Brevet FR2616802A1 — publié le 19881223

L'invention concerne un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique avec un micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique (appelé ci-après "microbe produisant de l'acide hyaluronique"). Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique, comprenant l'incubation d'un micro-organisme produisant de l'acide hyaluronique dans un milieu de cultu- re contenant du sérum sanguin, une enzyme bactériolytique, un agent tensio-actif, ou une enzyme bactériolytique plus un agent tensio-actif, pour produire et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture; et l'isolement de cet acide. L'acide hyaluronique existe dans les tissus conjonc- tifs, tels que les articulations, les corps vitreux, les cordons ombilicaux, les cartilages, la peau et les crêtes des volatiles, et il remplit d'importantes fonctions telles que le maintien de la souplesse et de la structure des tis- sus et la régulation métabolique des cellules. L'acide hya- luronique est un polymère de masse moléculaire très élevee, dans une large gamme, et sa solution présente une visco- élasticité et une fonction de rétention d'eau importantes. Il trouve donc une large gamme d'applications dans les cos- métiques, en médecine pour les blessures, dans les lotions occulaires et comme médicament pour l'arthrite. L'acide hyaluronique a été obtenu commercialement jusqu'à maintenant par un procéde d'extraction à partir de crêtes de volatiles, de corps vitreux d'yeux de bovins, de cordons ombilicaux, de cartilages de cétacés ou simi- laires. Mais, l'acide hyaluronique obtenu à partir de corps vivants par le procéde d'extraction, se présente sous la forme d'un complexe avec une protéine ou un mucopolysaccha- ride tel que la chondroitine et nécessite donc des opéra- tions de séparation et de purification compliquées. Etant donné que dans la plupart des cas il est présent sous la forme d'un mélange avec l'hyalurodinase, il en résulte des inconvénients, à savoir qu'un tel acide hyaluronique peut être décomposé au cours de l'extraction et de la purifica- tion, ce qui réduit sa masse moléculaire et a également pour conséquence une diminution de sa viscosité et de son pouvoir de rétention d'eau. A cet égard, on a essayé de préparer l'acide hyaluronique par le procédé de culture décrit dans la demande de brevet japonais publiée N 56692/1983. Cependant, l'inconvénient de ce procédé rési- de dans une faible productivité d'acide hyaluronique. La Demanderesse a effectué de nombreuses recherches pour résoudre le problème ci-dessus, inhérent à la prépa- ration de l'acide hyaluronique. A la suite de ces recher- ches, elle a trouvé que l'utilisation d'un milieu de cul- tute contenant du sérum sanguin ajouté en plus ou d'un mi- lieu de culture contenant une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensio-actif ajoutés lors de l'incubation d'un. micro-organisme produisant l'acide hyaluronique, augmente considérablement la productivité d'acide hyaluronique, ce qui constitue le point de départ de l'invention. Tel qu'il ressort de la description précédente, l'invention a pour objet de fournir un procédé pour la pré- paration d'acide hyaluronique avec une productivité stable et considérablement augmentée, à un moindre-coût. Selon un de ses aspects, l'invention fournit un pro- cédé pour la préparation d'acide hyaluronique comprenant les opérations qui consistent à faire incuber un micro-or- ganisme capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture contenant du sérum sanguin ajouté au milieu pour obtenir et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hyaluronique à partir du milieu. