Brevet FR2611721A1 — publié le 19880909

La présente invention, concerne des dérivés de l'acide glutamique ainsi que leurs sels, Le procédé de préparation, l'application à titre de médicaments de ces dérivés et les compositions les renfermant. Des dérivés de l'acide diaminopimélique doués de proprié- tés antibactériennes ont été décrits dans la demande de brevet francais n' 2.566.410. L'invention a pour objet des dérivés de l'acide glutamique ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques ou avec les bases, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I: _O-R3 CI) Z--NH-CO-CH2-CH2- fH-COOR5 tI) Y NH-R1 dans laquelle l'acide glutamique est de configuration D ou L, R1 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé ou un peptide constitué de 2,3 ou 4 acides aminés ou un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés dont L'amine est estérifiée par un acide aliphatique saturé ou insaturé C6- C24 ou R1 représente le reste d'un acide aliphatique saturé ou insaturé C6-C24, R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, R3 représente un radical hydroxy, alkoxy C1-C5 ou un acide aminé dont l'amine peut être substituée par un radical alkyle C1-C5, z représente un groupement de formule: 0-R4 R2-NH - î-U- X dans lequel R2 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés, R4 représente un radical hydroxy, alkoxy C1-C5 ou un acide aminé dont l'amine peut être substituée par un radical alkyle C1-C5, U représente une chaîne -CH2-H-CH2-, - CH=CCH2-(E ou Z), CH2 -CH2-CH=CH-(E ou Z) ou -CH2- îH-CH2- CH3 ou U représente ensemble avec X une chaîne =CH-CH2-CH2- (E ou Z) ou U représente ensemble avec Y une chaîne -CH2-CH2-CH= (E ou Z) et X et Y représentent un atome d'hydrogène ou une liaison supplémentaire avec U. Dans la formule générale I et dans ce qui suit, L'acide aminé est de préférence un acide alpha-aminé et peut être choisi dans le groupe constitué par Ala, Val, Ival, Leu, ILe, Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, Cys, Met Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His et Pro, Nva, Nle, Hyp, Orn, ces acides étant sous la forme D ou L ainsi que par Sar et Gly, tous les acides précédemment nommés pouvant être N estérifiés ou N-alcoylés dans le cas d'un peptide comprenant 2, 3 ou 4 acides aminés, ceux-ci sont choisis dans le groupe constitué par les acides aminés ci-dessus. On admettra par convention que les symboles des acides alpha-amino carboxyliques représentent ces acides sous leur configuration D ou L (par exemple, le terme Ala signifie Alanine.sous forme D ou sous forme L). L'acide aliphatique saturé ou insaturé renferme de 6 à 24 atomes de carbone et de préférence de 12 à 22 atomes de carbone, on peut citer par exemple les acides stéarique, palmitique, laurique, caprylique, myristique, alpha ou gamma linolénique, linoléique, arachidonique ou docosopentaénoique. Le terme radical alkyle C1-C5 désigne, par exemple, les radicaux pentyle, isobutyle, butyle, isopropyle et de préférence les radicaux propyle, éthyle ou méthyle. Le terme radical alkoxy C1-C5 désigne, par exemple, les radicaux pentoxy ou butoxy, mais de préférence propoxy, éthoxy ou méthoxy. Les sels des dérivés de l'invention peuvent être formés avec des bases organiques et minérales. Parmi les bases minérales, on peut citer les hydroxydes alcalins et alcalino- terreux, tels que par exemple, les hydroxydes de sodium, de potassium, de lithium et de calcium, l'hydroxyde de magnésium ou d'ammonium. Parmi les bases organiques, on peut citer les amines alcoylées substituées ou non substituées, telles que par exemple, la triméthylamine, la méthylamine, la propylami- ne, la N,N-diméthyléthanolamine ou la tris(hydroxyméthyl) méthylamine; on peut citer également des acides aminés basiques tels que, par exemple, la lysine ou l'arginine; on peut citer encore d'autres bases telles que, par exemple, la glucosamine ou la procaine. Les sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques peuvent être, par exemple, les sels formes avec les acides chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, sulfurique, phosphori que, acétique, formique, propionique, benzoique, maléfque, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, alcane sulfoniques tels que les acides méthane ou éthane sulfoniques, arylsulfoniques, tels que les acides benzene ou paratoluène sulfoniques et arylcarboxyliques. Parmi les produits, objet de l'invention, on peut citer notamment les dérivés répondant à la formule I ci-dessus ainsi lOque leurs sels d'addition caractérisés en ce que dans ladite formule I l'acide glutamique est de configuration D. Parmi ceux-ci, on peut citer plus particulièrement les dérivés caractérisés en ce que dans ladite formule I, R3 et R4 représentent un radical hydroxy ainsi que ceux dans laquelle R5 représente un atome d'hydrogène et tout particulièrement - L'acide 2-amino 6-/ Y-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptané- dioi'que, - L'acide 2-/L-alanyLamino/ 6-/r-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptanedioique ainsi que leurs sels d'addition. