Brevet FR2613624A1 — publié le 19881014

La présente invention concerne une composition pharmaceutique administrable par voie orale destinée à réduire les effets des ss-lactamines sur la flore intestinale. La présente invention concerne plus spécialement une composition contenant des bactéries non pathogènes pour l'homme. On sait que le traitement par voie parentérale par des 8-lactamines à large spectre entraine des modifications importantes de la flore microbienne normale et en particulier de la flore intestinale dans le cas d'un traitement par des ss-lactamines à élimination biliaire notable. Ces modifications peuvent concerner en particulier les bactéries anaérobies strictes qui contituent les populations dominantes de la flore intestinale et qui s'opposent normalement à la colonisation par des microorganismes potentiellement pathogènes tels que entérobactéries, Pseudomonas, Staphylocoques, levures, etc... La diminution de la flore dominante peut donc conduire au développement de germes infectieux, ce qui est particulièrement dangereux chez certains patients. Par le passé on a déjà proposé d'administrer par voie orale diverses bactéries ou levures. I1 s'agissait toutefois de suppléer aux bactéries constituant initialement la flore intestinale. La présente invention vise à fournir une composition contenant des bactéries non pathogènes qui est destinée non pas à remplacer la flore initiale mais à éviter la disparition de la flore intestinale naturelle. A cet effet la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique, administrable par voie orale1 destinée à réduire les effets des t3- lactamines sur la flore intestinale chez l'homme, etcaractérisée en ce qu'elle comprend des bactéries anaérobies strictes non pathogènes pour l'homme et productrices de (3-lactamases. La composition selon l'invention est normalement administrée par voie orale quelques heures avant ou pratiquement en me me temps que le traitement par la ss-lactamine par voie parentérale. Des prises répétées peuvent être envisagées pendant le traitement par la 8-lactamine. La composition selon l'invention trouve une application lors du traitement par des 8-lactamines telles que - des pénicillines notamment la pénicilline G et les phénoxyméthylpénicillines, la méthicilline et les isoxazolylpénicillines (par exemple oxacilline et cloxacilline), des aminopénicillines (par exemple ampicilline et amolline), des amidinopénicillines (par exemple pivmecillinam), des carboxypénicillines (par exemple carbénicilline, ticarcilline) des méthoxycarboxypénicillines (par exemple témocilline) des acylureidopénicillines (par exemple Mezlocilline, Azlocilline, Pipéracilline), des acylpénicillines (par exemple Apalcilline). - des céphalosporines notamment la céfalotine, la céfazoline, le céfamandole, le céfuroxime, le céfotaxime, le ceftizoxime, la ecftazidime, la ceftriaxone. - des monobactames (à noyau azétidine) par exemple l'aztréonam. Les souches de bactéries anaérobies strictes que l'on utilise dans la présente invention sont notamment des souches productrices de ss-lactamase appartenant au genre Bactéroides. Comme exemple de souches non pathogènes on peut citer les souches suivantes - Bactéroides ovatus - Bactéroides uniformis - Bactéroides thétaiotaomicron Les souches productrices de 8-lactamases peuvent être déterminées par un test in vitro. On peut utiliser à cet effet une méthode qui consiste à doser la quantité de ss-lactamine résiduelle après contact avec la solution présumée contenir une activité (3-lac- tamase (Rolfe RD et coll. J. Infect Dis. 147, 227, 1983). On sélectionne les souches qui ont une activité enzymatique d'au moins 0,02 umole de céphaloridine/minute/mg de protéine. Des souches productrices de ss-lactamases peuvent être isolées de fèces humaines. Les bactéries anaérobies strictes non pathogènes productrices de (3-lactamases peuvent être conditionnées sous forme lyophilisée et ajoutées à un excipient buvable juste avant l'administration. Elles peuvent être également conditionnées sous forme de gélules, comprimés, ou formes solides analogues en mélange avec des excipients. Pour éviter toute destruction des bactéries lors du passage dans l!