Brevet FR2617715A1 — publié le 19890113

Le virus de la rougeole est responsable d'une maladie humaine très contagieuse caractérisée par des symptômes divers (conjonctivite, toux et éruption cutanée). Le système nerveux central peut également être atteint en donnant lieu soit à une encéphalite soit de manière plus rare une panencéphalite sub- aiguë sclérosante. Les différentes formes de la maladie peu- vent être évitées grâce à la vaccination avec un virus de la rougeole atténué selon des méthodes traditionnelles. Bien que les vaccins actuellement employés donnent pour une large part satisfaction car ils permettent d'abaisser de manière specta- culaire le nombre des cas de rougeole ainsi que le nombre de décès ou complications dûs à ce virus, plusieurs problèmes subsistent qui justifient l'amélioration de la prévention anti-rougeoleuse. Une première difficulté est liée au fait que les vaccins utilisés actuellement sont constitués de virus vivant atténué, dont l'administration pose plus de problèmes que celle d'un vaccin à base d'organismes tués. Les efforts réalisés jusqu'à présent pour mettre au point un vaccin tué ont tous échoué. Par ailleurs, les vaccins actuellement utili- ses sont relativement sensibles à la chaleur en raison des propriétés physico-chimiques du virus ce qui rend leur emploi difficile dans les pays tropicaux. Or la rougeole est l'une des premières causes de décès chez l'enfant dans de nombreux pays a climat tropical. Les travaux antérieurs (Norrby, 1985) sur le virus de la rougeole et les analogies que l'on peut établir avec d'au- tres virus appartenant à la même famille donnent à penser que les protéines de surface de la particule virale, a savoir la protéine hémagglutinante (HA) et la protéine de fusion (F), sont suffisantes pour induire une immunité protectrice. Par ailleurs, les relations immunologiques entre les protéines de surface du virus de la rougeole et celles des autres Morbillivirus (5, 1, 4, 8, 9) et les homologies de sé- quences entre les ADN codant pour certaines de ces protéines (10) permettent d'envisager l'utilisation d'antigènes du virus 2 2617715 de la rougeole pour la vaccination contre la maladie de Carré, la peste bovine et la peste des petits ruminants. Il est également possible de prévoir l'utilisation des antigènes de surface provenant de chacun des Morbillivirus en système de vaccination homologue ou hétérologue. C'est pourquoi la présente invention concerne un Poxvirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte, dans une partie non essentielle de son génome, une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'au moins une protéine de surface d'un Morbillivirus ainsi que les éléments assurant l'expressi- on de cette protéine, celle-ci induisant des anticorps neutra- lisant ledit Morbillivirus. Les Morbillivirus qui peuvent être utilisés sont choisis parmi le virus de la rougeole, le virus de la maladie de Carré, le virus de la peste bovine et le virus de la peste des petits ruminants. Parmi les Poxvirus utilisables, il faut citer plus particulièrement le virus de la vaccine. Les protéines de surface plus particulièrement inté- ressantes sont la protéine hémagglutinante (HA) et la protéine de fusion (F). Les séquences d'ADN correspondantes peuvent coder pour la protéine de longueur totale ou bien pour des fragments suffisants pour induire in vitro des anticorps neu- tralisant le virus de la rougeole ou les autres Morbillivirus. Il est évidemment possible de prévoir la mise en oeuvre d'une séquence d'ADN codant pour plusieurs protéines ou plusieurs fragments de celles-ci. Bien que la souche du virus de la rougeole mise en oeuvre dans les exemples du brevet soit une souche particuli- ère, il est possible d'utiliser d'autres souches. En effet, étant donné la conservation importante des épitopes antigéni- ques associés aux protéines HA et F des différentes