Brevet FR2616432A1 — publié le 19881216

La présente invention concerne de nouveaux aminoacylates d'acétal du glycérol, un procédé pour leur préparation ainsi que des compositions thérapeutiques en contenant. La présente invention concerne les aminoacylates d'acétal du glycérol de formule générale I: CH2- 0 R1 IsC' \c I CH - 0 R2 CH20 CO(CH2)-Ne X dans laquelle - R1 représente un groupement phényle substitué ou un groupe de formule CmH2m + 1, m étant un entier de 9 à 25, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule CnH2n + 1, n étant un.entier de 1 à 10, p est un entier de 3 à 10, -N)représente un groupement hétérocyclique contenant un atome d'azote tel que le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinolinium, l'imidazolium et le pyrazinium, et X représente l'anion pharmaceutiquement acceptable d'un acide minéral ou organique, un ion halogène tel que le chlore, le brome, l'iode ou les anions des acides benzoique, acétique, méthanesulfonique, ou tartrique, sous la- forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci. -2- Les composés selon l'invention sont intéressants en tant qu'agents anti-PAF (PAF signifie Facteur d'Agrégation Plaquettaire), avec l'activité correspondante comme anti-anaphylactiques, anti-thrombotiques, anti-coagulants, anti-bronconstricteurs, anti-ischémiques, normotenseurs, immunodépresseurs et ils agissent contre l'altération des reins, contre différents chocs, contre les allergies de là peau et les ulcères intestinaux provoqués, par exemple, par l'endotoxine. L'invention concerne, également, un procédé pour la préparation des composés de formule I, tels que définis plus haut, ce procédé consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule R1COR2, dans laquelle Rl et R2 sont tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis à faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-l,3 ainsi obtenu sur un chlorure de w- haloalcane de formule ClCO(CH2)pX, dans laquelle p et X sont tels que définis précédemment, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine et, enfin, à faire réagir, entre 50 et 80'C, sous circulation d'azote, le composé résultant, de formule 0 R2 OCO(CH2)p-X sur un composé hétérocyclique contenant un atome d'azote de formule Les composés selon l'invention sont obtenus sous forme d'un mélange non-séparé de leurs diastéréoisomères, mais ils peuvent être séparés par les méthodes habituelles. - 3 - Ce procédé de préparation peut être illustré par la séquence de réactions suivante: Etapes 0 a R -C-R2 + CH20H-CHOH-CH2H aO -0 R2 a 0 -OH O R N Et3 X 1 + Cl CO(CH2)p X) 0 R2 b C3 oCO(CH2)p X + NO) >) E > 2 c 7 -0R2 ize - CO(CH 2) p-N) X. I L'invention sera mieux comprise grâce à la description des exemples qui suivent. L'exemple I est décrit en détail; dans les exemples suivants, seules sont données les caractéristiques des substituants et des composés obtenus (la chromatographie en couche mince est réalisée sur plaques au gel de silice, sauf indication contraire). -4- EXEMPLE 1 Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-4' butyryl- oxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 R1 = C17H35, R2 = CH3, -N) = pyridinium, X = Cl, p = 3. Etape a: Préparation de l'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxy- méthyle-4 dioxolane-1,3. a Dans un réacteur approprié, on verse 11,1 g (40 mmole) de nonadécanone-2, 6 g de glycérol bidistillé - ce qui représente un léger excès par rapport aux proportions stoechiométriques - et 0,6 g d'acide p-toluènesulfonique dissous dans 120 ml de toluène sec. Le mélange réactionnel est porté au reflux sous agitation pendant 12 heures et l'eau obtenue est éliminée au moyen d'un appareil Dean Stark. Après refroidissement, la phase organique est lavée avec 30 ml, à 5 % en poids, d'une solution aqueuse de potasse, puis à nouveau trois fois avec la quantité minimale d'eau. Après séchage sur sulfate de soude anhydre, le solvant -est éliminé sous pression réduite. Le résidu est ensuite purifié par chromatographie sur colonne au gel de silice. On sépare la fraction de cétone qui n'a pas réagi (éther de pétrole: éther éthylique, 95: 5 en volumes), et enfin le dioxolane a (éther de pétrole: éther éthylique, 85: 15 en volumes). Le dioxolane est un produit visqueux, partiellement cristallisé. Rendement: 11 g (78 %) rf: 0,18 (éther de pétrole: éther éthylique, 70: 30 en volumes). IR: 3500 cm-1 (OH) 1100 - 1060 cm-1 (C-O-). 