Brevet FR2620459A1 — publié le 19890317

VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE La présente invention concerne un virus recombinant de la vaccine, et plus particulièrement, un virus recombinant de la vaccine dans lequel un ADNc codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise est inséré dans une région de l'ADN du génome du virus de la vaccine, non-essentielle à la croissance de celui-ci. Comme vaccin contre l'encéphalite japonaise, on a utilisé jusqu'à présent un vaccin contenant un virus inactivé de l'encéphalite japonaise, en tant qu'ingrédient efficace. Une souche de virus de l'encéphalite japonaise, provenant du Nakayama Health Institute, est inoculée dans le cerveau de souris normales, et on recueille de façon aseptique les cerveaux des souris ayant souffert de l'encéphalite japonaise, on les purifie selon un procédé à l'alcool-protamine, et on 1es inactive pour obtenir une solution non-dlluée dans un vaccin à base de virus de l'encéphalite japonaise ("Japanese Vaccine" édité par ie National Institute of Health, seconde édition révisée (publiée par Maruzen Publishing Co., Ltd., le 20 janvier 1977)). Ce vaccin inactivé, bien qu'il soit très sQr, souffre des inconvénients suivants: il exige un laps de temps relativement long pour l'immunisation, et la période d'immunité est de courte durée. On a également essayé d'obtenir une protéine antigénique de surface (désignée ci-après comme étant la protéine E) du virus de l'encéphalite japonaise, par manipulation génétique, en utilisant une levure comme hôte (Préliminary Agenda for the 34th Meeting of the Japanese Virological Society, page 91, Octobre 1986), mais il n'existe pas d'exemple réussi de production de la protéine E. Même si on avait réussi à la produire, la protéine E ne pourrait pas constituer un vaccin vivant, dont on attend qu'il confère une immunité de longue durée. Ces dernières années, on a inventé un procédé de construction d'un virus recombinant de la vaccine, comportant un ADN hérérologue inséré dedans, et on a proposé une méthode utilisant, en tant que vaccin vivant, un virus recombinant de la vaccine, que l'on construit en insérant par exemple, comme ADN hétérologue, un ADN codant pour un antigène pathogène provoquant une maladie infectieuse (voir par exemple la demande de brevet japonais N' 129971/83 ouverte à l'inspection publique, la demande de brevet japonais N' 500518/85 divulguée, la demande de brevet japonais N' 501957/86 divulguée, etc.). Cependant, le virus de l'encéphalite japonaise, qui appartient à la famille Togavirus et au genre Flavivirus, possède, en tant que génome (élément portant l'information génétique du virus), un ARN simple brin, et il est caractérisé en ce qu'un polypeptide unique, obtenu par traduction monocistronique à partir du génome dans des cellules infectées par le virus, est dégradé (terme que l'on utilise pour signifier qu'un polypeptide unique est coupé par des protéase, dans les cellules, pour former chaque protéine) en une protéine nucléaire, une protéine matrice,la protéine E et 5 protéines non- constitutives. Il est donc difficile d'insérer par manipulation l'ADNc codant pour la protéine E dans un virus de la vaccine et de le faire s'exprimer. I1 n'y a donc jusqu'a présent aucun rapport au sujet de cette expression. Etant donné ces connaissances, la Demanderesse a fait des recherches poussées dans le but de construire des virus recombinants de la vaccine, capables d'exprimer la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise. Le résultat de ses recherches est que l'on a trouvé qu'en sélectionnant une région codant pour la protéine E dans les ADNc construits à l'aide de l'ARN du génome du virus de l'encéphalite japonaise, utilisé comme matrice, en introduisant un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction après et avant cette région, en liant celle-ci à un promoteur du virus de la vaccine et en insérant celui-ci dans une région de l'ADN génomique, non-essentielle à la croissance, du virus de la vaccine, on peut obtenir un virus recombinant de la vaccine, capable d'exprimer la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise dans des cellules infectées, et on a pu ainsi réaliser la présente invention. La présente invention a donc pour objet un virus recombinant de la vaccine, dans lequel on a inséré, dans une région du génome, nonessentielle à la croissance, du virus de la vaccine, tout ou partie d'un ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, de préférence conjointement avec un fragment d'ADN ayant une fonction de promoteur contrôlant l'ADNc et un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction synthétisés ou ajoutés artificiellement, le tout se trouvant sous une forme apte à l'expression. La figure 1 indique des modes opératoires de clonage de l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise. La figure 2 indique les relations de position des sites d'action des enzymes de restriction de l'ADNc.La fig.