Brevet FR2600079A1 — publié le 19871218

La présente invention concerne plus particulièrement un vaccin destiné à la prévention du S.I.D.A. Le syndrome d'immunodéficience acquise (S.I.D.A.) est une affection virale qui présente main5 tenant une importance majeure en Amérique du Nord, en Europe et en Afrique centrale. Les estimations récentes suggèrent que environ 1 Million d'Américains peuvent avoir été exposes au virus du S.I.D.A. Les individus affectés présentent une immunodépression sévère et la maladie est, en général, fatale. La transmission de la maladie s'effectue le plus souvent par contact sexuel, bien que les personnes utilisant des stupéfiants par voie intraveineuse repré15 sentent également un groupe à haut risque; d'autre part, un grand nombre d'individus ont été infectés par ce virus après avoir reçu du sang ou des produits sanguins contaminés. L'agent causal -de cette affection est un rétro20 virus. De nombreuses affections animales ont été attribuées auxrétrovirus, mais c'est seulement récemment que des rétrovirus affectant des hommes ont pu être décrits. Alors que des rétrovirus des cellules T humaines (HTLV: human T leukemia virus)de types I et II ont été 25 impliqués comme agent causal de certaines leucémies des cellules T chez les adultes, le rétrovirus associé à des lymphadénopathies (virus LAV), qui est également appelé virus ETLV III ou A.I.D.S.-related virus (ARV), est maintenant couramment accepté comme l'agent responsable du 30 S.I.D.A. Le génome de plusieurs isolats du rétrovirus LAV HTLV III a été caractérisé de façon très complète (Wain-Hobson et al., 1985; Ratner et al., 1985; Muesing et al., 1985; Sanchez-Pescador et al., 1985)et des infor35 mations sur la séquence indiquent une relation étroite avec le groupe es lentivirus. Les lentivirus, dont le prototype est le virus ovin Visna, sont les agents de maladies à progression très lente et qui présentent typiquement une période d'incubation prolongée. Le LAV et le virus Visna par5 tagent de nombreuses similarités, en particulier dans leur tropisme pour le tissu neural. En plus des trois parties de génome retrouvées chez tous les rétrovirus et désignées gag, pol et env, le virus LAV comporte au moins trois autres gènes dénommés 10 Q ou Ser, TAT et F ou 3'orf (Wain-Hobson et al., 1985; Arya et al., 1986). Le produit du gène F a été caractérisé par réaction avec des sérums de malades atteints de S.I.D.A. et l'identité de la protéine confirmée par un séquençage direct des acides aminés (Allan et al., 1985). Selon les auteurs, la protéine F est reconnue par 30 à 90 % des sérums de malades. Cette protéine migre sur un gel d'acrylamide SDS selon un poids moléculaire apparent compris entre 26 et 28 kD. Certains auteurs ont mis en évidence un produit du gène F compris entre 24 et 20 25 kD, évoquant la possibilité d'une initiation de la traduction au deuxième ATG. La protéine F n'est pas glycosylée, bien que deux sites potentiels de Nglycosylation soient présents. Enfin, il a été démontré que la protéine F est acylée par 25 l'acide myristique. Il existe sur la protéine F un tetrapeptide (Arg - Phe - Asp Ser), retrouvé sur certaines protéines intervenant dans l'adhésion cellulaire, et également sur une chaîne de l'antigène HLA de classe II. Auffray (Auffray, 1986) a évoqué la possibilité pour la protéine F de jouer un rôle dans la reconnaissance et l'attachement de la protéine env et du virus LAV aux lymphocytes T4, contribuant ainsi à la dissémination du 3 2600079 virus. De plus, la variabilité élevée (2 à 17 %) de la protéine F d'une souche à l'autre, variabilité comparable à celle de la glycoprotéine d'enveloppe, laisse à penser que la protéine F joue effectivement un rôle dans l'infection (Ratner et al., 1985). La présente invention propose d'utiliser comme vecteur d'expression de la protéine F un vecteur viral permettant l'expression de la protéine dans un environnement qui permettra sa restructuration post-traductionnelle. C'est pourquoi la présente invention concerne un vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporteo le gène F du virus responsable du S.I.D.A. Parmi les vecteurs viraux utilisables, il faut citer plus particulièrement les poxvirus, et notamment le virus de la vaccine (VV). Le virus de la vaccine est un virus à ADN double brin qui a été utilisé très largement dans le monde entier pour contrôler et éradiquer la variole. Des développements techniques récents ont permis le développement 20 de ce virus comme vecteur de clonage et des virus recombinants vivants ont permis d'exprimer des antigènes étrangers et rmrme d'obtenir des immunisations contre différentes maladies virales ou parasitaires. Ainsi, plusieurs groupes ont récemment mis en 25 - évidence l'utilisation de recombinants de ce type pour