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des dérivés tels que définis par la formule I ci- dessus ainsi que de leurs sels, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de l'acide glutamique de formule II: HOOC-CH2-CH2-CH-COO-Alk (II) NH-R'1 dans laquelle Alk représente un radical alkyle C1-C3 et R'1 a la signification de R1 déjà indiquée, à l'exception de l'hydrogène ou représente un groupement protecteur d'une amine, avec un dérivé de formule III COO-Alk2 COO-Alk1 R'2 - NH -C - - NH2 2 y- NtI2- s X' Y' dans laquelle U a la signification déjà indiquée, Alk1 et Alk2 représentent un radical alkyle C1-C3, X' et Y' représentent un atome d'hydrogène ou un radical -COOAlk3, Alk3 ayant la signification de Alk1 et Alk2 et R'2 représente un groupement protecteur d'une amine ou un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés dont l'amine est protégée par un groupement protecteur, pour obtenir un produit de formule IA: OO-Alk2 0OQ-Alk1 R#2-NH-- U- -NH-CO-CH2-CH2-H- COOAlk (IA) X' Y' NH-R'1 dans Laquelle R'1, R'2, Alk, Alk1, Alk2, X', Y' et U ont la signification déjà indiquée, que l'on isole et, si désiré, salifie, ou l'on soumet si nécessaire et si désiré, à l'une des réactions suivantes, dans un ordre quelconque: a) si X' ou Y' représente un radical COOAlk3: décarboxylat i on, b) déprotection des fonctions amino, c) désalkylation des fonctions carboxyles, d) amidification des fonctions amino libres par un acide aminé ou un peptide constitué de 2,3 ou 4 acides aminés dont la fonction. amino est protégée, puis déprotection de cette fonction amino, e) estérification ou salification par une base des fonctions carboxy, f) salification par un acide des fonctions amino. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le dérivé de l'acide glutamique est activé par la présence d'agents de condensation tels que le dicyclohexylcarbodiimide, le N,N'-carbonyl diimidazole ou des amides bis-alcoyliques d'acide sulfureux tels que SO-(N(CH3)2)2 ou encore par formation d'anhydride mixte avec le chloroformiate d'isobuty- le. La décarboxylation est de préférence réalisée par l'action d'un acide minéral concentré tel que l'acide chlorhydrique 12N. Une décarboxylalkylation directe peut être réalisée directement par la procédure de Krapcho. La déprotection des fonctions amino (formyle ou BOC par exemple) est réalisée de préférence par action d'un acide minéral dilué tel que l'acide chlorhydrique. La désalkylation des fonctions carboxyles est réalisée de préférence par saponification à l'aide d'une base minérale comme la potasse et notamment la soude. Elle peut, si nécessaire être opérée en deux fois au cas o elle serait incomplète. Dans ce dernier cas, la seconde désalkylation est de préférence réalisée après la déprotection des fonctions amino et/ou la décarboxylation. L'amidification des fonctions amino libres est réalisée par exemple à L'aide d'un dérivé fonctionnel tel qu'un halogénure de L'acide aminé ou du peptide, ou en présence d'un agent de condensation tel que ceux ci-dessus. L'estérification des fonctions carboxyles est réalisée par exemple dans les mêmes conditions que ci-dessus (agents de condensation). Les dérivés de formule I présentent selon le cas un caractère basique ou acide. On peut avantageusement préparer les sels d'addition des dérivés de formule I en faisant réagir en proportions sensiblement stoechiométriques, selon le cas, un acide ou une base minérale ou organique, avec ledit dérivé de formule I. Dans des conditions préférentielles l'on effectue sur le dérivé de formule IA, les opérations suivantes et dans cet ordre: - désalkylation des fonctions carboxyles, - déprotection des fonctions amino et décarboxylation, - amidification ou salification par un acide des fonctions amino et/ou estérification ou salification par une base des fonctions carboxy. Certains dérivés de formule III sont connus. lorsqu'ils ne sont pas connus, ils peuvent être préparés comme suit: on fait réagir un dérivé de formule