Brevet FR2601688A1 — publié le 19880122

Méthode de purification de parvovirus multipliés en cultures cellulaires animales La présente invention a pour objet, à titre de procédé de purification nouveau des Parvovirus, un procédé mettant en jeu successivement I'élution à pH basique des Parvovirus absorbés sur les débris cellulaires et les particules solides du milieu de culture récolté lors de la phase de lyse cellulaire; - la fixation des Parvovirus sur des particules de poudre de verre à pH 3,5; I'élution des Parvovirus des particules de poudre de verre à pH basique en présence d'extrait de boeuf;; le traitement de l'éluat par le Freon 113 aboutissant a la séparation des Parvovirus dans la phase aqueuse supérieure obtenue après la centrifugation du mélange Eluat + Freon 113. On va décrire en détail, pour illustrer le procédé de l'invention, les exemples non limitatifs suivants EXEMPLE I: PURIFICATION DU PARVOVIRUS DU CHIEN - La nappe cellulaire du rein de chien et le milieu de culture sont congelés - décongelés 3 fois quand l'effet cytopathogène viral est suffisant; - On ajoute à la suspension milieu et cellules, volume égal de tampon boraté à 0,05 M, isotonique, de pH 9; - On agite et on laisse 30 minutes à la température du Laboratoire; - On centrifuge à 1.000 g pendant 20 minutes pour éliminer les débris cellulaires; on garde le surnageant; - Si le surnageant est d'un volume inférieur à deux litres, on complète à 2 litres avec de l'eau distillée stérile; - On acidifie à pH 3,5 avec HCI.N en agitant; - On ajoute AL C13 anhydre, P.M. - 133,34 pour obtenir une concentration finale de 5xl0 4M, soit 0,666 g/10 litres de surnageant de culture cellulaire; - On adsorbe les Parvovirus sur de la poudre de verre, par le procédé suivant - Dans une ampoule à décantation en verre, modifiée, constituée d'une colonne de verre ( 50 mm x 340 mm); prolongée à sa partie supérieure par une chambre d'expansion sphérique (eS 160 mm x 200 mm) munie, à son sommet opposé à la colonne, d'une tubulure de sortie. La partie inférieure de la colonne est prolongée par un cône normalisé (19 mm x 26 mm) qui la relie à un élément secondaire en verre, muni d'une plaque frittée et d'une tubulure d'arrivée entre 2 robinets, I'un côté plaque frittée, en haut, I'autre côté sortie, en bas. - Par la tubulure supérieure de la sphère, on introduit 150 g de poudre de verre stérile (100 mm / 200 mm). - On aspire le surnageant de culture cellulaire acidifié à pH 3,5 et additionné de Al C13 par la partie inférieure de la colonne de verre. Le surnageant monte à travers la colonne entraînant la poudre de verre qui, en suspension, forme un filtre dynamique jusqu'au tiers inférieur de la chambre sphérique. On règle la vitesse de passage du surnageant pour avoir une suspension homogène de poudre de verre. - Lorsque tout le surnageant est passé à travers la poudre de verre, on rince celle-ci en faisant passer de la même façon, à travers -la poudre de verre en suspension, deux litres d'eau distillée à pH 3,5, contenant 5 x 10 4M de Al C13 anhydre, soit 0,0666 g pour un litre d'eau distillée. - Par la tubulure du sommet de la sphère, on introduit 150 ml de tampon boraté pH 9, isotonique, additionné de 3% d'extrait de boeuf. A pH alcalin, en présence de protéines, les Parvovirus qui ont été adsorbés sur la poudre de verre à pH 3,5 sont élués. On suit la progression du front de l'éluat à travers la poudre de verre. On recueille les 25 premiers ml qui contiennent les Parvovirus élués de la poudre de verre. - Sur les 25 ml d'éluat, on pratique une extraction par le Freon 113 selon la technique suivante : - L'éluat est mélangé avec un volume égal de Freon 113. Le mélange est agité 2 minutes et centrifugé 3 minutes à 23.500 g. La couche supérieure aqueuse contient le virus partiellement purifié. RESULTATS : : Titre en unités : Extrait sec % : hémaggtutinantes Surnageant de culture : cellulaire avant purification : 1.024 UHA/ml : 7,50 Suspension virale : : après purification 2.048 UHA/ml 1,2 EXEMPLE Il: PURIFICATION DU PARVOVIRUS DE LAPANLEUCOPENIE DU CHAT La technique de purification est rigoureusement identique