exprimer l'antigène de l'Influenza, de l'hépatite B et la glycoprotéine de la rage pour immuniser contre ces maladies (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983; Kieny et al., 1984). L'expression d'une séquence codant pour une protéine étrangère par le virus de la vaccine (VV) implique nécessairement deux étapes: 4 2600079 1) la séquence codante doit tre alignée avec un promoteur de W et être insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de W, cloné dans un plasmide bactérien approprié; 2) les séquences d'ADN de WVV situées de part et d'autre de la séquence codante doivent permettre des recombinaisons homologues in vivo entre le plasmide et le génome viral; une double recombinaison réciproque conduit à un transfert de l'insert d'ADN du plasmide 10 dans le génome viral dans lequel il est propagé et exprimé (Panicali et Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983). Bien entendu, l'utilisation de ce type de vecteur implique souvent une délétion partielle du génome 15 du virus vecteur. La présente invention concerne plus particulièrement un vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte au moins: - une partie du génome d'un virus vecteur, 20 - un gène codant pour la protéine F du virus responsable du S.I.D.A. - ainsi que les éléments assurant l'expression de cette protéine dans des cellules. L'invention concerne également les ADN recorbinants 25 correspondant auxdits vecteurs viraux. kar virus responsable du SIDA, on entend notamment désigner le virus LAV, le virus HTLV III ou ARV, de même que d'éventuels mutants ponctuels ou des délétions partielles de ces virus, ainsi que les virus 30 apparentés. Les vecteurs viraux, dans la partie correspondant au génome du virus vecteur (distinct du virus responsable du S.I.D.A.), peuvent être constitués à partir du géernome d'un virus d'origine quelconque. Toutefois, on préférera utiliser une partie du génome d'un poxvirus et plus particulièrement une partie du génome de la vaccine. Les conditions nécessaires.pour l'expression 5 d'une protéine hétérologue dans le virus de la vaccine ont été rappelées précédemment. De façon générale, le gène en cause, par exemple le gène F. devra, pour pouvoir Itre exprimé, être sous la dépendance d'un promoteur d'un gène de la vaccine, ce promoteur 10 sera en général le promoteur de la protéine 7,5K de la vaccine. En outre, la séquence codante devra être clonée dans un gène non essentiel de la vaccine qui pourra éventuellement servir de gène marqueur.Dans la plupart des cas, il s'agira du gène TK. La protéine F native ne possède pas de signal 15 d'excrétion et n'est pas glycosylée. On propose ici des modifications de ce gène pour améliorer l'immunogénicité du produit d'expression. On propose de modifier le gène F de façon à assurer son excrétion hors de la cellule, et, d'autre part, 20 pour une troisième construction, à assurer l'ancrage de la protéine dans la membrane. Podr ce faire, le gène pourra être modifié au niveau de sa partie codant pour l'extrémité NH2 terminale de la protéine en ajoutant une séquence signal qui provienne 25 d'un virus hétérologue, par exemple la séquence signal de la glycoprotéine du virus rabique. Ceci permettra l'excrétion de la protéine hors de la cellule. Enfin, il peut être- intéressant pour l'immunogénicité de la protéine que celle-ci soit ancrée dans la membrane cellulaire et ainsi correctement présentée au système immunitaire de l'hôte. C'est pourquoi il est proposé, à partir de la précédente construction (F + signal rage), d'ajouter au niveau de la partie codant pour I'extrém-ité CODH terminale 6 2600079 de la protéine une séquence codant pour la portion transmembranaire provenant d'un virus hétérologue, celle de la glycoprotéine du virus rabique également. La présente invention concerne tout d'abord l'utilisation de vecteurs viraux pour l'obtention de la protéine codée par le gène F du virus LAV dans des cultures cellulaires. Il s'agit donc dans un premier temps de cellules de mammifères qui ont été infectées par un vecteur viral selon l'invention ou bien qui peuvent contenir l'ADN recombinant correspondant; parmi ces cellules, il faut citer plus particulièrement les cellules diploides humaines, des cultures primaires ainsi que les cellules Vero. Bien entendu, il est possible de prévoir d'autres types de cellules conmme cela ressortira d'ailleurs des exemples 15 ci-après. Les protéines ainsi obtenues peuvent être utilisées après purification pour la réalisation de vaccins. Il est également possible de prévoir l'utilisation directe des vecteurs viraux selon l'invention afin 20 d'effectuer une vaccination, la protéine F étant alors produite ir. situ et in vivo. Enfin, la présente invention concerne également les anticorps dressés contre les protéines