Brevet FR2620701A1 — publié le 19890324

La présente invention a pour objet un nouveau dérivé de l'acide diéthyl- dithio-carbamique, le diéthyl-dithio-carbamate de choline, son procédé de préparation, et son utilisation thérapeutique. Le nouveau composé selon l'invention, le diéthyl-dithio-carba- mate de choline, de formule brute CO10 H24 N2 0 S2, répond à la formu- le développée suivante: C2H5 CH3 C NH"S - [H3L -CH2-CH20H CH3 C2H5 S CH3. et a un poids moléculaire de 252,40. Ce nouveau sel de choline se présente sous forme de fins cris- taux incolores ou légèrement jaunâtres, ayant un point de fusion à 9697 C, facilement solubles dans l'eau, dans les alcools et les glycols, et beaucoup moins solubles dans les solvants organiques. Les cristaux de diéthyl-dithio-carbamate de choline sont très hygroscopiques et doivent donc être conservés dans une enceinte hermétique et froide. L'analyse centésimale du produit donne les résultats suivants: Calculé Trouvé Moyenne Garbone 48,85 % 48,18 - 48,47 48,33 % Hydrogène 9,64 % 9, 37 - 9,54 9,45 % Azote 11,12 % 11,59 - 11,51 11,55 % Soufre 25,55 % 24,94 - 24,75 24,85 % Oxygène 6,35 % Les spectres I.R.,U.V., R.N.M. et debase montrent bien les bandes caractéristiques de la molécule du nouveau produit de l'invention. Le diéthyl-dithio-carbamate de choline peut être préparé par synthèse à partir du diéthyl-dithio-carbamate de sodium tri-hydraté et du chlorure de choline. La réaction est la suivante: C2H5 r CH3 1 Cl N-C-S-Na + [CH3-N-CH2-CH2OH] C2H5 CH3 C5H10NNaS2 3H20 C5H14C1NO C2H5 CH3 N-C-S- CH3-N-CH2-CH2OH / 1 + N.aCi C2H5 S CH3 C0loH24N2oS2 La synthèse peut être opérée selon le mode opératoire suivant: Dans deux erlens ou 2 bechers de capacité appropriée, on dissout séparément: - 56 g (0,40 mole) de chlorure de choline dans 100 ml d'éthanol absolu en le faisant tiédir à l'aide d'une plaque électrique ou d'un bain-marie et en remuant la solution pour favoriser la dissolu- tion. - 90 g (0,40 mole) de diéthyl-dithio-carbamate de sodium trihydraté dans 100 ml d'éthanol absolu. Quand les deux solutions sont limpides, on introduit lentement en mince filet la solution alcoolique de choline dans celle du sel sodique, ceci sous forte agitation et en refroidissant extérieu- rement par un bain d'eau froide, car la réaction est très exothermique. Quand le tiers environ est ajouté, il se forme un abondant précipité. On continue l'addition tout en maintenant une très vigou- reuse agitation. L'addition de la solution alcoolique de choline dans celle du sel sodique dure environ 15 minutes. On continue l'agitation encore pendant 30 minutes. On laisse ensuite refroidir pendant toute une nuit. Le récipient contenant la masse réactionnelle res- tant fermé. Le lendemain on élimine le chlorure de sodium par essorage et on lave sur filtre deux fois avec 50 ml d'éthanol absolu. On récupère environ 23 g de chlorure de sodium. On concentre les eaux-mères alcooliques (contenant le diéthyl- dithio-carbamate de choline dissous dans l'éthanol) au bain-marie, sous le vide de la trompe-à-eau pour chasser tout l'excès d'éthanol. On verse ensuite rapidement le résidu très visqueux dans un becher ou un mortier en verre ou en porcelaine. On sèche dans un dessicateur sous bon vide avec le pentoxyde de phosphore comme agent desséchant. Le produit obtenu se présente en bloc que l'on réduit en fins cristaux ou en fine poudre micro-cristalline qui est incolore ou très légèrement jaunâtre. Le rendement quantitatif en diéthyl-dithio-carbamate de choline obtenu est d'environ 100 g. -Le diéthyl-dithio-carbamate de choline ainsi obtenu doit être conservé dans une enceinte hermétique a cause de son hygroscopie. Selon la présente invention, on a mis en évidence les propriétés thérapeutiques du nouveau sel de choline et on a fait