IV: OO-Alk2 îOO-Alkl R'2 - NH - U C - OH (IV) dans laquelle Alkl, Alk2, U, X', Y' et R'2 ont la signification déjà indiquée, avec un halogénure d'alcane C1-C3 sulfonyle, de préférence le chorure de méthane sulfonyle, en présence d'un agent de condensation telle que la pyridine, puis avec un azoture alcalin comme l'azoture de sodium ou diphényl phosphoryl azide, pour obtenir un dérivé de formule V fOOALk2 OO-ALk1 R'2 - NH -I U - N3 (V) w' y# dans laquelle Alk1, Alk2, U, X', Y' et R'2 ont la signification déjà indiquée, que l'on réduit, par exemple, par action de triphénylphosphine suivie d'hydrolyse aqueuse, ou hydrogénation catalytique, par exemple en présence de palladium sur charbon empoisonné (catalyseur de Lindlar) pour obtenir le dérivé de formule III recherché. Les dérivés de formule IV et de formule II sont connus. Ils peuvent notamment être préparés comme indiqué dans les exemples. Les dérivés, objet de la présente invention, possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques, ils sont doués notamment de remarquables propriétés immunomodulatrices, notamment par activation des monocytes humaines et production de monokines telles le TNF (Tumor Necrosis factor) et l'IL1: Interleukine 1. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des dérivés de l'acide glutamique ainsi que de leurs sels, à titre de médicaments. La présente demande a ainsi également pour objet l'application, à titre de médicaments, des dérivés de l'acide glutamique, tels que définis par la formule I ainsi que de leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptables. Parmi les médicaments, objet de l'invention, on retient, de préférence les médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés de l'acide glutamique répondant à la formule I dans laquelle l'acide glutamique est de configuration D ainsi que par leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptables. Parmi ceux-ci, on retient notamment ceux répondant à la formule I dans laquelle R3 et R4 représentent un radical hydroxy ainsi que ceux dans laquelle R5 représente un atome d'hydrogène ainsi que leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptables. Parmi ces derniers, on retient tout particulièrement, les dérivés dont les noms suivent: - l'acide 2-amino 6-/ e'-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptanediolque, - l'acide 2-/L-alanylamino/ 6-/d-D-glutamyl amino/ 4méthylène heptanediolque, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Les médicaments selon l'invention trouvent leur emploi, par exemple, dans le traitement des maladies autoimmunes, qu'il s'agisse d'atteintes non spécifiques d'organes (poly arthrite rhumatoide, lupus érythémateux, anémie hémolytique, leucopénie auto-immune etc...) ou qu'il s'agisse de maladies spécifiques d'organes (thyroidite, maladie de Basedow, d'Addison, sctérose en plaques, pemphigus, rectocolite hémorragique, certaines néphropathies, etc...). Ces médicaments peuvent également être utilisés dans le traitement des hémopathies, du cancer, du sida, des affections virales et microbiennes, surtout chroniques et recurrentes (bronchite, grippe etc...); des maladies des cavités buccales, etc.. Ils peuvent constituer des adjuvants de la thérapie virale, de l'antibiothérapie ou de la chimiothérapie anticancereuse. Its trouvent également leur application dans le traitement de. nombreux déficits immunitaires secondaires ou acquis observés au cours d'affections très diverses: déficits associés aux troubles métaboliques, déficits d'origine iatrogène, (corticoides, radiations ionisantes...) déficits observés chez les grands brOlés, etc. La dose usuelle, variable selon le dérivé utilisé, le sujet et l'affection en cause peut être par exemple de 0,05 mg à 50 mg par jour. Par voie orale, chez l'homme, le dérivé de l'exemple 1 peut être administré à la dose quotidienne de 0,5 mg à 50 mg, par exemple, pour le traitement de la polyarthrite rhumatoide, soit environ de 0,007 mg à 0,7 mg par kilogramme de poids corporel. L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceu- tiques qui renferment au moins un dérivé précité ou l'un de ses sels d'addition avec Les acides pharmaceutiquement acceptables, à titre de principe actif. A titre de médicaments, les dérivés répondant à la formule I et Leurs sels d'addition avec les acides ou les bases pharmaceutiquement acceptables peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, sotides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1: Acide 2-amino 6-/J-D-gLutamyl amino/ 4-méthyLène