Brevet FR2617403A1 — publié le 19890106

1. La présente invention concerne un procédé de pré- paration de dérivés des acides nucléiquEs et un procédé de préparation d'une composition médicale contenant ces déri- vés. Les acides nucléiques sont composés de cycles purine et de cycles pyrimidine et de ribose ou de sucres analogues sous forme liée aux cycles, ces éléments consti- tutifs étant liés les uns aux autres par un pont phospha- te pour former une structure en chaîne. - Parmi les acides nucléiques, le RNA (polymère de ribonucléotide) est un composé macromoléculaire à structure en chaîne ayant comme sucre le ribose dans le- quel les parties sucre sont liées les unes aux autres par un pont phosphate par la liaison diester. Dans les acides nucléiques à deux brins, les parties cycles purine ou cycles pyrimidine des bases constituant l'acide nucléique (par exemple l'inosine, l'adénosine, la cytidine, 2. l'uridine, etc.) sont liées par une "liaison hydrogène complémentaire pour donner une stéréostructure en dou- ble hélice. Comme on s'attend à ce que des acides nucléi- ques ayant une structure à deux brins aient des fonctions physiologiques utiles, de nombreuses études ont été ef- fectuées jusqu'à présent sur ces acides nucléiques (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, etc.). Parmi les acides nucléiques de cette espèce, un RNA synthétique à deux brins, dérivé de l'acide poly- inosinique.acide polycytidylique est désigné ci-après sous le nom de dérivé "poly-I.poly-C" et l'acide polyino- sinique qui est la partie constitutive de ce dérivé, est désignée sous le nom de "poly-I" et l'acide polycytidyli- que sous le nom de "poly C". Récemment, on a trouvé que divers RNA naturels et synthétiques à deux brins avaient une capacité d'induc- tion de l'interféron (Field et coll., Proc. Nat. Acad. Sci., US., 58, 1004, 1967; Field et coll., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 58, 2102, 1967; Field et coil., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et coll., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 58, 1719, 1967; Field et coll. J. Gen. Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et coll., Methods in Enzymology, 78, 291, 1981). Des exemples typiques de dérivés connus d'acides nucléiquessynthétiques sont mentionnés ci-dessous. Dérivés d'acidesnucléiquessynthétiqurs pour induc- teur de l'interféron (I) Complexes homopolymère.homopolymère (polymères d'acide nucléique à deux brins ayant le poly-I.poly-C comme structure apparentée. (1) Dérivés modifiés par des bases: Acide polyinosinique.poly(acide 5-bromocytidy- lique; Acide polyinosinique.poly(acide 2-thiocytidylique); 3. Acide poly (acide 7-déazainosinique).acide poly- cytidylique; Acide poly (7-déazainosinique).poly (acide 5-bro- mocytidylique). (2) Dérivés modifies par des sucres: Poly (acide 2 '-azidoinosinique).acide polycyti- dylique. (3) Dérivés modifiés par l'acide phosphorique: Acide polyinosinique.poly(acide cytidine-5'- thiophosphorique). (II) Copolymères intermodifiés: Poly(acide adénylique-acide uridylique). (III) Complexes homopolymère.copolymère: Acide polyinosinique.poly (acide cytidylique, acide uridylique); Acide polyinosinique.poly(acide cytidylique, acide 4-thiouridylique). (IV) Complexes acide synthétique/polycation: Acide polyinosinique. acide polycytidylique.poly- L-lysine (désigné ci-après sous le nom de "poly-ICLC"). (V) Autres: Acide polyinosinique.poly(acide 1-vinylcytidyli- que). Comme il a été indiqué ci-dessus, divers types de RNA à deux brins, en particulier des dérivés compre- nant le poly-I.poly-C comme corps apparenté, ont été signalés ces dernières années. Il existe une théorie bien établie sur une série de dérivés des acides nucléiques, dont ceux-ci en ce qui concerne les relations entre la structure des dérivés et leurs fonctions (De Clercq et coll., Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982). La demanderesse a trouvé sur la base de la technique antérieure mentionnée ci-dessus, que lorsque 4. le poly-I.poly-C et divers dérivés de celui-ci ayant une partie poly-I.poly-C comme corps apparenté sont calibrés de telle sorte que la répartition de toutes les tailles moléculaires des dérivés puisse tomber dans l'intervalle de valeur de la constante de sédimentation de 4S à 13S (soit un nombre de bases des dérivés de 50 à 10 000), les dérivés ainsi calibrés peuvent avoir une toxicité notablement abaissée et peuvent conserver les activités physiologiques qui seront mrentionnées ci-dessous. En conséquence, la de- manderesse a déposé des demandes de brevet à l'Office ja- ponais des brevets (demande de brevet japonais n 62-167433 et une autre demande de brevet avec la priori- té de cette demande n 62-167433). En même temps que l'étude ci-dessus, la deman- deresse a encore étudié divers moyens pour obtenir avec un bon rendement les produits ci-dessus. En particulier, elle a effectué diverses études sur un moyen de cali- brer des dérivés d'acide nucléique pour qu'ils aient une répartition des tailles moléculaires correspondant à 50 à 10 000 bases et un moyen pour former un polymère d'acide nucléique à deux brins à partir de deux types de polymè- res d'acide nucléique à un seul brin. En ce qui concerne le premier moyen, l'opération de limitation de la réparti- tion des tailles moléculaires des dérivés d'acide nucléi- que dans un intervalle déterminé est désignée sous le nom de "calibrage". Comme le calibrage est accompagné d'une conversion en substances de faible masse moléculaire con- formément au procédé de l'invention, le calibrage com- prend un "raccourcissement des chatnes". En ce qui con- cerne le dernier moyen, celui-ci est désigné ci-après sous le nom de "recuit". La paire de bases (désignées ci-après sous le nom de "pb") qui est généralement utilisée comme unité pour représenter la taille moléculaire des acides nucléiques peu, être employée pour représenter la taille 5. moléculaire des acides nucléiques par le nombre des bases constituant-l'acide nucléique. (Par exemple, 10 pb" si- gnifie un polymère à double brin ayant 10 bases). Dans le présent mémoire, il est également fait mention d'autres polymères d'acide nucléique que les polymères à deux brins en plus des polymères d'acide nucléique, et par consé- quent, le terme "nombre de bases" est utilisé ici à la pla- ce de "pb" pour représenter la taille moléculaire des aci- des nucléiques. (par exemple, un polymère d'acide nucléi- que ayant un "nombre de bases de 10" signifie que le poly- mère a 10 bases). Lorsque la taille moléculaire d'un acide nucléique doit être déterminée ou identifiée, on utilise en général une "valeur de constante de sédimentation" (valeur S). Ce- pendant, la demanderesse a pu obtenir le nombre de bases des acides nucléiques mentionné ci-dessus au moyen d'une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en uti- lisant une colonne de filtration sur gel ou une électro- phorèse (décrite ci-dessous en détail) dans laquelle le DNA à deux brins (fragments de DNA de phage M13) ayant des tailles moléculaires connues est utilisé comme mar- queur, et le nombre de bases de l'acide nucléique à dé- terminer est calculé à partir du nombre du témoin. Jusqu'à présent, la valeur de la constante de sédimentation (valeur S) a été largement-utilisée pour la représentation de la masse moléculaire des acides nucléiques macromoléculaires. Les acides nucléiques macro- moléculaires qui existent dans le commerce sont représen- tés par leur valeur S. Cependant, en raison des progrès des techniques expérimentales de ces dernières années, un moyen pour déterminer de manière plus précise la masse moléculaire des substances macromoléculaires a été mise au point en utilisant l'électrophorèse sur gel, la chroma- tographie de filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ions etc. de telle sorte que la détermination 6. de la longueur de chaSne des acides nucléiques macro- moléculaires est devenue possible. Dans ces conditions, la relation entre la représentation par la valeur S et la représentation par la longueur de chatne devien- drait problématique. En particulier, comme les molé- cules respectives d'acide nucléique ont leurs valeurs in- trinsèques dans le cas de la représentation par la valeur S, la question de savoir si oui ou non la représentation par la valeur S et la représentation par la longueur de chaTne peuvent correspondre exactement l'une à l'autre comme moyen de représenter la masse moléculaire des aci- des nucléiques ne pose pas toujours de problème. En conséquence, pour la présentation de la mas- se moléculaire des polymères d'acide nucléique de la pré- sente invention, la représentation par la valeur S est également utilisée dans la description du présent mémoi- re conformément à l'usage dans le domaine de la chimie des acides nucléiques. Cependant, comme la "valeur S" est une valeur obtenue par un procédé de mesure de la masse moléculaire des acides nucléiques macromoléculaires sous la forme d'une masse moléculaire comme un tout (ou sous la foriae d'un état moléculaire de la substance), la représentation sur la base de la mesure de la longueur de chaîne de la substance (qui est le "nombre de bases" auquel il est fait référence ici) est également men- tionnée ici en même temps que cette "valeur S". La rai- son en est en particulier que la limite d'une réparti- tion des mases moléculaires doit être représentée de manière plus précise dans la mise en application de la présente invention. Conformément aux moyens classiques de calibrage du poly-I.poly-C et de divers dérivés de celui-ci ayant le poly-I.poly-C comme corps apparenté pour donner des polymères d'acide nucléique à double chaîne calibrés, des polymères d'acide nucléique à double chaîne déjà 7. existants sont décomposés en composés de faible masse moléculaire ou encore des acides nucléique à un seul brin sont hydrolysés en composés de faible masse moléculaire avant le recuit. Cependant, les moyens classiques ne conviennent pas pour obtenir le produit désiré à l'échelle industrielle car le calibrage est long à effectuer, et le procédé ne peut pas être effectué rapidement. En outre, les moyens classiques ne sont pas toujours satisfaisants du point de vue du rendement des produits. D'autre part, si on doit sulfurer, après calibra- ge, des polymères d'acide nucléique à un seul brin, les poly- mères sont sulfurés avec de l'hydrogène sulfuré et, dans le procédé classique, on fait évaporer l'hydrogène sulfu- ré du solvant. Il est à noter qu'après sulfuration, on fait évaporer la pyridine de la solution.réactionnelle, par exemple avec une pompe à vide,de telle sorte que l'hydro- gène sulfuré peut être éliminé de la solution réactionnel- le en même temps que la pyridine par évaporation. Cepen- dant,' par ce procédé, l'hydrogène sulfuré s'évapore dans l'air et par conséquent, ce procédé est désavantageux à l'échelle industrielle du point de vue de la pollution de l'environnement. En outre, conformément à ce procédé, la couche aqueuse séparée après évaporation de la pyri- dine est placée dans un tube à dialyse pour être dialy- sée contre de l'eau courante de manière à obtenir le pro- duit désiré. Cependant, le