Brevet FR2622445A1 — publié le 19890505

1- APPLICATION DE GROUPES NITROPHENYLES A LA STIMULATION DES CAPACITES D'INCORPORATION D'UN MEDICAMENT DANS LES CELLULES SENSIBLES DE L'HOTE. La présente invention a pour objet l'applica- tion des groupes nitrophényles à la modification de principes actifs de médicaments afin de favoriser leur incorporation aux cellules sensibles de l'hôte auquel le médicament est destiné. Par groupes nitrophényles on entend les molé- cules possédant des groupes dinitro ou trinitro-phényles et leurs dérivés. Par cellule sensible on entend toute cellule de l'hôte constituant une cible reconnaissant des groupes nitrophényles. De telles cellules cibles sont notamment les lymphocytes T ou B, ou les thymocytes les fibroblastes, les cellules rénales... Ces cellules sont aussi sensibles pour certains agents pathogènes. Il a déjà été observé que l'interaction in vi- vo entre un agent pathogène, par exemple un virus infec- tieux et les cellules sensibles correspondantes, se manifeste par une modification du taux d'anticorps naturels (AcN) chez l'hôte atteint de la maladie infec- tieuse ou autoimmune correspondante. Ces AcN sont des - anticorps contenus dans les sérums et les liquides biologiques des humains et des animaux, capables de reconnaître des antigènes (Ag) du 'soi' et du 'non-soi". Ces AcN existent dans les liquides biologiques alors même que les hommes et les animaux n'ont pas été préa- lablement intentionnellement immunisés contre un agent pathogène déterminé. La polyspécificité des AcN et le fait que souvent ils possèdent une haute affinité pour un antigène donné (T. Ternynck, S.Avrameas, Immunol. Rev. 1986) leur permet de reconnaitre plusieurs antigènes présents chez des agents pathogènes. Il est à noter par ailleurs que parmi ces AcN, certains possèdent une activité du type anti-dinitrophényle (DNP) ou anti- trinitrophényle (TNP) et que dans plusieurs situations pathologiques (maladie autoimmunes et infections virales) le titre de ces anticorps (anti-NP) sériques est significativement modifié (P. Matsiota et al. Clin. exp. Immunol., 1987, Ann. Inst. Pasteur 1987). su lePour des commodités de langage, on regroupera sous le terme NP, les molécules contenant des groupes nitrophényles possédant 1, de préférence 2 ou 3 groupes nitro. De façon préférée, les molécules NP sont des ni- trophénols. D'autres molécules intéressantes sont plus particulièrement le 2,4-dinitrophényle (DNP), ou le 2,4,6-trinitrophényle (TNP). On a plus particulièrement remarqué que le taux d'anticorps ayant une activité anti-NP (Ac anti-NP) est significativement plus élevé que le taux des autres anticorps naturels lors de ces mêmes maladies auto- immunes ou de ces infections virales. Ces résultats ont notamment fait l'objet de publications à la suite d'études faites dans le cadre d'infections causées par le virus du SIDA (HIV)("Détection of natural auto-anti- bodies in the serum of anti-HIV-positive individuals.", autrement dit "Détection d'auto-anticorps naturel dans le sérum d'individus ayant une réaction positive anti- HIV". P.Matsiota et al. Ann. Inst. Pasteur/Immunol 1987, 138, 223-233.) et dans le cadre d'une étude concernant le lupus érythémateux ("Natural antibodies in systemic lupus erythematosus." autrement dit *Anticorps naturels du lupus érythémateux de l'organisme".P. Matsiota et al. Clin. exp. Immunol (1987) 69, 79-88). L'invention découle de la découverte faite par les inventeurs que la réalisation d'une mise en contact -in vitro ou in vivo- des cellules sensibles à un agent pathogène, avec des dérivés de NP reconnus par des an- ticorps anti-NP s'accompagnait dans la plupart des cas de l'internalisation d'une partie au moins de ces NP, dans les cellules sensibles correspondantes. En d'autres termes, l'invention met & profit la capacité des NP mise en évidence par les inventeurs, à pénétrer dans des cellules sensibles, tout en étant susceptibles d'y entraîner le principe actif d'un mé- dicament, dans la mesure o celui-ci avait auparavant été couplé chimiquement à un NP, notamment au niveau de la position Cl du cycle phényle ou au niveau