Brevet FR2599038A1 — publié le 19871127

La présente invention concerne un procédé de préparation en phase liquide de nonacosapeptides ayant une activité GRF et des peptides intermédiaires pour la ise en oeuvre dudit procédé. Le GRF ou hGRF ou hpGRF (human pancreatic Growthhormone Releasing Factor) ou somatocrinine est un peptide constitue par l'enchainement de 44 amino acides. Sa séquence est la suivante 1 5 10 15 H-Tyr-Ala-Asp-Ala- I le-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Gly 20 25 30 Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln 35 40 44 Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Il a été découvert par A.GUILLEMIN et Coll., Scien ce, 1982, 218, 585-587, à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine.Ce peptide est particulidrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier, son efficacité se manifeste à des doses de quelques femto moles/ml (ED50 = 15 femto moles/ml). L'intérAt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique proteique, par exemple ulcère de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brulûres étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéoporoses. Par la suite, il a été montré que des peptides plus courts maintenaient l'activité biologique de base. Tout particulièrement, la séquence des 29 premiers acides aminés avec la terminaison amide, hGRF(1-29)-NH2, présente une activité très proche du hGRF (1-44)-NH2 (Rivier et ai., Nature, 1982, 300, 276-278). I1 est également connu que la Met-27 du hGRF (1-29)-NH2 peut être avantageusement remplace par-Nle ou Ile pour obtenir des produits ayant une stabilité chimique (oxydation par l'oxygène) et une résistance à la dégradation enzymatique supérieures à celles de la séquence naturelle, tout en possédant une activité intrinsèque équivalente. Selon ce qui est indiqué dans la littérature, le GRF(1-29)-NH2 et ses analogues Nie-27 et Ile-27 ont été synthétisés en phase solide mais cette technique n'est pas souhaitable pour une production des produits ci-dessus en quantités importantes. Des synthèses en phase liquide desdits produit t n'ont pas été décrites en littérature. Par ailleurs, l'enchaî- nement de 29 acides aminés par voie séquentielle en phase liquide présente des difficultés On a maintenant trouvé que le hGRF(1-29)-NH2 et ses analogues Nle-27 et Ile-27 peuvent être préparés par une synthèse par fragments en phase liquide qui peut être transposée à l'échelle industrielle et qui permet d'obte- nir les produits souhaités avec des rendements et puretés excellents. Les acides alpha-aminés sont représentés ci-après par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de l'IUPAC-IUB section biochimie. Ala : Alanine Arg : Arginine Asn : Asparagine Asp : Acide aspartique Gln : Glutamine Gly : Glycine Ile : Isoleucine Leu : Leucine Lys : Lysine Met : Methionine Phe : Phenylalanine Ser : Serine Thr : Thréonine Tyr : Tyrosine Val : Valine Nle : Norleucine A l'exception de la glycine, ils sont tous de configuration L. On utilisera également, ci-après, les abréviations suivantes: THF : Tétrahydrofuranne AcOH : Acide acétique HBr : Acide bromhydrique CCM : Chromatographie sur couche mince OBzl : Ester benzylique Z : Benzyl-oxycarbonyle (carbamate) Boc : Tertiobutoxy-carbonyle(carbamate) DMF : Diméthyl-formamide NEM : N-éthyl-morpholine TFA : Acide trifluoroacétique AcOEt : Acétate d'éthyle 2-Br-Z : Bromo-2 benzyloxycarbonyle 2-Cl-Z : Chloro-benzyloxycarbonyle AAA : Analyse d t acides aminés Cha : Cyclohexylamine DCCI : Dicyclohexylcarbodiimide DCU : Dicyclohexylurée ONSu : Ester activé avec le N-Hydroxy-succinimide ONp 6 Ester activé avec le para nitro-phénol OTcp : Ester activé avec le2,3,5-trichloro-phénol Mts : Mesitylène-sulfonyle OHBT :N-hydroxy-benzotriazole ONb Ester activé avec le N-hydroxy-norbornène-5 dicarboximide-2, 3 BOP : Hexafluorophosphate de benzc-triazolyloxy- tris (diméthylamino) phosphonium T.A. : Température ambiante EPP : Pureté polypeptidique DIPEA : Diisopropyl-éthyl-amine TFMSA : Acide trifluorométhane sulfonique Les dénominations Sephadex et Biogel des résines échangeuses d'ions sont des marques. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un nonacosapeptide de formule H-Tyr-Ala-Asp-Ala-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln Asp-Ile- (A) -Ser-Arg-NH-2 (I) dans laquelle (A) représente Met, Nle ou Ile, et de ses sels pharmaceutiquement acceptables, dans lequel on couple un tripeptide protégé II' dérivé du tripeptide II de formule X-Arg-Lys-Leu-NH-Nh2 (II) dans laquelle X représente un groupe N-protecteur la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine dudit tripeptide II' etant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les condi- tions de déprotection du groupement X, avec un heptapeptide protégé de formule III' dérivé de l'heptapeptide de formule III H-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (III) dans laquelle (A) est tel que défini cimdessus @ les fonc- tions laterales de l'acide aspartique et de l'arginine de l'heptapeptide protégé III', étant protégées par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupe X, ou, dans le cas de l'arginine, par protonation. Après clivage du