une étude très complète de sa toxicité. L'étude toxicologique a été effectuée sur la souris blanche SWISS. Chez cet animal on a pu étudier pour le diéthyl-dithio-carbamate de choline, la toxicité aiguë, la toxicité chronique, l'influence sur la prolificité, la tératogénèse, la fertilité dans le temps et la longévité, l'influence sur l'efficacité de la réponse immuni- taire. - Pour toutes ces expériences, les animaux ont été randomisés, séparés selon les sexes, répartis par lots de 30, les femelles gravi- des étant isolées en cages individuelles. Ces animaux étaient nour- ris avec un aliment complet convenable qu'ils pouvaient consommer ad libitum, pour éviter toute carence au cours de l'expérimentation. Leur boisson était l'eau ordinaire additionnée ou non du produit attesté, a savoir le diéthyl-dithio-carbamate de choline. L'aliment complet utilisé contenait avantageusement des céréales, des protéines végétales, des protéines animales, des sels minéraux et des vitamines. La mesure de la toxicité aiguë du nouveau composé selon l'inven- tion, administré par voie intrapéritonéale et sous-cutanée, montre que cette toxicité aiguë est très faible: Au-dessous de 1 g/kg il n'y a pas de mortalité. La DL 50 est comprise entre 1,4 et 1,7 g/kg. Le graphique suivant illustre ces résultats. TOXICITE AIGU CHEZ LA SOURIS EN G/KG (voie intrapéritonéale et sous-cutanée) - tr - c> - o -4 o 50- v _ ( -., If I 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 diéthyl-dithio-carbamate de choline g/kg Pour mesurer la toxicité chronique du nouveau composé selon l'invention, on a administré par voie buccale dans l'eau de boisson une dose de 20 mg/kg par jour du nouveau composé, à 4 lots de 30 souris pendant 100 jours. Aucun effet néfaste sur la santé des animaux n'a pu être relevé. On a examiné quel était l'effet du nouveau composé selon l'in- vention sur la prolificité et la tératogénèse des souris blanches SWISS. Les expériences ont été poursuivies sur quatre générations d'animaux et ont montré que les lots recevant le nouveau composé selon l'invention avaient globalement 15 % de plus de descendants que les lots témoins, ceci avec un taux de souriceaux mort-nés infé- rieur de moitié. Les résultats figurent dans le tableau ci-dessous: EXPERIENCES DE PROLIFICITE ET DE TETRATOGENESE EFFECTUEES SUR QUATRE GENERATIONS DE SOURIS BLANCHES FEMELLES SWISS DE 4 MOIS (Lots T - témoins; lots G - diéthyl-dithio-carbamate de choline à 1 "/oo dans l'eau de boisson) O Nombre de souris Nombre de souri- Nombre de Nombre O gravides contrâ- ceaux nés souriceaux de foetus lées a chaque gévivants mort-nés résorbés nération O T G T G T G T G I 30 30 255 249 7 - 15 2 II 30 30 242 316 5 2 9 2 III 30 30 258 324 8 - 8 - IV 30 30 263 308 3 - 1' _ Totaux 120 120 1018 1197 23 2 43 4 De même la mesure de la fertifilité des souris femelles en fonction de leur âge a montré que l'administration du nouveau composé selon l'invention allonge substantiellement la période de fertilité des souris femelles comme le montre le tableau ci-dessous: EXPERIENCES DE FERTILITE DES SOURIS FEMELLES SWISS SELON LEUR AGE (Lots T = témoins; lots G = Diéthyl-dithio-carbamate de choline à 1 '/oo dans l'eau de boisson % de souris nombre moyen de !S femelles souriceaux par fertiles souris fertile T G T G _ souris de 4 mois 97 97 8,5 9,8 souris de 8 mois 62 92 6,9 8,0 souris de 15 mois 23 60 -5,2 7,5 Enfin, en ce qui concerne la croissance et la longévité des animaux, on a pu remarquer que le nouveau composé selon l'invention n'avait pas d'influence'négative sur la croissance malgré une réduc- tion d'environ 25% de la prise d'eau et d'environ de 5 % de la pri- se de nourriture. On a au contraire constaté que l'administration du nouveau composé selon l'invention retardait considérablement le