Brevet FR2622108A1 — publié le 19890428

La présente invention porte sur l'obtention de concentrés thérapeutiques de proconvertine (ou Facteur VII) et de Facteur anti-hémophilique B (ou Facteur IX) de haute pureté à partir de plasma humain, selon un procédé qui permet d'obtenir également des fractions enrichies respectivement en alpha-1-antitrypsine, en protéine C et protéine S et en prothrombine (Facteur II) et Facteur de Stuart (Facteur X). La mise à disposition de concentrés de Facteur VII, d'une part, et de Facteur IX, d'autre part, dépourvus d'autres protéines à activités coagulantes est très bénéfique pour les patients déficitaires tant en Facteur VII qu'en Facteur IX (hémophiles B). En effet, ces deux catéoories de maladie sont actuellement traitées par l'utilisation de concentrés de protéines plasmatiques du complexe prothrombinique (aussi appelé PPSB) renfermant quatre protéines coagulantes, les Facteurs II, VII, IX et X. Soumis lors de leurs épisodes hémorragiques à un traitement par le PPSB tant les malades atteints de déficit en Facteur VII, que ceux déficitaires en Facteur IX, reçoivent des doses importantes de Facteurs de coagulation (Facteurs II, IX et X, et II, VII, et X respectivement) dont ils ont par ailleurs, avant traitement, des taux physiolo- logiques actifs. Ce surcroît de protéines coagulantes peut induire des risques de thrombose. Ce danger est particulièrement net chez les déficients en Facteur VII, car cette protéine a, in vivo, une demi-durée de vie relativement brève (7 à 9 heures) qui conduit, pour rétablir des taux physiologiques actifs, à injecter des doses massives de PPSB et donc de Facteurs II, IX, et X. Ce phénomène est d'autant plus marqué que le PPSB est généralement pauvre en Facteur VII (10 à 18 UI/ml contre 30 à 45 UI/ml de Facteur X, par exemple). Des traitements à base de plasma total ont été proposés, mais ceux-ci induisent des risques notoires de contamination virale puisque le plasma thérapeutique n'est généralement pas inactivé vis-à-vis des virus pathogènes, et nécessitent les mêmes injections massives et répétées que le PPSB, conduisant à des surcharges de protéines plasmatiques annexes. S'il existe certaines publications démontrant l'intérêt de la chromatographie d'échanges d'ions (DEAE) et d'affinité (héparine - Sépharose) (Andersson et al., Thrombosis Research, 7, 451-459, 1975), il y a peu de concentrés thérapeutiques spécifiques en Facteur VII et Facteur IX. Il existe actuellement un concentré de Facteur VII mais ce dérivé renferme des antigènes des Facteurs IX, II et X,de la protéine C et des doses importantes d'héparine. Une méthode de préparation d'un concentré de Facteur IX, haute pureté, a été publiée (Menaché et al., Blood, 64, 1220-1227, 1984); elle utilise deux étapes d'adsorption chromatographique, la première "en batch" en présence de DEAE-Sephadex, la deuxième en colonne sur gel d'affinité à base de sulfate de dextran.Cette technique consiste dans les faits à purifier d'abord le PPSB (DEAE-Sephadex) puis à isoler-le Facteur IX grace à son affinité pour le sulfate de dextran. Cette méthode ne bénéficie cependant pas de tous les avantages de la chromatographie industrielle en colonne, du fait de l'adsorption en discontinu (méthode peu automatisable, peu reproductible), et nuit à la récupération optimisée d'autres fractions plasmatiques potentiellement utiles. Enfin, elle ne favorise pas la récupération simultanée de la proconvertine. La Demanderesse a maintenant réussi à obtenir selon la présente invention et à préparer tout à la fois de la proconvertine avec une activité spécifique supérieure ou égale à 0,7 et du Facteur IX avec une activité spécifique du Facteur IXc supérieure ou égale à 5 et largement dépourvu des Facteurs II, VII et X en utilisant une fraction plasmatique obtenue dans tous les centres de fractionnement produisant de l'albumine et du Facteur VIII. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on soumet un surnageant de cryoprécipité humain à une chromatographie sur résine échangeuse d'anions en présence d'héparine et on sépare un filtrat contenant de l'antithrombine III, des immunoglobulines et de l'albumine et,par augmentation de la force ionique du tampon, quatre fractions enrichies respectivement en alpha-1-antitrypsine (AAT), en proconvertine (Facteur VII), en protéines C et S et en inter-alpha trypsine inhibiteur, et, enfin, en facteur anti-hémophilique B (Facteur IX). Ce procédé permet d'obtenir, avec un rendement de l'ordre de 45 %, une proconvertine à activité spécifique de 0,7 UVmg de protéine au moins, et, avec un rendement de l'ordure de 30 UUmg de protéine au moins, ces deux protéines ayant conservé leur activité coagulante. On met avantageusement en oeuvre au préalable une étape de dilution-filtration du surnageant de cryoprécipité avec de l'eau osmosée afin d'en abaisser la force ionique et permettre l'adsorption des protéines intéressantes sur le premier gel de chromatographie. L'héparine est alors ajoutée au surnageant du précipité. On utilise avantageusement une dose de 1 UI/ml finale d'héparine. A partir du surnageant dilué et hépariné, on sépare par chromatographie d'échange d'anions un filtrat de protéines non adsorbées, riche en albumine, immunoglobulines et antithrombine III en particulier, puis quatre autres fractions riches en alpha-1-antitrypsine, en proconvertine, en protéines C et S et en acteurs II, IX et X. On purifie alors le Facteur IX après diverses étapes de concentration, dialyse et éventuellement inactivation virale, par chromatographie d'affinité qui sépare aussi les Facteurs II et X. La fraction riche en alpha-1-antitrypsine est d'abord récupérée de la résine échangeuse d'anions par un tampon renfermant entre 0,13 et 0,17 M de NaCl, plus particulièrement ajusté à 0,16 M de NaCl. La fraction riche en proconvertine s'élue par augmentation de la concentration en NaCl, celle-ci étant ajustée entre 0,18 et 0,20 M et préférentiellement 0,19 M. Dès sa réception, il est souhaitable d'y adjoindre de l'antithrombine III humaine, ceci à une dose souhaitable de 1 UI/ml. La fraction est ensuite concentrée et, à ce stade, le taux d'héparine est ajusté entre 5 et 10 UI/ml, avantageusement à 5 UI/ml. Après concentration, on inactive de préférence les virus éventuellement présents, tels que le virus du SIDA, par chauffage en milieu liquide en présence de stabilisants. La température utilisée de préférence est comprise entre 55 et 650C et est plus particulièrement voisine de 600C. Un temps de chauffage de 30 minutes est suffisant pour inactiver le virus du SIDA. Le stabilisant préconisé est très préférentiellement le sorbitol qui donne des résultats de rendement et d'activité coagulante du Facteur VII tout à fait satisfaisants (de l'ordre de 85 %). On utilise le sorbitol à raison de 60 à 70 % (poids/volume). Après diafi-ltration pour éliminer le stabilisant et ajuster la teneur en protéines à environ 30 g/l on répartit le concentré en flacons et on le lyophilise. Le produit obtenu a fait la preuve de son efficacité dans le traitement des troubles hémorragiques des déficits constitutionnels majeurs en proconvertine. I1 est administré par injection intraveineuse. Le concentré est dénué de risques thrombogéniques comme l'ont démontré des tests de thrombogénicité chez le lapin (DE 50 supérieure à 500 UI/kg). La récupération des autres fractions plasmatiques adsorbées sur la lysine échangeuse d'anions s'opère par augmentation graduelle de la force ionique. C'est ainsi que s'élue préférentiellement une fraction contenant la protéine C et la protéine S, en augmentant la concentration saline du tampon chromatographique. La concentration en sel, préférentiellement le chlorure de sodium, doit hêtre comprise entre 0,26 et 0,30 M et est avantageusement ajustée à 0,28 M. La fraction riche en Facteurs IX, Il et X est éluée par nouvelle augmentation de la concentration saline du tampon chromatographique, celle-ci étant portée entre 0,34 et 0,38 M de chlorure de sodium, et préférentiellement 0,36 M, le pH étant ajusté à 8,0. On y ajoute un stabilisant de l'activité coagulante du Facteur IX, qui est spécifiquement de la lysine. La fraction en question est, après concentration à 10-15 g/l, éventuellement soumise à un traitement d'inactivation virale, puis est ensuite diluée. Le Facteur IX est alors purifié par mise en oeuvre d'une chromatographie d'affinité permettant la séparation en particulier des Facteurs II et X. De bons résultats de purification sont obtenus par utilisation d'une résine chromatographique sur laquelle