Brevet FR2601687A1 — publié le 19880122

La présente invention a été réaliste dans le cadre du Laboratoire de Microbiologie de l'Ecole Nationale Supérieure de Biologie Appliquée à la Nutrition et à l'Alimentation (ENSBANA). La présente invention concerne un procédé pour la mise en oeuvre de réactions enzymatiques utilisant des microorganismes inclus dans une matrice de polymère. Il a été démontré antérieurement que ces préparations microbiennes pouvaient servir à la préparation de boissons fermentées telles que le vin et la bière (FR 2 320 349 et FR 2 359 202). On a même proposé leur utilisation dans les procédés de champagnisation classique (FR 2 432 045). Enfin, de nombreuses publications scientifiques ont souligné les remarquables performances des réacteurs à cellules immobilisées (Colloque de Biotechnologie - MUNICH 1984). Cependant, ces procédés présentent des inconvénients. En particulier, l'activité des particules de microorganismes n'est pas parfaitement contrôlée. L'un-des buts de la présente invention est d'améliorer le contrôle de la fermentation dans le cas des microorganismes inclus et d'améliorer les performances de ces fermentations. En effet, nombreux procédés de fermentation, très lents, exigent des investissements lourds en locaux et volume de cuverie. C'est le cas en particulier du cidre. Le jus de pomme est plus difficilement fermentescible que le jus de raisin, à cause notamment de sa faible teneur en substances azotées. Ainsi, les fermentations classiques pratiquées à faible température, et souvent sans levurage, sont très longues. Le volume de cuveries immobilisé est donc très important. De plus, le cidre commercialisé n'est souvent qu'un assemblage de divers produits : cidre sec fermenté complètement, cidre à demi-fermenté, moût frais, moût reconstitué, etc... Même s'il existe des cuves closes, dans la plupart des cas, le cidre est gazéfié artificiellement avec du gaz carbonique avant embouteillage. Les études portant sur les fermentations sous pression ont montré les difficultés de ce type de réaction. Ainsi, KUNKEE et OUGH (Applied Microbiology, Vol. 14, nO 4, 1966) ont signalé la difficulté d'assurer une multiplication correcte des levures lorsque la fermentation est déclenchée sous pression. Des auteurs russes font état de la possibilité de réaliser des fermentations alcooliques sous pression en continu, soit en ajoutant continuellement des levures (BROUSSILOVSKY, Bulletin O.I.V., 384, 1963), soit en utilisant des dépôts de levures retenus dans des tuyères au niveau desquelles s'effectue la prise de mousse (SARICHVILI, Bulletin de l'OIV, 609,1981). Des oenologues ont fait état de la possibilité de réaliser des boissons à faible degré alcoolique en utilisant successivement la consommation des sucres par une levure aérobie puis la fermentation alcoolique en utilisant des levures libres. Dans aucun de ces procédés, l'activité des microorganismes n'est bien contrôlée. Le procédé selon la présente invention a pour but de résoudre les difficultés mentionnées précédemment. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de fermentation réalisée sous une pression de gaz carbonique (C02). Cette pression de C02 est comprise entre 0,1 et 7 bar. Elle sera, par exemple, de l'ordre de 5,5 bar pour-l'obtention de vins mousseux, et de l'ordre de 0,5 bar pour l'élaboration de boissons peu alcoolisées. Elle sera de préférence selon la présente invention, supérieure à 1 bar, et ce, notamment pour l'obtention de cidre. Cette étape de fermentation peut entre réalisée selon un mode de fonctionnement discontinu, notamment pour l'élaboration de boissons mousseuses en bouteilles obtenues selon la méthode champenoise (cidre mousseux, mélanges de vins, de jus de fruits). Dans ce cas, la pression en C02 lors de l'étape de fermentation est déterminée par l'intermédiaire de la quantité de sucre ou matière sucrée ajoutée au jus avant la fermentation. L'étape de fermentation est, de préférence, réalisée selon un mode de fonctionnement en continu. Un tel procédé de fermentation en