Brevet FR2619383A1 — publié le 19890217

L'invention a pour objet une famille de protéi- nes, notamment de glycoprotéines, à activité vasculaire, inhibitrices de la prolifération des cellules endothe- liales, en particulier un facteur dérivé des monocytes, un procédé pour l'extraction de ce facteur, et les applications de ces protéines. La régulation de la croissance des cellules vasculaires est un facteur important dans la genese et le développement de l'atherosclerose et de la neoangiogenése. Récemment, on a porté une attention toute particulière aux facteurs de croissance qui stimulent la prolifération des cellules endotheliales. des cellules des muscles lisses et des fibroblastes. On n'a caractérisé qu'un petit nombre de facteurs qui sont capables d'inhiber la prolifération des cellules vasculaires. De nombreux chercheurs ont récemment concentré leur intérêt sur le rôle des monocytes circulants dans la régulation de la croissance des cellules des parois vasculaires. La participation des monocytes a de nom- breux processus pathologiques impliquant la paroi des vaisseaux sanguins tels que la vascularite. l'athe- rosclérose, l'inflammation et les métastases cancéreuses a été récemment signalée (références 1 et 2). Les fac- teurs de régulation de la croissance tiennent des rôles importants dans de tels cas. Des facteurs favorisant la croissance, dérivés des monocytes MDGF (Monocyte-derived Growth Promoting Factors) ont été isolés et caractérisés (références 3 à 11). Les résultats des travaux préliminaires du demandeur (référence 12) qui sont en accord avec les résultats obtenus par Kahaleh et coll. (référence 13),montrent qu'outre les facteurs favorisant la croissance, les monocytes peuvent également produire des facteurs inhibiteurs. Le demandeur a en particulier établi que les monocytes humains normaux produisent un facteur inhibiteur de la prolifération des cellules endothé- liales humaines, auquel il a donné le nom de MECIF (Monocyte-derived úndothelial Cell inhibitory Factor: facteur lnhlbiteur des cellules endothellales, dérivé des monocytes). Le demandeur a maintenant mis au point un procede d'extraction permettant d'obtenir le MECIF a un degré de pureté tel qu'il a éteé possible de l'analyser. Selon l'un de ses aspects. l'invention a pour objet un procéde pour l'extraction d'un facteur inhibl- teur des cellules endotheliales, dérivé des monocytes ou MECIF. caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant a: 1') cultiver des monocytes humains normaux, 2') faire passer le surnageant de culture filtre à travers une colonne en polysaccharide réticulé, équilibree à pH 8 environ. 3') faire passer ensuite ce surnageant à travers une colonne de gel d'agarose phényle et réticulé, équilibrée a pH 8 environ, en développant avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonlum. 4') faire passer les fractions actives obtenues sous 3') à travers une colonne du type de celle utilisée sous 2'). équilibree à pH 8 environ. ') faire passer l'éluat obtenu sous 4') à travers une colonne échangeuse d'ions de type diéthylamino- éthylee (DEAE), en développant avec un gradient croissant de chlorure de sodium. 6') faire passer les fractions obtenues sous 5') à tra- vers une colonne de chromatographie d'exclusion basse pression, équilibrée au moyen d'un milieu de culture de cellules, et 7') recueillir le produit purifié, éventuellement après avoir soumis les fractions actives obtenues sous 6') à une chromatographie liquide haute pression. Les monocytes humains normaux sont isolés du sang, soit par centrifugation différentielle, soit par cytaphérése puis par adhésion sélective dans des boltes de plastique recouvertes ou non de fibronectine. Le détail de cette technique est décrit dans la partie expérimentale qui suit. Les monocytes sont avantageusement cultivés pendant environ 24 heures. La colonne en polysaccharide réticulé peut être par exemple du type de celle commercialisée sous la dénomination Sephadex G-25 par la Société Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Suede). La colonne de gel d'agarose phényle et réticulé peut être par exemple du type de celle commercialisée sous la dénomination Phenyl Sepharose CL 4B par la même société Pharmacia. La colonne échangeuse d'ions de type DEAE peut être par exemple celle commercialisée sous la dénomi- nation DEAE-Trisacryle LS par la Sociéte IBF (Genne- vllilers, France). La colonne de chromatographie d'exclusion basse