Brevet FR2621695A1 — publié le 19890414

La présente invention concerne un réactif de lyse pour la détermination d'au moins trois populations de leucocytes par l'utilisation d'un système automatique d'analyse du sang. La séparation des leucocytes par une distribution volumique est considérée aujourd'hui comme un procédé de diagnostic clinique. Chaque type de globule dans le sang circulant à son propre volume caractéristique 9 m en moyenne pour les plaquettes 3 et 900/m3 pour les cellules polynucleaires. I1 est bien connu que la forme et la taille d'une impulsion électrique générée par une particule se déplaçant à travers un champ électrique est fonction de la forme. du volume et de la résistivité de la particule que l'on souhaite compter. Les membranes des cellules d'un échantillon de sang dilué dans une solution électrolytique isotonique ont une résistivité bien plus grande que l'électrolyte et peuvent étre considérées comme non conductrices. La lecture des impulsions electriques générées par le passage dans un champ électrique des cellules du sang dilué dans un électrolyte. permet de différencier les cellules en fonction de leur taille. Les globules rouges et les cellules lymphocytaires ayant approximativement la mëme taille ne peuvent etre différenciés sauf si on fait varier leur volume. Pour cela. il est bien connu qu'en utilisant un agent de lyse puissant. les globules rouges sont réduits en de petites particules ou solubilisées et la taille des leucocytes est réduite â celle de leur noyau. On peut ainsi compter les leucocytes mais leur distribution volumétrique ne permet pas de les différencier entre eux. Il est connu (brevet français n 2.484.649) qu'un agent de lyse avec au moins un sel d'amonium quaternaire, utilisé avec un diluant isotonique approprié. permet de différencier les leucocytes en deux populations lymphoides et myéloides des leucocytes. Il est connu également (brevet US 4.485.175) qu'un système de réactifs comprenant un agent de lyse avec au moins deux sels d'ammonium quaternaire. utilisé avec une méthode appropriée, peut permettre de différencier les leucocytes en trois populations lymphocytes, monocytes et granulocytes. Parmi les granulocytes, il est souhaitable de differencier les éosinophiles des autres granulocytes pour un meilleur diagnostic médical, chose que les techniques antérieures rappelees ci-dessus ne permettent pas. La présente invention concerne un réactif de lyse qui utilise un sel d'ammonium quaternaire. au moins un sel d'ammonium tertiaire et au moins un agent protecteur des leucocytes afin Justement de mieux séparer les populations de leucocytes et, en particulier, les éosinophiles des granulocytes. Les molécules du sel d' ammonium quaternaire agissent comme des aiguilles perforatrices des membranes des cellules du sang - les globules rouges perforés n'ayant pas de noyau, perdent leur cytoplasme et leur membrane se réduit en de petites particules: - les cellules mononucleaires perdent leur cytosol à travers la membrane perforée, et celle-ci vient se plaquer sur le noyau qui occupait presque tout le volume de la cellule. Il est ainsi possible de différencier les lymphocytes, dont le diamètre moyen est inférieur à celui des monocytes. - les cellules polynucléaires perdent également leur cytosol à travers leur membrane perforée mais les granules du cytoplasme vont plus ou moins boucher les zones perforées en fonction de la taille des granules et ainsi laisser échapper plus ou moins de cytosol. Les éosinophiles avec de gros granules seront différenciés des neutrophiles qui ont de petits granules. Les globules rouges ayant été réduits en de petites particules par l'action du sel d'ammonium quaternaire, ces petites particules peuvent être confondues avec des lymphocytes de petite taille. Pour remédier à cela, il est ajouté au réactif un sel d'ammonium tertiaire ou un mélange de sels d'ammonium tertiaire qui solubilise les petites particules et évite leur agrégation. Pour diminuer l'action du sel ou du mélange de sels d ' ammonium tertiaire dont les molécules, comme celles du sel d ammonium quaternaire agissent comme des aiguilles qui perforent les membranes des leucocytes, il est ajouté au réactif de lyse un agent protecteur, qui agit comme un bouclier pour diminuer l'action des aiguilles sur les membranes. L agent protecteur utilisé est de préférence un produit dérivé de l adamantane ayant des fonctions carbonyles (cétone. ester} ou sous forme de chlorhydrate d'amine pour qu'il puisse se fixer facilement sur les membranes cellulaires soit par liaison chimique, soit par liaison ionique. Par effet stérique, ces molécules occupent un espace interdisant aux molécules du sel d'ammonium quaternaire et du ou des sels d'ammonium tertiaire d'approcher et de venir perforer les membranes des cellules. C'est par la gamme de concentration de l'agent protecteur et des sels d'ammonium que l'on peut séparer les populations de cellules de sang. Il peut ëtre également rajouté au réactif de lyse un cyanure de métal alcalin pour convertir l'hémoglobine, contenue dans les globules rouges, en un chromagéne. Comme agent de formation du chromagéne, il peut ëtre utilisé d'autres agents comme le réactif de Drabkin qui contient du ferricyanure de potassium et du bicarbonate de sodium. Le réactif de lyse selon la présente invention peut ëtre utilisé sur les appareils automatiques d'analyse de cellules du type MINOS STX de la Société ABX de France. Le réactif selon la présente invention est une solution aqueuse contenant comme composés actifs un sel d ammonium quaternaire associé à au moins un sel d' ammo- nium tertiaire, un agent protecteur des leucocytes et un cyanure de métal