Brevet FR2614790A1 — publié le 19881110

DESCRIPTION: La présente invention concerne une nouvelle composition ophtalmologique dont le principe actif est l'acide eicosapentaénoique. L'expression "acide eicosapentaénoique" (appelé ci-après en abrégé "EPA") désigne l'acide cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaénoique répondant à la formule G z COOH L'EPA est un acide gras polyinsaturé connu provenant de la chaine alimentaire marine et servant de précurseur pour les familles de la prostaglandine-3 et du thromboxane-3. Il diffère de l'acide arachidonique par l'introduction d'une double liaison supplémentaire entre les atomes de carbone en positions 17 et 18. L'invention concerne une composition ophtalmologique comprenant une suspension d'EPA dans une alcoyl-cellulose et/ou une hydroxyalcoylcellulose en sollution aqueuse. L'EPA est présent, de préférence, en une quantité de 0,5 à 3%, mieux encore, à raison de 1%. La méthyl-cellulose et l'hydroxypropyl-cellulose sont respectivement l'alcoyl- - 2 - cellulose et l'hydroxyalcoyl-cellulose préférées et la solu- tion de cellulose est, de préférence, une solution à 0,5 %. L'intérêt de la composition ophtalmologique suivant la présente invention est illustré par 1' expérimentation suivante effectuée en utilisant des compositions ophtalmologiques contenant l'acide eicosapentaénoique sur des yeux de lapins. EXPERIMENTATION On a effectué cette expérimentation sur des lapins chinchillas pigmentés males pesant 2,0-2,5 kg. Initialement, on a examiné tous les yeux avec une lampe à fente. Seuls les animaux ne présentant aucun signe d'inflammation oculaire ont été retenus pour l'étude. On a procédé à l'immunisation des lapins pigmentés par injection de 20 pl d'albumine de sérum humain exempte de pyrogènes (HSA, solution à 20 %) dans la cornée des deux yeux, suivant le procédé de Morawiecki, après anesthésie cornéenne avec de l'oxybuprocaîne à 0,4 % et sédation par "Hypnorm" (marque commerciale déposée; fluanison 10 mg/ml et citrate de phentanyle 0,2 mg/kg du poids du corps). Les résultats ont été évalués en mesurant la formation d'oedème cornéen et en déterminant les acides gras présents dans les tissus cornéens. a) Mesure de la formation d'oedéme cornéen On a traité les yeux de lapins avec des suspensions d'acides gras préparées avec de l'hydroxypropylcellulose à 0,5 % comme véhicule. On a préparé ces suspensions immédiatement avant l'application. Les témoins ont été traités uniquement avec le véhicule. On a commencé le traitement avec les préparations d'acides gras (une goutte 2 6 1 4 7 9 0 -3- oculaire de 30 pl trois fois par jour, instillée dans le sac conjonctival) huit jours après l'immunisation et on a poursuivi le traitement pendant la durée des expériences. On a évalué la kératite des yeux de lapins en mesurant la formation d'oedème cornéen, la néovascularisation et l'apparition d'une infiltration leucocytaire annulaire dans la cornée (anneau de Wesseley). Ces trois paramètres de l'inflammation cornéenne peuvent étre très bien observés in vivo. L'observation clinique a été organisée suivant un mode à double masquage et, pour chaque animal, on a établi la moyenne des valeurs obtenues pour les deux yeux. On a évalué l'aspect de la cornée en comptant le nombre de jours au cours desquels des anneaux opaques ou une cornée diffuse complètement opaque étaient visibles, ainsi que le nombre de jours au cours desquels les vaisseaux étaient visibles dans la cornée. Pour ces mesures, on a utilisé une lampe à fente "Haag-Streit" avec un pachymètre équipé de lampes à fixation centrale suivant Mishima et Hedbys. Pour chaque oeil, on a