pression peut être par exemple celle commercialisée sous la dénomination Trisacryle GF-05. par la même société IBF. La chromatographie liquide haute pression (HPLC) peut être effectuée sur une colonne commercialisée sous la dénomination TSK-250 par la Société BRo-Rad (Munich, RFA). Un exemple détaillé. non limitatif, de mise en oeuvre de ce procédé est donné dans la partie expéri- mentale du présent mémoire, pour mieux l'expliquer encore. Selon une variante, le MECIF peut être isolé à partir de surnageants de lignées cellulaires leucémiques monocytoïdes comme la lignée HL 60 (référence 14), après stimulation par l'acide rétinoïque ou mieux encore par le DMSO. Le MECIF et ses dérivés dont il sera question plus loin peuvent également être obtenus par les techni- ques du génie génétique, à partir de la séquence pepti- dique connue, avec isolement de l'ARN correspondant. m L'analyse du MECIF purifié obtenu a permis d'établir qu'il s'agit d'une glycoprotéine de masse moléculaire apparente de 64-70 kd. Cette glycoprotéine comporte 568 résidus d'acides amines qui se repartissent selon les propor- tions approximatives suivantes: Asp: 80: Thr: 23.06: Ser: 29,40; Glu: 56, 5; Pro: 27,70: Gly: 38.98: Ala: 42.88 Val: 36.16: Met: 4,83: Ile: 18,79 Leu: 50,92 Tyr: 20,15; Phe: 27.16: GlcNH2: 3,10: Lys: 60.87 His: 13,81: Arg: 27,60. Sa séquence peptldique N-terminale est: Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser- ou X et Y, qui peuvent être identiques ou différents. représentent chacun Trp ou Asp. Cette glycoprotéine comporte des sucres aminés et des sucres non aminés. Elle peut être conservée à 4'C pendant 2 mois ou, pour des périodes plus longues, à -80'C ou sous forme lyophilisée. La glycoprotéine ainsi definie constitue un autre objet de l'invention. L'invention a également pour objet une protéine, de préférence glycosylee, de poids moléculaire compris entre environ 0.6 et 200 kd, comportant la sequence: -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe- De préférence, cette sequence est N-terminale. De préférence encore, la séquence en question est: -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser- o X et Y, qul peuvent être ldentiques ou différents, représentent chacun Trp ou Asp. X et Y sont de préférence différents et, de préference encore, X représente Trp et Y représente Asp. Une telle protéine est avantageusement préparée par mise en oeuvre des techniques classiques du génie génétique. Le MECIF est actif sur les cellules endothé- lhales humaines a des concentrations de l'ordre du picogramme par millilitre et est peu actif sur les cellules endotheliales de porc. Il ne modifie pas de manière sensible la croissance des cellules des muscles lisses. des arteres humaines, ni des fibroblastes de peau adulte ou des fibroblastes de poumon embryonnaire. Sur les cellules endotheliales humaines son action est détectable après 6 heures de contact. Elle atteint un plateau au bout de 12 heures et est stable 48 heures. Son action est partiellement réversible (50 %) par l'addition d'un facteur de croissance (ECGF: Endothellal Cell Growth Factor: facteur de croissance des cellules endotheliales). Le MECIF n'est pas cytotoxique a la concen- tration de 5 mg/ml. Le MECIF et les (glyco)proteines en dérivant, définies ci-dessus, possédant les mêmes propriétés, peuvent être transformés, en présence d'adjuvants et/ou excipients usuels, en formes galéniques destinées à l'application locale cutanée, à l'injection intra- articulaire, à l'injection sous-cutanée ou à la perfu- sion intraveineuse, ou en collyre, notamment. Le MECIF et ses dérivés possédant les mêmes propriétés peuvent être utilisés en thérapeutique. notamment: - en ophtarmologie dans le traitement des rétinopathies diabétiques, de la néovascularisation, de la degénérescence maculaire sénile: - dans le traitement de la maladie vasculaire périphé- rique ou artérite, dans la prévention de l'obstruc- tion des prothèses par prolifération endotheliale: - dans le traitement de la maladie veineuse pour empê- cher la prolifération des neocapllaires, dans le traitement de la maladie veineuse des membres inférieurs et de la couperose: - dans le traitement de la maladie vasculaire tumorale: anglomes avec prolifération vasculaire, syndrome de Kaposl, néoanglogenése tumorale (tumeurs solides, reins, foie...): - dans le traitement de la maladie inflammatoire: arthrite rhumatoide. La forme d'administration et la dose dépendent