Brevet FR2623055A1 — publié le 19890519

La présente invention concerne l'agriculture, et plus précisément, un procédé de culture in vitro de microtubercules de pomme de terre, trouvant une appli- cation dans la culture des semences de la pomme de terre pour obtenir ses semailles ainsi que dans la sélection au cours de la multiplication d'espèces uniques nouvellement obtenues. On connaSt un procédé de préparation de microtubercules in vitro (Fiziologia rasteny, v. 25, fascicule 2, 1978, S.E. Morozova, O.S. Melik-Sarkisov "Razmnozhenie bezvirusnogo kartophelya klubnyami, poluchennymi in vitro", pages 373-378) , qui consiste à entreprendre le bouturage des plantes protégées contre l'infection de virus, puis à réaliser la culture des boutures obtenues sur un milieu enrichi d'une source de carbone, par exemple sur un milieu de Murashige-Skoog, à une concentration élevée en glucose (jusqu'à 3% en poids). Pour stimuler la formation des tubercules, on introduit, dans le milieu nutritif, des substances biologiquement actives, telles que les acides B-indolylbutyrique, B-indolylacétique,dJ-naphtylacétique. On effectue la culture des boutures préalablement sous éclairage avec une photopériode de 8 heures pendant 24 heures et à une température réduite (10 C) pendant au moins 12 jours. Puis, jusqu'à l'achèvement de la formation des tubercules et l'atrophie des plantes, on les cultive à une température de 18-20 C sous éclairage ave une photopériode de 8 heures ou à une lumière diffuse pendant 16 heures. On récolte les tubercules formés, on les conserve à l'obscurité pendant 3 mois à une tempé- rature de 2-3 C, puis on les fait germer en conditions de laboratoire serre à une température de 26 C. 80% de tubercules germent avec formation de plantes normales. Les dimentions des tubercules sont de 0,3-0,7 cm, le poids étant de 70-150 mg. Le procédé indiqué est caractérisé par un très faible rendement en microtubercules, ne dépassant pas %, rapport de la quantité de boutures qui ont formé des tubercules à la quantité de boutures de départ (plantées). Les tubercules ne se forment que sur les boutures de la partie inférieure de la plante. Les microtubercules formés sont fréquemment en dehors de la norme morphologique et se forment sur des plantes affaiblies et difformes. Le poids et les dimensions des microtubercules ne sont pas considérables. Le procédé indiqué ne peut ëtre utilisé largement dans la culture des semences de pomme de terre. On connaît largement d'autres procédés de production in vitro des microtubercules de pomme de terre dans le but de conserver la collection des échantillons sélectionnés, par exemple un procédé (SU,A, 743646) qui consiste à bouturer des plantes assainies. Les boutures obtenues sont cultivées sur un milieu nutritif de White à une teneur de 1% en poids de saccharose. On réalise la culture sous un éclairage de 4-6 milliers de lux à une photopériode de 16 heures pendant les trois premières semaines, puis sous une lumière diffuse. Dans ces conditions, les tubercules atteignent une dimension de 0,2-0,4 cm. On conserve les tubercules à la température de +2 à +4 C. En cas de besoin, on les cultive sur un milieu dans des conditions optimales de la culture in vitro pour obtenir les plantes. Une basse qualité des tubercules, leurs dimensions et leur poids insuffisants ainsi qu'une réserve limitée de substances organiques et minérales dans ceux-ci, excluent la possibilité d'utilisation de ces procédés dans la culture des semences de pomme de terre. On connaît aussi un procédé de culture in vitro de microtubercules de pomme de terre pour obtenir la pomme de terre de semence (American potato journal, v.59, 1982, Po-Jen Wang and Ching-Yen Hu, "in vitro mass tuberisation and virus free seed potato production in Taiwan", pages 33-37). Ce procédé est réalisé de la manière suivante. On entreprend le bouturage de plantes assainies après leur multiplication par culture in vitro. Pour cela, on coupe des brins de plantes d'une longueur de 7-9 cm et on les cultive sur un milieu nutritif de MurashigeSkoog, contenant une quantité élevée de saccharose (jusqu'à 8% en poids). En qualité de substance biologiquement active stimulant la formation des tubercules, on introduit, dans le milieu nutritif, de la benzyladénine-à une concentration de 10 mg/l du milieu. On réalise la culture à une températuree de 20 C sous une lumière diffuse à une intensité de 100 lux pendant 4 mois. On récolte les microtubercules formés dont le poids