Brevet FR2617169A1 — publié le 19881230

La présente invention concerne de nouveaux dérivés peptidiques ayant une activité antiagrégante, leur procédé de préparation et leurs applications en thérapeutique et comme agents de diagnostic. De façon plus précise, elle concerne des analogues peptidiques d'une séquence du fibrinogène utilisables notamment comme antagonistes du fibrinogène vis à vis des plaquettes sanguines. On sait qu'au cours de I'hémostase les plaquettes sanguines adhèrent au sous-endothélium du vaisseau lésé. secrètent leur contenu granulaire après stimulation et agrègent les unes aux autres pour former un thrombus plaquettaire. L'agrégation dépend des contacts qui s'établissent entre membranes de plaquettes adjacentes. Cette réaction est nécessaire pour l'arrêt d'un saignement. Elle a cependant de nombreuses déviations pathologiques, notamment dans les cas de thromboses veineuses ou artérielles, au cours du développement d'une plaque d'athérome, ou de la formation de microthrombi qui peuvent obstruer la microcirculation périphérique ou cérébrale.Le controle et la régulation de l'agrégation plaquettaire sont donc un objectif majeur dans la prévention de la thrombose et de I'athérosclérose et de nombreuses études sont consacrées à la recherche et au développement de molécules aux propriétés antiagrégantes. Dans ce phénomène. le fibrinogène a un ralle important. Ainsi dans le plasma de malades atteints d'afibrinogènemie congénitale, I'agrégation plaquettaire est fortement diminuée ou absente et ce défaut est corrigé par l'injection de fibrinogène. De môme en l'absence de fibrinogène, des plaquettes lavées n agrègent pas à 1'ADP ou à I'épinéphrine. La présence de fibrinogène est donc -une nécessité pour le dévelop pement normal d'un thrombus plaquettaire. La participation du fibrinogène à l'agrégation est due à l'in- duction d'un récepteur spécifique pour cette protéine sur la membrane de la plaquette activée.Tous les stimuli physiologiques de la plaquette induisent une classe unique de récepteur et l'interaction du fibrinogène avec ce récepteur régule l'agrégation plaquettaire. Il existe donc un mécanisme de l'agrégation plaquettaire. commun à tous les inducteurs, qui dépend de l'interaction entre le fibrogène et son récepteur. L'importance physiologique de cette voie de l'agrégation plaquettaire dépendante du fibrinogène est attestée par l'étude des thrombasthénies de Glanzmann dont les plaquettes ne fixent pas le fibrinogène et n'agrègent pas en réponse à tous les stimuli physiologiques de la cellule. En résumé, le récepteur du fibrinogène n'est pas exprimé sur la plaquette circulante, il est induit dès que la cellule est stimulée. Cette induction peut être dépendante ou indépendante de la réaction de sécrétion. Tous les stimuli expriment le même récepteur et l'interaction entre le fibrinogène et le récepteur conduit directement à l'agrégation. La dissociation du fibrinogéne lié à la plaquette a pour conséquence la désagrégation des plaquettes. Dans ce contexte il est clair que si l'inte- raction entre le fibrinogène et son récepteur plaquettaire pouvait être régulée, ceci constituerait un moyen pour contrôler l'agrégation in vitra et in vivo. La présente invention vise précisément à fournir de nouveaux agents qui permettent d'inhiber. de réguler ou de mesurer sélectivement la voie de l'agrégation dépendante du fibrinogène. Des séquences peptidiques issues de la molécule de fibrinogène