Brevet FR2615103A1 — publié le 19881118

La présente invention est relative à un nouveau procédé de production de fractions natives de Leishmania et aux propriétés biologiques et biochimiques des fractions natives obtenues par ce procédé. Par "activité immunogène" on entend dans ce qui va suivre une activité qui provoque une réponse de la part des cellules impliquées dans le système immunitaire. Des fractions polypeptidiques de Leishmania (parasites du genre Leishmania responsables de maladies parasitaires humaines graves largement répandues dans les deux hémisphères) de poids moléculaires de l'ordre de 25 KD,40 kD, 70 kD et 113 kD sont connues par le Brevet Français nO 84 15079 publié sous le nO 2 570 947 et leurs propriétés antigéniques ont été décrites dans ce Brevet, en particulier l'activité immunogène de l'antigène de 70 kD, qui serait présent dans toutes les souches de Leishmania étudiées dans ce Brevet.Selon ce dernier, ces fractions polypeptidiques sont obtenues à partir de lysats des parasites susdits ou de surnageants de milieux de culture de ces parasites, dont les fractions polypeptidiques sont séparées par électroélution de la région d'un gel de polyacrylamide SDS sur lequel ont été séparés les différents antigènes du ou des parasites, laquelle région correspond à une fourchette de poids moléculaires. Ce procédé, cependant, ne permet d'obtenir et d'étudier que des fractions dénaturées, qui ne sont, au demeurant, obtenues qu'en faibles quantités. I1 a pu être établi ultérieurement que les fractions polypeptidiques antigéniques identifiées dans le Brevet Français 2 570 947 susceptibles d'être mises en oeuvre pour la production de compositions vaccinantes contre les leishmanioses, sont des glycoprotéines présentant respectivement des poids moléculaires de l'ordre de 70 kD (et des groupes glucose et mannose), de l'ordre de 20 kD ou de 30-32 kD (et des groupes fucose et a-D-N-acétyl-galactosamine), et peuvent être isolées à partir de lysats de diverses espèces de Leishmania, en procédant comme décrit dans le Brevet Français 85 01892 publié sous le nO 2 577 140, par dénaturation de suspensions soniquées de lysats de cultures de parasites, par du SDS et du ~mercaptoéthanol à 100"C, suivie de leur fractionnement sur gel de polyacrylamide. Ce procédé, qui est praticable uniquement à l'échelle du laboratoire et n'est pas transposable à l'échelle industrielle, donne lieu à des fractions dénaturées, contaminées par le SDS, puisque traitées par du SDS, duss -mercaptoéthanol et chauffées à 1000C pendant 5 minutes. La présente invention s'est fixé pour but de pourvoir à des fractions natives (non dénaturées) de Leishmania, présentant des propriétés immunogènes et en particulier une activité immunogène protectrice in vivo et une activité lymphoproliférative, c'est-à-dire une activité mitogène sur les lymphocytes et une activité d'induction d'une activité interleukine 1 (IL 1) ; elle s'est également fixé pour but de pourvoir à des compositions vaccinantes contenant lesdites fractions natives, ainsi qu'à des produits de diagnostic de la leishmaniose, contenant ces fractions. La présente invention s'est également fixé pour but de pourvoir à un procédé d'obtention de ces fractions natives, qui exclut pour leur préparation l'utilisation de substances toxiques contaminantes telles que le SDS et qui est apte à être mis en oeuvre à l'échelle industrielle. La présente invention a pour objet des fractions extraites de Leishmania, et notamment de Leishmania infantum, caractérisées en ce qu'elles présentent des propriétés immunogènes et une activité lymphoproliférative. La présente invention a également pour objet des compositions antigéniques protectrices contre les leishmanioses, qui sont caractérisées en ce qu'elles contiennent en tant que constituant actif, au moins l'une des fractions susdites. Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdites compositions antigéniques protectrices sont des compositions vaccinantes dans lesquelles les fractions susdites sont associées à un véhicule et/ou un adjuvant d'administration approprié. La présente invention a, de plus, pour objet un produit de diagnostic de leishmaniose caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'une des fractions susdites, mises sous une forme injectable. Le produit de diagnostic conforme à l'invention permet de suivre l'évolution ultérieure dudit sujet et de pronostiquer une résistance à la maladie lors d'un éventuel challenge naturel ou artificiel. Conformément à l'invention, ce produit de diagnostic est avantageusement inclus dans un kit de diagnostic. La présente invention a en outre pour objet un procédé de production de fractions natives de Leishmania présentant des activités immunogènes et lymphoprolifératives, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - Une première étape dite de "préculture", au cours de laquelle des promastigotes d'au moins une souche appropriée de Leishmania sont mis en culture pendant une durée appropriée, à une température de l'ordre de 270C + 