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique compre- nant les opérations qui consistent à incuber un micro-or- ganisme capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture contenant une enzyme bactériolytique et/ ou un agent tensioactif ajoutés au milieu pour obtenir et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hyaluronique à partir du milieu. Comme micro-organisme produisant de l'acide hyalu- ronique, utilisable dans le procédé de l'invention, on peut mentionner par exemple Streptococcus pyogenes, Strep- tococcus equi, Streptococcus equisimilis, Strepcococcus dysgalactiae, Streptococcus zooepidemicus et Pasteurella multocida. Dans le procédé de l'invention, on peut utiliser au choix un sérum sanguin de bovin, un sérum sanguin de cheval, un sérum sanguin de porc, un sérum sanguin de ché- vre, un sérum sanguin de mouton, un sérum sanguin de vo- laille ou un sérum sanguin humain. Comme sérum sanguin de bovin, on peut utiliser un sérum sanguin prélevé chez un foetus, un veau mort-né, un veau, une vache et un taureau. Au lieu de sérum sanguin, on peut utiliser le sang complet d'un bovin, d'un cheval, d'un porc, d'une chèvre, d'un mou- ton, d'un volatile ou d'un être humain. Au lieu de sérum sanguin, on peut également utiliser un constituant diffé- rencié du sérum sanguin de tout animal mentionné ci-dessus ou d'un être humain. La quantité de sérum sanguin à ajou- ter au milieu de culture est comprise de préférence entre 0,3 et 5,0 % en volume, elle est avantageusement de 1,5 % en volume. Comme enzyme bactériolytique utilisable dans le pro- cédé de l'invention, on peut avoir recours à toutes les en- zymes provoquant une bactériolyse, mais on préfère en par- ticulier une lysozyme. La- quantité d'enzyme bactériolytique aà ajouter au miiieu de culture n'est pas particulièrement limitée, mais elle est de préférence de 100 à 2 500 unités, avantageusement de 300 à 2 000 unités, et plus particuliè- rement de 500 à 1 000 unités, par litre de milieu de cultu- re. L'addition d'une quantité trop faible d'enzyme bacté- riolytique se traduit par une production et une accumula- tion trqp faibles d'acide hyaluronique. L'addition d'une quantité trop élevée d'enzyme bactériolytique se traduit par une bactériolyse trop importante au point d'empêcher 1 a proliferation du ricroorcanisre produisant de l'acide hiyaluroni- cqoe. En ce qui concerne le moment de l'addition de 1l'en- zyme bactériolytique dans le milieu de culture, on préfère effectuer cette addition dans des conditions aseptiques après stérilisation d'un milieu de culture auquel on doit ajouter l'enzyme, par exemple, selon le procédé de stérili- sation à la vapeur sous pression, suivie d'un refroidisse- ment à une température de 45 C ou moins. Comme exemples d'agent tensioactif utilisable dans le procédé de l'invention, on citera le bromure de cétyltri- méthylammonium, le chlorure de décylpyridinium, le Tween 80 (marque déposée d'un tensioactif fabriqué par Kao Kagaku Kabushiki Kaisha), le Tween 90 (agent tensioactif du même fabricant), le lauryl sulfate de sodium, le Triton X-100 (marque déposée d'un agent tensioactif fabriqué par Rohm & Haas Co.), le Span 80 (marque déposée d'un agent tensio- actif fabriqué par Kao Kagaku Kabushiki Kaisha), le Span 90 (agent tensioactif du même fabricant), le Nonion (marque déposée d'un agent tensioactif fabriqué par Nippon Oil and Fats Co., Ltd) et le sulfosuccinate de diéthylhexyle. La quantité d'agent tensioactif à ajouter au milieu de cultu- re est de préférence comprise entre 0,5 et 10 g, avantageu- sement entre 0,5 et 3 g, et plus particulièrement entre 1,0 et 2,0 g, par litre de milieu de culture. On ajoute l'a- gent tensioactif au milieu de culture avant la stérilisa- tion du milieu de culture avec de la vapeur sous pression. Dans le procédé de l'invention, un milieu de cultu- re avant l'addition du sérum sanguin, ou de l'enzyme bacté- riolytique et/ou de l'agent tensioactif, peut être tout milieu de culture utilisé ordinairement pour l'incubation d'un micro-organisme produisant de l'acide hyaluronique, *et peut contenir, par exemple, de 2,0 à 3,0 % de glucose, 0,3 % de phosphate acide mono-potassique, 0,2 % de phos- phabe bipotassique, 0,01 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'un agent antimousse, et peut avoir un pH de 6,0 à 8,5 par exemple, ou il peut contenir 2,0 % de glucose, 0,3 % de phosphate acide mono- potassique, 0,2 % de phosphate bipotassique, 0,01 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium et 0,5 % d'un agent antimousse et avoir un pH de 6,0 à 8,5 par exemple. (Tout