Brevet FR2621597A1 — publié le 19890414

PROCEDE DE CLONAGE ET D'EXPRESSION DE GENES CODANT POUR DES PROTEINES CONSTITUANT DES EDIFICES FONCTIONNELS ORGANISES L'invention a pour objet un procédé de clonage et d'expression de gènes codant pour des protéines cons- tituant des édifices fonctionnels organisés. Un très grand nombre de gènes actifs codent pour des protéines dont les activités s'exercent, ou sont inhibées, à la suite d'interactions avec les protéines spécifiées par d'autres gènes. Ces systèmes multiprotéi- ques sont le plus souvent des systèmes homologues c'est- à-dire dérivés d'un même organisme. Ils peuvent être parfois hétérologues et sont formés de protéines inter- agissant entre elles, mais provenant d'organismes dif- férents. Les principales méthodes de clonage connues à ce jour permettent l'intégration d'une seule unité étrangère ou d'une suite contiguë d'unités, que l'on détectera après clonage. Cependant, elles ne sont pas utilisées pour le clonage de plusieurs unités génétiques ayant une parenté fonctionnelle, mais qui peuvent n'avoir aucune parenté, ni par leur position d'origine dans un chromosone, ni même de parenté d'organisme d'origine. Il existe bien des dispositifs variés mettant simultanément sur une unité réplicative des gènes d'origines diverses; c'est le cas par exemple d'un gène clone, considéré en même temps qu'un gène de résistance à un antibiotique sur un plasmide de clonage. Mais il s'agit là d'une association contingente, qui n'implique aucune parenté fonctionnelle entre les gènes étudiés. Il existe aussi des opérons qui représentent une suite fonctionnelle préexistante, présente dans un organisme donné. On a également proposé d'associer deux gènes différents, clones sur une même unité réplicative, l'un étant un gène de contrôle, qui permet l'expression de l'autre. Grâce à cette association, il est possible d'obtenir une expression conditionnelle du gène cloné et de s'approcher ainsi de certaines contraintes de toxici- té. En général, il s'agit du clonage simultané d'un ré- presseur, contrôlable par un paramètre physique comme la température, ou par la présence d'un inducteur que l'on peut ajouter à volonté au milieu. Dans ce cas, l'associa- tion des gènes ne correspond aucunement à une parenté d'activité du produit des gènes clones simultanément. En outre, il est à noter que dans les procédés de clonage des gènes, il est généralement nécessaire d'obtenir une quantité suffisante du produit exprimé pour pouvoir le révéler. cne Il peut être de plus difficile ou impossible de cloner le gène lorsque le produit exprimé se révèle délétère. L'invention a pour but de remédier au moins en partie à ces difficultés et d'améliorer les techniques proposées à ce jour permettant le clonage direct des gènes ou l'expression simultanée des systèmes multipro- téiques. L'invention vise plus spécialement à fournir un procédé permettant de produire simultanément une série de protéines distinctes, selon une association fonctionnelle qui n'existe pas en tant qu'organisation génétique pré- existante dans le ou les organismes considérés. Le procédé de clonage et d'expression de l'in- vention est caractérisé en ce que: - on transforme les cellules d'une souche de microorga- nisme réceptrice, c'est-à-dire capable d'accueillir de l'ADN étranger et de l'exprimer, en introduisant des fragments d'ADN constitués par, ou comprenant, au moins deux gènes étrangers, à savoir au moins un gène indica- teur et au moins un gène à révéler, ces gènes étant, le cas échéant, interchangeables en tant que gènes indica- teurs ou gènes à révéler, et capables d'exprimer dans les cellules réceptrices, des protéines constituant des édi- fices fonctionnels organisés, le gène indicateur étant capable d'exprimer une protéine permettant de détecter l'activité biologique de la protéine exprimée par le gène à révéler, cette activité biologique résultant de l'in- teraction entre les protéines, - on détecte l'activité biologique de la protéine recher- chée par mise en oeuvre par exemple d'un moyen physico- chimique, biochimique, microbiologique ou radioimmuno- logique et, dans les systèmes homologues, et le cas échéant, dans les systèmes hétérologues, - on