est greffée de l'héparine. Après injection de la fraction protéique, on récupère un filtrat renfermant en particulier le Facteur II, qui peut être éventuellement utilisé pour fabriquer de la thrombine Par augmentation de la concentration saline et, plus précisément, en ajustant la quantité de chlorure de sodium dans la gamme 0,23 i 0,27 M et plus favorablement 0,25 M, on élue une fraction riche en Facteur X. Enfin, en portant la concentration en NaCl à une dose de l'ordre de 0,43 - 0,47 M, et préférentiellement 0,45 M, on élue une fraction riche en Facteur IX. Pour favoriser la stabilité du Facteur IX, il est avantageux de prévoir un ou plusieurs stabilisants qui le protègent d'une dégradation et évitent la perte de l'activité coagulante. Ces stabilisants sont préférentiellement ajoutés au tampon d'élution. Parmi divers produits évalués, l'arginine s'est révélée particulièrement efficace pour stabiliser le Facteur IX. L'arginine est avantageusement utilisée à une dose minimale de 1 g/l, par exemple comprise entre 1 et 5 g/l. Le Facteur IX est aussi judicieusement protégé par le biais de l'adjonction d'un autre stabilisant,sitot son élution de la colonne chromatographique. Le stabilisant utilisé dans l'éluat est très préférentiellement la lysine qui donne des résultats satisfaisants dans la protection du Facteur IX à la lyophilisation. La concentration en lysine doit etre au moins de 0,5 g/l, par exemple comprise entre 0,5 et 2 g/l. La fraction de Facteur IX est ensuite concentrée jusqu'à une teneur en protéines de l'ordre de 5-10 g/l puis répartie et lyophilisée. Le produit ainsi obtenu est utilisé dans le traitement des troubles hémorragiques des hémophiles B. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE On obtient le surnageant de cryoprécipité par décongélation et centrifugation à 0-20C de plasma frais congelé. Le surnageant de cryoprécipité est ensuite dilué au 1/3 par de l'eau osmosée. Après filtration, le surnageant de cryoprécipité est additionné de lUI/ml d'héparine (concentration finale) et injecté sur une colonne de DEAE-Sépharose CL-6B (Pharmacia) équilibrée par un tampon phosphate à pH 6,0. Récupération du filtrat chromatogranhique Le filtrat chromatographique est collecté et récupéré pour purification de l'albumine, des immunoglobulines, et de l'antithrombine III en particulier. Récupération de la fraction riche en alpha-1-antitrypsine Par élution dans un tampon phosphate additionné de 0,16 M de NaCl à pH 6,0, on récupère une fraction enrichie en alpha-1-antitrypsine qui peut être purifiée par chromatographie sur Séphacryl S-200 (Pharmacia). Récupération de la fraction de proconvertine Par élution au chlorure de sodium 0,19 M dans le tampon 6 mM phosphate et en présence de 5 mM de citrate de sodium, on collecte la fraction riche en proconvertine. La fraction est additionnée d'antithrombine III à une concentration finale de 1 UI/ml, puis ultrafiltrée. Le taux d'héparine est ajusté à 5 UI/ml puis, on ajoute du sorbitol à concentration finale de 65 % (poids/volume). On effectue l'inactivation virale par chauffage à 600C à l'état liquide. Après diafiltration pour éliminer le sorbitol et ajuster la teneur en protéines à environ 30 g/l on met le concentré en flacons de 50 mol, à raison de 20 ml par flacon, et on lyophilise. L'analyse du concentré ainsi obtenu révèle que la proconvertine y est présente à une activité de l'ordre de 25 Ul/mi pour une activité spécifique comprise généralement entre 0,8 et 1,1 UI/mg de protéine. On y confirme également l'absence des facteurs de coagulation II, IX et X, qui contribueraient à accroître la thrombogénicité du produit, et celle de la protéine C. Le faible pouvoir thrombogénique du produit est d'ailleurs corroboré par des tests "in vitro" (NAPTT, TGT 50) et "in vivo" (dose efficace 50 chez le lapin supérieure à 500 UI/kg contre environ 30 à 60 UI/kg pour le PPSB). Les caractéristiques du produit établissent qu'il apporte un bénéfice significatif dans les traitements anti-hémorragiques des malades présentant un déficit en proconvertine. Récupération de la fraction de Protéine C et de Protéine S La fraction en question est désorbée de la colonne de DEAE-Sépharose par passage du tampon phosphate en présence de 5 mM de citrate de sodium, à un pH de 