Brevet FR2619819A1 — publié le 19890303

La présente invention est relative a des sondes mo séculaires d'ADN spécifique utiles pour la détermination du sexe - ou sexage - d'embryons ou de foetus de ruminants, notamment de la sous-famille des bovinés, et en particulier du genre Bos, présentant des séquences d'ADN spécifique du sexe mâle, ainsi qu'à des séquences flanquantes pour l'amplifica- tion génique de ces sondes ; la présente invention englobe également les applications desdites sondes, de préférence am amplifiées à l'aide des séquences flanquantes susdites, et notamment leurs applications à la détermination du sexe d'embryons et de foetus des ruminants susdits, et au contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes ainsi qu'à la séparation de ladite population en deux groupes comprenant respectivement le chromosome Y et le chromosome X, en vue de l'insémination artificielle. La Demande Internationale PCT 86/07095 au nom de THE SALK INSTITUTE BIOTECHNOLOGY INDUSTRIAL ASSOCIATES, déposée le 30 Mai 1986 en revendiquant une priorité US Serial Number 739 817 du 31 Mai 1985 et publiée le 4 Décembre 1986, décrit des sondes d'acide nucléique pour le sexage prénatal de mâles du genre Bos, plus particulièrement des races Hereford et Holstein. Ces sondes qui ont pour caractéristique d'être constituées par des acides nucléiques qui hybrident de façon significative avec 1'ADN total de mâles d'une des races précitées du genre Bos, sont constituées a) soit par un segment qui a sensiblement la même séquence que le plus petit fragment PstI du plasmide pES5 (2), . ou le plus petit fragment PstI du plasmide pES8, ou le fragment EcoRI 6,2 kpb du génome de lambda-ES6,0 ; b) soit par tout segment supérieur à une longueur de 20 pb de l'un quelconque des segments énumé- rés sous a) c) soit l'un ou l'autre des brins de l'un des segments énumérés sous a) et b) d) soit 1'ARN simple ou double-brin, présentant la même séquence que l'un des segments énuméree soue a), b) et c > ci-dessus. Cependant, bien que 1'ARN soit mentionné dans cette Demande Internationale PCT (voir d) ci-de6sus), il semble que les acides nucléiques préférés soient de 1'ADN et soient constitués par le fragment EcoRI de 6,2 kpb, 4,0 kpb ou 2,2 kpb du génome de #-ES6,O. Conformément a cette Demande Internationale, le procédé de sexage des embryons ou des foetus du genre Bos consiste à : - mettre en contact 1'ADN de cellules de l'embryon ou du foetus, dans des conditions d'hybriidation, avec une ou plusieurs sondes d'hybridation tell s que définies plus haut, marquées chacune de façon détectable - vérifier qu'il se produit une hybridation significative entre 1'ADN des cellules de l'embryon ou du foetus et la ou les sonde(s) d'hybridation. Conformément à la Demande Internationale PCT en question, les sondes d'hybridation sont obtenues par nicktranslation et 1'ADN d'embryons ou de foetus ne proviendrait que d'au moins 4, mais de préférence d'au moins 10, cellules d'embryons. La Demande Internationale PCT 86/07095 décrit en outre un procédé d'isolement d'un clone d'ADN provenant d'une banque génomique des mâles de l'espèce concernée qui consiste à s cribler la banque génomique par hybridation d'acide nucléi que avec une préparation de sonde mâle-spécifique compre nant 1'ADN mâle total et 1'ADN femelle total de l'espèce, pour identifier les clones de la banque qui comprennent 1'ADN qui hybride avec un fragment contenant un segment d'ADN mâle-spécifique, ledit criblage étant réalisé sur un support solide pré-hybridé avec 1'ADN femelle total de l'espèce, fragmenté au hasard pour avoir une longueur moyenne d'environ 20 à 1000 nucléotides t - puis identifier les clones de la banque identifiés au cours du criblage, qui abritent de 1'ADN qui hybride considéra blement plus avec de 1'ADN mâle total de l'espèce qu'avec de l'ADN femelle total de ladite espèce. Dans la pratique, pour permettre l'hybridation détectable avec les faibles quantités d'ADN embryonnaire disponibles dans le petit nombre de cellules susceptibles d'être prélevées chez les embryons ou les foetus à sexer, il