moyen est d'environ 200 mg et dont les dimensions sont de 0,2 à 0,7 cm. On plante les microtubercules dans des ouvrages de culture (serres). On utilise la récolte obtenue pour la multiplication en pleine terre. Les tubercules obtenus de cette façon sont une matière de départ pour la culture des semences de pomme de terre. Ce procédé est caractérisé par un bas rendement en microtubercules, puisque seulement 30-50% de brins cultivés sur le milieu nutritif forment des microtubercules. Les microtubercules se forment pendant une période de culture prolongée des brins (4 mois). Les microtubercules obtenus in vitro sont d'une mauvaise qualité (dimensions et poids insuffisants), ce qui ne permet pas de les cultiver en pleine terre. Leur culture en serres avant l'ensemencement en pleine terre crée un danger de leur contamination secondaire par le virus. Tous cela rend la production des semailles de départ économiquement désavantageuse. On s'est donc proposé d'accroître la qualité et la quantité de microtubercules, de réduire la durée du processus de leur obtention, d'assurer leur aptitude à l'ensencement en pleine terre et d'obtenir les semailles par modifications des techniques et des conditions de la mise en oevre du processus. La solution consiste en ce que, dans le procédé de culture in vitro des microtubercules de pomme de terre consistant dans le bouturage des plantes, la culture des boutures sur un milieu nutritif enrichi d'une source de carbone contenant des sels minéraux et des substances biologiquement actives, sous éclairage, avec obtention ultérieure des microtubercules, conformément à l'invention, les boutures sont cultivées sur un milieu nutritif dont la substance biologiquement active stimulant la formation des tubercules est l'adénine à une concentration de O,015mg/l de milieu, on effectue alors un régime d'éclairage en lumière directe de lampes comme suit: les 5 à 7 premiers jours, la photopériode est de plus de 12 heures et dans les 2-3 mois subséquents, on éclaire en cycles répétés qui comprennent l'alternance d'une obscurité de 24 heures et de périodes d'éclairage de 4-6 heures, 6-10 heures, 10-18 heures par jour, la durée de ces dernières étant de 2-5 jours. Il est avantageux, pour augmenter la quantité et le poids des microtubercules pendant la culture des boutures à partir des tiers supérieurs des plantes, d'introduire, dans le milieu nutritif, une substance biologiquement active, à savoir, à kinétine d'une concentration de 0,01-5,0 mg/l de milieu. On réalise l'éclairage en lumière directe de lampes, de préférence à une intensité de 3000-4000 lux. l'éclairage des boutures par la lumière directe de lampes et au régime indiqué, en combinaison avec les substances biologiquement actives stimulant la formation des tubercules, crée un nouvel état physiologique de la plante, change l'orientation et l'intensité des processus physiologiques et biochimiques qui se manifestent dans la croissance puissante de la plante, dans la formation précoce des stolons et la réduction de la période de la formation de tubercules. Tous cela permet d'augmenter les dimensions des microtubercules comparativement au procédé connu d'environ 2 fois, de diminuer de 1,3-2 fois la durée de l'obtention des microtubercules et d'accroître de 2-2,5 fois la quantité de plantes qui ont formé des microtubercules (parmi celles cultivées sur le milieu nutitif). L'amélioration de la qualité des microtubercules permet de les utiliser pour l'ensemencement en pleine terre et d'obtenir la semaille de départ pour la culture primaire des semences. Le stade de culture des microtubercules en serre, en comparaison avec le procédé connu, est exclu de la technologie d'obtention de la semaille de départ dans la culture primaire des semences. Cela permet d'éliminer le danger de la contamination secondaire des microtubercules par un virus dans des serres et rend le procédé revendiqué économiquement avantageux. Le procédé revendiqué est mis en oeuvre de la façon suivante. En qualité de semaille de départ, on utilise des plantes bouturées de diverses espèces de pomme de terre, assainies contre l'infection virale. On cultive les boutures sur un milieu nutritif enrichi de sources de carbone, contenant des sels minéraux, des substances biologiquement actives, y comprit des substances stimulant la formation des tubercules. En qualité de substances biologiquement actives stimulant la formation des tubercules, on utilise l'adénine à une concentration de 0,01-5 