heptanedioique. Stade A: 1-formylamino 3-méthylène 5-/N-trifLuoroacétyl Y-D- glutamyl (O-méthyl) amino/ 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyLe. On ajoute une solution de 4 g de N-trifluoroacétyl D- glutamate de 1-méthyle dans 20 cm3 de diméthoxyéthane à une solution de 5, 1 g de 5-amino 1-(formylamino) 3-méthylène 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle dans 280 cm3 de diméthyléthylamine refroidit à O"C, ajoute peu à peu 3,2 g de dicyclohexylcarbodiimide, agite pendant 16 heures à 0OC, filtre, amène à sec, reprend le résidu au diméthoxyéthane à froid, filtre, amène à sec, reprend au chlorure de méthylène, lave à l'acide chlorhydrique N, avec une solution saturée de bicarbonate de soude puis à l'eau saturée au chlorure de sodium, sèche, évapore à sec, purifie par chromatographie sur silice (éluant: acétate d'éthyle - cyclohexane 5-5) et obtient 5 g du produit attendu. //D = +8' c = 1% dans le chlorure de méthylène. STADE B: Acide 2-amino 6-/r-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptanedioique Saponification: On ajoute goutte à goutte en cinq minutes à O C, 10,9 cm3 de soude N à une solution de 1,28 g de produit du stade A dans 3520 cm3 d'éthanol, laisse revenir à température ambiante, agite pendant 24 heures, neutralise à l'aide de 0,9 cm3 d'acide chlorhydrique 12N et amène à sec sous pression réduite. Décarboxylation - Déformylation. On reprend le résidu dans 10 cm3 d'éthanol, ajoute 1 cm3 d'acide chlorhydrique 12N et agite pendant 40 minutes à 80 C. Saponification: On glace le produit ci-dessus, ajoute goutte à goutte en cinq minutes, 15,2 cm3 de soude 2N, agite pendant 24 heures à température ambiante, ramène à pH 6 à L'aide d'acide chlorhydrique 12N et amène à sec. Purification: On reprend le produit ci-dessus dans quelques cm3 d'eau, ajuste le pH à 6 à la soude N, déalcalinise sur Résine Dowex W x 8H+ (50-100 mesh), on élue d'abord à l'eau puis à l'ammoniaque N, purifie par chromatographie sur silice (éluant: éthanol - ammoniaque 95-5 puis éthanol - ammoniaque 8-2) amène à sec, reprend dans 200 cm3 d'eau, filtre, lyophitise pendant 16 heures et obtient 400 mg du produit attendu. //D = -9,5' 1 (c = 1 % dans l'acide chlorhydrique 4N). A: Préparation du N-trifluoroacétyl D alutamate de 1-méthyle. Stade 1: N-(trifluoroacétyl) D-glutamate de 5-(1,1-diméthyl éthyl) 1-méthyle. On ajoute 4,1 cm3 de triéthylamine puis en refroidissant et goutte à goutte 4,1 cm3 d'anhydride trifluoroacétique à une solution de 5,5 g de D-glutamate de 5-(1,1-diméthyléthyl) 1- méthyle dans 180 cm3 de chlorure de méthylène. On agite ensuite pendant deux heures à température ambiante, verse sur cm3 d'eau glacée, extrait au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, amène à sec et obtient 7,1 g du produit attendu. /"/D = +5 1 (c = 1,3 X dans le dioxanne). Stade 2: Préparation du N-trifluoroacétyl D-glutamate de 1- méthyle. On dissout 6,8 g du produit ci-dessus dans 50 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 50 cm3 d'acide trifluoroacétique, agite pendant une heure, amène à sec, reprend à l'acétate d'éthyle, verse sur de l'eau, extrait à l'acétate d'éthyle, lave à l'eau salée, amène à sec et obtient 5,5 g du produit attendu. //D = +9' +2 (c = 0,6% dans le dioxanne). B Préparation du 5-amino 1-Cformylamino) 3-méthylène 1l1,5- pentane tricarboxylate de triéthyle de départ de l'exemple 1. Stade I: 2-(formylamino) (2-méthyl 2-propényl) propane dioate de diéthyle. On ajoute 40 g de carbonate de potassium, 0,380 g de catalyseur éther couronne 18 crown 6 et 39,9 g de chlorométhyl propène à une solution de 30 g de formamido-malonate d'éthyle dans 300 cm3 de cyanométhyle, agite au reflux pendant 3 heures, filtre, amène à sec, refroidit à 0 -5eC, reprend dans cm3 d'éther isopropylique, filtre, lave à l'éther isopropy- lique, sèche sous pression réduite et obtient 25,2 g du produit attendu. F'72 C. Stade 2: 1-(formylamino) 5-hydroxy 3-méthylène 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle (mélange d'isomères). On ajoute goutte à goutte en dix minutes une solution de 26,5 g de glyoxylate d'éthyle dans 180 cm3 de chlorure de méthylène, à une solution de 84 g de chlorure ferrique dans cm3ode chlorure de méthylène, agite une heure, refroidit à -20'C, ajoute goutte à goutte en vingt minutes une solution de 34 g de produit tel qu'obtenu au stade A dans 180 cm3 de chlorure de méthylène et agite une heure à -20"C. On verse sur 300 cm3 d'eau glacée, extrait au chlorure de méthylène, lave avec HCl 2N puis à l'eau salée, sèche, amène