Brevet FR2616915A1 — publié le 19881223

La présente invention concerne une solution d'une substance de nature polypeptidique, utile notamment pour réduire les phénomènes d'adsorption de ladite subs- tance. Dans la présente demande, on entend par phénomènes d'adsorption, aussi bien 1) l'adsorption sur phase solide que 2) des phénomènes de fixation non spécifique à d'autres molécules. On entend par fixation non spécifique une fixation autre qu'avec l'anticorps ou l'antigène spécifiques lorsque la substance est un antigène ou un anticorps. Les substances molypeptidiqlus sont en qgénéral dans des solutions tampons comprenant entre autres des agents stabilisateurs du type protéique, principalement de l'albumine de sérum de bovin (ou BSA). Cependant, on a découvert, selon la présente invention, que de nombreuses substances de nature poly- peptidique n'étaient pas stabilisées de façon suffisante par ces agents stabilisateurs tels que la BSA et qu'il apparaissait des phénomènes d'adsorption du type de ceux précités, phénomènes très dommageables en cas notamment de dosages immunologiques de la substance. Ainsi, vraisemblablement, en vertu de leur structure non glycosylée, de nombreuses protéines de recombinants génétiques présentent des phénomènes d'adsorp- tion sur phase solide et de fixation non spécifique très importants, même conservés dans des solutions stabilisées à la BSA. Cet état de fait est particulièrement sen- sible dans le cas de l'interféron y (IFNy) préparé par génie génétique comme nous le verrons par la suite (exemple 1). Cette adsorption sur phase solide se pro- duit également pour des protéines naturelles purifiées, comme pour la myéloperoxydase. Cette adsorption sur phase solide a lieu sur les parois internes du flacon de conservation ou des tubes de dosages des substances. Elle se traduit alors par une perte d'immunoréactivité importante de la substance qui affecte considérablement la qualité de son dosage immu- nologique. Cette perte d'immunoréactivité est observée pour des traceurs et des standards conservés dans des fla- cons à 4 C, surtout après avoir été congelés et lyophili- sés. Cette adsorption sur phase solide a également des conséquences f&cheuses lorsqu'elle apparaît dans les colonnes de purification. Ceci est le cas, après le mar- quage radioactif de l'antigène ou de l'anticorps, pour la préparation du traceur en vue de dosages immunologiques, et peut conduire à des rendements très mauvais de purifi- cation dudit traceur. Outre ce phénomène d'adsorption sur phase solide, on a donc également constaté des phénomènes relevant plutôt de la fixation à d'autres molécules. En particulier, on a constaté lors de dosages immunologiques la fixation de certains antigènes sur les anticorps non spécifiques utilisés pour précipiter le complexe(antigène marqué -- anticorps spécifique),fixation non spécifique qui s'accom- pagne aussi d'une perte d'immunoréactivité de la substance et en affecte le dosage immunologique. Le but de la présente invention était donc de remédier à ces inconvénients en proposant une solution à ces problèmes d'adsorption de certaines substances de na- ture polypeptidique, solution qui préserve néanmoins la sensibilité et la spécificité de la réaction(antigène- anticorps spécifique) n vue de dosages immunologiques. Pour ce faire, la présente invention propose d'ajouter dans les solutions classiques de dilution de ces substances, telles que les solutions tampons, un amino-acide basique monomère ou polymérisé. On a découvert en effet qu'en ajoutant dans les tampons de dilution d'une substance de nature poly- peptidique un amino-acide basique monomère ou polymérisé, à savoir de la lysine ou polylysine, de l'arginine ou polyarginine et de l'histidine ou polyhistidine, on ré- duisait de façon remarquable les phénomènes d'adsorption pouvant intervenir sur phase solide, comme le verre ou divers polymères (polypropylène, polystyrène). Cette spécificité des amino-acides basiques est vraisemblablement liée à la présence dans leur struc- ture moléculaire d'un groupe amine supplémentaire par rapport aux autres amino-acidesqui permet peut-être à ces substances amino-acides basiques de s'adsorber pré- férentiellement à la substance à protégersur phase solide. Ainsi, on a remarqué qu'en ajoutant