Brevet FR2617865A1 — publié le 19890113

L'invention se rapporte à un perfectionnement dans la culture de microorganismes, plus particulièrement celle de champignons. Elle comprend un dispositif pour la réalisation de ce procédé amélioré, ainsi que des applica- tions de celui-ci. L'invention vise notamment l'applica- tion du perfectionnement concerné à la production d'en- zymnes par des champignons, en particulier de la ligninase. La biotechnologie a de plus en plus recours à des cultures de microorganismes en vue de la production de différentes substances utiles; c'est notamment le cas de la préparation de diverses enzymes et d'antibiotiques, dont on connaît l'importance. Etant donné la lenteur des productions biologiques par rapport aux fabrications chi- mique, et leur faible rendement par unité de volume de l'appareillage utilisé, des efforts constants sont faits en vue de l'augmentation de ces facteurs. C'est ainsi que le mode opératoire classique des cultures et fermentations, en phase liquide dans des récipients fixes, a été amélioré par l'introduction d'appareils à agitation, à colonnes ou tubulures, à lit fluidisé par un courant d'air, à disques tournants, et autres dispositifs. Cependant, le problème reste toujours posé, puisqu'une réalisation industrielle d'une opération demande une vitesse et un rendement aussi grands que possible. Il se pose particulièrement lorsqu'on travaille sur des champignons ne sécrétant pas de substances polymères et - par conséquent - ne pouvant pas se fixer sur une paroi exposée au renouvellement rationnel de l'oxygène et de liquides appropriés. Tel est notamment le cas de di- vers basidiomycètes et en particulier du Phanerochaete chry- sosporium intéressant à cause de la ligninase qu'il sécrète, mais difficile à cultiver. La présente invention apporte dans ce domaine une contribution importante: elle permet d'accélérer sensible- ment la croissance des champignons qui ne sécrètent pas de matière polymère, d'augmenter la longévité de leurs cultures 2-617865 et d'intensifier la production des substances intéressantes par ces champignons. Ces avantages sont dus à ce que l'in- vention rend possible le maintien des champignons, ne sé- crétant pas de polymères, bien accrochés sur un support solide, pendant que l'on fait passer sur celui-ci un abon- dant débit d'air ou d'oxygène. Le procédé de culture suivant l'invention, qui consiste à maintenir le mycélium du champignon sur un sup- port solide, au sein d'un milieu nutritif, en faisant pas- ser de l'air ou de l'oxygène au contact du mycélium, est caractérisé en ce que la surface du support présente une multitude de creux et de reliefs successifs, la distance entre deux reliefs adjacents étant de 0, 05 à 0,5 mm et, de préférence, 0,1 à 0,3 mm. L'effet surprenant de l'invention réside en ce que, malgré l'absence de toute sécretion de matière. poly- mère, notamment de polysaccharide, qui permettrait au chani- pignon de coller à un support solide, on arrive tout de même à obtenir une fixation ferme du mycélium, lorsque le support comporte les rugosités des dimensions spécifiques, susindiquées. De préférence, la profondeur des creux est de l'ordre de 0,01 à 0,5 mm, de préférence 0,025 à 0,5 mm. Le procédé de culture de microorganismes suivant l'invention consiste ainsi à laisser croître les microorga- nismes dans un milieu nutritif, liquide, approprié, dans lequel on a disposé un ou plusieurs supports dont la surface présente une multitude de creux et reliefs se succédant les uns aux autres aux distances indiquées plus haut. Lorsque le mycélium a formé, sur son support, une certaine épaisseur, le support est retiré et remplacé par un autre, non encore recouvert de culture; s'il y a lieu, le milieu nutritif est alors renouvelé; il peut d'ailleurs être introduit en continu, dans l'espace de cul- ture, avant et après le retrait du support initial. Dans une forme particulière d'exécution du procédé de l'invention, lorsque l'épaisseur du mycélium a atteint une certaine va- leur, on remplace le milieu liquide par un autre, prévu pour faire sécréter-aux microorganismes les substances dé- sirées. Le nouveau procédé s'applique tant au travail aérobie qu'aux cultures anaérobies. Dans le premier cas, il peut être avantageusement réalisé avec les méthodes con- nues de soufflage de l'air ou de l'oxygène dispersé, ou la flottation. Le procédé suivant l'invention est mis