F précédentes obtenus par infection d'un organisme vivant avec un vecteur 25 viral tel cue décrit précédemment et récupération des anticorps induits après un temps déterminé. Les techniques mises en oeuvre pour l'obtention de la protéine F, les cultures cellulaires et les techniques de vaccination sont identiques à celles qui sont pratiquées 30 actuellement avec les vaccins connus et ne seront pas décrites ern détail. La présente invention sera mieux caMprise à la lecture des mWthodes et exemples suivants: Deux figures illustrent les exemples:. La figure 1 représente l'action de la tunicamycine sur les protéines synthétisées par les recombinants VWIMEAV1147 et VVIGFMAV1145 et immunoprécipitées grâce à un sérum anti-LAV. Dans cette figure, les poids moléculaires sont donnés en kilodaltons, et on représente par: P, le culot cellulaire S, le surnageant 10. -, les produits obtenus sans traitement +, les produits obtenus après traitement à la tunicamycine 1, VVIFIAV1145. 2, VVIGtAV1147 3, virus de la vaccine, type sauvage; 15. La ficure 2 représente le criblage de sérums anti-LAV pour leur capacité à reconnaître la protéine F synthétisée par le virus recombinant VvTOLAV1 145. Les poids moléculaires sont exprimés en kilodaltons, et on représente par: O, virus de la vaccine, type sauvage 20. 1, \vGFILAV1145 clone C 2, V\F3LAV1145 clône D -, sérui témoin négatif À a, b, c, d, e, sérums de malades atteints de SIDA. -IEODES Clonages: Maniatis et al., 1982. Enzymes: utilisées selon les prescriptions du fournisseur. Matagénèse localisée: méthode dérivée de Zoller and Smith, 1983. Transfert dans la vaccine: Kieny et al., 1984 30 Seule différence: les cellules humaines 143B rermlacent les cellules L?.T. Prénaration du stock de virus Les cellules primaires de poulet "germ free" sont infectées à 0,01 pfu/cellule pendant 4 jors à une te.D_'rature de 37:C (milieun 3- 1E: + 5 % WCS). Purification du virus On effectue une centrifugation du stock de virus cidessus pendant 15 minutes à 2 500 tours (Rotor GSA Sorvall). Le surnageant est mis de côté. On reprend le culot dans un tampon RSB (Tris HCl 10 mM pH 7,4, KCl mM, MgC12 1 mM) pendant 15 minutes à 4 C. On effectue un broyage au potter, puis une centrifugation pendant 15 minutes à 2 500 tours. Le surnageant est ajouté au précédent puis on effectue un deuxième broyage de la même 10 façon. Tous les surnageants sont déposés sur 10 ml de coussin de saccharose 36 % (p/v) (Tris 10 mM pE 8). On effectue une centrifugation pendant 2 heures à 14 000 tours (Rotor SW28, Beckman). Le culot est repris, dissocié et remis sur un deuxième coussin identique. Le 2ème culot est repris dans 5 ml PBS et chargé sur un gradient 20-40 % de Saccharose (Tris 10 mM pH 8) (mzme rotor). On effectue une centrifugation pendant 45 minutes à 12 000 tours. 20)On récupère la bande de virus - Elle est culottée par centrifugation pendant 1 heure à 000 tours. Le culot est repris dans du Tris 10 mM pH 8. Ir-munoprécipitations On effectue une infection de cellules BHK-21 (boites de 3 cr de diamètre, 106 cellules par boite, cultivées en G-MEM + 10 % FCS) à 0,2 pfu/cellule pendant 18 heures. Le milieu est décanté et remplacé par 1 ml de milieu sans méthionine et 10 gl de méthionine 30 35S (5 mci/300 il) (Amersham) par boîte. On ajoute un excès de méthionine non radioactive après 2 heures. A la fin du marquage, on effectue un grattage des cellules infectées, une centrifugation pendant 1 minute dans une centrifugeuse Eppendorf, une séparation des fractions surnageant et culot, un lavage du culot une fois en tampon PBS, puis une immunoprécipitation et un gel (selon Lathe et al., 1960). 9 2600079 Immunoprécipitation des protéines synthétisées en présence de tunicamycine Apres infection de cellules BHK-21 comme décrit précédemment, on ajoute après 18 heures 1,5 gg de tunicamycine par ml de milieu pendant 1 heure. Le milieu est ensuite décanté et remplacé par 1 ml de milieu MEM sans méthione contenant 1,5 gg de tunicamycine et 10 il de méthionine 5S (Amersham). La suite de la manipulation s'effectue comme précédemment. 10 Traitement endo-F Apres immunoprécipitation des protéines marquées par un sérum-de malade atteint du SIDA, la fraction protéine-A sepharose est reprise dans: 0,2 M phosphate de Na, pH 6,1 15 - 0,05 % SDS 0,1 % Nonidet P40 0,1 % Béta-mercaptoéthanol 0,1 % EDTA pH 8 et bouillie pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines. 20 On effectue une incubation pendant 20 heures à 37 C, avec 4 unités d'Endo-F par ml, puis une précipitation pendant 2 minutes dans la glace avec 1/5 de volume de TCA 100 %. On lave le culot 3 fois à l'acétone 80 %, on ajoute le tampon d'échantillon et on charge sur gel SDS. 25 Dosage des anticorps vaccine par test ELISA Des plaques 96 trous (NUNC) à fond plat sont incubées pendant 18 heures à 37 C avec 106pfu de virus de la vaccine type sauvage en tampon carbonate. Les plaques sont ensuite saturées avec de la gélatine 0,01 %. 