Brevet FR2618905A1 — publié le 19890203

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA PRESENCE DE SPERMATOZOIDES VIVANTS ET TESTS A CETTE FIN La présente invention a pour objet un procédé nouveau de détermination de la présence de spermatozoïdes vivants dans le liquide spermatique. Elle se rapporte également aux tests permettant la mise en oeuvre dudit procédé. En fait, l'invention a plus particulièrement pour objet un procédé permettant la détermination quantitative des spermato- zoOdes présents dans un échantillon de liquide spermatique. On connait un certain nombre de procédés permettant la détermination de la présence de spermatozoïdes vivants dans un liquide spermatique. Ces procédés présentent l'inconvénient soit de ne pas permettre une détermination quantitative soit de ne la permettre que sous réserve de l'emploi d'appareillages compliqués, donc coûteux, nécessitant un personnel qualifié; en fait dans ce dernier cas, la mesure quantitative des spermatozoïdes est obtenue soit par différence entre deux opérations, à savoir une détermination du nombre de spermatozoïdes morts et vivants présents dans un échantillon et une détermination du nombre de spermatozoïdes morts dont la présence est révélée par coloration dans l'échantillon, ce qui implique deux déterminations, 25.soit par comptage du nombre des spermatozoïdes vivants par une technique de révélation impliquant coloration directe et mesure de fluorescence, donc nécessitant un appareillage compliqué (microscope par fluorescence, etc). De tels procédés et dispositifs sont entre autres décrits dans 30. Belsey et Al, Laboratory Manual for the examination of human semen and semencervical mucus interaction'.Press Concern Singapour (Publications OMS); Eliasson et Ai, le chapitre "Analysis of semen" dans l'ouvrage "The Testis" EDit. Burger and Kretser 1981 p. 381-399; 5. Jouannet et Ai "Facteurs de fertilité humaine" Colloques Inserm. Ed. Spira et Jouannet, 1981, vol. 103 p. 73-90. La présente invention a pour objet un procédé de déter- mination de la présence de spermatozoïdes vivants consistant à préparer un support auquel adhère un agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes humains vivants, à mettre ledit support au contact du liquide spermatique, puis à traiter le support par une solution aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'activité lacticodéhydrogénase du spermatozoïde, et contenant un révélateur. Selon une forme d'exécution du procédé de l'invention, le support est un élément rigide, tel plaque, coupelle, tube, batonnet, bille, microsphère, ou un élément semi-rigide ou souple, tel membrane, papier, bandelette, etc. Selon une autre forme d'exécution du procédé de l'inven- tion, le support est formé de polystyrène, polypropylène, polyéthylène, chlorure de polyvinyle, cellulose, nylon, etc. Selon une première -forme d'exécution du procédé de l'invention, l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est un agent immunologique consistant en un anticorps spécifique des spermatozoides, tels les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des associations d'anticorps mbnoclonaux. Selon une seconde forme d'exécution du procédé de l'inven- tion, l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est une lectine fixant des sucres de surface des spermatozoïdes. Selon une autre forme d'exécution encore du procédé de l'invention, l'agent de fixation précité est fixé sur le support par adsorption due au contact dudit support avec une solution dudit agent suivie d'un traitement de saturation de la surface puis d'un séchage à température et pendant une durée définis. Selon une forme de réalisation du procédé de l'invention, le révélateur comprend une nicotinamide adénine dinucléo- tide (NAD), un réducteur et un colorant. Selon une autre forme de réalisation du procédé de l'invention, le réducteur consiste en phénazine-méthosulfate (PMS). Ce réducteur est destiné à provoquer le déplacement d'atomes d'hydrogène vers le colorant. Selon une autre forme encore de réalisation du procédé de l'invention, que le colorant est le nitrobleu de tétrazo- lium (NBT). Selon une forme d'exécution du procédé de l'invention, le substrat de l'activité lacticodéhydrogénase est un L-lactate de métal alcalin, de préférence, de sodium ou de lithium. Selon une autre forme d'exécution du procédé de l'inven- tion, le substrat de l'activité lacticodéhydrogénase est un substrat spécifique de l'isoenzyme LDH-C4 ou LDH-X, tel l'acide cétohexanoique. Selon une autre forme encore d'exécution du procédé de l'invention, le substrat est celui d'un enzyme essentiel du spermatozoïde, tel glucose-6-phosphate déhydrogénase ou 6-phos- photogluconate déhydrogénase. La présente invention a également pour objet un test pour la mise en oeuvre du procédé précité consistant en un kit comprenant d'une part un support auquel adhère un agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes humains vivants, et d'autre part une solution aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'activité iacticodéhydrogénase du spermatozoïde, et contenant un révélateur. De préférence, le support est un élément rigide tel plaque, coupelle, tube, batonnet, bille, microsphère, ou un