groupe protectauxX, on couple le décapeptide protégé IV' ainsi obtenu dérivé du décapaptide de formule IV : H-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (IV dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de la lyeine et de l'arginine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un pentadécapeptide protégé V' dérivé du pentadécapeptide de formule V X-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V) dans laquelle X est un groupe Nwprotecteur, les fonctions latérales de la lysine et de l'argînine dudit pentadecapeptide étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement X.Ensuite, après clivage du groupe protecteur X, on couple le pentacosapeptide protégé VII ainsi obtenu dérivé du pentacosapeptide de formule VI H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-(A) Ser-Arg-NH2 (VI) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de l'arginine et de la lysine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un tétrapeptide protégé VII', dérivé du tétrapeptide de formule VII X'-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH (VII) dans laquelle X' représente un groupe N-protecteur et la fonction acide latérale de l'acide aspartique du tétrapeptide VII' étant protégée.Lesdits couplaques sont effectuée dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage. Enfin on soumet le nonacosapeptide ainsi obtenu, dans lequel toutes les fonctions latérales sont protégées a une déprotection, on isole le produit de formule I ainsi obtenu et on le transforme éventuellement en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Le groupe X peut etre un groupe protecteur quelconque utilisé dans la chimie des peptides dans l'opération d'élongation des chaînes, le groupe Boc étant particulièrement préféré Le groupe X' peut être le même groupe X, mais il est préférable qu'il soit différent, de façon à ouvoir être clivé en même temps que les groupes protecteurs de acide aspartique, de la lysine et de l'arginine déjà présents dans les composés VI' et VII' Au niveau de la déprotection terminale en fin de séquence, tous les groupes protecteurs sont éliminés, de préférence par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique. Comme groupement protecteur de la fonction latérale de l'arginine, on utilise de préférence le Mts, mais on peut également protéger ladite fonction par simple protonation ou par un groupement nitro qui doit cependant être clivé le plus t8t possible. Les fonctions acides carboxyliques des chaînes latérales de l'acide aspartique sont protégées par des groupements clivables par hydrogénation catalytique par exemple par H2/Pd/charbon ou bien en milieu acide fort comme les mélanges acide méthanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique, ou acide trifluorométhanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique. Les groupes protecteurs préférentiels sont l'ester benzylique (OB21) ou l'ester 2,6 di chlorobenzylique. Ces groupements protecteurs sont stables dans. les conditions de déprotections intermittentes des amines en alpha comme par exemple dans le cas de l'élimination des groupements Boc par l'acide trifluoracétique. Les fonctions amines des chaines latérales des lysines sont protégées par des groupements clivables dans les mêmes conditions que précédemment. Les groupements benzyloxycarbonyle (Z), 2-chloro-ou 2-bromo benzyloxycarbonyL (2 - Cl-Z ou 2 - Br-Z), stables dans les conditions de déprotection intermittente par l'acide trifluoroacétique, sont particulièrement préférés. Les fonctions hydroxyles présentes dans la thréonine, la sérine et la tyrosine, ne sont pas protégées. L'ensemble du procédé de la présente invention est représenté par le schéma suivant utilisant des groupes protecteurs préférentiels. Boc-Arg(Mtz)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 (II") H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(E+)-NH2 Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser (III") -Arg(H+)-NH2 H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser -Arg(H+)-NH2 (IV") puis H+ Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val -Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V"). BOP puis H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln -Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 (VI") + Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (VII") hGRF (1-29)-NHo BOP puis H+ fort Arg(H+) représente le radical dérivé de l'amino acide arginine dans lequel le groupe guanidino de la channe latérale est protégé par protonation. Dans le procédé de synthèse de la présente invention on applique le principe de la protection minimale au niveau des channes latérales fonctionnalisées. L'élongation du peptide à partir des fragments synthétisés est réalisée en utilisant un agent de couplage comme l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy tris (diméthylamino) phosphonium (BOP), la dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxy-1 benzotriazole, ou la méthode aux carboxyazides (Curtius) dans un solvant approprié comme le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tie ant insolubilisant tel que éther ou l'acétate d'éthyle, qui précipite le peptide. On se