Brevet FR2604183A1 — publié le 19880325

Le virus de la vaccine est de plus en plus employé comme vecteur d'expression dans des cellules animales depuis la mise au point des méthodes propres & ce système (Panicali et Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al.; Kieny et al., 1984). La construction de virus recombinants du virus de la vaccine contenant des gênes qui codent pour des protéines d'intérêt médical ou vétérinaire est particulièrement recherchée. La synthèse de la protéine étrangère dont le gène a été intégré dans le génome du virus de la vaccine peut ensuite être obtenue en culture cellulaire in vitro ou après inoculation à un orga- nisme vivant, selon le but poursuivi. Un des avantages du virus de la vaccine en tant que vecteur est sa capacité de se multiplier dans un grand nombre de types cellulaires diffé- rents. Cependant quelques exceptions à cette règle existent et, en particulier, le virus de la vaccine de type sauvage est incapable de se multiplier dans une lignée de cellules d'ovaires de hamster chinois, CHO (Drillien, Spehner et Kirn, 1978). Or les cellules CHO constituent un des systèmes les plus prometteurs pour la synthèse de protéines dans des cel- lules de mammifères. En effet ces cellules se cultivent faci- lement, elles ont un temps de génération court et leur géné- tique est la mieux maîtrisée de tous les systèmes analogues. La présente invention concerne la modification du virus de la vaccine par l'intégration dans son génome d'un gène étranger qui lui confère la capacité de se multiplier dans les cellules CHO.'Le gène apportant cette nouvelle spé- cificité d'hôte est dérivé du virus du cowpox (ou variole bovine, virus de la vache apparenté au virus de la vaccine) qui est capable de se multiplier dans les cellules CHO. 2 2 6 0 2604183 Les génomes du cowpox et du virus de la vaccine sont très proches particulièrement dans les 100.000 paires de bases de la partie centrale de l'ADN (Mackett et Archard, 1979). Ce- pendant le génome du cowpox est plus grand que celui de la vaccine (environ 230.000 pb au lieu de 190.000) et l'informa- tion génétique supplémentaire qu'il contient semble résider essentiellement dans ses extrémités. La similitude entre le génome' du virus de la vaccine et celui du cowpox permet d'en- visager d'employer le cowpox comme vecteur naturellement adapté aux cellules CHO. Toutefois, le cowpox se multiplie à un titre dix fois inférieur à celui de la vaccine ce qui risque d'entrai- ner un rendement plus faible de l'expression d'une protéine produite par un recombinant cowpox en comparaison avec un recombinant vaccine. D'autre part dans la perspective de l'utilisation de recombi- nants viraux pour la vaccination, il faut souligner que l'em- ploi du virus de la vaccine est bien maîtrisé et a permis à ce jour l'éradication complète la variole. La présente invention concerne la mise au point d'un vecteur présentant les avantages connus du virus de la vaccine et la capacité de se multiplier sur cellules CHO du virus du cow- pox. La présente invention concerne, d'abord, l'identifi- cation et la localisation de l'information génétique qui confère au virus du cowpox la capacité de se multiplier dans les cellules CHO. En effet, les études menées ont permis d'identifier une séquence impliquée dans la multiplication du virus cowpox dans les cellules CHO et qui, transférée dans le virus de la vaccine, assure la multiplication de ce virus dans les cellu- les CHO. Ainsi, l'invention concerne une séquence d'ADN iso- l1e notamment du virus du cowpox et qui participe à la multi- plication de ce virus dans les cellules CHO et qui comprend la totalité ou une partie fonctionnelle de la séquence repré- sentée dans la figure 6 ou une séquence équivalente fonction- nelle. Il est possible qu'une partie de ce gène soit suffi- sante pour assurer la fonction de multiplication, on l'appel- le "partie fonctionnelle". Il est également possible que des mutations ou des variations ponctuelles ne modifient pas la fonction, on parle alors de "séquence équivalente fonction- nelle". Bien que l'on préfère que cette séquence d'ADN com- porte ses propres signaux de contrôle qui assurent son ex- pression dans les cellules CHO, ceci n'est pas indispensable et l'on peut envisager de la mettre sous le contrôle d'élé- ments ayant une autre origine. Comme