Brevet FR2615395A1 — publié le 19881125

La présente invention a pour objet l'utilisation comme ingrédients actif s, dans la préparation de médicaments contre le paludisme, de dérivés pepti dlques comprenant une séquence constituant un substrat pour une protéase de Plasmodium falciparum. On sait que parmi les maladies humaines le paludisme reste l'infection la plus répandue dans le monde, et celle qui cause le plus de décès. Malgré de gros efforts d'éradication du paludisme dans la plupart des pays depuis 1950, on observe actuellement dans la plus grande partie des régions tropicales une recrudescence de la maladie, car de nombreuses souches sont devenues résistantes aux médicaments antipaludiques actuellement utilisés. En outre, la résistance aux drogues de la souche de Plasmodium la plus dangereuse pour l'homme, Plasmodium falciparum, est en augmentation. On estime que plus de 200 millions d'humains souffrent du paludisme, et qu'environ 1 million de morts par an lui sont imputables directement ou indirectement en Afrique. Chez la femelle infectée du moustique (Anophèle), le Plasmodium se développe dans les parois de 1' intestin puis migre dans les glandes salivaires sous la forme de sporozoites. Les sporozoites injectés par piqûre chez l'homme envahissent des cellules hépatiques, se multiplient et se développent en schizontes. Les schizontes donnent naissance par une série de mitoses à des milliers de mérozoites qui, libérés dans la circulation sanguine, envahissent les érythrocytes. Dans les érythrocytes, les parasites se transforment en trophozoites puis en schizontes. Enfin les schizontes se multiplient en mérozoites (6 à 24 chacun selon les espèces) qui sont libérés par rupture de l'érythrocyte parasité et qui vont infester à nouveau d'autres érythrocytes, recommençant un nouveau cycle érythrocytaire.D'autre part, la présence de gamétocytes dans le sang humain permet, lors du prélèvement sanguin par le moustique femelle, d'assurer la formation d'un zygote dans l'estomac de l'insecte. Le zygote se développe ensuite dans les parois de l'intestin pour donner des oocystes contenant des milliers de sporozoltes. Les sporozoites libérés par éclatement de l'otocyste migrent vers les glandes salivaires du moustique qui les inocule à un vertébré, puis le cycle biologique recommence. On sait que les accès fébriles caractéristiques de la phase endoérythrocytaire du paludisme humain correspondent à l'éclatement synchrone des globules rouges infestés par les schizontes du Plasmodium et à la libération des mérozoltes. Un nouveau cycle endoérythrocytaire peut alors être initié, ce qui confère un caractère périodique aux accès fébriles (fièvre tierce ou quarte selon les espèces de Plasmodium). L'invasion d'un globule rouge par un mérozolte est un mécanisme séquentiel complexe comprenant : 1) une étape de reconnaissance et d'attachement du mérozoIte au globule rouge et 2) une étape de pénétration du mérozolte. On sait que le mérozoite est une cellule polarisée. L'adhésion initiale au globule rouge peut se faire en tout point du parasite (Bannister et al., 1977. Bull. W.H.O. 55, 163-169). Par contre, la pénétration ne peut être initiée que si l'extrémité apicale du mérozolte est en contact avec la membrane érythrocytaire (Dvorak et al, (1975), Science, 187, 718-750). La pénétration du mérozoite dans le globule rouge met en jeu une cascade de réactions qui n'est pas complètement connue. On sait que les médicaments les plus utilisés dans cette infection, tels que la chloroquine, la quinine et la méfloquine, sont des schizontocides. Dans un premier temps, l'invention a consisté a isoler une protéase de Plasmodium falciparum (forme mérozoite) qui est localisée dans l'extrémité apicale du mérozoite et qui est impliquée dans l'invasion des érythrocytes pa le parasite, puisque des inhibiteurs de cette protéase permettent d'inhiber ce invasion, comme cela sera montré ci-apres. De tels inhibiteurs peuvent donc constituer un nouveau type de médicament contre le paludisme, capable de bloquer l'invasion des érythrocytes par Plasmodium falciparu. La nouvelle protéase de Plasmodium falciparum est caractérisée par le fait - qu'elle est localisée dans les mérozoltes - qu'elle a une masse moléculaire d'environ 68 000 mesurée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en plaque en présence de 2% de dodécy sulfate de sodium, et d'environ 70 000 mesurée par tamisage moléculaire sur gel d'agarose;; - qu'elle a un point isoélectrique acide, inférieur à S - qu'elle a une activité d'endopeptidase et hydrolyse les substrats peptidiques contenant les séquences -TLCK-X, -VLGK-X, -SGK-X, -IVGK-X, -IVGR- et -VLGR-X , dans lesquelles X est le reste d'une molécule aminée formant unz liaison amide avec le groupement carboxylique de l'acide aminé C-terminal auquel il est lié, en libérant l'amine ItB correspondante ;; - que son activité d'endopeptidase est maximum à un pH compris entr 7 et 8 - et que son activité d'endopeptidase est pratiquement totalement inhibée par la présence de ZnCl2 ou HgCl2 ImM, et est inhibée à plus de 90Z par la leupeptine lmS, l'antipalne 0,5mM et le PCMB 1mM. Le PCMB est le