limite pendant les étapes de couplage A des purifications sommaires du type lavages en phase solide à a l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer de légers excès du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage. Chaque opération de couplage daun fragment est suivie d'une phase de déprotection du groupement protecteur1 le groupe Boc de préférence, au niveau de l'amine sur laquelle va être effectue le couplage suivant. La déprotection au niveau du groupement X est effectuée selon des méthodes connues.Le Boc est clivé par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène (50/50 en volume) Les déprotections des channes latérales en fin d'élongation du peptide peuvent être effectuées par hydrogénation catalytique, en utilisant par exemple Pd/C, à l'aide d'hydrogène gazeur sous légère pression (1 à 5 kg) ou bien avec un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium Il est également pos- sible d'éliminer ce type de groupements protecteurs par un acide fort comme les mélanges d'acide méthanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M) ou bien d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M). Le produit de formule I, , après les déprotections ter minales, est purifié par filtration sur gel Sephadex G 50 à l'aide de l'acide acétique à 30 %. Les fractions @@@@- chies en produit de formule I sont réunies et soumises@@ une chromatographie sur échangeurs d ions (cations) du type carboxy et à l'aide d'un gradient à force ionique croissante adaptée au type de résine échangeuse d'ions utilisée. Les fractions de plus haute pûreté sont réunies et purifiées, soit par chromatographie de partition sur un support approprié du type Séphadex G 50 ou Biogel P 10, soit par la distribution à contre-courant.Les fractions dont le titre de pureté est jué satisfaisant par EPLC analytique sont réunies Les autres sont recyclées Une variante au procédé consiste à remplacer la chromatographie de partition ou la distribution à contre courant par la HPLC préparative sur un support et avec un tampon appropriés. Les différents fragments de formules IV' et VI' et sous-fragments de formules II' et III' intervenant dans le procédé de la présente invention du GRF sont synthétisés selon une stratégie adaptés à chaque ces Les stratégies utilisées pour la synthèse des sous- fragments II' et III' sont celles reportées dans les tableaux I, II ci-après. Les fragments V' et VII' sont decrits dans la demande de brevet européen publiée sous le numéro 171 315. Le fragment de formule VI' et les sous fragments de formules II', III' et IV' sont nouveaux et représentent des intermédiaires utiles dans la préparation du hGRF(1-29)-NH2 et de ses analogues Nle-27 et Ile-27. Ils rentrent dans le cadre de la présente invention. Ainsi, selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un peptide protégé II' dérivé du peptide de formule X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 (il) dans lequel X est un groupe protecteur et la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par protonation ou par groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement X. et un peptide de formule X"-Q-'R-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (VIII) dans laquelle - R représente une liaison directe ou Arg-Lys-Leu-, - O représente une liaison directe ou Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu Ser-Ala - (A) représente Met, Nie ou lie - X" représente l'hydrogène ou le groupe N-protecteuz X, Q étant obligatoirement une liaison directe lorsque R est une liaison directe, ainsi que ses dérivés protégés dans iesquels les fonctions latérales de Asp, Arg et Lys éventuellement présentes dans ledit peptide sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de clivage du groupe N-protecteur X. Les sels du peptide de formule VIII où X" représente l'hydrogène rentrent également dans le cadre de la présente invention. Le groupe protecteur représenté par X est de préférence le groupe Boc. Les groupes protecteurs des acides aminés Asp, Lys et Arg sont de préférence ceux qui sont indiqués ci-dessus. Des peptides particulièrement préférés sont représentés par les formules suivantes: Boc-Arg (Mts) -Lys (Z) -Leu-NH-NH2 H-Leu-Gln-Asp (OBzl) -Ile-(A) -Ser-Arg (H+) -NH2 H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser -Arg(H+)-NH2 H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly -Gln-Leu-Ser-Ala- rg(Mts)-Lys(Z)-Leu Leu-Gln-Asp(OBzl) -Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 dans lesquelles (A) est Met, Ile ou Nie, de préférence Met ou Nle. TABLEAU I: SOUS FRAGMENT III' Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg | | | | | | | NO2 | | | | | | Z | OH | | | | | | |# NO2 | | | | | | | | | | | | | Z | NH2 | | | | | | HBr/AcOH |# | | | | | | | NO2 | | | | | Doc-SeR-ONb H | NH2, HBr | | | | | | # | NO2 | | | | | Boc | | NH2 | | | | | | # TFA | NO2 | | | | Doc-Met-ONp + H | | NH2, TFA | | | | | # | | NO2 | | | | Doc | | | NH2 | | | | | TFA # | | NO2 | | | Doc-Ile-ONsu + H | | | NH2, TFA | | | | | # | | NO2 | | | Doc | | | | NH2 | | | | | # TFA | | NO2 | | | H | | | | NH2, TFA | | | OBzl | | # H2/Pd | | H+ | | Boc-Asp-ONsy + H | | | | NH2 | | | OBzl | | | | H+ | | Boc | | | | | NH2 | | | OBzl | # TFA | | | H+ | Boc-Gln-ONp + H | | | | | NH2, TFA | | # | OBzl | | | | H+ | Boc | | | | | | NH2 | | | OBzl # TFA | | | | H+ Buc-Leu-ONSu + H | | | | | | NH2, TFA | | | OBzl | | | | H+ Boc | | | | | | | NH2 | | | OBzlTIA # | | | | H+ H | | | | | | | NH2 TABLEAU il :SOUS FRAGMENT Il' Arg Lys Leu Z Boc0Tcp H ~ OMe, HC1 z Boc OH Boc g OMe : : : ; 'SFA Mts z > Z TFA BOY /OH H / OMe, TFA : DCC/NSuQH: ts DCC/NSuOH: M Z Boc / / r OMe t NH2NH2 t Mts : Z 4 O Boc NH-NH2 2 Le procédé de la présente invention étant basé sur le principe d'une synthèse par fragments en phase liquide, présente l'avantage de permettre la synthèse en parallèle de ces fragments, ce qui se traduit par un gain notable de temps et une transposition aisée à grande échelle. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont effectuées sur des plaques de silice Merck 60F 254 (5 x 7,5 cm). EXEMPLE I : SYNTHESE DU PEPTIDE III" H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 1 ) Z-Arg(NO2)-NH2 On dissout 30 g de Z-Arg(NO2)-OH dans 200 ml de THF contenant 23 ml de n tributylamine. On ajoute 9,8 ml de chloroformiate d'éthyle puis, après agitation pendant 10 min et refroidissement à + 50C, on ajoute 19 ml d'ammoniaque à 28%. On maintient l'agitation et la température pendant 2 h, puis le solide est essore, lavé à l'éther, séché. Rendement : 25,2 g t 80 % CCM : chloroforme-MeOH-AcOH (60/20/15) ; Rf : 0,25 2 ) H-Arg(NO2)-NH2, HBr On dissout 25,2 g de Z-Arg(N02)-NH2 dans 260 ml d'AcOH à 33 % HBr On agite 30min, puis on précipite le produit par addition d'éther. I1 est essoré, lavé à l'éther et séché. Rendement : 22,8 g ; (97 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf = 0,16 3 ) Boc-Ser-Arg(NO2)-NH2 On dissout 20 g de H-Arg(NO2)-NH2, HBr et 22,9 g de Boc-Ser-ONb dans 250 ml de DMF. On maintient le pH à 6,5 par addition de NEM à T.A. On contrôle la fin de la réaction par CCM après 3 h.Le milieu est évaporé à sec et repris dans le chlorure de méthylène. Un solide précipite. Il est décanté, repris dans l'éther, essoré, lavé à l'éther et séché. Rendement : 22,8 g t (84 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,60 4 ) H-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA On dissout 10,5 g de Boc-Ser-Arg(NO2)-NH2 dans 130 ml solution 50/50 chlorure de méthylène - TFA, refroidie à + 100C. On agite 60 min à T.A.. On évapore sous vide et le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther et snché. Rendement : 9,46 g ; (86 %) CCM : :-BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf -= 0,14 5 ) Boc-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2 On dissout 43 g de H-Ser-Arg(N02)-NH2, TFA et 38,1 g Boc-Met-ONp dans 450 ml DMF. On ajoute 1,14g d'OHBT et on agite 18 h à T.A. en maintenant le pH à 6,5 par NEM.Après contrale CCM, le milieu est évaporé à sec, repris par .1'AcOEt. Un produit précipite, l'-AcOEt est décanté, remplacé par de l'éther, puis le solide est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther et séché. Rendement : 38,5 g ; (70 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,62 6 ) H-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA On dissout 38 g de Boc-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2 dans 400 ml d'un mélange 50/50 de chlorure de méthylène/TFA contenant 10 % d'éthane dithiol, refroidi à + 100C. On agite 45 min ? T.A., puis on évapore et on précipite le produit par addi- tion d'éther. Il est essoré, lavé à à l'éther, séché. Rendement : 38.4 g ; (98 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : : 0,07 7o) Boc-Ile-Met-Ser-Arg(NO2)-NH) On dissout 4,5 g H-Met-Ser-Arg(N02)-NH2, TFA et 3,03 g Boc-Ile-ONSu dans 50 l de DMF . On maintient le pH à 6,5 par NEM.18 h. Après contrôle de la fin de réaction, on évapore à sec et on précipite le produit par addition d'AcOEt. il est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther et seche. Rendement : 4,1 g ; (77 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) t Rf : 0,62 80) H-Ile-Met-Ser-Arg(NO2)-NH2, TFA On dissout 13,7 g de Boc-Ile-Met-Ser-Arg(No2)-Leu-NH2 dans 150 ml d'un mélange 50/50 chlorure de méthylène/TFA à 10 % d'éthane dithiol, refroidi à + 10 C. Le milieu est agité 45 min à T.A., , évaporé à sec, précipité par addition d'éther. Le produit est essoré, lavé à l'éther, séché; Rendement : 14 g ; (100 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf : 0,14 9 ) H-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA On dissout 19,7 g de H-Ile-Met-Ser-Arg (N02)-NH2, TFA dans 200 ml d'eau, on ajoute 60 ml de HClIN et 40 g de Pd/C a 10 % (50 % humide). On hydrogène 48 h (100 mm Hg). On essore et on lave le catalyseur à l'eau. On ajoute de la résine IR 45 OH jusqu'à amener le pH à 8,5. On essore et on lave la resine. On dégaze le milieu. On vérifie l'absence de NH4+ et on lyophilise. RENDEMENT : 11,5 g ; (77 %) CCM : nBuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48)-;- Rf 0,50 AAA : Ser ; 0,93 - Met : 1,01 - ile : 1,00 - Arg : 1,07 10 ) Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 On dissout 7 g de H-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA dans 80 ml de DMF, et on ajoute goutte à goutte 6 g de Boc-Asp(OBzl)-ONSu