Brevet FR2612527A1 — publié le 19880923

252? Procédé de dosage de la lécithine-cholestérol acyltransférase et composition utile à cet effet. La présente invention est relative à un procé- dé de dosage enzymatique de la lécithine-cholestérol acyltransférase (dénommée ci-après "LCAT") dans un échantillon, ainsi qu'à une composition qui peut être utilisée à cet effet. La LCAT est une enzyme qui agit sur la lécithi- ne et le cholestérol libre servant de substrats dans le sang pour produire de la lysolécithine et de l'ester de cholestérol, cette enzyme étant biosynthétisée dans le foie. Le dosage de la LCAT est utile pour un test de fonctionnement du foie et également pour l'étude pathologique des troubles du métabolisme des lipides et du diabète sucré, puisque l'activité de la LCAT est liée aux troubles des cellules du foie. C'est ainsi, par exemple, que la LCAT diminue, dans le cas d'hépatites aiguës, de cirrhoses du foie, de jaunisses et de cancers du foie, tandis qu'elle augmente dans le cas de troubles hépatiques dus à l'alcool et dans la stéatose hépatique. Jusqu'ici on a effectué le dosage de cette enzyme en déterminant la variation de la quantité de cholestérol libre consommée servant de substrat. En pra- tique, on chauffe du sérum sanguin (ou du plasma san- guin) pendant une durée définie (par exemple pendant 2 heures) à une température de réaction optimale de 37 C et on détermine la variation d'une quantité (n mole) de cholestérol libre avant et après le chauffa- ge. L'activité est indiquée par la quantité de n moles par ml de sérum sanguin par heure (h), c'est-à-dire n mole/(ml.h). Le taux de réaction des enzymes est indi- qué, habituellement, comme étant celui à l'état ini- tial de la réaction quand il y a une quantité suffi- sante de substrat dans une solution réactionnelle et la courbe de réaction est linéaire par rapport au temps. Mais, dans le cas de la LCAT, le dosage est très difficile, parce que la réaction se produit dans une lipoprotéine de grande masse volumique, l'apoprotéine A-1 de la lipoprotéine de grande masse volumique agissant en tant que facteur d'activation de l'enzyme et, en outre, la lécithine et le cholesté- rol sont sensiblement insolubles dans l'eau. On divise les procédés de dosage en deux classes principales, à savoir le procédé au substrat commun dans lequel on ajoute un excès du substrat n'ayant pas d'activité de LCAT à une petite quantité de sérum sanguin (ou de plasma sanguin) et le procédé au substrat propre dans lequel on chauffe directement le sérum sanguin (ou le plasma sanguin) et on utilise une lipoprotéine endo- gène comme substrat. Dans ce dernier cas, il est diffi- cile de déterminer'la variation de quantité de choles- térol libre par analyse spectrophotométrique, à moins que le temps de chauffage soit très long, puisque la réactivité de la LCAT elle-même est essentiellement très petite, et puisque la linéarité des paramètres se perd en une heure après le début de la réaction, quand on porte le sérum (ou le plasma) lui-méme à 37 C. Pour résoudre les difficultés mentionnées ci- dessus, on a fait diverses propositions. L'une d'entre elles est d'ajouter une lécithine comprenant un agent tensio-actif à un échantillon (demande de brevet japo- nais non examiné No 51-129293). Ce procédé n'est pas satisfaisant, cependant, du point de vue clinique, parce que l'absence de cholestérol libre, qui est un autre substrat pour la LCAT, diminue l'activité de la LCAT et, parce que l'agent tensio-actif ajouté pour la solubilisation de la lécithine inhibe l'activité de la LCAT. Une autre manière de procéder consiste à trai- ter une solution de l'échantillon contenant de la léci- thine et du cholestérol libre comme substrat par des ultra- sons pour la rendre transparente et la solubiliser (Clinical Chemistry, Vol. 4, collectec No 3-4, 306 à 311, (1976). Mais cette solution peut difficilement s'appliquer en clinique, parce que le traitement par les ultrasons ne réduit que temporairement la turbi- dité de la solution, mais ne la rend pas transparente, et parce qu'une précipitation a lieu 2 à 3 heures apres. Les autres manières de procéder sont celles dans lesquelles on diminue la durée d'incubation d'un échantillon en maintenant la linéarité de la réaction de la LCAT, ou en en augmentant l'activité. Elles com- prennent, par exemple, un dosage de l'activité de la LCAT qui consiste à ajouter des dérivés de sucre poly- anioniqueapour rendre le cholestérol et la lécithine transparents (demande de brevet au Japon, non examinée, No 60-262600), et un dosage de l'activité de la LCAT qui consiste à ajouter un liposome comprenant du cho- lestérol et de la lécithine (dénommé "méthode au lipo- some") (26ème rencontre de la Society of Clinical Chemistry, qui s'est tenue le 22 novembre 1986, (point essentiel du rapport, pages 100 à 101, 1986)). Mais ces procédés ne sont toujours pas satisfaisants comme dosage enzymatique, puisque la durée de réaction (durée d'incubation) est supérieure à 40 minutes pour le procédé