est préféré que les acides nucléiques utilisés comme sondes soient marqués par des atomes radioactifs et il semble également préféré de mettre en oeuvre conjointement deux des sondes définies plus haut. Trois sondes mâles-spécifiques ont été obtenues, dont la première correspond au fragment RsAI de 5-6 kpb d'ADN mâle bovin, la seconde au fragment RsaI-EcoRI de 4 kpb d'ADN mâle bovin et la troisième au fragment EcoRI de 2,2 kpb d'ADN mâle bovin, et leur séquence en nucléotides a été au moins en partie identifiée. Toutefois, en raison même de leur longueur, il est difficilement envisageable de synthétiser de telles sondes, dont rien n'indique, au demeurant, dans ladite Demande Internationale PCT, quels sont les segments de ces séquences qui sont "spécifiquement" mâles-spécifiques et sont effectivement utiles pour le sexage des embryons, et qui n'ont manifeste- ment pas été identifiés. Les Demanderesses ont, de leur côté, isolé une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome mâle de mammi fèces, notamment du genre Bos - que les Inventeurs sont d'ailleurs parvenus à synthétiser -, dont le profil d'hybridation (déterminé par hybridation de ladite sonde avec de 1'ADN génomique mâle digéré par EcoRI) fait apparaître la la présence d'une bande de l'ordre de 7 kb spécifique du génome mêle du genre Bos (et absente de 1'ADN génomique femelle) , laquelle sonde - qui a reçu la dénomination bc.1.2 - comprend 49 paires de bases dont la séquence en nucléotides est la suivante 5' 3' # # ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT ou un fragment de ladite séquence comportant au moins 11 nucléotides. Cette sonde est décrite et revendiquée dans une Demande de Brevet déposée en France au nom des Demanderesses en date du 28 Février 1986, sous le N 86 02811, et ses applications sont décrites et revendiquées, d'une part, dans ladite Demande et, d'autre part, dans une Demande de Certificat d'Addition à cette Demande, qui a été déposée en France, le 9 Septembre 1986, sous le N 86 12616. Dans le cadre de la poursuite de leurs recherches dans le but de priser si la spécificité de la reconnaissance du génome mâle pouvait être identifiée dans un segment de la séquence de 49 nucléotides qui constitue la sonde objet de la Demande de Brevet français N 86 02811, les Inventeurs ont établi qu'à l'intérieur de cette séquence, des segments de 19 à 20 nucléotides consécutifs présentent le profil d'hybridation défini dans leur Demande de Brevet de Février 1986 et sont spécifiques du génome mâle du genre Bos. La possibilité de pouvoir disposer d'une sonde comprenant une séquence en nucléotides de faible longueur présente un intérêt considérable, car telle permet la synthèse à volonté, a des prix de revient industriellement acceptables, d'une telle sonde qui, de ce fait, est totalement pure et ne provoque pas de bruits de fond. De plus, les Inventeurs sont parvenus & identifier les segments flanquants desdites sondes ce qui leur a permis d'amplifier ces dernières et a pour conséquence d'augmen ter leur sensibilité, d'assurer une fiabilité de la détermination du sexe des embryons de l'ordre de 100 t, de réduire le temps nécessaire à une telle détermination. La présente invention a pour objet deux oligonucléotides synthétiques de 20 bases chacun qui comprennent respectivement les séquences en nucléotides suivantes 5' 34 r ATCAGTGCAGGGACCGAGAT (1) 5' 3' 7 GTGCTCCAAGGAGTGTTTAT (2) ainsi que leurs complémentaires, ou un fragment desdites séquences comportant au moins 11 nucléotides consécutifs ou tout autre fragment présentant au moins 70% d'homologie avec ces derniers, lesquelles correspondent pour le premier au segment de la sonde de 49 pb conforme à la Demande de Brevet français N0 86 02811 qui va de la base 1 à la base 20 et, pour le second, au segment de ladite sonde qui va de la base 21 à la base 40 ; chacun de ces deux oligonucléotides présente, par hybridation avec de 1'ADN génomique mâle du genre Bos, digéré par une enzyme appropriée, un profil d'hybridation qui fait apparaître la présence d'au moins une bande spécifique du génome mâle du