Brevet FR2618556A1 — publié le 19890127

PROCEDE PERMETTANT DE DETECTER SI UN PRODUIT ALIMENTAIRE A ETE IRRADIE. L'invention concerne un procédé permettant de détecter si un produit alimentaire a été irradié, le procédé étant notamment applicable aux produits frais et aux produits congelés. La mise au point de procédés de détection de l'irradiation est en effet l'une des étapes à franchir pour qu'une plus large utilisation des rayonnements ionisants pour la conservation des aliments puisse être réalisée. Sans la mise au point de tels procédés, le droit à l'information du consommateur n'est pas respecté, le contrôle aux frontières des denrées importées et celui du respect de la législation à intérieur du pays sont impossibles. De nombreux procédés sont actuellement à l'étude, mais aucun d'entre eux ne semble applicable à une large gamme de produits alimentaires. C'est précisément un des résultats de l'invention que d'offrir une solution à ce problème. L'invention concerne plus précisément un procédé permettant de détecter si un produit alimentaire a été irradié, caractérisé en ce qu'il consiste à rechercher l'existence de cassures de la chaîne d'ADN des cellules du dit produit concerné, cette recherche étant réalisée en séparant les chaules d'ADN en fonction de leurs tailles par filtration et en dosant 1'ADN contenu dans différentes fractions. L'invention sera mieux comprise à l'aide des explications qui vont suivre. Le procédé selon l'invention consiste à détecter si un produit a été irradié en mettant en évidence que l'acide desoxyribonucléique (ADN) des cellules de ce produit a été cassé. L'ADN est en effet par sa taille, la principale cible moléculaire des rayonnements ionisants, et des cassures dans la chaîne d'ADN sont l'un des principaux types de lésions observées sur cette molécule. La Demanderesse a mis en évidence dans le domaine alimentaire que la quantité d'ADN retenue sur un filtre de porosité déterminée diffère de manière significative, toute chose étant égale par ailleurs, selon que le produit a été irradié ou non. Selon une caractéristique de l'invention, le procédé conforme à l'invention consiste: - d'une part, à établir préalablement pour chaque type de produit concerné des valeurs d'étalonnage (références), en mesurant, dans des conditions opératoires identiques, les quantités d'ADN piégé sur un filtre de porosité déterminée, cette mesure étant effectuée sur un échantillon de produit irradié à la dose minimale acceptable et sur un échantillon comparable de produit non irradié; - d'autre part, à procéder au même dosage, dans les mêmes conditions opératoires, pour le produit à contrôler et à comparer le résultat avec les valeurs de référence du dit produit. La Demanderesse a également mis en évidence qu'il existait une relation entre le pourcentage d'ADN total piégé par le filtre de porosité déterminée et le fait que le produit ait été irradié ou non. Un exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est décrit ci-dessous. Il est relatif à des langoustines congelées, mais ce procédé est applicable à la plupart des produits alimentaires frais et congelés. 1ère Etape Les langoustines sont sorties rapidement du congélateur et décortiquées. 200 mg de tissu musculaire sont prélevés dans l'abdomen du crustacé, en évitant soigneusement de prélever en même temps des fragments de tube digestif. Le prélèvement de tissu est alors déposé dans un broyeur de "Potter" et homogénéisé dans une solution froide de tampon phosphate à pH 7. 2ème Retape Cette opération est suivie d'un passage sur gaze destinée à éliminer les gros débris, puis d'une centrifugation du filtrat à 80 g pendant 5 minutes à 40C destinée à recueillir les cellules. Le culot cellulaire obtenu est alors repris dans 4 ml de tampon phosphate froid et 2 ml de la suspension obtenue sont déposés sur un filtre en polycarbonate (diamètre des pores: 2 microns) disposé sur un appareil de filtration. Le système de filtration choisi pour la mise au point du procédé selon l'invention est celui préconisé par Kohn et al. (1981) - Measurement of strand breaks and cross-links by alkaline elution. In: DNA repair, A Laboratory Manual of Research Procedures (E.C. Friedberg and P.C. Hanalwalt, eds). Marcel Dekker, New York. Vol. 1, part B, pp 379-401. Brièvement, il se compose d'un tube de 50 ml en polypropylène monté sur un porte-filtre; l'étanchéité est assurée par un joint torique; en sortie du porte-filtre, un fin tuyau pourvu d'un robinet permet l'évacuation des solutions au moment désiré. 