Brevet FR2619216A1 — publié le 19890210

La présente invention a pour obDet un procédé de dosage des lipases, ainsi que le dispositif permettant sa mise en oeuvre. On sait que les lipides constituent une partie importante des organismes vivants et que parmi eux les triglycérides représentent la principale réserve énergétique des animaux supérieurs. Le renouvellement métabolique de ces lipides se trouve assuré par les enzymes lipolytiques, ou lipases, qui sont d'autre part impliqués dans le transfert lipidique d'un organisme à l'autre, par exemple d'une plante vers un animal supérieur. On sait par ailleurs le rôle essentiel joué par les lipases digestives dans l'assimilation des lipides alimentaires, constitués en majeure partie de triglycerices et les troubles qui peuvent etre engendrés par une carence lipasique. Aussi importe-til de pouvoir recourir à des moyens surs et précis pour contrôler l'activité lipasique des sucs digestifs. Différentes méthodes de dosage des lipases ont été proposées à ce jour, en particulier des méthodes chimiques faisant appel à la pHmétrie, la colorimétrie ou la chromatographie, et des méthodes physiques comme la turbidimétrie, la conductimétrie ou la technologie des couches monomoléculaires. Toutefois, aucune de ces méthodes n'a pu donner lieu à une mise en oeuvre susceptible d'etre adaptée à des analyses de routine La présente invention a pour but d'apporter une solution à ce problème en proposant une nouvelle méthode de dosage des lipases, qui allie à la simplicité de sa mise en oeuvre l'avantage d'une grande sensibilité. Le procédé selon llinvention est basé sur la méthode dite "de la goutte d'huile" qui a été décrite depuis longtemps comme étant particulièrement appropriée à la mesure de la tension interfaciale huile/eau, dans le cadre d'études conduites sur des huiles minérales. Le procédé selon l'invention est plus particulièrement basé sur l'observation des variations de tension à l'interface huile/eau pendant un processus de lipolyse. I1 a en effet été observé qu'une goutte d'huile végétale formée à l'aide d'un compte-gouttes dans une solution lipasique subit une déformation progressive avant de se détacher du comptegouttes, l'action de la lipase ayant pour effet de réduire peu à peu la tension interfaciale qui maintient la goutte en place, jusqu'à provoquer son détachement. Le procédé selon l'invention consiste à former une goutte d'huile dans une solution de la lipase à doser, et à observer la déformation de cette goutte d'huile jusqu'à son détachement de l'aiguille sur laquelle elle a été formée. Dans un premier mode de réalisation du procédé selon l'invention, on mesure le temps de résidence de la goutte d'huile sur l'aiguille. Ce temps de résidence se trouvant en proportion directement inverse de la concentration en lipase de la solution, sa mesure précise fournit une indication également précise ce cette concentration, après un étalonnage convenable des moyens de mesure utilisés. La mise en oeuvre de ce premier mode de réalisation du procédé selon l'invention peut être réalisé au moyen d'un dispositif comprenant une cuve munie à sa base d'une ouverture pour le passage d!un tube relié à des moyens permettant l'admission lente et progressive de l'huile, la-hauteur de la goutte étant contrôlée par des moyens appropriés, eux-mêmes reliés à des moyens de mesure du temps tels qu'une horloge munie d'un système de comptage. La cuve dans laquelle la goutte d'huile est formée est avantageusement insérée dans un support thermostaté contribuant à la reproductibilité des mesures. Les moyens d'admission de l'huile dans le tube peuvent être constitués d'une seringue dont le mouvement d'avancée du piston est entraîné par une crémaillère reliée à un moteur à courant continu. La hauteur et la présence de la goutte d'huile sont avantageusement contrôlées au moyen de deux capteurs optiques dont l'un contrôle la hauteur de la goutte d'huile et déclenche l'horloge et le système de comptage dès que cette hauteur atteint une valeur prédéterminée, tandis que l'autre contrôle la présence de la goutte, arrêtant le comptage dès qu'elle se détache. Ces capteurs optiques peuvent être des capteurs à lasers ou des capteurs à infrarouge à fibre optique sensibles à la variation d'indice optique du milieu liée à l'apparition ou à la disparition de la goutte. Les moyens de mesure du temps peuvent être