p-hydroxy mercuribenzoate. En outre, cette protéase hydrolyse selon un ordre préférentiel décroissant, les substrats peptidiques -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X et -VLGR-X, X étant défini comme précédemment. On rappelle que selon la nomenclature admise pour les acides aminés: G désigne la glycine I désigne l'isoleucine K désigne la lysine L désigne la leucine R désigne l'arginine S désigne la sérine T désigne la thréonine et V désigne la valine, Les abréviations utilisées pour les acides aminés sont conformes aux règles de nomenclature de la commission de l'IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37). La protéase définie ci-dessus peut être isole et purifiée par un procédé principalement caractérisé par le fait que l'on réalise, selon les méthodes connues, une culture synchrone in vitro de Plasmodium falciparum, en présence d'érythrocytes, jusqu'au stade schizonte mature ou jusqutau stade mérozoite libre, que, dans le premier cas, on procède à une lyse des érythrocytes à l'aide d'un tensio-actif et recueille les parasites, selon les méthodes connues, que, dans le second cas, on isole les parasites selon les méthodes connues, que dans tous les cas, on procède à une lyse des parasites recueillis, selon les méthodes connues, que l'on élimine les débris cellulaires insolubles, que l'on fractionne les protéines du lysat et isole les fractions capables d'hydrolyser un substrat peptidique contenant la séquence -TLCK-, -VLGK-, -SGK-, -IVGK-, -IVGR- ou -VLGR- , ledit substrat peptidique ayant ses extrémités C-terminale et N-terminale protégés, sous forme d'amide, avec respectivement un groupement amine et un groupement acyle. Les deux modes de réalisation des cultures in vitro de Plasmodium falciparum sont illustrés ci-après respectivement dans les exemples 1 et 2 de la partie expérimentale. Le stade schizonte mature est le stade précédant immédiatement la libération des mérozoites par éclatement des érythrocytes. Pour lyser les érythrocytes, on utilise par exemple un détergent non ionique tel que la saponine. Pour lyser les mérozoltes, on peut utiliser la pression osmotique, en disposant les parasites dans l'eau ou dans un tampon aqueux de faible force ionique. Les méthodes de fractionnement utilisées peuvent comprendre toute méthode connue de fractionnement des protéines, comme par exemple la chromatofocalisation, la filtration sur gel, l'ultracentrifugation, le relargage par les sels neutres, la précipitation fractionnée à l'aide d'un agent précipitant usuel, la chromatographie sur matrice échangeuse d'ions, la chromatographie d'affinité, etc..... Le principe de l'utilisation de ces méthodes de fractionnement des protéines est connu et ne sera pas rappelé ici. La chromatofocalisation peut être effectuée soit en veine liquide, soit sur gel, selon les techniques connues. Les matrices échangeuses d'ions sont par exemple des celluloses modifiées ou des gels de polyacrylamide ou de dextrane réticulés, contenant des groupements diéthylaminoéthyles ou carboxyméthyles. Pour purifier la protéase de l'invention par chromatographie d'affinité, on utilise un support classique inerte sur lequel on fixe par covalence selon les méthodes connues des anticorps dirigés contre ladite protéase. Pour concentrer la protéase obtenue on peut utiliser, outre les techniques de précipitation, les techniques d'ultrafiltration ou de lyophilisation. Pour tester l'activité d'endopeptidase sur les substrats mentionnée ci-dessus, on utilise les méthodes connues, par exemple celle décrite par M. Monsigny et al., the EMBO Journal, Vol.1, n03, pp.303-306 (1982) On sélectionne les substrats peptidiques pour la protéase par le prc cédé suivant : On prépare un dérivé fluorogénique ou chromogénique du substra étudié, selon les méthodes connues, on fait incuber ledit dérivé avec la prot on évalue l'hydrolyse éventuelle du substrat et l'on sélectionne les substrat. spécifiquement hydrolysés par la protéase. Les dérivés fluorogéniques ou chromogéniques utilisables sont des substrats peptidiques dont la séquence est spécifique de la protéase (tels qt ceux mentionnés précédemment) et dont le groupement C-terminal est amidé pa un chromophore ou un fluorophore aminé tel que par exemple, la p-nitroaniline la 4-méthoxy-2-naphtylamine, la 7-amino-4-méthyl coumarine, l'alpha-naphtylamine, la beta-naphtylamine, le 3-amino-9-éthyl carbazole (AEC), l'indolylamine, etc...., ou estérifié par un alpha-ou beta-naphtol te que par exemple la 2-hydroxy aniline, l'acide 3-hydroxy-2-naphtorque, etc.... Ces dérivés peptidiques peuvent avoir leur groupement N-terminal substitué par un groupement acyle (par exemple acétyle, benzoyle, t-butyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, glutaryle, succinyle ou tosyle). L groupement N-terminal peut aussi être substitué par un groupement acyle dérivé d'un acide polyhydroxyalkanoique, comme décrit dans la demande de brevet français n 83.08051, cette substitution par un dérivé polyhydroxyalkanoyle présentant le double avantage de permettre une très bonne solubilisation du dérivé peptidique dans l'eau et d'empêcher sa dégradation par les aminopeptidases. Les