Brevet FR2614621A1 — publié le 19881104

La présente invention concerne un procédé permettant de purifier les phosphatidylcholines. Les phosphatidylcholines, ou lécithines, sont des lipides constitués par l'union de glycérol, d'acides gras, d'acide phosphorique et d'une base azotée, la choline. Leur existence a été signalée en 1812 par Vauquelin, qui les isola du cerveau ; en 1846, Gobley les retrouva dans le jaune d1 oeuf. La présente invention concerne plus particulièrement la purification de L-a-phosphatidylcholines (P.C.) dont les formules chimiques sont données cidessous Dans cette formule, R1 et R2 représentent des acides gras en C16 ou C18. Les sources de lécithine sont multiples et variées, aussi bien dans le règne animal que végétal : graines de soja, huile de colza, de coton, jaune d'oeuf, cerveau ou coeur d'animal. Les deux principales sources au point de vue commercial étant les graines de soja et le jaune d'oeuf. Suivant la source utilisée, la lécithine extraite aura des caractéristiques différentes. Par exemple, la composition en acide gras diffère selon que la lécithinepro- vient du soja ou du jaune d'oeuf, la lécithine de soja étant plus riche que celle d'oeuf en acides gras insaturés. Ainsi, dans le cas des L-a-phosphatidylcholines, les différences au niveau de la composition en acides gras sont les suivantes en fonction du nombre de double liaison C=C (O, 1, 2 ou 3) L-phospatidy1choine acides gras (%) C16:1 C18:O Cl8:l C18:2 C18::3 oeuf 34 ,0 13 % 35 % 17 t0 soja 18 % 4 % 12 % 61 > 5 % Les intérêts industriels des phosphatidylcholines, et, plus généralement des phospholipides sont nombreux et notamment dans les domaines de l'alimentation parentérale (l'administration de phospholipides pures est nécessaire dans le traitement de certaines carences spécifiques), de la thérapie (traitement de l'hypercholesterolémie) et de la chimie en général. On connait, en particulier, l'utilisation croissante des liposomes ou des microcristaux pour véhiculer des principes actifs vers les cellules cibles.Ce ciblage est notamment permis grâce à l'incorporation de phosphalipides dans la membrane de ces véhicules pharmaceutiques. Dans toutes ces utilisations, la P.C. doit être pure à 100 %. Or un problème majeure, rencontré lors de l'utilisation des lécithines, concerne justement leur purification. Pour obtenir une substance brute contenant des phosphatidylcholines par exemple à partir d'oeuf, il suffit de traiter du jaune d'oeuf par de l'acétone qui le déshydrate et lui enlève des pigments et divers lipides, sans dissoudre la lécithine. Ceci fait, on reprend le jaune d'oeuf par du chloroforme qui dissout la lécithine, on filtre la solution chloroformique, puis on en précipite la lécithine par addition de trois ou quatre volumes d'acétone. On obtient ainsi un précipité blanc qui, après dessication, se présente sous l'aspect d'une matière pâteuse, un peu dure, onctueuse au toucher, jaune paille, brunissant assez rapidement à l'air en raison de l'oxydabilité des acides non saturés. Cette matière est la "lécithine" brute ; elle est soluble dans le chloroforme, le benzène, l'alcool (surtout à chaud) et l'éther ; elle est à peu près insoluble dans l'acétone. Non seulement il est difficile de séparer convenablement les diverses lécithines d'un mélange, mais le produit brut que l'on obtient en extrayant la lécithine de l'oeuf, du soja ou d'un tissu contient, en outre, d'autres phosphoaminolipides (céphalines) et d'autres substances lipoldiques. Pour éliminer ces impuretés, on peut utiliser la propriété qu'ont les lécithines de donner avec le chlorure de cadmium, en solution alcoolique, un complexe insoluble dans l'alcool ; on régénère les lécithines en détruisant le complexe par du carbonate d'ammonium qui précipite le cadmium à l'état de carbonate. Mais la lécithine obtenue ne possède jamais un degré de pureté satisfaisant. La chromatographie sur alumine puis sur acide silicique est actuellement la méthode la meilleure pour isoler et purifier les lécithines. C'est ainsi que la lécithine de jaune d'oeuf est usuellement purifiée par chromatographie