Brevet FR2621780A1 — publié le 19890421

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION 1. Domaine de l'invention La présente invention concerne d'une manière générale un procédé de production d'un produit de transformation de plante ou transformant de plante. Plus spécifiquement, elle concerne un procédé pour générer une transformation des plantes par l'inter- médiaire des primordia de pousses. 2. Description de l'art antérieur Les techniques connues pour la production d'un transfor- mant de plante, utilisant la nature infectieuse de l'Agrobacterium tumefaciens dans lequel le plasmide Ti est contenu (facteur induc- teur de tumeurs) incluent la méthode d'inoculation directe Matsumoto T. et Machida I., Plant Mol. Biol. Rep. (1986) 4: 42 - 47; la méthode à disque de feuille Horch, R.B. et col., Science (1985) 227: 12 9 - 1231; et McCormick, S. et col., Plant Cell Reports (1986) 5: 81 - 84, la méthode de co-culture avec des protoplastes Marton, L. et col., Nature (1979) 277: 129 - 131; Wullems, G.T. et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 4344 - 4348 et Horsch, R.B. et col., Science (1984) 223: 496 - 498. Dans la méthode d'inoculation directe, des jeunes plantes, qui sont de préférence cultivées aseptiquement, sont percées par des aiguilles sur lesquelles adhère l'Agrobacterium tumefaciens fraîchement cultivé, pour introduire le plasmide Ti dans les cellules de plante qui sont ensuite regénérées en nouvelles plantes. Dans la méthode à disque de feuille, un disque de feuille est préparé à partir d'une feuille, en utilisant une poinçonneuse à papier, le disque est trempé dans un bouillon de culture d'Agrobacterium tumefaciens pour introduire un gène exogène dans le plasmide Ti dans les cellules de plantes, et les cellules de plantes transformées sont ensuite regénérées en une nouvelle plante. Bien que les procédés des deux méthodes mentionnées ci- dessus soient simples, ces méthodes sont désavantageuses en ce que la formation du cal et la regénération d'une plante à partir du cal prennent beaucoup de temps. 2 2621780 Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus dans lesquelles un tissu de plante est infecté d'Agrobacterium tumefa- ciens, dans la méthode de co-culture avec des protoplastes, les protoplastes sont infectés par l'Agrobacterium tumefaciens. Les protoplastes sont préparés à partir de cellules de feuille ou de ceLlules de plantes de culture, les protoplastes sont incubés jusqu'au moment de la division cellulaire, et en ce point, les cellules d'Agrobacterium tumefaciens sont ajoutées à la culture de protoplastes, et les cellules microbiennes et les protoplastes de plantes sont co-cultivés pour introduire le plasmide Ti des cellules microbiennes dans les protoplastes de plantes. Bien que cette méthode fournisse un grand nombre de transformants, les conditions de culture des protoplastes et de regénération de plantes diffèrent fortement selon les espèces ou les variétés de plantes auxquelles cette méthode est appliquée, et ainsi, cette méthode ne peut être utilisée que pour des types limités de plantes. Par exemple lorsque cette méthode doit être appliquée aux plantes ligneuses, elle ne peut être appliquée qu'à un très petit nombre de plantes, incluant par exemple le peuplier et le citronier. Récemment, divers procédés pour la propagation des plantes ont été développés. Par exemple, pour la propagation des plantes annuelles autres que les plantes ligneuses, une méthode de "primordium de pousse" a été proposée (Tanaka R. et Ikeda H., Jpn. J. Genet. Vol. 58, 65-70, 1983; publication de brevet japonais non examinée n 59-132822; et publication de brevet japonais non examinée n 59-132823). La méthode de "primordium de pousse" est appliquée aux plantes annuelles telles que pastèque, mais, riz, volubilis des jardins, Swertia, Papaver et analogues, et est égale- ment applicable aux plantes ligneuses vivaces telles que peupliers et eucalyptus (publications de brevets japonais non examinées oo n 61-64800 et n 62-55020). Néanmoins, l'application de la méthode de primordium de pousse à la transformation de plantes