(3A- 3F)représente la séquence de bases de l'ADNc contenant une région codant pour la protéine E, ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante. La figure 4 représente des modes opératoires de construction du plasmide recombinant pAKJ4 contenant l'ADNc codant pour la protéine E. Le virus utilisé pour la construction du virus recombinant selon la présente invention peut être n'importe quel virus classé parmi les virus de la vaccine. Des exemples d'un tel virus englobent la souche WR (Journal of Virology, 49, 857 (1984)), la souche Lister, un mutant de la souche Lister, sensible à la température (voir le brevet US N' 4.567.147 et la demande de brevet japonais (ouverte à l'inspection publique) N' 44178/87), la souche "New York Board of Health", les souches de virus vaccinal antivarioleux ("Vaccinia Viruses as Vectors for Vaccine Antigens", pp. 87100, édité par J. Quinnan, Amsterdam, New York & Oxford, Elsevier Publishing Co.) comme la souche LC16m8, et analogue. Parmi ces virus, on préfère ceux qui provoquent, sur la membrane chorioallantoique d'un oeuf passé à l'état d'embryon, l'apparition de pustules présentant une taille de 3 mm ou moins, et qui présentent une température de blocage d'activité dans des cellules de rein de lapin inférieure ou égale à 41'C. Des exemples particuliers sont les souches atténuées de virus de la vaccine LA et LB (CNTM-I-423), décrites dans la demande de brevet japonais N' 44178/87, et la souche LC16m8, décrite ci-dessus. Ces souches ne sont que très faiblement toxiques, et elles sont donc avantageuses du point de vue de la sécurité, lorsque l'on utilise en tant que vaccin le virus recombinant de la présente invention à l'état vivant. En outre, on peut construire l'ADNc codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise, en utilisant, par exemple, la souche du Nakayama Health Institute décrite ci-dessus, la couche JaOAr (Arboviruses Research Institute Center, Eire University) ou la souche Sagayama (même centre). Dans le virus recombinant de l'invention, l'ADNc codant pour la protéine E, construit par exemple à partir de la souche Sagayama mentionnée cidessus, se compose au total de 1500 paires de bases, et code pour la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 3. Dans la présente invention, l'ADNc peut être un ADNc modifié (c'est-à-dire un ADNc dans lequel une séquence de bases a été remplacée, insérée ou supprimée), dans la mesure o il a pratiquement la même fonction que l'ADNc mentionné cidessus. L'ADNc peut également être modifié de telle sorte que la séquence d'acides aminés correspondante est différente; il peut donc coder pour un autre polypeptide, mais bien str sous réserve que celui-ci ait pratiquement la même fonction. Lorsque l'on met en pratique la présente invention, on construit un premier vecteur recombinant par une opération d'insertion dans une région de l'ADN, non- essentielle à la croissance, du virus de la vaccine. Dans ce cas, on préfère insérer dans la région décrite ci- dessus un promoteur fonctionnant dans le virus de la vaccine, et insérer en outre, en aval du promoteur, un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction, ainsi que, entre eux deux, un fragment d'ADN synthétique de liaison, portant un site convenable de restriction enzymatique. L'expression "région d'ADN non-essentielle à la croissance" utilisée dans cette description désigne une région quelconque d'ADN qui n'affecte pratiquement pas la capacité de croissance des virus, même si cette région subit des variations dues à l'insertion d'ADN hétérogène, par exemple le gène de la thymidine-kinase (TK) ou le gène de l'hémagglutinine (HA) du virus de la vaccine, un fragment F, M ou N. coupé par Hind III, de l'ADN de la souche WR du virus de la vaccine (Virus, 36, (1), 23-33 (1986)), etc. L'expression "promoteur qui fonctionne dans un virus de la vaccine" utilisée dans cette description désigne un promoteur comportant une séquence de bases quelconque, pour autant