substrats pour la protéase décrite ci-dessus sont en particulier les dérivés contenant les séquences peptidiques TLGK, IVCK, IVGR, VLGK, SGK et VLGR. - L'invention a pour objet l'utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, de dérivés peptidiques de formule générale I R1 - P1 - P2 - R2 (I) sous forme libre ou salifiée, dans laquelle P1 est un reste peptidique choisi parmi -TLG, -IVG, -VLC et SGou leurs analogues N-méthylés ou de configuration D, ledit peptide étant lié au substituant R1 par son extrémité N-terminale, R1 représente -H ou un groupement protecteur classique du groupement N-terminal d'un peptide, ou un groupement hydrosolubilisant, ou encore le reste d'un acide aminé de configuration D, P2 est un reste d'acide aminé de formule:: - H - CH - Y - CO dans laquelle Y1 est- une liaison covalente ou un alkylène ayant 1 ou 2 atomes de carbone éventuellement substitué par un hydroxyle, Y2 est un alkylène ayant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un hydroxyle, p = O ou 1, X est un groupement p-phénylène, et R3 représente alors un groupement ou bien X représente - S - et R3 représente alors un groupement aminoalkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, R2 représente - OH, le reste d'un acide aminé de configuration D, le reste d'un acide aminé N-méthylé ou le reste d'une drogue antipaludique aminée formant avec l'extrémité C-terminale de P2 une liaison amide, X1 étant un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, X2 représentant -H ou un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, étant entendu que - lorsque R1 représente -H, l'acide aminé de l'extrémité N-terminale de P1 a la configuration D, - et lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé correspondant au reste P2 est de configuration D. Parmi les composés de formule I, on citera en particulier ceux pour lesquels R1 est un groupement acyle, en particulier un groupement t-butyloxycarbonyle, acétyle, succinyle, glutaryle, ou un groupement hydrosolubilisant polyhydroxyalcanoyle tel que galactanoyle, gluconoyle, ribonoyle, érythronoyle, thréorroyle, arabinoyle, xylonoyle, glucoheptonoyle ou glycooctonoyle, ces derniers dérivés pouvant être obtenus comme décrit dans la demande de brevet français nô83.08051 ; ou bien R1 peut représenter un reste acyle lié à une macromolécule polyhydroxylée contenant par exemple des motif s: dans lesquels Z1 est un groupement hydrocarboné ayant 1 à 8 atomes de carbone, et Z2 et Z3 sont des groupements hydrocarbonés ayant 1 à 4 atomes de carbone, ces derniers composés pouvant être obtenus comme décrit dans la demande de brevet français 85.08648. Dans la formule I, P2 peut représenter notamment le reste de la lysine, la delta-hydroxylysine, l'arginine, l'ornithine, la p-guanidino phénylalanine, la p-guanidino phénylglycine, la p-amidino phénylalanine, ou l'aminoéthylcystéine ; lorsque X1 et X2 représentent un groupement aliphatique (cas où R2 représente -NX1X2), il s'agit notamment d'un groupement alkyle (éventuellement hydroxylé) ayant 1 à 4 atomes de carbone ; lorsque R2 représente le reste d'une drogue antipaludique, il s'agit par exemple de la mépacrine, de la primaquine, de la pyriméthamine, de la sulfadoxine, de l'amino-2 butanol-1, de l'amino-2 propanediol-1,3, etc... Les produits de formule I peuvent être préparés selon les méthodes usuelles de préparation des dérivés peptidiques et/ou selon les méthodes décrites dans ces brevets français 83.08051 et 85.08648. Les peptides utilisés dans la préparation des composés de formule I peuvent être soit des peptides commerciaux, soit des peptides que lton synthétise selon les méthodes classiques de la synthèse peptidique. Dans les composés de formule I, lorsque R1 représente -H, l'acide aminé N-terminal du peptide P1 est de configuration D, de façon à empêcher la dégradation dudit peptide par les aminopeptidases Il en va de même lorsque R1 représente un acide aminé de configuration D. Lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé C-terminal (P2) est de configuration D. Les composés de formule I correspondants, grâce à leur affinité pour la protéase de l'invention, agissent alors comme des inhibiteurs de ladite protéase, et inhibent en conséquence l'invasion des érythrocytes par les mérozoltes. En outre, la dégradation par les carboxypeptidases est évitée. Lorsque R2 est le reste d'un acide aminé de configuration D, la dégradation des composés de formule I par les carboxypeptidases est évitée. Lorsque R2 est le reste d'un acide aminé N-méthylé, cela empêche la coupure des composés I par la protéase de l'invention. Les composés I correspondants sont donc des inhibiteurs de ladite protéase, et l'acide aminé correspondant à R2 est alors de préférence un acide aminé aromatique (tyrosine, phénylalanine, tryptophane), ce qui permet d'augmenter l'affinité du composé I pour la protéase. Si un des acides aminés du peptide P1 est soit N-méthylé, soit de configuration D, la coupure de la liaison de cet acide aminé avec l'acide aminé voisin par une enzyme spécifique est empêchee, et la dégradation du composé de formule i est ainsi évitée. Les composés de formule