Brevet FR2621127A1 — publié le 19890331

L'invention concerne généralement des anticorps monoclonaux et leur interaction avec des déterminants antigéniques spécifiques. Cette invention décrit une lignée de cellules hybridomes qui produit un anticorps monoclonal qui se lie spécifiquement au récepteur de surface des cellules lymohoc-ftaires humaines. Plus précisément, l'anticorps mo.--oclonal selon l'invention, se lie à un épitope unique du récepteur de surface des cellules T codé par un gène réarrangeant dit "gamma". Dans ce domaine technique, il est bien connu que le système immunitaire humain comprend des éléments cellulaires et des éléments solubles dans le sang ainsi que différents organes du système réticulo-lymphocytaire. Une substance étrangère, dénommée antigène, pénétrant dans le corps humain, quand elle est identifiée, entraine une réaction ou réponse du système immunitaire. La réaction peut se traduire par une inflammation localisée ou une réaction de phagocytose ou peut résulter en une réaction humorale spécifique ou en une réaction à médiation cellulaire. Ces réactions spécifiques nécessitent l'intervention des lymphocytes pour produire un anticorps contre la substance étrangère, qui peut être par exemple une cellule, un virus ou une bactérie. Les principaux éléments dans la réponse immunitaire sont les cellules T dérivées du thymus et les cellules B dérivées de la moelle osseuse.Les cellules T interagissent avec les cellules B pour créer la formation d'un anticorps contre la substance étrangère, ce qui est, en d'autres termes, une immunité à médiation cellulaire. La réponse immunitaire humorale nécessite uniquement la présence d'un lymphocyte B présensibilisé avec la substance étrangère. Leur interaction entraine la prolifération des cellules B et le début de la synthèse des immunoglobulines ou d'une protéine anticorps contre l'antigène. Les composés cellulaires du sang périphérique circulant comprennent les globules rouges ou érvthrocytes, les globules blancs ou leucocytes et les plaquettes ou thrombocytes. Les leucocytes sont divisés en cinq Grandes populations dénommées : neutrophiles, éosinophiles, basophiles, monocytes et lymphocytes.Les lymphocytes sont de plus subdivisés en cellules T dérivées du thymus et en cellules B dérivées de la moëlle osseuse. Les lymphocytes B et T sont encore divisés en nombreuses sous-populations, telles que les cellules inductrices, les cellules suppressives, les cellules tueuses et c'autres, avec un nombre croissant de sous-populations qui sont identifiées dans des recherches en cours. Les techniques relatives aux anticorps monoclonaux dérivent des travaux de Koehler et Milstein dans : "Nature, 1975, 256, 4a5-497" ; elles ont procuré un grand élan dans la recherche scientifique sur les fonctions des leucocytes et leur implication en physiologie humaine. Des anticorps monoclonaux ont été produits contre des antigènes ou des épitopes de surface des lymphocytes B et T humains dans leurs différentes étapes de développement et de maturation et sont utilisés pour classer des cellules T et B malignes, telles que des cellules B ou T leucémiques ou lymphomateuses.La capacité des anticorps monoclonaux à reconnaStre différentes structures moléculaires de la surface des cellules B ou T fonctionnelles, permet une caractérisation précise à la fois du mécanisme d'activation de cellules T et des sous-populations distinctes de cellules T. De plus, des anticorps monoclonaux qui se lient aux cellules tumorales solides, aux molécules glycoprotéTques de surface des globules rouges, aux sites enflammés de tissus humains infectés par des virus, comme par exemple dans la maladie du SIDA, etc... ont été développés. L'étude efficace des cellules humaines, à la fais normales et anormales, dans leur fonction et leur impact sur le système immunitaire humain, a progressé de façon spectaculaire si bien que des nouveaux anticorps monoclonaux sont développés pour des applications thérapeutiques et des utilisations en diagnostic, à la fois in vitro et in vivo. Dans le brevet américain No. 4 550 086 intitulé "Anticorps monoclonaux reconnaissant des cellules humaines", l'attention est dirigée sur la définition de molécules de surface exprimées sur les lymphocytes T et à'autres cellules, telles que les structures désignées "z", "T4", et "T8". L'anticorps monoclonal désigné "knti-T3 contre T3" était capable de bloquer la capacité de chacun des clones de cellules T fonctionnelles, à reconnaître scn antigène cible. On a ainsi appris que chaque clone différent de cellules T matures a une structure moléculaire protéique unique qui permet à une cellule T de reconnaître son antigène cible.Cependant, ce brevet enseigne que bien que les clones de