Brevet FR2618335A1 — publié le 19890127

EXTRAIT DE COCHLSPERKUJ PLANCHONII, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION THERAPEUTIQUE DONAINE DE L'INVENTION La présente invention a trait à un extrait de Cochlospermui planchonfi en tant que produit industriel nouveau. Elle concerne également le procédé de préparation et l'utilisation en thérapeutique de cet extrait, notamunt en tant qu'agent hépato- protecteur particulièrement intéressant dans le traitement des hépatites virales et fulminantes. ART A]TERIEUR On sait que le Cochlospermum planchoni est un arbuste de la famille des cochlospermacées qui a été notamment décrit par F.R. IRVINE dans l'ouvrage "Woody Plants of Ghana", page 72, Oxford University - Press, - London 1961. Il pousse enssentiellement en Afrique de l'Ouest, et en particulier au Ghana. On sait que ses racines ont été utilisées en alimentation et médecine indigène. En tant qu'aliment, les racines qui possèdent une teneur importante en amidon sont préparées bouillies dans de l'eau pour être consommées comme des pommes de terre ou des salsifis. En médecine indigène, on sait que l'on a préconisé un grand nombre d'indications pour les infusions ou tisanes de racines de Cochlospermum planchonii. Parmi ces indications, il convient de rappeler celle concernant d'une manière générale les ictères de toute nature. Or sait egalemeert que les extractions de racines de cochl'osermum rlanchonii avec des solvants non-polaires ont oermi- d'is oer de, 2omDoses qui se sont révéeés inactifs en therapeutique, voir a cet effet le, articles de Ivan ADDAE-M]ENSAH et ai., LiebiEs Arnr. Cher., pages 1284-1287 (1985) et de Hans ACHENBACH. Pure & Appl. Chem., 5 (N'5), pages 653-662 (1986), relatifs a l'isolation de quatre substances dénomméees coch'osúermines A.B. C et D. L'article de H. ACHENBACH précité enseigne que ces substances, en dépit de leur inactivité biologique, présentent un intérêt théorique dans le cadre de l'identification sans dénaturation ni dégradation de chacun des trois groupes alkyle à chaine hydrocarbonée linéaire et longue présents dans chaque molécule desdites cochlospermines. BUT ET ORIGINALITE DE L'INIEITION Suivant l'invention on se propose de préparer un nouvel extrait aqueux de racines de Cochlospermum planchoni, utile en tant qu'agent hépatoprotecteur et différent (i) des extraits inactifs obtenus par extraction avec des solvants non-polaires, et (ii) des infusions et tisanes aqueuses utilisées avec plus ou moins de succès en médecine indigène en tant que moyens anti- ictères. On a en effet observé suivant l'invention que l'obtention des propriétés hépato-protectrices de l'extrait aqueux dépend en particulier de la température d'extraction. Plus précisément, pour faire passer en solution aqueuse une quantité substantielle de l'ingrédient actif hépatoprotecteur, sans altération ou modification essentiellement néfastes visa-vis desdites tr.retes hevato-prote_,trices, il faut operer su iv: a *, conditions opératoires strictes. a savoir notamment sous la o:ess:on atmosphérique (1 atm correspondant approximativemen: a rascals une température d'extraction a l'eau comtrie- darn- a gamme de 56 64' C pendant au mains 15 minutes. es. conditions strictes ne sont pas rencontrées lors de la préparation des infusions et tisanes suivant les techniques usuelles antérieures qui comprennent le chauffage de l'eau jusqu'a l'ébullition puis le traitement des racines de la plante avec une eau ayant une température initiale comprise entre 80 et ' C. Par suite, en médecine indigène l'effet hepato-protecteur bénéfique et spécifique que l'on vient de découvrir suivant l'invention ne pduvait pas se manifester par administration orale 1S desdites infusions et tisanes. Un autre but de l'invention est de proposer une nouvelle solution technique permettant de standardiser la préparation de l'extrait hépatoprotecteur de racines de Cochlospermum planchonii, de façon que ladite préparation soit reproductible ce qui n'était pas le cas en médecine indigène. RESUME DE L'IIVENTION Le procédé que l'on préconise suivant l'invention pour la