Brevet FR2619820A1 — publié le 19890303

I Procédé de réduction de résidus sulfoxyde de méthionine. Le produit d'oxydation de la méthionine en sulfoxyde est un dérivé fréquemment rencontré dans la nature, ainsi que dans la chimie de6 synthèse des peptides. La facilité avec laquelle il est formé en fait une impureté commune dans la plupart des peptides contenant de la méthionine isolés à partir de sources naturelles. Pour les peptides purifiés, il1 est très recommandé d'éviter des conditions de stockage dans lesquelles la formation de sulfoxyde est favorisée (Toennies, G., et Callan, T.P. (1939), J. Biol. Chem. 129, 481). Une fois oxydé, le caractère nucléophile réduit du partenaire thioéther rend l'aminoacide moins sensible à d'autres modifications. Ceci est la base de son utilisation dans la synthèse des peptides (Iselin, B. (1961) Helv. Chim. Acta j44, 61) et dans les études de modification des protéines (TashJian, A., Ontjes, D. et Munson, P. L. (1964) Biochem. 3_ 1175). La propension à l'oxydation de la méthionine, une fois purifiée, en plus de la nécessité de protection réversible lors de synthèses, a amené un grand nombre de chercheurs à la remplacer par d'autres aminoacides (Kempe, T., Chow, F., Peterson, S. M., Baker, P., Hays, W., Opperman, G., L'Italien, J. J., Long, G., et P_'ucon, B., (1986) B.otech-l 4 565; rtcr.anssk, J. L., Tr. vedi.,.,.hnson,. , et r-9by,' V. (1986) J.A.. he. Soc. 108 1696; et Schalch, D., Psm.a., D., Em2cr, C., Humbci, R., L4, C. H., Petors, M., et Lau, E. (1984} Endocrinolov 115, 2490). La réduction sélective et non destructive de peptides contenant du suif oxyde de méthionine a été un problème périodique dans la chimie des peptides (Kessler, W., et Iselin, B. (1966) Helv. Chim. Acta 49, 1330). La plupart du temps, la réduction est obtenue par l'utilisation de concentrations élevées d'agents réducteurs tels que du dithiothréitol ou du - mercaptoeéthanol a des températures élevées (Houghten, R. A., et Li, C. H. (1979) Anal. Biochem. 98. 36). La vitesse de réaction est lente et le procédé résulte en général en une réduction incomplète. La promotion d'échange d'oxygène par le diméthylsulfure ou le thicanisol dans du HCl aqueux (Savige, W.E., et Fontana, A. (1977) Adv. in Enzymologv 47, 453; Shechter, Y. (1986) J. Bio. Chem. 261, 66), dans du HF anhydre (Tam, J. P. , Heath, W. F., et Merrifield, R. B. (1983) J. Am. Chem. Soc. 105, 6442), dans de l'acide trifluorométhanesulfonlque TFA 1 M (Fujii, N., Kuno, S., Otaka, A., Funakoshi, S., Takagi, K., et Yajami, H. (1985) Chem. Pharm. Bull., Jpn. 33, 4587) sont d'autres moyens de réduction. Dans ces cas, la réduction est aisée et un degré variable d'intégrité du disulfure peut être maintenu. Les conséquences secondaires potentielles dues à l'exposition aux acides forts de ce genre sont toutefois d'intérêt notable. Il est reconnu depuis un certain temps que les haloacides catalysent le transfert d'oxygène d'un sulfoxyde vers un sulfure (Scorranno, G. (1973), Acc. Chem Res., 132). Savige et Fontana, supra, ont été les premiers à décrire explicitement la réduction de sulfoxyde de méthionine libre (c'est-a-dire ne faisant pas partie d'une protéine) par l'utilisation de HCl 12 N et de sulfure de diméthyle. La réussite de l'application sur un dérivé d'un lysozyme oxydé a aussi été décrite -ve une observation minimale de réactions -.acc..p,.gne=..nt secondaires. T' ont