Brevet FR2613379A2 — publié le 19881007

FR 2613379 A2 19881007 FR 8704699 A 19870403 La purification de la molécule naturelle du facteur VIII (1 à 6) et le clonage du gène correspondant ont apporté des informations sur la structure et sur la fonction du facteur VIII et ont permis de déterminer la position des sites de clivage responsables de l'activation de la molécule. Un premier clivage (par une protéase non identifiée) se produit entre les acides aminés 1648 et 1649 et entraîne la dégradation protéolytique de la partie centrale de la molécule (domaine B) ; ensuite la thrombine clive la partie NH2-terminale à l'acide aminé 740. I1 en résulte deux polypeptides d'environ 90 kd et 80 kd qui sont maintenus ensemble par un pont calcium. I1 a été démontré (1 à 6) que ces deux polypeptides (chaîne lourde : HC et chaîne légère : LC) sont nécessaires et suffisants pour donner l'activité procoagulante du facteur VIII (FVIII:C), en effet, les sites d'activation par la thrombine sont situés à l'acide aminé 372 sur la channe lourde et 1689 sur la chaîne légère. Cette observation suggère que le domaine B n'est pas nécessaire à la fonction procoagu- lante de la molécule. Des travaux récents ont décrit le clonage et l'ex- pression du cXDX total du facteur VIII dans des cellules de mammifères et l'obtention d'une molécule biologiquement active (7 à 10 et brevet principal : 86.08258). La présente'addi- tion concerne plus particulièrement le clonage des séquences codantes des deux polypeptides HO et LC séparément, en utilisant le virus de la vaccine comme vecteur, et l'expression simultanée des deux molécules par co-infection de cellules de mammifères avec les deux virus recombinants. Plus particulièrement, la présente invention concer- ne un vecteur selon l'une des revenoications 4 à s du brevet principal, caractérisé en ce que la séquence codant pour une partie du FVIII code pour au moins l'un des polypeptides, la chaîne lourde du FVIII, HC ou la chaîne légère du FVIII, LC. De préférence, la séquence codant pour HC ou LC est précédée de la séquence signal du facteur VIII. La présente addition concerne également les cellules de mammifères infectées par un vecteur tel que décrit précédemment, ainsi que les plasmides utiles pour la construction desdits vecteurs et comportant au moins une séquence codant pour HC ou LC. Ces cellules infectées après mise en culture comme décrit dans le brevet principal, qu'elles aient été transfectées par un vecteur codant pour HC ou LC ou bien co-transfec- tées par deux vecteurs codant, 1-un pour HO, l'autre pour LC, conduisent à la sécrétion de polypeptides présentant un intérêt thérapeutique. En particulier, il est possible de prévoir la production d'une molécule ayant l'activité au facteur VIII par des cellules de mammifères par réassociation in vivo des deux chaînes lourde et légère synthétisées par les deux vecteurs indépendants codant, l'un pour HC, l'autre pour LC. Outre l'utilisation du composé obtenu par réassociation des chaînes HO et LC, il est possible de prévoir d'autres utilisations des polypeptides. selon l'invention. En effet, on sait que S à 20 t des patients atteints d'hémophilie A sévère et qui nécessitent des transfusions multiples développent des anticorps contre le facteur VIII. Le traitement de tels "patients inhibiteurs" par injection de concentrés de facteur VIII présente d'importantes difficultés. Les Epitopes reconnus par ces anticorps sont limités à certaines parties de la molécule. On peut envisager l'uti lisation thérapeutique des portions de facteur VIII telles que décrites précédemment comme agents bloquants des anti corps ; ces portions pourraient être administrées avant l'in jection du facteur VIII intact, afin de faciliter le traite ment des patients inhibiteurs. Les exemples ci-après et la figure annexée permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Figure 1 A. Représentation schématique de la construction des 2 plasmi des contenant soit la chaîne lourde (Heavy chais), pTG1021, soit la chaîne légère (light chain), pTGlO25, de la séquen ce de cADS an facteur VIII. La première ligne représente la séquence complète du cADN FVIII. Les séquences 5' et 3' non traduites sont hachurées / le codon initiateur ATG et stop TGA et les sites de restriction utilisés pour les construc tions sont indiqués. Dans la construction pTG1021 la zone quadrillée représente la séquence décalée et le codon STOP qui sont créés par "frameshift" au niveau du site SphI (voir texte,. B. Représentation des produits de la première protéolyse (avant activation). Les chiffres indiquent les acides a...i- nés ou s' effectuent les clivages. Exemple 1 Construction des plasmides portant la séquence codante de la chaîne lourde ou de la chaîne légère du facteur VIII Le plasmide pTG1016 qui porte la séquence codante complète du facteur VIII, et qui est décrit dans le brevet principal, a été utilisé pour réaliser les constructions suivantes, qui sont représentées dans la figure en annexe. 