au liposome et est d'au moins une heure pour les autres procédés. En outre, ces dosages sont diffi- ciles à mettre en pratique en clinique, puisqu'on ne peut guère effectuer un dosage rapide. Même dans la méthode au liposome, qui nécessite actuellement la du- rée la plus courte, il est très difficile de préparer un liposome homogène et stable et ainsi il est en fait difficile de fournir toujours un liposome de composi- tion définie à l'endroit o s'effectuent en général les diagnostics cliniques. On a indiqué récemment un dosage de la LCAT qui consiste à augmenter la vitesse de la lysolécithine en utilisant une lécithine exogène et une cholestérol estérase (demande de brevet japonais non examinée, No 61-293396). Ce procédé présente également des in- convénients parce qu'il exige une durée de réaction supérieure à 1 heure pour mesurer l'augmentation de quantités de lysolécithine. Comme mentionné ci-dessus, ce procédé n'est pas souhaitable du point de vue d'une mesure rapide. Une durée de réaction si longue est due à la limite de sensibilité du colorimètre. On a maintenant trouvé un procédé de dosage de la LCAT qui peut être effectué quotidiennement, rapide- ment et facilement, avec une grande sensibilité. L'invention repose sur le fait que l'on dose l'activité de la LCAT en mettant un échantillon en contact avec un substrat comprenant de la lécithine et du cholestérol libre, jusqu'à production de lysoléci- thine et d'ester de cholestérol,on fait réagir de la lysophospholipase (EC, 3.1.1.5; dénommée ci-après LYP) et de la glycérophosphocholine phosphodiestérase (EC, 3.1.4.2; dénommée ci-après GPCP) sur la lysolécithine produite ci-dessus, eton y mesurela quantité de glycé- rol-3-phosphate (désigné ci-après par G3P) produite simultanément ou successivement en utilisant un procé- dé enzymatique de cyclisation ayant une grande sensibi- lité. En outre, l'invention repose sur le fait que le dosage de la LCAT s'effectue rapidement, d'une manière précise et facilement en utilisant une composition contenant de la LYP, de la GPCP, de la glycérophosphate oxydase (dénommée ci-après GPO) et du nicotinamide adénine dinucléotide réduit (dénommé ci-après NAD réduit). La présente invention vise un procédé de dosage de la LCAT dans un échantillon à doser avec une grande sensibilité, qui consiste à mettre les échantillons en contact avec un substrat comprenant de la lécithine et du cholestérol jusqu'à production de lysolécithine et d'ester de cholestérol, à faire réagir de la lysophos- pholipase et de la glycérophosphocholine phosphodiesté- rase sur la lysolécithine obtenue et à mesurer la quan- tité de glycérol-3-phosphate produite simultanément ou successivement, en utilisant un procédé enzymatique de cyclisation, et en outre l'invention vise une composi- tion pour effectuer le procédé de dosage de la LCAT qui comprend de la LYP, de la GPCP, de la GPO et du NAD réduit. Dans un procédé de dosage de la LCAT, en utili- sant un système enzymatique de réaction tel qu'exprimé par la formule (i), et en mesurant la quantité de lyso- lécithine produite ainsi ou son taux de production, Lécithine + cholestérol L,T libre lysolécithine + ester de cholestérol (i) le procédé classique exige un temps très long et ne per- met pas d'obtenir une mesure aisée, puisque la quanti- té de lysolécithine produite, ou son taux de production est très petite. La présente invention procure un procédé permettant d'effectuer un dosage rapide et aisé de la LCAT en clinique, en combinant une réac- tion enzymatique de formule (ii) et un système enzyma-. tique de cyclisation de formule (iii) au système réactionnel enzymatique de formule (i). LYP lysolécithine glycérophosphorylcholis + acide gras GPCP - glycérophosphorylcholine G3P + choline (ii) tQ GPO H202 ----> G3 /. DHAP (iii) NAD GPDH NAD réduit dans laquelle GPDH signifie glycérophosphate déhydrogénase DHAP signifie dihydroxyacétone-3-phosphate. Dans la présente invention, les substrats né- cessaires pour effectuer la réaction de formule (i) sont la lécithine et le cholestérol libre. Mais il n'est pas toujours nécessaire d'ajouter de la lécithine et/ou du cholestérol libre pour effectuer l'invention quand un échantillon à doser est du sérum sanguin ou du plasma sanguin, puisqu'ils contiennent de la lécithine et du cholestérol libre. On peut ajouter une lécithine exogène pour com- penser le défaut de lécithine dû à la réaction de la LCAT. Des exemples de lécithine exogène englobent la dipalmitoylphosphatidylcholine, la dioleylphosphatidyl- choline, la dimyristoylphosphatidylcholine, la distéa- roylphosphatidylcholine, la dilauroylphosphatidylcholine, la lécithine naturelle ou diverses lécithines traitées par ultrasons. En outre, on peut ajouter un substrat qui n'inhibe pas l'activité de la LCAT, tel qu'un liposome consistant en lécithine et en cholestérol. En variante, on peut ajouter avantageusement une cholestérol ester hydrolase au système réactionnel de la LCAT, puisque le cholestérol libre consommé dans la réaction de la