Brevet FR2603048A1 — publié le 19880226

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'arômes de produits alimentaires ou thérapeutiques par production de métabolites secondaires "aromatiques" et les nouvelles souches de champignons filamenteux obtenues par le procédé. Les micro-organismes sont depuis longtemps connus pour produire dans certains cas des arômes et cette particularité a été mise en évidence aussi bien pour des bactéries que pour des levures et des champignons. Les odeurs de champignons filamenteux en culture ainsi que leur évolution lors de la croissance ont fait l'objet de nombreuses études systématiques, notamment en ce qui concerne certaines espèces dont les odeurs ont été un critère de classification. On sait qu'une molécule isolée de la culture de TRICHODERMA VIRIDE (6-pentyl-Z-pyrone) possède une odeur caractéristique de noix de coco ; cette molécule a été identifiée dans de nombreux fruits (pêche...). Une forte odeur de banane a également été obtenue par culture d'une souche de CERATOCYS TIS MONILIFORMIS. L'analyse des extraits aromatiques a per mis de mettre en évidence la présence d'acétate d'isoamyle, molécule entrant dans la composition aromatique de la banane mûre. L'industrie alimentaire ou thérapeutique notamment utilise de nombreux arômes et il peut être intéressant de les produire par des procédés permettant de s'affranchir, partiellement ou totalement, des inconvénients dus à l'utilisation de fruits, notamment pour des contraintes liées à la lenteur du métabolisme (temps de croissance des arbres fruitiers, temps de maturation des fruits) ainsi que pour des problèmes liés à leur commercialisation (transports, approvisionnements), ce qui conduit à des prix de revient très élevés. Le but est donc de produire des additifs ou des intermédiaires de synthèse ou de composition aromatique naturelle,ou des arômes complets naturels, c'est-à-dire des arômes produits par un organisme vivant. Le but de la présente invention est d'utiliser pour cette production des sous-produits agro-industriels ou des excédents de production (lait, jus de fruits, lactosérums) dilués ou non, seuls ou en mélange, avec introduction ou non d'éléments spécifiques tels que des acides aminés, des peptides, des acides gras, ou leurs sels. L'invention se caractérise donc par un procédé de fabrication d'arômes de produits alimentaires ou thérapeutiques à partir de mycéliums de champignons filamenteux et de sous-produits agro-industriels tels que du lait, des jus de fruits, du lactosérum ou du vin comportant les étapes suivantes a) isolement de nouvelles souches de champignons sur milieu de culture gélosé, b) sélection d'au moins une souche pour son aptitude à produire un arôme en milieu immergé sur substrat agro-industriel, c) test de l'aptitude des souches sélectionnées à croître en présence de quantités variables de métabolites responsables de l'arôme avec choix de la souche la plus performante, d) culture de cette souche sélectionnée en milieu liquide sur substrat agro-industriel, e) isolement des métabolites secondaires produits du milieu de culture, f) piégage des arômes. L'isolement de ces nouvelles souches est réalise par ensemencement de différents types de milieux obtenus à partir de produits agro-industriels liquides gélifiés, par des fragments de mycéliums obtenus à partir des souches de champignons filamenteux. On évalue alors les différentes croissances mycéliennes de façon à isoler les souches qui ont la croissance la plus rapide. On sélectionne alors au moins une de ces souches avec une croissance rapide qui est alors testée pour connaître son aptitude à supporter en début de croissance les métabolites produits. On ensemence alors des milieux gélosés obtenus à partir de produits agro-industriels gélifiés contenant des concentrations croissantes de métabolites avec des fragments de mycélium et l'on isole la souche la plus performante. On sélectionne également les souches par leur aptitude à produire l'arôme défini. La souche ayant la croissance la plus rapide, qui n'est pas inhibée par les métabolites produits en début de croissance et capable de produire l'arôme souhaité est la souche recherchée. Cette souche est alors cultivée en milieu liquide sur substrat agro-industriel en fiole agitée ou en fermenteur, en continu ou en batch, germes immobilisés ou libres, avec recyclage total ou partiel du milieu ou apport de milieu neuf. Enfin, les molécules produites sont extraites de manière classique du milieu à l'aide par exemple de l'extraction par solvant. Ce procédé de fabrication d'arôme est la caractéristique essentielle de l'invention mais à titre de produit industriel nouveau, l'invention se caractérise également par les nouvelles