Brevet FR2617485A1 — publié le 19890106

La présente invention a pour objet une méthode de marquage fluorescent d'un sucre ou d'une chaîne glucidique et, en particulier, une méthode de marquage fluorescent quantitatif de l'extrémité réductrice d'un sucre ou d'une chaîne glucidique, de manière à permettre son analyse avec une haute sensibilité de l'ordre des picomoles, ou bien même supérieure. Ces dernières années, la relation entre les activités physiologiques de sucres conjugués et les structures de leurs chaines glucidiques a fait l'objet d'études et, en outre, des différences concernant la structure et la fonction des chaines glucidiques entre des glycoprotéines, produites par l'utilisation de la tech- nologie de manipulation des gènes, et des glycoprotéines naturelles ont également fait l'objet d'études. A ces fins, entre autres, il est devenu nécessaire d'effectuer l'analyse des structures de sucres ou de chaînes glucidi- ques. Cependant, les organismes vivants produisent habituellement seulement une petite quantité de cette substance et, en conséquence, seule une quantité faible d'échantillons peut être obtenue à partir de ces organismes afin d'être testée. En conséquence, une méthode analytique extrêmement sensible est requise. Comme méthodes d'analyse de traces de chaines glucidiques qui sont couramment utilisées, on peut citer celles dans lesquelles un marqueur [3H] est introduit au moment de la transformation de l'extrémité réductrice en alcool dérivé de sucre et sa radio-activité est utilisée pour les mesures (C. J. Liang, K. Yamashita, C. G. Muellenberg, H. Shichi, et A. Kobata, J. Biol. Chem., 254, 6414 (1979), et S. Takasaki, T. Mizuochi, et A. Kobata, Methods in Enzymology, 83, 263 (1982)). La sensibilité de détection est de l'ordre des picomoles, ce qui est satisfaisant, mais, l'analyse faisant intervenir l'utilisa- tion d'une substance radio-active, il existe des limita- tions à l'utilisation de la méthode. Pour cette raison, une méthode de marquage fluorescent utilisant un groupe pyridylamino a été mise au point (S. Hase, T. Ibuki et T. Ikenaka, E. Biochem., 95, 197-203 (1984), méthode désignée ci-après sous le nom de "méthode classique". Dans cette méthode classique, un groupe pyridylamino est introduit à l'extrémité réductrice d'un sucre ou d'une chaîne glucidi- que par utilisation d'acide chlorhydrique pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduite par l'utilisation d'un composé non volatil renfermant du bore. Puis l'échan- tillon est irradié avec une longueur d'onde d'excitation de 320 nm, et la fluorescence à 400 nm est détectée. La sensibilité est également de l'ordre des picomoles. Si la méthode ci-dessus est utilisée, l'analyse peut être effectuée facilement par l'utilisation de la chromatographie en phase liquide sous haute pression (CLHP), qui constitue un des modes opératoires les plus utiles dans le domaine de la micro-analyse, et la sen- sibilité est égale ou supérieure à celle atteinte avec la méthode qui comprend l'utilisation d'une substance radio- active. Cependant, avec la méthode classique décrite ci-dessus, le rendement en la substance désirée à partir de la réaction, par rapport à la quantité du sucre ou de la chaîne glucidique de départ, est faible, à savoir de 75 à %, ce rendement n'étant pas quantitatif. En outre, le rendement de la réaction dans la méthode classique telle qu'elle est appliquée à un cétose est seulement égal à environ 10%, ce qui est extrêmement insatisfaisant. En outre, avec la méthode classique, un large excès de 2- aminopyridine par rapport au sucre ou à la chaîne glucidi- que de départ doit être utilisé pour accroître le rendement en base de Schiff et un large excès de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) doit également être utilisé comme agent réducteur. En conséquence, lorsque le sucre ou la chaîne glucidique qui a été marqué par fluorescence doit être analysé, l'excès de 2-aminopyridine et de NaBH3CN doit être éliminé par chromatographie sur colonne, ce qui nécessite du temps et de l'habileté, et diminue également la sensibilité de l'analyse. En conservant présentes & l'esprit ces circonstances, l'objectif de la présente invention consiste & proposer une méthode de marquage fluorescent dans laquelle le rendement de la réaction pour le marquage fluorescent est amélioré, tandis que le mode opératoire est simplifié, méthode qui permet la micro- analyse d'un sucre ou d'une chaîne glucidique à l'état de trace avec une