Brevet FR2620940A3 — publié le 19890331

FR 2620940 A3 19890331 FR 8812571 A 19880927 ! STRUCTURE FONDAMENTALE DE L'ACTION DES HORMONES, DES NEUROTRANSMETTEURS ET DES FACTEURS DE CROISSANCE DANS LA TRANSMISSION DU SIGNAL DANS LA CELLULE ET SES CONSEQUENCES PRATIQUES TRES IMPORTANTES. La communication joue un rôle indispensable dans la vie cellulaire d'un organisme o il y en a des milliards. Pour atteindre cet objectif, les molé- cules spéciales et sélectives, se trouvant en général à la surface membra- naire (je n'examine pas ici les hormones stéroides et d'autres hormones d'action analogue), réagissent avec les messagers de communication (ligands): les hormones, les neurotransmetteurs, les facteurs de croissance; ceux-ci dé- clenchent la séquence des événements (signal) qui induit la réponse cellulaire adéquate à l'état d'un organisme (la mitose, la synthèse des molécules, la différenciation, l'exocytose etc). Etant le sujet-clé de nombreuses disciplines biologiques et médicales (en- docrinologie, pharmacologie, immunologie, physiologie, neurologie, toxicologie, pathologie), cette question attire l'attention de très nombreux laboratoires de tendance basique et appliquée des Universités, des Instituts et des Hopitaux du monde entier. Malgré la récente explosion spectaculaire dans de nouvelles con- naissances (o les informations vieillissent en 2 ans seulement) dans la struc- ture établie et dans le mécanisme de l'action (et de la généralisation à partir de ceux--ci) des récepteurs, des protéines G et du second messager avec le phos- phatidyl phosphoinositol (PPI) et les protéines kinases, on n'a pas encore de connaissance approfondie des événements qui se passent à partir des récepteurs membranaires et, par conséquent, la cause de la présence de nombreux composants dans la membrane cellulaire reste aujourd'hui un vrai mystère. De nombreux points concernant la transformation du signal à travers la mem- brane restent à developper. Heureusement de nombreux résultats scientifiques divergents, concernant ce domaine-clé des Sciences de la vie et une série de mes propres travaux-clés dans le domaine du début du signal dans la cellule et dans la compréhension de l'action-du signal m'ont permis de créer et de dé- velopper une structure fondamentale et originale d'une action des hormones, des neurotransmetteurs et des facteurs de croissance. Les dérangements pendant les actions de ces substances physiologiquement importantes doivent conduire (et malheureusement ont conduit) aux nombreuses maladies existantes. Comme conséquence de cette structure fondamentale je présente ici les dfteloppments pratiques très importants et urgents: les préparations contre une dizaine de maladies mentales des nouveaux-nés, contre le cancer et pour l'exécution de l'anesthésie. Ma structure originale et fondamentale est exposée ci-dessous. Apres l'inte- raction du ligand avec le récepteur il y a un changement de conformation du ré- cepteur (garplus M. et McCammon J.A. Ann.Rev.Biochem.52,263,1983; Hakomori S. et collaborateurs J.Biol.Chem.259,6818,1984). Il doit être suffisamment large pour permettre selon la structure proposée aux chaînes des glucides de récepteur-glycoprotéine d'avoir l'interaction avec les glucides de glycoli- pides (Sharom F. et Grant C.W.M. Biochim.Biophys.Acta 507,280,1978).Le fait de la présence des similitudes fortes des structures glucidiques terminales des glycoprotéines membranaires avec les structures glucidiques des glycoli- pides (gangliosides et cérébrosides) (Jârnefelt J. et al Trends Biochem. Sci.3, ,1978;Hakomori S. Ann.Rev.Biochem.50,733,1981) peut permettre leur interac- tion plus forte à cause de la meilleure interaction des groupes hydroxyles des structures-"chaises",celles-ci devant avoir une superposition correspondante. Dans les systèmes des glucides ayant les liaisons H fortes, les molécules du solvant (l'eau), en général, sont exclues pendant cette interaction (Jeffrey G.A. et Matra J. Acta Cryst.B 39,469,1983;Goodby J.M. Molec.Cryst.Liquid Cryst. ,205,1984).Considérant les différences entre les parties des glucides pro- ximales des glycoprotéines et des glucides des glycolipides (Trends Biochem. Sci.3,110,1978), on peut imaginer les chaînes des glucides des protéines comme les branches d'un tronc d'arbre se penchant en direction de la membrane, le tronc étant incliné en direction parallèle au plan membranaire. Je considère que les molécules des gangliosides sont les premières de tous les glycolipides (ou plutôt des glycosphingolipides) qui réagissent avec les récepteurs-glycoprotéines, parce que d'une part il y a des interactions spéci- fiques et l'attraction électrostatique des charges négatives des gangliosides qui peuvent réagir avec les charges négatives des protéines au moyen des ponts de Ca2+ (Marsh D. et al Biochemistry 27,2398,1988)./Le degré de l'association de Ca2+ avec les gangliosides est- semblable à celui des phospholipides négatifs (McDaniel R. et McLaughlin S. Biochim. Biophys.Acta 819,153,1985), permettant aux molécules-"chases" de se rapprocher et d'avoir des interactions plus fortes./ D'autre part la plus grande hydratation et la plus grande dimension du groupe-tête doivent amplifier l'effet du signal faisant du ganglioside un premier réactif plus sûr (la quantité d'eau congelée pour des gangliosides est beaucoup plus importante que pour les cérêbrosides- Bach D. et al Chem. Phys. Lipids 31,381,1982). Le fait clair, qu'à partir des gangliosides, il y a déjà la formation de "patches" et de "caps" avec les anticorps contre les groupes de colorants conjugués avec ces gangliosides et évidemment se trouvant unique- ment sur les gangliosides des lymphocytes T (Spiegel S. et al J.Biol.Chem. 99, 1575,1984), argumente aussi pour la priorité des gangliosides. La participa- tion des gangliosides (les antigènes I et i) dans le processus de "capping" sans création de liens directs avec le ligand Concanavaline A (Con A) indique la même conclusion (Feizi T. et al Biochem.J.173,245,1978) . Le fait d'une action primaire des toxines, des virus et probablement d'autres agents est devenu ambigu d'après de nombreuses expériences (Curatolo W. Biochim. Biophys. Acta 906,137,1987; Goins B. et al Biophys.J.49,849,1986) qui indiquent les glycoprotéines comme de veritables récepteurs des virus et des toxines (c. a.d. plus proche de mon shéma proposé, reg.plus bas, s.v.p.). Ainsi on peut expliquer déjà les expériences de Kanfer J.N. et al (J.Biol. Chem.251,7610,1976), qui n'étaient pas facilement compréhensibles jusqu'à main- tenant. Avec les concentrations faibles de toxine cholérique il n'y avait pas d'effet de la toxine parce que ces concentrations n'étaient pas suffisantes pour réagir avec les glycoprotéines correspondantes (concentration molaire O plus faible que celle des gangliosides correspondants). D'autre part avec des concentrations très fortes de toxine, il y avait apparemment un blocage des groupes nécessaires de tous les gangliosides par la molécule de toxine relati- vement grande. Cette nouvelle explication interprète facilement la suppression du signal avec les quantités excessives de Con A. Ce fait est le sujet de nom- breuses discussions depuis longtemps (Edelman G. et al Proc.Natl.Acad.Sci. USA ,1442,1973). Les expériences avec les ligands multivalents, réagissant seu- lement contre les gangliosides, montrent l'absence des amas et confirment cette interprétation (Goins B. et al Biophys.J.49,849,1986; Thompson T.E. M. et al Biochim.Biophys.Acta 817,229,1985). De plus les expériences concernant D une action positive des molécules monovalentes de Con A et de Ricine (RCA 60) (Osawa T. et Berri M. Methods Enzymol.150,147,1987; Zagyansky Y. et Jard S.Exp. Cell Res. 132,387,1981)sont explicables en considérant le changement de confor- mation de la protéine-récepteur (comme l'action de l'hormone monovalente) Les expériences concernant le mécanisme de l'action de la toxine pertussis confirment cette explication. Selon ces expériences (Armstrong G.D. et al J.Bicl.Chem.263,8677,1988), l'hydrolyse de l'acide sialique et des groupes de N-acetylglucosamine (3ème de l'extremité de la chaîne glucide de récepteur- glycoprotéine) diminue fortement l'affinité de la chaîne glucidique pendant l'interaction avec la toxine. Mais l'hydrolyse du glucose (2ème de l'extre- 0 mité)ne change pas cette affinité. De plus grâce à la synthèse de cette chaîne glucidique sans ce glucose, l'affinité mentionnée a même augmenté. Sa- chant, par exemple, que la quantité optimale des glucides dans le site actif des anticorps est approximativement de 5 on peut supposer que seuls ces groupes (acide sialique et N-acetylglucosamine) interagissent avec le site actif de la toxine en se rapprochant et en provoquant une plus forte tension de la cha!ne parce que les groupes intermediaires du glucose apparemment ne font pas cette interaction. Maintenant je voudrais montrer pourquoi les glycosphingolipides membranaires ont les propriétés particulières qui leur permettent d'être des initiateurs li- 0 pidiques du signal dans la membrane. L'observation d'un comportement des sphin- golipides naturels lors des temperatures de transition montre qu'il y a la présence d'un état métastable. Cet état métastable est caractérisé par la participation des liaisons H interlipidiques (Pascher I. Biochim. Biophys.Acta 455,433i1976; Barenholz Y. et al Biochemistry 15,2441,1976; Estep T.N. et al Biochemistry 19,20,1980). La phase plus stable est caractérisée par l'hydratation des lipides avec les groupes de la surface et par la rupture des liaisons H intermoléculaires (Freire E. Biochemistry 19,3662,1980). Les sphingolipides ont aes groupes dans leur échine qui sont les donneurs et les accepteurs des liaisons H. L'orienta- tion des ces liaisons H des donneurs et des accepteurs (les groupes amides et les groupes hydroxyles) permet à ces molécules l'interaction latérale avec les autres molécules lipidiques (Pascher I. Eiochim.Biophys. Acta 455,433,1976). Si ces groupes OH sont exposés à l'eau enrobant les lipides membranaires, les liaisons H individuelles entre les molécules (lipide-lipide ou lipide-H20) n'ont pas besoin d'être fortes pour se refermer (lipide-lipide) d'une molé- cule à une autre (Boggs J.M. Biochim.Biophys.Acta 96,353,1987). Les ségréga- tions latérales des sphingolipides formant des amas sont bien connues (Chem. Phys.Lipids 42,3,1986). Mais cet état métastable"magique"n'est pas seulement la propriété des sphingolipides parce que même la phosphatidyl choline (PC) peut avoir la phase métastable semblable à celle de glycosphingolipides après transformation de sa chaîne acylique dans la chaîne "acyl-carbamoyl" qui se manifeste comme liaison H-donneur via le groupe NH (Curatolo W. Biochim.Biophys.Acta 906,111,1987). C.a.d. la phase métastable des sphingo- lipides est caractérisée par la liaison H entre les molécules mais pas par une conformation spécifique ou par une configuration stérique des groupes- têtes ou de l'échine des céramides. Dans la structure fondamentale proposée je suppose que, après cette forte déshydratation produite à cause des interactions plus fortes des glu- cides de gangliosides avec ceux de glycoprotéines, il y a une transition des molécules lipidiques des gangliosides dans un état caractérisé par les liai- sons H entre les chaînes d'après le changement de conformation et très probab- lement une déshydratation provoquée par les interactions indiquées plus haut. Le fait de l'inhibition totale de l'aggrégation des plaquettes seulement après le remplacement de l'eau par D20 sans le changement de l'association du ligand (Hwang S.B. et al Biochemistry 22,4756,1983), prêche en faveur de l'importance mentionnée de l'eau dans la transmission du signal à travers la membrane, bien que je ne puisse pas insister, selon la structure proposée, sur l'issue de toutes les expériences semblables. Un autre fait important et pas accidentel est très interessant. Les régions des récepteurs, comme le ré- cepteur muscarinique (Kerlavage A.R. et al Trends Pha-ac.Sci.8,426,1987), le récepteur,P-adrénergique (Dolhman H.G.et al Biochemistry 26,2657,1987), ou le récepteur de la lipoprotéine de faible densité (LDL) (Goldstein J. L. et al Ann.Rev.Cell.Biol.1-,1,1985) (qui participe aussi dans la transmission du signal- Block L.H. et Pletscher A.Trends Pharm.Sci.9,214, 1988), se situant près des places d'une fixation des glucides et ayant l'interaction avec les glycosphingolipides, ont trop peu de charges. Ceci doit aider à la déshydra- tation profonde mentionnée et indique la justesse de la structure proposée. Les résultats,obtenus avec la sonde paramagnétique, indiquent la redistribu- tion des liaisons H des céramides et des cérebrosides après l'interaction des ligands (la Con A et la phytohémagglutinine) avec leurs récepteurs (Cur- tain C.C. et al Biochim.Biophys.Acta 596,43,1980). Le fait que des gangliosides (la chaîne glucidique du ganglioside intacte avec la chaîne lipidique dégénérée) agglomèrent ("cocap") avec les "caps" des immunoglobulines membranaires avec