en pratique dans un appareil comportant une chambre à culture, statique ou munie de moyens de circulation de liquide et - éventuel- lement - de gaz, caractérisé en ce que, dans cette chambre, sont placés un ou plusieurs supports définis plus haut. 1.5 Lorsque la chambre à culture est à circulation de milieu liquide, le ou les supports sont suspendus de pré- férence longitudinalement suivant le sens de circulation du liquide. Selon une forme préférée de l'invention, le sup- port, offert au mycélium, est constitué par un tissu, un grillage ou un écheveau, dont les fils ou rubans constitu- tifs peuvent être en des matières très diverses, à condi- tion de ne pas être attaquables par les microorganismes ou répulsifs visà-vis de ceux-ci. Ainsi, le support peut être en métal, en fibre de verre ou autre minéral, ou bien en l'une des nombreuses matières polymères connues à l'heure actuelle. Des exemples non limitatifs sont des grilles en acier inoxydable, tissu de fibre de verre, gaze ou trame d'acétate de cellulose, de polyester, polyacrylonitrile, polyamide (Nylons), polyéthyIlène, polyacrylate, etc. Une variante comprend, en tant que supports de my- célium, des plaques ou feuilles dont la surface est sculp- tée, gaufrée ou rainurée en fins reliefs et creux, très rapprochés les uns des autres. Les mêmes matières, indi- quées plus haut, conviennent. En particulier peut-on emplo- yer des plaques gaufrées en poly(chlorure de vinyle), poly- styrène, phénoplaste, polypropylène, polyuréthanne, etc. Commeindiqué, l'écart entre deux reliefs ou fils, dans le support de mycélium suivant l'invention est de 0,05 à 0,5 mm, ou mieux, de 0,1 à 0,3 mm. Avec des grilles, trames et tissus, d'excellents résultats ont été obtenus pour des écarts d'environ 0,1 à 0,3 mm entre deux fils adja- cents, ce qui correspond à des tamis N 21 à 29 selon les normes AFNOR (tamis TYLER standard 60 à 150). Les dimensions des supports dépendent, bien enten- du, de celles de l'appareil utilisé pour la culture donnée, mais il est en général préférable que la longueur du support soit 5 à 25 fois la largeur: cela permet de disposer les supports longitudinalement dans le sens de la circulation du liquide dans l'appareil. Le principe de la présente invention peut s'appli- / / quer aux dispositifs connus pour la culture de microorga- nismes s il suffit pour cela de placer un ou plusieurs sup- ports suivant l'invention dans la chambre de culture de l'appareil, Une forme d'exécution particulièrement interes- sante est celle o un appareil, du type à soufflage de l'air dispersé et à circulation de liquide, est muni d'un ou de plusieurs supports selon l'invention dans la tubulure servant de chambre de culture. A titre d'exemple non limitatif de nouveau dispo- sitif,on en décrit un ci-après, avec référence au dessin annexé. L'appareil comprend deux tubulures, 1 et 2, commu- niquant au bas, 6, et en haut, 7, d'une partie 8 servant de chambre de culture. Une canalisation latérale 5 permet l'approvisionnement en le milieu de culture, dont le sou- tirage se fait en bas, par 4. Au bas de la tubulure 1 sont placés des moyens de dispersion 3 du gaz sous pression in- troduit par 11; ces moyens sont constitués par exemple par une plaquette de verre fritté ou par une fine grille métal- lique. Les deux branches, 1 et 2, sont entourées d'envelop- pes 10 et 10', pour le passage d'un fluide calorifique, per- mettant de régler la température à la valeur voulue à l'in- térieur de l'appareil. La caractéristique importante, suivant l'inven- tion, est la présence d'un support 9 placé longitudinale- ment dans la tubulure 1. Ce support peut avoir les forme et nature décrites plus haut. Dans des cas particuliers, de très bons résultats ont été obtenus avec des supports constitués par de la trame de polyamide 6 ou 6.6 (Nylon 6 ou 6.6). La pose amovible du support 9 dans la chambre 1 peut s'effectuer par tous moyens connus, notamment par suspension, ou par calage sur le fond de la tubulure 1 ou sur des pièces prévues à cet effet, non représentées sur le dessin. Le procédé et l'appareil suivant l'invention peu- vent s'appliquer à diverses cultures bactériennes ou fongi- ques, et tout particulièrement à celles de certains champi- gnons, Ils sont illustrés non limitativement par l'applica- tion à la culture du champignon basidomycète Phanerochaete Chrysosporium et la production de l'enzyme ligninase par ce