3ème Etape: Les cellules ayant été déposées sur le filtre dans un volume de 2 ml de tampon phosphate froid, on laisse stécouler environ 1 ml de la solution tampon puis, après fermeture du robinet, on ajoute 2 ml d'une solution de lyse de composition suivante: SDS à 2 %, Na2 EDTA 20 m M ajusté à pH 10 avec NaOH. Pour permettre la lyse des cellules, la solution est préalablement incubée à 370 C puis l'ensemble, après addition de cette solution, est maintenu à température ambiante pendant 1 heure. La lyse cellulaire est effectuée directement sur le filtre de façon à éviter toute manipulation de 1'ADN, susceptible d'engendrer de nouvelles cassures. Ensuite, la solution de lyse est évacuée par gravité; elle entrain avec elle les débris cellulaires ainsi que les morceaux d'ADN de petite taille aux travers des pores. Les brins d'ADN plus longs donc de poids moléculaire plus élevé) sont, quant à eux, retenus sur le filtre. 4ème Etape: Cette quatrième étape est suivie d'un lavage du filtre avec 10 ml d'une solution de tampon phosphate à pH 7,0 ce qui permet à la fois d'éliminer les traces de SDS gênant pour le marquage microfluorimétrique et d'entratner les petits brins d'ADN non encore passés au travers du filtre. 5ème Etape: Le filtre est ensuite retiré de son support et 1'ADN piégé est dosé par marquage microfluorimétrique, avec le produit Hoechst 33258, suivant la méthode de Césarone, C.F., Bolognesi, C. and Santi, L. (1979) (Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. Anal. Biochem. 100: 188-197) modifiée par Stout, D.L. and Becker, F.F. (1982) (Fluorometric quantitation of single stranded DNA: A method applicable to the technique of Alkaline Elution. Anal. Biochem. 127: 302-307). Le protocole consiste à extraire l'ADN du filtre par agitation dans le tampon phosphate et après addition d'une solution de produit Hoechst, à lire les valeurs obtenues en fluorescence. Selon une caractéristique importante de l'invention, l'ADN est directement dosé après la lyse cellulaire sans être mis dans des conditions dénaturantes. Les conditions sont alors suffisantes pour mettre en évidence de manière significative RADON cassé provenant d'un produit irradié, de 1'ADN non cassé, et donc retenu sur le filtre, d'un produit non irradié. En suivant les étapes du procédé selon l'invention, l'élution est donc réalisée à pH neutre et à la pression atmosphérique, ce qui rend le procédé simple, rapide et reproductible. Pour connaître la proportion d'ADN retenue, il est nécessaire de déterminer également la quantité totale d'ADN présente dans une aliquote de la suspension de cellules lysées ou encore la quantité d'ADN présente dans le filtrat. Pour quantifier l'ADN total des cellules d'une aliquote de la prise d'essai, on réalise la lyse directement dans la suspension cellulaire. Dans ce dernier cas, ainsi que dans le cas où on veut doser l'ADN présent dans le filtrat, il est nécessaire d'éliminer préalablement le Sodium Dodesyl Sulfate (SDS) pour éviter qu'il n'interfère avec le dosage microfluorimétrique. Pour cela, on ajoute à la solution du NaCI à la concentration finale 0,5 M et on incube le mélange quelques heures à OOC. Puis, après une centrifugation à 800 g pendant 10 minutes, le culot est éliminé tandis que le surnageant, additionné de 2 volumes d'éthanol froid, est conservé pendant 2 heures à -200C pour permettre la précipitation de l'ADN. Cet ADN est ensuite recueilli sur un filtre (diamètre des pores par exemple 0,2 um) puis quantifié suivant le protocole de dosage microfluorimétrique décrit précédemment. Les résultats obtenus expérimentalement sont donnés ci-dessous: ils concernent, comme cela a été dit précédemment, des langoustines congelées crues non irradiées ou irradiées à la dose de 3KGrays, c'est-à-dire à une dose inférieure à celle la plus couramment appliquée pour traiter des petits crustacés (environ 5 KGy) dans les pays où la législation le permet. Exemple nO 1 Le tableau ci-dessous donne la quantité d'ADN retenue sur le filtre de porosité 2 > im. La quantité d'ADN retenue sur un filtre de porosité 2 um est comparée pour des langoustines irradiées et non irradiées. Ce tableau 1 résume les résultats obtenus (moyenne plus écart-type) au cours de cinq expériences réalisées dans des conditions