Brevet FR2601000A1 — publié le 19880108

La présente invention concerne un procédé de marquage de gangliosides par de l'iode radioactif par voie enzymatique. Dans le système nerveux central, la membrane plasmique de la cellule neuronale est particulièrement enrichie en gangliosides définis comme des glycosphingolipides contenant de l'acide sialique, principalement l'acide N-acétyl neuraminique. On indiquera ci-après la structure des cinq gangliosides majeurs présents dans le cerveau des mammifères, à savoir GMl, GDla, GDtb, GTlb, GQlb N-Acéty I Galactose golactosomine Golactose Glucose GM1, R1 = R2 = H GD1a, R1 = NeuAc, R2 = H GD1b, R1 = H, R2 = NeuAc GT1b, R1 = R2 =NeuAc = NeuAc GQ1b, R1 = NeuAc(2-8)NeuAc, R2 = NeuAc. La présente invention est destinée à effectuer ia radioiodation d'un ou plusieurs gangliosides choisi(s) parmi GM3, GM2,GM1 ,GD3,GD1a,GD1b,GT1b,Gq, ainsi que leurs mélanges. De nombreuses recherches, qui avaient pour but de déterminer le rôle physiologique des gangliosides dans le système nerveux, ont abouti aux hypothèses suivantes t Les gangliosides seraient impliqués dans la maturation et la différenciation du neurone en agissant comme des agents neurotropes ou neuritogènes (SPOERRI, P.E. (1983) Int.J. Devl.Neuroscience 1,383 et LESKAWA, K.C. and HOGAN, E.L. (1985) J.Neuroscience Res. 13,539). t Les gangliosides moduleraient les activités d'enzymes clés (JANlGRO,D., Dl GREGORIO, F., VYSKOCIL, and GORIO, A. (1984) J.Neuroscience Res. 12,499) ou les propriétés de certains récepteurs (BRENNER, E.G., HAKOMORI, S.I., BOWEN-POPE, D F. RAINES, E. and ROSS, R. (1984) J.Biol.Chem. 259,6818) de la membrane plasmique. $ Les gangliosides agiraient comme des "agents réparateurs, suite à des lésions cérabrales (WOJCIK, M., ULAS, J., ODERFELD-NOWAK, B. (1982) Neuroscience 7,495). Afin de mieux suivre l'insertion et le métabolisme des gangliosides dans la cellules nerveuse, on a déjà proposé d'utiliser des précurseurs radioactifs (3H, 14C, rayonnement ss) (TETTAMANTI, G., GHIDONI, R., VENERANDO, B., FIORILLI, A. and SANDRO, S., Colloque INSERM-CNRS, Aspects cellulaires et pathologiques du métabolisme des glycoconjugués, INSERM 1984 (DREYFUS, H., MASSARELI, R., rREYSZ, L. et REBEL, G., eds) 126,135) et (YAVIN, E. RlCHTER-LANSBERG, C., DUKSI N, D. and YAVIN, Z. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81,5638), pour marquer une partie de la molécule ou encore de synthétiser des gangliosides portant un marqueur de spin (radical nitroxyde) (SCHWARZMANN,G., SONDERFELD, S., CONZELMANN, E., MARSH, D. and SANDHOFF, K. Colloque INSERM-CNRS, Aspects cellulaires et pathologiques du métabolisme des glycoconjugués, INSERM 1984 (DREYFUS, H., MASSARELI, R., FREYSZ, L. et REBEL, G., eds) 126,195). La présente invention a eu pour but d'insérer un élément radioactif, en particulier de l'iode 125, dans les gangliosides et de préférence dans le domaine hydrophobe composant les gangliosides majeurs. L'invention propose donc un nouveau procédé enzymatique permettant d'obtenir des gangliosides marqués par de l'iode radioactif en utilisant une peroxydase et un générateur de peroxyde. Ce procédé peut être mis en oeuvre avantageusement en milieu aqueux, dans des conditions réactionnelles douces et en exerçant un contrôle de la génération de peroxyde. On rappellera- que, dans l'état de la technique, aucune méthode chimique ou enzymatique permettant le marquage avec des éléments à haute énergie (rayonnement t ) des différentes espèces moléculaires des gangliosides n'a été décrite. Des réactions d'halogénation catalysées par des haloperoxydases ont été décrites par d'autres auteurs (LEE, T.D., GEIGERT, J., DALIETOS, D.J. and HIRANO, D.5.