cellules T peuvent différer quant à "leur structure de reconnaissance", ils apparaissent comme ayant certaines caractéristiques communes. Une caractéristique commune à tous les clones de cellules T est constituée par la présence des glycoprotéines T3 et d'un dimère composé de deux protéines distinctes telles qu'identifiées dans le brevet précité. L'anticorps monoclonal décrit dans le brevet, reconnaît spécifiquement le complexe récepteur de surface des lymphocytes T. L'anticorps monoclonal selon l'invention, reconnaît une sous-population de cellules T périphériques humaines qui représente approximativement 1 à 15: des cellules circulantes sanguines mononuclées, et en moyenne environ 3% de ces lymphocytes. Les lymphocytes de cette sous-population expriment un récepteur de surface des cellules T de la "seconde famille", encodé par des gènes de la classe gamba qui réarrangent spécifiquement dans les cellules T. L'anticorps monoclonal selon l'invention, se lie à un épitope unique d'une molécule glycoprotélque sur la surface des lymphocytes T humains ayant une masse moléculaire d'environ 85 000 daltons, déterminée sous des conditions non réductrices et de 41 000-44 000 daltons, déterminez sous des conditions réductrices.L'épitope unique caractérisé par cet anticorps monoclonal permet la caractérisation d'une sous-population de lymphocytes T humains avec une définition nettement améliorée comparativement à ce oui a été réalisé jusqu'alors. L'anticorps monoclonal selon l'invention identifie une nouvelle sous-population de lymphocytes humains avec un récepteur des cellules T muni d'un complexe gamma. L'anticorps monoclonal est dénommé "anti-^iònmaA". Il appartint à la sous-classe des Ig G2. L'anticorps monoclonal peut être marqué avec un marqueur approprié tel qu'un marqueur radioactif ou fluorescent, pour identifier et définir les sous-populations de lyrnphocytes T humains dans le sang circulant prélevé chez des sujets sains, des sujets malades ou qui ont subi une greffe d'organe ou une transplantation de moëlle osseuse. L'anticorps est aussi utile pour caractériser l'état de différenciation des lymphocytes T humains dans le sang circulant. De plus, l'anticorps peut être utilisé en thérapie avec d'éventuelles manipulations in vitro, ex-vivo ou in vivo de lymphocytes T humains portant l'épitope TigammaA. L'anticorps monoclonal anti-TigammaA se lie à un déterminant antigénique du récepteur des lymphocytes T humains, spécifiquement au complexe Ti de la structure T3 Ti du récepteur de surface des cellules T humaines. La structure moléculaire Ti porte la channe gamma et l'anticorps monoclonal anti-TiammaA définit la channe ganma de telle façon cue l'invention permet la détection, la quantification et la caractérisation approfondie du complexe Ti de la "seconde famille" du récepteur de surface des cellules T. Cet épitope apparaît sur une sous-population de lymphocytes T du sang et des organes lymphoides humains comme par exemple le thymus, la rate, les ganglions et la moelle osseuse.Les avantages susceptibles de se présenter, dérivés des applications t:aérapeutiques et en diagnostic, à partir de cet anticorps monoclonal, seront développés plus loin. L'anticorps monoclonal anti-TigammaA selon l'invention, a été obtenu comme décrit ci-dessous. Une suspension de cellules d'un clone lymphocytaire humain, de phénotype CD3+, 4T3l, "Nowill et al ; 19S6 ; Natural clones derived from fetal (25 wk) bloom ; J. Exp. Med. ; 63 ; 16C1", mais n'exprimant pas en surface le récepteur T i/, est préparée. Ces cellules expriment une activité fonctionnelle dite "cytotoxique naturelle". La suspension est injectée dans une souris Biozzi. L'immunisation est réalisée par deux premières innec-ions intrapéritonéales à raison de 4x106 cellules dans un adjuvant de Freund par injection, suivies d'une injection intraveineuse de 4x106 cellules sans adjuvant. Trois ours après, l'animal est sacrifié, la rate est prélevée et les cellules spléniques sont récoltées. L'hybridation est ensuite effectuée en procédant à une fusion cellulaire entre les cellules spléniques ainsi récoltées et une lignée mvélomateuse murine NS-l. Cette fusion cellulaire a été réalisée selon un procédé connu décrit dans "Moingeon P. et autres, 1986, Nature, Vol. 323, p. 638". Les cellules hybrides obtenues après fusion sont cultivées sur un milieu HAT contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine, de la thynidine, lOC' de sérum de veau foetal et 10V de sérum de cheval. Les hybridomes sont ensuite sélectionnés. Le criblage est effectué en testant la capacité des surnageants hybridomes à bloquer des réactions cytotoxiques exercées par le clone immunisant contre une lignée de cellules leucémiçues maintenues en