Brevet FR2598917A1 — publié le 19871127

- 1 La présente invention est relative à une nouvelle lymphokine suppressive de l'activation plaquettaire, à son procédé d'isolement et de purification et aux médicaments la contenant. L'on sait que les cellules T stimulées excrètent un certain nombre de facteurs solubles parmi lesquels certains sont capable de réguler les fonctions des cellules effecteurs. Il a été démontré récemment [pf. M. JOSEPH, 10 C. AURIAULT, A. CAPRON, M. VORNG et P. VIENS, NATURE 303: 8103 que les plaquettes sanguines prélevées chez des rats infectés par Schistosoma mansoni, expriment des propriétés antiparasites destructrices in vitro, qui augmentent au cours de l'infection. Le maximum de cytotoxicité a été observé 15 lorsque les rats ont exprimé un taux élevé d'immunité vis-àvis de la réinfection. Cette cytotoxicité plaquettaire décline rapidement après 8 semaines d'infection, en dépit de la présence d'anticorps IgE dans le sérum de ces rats infectés. C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont été amené à 20 considérer que les facteurs des cellules T, produits après stimulation de cellules T suppresseurs par des antigènes circulants de S. mansoni, jouent un rôle dans cette diminution, ce mécanisme pouvant apparaître comme une régulation en retour des fonctions immunes des plaquettes dans l'infection du 25 rat. De même, il a été montré que les plaquettes humaines peuvent être induites en effecteurs cytotoxiques contre les schistosomules, par incubation avec du sérum riche en IgE de patients atteints de schistosomiase ou de patients allergiques asthmatiques, le processus cytotoxique étant retardé 30 dans ce dernier cas par l'addition d'anti-IgE ou d'un allergène spécifique [cf. M. JOSEPH, J.C. AMEISEN, J.P. KUSNIERZ, V. PANCRE, M. CAPRON et A. CAPRON, 1984, C.R. ACAD. SC. PARIS 298: 553. La présente invention a pour but d'isoler un fac35 teur suppresseur de l'activité des plaquettes sanguines, qui - 2 est capable de jouer, entre autres, un rôle d'immunomodulateur des manifestations allergiques. La présente invention a pour objet un facteur obtenu à partir de cellules T stimulées par la Concanavaline A ou 5 par un antigène, capable d'inhiber la cytotoxicité plaquettaire IgE-dépendante vis-à-vis de jeunes larves de S. mansoni, de diminuer fortement la chimioluminescence de plaquettes dans une réaction IgE/anti-IgE, qui est un correlat de la cytotoxicité antiparasitaire et d'inhiber l'activation pla10 quettaire dans des intolérances non-IgE dépendantes, lequel facteur est désigné sous le nom de lymphokine suppressive de l'activité plaquettaire (PASL) et est produit par les lymphocytes T OKT8+. Selon un mode de réalisation de la PASL, celle-ci 15 est isolée de surnageants de cultures de lymphocytes T OKT8+ stimulés par la Concanavaline A ou un antigène. Selon un autre mode de réalisation de la PASL, dans le cas o elle est isolée de surnageants de cultures de lymphocytes T OKT8+ stimulés par un antigène, les lympho20 cytes T ont été stimulés par des antigènes d'Echinococcus granulosus ou de Schistosoma mansoni. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de la PASL qui consiste à stimuler des cellules T d'origine humaine ou murine par la Concanavaline A 25 ou un stimulant mitogènique analogue ou par un antigène pris dans le groupe qui comprend les antigènes de S. mansoni et les antigènes d'Echinococcus granulosus, à cultiver les cellules T stimulées, pendant une durée appropriée, à récupérer les surnageants de culture et à les filtrer, éventuellement 30 après centrifugation, à travers des membranes de dimension de pores de l'ordre de 0,22 pm, puis à les purifier par gelfiltration et à soumettre la fraction protéique active recueillie, préalablement identifiée par recherche de l'activité biologique ou immunologique et éventuellement lyophilisée, à 35 une chromatographie en phase inverse sur un gel de silice - 3 greffé, de granulométrie et de porosité calibrées, suivie d'une élution par un gradient de CH3CN-H20 contenant 1% d'acide trifluoroacétique, allant de 1-99 à 60-40, la fraction protéique purifiée contenant la PASL étant ensuite avan5 tageusement lyophilisée après détection par enregistrement de densité optique à 215 nm et détermination de l'activité biologique. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé d'obtention de la PASL conforme à la présente invention, 10 l'activité biologique de la fraction protéique active et de la fraction protéique active purifiée contenant la PASL est déterminée par l'obtention de 60% d'inhibition de la cytotoxicité par le surnageant de culture de lymphocytes T stimulés par la Concanavaline A ou par des antigènes d'E. granu15 losus, vis-à-vis de plaquettes sanguines normales utilisées comme cellules effectrices, incubées avec du sérum de patients atteints de schistosomiase ou avec du sérum de patients allergiques présentant un taux élevé d'IgE circulantes et stimulés par des anti-IgE ou par l'allergène spécifique. La présente invention a en outre pour objet un nouveau médicament immunomodulateur des manifestations allergiques qui est caractérisé en ce que son constituant actif est la PASL isolée de surnageants de cultures de lymphocytes T stimulés par un agent mitogène tel que la Concanavaline A ou 25 analogue ou par un antigène approprié tel que notamment un antigène d'E. granulosus ou de S. mansoni, qui présente les propriétés énoncées plus haut et dont le poids moléculaire est de l'ordre de 15 à 20 kDa et le Pi est de l'ordre de 4,4 à 5-,0, laquelle lymphokine possède une structure de liaison 30 spécifique du type d'un récepteur, à la surface des plaquettes sanguines, c'est-à-dire une spécificité d'adsorption sur les plaquettes. Les tests menés pour vérifier l'activité biologique du surnageant de cultures de lymphocytes T stimulés conformé35 ment à la présente invention ont permis de parvenir aux con- - 4 clusions suivantes: Effet du surnageant sur la cytotoxicité des plaquettes Les surnageants obtenus après stimulation de lymphocytes T, périphériques ou d'amygdales, humains normaux, par la Concanavaline A (0, 01 à 5 pg/ml) ou de lymphocytes T de rate d'un patient atteint d'Echinococcose, par des antigènes d'E. granulosus (5 à 100 mg/ml), testés dans des processus cytotoxiques de plaquettes vis-à-vis de schistosomules, ont permis d'obtenir les résultats réunis dans le 10 Tableau I ci-après: TABLEAU I Effet de la PASL sur la cytotoxicité antiparasitaire IgE-dépendante de plaquettes sanguines murines et humaines provenant d'individus infectés et allergiques 20 Homme(a) Rat(b) Cytotoxicité A B Dans un milieu activateur 72,7 2,9 81,7i5,5 71,2 5,2 avec du surnageant Con. A 20,5i 2,1 22,1*4,0 19,5 2,5. avec du surnageant Ag 35,0 15,0 33, 6 6,1 21,5i0,5 avec du milieu de culture 70,2 3,2 81,5 4,6 78,0 7,0 de lymphocytes N.B. Dans tous les cas la cytotoxicité avec des sérums de rat ou humains normaux, n'excède pas 9,5 *7,3. a) Les plaquettes purifiées ont été incubées avec du sérum A (de patients atteints de Schistosomiase mansoni) ou B (de 30 donneurs allergiques) en présence de larves de S. mansoni (Schistosomules). Le surnageant de lymphocytes ou le milieu de culture de lymphocytes et les anti-IgE ou l'allergène correspondant dans le cas d'incubation dans du sérui de donneurs allergiques, ont été ajoutés et la cyto35 toxicité a été appréciée en pourcentage de schistosomule -5 mortes à la fin d'une durée d'incubation de 24 heures à 37C (moyenne écart type). b) Les plaquettes purifiées ont été incubées avec du sérum de rats atteints de Schistosomiase mansoni en présence de 5 larves de S. mansoni (schistosomules). Le surnageant de lymphocytes ou le milieu de culture de lymphocytes a été ajouté et la cytotoxicité a été appréciée en pourcentage de schistosomules mortes à la fin d'une durée d'incubation de 24 heures à 37 C (moyenne i écart type). Les Inventeurs ont mis en évidence que les surnageants sont actifs directement sur les fonctions plaquettaires et non par protection des cibles, car la préincubation séparée des plaquettes effectrices ou des schistosomules avec les surnageants de lymphocytes T, suivie d'un test de cyto15 toxicité dans lequel les plaquettes et les parasites ont été séparés par une membrane en polycarbonate de porosité 0,2 p, ne détermine l'inhibition attendue que dans le cas o les plaquettes ont été préincubées et non dans le cas o les larves ont été incubées, ainsi