utilisant comme médiateur le plasmide Ti, c'està-dire un procédé pur la transformation des plantes comprenant une combinaison de la méthode de primordium de pousse et la méthode au plasmide Ti n'est pas connue. SOMMAIRE DE L'INVENTION En conséquence, la présente invention fournit un procédé de production d'un transformant de plante utilisant une combinai- son de la méthode de primordium de pousse et la méthode de trans- formation à médiateur plasmide Ti, ledit procédé peut être conduit facilement, peut être appliqué à divers types de plantes, et peut fournir un grand nombre de plantes transformées en un temps court. Plus spécifiquement, la présente invention fournit un procédé de production d'un transformant de plante comprenant les étapes suivantes: (1) préparation d'une masse de primordium de pousse à partir d'une plante à transformer; (2) division de la masse de primordium en petites sections; (3) co-culture des petites sections de la masse de primor- dium de pousse avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens, dans un milieu liquide, pour transformer les primordia de pousse avec le plasmide Ti contenu dans les cellules d'Agrobacterium tumefaciens; et (4) regénération d'une nouvelle plante à partir de la masse transformée de primordium de pousse. La présente invention concerne également un procédé de production d'un transformant de plante comprenant les étapes suivantes: (1) préparation d'une masse de primordium de pousse à partir d'une plante à transformer; (2) division de la masse de primordium de pousse en petites sections; (3) culture des petites sections de la masse de primordium de pousse dans un milieu liquide, sous agitation, pour préparer une masse de primordium de pousse; (4) division de la masse de primordium de pousse obtenue dans l'étape (3) en petites sections; 4 262 1 78 0 (5) co-culture des petites sections de la masse de primor- dium de pousse obtenue dans l'étape (4) avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens, dans un miLieu liquide, pour transfor- mer les primordia de pousse avec le plasmide Ti contenu dans Les cellules d'Agrobacterium tumefaciens; et (6) regénération d'une nouvelle plante à partir de la masse transformée de primordium de pousse. Le nouveau procédé de la présente invention présente les avantages suivants sur les procédés conventionnels: (1) les techniques conventionnelles selon lesquelles des parties d'une plante sont infectées d'Agrobacterium tumefaciens, c'est-à-dire la méthode d'inoculation directe et la méthode à disque de feuille, ne peuvent pas être appliquées aux plantes ayant une faible capacité de régénération, car ces méthodes mettent en oeuvre la formation de cal et la régénération d'une plante à partir de ce cal. Toutefois, la présente invention peut être appliquée à un très large éventail de plantes et elle isole et fixe complè- tement le transformant, car la capacité de regénération d'une masse de primordium de pousse est suffisamment supérieure à celle des techniques conventionnelles pour produire les transformants. (2) Etant donné que le procédé conventionnel, selon lequel des cellules simples ou de protoplastes sont infectées par l'Agrobacterium tumefaciens, comme dans la méthode de co-cultureavec les protoplastes, doit utiliser les étapes essentielles de forma- tion de colonies, de formation de cal, et de formation de pousse à partir du cal, le procéde entier demande un temps long. Au contraire, étant donné que le présent procédé, selon lequel les primordia de pousse sont infectés d'Agrobacterium tumefaciens, ne nécessite pas l'emploi des étapes mentionnées ci-dessus, les plantes transformées peuvent être isolées et fixées efficacement en un temps court. DESCRIPTION BREVE DES DESSINS La figure 1 montre de petites sections préparées par division fine d'une masse de primordium de pousse de Populus charkowiensis X P. caudia, OP-20; 262 1 780 la figure 2 montre une masse de primordium de pousse de PopuLus charkowiensis X P. caudia, OP-20 transformée par l'Agrobacterium tumefaciens et cultivée dans un milieu exempt d'hormone; o5 la figure 3 montre une masse non