Brevet FR2603607A1 — publié le 19880311

L'invention concerne une souche microbío- logique particulière et spécifique appartenant au genre Pénicillium et à l'espéce P. Candidum. Elle concerne également l'utilisation de cette souche pour l'affinage de fromage fondu. L'espèce P. Candidum est une moisissure utilisée en fromagerie en tant que flore de surface des produits ou elle confère à ces derniers leur "fleur" blanche et où elle contribue au développement de l'affinage (croüte) et de l'arôme par ses propriétés lipolytiques, protéolytiques et son pouvoir désacidifiant. Par son pouvoir protéolytique elle dégrade les protéines du fromage (caséines) en peptides aromatiques ou mëme en ammoniaque dans le cas de protéolyse trop importante ce qui n'est pas toujours souhaitable. Elle dégrade aussi les lipides en acides gras (composes aromatiques ou non ). L'espèce P. Candidum ou du moins certaines de ses souches sont habituellement employées sur des fromages fabriqués selon des procédés de fromagerie traditionnelle, c'est à dire qu elles sont ensemencées directement sur du caillé après saumurage ou incorporées dans le lait ou la saumure. A cette fin, le fromager emploie des souches commerciales sélectionnées et appropriées à cet usage. Malheureusement, quant la matière première n'est pas un caillé "traditionnel" mais une base fromagère fondue, les souches commerciales habituelles ne sont pas appropriées au développement d'une "fleur" homogène. On entend par "base fromagère fondue" un produit obtenu par la fonte selon un procédé traditionnel de traitement thermique (généralement à une température de 80 à 120C pendant 1 à 5 minutes), de caillé "frais" (traditionnel ou obtenu par un procédé d'ultrafiltration) et/ou de fromages affinés auxquels on a ajouté éventuellement du lait entier ou écrémé sous forme de poudre ou non, des concentrés protéiques laitiers (caséines, séroprotéines) ou non (concentrés de protéines de soja) de la matière grasse laitière ou non, et/ou des sels de fonte. On peut trouver une description de telles bases fromagères fondues notamment dans EP-A-D 133 402. Il est évident que les propriétés physicochimiques (état et structure des protéines, état et structure des lipides, état minéral) des composés de cette base sont totalement différentes des propriétés d'un caillé et que par conséquence le comportement des flores de surface ne sera pas identique. En particulier, les protéines et lipides "d'une base fromagère" sont en partie modifiés (par action conjuguée du traitement thermique et des sels de fonte éventuels et par l'affinage des produits utilisés). Aussi, la pousse des flores du commerce sur un tel milieu n'entraine qu'un résultat médiocre notamment au niveau - de l'accrochage du Pénicillium, - de l'aptitude protéolytique et lipolytique des souches (pouvoir lipolytique et protéolytique souvent trop rapide). En effet, d'une part l'accrochage se fait mal et il se produit des décollements du Pénicillium à la surface des fromages. d'autre part, le pouvoir li polytique et protéolytique importants entraine rapidement sur une matière premiere déjà dégradée des défauts d'arômes par dégradation trop rapide (rancidité, amertune). Aussi, pour remédier à ces problèmes, la Demanderesse a été amené à isoler et à sélectionner une souche originale qui ne présente pas ces inconvénients. La présente invention a ainsi pour objet - une souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477. - une culture de la souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477. - l'utilisation de la souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro 1-477 pour l'affinage de fromages fondus. - un procédé de fabrication d'un fromage fondu affiné ayant l'aspect et les propriétés organoleptiques d'un fromage à pàte molle ou à pàte pressée et à croute moisie, par formation d'un bloc de fromage à partir d'une base fromagere fondue, ensemencement de la surface du bloc de fromage avec une moisissure d'affinage et affinage du fromage ainsi ensemencé, caractérisé en ce que on utilise comme moisissure une souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro 1-477. La souche qui a été isolée à partir de produits fromagers traditionnels appartient à l'espèce P. Candidum mais elle possède des caractéristiques spécifiques qui permettent de la distinguer nettement des autres souches commerciales de P. Candidum. Elle se distingue des autres souches commerciales par ses caractéristiques morphologiques, physico-chimiques et immunologiques (sérologiques) comme l'indique la description ci-après. Dans cette description les souches testées sont celles indiquées dans le tableau 1. Caractéres morphologiques. Ensemencée sur un milieu gélosé au malt et un milieu de Czapek, la souche isolée se distingue par les caractères morphologiques suivants a) Elle possède une vitesse d'étalement beaucoup plus lente que les autres souches; ainsi après 12 jours à 22 C. elle montre un diamètre d'étalement sur un milieu de Czapek de 35 mm, alors que les autres souches ont des