à sec sous pression réduite et obtient 56,5 g du produit attendu (mélange d'isomères). F z 68 C après purification par chromatographie sur silice (éluant: acétate d'éthyle - cyclohexane 6-4). Stade 3: 5-azido 1-(formylamino) 3-méthylène 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle. On dissout 46 g du produit (mélange d'isomères) obtenu au stade 2 dans 500 cm3 de pyridine, refroidit à O à sec sous pression réduite. On dissout les 56 g de résidu obtenus dans 250 cm3 de diméthylformamide, ajoute 9,98 g d'azoture de sodium, agite 16 heures à température ambiante, élimine le solvant, reprend dans du chlorure de méthylène, lave avec une solution saturée en bicarbonate de sodium puis à l'eau salée, sèche, amène à sec et obtient 59 g de produit attendu (mélange d'isomères) que l'on purifie par chromatographie sur silice (éluant: 1 1 cyclohexane - acétate d'éthyle 8-2) pour obtenir 26 g du produit attendu. Stade 4: 5-amino 1-(formylamino) 3-méthylène 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle. On ajoute 10,9 g de triphénylphosphine à une solution de 13 g du produit ci-dessus dans 250 cm3 de tétrahydrofuranne à environ -5 C, agite 5 heures à température ambiante, ajoute 8,5 cm3 d'eau, agite 24 heures à température ambiante, évapore le tétrahydrofuranne, reprend le résidu au chlorure de méthylène, verse sur de L'acide chlorhydrique 2N glacé, extrait à L'acide chlorhydrique 2N, neutralise au bicarbonate de sodium, extrait au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, amène à sec et obtient 10 g du produit attendu. F Exemote 2: Acide 2-/L-aLanylamino/ 6-/ r-D-ulutamylamino/ 4- méthylène heDtanedioiaue. Stade A: 1-amino 3-méthylène 5-/N-trifluoroacétyl K'-D- gLutamyl (CO-méthyl) amino/ 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle. On ajoute 1,5 cm3 d'acide chlorhydrique 12N à une solution de 1,22 g de produit du stade A de l'exemple 1 dans 15 cm3 d'éthanol, agite 40 minutes à 80 C, élimine le solvant sous pression réduite, reprend le résidu dans 10 cm3 d'eau, neutralise avec du bicarbonate de sodium, extrait au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, amène à sec, purifie par chromatographie sur silice (éluant acétate d'éthyle- cyclohexane 8-2) et obtient 0,850 g du produit attendu. Stade B: 1-/N-/(1,1-diméthyLéthoxy) carbonyl/ L-alanyl amino/ 3-méthylène 5-/N-trifluoroacétyl 1-D-glutamyl (O-méthyl) amino/ 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle. On dissout 0,310 g de B.O.C-L-alanine dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne, ajoute 0,43 cm3 de triéthylamine, refroidit à 5 C environ, ajoute 0,23 cm3 de chloroformiate d'isobutyle, agite 30 minutes à +5 C environ, ajoute goutte à goutte en 5 minutes une solution de 0,800 g de produit du stade A dans cm3 de tétrahydrofuranne, laisse revenir à température ambiante et agite pendant 16 heures. On élimine le tétrahydro- furanne, reprend dans un mélange eau-chlorure de méthylène, extrait au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, amène à sec, purifie par chromatographie sur silice (éluant: 2 6 1 1721 acétate d'éthyle - cyc.lohexane 5-5) et obtient le produit attendu. //D = +12 +10 (c = 1% dans le chlorure de méthylène) Stade C: Acide 2-/L-alanylamino/ 6-/f-D-glutamylamino/4- méthylène heptanedioique. On opère comme indiqué ci-dessus au stade B de l'exemple 1, à partir de 700 mg de produit du stade B ci-dessus. Saponification, déprotection de l'amine protégée par le B.O.C, saponification, purification et obtient 170 mg du produit 1O attendu. / ExemDLe 3: Acide 2-amino 4-méthylène 6-/N-(1-oxooctadécYL) L- alanyL t-D-lLutamyl amino/ heDtandioiaue. On opère comme indiqué à l'exemple I ci-dessus, mais en utilisant le N-/N-(1-oxo octadécyl L-alanyl/ D-glutamate de 1- méthyle à la place du N-trifluoroacétyl correspondant, obtenu dans la préparation A de l'exemple 1, pour obtenir le produit attendu. /(/D = -25 c = 0,6% dans l'eau. Préparation du N-/N-(1-oxo octadécyl L-alanyl/ D-glutamate de 1-méthyle. Stade 1: N-(1-oxo octadécyl) L-alaninate de méthyle. A une solution de 10 g de chlorhydrate de L-alanine méthyl ester dans 250 cm3 de chlorure de méthylène, on ajoute 24,9 cm3 de triéthylamine, puis goutte à goutte en 30 minutes, une solution de 21,7 g de chlorure de stéaryle dans 50 cm3 de chlorure de méthylène, agite pendant deux heures 30, filtre, lave avec de l'acide chlorhydrique 2N, puis à l'eau salée, sèche, amène à sec sous pression réduite, empâte le résidu à l'éther isopropylique, essore et recristallise dans le méthanol. On