Brevet FR2611205A1 — publié le 19880826

Dipeptides. procédé de préparationr et utilisatic dans le dosage de s pmtar- DOXNAIE DE L' INVETIQON La présente invention concerne, en tant que produits industriels nouveaux, les composés dipeptides de formule I ci-après. Elle concerne également leur procédé de préparation et leur utilisation dans le domaine du dosage de protéases et de peptidases, en particulier en tant que substrats dans le domaine du dosage quantitatif d'enzymes de la classe E.C. 3.4.4 (à présent nouvelle classe "E.C. 3.4.21", selon l'ouvrage Enzyme Nomenclature", Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam 1973, page 238 et suivantes). ART ANTERIEUR On sait que les enzymes de la classe sus-visée sont des substances qui scindent les liaisons amides du squelette protéique ou peptidique du côté du groupe carboxyle des restes Arg, Lys, Orn et His. Il s'agit là d'un mécanisme de clivage bien connu de l'homme du métier et qui est amplement exemplifié dans les documents antérieurs cités ci- après. On sait que l'on a déjà proposé dans le passé des substrats spécifiques pour le dosage d'enzymes de ladite classe tels que notamment la thrombine (E.C. 3.4.21.5), la plasmine (E.C. 3.4.21.7), le Facteur la (E.C. 3.4.21. 6) et la trypsine (E.C. 3.4.31.4), lesdits substrats étant des substances de formule brute: o - Ao - Yo (Io) dans laquelle Xo représente un groupe protecteur et le cas échéant un atome d'hydrogène; Yo est un groupe de marquage, notamment un reste radioactif ou un reste capable de conférer, avant ou (mieux) après clivage, une coloration ou une fluorescence; et, Ao est un reste de monoaminoacide ou de polyaminoacide et de préférence un reste tri- ou tétrapeptidique. le groupe protecteur Xo est fixé sur l'extrémité N-terminale de la chaîne Ao et représente de façon classique dans la littérature antérieure un groupe acétyle, benzoyle, tbutyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, succinyle, tosyle ou analogue. Historiquement, les premiers substrats qui ont été proposés sont ceux dans lesquels Ao représentait un reste de monoaninoacide. Voir à cet effet, l'article de ERLANGER et al., Arch. Biochem. Biophys., 95, 271 (1961) qui décrit les premiers substrats du type CsHaCO-D,L-Arg-pNA Les dérivés de formule Io o Ao est un reste de monoaninoacide ne se sont pas révélés particulièrement intéressants en tant que substrats d'enzymes, essentiellement par défaut de sélectivité. Néanmoins, on sait que l'acide -glutamyl-p-nitroanilide-3-carboxylique a été proposé dans FR-A- 2 208 886 comme substrat chromLbène de la V-glutamyl transpeptidase (E.C. 2.3.2. 2), et que, dans FR-A-2 546 163 ont été proposés (i) les PEA-L-Phe-Yo et PHA-L-Tyr-Yo (o PHA désigne un reste polyhydroxyalkyle) pour le dosage de la chymotrypsine (E.C. 3.4.31.1), et (li) les PHA-L-Arg-Yo et PHA-L-Lys-Yo pour le dosage de la trypsine (E.C.3.4.31.4). Pour pallier les difficultés des substrats monoaninoacides, on sait que l'on a proposé des composés de formule Io, o Ao représente plus particulièrement un reste tri- ou tétrapeptidique et Yo un groupe chromogène scindable ou clivable par hydrolyse enzymatique, pour le dosage des enzymes de la classe susvisée. Le nombre de publications concernant les substrats tétrapeptidiques et surtout tripeptidiques est considérablement supérieur à celui relatif aux substrats de monoaninoacide. Pour information, des tripeptides et des tétrapeptides sont décrits dans les documents FR-A-2 546 163 précité, FRA- 2 372 798, EP-A-O 004 256, US-A- 4 508 644, US-A- 4 448 715, FR-A- 2 471 411, FR-A- 2 317 280 et FR-A- 2 459 226. On sait notamment de l'exposé de BARBIER présenté lors du ème Congrès National des Biologistes des Hôpitaux Généraux tenu à Hyères les 7-9 octobre 1981, que les composés tétrapeptidiques et surtout tripeptiques de formule la étaient les plus intéressants eu égard à leur spécificité vis-à-vis d'enzymes protéolytiques. En particulier ont été commercialisés avec succès les tripeptides suivants: H-D-But-L-CHA-L-A g-pNA,2AcOH (cf. exemple 41 de US-A- 4 428 874) en tant que substrat de la plasmine, H-D-CHG-L-BUT-L-Arg-pNA, 2AcOH (cf. exemple 71 de US-A- 4 428 874) en tant que substrat de la thrombine), et CHKSO2-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA, AcOH (selon notamment US-A-4 440 678) en tant que substrat du facteur Xa. On sait également que des tri- et tétrapeptides chromogènes présentant sur l'extrémité N-terminale de la chaîne peptidique un groupe -méthoxycarbonylalkylènecarbonyle ou u- éthoxycarbonylalkylênecarbonyle (o le fragment alkylènecarbonyle comporte 2 à 4 atomes de carbone) ont été proposés dans EP-A-O 128 118 qui décrit spécifiquement les EtO -CO-CH2-CO-Lys (e-Cbo)-Gly-Arg-pJA, AcOH (cf.exemple 14) et XeO-CO-CH2CH2-CO-Lys (e-Cbo)-Gly-Arg-pNA, AcOH (cf.exemple 19). Or il se trouve que, dans la série des tri- et tétrapeptides, le remplacement d'un atome d'hydrogène de l'extrémité N-terminale NH2 par un groupe oxycarbonylalkylènecarbonyle entraîne une diminution systématique de l'activité (voir à cet effet les résultats d'essais comparatifs consignés dans le tableau III ci- après). On sait par ailleurs qu'il existe un très grand nombre de publications ayant trait à l'obtention de composés dipeptidiques. Pratiquement toutes ces publications