leurs anticorps sur des lymphocytes (Sedlacek H.H. et al FEBS Lett.61,272,1976), confirme l'ordre des événements indiqués ci-dessus. Les résultats de la résonance magnétique nucléaire (Tka- czuk P. et Thornton E.K. Biochem.Biophys.Res.Comm.91,1415,1979) montrent la dépendance entre la conformation de la chaîne acylique et la groupetête de glucides dans les glycolipides. On trouve la même dépendance entre la confor- mation du groupe-tête et la chaîne lipidique dans les expériences avec les molécules synthétiques et naturelles de sphingomyéline (SM) avec les lon- gueurs des chaÂnes différentes. Seulement les molécules de stearoyl-SM ont eu un état de la transition métastable (Estep T.N. et al Biochemistry 19,20, 1980). La dépendance de l'accessibilité des cérébrosides de la matrice li- pidique à leurs anticorps(Crook et al Biochemistry 25,7488,1986) montre aussi la validité de l'interprétation ci-dessus. On peut supposer que, après cette interaction des glucides avec la déshy- dratation mentionnée, les parties lipidiques des gangliosides peuvent plus facilement avoir des interactions qui correspondent à un état métastable des liaisons H intermoléculaires. Cette "cristallisatinn' à partir d'un centre protéinique (récepteur) après les interactions des gangliosides, qui ont un plan structural des glucides semblable, doit continuer avec les cérébrosides. On voit ici encore une confirmation. La majorité des cérébrosides ont le glu- cose et le galactose dans le groupe-tête. On les trouve dans la partie pro- ximale des gangliosides, libres de l'interaction avec glycoprotéines, avec une autre confirmation. Je propose que les cérébrosides constituent la partie de ce "cristal" (plaque) métastable dans le deuxième "cercle concentrique" autour du récepteur par les interactions des glucides et, encore plus impor- tant, par les liaisons H interlipidiques. Apparemment à partir d'une dimen- sion (qui reflète des changements plus grands accompagnant la soustraction de l'eau de la partie correspondante de la membrane) les interactions lipi- diques sont suffisantes parce que les lipides comme céramide (sans les glu- cides) sont agglomérés dans la plaque (Curtain C.C. et al Biochim.Biophys. Acta 596,43,1980;Curtain C.C. Biomembranes 12,229,1984;Curtain C.C. Methods Enzymol.150,480,1987) (il n'y a que les quantités faibles du céramide dans la membrane naturelle,reflétant le fait qu'il est le produit du métabolisme). La molécule de SM avec la longueur de la chaîne acylique 18C (18:0),qui a la phase métastable mentionnée et caractérisée par les liaisons H intermolé- culaires (Biochemistry 19,20,1980),peut vraisemblablement participer par sa partie lipidique à cette plaque agrandissant par des liaisons H interlipi- diques. Mais les autres molécules naturelles de SM ne peuvent pas, apparem- ment, y participer (Barenholz Y. et Thompson T.E. Biochim.Biophys.Acta 514, 239,1978).Les résultats de RMN indiquent la présence de liaisons H intramo- léculaires dans ces molécules (Bruzic K.S. Biochim.Biophys.Acta 939,315, 1988).Très vraisemblablement cela reflète l'absence d'un état métastable des molécules de SM naturelles (Biochemistry 19,20,1980) et la constance d'un spécimen de la diffraction des rayons X des bicouches de SM exposées aux humidités différentes (Khare R.S. et WArthington C.R.W. Biochim.Biophys. Acta 514,239,1978). Et apparemment pour "attirer" toutes les molécules de SM membranaires la Nature a trouvé une solution originale. On sait que les SM des membranes des mammifères ont leur temperature de transition à près de 37 C (Shmidt C.F. et al Biochemistry 16,2649,1977). On sait également que plus de 50% des SM de la membrane plasmique ont sur la longueur de la chaîne acylique plus de 20 carbones (Biochim.Biophys. Acta 604, 129,1980). Et en plus l'empaquetage des chaînes lipidiques de SM dans la bi- couche est très dense et il n'y a aucune interdigitation des molécules adja- centes dans la même couche (Biochim.Biophys.Acta 514,239,1978). C.a.d. il y a une forte dissipation de l'énergie libre pendant la transition de phase de SM. Et quand avec les liaisons H intermoléculaires les molécules de SM (qui ont la longueur des chaînes 18:0 et la temperature de transition évidemment de plus de 370C) sont pris dans la plaque mentionnée, le reste des autres molécules de SM doit avoir l'état- du gel sans influences complémentaires de près des mêmes 37 C "cellulaires". Il est probable que la mosaïque organisée des molécules de SM avec les chaînes très et moins longues doive surgir dans la plaque autour du récepteur. La mosaïque des chaînes grasses ayant "le cercle concentrique" décrit peut apparaître et autour des dimères des récep- teurs du facteur de croissance epidermique (EGF) et de l'insuline (Schlessin- ger J. J.Cell.Biol.103,2067,1986) avec les dimensions plus petites, ces di- mères étant formés après l'action du ligand sans négation du changement de conformation indépendant (Cochet C. et al J.Biol.Chem.263,3290,1988). Mais après cette création des domaines de SM (même conmme "anneau extérieur") on peut naturellement supposer qu'il y a une interaction du cholestérol avec SM parce que l'interaction préférentielle du cholestérol avec SM (Boggs J. M. Biochim.Biophys.Acta 906,353-404,1987; Lund-Katz S. et al Biochemistry 27, 3416,1988) peut avoir lieu seulement avec les domaines de SM mais pas avec les molécules de SM individuelles (Stevens V.L. et al Biochemistry 25,4287, 1986). Je suppose que cette redistribution du cholestérol dans le plan mem- branaire doit conduire à la diminution appréciable de la quantité de chole- stérol dans le reste de la membrane qui doit provoquer la séparation de phases (Oldfield E. et Chapman D. FEBS Lett.23,285-297,1972) après l'interaction d'un ligand avec le récepteur (Zagyansky Y. et Jard S. Nature 280,591, 1979). En conséquence on peut supposer la création de zones fluides avec les phospho- lipides qui ont une affinité faible pour le cholestérol ou à cause de leurs chaînes lipidiques ou à cause de leurs têtes. Par exemple, la phosphatidyl éthanolamine a une telle affinité au cholestérol(Van Dijck P.W.M. et al Bio- chim.Biophys.Acta 455,576,1976) et doit apparemment être dans cette zone li- pidique. La publication de Broekman M.J. et al (J.Clin.Invest.66,275,1980) , selon laquelle la phospholipase A2 agit préférentiellement sur PE pendant l'activation des plaquettes argumente pour cela. Le fait de la présence de seulement 10% de l'acide arachidonique (AA) dans la couche extérieure de la quantité de AA totale dans la membrane (Biochim.Biophys. Acta 556,434,1979) et de la présence d'au moins 50% de AA dans la couche extérieure de la quan- tité totale de AA dans PE (Schick P.K. et al Biochim.Biophys.Acta 556,434, 1979) (donnant une plus forte garantie de l'action de la séparation de phases enregistrée par Zagyansky et Jard -Nature 280,591,1979) confirme la propaga- tion mentionnée. Les molécules de PC avec les chaînes cis et bien insaturées comme AA (20:4) doivent avoir une faible affinité au cholestérol parce que, dans le cas de la bicouche de PC, le cholestérol s'étend seulement jusqu'au douzième atome C (Biochemistry 27,3416,1988). Il est évident que les différents coudes de AA sont un obstacle aux meilleures interactions avec le cholesté- rol, Les expériences avec les antibiotiques (polyenes) qui font les interac- tions spécifiques avec le cholestérol et même selon Schroeder (Prog.Lipid Res.23,97,1984) l'elimine de la membrane en faisant le complexe, confirment aussi la validité de la structure proposée avec la participation du cholesté- rol. Selon Zagyansky et Jard (Exp.Cell Res.132,387,1981), l'amphotéricine B elimine les effets biologiques et physiques de l'action des ligands et selon Williams et Lefkowitz (J.Biol.Chem.252,7207,1977), la molécule de filipine fait un obstacle à l'association de l'agoniste avec le récepteur 8adréner- gique. La présence du site actif du récepteur de ce type près de la membrane bioloqique (Khorana H.G. J.Biol.Chem.263,7439,1988; Wong S.K.F. et al J. Biol. Chem.263,7925,1988) a facilité apparemment l'obtention de ces résultats. Selon H.McConnel et collaborateurs (J.Phys.Chem.90,2311,]986), le chole- stérol s'accumule près des interfaces: liquide-solide pour diminuer la ten- sion de surface. Cette conclusion de McConnel et collaborateurs coincide avec ma suggestion que justement les molécules de SM, qui ont l'affinité supérieure au cholestérol et qui n'ont pas de liaisons H intermoléculaires, doivent se trouver près de la frontière liquide-solide. La conclusion que SM ait une liaison intramoléculaire entre le groupe 3hydroxyl et l'oxygène de la partie ester (Biochim.Biophys.Acta 939,315, 1988) et la conclusion que le cholestérol fasse l'ineraction avec le carbonyl du groupe amide des sphingolipides par la liaison H (Fong J.W. et al Lipids 12,857,1977; Brockerhoff H. Lipids 9,645,1974), confirme le fait de l'interac- tion plus forte du cholestérol avec SM. D'un autre côté très vraisemblable- ment, les groupes NH des glycosphingolipides participent aux interactions intermoléculaires des lipides, et leur interaction avec le cholestérol doit être plus faible. L'interprétation de la confirmation expérimentale de cette création de zones plus fluides autour de la plaque avec le récepteur est con- cluable d'après les expériences de Curtain et al (Biochim.Biophys.Acta 596,43, 1980). (La PC avec une chaîne modifiée n'a pas dû avoir l'interaction forte avec le cholestérol et son microenvironnement devient plus fluide après le signal). Huganir et Greengard (Trends Pharm.Sci.8,472,1987) ont classifié les récep- teurs membranaires en 3 groupes:l)les récepteurs qui activent des effecteurs par les protéines G, 2)les récepteurs qui sont les tyrosine kinases, 3)les récepteurs qui font la conductibilité des ions par ses changements de confor- mation. /Selon Morrison et Needleman "Hormonal Function and the Kidney',' Bren- ner B.M. et Stein J.H. eds. vol.4,66-114,1979-la citation par J.Biol.Chem. 263,10745,1988-les métabolites de l'acide arachidonique ne fonctionnent pas comme hormones circulantes mais sont plut8t les parahormones ou autocoids et font leur action au niveau des seconds messagers.Reg.,s.v.p.,aussi Axel- rod J. et al Trends Neur.Sci.11,117,1988; Yamaguchi D.T. et al J.Biol. Chem. 263,10745,1988/. Les récepteurs du 3ème groupe (comme l'acetylcholine récep- teur nicotinique) ne sont pas le sujet de cette invention quoique la partie essentielle des conclusions de la structure proposée est applicable pour l'action de ces récepteurs/.D'un autre côté on peut diviser le premier groupe en deux sous-groupes: les récepteurs qui activent le cycle de phosphatidyl inositols et les récepteurs qui activent ou inhibent l'adényl cyclase. Outre cela,-les protéines G doivent apparemment participer à l'action des récepteurs du deuxième groupe (Delphin A.C. Trends Neur.Sci.11,287,1988). En réalité la classification est beaucoup plus compliquée parce qu'il y a la présence de l'interaction homogène et hétérogène des récepteurs (Ber- ridge M.J. Ann.Rev.Biochem.56,159,1987; Enna S.J. et Karbon E. Trends Pharm. Sci.8,21,1987; Alkon D.L. et Rasmussen H. Science 239,998,1988; Huganir R. et Greengard P. Trends Pharm.Sci.8,472,1987) ou par exemple, il y a la présence des formes différentes des isorécepteurs avec des mécanismes d'action diffé- rents (Michel B. Trends Pharm.Sci.9,N04,VI,1988 ou par exemple Peralta E. Na- ture 334,434,1988) ayant l'interaction entre eux. En conséquence, le signal est determiné comme une somme d'après une superposition des composants des cycles et des noeuds interférant entre eux qui dépend d'un type cellulaire, d'un type du tissu, d'un état cellulaire dans un moment particulier, des con- centrations des substances différentes, d'une présence des autres signaux etc. Mais quand même on peut reveler les noeuds du signal essentiels et même com- muns pour tous les cas mentionnés ci-dessus d'après toutes les manifestations nombreuses de l'activité cellulaire souvent observées dans les cultures cellu- laires étant dans les conditions différentes de celles d'un organisme, dans les lignes etablies et leurs mutantes ayant la quantité de chromosomes modi- fiée, ou dans les cultures des cellules cancéreuses ou transformées. Je pense que ces noeuds communs incluent les complexes des ligands avec des récepteurs, des glycolipides et des phospholipides ayant une haute affi- nité (reg.plus bas,s.v.p.) et se situant longtemps sur la surface cellulaire pendant le signal. Ces noeuds communs incluent aussi les complexes des ligands avec des récepteurs et des lipides ayant une faible affinité et servant, comme je suppose la première fois, à la régulation de l'activité des enzymes sur la couche intérieure de la membrane. La présence de ces récepteurs d'affinité différente a été observée dans tous les types de récepteurs (et comme je le suppose d'une manière convaincante, peut être révélée dans tous les récepteurs): les récepteurs avec le cycle PPI, avec l'action de cAMP et avec l'action de tyrosines kinases (reg.plus