Brevet FR2605411A1 — publié le 19880422

La protéine C (PC) a été isolée du plasma bovin par Stenflo en 1976 et du plasma humain par Kisiel en 1979. Elle est synthétisée par le foie et sa synthèse est vitami- ne K dépendante. La PC fait partie des protéines du complexe prothrombinique et sa fonction consiste à inhiber la coagu- lation du sang en inactivant par voie proteolytique les fac- teurs VIII C et V, En effet, sa carence congénitale grave provoque la mort par thromboses veineuses récidivantes et embolie pulmonaire (Friffin et Al., 1981). Tout comme les autres enzymes de la coagulation, la PC est normalement présente dans le plasma sous forme de zymogènes et est convertie en sa forme active par la throm- bine en présence du cofacteur protétique endothélial, la thromboduline, en présence d'ions Ca++. La détermination de l'activité biologique de la PC présente un grand intérêt dans la mesure o sa carence, plus ou moins grave, constitue un facteur de risque de thrombose. La possibilité de réaliser ce test de laboratoi- re ensemble avec ceux d'autres indices bio-humoraux permet- trait d'identifier avec plus de précision les sujets pré- disposés à un accident thrombotique. On a déjà proposé trois méthodes pour la détermi- nation de l'activité biologique des PC qui, fondamentale- ment, reposent sur les principes décrits ci-après. 1) Selon une première méthode (Francis R.B.Jr. and Patch M.J.: Thromb. Res. 32; 605-613, 1983), la PC est partiel- lement séparée du plasma moyennant adsorption avec citrate de baryum; le complexe prothratbinique est ensuite élue avec un tampon MES-citrate à pH 6 et la PC est activée en ajoutant à l'éluant la thrombine, qu'on fait agir pendant une heure à 37 C. Etant donné que l'activité biologique de la PC activée (PCa) est mesurée en évaluant l'allongement qu'elle induit sur le temps de thromboplastine partielle d'un plasma servant de substrat, il est nécessaire de neu- traliser complètement la thrombine résiduelle de la réac- tion d'activation de la PC. Cette neutralisation est réalisée en ajoutant de l'antithrombine III, de l'héparine et du sulfate de prota- mine au mélange de réaction, L'utilisation simultanée en solution de quatre substances d'origine extractive et mu- nies d'activité biologique (Thrombine, Antithrombine III, Héparine, Sulfate de Protamine) rend difficile l'emploi de cette méthode dans la pratique quotidienne de laboratoire. 2) Selon une autre méthode déjà proposée (Comp P.C,, Nixon R.R, and Esmon C.T,; Blood, 63; 15-21, 1984), la PC est activée directement dans le plasma recalcifié par un complexe équimoléculaire de thrombine et de thromboduli- ne. La PC activée (PCa) est ensuite séparée du mélange d'activation moyennant immunoadsorption avec un gel consti- tué par des microsphères d'agarose revêtues d'un anticorps anti-PC humaine. Enfin, étant donné que même liée au gel la PC conserve son activité amidolitique sur le substrat chromogénique S-2238 (Kabi Diagnostica, Suède), la mesure calorimétrique est possible. Ce test, étant donné l'actuel- le difficulté d'identification de la thromboduline, ne peut être effectué que par des laboratoires spécialisés dans l'étude de la maladie thrombotique, 3) Selon une troisième méthode connue (XARTINOLI J.L., STOCKER K.: THROMBOSIS RESEARCH, 43; 253-254, 1986), la PC est activée directement en utilisant le vénin d'un rep- tile de l'espèce Agkistodon Contortrix et l'activité bio- logique de la PC est mesurée sur un plasma servant de sub- strat dépourvu de PC au moyen d'un test coagulomnétrique ou d'un test colorimétrique sur le substrat artificiel chro- mogénique BCP 300, Ce test exige, pour être réalisé, de pouvoir disposer de plasma servant de substrat dépourvu de PC et cela augmente considérablement les coûts de production. La présente invention a pour but de proposer un procédé de détermination