présentent les composés dipeptidiques, qu'elles décrivent, en tant qu'intermédiaires de synthèse des tri- et tétrapeptides susvisés. Ponctuellement, le nombre de documents mentionnant l'utilisation de dipeptides com-' subst'-ts est très faible, à savoir: (i)US-A- 4 217 269 qui décrit des phénoxyacétyl- dipeptides chromogènes, en tant que substrats de la thrombine et de la trypsine, notamment les PhO-CH2CO-L-Pro-L-Arg-pîA, PhO-CH2CO-L-Pip-L-ArgpNA, PhO-CH2CO-L-Aze-L-Lys-pNA, et PhO-CH2CO-L-Pro-L-Orn-pNA; (ii)FR-A- 2 471 411 qui propose en tant que substrats, pour le dosage de l'antithrombine III, les dipeptides de formule: Xo-L-Pro-L-Arg-pNA o Xo est un groupe "-hydroxyacyle choisi parmi les L- et D-a-hydroxy-9-phénylpropionyle, L- et D-a-hydroxy- isocaproyle, et, glycoyle; (iii) US-A- 4 448 715 précité qui décrit spécifiquement des tripeptides en tant que substrats de la kallikréine plasmatique et englobe dans sa formule générale des dipeptides de structure: 2 6 1 1 2 05 Io-L-Phe-L-Arg-Yo (o Yo est défini comme ci-dessus et Xo représente un groupe cycloalkylcarbonyle dans lequel le reste cycloalkyle comprend de 3 à 6 atomes de carbone) qui ne sont pas exemplifiés; de même des dipeptides sont inclus dans les formules générales proposées par FR-A- 2 546 163 précité et Dl.-A- 3 108 322, mais ne sont pas spécifiquement exemplifiés dans ces documents. OBJET DE L'IIVRITION Suivant l'invention on préconise de nouveaux composés dipeptidiques de formule I ci-après qui (i) diffèrent des dipeptides antérieurement connus comme intermédiaires de synthèse ou substrats par la nature du groupe protecteur Q de l'extrémité N-terminale, qui comporte 2 groupes carbonyle et plus précisément une structure linéaire o-oxycarbonylalkylènecarbonyle: -O-CO-( C)n-CO- et (ii) sont utiles en tant que substrats vis-à-vis des enzymes de la classe E.C.3.4.21 susvisée et de l'ancienne classe E.C.3.4.4. On vient de trouver de façon surprenante que ledit groupe protecteur Q, qui a pour formule RO-CO-(CR2R3), -CO (o R, R2, R3 et n sont définis comme indiqué ci-après) et qui est partiellement exemplifié dans EP-A-O 128 118 précit6, ne provoque pas dans la série des dipeptides suivant l'invention la - baisse d'activité observée pour les séries des tri- et tétrapeptides. Par ailleurs un tel groupe Q n'apparaît pas dans les dipeptides intermédiaires décrits dans EP-A-O 128 118. Les composés dipeptidiques suivant l'invention sont notamment intéressants en tant que substrats pour le dosage quantitatif de la thrombi..e, de la plasmine et du Facteur Xa. On a également trouvé qu'ils sont en outre particulièrement intéressants eu égard à leur spécificité vis-à-vis de la Protéine C. Les nouveaux dérivés dipeptidiques suivant l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi l'ensemble comprenant: (i) les composés de formule: Q-A,-A -R, (dans laquelle: Q est un reste RO-CO-(CR2R3),, -CO o R représente l'atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1- C;, un groupe phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes notamment CH3, OC1H3 I et alkylènedioxy, un groupe benzyle éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes, notamment CH (ii) leurs sels d'addition. ABREVIATIONS Dans la présente description on a utilisé les abréviations suivantes par commodité: -pour les restes d'aminoacide: Ahx = e-aminohexanoyle ACC = l-amino-cyclohexane-1-carbonyle Aib = 2aminoisobutyryle (ou 2- méthylalanyle) Ala = a-alanyle A-Ala = A-alanyle Arg = arginyle Asn = asparaginyle Asp = a-aspartyle 9-Asp = 9-aspartyle ATC = thiazolidine-4-carbonyle (ou thioprolyle) Aze = azétidine-2carbonyle But = 2-aminobutyryle (ou a-amino-n-butyryle) 4-But = 4aminobutyryle (ou Y-amino-n-butyryle) CHA = 3-cyclohexylalanyle- CHG = a-cyclohexylglycyle CHT = 3-(4-hydroxycyclohexyl)alanyle Cle = cyclocleucyle (ou 1-amino-cyclopropane-l-carbonyle) Cys = cystljle Dab = 2,4-dlaminobutyryle x-Dab = pyrodiaminobutyryle Gin = glutamyle Glu = glutaminyle y-Glu = Y-glutaminyle Gly = glycyle His = histidyle 4-Hyp = 4-hydroxyprolyle (ou 4-hydroxy-2- Bpyrrolidinecarbonyle) 3-Hyp = 3-hydroxyprolyle (ou 3-hydroxy-2- pyrrolidinecarbonyle) Ile = isoleucyle Leu = leucyle Lys = lysyle r Ket = Mwthionyle YLeu = norleucyle NVal = norvalyle Orn = ornithinyle Phe = phénylalanyle Phg = phénylglycyle Pip = pipécolinoyle Pro = prolyle Pyr = pyroglutaminyle (au 2-pyrrolidone-5-carbonyle) Sar = sarcosyle Ser = séryle Thr = thréouyle Tyr = tyrosyle Val = valyle - pour les autres abréviations: Ac = acétyle AcOH = acide acétique Adoc = adamantyloxycarbonyle Aoc = t-amyloxycarbonyle Bac = t-butyloxycarbonyle Bz = benzoyle Bzl = benzyle Cbo = carbobenzoxy CCM = chromatographie sur couche mince o-Cl-pNA= o-chloro-p-nitroanilide DCCI = dicyclohexylcarbodiimide DCHU = dicyclohexylurée DMF = diméthylformamide Et = éthyle Et3N = triéthylamine Foc = furfuryloxycarbonyle HMPT =!,K,', J', n""- hexaméthylphosphorotriamide HOBT = 1-hydroxybenzotriazole HPLC = chromatographie liquide de haute performance H-TFA = acide trifluoroacêtique Iboc = isobornyloxycarbonyle Me = méthyle KMX = CHO0-COCH2-CO- ( i.e. méthyloxymalonyle,groupe protecteur suivant l'invention). nkat = nanokatal (1 nkat est l'activité enzymatique d'un enzyme qui hydrolyse 1 nanomole de son substrat par seconde dans les conditions