qu'il puisse effectivement fonctionner comme promoteur dans le système de transcription que possède un virus de la vaccine, que ce promoteur soit d'origine synthétique ou naturelle. Des exemples particuliers de ce promoteur englobent les promoteurs que l'on trouve dans un virus de la vaccine et qui sont décrits par exemple dans Journal of Virology, 662-669 (1984), et en particulier, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour le polypeptide 7,5 K, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour le polypeptide 19 K, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour le polypeptide 42 K, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour la thymidine- kinase, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour le polypeptide 28 K, un promoteur du gène du virus de la vaccine codant pour le polypeptide 11 K, etc. On peut construire un premier vecteur recombinant d'une façon classique, par exemple après avoir inséré dans un vecteur approprié un fragment d'ADN, non- essentielle à la croissance, du virus de la vaccine (demande de brevet japonais N' 129971/83 (ouverte à l'inspection publique), demande de brevet japonais N' 500518/85 (divulguée), demande de brevet japonais N' 44178/87 (divulguée), etc.).Par exemple, après avoir inséré dans un vecteur approprié un fragment d'ADN, non- essentielle à la croissance, du virus de la vaccine, on peut insérer un promoteur auquel a été ajoutée une séquence de restriction enzymatique, si nécessaire et si on le désire,en utilisant un site de restriction enzymatique présent dans le fragment. Ensuite, la protéine du virus de l'encéphalite japonaise est, après synthèse par voie monocistronique, dégradée pour être divisée en protéine antigénique de surface, etc., comme décrit ci-dessus. En conséquence, quand l'ADNc entié est inséré dans le génome du virus, il n'est pas nécessaire d'insérer artificiellement un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction; cependant, lorsque l'on désire n'insérer que l'ADNc codant pour la protéine E, il est nécessaire d'insérer également un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction, avec, entre eux-deux, un fragment d'ADN synthétique de liaison présentant une séquence de restriction enzymatique, en utilisant un site de restriction enzymatique présent en aval du promoteur précédemment inséré. Il est souhaitable que le codon de fin de traduction à insérer soit placé en trois endroits, avec une différence dans les phases de lecture, de façon que la coïncidence puisse avoir lieu même si l'ADNc codant pour la protéine E prend l'une quelconque des phases de lecture. L'ADNc à insérer peut également contenir des régions codant pour d'autres protéines supplémentaires, pourvu qu'il contienne une région codant pour la protéine E. En ce qui concerne les virus appartenant au genre Flavivirus, des régions codant pour une protéine de matrice (désignée ci-après par protéine M), une protéine de prématrice (désignée ci-après par protéine. PreM) et une protéine nucléaire (désignée ci-après par protéine N) sont présentes en amont de la région codant pour la protéine.E. Dans la présente invention, on peut également utiliser un virus dans lequel tout ou partie des ADNc codant pour ces protéines peuvent être liés à l'ADNc codant pour la protéine E, en amont de celui-ci. Des exemples particuliers du vecteur utilisé englobent des plasmides comme pBR 322, pBR 325, pBR 327, pBR 328, pUC 7, pUC 8, pUC 9, pUC 19 et similaires; des phages comme le phage lambda, le phage M 13 et similaires; des cosmides comme pHC 79 (Gene, 11, 291, 1980). Dans la présente invention, la région codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est ensuite insérée en aval du promoteur d'un premier vecteur recombinant, formant ainsi un second vecteur recombinant. Le processus d'insertion peut également être réalisé de façon classique (voir par exemple les publications des brevets indiquées ci-dessus); par exemple, on peut insérer, au niveau et en aval du promoteur du premier vecteur, un fragment d'ADNc dérivé du virus de l'encéphalite japonaise, en utilisant un site de restriction enzymatique préalablement disposé entre le codon de début de traduction et le codon de fin de traduction ajoutés artificiellement ou synthétisés. Pour la construction de ces premier et second vecteurs recombinants, on peut utiliser le système Escherichia coli qui est facile à utiliser pour des manipulations génétiques. Les vecteurs plasmides que