pourcentage indiqué ici et ultérieurement désigne un pourcentage en poids/volume dans lequel le poids et le vo- lume sont respectivement exprimés en termes de gramme et de litre, sauf mention contraire). Dans le procéde pour la préparation d'acide hyaluro- nique selon l'invention, on stérilise un milieu de culture ne contenant pas de sérum sanguin, par exemple, selon le procéde de stérilisation sous pression de vapeur, et on refroidit à une température de 45 C ou moins, puis on peut, dans des conditions aseptiques, ajouter le sérum sanguin au milieu de culture mentionné ci-dessus. On inocule ensuite un microorganisme produisant de l'acide hyaluronique dans le milieu de culture résultant. On agite alors le milieu de culture par insufflation d'air ou on laisse au repos à une température de 25 à 40 C de préférence, en particulier de 35 C, et à un pH ajuste de préférence entre 6,5 et 8,0, avantageusement vers 7,0, pendant de 1 à 2 jours pour ef- fectuer l'incubation, après quoi on ajoute au milieu de culture un constituant de saccharide en une quantité de 3 Z, puis on incube de nouveau pendant de 10 heures à 2 jours pour produire et accumuler l'acide hyaluronique. On peut également stériliser selon le procéde de stérilisation à la vapeur sous pression, puis refroidir à une température de 45 C ou moins, un milieu de culture ne. contenant ni enzyme bactériolytique, ni agent.tensioactif ou un milieu de culture contenant un agent tensioactif, mais pas d'enzyme bactériolytique, après quoi, dans des conditions aseptiques, on ajoute une enzyme bactériolytique au milieu de culture, et on inocule un micro-organisme pro- duisant de l'acide hyaluronique dans le milieu de culture résultant, toujours dans des conditions aseptiques. Lors- qu'on ne doit pas ajouter d'enzyme bactériolytique, on stérilise un milieu de culture contenant un agent tensio- actif, par exemple, selon le procédé de stérilisation & la vapeur sous pression mentionné ci-dessus, et on refrai- dit à une température de 45 C ou moins, puis dans des conditions aseptiques on inocule un microorganisne produisant cl l'acide hyaluronique dans le milieu de culture. On agite ensuite le milieu de culture par insufflation d'un courant d'air ou on laisse au repos à une température comprise de préférence entre 25 et 40 C, en particulier entre 30 et 35 C et à un pH.réglé de préférence entre 6,5 et 8,0, et en particulier de 7,0; pendant de 1 ou 2 jours, pour effeó- tuer l'incubation, après quoi on ajoute encore au milieu de culture un constituant de saccharide en une quantité de 3 % et on incube pendant de 1 à 2 jours pour obtenir et accumuler l'acide hyaluronique. On sépare ensuite le micro-organisme du milieu de culture par centrifugation ou filtration et on libère le filtrat résultant des substances de faible masse molcuw- laire par ultrafiltration ou dialyse. Au filtrat ainsi if- béré des substances de faible masse moléculaire, on peut ensuite ajouter un alcool tel que le méthanol ou 1 'éthan'o de manière à précipiter un produit brut d'acide hyalurci:.r- que. On redissout dans l'eau l'acide hyaluronique prêciti-, té. Puis, à la solution résultante, on ajoute du bromure de cetyltrimêthylammonium pour effectuer une.précipitatiean différentielle avec le bromure de cetyltriméthylammoniwum. Pour purifier l'acide hyaluronique résultant, on applique ensuite un procéde de purification connu, tel que la cire- matographie par échange d'ion ou la chromatographie par permeation de gel. L'utilisation d'un milieu de culture auquel or a ajouté du sérum sanguin ou un milieu de culture contemamt une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensioactif, se- lon le procédé de l'invention, permet d'augmenter la preduc- tivité d'acide hyaluronique, par exemple de 4 à 5 fois, par litre de milieu de culture, par rapport au procéde deti"- cubation effectué en utilisant un milieu de culture ordb- naire ne contenant ni sérum sanguin, ni enzyme bactério- lytique, ni agent tensioactif (voir les exemples de com- paraison). En outre, étant donné qu'on ne constate prati- quement pas de variation de qualité d'un lot à l'autre de