de la posi- tion phénol du NP. En d'autres termes, le NP peut jouer le rôle d'un vecteur - ou d'une "locomotive" - capable d'induire ou de favoriser l'introduction de ce principe *actif de médicament dans les cellules sensibles dans lesquelles il peut exercer les actions biologiques qui sous-tendent les effets thérapeutiques de ces principes actifs. L'invention concerne par conséquent des conju- gués réalisés par couplage chimique entre un NP, d'une part, et le principe actif de médicament d'autre part, dont la reconnaissance ou l'internalisation dans des cellules sensibles est recherchée. L'invention vise plus particulièrement des composés tels que décrits cidessus, dans lesquels le principe actif de médicament est constitué par tout composé ayant une activité thérapeutique par exemple un agent antiviral, un agent antibactérien ou un agent cytostatique capables d'exercer - in vivo - leurs activités thérapeutiques respectives, notamment au niveau des cellules sensibles affectées. Dans un mode de réalisation préféré des con- jugués selon l'invention, le principe actif de médica- ment est couplé par une liaison covalente au vecteur constitué par un NP, au niveau de la position C1 du cycle phényle ou au niveau de la position phénol de celui-ci. Il doit être remarqué que le couplage d'un NP, plus particulièrement au niveau de la position C1 du cycle phényle ou au niveau de sa position phénol, avec un principe actif de médicament, assure en même temps la neutralisation d'éventuelles propriétés toxiques in vivo de la molécule NP non modifiée, sans que soit affectée sa capacité à être reconnue par les anticorps anti-NP. D'une. façon générale, la conjugaison entre une molécule NP et le principe actif de médicament choisi peut être réalisée par toute réaction chimique appro- priée mettant en oeuvre la position C1 du cycle phényle du NP ou sa position phénol d'une part, et une fonction réactive portée par le principe actif de médicament d'autre part. Par exemple, le principe actif de médicament porte une fonction amine, cas dans lequel on peut avoir recours à toute technique appropriée pour coupler entre elles cette fonction amine avec la fonction hydroxyle du NP. Lorsque la molécule de modification porte une fonction carboxyle on peut procéder à une réaction d'estérification. Par exemple, les agents de condensation peu- vent être constitués par des carbodiimides lorsque les fonctions complémentaires sont respectivement consti- tuées par des groupes carboxyle et amine, ou vice-versa, par exemple le p-toluène-sulfonate de N-cyclohexyl-N- p-(N-méthyl-morpholino-éthyl)-carbodiimide et le chlo- rhydrate de (3-méthyl)-aminopropyl-carbodiimide ou le dicyclohexylcarbodiimide. La réaction ester alors conduite dans des conditions usuelles dans la chimie des protéines. Les agents de condensation peuvent encore être constitués par un 6-maléimido-caproique-acyl-N-hydroxy- succinimide-ester ou le N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-di- thio)-propionate (SPDP), lorsque les fonctions complé- mentaires sont respectivement, au départ, un groupe sulfhydryle et un groupe amine ou vice-versa. Des conditions de réaction appropriées sont encore celles décrites dans les articles suivants: J. CARLSSON et coll. Biochem. J. (1978) 173, 727-737 ou P.E. THORPE et coll. dans Euro. J. Biochem. (1981), 116, 447-454. La compatibilité du principe actif de médica- ment avec la capacité de la molécule NP conjuguée à ce principe, peut être vérifiée par un test in vitro com- prenant la mise en contact de ce conjugué avec des anti- corps anti-NP préalablement immobilisés sur un support -solide insoluble dans des conditions permettant la formation éventuelle d'un complexe immunologique entre des anticorps anti-NP et le conjugué et la détection de ce complexe immunologique. De même, la compatibilité de la conjugaison avec la conservation de l'activité thérapeutique du principe actif de médicament peut être vérifiée, plus particulièrement lorsque ce principe exerce cet effet sur les mêmes cellules sensibles, par l'observation de l'effet pharmacologique du conjugué vis-à-vis