26' 16432 - 5 - Etape b: Heptadécyle-2 méthyle-2 (chlorobutyryloxy- méthyle-4')-4 dioxolane-1,3. b Un mélange de 6,4 g (18 mmole) d'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxyméthyle-4 dioxolane-l,3, préparé comme décrit à l'étape (a) ci-dessus, et de 6 ml (45 mmoli) de triéthylamine dans 15 ml de chloroforme sec est ajouté goutte à goutte à une solution de 6,25 g (22 mmole) de chlorure de chlorobutyryle-4 dans 10 ml de chloroforme sec à 0 C. Le mélange est agité pendant 12 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 20 ml de chloroforme, le mélange est lavé avec une solution aqueuse de soude 1N, puis avec de l'eau jusqu'à neutralité. L'élimination du solvant donne un résidu que l'on chromatographie sur colonne de gel de silice avec, comme éluant, des mélanges éther de pétrole: éther éthylique successivement 95: 5, 90: 10 et finalement 80:. 20 en volumes. On obtient ainsi 7,6 g (rendement: 82 %) d'un produit huileux qui cristallise; point de fusion: 39-400 C. Ce produit est un mélange de deux isomères cis et trans, difficilement séparables. rf: 0,45 at 0,37 (éther de pétrole: éther éthylique, 80: 20 en volumes). IR: 1740 cm'1 (C=O) 1180 - 1160 cm'1 (C-O-C éther et ester) RMN: 60 MHz, CDC13, (TMS.) S: 0,9 (triplet, 3H, CH3 de la chaine) 1,3 (mult., 35H, 32H + CH3) 2,1 (mult., 2H, CO-CH2-CH2) 2,5 (triplet, 2H, CO-CH2) 3,6 (mult., 4H, CH2-O et CH2Cl) 4,2 (mult., 3H, CH20CO et CH-O). - 6 4 3 -6- Etape c: Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(pyridinium-N)-4' butyrylpxyméthyle]-4 dioxolane-1,3. I g du composé obtenu à l'étape (b) précédente sont dissous dans 30 ml de pyridine, le mélange est agité à 80 C, sous circulation d'azote, pendant 24 heures. L'excès de pyridine est ensuite éliminé sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice. On élue avec du chloroforme (pour recueillir le matériau de départ qui n'a pas réagi), puis avec des mélanges chloroforme: méthanol, tout d'abord à 90: 10, puis à 80: 20 en volumes; on obtient 3,80 g du composé recherché. Ce produit est un mélange des deux isomères cis et trans difficilement séparables. Rendement: 40 % sur l'ensemble de l'exemple (65 % pour cette étape). Point de fusion: 84-85 C. rf: 0,28 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes) IR (nujol): 1740 cm-1 1630 cm-1 (pyridine) 1200, 1180 cm-1 (C-O-C). RMN: 250MHz, CDC13. 6: 0,9 (triplet, 3H, CH3) 1,2 (sing. large 30H) -0 1,4 (doublet, 3H, -OX CH3) (les deux CH3 des deux diastéréoisomères) -O CH2- 1,55 (mult., 2H, -0X) 2,35 (mult., 2H, CO CH2-CH2) 2,6 (triplet, 2H, CO CH2) 3,9 (mult., 1H, CH-O) 4 (mult., 2H, CH2O CO) 4,2-3,6 (2 mult., 2H, CH2O) (des deux diastereoisomères) ,10 (mult., 2H, CH2N) ,10 (mult., 2H, CH2N) 26 1 6432 -7 - 8 (mult., 2H, HP) pyridinium. 8,4 (mult., 1H, H1) 9,6 (doublet, 23H) Spectre de masse: M - Cl m/z -: 504 EXEMPLE 2 Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(quinolinium-N)-4' butyryl- oxyméthylel-4 dioxolane-1,3. Etape c: 5 g du composé obtenu dans l'exemple 1 (étape b) sont dissous dans un mélange de 20 ml de quinoléine et de 20 ml de DMSO, puis chauffé à 80 C sous circulation d'azote, pendant 4 jours. La quinoléine et le DMSO sont distillés sous pression réduite et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice (Eluants successifs: CHC13, puis CHCl3: MeOH, 95: 5 en volumes). On obtient 2,5 g du produit recherché sous forme d'un mélange de ses deux diastéréoisomères. rf: 0,58 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes) IR v quinoléine 1650, 1630 et 1600 cm-1 Spectre de masse: M - C1 m/z: 554 0 _ (CH2)3_ CO2H 216. --8-- RMN: quinolinium au lieu de pyridinium. 6 ppm: 7,90 - 8,10 (4H), 8,70 (1H), 8,90 (1H), 10,90 (lHa). EXEMPLE 3 Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-thiazolinium)-4' butyryl oxyméthyle]l-4 dioxolane-1,3. Etape c: 850 g du produit obtenu dans l'exempie 1 (étape b) mélangés avec 4 ml de thiazole et 6 ml de DMSO sont chauffés à 800 C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est évaporé sous vide et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice, éluant: CHC13: MeOH, 50: 50 en volumes. On obtient un produit visqueux. rf: 0,34 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes). RMN: thiazolinium au lieu pyridinium. 