bas,s.v.p.). Ces complexes avec une faible affinité (qui n'est pas elle-même constante et, apparemment, diminue avec la progression du signal-reg.plus bas,s.v.p. ) ne se trouvent pas pendant longtemps sur la surface cellulaire. Ils sont endo- cytés par les puits recouverts. Les produits de cette endocytose servent seule- ment à la régulation de l'action des complexes affins mais moins nombreux dans tous les types de récepteurs considerés, restant pendant longtemps sur la sur- face cellulaire (reg.plus bas, s.v.p.). La confirmation sérieuse de la généra- lité des processus, ayant lieu sur la surface cellulaire, est la présence du courant "sustained" de Ca2 à travers la membrane plasmique dans tous les types de récepteurs (Kojima I. et al J.Biol.Chem.260,9171,1985; Schlessinger J. Biochemistry 27,3119,1988; Meldolesi J. et Pozzon T. Exp. Cell Res.171,271, 1987). Puis le noeud commun de tous les récepteurs considérés doit être la protéine kinase C (reg.plus bas, s.v.p.). L'endocytose mentionnée plus haut, synchronisée avec le courant du signal, doit servir à sa régulation (au moins) comme rétroaction. Comme je le pense (reg.plus bas,s.v.p.), la régula- tion de l'association "adressable" des protéines périphériques et temporaires comme la protéine kinase C ou les protéines G (aussi présentes dans tous les signaux- Dolphin A.C. Trends Neur.Sci.11,287,1988) a lieu pour tous les si- gnaux: 1) avec la mosaique des longs acides gras de la couche extérieure de la membrane pendant la création du complexe mentionné des sphingolipides avec les récepteurs qui doivent être individuels pour chaque signal, 2) avec le système de l'inclusion bien régularisée et synchronisée des acides gras insaturés dans les phospholipides de la couche intérieure comme conséquence de l'augmentation de la transformation de l'échange des lipides dans la cel- lule avec la propagation du signal. Dans la grande quantité des récepteurs de tous les types considerés (Fre- lin C. et al Eur.J.Biochem.174,3,1988) avec la propagation du signal il y a une augmentation du pH dans le cytoplasme qui est la conséquence de l'action + + de l'echangeur Na /H activé par la protéine kinase C (reg.plus bas, s.v.p. ). Comme résultat du signal,le sodium entre dans la cellule et il y une activa- tion de la synthèse de ARN, des protooncogènes et de ADN dans le cas de la mitose (Berridge M.J. Ann.N.Y.Acad.Sci.494,39,1987). Comme je pense, les deux types des récepteurs avec les affinités très diffé- rentes sont justement le résultat des interactions mentionnées ci-dessus (Lefkowitz R.J. et al Ann.N.Y.Acad.Sci.185,195,1971; Jard S. et al Adv. Cycl. Nucl.Res.5,31,1975; Kahn C.R. J.Cell.Biol.70,261,1976; Bonne D. et Cohen P. Eur.J.Biochem.56,295,1975; Yanagibashi K. et al Endocrinol.Japn.25,545, 1978; Muchmore et al J.Biol.Chem.256,365,1981). Les arguments suivants témoignent de cela. Harden et al (Science 210,441,1980) ont séparé dans le gradient de densité les récepteurs -adrénergiques avant l'interaction avec le ligand obtenant le spectre continue des récepteurs avec les deux maximums faiblement exprimés dans le diapason des densités. Après l'interaction avec le ligand, dans la cellule bien sûr, il y a une forte redistribution du nombres de ré- cepteurs et les 2pics deviennent clairement exprimés. Le pic, essentiellement plus grand, correspond aux récepteurs avec l'affinité moins forte. C'est la première fois que je propose qu'il y ait un équilibre dynamique entre ces deux formes de récepteurs. Apparemment des composants comme les glycolipides, avec lesquels il y a la création du complexye ligand-récepteur, changent l'af- finité de récepteur au ligand, et ils sont justement de tels composants mi- grants entre les récepteurs différents qui font l'équilibre dynamique men- tionné des récepteurs, celui-ci étant profondement déplacé en présence du ligand, en plus dans les formes stables. Selon Hakomori et collaborateurs, Il par exemple les gangliosides GM1 et GM2 augmentent l'affinité des récepteurs au facteur de croissance (J.Biol.Chem.259,6818,1984). Ou par exemple, selon la proposition de Chorev et collaborateurs (Eur.J.Biochem. 146,9,1985), le derivé de l'antagoniste irreversible se lie avec le site du récepteur tan- dis que sa queue bromacylique fait l'interaction avec la molécule de lipide qui apparemment participe à la création du site actif. Cette nouvelle hypo- thèse pourrait clairement expliquer le mystère de 12 ans d'une absence de la restitution complète de fluorescence des complexes des récepteurs avec ou sans ligands dans la membrane cellulaire native en commençant par la prem- ière au monde, en 1975, expérience sans ligand dans le site actif (Edidin M., Zagyansky Y. et Lardner T.J. Science 191,466,1976) par la technique du rétab- lissement de la fluorescence après photo-extinction (FPR) (Edidin M. New Comprehensive Biochemistry vol.I Membrane Structure p.37 Eds.Finean J.B. and Michel R.H., Elsvier 1981; Jacobson K. et al Ann.Rev.Physiol.49,163, 1987). De plus malgré la présence de zones à mobilité limitée après l'interaction du * récepteur avec le ligand (Zagyansky Y. et Jard S. Nature 280,591,1979), in- fluençant remarquablement le pourcentage du rétablissement de la fluorescence, il y a la présence des"récepteurs immobiles" parce que le pourcentage du ré- tablissement de la fluorescence dans cette expérience augmente de 30 à 50 d'après les photo-extinctions réitérées quoiqu'il n'y a pas eu 100% du rétab- lissement à cause des zones à mobilité limitée.La présence de la mobilité de "100% des récepteurs libres, sans ligand,sur toute l'étendue de la cellule dans le champ électrique (Poo M. et al J.Cell.Biol.76,483,1978; Zagyansky Y. et Jard S. Nature 280,591,1979;McCloskey M.A. et al J.Cell. Biol.99,778,1984; Tank D. et al J.Cell.Biol.101,148,1985) est bien résoluble, et apparemment essentiellement grace à l'hypothèse introduite, même avec une apparente con- tradiction à la présence d'un grand pourcentage des "récepteurs immobiles" (Il n'y avait pas du tout de mobilité des récepteurs dans toutes ces expériences dans un certain pourcentage des cellules, peut- être par exemple à cause de la présence des cellules dans des stades différents pendant le cycle cellulaire- De Laat et collaborateurs Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,1526,1980). Je pense que deux larges sous-groupes des récepteurs, révélés pendant l'in- teraction de récepteurs. -adrénergiques avec les lectines conjuguées avec l'agarose (Lefkowitz R.J. et collaborateurs J.Biol.Chem.259,8655,1984), doivent refléter justement la présence des changements de conforamtion dans les récepteurs qui sont apparemment dans le complexe avec les sphingolipides les plus proches. Cela doit provoquer une accessibilité différente des ré- cepteurs aux lectines sur l'agarose et une apparence de deux types d'affinité pour les récepteurs sans ligands.On peut supposer aussi que, puisque les ré- cepteursú-adrénergiques sont les récepteurs pour Con A, il y a le déplace- ment d'un équilibre entre les deux types de récepteurs sans ligands après l'interaction avec Con A (Science 210,441,1980) parce qu'apparemment il y a un changement du microenvironnement sphingolipidique. Selon De Meyts et al (J.Biol.Chem.251,1877,1976) l'occupation du site ac- tif des récepteurs de l'insuline par les molécules du ligand commence par les récepteurs plus affinés en continuant par les récepteurs moins affinés. Comme je suppose, les composants, comme les gangliosides pour un état d'affinité forte, étant en quantité limitée dans la membrane cellulaire, sont "arrachés" par les récepteurs réagissant en premier lieu, en outre apparemment statisti- quement. Le fait que les récepteurs de Con A,beaucoup plus nombreux que les récepteurs de l'insuline,prennent dans ces sites actifs ces composants essen- tiels mais déficitaires, indique aussi pour cette supposition, parce que, d'après cette intervention de Con A,le graphique de Scatchard devient linaire, reflétant seulement la présence des sites avec l'affinité faible. Aussi les graphiques de Scatchard sont devenus linaires avec les sites actifs de l'affi- nité faible après la modulation analogue par les récepteurs de Con A des immu- noglobulines G membranaires (J.Biol.Chemr.251,1877,1976). Le fait, que pour une élimination des sites actifs les plus affins des récepteurs différents, l'in- teraction seulement avec Con A soit nécessaire, prouve clairement qu'apparem- ment cela doit concerner les molécules ayant les glucides correspondants. Il est très probable que cela concerne les gangliosides, ce qui confirme claire- ment la structure proposée. Apparemment les nombreuses interactions des lec- tines différentes bloquent l'association de l'EGF avec leurs récepteurs (37 et 4 C) (Carpenter G. et Cohen S. Biochem.Biophys.Res.Comm.79,545, 1977). En considerant tous ces résultats expérimentaux il faut avoir en vue que, en réalité, les sites actifs des récepteurs doivent avoir une plus forte affinité pendant une association avec les antagonistes que celle reçue déjà d'après des manipulations avec eux (Catt J. et al Nature 280,109,1979). On peut voir d'après les expériences de Pratt et Pastan Nature 272,68, 1978) que l'affinité du site actif est créee avec l'assistance des interac- tions glucidiques et en conséquence, d'après ma structure proposée, avec l'as- sistance des glicoiipides, parce que le changement analogue mentionné de l'af- finité des récepteurs de l'insuline a lieu apparemment dans ce cas lorsque l'association de l'EGF avec les récepteurs des cellules mutantes, privées de la synthèse de N-acetylglucosamine, est seulement un tiers de l'association de cellules normales (37 et 4 C), et n'est que 13% avec les récepteurs des cellules mutantes transformées avec la tunicamycine, qui inhibe l'association des glucides aux récepteurs. Et encore apparemment, le même cas d"'arrache- ment" des composants "déficitaires" avec la diminution de la constante d'asso- ciation a lieu après l'association irréversible de l'antagoniste -adréner- gique ("affinity label") qui a une liaison covalente avec le lipide constitu- ant le site actif. Avec cela, cet antagoniste peut être associer seulement avec la moitié des sites actifs (Levitzky A. et collaborateurs Eur.J.] iochem. 146,9,1985). Le fait, que la structure oligomère de ce récepteur ne soit pas connue, confirme cette conclusion (Lefkowitz R.J. et Caron M.G. J.Biol. Chem. 263,4993,1988). Je pense qu'il y a deux types d'événements pendant et après la création des complexes, mentionnés ci-dessus, pour tous les types de si- gnaux. Premièrement, ce sont les événements qui passent dans la couche extér- ieure de la membrane qui conduisent d'un côté à l'augmentation du courant de Ca2+ dans la cellule à travers la membrane plasmique et d'un autre c8té à 0 la désensibilisation et l'endocytose des récepteurs avec les ligands. Et deuxièmement, ce sont les événements se propageant à cause apparement des changements de conformation des récepteurs à l'intérieur avec l'activation de la tyrosine kinase, de l'adényl cvclase, de la protéine kinase C. Avec cela, il y a aussi la modulation, comme je propose la première fois, de la redistri- bution et de la conformation des chaînes grasses des glycolipides et des phos- pholipides de la couche intérieure de la membrane avec surtout les chaînes de sphingolipides "intentionnellement" longues des complexes décrits plus haut qui conduit au changement de redistribution des protéines différentes comme protéines G, protéines kinases et phospholipases et leurs substrates entre 0 la surface membranaire intérieure et le cytoplasme et, comme je pense, qui détermine la localisation suffisamment précise de ces protéines périphériques dans les niches préparées pour eux dans la membrane. Les niches doivent être suffisamment bien déterminées pour chaque type de récepteurs parce que elles (niches) doivent être déterminées par le shéma de l'interaction proposé plus haut: récepteur-+ ganglioside+ cérébroside-. sphingomyéline évidemment individuel pour chaque récepteur. Regardons les événements se passant dans la couche extérieure de la mem- brane. Vraisemblablement, la redistribution des lipides sur la surface mem- branaire et la création des phases différentes d'après l'action du ligand 0 conduit à l'activation des phospholipases C et D spécifiques pour les molé- cules de glycosylphosphatidyl inositol qui contiennent le glycanne, l'étha- nolamine et la protéine interconnectés avec les liaisons covalentes avec le phosphatidyl inositol (PI) (LowH.G. et Satiel A.R. Science 239,268, 1987; Satiel A.R. et al Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.320,345,1988). Si une large expan- sion de ces molécules dans la membrane plasmique des cellules différentes (Margolis R.K. et al Eochemistry 27,3454,1988) confirme le caractère géné- ral de l'action des phospholipases C et D dans ce cas pendant les signaux dif- férents. Telle hydrolyse conduit à l'apparition des molécules de diacylglycé- rol (DG) (Satiel A.R. et al Science 233,967,1986; Mato J.M. et al J.Biol. Chem. 0 