vieillissement. Cette dernière activité est particulièrement spectaculaire chez les souris mâles, et semble due à une modification des caractères et des comportements amenant une diminution de la vulnérabilité qui résulte habituellement d'une très forte agressi- vité. Les mâles témoins se battent beaucoup plus, s'épuisent, se blessent et se tuent. EXPERIENCES DE LONGEVITE COURBES DE MORTALITE DES SOURIS SWISS MALES ET FEMELLES abreuvées avec de l'eau ordinaire pour les témoins et de l'eau ordinaire additionnée de 1 /0o de diéthyl-dithio-carbamate de choline pour les lots expérimentaux (chaque courbe est la moyenne de 10 lots de 30 souris). / (1) - E o m 50 X -4 o 40 - ci> x e r30 - / / (2) o 30 20 / (3) i (4) 0- 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 âge en mois (1) souris mâles témoins (2) souris mâles recevant du diéthyldithio-carbamate de choline (3) souris femelles témoins (4) souris femelles recevant du diéthyl-dithio-carbamate de choline On a également étudié l'influence du nouveau composé selon l'invention sur l'efficacité de la réponse immunitaire chez les souris blanches SWISS. La protection des animaux supérieurs contre les agressions est assurée par le système immunitaire, qui opère harmonieusement par des processus diversifiés et fort complexes, en relation avec les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité. L'efficacité de la réaction immunitaire dépend des mécanismes et d'équilibres conjugués qui déterminent les principaux paramètres de la compétence (sensibilité, précision, intensité, durée). Ainsi, les multiples et diverses agressions sont habituellement rapidement maitrisées sans être sciemment perçues par l'hâte agressé. Mais lorsque les réponses inappropriées et erronées sont fréquentes, elles sont à l'origine de nombreuses maladies inflammatoires difficiles à maîtri- ser et qui s'amplifient généralement avec le vieillissement. Dans ces cas la, une stratégie hygiénique et des interventions thérapeuti- ques s'imposent pour corriger les erreurs immunitaires, maîtriser l'inflammation et pour rétablir la fonctionnalité des tissus et des territoires lésés. Le tableau ci-après illustre la potentialisation de la compéten- ce immunitaire par le diéthyl-dithio-carbamate de choline. Le tableau montre en effet que pour obtenir la même protection immu- nitaire, il faut 100 mcg de vaccin spécifique chez les témoins et seulement 20 mcg pour les souris traitées avec le composé selon l'invention. INFLUENCE DU DIETHYL-DITHIO-CARBAMATE DE CHOLINE CHEZ LA SOURIS, SUR L'EFFICACITE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE A L'INJECTION SOUS-CUTANEE D'UN ESCHERICHIA COLI PATHOGENE (T = lots témoins; G = lots abreuvés depuis 21 j avec de l'eau de boisson comportant l' /oo de diéthyl-dithio-carbamate de choline) Quantités de vaccin injectées par voie sous-cutanée (mcg/souris de 25 g), À > 8 jours avant l'épreuve pathogène O 3 10 20 50 70 100 150 T G T G T G T G T G T G T G T G DLO + + + + + + + oI >ODL30 I GOU - 41 E C DL50 + tu -E M (O J 4J,- d À- cO o cC: DL70 + + + O ')O0 '-i 1) G mo _ _ __ __ 8 _lo cz - - + + GC (H DL100 + ++ + _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _j _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Il résulte de toutes les expérimentations relatées ci-dessus que la toxicité du nouveau composé selon l'invention est pratiquement nulle. Il apparaît également que l'administration de ce nouveau sel de choline aux souris blanches SWISS entraîne des effets très favorables sur la prolificité, la longévité, les comportements et l'efficacité de la réponse immunitaire. Les études pharmacologiques. du nouveau composé selon l'invention ont montré qu'il possédait un effet chélatant des métaux lourds et de transition, un effet immuno-stimulant, un effet