6 ppm: 8,19 (d 1H), 8,4 (d: 1H, ,90 (sing. 1H). Spectre de masse: M - Cl: 510 m/z. EXEMPLE 4 Chlorure d'heptadécyle-2 [(N-pyridinium)-4' butyryloxy- méthyle]l-4 dioxolane-1,3. R1 = C17H35, R2 = H, -N) = pyridinium, X = Cl, p = 3. 2 b rf: 0,17 (éther de pétrole: éther éthylique, 30: 70 en volumes) 3 b rf: 0,37 (éther de pétrole: éther éthylique, 70: 3C en volumes) Ib rf:0, 16 (chloroforme: méthanol, 70: 30 en volumes) - 9- -0 Ib RMN au lieu de CH3 à 1,4 (-O XCH3) -0 2 multiplets centrés sur 4,9 ppm (-OXH) Spectre de masse: M-Cl: 490 m/z. EXEMPLE 5 Chlorure d'heptadécyle-2 r(N-quinolinium)-4' butyryloxy- méthyle] -4 dioxolane-l, 3. R1 = C17H35, R2 = H, -N) = quinolinium, X = Cl, p = 3. rf: 0,48 (chloroforme: méthanol, 70: 30 en volumes). EXEMPLE 6 Chlorure d'heptadécyle-2 (n-propyle)-2 [ (N-pyridinium)-4' butyryloxyméthylel] -4 dioxolane-1,3. R1 = C17H35, R2 = n-propyl, -N) = pyridinium, X = Cl, p = 3. 2 c rf: 0,23 (éther de pétrole: éther éthylique, 70: 30 en volumes) 3 c rf: 0,38 (éther de pétrole: éther éthylique, 80: 20 en volumes) Ic rf: 0, 20 (chloroforme: méthanol, 73: 30 en volumes) Ic RMN au lieu de CH3 à 1,4 -O CH2- 1,55 (mult. 4H -O CH2-) 1,2 (32H) 0,9 (triplet, 6H, 2CH3) Spectre de masse: M - Cl: 532 m/z. - 10 - EXEMPLE 7 Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-5' pentanoyloxyméthyle]l-4 dioxolane-1,3. R1 = C17H35, R2 = CH3, -NOO) = pyridinium, X = -Cl, p = 4. rf: 0,23 (chloroforme: méthanol, 70: 30 en volumes). EXEMPLE 8 Chlorure de (triméthoxyphényle - 3,4,5) - 2 méthyle-2 [N-pyridinium)-4' butyryloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3. OCH3 G) R1 0 OCH3, R2 = CH3, -Noo)= pyridinium, X = Cl, p = 3 OCH3 2 d rf: 0,32 (chloroforme: méthanol, 98: 2 en volumes) 3 d rf: 0,61 (chloroforme: méthanol, 98: 2 en volumes) Id rf: 0,34 (chloroforme: méthanol, 60: 40 en volumes) IR 1735 (C=O) 1610 (pyridine) 1590 (benzène) 2740 (OCH3) Id RMN au lieu de la chaine R1 -0 1,5 ppm (m, 3H, -OX CH3) pour R2 3,7 (sing., 9H, OCH3) 6,8 (2H arom.) Spectre de masse: M - Cl: 432 m/z. - 11 - EXEMP1E 9 Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 r(N-pyridinium)-6' hexanoyl- oxyméthylel-4 dioxolane-1,3. (D 0 R1 = C17H35, R2 = CH3, -N) = pyridinium, X = Br, p = 5. Etape b: Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 (bromohexanoyloxy- méthyle-6')-4 dioxolane-1,3. En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromohexanoyl-6, on obtient le produit recherché sous forme de produit visqueux (rendement: 82 %). rf: 0,57 (éther de pétrole: éther, 80: 20). EtaDe c: Suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, le produit recherché est obtenu sous forme d'un produit visqueux (rendement: 70 %). rf: 0,36 (CHCl3: MeOH), 70: 30) IR: 3450 cm-1 (eau résiduelle) vCo 1740, vC-O-C 1180, vpyridine 1640 cm-1 RMN 500 MHz CDC13, 6 (TMS) 0,85 (triplet, 3H, CH3); 1,25 (sing. large 30H); -O 1,35 (d 3H, -OXCH3 Z + E); 1,45 (mult., 2HF, CH2); 2,1 (mult., 2H, COCH2CH2); 2,35 (mult., 2H, COCH2) -; 2,70 et 4,35 (mult., 2H, CH2O, Z + E); 4(mult. 3H, CH2OCO et H-C-O); 5,05 (triplet, 2H, CH2N). pyridinium 8,1 (triplet, 2H, H$); 8,6 (triplet, 1H, HJ); 9,5 (d: 2H, Ha). U.V. (Ethanol) loge 3,65 A 258,8 nm. Spectre de masse: M -Brm/z: 532 (DN - (CH2)3 - C02H 194. - 12 - EXEMPLE 10 Bromure d'heptadéçyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyl- oxyméthyle]-4 dioxolane-1,3. rf: 0,60 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes) IR Quinolinium 1650, 1630, 1600 cm-1 U.V. (Ethanol) logE 4,53 A 235,4 nm 2,18 A 316,5 nm RMN quinolinium au lieu de pyridinium. 6: 5,5 (2H, CH2N), 7,90 - 8,40 (5H), 9,10 (1H), 10,70 (1H, Ha) Spectre de masse: M - Br m/z: 582 0 -- (CH2)3 --C02H 244. :244. EXEMPLE 11 Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 r(N-isoquinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 &ioxolane-1,l3. Etape c: On utilise de l'isoquinoléine au lieu de la quinoléine. rf: 0,55 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes) IR isoquinoléine 1650, 1610, 1590 cm-1. RMN isoquinolinium au lieu de quinolinium. e 6: 5,15 (triplet, 2H, CH2N); 7,95 - 8,40 (4H); 8,80 (2H); 11,05 (1H). Spectre de masse: M - Br: 582 m/z. - 13 - EXEMPLE 12 Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-ll' undéca- noyloxyméthylel-4 dioxolane-1,3. R1 = C17H35, R =C3,-NO R1 = C17R35t R2=, = CH3 = pyridinium, X = Br, p = 10. Etape b: Heptadécyle-2 méthyle-2 (bromo-undécanoyloxy- méthyle-11')-4 