30 Les sérums de souris sont alors adsorbés sur les plaques et on effectue le reste du protocole comme pour un test ELISA classique. Lectures à 492 nM. EXEMPLE 1 Construction des plasmides hybrides Les tailles combinées des différents éléments nécessaires pour letransfert de la séquence codant pour 5 le gène env dans le génome de VV et son expression subséquente sont de l'ordre de plusieurs Kb. Il a donc été jugé nécessaire de minimiser la taille du plasmide de réplication dans E. coli utilisé pour le travail de construction de façon à faciliter les manipulations 10 nécessaires. Le fragment EindIII (Hin-J) du génome de WVV contient le gène complet de la thymidine kinase (TK) qui a déjà été utilisé précédemment pour permettre l'échange et la recombinaison de l'ADN inséré dans le génome de 15 VV (Mackett et al., 1982). Il est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TE du génome de WVV crée un virus TK déficient qui peut être sélectionné. Il a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant un site unique HindIII utilisable pour l'intégration du fragment Hin-J W. En outre, il était nécessaire d'éliminer les séquences de restriction non nécessaires du plasmide de façon à permettre les manipulations suivantes. La construction a été amorcée à partir du plas25 mide pML2 (Lusky et Botchan, 1981) qui est un vecteur dérivé du plasmide pBR322 par délétion spontanée dans lequel le segment entre les nucléotides 1089 et 2491 a été perdu. D'abord la séquence de PstI a été éliminée par insertion du fragment AhaIII-AhaIII de pUC8 (Vieira 30 et Messing, 1982) entre deux sites AhaIII de pML2 en éliminant 19 paires de bases. On a utilisé la méthode du "linker-tailing" (Lathe et al., 1984) pour insérer un linker HindIII entre lessites Nru et EcoRP.I traité par S1 de ce plasmide, en éliminant le site BamHi. Ceci conduit à un plasmide de 2049 paires de bases portant le gène bêtalactamase fonctionnel (conférant la résistance à l'ampicilline) et comportant en outre une origine de réplication active dans E. coli et un site de restriction unique HindIII. Cette construction a été appelée pTG1H. Le.fragment Hin-J de l'ADN de WVV portant le gène TK a préalablement été cloné dans un vecteur provenant de pBR327 (Drillien et Spehner, 1983). Ce frag10 ment de 4,6 Kb a été recloné dans le site HindIII de pTG1H. Un clone a été sélectionné dans lequel le gène TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Cette construction pTG1H-TK a été utilisée comme 15 vecteur dans l'expérience suivante. L'étape suivante a été d'isoler un promoteur de VV utilisable pour commander l'expression de la séquence codant pour le gène à exprimer. Le promoteur d'un gène précoce codant pour une protéine de 7500 daltons 20 (7,5 K) a-déjà été utilisé avec succès dans un but identique (Smith et al. , 1983) et on a donc procédé à l'isolement de ce segment. Le gène 7,5 K est situé sur l'un des plus petits fragments SalI (fragment Sal-S) du génome de WVV type WR 25 (Venkatasan et al., 1981). Comme les petits fragments sont clones de façon préférentielle, une grande proportion des clones obtenus par clonage direct de l'ADN de VV type WR coupé par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal-S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (voir Kieny et al., 1983), par digestion SalI et religation, en conduisant ainsi au., phage M13TGSal-S. 12 2600079 Dans ce clone, un site ScaI se trouve immédiatement à proximité de l'ATG d'initiation du gène 7,5 K. En aval du gène 7,5 K se trouvent situés des sites uniques BamHI et EcoRI provenant du vecteur. Les sites 5 BamHI et ScaI sont fusionnés par l'intermédiaire d'un linker BglII 5' -CAGATCTG-3' après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment Klenow de la polymérase de E. coli. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et déplace 10 le site unique EcoRI en aval. En même temps, le site Sala (AccI) en aval est éliminé, le site Sal I en amont devient donc unique. Cette construction est appelée M13TC 7,5 K. A l'intérieur du fragment Hind-J de l'ADE de VV 15 se trouvent situés des sites ClaI et EcoRI qui sont séparés par environ 30 paires de bases (Weir et Moss, 1983). Le fragment promoteur de 7,5 K présent dans M13TG7, 5K est excisé par AccI et EcoRI et cloné entre les sites ClaI et EcoRI de pTG1H-TK pour générer 20 pTG1H-TK-P7,5K. Cette construction conduit au transfert des sites BamrEI et EcoRI uniques du vecteur M13 immédiatement en aval de la séquence du promoteur 7,5K. Ces sites uniques BamHI et EcoRI sont utilisés dans 25 la construction suivante. Le segment polylinker du bactériophage