en parti- culier de la polylysine par exemple, dans les tampons d'élution classiques des antigènes marqués (traceurs) pour leur purification à travers une colonne du type Séphadex, on obtenait des rendements de purification nettement meilleurs. On a aussi constaté qu'en ajoutant de la polylysine dans les tampons classiques de conservation du traceur avant dosage et les tampons d'incubations classiques du traceur, de l'antigène à doser ou de l'antisérum lors du dosage proprement dit, on obtenait une meilleure immunoréactivité due à une réduction de l'adsorption sur les parois de flacons et tubes de do- sage et une fixation très faible avec les anticorps non spécifiques de précipitation. Ceci offre de surcroît la possibilité d'utiliser le traceur pour un dosage immunologique sans le purifier au préalable sur une colonne Séphadex. Cette diminution de l'adsorption sur phase solide et de la fixation non spécifique est particu- lièrement notable dans le cas de polypeptides préparés par génie génétique, notamment pour l'IFNy comme évoqué ci-dessus, mais aussi pour d'autres cytokines, comme les interleukines 1 et 2 ou le tumor nécrosing factor (TNFa) et encore pour d'autres substances polypeptidiques telles que le glucagon, l'insuline ou la myéloperoxydase. La présente invention a donc pour objet des solutions d'une première substance de nature polypep- tidique, visant notamment à réduire les phénomènes d'adsorption de ladite première substance, caractérisées en ce que la solution comporte outre ladite première substance,notamment une seconde substance choisie parmi les amino-acides basiques monomères ou polymérisés. Parmi ces amino-acides basiques monomères ou polymérisés, on peut citer particulièrement la poly- lysine. Les résultats les plus satisfaisants ont été obtenus avec de la polylysine de poids moléculaire 14 000 et de degré de polymérisation 70. On peut ajouter ces secondes substances dans des faibles dilutions pouvant descendre jusqu'à 0,05 %o et même jusqu'à 0,01 %O. Cette caractéristique est particulièrement intéressante,compte tenu du prix très élevé de ces produits. La solution peut être un tampon d'élution classique pour la purification de la substance de nature polypeptidique marquée ou non à travers une colonne de purification, tampon auquel on a rajouté un amino-acide basique monomère ou polymérisé. La solution peut également être un tampon de conservation ou d'incubation de la substance de nature polypeptidique marquée ou non, antigène ou anticorps, destiné à des dosages immunologiques, la phase solide étant la paroi interne du flacon ou des tubes de dosage. Ces tampons peuvent être des tampons phos- phate ou des tampons Tris, par exemple. On peut citer entre autres un tampon phosphate 0,05 M pH 7,5 avec 5 %o de BSA et 0,5 %O de NaN3 et éventuellement 5 à 20 % de polyéthylène glycol. On peut citer également, comme tampon Tris, un tampon Tris 40 mM pH 8 avec 30 mM de NaCl, 20 % de glycérol, 10 mM de dithiothréitol avec éventuellement à 20 % de polyéthylène glycol. Enfin, un avantaae supplémentaire des solu- tions conformes à l'invention est qu'elles permettent éventuellement de conserver lesdites premières substances sans agent stabilisateur du type protéique tel que la BSA. Cet avantage est très intéressant lorsqu'on en- visage le marquage de ladite première substance, car l'agent stabilisateur, généralement présent dans la solu- tion, se marque également, ce qui n'est pas le cas de la deuxième substance amino-acide basique. Za présente invention a également pour objet une trousse de réactifs en vue de dosages immunolo- giques comportant des flacons contenant ladite première substance antigène et/ou antisérum,marquée ou non,dans des solutions conformes à la présente invention ou sous forme de lyophilisats desdites solutions. Notamment, la présente invention a pour objet une trousse de dosages immunologiques de l'inter- féron y comportant des flacons contenant de l'inter- féron y ou un antisérum anti-IFNy,marqués ou non, en solution dans un tampon comportant un amino-acide basique monomère ou polymérisé, notamment de la polyly- sine, et lyophilisésà partir de telles solutions. Comme il a déjà été évoqué précédemment et comme il sera explicité dans la suite de la description, l'apport de ladite seconde