dioxolane-1,3. En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromo-l! undécanoyle, on obtient le produit recherché. Point de fusion: 52 C (rendement 60 %) rf: 0,26 (éther de pétrole: éther éthylique, 85: 15). Etape c Point de fusion: 92' C rf: 0,45 (CHCL3: MeOH, 70: 30 en volumes) Spectre de masse: M - Br: 602 m/z. EXEMPLE 13 Bromure d'heptadécyle-2 (n-propyle)-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoylméthylel-4 dioxolane-1,3. R1 = C17H35, R2 = n-propyle, -NO) = pyridinium, X = Br, p = 5. rf: 0,44 (CHC13: MeOH, 70: 30 en volumes) Point de fusion: 76' C Spectre de masse: M - Br: 560 m/z. - 14 - EXEMPLE 14 Bromure de nonyle-2 méthyle-2 r[(N-pyridinium)-6' hexanoyloxy- méthylel-4 dioxolane-1,3. R1 = C9H19, R2 = CH3, NI) = pyridinium, X = Br, p = 5. Etape b rf: 0,50 (éther de pétrole: éther éthylique, 80: 20 en volumes) Etape c rf: 0,30 (CHCl3: MeOH, 70: 30 en volumes) Spectre de masse: M - Br: 420 m/z. - 15 - TOXICOLOGIE Les composés selon l'invention ont été administrés à la souris pour déterminer la valeur de la DL50. Pour tous les composés selon l'invention, la DL50 a été supérieure à 300 mg/kg (IP ou SC) et à 600 mg/kg (PO). PHARMACOLOGIE L'intérêt pharmaceutique des composés de l'invention a été mis en évidence par l'expérimentation pharmaceutique suivante. l) - Inhibition de l'agrégation plaquettaire sur le lapin de Nouvelle-Zélande. L'expérimentation a été conduite sur des plaquettes, à partir de plasma de lapin de Nouvelle-Zélande. Les échantillons de sang ont été prélevés par l'artère auriculaire et mis dans une solution de tampon citrate (3,8 %; pH 7,4); le sang a ensuite été centrifugé pendant 15 mn à 1200 t/mn. L'échantillon testé a été préparé dans le DMSO, puis versé sur des plaquettes riches en plasma avec lesquelles il a été laissé en contact pendant 1 mn, et une dose de 2,5 nM de PAF a été ajoutée. La détermination est faite sur un appareil Cronolog Coultronics qui détermine le pourcentage de transmission correspondant à la valeur maximale du pic avant la désagrégation. Le pourcentage de variation de l'inhibition, en ce qui concerne le pourcentage de transmission, est calculé (témoin: DMSO pur). Cette méthode est décrite en détail dans LABORATORY INVESTIGATIONS, Vol. 41, No. 3, p. 275, 1979, JEAN-PIERRE - 16 - CAZENAVE, Dr. MED., JACQUES BENVENISTE, Dr. MED., et J. FRASER MUSTARD, M. D., "Aggregation of Rabbits Platelets by Platelet-Activating Factor is independent of the Release Reaction and the Arachidonate Pathway and inhibited by Membrane-Active drugs". Les résultats démontrent que les composés inhibent l'agrégation induite par 2,5 nM de PAF. Cinq tests, effectués sur des lots de chacun cinq lapins, ont permis de calculer la CI50 des divers composés en utilisant la méthode de régression linéaire. Pour les composés des différents exemples, les valeurs suivantes de CI50 ont été trouvées: Exemple No. CI50 PRP (M) No. 1........................ 2,2. 10-6 No. 2........................ 1,2. 10-6 No. 3................... ... 2,15. 10-5 No. 4........................ 7. 10-6 No. 5................DTD: ........ 3,1. 10-6 No. 6........................ 3,04. 10-6 No. 7.........DTD: ............... 5. 10-6 No. 8.........................1,13. 10-5 No. 9....DTD: .................... 4,04. 10-7 No. 10........................ 3,03. 10- 7 No. 12........................ 3,12. 10-5 No. 13........................ 1,73. 10-6 No. 14........................ 1,46. 10-6 -17-..DTD: 2 INTERACTION AVEC LA FIXATION DU PAF SUR SON RECEPTEUR MATERIEL ET METHODE Le PAF - [3H] synthétique tritié utilisé- est une solution éthanolique présentant une activité spécifique de 59,5 ci/mmols. Le PAF non marqué et le PAF-lyso sont en solution dans l'éthanol et stockés & -80 C. Les composés testés sont en solution dans le DMSO. Préparations des plaquettes de membrane On prélève du sang complet de lapin (6 volumes) par l'artère principale de l'oreille et on le verse dans 1 volume d'une solution d'ACD (1,4 g d'acide citrique, 2,5 g citrate de sodium, 2 g de dextrose pour 100 ml de H20) et on le centrifuge à 150 g pendant 15 minutes. Les plaquettes riches en-plasma (PRP) sont retirées avec précaution et centrifugées pendant 15 minutes à 1000 g. L'amas plaquettaire est ensuite lavé 3 fois: deux fois à l'aide de 10mM d'un tampon Tris-HCl, pH 7,4 contenant 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM d'EDTA et une dernière fois par le même tampon mais sans chlorure de sodium. L'amas plaquettaire est remis en suspension dans ce dernier tampon, congelé rapidement dans l'azote liquide et décongelé lentement à température ambiante au moins 3 fois comme cela a été décrit par T. Y. Shen et al.. Les plaquettes lysées sont centrifugées à 100 000 g pendant 30 minutes dans une ultra centrifugeuse L8 55 modèle BECKMAN (Rotor 50,2 Ti). - Les plaquettes homogénéisées sont stockées à -80 C et utilisées sous deux semaines sans changements notables dans les. caractéristiques de l'interaction du PAF acéther. Le contenu en protéines est déterminé par la méthode Lowry utilisant de la serumalbumine bovine comme étalon. - 18 - Dosaqe de l'interaction avec la fixation du PAF sur son récepteur On ajoute 60 à 100 pg de protéines de la membrane sous un volume final d'un ml dans des tubes plastiques contenant 1 nM PAF [3H] dans 10nM d'un tampon de Tris-HCl de pH7 contenant 0,025 % serumalbumine bovine et incubé avec ou sans PAF non marqué ou d'antagonistes du PAF. L'incubation s'effectue pendant 1 h 30 à 0C. Le PAF - [3H] lié s'est séparé du PAF - [3H] par filtration immédiate sous vide sur filtres en fibre de verre GF/C (système Brandel). Le réacteur et les filtres sont lavés 3 fois à l'aide d'une solution de 5 ml de tampon glacé.Les filtres sont ensuite placés dans des flacons en polyethylène remplis de 10 ml de fluide de scintillation liquide et on mesure la radioactivité avec un compteur LKB p dont le rendement est de 45 %. On détermine l'interaction non spécifique en présence -6 de 106 M de PAF non marqué. On calcule l'interaction spécifique en soustrayant l'interaction non spécifique de l'interaction totale. On détermine l'inhibition provoquée par les composés sur l'interaction PAF - [3H] spécifique en pourcentage d'inhibition par la formule suivante: (3H-PAF lié PAF-3H lié en présence) (3H-PAF lié totalt - L des composs testés) % inhibition = aposesx 100 PAF- 3H lié spécifiquement Les valeurs trouvées pour les corps des différents exemples sont les suivantes: Exemple No. IC SO No. 1.............. 4,5. 10-7 No. 9.............. 3,5. 10-8 No.10...... ...... 3,5.10-8 No.14.............. 6,1. 10-7..DTD: - 19 - 3 - BRONCHOCONSTRICTION, LEUCOPENIE ET THROMBOCYTOPENIE INDUITES PAR PAF CHEZ LE COCHON D'INDE. MATERIAUX ET METHODES On anesthésie des cochons d'Inde mâles (400 à 500 g) avec de l'uréthane (1,5 g/kg, IP) avant de leur faire subir une trachéotomie et d'introduire une pompe respiratoire (UGO BASILE) (70 à 80 inspirations par minute, 1 ml d'air / 100 g / inspiration), pour supprimer toute respiration spontanée, on effectue un pneumothorax. La résistance à l'insuflation est mesurée avec un transducteur de pression (UGO BASILE) par rapport à une pression initiale de 10 cm H20 selon Konzett et Rossler. Les animaux sont répartis dans plusieurs groupes qui sont traités ou non avec les composés de l'invention (0,05; 0,1; 0,5; 1 et 5 mg/kg). Les produits sont administrés par intra-veineuse 1 heure avant le PAF. Les animaux sont testés avec différentes doses de PAF (30 à 100 n/kg) administrées par intra-veineuse; on enregistre les variations de la résistance à l'insuflation. Des échantillons de sang sont prélevés avant administration du PAF puis 1, 5 et 10 minutes après administration. Quarante p1 de sang sont dilués dans 10 ml d'isoton (Coultronics, FRANCE); les érythrocytes sont dilués dans de la zapoglobine avant de compter les leucocytes avec un compteur Coulter. Pour déterminer le nombre de plaquettes, 40 pl de sang sont dilués dans 2 ml d'isoton puis centrifugés à tours/minute pendant 30 secondes, on prélève 100 p1 de la couche de surface et on les dilue dans 10 ml d'isoton avant de compter les plaquettes avec un compteur Coulter. - 20 - Tableau n' 1:Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [ (N pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioxolane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF. Doses Pourcentage de Pourcentage mg/kg n Bronchoconstriction de Variation IV Témoin - 8 79,8 +/- 3,22 3 3,5 +/- 1,53 - 95,6 *** Composé 1 4 19,1 +/- 10,51 - 7,61 *** de 0.5 6 23,6 +/- 7,15 - 70,4 *** l'exemple 0.1 6 43,8 +/- 14,77 - 45,1 ** No. 9 0.05 3 79,0 +/- 9,27 - 1,0 NS LEGENDE DE TOUS LES TABLEAUX: NS: Non significatif *: p - 21 - Tableau No.2:Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioxolane - 1,3 sur la leucopénie induite par PAF. Pourcentage de Doses n Temps diminution du Pourcentage mg/kg (mn) nombre de de Variation IV leucocytes 8 1 40,8 +/- 7,18 - Témoin - 8 5 29,2 +/- 10,89 - 8 10 33,5 +/- 5,04 - I0 3 1 16,5 +/- 2,42 - 59,6 * 5 3 5 15,9+/- 0,99 - 45,5 NS Composé 3 10 18,7 +/- 5,08 - 44,2 NS 4 1 3,5 +/- 12,6D - 91,4 ** de 1 4 5 2,9 +/-10,51 -90,1* 4 10 1,0 +/- 22,62 - 97,0 ** l'exemple 6 1 34,6 +/- 6,35 - 15,2 NS 0,5 6 5 19,0 +/- 6,42 - 34,9 NS *6 10 14,6 +/- 5,36 - 56,4 NS No. 9 6. 