Brevet FR2614899A1 — publié le 19881110

Le terme de C.I.V.E.T.E. correspond aux abréviations de Culture Intra Vaginale Et Transfert Embryonnaire. Depuis la mise au point de cette technique en novembre 1985 (Brevet FR 85/16 558, PBT-FR 8 & 00378) et de ses dérivées, qui correspondent à une très importante simplification de la technique de fétondation in vitro classique, nous n'avons cessé de rechercher une préparation plus facile des spermatozoldes La préparation classique est le plus souvent réalisée par swimming up". Cette technique, comme la majorité de celles utilises actuellement, correspond à débarrasser les spermatozoldes du liquide séminal dans lequel ils se situent et qui interdit toute capacitation.Ainsi le sperme recueilli après éjaculation est dilué dans une solution de Earle, ou autre solution saline à une concentration variant de 20 à 30/. Après dilution et homogénéisation, les tubes contenant le sperme dilué sont centrifugés a 2400-2500 tours / minute pendant 10 à 15 minutes, soit 600 a 700 g. Après ce délai, le surnageant est extrait et les culots de spermatozoides sont regroupés et resolubilisés dans 5 cc de Earle environ, une 2ème centifugation est alors pratiquée, dans les mêmes conditions; le surnageant est à nouveau enlevé et l'on verse au dessus du culot ainsi obtenu 1 cm3 environ- de B2 de Menezo, milieu utilise pour la fécondation. Le tube est laisse a température ambiante ou place dans l'étuve a 37$ afin que la migration des spermatozoldes les plus mobiles steffectue dans le surnageant de 82. Une température w 37' accélère le phénomène de capacitation et la migration des spermatozoïdes. Dans la majorité des spermes préparés, une concentration satisfaisante de 5 à 50 M. de spermatozoïdes présentant une mobilité progressive supérieure a 0% est observée. Cependant cette technique demeure longue et nécessite une centrifugeuse. Lors des présentations de la C.I.V., un repproche nous a souvent été fait de, certes simplifier la technique de fecondation, mais de toujours avoir à faire cette préparation du sperme. Dans le désir de simplifier au maximum toute l'étape biologique de la F.l.V. lourd, nous avons mis au point une nouvelle technique de préparation des spermatozoïdes å l'aide de filtres. Ce mode de preparation peut aussi être utilisé dans tous les cestes théra#eutiques nécessitant des spermatozoïdes lavés et capacités, de façon stérile, telle l'insémination intra-utérine, intra-tubaire, intra-vaginale, intra-péritonéale ou autre. La sélection naturelle des meilleurs spermatozoides s'effectue, chez la femme, par l'intermédiaire de la glaire dont les études en microscopie électronique ont révélé qu'elle était constituée de grosses mailles comme celles d'un filet de pèche. Les mailles s'élargissant en période ovulatoire afin de laisser passer les spermatozoïdes. En nous basant sur ces observations, nous nous sommes dit qu il serait peut-être possible de reproduire ce système de filet en remplaçant les mailles par les pores de filtres permettant ainsi de sélectionner les spermatozoïdes.Un système de billes de verre, ou d'une colonne de fibres de verre a déjà été utilisé mais il s'avère être peu efficace, complexe et codteux. Il peut même nuire, dans le cas des fibres de verre, à l'lntégrité de la structure des spermatozoïdes. Notre méthode, elle, repose sur un système de filtration comprenant plusieurs filtres dont la dimension des pores est variable, permettant ainsi de retenir les différents éléments étrangers au spermatozoïdes. Nous allons vous décrire le dispositif que nous envisageons Cette filtration s'effectue de fanon passive dès la liquéfaction du sperme. L'éjaculait va se déverser (a travers le fond percé de trous, 2) directement dans une ampoule, cartouche ou flacon (3i à moitié remplie de solution de Earle, ou tout autre milieu de culture dans lequel il se diluera, plusieurs milieux de culture ont été testés sans variations notables du pourcentage de soermatozoïdes capacités (Earle, Thyrode, Ham's F.10, E2 ect...). Cette ampoule ou flacon (3) peut être présentée fermez et conditionnée de façon stérile, afin de conserver intact les qualités du milieu, d'un volume de plus de 20 ml, avec 10 ml de milieu de culture, les 10 ml restant seront en partie comblés des I'eJaculation par le volume du sperme. Après ouverture de l'ampoule, et avant le prélèvement, un système de pas de vis ou d'embout conique (4) permet de l'adaptation du fond du réceptacle a l'ampoule. Cette ampoule devra présenter une base assez large afin de pouvoir servir de support au receptacle. Dans le cas d'un sperme très visqueux, filant, un rinçage par un supplement de Earle pourra être nécessaire.. Le diluat de sperme va être secondairement filtre par un système qui comporte une ou plusieurs unités de filtration fixées impérativement ou en