similaires, pour des quantités de tissu et donc d'ADN voisines. TABLEAU 1 Langoustines non irradiées irradiées Quantité en > 'g d'ADN retenu sur le premier 2,32 + 0,25 0,21 + 0,14 filtre (porosité 2 > im) Ces résultats reproductibles montrent que pour une même quantité de cellules lysées, l'ADN extrait de langoustines irradiées est retenu en quantité significativement beaucoup moins importante sur le filtre que lorsque les langoustines n'ont pas subi de traitement d'irradiation. Exemple nO 2: Le tableau nO 2 donne le pourcentage dtADN retenu sur le filtre (porosité 2vus). Si les conditions sont rigoureusement standardisées, le simple fait de déterminer la quantité d'ADN retenue sur le filtre apres la lyse cellulaire permet en fait d'identifier le produit irradié. Mais, en l'absence de produit témoin et pour parer au risque de variations de la quantité de cellules donc d'ADN déposés sur le filtre, il est préférable de déterminer aussi la quantité totale d'ADN déposée sur le filtre par l'un des deux procédés décrits précédemment (dosage sur une aliquote de la suspension de cellules, ou dosage dans le filtrat de la première filtration). TABLEAU 2 Langoustines non irradiées irradiées Quantité en pg d'ADN retenu sur le premier 2,36 0,21 filtre (porosité 2 um) Quantité en pg d'ADN retenu sur le second filtre 6,11 7,27 (porosité 0,2 pm) après traitement à I'éthanol ADN retenu sur le premier filtrelADN retenu sur les 28 Só 3 96 deux filtres, en pourcentage Dans le procédé décrit précédemment, le dosage de l'ADN total ou celui de l'ADN présent dans la solution de lavage sont relativement longs car ils nécessitent l'élimination du SDS, pour doser l'ADN. Selon une variante de réalisation, on élimine cet inconvénient en remplaçant le SDS par d'autres détergents n'interférant pas avec le marquage microfluorimétrique, comme le sarkosyl. Une autre variante de la procédure permettant d'analyser simultanément une douzaine d'échantillons consiste à utiliser le système Manifold commercialisé par Millipore, ou un système similaire; la lyse est alors effectuée également sur le filtre en maintenant en surpression l'intérieur de l'appareil de manière à ce qu'il n'y ait pas d'écoulement de la solution de lyse, pendant le temps nécessaire à cette lyse. L'invention décrite précédemment permet donc de connaltre l'état de l'ADN du produit étudié et d'en déduire s'il a été soumis à un traitement ionisant. Elle s'applique au contrôle d'un grand nombre de produits alimentaires sur le plan de l'irradiation. REVENDICATIONS 1. Procédé permettant de détecter si un produit alimentaire a été irradié, caractérisé en ce qu'il consiste à rechercher l'existence de cassures de la chaîne d'ADN des cellules du dit produit concerné, cette recherche étant réalisée en séparant les chaînes en fonction de leurs tailles par filtration et en dosant l'ADN contenu dans différentes fractions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste, pour chaque produit, à établir des valeurs de références et à comparer à cellesci les quantités de fragments d'ADN recueilli dans les mêmes conditions opératoires. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fragments d'ADN - sont recueillis par filtration sur un premier filtre de porosité déterminée. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce outil consiste d'abord à effectuer sur les cellules résultant d'un prélèvement broyé mis en suspension et filtré, la lyse des dites cellules directement sur le filtre de l'appareil de filtration de façon à éviter toute manipulation de l'ADN susceptible d'engendrer de nouvelles cassures, puis à séparer les brins par élution en condition non dénaturante, enfin à doser l'ADN de différentes fractions par une méthode microfluorimétrique. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à déterminer Ia proportion d'ADN retenu sur le premier filtre par rapport à la quantité totale d'ADN. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer la quantité d'ADN subsistant dans le filtrat résultant de la filtration à travers le premier filtre en piégeant cet ADN du filtrat sur un second filtre de porosité plus fine. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer la quantité totale d'ADN en effectuant la lyse d'une suspension cellulaire correspondant à une partie aliquote de celle de la prise d'essai et en recueillant l'ADN sur un second filtre de porosité plus fine.