1 41,8 +/- 6,50 + 2,5 NS 0,1 6 5 31,9 +/- 4,88 - 9,2 NS 20. 6 10 33,5 +/- 4,65 0,0 NS 3 1 45,3 +/- 5,70 + 11,0 NS 0,05 3 5 21,6 +/- 3,42 - 26,0 NS 3 10 14,2 +/- 17,30 - 57,6 NS - 22 - Tableau No. 3: Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane - 1,3 sur la thrombocytopénie induite par PAF. Pourcentage de Pourcentage Doses Temps diminution du de mg/kg n (mn) nombre de Variation IV leucocytes 8 1 68,6 +/- 6,79 Témoin _ 8 5 42,4 +/- 2,71 - 8 * 10 42,5 +/- 3,14 - 3 1 4,2 +/- 2,35 - 93,9 *** 5 3 5 5,6 +/- 1,84 - 86,8 *** Composé 3 10 1,1 +/- 1,15 - 97,4 *** 4 1 11,5 +/- 6,21 - 83,2 *** 1 4 5 22,5 +/- 3,27 - 46,9 * de 4 10 21,0 +/- 3,87 - 50,6 * 6 1 19,3 +/- 10,19 - 71,9 *** 0,5 6 5 9,6 +/- 12,15 - 77,4 *** l'exemple 6 10 10,9 +/- 9,94 - 74,4 *** 6 1 30,1-+/- 13,72 - 56,1 ** 0,1 6 5 34,7 +/- 3,60 - 18,2 NS No. 9 6 10 42,3 +/- 4,79 - 0,5 NS 3 1 45,2 +/- 1,20 - 34,1 NS 0,05 3 5 43,0 +/- 4,80 + 1,4 NS 3 10 36,1 +/- 2,41 - 15,1 NS - 23 - Tableau No.4 Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N quinolinium) - 6'hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF. Doses Pourcentage de Pourcentage mg/kg IV n Broncho- de constriction Variation Témoin - 6 90,8 +/- 0,95 - Composé 1 5 8,1 +/- 2,91 - 91,1 *** de 0,5 5 25,1 +/- 6,53 - 72,4 *** l'exemple No. 10 0,1 5 80,4 +/- 13,78 - 11,5 NS - 24 - Tableau No.5:Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N quinolinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la leucopénie induite par PAF. 5.Pourcentage de Doses Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de de IV leucocytes Variation 6 1 41,4 +/- 8,0 Témoin 6 5 28,7 +/- 6,9 _ 6 10 26,9 +/- 10,1 1 24,1 +/- 6,8 - 41,0 NS 1 5 5 9,3 +/- 9,4 - 67,6** Compose 10 8,9 +/- 13,2 - 66,9 ** de 5 1 17,0 +/- 12,9 - 58,9 * 0,5 5 5 9,0 +/- 11,8 - 68,6 ** l'exemple 10 - 7,6 +/- 17,5 + 128,3 NS 1.5i No. 10 5 1 38,8 +/- 6,3 + 6,3 NS 0,1 5 5 38,9 +/- 5,7 + 35,5 NS 10 41,2 +/- 6,5 + 53,2 NS - 25 - Tableau No.6:Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [ (N quinolinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la thrombocytopénie induite par PAF. Pourcentage de Doses Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de de IV leucocytes Variation 6 1 65,3 +/- 8,5 Temoin - 6 5 49,1 +/- 4,8 6 10 48,5 +/- 0,5 1 19,3 +/- 1,4 - 58,3 *** 1 5 5 22,1 +/- 2,5 - 55,0 ** Compose 10 19,4 +/- 3,6 - 60,0 ** de 5 I 26,2 +/- 6,3 - 59,9 ** 0,5 5 5 29,8 +/- 1,7 - 39,3 * l'exemple 10 32,1 +/- 5,8 - 33,8 * No. 10 5 1 51,1 +/- 12,1 - 21,7 NS 0,1 5 5 49,1'+/- 8,8 O NS 10 45,0 +/- 9,7 - 7,2 NS - 26 - RESULTATS Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 (0,5; 1 et 5 mg/kg, IV) et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 (0,5 et 1 mg/kg, IV) inhibent la bronchoconstriction et la thrombocytopénie induites par PAF chez le cochon d'Inde. 4 - BRONCHOCONSTRICTION, LEUCOPENIE ET THROMBOCYTOPENIE INDUITES PAR ANTIGENE CHEZ LE COCHON D'INDE PASSIVEMENT SENSIBILISE PAR SERUM HETEROLOGUE. Une injection intra-veineuse d'ovalbumine à des cochons d'Inde passivement sensibilisés avec un sérum anti-ovalbumine de lapin induit une bronchoconstriction associée à une leucopénie et à une thrombocytopénie. Cette réaction anaphylactique semble être dûe à la libération d'histamine et à la génération de métabolites d'acide arachidonique (prostaglandines, thromboxane A2 et leucotriènes). Chez le cochon d'Inde, -la libération d'autacoides est en principe déclenchee via les immunoglubulines de la classe IgG. METHODE - Animaux: Cochons d'Inde mâles, Charles River (450 à 500 g) - Procédé d'immunisation: Injection intra-veineuse, 18 heures avant le test avec l'antigène, de 0,5 ml/kg d'une dilution à 1/2 d'antisérum d'anti-ovalbumine de lapin.