1"C, à un pH de l'ordre de 6 à 8, régulé de manière appropriée, avec une pression partielle d'oxygène (PO2) convenable, de l'ordre de 10 à 80 %, sous une agitation de l'ordre de 50 tours/minute + 10 tours, dans un milieu de culture approprié, pour obtenir à partir d'un inoculum de l'ordre de 105-106 parasites/ml dans un fermenteur de faible volume, au moins 50.106 parasites/ml; - Une deuxième étape dite de "culture", au cours de laquelle la préculture recueillie (de l'ordre de 50.106 parasites/ml) est utilisée comme inoculum dans un fermenteur industriel (d'au moins 20 litres), est mise en culture dans un milieu de culture similaire à celui mis en oeuvre dans l'étape de préculture, à une température et à un pH similaires, la régulation du pH étant toutefois réalisée à l'aide d'un acide organique métabolisable, tel que l'acide acétique notamment, tandis que la p02 est de l'ordre de 50 à 100 % et que l'agitation est de l'ordre de 30 tours/minute + 5 tours, à l'issue de laquelle on recueille une culture de l'ordre de 65.106 à 80.106 parasites/ml - Une troisième étape au cours de laquelle les parasites collectés sont céntrifugés, de préférence à 6000 tours/minute pendant une durée de l'ordre de 10 minutes, pour donner un culot de parasites - Une quatrième étape au cours de laquelle le culot de parasites résultant de la troisième étape est resuspendu dans un tampon approprié, de manière à obtenir une concentration de 6.109 parasites/ml. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, et plus particulièrement de sa quatrième étape, le culot de parasites résultant de la troisième étape, ou étape de centrifugation, est mis en suspension dans de l'acétate d'ammonium 10 à 20 mM contenant 1 % de détergent non ionique tel que Triton X100 notamment, cette suspension est centrifugée, de préférence à 6000 tours/minute environ, et. le surnageant de centrifugation récupéré, tandis que le culot est remis en suspens ion dans environ 1/10 du volume initial de culture et soumis à sonication, puis on centrifuge à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment, pour collecter un deuxième surnageant et un deuxième culot qui est également soniqué, puis à nouveau centrifugé pour collecter un troisième surnageant, les surnageants de sonication sont réunis et déposés sur une colonne de tamis moléculaire à partir de laquelle on recueille, en utilisant l'acétate d'ammonium comme éluant, des fractions dont les- poids moléculaires sont évalués de manière appropriée et dont l'activité lymphoproliférative est évaluée à l'aide de tests appropriés. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les poids moléculaires des fractions sont évalués par révélation au nitrate d'argent d'un gel PAGE SDS. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le milieu de culture mis en oeuvre pour la préculture et/ou pour la culture de promastigotes de Leishmania, est avantageusement constitué par un mélange 1:1 de milieu RPMI 1640 et de milieu 199, (milieux commercialisés par GIBCO), additionné de 2 à 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté, de glutamine 2 mM, de tricine pH 7, 50 à 100 mM et d'antibiotiques appropriés (pénicilline 100 u/ml, streptomycine 100 Pg/ml, kanamycine 100pg/ml). Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, les opérations de mise en suspension et de centrifugation qui constituent la quatrième étape dudit procédé, sont réalisées de préférence à une température de l'ordre de +40C. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, la première étape, ou étape de préculture, est supprimée, auquel cas on utilise comme inoculum 500 ml à 1 litre de la culture résiduelle provenant d'une culture précédente. L'activité lymphoproliférative des fractions antigéniques natives de Leishmania conformes à la présente invention est évaluée par estimation de l'induction de la prolifération de lymphocytes par lesdites fractions, en prélevant des lymphocytes chez des donneurs humains ou animaux appropriés, en les mettant en culture dans un milieu de culture pour lymphocytes, en les mettant en contact avec les fractions antigéniques de Leishmania susdites diluées à différentes concentrations, et en mesurant la prolifération des lymphocytes au bout d'une durée appropriée de culture, par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée, exprimée en cpm ou en Index de Prolifération Maximum, IPM, qui est le rapport de l'incorporation maximale mesurée pour 105 lymphocytes en présence de la dose optimale de la fraction considérée, à l'incorporation mesurée en l'absence de tout stimulus. L'activité biologique des fractions extraites de Leishmania conformes à la présente invention a également été évaluée par leur capacité à induire la libération d'interleukine 1 (IL 1) par les monocytes humains. Pour identifier les activités immunogènes des fractions natives extraites de Leishmania, conformes à la présente invention, on a tout d'abord cherché à identifier leurs activités à médiation humorale et plus précisément leur activité inductrice d'anticorps. Cette