Brevet FR2613380A1 — publié le 19881007

La présente invention est relative à une nouvelle substance présentant un effet adjuvant, obtenue à partir du surnageant de cultures de Vibrio cholerae, à un procédé d'obtention de cette substance par extraction à partir de surnageant de culture de Vibrio cholerae et à des compositions thérapeutiques contenant ladite substance. Les Inventeurs ont isolé de surnageants de cultures de Vibrio cholerae une substance qu'ils ont dénommée "D.G.Z." et qui est caractérisée en ce que - injectée au lapin selon la technique de Oudin, elle provo que chez celui-ci l'apparition d'anticorps qui par la tech nique de double diffusion en gélose, se manifestent sous forme d'une bande de précipité antigène-anticorps et par analyse immunoélectrophorétique contre le sérum obtenu, par une seule bande - son poids moléculaire, obtenu par ultracentrifugation et électrophorèse, est sensiblement de l'ordre de 57 000 daltons; - elle se compose de sucres (environ 28,3 %), d'acides aminés (17 % environ) et d'acides gras (environ 9 %). Conformément à l'invention, sa composition en sucres comprend essentiellement rhamnose 4,1 % environ mannose 42 % environ galactose 32 % environ glucose 2,3 % environ Egalement conformément à l'invention, sa composition en acides amines comprend essentiellement asparagine 8,2- 8,7 % environ glutamine 8,9-10,5 % environ sérine 5,5- 7,2 % environ glycine 4,4- 8,6 % environ histidine 2,3- 3,4 % environ arginine 2,8- 4,1 % environ. thréonine 5,1- 5,6 % environ alanine 7,2- 8,1 8 environ proline 5,8- 7,6 % environ ammoniac 11,0-14,7 % environ tyrosine 2,0- 2,9 % environ valine 5,6- 6,3 8 environ méthionine 0,9- 1,1 % environ cystéine 0,6- 1,1 % environ isoleucine 2,4- 2,8 % environ leucine 6,9- 8,8 % environ phénylalanine 3,4- 4,2 % environ lysine 4,6- 7,0 % environ Conformément à l'invention, sa composition en acides gras comprend essentiellement des acides gras en C10 à C20 dans les proportions suivantes C10 4,5 % environ C11 15,4 % environ C10,30H 15,5 % environ C12 14,5 % environ C13 5,2 % environ C12, 30H 1,7 % environ C14 0,91% environ C13,30 40,1 % environ C14,30H C16 1 0,13% environ C16 1,05% environ C18 1 0,5 % environ C18 2,5 % environ C19 0,13% environ C20 0,5 % environ C15 0,55% environ La présente invention a également pour objet une composition antimitotique caractérisée en ce qu'elle comprend la substance adjuvante extraite de surnageant de Vibrio cholerae conforme à la présente invention, associée à au moins un agent antimitotique. Selon un mode de réalisation avantageux de cette composition antimitotique, l'agent antimitotique est avantageusement pris dans le groupe-qui comprend notamment le Cisplatine, le 5-fluorouracile, l'adriamycine, la mitomycine. Selon un autre mode de réalisation avantageux de cette composition antimitotique, l'adjuvant et l'antimitotique sont présents dans la composition dans un rapport adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une substance présentant un effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae, qui est caractérisé en ce que du surnageant de cultures de Vibrio cholerae est précipité, puis centrifugé, puis le culot de centrifugation est dissous en eau distillée, et la solution chauffée puis centrifugée, dialysée et lyophilisée pour donner lieu à la substance à effet antimitotique identifiée ci-dessus. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le surnageant de culture est obtenu à partir d'une culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline, cultivée pendant 8 heures environ à 37-C environ et récoltée dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'environ 1010 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fioles de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ces fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 370C environ sous agitation continue, puis la récolte est recueillie, centrifugée e et le surnageant de culture obtenu est recueilli pour être traité en vue de l'obtention de la substance adjuvante conforme à l'invention. Outre les dispositions qui précédent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation de la substance adjuvante conforme à la présente invention, à un exemple de mise en évidence de I'ati- vit de cette substance et à un compte-rendu d'exprimentation clinique. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement & titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - Préparation de la nouvelle substance adjuvante conforme à l'invention La culture est réalisée en fiole de Fernbach de 2 litres emplie à moitié de billes de verre et stérilisée à l'autoclave, puis complétée à 200 ml par de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2. On utilise comme souche de vibrions, une souche de Vibrio cholerae Ogawa appelée Stockholm nO 20 (déposée au Centre National de Référence des Vibrions à 1'INSTITUT PAS TEUR) et choisie par les Inventeurs. Le nombre de germes par millilitre est constitué par la totalité des germes d'un tube de culture de gélose nutritive alcaline cultivée pendant 8 heures à 370C, la culture étant récoltée dans 20 ml d'eau physiologique tamponnée (sensiblement 1010 germes/ml). La fiole de Fernbach est ensemencée par cette culture et est portée pendant 18 à 20 heures dans une étuve à 370C avec agitation continue, après quoi, la récolte est recueillie, centrifugée à 5000 tours/minute pendant 20 minutes. Le surnageant de culture est alors précipité par du polyéthylèneglycol à 28 % concentration finale. Le surnageant est centrifugé à 20000 G pendant 20 minutes. Le surnageant est alors rejeté et le culot séché. Celu -ci est dissous en eau distillée. Celle-ci est ajoutée progressivement de façon à obtenir une dissolution totale du produit avec l'aide de quelques billes pour homogénéiser la solution. La solution ainsi obtenue est ensuite chauffée pendant une demi-heure au bain-marie à 100"C. Elle est centrifugée à 20000 G pendant 20 minutes puis dialysée contre de l'eau distillée, lyophilisée et pesez EXEMPLE 2 - Mise en évidence de 1'activité de la nouvelle substance conforme a l'invention L'activité de la substance conforme a l'invention a été mise en évidence par des méthodes in vitro et in vivo. A. In vitro 1. L'activité a été mise en évidence sur des cultures cellulaires de cellules du Sarcome 180, en mettant en pré sence dans un milieu de culture constitué par de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2, les cellu les et des quantités croissantes de la substance conforme à l'invention. L'activité de ladite substance a e' été évaluée sur le nombre de cellules vivantes par coloration vitale durant 24 heures. On a évalué selon la même méthode l'activité de l'association de la substance conforme à l'invention avec le Cisplatine. Les résultats obtenus sont représentés respective ment dans les figures 1, 2 et 3 annexées qui montrent que cultivées in vitro, des cellules de Sarcome 180 se mul tiplient jusqu'au 6ème - 7ème jour pour donner 106cel- lules/ml, en présence de DGZ. La figure 1 montre la viabilité % d'une culture de cellu les de Sarcome 180 (106 cellules/boîte) en fonction du temps en présence de DGZ seule (courbe Ib) par comparaison avec un témqin (culture des cellules de sarcome 180 seule) (courbe Ia). Alors qu'au 8ème jour le taux de viabilité des cellules témoins est de 40 % environ après un maximum à 80 % entre le 5ème et le 6ème jour, en présence de DGZ seule, il dé croit régulièrement à partir du 2ème jour (où il est de 90 % environ) jusqu'au 8ème jour o il est à environ 60 %. La figure 2 montre la viabilité 8 d'une culture de cellu les (1.p6 cellules/botte) de Sarcome 180 en fonction du temps, en présence d'une asso ciation de Cisplatine et de DGZ on constate une décroissance régulière du taux de viabi lité de 80 % au ler jour à 15 % environ au 8ème jour. La figure 3 montre la viabilité % d'une culture de cellu les (106 cellules/boîte) de Sarcome 180 en fonction du temps, en présence de Cisplatine seul. La courbe décroît régulièremçnt de 90 8 envi ron au ler jour à environ 15 % au 8ème jour. 2. Une activité de la substance conforme à l'invention a été démontrée en mesurant l'incorporation de la thymidine tritiée, dans des cultures en micropuits de cellules mononucléées sanguines humaines, en présence ou en absence de phytohémagglutinine (PHA), phytohémagglutinine diluée au l/500è avec des concentrations de substance variant de 0,1 à 1000 mcg/ml. En présence de PHA, il existe une activité dose-dépendante qui permet une augmentation importante de la thymidine tritiée à l'intérieur de la cellule. Les résultats obtenus sont représentés respectivement dans les figures 4 et 5 > annexées. Dans la figure 4, la courbe a représente l'incorporation de la thymidine en présence d'associa tions de DGZ et de Cisplatine dans les quelles la DGZ est présente soit en quantités variables, soit en quantités fixes, la courbe ss représente l'incorpo ration de thymidine en présence de DGZ seule. Les courbes a et B de la figure 5 ont la même significa tion que les courbes correspondantes de la figure 4, à ceci près que la subs tance étudiée (association de DGZ + cisplatine ou DGZ seule) est pré sente à une dilution de raison 2 par rapport à la figure 4. 