que cela ressort du Tableau 2 qui 20 va suivre. TABLEAU 2 Action directe de la PASL sur les plaquettes sanguines humaines P/S P*/S P/S* Cytotoxicité IgE/anti-IgE 92,3*5,1 14,6*9,2 71,5 6,3 Les plaquettes (P) humaines et les schistosomules (S), trai30 tées (*) ou non par du surnageant de lymphocytes, ont été séparées par un filtre (/) en polycarbonate de porosité 0,22 Mm dans des chambres de Boyden. La cytotoxicité a été appréciée en pourcentage de schistosomules mortes à la fin d'une période d'incubation de 24 heu35 res à 37'C (moyenne I.S.D.). - 6 De plus, les Inventeurs ont démontré que cette inhibition n'est pas la conséquence d'un effet toxique du surnageant de lymphocytes T car il n'a pas été détecté de LDH dans la suspension de plaquettes (Lactico-deshydrogénase). La stimulation mitogénique de lymphocytes T de rate de rats soit par la Concanavaline A soit par le PHA [(2gg/ml); PHA = Phytohémagglutinine] ou la stimulation antigénique de lymphocytes T mésentériques ou de rate de rat infecté par S. mansoni, par de l'antigène de schistosome adul10 te, produit des surnageants qui inhibent la cytotoxicité IgE-dépendante de plaquettes de rats (40 à 60% d'inhibition), ce qui montre que les lymphocytes T de rats sécrètent, de même que les lymphocytes T humains, la lymphokine PASL qui est un facteur inhibiteur de plaquettes. Comme le montre la Figure 1 annexée, qui représente le pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité en fonction de la quantité de Concanavaline A (exprim6e en pg/ml) utilisée comme stimulant, l'effet inhibiteur est proportionnel à la dose de Concanavaline A utilisée pour la stimulation des cel20 lules T et l'effet optimal est obtenu à une dose finale de 1 pg/ml. Les surnageants produits en l'absence de Concanavaline A expriment également une activité suppressive, mais sensiblement inférieure à celle observée avec des surnageants activés à la lectine (20-25%). Comme le montre la Figure 2, qui représente le pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité en fonction de la quantité de surnageant (exprimée en pl) mise en oeuvre, le surnageant agit d'une manière qui est fonction de la quantité mise en oeuvre, pour atteindre un plateau à 50 p1 (1:4 de di30 lution finale), ce qui est la dose utilisée pour toutes les expériences ultérieures. L'effet de l'addition de surnageants à différentes périodes avant et après le commencement du processus cytotoxique est représenté à la Figure 3 annexée dans laquelle le pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité est représenté en fonction de l'addition de surnageant dans le * -. -7 temps, exprimée en heures; l'inhibition optimale a été obtenue par addition du surnageant de cellules T au cours de la première heure de contact entre les plaquettes effectrices et les schistosomules (dans cette Figure "Smules" signifie schistosomules). Structure de liaison sur les plaquettes Trois incubations successives de surnageant de cellules T qui contient le facteur conforme à l'invention, qui est capable d'inhiber les propriétés destructrices des pla10 quettes vis-à-vis des schistosomules, avec des plaquettes mises en comprimés, suppriment son activité inhibitrice de la cytotoxicité des plaquettes: cette absorption du facteur suppresseur par les plaquettes suggère l'existence d'une structure de liaison. Par contre, lorsqu'on utilise des li15 gnées cellulaires de myelome d'IgE, de K562, de U937 ou des macrophages broncho-alvéolaires, comme absorbants, l'effet inhibiteur du surnageant de lymphocytes est préservé. Effet du surnageant sur la chimioluminescence des plaquettes Les Inventeurs ont démontré précédemment [C. R. 20 ACAD. SC. PARIS, 1984, 298:55 déja cité] que, dans la cytotoxicité IgE-dépendante vis-à-vis des schistosomules, il est possible d'obtenir la production de métabolites de l'oxygène par les plaquettes humaines, mesurée par chimioluminescence. L'effet du surnageant de lymphocytes T stimulés par ?5 la Concanavaline A (1 pg/ml) sur la chimioluminescence des plaquettes a été testé: comme le montre la Figure 4 annexée, une incubation de plaquettes avec du surnageant de lymphocytes T pendant une heure, à une dilution finale de 1:4, diminue fortement (de 60%) la production de métabolites de 30 l'oxygène qui est normalement observée dans le cas o les plaquettes normales ont été stimulées par une réaction IgE/anti-IgE ou dans le cas o des plaquettes de patients allergiques ont été stimulées par l'allergène correspondant, ce qui confirme le rôle direct de la lymphokine conforme à 35 l'invention, vis-à-vis des plaquettes ellesmêmes. - 8 Dans la Figure 4, les initiales NS et AS ont les significations suivantes: NS = incubées dans du sérum normal, AS = incubées dans du sérum de patients allergiques, AS+ConA Sup = incubées dans du sérum de patients allergiques et du surnageant de lymphocytes. L'activité maximum de la chimioluminescence luminol/luciférine de 5.105 plaquettes dans du PBS a été enregistrée dans les cinq minutes qui ont suivi l'addition du 10 milieu (1ère colonne de chaque groupe) ou de l'agent retardateur:anti- IgE (10 pg d'anticorps/ml) (2ème colonne de chaque groupe) ou allergène (10 pg/ml) (3ème colonne de chaque groupe). Caractérisation des cellules impliquées dans la production de 15 lymphokine suppressive Pour définir le type de cellules responsables de la production du facteur inhibiteur conforme à la présente invention, les Inventeurs ont examiné l'effet d'une déplétion de sous-population T sélective: ils on traité des cellules T 20 par de l'anticorps monoclonal OKT4 (pour les sous-classes auxiliaire/inducteur) ou par de l'anticorps monoclonal OKT8 (pour les sous-classes supresseur/destructeur) en présence de complément. Les cellules ont alors été stimulées par la Concanavaline A et on a examiné si de la lymphokine suppres25 sive a été produite. Comme le montre la Figure 5, la dépletion de lymphocytes OKT 8+ a supprimé la production du facteur inhibiteur, tandis que la dépletion de cellules OKT 4+ n'a pas modifié sa formation. La Figure 5 illustre le taux d'activité 30 suppressive respective de PASL obtenue à partir de cellules T, de cellules OKT8+OKT4- et de cellules OKT8-OKT4+, stimulées par la Concanavaline A. Les résultats sont exprimés en suppression % (moyenne) de la cytotoxicité IgE-dépendante, vis-à-vis des schistosomules. Cette observation montre bien qu'une sous- 98 9 1 7 - 9 population de cellules T suppressives produit le facteur responsable de l'inhibition observée des fonctions effectrices des plaquettes. Effet du traitement de cellules T par l'indométhacine sur la 5 production de la lymphokine (PASL) inhibitrice conforme à l'invention Les prostaglandines jouent, comme on le sait, un rôle dans l'induction de cellules T suppressives nonspécifiques, pendant la stimulation mitogènique et anti10 gènique de lymphocytes. Les Inventeurs ont donc traité les lymphocytes par l'indométhacine (10-5M concentration finale) qui est un inhibiteur de la synthèse des prostaglandines et ils ont examiné la production de lymphokine inhibitrice induite par l'agent mitogène. La production de ce facteur est 15 demeurée inchangée dans ces conditions (48,0 3,0% d'activité suppressive avec l'indométhacine, pour 45,0 2,5% sans l'indométhacine). Caractéristiques physicochimiques de la lymphokine inhibitrice plaquettaire (PASL) conforme à l'invention. L'effet suppresseur est demeuré inchangé après dialyse du surnageant de lymphocytes pendant 24 heures contre une solution tampon de phosphate (PBS). Le facteur inhibiteur est stable vis-à-vis de la chaleur (560C pendant une heure ou 100 C pendant 5 minutes) et des acides, car une dialyse pen25 dant 24 heures contre un tampon à pH2 n'a pas altéré son effet suppresseur, ainsi que cela ressort du Tableau 3 ci-après qui montre les propriétés physicochimiques de la PASL: la stabilité de la PASL vis-à-vis de la chaleur a été évaluée en chauffant les surnageants au bain-marie à 56 C pendant 30 120 minutes, ou à 100 C pendant 5 à 10 minutes. La PASL dialysée a été préparée par dialyse du surnageant à 4 C pendant 24 heures contre du PBS, avec des changements multiples de milieu. Les surnageants traités par un acide ont été préparés par dialyse à 4 C pendant 24 heures contre du tampon glycine 35 à pH2, suivie d'une dialyse pendant 24 heures supplémentaires contre du PBS pour éliminer l'acide en exces. 