Brevet FR2617848A1 — publié le 19890113

La présente invention a pour objet des polysaccharides extraits notamment de végétaux, ainsi que des procédés pour leur extraction et leur application à titre de médicaments et d'additifs alimentaires. Ces nouvelles substances poJysaccharidiques ont la propriété d'augmenter la sécrétion de la prolactine, principale hormone de la lactation, et d'augmenter la sécrétion de la béta-caséine, principale protéine du lait, et, par voie de conséquence, augmentent la sécrétion de lait chez les animaux et les êtres humains, et sont donc susceptibles de recevoir des applications industrielles, notamment dans l'élevage des animaux et dans l'allaitement maternel de l'espèce humaine. Plus particulièrement, la présente invention concerne des polysaccharides contenant des unités correspondant au rhamnose, arabinose, xylose, mannose, galactose et glucose assurant chez les animaux et les humains une augmentation du taux de prolactine plasmatique. Ces polysaccharides sont, en outre, caractérisés en ce que leur masse moléculaire est comprise entre 104 et 106 daltons, en général entre 2.104 et 105 daltons. Ces polysaccharides contiennent, en outre, de l'azote et du soufre, en général de I à 8 % d'azote et de 0,8 à 2 % de soufre. Ces produits sont en général d'origine végétale, mais il est possible d'envisager leur synthèse ou leur hémi-synthèse à partir de produits d'origine diverse ou même une synthèse totale à partir de produits chimiques connus. L'invention concerne également des procédés de préparation de ces polysaccharides à partir de plantes contenant ces polysaccharides par extraction à l'eau chaude, les polysaccharides étant récupérés à partir de l'extrait aqueux obtenu, celui-ci pouvant éventuellement être purifié. La purification peut être effectuée par tous les procédés connus, mais en particulier il est possible de prévoir une précipitation de l'extrait aqueux à l'aide de solvants organiques miscibles à l'eau et ne dissolvant pas les polysaccharides, en particulier les solvants hydroxylés comme l'éthanol, le méthanol. 2 6 1 7 8 4 8 Il est bien entendu possible de prévoir d'autres techniques de purification telles que des fractionnements par poids moléculaires. Les produits selon la présente invention sont plus particuliè- rement extraits de plantes du genre Gossypium sp. de la famille des Malvacées et de l'espèce Euphorbia Hirta Linné de la famille des Euphorbiacées.- Le procédé de l'invention consiste essentiellement à traiter des organes végétaux de Gossypium sp., en particulier les graines réduites en poudre ou les tourteaux correspondants. Pour l'Euphorbia Hirta, c'est la plante entière qui est réduite en poudre. La poudre dégraissée ou non au préalable est extraite par de l'eau à chaud, ce qui fournit une solution aqueuse. La solution aqueuse est concentrée et traitée de différentes façons. La solution aqueuse concentrée est soit lyophilisée soit transformée en une poudre sèche par des méthodes physiques d'évaporation et de séchage. La poudre ainsi obtenue est traitée ensuite soit par de l'éthanol, soit par du méthanol, soit par d'autres solvants organiques ne dissolvant pas les polysaccharides. La solution aqueuse d'extraits totaux peut être aussi traitée par de l'éthanol ou d'autres solvants pour précipiter les polysaccharides totaux. A la fin des opérations précitées, on obtient l'ensemble des fractions polysaccharidiques galactogènes. Si nécessaire, une purification plus poussée peut être obtenue par des méthodes physiques, chimiques ou physico-chimiques de fractionnement connues: ultrafiltration, filtration sur gel, précipitation différentielle, chromatographie par affinité, par exemple. La présente invention concerne plus particulièrement les extraits totaux polysaccharidiques ainsi que les fractions de nature polysaccharidique, hautement actives, extraites du genre Gossypium sp. nommées Gossypine A et Gossypine B. Les Gossypines A et B sont caractérisées de la façon suivante Les Gossypines A et B sont des polysaccharides, de masse moléculaire comprise entre 2.104 - 105 daltons. 