continu présente de très nom bref'c avantages. Ainsi, par exemple, les cidriers ont, depuis peu, l'autorisation de mettre à fermenter des jus concentrés reconstitués alors qu'auparavant, seuls les moûts "entiers" pouvaient subir une fermentation. Un procédé de fermentation en continu doit permettre à llindus- trie du cidre de répartir sa production et son activité sur toute l'année. Et le procédé selon l'invention va permettre non seulement de régler rapidement le taux d'éthanol et la quantité de sucres souhaités mais aussi d'obtenir un cidre directement pétillant. La pression de C02 est de préférence selon la présente invention, déterminée par une fermentation réalisée dans une cuve parfaitement close ou réacteur de fermentation Ce réacteur est, de préférence, réalisé dans un matériau inoxydable. On peut utiliser des réacteurs de formes variables, mais, de préférence selon la présente invention, on utilisera des réacteurs de taille réduite. En effet, une taille réduite autorise un contrôle précis de la température. En outre, les réacteurs selon la présente invention seront munis d'un dispositif d'agitation. Ce dispositif d'agitation permettra de charger très fortement les réacteurs en biomasse et de réduire ainsi considérablement les temps de séjour de la biomasse. Ce dispositif d'agitation a également pour avantage d'éliminer la mousse qui se forme lors de la fermentation dans la partie supérieure du réacteur. Le polymère constitutif de la matrice immobilisant les microorganismes peut être choisi parmi tous les polymèresconnus dans ce domaine par l'homme de l'art. Il s'agira, de préférence, d'un alginate. Quant aux microorganismes de fermentation, ils peuvent être choisis parmi les diverses souches de levures connues dans les techniques de fermentation. Selon la présente invention, on choisit de pré férence une levure telle que Saccharomyces Cerevisiae. Par ailleurs, le procédé selon l'invention peut comporter diverses étapes, et notamment, une étape de réduc tion de la teneur en sucre à l'aide de levure non fermentaire, telle que Rhodotorula Glutinis. De même, on peut utiliser pour améliorer les pro priétés organoleptiques des produits fermentés, diverses levures aromatisantes et aérobies telles que les levures du genre Sporobolomyces. Dans tous les cas, les combinaisons levures aérobie, levures aérobie aromatisantes, levures fermentaires dans des réacteurs séparés permettent d'obtenir une boisson fermentée au degré de sucre et d'éthanol voulu. Pour la mise en oeuvre de la réalisation en continu de ce procédé, la présente invention concerne un appareillage comportant une cuve close munie d'un dispositif d'agitation. Cet appareillage comporte aussi un dispositif permettant l'alimentation en continu du réacteur en un milieu liquide comportant toutes les substances de croissance nécessaires à la survie des microorganismes utilisés. Il comporte aussi un dispositif permettant le soutirage en continu des produits fermentés. La présente invention concerne, enfin, l'application du procédé décrit ci-dessus pour diverses préparations de boissons alcoolisées comprenant, notamment1 la fermentation de jus de fruits ou de mélanges de jus de fruits ainsi que la refermentation de vins ou de bière, c'est-à-dire la seconde fermentation de boissons déjà fermentées. De préférence, la présente invention concerne l'application dudit procédé pour la préparation de cidre La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants et illustrée par les figures qui représentent - Pour la figure 1, le schéma d'un appareillage permettant la réalisation du procédé de l'invention. Cet appareillage comporte un réacteur en inox 7 muni d'un dispositif d'agitation comportant une pâle d'agitation 2 et un agitateur magnétique 3.Un manomètre 4 permet de mesurer la pression à l'intérieur du réacteur et une soupape réglable 5 permet de .modifier ladite pression. Le milieu d'alimentation est pompé à partir d'une réserve 6 par l'intermédiaire d'une pompe d'alimentation 7 puis injecté dans le réacteur où se trouvent des