pris la moyenne de trois mesures. On a mesuré l'épaisseur cornéenne centrale avant et aux 7e, 9e, 11e, 14e, 16e, 18e, 20e, 23e et 27ème jours après l'injection intrastromale de HSA. Pour chaque animal, les différences entre les mesures pachymétriques avant et après l'injection intraoculaire de HSA ont été considérées comme de l'oedème (= à épaisseur cornéenne). b) Détermination des acides gras présents dans les lipides du tissu cornéen après traitement topique avec l'acide eicosapentaénoique ou l'acide colombinique On a donné, à trois groupes de quatre lapins ayant des yeux non enflammés, trois fois par jour, pendant quatre jours, une goutte oculaire de 30 pl du véhicule (hydroxypropyl-méthyl cellulose à 0, 5 % dans de l'eau) ou - 4 - d'une suspension d'acide colombinique à 3 % ou d'acide eicosapentaenoique à 1 % dans le véhicule. On a tué les lapins en utilisant une dose excessive de penthothal, le cinquième jour, quatre heures après leur avoir donné une dernière dose (par voie topique) d'acide eicosapentaénoique ou d'acide colombinique. En utilisant un trépan de 14 mm, on a disséqué les cornées de l'oeil énucléé intact. On a lavé quatre fois les cornées dans une solution salée pour empêcher la contamination, dans le procédé analytique, avec les acides gras appliqués par voie topique. Dans chacun des trois groupes d'animaux, on a réuni séparément les yeux droits et gauches en vue de l'analyse des acides gras. On a ajouté un volume de méthanol aux échantillons réunis et on les a conservés à -60 C jusqu'à l'anlyse biochimique. On a extrait les lipides des tissus cornéens avec un mélange 2:1 de chloroforme/méthanol. On a concentré la couche de chloroforme avec un courant d'azote et on a transestérifié le résidu avec de l'acide chlorhydrique méthanolique, pendant deux heures à 65 C. Après extraction avec un mélange 50/50 d'hexane/éther diéthylique et évaporation du solvant avec un courant d'azote, on a soumis les esters d'acides gras à une chromatographie sur des colonnes de silice avec un mélange 90:10 d'hexane/éther diéthylique. On a soumis les esters méthyliques d'acides gras à une analyse par chromatographie gaz/liquide après élimination du solvant avec un courant d'azote. On a utilisé un chromatographe gazeux HP 5880 équipé d'un préleveur automatique (7672 A, Hewlett-Packard) et d'un détecteur FID en utilisant une colonne capillaire en verre WCOT (CP SIL 88, longueur = 25 cm, diamètre intérieur = 0,22); température d'injection 225 C, détection à 350 C, programmation de 110 à 186 C à raison de 2 C/minute et -- 5 -- maintien pendant 10 minutes à la température finale. Analyse statistique On a analysé les données par des procédés non paramétriques pour éviter les hypothèses à propos de la répartition des variables en cause. On a pratiqué l'essai de classement par rangs marqués d'un signe de Wilcoxon pour les données pachymétriques moyennes obtenues à différents moments dans les groupes traités et non traités au cours de la période d'inflammation et l'on s'est servi de l'essai U de Mann- Whitney pour l'analyse de la durée de la néovascularisation et de l'opacification cornéenne dans les yeux traités et non traités à n'importe quel moment donné. La signification de la différence est indiquée pour deux observations se suivant de près, les valeurs P inférieures à 0,05 étant considérées comme significatives. RESULTATS Yeux non traités L'aspect de la kératite dans les yeux traités avec le véhicule était le suivant: une semaine à dix jours après l'injection intracornéenne de HSA, l'opacification de la cornée a débuté au limbe et aux 14ème-17ème jours environ, est apparu un anneau