mg/l de milieu nutritif. La diminution et l'augmentation de la concentration en adénine relativement à la limite indiquée sont désavantageuses, étant donné que la qualité de tubercules s'altère brusquement, les dimensions et le poids diminuent, ce qui les rend inutilisables pour l'ensemencement en pleine terre. Il est rationnel, pour augmenter les dimensions, le poids et la quantité des microtubercules pendant la culture des boutures des tiers supérieurs des plantes, d'introduire additionnellement, dans le milieu nutritif, une substance biologiquement active, la kinétine, à une concentration de 0,10-5 mg/l de milieu. Les concentrations indiquées en kinétine assurent les conditions optimales de formation des tubercules, en favorisant l'augmentation de la quantité et du poids des microtubercules. Pour la culture des boutures, on peut utiliser un milieu nutritif quelconque enrichi de sources de carbone et de sels minéraux utilisables pour les plantes de pomme de terre. En qualité de source de carbone, le milieu nutritif peut contenir du saccharose, du glucose et autres substances. On cultive des boutures sous l'éclairage de la lumière directe de lampes, de préférence d'une intensité de 3000-4000 lux. Pour stimuler la formation orientée des microtubercules, on effectue l'éclairage d'après le schéma suivant: les 5-7 premiers jours, on effectue la culture à une photopériode de plus de 12 heures. Pendant la période de 2-3 mois qui suit, les boutures sont cultivées suivant des cycles répétés d'éclairage qui comprennent l'alternance de l'obscurité de 24 heures et de périodes d'éclairage de 4-6 heures, ou 10-18 heures par jour, la durée de ces dernières étant de 2-5 jours. Le réglage de l'ordre d'alternance des photopériodes et de leur durée permet d'équilibrer les processus de la croissance des plantes et de l'accumulation des microtubercules. Lors de la détermination de l'ordre d'alternance des photopériodes et de l'obscurité d'un jour, il est nécessaire de partir de l'orientation suivante de leur action. L'obscurité de 24 heures produit un effet puissant sur l'initiation de la formation de stolons et de tubercules; une photopériode de 4-6 heures continue ce processus mais elle protège les plantes contre l'épuisement et la dégradation de l'appareil photosynthétique; cette courte photopériode assure un déroulement plus lent de la formation de stolons et de tubercules et une accumulation intense de ces derniers; une photopériode prolongée protège les plantes contre l'épuisement dû aux périodes d'obscurité et à la photopériode courte. L'utilisation de la lumière directe des lampes au régime indiqué d'éclairage permet d'augmenter de 2 fois les dimensions des microtubercules en comparaison avec le procédé connu, ainsi que d'améliorer leur composition biochimique. La teneur relative en substances sèches a augmenté de 15,8%, en amidon de 14,2%, en azote protéique de 23,1%, en comparaison avec le procédé connu. En 2-3 mois de culture des boutures sur le milieu nutritif, la formation de tubercules s'achève, les plantes s'atrophient. On récolte les microtubercules, on les met dans des récipients avec de l'agar, o ils sont conservés durant un temps prolongé dans un réfrigérant à une température de +2 à +4 C et sous éclairage périodique. Les tubercules accumulés sont ensemencés au printemps dans les champs suivant la technologie généralement admise pour les semis'de production de semences. Si les microtubercules n'ont pas eu de repos végétatif au cours du stockage, on les traite par substances stimulatrices pour rompre la période du repos végétatif avant la plantation dans le champ. La récolte d'automne est une semaille de départ pour la culture des semences de pomme de terre primaire. Pour mieux faire comprendre la présente invention, on donne ci-après des exemples de la mise en oeuvre du procédé revendiqué. Exemple 1 On fait le bouturage de plantes de pomme de terre de la variété Iskra préalablement protégée contre l'infection virale, et multipliées par culture in vitro. On introduit les boutures obtenues (en quantité de 100 boutures) dans des éprouvettes sur un milieu nutritif de Murashige-Skoog enrichi de 6% en poids de saccharose. On y introduit de l'adénine en une quantité de 0,25 mg/l de milieu. La culture est faite à une température de 22-24 C pendant 2 mois. Les 7 premiers jours, on cultive les boutures sous éclairage en lumière directe de lampes à luminescence d'une intensité de 4000 lux et à une photopériode de 16 