Brevet FR2601691A1 — publié le 19880122

La présente invention concerne un nouveau procédé pour la production d'acide L-glutamique qui est largement utilisé comme condiment. L'acide L-glutamique a été fabriqué à l'échelle industrielle par le procédé de fermentation utilisant un micro-organisme appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Avec la fabrication de L-lysine par le procédé de fermentation, on sait que cet aminoacide peut être produit avec des rendements plus élevés par certaines souches appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui sont capables de produire la L-lysine et sont résistantes à une concentration élevée (30 g/dl) d'éthylèneglycol (brevet japonais Kokai n0 115 186, 1983). Cependant, en ce qui concerne la fermentation d'acide L-glutamique, on ne savait pas qu'un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique qui est résistant à une concentration élevée de chlorure de sodium (10 gdL)pouvait produire de l'acide L-glutamique avecunrendement élevé. L'objet de la présente invention est de mettre au point un nouveau procédé de fermentation pour produ -e un L-aminoacide à l'échelle industrielle avec un coût plus faible. Les études effectuées en vue d'améliorer Les procédés classiques de fermentation pour la production d'acide L-glutamique ont permis à la demanderesse d'isoler avec succès des souches ayant une excellente capacité de production d'acide L-glutamique à partir de mutants dérivés d'une espèce productrice d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et capable de pousser en présence d'un sel à haute concentration. La présente invention concerne un nouveau procédé de fermentation pour la production d'acide L-glutamique qui consiste à faire pousser dans un milieu de culture liquide une souche mutante appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium capable de produire l'acide Lglutamique et de pousser même en présence d'un sel à haute concentration ; et à récupérer l'acide L-glutamique formé et accumulé dans ledit milieu liquide.Des exemples de mutants utilisés dans le procedé selon l'invention et capables de pousser même en présence d'un sel à haute concentration comprennent Brevibacterium lactofer mentum AJ 12300 (FERM P-8846, FERM BP-1363) et Corynebacterium glutamicum AJ 12301 (FERM P-8847, FERM BP-1364) capables de pousser en présence d'une concentration élevée du chlorure de sodium. Les mutants identifiés ci-dessus par des numéros FERM-P ont été déposés initialement le 10 juillet 1986 à l'institut de Recherche sur la Fermentation, agence des Sciences Industriel les et de la Technologie, Ministère du Commerce International et de l'industrie (FRI), 1-3 Higashi 1-chome, Vatabe-machi, Tsukubagun, Ibaragi-ken, au Japon et ont reçu les numéros FERM-P indiqués ci-dessus.Les dépôts de mutants ont ensuite été convertis en dépôt selon le traité de Budapest le 15 mai 1987 et ont reçu les numéros FERM-BP correspondants. Ces couches constituent un autre objet de l'invention. Ces souches ont été induites à partir de Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) et Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) en utilisant une méthode de mutation. Les autres souchesmères dont dérivent les mutants utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent des micro-organismes producteurs d'acide Lglutamique de l'espèce Brevibacterium, par exemple B. flavum (ATCC 14067), B. devaricatum (NRRLB-2311) et B. saccharolyticum (ATCC 14066); de l'espèce Corynebacterium, par exemple C. acetoacidophilum (ATCC 13870) et C. acetiglutamicum (ATCC 15806); et Microbacterium ammoniaphilum (ATCC 15354). L'irradiation par les ultraviolets, les rayons X et d'autres rayonnements, le traitement par un agent mutagène et toutes autres techniques couramment utilisées pour la mutation des micro-organismes peuvent être utilisées pour obtenir les souches mutantes selon L'invention à partir des souches-meres mentionnées ci-dessus. On citera par exemple le traitement par 250 ,ug/ml de Nnitro-N'-méthyl-N-nitrosoguanidine à 300C pendant 20 min. On entend dans la présente invention par sels à haute concentration les sels qui, Lorsqu'on les ajoute à un milieu liquide, élèvent sa pression osmotique, retardant ou arrêtant ainsi la croissance d'un microorganisme dans ce milieu.On citera à titre d'exemples les composés suivants : chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure d'ammonium, chLorure de magnésium, chlorure de