isole le gène codant pour cette protéine en mettant en jeu une propriété caractéristique du gène. On observera qu'on constitue, avec ce procédé, un ensemble fonctionnel artificiel au sein d'un organisme permettant l'expression. Selon un aspect de l'invention, le procédé défini ci-dessus fournit des moyens pour isoler un gène codant pour une sous-unité protéique donnée d'un ensemble fonctionnel, à partir de différents fragments d'ADN sus- ceptibles de le renfermer. L'invention permet ainsi la caractérisation mo- léculaire du gène, et donc son expression. Selon un autre aspect, l'invention fournit des moyens de production en masse des protéines exprimées par les gènes révélés, ou à la fois par les gènes indicateurs et les gènes révélés, ou encore des protéines résultant de l'interaction des protéines exprimées par les gènes étrangers introduits, et ce, de manière avantageuses, chez des divers organismes cellulaires récepteurs. De nombreuses souches réceptrices conviennent pour la mise en oeuvre de l'invention, dès lors qu'elles sont capables d'accueillir de l'ADN étranger et de l'ex- primer. Il s'agit en particulier de souches avec le code génétique universel. On citera les souches bactériennes, les levu- res, les cellules eucaryotes. De préférence, les souches bactériennes utili- sées présentent un caractère de restriction moins, ce qui permet une mise en oeuvre directe du procédé de l'inven- tion, c'est-à-dire sans passage préalable par une souche intermédiaire restriction moins. Pour permettre la détection de la production d'une protéine donnée, ces souches ont avantageusement une déficience stable, et non réversible, à un taux éle- vé, dans les gènes spécifiant la synthèse de protéines ayant une activité homologue à celle de la protéine ou des protéines à exprimer. Une illustration comprend le clonage et l'ex- pression de protéines multimériques eucaryotes dans une bactérie o il n'y a pas de contrepartie homologue. Il s'agit par exemple du cas de l'expression d'immunoglobu- lines fonctionnelles ou d'hémoglobines chez une bactérie. Selon une variante de l'invention, les gènes introduits sont des gènes impliqués dans des systèmes hétérologues. Cette variante sera développée plus loin dans le cas du clonage et de l'expression d'une toxine bactérienne dont l'activité dépend de la présence d'une protéine euca- ryote. Conformément à l'invention, on effectue de pré- férence un clonage successif des gènes codant pour les diverses unités de l'édifice multiprotéique. Selon ce mode de réalisation, on introduit suc- cessivement dans la cellule réceptrice des fragments d'ADN, de préférence portés par des réplicons différents, comportant respectivement les gènes indicateurs et les gènes à révéler. Ces réplicons sont de préférence compatibles entre eux. Pour permettre un dosage de l'expression, on utilise de préférence un contrôle s'exerçant simultané- ment sur plusieurs gènes. Il peut s'agir par exemple de l'association entre un plasmide porteur du répresseur thermosensible du bactériophage lambda (pDIA 9205) et d'un plasmide de groupe d'incompatibilité différent porteur d'un promoteur contrôlé par ce répresseur (pDIA 3237 voir FEMS Microbiology Letters 37 (1986) 193-197). Un contrôle de ce type, efficace chez E.coli permet avantageusement l'expression de protéines chiméri- ques, comme les immunoglobulines. D'une manière avantageuse, l'invention permet ainsi l'expression de protéines eucaryotes multimériques ]5 dans une bactérie. En variante, la transformation de la cellule réceptrice est réalisée en n'utilisant qu'un seul type de réplicon, les clonages ultérieurs sont effectués sur le réplicon en un site permettant la conservation fonction- nelle du premier gène introduit. Les réplicons sont avantageusement choisis par- mi les plasmides, cosmides et bactériophages utilisables de manière habituelle comme vecteurs. Le chromosome de la cellule réceptrice peut être également utilisé. Des plasmides appropriés pour un clonage chez E.coli comprennent les dérivés du réplicon colE1 (groupe Inc. Q), pACYC184 (groupe Inc. P15A) ou pDIA13 (groupe Inc W voir la référence ci-dessus dans FEMS Microbiology Letters). La détection de l'activité biologique