Brevet FR2616798A1 — publié le 19881223

DESCRIPTION La présente invention concerne la culture de microorganismes aérobies doues de tolérance à L'égard du gaz carbonique. De nombreuses réactions biologiques font appel à la culture de microorganismes aérobies en fermenteurs aérés-agités. Pour permettre le déroulement de ces réactions, il est indispensable de satisfaire les exigences nutritionnelles des microorganismes, à savoir apporter en quantités suffisantes les différents substrats et nutriments spécifiques du type de la réaction et du type de microorganisme. tes sources de carbone, d'azote, de phosphore, de soufre, d'oligoéléments et de vitamines sont généralement apportées par le milieu de culture, l'oxygène étant apporté par le dispositif d'aération-agitation. te rôle des dispositifs d'aération places dans les fermenteurs est de fournir aux microorganismes l'oxygène nécessaire a leur métabolisme , par ailleurs, le but de l'agitation est non seulement d'assurer i 'hnité du du milieu de culture de façon à accélérer les vitesses d'échange entre le milieu nutritif et les microorganismes, mais aussi de diviser les bulles d'air de façon à accroître leur surface et de créer des turbulences en vue d'augmenter leur séjour dans le milieu de fermentation. Aération et agitation sont donc deux paramètres intimement liés. Dans la pratique, la culture de microorganismes en fermenteurs aérés-agités est souvent accanpagnée de phénomènes se traduisant par un ralentissement, voire un arrêt de l'activité métabolique de ces microorganismes (croissance, production de métabolites). Lorsque les substrats fournis, par le milieu de culture sont apportes en quantités suffisantes, ces phénomènes sont généralement lies à la diffusion insuffisante de 1 'oyygene dans le fermenteur ou/et à la présence de substances inhibitrices issues le plus souvent du métabolisme des microorganises telles que le 0D2, des acides organiques, des alcools...Il existe dans ce cas des solutions techniques industriellement éprouvées, telles que le système de perfusion au travers d'une membrane de microfiltration ou d'ultrafiltration, permettant d'éliminer en continu les substances inhibitrices produites afin qu'elles ne s'accumulent dans le milieu de fermentation. Les causes d'une limitation par manque d'oxygène peuvent être de diverses origines. A la suite de réactions de croissance, la concentration en microorganismes peut atteindre une valeur telle que l'apport d'oxygène pour des conditions données d' aération/agitation peut devenir insuffisant pour satisfaire la demande en oxygène de l'ensemble de la population: Dans le but d'améliorer la productivité des fermenteurs, il est nécessaire de travailler avec de fortes concentrations cellulaires , bien supérieures à celles que 1 'on peut habituellement obtenir en fin i culture, et donc d'utiliser un des nombreux artifices de concentratics des cellules de microorganismes (fermentation à dialyse, microfiltration ou ultrafiltration ; fermentation avec centrifugation et recyclage des microorganismes, fermentation avec microorganismes inclus, immobilisés ou floculés...).C'est pour la raison précédemment évoquée que la plus de ces fermantations dites "à haute densité cellulaire" sont limitées par le transfert d'oxygène. La nature du métabolite produit peut également nuire si transfert d'oxygène ; une augmentation de viscosité par exemple (production de biopolymères : Xanthane, Scléroglucane, Dextrane---) accroît considérablement la résistance au transfert d'oxygène et une limitation par manque d ' oxygène apparait généralement assez tôt pour ce type de fermientationi. te car portement en culture ou encore le mode de culture du: microorganisme peuvent avoir une incidence sur le transfert d'oxygène. Ainsi, la plupart des champignons filamenteux (Fungi), sous certaines conditions d'agitation, se transforment en pelotes appelées 'pellets" de plusieurs millimètres de diamètre. Cette conforination entraine inévitablement des problèmes de transfert de