souches obtenues par le procédé à partir de souches connues notamment de TRICHODERMA VIRIDE et de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS. On va maintenant décrire un certain nombre d'exemples de fabrication d'arômes selon le procédé qui fera apparaître d'autres avantages et caractéristiques du procédé en accord avec les figures annexées qui représentent figure 1 : chromatogramme de l'extrait obtenu à partir de culture de TRICHODERMA VIRIDE, figure 2a : chromatogrammes caractéristiques de la production de 6-pentyl-Z-pyrone à différentes étapes de la culture, figure 2b : évolution de la teneur en 6-pentyl figure 3 : évolution de la présence d'arôme dans le milieu en cours de fermentation pour CERATOCYSTIS MONILIFORMIS ; cas de la fiole agitée, figure 4 : évolution de la présence d'arôme dans le milieu en cours de fermentation pour CERATOCYSTIS MONILIFORMIS ; cas de la culture en fermenteur. Le procedé de fabrication d'arôme selon l'invention nécessite donc une première étape d'isolement d'une nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE qui comprend la succession d'étapes suivantes a) on recueille des champignons inférieurs dans des lieux connus pour contenir les TRICHODERMA VIRIDE, c' est-à-dire des sols humides ou des milieux agro-industriels traitant des végétaux tels que les usines de jus de fruits, b) on isole les couches prélevées sur un milieu de culture gélosé placé à l'obscurité pendant 3 à 6 jours à 23 environ, c) on sélectionne la ou les meilleures souches pour leur aptitude à croître sur milieu agro-industriel en procédant de la façon suivante - on prélève un fragment de mycélium développé sur culture gélosée à un instant donné de l'étape précé- dente avec lequel on ensemence un milieu en boîte de pétri réalisé à partir de produits ou sous-produits agro-industriels liquides ou d'excédents de production alimentaire, dilué ou non, auxquels on devra associer un gélifiant en quantité suffisante (agar-agar 15 grammes par litre), les différents produits pouvant cotre du lait ou du lactosérum, des jus de fruits tels que des jus de raisins ou de pommes ou du vin. - au bout de 3 à 6 jours à 23 C on note l'évolu- tion de la croissance mycélienne. d) parmi les souches ayant une croissance mycélienne suffisante en milieu liquide sur substrat agro-industriel, on retient celles qui ont une bonne aptitude à produire de l'arôme du type souhaité. Cette étape d'isolement prévoit aussi de vérifier que les différentes souches sélectionnées ont une bonne aptitude à supporter en debut de croissance les métabolites produits et que la production d'arôme ne sera pas inhibée dès le début de la culture. On procède alors de la façon suivante : on prépare en boite de pétri des milieux gélosés à base des mêmes sous-produits agro-industriels auxquels on associe des concentrations croissantes de métabolites que l'on a préalablement isolés. Ces milieux de culture sont alors ensemencés par des disques de mycéliums obtenus à l'étape b). On observe alors toutes les 24 heures pendant 6 jours la qualité de la croissance. On retient alors la ou les souches qui ont la meilleure croissance et la meilleure capacité à produire l'arôme souhaité et enfin qui supportent en début de croissance les métabolites produits. On obtient alors une nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE dont l'aspect structural est le suivant - un mycélium ras, translucide, à la surface duquel apparaissent au bout de 3 jours environ de culture des formations sporogones d'abord blanches se colorant par la suite en vert, - le conidiophore de forme sphérique contient de 10 à 20 conidies globuleuses de 2,5 à 3 m de diamètre, - la température de croissance est de 15 à 350C avec un optimum de croissance de 22 à 260C, - elle pousse sur milieu classique tel que maltagar, ou pomme de terre-glucose-agar à un pH compris entre 4 et 7,5 avec un optimum vers 5,5, - la croissance est aérobie. Le procédé de fabrication d'arôme prévoit alors la culture de la souche ainsi sélectionnée. Les souches sont donc cultivées en milieu liquide toujours sur substrat agro-industriel, dilué ou non, éventuellement complémenté en éléments spécifiques tels que des acides aminés, des peptides, des acides gras ou leurs sels destinés à orienter le développement des métabolites. Les paramètres de culture (temps, quantité et qualité du milieu, paramètres physicochimiques) sont optimisés de façon telle que pour une masse mycélienne donnée, le rapport métabolites secondaires aromatiques sur mycélium total produit (actif ou inactif) soit maximum. Cette culture peut être menée en fiole agitée ou en fermenteur dans lesquels se développe le mycélium. Les métabolites secondaires produits sont alors isolés