sensibilité supérieure à celle des méthodes précédentes. Pour résumer, la présente invention a pour objet une méthode de marquage fluorescent d'un sucre ou d'une chaîne glucidique, dans laquelle est utilisé, comme ion complémentaire, un acide pratiquement dépourvu d'eau, dans la réaction de marquage fluorescent à l'extrémité réductrice d'un sucre ou d'une chaîne glucidique avec une substance fluorescente ayant au moins un groupe amino. Les sucres auxquels la présente invention peut être appliquée sont, par exemple, des monosaccharides, des oligosaccharides, des polysaccharides et des sucres conjugués tels que des glycoprotéines ou des glycolipides. Comme procédés permettant de cliver les chaînes glucidiques de sucres conjugués tels que des glycoprotéines ou des glycolipides, on peut citer des procédés bien connus tels que l'hydrazinolyse-N-acétylation, la trifluoracétolyse, le traitement par une substance alcaline, la digestion enzymatique (endoglycosidase, glycopeptidase, etc.). Il a été trouvé que, lorsque de l'acide chlorhydrique qui a été utilisé dans l'étape de la réaction pour former une base de Schiff dans la méthode classique, c'est-à-dire dans l'étape de la réaction pour l'introduc- tion du marqueur fluorescent, est remplacé par un acide e617485 pratiquement dépourvu d'eau, par exemple un acide inorgani- que qui est pratiquement anhydre (comprenant un acide inorganique dissous dans un solvant organique, par exemple l'acide fluorhydrique dissous dans la pyridine) ou un acide organique (par exemple l'acide acétique, l'acide tri- fluoracétique (ATF)), un résultatIbien meilleur peut être obtenu. Ainsi, par exemple, un sucre ou une chaîne glucidique est amené à réagir avec un excès d'une substance fluorescente ayant au moins un groupe amino (par exemple la 2-aminopyridine, la 2-aminoquinoléine, la 2,3-diaminopy- ridine) dans un acide qui est pratiquement dépourvu d'eau. Parmi les acides énumérés ci-dessus, l'acide acétique est préférable mais d'autres acides qui ne contiennent pas d'eau (par exemple le ATF) peuvent également être utilisés. Les conditions réactionnelles classiques sont une température allant de la température ambiante à 100'C et un temps de réaction allant de plusieurs minutes à une heure. De préférence, la température est égale à environ 90'C et le temps de réaction est égal à environ 15 minutes. Dans cette réaction, des bases de Schiff sont produites quantitativement et le milieu réactionnel résultant peut être purifié par concentration et déshydratation sous pression réduite et par traitement azéotrope. Pour la réduction de ladite base de Schiff, qui est par elle-même connue, il est possible d'utiliser des agents réducteurs usuels pour les bases de Schiff, mais des complexes de borane conviennent particulièrement. Les types usuels de complexes de borane peuvent être utilisés mais, eu égard aux étapes ultérieures, un complexe de borane qui est volatil est préféré, complexe dont on peut citer les exemples suivants: complexe boranepyridine, complexe borane-triéthylamine et complexe borane-diméthylamine. La substance fluorescente qui a été utilisée pour former la base de Schiff et l'acide qui est pratiquement dépourvu d'eau peuvent être ajoutés à ce milieu réactionnel réducteur. Les conditions classiques pour la réaction de réduction sont une température allant de la température ambiante à 100-C et un temps de réaction de 1 heure à 10 heures; de préférence, la température est égale à environ -C et le temps de réaction est'égal à environ 1 heure. Après réaction, les impuretés peuvent être éliminées par concentration du mélange réactionnel sous pression réduite et par traitement azéotrope. Puis le mélange est dissous dans un solvant approprié et soumis à une analyse par CLHP. Conformément à la méthode de la présente invention, le rendement de la réaction pour le marquage fluorescent est quantitatif, même pour un aldose (y compris des sucres aminés) et un cétose, et lorsqu'un réactif volatil est utilisé, il peut être éliminé facilement. La présente invention est expliquée concrète- ment au moyen des exemples suivants et en se référant partiellement aux dessins annexés sur lesquels la figure 1 et la figure 2 présentent respectivement les résultats d'analyse par chromatographie CLHP de la N-acétylglu- cosamine et du fructose, qui ont été tous deux soumis à un marquage fluorescent, et la figure 3 présente le résultat d'analyse par chromatographie sur colonne avec inversion de phase de la fétuine marquée