genre Bos, laquelle bande est de l'ordre de 7 kb. La présente invention a également pour objet des segments flanquants situés de part et d'autre de la séquence nucléotidique constituant l'une des sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères ruminants, notamment du genre Bos, utiles pour l'amplification génique de ladite sonde, que cette dernière soit la sonde comprenant 49 pb conforme à la Demande de Brevet français 86 02811, ou l'un de ses sous-fragments (1) ou (2) conforme à la présente invention. Conformément à la présente invention, lesdits segments flanquants sont caractérisés en ce qu'ils présentent les séquences en nucléotides représentées par les formules (F 1) à (F 18) ci-après : 5' 3' r ACCGGTCTAGGTCTAGCCCTTGTTCGGGACGCACATCACAGGCTCCTGAGCCCCCATCTC (F 1) 5' 3' # # GGTAGAGCCCGCATCTCGGTCCCCGCGGTGAACCTGGCCCGGTTCCTACCCCAGTC (F 2) 5' 3' # # CTGAGGCCTCCTCTCGCACTCTGCCCTGAAGCCGTGCGCGTCCTGCCCTCGATCAGACCT (F 3) 5' 3' r GACAGGGTGGGCCGTGCCCTCGTTCAGTCACCCGGGAAACACTGCTGAGCCCGCATCTTG (F 4) 5' 3' # # ACACTGCTGAGCCCGCATCTTGATCCCCGCGCTAAACCTGGCCGGCTCCTACCCCCAGG (F 5) 5' 3' # # ACCGGTCTAGGTCTGGCCCTTGTTCGATTCACTCAGCACAGACTCCTGAGCCCCCATCTC (F 6) 5' 3' # # AGCTGTGATCCCGCAGCTCANTCCCGGCACTGAAGCCACCTCTGGGGCTTGGCCTGCTTC (F 7) 5' 3' # # AGAAGCAGTCTAGGGCCTGCCTTGTTCGGAATTCGGATGGATGCTGCCCTTGGGCAACAC (F 8) 5' 3' r TTCGGAATTCGGATGGATGCTGCCCTTGGGCAACACCCCCACCGCCCCCAAACTCACACA (F 9) 5' 3' r AGCTCAACCACGGTGGTTTCTCTCTGGCCAAGCCTCGACAATCAATCCTGAGCCCA (F 10) 5' 3' # # ATCTCACGCGCTGCACTAAACCACGCAGAGTTCCGCCCTTCCTGAAGTGCCCGTCTAAAG (F 11) 5 3' r ACCAGTCGAGGTCCTGCCCTTTGTGCGGGCCCCTAGCACAGACTCCCGACCCAAACCTCT (F 12) 5' 3' # # ACACTGCTGAGCCCGCATCTTGATCCCCGCGCTAAACCTGGCCGGGCTCCTACCCCCAGG (F 13) 5 3 r ACCGGTCTAGGTCTGGCCCTTGTTCGATTCACTCAGCACAGACTCCTGAGCCCCCATCTC (F 14) 5' 3' # # CCCCCCGCCCGGTGTCTGCACTGATCCAGGCTGGCTCCTGCCCTCGGTCAAGACCCTGG (F 15) 5' 3' # # AGCAGGCTGGCTCCTGCCTTCGTTCAAGCACCTGGCAAAGTAACCGCCGGGGAGCTCCAG (F 16) 5 3' r AGCTGTGATCCCGCAGCTCACTCCCGGACTGAAGCCACCTCTGGGGCTTGGCCTGCTTC (F 17) 5' 3' # # AGAAGCAGTCTAGGGCCTGCCTTCTTCGATTCCCGCGACACACACTCCTGAGCCACAGCT (F 18) La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'amplification génique de sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment de ruminants, plus particuliérement de la sous-famille des bovinés et de façon spécifique du genre Bos, lesquelles sondes présentent l'une des séquences en nucléotides (A), (1) ou (2) ci-après : 5' 3' # # ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT (A) 5 3 # # ATCAGTGCAGGGACCGAGAT (1) 5' 3' TGCTCCAAGGAGTGTTTAT (2) lequel procédé d'amplification consiste à fixer à chacune des extrêmités, respectivement, de ladite sonde moléculaire, une séquence flanquante judicieusement choisie parmi les séquences flanquantes (F 1) à (F 18) telles que définies plus haut, par hybridation, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extensiondénaturation, connu sous le nom de cycle PCR, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence constituant la sonde moléculaire de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle des mammifères mentionnés plus haut, identifiées plus haut et, le cas échéant, avantageusement amplifiées conformément à la présente invention, et dûment marquées par un radio-isotope ou par une substance non radioactive appropriée, sont utilisées comme décrit dans -la Demande de Brevet français N 86 02811 et/ou dans son Certificat d'Addition N 86 12616 pour le sexage des embryons ou des foetus ou pour le contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes, ou encore pour la séparation des spermatozoïdes en deux populations de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome Y et du chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation de mammifères rongeurs par des fractions de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y - ou X - contrôlées par hybridation avec une sonde de formule (1) ou (2), ou une sonde de formule (A) amplifiée par un ou plusieurs segments flanquants de formules (F 1) à (F 18). La présente invention a, de plus, pour objet des réactifs immunologiques spécifiques reconnaissant des déterminants antigèniques contrôlés par les chromosomes X ou Y, ayant servi à l'obtention desdits réactifs et exprimés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps obtenus en mettant en oeuvre le procédé précité, éventuellement purifiés. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 SYNTHESE ET PURIFICATION DES DEUX OLIGONUCLEOTIDES DE SYNTHESE DE FORMULES (1) et (2) CONFORMES A L'INVENTION Ces deux oligonucléotides -de 20 paires de bases chacun qui répondent respectivement aux formules (1) et (2) ci-après 5' 3' ATCAGTGCAGGGACCGAGAT (1) 5' 3' GTGCTCCAAGGAGTGTTTAT (2) sont des fragments de la séquence de 49 paires de bases qui présente la composition en nucléotides (A) ci-après 5' 3' ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT (A) à savoir la séquence (1) comprend les bases 1 à 20 de la séquence (A), alors que la séquence (2) comprend les bases 21 à 40 de ladite séquence (A). La synthèse des fragments (1) et (2) a été réalisée en prenant pour modèle la séquence (A). Cette synthèse chimique a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique wApplied Biosystems" selon la technique de phosphoramidite en phase solide. La réaction étant efficace à 95-97 % à chaque stade, il a été nécessaire de purifier le produit final (sous-fragments (1) et (2) - 20 mer) des oligonucléotides intermédiaires. Environ 7 mg du mélange d'oligonucleotides dans 60 pl H20 sont séparés par électrophorèse dans le gel de 20 % polyacrylamide + 8 M urée à 700 V, 38mA pendant 3 heures. Les bandes correspondant au 20 mer sont repérées à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de gel de silice, fluorescente à 254 nm (Merck). Cette partie du gel est découpée, puis 1'ADN élué dans 1,5 ml de la solution 0,5 M CH3COONH4 + 5 mM EDTA sous agitation à 37iC pendant 16 heures. Le surnageant est concentre à environ 300 pl et l'urée est éliminée par chromatographie sur une colonne 10 cm x 1 cm de Sephadex G-50 (Pharmacia) équilibré avec le tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5 + 1 mM EDTA. L'ADN ainsi isolé est lyophilisé et conservé à -20*C. MARQUAGE RADIOACTIF (32p) DES FRAGMENTS (1) et (2) DE SYNTHESE (Monobrin) 10 à 20 pM des sondes 1 et 2 dans un volume de 3 pl sont ajoutés à 23 pl du mélange réactionnel composé de 100 mM dithiothréitol (2,5 pl), 10 mM spermidine (2,5 pl), tampon d'incubation 500 mM Tris-HCl pH 7,5 + 100 mM MgCl2 (2,5 p1), 100 pCi ( -32P) adénosine triphosphate-ATP 3000Ci/mmole (Amersham) et 20 U T4 polynucléotide kinase (Boehringer). Après incubation de 30 mn à 37'C, la réaction est arrêtée avec 2pl 400 mM EDTA et l'oligonucléotide marqué est séparé de 1'ATP par chromatographie sur colonne avec Séphadex G-50. PREHYBRIDATION ET HYBRIDATION Les filtres ou blots sont préhybridés à 55 C pendant 4 heures avec un mélange 5xSSPE contenant 0,9 M NaCl ; 50 mM NaHP04 pH 7,4 t 5 mM EDTA pH 7,4 5 x Denhart ; 0,3 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et hydrolysé ; 0,5 % dodecyl sulfate de sodium. L'hybridation est réalisée dans le même mélange. Chacune des sondes radiomarquées au 32P,dénaturées à 10OC pendant deux minutes, est ajoutée dans la solution d'hybridation à 1 à 2x106cpm/ml. L'hybridation est réalisée à 55iC pendant au moins 18 heures. Après l'hybridation, les filtres sont lavés dans un tampon 6 x SSC plus 0,1 % SDS, une à deux fois à 65"C pendant 20 minutes. Les filtres sont ensuite placés dans une cassette équipée d'intensificateurs wCRONEX" (DUPONT), mise en contact avec un film Kodak XAR-5 pour l'autoradiographie pendant 7 à 36 heures à -70*C. EXEMPLE 2 DETERMINATION DU SEXE DES EMBRYONS BOVINS PAR HYBRIDATION IN SITU AVEC DES SONDES (1) et (2) D'ADN BIOTINYLEES(NON-RADIO ACTIVES) A. Préparation des cellules Les cellules utilisées proviennent d'embryons bovins agés de 7 à 8 jours de gestation. Après avoir été disséquées, les cellules sont déposées sur une lame et incubées pendant 10 à 15 minutes dans une solution de fixateur tel que le mélange alcool-acide acétique (3 : 1 v/v) puis séchées à l'air. Les lames sont utilisées immédiatement ou, en cas de sexage différé, conservées à 4C à l'abri des poussières. B. Biotinylation des sondes (1) et (2). La biotinylation des 20-mer s'effectue par addition en 3' de dUTP biotiné ou tout autre désoxynucléotide biotiné à l'aide de l'enzyme terminal-transférase (Boehringer). 