Brevet FR2617849A1 — publié le 19890113

La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention d'acide hyaluronique de haut poids moléculaire par fermentation. Elle a plus particulièrement pour objet la production d'acide hyaluronique de haut poids moléculaire par culture d'un microorganisme appartenant au genre Streptococcus. L'acide hyaluronique est un haut polymère lind- aire naturel du dioxide 3-0-ss-D glucoronopyranosyl-Nacétyl D-glucosamine. On trouve l'acide hyaluronique dans de nombreux tissus conjonctifs animaux, tels que la peau et le cartilage. Certains organes sont particulièrement riches en acide hyaluronique comme le cordon ombilical, l'humeur vitrée de l'oeil de boeuf, la crête de coq. Le liquide synovialest lui aussi très riche en acide hyaluronique. Les principales propriétés biologiques de l'acide hyaluronique sont liées à sa capacité de fixer l'eau et de former des gels lui conférant des propriétés hydratantes pour les tissus et lubrifiantes au niveau des articulations. Les procédés d'obtention d'acide hyaluronique ont longtemps fait appel à des extractions à partir des sources anatomiques citées ci-dessus. Mais l'utilisation de ces sources limitées dans la mise en oeuvre de procéda de faible rendement menait à des produits de prix de revient très élevés. Les besoins importants en acide hyaluronique de prix acceptable ont conduit à la recherche d'autres modes de production. C'est ainsi que les publications B. Hömstrom - Appl. Microbiol. (1967) p. 1400-1413 J.B. Woolcock - J. Gen. Microbiol. (1974) 85, 372-375 G et W Kôhler-Zbl. Bakt., I.Abt. Orig. (1970) 215, 187195, et K. sugahara- J. Biol. Chem. (1979) 254, 14 , 625. 6261 décrivent des procédés de fermentation de bactéries productrices d'acide hyaluronique dans le milieu de cult La bactérie la plus largement utilisée est le s treptococcus. Les brevets WO 84/03303 et WO 86/04355 décriv des procédés de fabrication d'acide hyaluronique par fer tation de Streptococcus zooépidemicus et de Streptococcu pyogenes. Toutefois, malgré des fermentations assez lon (24 à 72 heures en moyenne), les rendements restent faib et la purification délicate. De plus, pendant la ferment on déplore la production de hyaluronisases, enzymes dégr dant partiellement l'acide hyaluronique en fragments de faible poids moléculaire dépourvus d'intérêt biologique. Le brevet FR-A-2 564 859'décrit quant à lui, un procédé de fermentation de Streptococcus zooepidemicu meilleur rendement en acide hyaluronique. Néanmoins, ce procédé ne résoud pas les problèmes de dégradation de l'acide hyaluronique, par les hyaluronidases. L'objet de l'invention est un nouveau procédé de production d'acide hyaluronique d'origine bactérienne. L'invention a pour but un procédé d'obtention d'acide hyaluronique sans production d'enzymes le dégradant. Le procédé comprend trois étapes : fermentation, puis isolement et purification de l'acide hyaluronique. Le Streptococcus que l'on peut utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est un mutant appartenant au genre Streptococcus pyogenes du groupe A, enregistré sous le nO I 672 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, le 2 juillet 1987, 28 rue du Docteur I > u > c u x - 75724 PARIS CEDEX 15. Des conditions d'entretien consistant à inoculer périodiquement la souche chez un animal puis à l'isoler du sang de ce dernier, plusieurs fois de suite, ont permis non seulement d'exacerber la virulence de cette souche, mais aussi sa capacité à produire de l'acide hyaluronique en grande quantité, sans conduire à la production de hyaluronidases. Du fait de l'exacerbation de cette capacité de production, on peut avantageusement obtenir des concentrations importantes d'acide hyaluronique dans le milieu de culture avec des durées de fermentation beaucoup plus courtes (24 heures maximum) que celles décrites dans l'art antérieur. Selon un mode préféré de réalisation de ce procédé, la souche est inoculée 9 fois successives par voie péritonéale à la souris, puis 24 heures plus tard, isolée à partir du sang de l'animal. A la fin de cette série d'inoculations, la souche est prête à être utilisée dans un fermenteur dans le cadre de la mise en oeuvre deu procédé selon l'invention. Selon l'invention, le mutant Streptococcus peut être cultivé sur un milieu de culturé contenant des sources d'azote, de carbone et des sels minéraux. Comme source d'azote, on utilisera de l'extrai de levure,de la peptone de soja ; les éléments minéraux seron apportés par le chlorure de sodium. Les hydrates de carbon seront amends par le glucose. Ces différents constituants sont incorporés au milieu de culture dans les proportions suivantes Extrait de levure ..................... 