Brevet FR2612732A1 — publié le 19880930

Dans les années 60, on a observé qu'il était pos- sible d'obtenir des plantes à partir de parties de plantes ou d'un tissu de bourrelet cicatriciel indifférencié. Cette technique est désignée sous le terme de microdéveloppement, qui est par conséquent une reproduction asexuée des plantes en laboratoire. Le but du microdéveloppement est de produire des plantes individuelles de qualité supérieure identiques du point de vue génétique. Par conséquent le choix de la plan- te mère est une étape importante essentielle étant donné que les plantes devant être produites seront les clones de cette plante. Le microdéveloppement peut commencer à partir d'un élément en pleine croissance, à savoir un bourgeon ou par exem- ple un pétiole, coupé sur la plante mère. La culture est exé- cutée dans des conditions aseptiques sur un substrat qui con- tient les éléments nutritifs principaux et les éléments nu- tritifs à l'état de traces, que requièrent les plantes, et des vitamines et des hormones, qui permettent de régler la croissance. Habituellement on donne une consistance plus fer- me au substrat en utilisant de l'agar-agar. Au départ la partie de la plante forme une pousse ou un rejeton, que l'on transplante du tube à essai dans une enceinte en verre ayant des dimensions plus importantes, de manière qu'elle se développe. Grace à l'utilisation d'hormones, principalement les cytokinines, de nouvelles pousses se déve- loppent à partir de bourgeons axillaires ou par exemple à par- tir de bourgeons adventifs en formant une feuille de la plan- te. Au bout d'environ quatre semaines de croissance, on coupe les pousses qui se sont développées et on les transplante sur de nouveaux substrats pour qu'elles se développent. Ce déve- loppement se poursuit jusqu'à ce que le nombre désiré de plan- tes ait été obtenu. Pour la formation des racines, on transplante les pousses habituellement sur un substrat qui contient de l'au- xine. Une fois que les racines se sont développées, on trans- plante les plantes sur un terrain de support placé dans une serre, dans laquelle l'humidité de l'air est importante. Une augmentation graduelle de la lumière déclenche la photosyn- thèse de la plante. Le facteur de coût le plus important dans le mi- crodéveloppement est la quantité importante de travail requé- rant une grande habileté professionnelle et qui réside prin- cipalement dans la coupe manuelle des plantes et leur trans- plantation d'un substrat à un autre. Le tissu sensible de la plante peut être aisément endommagé lors de la coupe. La coupe exécutée avec un couteau est lente, en particulier lorsqu'on travaille sur un tissu ou un matériau pouvant être aisément contaminé, auquel cas il faut prendre des soins particuliers pour conserver des con- ditions d'asepsie. On s'est aperçu que, d'une manière surprenante, on peut réduire les problèmes mentionnés précédemment en uti- lisant un faisceau laser pour couper les plantes. On a découpé des tissus vivants en utilisant un faisceau laser uniquement dans le domaine de la chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales, la cautérisation des vais- seaux sanguins dans le tissu peut être considérée comme un avantage, la coupe étant facilitée lorsque le saignement est empêché, en particulier le saignement de petits vaisseaux san- guins. Au lieu de cela, en liaison avec la présente invention, on a observé que, d'une manière surprenante, les faisceaux vasculaires du tissu des plantes ne sont pas endommagés de façon nuisible en liaison avec la coupe par laser et que, au contraire, le tissu conserve son aptitude à absorber de l'eau et des substances nutritives au niveau de la surface de coupe et qu'en outre le tissu proche de cette surface de coupe con- serve sa totipotence. Les avantages de l'utilisation d'un faisceau laser pour couper les plantes résident également dans la commodité d'utilisation et la rapidité du procédé. En raison d'exigen- ces élevées d'asepsie, lorsqu'on travaille sur une plante en utilisant habituellement un couteau, il faut stériliser le couteau avant d'effectuer la coupe, en l'immergeant dans de l'éthanol ou bien en le passant dans une flamme. Ceci ralentit la coupe, et l'éthanol peut pénétrer dans le tissu de la plante; même en de faibles quantités, l'éthanol entraîne un retard dans le démarrage de la crois- sance ou bien peut tuer la plante. On peut également exécuter la stérilisation en chauffant l'instrument. D'autre part le faisceau laser est naturellement stérile, ce qui améliore con- sidérablement les conditions d'asepsie. De façon analogue, la vitesse de coupe augmente lorsque l'étape de stérilisation est supprimée. On peut également mettre en oeuvre une automatisa- tion dans le cas o la coupe est effectuée avec un laser. Dans ce cas, le travail manuel mis en oeuvre est faible et la cou- pe est