Brevet FR2620230A1 — publié le 19890310

La présente invention a pour objet un procédé et un dispositif pour la séparation par électrophorèse de macromolécules de grandes dimensions. L'électrophorèse est une technique largement utilisée pour l'analyse qualitative, ainsi que pour la séparation et la purification de macromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques. Elle consiste à soumettre les macromolécules incorporées à un gel convenable à l'action d'un champ électrique généré par des électrodes, qui provoque la migration des micelles vers ces électrodes. La plupart des techniques connues mettent en oeuvre deux électrodes produisant un champ électrique orienté dans une seule direction. Ces techniques présentent l'inconvénient d'être limitées sous plusieurs aspects, ne permettant pas en particulier la résolution de molécules d'ADN de dimensions supérieures à 50 kilobases. Des techniques plus récentes ont été mises au point, qui font appel à une multiplicité d'électrodes produisant des champs électriques générés alternativement dans des directions différentes. Ces techniques ont permis de séparer entre autres des molécules d'ADN de dimensions allant jusqu'à 2 mégabases, toutefois elles présentent l'inconvénient majeur de générer un champ électrique non uniforme, si bien que l'ADN migre avec des mobilités et selon des trajectoires qui dépendent de l'emplacement dans le gel de l'échantillon à analyser. Il en résulte une difficulté non négligeable à comparer des échantillons entre eux, et la quasi-impossibilité d'obtenir des résultats reproductibles. La présente invention permet de pallier ces inconvénients en proposant un procédé qui permet la séparation par électrophorèses de grosses macromolécules, en particulier de molécules d'ADN de dimensions allant jusqu'à 2 mégabases, tout en assurant la reproductibilité des résultats et la possibilité de comparer des échantillons entre eux. La présente invention est basée sur la découverte que des électrodes multiples disposées à intervalles égaux sur le contour d'un polygone régulier et soumises, sous l'action de courants électriques d'intensité fixe, à la génération d'au moins deux champs électriques alternés dans au moins deux directions différentes, produisent un champ électrique uniforme dans la zone centrale dudit polygone, l'uniformité dudit champ avoisinant celle qui pourrait être obtenue = l'aide de deu>: électrodcs parallèles lnfl.les. La présente invention a ainsi pour objet un procédé pour l'électrophorèse de macromolécules de grandes dimensions caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre lesdites macromolécules, dans un milieu convenable, à l'action d'au moins deux champs électriques uniformes générés alternativement dans au moins deux directions différentes, ces champs électriques étant produits par des électrodes multiples reliées à des sources de courant électrique d'intensité fixe et disposées à intervalles égaux sur le contour d'un polygone régulier dans la zone centrale duquelI se trouve place l'échantillon de gel renfermant lesdites macromolécules. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, les électrodes sont disposées sur le contour d'un hexagone régulier, à raison de 4 à 6 électrodes par côté, et situées à une distance du fond de la cuve telle qu'elles se trouvent approximativement au niveau du milieu de la hauteur de l'échantillon de gel renfermant les macromolécules, de façon que le champ électrique généré traverse cet échantillon avec une efficacité optimum. Dans ce mode de réalisation préféré, les électrodes sont réparties en deux groupes "actifs" et un groupe "neutre", les groupes "actifs" étant chacun constitué de deux rangées d'électrodes opposées et étant soumis alternativement à l'action d'un courant électrique d'intensité fixe entraînant la génération de deux champs électriques, orientés dans deux directions différentes tandis que le groupe "neutre" est constitué des deux autres rangées d'électrodes, également opposées, et fixées à un potentiel déterminé de manière à assurer l'uniformité du champ électrique au centre de l'hexagone. Pour assurer l'uniformité du champ au centre de l'hexagone les électrodes "actives" doivent être toutes alimentées en un courant de même intensité, qui fixe également la différence de potentiel entre les électrodes "neutres", étant bien entendu que les deux groupes d'électrodes "actives" sont alimentés alternativement. La présente invention a également pour objet un dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le dispositif selon l'invention se compose d'une cuve 3 -2620230 éeuip'e d'électrodes caractérisée en ce qu'elle comporte unr. couvercle hermétique sur lequel se trouvent fixées des électrodes disposées régulièrement selon le contour d'un polygone régulier, et dont l'extrémité horizontale se trouve située à une faible distance du fond de la cuve, lequel comporte, approximativement au centre du polygone régulier formé par les électrodes, un emplacement destiné à recevoir l'échantillon de gel renfermant les macromolécules à séparer, les électrodes étant reliées, à l'extérieur de la cuve, à des sources de courant électrique d'intensité fixe elles-mêmes reliées à des moyens permettant de les mettre sous tension alternativement par groupe de deux rangées opposees. Selon un mode de réalisation préféré du dispositif selon l'invention, les électrodes se trouvent disposées selon le contour d'un hexagone régulier, à raison de 4 à 6 électrodes par côté, à une distance du fond de la cuve telle qu'elles se