ont déjà été identifiées comme inhibant la fixation de cette protéine sur les pla quettes et bloquant ainsi leur agrégation. Ainsi E. Plow et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 8057, 1985) ont décrit l'activité de la séquence Arg-Gly Asp-Ser (RGDS)* présente dans la chaine alpha du fibrinogène. La présente invention a pour objet des ana logues peptidiques de l'extrémité C-terminale de la chaine alpha du fibrinogène qui présentent un effet inhibiteur de la liaison fibrinogène-piaquette et de l'agrégation plaquettaire. Ces dérivés peptidiques répondent à la formule générale suivante X - Y - Gly - Asp - Z - W (I) dans laquelle X représente l'hydrogène, un résidu d'a cide aminé, un groupement de formule DE-où D représen te un groupe N-protecteur physiologiquement accepta ble, ou l'hydrogène, et où E représente une simple liaison ou un résidu d'acide aminé, Y représente un résidu L-arginyle, ou D arginyle, Z représente un résidu L-phénylalanyle ou 0-phénylalanyle, W représente un groupe OH, NH2, O-R avec R1 représentant un radical alkyle en C1 à Cs NNR2 avec 2 R représentant un radical alkyle en C1 à C*, ou un résidu d'acide amine. * La signification des symboles et abréviations utilisuées est donnée en annexe. Dans les groupes X et W les résidus d'acides aminés susceptibles d'être utilisés sont notamment les radicaux D ou L-pyroglutamyle, L ou D-alanyle. -alanyle, glycyle, L ou D-prolyle, L ou D-valyle, L ou D-phenylalanyle, L ou D-homocystéyle, L ou D-aspartyle, L ou D-glutamyle, L ou D-hystidyle, L ou D-méthionyle, L ou D-threonyle, L ou D-séryle, L ou D-cystéyle, L ou D-leucyle, L ou D-arginyl-e, L ou D-tryptophanyle, L ou D-tyrosyle, L ou D-lysyle et L ou D-ornithyle. Les groupes N-protecteurs physiologiquement acceptables sont notamment les groupes protecteurs de l'attaque en N-terminal des enzymes exopeptidases. Comme exemples de tels groupes on peut citer les groupes acyles tels que les groupes t-butyloxycarbonyle (Boc), tert-amyl-oxycarbonyle (+Aoc), benzyloxycarbonyle, benzoyle, acétyle, formyle, propanoyle, butanoyle, phénylacétyle, phenylpropanoyle, cyclo pentylcarbonyle. La présente invention englobe également les équivalents des dérivés peptidiques de formule 3 dans lesquels chaque liaison peptidique (-CO-NH-) entre deux résidus d'acide aminé de la formule générale I est remplacée par les structures suivantes - CO-N(CH3 )- ; -CO-O- ; -CH2-NH- ; -CS-NH- - CO-CH ; CH2-S- ; -CHOH-CH2- ; -HN-CO - CH2CH- ; - CH2 -CH2-. ou dans lesquels le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que des groupes -CH2-, -NH-, -O-. Un dérivé peptidique préféré est un dérivé de formule H - Arg - Gly - Asp - Phe - OH La présente invention a également pour objet - une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un d8rivépeptidique de formule I - un agent de diagnostic comprenant un dérivé de peptidique de formule I Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être préparés de manière classique par synthèse peptidique en phase liquide ou solide par couplages successifs des différents résidus d'acides aminés à incorporer (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide. ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale en phase solide) et dont les extrémités N-terminales et les chaînes latérales réactives sont préalablement bloquées par des groupements tels que ceux mentionnés ci-dessous 1) Extrémité N-terminale protégée par :Boc Spoc Fmoc 2) Groupement bloquant Résidu la chaine latérale Alanyle H Arginyle tosyle Asparagyle H,xanthyle Aspartyle O-benzyle Cystéyle acétamidométhyle(Acm), 4-méthylbenzyle (Meb), 4-methoxybenzyle(Mob), S-ben zyle Glutamyle O-benzyle Glutaminyle xanthyle Glycyle H Histydyle tosyle, 2-4-dinitrophényle(Dnp) Isoleucyle H Leucyle H Lysyle 2-chlorobenzyloxycarbonyle(Clz), tri fluoroacétyle(TFA), formyle(For) , ben zyloxycarbonyle(Z) Méthionyle H Norleucyle H Ornithyle benzyloxycarbonyle Phénylalanyle H Propyle H Pyroglutamyle H Sarcosyle H Séryle O-benzyle Thréonyle H, O-benzyle Tryptophany-le H, formyle Tyrosyle H, 2-6-dichlorobenzyle(dcb), 2-bromo benzyloxycarbonyle Valyle H On peut utiliser différentes méthodes de couplage 1. Couplage des résidus par un carbodiimide (ex : DCC, EDC) avec ou sans catalyse (ex : HOBT) ou autre agent couplant (ex : EEDQ) 2. Utilisation des acides aminés sous forme d'anhydrides symétriques préformés 3. Utilisation des acides aminés sous forme d'esters activés (ex : p-nitrophénylester, HOBT ester) et couplage par l'intermédiaire de- DCC. En synthèse en phase solide (SPPS) le tableau I ci-dessous mentionne les différents types de résine utilisable ainsi que les protections et méthodes adéquates pour les différentes étapes. Tableau I Systeme SPPS Liaison Protection reactif de protection reactif de utilise peptide-résine an alpha déprotection chaine latérale clivage Classique Benzyl ester Boc TFA HCl - Benzyl NF, HBr Stable (longue chaine) Pam Boc TFA, HCl Benzyl HF, HBr Benzyl ester Bpoc TFA dilue Benzyl HF Benzyl ester Bpoc TFA dilue t-Butyl HF Labile Ether resine Bpoc TFA dilué t-Butyl TFA Orthogonal Ether résine Fmoc Piperidine t-Butyl TFA Synthèse de Ether résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA segment t-Butyl résine - Fmoc Piperidine Benzyl TFA Hydrazide resine Fmoc Piperidine Benzyl TFA Assemblement Benzyl ester Fmoc Piperidine Benzyl HF de segments Peptides amides MBHA, BHA Boc TFA, HCl - Benzyl HF Peptides alcools Benzyl ester Boc TFA, HCl Benzyl LiBH4 En synthèse en phase solide le 1er acide aminé (extrémité C-terminale) à fixer sur la résine peut être soit acquis commercialement déjà attaché au support soit fixé par l'intermédiaire de sel de césium (méthode de Gisin), d'un sel de tétraméthylammonium (méthode de Loffet) ou d'un carbodiimide. Les exemples suivants illustrent la prépara tion des dérivés peptidiques de formule I Exemple 1 Synthèse du peptique H-Arg-Gly-Asp-Phe-OH (ou R G D F) Ce peptide a été synthétisé en phase solide en utilisant les méthodes suivantes - support : résine Merrifield chlorométhylée (0.7 mmol Cl/g) à 2% de divinylbenzène. Préparation de Boc-Phe-résine : 7,'5 mmoles (29) de Boc-Phe-OH solubilisées dans 10 ml d'éthanol ont été additionnées de 3,75 mmoles (1,229) de Cs2 C03 dans 2 ml d'eau. L'ester de césium formé (Boc-Phe-OCs, 7,5 mmol) après quelques minutes d'agitation a été évaporé à sec et mis au dessicateur sous vide pendant 48 h. Il a été ensuite resolubilisé par 80 ml de DMF et mélangé à 10,79 de résine (0,7 mmol Cl). La réaction a été réalisée en 24 h. sous agita- tion dans un bain chauffant à 50il. La résine dérivatisée (Boc-Phe-résine) a été ensuite filtrée et lavée par DMF, DMF/H20, DMF, EtOH, puis séché sous vide pendant 3 h.Le taux de substitution de la résine a été calculé par analyse d'acide aminé après hydrolyse à 150il, pendant 3 h., par le mélange HCl/acide propionique (50/50). La substitution obtenue a été de 0,24 mmol Phe/g