souches du virus de la rougeole, la méthode décrite pour une souche de virus peut être étendue aux autres souches. Les éléments d'expression de la protéine sont essen- tiellement des promoteurs, en particulier des promoteurs effi- caces dans la vaccine, ainsi on peut utiliser le promoteur du gène 7,5 Kd de la vaccine. L'insertion de l'ADN doit se faire dans une partie non essentielle du génome du virus, c'est-à-dire dans une partie qui n'empêche pas la réplication du Poxvirus. On effectue par exemple l'intégration dans le gène TK de la vaccine car, outre le fait qu'il n'est pas essentiel pour le virus, ce gène permet une sélection des virus ayant intégré la séquence en cause. Les Poxvirus recombinants ainsi obtenus, qu'ils soient vivants ou inactivés, sont plus particulièrement utili- sables comme vaccins, notamment contre la rougeole, la maladie de Carré, la peste bovine et la peste des petits ruminants. Toutefois, il est possible d'utiliser ces Poxvirus de façon indirecte pour infecter des cellules de mammifères, in vitro, afin d'obtenir des protéines de surface de Morbillivi- rus, notamment de la rougeole, qui pourraient être utilisées comme agents d'immunisation et de vaccination ou encore à titre d'éléments de diagnostic selon des procédés connus. C'est pourquoi l'invention concerne également l'ap- plication des protéines de surface ou de fragments de proté- ines de surface à titre d'agents vaccinants et qui peuvent notamment être obtenues à partir des cultures cellulaires précédentes. 4 2617715 2 6 ?? 71 5 Les figures suivantes illustrent les exemples: Figure 1: Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine HA dans le génome du virus de la vaccine. La séquence rougeole (HA measles) est indiquée par un arc ouvert avec une flèche qui donne le sens de la traduction du gène. Le grand fragment BamHI dans pCD-HA est le vecteur pCD tandis que dans M13TG2101 et M13TG2106 le grand fragment BamHI est le vecteur M13TG131. Dans l'étape 3 le plasmide recombi- nant M13TG2107 n'est pas représenté. Dans le plasmide pTG1169 le petit fragment HindIII correspond à pTGlH, le trait continu au fragment HindIIIJ du virus vaccinal interrompu dans le gène TK et la flèche large correspond au promoteur de la protéine 7,5 Kd. Figure 2: Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F dans le génome du virus de la vaccine. La séquence rougeole (F measles) est indiquée par un arc ouvert avec une flèche qui donne le sens de la traduction. Les autres annotations sont identiques à celles employées dans la figure 1. Figure 3: Protéines HA et F du virus de la rougeole synthéti- sées dans des cellules infectées par les recombi- nants du virus de la vaccine et mises en évidence par immunofluorescence. Le panneau A montre l'immunofluorescence membranaire obtenue après infection de cellules LTK- avec le recombinant VV.TG.HAM2-2 et réaction d'un anticorps monoclonal anti-HA suivi d'un anticorps anti-souris marqué a la fluorescéine. Le panneau B montre l'immunofluorescence observée après infection des cellules LTK- avec le recombinant VV.TG.FM1173 et réaction d'un anticorps monoclonal anti F suivi d'un anticorps anti- souris marqué à la fluorescéine. Figure 4 I Immunoprécipitation des protéines HA et F du virus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par des recombinants du virus de la vac- cine. Autoradiographie du gel de polyacrylamide sur lequel les pro- téines immunoprécipitées ont été déposées. L'hémaglutinine (HA) est présente dans les cellules infectées avec VV.TG.HAM2-2 tandis que la protéine de fusion (F0) et ses produits de clivage F1 et F2 sont présents dans les cellules infectées avec VV.TG.FM1173. Figure 5: Construction du vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine F et HA dans le génome du virus de la vaccine. Les annotations sont identiques à celles employées dans les figures 1 et 2. Figure 6: Immunoprécipitation des protéines HA et F du virus de la rougeole synthétisées dans des cellules infectées par le recombinant vv. TG.HAFM2122 codant pour les deux protéines. Autoradiographie du gel de polyacrylamide sur lequel les pro- téines immunoprécipitées ont été déposées. Les extraits de cellules infectées avec VV.TG.FM1173 (colonne 1), VV.TG.HAM2-2 (colonne 2) et VV.TG.HAFM2122 (colonne 3) ont été immunopréci- pitées avec un sérum polyclonal de cobaye. Les protéines HA, F0, F1 et F2 attendues après infection avec le recombinant VV.TG.HAFM2122 apparaissent distinctement dans la colonne 3. 6 E r2617715 Exemple 1 Construction d'un vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la protéine HA dans le génome du virus de la vaccine. Le cADN codant pour la protéine HA du virus de la souche Hallé a été isolé et séquencé précédemment (3). Afin de faciliter la manipulation du gène, le cADN HA provenant du plasmide pCD HA a été excisé par les deux sites BamHI qui l'entourent et inséré dans le vecteur M13TG131 (6) pour donner naissance au plasmide M13TG2101. Un site Pstl a été introduit par mutagénèse localisée en amont de la partie codante du gene HA portée par le plasmide M13TG2101 à l'aide de l'oligonuclé- otide synthétique suivant: GGGGGGGGAGGGCTGCAGATCATCCACAATG Le plasmide muté a été dénommé M13TG2106. Un fragment Pstl- BamHI contenant le gène HA a été excisé du M13TG2106 et inté- gré dans le vecteur M13TG130 (6) préalablement coupé par Pstl- BamHI pour donner naissance au plasmide M13TG2107. La séquence nucléotidique de la région mutée du cADN HA a été vérifiée par la méthode des didéoxynucléotides puis le cADN HA a été excisé du vecteur M13TG2107 avec les enzymes Pstl-EcoRI et inséré en aval du promoteur 7,5 Kd du vecteur de transfert pTG186POLY (brevet français 84.06499) préalablement coupé par les enzymes Pstl-EcoRI pour donner naissance au plasmide pTG1169. L'ensem- ble de ces étapes est schématisé dans la figure 1. Exemple 2 Construction d'un vecteur permettant le transfert du cADN codant pour la proteine F dans le génome du virus de la vaccine. Le cADN codant pour la protéine F du virus de la souche Hallé a été isolé et séquence précédemment (2). Afin de faciliter la manipulation du gène, le cADN codant pour la protéine F a été excisé du vecteur pCD F (2) à l'aide de l'en- zyme BamHI. Ceci donne deux fragments, l'un qui recouvre la partie 5' du gène et l'autre qui recouvre la partie 3' du 7 2617715 gène. Le fragment 5' a été inséré dans le vecteur M13TG131 préalablement coupé par l'enzyme BamHI pour donner le plasmide M13TG2103-5. La partie 3' a été de même intégrée dans le vec- teur M13TG131 pour donner M13TG2103-3'. Un site Nsil a été introduit par mutagénèse localisée en amont de la partie co- dante du gène F porté par le plasmide M13TG2103-5' à l'aide de l'oligonucléotide synthétique suivant: Nsil AAGACTCATCCAATGCATATCATGGGTCTCAAG Le plasmide muté a été dénommé M13TG2109. Un fragment Nsil- BamHI contenant la partie 5' du gène F a été excisé du M13TG2109 et inséré en aval du promoteur 7,5 Kd du vecteur de transfert pTG186POLY préalablement coupé par les enzymes Pstl- BamHI pour donner naissance au vecteur pTG1172. La partie 3' du gène F a été excisée de M13TG2103-3' par l'enzyme BamHI et insérée dans l'orientation qui reconstitue le gène naturel dans pTG1172 préalablement coupé par BamHI pour donner le vecteur pTG1173. L'ensemble de ces étapes est schématisé dans la figure 2. Exemple 3 Construction d'un recombinant du virus de la vaccine contenant le gène HA du virus de la rou- geole et capable d'exprimer la protéine corres- pondante. Le gène codant pour la protéine HA contenu sur le plasmide pTG1169 a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon un protocole classique précédemment décrit (bre- vet français 84.06499). En bref, des cellules d'embryon de poulet ont été infectées avec le mutant