blanc d'opacification connu sous le nom d'anneau de Wesseley. L'anneau est apparu pendant un à huit jours. Au cours d'un intervalle de deux à quatre jours, la vascularisation de la cornée a débuté à partir du limbe, elle s'est poursuivie à peu près jusqu'aux 22ème-25ème jours, puiselle a régressé rapidement pour donner lieu, dans tous les cas, à une cornée claire, 30 jours après l'injection de HSA. Tous les animaux ayant reçu une injection de HSA ont -6- répondu par la formation d'un anneau blanc et une néovascularisation. La formation de l'oedème cornéen enregistrée par pachymétrie a commencé aux environ du 7ème jour et a duré jusqu'au 30ème jour. Yeux traités avec des acides gras Chez des lapins traités avec EPA, l'acide colombinique, l'acide DHGL (=acide dihomo--y-linolénique) et l'acide 7-linolénique, la période d'opacification cornéenne a été nettement plus courte comparativement aux témoins. La croissance des vaisseaux a été fortement diminuée après traitement avec l'EPA, l'acide colombinique et l'acide 1-linolénique (tableau I). Ces substances, de même que l'acide DHGL, ont également inhibé de façon significative la formation d'oedème cornéen. L'application topique d'acide arachidonique n'a ni accru, ni réduit la réponse inflammatoire (tableau I). OPACITE CORNEENNE, CROISSANCE DES VAISSEAUX ET FORMATION D'OEDEME AU COURS DE LA KERATITE IMMUNOGENE Durée de Durée de la Pachymétrie, l'opacité néovascularisation zone sous la cornéenne cornéenne courbe (% com- (jours) (jours)* parativement aux témoins) Témoins (n=16) 6,7 + 0,5 7,2 + 0,8 100 + 13 Acide colombinique 3% 3,7 + 0,7*** 3,7 + 0,7** 47 + 10++ (18:2 n-6 trans) (n=8) Acide eicosapentaénoique 1% 3,3 + 0,5*** 4,3 + 0, 8* 60 + 11++ (20:5 n-6) (n=8) Acide dihomo-y-linolénique 1% 3,9 + 0,5** 4, 9 + 0,9 70 + 15++ (20:3 n-6) (n-8) Acide Y-linolénique 1% 4,6 + 0,5* 4,8 + 0,6** 71 + 12++ (18:3 n-6) (n=8) Acide arachidonique 1% 5,3 + 1,0 6,4 + 1,0 97 + 21++ (20:4 n-6) (n=8) : moyenne + erreur type de la moyenne La signification de la différence vis-à-vis des témoins pour la durée de l'opacité cornéenne et de la croissance des vaisseaux a été calculée en adoptant l'essai U de U de Mann-Whitney. * p moments au cours de l'inflammation ont été évaluées, en ce qui concerne leur signi- fication, en adoptant l'essai de classement par rangs marqués d'un signe de Wilcoxon. Acides gras présents dans les lipides du tissu cornéen après traitement topique avec l'acide eicosapentaénoique ou l'acide colombinique Après un traitement topique de quatre jours, on a constaté, chez les animaux traités à l'EPA, l'apparition de 1,8 % d'EPA (20:5 n-3) et de 2,5 % de son métabolite 22:5 n-3 dans les phospholipides cornéens (voir tableau II). Chez les animaux traités à l'acide colombinique, on a constaté l'apparition de 5,6 % de cet acide gras dans les phospholipides cornéens. Apres traitement à la fois avec l'EPA et l'acide colombinique, la teneur en acide arachidonique (20:4 n-6) a diminué et, en outre, la métabolisation de l'acide arachido- nique jusqu'à 22:4 n-6 a été partiellement inhibée (1,9 %, respectivement 2,5 %, 22:4 n-6) chez les animaux traités comparativement à 3 % chez les animaux témoins. De même, la teneur en acide oléique (18:1) a diminué et la teneur en acide palmitique (16:0) a augmenté dans les phospholipides cornéens des animaux traités à l'EPA et à 1' acide colombinique. La quantité totale d'acides gras libres était de 4 % de la quantité d'acides gras liés aux phospholipides. L'acide colombinique et l'EPA étaient présents dans la fraction d'acides gras libres, mais la teneur en acides gras de ce type était faible comparativement