substance est particulièrement avantageux lorsqu'il y a conservation de ladite première substance sous forme lyophilisée. Il s'agit ici de dosage d'antigènes ou d'anticorps en solution tels qu'ils existent dans les liquides biologiques. Il existe une très grande variété de principes qui ont donné naissance à des trousses de réactifs commercialisés en vue de ces dosages. Les schémas réactionnels sont nombreux et peuvent faire l'objet de multiples classements particu- liers en fonction de: - a) la nature de la substance à doser (antigène ou anticorps), - b) le mode réactionnel, compétitif ou non compétitif. Par exemple, si l'on met en présence d'une quantité définie d'anticorps spécifique une quantité égale- ment définie d'antigène marqué (traceur) et une quantité inconnue d'antigène normal non marqué et à doser, les molécules d'antigène marquées et non marquées vont se trouver en compétition à l'égard de l'anticorps. Au contraire, d'autres modes réac- tionnels se font à partir de réactions successives de sorte qu'il n'y a pas de compétition. On peut aussi fixer des anticorps spécifiques sur un support solide, faire réagir ensuite l'antigène à doser sur ces anticorps insolubilisés. Si cet antigène a au moins deux sites, il peut encore réagir avec une seconde molécule d'anticorps qui sera marquée. Dans un tel cas, il n'y a pas compétition. On peut aussi faire réagir simultanément l'antigène a doser et l'anti- gène froid (standard) ainsi que la seconde molecule d'anticorps marcuée, de cette façon il y aura compétition. - c) la méthodologie utilisée pour séparer l'antigène (à doser) se trouvant sous forme de complexe avec l'anticorps (dit "lié") de l'antigène n'ayant pas réagi (dit "libre"). On peut, bien entendu, retour- ner la proposition et parler d'anticorps au lieu d'antigène. Les avantages et caractéristiques de la présente invention seront maintenant plus explicités à l'aide des exemples suivants. Ces exemples font référence à des dessins sur lesquels: la figure 1 représente des courbes standard de dosages pour un même interféron y conservé dans différentes conditions sans polylysine, la figure 2 représente des courbes standard de dosages RIA pour l'IFNy conservé de différentes façons en "tampon polylysine" avant l'incubation du dosage, la figure 3 représente des courbes standard RIA pour différents IFNy avec et sans "tampon polylysine" à l'incubation lors du dosage seulement, la figure 4 représente des pics d'élution sur colonne Séphadex G75 de l'IL-1 marqué à I2. Dans la présente demande, on entend par: - "tampon Tris": un tampon Tris 40 mM pH 8 contenant mM NaCl, 20 % de glycérol et 10 mM de dithio- thréitol, - "tampon d'incubation": un tampon phosphate PO04 0,05 M pH 7,5 avec 5 %O de BSA et 0,5 %O de NaN3, - "tampon polylysine": le même tampon d'incubation + 1 %O de polylysine (polylysine SIGMA, PM = 14 000 degré de polymérisation 70). - "tampon éthylène glycol": le tampon d'incubation + % d'éthylène glycol. Par la suite, on a utilisé un interféron y humain (IFNy-hu) (Gg 23-901530) du National Institutes of Health Bethesda (N.I.H.) comme référence pour les dosages radioimmunologiques. Cet IFNy (N.I.H) d'origine non reombinante est en solution dans un milieu de culture enrichi d'albu- mine humaine et'ne connatt donc pas les problèmes liés aux sphénMnes d ' &sorption. EXEMPLE I: Influence de la polylysine sur l'adsorption de l'interféron y. Cette influence a été appréciée lors de dosages radioimmunologiques (A) et lors de la purification de l'interféron y marqué (B). (A) Dosages radioimmunologiques Comme traceur,ainsi que pour l'immunisation, on a utilisé de l'interféron y recombinant produit par culture de lignée cellulaire d'ovaire de hamster chinois avec des plasmides codant pour de l'IFNy-hu et de l'ADNc de dihydrofolate réductase de souris selon (3) et(4) Il était dilué dans du tampon Tris. Cet interféron IFNy-hu a été marqué avec Il s à l'aide de chloramine T selon la méthode de Green Wood et al. (1). La séparation de IFNy-hu marqué des radicaux radioactifs a été effectuée sur colonne Séphadex G25 (0,9 x 30 cm) avec un tampon d'élution correspondant au "tampon d'incubation + 15 % d'éthylène glycol"(="tampon éthylène glycol") ou en "tampon polylysine". Le produit marqué était élué dans le premier pic principal. Le