sur colonne selon le procédé de RHODES et LEA (Biochemical Journal 65 (1957), S26-533). Ce procédé comprend l'extraction d'un mélange brut comportant des phospholipides à partir du jaune d'oeuf, l'enlèvement des phospholipides ne contenant pas de choline par chromatographie sur colonne d'alumine et la purification finale de la L-a-phosphatidylcholine sur colonne d'acide silicique en utilisant comme éluant un mélange chloroformeméthanol (70 : 30, en volume). La L-a-phosphatidylcholine (P.C.) est récupérée dans les premières fractions et les lipides restant (sphingoelines, lysophcsphatidylcholine, autres phospholipides...) sont élués ensuite par un mélange chloroformemethanol-eau (25:70:5 en volume). Sur gel de silice, la PC. estusuellement éluée par un mélange chloroforme-methanol contenant 30 à 40 % de méthanol (J. POKORNY, in Liquid Column Chromatography, Deyl Z, Macek K. and Janak J. Editors Elsevier, Amsterdam 1975, pp 581-592). Les différentes étapes de ce procédé le rendent particulièrement long et coûteux. Le fait notamment de devoir recourir à deux chromatographies successives rend ce procédé particulièrement complexe. Au surplus, les risques de perte et de dégradation en P.C. augmentent proportionnellement avec le nombre des étapes telles que les étapes d'élution. La présente invention permet de résoudre les- diffi- cultés mentionnées ci-dessus en simplifiant à l'extrême le procédé de purification des phosphatidylcholines. La présente invention a pour objet un procédé de purification de phosphatidylcholines, notamment de L-a phosphatidylcholines à partir d'un mélange brut en contenant avec notamment d'autres phospholipides, caractérisé en ce qu'on obtient la phosphatidylcholine purifiée en faisant passer ledit mélange brut à travers une unique colonne de chromatographie. Plus particulièrement, la colonne est une colonne de chromatographie sur gel de silice conditionnée en faisant passer du méthanol à travers la colonne préalablement au passage du mélange brut. De préférence, la colonne de chromatographíe sur gel de silice est conditionnée en faisant passer à travers la colonne du méthanol,un mélange méthanolchloroforme, puis du chloroforme préalablement au passage du mélange brut. Après passage du mélange brut dans la colonne, la phosphatidylcholine se décroche du gel par élution avec un mélange chloroforme-méthanol-eau. On notera donc que la P.C. selon la présente invention ne se décroche pas du gel par un mélange comportant uniquement du chloroforme et du méthanol comme dans les techniques où deux colonnes sont utilisées. De préférence, le mélange chloroforme-méthanoleau a une constitution en volume de (47,5:47,5:5). Dans un mode de réalisation, on fait passer le mélange brut dissous dans du chloroforme ou un mélange chloroforme-méthanol à travers la colonne, après fixation du mélange brut sur la colonne celle-ci est éluée avec du chloroforme puis avec un mélange méthanol chloroforme jusqu'à ce que plus rien ne soit élué de la colonne, et la phosphatidylcholine pure est ensuite décrochée par élution avec un mélange chloroforne-méthanol-eau. La présente invention s'étend bien évidemment aux phosphatidylcholines purifiées obtenues par le procédé décrit ci-dessus. Les exemples suivants permettront d'illustrer la présente invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 PURIFICATION DE LA L-a-PHOSPHATIDYLCHOLINE DE JAUNE D'OEUF Conditionnement de la colonne 120 grammes de gel de silice Lichroprep Si-60 (40-63 wm) (E.MERCK, Darmstadt, F.R.G.) contenus dans une colonne de chromatographie ( 3.5 cm, h : 40 cm) sont conditionnés par 400 ml de méthanol puis par 400 ml de chloroforme-méthanol (1 : 1, en volume) puis oar 500 ml de chloroforme. PURIFICATION DE LA ?HOSPHATIDYLCHOLINE DE JAUNE D'OEUF 8 gr de phosphatidylcholine de jaune d'oeuf par tiellement purifiée (?hosphatidylcholine à 60 %, Sigma chemicals, St. Louis, USA, type X-E contenant d' autres phospholi pides comme la phosphatidyléthanolamine) sont dissous dans 50 ml de chloroforme et déposés sur la colonne. Celle-ci est éluée sous pression d'azote par 500 ml de chloroforme, 