1) pTG1021 : plasmide portant la séquence codante de la chaî ne lourde. Par digestion du plasmide pTG1016 avec l'enzyme SphI, on délète un fragment d'ADN compris entre les nucléotides 3935 et 6585 (numérotation des nucléotides et des acides aminés selon Wood et al. 7). Le plasmide religué porte donc la sé quence correspondant aux acides aminés 1 à 1293, c'est-a- dire à la chaîne lourde du facteur VIII, suivie des 144 der niers nucléotides qui restent de la séquence située en aval du deuxième site SphI et d'un codon STOP qui résulte d'un décalage de la lecture des codons ("frameshift") du à la position du site SphI. (Cette portion d'ADN est quadrillée sur la figure) Ce plasmide est appelé pTG1021. 2) pTG1025 : plasmide portant la séquence codante de la chai ne légère. Par digestion du plasmide pTG1016 avec l'enzyme BclI, on délète un fragment d'ADN compris entre les nucléotides 402 et 4419. Le plasmide religué porte donc la séquence correspondant au peptide signal, aux acides aminés 1 à llC de la chaîne lourde puis 1455 à 2232, c'est-à-dire à la chaîne légère, et le codon STOP naturel du gène du facteur VIII. Ce plasmide est appelé pTG1025. Exemple 2 Sélection de virus de la vaccine recombinants portant les séquences codantes des chaines lour de ou légère du facteur VIII des constructions pTG1021 ou pTG1025 Comme dans le plasmide pTG1016 de départ, dans les plasmides pTG1021 et pTG1025, les séquences codantes sont placées sous le contrôle du promoteur de la protéine 7.5 K du virus de la vaccine et l'ensemble de ce bloc fonctionnel d'ADN est inséré dans le gène TK de la vaccine. Ces plasmides permettent donc l'intégration du bloc fonctionnel d'ADN dans le gène TK d'un virus sauvage de la vaccine, par recombinaison homologue dans les cellules infec- tées et transfectées par le plasmide, selon une technique devenue classique (décrite notamment dans le brevet frayais 84.06499). Le virus sauvage utilisé est le virus de type Copenhagen ts26. La recombinaison est effectuée dans les cellules BHK21. Les virus recombinants sont sélectionnés par leur caractère T-. Un virus recombinant a été retenu pour chacune des constructions : - C"J,TG.FVIII HC.1 qui dérive du plasmide pTGlG21 - VV.TG.FVIII LC.1 qui dérive du plaside pTGlD25 Le virus Wt.TG.FVIII 10.2.1 qui porte la séquence complète du facteur VIII et dérive du pTGlG16 a été décrit dans le brevet principal. Exemple 3 Synthase du facteur VIII par les cellules infec tées par les virus recombinants et activité antithrombinique des molécules synthétisées Dans les deux constructions décrites dans l'exemple 2, les séquences codantes des chaînes HC et LC sont précédées par la séquence signal naturelle du facteur VIII qui permet l'excrétion de la molécule dans le milieu de culture. De plus, les deux séquences comprennent un site de clivage par la thrombine qui permet l'activation protéolytique de la molécule. On peut donc mesurer la présence de la molécule (c'est-à-dire l'antigène facteur VIII) et son activité dans le milieu de culture surnageant des cellules. Des cultures de cellules BHK21 (de 2.lot cellules) sont infectées avec le virus de la vaccine sauvage, corme témoin, ou avec les virus recombinants, à une multiplicité d'infection de 1 ufp/cellule. Avec les recombinants, 4 inoculations indépendantes sont effectuées - W .TG.FVIII 10.2.1 - VV.TG.FVIII Hic.1 - VV.TG.FVIII LO.l - .TG.FVIII HC.1 + VV.TG.FVIII LC.1, en co-infection. Après 1 heure d'adsorption, les cultures sont lavées et le milieu de culture est renouvelé. Ce milieu contient 4 % d'ASB mais pas de sérum de veau, 1 mM CaC12 et 0,5 unités/ml de facteur von Willebrand (vWf). Après 24 ou 48 heures, les surnageants sont récoltés et immédiatement congelés à l'azote liquide pour être testés ultérieurement. 