pic principal de radioactivité était recueilli dans une zone d'élution correspondant envi- ron à 40-50 KD. Ce pic a été utilisé comme traceur dans les radioimmunodosages. On a utilisé pour ces dosages un antisérum polyclonal de lapin. Un lapin a reçu une émulsion constituée de 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund et 0,5 ml de NaCl 0,9 % contenant 7,5 à 10.105U de IFNy-hu. Selon la méthode de Vaitukaitis (2), l'immunisation a consisté en 10 injections intradermales sur chaque côté de l'épine dorsale. Cinq administrations de rappel ont été effectuées à six semaines d'intervalle en utilisant la même quantité de IFNy-hu. Quatorze jours après le der- nier rappel, l'inverse de la dilution d'antisérum per- mettant d'obtenir une liaison de 30 % de l'antigène marqué était de 60 000. Méthode de dosage: La première étape consiste dans l'incubation de 0,1 ml du tampon d'incubation contenant soit des quantités croissantes d'IFNy non marqué, soit l'échan- tillon à doser et 0,1 ml d'antisérum à la dilution ini- tiale de 1/60 000. Le volume total (0,2 ml) était incubé à 4 C pendant 24 heures. Le traceur (dans 0,1 ml de tampon contenant du sérum de lapin normal à dilution 10 2) était ajouté au milieu pour une incubation supplémentaire de 24 heures. L'IFNy-hu marqué libre était séparé de la partie liée à l'anticorps par double précipitation. Au milieu d'incubation était ajouté 1 ml de tampon d'incu- bation + 6 % de polyéthylène glycol (PEG 6000), + 0,02 % (W/V) de cellulose microcristalline + 0,5 % de tween et + de l'antisérum antilapin préparé chez le mouton dilué à 1:150. Après 20 minutes d'incubation et 15 minutes de centrifugation, le surnageant était mis à l'écart et le précipité était compté. La figure 1 représente des courbes semi- logarithmiques stardard de dosage, selon la méthode décrite ci-dessus pour différents produits (Sl à S4): 1 1 l'IFNy-hu de référence (N.I.H.) dans le "tampon d'incubation": Si, l'IFNy- hu recombinant (AMERSHAM) non glycosylé, a) liquide dans le "tampon d'incubation": S2, b) le même qui a été congelé deux semaines dans le même tampon, puis décongelé juste avant l'incuba- tion: S3, c) le même AMERSHAM qui a été lyophylisé dans des fioles siliconées avant réhydratation dans le même tampon: S4. 1) On observe sur la figure 1 qu'en "tampon d'in- cubation", soit par congélation (S3) ou par lyophili- sation (S4), il y a une perte d'immunoréactivité du produit AMERSHAM par rapport à la référence (S1) qui ne connaît pas d'adsorption (IFNy N.I.H. produit froid et antisérum conservé congelé). En effet, sur cette figure B représente la radioactivité du précipité, c'est-à- dire de l'IFNy marqué lié à l'anticorps spécifique, T représente la radioactivité totale du traceur ini- tial. Pour une valeur donnée de B, il faut des quantités supérieures d'IFNy AMERSHAM par rapport à la référence, que ce soit pour le produit conservé dans "tampon d'incubation" ou les produits qui ont été conge- lés et lyophylisés. Il y a donc une perte d'immunoréacti- vité de l'antigène lors de l'incubation pour le dosage. On perd de l'antigène froid par adsorption sur le flacon lors de la conservation. En revanche, figure 2, les produits AMERSHAM non glycosylés ont été mis en solution dans un "tampon polylysine", les différentes courbes: SI NIH (Référence) (produit froid) SI liquide (AMERSHAM) S3 congelé (AMERSHAM) S. lyophylisé (AMERSHAM) montrent qu'il n'y a pas perte d'immunoréactivité par rapport au NIH. La différence existant entre la référence N.I.H. et les standards AMERSHAM est due à un étalonnage différent. 2) On a réalisé des courbes RIA (figure 3) a) en ajoutant de la polylysine lors de l'incubation seulement o se produit la réaction antigène-anticorps spécifique et b) sans en ajouter, pour un même standard dans les deux cas (AMERSHAM ou NIH). On obtient des courbes quasiment superposées, ce qui indique donc que la polylysine ne perturbe pas la réaction antigène-anticorps spécifique. Sur la figure 3, les courbes S' à S' représentent l: standard NIH en "tampon d'incubation", SI': standard NIH en "tampon polylysine", S3': standard AMERSHAM en "tampon d'incubation", SZ: standard AMERSHAM en "tampon polylysine", Bc = radioactivité de l'antigène marqué, lié à l'anti- corps en l'absence d'antigène froid, B = radioactivité de l'antigène marqué, lié à - l'anticorps spécifique à une dilution constante de ce dernier, et pour une quantité donnée d'antigène froid. B) Purification d'interféron y marqué L'expérience a été réalisée avec de 1'interféron y AMERSHAM. Le tableau I ci-après montre qu'uniquement en "tampon polylysine" on élue pratiquement tout ce qui a été déposé sur une colonne de G25. Dans ce tableau I R représente ce qui reste accroché à la colonne. On réalise une succession de prélèvement par fraction de 1 ml dans une série de tubes (1 à 11). Les molécules de plus petites tailles (ici Il'25) sont éluées en dernier. Les tubes 7 et 8 représentent les tubes d'élution du traceur. On compte 1500-2000 cpm en "tampon polylysine" pour le traceur et seulement 350 cpm pour ce qui reste accroché à la colonne. Tableau I (les valeurs sont données en cpm) ul IFSy Su1 IFNy 51 IFNY &1 PO. 0,SM Su1 TRIS Sul PO. 0,SM *T. Ethylène î mixture Tampon glycole T. Ethyl. polylysine giycole _ - 15 - 6 250 15 15 7 1K5 1K 2K 8 300 800 1,5K 9 100 100 150 100 100 150 11 *R 1,5K R 1,5K R 350 * T = tampon R a reste En outre, on a observé que 10 g1 d'une solu- tion ae polylysine a 1/i000 ne gênent pas lors du marquage. EXEMPLE II: Influence de la polylysine sur la fixation non spécifique de l'interféron y. Cette fixation non spécifique s'apprécie en mesurant To qui représente le "témoin", c'est-à- dire la radioactivité représentée par la quantité-de pro- duits marqués, liés à l'anticorps de précipitation qu'on rajoute pour précipiter le complexe formé par l'antigène marqué avec l'anticorps spécifiques. T0 se mesure en in- troduisant uniquement l'anticorps précipitant (antisérum antiglobuline de lapin préparé chez le mouton) et l'anti- gène marqué et en séparant le précipité obtenu. Dans les tableaux II et III ci-après, on a également mesuré AT, Bo, B2U et B20U. AT représente la radioactivité totale initiale du traceur. Bo représente la radioactivité du traceur lié à l'anti- corps spécifique en l'absence d'antigène froid. B2U et B20U représentent la radioactivité de l'antigène marqué, lié à l'anticorps spécifique en présence de 2U et 20U d'antigène froid. Comme traceur, on a utilisé plusieurs solutions de marquage, soit directement après marquage, soit après purification sur colonne Séphadex G25: APRES MARQUAGE: signifiant que l'on a utilisé 20 gl de la solution de marquage +1 ml de "tampon d'incubation" ou 1 ml de "tampon poly- lysine", et APRES G25:signifiant que l'on a utilisé 30 Al de la solution de marquage appliquée sur colonne Séphadex G25 (H = 30 cm diamètre = 0,8 cm) et éluée en "tampon incubation + 15 % éthylène glycol" ("tampon éthylène glycol") ou en "tampon polylysine"). La solution A provient d'une solution de marquage constituée par: - 5 4l de IFNy AMERSHAM L-13 - 5 4l de PO4 0,5 M - 10 4l de Il2 - 10 4l de chloramine T (20 gg, 30 secondes) - 10 4l de métabisulfite (20 ag) - 300 4l de PO4 0,05 M. La solution B = même solution que A, mais avec 5 4l de Tris 0,5 M au lieu de 5 4l de P04 0,5 M. La solution C = la solution A, mais l. tampon PO4 est additionné de polylysine ( "tampon poly- lysine"). La solution D = la solution A, mais avec 2,5 4l de IFNy BOEHRINGER au lieu de 5 4l de IFNy AMERSHAM. On a réalisé deux séries de dosages, un dosage n 1 avec des incubationsen "tampon incubation" d'une journée à 4 C et un dosage n 2 avec des incubations en "tampon incubation" de 4 heures à 20 C,au tableau II. Au tableau III, on a également effectué deux dosages supplémentaires avec des incubations en "tampon polylysine". Au tableau III, les valeurs soulignées sont celles correspondant à des incubations en"tampon poly- lysine". Les tableaux II et III ci-après montrent que les produits marqués, lorsqu'ils sont conservés en "tampon incubation" ou lorsqu'ils sont conserves et élués en "tampon éthylène glycol" et incubés en "tampon incubation" donnent un "témoin" fort important et une sensibilité anormalement élevée par rapport à nos résul- tats obtenus avec le traceur glycosylé de l'EXEMPLE I A) qui étaient de l'ordre de 1,5 à 2. En revanche, ces produits marqués, lorsqu'ils sont conservés et éventuelle- * ment élués en "tampon polylysine" et incubés en "tampon incubation" donnent un "témoin" nettement plus faible et une sensibilité qui se rapproche de celle donnée par le traceur glycosylé de référence. Enfin, les résultats desdosages n 3 et 4 du tableau III montrent que les produits marqués conservés et incubés en "tampon polylysine" donnent un "témoin" encore plus faible que celui obtenu avec les mêmes pro- duits incubés en "tampon incubation". Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IFNy AMERSHAM et BOEHRINGER. Par conséquent, la réduction de la fixation non spécifique à l'aide de polylysine est bien mise en évidence. 2 6 1 6 9 1 5 Tableau II Solution de uarquaqe Solution A avec: Solution B avec Solution C avec Après marquage = Après marquage = Après marquage = conservé en'I"tampon conservé en"tampon conservé en"tampon d'incubation" d'incubation" polylysine" Après G25 = Après G25 = Après G25 = Zlué et conservé élué et conservé élué et conservé en en "tampon trnylene en "tampon éthylène "tampon polylysine" glycol" glycol" Après Apres Après Après Après Après marquage G25 marquage G25 marquage G25 DOSAGE N 1 - 1 J à 4 C - INCUBE EN "TAMPON INCUBATION" T0 16,3 18,0 16,5 17,1 5,9 7,7 AT 32 600 32 250 32 700 40 500 34 800 32 300 Bo 29,6 28,0 27,5 25,4 34,1 36,8 B2U 72,0 79,0 75,2 77,1 90,0 85,8 MOU 23,6 21,0 24,3 22,4 47,5 47,2 DOSAGE No 2 - 4 H 4 20 C - INCUBE EN "TAMPON INCUBATION" To 13,8 14,6 14, 3 14,7 4,8 7,6 AT 33 400 32 600 32 400 40 800 35. 500 33 150 Bo 23,1 23,1 23,3 22,1 25,1 27,4 B2U 67,0 69,6 66,0 64,7 92,8 84,6 B20U 23,3 23,8 22,7 21,7 56,1 47,0 Tableau III Solution de marquaQe Solution A avec: Solution A avec: Solution D avec Après marquage = Après marquage = Après marquage = conservé en"tampon conservé en"tampon conservé.en"tampon d'incubation" polylysine" polylysine" Après G25 = Après G25 = Après G25 = élué et conservé élué et conservé en élué et conservé en. en "tampon éthyiene "tampon polylysine" "tampon polylysine" glycol" Après Après Après Après Après Après marquage G25 marquage. G25 marquage G25 DOSAGE I0 3 - 1 JOUR A 4 C - DXE EAXGON UNCUBATt tYU"AMON POLYLYSINE" Te 3,1 2,5 1 2,1 8 1,5 1,4 21,6 15,8 5,4 5,8 2,0 2,4 AT 34 300 33 800 32 900 29 500 33 000 41 000 32 800 30 400 36 300 27 140 34 500 38 000 BO 35,7 38,8 36,7 22,7 36,8 93,9 ,3 30,2 34,9 26,7 36,0 35,2 DOSAGE NI 4 -H A TflPERATBE ORDiNAmE "TAMPDN INCBATIWNOU%83N POLYLYSINE" Tc 3,0 2,4 2,0 2,7 1,5 16 ,4 18,2 5,1 5,6 2,2 2,0 AT 34 900 30 800 33 400 29 800 33 800 41 000 33 400 30 300 36 000 26 600 34 200 38 500 Bo 24,8 29,0 25,6 14,5 27,6 26,7 17,2 16,3 25,3 22,0 27,5 27,9 Les valeurs soulignées sont obtenues pour des incuba- tions en "tampon polylysine". EXEMPLE III: Influence de la concentration en poly- lysine, du poids moléculaire et degré de polymérisation de la polylysine. Nous avons testé des concentrations de plus en plus faibles de polylysine de poids moléculaire et de degré de polymérisation différents, ainsi que le bromure d'alkyl-triméthylammonium qui est un détergent très puissant. 1) Pour le Tableau IV, ci-après, l'interféron y marqué AMERSHAM non purifié sur gel de Séphadex et conservé en "tampon éthylène glycol" est incubé dans le tampon habituel, ainsi que dans du tampon contenant diffé- rentes polylysines ou détergents à des concentrations de plus en plus faibles (0,05 %O à 1 %o). La polylysine de poids moléculaire (P.M.) 14000 et de degré de polymérisation (D.P.) 70 nous donne les ré- sultats les plus satisfaisants, même jusqu'à une con- centration de 0,05 %O puisqu'on obtient les valeurs de To les plus faibles par rapport aux polylysine de poids moléculaires supérieurs. 2) Le Tableau V, ci-après, met également en évidence la spécificité de la polylysine de P.M. 14000 et D.P. 70 puisqu'il y apparait que la lysine ou une polylysine de P.M. et D.P. plus faible donne également de moins bons résultats. Ils ont en effet été testés lors du marquage dans le tampon de conservation ou d'élution du produit marqué. Le Tableau V montre que, juste après marquage, quel que soit le tampon de conservation utilisé, la dilution de l'antigène marqué pour obtenir environ 30 000 cpm/ il est identique. En revanche, après élution sur colonne G25, les résultats sont différents sui7rt le tampon utilisé. En effet, en présence d'éthylène glycol il faut diluer l'antigène marqué 500 fois, en présence de polylysine P.M. 14000 et D.P. 70 il faut diluer l'antigène marqué 3000 fois, en présence de polylysine P.M. 360 et D.P. 17 il faut diluer 2000 fois et, enfin, avec de la lysine il faut diluer 750 fois. Pour le tableau V, un IFNy BOEHRINGER marqué et purifié sur gel de Séphadex a été utilisé. "TAMPON "TAMPON "TAMPON 1 JOUR A "TAMPON POLYLYSINE"- POLYLYSINE" POLYLYSINE" ALKYLTRI-METIIYL- 4-C INCUBA- Degré de polyméri- Degré de polyméri- Degré de polymériAMMONIUM BROMIDE TION " sation 70 sation 220 sation: 1850 PH: 14.000 PM: 40.000 PM: 390.000 = 1.0,5%. 