du milieu de culture dans lequel ils avaient été relargués. Suivant le procédé, en continu ou en batch, la séparation des métabolites du milieu est réalisée soit en continu ou en discontinu lorsque la concentration dans le milieu est optimale. EXEMPLE 1 CULTURE EN FIOLE AGITEE On prépare le milieu de culture ayant la composition suivante - Jus de raisin 100 ml - Supplément en acides aminés libres 0,26 g - H2O quantité suffisante pour 1 1 Le pH de cette préparation est naturellement de 3,3. On l'ajuste aux alentours de 5 par addition de soude 5N. Ce milieu est alors réparti dans des fioles de 150 ml à raison de 50 ml par fiole La stérilisation se fait à l'autoclave à 1210C pendant 20 minutes. L'ensemencement est réalisé par un disque de gélose recouvert de mycélium de la nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE. On laisse alors cette préparation sur une table agitante à 50 tours/minute à amplitude de 5 cm pendant 72 heures. A la fin de l'incubation, le milieu de culture est récupéré et séparé du mycélium par des moyens mécaniques tels qu'une filtration. Les arômes sont ensuite piégés sur des polymères. L'élution est réalisé par passage à contrecourant de solvant. Après concentration, la fraction aromatique ainsi isolée est analysée par chromatographie en phase gazeuse. Le système chromatographique est ainsi défini - chromatographe commercialisé sous la dénomination VARIAN série 6000 - gaz vecteur : azote 15 ml/min - comburant : air 300. ml/min - carburant : hydrogène 50 ml/min - gradient de température : 100 à 2200C, à 20C/min - colonne Mégabore (diamètre interne 0,53 mm) série D.B WAX (dénomination commerciale) longueur : 15 m phase stationnaire : polyéthylène-glycol - détection F.I.D (Flame Ionization Detector) Le chromatogramme de la figure 1 montre un premier pic 1 correspondant à la 6-pentyl-oL-pyrone, isolée du milieu ; les pics 2 et 3 sont des témoins de - décalac tone et 6 - undécalactone synthétiques de référence. La 6-pentyl-X-pyrone a été identifiée par couplage chromatographie phase gazeuse-spectromètre de masse. Le volume de rétention relatif par rapport à la décalactone est de 15 ml. EXEMPLE 2 CULTURE EN FERMENTEUR On réalise la culture dans un milieu avec la composition suivante - Jus de raisin 1,5 1 - Supplément en acides aminés libres 3,9 g - H2O quantité suffisante pour 15 1 Le pH de cette préparation est naturellement de 3,3 non on le ramène aux alentours de 5 avec de la soude 5N. La stérilisation est réalisée directement dans la cuve du fermenteur pendant 20 minutes à 1200C pour une cuve de 20 litres totaux. L'ensemencement est alors réalisé à l'aide du mycélium de la nouvelle souche après que l'on ait vérifié qu'il présente bien un début d'activité métabolique secondaire. Les différents paramètres physico-chimiques sont alors régulés avec les valeurs suivantes - pH 5,2 - Température 270C - Agitation 250 tours/minute - Aération 65 % d'oxygéne dissous On obtient au cours du temps les résultats représentés sur la figure 2a notamment à la 12ème heure, à la 30ème heure et à la 42ème heure. Sur la figure 2b qui représente les aires des pics obtenues à différents temps tel qu'en 2a, on constate une première phase A dite phase d'adaptation, puis une phase active de production aromatique phase B , qui correspond à une croissance mycélienne élevée. Le maximum de production aromatique est atteint aux environs de 40 heures de culture ; à partir du point P, la courbe montre nettement que la concentration du métabolite relargué dans le milieu décroit. Cela correspond à la phase inactive C. Le même procédé de fabrication d'arôme tel qu'il vient d'être donné dans un premier exemple avec la souche de TRICHODERMA VIRIDE peut être également utilisé pour la culture d'une souche de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS. L'isolement est alors conduit selon la succession d'étapes suivantes a) on recueille les champignons inférieurs dans des lieux connus pour contenir des CERATOCYSTIS MONILIFORMIS, c'est-d-dire des sols de forêts et des arbres tropicaux, b) on isole les souches prélevées sur un milieu de culture gélosé placé à l'obscurité pendant 4 à .6 jours à 230C, c) on sélectionne la ou les meilleures souches pour leurs aptitudes à croître dans un milieu liquide sur substrat agro-industriel de la même façon qu'avec le TRICHODERMA VIRIDE, les meilleures souches retenues étant celles qui permettent de produire le plus rapidement l'arôme défini en milieu immergé sur substrat agro-industriel et qui ne sont pas inhibées par les métabolites produits en début de croissance. La nouvelle souche de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS obtenue présente l'aspect structural suivant - un mycélium plan, cotonneux, blanc