I pour lesquels -R2 représente une drogue amine libéreront la drogue par hydrolyse au voisinage des parasites. On a en outre découvert que les composés de formule I pour lesquels R représente le reste d'une amine telle que l'éthylamine ou la diéthylamine libèrent de façon analogue, sous l'action de la protéase de l'invention, cette amine qui a une action toxique vis-à-vis du parasite. Bien entendu, dans les composés de formule I pour lesquels R2 représente -NX1X2 ou le reste d'une drogue antipaludique aminée, l'acide aminé P2 a la configuration L, de façon à permettre la libération de l'amine R2-H par l'action de ladite protéase des mérozoStes. Les composés de formule I, autres que ceux pour lesquels R2 représente -NXlX2 ou le reste d'une drogue antipaludique, inhibent l'endopeptidase de l'invention et empêchent ainsi l'invasion des globules rouges. Les médicaments à base de dérivés de formule I peuvent être utilisés comme médicaments anti-paludiques, soit à titre préventif, soit à titre curatif. Comme indiqué ci-dessus, ils ont soit la propriété de bloquer l'invasion des érythrocytes par les mérozoltes, soit la propriété de libérer une drogue toxique pour le parasite. Ces médicaments sont utilisés de préférence par voie parentérale, orale ou nasale. A cet effet, ils se présentent notamment sous la forme de solutions, de suspensions ou de poudres lyophilisées permettant de reconstituer des solutions ou suspensions, de comprimés, de comprimés enrobés, etc... La posologie, chez l'adulte, est généralement comprise entre 50mg et 1,5g par jour. L'invention a également pour objet l'utilisation des dérivés peptidiques de formule I comme ingrédients actifs dans la préparation d'un médicament anti-paludique. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 Purification de l'endopeptidase de Plasmodium falciparum On utilise comme produit de départ une culture de Plasmodium falciparum réalisée in vitro dans un milieu contenant des érythrocytes. La souche FCR-3/Gambia (ATCC ne30932) est cultivée selon Trager et Jensen (Science (Wash D.C.), 1976, 193, 673-675) avec du milieu dérivé de ZolE et al (J.Parasitol, 1982, 68, 1072-1080) en atmosphère 3% CO2, 6% 021 91% N2 La culture s'effectue à un hématocrite de 4% en présence de 5X de sérum humaiT + + (A ou O ). Le milieu est remplacé quotidiennement et le repiquage des cultures par de nouveaux globules rouges sains est nécessaire à partir d'un taux de parasitémie de 5 à 8%. Le développement des parasites est synchronisé par un premier traitement au sorbitol selon Lambros et Vanderberg (J. Parasitol, 1979, 65, 418-420) qui sélectionne les globules rouges avec les parasites au stade anneau. Après une remise en culture de 12 heures, les globules sont traités pendant 18 heures par de l'aphidicoline (0,75 pg/ml) selon Inselburg et Banya (Exp.Parasitol, 1984, 57, 48-54). Après ce second traitement, les globules rouges sont remis en culture dans un milieu normal (ctest-à-dire sans sorbito ni aphidicoline) jusqu a la maturation des stades schizontes (contenant les mérozoItes avant leur libération dans le milieu de culture). Les parasites sont alors concentrés sur gradient de Percoll selon Rivadeneira et al. J.Protozool, 1983, 30, 367-370) : 1 volume de globules rouges parasités à 50: d'hématocrite avec du PBS est mélangé avec 10 volumes de Percoll isotonique, puis ltensemble est centrifugé à 26.000 g pendant 30 min. à 40C. Les globule rouges parasités au stade schizonte sont recueillis dans la partie supérieur du gradient. Après lavage des globules rouges en milieu PBS, on procède à une lyse des globules rouges avec une solution de saponine à 0,2% dans du tampon PBS, pendant 20 minutes, à 370C. On sépare par-centrifugation à 600g pendant 7 minutes les débris cellulaires, on lave 5 fois la fraction "parasites" avec du tampon PBS à 4"C. On procède à une lyse des parasites à l'aide d'un tampon phosphate 5 mM, pH 7,5, à 4 C, pendant 30 minutes. On centrifuge le lysat à 4"C pendant 30 minutes à 100.000g. Le surnageant est concentré par ultrafiltration sur membrane (Centriflo, Amicon, CF 25). On purifie l'endopeptidase par FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) avec un appareil Pharmacia, Fine Chemicals. Le lysat concentré est déposé sur une colonne de chromatofocalisation, ("Mono P" HR 5/20 Pharmacia), équilibrée avec un tampon Tris/HCl 25 mM, pH 6,3. On élue au moyen d'un gradient linéaire de pH 6,3 à 4,0 réalisé à l'aide de "Polybuffer 74" (Phamacia) dilué au l/lOème avec un débit de 0,5 ml/min. On teste les fractions recueillies à l'aide de substrat GlcA-VLGK-AEC (GîcA désignant un groupement gluconoyle et AEC désignant l'amino-3-éthyl-9 carbazole), selon la méthode décrite par M. MONSIGEY et al, the EMBO Journal, vomi.1, n"3, pp.303-306 (1982). On rassemble les fractions capables d'hydrolyser ce substrat et les soumet à une opération de gel-filtration sur colonne "Superpose 12" (Pharmacia) 30 cm x 1 cm équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 25mM, pH 7,5, avec un débit de 0,3ml/min. Cette étape permet d'éliminer le tampon utilisé précédemment. Les fractions recueillies sont à nouveau testées sur le