M13TG131 (Kieny et al., 1983) est excisé par EcoRI et Bgl II et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pTG1H-TK-P7,5K, générant pTG186-poly. Dans cette construction, 5 sites de restriction uniques sont disponibles pour le clonage d'un gène étranger sous le contrôle de P7,5K (PstI, BamHI, SstI, SmaI, EcoRI) 13 2600079 EXEMPLE 2 Construction du plasmide portant la séquence F Tout d'abord, le gène env du LAV entouré par les séquences signal et transmembranaire de la glycoprotéine du virus rabique a été inséré dans un plasmide (pTG1134) précédemment décrit. Le fragment PstI-PstI du plasmide pTG1134 est cloné dans le vecteur M13mp7l01 dans une orientation adéquate. Le bactériophage résultant est M13TG169 PstI SR Env TMR PstI 1// KpnI HindIII (SR = signal rage (TMR = transmembranaire rage 10 Le fragment génomique codant pour la protéine F est obtenu par une digestion BamHIHindIII du plasmide pJ19-6, segment proviral cloné et décrit précédemment. Le fragment BamHI-HindIII de PJ19-6 est cloné dans le vecteur M13TG169 ouvert aux sites KpnI et HindIII. Le site BamHI est relié au site KpnI par un linker oligonucléotide simple brin de séquence: 5' GATCGTAC 3'. ' G T A G A T C 3' Kun:- BamHI C A T G CTAG 2'3, 5' Le bactériophage résultant est appelé M13TG170 PstI SR F TMR PstI Kpr.n SstI HindIII BarHI Afin de pouvoir exciser uniquement la séquence codante de la protéine F, un site BamHI est généré en amont de l'ATG d'initiation de la traduction, par mutagénèse dirigée par oligonucléotide. 14 2600079 ATG F ___________ _i /M13TG170 (simple brin) La séquence de l'oligonucléotide est: ' GAAAGGATCCTGCTATAAG 3' BamHI Après réparation et criblage des plages par l'oligo5 nucléotide marqué au P, le phage M13TG173 est isolé. Il ne diffère du phage M13TG170 que par le site BamHI situé en amont de l'ATG d'initiation. ATG F TGA /1 t I // (M13TG173) BamHI SstI L'introduction de ce site permet de cloner le 10 fragment BamHI-SstI qui contient le gène F dans le plasmide de transfert pTG186-poly ouvert aux sites BamHI et SstI, et dont la construction a été décrite précédemment. Comme cela a été indiqué, l'expression d'une protéine hétérologue dans le virus de la vaccine nécessite que la séquence codante soit alignée avec une séquence du promoteur de la vaccine et soit insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de la vaccine. Cet ADN situé de part et d'autre permet la recombinaison avec le génome de la vaccine in vivo par une double recombinaison réciproque qui transfère la séquence codante et le promoteur 20 accompagnant dans le génome de la vaccine. Le plasmide résultant est le plasmide pTG1147. Le transfert de la séquence codante du gène F et du promoteur accompagnant dans le génome de la vaccine est effectué comme suit. 25 1 5 EXEMPLE 3 Clonage dans le virus de la vaccine pour générer WTGFLAV1147 La stratégie décrite par Smith et coll. (1983) 5 repose sur l'échange in vivo entre un plasmide portant un insert dans le gène W TK et le génome viral de type sauvage de façon à inactiver le gène TK porté par le virus. Les virus TK peuvent être sélectionnés par étalement sur une lignée cellulaire (TKnégative) en présence de 5-bromodéoxyuridine (5BUDR) (Mackett et coll., 1982). La thymidine kinase phosphoryle le 5BUDR en 5'-monophosphate, qui est ensuite converti en triphosphate. Ce composé est un analogue de dTTP et son incorporation dans l'ADN bloque le développement correct 15 du virus. Un virus TK peut néanmoins répliquer son ADN normalement et il conduit à des plages virales visibles dans une lignée cellulaire également TK. Le virus de la vaccine se propage dans le cytoplasme des cellules infectées plutôt que dans leur 20 noyau. C'est pourquoi il n'est pas possible de tirer avantage de la machinerie de réplication et de transcription de l'ADN de l'hôte et il est nécessaire que le virion possède les composants pour l'expression de son génome. L'ADN de W purifié est non infectieux. Afin de générer les recombinants, il est nécessaire d'effectuer simultanément l'infection cellulaire avec du virion VV et une transfection avec le segment d'ADN cloné qui présente de l'intérêt. Toutefois, la génération des recombinants est limitée à la petite 30 proportion des cellules qui sont compétentes pour la transfection par l'ADN. C'est pour cette raison qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre une stratégie de "congruence" indirecte pour réduire le bruit de fond des virus parentaux non-recombinants. Ceci a été effec- tué en utilisant comme virus infectieux vivant un mutant thermosensible (ts) de la vaccine qui n'est pas capable de Be propager à une température non permissive de 39,5 C (Drillien et Spehner, 1983). Lorsque les cellules sont infectées par un mutant ts dans des conditions non permissives et