10 à 20 pM des 20 mer sont ajoutés à 100 pl du mélange réactionnel composé de : 140 mM cacodylate de potassium ; 30 mM Tris-HCl pH 7,6 ; 0,1 mM dithiothréitol 1 mM CoC12 + 0,02 mM de dUTP biotinylé et 1 à 2 unités d'enzyme terminal-transférase. Après incubation de 1 heure à 37in, l'oligonucléotide marqué est séparé par chromatographie sur colonne avec Sephadex 25 superfine. C. Technique d'hybridation sur lames. Les lames sont incubées avec 90 à 100 pl de liquide d'hybridation et recouvertes d'un film plastique (pour éviter l'évaporation). Après dénaturation pendant 10 mn dans un four à 100'C, les lames sont mises en chambre humide et incubées à 55C pendant 16 heures, La composition finale du liquide d'hybridation est . 0,9 M NaC1 5 mM EDTA . 50 mM NaHP04 pH 7,4 . 5 x Denhart . 0,5 % SDS (5 x Denhart 2 0,1 % BSA, ou 0,1 % lait écrémé en poudre ; 0,1 % polyvinylpyrrolidone 0,1 % Ficoll). Après avoir ôté le film plastique, les lames sont lavées successivement en solution 6 x SSC (2 x 30 minutes à 550C), puis en PBS pH 7,4 additionné de 0,1% v/v de Triton x - 100 et 0,5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Régilait). D. Révélation Les lames encore humides après avoir ôté l'excédent de fluide sont alors incubées 1 heure à 37 C avec un anti corps de chèvre antibiotine ou un anticorps de lapin anti biotine. Cet anticorps est vendu purifié par chromatogra phie d'affinité (Vector Laboratories ref. SP-300) et est utilisé dans nos tests, dilué au 1:350 dans du PBS pH 7,4 + 0,1% (v/v) Triton x - 100 + 0,5% (p/v) lait écrémé en poudre. Après un lavage de 15 minutes à température ambian te dans PBS pH 7,4 + 0,14 (v/v)Triton x - 100 + 0,5% (p/v) lait écrémé en poudre, les lames sont alors incubées 1 heure à 37iC avec un anticorps conventionnel de lapin anti-chèvre ou de chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase (Biosys ref. BI 2403) dilué 1:40 dans PBS pH 7,4 + Triton 0,1% + lait écrémé en poudre 0,5%. Les lames sont ensuite lavées deux fois 15 minutes dans PBS pH 7,4 contenant cette fois 0,1% (v/v) de Tween 20 et finalement dans du PBS pH 7,4 pendant 5 minutes. On procède à une incubation de 5 à 8 minutes à température ambiante avec une solution de diaminobenzidine (DAB SIGMA ref. D 8001) à 0,5 mg/ml dans PBS pH 7,4 contenant 0,01% de H2O2. Le précipité formé par l'action de la peroxydase sur la DAB est amplifié par précipitation successive de sels d'or et d'argent selon le procédé décrit par BURNS et al (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092) : Dans un premier temps on dépose 50 à 100 p1 par lame d'une solution 2,5 mM de chloroaurate de Na (NaAuC14 BDH ref. 30125 2R) et on incube 5 mn à température ambiante. Après un lavage de 5 mn dans de l'eau distillée, les lames sont incubées 5 mn à température ambiante avec 50 à 100 pl d'une solution 0,1 M de sulfure de Na (Na2S, SIGMA ref. S 2006), rincées 5 mn à l'eau distillée et incubées 4 à 8 minutes avec 100 à 300 pl de réactif à 1' argent. La composition du réactif à l'argent est la suivante A Carbonate de Na 0,24 M (SIGMA ref. S 4132) B1 Nitrate d'Ammonium 13 mM (SIGMA ref. A 9642) B2 Nitrate d'Argent 6 mM (BDH ref. 303873N) B3 Ac. Dodecatungsto silicique 1,5 mM (BDH ref. 305453R) B4 Formaldéhyde 37% 0,6 pl/ml (SIGMA ref. F 1635) Le réactif à l'argent est préparé en mélangeant successivement et sous agitation les solutions B1 - B2 B3 - B4. Le mélange obtenu est additionné 1:1 à la solution A et le réactif ainsi préparé est utilisé immédiatement. Après le traitement au réactif f a l'argent, les lames sont lavées à 1'H20 distillée pendant 15 minutes, puis dans l'acide acétique 1% (v/v) 2 fois 15 minutes et enfin colorées pendant 1 minute en Pyronin Y (SYGMA réf. P 7017) 1% en H2O, rincées pendant quelques secondes à l'eau distillée, séchées à l'air chaud et montées en DPX. EXEMPLE 3 