Brevet FR2599032A1 — publié le 19871127

NOUVEAUX FLUOROPHOSPHATES SIMPLES OU MIXTES D'AMINO-ACIDES, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENT, NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES 15 SYNDROMES DEGENERATIFS DE L'OS La présente invention concerne de nouveaux composés actifs dans tous les syndromes dérivant d'une minéralisation défectueuse du stroma osseux métaphysaire. Le tissu osseux est un type particulier de tissu conjonctif dans lequel la substance minérale, essentiellement l'hydroxyapatite, se dépose sur le stroma morphologiquement constitué par une partie protéique (fibrille collagène) et par des chaines polysacchari25 diques dites glucosaminoglycanes (GAG) ou mucopolysaccharides dont les composants fondamentaux sont des unités disaccharidiques dans lesquelles sont présents des sucres aminés et des acides uroniques, diversement substitués. La triple nature du tissu osseux, c'est-à-dire minéralE, protéique et mucopolysaccharidique fait en sorte que les dysmétabolismes de chacun des trois types de constituants fondamentaux induisent inévitablement des dysfonctions également A la charge des 35 autres, ce qui entraîne l'apparition de maladies ostéo-articulaires. L'ostéoporose, caractérisée par un tissu osseux spongieux et vacuolaire, à résistance générale diminuée et donc présentant une facilité de fracture, est déterminée en tant que phénomène macroscopique par une minéralisation défectueuse de la matrice ostéolde. L'étiologie du phénomène est cependant très souvent assez complexe étant donné qu'elle peut résider aussi bien dans un défaut enzymatique dans le "turnover" des glucosaminoglycanes, que dans une disponibilité déséquilibrée des constituants de la partie minérale, et que dans un déséquilibre des facteurs hormonaux qui régularisent directement ou indirectement le métaboliszxe osseux. Très souvent, tous ces facteurs se trouvent impliqués en même temps par des interactions réciproques et créent en fin de compte un tableau pathologique tres compliqué et difficile à résoudre. Dans ces cas, divers types de traitements sont proposés et utilisés; entre autres l'emploi d'hormo20 nes telles que la calcitonine et la parathormone, de vitamine D liée à des sels de calcium ou encore l'administration seule ou combinée d'éléments qui entrent dans la morphologie de la partie minérale de l'os tels que le fluor, le calcium et le phosphore. Dans aucun cas, les résultats ne se sont montrés complètement satisfaisants étant donné que les agents thérapeutiques employés tendent, très probablement, à rééquilibrer ou à corriger seulement une partie des causes qui sont à la base de l'état pathologique, induisant des effets thérapeutiques qui ne sont pas satisfaisants ou qui sont éphémères. Les composés, objet de la présente invention, offrent une nouvelle et originale composition thérapeutique dans le traitement des états pathologiques décrits 35 ci-dessus. Un des objets de la présente invention est constitué par de nouveaux sels de l'ion monofluorophosphate avec des amino-acides lesdits sels étant des sels simples ou mixtes. Les sels simples répondent à la formule générale AAn FPO3 dans laquelle AA est un amino-acide de la série L;D; ou D,L et n est un entier égal à 1 ou à 2. Les composés répondant à la formule générale mentionnée ci-dessus ne 10 restent stables qu'en l'absence d'humidité; par exposition à l'atmosphère, de tels composés présentent une hygroscopicité élevée et, dans un espace de temps compris entre 10 minutes et quelques heures (en fonction de l'amino-acide utilisé) et de l'humidité relative 15 ambiante, se transforment en pâte ou en huiles visqueuses complètement inutilisables pour un type quelconque de manipulation. I1 a été découvert que la stabilisation desdits composés, sauf le cas de la proline et de l'hydroxy20 proline, dont les produits de cocristallisation avec le fluorophosphate et le chlorure de sodium sont de toute façon hygroscopiques, peut être obtenue au moyen d'un processus de co-cristallisation avec le chlorure de sodium qui permet d'obtenir des composés cristallins, stables dans de larges