conclu que "_ ccnditions de réaction sont plutôt dures et eûtger.t de concentrations élevées en. HC.". Plus récemment, Shechter, supra, a rapporté une réduction similaire de sulfoxyde de méthionine dans des protéines par l'utilisation du sulfure de di.méthyle et de concentrations variables en HCl. Il conclut qu'"à 4,4-10,7 M en HCl, la réaction tend & être complète alors qu'à des concentrations inférieures en HC1 (par exemple 1,0 M), l'importance de la réduction est fortement retardée". Des analyses de haute performance pour déceler des modifications secondaires n'ont été réalisées dans aucune de ces deux études. La réduction de sulfoxyde de méthionine dans du HF anhydre ou dans de l'acide trifluorométhanesulfonique TFA 1M est supposée se produire via un autre mécanisme que le mécanisme ayant lieu dans du HCi aqueux. Dans ces acides anhydres forts, la réduction est supposée être une fonction de l'acidité du mélange et ne dépend pas du caractère nucleophile de l'anion acide. Une réduction efficace avec des taux de modifications indésirables minimaux a été rapportée. La nature caustique de ces solvants exige toutefois des précautions de manipulation spéciales qui imposent des restrictions sévères quant à leur utilisation. L'objet de cette invention est un procédé facile et hautement sélectif de traitement de protéines et de peptides possédant des résidus de sulfoxyde de méthionine pour réduire sélectivement ces résidus en résidus de méthionine. Plus spécifiquement, le procédé selon l'invention réalise la réduction dans des conditions substantiellement plus douces que celles imposés par les méthodes antérieures. Ainsi, l'objet de cette Invention est un procédé de traitement de protéines et de peptides possédant un ou plusieurs résidus 'de sulfoxyde de méthionine pour réduire ces résidus en résidus de méthionine, qui comprend la soumission dudit peptide ou de ladite protéine à un milieu réactionnel d'acide trifluoroacétique subzstantle!lement anhydre cntenant un sulfure organique à urc....-centra-on comprise entre environ 0,01 M et environ 3 M et un haloacide à une concentration compr - entre environ 0,01 M et 3 M choisi dans le groupe consistant en acide chlorhydrique, acide bromhydrique et acide iodhydrique. Comme indiqué ci-avant, l'obJet de cette invention est un procédé de réduction sélective des protéines et des peptides contenant des résidus de sulfoxyde de méthionine en leurs résidus de méthionine correspondants analogues. Le procédé trouvera son utilisation principale dans la génération d'un produit biologiquement actif, mature à partir de son précurseur oxydé, ce dernier étant le plus souvent produit suite aux conditions utilisées lors de la génération synthétique de la protéine ou du peptide. Les conditions provoquant l'oxydation des résidus de méthionine en la forme sulfoxyde peuvent apparaître au cours d'une étape quelconque d'une série d'étapes du procédé, y compris la synthèse et la purification de la protéine désirée ou du peptide désiré. En l'absence d'une méthode efficace de reconversion du résidu de méthionine à son état réduit, on serait en peine d'obtenir, au moins dans la production de quantités importantes du produit mature, des quantités d'un niveau raisonnable du produit désiré. Le procédé selon l'invention est réalisé dans de l'acide trifluoroacétique comme solvant. Bien que cela ne soit pas absolument essentiel, il