(1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 110,880 ; GEIGERT, J., NEIDLEMAN, S.L. and DALIETOS, D.J. (1983) J.Biol.Chem. 258,2273 ; NEIDLEMAN, S.L. and GEIGERT, J. (1983) Trends in Biotechnol.1,21 et GEIGERT, J., and NEIDLEMAN, S.L. (1983) Devel. in Industrial Microbiology 24,385). Mais les substrats sont des alcènes ou alcynes, ne dépassant pas 8 carbones, la réaction se fait en milieu acide (pH 3), l'eau oxygénée n'est pas générée par un système enzymatique et l'halogénation se fait uniquement par addition sur double ou triple liaison et non par substitution. En revanche, la radioiodation selon l'invention se déroule dans des conditions salines et de pH physiologiques et aucune modification de la structure (à part I'halogénation) de la molécule ne peut intervenir. Aussi le marquage se fait sur des chaînes aliphatiques contenant plus de 8 carbones et donc sur des structures micellaires. La synthèse ou biosynthèse de gangliosides marqués par l'isotope '14C3 ou oar l isotope Le temps nécessaire afin d'obtenir des gangliosides radioactifs (14C,3H) est de l'ordre de 2 jours dans les conditions les plus optimales. Afin d'augmenter le rendement, une synthèse chimique à grande échelle est nécessaire, et la durée de l'opération est d'autant plus longue. L'utilisation de gangliosides tritiés est désavanta geuse, le phénomène d'échange isotopique in vitro et in vivo risque de perturber l'interprétation des résultats finaux. La synthèse d'un ganglioside tritié sur une position spécifique de la molécule augmenterait de beaucoup le coût de la production. Les composés marqués au carbone ( 14C) ou au tritium (3H) nécessitent I'addition de solvants organiques (scintillateurs), afin de pouvoir quantifier la radioactivité (cpm:coups par minute). Après le comptage de la radioactivité ces produits sont donc irrécupérables. De plus, le (14C) et le (3H) émettent des rayonnements ss et, afin de pouvoir détecter les composés radioactifs, une activité spécifique élevée est nécessaire. Les gangliosides marqués conformément au procédé de I'invention sont utiles en recherche fondamentale tant in vivo que in vitro, ainsi qu'en tant que matériel de test ou de diagnostic. Le procédé de I 'invention est caractérisé en ce que l'on met à réagir une solution aqueuse d'au moins un ganglioside avec un composé iodé radioactif, en particulier un iodure 1251, en présence d'une peroxydase catalysant les réactions d'halogénation et d'un peroxyde ou générateur de peroxyde, puis après achèvement de la réaction, en ce que l'on purifie et l'on récupère les gang josides radiomarqués. Selon une caractéristique particulière du procédé de l'invention, ladite peroxydase est choisie parmi la lacto peroxydase, la peroxydase de raifort et la chloroperoxydase. Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de l'invention, le générateur de peroxyde est un générateur d'eau oxygénée ; il peut en particulier être constitué par le couple glucose-glucose oxydase. Il est également possible de réaliser la radioiodation en utilisant directement le peroxyde d'hydrogène (H202). Selon une autre caractéristique de l'invention, l'un des deux réactifs du couple glucose-glucose oxydase, en particulier le glucose, est ajouté en dernier lieu au milieu réactionnel comme initiateur de la réaction. Il convient de noter qu'en variante, le générateur de peroxyde peut également être constitué par un persel, notamment un persulfate, par exemple le persulfate d'ammonium (NH4)2 52087 Selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de l'invention, on réalise les diverses étapes successives suivantes - solubilisation des gangliosides dans un solvant organique, en particulier le mélange chloroforme méthanol (21); - évaporation du solvant organique - addition au résidu d'évaporation d'un tampon phosphate - addition de Na.1251 dissous dans un tampon phospha te - addition de la peroxydase préparée dans un