standard) OD = densité optique pNA = p-nitroanilide Ph = phényle RT = température ambiante (15-20 'C) l5 TEA = triéthanolamine Tos = ptoluènesulfonyle (ou tosyle) UNIH = unité enzymatique standardisée de l"US National Institute of Health" Z = benzyloxycarbonyle Z (p-Cl)= pchlorobenzyloxycarbonyle Z (p-OXe)= p-méthoxybenzyloxycarbonyle DESCRIPTIO DETAILLEE DB L'ITrVETIOJ Parmi les groupes alkyle en C1-C4 inclus dans les définitions de R, R2 et R3, qui conviennent selon l'invention, ont peut mentionner notamment les groupes CH-, CH=CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3 et CH(CH3)CH2CH2. Parmi les groupes beuzyle substitués qui entrent dans la définition de R on peut notamment citer les groupes 3-méthylbenzyle, 3,5-diméthlylbenzyle, 4-méthylbenzyle, 4-méthoxybenzyle, 3,4-diméthoxybeuzyle, 2,4,6-trimétho- xybenzyle et 3,4-méthlylènedioxybenzyle. Parmi les groupes phényle substitués, qui entrent dans la définition de R, on peut notamment mentionner les groupes o-,m- et p-tolyle, xylyle, 2-, 3- et 4-méthoxyphényle, 3,5-dimé- thoxyphényle, 3,4-diméthoxyphényle, 2,4-dimthoxyphényle, 3,4,5-triméthoxyphényle, 2,4,6-triméthoxyphényle, 3,4-méthylène- dioxyphényle, 3-méthoxy-4-méthylphényle et 4- méthoxy-3- méthylphényle.De façon avantageuse, on préfère surtout suivant l'invention que R = CH3 et que R2 = R3 = H A, est un reste de monoaminoacide non basique. Il provient d'un aminoacide naturel ou synthétique ayant un pH inférieur ou égal à 7 ou d'un aminoacide ayant un pH supérieur à 7 mais convenablement substitué pour bloquer essentiellement son caractère basique et atteindre un pH inférieur ou égal à 7. A, englobe donc: l')les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction acide et une seule fonction basique, 2') les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction basique et plus d'une fonction acide et dans lesquels chaque fonction acide latérale (n'entrant pas ou n'intervenant pas dans la liaison peptidique) est susceptible d'être bloquée notamment sous forme amide ou ester,et 3') les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction acide et plus d'une fonction basique et dans lesquels chaque fonction basique-latérale est convenablement substituée pour bloquer et supprimer essentiellement son caractère basique. Bien entendu les restes d'aminoacides sus-visés, qui sont notamment énumérés dans le chapitre abréviation ci-dessus, peuvent comporter des groupes hydroxyle (OH) ou thiol (SH) latéraux qui sont susceptibles d'être bloqués, le cas échéant, par un groupe protecteur éther ou ester. Conviennent en particulier pour Ai, les restes provenant d'amninoacides: naturels non-basiques dits "neutres" tels que notamment Ala, g-Ala,Cys, Gln, Gly, 4-Hyp, 3-Hyp, Leu, Xet, NLeu, NVal, Phe, Pro, Sar, Ser, Thr, Tyr, Val, o le groupe OH latéral des restes 4-Hyp, 3- Hyp, Ser, Thr, Tyr est protégé ou non par un groupe protecteur éther ou ester, et o le groupe SH latéral du reste Cys est protégé ou non par un groupe protecteur thioéther ou thioester; -naturels acides tels que notamment Asp, E-Asp, Glu, y- Glu, dans lesquels la fonction acide latérale est libre ou bloquée sous forme ester, notamment sous forme d'ester benzylique ou t-butylique; naturels initialement basiques dans lesquels la ou les fonctions basiques latérales n'entrant pas dans la liaison peptidique sont bloquées par un groupe convenable éliminant pratiquement le caractère basique tel que Boc, Cbo etc, lesdits restes d'aminoacide étant notamment les restes Arg, Lys, His, et Orn convenablement bloqués notamment par un groupe Cbo; synthétiques non- basiques dits *neutres" tels que notamment ACC, Ahx,Aib, ATC, Aze, But, 4-But, CHA, CHG, CHT (o le groupe OH latéral est protégé le cas échéant sous forme éther ou ester), Cle, x-Dab, Phg, Pip, Pyr; synthétiques initialement basiques dans lesquels chaque fonction basique latérale est protégée par un groupe convenable éliminant substantiellement le caractère basique, notamment le reste Dab o la fonction basique latérale est bloquée par un groupe tel que Cbo. Parmi les restes d'aminoacides synthétiques qui conviennent également, on peut notamment mentionner (i) les restes d'aminoacides cycloaliphatiques o le groupe amino et le groupe carboxy sont situés sur le même atome de carbone cyclique (tels que Cle susvisé) ou sur deux atomes de carbone cycliques différents et (ii) les restes d'aminoacides aromatiques tels que notamment les restes o-,m- et p-aminobenzoyle, et, les restes d'aminoacides aralkyliques tels que notamment les p- aminobenzylcarbonyle, m-aminobenzylcarbonyle. De façon avantageuse le reste A, selon l'invention sera un reste d'aaminoacide tel que ACC, Aib, Ala, ATC, Aze, But, CHA, CHG, CHT,Cle, Gly, 4- Hyp, 3-Hyp, Ile, Leu, Met, NLeu, NVal, Phe, Pip, Pro,Sar, Ser, Thr, Tyr, Val, un reste P-Ala, ou un reste CHT, 4- Hyp, 3-Hyp, Ser, Thr, Tyr dans lequel le groupe latéral OH est protégé par un groupe éther ou ester. Le reste A, comprend donc des restes d'aminoacides tels que Aib, Cle,Gly, Sar et 4-But dépourvus d'atome de carbone asymétrique, et des restes d'aminoacides présentant un atome de carbone asymétrique. Lorsque l'aminoacide présente un atome de carbone asymétrique, le reste A, est, de préférence, de configuration L car les dipeptides de formule I dans lesquels