Brevet FR2621049A1 — publié le 19890331

La présente invention concerne un procédé de numération et de dépistage des mycoplasmes urogénitaux. On sait que les mycoplasmes sont des bactéries sans paroi dotées de propriétés enzymatiques (uréase pour Ureaplasma Urealyticum et arginine décarboxylase pour Mycoplasma Hominis et Fermentans). Ces propriétés enzymatiques ont été utilisées pour l'identification et la numération de ces souches dans les prélèvements urogénitaux. En effet, ces germes sont des bactéries commensales (présents sur des muqueuses d'individus parfaitement sains à des taux faibles inférieurs ou égaux à 103 UCC/ml - unités de changement de couleur/ml-). Ils peuvent, lorsqu'une infection se déclare ou lorsqu'une muqueuse est fragilisée (infection virale, bactérienne, déséquilibre hormonal, etc...) proliférer et entrainer des états de surinfection chronique pouvant aboutir - soit à des stérilités tubaires - soit à des stérilités masculines - soit à des salpingites aiguës ou chroniques - soit à des syndromes d'urétroprostatite - soit à des dysplasies endocervicales (lorsqu'ils surinfec tent des infections virales : Papilloma Virus, Herpes, CMV etc...). Dans tous ces cas de figure, ils sont présents à des taux suprapathologiques supérieurs ou égaux à 104 UCC/ml. Or, jusqu'à présent, deux techniques sont utilisées pour la numération des mycoplasmes urogénitaux 1. On numère le nombre de colonies par champ microscopique sur une gélose d'isolement. Cette technique est assimilable à celle utilisée pour la numération des germes dans les infections urinaires (Kass). Ce type de numération présente, cependant, l'inconvénient d'utiliser systématiquement une gélose solide dont le prix de revient est élevé, peu adapté à la recherche systématique des mycoplasmes urogénitaux. De plus, cette technique impose une incubation en jarre anaérobie. 2. Une numération basée sur la dilution en cascade du prélè vement à analyser en milieu liquide (Ug pour U. Uréalyticum, M42 pour M. Hominis) et sur le virage d'un indicateur coloré approprié du type Rouge de Phénol contenu dans le milieu de dilution. Cette technique utilisant les propriétés enzymatiques des M. Urogénitaux présente toutefois plusieurs inconvénients L'urée, en milieu liquide complexe, est instable. De ce fait, sa concentration (représentant le substrat enzymatique) peut être variable d'une série de tests à l'autre, entraînant un risque de manque de reproductibilité. La lecture n'est possible qu'après une stabilité des virages de l'indicateur d'au moins 24 heures, ce qui entraîne un délai minimum de réponse de 72 heures. La technique des dilutions en cascade est lourde, et de plus elle est entachée d'un coefficient d'erreur dû à la manipulation. On ne dispose sur le marché d'aucun "kit" contenant l'ensemble des réactifs nécessaires ainsi que des supports. La présente invention se propose d'obvier à ces inconvénients et vise un procédé de numération et de dépistage des mycoplasmes urogénitaux faisant appel à la cinétique enzymatique. On sait en effet utiliser cette dernière technique en biochimie pour doser les enzymes mais il n'a jamais été suggéré ou envisagé de l'utiliser pour le dosage des bactéries comme c'est le cas dans le procédé de la présente invention. La Demanderesse a en effet trouvé que la vitesse de la réponse enzymatique était proportionnelle à la quantité de Mycoplasmes présents dans l'échantillon soumis à l'analyse. Ce procédé est essentiellement caractérisé par le fait qu'on réalise des réactions enzymatiques dans des conditions d'anaérobiose, entre un milieu liquide de croissance de mycoplasmes servant de milieu de dilution de l'échantillon du fluide à analyser et, d'une part, un premier substrat comprenant de l'urée déshydratée en présence d'un indicateur coloré de pH également sous forme déshydratée et, d'autre part, un second substrat comprenant de l'arginine également sous forme déshydratée en présence d'un indicateur coloré de pH et qu'on suit la vitesse de réponse enzymatique en notant le temps correspondant au virage des indicateurs, les quantités respectives d'urée et d'arginine, d'une part, et la concentration et les composants nutritifs dudit milieu de croissance et de dilution, d'autre part, étant préalablement choisis et étalonnés de telle sorte que, pour des Ureaplasma Urealyticum présents à des taux supra- ou infra-pathologiques, on obtienne ou non le virage des indicateurs colorés au bout d'un laps de temps déterminé. Suivant d'autres caractéristiques - L'indicateur de pH est choisi de