résine. - couplage Tous les dérivés aminés incorporés on-t été couplés par la méthode du carbodiimide DCC en présence de catalyseur HOBT (2 équivalents Phe en acide aminé, en DCC et en HOT). Les dérivés protégés utilisés et leur milieu de solubilisation ont été les suivants Dérivés Solvants Boc-Asp-O-Bzl DCM Boc-Gly DCM Boc-Arg(Tos) DMF Les couplages ont été réalisés en 2 h. dans du DCM. Les déprotections par TFA et les couplages ont tous été controlés par un test de Kaiser. - clivage Le clivage du peptide synthétisé a été effectué par HF (10 ml/g résine) en présence d'anisol (1 ml/g rés.) pendant 1 h. à 0 C. Après lavage à l'éther, le peptide a été ensuite extrait par de l'acide acétique à 15Z et lyophilisé. - purification : sur colonne de Sephadex G10 éluée par de l'acide acétique à 10Z - contrle : analyse d'acide aminé : après hydrolyse pendant 30 mn à 150 C par HCl/acide propionique 50/50 chromatographie sur couche mince de silice éluant : CH30H/CHCl3/NH*OH 252 (60/40/20) détection : phenantrène quinone (Arg) ninhydrine (NH2) TDM (NH) Rf = 0,51 éluant 2 : 2-butanone/CH3COOH/H20 (10/30/25) Rf = 0,73 éluant 3 : butanol/CH3COOH/H2Q (75/10/24) Rf = 0,16 Exemple 2 Synthèse du peptide H-Leu-Arg-Gly-Asp-Phe-OH (ou L R G D F?. Ce peptide a été synthétisé, purifié et analysé selon les mêmes méthodes que le peptide de l'exemple 1. Ses caractéristiques analytiques sont les suivantes chromatographie sur couche mince de silice éluant 1 :CH30H/CHCl3/NHsOH 252 (60/40/20) Rf = 0,82 éluant 2 : 2-butanone/CH3COOH/H20 (10/30/25) Rf t 0,69 éluant 3 : butanol/CH3COOH/H20 (75/10/24) Rf = 0,21 On donnera ci-après des résultats des études pharmacologiques mettant en évidence les propriétés des dérivés peptidiques de formule I 1. Inhibition de la liaison Dlaouette-fibrlnoqène Préparation des plaquettes Les plaquettes sont isolées à partir de 60 ml de sang humain prélevé sur un tampon anticoagulant, l'ACD, à raison d'1 volume d'ACD pour 6 volumes de sang. L'ACD.a la composition suivante Citrate trisodique 5 H20 5,95 g Acide citrique 3,41 g Dextrose 5g H20 qsp 250 ml Le sang est ensuite centrifugé 20 mn à 1000 t/mn (centrifugeuse JOUAN E 96) à température ambiante. Le PRP (plasma riche en plaquettes) est décanté et additionné de PGE1 0,1 uM puis centrifugé 15 mn à 2000 t/mn. Les plaquettes obtenues dans le culot sont alors reprises par -1 ml de tampon Tyrode-albumine pH 7,2 préparé selon la composition suivante Tampon Tyrode (solution mère) NaCl 1,3 M KCl 0,026 M NaHC03 0,12 M Tampon Tyrode-albumine solution mère 1/10 M D-glucose 0,0055 M albumirie 2X HCl 1M qsp pH 7,2 Les plaquettes sont lavées sur une colonne de Sépharose CL 26 par du tampon tyrode-albumine pH 7,2 puis les plaquettes recueillies sont diluées à la concentration de 2.108 pl./ml. Les essais sont réalisés sur 4.107 plaquettes en présence de CaCl2 (0.5 mM), de 125I-fibrinogène -6 (0,1.10-6 M) et de différentes concentrations de pep- tide, et la stimulation des plaquettes est provoquée par de l'ADP (5.106M?. Après 15 mn d'incubation et dépôt sur une solution de saccharose à 15Z le complexe 125I-fîbrinogène-plaquette est isolé par centrifugation à 12000 t/mn pendant 2 mn. Les résultats sont donnés sous forme de CI50 dans le tableau II. Ce tableau donne également la séquence des peptides. 