0,1 %.1%0 0,5 %0 0,1 % 1% 0,5 %0 0,1 %0 1 %. 0,5 %0 0,1 1 AT 29.389 23.711 34.178 27.799 32.685 30.124 30.779 32.210 32.423 31.967 34.900 31.200 32.039 (D T. 9,0 3,3 3,3 3,7 22,1 21,0 9,7 6,9 5,4 4,1 7,1 9,6 8,0 Pl Bo - T. 30, 8 33,6 30,3 32,7 38,2 26,6 32,0 29,5 - - 1,7 8,9 3-,0 ...!!..DTD: 24/2/1987 0,1 %0 0,05%o 0,01%Q 0,1 O 0,05%o 0,01%o - - - 0,1 %0 0,0510 0, 11%o AT 30.600 27.255 29.040 52.174 23.487 24.915 28.446 - - - 27.666 30.423 26.237 To 11,5 4,4 4,1 4,8 9,9 8,4 7,5 - - - 7,6 7,8 9,6 Bo - To 26,9 29,5 29,6 22,5 32,1 30,9 30,6 - - 29,5 29,8 29 ro Cn Ln MARQUAGE IFNy BOEHRINGER INCUBATION I JOUR A 4 C Conservation et Elution danOxervation et Elution dans Oxuervation et Elutiondn Omservation et Elution dans T/QON ETHYLE GLlL# NTWMON POLLYLSINE" 1 | TMW POLYLYSINE# O,5 so. "T;NêN LYSIE' 1 t. 11P: 70 - P14000 DP: 17 - Pt 3600 Iincuton dansm Incubation dansIncubation dansI ncubation danincubation dansIncubation danstibtindans Incbatindmis -Tapon incubatio 'Tampon élutionw n" incubation -"Tanpn élution' |Tampon incubation" Tampon élution "TaMPn incubation "Tamponutiod' =pràès G025 A 025 A2S G25 Aprss 5 rè 25 G25 b 25 - AT 27.955 33.621 27.866 34.300 26.59429.760 28.400 33.900 33.000 32.400 31.000 35.895 30.100 30.30032.564 36.100 T. 2,5 2,4 2,9 2,9 2,1 4,7 1,9 2,1 2,5 6,3 1,7 2,6 2,6 6,7 2,2 6,3 F I li BooT. 46,1 40,8 44,1 37,2 47,1 35,0 43,4 33,9 42,4 28,0 41,0 32,1 45,0 25,4 41,7 29,0 B SU 49,0 47,0 56,0 54,0 50,7 55,1 52,5 50,1 53,7 57,6 53,5 51,7 47,7 59, 0 53,0 56,0 ' 1/250 1/500 1/250 1/500 1/250 1/3000 1/250 1/3000 1/250 1/2000 1/250 1/2000 1/250 1/750 1/250 1/750 II l I t T t!! I rdoo o go g o __1O EXEMPLE IV: Influence de la polylysine sur d'autres substances. A) TNFcL L'élution sur colonne Séphadex G50 du TNFa marqué est identique en tampon enrichi en BSA (10 g/l) ou cn "tampon polylysine". Les résultats obtenus avec le TNFa marqué non purifié sur Séphadex G50 et conservé en tampon contenant 10 g d'albumine sont non reproductibles, par contre, ceux obtenus en conservant le TNFa marqué dans du tampon polylysine sont tout à fait satis- faisants. Après élution sur colonne G50, les résultats sont semblables, quel que soit le tampon employé. Par conséquent, même si la polylysine n'est pas indis- pensable, sa présence ne diminue en rien les résul- tats obtenus, et, plutôt, les améliore. B) IL-1 1) Sur la figure 4 sont représentés les pics d'élution de l'IL-1 avec différents tampons d'élu- tion (a, b et c). Les pics la et 2a sont obtenus en marquant avec 20 gg de chloramine T + 20 ig de métabisul- fiteetnéluant avec un "tampon éthylène glycol". Les pics lb et 2b sont obtenus avec le même marquage, mais en éluant en "tampon polylysine". Les pics 2a et 2b sont en fait des épaule- ments. a = 20 gg chloramine T + 20 gg métabisulfite "Tampon éthylène glycol" - b = 20 gg chloramine T + 20 gg métabisulfite "Tampon polylysine" c = 20 gg chloramine T "Tamponpoly lysine". La dégradation d'un produit s'apprécie par rapport à la symétrie du pic d'élution. Comme le montre le profil d'élution de la figure 4 sur colonne Séphadex G75, c'est l'IL-1 marquée en présence de 2 gg de chloramine T et éluée en "tampon polylysine"(piclc)quisanbelamins dégradée. En effet, d'après nos expériences pré- cédentes, seule la fraction éluée au niveau du tube 23 donne des résultats satisfaisants tant au point de vue de la fixation (à l'anticorps spécifique), qu'au point de vue de la sensibilité (immunoréactivité). 