LCAT est ainsi complété et que la concentration initiale du cholestérol libre endogène est augmentée, ou la réaction enzymatique de la LCAT est accélérée en faisant réagir la cholestérol ester hydrolase sur un ester de cholestérol endogène, ou sur celui produit par la réaction de la LCAT. Ceci sert à améliorer la sensibilité du dosage. Les cholestérol ester hydrolases sont des hydrolases qui réagissent sur l'ester de cholestérol pour donner du cholestérol libre. Cette cholestérol hydrolase inclut ce que l'on appelle des cholestérol estérases (dénommés ci-après CHE), ainsi que celles dénommées lipase et estérase ayant cette action enzyma- tique. Des exemples de CHE englobent celles provenant de tissus d'animaux tels que le pancréas, le foie, la glande surrénale, les testicules et les ovaires; et ceux provenant de microorganismes tels que Pseumononas fluorescens, Schizophyllum comune et Chromobacterium viscosum. Des exemples de lipase englobent celles pro- venant de tissus d'animaux tels que du pancréas, du foie et de tissus graisseux, celles provenant de grai- nes de plantes et celles provenant de microorganismes tels que Pseudomonas fluorescens et Geotricum candidum. Ces cholestérol estérases peuvent être utilisés en une quantité d'au moins 1U, et de préférence de 1 à 70U par test. La lysolécithine produite par la réaction enzy- matique de la LCAT, telle qu'indiquée par la formule (i) est transformée en G3P et en choline par les réac- tions enzymatiques en deux stades telles qu'indiquées 2 6 1 2 527 à la formule (ii). Dans cette réaction enzymatique, on utilise habituellement de la lysophospholipase (LYP) en une quantité de 0,3 à IOU/test, de préférence de 0,5 à 3U/test, et de la glycérophosphocholine phosphodiesté- rase (GPCP) en une quantité de 0,3 à 1OU/test, de pré- férence de 0,5 à 3U/test. Suivant la présente invention, on applique un procédé de dosage du glycérol-3-phosphate (G3P) utili- sant le procédé enzymatique de cyclisation tel qu'indi- qué par la formule (iii) (brevet des Etats-Unis d'Amé- rique 4693971) à du G3P formé par la réaction enzymati- que (ii). L'application de la formule (iii) facilite la mesure rapide de l'activité de la LCATavec facili- té et avec une grande sensibilité en clinique, en dépit des réactions enzymatiques compliquées englobant divers systèmes réactionnels enzymatiques. Les constituants initiaux participant à la réaction enzymatique de cyclisation suivant la formule (iii) sont GPO, GPDH, 02 et NAD réduit. Dans cette réaction enzymatique de cyclisation (iii), GPO consomme 1 molécule de chacun de G3P et de 02 pour donner 1 mo- lécule de chacun de H202 et de DHAP et, en outre, en utilisant ce DHAP comme substrat, GPDH consomme 1 molé- cule de chacun de DHAP et de NAD réduit, pour donner 1 molécule de chacun de G3P et de NAD, ce qui forme un système réactionnel cyclique de G3P-DHAP. Dans la formule (iii), GPO, GPDH, 02 et NAD réduit sont essentiels pour former cette réaction enzy- matique de cyclisation. Mais, en pratique, il suffit du 02 dissous dans le système réactionnel pour ce qui concerne 02' et GPO, GPDH et NAD réduit sont utilisés en excès comme réactifs pour la mesure. Des quantités de GPO et de GPDH à utiliser dans la réaction ne sont pas limitées d'une manière particulière, mais peuvent être déterminées sur la base de la somme des quantités de G3P provenant de la lysolécithine endogène contenue dans l'échantillon et du G3P qu'on estime devoir être produit en fonction de l'activité de la LCAT, en prenant en considération l'équilibre entre les quantité de GPO et de GPDH et celles de G3P. On utilise habituellement GPO en une quantité de 5 à 20 U et, de préférence, de 8 à 15 U, et GPDH en une quantité de 0,3 à 1,8 U et, de préférence de 0,5 à 1,5 U par test d'échantillon, mais on peut utiliser ces enzymes en des quantités su- périeures à celles qui sont mentionnées ci-dessus. On peut utiliser NAD réduit en des quantités supérieures à la valeur de Km du GPDH pour le NAD réduit. On utili- se habituellement le NAD réduit en une quantité bien supérieure à celle du G3P, par exemple en une quantité représentant au moins 50 fois et, de préférence, 100 à 1000 fois la quantité du G3P. On peut utiliser davan- tage de NAD réduit. On peut encore augmenter la sensibilité pour l'activité de la LCAT par une modification, c'est-à- dire augmenter la sensibilité en faisant réagir le NAD réduit sur H202, pour former du NAD. Cette variante est illustrée par la formule (iv) cidessous: O GPO H 0 NADPO 2 2 2 iF (iv) G3 DHAP 2H20 + NAD NAD GPDH NAD réduit dans laquelle on utilise de la NAD+ peroxydase (EC, 1. 