anti-dégéné- ratif et un effet sur les transferts neuronaux, et qu'il présentait par conséquent une très intéressante activité thérapeutique dans le domaine des maladies dégénératives cérébrales, telles que les démences séniles, la maladie d'Alzheimer et les démences de type Alzheimer. On sait que dans ces maladies, les neurones centraux cholinergi- ques sont les premiers atteints par la dégénérescence, que ce soit au niveau de la synthèse du neuro-médiateur: l'acétyl-choline, ou au niveau de la membrane qui nécessite de la choline pour sa biosynthése. Or du point de vue thérapeutique, on ne peut pas admi- nistrer directement de l'acétyl-choline qui ne traverse pas les membranes, et les résultats obtenus par administration de choline seule sous forme de chlorure sont tout à fait insuffisants. On sait par ailleurs que dans ces maladies dégénératives, les capacités immunitaires des sujets sont diminuées et que les teneurs en métaux retrouvées au' niveau des lésions cérébrales sont très élevées. Selon la présente invention, on a trouvé que le nouveau dérivé de choline, le diéthyl-dithio-carbamate de choline, était susceptible de traiter ces maladies dégénératives cérébrales, en réalisant, grâce à un tropisme particulier, un apport de choline, précurseur de la synthèse de l'acétylcholine, apport intervenant à la fois au niveau de la membrane et au niveau du fonctionnement cholinergique des neurones. Par ailleurs le nouveau composé selon l'invention permet de diminuer les concentrations en métaux toxiques grâce à son pouvoir chélatant et augmente les capacités immunitaires des malades grâce à ces propriétés immuno-stimulantes. Le nouveau composé selon l'invention a fait l'objet d'un certain nombre d'expérimentations conduites sur deux modèles animaux de dégénérescence nerveuse, provoquée soit par une destruction des noyaux cholinergiques de la base, soit par l'administration réitérée d'hydroxyde d'aluminium. On a observé dans les deux cas, que les capacités d'apprentissage des animaux, détériorées en liaison avec la dégénérescence, se trouvaient restaurées par l'administration par voie orale du diéthyl-dithio-carbamate de choline selon l'inven- tion. Apres un traitement de trois semaines, on observait un effet- dose et les mesures de dose efficace révélaient que la DE50 était comprise entre 0,10 g et 0,30 g/kg de poids d'animal. L'étude clinique du diéthyl-dithio-carbamate de choline a été réalisée en procédant à des expérimentations cliniques sur des pa- tients atteints d'une maladie dégénérative cérébrale, parfaitement définie selon les critères DSM III du MMS, d'un-bilan psychométrique approfondi et d'une radiographie SCANER. L'expérimentation a été menée en double insu, en milieu hospita- lier avec les traitements suivants d'une durée de six a douze semai- nes: - placebo - chlorure de choline - diéthyl-dithio-carbamate de choline. Les doses de substance active utilisées étaient de 125 mg par prise orale trois fois par jour, soit une dose journalière de 375 mg. Les résultats montrent que dans 70 % des cas traités par le produit selon l'invention, on observe une suppression ou une réduc- tion significative des troubles de comportement et de l'humeur des patients, ces résultats étant objectivés par des tests psychométri- ques. Dans le cas des patients traités avec le placebo ou le chlorure de choline, on observe dans 30% des cas seulement des améliorations légères peu nettes et moins durables que celles obtenues dans le cas des patients traités avec le nouveau composé de l'invention. Selon la présente invention, on réalise des préparations pharma- ceutiques contenant le diéthyl-dithio-carbamate de choline à titre de principe actif, ces préparations pouvant être administrées par voie orale, rectale, ou injectable, selon l'état