transfectées avec l'ADN d'un virus de type sauvage, la multiplication virale interviendra seulement dans les cellules qui sont compétentes pour la transfection et dans lesquelles une recombinaison entre l'ADN viral sauvage et le génome du virus ts aura eu lieu; aucun virus ne se multipliera dans les autres cellules, en dépit du fait qu'elles ont été infectées. Si un plasmide recombinant contenant un fragment de l'ADN de vaccine tel que pTG1147 est inclus dans le -15 mélange de transfection, à la concentration appropriée, avec l'ADN du type sauvage, il est également possible d'obtenir qu'il participe à la recombinaison homologue avec l'ADN de la vaccine dans les cellules compétentes. Des monocouches de cellules primaires de fibro20 blastes d'embryons de poulets (CEF) sont infectées à 33 C avec VV-Copenhague ts7 (0,1 pfu/cellule) et transfectées avec un coprécipité au phosphate de calcium de l'ADN du virus de type sauvage VV-Copenhague (50 ng/106 cellules) et le plasmide recombinant (50 ng/106 cellules). 25 Après incubation pendant 2 heures à une température qui ne permet pas le développement du virus ts (39,5 C), les cellules sont incubées de nouveau pendant 48 heures à 39, 50C. Des dilutions de virus ts+ sont utilisées pour réinfecter une monocouche de celluleshumaines 30 143B-TK- à 37 C qui sont ensuite incubées en présence de 5BUDR (150 gg/ml). Différentes plaques de virus TK sont obtenues à partir de ces cellules qui ont reçu le plasmide recombinant, tandis que les cultures contrôles sans plasmide ne montrent pas de plaques visibles. Les virus TX' sont ensuite sous-clonés par une deuxième sélection en présence de 5BUDR. Une double recombinaison réciproque correcte 5 entre le plasmide hybride pTG1147 et le génome de W aboutit à l'échange du gène TK portant l'insert avec le gène TK du virus, les recombinants devenant ainsi TK. Les ADN purifiés d partir des différents virus recombinants TK sont digérés par Hindllet soumis à 10 une électrophorèse sur gel d'agarose. Les fragments d'ADN sont transférés sur un filtre de nitrocellulose selon la technique décrite par Southern (1975). Le filtre est ensuite hybridé avec. le plasmide pTG1147 nicktranslaté au 32p. Après lavage du filtre, ce dernier est fluorographié et des bandes de 3.85, 2.9, 0.8 Kb sont visibles sur l'autcradiographie quand le virus vaccine a incorporé le gène F du LAV. L'un de ces recombinants VV.TG.FLAV1147 a été sélectionné pour les études suivantes. EXEMPLE 4 Protéine F synthétisée à partir d'un virus recombinant vaccine-LAV Pour mettre en évidence l'expression du gène F du LAV à partir du virus vaccine hybride, on infecte 25 des cellules de rongeur, BHK21, qui sont cultivées dans un milieu G-MEM + 10 % de sérum de veau foetal avec ledit recombinant VV.TGFLAV.1147. Une monocouche semi-confluente fraîche (10 cellules) est infectée avec 0,2 pfu/cellule et 30 incubée pendant 18 heures. Le milieu est ensuite éliminé et on ajoute un milieu à faible teneur en méthionine (1 ml pour 106 cellules) supplémenté avec 10 l/ml de méthionine 35S(5mCi/300ul) Les cellules sont incubées à 37 C et les protéines marquées sont collectées par centrifugation. Après séparation en culot et surnageant, les protéines sont incubées avec un sérum appartenant à des patients atteints de SIDA. Les protéines réagissant avec le sérum sont récupérées par adsorption sur une résine protéine A- sépharose et étalées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide SDS et autoradiographiées selon une technique décrite par Lathe et al., 1980. Les autoradiographies montrent que certains sérums des patients atteints du SIDA lient spécifiquement deux 10 protéines des extraits cellulaires infectés. Les poids moléculaires apparents de 25,5 et 27 kD suggèrent l'équivalence avec la protéine F identifiée par des sérums de malades atteints du SIDA, dans une préparation de protéine F authentique et dans des extraits de cellules infectées par le virus LAV. 15 La séquence codant pour F conduit à un produit de traduction primaire d'environ 23 kD alors que la protéine F obtenue par le procédé précédent présente un poids moléculaire apparent compris entre 25 et 27 kD. Cette hétérogénéicité peut être attribuée à une modification (acylation) et/ou être due 20 au fait que deux ATG peuvent être utilisés pour l'initiation de la traduction de F. EXEMPLE 5 Construction de pTG1145 Le plasmide pTGi145 contient le gène F dont la partie codant pour l'extrérmité NH2 terminale de la protéine a été mise en phase avec la séquence signal de la glycoprotéine rabique. Les constructions dérivent du phage M13TG170 décrit auparavant. La partie 5' du gène F est mise en phase avec la séquence signal de la glycoprotéine rabique au moyen d'une délétion générée par oligonucléotide. Les quatre premiers acides