thermosensible du virus de la vaccine ts N7 à raison de 0,1 pfu par.cellule et incubées pendant deux heures à 33 C (température permissive pour le mutant). Les cellules ont été ensuite transfectées avec un précipité de phosphate de calcium contenant 1 4g d'ADN de la souche sauvage du virus de la vaccine et 100 ng du plas- mide pTGl169. Après une heure d'incubation à température ambi- ante, un milieu de culture frais a été ajouté aux cellules sans enlever le précipité et l'incubation a été poursuivie pendant deux heures & la température de 39,5C (température non permissive pour le mutant). Au bout de cette période le milieu contenant le précipité a été éliminé et remplacé pen- dant une minute par un milieu de culture contenant 10 % de glycerol. Enfin les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis incubées pendant deux jours & 39,5 dans un milieu de culture normal. Des virus recombinants, thymidine kinase néga- tif ont ensuite été sélectionnés, & partir du virus non ther- mosensible produit dans la transfection précédente. Pour ré- aliser cette étape les cellules de poulet infectées et trans- fectées de la manière décrite ci-dessus ont été lysées par congélation puis sonication et le virus qu'elles contiennent titré sur cellules LTK- en présence de 100 4g/ml de bromodéso- xyuridine et sous une couche d'agarose 1 %. Des plages de virus TK- ont été reprises et le virus qu'elles contiennent a été amplifié sur des cultures fraîches de cellules d'embryon de poulet. Les stocks de virus ainsi obtenus ont été analysés pour leur aptitude A synthétiser de la protéine HA, soit par une technique d'immunofluorescence, soit par une technique d'immunoprécipitation. Pour l'immunofluorescence des cellules LTK- ont été infectées avec le virus recombinant A raison d'environ une pfu par cellule pendant 15 heures. Les cellules infectées.ont ensuite été fixées à l'acétone, réhydratées au PBS puis incu- bées pendant une demi-heure avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la protéine HA du virus de la rougeole et dilué au 1/200e. Après lavage au PBS pour éliminer l'anticorps non fixé, les cellules ont été incubées en présence d'anti- corps anti-souris marqué à la fluorescéine et dilué au 1/100e. Après de nouveaux lavages pour éliminer l'anticorps marqué et fixé aspécifiquement, les échantillons sont observés au mi- croscope à fluorescence. La photo de la figure 3 montre que les cellules infectées avec le recombinant isolé ci-dessus présentent une fluorescence caractéristique de cellules infec- 9 2617715 tées par le virus de la rougeole tandis que les cellules infectées par du virus de la vaccine sauvage ne présentent pas cette fluorescence. Un des recombinants du virus de la vaccine capable de-synthétiser la protéine HA a été choisi et dénommé VV.TG.HAM2-2. Pour s'assurer qu'il ne contenait pas de conta- mination par un autre virus non recombinant- il a été purifié une nouvelle fois par isolement d'une plage infectieuse et amplification sur cellules d'embryon de poulet. Afin de confirmer la synthèse de la protéine HA d'une taille attendue, des cellules BHK21 ont été infectées à raison d'environ 0,1 pfu par cellule pendant 15 heures puis incubées dans un milieu dépourvu de méthionine normale mais contenant de la méthionine radioactive marquée au soufre 35. Après qua- tre heures de marquage, les cellules infectées ont été lysées dans du tampon d'immunoprécipitation et la protéine HA immuno- précipitée avec un anticorps polyclonal de cobaye dirigé con- tre les protéines du virus de la rougeole, en présence de la protéine A de Staphylocoque aureus fixée au sépharose. Les protéines immunoprécipitées ont été analysées sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le gel séché est soumis à autoradiographie. Les résultats (figure 4) montrent que le recombinant du virus de la vaccine VV.TG.HAM2-2 induit la synthèse