transformée de primordium de pousse de Populus charkowiensis X P. caudia OP-20 cuLtivée dans un milieu exempt d'hormone; la figure 4 montre les pousses transformées de Populus charkowiensis X P. caudia, OP-20 regénérées à partir de la masse transformée de primordium de pousse qui est sélectionnée dans un milieu additionné de kanamycine; et la figure 5 montre des pousses transformées de Crepis capillaris regénérées à partir de la masse transformée de primor- dium de pousse qui est sélectionnée dans un milieu additionné de kanamycine. DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES Conformément à la présente invention, une plante herbacée ou une plante ligneuse est utilisée pour préparer une masse de primordium de pousse qui est ensuite finement divisée en petites sections, ou éventuellement, les petites sections résultantes sont cultivées en plus dans un milieu liquide pour former une masse de primordium de pousse qui est à nouveau finement divisée en petites sections. Les petites sections de la masse de primordium de pousse ainsi préparées sont ensuite co-cultivées avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens pour transformer les cellules des sections de primordium de pousse avec un plasmide Ti comprenant la région T dans laquelle un gène exogène a été inséré. La masse transformée de primordium est ensuite regénérée en une plante transformée. Les plantes auxquelles on peut appliquer la présente méthode incluent, sans y être limité, les suivantes: arbres à larges feuilles persistantes tels qu eucalyptus, acacia, caoutchouc et caféier; arbres à larges feuilles caduques tels que peuplier, paulownia, Quercus, chêne, arbres à laques japonais; conifères tels que pin, cèdre japonais, cyprès japonais, sapin, 262 1 780 sapinette, mélèze japonais; plantes à fruits telles que oranger, citronier, pommier, poirier, avocat, kiwi, kaki, noyer, vigne, figuier, amandier et manguier; et des arbustes ou arbres à fLeurs tels que rosier, camélia, abricotier japonais et cerisier. En outre, en addition aux plantes ligneuses mentionnées ci-dessus, on peut appliquer la présente méthode aux plantes herbacées par exemple du type à fleurs, telles que petunia et cosmos; et plantes de culture telles que tabac, lin, riz, blé, tomate, épinard et soja. Préparation d'une masse de primordium de pousse Des morceaux de pousses sont prélevés d'une plante à transformer, stérilisés dans une solution de stérilisation, et lavés à fond par de l'eau stérile. Sous un stéréo-microscope, les extrémités de pousses contenant une paire de primordium de feuille et ayant une longueur d'environ 0,5 mm sont prélevées aseptiquement des morceaux de pousse stérilisés, et les extrémités des pousses sont transplantées dans un milieu liquide artificiel contenant des sels minéraux, des sels organiques et des hormones de croissance de plantes. La composition des sels minéraux et organiques contenue dans le milieu liquide artificiel varie selon le type de plante à traiter, mais fondamentalement est constituée d'un milieu de Gamborg B5 (en abréviation milieu B5 ci-après), ou un milieu de Murashige-Skoog (en abréviation milieu MS ci-après). Les hormones de croissance de plantes incluent les auxines telles que l'acide naphtalene acétique (NAA), l'acide 2,4dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l'acide indole-3-acétique (IAA), l'acide indole-3-propio- nique (IPA), l'acide indole-3-butylique (IBA), l'acide phénylacé- tique (PAA), l'acide benzofuranne-3-acétique (BFA), l'acide phényl- butylique (PBA) et analogues; et les cytokinines telles que la 6benzylaminopurine (également dénommée benzyladénine) (BA), la kinétine, KT-30 (Kyowa Hakko, Japon), la zéatine et analogues. La culture est conduite sur un tambour giratoire placé obliquement à une température constante de 15 C à 30 C, de préfé- rence de 25 C à 30 C. A une température inférieure, la propagation est retardée; et à une température trop élevée, la croissance est médiocre et instable. L'éclairage est conduit, de préférence d'une manière continue, à un éclairement de 2000 à 20 000 lux utilisant une lampe fluorescente. Un