est fortement préféré d'effectuer le procédé selon l'invention dans des conditions substantiellement anhydres et donc d'utiliser de l'acide trifluoroacétique substantiellement anhydre. Par le terme acide fluorhydrique "substantiellement anhydre", on ne vise pas à exiger des mesures effectives destinées à exclure la présence de traces d'eau. On vise seulement à éviter une addition effective d'eau. La protéine ou le peptide qui sera soumis à la réduction est ajouté dans l'acide trifluoroacétique avec un sulfure organique et un haloacide. Les réactifs peuvent être ajoutes dans un ordre quelconque. Idale-ent", toutefois, la protéine ou le peptide est d'abord dissous dans 'acide trifluorcacdtiquc, s"tc a quoi le sulfure organique est ajouté, suivi de l'haloacide. La quantité de protéine ou de peptide ajoutée à l'acide trifluoroacétique sera en général telle qu'elle donnera des concentrations comprises entre environ 0,01 et environ 100 mg/ml. La concentration sera de préférence comprise entre environ 0,1 et environ 20 mg/ml et plus particulièrement entre environ 1 et environ 10 mg/ml. La protéine ou le peptide est mis à réagir dans de l'acide trifluoroacétique avec un sulfure organique et un haloacide. Un sulfure organique quelconque choisi dans une grande série de sulfures organiques peut être utilisé, la seule exigence, à l'exception du reste sulfure réactif, étant qu'il soit inerte dans les conditions du procédé selon l'invention. Des exemples de sulfures typiques sont le sulfure de diméthyle, le sulfure de diéthyle, le sulfure d'éthyle et de méthyle, le sulfure diphényle, le dithiothréitol, la cystéine et les sulfures analogues. Les sulfures préférés sont les sulfures de dialkyle dans lesquels chaque groupe alkyle contient 1 à 3 atomes de carbone. Le sulfure de diméthyle est fortement préféré pour l'utilisation dans le procédé selon l'invention. Le sulfure organique est ajouté au mélange réactionnel de façon & produire une concentration généralement comprise entre environ 0,01 M et environ 3 M. La concentration est de préférence comprise entre environ 0, 1 M et environ 1 M et plus particulièrement entre environ 0,5 M et environ 1 M. Un autre réactif essentiel est un haloacide. L'haloacide est choisi parmi le chlorure d'hydrogène, le bromure d'hydrogène et l'iodure d'hydrogère. L'haloacide préféré est le chlorure d'hydrogène. L'haloacide est en général présent dans le mélange réactionnel en une quantité comprise entre environ 0,01 M et environ 3 M. L'haloacide est de préférence présent en une quantité ccr,-ip _ ze entre er.-v.ro.. CM È- caea.'tf. _ l'intervalle s'il n'y a pas de disulfures. Malgré la discussion ci-avant concernant la préférence de réaliser le procédé dans des conditions anhydres, une certaine quantité d'eau sera normalement incorporée dans le mélange réactionnel lors de l'addition de l'haloaclde. Etant donné que la quantité totale d'haloacide utilisée est petite et qu'elle peut être incorporée par addition d'acide concentré, on ne devra ajouter en fait qu'une petite quantité d'eau au mélange. La quantité ajoutée est entièrement tolérable dans le procédé selon l'invention. Le procédé selon l'invention peut être réalisé dans une large plage de température, par exemple comprise généralement quelque part entre environ 4 OC et environ 45 OC. La réaction est de préférence réalisée aux environs de la température ambiante (entre