cela est décrit précédemment, cette séquence d'ADN est plus particulièrement destinée à être intégrée dans le virus de la vaccine pour assurer sa multiplication dans les cellules CHO. Cette intégration s'effectue par recombi- naison homologue, il est donc intéressant de prévoir que la séquence d'ADN en cause comportera au moins une région homo- logue d'une séquence du virus de la vaccine qui pourra parti- ciper à ce processus de recombinaison homologue au cours de la multiplication intracellulaire des virus. En fait, il apparait que chez le virus cowpox le gène permettant la multiplication dans les cellules CHO est entouré de séquences homologues à des séquences du génome de la vaccine, ce qui permet de simplifier la préparation d'un vecteur plasmidique de recombinaison. Comme cela est déjà connu pour le virus de la vacci- ne, il est possible d'insérer dans la séquence d'ADN, objet de l'invention, un gène codant pour une protéine d'intérêt industriel sous la dépendance d'éléments de contrôle assurant son expression dans les cellules h8tes. Cette technologie a déjà été décrite, notamment dans les brevets suivants: 84.06499, 84.07959, 85.09225 et peut être utilisée avec éven- tuellement certaines adaptations et avantages. En particuli- er, dans les contructions précédentes, la sélection des virus recombinants était effectuée en insérant le gène à exprimer dans le gène TK de la vaccine, ce qui a pour conséquence de rendre le virus recombinant TK- et de permettre la sélection par le procédé connu. Dans le cas présent, il n'est pas indispensable d'effectuer une insertion dans le gène TK car, dans la mesure o le gène codant pour la protéine d'intérêt industriel est lié au gène assurant la multiplication dans les cellules CHO; seuls les virus recombinants peuvent se multiplier sur cellu- les CHO, ce qui autorise une sélection "naturelle" des virus recombinants. Dans ce dernier cas, il est préférable que le bloc d'ADN comprenant les gènes à recombiner soit flanqué de sé- quences homologues de séquences du virus de la vaccine afin qu'ils restent liés lors de la recombinaison. La présente invention concerne également les cellu- les CHO infectées par un virus de la vaccine recombinant incorporant une séquence d'ADN telle que décrite précédemment et, en particulier, un gène codant pour une protéine d'inté- rêt industriel, ainsi que les virus correspondants. L'invention concerne également les vecteurs plasmi- diques incorporant une séquence d'ADN telle que décrite pré- cédemment, ces vecteurs étant utilisables pour effectuer la recombinaison in vivo. L'invention concerne également des cellules CHO ayant intégré une séquence d'ADN selon la présente invention et capables d'assurer la multiplication du virus de la vacci- ne dans ces cellules. Enfin, l'invention concerne la préparation de proté- ines d'intérêt industriel par culture de cellules CHO infec- tées par un virus recombinant selon l'invention. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente inven- tion.. Exemple 1 Identification de la région du génome du virus du cowpox qui permet la multiplication dans les cellules CHO. Des recombinants entre le virus de la vaccine et le cowpox ont été sélectionnés après infection mixte de cellules d'embryons de poulet avec chacun des virus. L'analyse de l'ADN des recombinants montre que la capacité de se multipli- er dans des cellules CHO est associée à la conservation des sites de restriction de l'extrémité gauche du génome du cow- pox. Des cellules primaires d'embryon de poulet, prépa- rées à partir d'oeufs embryonnés de 11 à 12 jours, sont infectées simultanément avec un mutant thermosensible du virus vaccinal, tsN7 (Drillien et al., 1982) et le cowpox (souche Brighton) à raison de 2 unités formant plage (ufp) par cellule. Parallèlement d'autres tapis cellulaires sont infectés avec chacun de ces virus. Après une heure d'adsor- ption l'excès de virus non adsorbé est éliminé et du milieu frais est ajouté aux cellules. Celles-ci sont incubées & 33C pendant un A deux jours jus- qu'& la nécrose totale de la couche cellulaire. Les cellules infectées sont alors congelées puis décongelées et le virus issu de l'infection est titré & 39,5C sur cellules d'embryon de poulet, sous une couche de milieu contenant 1 % d'agar noble. Après deux jours & 39,5C un plus grand nombre de plages de