éclairement supérieur ou inférieur a un effet adverse sur la croissance de la masse de primordium de pousse. La méthode de culture sur un tambour giratoire est essentielle pour assurer une croissance suffisante de la masse de primordium; c'est-à-dire une culture sur plaque de gélose produit seulement une croissance médiocre de la masse de primordium de pousse. Pour la culture, par exemple, un appareil de culture (Nippon Ika Kikai Seisakusho, Japon) ayant un tambour giratoire d'un diamètre d''environ 100 cm est utilisé. Des tubes à essai contenant un milieu dans lequel une extrémité de pousse est trans- plantée sont attachés au-tambour giratoire d'une manière telle que les tubes soient parallèles à l'axe de rotation du tambour, et fassent face dans la même direction durant la rotation du tambour giratoire. Les tubes sont éclairés par le haut. La vitesse de rotation du tambour giratoire est de préférence aussi faible que 1 à 10 tr/min, car une vitesse de rotation trop élevée donne une grande quantité de cals, et une vitesse de rotation trop faible donne une grande quantité de branchages précoces, conduisant tous les deux à une masse médiocre de primordium de pousse. La masse de primordium de pousse est obtenue comme décrit précédemment, et éventuellement, la masse de primordium de pousse ainsi préparée prolifère comme suit: la masse de primordium de pousse est homogénéisée dans un homogénéiseur à 10 000 à 000 tr/min pendant 5 à 20 s dans une solution de lavage, pour préparer de petites sections de la masse de primordium de pousse, et les petites sections sont lavées de 1 à 5 fois dans la solution de lavage. La solution de lavage est un milieu de Gamborg B5 ou un milieu de Murashige-Skoog, supplémenté avec une auxine telle que l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l'acide naphtalène acétique (NAA), l'acide indole-3-acétique (IAA) ou analogues, et une cytokinine telle que benzyladénine (BA), la kinétine, KT-30, la zéatine ou analogues, et supplémenté en outre par du saccharose. 2 6 2 1 7 8 0 Les petites sections de la masse de primordium de pousse préparées comme décrit précédemment sont éventueLlement transplan- tées dans un milieu comme décrit précédemment et-sont cultivées sur une secoueuse rotative pendant 12 à 16 h à une température de 200C à 30 C, sous un éclairage ayant un éclairement de 5 000 à 000 lux, en utilisant une lampe fluorescente, et avec secouage à à 100 tr/min, pour obtenir une grande quantité d'une masse de primordium de pousse. Le procédé de prolifération de la masse de primordium de pousse est décrit en plus ample détail dans la o demande de brevet japonais n 62-204269. Co-culture d'une masse de primordium de pousse avec l'Agrobacterium tumefaciens Les souches d'Agrobacterium tumefaciens utilisées pour la présente invention sont par exemple la souche C58 qui est une souche du type sauvage, provoque la formation d'une galle en couronne et fait croître une cellule de plante sur un milieu exempt d'hormone et le LBA4404 qui est une partie du système de fusion de gène Gus commercialisé par les laboratoires Clontech, Inc. EUA. Dans l'emploi du système de fusion de gène Gus, des cellules transformées sont capables de croître sur un milieu contenant de la kanamycine. La souche C58 est décrite par Depicker et col., Molec, Gen. Genel. 188, 425(1982), et déposée chez ATCC avec le n 3397D. L'Agrobacterium tumefaciens est stocké et cultivé par un procédé conventionnel. Par exemple, l'Agrobacterium tumefaciens est stocké à 50 C à -80 C, et au moment de l'emploi, les cellules stockées sont inoculées sur un milieu à plaque de gélose ayant une composition conventionnelle pour la culture bactérienne, pour former des colonies simples. Les cellules provenant de la colonie simple sont ensuite inoculées dans un milieu liquide, et cultivées pendant environ un ou deux jours, sous secouage, à une température de 25 C à 30 C. Le bouillon de culture est ensuite centrifugé pour séparer les cellules de culture de A. tumefaciens, qui sont ensuite éventuellement lavées. Les cellules bactériennes sont ensuite ajoutées, par exemple, à une