trouvent approximativement au niveau du milieu de la hauteur de l'échantillon de gel renfermant les macromolécules. Dans ce mode de réalisation préféré, les électrodes sont réparties en deux groupes "actifs" et un groupe "neutre, les groupes "actifs" étant chacun constitué de deux rangées d'électrodes opposées et étant soumis alternativement à l'action d'un courant électrique d'intensité fixe entraînant la génération du champ électrique, tandis que le groupe "neutre" est constitué des deux autres rangées d'électrodes, également opposées, fixées à un potentiel déterminé de manière à assurer l'uniformité du champ électrique dans la zone centrale de l'hexagone. Les groupes "actifs" d'électrodes sont alimentés alternativement en un courant électrique d'intensité prédéterminée, selon des périodicités fixées à l'avance, et qui peuvent varier de quelques secondes à quelques minutes. Les électrodes du dispositif selon l'invention se trouvent toutes reliées les unes aux autres par l'intermédiaire de résistances toutes égales, de manière que la différence de potentiel entre deux électrodes voisines soit toujours la même sur tout le contour du polygone, ce qui a pour effet de générer -entre les deux rangées d'électrodes "neutres" un champ électrique de même intensité que celui généré entre les deux rangées opposés d'un même groupe d'électrodes "actives". En raison de la configuration polygonale de l'ensemble L4 2620230 d'électrodcs, les champs électriques gnriérés alternativement par chacun des groupes d'électrodes "actives" ont des directions différentes, pouvant faire entre elles un angle de 120 dans le cas o le polygone est un hexagone. Cette caractéristique, ainsi que la présence du groupe d'électrodes "neutres", permet d'assurer l'uniformité du champ électrique dans la zone centrale du polygone. Les électrodes mises en oeuvre dans le dispositif selon l'invention peuvent être des électrodes de graphite ou des électrodes métalliques. Dans ce dernier cas, elles sont avantageusement constituées d'un fil d'un métal peu oxydable, de préférence un fil de platine en formre de "L" dont la partie horizontale est placée à une courte distance du fond de la cuve. Selon un mode de réalisation préféré du dispositif selon l'invention, les électrodes sont constituées d'un fil de platine supporté par des colonnes porte-électrodes réalisées dans une matière plastique telle que le pexiglas, fixées au couvercle de la cuve par tout moyen approprié. Les électrodes sont insérées dans un logement prévu à cet effet dans lesdites colonnes, chaque électrode étant fixée par son extrémité supérieure à une fiche électrique elle-même fixées dans le couvercle de la cuve, à l'intérieur duquel elle est reliée à un dispositif électronique assurant son alimentation en courant électrique. La partie horizontale, active de chaque électrode, se trouve située immédiatement en-dessous de la colonne, laquelle présente avantageusement à sa base un évidement prolongé à sa partie supérieure par un conduit latéral débouchant à l'extérieur de la colonne, afin de permettre l'évacuation progressive des bulles gazeuses qui apparaissent, au cours de l'électrophorèse, à la surface du fil de platine. Afin d'assurer la bonne fixation de l'électrode, son extrémité inférieure peut être insérée dans un logement prévu à cet effet, dans la colonne, audelà de l'évidement dont il vient d'être question. Les deux groupes d'électrodes "actives" sont reliées, à l'extérieur de la cuve, à un circuit électrique comportant tous les éléments nécessaires à leur alimentation en courant électrique, ces connexions pouvant se faire par l'intermédiaire d'un ensemble électronique programmé pour contr6ler les opérations. L'éJectrophorèse peut être conduite, au moyen du dispositif qui vient d'être décrit, ern milieu tampon de type connu, et en mettant en oeuvre un gel approprié, de type également connu, renfermant l'échantillon à analyser. Le dispositif selon l'invention va être maintenant décrit en détail par référence aux dessins annexés qui en représentent une réalisation, étant bien entendu que cette description ne présente aucun caractère limitatif. Parmi les dessins annexés: - La figure 1 représente une demi-coupe d'une cuve électrophorèse selon l'invention. - La figure 2 représente une vue de dessous du couverc!e de la cuve. En se référant à la figure 1, on voit que la cuve 1 se compose d'un bac surmonté d'un couvercle 2 présentant en son centre une partie 3 transparente permettant de contrôler- les manipulations. Un évidement 4 est ménagé dans le fond du bac 1, approximativement en son centre, pour recevoir le porte- échantillon.portant le gel renfermant le produit à analyser. Un réservoir 5 situé en-dessous du bac 1 et relié à une pompe et un cryostat non représentés permet d'assurer la circulation dans le bac 1 du liquide tampon de refroidissement, qui entre dans le réservoir 5 par une douille d'entrée 6 et un ressort par une douille de sortie non représentée, située de l'autre côté de la cuve. Sur le couvercle 2 se trouvent fixées, au moyen de vis 6, les colonnes porte-électrodes 7 supportant les électrodes 8 en fil de platine. Un évidement 9 à la base des colonnes 7 permet d'évacuer par le conduit 10 les bulles de gaz qui se forment autour des électrodes 8 au cours de l'opération d'électrophorèse. L'électrode 8 est fixée par sa partie supérieure à une fiche électrique mâle 11 tandis que sa partie inférieure, recourbée à son extrémité, est maintenue dans un logement 12 ménagé dans la colonne 7. Les électrodes 8 sont toutes