particules d'alginate 8 renfermant les microorganismes de fermenta tion. Les produits fermentés sont soutirés par l'inter médiaire d'une pompe de soutirage 9 puis injectés dans un récipient de réserve en produits fermentés 10. Les réserves en milieu d'alimentation 6 et en produits fer mentés 10 sont placés dans une enceinte réfrigérée à 40C 11. - Pour la figure 2, le spectre des jus de raisin obtenu selon le procédé de l'invention. Sur cette figure reprdsente le spectre du jus sortant du réacteur à R. glutinis, représente représente du jus de raisin pur; o représente du jus sortant du réacteur à S. Cerevisiae. - Pour la figure 3, une courbe établissant la relation entre la pression et l'adjonction de jus de pomme (* *) ou de saccharose (. ). On peut noter que les résultats de chaque expérimentation peuvent être très certainement améliorés en optimisant, dans chaque cas, les conditions d'oxydation et de fermentation. EXEMPLE 1 Fermentat~on~du~ius~de~pomme La souche utilisée est une Saccharomyces Cerevisiae isolée dans une fermentation alcoolique et déposée au laboratoire de Microbiologie de l'ENSBANA sous le nO M1. Le milieu de culture de la levure est un Malt Wickeram à 10 grammes de glucose par litre-. Après 16 heures de culture, les levures sont centrifugées et remises en suspension dans une solution aqueuse. Celle-ci est mélangée ensuite à une solution aqueuse d'alginate de sodium à 18,75 % de marque "CECA SG 1000". Le mélange est ensuite pompé et goutté dans une solution de Chlorure de Calcium (55 g/l pH = 7). Après 50 minutes de contact, les particules, durcies, sont rincées à l'eau distillée. Elles contiennent alors 2 x 109 cellules par ml. 200 ml de particules sont alors immergées dans un réacteur dont le volume total est 454 ml (volume liquide + volume particules) et dont le schéma est représenté en figure 1. Le montage a été simplifié pour les besoins de l'étude. D'autres modes de conduite des levures immobilisées sont plus performants : succession de réacteurs à pressions différentes, ou réacteurs hétérogènes. La température est de 2O0C. Le milieu d'alimentation est un jus de pomme concentré fournit par la S.A. La Fermière 35480 MESSAC. Après dilution dans l'eau distillée, on obtient un jus dont les principales caractéristiques sont les suivantes - sucres totaux : 100 g/l - Azote total : 76 mg/l - pH . 4,07 Le jus est enrichi en phosphate diammonique à raison de 100 mg/l. A l'aide d'une soupape réglable, on peut modifier la pression dans le réacteur. Les résultats obtenus, après stabilisation des activités, pour un débit de 160 ml/h, soit un temps de séjour de 2 h 50 min calculé sur le volume de 454 ml, sont présentés dans le tableau 1 suivant. TABLEAU 1 ( . bar Alcool ) Pression bar Alcool GL : Sucres g/l Relargage#/ml 0,2 . 4,6 14,c 3,5 107 2,0 4,7 : 15,0 2,1 107 ( 3,5 : 4,8 16,2 6,0 106 5,5 4,7 19,4 3,0 106 * OGL correspond au degré aicoométrique de Gay-Lussac.Une solution est n GL quand elle renferme n cm d'alcool pur pour un volume total de 100 cm3 à la température de + 15 C. Effet de l'augmentation de la pression dans le réacteur Ainsi, jusqu'à 5,5 bars, l'activité globale du réacteur n'est pas dépendante de la pression. Par contre, l'augmentation de celle-ci induit une amélioration du rendement de fermentation et une diminution du nombre de levures relarguées. Dans tous les cas, les levures relarguées peuvent être facilement éliminées par filtration isobarométrique. Le récipient contenant le cidre peut alors être bouché et pasteurisé selon les barèmes classiques pour obtenir sa stabilisation. On a montré que ce même réacteur peut produire un cidre brut de 30 d'alcool et de 48 g de sucres en 1 h 30 min et un cidre doux à 20 d'alcool et 66 g de sucres en O h 43 min. De plus, bien que de nombreux gels puissent être utilisés (Agar, Pectate, Carraghenane, Plastiques divers, dérivés de Chitine...) l'alginate présente des caractères de.fonctionnement intéressants et parait bien adapté au fonctionnement sous pression. En effet, le fonctionnement sous pression induit un gonflement moindre des particules et leur conserve une dureté meilleure, comme on peut le voir dans le tableau 2 suivant. TABLEAU 2 : Re'z^tezr ayant fonctionné : Rédacteur azurant fonctionné à : sous pression (5,5 bars) : la pression atnosEhérique Dureté en g : 43,5 : 18,5 Taux de gonflement . 