microorganisme. Les ligninases du champignon basidiomycète Phane- rochaete chrysosporium Burds sont des peroxydases extracel- lulaires, capables de cliver des liaisons caractéristiques de lignines. Aussi leur utilisation potentielle comme agent de délignification, dans des domaines tels que l'alimenta- tion des ruminants ou le blanchiment des pâtes à papier, a-t-elle été envisagée. Cependant, outre les difficultés que présente une mise en oeuvre de ces enzymes dans un pro- cédé biotechnologique, leur production, dans des conditions transposables à grande échelle, n'a pas encore été réali- sée. Les ligninases ont été décrites comme des enzymes sécrétées dans le milieu de culture de Phanerochaete dihrysosporium, lorsque celui-ci est cultivé en milieu syn- thétique dans des fioles d'erlenmeyer non agitées (TIEN et KIRK 1983, Science, 221, 661-663). Par la suite, d'autres modes de culture, destinés à accroître la productivité de ligninases,ont été proposés: en milieu agité (RENGANATHAN et coll. Arch. Biochem, Bio-phys.241,304-312; JAGER-et coll. Appl. Environ. Microbiol. 1985, 50, 1274-1278; LEISOLA et FIECHTER, 1985, FEMS. Microbiol, Lett. 29,33-36), avec un dispositif rotatif, (KIRK et coll. 1986 Enzyme Microb. Technol. 8, 27-32; PASZCZYINSKI et coll. 1986, FEMS Microb, lett. 29, 37-41); sous forme de mycélium im- mobilisé (LINKO et coll. 1986 Journ. Bio-Techn, 4, 283- 291). Aucun de ces travaux n'a conduit à une production in- dustrielle.L'application de la présente invention, par con- tre,permet une production de ligninases compatible avec une expérimentation à grande échelle, Dans les conditions des exemples qui suivent, le champignon est d'abord fixé sur une trame- de nylon. Ensui- te, la trame est introduite dans un réacteur, comme celui du dessin annexé, contenant le milieu de culture. Un cou- rant d'air ou d'oxygène sous pression est utilisé pour homo- généiser le milieu et établir des conditions favorables à la croissance fongique, et à l'expression du système ligninoly- tique. Lorsque la production des ligninases atteint son ma- ximum, le milieu de culture est récupéré dans sa totalité. Le réacteur est alors alimenté en milieu neuf, qui permet ultérieurement l'obtention d'un nouveau lot de jus actif.Ce processus peut être répété durant plusieurs semaines. Le mode opératoire comportait les opérations que voici: 1- Fixation du champignon Le champignon est mis en culture dans une fiole d'erlen- meyer de 1 litre, contenant 400 ml de milieu nutritif et une trame de nylon de 30 x 2 cm avec 0,25 mm de vide de maille. Le milieu avait la composition en g/l: KH2PO4 2 Glycérol 5 Mg SO4 7H20 0,5 Tween 80 1 Ca Cl2 2H20 0,1 Alcool vératrylique 67x10 (NH4)2 C4H46 2,4 (activateur) Thiamine HCl 0,2x10 Solution minérale 7 ml Ce milieu est tamponé à pH 4,5 par de l'acétate de Na mM. La solution minérale, employée, avait la composition en g/l: Mg SO4 7H20 3 Zn S04 7H20 0,1 Mn S04 H20 0,5 Cu S04 5H20 0,01 Na Cl 1 Ca Cl2 2H20 0,1 Fe SO4 7H20 0,1 Ai K (SO4)2 12H20 0,01 Co Cl2 0,1 H3 BO4 0,01 Na2 MoO4 2H20 0,01 L'ensemencement était réalisé par des spores en suspension dans une solution aqueuse de "Tween 80" à 0,1%, à raison de 0,25 x 106 spores/ml de milieu. La culture s'est poursuivie 24 heures à 35 C sous agitation. Dans ces conditions, le mycélium s'est présenté sous la forme de paillettes fixées sur la trame. 2- Croissance en réacteur à soufflage d'air disperse. Le réacteur, constitué par les deux compartiments, 1 et 2, en verre, reliés entre eux, selon dessin annexé, avait une capacité de 1 litre. La chambre 8 du compartiment I reçoit la trame 9; par la plaque de verre fritté 3 on réalisait une bonne diffusion de l'air ou d'O2 dans le milieu de culture. Le compartiment 2 permettait une circulatien du milieu dont la température optimale de croissance du champignon était réglée à 35 C. Après introduction de la trame dans le réacteur, on faisait passer en continu des bulles d'air, durant une période de 48 heures, avec un débit de lOOml/mn, nécessaire au déve- loppement du mycélium. A partir de là, la culture fut main- tenue sous 02 pur tout au long de l'expérimentation. EXEMPLE 1 On a maintenu le champignon en culture pendant plus de 2 mois dans les conditions décrites plus haut. L'ac- tivité ligninase était suivie au cours de ce temps de la façon suivante. 