dernière a été examinée par rapport d'une part à des antigènes de nature protéique et d'autre part à des antigènes de nature glycolipidique. Dans ce but, des souris Balb/c ont été inoculées avec une fraction conforme à l'invention et les. sérums recueillis ont été incubés a) pour l'obtention d'un profil d'antigène pro téique, avec une immunoempreinte dudit profil antigénique sur une feuille de nitrocellulose, conformément à la technique du Western-blot; b) pour l'obtention d'un profil d'antigène glyco lipidique, avec le chromatogramme des lipides ex traits des parasites par des solvants organiques appropriés, c'est-à-dire avec l'immunoempreinte de la migration des lipides de l'organisme para site, conformément à la méthode de MAGNANI et Al. [j. BIOL. CHEM. (1982), 257, 14365-14369 et (1986), 261, 3826-3832. L'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'inven- tion et de mise en évidence des caractéristiques des fractions obtenues par ce procédé. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - Production de fractions antigéniques de Leishmania A) Production de biomasse de Leishmania à l'échelle pilote pour l'industrie Préculture Les promastigotes de Leishmania LEM 497 sont mis en culture dans un fermenteur de 2 litres dans les conditions suivantes : - Inoculum de 105 à 106 parasites/ml - Température : 270C + 10C - pH : 7 + 0;2 régulé par de l'acide chlorhydrique - P02 : 20 % - Agitation : 50 pm - Milieu : 1 litre de mélange (1:1) RPMI 1640/mi lieu 199 (milieux commercialisés par Gibco) auquel on ajoute 10 t de sérum de veau foetal décomplémenté, glutamine 2 mM ; tricine pH 7, 50 à 100 mM, antibiotiques (pénicilline 100 uni tés/ml, streptomycine 100 ug/ml, kanamycine 100 g/ml). Le plateau de la culture est atteint en environ quatre jours (50.106 parasites/ml). On utilise alors le contenu de ce fermenteur pour inoculer un fermenteur de 20 litres (SETRIC, Génie Industriel). B) Culture en fermenteur de 20 litres Les conditions de culture en fermenteur de 20 litres sont presque les mêmes que dans le fermenteur de 2 litres sauf que - l'agitation se fait avec des pales de cyto culteur ; elle est de 30 rpm. - la PO2 est de 50 t. - la régulation du pH se fait avec de l'acide acétique 1 M au lieu d'acide chlorhydrique. - le volume de départ est de 17 litres. Dans ces conditions, si on part d'une culture à 106 parasites/ml, on atteint en quatre jours un plateau jusqu'à 65.106 parasites/ml. Les parasites sont ensuite collectés stérilement puis centrifugés (6000 rpm, .10 minutes sur rotor JA-20 Beckman) et le culot est rincé deux fois par du PBS. Le culot des parasites ainsi obtenu est resuspendu dans un tampon défini selon les conditions ultérieures de séparation, de façon à obtenir une concentration de 6.109 parasites/ml, soit 44,5 pg/ml en protéines dosées par la méthode de FOLIN. C) Production de fractions natives Les parasites sont suspendus cette fois dans de l'acétate d'ammonium 10 à 20 mM avec Triton X100 à 1 % et on laisse ainsi une heure à 40C en agitant. Puis, on centrifuge à 40C 10 minutes à 6000 rpm dans un rotor JA-20 (Beckman). Le surnageant est récupéré (=S1). Le culot est resuspendu dans 1/10 du volume initial de culture et soumis à sonication 30 minutes à 40C sur un sonicateur Branson (position 1, continu, fréquence minimale de 20 Hz). On centrifuge de nouveau 10 minutes dans les mêmes conditions que précédemment : on collecte un surnageant S2 et le culot résultant subit un traitement analogue au précédent. Les opérations sont répétées de façon à avoir 3 surnageants S1, S2, S3. Les surnageants de sonication sont réunis et déposés sur une colonne de tamis moléculaire, tel qu'un polymère d'acrylamide et de Sépharose, commercialisé sous le nom de "Sephacryl S200", qualité "Superfine" (Pharmacia). Les caractéristiques de la colonne sont les sui vantes - Taille du dépôt : de 60 à 90 ml - Température d'élution : 40C - Longueur : 96 cm - Rayon : 5 cm - Volume mort : 890 ml - Débit : 40 ml/h à 70 ml/heure - Elution : acétate d'ammonium 20 mM dans l'eau On recueille 7 fractions d'après les Kav suivants avec les caractéristiques suivantes Fraction Kav Teneur en Volume (+ 0,02) protéines (Folin) (en ml) 1 0 390 ssg/ml 236 2 0,43 163 ag/ml ' 434 3 0,75 80 Fg/ml 212 4 1,06 70 ag/ml 25 5 1,24 65 g/ml 438 6 1,54 125 g/ml 128 7 1,92 35 rg/ml 220 Le profil d'élution classique est donné par la Figure 1 annexée dans laquelle les Kav sont donnés en abscisse et les teneurs en protéines en ordonnée, et qui montre les fractions F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7. La densité optique (DO) est lue à 260 nm (courbe I en trait continu de la figure 1) et à 280 nm (courbe II en traits discontinus de la figure 1). Comme on le sait, Rav exprime le rapport suivant Kav = VE - VO VT - VO où VE = volume d'élution VT = volume total VO = volume mort. La répartition des espèces moléculaires est donnée par caractérisation sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, comme représenté à la Figure 2 annexée dans laquelle les numéros des