situées dans le même plan horizontal, à une distance du fond du bac 1 telle qu'elles arrivent au niveau du milieu de la hauteur de l'échantillon de gel placé dans l'évidement 4. Ainsi, avec un échantillon de gel de 8 mm de haut, les électrodes 8 doivent être à 4 mm du fond de la cuve. Cette précision est importante pour assurer l'efficacité 6' 2620230 optimum de l'électrcphorèsc. Le couvercle 2 comporte un évidement 13 permettant de loger les connexions électriques raccordées aux électrodes 8 ainsi que l'ensemble électronique contrôlant l'électrophorèse et disposé sur des circuits imprimés 14 fixés au couvercle 2 par des vis 15. L'ensemble de la cuve est monté sur trois pieds 16 permettant le réglage de l'horizontalité. En se référant maintenant à la figure 2, on voit la disposition des colonnes porte-électrodes 7 sur le couvercle 2, selon le contour d'un hexagone, dont chaque côté porte 4 électrodes. Les électrodes sont réparties en deux groupes d'électrodes actives A+A, B+B- et un groupe d'électrodes neutres, non désigné sur le dessin. Les groupes A+A et B+B sont alimentés alternativement en courant électrique, générant un champ électrique orienté alternativement entre A+ et A, et entre B+ et B, ces deux directions faisant entre elles un angle de 120 . L'électrophorèse est réalisée, dans le dispositif qui vient d'être décrit, après que le porte-échantillon, convenablement chargé du gel renfermant le produit à analyser, ait été placé dans l'évidement 4 destiné à le recevoir. Le liquide tampon de refroidissement, refroidi à 9 C, est mis en circulation dans le bac 1, de manière à recouvrir l'échantillon. Les raccordements électriques étant réalisés entre les électrodes "actives" et les sources de courant, l'ensemble est placé sous contrôle du dispositif électronique disposé sur les circuits imprimés 14, qui régit l'alternance d'alimentation des électrodes par un courant d'intensité fixe. Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent, ainsi qu'il a déjà été dit, de séparer des macromolécules de grandes dimensions, telles que des génones de type humain ou des chaînes d'ADN de levures. La méthode se distingue par la qualité de la résolution et la linéarité de la migration, qui facilite considérablement la lecture des résultats. 26202,0 REVENDICATIONS 1) Procédé d'électrophorèse permettant - la séparation de macromolécules de grandes dimensions, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le produit renfermant lesdites macromolécules, dans un milieu convenable, à l'action d'au moins deux champs électriques uniformes générés alternativement dans au moins deux directions différentes par des électrodes multiples alimentées en courant électrique d'intensité fixe, disposées a intervalles égaux selon le contour d'un polygone régulier dans la zone centrale duquel se trouve placé l'échantillon de produit. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les électrodes sont réparties en deux groupes dont l'un, constitué d'au moins deux couples de rangées opposées, est soumis à l'alternance d'alimentation en courant électrique et l'autre, constitué d'au moins un couple de rangées opposées, est fixé à un potentiel déterminé. 3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les électrodes sont réalisées en graphite ou en métal. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les électrodes sont disposées selon le contour d'un hexagone régulier, à raison de 4 à 6 électrodes par c6té. ) Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé qui fait l'objet de la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comporte un bac 1 surmonté d'un couvercle 2 auquel se trouvent fixées des colonnes porteélectrodes 7 supportant les électrodes 8 reliées par leur extrémité supérieure à une fiche électrique 11 permettant de les connecter à la source de courant électrique. 6) Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les électrodes 8 sont situées à une distance du fond de la cuve telle qu'elles se trouvent approximativement au niveau du milieu de la hauteur de l'échantillon de gel renfermant les macromolécules. 7) Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les électrodes sont réparties en deux groupes "actifs" et un groupe "neutre", les groupes "actifs" étant chacun constitué de deux rangées d'électrodes opposées et étant soumis alternativement 8 2620230 à l'action d'un courant électrique d'intensité fixe entrainant la génération du champ électrique, tandis que le groupe "neutre" est constitué des deux autres rangées d'électrodes, également opposées, fixées à un potentiel déterminé, les groupes "actifs" d'électrodes étant alimentés alternativement en un courant électrique d'intensité prédéterminée, selon des périodicités fixées à l'avance. 8) Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les colonnes porte-électrodes 7 comportent à leur partie inférieure un évidement 9 prolongé à sa partie supérieure par un conduit 10 assurant l'évacuation progressive des bulles de gaz qui apparaissent sur l'électrode 8 au cours de l'électrophorèse. 9) Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'alimentation en courant électrique des électrodes 8 est contr6lé par un ensemble électronique disposé sur des circuits imprimés 14 situés à l'intérieur d'un évidement 13 ménagé dans le couvercle 2. ) Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la cuve 1 comporte à sa partie inférieure un réservoir 5 destiné à assurer la circulation, dans la cuve 1, d'un liquide tampon de refroidissement qui vient recouvrir l'échantillon de produit.