20 ml de milieu sont prélevés; le volume de la culture est maintenu constant par l'apport du tampon acétate 10 mM pH 4,5. L'activité enzymatique est déterminée par la méthode de TIEN et KIRK (1983), exposée dans la publication citée plus haut, basée sur l'oxydation de l'alcool vératrylique CH30 CH20HR. OCH3 en l'aldéhyde correspondant par de l'eau oxygénée. On opérait sur 3 ml de mélange réactionnel composé de lml de jus de culture, de tampon glycine-HCl, 0,1 MpH3, 0,4 mM d'alcool vératrylique et 0,1 mM de H202. L'unité de l'activité de la ligninase est définie comme la quantité de cette enzyme qui conduit à la formation de 1 micromole d'aldéhyde vératrylique par minute. L'activité du jus de la culture est de 230 U/l soit plus de 1,5 fois le maximum atteint par Alexander JAGER et coll. (Applied and Environmental Microbiology, Nov. 1985 - vol. 50, n 5, page 1276, Tableau 2). Lorsque la production de ligninase atteint son maximum, la totalité de jus de culture est récupérée. Le milieu de remplacement est identique au milieu de base, mais les con- centrations des différents constituants sont divisées par à l'exception de celles du tampon, de l'alcool vératry- lique et du "Tween 80". ESSAI COMPARATIF Les opérations de l'exemple 1 étant répétées sans le support de nylon dansle réacteur, la production de li- gninase est très faible. EXEMPLE 2 Les opérations de l'exemple ont été répétées, mais le tampon d'acétate de Na, pH 4,5 fut remplacé par un tampon de diméthyl-2,2 succinate de Na de même concen- tration 10mM, pH également 4,5. Les résultats sont alors moins bons, mais encore meilleurs que sans support ide nylon-. EXEMPLE 3 On procède comme dans l'exemple 1,mais l'appa- reil fonctionne en continu à raison de 15 ml de milieu de remplacement introduit par heure; le même débit d'oxygène de 100 ml/h que dans l'exemple 1 est maintenu en permanence. On arrive ainsi à une production de ligninase d'activité moyenne constante de 100 U/l, qui a été maintenue pendant jours. Revendications 1. Procédé de culture de microorganismes dans un milieu nutritif, liquide, caractérisé en ce que l'on plonge dans ce milieu un ou plusieurs supports pour le mycélium, la surface de ces supports présentant une multitude de creux et reliefs, la distance entre deux reliefs adjacents étant de 0,05 à 0,5 mm. 2. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que le ou les supports sont retirés, lorsque le mycélium sur leur surface a atteint une certaine grandeur, pour être éventuellement remplacés par de nouveaux supports. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que la profondeur des creux est de l'ordre de 0,01 à 0,5 mm et de préférence de 0,025 à 0,5 mmn. 4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support est constitué par un tissu, grillage, écheveau ou bien feuille ou plaque à surface gau- frée ou rainurée, en métal, verre ou autre minéral, ou po- lymère, en particulier textile. 5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les écarts préférés entre deux re- liefs successifs dans le support sont de 0,1 àO 0,4 mm. 6. Dispositif pour la culture de microorganismes, qui comporte une chambre de culture et des moyens pour l'in- troduction et soutirage de liquide (4,5) et des moyens pour le soufflage de gaz (3,11), caractérisé en ce qu'un ou plu- sieurs supports (9) sont placés dans cette chambre (8), de préférence longitudinalement par rapport au passage de li- quide, ces supports présentant une surface avec une multi- tude de creux et de reliefs, la distance entre deux reliefs adjacents étant de 0,05 à 0-5 mm et de préférence 0,1à 0,3 mm. 7. Dispositif suivant la revendication 6, carac- térisé en ce que le support (9) est un tissu, grille, éche- veau ou plaque gaufrée, en métal, verre ou autre minéral, ou polymère, en particulier textile. 8. Dispositif suivant la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que la profondeur des creux est de 0,01 à 0,5 mm et de préférence de 6,025 à 0,5 mm. 9. Application du procédé suivant une des reven- dications 1 à 5 à la culture du champignon Phanerochaete chrysosporium en vue de la production de la ligninase. 10. Application suivant la revendication 9, caractérisée en ce que le support utilisé est une trame de polyamide placée dans la chambre de culture longitudina- lement par rapport au passage du milieu nutritif et de l'o- xygène. 11. Application suivant la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que la culture a lieu dans un milieu tamponné à l'acétate de sodium à pH 4,5.