préparation d'un extrait de racines de Cochlospermum planchonii, utile notamment en tant qu'agent hépato-protecteur, comprend le traitement desdites racines avec de l'eau. Il est caractérisé en ce que l'on extrait avec de l'eau distillée les racines préalablement séchées et broyées de Cochlospermum planchonii. à 2618 3 3 5 une température comprise entre 56' C et 64C so:;j- une pre_=ioL d'environ 10' Fa pendant au moins 0.25 L. De façon pratique ledit procède comprnrd elr etaà- suivantes a) l'on extrait avec de l'eau distillée les racines préalablement séchees et broyées de Cocblospermum planchonii, à une temoérature comprise entre 56' C et 64'C sous une pression d'environ Fa pendant au moins 0,25 h pour écarter l'insoluble et recueillir la solution aqueuse résultante; b) on concentre ladite solution aqueuse sous pression réduite à une température inférieure ou égale à 50'C; puis c) on lyophilise le concentrat ainsi obtenu. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'IIVEITIOI Dans le procédé de l'invention la gamme des températures 56- 64'C sous une pression de 10 Pa environ est critique. Si l'extraction est effectuée à une température inférieure ou égale à 55'C, on ne recueille pratiquement pas l'ingrédient hépato- protecteur présent dans lesdites racines, d'une part, et si l'extraction est réalisée à une température supérieure ou égale à 'C, on observe que l'extrait résultant est pratiquement dépourvu d'activité hépatoprotectrice (ceci impliquant une destruction ou une altération substantielle de l'ingrédient actif hépato-protecteur), d'autre part. Voir à ce sujet les résultats d'essais comparatifs donnés ci-après. De façon avantageube sulvanri I'irinvei.tion. Su ure u resir. de 10' Pa environ. la temDorature d'extration eet.omorise entre e et 62'C et mieux entre 59 et LAC. De façon egale-enit avantageuse suivan: l'inventionr. T traite 50 g de racines séchees et brovées de Cochlospermum planchonhi avec au moins un hitre d'eau. la durée de] 'extraction étant de 0,5 h. Après traitement desdites racines sêóhees et broyées ave- de l'eau distillée & une température de 56 a 64 C (de preéférence a une température de 58 à 62'C et mieux à une température de 59 à !0 61'C), on sépare l'insoluble qui est susceptible d'être épuisé par une ou plusieurs autres extractions à l'eau comme indiqué ci- dessus, d'une part, et la solution aqueuse que l'on recueille, d'autre part. Cette séparation est réalisée selon une méthode connue en soi, notamment par filtration ou centrifugation. Au stade b) on concentre sous pression réduite à une température inférieure ou égale à 50'C la solution aqueuse ainsi recueillie et qui contient l'ingrédient actif hépato-protecteur, dans le cadre d'une extraction unique, ou mieux les solutions aqueuses combinées, dans le cadre d'un épuisement des racines de la plante par des extractions aqueuses successives. Cette concentration est effectuée de façon avantageuse pour obtenir un volume de concentrat aqueux à partir de 4 à 8 volumes d'eau totale utilisée pour l'extraction du stade a), et mieux un volume de concentrat pour 5 à 7 volumes d'eau. La lyophilisation du stade c) est mise en oeuvre de façon classique. On recommande plus particulièrement de congeler le concentrat aqueux obtenu au stade b a une temperature de -45'C à -80'C sous pression réduite puis de sublimer l'eau par apport de chaleur lent pour revenir a la pression normale 4') on lyophilise ledit concentrat aqueux. L'extrait de racines de Cochlospermum planchonli suivant l'invention qui est obtenu grâce au procédé décrit ci-dessus présente dans son spectre UV deux maxima à 210 nm, d'une part, et 265 nm, d'autre part. Cet extrait, qui est de couleur marron, contient des polyphénols et est dépourvu d'alcaloide et de saponine. Il est totalement soluble nans l'eau et parti-i emerit soluble dans le mzthanol et le melanSe acetone-eau (6:4) v/v. D'une manière generaie, on obtient 13 a 23 g de lyophilisat à partir de 100 g de racines sèches. soit un rendement de 13 à 23%. Suivant le meilleur mode de mise en oeuvre décrit ci-dessus ledit rendement est de l'ordre de 20 