d'une protéine de taille identique à la protéine HA authentique du virus de la rougeole. Exemple 4 Construction d'un recombinant du virus de la vaccine contenant le gène codant pour la protéine F du virus de la rougeole. Le gène codant pour la protéine F porté par le plas- mide pTG1173 a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon le même protocole que celui décrit dans l'exem- ple 3 pour le gène HA. Ainsi un recombinant viral dénommé VV.TG.FM1173 a été isolé. Afin de confirmer que ce recombinant induit la synthèse de la protéine F, des cellules BHK21 ont 2617715 été infectées avec environ 0,1 ufp par cellule pendant 15 heures puis incubées dans un milieu dépourvu de méthionine normale mais contenant de la méthionine radioactive marquée au S. Après quatre heures de marquage, les cellules infectées ont été lysées dans du tampon d'immunoprécipitation et la protéine F immunoprécipitée avec un anticorps polyclonal de cobaye dirigé contre les protéines du virus de la rougeole, en présence de la protéine A de Staphylocoque aureus fixée au sépharose. Les protéines immunoprécipitées ont été analysées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le gel séché est soumis A autoradiographie. Les résultats (figure 4) montrent que le recombinant VV.TG.FM1173 induit la synthèse de la pro- téine F0 correspondant au produit initial de la traduction du gène F et des produits de clivage protéolytique F1 et F2 qui apparaissent naturellement lors d'une infection par la rougeo- le. Les protéines F0, F1 et F2 ont la taille attendue pour les protéines authentiques du virus de la rougeole. Afin de mon- trer que ces protéines sont associées a la membrane de la cellule infectée comme lors de l'infection par le virus de la rougeole, des cellules LTK- ont été infectées avec le recombi- nant VV.TG.FM1173 à raison d'environ une ufp par cellule pen- dant 15 heures. Les cellules infectées ont ensuite été fixées A l'acétone, réhydratées au PBS puis incubées pendant une demi-heure avec un anticorps monoclonal de souris dirigé con- tre les protéines F du virus de la rougeole et dilué au 1/100e. Après lavage au PBS les cellules ont été incubées en présence d'anticorps antisouris marqués A la fluorescéine et dilué au 1/100e. Après de nouveaux lavages pour éliminer l'an- ticorps marqué et fixé aspécifiquement, ies échantillons sont observés au microscope à fluorescence. La photo de la figure 3 montre que les cellules infectées avec le recombinant VV.TG.FM1173 présentent une fluorescence membranaire caracté- ristique de cellules infectées par le virus de la rougeole tandis que les cellules infectées avec le virus de la vaccine de type sauvage ne présentent aucune fluorescence. ll 2617715 Exemple 5 Vaccination des souris avec le recombinant W.TG.HAM2-2. Des souris Balb C âgées de 4 à 5 semaines ont été vaccinées par scarification de la queue avec 4 107 pfu de virus, soit du recombinant VV. TG.HAM2-2, soit du virus VV sauvage. Trois semaines après l'inoculation du sang a été prélevé des animaux et on a mesuré le taux d'anticorps capa- bles d'inhiber l'activité hémagglutinante du virus et capables de neutraliser le virus in vitro. Le tableau 1 montre que la plupart des souris vaccinées avec VVW.TG.HAM2-2 présentent aussi bien des anticorps anti-hémagglutinants que des anti- corps neutralisants. Trois semaines après la vaccination une inoculation d'épreuve a été administrée aux animaux: chaque souris a reçu 50 g1 d'une suspension diluée à 10 % d'un cer- veau de souris préalablement infectée avec une souche de rou- geole neuroadaptée (11). Les animaux ont été surveillés pen- dant un mois. Le tableau 2 montre que les souris vaccinées avec la souche VV.TG.HAM2-2 sont protégées tandis que les autres animaux succombent à l'inoculation d'épreuve. Exemple 6 Vaccination des souris avec le recombinant VVW.TG.FM1173. Des souris Balb C femelles âgées de