Brevet FR2614037A1 — publié le 19881021

Obiet de l'invention La présente invention se rapporte à un nouveau procédé visant à l'extraction de l'activateur tissuLaire du pLasminogène à partir de L'ovaire de La truie pLeine. Antécédents de l'invention L'activateur tissuLaire du plasminogene, ou tPA, est bien connu dans la Littérature pharmaceutique en raison de sa capacité à activer Le plasminogène seul en présence de fibrine, qui agit comme cofacteur, entraînant une accélération de la réaction tPA-PG de L'ordre de 3 000 fois par rapport au fibrinogène. Depuis Les travaux de Preben Kok et Tage Astrup, on sait qu'il existe au niveau de L'ovaire de truie une teneur élevée en activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et que La gestation fait augmenter énormément la quantité de cette enzyme dans cet organe. En raison des difficultés que pose L'obtention de la matière première, et en raison aussi de La complexité du procédé d'extraction, les études sur le tPA se sont centrées sur un matériau extrait d'une culture de cellulec de mélanome malin, à partir duquel ont été réalisées les premières expériences "in vivo", tant chez L'afin mal que chez l'être humain. Mais Les cellules malignes ayant été remises en question par Les comités d'éthique en tant que source d'extraction, La recherche s'est tournée vers la production par L'ingénierie génétique.Le tPA obtenu par recombinaison génétique a permis d'établir des observations cliniques très importantes, notamment en cas d'infarctus aigu du myocarde, mais ont été cons tatées toutefois des chutes de la teneur en fibrinogène, accompagnées très souvent d'hémorragies, phénomène qui n'a pas été rapporté Lors des expériences faites avec du tPA natif. Ces données ont amené à rechercher avec pLus d'insistance une production de tPA natif à partir d'une source d'extraction appropriée. C'est dans cette Ligne qu'a été reprise La recherche au niveau de L'ovaire de La truie pleine, cet organe ayant fourni d'excellents résuLtats et beaucoup de facilités en ce qui concerne Le stockage de la matiére première. Descriotion de L'invention Le procédé qui est présenté ici, objet de l'invention, a des avantages nombreux et importants par rapport aux méthodes connues antérieurement, notamment L'obtention d'un activateur tissuLaire du plasminogène purifié et doué d'une haute activité. D'une manière pLus précise, ce procéde commence par une macération du tissu, à la suite de LaqueLLe Les ovaires sont separés des trompes, débarrassés de toute matière environnante et broyés finalement jusqu'à leur transformation en une pâte. Ils sont soumis ensuite à une phase de délipidation, puis à une phase d'extraction au thiocyanate de potassium, ensuite à une phase d'acidification et enfin à une phase de remise en suspension dans du thiocyanate de potassium. Après une phase de dilution, ils subissent une nouvelle phase d'extraction, à la fibrine maintenant, suivie d'une phase de séparation du tPA et, finalement, d'une phase de purification qui met fin au processus. Réalisation oréférentielle de l'invention D'une manière spécifique, les phases opérationnelles décrites ci-dessus sont conduites comme indiqué par la suite : 1e Phase opérationnelle : MACERATION DU TISSU : Les ovaires sont séparés des trompes et débarrassés de toute matière environnante, puis lavés à grande eau à la température ambiante. Le matériau obtenu est broyé ensuite à L'aide d'un hachoir jusqu'à sa transformation en une pâte (environ 30 s de broyage). 2e Phase opérationnelle : DELIPIDATION : Le triturat d'ovaire est dilué à 1/10e dans de l'acétone, à une température de 0 C. Le mélange se fait par agitation pendant 20 min, afin de maintenir la matière en suspension ; La séparation se fait ensuite par centrifugation à 2 000 g. Le surnageant est éLiminé et Le précipité est resuspendu dans de L'acétone à 1/10e. Ce processus est renouvelé encore deux fois. Le précipité final est recueilli par centrifugation, déposé sur du papier absorbant et laissé Là à la température ambiante jusqu'à disparition de L'acétone. Par évaporatcn sous cloche à gaz, L'acétone est entiere- ment éliminée. Après séchage, La poudre est conservée à une tenpérature de 20"C jusqu'à son traitement. 