fractions figurent en abscisse et les poids moléculaires en ordonnée ; les fractions présentant une activité protectrice sont celles dont le Kav est égal ou supérieur à 1. Pour évaluer la répartition des espèces moléculaires, on a procédé comme-suit : Les différentes fractions ont été déposées sur un gradient de 5 à 20 % de gel PAGE-SDS (Phast Gel Pharmacia) et leur profil électrophorétique comparé par rapport à des marqueurs de poids moléculaires (PM) de référence. Ces marqueurs de référence, fournis par la Société PHARMACIE (Suède), sont présentés sous forme de kits de calibrage de hauts poids moléculaires (HMW) et de bas poids moléculaires (LMW), respectivement, dont la composition est la suivante A. Kit de calibrage de hauts poids moléculaires (HMW) I I I I I I I Poids IPoids mo-l I I Protéine I molécu- lléculairel Source I I I laire Ides sous- unités I I I I I I Thyroglobuline I 669 000 1 330 000 IThyrolde de I I I I porc I I I I I I I ferritine 1 440 000 18 500 I rate de I I I 1(220 000)1 cheval I I I I I I I catalase 1 232 000 1 60 000 Ifoie de boeufl I I I I lactate- I I I I I déshydrogénase 1 140 000 1 36 000 I coeur de I I I I I boeuf I I I I I I I Albumine I 67 000 1 67 000 sérum bovin I B.Kit de calibrage de bas poids moléculaires (LMW) I I I I I Poids I I I moléculaire I Protéine I des I Source I I I sous-unités I I I I I I Phosphorylase B I 94 000 Imuscle de lapinl I I I albumine 1 67 000 Isérum bovin I I I I I I ovalbumine 1 43 000 Iblanc d'oeuf I I I I anhydrase I l I I carbonique 1 30 000 Iérythrocytes I I I I bovins I I I I I Inhibiteur de I I I I trypsine 1 20 100 Isoja I I I I a-lactalbumine 14 400 Ilait de vache I I I I La coloration du gel est faite par du nitrate d'argent. Le procédé de coloration au nitrate d'argent consiste en 1. une fixation du gel avec un acide et de l'alcool, 2. une réaction au bichromate/acide nitrique, 3. une réduction du nitrate d'argent se traduisant par des taches noires aux niveaux des molécules réductrices situées dans le gel. Dans le Tableau I ci-après, les numéros se réfèrent aux numéros de fractions et la Figure 2 représente la caractérisation desdites fractions sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (en abscisse les numéros des fractions, en ordonnée, les poids moléculaires), selon la méthode de LAEMMLI [Nature, 277, p. 680 (19703. TABLEAU I Caractérisation sur un gradient de gel de 5 à 20 t de polyacrylamide en présence de SDS (selon LAEMMLI) des fractions obtenues Fraction Poids moléculaires des bandes colorées n en kilodaltons + 10 % 1 210 160 21 à 17,5 2 79 24,5 * 22,4* 21,1* 18,3 3 81 56,6 41,4 35,1* 32,1 18,7 16,6 4 78,7 56,6 41,4 5 91,3 83,5 6 90,2 83 71,9 7 90,2 83 * bandes majeures. Par ailleurs on a caractérisé la nature glucidique des différentes fractions. Pour cela, des lectines ont été conjuguées à la péroxydase selon la technique de J.L. GUESDON et Col. [J. Immunol. Methods 39 (1980),p. 1-133. Ces conjugués ont été incubés sur les profils électrophorétiques de fractions de Leishmania infantum, transférés sur nitrocellulose. La composition des fractions F1 à F6 en sucres est ainsi établie I Lectine I POIDS MOLECULAIRES DE (en KD) I testée I I I F1 I F2 I F3 I F4 I F5 I F6 I I I I I I I I I I I I I Lectine I d'arachide I I 16 1 I I I I I (ou PNA) I I 18 1 I I I nt I (ss-D-galac- I I I I tose) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I concanava- I I I I Linge A I I 16 1 # 14 1 f 14 1 I nt I (mannose- I I I I I I glucose) I I I I I I I I I I I I I Ulex I I I # 14 I europeus I I I 16 1 25 1 4 14 14 I I (L. fucose)l 1 18 1 60 1 I I I I I I I 60 1 I nt I I I I 75 1 75 1 I I nt = non teste La PNA appelée aussi lectine d'arachide (peanut agglutinin) est fournie par la Société BIOSYS (Compiègne, France), la concanavaline A par SIGMA, l'Ulex Europeus I par la Société américaine VECTOR, et la peroxydase est fournie par BOEHRINGER MANNHEIM. La fraction F2 contient des groupes ss-D-galactose ; les fractions F2, F3, F4 contiennent des groupes mannoseglucose les fractions F2, F3, F4 contiennent également des groupes Lfucose. EXEMPLE 2 - Analyse-de ia réponse humorale consécutive à l'injection des fractions de Leishmania infantum conformes à l'invention chez la souris Balb/c La Figure 3 annexée représente un Western blot obtenu à partir d'un profil électrophorétique de la souche LEM 497 C (Leishmania infantum) transféré sur nitrocellulose et soumis à une immunoempreinte avec des sérums de souris. Ces souris ont reçu au préalable 3 injections successives à 15 jours d'intervalle avec l00 g de l'une des fractions conformes à l'invention, dans 100 l d'adjuvant de Freund (complet pour la première injection puis incomplet pour les autres injections). Dans la Figure 3, les numéros 0 et 13 représentent le profil des transferts, colorés à l'encre de Chine. Les numéros : sont relatifs aux bandelettes Les nombres pairs correspondent aux sérums dilués 1/200 Les nombres impairs correspondent aux sérums dilués 1/50. Seules les souris immunisées avec la fraction "F2" fabriquent des anticorps contre des antigènes de plus de 330 kD et d'une région de 15-14 kD, ce qui signifie que les autres fractions (F3 et F4) sont plus difficilement inductrices d'anticorps. EXEMPLE 3 - Tests d'évaluation de 1'activité lymphopro liférative de fractions antigéniques de Leishmania 1: A immunisées contre la fraction F2 souris B 5 6 souris immunisée contre la fraction F3 7 8 3 souris A 101 souris B immunisées contre la fraction F4 1o 11? 