environ 20.C et environ 25 OC). La réaction se produit normalement de manière très rapide. Bien que la réaction puisse être réalisée au cours d'une période étendue, par exemple pendant environ 6 heures, elle peut être terminée en un laps de temps aussi court que 5 minutes. La réaction est par conséquent habituellement réalisée en une période d'environ 30 à environ 90 minutes. A la fin de la réduction, le produit désiré peut être récupéré en utilisant une technique quelconque d'une série de techniques de récupération reconnues. Les exemples suivants sont donnés pour illustrer le procédé selon l'invention. Ils ne visent cependant pas à limiter l'étendue de l'invention. av-'e T-ratemer.t de H-Phe-Met(O) -'y-Pro-G'u-Thr-,'H, (fM(0)0GPET-N:.%) Le peptide FM(O)GPET-NH2 (2,15 mg) a été dissous dans 1,72 m1 d'acide trifluoroacétique anhydre (TFAA. La solution peptidique a été divisée en 17 parties aliquotes de 80 pi. Une partie aliquote, servant de référence, n'a pas reçu de sulfure de diméthyle (DMS) ni d'acide chlorhydrique (HCl). Aux 16 autres solutions peptidiques on a ajouté différentes quantités de DMS à une concentration comprise entre 0,01 M et 1 M et du HC1 concentré jusqu'à une concentration en HC1 comprise entre 0,01 N et 1 N. Les solutions ont d'abord été agitées vigoureusement et ensuite laissées au repos à température ambiante pendant 60 minutes. Les réactions ont été arrêtées par addition de 900 pl de TFA aqueux à 0,1%. L'étendue des modifications chimiques a été déterminée par la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) au moyen d'une colonne en phase réversible Altex Ultrasphere ODS (0,46 x 25 cm). La chromatographie a été exécutée dans du TFA aqueux à 0,1 % à 45 OC et l'élution a été réalisée au moyen d'un gradient linéaire croissant de CH3CN. La détermination quantitative était basée sur des mesures de surface de pic à 214 nm. Le FM(O)GPET-NH2 traité par TFA/DMS/HCI a donné un peptide ayant un temps de rétention chromatographique identique à celui d'un FMGPET-NH2 synthétique standard. Les résultats des essais sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. * zpAqul2 afl5T O.ZOflt;sI; G PI r Su>ax 0 g6 0' 0'1 Oz 0 86 1'0 0'1 0 t6 10'O 011 Ge 0i S 8 0 o seg 89 O'1T 10 1t >9 1'0 1'0 gi it Lg 10'0 1'0 96 t O 1'0 G8 Zr 0' T10'0 8 Il T'O TO' o 98 01 tO'O TO' O01 ú6 O 0 '1010 68 z 0' 0 6S6 O'h 0 ú6 0 VO 0 86 0 lû'O O 001 0 0 0 Y - 2isdo(O)w swa awGoq OZ86.9Z qe" 086 L9 Z Du GRF(I-45)M-45)N27r)- I * 4_Ir_ 1 à D" '-45Mett.-,,.-4- (1,63 mg) a été dissous dans 1,5 d'acide anhydre 'TFA). 100 1 de sulfu.re de diméthyle (DMS) ont été ajoutés à 900 p1 de solution peptidique, suivis de 10 pl de HCI concentré. La solution a été agitée vigoureusement et ensuite laissée au repos à température ambiante. A 5, , 30 et 60 minutes après l'addition de HCl, des parties aliquotes de 60 Dl ont été prélevées de la solution de mélange réactionnel. Chaque échantillon a été séché au moyen de N2 et dilué à 1,2 ml par addition de TFA aqueux à 0,1 %. A la fin des 60 minutes, du HCI concentré supplémentaire (7,6 pl) a été ajouté à la solution peptidique restante (760 pl), et la solution a à nouveau été agitée vigoureusement et ensuite laissée au repos à température ambiante. 