procédé exige au moins 3 jours pour une opération comiplète,et le rendement du produit - est au plus de 80 % environ. Ainsi, ce procédé classique pose divers problèmes techniques en ce qui concerne le rendement des produits, le coût de fabrication et la du- rée de l'opération. On ne peut pas dire non plus que la technique de calibrage elle-même n'a pas été source de difficultés dans la technique antérieure. Dans ce domaine technique, d'une manière générale, 8. on chauffe un polymère d'acide nucléique en présence de formaldéhyde de manière à l'hydrolysEen composés de fai- ble masse moléculaire. Dans ce procéd& classique, on ob- tient des produits ayant la longueur de chaîne désirée en réglant adéquatement la durée de réaction et la tempé- rature de réaction, puis on soumet la solution réaction- nelle à une dialyse de manière à éliminer les composés ayant éventuellement subi une décomposition trop poussée et ayant une taille moléculaire trop faible. Conformé- ment au procédé classique, cependant, des composés ayant diverses répartitions des masses moléculaires se forme- raient par calibrage même si les conditions réactionnel- les sont maintenues constantes, suivant les propriétés des polymères d'acide nucléique utilisés. Par conséquent, le procédé pose un problème de reproductibilité. On con- sidère que ceci provient du fait que,quand les matières premières destinées à être utilisées dans le procédé sont préparées par une réaction enzymatique, la taille des ma- tières premières ne peut pas être considérée comme cons- tante. En outre, par la dialyse telle qu'elle est appli- quée au procédé, il est en principe impossible d'élimi- ner les polymères d'acide nucléique ayant une longueur de chaîne plus grande que les produits formés. Dans ces con- ditions, il est souhaitable de disposer d'un moyen fonda- mental pour résoudre les problèmes de la technique anté- rieure mentionnés ci-dessus. En conséquence, la demanderesse a effectué di- verses études pour atteindre les objectifs suivants: (1) Des polymères d'acide nucléique à deux brins calibrés sont obtenus comme produits par un procédé rapide. (2) Le rendement des produits est élevé. (3) Même lorsque le procédé est effectué à l'échelle industrielle, le procédé ne cause pas de pollution de l'environnement ni d'autres 9. perturbations. (4) Dans ce procédé, les opérations successives sont suffisamment quantitatives et reproducti- bles. A la suite de ces études, elle a abouti à la présente inventionquifournit: (1) un prQcéCé de préparation de dérivés d'aci- de nucléique à deux brins ayant le RZA comme corps apparenté, dont toute la répartition des tailles moléculaires tombe dans l'intervalle de valeur de la constante de sédimentation de 4S à 13S, dans lequel les polymères d'acide nucléi- que sont calibrés avant d'être recuits; et (2) un procédé de préparation de dérivés d'acide nucléique à double chaîne ayant le RNA comme corps apparenté, dans lequel les molécules pour la répartition maximale dans toute la distribution des tailles moléculaires des dérivés ont des nombres de bases dans l'intervalle de 50 à 10 000, les polymères d'acide nucléique étant calibrés avant d'être recuits. En particulier,l'essentiel de la présente inven- tion réside dans les points suivants: (1) des polymères d'acide nucléique à chaîne unique sont calibrés avant d'être recuits. (2) Pour le calibrage dans le stade (1), on utilise la HPLC (filtration sur gel, chromatogra- phie liquide à haute performance) à la place de l'électrophorèse classique de telle sorte que la répartitionÈbs tailles moléculaires des produits est numériquement définie. En conséquence, les fluctuations de la répartition des tailles molé- culaires peuvent aisément être contrôlées de telle sorte que des produits ayant l'intervalle de dis- tribution des tailles moléculaires voulues 10. correspondant à une valeur de la constante de sédimentation de 4S à 13S (ou à un nombre de ba- ses de 50 à 10 000) peuvent être obtenus rapi- dement. Le procédé rapide et précis de sélec- tion des produits ayant la longueur de chaine désirée a été établi par la présente invention. (3) Après le calibrage, on peut ajouter un al- cool inférieur à la solution réactionnelle pour iso- ler les produits. (Dans les procédés classiques, les produits sont obtenus par dialyse). La présen- te invention a établi un stade d'isolement extrê- ment simple pour augmenter le rendement des pro- duits. (4) Après le calibrage, si les polymères d'aci- de nucléique à chaîne unique calibrés doivent être sulfurés, les polymères sont d'abord sulfu- rés avec de l'hydrogène sulfuré, puis, après addition d'un alcool arylique à la solution réactionnelle de sulfuration, la solution obte- nue est soumise à une centrifugation pour éliminer l'hydrogène sulfuré. (Dans les procédés classi- ques, l'hydrogène sulfuré est directement évaporé du solvant). Ainsi, la présente invention a éta- bli un stade extrêmement simple d'élimination de l'hydrogène sulfuré pour augmenter le rende- ment des produits. (5) Comme procédé de réglage et de limitation de la répartition des masses moléculaires des polymères d'acide nucléique à brin unique cali- brés,on utilise une résine échangeuse d'ions. (Cette opération est désignée ici sous le nom de "limitation de la taille"). La présente invention sera expliquée à présent plus en détail ci-après. Le. recuit est un stade de liaison complémentaire 11. des polymères d'acide nucléique à un seul brin en poly- mères à deux brins, et c'est une opération qui peut na- turellement être effectuée facilement. Si le calibrage était effectué