essentiellement de la maladie a traiter, d'une part et des caractéristiques particulleres du patient, d'autre part. Elles peuvent être déterminees par l'Homme du métier sur la base de ses connaissances usuelles. En outre, le MECIF peut être utilisé pour produire, selon des techniques usuelles, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques qui peuvent être utilisés pour déterminer les taux de MECIF dans la pathologie vasculaire et tumorale, rhumatismale et inflammatoire. Pour ce faire, on peut avantageusement avoir recours a la technique ELISA, notamment telle que décrite à la référence 15. Les dérivés du MECIF décrits plus haut peuvent également être utilisés pour produire des anticorps. La description détaillée qui suit d'un exemple d'extraction du MECIF et de son étude physico-chimique et pharmacologique est destinée a mieux expliquer l'invention sans en limiter la portée. PARTIE EXPERIMENTALE I. Préparation d'un surnageant de culture de monocvtes: On utilise un échantillon de sang humain complet citrate provenant de donneurs normaux en bonne santé. les cellules mononucléées sont d'abord séparées par centrifugation à gradient de densité puis les monocytes sont isoles par une méthode d'adhésion sélective. c'est- a-dire en ensemencant les cellules mononucleéées sur des boltes de culture en matière plastique (référence 16). Les cellules mononuclééeees ayant adhére récupérées apres cette mise en oeuvre sont constituées par 95 3 % de monocytes. selon la détermination effectuée par colo- ration spécifique a l'esterase et marquage des cellules par des anticorps monoclonaux spécifiques pour les monocytes et les lymphocytes (référence 16). La conta- mination par des plaquettes est comprise entre 5 et 10 plaquettes par monocyte. Les monocytes sont ensuite incubés dans du milieu de culture M-199 provenant de la société GIBCO. additionné de 2.5 % de sérum de veau foetal (FCS) pendant 24 heures à 37'C dans une atmosphère à 5 % de C02. A la fin de cette période. le surnageant de culture est recueilli et filtré au moyen d'un filtre de 0.2 p de porosité. Toutes les étapes qui précèdent sont mises en oeuvre dans des conditions stériles. Note: Les effets de différents produits chimiques sur la production du MECIF ont été étudiés en ajoutant ces produits aux monocytes au debut de l'incubation. II. Purification de la protéine: Matériels Les supports de chromatographie, à savoir le Sephadexe G-25, la Phényl Sepharosee CL4B proviennent de Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Suède), le DEAETrisacryle LS et le TrTsacryle GF-05, proviennent d'IBF (Gennevilliers, France) et la colonne HPLC TSK-250 provient de Bio-Rad (Munich, RFA). Tous les produits chimiques utilisés sont de qualité "réactif". A chaque étape du processus de purification, chaque fraction est testée en triple exemplaire dans l'essai de prolifération des cellules endothéllales pour détecter la fraction contenant l'activité inhibitrice. Dans des essais séparés, on fait passer plu- sieurs portions d'un litre de surnageant de culture de monocytes a travers une colonne de Sephadex G-25 (4,4 X cm) qui est équilibrée avec du tampon Tris 10 mM, pH 8,0. Les fractions actives rassemblées sont ensuite traitées par du sulfate d'ammonium solide a 30 % de sa- turation et, après avoir été centrifuge, on fait passer ensuite le surnageant à travers une colonne de Phényl Sépharose (3.2 X 33 cm) équilibrée avec du tampon Tris mM, pH 8,0 contenant du sulfate d'ammonlum a 30 % de saturation. Apres mise en place de l'échantillon et rinçage adéquat avec du tampon d'équilibrage, la colonne est développée au moyen d'un gradient linéaire de sulfate d'ammonium allant de 30 jusqu'à 0 %, dans du tampon Tris 10 mM, pH 8,0. Les fractions actives sont rassemblées et on les fait passer a travers une colonne de Sephadex G-25 comme décrit plus haut, avant de faire une séparation supplémentaire au moyen d'une colonne de DEAE Trisacryl-LS (1,5 X 8 cm) avec un gradient linéaire de NaCl allant de 0 jusqu'à 1 M dans du tampon Tris 10 mM, pH 8,0. Avant d'être examinées en ce qui concerne leur activité biologique sur les cellules vasculaires en culture, toutes les fractions de chromatographie doivent être passées à travers une colonne de Trisacryl GF-05. (2,4 X 10 cm). équilibree avec un milieu de culture, à savoir du tampon de Hanks (provenant de l'Institut Pasteur, Paris, France). Le facteur de purification final jusqu'à la chromatographie sur