obtient 22 g du produit attendu. F840C /0 Stade 2: N-(1-oxooctadécyl L-alanine. On refroidit à O C une suspension de 21 g de produit ci- dessus dans 500 cm3 de méthanol, ajoute goutte à goutte 62 cm3 de potasse N, agite pendant 16 heures à température ambiante, ajoute 500 cm3 de méthanol, agite pendant quatre heures, refroidit à OC, amène à pH 3 à l'aide d'acide chlorhydrique 2N, évapore, reprend au chlorure de méthylène, Lave à l'eau salée, sèche, amène à -sec sous pression réduite, empâte le résidu à l'éther isopropylique, essore, recristallise dans le méthanol et obtient 11,8 g du produit attendu. F 102 C. /o/D = -18' (c = 0,9% pyridine). Stade 3: N-/N-(1-oxo octadécyl) L-alanyl/ D-glutamate de 5- (1,1-diméthyl éthyle) et 1-méthyle. On refroidit à 0OC une suspension de 1,77 g de N-C1-oxo octadécyl) L-alanine et 1,08 g de D-glutamate de 5-(1,1- diméthyLéthyle) et 1-méthyle dans 170 cm3 de diméthoxy éthane, ajoute goutte à goutte en dix minutes une solution de 1,23 g de N,N-dicyclohexyl carbodiimide dans 5 cm3 de diméthoxyétha- ne, agite 3 heures à température ambiante, refroidit, filtre amène à sec, reprend dans 250 cm3 d'éther à chaud, filtre, amène à. sec sous pression réduite, empâte dans l'éther isopropylique, essore et obtient 2,4 g du produit attendu. F100' C après recristallisation dans le méthanol. //D = -32 +1 (c = 1X CH2Cl2) Stade 4: N-/N-(1-oxo octadécyl L-alanyl/ D-glutamate de 1- méthyle. On ajoute goutte à goutte 31 cm3 d'acide trifluoroacétique à une solution de 11,4 g du produit ci-dessus dans 150 cm3 de chlorure de méthylène, laisse pendant 16 heures sous agitation, amène à sec sous pression réduite, reprend au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, filtre, amène à sec sous pression réduite, cristallise, recristallise dans l'éthanol et obtient 6,8 g du produit attendu. Fz110 C. /'/D = -16 + 1 (c = 0,9 % pyridine). ExemDPle 4: acide 2-amino 6-/ -D-glutamyl amino hept-3-èn diofque. On opère comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus, mais en utilisant du 5-amino 1-formylamino 1,1,5-pent-2-èn tricarboxy- late de triéthyle, pour obtenir le produit attendu. Préparation du 5-amino 1-formylamino 2-pent-èn 1,1,5-tricarbo- xylate de triéthyle. On opère comme indiqué ci-dessus pour la préparation du 5- amino 1-(formylamino) 3-méthylène 1,1,5-pentane tricarboxylate de triéthyle, mais en remplacant le chlorométhyl propane par du bromure d'allyLe, pour obtenir le produit attendu sous forme d'une huile. Rf. = 0,4 dans l'acétate d'éthyle - éthanol 4-1. 14 2611721 Exempte 5: Acide 2-glyçylamino 6-//N-(1-oxododécyl) L-alanyl /V-D-glutamyl/ amino/ 2-heptène dioique. On opère comme indiqué aux exemples 1 et 3 en faisant réagir le N-/N-(1-oxo dodécyl L-alanyl/ D-glutamate de 1- méthyle préparé comme le N-/N-(1-oxo octodécyl L-alanyl) D- glutamate de 1-méthyle à l'exemple 3 en remplacant le stéaryle par le lauryle (dodécyle) avec le 6-amino 2-/(N-formylglycyl) amino 3-heptène dioate de 7-éthyle 1-méthyle). Dans ce cas, la déformylation par l'acide chlorhydrique n'est pas nécessaire. La neutralisation et la dessalification peuvent se faire simultanément à l'aide d'une résine H+ (Amberlyst 15). On obtient le produit attendu devenant gommeux à 150'C. /P/D = -14 (c = 0,8% dans l'eau.) PréDaration du 6-amino 2-/(Nformylalycyl) amino/ 3-heptène dioate de 7-éthyle 1-méthyle. On opère comme indiqué à la préparation B de l'exemple 1 en remplacant au stade 2, le (formyl amino) -(2-méthyl 2- propényl) propane dioate de diéthyle par te 2-/(N- formylglycylamino/ 2-(2-propényl) éthanoate de méthyle, pour obtenir le produit attendu. Rf. = 0,2 dans le mélange chlorure de méthylène - méthanol (9-1). Remarque: la réduction de l'azoture en amine (stade 4 de la préparation B de l'exemple 1) est réalisée dans ce cas par hydrogénation en présence de palladium sur carbonate de calcium et de quinoléine, au lieu de triphénylphosphine). Exemole 6: On a préparé des comprimés répondant à la formule: Acide 2amino 6-/ t-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptanedioique.................. ................. 50 mg..DTD: Excipient q.s. pour un comprimé terminé à........... 100 mg. (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). Exemole 7: On a préparé des comprimés répondant à la formule: Acide 2-/Lalanylamino/ 6-/ r-D-glutamuyl amino/ 4-méthylène heptanedioique.......... .......................... 