dans 30 ml de DMF en maintenant le pH à 6,5 par addition de NEM. Le milieu est agité à T.A. en maintenant le pH à 6,5 par NEM durant 18 h. Après contrale CCM, le milieu est évaporé à sec et le produit précipité par addition d'AcOEt. I1 est essoré, lavé AcOEt, éther, séché. CCM : BuOH--2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf- : 0,56 110) H-Asp(OBzl) -Ile-Met-Ser-Arg (H+)-NH2, TFA On dissout à +10 C, 8,75 g de Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 dans 90 ml d'un mélange 50/50 chlorure de méthylène/TFA à 10 % d'éthane dithiol. On agite 45 min à T.A. On évapore à sec et précipite le produit par addition d'éther. On essore, lave et sèche le produit obtenu. Rendement : 8,9 g ; (100 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H20 (71/7/21) ; Rf : 0,28 12 ) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 On dissout 8,9 g de H-Asp(OBzl) Iie-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 4,3 g de Boc-Gln-ONp dans 100 ml de DMP. On ajoute 0,2 g d'OHBt et on agite à T.A. 18 h en maintenant le pH à 6,5 par NEM. Après évaporation à sec, le produit est précipité par addition d'AcOEt, essore', lavé avec AcOEt et l'éther, puis séché. CCM : BuOH-2/AcOH/H O (71/7/21) ; Rf : 0,43 2 130) H-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA. On dissout à + 100C, 8,33 g de Boc-Gln-Asp(OBzl) Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 dans 90 mi d'un mélange 50/50 chlorure de méthylène/TFA à 10 % d'éthane dithiol. On agite 45 min à T.A., puis on évapore le milieu. Le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther et séché. Rendement : 8,8 g ; (100 %) CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H2o (60/12/12/48) t Rf : 0,3 14 ) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 On dissout 5,5 g de H-Gln-Asp(OBzl) Ile-Met-Ser-Arg(H+) -NH 2, TFA, 2,3 g de Boc-Leu-ONSu dans 50 ml DMF. On maintient le pH à 6,5 18 h par addition de NEM. Après contrôle de fin de réaction, on évapore. Le produit est précipité par addition d'AcOEt, essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther, et séché. Rendement @ 3,1 g , (84 %) CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48) t Rf = 0t77 15 ) H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA On dissout 5 g de Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met Ser-Arg(H+)-NH9 à + 100C dans 60 ml d'un mélange 50-/50 de chlorure de méthylène/TFA à 10% d'éthane dithiol. Le milieu est agité à T.A., 45 min, puis évaporé. Le produit est précipité par adition d'éther, essoré, lavé à l'éther, séché. RENDEMENT : 5 g ; (98 %) CCM : n BuOH/pyridine/AcOH/H20 (60/12/12/48) Rf : 0,37 EXEMPLE II : SYNTHESE DU PEPTIDE II" Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 (II") 1 ) Boc-Arg(Mts)-OH, Cha 50 g de Boc-Arg-OH, HC1, H2O (0,152 M) sont dissous dans 190 ml de soude 4 N (pH 13-14). On ajoute 1.200 ml d'acétone et refroidit l'ensemble à -50C, dans un mélange glace + sel.A la solution précédente, on ajoute sous bonne agitation en 1 h, 66 g de chlorure de mésitylène sulfonyle soit 0,3 M, en solution dans 300 ml d'acétone; En fin d'addition, on agite encore 1 h à -50C, puis on amène le pH de 8 à 11-12 par addition de soude 4N. On supprime le bain réfrigérant et laisse revenir progressivement à T.A. On poursuit l'agitation pendant 2 h 30 et rajoute 200 ml d'eau, pour dissoudre le précipité de chlorure de sodium, formé en cours de réaction. Un contrôle en CCM chloroforme/méthanol/acide acétique 87/7/3 indique que la réaction est terminée. On évapore l'acétone au maximum sous vide (25 mm Hg) à 30 C. Le résidu est dilué dans 500 ml d'eau, et on extraitl'ensemble par de l'acétate d'éthyle (2 x 400 ml), pour éliminer l'excès de chlorure de mésitylène sulfonyle. La solution aqueuse est traitée, en présence de 1000 m d'acétate d'éthyle, par une solution saturée de KHSO4, le pH passe de 9 à 3. L'acétate d'éthyle est décanté, et on extrait la phase aqueuse par 3 x 500 ml d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle sont réunies, lavées par des solutions aqueuses de KHSO4-K2S04 à 5 % (2 x 300 ml), H2O (3 x 300 ml), puis séchées sur sulfate de magnésium.La solution ( 2.500 ml d'acétate d'éthyle) est filtrée et conservée au réfrigérateur jusau'au lendemain. On reprend la solution précédente et on la concentre -sous vide (25 mm Hg) jusqu'd 500 ml. On rajoute à froid 18 ml de cyclohexylamine : le produit précipite sous forme d'une gomme blanche. On rajoute quelques gouttes de cyclohexylamine pour que le pH passe de 6 à 8. On évapore l'acétate d'éthyle sous vide, et obtient une gomme; les dernière s traces de solvant sont éliminées sous videpoussé. Le solide s'organise ; on le reprend dans 500 ml d'éther éthylique et triture l'ensemble : on obtient ainsi un solide blanc qui est essoré et séché. CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique 87/7/3 Tache unique RENDEMENT : 71 % ; Poids : 60 g 20) Boc- rg(Mts)-OH 300 g de Boc-Arg(Mts)-OH, Cha (0,54 M) sont dissous dans 3000 ml d'acétate d'éthyle. On y rajoute 1000 ml d'eau et acidifie au pH-mFtre jusqu'd pH 2, par addition d'une solution saturée de KHSO4. On décante l'acétate d'éthyle, et on extrait la phase aaueuse avec de l'acétate d'éthyle (2 x 500 ml). On réunit les phases d'acétate d'éthyle, lave à l'eau (2 x 300 ml), sèche la phase organique sur sulfate de magnésium. On évapore au rotavapor sous vide de 25 mm de Hg à 300C. On obtient une gomme semi-cristallisée qui est triturée dans le pentane (2000 ml), au mixeur jusqu'à l'obtention d'une poudre, qui est isolée par essorage. Rendement : 73 % ; Poids : 180 g ; CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique (87/7/3) 1H RMN conforme. 