virus s'est-formé sur les tapis cellulaires infec- tés avec le mélange des 2 virus que sur les tapis témoins (ni le mutant thermosensible du virus de la vaccine ni le cowpox ne donnent un nombre significatif de plages); les plages qui apparaissent à partir de l'infection mixte peuvent donc cor- respondre à des recombinants entre le cowpox et le virus de la vaccine. Les plages de recombinants potentiels sont reprises individuellement et le virus qu'elles contiennent est ampli- fié par multiplication sur cellules d'embryon de poulet. Leur ADN est ensuite purifié, coupé par des enzymes de res- triction puis analysé sur gel d'agarose. Les profils de restriction permettent de déduire que chaque plage correspond effectivement à un recombinant entre l'ADN du virus de la vaccine et l'ADN du cowpox. Grâce aux cartes de restriction connues pour les virus parentaux (Mackett and Archard 1978, Drillien and Spehner 1983) il est possible de reconnaître l'origine de la plupart des fragments des recombinants et de dresser leurs cartes de restriction (figure 1). On voit que les recombinants dénommés 4, 6, 14, 15 et 19 qui sont capables de se multiplier dans des cellules CHO ont conservé les sites caractéristiques de l'extrémité gauche du génome du cowpox. Les autres recombinants dénommés 2, 7, 11, 16 et 18 qui sont incapables de se multiplier dans des cellules CHO ne possèdent que partiellement ou pas du tout ces sites de l'extrémité gauche du génome du cowpox. Il ressort de ces résultats que la conservation des mites de restriction de l'extrémité gauche du génome du cow- pox est associée au phénotype de multiplication sur cellules CHO. Exemple 2 Isolement et analyse du génome de recombinants du virus de la vaccine ayant intégré un fragment d'ADN du cowpox. Pour mieux préciser la localisation de l'information génétique utile, des recombinants capables de se multiplier sur cellules CHO ont été sélectionnés après infection avec le virus de la vaccine et transfection avec des fragments d'ADN du cowpox. Les fragments de restriction utiles à l'analyse de la partie importante, c'est-à-dire l'extrémité gauche des 2 virus sont représentés dans la figure 2; c'est dans cette partie du génome que l'on peut soupçonner qu'interviennent les événements de recombinaison décrits dans l'exemple 1. Des cellules primaires d'embryon de poulet sont infectées avec le mutant tsN7 du virus de la vaccine (Drillien et al., 1982) à raison de 0,1 ufp par cellule et transfectées avec un mélange d'ADN intact de la souche sauva- ge du virus de la vaccine (souche Copenhagen) et de l'ADN du cowpox (souche Brighton) préalablement digéré avec l'enzyme HindIII. Des témoins de transfection sans ADN ou avec seule- ment l'ADN du virus de la vaccine sont réalisés. Après 48 heures d'incubation à 39,5C les cellules sont con- gelées, décongelées puis le virus ainsi libéré est titré sur une monocouche de cellules CHO qui sont ensuite recouvertes de milieu contenant 1 % d'agar. Les échantillons provenant de cellules transfectées avec l'ADN du cowpox donnent de nombreuses plages de lyse sur cellules CHO tandis que les échantillons témoins n'en donnent aucune. Les plages visibles sur cellules-CHO sont reprises individuellement et le virus qu'elles contiennent est ampli- fié sur cellules d'embryon de poulet. Leur ADN est ensuite extrait et analysé en comparaison avec l'ADN des 2 souches parentales de vaccine et de cowpox. Après digestion par l'en- zyme EcoRI, les fragments d'ADN sont séparés par électropho- rèse sur un gel d'agarose' puis ils sont transférés à un fil- tre de nitrocellulose et hybridés au fragment SalI-K du virus de la vaccine marqué radioactivement au ezP. Après lavage de la nitrocellulose pour enlever la radioacti- vité fixée de manière aspécifique une autoradiographie est réalisée. L'autoradiographie (figure 3) montre que les re- combinants du virus de la vaccine ayant intégré un fragment du cowpox ont perdu le fragment EcoRI-C typique du virus de la vaccine et comportent un fragment EcoRI qui s'hybride avec le fragment radioactif SalI-K de la vaccine; ce fragment est intermédiaire en taille entre le fragment EcoRIA du cowpox et le fragment EcoRI-C du virus de la vaccine. Ce nouveau fragment EcoRI hybride cowpox-vaccine, présent dans tous les recombinants, provient d'une double recombinaison entre le fragment EcoRI-A