2. Inhibition de l'agrégation claouettaire L'effet des peptides synthétiques sur l'agrégation plaquettaire a été étudié- sur des plaquettes isolées comme précédemment pour l'étude de la liaison au fibrinogène. La stimulation des plaquettes est également obtenue par l'ADP 5.10 M et l'essai réalisé en présence de fibrinogène 1,1.10 6M et de CaCl2 0,5.10 M. Les résultats sont donnés dans le tableau II et mettent en évidence une activité inhibitrice sur l'agrégation plaquettaire des peptides de formule I. Tableau II Inhibition ICSO cyn) Peptide NornCncliturc Liaison plaquettaire Agrégation Fibrinogène Arg-Gly-Asp- Phe R G D f 7 15 Leu - Arg - Gly - Asp - Phe L R G D V 20 20 Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être utilisés notamment pour le traitement et la prê- vention des thromboses, en particulier dans les états préthrombotiques pour bloquer l'agrégation plaquettaire. Ils peuvent également exercer un effet inhibiteur sur - l'adhésion des plaquettes sanguines aux cellules endothéliales des parois vasculaires ou du sous endothélium. - l'athérogénèse - le développement de métastases - la réponse inflammatoire Les compositions thérapeutiques selon l'invention peuvent être administrées à l'homme ou aux animaux par voie orale ou parentérale. Elles peuvent être sous la forme de préparation solides, semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les comprimés, les gélules, les solutions ou les suspensions injectables. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les compositions thérapeutiques peuvent contenir notamment de 1 à 60Z en poids de principe actif. La quantité de principe actif administrée dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Elle est généralement de 1 à 500 mg. ANNEXE Abréviations usuelles de la chimie des peptides BHA : benzylhydrylamine (résine) 80c : tert-butyloxycarbonyle Bpoc : 2-(4-biphénylyl)propyl(-2)oxycarbonyle Bzl : benzyle Clz : 2-chlorobenzyloxycarbonyle DCC : dicyclohexylcarbodiimide DCM : dichlorométhane DMF : diméthylformamîde EDC : N-ethyl-N'-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide EEDQ : N-ethyloxycarbonyl-2-ethyloxy- 1,2- dihydroquinoline Fmoc : 9-fluorénylméthyloxycarbonyle HOBT : 1-hydroxybenzotriazole MBHA : 4-méthylbenzhydrylamine (résine) TDM : N,N.N' ,N' ,tétraméthyl-4,4'-diamînodiphé- nylméthane TFA : acide trifluoroacétique Tos : tosyle Xan : xanthyle Svmboles des acides aminés A Ala alanine C Cys . cystéine O Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Glu2 glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1. Dérivés peptidiques de formule X - Y - Gly - Asp - Z - W (I) dans laquelle X représente l'hydrogène, un résidu d'acide aminé, un groupement de formule DE- où D représente un groupe N-protecteur physiologiquement acceptable, ou l'hydrogène. et où E représente une simple liaison ou un résidu d'acide aminé. Y représente un résidu L-arginyle ou D-arginyle; Z représente un résidu L-phénylalanyle ou D-phénylalanyle. W représente un groupe OH, NH2, O-R avec R représentant un radical alkyle en C1 à Cq, NHR2 avec R représentant un radical alkyle en C1 à C4, ou un résidu d'acide aminé. 2. Dérivés selon la revendication 1, dans lesquels X est l'hydrogène ou un résidu L-leucyle ou D-leucyle. 3. Peptide de formule H - Arg - Gly - Asp - Phe - OH 4. Peptide de formule H - Leu - Arg - Gly - Asp - Phe - OH 5. Composition thérapeutique, caractérisé en ce qu'elle contient à titre de principe actif un dérivé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Agent de diagnostic, caractérisé en ce qu'il contient un dérivé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.