérapeutiques de cette lymphokine en médecine humaine. En effet, une telle lymphokine est capable, comme son homologue in vitro, d'inhiber spécifiquement la sécrétion d'une classe d'immunoglobulines et donc d'arrêter un mécanisme effecteur dans certaines pathologies, telles que les maladies précitées, sans pour autant, du fait de sa spécificité en effet, un récepteur pour les IgG n'entraînera l'inhibition que de la sécrétion d'IgG - entrainer une inhibition de la sécrétion des autres ciasseS- d'immunoglobuiines, permettant donc au malade de ne pas être pour autant imuno-déprime. De même, en bloquant les fragement Fc d'immuno- globulines déjà engagés dans une réaction antigène-anticorps délétère (comme pour les autoanticorps an-i-plaquettaires dans le purpura thrombopénique idiopathique par exemple), cette lymphokine pourra empêcher la relation entre ces complexes immuns et les cellules du système réticulo- endothélial qui normalement auraient phagocyté ces antigènes dans l'exemple choisi). On décrira ci-après un mode de réalisation particulier du procédé de dosage de l'invention. (1) Préparation des plaques de microtitration Les plaques de microtitration utilisées sont des plaques en poly(chlorure de vinyle), à fond en U, à 96 puits (fabriquées par la Société " ). L'anticorps monoclonal 3G8 est versé, à raison de 3 Mg par puits, dans 100 yl de tampon carbonaté à pH 9,6. L'incubation dure de 8 à 12 heures à la température de 4'C. (2) Lavage On lave 6 fois avec du PBS (Phosphate Buffered Saline) contenant 0,1% v/v de Tween 20. Cette solution de lavage, que l'on aura l'occasion d'utiliser encore dans la suite de ce dosage, sera maintenant désignée plus simplement par l'expression "PBS Tween". (3) Dépôt de l'échantillon à doser On dépose, dans chaque puits, 100 1l de l'échantillon à doser, pur ou dilué dans du PBS Tween que l'on a laissé pendant 4 heures & 22'C environ (température ambiante). (4) Lavage Ce lavage est effectué de le meme façon qu'a l'étape (2n. (5) L t dtLiCO ant'i-la b On dépose, dans chaque puits, 80 ng d'anticorps anti-leu-llb (provenance: Beckton-Dickinson) dilué dans pl de PBS Tween. L'incubation est effectuee Dendant 2 heures à 22 C environ. (6) Lavage Ce lavage est effectue de la meme façon qu'a l'étape (2>. (7) Dépôt d'anticorps de chèvre anti-IZM de souris conjugue à de la peroxydase de raifort On introduit l'anticorps sus-indiqué (provenance: Jackson Immuno-Research Laboratories Inc.>, dilué au 1/5000 dans du PBS Tween réalisant au total 100 pl par puits. On fait incuber pendant 1 heure à 22'C. l'étape (2). (9> Dépôt du substrat colorimrtrique de la peroxvdase On dépose 150 pl par puits de tampon citrate phosphate contenant 4 mg/ml d'orthophénylène diamine et 0,8 pl/ml d'eau oxygénée. On arrête la réaction colorimétrique par le dépôt de 75 p1 par puits d'une solution aqueuse d'acide sulfurique à 10% et on lit le résultat à 492 nm dans un appareil de lecture d'ELISA. Grâce au procede de dosage selon la présente invention, on a mis en évidence dans le sang humain une molécule correspondant à une forme soluble sérique du récepteur de faible affinité pour le fragment Fc des IgG. On a purifié ce récepteur soluble grâce à une chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose couplée à des anticorps 3G8 éluéepar une solution 0,5 molaire d'acide acétique neutraliséepar du bicarbonate d'ammonium. Il est possible grâce au procédé de la présente invention de déterminer de façon quantitative quelles sont les frac:ions d'e!ution qui contiennent le récepteur soluble purifie a partir du serum. Une rurification plus complète e=t ernsuite réalisee par chromatographie sur colonne ae Superose 6r Kyélome Multiple ou maladie de Kahler. 2 - Maladie des complexes immuns ou maladies s'accompagnant de la présence de complexes immuns tissulaires ou sériques, telles que lupus érythémateux et autres maladies auto-immunes. 3 - Lymphomes et leucémies, notamment le lymphome de Burkitt. 4 - Rejet de greffe de moelle ou d'organe (foie, rein, coeur par exemple) à titre curatif ou préventif. - Déficits immunitaires acquis et, notamment, au cours des infections par le virus HIV. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour le dosage des formes solubles sériques circulantes des recepteurs Fc gamma de faible affinité, caractérise par le fait qu'il consiste a (a) fixer, sur une phase solide, un premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel du récepteur Fc gamma à doser; (b) laver ladite phase solide pour éliminer ledit premier anticorps non couple; (c) mettie à incuber l'échantillon renfermant le récepteur Fc gamma à doser en présence de la phase solide revêtue dudit premier anticorps; (d) laver pour éliminer le matériel non spécifiquement fixé audit premier anticorps; (e) mettre à incuber, en présence de la phase solide résultante, un second anticorps, qui est un anticorps monoclonal anti-récepteur Fc reconnaissant la même catégorie de récepteurs Fc mais par un épitope totalement différent; (f) laver pour éliminer ledit second anticorps non spécifiquement fixé; (g) mettre a incuber, en présence de la phase solide résultante, un troisième anticorps, qui est un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit second anticorps; (h> laver pour éliminer le troisième anticorps non spécifiquement fixé; et, (i) doser le troisième anticorps fixe et en déduire la quantité de récepteur Fc initialement présente dans l'échantillon. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape (a), on utilise, comme premier anticorps, l'anticorps monoclonal 3G8. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'à l'étape (e), on utilise, comme second 2 6 1 1 9 13 11' anticorps, une IgX de souris consistant en l'anticorps anti- leu 11b. 4 - Proced selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'à l'étape (g), on utilise, comme troisième anticorps, un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgK de souris. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'à l'étape (g), on met en oeuvre un troisième anticorps marqué par une enzyme et qu'a l'étape (i) on ajoute un substrat colorimétrique de ladite enzyme, et,après avoir fait cesser la réaction colorimétrique,on lit la variation colorimétrique de laquelle on déduit la quantité de récepteur Pc recherchée. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'enzyme est la peroxydase, notamment la peroxydase de raifort et le substrat colorimétrique de la peroxydase est l'orthophénylène diamine en présence d'eau oxygénée, la lecture colorimétrique étant effectuée à 492 nm. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'incubation de l'étape (a), en vue de la fixation du premier anticorps sur la phase solide, est effectuée à une température de l'ordre de 4'C, pendant une période de temps allant de 8 à 12 heures. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les incubations des étapes (c), (e) et (g) sont effectuées à la température ambiante, sur une période de temps allant de 1 à 4 heures. 9 - Coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une des revendication 1 a 8, caractérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide, notamment une plaque de micro- titration, pourvu d'un premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel du récepteur Fc gamma à doser; un second anticorps, qui est un anticorps monoclonal anti-récepteur Fc, reconnaissant la même catégorie de récepteurs Fc mais par un epitope totalement different; - un troisième anticorps, qui est un anticorps capable de reconnaître spécifiquement le second anticorps; - un système de dosage dudit troisième anticorps. - Coffret selon la revendication 9, caractérisé par le fait que le premier anticorps est l'anticorps monoclonal 3G8, le second anticorps est un anticorps monoclonal consistant en une IgM de souris, soit l'anticorps anti-leu llb, et le troisième anticorps est anticorps polyclonal de chèvre anti-IgM de souris. 11 - Coffret selon l'une des revendications 9 et , caractérisé par le fait que le système du dosage du troisième anticorps comprend une enzyme conjuguée audit troisième anticorps, un substrat colorimétrique associé à ladite enzyme et une substance destinée à arrêter la réaction colorimétrique. 12 - Coffret selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'enzyme est la peroxydase, notamment la peroxydase de raifort, le substrat associé à ladite enzyme est l'orthophénylène diamine en présence d'eau oxygénée et la substance destinée a arrêter la réaction colorimétrique est une solution aqueuse d'acide sulfurique. 13 - Application du procéde tel que défini à l'une des revendications 1 à 8 au diagnostic et au suivi de la thérapeutique de maladies mettant en jeu les récepteurs Pc, en particulier les maladies infectieuses, les maladies auto- immunes, les reJets de greffes et les cancers. 14 - Application du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 8 à l'étude des polymorphismes humains.