diamètres d'étalement d'au moins 45 mm. b) Elle développe un mycélium très ras; après 11 jours d'incubation à 25'C sur un milieu gélosé au malt (pH 5,0 et 2,5% de NaCl) au à 22*C sur un milieu de Czapek, elle a un mycélium dont la hauteur est inférieure à 1,5 mm contre des hauteurs de 3,5 mm à 6,5-7 mm pour les autres souches. Ce caractère visible à l'oeil nu est une caractéristiques essentielle de discrimination, c) Elle présente également une faible densité de mycélium. Bien que ce critère soit visible à l'oeil nu et reconnaissable de l'homme de l'art, cette valeur n'est pas quantifiable. L'homme de l'art estime qu'elle est deux fois moins dense, moins duveteuse, que les souches commerciales considérées comme les moins denses après développement dans des boites de Roux sur milieu gélosé au malt (pH 5,0 et 2,57. de NaCl) après 12 jours à 25-C, d) Elle se différencie après incubation à 22 C sur milieu de Czapek des autres souches par le revers qui est rosé sans sectorisaiton, une autre souche étudiée (n 12) assez proche quant à ce caractère a un revers rosé mais avec sectorisation. De meme à 32-C sur milieu de Czapek son revers blanc le différencie des autres souches. Caractères ohvsico-chimiaues a) Assimilation de l'acide lactique, pouvoir désacidifant. Sur un milieu à base de sérum de fromagerie (pH 4,8 ajusté avec de l'acide lactique) et après incubation de 10 spores/ml pendant 25 jours à 22 C la souche fait partie des souches désacidifantes si l on mesure la diminution de l'acidité du milieu en degré Dornic; ce dernier diminue de -0,12 à -0,15. b) Activités lipolytiques et protéolytiques. Elle possède une activité faible en ces deux critères mais nons significativement discriminante par rapport aux autres souches. c) PH. Le pH optimal de croissance se situe à 4,50 alors que le pH optimal pour les souches commerciales est de 5,0 a 5,50. La mesure-est effectuée sur milieu gélosé au malt (avec 2,57. de NaCl) après incubation de 8 jours à 22-C. Caractères séroloqiaues Une étude plus fine de différentiation de cette souche par rapport aux autres souches a été effectuée sur ses caractères sérologiques a l'aide d anti-corps monoclonaux afin de mettre en évidence des caractères spécifiques à cette souche par comparaison à celles qui lui sont le plus semblables par leurs caractères morphologiques et physico-chimiques et de dresser sa carte antigénique. Dans cette étude les unités antigéniques sont révélées après réaction avec des anticorps monoclonaux par une méthode immunoenzymatique ("Western blot analysis" décrite par Towbin et al, 1979. Natl. Acad. Sci. USA. 76 : 4350, 4354). Les anticorps monoclonaux utilisés sont dirigés contre Microsoorum canis (MAB3, MABS, MAB7, MAB13) ou Candida albicans (MAB1); ils ont été sélectionnés et produits au laboratoire de mycologie du Dr. Polonelli (Polonelli et al., 1985. J. Clin. Microbiol., 21 : 138, 139). Après réaction deux types de profils antigéniques sont retenus - type A obtenu avec MA83 et MAB13, - type B obtenu avec MAB1 et MAB7. Dans l'ensemble la réaction avec les anticorps monoclonaux MAB3, MAB5 et MAB13 n'est pas très spécifique par contre la réaction avec les anticorps MAB1 et MAB7 est plus spécifique ; elle permet l'identification de nombreux déterminants antigéniques et par conséquent une comparaison plus fine entre les souches. Si 6 déterminants sont communs à toutes les souches, certaines souches sont caractérisées par la présence de déterminants supplémentaires spécifiques à chacune d'entre elles et dont les poids moléculaires sont variables. Le tableau II donne les profils antigéniques de chaque souche, les déterminants antigéniques étant classés selon leur poids moléculaires, à savoir Classe Poids moléculaire (Kdalton) 1 16-18 2 19-21 3 27-32 4 44-54 5 58-64 6 66-79 7 81-85 8 88-100 Il apparait clairement que la souche reven diquée se distingue par sa réaction avec MAB13 et MAB7 (les valeurs permettant de les distinguer étant soulignées). On donnera ci-après dans les tableaux III et IV les cartes des déterminants antigéniques obtenus après réaction respectivement avec MAB7 et MAB13. On constate en particulier que la souche selon l'invention (n' 2) se distingue de la souche C2 (n 5) dans sa réaction avec MAB7 par l'absence de deux déterminants antigéniques de poids moléculaire dans la classe 5 (60 et 62 Kdaltons) et dans sa réaction avec MAB13 par un déterminant antigénique supplémentaire dans la classe 7 (82 Kdaltons). L'étude de l'ensemble des caractères morphologiques, physico-chimiques et sérologiques fait apparaitre assez nettement les propriétés spécifiques et l'originalité de la souche I-477. C'est par ses caractères spécifiques et originaux qu'elle se développe harmonieusement sur une "base fromagère fondue" et confère à cette dernière après ensemencement et affinage dans des conditions déterminées un duvet blanc et homogène caractéristique des fromages à pàte molle ou a pàte pressée traditionnels tels que Camembert, Brie ou Tome blanche. Les conditions d'affinage sont des conditions