11.1.1; dénommée ci-après NADPO) (J. Biol. Chem., 22, 5, 557 (1957)), en combinaison avec une enzyme capable de catalyser une réaction pour consommer 1 molécule de H202 et 1 molécule de NAD réduit dans la réaction enzymatique de cyclisation (iii), jusqu'à production de 2 molécules d'eau (H20) et de 1 molécule de NAD. Dans la réaction enzymatique (iv), on consomme 2 molécules de NAD réduit par cycle, puisque le H202 formé dans la réaction enzymatique de cyclisation (iii) est ensuite consommé en même temps que du NAD réduit pour former du NAD. Ceci signifie que le dosage de la LCAT s'effectue avec une sensibilité plus grande que ce n'est le cas avec la réaction (iii) seule, puis- qu'une quantité de NAD réduit devient deux fois plus grande que ce n'est le cas dans la réaction (iii) seule. On peut utiliser n'importe quel milieu dans les diverses réactions enzymatiques et les réactions enzymatiques de cyclisation décrites cidessus, pour autant qu'il a une gamme de pH dans laquelle les ac- tivités des diverses enzymes sont stables. Habituelle- ment, pour le dosage actuel de la LCAT, le milieu a un pH de 7,0 à 8,5 et, de préférence, de 7,3 à 8,2. Des exemples de la solution-tampon pour le milieu sont une solution-tampon au phosphate, une solution-tampon tris- acide chlorhydrique, une solution-tampon imidazole- acide chlorhydrique, une solution-tampon glutarate de diméthyle-hydroxyde de sodium, une solution-tampon PIPES, une solution-tampon HEPES, etc., dans lequel le pH est ajusté dans la gamme mentionnée ci-dessus. On peut ajouter au milieu des sels métalliques, tels que des sels de calcium et des sels de magnésium qui sont un agent d'activation du LYP et du GPCP. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut ajouter du chlorure de calcium qui est l'un des sels de calcium, en une con- centration de 1 à 10 mM et, de préférence, de 2 à 6 mM. On effectue habituellement l'incubation à une tempéra- ture de 37 C environ. Quand les réactions enzymatiques (i) et (ii) et la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) sont effectuées simultanément, on effectue la réaction pendant au moins 5 minutes et, de préférence, pendant 5 à 10 minutes/pour assurer la rapidité de la mesure. Quand on effectue les réactions enzymatiques (i) et (ii) et la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) successivement, on effectue la réaction enzymatique (i) pendant au moins 10 minutes, et la réaction enzymatique (ii) et la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) pendant au moins 2 minu- tes, respectivement. En outre, quand on effectue la réaction enzymatique (i) avant la réaction enzymatique (ii), et quand on effectue la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) simultanément, on effectue la réaction enzymatique (i) pendant au moins 10 minu- tes, et la réaction enzymatique (ii) et une réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) pendant au moins 2 minutes. Quand les réactions décrites ci-dessus sont terminées, on mesure quantitativement la variation de quantité ou la variation de taux due à la réaction. Les paramètres décelables de variation de quantité sont ceux qui sont consommés ou produits dans le rap- port de 1 mole ou dans le rapport de 2 moles en un seul cycle de la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv), un rapport de 1 mole de G3P ou de DHAP étant formé ou consommé. Ce sont le 02 consommé, le NAD réduit consommé, ou le H202 produit. On mesure le 02 consommé à titre de quantité de changement électrochimique en utilisant une électrode à l'oxygène. On calcule le NAD réduit consommé par la différence entre la quantité de NAD réduit utilisée avant la réaction et celle restant après la réaction. Le NAD réduit restant après la réaction, ou utilisé avant la réaction, est mesuré par divers procédés connus. L'un d'entre eux est l'absorptiométrie, non sur la base de l'absorbance spécifique du NAD présent, mais sur celle du NAD réduit. Le maximum d'absorption spécifique pour la mesure du NAD réduit est au voisi- nage de 320 à 360 nm et, de préférence, de 340 nm. On mesure la quantité de NAD réduite restante en utili- sant cette longueur d'onde. Un autre procédé de mesure du NAD réduit est la colorimétrie en utilisant un chro- mogène de transport d'électron ayant un accepteur d'électron du NAD réduit. Des exemples de chromogènes de transport d'électron sont des sels de tétrazolium et le 2,6-dichlorophénolindophénol, de préférence une association d'un sel de tétrazolium soluble dans l'eau et de diaphorase ou de phénazine méthosulfate. Le chromogène de transport d'électron se colore sous l'effet d'un atome d'hydrogène du NAD réduit. On obser- ve la couleur Formazan produite par chlorimétrie à l'absorption maximale telle que 500 à 550 nm. Un autre procédé pour le NAD réduit est la fluorométrie dans laquelle on applique la diaphorase en la présence d'un agent fluorescent tel que la résazuline. En particu- lier, quand on effectue la réaction enzymatique (iv), on préfère la mesure du NAD réduit en tant que dosage deux fois plus sensible pour la LCAT, puisqu'une varia- tion du NAD réduit transformé est deux fois plus grande que celle de la réaction enzymatique de cyclisa- tion (iii) seule. La mesure du H202, qui est un cons- tituant engendré, repose sur le changement électrochi- mique en utilisant une électrode au peroxyde d'hydro- gène ou sur un produit formé par une composition indi- catrice qui réagit sur H202. Des exemples d'indicateurs sont un indicateur coloré qui provoque un changement de coloration dans le domaine visible, un réactif fluorescent qui devient fluorescent sous l'effet d'une lumière d'excitation, ou un réactif luminescent dont le changement peut être détecté par des moyens spectro- photométriques. 