110 145 Influence de la pression sur la tenue des particules Dureté : Mesurée au pénétromètre "Stevens LFRA Texture Analyser" et exprimée par la force mesurée en gramme. Taux de gonflement : Exprimé par le rapport Volume final x 100 Volume initial Cette expériméntation a eu lieu dans les conditions précédemment citées. EXEMPLE 2 Prise de mousse Les levures ainsi préparées peuvent être aussi utilisées pour obtenir du cidre bouché selon la méthode champenoise, en reprenant le procédé déjà revendiqué pour les vins mousseux dans le brevet FR 2 432 045. Un cidre sec est enrichi à 25 g de sucre par litre et 200 mg de phosphate diammonique par litre. Le mélange est placé dans une bouteille de 750 ml dans laquelle on a introduit 4 ml de particules préparées selon le protocole précité. La prise de mousse a lieu en 30 jours environ. Après prise de mousse et évacuation des particules, le produit peut être resucré avec une liqueur d'expédition. C'est l'adjonction de sucre qui permet de déterminer la pression de C02. Des courbes ont été établies dans ce sens (figure 3). EXEMPLE 3 Fermentation du~ius~de ra~sin Le mode opératoire est le même que celui décrit dans l'exemple 1. L'alimentation se fait avec un jus de raisin contenant 149 g de sucres par litre. Avec un temps de séjour de 1 h 24 min, on obtient un "pétillant de raisin" à 2,9 d'alcool et 100 g de sucres, à 5,5 bars de pression. Le relargage cellulaire est alors de 3,5.106 Q/~.1. EXEMPLE 4 Fermentatlon du jus d'ananas Le mode opératoire est identique à celui de l'exemple 1. L'alimentation se fait avec un jus d'ananas contenant 125 g de sucres par litre. Avec un temps de séjour de 4 heures, on obtient un "pétillant "contenant 4,560 d'alcool, 30 g de sucres à 6 bars de pression. Le relargage cellulaire est de 1,6.105 /mol. EXEMPLE 5 : Fermentation de melanqes de ius de fruits (anana~~iu~~ de raisin) L'alimentation se fait en mélangeant 20 % de jus de raisin et 80 % de jus d'ananas soit 129 g de sucre. Avec un temps de séjour de 4 heures, on obtient un pétillant d'ananas contenant 50 d'éthanol à 5 bars de pression avec un relargage cellulaire de 2,4.105 /mol. EXEMPLE 6 Prise de mousse Le "vin" d'ananas sec est enrichi à 25 g de sucre par litre et 200 mg de phosphate biammonique par litre. Le mélange est placé dans une bouteille de 750 ml dans laquelle on introduit 4 ml de particules préparés selon le protocole précédent. La prise de mousse a lieu en 12 jours environ à la température de 140C. EXEMPLE 7 Fermentation du mou t de bière Le moult mis à fermenter (forrni par la Société Européenne de Brasserie est à 12,50 Plateau et 80 % des sucres sont fermentescibles. 150 ml de particules chargées à 3,5.1ou /ml d'une souche de Saccharomyces Carlsbergensis sont immergées dans un réacteur dont le volume total est 350 ml. Avec un débit d'alimentation de 40 ml/h, donc un temps de séjour de 8 h45 mn, une pression de 2,5 bars et une température de 150C, on obtient une bière à 5,20 GL contenant 3 x 106 Cellules par ml. D'autre pat des essais de refermentation de bière ont été effectués. En alimentant le réacteur précédent avec une bière du commerce enrichie en sucre (14 g/l), on obtient un produit refermenté plus riche en alcool et dont les qualités organoleptiques sont améliorées ( on a en outre observé une diminution du taux de diacétyl qui passe de 0,43 mg/l à 0,20 mg/l). EXEMPLE 8 Elaboration de vin mousseux La souche utilisée est une Saccharomyces Bayanus déposée au laboratoire sous le nO M5. Le réacteur a un volume total de 350 ml. On y place 165 ml de particules chargées à 1,5 x 109 ce les par ml. La température est de 170C. Le milieu d'alimentation est un vin blanc d commerce, de marque "MAUCHAMP" à 110 GL. Nous avons effectué une première expérimentation avec ce vin