d'affinage classiques avec P. Candidum et comprennent généralement le maintien à une température de 10-15vC et à une hygrométrie d'environ 85 à 98% pendant 6 à 10 jours. L'exemple qui suit donné à titre non limitatif permettra d'illustrer l'utilisation et le rôle de cette souche lors de la fabrication de fromages affinés à partir d'une matière première préparée selon une technologie appliquée traditionnellement en fonte. EXEMPLE On réalise un fromage fondu traditionnel à partir de - caillé gras 60% en poids - crème 18% en poids - caséinate 2% en poids - NaCl 1Z en poids - Citrate de sodium 2X en poids de façon à obtenir un mélange dont l'extrait-sec (ES) et la teneur en matière grasse sont ceux d'une pâte molle riche en graisse, genre Camembert à savoir -matière grasse 70Z - ES 50X On chauffe le mélange à 100 C pendant 1 mn. Le pH est de 5,3. On laisse refroidir jusqu'à 8OC. On coule alors le mélange chaud et fondu dans des moules de format type Camembert, On laisse refroidir pendant 6 à 48 heures afin d'obtenir une texture assez dure du fromage. On répartit les fromages obtenus en 2 lots. On vaporise sur le premier lot (lot témoin A) une souche commerciale de Pénicillium Candidum (souche Neige), et sur le 2ème lot (lot B) la souche decrite dans la présente invention, à raison d'une concentration en spores de 105 a 107 spores/ml. On place les deux lots de fromages dans un haloir dont les conditions d'hygrométrie et de température sont respectivement de 95Z et 14 C. On maintient ces fromages dans ces conditions pendant 8 jours en les soumettant à des soins intensifs de cave (retournement) Après cette période l'on note une différence de qualité du "duvet" sur les faces extérieures du fromage ; dans le lot témoin, l'accrochage s'étant réalisé de façon médiocre l'on observe une pousse très irrégulière avec des plaques totalement vierges de Pénicillium alors que dans le lot B la pousse du Pénicillium s'est faite de façon régulière et la qualité du duvet développé est très homogène (en taille et en densité). En outre, à la dégustation le lot A présente des goûts prononcés de lipolyse et d'amertume que ne présentent pas le lot B ; goûts qui s'accentuent tout au long de la conservation, TABLEAU I Numéros Référence des souches 1 LV2 2 Invention (I-477) 3 SAM2 4 C1 5 C2 6 C3 7 Blanche hermine 8 Velourg blanc 9 Neige 10 Standard export 11 Rapide export 12 P9 13 B5 14 R 15 K5 16 TP 17 PSM 18 MB5 19 MB8 20 Super actif 21 Tradition 22 S11 23 V5 TABLEAU II MAB 5 MAB 3 MAB 13 MAB 7 MAB 1 n classe 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 souche 2 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 2 1 1 5 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 0 2 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 3 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 7 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 4 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 6 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 14 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 2 2 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 8 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 2 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 9 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 10 0 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 0 2 0 2 0 0 1 0 0 2 0 1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 12 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 13 0 0 1 0 0 3 0 1 0 0 1 0 1 2 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 3 0 1 1 1 1 1 1 2 1 1 11 0 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 1 0 4 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 2 0 1 2 0 1 1 0 2 001 TABLEAU III MAB 7 Poids moléculaire kdalton (x 10) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7 x x x x x x 1 x x x x 3 x x x x x x x 4 x x x x x x x 6 x x x x x x x x 9 x x x x x x x 12 x x x x x x x 2 + + + + x x 5 x x x x x x + + + 8 x x x x x x x x x 10 x x x x x x x x x 11 x x x x x x x x x x x 13 x x x x x x x x x 14 x x x x x x x x x TABLEAU IV MAB 13 Poids moléculaire kdalton (x 10) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 x x x 4 x x x 6 x x x 7 x x x 9 x x x 12 x x x 14 x x x 2 + + + + 5 x x x x 1 x x x x 10 x x x x 11 x x 13 x x x x 8 x REVENDICATIONS 1. Souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477. 2. Culture de la souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477. 3. Utilisation de la souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477 pour l'affinage de fromages fondus. 4. Procédé de fabrication d'un fromage fondu affiné ayant l'aspect et les propriétés organoleptiques d'un fromage à p@te molle ou à pate pressée et à croûte moisie, par formation d'un bloc de fromage à partir d'une base fromagère fondue, ensemencement de la surface du bloc de fromage avec une moisissure d affinage et affinage du fromage ainsi ensemencé, caractérisé en ce que on utilise comme moisissure une souche de Pénicillium Candidum déposée à la CNCM sous le numéro I-477.