substrat GlcA-VLGK-AEC, comme précédemment. L'expérience montre que la fraction principale, qui contient la protéine de l'invention, hydrolyse bien ce substrat. Détermination de la masse moléculaire On effectue cette détermination par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en plaques (SDS-PAGE) selon la méthode décrite par LAEHMLI, Nature (dondon) 227, 680-685 (1970). Les échantillons sont préalablement dissociés dans 2Z de dodécylsulfate de sodium et 2% de beta-mercaptoéthanol, à 1Ô00C, pendant 5 minutes. Après migration électrophorétique (160 Volts, lu30) les protéines sont colorées à l'argent selon le procédé de Merril et al., Science (Washington) 211, 1437-1438 (1981). Cette détermination permet de montrer l'existence d'une seule bande ayant une masse moléculaire de 68000. Par tamisage moléculaire en FPLC, la masse moléculaire est d'environ 70000. Point isoélectrique Par chromatofocalisation sur colonne "Mono P (Pharmacia)", on trouve un point isoélectrique de 4,3 - 4,4. pH optimal La fraction de protéase a été incubée pendant 30 minutes à 37"C avec des substrats fluorogéniques spécifiques contenus soit dans un tampon O,lM citrate de sodium (pH 3,0-7,0), soit dans des tampons Tris-HCl (pH 7,0-9,5). On révèle l'activité enzymatique par dosage à l'aide du composé GlcA-VLGK-AEC (4.10 M). On constate que le pH optimal se situe dans la zone de pH physiologique (entre 7 et 7,5 environ). Inhibiteurs On a recherché l'action de divers inhibiteurs de la protéase, le degré d'hydrolyse étant ici encore évalué par dosage avec le substrat GlcA-VLGK-AEC. Les résultats sont résumés dans le Tableau suivant Inhibiteurs Concentration % activite résultante par rapport au témoin Témoin ~ 100 ZnCl2 1 mM 2 HgC12 1 mM O PCMB 1 mM 7 Leupeptine 1 mM 6 AntipaIne 0,5 mM 7 lodoacétamide 3 mM 2 Aprotinine 1 mM 50 EDTA 5 mM 72 PMSF 1 mM 98 PMSF = fluorure de phényl méthyl sulfonyle Substrats Une étude comparative sur une même fraction purifiée de la protéase montre que les substrats sont hydrolysés selon l'ordre préférentiel décroissant suivant 1) GlcA-TLGK-AEC 2) GlcA-VLGK-AEC 3) GlcA-SGK-AEC 4) GlcA-VLGR-AEC EXEMPLE 2 Localisation de l'endopeptidase de P.falciparum. Obtention d'anticorps. Cette localisation a été effectuée par 2 méthodes complémentaires a) dosage de l'activité sur des mérozoites viables isolés L'isolement des mérozoïtes a été effectué à partir de cultures synchronisées selon la méthode décrite par Hrema et al, Exp. Parasitol., 54, 285-295 (1982), de la souche FCR-3/Gambia. Au départ de la culture de P.falciparum synchronisée sur 6 heures (3% d'hématocrite) on laisse évoluer la parasitémie jusqu'à 1-5A. 12 heures avant la libération des mérozoltes, on concentre les parasites et les remet en culture (0,3% dthématocrite). Après le début de libération des mérozoites, on effectue une centrifugation. Les mérozoites sont recueillis avec le surnageant, alors que le culot de centrifugation contient des schizontes non libérés qui peuvent être remis en culture. Le surnageant est filtré sur membranes GELMAN Versapor 3um, qui retiennent les schizontes, puis sur membrane 1,opm laissant passer les mérozoltes. Après filtration, les mérozoltes sont concentrés par centrifugation. On obtient un culot de mérozovtes purifiés que lton soumet à une lyse avec un tampon phosphate 5mM pendant 30 minutes à 40C.Après centrifugation, le surnageant de lyse des mérozoites purifié est soumis à une chromatofocalisation sur colonne "Mono P" comme décrit précédemment. L'activité d'endopeptidase vis-à-vis de GlcA-VLGK-AEC est détectée dans la fraction correspondant au point isoélectrique 4,3 - 4,4. b) Localisation par immunochimie La solution de protéase préparée ci-dessus a été injectée à des souris Balb/c de la façon suivante : une première injection intrapéritonéale de 400p1 d'un mélange contenant 200 pl d'adjuvant de Freund complet (Biomérieux, France), 100 pl d'Alugel (Serva, RFA) et 100 pl d'une solution de protéase issue de chromatofocalisation (10-pg/100 pl PBS) est réalisée ; puis deux autres injections identiques mais avec de l'adjuvant de Freund incomplet sont effectuées à 15 jours d'intervalle.Une semaine après la 3ème injection, on recueille le sang des souris immunisées pour tester le sérum soit par ELISA sur une solution de protéase (purifiée par chromatofocalisation) soit par immunochimie. L'antisérum qui contient des anticorps dirigés contre la protéase de Plasmodium falciparum, est contrôlé après électrophorèse par transfert de l'antigène sur feuille de nitrocellulose, incubation avec l'antisérum et révélation des anticorps fixés selon la méthode de Western blotting décrite par Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 76, 4350-4354 (1979). La révélation des anticorps fixés est effectuée à l'aide d'immunoglobulines de chèvre (dirigées contre des immunoglobulines de souris) couplées à la peroxydase. La révélation de l'activité peroxydasique est effectuée en présence de 4-chloro-V-naphtol dans un mélange tampon Tris-NaCî-H2O2 -méthanol. Par itmunoblotting, î'antisérum préparé marque de manière intense une bande de masse moléculaire 68000 correspondant à la protéase de