50 mg..DTD: Excipient q.s. pour un comprimé terminé à........... 100 mg. (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). ETUDE PHARMACOLOGIQUE Stimulation des cellules monocytaires par un immunostimulant. Les cellules mononuclées du sang circulant de donneurs normaux sont séparées suivant la technique classique décrite par Boyum utilisant un gradient de Ficoll. Après lavage, les mononucléaires sont mis à incuber à 37cC pendant une heure à raison de 5.106 monocytes (cellules NSE+) par ml de milieu de culture, 5 ml par flacon de culture. Le milieu de culture utilisé dans cette expérience se compose de RPMI 1640 additionné d'antibiotiques et de tampon Hépès. Au bout d'une heure, les cellules non adhérentes sont enlevées par lavage des flacons à l'aide de milieu précédemment porté à 37C, les cellules adhérentes se composant essentiellement de monocytes (>90%) sont remises en culture en présence de différentes quantités de produits à tester dans un milieu P.B.S. (Dulbeno) sans Ca2+ niMg2+. La culture est poursuivie pendant 24 ou 48 heures et les surnageants des cellules sont alors prélevés, centrifugés, aliquotés et conservés soit à -80'C soit à -20 C. Les surnageants de culture sont remplacés, dans les flacons par la même quantité d'eau distillée apyrogène afin de lyser les cellules. Le lysat est récupéré, aliquoté et conservé également à -20'C. Les expériences suivantes ont été réalisées en présence ou en l'absence d'Interferon t(103 U/ml) à une dose o l'IFN {seul est inactif. Tests de la présence dans les surnageants de monokines (Interleukine-1 et Tumor Necrosis Factor) par leur activité biologique. Test Interleukine-1 (IL-1): Ce test a été décrit la première fois par I. Gery et Waksman en 1972 (Gery I and B.H. Waksman 1972. Potentiation of the T lymphocyte response to mitogens. II. The cellular source of potentiating mediator (s) J.Exp.Med., 136-1'43. Il est basé sur L'action co-mitogêne de l'IL-1 en présence d'un antigène (mimé par la phytohémaglutinine dans le test) sur des thymocytes de souris. 1,5 x 106 thymocytes de souris C3H/HeJ (provenant du C.S.E.A.L. d'Orléans) sont mis en culture pendant trois jours en présence de différentes dilutions de surnageants et de lysats cellulaires susceptibles de contenir de l'activité IL-1 et de PHA-P Wellcome (1leg/ml) dans des plaques de culture 96 puits fond plat, dans un volume final de 200,kl de..milieu composé de RPMI 1640 contenant outre des antibiotiques (pénicilline 1 /ml - steptomycine 1000 U/ml du tampon Hépès 1 mM de la glutamine, 2 mM 5 % de sérum de veau et 5 x 10-5M de 2-mercaptoéthanol. Au bout de 68 heures de culture, I k-Ci de thymidine tritiée est ajoutée à chaque puits (3H-méthyl-thymidine, CEA Saclay, TMM79A activité spécifique I Ci/mM), la radioactivité incorporée par les cellules est évaluée après avoir filtré les cultures sur appareil collecteur semi- automatique de type Skatron et compté les filtres dans un compteur à scintillation (LKB). Les résultats sont exprimés par la différence entre les impulsions par minutes incorporées par les cultures en présence de surnageants et les impulsions par minutes incorporées par les cultures témoins. Test Tumor Necrosis Factor (TNF): L'activité TNF est mise en évidence par la toxicité de ce facteur sur des cellules cibles L-929 (sous-clone alpha) . La technique a été sensibilisée en ajoutant dans le test de l'actinomycine D. Les cellules L sont distribuées à raison de 2 x104 cellules par puits d'une microplaque à fond plat dans 100l/l de milieu RPMI 1640 enrichi avec 5% de sérum de veau, de la glutamine, du tampon Hépès et des antibiotiques. Au bout de 24 heures, différents dilutions des surnageants à tester sont ajoutés dans un volume de 100 /A ainsi qu'une dose d'actinomy- cine D de I kg/ml. Au bout de 24 heures de culture, la quantité de cellules viables non lysées est évaluée en colorant les plaques au violet crystal et en mesurant la densité optique des différents puits sur lecteur multiscan. RESULTATS: Les produits des exemples 1 et 2 stimulent les monocytes et leur production d'IL-1 et de TNF. De plus, il y a sunergie entre les produits des exemples 1 et 2 et ['Interféron K'. 