par fluorescence. Les exemples sont proposes seulement à titre d'illustration et en aucune manière à titre limitatif du cadre de la présente invention. À 1 Mkarauae fluorescent de la N-acétvlylolucosamine , 11,06 mg de Nacétylglucosamine (recristallisée dans le méthanol; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ont été dissous dans 100 ml d'eau. Puis une portion de 2 ml de solution (qui contenait 1 nmole de N-acétylglucosamine) a été introduite dans un tube à essai et a été lyophilisée pour éliminer l'eau. 10 Ml d'agent de pyridylamination (solution 23 M de 2-aminopyridine dans l'acide acétique) ont été introduits dans le tube à essai. Le tube à essai a été fermé et chauffé à 90-C. Au bout de 15 minutes, le tube à essai a été ouvert et les réactifs et l'acide acétique en excès ont été - éliminés par traitement azéotrope en utilisant de la triéthylamine ee par concentration sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans 50 p1 de méthanol et 2 p1 de complexe de borane-pyridine (Aldrich Chemical Co., Inc.) ont été ajoutés et le tube a été bouché. Puis la réaction de réduction a été conduite en maintenant le tube à essai à 90'C pendant 1 heure. Après réaction, le tube a été ouvert et les réactifs et le solvant ont été éliminés par concentration sous pression réduite et par distillation azéotrope. Le résidu a été dissous dans 200 p1 d'eau et 2 M1 de cette solution (correspondant à 10 pmoles) ont été analysés par CLHP par la méthode de H. Takemoto, S. Hase et T. Ikenaka (Anal. Biochem., 145, 245 (198)). La figure i représente le chromatogramme montrant la relation entre le temps d'élution (minutes, en abscisses) et l'intensité de fluorescence (en ordonnées). A ce propos, une colonne Ultrasphere C18 (4,6 x 250 mm, Beckman Instruments, Inc.) a été utilisée, avec un tampon au citrate de sodium 0,025 M (pH 4,0) contenant 0,1% d'acétonitrile comme solvant, et un débit de 0,8 ml/minute. La surface du pic obtenu a été utilisée pour le calcul du rendement du marquage fluores- cent, quiétait égal à 94,1%. EXEMPLE 2 Marauage fluorescent du fructose Tout d'abord, 9,01 mg de fructose (Wako) ont été mesurés et dissous dans 100 ml d'eau. 2 p1 de cette solution (contenant 1 nmole de fructose) ont été introduits dans un tube à essai. Les mêmes modes opératoires que dans l'exemple 1 pour la Nacétylglucosamine ont été répétés et l'analyse a été également effectuée de la même manière. Le résultat de l'analyse est présenté sur la figure 2. Le rendement de la réaction de marquage fluorescent a été obtenu à partir de la surface de ce pic. Le rendement du marquage fluorescent était égal à 92,3%. Analyse des chaînes alucidiques de la fétuine galvcoDro- téine provenant du sérum de veau foetal (1) Séparation des chaînes glucidiques de la fêtuine Par les procédés usuels, 480 Mg (1 nmole) de fétuine (Sigma Chemical Co.) ont été soumis & une hydrazi- nolyse, puis à une N-acétylation de la manière décrite par S. Hase, T. Ikenaka et Y. Natsushima (J. Biochem., 90, 407- 414 (1981>) et par S. Takasaki, T. Mizuochi et A. Kobata (Methods in Enzymol., 83, 263 (1982). Le mélange réaction- nel contenant les chaînes glucidiques et la protéine décomposée a été lyophilisé. Cette substance lyophilisée a été ajoutée avec 45 j1 de méthanol et 5 î1 d'une solution de 2-aminopyridine 5 M à de l'ac4de acétique. On a laissé la solution réagir à 90'C pendant 15 minutes. Puis le solvant a été éliminé par distillation, et la 2-aminopyri- dine n'ayant pas réagi a été éliminée en effectuant à quatre reprises une distillation azéotrope avec de la triéthylamine. 50 p1 de méthanol ont été ajoutés au résidu afin de le dissoudre, puis 2 M1 de complexe boranepyridine (Aldrich) ont été ajoutés. On a bouché le tube à essai et on a laissé la réaction de réduction s'effectuer pendant une heure à 90-C. Apres réaction, le solvant et les réactifs ont été éliminés par distillation azéotrope. Le résidu obtenu a été analysé par une méthode bien connue (S. Hase, K. Okawa et T. Ikenaka, J. Biochem., 91, 735 (1982)) pour la CLHP avec une colonne à inversion de phase (Cosmosil C18 (Nakarai Chemicals, Ltd.), 4,6 x 250 mm). Du tampon & l'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 4,0) a été utilisé comme solvant dans un gradient de 0% à 0,5% de n-butanol, et la séparation a été effectuée, donnant une chaîne glucidique A, qui a été identifiée par analyse enzymatique et analyse instrumentale. La figure 3 montre les résultats d'analyse de cette chromatographie