CONTROLE DE LA QUALITE DU TRI D'UNE POPULATION DE SPERMATOZOIDES BOVINS AVEC LES SONDES D'ADN SPECIFIQUES DU SEXE MALE CONFORMES A L'INVENTION. Préparation des cellules Les cellules utilisées sont des spermatozoïdes de taureau congelés et stockés dans l'azote liquide. On décongèle une paillette, soit environ 13 000 000 de spermatozoïdes vivants. Les paillettes sont réchauffées pendant 30 secondes à 370C puis le sperme dilué dans 1 ml de PBS stérile. On procède à une série de centrifugations dans le but d'éliminer au maximum le milieu de congélation. La suspension des spermatozoïdes en PBS est d'abord centrifugée pendant 10 mn à 500 g, le surnageant aspiré et les spermatozoïdes repris en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on reprend en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 5% DMSO, on centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend dans 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 15% DMSO. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend dans 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 50% DMSO. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant; on resuspend dans 1 ml de 0,11 M citrate de sodium dans du Tris-HCl 0,1 M pH 7,4. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant et on resuspend dans 250 pl de ce même tampon. A ce stade, les cellules sont soit déposées sur lame (30 - 40 pl de suspension de spermatozoïdes par lame) et traitées par hybridation in situ avec une des sondes (1) ou (2) biotinylées, soit déposées sur filtre et hybridées selon la technique des dot-blots avec l'une des sondes (1) ou (2) marquées à l'aide de nucléotides radioactifs; EXEMPLE 4 AMPLIFICATION GENIQUE IN VITRO DES SONDES MOLECULAIRES D'ADN SPECIFIQUES DU GENONE MALE DE MAMMIFERES RUMINANTS, NOTAMMENT DU GENRE BOS. Le processus d'amplification génique in vitro est basé sur des cycles successifs-d'hybridation des sondes avec des "amorces" oligonucléotidiques (les "amorces" sont des segments flanquants et, spécifiquement, dans le cas présent, les segments flanquants de formules (F 1) à (F 18)), - d'extension à partir des "amorces", à l'aide de l'enzyme ADN-polymérase et - de dénaturation , par exemple selon un processus dit PCR ("Polymerase chain reaction") décrit par la Société CETUS CORPORATION (cf. notamment MULLIS et Al., COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY, Vol. I-I, 1986, pages 263-272). Les cellules d'une biopsie sont déposées dans un microtube sous un volume de lOpl dans du PBS - 35 pl d'H2O sont ajoutés, puis le tube est placé à 95 C pendant 10 minutes pour lyser les cellules et dénaturer 1'ADN. Dans le lysat est ajouté 55 pl du tampon PCR (50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 pM d'amorce A à fixer à l'une des extrêmités de la sonde, 1 pM d'amorce B à fixer à l'autre extrêmité de la sonde, 1,5 mM d'ATP,1,5 mM dCTP, 1,5 mM dTTP, 1,5 mM dGTP et 10 % DMSO (v/v). Les échantillons sont ensuite transférés à 30*C pour 2 minutes de façon à ce que les amorces se fixent. L'extension des brins est initiée par l'addition d'une unité de fragment de Klenow d'Escherichia coli polymérase I (Boehringer) et l'incubation à 37*C pendant 2 minutes.Ce cycle est répété de 20 à 25 fois. Les échantillons sont ensuite dénaturés dans une solution 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA et déposés sur une membrane Nylon manuellement ou à l'aide d'un appareil à dot-blot. La répétition de ce cycle à 20 reprises procure une augmentation de plus de 100 000 fois de la quantité de la séquence de départ qui constitue la sonde proprement dite. Les membranes sont ensuite neutralisées, préhybridées et hybridées à 55 C dans un tampon 5 x SSPE, 5 x Denhart, 0,5 % SDS contenant les sondes (20 mer) radiomarquées en 5' - terminal avec @ 32P / ATP à l'aide de l'enzyme polynucléotide-kinase. Les sondes (49 mer ou 20 mer) peuvent être soit radioactives, soit marquées avec la biotine ou un autre composé froid. L'hybridation à 55 C est effectuée pendant 1 a 18 heures. Les membranes sont ensuite lavées 2 fois dans du 2 x SSPE, 0,1 % SDS à température