262,2131,1987; Standaert M.L. et al J.Biol.Chem.263,8696,198). L'acide phos- phatidique (PA) doit apparaître apparemment tout de suite (Farese R.V. et al Science 236,586,1987) ou après l'action de la phospholipase D dans la couche extérieure de la membrane (Low H.et Satiel A.Science 239,268,1987) ou avec le délai d'après l'action de la diacylglicèrol kinase sur DG (Billah M. et al Biochem.Biophys.Res.Comm.90,92,1979; Cockcroff S Biochim. Biophys.Acta 795, 37,1984). En outre, l'activité de la phospholipase C spécifique pour PC (son action était révélée dans la couche extérieure de la membrane en quelques se- condes) contribue à l'apparence de DG. Le fait de la présence du petit pic, qui est près du début du signal, montre que l'action de ces phospholipases de la couche extérieure a lieu (Honeycutt P.J. et Niedel J. E. J.Biol.Chem.261, 15900,1986): ce pic a les dimensions relatives semblables à l'expérience de Griendling K.K. et al (J.Biol.Chem.261,5901, 1986) après l'action de la toxine pertussis qui inhibe des protéines G se situant à la couche intérieure de la membrane et ayant la participation à l'action des phospholipases C (aussi A2 et D) de la couche intérieure de la membrane (Exton J.H. FASEB J.2,2670,1988) (reg.plus bas, s.v.p.). Avec cela apparemment, le réseau favorable des liai- sons H intramoléculaires dans la molécule de phospholipase A2 nécessaires à son activation (Ono T. et al J.Biol.Chem.263,5732,1988) est crée, considérant la création des liaisons H intermoléculaires mentionnées des sphingolipides et la déshydratation près de la structure extérieure lipidique. Le fait de la diminution de l'activité de la phospholipase A2 avec l'action des anesthé- tiques (Mooibroek M.J. et al J.Neurochem.44,1551,1985) confirme cet argument. Il est proposé que les anesthétiques suppriment les liaisons H dans leur ac- tion (Brockerhoff H. et al Lipids 21,405,1986; Boggs J.M. Biochim.Biophys. Acta 906,353,1987). C.a.d. d'après ma structure proposée plus haut, on peut déduire un mécanisme concret et pratique de l'anesthésie: la suppresion des liaisons hydrogènes entre les molécules des sphingolipides. Les expériences de Hirata et al (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,3190,1981) prouvent la présence de l'activation de la phospholipase A2. Les anticorps contre les molécules de lipomoduline (l'inhibiteur de la phospholipase A2) appliqués à l'extérieur de la cellule ont augmenté l'activité de cet enzyme appr. de 3 fois (sans hormone) et de 12 fois (avec hormone). Ainsi l'action des enzymes différents sur la surface cellulaire conduit à la formation temporaire de DG et à la création de PA presque dès le début du signal (Lapetina E.G. et Cautricasas P. Biochim.Biophys.Acta 573,394,1979). Apparemment dans tous les types de ré- 2± cepteurs, le PA sert au flux de Ca à travers la membrane par un mécanisme encore mystérieux: un autre mécanisme proposé (avec le métabolisme de PPI) n'a pas les confirmations essentielles (Downes C.P. Trends Neur.Sci.11,336, 1988). Ensuite, il y a une activation de la protéine kinase C dans tous les cas. Dans le cas du mecanisme-"PPI",cette activation a lieu à cause de l'augmen- tation temporaire de Ca2+ dans le cytoplasme et de l'augmentation de DG (Ni- shizuka Y. Nature 308,693,1984) et dans les autres cas, apparemment à cause d'une action directe de DG (Standaert M.L. et al J.Biol.Chem.263, 8696,1988; Satiel A.R. et al Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 320,345,1988). Il y a de nombreux résultats qui indiquent que la protéine kinase C participe à l'action du si- gnal dans les systèmes sans le cycle PPI (Levitzki A. Physiol.Rev.66,819, 1986; Sibley D.R. et al Biochem.Biophys.Res.Comm.121,973,1984; Kelleher D. J. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,4316,1984; Jacobs S. Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80,6211, 1983; Iwashita S. et Fox C.F. J.Biol.Chem.259,2559,1984; Bell J.D. et al J. Biol.Chem.260,2625,1985; Standaert M.L. et al J.Biol.Chem.263,8696,1988; Bol- lag G.E. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,5821,1986; Yarden Y. et Ulrich A. Biochemistry 27,3113,1988; Schlessinger J. Biochemistry 27,3119,1988; Nishi- zuka Y. Nature 334,661,1988; Clegg R.A. Curr.Top Cell.Regul.29,77,1988). Et en plus on sait que la protéine kinase C influence l'echangeur Na+/H+ et les ions hydrogènes sortent de la cellule en augmentant le pH dans le cytoplasme (Siffert W. et Akkerman J.W. Trends Biochem.Sci.13,148,1988; Hagag N. et al Mol.Cell.Biol.7,1984,1987;Zavoico G.B. et al J. Biol.Chem. 261,13160,1 6; FRelin C. et al Eur.J. BIochem.174,3,1988; Rozengurt E. Ciba Foundation Symp. 116,66,1985-Pitman,LOndon; Berridge M.J. Ann.N.Y.Acad.Sci.494,39,1987). Cette augmentation du pH était enregistrée dans un très grand nombre de signaux de tous les types (Frelin C. et al Eur.J.Biochem.174,3,1988), ce que confirme respectablement le fait de l'activation de la protéine kinase C dans tous ces signaux. Le DG, dans la couche intérieure de la membrane, apparemment est formé de plusieurs sources. C'est la phospholipase C spécifique pour PI (Grillone L.R. et al J.Biol.Chem.263,2658,1988; Griendling K.K. et al J.Biol.Chem.263, 10620, 1988) avec l'activité dépendant du flux de Ca2+ à travers la membrane (Bil- lah M. et al Biochem.Biophys.Res.Comm.90,92,1979; Pai J.K. et al Biochem. Bio- phys.Res.Comm.150,355,1988). Outre cela, il y a la phospholipase C spécifique pour PC (phosphatidyl éthanolamine-PE) qui a apparemment sa protéine G (Ir- ving H.R. et Exon J.H. J.Biol.Chem.262,3440,1987; Wolf R.A. et Gross R.W. J. Biol.Chem.260,7295,1985; Bocikino S.B. et al J.Biol.Chem.260,14201,i B5; Gril- lone L.R. et al J.Biol.Chem.263,2658,1988). Cette protéine G peut être ac- tivée par la protéine kinase C (Bocikino S.B. et al J.Biol.Chem.260,14201, 1985). La phospholipase C spécifique pour PC (PE) n'a pas besoin de flux de Ca2+ à travers la membrane (Biochem.Biophys.Res.Comm.150,355,1988) comme la phospholipase D de la couche intérieure pour PC(PE) qui a aussi sa protéine G spécifique (Bocikino S.B. et al J.Biol.Chem.262,15309,1987; Cabot M.C. et al FEBS Lett.233,153,1988) L'activité de cette phospholipase D peut être augmentée par la protéine kinase C (FEBS Lett.233,153,1988). La cinetiquo (de nla formationl de DG est souvent avec les deux pics (Griend- ling K.K. J.iol.Chem. 261,521,1986; Besterman J.M. et ai Proc.Natl.Acad. USA 83,6785,1986: Farose R.V. et al Science 236,586,1987; Reibman J. et al J.Biol.Chem. 263,6322,1988). La précision de la méthode n'est pas très grande parce que)DC était mesure dans la membrane et dans le cytoplasme. Et par exemple dans le cas des cellules adipeuses, une augmentation de DG, à cause de la degradation de PI, est très difficile à voir parce que la quan- tité de DG dans ce type de cellules est très grande (Augert G. et Exton J. N. J.Biol.Chem. 263,3600,1988). Je pense que le premier pic correspond aux deux réactions décrites plus haut: la formation de DG dans la couche extérieure de la membrane à cause de l'hydrolyse des glycosylinositols et de l'hydrolyse de PC (PE) et la formation de DG dans la couche intérieure de la membrane à cause de l'hydrolyse de PPI (Yap W.H. et ai Science 234, 355,1986; Griendling K.K. et al J.Biol.Chem.261,591,1986; Reihman J. et al J.Biol.Chem. 263,6222, 1988). Avec l'activation do la protéine kinase C, il y a une inhibition de l'activité de la phospholipase C hydrolysant spécifiquement PPI (Griendling K.K. et al J.Bi,,.Chem; 261,54)1,1 96; Griendling K.K. et al J.Biol.Chem.263, 10620,1988: Nishizuka Y. Nature 334,661,1988). Apparemment le deuxième pic doit être présent grâce à l'action de la protéine kinase C parce qu'on peut le simuler avec le phorbol ester (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,6785, 1986; J. Biol.Chem. 263, 6322,198). Vraisemblablement ce pic est formé à cause de l'activation des phospholipases qui hydrolysent PC (phosphatidyl éthanolamine) (J.Biol. Chem.260,14201,1985;J.Biol.Chem.261,15990,1986; Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 6785,1986;J.Biol.Chem.262,3440,1987; J.Biol.Chem.263,2658,1 98) et/ou PI (J.Biol.Chem.261,5gJl,1986; J.Biol.CHem.263,2658,1 98; J.Biol.Chem.263, 10620, 1988) avec la stade de la phosphorilation des protéines G par les molécules de la protéine kinase C déjà activée. Après ou/et pendant l'activation des phospholipases C il y a apparemment l'activation des phospholipases A2 de la couche intérieure (Lapetina E.G. et Cautricasas P. Biochim.Biophys.Acta 573,394,1979). Comme il était mentionné, l'activation des phospholipases A2 est favorisée par la séparation de phases, par les phospholipides avec la 2+ charge négative et par les ions de Ca. Outre cela, les produits comme le DG, qui sont les résultats du signal, favorisent le déplacement de l'équilibre de la présence de phospholipases A2 entre le cytoplasme et la couche inter- ieure en direction de sa présence dans la membrane (Schonhardt T. et Ferber E. Biochem.Biophys.Res.Comm.149,769,1987). En outre, on doit mentionner la pré- sence des formes nombreuses des phosphqlipases A2 (reg.,s.v.p., par exemple J.Biol.Chem.261,10467,1986).Protéine kinase C favorise aussi l'activation de la phospholipase A2 par l'inactivation de ses inhibiteurs (lipomoduline et li- nocortine)(Hirata F. J.Biol.Chem.256,7730,1981! Vargaftig B. et al Nature 321, 177,1986). L'activation de la phospholipase A2 avec le phorbol ester se mani- -17 2620940 feste aussi en faveur de cela (Flesch I. et Ferber E. Biochim.Biophys. Acta 889,6,1986). Les phospholipides chargés négativement (PA) /qui activent la phospholipase A2/(Lapetina E.G. et al J.Biol.Chem.256,11984, 1981) et les ions de Ca2+ se presentent comme résultat du flux de Ca2+ à travers la mem- brane, comme action des phospholipases D activées par la protéine kinase C avec la protéine G dans la couche intérieure de la membrane (Cabot M.C. et al FEES Lett.233,153,1988) ou comme action de la diacylglycérol kinase sur le DG (Biochem.Biophys.Res.Comm.150,355,1988). Comme je pense, les mêmes composants favorisent une certaine séparation localisée des phospholipides 0 dans la couche intérieure de la membrane avec la création des zones va- cantes pour les protéines périphériques (la protéine kinase C et la phospho- lipase A2 compris) (reg.plus bas, s.v.p.). Avec le temps la quantité de DG diminue au profit de l'activation de la diacylglicérollipase qui dépend de Ca2+ (Bell R. et al Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76,3278,1979; Habernicht A.J. et al J.Biol.Chem.256,12329,1981) ou au profit de l'action de diacylglycérol kinase (Putney J.W. et al Phil.Trans. R. Soc.Lond.B 296,37,1981) favorisant une accumulation de PA (Biochim. Biophys. Acta 573,394,1979; J.Biol.Chem.256,5399,1981; Science 236,586,1987). Vraisemblablement la diacylglycérol kinase hydrolyse seulement les chaînes O grasses dans la position C2 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,3238,1979) et en con- séquence le monoacylglycérol (MAG), en migrant bien de la bicouche, peut être révélé en quantités suffisantes à l'extérieur, dans la solution, et à l'in- térieur de la cellule (J.Biol.Chem.256,12329,1981). Cette chaîne du métabo- lisme doit conduire plus tard à la synthèse cellulaire de PI par l'acide ly- sophosphatidique et PA (sans DG comme produit intermédiaire), mais avec une inclusion probable de AA (s.v.p., reg. plus bas les details de la corrélation avec les traveaux de Resch et collaborateurs- Immunobiol.75,159,1987; Cellul. Immunol.93,239,1985). Cette inclusion ne se passe pas d'après la synthèse des phospholipides dans la cellule de novo (Irvin R.F. Biochem.J.204,3-16, 1982). ) Les acides gras (les AA inclus) sont incorporés dans les phospholipides ou à partir de lipoprotéines endocytés (Spector A.A. et al Prog.Lipid Res. 1 9,155, 1981), ou à partir d'une réserve cellulaire (Rosenthal M. Prog. Lipid Res.26, 87,1987). Avec l'action du signal, la quantité des acides gras libres doit augmenter (Broeckman M.J. et al J.Clin.INvest.66,275, 1980) créant le courant dynamique de ces acides gras en direction de la membrane (Scow R. et Blan- chette E. Prog.Lipid Res.24,197,1985), bien que le niveau des acides gras libres doive être très faible à cause d'un processus de l'estérification des acides gras avec leur inclusion dans les phospholipides (Howard B.V. et Kri- tchevsky D. Lipids 5,49,1970). Le triacylglycérol (TG), le dépôt des acides gras, est hydrolisé, en général, par des lipases se situant dans les lyso- 18 2620940 somes ou dans les membranes plasmiques (Hlsmann W.C. et al Biochem. Bicphys. Res.Comm.102,440,1981; Debeer L.J. et al J.Biol.Chem.254,8841,1979; Groener J.E.M. et Knauer T.E. Biochim.Biophys.Acta 665,306,1981). /L'activation des lipases se situant dans les membranes plasmiques sert, apparemment, à l'hydro- lyse de TG accumulés dans les membranes plasmiques avec l'activation du signal, celle-ci pouvant être executée avec le phorbol ester- Mountford C. E. et Wright L.C. Trends Biochem.Sci.13,172,1988/. La synthèse de novo des phospho- lipides (Vance