12 3 souris non immunísées 1. induction de la prolifération des lymphocytes humains par des fractions de Leishmania Les fractions ont été dissoutes dans du milieu de culture pour lymphocytes humains (RPMI 1640, Pénicilline, Streptomycine, 10 % sérum humain AB+), dans des conditions stériles.Des lymphocytes humains ont été préparés par centrifugation sur gradient discontinu de Ficoll (Histopaque, Sigma) à partir de sang périphérique de donneurs sains n'ayant pas de passé clinique connu de Leishmaniose. Ces lymphocytes ont été mis en contact avec les différentes fractions à des concentrations variables de 25 à 0,1 vg par ml de culture. La prolifération cellulaire est mesurée après 6 jours de culture en étuve gazée à 37 OC, par mesure de l'incorporation de 3H-thymidine pendant 18 heures. La prolifération observée en présence de chaque fraction est exprimée en Index de Prolifération Maximum, IPM : rapport de l'incorporation maximale mesurée pour 105 lymphocytes en présence de la dose optimale de la fraction considérée, à l'incorporation mesurée en l'absence de tout stimulus. Quatre préparations de lymphocytes provenant de donneurs différents ont été utilisées. Les résultats de cette évaluation sont réunis dans le Tableau II ci-après. TABLEAU II IPM mesuré pour les différentes fractions isolées à l'Exemple 1 Extrait total Fractions de Leishmanies 1 2 3 4 5 6 7 Exp. nO I 14 22 6 1 nt 6 nt 5 Exp. nO II 13 18 nt 13 17 nt 1 nt Exp. nO III 28 28 21 6 9 7,5 7 7,5 Exp. nO IV 7 nt 9,5 nt 1,5 4,5 5 1,5 nt : non testé dans cette expérience. Des contrôles négatifs effectués dans les mêmes conditions avec de la sérumalbumine bovine donnent un IPM=1; des contrôles positifs avec la PHA donnent des IPM de 50 à 100 selon les préparations de lymphocytes. Des activités prolifératives diverses sont observées selon les préparations de lymphocytes utilisées. Une forte activité proliférative est observée dans l'extrait total des parasites. Les fractions 1, 2 et 4 présentent une activité proliférative importante (IPM de l'ordre de 10 ou plus) dans au moins deux sur trois des expériences où elles ont été testées. 2. Test de lymphoprolifération : modèle murin Cet essai a été réalisé sur des splénocytes de souris Balb/c, cultivés en microplaques en milieu RPMI 1640, 1 8 de sérum de veau foetal (0,5.106 cellules/ puits). Les fractions 1 à 6 (diluées en tampon PBS) ont été testées à 20, 10, 5, 2.5 1.25, 0.6, 0.3 et 0.15 ssg/ml en comparaison avec de la Concanavaline A (ConA 2.5 ssg/ml) et du lipopolysaccharide (LPS 10 ag/ml, commercialisé par DISCO) La lymphoprolifération a été estimée au Jour + 2 et au Jour + 4 par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée. Les résultats présentés sur le Tableau III ciaprès sont représentatifs de deux expériences réalisées dans des conditions identiques.Les 6 fractions testées ont une activité lymphoproliférative détectable. Celleci est optimale 48 heures après le début des cultures. Les fractions 4, 5 et 6 sont plus actives que les fractions 1, 2, 3. TABLEAU III Incorporation maximale (cpm) obtenue à J + 2 J + 4 PBS (diluant) 553 785 LPS (10 vg/ml) 9011 2798 ConA (2.5 p g/ml) 41356 57013 1 2780 (2.5)* 971 (0.6) 2 1743 (1.2) 1262 (1.2) 3 3953 (0.3) 1335 (0.3) Fractions 4 4916 (2.5) 1676 (1.25) 5 6528 (20) 2611 (10) 6 + 7 7322 (20) 2437 (20) cumulées * Concentration (g/ml) pour laquelle a été obte nue l'incorporation maximale. 3. Test d'induction d'une activité interleukine 1 (IL 1) La capacité des fractions de Leishmania à induire la libération d'interleukine 1 (IL 1) par les monocytes humains a été recherchée. Dix microgrammes de chacune d'entre elles ont été ajoutés à 5 x 105 monocytes humains/0.5 ml milieu RPMI 1640 sélectionnés par adhérence à partir des cellules mononucléees obtenues après centrifugation du sang total sur Ficoll-Histopaque.. Après 24 heures de culture, les surnageants sont récupérés et testés pour leur activité IL 1 à l'aide du test de comitogénicité sur des thymocytes de souris C3H/HeJ en présence de doses suboptimales de concanavaline A. I1 est apparu, ainsi que cela ressort du Tableau IV ci-après, que les fractions F1 et P3 sont dépourvues d'activité inductrice d'IL-l, tandis que les fractions F2, F4, F5 et F6 induisent la présence d'une activité IL-l dans les surnageants de monocytes. Les expériences préliminaires menées en présence de polymyxine B (PMB) tcommercialisée par SIGMA2, en vue de neutraliser d'éventuelles contaminations en endotoxines, puissants inducteurs d'IL-l, semblent suggérer que les activités inductrices d'IL-l observées avec les fractions F2, F4 et F5 pourraient être