matière, d'oxygène en particulier, dans la masse de ces agrégats. I1 s'en suit généralement une perte d'activité du fermenteur. Ce type de phénomène se rencontre églement dans des procédés de fermentation mettant en oeuvre des microorganismes immobilisés sur des surfaces (garnissages) et formant un film microbien. L'apparition des phénomènes de limitation par l'oxygène dépend enfin du type de fermentation ; ainsi pour une fermienitation très a;* d'oxygène, de type "biooxydation" par exemple, cù l'oxygène est utiis de façon stochiometrique par le microorganisne pour oxyder une donnée (ex : production d'acides acétique, gluconique ; de sorbose, de dihydroxyacétone...), ces phénomènes de limitation par manque d'oxygène apparaissent très tôt et il est nécessaire d'améliorer le transfert d'oxygène dans le fermenteur pour en accroître les performances. Lorsque l'on se trouve devant une telle situation de limitation par l'oxygène, il existe différentes solutions pour améliorer le transfert d'oxygène. Certaines agissent sur le coefficient de transfert, d'autres sur la force motrice du transfert. D'une façon générale, le coefficient de transfert d'un fermenteur donné dépend, entre autres, de la puissance d'agitation et du débit d'aération appliqués au fermenteur. Augmenter chacun de ces paramètres revient à ameliorer le transfert d'oxygène. L'augmentation de la puissance d'agitation n'est à priori guère possible industriellement dans la mesure où les fermenteurs ont une puissance installée donnée qui est difficilement modifiable. L'augmentation du debit d 'aération n'est guère utilisée en pratique car une augmentation du débit d'aération entraine une diminution du volume réactionnel et une production accrue de mousses. A titre d'actions sur la force motrice de transfert, d'une façon générale, an recherche une augmentation de la valeur de la concentration en oxygène à l'interface gaz-liquide et cela jusqu'à la concentration à saturation. Cette concentration dite "saturante" dépend de la teneur en oxygène du gaz d'aération, de la pression du ciel gazeux et d'autres facteurs tels que la force ionique du milieu notamment. Pour une aération à l'air et à la pression atmosphérique, la concentration saturante en oxygène pour de l'eau pure à 30 0C est de 7,6 mg/litre (7,6 ppm). La concentration saturante étant proportionnelle à la pression du mélange gazeux en tête de fermenteur, on a envisage d'augeenter la pression dans le ciel gazeux du fermenteur pour améliorer le transfert. Cette technique présente toutefois quelques inconvénients. En effet, outre la nécessité d'utiliser des fermenteurs ayant une bonne tenue à la pression, une augmentation de celle-ci favorise la dissolution du C02, très soluble dans les milieux acqueux, pouvant entrainer rapidement une inhibition de la réaction biologique. De plus, cette technique nécessite l'installation d'un compresseur plus puissant entraînant un investissement relativement conséent. On a pu égalent augmenter la concentration saturante en augmentant la concentration en oxygène de la phase gazeuse puisque les deux grandeurs sont directement proportionnelles. Ce procédé peut être développé seul ou associé aux techniques précédentes. I1 permet d'obtenir l'effet désiré tout en évitant les problèmes inhérents aux autres techniques. Les phénomènes précédemment décrits, consécutifs à la limitation de la fermentation par manque d'oxygène (ralentissement de l'activité métabolique et/ou baisse des rendements de croissance, de conversion...) apparaissent dans la pratique dès que la concentration en oxygène dissous dans le milieu chute en deçà d'une certaine valeur appelée "concentration critique en oxygène". On peut noter qu'il existe dans certains cas une concentration toxique en oxygène au-delà de laquelle les mêmes phénomènes biologiques peuvent apparaître mais lies, cette fois-ci, à l'action inhibitrice de l'oxygène sur les microorganismes en question. Le technique liée à ce procédé consiste à réguler la concentration en