3 ) Boc-Lys(Z)-Leu-OCH3 Dans 1600 ml d'acétate d'éthyle refroidis à + 100C, on dissout - 54,5 gde H-Leu-OCH3, HCl (soit 0,3 M) - 42,2 ml de N-éthyl morpholine (0,33 M) - 50,5 g de 1-Hydroxybenzotriazole, hydrate. A cette solution, on ajoute alors 167,9 g de Boc-Lys(Z)-OTcp (0,3 M). On ajuste le pH- à 6-7 si nécessaire par addition de NEM. On agite le milieu réactionnel une heure à + 100C, puis une nuit à T.A. Le lendemain, on contrôle par CCM [chloroforme/méthanol/acide acétique (95/5/3], s'il n'y a plus de Boc-Lys(Z)-OTcp ; on essore un léger insoluble. La phase acétate d'éthyle est lavée par les solutions aqueuses suivantes - 2 x 300 ml HKSO4-K2SO4 à 5 % - 2 x 300 mi solution saturée de chlorure de sodium - 2 x 300 ml solution saturée de bicarbonate de sodium - 300 ml eau On sèche la solution d'acétate d'éthyle sur sulfate de magnésium, filtre, et évapore le solvant sous vide de 25 mm de Hg à 300C ; on obtient une huile visqueuse qui estchromatographiée sur une colonne de gel de silice Merck 60 (200-400 mesh) diamètre 7 cm - -hauteur de lit : 210 cm Eluant de départ : chloroforme. Après passage des impuretés de tête, on rajoute 2 % de méthanol au chloroforme. On suit le déroulement de la chromatographie par CCM (chloroforme/méthanol/acide acétique 95/5/3). Les fractions intéressantes sont réunies, le solvant est.évaporé sous vide (25 mm de Hg) à 300C, et le résidu est recristallisé dans un mélange pentane-Ether éthylique 50/SOn On obtient des cristaux blancs. Rendement : 79 % ; Poids : 119 g 1 H RMN - Conforme. 40) H-Lys(Z)-Leu-OCH3 , TFA 37,8 g de Boc-Lys(Z)-Leu-OCH3 sont dissous dans 190 ml de chlorure de méthylène, refroidis au bain de glace. On ajoute en 5min, 190 ml d'acide trifluoracétique et agite une heure à T.A. On évapore le mélange réactionnel sous vide (25 mm de Hg) et à 300 C, jusqu'à obtention d'une huile de poids constant, utilisée telle quelle pour l'opération suivante. 5 ) Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-OCH3 34 g de Boc-Arg-(Mts)-OH (0,075 M) sont dissous dans 560 ml de tétrahydrofuranne, refroidis dans un bain de glace. On y ajouté 10,5 g de N-hydroxy-succinimide (0,07-5 Mx 1,2, soit 20 % d'excès), et 18,6 g de DCCI (0,075 Mx 1,2), soit 20 % d'excès. Au bout d'une heure, apparat un précipité important (18 g) de DCU, qui est séparé par essorage. A cette solution de Boc-Arg(Mts)-ONSu préparé in situ, est ajouté à froid (bain de glace), 0,075 M de TFA, H-Lys(Z)-Leu-OMe dans 150 ml de tétrahydrofuranne. Le pH du milieu réactionnel est amené et maintenu à 7 par addition de NEM. On agite une nuit à T.A. et on vérifie en CCM (chloroforme/méthanol/acide acétique (95/5/3) que la réaction est terminée. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (25 mm de Hg) à 300C. Le résidu huileux obtenu est repris dans 1000 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement avec - 2 x 300 ml solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium - 2 x 300 ml solution aqueuse de HKSO4-K2SO4 à 5 % - 300 ml solution aqueuse saturée de chlorure de sodium La solution d'acétate d'éthyle est séchée sur sulfate de magnésium, puis évaporée à sec sous vide (25 mm de Hg) à 300C. On obtient une gomme (80 g) qui est purifiée par chromatographie, sur une colonne de gel de silice (Merck 60 A 200-400 mesh), de 7 cm de diamètre, par 210 cm de hauteur. Le produit est introduit dans le mélange d'élution (chloroforme/méthanol 100/1,5 v/v). La chromatographie est suivie par CCM ou par détection UV. Les fractions intéressantes sont réunies, les solvants évaporés et le résidu obtenu recristallisé dans un mélange pentane/éther éthylique (50/50 v/v). On obtient 40 g d'une poudre blanche. Rendement : 63 % CCM : chloroforme/méthanol/acide acétique 90/10/1 Rf : 0,59 1H RMN - Conforme. 6 ) Bpc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 10 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-OCH3 (0,0118 M) sont dissous dans 16.0 ml de méthanol. On agite en refroidissant dans un bain de glace et ajoute 28,2 ml d'hydrate d'hydrazine (0,0118 x 50 équiv.) CCM dans chloroforme/méthanol 90/10 + 3 gouttes d'eau : la réaction est terminée au bout de 4 h. On concentre la solution méthanoliaue à moitié et on la verse sur de la glace.