des propriétés intrinsèques de ces fractions. TABLEAU IV Exp. I* Exp. II* I Milieu de I I Milieu de I I culture I+PolymyxineB culture l+Poly- I I RPMI I 2 g/puits RPMI I myxineB I I I 2 g/puits I I I O .1/401 1093 1 1433 1 1195 1 1091 1 1/101 610 1 1259 1 920 1 937 1 i i F1 10 g 1 1247 1 1247 1 1150 1 1195 1 1 2333 1 1453 i 1423 1 1345 1 i i F2 10 g 1 4716 1 4989 1 4743 1 3273 1 1 5229 1 5449 1 6517 1 4659 i F3 10 g 1 1482 1 1154 1 1042 1 1147 1 1 1945 1 1167 1 1143 1 964 t I F4 10 g 1 7236 1 5326 1 3999 1 5623 1 1 5707 1 5778 1 8544 1 6891 1 F5 10 g 1 3923 1 5472 1 3875 1 4411 1 1 8234 1 7837 1 6725 1 9057 F6 10 g 1 5699 1 5848 i 5058 1 3429 i 1 8025 1 4511 1 6281 1 3833 1 I LPS SE ** I 4022 1 6259 1 1782 1 7727 1 1 g 1 2774 1 7059 1 5032 1 8275 i 10 g 1 6422 1 1 8224 1 i 1 8335 1 1 5618 1 * I : Monocytes humains provenant d'un donneur féminin de 27 ans, groupe sanguin A+ ; 79,5x106 cellules mononuclées/50 ml sang 20% NSE+ (NSE = non specific esterase) * II : Monocytes humains provenant d'un donneur féminin de 19 ans, groupe sanguin 0+ ; 73,5x106 cellules mononuclées/50 ml sang 20,9 % NSE+ (non specific esterase) ** SE : Salmonella enteridis. EXEMPLE 4 - Test d'identification de la présence éventuelle d'anticorps antiglycolipides anti-Leishmania dans des sérums. Des souris ont été immunisées avec les différentes fractions de Leishmania infantum. La présence éventuelle dans leur sérum d'anticorps antiglycolipides a été étudiée. L'identification de ces anticorps a été effectuée selon la méthode décrite par MAGNANI selon laquelle les lipides du parasite sont extraits par 20 volumes d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (5:10:3, vol/vol). L'extrait lipidique provenant de 10 à 20 mg de culot parasitaire est chromatographié sur des plaques HP-TLC (gel de silice 60, Merck), dans un solvant chloroforme-méthanol-KCl 0,25 % H2O (50:40:10, vol/vol). Le chromatogramme est séché puis immergé pendant 2 minutes dans une solution de polyisobutylméthacrylate (Polysciences) à 0,1 g dans l'hexane. Après séchage à l'air, le chromatogramme est vaporisé avec du tampon phosphate (tampon A), puis immergé pendant 20 minutes dans un tampon Tris ou tampon B (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 1 % Sérumalbumine bovine). Puis la plaque est incubée dans le sérum à tester dilué au 1/50e dans le tampon B, pendant une heure à la température du laboratoire. Le chromatogramme est ensuite lavé dans 4 bains successifs de tampon B puis recouvert d'anticorps de chèvre anti-Immunoglobulines /IgG (H+L)/ de souris marqués à l'Iode 125 (lodogen). Après une heure d'incubation le chromatogramme est lavé dans quatre bains successifs de tampon A, séché, puis mis en contact avec un film pour autoradiographie Kodak XAR 5. Les sérums des souris immunisées avec les fractions 2, 3 et 4 ont été testés. Les sérums des animaux immunisés avec les fractions 2 et 3 ne présentent aucune réactivité sur les lipides extraits des Leishmanies. Par contre, les sérums des souris immunisées avec la fraction 4 contiennent des anticorps spécifiques d'un lipide extrait du parasite. Ce lipide, après chromatographie, apparaît comme une double bande, aspect classique de la migration des glycolipides. Ce lipide antigénique se situe, après chromatographie dans le solvant utilisé, entre les Gangliosides GM3 et GM1. Ce test contribue à la mise en évidence de la composition chimique de la famille dtimmunogènes conforme à la présente invention. EXEMPLE 5 - Evaluation des activités immunogènes in vivo de fractions de Leishmania LEM 497 isolées sur tamis molétulaire, contre une infection leishmanienne. Des lots de 5 souris Balb/c (IFFA CREDO, FRANCE) de 20 g ont subi le protocole d'immunisation suivant chacune des souris a été traitée comme suit 3 injections sous-cutanées dorsales de fractions de L. infantum (LEM 497), espacées chacune de 15 jours, puis 10 jours après, un challenge de 2.107 promastigotes de L. mexicana mexicana (LV 4) en injection sous-cutanée à la base de la queue. Les lots de souris sont les suivants et les doses indiquées sont celles administrées à chacune des souris lot Nature de l'injection 1 Surnageant de sonication de L. infantum 320 g à la première injection puis 160 g pour les deux autres avec 50 g de MDP (BIOSYS, COMPIEGNE, FRANCE), soit 640 vug de surnageant par souris de 20 g. 2 Toutes les fractions de colonne réunies moins la fraction F4 (Kav = 1,06) 120 g à la première injection puis 60 g pour les deux autres avec 50 g de MDP. 3 Fraction F4 seule 200JUg à la première injection puis 100ug pour les deux autres, avec 50 g de MDP, soit 400)ig de surnageant par souris de 20 g. 4 Eau physiologique Avec 50 g de MDP 5 Eau physiologique Sans MDP Après le challenge infectieux, les souris sont examinées au site d'injection du challenge infectieux. Le résultat des observations est le suivant : on observe l'induration au point d'inoculation et son évolution ultérieure avec, plus tard, la mort éventuelle de l'animal, les croix traduisant la croissance de l'induration. TEMPS J + 