2598 9 17 1 0 - 10 TABLEAU 3 Propriétés physicochimiques de la PASL Traitement Indice d'inhibition 64,0*1,4 A. Chauffage minutes à 56'C 65,7*5,6 minutes à 100'C 74,8*8,8 B. Dialyse pendant 24 heures 64,3 3,6 C. Traitement acide pendant 24 heures 68,5 2,5 Comme le montre la Figure 6 annexée, qui montre le 15 pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité de surnageants traités par diverses enzymes, respectivement la trypsine, la protéase K et la neuraminidase, la lymphokine isolée conformément à la présente invention est sensible à la trypsine et à la protéase K, tandis que la neuraminidase n'a aucune in20 fluence sur son activité. Un profil chromatographique de la lymphokine inhibitrice des plaquettes sanguines, conforme à la présente invention, sur un tamis moléculaire en Sephadex-G75, est représenté à la Figure 7. La PASL a été fractionnée sur une colon25 ne de Sephadex-G75 préparée dans du tampon phosphate (pH 7,4). Les fractions éluées ont été testées pour leur activité PASL dans la cytotoxicité plaquettaire IgE-dépendante, anti-schistosome. L'activité suppressive a été détectée dans deux pics, mais l'activité optimale a été trouvée dans le se30 cond pic, le plus petit, migrant dans la gamme de poids moléculaire inférieure ou égale à 25000 et de préférence comprise entre 18000 et 20000; le premier et plus grand pic pourrait correspondre à une forme agrégée de la molécule. La charge électrique de la lymphokine inhibitrice 35 plaquettaire PASL a été examinée: l'activité est maximale à - 1il un point isoélectrique (Pi) compris entre 4,1 et 4,6, comme le montre la- Figure 8 qui montre le pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité en fonction du pH. La focalisation du point isoélectrique de la PASL a été réalisée dans une colon5 ne de Sephadex-G75 contenant 5% d'ampholines supports dans une gamme de pH de 3,8 à 10, pendant 16 heures, à une puissance constante de 8 watts. Chaque fraction de gel a été éluée, dialysée pendant une nuit contre du PBS contenant du NaCl, pour éliminer les ampholines, après quoi son activité 10 suppressive a été examinée en évaluant sa cytoxicitéplaquettaire IgE-dépendante vis-à-vis des Schistosomules. Il ressort de ce qui précède que la lymphokine PASL inhibe les fonctions effectrices des plaquettes sanguines, ce qui suggère qu'elle joue un rôle dans la régulation de trou15 bles immunopathologiques dans lesquels le taux d'IgE est augmenté, notamment dans les allergies atopiques, et plus particulièrement dans l'asthme. De ce fait, la PASL constitue une substance immunopharmacologique d'un grand intérêt pour le traitement des troubles allergiques dans lesquels les pla20 quettes semblent impliquées. La description qui va suivre se réfère à un exemple de préparation de la lymphokine PASL conforme à la présente invention, qui est donné à titre d'illustration de l'un des objets de la présente invention, et n'a aucun caractère limi25 tatif. Exemple de préparation de lymphokine PASL purifiée 1. Préparation de surnageants de lymphocytes T Les surnageants de lymphocytes T peuvent être obtenus soit par stimulation mitogènique, soit par stimulation 30 antigénique, comme décrit ci-après. A. Par stimulation mitogénique - à partir de cellules humaines, 3.106 de cellules T périphériques ou d'amygdales, prélevées chez l'homme, sont incubées dans du mi35 lieu RPMI-FCS úc'est-à-dire du milieu RPMI-1640 - 12 contenant 5% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS)] avec de la Concanavaline A (0,01 à 5 mg/ml) à 37C dans des plaques de culture comportant des puits à fond plat, pendant 24 heures, 5 dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Les cellules sont ensuite lavées pour éliminer la Concanavaline A et cultivées pendant 24 heures. Les surnageants de chaque puits sont récupérés, centrifugés à 400xg et filtrés à travers des membranes de 10 porosité 0,22 ym, après quoi, s'ils ne sont pas utilisés immédiatement, ils sont stockés à - 20 C. - à partir de cellules murines 1.106 lymphocytes de ganglions lymphatiques ont été utilisés et les surnageants préparés comme décrit 15 ci-dessus. B. Par stimulation antigénique - la stimulation de cellules T humaines provenant d'un patient atteint d'Echinicoccose a été effectuée