26 1 7 8 4 8 La Gossypine A correspond à la fraction de masse moléculaire comprise entre 2.104 et 5.104 daltons et contient 3,40 % + 0,3 d'N et 1,32 % + 0,3de S. Par hydrolyse acide, la Gossypine A fournit des mono- saccharides qui sont transformés en alditols par réduction au borohydrure de sodium. Ces monosaccharides réduits sont acétylés et analysés par la technique de chromatographie en phase gazeuse (CPG) couplée à la spectrométrie de masse (SM). La Gossypine A fournit les résultats (en analyses par CPG - SM) en pourcentage de monosaccharides Rha(*) Ara Xyl Man Gal Glu dérivé acétylé 1,1 % 5,7 % 1,5% 7,6 % 40,6 % 41,8 % 1,7 % (*) On admettra par convention que les symboles Rha, Ara, Xyl, Man, Gal, Glu représentent les dérivés réduits et acétylés des oses correspondants: Rhamnose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucose. La chromatographie en phase gazeuse est réalisée d'après les conditions suivantes Colonne capillaire en verre de longueur 25 m, de diamètre 0,32 m/m, épaisseur de film: 0,2 pim; phase: Silar 10 C, température de colonne: 220 C, température de l'injecteur: 220 C, température de l'interface: 250 C, pression de l'hélium: 0,7 Bar. La spectrométrie de -masse est réalisée à 70 eV - 0,25 pA, photomultiplicateur I 300 eV. La Gossypine B correspond à la fraction de masse moléculaire comprise entre 5.104 et 105 daltons et contient 6,7 % + 0,3 d'N et 1,32 % + 0,3 de S. Par hydrolyse acide, la Gossypine B fournit des mono- saccharides qui sont analysés sous forme de dérivés alditols, dans les mêmes conditions que dans le cas de la Gossypine A. La Gossypine B, en analyse par CPG - SM correspond au pourcentage suivant de monosaccharides Rha Ara Xyl Man Gai Glu dérivé acétylé 3,1 % 16,3% 6,1 % 2,5 % 33,9 % 33,3 % 4,8 % La présente invention concerne également les extraits et les fractions actives, galactogènes, extraites du genre Euphorbia Hirta Linné, nommées EUPHORBINE A et EUPHORBINE B. Les Euphorbines A et B sont caractérisées de la façon suivante Les Euphorbines A et B sont des polysaccharides de masse moléculaire comprise entre 3.104 et 105 daltons. L'Euphorbine A correspond à la fraction de masse moléculaire comprise entre 3.104 et 5.104 daltons et contient 3,10 % + 0,3 de N et 1,09 % + 0, 3 de S. Par hydrolyse acide, l'Euphorbine A conduit à des mono- saccharides qui sont transformés sous la forme réduite des oses. Ces monosaccharides réduits sont acétylés et analysés par la technique de chromatographie en phase gazeuse, couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM). Par CPG - SM dans les mêmes conditions que dans le cas des Gossypines A et B, l'Euphorbine A fournit les résultats suivants: Rha Ara Xyl Man Gal Glu dérivé acétylé 8,4 % 19,5 % 4,2 % 3,8 % 19,3 % 42,6 % 2,2 % L'Euphorbine B est une fraction de polysaccharide galactogène, de masse moléculaire comprise entre 5.104 et 105 daltons et contient 2,5 % + 0,3 de N et 1,1 + 0,3 de S. Par hydrolyse acide, l'Euphorbine B conduit à des mono- saccharides qui sont transformés sous la forme réduite des oses ou alditols. Les alditols obtenus sont acétylés et analysés par la technique (CPG-SM). L'Euphorbine B correspond aux résultats suivants: Rha Ara Xyl Man Gal Glu dérivé acétylé 12,7 % 25,1 % 9,5 % 9,2 % 15,8 96 19,2 % 8,4 % Les produits selon la présente invention sont plus particuliè- rement intéressants pour augmenter le taux de prolactine plasmatique chez les animaux ou chez les êtres humains. Chez les mammifères ils augmentent le taux de béta-caséTne de la glande mammaire.- Ces propriétés galactogènes peuvent être mises à profit dans l'élevage des animaux et dans l'allaitement maternel de l'espèce humaine, tant sous forme de médicament que sous forme d'additif alimentaire. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. L0 EXEMPLE I A I 000 g de plantes entières pulvérisées de Euphorbia Hirta, on ajoute 6 litres d'eau. Le mélange est porté à 90-95 C pendant minutes. On filtre, le résidu solide est traité de la même façon, deux fois de suite. Les filtrats aqueux sont réunis et concentrés à 2 litres. Cet extrait aqueux est lyophilisé. Le lyophilisat obtenu est traité par de l'éthanol à reflux pendant 5 minutes (3 fois 500 ml). La partie insoluble pèse 98,1 g et constitue l'extrait total polysaccharidique. EXEMPLE 2 A I 000 g de plantes entières pulvérisées de Euphorbia Hirta, on ajoute 6 litres d'eau, le mélange est porté à 90-95 C pendant minutes. On filtre, le résidu solide est traité de la même façon, deux fois de suite. Les filtrats aqueux sont réunis et concentrés à 0,3 litre. On y ajoute 2 litres d'éthanol et on sépare le précipité. Le précipité séché pèse 101,5 g et constitue l'extrait total polysaccharidique. EXEMPLE 3 g d'extrait total polysaccharidique de Euphorbia Hirta sont dissous dans 2 litres d'eau. On filtre, le filtrat est filtré ensuite sur membrane à perméabilité sélective, à seuil d'arrêt nominal en poids moléculaire de 3. 104 daltons. La phase aqueuse contenant des produits de masse moléculaire inférieure à 3.104 daltons est lyophilisée et fournit 21,4 g. La phase aqueuse contenant des molécules de masse moléculaire supérieure à 3.104 daltons est ultrafiltrée sur une membrane à seuil d'arrêt de 10 daltons. La phase aqueuse contenant des molécules de masses moléculaire comprise entre 3.104 daltons et 105 daltons est ultrafiltrée ensuite sur une membrane à seuil d'arrêt de 5.104 daltons. Après lyophilisation, ou nébulisation, de ces fractions on obtient 8,3 g d'Euphorbine A et 2,2 g d'Euphorbine B. EXEMPLE 4 A 10 kg de poudre de graine de Gossypium sp. on ajoute 100 litres d'eau. Le mélange est porté à 90-95 C pendant 20 minutes. On filtre. Le résidu solide est traité deux fois de suite avec 70 litres d'eau chaque fois, à 90-95 C pendant 20 minutes. Les filtrats réunis conduisent à 2,14 kg de nébulisats de polysaccharides bruts. EXEMPLE 5 A 100 g de nébulisats de polysaccharides bruts de Gossypium sp. on ajoute 500 ml d'éthanol et le mélange est porté à reflux pendant minutes. Le résidu est repris deux fois successivement avec de l'éthanol (2 x 250 ml). Le résidu insoluble dans l'éthanol (83,3 g) constitue l'extrait total polysaccharidique. EXEMPLE 6 A 10 kg de tourteaux de graines de Gossypium sp. on ajoute litres d'eau. Le mélange est porté à 90-950C pendant 20 minutes. On filtre, le résidu est traité de nouveau deux fois avec 70 litres d'eau chaque fois, à 9095 C pendant 20 minutes. Les filtrats réunis fournissent 1,91 kg de nébulisats de polysaccharides bruts. EXEMPLE 7 A 100 g de nébulisat de polysaccharides bruts de Gossypium sp. de l'exemple 6, on ajoute 500 ml d'éthanol et. le mélange est porté à reflux pendant 5 minutes. Le résidu solide est repris deux fois avec de I'éthanol (2 x 250 ml). Le résidu insoluble dans l'éthanol constitue l'extrait total polysaccharidique (90,1 g). EXEMPLE 8 g de l'extrait total polysaccharidique de Gossypium sp. de l'exemple 7 sont dissous dans 5 litres d'eau. La solution aqueuse est ultrafiltrée successivement sur une membrane à seuil d'arrêt de 10 daltons. La fraction de masse moléculaire inférieure à 105 daltons est ultrafiltrée sur une membrane à seuil d'arrêt de 5.104 daltons. La fraction de masse moléculaire inférieure à 5.104 daltons est ultrafiltrée sur une membrane à seuil d'arrêt de 2.104 daltons. Ces différentes fractions aqueuses sont lyophilisées et on obtient ainsi 295 mg de Gossypine A de masse moléculaire comprise entre 2.104 et 5.104 daltons et 208 mg de Gossypine B de masse moléculaire comprise entre 5. 