Brevet FR2613725A1 — publié le 19881014

La presente invention se rapporte à un procédé simple et avantageux pour obtenir de la lactoperoxydase active et de la lactoferrine, à partir du lactosérum. Ce procédé s'inscrit dans un programme de valorisation du lactosérum de fromagerie et de caséinerie. En effet, on sait que la fraction présentant la valeur la plus élevée du lactosérum est constituée par les protéines qu'il renferme. Le plus souvent, celles-ci sont récupérées par ultrafiltration, ou encore par thermocoagulation à pH acide, afin d'être utilisées pour l'alimentation humaine ou animale. Toutefois, sans rejeter pour autant cette utilisation, on peut penser que certaines des protéines présentes dans le lactosérum, si elles pouvaient être isolées de ce dernier, auraient des débouchés intéressants, notamment celles qui ont une activité biologique et qui peuvent être actives à des concentrations très basses. Parmi ces protéines intéressantes, on trouve la lactoperoxydase qui est l'enzyme la plus abondante du lait de vache (10-30 mg/litre? et qui se retrouve en totalité dans le lactosérum. Elle garde son activité après une pasteurisation normale, à 72'C, pendant 15 secondes, étant détruite plus ou moins complètement lorsque la température est plus élevée ou le temps plus long. Pour illustrer l'intérêt de la lactoperoxydase. on peut mentionner plusieurs de ses applications - elle peut ainsi être utilisée comme additif pour des laits dans lesquels la lactoperoxydase a été détruite, ou pour d'autres liquides alimentaires. Elle permet alors d'assurer une conservation de ces liquides par son activité bactéricide en présence d'eau oxygénée et de thiocyanate, comme décrit dans le brevet britannique n' 1 468 405 - elle peut également entrer dans des préparations pharmaceutiques pour le traitement d'infections gastro intestinales chez les animaux. On met là aussi a profit son activité bactéricide, suivant le même prin cipe que ci-dessus. Le brevet britannique n' 1 546 747 porte sur de telles compositions pharmaceutiques anti bactériennes.On connait aussi des compléments alimen taires à base de lactoperoxydase et de lactoferrine destinés au traitement préventif des diarrhées bacté riennes chez les jeunes ruminants - elle est couramment utilisée pour le marquage des protéines à l'iode radioactif et pour le marquage enzymatique d'anticorps ou d'antigène, dans les techniques ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) utilisées pour le dosage d'antigène ou d'anticorps - enfin, on peut utiliser la lactoperoxydase pour l'esti mation de la glycémie par la méthode Boehringer (W. Werner, H.G. Rey, H. Wielinger. Communication Congrès "Biochemische Analytik 70", Munich, 29 avril 2 mai 1970), utilisant la glucose oxydase et la peroxydase. La lactoperoxydase est connue depuis fort long temps elle elle a en effet été isolée à l'état cristallisé par Theorell, H. et al. : "Arkiv. Kemi, Mineral. Geol., 17B, n' 7 (1943) et 18A, n' 12 (1944). Des techniques relativement simples de préparation par chromatographie sur supports anioniques ont été disponibles à partir de 1957 ainsi, on pourra se reporter à l'article de M. Morrison, H. B. Hamilton et E. Stotz, intitulé "L'isolement et la purification de la lactoperoxydase par chromatographie d'échanges d'ions, The Journal of Biological Chemistry. 28, 767. Ces techniques sont basées sur le fait que seules quelques protéines du lait (lactoferrine, lactoperoxydase et immunoglobulines) se fixent sur de tels supports à pH neutre.Plusieurs méthodes de ce type, permettant une préparation en laboratoire, ont été publiées. On peut citer, à titre d'illustration, les techniques rapportees par M. Morrison et D. E. Hultquist, The Journal of Biological Chemistry, 238, (1963) 2847 ; M. L. Groves, Biochimica et Biophysica Acta 100 (1965) ; K.G. Paul, P. I. Ohlsson et A. Henriksson, FEBS Letters 110 n' 2, (1980) 200 ; et par C. Dumontet et B. Rousset, The Journal of Biological Chemistry, 253, On cannant également par le brevet belge n' 214464 (brevet français correspondant n' 2 576 752?, un