après le recuit, le degré de sulfura- tion varierait d'une manière erronée de telle sorte qu'il deviendrait difficile d'obtenir quantitativement le pro- duit. En conséquence, la demanderesse a essayé d'effectuer l'opératioEL de calibrage avant le stade de recuit, et elle a obtenu ainsi un résultat tout à fait excellent. L'as- pect (1) mentionné ci-dessus est en relation étroite avec l'aspect (2). Conformément aux moyens classiques de détermination d'une masse moléculaire par électrophorèse, au moins une nuit complète est nécessaire pour la migra- tion, la coloration et d'autres stades, et par consé- quent, une opérationimpide est difficile. Au contraire, conformément à la présente invention, la filtration sur gel HPLC est appliquée à la détermination de la masse moléculaire des dérivés d'acide nucléique, de telle sorte que le temps de réaction avant l'élution des dérivés ayant la répartition désirée des masses moléculaires (c'est-à-dire entrant dans l'intervalle de valeurs de la cons- tante de sédimentation 4S à 13S ou de nombre de. bases de 50 à 10 000) peut être notablement raccourci Conformément à la présente invention, on arrête la réaction lorsqu'on constate que la réaction de cali- brage est terminée, puis on ajoute un alcool inférieur pour le traitement ultérieur de la solution réactionnel- le. Parmi les alcools inférieurs, on préfère particuliè- rement l'éthanol. Dans le cas de la précipitation par l'éthanol dans la présente invention, par exemple, le rendement en L-poly-C (poly-C calibré) (le préfixe "L-..." signi- fie ci-après "calibré...." I) à partir du poly-C est de 93 % et le rendement du L-poly-I à partir du poly-I est de 78 %. Par conséquent, le rendement en produits 12. calibrés est élevé. Au contraire, dans le procédé classique, on doit placer la solution réactionnelle dans un tube à dialy- se pour la dialyse. Dans ce cas, le taux de récupération n'est que de 60 % environ, et on peut s'attendre à ce que le rendement en L-poly-I à partir du poly-I ne soit que d'environ 40 %. En outre, l'opération de dialyse exi- ge une durée de l'ordre de 3 jours. Cependant, par le procédé de précipitation par * l'éthanol de la présente invention,dans lequel de l'étha- nol est ajouté à une solution réactionnelle dans une quan- tité égale à deux fois la solution réactionnelle et agi- tée de manière à précipiter le produit désiré, puis le précipité obtenu est recueilli par centrifugation et lavé et séché, l'opération peut être terminée en une heure. L'aspect (3) ci-dessus est la caractéristique la plus importante de la présente invention. La réaction de remplacement des atomes d'azote dans la partie acide nucléique d'un polymère d'acide nucléique à chaîne unique calibré par des atomes de soufre (par exemple la substitution du groupe amino de la partie radical cytidine dans le poly-C par un groupe mercapto dans une certaine proportion) de manière à trans- former cette partie acide nucléique en un acide nucléique différent (la réaction étant désignée ici sous le nom de "sulfuration"), est souvent utilisée dans la synthèse de copolymères. Une autre caractéristique de la présente invention consiste à ajouter un alcool arylique aux poly- mères d'acide nucléique à chaîne unique calibrés pour l'isolement de copolymères sulfurés. Ceci est l'aspect (4) mentionné ci-dessus. Comme alcool arylique, on peut par exemple uti- liser à cet effet le phénol. Par exemple, on ajoute d'abord la moitié du phé- nol à la solution réactionnelle contenant de la pyridine, 13. de l'eau, et de l'hydrogène sulfuré gazeux en mélange, on agite et on centrifuge, de telle sorte que la couche aqueuse se sépare nettement de la couche phénolique, et que l'agent colorant de la solution réactionnelle ainsi que le soufre formé comme sous-produit etc. passent dans la couche phénolique. On isole, ensuite, la couche aqueuse et on précipite le produit désiré par traitement avec une solution aqueuse de sel et un alcool. Puis, on iso- le le produit ainsi précipité par centrifugation et le lave avec un alcool pour obtenir un produit purifié. Conformément à ce procédé, la quasi-totalité de l'hydrogène sulfuré est transférée dans le liquide surna- geant sous la forme d'une solution d'hydrogène sulfuré, et par conséquent celui-ci peut aisément être éliminé du produit de la réaction. Par exemple, conformément au procédé de la pré- sente invention utilisant le phénol, l'opération peut être terminée en une heure et le rendement est presque égal à %: En outre, le produit peut être isolé quantitative- ment. Les aspects caractéristiques (2) à (4) de la pré- sente invention mentionnés ci-dessus sont importants pour le calibrage avant le recuit. C'est-à-dire que ceux-ci sont tout à fait essentiels pour effectuer efficacement l'opération de calibrage avant le recuit. L'aspect (5) mentionné ci-dessus est encore une autre caractéristique de la présente invention, dans laquelle un stade de définition des dimensions est effec- tué entre les stades de calibrage et de recuit. Ceci sera expliqué ci-dessous. Dans ce stade, on utilise une résine échangeuse d'ions. Comme exemple de l'application d'une résine échan- geuse d'ions à des acides nucléiques macromoléculaires, de la DEAE-cellulose, du DEAE-Séphadex, de la DEAE-cellulo- se benzoylée etc. sont appliquées à un t-RNA (BBA, 47, 14. 