ambiante, suivi d'un lavage à 55-C dans un tampon 5 x SSPE, 0,1 % SDS pendant 10 à 30 minutes. Pour les sondes radioactives, l'autoradiographie est effectuée pendant 2 à 10 heures à -80iC avec écran intensificateur. Pour les sondes froides, la mise en évidence de l'hybridation se fait par une suite de réactions immunocytochimiques décrites à l'Exemple 2 ci-dessus. Bien que la description qui précède ait essentiellement fait état du rôle joué par les sondes (1) et(2) pour la détermination du sexe des embryons de bovins, le contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes et la séparation de cette dernière en deux groupes comprenant respectivement le chromosome Y et le chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle, l'on comprendra aisément que ce rôle puisse s'étendre à d'autres animaux dans la mesure ou ces derniers présentent des séquences d'ADN spécifique du sexe mâle similaires à celles desdits embryons de bovins: de même, le rôle des sondes (1) et (2) tel que décrit dans ce qui précède, est uniquement donné à titre d'exemple non limitatif et peut s'étendre à la recherche d'autres séquences spécifiques du sexe mêle. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement & ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir a l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS le) Oligonucléotides synthétiques de 20 bases chacun, caractérisés en ce qu'ils comprennent respectivement les séquences en nucléotides suivantes : 5' 3' r ATCAGTGCAGGGACCGAGAT (1) 5' 3' r -1 GTGCTCCAAGGAGTGTTTAT (2) ainsi que leurs complémentaires, ou un fragment desdites séquences comportant au moins 11 nucléotides consécutifs ou tout autre fragment présentant au moins 70% d'homologie avec ces derniers, lesquelles correspondent pour le premier au segment comprenant les bases 1 à 20 et pour le second au segment comprenant les bases 21 à 40 de la sonde moléculaire comprenant la séquence en nucléotides de 49 pb (A) ci-après, connue en elle-même : 5' 3' ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT (A) et également caractérisés en ce que chacun d'eux présente, par hybridation avec de 1'ADN génomique male du genre Bos, digéré par une enzyme appropriée, un profil d'hybridation qui fait apparaître la présence d'au moins une bande spécifique du génome mâle du genre Bos, laquelle bande est de l'ordre de 7 kb. 2) Segments flanquants situés de part et d'autre de la séquence nucléotidique constituant l'une des sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères ruminants, notamment du genre Bos, selon la Revendication 1, ou la sonde (A), utiles pour l'amplification de ladite sonde, lesquels segments flanquants sont caractérisés en ce qu'ils présentent les séquences en nucléotides représentées par les formules (F 1) à (F 18) ci-après : 5' 3' # # ACCGGTCTAGGTCTAGCCCTTGTTCGGGACGCACATCACAGGCTCCTGAGCCCCCATCTC (F 1) 5' 3' # # GGTAGAGCCCGCATCTCGGTCCCCGCGGTGAACCTGGCCCGGTTCCTACCCCAGTC (F 2) 5' 3' r CTGAGGCCTCCTCTCGCACTCTGCCCTGAAGCCGTGCGCGTCCTGCCCTCGATCAGACCT (F 3) 5' 3' # # GACAGGGTGGGCCGTGCCCTCGTTCAGTCACCCGGGAAACACTGCTGAGCCCGCATCTTG (F 4) 5' 3' # # ACACTGCTGAGCCCGCATCTTGATCCCCGCGCTAAACCTGGCCGGCTCCTACCCCCAGG (F 5) 5' 3' # # ACCGGTCTAGGTCTGGCCCTTGTTCGATTCACTCAGCACAGACTCCTGAGCCCCCATCTC (F 6) 5' 3.' # # AGCTGTGATCCCGCAGCTCANTCCCGGCACTGAAGCCACCTCTGGGGCTTGGCCTGCTTC (F 7) 5' 3' # # AGAAGCAGTCTAGGGCCTGCCTTGTTCGGAATTCGGATGGATGCTGCCCTTGGGCAACAC (F 8) 5' 3' r TTCGGAATTCGGATGGATGCTGCCCTTGGGCAACACCCCCACCGCCCCCAAACTCACACA (F 9) 5' 3' # # AGCTCAACCACGGTGGTTTCTGCCTCTGGCCAAGGCCCTCGACAATCCTGAGCCCA (F 10) 5' 3' # # ATCTCACGCGCTGCACTAAACCACGCAGAGTTCCGCCCTTCCTGAAGTGCCCGTCTAAAG (F 11) 5' 3' r ACCAGTCGAGGTCCTGCCCTTTGTGCGGGCCCCTAGCACAGACTCCCGACCCAAACCTCT (F 12) 5' 3' # # ACACTGCTGAGCCCGCATCTTGATCCCCGCGCTAAACCTGGCCGGGCTCCTACCCCCAGG (F 13) 5' 3' # # ACCGGTCTAGGTCTGGCCCTTGTTCGATTCACTCAGCACAGACTCCTGAGCCCCCATCTC (F 14) 5' 3' # # CCCCCCGCCCGGTGTCTGCACTGATCCAGGCTGGCTCCTGCCCTCGGTCAAGACCCTGG (F 15) 5' 3' # # AGCAGGCTGGCTCCTGCCTTCGTTCAAGCACCTGGCAAAGTAACCGCCGGGAGACTCCAG (F 16) 5' 3' # # AGCTGTGATCCCGCAGCTCACTCCCGGACTGAAGCCACCTCTGGGGCTTGGCCTGCTTC (F 17) 