A, est un reste de configuration D sont en général inactifs ou peu actifs en tant que substrats. Le groupe A, selon l'invention sera de préférence un groupe Aib, L-Ala, PAla, L-ATC, L-Aze, L-But, L-CHA, L-CHG, L-CHT,Cle, Gly, L-4-Hyp, L-3-Hyp, L-Ile, L-Leu, L-NLeu, L-NVal, L-Phe, L-Pip, L-Pro,Sar, L-Ser, L-Thr, LTyr, L-Val ou un reste L-CHT, L-4-Hyp,L-S-Hyp, L-Ser, L-Thr ou L-Tyr dans lequel le groupe OH latéral est protégé par un groupe éther ou ester. A2 est le reste d'un a- aminoacide basique. Il provient d'un monoaminoacide ayant un pH supérieur à 7, c'est-à-dire comportant une fonction acide COOH et, en plus de la fonction basique en a, au moins une fonction basique latérale. Dans A2 ladite fonction basique latérale n'est pas bloquée. Parmi les restes d'a-aminoacides qui conviennent, on peut mentionner notamment les restes Dab, L-Arg, L-Lys, L-His et L-Orn. Les restes préférés sont des restes d'a-L-aminoacides, notamment L- Arg, L-Lys, L-His et L-Orn, le reste le plus intéressant selon l'invention étant L-Arg. 261 1205 Le groupe marqueur aminé Ri est bien connu dans la technique des dosages biologiques et microbiologiques, voir à cet effet le document US-A- 4 448 715 précité. Il peut notamnment être choisi parmi les groupes WH-R', qui (i) induisent une modification de coloration, (ii) induisent une modification de fluorescence ou (iii) comportent au moins un élément radioactif. Convient au but de l'invention tout groupe amino NE-R', donnant pendant ou après la réaction enzymatique un signal susceptible d'être amplifié pour être détecté (par exemple par mesure de la densité optique sous une longueur d'onde donnée, ou encore par mesure de la radioactivité). Parmi les groupes fluorescents entrant dans la définition de Ri on peut notamment citer les 4-méthylcoumaryl-7-amino, 4-trifluorométhylcoumaryl-7-amino et analogues. Le groupe Ri peut également représenter un groupe comportant un élément radioactif, par exemple un groupe anilino ou benzylamino marqué par un radioisotope ''C ou 3H. Le groupe Ri que l'on préfère suivant l'invention est un groupe chromogène, de façon typique un groupe nitrophényle (dans lequel le reste phényle est susceptible d'être substitué par un groupe COOH, F, C1, Br, CH3, OCa1, CN, CFa, et/ou SO3H), un groupe naphtyle (dans lequel le reste naphtyle est susceptible d'être substitué par un groupe OCH3, COOH, SO3H ou CH3), un groupe pyrimidinyle, benzimidazolyle, triazinyle, indazolyle, pyrènyle, coumaryle, quinolyle etc. De façon avantageuse, le groupe Ri représentera un reste aminé chromogène ou fluorescent. Parmi les groupes aminés chromogènes, qui conviennent suivant l'invention, on peut notamment citer les p-nitroanilino (en abrégé pNA), 2-carboxy- 4-nitroanilino et 3-carboxy-4-nitroanilino, 2-halogéno-4- nitroanilino et 3-halogéno-4-nitroanilino (o l'halogène est F,Cl, ou Br), 2-méthoxy-5-méthyl-4-nitroanilino, 2- hydroxysulfonyl-4-nitroanilino, 4-trifluorométhyl- 2-nitroanilino, 4-trifluorométhyl-2-nitroanilino, 4-cyano-2-nitroanilino, 2-naphtylamino, 4-hydroxysulfonyl-l- naphtylamino, quinolylamino, nitroquinolylamino, 2-pyrimidi- nylamino et analogues. Le groupe Ri que l'on préfère suivant l'invention est un groupe chromogène, à savoir pNA, qui convient d'une manière générale à la détermination quantitative des enzymes protéolytiques susvisés et est particulièrement adapté à la détermination de la Protéine C et de la plasmine. Les sels d'addition suivant l'invention sont essentiellement des sels d'addition d'acide obtenus-par réaction d'un composé de formule I avec un acide minéral ou organique. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à utiliser comme substrat un composé dipeptide, dans lequel R est CH3, R2 et R3 sont H, et, n vaut 1, et répondant à la formule: CH30-CO-CH2-CO-A,-Arg-pNA (II} o A, est choisi parmi les restes Ahx, Aib, L-Ala, P-Ala, L-ATC, L-Aze, L-But, L-CHA, L-CHG, L-CHT, Gly, L-4-hyp, L-3-Hyp, L-Ile, L-Leu, L-ELeu, L-NVal, L-Phe, L-Pip, L-Pro,Sar, L-Ser, L-Thr, L- Tyr et L-Val et les restes L-CHT, L-4-Hyp,L-3-Hyp, L-Ser, L-Thr et L-Tyr dans lesquels le groupe OH latéral est protégé sous forme éther ou ester. Les composés de formule II ont l'avantage de présenter une grande affinité pour l'eau à la différence des dérivés peptidiques antérieurement connus qui sont peu solubles ou peu dispersables dans l'eau. En raison de la faible affinité pour l'eau des peptides antérieurement connus, il est quelquefois nécessaire de leur adJoindre un solvant organique afin de pouvoir les utiliser. Les systèmes comprenant des solvants mixtes (notamment du type eau-solvant organique) ne sont guère compatibles d'une manière générale avec les milieux biologiques: ils entraînent soit une diminution de l'activité du substrat, soit encore dans certains cas une détérioration de l'enzyme que l'on veut doser. De plus, la faible affinité pour l'eau de ces substrats entraînent une diminution de la sensibilité des méthodes de dosage des enzymes. L'utilisation des composés de formule Il permet de pallier avantageusement les inconvénients sus-énoncés. De façon non limitative on a consigné dans le tableau I ci-après un certain nombre de composés dipeptides suivant l'invention notés wEx' avec des peptides de référence notés "A1-A4", et, des peptides de comparaison notés "B1-B4" comportant le groupe protecteur terminal CH3O-CO-CH2-CO selon l'invention et "C1-C4" sans ledit groupe protecteur. HODYV V-1 (qP-3)sKq-l X - 98 xE Yqi-H sqHD-'I HO- - i X- YIl-H szy-q xqv-l X 8 94, 9T X1 OZ Vii-H S'yV- (IZS)Jaq-lXX O& bS Si XE YAI-H SaY-J lnE[-,.x 69 bS t I X YVli-H - qTv X 99 bS 1I XS VAl-H 21S-1 Div-'I KR L9 bS Zl XS V&l-H SY-'I LI XX 99 bS 11 XH SI ViL-H Nv-jdú-tIxx 9 bS OT xa V&L-H 2-V-- IVAK-II t19 bS 6 XH VY1-H -' - naX-'I xx 99 bS 9 XH VYl-H syV-q naq'I-'Ix Z9 bS 1 XH VAl-H SyV-'I IV- XX 19 bs 9 XH OI Vii-H iV-q (Iza) -aS-1xX 09 bS S XH VYA-H ayV-q aqA-I xx 65 bS XH VYL-H S'V-,I IYV-i 99 8 S g XA VYil-H 2la-q IVA-1 4 9 XS bSXH VAL-H syV- - XI 1t bS I XS X HUOD Ha.K Xinao I Xa. XHx zyV XHX (YXd-Y-Vbll I nVHaiat SOZI. 19Z TABLEAU I (fin) PRODUIT N'DE CODE Q Ai A2 xHEX EX 19 - (1) L-Val L-Arg AcOH EX 20 - (2). L-Leu L-Orn AcOH. EX 21 - (2) L-CHG L-Arg AcOH EX 22 - (1) L-CHA L-Arg AcOH EX 23 - XX Ahx L-Lys AcOH EX 24 - MX L-Pro L-His AcOH A. 34.47 H D-CHG-L-But L-Arg 2AcOH A2 31.39 CH3S02 D-Leu-Gly L-Arg AcOH A3 30.41 H D-But-L-CHA L-Arg 2AcOH A. 65.25 H D-Lys(eCbo)- L-Arg 2AcOH L-Pro Bi SQ 72 MX Gly-L-Pro L-Arg H-TFA Ci - H Gly-L-Pro L-Arg 2 H-TFA B2 SQ 71 XX Gly-L-Pip L-Arg H-TFA C2 - H Gly-L-Pip L-Arg 2 H-TFA B3 SQ 56 XM D-Pro-L-Pro L-Arg - H-TFA C3 55.10 H D-Pro-L-Pro L-Arg 2 H-TFA B4 SQ 52 MX D-NLeu-L-CHA L-Arg H-TFA C4 33 08 H D-ILeu-L-CHA L-Arg 2 H-TFA N;otes (1) pCH3CaH4SO2CH20-CO-CH2-CO (2) pXeOCsHAO-CO-CH2CO; Les composés dipeptides de formules I et II cl-dessus peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels classiques. Suivant l'invention on préconise un procédé de préparation qui est caractérisé en ce qu'il comprend: 1') la réaction d'un a-aminoacide N-protégé par un groupe protecteur temporaire approprié Z, de formule: Z1-A2-OH (III) o A2 est défini comme ci-dessus, avec un isocyanate, correspondant au groupe marqueur Ri, de formule: O=C=N-R'1 (IV) pour obtenir un composé de formule: Zl-A2-Ri (V) 2') la soumission du composé V ainsi obtenu à une réaction d'acidolyse au moyen d'un mélange HBr/AcOH pour éliminer le groupe protecteur Z, et obtenir le dérivé de formule: H-A2-Ri (VI) 3') la réaction du dérivé VI ainsi obtenu avec un aminoacide X-protégé de formule: Z2-A1-OH (VII) o A, est défini comme indiqué ci-dessus et Z2 est un groupe protecteur temporaire, pour obtenir par condensation un dipeptide protégé de formule: Z2-A -A2-R1 (VIII) 4') la soumission dudit dipeptide N-protégé de formule VIII ainsi obtenu à une réaction d'acidolyse au moyen de l'acide trifluroacétique pour éliminer le groupe protecteur Z2 et donner un dipeptide de formule: H-A.-A2-R1 (IX) et, 5') la réaction du dipeptide de formule IX ainsi obtenu avec un composé de formule: R-O-CO-CR2R3-CO-T (X) o R, R2 et R3 sont définis comme indiqué ci-dessus et T représente OH, F. Cl ou Br (l'atome d'halogène préféré étant le chlore) pour obtenir le composé de formule I attendu. Le groupe protecteur temporaire Z, qui intervient au stade 1' est ici un groupe protecteur classique bien connu de l'homme de l'art, par exemple Boc, Aoc, Adoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl), Z(p-ONe) ou analogue. Le groupe protecteur temporaire Z2 est un groupe protecteur classique de l'extrémité N- terminale, ici ce groupe est identique ou analogue à Zi. Le stade 5' comprend la réaction du dipeptide de formule IX avec un halogènure d'acide: R-O-CO-CR2R3-CO-Hal (XI) o Hal représente un halogène F, Cl, ou Br, ou avec un acide: R-0-CO-CR2R3-CO-OH (XII) De façon avantageuse la réaction IX + XI * I est mise en oeuvre dans un solvant inerte tel que notamment le DMF en présence d'une base en excès agissant comme co-solvant et accepteur de protons, notamment Et3N, avec un rapport molaire IX/XI inférieur ou égal à 1/2. De façon avantageuse la réaction IX + XII est effectuée dans un solvant inerte tel que notamment le DMP en présence d'une base en excès intervenant comme co-solvant et accepteur de protons, notamment Et3N, de HOBT et de DCCI, à une température voisine de O'C pendant au moins 1 heure puis à RT pendant au moins 24 heures, le rapport molaire IX/XII étant compris entre 1/1 et 1/1,5. De façon préférée, on utilisera dans la réaction IX + XI q I un rapport molaire IX/Et3a inférieur ou égal à 1/2,7 et dans la réaction IX + XII 4 I un rapport molaire IX/Et3N de l'ordre 1/1,1, un rapport molaire IX/HOBT de l'ordre de 1/2 et un rapport molaire IX/DCCI de l'ordre de 1/1,18 à 1/1,20. Dans cette dernière réaction le couplage se fait par une activation in situ de la fonction acide en présence de DCCI et HOBT, HOBT étant un agent de couplage non racémisant. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation et d'essais comparatifs, l'ensemble de ces éléments n'étant pas limitatif mais donné à titre d'illustration. PREPARATION I Obtention de NXX-L-4-Hyp-L-Arg-pNA. H-TFA (Exemple 10: No de code: SQ 65) a) Z-L-Arg-pNA, HCl On dissout 13 g (41 mmoles) de Z-L-Arg-OH, HC1 (préalablement séché sur P20a) dans 100 ml de EXPT anhydre à RT. On additionne à RT 5,7 ml de Et3o et ensuite graduellement 82 mmolesd'isocyanate de p-nitrophényle (2 eq). On laisse le mélange réactionnel sous agitation à RT pendant 24 h. On concentre ensuite le milieu réactionel par distillation de HXPT sous pression réduite. Le résidu d'évaporation est repris plusieurs fois avec une solution aqeuse de AcOH à 30 % p/v. La solution acétique est purifiée par HPLC préparative sur un système "PROTEIN-PAK" (colonne échangeuse d'ions "SP 5PW" de dimensions: 15cm x 2,15cm; commercialisée par la société dite KILLIPORE WATERS). On obtient le produit attendu à l'état pur avec un rendement de 45%: [î]2 o = -10,9 (c= 1% dans XeOH) Ce produit ainsi obtenu est homogène en CCX: Rf. = 0,6 avec comme éluant: CHCl3-XeOH-AcOH (5/3/1) v/v; et Rf.