26 1 2527 Des paramètres de taux de changement qui sont décelables et qui sont dus à la réaction enzymatique de cyclisation (iii) ou (iv) sont le taux de diminu- tion du 02 consommé par la réaction, le taux de dimi- nution du NAD réduit consommé et le taux d'augmenta- tion de H202 engendré par la réaction. Le taux de va- riation est proportionnel à la quantité d'un substrat quand la réaction enzymatique de cyclisation atteint l'état stationnaire en une courte durée. On dose la LCAT d'un échantillon en mesurant la variation de taux avant et après la réaction de la LCAT, par exemple le taux de diminution du NAD réduit avant et après la réaction à 340 nm, en utilisant un spectrophotomètre, le taux de diminution de 02 en utilisant une électrode à oxygène ou le taux d'augmentation de H202 en uti- lisant une électrode au peroxyde d'hydrogène. On effectue le dosage pratique de la LCAT de la manière suivante. On subdivise, par exemple, un échantillon de sérum sanguin ou de plasma sanguin et on le verse dans deux tubes à essai. Dans l'un des tubes, on ajoute un inhibiteur de la LCAT, par exem- ple de l'acide cholique, ou au moins 1 % de Triton-X- (marque de fabrique: fabriquée par Sigma Co.), on y ajoute une quantité donnée de cholestérol ester hydrolase et on refroidit le tube par de la glace (A). Dans un autre tube à essai, on ajoute une quanti- té donnée de cholestérol ester hydrolase, on fait in- cuber le tube à 37 C pendant une durée donnée, habi- tuellement supérieure à 10 minutes et, de préférence, comprise entre 10 et 20 minutes et on ajoute un inhi- biteur de la LCAT pour arrêter la réaction enzymatique basée sur l'activité de la LCAT (B). Puis on prélève respectivement des tubes des quantités données des solutions d'échantillonsauxquelles on ajoute un agent de dosage de la LCAT, contenant respectivement du NAD réduit, LYP, GPCP, GPO et GPDH. On mesure par spec- trophotométrie, à 37 C et à 340 nm, le taux de diminu- tion du NAD réduit ou on mesure le taux d'augmentation du H202 en utilisant une électrode au peroxyde d'hydro- gène. De la même manière que ci-dessus, après avoir ajouté une quantité donnée de solution de G3P d'une concentration connue (solution de référence) à l'agent de dosage de la LCAT, on mesure le taux de diminution du NAD réduit ou le taux d'augmentation du H202 (Rc). On calcule l'activité de la LCAT à partir de ces valeurs par l'équation suivante: RB RA 1 U = xS x T x f CRC dans laquelle: U:activité de la LCAT (n mole/ml.h)), RA:taux de diminution du NAD réduit (ou taux d'aug- mentation de H202) dans l'échantillon du tube à essai A, RB: taux de diminution de NAD réduit (ou taux d'aug- mentation de H202) dans l'échantillon du tube à essai B, RC: taux de diminution du NAD réduit (ou taux d'aug- mentation de H202) dans la solution de référence, S:concentration de la solution de référence (n mole/ ml), T:durée d'incubation avant l'addition d'un inhibi- teur de l'activité de la LCAT dans le tube à essai B (h), et f:valeur de correction due à la différence du degré de dilution entre la solution de l'échantillon et la solution de référence. Il faut habituellement, pour le dosage de la LCAT, suivant l'invention,. un échantillon de 2 à 30 l1 et, de préférence, de 4 à 16 pl. La sensibilité du dosage doit être déterminée en fonction de l'équilibre entre une quantité de lysolécithine endogène (comme exemple pratique, RA/RC x S x f) et une activité de la LCAT [(R-RA)/RC x S x f]. Le taux normal de la lyso- lécithine n'a pas été déterminé cliniquement. Suivant l'invention, quand on utilise environ 5 pl d'échantil- lon, on obtient une sensibilité suffisante pour une durée d'incubation (T) de 15 minutes. On améliore la sensibilité quand on se rend maître du taux de cycli- sation de la réaction enzymatique de cyclisation (i) * en réglant la quantité de GPO et de GPDH. Quand on effectue un dosage de la LCAT par le procédé décrit ci-dessus, on considère qu'une erreur est provoquée par la présence possible d'une phospho- lipase A2 active (EC, 3.1.1.4; désignée ci-après par PLPA2) qui est une enzyme produisant de la lysoléci- thine et un acide gras libre par réaction sur la léci- thine et l'eau de l'échantillon. Mais un effet faible a été observé dans le dosage de la LCAT sur plus de dix échantillons. Lors du traitement de la solution d'essai dans le tube à essai (A), on peut doser l'acti- vité de la LCAT quelle que soit la quantité de PLPA2 active qui existe éventuellement dans l'échantillon à doser en ajoutant une quantité donnée d'un inhibiteur de LCAT;en ajoutant correctement une quantité donnée de cholestérol ester hydrolase, en faisant incuber à 37 C pendant une durée donnée, puis en