10 à 40 g/l, Peptone de soja ..................... 5 à 20 g/l, NaCl ..................... 5 gll, Glucose ................. 50 à 100 g/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les composés ci-dessus incorporés au milieu de culture, le sont dans les proportions suivantes Extrait de levure ..................... 30 g/l Peptone de soja ....................... 10 g/l. Glucose ............................... 75 g/l. Seule une partie du glucose est incorporée au milieu de culture avant la fermentation. Environ les 2/3 du glucose sont incorporés au milieu de culture en cours de fermentation, par petites quantités et à intervalles réguliers.selon un mode préféré de réalisation du procédé selon l'invention, on ajoute 12,5 g/l de glucose à la 11ème, 14ème, 17ème et 20ème heure, soit 50 g/l de glucose au total. Selon le procédé, la culture du Streptococcus pyogenes se déroule de préférence en aérobiose, les conc trations d'oxygène dissout variant de 20 % à 80 % de la saturation. Pendant toute la durée de la fermentation, le pH est maintenu constant, égal à une valeur comprise ent 6,5 et 7,5 de préférence égal à 7. La température de fermentation est comprise gén ralement entre 350C et 400C de préférence égale à 370C. La fermentation se fait de préférence sous agitaconstante. Quand la concentration d'acide hyaluorique dans le milieu de culture atteint 4 g/l, la fermentation peut être stoppée par la chaleur. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, 24 heures après le début de la fermentation dans les conditions décrites ci-dessus, la température est rapidement élevée au-dessus de 400C, de préférence jusqu'à 450C. Immédiatement, après la fin de la fermentation, l'acide hyaluronique est isolé par centrifugation continue de la biomasse. Le surnageant clarifié contenant l'acide hyaluronique est recueilli puis refroidi. La phase de purification peut être effectuée de différentes facons mais de préférence , elle comprend les étapes suivantes a) preclpltation de l'acide hyaluronique à partir du sur nageant clarifié, b) traitement enzymatique du précipité obtenu en a), c) ultrafiltration après dilution dans l'eau, de la composi tion ainsi obtenue, d) précipitationsalccoliques successives de la solution selon c), e) essorage et séchage du précipité obtenu en d). De nombreux solvants organiques peuvent être utilisés pour précipiter l'acide hyaluronique. Les ammoniums quaternaires tels que le bromure de cétyl triméthyl ammonium (CTAB) sont couramment utilisés par la technique antérieure. L'utilisation d'acétone dans le cadre du procédé selon l'invention permet pour un faible volume ajouté, d'obtenir par simple décantation un précipité d'acide hyaluronique très soluble. Le traitement enzymatique est destiné d éliminer spécifiquement les acides nucléiques et les protéines contaminantes, grâce à l'action de RNases, DNases, protéi nases,notamment. Selon un mode préféré de réalisation du procédé, le traitement enzymatique peut se faire par l'action de RNase type I, de DNase pancrdatique et de protéinase K. L'ultrafiltration de la composition obtenue après digestion enzymatique est réalisée sur membrane à seuil i coupure convenablement choisi, et permet une élimination simultanée des produits de la digestion enzymatique'et d sels. On achève alors la purification par une série de cipitations alcooliques. Selon un mode préféré de mise el oeuvre du procédé, les précipitations ont lieu en présenc d'alcool éthylique à 95 %. Enfin, la composition d'acide hyaluronique est recueillie, essorée puis séchée. La composition d'acide hyaluronique ainsi obtenue présente les caractéristiques suivantes en pourcentage de poids sec Acides uroniques 30 % à 46 % Hexosamines 25 % à 35 % N-Acétylhexosamines 35 % à 49 % Acides nucléiques Azote total 2 % à 6 % Acides aminés Cendres 5 % à 10 % Teneur en eau 5 % à 15 % Poids moléculaire 000 000-1 500 000 D Ta compositionsd'acide hyaluronique de haut poids moléculaire obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont avantageusement utilisés en cosmétologie. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparattront à la lecture des-exemples suivants. EXEMPLE 1 Production d'une composition d'acide hyaluronique de haut poids moléculaire par fermentation du Streptococcus pyogenes I 672 Le Streptococcus pyogenes I 672 est mis en fermentation dans 400 1 du milieu suivant Extrait de levure 30 g/l Peptone de soja 10 g/l Glucose 25 g/l NaCl 5 g/l. Le pH est maintenu égal à 7, la température à 370C. Le taux d'oxygène dissout est maintenu à 20 % de la saturation. Le glucose est ajouté sous forme de solution concentrée stérile , à raison de 12,5 g/l à la 11ème, 14ème, 17ème, et 20ème heure. Le milieu de culture est constamment agité pendant toute la durée de la fermentation. Après 24 heures de culture dans les conditions cidessus, la température à l'intérieur du fermenteur est rapidement portée à 450C et la biomasse est immédiatement éliminée par centrifugation continue. Le surnageant clarifié contenant l'acide hyaluronique libre est recueilli puis refroidi. L'acide hyaluronique est ensuite précipité par addition au milieu clarifié de 1 volume d'acétone sous agitation rapide. L'agitation est alors arrêtée et le précipité laissé en décantation pendant 2 heures dans le réacteur, puis soutiré et essoré. Le traitement enzymatique se déroule dans les conditions suivantes. Le précipité obtenu précédemment est repris en sol tion dans 100 1 d'eau, dans un réacteur thermostaté. Le p: est ajusté à 7,0, avec NaOH concentré. On ajoute 10 mg/l de RNase type I et 10 mg/l de DNase pancréatique. La température est portée à 25"C puis on laisse l'hydrolyse se poursuivre pendant une nuit à ce température. On ajoute alors 50 mgol de protéinase K et la dige tion enzymatique est poursuivie 5 heures à 370C à pH 7,0. La concentration en acide hyaluronique dans la sol tion est ensuite ajustée à 10 g/l par dilution avec de 1' puis on procède à une diafiltration sur membrane à seuil coupure de 100.000 daltons, à volume constant, jusqu'à ce que la résistivité devienne constante. On concentre ensui au 1/4 du volume initial. Les précipitations alcooliques se déroulent de la manière suivante. A la solution concentrée précédente, on ajoute de l'acétate de sodium pour avoir une molarité de 0,1 M. L'a hyaluronique purifié est alors précipité de cette solutic par addition progressive, sous agitation de 2 volumes d'a cool éthylique à 95 %. Le précipité est recueilli par décantation puis re en suspension dans 1 volume d'alcool à 95 %. Le précipité lavé est alors recueilli par décantation puis essorage. Il est finalement séché à l'étuve sous vide pendar 24 heures à 500C. Caractéristiques analytiques de l'acide hyaluronique ainsi préparé Les résultats sont exprimés en pourcentage du poids sec. Acides uroniques 40,9 % Hexosamines 3-7,2 % N-Acétyl hexosamines 46,1 % Acides nucléiques 0,6 % Azote total 3,2 % Acides aminés Cendres sulfuriques 7,5 % Teneur en eau 10,0 % Poids moléculaire > 800 000 D EXEMPLE 2 COMPARAISON ANALYTIQUE ENTRE DES COMPOSITIONS D'ACIDES HYALURONIQUES CONNUES ET CELLE OBTENUE PAR LE PROCEDE SELON L'INVENTION La comparaison est faite à partir des compositions contenant de l'acide hyaluronique disponibles dans le commerce 1) Cordon ombilical (Sigma), 2) Crête de coq (Cerva), 3) Acide hyaluronique d'origine bactérienne (Shiseido) Le principe de la comparaison est le suivant: 1'hydrolyse enzymatique de l'acide hyaluronique par une éliminase de Streptomyces hyalurolitieu5 libère des oligosaccharides insaturés caractéristiques, détectables en U.V. . tétrasaccharides (HA.DA), . Hexasaccharides (HA.D6), . Octosaccharides (HA.D8), Decasaccharides (HA.D10), . Dodecasaccharides (H.D12). Les oligosaccharides ainsi obtenus sont séparés par chromatographie HPLC sur colonnes échangeuses d'anions par l'acide trifluoroacétique 8 mM et ddtectds:en UV à 240 nm. Les fractions isolées I, Il, III, IV sont identi fiées par spectromètre de masse en mode FAB (tastAtom Bombardement) negatif, comme étant respectivement le tétra, l'octa, le déca et le dodécasaccharide. La figure 1 représente le chromatogramme HPLC de l'acide hyaluronique issu du cordon ombilical et celui issu de la crête de coq. La figure 2 représente les chromatogrammes de l'acide hyaluronique shiseido et celui de l'acide hyaluron; que obtenu par le procédé selon l'invention. La figure 3 représente le spectogramme de masse de HAD6) La figure 4 représente le spectogramme de masse de (HAD8). La figure 5 représente le spectogramme de masse de (HAD10). La figure 6 représente le spectogramme de masse de (HAD12). Comparativement à l'acide hyaluronique de référ Sigma isolé du cordon ombilical, on peut conclure que l'ac hyaluronique isolé de la crête de coq et celui obtenu sel le procédé de l'invention, présentent des caractéristiques strictement identiques quant à leurs compositions relatives en oligosaccharides après hydrolyse enzymatique. Par contre, l'acide hyaluronique.Shiseido prisez un profil chromatographique très différent tant par sa com en oligosaccharides que par la présence d'épaulements et d pics supplémentaires correspondant vraisemblablement à des impuretés. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'acide hyaluronique de haut poids moléculaire par fermentation d'un Streptococcus producteur d'acide hyaluronique et non producteur d'enzymes dégradant l'acide hyaluronique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, avant la fermentation, la souche subit plusieurs fois de suite une inoculation chez la souris puis un isolement à partir du sang de cette dernière. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique de haut poids moléculaire est obtenu par fermentation d'un Streptococcus pyogenes du groupe A enregistré sous le n" I 672 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le Streptococcus est mis en culture dans un milieu contenant de l'extrait de levure, de la peptone de soja, du glucose et du chlorure de sodium dans les concentrations suivantes Extrait de levure 10 à 40 g/l, Peptone de soja 5 à 20 g/l, NaCl 5 g/l, Glucose 50 àîoOg/l. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les concentrations d'extrait de levure, de peptone de soja, de glucose et de chlorure de sodium sont les suivantes Extrait de levure 30 g/l Peptone de soja 10 g/l Glucose 25 g/l 6. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la culture du microorganisme se faii en aérobiose. 7. Procédé selon la revendication 6, caractdrisz en ce que la concentration en oxygène dissout est entre 2 et 80 8 de la saturation. 8. Procédé selon les revendications 1 à 7, carac térisé en ce que pendant la culture du microorganisme, le pH est maintenu entre 6,5 et 7,5, de préférence égal à 7, 9. Procédé selon la revendication 1 à 8, caractérisé en ce que 2/3 du glucose total sont ajoutés au mil de culture en cours de fermentation, par petites quantité et à intervalles de temps réguliers. 10. Procédé selon la revendication 9, caractéris en ce que le glucose est ajouté au milieu de culture à ra de 12,5 g/l toutes les 3 heures à partir de la 11ème heur 11. Procédé selon la revendication 10, caractéri en ce qu'on ajoute 50 g/l de glucose au milieu de culture en cours de fermentation. 12. Procédé selon les revendications 1 à 9, cara térisé en ce que la fermentation est stoppée quand la con centration en acide hyaluronique dans le milieu de cultur atteint 4 g/l. 13. Procédé selon la revendication 12, caractéri en ce que la fermentation est stoppée par une élévation d la température au-dessus de 400C, de préférence jusqu'S 4 14. Procédé selon les revendications 1 à 9 compr nant une étape de fermentation, une étape d'isolement de l'acide hyaluronique à partir du milieu de culture, et un étape de purification du surnageant contenant l'acide hya ronique, ledit surnageant étant obtenu par centrifugation continue de la biomasse. 15. Procédé selon la revendication 14, caractéri en ce que ladite purification comprend les étapes suivant a) précipitation de l'acide hyaluronique à partir du sur nageant clarifié, b) traitement enzymatique du précipité obtenu en a), c) ultrafiltration, après dilution dans l'eau, de la compo sition ainsi obtenue, d) précipitations alcooliques successives de la solution obtenue selon c), e) essorage et séchage du précipité obtenu selon d). 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit traitement enzymatique comprend l'utilisation de RNase, de DNase, et protéinase. 17. Procédé selon la revendication 16, comprenant l'utilisation de RNase type I, de DNase pancréatique, de protéinase K. 18. Acide hyaluronique de haut poids moléculaire obtenu par le procédé conforme à l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le poids moléculaire dudit acide hyaluronique est compris entre 500 000 D et 1 500 000 D. 19. Application de la composition d'acide hyaluronique obtenue selon le procédé conforme à l'une des revendications 1 à 18 aux compositions cosmétologiques.