3. Tests de toxicité Ils ont été effectués sur des souris Balb/c pesant 20 g environ. Toxicité aiguë : une injection de 20 mg par voie intrapéritonéale ne provoque aucun trouble. Toxicité chronique : des injections de 16 à 20 mg par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 4 semaines provoquent l'appa rition de diarrhée. B. In vivo -1. Des essais ont été réalisés sur des souris Balb/c inoculées par 105 cellules de Sarcome 180 et traitées dès la 24ème heure par voie intrapéritonéale pendant 4 jours avec des doses de 2 mg de la substance conforme à l'inven tion, soit seule soit en association avec du Cisplatine. Les résultats suivants ont été obtenus - avec une association comprenant 2 mg de la substance conforme à l'invention et 0,0125 mg de Cisplatine, 80 à 90 % des souris ont survécu sans ascite ni tumeur selon la modalité expérimentale. A signaler qu'elles n'ont pu être réinoculées quelle que soit la dose de cellules injectées. Les résultats obtenus sont représentés aux figures 6 et 7 annexées qui montrent le nombre de souris survivan tes (en ordonnée) en fonction du temps (en abscisse), ex primé en jours. La figure 6 montre le taux de survie de souris auxquelles ont été inoculées 106 cellules de Sarco me 180, traitées par des injections d'eau physiologique tamponnée, 2 fois par semaine pendant 4 semaines s aucune souris survivante au 12ème jour. La figure 7 montre le taux -de souris inoculées par 106 cellules de Sarcome 180 traitées par des injections de DGZ (en eau peptonée) chauffée une heure à 100,C et de Cisplatine à raison de 2 mg de DGZ 2fois par semaine 0,0250 mg de Cisplatine /4 semaines Sur un lot de 20 souris, 18 étaient toujours vivantes au 75ème jour après le début du traitement (2 décès observés au 39ème jour). 2. Des essais ont été réalisés également sur des souris C57 black inoculées avec des cellules de la tumeur de Lewis, 104 cellules dans la patte arrière gauche. L'évolution de la tumeur est suivie, chez les témoins comme chez les souris traitées, par mesure de l'épaisseur de la patte. Le traitement a été réalisé par voie intrapéritonéale pendant 4 jours, à raison de 1 mg de la substance conforme à l'invention et de 0,0125 mg de Cisplatine dans la meme seringue par souris et par jour, pendant 4 jours, et sous un volume de 0,20 ml Les résultats ont été les suivants : 70 % des souris traitées ont survécu sans développer ni tumeur ni métastase. Elles n'ont pu être réinoculées ultérieurement par des quantités de 106 à 108 cellules de Lewis. Ces résultats sont reproduits aux figures 8 à 10 annexées qui montrent l'augmentation d'épaisseur de la patte (exprimée en mm) en fonction du temps (exprimé en jours). Dans la figure 8 après inoculation de 104 cellules de Lewis suivie d'un traitement pendant 4 jours par le Cisplatine associé à la DGZ : on observe une augmentation d'épaisseur brusque entre le 12ème et le 15ème jour après l'inoculation chez les souris traitées,de 4,7 mm à 6,2 mm, soit 1,5 mm, alors que dans le cas de souris traitées par le Cisplatine seul (figure 9), l'augmentation d'épaisseur atteint 2,5 mm et que dans le cas des souris témoins traitées par de l'eau physiologique, on observe une augmentation d'épais seur bien plus considérable, puisqu'elle est de 4,3 mm (figure 10). EXEMPLE 3 - Compte-rendu d'expérimentations cliniques A. Cancers de l'ovaire Al. Traitement de malades après intervention chirurgicale, par la substance adjuvante conforme à l'invention administrée par voie intrapéritonéale seule dans 33,3 % des cas en association avec au moins un autre antimitotique dans 66,6 % des cas 60 % de taux de survie ont été observés avec dispari tion de l'ascite. A2. Traitement de malades présentant une récidive La moyenne de survie de ces malades qui récidivent ne dépasse pas 6 mois habituellement quel que soit l'antimitotique de l'Art antérieur utilisé pour le traitement. Avec la substance conforme à l'invention adminis trée par voie intrapéritonéale . soit seule . soit en association avec au moins un