l'on peut utiliser ne tombe pas sous le coup de limitations particulières, pourvu qu'ils soient adaptés à l'usage envisagé. Selon la présente invention, le second vecteur recombinant est ensuite introduit (ce qui constitue une transfection) dans des cellules animales cultivées, préalablement infectées avec un virus de la vaccine, pour provoquer une recombinaison homologue entre l'ADN vecteur et l'ADN génomique du virus, et on construit ainsi un virus recombinant de la vaccine. Les cellules animales cultivées utilisées ici peuvent être des cellules quelconques, pourvu que le virus de la vaccine puisse s'y développer. Des exemples particuliers englobent TK-143 (provenant d'un ostéosarcome humain), FL (provenant de l'amnios humain), Hela (provenant d'un carcinome du col de l'utérus humain), KB (provenant d'un carcinome du rhinopharynx humain), CV-1 (provenant d'un rein de singe), BSC-1 (provenant d'un rein de singe), RK13 (provenant d'un rein de lapin), L929 (provenant d'un tissu conjonctif de souris), CE (embryon de poulet), CEF (fibroblaste d'embryon de poulet), etc. La construction du virus recombinant de la vaccine peut être effectuée de façon classique. Selon par exemple DNA Cloning, volume II, A Pratical Approach, pp. 191-211, édité par D.M. Glover (IRL Press, Oxford, Washington), le second vecteur recombinant, traité par la méthode de co- précipitation au phosphate de calcium, est introduit (transfection) dans des cellules RK13 infectées avec un virus de la vaccine; des cellules TK négatives, cultivées sur milieu MEM nutritif d'Eagle, sont infectées avec une masse de virus contenant le virus recombinant obtenu; des plaques que l'on a fait croître en présence de BUdR (5-bromouracile-désoxyribose) sont sélectionnées comme souches candidates pour un virus recombinant. Le procédé de sélection, à partir de ces souches candidates, d'un virus dans lequel est inséré un fragment d'ADN codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est le suivant: les plaques sont purifiées par hybridation, l'ADN étant utilisé comme sonde; en variante, on peut aussi faire appel à une méthode de test immunologique, utilisant un anti-sérum ou un anticorps monoclonal. Selon la présente invention, on obtient ainsi un virus recombinant de la vaccine, utilisable dans un vaccin à base de virus vivant, dans lequel l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est inséré dans une région de l'ADN génomique, non- essentielle à la croissance, du virus de la vaccine, conjointement avec un ADN présentant une fonction de promoteur, sous une forme apte à l'expression. La présente invention sera décrite de façon plus détaillée à l'aide des exemples ci-dessous. Exemple 1 (1) Extraction de l'ARN génomique du virus de l'encéphalite japonaise: Des cellules C6/36 dérivées de moustiques (J. Gen. Virol., 40, 531-544 (1978)) sont infectées avec une souche Sagayama de virus de l'encéphalite japonaise. Après la croissance du virus, on mélange le liquide surnageant de la culture avec du polyéthylène-glycol. On centrifuge le mélange pour purifier le virus de l'encéphalite japonaise. Après extraction au phénol effectuée sur le virus purifié, on ajoute de l'éthanol à l'extrait pour provoquer une précipitation, et on isole ainsi l'ARN génomique du virus (environ 11 Kb). (2) Clonage de l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise (voir figure 1) En utilisant de la poly(A)-polymérase (Takara Shuzo Co., Ltd.), on ajoute du poly(A) à l'ARN génomique du virus, préparé en (1). En utilisant le résultat de cette opération comme matrice, et un oligo-dT comme amorce, on fait réagir les quatres types (A, G, C, T) de déoxyribonucléosidetriphosphates et de la transcriptase inverse, afin de synthétiser un premier brin d'ADNc. Ensuite, on construit un ADNc double brin en utilisant de la RNase H d'E. coli et les 4 types (A, G, C, T) de déoxyribonucléoside-triphosphates, ainsi que de l'ADN- polymérase d'E. coli (Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Lab., (1982>), p. 211-246), puis on ajoute une chaîne dC en utilisant une transférase terminale. D'autre part, après avoir fait digérer le plasmide pUC 9 (produit par Pharmacia) par l'enzyme de restriction Pst I, on ajoute une chaîne dG au produit de digestion, à l'aide d'une transférase terminale. On mélange le produit à chaîne dG ajoutée avec l'ADNc décrit ci-dessus, et on opère sur le mélange une cyclisation par ligature.. On introduit le plasmide recombinant obtenu dans une