à 23 Z. On préconise suivant l'invention une composition thérapeutiQue qui est caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, un extrait de racines de Cochlospermum planchonii obtenu selon le [ procédé décrit ci-dessus. Bien entendu dans une telle composition ledit extrait intervient en une quantité pharmaceutiquement efficace. - On préconise enfin l'utilisation de l'extrait de racines de Cochlospermum planchoni suivant l'invention pour l'obtention d'un médicament hépato-protecteur destiné à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des hépatites virales et fulminantes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de préparation et, de résultats d'essais pharmacologiques. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration. Préparation I Obtention d'un extrait lyophilisé de racines de Cochlospermum planchonil (Exemple 1, N' de code: D 86.03) on brove 500 i de racines seches (ayant une teneur en eau dje]'ordre de 5; en boids par rapport au poids desdites ra:ine- de CoLDdlospermul ranchDnii lusou'a ce qu'on obtienne une soudre avarnt une grarnuiometrie de 6 mm environ, notamment au m:vere d'un broyeur à couteaux {par exemple un broyeur commerclalis par la societé dite HENRY). Dans un ballon de 20 iitre. mini d'un agitateur mecanique et eéquipé d'une enceinte chauffante on met en contact les 500 g de poudre de racines séchées avec 10 litres d'eau distillée. On porte le mélange résultant a 60' C et maintient cette température pendant 0,5 h à la pression atmosphérique (environ lO'1 Fa). On recueille la solution aqueuse qui contient l'ingrédient hépatoprotecteur par filtration, notamment par passage dans un séparateur de laboratoire à bol (par exemple un séparateur commercialisé par la société dite VESTFALIA). 2') on traite deux fois l'insoluble, obtenu lors de la filtration précitée, dans les mémes conditions qu'au point 1') ci-dessus, pour obtenir successivement deux nouvelles solutions aqueuses. 3') la fraction aqueuse (3 x 10 litres) constituée par les trois solutions aqueuses combinées et qui a un pH de 5, est concentrée sous pression réduite à une température de 45 C Jusqu'à un volume de 5 litres de concentrat aqueux, notamment au moyen d'un évaporateur rotatif sous vide. 4') on lyophilise ledit concentrat ainsi obtenu par congélation, dans des flacons renfermant chacun 200 ml dudit concentrat à -55'C sous vide puis sublimation de l'eau par apport d- chaleur en revenant lentement a 25'C et a la pression atcsphérique. La durée de lyophilisation est au total de 6 our. rOn obtient ainsi 115 g (rendement: 23 %) d'extrait !voohilise D 86.03. Analyse: - l'extrait D 86.03 ne renferme aucun alcaloide (réaction négative au réactif de Draggendorf). - il ne renferme aucune saponine (réaction négative à l'indice de mousse), - il contient despolyphénols (coloration gris-noir avec FeClT.), et - il présente dans son spectre UV deux maxima (à X= 210 nm et X 265 nm), - l'étude préliminaire de l'extrait D 86.03 indique la présence d'acide gallique et de ses dérivés (notamment glycosides et esters). PREPARATIOIS II et IIlI (Exemples comparatifs A et B) En procédant comme indiqué à la préparation I mais en effectuant l'extraction des racines séchées et broyées avec de l'eau distillée à 55' C (par exemple comparatif A) et à 65'C (exemple comparatif B) on obtient deux extraits lyophilisés pour comparaison. PREPARATIOIS IV et V (Exemples 2 et 3) En procédant comme indiqué à la préparation I mais en effectuant l'extraction des racines séchées et broyées avec de l'eau distillée à 56' C (exemple 2) et a 64' C '(exerme S, on obtient avec: un rendement de 17 % des extraits iycphil'seE similaires à l'extrait D 86,03 de ladite preparation 1. ETUDE DES PROPRIETES HEPATO-PROTECTRICES Comme au cours des essais in vitro l'extrait lyophilise D 86 03 (Ex 1) a présenté un effet protecteur sur les hépatocytes intoxiques par le paracétamol, une étude in vivo a été réalisée avec le paracétamol comme agent d'intoxication. Le mécanisme de l'effet hépatotoxique du paracétamol est bien connu: lorsque les voies de glucurono- et de sulfoconjugaison