du cowpox et le frag- ment EcoRI-C de la vaccine et doit renfermer l'information nécessaire pour la multiplication dans des cellules CHO. Pour que cette recombinaison ait pu se produire il fallait que l'information permettant la multiplication sur cellules CHO soit entourée de part et d'autre par des séquences du génome du cowpox homologues à des séquences du génome vaccine. Exemple 3 Construction d'un plasmide recombinant portant la région du génome du cowpox qui permet la multiplication dans des cellules CHO. Afin d'isoler l'information génétique permettant la multiplication dans des cellules CHO le fragment EcoRI-A de l'un des recombinants décrits dans l'exemple 2 a été cloné dans le plasmide bactérien pAT153 (Twigg et Sherratt, 1980). L'ADN d'un des recombinants décrits dans l'exemple 2 est purifié puis coupé avec l'enzyme EcoRI. Le fragment EcoRI-A est élué d'un gel d'agarose puis inséré dans le plas- mide pAT153 préalablement soumis à l'action d'EcoRI. Des bactéries HB101 sont transformées avec le mélange de ligation puis l'ADN des colonies obtenues est transféré sur nitrocel- lulose et hybridé au fragment SalI-K du virus de la vaccine. Les colonies positives à l'hybridation sont amplifiées et 1l'ADN plasmidique qu'elles contiennent est purifié. Deux plasmides ont été retenus: pEAl et pEA2, qui correspondent à l'insertion du fragment EcoRIA dans les deux orientations opposées dans le vecteur pAT153. Pour vérifier que ces plasmides portent l'informati- on génétique permettant la multiplication du virus sur cellu- les CHO on provoque une recombinaison entre l'insert d'ADN du plasmide et un virus de la vaccine: des cellules d'embryons de poulets sont infectées avec le mutant thermosensible du virus de la vaccine tsN7 à raison de 0,1 ufp par cellule puis transfectées avec l'ADN du virus de la vaccine sauvage et avec l'ADN du plasmide pEAl ou pEA2. Des témoins sans ADN du virus de la vaccine ou sans plasmide sont également réalisés. Après 48 heures d'incubation à 39,5C, les cellules sont congelées puis décongelées et le virus issu de l'infection est titré sur cellules CHO. Seuls les échantillons provenant de cellules transfectées avec l'ADN du virus de la vaccine et les plasmides pEAl ou pEA2 donnent des plages sur cellules CHO. Exemple 4 Sous-clonage de fragments de plus petite taille du pEAl dans un plasmide vecteur destiné à la recombinaison avec le virus de la vaccine. Pour affiner la localisation de l'information géné- tique permettant la multiplication dans des cellules CHO, des fragments de restriction recouvrant des portions réduites du plasmide pEAl ont été clones dans un plasmide portant le gène thymidine kinase (TK) du virus de la vaccine: pTG186poly. - Construction de pTG186poly: Le fragment HindIII (Hin-J) du génome du virus de la vaccine (VV) contient le gène complet de la thymidine kinase (TK) qui a déjà été utilisé précédemment pour permettre l'é- change et la recombinaison d'un fragment d'ADN étranger dans le génome de VV (Mackett et al., 1982). Il est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TK du génome de WVV crée un virus TK défi- cient ce qui facilite sa sélection. Il a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant un site unique HindIII utilisable pour l'intégration du fragment Hin-J de VV. En outre, il était nécessaire d'éliminer les sites de restricti- on non nécessaires du plasmide, de façon à permettre les manipulations ultérieures. La construction a été amorcée à partir du plasmide pML2 (Lusky et Botchan, 1981) qui est un vecteur dérivé du plasmide pBR322 dans lequel le segment compris entre les nucléotides 1089 et 2491 a été perdu par délétion spontanée. D'abord la séquence de PstI a été éliminée par insertion du fragment AhaIII-AhaIII de pUC8 (Vieira et Messing, 1982) entre deux sites AhaIII de pML2 en éliminant 19 paires de bases. 