65, 75, 90, 120 et 180 minutes après la première addition de HC1, des parties aliquotes de 60 pi ont été prélevées et séchées au moyen de N2 et diluées par 0,1 % de TFA aqueux comme décrit ci- dessus. L'importance des modifications chimiques a été déterminée par la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) au moyen d'une colonne en phase réversible Vydac C4 (0,46 x 10 cm). La chromatographie a été exécutée dans du TFA aqueux à 0,1 X à 45 OC et l'élution a été réalisée au moyen d'un gradient linéaire croissant de CH3CN. La détermination quantitative était basée sur des mesures de hauteur de pic à 214 nm. Le GRF(1-45)Met(0)27,Lys45-OH traité par TFA/DMS/HC1 a donné un peptide ayant un temps de rétention chromatographique identique à celui d'un GRF(1_45)Met27,Lys45-OH synthétique standard. Les résultats des essais sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous. ap uasow ne sa9qDos;a sag9aslgd 949 4uo uo;;nros anbeqo ap rId 09 ap saoonbTe saT;aed sap 'tOH op uo;lTppe amTxnap eo s9de sa4nuu w 09 -aue; qwe ain;e.gdwa; V sodai ne s9ssTe: sTnd ':uaouasnajnoZTA s;T;5e 99;uo saouelgm sai sa;ue;saa sanbipT;dad suoflnTos xne gú noce q;9 u aTe; uaw9Tddns;uuasuoo tOH np 'as4num 09g sep uig et V X iVo V xnanbw V&l aP lm a'i osae Uo FnrP aun aed;a ZU ap ua&ow ne apidea atsqos un aud sQ9q 3ae q; 4uo suoT;zoe9 sat;a uoT;nros onbeqo ap sa9Aargd q;q.uo Tr 09 ap saoonbiFe satr;ed saa 'gZ uoT;Tsod ua O0 uofeonut np zu.azuç aueqdo4dAa np uoT;;na4sap el mnmrutu ne asTnpg. inod 9;no e 9;q e aueqdo.d&a; al 'a; uTqwem a.n;admsa sa4nuT= og 4umpuad sodao ne sassTer azçnsua;a 4uamasnainobnA saeTSm e9 4uo suo ;nros sa: 4a suoT;nros xne sa94no e q;e 4uo aueqdo;dAjx ap.a gç g;uasouoo tOH ap sarqe7enA sa414uenb saa suoT;od g ua ?sFATFP 99 e sHa/va/apFldad uoTinros m ' '0 e xnanbe V.9 op Tm Z'l suep;umsTTqnros er ue;a ZN ap ua&om ne 4ueqtos er ua 'tr oC ap asonbTre aGied aun.ueAartad ua anua;qo 99 e ael ; uou asuaaa;9a Qua '(V&L) aipAgue oz anbT;;qeoaonr:;; apoe,1r ap sup Hi Swa ap Tri o099 suep snossGp q;q e (Ew zz't) LZ(0) 9W utofiecnto nC LZ(0)49W uoevonrO Op 4uzwas;eXL C a axl gT 88 081 $6 0 S6 06 L6 SL O0 96 S9 g6 09. 86 O0 Z6 g t9 - St zuamapuai 'Ho-> ZlWS-91.i da HO- tCA'g G z (o s-r) ap uoP Fo. npQ Z 9rquZ cr O086L93 N T ap uo T4.xuaouoi aun V Swa ap aouasg, ge uobvonzo np saaTmIom sua:eAFnbq ua 9M=FdxI 1 Te Z'O OZI 00t T E8 Z'O OZI 00t gt 9L t'0 09 001 08 LI gL l'0 09 00t 1 69 Z'0 OZI Ot 1 8S Z'Oo OZI Ol L 99:'O 09 Ot L 89 1'0 09 O0 GZ * SZ Z'O OZI 0 Z G8Z Z'O OZI 8 Ot 1'0 O09 O or ao 01 8g 1'O 09 0 : u24sa.O (0)z unua4qo N TOH u-,H uoor2rg X uo t a D M sI%0t00 Z L d DUQ -Mu0 C(o)0)9a uo5genrg ap uo:.onpa C nmalqml :snossap-lo g nmaE qi al sump sauucp 'Sl uos simssa sap s;nLsali sal.pampum:,s anbTaqSu.us uoSeonIB un,p TnrIa e anbruapr anbrqde=do eozq oT;ua4a= ap sdma; un 4umAm ap:;dad un,uuop e IOH/SNG/v&i amd a4tez% L,(o)41N uo5eonr al -mu tIZ e ord ap aoe;ns ap saansam sap ans aasmq e;% aAr4e2.fUelunb Ol uor:Veura.a eq ' Nm1HO ap auGsIFJa aJma-UFT :.uarpma5 un,p uaAom nte aqs-ivaa p:,a e uorlnjpr 4a.0 gt E L Hd ' j t'o mnruommuOrp a;mqdsoqd np 9u-p Sar._,ta 2aza e r rv,4n,5,-n,it,-it.,t nfV *t, v..,,r n& 9,.Â 8.-. o-a L 8^ Gsr-qd ua Guausoo au.nip ua.Aom nv %'o- dH) azurmaoaad alt'nm g aprnbri Dom-qd ua arqdm ouoqo ml ad aapuragp Oa8; 6M suorCzr;Tpo cap azum;a dr,'7 """- 'o v' v E' -. -,ii ' G'S lu: Z;,- z0. ^.- saanz-pp 7X c: OZ86L9Z __..Hl 4 Traitement de F_ Mét)9 rD..,*-'é....