refroidissant par de la glace. Il s'ensuit que le procédé de dosage de la LCAT peut être remplacé correctement par ce pro- cédé. Quand on effectue le dosage de LCAT en effectuant la réaction enzymatique (i), (ii) et (iii) simultané- ment, on ajoute un constituant qui inhibe seulement l'activité de la PLPA2, mais non celle des autres enzymes. L'invention fournit donc un nouveau procédé de dosage de la LCAT et vise également une composition pour le dosage de la LCAT qui contient LYP, GPCP, GPO, GPDH et NAD réduit, qui sont des constituants essentiels pour le nouveau procédé de dosage. L'invention permet d'effectuer un dosage simple et rapide de la LCAT pour des diagnostics cliniques. A la composition suivant l'invention, on peut ajouter divers solvants mentionnés ci-dessus, à propos du procédé de dosage. Les enzymes LPY, GPCP, GPO et GPDH et le substrat,.le NAD réduit, peuvent être four- nis tous ensemble ou séparément avant ou après une lyophilisation par unprocédé connu de manière qu'il puisse être utilisé par dissolution ou dispersion dans une quantité correcte prescrite d'un solvant pour la mesure. L'invention sera décrite ci-après en se réfé- rant aux exemples, mais il va de soi qu'elle n ' est pas limitée à ceux-ci. En se reportant aux dessins annexés, la figure 1 représente les courbes de variation des activités de la LCAT en fonction de la durée d'incubation d'un sérum sanguin suivant l'addition de la cholestérol estérase, et la figure 2 représente une courbe d'éta- lonnage. Exemple 1 (1) Préparation du réactif pour le dosage de la LCAT. Lysophospholipase; [(LYP); Toyo Jozo Co., Ltd., provenant du genre Vibrio], 10 unités, glycéro- phosphocholine phosphodiestérase [(GPCP); Toyo Jozo Co., ltd.; provenant d'un microorganisme, Toyo Jozo Bulletin No T-33], 10 unités, glycérophosphate oxydase [(GPO); Toyo Jozo Co., Ltd.; provenant d'Aerococcus], unités, et glycérophosphate déhydrogénase [(GPDH); Boehringer Mannheim AG; provenant de muscles de lapin], 2 6 1 2527 68 unités, sont dissous dans une solution-tampon (pH 8,0) de 40 mM d'HEPES contenant 5 mM de chlorure de calcium et 0,25 mM de NAD réduit (NADH) pour obtenir ml d'une solution. (2) Dosage de la LCAT. On utilise quatre échantillons de sérum. On verse 0,1 ml de l'échantillon respectivement dans deux tubes à essai, de la cholestérol estérase [(CHE); Toyo Jozo Co. Ltd., provenant de Pseudomonas], 1,4 uni- tés, ou une lipase [(LP); Toyo Jozo Co., Ltd., prove- nant de Chromobacterium], 5 unités ayant été ajoutée à l'un d'entre eux. On refroidit les deux tubes par de la glace. On ajoute chaque 5 l1 de l'échantillon à 1 ml du réactif pour le dosage de la LCAT et, après incubation à 37 C pendant 5 à 6 minutes, on mesure la variation d'absorbance à 340 nm. On fait incuber les deux tubes à 37 C pendant 15 minutes et on leur ajoute 1l de Triton X-100, pour arrêter la réaction de la LCAT. Puis on ajoute 5 pil de chacun des échantillons à 1 ml de l'agent pour le dosage de la LCAT, et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 5 à 6 minutes, et on mesure la variation d'absorbance à 340 nm. En outre, on effectue la mesure de la même manière que ci-dessus pour 5 p1 de glycérol-3-phosphate à 200 pM. On calcule les valeurs du dosage de la LCAT en utilisant la formule de calcul décrite ci-dessus. Pour chaque échantillon, l'addition de cholestérol ester hydrolase donne une ac- tivité de 2 à 3,5 fois plus grande que celle que l'on obtient sans l'enzyme. Les résultats sont indiqués au tableau 1. Suivant l'invention, bien que l'addition de cholestérol ester hydrolase soit donnée à titre d'exem- ple, le cas o on n'a pas ajouté d'enzyme a donné éga- lement une valeur satisfaisante. Tableau 1 Valeur de dosage de la LCAT (n mole/(ml.h)) Pas Addition Addition d'addition de CHE de LP Sérum 1 58 202 Sérum 2 112 220 Sérum 3 84 258 - Sérum 4 34 102 102 Exemple 2 (1) Préparation du réactif pour le dosage de la LCAT. De la lysophospholipase (la même que ci-dessus), unités, de la glycérophosphocholine phosphodiestérase (la même que ci-dessus), 10 unités, de la glycérophosphate oxydase (la même que ci-dessus), 160 unités et de la glycérophosphate déhydrogénase (la même que ci-dessus), 68 unités sont dissoutes dans une solution-tampon (pH 8,0) de 40 mM d'HEPES contenant 5 mM de chlorure de calcium et 0,25 mM de NAD réduit (NADH), pour obtenir ml d'une solution. (2) Dosage de la LCAT. On en verse respectivement 0,1 ml d'un échantillon dans trois tubes. A chaque tube, on ajoute de la cholestérol estérase en une quantité respectivement de 1,4 unité, 14 unités et 70 unités par ml. On fait incuber les tubes respectifs à 37 C pendant une durée convenable, puis on y ajoute 5 i1 de Triton X-100 à % pour arrêter la réaction de la LCAT. A chaque Pl du mélange ayant réagi, on ajoute 1 ml du réactif pour le dosage de la LCAT et, après incubation à 37 C pendant 5 à 6 minutes, on mesure la variation d'absor- bance à 340 nm. On effectue en outre la même mesure sur un échantillon de 5 4l de glycérol-3-phosphate à