=0,5 avec comme éluant:CHCl3-NeOH-AcOH-H20 (60/45/24/6) v/v. Les fractions obtenues après chromatographie préparative sont contrôlées en HPLC sur une colonne de même nature (de dimensions: 7,5cm x 0,75 cm), la phase mobile utilisée étant un gradient de 2 tampons allant en 25 minutes de 100 % de tampon A (Tris 20 mX à pH 8,5 et acétronitrile 10 %) à 100 % de tampon B (Tris 20 mN à pH 8,5 + NaCl 1 X et aèétronitrile 10 %) à un débit de 1 ml/min, la détection étant réalisée à 254 nm et à 'C. b) H-Arg-plA. 2HBr A 10 g- (23 moles) de Z-Arg-pNA, HCl ainsi obtenu on ajoute successivement 20 ml d'anisole, 80 ml de AcOH glacial et ml d'une solution de HBr à 45 X dans AcOH glacial. On laisse le milieu réactionnel à TR pendant une heure et suit l'évolution de la réaction par CCX. Dès qu'elle est achevée, on transvase le milieu réactionnel dans un litre d'éther et agite vigoureusement pendant quelques minutes. Après décantation, le surnageant est aspiré au moyen d'un tube plongeant muni d'un filtre en verre fritté. L'opération de lavage dans l'éther est répétée plusieurs fois (au moins trois fois) et le produit obtenu est séché. On obtient 9,5 g (rendement 97 %) de H-Arg-pNA, 2HBr sous forme de poudre ta]2C'c5 s = +55,1' (c= 1% dans XeOH). Ce produit est homogène en CCX [ éluant: CHCli/NeOH/AcOH (5/3/1) v/v]; Rf. = 0,4. L'analyse par HPLC sur 'PROTEIN- PAK" "SP 5PW (dimensions : 7,5 cm x 0,75 cm) avec le gradient sus-décrit de tampons A et B donne un temps de rétention de 34,6 minutes. c) Boc-L-4-Hyp-L-Arg-pNA. HBr 2 611205 On introduit sous agitation 10 g (1 eq) de H-L-Arg-pNA, 2HBr et 5,0575 g (1 eq) de Boc-L-4-Hyp-OH dans un ballon contenant 66 ml de DXF et refroidi au moyen d'un bain de glace. Lorsque la température d'équilibre est atteinte, on ajoute 3,055 ml (1 eq) de ETaN 6,785 g (1,5 eq) de DCCI et 6,695 g (2eq) de HOBT. On laisse réagir le milieu réactionnel pendant 24 heures. On contrôle l'achèvement de la réaction par CCX puis ajoute la réaction terminée 10 ml de AcOH glacial et agite pendant 0,25 h. Par filtration de la DCHU formée et évaporation du filtrat sous pression réduite, on obtient par précipitation dans l'éther 6,823 g du produit attendu homogène par CCX et HPLC. Analyse 1') CCM sur couche de silice - CCX (A) avec éluant: mélange CECl3/XeOH/AcOH (50/30/10) v/v Rf = 0,75 - CCM (B) avec éluant: mélange nbutanol/AcOH/eau (3/1/1) v/v Rf = 0,60 2') HPLC sur PROTEIN PAK" (avec gradient de deux tampons comm indiqué ci-dessus: les tampons A et B précités), temps de rétention 16,6 minutes. 3') Pouvoir rotatoire [a]20c.,n = -45,50'(c=l1 dans XeOH) d) H-L-4-Hyp-LArg-p!A. 2H-TFA Dans un ballon muni d'une garde de CaCl2, on introduit 6, 823 g (1 eq) de Boc-L-4-Hyp-L-Arg-pNA, HBr, 32,6 mi (3,7 eq) de H-TFA et 32,6 mi de dichlorométhane. La durée de réaction est d'environ 1 h; 30 mm après le début de la réaction, on contrôle son évolution par CCX (A) et CCX (B) comme indiqué ci-dessus au stade c>. Lorsque la réaction est achevée, on évapore H-TFA sous pression réduite, puis par précipitation dans l'éther, on obtient 7,382 g du produit attendu. Analyse 1') CCX sur silice CCX (A): Rf = 0,55 CCX (B): Rf = 0,42 2') HPLC (avec gradient de deux tampons: tampon A comne au stade b) et tampon C (Tris 2OmX à pH 8,5 + acétonitrile 10 % + NaCl 1X), temps de rétention: 18,4 minutes. 3') [.]2 'óm=,- = -21,4'(c= 1% dans NeOH). e) XX-L-4-Hyp-L-Arg-pNA. H-TFA On introduit sous agitation 7, 382 g (12 Bmoles) de H-L- 4-Hyp-L-Arg-pNA, 2H-TFA avec 35 ml de DMF dans un ballon de 50 ml refroidi au bain de glace et maintient l'agitation. Lorsque la température d'équilibre est atteinte, on ajoute 4,4 ml (31,4 mmles; soit 2,7 eq) de Et3N puis 2,5 ml (24 mmoles) de chlorure de méthyloxymalonyle ( une hydrolyse enzymatique et conduisant à une libération de pNa. Les fractions ainsi retenues que l'on obtient sont concentrées sous pression réduite puis lyophilisées. AIalyse 1') CCX sur silice CCX (A): Rf = 0,85 CCX (B): Rf = 0,52 2') HPLC (avec un gradient de deux tampons: tampons A et B du stade b), temps de rétention: 16 minutes. 