au stade jeune à la surface duquel apparaissent au bout d'environ 4 jours des formations périthéciales brunes, - l'observation au microscope électronique à balayage montre des conidies de forme globuleuse ne presentant pas d'ornementation particulière de diamètre environ 6 m. Les périthèces sont enveloppés par une couche de mycélium, disposé en forme concentrique au niveau du col. Leur longueur est supérieure à 250 Fm, leur diamètre à la base est d'environ 16 rm et leur diamètre supérieur à 130 m, - la température de croissance est de 18 à 30"C avec un optimum à 230C, - elle pousse sur milieu classique tel que maltagar ou pomme de terre-glucose-agar à un pH compris entre 4,5 et 7 avec un optimum vers 5, - la croissance est aérobie. Un exemple va maintenant être donné concernant l'application du procédé de fabrication d'arôme à une souche de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS. EXEMPLE 3 CULTURE EN FIOLE AGI TEE On prépare le milieu de culture avec la composition suivante - DIFCO Yeast carbon Base 11,7 g - Supplément en acides aminés libres 4,67g - H2O quantité suffisante pour 1 1 On ajuste le pH de cette préparation à 5,2 avec de la soude 5N et ce milieu est réparti dans des fioles de 150 ml à raison de 50 ml par fiole. La stérilisation se fait à l'autoclave à 1100C pendant 20 minutes. L'ensemencement est réalisé par un disque de gélose recouvert de mycélium de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS. On laisse cette préparation sur une table agitante à 50 tours/minute d'amplitude 5 cm. On effectue un prélevement par intervalles répétés jusqu'à 120 heures. A la fin de chacun des temps d'incubation le milieu de culture est récupéré et séparé des mycéliums. Les arômes sont alors séparés par extraction liquide-liquide et après concentration la fraction aromatique est analysée par chromatographie en phase gazeuse. Le système chromatographique est ainsi défini - chromatographe commercialisé sous la dénomination PACKARD - gaz vecteur : azote 12,9 ml/min - comburant : air 132 ml/min - carburant : hydrogène 13,8 ml/min - gradient de température : 70 à 1800C, à 20C/min - détection F.I.D - colonne remplie (diamètre interne 2 mm) - longueur : 3 m support du commerce chromosorb WAW 100-120 Mesh imprégné de phase stationnaire Carbowax 20M 10 % Les chromatogrammes montrent 2 pics principaux, qui possèdent les mêmes volumes de rétention que les acétates d'isoamyle et de n - amyle ; ces molécules rappellent l'odeur de la banane mûre. EXEMPLE 4 CULTURE EN FERMENTEUR la nouvelle souche sélectionnée est également mise en culture dans un milieu ayant la composition suivante - DIFCO Yeast carbon Base 58,5 g - Supplément en acides aminés libres 23,35 g - H2O quantité suffisante pour 5 1 Le pH de cette solution est ramené à 5,2 avec de la soude 5N. La stérilisation est réalisé dans la cuve d'un fermenteur de 7 litres totaux pendant 25 minutes à 1100C. L'ensemencement est réalisé à partir des souches obtenues après que l'on ait vérifié que le mycélium présente bien un début d'activité métabolique secondaire. Les différents paramètres physico-chimiques de culture sont les suivants pH 5,2 Température 250C Agitation 200 tours/min Aération 45 % d'oxygène dissout On a ainsi pu suivre l'évolution de la présence d'arôme dans le milieu en cours de fermentation, ce que l'on retrouve dans la courbe représentée en figure 4. Le procédé de fabrication selon l'invention peut bien évidemment être appliquée à d'autres souches et les deux exemples fournis ne l'ont été qu'à titre indicatif. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires à fins d'aromatisation de produits alimentaires ou thérapeutiques, à partir de souches de champignons filamenteux et de produits ou sous-produits agro-industriels, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) isolement de nouvelles souches de champignons sur milieu de culture gélosé, b) sélection d'au moins une de ces souches pour son aptitude à produire l'arôme souhaité en milieu immergé sur substrat agro-industriel, c) test de l'aptitude des souches sélectionnées à croître en présence de quantités variables de leurs métabolites secondaires, d) choix de la souche s'étant révélée la plus performante après la suite d'étapes a, b et c, e) culture de cette souche en milieu liquide sur substrat agro-industriel, f) séparation du mycélium de son milieu de culture enrichi en métabolites secondaires produits au cours de la fermentation, g) séparation des métabolites secondaires. 