concentration de 106 - 109/ml, à un milieu contenant les petites sections de la masse de primordium de pousse préparées 262 1780 comme décrit précédemment, et La co-cutlure des sections de primordium de pousse avec Les celLules de A. tumefaciens est conduite à 20 C à 30 C pendant environ 48 h, sous secouage à 50 à tr/min, pour transformer les primordia de pousses avec Le plasmide Ti contenu dans les cellules bactériennes. Le milieu utilisé pour la co-cuLture est habituellement un milieu Gamborg B5 ou un milieu Murashige-Skoog supplémenté par une auxine telle que l'acide naphtaLène acétique (NAA), l'acide 2,4-dichlorophénoxyacé- tique (2,4-D), l'acide indole-3-acétique (IAA) ou analogues et une cytokinine telle que benzyladénine (BA), KT-30, kinétine, zéatine ou analogues. Sélection d'une masse transformée de primordium de pousse Après la co-culture, les antibiotiques tels que vancomy- cine, carbénicilline, tétracycline et/ou ampicilline sont ajoutés à La culture, et le tout incubé à une température de 20 C à 30 C pendant 2 à 14 jours. Après l'incubation, une masse de primordium de pousse est transférée au milieu B5 ou MS exempt d'hormone dans le cas de co- culture avec la souche C58, et dans un milieu B5 ou MS additionné de kanamycine dans le cas de co-culture avec la souche LBA4404. Les deux sont cultivés à une température de 20 C à 30 C pendant 7 à 14 jours, sous un éclairage ayant un éclairement lumineux de 3 000 à 5 000 lux, utilisant une lampe fluorescente, sous secouage à 50 à tr/min. Durant cette culture, seule la masse transformée de primordium de pousse poussera; la masse non transformée de primordium de pousse est réduite en dimension et souffre d'un changement de coloration du vert au brun. En conséquence, la masse transformée de primordium de pousse est facilement sélectionnée, en raison de la différence de taille et de couleur. Regénération d'une plante à partir d'une masse transformée de primordium de pousse divisée à partir d'une co-culture avec le LBA4404 La masse de primordium de pousse dont la croissance et la sélection ont été décrites ci-dessus est transférée dans un milieu liquidede formationdepousse, ayant une composition similaire à celle utilisée pour la formation d'une masse de primordium de pousse pour l'addition de la kanamycine, et cultivée sur une plaque de géLose à C à 30 C, sous un éclairage ayant un éclairement de 1 000 à 4 000 lux, pendant 20 à 30 jours, pour former un grand nombre de petites pousses. Ensuite, les pousses sont séparées et transférées dans un milieu de formation de racine, dans lequel les pousses forment des racines, et ainsi, les petites plantes entières sont obtenues. Il est à noter qu'une période d'environ trois mois doit s'écouler entre le début de la culture sur plaque de gélose avant la formation d'une plante entière. Il est à noter que dans certains cas, la masse transformée de primordium de pousse contient, en plus du transformant, des primordia de pousses non transformés. Dans ce cas, un procédé de sélection indivicduelle conventionnel doit être conduit pour éliminer les plantes non transformées. La présente invention sera illustrée ci-après par l'exemple suivant sans y être limitée. Exemple 1 Plante utilisée pour l'expérience: Populus charkowiensis X P. caudia, OP20 Agrobacterium utilisé pour l'expérience souche C58 Préparation des primordia de pousses Des morceaux de pointes ayant une longueur d'environ 20 mm sont découpés d'une branche verte d'un peuplier à croissance active et stérilisés par de l'éthanol à 70 % pendant 5 min, avec une solution d'hypochlorite de sodium diluée à 7 fois pendant 15 min, et ensuite lavés par de l'eau stérilisée. Ensuite, dans des conditions aseptiques, les pointes de pousses incluant une pointe de crois- sance et ayant une longueur d'environ 0,5 mm sont prélevées sur les morceaux stérilisés, en utilisant des pinces et un scalpel chirur- gical sous un stéréomicroscope. Les bouts de pousses séparés sont ensuite transplantés dans le milieu de Gamborg ayant la composition mentionnée dant le tableau 1. 