procédé de purification de protéines du lait dont le pH isoélectrique est supérieur à 7,5 On voit donc que l'état antérieur de la technique n' offre pas de procédé permettant d'isoler la lactoperoxydase par chromatographie d' échange d' ions sur support disponible commercialement, d'une manière simple et répondant à un besoin industriel. La présente invention apporte maintenant une solution ; elle propose, å cet effet, dans une technique conventionnelle consistant en un traitement du lactosérum avec un échangeur anionique, suivi par une élution, des conditions originales d'élution de la protéine recherchée, après sa fixation sur l'échangeur. En effet, contrairement à tous les procédés connus en laboratoire ou industriels dans lesquels on utilise, pour réaliser l'élution, une augmenta tion de la force ionique La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention de lactoperoxydase active et de lactoferrine à partir du lactosérum, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à : (a) amener le pH du lactosérum à une valeur voisine de la neutralité échangeur anionique sont fixées la lactoperoxydase et la lactoferrine, puis le laver pour éliminer toute autre protéine et les contaminants provenant du lactosérum ; et avec augmentation de pH, par utilisation d'une base volatile et en mettant en oeuvre, comme solution d'élution, une solution d'un sel volatil de ladite base, et, si on le désire, relarguer ensuite la lactoferrine. On utilise1 comme matière de départ, soit du lactosérum de fromagerie ou de caséinerie, tel qu'il est obtenu à partir de lait cru ou de lait pasteurisé, soit du lactosérum concentré par ultrafiltration, par exemple de dix fois ou plus, cette deuxième voie étant préférée à la précédente. A l'étape (a), on amène le pH du lactosérum à une valeur proche de la neutralité, par une solution d'ammoniaque, d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium. L'utilisation de l'hydroxyde de sodium ou de potassium, qui ne sont pas des bases volatiles, est cependant sans inconvénient pour réaliser cette neutralisation ; en effet, la lactoperoxydase se fixe de la même manière à l'échangeur anionique que si l'on utilise une solution d'ammoniaque, car le lavage, qui précédera l'élution, éliminera les sels non volatils. Par ailleurs, le lactosérum débarrassé de la lactoperoxydase (ainsi que de la lactoferrine, qui est éluée après la lactoperoxydase) peut être tout aussi bien utilisé par la suite. A l'étape (b), on peut utiliser n'importe quel échangeur anionique ; on peut citer, par exemple, un oe échangeur de type CM-Sepharose Fast Flow équilibré à l'aide d'un solution, de pH proche de 7, du sel volatil utilisé également aux étapes (c) et A l'étape le pH de la-solution de lavage étant inférieur à ceux des solutions qui réalisent l'élution, et supérieur à 7 ; il peut être, par exemple, de l'ordre de 8,5. Le lactosérum obtenu à la fin de l'étape (c?, qui contient toujours les principales protéines de lactosérum, à savoir l'a-lactalbumine et la 13-lactoglobuline, peut être utilisé de façon classique, comme du lactosérum non traité, notamment pour récupérer les protéines précitées. Quant au liquide de lavage, de même que les liquides provenant de lavages ultérieurs, il peut être, soit recyclé, soit utilisé comme source de carbone et d'azote dans la préparation industrielle de micro-organismes, par exemple de levures. Aux étapes (c) et (d > , on utilise, comme base volatile, notamment l'ammoniaque pour élever le pH et, comme sel volatil de ladite base, l'acétate ou le formiate d'ammonium, indifféremment. Par le procédé de l'invention, on peut obtenir la lactoperoxydase pure et active, directement par lyophilisation ou par séchage par pulvérisation . Cet éluat peut toutefois, avant lyophilisation, être soumis à une concentration par ultrafiltration, en utilisant, par exemple des membranes minérales. De plus, après élution de la lactoperoxydase, on peut obtenir la lactoferrine encore fixée sur la colonne en réalisant l'élution à l'aide d'une solution dans l'eau de la base utilisée