- 27 - - Le test est composé de: À Ovalbumine, 0,75 g/kg, À Injection intraveineuse de l'antigène en dosage final de 1 ml/kg, 5. Agent vecteur: 0,15 M de NaCl. - Les composés sont administrés par voie orale, dosés à 1,5 ml/kg, 1 heure avant le test avec l'antigène, après anesthésie par injection intrapéritonéale de carbamate d'éthyle (1,5 g/kg) dosé à 10 ml/kg. Paramètres contrôlés et expression des données: a - Bronchoconstriction: À bronchoconstriction induite par antigène en mm (A), bronchoconstriction maximale en mm (B). Le pourcentage de bronchoconstriction est calculé comme suit: A x 100 B Le comptage des neutrophiles et des plaquettes est réalisé 1 minute avant le test puis 1,5 et 10 minutes après le test. Les écarts sont exprimés en pourcentages calculés par rapport aux valeurs obtenues une minute avant le test. - 28 - L'équipement suivant a été utilisé: - Ugo Basile, Comerio ITALIE, Respirateur Rodent réf. 7025 Transducteur Bronchospasme réf. 7020 5. Enregistreur Deux-Pistes "GEMINI" réf. 7070 - Coultronics, FRANCE, Compteur Coulters Z B I Tableau No.7:Effets ' du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par antigène. Pourcentage Dose de Broncho- Pourcentage mg/kg IV n constriction de Variation Témoin - 6 71,9 +/- 14,2 - d Composé de l'exemple 5 8 51,3 +/- 14,2 - 28,7 NS No. 9 26 e 16 4 3 2 - 29 - Tableau No.8 Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la leucopénie induite par antigène. _Pourcentage de Dose Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de d'inhibition IV leucocytes - 6 1 - 11,8 +/- 5,1 Témoin - 6 5 - 39,6 +/- 9,5 - 6 10 - 53,9 +/- 7,1 Composé 8 1 - 15,6 +/- 6,6 + 32,0 NS de l'exemple 5 8 5 - 8,7 +/- 10,7 78, 0 * No. 9 8 10 - 12,3 +/- 14,1 - 77,2 * Tableau No.9:Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la thrombocytopénié induite par antigène. Pourcentage de Dose Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de d'Inhibition IV leucocytes 6 1 - 6,8+/- 2,7 Témoin - 6 5 - 39,7 +/- 12,5 - 6 10 -26,1 +/- 8,1 Composé 8 1 + 0,3 +/- 7,9 - 104,4 NS de l'exemple 5 8 5 - 3,5 +/- 3,1 91,2 ** No. 9 8 10 - 15,7 +/- 6,2 - 39,8 NS - 30 - RESULTATS Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium).-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 (5 mg/kg, IV) neutralise la leucopénie et la thrombocytopénie induites par l'antigène, sans réduire notablement la bronchoconstriction induite par l'antigène. - ACTION SUR L'HYPOTENSION INDUITE PAR LE PAF CHEZ LE RAT ANESTHESIE. MATERIAUX ET METHODES: Des rats Sprague Dawley males (Charles River) (250 à 300 g) sont anesthésiés (IP) au carbamate d'éthyle dosé à 1,2 g/kg. Une injection intra-veineuse de PAF provoque une hypotension dosedépendante. On recherche les effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-l,3 et du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(Nquinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 sur l'hypotension induite par le PAF, dans les traitements curatifs. L'hypotension est provoquée par une seule dose de PAF (1 pg/kg), 0,1 ml/100 g en volume, injectée IV, directement dans la veine du pénis. On administre les composés quand le point d'hypotension maximum est atteint, c'est-à-dire 3 minutes après l'injection de PAF. - Paramètres mesurés et expression des résultats: On mesure les pressions systolique et diastolique (mm Hg). Les valeurs sont exprimées, sous la forme de leur moyenne +/- SEM, sur les courbes figurant sur la planche en annexe. - Appareils de mesures: 30. Transducteur Gould P50 pour mesurer la pression artérielle, Perfuseur Braun, Enregistreur polygraphique Gould 8000 S. - 31 - 6 --ANTAGONISME DE L'AGREGATION DE LEUCOCYTES POLYMORPHO- NUCLEAIRES INDUITE PAR LE PAF. On obtient des leucocytes polymorphonucléaires (PMNs) selon la méthode décrite par A. W. Ford-Hutchinson & al. (Br - J. Pharmacol. 76, 367 - 371, 1982). Des suspensions cellulaires ( 12 % à des rats Wistar males, pesant 300 g. Après centrifugation, les cellules sont lavées à la solution de Hanks et remises en suspension dans du MEM/Hepes à mM en moyenne (PM = 7,4), la concentration étant de 107 cellules par ml. Dix minutes avant le début de l'agrégation, on ajoute de la cytochalasine B (5 p/ml) de façon à augmenter l'agrégation des PMNs. La transmission lumineuse à travers la suspension cellulaire (400 pl) est mesurée sous agitation magnétique à 900 T/mn, à l'aide d'un agrégomètre à double faisceau (Chronolog Corp. Coultronics). Le bac témoin contient la suspension cellulaire diluée à 20 % du nombre de cellules avec le MEM et la différence représente 100 % de transmission. La variation de la transmission, lorsqu'on ajoute du PAF, est enregistrée en continu. 