Brevet FR2599754A1 — publié le 19871211

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs d'expression du facteur VIII humain ainsi qu'un procédé pour la préparation du facteur VIII. Le clonage récent du facteur VIII (FVIII) ou facteur anti-hémophilique (réf. 1 à 3) permet d'espérer, pour les patients hémophiles A, une thérapeutique plus sure. Les patients hémophiles A sont traités avec des concentrés de plasma de FVIII contenant moins de 0,1 % d'activité pro-coagulante de FVIII (réf. 4) qui sont obtenus à partir de mélanges de plasma provenant de nombreux donneurs. Les hémophiles sont, dans ces conditions, soumis à des risques très importants de contagion par des agents pathogènes tels que le virus de l'hépatite ou le virus du LAV/HTLVIII, l'agent causatif du SIDA. En utilisant des techniques de génie génétique, il est possible de préparer du FVIII recombinant, lequel sera produit en quantités très importantes et évidemment exempt de contamination, ce qui le rendrait beaucoup plus acceptable sur le plan thérapeutique. Le rendement et la stabilité du produit recombinant, toutefois, dépendent dans une certaine mesure du système d'hôte utilisé pour l'expression. Des mécanismes particuliers sont responsables du rendement ou du maintien de l'intégrité de la protéine exprimée, par exemple des modifications post-traductionnelles correctes. Un système test est intéressant pour évaluer les différentes lignées cellulaires et vérifier, en particulier, la conformité de la protéine obtenue. Les systèmes basés sur le virus de la vaccine sont, de ce fait, extrêmement puissants car, tout à la fois, le virus sauvage et le virus recombinant peuvent infecter et se répliquer dans pratiquement un nombre illimité de cellules. En outre, ce système ne nécessite pas l'utilisation de système de sélection de longue durée comme les lignées cellulaires hôtes présentant un marqueur, ce qui simplifie grandement son utilisation. L'expression d'une séquence codante pour une protéine exogène dans le virus de la vaccine (W) implique nécessairement deux étapes 1) La séquence codante doit être sous la dépendance d'un promoteur de W et être insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de W, cloné dans un plasmide bactérien approprié. 2) Les séquences d'ADN de W situées de part et d'autre doivent permettre des recombinaisons homologues in vivo entre le plasmide et le génome viral. Une double recombinaison réciproque conduit à un transfert de l'insert d'ADN du plasmide dans le génome viral par lequel il sera propagé et exprimé (réf. 5 : Smith et col., 1983 ; 6 : Panicali et col., 1983 7 : Kieny et col., 1984). La présente invention concerne un poxvirus, en particulier un virus de la vaccine, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence d'ADN codant pour le facteur VIII. Ce virus comportera, de préférence, l'ensemble des éléments assurant l'expression du FVIII mature complet qui sera sécrété par les cellules dans le milieu. En particulier, il comportera un promoteur d'un gène de poxvirus, notamment de la vaccine, situé en amont de la séquence codant pour le FVIII, tel quelle promoteur du gène de 7,5K, noté P7,5K, qui assurera la transcription de la séquence d'ADN codant pour FVIII, nommée ci-après d'ADN(FVIII). Cet ensemble promoteur/séquence d'ADN(FVIII) sera inséré dans une séquence non essentielle de l'ADN de la vaccine telle qu'un gène du virus de la vaccine, par exemple le gène TK (thymidine kinase), ce qui fournit-une possibilité de sélection, comme cela sera expliqué ci-après. Bien entendu, dans le cadre de la présente invention, lorsque l'on parle de "virus de la vaccine", il peut s'agir du virus entier ou dlun virus dont certaines parties non essentielles ont été délétées. L'invention concerne également des cellules de mammifères infectées par un virus tel que défini précédemment. Parmi les cellules particulièrement utilisables, il faut citer notamment les cellules BHK21, bien que d'autres cellules puissent être utilisées, comme cela sera décrit dans les exemples. L'invention concerne également un procédé de préparation de FVIII obtenu par culture des cellules décrites précédemment dans un milieu de culture approprié. L'invention concerne, en particulier, un