sont saturées, un métabolite hautement réactif est produit par le système des monooxygénases. Ce métabolite se conjugue au glutathion puis après déplétion de celui-ci se fixe de façon covalente aux macromolécules. Il en résulte des altérations membranaires entraînant la libération des enzymes. La N-acétylcystéine a été choisie comme produit de référence. Cette molécule constitue l'antidote le plus performant lors d'une intoxication par le paracétamol. Son mode d'action exacte n'est pas connu; trois hypothèses ont été émises: augmentation du pouvoir de sulfoconJugaison après métabolisme en sulfate inorganique, action comme nucléophile (sans transformation en glutathion) et réaction avec le métabolite réactif, 25. transformation en L-cystéine et incorporation au pool de gutathion. ll Des souris màles. de souche OF1 Dpeant de 25 a 3 E ont ete mises a jern sur grille 18 h (instant To - le *h) avant l'administration du paracétamol. A l'instant To le paracétamol (en solution a 12 m,/ml dari- du sérum physiologique) a été administré par voie intraperi- tonéale à la-dose de 400 mg/kg. sous un volume de 0,5 ml. A l'instant To on administre également la N-actylcysteirne (en solution à 24 mg/kg dans du. sérum physiologique) par voie intrapéritonéale à la dose de 400 mg/kg, sous un volume de 0,5 ml. L'extrait lyophilisé D 86.03 (exemple I) a été administré par voie intrapéritonéale à la dose de 200 mg/kg à l'instant To -24 h puis à la dose de 200 mg/kg à l'instant To, sous un volume total de 0,5 ml. *Les animaux témoins ont reçu i ml de sérum physiologique par voie intrapéritonéale à l'instant To. Les animaux traités et les animaux témoins ont été sacrifiés à l'instant To + 4 h pour prélèvement du sang (dans des tubes héparinés) et des foies (congelés dans l'azote liquide Juste après le sacrifice). On mesure les valeurs GPT et GOT plasmatiques exprimées en unité internationale par millilitre (UI/l) et la valeur de glutathion hépatique exprimée en nanomoles par gramme (nmole/g). Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau I ci-après. 2 6 18 3 3 5 TABLEAU I TRAITEKENT GPT GOT GLU7ATH10N (nombre (UI/i) (UT/1i HEFATIQUE 'animaux) innole/g) Témoins 52 t 10 204 + 29 5,24 + 0,23 (n=10) Paracétamol 634 + 161 1 510 + 395 1,85 + 0,36 (n =10) Paracétamol 248 + 38 908 + 41 1,84 + 0,18 + N-Acétyl- cystéine (n = 10) Paracétamol 214 + 60 491 + 100 2,31 + 0%35 D 86.03 (n = 10) Notes: PT: L-alanine amino transférase GOT: 2-oxoglutarate amino transférase Les resultats du tableau i montrent clairement que a) l'administration par voie intraperitoneaie d'une dose de 400 mrn'kg de paracétamol entraine une élévation importante des. transaminases 'lasmatlou.s. Cette liberation des transaminases s'accompagne d'une déeDletion de 7lutathion hepatique: et b) dans les conditions de cette etude. l'extrait D 86.03 présente d'après le dosage des transaminases un effet hépato-protecteur supérieur à celui de la N-acétylcysteihe. Cet effet ne s'accompagne apparemment pas d'une régénération du pool du glutathion hépatique. Des essais comparatifs avec les extraits des exemples 1 (D 86.03), 2 et 3 selon l'invention et les extraits A et B des préparations II et III, ont été réalisés suivant le même protocole expérimental en ce qui concerne la détermination des GPT et GOT plasmatiques. Les résultats de ces essais comparatifs consignés dans le tableau II ciaprès montrent que les extractions à 55' C et & 'C ne conduisent pas à l'obtention de l'ingrédient hépato- protecteur. TABLEAU l aFAiTE1ÂENT GOT óram.re d'animau:: Ul/l) ( UI/') Temoinf (n='10 56 + 5 290 + 36 ParacétamDl (n=C-) 680 + 165 I 710 + 370 Paracétamol + Ex 1 (a) 221 + 60, 387 + 58 (n=10) Paracétamol + Ex 2 (b) 325 + 81 451 + 85 (n=10) __ __ ____ _ Paracétamol + Ex 3 (c) 345 + 85 521 + 90 (nu10) Paracétamol + A (d) 650 + 150 1 750 + 380 (n10) Paracétamol + B (e) 585 + 170 1 680 + 350 2618 3 3 5 Ex 1 (D86..O3 avec extraction a 60 C bb, Ex 2 avec extraction à 56 C ( Ex 3 avec extraction à 64' C d: A avec extraction a 55 C B avec extraction a 65' C Au cours des essais cliniques oui ont été entrepris, l'extrait lyophilisé