élément semi-rigide ou souple, tel membrane, papier, bandelette, etc. et est formé de polystyrène, polypropylène, polyéthylène, chlorure de polyvinyle, cellulose, nylon, etc. Selon un mode de réalisation du test de l'invention, l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est un agent immunologique consistant en un anticorps spécifique des spermatozoïdes, tels les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des associations d'anticorps monoclonaux. Selon un autre mode de réalisation du test de l'invention, l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vi- vaits est une lectine fixant des sucres de surface des sperma- tozoides. Selon une forme d'exécution de l'invention, le révélateur comprend une nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), un réducteur et un colorant. De préférence, le réducteur consiste en phénazine-méthosulfate (PMS), le colorant est le nitrobleu de tétrazolium (NET) et le substrat de l'activité lactico- déhydrogénase est un L-lactate de métal alcalin, de préférence, de sodium ou de lithium, un substrat spécifique de l'isoenzyme LDH-C4 ou LDH-X, tel l'acide cétohexano!que ou un substrat de l'activité glucose-6-phosphate déhydrogénase ou de l'activité 6-phosphotogluconate déhydrogénase. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre non limitatif. Exemple 1 Dans un tube en polystyrène ayant 7,5 cm de long et 1,2 cm de diamètre, on verse une solution d'un anticorps monoclonal spécifique des spermatozoides. Après 60 minutes de contact, on retire ladite solution du tube, on verse dans le tube une solution bovine à 2% puis après lavage à l'aide d'un tampon TRIS, sèche le tube à une température de 45 C pendant minutes. On prépare, par ailleurs, une solution aqueuse tamponnée contenant 1 mmole de nicotinamide adénine dinucléotide, 0,1 mmole de nitrobleu de tétrazolium, 0,054 mmole de phénazine méthosulfate, 5 mmoles d'acide cétohexanoique, 50 mmoles de TRIS, 150 mmoles de NaCl et de l'eau (qsp 1 litre). Exemple 2 et 3 On prépare les mêmes tube et solution aqueuse tamponnée que dans l'exemple 1, sinon que la solution d'anticorps spécifi- que est une solution d'anticorps polyclonaux spécifiques (exemple 2) et d'un mélange d'anticorps monoclonaux (exemple 3). Exemples 4 à 6 On prépare les mêmes tube et solution aqueuse tamponnée que dans les exemples 1 à 3 respectivement, sinon que la solution aqueuse tamponnée préparée comporte 6 mmoles de L-lactate de sodium. Exemples 7 à 9 On prépare les mêmes tube et solutions aqueuses tampon- nées que dans les exemples 4 à 6 respectivement, sinon que le L-lactate de sodium est remplacé par 5,9 mmoles de L-lactate de lithium. Exemples 10 à 12 On prépare les mêmes tube et solution aqueuse tamponnée que dans l'exemple 1, sinon que le tube est un tube en polypro- pylène, en polyéthylène et en chlorure de polyvinyle respecti- vement. Exemples 13 à 21 Au lieu des tubes employés dans les exemples 1 à 9, on emploie une plaque standard de microtitration à base de poly- styrène comportant 96 puits à fond plat ayant les dimensions suivantes 12, 5 cm x 8,5 cm et présentant une épaisseur de 0,15 cm. Essais A1 à L1 On effectue une série de tests A1 à L1 sur les ensembles tube-solution aqueuse tamponnées des exemples 1 à 12 respecti- vement. Pour mettre en oeuvre ces tests, on verse dans le tube, 0,5 cm3 de liquide spermatique. Après 15 minutes de contact entre le liquide spermatique et la paroi des tubes, on jette le liquide spermatique puis rince le tube. On verse ensuite dans les tubes les solutions aqueuses tamponnées correspon- dantes. On obtient une coloration bleue violacée. On effectue une série de tests témoins AB1 à LB1, le liquide spermatique étant remplacé par un volume correspondant de liquide spermatique dont les spermatozoldes ont été tués par des cycles de congélation/décongélation classiques. On n'obtient aucune coloration. Essais A2 à I2 On effectue des tests A2 à I2 identiques aux tests A1 à Il sur les ensembles plaque-solution aqueuse tamponnée des exemples 13 à 21 respectivement. De même, on effectue une série de tests AB2 à JB2 sur lesdites plaques. Lecture des tests La lecture des tests peut-être faite optiquement soit à l'oeil soit au spectrophotomètre dans le rayonnement visible ou ultraviolet. On constate, pour les essais A1 à LI, une forte colora- tion du contenu des tubes, facile à déterminer par lecture visuelle. Pour les essais A2 à I2, il est plus difficile de faire une lecture visuelle du test et il est préférable d'opé- rer par lecture optique à l'aide d'un spectrophotomètre de tupe MULTISKAN (dénomination commerciale de Titertek) par exemple. Pour permettre une analyse quantitative, on utilise une échelle de coloration des bleus violacés obtenus. Par étalon- nage on obtient un nuancier des colorations obtenues auquel on se réfère pour déterminer la concentration en spermatozoïdes vivants présents et on rapporte celle-ci au volume total de l'éjaculat. La détermination du nombre de spermatozoïdes vivants n'est pas suffisante pour déterminer la fertilité du liquide spermatique, la détermination de conditions supplémen- taires telles que motilité du spermatozoïde étant entre autres nécessaire. REVENDICATIONS 1.