procédé de préparation de FVIII dans lequel on met en culture dans un milieu de culture approprié des cellules de mammifères infectées par un vecteur assurant l'expression du facteur VIII, ledit milieu contenant le facteur von Willebrand (vwf). Les expériences ont en effet démontré que la présence de ce facteur dans le milieu de culture permettait de stabiliser le FVIII produit. De préférence, le facteur von Willebrand est ajouté b une concentration supérieure à 0,1 U/ml. L'invention concerne, enfin, la protéine FVIII humaine obtenue par la mise en oeuvre dudit procédé. L'invention concerne, en particulier, les compositions thérapeutiques contenant à titre de principe actif le FVIII obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon 1 'invention. Les exemples suivants illustrent les propriétés des différents composants obtenus. Les différents matériels mis en oeuvre sont identifiés dans les exemples. Sauf indication contraire, les enzymes sont utilisées dans les conditions préconisées par le fabricant et les techniques mises en oeuvre sont connues de l'homme de métier. Sur les figures . la figure 1 schématise la préparation du gène du FVIII utilisé dans les exemples, la figure 2 est une analyse par hybridation Southern des recombinants W contenant le FVIII recombinant, et . la figure 3 schématise l'activité pro-coagulante de FVIII recombinant en fonction du temps, en présence ou en l'absence de vwf. EXEMPLE 1 CLONAGE DE LA SEQUENCE CODANT POUR LE FACTEUR VIII Compte tenu du fait que le mARN codant pour le FVIII humain est connu pour être extrêmement long, c'est-à-dire environ 9 000 nucléotides (ntd) (réf. 1 à 3), son clonage sous forme d'une molécule de cADN complet en utilisant la méthode classique d'amorçage à l'oligofdT) est considéré comme non réaliste. C'est pourquoi, sur la base des séquences de cADN déjà publiées, on a mis au point une stratégie utilisant deux chemins parallèles a) l'amorçage spécifique des mARN sur l'ensemble de la séquence codante, et b) le clonage d'ADN génomique. Des oligonucléotides synthétiques (18 et 21 mères) ont été utilisés, à la fois comme amorce pour l'élongation du cADN et comme sonde pour la détection des séquences clones. On a pu mettre en évidence que le criblage des banques génomiques avec deux 21 mères placés en tandem constituait une méthode très efficace pour la sélection des clones FVIII, aucun faux positif n'a été mis en évidence après analyse des séquences. Comme cela ressort de la figure 1, des portions de cADN ont été synthétisées à partir de mARN isolés de foies humains en utilisant soit des amorces spécifiques soit de l'oligo(dT). Comme les mARN de FVIII sont présents en très faible quantité dans ce tissu (1 mARN pour 100 000 à 200 000 molécules du mARN total) on a utilisé un vecteur de clonage du type lambdagtlO (lambdaNM607) (réf. 8) qui assure une banque représentative pouvant comporter jusqu'à 50 000 recombinants par nanogramme de- cADN double brin. Les étapes classiques de méthylation et d'addition de "linier" qui sont en général peu satisfaisantes ont été écartées en utilisant une méthode "tailing-adaptor" (réf. 9). La portion centrale de la séquence codante, qui constitue l'exon le plus grand du gène du FVIII humain, c'est-à-dire l'exon 14 dont la longueur est de 3 106 pb (réf. 10), a été clonée à partir d'une banque d'ADN génomique de lymphocytes humains. La portion 5' comportant une région non traduite 5' (UT :"untranslated"), exons 1 et 2, a été isolée sous forme de deux clones génomiques indépendants à partir d'une banque d'ADN GM1202A humain (lignée cellulaire 4XY). De façon à assembler'la séquence codante complète (voir figure 1), la région UT 5' plus le premier exon ont été accolés au second exon par une excision très précise des séquences intervenantes (un intron de 22,9 kb sépare l'exon 1 et 2 dans le gène du FVIII (voir figure 1)). Les autres cADN ou les clones génomiques ont alors été ligués ensemble en utilisant des sites de restriction placés de façon connue. La construction finale de la séquence codante du FVIII introduite dans le plasmide vecteur pUC8 est appelée pTG1080 et comporte la séquence codante entière du FVIII plus la portion 5' UT (à partir de ntd -64 jusqu'à ntd -1) et