l'enzymebactériolytique et de l'agent tensioactif à uti- liser, l'acide hyaluronique peut toujours être préparé avec une qualité et une productivité constantes. C'est ainsi que l'invention fournit un procéde qui fait date, pour la préparation d'acide hyaluronique. La teneur en im- puretés dans l'acide hyaluronique préparé selon le procéde de l'invention est si faible que le produit du procédé de l'invention représente la qualité la plus élevée d'acide hyaluronique. Ce qui permet d'utiliser avantageusement cet acide dans des applications pharmaceutiques et cosmé- tiques. Tel que décrit ci-dessus, le procéde pour la prépa- ration d'acide hyaluronique selon l'invention est un pro- cédé capable de produire un acide hyaluronique très pur, d'une manière stabilisée, avec une productivité élevée. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus- tration de l'invention, par rapport aux exemples de compa- raison, mais ne limitent aucunement le but de l'invention. Streptococcus equi utilisé dans l'invention, a été obtenu auprès du "Medical Science Research Institute", rattaché au Medical Department of Tokyo University, et Streptococcus zooepidemicus a été obtenu auprès du "Natio- nal Institute of Animal Health of Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries" du Japon. Ils ont fait l'objet d'un dépôt auprès de l'Autorité de dépôt internationale Fermentation Research Institute et ont reçu respectivement les numéros FERM BP-879 et FERM BP-878. Exemple 1 et Exemple de comparaison 1 Dans des conditions aseptiques, on ajoute 22,5 ml de sérum sanguin d'un veau nouveau-né à 1,5 litre d'un mi- lieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,3 % de phos- phate acide monopotassique, 0,2 % de phosphate dipotassi- que, 0,011 Z de thiosulfate de sodium; 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium et 1,0 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0. Dans le mi- lieu de culture résultant, on inocule 100 ml d'un milieu de culture, préalablement prépare, de Streptococcus equi et on incube le microorganisme sous un courant d'air de 0,7 vol/vol/minute, en agitant avec un agitateur à 300 tours/mn, à une température de 35 C pendant 40 heures, tout en maintenant automatiquement le pH à une valeur de 7,0. Au milieu de culture, on ajoute ensuite 25 g de glu- cose dans des conditions aseptiques, puis on incube pen- dant 10 heures. Au milieu de culture, on ajoute alors 1,6 litre d'eau désionisee, puis on sépare le micro-organisme par centrifugation. Au produit surnageant, ainsi obtenu, on ajoute de l'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le pH à une valeur de 5,5. On concentre la solution résultan- te sur un ultrafiltre à fibres creuses jusqu'à obtention de 0,75 1 et on dialyse contre une eau désionis'ee. On pu- rifie 'la solution résultante selon les procédes connus: successivement précipitation différentielle avec de l'al- cool éthylique, traitement avec du chlorure de cetylpyri- dinylammonium et chromatographie avec de la Cellulofine (marque déposée) échangeuse d'ion pour obtenir 8,7 g d'u- ne poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 5,8 g par litre de milieu de culture. La teneur en protéine de l'hyaluronate de sodium purifié est de 0,05 % en poids. On mesure la masse moléculaire de l'hyaluronate de sodium purifié par chromatographie par permeation de gel avec du Sepharose 6B (marque déposée) fabriqué par Pharmacia Finechemicals Co., et on trouve 2 x 106 daltons. On injecte par voie intraveineuse une solution saline physiologique contenant 1 % en poids d'hyaluronate de sodium à un lapin qui ne montre toutefois aucune réaction pyrogène. Dans un exemple de comparaison 1, on incube un micro-organisme produisant de l'acide hyaluronique dans les mêmes conditions et selon le mode opératoire de l'exem- ple 1, si ce n'est qu'on utilise un milieu de culture dans lequel le constituant sérum n'est pas ajouté. On soumet le milieu de culture résultant au même traitement et on purifie selon l'exemple 1 pour obtenir 0,9 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 0,6 g par litre de milieu de culture, Exemple 2 Dans une