Brevet FR2620706A1 — publié le 19890324

La pressente invention a pour objet un procédé de traitement par solvants dtADN en phase hétérogéne. On sait que 1'ADN est soluble presqu exclusivement dans l'eau, ce qui rend très difficile, voire impossible, cie lui faire subir des transformations chimiques faisant intervenir des réactions dans des solvants non miscibles à l'eau. On connaît également les difficultés -rencontrées dans l'obtention d'ADN purifié, les procédés mis au point à ce jour faisant appel à une succession d'extractions en phases liquides qui présentent l'inconvénient d'être longues et délicates. Parmi ces procédés, l'un des plus récents consiste à fixer 1'ADN en -solution aqueuse sur les particules d'une poudre de verre au moyen d'un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. Cette fixation se faisant sélectivement permet de séparer 1'ADN des protéines et de 1'ARN en solution qui l'accompagnent généralement, et conduit à l'obtention d'un produit de fixation de 1'ADN sur la poudre de verre, dont on sépare 1'ADN par une élution pratiquée au moyen d'une solution aqueuse. La solution d'ADN ainsi obtenue doit être ensuite soumise à une succession d'opérations de purification, qui consistent généralement en des traitements successifs à la RNase, à la protéinase K, au phénol et au chloroforme, tous opérés en phases liquides. I1 ressort de ce qui précéde que le traitement de 1'ADN se heurte à des difficultés non négligeables, dont la moindre n'est pas le nombre d'opérations successives mises en oeuvre, qui nuit à la rentabilité du traitement, empêchant en particulier la mise au point d'appareillages automatiques susceptibles de faciliter les manipulations et d'en accroître le rendement. La présente invention a pour but de remédier à ces divers inconvénients en proposant un procédé de traitement de 1'ADN qui rend aisée sa manipulation, que celle-ci vise à la modification chimique ou enzymatique de sa molécule ou à l'obtention d'ADN purifié. Le procédé selon l'invention consiste à traiter par au moins un solvant 1'ADN fixé de façon non covalente et réversible sur un support insoluble à la fois dans ledit solvant et dans 1 'eau. Le solvant mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peut être n'importe quel solvant organique ou minéral présentant la particularité de ne pas solubiliser 1'ADN. I1 peut être additionné d'eau ou d'une solution aqueuse d'au moins un sel minéral pouvant renfermer également au moins un agent tampon,un agent chélatant et/ou un agent antioxydant. A titre d'exemple de solvants utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer le chloroforme, l'éthanol, l'isopropanol, le butanol ou encore une solution aqueuse saturée de phénol. L'eau susceptible d'être ajoutée au solvant peut être additionnée par exemple d'une faible quantité de chlorure de sodium, d'EDTA ou de Tris HC1. Le support utilisé pour fixer 1'ADN peut être n'importe quel support finement divisé susceptible de fixer 1'ADN de façon réversible et présentant la particularité de n'être soluble ni dans l'eau ni dans le solvant. A titre d'exemple de tels supports, on peut citer la poudre de verre, et de préférence celle obtenue par broyage de flacons de scintillation, les particules retenues étant celles sédimentant à moins de 0,25 cm/minute, de dimensions égales ou inférieures à 5 microns. L'ADN est fixé sur le support insoluble dans les conditions imposées par la nature dudit support : ainsi, dans le cas où le support est de la poudre de verre, la fixation se fera au moyen d'un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. Dans un but de simplification, le produit de fixation de 1'ADN sur le support sera désigné dans tout ce qui suit par "complexe ADN - support". Dans un premier mode de réalisation du procédé selon l'invention, le complexe ADN - support est soumis à un traitement par solvant en vue d'une modification chimique ou enzymatique de sa molécule au moyen d'un réactif convenable. Dans ce cas, le traitement par solvant conduit à l'obtention d'une suspension, dans ledit solvant, du complexe ADNsupport. La suspension obtenue présente l'avantage de pouvoir être facilement mise en oeuvre dans des réactions chimiques ou enzymatiques visant à modifier la molécule d'ADN. Dans un second mode de réalisation du procédé selon l'invention, le complexe ADN - support est soumis à un traitement par solvant en vue de l'obtention d'ADN purifié. Dans ce cas, le traitement par solvant vise essentiellement à séparer de l'ADN les molécules contaminantes qui s'y trouvent fixées. Ces molécules contaminantes peuvent être entre autres des protéines, de l'agarose, des corps gras ou des agents fluorescents tels que le bromure d'éthidium, utilisés pour