27261 1721 REVENDICATIONS 1) Les dérivés de L'acide glutamique ainsi que leurs sels d'addition avec Les acides minéraux ou organiques ou avec les bases, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I: TO-R3 Z - I - NH - CO - CH2 - CH2 - H - COOR5 (I) Y Ni dans Laquelle L'acide glutamique est de configuration D ou L, R1 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés, ou un acide aminé, ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés dont l'amine est estérifiée par un acide aliphatique saturé ou insaturé.C6-C24 ou R1 représente le reste d'un acide aliphati- que saturé ou insaturé C6-C24, R5 représente un atome d'hydro- gène ou un radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, R3 représente un radical hydroxy, alkoxy C1-C5 ou un acide aminé dont L'amine peut être substituée par un radical alkyle C1-C5, Z représente un groupement de formule: fO-R4 R2 - NH - C - U - dans lequel R2 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés, R4 représente un radical hydroxy, alkoxy C1-C5; ou un acide aminé dont l'amine peut être substituée par un radical alkyle C1-C5, U représente une chaÂne: -CH2-C-CH2- -CH=CH-CH2-(E ou Z), -CH2-CH=CH-(E ou Z) ou -CH2- H-CH2- ou U représente ensemble CH3 avec X une chaîne = CH - CH2 - CH2 -(E ou Z), ou U représente ensemble avec Y une chaîne -CH2 - CH2 - CIH= -(E ou Z) et X et Y représentent un atome d'hydrogène ou une liaison supplémentaire avec U. 2) Les dérivés de l'acide glutamique tels que définis par la formule I de la revendication 1, ainsi que leurs sels d'addition caractérisés en ce que l'acide glutamique est de configuration D. 3) Les dérivés de l'acide glutamique selon la revendication 2, 26117Z1 ainsi que leurs seLs d'addition, caractérisés en ce que R3 et R4 représentent un radical hydroxy. 4) Les dérivés de l'acide glutamique selon la revendication 2 ou 3 ainsi que leurs sels d'addition, caractérisés en ce que R5 représente un atome d'hydrogène. ) Les dérivés dont les noms suivent: - L'acide 2-amino 6-/ Jf-D-glutamyl amino/ 4-méthylène heptanedioique, - l'acide 2-/Lalanylamino/ 6-//-D-glutamylamino/ 4-méthylène heptanedioique, ainsi que leurs sels d'addition. 6) Procédé de préparation des dérivés tels que définis par la formule I de la revendication 1 ainsi que de leurs sels, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de l'acide glutamique de formule II: HOOC - CH2 CH2 - fH - COO - Alk (II) NH - R'1 dans laquelle Alk représente un radical alkyle C1-C3 et R'1 a la signification de R1 déjà indiquée, à l'exception de l'hydrogène ou représente un groupement protecteur d'une amine, avec un dérivé de formule III: 00-Alk2 COO-Alk1 R'2 - NH U - C - UNH2 XI Ys X ' Y' (III) dans laquelle U a la signification déjà indiquée, Alk1 et Alk2 représentent un radical alkyle C1-C3, X' et Y' représentent un atome d'hydrogène ou un radical -COOAlk3, Alk3 ayant la signification de Alk1 et Alk2 et R'2 représente un groupement protecteur d'une amine ou un acide aminé ou un peptide constitué de 2,3 ou 4 acides aminés dont l'amine est protégée par un groupement protecteur, pour obtenir un produit de formule IA: CIOO-ALk2 COO-Alk1 R'2 - NH -C - U - C- NH - CO - CH2 - CH2 - CH -COOAlk XI YI NH-R'I dans laquelle R'1, R'2, Alk, Alk1, Alk2, X', Y' et U ont la signification déjà indiquée, que l'on isole et, si désiré, salifie, ou l'on soumet si nécessaire et si désire, à l'une des réactions suivantes, dans un ordre quelconque: a) si X' ou Y' représente un radical COOAlk3: décarboxylation LU 6 17 2. b) déprotection des fonctions amino c) désalkylation des fonctions carboxyles, d) amidification des fonctions amino libres par un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés dont la fonction amino est protégée, puis déprotection de cette fonction amino, e) estérification ou satification par une base des fonctions carboxy, f) salification par un acide des fonctions amino. 107) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on effectue sur le dérivé de formule IA, les opérations suivantes et dans cet ordre: désalkylation des fonctions carboxyles, - déprotection des fonctions amino et décarboxylation, - amidification ou salification par un acide des fonctions - amino et/ou estérification ou salification par une base des fonctions carboxy. 8) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés de l'acide glutamique, tels que définis o20par la formule I de la revendication 1 ainsi que par leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquément acceptables. 9) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés de l'acide glutamique, tels que définis dans l'une des revendications 2 ou 3, ainsi que par leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables. ) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les dérivés de l'acide glutamique, tels que définis dans l'une des revendications 4 ou 5, ainsi que par leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptabtes. 11) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments, tels que définis à l'une des revendications 8, 9 ou 10.