193, 1961; BBRC, 10, 200,1963;Biochem., 6, 3043, 1967). Dans lVexemple, cependant, la résine échangeuse d'ions n'est appliquée qu'à la purification d'acides nucléiques de faible masse moléculaire ayant un nombre de bases au plus égal à 80 environ. La demanderesse a effectué diverses études pour savoir si la propriété intrinsèque d'adsorbabilité de charge des résines échangeuse d'ions pouvait être appli- quée à la purification de polymères d'acides nucléiquE macromoléculaires sur la base de l'indice du nombre de ba- ses des polymères, et elle est parvenue, à la suite de ces études, à la présente invention. Comme les produits finaux à obtenir par la présente invention sont extrêmement uti- les comme médicaments, on pense que le fait d'effectuer la définition des dimensions en utilisant une résine échangeuse d'ions (ce qui sera également désigné ici sous le nom de "procédé d'échange d'ions") est une carac- téristique particulièrement avantageuse du procédé de l'invention. Dans le procédé d'échange d'ions de la présente invention, une résine échangeuse d'ions peut être placée dans un récipient contenant un polymère d'acide nucléi- que à traiter de manière à atteindre l'objectif (procédé discontinu), mais en général, la chromatographie sur colonne est utilisée pour le fractionnement (procédé - en colonne). En particulier, une résine échangeuse d'ions est placée dans une colonne et une solution du po- lymère d'acide nucléique est introduite dans la colonne de façon que le polymère soit adsorbé sur la résine échangeu- se d'ions. Puis, on fait passer à travers la colonne un éluant tel qu'un sel-tampon tris ou analogue, linéaire- ment ou par stade, en faisant varier la concentration en sel de. manière à obtenir une quantité constante d'éluat. Le nombre de bases du polymère d'acide nucléique contenues dans chaque fraction élueest détecté par la même HPLC 15. filtration sur gel que ci-dessus en utilisant comme indi- ce un marqueur, et on peut ainsi recueillir les frac- tions contenant le produit final désiré. Pour atteindre l'objectif de la présente inven- tion par le procédé d'échange d'ions mentionné ci-dessus, la nature de la résine échangeuse d'ions à introduire dans la colonne ainsi que la nature de l'éluant à utiliser pour l'élution sont des facteurs extrêmement importants. Par exemple, lorsque du poly-I est dissous dans le tampon tris-HCl et est adsorbé sur du QAE (amino- éthyle quaternaire) utilisé pour la définition des tail- les du poly-I, pour l'échange d'ions, le produit désiré ne peut pas être obtenu même si la concentration en sel dans l'éluant est extrêmement élevée. Ceci provient du fait que le poly-I lui-même s'insolubilise lorsque la con- centration en sel dans l'éluant est supérieure à celle d'un éluant approprié pour le poly-I sur la résine QAE. Ceci ressort clairement du fait que l'acide inosinique qui est le motif constitutif du poly-I est structurellement plus hydrophobe. Dans ce cas, la concentration en sel dans un éluant approprié pour le poly-I peut être déter- minée par comparaison avec le cas du poly-C. Dans une autre expérience effectuée par la deman- deresse, il a été observé qu'une solution de poly-I de- venait blanche et trouble en formant un précipité dans un tampon ayant une concentration en sel de l'éluant ap- proprié pour le poly-I dans une résine QAE. En conséquen- ce, dans le procédé d'échange d'ions de la présente inven- tion, on peut dire que le choix du type de la résine échan- geuse d'ions à utiliser ainsi que le choix de la concen- - tration 5asel éluant sont des facteurs extrêmement impor- tants. Par exemple, dans le cas du poly-I, la résine DEAE a donné des résultats extrêmement bons. Dans le cas du poly-C, on a trouvé que tant la résine QAE que la 16. résine DEAE pouvaient donner des résultats favorables. Pour l'élution, on peut utiliser soit une élution à gra- dient linéaire, soit une élution à gradient progressif de sel, grâce à quoi les polymères peuvent être fraction- nés et élués dans l'ordre de la longueur des chaînes des polymères. Par exemple, lorsque du poly-C (38 mg, S20, 8,6) est adsorbé sur du DEAEToyopearl 650 C (O 10 x 130 mm) et est ensuite élué par éluation à gradient linéaire en utilisant les éluants (A) et (B) suivants, chacun dans une quantité de 100 ml. (A) = NaCl 0 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (B) = NaCl 0,5 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) Le cradient linéaire était pour (B) (de 0 % à 100 %); et les conditions d'élution étaient les suivantes Débit linéaire: 1,32 c.a/min. Vitesse d'élution: 175 gouttes/fraction. Il en résulte que les fractions suivantes, ayant chacune la longueur de chaîne indiquée, ont été éluées dans l'ordre. Fraction Paires de bases 33 340 34 470 740 36 1000 37 1500 En outre, le même échantillon a été élué par élution à gradient progressive, une fraction inférieure à 500 paires de bases était d'abord éluéeavec NaCl 0,3M4/Tris- HC1 10 mM (pH 7,0) (50 ml), puis une fraction de 500 à 1503 paires de bases était éluée avec NaCl 0,5M/Tris-HCl rM (pH 7,0) (50 ml). De la même manière, on a élué du poly-I (7,8 mg, S20, 7,3) par éluation à gradient linéaire dans les mêmes conditions que ci-dessus. Dans ce cas, les fractions 17. suivantes ont été éluées dans l'ordre. Fraction paires de bases 30 36 140 37 230 38 350 39 460 540 En outre, le même échantillon a été élué par élu- tion à gradient par paliers successifs, grace à quoi une fraction inférieure à 300 paires de bases a d'abord été éluée avec NaCl 0,3M/TrisHCl 10 mM4 (pH 7,0) (50 ml) puis une fraction de 300 à 600 paires de bases a été éluée avec NaCl 0,5 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (50 ml). Comme il a été indiqué ci-dessus, même des aci- des nucléiques macromoléculaires peuvent être fractionnés par le procédé de la présente invention en fractions d'aci- de nucléique