cellule compétente HB 101 d'E. coli, pour obtenir un transformant. On prélève des plasmides de ce transformant, et on compare les longueurs d'ADNc inséré, sur un gel d'agarose. Pour l'ADNc inséré le plus long, on analyse la séquence située du côté 5' (Gene, 19, 269 (1982)). En se basant sur les résultats de l'analyse de cette séquence, on construit à nouveau un ADNc par le procédé décrit ci- dessus, en utilisant l'oligonucléotide synthétique 20- mère (5'-dATTCCGTACCATGCAGTCCA-3') comme amorce, et l'ARN génomique du virus comme matrice. On opère la ligature de l'ADNc avec le plasmide pUC 9 pour obtenir un certain nombre de transformants. Parmi les transformants obtenus, on sélectionne, par le procédé décrit ci-dessous, un transformant contenant un plasmide recombinant qui comporte l'ADNc codant pour la protéine antigénique de surface dont il a été question plus haut. En ce qui concerne le procédé de construction d'un clone d'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise, on trouvera dans Gene, 48, 195-201 (1986) un exemple de construction, réalisée de façon semblable, d'un clone d'ADNc à l'aide de la souche JaOArS 982 du virus de l'encéphalite japonaise. (3) Criblage du plasmide recombinant pJE 4118 comportant l'ADNc (4118) codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise (voir figures 1 et 2). On opère la réplication des transformants obtenus dans l'étape (2) sur un filtre de nitrocellulose. Après avoir doucement lavé le filtre de réplication avec une solution à 0,2 % de NP-40 (un tensio-actif fabriqué par Nakarai Kagaku), on soumet ce filtre à un criblage immunologique, à l'aide d'un anti-sérum JE. On obtient un transformant capable de réagir positivement, bien que la réactivité soit faible. Le plasmide que possède la souche est appelé pJE 4118. Puis on prépare le plasmide pJE 4118 de la façon classique (Molecular Cloning, 75-95, (supra)), et on excise l'ADNc inséré dans le plasmide pUC 9, à l'aide de l'enzyme de restriction Pst I. En utilisant cet ADNc comme sonde d'ADN, on soumet les divers transformants obtenus dans l'étape (2) à un criblage par le procédé d'hybridation de colonie (Molecular Cloning, 382-387 (supra)). On sélectionne un plasmide comportant un ADNc en chevauchement avec l'ADNc (4118) inséré de pJE 4118. L'ADNc (2-20) ainsi sélectionné est récupéré à partir du plasmide, et on détermine sa position à l'aide d'enzymes de restriction (voir la figure 2). Ainsi, il apparaît clairement que l'ADNc (2-20) recouvre partiellement la fraction d'ADNc (4118) du virus de l'encéphalite japonaise qui correspond à l'extrémité N- terminale de la protéine E. (4) Analyse d'une séquence de bases de l'ADNc codant pour la protéine antigénique de surface (voir figure 3). Les plasmides recombinants pJE 4118 et pJE 2-20 sont digérés par l'enzyme de restriction Pst I et donnent des fragments d'ADN d'environ 2,5 Kb et d'environ 1,0 Kb, respectivement. Les séquences de ces fragments ont été analysées selon le procédé de Messing et al., à l'aide du phage M 13 (Gene, 19, 269 (1982), Science, 241, 1205 (1981), à partir de l'extrémité 5' dans le cas de l'ADNc (4118) et à partir de l'extrémité 3' dans le cas de l'ADNc (2-20). En guise de résultat, on a remarqué que la séquence d'ADNc, dans les parties o les deux se recouvrent, comporte 334 bases, depuis la troisième base du codon du cinquième amlno-acide jusqu'au codon du 1166ne amino- acide, comme le montre la figure 3. La comparaison entre la séquence d'acides aminés attendue pour cette séquence de bases et la séquence d'acides aminés de la protéine E du virus de la fièvre jaune (qui est apparenté au virus de l'encéphalite japonaise et qui appartient au même genre que celui-ci), que l'on connaît déjà (Science, 229, 726-733 (1985)), montre que la protéine E du'virus de l'encéphalite japonaise comporte les acides aminés indiqués sur la figure 3, depuis le repère +1 jusqu'au repère +500. De la même manière, on a trouvé que la protéine M du virus de l'encéphalite japonaise comporte les acides aminés indiqués sur la figure 3, depuis le repère -75 jusqu'au repère -1, et que la protéine PreM comporte les acides aminés indiqués sur la figure 3, depuis le repère 167 jusqu'au repère-76. En outre, on a trouvé que la queue 5' de l'ADNc correspondant à la protéine PreM code pour une partie de la protéine C du virus de l'encéphalite japonaise. (5) Construction d'un ADNc codant pour une protéine constitutive du virus de l'encéphalite japonaise (voir figures 2 