éstomac, on peut notamment prévoir des formes comportant un excipient anti-acide ou un revêtement entérique. La quantité de bactéries productrices de (3- lactamases qui est administrée chez l'homme par voie orale est d'environ 108 à 1011 cellules bactériennes viables. L'activité des compositions selon l'invention a été mise en évidence sur le modèle de la souris hétéroxénique traitée par la ceftriaxone. Préalabl ment des souches de bactéries anaérobies productrices de ss-lactamases avaient été isolées d'échantillons defèces humaines et ce sont les cultures titrées de cesbactéries qui ont été administrées. 1. Isolement de souches de bactéries anaérobies strictes productrices de (3-lactamase. On a isolé des fèces de sujets sains des bactéries anaérobies strictes dans des conditions d'anaérobiose. Chez chaque sujet on a identifié les clones dominants et on a mesuré in vitro l'activité ss-lactamase des souches isolées. Les ss-lactamases sont détectées grâce à la méthode microbiologique semi-quantitative décrite par Rolfe RD et coll. (J. Infect Dis. 147, 227, 1983). L'activité est quantifiée sur une échelle de O+ à 4+. Le maximum d'activité ss-lactamase est représenté par 4+. Les activités intermédiaires 3+, 2+, 1+ correspondent à une hydrolyse partielle de l'antibiotique. 0+ est considéré comme l'absence d'activité (3-lactamase. Le milieu gélosé Médium 5 (Difco) et la souche test B. subtilis ATCC6633 ont été utilisés. Les échantillons de fèces sont incubés pendant 30 minutes à 37 C, avec une concentration connue d'antibiotique : Ceftriaxone (400 mcg/ml) ou Ticarcilline (64 mcg/ml), l'activité antibiotique résiduelle est dosée. Le profil d'activité de souches isolées est donnée dans le tableau I suivant. Les valeurs données sont la différence des diamètres d'inhition en mm obtenus d'une part avec différentes 6-lactamases et un témoin (après 4 heures d'incubation). Tableau I Souche Amoxicilline Ticarcilline Céfotaxime Ceftriaxone Céfopérazone B. uniformis D3 15 16 27 26 24 B. uniformis D4 18 16 27 26 11 B. uniformis D5 30 16 27 26 24 1er sujet B. uniformis D7 30 16 27 26 24 B. uniformis D8 7 16 27 26 24 B. uniformis D9 2 16 9 26 24 B. uniformis DKV 30 16 27 26 2 B. thétaiotaomicron C1 5 3 3 26 24 B. thétaiotaomicron C2 9 6 27 26 24 2ème sujet B. C6 30 16 27 26 24 B. uniformis C8 30 16 0 0 2 B. thétaiotaomicron C10 22 16 27 26 24 L'activité ss-lactamase a en outre été testée selon une méthode spectrophométrique (O'Callaghan et coll. Antimicrobial Agents Chemotherapy 1, 283, 1972). Tableau II ACTIVITE ss-LACTAMASE DES EXTRAITS BACTERIENS ( mole de céphaloridine/mn/mg de protéine) Souche Activité B.uniformis D3 0,088 B.uniformis D4 0,793 1er sujet B.uniformis D5 1,065 B.uniformis D7 0,712 B.uniformis D8 2,165 B.uniformis D9 0,578 B.thetaiotaomicron C1 0,337 B.thetaiotaomicron C2 0,109 B.thetaiotaomicron C4 B.uniformis C8 0,010 B.ovatus C9 B.thetaiotaomicron C10 0,162 B.thetaiotaomicron C11 On considère que les souches utilisables doivent avoir une activité ss-lactamase # 0,02 mole de céphaloridine/minute/mg de protéines bactériennes totales. 2. Mise en évidence des propriétés des souches isolées chez la souris a) Association de quatre souches de Bactéroides et traitement par la ceftriaxone Des souris sans germe (axéniques) C3H (Centre de Sélection des Animaux de Laboratoires, Orléans, France) sont maintenues en isolateur de plastique souple de type Texler. Elles reçoivent de l'eau de boisson à pH 3, stérilisée par la chaleur. La nourriture est préparée commercialement (R03, Villemoisson/Orge, France) et stérilisée par irradiation à 4 mégarads. De tels animaux sont associés à quatre souches de Bactéroides - Cl : B. thetaiotaomicron - C6 : B. ovatus - D9 : B. uniformis - V4E3 : B. thetaiotaomicron Avant le traitement par la ceftriaxone l'activité (3-lactamase n'est pas détectable (0+), alors que les souches bactériennes s'implantent à 10 (10,02 f0,31) ufc/g de fèces. Lorsque ces mêmes souris reçoivent la ceftriaxone per os (ajouté à l'eau de boisson à raison de 2 mg/ml) les comptes totaux ne sont pas modifiés, l'activité enzymatique reste non détectable mais l'antibiotique n'est pas retrouvé dans les fèces. b) Influence de l'introduction de souches de Bactéroides productrices de 6-lactamases chez les souris à flore humaine traitées avec la ceftriaxone Des souris