2 604183 On a utilisé la méthode du "linker-tailing" (Lathe et al., 1984) pour insérer un adaptateur HindIII entre les sites NruI et EcoRI traité par S1 de ce plasmide, en éliminant le site BamHI. Ceci conduit & un plasmide de 2049 paires de bases portant le gène p-lactamase fonctionnel (conférant la résis- tance & l'ampicilline) et comportant en outre une origine de réplication active dans E. coli et un site de restriction unique HindIII. Cette construction a été appelée pTGlH. Le fragment Hin-J de l'ADN de WVV portant le gène TK a préalablement été cloné dans le vecteur pAT153 (Drillien et Spehner, 1983). Ce fragment de 4,6 kb a été recloné dans le site HIndIII de pTGlH. Un clone a été sélectionné dans lequel le gène TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Cette construction a été appelée pTGlH-TK. La construction pTGlH-TK a été utilisée comme vec- teur pour les constructions suivantes. L'étape suivante a été d'isoler un promoteur de WVV utilisable pour commander l'expression du gène étranger à intégrer dans W. Le promoteur d'un gène précoce codant pour une protéine de 7500 daltons (7,5 K) a déjà été utilisé avec succès dans un but identique (Smith et al., 1983) et on a donc procédé à l'isolement de ce segment. Le gène 7,5 K est situé sur l'un des plus petits fragments SalI (fragment Sal-S) du génome de W type WR (Venkatasan et al., 1981). Comme les petits fragments sont clonés de façon préférentielle, une grande proportion des clones obtenus par clonage direct de l'ADN de WVV type WR coupé par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal- S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (Kieny et al., 1983), par digestion SalI et religa- tion, ce qui donne le phage M13.TG.Sal-S. Dans ce clone, un site ScaI se trouve immédiatement & proximité de l'ATG d'initiation du gène 7,5 K. En aval du gène 7,5 K se trouvent situés des sites uniques BamHI et EcoRI provenant du vecteur. Les sites BamHI et ScaI sont fu- sionnés par l'intermédiaire d'un adaptateur BglII: '-CAGATCTG-3' après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment Klenow de la polynmérase de E. coli. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et déplace le site unique EcoRI en aval. En même temps, le site SalI (AccI) en aval est éliminé et le site SalI en amont devient donc unique. Cette construction est appelée M13.TG.7,5K. A l'intérieur du fragment Hin-J de l'ADN de VV se trouvent situés des sites ClaI et EcoRI qui sont séparés par environ 30 paires de bases (Weir et Moss, 1983). Le fragment - promoteur de 7,5 K présent dans M13.TG.7,5K est excisé par AccI et EcoRI et cloné entre les sites ClaI et EcoRI de pTGl- H-TK pour générer pTGlH-TK-P7,5K. Dans cette construction les sites BamHI et EcoRI uniques du vecteur M13 se retrouvent immédiatement en aval de la séquence du promoteur 7,5 K. Ces sites uniques BamHI et EcoRI seront utilisés dans la construction suivante. Le segment polylinker du bactériophage M13TG131 (Kieny et al., 1983) est excisé par EcoRI et BglII et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pTGlH-TK-P7,5K, générant le pTG186poly. Dans cette construction, 5 sites de restriction uniques sont disponibles pour le clonage d'un gène étranger sous le contr8le du promoteur P7,5K: PstI, BamHI, SstI, SmaI et EcoRI. - Insertion de fragments du pEAl dans pTG186poly: Le fragment EcoRIA du plasmide pEAl a été digéré par différents enzymes et des fragments de différentes tailles ont été insérés dans le pTG186poly. 6Uq'1o Les plasmides recombinants dérivés de pTG186poly et contenant des portions du fragment EcoRI-A du plasmide recombinant pEAl sont représentés dans la figure 4. La coupure du plasmide pEAl avec l'enzyme BglII donne plusieurs fragments. Le plus grand des fragments BglII a été inséré dans le site BamHI du vecteur pTG186poly pour donner les plasmides pEA5a et pEA5b qui se distinguent par l'orientation de l'insertion. Le plasmide pEA6 est dérivé du plasmide pEA5a par coupure de ce dernier avec l'enzyme PstI puis recircularisa- tion du plus grand fragment ce qui a pour effet de dél&ter le petit fragment BglII-PstI du plasmide pEA5a. Le plasmide pEA7 provient de pEA6 apr&s coupure de ce-dernier avec l'enzyme ClaI et recircularisation du grand fragment obtenu ce qui donne une dél4tion du petit fragment ClaI. Le plasmide pEA8 provient de pEA6 après coupure de ce dernier par SphI puis recircularisation du grand fragment ce qui donne une délétion du fragment SphI-BglII de droite. Le plasmide pEA9 provient du plasmide pEA5b après coupure de ce dernier par SphI puis religation ce qui donne une délétion du fragment gauche SphI-BglIII. Le plasmide pEA36 a été construit en deux étapes. D'abord le petit fragment HpaI a été isolé du plasmide pEA9 et il a été inséré dans le site SmaI du vecteur M13-130. Puis le fragment HpaI a été