la région 3' UT (à partir de ntd 7055 jusqu'à ntd 8235). La numération des ntd est effectuée selon Wood et al. (réf. 1). L'insert complet de 8,3 kb est flanqué de deux sites SalI. De façon plus précise, l'ARN total a été extrait de foies humains adultes en utilisant le procédé au guanidinium HCl (réf. 11). Le polyA(+)-ARN obtenu après 2 passages sur oligo(dT)- cellulose (réf. 12) a été utilisé comme support pour la synthèse du cADN. Les amorces ont été : oligo(dT) 12-18 pour le cADN 1, un 18 mère (ntd 6937 à 6954) pour le cADN 2 et un 21 mère (ntd 3067 à 3087) pour le cADN 3. La synthèse du premier et du second brin, le traitement à la nucléase S1 et l'enrichissement sur gradient de sucrose pour les séquences supérieures à 500 ntd ont été effectués comme cela a été décrit précédemment (réf. 9). Toutefois, dans le cas de l'amorçage spécifique, on a trouvé qu'il était nécessaire d'utiliser au moins 50 g du support polyA(+)-ARN et 1 Fg/ml de l'amorce spécifique dans la réaction du premier brin de cADN. L'oligo(dG) "tailing" du cADN, la réaction avec l'oligomère phosphorylé 5'-dAATTCCCCCCCCCCC-3' et la ligation avec le vecteur lambdaNM607 digéré par EcoRI ont été effectués comme cela est décrit dans la référence 9. L'ADN recombinant ligué a été empaqueté in vitro dans des particules de phage pour infecter un tapis de E. coli POP 101 (réf. 13). Normalement, 1 ng du cADN oligo(dG)-"tailed" génère 2x104 à 5x104 ufp recombinants. Des répliques de filtres effectuées à partir de plaques (diamètre : 130 mm) contenant 2x104 ufp sont hybridées une nuit complète dans une solution contenant 6xSSC, 5 % de sulfate de dextrane, 4xsolution de Denhardt, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 0,1 % de SDS et l'oligonucléotide 32 synthétique P phosphorylé 18 ou 21 mère. La température d'hybridation est de 420C pour le 18 mère et 500C pour le 21 mère. Les filtres sont lavés dans une solution 6xSSC et 0,1 % de SDS à température d'hybridation appropriée. Les candidats sont répliqués et une seconde sélection est effectuée en utilisant le 18 mère et le 21 mère placés adjacents à ceux utilisés pour le criblage primaire. L'exon 14 (portion 4, ligne pointillée) a été isolé sur un clone lambda unique à partir d'une banque génomique lambdaEMBL3 (réf. 14) (2x106 phages recombinants)obtenue à partir d'ADN de lymphocytes humains partiellement digérés avec MboI, les tailles étant fractionnées sur gel d'agarose. Les exons 1 et 2 (portion 5, ligne pointillée) ont été isolés à partir de deux clones séparés d'une banque génomique 4XY dans lambdaEMBL3, obtenue à partir d'une lignée cellulaire lymphoblastolde humaine GM1202A. Dans les deux cas, deux sondes oligonucléotides 21 mères placés en tandem dans la séquence de FVIII ont été utilisés pour le criblage dans des conditions similaires à celles utilisées pour le criblage des banques de cADN. Les deux exons ont été sous-clonés dans M13. Ces deux clones ont été linéarisés avec une enzyme de restriction qui coupe dans la séquence intervenante 3' de l'exon 1 et 5' de l'exon 2, traités avec la nucléase Bal31, réparés avec la polymérase de Klenow en présence de 4 dNTPs, digérés avec SstI (clone exon 1) ou EcoRI (clone exon 2) et insérés dans le phage M13TG131 (réf. 15) de façon à ce que les deux exons soient positionnés dans le même vecteur, dans la mEme orientation correcte, séparés par 1,2 kb de séquence intermédiaire. Un ADN support mono brin a été préparé à partir de ce clone et la séquence intermédiaire précisément excisée, par élimination de la séquence monobrin sans séquence complémentaire appariée, en utilisant un oligonucléotide 36 mère spécifique pour 18 bases à l'extrémité 3' de l'exon 1 et 18 bases à l'extrémité 5' de l'exon 2. Des clones correctement mutés ont été identifiés en utilisant l'hybridation du 36 mère à 600C dans 5xSSC et lavage à 600C dans 0,2xSSC. Les cADN et les séquences génomiques ont été liés un par un en utilisant les enzymes de restriction indiquées en haut de la figure. Le séquençage de l'ADN de la molécule complètement assemblée a été effectué en utilisant la méthode au didéoxynucléotide (réf. 16) ou la technique de dégradation chimique (réf. 17). La figure 1 représente schématiquement l'assemblage de la