Brevet FR2618160A1 — publié le 19890120

La présente invention concerne d'une manière générale les techniques enzymatiques utilisant la pro- priété de certaines enzymes simples comme la peroxydase de transformer un substrat incolore et soluble en un produit coloré, qui éventuellement précipite, permettant ainsi une visualisation rapide. Plus particulièrement, la présente invention concerne les techniques immunohistochimiques mettant en oeuvre une réaction immunologique, par exemple les techniques de dosages immunologiques, utilisant un mar- quage enzymatique. Pour ces marquages, des enzymes à haute acti- vité ont déjà été proposées, telles que la peroxydase du raifort, la glucose oxydase d'origine fongique, la B galactosidase d'origine bactérienne. Ces techniques requièrent l'utilisation de substrats spécifiques de ces enzymes qui donnent nais- sance, après action enzymatique, selon les cas: - à des dérivés insolubles, colorés ou opaques aux faisceaux d'électrons. Ces substrats sont utilisés en microscopies optique et électronique; - à des dérivés colorés solubles. La densité optique peut être mesurée par les techniques photométriques cou- rantes. D'une façon plus générale, toute action enzy- matique donnant naissance à un phénomène mesurable peut être utilisée. Plus précisément, la présente invention concerne les techniques enzymatiques utilisant la peroxydase, notamment la peroxydase du raifort. La méthode la plus fréquemment utilisée fait appel à des anticorps spécifiques marqués à la peroxy- dase, ceux-ci sont révélés dans les coupes destinées à la microscopie optique par addition de dérivés de la ben- zidine, notamment le tétrahydrochlorure de 3,3' diamino- benzidine qui, sous l'action de la peroxydase et en pré- sence d'eau oxygénée, vont donner naissance à des dépôts bruns sombres. Cette méthode est utilisée par exemple dans les dosages non compétitifs du type sandwich. Il suffit d'ajouter le révélateur chromogène et de stopper l'action enzymatique au moment o le contraste optimum est obtenu, c'est-à-dire de faire une mesure de la den- sité optique à la longueur d'onde optimale du chromo- gène. Plus la densité optique sera élevée, plus il y aura d'antigène. Les anticorps marqués à la peroxydase sont également particulièrement bien adaptés à l'utilisation en microscopie électronique. Le principe de ces tech- niques est le suivant: comme pour la technique précé- dente, le conjugué anticorps-peroxydase fixé sur les sites antigéniques est mis en présence de 3,3' diamino- benzidine et d'eau oxygénée, mais aussi de tétroxyde d'osmium. Le polymère oxydé de diaminobenzidine qui se forme a la propriété de former des chélates insolubles avec l'oxyde d'osmium, qui sont très denses aux élec- trons. C'est ce chélate qui, après les lavages, usuels, est mis en évidence en microscopie électronique. Dans la technologie des sondes nucléiques, la détection de ces sondes fait également appel à des systèmes enzymatiques tels que la phosphatase alcaline ou la peroxydase. De nombreuses techniques ont été déve- loppées. Elles sont fondées: - soit sur la détection indirecte de l'hybride par des systèmes utilisant des molécules intermédiaires ca- pables de reconnaître des motifs fixés sur la sonde nucléique. La reconnaissance est alors du type pro- téine-coenzyme ou anticorps-haptènes, ces molécules étant elles-mêmes couplées directement ou non.à des enzymes de visualisation; - - soit sur la détection directe de l'hybride par cou- place covalent d'une enzyme à la sonde. Il a par exemple été développé une procédure utilisant un analogue de base: le 5-bromodéoxyuridine (5-BdUr). Cet analogue est incorporé dans la sonde par la technique de déplacement de coupure (nick-translation). L'hybride est visualisé après reconnaissance du 5-BdUr par un anticorps monoclonal de souris anti-5-BdUr. L'anti- corps de souris est ensuite lui-même reconnu par un anticorps de mouton anti-souris couplé à la peroxydase et la visualisation proprement dite a lieu par trans- formation du substrat incolore en produit coloré par l'action de cette enzyme. De nombreuses techniques ont également été développés pour coupler directement, de manière cova- lente, la peroxydase à des acides nucléiques. Le poly- éthylèneimine par exemple a été utilisé pour coupler la peroxydase à l'ADN en présence de glutaraldéhyde. La présente invention a donc pour objet une technique enzymatique utilisant la révélation de la peroxydase par un chromogène consistant dans le DAB (tétrahydrochlorure de 3,3' diaminobenzidine). Plus particulièrement, la présente invention a pour objet des techniques immunologiques, notamment de dosages, mettant en oeuvre des anticorps marqués à la peroxydase et, comme révélateur chromogène, le tétra- hydrochlorure de 3,3' diaminobenzidine (DAB). La présente invention a également pour objet les techniques enzymatiques mettant en oeuvre des sondes d'acides nucléiques et un marquage à la peroxy- dase. La présente invention a donc naturellement pour objet une trousse de réactifs pour la mise en oeuvre d'une de ces techniques enzymatiques, notamment un "kit" de dosage et/ou diagnostique comportant du DAB. La présente invention a donc également pour objet des "kits" ou trousses de réactifs pour techniques immunologiques, notamment des dosages, comportant des anticorps marqués à la peroxydase et comportant notam- ment, comme