sorti du vecteur M13-130 grâce aux sites EcoRI et PstI et il a été intégré dans les sites EcoRI et PstI du vecteur pTG186poly. Chacun de ces plasmides a été utilisé dans une expé- rience de transfection de manière & transférer l'insertion qui se trouve dans le gène TK porté par le plasmide au génome du virus de la vaccine, selon la méthode décrite dans l'exem- pie 3. Les plasmides capables de conférer la capacité de multiplication dans des cellules CHO au virus de la vaccine sont pEAl, 2, 5a, 5b, 6, 9, 36. Le plus petit fragment ayant cette propriété est porté par le plasmide pEA36. Il comprend 2004 paires de ba- ses. Exemple 5 Séquençage du gène permettant la multiplication du virus de la vaccine dans les cellules CHO. L'ADN du cowpox porté par le plasmide pEA36 et situé entre les sites Hpal a été entièrement séquence selon la méthode des didéoxynucléotides (Sanger et al. 1980) après insertion des plus petits fragments dans les phages M13-130 et M13-131 (Kieny et al. 1983) en suivant la stratégie sché- matisée dans la figure 5. Le cadre de lecture pouvant coder pour une protéine de 77.000 daltons débute aux nucléotides ATG et se termine aux nucléotides TAA représentés sur la carte de la figure 5. Les flèches en-dessous de la carte indiquent l'endroit o commence la lecture de chaque clone, la longueur de la lectu- re et sa direction. Lorsque le début de lecture ne commence * pas & un site de restriction, des amorces constituées d'oli- gonucléotides synthétiques déduits d'une séquence partielle ont été utilisées. La séquence complète du gène ainsi- que la séquence de la protéine de 77. 000 daltons pour laquelle il peut coder est présentée dans la figure 6. Exemple 6 Recombinaison homologue et intégration du gêne du cowpox dans l'ADN de la vaccine, en dehors du gène TK. Parmi les virus recombinants, décrits dans l'exemple 4, capables de se multiplier sur cellules CHO, on constate que certains sont TK+ et d'autres TK-. Par exemple dans la transfection des cellules avec le plasmide pEA9, sur 27 plages de virus recombinants sélec- tionnées pour leur multiplication sur CHO, 16 étaient TK- et 11 TK+. La recombinaison introduisant l'information qui permet la multiplication dans des cellules CHO s'est donc produite dans une région différente de c. elle du gène qui code pour la thymidine kinase. Ce résultat implique la possibilité de sélection pour l'insertion d'un gène étranger dans une région du génome autre que le gène TK, simultanément à la sélection pour la multiplication sur cellules CHO. Il suffit pour cela de jux- taposer le gêne choisi et le gène permettant la croissance sur cellules CHO. L'insertion de ce dernier par recombinaison homologue avec le génome du virus de la vaccine entrainera la co-intégration du gène étranger. Dép8t de souche représentative de l'invention. La souche de E. coli 1106 portant le plasmide pEA36 a été déposée & la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le ne I 594, le 2 septembre 1986. Le plasmide pEA36 porte un fragment d'ADN de 2.004 pb du virus du Cowpox qui permet la multiplication du virus dans les cellules CHO; ce fragment d'ADN est destiné à la recombinaison in vivo avec le virus de la vaccine (qui ne se multiplie pas dans les cellules CHO). Par transfection des cellules avec l'ADN plasmidique et co-infection avec-le virus de. la vaccine, on pourra sélectionner des virus recombinants de la vaccine qui ont acquis la capacité de se multiplier sur cellules CHO. REFERENCES Drillien, R., Spehner, D. & Kirn, A. J. Virol. 28, 843-850 (1978). Drillien, R., Spehner, D. & Kirn, A. Virology 119, 372-381 (1982). 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Les sites de restriction notés avec une flèche sont des sites caractéristiques du génome du cowpox; ceux notés avec un trait vertical sont caractéristiques du génome du virus de la vaccine. Les sites communs aux deux génomes ne sont pas notés. Les pointillés indiquent des régions d'incer- titude dans la détermination. Figure 2 Cartes de restriction de l'extrémité gauche des virus de la vaccine (VV) et du cowpox (CP) après coupure avec les enzymes EcoRI, HindIII et Sall. Les fragments sont notés conventionnellement A, B, C..., par ordre de taille décroissant. Figure 3 Caractérisation des profils de restriction de l'ADN des recombinants entre le virus de la vaccine et le