totalité de la région codante de FVIII. Le cADN complet est en haut. Le premier ATG, le codon stop TGA et le site de polyaddnylation AATAAAsont indiqués ainsi que les sites de restriction utilisés dans l'assemblage. Les régions UT 5' et 3' sont hachurées. Les flèches 1, 2 et 3 représentent les clones de cADN utilisés ainsi que leurs amorces. Les séquences génomiques 4 et 5 sont représentées par des lignes pointillées. En bas de la figure, l'assemblage final est cloné dans le site SalI du plasmide pUC8. L'analyse de la séquence d'ADN de la région codante révèle deux différences par rapport au FVIII synthétisé par les cellules AL-7 (réf. 1) et par les reins humains (réf. 3) : 1) la position 1035 : A - G (silencieuse) 2) la position 3864 : A -+ C (silencieuse). La première substitution qui détruit le site unique AccI provient d'une erreur dans le processus de transcription réverse, compte tenu du fait que 14 clones de cADN isolés indépendamment à partir de la même banque maintiennent ce site de restriction. La seconde substitution est présente dans là portion centrale, qui a été clonée à partir d'une banque génomique et peut représenter un polymorphisme génétique. EXEMPLE 2 EXPRESSION DU FVIII DANS LES CELLULES DE MAMMIFERES Dans pTG1080 le site SmaI de pUC8 se trouve en amont de la région 5' UT de FVIII tandis que le site HpaI est présent à la position 7434 de la région 3' UT. Ces deux enzymes ont été utilisées pour exciser la séquence FVIII pour permettre son insertion dans le vecteur pTG186-poly. Ce plasmide permet la remcombinaison homologue in vivo avec le génome du virus de la vaccine (W). L'ADN de différents recombinants W a été préparé et analysé par la méthode de Southern pour confirmer l'intégration de la séquence FVIII dans l'ADN viral (figure 2). De façon plus précise, les analyses d'hybridation par Southern desrecombinants W.FVIII ont été effectuées par digestion avec HindIII (A) ou BamHI (B). Dans chacun de ces cas, pTG186-poly est le vecteur de recombinaison W tandis que pTGiOî6 et pTG1015 représentent pTG186-poly avec insertion de la séquence VIII placée soit dans l'orientation correcte, soit dans l'orientation incorrecte pour la transcription respectivement. Les clones 10.1 à 10.10 représentent l'ADN de 10 W (TK-) dérivés après recombinaison entre le génome de W et pTG1016. Les clones 6.1 à 6.5 sont dérivés de pTG1015.Les produits sont hybridés, soit avec (A) un mélange d'oligonucléotides 32p phosphorylés (21 mères ou 18 mères) complémentaires de fragments HindIII de la séquence FVIII, ou (B) avec le FVIII entièrement assemblé (fragment SmaI-HpaI) marqué au P par "nick translation". Dans la partie B, seuls les recombinants W choisis pour des analyses complémentaires ont été indiqués. La séquence de FVIII présente dans pUC8 (pTG1080) a été digéré avec SmaI + HpaI et insérée dans les deux orientations dans le site BamHI, rendu franc par traitement à la nucléase S1, de pTG186-poly, un dérivé de pTGi86 contenant le polylinker M13TG131 (BglII à EcoRI) (réf. 15). Le vecteur pTG186-poly peut être obtenu par exemple--d partir de vecteurs décrits dans la demande de brevet WO 85 05376. Le plasmide pTG186-poly peut être généré à partir du plasmide pTG188 digéré par PstI et religué par la ligase T4.Le plasmide pTG393 est mis en digestion avec BamHI pour générer après ligation le plasmide pTG1H-TK-P7,5K ; puis le segment polylinker du bactériophage M13TG131 (réf. 15) est excisé par EcoRI et BglII et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pTGlH-TK-P7,5K générant pTG186-poly. Dans cette construction, 10 sites de restriction sont disponibles pour le clonage d'un gène étranger sous le contrôle de P7,5K. L'insertion de la séquence FVIII dans W (Copenhagen ts 26) est effectuée comme cela a été décrit (réf. 7) et produit un virus TK Après sélection avec la 5-bromodéoxyuridine, l'ADN des recombinants est extrait, découpé avec HindIII ou BamHI, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1 z et placé sur filtre de nitrocellulose et hybridé avec des sondes tel que décrit précédemment. Après une nouvelle sélection des clones TK-, , l'un des recombinants W contenant l'ADN du FVIII dans une orientation transcriptionnelle correcte (W.TG.FVIII 