à la fraction liée aux phospholipides. DISCUSSION Les acides gras que sont l'acide colombinique, l'acide eicosapentaénoique et l'acide 7-linolénique, sont efficaces pour inhiber l'infiltration leucocytaire, la néovascularisa- tion et la formation d'oedème cornéen. En ce qui concerne la néovascularisation et l'oedème cornéen, l'acide colombinique assure l'inhibition la plus efficace. L'acide eicosapentaénoique est l'inhibiteur le plus efficace de l'infiltration leucocytaire. L'acide DHGL assure une importante inhibition de l'infiltration leucocytaire et de la formation d'oedème, mais non de la néovascularisation. Le traitement arachidonique ne produit ni une action inhibitrice, ni stimulante sur les paramètres de la kératite par complexes immuns. Les animaux traités uniquement avec le véhicule ont répondu à 100 % par une opacification cornéenne, une néovascularisation et un oedème. L'apparition d'anneaux opaques et de la néovascularisation dans la cornée concorde avec les observations antérieures en utilisant ce modèle d'anaphylaxie cornéenne. PRESENTATION - POSOLOGIE La présentation préférée comprend 0,5 à 1 % en poids d'EPA dans une suspension aqueuse d'hydroxypropyl- cellulose/méthyl-cellulose. La posologie habituelle comprend trois instillations par jour, pendant environ dix jours. INDICATION La composition selon l'invention peut être utilisée dans tout cas d'inflammation oculaire chez l'homme et l'animal. ACTION DE L'ADMINISTRATION TOPIQUE D'ACIDE COLOMBINIQUE (18:3 5,9,12) OU D'ACIDE EICOSAPENTAENOIQUE (20:5 n-3) SUR LA COMPOSITION DU TISSU CORNEEN DE LAPIN EN ACIDES GRAS LIBRES ET LIES AUX PHOSPHOLIPIDES Acides gras Composition des acides gras (poids) Symbole Dénomination Témoins Acide Acide numérique habituelle de colombinique eicosapentaénoique l'acide gras PL FFA PL FFA PL FFA 16:0 palmitique 10,9 0,7 13,8 0,4 15,8 0,7 18:0 stéarique 8,9 1,4 10,6 0,9 9,0 1,1 18:1 n-9 oléique 42,5 0,8 37,1 1,4 35,7 1,1 H 18:2 n-6 linoléique 0,9 0,0 0,7 0,1 0,5 0,0 w ti o 18:3 5,9,12 colombinique 0,0 0,0 5,6 0,4 0,0 0,0 c g :4 n6 arachidonique 7,5 0,0 5,9 0,2 4,9 0,0 :5 n-3 eicosapentaenoique 0,0 0,0 0,0 0,0 1,8 0,1 22:4 n-6 3,0 0,0 2,5 0,1 1,9 0,0 22:5 n-3 0,7 0,0 0,5 0,0 2,5 0,1 22:6 n-3 docosahexanoique 0,3 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 Les valeurs indiquées représentent la moyenne de deux préparations réunies de tissu cornéen, obtenues à partir de quatre animaux différents, extraites et analysées comme décrit plus haut. Les chiffres indiquent les pourcentages des acides gras totaux. Le symbole numérique désigne la longueur de chaine et le nombre de doubles liaisons de l'acide gras, n désignant l'emplacement de la première double liaison. (PL = acides gras liés aux phospholipides, FFA = acides gras libres). REVENDICATIONS 1.- Composition ophtalmologique comprenant une suspension d'acide eicosapentaénoique dans une alcoyl-cellulose et/ou une hydroxyalcoyl-cellulose en solution aqueuse. 2.- Composition ophtalmologique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide eicosapentaénoique est présent en une quantité de 0,5 à 3 %. 3.- Composition ophtalmologique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'acide eicosapentaénoique est présent en une quantité de 1 %. 4.- Composition ophtalmologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la solution de cellulose est une solution à 0,5 %. 5.- Composition ophtalmologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'alcoyl- cellulose est la méthyl-cellulose. 6.- Composition ophtalmologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hydroxyalcoyl-cellulose est l'hydroxypropyl-cellulose.