aminés de la glycoprotêine rabique sont conservés pour favoriser un bon clivage du peptide signal. ' Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Gly Ls Trp Ser Lys 3' TTT GGG AAA TTC CCT-ATT GGT GGC AAG TGG TCA AAA fin du 4 premiers F signal acides aminés (I'ATG d'initiation est rage de la glyco- délété) protéine rabique L'oligonuclêotide servant à générer la boucle a pour séquence 'TTTTGACCACTTGCCACCAATAGGGAATTTCCCAAA 3' On obtient ainsi le phage M13TG171. Le signal rage (SR) de la glycoprotéine rabique fusionné avec le gène F est ensuite transféré dans le plasmide pTG186-poly. Pour ce faire, on clone le fragment PstI-PstI de Mi3TG171 dans pTG186poly ouvert au site PstI. Le plasmide 15 résultant est nommé pTG1145. Le gène F fusionné avec le signal rage est transféré dans la vaccine comme décrit précédemrLent. EXEMPLE 6 Construction de pTG1146 Dans ce plasmide, la séquence codant pour la zone transmembranaire de la glycoprotéine rabique (TMR) est. fusionnée avec la fin du gène F. Le codon TGA (stop) du gène F est compris dans la boucle de délétion générée par l'oligonucléotide, qui a pour séquence 5' TGCACTCAGTAATACATAGCAGTTCTTGAAGTACTC 3' 2600079 Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Tyr Val Leu Leu Ser Ala GAG TAC TTC AAG AAC TGC TAT GTA TTA CTG AGT GCA F TMR On obtient ainsi le phage M13TG172. Le gène F fusionné en amont avec le signal rage et en aval avec la portion transmembranaire rage est transféré dans le plasmide pTG186-poly. Pour ce faire, on clone le fragment PstI-PstI de M13TG172 dans le plasmide pTG186-poly, ouvert par PstI pour générer le plasmide pTG1146. EXEMPLE 7 Immunoprécipitation des protéines synthétisées par les virus recombinants VVTGFLAV 1145 et 1146 En opérant comme cela a été décrit précédemment pour le plasmide pTG1147, on obtient les vecteurs vaccine hybrides correspondant aux différents plasmides préparés 15 précédemment. Ces vecteurs viraux seront appelés respectivement VVTGFLAV 1145 VVTGFLAV 1146 Les protéines obtenues comme cela a été décrit 20 précédemment sont testées par immunoprécipitation (figure 1). Les immunoprécipités obtenus avec le produit de VVTGFLAV 1145 font apparaître une protéine dont le poids moléculaire apparent est aux environs de 28 kD. La protéine mise en évidence dans le surnageant du milieu de culture 25 est d'un poids moléculaire apparent plus élevé. Il sem.ble que le produit du gène F soit effectivement excrété dans le surnageant de culture. L'aspect diffus du signal autoradiogrark:-ze suggérant l'existence d'une glycosylation, une manipulation 21 2600079 de marquage à la 35S méthionine en présence de tunicamycine a été conduite. En présence de tunicamycine, on obtient une protéine de poids moléculaire apparent de 26 kD, nettement inférieur à celui constaté auparavant. Ceci indique que le produit du virus VVTGFLAV 1145 est glycosylé. La présence du peptide signal et de sites potentiels de Nglycosylation a entraîné une glycosylation de la protéine F. Comme la différence de poids moléculaire entre la protéine glycosylée et non glycosylée est de 2 kD, il estyvraisemblable qu'un 10 seul des deux sites de glycosylation soit utilisé. La même expérience conduite avec le virus VVTGFLAV 1147 montre que le produit de ce virus n'est pas glycosylé. Les immunoprécipités obtenus avec le produit de VVTGFLAV 1146 font apparaître une protéine de. poids molécu15 laire apparent supérieur (34 kD) à ceux observés précédemment. On pouvait attendre ce résultat car le gène F est fusionné avec la partie terminale de la glycoprotéine rabique, comprenant la partie transmembranaire de cette dernière. Il est également démontré par marquage à la 20 méthionine 35S en présence de tunicamycine que le produit de VVTGFLAV 1146 est glycosylé. L'excrétion observéeest moindre que celle constatée avec VVTGFLAV 1145, indiquant que la protéine est bien ancrée à la surface des cellules. Cela est confirmé par immunofluorescence selon 25 une technique décrite précédemment. La surface des cellules apparait nettement fluorescente par rapport à un témoin négatif, ce qui démontre la présence de la protéine F en surface des cellules. EXEMPLE 8 Mise en évidence des anticorps anti-F chez des souris vaccinées avec les virus VVTGFLAV 1145, VVTGFLAV 1146 et VVTGFLAV 1147 Des souris Balb/c et C57/Bl mâles de 7 semaines 5 sont vaccinées par injection sous-cutanée de 5.107 pfu ou par scarification de la base de la queue et application de 2.107 pfu de virus VVTGFLAV par animal. Elles reçoivent une injection de rappel avec la même dose après 2 semaines, et subissent une prise de sang au moment du rappel ainsi que 2 et 4 semaines après le rappel. La présence d'anticorps dirigés contre des déterminants du virus LAV et du virus de la vaccine dans leurs sérums est recherchée. Tous