heures. Puis on réalise l'éclairage durant deux cycles de 10 jours de culture sous le régime suivant, à la même intensité: période de 24 heures dans l'obscurité; deux jours de photopériode de 4 heures; 5 jours de photopériode de 10 heures; 2 jours de photopériode de 10 heures; 2 jours de photopériode de 16 heures. L'initiation des tubercules terminée (au bout de 27 jours de végétation), on exclut l'obscurité de 24 heures et la photopériode de 4 heures et on prolonge la durée de la photopériode de 10 heures. L'accumulation du poids de tubercules s'achève au bout de 2 mois. Les plantes jaunissent et s'atrophient. On récolte les microtubercules et on les place dans des récipients en verre avec de l'agar au fond. Les microtubercules et l'agar dans le récipient sont séparés par une couche de papier. On conserve les microtubercules à la température de +2 à +4 C jusqu'à l'ensemencement en pleine terre. Parmi les plantes régénérées à partir de 100 boutures plantées sur le milieu nutritif, 95 plantes ont formé des microtubercules, y compris 15 plantes dont chacune avait deux microtubercules. Le poids moyen d'un microtubercule est de 520 mg, son diamètre moyen étant de 0,8cm. Exemple 2 On pratique comme à l'exemple 1. On utilise des plantes de pomme de terre de l'espèce Mavka. On enrichit le milieu nutritif de Murashige- Skoog en saccharose à une teneur de 8% en poids. On établit le régime suivant d'éclairage à une intensité de 3000 lux: pendant les 5 premiers jours de culture, la photopériode est de 16 heures. Puis pendant les 3 cycles de 10 jours de cultures on effectue l'éclairage sous le régime suivant: période de 24 heures d'obscurité; - deux jours à la photopériode de 4 heures; - 5 jours à la photopériode de 10 heures. - deux jours à la photopériode de 16 heures Enfin, dans les cycles de 10 jours de culture, les photopériodes de 10 heure et une heure s'alternent. La formation de microtubercules s'achève au bout de deux mois et demi. Parmi 100 plantes, 92 ont formé des microtubercules à partir des boutures cultivées, dont 2 plantes avaient 2 microtubercules chacune. Le poids moyenne d'un microtubercule est de 480 mg; son diamètre moyen est de 0,9 cm. Exemple 3 On pratique comme à l'exemple 1. Les boutures des tiers supérieurs des plantes in vitro de l'espèce Iskra sont plantées sur un milieu nutritif identique à celui cité à l'exemple 1. On introduit additionnellement, dans le même milieu nutritif, de la kinétine à une concentration de 0,25 mg/l. Des boutures analogues de l'espèce Iskra sont plantées sur ce milieu. On récolte les microtubercules au bout de 2 mois de culture. 26 plantes parmi 50 plantes régénérées des boutures cultivées sur un milieu identique à celui de l'exemple 1 ont formé des microtubercules. Leur poids moyen est de 260 mg, le diamètre moyen étant de 0,6 cm. Parmi 50 plantes cultivées sur le milieu additionné de la kinétine, 48 ont formé des micro- tubecules dont 5 plantes avaient chacune 2 microtuber- cules. Le poids moyen d'un microtubercule est de 390 mg, son diamètre moyen étant de 0,7 cm. R E V E N D I C A T ION S 1. Procédé de culture in vitro de. microtubercules de pomme de terre comprenant le bouturage des plantes, la culture des boutures sur un milieu nutritif enrichi d'une source de carbone contenant des sels minéraux, des substances biologiquement actives, sous éclairage avec obtention ultérieure de microtuber- cules, caractérisé en ce qu'on effectue la culture des boutures sur un milieu nutritif contenant, en qualité de substance biologiquement active stimulant la formation des tubercules, de l'adénine à une concentration de 0,01-5 mg/l de milieu, et on réalise un éclairage en lumière directe de lampes au régime suivant: les 5-7 premiers jours, avec une photopériode de plus de 12 heures, et les 2-3 mois ultérieurs on effectue l'éclairage par cycles répétés comprenant l'alternance de l'obscurité de 24 heures et de périodes d'éclairage de 4-6 heures, 6-10 heures, 10-18 heures par jour, la durée de ces dernières étant de 2-5 jours. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour augmenter la quantité et le poids des microtubercules pendant la culture des boutures à partir des tiers supérieurs des plantes, on introduit, dans le milieu nutritif, additionnellement, une substance biologiquement active, la kinétine, à une concentration de 0,01-5,0 mg/l de milieu. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'éclairage en lumière directe de lampes d'une intensité de 3000-4000 lux.