1) La présence de molécules de facteur VIII ou de fragments de celui-ci est mesurée par un dosage radioimmunométrique. L'antigène (FVIII:Ag) est dosé "en sandwich" entre de l'immunoglobuline G de sérum de patient hémophile inhibi teur, adsorbée sur la paroi du tube à essai, et un anti corps monoclonal anti-facteur VIII, spécifique d'un épito pe de la chaîne L, radioactif (selon une méthode décrite par Lee et al. 11). Les résultats sont présentés dans le tableau (seule la chaîne L est détectahle avec l'anticorps monoclonal utili sé) - les cellules infectées avec le recombinant VV.TG.FVIII LC.1 produisent une quantité d'antigè ne semblable à celle produite par le recombinant VV.TG.FVIII 10.2.1 - les cellules co-infectées par les 2 recom..binants LO et HC produisent environ 2 fois moins d'antigè ne LC, ce qui s'explique par la copetition entre les 2 virus recombinants au niveau de la rchine- rie cellulaire nécessaire à l'expression des 2 protéines. 2) La mesure de l'activité du facteur VIII (FVIII:C) est réalisée classiquement par le temps partiel de thrombo plastine activée (12). Les résultats sont présentés dans le tableau suivant Tableau : Détermination de la quantité d'antigène FVIII (FVIII:Ag) et de l'activité procoagulante (FVIII:C) dans le surnageant de cultures de cel lules BER21 infectées avec les virus \vJ recombi nants. 24 heures 48 heures FVIII:C* FVIII:Ag** FVlII:Ct FVIII::Ag** W .TG.FVIII 10.2.1 0.140 0.142 0.235 0.470 VV.TG.FVIII HC.1 + 0.010 0.195 - 0.095 W .TG.FVIII LC.1 W .TG.FVIII HC.1 - ND - ND W .TG.FVIII LC.1 - 0.407 - 0.247 VV sauvage FVIII:C* (en unités par ml) : déterminé par le temps partiel de thrombine activée. FVIII:Ag** (en unités par ml) : déterminé par dosage radioimmunométrique. ND : non déterminé. - : sous le seuil de détection. - dans le surnageant des cellules co-infectées avec les 2 virus recombinants LO et HO on mesure une activité procoagulante significative mais plus fai- ble que celle mesurée avec le recombinant FVIII complet. On note que cette activité décroît après 4â heures, ce qui indique probablement une instabilité plus grande de la molécule réassociée. Cette activité est bien spécifique parce qu'elle peut être neutralisée par l'addition d'anticorps monoclonal antifacteur VIII ou par l'addition de sérum de patient hémophile inhibiteur. - on ne détecte aucune activité FVIII:C dans les sur nageants des cellules infectées par le virus sauvage (contrôle négatif) ni par les recombinants exprimant seulement la chaîne H ou la chaîne L. Le mélange in vitro de ces surnageants contenant les chaînes H et L ne permet pas dc restaurer l'activité procoagulante, soit parce que les quantités produites sont ins'uffisantes pour permettre la réassociation des 2 chaines, soit parce que cette réassociation est instable ou ne peut se réaliser que dans des conditions d'environnement particulières. 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Vecteur selon l'une des revendications 4 à 9 du brevet principal, caractérisé en ce que la séquence codant pour une partie du facteur VIII code pour au moins l'un des polypeptides, la chaîne lourde du facteur VIII, HC ou la chaîne légère du facteur VIII, LO. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence en cause code pour la chaîne lourde du facteur VIII. 3. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence en cause code pour la chaîne légère du facteur VIII. 4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les séquences codant pour HO ou LC sont précédées de la séquence signal naturelle du facteur VIII. 5. Cellule de mammifère infectée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Cellule. selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est co-infectée par un vecteur comportant une séquence d'ADN codant pour HC et par un vecteur comportant une séquence d'ADN codant pour LO. 7. Procédé de préparation de parties du facteur VIII, caractérisé en ce qu'on met en culture, dans un milieu approprié, des cellules de mammifère infectées par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, assurant l'expression du facteur VIII, ledit milieu contenant le facteur von ;;illebrand, 8. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide comportant une séquence codant pour HC ou LC. 9. Polypeptide ayant la structure de HC ou de LC ou correspondant à la réassociation de HC + LC. 10. Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif au moins un polypeptide ou un composé de réassociation selon la revendication 9.