21 J+42 après challenge J + 60 après challenge @ 0 + ++ +++ 1 Ulc, 0 + ++ +++ Ulc. O + ++ +++ Ulc. Lot 1 1 2 4 0 2 3 2 6 1 Lysat total + +MDP i Lot 2 3 4 1 2 5 i O i toutes 7 les frac tions -F4 4 MDP Lot 3 4 3 1 2 2 3 1 1 4 3 F4 + MDP Lot 4 1 4 0 5 2 3 MPD seul I Lot 5 1 4 2 2 1 2 3 PBS sans * 0 = rien + = induration jusqu'à 3 mm ++ = induration 3 - 5 mm +++ = induration 5 - 7 mm Ulc. = ulcération Ce résultat préliminaire montre l'apparition de lésions associée à la fraction F4 (Kav = 1,06) (lot n 3 et lot n 1) pendant les 40 premiers jours suivant le challenge. Une stabilisation, puis une régression dans l'évolution ultérieure des lésions par rapport aux autres lots, est à noter. Cet effet ne semble pas apparaître lorsque la fraction F4 est absente des fractions injectées (lot nO 2). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. NDICATIONS 1.- Fractions natives caractérisées en ce qu'elles sont extraites de Leishmania. 2.- Fractions natives selon la revendication 1, caractérisées par leurs propriétés immunogènes et leur activité lymphoproliférative. 3.- Fractions natives selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisées en ce qu'elles sont extraites de Leishmania infantum. 4.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de l'ordre de 0, un poids moléculaire -évalué sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (PAGE-SDS), selon la méthode de LAEMMLI-comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes de l'ordre de 21, 160 et 210 KD, une composition en glucides -évaluée sur des profils électrophorétiques transférés sur nitrocellulose - présentant une bande à ss 14 KD contenant du -D-galactose, du mannose et du glucose et du L-fucose, respectivement, laquelle fraction est dénommée ''F1'', 5.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce -qu'elle présente un Kav de l'ordre de 0,43, un poids moléculaire comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes majeures de l'ordre de 21,1 KD, 22,4 KD, 24,5 KD et des bandes de l'ordre de 18,3 KD et 79 KD, une composition en glucides présentant une bande de l'ordre de 16 et 18 KD caractéristique du mannose et du glucose, et des bandes à 16 et 18 KD caractéristiques du L-fucose et du p-D-galactose, laquelle fraction est dénommée "F2n. 6.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de 0,75, un poids moléculaire, évalué sur PAGE-SDS, comprenant, après coloration au nitrate d'argent, une bande majeure de l'ordre de 35,1 KD et des bandes de l'ordre de 16,6, 18,7, 32,1, 41,4, 56,6 et 81 KD, une composition en glucides présentant des bandes 4 14 KD caractéristiques respectivement du mannose et du glucose et des bandes (14 KD, 25 KD, 60 KD et 75 KD caractéristiques du L-fucose, laquelle fraction est dénommée "F3". 7.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de l'ordre de 1,06, un poids moléculaire comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes de l'ordre de 41,4, 56,6 et 78,7 KD, une composition en glucides présentant des bandes à 4 14 KD, caractéristiques respectivement du mannose et du glucose et une bande 414 KD, 60 KD et 75 KD caractéristiques du L-fucose, laquelle fraction est dénommée "F4". 8.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de l'ordre de 1,24, un poids moléculaire comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes de l'ordre de 83,5 KD et 91,3 KD, laquelle fraction est dénommée "Fs". 9.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de l'ordre de 1,54, un poids moléculaire comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes de 1J ordre de 71,9 KD, 83 KD et 90,2 KD, laquelle fraction est dénommée "F6 " 10.- Fraction native selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente un Kav de l'ordre de 1,92, un poids moléculaire comprenant, après coloration au nitrate d'argent, des bandes de l'ordre de 83 KD et 90,2 KD, laquelle fraction est dénommée ex7". 11.- Compositions antigéniques protectrices contre les leishmanioses, caractérisées en ce qu'elles contiennent en tant que constituant actif, au moins l'une des fractions natives extraites de Leishmania, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12.- Compositions antigéniques protectrices selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par des compositions vaccinantes dans lesquelles au moins l'une des fractions selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 est associée à un véhicule d'administration approprié, et éventuellement à un adjuvant. 13.- Produit de diagnostic de leishmaniose caractérisé en ce qu'il contient au moins l'une des fractions natives extraites de Leishmania, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 14.- Kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une dose utile pour la réalisation d'un test de diagnostic de leishmaniose, d'au moins une fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ainsi que les diluants et tampons nécessaires à la réalisation dudit test. 15.- Fractions natives selon au moins l'une quelconque des revendications 4 et/ou 5 et/ou 7, caractérisées par leur activité lymphoproliférative sur des cultures de lymphocytes humains. 