10.2-1, dérivé du clone 10.2) a été choisi et utilisé pour infecter différents types de cellule. Après 1 heure d'absorption, le milieu supplémenté par du sérum de veau foetal (SFC) a été éliminé, les cellules ont été rincées très complètement et un nouveau milieu sans SFC a été utilisé. Après 24 heures, le taux d'antigène FVIII (FVIII.Ag) a été mesuré dans chaque surnageant par dosage immunoradiométrique (IRMA) (réf. 18) et les résultats sont indiqués dans le tableau 1. TABLEAU 1 TAUX D'Ag FVIII (U/ml) DANS LE SURNAGEANT DES CULTURES DE DIFFERENTES LIGNEES CELLULAIRES Lignées cellulaires BHK21 Vero HeLa HepG2 VV.TG.FVIII 10.2-1 0,120 0,049 0,035 0,028 WT VV 2x106 cellules sont infectées à 1 upf/cellule pendant 1 heure. Ensuite le milieu avec SFC est éliminé,les cellules sont lavées puis on les place dans un milieu sans SFC mais contenant 4 % d'albumine de sérum bovin (BSA) et 1 mM CaCl2. Après 24 heures, le titre de FVIII.Ag est mesuré par IRMA, en utilisant une IgG purifiée d'un sérum de patient hémophile inhibiteur comme premier anticorps et un anticorps et un anticorps monoclonal anti FVIII comme second anticorps. Les surnageants des cellules infectées avec le W sauvage donnent des résultats insignifiants. Lorsque les surnageants sont testés pour l'activité pro-coagulante de FVIII (mesureclassique du temps de thromboplastine partielle activée - APTT (réf. 19)) des valeurs d'activité très hétérogènes, parfois même sans rapport avec les taux d'antigène correspondants, sont obtenues. Les cellules BHK21 infectées avec W .TG.FVIII 10.2-1 sécrètent du FVIII avec un pic d'activité correspondant à environ 0,09 unités (U/ml) à 24 heures, les contrôles étant négatifs. L'activité décroît lentement après 36 à 48 heures, probablement en raison de nombreux facteurs tels que la labilité de la protéine à 370C (il s'agit là d'un fait qui est déjà connu dans le stockage de concentrés de FVIII plasmatique (réf. 20)) et/ou la lyse des cellules par les W avec une libération correspondante de protéasesintracellulaires et protéolyse progressive de la protéine recombinante. L'activité pro-coagulante spécifique du FVIII a été inhibée en utilisant un sérum de patients hémophiles inhibiteurs et un anticorps monoclonal anti-FVIII, CAG-1 175A7, (réf. 21) qui neutralise cette activité à différentes dilutions. Un bruit de fond très important a été trouvé dans les surnageants de cellules Vero de reins de singe et des cellules HeLa infectées avec le virus vaccine sauvage. Ce phénomène peut s'expliquer par une lyse provenant des W qui conduit à un relarguage de protéases endogènes, qui peuvent interférer avec le test de APTT. Aucune activité pro-coagulante significative n'a été trouvée dans le surnageant de l'hépatome humain G2 (HepG2 infecté avec W.TG.FVIII 10.2-1 C'est un résultat qui contraste avec la détection d'un certain taux d'antigène FVIII dans lemême échantillon. La question de savoir si le FVIII est sécrété sous forme inactive ou s'il est rapidement inactivé dans ce type de cellule n'est pas encore claire. Ces résultats démontrent qu'un recombinant actif de FVIII est exprimé dans les cellules BHK2i. EXEMPLE 3 STABILISATION DU FVIII Cette diminution progressive de l'activité pro-coagulante après 24 heures observée dans le cas des cellules BHK21 a conduit la Demanderesse a effectuer des investigations afin de déterminer s'il était possible d'augmenter la stabilité de la molécule recombinante ainsi obtenue Il a été ainsi décidé d'utiliser des préparations purifiées de facteur von Willebrand (vWf) (il s'agit d'une glycoprotéine assez grosse qui fonctionne comme une molécule porteuse de FVIII dans le sang et-qui joue un rôle actif dans l'adhésion plaquettaire après des dommages vasculaires) (réf. 22). Après infection des cellules BHK21 avec W.TG.FVIII 10.2-1 et lavages subséquents, le milieu est supplémenté avec une préparation de vwf (0,5 U/ml). Les variations de l'activité pro-coagulante sont représentées sur la figure 3 - en présence de vWf O - O en présence d'un autre vWf 1-. - sans vwf. Après une période de 48 heures, l'activité pro-coagulante augmente de façon pratiquement linéaire, le maximum est atteint pour 0,18 u/ml en présence de vWf. En l'absence de vWf, le déclin normal de