la colonne de GF-05 est de 570 fois. Pour vérifier que la protéine lsolee après les chromatographies sur colonnes DEAE et GF-05 représente la protéine MECIF et pour déterminer le poids moléculaire de cette protéine, la fraction active est ensuite soumise a un autre processus de chromatographie sur une colonne HPLC TSK-250 et analysée par électrophorèse SDS PAGE (Sodlum Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis: électrophoresis dodécylsulfate de sodium - gel de polyacrylamide). La concentration en protéine est déterminée sur la fraction pure au moyen de la composition en amino-acides et par mesure à l'auto-analyseur. La composition en amino-acides donnée plus haut est déterminee a l'aide d'un séquenceur. L'analyse à l'autoanalyseur d'un échantillon du produit a permis de déterminer les concentrations suivantes en amino-acides (valeurs en picomoles): Asp: 20.079; Thr: 5.79; Ser: 7.38: Glu: 14,18: Pro: 6,95: Gly: 9,78 Ala: 10,764: Val: 9.078: Met: 1.212: Ile r 4,716: Leu: 12.781: Tyr: 5,058: Phe: 6.819; GlcNH2: 0,778: Lys: 15,279: His: 3.48; Arg: 6,92. On en a deduit les nombres approximatifs de résidus de ces différents amino-acides donnés plus haut. III. Essai de culture cellulaire et de prolifé- ration: Des cellules endothéliales vasculaires humaines sont recueillies à partir du cordon ombilical et mises en culture selon une technique décrite précédemment (référence 17). Les fibroblastes de peau humaine et de poumon embryonnaire, sont un cadeau de A. Macielra Coehlo (INSERM U-50, Villejulf, France) et les cellules de muscles lisses femoraux humains sont un cadeau de J. Larrue (INSERM U-8, Pessac, France). Les cellules endo- théliales aortiques porcines ont été fournies par L. Drouet (INSERM U-150, Paris, France). La (méthyl-3H)- thymidine (5 Ci/mmole) provenait du Commissariat à l'Energie Atomique, France. Les cellules vasculaires en culture, marquees à la thymidine, ont été recueillies en utilisant un "collecteur" (harvester) de cellules (Skatron, Lier, Norvège). L'activité biologique du MECIF a été testée en triple exemplaire par incorporation de la (methyl-3H)- thymidine dans l'ADN de cellules vasculaires en culture. Pour ce faire, 12 à 15000 cellules dans du milieu de culture M-199 additionné de 10 % de sérum de veau foetal sont ensemencées dans chaque puits de culture d'une boite multipuits et incubées pendant 24 heures à 37*C en présence de MECIF et sous une atmosphère à 5 % de C02. Les cellules cultivées sont ensuite incubées pendant 16 heures avec de la (méthyl-3H)thymidine (1 pCi/puits). A la fin de cette période, le milieu est élimine et, après exposition a de la collagénase, les cellules sont recueillies sur des filtres en fibres de verre en utill- sant un "collecteur" de cellules. Les cellules endothé- liales humaines et porcines employées pour l'étude de prolifération provenaient de cultures primaires, alors que les cellules de muscles lisses et les fibroblastes provenaient des huitième et treizième passages, respec- tivement. Résultats: Production du MECIF par des monocvtes humains normaux en culture: On a trouvé que les monocytes de sang humain isolés libèrent un facteur appelé MECIF qui peut inhiber la prolifération des cellules endothéliales de la veine 261938 3 ombilicale humaine, comme le montre l'incorporation de la (méthyl-3H) thymidine dans ces cellules. La production du MECIF par les monocytes en culture atteint son maximum après 24 heures d'incubation puis décline après cette période. Toutefois. le MECIF présent dans le milieu après les 24 premières heures pourrait rester stable pendant au moins 72 heures. La production du MECIF est dépendante du nombre de monocytes et des concentrations en protéines du sérum dans le milieu de culture. L'expression maximale du MECIF a été observée lorsque la concentration en sérum de veau foetal dans le milieu de culture des monocytes était de 2,5 %. Pour exclure la possibilité que les cellules contaminantes soient à l'origine de l'expression du MECIF. des milieux de culture de plaquettes ou de lymphocytes aux concentrations normalement trouvées dans la préparation de monocytes ont été testes sur les cellules endotheliales en culture en employant un processus similaire a celui décrit pour les monocytes. Les résultats ont montre au contraire un accroissement de la synthèse d'ADN dans les cellules endothéliales, suggérant ainsi que la production du MECIF est directement attribuable aux monocytes. Le