de longueur de chaîne définie (définition de la taille) en choisissant adéquatement la concentra- tion en sel dans la solution. Comme il a été illustré dans les deux exemples ci-dessus, des fractions (constituants principaux) ayant une répartition adéquate de longueur de chalne convenant pour l'utilisation pharmaceutique comme médicaments peu- vent aisément être fractionnées à partir d'un mélange contenant divers acides nucléiques macromoléculaires ayant des répartitions différentes de longueur de chaîne, et le fractionnement peut être effectué à l'échelle industriel- le. La caractéristique du fractionnement est l'aspect le plus important dans le procédé d'échange d'ions de la présente invention. Lorsqu'une composition pharmaceutique est fabri- quée sous la forme d'une injection, il est bien connu qu'une opération d'élimination des pyrogènes du liquide pour injection est indispensable. Les pyrogènes sont 18. connus pour être composés de lipopolysaccharides, et ceux-ci ne doivent pas être incorporés à des compositions médicamenteuses. Si les dérivés d'acide nucléique de la présente invention sont utilisés comme injection pour l'administration à l'homme, l'élimination des pyrogènes éventuellement présents est essentielle. - Heureusement, on a trouvé que l'application du procédé d'échange d'inos ci-dessus des dérivés d'acide nucléique de la présente invention peut être efficace pour éliminer les pyrogènes des dérivés. En conséquence, la demanderesse a poursuivi diverses expériences de manière à étudier plus précisé- ment le phénomène favorable ci-dessus qui a été découvert par hasard, et elle a trouvé en outre que les pyrogènes pouvaient être éliminés de tout acide nucléique à un seul brin quelle que soit sa longueur de chaîne par les pro- cédés d'échange d'ions de la présente invention. Ceci est un autre aspect caractéristique de la présente inven- tion. En conséquence, la présente invention comprend en outre un mode de réalisation du traitement des dérivés d'acide nucléique de la présente invention par une résine échangeuse d'ions de manière à éliminer les pyrogènes de ceux-ci pour préparer un liquide pour injection contenant le dérivé. Les résultats obtenus par un test limule de dé- termination quantitative de la quantité d'endotoxine dans divers RNA à chaîne unique (poly-C du commerce et ses dérivés à chaîne raccourcie) sont donnés dans le ta- bleau. Dans le tableau, UE (unité d'endotoxine) désigne une unité dans l'essai de fièvre du lapin avec de l'endo- toxine étalon USP de référence (E. coli 0113). (1) indi- que une eau distillée pour injection (témoin); (2) indi- que un poly-C (produit commercial-l); (3) indique un 13. poly-C (produit commercial-l); (3) indique un poly-C (produit commercial-2); et (4) indique le produit obtenu dans l'exemple (5-4) suivant. Substan- Avant ou: Concentration ce d'es-aprèes la i g/ml UE/ml I pg/mg UE/mg I saill sai colonne d'échan- i !____ ge d'ions (1) - t 29,92 0,0868 ! (2) Avant 308,29 0,8941 548,07 1,5895 iAprès 18,68 0,0542 33,96 0,0985 (3) Avant 93,89 0,2723 166,18 0,4891 Apres 19,45 0,0564 34,12 0,0989 (4) Avant 89,63 0,2599 155,98 0,4520 i Après 57,45 0,1666 114,90 0,3332 15. L'effet d'élimination des pyrogènes par échan- ge d'ions ressort clairement des résultats du tableau ci-dessus. L'activité physiologique des dérivés d'acide nucléique de la présente invention est extrêmement utile pour des médicaments. Les dérivés d'acide nucléique de la présente invention ont une forte activité cancéro- statique qui sera mentionnée ci-dessous en détail. Cette activité n'est qu'une des diverses autres activités phy- siologiques des dérivés d'acide nucléique de la présente invention. Comme autres activités physiologiques des déri- vés d'acide nucléique de la présente invention qui ont un poly-I.poly-C comme corps apparenté, on peut en outre mentionner la capacité de production de TNF, la capacité de production d'interféron, la capacité de production d'interleukine 2-, la capacité d'activation des macropha- ges, la capacité d'activation des cellules NK, l'activi- té d'inhibition de la prolifération des cellules tumora- les, l'activité d'inhibition de la prolifération des cel- lules tumorales chez la souris rasée portant des 20. cellules tumorales humaines, l'activité d'inhibition des métastases des cellules tumorales dans le poumon etc. Les dérivés d'acide nucléique de la présente in- vention ont une sécurité bien plus élevée que le poly-I. poly-C classique et les inducteurs de l'interféron ana- logues. En conséquence,les composés de la présente inven- tion -ontutiles comme agent antiviraux, comme agent.an- ti-tumoraux, etc. Les activités physiologiques des dérivés d'acide nucléique de la présente invention telles que mentionnées ci-dessus sont décrites en détail dans les descriptions de brevet précitées (demande de brevet japonais n 62-167433 et une autre demande de brevet sous priori- té de cette demande de brevet n 62-157433). L'exemple suivant est destiné à illustrer la préparation des dérivés d'acide nucléique de la présente invention d'une manière plus détaillée mais non à limiter le domaine de la présente invention. EXEMPLE (1) Préparation et purification du L-poly-I (Poly-I cali- bré): On ajoute 200 ml d'eau distillée, 250 ml de forma- mide et 500 ml d'une solution de NaCl 5M à 10 g d'un poly-I du commerce et on les chauffe à 80 C pendant envi- ron 4 heures. On soumet la solution réactionnelle à une filtra- tion sur gel par HPLC en utilisant une colonne G-DNA-PW de gel TSK (7,88 mm de diamètre intérieur x 300 mm) (éluant: tampon Tris-HC1 50 mM (pH 7,5) , solution de NaCl 0,3 M EDTA 2raM; débit: 0,5 ml/min), après quoi on arrête la réaction lorsqu'on a obtenu une fraction ayant un pic de temps de rétention de 21,86 + 0,2 minutes. 