de la même manière que pour la figure 1. D'après le temps d'élution, la chaîne glucidique A a semblé avoir une structure complexe. (2) Analyse de constituant de la" chaîne glucidique A obtenue à partir de la fétuine. La chaîne glucidique A obtenue de la manière présentée ci-dessus dans le paragraphe (1) a été hydrolysée par les deux types de procédés décrits cidessous. Chacun des produits a été soumis à un marquage fluorescent par l'utilisation de 2-aminopyridine, puis a été analysé. (a) Analyse des sucres neutres On a tout d'abord dissous 100 pmoles de chaîne glucidique dans 60 g1 d'une solution aqueuse 4 M de ATF et on a laissé l'hydrolyse s'effectuer pendant 3 heures à C. Le liquide réactionnel a été concentré sous pression réduite et le résidu a été dissous dans 200 p1 d'une solution à 10% de pyridine dans le méthanol. 10 1pl d'acide acétique anhydre ont été ajoutés à ce mélange et ce dernier a été laissé au repos à température ambiante pendant plusieurs minutes. Puis la pression a été abaissée à 133,32 x 10-3 Pa et une concentration à siccité a été effectuée. Le résidu a été dissous dans 45 p1 d'éthanol. On a ajouté à ce dernier 5 M1 de 2-aminopyridine 5 M dans de l'acide acétique et on a laissé le mélange réagir à 90-C pendant 15 minutes. Ce liquide réactionnel a été concentré et déshydraté sous une pression réduite égale à 133,32 x 10-3 Pa, puis la 2-aminopyridine qui n'avait pas réagi a été éliminée par distillation azéotrope à 4 reprises avec de la triéthylamine. Le résidu a été dissous dans 50 p1 de méthanol et 2 1pl de complexe de borane- pyridine ont été ajoutés à cette solution. On a bouché le tube à essai et on a laissé le mélange réagir pendant une heure à 90'C. Puis le liquide réactionnel a été concentré et déshydraté sous une pression réduite égale à 133,32 x 10-3 Pa et une distillation azéotrope a été effectuée & plusieurs reprises. Le résidu obtenu a été analysé par une méthode bien connue (H. Takemoto, S. Hase, et T. Ikenaka, Anal. iochem., 154, 245 (1985)). Les résultats sont présentés sur le tableau 1. (b) Analyse des sucres aminés 1pl de HC1 6 M, 20 p1 de ATF 6 M et 20 11 d'eau ont été tout d'abord ajoutés à 100 pmoles de chaînes glucidiques et le mélange a été hydrolysé pendant 6 heures à 100'C. Les modes opératoires qui ont été ensuite utilisés étaient identiques & ceux du paragraphe (a) ci-dessus. Les résultats sont présentés sur le tableau 1. Le tableau 1 montre également les résultats d'analyse des sucres neutres et des sucres aminés avec une correction des résultats (présentés en moles/mole de chaîne glucidique) par l'utili- sation de rhamnose comme étalon interne. TABIZAU 1 Echantillon Man Gal GlcNAc (A) 2,7 3,2 5,3 Note: Gal: galactose GlcNAc: N-acétylglucosamine Man: mannose D'après les résultats ci-dessus, la structure de la chaîne glucidique (A) intéressante semblait être la suivante, correspondant à la structure de la chaîne glucidique principale de la fétuine. Gal-GlcNAc-Man- \ Man-GlcNAc-GlcNAc-PA Gal-GlcNAc / Nan Gal-GlcNAc/ (PA: groupe pyridylamino) Comme cela a été expliqué en détail ci-dessus, par l'analyse de la présente invention, il est possible de marquer un sucre ou une chaîne glucidique par fluorescence dans une réaction quantitative et, par l'utilisation d'un solvant volatil, le mode opératoire est simplifié, rendant possible d'effectuer une micro-ahalyse d'une trace d'un sucre ou d'une chaîne glucidique. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. RVENDICATIONS 1. Méthode de marquage fluorescent d'un sucre ou d'une chaîne glucidique par la réaction de marquage fluorescent à l'extrémité réductrice d'un sucre ou d'une chaine glucidique avec une substance fluorescente ayant au moins un groupe amino, caractérisée en ce que la réaction est conduite en utilisant, comme ion complémentaire, un acide pratiquement dépourvu d'eau. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide est l'acide acétique anhydre ou l'acide trifluoracétique anhydre. 3. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance fluorescente est la 2- aminopyridine, la 2-aminoquinoléine ou la 2,3-diaminopyri- dine. - 4. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la base de Schiff formée par la réaction de marquage est réduite par l'utilisation d'un complexe de borane volatil. 5. Méthode suivant la revendication 4, caractérisée en ce que le complexe de borane volatil est un complexe de borane-pyridine, un complexe de borane- triéthylamine ou un complexe de borane-diméthylamine.