à celle de L'exempLe I. RESULTATS : Titre en unités : Extrait sec % : cytopathogènes par : immunofluorescence Surnageant de culture celLulaire avant purification : 10 DICP 50/ml 6,90 Suspension virale : : après purification : 5 x 10 DICP /50 ml : 0,90 La présente invention consiste, d'une part à éluer les Parvovirus du milieu de culture, à pH basique, les fixer à pH acide sur de La poudre de verre, les éluer de la poudre de verre à pH alcalin; d'autre part, à traiter L'élut de Parvovirus par le Fréon 113. Ce procédé peut, en outre, posséder les caractéristiques suivantes prises isolément ou en combinaison a) L'élution des Parvovirus fixés sur les particules solides du surnageant des cultures cellulaires peut être effectuée par un tampon isotonique à 0,2 M glycine à pH 9, ou par tout autre tampon isotonique à pH 9; le pH des tampons d'élution peut varier entre pH 8 et pH 10. b) La quantité de tampon Boraté isotonique à pH 9 à ajouter au surnageant de cultures cellulaires pour éluer les Parvovirus peut varier entre 0,5 litre de tampon pour 1 litre de liquide de culture à 20 litres de tampon boraté pH 9 pour 1 litre de culture. c) L'acidification du surnageant de culture de Parvovirus pour fixer les Parvovirus sur la poudre de verre peut se faire à un pH compris entre 3,2 et 3,8. La concentration finale de Al CL3 peut varier entre 0,0600 g/10 litres et 0,0700 g/10 litres. d) L'élution en milieu basique des Parvovirus fixés sur la poudre de verre peut s'effectuer en remplaçant le tampon isotonique boraté de pH 9 par un tampon isotonique à 0,02 M glycine à pH 9. Le pH des tampons isotoniques employés peut être compris entre pH 8 et pH 10. e) La concentration d'extrait de viande ajouté au tampon basique d'élution des Parvovirus de La poudre de verre peut varier entre 2 x et 4 2. La proportion de Freon 113 à mélanger à L'élut de Parvovirus élués de la poudre de verre peut varier entre: 1/2 volume de Freon pour un volume d'Eluat et 10 volumes de Freon pour un volume d'Eluat. REVENDICATIONS 1"- Procédé nouveau de purification de suspension virale de Par vovirus obtenues en cultures de celluLes animales caractérisé en ce qu'il consiste, d'une part à éluer les Parvovirus.du milieu de culture, à pH basique, les fixer à pH acide sur de la poudre de verre, les éluer de la poudre de verre à pH alcalin; d'autre part, à traiter L'élut de Par vovirus par-le Freon 113. 20- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que L'élution des Parvovirus fixés sur les particules solides du surnageant des cultures cellulaires peut être effectuée par un tampon isotonique à 0,2 M glycine à pH 9, ou par tout autre tampon isotonique à pH 9; le pH des tampons d'élution peut varier entre pH 8 et pH 10. 30 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que La quantité de tampon Boraté isotonique à pH 9 à ajouter au surnageant de cultures cellulaires pour éluer les Parvovirus peut varier entre 0,5 litre de tampon pour 1 litre de liquide de culture à 20 litres de tampo boraté pH 9 pour 1 litre de culture. 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'acidification du surnageant de culture de Parvovirus pour fixer les Parvovirus sur la poudre de verre peut se faire à un pH compris entre 3,2 et 3,8. La concentration finale de AI Cl3 peut varier entre 0,0600 g/10 litres et 0,0700 g/10 litres. Procédé selon La revendication 1 caractérisé en ce que l'élution en milieu basique des Parvovirus fixés sur la poudre de verre peut s'effectuer en remplaçant le tampon isotonique boraté de pH 9 par un tampon isotonique à 0,02 M glycine à pH 9. Le pH des tampons isotoniques employés peut être compris entre pH 8 et pH 10. 6 - Procédé selon L'ensemble des revendications précédentes caractérisé en ce que la concentration d'extrait de viande ajouté au tampon basique d'élution des Parvovirus de la poudre de verre peut varier entre 2% et 4% 7"- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que La proportion de Freon 113 à mélanger à l'eluat de Parvovirus élués de la poudre de verre peut varier entre: 1/2 volume de Freon pour 1 volume d'Eluat et 10 volumes de Freon pour 1 volume d'Eluat