3' [ta]2 'c46 r= -30,4' (c= 1 % dans XeOH) PREPARATIO! II En procédant suivant le procédé de la préparation I, mais en remplaçant l'isocyanate de p-nitrophényle par l'isocyanate de r-chloro-p-nitrophényle, on obtient le X-L-4-Hyp-L-Arg-w-Cl- pNA, H-TFA. PREPARATION III Obtention de XX-L-Pro-L-Arg-pNA, H-TFA (Exemple 1; n' de code: SQ 41) Dans un ballon on dissout successivement 317 mg (2,68 mmoles) d'acide monométhyloxymalonique, 1,66 g (2,68 moles) de H-L-Pro-L-Arg-pNA, 2H-TFA, 800 mg (5,36 moles) de HOBT et 413p1 (2,95 umoles) de Et3N dans 15 ml de DXF. Le mélange est refroidi dans de la glace et mis sous agitation. On ajoute 660 mg (3,2 moles) de DCCI et maintient l'agitation pendant une heure à O' C et 24 heures à RT. On suit l'évolution de la réaction par CCX. Après achèvement de la réaction on filtre pour écarter la DCHU formée et évapore le solvant du filtrat sous pression réduite.Le résidu d'évaporation ainsi obtenu est-précipité dans l'éther et purifié par HPLC préparative sur dispositif "PROTEIN PAK" SP 5 PV ( de dimensions 15 cm x 2,15 cm). Les fractions recueillies sont homogènes en CCX et HPLC. Analyse 1') CCX sur silice CCX (A): Rf = 0,64 CCX (B): Rf = 0,60 2') HPLC (gradient de deux tampons: tampons A et B de la préparation Ia), temps de rétention: 16,4 minutes 3') [a]2'ca46 nm. = -65,9' (c= 1% dans XeOH) On a consigné ci-après dans le tableau II les caractéristiques des produits suivant l'invention. TABLEAU II PRODUIT [(]a '0 4s nin RF HPLC (conc./XeOH) CCX(A)ICCX(B) (a) (b) I EX 1 -65,9' (1%) 0,64 0,60 16,4 A-B EX 2 -33' (1%) 0,98 I 0,64 14 A-C EX 3 -25' (1%) 0,96 | 0,56 13 A-C EX 4 -9,6- (1%) 0,94 0,69 34,4 A-B EX 5 -16,9' (1%) 0,97 I 0,75 37,5 A-B EX 6 -18,7' (1%) 0,79 ' 0,58 26,2 A-B EX 7 -22' (1%) 1,0 1 0,66 22 A-B EX 8 -46,7' (1%) 0,99 I 0,64 26,6 A-B EX 9 +21,3' (1%) 0,975j 0,63 19,8 A-B EX 10 -30,4' (1%) 0,85 i 0,52 16 AB EX 11 -13,5' (1%) 0,8 I 0,5 19,9 A-B EX 12 -40,4' (1%) 0,92 1 0,53 23,7 A-B EX 13 +1,08- (1%) 0,9 i 0,56 23,6 A-B EX 14 -15,8' (1%) 0,9251 0,59 17,1 A-B EX 15 -13,0' (1%) 0,90 0,77 33,8 A-B Notes: a) temps de rétention en minutes b) gradient de deux tampons allant en 25 minutes de 100% de A à % de B ou C, puis pendant 20 minutes à 100 % de B ou C; lecture à 254 nm, à 20' C (pour tampons A et B, voir préparation Ia et pour tampon C voir préparation Id) ACTIVITE DES SUBSTRATS L'activité des dipeptides suivant l'invention et des tripeptides consignés dans le tableau I a été étudiée sur la thrombine humaine, la plasmine humaine, le Facteur Xa humain et la Protéine C bovine, les tripeptides A1-A4 étant les substrats de référence du commerce. La libération du marqueur HR, ( amine H2NR',), qui est objectivée par la variation de OD pendant l'hydrolyse enzymatique des substrats, sert d'outil de comparaison. La lecture de OD est en général effectuée & 300-470 nu, et plus précisément à 405 nm quand Ri est pNA, pendant environ 5 minutes. Les essais ont été réalisés sur appareil GILFORD 203 S pour automatiser la lecture des échantillons et standardiser leur traitement. Enzymes On prépare des solutions dans du sérum physiologique renfermant chacune un enzyme: thrombine humaine 3 UNIH/ml Facteur Xa humain 3,7 nkat/ml plasmine humaine 2,3 nkat/ml protéine C bovine activée lOpg/ml Substrats On dissout chaque peptide à tester dans de l'eau A une concentration de 10 mg/ml. ]esures 400 pl d'enzyme dilué au 1/2 dans du tampon TEA (pH 8,4) sont ajoutés à 200 pl de chacun des différents peptides à tester. On détermine les vitesses d'hydrolyse desdits substrats en suivant l'évolution de la libération de pNA. Cette évolution peutit être suivie par la lecture de la variation de OD par unité de temps (AOD/minute) à..405 nm. Résultats Les résultats obtenus (exprimés en AOD/minute) sont consignés dans le tableau III ci-après. Ils mettent en évidence que: (i) les produits EX 1 et EX 10 sont particulièrement intéressants en tant que substrats, EX 1 et EX 10 étant plus sensibles à la protéine C que le produit de référence A4, le produit EX 10 étant en outre plus sensible à la plasmine que le produit de référence A3; (ii) le produit EX 12 est particulièrement spécifique vis-à-vis de la protéine C; (iii) le produit EX 4 est particulièrement spécifique vis-à-vis de la plasmine; (iv) le produit EX 11 est plus sensible vis-à-vis du facteur Xa que vis-à-vis de la thrombine, de la plasmine et de la protéine C; et (v) dans la série des tripeptides, par comparaison de B1 avec C1, de B2 avec C2, de B3 avec C3, de B4 avec C4, on constate que le remplacement du groupe H de l'atome d'azote 261120-5 terminal du peptide par le groupe XX selon l'invention, diminue systématiquement l'activité. TABLEAU III PRODUIT N'code Vitesse d'hydrolyse en AOD/minute Thrombine Facteur Xa Plasmine Protéine C EX 1 SQ 41 0,68 0,14 0,230 0,83 EX 2 SQ 57 0,21 0,03 0,08 0,12 EX 3 SQ 58 0,20 0,05 0,03 0,04 EX 4 SQ 59 0,05 0,13 0,64 0,16 EX 5 SQ 60 0,07 0,09 0,20 0,08 EX 6 SQ 61 0,02 0,03 0,05 0,02 EX 7 SQ 62 0,04 0,16 0,17 0,10 EX 8 SQ 63 0,04 0,16 0,21 0,11 EX 9 SQ 64 0,14 0,07 0,17 0,12 *EX 10 SQ 65 0,61 0,34 1,12 0,88 EX 11 SQ 66 0,03 0,15 0,04 0,04 EX 12 SQ 67 0,18 0,07 0,14 0,41 EX 13 SQ 68 0,04 0,01 0,02 0,03 EX 14 SQ 69 0,19 0,06 0,10 0,25 EX 15 SQ 70 0,05 0,01 0,04 0,08 EX 16 SQ 73 0,24 0,03 0,07? 