fonction des besoins. La première unité (5) peut être constituée de plusieurs filtres, plaques filtrantes ou membranes (6) dont le diamètre des pores, variables d'un filtre à l'autre pourra aller de fanon décroissante de 200 a 30 um, afin d'arrêter la plus grande fraction des cellules et débris protéiques. Une large surface de filtration est nécessaire ainsi, si plusieurs pores sont obstrués par des débris cellulaires, ceci n'interdit pas la filtration du reste du liquide.L a structure de ces filtres (6) doit être suffisamment résistante pour qu'un lavage puisse s'effectuer en sens inverse par l'injection d'un liquide sous pression à l'autre extrémité du filtre, afin de le déboucher. Des cellules de plus en plus petites sont retenues au cours de- leurs passages à travers les plaques de filtration. Le nombre des filtres et le diamètre des pores restent à déterminer. Ce tYpe de filtre n'a pu être testé puisqu'il n'en existe aucun qui présente des pores de diamètre supérieur à 7 um, en emballage individuel stérile. Ces filtres a larges pores, lorsqu'ils existent présentent des chelateurs pour retenir certaines poussières ou substances, ou correspondent à des cartouches dont les volumes de filtration sont très nettement supérieurs à ceux que nous envisageons. Cette filtration s'effectue de façon pass-ive. L'ampoule (3) est détachée du réceptacle puis fixée par l'intermédiaire du pas de vis ou de l'embout conique (4) à l'unité de filtration. L'autre extrémité de l'unité présentant un conteneur (7) vide là aussi vissé ou fixe a l'unité dans lequel viendra se déverser le produit de la-filtration. Il suffit de ret-ourner l'unité de filtration, l'ampoule (3) est en haut. lé conteneur (7) en bas pour que la filtration s'effectue, la base du conteneur (7) devant etre assez large ou pouvant se glisser dans un support afin d'assurer une stabilité à l'ensemble. Le conteneur (7) ainsi rempli est détache de la première unité (5) et vissé ou fixé sur la deuxième unité de filtration (8) dont les pores sont plus petits. Le diamètre pouvant aller de 20 um å moins de 1 um. Un autre conteneur (9) fixé à l'autre extrémité viendra recueillir là encore le produit de filtration qui, cette fois-ci, ne contiendra pas les spermatozoldes. Ceux-ci auront été retenus au niveau du dernier filtre dont les pores inférieurs à la dimension d'un spermatozoïde en interdisent le passage. Cette unité de filtration (8) devra posséder des éléments de filtration assez résistants, le passage du liquide se faisant dans les deux sens. Un rinçage des spermatozoïdes s'effectue en remplaçant le conteneur (9) possédant le résidu de filtration par une deuxième ampoule ou flacon (10) remplie de Earle. En retournant l'unité de filtration, le contenu de l'ampoule (10) se déversera, entrainant les s#ermatozoïdes dans le conteneur (7). Après agitation, afin d'homogénéiser et laver les spermatozoïdes l'unité filtrante est à nouveau retournée. Le conteneur (7) se vide alors et le milieu de culture correspondant u ce rinçage se retrouve dans la cartouche Ceci impose que cette 2ème unité de filtration soit constituée de 2 parties qui peuvent se séparer au dessus de la dernière membrane de filtration afin d'accéder à la chambre (12). Cette 2ème unité, comme la iere, présentera un nombre variable de membranes filtrantes (6) et des diamètres décroissants des pores d'une membrane à l'autre, qui- restent à fixer en fonction de nos observations. Toutes les combinaisons peuvent être possible; on peut d'ailleurs envisager que la 1ère unité (5) comporte des filtres dont le dernier presente des pores de 15 u, laissant passer les spermatozoïdes tout en filtrant la majorité des particules et que la deuxième unité soit uniquement constituée d'un filtre retenant les spermatozoïdes et permettant leur lavage et leur migration dans une chambre (12).Les pores des différents filtres devraient présenter des bords les plus lisses et les plus réguliers possible afin de ne pas nuire à la structure du spermatozoïde (perforation des trous à l'aide d'un rayon laser par exemple). La ou les matières qui composent le réceptacle, les amroules, les conteneurs et les-unités de filtration doivent être non toxiques et de préférence transparents, afin de pouvoir suivre les différentes étapes. L'intérêt de ce système de filtre est de laver les spermatozoïdes, d'obtenir leur capacitation avec un minimum de manipulations et dans des conditions d'aseptie stricte. La filtration s'effectuant de façon passive, sans transfert du sperme, à l'aide de pipette, d'un tube à l'autre! ce qui diminue de façon considérable les risques éventuels de contamination septique. Une filtration active peut être réalisée en remplaçant les différentes cartouches de Earle et les conteneurs par des corps de seringues dont le piston permettra de pousser le diluat