0p ajoute une quantité double d'éthanol à la solu- tion réactionnelle et on recueille le précipité formé par centrifugation (3000 tours/minute, 4 C). On le lave avec 21. de l'éthanol à 70 % et on le sèche sous vide,pour obte- nir 10,2 g de L-poly-I. L'eau et les solutions utilisées dans le procé- dé ci-dessus sont toutes stérilisées. Ceci s'applique également pour ce qui suit. (2) Préparation et purification du L-poly-C (poly-C calibré): On ajoute 200 ml d'eau distillée, 250 ml de for- manide et 50 ml d'une solution de NaCl 5M à 10 g de poly- C et on les chauffe à 80 C pendant environ 4 heures. Par la même filtration sur gel par HPLC que ci-dessus, on confirme le point final de la réaction (temps de réten- tion: 21,33 + 0,2 min). On ajoute à la solution réactionnelle une quan- tité double d'éthanol et on recueille le précipité formé par centrifugation (3000 tours/minute, 4:C). On le la- ve avec de l'éthanol à 70 % puis on le sèche sous vide pour obtenir 9,5 g de L-poly-C. (3) Sulfuration du L-poly-C: On dissout 8,0 g du L-poly-C obtenu dans le sta- de (2) ci-dessus dans 240 ml d'eau et on les place dans une bombe d'acier de 500 ml. On y ajoute une solution dans la pyridine contenant de l'hydrogène sulfuré (12 g/ ml) en refroidissant à la glace. Après l'avoir fer- méehermétiquement, on chauffe la bombe à 50 C pendant environ 10 heures. Après refroidissement, on ajoute un phénol saturé de TE (200 ml), on l'agite et on le centrifuge (3000 tours/minute, 15 C,5 minutes). On ajou- te 1/10ème de la quantité d'une solution NaCl 5M et une quantité double d'éthanol à la solution aqueuse qui se sépare pour y former un précipité. On recueille le pré- cipité formé par centrifugation (3000 tours/minute, 4 C, 10 minutes), on le lave avec de l'éthanol à 70 % et on le sèche sous vide pour obtenir 8, 0 g de L-poly(C20, S4 U) (c'est-à-dire un dérivé de poly-C calibré dans -2617403 22. lequel les acides cytidyliquE sont remplacés par de l'acide 4-thiouridylique à raison d'un acide 4-thiouri- dylique pour 20 acides cytidyliques). Le TE ci-dessus désigne un tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) contenant de 1'EDTA à la concentration de 1 mM. (4) Réalisation du recuit: On dissout 6,00 g du L-poly(C20, S U) obtenu dans le stade (3) ci-dessus et 6,44 g du poly-I obtenu dans le stade (1) ci-dessus dans 300 ml d'une solution tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)/NaC1 50 mM et on les y mélange. On chauffe la solution obtenue à 70 C dans un bain-marie et on la maintient à cette température pen- dant 10 minutes. On la laisse ensuite refroidir telle quelle pendant une nuit. Après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol, on ajoute de l'eau (en- viron 200 ml) au précipité formé de manière à le dissou- dre. Puis on dialyse la solution obtenue contre de l'eau à 4 C. On concentre le dialysat à sec pour obtenir 12,4 g d'un composé recuit. (5) Définition des tailles par un procédé d'échange d'ions L'échange d'ions a été effectué par élution par paliers successifs ou élution à gradient linéaire. Dans les deux cas, le rendement et la longueur de chaîne des produits ont été presque les mêmes, pourvu que les con- ditions d'élution soient convenablement choisies. Pour l'élution par paliers successifs du L-poly-C et du L-po- ly(C, S U), on a utilisé en continu du NaCl 0,15 M/Tris- HC1 10 mi (pH 7,0) et du NaCl l,OM/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0). En ce qui concerne l'élution par paliers suc- cessifs du L-poly-I, on peut se référer à l'exemple (5-1) ci-après. Pour l'élution à gradient linéaire du L-poly-I, on a utilisé les solutions (A) et (B) suivantes et 23. l'élution a été effectuée dans les conditions de gra- dient de la solution (B) de O à 100 %. (A) = NaCl O M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (B) = NaCl 0,5 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0). En ce qui concerne l'élution à gradient linéai- * re du L-poly-C et du L-poly(C, S4 U), on peut se réfé- rer aux exemples (5-2) et (5-4) ci-après. (5-1) Définition des tailles du L-poly-I: On dissout 210 mg du L-poly-I obtenu dans le stade (1) mentionné ci-dessus dans 5 ml de tampon Tris- HC1 10 mM (pH 7,0) et on les adsorbe sur du DEAE- Toyopearl 650 C (O 10 mm x 130 mm). Puis on élue par paliers successifs avec un débit linéaire de 1,30 cm/min. avec comme éluants du NaCl 0,03M/TRis-HC1 10 m4 (pH 7,0) (50O1) et du NaCl 0,5 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (80 ml). On recueille la fraction éluée par NaCl 0,5 M et on mesu- re son temps 'de rétention par la même filtration sur gel par HPLC que dans le stade (1) ci-dessus, lequel est de 21,90- 0,2 (min.). Le produit final recherché L-poly-I (dont la taille a été définie) ayant un nombre de base de 100 à 1000 a été obtenu avec un rendement élevé. Le rende- ment de récupération est de 91%. (5-2) Définition des tailles du L-poly-C: On dissout 610 mg du L-poly-C obtenu dans le sta- de (2) ci-dessus dans 10 ml de tampon Tris-HC1 (pH 7,0) et on l'adsorbe sur du QAE-Toyopearl 550 C (0 10 mm x mm), puis on élue par élution à gradient linéaire avec un débit linéaire de 1,30 cm/min., après quoi on utilise les solutions (A) et (B) suivantes chacune à raison de 100 ml et on effectue l'élution dans des con- ditions de gradient de la solution (B) de O à 100 %. (A) = NaCl O,OM/Tris-HCl 10 mM (pH 7,O) (B) = NaCl 1,0 