considérablement accélérée. Lors du découpage au laser, l'endommagement de la substance ou du tissu de la plante est provoqué principale- ment par le chauffage. On utilise des gaz protecteurs iner- tes tels que de l'azote, du gaz carbonique ou de l'argon, pour améliorer le résultat de la coupe. Le gaz protecteur est dirigé sur la plante à couper à l'air libre, à l'aide d'une buse, ou sinon la coupe est exécutée dans l'enceinte remplie d'un gaz protecteur. La quantité de gaz protecteur est choi- sie de manière que le brûlage soit aussi limité que possible. Dans le cadre de la présente invention, l'équipe- ment utilisé pour couper les plantes est un équipement laser, dont les paramètres les plus importants vont être indiqués ci-après. Le mode de l'équipement laser indique la forme de distribution de son faisceau. Dans les expériences de coupe, le mode de fonctionnement était en permanence le mode TEM 00, c'est-à-dire que l'intensité du faisceau est distribuée con- formément à la courbe en cloche de Gauss. L'énergie de coupe de l'instrument laser indique quelle énergie l'instrument peut transférer par unité de temps à l'objet à découper, ou ici la plante à couper. Souvent tou- te l'énergie n'est pas absorbée dans l'objet à découper, mais est réfléchie par la surface de cet objet et/ou est absor- bée par les vapeurs et les gaz émanant de l'objet. L'énergie de coupe peut être également exprimée par une intensité, qui indique l'énergie de coupe par surface unité du faisceau. Etant donné que la lentille de focalisation focalise le fais- ceau au foyer sur une très faible surface, il est possible d'obtenir des intensités élevées même dans le cas d'une fai- ble énergie de coupe. Des expériences ont révélé qu'il est possible de couper les plantes en utilisant même un laser au CO2 possédant une énergie de seulement 20 W, mais dans ce cas la vitesse de coupe n'est pas suffisante. Dans la littérature, il a été indiqué qu'une énergie d'environ 40 W est suffisante pour couper un tissu animal vivant. D'autre part, le prix d'un instrument laser augmente presque d'une manière directement proportionnelle au carré de l'énergie et par conséquent l'éner- gie maximale admissible du point de vue économique pour un instrument laser est égale à environ 100 W. Compte tenu de ce qui précède, l'énergie d'un instrument laser convenant pour être utilisé en liaison avec la présente invention doit être comprise dans la gamme de 30-100 W. Lorsque le faisceau laser est pulsé, les valeurs concernant la durée de l'impulsion et l'intervalle de temps entre impulsions peuvent être choisies de manière que le ma- tériau à couper soit chauffé aussi peu que cela est possible. Les valeurs comprises entre 0,1 et 10 ms sont des valeurs ap- propriées. Le diamètre du faisceau au niveau du foyer influe également sur le résultat de la coupe, mais en général ce pa- ramètre est constant et est de l'ordre de 0,2 mm ou moins. Dans les exemples qui vont suivre, on a utilisé un laser de coupe qui était un laser au CO2 à écoulement longi- tudinal (cohérent), dont le mode de fonctionnement était le mode TEM 00 et dont le résonateur comportait un module ECQ permettant une commande impulsionnelle du faisceau. L'éner- gie continue délivrée par l'instrument laser était en princi- pe réglable dans la gamme de 90-350 W, mais pour l'expérience de coupe, il était souhaitable de réduire l'énergie en utili- sant un mélange de gaz spécial, et l'énergie continue cons- tante était de 61 W. La fréquence des impulsions a pu être choisie approximativement dans la gamme de 10-2500 Hz, et la durée d'une impulsion laser individuelle a pu être choisie dans la gamme de 0,1 ms-10 s. Le diamètre du faisceau au ni- veau du foyer était égal à envion 0,2 mm. Le gaz protecteur utilisé était de l'azote possédant une pureté de 99,998 %. Le poste de travail était constitué par une table xy, dont les dimensions étaient 600 x 600 mm. Exemple On a effectué les expériences sur un bouleau. On a observé les effets de la coupe au moyen d'une expérience de développement et d'une culture ultérieure en serre. Etant donné qu'un faisceau laser chauffe l'objet, ici la plante, à couper, le tissu de la plante peut se des- sécher ou être brûlé. On a contrôlé l'endommagement de la sur- face de coupe en utilisant un microscope. Si l'on soumettait la surface de coupe à une énergie trop élevée, ce fait était mis en évidence souvent sous la forme d'une carbonisation et d'une constriction totale des faisceaux vasculaires, c'est - à-dire une "fusion" du tissu. En modifiant les paramètres de l'instrument, on a essayé d'améliorer la trace de coupe. Pour réaliser la coupe, on a fixé en position des parties de la plante en utilisant de petites boîtes de Pétri stériles, remplies d'agar-agar (9 g/l). Bouleau, Betula pendula On a coupé des pousses de bouleau (d'une popula- tion in vitro) sous la forme