de l'activité biologique de la PC qui puisse être appliqué avec des coûts acceptables et avec des techniques pas trop complexes dans des laboratoi- res d'analyses courants et qui possède des caractéristi- ques de haute précision et une bonne capacité de répétition. A cette fin, selon l'invention, le procédé de détermination de l'activité biologique de la protéine C dans le plasma humain comprend les phases suivantes: adsorption de la PC présente dans le plasma sur un ma- tériau à haute affinité pour les Drotéines du complexe pro- thrombinique, liaison covalente d'un agent activateur de la PC et d'un support comprenant des microsphères, mise en contact de la PC avec l'agent activateur sur le support pour l'activation de la PC, séparation de la PC activée de l'agent activateur sur support, réalisation sur la PC activée et ainsi séparée d'un test d'activité biologique, Selon cette méthode de détermination conformé- ment à l'invention, le support pour l'activateur est cons- titué avantageusement par des microsphères de dextrans po- lymérisés (Ex.: Sepharose TM de la Pharmacia Fine Chemi- cals, Uppsala, Suède; Affi-Gel TM de la Bio-Rad Richmond, California USA; Ultrogel et Magnogel T!M de la IBF-LKB, France) et l'activité biologique de la PC elle-même est ensuite mesurée moyennant un test coagulométrique sur un plasma servant de substrat constitué par un pool de plas- mas normaux ou au moyen d'un test colorimétrique en utili- sant un substrat chromogénique non nécessairement spécifi- que pour la PCa. Selon le nouveau procédé, la PC est partielle- ment séparée des autres protéines du plasma par adsorption sur des matériaux à haute affinité pour les protéines du complexe prothrombinique (telles les résines échangeuses d'anions ou le citrate de baryum ou encore le gel hydroxyde d'aluminium). Le choix entre les divers moyens de sépara- tion peut être effectué en tenant compte des exigences par- ticulières de l'expérimentateur (équipements de laboratoi- re, temps d'exécution, nombre d'échantillons à examiner, etc,)* La séparation partielle de la PC est rendue né- cessaire par la présence dans le plasma de l'inhibiteur physiologique de la PCa, Selon le procédé objet de la présente invention, la réaction d'activation de la PC est effectuée avec un système hétérogène dans lequel l'activateur de la PC est véhiculé par des microsphères. Cela permet, une fois ter- minée la réaction d'activation, d'éloigner l'activateur de la PCa sans avoir recours à des réactions de neutrali- sation de l'activateur lui-même et en obtenant une meilleu- re capacité de répétition du test par rapport, par exemple, à la méthode connue rappelée ci-dessus dans le point 1, On peut ainsi obtenir facilement des coefficients de variation inférieurs à 7 %; cette nouvelle méthode peut donc être proposée pour l'application en grande série, Les activateurs ont été liés au Sepharose CL 48 en suivant les indications du fabricant (Pharmacia Fine Chemical, Uppsala, Suede); on a obtenu ainsi la formation d'une liaison covalente entre activateur et microsphères; cette liaison est suffisamment stable pour que le réactif qu'on obtient puisse être conservé à 4 C pendant au moins 24 mois sans qu'il perde son activité biologique. Activa- teui utilisés: thrombine humaine, thrombine bovine et une fraction obtenue par la purification du venin de Agkisto- don Contortrix. L'activation avec la thrombine, aussi bien humai- ne que bovine, a été réalisée en mettant en contact un éluant de complexe prothrombinique avec une suspension de microsphères -thrombine dans un tampon d'activation, cons- titué par Tris 0fO5M à pH 8 contenant NaCl 0l15M et albu- mine bovine lg/L, à 37 C pendant 60 minutes, Les résultats qu'on obtient avec les deux thrombines différentes sont pratiquement superposables. Le vénin de Agkistodon Contortrix est un mélange