de ces cellules sensibles par comparaison avec celles du principe actif de médicament non couplé. On peut aussi mesurer le taux de principe actif internalisé dans les cellules, en particulier chaque fois que le principe actif se manifeste par une activité susceptible d'être dosée et qui n'est pas af- fectée par la conjugaison. Un test comprend alors, après la mise en contact in vitro du conjugué formé avec des cellules sensibles, la séparation des cellules et leur récupération hors du milieu dans lequel la susdite mise en contact avait été réalisée et le dosage (le cas échéant après rupture- des parois cellulaires desdites cellules) de l'activité dosable retenue par ces cellu- les. La conservation de la capacité des NP à réagir avec des cellules sensibles, après leur couplage avec le susdit principe actif de médicament peut alors être vérifiée par exemple par la mise en oeuvre d'un test comprenant la mise en contact,in vitro, de ce conjugué avec des cellules sensibles et la détection du taux d'incorporation dudit conjugué à ces cellules sensibles et, le cas échéant, la comparaison du taux d'incorporation observé avec le taux d'incorporation dans les mêmes cellules sensibles, dans les mêmes conditions selon le cas, du même NP, cependant non couplé, au principe actif de médicament. L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques associant le conjugué selon l'invention. Pour ce qui est de l'utilisation de ces compositions pharmaceutiques, il a lieu de noter que la détermination des doses appropriées sera effectuée dans chaque cas, selon la nature du principe actif de médicament entrant dans le conjugué selon l'invention et la nature de la pathologie à combattre. les doses appropriées devront naturellement aussi être évaluées par le clinicien, au vu des sensibilités différentes des patients à la thérapeutique choisie. D'autres caractéristiques techniques de l'invention apparaîtront dans l'exemple illustratif qui suit. Cet exemple a essentiellement pour but d'illustrer les capacités que possèdent les NP modifiés à s'intégrer à des cellules sensibles, notamment lorsque celles-ci sont sollicitées par un agent agresseur ou pathogène, d'o également le bien fondé de l'idée sur laquelle l'invention repose, à savoir la capacité des NP eux- mêmes à servir de vecteur permettant l'apport sélectif de principes actifs de médicaments aux cellules cibles qui doivent être atteintes. EXEMPLE I Effet des dérivés NP sur la prolifération des lvmphocvtes de souris a/ Préparation des dérivés NP Le TNP a été couplé à la sérumalbumine bovine (BSA) par la méthode de Little & Eisen: 1ml de BSA à 20mg/ml dans le tampon carbonate-bicarbonate, 0,1M, pH 9,5, est ajouté à lml d'une solution d'acide trini- trobenzène sulfonique à 2 mg/ml dans le même tampon. La réaction est arrêtée après 30 à 120 minutes selon la substitution voulue par élimination de l'excès de réactif sur échangeur d'ions (DOWEX 1 x 4) puis dialyse. Des préparations de BSA substituée avec soit 14 ou 30 molécules de TNP par molécule de BSA (TNP14-BSA ou TNP30-BSA) ont été utilisées. Le DNP-Glycine (DNP-Gly) et le DNP-Lysine (DNP-Lys) proviennent des Laboratoires Sigma et sont solubilisés directement dans le milieu de culture. b/ Préparation des populations cellulaires Les cellules proviennent de rate ou de thymus de souris. Les souris sont tuées par dislocation cer- vicale et leur rate ou leur thymus prélevé stérilement sont déposés dans du milieu RPMI. Les cellules sont dissociées, lavées une fois avec du milieu puis les globules rouges sont lysés au chlorure d'ammonium (0,9%) pendant 1 minute à froid puis les cellules sont relavées dans le milieu complet. Les sous-populations de cellules B ou T sont ensuite séparées comme suit: - Sous-population T: les cellules T sont obtenues à partir de la population de cellules de la rate par élimination des cellules portant des Ig à leur surface (sous-population B) sur des anticorps anti-Ig de souris immobilisés soit sur des billes magnétiques (Magnogel) soit sur des boites de Pétri. - Sous-population B: les cellules B sont obtenues après détachement mécanique