oxygène dissous dans le milieu, dès que celle-ci chute en-dessous de la concentration critique, à une valeur comprise entre les valeurs critique et toxique par augmentation de la pression partielle en oxygène dans le gaz d'aération. Cette phase de la fermentation pendant laquelle il est nécessaire de procéder à cette régulation est appelée "phase critigue". La rentabilité économique du procédé d'enrichissement en oxygène des gaz de fermentation, encore appelée procédé de "dopage à l'oxygène", est conditionné par de nombreux facteurs. Elle dépend en effet du taux d'amélioration des performances du fermenteur (productivité, rendement...) mais aussi de la valeur ajoutée du métabolite produit ainsi que la consasnation d'oxygène pur ; cette dernière dépendant elle-même de la concentration critique en oxygène dissous, de la durée de la phase critique, ainsi que du rendement d'utilisation de l'oxygène lié au système de fermentation. Dans certains cas, cette tenu du taux d'amélioration des performances biologiques et la valeur ajoutée des nétabolites synthétisés, le gain réalisé sur un cycle de fermentation compense largement la conscsation d'oxygène pur liée à la technique de dopage. Dans d'autres cas, cette technique n'apparaît pas fuffisament rentable et il convient, dans ce cas, de faire appel à une technique consistant à réutiliser l'oxygène qui n'aurait pas été consaeme au cours de la réaction biologique en recyclant dans le fermenteur les gaz effluents de fermentation. Au cours de la fermentation, au moins une partie de l'oxygène consommé est transformée en gaz carbonique et afin d'éviter tout effet indésirable du CO2, il a été envisagé de l'éliminer des gaz effluents en continu, avant leur recyclage dans le fermenteur. Un apport continu d'oxygène dans le système est réalisez de façon à ccseenser la quantité d'oxygène consommé au cours de la tententation et les pertes éventuelles en oxygène du système de recyclage. L'élimination du C02 se fait par piégeage par absorption ou adsorption à pression atmosphérique sur charbons actifs. Les charbons sont dans un deuxième temps régénérés à l'air. Pour pouvoir fonctionner en continu, un tel système nécessite deux colonnes d'adsorption (la première étant en phase d'adsorption, la deuxième en phase de regeneration) qui sont régulièrement interverties. C'est au cours de ces interversions que le système accuse certaines pertes en oxygène. Dans ce cas, l'utilisation d'un épurateur ne se justifie que si le microorganisme est sensible au CO2, le système d'épuration est alors dimensionne en fonction du débit de gaz à épurer mais aussi de sa concentration en CO2 et de la concentration maximale en CO2 que tolère le microorganisme. I1 existe cependant des microorganismes industriels présentant une certaine tolérance au CO2, maintenant leur activité spécifique à un niveau optimal jusqu'à une certaine concentration en CD2. Celle-ci est appelée concentration toxique au-delà de laquelle apparaissent les signes d'une inhibition (perte d'activité spécifique, chute des rendements...). L'utilisation d'un épurateur apparaît dans ce cas inutile au moins jusqu'à un certain degré d'avancement de la réaction. Ceci conduit à un taux d'utilisation de l'épurateur moine itqportant, l'investissement relatif à celui-ci ramené au toeps d'utilisation devenant alors pénalisant pour la technique. il est alors possible dans ce cas d'envisager un recyclage des gaz de fermentation, sans élimination du CO2, la concentration toxique en CO2 déterminant alors la durée de recyclage. La présente invention concerne donc d'abord un procédé de culture de microorganismes doués de tolérance à l'égard du gaz carbonique, dans un substrat nutritif soumis à une oxygénation maintenant la teneur en oxygène dissous dans le dit substrat au-dessus d'un seuil critique, selon lequel au cours d'une phase initiale de la culture, l'oxygénation est assurée exclusivement par de l'air renvoyé à l'atmosphère, tandis qu'au cours d'une phase subséquente, l'oxygénation est