D.E. et Choy P.C. Trends Biochem.Sci.4,145,1979) pendant le signal était enregistrée dans un certain nombre de cas à partir du glycéro- phosphate formé d'après la glycolyse (Farese R.V. et al Science 236,586, 1987). Ces phospholipides sont inclus apparemment dans la membrane cellulaire avec le système de la membrane vésiculaire de Golgi et du réticulum endoplasma- tique activé par le signal (Reibman J. et al J.Biol.Chem.263,6322,1988;Ro- soff P.M. et al Cell 54,73,1988), par exemple avec le mécanisme incluant la protéine G (Bourne H.R. Cell 53,669,1988) ou/et, comme je pense,avec l'acti- vation de la protéine kinase C, qui augmente une efficacité de ce processus du transport dirigé à partir des membranes intracellulaires de Golgi et du réticulum endoplasmique à la membrane plasmique au profit de la phosphorila- tion des protéines d'assemblage inclues dans la régulation de la structure et de la fonction des puits recouverts (Keen J.H. et Black M.M. J.Cell. Biol. 102,1325,1986). Il est évident que plus l'endocytose est intensive, plus on observera des lipides membranaires qui vont vers les lysosomes. Cette formulation aide à éclaircir le rôle qui j'ai proposé pour la pro- téine kinase C dans la création des puits recouverts avec la phosphorilation de leurs protéines d'assemblage. Selon les expériences de Larkin et al (Cell 33,273,1983) la quantité des puits recouverts et le degré de l'endocy- tose diminuent avec une exposition des cellules dans le tampon sans K+. D'après les expériences de RasmussenH. et collaborateurs (J.Biol.Chem.260, 9171,1985) on sait qu'il y a une augmentation du flux "sustained" de Ca2+ dans une cel- lule avec une augmentation des ions de K+ dans le tampon extérieur (avec l'hyperpolarisation correspondante). C.a.d. dans le cas de l'expérience de Larkin et al, il y avait une diminution du niveau basal du flux de Ca2 dans la cellule à travers la membrane (ne pas confondre avec les canaux dependant d'un voltage) (reg.plus bas, s.v.p.). Comme je pense cela doit amener une diminution d'un niveau basal de l'activité de la protéine kinase C dépendant de la concentration de Ca2+ (Nature 308,693,1984), c.a. d. une diminution de la phosphorilation des protéines d'assemblage mentionnées (Pearse B. et Crow- ther Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.16,49,1987). On peut voir la confirmation de la structure de la régulation de l'endocytose avec les puits recouverts dans les expériences de Kolesnick(J.Biol.Chem.262,16759,1987) selon les- 19 2620940 quelles DG stimule une augmentation de l'hydrolyse de SM dans toute la cel- lule. On peut expliquer ces expériences par une augmentation de l'activité de la protéine kinase C d'après laquelle un certain nombre de puits recou- verts et un degré de l'endocytose augmentent. En conséquence, une plus forte quantité de SM va dans les lysosomes o elle est hydrolysée. Enfin on peut voir d'un côté les processus de la degradation et de l'eli- mination des lipides de la membrane plasmique et d'un autre côté la synthèse et l'incorporation des lipides dans la membrane plasmique, logiquement au égales à la masse. Naturellement on se pose la question de savoir pourquoi on a besoin de ce flux dynamique des lipides. On voit une augmentation sys- tématique de l'inclusion des acides gras insaturés et inclusion de AA dans les phospholipides d'après les expériences de Resch et collaborateurs avec la stimulation de la mitose des lymphocytes T par Con A (Biochim.Biophys.Acta 904,22,1987; Biochim.Biophys.Acta 688,66,1982; J.Biol.Chem.256,11618,1981) . Ces auteurs et d'autres ont démontré que par exemple l'activité de la Na K ATPase ou de la lysolécithine acyltransférase augmente mais l'activité des autres enzymes (par exemple la phosphatase) diminue (Averdunk R. et Lauf P. Exp.Cell Res.93,331,1975; Ferber E. Biomembranes 12,633,1984). Avec cela on peut simuler le même effet de la modulation de l'activité des enzymes men- tionnés par l'addition simple des acides gras insaturés (dans des limites restreintes) aux fragments membranaires des lymphocytes (Poon R. et al Biochim. Biophys.Acta 640,58,1981;Szamel M. et Resch K. J.Biol.Chem.256,11618,1981) . De plus, l'effet de la modulation des enzymes membranaires par le degré des acides gras insaturés inclus dans les phospholipides a une expansion plus large (Stubbs C.D. et Smith A.D. Biochim.Biophys.Acta 779,89,1984) en augmen- tant aussi, par exemple, l'activité de tels enzymes comme l'adényl cyclase. Selon Rozengurt (Ciba Foundation Symp.116,66,1985-Pitman,LOndon) ou Berrindge (Ann.N.Y.Acad.Sci.494,39,1987) justement les enzymes, qui changent la concen- tration ionique de Ca2+ et de Na (c.a.d., par exemple, la Na K ATPase men- D tionnée), sont associés par le moyen nécessaire au développment du signal et à l'induction de la synthèse de ADN et de la croissance cellulaire, et, par exemple, une inhibition de cet enzyme conduit à l'arrêt de la mitose au stade premier (Szamel M. et al J.Biol.Chem.256,9198,1981; Ferber E. Biomem- branes 12,633,1984). En plus selon Li et al (Prog.Lipid Res.25,41,1986) l'activité d'une autre ATPase (Ca2+ Mg 2+ATPase) doit avoir une dépendance di- recte du degré de l'insaturation des acides gras de la bicouche parce que la composition des lipides entourant cette ATPase depend directement de la con- centration totale des lipides insaturés dans la membrane.)Hochman Y. et al J. Biol.Chem.258,6509,1983)/.Enfin on voit que cet entrelacs (décrivant des O chemins métaboliques des événements bien synchronisés quand même et passant 2620940 pendant le signal) est nécessaire pour la modulation du degré de la satura- tion des lipides dans la membrane plasmique, qui (la degré) change avec la propagation du signal et ne change pas même après une exposition simple des lymphocytes intacts avec les acides gras dans le tampon extérieur (Goppert- Stabe M. et Resch K. Biochim.Biophys.Acta 904,22,1987).De plus, selon Stubbs et Smith (Biochim.Biophys.Acta 779,89,1984) le degré de l'insaturation des acides gras régularise l'affinité et la perte des récepteurs membranaires. Enfin, j'ai l'impression que le signal, dans sa totalité, est le processus bien synchronisé dans lequel un mouvement ou une interaction de tel ou tel type de protéines, de lipides, de glucides ou d'acides nucléiques et leurs dérivés sont synchronisés avec la rétroaction pendant la propagation du si- gnal, ce qu'on voit même d'après une information incomplète et nondetaillée d'aujourd'hui (Parker C. Meth.Enzymol.150,29,1987). La composition phospho- lipidique de la membrane est maintenue automatiquement avec une précision suf- fisante par les enzymes différents. Par exemple, selon Mooibroek et al (J. Neu- rochem.44,1551,1985) le rapport SM/PC est maintenu par l'action de la sphin- gomyélinidase. Il faut remarquer que le rapport de deux branches d'utilisa- tion des acides gras,la synthèse de novo et l'echange sont différents pour les types de cellules différentes et pour les conditions expérimentales dif- férentes (Rosenthal M.D. Prog.Lipid Res.26,87,1987). Je pense que le processus synchronisé de l'augmentation de la quantité des acides gras insaturés dans les phospholipides doit servir à d'autres buts. Il y a la modulation directe des acides gras dans la couche intérieure grâce à la présence des acides gras longs dans les molécules des sphingoli- pides interagissant avec le récepteur dans la couche extérieure de la mem- brane. Récemment on a trouvé même les chaînes très longues de 28-38 atomes du carbone dans les molécules de SM et de PC (Poulos A. et al Biochem.J. 248, 961,1987; Biochem.J.263,645,1988). L'expérience indiquant l'importance de la transformation d'un signal artificiel avec les chaînes longues a été faite en 1978 (Schmidt C.F. et al Nature 271,775,1978). Je pense, que pour formation de la bicouche d'épaisseur plus ou moins égale, les molécules avec les chaînes grasses les plus courtes d'une couche doivent se trouver en dessous des molécules avec les chaînes grasses les plus longues d'une autre couche. En outre, les molécules de protéines, qui changent de lieu dans la cellule pen- dant le signal (cytoplasme 0 membrane plasmique) en obtenant "par hasard" les chaînes grasses les plus courtes, pourraient trouver par un tel moyen leur place dans la membrane à cause d'un mouvement et d'une fixation (Proc. Natl. Acad.Sci.USA 83,7246,1986) dans la membrane, ces-places étant déterminées par les glucides de récepteur,c.a.d. par le type de récepteur. Par exemple, le substrate principal de la protéine kinase C "obtient" la chaîne 14:0 pour être 21 2620940 phosphorilé dans la membrane (Buss J.E. et al J.Virol.58,468,1986; Green- gard P., Cohn Z. et collaborateurs Nature 332,362,1988). La protéine ki- nase C (elle-même) "obtient" les chaînes myristiques ou palmitiques (J. Cell. Biol.104,1449,1987; J.Biol.Chem.262,2291,1 987). Selon Buss J.E. et al (Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84,7493,1987) les autres protéines kinases (tyrosine et A) et le régulateur de la phosphatase et apparemment toutes les protéines G sont modifiés par l'acide myristique pour être insérés dans la couche intér- ieure de la membrane. Vraisemblablement une augmentation de la quantité des acides gras insaturés sert aussi au meilleur accueil de ces protéines tempo- raires périphériques dans la membrane, parce que les liaisons doubles cys dans les acides gras provoquent la conformation plus chaotique et moins dense dans la couche lipidique (Seelig A. et Seelig J. Biochemistry 16,45, 1977). Cela concerne plutôt la couche intérieure de la membrane parce que selon Perret B. et al (Biochim.Biophys.Acta 556,434,1979)le 90%'AA sont situés dans la couche intérieure o les composants périphériques temporaires mentionnées peuvent s'insérer plus correctement en accord avec la chronologie du signal. Le fait que la longueur de l'acide arachidonique même à l'état allongé soit moindre que celle de l'acide oléique allonge, selon Li et collaborateurs (Prog.Lipid Res.25,41,1986),argumente pour cela. Le fait que, par exemple, la phospholi- pase C et les oncogènes avec l'activité de la tyrosine kinase aient les do- maines communs qui sont destinés apparemment aux interactions avec les com- posants cellulaires, indique l'existance de telles places avec "l'adresse" (Suh P.G. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5419,1988). Il y a aussi les do- maines communs analogues entre la phospholipase A2 et la protéine kinase C (Maraganore J. Trends Biochem.Sci.12,176,1987). Apparemment une augmentation de l'affinité, par exemple, de l'adényl cyclase (le récepteur -adrénergique), pendant l'inclusion dans la membrane de l'acide cys-vaccenique, a la connec- tion justement avec la création de "l'adresse" particulière pour la protéine G mais ce n'est pas à cause d'une diminution de la viscosité membranaire (He- nis Y.I. et al J.Biol.Chem.257,1407,1 9B2). La lysophosphatidyl transférase a un rôle important dans le remplacement des acides saturés par les acides insaturés. L'activité de tel enzyme peut être modulée justement par les facteurs qui se modifient avec la chronologie du signal: une augmentation d'un degré de l'insaturation dans les phospholi- * pides avec certaines limites /une stimulation de l'acetyltransférase accom- pagne une augmentation de la liberation de l'acide arachidonique dans les plaquettes stimulées par la trombine (Rittenhouse-Simmons S. et al Biochem. Biophys.Res.Comm.70,295,1976) et dans les lymphocytes stimulés par Con A (Ferber E. Biomembranes 12,633,1984)/, et aussi le changement de la concen- tration de DG. Le DG inhibe directement la lysophosphatidyl transférase se- ion les travaux de Resch et collaborateurs (Biochem.J.247,773,1987). On peut en voir le support dans les expériences de Axelrod et collaborateurs (J. Biol. Chem.263,4764,1988) selon lesquelles le DG stimule une augmentation de la synthèse de prostaglandine après l'action de la bradykinine avec le moyen in- dépendant de la protéine kinase C. Parce que si le DG inhibe réellement la lysophosphatidyl transférase, cela doit produire une augmentation de la con- centration de l'acide arachidonique conduisant à la synthèse de la prostagla- ndine. La quantité de DG dans la membrane diminue (reg, plus haut,s.v.p.) avec la propagation du signal et une faible concentration de DG dans les mem- branes des cellules, appartenant aux lignes cancéreuses établies qui se trouvent dans le processus permanent de l'action du signal (mitose), temoigne pour cela o cette concentration peut être déterminée expérimentalement plus facilement(Mountford C. et Wright L.C. Trends Biochem.Sci.13,172,1988) (reg. plus haut, s.v.p.). Les expériences avec les molécules de cyclosporine qui a inhibé directe- ment (en utilisant le contr8le de l'activité avec les fragments membranaires) l'activité de l'acyltransférase activée pendant le signal (Szamel et al J. Im- munol.136,264,1986) parlent en faveur de cela. En plus la molécule de cyclo- sporine inhibe une inclusion de AA dans PC et PE des lymphocytes stimulés par Con A et par les anticorps contre