complexe de protéines ayant différentes activités biologi- ques; des techniques électrophorétiques analytiques à haute précision (iso-électrofocalisation avec un large in- tervalle de pH) ont mis en évidence au moins 25 bandes, dont la plupart correspondent à des protéines différentes. On a identifié trois activités biologiques du vénin: une activité fibrinogénolitique, qui sépare le fibrinopeptide B, une activité amidolitique thrombino similaire sur le substrat S-2238 (ou analogues) différente de la précéden- te et une activité relative à l'activation in vitro de la PC humaine. En liant la fraction de vénin correspondant à cette dernière activité à des microsphères de Sepharose -CL-4B (TM), on a pu activer la PC humaine, contenue dans un éluat de complexe pro-thrombinique, en 5 minutes à 37 C ou à la température ambiante. Ce dernier type de réaction d'activation offre, par rapport aux méthodes 2 et 3 déjà connues, les avanta- ges suivants; a) la vitesse de la réaction d'activation est pratique- ment superposable à celle qu'on obtient avec le complexe thrombine-thromboduline; on s'est ainsi libéré de la dif- ficile identification de la thromboduline; b) lors de la réaction coagulométrique de mesure de la PCa, le plasma dépourvu de PC n'est plus nécessaire comme plasma servant de substrat, puisque la PC est partiellement purifiée avant d'être activée et que l'activateur utilisé est fixé à un véhicule. La réaction de mesure de la PCa peut être réali- sée, comme déjà indiqué ci-dessus, de deux manières diffé- rentes: test coagulométrique et test colorimétrique, Dans le test coagulométrique, on évalue l'activi- té inhibitrice que la PCa de l'échantillon exerce sur le temps de thromboplastine partielle activée (aPTT) d'un pool de plasmas normaux. En bref, 0,05 ml du pool de plasmas sont mis à incuber pendant 3' à 37 C avec 0,1 ml de réactif à PTT (céphaline + activateur facteur XII) et avec 0,05 ml de la solution contenant la PCa; à la fin de cette incuba- tion, le mélange est recalcifié avec 0,1 ml de CaCl 0,025M et le temps de formation du coagulum est enregistré. L'allongement obtenu sur le PTT est en rapport avec la quantité de PCa présente dans l'échantillon, comme le montre la Figure 1 ci-jointe dans laquelle on peut voir l'allure d'une courbe dose-réponse obtenue en mélangeant entre eux un pool de plasmas normaux et un plasma dépourvu de PC, La courbe est linéaire, déterminée par les paires de valeurs expérimentales suivantes: A % aPTT (sec) 117 50 74 53 12,5 40 0 31 Dans le test colorimétrique, l'activité amidoli- tique-de la PCa est évaluée sur un substrat chromogénique (par exemple S2366, Kabi, Suede, ou autres, spécifiques ou non spécifiques) en réalisant la réaction avec un tam- pon Tris 0,15M à pH 8 contenant NaCl 0,15M et PEG 6000 à 1 %, la concentration du substrat étant de 2mM, Cette ré- action peut être suivie en cinétique à 405 nm ou bien peut être évaluée à la fin en arrêtant la réaction avec de l'a- cide acétique 50 % après un laps de temps convenable, Dans ce cas également, on peut mettre en rapport- l'activité amidolitique et la quantité de PC dans l'échan- tillon, comme le montre la Figure 2 o l'on voit une corré- lation linéaire déterminée par les paires de valeurs expé- rimentales suivantes: A% D,0 100 0f977 0,572 0,348 12,5 0,240 0 0,147 Le procédé selon l'invention permet d'adopter des techniques différentes pour mettre en contact la PC avec l'agent activateur sur support en forme de micro- sphères; leur facilité de séparation atténue la contrainte du choix de la technique. Cependant, il peut être avanta- geux de réaliser le contact entre la PC et les microsphères qui véhiculent l'activateur en réalisant des colonnes o sont contenues les microsphères et qui sont traversées par la PC éluée; la hauteur des colonnes déterminera le temps de traversée de l'éluant et