*r Lq59 F.Aété A ' s s ' 's dans 0,9^ m' d.cde t rf...cac que anhydre (TFA]. slton peptidique a été divisée en 8 parties aliquotes de.00 Bl. Les échantillons 1, 2, 7 et 8 ont été séchés au moyen de N2 avant le traitement. Chaque paire d'échantllons (c'est-a-dire 1 et 2, 3 et 4, 5 et 6, 7 et 8) a subi le même traitement sauf que les échantillons pairs étaient convertis en G-sulfonate de cystéinyle avant l'essai. Différentes quantités de TFA anhydre, de sulfure de diméthyle (DMS) et de HCl concentré ont été ajoutées aux échantillons. Les solutions ont été agitées vigoureusement et ont ensuite été laissées au repos à température ambiante. Certains échantillons ont été add i-ronnés de HC! concentré supplémentaire 30 minutes après la première addition de HCl. Les réactions dans tous les échantillons ont été arrêtés après 30 ou 60 minutes par dilution au moyen de TFA aqueux à 0,1 % ou de sulfitolyse de solutions neutralisées. L'importance des modifications chimiques a été déterminée par la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) au moyen d'une colonne en phase réversible DuPont C8 Reliance (0,6 x 4 cm). La chromatographie a été exécutée dans du phosphate d'ammonium 0,1 M, pH 7 à 45 *C et l'élution a été réalisée au moyen d'un gradient linéaire croissant de CH3CN. La détermination quantitative était basée sur des mesures de surface de pic à 214 nm. Le IGF-I,Mét(0)59 traité par TFA/DMS/HCl a donné un peptide ayant un temps de rétention chromatographique identique & celui d'un IGF-I synthétique standard. Les résultats des essais sont donnés dans le tableau 4 ci-dessous. :g'i 0O os G'O D'à 0 8 1i> 6'9 0ú g'O ' 0 L c98 L6 09 t z'O 001 9 C c9g 86 09 T Z'O 001 z69 os08 0E 1 1 'O 001 eL9 os08 0 1 ' O 001 - 0 O 0 0 0 Z - 0 0 0 O O 6.../,..a.... ap uo z d7 T OZ8 6 L9 C; )OZ86L19 Z P.. de. tra... ent de proteines et de pept.des pcs.édant un ou p.eur..... dû sulfcyJc de méthion.ine pour réduire ces résidus en résidus de h.nine, qui ccmprend la soumission dudit peptide ou de ladite protéine à un milieu réactionne/ d'aclde triflucroacétique substantiellement anhydre contenant un sulfure organique à une concentration comprise entre environ 0,01 M et environ 3 M et un haloacide à une concentration comprise entre environ 0,01 M et 3 M choisi dans le groupe consistant en acide chlorhydrique, acide bromhydrique et acide iodhydrique. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la protéine ou le peptide est présent à une 1.5 concentration comprise entre environ 0, 01 et environ 100 mg/rml. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la protéine ou le peptide est présent à une concentration comprise entre environ 0,1 et environ 20 mg/ml. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le sulfure organique est un sulfure de dialkyle dans lequel chaque groupe alkyle contient 1 à 3 atomes de carbone. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le sulfure organique est du sulfure de diméthyle. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le sulfure organique est présent dans le mélange réactionnel à une S30 concentration comprise entre environ 0,1 M et environ 1 M. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le sulfure organique est présent dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre environ 0, 5 M et environ 1 M. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'haloacide est de l'acide chlorhydrique. 9. Procédé selon l'une quelconque des u t..aStonlflAi.a%voua*asra alun e t FaOtrttpU,3 a, Ga7zzc:pq,, anz GO u aSac rZ.6 ozs6 t.