désalcoolisé par évaporation sous vide à 400C jusqu'à obtention d'un degré d'alcool égal à 7,5. Dans les deux cas, le vin de base est sucré à raison de 28 g et enrichi de 200 mg/l de phosphate diammonique. Le tableau 3 présente les résultats obtenus avec les dieux types de vin de base, à la pression de 5,5 bars. TABLEAU 3 .Temps de de Durée de i'eppé- Teneur en ; sucres . Relar : séjour :rimentation : alcool du : résiduels: gage . vin refermenté Vin de baste à 7,5 GL 3h18 min 136 h 8,80 GL * Vin de base: 4h42 niin 234 h 12,30 GL 5,6g/i 3 105 #/ml à 110 GL *Degré Gay-Lussac Il n'a pas été observé de baisse d'activité du du réacteur, pendant les 234 heures de fonctionnement 5,5 bars de pression et 12,30 d'alcool dans le milieu, ce qui montre l'efficacité du procédé. EXEMPLE 9 : Elaboration de boissons faiblement alcoolisées. Au lieu de réaliser une fermentation normale, on a procédé en deux étapes. La première consiste à réduire le taux de sucre dans le jus de fruit par une levure non fermentaire puis à partir de ce jus sucré, d'effectuer une fermentation par la levure fermentaire afin d'obtenir un faible degré alcoolique. Ainsi, on peut garder les caractéristiques aromatiques proches de celles d'une boisson fermentée. Première étape La levure non fermentaire utilisée dans l'exemple choisi est une souche de Rhodotorula glutinis déposée au labora toire de Microbiologie sous le numéro RG1, les conditions de culture et de préparation des particules sont identiques à celles réalisées par Saccharomyces cerevisiae. La consommation du sucre a été obtenue en continu dans une colonne de diamètre = 7 cm avec un verre fritté de porosité 3. De l'air forcé à travers cette plaque permet de fournir l'oxygène nécessaire et d'homogénéiser le réacteur d'autant plus que la base de ces colonnes crée un courant de convection. La réaction est réalisée dans un volume total de 200 ml, on y place 80 ml de particules chargées à 1,4.10 u cellules/ml. La température est de 200C. Le milieu d'alimentation est du jus de raisin rouge à 160 g/l de sucre, 45 mg/l d'azote ammoniacal et ï = 3,35. Après stabilisation des activités et en fonction au temps de séjour, on a obtenu Jus de raisin de Temps de séjour Teneur en Ethanol Pocula- base sucre en Alcool tion de sortie levures libres 1) Sucre entré : 160 g/l 4 h 30 îoe g/l 0 8 2) Deuxième passage * Sucre entré : 100 g/l 4 h 30 50 g/i O 75.107 3) Sucre entré : 160 g/l 2 h 130 g/l 0 6.10' 4) Sucre entré : 160 g/l 4 h 30 76 g/l 0 4,3.108 (Air enrichi avec 65 % dlo2) * il est préférable d'éviter la prolifération trop abon dante de Rhodotorula glutinis sous forme libre dans ce cas, les cellules libres-pénalisent le :cflctionnement des cellules immobilisées qui ne sont plus approvisionnées en oxygène et qui deviennent rapidement non fonctionnelles, c'est pourquoi pour un deuxième passage, il est recommandé de pratiquer au préalable l'élimination des cellules libres issues du premier traitement. Des consommations de sucre analogues ont été obtenues sur le jus de pomme utilisé dans l'exemple nO 1. On a vérifié des performances identiques pour une levure aérobie du gens Sporobolomyces qui est très aromatisante et qui n'accumule pas d'éthanol. Deuxième étape Les jus partiellement dé sucrés à la dose de sucre voulue sont ensuite s fermentés selon les techniques préconisées ici et à l'aide de S. cerevisiae incluse. A titre d'exemple, on donne les résultats obtenus dans deux titres de réacteurs différents gype parfaitement agité et type "lit fluidisé"). Réacteur 1 (homogène) Réacteur 2 ("lit fluides") - volume total 350 ml 450 ml - volume des particules 110 ml 15 1 débit du jus 230 ml/h ~~ i/h - Nb # viables par 9 ml de particules 2,2.10 1,5.10 - Nb {# viables par ml de liquide effluent 6.10 7.10 - Concentration en sucre du jus de raisin à l'entrée 93 66 - Concentration en sucre du jus de raisin sortant du réacteur 45 3 alcool produit 30 40 On peut constater que la teinte du jus final fermenté par S. cerevisiae retrouve alors une teinte proche du jus de raisin initial. La figure nO 2 représente le spectre des jus de raisin obtenu selon ce procédé. il est possible en augmentant le débit d'alimentation de n'obtenir la fermentation que de quelques grammes de sucres pour aboutir à l'obtention de boissons très faiblement alcoolisées inférieures à 10dcooi. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour la préparation de boissons fermentées contenant initialement les substances de croissance nécessaires à la survie des levures utilisées. il est possible de réaliser la fermentation d'une eau sucrée contenant les substances nécessaires au maintien de la biomasse. On peut aussi étendre le champ d'application au procédé à la fermentation d'un mélange de jus de fruits ou d'un mélange d'unrin sec et d'un jus de fruits ou d'une décoction de fruits. Dans tous les cas, les combinaisons levures aérobie, levures aérobie aromatisante, levure fermentaire dans des réacteurs séparés permettent d'obtenir une boisson fermentée au degré de sucre et d'éthanol voulu. La technologie proposée permet donc de s'affranchir des procédés de désalcoolisation utilisant les techniques à membrane sélective et de distillations (utilisant le C02 supercritigue , vide, température) en maintenant ou en produisant de bonnes caractéristiques aromatiques. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la mise en oeuvre de rdactions enzymatiques utilisant des microorganismes inclus dans une matrice de polymère, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de fermentation de jus sucré réalisée sous une pression de gaz carbonique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé cen ce que la pression de C02 varie de 0,1 à 7 bars. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la pression de C02 est supérieure à 1. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de fermentation sous pression est réalisée en continu. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la pression de CO2 est déterminée par une fermentation réalisée dans une cuve close. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de fermentation sous pression est réalisée en discontinu. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisa en ce que la pression de gaz carbonique est déterminée par l'intermédiaire de l'adjonction de sucre ou matière sucrée. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le polymère constitutif de la matrice est un alginate. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure. 10. Procédé selon la revendication 9, car ztérisd en ce que la levure est Saccharomyces Cerevisiae. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendi cations 1 à 10, caractérisé en ce que l'étape de fermen tation réalisée sous pression de C02 est précédée d'une étape de réduction de la teneur en sucre. 12. Procédé selon la revendication 11, caracté risé en ce que l'étape de réduction de la teneur en sucre est réalisée grâce à une levure non fermentaire. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la levure non fermentaire est Rhodotorula Glutinis. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une ou plusieurs étapes mettant en oeuvre des microorganis mes choisis parmi les levures aérobie, les levures aérobie aromatisantes , les levures fermentaires. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les microorganismes choisis sont des levures du genre sporobolomyces. 16. Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé dé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte une cuve close munie d'un dis positif d'agitation. 17. Appareillage selon la revendication 16, car2-- térisé en ce qu'il comporte des dispositifs permettant l'alimentation en continu en milieu de culture des microorganismes et le soutirage en continu des produits fermentés. 18. Application du procédé selon les revendications 1 à 15 pour la préparation de cidre. 19. Application du procédé selon les revendications 1 à 15 pour la fermentation de jus de fruits ou de mélanges de jus de faits. 20. Application du procédé selon les rezenaications 1 à 10 pour la refermentation de vin et/ou de bière.