cowpox. L'ADN du virus de la vaccine (VV), du cowpox (CP) et de qua- tre recombinants appelés rec2, rec3, rec4 et rec6, isolés selon l'exemple 2, a été préparé à partir de cellules d'em- bryon de poulet infectées en présence de thymidine 3H. 2604183 La partie A de la figure présente une autoradiographie des fragments obtenus après digestion de l'ADN avec EcoRI, sépa- ration des fragments sur gel d'agarose et autoradiographie du gel sec pendant quinze jours d'exposition. En B, l'ADN traité de la même manière qu'en A a été transféré sur nitrocellulose et hybridé & une sonde Sall-K portée par le plasmide pAT153. Figure 4 Plasmides recombinants contenant des portions du fragment EcoRIA du plasmide pEAl intégrés dans le vecteur pTG186poly. Les deux lignes horizontales supérieures représentent l'ex- trémité. gauche de l'ADN du virus de la vaccine et du cowpox avec les sites de restriction pour l'enzyme EcoRI. La troisi- ème ligne est une représentation linéaire du plasmide pEAl avec le fragment EcoRI-A en trait continu et le plasmide pAT153 en trait discontinu. Les lignes suivantes sont des représentations linéaires des différents plasmides recombinants avec le fragment dérivé de pEAl en trait continu et le vecteur pTG186poly en traits discontinus; le promoteur du gène 7.5 K est symbolisé par une flèche ouverte qui donne le sens de la transcription. Les sites de restriction sont symbolisés par les lettres suivantes m B BglII C ClaI E EcoRI H HpaI P Pstl S Sall Sp Sphl X Xhol 21 2 04183 Figure 5 Stratégie de séquençage du gène permettant la multiplication dans des cellules CHO. La ligne horizontale en trait gras représente le fragment d'ADN séquencé et compris entre les sites HpaI (Hi). Les autres sites de restriction sont symbolisés par les lettres suivantes S (Sau3A), H2 (Hpa2), X (XhoI), C (ClaI), Xb (XbaI). Le cadre de lecture pouvant coder pour une protéine de 80.000 daltons débute aux nucléotides ATG et se termine aux nucléotides TAA portés sur la carte. Les flèches en- dessous de la carte indiquent l'endroit o commence la lectu- re de chaque clone, la longueur de la lecture et sa directi- on. Figure 6 Séquence du gène permettant la multiplication dans les cellules CHO. REVENDICATIONS 1. Séquence d'ADN isolée notamment du virus du cowpox et qui participe & la multiplication de ce virus dans les cellulles CHO, et qui comprend la totalité ou une partie fonctionnelle de la séquence représentée dans la figure 6 ou une séquence équivalente fonctionnelle. 2. Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre ses propres signaux de contrôle qui assurent son expression dans les cellules CHO. 3. Séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une région homologue d'une région du virus de la vaccine qui peut participer à un processus de recombinaison homologue au cours de la multiplication intracellulaire des virus. 4. Séquence d'ADN selon l'une des revendications i à 3, caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, un gène codant pour une protéine d'intérêt industriel. 5. Séquence d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gène codant pour une protéine d'in- térêt industriel est placé sous des signaux de contrôle de poxvirus, Assurant son expression dans les cellules CHO. 6. Séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisée en ce que les extrémités de cette séquence comportent des régions homologues de régions du virus de la vaccine pouvant assurer une recombinaison. 7. Vecteur plasmidique comportant une séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Virus recombinant de la vaccine comportant une séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 6. 9. Cellules CHO infectées par un virus recombi- nant de la vaccine selon la revendication 8. 23 2604183 10. Procédé de préparation d'une protéine d'inté- rêt industriel caractérisé en ce qu'on cultive des cellules CHO selon la revendication 9 infectées par un virus recombi- nant de la vaccine comportant un gène codant pour une proté- ine d'intérêt industriel, ledit gène étant sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans les cellules CHO. 11. Cellules CHO transformées ayant intégré une séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 6. 12. Cellules CHO selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles permettent la multiplication du virus de la vaccine.