de sperme à travers le filtre. Nous avons expérimenté cette technique de préparation sur 30 spermes de patients avec uniquement des filtres dont les pores étaient respectivement de 7 u et 0,22 u. Nous n'avons pas observé, par rapport à la technique classique (lavages! centrifugations et migration), de différences de mobilité des spermatozoïdes ainsi capacités. Cependant les spermes qui sont rentrés dans cette étude ne présentaient que peu ou pas de cellules ni d'éléments tapioca, en raison même de l'absence de filtre stérile à gros pores. Un autre mode de filtration que nous avons cité dans le brevet sur 1a fécondation en paillette, concerne des petites unités de filtration soit isolées, soit intégrées à l'extrémité de la paillette, et qui permettraient, à partir de sperme frais, de sélection#er, comme la glaire le réalise, les spermatozoïdes les plus mobiles a partir d'une petite fraction d'éjaculat frais place dans un petit conteneur. Cette petite unité de filtration pourrait être constituée de micro-filtres, DU d'une substance filtrante très visqueuse, ou même de l'association des deux. Les micro-filtres peuvent être constitués par l'enroulement d'une feuille constituée de fibres synthétiques ou non, tissées.Ce tissage laisse des espaces entre les fibres correspondant aux mailles du filet de la glaire. Ces micro-filtres peuvent être baignés d'une substance visqueuse (collagène par exemple) renforçant le pouvoir filtrant. A l'une des extrémités on peut adjoindre un petit conteneur pour une petite fraction de sperme frais, l'autre extrémité est en contact avec du milieu de culture ou avec la chambre de culture des ovocytes dans le cas de la fécondation en paillettes par exemple. Ce mode de préparation du sperme par filtration peut aussi- être envisagé chez l'animal. Les réceptacles, la taille des ampoules et des conteneurs variant en fonction de l'espèce. Ces différents éléments devront être présentés en emballage stérile. Un kit pour fécondation in vitro peut ainsi être envisagé pour l'étape biologique regroupant les conteneurs de fécondation et le système de préparation du sperme que nous venons de décrire. REVENDICATIONS I! Dispositif permettant la préparation et la sélection des spermatozoïdes humains et animaux ainsi que leur capacitation par filtration en vue d'une fécondation in vitro, ou plus généralement d'une insémination, se composant d'un réceptacle (1) pour prélever le sperme, d'ampoules ou flacons (3) (10), de milieux de cultures pour la dilution et le lavage des spermatozoïdes et d'un système de filtres 2) Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réceptacle (I) pour le prélèvement du sperme, de forme classioue, présente un fond percé de trous (2), jouant le r#le de préfiltre, afin d'arrêter les éventuelles concrétions protéiques et un système de pas de vis ou d'embout conique (4) par exemple, qui permet l'adaptation d'une ampoule ou cartouche (3) conditionnée stérilement, contenant le milieu de culture afin de diluer le sperme des sa liquéfaction. 3) Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le système de filtration comporte plusieurs filtres associés en une ou plusieurs unités de filtration (5) (8), la première (5) constituée de membranes filtrantes ou de filtres (6) à larges surfaces, avec des pores dont le diamètre est décroissant d'un filtre ou d'une membrane à l'autre et qui permet de retenir les éléments les plus volumineux; la deuxième unité 4) Dispositif selon les revendications I et 8 caractérîsqé en ce que le dernier filtre du système présente des pores de très faible diamètre, inférieur à celui des spermatozoïdes afin de les arrêter et est surmonté d'une chambre 5) Dispositif selon les revendications 1 et 3 caractérisé par des conteneurs (7) (9i qui peuvent se fixer aux extrémités des unités filtrantes et recevoir les diluats, et par une ou plusieurs ampoules ou flacons de milieu de culture (10) supplémentaires à celle du départ (3) qui permet de parfaire le lavage des spermatozoïdes. 6) Dispositif selon les revendications l et 3 caractérisé en ce que les filtres utilisés présentent des pores dont les bords doivent être les plus lisses et réguliers possibles, afin d'éviter toute atteinte de la structure du spermatozoïde lors de .son passage et être constitué, surtout pour le dernier filtre, d'une membrane filtrante suffisamment résistante pour permettre une filtration dans les deux sens. 7) Dispositif selon l'ensemble des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est présenté en emballage stérile. 8) Utilisation du dispositif selon les revendications prises dans leur ensemble pour la préparation, la sélection et la capacitation stériles des spermatozoldes humains ou animaux par filtration, en vue d'une fécondation in vitro ou de l'insémination de ceux-ci dans une -cavît#naturelle.