manière à avoir un point de virage entre pH 6,4 et pH 8 - L'indicateur de pH est avantageusement le Rouge de Phénol - La concentration d'urée déshydratée et de l'indicateur de pH, d'une part, la concentration du milieu liquide de croissance et de dilution et la quantité du fluide à analyser dans ce milieu, d'autre part, sont choisies de telle sorte qu'à des taux suprapathologiques (supérieurs ou égaux à 104 UCC/ml) de Ureaplasma Urealyticum, le virage de l'indicateur se produise en un laps de temps de 24 heures et qu'à des taux de U.Urealyticum infrapathologiques (inférieurs ou égaux à 103 UCC/ml), le virage de l'indicateur se produise en un laps de temps de 48 heures - La concentration d'arginine déshydratée et de l'indicateur de pH, d'une part, la concentration du milieu liquide de croissance et de dilution et la quantité du fluide à analyser dans ce milieu, d'autre part, sont choisies de telle sorte que l'on obtienne en 24 ou 48 heures le virage de l'indicateur pour des taux suprapathologiques (supérieurs ou égaux à 103 UCC/ml) de M.Hominis et.Fermentans avec absence de virage en 48 heures pour des taux infrapatholo giques (inférieurs ou égaux à 103 UCC/ml) -,; - Le milieu de dilution de l'échantillon à analyser est essentiellement à base d'un bouillon de croissance de mycoplasmes, additionné d'éléments nutritifs appropriés - Le milieu de dilution de l'échantillon à analyser est avantageusement constitué de bouillon de mycoplasmes, de sérum de poulain, d'ampicilline, d'un antibiotique, d'un réducteur du type thioglycolate de Na, de levure et de cystéine. Le procédé selon l'invention est de préférence mis en oeuvre dans des cupules de faibles dimensions renfermant les unes l'urée, les autres l'arginine déshydratée et, après y avoir introduit le liquide soumis à analyse, on réalise les conditions d'anaérobiose en recouvrant chaque cupule d'une substance huileuse inerte comme l'huile de paraffine. Le choix des concentrations et l'étalonnage des réactifs pour la mise en oeuvre du procédé del'invention se font en dressant une courbe de correspondance en procédant à des numérations suivant les deux techniques usuelles rappelées précédemment. D'autres caractéristiques et les avantages de l'invention ressortiront plus clairement de la description et de l'exemple qui vont suivre. On a utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention au moins deux cupules d'un type bien connu présentant un diamètre de 9 mm et une profondeur de 6 mm. Dans une de ces cupules, on a introduit une quantitée d'urée déshydratée de 1 mg (milligramme) et dans l'autre une quantito d'arginine déshydratée de 1,68 mg (milligramme). Dans chacune de ces cupules, on a également introduit 6,8 ug (microrame) du msme indicateur de pH deshydraté, à savoir du Rouge de Phénol. L'échantillon prélevé sur un malade en vue d'analyse a été dilué au moyen d'un milieu désigné ci-après milieu A3 correspondant à la composition suivante et obtenue à partir d'un bouillon de mycoplasmes déshydratés (25,5 g) dissous dans 713 ml d'eau distillée. Le milieu liquide résultant a été additionné de - 200 ml de sérum de poulain - 0,5 g d'ampicilline ; - 8 mg de Bactrim (antibiotique) - 0,5 g de réducteur (thioglycolate de sodium) - 100 ml de levure - 2,5 ml de cystéine à 4 %. Chacune des cupules a été recouverte de quelques quelques gouttes d'huile de paraffine pour créer l'anaérobiose nécessaire aux réactions enzymatiques. Cette composition et les quantités d'urée, d'arginine et d'indicateur de pH ont été adaptées en faisant des essais comparatifs utilisant les deux techniques classiques actuellement couramment utilisées, de manière à obtenir des virages en 24 heures pour des taux suprapathologiques pour U. Urealyticum et des virages en 24 ou 48 heures pour des taux suprapathologiques pour M. Hominis. Pour ces essais comparatifs, on a utilisé, dans la technique dite de dilution, le milieu liquide de dilution classique à based'urée et d'arginine,à raison de 150 L de ce milieu,dans lequel on a introduit 15 l du milieu A3 ensemencé par l'échantillon prélevé ' avec dilution en cascade à raison de 15 L de chaque prise d'essai. Pour la technique de numération sur boîte (gélose A7), on a procédé, comme cela se fait habituellement, à l'évaluation du nombre moyen de colonies de mycoplasmes par champ microscopique (avec un grossissement de 100) , de la façon suivante, UFC/ml signifiant "unité formant colonie": moins de 1 colonie .......... concentration de germes 4 103 UFC/ml de 1 à 5 colonies ........... voisin de 104 UFC/ml