2) Sur le Tableau VI ci-après, on peut constater que l'IL-1 marquée en présence de 2 ug de chlor- amine T et éluée en "tampon polylysine" donne bien les meilleurs résultats: en effet, le témoin To est faible, le pourcentage de fixation très bon (Bo) et la sensibilité correcte (B 200 ng). C) MYELOPEROXYDASE Grâce à la polylysine, on a pu éluer la myéloperoxydase qui, comme l'IFNy, restait très forte- ment accrochée à une colonne ACA 34. De la même manière que pour l'interféron y AMERSHAM et BOEHRINGER, pour la myèloperoxydase, la polylysine est donc indispensable pour obtenir des résultats satisfaisants. De manière générale, pour les autres subs- tances étudiées, même lorsqu'elle n'est pas indispen- sable, la présence de polylysine ne diminue en rien les résultats obtenus ou mieux les améliore. ANTISERUM BIOGEN 1/1500 TAMPON INCUBATION ETUDE DES MARQUAGES D'IL-1 MARQUAGE 2 Cq MARQUAGE 20 pg CHLORAMINE MARQUAGE 20 Mg CBLORAMINE CHLORAMINE T - éluéen METABISULFITE-TAMPON ETHYLENE METABISULFITE-TAMPON POLY- TAMPON POLYLYSINE GLYCOL (élution) LYSINE (élution} Après è A&TèS Exp6rien.. AprèsApèArsArs Expérien Après Apr Aprs Après Après G75rs G75 Après Après A7 ce 1 maGp e c51G25G2 mauage PIC 1la PIC 2a marquage PIC lb PIC 2b PIC ic G25 AT 22.815 28.998 22.750 20.060 34.100 36.600 19.500 23.100 27.100 27.600 24.200 To 1,5 1,6 1,4 1,5 1,2 1,7 1,9 1,4 1,6 1,2 1,4 Bo+T- 12,8 32,4 21,3 54,7 52,4 68,7 30,6 52,3 55,5 72,5 27,3 Pi Ebrience (D AT 21.232 27.000 20.700 21.062 21.700 20.540 20.653 23.700 27.350 25.232 22.876 To 1,6 1,3 1,4 1,5 1,5 1,4 1,4 1,7 1,6 1,7 1,4 Bo+To 12,3 32,9 21,8 42,9 49,2 63,8 25,0 48,3 49,8 62,5 25,9 B200 ng 83,4 78,5 62,2 93,2 87,8 93,9 78,6 90,9 93,3 92,1 81,0 ANTISERUM IL-1 62 1/25000 1 IRE-MEDGENIX) Expérien- oe2 AT 20.500 27.140 20.600 20.900 21.600 20.499 20.231 24.600 26.980 24.600 23.260 To 1,4 1,5 1,2 1,3 1,4 1,4 1,3 1,8 1,4 1,( 1,3 Bo+Ta 14,5 31,1 29,9 25,9 29,6 32,5 26,2 27,8 31,0 31,6 24,2 B200ng 44,1 39,2 16,3 68,3 67,2 86,7 28,6 69,0 69,0 81,6 23,6 % REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) GREENWOOD, F., HUNTER, W., GLOVER, S. et al.: Preparation of 1.125 labeled human growth hormone of high specific radioactivity. 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Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que la solution comporte de la poly- lysine. 3. Solution selon la revendication 2, caractérisée en ce que la polylysine est de poids molé- culaire 14000 et de degré de polymérisation 70. 4. Solution selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite seconde substance est présente dans des dilutions pouvant descendre jusqu'à 0,05 %.- 5. Solution selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite seconde subs- tance est présente dans des dilutions pouvant descendre jusqu'à 0,01 %t. 6. Solution selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite première substance de nature polypeptidique est marquée, notam- ment avec de l'iode radioactif. 7. Solution selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite première substance de nature protéique est choisie notamment parmi l'inter- féron y, le TNFa, l'IL-1, l'IL-2, le glucagon, l'insuline et la myéloperoxydase. 8. Solution selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la solution est un tampon d'élution classique pour la purification de ladite première substance marquée ou non, à travers une colonne de purification, tampon auquel on a rajouté ladite seconde substance. 9. Solution selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la solution est un tam- pon de conservation classique de ladite première subs- tance marquée ou non, tampon auquel on a rajouté ladite seconde substance. 10. Solution selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la solution est un tampon d'incubation de ladite première substance marquée ou non, antigène ou anticorps, destiné à des dosages immu- nologiques de ladite première substance, tampon auquel on a rajouté ladite seconde substance. 11. Solution selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la solution ne comporte pas d'agent stabilisateur protéique tel que la BSA autre que ladite seconde substance. 12. Trousse de dosages immunologiques, carac- térisée en ce qu'elle comporte des flacons contenant des solutions ou des lyophilisats de solutions selon l'une des revendications précédentes. 13. Trousse de dosages immunologiques de l'IFNy, caractérisée en ce qu'elle comporte des flacons contenant de l'IFNy marqué ou non, et un antisérum anti- IFNy marqué ou non, en solution dans des tampons selon l'une des revendications précédentes ou lyophilisé à partir de ces solutions.