Brevet FR2614305A2 — publié le 19881028

FR 2614305 A2 19881028 FR 8705692 A 19870422 La présente addition concerne l'identification et la détermination de la séquence de cADN qui code pour une deu xième protéine P28 reconnue par des anticorps dressés contre la protéine P28 native. La présente addition concerne tout d'abord la séquence d'AD codant pour la protéine P28II mature telle que décrite dans la figure 1. La présente addition concerne également une protéine dont la synthèse est dirigée par ce cADN ou une partie de ce cADN, ladite protéine étant reconnue par les anticorps dressés contre la protéine P28 native. ta présente invention concerne également les cellules incorporant le cADN codant pour la protéine P28II mature ou un fragment de celle-ci tel que décrit précédemment. Bien que dans les exemples ci-après la protéine ne soit exprimée que dans une bactérie, E. coli sa synthèse peut aussi être effectuée dans différentes cellules-hôtes, bactéries, levures ou cellules supérieures, en fonction du vecteur dans lequel le cADN est inséré, comme cela a été décrit dans le brevet principal. L'expression du gène correspondant à P28II a été obtenue avec le vecteur décrit dans le brevet principal qui comprend le promoteur PL de lambda et le site de fixation des ribosomes cII rbs. La présente addition concerne également la préparation desdites protéines par culture des cellules décrites précédemment. Enfin, l'addition concerne la composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention de la schistosomose, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif au moins une protéine telle que décrite précédemment. Bien entendu, si comme cela est décrit dans le brevet principal le cADN est incorporé dans un poxvirus tel que la vaccine, ce poxvirus pourra dans certains cas être utilisé directement comme agent vaccinant. Il est également possible de dresser des anticorps contre ces protéines. Ces anticorps et ces protéines pourront être utilisés comme agent de diagnostic de la schistosomose. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La description sera faite en utilisant les figures ci-annexées sur lesquelles - les figures la et lb représentent la séquence du cADN de la protéine P2SII ainsi que la séquence de la protéine corres pondante suivant les 3 phases de lecture, - la figure 2 représente une électrophorèse sur gel d'acryla mide d'extraits de E. coli après coloration au bleu de Coomassie A, C et F extrait total B, D et E fraction non soluble des mêmes extraits A, B, C, D E. coli TGE901/pTG56 E, F E. coli TGE901/pTG908 (vecteur témoin) G marqueurs de masse moléculaire Exemple 1 Criblage de la banque et sélection du candidat XTG07. Le criblage de la banque de cADN en kgtll, décrite dans l'exemple I du brevet principal, a permis de révéler plusieurs types de candidats. Par immunodétection avec un anticorps polyclonal de rat (induit par injection de la P28 purifiée à partir de schistosomes) on a sélectionné un nouveau candidat, XTG07, qui n'est pas reconnu par les sondes synthétiques qui ont été utilisées pour sélectionner les candidats hTG10 et XTGll, décrits dans l'exemple I du brevet principal, et dont la séquence est donc différente. Comme la protéine est reconnue par les mêmes anticorps anti-P28, cette nouvelle protéine sera appelée P28II (et celle qui avait été identifiée précédemment sera appelée P28I). Exemple 2 Détermination de la séquence du cADN porté par le phage XTG07. Divers fragments de restriction du cADU ont été reclonés dans M13 pour etre séquencés. La séquence complète du cADN et la structure primaire en acides aminés qu'on peut en déduire (dans les 3 phases de lecture) sont présentées dans la figure la et lb. Exemple 3 Création d'un site BamHI au début de la séquence du cADN. Pour faciliter l'insertion du cADN dans un vecteur d'expression approprié, on a créé, par mutagénèse dirigée, un site BamHI au début de la séquence codante. La mutagénèse a été effectuée sur l'ADN cloné dans M13 avec l'oligomère de synthèse suivant, qui est un 21-mère complémentaire des nucléotides 18 à 38 de la séquence représentée dans la figure la, à l'exception des nucléotides à muter 5' GTRAGGAGC,GGATCCACGATG 3' site BamHI La séquence de cADN peut donc être récupérée sous forme de fragment BamHI, un deuxième site BamHI étant présent dans le polylînker du M13, en aval de la séquence codante. Exemple 4 Expression de la protéine P28II dans E. coli. La séquence de cADN codant pour la P28II a été récupérée sous forme de fragment BamHI et introduite dans le vecteur d'expression pTG908, dans le site BamHI. La structure du recombinant obtenu est identique à celle qui est schématisée dans la figure 2 du brevet princi- pal. Ce vecteur contiént une origine de réplication, le promoteur PL du phage lambda et la séquence de fixation des ribosomes de cII incluant l'extrémité N-terminale du gène cII, avec un site de restriction BamHI 39 pb en