résultant de l'interaction entre les protéines exprimées dans la cellule réceptrice est avantageusement réalisée par un moyen physico-chimique, biochimique (enzymatique), micro- biologique (test de croissance). On citera encore le do- sage de la production d'un métabolite par technique spec- troscopique, étude de l'apparition d'une activité biolo- gique par croissance sur milieux appropriés. Le gène codant pour la protéine recherchée est isolé en mettant en jeu une propriété caractéristique du gène, telle qu'une résistance à un antibiotique ou à un microorganisme virulent, ou encore l'aptitude à croitre sur un milieu dans lequel la souche originale ne peut croître, ou toute autre révélation microbiologique. Une autre application importante du procédé de l'invention consiste dans le clonage de gènes codant pour des protéines permettant d'élaborer, par exemple à la suite d'interactions avec d'autres protéines, des pro- duits toxiques utilisables, notamment, comme principes vaccinants. La production en grande quantité de ces pro- téines dans des microorganismes revêt également un grand intérêt. Cet aspect de l'invention sera illustré par le clonage du gène de B.Pertussis codant pour l'adénylate cyclase et la production de la protéine toxique. On connaît la pathogénicité élevée de B.pertussis, bactérie responsable de la coqueluche. Parmi les éléments impliqués dans le caractère pathogène de cette bactérie, il semble qu'un phénomène majeur soit la production considérable d'AMP cyclique (ou AMPc) par les cellules infectées. Cette production fait intervenir un mécanisme d'activation de l'adénylate cyclase produite par B.Pertussis, par une protéine de l'hôte, la calmo- duline. Il s'agit donc dans ce cas d'un système pro- téique formé de deux sous-unités, la calmoduline et l'adénylate cyclase, spécifiées chacune par des gènes d'organismes différents. L'utilisation conformément à l'invention, de l'interaction entre ces deux sous-unités, permet l'isole- ment du gène codant pour l'adénylate cyclase, dont les difficultés de clonage par les méthodes habituelles sont, par ailleurs, bien connues. Selon la stratégie de l'invention, on introduit dans une cellule un réplicon A, contenant le gène indi- cateur codant pour la calmoduline, puis on introduit dans cette cellule les fragments de l'ADN à total de B.Pertussis dans un réplicon B. Les réplicons A et B sont avantageusement choi- sis parmi ceux définis ci-dessus et la cellule réceptrice est plus spécialement une cellule bactérienne, telle que E.coli. Il va de soi, cependant, qu'un seul vecteur de clonage peut également être utilisé: le réplicon A por- teur d'un gène indicateur, dans lequel on clonera par criblage le gène à révéler. Par criblage des fragments de l'ADN total de B.Pertussis, il est possible d'isoler le gène codant pour l'adénylate cyclase, en révélant par exemple à l'aide d'un test coloré sur milieu de maltose, la production d'AMPc qui résulte de l'activation de l'adénylate cyclase par la calmoduline, dans une souche réceptrice dépourvue d'adénylate cyclase. L'invention vise également le fragment d'ADN cloné de la partie active du gène de l'adénylate cyclase dont la séquence est donnée sur la figure 2. La partie catalytique Ou fragment d'ADN comprend la séquence de nucléotides située entre les positions 0 et 2 050, la position 0 correspondant au site de restriction BamHI. Il va de soi que les bases de la séquence nu- cléotidique considérée peuvent être dans un ordre diffé- rent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être le cas échéant substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la ca- pacité de reconnaître la présence d'un gène codant pour une protéine à activité adénylate cyclase. Toute séquence nucléotidique hybridable avec celle de l'enchaînement de la séquence de la figure 2, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique entre également dans le cadre de l'invention. L'invention concerne également une séquence de nucléotides codant pour la séquence d'acides aminés re- présentée sur la figure 2a à 2f. Elle concerne également tout ou partie de cette séquence d'acides aminés et d'une manière générale une protéine à activité adénylate cyclase capable de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés con- tre des protéines à activité adénylate cyclase. Entrent également dans le cadre de l'invention les anticorps polyclonaux formés contre la protéine de l'invention ainsi que les anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement cette protéine. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans l'exemple qui-suit relatif au clonage du gène codant pour l'adénylate cyclase de B.Pertussis et en se reportant aux figures 1 et 2: - la figure 1 représentant la carte de restric- tion de la partie active du gène de l'adénylate cyclase de B. Pertussis cloné chez E. coli, et - la figure 2a à 2f, la séquence du fragment d'ADN de la partie du gène correspondant au domaine cata- lytique. EXEMPLE: 1/ - Construction de trois souches cya-, restriction de E.coli, à savoir: - une souche de référence, restriction moins, qui résiste jusqu'à 5 mM d'AMP cyclique (ou AMPc) exogène, et qui permet de détecter aisément 0,5 mM d'AMPc exogène; - une souche dite bas niveau, restriction moins, qui per- met de détecter 50 pM d'AMPc exogène, mais dont la sensi- bilité à l'AMPc apparait au-dessus de 1 mM; - une souche dite résistante qui permet de détecter 3 mM d'AMPc et qui résiste à 30 mM au moins de ce nucléo- tide. Ces souches sont aisément transformables (à 106 au moins transformants pour 1 pg de pBR322, par la tech- nique classique décrite par Maniatis dans Cold Spring Harbor N. Y., p. 352-355. Ces souches sont avantageusement stabilisées pour être cultivables sur plusieurs générations. La détection du caractère "production d'AMP cyclique' est réalisée au moyen de tests colorés indi- quant la fermentation de certaines sources de carbone comme le maltose. Le caractère cva peut être aisément sélectionné en mettant à profit la résistance connue de tels mutants à des antibiotiques comme le Mecillinam, ou la phosphomycine et au bactériophage lambda virulent: microlitres d'une culture saturée de la souche initiale sont étalés en présence d'un nombre dix fois plus élevé d'un bactériophage lambda virulent, sur une boite de Pétri contenant un milieu Mac Conkey Maltose (Miller 1972), supplémenté avec la concentration léthale minimum pour E.coli de l'antibiotique. Cet antibiotique, en effet, permet une sélection efficace des mutants dé- pourvus d'adénylate cyclase (cva) ou de récepteur de l'AMP cyclique (cru); par ailleurs, les souches óya ou 0cr sont résistantes au phage lambda virulent et comme elles ne fermentent pas le maltose, elles apparaissent sous la forme de colonies blanches sur le milieu Mac Conkey. Il convient de s'assurer que les mutants sont effectivement de type cva en confirmant qu'ils retrouvent d'une part leur capacité de croître sur maltose en pré- sence d'AMPc et, d'autre part, qu'ils peuvent croître sur glucose (ce qui exclut certains mutants du système des phosphotransférases (système dépendant du phosphoénol- pyruvate: pts)). Pour obtenir des mutants dits à bas niveau, on utilise 100 pl d'une culture d'un mutant cYa préalable- ment isolé, que l'on fait croitre sur un milieu synthé- tique M63 (Miller, 1972 Cold Spring Harbor N. Y., p. 352-355) en présence de 0,4%' de maltose et de 50 pM d'AMPc. Les colonies trouvées sont alors réisolées 3 fois sur le même milieu, puis testées pour leur incapacité à croître sur le même milieu dépourvu d'AMPc. On confirme, par ailleurs, leur sensibilité à l'AMPc qui est généra- lement supérieure à celle de la souche originale. Pour obtenir des mutants dits à haut niveau, on procède par étapes successives en augmentant, sur un mi- lieu LB (Miller, voir référence ci-dessus) la concentra- tion d'AMPc. Parmi les mutants obtenus, un grand nombre sont des mutants crP, qui sont devenus insensibles à l'AMPc, mais qui ne permettent plus de détecter sa pré- sence: il convient donc, à chaque étape (deux étapes, 12 mM et 30 mM, sont généralement suffisantes) de s'as- surer que les bactéries forment des colonies blanches en l'absence d'AMPc et rouges en présence de 3 mM d'AMPc sur le milieu Mc Conkey maltose. Les bactéries obtenues sont généralement légèrement dépendantes de la présence d'AMPc et il convient de les faire croître dans les précultures en présence d'une concentration au moins égale à 3 mM d'AMPc, afin de conserver leur caractère résistant de façon stable. 