D 86.03 s'est révélé, par administration orale, particulièrement intéressant chez l'homme adulte vis-à- vis des hépatites virales et fulminantes. On a ainsi pu traiter avec le D 86.03 et sauver de façon spectaculaire trois patients atteints d'hépatite fulminante avec coma profond déjà installé depuis 1 à 3 jours au moment du début du traitement. L'administration orale de D 86.03 chez ces malades a été effectuée par sonde naso-gastrique. On rappelle que d'une manière constante l'hépatite fulminante évolue vers un coma profond entraidant presque toujours la mort du sujet. La guérison des cas d'hépatite fulminante met en évidence l'intérêt clinique du D 86.03. Dans l'état actuel des connaissances on pense que l'ingrédient actif hépato-protecteur contenu dans l'extrait suivant l'invention comporte une ou plusieurs substances actives. REVE]DICATIONS Frocéde de préparation d'un extrait de racines de cvch ospermum planchoni, utile notamment en tant qu'azent hépato-protecteur, ledit procédé, qui comprend le traitement desdites racines avec de l'eau, étant caractérisé en ce que l'on extrait avec de l'eau distillée les racines préalablement sechées et broyées de Cochlospermun planchonii, a une température comprise entre 56' C et 64'C sous une pression d'environ 10' Pa pendant au moins 0,25 h. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) l'on extrait avec de l'eau distillée les racines préalablement séchées. et broyées de Cocblospermum plancbonmi, à une température comprise entre 56' C et 64'C sous une pression d'environ l10 Pa pendant au moins 0,25 pour écarter l'insoluble et recueillir la solution aqueuse résultante; b) on concentre ladite solution aqueuse sous pression réduite à une température inférieure ou égale à 50'C; puis c) on lyophilise le concentrat ainsi obtenu. 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que sous une pression de 10D' Pa environ, la température d'extraction est comprise entre 58 et 62'C et mieux entre 59 et 61'C. 4. Procedé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on traite 50 g de racines séchées et broyées de Cochlospermum planchonif avec au moins un litre d'es3. la-duree de l'extraction étant de 0,5 h. 5. Procédé suivant la revendication 2, caractérise en ce cue au stade b) la concentration est effectuee de façon a obtenir un volume de concentrat aqueux à partir de 4 a 8 volumes d'eau totale utilisée pour l'extraction du stade a). 6. Procéde suivant la revendication 5, caracterisé en ce que la concentration est effectuée de façon a obtenir i volume de concentrat aqueux & partir de 5 à 7 volumes d'eau. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1'> on extrait avec 1 litre d'eau distillée 50 g de racines séchées et broyées de Cochblospermum planchonfi, & une température de 59 - 61' C sous une pression d'environ 10V Pa pendant 0,5 h, pour recueillir la solution aqueuse; 2') on extrait deux fois de suite l'insoluble résultant avec de l'eau distillée comme indiqué au stade 1') ci-dessus, puis rassemble les trois solutions aqueuses qui ont été recueillies et constituent la fraction aqueuse., ladite fraction aqueuse ayant un volume d'environ 3 litres; 3') on concentre ladite fraction aqueuse sous pression réduite à une température inférieure ou égale & 50' C Jusqu'à l'obtention d'un volume de 0,5 litre de concentrat aqueux; puis 4') on lyophilise ledit concentrat aqueux. 8. Extrait de racines de Cochlospermum planchonil obtenu suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractéris en ce au'il presents dar: -.nr s.rtre UV aux à a:-,r a 210 nm, d'une part, et 265 nim, d'autre part. 9. Conositiorn therapeutique cara:trisee er; c -J'ee renferme, en associatiorn avec un ex.iplent prsiyoioIveme.; acceptable, un extrait de racines de Coclilospermum pianchonii obtenu selon la revendication 6. 10. Utilisation de l'extrait de racines. de Codh1osreryuj planchonil suivant la revendication 8, caractérise en ce que l'on utilise ledit extrait pour l'obtention d'un médicament hépazo- protecteur destiné à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des hépatites virales et fulminantes.