tampon phosphate - addition de glucose-oxydase dissoute dans un tampon phosphate;; - addition de D-glucose dissous dans un tampon phosphate - évaporation du milieu réactionnel sous atmosphère d'azote à température ambiante, et - séparation chromatographique. Il convient ici de noter que la solubilisation du ou des gangliosides au sein de solvants organiques n' est toutefois pas nécessaire. En effet, il est également possible de faire appel à des gangliosides qui sont présentés sous une forme lyophilisée et qui sont directement solubles dans le milieu réactionnel. Ils peuvent donc être radioiodés sans solubilisation préalable dans des solvants organiques ou des stabilisateurs. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée faite ci-après en s appuyant sur des exemples de mise en oeuvre particuliers. EXEMPLE 1 : Radioiodation catalysée par la lactoperoxydase A) Matériel utilisé Gangliosides : mélange purifié à partir de cerveau de boeuf (GM1 20%, GD3 5%, GDla 40%, GDlb 15%, GTlb 17%, GQ1 3%, FIDIA, Abano Terme, Italie) Glucose (Merck, RFA) 1251 (15 mCi/ug 1251) (Amersham, GB) Lactoperoxydase (EC 1.11.1.7; 60 Ul/mg protéine)(Sigma) Glucose oxydase (EC 1.1.3.4; 300 Ul/mg protéine d'origine Asperillus niger) (Sigma) Neuraminidase (EC 3.1.1.4 ; 150 Ul/mg protéine d'origine Vibrio cholerae) (Sigma) Tampons : phosphates (50 mM ou 100 mM à pH 6,0 ou 7,0) Solvants organiques : de qualité Analar Films, révélateurs et fixateurs : Agfa-Gevaert.Cassettes pour autoradiographie : Phillips avec écran Détecteur de radioactivité sur couche mince: Berthold,RFA Silice H60: Merck. Gei pour chromatographie en milieu hydrophobe : LH-20 (Pharmacia, Suède) B) Mode opératoire de la réaction de radioiodation Les gangliosides sont solubilisés dans un solvant organique, en particulier dans le mélange chloroforme:méthanol 2:1 Evaporation des solvants organiques . Addition de tampon phosphate (200 l) 125 108cpm) dans 8 . Addition de 100 Ci de Na.1251(1,6x108cpm) dans 10 l de tampon phosphate Na.125l + { KI 1mM # {Kl 1mM # .Addition de 10 Cig de LPO préparée dans du tampon phosphate, 10 KI 1mM # Na.125 I + LPO + K 1mM e Addition; de glucose oxydase : 10 mU dans 10 pl de tampon phosphate K1 1mM # Na. 1251 + LPO + GO + Kl 1mM # Addition de D-Glucose : 250 nmoles dans 50 trl de tampon phosphate Na.125I + LPO + GO + D-Glucose La réaction est initiée par addition du glucose Glucose + GO H2O2 + Gluconolactone H202 + 1251 + LPO + Gangliosides (Gangliosides) (# Gangliosides) + 125l + H2O + LPO La réaction dure 10 minutes à 200C. C) Purification et chromatographie sur couche mince Aucun réducteur n'est ajouté à la fin de la réaction (afin d'éviter la formation de sels de Bunte) et le milieu réactionnel est évaporé sous atmosphère d'azote à la température ambiante. Le résidu est appliqué sur une colonne de silice (volume du gel 500 l), préparé dans du chloroforme:méthanol :eau (74:21:1) (E1), le premier éluat (E1, 10 ml) est écarté et le deuxième (chloroforme:méthanol:eau (50:50:15) récupéré et évaporé dans un Rotovapor (Buchi, Suisse). Le résidu est récupéré dans 20 ul de chloroformeméthanol (2:1) et déposé sur couche mince de silice. Le dépôt est élué avec trois solvants différents selon la méthodede Dreyfus et coll. (HARTH, S.E., DREYFUS, H., URBAN, P.F. and MANDEL, P. (1978) Anal. Biochem. 