le marquage des molécules d'ADN. Le choix du solvant est dans ce cas fonction de l'origine de l'ADN à purifier : ainsi dans le cas où l'ADN est contaminé en majeure partie par des protéines, on utilisera avantageusement du phénol saturé d'eau, tandis que dans le cas où le contaminant est essentiellement constitué de c-orps gras, le solvant sera de préférence du chloroforme. Dans ce second mode de réalisation du procédé selon l'invention, le traitement par solvant du complexe ADN - support est suivi d'une élution de l'ADN du support, opérée au moyen d'eau éventuellement additionnée d'au moins un sel minéral, au moins un agent tampon, au moins un agent chélatant et/ou au moins un agent antioxydant. L'ADN ainsi obtenu est d'une grande pureté, et peut être conservé dans la solution d'élution. Le procédé selon l'invention se trouve illustré par l'exemple non limitatif qui suit, et qui se rapporte à son second mode de réalisation. EXEMPLE Cet exemple décrit l'obtention d'ADN plasmidique de la bactérie "ESCHERICHIA COLI". 1) On prend 1,5 ml de culture de la bactérie que l'on centrifuge et on reprend le culot dans 100 ul de TGE (Tris HCl 25 mM pH 7,5 ; EDTA l0mM ; Glucose 50 mM). Toutes les étapes ultérieures sont réalisées à 4 C. 2) On rajoute 200 > il de solution NaOH 0,2 M SDS 1% et on mélange. 3) On rajoute 150 ul d'acétate de potassium 5 M pH 5, on mélange et on laisse agir 5 minutes. 4) On centrifuge pendant 2 à 5 minutes (centrifugeuse type microfuge), et on récupère 400 yl de surnageant. 5) On rajoute 800 ,ul de solution aqueuse de NaI 8 M et environ 2,5 mg de poudre de verre. On mélange 5 minutes. 6) On centrifuge pendant 1 à 5 minutes et on élimine le surnageant. 7) On reprend le culot dans 400 ul de phénol saturé en eau et on agite pendant 5 minutes. 8) On centrifuge pendant 1 à 5 minutes et on élimine le surnageant (l'étape 7 peut être réalisée deux fois si nécessaire). 9) On reprend le culot dans 400 ul de chloroforme et on mélange pendant 5 minutes. l0-) On centrifuge pendant 1 à 5 minutes et on élimine le surnageant. 11) On reprend le culot dans 1 ml de solution de lavage à 50% d'éthanol, TE, NaCl 0,3M (TE = Tris HCl 10 m M - pH 7,5 ; EDTA 1 mM). On mélange pendant 5 minutes. 12) On centrifuge pendant 1 à 5 minutes et on récupère le surnageant. 13) On reprend le culot dans 50 à 100 )il de TE et cn mélange 5 minutes. 14) On centrifuge pendant 5 minutes et on récupère le surnageant. L'ADN plasmidique obtenu est extrêmement pur, les étapes de traitement à la RNase, à la protéinase K, au phénol, au chloroforme ne sont plus nécessaires. L'PDN ainsi préparé a été testé dans différentes réactions de biologie moléculaire et les résultats obtenus ont confirmé sa haute pureté. Le procédé selon l'invention, ainsi qu'il a déjà té dit, offre l'avantage de permettre le traitement chimique de l'ADN sans recourir à une multiplicité d'opérations délicates et de faible rendement. Il rend également possible l'obtention d'ADN de grande pureté par une suite d'opérations simples, facilement automatisables. Il trouve ainsi une application particulièrement intéressante dans l'élution d'ADN de gels d'agarose, l'isolement d'ADN de diverses origines et la modification chimique de molécules d'ADN. REVENDICATIONS l) Procédé de traitement de l'ADN, caractérisé en ce que l'on traite l'ADN, préalablement fixé de façon non covalente et réversible sur un support, par au moins un solvant dans lequel l'ADN et le support sont insolubles. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est de la poudre de verre. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant-est un solvant organique ou minéral, ou un mélange des deux. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le solvant est additionné d'eau. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 1 'eau ajoutée au solvant renferme au moins un composé choisi dans le groupe que-constituent les sels minéraux, les agents tampon, les agents chélatants et les agents antioxydants. 6) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le solvant est choisi dans le groupe que constituent le chloroforme, l'éthanol, l'isopropanol, le butanol et le phénol en solution aqueuse. 7) Procédé selon la revendication 1, appliqué à la modification chimique de la molécule d'ADN, caractérisé en ce que l'ADN fixé sur le support est soumis à une réaction chimique au sein dudit solvant. 8) Procédé selon la revendication 1, appliqué à l'obtention d'ADN purifié, caractérisé en ce que, postérieurement au traitement par solvant, l'ADN est élué du support par de l'eau éventuellement additionnée d'au moins un composé choisi dans le groupe que constituent les sels minéraux, les agents tampon, les agents chélatants et les agents antioxydants.