et 3). On supprime de l'ADNc (4118) la partie correspondant aux 5 acides aminés se trouvant à l'extrémité N-terminale de la protéine E. Puis on réalise un épissage, au niveau du site de Aat II, en utilisant l'ADNc (2-20), pour obtenir l'ADNc (203), qui contient toute la partie correspondant à la protéine E. (a) On obtient un fragment d'environ 1,6 Kb, le fragment (J7) de l'ADNc (203), en préparant le fragment Hpa II-Hpa I (enViron 810 b) et le fragment Hpa I-Bgl II (environ 800 b) à partir de l'ADNc, et en les liant. Ce fragment contient une petite partie d'une région codant pour la protéine M, en amont d'une région codant pour la protéine E. Dans la figure 2, NS1 représente une région codant pour une protéine non-constitutive. (b) On obtient un fragment d'environ 2,1 Kb, le fragment (J4) de l'ADNc (203), en traitant l'ADNc avec Xho II et Bgl II. Ce fragment contient une région codant pour la protéine M, en plus d'une région codant pour la protéine E. (c) On obtient un fragment d'environ 2,4 Kb, le fragment (J6) de l'ADNc (203), en traitant l'ADNc avec Hae II. Ce fragment contient les régions correspondant à la protéine E, la protéine M, la protéine PreM et une partie de la protéine C. (6) Construction d'un premier vecteur recombinant, pAK 8, contenant le gène TK du virus de la vaccine, dans lequel sont insérés un polylinker et le promoteur 7,5 K du virus de la vaccine (voir figure 4). Apres avoir fait digérer le plasmide pUC 9 par EcoR I et Pst I, on traite le produit de digestion avec une polymérase, l'extrémité coupée étant émoussée et liée de façon à construire un pUC 9 dont le site EcoR I a été supprimé. Après avoir coupé avec Hind III ce pUC 9 ne portant plus de site EcoR I, le produit de coupure est lié avec le fragment J Hind III provenant de la souche WR du virus de la vaccine, pour donner le vecteur recombinant pUHK. Ensuite, après avoir inséré, au niveau du site Hinc II du plasmide pUC 19 (fabriqué par Pharmacia), le promoteur 7,5 K de la souche WR du virus de la vaccine (Moss et al., Cell, 125, 805-813, 1981), on réalise successivement des coupures avec Hind III et EcoR I, pour obtenir un fragment d'ADN (d'environ 350 b) qui comporte un polylinker avant et après le promoteur 7,5 K. Après avoir traité avec une polymérase le fragment d'ADN (voir figure 4) et le produit de digestion par EcoR I du plasmide pUHK, on effectue une ligature. Le plasmide recombinant obtenu est nommé pNZ68K2. Ensuite, on synthétise (voir figure 4) un linker qui comporte un site BamH I à chacune de ses deux extrémités, ainsi qu'un codon de début de traduction, un codon de fin de traduction et une séquence de coupure par des enzymes de restriction (Bgl II, Nco I) entre eux deux, et on l'lnsère au niveau du site BamH I de pNZ68K2 pour construire le premier plasmide recombinant visé pAK8. (7) Construction d'un second plasmlde recombinant dans lequel est inséré, en aval du promoteur 7,5 K, l'ADN codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise (voir figure 4). (a) Construction d'un second plasmide recombinant (pAKJ7) dans lequel est inséré le fragment J7 d'ADNc. On traite le fragment J7 d'ADNc obtenu en (5) avec une nucléase Sl,puis on lie le produit avec un plasmide coupé obtenu par digestion du plasmide pAK8, obtenu en (6), par Nco I et traitement ultérieur avec une polymérase. On obtient ainsi le plasmide recombinant pAKJ7 dans lequel est inséré le fragment J7 d'ADNc, en aval du promoteur 7,5 K et entre le codon de début de traduction et le codon de fin de traduction. On reconnaît ce plasmide au fait qu'il forme un fragment d'ADN d'environ 0,4 Kb lorsqu'on le coupe par l'enzyme de restriction Nco I. A titre d'information, dans le cas d'un plasmide recombinant comportant le fragment J7 d'ADNc inséré dans le sens opposé, il se forme un fragment d'ADN d'environ 1,2 Kb. (b) Construction d'un second plasmide recombinant (pAKJ4) dans lequel est inséré le fragment J4 d'ADNc. Le fragment J4 de d'ADNc, obtenu en (5), est lié au produit de digestion par Bgl II du plasmide pAK8, obtenu en (6), ce qui donne le plasmide recombinant pAKJ4 dans lequel est inséré le fragment J4 d'ADNc, en aval du promoteur 7,5 K et entre le codon de début de traduction et le codon de fin de traduction. On reconnaît ce plasmide au fait qu'il forme un fragment d'ADN d'environ 0,74 Kb lorsqu'il est coupé par l'enzyme de restriction Nco I. (c) Construction d'un second plasmide recombinant (pAKJ6) dans lequel est inséré le fragment J6 d'ADNc. On