dans du milieu RPMI-FCS par addition d'ex20 traits bruts d'Echinococcus granulosus (concentration finale: 5, 40 ou 100) en présence de cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) autologues irradiées (2000 rads, 2 minutes). Après avoir séjourné 24 heures dans une atmosphère humidifiée, 25 les cellules ont été lavées pour éliminer les extraits précités et elles ont été cultivées pendant 4 jours. Le surnageant de culture a été, récupéré, filtré à travers une membrane à 0,22 im et stocké à - 20 C s'il n'est pas utilisé immédiatement, - des cellules T obtenues à partir de ganglions lymphatiques de rats infectés par S. mansoni (14, 35 ou 56 jours d'infection) ont été incubées dans du milieu RPMI-FCS supplémenté par de la IL2 (Interleukine 2), des cellules thymiques de rat irradiées 35 (APC) et d'antigène de ver adulte de S. mansoni - 13 (50 pg/ml de concentration finale) dans des plaques de culture à puits multiples à fond plat, dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Cette stimulation a été effectuée tous les 5 jours et le 5 15ème jour, les surnageants ont été récupérés, centrifugés pour en éliminer toutes cellules contaminantes éventuellement présentes, et filtrés à travers des membranes de 0,22 pm, avant d'être stockés à -20 C, si nécessaire. En même temps, la réponse 10 de multiplication des cellules T a été mesurée dans ces conditions, après une impulsion de 16 heures avec 1 pCi de 3H-Thymidine (lCi/mmole), la radioactivité incorporée étant déterminée par filtration de la culture à travers des membranes Millipore et 15 comptage des filtres dans un fluide de scintillation liquide, dans un bêta-spectromètre. 2. Purification des surnageants pour en extraire la lymphokine PASL active 2.1. Le surnageant, éventuellement décongelé après stockage, 20 est dialysé en cellule Amicon (membrane UM5) pour en éliminer les sels et les petites molécules. 2.2. Après dialyse, la lymphokine PASL est purifiée par gelfiltration sur une colonne de Biogel-P30 extra fin (granulométrie 400 mesh) en milieu AcOH 1%, à un débit li25 néaire de 2 cm/heure. Le contrôle des effluents est effectué par lecture à 254 nm et par recherche de l'activité biologique ou immunologique comme décrit plus loin. Les fractions ainsi localisées sont réunies et lyophilisées. 2.3. La protéine (lymphokine PASL) est alors soumise à une chromatographie en phase inverse (CLHP) sur un gel de silice greffé (tel que l'octadécylsilane, par exemple) dont les particules sont de granulométrie contrôlée (5 pm) et dont les pores sont calibrés (300 ). L'élution s'effectue à l'aide d'un gradient de CH3CN-H20 - 14 allant de 199 à 60-40, en 3 heures. A ces deux phases est ajouté 1%. d'acide trifluoroacétique pour l'appaÉfement ionique.! La détection est effectuée par enregistrement de densité 5 optique à 215 nm et détermination de l'activité biologique. Les fractions ainsi localisées sont alors lyophilisées et contrôlées: elles sont constituées par la lymphokine PASL. 3. Détection de l'activité biologique L'activité biologique est détectée par l'aptitude des plaquettes à tuer des larves de schistosome en présence d'IgE spécifiques, et par l'évaluation de la chimioluminescence induite par le métabolisme oxydatif en présence de luminol et de luciférine. 4. Détermination du poids moléculaire de la lymphokine PASL conforme à l'invention Le surnagant stimulé par la Concanavaline A, dans l'exemple décrit, concentré (2 ml), est filtré à travers une colonne de Sephadex G75 (1,8 x 38 cm) et élué avec 20 du PBS à un débit de 5 ml/heure. L'activité lymphokinique de chaque fraction est testée comme décrit en 3. ci-dessus. Pour déterminer le poids moléculaire de la lymphokine, le chromatogramme est calibré avec un kit de calibrage 25 de faible poids moléculaire (fourni par PHARMACIA, UPPSALA, Suède) contenant de la sérum-albumine bovine (BSA, p.m. 67000), de l'ovalbumine (p.m. 43000), du chymotrysinogène A (p.m. 25000) et de la ribonucléase A (p.m. 13700). Le poids moléculaire du polypeptide qui 30 constitue la lymphokine, déterminé comme indiqué cidessus, est compris entre 15000 et 20000. Ainsi que cela ressort de ce qui précède on isole, conformément à la présente invention, une