104 et daltons. EXEMPLE 9 ETUDES PHARMACOLOGIQUES Activité galactogène Principe L'administration à des animaux d'un produit galactogène se traduit part: 1) une augmentation du taux de béta-caséine de la glande mammaire 2) une augmentation du taux de prolactine plasmatique. Dosage radio-immunologique de la béta-caséîne Des rates âgées de 3 mois sont réparties par lot de 4 rates. Le produit à étudier est, soit en suspension, soit en solution dans I ml d'eau, administré par gavage deux fois par jour pendant 4 jours. Au 5ème jour, les glandes mammaires des animaux sacrifiés sont prélevées pour le dosage radio-immunologique de la béta-caséine (selon la méthode de F.C. GREENWOOD, W.M. HUNTER et 3.G. GLO'.ER, Bioch. 3. (1963) 89, 114). De l'eau est administrée aux rates témoins. On évalue le rapport de la quantité de béta-caséine produite par les glandes mammaires des rates traitées et de celle produite par les glandes mammaires des rates témoins. Les résultats obtenus sont les suivants Dose/jour Produits Béta-caséTne rates traitées/ -Béta-caséine rates témoins Eau (témoin) I 400 mg produit de l'exemple 4 3 400 mg produit de l'exemple 5 4 400 mg produit de l'exemple 6 3 400 mg produit de l'exemple 7 4 mg produit de l'exemple I 2 mg Gossypine A 4 mg Gossypine B 5 mg Euphorbine A 2 10 mg Euphorbine B 4 Dosage radio-immunologique de la prolactine On dose le taux de prolactine plasmatique des brebis ayant reçu, en injection intra-veineuse, des produits à étudier, utilisant le sérum physiologique comme excipient. Des prélèvements sanguins sont effectués toutes les 10 minutes et ceci pendant une heure. Le plasma obtenu par centrifugation sert au dosage radio-immunologique de la prolactine qui est exprimée en ng par ml de sérum. Les brebis sont leur propre témoin. On dose le taux de prolactine plasmatique avant et après l'injection des produits à étudier. Les résultats, exprimés par le rapport entre 'le taux maximum de prolactine obtenue après l'injection et le taux de base obtenu avant l'injection, sont les suivants Dose/jour Produits Prolactine sérum physiologique (témoin) > 500 mg produit de l'exemple 4 4 300 mg produit de l'exemple 1 - 4 mg Gossypine A 2 mg Gossypine B 5 mg Euphorbine A 4 mg Euphorbine B 5 O 2 6 1 7 8 4 8 261784,8 RE VENDICATIONS 1) Polysaccharide contenant des unités correspondant au Rhamnose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose et Glucose assurant, en outre, chez les animaux et les humains une augmentation du taux de prolactine plasmatique. 2) Polysaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce 4 6 *que la masse moléculaire est comprise entre 10 et 10 daitons et en ce qu'il contient de l'azote et du soufre. 3) Polysaccharide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient I à 8 % d'azote et 0,8 à 2 % de soufre. 4) Polysaccharide selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polysaccharide d'origine végétale. ) Polysaccharide selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce qu'il augmente chez les mammifères le taux de béta-caséine de la glande mammaire. 6) Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi la Gossypine A la Gossypine B l'euphorbine A l'euphorbine B. 7) Procédé de préparation de polysaccharides selon l'une des revendications l à 6, caractérisé en ce qu'on effectue une extraction à l'eau chaude d'une plante contenant lesdits polysaccharides et en ce que l'extrait aqueux est recueilli et éventuellement purifié. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'extrait aqueux contenant les polysaccharides est précipité par un solvant organique miscible à l'eau et ne dissolvant pas les polysaccharides, et le précipité de polysaccharides est récupéré. 9) Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'on sépare les polysaccharides ayant un poids moléculaire compris entre 104 et 106 daltons. 26 1 7848 ) Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que les plantes traitées sont choisies parmi Euphorbia Hirta et Gossypium sp. 11) Médicament pour usage humain ou animal contenant à titre de principe actif au moins un polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 6. 12) Additif alimentaire caractérisé en ce qu'il comporte un polysaccharide selon l'une des revendications I à 6. o o