culture. Les hybridomes produisant les anticorps monoclonaux sont clonus par des techniques de dilution limite. t, finalerent des ascites immuns sont produits, dans lesquels les anticorps peuvent être prélevés. Les anticorps anti-Tigamma. ainsi fabriqués sont de la sous-classe IgG2 et peuvent fixer le cornplément. La réactivité de l'anticorps monoclonal et l'étendue de son action ont été déterminées sur une sous-population de lymphocytes humains au moyen d'analyses par immunofluorescence en double couleur avec lecture par méthodes cytofluorométriques. Les cellules de la sous-population à tester, ont été isolées à partir de la fraction mononucléée du sang périphérique prélevé chez 30 donneurs sains adultes. Cette fraction a été purifiée par une technique de centrifugation sur gradient de Ficoll. 3,0x105 cellules sont analysées par échantillon sur un cytofluoromètre tel qu'un appareil "Epics C" manufacturé par Coulter Corporation, Hialeah, Floride, USA. Les réactifs de contrôle sont une FITC-Ig G et une PE-Ig G. Les lymphocytes non adhérents sont traités pendant 30 minutes avec l'anticorps monoclonal de l'invention, anti-TigammaA, muni d'un marqueur fluorescent vert, la fluorescéine, en présence d'un autre anticorps connu qui est également muni d'un marqueur fluorescent rouge, la phycoérythrine (PE). Les autres anticorps connus sont les suivants : anti-CD2, -CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -NKHl, et les anticorps déterminant les molécules codées par les gènes dits de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité. Ces anticorps connus sont fournis par la société Coultronics, araency, France. Les résultats obtenus, à partir de l'anticorps selon l'invention, permettent de caractériser les lymphocytes T humains exprimant le déterminant antigénique XigarAmat. La grande majorité des lymphocytes TigammaA+ exprime les glycoprotéines CD2 et CD3. Une majorité des rymphocytes TigammaA+ exprime les protéines CD5. I1 est à noter icl que lorsque ces protéines CD5 sont présentes, la densité de l'antigène CD5 par cellule est plus basse dans le contingent de cellules TigammaA+ que dans la population de lymphocytes classiques exprimant le récepteur T i /ss . L'expression de CD8 dans la sous-population TigammaA+ varie de façon assez large d:un individu à l'autre. Chez la plupart des sujets, seule une minorité des lymphocytes TigammaA+ exprime la protéine CDS avec une densité antigénique faible. Au repos, les lymphocytes TigammaA+ n'expriment pas les protéines CD4, NKH1 et les molécules codées par les gènes de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité. D'autres analyses comparatives de la réactivité de l'anticorps monoclonal anti-TigammaA, réalisées au moyen de techniques d'immunofluorescence, ont permis de détecter les cellules exprimant les protéines CD3 d'une part, et les cellules exprimant un récepteur T d'autre part, en utilisant un anticorps monoclonal spécifique T3 approprié et l'anticorps monoclonal BMA 031 (fourni par Behring Co.). Ces anticorps particuliers ont été choisis car ils présentent des signaux optimaux dans des analyses d'immunofluorescence indirecte. Les résultats montrent que la sous-population TigammaA+ représente une majorité des lymphocytes circulants qui expriment les protéines CD3 mais qui n'expriment pas à leur surface le récepteur T conventionnel g Par ailleurs, certains effets fonctionnels induits par l'interaction entre l'anticorps monoclonal anti-TigammaA et les lymphocytes qui expriment le déterminant antigénique correspondant, ont été étudiés. En présence d'Interleukine 2 exogène avec des quantités d'environ 50 U/ml NIH, l'interaction de l'anticorps monoclonal avec le déterminant antigénique entraSne l'activation et la prolifération des lymphocytes circulants non cultivés. Lorsque les lymphocytes TigammaA+ sont préactivés avec un miocène comme, par exemple, la phytohémaXc-lutinine a une dose d'environ 2 ssg/ml, puis cultivés et stimulés avec l'anticorps monoclonal anti-TigammaA couplé à des billes de sépharose activées par le bromure de cyanogène, une prolifération des lymphocytes T est bien mise en évidence 48 heures après la stimulation. Ces lymphocytes T peuvent de surcroît secréter leur propre Interleukine 2. L'activité cytotoxique des lymphocytes a été observée de façon plus précise au moyen d'autres expériences. La cytotoxicité se mesure au cours d'une expérience de trois heures après marquage des cellules cibles au 51Cr. Les cellules TigammaA+ déterminées par l'anticorps monoclonal de l'invention, apparaissent à l'état de repos comme une population très homogène de lymphocytes à grains. Cependant, elles exercent peu ou pas d'activité cytotoxique spontanée contre les cibles classiques du