mini-cuve de fermentation d'un volume in- terne de 3,0 litres, on introduit 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de levure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopo- tassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thio- sulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium hepta- hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0, et on stéri- lise avec de la vapeur sous pression à 1-20 C pendant 15 minutes, puis on refroidit à la température ambiante. Au milieu de culture résultant, on ajoute 0,75 mg (675 unités) de lysozyme de blanc d'oeuf dans des conditions aseptiques. Dans le milieu de culture, on inocule ensuite 0,1 litre du milieu de culture de Streptococcus zooepidemicus préa- lablement préparé et on incube le micro-organisme dans un courant d'air de 0,7 vol/vol/minute, en agitant avec un agitateur à 300 tours/mn à 35 C pendant 24 heures, en ajustant automatiquement le pH à 7,0. Apres quoi, dans des conditions aseptiques, on ajoute au milieu de culture ml d'une solution aqueuse de glucose à 50 %. On pour- suit l'incubation dans les conditions d'incubation mention- nées ci-dessus, pendant 26 heures. Au milieu de culture résultant, on ajoute 3,2 litres d'eau désionisée, puis on agite et on centrifuge pour séparer le micro-organisme. On concentre le produit surnageant ainsi obtenu à 1,6 litre sur un ultra-filtre à fibres creuses et on dialyse contre de l'eau désionisée. A la solution résultante, on ajoute de l'acétate de sodium de manière à avoir une teneur en aceta- te de sodium de 0,5 %, et 5 litres d'éthanol pour précipi- ter les polysaccharides comprenant l'acide hyaluronique 26 1 6802 qu'on isole ensuite par centrifugation. On dissout les polysaccharides isolés, contenant l'acide hyaluronique, dans 0,5 litre d'eau désionisée et à la solution résultante on ajoute 0, 23 litre d'une solution aqueuse de bromure de cétyltriméthylammonium à 4 %, puis on sépare le précipité formé. On disperse le précipité dans 40 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium ayant une concentration de 0, 3 mole/litre et on sépare par centrifugation. A la solution surnageante, on ajoute 120 ml d'éthanol et on sépare le précipité formé. On dissout le précipité dans de l'eau désionisée et on purifie par chromatographie d'échange d'ion pour obtenir 7,8 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium puri- fié.On obtient ainsi 5,2 g de produit par litre de 'milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,05 % en poids. La viscosité intrinsèque [n] de l'hyaluronate de sodium purifié, mesurée au moyen d'un viscosimétre Ubbelohde est de 17,3 dl/g. La masse mo- léculaire est donc de 1 005 000 daltons. Exemple 3 Dans une mini-cuve de fermentation d'un volume inter- ne de 3,0 litre, on introduit 1,5 litre d'un milieu de cul- ture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de le- vure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopotas- sique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thio- sulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium hepta- hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II), 0,5 % d'huile de soja et 1,5 g de Tween 80 (Marque déposée) en tant qu'agent tensioactif, ayant un pH de 7,0, et on stéri- lise avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 minutes, puis on refroidit a la température ambiante. Dans des conditions aseptiques, on inocule ensuite 0,1 litre d'un milieu de culture de Streptococcus equi, préalablement préparé, dans le milieu de culture résultant et on incube le micro-organisme dans les mêmes conditions d'incubation et selon le même procédé d'incubation que dans l'exemple 2. ill On soumet ensuite le milieu de culture au même traitement de purification que dans l'exemple 2 pour obtenir 6,1 g d'une poudre blanche d'hyalorunate de sodium. La quantité de produit correspond à 4,1 g par litre de milieu de cultu- re. L'hyalorunate de sodium purifié a une teneur en protei- ne de 0,03 % en poids. La viscosité intrinsèque [n] mesu- ree au moyen d'un viscosimètre Ubbellohde est de 12,0 dl/g. On confirme ainsi que la masse