5' 3' # # AGAAGCAGTCTAGGGCCTGCCTTCTTCGATTCCCGCGACACACACTCCTGAGCCACAGCT (F 18) 3e) Procédé d'amplification génique de sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment de ruminants, plus particulièrement de la sous-famille des bovinés et de façon spécifique du genre Bos, lesquelles sondes présentent l'une des séquences en nucléotides (A), (1) ou (2) ci-après : 5' 3' # # ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT (A) 5' 3' # # ATCAGTGCAGGGACCGAGAT (1) 5' 3' r GTGCTCCAAGGAGTGTTTAT (2) lequel procédé d'amplification est caractérisé en ce qu'il consiste à fixer à chacune des extrêmités, respectivement, de ladite sonde moléculaire, une séquence flanquante judicieusement choisie parmi les séquences flanquantes (F 1) à (F 18) selon la Revendication 2, par hybridation, puis a mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, connu sous le nom de cycle PCR. un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence constituant la sonde moléculaire de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. 4v) Application des sondes moléculaires de formules (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageusement marquées par un radio-isotope ou par une substance non-radioactive appropriée, a la détermination du sexe d'embryons ou de foetus de mammifères ruminants, notamment de la sous-famille des bovinés, et en particulier du genre Bos. 5 ) Application des sondes moléculaires de formules (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageusement marquées par un radio-isotope ou par une substance non-radio-active appropriée, au contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes. 6o) Application des sondes poléculaires de formules (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageusement marquées par un radio-isotope ou par une substance non radio-active appropriée, à la séparation des spermatozoïdes en deux populations de spermatozoïdes porteurs respectivemEnt du chromosome Y et du chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle. 7-) Application des sondes moléculaires de formules (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageusement marqué.. de façon appropriée et amplifiées à l'aide d'un ou plusieurs des segments flanquants (F 1) à (F 18) selon la Revendication 2, à la détermination du sexe d'embryons ou de foetus de mammifères ruminants, notamment de la sous-famille des bo nés, et en particulier du genre Bos. 8) Application des sondes moléculaires de o (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageus.-nt marquées de façon appropriée et amplifiées à l'aide d'un o plusieurs des segments flanquants (F 1) à (F 18) selon la Revendication 2, au contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes. i) Application des sondes moléculaires de formules (1) et (2) selon la Revendication 1, avantageusement marquées de fanon appropriée et amplifiées à l'aide d'un ou plusieurs des segments flanquants (F 1) à (F 18) selon la Revendication 2, à la séparation des spermatozoïdes en deux populations de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome Y et du chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle. 1O) Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation de mammifères rongeurs par des fractions de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y - ou X - contrôlées par hybridation avec une sonde de formule (1) ou (2), selon la Revendication 1. 11.) Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation de mammifères rongeurs par des fractions de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y - ou X - contrôlées par hybridation avec une sonde de formule (1) ou (2), selon la Revendication 1, ou une sonde de formule (A) amplifiée par un ou plusieurs segments flanquants de formules (F 1) à (F 18) selon la Revendication 2. 12') Réactifs immunologiques spécifiques reconnaissant des déterminants antigeniques contrôlés par les chromosomes X ou Y, ayant servi à l'obtention desdits réactifs et exprimés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon la Revendication 10 ou la Revendication 11, éventuellement purifiés.