précédemment, à un pH supérieur. La lactoferrine peut ensuite etre isolée à l'état pur, de la même manière que la lactoperoxydase. On voit donc que le procédé de l'invention présente l'avantage d'un nombre d'opérations très limité, l'ensemble de celles-ci pouvant être réalisé sur une même colonne, par exemple en lit fluidisé. On pourrait, de même, réaliser les opérations de façon automatique en continu avec deux colonnes, en passant d'une colonne sur l'autre quand la première est saturée en lactoperoxydase, laquelle est éluée, tandis que la première colonne se trouve en charge. Enfin, la technique selon l'invention ne modifie pas le lactosérum, de façon gênante, puisque le seul traitement de celui-ci est un ajustement du pH à 7,0, d'où il résulte que le lactosérum traité peut être réutilisé de façon conventionnelle. EXEMPLE On concentre de dix fois, par ultrafiltration, du lactosérum de fromagerie et on amène son pH à 7,0 avec une solution commerciale d'ammoniaque concentrée (28), à raison de 90 ml environ pour 5 1 de rétentat 10. On ajoute au lactosérum en cuve, un échangeur anionique de type CM oe + Sepharose Fast Flow, sous forme NH4 à pH 7,0, équilibré avec de l'acétate d'ammonium 80mM à pH 7. On agite modérément, pendant dix minutes, à la température ambiante, on récupère l'échangeur sur filtre, ou de toute autre manière, et on le lave sur filtre, ou de toute autre manière, avec de l'acétate d'ammonium 80 mM, dont le pH a été amené à pH 8,5 par de l'ammoniaque. L'échangeur est ensuite mis en colonne. La lactoperoxydase est éluée seule par une solution d'acétate d'ammonium 80 mM, amenée à pH 10,5 par de l'ammoniaque, et on l'obtient pure directement par lyophilisation. L'échangeur est lavé et régénéré en colonne par une solution d'ammoniaque 0,2 m, à pH 11,5, qui élue la lactoferrine encore fixée sur la colonne. Celle-ci est récupérée de la même manière que la lactoperoxydase. L'échangeur est enfin lavé à l'acétate d'ammonium, 80mM, pH 7, sur colonne pour ramener son pH aux environs de 7, en vue de sa réutilisation. RLYSXXICATIONS 1 - Procédé d'obtention de lactoperoxydase active et de lactoferrine, à partir du lactosérum, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à (a) amener le pH du lactosérum à une valeur voisine de la neutralité échangeur anionique sont fixées la lactoperoxydase et la lactoferrine, puis le laver pour éliminer toute autre protéine et les contaminants provenant du lactosérum ; et (d) relarguer la lactoperoxydase par élutions successives avec augmentation de pH, par utilisation d'une base volatile et en mettant en oeuvre, comme solution d'élution, une solution d'un sel volatil de ladite base, et, si on le désire, relarguer ensuite la lactoferrine. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise > comme matière de départ, du lactosérum de fromagerie ou de caséinerie, tel qu'il est obtenu d partir de lait cru ou de lait pasteurisé. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise > comme matière de départ, du lactosérum concentré par ultrafiltration. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 a 3, caractérisé par le fait qu'à l'étape 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'a l'étape 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'à l'étape , le pH de la solution de lavage étant inférieur à celui de la solution qui réalise l'élution et supérieur à celui du lactosérum neutralisé. 7 - Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait qu'aux étapes 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 a 7, caractérisé par le fait que l'on obtient la lactoperoxydase pure et active par lyophilisation directe ou par séchage par pulvérisation à partir du premier éluat obtenu à l'étape 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on obtient la lactoperoxydase pure et active par lyophilisation du premier éluat obtenu à l'étape 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 a 9, caractérisé par le fait qu'à l'étape 11 - Lactoperoxydase et lactoferrine obtenues par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 10.