moléculaire du produit est de 628 000 daltons. Exemple 4 On ajoute 0,7 g de Tween 80 (marque déposée) en tant qu'agent tensioactif à 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de levure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopotassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'huile de soja et ayant un pH de 7,0. On verse alors le milieu de culture dans une mini-cuve de fermentation ayant un volume interne de 3,0 litreset on stérilise avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 minutes, puis on refroidit à la température ambiante. Dans des conditions aseptiques on ajoute alors au milieu de culture 0,4 mg (360 unités) de lysozyme de blanc d'oeuf. Puis on inocule O,1 litre d'un milieu de culture de Streptococcus zooepidemicus, préala- blement prépare, dans le milieu de culture résultant et on incube le micro-organisme dans les mêmes conditions et se- lon le même procédé d'incubation que dans l'exemple 2. On soumet ensuite le milieu de culture résultant au même trai- tement de purification que dans l'exemple 2 pour obtenir 8,0 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 5,3 g par litre de milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,04 % en poids. La viscosité intrinsèque [rin] du produit, mesurée au moyen d'un viscosimétre Ubbellohde est de 15,0 dl/g. Ceci confirme une masse moléculaire de 26 1 6802 837 000 daltons pour le produit. Exemple de comparaison 2 Dans une mini-cuve de fermentation ayant un volume interne de 3,0 litres, on introduit 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de levure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide mono- potassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium hepta- hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 Z de chlorure de cobalt (II); 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0 et on stérili- se avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 mi- nutes, puis on refroidit à la température ambiante. On ino- cule ensuite 0,1 litre d'un milieu de culture de Streptorcoc- cus zooepidemicus, préalablement prépare, dans le milieu de culture et on incube le micro-organisme dans les mêmes conditions d'incubation et selon le même procédé d'incuba- tion que dans l'exemple 2. On soumet ensuite le milieu de culture au même traitement de purification que dans l'exem- * ple 2 pour obtenir 1,5 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 1,O g par litre de milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,03 % en poids. Sa viscosité intrinsèque [n], mesurée au moyen d'un viscosimètre Ub- bellohde est de 12,0 dl/g. Ceci confirme une masse molécu- laire de 628 000 daltons pour le produit. U616602 - 13 - REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'acide hyaluronique comprenant les opérations qui consistent à incuber un micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture contenant une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensioactif ajoutés au milieu de manière à produire et à accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hyaluronique à partir du milieu. 2. Procédé pour la préparation d'acide hyaluronique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une lysozyme comme enzyme bactério- lytique. 3. Procédé pour la préparation d'acide hyaluronique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique est inoculé dans le milieu de culture auquel on a ajouté une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensioactif, et le milieu de culture résultant est agité par insufflation d'air ou mis en contact avec de l'air pour effectuer une incubation, tout en maintenant la température d'incubation entre et 40C et le pH entre 6,5 et 8,0, de manière à produire et accumuler l'acide hyaluronique. 2S 4. Procédé pour la préparation d'acide hyaluronique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique est choisi parmi Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus equisimilis et Streptococcus dysgalactiae. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi - 14 - parmi Streptococcus equi FERM BP 879 et streptococcus zooepidemicus FERM BP 878.