réactif chromogène, du tétrahydrochlorure de 3,3' diaminobenzidine (DAB). La présente invention a également pour objet un "kit" de dosage et/ou diagnostique comportant une sonde d'acide nucléique marquée à la peroxydase, ainsi que du DAB. Ce révélateur chromogène est très efficace. Il constitue même un réactif idéal pour l'immunohistochi- mie impliquant les techniques immunoperoxydasiques, comme on l'a vu. Cependant, il présente l'inconvénient d'être très toxique sous forme de poudre. Le DAB est en effet considéré alors comme très hépatotoxique ou hépatocarcinogène. Les manipulations-de ce produit peuvent donc entraîner des risques de contamination et sont à éviter au maximum. Mais ce produit, lorsqu'il est livré en poudre, même congelé et conservé à 4 C, se dégrade rapidement. C'est pourquoi il est actuellement proposé, notamment dans les trousses immunohistochimiques, sous forme de poudre. Conservé dans cette présentation, le DAB offre alors une stabilité suffisante, pourvu qu'il soit conservé à 4 C. Toutefois, son utilisation nécessi- te une étape de manipulation dangereuse pour le remettre en solution et surtout pour le filtrer. Ce qui est indis- pensable lorsqu'il est présenté initialement sous forme de poudre, compte tenu des difficultés de solubilisation existantes. Le problème qui se pose avec le DAB n'a encore jamais été résolu et les kits actuellement proposés comportent du DAB très toxique présenté sous forme de poudre. Il a été envisagé de remplacer le DAB par une autre substance non toxique, mais les caractéristiques particulièrement avantageuses de celui-là n'ont jamais pu être retrouvées. Ainsi de nombreux kits utilisent le chromogène AEC, mais celui-ci donne un précipité moins important d'une part et d'autre part n'offre pas la possi- bilité de procéder à la déshydratation des lames contraire- ment au DAB. Il en résulte que les lames marquées au DAB se conservent plus longtemps. Le but de la présente invention est donc de trou- ver une présentation pour la conservation du DAB qui évite les manipulations dangereuses du produit lors de son utilisa- tion, tout en lui conférant une stabilité améliorée par rap- port à sa conservation en solution. On a découvert, selon la présente invention, qu'en conservant le DAB sous forme lyophilisée ces conditions étaient remplies, le produit étant en effet quasiment prêt à l'emploi sans manipulation dangereuse, notamment sans étape de filtration d'une part et conservant toutes ses propriétés chromogènes d'autre part. Selon la caractéristique essentielle de la pré- sente invention, le DAB est donc présenté et conservé sous forme lyophilisée, puis remis en solution en milieu aqueux our usage. * Le produit peut être remis facilement et rapide- ment en solution en milieu aqueux, tel que de l'eau distil- lée, par exemple au moyen d'une seringue et sans nécessité, notamment d'étapes de filtration ultérieure comme pour le DAB présenté sous forme de poudre. En outre, le produit, même conservé à température ambiante, présente une stabili- té suffisante pourvu qu'il soit conservé sous atmosphère d'azote ou d'un autre gaz inerte pour le préserver de tout risque d'oxydation au contact de l'air. Dans la pratique, conservée à 4 C, il présente une excellente stabilité. La présente invention a également pour objet un procédé de lyophilisation du DAB. D'autres caractéristiques et avantages de la pré- sente invention apparaîtront à la lumière d'un exemple de réalisation du procédé selon l'invention. La lyophilisation se fait à partir d'une solution de DAB dans une solution tampon Tris-Hcl 0,05 M à pH ajusté à 7,4 à raison de 0,5 mg/ml et sous atmosphère d'un gaz iner- te, tel que l'argon ou l'azote. Cette atmosphère inerte permet également d'éviter l'oxydation risquant de se produire au contact de l'air. mg de DAB (Grade II de chez SIGMA) sont dilués dans 10 ml d'un tampon Tris-Hcl 0,05 M, pH 7,4. Le pH est ajusté à 7,4. Le mélange est lyophilisé selon un procédé classique de lyophilisation en présence d'argon ou d'azote. Le DAB lyophilisé est conditionné dans des flacons prêts à l'emploi après reconstitution avec de l'eau distillée Les manipulations de ce produit toxique ne présentent plus les risques que l'on connaissait, et le produit stocké à 4 C est stable. REVENDICATIONS 1. Technique enzymatique utilisant la révélation de la peroxydase avec comme chromogène le DAB (tétrahydrochlorure de 3,3' diaminobenzidine), caractérisée en ce qu'on fait usage du DAB conservé sous forme lyophilisée que l'on remet en solution en milieu aqueux. 2. Technique enzymatique selon la revendi- cation 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une technique immunologique, notamment de dosages immunologiques mettant en oeuvre des anticorps marqués à la peroxydase. 3. Technique enzymatique selon l'une des reven- dications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une technique mettant en oeuvre des sondes d'acides nucléiques et un marquage à la peroxydase. 4. Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre d'une technique selon l'une des revendications 1 à 3, notamment un kit de dosage et/ou diagnostique, caracté- risée en ce qu'elle comporte du DAB présenté sous forme lyophilisée. 5. Procédé de lyophilisation du tétrahydro- chlorure de 3,3' diaminobenzidine (DAB) pour la mise en oeuvre d'une technique selon l'une des revendications précédentes.