l'invention. Localisation cytologique par immunofluorescence indirecte Sur des frottis de globules rouges parasités par P. falciparum, fixés au métharol/acétone, incubés avec l'antisérum préparé ci-dessus, on révèle la présence des anticorps fixés à l'aide d'anticorps anti-(immunoglobulines de souris) marqués à la fluorescéine. On observe un marquage ponctiforme des mérozoites, correspondant à la localisation de l'endopeptidasè dans des organites cytoplasmiques. La visualisation des mérozoites est effectuée par l'utilisation du colorant Noechst 33258, qui est un marqueur de l'ADN. EXEMPLE 3 Inhibition de la ré invasion des hématies humaines par Plasmodium falciparum en présence de GlcA-VLGK-NEEt On réalise une culture in vitro de Plasmodium falciparum, souche FCR-3/Gambia, dans le milieu RPMI 1640/TES/5% serum + selon la méthode de Zolg et al, J.Parasitol., 68, 1072-1080 (1982). L'hématocrite est de 4Z. L'isolement des trophozortes âgés et schizontes est effectué par centrifugation sur Percoll (Pharmacia) 72% (2.000 t/min., 37"C). On remet en culture les globules parasités en présence de globules rouges sains (4Z hematocrite) : a) soit dans le milieu normal témoin (qui ne contient pas de peptid inhibiteur). b) soit dans le milieu contenant GlcA-VLGK-NHEt 1OmM. Après une incubation de 6 ou 20 heures à 37"C, les frottis sont fixés au méthanol et colorés au Giemsa. Résultats : - témoins : les parasites se sont développés normalement et se présentent sous la forme anneaux et trophozoites jeunes ; - traités : la majorité (plus de 80Z) des mérozoltes nta pas pénétré; on les retrouve à la surface des globules rouges. Des résultats comparables sont obtenus avec des cultures de Plasmodium falciparum, souche Uganda/Palo-Alto (David P.H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), Vol 81, 5075-5079). EXEMPLE 4 Synthèse de GlcA-VLGK-NHEt, HCl Dans cet exemple, on utilise les abréviations suivantes conformes aux règles de nomenclature de L'IUPAC-IUB (Eur.J.Biochem., 1984, 138, (9-37) - Nps : o-nitrophénylsulfényle - OBzl : ester benzylique - DCHA : dicyclohexylamine - DCCI : dicyclohexylcabodiimide - DCHU : dicyclohexylurée - Boc : t-butyloxycarbonyle - TEA : triéthylamine - DMF : diméthylformamide - Lys(Z) : lysine avec epsilon-NH2 protégé-par un benzyloxycarbonyle - HOBt : l-hydroxybenzotriazole - Et : éthyle - GlcA : gluconoyle Produits de départ Les composés Nps-L-Lys(Z)-OH, DCHA, et Nps-L-Leu-OH, DCHA ont été préparés respectivement à partir de N epsilon-Z-L-Lysine et de L-Leucine selon la méthode décrite par L. Zervas, D.Borovas et E. Gazis, J.Am.Chem.Soc., 1963, 85,3660-3666. Les dérivés Nps-L-Lys(Z)-NHEt et HCl,H-L-Lys(Z)-NHEt ont été synthétisés d'après la méthode de R. Mayer, A. Caille et G. Spach, Biopolymers, 1978, 17, 325-336. Les dérives Boc-L-Val-OH, DCHA et Boc-L-Ser(Bzl)-OH, DCHA ont été préparés selon la méthode de M. Itoh, D. Hagivara et T. Kamiya, Tetrahedron Lett., 1975, 4393-4394. Le composé HCl, H-Gly-OBzl a été synthétisé selon le procédé de B.F. Erlanger et E. Brand, J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 3508-3510. Le composé H-Arg-NHEt, 2 HCl a été synthétisé d'après une méthode dérivant de celle décrite pour le H-Lys(Z)-NHEt, HCl. Le composé GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-AEC a été préparé selon la méthode décrite dans la demande de brevet français n 83.08051 Sauf indication contraire, les acides aminés ont la configuration L. a)Nps-Leu-Gly-OBz1 9,3g (0,02M) de Nps-Leu-OH,DCHA sont dissous dans 200ml d'acétate d'éthyle et couplés à 4,03g (0,02M) de HCl,H-Gly-OBzl en présence de 4,4g (0,022M) DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure à -100C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après lavages avec une solution aqueuse de NaHC03 à 5%, à S04HK HR 5%, puis avec 3 SO4HK de l'eau, la phase organique est séchée sur du sulfate de sodium. L'acétate d'éthyle est ensuite évaporé. L'huile obtenue est séchée sous vide. On obtient 7,75g (rendement 90%) Rf=0,85 dans le système CHCl3/CH3OH (8/1) b) HCl ,H-Leu-Cly-OBzl L'huile précédente est dissoute dans 150ml de mélange acétone/éther (/2). On ajoute 12ml d'une solution HCl/éther (4,3N) et l'on agite 20minutes. La solution est ensuite précipitée dans l'éther de pétrole. On obtient 5,20g d'huile (rendement 92%). c) BOC-Val-Leu-Gly-OBzl 4,92g (0,012M) de Boc-Val-OH, DCHA sont dissous dans 110ml de chloroforme et couplés à 3,89g (0,012M) de HCl,H-Leu-Gly-OBzl en présence de 2,8g (0,0132M) DDCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures à -10 C et une nuit à température ambiante. L'insoluble est éliminé par filtration. Après des lavages à WaHC03 5Z, à SO4HK 5%, puis à l'eau, la phase organique est séchée sur du sulfate de sodium. Le chloroforme est ensuite évaporé. On redissout dans l'acétate d'éthyle. La DCHU est éliminée par filtration. Après évaporation de l'acétate d'éthyle, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/CH3OH (10/1). On obtient 3,3g (rendement 56Z) F = 65 - 68 C [&alpha;]25546 Rf=0.65 dans le système CHCl3/CH3OG (10/1) Rf=0,65 dans le système CHCl3/CH3OH (10/1) Les spectres UV et IR sont conformes à la formule