d'éléments contenant chacun un bourgeon axillaire, en utilisant un instrument laser. On a exécuté l'expérience de contrôle en découpant des pousses avec un couteau. On a placé les bourgeons sur un substrat de dé- veloppement et on les a cultivés dans un incubateur (23 C, humidité 50 %, lumière 2000 lux, 16/8 h). On a exécuté des expériences parallèles en plusieurs exemplaires (3-7 pousses par expérience). On a observé le démarrage de la croissance des transplants et on a calculé deux fois le coefficient de dé- veloppement, au bout de 4 semaines et ou bout de 6 semaines à partir de l'instant de la transplantation. Les paramètres reproduits dans le tableau 1 ci-après, ont été étudiés dans le cas de la coupe au laser. Tableau 1: Différents paramètres étudiés lors de la coupe au laser appliquée à un bouleau N de la métho- Paramètres de commande Vitesse maximnale Energie moyenne/W de de coupe impulsionnelle % 1 m/s Tp/ms Te/ms T/ms f/Hz 1 0,1 0,4 0,5 2000 0,5-0,6 15,5 2 0,1 0,7 0,8 1250 0,4-0,5 10,5 3 0,1 1,0 1,1 909 0,2 8,5 1,0 1,0 2,0 500 2,0 33 6 1,0 10 11 91 0,2 12 7 10 10 20 50 0,6 32 8 énergie continue 2,4 61 Les transplants coupés au laser se sont bien déve- loppés. Le stade de développement des bouleaux découpés de différentes manières, au bout de 4 semaines et au bout de 6 semaines de croissance est représenté sur la figure annexée à la présente demande. Cette figure représente un graphique, sur lequel on a porté en abscisses la méthode de coupe de contrôle et en ordonnées le coefficient de développement de la plante. La durée de l'impulsion Tp a été conservée égale à 0,1 ms dans les méthodes de coupe 1-3, mais la phase de ré- tablissement (Te) a été modifiée. Lorsque la coupe a été exé- cutée conformément à la méthode N 1, la phase résiduelle en- tre les impulsions était égale à 0,4 ms, tandis que dans le cas d'utilisation de la méthode N 2, elle était égale à 0,7ms. Il a été possible de conserver la vitesse de coupe presque à la même valeur pour les deux méthodes. La phase allongée de récupération semble améliorer la vitalité du tissu, ce qui s'est manifesté par un coefficient de développement accru. Le développement a semblé être plus efficace dans le cas de l'utilisation des méthodes de coupe 5,6 et 7. Dans l'expérien- ce N 5, une impulsion de longue durée (1,0 ms) et un intervalle de temps assez long (1,0 ms) entre les impulsions lors d'une -1 opération rapide (2 %/ms),ontfourni un bon résultat. L'allon- gement de l'intervalle de 10 ms aux dépens de la vitesse de fonctionnement a fourni le même résultat de développement dans l'expérience N 6. De façon surprenante, l'expérience N 7 a fourni le meilleur résultat de croissance: lors de cette ex- périence on a combiné une impulsion de très longue durée (10 ms) et un intervalle très long (10 ms) entre impulsion à une -1 vitesse modérée de fonctionnement (0,6 %/ms). Un tissu coupé en utilisant une énergie continue de 61 W (expérience N 8) a semblé sedévelopperen moyenne plus faiblement que le tissu coupé avec un faisceau pulsé. Sur la base de ces expériences, on peut conclure qu'un faisceau laser convient bien pour réaliser la coupe de bouleaux. Le développement a été au moins aussi intense que lorsque la coupe a été exécutée avec un couteau. Les pousses ont fait des racines d'une manière normale au cours du déve- loppement qui a suivi la coupe effectuée à l'aide du laser. On a obtenu le meilleur développement au moyen de la commande impulsionnelle du laser conformément à l'expérience N 7, pour laquelle on suppose que le long temps de récupération a empe- ché un chauffage et une combustiontropirmportantsdu tissu. On peut également conclure, sur la base de ces expériences, qu'un faisceau laser oscillant à une basse fréquence endommage le moins les plantes (méthode 7). REVENDICATIONS 1. Procédé pour couper des plantes en vue d'en pro- voquerle développement, caractérisé en ce que la coupe est exécutée en utilisant un faisceau laser. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le développement des plantes est un microdévelop- pement. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le laser utilisé est un laser au CO2. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que la coupe est exécutée en utilisant une énergie continue ou bien grâce à une commande impulsionnelle du faisceau. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'énergie continue utilisée est une énergie située dans la gamme de 30-100 W. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, pendant la commande impulsionnelle, l'énergie mo- yenne varie dans la gamme de 5-40 W. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, caractérisé en ce qu'un gaz protecteur est utilisé autour de la plante à couper. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le gaz protecteur utilisé est un gaz inerte, de préférence de l'azote ou du gaz carbonique.