traitement des monocytes en culture par le cyclohexlmide élimine complètement la libération du MECIF dans le milieu de culture. Par ailleurs, le traitement par l'lndométhacine, un inhibiteur de la cyclooxygénase, ne conduit pas a une altération de l'expression du MECIF. Cela suggère la nécessité de la synthèse des protéines, mais non du métabolisme de l'acide arachidonique, pour l'expression du MECIF. L'activation des monocytes par l'endotoxine [LPS (lipopolysaccharide), Escherichia coli. 10 pg/ml] ou par la fMLP (formyl-Méthionyl Leucine Phénylalanine, 0,1 pM) ne favorise pas la production du MECIF. Le stockage d'un milieu de culture contenant du MECIF à 4'C n'a pas d'effet sur la bloactivité et le milieu est stable pendant 5 minutes a 56'C. La bloactivité du MECIF n'est pas neutralisée par l'aprotinine, un inhibiteur de protéase. D'autres observations ont montré que le MECIF n'exerce pas sa bioactivité sur les cellules endothé- liales au moyen d'une cytotoxicité directe, étant donné qu'il ne. provoque pas la libération de 51Cr a partir des cellules endothéliales préalablement marquées. Purification de la Drotéine: Apres l'étape de purification sur Phényl Sépha- rose, l'activité du MECIF sur les cellules endothéliales a été observée dans le pic élue a environ 14 % de sulfate d'ammonium. Les autres fractions présentaient une activité négligeable. L'étape de purification supplémentaire avec le DEAE Trisacryl-LS a séparé le MECIF des autres protéines. La fraction contenant le MECIF a été eéluee dans le premier pic et l'analyse par électrophorèse sur gel a montré qu'il s'agissait d'une bande unique. L'activité de cette protéine a été encore con- firmee telle que présente dans les fractions du pic unique, après avoir subi la chromatographie HPLC TKS- 250. En outre, en faisant passer le milieu de culture de monocytes contenant le MECIF brut a travers la colonne de TSK-250, les fractions actives ont été trouvées dans le même volume les fractions actives provenant de la chromatographie sur DEAE. Des essais pour introduire des chromatographies sur Heparine Sepharose et sur Clbacron Blue F3GA Sepharose dans le processus de purification ont été également effectués. Toutefois, on a trouvé que le MECIF ne pouvait pas être retenu par l'un ou l'autre de ces supports de chromatographie. Propriétés du MECIF Purifié: Comme détermine par électrophorese SDS/PAGE dans- des conditions non réduites et avec coloration par du Bleu de Coumassie. le MECIF purifié après chromato- graphie sur DEAE-Trisacryl LS migre sous forme d'une bande unique large ayant un poids moléculaire apparent de 64 kd. Dans des conditions réduites, il apparalt sous forme de deux bandes avec une bande majeure d'environ 70 kd et une seconde d'environ 68 kd. La chromatographie liquide haute pression par TSK-250 (60 X 0,75 cm) révèle un pic unique correspondant à un poids moléculaire d'environ 66 kd. La coloration du gel d'electrophorèse SDS/PAGE avec du nitrate d'argent ne révèle pas de bandes supplémentaires comme cela avait été observe avec la coloration par le Bleu de Coumassie. La réaction acide périodique- Schiff (PAS) est positive, démontrant que le MECIF est une glycoprotéine. Lorsque le surnageant des monocytes est soumis à une chromatograpie liquide haute pression (sur TSK-250). l'activité inhibitrice se retrouve dans les fractions (poids moléculaire: 66 kd) éluées dans le même volume que l'était le MECIF pur, ce qui montre que le MECIF correspond a l'activité inhibitrice présente dans le surnageant de monocytes. Activité régulatrice de la croissance: On a trouvé que l'inhibition de l'incorporation de la (méthyl-3H)thymidine est dépendante de la concentration du milieu de culture contenant le MECIF. La dilution de ce milieu à partir de sa concentration d'origine jusqu'à 64 fois provoque la diminution de l'effet inhlbiteur de 80 à 30 % par rapport au témoin (n = 15). Une concentratin de 14 pg de MECIF produit un effet lnhlbiteur de 81 2,5 % (X SEM: SEM = erreur standard de la moyenne) vis-a-vis de l'incorporation de la thymidine en présence de sérum de veau foetal (2,5 à %) (n = 16). Les effets régulateurs de la croissance sur les cellules endotheliales vasculaires sont dépen- dants de la concentration en MECIF. Aux mêmes concen- trations, le MECIF n'influence pas de façon marquante l'incorporation de thymidine dans les fibroblastes tant de peau humaine normale (113 5 %, n = 6) que provenant de poumon embryonnaire (128 