du titre. d) HCl, H-Val-Leu-Gly-OBzl 3,3g (7mM) de BOC-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 9ml d'acide acétique. On ajoute 26ml d'une solution HCI/CH3COOH (1,34N) et l'on agite 20 minutes à température ambiante. On évapore à sec pour redissoudre dans 25ml de dichlorométhane. La solution est ensuite précipitée dans un mélange éther éthyliqueléther de pétrole (1/1). Le précipité obtenu est lavé abondamment à l'éther et séché. On obtient 2,7g (rendement 95%) F : 100 - 1070C [&alpha;]25546 =-30,2 (c=1, CHCl3) Rf=0,80 dans le système CHCl3/CH3OH/H20 (8/3/0,2) Dosage argentimétrique : 99% Les spectres UV et IR sont conformes à la formule du titre. e) GlcA-Val-Leu-Gly-OBzl 2,7g (6,53mM) de HCl,H-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 11ml de mélange DMF/H20 (10/1) et couplés à 3,5g (19,6mM) de delta-gluconolactone en présence de 2,74ml (19,6mM) de TEA. Le mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à 500C. On refroidit la solution. Le sel de triéthylamine formé est éliminé par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/CH3OH/H2O (8/3/0,2). On obtient 1,34g (rendement 37Z) F : 100 - 105 C 25 [&alpha;]546=-24,4 (c = 1,CH3OH) Rf=0,55 dans le système CHCl3/CH3OH/H2O (8/3/0,2) Les spectres W et IR sont conformes à la formule du titre. f) GlcA-Val-Leu-Gly-OH 1,34 (2,4mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 20ml de mélange CH3OH/H2O (3/1) et hydrogénolysés en présence de 300mg de palladium sur charbon actif (10% Pd) pendant 6 heures à température ambiante et sous agitation magnétique. Le noir est éliminé par filtration. Après évaporation du méthanol, la solution aqueuse finale est lyophilisée. On obtient 1,05g (rendement 94x) F = 85 - 900C [&alpha;]25 546=-15,7 (c=1,CH30H) Rf=0,52 dans le système CHCl3/CH30H/H2O (6/6/1) Les spectres IR et RMN sont conformes à la formule du titre. g) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-NHEt 0,72g (2,1!) de HCl, H-Lys(Z)-NHEt sont dissous dans 10ml de DMF et couplés à 0,97g (2,1mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OH en présence de 0,29 ml (2,1mM) de TEA, de 0,32g (2,1mM) de HOBt monohydrate et de 0,47g (2,3mM) de DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures à -100C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption sur une première colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/MeOH (4/t) puis sur une seconde colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/MeOH/H20 (8/3/0,2). On obtient 0,78g (rendement 57%), F : 145-146 C, Rf = 0,13 dans le système CHCl3/MeOH/H20 (8/3/0,2). Les spectres IR et RMN sont conformes à la formule du titre. h) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NHEt, HC1 O,75g (1mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-WHEt sont dissous dans 10ml de mélange CH3OH/H2O/HCl(1N) (18/5/1,1, v/v) et hydrogénolysés en présence de 200mg de palladium sur charbon actif (10% Pd) pendant 3 heures à température ambiante et sous agitation magnétique. Le catalyseur est alors éliminé par filtration. Après évaporation du méthanol, la solution aqueuse est lyophilisée. On obtient- 630mg (rendement 96%), F=129-1300C ; Rf 0,13 dans le système CHCl3/MeOH/H2O(8/3/0,2). Le spectre RMN à 300 MHz est conforme à la formule du titre. EXEMPLE 5 Synthèse de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-N(Et)2, HCl a) Nps-Lys(Z)-N(Et)2 4,34g (10 2M) de Nps-Lys(Z)-OH sont dissous dans 10ml de DMF et couplés à 2,07 ml (2.10 M) de diéthylamine en présence de 1,53g (10 M) de -2 HOBt monohydrate et de 2,2g (1,1.10 M) de DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures à -10 C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est filtrée. Après évaporation du DMF, le résidu obtenu est purifié par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec mélange-CHCl3/MeOH (8/1). On obtient 4,5g (rendement 92%) d'une huile homogène en chromatographie sur plaque :Rf = 0,88 dans le système CHC13/MeOH (8/1). Les spectres UV, IR et RMN sont conformes à la formule du titre. b) HCl, H-Lys(Z)-N(Et)2 L'huile précédente est dissoute dans 70ml d'un mélange acétone/éther (3/4). On ajoute 4,7ml d'une solution HCl/éther (4,5 N ; 2,3 eq) et lon agite pendant 20 minutes. Après évaporation à sec, l'huile obtenue est purifie par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/MeCH (4/1). Après évaporation du solvant le produit purifié est repris par un minimum d'acétone, acidifié par HCl/éther et précipité dans l'éther. L'huile obtenue cristallise après séchage intensif. On obtient 2,91g (rendement 85Z) d'un composé très hygroscopique homogène en chromatographie sur plaque : Rf=0,56 dans le système CHCl3/MeOH (411). c) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys (Z)-N(Et)2 0,78 g (2,1mM) de HCl, H-Lys(Z)-N(Et)2 sont dissous dans 10ml de DMF et couplés à 0,97 g (2,lmM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OH décrit précédemment (exemple If) en présence de 0,29ml (2,lmM) de TEA, de O,32g (2,1mM) de HOBt monohydrate et de 0,47 g (2,3mM) de DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures à -1C C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/bteOH (4/1). On