3e Phase opérationnelle EXTRACTION AU THIOCYANATE DE POTASSIUM (KSCN) : Préparer une solution 2 M de KSCN. Diluer dans 400 ml de solution de thiocyanate 60 g de matériau d'ovaire, puis agiter pendant 12 h à L'aide d'un agitateur constant à 4"C. Ensuite, séparer le surnageant de la préparation, qui est diluée de nouveau dans 200 ml de solution de thiocyanate et agitée pendant 1 h. 4e Phase opérotionelle : ACIDIFICATION : Les surnageants oDtenus sont mélangés, puis traités à l'acide chlorhydrique normal jusqu a atteindre le pH 1. Cette opération implique L'apparition d'un précipité, qui est recueilli par centrifugation à 2 500 g ou par filtration sur filtres en étoffe. 5e Phase opérationnelle : REMISE EN SUSPENSION DANS DU THIOCYANATE DE POTASSIUM : Le matériau est dilué dans du thiocyanate de potassium 2 M (200 ml), puis soumis à l'agitation pendant 1 h à 4"C, et finalement centrifugé. 6e Phase opérationnelle : DILUTION : Le surnageant est dilué à 1/10e dans du solute physiologique, le pH étant porté jusqu'à 7,4 par addition d'hydroxyde de sodium (NaOH) 0,1 N. 7e Phase opérationnelle : EXTRACTION A LA FIBRINE Diluer du fibrinogène bovin dans une solution tampon d'Owren à pH 7,4, puis faire passer cette solution par une colonne de séfarose-lysine. Ce procédé est également réalisable par l'utili- sation de séfarose-lysine sous "batch", c'est-à-dire en mélangeant de la séfarose-lysine et du fibrinogène et en agitant pendant 20 min afin d'en extraire le plasminogène. Le fibrinogène est dilué ensuite dans du glycérol jusqu'à atteindre une concentration de 70 %. Additionner de la thrombine humaine à une concentration de 10 Ul/ml jusqu'à transformer le fibrinogène en des monomères de fibrine. Ces. monomères sont ensuite additionnés à la solution obtenue après traitement de l'ovaire, et le tPA va adherer aux monomères de fibrine. 8e Phase opérationnelle SEPARATION DU tPA : La séparation du tPA des monomères de fibrine se fait par centrifugation. Aditionner ensuite du thiocyanate de potassium (50 ml) en solution 2 M, en agitant pendant 30 min à 4 C à l'aide d'un agitateur magnétique. Faire passer par Sefadex G 300 sur une coLonne, opération qui permet la séparation de 2 pics : L'un de tPA, l'autre de fibrine. 9e Phase opérationnelle : PURIFICATION -Le pic protéique obtenu de tPA est passé sur de la séfarosearginine ; la colonne est lavée par de la solution tampon et de l'éluat à gradient linéaire de chlorhydrate d'arginine, ce qui permet d'obtenir du tPA à forte activité (200 000 Ul/mg). Ce procédé permet donc l'obtention d'un activateur tissulaire du plasminogène hautement purifié et doué d'un très haut niveau d'activité. IL n'est pas jugé utile d'allonger cette description et tout homme du métier sera en mesure de saisir la portée de l'invention et les avantages qui peuvent en découler. La description de l'invention est donnée à titre d'illustration sans limiter la portée de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction de l'activateur tissulaire du plasminogène à partir de l'ovaire de la truie pleine, caractérisé essentiellement par les phases opérationnelles suivantes : - Macération du tissu de L'ovaire de la truie pleine, - Délipidation, - Extraction au thiocyanate de potassium, - Acidification, - Remise en suspension dans du thiocyanate de potassium, - Dilution, - Extraction à la fibrine, - Séparation du tPA, - Purification. 2. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les ovaires, après macération et après séparation et nettoyage, sont broyés à l'aide d'un hachoir jusqu'à leur transformation en une pâte. 3. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la deuxième phase opérationnelle de délipidation, 1/10 de la matière première macérée est dilué dans de l'acétone à O"C et mélangé sous agitation pendant 20 min afin de maintenir la matière en suspension, la séparation se faisant ensuite par centrifugation et le surnageant est éliminé, la remise en suspension du précipité est prévue dans de l'acétone 1/10e, ce processus étant encore renouvelé deux fois, le précipité est recueilli finalement par centrifugation, déposé sur du papier absorbant et laissé Là à la température ambiante jusqu'à disparition de L'acétone, cette phase d'élimination de L'acétone pouvant faire appel à une cloche à gaz, et après séchage, le produit obtenu est stocké à -20 C jusqu'au moment de son traitement. 4. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la troisième phase opérationnelle d'extraction, est préparée une solution 2 M de thiocyanate de potassium, ensuite 50 g du produit obtenu sont dilués dans 400 ml de thiocyanate, puis agités pendant 12 h, sous agitation constante et à une température de 4"C et, finalement, le surnageant est séparé de la préparation, qui est diluée de nouveau dans 200 ml de thiocyanate et agitée pendant 1 h. 5. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la quatrième phase opérationnelle d'acidification, les surnageants obtenus dans la phase précédente sont mélangés et traités à l'acide chlorhydrique normal jusqu'à atteindre une valeur de pH égale à 1, et le précipité qui se forme est recueilli soit par centrifugation, soit par filtration. 6. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la cinquieme phase opérationnelle de mise en suspension, la matière est diluée dans du thiocyanate de potassium 2 M, agitée pendant 1 h à une température de 4"C et finalement centrifugée. 7. Procédé d'extractionselon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la sixième phase opérationnelle de dilution, Le surnageant est dilué à 1/10e dans du soluté physiologique, en portant le pH à une valeur de 7,4 par addition d'hydroxyde de sodium 0,1 N. 8. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la septième phase opérationnelle d'extraction à la fibrine, du fibrinogène bovin est dilué dans une solution tampon d'Owren à pH 7,4, cette solution est passée ensuite sur une colonne de séfarose-lysine, le fibrinogène est dilué ensuite dans du glycérol, jusqu a une concentration de 70 %, de la thrombine humaine est additionnée à une concentration de 10 Ul/ml jusqu'à transformer le fibrinogène en des monomeres de fibrine, et ces monomères sont additionnés finalement à la solution obtenue après traitement des ovaires, à la suite de quoi le tPA adhère aux monomères de fibrine. 9. Procédé d'extraction selon la revendication 8, caractérisé par le fait que, lors de la dilution du fibrinogène bovin, il est possible d'utiliser en option de la séfarose-lysine sous forme de "batch", c'est-à-dire un mélange de séfarose-lysine et de fibrinogène agité pendant 20 min afin d'en extraire le plasminogène. 10. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la huitième phase opérationnelle de séparation du tPA, il est procédé à la séparation du tPA des monomères de fibrine par centrifugation, avec addition ultérieure de thiocyanate de potassium (50 ml) en solution 2 M, le mélange est agité pendant 30 min à une température de 4"C, de préférence avec un agitateur magnétique, et passé ensuite par Sefadex G 300 sur une colonne qui permet d'obtenir d'une part le tPA et d'autre part la fibrine. 11. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la neuvième phase opérationnelle de purification, le pic protéique de tPA est passé sur de la sefarose- arginine, la colonne est lavée à la solution tampon, le pic est finalement élué à gradient linéaire avec du chlorhydrate d'arginine, ce qui permet d'obtenir un tPA très actif.