- Procédé de détermination de la présence de sperma- tozoYdes vivants consistant à préparer un support auquel adhère un agent de fixation de sites de membrane de spermato- zoldes humains vivants, à mettre ledit support au contact du liquide spermatique, puis à traiter le support par une solu- tion aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'activité lacticodéhydrogénase du spermatozoïde ou d'une autre enzyme essentielle du spermatozoïde et contenant un révélateur. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est un élément rigide tel plaque, coupelle, tube, batonnet, bille, microsphère, ou un élément semi-rigide ou souple, tel membrane, papier, bandelette. 3.- Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que le support est formé d'une matière à base entre autre de polystyrène, polypropylène, polyéthylène, chlorure de polyvinyle, cellulose, nylon. 4.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoides vivants est un agent immunologique consistant en un anticorps spécifique des spermatozoïdes, tels les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des association d'anticorps monoclonaux. 5.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est une lectine fixant des sucres de surface des spermatozoïdes. 6.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent de fixation précité est fixé sur le support par adsorption due au contact dudit support avec une solution dudit agent suivie d'un traitement de satu- ration de la surface puis d'un séchage à température et pendant une durée définis. 7.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le révélateur comprend une nicotin- amide adénine dinucléotide (NAD), un réducteur et un colorant. 8.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le réducteur consiste en phénazine- méthosulfate (PMS). 9.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 8, caractérisé en ce que le colorant est le nitrobleu de tétrazolium (NBT). 10.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le substrat de l'activité lactico- déhydrogénase est un L-lactate de métal alcalin, de préférence, de sodium ou de lithium. 11.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat de l'activité lactico- déhydrogénase est un substrat spécifique de l'isoenzyme LDH-C4 ou LDH-X, tel l'acide cétohexanoique. 12.- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat est celui d'une enzyme essentielle du spermatozoïde, tel que glucose-6-phosphate déhydrogénase ou 6-phosphotogluconate déhydrogénase. 13.- Test pour la mise en oeuvre du procédé selon une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste en un kit comprenant d'une part un support auquel adhère un agent de fixation de sites de membrane de spermato- zoides humains vivants, et, d'autre part, une solution aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'activité lacticodéhydrogénase du spermatozoïde ou d'une autre enzyme essentielle du spermatozoïde, et contenant un révélateur. 14.- Test selon la revendication 13, caractérisé en ce que le support est un élément rigide tel plaque, coupelle, tube, batonnet, bille, microsphère, ou un élément semi-rigide ou souple, tel membrane, papier, bandelette. 15.- Test selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que le support est formé d'une matière consistant entre autre de polystyrène, polypropylène, polyéthylène, chlorure de polyvinyle, cellulose, nylon. 16.- Test selon une quelconque des revendications 13 à , caractérisé en ce que l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est un agent immunologique consistant en un anticorps spécifique des spermatozoïdes, tels les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des association d'anticorps monoclonaux. 17.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que l'agent de fixation de sites de membrane de spermatozoïdes vivants est une lectine fixant des sucres de surface des spermatozoïdes. 18.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que l'agent de fixation précité est fixé sur le support par adsorption due au contact dudit support avec une solution dudit agent suivie d'un traitement de satu- ration de la surface puis d'un séchage à température et pendant une durée définis. 19.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que le révélateur comprend une nicotin- amide adénine dinucléotide (NAD), un réducteur et un colorant. 20.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que le réducteur consiste en phénazine- méthosulfate (PMS). 21.- Test selon une quelconque des revendications 13 à , caractérisé en ce que le colorant est le nitrobleu de tétrazolium (NBT). 22.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que le substrat de l'activité lactico- déhydrogénase est un L-lactate de métal alcalin, de préfé- rence, de sodium ou de lithium. 23.- Test selon une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que le substrat de l'activité lactico- déhydrogénase est un substrat spécifique de l'isoenzyme LDH-C4 ou LDH-X, tel l'acide cétohexanoîque. 24.- Procédé selon une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que le substrat est celui d'une enzyme essentielle du spermatozoïde, tel que glucose-6-phosphate déhydrogénase ou 6-phosphotogluconate déhydrogénase.