l'immunoglobuline G et avec l'ionophore de Ca2+ A-23187 (Szamel M. et al Cellular Immunol.93,239,1985; J.Immunol.136,264, 1986). Avec cela pourtant l'inhibition de l'inclusion de AA dans PI était une exception:dans ce cas-là il y avait seulement une inhibition faible de l'in- clusion de cet acide, confirmant élégamment la structure de la synthèse ad- ditionnelle "demi"-de novo de PI selon la branche métabolique: DG + MAG + PA ±> + PI (reg.plus haut, s.v.p.). Apparemment, l'importance du processus de l'in- clusion des acides gras insaturés dans les phospholipides membranaires est confirmée d'après une inhibition par la molécule de cyclosporine de la pro- lifération des lymphocytes B et T (Kroggel R. et al Immunobiology 175,159, 1987) et de la prolifération des cellules mésangliales rénales (Martin M. et al Biochem.Pharmacol.37,1083,1988). Une diminution de l'affinité des récepteurs membranaires et leur perte de la surface membranaire étaient enregistrées avec une augmentation d'un degré de l'insaturation des acides gras et en particulier avec une augmentation de la quantité de AA (Biochim.Biophys.Acta 779,89,1984). Comme je suppose la première fois, cela signifie qu'il y a une augmentation du volume des zones avec une plus grande fluidité apparue dès le début de la séparation de phases (Zagyansky Y. et Jard S. Nature 280,591,1979). Comme résultat du pro- cessus, ces petites zones, apparemment, confluent dans un courant commun dans lequel il y a la formation continue des "patches" et des "caps". Avec cela, ces "patches" et ces "caps" sont constitués des complexes des récep- teurs formés à cause de l'association des "anneaux" extérieurs des "patches" de SM qui font une structure dense (reg.plus haut, s.v.p.). Et plus tard des complexes, vraisemblablement, vont aux puits recouverts et disparaissent de la surface membranaire. Par exemple, dans le cas des récepteurs B-adrénergiques, selon la publi- cation mentionnée de Harden et al (Science 210,441,1980), il y avait une augmentation du maximum dans un gradient de densité appartenant aux récep- teurs avec l'affinité faible après l'interaction avec l'agoniste (15 min, 37 C). Dans le cas des récepteurs,B-adrénergiques pendant l'interaction des molécules (ligands) avec les récepteurs, il y avait dès le début (avec t1/2 e 3 min) la diminution de l'affinité de l'adényl cyclase et après (avec lag-periode t 60 min) il y avait la perte des récepteurs (Harden T. et al Science 210,441,1980; Stadel J.M. et al J.Biol.Chem.258, 3032,1983). Dans le cas, par exemple, des récepteurs avec l'activation de la tyrosine kinase (EGF, insuline) il y avait la perte des récepteurs pendant la dizaine de mi- nutes (Schlessinger J. et al Proc.Natl.Acad.Sci.75,2659,1978), comme dans le cas de l'interaction des lectines mitogéniques ou dans le cas des anticorps contre les immunoglobulines avec la surface des lymphocytes (Schreiner G. F. et Unanue E.R. Adv.Immunol.24,37,1976). Avec cela, les processus de la di- minution de l'affinité mentionnée dans le shéma général doivent avoir lieu aussi dès le début. Je répète, comme je propose la première fois, cette di- zaine de minutes, d'une "attente" pendant le processus de la formation des "patches", est nécessaire justement pour l'augmentation du dégré de l'insa- turation des acides gras de ces lipides dans la couche extérieure de la mem- brane. On peut clairement voir dans les photographies de la publication de Haigler et al (ProcNatl.Acad.Sci.75,3317,1978) que justement les complexes avec une faible affinité des récepteurs de 1'EGF avec des molécules de 1'EGF qui ont été marquees par la fluoresceine et en consequence ont perdu la par- tie de l'activité biologique, sont endocytés mieux que les molécules de 1'EGF natives (selon la publication de Schlessinger et collaborateurs (Proc. Natl.Acad.Sci.USA 75,2659,1978), même dans le cas des précautions spéciales pour préserver l'activité biologique de 1'EGF, l'activité dérivante a di- minué de 60%). Seule l'occupation des récepteurs par ligand, même avec un débrayage temporaire de l'effecteur au niveau de la protéine regulatrice ou de la protéine kinase A2,est suffisante pour la désensibilisation (Green D.A. et Clark R.B. J.Biol.Chem.256,2105,1981;Shear M. et al J. Eiol.Chem.251, 7572, 1976), ce qui indique l'importance des processus primaires concernant l'in- teraction ligand-récepteur. En plus la comparaison des différents types de "caps" par leurs dimen- 24 2620940 sions, qui n'ont pas de corrélation directe avec la quantité de récepteurs, favorise la présence et l'importance de la partie lipidique des complexes. Par exemple, la quantité de récepteurs de Con A est de 9 à 27 fois plus grande que la quantité de récepteurs des immunoglobulines de la surface (Stackpole C.W. J.Cell.Physiol.83,441,1974), mais le"cap" formé avec les immunoglobu- lines de la surface est beaucoup plus grand que le "cap" formé avec les ré- cepteurs de Con A (Kourilsky F.M. et al Eur.J.Immunol.2,249,1972; Bourgignon L.Y.W. et Bourgignon G.J. Int.Rev.Cytol.87,195,194). Et dans le cas des nom- breuses molécules de glycoprotéine principale de la surface cellulaire qui ne sont pas des récepteurs et qui sont agglomérées par les trois couches des an- ticorps, le "cap" a la dimension d'un petit cercle (Int.Rev.Cytol.87,195, 1 94). On peut voir à travers ces (et d'autres) expériences qu'apparemment la dimension des amas différents depend fortement de quelques autres facteurs. Vraisemblablement ces facteurs sont les lipides constituant les complexes spé- cifiques avec chaque type individuel de récepteurs selon ma structure pro- posée. Déjà les premières expériences de FPR (Edidin M., Zagyansky Y. et Lardner T.J. Science 191,466,1986) ont pu dessiner la création de petites zones dès le début du processus de la formation des amas avec la distribution de la fluorescence uniforme visible dans le microscope fluorescent. Le "cap" (pH neutres) était observé après la coloration des composants de la surface cellu- laire (pH faiblement alcalines) (v30% de lipides etv70% des protéines). De plus le pourcentage du rétablissement de la fluorescence était clairement nul, malgré le fait qu'on ait pu voir la formation et la mobilité des amas à l'oeil. Ce paradoxe de plusieurs années, d'après cette structure présentée, peut être facilement expliqué par la présence au début du processus des zones de séparation de phase beaucoup plus petites que la grandeur du diamètre du faisceau laser. La fusionnement suivant ces zones, apparemment pendant le processus de l'augmentation de l'insaturation des lipides, conduisait au pro- cessus, déjà visible, de la formation des amas de plus en plus grands. Les faits suivants sont en faveur de cette interprétation. Quand on place les cellules après le processus du "capping" dans le thermostat pour le temps suf- fisant, les molécules fluorescentes qui n'étaient pas dans le "cap" de- viennent mobiles (latéralement) avec la courbe suffisamment homogène et la constante de diffusion semblable à la constante de diffusion des protéines dans la membrane(Science 191,466,1976), et ayant la valeur du rétablissement de la fluorescence déjà de près de 60%. C.a.d. il est assez clair que les zones formées par les molécules qui sont devenues la partie de "cap" ont gené le rétablissement de-la fluorescence de ces récepteurs. Il semble que le pro- cessus du "capping" était initié par les glycolipides à cause de la dimèrisa- 2620940 tion des colorants au pH faiblement alcalins. Apparemment justement cette dimèrisation, approchant les glucides,menait à la formation des liaisons hy- drogènes (reg. plus haut, s.v.p.). Ces expériences ont été confirmées avec les récepteurs différents dans un nombre de publications (par exemple, Drug- stein P. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,6163,1979). On peut trouver une ex- plication analogue de l'influence des zones formées par un type de récepteurs nombreux avec des ligands sur le mouvement des autres pour les expériences de Poo (Ann.Rev.Biophys.Bioenerg.10,245,1981) avec le ralentissement de la mobilité dans le champ électrique des récepteurs libres de lectines d'après une interaction des autres récepteurs des lectines avec leurs ligands. Vrai- semblablement les nombreux récepteurs de Con A (avec le ligand) avaient une influence semblable sur le pourcentage du rétablissement de la fluorescence pour les récepteurs representant les immunoglobulines de surface.klenis Y. I. et Elson E.L. Proc.Natl.Acad.SCi.USA 78,1072,1 91). Outre l'endocytose provoquée par une occupation du récepteur par le ligand, il y a l'endocytose provoquée par la phosphorilation du récepteur avec la protéine kinase C. Par exemple, dans le cas des récepteurs de l'EGF, o le mécanisme moléculaire de l'endocytose provoquée par le ligand et la protéine kinase C est mieux étudié, le processus initial de l'internalisation est différent. Il y a la phosphorilisation de la thréonine 654 dans le cas o l'internalisation est provoquée seulement par la protéine kinase C, ce que l'on n'observe pas dans le cas de l'endocytose provoquée seulement par la présence du ligand (Schlessinger J. Biochemistry 27,3119,19o8). On peut sup- poser qu'il y a une régulation analogue des autres récepteurs (moins étudié dans cet aspect) par la protéine kinase C. Cela confirme encore le r8le-clef de la protéine kinase C dans la transmission du signal dans la cellule (Ber- ridge H.J. Ann.Rev.Biochem. 56,159,1987 et plus haut). Ce processus, quand la protéine kinase C peut régulariser le récepteur (qui l'a activé) en l'éli- minant de la surface cellulaire, s'appelle la régulation homogène (Berridge H.J. Ann.Rev.Biochem.56,159,1987) et je pense que cela a lieu grâce a la position proche du récepteur et de la protéine kinase C activée par ce ré- cepteur, qui (protéine kinase C) vraisemblablement est suffisamment immobile (mobilité latérale), dans le niche en "dessous" du récepteur preparée pour cet enzyme par les chaînes longues de la couche extérieure de la membrane et par la modulation de la couche intérieure (reg. plus haut, s.v.p.). En outre, la protéine kinase C peut exécuter la régulation des autres récepteurs (la régulation hétérogène) dans les niches o elle ne se trouve pas (1rridge H.J. Ann.Rev.Biochem.56,159,1987; Enna S.J. et Karbon E. Trends Pharm.Sci. 8,21,1987). Dans telle régulation, la protéine kinase C fait la phosphorila- tion déjà des composants plus mobiles. Apparemment ses substrats mobiles 26 2620940 (eux-mêmes) la"trouvent" grace à leur phosphorilisation avec l'acide myris- tique (le sous-composant cationique de la protéine kinase A, les protéines G, p60 v-src). Par exemple, dans le cas des récepteurs,f-adrénergiques vraisemblablement, protéine kinase C désensibilise des récepteurs des érythrocytes (Levitzki A. Physiol.Rev.66,819,1986) se trouvant avec eux dans le même complexe immobile. Dans le cas de récepteurs p-adrénergiques des autres cellules, il n'y a ap- paremment pas de désensibilisation par la protéine kinase C (Physiol.Rév. 66, 81 9,1 986). Pourtant la protéine kinase C dans ces cellules peut exécuter l'activation (ou l'inhibition) hétérogène grâce à la phosphorilisation de la protéine G ou du sous-composant cationique de la protéine kinase A (Bell J.D. et al J.Biol.Chem.260,2625,1985). On peut voir ce type de régulation hétéro- gène, et important apparemment pour chaque signal, dans la structure proposée plus haut (par exemple l'activation des phospholipases différentes de la couche intérieure de la membrane). Vraisemblablement, comme c'était mentionné, les récepteurs, qui doivent être endocytés, passent par les puits recouverts, par les endosomes (ou GERL) et par les lysosomes (Hopkins C. Trends Biochem.Sci.11,473,1986; Pearse B. et Crowther Ann.Rev.Biophys. Bophys.Chem.16,49,1987). Généralement les récep- teurs de hormones et de facteurs de croissance (le nombre de leurs activites apriori a lieu dans la bicouche normale de la membrane plasmique) vont dans les puits recouverts en étant déjà reconnus après l'interaction avec les li- gands (Maxfield F. et al Cell 14,805,1978; Carpentier J.L. et al J.Cell. Biol. ,73,1982). Même cela, dans le cas des récepteurs de LDL (qui en général doivent seulement fournir le cholestérol dans la cellule), change la valeur de la duffusion latérale flO 100 fois après l'interaction avec le ligand (Tank D.W. et al J.Cell.Biol.]01,148,1 95) et, par exemple, les derniers résultats, faits avec les précausions spéciales, indiquent le caractère primaire diffu- sif de leur distribution dans la membrane (Fukuda S.et al Virchows Arch. B Cell Pathol.52,1,1986). En outre d'-après Goppert-Stbbe et Resch (Biochim. Biophys.Acta 04,22,19B7), on peut voir que la quantité des phospholipides reste la même pendant l'action du signal à l'exeption de SM, justement tel phospholipide qui participe à la formation du complexe lipidique avec le ré- cepteur selon la structure proposée plus haut. Comme il était mentionné avec l'addition de DG de l'extérieur, l'hydrolyse totale de SM dans toute la cel- lule augmente (Kolesnick R. J.Biol.Chem.262,16759,1987), ce qu'on peut ex- pliquer aussi (reg. plus haut, s.v.p.) avec une augmentation du transport de SM dans les lysosomes par les puits recouverts. On peut voir d'après les ex- périences de 1Wilson et al (J.Biol.Chem. 263,4304,1988) (reg. plus bas, s. v.p.) la preuve analogue de l'endocytose des complexes lipidiques avec le récepteur. 