système dit "cytotoxique naturel" comme par exemple la lignée K562 qui dérive d'u-. épancherent pleural de leucémie mvélolde chronique. Par conséquent, cette sous-population ne contribue pas de façon significative à l'activité cytotoxique naturelle du sang périphérique, ce qui est logique avec l'absence d'expression en surface du marqueur 1TZM1, comme démontrée précédemment. Au contraire, lorsque les lynphocytes TigammaA+ sont activés au moyen de mitogènes et par de l'Interleul4-r.e 2 exogène, ils deviennent très cytotoxiques contre de nombreuses cellules tumorales, en particulier les cellules de la lignée K562. Cettecytotoxicité peut être induite dans un période de temps très courte allant de 3 à 5 jours. Les lymphocytes TigammaA+ ainsi activés peuvent alors participer au phénomène dénommé "fonction tueuse activée" (qui correspond au "L.ML phenomenon" anglais). De plus, à la suite de l'interaction entre des lymphocytes TigammaA+ activés et l'anticorps monoclonal anti-TigammaA, une modification profonde de la fonction cytotoxique est obsenrée. Le type de modification dépend des conditions expérimentales utilisées. Si on utilise des cellules cibles relativement résistantes exprimant le récepteur Fc des immunoglobulines comme par exemple la lignée histiocytique humaine U 937, l'action de l'anticorps se traduit par une augmentation très substantielle de la cytotoxicité cellulaire. De tels résultats sont expliqués par le fait que l'anticorps anti-TigammaA peut lier le fragment Fc exprimé sur certaines cellules cibles. Plus précisément, dans cette liaison, l'anticorps établit un pont entre cellules effectrices et cellules cibles et modifie le déterminant antiénIque TigammaA. De ce fait, le processus lytique est déclenché. Au contraire, si l'on choisit des cellules cibles dépourvues du récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines comme par exemple la lignée leucémique dite "jurkat", l'action de l'anticorps se traduit par une virtuelle abrogation de la fonction cytotoxique. tn effet, dans le cas oeb les cellules cibles n'expriment pas le récepteur Fc, la réaction de liaison par pont décrite ci-dessus pour la lignée histiocytique humaine U 937, ne se produit pas. Ici, l'anticorps interagit uniquement avec son déterminnt antigénique spécifique à travers le fragment Fab. Cette interaction indu-t une modulation du complexe moléculaire CD3-TigammaA, les molécules CD3 et TigammaA étant liées de façon non covalente È. la surface cellulaire. Ce phénomène se traduit par une diminution profonde de la lyse cellulaire. il est à noter ici que l'ensemble des résultats décrits précédemment conduit directement à l'hypothèse que TipamaA représente une partie d'un récepteur fonctionnel impliqué dans des mécanismes de cytotoxicité cellulaire non restreinte par les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité. Des expériences d'immunoprécipitation réalisées avec l'anticorps anti-TigammaA ont montré que la structure du récepteur caractérisé par l'anticorps, est en fait un complexe moléculaire associé aux protéines CD3, ce complexe étant lié par des liaisons disulfure. Ces expériences d'immunoprécipitation permettent en outre d'identifier la masse moléculaire du déterminant antigénique défini par l'anticorps anti-TigammaA. Les expériences sont conduites avec une lignée cellulaire humaine d'origine foetale connue sous le non de F6C7. Ces cellules F6C7 sont marquées sur leur surface 125 par du i en ut lisant un procédé standard à base de lactopéroxidase, qui est décrit dans "Moingeon P., 1986, ature, Vol.323, p.638". Plusieurs étapes de préclarification sont effectuées avec une suspension de Staphylococcus A, ainsi qu'avec d'autres anticorps. Puis, des réactions de précipitation ont lieu pendant environ 4 à 6 heures à une température de 40C avec les anticorps monoclonaux anti-Tiga.-,aA, couplés à des billes de sépharose protéIne A. L'électrophorèse du type SDS - PAGE est réalisée sur gel de polyacrylar:.ide à îoe,' sous des conditions d'une part non réductrices, et d'autre part, réductrices après l'addition de 5% de 2-rE. Les résultats de l'analyse électrophorêtique sont les suivants. La molécule TigammaA migre en produisant une bande homogène à approximativement 85 KD dans des conditions non réductrices. En conditions réductrices, la molécule se présente comme une bande majeure à environ 44-1O et une bande mineure à environ 41KD. Ce profil d'immunoprécipitation est très analogue d'une cellule à l'autre. Des différences minimes de mobilité électrophorétique, d'une cellule à l'autre correspondent probablement à des différences de glycosylation. Ces expériences montrent que les deux bandes de 44 et 41 KD immunoprécipitées par l'anticorps anti-TigammaA