pM. On calcule les valeurs du dosage de la LCAT en fonction du temps, en utilisant la même formule de calcul que ci-dessus. Les résultats obtenus sont indi- qués à la figure 1, dans laquelle la durée d'incubation du sérum est portée en abscisses et l'activité de la LCAT en ordonnées; -o- -C- et -Lcorrespondent à 1,4 U/ml, 14 U/ml et 70 U/ml de cholestérol estérase respectivement et -e- correspond à du sérum seulement. Les courbes montrent que l'activité de la LCAT dépend d'autant moins de la cholestérol estérase que la durée de réaction est plus longue. Ceci peut être dû à la dé- composition de la lipoprotéine de grande densité dont la structure est indispensable pour la réaction de la LCAT. Mais on n'observe pratiquement pas d'influence pour une durée de mesure inférieure à 20 minutes, cette durée étant préférée pour le dosage de la LCAT suivant l'invention. Les résultats de l'exemple 1 montre que l'addition de cholestérol ester hydrolase a une in- fluence remarquable sur le système de dosage de la LCAT, avec possibilité d'effectuer une mesure en peu de temps et d'une grande précision. Exemple 3 (1) Préparation du réactif pour le dosage de la LCAT. De la lysophospholipase (la même que ci-des- sus), 5 unités, de la glycérophosphocholine phospho- diestérase (la même que ci-dessus), 5 unités, de la glycérophosphate oxydase (la même que ci-dessus), 150 unités et de la glycérophosphate déhydrogénase (la même que ci-dessus, 34 unités, sont dissoutes dans une solution-tampon (pH 8,0) de 40 mM d'HEPES contenant mM de chlorure de calcium, 0,25 mM de NAD réduit (NADH) et 0,1 % de Triton X-100 pour former 10 ml d'une solution. (2) Dosage de l'activité de la LCAT. On dose quatre échantillons. On verse 0,1 ml de chacun des échantillons dans deux tubes à essai. A l'un d'entre eux, on ajoute 5 pl de Triton X100 à 10 % et 0,2 unité de cholestérol estérase (la même que ci-dessus), puis on refroidit le mélange par de la glace. A l'autre tube, on ajoute 0,2 unité de cho- lestérol estérase (la même que ci-dessus). On fait in- cuber les tubes à 37 C pendant 15 minutes, puis on ajoute 5 pl de Triton X-100 à 10 % pour arrêter la réaction de la LCAT. Ensuite, à chaque 5 pl du mélange, on ajoute 1 ml du réactif dedosage de la LCAT et, après incubation à 37 C pendant 5 à 6 minutes, on me- sure la variation d'absorbance à 340 nm. On applique un dosage similaire à un échantillon (5 p1) de glycé- rol-3-phosphate à 200 pM. Puis on calcule les activi- tés de la LCAT sur la base de la formule de calcul ci- dessus. Les résultats sont indiqués au tableau 2. Tableau 2 Valeur de dosage de la LCAT (n mole/(ml.h) Sérum 1 204 |Sérum 2 220 Sérum 3 258 Sérum 4 102 On prépare en outre des échantillons en diluant le sérum sanguin 2, en les rapports 4/5, 3/5, 2/5 et 1/5 respectivement. On mesure l'activité de la LCAT de chacun des échantillons dilués et on prépare une cour- be d'étalonnage. Elle présente une bonne linéarité, comme le montre la figure 2 (les taux de sérum conte- nu dans chaque échantillon étant portés en abscisses et l'activité de la LCAT en ordonnées). Exemple 4 (1) Préparation du réactif pour le dosage de la LCAT. Réactif 1: De la lysophospholipase (la même que ci-dessus), 5 unités, de la glycérophosphocholine phosphodiestérase (la même que ci-dessus), 5 unités, et de la glycérophosphate déhydrogénase (la même que ci-dessus), 8,5 unités sont ajoutées à une solution- tampon (pH 8,0) de 50 mM d'HEPES contenant 5 mM de chlorure de calcium, 0, 25 mM de NAD réduit (NADH) et 0,1 % de Triton X-100, pour obtenir 5 ml d'une solution. Réactif 2: De la glycérophosphate oxydase (la même que ci-dessus), 160 unités, est ajoutée à une solution-tampon (pH 8,0) de 50 mM d'HEPES, pour obtenir 1 ml d'une solution. Réactif 3: Solution de dodécylsulfate de so- dium à 1,5 %. (2) Dosage de la LCAT. On utilise deux échantillons de sérum. On place 0,05 ml des échantillons, respectivement dans deux tu- bes à essai. A l'un des tubes, on ajoute 5 1l de Triton X-100 à 10 %, puis 0,5 unité de cholestérol estérase (la même que ci-dessus) et on refroidit le mélange par de la glace. A l'autre tube, on ajoute 0,5 unité de cholestérol estérase (la même que ci-dessus). On fait incuber les tubes à 37 C pendant 15 minutes, puis on y ajoute 5 p1 de Triton X-100 à 10 % pour arrêter la réaction de LCAT. A chaque 5 pil de l'échantillon préle- vé des tubes respectifs, on ajoute 0,5 ml du réactif 1 préalablement chauffé et, après avoir chauffé le mélange à 37 C pendant 5 minutes, on ajoute 0,05 ml du réactif 2. Apres avoir encore chauffé à 37 C pen- dant 5 minutes, on ajoute 0,5 ml du réactif 3 au mé- lange pour arrêter la réaction enzymatique de cycli- sation. On prélève 0,01 ml de l'échantillon du mélange réactionnel. Après y avoir ajouté le réactif 2, on mesure l'augmentation de quantité de peroxyde d'hydro- gène en continu pendant 5 minutes en utilisant des électrodes au peroxyde d'hydrogène. On effectue le même essai sur un échantillon de 5 pi d'une solution de glycérol-3-phosphate (200 pM). On calcule les va- leurs des activités de la LCAT des échantillons en utilisant la formule de calcul ci-dessus. Les résul- tats obtenus sont indiqués au tableau 3. 