traite par une polymérase le fragment J6 d'ADNc, obtenu en (5), puis on lie le produit avec le produit de digestion par Bal I du plasmide pAK8obtenu en (6), ce qui donne un plasmide recombinant pAKJ6 dans lequel est inséré le fragment J6 d'ADNc, en aval du promoteur 7,5 K et entre le codon de début de traduction et le codon de fin de traduction. On reconnaît ce plasmide au fait qu'il forme un fragment d'ADN d'environ 0,4 Kb et un fragment d'ADN d'environ 0,7 Kb, lorsqu'il est coupé par l'enzyme de restriction Nco I. (8) Préparation d'un virus recombinant de la vaccine. Dans 0,1 pfu/cellule (pfu: unité fromine-plaque), on inocule une souche atténuée de virus variolique (souche LA atténuée de virus variolique, décrite dans la demande de brevet japonais N' 44178/87 (ouverte à l'inspection publique), présentant une température de blocage d'activité de 41'C dans des cellules de rein de lapin et occasionnant l'apparition de pustules de dimensions 2-3 mm sur la membrane chorioallantoique d'un oeuf passé à l'état d'embryon), cultivée dans un flacon de culture de 25 cm3. 45 minutes après, on dissout dans 2,2 ml d'eau stérilisée 10 pg de chacun des divers plasmides recombinants obtenus en (7) (pAKJ7, pAKJ6), et on prépare des co-précipités ADN- phosphate de calcium selon le procédé de Hidaka et al. (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 27, 340, 1985). Puis on ajoute goutte-à- goutte 0,5 ml de ces co-précipités sur des cellules RK-13 infectées. Après sédimentation dans un incubateur à 7 % de C02 à 37'C pendant 30 minutes, on y ajoute 4,5 ml de milieu MEM d'Eagle contenant 5 % de sérum foetal bovin. 3 heures après l'addition, la solution de culture est échangée, puis on cultive à 37C pendant 48 heures dans un incubateur à 7 % de C02. On congèle et on fait fondre à trois reprises le système, y compris les cellules de culture. Pour la sélection d'un recombinant, on inocule la solution virale décrite ci-dessus à des cellules TK-143 cultivées dans une boite de Petri de 10 cm de diamètre. 30 minutes après, on dépose par-dessus, en couches, du milieu MEM d'Eagle additionné de 1 % d'agarose, de 5 % de sérum foetal bovin et de 25 pg/ml de BUdR. Après trois jours de culture, les cellules infectées sont colorées avec du rouge neutre à 0,01 %. A l'aide d'une pipette de Pasteur, on prélève le virus dans la plaque formée et on le met en suspension dans une solution tampon phosphate contenant 2 % de gélatine. Afin de réaliser une hybridation par points, on dépose une partie de la suspension, en taches, sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose, et on *met le reste en réserve à -20'C. Après avoir exécuté trois fois un traitement de 10 minutes à la soude 0,5 N et un traitement de 5 minutes avec un tampon tris-chlorhydrate i M, la membrane tachée est traitée pendant 5 minutes avec du NaCl 1,5 M et un tampon tris-chlorhydrate 0,5 M. On effectue la saturation avec SSC double (SSC simple, NaCl 0,15 M, citrate de sodium 0,015 M) et on effectue l'agglutination à 80'C pendant 2 heures. On traite le système avec SET quadruple (NaCl 0,6 M, tris-HCl 0,08 M, EDTA 4 mM (pH 7,8))- Denhardt décuple-SDS (dodécylsulfate de sodium) 0,1 %, à 68C pendant 2 heures. De l'ADN de sperme de saumon, modifié par SET quadruple-Denhardt décuple-SDS 0,1 % -Na4P207 0,1 % (50 ig/ml), et de l'ADNc codant pour la _-2tine E du virus de l'encéphalite japonaise, marqué au 32p, sont hybridés par translation de coupure à 68'C pendant 14 heures. Après lavage, on place la membrane sur un film sensible aux rayons X, on soumet le tout à une autoradiographie, et on sélectionne les taches noircies apparaissant sur le film. La solution virale correspondant aux taches noircies est à nouveau inoculée dans des cellules TK-143. 30 minutes après, on dépose par- dessus, en couches, du milieu MEM d'Eagle, additionné de i % d'agarose, de 5 % de sérum foetal bovin et de 25 pg/ml de BUdR. Après 3 jours de culture, les cellules infectées sont colorées avec du rouge neutre à 0,01 %. La plaque formée est soumise aux mêmes modes opératoires que ceux décrits ci-dessus. On répète le mode opératoire de purification jusqu'à ce que les plaques obtenues soient toutes noircies par hybridation par points. Les virus ainsi obtenus sont les virus recombinants de la vaccine voulus, que l'on nomme respectivement LAJ7, LAJ4 et LAJ6, en fonction du plasmide recombinant utilisé. (9) Expression d'un virus recombinant de la vaccine dans des cellules infectées. (a) détermination par l'anticorps anti-V3. La souche de virus recombinant de la présente invention, présentant une multiplicité d'infection de 1,0 ou 0,1 est inoculée dans des cellules RK 13 cultivées dans une enceinte pour culture de tissus. Après avoir laissé l'infection s'effectuer à 37'C pendant 1 heure, on retire la solution de virus et on lave les cellules avec un milieu MEM. Puis on y ajoute du milieu MEM d'Eagle contenant 5 % de sérum foetal bovin. 