alcalin. Le sel d'ammonium quaternaire est du chlorure de dodécyltriméthyl ammonium, couramment employé comme agent de stomatolyse. Le ou les sels d'ammonium tertiaire sont choisis dans un groupe de composés ayant pour formule ou Ri est un radical alcoyle à chaine longue ayant de 10 à 18 atomes de carbone et R2 et R3 sont des radicaux alcoyle à chaine courte ayant de un à trois atomes de carbone et X est un ion halogénure Cl, Br ou I. Les sels d'ammonium tertiaire préférés sont ceux avec un radical alcoyle C12 ou C14. Par exemple : chlorure de dodécyldiméthylammonium et/ou bromure de tétradécyldiméthylammonium L'agent protecteur des leucocytes est un produit dérivé de l'adamantane. Par exemple. il peut ëtre utilisé du chlorhydrate de 2-adamantanamine et/ou du 2-adamantanone. Dans la mesure ou l'on souhaite mesurer également avec ce réactif de lyse l'hémoglobine contenue dans les globules rouges. il peut ëtre rajouté au réactif un agent de formation du chromogène tel que le cyanure de potassium dans des proportions pouvant varier de 0,1 g à 0.8 g/l de solution. Les compositions préférees du réactif de lyse sont décrites ci-dessous chlorure de dodécyltriméthylammonium : 15 à 60 g /1 chlorure de dodécyldiméthylammonium : 0,5 à 5 g/l chlorhydrate de 2-adamantanamine : 0,01 à 0.05 g/l ou chlorure de dodécyltriméthylammonium : 15 à 60 g/l bromure de tétradécyldiméthylammonium: 0,5 à 4 g/l 2-adamantanone : 0,01 à 0.05 g/l ou chlorure de dodécyltriméthylammonium : 15 à 60 g/l bromure de tétradécyidiméthylammonium : 0,5 à 4 g/l 2-adamantanone : 0,005 à 0,025 g/l chlorhydrate de 2-adamantanamine : 0.005 à 0,025 g/l Aux melanges ci-dessus, il peut ëtre rajouté, afin de mesurer l'hémoglobine, 0,1 à 0.8 g de cyanure de potassium par litre de réactif de lyse. Pour illustrer la présente invention on donnera les exemples suivants qui ont été expérimentés sur un analyseur de cellules MI NOS de la société fran çaise ABX La composition du réactif de lyse pour les deux exemples ci-apres est pour un litre de solution chlorure de dodécyltriméthylammonium : 20 g chlorure de dodécyldiméthylammonium : 2,5 g chlorhydrate de 2-adamantanamine : 0,02 g cyanure de potassium : 0.3 g eau q.s.p l litre Exemple 1 La distribution de la taille en /um des leucocytes est representée sur la figure 1 annexée avec quatre populations différenciées de leucocytes. Cette distribution leucocytaire correspond à un sang normal humain contenant peu d'éosinophile. ExemDle 2 3 La distribution de la taille en ,um des leucocytes est représentée sur la figure 2 annexee. Cette distribution leucocytaire correspond à un sang humain contenant une forte proportion d'éosinophile. Sur les figures 1 et 2, les différentes parties des courbes indiquées représentent les populations de cellules suivantes 1 : population des lymphocytes 2 : population des monocytes 3,4,5 : population des granulocytes dont la Partie 5 représente la population des éosinophiles. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre illustratif et nullement limitatif et que toute modification pourra y ëtre apportée sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Réactif de lyse pour la détermination des populations de leucocytes par différenciation volumétrique, caracterisé en ce qu'il comprend un mélange d'une solution aqueuse de a) : un sel d'ammonium quaternaire b) : au moins un sel d'ammonium tertiaire c) : un agent protecteur des leucocytes à une gamme de concentration permettant de différencier par leur volume, les leucocytes, en au moins trois populations dont les éosinophiles.- 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel d'ammonium quaternaire est le chlorure de dodécyltriméthylammonium. 3. Reactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium tertiaire sont choisis dans un groupe de composés ayant pour formules où R1 est un radical alcoyle à chaine longue ayant de 10 å 18 atomes de carbone et R2 et R3 sont des radicaux alcoyles à chaine courte ayant de un à trois atomes de carbone et X est un un ion halogénure Cl, Br ou I. 4. Réactif selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'agent protecteur de leucocytes est un dérivé de l'adamantane. 5. Réactif selon la revendication 4. caractérisé en ce que le produit dérivé de l'adamantane est une cétone ou un ester ou un chlorhydrate d'amine ou un mélange de ces produits. 6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la cétone est la 2-adamantanone, et le chlorhydrate d'amine est le chlorhydrate de 2-adamantanamine. 7. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. caractérisé en ce que le chlorure de dodécyltriméthylammonium est présent dans une gamme de concentration comprise entre 15 et 60 g par litre de réactif. 8. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le ou les sels d ammonium tertiaire comprennent dans leur formule au moins un radical alcoyle en C12 ou C14. 9. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium tertiaire sont : un chlorure de dodécyldiméthylammonium dans une gamme de concentration de 0,5 à 5 g par litre de réactif ou un tétrabromure de dodécyldimèthylammonium, dans une gamme de concentration de 0,5 à 4 g par litre de réactif ou un mélange d'au moins ces deux sels d'ammonium tertiaire dans une gamme de concentration de 0,5 à 5 g par litre de réactif. 10. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'agent protecteur de leucocytes, lorsqu'il est un dérivé de l adamantane, est dans une gamme de concentration de 0,01 à 0,05 g par litre de réactif. 11. Réactif selon l'une quelconque des revendications de là 10, caractérisé en ce que l'on utilise de plus un cyanure de métal alcalin pour transformer l'hémoglobine en chromagéne.