avantageusement reliés à une unité de calcul susceptible de fournir, après un étalonnage approprié, l'indication de la concentration lipasique, par exemple par affichage sur un afficheur à cristaux liquides. Dans un second mode de réalisation du procédé selor l'invention, la déformation de la goutte d'huile est enregistrée sous forme d'images successives réalisées au moyen d'un appareil photographique ou d'une caméra. Ces images successives fournissent une succession de valeurs absolues de la tension interfaciale huile/eau, qui peuvent être facilement déduites des valeurs successives du diamètre équatorial (D) et de la sécante (d) de la goutte, telles que représentées sur la figure 4a, la figure 4b représentant la variation de la tension interfaciale en fonction du temps. Les données cinétiques ainsi obtenues, convenablement traitées par calcul, fournissent la vitesse initiale de décroissance de la tension interfaciale huile/eau, laquelle est en proportion directe de la concentration lipasique de la solution, comme l'indique la figure 5. Un étalonnage approprié des moyens de mesure utilisés permet ainsi d'obtenir avec précision l'activité lipasique de la solution. L'huile utilisée pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peut être n'importe quelle huile végétale exempte de tensio-actifs tels qu'acides-gras ou mono- ou di-glycérides. Elle peut être par exemple constituée d'une huile de soja du commerce préalablement purifiée par passage sur une colonne de silice équilibrée dans de l'hexane, suivi d'une élution à l'hexane. La stabilité dans le temps de la tension interfaciale huile/eau de l'huile ainsi obtenue indique l'absence de contaminants tensioactifs. Le dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention se trouve plus précisément décrit dans la description non limitative qui suit et qui se référe aux dessins annexés, parmi lesquels - La figure 1 représente une vue de face du dispositif selon l'invention. - La figure 2 représente une vue de dessus de l'ensemble des moyens contrôlant l'avancée du piston de la seringue. - La figure 3 constitue un schéma d'ensemble montrant le dispositif selon l'invention relié à différents moyens permettant son automatisation. Si l'on se reporte d'abord à la Figure l, on voit la cuve 1 renfermant la solution lipasique à doser. Cette cuve 1 est insérée dans un support thermostaté 2 et présente à sa base une ouverture pour le passage d'une aiguille 3 sur lequel on forme la goutte d'huile 4. L'aiguille 3 est reliée, à l'extérieur de la cuve 1, à une seringue 6 dont le piston 7 est lui-même relié à des moyens, non représentés, permettant de contrôler son avancée. Des fibres optiques 8 et 9 sont dirigées l'une vers la base de la goutte 4 et l'autre vers son sommet, leurs positions étant fixées à l'avance en fonction de la hauteur de la goutte à former. Les fibres optiques 8 et 9 sont reliées à une horloge 15 munie d'un système de comptage, la fibre 8 étant par ailleurs reliée aux moyens, non représentés, permettant de contrôler l'avancée du piston de la seringue. La fibre 8 déclenche le système de comptage et arrête le piston de la seringue lorsque la goutte atteint la hauteur voulue, tandis que la fibre 9 arrête le comptage lorsque la goutte se détache. En se référant à la figure 2, on voit la seringue 6 placée dans un bloc 11 qui la maintient en place et le piston 7 couplé à une crémaillère 12 par l'intermédiaire d'une pièce 13 en U et d'une vis de blocage 14. La crémaillère 12 est entrainée, au moyen d'un pignon 15, par un moteur 16 muni d'un réducteur 17. Un potentiomètre 18 couplé par l'intermédiaire d'un pignon 19 à la crémaillère 12 permet de contrôler la position du piston 7 de la seringue 6. La figure 3 montre le synoptique de l'ensemble électronique associé au dispositif selon l'invention pour permettre son automatisation. On retrouve sur cette figure les éléments des figures 1 et 2 complétés par une unité de calcul 21 reliée à l'horloge 10 et à une unité d'étalonnage 20, et prolongée par une unité d'affichage 22 munie d'un afficheur 23 à cristaux liquides. Une unité d'asservissement 24 du moteur 16 reliée au capteur haut 8 commande l'arrêt du moteur 16 lorsque la goutte 4 a atteint la hauteur voulue. Par ailleurs un dispositif d'alarme 25 relié d'une part à l'unité d'asservissement 24 du moteur et d'autre part au potentiomètre 18 permet de signaler