cinq semaines ont été vaccinées par scarification de la queue avec 4.107 ufp de virus, soit du recombinant VVW.TG.FM1173, soit du virus WVV sauvage. Vingt cinq jours après l'inoculation, du sang a été prélevé des animaux et on a mesuré le taux d'anticorps capa- bles de neutraliser le virus in vitro. Le tableau 3 montre que la plupart des souris vaccinées avec VV.TG.FM1173 présentent des anticorps neutralisants. Le jour du prélèvement sanguin les souris ont été inoculées par voie intracérébrale avec une souche virulente neuroadaptée du virus de la rougeole. Chaque souris reçoit 50 pl d'une suspension diluée A 10 % d'un cer- veau de souris préalablement infectée avec la souche virilente 12 2617715 neuroadaptée. Les animaux sont surveillés pendant un mois. Seules les souris vaccinées avec la souche VV.TG.FMl173 sont protégées contre l'inoculation d'épreuve (Tableau 2). Tableau 1 Immunisation de souris par inoculation du virus recombinant VV.TG.HAM2-2. souris femelles anticorps anticorps anti-hémagglutinine neutralisants 1 320 1280 2 80 160 3 160 80 320 1280 6 40 80 7 8 40 40 9 160 160 40 - souris mâles 1 160 80 2 160 80 3 160 320 4 160 320 80 640 6 160 320 7 160 320 8 160 160 9 40 80 80 80 11 80 80 12 80 320 13 80 320 14 80 320 80 80 Les titres sont exprimés en réciproque de la dilution la plus élevée du sérum qui donnait une neutralisation complète de 50 ufp du virus de la rougeole ou une inhibition totale de l'activité hémagglutinante. Les sérums de souris non vaccinées ou vaccinées avec la souche Wvv sauvage donnaient un titre d'anticorps anti-h4magglutinine inférieur à 20 et un titre d'anticorps neutralisants inférieur à 40. 14 2617715 Tableau 2 Protection des souris. Expérience 1 Expérience 2 virus utilisé W pas VV pour la sauvage VV.TG. HAM2-2 de sauvage VV.TG.FM1173 vaccina- virus tion nombre d'animaux 12 19 9 3 22 inoculés nombre* de survi- 2 19 1 0 22 vants * Trois semaines après la vaccination, les souris ont été éprouvées avec une souche SSPE de la rougeole adaptée à la souris. Les décès ayant eu lieu dans les trois premiers jours n'ont pas été comptabilisés dans les résultats car ils sont attribués au traumatisme de la voie d'inoculation. Tableau 3 Immunisation des souris par inoculation du virus recombinant W.TG.FM1173. Souris femelles Anticorps neutralisants 1 160 2 160 3 160 4 320 320 6 160 7 160 8 80 9 20 40 11 20 12 20 *13 80 14 160 40 16 160 17 160 18 80 19 320 160 21 160 22 40 23 40 24 40 Les titres sont exprimes en réciproque de la dilution la plus élevée du sérum qui donnait une neutralisation oomplète de 50 ufp du virus de la rougeole. Les sérums de souris non vacci- nées ou vaccinées avec la souche sauvage donnaient un titre d'anticorps neutralisants inférieur à 40. 16 2617715 Exemple 7 Construction d'un recombinant du virus de la vac- cine contenant les gènes codant pour la protéine F et pour la protéine HA du virus de la rougeole. Un plasmide recombinant permettant le transfert si- multané des gènes HA et F dans le génome du virus de la vacci- ne a été construit de la manière suivante (illustré dans la figure 5): le promoteur 7,5 Kd a été excisé du vecteur M13TG2119 par digestion partielle avec l'enzyme BglII et di- gestion complète avec EcoRI. Le fragment BglII-EcoRI ainsi obtenu a été inséré dans le plasmide pTG1169 préalablement coupé par BamHI et EcoRI. De cette manière un nouveau plasmide a été isolé et appelé pTG2121. Dans cette construction, le gène HA est suivi en 3' par le promoteur 7,5 Kd orienté dans le même sens de trans- cription que le gène HA. Le plasmide pTG2121 a été ouvert en aval du second promoteur 7,5 Kd avec les enzymes BamHI et EcoRI pour y insé- rer le gène F, excisé du plasmide pTG1173 par les enzymes BglII et EcoRI; le nouveau plasmide est appelé pTG2122. Ainsi le plasmide pTG2122 correspond au plasmide pTG186POLY dans lequel ont été insérés les gènes HA et F, chacun étant