lymphokine qui se distingue des lymphokines identifiées jusqu'à ce jour, aussi 35 bien par ses propriétés biologiques que par ses propriétés - 15 physico-chimiques, et qui inhibe les fonctions effectrices des plaquettes, fournissant ainsi une substance immunopharmacologique propre à jouer un rôle important dans la régulation de troubles immunopathologiques dans lesquels le 5 taux des IgE est augmenté, et plus particulièrement dans les allergies atopiques et plus particulièrement encore dans l'asthme. - 16 REVENDICATIONS 1) Nouvelle lymphokine suppressive de l'activation plaquettaire, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un facteur obtenu à partir de cellules T stimulées par la 5 Concanavaline A ou par un antigène, capable d'inhiber la cytotoxicité plaquettaire IgE-dépendante vis-à-vis de jeunes larves de S. mansoni, de diminuer fortement la chimioluminescence de plaquettes sanguines, dans une réaction IgE/anti- IgE, qui est un corrélat -de la cytotoxicité anti10 parasitaire, et d'inhiber l'activation plaquettaire dans des intolérances non-IgE dépendantes, lequel facteur est désigné sous le nom de lymphokine suppressive de l'activité plaquettaire (PASL) et est produit par les lymphocytes T OKT8+. 2 ) Lymphokine selon la revendication 1, caractéri15 sée en ce qu'elle est isolée de surnageant de cultures de lymphocytes T OKT8+ stimulés par la Concanavaline A ou un antigène. 3 ) Lymphokine selon la revendication 2, caractérisée en ce que dans le cas o elle est isolée de surnageants 20 de cultures de lymphocytes T OKT8+ stimulés par un antigène, les lymphocytes T ont été stimulés par des antigènes d'Echinococcus granulosus ou de Schistosoma mansoni. 4 ) Procédé de préparation d'une lymphokine suppressive de l'activité plaquettaire, caractérisé en ce qu'il 25 consiste à stimuler des cellules T d'origine humaine ou murine par la Concanavaline A ou un stimulant mitogènique analogue ou par un antigène pris dans le groupe qui comprend les antigènes de S. mansoni et les antigènes d'Echinococcus granulosus, à cultiver les cellules T stimulées, pendant une du30 rée appropriée, à récupérer les surnageants de culture et à les filtrer, éventuellement après centrifugation, à travers des membranes de dimension de pores de l'ordre de 0,22 pm, puis à les purifier par gel-filtration et à soumettre la fraction protéique active recueillie, préalablement identi35 fiée par recherche de l'activité biologique ou immunologique - 17 et éventuellement lyophilisée, à une chromatographie en phase inverse sur un gel de silice greffé, de granulométrie et de porosité calibrées, suivie d'une élution par un gradient de CH3CN-H20 contenant 1%, d'acide trifluoroacétique, allant de 5 1-99 à 60-40, la fraction protéique purifiée contenant la PASL étant ensuite avantageusement lyophilisée, après détection par enregistrement de densité optique à 215 nm et détermination de l'activité biologique. )'Procédé selon la revendication 4, caractérisé 10 en ce que l'activité biologique de la fraction protéique active et de la fraction protéique active purifiée contenant la PASL est déterminée par l'obtention de 60% d'inhibition de la cytotoxicité par le surnageant de culture de lymphocytes T stimulés par la Concanavaline A ou par des antigènes 15 d'E. granulosus, vis-à-vis de plaquettes sanguines normales utilisées comme cellules effectrices, incubées avec du sérum de patients atteints de schistosomiase ou avec du sérum de patients allergiques présentant un taux élevé d'IgE circulantes et stimulés par des anti-IgE ou par l'allergène spéci20 fique. 6 ) Nouveau médicament immunomodulateur des manifestations allergiques, caractérisé en ce que son constituant actif est la PASL isolée de surnageants de cultures de lymphocytes T stimulés par un agent mitogène tel que la 25 Concanavaline A ou analogue ou par un antigène approprié tel que notamment un antigène d'E. granulosus ou de S. mansoni, et dont le poids moléculaire est de l'ordre de 15 à 20 kDa et le Pi est de l'ordre de 4,4 à 5,0, laquelle lymphokine possède une structure de liaison spécifique du type d'un récep30 teur, à la surface des plaquettes sanguines, c'est-à-dire une spécificité d'adsorption sur les plaquettes.