86,543) - Chloroforme : 1 heure - chloroforme:méthanol:eau (70:30:4) : 2 heures - chloroforme:méthanol:eau (KCl 0,25%) (60:35:8) : 3 heures Les plaques sont séchées, les produits marqués détectés par "scan" ou autoradiographie et ensuite révélés selon la méthode de Svennerholm et coll. (SVENNERHOLM, L., (1957) Biochim. Biophys.Acta 24,604). D) Résultats t Radiochromatogramme Le radiochromatogramme des gangliosides radioiodés en l'absence d'iodure de potassium (Fig.1) montre un fort marquage des espèces GTlb, GD2 (a,b) et GM1. De même, le radiochromatogramme des gangliosides radioiodés en présence d'iodure de potassium (Fig.2) montre aussi le marquage des espèces GTlb, GD1 (a,b) et GM1. Le traitement des gangliosides marqués à la neuraminidase (10 mU, incubation à 370C pendant 30 minutes dans du tampon Tris-HCl, 50 mM, pH 7,2, contenant 100 41M de CaCl2) montre que les produits marqués sont bien des gangliosides, car ils sont transformés en GM1 (Fig.3). * Autoradiographie La revélation des produits radioactifs par scanning n étant pas assez fine, vu la résolution basse du scanner, il a été procédé à 'autoradiographie (Fig.4). La piste 1 correspond à la figure 1, la piste 2 à la figure 2, et les pistes 3 et 4 correspondent aux gangliosides marqués sans (piste 3) ou avec (piste 4) présence d'iodure de potassium (1 mM) et ensuite traités à la neuraminidase. L autoradiographie montre clairement que les gangl io- sides, GTlb, GD1 (a,b) et GM1, sont radioiodés et que le traitement à la neuraminidase transforme ces derniers en GM1. Il convient ici de bien noter que l'omission de LPO ou de glucose oxydase ne permet ps le marquage des gangliosides et seules des taches radioactives qui correspondent à 125l-3 et 12512 peuvent être détectées par autoradiographie. II a également été observé que l'activité spécifique est de 106 cpm/ 5 g d d'acide N-acétyl neuraminique ou de 2x105 cpm pour les gangliosides radioiodés en absence ou en présence de KI (1 mM). Ainsi, il apparaît clairement que la LPO catalyse la radioiodation des gangliosides. Les résultats obtenus (marquage du GM1 et transformation du GTlb et des GD1 (a,b) en GM1 par la neuraminidase) confirme que la radioiodation se fait par substitution sur les chaînes paraffiniques composant le 'céramide Malgré la demi période (t 2) de l'isotope relativement courte (61 jours), le procédé de I'invention permet d'obtenir des gangl iosides par un élément à rayonnement t ,qui ne nécéssi tent donc pas de scintillateurs pour les détecter et peuvent donc être récupérés. EXEMPLE 2 : Radioiodation d'un mélange de gangliosides catalysée par de la peroxydase de raifort insoluble A) Matériel utilisé a) Peroxydase insoluble (attachée à des billes d'aga rose),(Sigma n de catalogue P-3912, 23000 u/g agarose ou 36 800 mU/100 l de suspension). b) gangliosides : mélange purifié à partir de cerveau de boeuf (GM1 205 GD3 5%, GDla 40%, GDlb 15%, GTlb 17%, GQ1 35) (FIDIA, Abano Terme, Italie) c) Glucose oxydase (300 Ul/mg protéine d'origine Asperillus Niger), (Sigma, n de catalogue G-6500) d) D-Glucose, Merck e) Tampon phosphate : 50 mM, pH=7,0 f) KI : Prolabo g) Chromatographie sur couche mince 1ère élution : CHCl3, 1 heure 2ème élution :CHCl3, CH30H, H20 (70:30:4), 1 heure 3ème élution : méthyl acétate:propanol 1:schloroforme: méthanol:eau (25% KCl) (25:20:20:20: 17) B) Mode opératoire * 100 g de gangliosides contenus dans 10 ul de chloroforme:méthanol (2:1) sont déposés dans un tube à essai (Corning, borosilicate Glass, catalogue n 99 445) et le solvant évaporé. s 100 l de tampon phosphate sont ajoutés. * 100 l de 1251 (100 (100 Ci) sont ajoutés (tampon phosphate. * 100 l de Kl (1mM tampon phosphate) sont ajoutés. * 50 wI de suspension de peroxydase de raifort sori ajoutés (50 ont été relevés du s:ock, rincés pendant 15 minutes avec le tampon phosphate (500 l), centrifugés pendant 15 minutes à 4500 t/minute, et cette manipulation répétée encore deux fois, le culot a été resuspendu dans 50 l de tampon phosphate). 