placé sous le contrôle d'un promoteur 7,5 Kd. L'ensemble a été transféré dans le génome du virus de la vaccine selon le pro- tocole décrit dans l'exemple 3. Un virus recombinant (VV.TG.HAFM2122) capable d'induire la synthèse de la protéine HA et de la protéine F a été isolé et caractérisé par immuno- fluorescence et immunoprécipitation comme décrit dans les exemples 3 et 4 (voir figure 6 pour l'immunoprécipitation). LS9I u Il Snos 6911OBd/MS tS9I eu el gnos úLTIILd/ms : L861 ITTsA ú eT '(sTaBIa 'xnod a np an) seusTue6aooaxoTw ap sainqlno ep aluUOTIeN uoTI zaiToO el v saesodgp Sa? quo seluvATns satonos saI uoTueuT,I ap seATQ; uesl9dea seaRonos ap 9dea 51192. { LI 18 2617715 REFERENCES 1) Appel, M.J.G., Shek, W.R., Shesberadoran, H. & Norrby, E. Archives of Virology 82, 73-82 (1984). 2) Bucklan, R., Gerald, C., Barker, R. & Wild, T.F. J. Gen. Virol. BOUs presse (1987). 3) Gerald, C., Buklan, R., Barker, R., Freemon, G. & Wild, T.F. J. Gen. Virol. 67 (1986). 4) Hall, W.W., Lamb, R.A. & Choppin, P.W. Virology 100, 433- 449 (1980). ) Imagawa, D.T. Prog. Med. Virol. vol. 10, pp. 160-193 ed. Karger, Basel/New York (1968). 6) Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983). 7) Norrby, E. Measles 1985 in Virology ed. B.N. Fields et al. Raven Press, New York, 55, 1305-1321. 8) Norrby, E., Sheshberodaran, H., Mc Cullough, K.C., Carpenter, W.C. & Orvell, C. 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Virol. 4, 103-114 (1979). 19 2617715 REVENDICATIONS 1) Poxvirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte, dans une partie non essentielle de son génome, une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'au moins un proté- ine de surface d'un Morbillivirus ainsi que les éléments assu- rant l'expression de ladite protéine, celle-ci induisant des anticorps neutralisant ledit Morbillivirus. 2) Poxvirus selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Morbillivirus est choisi parmi le virus de la rougeole, le virus de la maladie de Carré, le virus de la peste bovine et le virus de la peste des petits ruminants. 3) Poxvirus selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la proté- ine hémagglutinante (HA). 4) Poxvirus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la protéine de fusion (F). 5) Poxvirus selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la protéine HA et'la protéine F. 6) Poxvirus selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus de la vaccine. 7) Poxvirus selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur de la vaccine. 8) Poxvirus selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur de la vaccine est le promoteur 7,5 Kd de la vaccine. 9) Poxvirus selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est clonée dans le gène TK de la vaccine. ) ADN recombinant correspondant au poxvirus selon l'une des revendications 1 à 9. 11) Cellule de mammifère infectée par le poxvirus selon l'une des revendications 1 à 9. 2 6 12617715 12) Procédé de préparation de tout ou partie d'une protéine de surface d'un Morbillivirus, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon la revendication 11 et en ce que l'on récupére ladite protéine de surface. 13) Protéine de surface de Morbillivirus suscepti- ble d'être obtenue par le procédé selon la revendication 12. 14) A titre d'agent immunogéne, les protéines selon la revendication 13, seules ou en combinaison. ) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un Poxvirus selon l'une des revendications 1 à 9 et/ou des proté- ines selon la revendication 13 seules en combinaison. 16) Vaccin selon la revendication 15, caractérisé en ce que le Poxvirus est vivant. 17) Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce que le Poxvirus est inactive. 18) Antisérum contenant les anticorps dressés contre les Poxvirus selon l'une des revendications l à 9 ou contre les protéines selon la revendication 13.