27 2620940 De plus je propose la première fois dans ma structure que l'endocytose serve seulement à la rétroaction de la propagation du signal dans la cellule pour l'inhibition au moins de la protéine kinase C. On a trouvé récemment que les sphingosines inhibent la protéine kinase C (Hannun Y.A. et Bell R. M. Science 235,670,1987). Parce que la protéine kinase C est l'enzyme principal présent dans tous les types de signaux (reg.plus haut, s.v.p.), on peut s'at- tendre à ce que le processus de l'endocytose, qui transporte les complexes des récepteurs avec les sphingolipides (reg.,s.v.p., la structure proposée plus haut) dans les lysosomes,ou ils (sphingolipides) sont hydrolysés jusqu'à ) la sphingosine, serve à une inhibition de la protéine kinase C par ces sphin- golipides transportés par ce chemin par les lysosomes vers la surface intér- ieure de la membrane plasmique. Il y a aussi les autres résultats confirmant la justesse de cette nouvelle proposition. Selon Maxfield (Proc.Natl.Acad. Sci.USA 76,5731,1979) la synthèse de l'ADN augmente de 2 à 7 fois d'après l'in- hibition de l'aggrégation des récepteurs de l'EGF.Selon Kahn (Ann.Rev.Med. 36, 429,1985) une injection d'insuline intacte à l'intérieure de la cellule n'a provoqué aucun effet biologique. Selon Schlessinger (Biochemistry 27,3119, 1988) la phosphorilation des récepteurs d'EGF (thréonine 654) par la protéine kinase C conduit à l'endocytose des récepteurs et à l'inhibition de la mitose. ) Outre cela, selon Russel et al (J.Biol.Chem.262,11833,1987), I'internalisation des récepteurs d'insuline avec les anticorps n'était pas capable de faire l'inclusion de la thymidine dans l'ADN. "La coincidence" suivante confirme d'une façon élémentaire ma proposition. Les récepteurs opiacés diminuent le niveau de cAMP grâce à l'inhibition de l'adényl cyclase. Dans ce cas-là, ap- paremment, on ne peut pas attendre une diminution trop dangereuse (du point de vue biologique) du niveau de cAMP et la rétroaction avec la protéine kinase C pourrait apparaître comme inutile. Et en réalité les amas formés pendant la mitose ne sont pas endocytés justement dans ce cas-là et la quantité et l'af- finité des sites actifs ne changent pas apparemment à cause de la formation O des ponts disulfures (Hazum E. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,3038,1980), par exemple, à la différence de l'aggrégation et l'endocytose des récepteurs TSH stimulant l'adényl cyclase (Avivi A. et al Science 214,1237,1981). On a démontré dans le cas des récepteurs muscariniques (Liles et al J.Biol.Chem.261, 5307,1986) que l'activité de la protéine kinase C reste forte jusqu'à l'in- hibition des récepteurs, ce qui confirme encore ma conclusion. Une preuve convaincante pour ma conclusion est l'augmentation de la quantité totale de la sphingosine dans la cellule d'après une action des formyl peptides dans les neutrophiles sans sa synthèse de novo. La concentration de la sphingo- sine augmente de 1,6 fois après l'action de la concentration de 10 nM des 3 peptides, et de 2,5 fois après l'action de 1 &M.des peptides. Une augmenta- 28 2620940 tion semblable de la sphingosine dans les cellules a été observée après le changement pour le tampon avec Ca2+, ce qui doit augmenter le niveau basal de l'endocytose avec cela. Comme avec l'endocytose,il y avait une augmentation seulement à 37 C mais il n'y en avait pas à 40 et à 25 C (Wilson E. et al J.Biol.Chem.263,9304,1968). L'interprétation des auteurs était fondée sur la présence connue des localisations intracellulaires des sphingosines(Symington et al J.Biol.Chem.262,11356,1987). De plus les résultats obtenus avec des amines comme les molécules de chloroquine et de monestine, augmentant le pH dans les lysosomes et en conséquence inhibant l'hydrolyse des produits de l'endocytose et servant à la thèse d'une importance de l'endocytose pour l'ac- tion du signal dans la cellule, sont ambigus en réalité. Sachant la structure polaire de ces substances, on peut attendre une interférence de ces substances au niveau des liaisons H déjà pendant la formation des complexes des récep- teurs avec les lipides et plus tard au niveau de l'endocytose des récepteurs. Justement le dernier fait était enregistré dans la presse scientifique (reg. par exemple Janicot H. et al Biochem.J.253,735,1988). C.a.d. la plus grande partie des récepteurs, se représentant comme les ré- cepteurs moins affins, comme je propose, sert à la régulation négative au moins de la protéine kinase C. En même temps la partie des récepteurs moins grande, se représentant comme récepteurs plus affins, doit rester sur la sur- face membranaire. La nécessité de la présence permanente de ces récepteurs sur la surface membranaire était démontrée d'une manière convaincante dans les expériences de Cautricasas et collaborateurs (Proc. Natl.Acad.Sci.USA 75,5788, 1 978) selon lesquelles la présence de ces récepteurs EGF pour l'exécution de la mitose était nécessaire pendant au moins 8 heures. Vraisemblablement ces récepteurs sont indispensables pour le flux "sus- tained" de Ca2 à travers la membrane plasmique (reg.,s.v.p., plus haut) (Ko- jima I. et al J.Biol.Chem.260,9177,1985; Yanagibashi K. et al Endocrinol. Japn.25,545,1978). Le fait, que la concentration de l'hormone l'ACTH néce- ssaire pour le moitié du flux de Ca2 maximal, soit 14 fois plus grande que pour la moitié de la production de l'aldostérone maximale, parle en faveur de cela (Kojima I. et al J. Biol.Chem.260,4248,1985). Comme confirmation de la structure de l'action universelle du flux de Ca2+ pour tous les types de signaux proposée plus haut, son activité était enregistrée d'après l'action des hormones de l'activation primaire de l'adényl cyclase et de l'activation de cycle PPI (Mauger J.P. et al J.Biol.Chem.260,11635,1985). Apparemment le PA a le r8le-clef dans ce flux "sustained" de Ca2+. On peut remarquer le parallélisme entre la formation de PA et le flux de Ca2 à tra- vers la membrane et leur régulation mutuelle. Selon Takuwa et collaborateurs J.Biol.Chem.262,182,I 97) une augmentation d'un niveau basal du flux "sus- 29 2620940 tained" de Ca2+ commence après - 5 secondes comme stimulation de la syn- thèse de PA (Lapetina E.G. et Cautricasas P. Biochim.Biophys.Acta 573,394, 1979; Salmon D.M. et Honeyman T.W. Nature 284,344,1980; Farese R.V. et al Science 236,586,1987) qui fait la corrélation avec l'action du signal (Na- ture 284,344,190). La publication de Putney et collaborateurs (Nature 284, 345,1980) indique ce rôle de PA et Ca 2+dans l'action du signal.Selon cette 2+ publication, le PA a stimulé le signal seulement en présence de Ca.De plus l'affinité de Ca 2+et de PA était bien démontrée (et aussi de l'ionophore de Ca -A23187 en comparaison des autres phospholipides).Le fait,que la régula- tion de la quantité de PA pendant la transformation de PA en PI dans la mem- brane soit réalisée par les deux seconds messagers cAMP et Ca2+ (Lapetina E.G. et al J.Biol.Chem.256,11984,1981) ayant les effets opposés (le Ca2+ augmente la concentration de PA), indique le rôle-clef de PA. Je voudrais proposer ici la structure moléculaire, en principe nouvelle et très importante, de flux "sustained" de Ca2+ à travers la membrane: Je pense qu'il y a une augmentation de la quantité de lysoPA dans la couche ex- térieure de la membrane d'après les actions des phospholipases A2 activées avec la structure du signal (de plus avec la présence des phospholipases A2 spécifiques justement pour PA- Billach M.M. et al J. Biol.Chem.256,5399,1981) dans la couche extérieure de la membrane et il y a une activation moderée des acyltransférases à cause d'une augmentation de la quantité de DG avec le si- gnal (reg.plus haut, s.v.p.).Avec cela, les nombreuses structures du type micellaire fermé (avec les chaînes grasses à l'intérieure) (Culis P.R. et de Kruijff B. Biochim.Biophys.Acta 559,399,1979) doivent se former, qui favo- risent le passage de lysoPA dans la couche intérieure de la membrane ou il y a encore la reacylation de lysoPA avec la sortie de cette structure dans les directions différentes au plan de la couche intérieure. Il se passe quelque chose comme la rotation de la "roue", constituant cette phase membranaire lipidique avec l'inclusion des phospholipides de la couche extérieure et leur sortie de la "roue" dans la couche intérieure. On peut même supposer que la phospholipase A2 spécifique pour PA est située près de la base de cette structure dans la zone de ces complexes des récepteurs d'une forte af- finité.Cette proposition peut avoir lieu pour l'acyltransférase (Szamel M. 2+ et al J.Immunol.136,264,1986).Le Ca bivalent,avec l'affinité forte au PA adhérant au lysoPA sur la surface extérieure par tel moyen travers la mem- brane en se tournant avec lui (lysoPA) dans la "roue" vers la surface intér- ieure de la membrane. Avec cela, le Ca2+ doit former aussi les ponts lipi- diques affermissant les phospholipides voisins dans la "roue". Je pense que justement cette phase est une base de l'action d'une structure commune de la création des pores relativement etroits pendant une action des agents ly- 2620940 tiques différents (Bashford C.L. et al J. Pol.Chem.261,9300,1986), et les ca- tions bivalents, le Ca 2+compris,diminuent la lysis membranaire vraisemblable- ment à cause de l'affermissement mentionné des phospholipides dans cette phase.Selon Lapetina et Cautricasas (Nature 292,367,1986) il y avait 10% de lysoPA pendant l'action du signal dans les plaquettes.Les expériences concer- nant la transformation de PA en PI d'après l'action de lysoPA (Lapetina E. G. et al J.Biol.Chem.256,11984,1981) confirment brillamment le transport de Ca2+ par ces phospholipides parce que le Ca2+ inhibe cette transformation (reg.plus haut,s.v.p.).Dans ce cas général comme résultat de ma structure proposée, le Ca 2+reste avec son porteur (subit à l'acylation) sur la surface intérieure de la membrane,sans le changement de la concentration totale de Ca2 à l'inter- ieure de la cellule mais avec le changement de la concentration locale de la surface de la couche intérieure de la membrane,ce qui entraîne une concordance exellente avec les conclusions de Alkon et Rasmussen (Science 239,998, 1988). En me fondant sur ce résultat j'ai la possibilité de déduire que la mobi- lité cellulaire est detérminée par une apparition de ces nouvelles struc- tures micellaires de l'autre phase d'après l'activation des récepteurs et leur rotation comme les chenilles d'un tracteur. Le fait, que la vitesse de la mobilité des neutrophiles d'après l'action des formyl peptides (et seule- ment d'après leur action à cause de la création des complexes structurésreg. plus haut,s.v.p.) augmente après une application extérieure de la phospholi- pase A2 (Lackie J.M. J.Cell.Sci.89,449,1988), est convaincant en faveur de cela. Apparemment il y a une autre confirmation grace à une inhibition de l'acyltransférase de la couche intérieure après une action du phorbol ester qui stimule l'augmentation de DG dans la couche intérieure par la protéine kinase C et par les phospholipases C (reg. plus haut, s.v.p.) en inhibant d'après cela l'acyltransférase de la couche intérieure. La réversibilité de la mobilité cellulaire après l'action d'un inhibiteur de la DGkinase (J. Cell. Sci.89,440,1988) permet de voir une image suffisamment pittoresque de la ro- tation des "roues" de la mobilité dans un sens inverse parce qu'avec une augmentation de la concentration de DG de la couche intérieure, les molé- cules de lysoPA peuvent s'accumuler déjà dans cette couche à cause de l'in- hibition de l'acyltransférase et se déplacer avec la "roue" vers la couche extérieure. Un rôle important présumé de PA dans l'activation des phospholipases A2 de la coche intérieure et extérieure était souligné plus tôt. La série des 2+ expériences concernant l'action de Ca et de cAMP sur la réaction d'une transformation de PA en PI confirme ce shéma (Lapetina E.G. et al J.Biol. Chem.256,11984,1981; Nature 292,367,1981; roekman M.J. et al J.Clin.Inv. 66, 275,1980; Kowalska M.A. et al Biochem.J.253,255,1988). Selon Nishizuka (Na- 31 2620940 ture 308,693,1984) la PC (comme SM) inhibe la protéine kinase C. Ce fait est soutenu par une inclusion de 80 à 90% de l'acide myristique, servant (reg.plus haut, s.v.p.) d'"adresse" aux substrats de la protéine kinase C, dans PC (Cabot M.C. et al FEBS Lett.233,153,1986; Farese R.V. et al Science 236,586,1987). On peut supposer que PA (l'acide myristique s'incorpore aussi dans PA -Science 236,586,1987), la molécule de phosphatidyl sérine et DG con- courissent avec PC pour une plus forte activité de ce enzyme-clé. On peut appliquer cette conclusion d'un rôle-régulateur de l'endocytose au problème important