calcium, chlorure ferreux, chlorure ferrique, chlorure de manganèse (II), sulfate d'ammonium, sulfate de sodium, sulfate de potassium, sulfate ferreux, sulfate ferrique, sulfate de magnésium, phosphate monopotassique, phosphate dipotassique, phosphate monosodique, phosphate disodique, phosphate d'ammonium, glutamate de sodium, glutamate d'ammonium et les polyalcools et acides organiques donnant une pression osmotique égale ou supérieure à celle d'une solution de chlorure de sodium à 10,0 g/dl sont également utiles à la place des sels, par exemple, sorbitol, saccharose, fructose, glucose, acide fumarique, acide citrique et éthylèneglycol, etc.On entend dans l'invention par mutants capables de pousser en présence d'un sel à haute concentration les souches mutantes qui peuvent pousser dans un milieu de culture solide ou liquide contenant un sel à haute concentration comme mentionné ci-dessus dans des conditions qui inhibent la croissance des souches-meres correspondantes. Le tableau I ci-dessous donne à titre d'exemples les résultats d'un essai de culture en présence de chlorure de sodium à haute concentration. TABLEAU I Conditions de croissance NaCl Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum (gdl) ATCC 13869 1 AJ 12300 | ATCC 13032 AJ 12301 8,0 ++ - +++ ++ 9,0 + ++ + ++ 10,0 + + + + 11,0 + + 13,0 +# # (+++) : pousse très- bien ; (++) : pousse bien (+) : légère croissance ; tt) : peu ou pas de croissance. Les conditions de croissance pour chaque souche indiquées dans le tableau I sont évaluées de la manière suivante. On stérilise à 1200C pendant 20 min des milieux de culture contenant 1 % de polypeptone, 1 % d'extrait de levure, 0,5 à 20,0 X de chlorure de -sodium et 2 % de gélose (pH 7,0) pour préparer des plaques de gélose. Chaque souche, préalablement cultivée dans un milieu incliné au bouillon pendant 24 h, est mise en suspension dans l'eau stérile, la suspension ainsi obtenue est inoculée à chaque plaque de gélose préparée ci-dessus (100 à 200 cellules par plaque), on continue l'incubation à 31,50C pendant 48 h et on mesure la dimension de la colonie qui s'est développée. On peut faire pousser les souches ainsi choisies, capables de pousser en présence d'un sel à haute concentration,pour produire de l'acide Lglutamique par des techniques connues couramment utilisées pour la fermentation d'acide L-glutamique. On peut utiliser à cet effet des milieux de culture courants contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions inorganiques et d'autres substances nutritives. On peut citer à titre d'exemples de sources de carbone les jus de betterave et de canne à sucre, la mélasse résiduaire, l'hydrolysat d'amidon et d'autres sucres ; et des acides organiques comme l'acide acétique. On peut utiliser des sels d'ammonium, l'ammoniac, l'urée et d'autres sources d'azote couramment utilisées pour la çermentation d'acide L-glutamique. En outre, on peut ajouter au milieu de culture selon le besoin,des ions inorganiques (par exemple ion phosphate et ion magnésium).On peut également utiliser la biotine (ou une substance à activité de biotine la condition que sa quantité ne dépasse pas la teneur maximale admissible pour une croissance satisfaisante de la souche cultivée ; on ajoute une pénicilline (G, F, K, O, V ou X) ou un agent tensioactif du type ester d'acide gras supérieur (par exemple monopalmitate de saccharose et monopalmitate de polyoxyethylènesorbitanne) comme inhibiteur de biotine lorsque l'on utilise comme source de carbone une mélasse résiduaire ou d'autres substances contenant de trop fortes quantités de biotine.Les conditions de culture sont égale- ment les mêmes que celles couramment utilisées pour la fermentation d'acide L-glutamique ; à savoir, des conditions aérobies à une température dans la gamme de 30 à 400C et à un pH dans la gamme de 6 à 8,5. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On prépare un milieu de culture contenant 50 mg/ml de glucose, 2 mg/ml d'urée, 1 mg/ml de KH2P04, 0,4 mg/ml de MgS04,7H20, 10 pg/ml de FeS04,7H20, 10 pg/ml de MnS04,4H20, 5 pl/ml d'hydrolysat acide de protéines de haricots ("Mieki"), 100 pg/l de chlorhydrate de thiamine, 2,5 pg/ml de biotine et 25 mg/ml de NaCI. On place 20 ml de ce milieu dans des flacons de secoueuse de 500 ml et on stérilise par chauffage à 1-150C pendant 10 min. On inocule ce milieu avec chacune des souches énumérées dans le tableau II et on continue la fermentation à 31,5 0C pendant 30 h sur une secoueuse à va-et-vient.Le pH du milieu de culture est maintenu dans la gamme de 6,0 à 8,5 pendant cette durée par addition de petites portions d'une solution aqueuse à 450 mg/ml d'urée. Les rendements en acide L-glutamique accumulé dans la liqueur de fermentation, rapportés au sucre consommé, sont indiqués dans le tableau il. Comme on peut le voir d'après le tableau II, les souches mutantes capables de pousser même en présence d'un sel à haute concentration accumulent l'acide L-glutamique en plus grandes quantités. TABLEAU II Souche Rendement, rapporté au sucre consommé (%) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 41,0 AJ 12300 43,5 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 38,0 AJ 12301 41,0 Exemple 2 On prépare un milieu de culture contenant 60 mg/ml (en glucose) de mélasse résiduaire, 1 mg/ml de KH2P04, 1 mg/ml de MgS04,7H20, 100 pg/l de chlorhydrate de thiamine et 25 mg/ml de NaCI (pour augmenter la pression osmotique) (pH 7,0). On place 20 ml de ce milieu dans des flacons de secoueuse de 500 ml et on stérilise par chauffage à 115 C pendant 10 min.On inocule ce milieu avec chacune des souches énumérées dans le tableau III et on continue la fermentation à 31,5 C pendant 36 h sur une secoueuse å va-et-vient. On maintient le pH du milieu de culture dans la gamme de 6,0 à 8,5 pendant cette durée en ajoutant par petites portions une solution aqueuse à 450 mg/ml d'urée. On ajoute du monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitanne (PESP) lorsque l'absorption à 562 nm d'une solution diluée à 1 : 26 de la liqueur de fermentation atteint 0,30. Les rendements en acide L-glutamique accumulé dans la liqueur de fermentation, rapportés au sucre consommé, sont indiqués dans le tableau III. Comme on peut le voir d'après le tableau III, les souches mutantes capables de pousser même en présence d'un sel à haute concentration accumulent l'acide L-glutamique en quantités plus grandes. TABLEAU III Souche Rendement, rapporté au sucre consommé (%) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 38,5 AJ 12300 43,5 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 37,0 AJ 12301 40,5 Exemple 3 On prépare un milieu de culture à pH 7,0 contenant 150 mg/ml (en glucose) de mélasse résiduaire, 1 mg/ml de KH2P04, 1 mg/ml de MgS04,7H20, 100 pg/ml de chlorhydrate de thiamine, 0,02 ml/l d'un agent antimousse et 50 mg/ml de sorbitol. On place 300 ml de ce milieu dans un fermenteur de 1 I et on stérilise par chauffage à 12O0C pendant 10 min. On inocule ce milieu avec chacune des souches énumérées dans le tableau IV ci-après et on continue la fermentation à 31,50C avec aération et agitation. On maintient le pH du milieu de culture à 7,8 par injection de gaz ammoniac et on ajoute du PESP lorsque l'absorption à 562 nm d'une dilution à 1 . 26 de la liqueur de fermentation atteint 0,35. Les rendements en acide L-glutamique accumulé dans la liqueur de fermentation, rapportés au sucre consommé, sont énumérés dans le tableau IV ci-après. Comme on peut le voir d'après le tableau IV, les couches mutantes capables de pousser même en présence d'un sel à haute concentration accumuLent l'acide L-glutamique en plus grandes quantités. TABLEAU iV Souche Rendement, rapporté au sucre consommé, (%) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 39,5 AJ 12300 43,0 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 38,0 AJ 12301 40,5 il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de fermentation pour la production d'acide Lglutamique, caractérisé en ce que l'on fait pousser un mutant appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium dans un milieu liquide en conditions aérobies et on récupère l'acide Lglutamique formé et accumulé dans ledit milieu liquide, ledit mutant étant capable de pousser à 31,5 C pendant 48 h dans un milieu de culture contenant 1,0 % de polypeptone, 1,0 X d'extrait de levure, 2,0 % de gélose et 10 g/dl ou plus de chlorure de sodium et capable de produire de l'acide glutamique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est choisi parmi Brevibacterium lactofermentum AJ 12 300 (FERM BP-l 363) et Corvnebacterium slutamicum AJ 12301 (FERM BP-l 364). 3. Mutant appartenant au genre Brevibacterium, caractérisé en ce qu'il est Brevibacterium lactofermentum AJ 12 300 (FERM BP-1 363). 4. Mutant appartenant au genre Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il est Corynebacterium nlutamicum AJ 12 301 (FERM BP-l 364).