autre anti mitotique, Les durées de survie ont été prolongées de façon spec taculaire puisque le taux d'échecs n'a été que de 5 % et que les durées de survie des malades récidivistes traités ont atteint de 13 mois à 92 mois, avec une disparition totale de l'ascite et du ventre énorme li à la présence de l'ascite, procurant ainsi aux malades non seulement une amélioration au moins temporaire sur le plan de la maladie elle-même, mais aussi une amé- lioration importante sur le plan psychologique résul tant de l'amélioration de leur aspect physique et de leur confort. Dans d'autres formes de cancers métastasés (pulmo naires, digestifs) des résultats similaires ont été obte nus, avec réduction de la tumeur principale et des métas tases. Les conditions d'administration ont été identiques à celles mises en oeuvre dans le traitement des cancers de l'ovaire. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1.) Nouvelle substance à effet adjuvant, caractérisée en ce que - injectée à un mammifère expérimental, elle provoque chez celui-ci l'apparition d'anticorps , - son poids moléculaire est sensiblement de l'ordre de 57 000 daltons - elle se compose de sucres (environ 28,3 %), d'acides aminés (17 % environ) et d'acides gras (environ 9 t). 2") Substance selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa composition en sucres comprend essentiellement rhamnose 4,1 % environ mamnose 42 % environ galactose 32 % environ glucose 2,3 % environ. 3-) Substance selon au moins l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que sa composition en acides aminés comprend essentiellement asparagine 8,2- 8,7 % environ glutamine 8,9-10,5 % environ sérine 5,5- 7,2 % environ glycine 4,4- 8,6 % environ histidine 2,3- 3,4 % environ arginine 2,8- 4,1 % environ thréonine 5,1- 5,6 % environ alanine 7,2- 8,1 % environ prolo 5,8- 7,6 % environ ammoniac 11,0-14,7 % environ tyrosine 2,0- 2,9 % environ valine 5,6- 6,3 % environ méthionine 0,9- 1,1 % environ cystéine 0,6- 1,1 % environ isoleucine 2,4- 2,8 % environ .leucine 6,9- 8,8 % environ phénylalanine 3,4- 4,2 t environ lysine 4,6- 7,0 t environ. 4t) Substance selon au moins l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que sa composition en acides gras comprend essentiellement des acides gras en C10 à C20 dans les proportions suivantes C10 4,5 % environ C11 15,4 % environ C10,30H 15,5 % environ C12 14,5 % environ C13 5,2 % environ C12, 30H 1,7 % environ C14 0,91% environ C13,30H C0,1 % environ C14,30H (0,1 % environ C16 1 0,13% environ C16 1,05% environ C18 1 0,5 % environ C18 2,5 % environ C19 0,13% environ C20 0,5 % environ C15 0,55% environ. 5 ) Composition antimitotique, caractérisée en ce qu'elle comprend la substance adjuvante extraite de surnageant de Vibrio cholerae selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, associée à au moins un agent antimitotique. 66) Composition selon la reverSication 5, caractérisée en ce que l'agent antimitotique est avantageusement pris dans le groupe qui comprend notamment le Cisplatine, le 5-fluorouracile, l'adriamycine, la mitomycine. 70) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisée en ce que l'adjuvant et l'antimitotique sont présents dans la composition dans un rapport adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10. 8 ) Procédé d'obtention d'une substance présentant un effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae, caractérisé en ce que du surnageant de cultures de Vibrio cholerae est précipité, puis centrifugé, puis le culot de centrifugation est dissous en eau distillée, et la solution chauffée puis centrifugée, dialysée et lyophilisée pour donner lieu à une substance à effet adjuvant telle que définie dans la revendication 1. 90) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le surnageant de culture est obtenu à partir d'une culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline, cultivée pendant 8 heures environ à 370C environ et récoltée dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'environ 1010 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fioles de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ces fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 37"C environ sous agitation continue, puis la récolte est recueillie, centrifugée et le surnageant de culture obtenu est recueilli pour etre traité en vue de l'obtention de la substance adjuvante selon la revendication 1.