de l'immunologie- l'interaction entre lymphocytes Bet G T résultant de la formation des cellules qui synthétisent l'immunoglobuline G (IgG). Selon Zagyansky (Bull.Offic.Propr.Industr. "Brevets" n 28, 15 Juillet 1988, Application N 2 609 398) pendant l'interaction entre lymphocytes B (avec le récepteur pour l'antigène- IgM membranaire) et lymphocytes T (avec les récepteurs pour l'antigène) l'interaction entre les fragments de l'anti- gène qui deviennent un pont entre les lymphocytes B et T et l'IgG soluble a lieu. Comme résultat l'IgG forme la structure-"scorpion". Cette molécule de l'IgG membranaire doit réagir plus tard avec les récepteurs Fc pour les anticorps des lymphocytes B qui surgissent comme résultat de l'action des molécules de lymphokines sécrétées par des lymphocytes T dans le microenvi- O ronnement des cellules B. La possibilité de cette sécrétion dirigée par les lymphocytes T pendant l'endocytose a été confirmée récemment (Nature 332, 378,1988). Je pense qu'après cette interaction il y a l'endocytose (J. Biol. Chem.226,7112,1988) de l'antigène par les lymphocytes B avec la protéolyse de l'antigène dans les lysosomes. Apres cette proLéolyse, les fragments de l'antigène doivent se déplacer en direction de la membrane (pareillement aux produits susmentionnés de l'hydrolyse des sphingolipides), sans ou avec une association préalable dans le cytoplasme avec les produits du complexe ma- jeur d'hystocompatibilité II (CMH II) qui doit apparaître comme résultat d'une action du facteur de croissance des cellules B (BCGF) qui induit 0 l'apparence de cette classe de CMH sur les cellules B (Lee F. et al Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83,2061,1986; Noma Y. et al Nature 319,640,1986). Je pense qu'après cette phase il y a l'activation des lymphocytes B (Jelinek D.F. et Lipsky P.E. Adv.Immunol.40,1,1987) et la première prolifération des cellules a lieu. Vraisemblablement il y a seulement une division à ce stade (Adv. Im- munol.40,1,1987). Après cette division, comme je propose, la deuxème inte- raction entre les lymphocytes B et T doit avoir lieu. Cette fois les lympho- cytes B sont déjà les cellules présentant l'antigène (Tony H.P. et Parker D.G. J.Exp.Med.161,223,1985; Lanzavecchia A. Nature 314,537,1985; Abbas A. K. * et al J.Immunol.135,1661,1985; Mosier J.Immunol.136,2090,1936). Cette deu- D xième interaction entre les cellules B et I a lieu déjà quand il y a le chan- gement spécial du complexe du récepteur de cellules T (la molécule CD4 inte- 32 2620940 ragit avec les récepteurs de cellules T- Kupfler A. et al Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84,5888,1987). Et la commutation des cellules B à la synthèse des sous-classes d'IgG avec la prolifération et la différenciation conséquante passent déjà après cette interaction des lymphocytes B et T avec le com- plexe CMH II (Adv.Immunol.40,1,1 9B7). C.a.d. l'innovation décrit plus haut de la structure nouvelle de l'action des hormones, des neurotransmetteurs et des facteurs de croissance donne la conséquence et la corrélation générale des événements qui ont lieu pendant le signal. Sans doute, il y aura la conséquence des interactions de tels ou tels glucides ou lipides concrets.Avec l'établissement exact des telles conséqu- ences (Carte) pour chaque récepteur concret par les méthodes de la biologie moléculaire et cellulaire comme la "liaison croisée" chimique bivalente,la migration de l'énergie, le blocage des groupes avec les anticorps, la modi- fication chimique exacte avec les dérivés du deutérium dans telles ou telles conditions dépendant d'un tissue, d'un age ou d'un sexe, les conditions qui n'ont jamais existé, seront présentes pour la Médecine de demain. Parce que sans aucun doute il y a des dérangements de ce processus dans l'état normal conduisant à beaucoup de maladies. Certainement avec cela, le but de l'utili- sation des préparations nouvelles est un approchement de l'état de l'action des récepteurs dans le cas pathologique à leur action dans le cas normal grâce à une introduction des préparations des gangliosides et des glycoli- pides neutres dans un organisme. Heureusement par exemple les gangliosides s'incorporent facilement dans la membrane de la cellule native à partir d'une solution à l'extérieur (Hakomori et collaborateurs J.Biol.Chem.259,6818, 1984;J.Biol.Chem.261,2434,1986;J.Biol.Chem.263, 10915,1988).Le fait empirique qu'avec une addition exogène des gangliosides, il y a une augmentation de l'action des protéines kinases différentes (Ledeen R.W. J.Neurosci.Res.12, 147,1984; Tsuji S. et al J. Biochem.(Tokyo) 97,969,1985) indique la justesse du chemin choisi selon la structure fondamentale. D'après le nombre des travaux, on sait que les modulations différentes de la croissance cellulaire conduisent au changement de la composition gly- colipidique (Fishman P. et al Biochem. Biophys.Res.Comm.59,292,1974;Patt. L. et al Nature 273,379,1981; Hakomori S. Ann.Rev.Nochem.50,733,1981). Le changement de la composition glycolipidique est brillamment observable à par- tir de nombreuses comparaisons des cellules normales et cancéreuses (Hol- mes E.H. et al J.Biol.Chem.262,15649,1987; Dyatlovskaya E.V. et %rgelson L. Eochim.Biophys.Acta 907,125,1987; Matyas G.R. et al Proc.Natl.Acad.Sci. IUSA 84,6065,1987; Prokazova N.V. et al Eur.J.Biochem.172,1,1988). La différence essentielle dans le processus du rétablissement de la fluorescence a été dé- montrée entre les cellules normales et cancéreuses (Zagyansky Y. et Edidin M. Biochim.Biophys.Acta 433,209,1986; Zagyansky Y. et al FEBS Lett. 77,206,1977), 33 2620940 ce qui doit témoigner apparemment en faveur des dimentions différentes des zones de mobilité limitée des récepteurs avec les ligands dans le cas de cel- lules normales et cancéreuses reflétant la composition différente des compo- sants lipidiques dans le complexe. De plus les travaux empiriques concernant une addition des glycolipides dans la membrane cellulaire ont démontré les changements considérables des processus les plus essentiels dans les cellules, et en particulier un arrêt de la prolifération cellulaire (Laine R.A. et Ha- komori S. Nochem.Biophys.Res.Comm.54,1039,1973; Bremer E.G. et al J.Biol. Chem. 259,6818,1984; J.Biol.Chem.261,2434,1986; Dyatlovskaya E.V. et ergelson L. D. Kochim.Biophys.Acta 907,125,1987). On vois bien en conséquence de ces tra- vaux le rôle des gangliosides dans le processus de la division ininterrompue des cellules et la possibilité avec leur aide d'influencer ce processus. Ben sûr c'est seulement avec la connaissance scientifique de la séquence des évé- nements pendant la formation du complexe récepteur - sphingolipides phospho- i lipides en accorde avec la structure proposée, qu'on peut trouver des prépara- tions les plus efficaces des sphingolipides naturels ou synthétisés spéciale- ment dans ce but par les méthodes de la biochimie ou de la chimie organique classiques (Methods Enzrmol.vol.138,Ed.Ginsburg V.,1987). Une autre application importante pour la médecine découle de la structure fondamentale concernant la dizaine de maladies mentales des nouveaux-nés du type de sphingolipidoses (notamment les maladies de Sandhoff, de Fabry, de Gaucher, de Krabbe, de Niemann-Pick, de Tay-Sachs, gangliosidose GM3, leuco- dystrophie métachromatique, gangliosidose généralisée, lactosylcéramidose) .Ces sphingolipidoses sont des maladies héréditaires avec une accumulation des ly- sosphingolipides à cause du catabolisme perturbé qui conduit à la sphingosine. Selon Hannun et Bell (Science 235,670,1987) et Kreutter et al (J.Biol. Chem. 262,1633,1987) les gangliosides différents et tous leurs dérivés ont inhibé la protéine kinase C in vitro.Le premier groupe des auteurs attribue "à une accu- mulation intracellulaire des lysosphingolipides.. une inhibition de la pro- ) téine kinase C". Le fait de la présence de telles accumulations dans la cel- lule, comme les auteurs le constatent, sert à leur hypothèse (J.Biol.Chem. 262, 11356,1987).Le deuxème groupe des auteurs attribue cette inhibition à la ré- action de la protéine kinase C avec les gangliosides.Ma structure fondamentale donne une autre explication claire de la forme de la régulation de la protéine kinase C.Les sphingolides se trouvent dans les lysosomes,comme résultat de l'endocytose provoquée par le ligand, ce que la première fois découle de ma structure proposée.Dans le cas normal il y a leur hydrolyse jusqu'à la sphin- gosine qui se déplace par les chemins intracellulaires "adressés" vers la surface intérieure de la membrane comme la rétroaction pour la protéine ki- ) nase C (reg.plus haut).Je propose la première fois que l'inactivation des kinases pendant leur interaction in vitro avec les autres sphingolipides et leurs produits se passe seulement à cause de la similitude de leur structure avec celle de la sphingosine mais ces glycosphingolipides ne peuvent pas être transportés Dar les mêmes chemins que la sphingosine.En conséquence je propose d'introduire la sphingosine pour la lutte contre les maladies mentionnées des dérangements du catabolisme de la sphingosine par le biais de l'endocytose (Et seulement de l'endocytose par des puits recouverts) parce que l'introduc- tion empirique des sphingolipides appliquée par les auteurs (Science 235, 670, 1987) doit conduire au nombre des autres effets (selon ma structure), et leur livraison vers la couche intérieure de la membrane ne peut pas être garantie adéquatement. Je constate qu'on peut, par exemple, créer la préparation nou- velle avec la méthode de l'extraction avec l'heptane des lipides de LDL (An- derson R.G.W. et al J.Recep.Res.1,17,1980), facilement endocytable, et leur remplacement par la sphingosine. La création des préparations plus effectives et moins nocives pour l'exé- cution de l'anesthésie est une application importante de la structure décrite parce que selon cette structure le mécanisme de l'action des anesthétiques (reg. plus haut, s.v.p.) consiste à detruire des liaisons H interlipidiques pendant la formation du complexe récepteur sphingolipides -- phospholipides + cholestérol grâce aux groupes polaires de l'anesthétique. 2620940 REVENDICATIONS l.Innovation "Structure fondamentale de l'action des hormones, des neuro- transmetteurs et des facteurs de croissance dans la transmission du signal dans la cellule et ses conséquences pratiques très importantes" caractérisée en ce qu'elle comporte une série de connaissances nouvelles qui ont permis d'etablir la structure nouvelle de l'action des hormones, des neurotransmet- teurs et des facteurs de croissance avec les validations nouvelles suivantes: la création des complexes ligand - récepteur + lipides selon le shéma: ré- cepteur + ganglioside -+ cérébroside - sphingomyéline + cholestérol avec les liaisons hydrogènes interglucidiques et interlipidiques surtout; la modulation de la structure de la couche intérieure de la membrane pour la création des sites de l'association avec les protéines mobiles comme la protéine kinase C, la protéine G ou les phospholipases par les chaînes très longues de la couche extérieure et une augmentation de l'insatura- tion des acides gras de la couche intérieure; la validation de l'endocytose comme moyen de la régulation négative (ré- troaction) des enzymes de la couche intérieure de la membrane, en par- ticulier de la protéine kinase C; la validation de la structure micellaire et rotatoire pour le transport de Ca2+ à travers la membrane plasmique avec l'acide lysophosphatidique d'après l'action de la phospholipase A2 et de l'acyltúansférase; les conclusions et les conséquences pratiques faites à partir de cette structure. 2.Innovation selon la revendication I caractérisée en ce qu'elle comporte l'exécution de nouvelles préparations avec la sphingosine contre les maladies mentales-sphingolipidoses (maladies de Sandhoff, de Fabry, de Gaucher, de Krabbe, de Niemann-Pick, de Tay-Sachs, gangliosidose GM3, leucodystrophie métachromatique, gangliosidose généralisée, lactosylcéramidose) incorporant les porteurs de sphingosine qui peuvent être endocytés dans la cellule pal les puits recouverts. 3.Innovation selon la revendication I caractérisée en ce qu'elle comporte l'exécution de nouvelles préparations pour la réalisation de l'anesthésie qui élimine à cause de ces groupes polaires les liaisons intermoléculaires hydrogènes d'après la création du complexe récepteur + sphingolipides phos- pholipides + cholestérol. 4.Innovation selon la revendication I caractérisé en ce qi'elle comporte l'exécution de nouvelles préparations des sphingolipides naturels 2L syr. thé- tiques contre le cancer qui bloquent la division continue des cellules. 5.Innovation selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comporte l'exécution de nouvelles préparations des gangliosides et des glycolipides 36 2620940 neutres qui approchent l'action des récepteurs de l'état pathologique à l'ac- tion des récepteurs en état normal connus par l'assistance des séquences (Cartes) de l'action de chaque récepteur particulier en état normal et patho- logique.