gammes de température et d'humidité et par conséquent parfaitement utilisables pour un type quelconque d'application pratique, y compris la préparation de formes pharmaceutiques orales et entérales pour usage thérapeutique. Les sels mixtes de la présente invention répondent à la formule générale AAnFPO3.2NaCl dans laquelle AA représente un amino-acide de la série L;D; ou D,L co-cristallisé avec l'ion monofluoro35 phosphate et le chlorure de sodium et n est un nombre - 2599032 entier de valeur 1 ou 2, qui représente le coefficient stoéchiométrique selon lequel l'amino-acide entre dans la composition du réseau cristallin. I1 résulte des essais expérimentaux mentionnés dans la suite de la présente description que l'activité "'in vitro" descomposés selon l'invention dans la stimulation de la synthèse des glucosamino- glycanes aussi bien cellulaire que tissulaire, se révèle particulièrement intéressante dans le rééquilibre d'éventuelles dysfonctions de la partie mucopolysaccharide du stroma osseux, et que leur activité "in vivo", en association avec des sels de calcium, dans le traitement de l'ostéoporose d'immobilisation, démontre leur efficacité dans la régulation et la normalisation 15 de la structure minérale des tissus osseux. Les amino-acides employés dans la préparation des sels simples et mixtes selon la présente invention, sont: l'ALANINE (D;L;D,L), l'ARGININE (L), l'ACIDE ASPARTIQUE (L;D;D,L), 1'ASPARAGINE (L;D;D,L), la CYSTEINE (L;D,L), la CYSTINE (L;D), l'ACIDE GLUTAMIQUE (L;D;D,L), la GLUTAMINE (L;D), la GLYCINE, l'HISTIDINE (L), 1'HYDROXYPROLINE (trans L), la LEUCINE (L;D,L), la - LYSINE (L), la METHIONINE (L;D;D,L), la PHENYLANINE (L;D;D,L), la PROLINE (L;D;D,L), la SERINE (L;D;D,L), 25 la THREONINE (L;D,L), le TRYPTOPHANE (L;D;D,L), la TYROSINE (L;D;D,L) et la VALINE (L;D;D,L). Le procédé général de synthèse des sels mixtes est constituée par-deux étapes, la première étape consistant en la préparation du monofluorophosphate de 30 l'amino-acide choisi, et la seconde étape étant la stabilisation du sel lui-même au moyen de la co-cristallisation avec du chlorure de sodium pour obtenir les composés selon la présente invention. La première étape (salification) consiste essentiellement à mettre en suspension l'amino-acide choisi dans un solvant organique (de préférence polaire) non hydroxylé tel que l'acétone, la méthyléthylcetone, le tétrahydrofurane, l'acétonitrile, en quantités variables représentant entre 5,5 et 7,5 fois (en volume), de préférence 6,5 fois le poids de l'amino-acide à salifier, à refroidir la masse réactionnelle à une température comprise entre 0 et -10 C (de préférence -5 C), à verser ensuite, de préférence, goutte à goutte sous agitation, par exemple 10 dans un espace de temps compris entre 2 et 4 heures (de préférence 3) la quantité stoechiométrique d'acide monofluorophosphorique; à maintenir la masse réactionnelle sous agitation pendant un temps variable se situant par exemple entre 18 et 48 heures (de 15 préférence 24) et à une temperature égale. celle indiquée ci-dessus, puis à filtrer le solide en suspension et enfin sécher le fluorophosphate in obtenu, sous vide, à une température ne dépassant. as C (de préférence 45 C). La seconde étape comprend essenti lemtent les opérations suivantes: dissoudre le sel cimple en présence de chlorure de sodium et reprâcipiter le sel mixte par addition d'un solvent miscible à l'eau. On dissout sous agitation le chlorure de sodium sec dans une quantité d'eau distillée comprise entre 3 et S -ois (de préférence 4) le poids dudit chlorure de sodium, à une température comprise entre 50 et 70 C (de préférence C); on maintient ensuite une température de 35 à 450C (de préférence 40 C), on ajoute toujours sous 30 agitation la quantité stoéchiométrique du fluorophosphate choisi, en maintenant la température constante jusqu'à la dissolution complète; on ramène la température entre 25 et 35 C (de préference 30 C) et on effectue, toujours sous agitation et en maintenant la 35 température constante, la précipitation du sel aimte désiré au moyen de l'addition d'un agent précipitant liquide