aval du site d'initiation de la traduction. L'insert de cADN-P2SII se retrouve donc en phase avec l'extrémité N-terminale du gène cII. Un plasmide recombinant portant l'insert dans la bonne orientation a été sélectionné : pTG56 et la construction a été vérifiée par séquençage. Une culture de E. coli TGE901 transformée par ce plasmide est mise en culture sur milieu LB jusqu'à une DO de 0,2 ; ensuite la synthèse de la protéine cII-P28II est induite par une augmentation de la température à 42"C pendant les 8 heures suivantes. En fin de culture, les extraits cellulaires sont récupérés après traitement aux ultra-sons et analysés après électrophorèse sur gel d'acrylamide-SDS et coloration au bleu de Coomassie (Figure 2). Une bande d'une masse moléculaire apparente de 28K est nettement visible dans les extraits de TGE901/pTG56 (Figure 2 : bandes A, B, C, D). Une analyse par Westerp blot" d'une préparation purifiée de cette protéine extraite de E. coli montre qu'elle est reconnue par les anticorps de rat dirigés contre la P28 native purifiée à partir des schistosomes. Une éventuelle activité enzymatique de glutathion-Stransférase a été recherchée mais le test est négatif. Ce résultat négatif était attendu, étant donné l'absence d'homologie entre les séquences des 2 protéines P28. Exemple 5 Vaccination de rats avec l'antigène P28II pro duit par E. coli. Les rats sont immunisés selon le protocole décrit dans l'exemple 5 du brevet principal et leurs sérums sont évalués dans un test de cytotoxicité dépendante des éosinophiles. Les résultats présentés dans le tableau I montrent que le pouvoir cytotoxique de ces sérums est comparable à celui des rats immunisés avec le premier antigène P28I ou avec la P28 native. Tableau I Test de cytotoxicité dépendante d'éosinophiles étude des sérums de rats immunisés avec la pro téine P28 native, cII-P28 et cII-P28II produites dans E. coli (dilution du sérum 1/16). rats immunisés % de cytotoxicité du sérum avec : récolté au jour 7 14 21 P28 native 52,5 % 29 z 73 % cII-P28I/coli 24,5 % 20 % 59,5 % cII-P28II/coli 55 t 63 % 61,5 % adjuvant seul 30 % (3SA + Pertusis) rats non injectés 0 % rats infectés par S. mansoni 89,5 % Les anticorps des rats immunisés avec la protéine P28II produite dans E. coli ne reconnaissent pas la protéine P28I. De même, les anticorps des rats immunisés avec la protéine P28I produite dans E. coli ne reconnaissent pas la protéine P28II. Toutefois les 2 types d'anticorps reconnaissent la préparation de P28 native purifiée à partir des schistosomes et les anticorps dressés contre la P28 native reconnaissent les 2 protéines recombinantes. Ce résultat s'explique par une hétérogénéité de la préparation de P28 native purifiée à partir de schistosomes. Une observation attentive de l'immunoprécipitation après migration sur gel en 2 dimensions de la protéine P28 native ou traduite in vitro sur les ARNm de schistosomes révèle l'existence d'une bande mineure qui dédouble la bande de 28 K (Figure publiée par J.M. Balloul, R.J. Pierce, J.M. Grzych et A. Capron, Mol. Biochem. Parasitology 17 (1985) 105-114). Cette bande mineure doit correspondre à la P28II. Dépôt de souche représentative de l'invention La souche TGE901/pTG56 a été déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 Rue du Dr. Roux, Paris, le 3 avril 1987, sous le n I.656. REVENDICATIONS 1) Protéine selon la revendication 1 du brevet principal caractérisée en ce qu'elle correspond à la protéine dont la synthèse est dirigée par le cADN de la figure 1 ou à un fragment ne ce cADN, ladite protéine étant reconnue par les anticorps dressés contre la protéine P28 native. 2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est d'origine bactérienne. 3) Cellule incorporant un bloc ou vecteur d'expression de la protéine selon l'une des revendications 1 et 2. 4) Cellule selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie transformée par ce plasmide comportant le gène codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 et 2 sous le contrôle d'un promo- teur bactérien. 5) Cellule selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gène codant est constitué par tout ou partie de la séquence de cADN de la figure 1. 6) Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu approprié une cellule selon l'une des revendications 3 à 5 et en ce que l'on récupère ensuite ladite protéine. 7) Séquence d'ADN codant pour la protéine selon l'une des revendications 1 et 2. 8) Séquence d'ADN selon la figure 1. 9) Composition pharmaceutique destinée notamment à la prévention de la schistosomose, caractérisée en ce qu'elle comporte a titre d'agent actif au moins une protéine selon l'une des revendications 1 ou 2. 10) Anticorps dressé contre une protéine selon l'une des revendications 1 et 2. 11) Application des anticorps selon la revendication 10 ou de la protéine selon l'une des revendications 1 et 2 à titre d'agent de diagnostic de la schistosomose.