2/ - Transformation des souches Ces souches sont alors transformées par un plasmide porteur d'un gène spécifiant la synthèse de 1 1 calmoduline tel que le plasmide pVUC-1, du groupe d'in- compatibilité ColE1 et porteur du gène de résistance à l'ampicilline. On introduit ensuite dans les trois souches des vecteurs renfermant de l'ADN de B.pertussis total frag- menté de diverses manières (coupures partielles par des enzymes de restriction EcoRI et SauIIIa, sonication sui- vie d'addition de "linkers" EcoRI par exemple). En raison des problèmes posés par l'incompati- bilité d'autres plasmides ayant le réplicon ColEI (voir plus haut) le clonage de fragments d'ADN total de B.pertussis partiellement coupé par l'enzyme SauIIIa a été effectué dans le vecteur compatible pACYC184, au site unique BamH1. Les souches réceptrices ont été transfor- mées et étalées sur des boites Mc Conkey Maltose. Plusieurs clones fermentant le maltose ont été isolés. Il a ensuite été démontré, que ces clones produisent de l'AMP cyclique. Par ailleurs, les plasmides extraits des souches productrices ont été intégrés par transformation dans des souches qui soit ne contiennent pas le plasmide pVUC-1, soit le contiennent. Dans le premier cas, les clones sont blancs sur les milieux Mc Conkey maltose, rouges dans le second, confirmant que c'est bien la présence des plasmides permettant la synthèse de calmodu- line qui a permis le clonage. 3/ - Détection de l'AMPc La souche bas niveau a été utilisée pour la détection de la présence d'AMPc de la façon suivante: 104 bactéries bas niveau ont été étalées sur une boite Mc Conkey Maltose, et une réplique de clones variés, conte- nant, entre autres, une souche de E.coli cru dépourvue du gène codant pour le récepteur de l'AMP cyclique et les souches contenant le plasmide pVUC-1 (Craig et al. 1987, J. Biol. Chem. 262, 3 278-84) ainsi que les plasmides putatifs contenant le gène de l'adénylate cyclase de B. pertussis, a été effectuée. Les souches ont été mises à incuber à 37C pendant 20 heures. Puis les colorations des taches observées: les souches cya- donnent des ta- + ches blanches, les souches gya des taches rouges, mais la souche crp(cva+) donne, de plus un halo rouge d'au moins 10mm de diamètre, indiquant que l'AMPc synthétisé dans ce cas, a diffusé et a permis la fermentation du maltose par la souche indicatrice bas niveau. Le même résultat a été obtenu avec les diverses souches contenant le gène putatif de l'adenylate cyclase de B.Pertussis en présence du plasmide pVUC-1. Ce résultat indique une forte production d'AMPc par ces bactéries. Par ailleurs, une confirmation ulté- rieure a été obtenue par le résultat négatif du catabo- lisme du maltose dans une souche crp- dépourvue du ré- cepteur de l'AMP cyclique contenant pVUC-1 et un plasmide porteur du gène cyclase de B.Pertussis. Les caractéristiques du fragment d'ADN conte- nant la partie active du gène de l'adenylate cyclase de B.Pertussis isolée de la souche E. coli TP610 pDIA7 dé- posée le 21 juillet 1987 sous le n' 1-678 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes) sont données sur les figures 1 et 2. L'exemple décrit ci-dessus illustre une méthode générale de clonage de gènes et de production dans des cellules réceptrices de leurs produits d'expression et des produits résultant de l'interaction des protéines exprimées. Ainsi, cette méthode s'applique, inter alia: - au clonage du gène de la toxine adénylate cyclase de Bacillus anthracis et à la production de cette toxine, - au clonage du gène d'adénylate cyclases eucaryotes, en utilisant des clones contenant soit un gène de calmodu- line, soit un gène de la sous-unité G activatrice de l'adénylate cyclase, soit un oncogène de type Ras, et à la production de ces cyclases, - au clonage des gènes dont les produits sont modulés par la calmoduline, - à la production de protéines oligomériques au moyen de couples de vecteurs: par exemple immunoglobulines ou hormones, - au clonage de gènes codant pour des récepteurs, activa- teurs d'enzymes repérables ou l'opposé, et à la produc- tion de ces protéines, - au