des supports sur lesquels elles étaient fixées par l'intermédiaire des anticorps anti-Ig (après l'isolement des cellules T), ou après élimination de la sous-population des cellules T de la population totale des cellules de rate par un traitement avec un anticorps anti-cellules T suivi de complément de cobaye. - Thymocytes: les thymocytes sont dissociés dans le RPMI et les cellules isolées sont lavées dans le milieu complet avant d'être mises en culture. c/ Culture des cellules Le milieu de culture utilisé est du RPMI 1640 contenant du sérum de veau foetal (5%), du pyruvate de sodium (lmM), de la L-glutamine (lmM), du 2-mercaptoe- thanol (0,05 mM), de la pénicilline (100p/ml) et de la streptomycine (50pg/ml). 2x105 cellules de chaque population cellulaire ou 4x105 de cellules de rate non fractionnées sont dis- tribuées sous un volume final de 200pl dans des boites de culture de 96 puits à fond plat en présence ou non des différents stimulateurs (ou mitogènes)(40pg/ml de lipopolysaccharide W.S.Typhosal 2pg/ml de concanavaline A, ou des surnageants de culture contenant les anticorps monoclonaux à différentes dilutions ou une solution de TNP-BSA à des concentrations finales allant de 200ng à pg/ml). Les cultures sont effectuées pendant 48 à 96 heures à 37C dans une atmosphère de 5% de C02. d/ Mesure de la prolifération des cellules Six à huit heures avant la fin de la culture, pl de surnageant sont prélevés de chaque puits de culture afin d'être testés quant à leUr contenu en anticorps. 10pl d'une solution de 3H-thymidine (activité spécifique = 5pCi=185GBq/mM) à 50 pCi/ml sont ajoutés à la culture qui est ensuite poursuivie. Les cellules de chaque puits sont collectées sur du papier filtre à l'aide d'un collecteur automatique et, après séchage, les filtres sont comptés dans un liquide scintillant. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau I pour ce qui concerne l'action des dérivés NP sur des cellules données. / / / / TABLEAU I Effets des dérivés NP sur la prolifération des lymphocvtes de la souris. Le pourcentage d'augmentation (+) ou d'inhi- bition (-) est calculé par rapport aux chiffres obtenus avec le milieu seul (M) ou additionné de lipopolysaccharide (LPS) ou de concavaline (con A). *Après traitement des cellules avec les déri- vés NP pendant 48 heures, les mitogènes concanavaline A (con A) et lipopolysaccharide (LPS) sont ajoutés aux cellules et la culture poursuivie pendant 24 à 48 heures. Dérivés NP TNP-BSA DNP-Glycine TNPLysine M conA* LPS* M conA* LPS* M conA* LPS* Cellules de rate 200pg/ml + 50 +46 +30 -64 -50 -60 0 -6 -3 +30 +30 +20 -30 0 -20 0 0 0 12 +10 +28 0 -10 -30 0 0 0 0 Cellules B 200pg/ml +100 nt +18 -90 nt -80 -50 nt nt +50 nt 0 -60 nt -64 30 nt nt 12 0 nt 0 -50 nt -40 -50 nt nt 3 0 nt 0 -25 nt -7 -40 nt Cellules T pg/ml +30 -50 nt +4 -45 nt +32 -50 nt +18 -25 nt +30 -15 nt + 20 -20 nt 12 +20 -20 nt 0 -4 nt 0 -20 nt 3 0 -40 nt 0 -5 nt 0 -10 nt 0,7 0 -50 nt +50 0 nt 0 0 nt CONCLUSION Ces résultats démontrent l'existence d'une acti- vité des dérivés NP sur la prolifération des cellules lymphocytaires. Les cellules lymphocytaires sont donc parmi les cellules sensibles qui peuvent être visées par les procédés selon l'invention. - /' / / REVENDICATIONS 1/ Conjugué résultant d'un couplage entre un principe actif de médicament un nitrophényle. 2/ Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le conjugué fait intervenir un nitrophényle et que la liaison covalente intervient en C1 du cycle phényle ou au niveau de sa position phénol. 3/ Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que le nitrophényle est un 2,4-dinitrophényle. 4/ Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que le nitrophényle est un 2,4,6-trinitrophényle. / Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un conjugué tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 6/ Application d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, à la production d'un médica- ment pour le traitement d'une affection semblable à celle qui peut être traitée par le principe actif du médicament intervenant dans le conjugué, mais à l'état libre.