4 p1 des composés dissous dans le MEM/Hepes sont ajoutés à.la suspension de PMNs, avant l'addition de PAF. RESULTATS Le PAF, dosé à 10-8 M, induit une agrégation de 55 à % dans cette suspension de PMNs. Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-l,3 inhibent, en fonction de leur dose, - 32 - cette agrégation avec les valeurs respectives de CI50s suivantes: bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3: 5 x 10-7 M, 5. bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(Nquinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3: 10-6 M. 7 - INHIBITION DE LA MOBILISATION INTRACYTOSOLIQUE LIBRE DE CALCIUM INDUITE PAR LE PAF DANS DES PLAQUETTES DE LAPIN LAVEES. On prélève du sang dans l'artère auriculaire du lapin, puis on le mélange avec de l'acide citrique, du citrate de sodium, de la dextrose et un anticoagulant; les plaquettes sont préparées selon Adlie & al., Brit. J. Pharmacology, 19, 7-17, 1970. Elles sont incubées avec 100 #M de sel acétylsalicique pendant 30 minutes pour éviter une agrégation induite par le thromboxane. Ces plaquettes sont ensuite chargées avec un colorant quin 2, indicateur de calcium fluorescent, par incubation avec l'acétométhylester de quin 2 (15 pM dans le DMSO pendant 20 minutes, à température ambiante), le colorant pénètre dans la membrane de la cellule et, après hydrolyse, est piégé dans la plaquette. Les composés sont préincubés avec les plaquettes pendant 15 minutes en même temps qu'un mélange de CP/CPK qui détruit 1'ADP sécrétée. Après avoir ajouté le PAF à la suspension plaquettaire, on effectue les mesures de fluorescence (excitation: A = 339 nm, émission: A = 492 nm). L'intensité de la fluorescence est proportionnelle au niveau cytosolique libre de calcium [Ca2+]i qui peut être quantifié suivant la méthode de Tsien & al., J. Cell Biol., 94, 325 - 334, 1982. - 33 - RESULTATS La stimulation plaquettaire induite par le PAF dosé à 2 x 10-9 M augmente le niveau de [Ca2+]i qui passe d'environ nM (au repos) à 400 - 600 nM. Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-1,3 dosés à 5 x 10-7 M inhibent totalement la mobilisation de [Ca2+]i induite par le PAF. A 5 x 10-8 M, l'inhibition de l'effet du PAF est, respectivement, de 44 % pour le bromure d'heptadécyle2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-l,3 et de 75 % pour le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-1,3. POSOLOGIE Chez l'homme, en administration orale, les doses quotidiennes vont de 0,1 à 0,5 mg en comprimés ou capsules à enrobage entérique; pour l'administration intra-veineuse, les doses quotidiennes correspondantes sont de 0,01 à 0,05 mg. La durée du traitement est de 2 à 6 semaines. - 34 - REVENDICATIONS 1 ) - Nouveaux aminoacylates d'acétal du glycérol de formule générale I: CH2-\0 R1 2I CH _O R2 CH20 CO(CH 2) - N) dans laquelle R1 représente un groupement phényle substitué ou un groupe de formule CmH2m + 1, m étant un entier de 9 à 25, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule CnH2n + 1, n étant un entier de 1 à 10, p est un entier de 3 a 10, -?N) représente un groupement hétérocyclique contenant un atome d'azote tel que le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinolinium, l'imidazolium et le pyrazinium; et X represente l'anion pharmaceutiquement acceptable d'un acide minéral ou organique, un ion halogène tel que le chlore, le brome, l'iode ou les anions des acides benzoîque, acétique, méthanesulfonique, ou tartrique, sous la forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci. - 35 - 2 ) - Un procédé de préparation des composés selon la revendication 1 consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule R1COR2, dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis a faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3 ainsi obtenu sur un chlorure de whaloalcane de formule ClCO(CH2)pX, dans laquelle p et X sont tels que définis-précédemment, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine et, enfin, à faire réagir, entre 50 et 80 C, sous circulation d'azote, le composé résultant, de formule EOXR1 O R2 OCO(CH2) p-X sur un composé hêtérocyclique contenant un atome d'azote de formule NP