clonage de gènes codant pour des enzymes toxiques (par exemple protéases/antiprotéases) et à la production de ces enzymes. Dans ce cas, le clonage a lieu dans des conditions de production de l'inhibiteur (dans un système traditionnel par exemple) et la révélation des clones intéressants se fait après inhibition de la synthèse de l'inhibiteur par apparition de la toxicité, - au clonage de gènes codant pour des inhibiteurs d'ac- tivités repérables, dont les gènes sont déjà connus, et à la production de ces inhibiteurs, - à la production de protéines excrétées, nécessitant la présence d'une protéine auxiliaire pour l'excrétion. REVENDICATIONS 1. Procédé de clonage et d expression de gènes codant pour des protéines ayant une parenté fonctionnelle caractérisé en ce que: - on transforme les cellules d'une souche de microorga- nisme réceptrice, c'est-à-dire capable d'accueillir de l'ADN étranger et de l'exprimer, en introduisant des fragments d'ADN constitués par, ou comprenant, au moins deux gènes étrangers, à savoir au moins un gène indica- teur et au moins un gène à révéler, ces gènes étant in- terchangeables, le cas échéant, en tant que gènes indi- cateurs et gènes à révéler, et capables d'exprimer dans les cellules réceptrices des protéines constituant des édifices fonctionnels organisés, le géne indicateur étant capable d'exprimer une protéine permettant de détecter l'activité biologique de la protéine exprimée par le gène à révéler, cette activité biologique résultant de l'in- teraction entre les protéines, - on détecte l'activité biologique de la protéine recher- chée par mise en oeuvre par exemple d'un moyen physico- chimique, biochimique, microbiologique ou radioimmunolo- gique, et - on isole, le cas échéant, le gène codant pour cette protéine en mettant en jeu une propriété caractéristique du gène. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la souche réceptrice est une souche bac- térienne, une levure ou une cellule eucaryote. 3. Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que la cellule réceptrice bactérienne présente un caractère restriction moins. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que les gènes étrangers introduits sont impliqués dans des systèmes homologues. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que les gènes étrangers introduits sont impliqués dans des systèmes hétérologues. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue un clonage successif des gènes codant pour les diverses unités de l'édifice multiprotéique en utilisant de préférence des réplicons différents portant les différents gènes. 7. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise un seul type de réplicon. 8. Procédé de clonage du gène codant pour l'adénylate cyclase de B. pertussis, caractérisé en ce qu'il comprend: - la transformation d'une cellule de microorganisme, en particulier d'une cellule bactérienne, à l'aide de deux réplicons A et B, différents l'un de l'autre, le réplicon A portant le gène codant pour la calmoduline et le réplicon B des fragments de l'ADN total de B.Pertussis. - le criblage des fragments d'ADN, en détectant par un test coloré l'activité biologique de l'AMP cyclique produite par l'adénylate cyclase codée par l'un des fragments d'ADN, activée en présence de calmoduline; - l'isolement du gène codant pour l'adénylate cyclase. 9. Application du procédé selon la revendica- tion 8 à la production d'adénylate cyclase. 10. Séquence de nucléotides codant pour au moins une p- e de l'adénylate cyclase, caractérisée par sa capacite - nybridation avec un gène capable d'exprimer une protéine à activité adénylate cyclase. 11. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence selon la figure 2a à 2f. 12. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle code pour la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 2a à 2f. 13. Protéine à activité adénylate cyclase, ca- ractérisée en ce qu'elle est capable de former un com- plexe immunologique avec des anticorps dirigés contre des protéines à activité adénylate cyclase. 14. Protéine selon la revendication 13, carac- térisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides ami- nés représentée sur la figure 2a à 2f.