0,08 A1 34.47 0,782 - - - A2 31.39 - 1,312 - A3 30.41 - - 0,235 - A4 65,25 - - - 0,520 TABLEAU III (fin) B1 SQ 72 0,13 0,02 0,03 0,18 Ci - 0,516 0,01 0,04 0,24 B2 SQ 71 0,14 0,01 0,04 0,09 C2 - 0,35 0,04 0,02 0,17 B3 SQ 56 0,05 0,01 0,01 0,03 C3 55.10 0,32 0,59 0,02 1,08 B4 SQ 52 0,01 0,01 0,04 0,02 CC4 33.08 0,61 0,02 0,65 0,11 Les dérivés dipeptides de formule I selon l'invention sont particulièrement intéressants en tant que substrats enzymatiques dans le domaine des dosages. Ils peuvent être conditionnés sous forme de kits ou trousses de dosage avec les autres réactifs requis pour lesdits dosages. REVENDICATIONS 1. Composé dipeptidique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble comprenant: (i) les composes de formule: Q-A1-A2-R1 (I) (dans laquelle: Q est un reste RO-CO-(CR2R3), -CO o R représente l'atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Ci- C4, un groupe phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes notamment CH3, OCHE et alkylènedioxy, un groupe benzyle éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes, notamment CH3, OCH3 et alkylènedioxy, ou, un groupe tosylméthyloxy; R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4; n est un nombre entier ayant pour valeur i à 5; Ri qui est un reste amino de formule NR-R'. constitue un marqueur clivable du groupe A2 par hydrolyse enzymatique, le groupe R', intervenant comme support du moyen de marquage; A, est un reste de monoaminoacide choisi parmi l'ensemble comprenant les restes d'aminoacides non-basiques; A2 est un reste de monoaminoacide choisi parmi l'ensemble comprenant les restes d'aaminoacides basiques; et (ii) leurs sels d'addition. 2. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu A, est un reste choisi parmi l'ensemble comprenant l')les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction acide et une seule fonction basique, 2') les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction basique et plus d'une fonction acide et dans lesquels chaque fonction acide latérale est susceptible d'être bloquée notamment sous forme amide ou ester,et 3') les restes d'aminoacides naturels ou synthétiques qui comprennent une seule fonction acide et plus d'une fonction basique et dans lesquels chaque fonction basique latérale est convenablement substituée pour supprimer essentiellement le caractère basique, lesdits restes sus-visés pouvant comporter des groupes hydroxyle (OH) ou thiol (SH) latéraux qui sont susceptibles d'être bloqués, le cas échéant, par un groupe protecteur éther ou ester. 3. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que A, est choisi parmi l'ensemble constitué par a) Ala, 0-Ala,Cys, Gln, Gly, 4-Hyp, 3-Hyp, Leu, Xet, NLeu, IVal, Phe, Pro, Sar, Ser, Thr, Tyr et Val, o le groupe OH latéral des restes 4-Hyp, 3- Hyp,Ser, Thr et Tyr est protégé ou non par un groupe protecteur éther ou ester, et o le groupe SH latéral du reste Cys est protégé ou non par un groupe protecteur thioéther ou thioester, b) Asp, P-Asp, Glu et y-Glu, dans lesquels la fonction acide latérale est libre ou bloquée sous forme ester, notamment sous forme d'ester benzylique ou t-butylique; c) Arg, Dab, Lys, His et Orn convenablement bloqué pour éliminer substantiellement le caractère basique, d) ACC, Ahx, Aib, ATC, Aze, But, 4-But, CHA, CHG, CHT (o le groupe OH latéral est protégé le cas échéant sous forme éther ou ester), Cle, x-Dab, Phg, Pip et Pyr; 4. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe A, est choisi parmi l'ensemble comprenant les restes Aib, L-Ala, A-Ala, L-ATC, L-Aze, L-But, 4-But, L-CHA, L-CHG, L-CHT, Cle, Gly, L-4-Hyp, L-3-Hyp, L-Ile, L-Leu, LILeu, L-NVal, L-Phe, L-Pip, L-Pro, Sar, L-Ser, L-Thr, L-Tyr et L-Val, les restes L-CHT, L-4-Hyp,L-3-Hyp, L-Ser, L-Thr et L-Tyr dans lesquels le groupe OH latéral est protégé par un groupe éther ou ester, et, les restes L-Arg, L-Lys, L-His et L- Orn dans lesquels la fonction basique latérale est convenablement bloquée pour éliminer substantiellement le caractère basique. 5. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que A2 est choisi parmi l'ensemble comprenant les L-Arg, L-Lys, L-His et L-Orn. 6. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que R est CIe, R2 est H, Rs est H, et, n est 1. 7. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe Ri est choisi parmi les groupes aminés NH-R', qui (i) induisent une modification de coloration (ii) induisent une modification de fluorescence ou (iii) comportent au moins un élément radioactif. 8. Composé dipep'idique suivant la revendication 7, caractérisé en ce que -R est pNA. 9. Composé dipeptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble comprenant les CH30O-CO-CH2-CO-L-Pro-L-Arg-pNA,CH30-CO-CH2-CO-L-4-Hyp- L-Arg-pNA et leurs sels d'addition. 10. Procédé de préparation d'un composé dipeptidique de formule I suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: ' 1) la réaction d'un a-aminoacide N-protégé par un groupe protecteur temporaire approprié Z, de formule: Z1-A2-OH (III) o A2 est défini comme ci-dessus, avec un isocyanate, correspondant au groupe marqueur Ri, de formule: O=C=N-R', (IV) pour obtenir un composé de formule: Z1-A2-R1 (V) 2') la soumission du composé V ainsi obtenu à une réaction d'acidolyse au moyen d'un mélange HBr/AcOH pour éliminer le groupe protecteur Z, et obtenir le dérivé de formule: H-A2-Ri (VI) 3') la réaction du dérivé VI ainsi obtenu avec un aminoacide N-protégé de formule: Z2-A -OH (VII) o A, est défini comme indiqué ci-dessus et Z2 est un' groupe protecteur temporaire analogue à Z,,pour obtenir par condensation un dipeptide protégé de formule: Z2-A,-A2-R1 (VIII) 4') la soumission dudit dipeptide X-protégé de formule VIII ainsi obtenu à une réaction d'acidolyse au moyen de l'acide trifluroacétique pour éliminer le groupe protecteur Z2 et donner un dipeptide de formule: H-A1 -A2-R, (II) et, ') la réaction du dipeptide de formule IX ainsi obtenu avec un composé de formule: R-O-CO-CR2R2-CO-T (X) o R, R= et R2 sont définis comme indiqué ci-dessus et T représente OH, F.Cl ou Br.