6 %, n = 8). Dans les mêmes conditions, les cellules de muscles lisses et d'artères humaines ne sont pas affectées (108 8 %, n = 12). Une inhibition de 28 7 % (n = 12) est obser- vée avec les cellules endotheliales porcines mais dans une mesure beaucoup moins importante. Une étude au cours du temps a montre que la synthèse d'ADN est supprimée par le MECIF a partir de 6 heures d'incubation et atteint son plateau après 12 heures d'incubation. De plus, l'effet du MECIF dans l'inhibition de la synthèse d'ADN est parallèle à la réduction de la prolifération de cellules, ce qui a été détermine par des comptages de cellules sous un micros- cope optique. En observant les cellules endotheliales sous un microscope optique, la présence du MECIF dans leur milieu de culture provoque des changements de morpholo- gie des cellules qui prennent une forme allongée. Toute- fois, comme le démontre une étude en immunofluorescence et des observations en microscople électronique à trans- mission, les cellules conservent encore leurs marqueurs spécifiques, c'est-a-dire le facteur de Wîllebrand et les corps de Weibel Palade. DISCUSSION Les résultats présentés dans cette partie expérimentale montrent l'aptitude des monocytes humains normaux en culture a libérer un facteur inhibant la croissance des cellules endothéliales humaines. Cet effet lnhibiteur n'est pas dO à une activité cyto- toxique mais à l'inhibition de la synthèse d'ADN. Le facteur en question. MECIF, est une glycoprotéine ayant un poids moléculaire apparent de 66 kd lorsqu'il est très purifié. L'expression de ce facteur dans les extraits monocytaires bruts est dépendante du nombre des monocytes ensemences dans le puits de culture et sa production implique la synthèse protéique. L'origine monocytaire du MECIF est confirmée par le fait que les cellules contaminantes possibles (pla- quettes, lymphocytes), dans les conditions expérimen- tales utilisées, ne produisent aucune Inhibition mais une faible proportion de lymphocytes ( par les monocytes. On a montré que, de par ses propriétés blolo- giques, le MECIF isolé de l'extrait monocytaire brut est un facteur inhlbiteur actif vis-a-vis de la croissance des cellules endotheliales. De plus, le MECIF provoque l'inhibition de la synthèse d'ADN dans les cellules endothéliales d'une manière dépendante de la dose. La puissance élevee du MECIF est démontrée par son aptitude à exercer ses effets à une concentration aussi faible que 10 pg/ml vis-a-vis de la croissance de 15000 cellu- les. De plus, on a trouvé que le MECIF est spécifique vis-a-vis des tellules. puisqu'il affecte peu la croissance des cellules des muscles lisses humains, des fibroblastes de peau humaine et des cellules endothéliales de porc. Toutefois, ces différentes cellules étaient à des stades différents de réplication et on ne peut par conséquent exclure la possibilité d'une réponse différente au MECIF selon l'age de la cellule. Les effets biologiques du MECIF sur la crois- sance des cellules endotheliales humaines pourraient être partiellement surmontés par la présence de 26 1 9383 quantités croissantes d'agents stimulant la croissance dans le milieu d'essai, tels que l'ECGF (facteur de croissance des cellules endothéliales). La pureté du MECIF en tant que produit a été démontrée par l'apparition d'une bande protéique majeure unique en électrophorése sur gel et également un pic unique après son passage à travers une colonne de chromatographie de filtration sur gel de type chromato- graphie liquide haute performance. * L'analyse par électrophorése sur gel dans des conditions > non réduites montre que la bande protéique majeure a un poids moléculaire apparent de 64 kd. Le MECIF présente des propriétés biologiques et chimiques différentes de celles de tous les.produits régulant la croissance connus, d'origine monocytaire ou macropha- gique, tels que les interférons (réferences 18,19,20), l'interleukine-1 (référence 11). le TNF (référence 21) ou le g TGF (référence 22). D'autres facteurs inhlbiteurs vis-a-vis de la croissance des cellulesendotheliales de différents types cellulaires par leur origine, par exemple le cartilage (référence 23), l'humeur vitrée (référence 24), les plaquettes (référence 25), les cellules endothéliales (références 26 et 27) présentent également des propriétés différentes de celles du MECIF. En résumé, l'ensemble de ces études suggère que le MECIF est un facteur inhlbiteur pour les cellules endothé- liales