9 70 mU de glucose oxydase dans 50 l de tampon sont ajoutés. * 50 ,ul de 0,09 %0 de glucose (tampon phosphate) sont ajoutés. t La réaction dure 30 minutes et le tube est agité toutes les 5 minutes. $ Le milieu réactionnel est ensuite centrifugé pendant 30 minutes à 4500 t/minute, le surnageant récupéré, évaporé sous azote, le résidu repris dans 40 l de chloroforme:méthanol (2:1) et déposé sur plaque de silice. C) Résultats La figure 5 (2 heures d'exposition du film à Rayon X après chromatographie) montre le marquage de GDla, GDlb, GTlb et GQ1b (piste 2). L'omission de peroxydase de raifort ne permet pas le marquage des gangliosides. EXEMPLE 3 : Radioiodation d'un melange de gangliosides catalysée par de la lactoperoxydase A) Matériel utilisé a) Lactoperoxydase (de lait, Sigma, Référence n L-2005) b) à f) comme à l'exemple 2 g) Chromatographie sur SEP-PAK (phase inverse) (C18 CARTRIDGE, WETERS Associates, millipore, Référence n 51910) h) Chromatographie sur couche mince méthyl acétate:Propanol 1 :chloroforme:methanol eau (25% KCl) (25:20:20:20::17) 1 heure B) Mode opératoire + lactoperoxydase - lactoperoxydase gangliosides 9 9 9 ,ug 1251 100 Ci. 100 uCi dans 100 pt tampon phos- phate KI 100 l 100 l 1 mM lactoperoxydase 50 g - 50 l dans tampon phos phate glucose oxydase 700 mU 700 mU tampon phosphate 50 l l glucose 50 l 50 l (9% dans H2O temps de réaction : 30 minutes * Evaporation sous azote 9 Le résidu est repris et mélangé dans 2 ml de chîoroforme:méthanol:H2O (0,1 M KCI) (3:48:47) et appliqué sur la colonne SEP-PAK. * La colonne est éluée avec 3 ml du même solvant et ensuite avec 5 ml de ce solvant (cet éluat est mis de côté) $ La colonne est éluée avec 10 ml d'eau et I éluat mis de côté * La colonne est éluée avec 2 ml de méthanol et ensuite deux fois 2 ml de chloroforme: méthanol Ces éluats sont évaporés sous azote, resuspendus dans 500 ,ul de chloroforme:méthanol (2:1) et 50 l déposés sur couche mince, (pour l'expérience où la lactoperoxydase est omise, le dépôt est de 100 pI). C) Résultats La figure 6 (piste 1) montre le marquage des gangliosides par la lactoperoxydase et démontre l'élimination totale des espèces iodées (I-, I2, I-3, I-5,...) qui n'ont pas réagi. Dans ces conditions, le rendement du marquage est de 100 % (1 atome d'iode par molécule de ganglioside) et le marquage suit la distribution des gangliosides marqués (GM1 20%; GD3 3%; GD1a 30%; GDlb 15%; GTlb 15% et GQlb 2%; le GM3 se marque aussi 10% et fait partie de a contamination du produit vendu par la FIDIA; le GM3 se marque fortement, car le petit copule glucidique favorise le marquage de la partie hydrophobe. Exemple 4 : Radioiodation d'un mélange de gangliosides catalysée par de la lactoperoxydase Le matériel utilisé et le protocole opératoire sont identiques à ceux décrits dans le cadre de l'exemple 3, à l'exception toutefois du couple glucose-glucose oxydase qui a été remplacé par 50 pI d'une solution de persulfate d'ammonium à 11%. Cette solution est ajoutée après l'addition de la iactoperoxydase. Les gangliosides ont ainsi pu être radioiodés tel que cela apparat sur la figure 7 (piste 1). EXEMPLE 5 : Radioiodation d'un mélange de gangliosides catalysée par de la lactoperoxydase Le matériel utilisé et le protocole opératoire sont identiques à ceux décrits dans le cadre de l'exemple 3, à l'exception toutefois du couple glucose-glucose oxydase qui a été remplacé par 3 ul d'H202 à 30% (Prolabo#). Cette solution est ajouté après I'addition de la lactoperoxydase. Les gangliosides ont ainsi pu être radioiodés tel que cela apparat sur la figure 7 (piste 2). EXEMPLE 6 : Radioiodation d'un mélange de gangliosides catalysée par de la lactoperoxydase Le matériel utilisé et le protocole opératoire sont identiques à ceux décrits dans le cadre de l'exemple 3, à l'exception toutefois du couple glucose-glucose oxydase qui a été remplacé par dix additions successives de 3 pl d H202 à 3%, à des intervalles de 3 minutes. Cette solution est ajouté après l'addition de la lactoperoxydase. Les gangliosides ont ainsi pu être radioiodés tel que cela apparat sur