de 6 à 10 colonies ........... voisin de 105 UFC/ml de 11 à 20 colonies ......... voisin de 106 UFC/ml supérieur à 20 colonies .... supérieur à 106 UFC/ml En procédant de la sorte à partir de prélèvements urogénitaux de patients hommes ou femmes, on a établi graphiquement la correspondance entre les différentes techniques. Le tableau suivant donne cette correspondance. NUMERATION EN M I L I E U A 7 MALADE MILIEU CUPULE UREE CUPULE ARG LIQUIDE NB DE COL. NUMERATION A 106 en 96 h > 20 106 Positive 24h B 10 en 72 h 1 # 10 Positive 48 h C | 0 en 96 h O 0D - - D 106 en 72 h 12 106 Positive 24h E | 0 en 96 h 0 0 F | 101 en 72 h O 0 - - G contamination 10 U 105 Positive 24h Positive 24h > 20 M 106 @ (trouble) | (trouble) H , 104 en 72 h ; 3 104 | Positive 24h I 105 en 48 h 7 105 Positive 24h On se réfèrera aussi à la courbe figurant en annexe. A l'examen de ce tableau et de la courbe comparative annexée, on notera que, pour des U. Urealyticum présents à des taux supérieurs ou égaux à 104 UCC/ml, la cupule de l'urée change de couleur (virage de l'indicateur) en 24 heures. Le virage dans cette même cupule en 48 heures correspond, soit à la présence de U. Urealytifcum à un taux inférieur ou égal à 10 UCC/ml (sans signification en pathologie humaine), soit à une interférence chimique ou bactérienne. L'absence de virage en 48 heures de la cupule urée permet d'affirmer l'absence totale de U. Urealyticum même à des taux faibles (102 à 103 UCC/ml) étant donné la grande sensibilité des cupules d'urée. On notera par ailleurs qu'aucune interférence (bactérienne ou chimique) ne peut fausser la réponse en 24 heures, d'où une parfaite fiabilité du dépistage qui pourra toutefois être vérifié en repiquant le milieu A3 sur une gélose solide A7 (lors d'utilisation des cupules en screening Pour M. Hominis et Fermentans, le pouvoir enzymatique étant moins puissant, seul un virage de la cupule d'arginine (ARG) en 48 heures permet la discrimination des taux infrapathologiques (inférieurs ou égaux à 10 UCC/ml avec absence de virage de la cupule en 48 heures) des taux suprapathologiques (supérieurs ou égaux à4 UCC/ml avec virage de la cupule en 24 ou 48 heures). Il s'ensuit que seul le virage de la cupule d'urée en 24 heures et le virage de la cupule d'arginine en 24 heures ou 48 heures sont intéressants. Le biologiste péut alors, dans ce laps de temps, affirmer s'il y a ou non une infection ou la surinfection d'une muqueuse par un mycoplasme. En se référant au tableau ci-dessus, on constate que, pour le malade F, les résultats correspondent à une concentration qui ne semble pas être dépistée par la présente technique du fait que le seuil de sensibilité des cupules a été volontairement fixé à 10 UCC/ml. Les concentrations inférieures ne présentent du reste aucun intérêt dans le diagnostic des infections à mycoplasmes. Il est du reste normal de ne pas retrouver de colonies sur le milieu A7 étant donné le facteur de dilution dû à la technique d'ensemencement direct. Quant au malade G, on constate que seule la numération sur boite est interprétable. On constate alors que toutes les numérations effectuées au moyen des trois techniques en question s'inscrivent sur la droite de correspondance entre la numération sur gélose A7 et la numération par dilution et se trouvent dans la zone de la cinétique de virage lui correspondant (24 heures pour des concentrations supérieures ou égales à 104 UCC/ml et 48 heures pour des concentrations inférieures à 103 UCC/ml). Comme indiqué précédement, on constate, sur le graphique annexé, que seul le malade F ne peut s'inscrire sur cette droite. On notera que le délai d'obtention moyen de la numération par la technique de dilution est de 72 heures, 24 heures suffisant pour des concentrations suprapathologiques, qui sont les seules intéressantes, avec la numération en cupules selon l'invention, alors que 48 heures suffisent pour la numération sur boîte. La Demanderesse a du reste constaté que la nouvelle technique selon l'invention faisant appel à la cinétique enzymatique sur des supports contenant le substrat déshydraté donne une très bonne corrélation dans 95 % des cas lorsqu'on la compare aux deux autres techniques actuellement utilisées. Les 5 % d'écart, constatés au cours de plusieurs essais, peuvent être attribués - soit à des souches poussant préférentiellement en milieu liquide, comme c 'est le cas où la numération sur gélose solide est mise en défaut - soit à des souches présentant une faible activité enzyma tique, comme c'est le cas où seule le numération sur