qul diffère des autres facteurs inhibiteurs caractérisés auparavant (références 28 à 30). Etant donné que l'on savait que les monocytes étaient capables de produire des agents favorisant la croissance des cellules endotheliales, le maintien de l'équilibre entre les facteurs favorisant et les facteurs inhibant la croissance devrait être important dans un grand nombre d'états pathophysiologiques comprenant l'inflammation et l'athérosclérose. De plus, cet équilibre pourrait jouer un rôle déterminant dans la modulation de l'angiogenése qui peut accompagner dans les processus de réparation des tissus, les rétino- pathies diabétiques et la neovascularisation tumorale. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. H. Setiadi, F. Lioté et J.L. Wautier. Monocytes and vascular lesions. Nouv. Rev. Fr. Hematol. (1986). 28. 339-343. 2. P.M. Henson. et R.B. Johnston Jr. Tissue injury in inflammation. Oxidants, proteinases, and cationic proteins. J. Clin. Invest. (1987), 79., 669-674. 3. L. Rifas, V. Shen, K. Mitchell, et W.A. Peck. Macro- phage-derived growth factor for osteoblast-like cells and chondrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984), 81, 4558-4562. 4. S.J. Leibovich, et R. Ross. A macrophage - dependent factor that stimulates the proliferation of fibro- blasts in vitro. Am. J. Pathol. (1976), 84, 501-514. 5. K.C. Glenn, et R. Ross. Human monocyte-derived growth factor(s) for mesenchymal cells: activation of secretion by endotoxln and concanavalin A. Cell. (1981), 25. 603-615. 6. Y. Martinet, P.B. Bitterman, J.F. Mornex, G.R. Grotendorst, G.R. Martin, et R.G. Crystal. Activated human monocytes express the c-sis proto-oncogene and release a mediator showing PDGF-l1ke activity. Nature. (1986), 319, 158-160. 7. P.J. Polverini, R.S. Cotran, M.A. Gimbrone, et E.R. Unanue. Activated macrophages induce vascular proliferation. Nature. (1977), 269, 804-806. 8. G.B. Greenburg, et T.K. Hunt. The proliferative response in vitro of vascular endothelial and smooth muscle cells exposed to wound fluids and macrophages J. Cell. Physiol. (1978), 96, 203-214. 9. R.T. Wall, L.A. Harker, L.J. Quadracci, et G.E. Striker. Factors influencing endothelial cell proliferation in vitro. J. Cell. Physiol. (1978), _fi. 203-214. 10. B.M. Martin, M.A. Glmbrone, E.R. Unanue, et R.S. Cotran. Stimulation of nonlymphoid mesenchymal cell proliferation by a macrophage-derived growth factor. J. Immunol. (1981), 126, 1510-1515. 11. B.S. Ooi. E.P. Mc Carthy, A. Hsu, et Y.M. Ooi. Human mononuclear cell modulation of endothelial cell proliferation. J. Lab. Clin. Med. (1983), 102, 428-433. 12. A. Courillon Mallet, J.L. Wautier, et M.P. Wautier. Monocyte-derived endothelial cell inhibitory factor (MECIF). Sixth InterWashington Spring Symposium, ed. L.L. GALLO (1986). 160 a (abrégé). 13. M.B. Kahaleh, F. De Lustro, W. Bock, et E.D. LeRoy. Human monocyte modulation of endothelial cells and fibroblast growth: possible mechanism for fibrosis Clin. Immunol. Immunopathol. (1986), 39, 242-255. 14. J.L. Wautier, M.P. Wautier. D. Pintigny et coll. Factors involved in cell adhesion to vascular endothellum, Blood cells, (1983),.2. 221-234. 15. E. Engvall et P. Perlmann. Enzyme-linked lmmuno- sorbent assay (ELISA) III: quantification of specific antibodies by enzyme labelled anti- immunoglobulin in antigen coated tubes. J. Immunol. (1972). 109, 129-135. 16. H. Setiadi, J.L. Wautier, A. Courillon Mallet, P. Passa, et J.P. Caen. Increase adhesion to fibro- nectin and Mo-1 expression by diabetic monocytes. J. Immunol. (1987), 138. 3230-3234. 17. J.L. Wautier, D. Pintigny, J. Maclouf, M.P. Wautier, E. Corvazler et J.P. Caen. Release of prostacyclin after erythrocyte adhesion to cultured vascular endothelium. J. Lab. Clin. Med. (1986), 107, 210- 215. 18. R. Friesel, A. Komoriya, et T. Maciag; Inhibition of endothelial cell proliferation by gamma-interferon. J. Cell. Biol. (1987), 104. 689-696. 19. W.E. Stewart, 2nd. Distinct molecular species of lnterferons. Vlrology (1974), 61. 80-86. 20. Y.K. Ylp, B. Barrowclough, C. Urban, et J. Vilcek. The molecular weight of human gamma lnterferon is similar to that of other human interferons. Science (1982), 215, 411-413. 21. L.J. Old. Tumor necrosis factor. Polypeptide mediat- or network. Nature. (1987), 326. 330-331. 22. R.L. Heimark, D.R. Twardzik et S.M. Schwartz. Inhibition of endothelial regeneration by type-beta transforming growth factor from platelets. Science (1986), 233, 1078-1080. 