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) La fraction éluée comme pic principal est recueillie et 24. son temps de rétention est mesuré par filtration sur gel par HPLC;il est de 21,35 - 0,2 min. Le produit final L-poly-C désiré (dont la taille a été définie) ayant un nombre de bases de 100 à 1000 est obtenu avec un rende- ment élevé. Le taux de récupération est de 93 %. (5-3) Définition de la taille du L-poly(C12, -U): 19 mg de poly(C12, U) (dans lequel les acides cytidyliques ont été remplacés par l'acide uridylique à raison d'un acide uridylique pour 12 acides cytidyliques) (celui-ci a un temps de rétention de 18,67 minutes dans la rmême HPLC que dans le stade (1)) ci-dessus sont dis- sous dans 5 ml de tampon Tris-HCl (pH 7,0) et adsorbés sur du DEAEToyopearl 650 C (0 10 mmn x 130 mm). Puis on élue par élution à gradient linéaire avec un débit linéaire de 1,30 cm/mrin., après quoi les solutions (A) et (B) sont utilisées chacune dans une quantité de ml et l'élution est effectuée dans des conditions de gradient de la solution (B) de O à 100 %. (A) = NaCl 0,0 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (B) = NaCl 0,5 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) La fraction éluée comme pic principal est recueillie et sonitemps de rétention est mesuré par filtration sur gel par HPLC qui est de 18,97 - 0,2 min. Le produit fi- nal L-poly-(C12, U) (dont la taille a été définie) recherché ayant un nombre de bases de 100 à 1000 est obtenu avec un rendement élevé. Le taux de récupération est de 87 %. (5-4) Définition de taille du L-poly(C20, S U): On dissout 600 mg du Lpoly(C20, S4 U) obtenu dans le stade (3) ci-dessus dans 10 ml de tampon Tris- Hcl (pH 7,0) et on les absorbe sur QAE-Toyopearl 550 C (0 10 mm x 130 mm). Puis on élue par élution à gradient linéaire avec un débit linéaire de... cm/min, après..DTD: quoi on utilise les solutions (A) et (B) suivantes cha- c35 une dans la quantité de 100 ml et on effectue l'élution 25. dans des conditio.. de gradient de la solu- tion (B) de O à 100 %. (A) = NaCl 0,0 M/Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) (B) = NaCl 1,0 M/tris-HCl 10 mM (pH 7,0) Le temps de rétention est mesuré par filtration sur gel par HPLC de la même manière que dans le stade (5-2) ci- dessus qui est de 21,35 + 0,2 min. Le produit final recherché,le Lpoly(C20, S U) (dont lataille a été définie) ayant un nombre de bases de 100 à 1000 est obtenu avec un rendement élevé. Le taux de récupération est de 90 %. (6) Recuit: (6-1) L-poly-I et L-poly-C: On dissout séparément 3,0 g du Lpoly-C dont la taille a été définie (obtenu dans le stade (5-2)) ci- dessus et 3,2 g du L-poly-I dont la taille a été définie (obtenu dans le stade (5-1)) ci-dessus dans 150 ml de tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)/NaCl 50 mM et on les y mélange.On chauffe la solution obtenue à 70 C dans un bain-marie et on la maintient à cette température pendant minutes. On la laisse ensuite refroidir une nuit telle quelle. Après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol, on ajoute de l'eau (400 ml) au précipité formé de manière à le dissoudre. Puis on dialyse la solu- tion obtenue contre de l'eau à 4 C. On concentre le dialy- sat à sec pour obtenir 6,2 g d'un composé recuit. (6-2) L-poly-I et L-poly-(C20, S4 U): - 4 On traite 1,46 g du L-poly(C20, S U) dont-la taille a été définie (obtenu dans le stade (5-4)) ci-des- sus et 1,57 g du L-poly-I dont la taille a été définie (obtenu dans le stade (5-1)) ci-dessus de la même manière que dans le stade (6-1) cidessus, et l'on obtient dans chaque cas 3,0 d'un composé recuit. La présente invention n'est pas limitée aux 26. exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. 27. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de dérivés des aci- desnucléiquesà deux brins ayant le RNA comme corps apparen- té dont la répartition des tailles moléculaires est dans l'intervalle de valeur de la constante de sédimentation de 4S à 13S, dans lequel les polymères d'acide nucléique sont calibrés puis recuits. 2 - Procédé de préparation de dérivés des aci- desnucléiquesà deux brins ayant le RNA comme corps appa- renté, dans lequel les molécules pour la répartition maxi- ma dans la distribution entière des tailles moléculaires des dérivés ont des nombres de bases dans l'intervalle de à 10 000, dans lequel les polymères d'acide nucléique sont calibrés puis recuits. 3 - Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel un alcool inférieur est ajouté à la solution réac- tionnelle contenant le polymère d'acide nucléique cali- bré avant le recuit. 4 - Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'alcool inférieur est l'éthanol. - Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel les parties d'acide nucléique dans les polymères d'acide nucléique à brin unique calibrs sont sulfurées en présence d'un alcool arylique, avant le recuit. 6 - Procédé selon la revendication 5, dans le- quel l'alcool arylique est un phénol. 7 - Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel les polymères d'acide nucléique à brin unique ca- libréssont traités par une résine échangeuse d'ions,avant le recuitde manière à recueillir les polymères ayant une distribution des tailles moléculaires entrant dans un in- tervalle déterminé pour la définition de la taille des polymères calibrés. 8 - Procédé de préparation d'un liquide pour injection essentiellement constitué de dérivés des acides 28. nucléiques,caractérisé en ce que les pyrogènes présents dans les dérivés, s'il y en a,sont éliminés en utilisant une résine échangeuse d'ions.