6,0, contenant 0,28 M de chlorure de sodium. L'éluat se caractérise par son contenu suivant Protéine C (UI/ml) : 5 Protéine S (UI/ml) : 5 Isolement des fractions de Facteur II et Facteur X et préparation du concentré de Facteur IX Cette fraction est éluée par injection du- tampon phosphate-citrate préalablement mentionné, mais ajusté à pH 8,0 et renfermant du chlorure de sodium 0,36 M. On y adjoint 1 g/l de lysine, puis on la concentre à un taux de protéines de l'ordre de 10 g/l. L'osmolarité du produit se situe vers 500 mosm. Le taux d'activité coagulante en Facteur IX est de l'ordre de 30 à 40 UI/ml. A ce stade, la fraction peut être utilisée ainsi ou stockée sous forme congelée à -350C. Elle est alors, si nécessaire, décongelée à 370C au bain-marie puis, dans tous les cas, diluée de moitié par un tampon citrate 20 mM, pH 7,4. Avant dilution elle est soumise à un traitement d'inactivation virale. Le mélange est alors injecté sur une colonne renfermant un gel chromatographique d'héparinesépharose équilibré dans le tampon citrate 20 mM, pH 7,4. On récupère alors un filtrat contenant le Facteur II. Le gel est soumis à un lavage par le tampon citrate enrichi en NaCl 0,25 M ; le Facteur X s'élue alors. Par élution plus poussée par le tampon renfermant du chlorure de sodium 0,45 M et supplémenté par 3,5 g/l d'arginine comme stabilisant, on récupère la fraction très enrichie en Facteur IX. Dès son élution, on y ajoute, en tant que stabilisant de lyophilisation, de la lysine à raison de 1 g/l, éventuellement de l'héparine au taux final de 5 UI/ml, puis le produit est concentré par ultrafiltration, filtré, stérilisé et lyophilisé. Les caractéristiques biochimiques moyennes du produit sont indiquées ci-dessous Solubilité (min à 200C) 1 Protéines (g/l) 5,0 Facteur IX : C (UI/ml) 30 Activité spécifique Facteur IX (UI/mg) 7 Facteur VII : C (UI/ml) 0,1 Facteur II : C (UI/ml) 0,2 Facteur X : C (UI/ml) 1 Grâce aux stabilisants, le taux de Facteur IX est , après reconstitution, stable au moins 2 heures à température ambiante ; sans stabilisant, une perte de 50 % est enregistrée. L-es études chez l'animal (test de Wessler chez le lapin) révèlent une activité thrombogénique beaucoup plus faible que celle du PPSB : DE 50 supérieure à 450 UI/kg pour le concentré de Facteur IX contre 30 à 60 UI/kg dans le cas du PPSB. Les tests de dépistage du Facteur IX activé sont négatifs, de même que ceux des kallicréines, de la plasmine et du Facteur Xa, comme souhaité pour un tel produit., à vocation non-thrombogénique. Les contaminants majeurs du PPSB, à savoir le composant C4 du complément, l'inter-alpha-trypsine inhibiteur et le kininogène de haut poids moléculaire sont absents du concentré de Facteur IX, ou n'y sont présents qu'à l'état de traces. Le rapport du Facteur IX coagulant sur le Facteur IX antigène (Facteur IXc/Facteur IXa) est de 0,8, soit une valeur qui traduit l'absence de dénaturation de la molécule. Par ailleurs le rapport du Facteur IXc aux Facteurs IIc, Xc et VIIc est supérieur à 15. Les premières études chez l'homme n'indiquent lors de l'injection, aucune réaction d'intolérance. Les dosages de Facteur V, fibrinogène, plaquettes sanguines n'indiquent aucune variation traduisant une quelconque thrombogénicité du produit. La récupération et la demidurée de vie du Facteur IX (de l'ordre de 30 heures) n'indiquent aucune différence significative avec le PPSB. L'usage de ceconcentré de Facteur IX à une dose de 20 à 50 UI/kg toutes les 12 heures en fonction de la gravité de l'hémorragie apporte un mieux significatif et une sécurité accrue lors du traitement des hémorragies des hémophiles B. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de dérivés plasmatiques caractérisé en ce qu'on soumet un surnageant de cryoprécipité humain à une chromatographie sur résine échangeuse d'anions en présence d'héparine et on sépare un filtrat contenant de l'antithrombine III, des immunoglobulines et de l'albumine et,par augmentation de la force ionique du tampon, quatre fractions enrichies respectivement en alpha-1-antitrypsine (AAT), en proconvertine (Facteur VII), en protéines C et S et en interalpha-trypsine inhibiteur, et, enfin, en facteur antihémophilique B (Facteur IX). 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise l'héparine associée à une résine DEAE-Sépharose. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2,caractérisé en ce que la chromatographie est précédée d'une étape de dilution-filtration. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fraction enrichie en AAT est éluée par un tampon phosphate, citrate et chlorure de sodium à pH légèrement acide. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé -en ce que le tampon comprend 0,13 à 0,17 mole de chlorure de sodium par litre. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fraction riche en proconvertine est éluée par un tampon de phosphate, citrate et chlorure de sodium à pH légèrement acide. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le tampon comprend 0,18 à 0,20 mole de chlorure de sodium par litre. 8.- Procédé selon la revendication 6 ou 7 pour l'obtention d'un concentré de proconvertine purifiée caractérisé en ce qu'on traite la fraction éluée en lui ajoutant de l'héparine et de l'antithrombine III puis du sorbitol et en appliquant un traitement thermique d'inactivation virale. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la teneur en héparine est maintenue entre 5 et 10 UI/ml. 10.- Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le traitement thermique est réalisé à 600C. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'on soumet le produit ayant subi le traitement thermique à une diafiltration puis on le lyophilise. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fraction enrichie en protéine C et protéine S est éluée par un tampon phosphate, citrate et chlorure de sodium à pH légèrement acide. 13.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tampon comprend 0,26 à 0,30 mole de chlorure de sodium par litre. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fraction riche en Facteur IX est éluée par un tampon au phosphate, citrate et chlorure de sodium, de pH légèrement basique. 15.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le tampon comprend 0,34 à 0,38 mole de chlorure de sodium par litre. 16.- Procédé selon la revendication 14 ou 15 pour l'obtention d'un concentré de Facteur IX de haute pureté caractérisé en ce qu'on soumet la fraction éluée à une nouvelle séparation chromatographique utilisant de l'héparine immobilisée. 17.- Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séparation chromatographique est faite après addition de lysine à la fraction éluée. 18.- Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que la séparation chromatographique est faite après une étape de concentration, inactivation virale et dilution de la fraction traitée. 19.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'on ajoute des agents de stabilisation du Facteur IX pour les étapes de concentration, dialyse et lyophilisation et pour stabiliser le Facteur IX lors de la reconstitution. 20.- -Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les agents stabilisants sont ajoutés dans le tampon d'élution. 21.- Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'on ajoute de l'arginine dans le tampon d'élution. 22.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la concentration du tampon en arginine est de 1 à 5 g/l. 23.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que les agents stabilisants sont ajoutés à l'éluat. 24.- Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'on ajoute de la lysine à l'éluat. 25.- Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la concentration de l'éluat en lysine est de 0,5 à 2 g/l. 26.- Concentré de proconvertine, caractérisé en ce qu'il présente une activité spécifique de 0,7 à 1,1 UI/mg de protéine. 27.- Concentré selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il est exempt des Facteurs II, IX et X et des protéines C et S. 28.- Concentré de Facteur IX, caractérisé en ce qu'il présente une activité spécifique du Facteur IXc supérieure ou égale à 5 UI/mg. 29.- Concentré selon la revendication 28, caractérisé en ce que le rapport du Facteur IXc aux Facteurs IIc, Xc et VIIc est supérieur à 15. 30.- Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un dérivé plasmatique obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25. 31.- Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un concentré selon l'une quelconque des revendications 26 à 29.