2 6 2 1 7 8 0 Tableau 1 MiLieu pour peuplier Composant Concentration (mg/l) NaH2PO4,H20 150 KNO3 2 500 (NH4)2S04 134 MgSO 47H2 250 4' 25 CaCL 22H20 150 2' 215 Fe-EDTA 40 MnSO 4,4H20 10 4' 2 H3BO3 3 ZnSO 47H20 4' 2 -2 Na2MoO4' 2H20 0,25 CuSO4,5H20 0,025 CoCl2,6H20 0,025 KI 0,75 acide nicotinique 1 thiamine-HCl 10 pyridoxine-HCl 1 myo-inositol 100 saccharose 30 000 acide naphtalène acétique 0,05 6-benzylaminopurine 0,4 pH 5,6 Le milieu de base est le milieu de Gamborg B5 La culture est conduite dans 25 ml du milieu du tableau 1 dans un tube à essai ayant un diamètre de 30 mm et une longueur de 12 22 61780 mm, à une température de 28 C, une intensité d'éclairage de 2 000 à 20 000 lux, et une vitesse de rotation de 2 tr/min. Au 40ème jour à partir du début de la culture, une masse verte de primordium de pousse ayant un diamètre d'environ 10 mm est obtenue. Au bout de trois semaines, la masse en croissance de primordium de pousse est divisée en masse de primordium de pousse ayant un diamètre d'environ 5 à 10 mm et la masse divisée de primordium de pousse est transpLantée sur un milieu franchement préparé ayant la même composition que celle décrite précédemment et cultivée pendant deux semaines. A la masse en prolifération de primordium de pousse, on ajoute, en quantité de 15 ml pour 1 g de la masse de primordium de pousse, une solution de lavage qui comprend le milieu décrit dans le tableau 1. Le tout est ensuite homogénéisé dans un homogénéiseur à 20 000 tr/min pendant 10 s, pour préparer de petites sections ayant une taille d'environ 1 mm à partir de la masse de primordium de pousse. L'homogénéisat est filtré à travers une toile de Nylon pour récupérer ces petites sections, qui sont ensuite lavées à deux reprises par la solution de lavage. A 1 g de ces petites sections lavées de la masse de primordium de pousse, on ajoute 100 ml du milieu mentionné ci- dessus et le mélange est placé dans un flacon conique de 500 ml. La culture est conduite à 27 C, pendant une photopériode de 12 h à un éclairement de 10 000 lux avec secouage à 100 tr/min. Une photo- graphie de la culture est montrée à la figure 1. Co-culture de petites sections de la masse de primordium de pousse avec des cellules de A. tumefaciens (souche C58) Des cellules d'Agrobacterium tumefaciens C58 stockées à -80 C sont inoculées sur un milieu de Lennox (peptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCL 10 g/l, gélose 15 g/l, pH 7,2), et cultivées à 28 C sous un éclairage à un éclairement de 3 000 lux pour former des colonies. Une seule colonie est sélectionnée et inoculée à 50 ml d'un milieu liquide ayant la même composition que celle décrite précédemment, sauf que la gélose n'est pas ajoutée, dans un flacon conique de 500 ml, et cultivée une nuit à 28 C. Le bouillon de culture est centrifugé à 4 600 tr/min pendant 10 min 13 2621780 pour séparer les cellules de culture, qui sont ensuite mises en suspension à une concentration de 2 x 108 cellules/ml. 2 ml de la suspension bactérienne sont ajoutés à 100 ml de la masse de la culture de primordium de pousse comme décrit précé- demment, et la co-culture est conduite pendant 48 h à 28 C sous secouage à 100 tr/min. Sélection d'une masse transformée de primordium de pousse La co-culture préparée comme décrit précédemment est filtrèe pour récupérer la masse de primordium de pousse, qui est ensuite lavée. La masse de primordium de pousse est ensuite cultivée dans un milieu qui est le même que le milieu mentionné précédemment (tableau 1), sauf que 250 mg/L de vancomycine et mg/l de carbénicilline sont ajoutés à 25 C pendant 10 jours avec secouage à 100 tr/min. Ensuite, la masse de primordium de pousse ainsi obtenue est transférée sur un milieu, qui est le même que le milieu mentionné ci-dessus (tableau 1), sauf que les hormones sont omises (milieu exempt d'hormone), et cultivée pendant 20 jours à 28 C sous un éclairage avec un éclairement de 5 000 Lux sous secouage à 200 tr/min. Comme résultat, il se produit une croissance remarquable de la masse transformée verte de primordium de pousse. Une photo- graphie de la masse transformée de primordium de pousse est montrée à la figure 2. Au contraire, la masse non transformée de primordium de pousse ne croit pas dans le milieu exempt d'hormone mentionné ci-dessus, et souffre d'un changement de coloration du vert au brun. En conséquence, la masse transformée de primordium de pousse est facilement sélectionnée en raison de la différence de couleur et de dimension. La figure 3 est une photographie montrant la masse non transformée de primordium de pousse cultivée dans le milieu exempt d'hormone. 