'Tableau 3 Valeur de dosage de la LCAT (n mole/(ml.h) |Sérum 5 108 Sérum 6 232 Exemple-te oin 1 (1) Préparation du réactif pour mesurer la lysolécithine. De la lysophospholipase (la même que ci-dessus, unités), de la glycérophosphocholine phosphodiesté- rase (la même que ci-dessus), 10 unités, de la glycéro- phosphate oxydase (la même que ci-dessus), 160 unités et de la glycérophosphate déhydrogénase (la même que ci-dessus), 68 unités, sont dissoutes dans une solution- tampon (pH 8,0) de 40 mI d'HEPES contenant 5 mM de chlorure de calcium et 0,25 mM de NAD réduit (NADH), pour obtenir 20 ml d'une solution. (2) dosage de la lysolécithine. On utilise trois échantillons de sérum. Dans un tube à essai, on place 0, 1 ml de sérum, puis on ajoute 5 p1 de Triton X-100 à 10 % pour arrêter la réaction de LCAT. Puis on ajoute 1,4 unités de choles- térol estérase (la même que ci-dessus) et on fait incu- ber le tube à 37 C. Lorsque la durée de réaction est achevée, on prélève 5 vl de l'échantillon des tubes respectifs et on les ajoute à 1 ml du réactif pour le dosage de la lysolécithine. On fait incuber l'échantil- lon à 37 C. 5 à 6 minutes après, on mesure la varia- tion d'absorbance à 340 nm pour déterminer une quanti- té de lysolécithine. Les résultats obtenus sont indi- qués au tableau 4. Tableau 4 Durée Quantité de lysolécithine (l mole/l) d'incubation du sérum Sérum 7 Sérum 8 Sérum 9 O mn 235 212 180 15 mn 234 214 181 mn 237 212 178 mn 230 213 180 L'exemple-témoin ci-dessus montre que l'on n'observe pas d'augmentation de la lysolécithine prove- nant de la phospholipase A2 active. Comme décrit ci-dessus, suivant l'invention, on effectue un dosage de la lécithine-cholestérol acyltransférase d'une manière sensible, rapide et aisée, de sorte que le procédé peut s'appliquer à des examens pratiques en clinique. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de la lécithine-cholesté- rol acyltransférase dans un échantillon à doser, carac- térisé en ce qu'il consiste à mettre l'échantillon contenant l'acyltransférase en contact avec une léci- thine et du cholestérol libre comme substrat, dans le- quel l'acyltransférase joue le rôle d'un catalyseur jusqu'à production de lysolécithine et d'ester de cholestérol, à faire réagir la lysolécithine produite sur de la lysophospholipase et de la glycérophospho- choline phosphodiestérase pour produire du glycérol- 3-phosphate (G3P), et à doser le G3P simultanément ou successivement en utilisant un procédé enzymatique de cyclisation. 2. Procédé de dosage suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer le dosage du G3P en faisant en sorte que de la glycéro- phosphate oxydase (GPO), de la glycérophosphate déhy- drogénase (GPDH), du nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NAD réduit) et 02 soient présents dans l'échan- tillon pour former une réaction de cyclisation (i) telle que ci-dessous: 2 GPO H 02 _ _ _ _ _ _ G3P. " DHAP (i) NAD G PH NAD réduit dans laquelle le glycérol-3-phosphate (G3P), le di- hydroxyacétone-3-phosphate (DHAP), le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), le NAD réduit, l'oxygène (02), le peroxyde d'hydrogène (H202), GPO et GPDH prennent part à la réaction de cyclisation, et à do- ser toute variation décelable de quantité ou de taux due à ladite réaction. 3. Procédé de dosage suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste à opérer, dans la réaction de cyclisation (i), en présence de NADK per- oxydase qui catalyse une réaction donnant 2 moles de H20 et 1 mole de NAD à partir de 1 mole de H202 et de 1 mole de NAD réduit, puis à doser toute variation de quantité ou de taux due à la réaction. 15.4. Procédé de dosage suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la variation décelable de quan- tité ou de taux est une quantité de 02 consommée ou un taux de diminution de 02. 5. Procédé de dosage suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la variation décelable de quantité ou de taux est une quantité de H202 engendrée ou le taux d'augmentation de H202. 6. Procédé de dosage suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le changement de quantité ou de tauxestle taux de consommation du NAD réduit ou le taux de diminution du NAD réduit. 7. Procédé de dosage suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer, en présence de cholestérol ester hydrolase, la réaction enzymatique de production de lysolécithine et d'ester de cholestérol à partir de lécithine et de cholestérol libre comme substrat, dans lequel la lécithine-choles- térol acyltransférase joue le rôle d'un catalyseur. 8. Composition de dosage de la lécithine- cholestérol acyltransférase, caractérisée en ce qu'elle comprend de la lysophospholipase, de la glycê- rophosphocholine phosphodiestérase, de la glycérophos- phate oxydase, de la glycérophosphate déhydrogénase et du NAD réduit.