16 minutes après, on enlève le milieu MEM d'Eagle et on lave doucement avec une solution tampon phosphate, puis on sèche à l'air.On traite les cellules avec de l'acétone à température ambiante pendant 5 minutes pour les immobiliser. On réalise l'examen par une technique'indirecte à anticorps fluorescent, en utilisant comme anticorps primaire l'anticorps anti-V3 et comme anticorps secondaire un anticorps anti-IgG de lapin, lié à de l'isocyanate de fluorescéine. Le résultat est que l'on confirme que les trois virus recombinants de la vaccine produisent de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise. On décrit ci-dessous un procédé de préparation de l'anticorps anti-V3. On décompose le virus de l'encéphalite japonaise dans une solution tampon phosphate contenant 1 % de SDS et 0,1 % de 2-mercapto- éthanol. La protéine E est isolée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 %. On traite le gel de façon à récupérer la protéine E. On inocule la protéine E ainsi obtenue à des lapins de façon à récupérer ensuite un anticorps anti-V3. L'anticorps anti-V3 ainsi obtenu reconnaît la protéine E modifiée, c'est-à-dire une structure primaire de cette protéine, et réagit avec elle. (b) détermination par l'anticorps anti-JEV. On détermine s'il y a ou non production de protéine E ayant une activité biologique, de façon semblable à ce qui est décrit ci-dessus, excepté que l'on utilise comme anticorps primaire un anticorps anti-JEV (anti-sérum obtenu par inoculation du virus de l'encéphalite japonaise lui-même). Puisse qu'on prépare cet anticorps anti-JEV à partir du virus de l'encéphalite japonaise ayant des activités biologiques, on suppose qu'une protéine capable de réagir avec l'anticorps anti-JEV aura des activités semblables à celles de la protéine présente à la surface du virus de l'encéphalite japonaise. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1. Ils montrent que tous les virus recombinants produisent la protéine E; en particulier, la protéine E produite par la souche LAJ6 présente des activités biologiques semblables à celles de la protéine E présente à la surface du virus de l'encéphalite japonaise. Tableau 1 Anticorps primaire Souche du virus Anticorps Anticorps Anticorps de la vaccine__ anti-V3 _anti-JEV anti-vaccine LA (souche parente) - - +++ LAJ7 ++ -+++ LAJ4 ++ +++ LAJ6 +++ ++ +++ -: pas de réponse : réponse impossible à déterminer +: réponse faible ++: réponse forte +++: réponse extrêmement forte REVENDICATIONS 1. Virus recombinant de la vaccine, caractérisé par le fait que l'on a inséré, dans ce virus recombinant, tout ou partie d'un ADNc codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise, dans une région du génome, non-essentielle à la croissance, du virus de la vaccine. 2. Virus recombinant de la vaccine conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine antigénique de surface est inséré conjointement avec tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine de matrice du virus de l'encéphalite Japonaise. 3. Virus recombinant de la vaccine conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine antigénique de surface est inséré conjointement avec tout ou partie des ADNc codant pour la protéine de pré-matrice et la protéine de matrice du virus de l'encéphalite japonaise. 4. Virus recombinant de la vaccine conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit ADNc se trouve sous le contrôle d'un promoteur. 5. Virus recombinant de la vaccine conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit ADNc incorporé est inséré entre un codon de début de traduction et un codon de fin de traduction synthétisés ou artificiellement ajoutés. 6. Virus recombinant de la vaccine conforme à l'une e=.c4nque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit ADNc codant pour la protéine antigénique de surface du virus de l'encéphalite japonaise code pour la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 3 ou pour un polypeptide ayant pratiquement la même fonction que cette séquence d'acides aminés.