les animaux vaccinés donnent des sérums capables de réagir avec le virus de la vaccine dans un 15 test ELISA. Des techniques d'immunoprécipitation ou de "Western Blot" ont été utilisées. Ces méthodes permettent de mettre en évidence les anticorps capables de réagir avec les protéines du virus LAV non dénaturées ou dénaturées au SDS dans un gel d'électrophorèse et transférées sur une membrane de nitrocellulose. Dans cette expérience, les membranes de nitrocellulose employées sont obtenues par transfert des protéines contenues dans un extrait cellulaire infecté par le virus LAV selon des techniques connues. Ces 25 membranes sont découpées en bandes et chaque bande est incubée avec le sérum des souris vaccinées (dilution au 1/20). La protéine A marquée à 1.25I permet de visualiser les protéines du virus LAV oui ont fixé des anticorps de souris. Des extraits cellulaires infectés par le virus 30 LAV et marues à la cvsteine 35S ont été utilisés pour les expériences d'immunoprécipitation. Plusieurs sérums donnent une réaction spécifique avec une prcti.-e de poids moléculaire autour de 27 kD, correspondant à la protéine F. Il faut noter que les sérums de quelques souris produisent en "Western Blot" des signaux correspondant à des protéines non identifiées de la préparation de virus LAV fixée sur les membranes. Le phage M13mp701 et le plasmide pTG1134 sont décrits dans la demande de brevet suivante, Kieny et al., 1986: n 86 05043, déposée le 8 Avril 1986. Le plasmide pJ19-6 a été déposé le 16 novembre 1984 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de 10 l'Institut Pasteur sous le n 366-I et est décrit dans le brevet anglais no 84 29099. La souche suivante a été déposée le 6 juin 1986 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur: 15. E. ccli transformé pTG1147 sous le n 1-561. 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Methods in Enzymology (Wu, Grossman, Moldave, eds.)100: 468-500. 27 2600079 REVENDICATIONS 1) Vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte au moins: une partie du génome d'un virus, un gène codant pour la protéine F du virus responsable du SIDA, ainsi que les éléments assurant l'expression de cette protéine dans des cellules. 2) Vecteur viral selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie du génome d'un virus est 10 une partie du génome d'un poxvirus. 3) Vecteur viral selon la revendication 2, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine. 4) Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence signal et/ou une séquence transmembranaire provenant d'un virus hétérologue. ) Vecteur viral selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence signal et/ou la séquence transmembranaire provenant d'un virus hétérologue provient du virus de la rage. 6) Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le gène codant est le gène F total comportant depuis l'extrémité 5': la séquence signal du gène G du virus de la rage, le gène F total, 25. la zone transmembranaire (TM) du gène G. 7) Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en-ce que la séquence d'ADN codant pour la protéine F est sous la-dépendance d'un promoteur d'un gène du poxvirus. 8) Vecteur viral selon la revendication 7, caractérisé en ce cue le mrornoteur est un promcteur du gène de la vaccine. 28 2600079 9) Vecteur viral selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la protéine F est sous le contrôle du promoteur du gène de la protéine 7,5K de la vaccine. 10) Vecteur viral selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la séquence codant pour la protéine F est clonée dans le gène TK de la vaccine. 11) ADN recombinant correspondant à un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 10. 12) Culture de cellules de mammifères infectées par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 10 ou comportant un ADN selon la revendication 11. 13) Procédé de préparation de la protéine F du virus responsable du SIDA, caractérisé en ce qu'on cultive 15 des cellules selon la revendication 12 et qu'on récupère la protéine F produite. 14) Protéine F de virus responsable du SIDA obtenue par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 13. ) Protéine selon la revendication 14, 20 caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, une partie de glycoprotéine de la rage. 16) Vaccin caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 10 et/ou par la protéine selon l'une des revendications 14 et 15. 25 17) Anticorps dressés contre la protéine F du virus responsable du SIDA, caractérisés en ce qu'on inocule un organisme vivant -avec un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 10 ou avec les protéines obtenues selon les revendications 14 et 15 et en ce qu'on récupère les 30 anticorps formés après un temps déterminé.