14 262 1780 Exemple 2 Plante utilisée pour l'expérience: Populus charkowiensis X P. caudia, OP20 Agrobacterium utilisé pour l'expérience: souche LBA4404 (contenant le plasmide pB1121 sur lequel est placé le gène résistant à la kanamycine) Préparation des primordia de pousse Pour la préparation d'une masse de primordium de pousse, on répète le même procédé que celui décrit à l'exemple 1. Co-culture de petites sections d'une masse de primordium de pousse avec des cellules de A. tumefaciens (souche LBA4404) La culture des petites sections est conduite conformément au même procédé que celui décrit à l'exemple 1. Sélection d'une masse transformée de primordium de pousse La co-culture préparée comme décrit précédemment est filtrée pour récupérer la masse de primordium de pousse qui est ensuite lavée. La masse de primordium de pousse est ensuite cultivée dans un milieu, qui est le même que celui (du tableau 1), sauf pour l'addition de 500 mg/l de carbénicilline et de 50 mg/l de kanamycine à 250 pendant 14 jours, sous secouage à 100 tr/min. Regénération d'une masse sélectionnée de primordium de pousse La masse transformée de primordium de pousse est susceptible de croître sur un milieu additionné de kanamycine mais la masse non transformée de primordium de pousse n'est pas suscep- tible de croître sur le même milieu et sa couleur vire au brun dans ce milieu. La masse transformée de primordium de pousse est transfé- rée sur le milieu de regénération qui est le même que le milieu de sélection, sauf pour la concentration hormonale et l'addition de gélose (0,6 %). La concentration hormonale du milieu de regénéra- tion est de 0,02 mg/l de NAA et de 0,02 mg/l de BA. Les pousses transformées sont regénérées de la masse transformée de primor- dium de pousse au bout de 20 jours de culture. La figure 4 est une photographie montrant la regénération des pousses transformées. 0 I262178 o Exemple 3 Plante utilisée pour l'expérience: Crepis capillaris Agrobacterium utilisé pour l'expérience: souche LBA4404 (contenant le plasmide pB1121 sur lequel est placé le gène résistant à la kanamycine). Préparation des primordia de pousse Une masse de primordium de pousses de Crepis est préparée selon la littérature (Tanaka, R. & H.Ikeda, Jpn. J. Genet., (1983) 58: 65 - 70; publication du brevet japonais non examinée 59-132822). Co-culture de petites sections d'une masse de primordium de pousses avec des cellules de A. tumefaciens (souche LBA4404) La culture est conduite conformément au même procédé que celui décrit à l'exemple 1, sauf pour la composition du milieu. Sélection d'une masse transformée de primordium de pousses La co-culture préparée comme décrit précédemment est filtrée pour récupérer la masse de primordium de pousse, qui est ensuite lavée. La masse de primordium de pousse est ensuite cultivée dans un milieu, qui est le même que le milieu (tableau 2), sauf pour l'addition de 500 mg/l de carbénicilline et de 50 mg/l de kanamycine, à 25 0C pendant 4 jours, sous secouage à 100 tr/min. Tableau 2 Milieu pour Crepis Composant Concentration (mg/l) KH2PO4 170 KNO3 1 900 NH4N03 1650 MgSO4,7H20 370 CaCL2,2H20 440 MnSOV4 H2 22,3 H 3BO3 6,2 H3B3 16 2 6 21 80 Tableau 2 (suite) Composant Concentration (mg/l) ZnSO4,7H20 8,6 Na2MoO4, 7H20 0,25 CuSO4,5H20 0,025 CoCL2,6H20 0,025 KI 0,83 FeSO4,7H20 27,8 Na 2EDTA 37,8 acide nicotinique 0,5 thiamine-HCl 1 pyridoxine-HCl 0,5 glycine 2 myo-inositol 100 saccharose 30 000 acide naphtalène acétique 0,5 6-benzylaminopurine 0,5 pH 5,6 milieu de base: milieu de Murashige et Skoog Regénération depuis une masse sélectionnée de primordium de pousse La masse transformée de primordium de pousse est suscep- tible