- On abandonne quelques heures : le produit précipite sur la glace. Après fusion on filtre sous vide, lave abondamment à l'eau, sèche. CCM : chloroforme/méthanol , 90/10 + 3 gouttes d'eau Rf : 0,40 On obtient 7,6 g ; Rendement : 76 % 1 H RMN - Conforme. EXEMPLE III: Synthèse du peptide IV" H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl) Ile-Met-Ser-Arg (H+) -NH 2 1 ) Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser Arg(H+)-NH2 On dissout 12,7 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 dans 280 ml DMF. On refroidit entre -15 et -20 C sous azote. On ajoute 7,3 ml d'HCl/dioxanne 6,75 N puis 2,1 ml nitrite de t -butyle. On maintient la solution 1 h à -15 C. On amène le pH à 6,3 avec DIPEA. On dissout le H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser Arg(H+)-NH2, TFA dans 200 ml DMF. On refroidit à -100C et on amène le pH à 6,6-6,9 par DIPEA. On ajoute en 30min à -15 , -20 C cette solution à la solution précédente. On ajuste le pH à 7 par DIPEA et on conserve le milieu à -150C pendant 72 h Après contrôle de fin de réaction, on évapore le milieu, on précipite le produit par addition AcOEt. I1 est essoré, lavé avec AcOEt, à l'éther, puis séché. Rendement : 13,1 g ; (61 %) BuOH-2/AcOH/H20 (72/7/21) ; Rf : 0,41 20) H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser- Arg(H+)-NH2, TFA On dissout 12 g de Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 à +'00C dans un mélange 50/50 chlorure de méthylène/TFA à 10 % d-'éthane dithiol. On agite 45 min à T.A., puis le milieu est évaporé et le produit précipité par addition d'éther, essoré, lavé à éther, séché. Rendement : 10,2 g ; (84 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ; Rf : 0,31 EXEMPLE IV : Synthèse de GRF (1-29)-NH2 protégé Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts) Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 1 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2 On dissout 5 g de H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln- Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 5,2 g de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH dans un mélange de 100 ml DMF et 50 ml DMSO. On ajoute 1,8 g de BOP et on maintient le pH à- 6,5 avec NEM.Après 4 h à T.A. et contrôle de fin de réaction, le milieu est concentré, le produit précipité par addition d'AcOEt. il est essoré, lavé avecAcOEt, à l'éther, puis séché. Rendement : 8 g ; (81 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) ;Rf 0,42 2 ) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2,TFA On dissout 8 g de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala Arg (Mtx)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met Ser-Arg(H+)-NH2 à +100C dans un mélange 50/50 de chlorure de méthylène/TFA à 10 % d'éthane dithiol, le milieu est agité 45min à T.A., évaporé à sec. Le produit est précipité par addition d'éther, essoré, lavé à l'éther, puis séché. Rendement : 8,3 g ; (100 %) CCM : BuOH-2/AcOH/H2O (72/7/21) t Rf : 0,33 30) GRF(1-29)-NH2 protégé On dissout 8 g de H-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)- Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z) Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg(H+)-NH2, TFA et 1,4 g de Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH dans 70 ml DMF et 30 ml de DMSO. On ajoute 1,4 g de BOP et on maintient le pH à 7 par NEM pendant 4 h. Après contrôle de fin de réaction, le milieu est concentré, et le produit précipité par addition d'AcOEt. I1 est essoré, lavé, AcOEt-, éther, séché. Rendement : 8 g ; (87 %) CCM : n-BuOH/pyridine/AcOH/H20 (60/12/12/48) EXEMPLE V : Déprotection et purification du GRF(1-29)NH2 10) Déprotection du GRF(1-29)-NH2 On agite à OOC, 60 min, 4,5 g de GRF(1-29)-NH2 protégé dans un mélange de 180 ml de TFA, 19,8 ml TFMSA, 27 mi thioanisole et 11 ml metacrésol. On précipite le produit par addition d'l 1 d'éther, il est essoré, lavé à l'éther, séché sous vide en présence de potasse. Le produit est dissout dans 200 ml d'eau, amené à pH 4,5 par de la résine IR45, forme acétate. Après 30min d'agitation, la résine est filtrée, lavée à l'eau et les filtrats réunis sont lyophilisés. Rendement : 3,80 g -CCM : nBuOH/pyridine/AcOH/H2O (60/12/12/48) 2 ) Purification Après passage sur-colonne de Séphadex G 50 F (élution AcOH 30 % avec 0,1 e béta mercapto éthanol), puis cange d'ions sur CM trisaoryle (élution par gradient acétate ammonium 0,1 à 0,4 M avec 0,1 % béta mercapto éthanol), le produit subit une chromatographie de partition sur Séphadex G 50 F dans n-BuOH/pyridine/EtOH/AcOH 0,2 N (4/1/1/7) sous saturation d'argon. Les fractions dont 1'EPP est sunérieure ou égale à 95 % sont réunies et lyophilisées. Le produit est contrôlé par HPLC par rapport à un standard de référence et AAA -Tyr : 1,90 (2) - Ala : 2,82 (3) - Asn, Asp : 2,85 (3) -Ile . 1,95 (2) - Phe : 0,92 (1) - Thr : 1,01 (1) -Ser : 2,78 (3) - Arg : 2,98 (3) - Lys : 1,98 (2) -Val : 1,01 (1) - Leu : 4,05 (4) - Gly : 0,97 (1) -Gln : 1,89 (2) - Met : 0,91 (1) EXEMPLE VI : Synthèse de H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH On opère selon le mode opératoire décrit dans les exemples I à V, à partir de H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Nle- Ser-Arg(H+)-NH2 obtenu' selon exemple I en utilisant la Boc-Nle-ONSu à la place de la Boc-Met-ONp EXEMPLE VII : Synthèse de H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg Lys-Val-Leu-Gly-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2 On opère selon le mode opératoire décrit dans les exemples I à V, à partir de n-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-aae- Ser-Arg(H+)-NH2 obtenu selon l'exemple I en utilisant la Boc-Ile-ONSu à la place de la Boc-Met-ONp. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un nonacosapeptide de formule H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- (A)-Ser-Arg-NH2 (I) dans laquelle (A) représente Met, Nle ou Ile, et de ses sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisé en ce qu'on couple un tripeptide protégé II' dérivé du tripeptide de formule II :: X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 -( il) où X représente un groupe N-protecteur, la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine dudit tripeptide II' étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les conditions de dé protection du groupement X, avec un heptapeptide protégé III' dérivé de l'heptapeptide de formule III : H-Leu-Gln-Asp-Ile- (A) -Ses-Arg-NH (III) 2 dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, les fonctions latérales de l'acide aspartique et de l'arginine dudit heptapeptide III' étant protégées par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupe X, ou, dans le cas de l'arginine, par protonation ; puis, après clivage du groupe protecteur X, on couple le décapeptide protégé IV' ainsi obtenu dérivé du decapeptide de formule IV H-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile- (A) -Ser-Arg-NH2 (IV) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de la lysine et de l'arginrne restent protégées comme défini ci-dessus, avec un pentadécapeptide protégé V' dérivé du pentadécapeptide de formule V X-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys -Val-Leu-Gly= Gln-Leu-Ser-Ala-OH (V) dans laquelle X est un groupe N-protecteur, les fonctions latérales de la lysine et de l'arginine dudit pentadecapeptide étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les conditions de déprotection du groupement X ; ensuite, après clivage du groupe protecteur X, on couple le pentacosapeptide VI' protégé ainsi obtenu dérivé du pentacosapeptide de formule VI H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile (A) -Ser-Arg-NH 2 (VI) dans laquelle (A) est tel que défini ci-dessus, dont les fonctions latérales de l'acide aspartique, de 1' arginine et de la lysine restent protégées comme défini ci-dessus, avec un tétrapeptide protégé VII' dérivé du tétrapeptide de formule VII X'-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH (VII) dans laquelle X' représentè un groupe N-protecteur et la fonction acide latérale de l'acide aspartique étant protégée ; lesdits couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage ; enfin on soumet le nonacosapeptide ainsi obtenu, dans lequel toutes les fonctions latérales sont protégées, à une déprotectiong on isole le produit de formule I ainsi obtenu et on le transforme éventuellement en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans les différents fragments à coupler X est un groupe Boc et en ce que les fonctions latérales des acides ami nés Asp, Lys et Arg sont protégées de façon stable dans les conditions d'élimination du groupe Boc 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracteri sé en ce que dans les différents fragments à coupler - la fonction latérale de l'acide aspartique est protégée sous forme de OBzl - la fonction latérale de l'arginine est protégée par protonation ou par un groupe Mts - la fonction latérale de la lysine est protégée par un groupe Z. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que la déprotection finale est effectuée par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhane- sulfonique dans l'acide trifluoroacétique 5.Peptide de formule "-Q-R-Leu-Gln-Asp-Ile-(A)-Ser-Arg-NH2 (VIII) dans laquelle - R représente une liaison directe ou Arg-Lys-Leu, - Q représente une liaison directe ou Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Ser-Ala- - (A) représente Met, Nle ou île - X" représente l'hydrogène ou le groupe N-protecteur X, Q étant obligatoirement une liaison directe lorsque R est une liaison directe, ainsi que ses dérivés protégés dans lesquels les fonctions latérales de Asp, Arg et Lys éventuellement présentes dans ledit peptide son protégées par des groupes protecteurs stables dan le' conditions de clivage du groupe N-protecteur X. 6. Peptide selon la revendication 5, caractérise en ce que Q et R ne sont pas une liaison directe. 7. Tripeptide protégé dérivé du peptide de formule : X-Arg-Lys-Leu-NH-NH2 (II) dans laquelle X est un groupe protecteur, la fonction guanidine de l'arginine et la fonction amine latérale de la lysine dudit tripeptide étant protégées par protonation ou par un groupement stable dans les condi tions de déprotection du groupement X. 8. Tripeptide protégé selon la revendicaeion i, caractérisé en ce qu'il répond à la formule i Boc-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-NH-NH 9. Peptide de formule H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg(H+)-Lys(Z)-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile 10.Peptide de formule H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-(A)-Ser-Arg(H+)-NH2 dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile. 11. Peptide de formule H-Arg(Mts)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile (A)-Ser-Arg(H+)-NH2 dans laquelle (A) est Met, Nle ou Ile.