l'activité peut être noté après 24 heures. Les surnageants de cellules infectées avec le W sauvage en présence de vWf ne donnent aucune activité pro-coagulante montrant que la contamination par du FVIII dans les préparations de vWf n'est pas significative. Des concentrations de vWf jusqu'd 0,1 U/ml se révèlent efficaces pour stabiliser la protéine recombinante. Des concentrations plus faibles, toutefois, ne protègent plus la molécule de FVIII après 24 heures. Ces résultats confirment que le recombinant actif FVIII est reconnu et stabilisé par le vWf natif. Le plasmide pTG188 a été déposé à la Collection Natipnale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, 75724 PARIS Cédex 15, le 20 juin 1985 sous le n E. Coli 5KpTG188 - n 1.458. Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, 75724 PARIS Cédex 15, le 6 juin 1986 : . Souche E. coli 5K pTG1016 - n I.558 Souche E. coli 5K pTG1080 - n I 559. REFERENCES 1. Wood W.I. et al. Nature 312, 330-337 (1984) 2. Toole J.J. et al. Nature 312, 342-347 (1984) 3. Truett M.A. et al. DNA 4, 333-349 (1985) 4. Thorell L. etBlomb & k B. Thromb. Res. 35, 431-450 (1984) 5. Smith G.L., Mackett M., Moss B. Nature 302, 490-495 (1983) 6. Panicali D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5364-5368 (1983) 7. Kieny M-P. et al. Nature 312, 163-166 (1984) 8. Murray N.E., Brammar W.J. et Murray K. Mol. Gen. Genet. 150, 53-61 (1977) 9. Le Bouc Y. et al. FEBS Lett 196, 108-112 (1985) 10. Gitschier J. et al. Nature 312, 326-330 (1984) 11. Chirgwin J.M. et al. Biochemistry 18, 5294-5299 (1979) 12. Pavirani A., Mage R. et Fitzmaurice L. Eur. J. Immunol. 12, 485-490 (1982) 13. Lathe R. et Lecocq J-P. Virology 83, 201-206 (1977) 14. Frischauf A.M. et al. J. Mol. Biol. 170, 827-842 (1983) 15. Kieny M-P., Lathe R. et Lecocq J-P. Gene 26, 91-99 (1983) 16. Sanger F., Nicklen S. et Coulson A.R. Proc. Natl. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977) 17. Maxam A.M. et Gilbert W. Methods Enzymol. 65, 499-560 (1980) 18. Girma J-P. et al. Br. J. Haematol. 47, 269-282 (1981) 19. Lee M.L., Maglalang E.A., Kingdon M.S. Thromb. Res. 30, 511-519 (1983) 20. Rock G.A. et al. Thromb. Res. 29, 521-535 (1983) 21. Croissant M-P., Van de Pol H., Lee H.H. et Allain J-P. (en presse) 22. Zimmermann T.S., Meyer D. Hemostasis and Thrombosis, Eds Colman R.W., Hirsch J., Marder V.J. et Salzman E.W. 54-74 (J.B. Lippincot Co. Philadelphia 1982) REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de facteur VIII, caractérisé en ce qu'on met en culture,dans un milieu de culture approprié, des cellules de mammifère infectées par un vecteur assurant l'expression du facteur VIII, ledit milieu contenant le facteur von Willebrand. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le facteur von Willebrand est ajouté à une concentration d'au moins 0,1 U/ml. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les cellules en culture sont des cellules BHK. 4) Vecteur assurant l'expression du FVIII dans les cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un poxvirus qui comporte tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour le FVIII. 5) Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus de la vaccine. 6) Vecteur selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour le FVIII est sous la dépendance d'un promoteur d'un gène de poxvirus. 7) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur d'un gène de la vaccine. 8) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour le FVIII est sous le contrôle du promoteur du gène de la protéine 7r5K de la vaccine. 9) Vecteur selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que la séquence codant pour le FVIII est clonée dans le gène TK de la vaccine. 10) Cellule de mammifère infectée par un vecteur selon l'une des revendications 4 à 9. 11) Cellule de mammifère selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule BHK27. 12) Procédé de préparation de FVIII caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon l'une des revendications 10 et 11 et que l'on récupère la protéine formée. 13) FVIII obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 12. 14) FVIII obtenu à partir de culture cellulaire, caractérisé en ce qu'il est sous forme mature et glycosylée.