la fin de course ou un éventuel blocage du piston 7 de la seringue 6. Enfin une unité 26 de contrôle de la position du piston 7 permet de connaitre à tout instant la quantité d'huile disponible dans la seringue 6, le déplacement du piston 7 étant visualise par un bargrapb 27. Un commutateur électrique 29 permet le déclenchement au processus d'analyse tandis qu'un second commutateur 30 commande par le moteur 16 le recul de la crémaillère 12 jusqu'à une position permettant la mise en place d'une nouvelle seringue. Le procédé selon l'invention, ainsi qu'il a déjà été dit, présente l'avantage considérable de permettre des mesures d'une très grande sensibilité la sensibilité de la méthode est en effet du même ordre de grandeur que celle des tests immunologiques existants, soit 10 3 UI/ml - "UI" désignant l'unité internationale de lipase, correspondant à 1 micro-équivalent d'acide gras libéré par minute. En raison de cette grande sensibilité, le procédé selon l'invention trouve une application particulièrement importante dans le secteur médical, où il peut être mis en oeuvre pour le dosage, entre autres, des lipases digestives ou des lipases sériques. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage des lipases, caractérisé en ce que l'on forme une goutte d'huile dans la solution à doser et que l'on observe la déformation de cette goutte sur l'aiguille qui a servi à sa formation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on mesure le temps de résidence de la goutte d'huile sur l'aiguille qui a servi à sa formation, ce temps de résidence étant en proportion inverse de l'activité iipasique de la solution. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le temps de résidence de la goutte d'huile sur le tube est mesuré à l'aide de deux capteurs optiques reliés à une horloge munie d'un système de comptage, l'un de ces capteurs optiques déclenchant l'horloge lorsque la goutte d'huile atteint une hauteur prédéterminée et l'autre arrêtant le comptage du temps lorsque la goutte d'huile se détache du tube. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'horloge est reliée à une unité de calcul préalablement étalonnée qui fournit l'indication de l'activité lipasique. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on enregistre la déformation de la goutte d'huile sous forme d'images successives réalisées au moyen d'un appareil photographique, et que l'on en déduit la vitesse initiale de décroissance de la tension interfaciale huile/eau, laquelle est en proportion directe de l'activité lipasique de la solution. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que que l'huile mise en oeuvre est une huile végétale purifiée exempte de tensio-actifs. 7. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé qui fait l'objet des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une cuve (1) munie à sa base d'une ouverture pour le passage d'une aiguille (3) reliée à l'extérieur de la cuve, à une seringue (6) dont l'avancée du piston (7) est contrôlée par des moyens appropriés, deux capteurs optiques (8) et (9) reliés à une horloge (10) et dirigés, l'un (9) vers la base de la goutte (4) et l'autre (8) vers son sommet permettant de déclencher l'horloge (10) lorsque la goutte d'huile (4) formée par le tube (3) atteint une valeur prédéterminée, et d'arrêter ladite horloge (10) lorsque la goutte (4) se détache. de l'aiguille (3). 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que la cuve (1) est insérée dans un support thermostaté (2). 9. Dispositif selon la revendication 7i caractérisé en ce que le capteur optique (8) est également relié aux moyens contrôlant l'avancée du piston (7), de manière à arrêter l'avancée dudit piston (7) simultanément au déclenchement de l'horloge (10). 10. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'avancée du piston (7) est commandée par une crémaillère (12) couplée audit piston (7) et entrainée, au moyen d'un pignon (15?, par un moteur (16) muni d'un réducteur (17). 11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé e ce qu'un potentiomètre (18) couplé à la crémaillère (12) au moyen d'un pignon (19) permet de contrôler la position du 'piston (7) de la seringue (6). 12. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'horloge (10) est reliée à une unité de calcul préalablement étalonnée qui fournit l'indication de l'activité lipasique de la solution.