obtient à 0,85g (rendement 52%), F =80-82 C Rf = 0,53 dans le système CHCl3/MeOH (4/1). Les spectres UV, IR et RMN sont conformes à la formule du titre. d) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-N(Et)2 HC1 0,78g (1mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-N(Et)2 sont dissous dans un mélange CH3OH/H20/HCl(IN) (18/5/1, v/v) et hydrogénolysés en présence de 300mg de palladium sur charbon actif (lO%Pd) pendant 3 heures à température ambiante et sous agitation magnétique. Le catalyseur est ensuite éliminé par filtration, le méthanol est évaporé et la solution aqueuse finale est lyophilisée. On obtient 0,63g (rendement 92Z), F =112-114 C. Rf 0,30 dans'le système CHCl3/Me0H/H2O (8/4/0,5). Les spectres IR et RMN à 300MHz sont conformes à la formule du titre. EXEMPLE 6 GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-NHEt, HCl Ce composé est synthétisé par couplage du GlcA-Val-Leu-Gly-OH avec H-Arg-NHEt, HCl dans des conditions analogues à celles de l'exemple 4. EXEMPLE 7 GlcA-Ser-Gly-Lys-NHEt, HCl Ce composé est préparé de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. EXEMPLE 8 GlcA-Ser-Gly-Lys-N(Et),HCl Ce composé est préparé de façon analogue à celle décrite à l'exemple 5. EXEMPLE 9 GlcA-Val-Leu-Gly-D-Lys-OH Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-D-Lys(Z)-OBzl de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4, puis hydrogénolyse du composé forme. EXEMPLE 10 GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-CH,C1, HCl Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-CH2Cl, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. EXEMPLE 11 GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH (CH2OH) -C 2H5 Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-NH-CH(CH2OH)-C2H5, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. EXEMPLE 12 GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH(CHnOH) Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-NH-CH(CH2OH)2, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. REVENDICATIONS 1 . Utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, des composés de formule I R1 - P1 - P2 - R2 (I) sous forme libre ou salifiée, dans laquelle P1 est un reste peptidique choisi parmi -TLC-, -IVO, -VLG- et SGou leurs analogues N-méthylés ou de configuration D, ledit peptide étant lié au substituant R1 par son extrémité N-terminale, R1 représente -H ou un groupement protecteur classique du groupement N-terminal d'un peptide, ou un groupement hydrosolubilisant, eu encore le reste d'un acide aminé de configuration D, P2 est un reste d'acide aminé de formule :: dans laquelle Y1 est une liaison covalente ou un alkylène ayant I ou 2 atomes de carbone éventuellement substitué par ur. hydroxyle, Y2 est un alkylène ayant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un hydroxyle, p = O ou 1, X est un groupement p-phénylène, et RR représente alors un groupement ou bien X représente - S - et R3 représente alors un groupement aminoalkyle ayant I à 6 atomes de carbone, R2 représente - OH, -CH2Cl, le reste d'un acide aminé de configuration D, le reste d'un acide aminé N-méthylé ou le reste d'une drogue antipaludique aminée formant avec l'extrémité C-terminale de P2 une liaison amide, X1 étant un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, X2 représentant -H ou un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, étant entendu que - lorsque R1 représente -H, l'acide aminé de l'extrémité N-terminale de P1 a la configuration D, - et lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé correspondant au reste P2 est de configuration D. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que R1 est un groupement acyle. 3 . Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que ledit groupement acyle est choisi parmi les groupements t-butyloxycarbonyle, acétyle, succinyle, glutaryle, un groupement hydrosolubilisant polyhydroxyalcanoyle tel que galactanoyle, gluconoyle, ribonoyle, érythronoyle, thréonoyle, arabinoyle, xylonoyle, glucoheptonoyle ou glycooctonoyle, et un groupement acyle lié à une macromolécule polyhydroxylée contenant par exemple des motifs: dans lesquels Z1 est un groupement hydrocarboné ayant 1 à 8 atomes de carbone, et Z2 et Z3 sont des groupements hydrocarbonés ayant 1 à 4 atomes de carbone. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée par le fait que P2 représente le reste de- la lysine, la delta-hydroxylysine, l'arginine, l'ornithine, la p-guanidino phénylalanine, la p-guanidino phénylglycine, la p-amidino phénylalanine, ou l'aminoéthylcystéine. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications i à 4, caractérisée par le fait que R2 représente -hX1X2, X1 représentant un groupement alkyle éventuellement hydroxylé ayant 1 à 4 atomes de carbone, et X2 représentant -H ou un groupement alkyle éventuellement hydroxylé ayant 1 à 4 atomes de carbone, ou R2 représente le reste d'une drogue antipaludique choisie parmi la mépacrine, la primaquine, la pyriméthamine et la sulfadoxine. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par le fait que -NX1X2 représente -NH-C2H5, -N(C2H5)2, -NH-CH(CH2OH)2 ( 2 )2 ou -NH-CH(CH2OH)-C2H5.