2 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'isolement d'une nouvelle souche de champignons est réalisé par la succession des étapes suivantes - prélèvement des champignons inférieurs dans leur milieu naturel, - isolement des souches cultivées sur un milieu gélosé, incubées à l'obscurité pendant au moins 1 jour à une température comprise entre 18"C et 350C, - prélèvement d'un fragment de mycélium de chaque souche, - ensemencement avec ces mycéliums de milieux gélosés obtenus à partir de produits agro-industriels liquides (lait, lactosérum, jus de fruits, notamment raisin, pomme, vin...) gélifiés, - évaluation des différentes croissances mycéliennes apres 2 jours au moins d'incubation à une température comprise entre 18 C et 350C. 3 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on sélectionne olfactivement au moins une souche apte à produire l'arôme souhaité en milieu immergé sur substrat agro-industriel. 4 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on teste à l'aide des étapes suivantes les souches sélectionnées pour leur aptitude à supporter en début de croissance les métabolites produits - prélèvement d'un fragment de mycélium de chaque souche, - ensemencement avec ces mycéliums de milieux gélosés obtenus à partir de produits ou sous-produits agroindustriels contenant des concentrations croissantes de métabolites isolés des cultures des souches ayant la meilleure aptitute à produire l'arôme souhaité, - on sélectionne la souche la plus performante. 5 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche la plus performante est cultivée en milieu liquide, sur substrat agro-industriel complété éventuellement en éléments spécifiques tels que acides aminés libres, peptides, acides gras et leurs dérivés, précurseurs, les paramètres de culture (temps, quantité et qualité du milieu, paramètres physico-chimiques) sont tels que l'on obtienne une valeur maximale du rapport (métabolites secondaires/mycélium total) produits. 6 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 5, caractérisé en ce que le mycélium est séparé par un procédé physique de son milieu de culture enrichi en métabolites secondaires produits au cours de la fermentation. 7 - Procédé de fabrication de métabolites secondaires selon la revendication 6, caractérisé en ce que les arômes sont séparés du milieu par une méthode usuelle et/ou fractionnement sur polymère. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les champignons inférieurs prélevés en milieu naturel contiennent des souches de TRICHODERMA VIRIDE. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les champignons inférieurs prélevés en milieu naturel contiennent des souches de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS. 10 - Nouvelle souche de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS obtenue par le procédé selon les revendications 1 à 7 et 9, caractérisée en ce qu'elle présente l'aspect structural suivant - mycélium plan, cotonneux, blanc au stade- jeune, à la surface duquel apparaissent au bout d'au moins 2 jours des formations périthéciales brunes, - conidies de forme globuleuse de diamètre moyen 6 Fm, - les périthèces sont enveloppés par une couche de mycéliums, disposé en forme concentrique au niveau du col, longueur supérieure à 250 am, diamètre à la base compris entre 10 et 20 m, diamètre supérieur compris entre 50 et 250 ssm, - la température de croissance est comprise entre 150C et 40du, plus particulièrement 23"C, - développement sur milieu classique : pomme de terre-glucose-agar, malt-agar, avec un pH légère ment acide de 5, - croissance aérobie. 11 - Nouvelle souche de CERATOCYSTIS MONILIFORMIS selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les métabolites secondaires qui en sont issus possèdent dans certains cas, une odeur de banane. 12 - Nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE obtenue par le procédé selon les revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle présente l'aspect structural suivant - mycélium ras, translucide.à la surface duquel apparaissent au bout d'au moins 2 jours des formations sporogones d'abord blanches se colo rant par la suite en vert, - conidiophore de forme sphérique contenant dé 10 à 20 conidies globuleuses de diamètre moyen 2,75 Fm, - température de croissance comprise entre 20 et 400C et plus particulicrement 22 à 260C, - développement sur milieu classique : pomme dé terre-glucose-agar, malt-agar avec un pH légère ment acide de 5,5, - croissance aérobie. 13 - Nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les métabolites secondaires qui en sont issus possèdent dans certains cas, une odeur de noix de coco. 14 - Nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que les molécules responsables de cet arôme sont principalement des lactones. 15 - Nouvelle souche de TRICHODERMA VIRIDE selon l'une des revendications 12, 13 et 14, caractérisée en ce que l'une des molécules produites est la 6-pentyl K-pyrone.