assure par une mise en circulation ferre de la charge gazeuse avec adjonction d'oxygène industriel pur en quantité régulée de compensation de l'oxygène console avec retrait de gaz carbonique, qui est caractérisé en ce que, pendant cette phase subséquente, on assure un dégagement systématique vers l'extérieur d'une partie excédentaire de la charge gazeuse au-dessus d'une pression de consigne et, périodiquement dès que la teneur en gaz carbonique de la dite charge gazeuse atteint une valeur critique, une purge substantielle de la dite charge gazeuse. De préférence la purge substantielle ae la charge gazeuse s'effectue au niveau du ciel gazeux du milieu de culture. L'invention concerne également une installation de culture de microorganismes, du genre comprenant une enceinte feriée formant le fermenteur, équipée d'une sonde à oxygène dissous, avec un circuit d'alimentation en gaz oxygène, incorporant une boucle de recyclage, une dérivation à l'air libre à vanne commandée, une source d'air et une source d'oxygène industriel débouchant dans le dit circuit d'alimentation incorporant un compresseur en amont du fermenteur, caractérisée par une vanne de purge asservie à un analyseur de gaz carbonique agencé sur la boucle de recyclage en aval du fermenteur. Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description qui suit, à titre d'exemple, en référence au dessin annexé dont la figure unique est une représentation schématique d'une installation selon l'invention. En se référant rraitenant à la figure, l'apport d'oxygène dans le fermenteur 1 est regulé à partir d'un signal d'oxygène dissous émis par une sonde à oxygène 2 plongeant dans le milieu de fermentation. Ce signal est trarunis à un régulateur 3 qui va déclencher ou modifier l'ouverture d'une vanne motoriste ou pneumatique 4 d'arrivée d'oxygène 21 d'origine cryogénique, ou provenant d'un système d'enrichissement par adsorption ou peeréation, permettant de maintenir la concentration en oxygène dissous au-dessus de la concentration critique. Au démarrage de la fermentation, le fermenteur est aéré par de l'air distribué au travers d'un électrovanne 5 en position ouverte, et comprimé au travers du compresseur 6 jusqu'à la pression désirée à l'entrée du fermenteur 1, les gaz de fermentation passent ensuite au travers d'un pot décanteur 7, afin de se décharger des visses qu'ils avaient pu entraîner, avant d'être évacues par une électrovanne d'échappement 8 en position ouverte, l'électrovanne 9 et le déverser 10 étant fermées. Dès que la concentration en oxygène dissous devient inférieure ou égale à la concentration critique le dispositif d'enrichissement en oxygène des gaz d'aération entre en action ainsi que le dispositif de recyclage des gaz. L'apport d'oxygène est régule de la façon precedemment décrite. Un dispositif anti-retour 11 évite tout refoulement de l'oxygène dans la canalisation d'air eliminant ainsi tout risque d'inflammation ou d'explosion. Les gaz de fermentation sont recyclés au travers de l'électrovanne 9 qui passe en position ouverte, tandis que les électrovannes 8 et 5 se fermant. Dans cette phase opératoire, il est nécessaire de prévoir, pour éviter toute montée an pression, un soutirage gazeux continu au travers d'un déverseur 10 (clapet taré, soupape à ressort, pressostat/vanne camandee...). Un analyseur de gaz carbonique 12 placé sur la conduite de recyclage permet une analyse continue de la pression partielle en gaz carbonique dans les gaz recirculés. Lorsque celle-ci atteint la valeur de consigne (légèrement inférieure à la concentration toxique), le régulateur général 13 commandant l'ensemble des vannes inverse les positions des vannes ; les vannes 8 et 5 s'ouvrent, la vanne 9 se ferme ; 1' installation se trouve alors an systt'e ouvert durant le temps nécessaire (quelques dizaines de secondes) pour purger le ciel gazeux du fermenteur du gaz carbonique qu'il contient. Le système bascule alors à nouveau en circuit ferme par l'inversion des électrovannes 8 et 5 d'une