donc le temps de contact entre la PC et l'activateur véhiculé. On évite de cette façon mê- me la plus simple séparation des microsphères et de la PC, EXEMPLE L'exemple décrit ci-après, comme exemple d'appli- cation pratique de la méthode constituant l'objet de la présente invention, se fonde sur l'adsorption de la PC avec de l'hydroxyde d'aluminium et l'évaluation de l'acti- vité de la PCa aussi bien par le test coagulométrique que par le test colorimétrique. A I ml de plasma on a ajouté 100 microl de gel d'hydroxyde d'aluminium, La suspension a été agitée pen- dant 10' à la température ambiante et elle a été ensuite centrifugée pendant 10' à 3,500 tr/min, Les protéines du complexe prothrombinique ont été éluées du gel avec 100 microl d'une solution de Phosphate de sodium 0, 2M à pH 8 l'éluat a été enfin dilué 1+11 avec NaCL 0O15M, 100 microl d'éluat dilué ont été mis en incuba- tion pendant 5' à 37 C avec 50 microl de sphères acti- vées avec la fraction du vénin de Agkistodon Contortrix et la PCa a été séparée de l'activateur par une brève cen- trifugation (1' è 200 tr/min). Dans le test coagulom5trique de mesure de la PCa, 50 microl d'un pool de plasma sont mis à incuber pendant 3' à 37 C avec 100 microl de réactif à PTT et avec 50 microl de la solution contenant la PCa, à la fin de cette incubation, le mélange est recalcifié avec 100 microl de CaCI2 O,025M et le temps de formation du coagulum est enregistré. Dans le test colorimétrique de mesure de la PCa, 100 microl de la solution de PCa ont été mélangés avec 100 microl de tampon Tris 0,15M à pH 8, NaCl 0,15M 1 % PEG 6.000, contenant S.-2366 2mM. Apres 3', la réac- tion a été arrêtée en ajoutant au mélange 100 microl 0; d'acide acétique à 50 %. La couleur apparue lors de cet- te réaction a été mesurée à 405 nm, contre un témoin constitué par tous les réactifs sauf la PCa. REVENDICATIONS 1. Procédé pour détermination de l'activité biologique de la protéine C dans le plasma humain, carac- térisé par le fait qu'elle comprend les phases suivantes: adsorption de la protéine C présente dans le plasma sur un matériau à haute affinité pour les protéines du complexe prothrombinique, liaison d'un agent activateur de la protéine C avec un support comprenant des microsphères, mise en contact de la protéine C et de l'agent acti- vateur sur le support pour l'activation de la protéine C, séparation de la protéine C activée de l'agent activa- teur sur support. exécution d'un test d'activité biologique sur la pro- téine C ainsi séparée, 2. Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que l'activateur est lié aux microspheres par liaison covalente. 3. Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que lesdits microsphères sont consti- tuées par des microspheres de dextran polymérisé. 4. Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que ledit activateur comprend au moins une fraction du vénin de reptile de l'espèce Agkistodon Contortrix. , Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que le test d'activité biologique effectué sur la protéine C est un test colorimétrique, 6. Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que le test d'activité biologique effec- tué sur la protéine C est un test coagulométrique, 7. Réactif pour l'activation de la protéine C pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend un activateur de la protéine C lié à des microsphères, 8. Réactif selon la revendication 7, caractéri- sé par le fait que l'activateur est lié aux microsphères par liaison covalente. - 9, Réactif selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que lesdites mricrosphères sont constituées par des microsphères de dextran polymerisé. 10. Réactif selon la revendication 1, caractéri- sé par le fait que ledit activateur comprend au moins une fraction du vénin du reptile de l'espèce Agkistodon Con- tortrix.