700 ml de chloroforme-méthanol (90:10, en volume), 300 ml de chloroforme-méthanol (80:20, en vo lume) et 800 ml de chloroforme-méthanol (50:50, en vo lume) jusqu'à ce que plus rien ne soit élué de la co lonne. La phosphatidylcholine pure est ensuite éluée par 500 ml du mélange chloroforme-méthanol-eau (47,5:47,-5:5. en volume). Les fractions contenant la PC pure sont poolées et le solvant est enlevé par évaporation sous vide à 300C. On récupère 4,8 gr de phosphatidylcholine pure. EXEMPLE 2 PURIFICATION DE LA PHOSPHATIDYLCHOLINE DE JAUNE D'CJEUF Une colonne LOBAR Si-60 taille C (E. MERCK, Darmstadt, F.K.G.) estccccitionnéeen y faisant passer à l'aide d'une pompe DURA^AT (E.MERCK) à un débit de 30 ml/min, successivement 500 ml de méthanol, 500 ml de chloroforme-méthanol (1:1 en volume) puis 500 ml de chloroforme. 10 gr de phosphatidylcholine (Sigma, type X-E, pure à 60 %) sont dissous dans 80 ml de chloroforme puis déposés au sommet de la colonne. Celle-ci est éluée par 250 ml de CHCl3, 1000 ml de chloroforme-méthanol (3:1, en volume), puis par 500 ml de chloroforme-néthanol (1:1, en volume). La thos- phatidylcholine sure est ensuite décrochée par 1 1 du élance chloroforme-méthanol-eau (47,5:47,5:5). Les fractions contenant la phosphatidylcholine sont poolées et le solvant éliminé par évaporation rotative sous vide à 300C, en reprenant le résidu par du méthanol et en évaporant à nouveau pour entraSner l'eau résiduelle. L'huile légèrement jaunâtre est blanchie par. remise en solution dans 250 ml de méthanol, addition d'environ 20 mg de noir animal (activated charcoal neutralized, SIGMA chemicals, St.Louis, Mi, USA), filtration et évaporation du sol vant sous vide à 300C. On récupère 5,1 gr de phosphatidylcholine pure. EXEMPLE 3 PURIFICATION DE LA PHOSPKATIDYLCHOLIE DE SOJA 8 grammes due phosphatidylchline de soja partiellement pure (phosphatidylcholine à 14 %, SIGMA chemicals, St. Louis, Mi, USA, type II-S) sont dissous dans 20 ml d'un mélange chloroforme-méthanol -(3:2, en volume), appliqués sur la colonne de gel de silice Lichroprep Si-60 (40-63 ssm). La colonne est éluée par 500 mil de CHCl3, 500 ml de CHCl3 : MeOH (4:1, en volume), 400 ml de CHCl3: MeOH (1:1, en volume). Ensuite la colonne est éluée par 700 ml du mélange CHCl3: MeOH:H20 (47,5:47,5:5,en volume). La phosphatidylcholine sort après passage sur colonne de 200 ml et est complètement éluée après 500 ml. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de phosphatidylcholines, notamment de L-a phosphatidylcholines à partir d'un mélange brut en contenant avec notamment d'autres phospholipides, caractérisé en ce qu'on obtient la phosphatidylcholine purifiée en faisant passer ledit mélange brut à travers une unique colonne de chromatographie. 2. Procédé selon la-revendication 1, caractérisé en ce que la colonne est une colonne de chromatographie sur gel de silice conditionnée en faisant passer du méthanol à travers la colonne préalablement au passage du mélange brut. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la colonne de chromatographie sur gel de silice est conditionnée en faisant passer à travers la colonne du méthanol,un mélange méthanolchloroforme, puis du chloroforme préalablement au passage du mélange brut. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce qu'après passage du mélange brut dans la colonne, la phosphatidylcholine se décroche du gel par élution avec un mélange chloroforme-méthanol-eau. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange chloroforme-méthanol-eau a une constitution en volume de 47,5:47,5:5. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'on fait passer le mélange brut dissous dans du chloroforme ou un mélange chloroforme-méthanol à travers la colonne, après fixation du mélange brut sur la colonne, celle-ci est éluée avec du chloroforme et un mélange méthanol-chloroforme jusqu'à ce que plus rien ne soit élué de la colonne, et la phosphatidylcholine pure est ensuite décrochée par élut ion avec un mélange chloroforme-méthanol-eau. 7. Phosphatidylcholines purifiées obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.