boîte permet une numération fiable. On fera alors observer que le dépistage de ces 5 % d'écart peut se faire en utilisant simultanément deux méthodes de numération, à savoir celle selon la présente invention et celle sur gélose solide. Par ailleurs, la cinétique enzymatique en cupules selon l'invention, dans laquelle le substrat se trouve sous forme déshydratée, présente, par rapport à la technique de dilution en cascade, les avantages suivants - Stabilité du substrat garantissant la reproductibilité - Suppression de manipulations et élimination de l'imprécision provenant de dilutions manuelles en microplaque avec des microprises d'essai - Délai de réponse de 24 heures au lieu de 72 heures, - Et enfin, abaissement du prix de revient lorsque l'on tient compte de tous les matériels mis en jeu. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification pourra y être apportée, sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de numération et de dépistage des mycoplasmes urogénitaux, essentiellement caractérisé par le fait qu'on réalise des réactions enzymatiques dans des conditions d'anaérobiose, entre un milieu liquide de croissance de mycoplasmes servant de milieu de dilution de l'échantillon du fluide à analyser et, d'une part, un premier substrat comprenant de l'urée déshydratée en présence d'un indicateur coloré de pH également sous forme déshydratée et, d'autre part, un second substrat comprenant de l'arginine également sous forme déshydratée en présence d'un indicateur coloré de pH et qu'on suit la vitesse de réponse enzymatique en notant le temps correspondant au virage des indicateurs, les quantités respectives d'urée et d'arginine, d'une part, et la concentration et les composants nutritirs dudit milieu de croissance et de dilution, d'autre part, étant préalablement choisis et étalonnés de telle sorte que, pour des Ureaplasma Urealyticum présents à des taux supra- ou infra-pathologiques, on obtienne ou non le virage des indicateurs colorés au bout d'un laps de temps déterminé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'indicateur de pH est choisi de manière à avoir un point de virage entre pH 6,4 et pH 8. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'indicateur de pH est avantageusement le Rouge de Phénol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la concentration d'urée déshydratée et de l'indicateur de pH, d'une part, la concentration du milieu liquide de croissance et de dilution et la quantité du fluide à analyser dans ce milieu, d'autre part, sont choisies de telle sorte qu'à des taux suprapathologiques (supérieurs ou égaux à 10 UCC/ml) de Ureaplasma Urealyticum, le virage de l'indicateur se produise en un laps de temps de 24 heures et qu'à des taux de U. Urealyticum infrapathologiques (inférieurs ou égaux à 10 UCC/ml), le virage de l'indicateur se produise en un laps de temps de 48 heures. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la concentration d'arginine déshydratée et de l'indicateur de pH, d'une part, la concentration du milieu liquide de croissance et de dilution et la quantité du fluide à analyser dans ce milieu, d'autre part, sont choisies de telle sorte que l'on obtienne en 24 ou 48 heures le virage de l'indicateur pour des taux suprapathologiques (supérieurs ou égaux à 103 UCC/ml) de M. Hominis et Fermentans avec absence de virage en 48 heures pour des taux infrapathologiques (inférieurs ou égaux à 103 UCC/ml). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu de dilution de l'échantillon à analyser est essentiellement à base d'un bouillon de croissance de mycoplasmes, additionné d'éléments nutritifs appropriés. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de dilution de l'échantillon à analyser est avantageusement constitué de bouillon de mycoplasmes, de sérum de poulain, d'ampicilline, d'un antibiotique, d'un réducteur du type thioglycolate de Na, de levure et de cystéine. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre dans des cupules de faibles dimensions renfermant les unes l'urée, les autres l'arginine déshydratée et,qu'après avoir introduit le liquide soumis à analyse, on réalise les conditions d'anaérobiose en recouvrant chaque cupule d'une substance huileuse inerte comme l'huile de paraffine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le choix des concentrations et l'étalonnage des réactifs pour la mise en oeuvre Ae ce procédé se font en dressant une courbe de correspondance en procédant à des numérations suivant les deux techniques usuelles rappelées précédemment.