physiopathologique du tractus digestif des malades considérés. Dans le cas de l'administration orale, les préparations pharma- ceutiques de l'invention se présentent sous forme de gélules ou comprimés dans lesquels le composé actif est associé à un excipient convenable comprenant du gel de silice pour tenir compte du caractère fortement hygroscopique du diéthyl-dithio-carbamate de choline. Par ailleurs pour éviter l'hydrolyse prématurée de ce dernier au niveau de l'estomac, il est nécessaire que l'enveloppe galénique de ces préparations pour administration orale soit de nature entéri- que (par exemple micro-encapsulation). Dans le cas de l'administration par voie rectale, on peut prépa- rer à partir du composé selon l'invention des suppositoires de compo- sition classique. Dans le cas de la voie injectable il est nécessaire de prévoir le conditionnement séparé du diéthyl-dithio-carbamate de choline et du soluté physiologique qui devra lui être additionné au moment de l'administration. La posologie retenue pour les nouvelles préparations pharmaceu- tiques selon l'invention se situe entre une administration journaliè- re de 250 mg a 2,5 g de composé actif, étant entendu que pour l'admi- nistration orale les gélules ou comprimés sont dosés à 125 mg du composé actif et peuvent être administrés à raison de 2 à 20 gélules ou comprimés par jour,' et que pour l'administration rectale les suppositoires sont dosés a 250 ou 500 mg de composé actif pour 3 g. Les preparations pharmaceutiques décrites ci-dessus sont données à titre d'exemple illustratif et non limitatif de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - A titre de nouveau composé le diéthyl-dithio-carbamate de choline ayant la formule développée suivante: C2H5 CH3 N-C-S- CH3-N-CH2-CH2OH C2H5 CH3 2 - Procédé de préparation du diéthyl-dithio-carbamate de choline caractérisé en ce qu'on fait réagir du chlorure de choline sur du diéthyl-dithio-carbamate de sodium tri-hydraté, en introdui- sant lentement une solution de chlorure de choline dans l'éthanol absolu dans une solution dans l'éthanol absolu de diéthyl-dithio- carbamate de sodium tri-hydraté, sous forte agitation et en assurant un refroidissement extérieur du milieu réactionnel, et en récupérant en fin de réaction après refroidissement complet, d'une part le chlorure de sodium formé et d'autre part les eaux- mères alcooliques qui contiennent le diéthyl-dithio-carbamate de choline dissous dans l'étahnol, en concentrant les eaux- mères et en séchant le résidu visqueux dans un dessicateur. 3 - Préparations pharmaceutiques utiles dans le traitement des mala- dies dégénératives cérébrales, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de composé actif du diéthyl-dithio-carbamate de choline. 4 - Préparations pharmaceutiques selon la revendication 3, caractéri- sées en ce qu'elles se présentent sous forme de gélules ou com- primés dosés & 125 mg de composé actif pour administration orale, ou sous forme de suppositoires dosés à 250 mg ou 500 mg de compo- sé actif pour administration rectale. - Preparations pharmaceutiques,selon la revendication 4, caractéri- sées en ce que les gélules ou comprimés présentent un enrobage avec une substance entéro-résistante ne se délitant qu'en milieu intestinal. 6 - Préparations pharmaceutiques selon les revendications 3, 4 et , caractérisées en ce que les gélules ou comprimés peuvent être administrés a raison de 2 a 20 gélules par jour réparties en trois prises, avec une posologie préférentielle de 2 à 10 gélules par jour, et en ce que les suppositoires peuvent être administrés à raison de 1 a 3 par jour. 7 - Préparations pharmaceutiques selon les revendications 3, 4, 5 et 6 caractérisées en ce que les gélules ou comprimés contien- nent un excipient comportant du gel de silice.