Brevet FR2617186A1 — publié le 19881230

MARQUEUR POUR SONDE GENETIQUE Les sondes génétiques actuelles utilisent une séquence d'opérations : le liquide contenant 1'ADN où l'on veut reconnaître la présence éventuelle dtune certaine séquence est posé, sous forme de goutte sur une feuille de nitrate de celullose; 1'ADN est fixé sur cette feuille au moyen d'un échauffement, puis l'on verse- su-r cette feuille une solution contenant un brin d'ADN complémentaire de celui que l'on recherche. Si L'ANS recherché est présent, 1'ADN complémentaire s'y apparie. Le problème est alors de reconnaître la présence du brin d'ADN complémentaire. Il existe pour cela deux méthodes les sondes chaudes et les sondes froides. Les sondes chaudes utilisent un ADN complémentaire marqué par du radiophosphore, dont la radioactivité est décelable. Ces sondes sont sensibles, mais le maniement d'un radioisotope à courte vie est rebutant pour beaucoup de laboratoires d'analyse. Les sondes froides agissent au moyen d'une enzyme fixée au brin d'ADN complémentaire. Cette enzyme catalyse une réaction qui fait apparaître une coloration. Ces sondes sont comodes d'emploi, mais environ 100 fois moins sensibles que les sondes chaudes. Le présent brevet décrit un marqueur qui, fixé à 1'ADN complémentaire, permet de déceler, sans radioactivité, la présence de quelques molécules d'ADN complémentaire dans une zone d'analyse de quelques microns carrés. Si la goutté contenant éventuellement la séquence dont on recherche la présence peut être déposée. sur une surface suffisament petite, d > un diamètre d'environ 200 microns, cette méthode est 100 fois plus sensible qu'une sonde chaude. Si la surface est un cercle de 2 mm de diamètre, la sensibilité de la méthode objet du présent brevet est égale à celle d'une sonde chaude. Si le cercle de dépot est plus grand, la sensibilité devient inférieure. Le marqueur est un caroténoide, de préférence le bixin, de formule brute Ct5HoO4 ou le crocetin, de formule brute C,,H,B06. D'autres caroténoides peuvent être utilisés. Ces molécules sont gréffées, au nombre d'une dizaine, sur le brin d'ADN complémentaire. Leur présence est ensuite recherchée par examen du spectre Raman. La longueur d'onde qui donne le meilleur résultat est la raie bleue d'un laser à argon, à 488 nm. Le pic raman qu'il est le plus opportun de rechercher est celui à 1520 cm . La meilleure méthode de détection consiste à utiliser un spectromètre multicanal à CCD, et à accumuler une centaine de passages. Le substrat de nitrate de cellulose ne donne aucune fluorescence génante dans la bande examinée. I1 peut être difficile de placer la zone à examiner dans la zone illuminée par le laser, car, une fois que la goutte contenant l'ADN à tester a séchée, elle laisse une trace très peu visible. Il est possible d'y remédier en mettant un colorant dans la goutte à tester. Cependant il faut éviter les colorants organiques, qui produisent une fluorescence très génante. Les colorants utilisables sont, à titre indicatif, le ferrocyanure de potassium en présence de traces d'ions Fe *'+, ou le sulfocyanure de fer en présence d'ions Fie+++. Le premier donne une couleur bleue, le second une couleur rouge. La puissance d'éclairement maximum qu'il est opportun d'utiliser est de 10 milliwatts sur une zone de 2 microns de diamètre. Au delà de cette puissance, les molécules examinées sont dégradées thermiquement, ainsi que le nitrate de cellulose. Cette méthode permet de déceler la présence de 10 à 20 molécules de caroténovde par micron carré dans la zone illuminée. Si l'on fixe une dizaine de molécule de caroténolde à chaque molécule d'ADN complémentaire, il est possible de déceler de 1 à 2 molécule d'ADN par micron carré. REVENDICATIONS 1) Détection de la présence d'un brin d'ADN complémentaire, caractérisée en ce que le brin est marqué par une molécule qui présente un pic raman résonnant très intense. 2) Détection selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur est un caroténoide. 3) Détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide contenant ltADN à testé est coloré par un colorant non. fluorescent.