16.- Fractions natives selon au moins l'une quelconque des revendications 7 et/ou 8 et/ou 9,-caractérisées par leur activité lymphoproliférative sur des cultures de lymphocytes murins. 17.- Fractions natives selon au moins l'une quelconque des revendications 5 et/ou 6, caractérisées par leur activité immunogène. 18.- Fractions natives selon au moins l'une quelconque des revendications 5 et/ou 7 et/ou 8 et/ou 9, caractérisées par leur activité de libération d'interleukine 1 (IL 1) sur les monocytes humains. 19.- Fraction native protectrice selon au moins l'une quelconque des revendications 7, 10, 15, 16, 18, caractérisée en ce qu'elle est extraite de Leishmania infantum. 20.- Procédé de production de fractions de Leish mania présentant des activités immunogènes et lymphoprolifératives, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou 15 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes a) étape dite de préculture b) étape dite de culture c) étape de récolte d) étape de concentration. 21.- Procédé selon la revendication 20, caractérisé - en ce qu'au cours de la première étape dite de "préculture", des promastigotes d'au moins une souche appropriée de Leishmania sont mis en culture pendant une durée appropriée, à une température de l'ordre de 270C + 10C, à un pH de 6 à 8 régulé de manière appropriée, avec une pression partielle d'oxygène (PO2) convenable, de l'ordre de 10 à 80 %, sous une agitation de l'ordre de 50 tours/minute + 10 tours, dans un milieu de culture approprié, pour obtenir à partir d'un inoculum de l'ordre de 105-106 parasites/ml dans un fermenteur de faible volume, au moins 50.106 parasites/ml; ; - en ce qu'au cours de la deuxième étape dite de "culture", la préculture recueillie (de l'ordre de 50.106 parasites/ml) est utilisée comme inoculum dans un fermenteur industriel (d'au moins 20 litres) et est mise en culture dans un milieu de culture similaire à celui mis en oeuvre dans l'étape de préculture, à une température et à un pH similaires, la régulation du pH étant toutefois réalisée à l'aide d'un acide organique métabolisable tel que l'acide acétique notamment, tandis que la pO2 est de l'ordre de 50 à 100 % et que l'agitation est de l'ordre de 30 tours/minute +. 5 tours, à l'issue de laquelle on recueille une culture de l'ordre de 65.106-80.106 parasites/ml;; - en ce qu'au cours de la troisième étape, les parasites collectés sont centrifugés, de préférence à 6000 tours/minute pendant une durée de l'ordre de 10 minutes, pour donner un culot de parasites - en ce qu'au cours de la quatrième étape, le culot de parasites résultant de la troisième étape est resuspendu dans un tampon approprié, de manière à obtenir une concentration de 6.109 parasites/ml. 22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que sa quatrième étape consiste en ce que le culot de parasites résultant de la troisième étape, ou étape de centrifugation, est mis en suspension dans de l'acétate d'ammonium 10 à 20 mM contenant 1 % de détergent non ionique tel que Triton X100, notamment, cette suspension est centrifugée, de préférence à 6000 tours/minute environ, et le surnageant de centrifugation récupéré, tandis que le culot est remis en suspension dans environ 1/10 du volume initial de culture et soumis à sonication, puis on centrifuge à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment, pour collecter un deuxième surnageant et un deuxième culot qui est également soniqué, puis à nouveau centrifugé pour collecter un troisième surnageant, les surnageants de sonication sont réunis et déposés sur une colonne de tamis moléculaire à partir de laquelle on recueille, en utilisant l'acétate d'ammonium comme éluant, des fractions dont les poids moléculaires sont évalués de manière appropriée et dont l'activité lymphoproliférative est évaluée à l'aide de tests appropriés. 23.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que les fractions recueillies sont au nombre de 7, les fractions F1, F2, F3, F4, F5, F6 et F7. 24.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que les poids moléculaires desdites fractions sont évalués par révélation au nitrate d'argent d'un gel PAGE-SDS. 25.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que le milieu de culture mis en oeuvre pour la préculture et/ou pour la culture de promastigotes de Leishmania est avantageusement constitué par un mélange 1:1 de milieu RPMI 1640 et de milieu 199, additionné de 2 à 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté, de glutamine 2 mM, de tricine pH 7, 50 à 100 mM et d'antibiotiques appropriés. 26.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que les opérations de mise en suspension et de centrifugation sont réalisées de préférence à une température de l'ordre de +40C environ. 27.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que l'étape de préculture est supprimée, auquel cas on utilise comme inoculum, 500 à 1000 ml de la culture résiduelle provenant d'une culture précédente.