correspondent à des protéines totalement et partiellement glycosylées et qui sont codées par le gène réarrangeant dans les cellules T dont la dénomination est gamma. Le gène précité encodant la protéine TigammaA à la surface cellulaire est caractérisé de façon plus précise par une série d'expériences dénommées "Southern and r;orthern blot" en utilisant plusieurs sondes moléculaires appropriées telles que celles du type C gamna, J gamma et V gamma. Les résultats de ces expériences ont conduit aux conclusions suivantes. Le réarrangement spécifique aboutissant à la transcription de L'ART messager qui donne naissance à la protéine TigammaA, implicue une jonction unique entre le gène V gamma 9 et le gène J gamma P. Ce réarrangement est de plus transcrit avec la région constante C gamma 1 car la protéine exprimée à la surface cellulaire est un digère lié par des ponts bisulfure. L'anticorps monoclonal anti-TigammaA reconnaît ainsi spécifiquement une structure glycoprotéSque, codée par un gène recombiné associant un segment V gamma 9 à un segment J gamma P. L'ensemble des expériences et résultats décrits précédemment, caractérisent donc l'anticorps monoclonal anti-TigammaA et par conséquent, la structure réceptrice des cellules lymphocytaires T qui est associée aux protéines CD3 et impliquée dans les fonctions cellulaires notamment les fonctions cytotoxiques. La lignée de cellules d'hybridomes produisant l'anticorps anti-TigammaA est déposée à l'American Type Culture Collection (ATCC) à Rockville, Maryland, USA sous le NO ATCC HB 9528. L'anticorps monoclonal selon l'invention peut être utilisé pour identifier des cellules lymphocytaires T humaines portant un récepteur codé par les gènes gamma. Il peut également servir à caractériser l'état de différenciation de ces cellules T. Par ailleurs, cet anticorps monoclonal peut être utilisé thérapeutiquement contre des maladies auto-immunes, des cancers et des infections virales. L'anticorps monoclonal utilisé ex vivo pourrait permettre la déplétion des populations lymphocytaires correspondantes avant transplantation d'organes ou de moelle osseuse. Il serait aussi envisageable d'utiliser l'anticorps monoclonal après transplantation in vivo pour combattre soit le rejet de greffes, soit la réaction du greffon contre l'hôte si il s'avérait que les cellules exprimant TigammaA Jouaient un rôle dans ces phénomènes biologiques. REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal, du type anti-TigaraA, caractérisé en ce que ledit anticorps reconnaît un récepteur des lymphocytes T de la "seconde fanille" codé par des gènes dits "gamma" qui réarrangent spécifiquement dans les cellules T. 2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il appartient à la sous-classe des IgG2. 3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il reconnaît une structure glycoprotéTque sur la surface de lymphocytes T humains ayant une masse moléculaire d'environ 85KD telle que déterminée par électrophorèse de type SDS-PAGE dans des conditions non réductrices. 4. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il reconnaît une structure glycoprotélque sur la surface de lymphocytes T humains ayant une masse moléculaire d'environ 41-44 KD telle que déterminée par électrophorèse de type SDS-PAGE dans des conditions réductrices. 5. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement une structure glycoprotéSque, codée par un gène recombiné associant un segment V gamma 9 à un segment J gamma P. 6. Anticorps monoclonal, du type anti-TigammaA, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridomes telle que déposée à l'ATCC sous le numéro HB 9528. 7. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications l à 6, caractérisé en ce qu'il est marqué avec un marqueur discernable. 8. Anticorps monoclonal selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit anticorps est radiomarqué. 9. Anticorps monoclonal selon la revendIcation 7, caractérisé en ce que ledit anticorps est muni d'un marqueur fluorescent. 10. Lignée de cellules d'hybridomes, caractérisée en ce qu'elle est capable de produire l'anticorps monoclonal selon la revendication 1. 11. Lignée de cellules d'hybridomes, caractérisée en ce qu'elle est déposée à l'ATCC sous le numéro HB 9528. 12. Utilisation de l'anticorps monoclonal tel cue défini selon l'une des revendications 1 à 6, pour i.muno3récipiter des molécules ayant une structure réceptrice T associée aux protéines CD3. 13. Utilisation de l'anticorps monoclonal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, pour immunoprécipiter des molécules de membranes ayant des masses olêculaires dans les régions de 41-44 KD et 85KD déterminées respectivement dans des conditions réductrices et non réductrices.