part, de l'électrovanne 9 et du déverseur 10 d'autre part. L'exesrple de réalisation donnée ci-dessous est tiré d'essais réalisés sur la fermentation gluconique par "gluconobacter axydans" en fermenteur pilote de 150 litres. Souche : Gluconcbacter oxydans Souchier Air Liquide Le milieu de fermentation contient entre 190 et 200 grammes par litre de glucose et environ 10 grammes/litre d'extrait de levure. Le PH est ajusté à environ 6,0 avant stérilisation (25 minutes à 1200C). Le fermenteur est stérilisé in situ. Le fermenteur est ensemencé à environ 15 % (vol/vol) avec un innoculum relativement concentré. Le PH de la culture est maintenu en permanence à 3,5 par addition de soude 4 N. La température est maintenue à 300C. Des essais préalables en laboratoire ont permis de déterminer une concentration critique en oxygène dissous équivalente à 30 % de la saturation à l'air soit 2,3 ppm. L'oxygène dissous est donc régulé à 35 % de la saturation. Une mesure du coefficient de transfert du fermenteur (kla) par la méthode dynamique (HUMPHREY 1966) a indiqué un kia de 90 à 100 h -1 pour des conditions d' aération/agitation représentatives de l'essai. Les essais préalables en laboratoire ont également permis d'évaluer le quotient respiratoire de la souche à environ 0,4. Plusieurs essais ont été réalisés dans ces conditions ; ils ont permis d'atteindre les performances suivantes - Concentration finale en Acide Gluconique = 199 - 203 g/1 - Temps de fermentation: 40 à 44 heures - Productivité globale : 4,5 à 5 grarrimes Acide Gluconique/litre/heure - Demande biologique maximale en oxygène : 30 mmoles d'oxygène par litre.heure correspondant à une pression partielle maximale d'O2 en entre de 35 % environ. Pendant la phase de recyclage, les cycles successifs de remise à l'air sont programmes à 30 secondes toutes les 30 minutes, de façon à ce que la pression partielle en C02 ne dépasse jamais 8 % au cours de la fermentation. L'invention s'applique à toute fermentation de microorgann:smes présentant une certaine tolérance au CO2 : nombreuses biooxydations (acide gluconique, production de dihydroxyacétone, d'acide acétique...) - production de bianasse (levures, E. Coli,...) ; - certaines productions d'antibiotiques. REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture de microorganismes doues de tolérance à l'égard du gaz carbonique, dans un substrat nutritif soumis à une oxygénation maintenant la teneur en oxygène dissous dans le dit substrat au dessus d'un seuil critique, selon lequel au cours d'une phase initiale de la culture, l'oxygénation est assurée exclusivement par de l'air renvoyé à l'atmosphère, tandis qu'au cours d'une phase subséquente, l'oxygénation est assurée par une mise en circulation fermé de la charge gazeuse avec adjonction d'oxygène industriel en quantité régulée ae canpensation de l'oxygène consommé avec retrait de gaz carbonique, caracterise en ce que pendant cette phase, an assure un déversement systematique vers l'extérieur d'une partie excédentaire de la charge gazeuse au dessus d'une pression de consigne et, périodiquement dès que la teneur en gaz carbonique de la dite charge gazeuse atteint une valeur critique, une purge substantielle de la dite charge gazeuse. 2.- Procédé de culture de microorganismes aércbiés selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purge substantielle et périodique de la charge gazeuse s'effectue au niveau du ciel gazeux du milieu de culture. 3.- Installation de culture de microorganismes du genre comprenant une enceinte fermée formant fermenteur, équipée d'une sonde à oxygène dissous, avec un circuit d'alimentation en gaz oxygéné, incorporant une boucle de recyclage, une dérivation à l'air libre à vanne camnandée, une source d'air et une source d'oxygène industriel débouchant dans le dit circuit d'alimentation incorporant un calrpresseur en amont du fermenteur, caractérisée par une vanne de purge asservie à un analyseur de gaz carbonique, agencé sur la boucle de recyclage en aval du fermenteur.