axéniques ont été également associées à une flore complexe humaine. La préparation de la solution de gavage est réalisée en chambre anaéro bie, à partir de fèces humaines fraîchement émises. L'échantillon est broyé à l'aide d'un Ultraturrax, et dilué 100 fois en milieu LCY. Cette dilution est transférée jusqu'a l'isolateur où se trouvent des souris axéniques. Afin de protéger cette solution bactérienne du contact avec l'oxygène, le transport se fait dans des tubes fermés hermétiquement à l'intérieur de la chambre anaérobie. Comme dans le cas précédent les animaux préalablement assoiffés sont gavés par voie gastrique et rectale. Le gavage est répété après 24 h. Dix à quinze jours sont nécessaires pour obtenir des équilibres et des effets de barrières comparables à ceux observés chez le donneur. Les souris à flore humaine sont associées à 4 souches de Bactéroides (C1, C6, D9, V4E3) productrices d'enzymes i vitro à la dose de 108, quelques heures avant le début du traitement avec la ceftriaxone qui a été ajouté à l'eau de boisson à raison de 2 mg/ml. Pendant la période de traitement aucune concentration antibiotique n'est détectée dans les fèces. Une activité ss-lactamase versus ceftriaxone est décelée après 14 jours de traitement, elle varie entre 1+ et 4+ (tableau III). Les entérobactéries sensibles sont éliminées. Les comptes d'entérocoques sont équivalents à ceux obtenus pour la flore E témoin non traitée (tableau III). La résistance à la.colonisation par des microorganismes exogènes résistants à la Ceftriaxone (Ent.cloacae IGR67, C.albicans IGR66) est maintenue chez les souris chez lesquelles les souches de Bacteroides actives ont été implantées précédemment (tableau III). Les bactéries anaérobies persistent dans le groupe ayant reçu les Bactéroides et les comptes totaux effectués en chambre anaérobie ne sont pas significativement modifiés par la présence de ces bactéries, par rapport au témoin (tableau III). Les CMI 50 et 90 de ces bactéries sont respectivement de 512 et > 1024 g de ceftriaxone par ml. Les bacilles à Gram négatif représentent alors 84% de cette flore, il y a égale-ment 13% de bacilles à Gram positif sporulés et 3% de cocci. L'identification par le système Api 20A, permet de retrouver parmi ces souches des B.ovatus et B.uniformis ayant les memes caractères que ceux administrés juste avant le début du traitement. Tableau III EFFET DE LA CEFTRIAXONE CHEZ DES SOURIS A FLORE HUMAINE ASSOCIEE OU NON AVEC DES BACTEROIDES TRAITES AVEC LA CEFTRIAXONE Flore Flore traitée Flore traitée + Bacteroides non traitée (s=4) (s=5) (s=5) Entérobactérie sensible Ent. Cloacae 7,23+0,86 IGR67 Entérocoque C. albicans 6,79#0,53 5,50#0,19 4,88#0,25 IGR66 Anaérobies (5,00 10,48t0,11 10,22+0,10 totales Concentration 890-1400* Ceftriaxone (n=40) (n=50) (n=55) g/ml Activité 0+ 1+ à 4+ 0+ B-lactamase (n=50) (n=50) (n=55) - Moyenne + SEM ufc/g de fèces (log) sur 6 prélèvements - Résultats soulignés: différences significatives p > 0,5 * Valeurs extrêmes REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique, administrable par voie orale, destinée à réduire les effets des ss-lactamines sur la flore intestinale chez l'homme, et caractérisée en ce qu'elle comprend des bactéries anaérobies strictes non pathogènes pour l'homme et productrices de ss-lactamases. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les bactéries sont choisies parmi des Bactéroides producteurs de ss-lactamases. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les bactéries sont choisies parmi les souches de Bactéroides ovatus productrices de (3-lactamases. 4. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les bactéries sont choisies parmi les souches de Bactéroides uniformis productrices de (3-lactamases. 5. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les bactéries sont choisies parmi les souches de Bactéroides thetaiotaomicron productrices de (3-lactamases. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les bactéries choisies ont une activité ss-lactamase d'au moins 0,02 pmole de.céphaloridine/minute/mg de protéines bactériennes totales. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle contient d'environ 108 à 1011 bacteries anaérobies strictes non pathogènes productrices de ss-lactamases.