23. H. Brem., et J. Folkman. Inhibition of tumor anglo- genesis mediated by cartilage. J. Exp. Med. (1975) 141, 427-439. 24. L. Raymond, et B. Jacobson. Isolation and identific- ation of stimulatory and inhibitory cell growth factors in bovine vitreous. Exp. Eye. Res. (1982), 34. 267-286. 25. M.T. Brown, et D.R. Clemmons. Platelets contain a peptide inhibitor of endothelial cell replication and growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986), B3, 3321-3325. 26. C.H. Willems, G.C.B. Asteldi, P.G. De Groot, M.D. Janssen, M.D. Gonsalvez, W.P. Zeljlemaker, J.A. Van Mourik, et W.G. Van Aken. Media conditioned by cultured human vascular endothelial cell inhibit the growth of vascular smooth muscle cells. Exp. Cell. Res. (1982), 139, 191-197. 27. J.J. Castellot Jr., L.V. Faveau, M.J. Karnovsky, et R.D. Rosenberg. Inhibition of vascular smooth muscle cell growth by endothelial cell-derived heparin. Possible role of platelet endoglycosidase J. Biol. Chem. (1982), 257., 11256-11260. 28. R. Crum, S. Szabo, et J. Folkman. A new class of steroids inhibits angiogenesis in the presence of heparin or a heparin fragment. Science (1985). 230. 1375-1378. 29. R.L. Heimark et S.M. Schwartz. The role of membrane- membrane interactions in the regulation of endothelial cell growth. J. Cell. Biol. (1985), j100, 1934-1940. 30. B.L. Schumacher, D. Grant, et R. Eisenstein. Smooth muscle cells produce an inhibitor of endothelial ceil growth. Arteriosclerosis. (1985),. 110-115. REVENDICATIONS 1. Protéine, de préférence glycosylée. de poids moléculaire compris entre environ 0,6 et 200 kd, comportant la sequence: -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-. 2. Protéine selon la revendication 1. caracté- risée en ce que ladite séquence est N-terminale. 3. Protéine selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite séquence est: -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser- ou X et Y, qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun Trp ou Asp. 4. Protéine selon la revendication 3, caracté- risee en ce que X et Y sont différents et en ce que de préférence X représente Trp et Y représente Asp. 5. Glycoprotéine de masse moléculaire apparente 64-70 kd. comportant 568 résidus d'acides aminés. qui se répartissent selon les proportions suivantes: Asp: environ 80: Thr: environ 23.06: Ser: environ 29,40: Glu: environ 56.5: Pro: environ 27,70: Gly: environ 38.98: Ala: environ 42.88: Val: environ 36,16: Met: environ 4,83: Ile: environ 18,79; Leu: environ 50.92: Tyr: environ 20.15: Phe: environ 27,16: GlcNH2: environ 3.10: Lys: environ 60.87; His: environ 13.81: Arg: environ 27.60, et qui présente la séquence peptidique N-terminale: Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser- o X et Y, qui peuvent être ldentiques ou différents, représentent chacun Trp ou Asp. 6. Glycoproteine selon la revendication 5, caractérisee en ce que sa masse moléculaire apparente est de 66 kd. 7. Procéde pour l'extraction de la glycoprotéine selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: 1) cultiver des monocytes humains normaux, 2') faire passer le surnageant de culture filtré a travers une colonne en polysaccharide réticulé, équilibree a pH 8 environ, 3') faire passer ensuite ce surnageant à travers une colonne de gel d'agarose phenylé et réticulé, équilibree a pH 8 environ, en développant avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonlum, 4') faire passer les fractions actives obtenues sous 3') à travers une colonne du type de celle utilisée sous 2'). équilibrée a pH 8 environ. ') faire passer l'éluat obtenu sous 4) à travers une colonne échangeuse d'ions de type diéthylamino- éthylee (DEAE), en développant avec un gradient croissant de chlorure de sodium, 6') faire passer les fractions obtenues sous 5') à tra- vers une colonne de chromatographie d'exclusion basse pression, equilibree au moyen d'un milieu de culture de cellules, et 7') recueillir le produit purifié, éventuellement après avoir soumis les fractions actives obtenues sous 6') à une chromatographie liquide haute pression. 8. Médicament, caracterisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, au moins une (glyco)protéine selon l'une des revendications 1 à 6. 9. Utilisation de la glycoprotéïne selon la revendication 5 ou 6 pour la préparation d'anticorps. 10. Utilisation de la proteine selon l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation d'anticorps.