de croître sur un milieu additionné de kanamycine, mais la masse non transformée de primordium de pousse n'est pas susceptible de croître sur le même milieu et sa couleur vire au brun dans ce milieu. La masse transformée de primordium de pousse est transfé- rée au milieu de regénération qui est le même que le milieu de sélection, sauf pour la concentration hormonale et l'addition de 17 0 I262178 o0 gélose (0,6 %). La concentration hormonale du milieu de regénéra- tion est de 0,02 mg/l de BA. Les pousses transformées sont regéné- rées à partir de la masse transformée de primordium de pousse après 14 jours de culture. La figure 5 est une photographie montrant la regénération des pousses transformées. Comme décrit précédemment, le procédé pour La regénération d'un transformant de plante conformément à la présente invention peut être appliqué à divers types de plantes, d'une manière simple et avec un rapport de transformation supérieur, en comparaison des méthodes de transformation conventionnelles, et est original et très utile. 262 1 780 REVENDICATIONS 1. Un procédé de production d'un transformant de plante, caractérisé en ce qu'iL comprend les étapes suivantes: (1) préparation d'une masse de primordium de pousse à partir d'une plante à transformer; (2) division de la masse de primordium de pousse en petites sections; (3) co-culture des petites sections de la masse de primordium de pousse avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens dans un milieu liquide pour transformer les primordia de pousse avec un plasmide Ti contenu dans les cellules d'Agrobacterium tumefaciens; et (4) regénération d'une nouvelle plante à partir de la masse transformée de primordium de pousse. 2. Un procédé de production d'un transformant de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (1) préparation d'une masse de primordium de pousse à partir d'une plante à transformer; (2) division de la masse de primordium de pousse en petites sections; (3) culture des petites sections de la masse de primordium de pousse dans un milieu liquide, sous secouage, pour préparer une masse de primordium de pousse; (4) division de la masse de primordium de pousse obtenue dans l'étape (3) en petites sections; (5) co-culture des petites sections de la masse de primor- dium de pousse obtenues dans l'étape (4) avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens dans un milieu liquide pour transformer les primordia de pousse avec le plasmide Ti contenu dans les cellules d'Agrobacterium tumefaciens; et (6) regénération d'une nouvelle plante à partir de la masse de primordium de pousse transformée. 3. Un procédé de production d'un transformant de plante, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la co-culture 262 1780 est conduite pendant 24 à 48 h à une température de 20 C à 30 C sous secouage à 50 à 100 tr/min. 4. Un procédé de production d'un transformant de plante, selon La revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu liquide pour la coculture est un milieu de Gamborg B5 ou un milieu de Murashige-Skoog supplémenté avec des hormones de plantes. 5. Un procédé de production d'un transformant de plante, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu liquide de coculture est un milieu de Gamborg B5 ou un milieu de Murashige-Skoog supplémenté par une auxine et la cytokinine. 6. Un procédé de production d'un transformant de plantes selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit procédé comprend également, entre les étapes de co-culture et de regéné- ration d'une plante, l'étape d'élimination des cellules bactérien- nes par incubation de la masse transformée de primordium de pousse dans un milieu contenant des antibiotiques. 7. Un procédé de production d'un transformant de plantes selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, entre l'étape de co-cuLture et l'étape de regénération d'une plante, l'étape pour éliminer la masse non transformée de primordium de pousse par incubation de la masse de primordium de pousse provenant de l'étape de coculture dans un milieu exempt d'hormone ou dans un milieu additionné de kanamycine.