la figure 7 (piste 3). EXEMPLE 7 : Radioiodation d'un ganglioside (GM1) catalysée par la lactoperoxydase En faisant appel au matériel et au protocole opératoire utilisés dans le cadre de l'exemple 3, on a réalisé la radioiodation de 20 g de GM1, tel que cela apparaît sur la figure 8 (piste 1). Il est en outre apparu que la neuraminidase ne dénaturait pas le produit radioiodé (Fig. 8, piste 2). REVEND I CAT I ONS 1/ Procédé de radioiodation de gangliosides, caractérisé en ce que l'on met à réagir une solution aqueuse d'au moins un ganglioside avec un composé iodé radioactif, en particu 125 - lier un iodure 125l, en présence d une peroxydase catalysant les réactions d'halogénation et d'un peroxyde ou générateur de peroxyde, puis après achèvement de la réaction, en ce que l'on purifie et l'on récupère les gangliosides radiomarqués. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite peroxydase est choisie parmi la lactoperoxydase, la peroxydase de raifort et la chloroperoxydase. 3/ Procédé selon I'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le générateur de peroxyde est un générateur d'eau oxygénée. 4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le générateur d'eau oxygénée est constitué par le couple glucose-glucose oxydase. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'un des deux réactifs du couple glucose-glucose oxydase, en particulier le glucose, est ajouté en dernier lieu au milieu réactionnel comme initiateur de la réaction. 6/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le générateur de peroxyde est constitué par un persel, tel que le persulfate d'ammonium H4)2 2087 7/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peroxyde utilisé est le peroxyde d'hydrogène (H202). 8/ Procédé selon I'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les différents réactifs sont ajoutés au milieu réactionnel en présence d'un tampon phosphate. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la température réactionnelle est voisine de la température ambiante. 10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en e nt e le ou les !32n9l oside(s) de dépert est ou (sont) choisi(s) parmi GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GTlb, GQ, et toute molécule comprenant un groupement céramide et un copule glucidique possédant au moins un groupement acide N-acétyl-neuraminique, ainsi que leurs mélanges. 11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les gangliosides de départ sont constitués par un mélange purifié de gangliosides obtenus à partir de cerveau de boeuf, en particulier un mélange répondant à la composition suivante GM1 20 % GD3 5 % GOla 40 % GD1b 15 % GTlb 17 % G01 3 %. 12/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la radioiodation consiste en une substitution sur les chaînes paraffiniques de la fraction céramide de l'acide N-acétyl-neuraminique des gangliosides. 13/ Procédé selon ('une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'étape de purification est obtenue par évaporation du milieu réactionnel sous atmosphère d'azote à température ambiante, suivie d'une séparation chromatographique. 14/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par la mise en oeuvre des étapes successives suivantes: - solubilisation des gangliosides dans un solvant organique, en particulier le mélange chloroforme méthanol (2-1) - évaporation du solvant organique - addition au résidu d'évaporation d'un tampon phosphate - addition de Na.125 I dissous dans un tampon phosphate - addition de la peroxydase préparée dans un tampon phosphate - addition de glucose-oxydase dissoute dans un tampon phosphate - addition de D-glucose dissous dans un tampon phosphate - évaporation du milieu réactionnel sous atmosphère d'azote à température ambiante, et - séparation chromatographique.