miscible à l'eau, dans lequel les produits & isoler ont une solubilité qui n'est pas supérieure à 0,1% (P/V). Comme liquide de précipitation, on peut utiliser par exemple l'acétone, la méthyléthylcétone, l'éthanol, l'acétonitrile et le tétrahydrofurane, ajoutés en volume de 8 à 12 fois supérieur (de prLéfrence 10) au volume d'eau distillée utilisée pour la dissolution des selso L'addition du liquide de précipitation est effectué dans l'espace de 5 à 7 heures (de préférence 6), après quoi la suspension de sel mixte désiré est maintenue à nouveau pendant une durée comprise entre 12 et 24 heures (de préférence l8) sous agitation lente et à une tesm= rature comprise entre 25 et 35 C (de préférence 30) de façon & perzettre aussi bien la précipitation complète que le grossissement appr opzî des cristaux. Le tempo nécessaire étant écoulê0 on refroidit la masse réactionnelle à une température comprise entre 0 et l00 20 (de préefrence 5), et on filtre le sel mixte qui est ensuite séché dans une étuve à circulation d'air jusqu'à obtention d'un poids constant. On obtient ainsi des produits cristallins blancs ou blanc crème ayant un point de fusion non définissable, mais en tout cas 25 résistant à des températures supérieures à 200 Co Les caractéristiques analytiques des produits selon l'invention ainsi que les rendements de r-actiqn correspondants, sont résumées dans le tableau A ci- après. Pour les produits les plus intéressants, on 30 décrira dans la suite et en détail les méthodes de synthèse. L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant comme ingrédient actif au moins un nouveau sel d'amino-acide. Des détails sur 35 l'emploi de ces compositions, notamment dans le traitement des syndromes dégénératifs de l'os, sont donnés ci-après dans la partie expérimentale. TABLEAU A - CARACTERISTIQUES ANALYTIQUES DES PRODUITS DE L'INVENTION Rendt % Rendct % Amino- Rapport sel sel Exemple acide AA/MFF Forme pur ou co-crist.t 1 Ci Ri N" Fi F-I Si I Glutamine 2 L 94,6 a87, 45,9 23,58 23, 10 2 Glutamine *'2 D V3,0 05;8 +6, 23,5a 23,7! 3 Alanine 2 L 93,9 83,1 414,2 18,24 18,20 4,36 11,'i 4,41 10,92 4,36 1101 4,34 10,8E 4,qB 7,09 4, 09 7,01 3,76 3,73 3,67 4,el81 4,E5 6,!? 6,12 é,02 7, 84 7,92 - Calc. - Trouvé - talc. - Trouvé - talc. - Trouvé e il Alanine Alanine 2 D 91,7 86,9 -13,4 18,24 16,36 Alanine 2 D, L 94,9 901 18,24 901 19,24 18,4!. Arginine! L 94,5 86,2 itll? 18,42 18,4? Acide 2 L 96,1 91,7 425,7 19,8Y aspartique 19,8 19,68 Acide 2 -D Y3,7 98,2 -21,9 15,89 aspartique. 20,6 Acide ' 2 D1,L 94>2 69,4 - 19,69 aspartique 2n,17 Asparagine 2 L 94,6 86, 1 +18e,6 1997 ,12 2t1) 12 Asparagine 2 D 31 83,2 5,6 1,7 19,60 Asparagine 2 DL 92,8 85,3 - 19,97 2Q,!4 Cystéine 2 L 96,1 85,2 47,2 15,69 ,79 Cystdine 1,1 Cystine 2 D,L 94,2 6B,2 - 15,67 - 15,74 Cystéine 2 L 97;,5 84,7 -210,915,76 ,80 Cystéine 2 D 94,2 B9,2 f223,515, 76 ,52 Acide glut. 2 L ?8,2 B,3 +30,5 -23,4? 23,79 Acide glut. 2 O 96,2 65,8 -29,1 23,47 23,03 Acide glut. 2 D.L î5lq 87i1 - 23,49 4,08 7,0; 4,04- 7,17 4,08 7,07 4,05 7,00 4,12 14,33 4,15 14,19 3,34 5,80 3,36 5,75 3,34 5,90 3,31 5,71 3,34 5,80 3,27 5,92 3,77 11,65 3,82 11,42 3, 77 11,65 3,75 11,73 3,77 11,65 3>74 11,63 3,51 6,10 3,55 6,04 3,51 6,10 3, 60 L,08 3,01 6,13 3,06 6,00 3,01 6,13 3,17 6,0B 3,94 5)4B 4,04 5,43 3,94 5,48 4, 01 5,30 3,94 5,48 4,s1 7,84 4,76 7,78 4,8! 7,64 4,E6 7,88 4,B6 7,92 4,91 7,91 3,93 6,41 3,97 6,5? 3,93 6,41 3,92 6,36 3,93 6,41 3,85 64,5 3, 95 6,^4 3,97 6,57 3,95 6,44 3,91 6,38 3,95 6,44 3,9? 6,51 4,14 6,75 4,05 6,62 4,14 6,75 4,10 6,6B 4,16 6",8 4,2B 7,00 4,16 6,78 4,14 6,65 3,72 6,06 3,59 5,95 3,72 6,06 3,74 '6)15 3,72 6,06 - talc. - Trouvé - talc. - Trouvé - talc. - Trouvé - talc. Trouvé - talc. Trouvé - talc. Trouvé - taClt. Trouvé - Celc. - Trouvé - alct. - Trouvé 13, C1talc. 14-2A Trouvé 13,97 Ctalc. 13,6b Trouvé 14,03 talc. 13,84 Trouvé 14,93 taClc. 14,27 Trouvé - telc. - Trouvé - Ctalt. Trouvé - CaIl. 12 13 14 15 17 18 19 2V Glycine 2 G n,7,i,5 z _, 7Z. O!-; ;,;i '4 12,74 21 Histidine I L 92,8 85,2 -37,2 1 ,37 17,22 . ydy2 22 Hydroxy- 2 L-tran 74,7 84,2 -68,6 26,62 proline 24,31 23 Leucine 2 L 16,6 88,3 -11,2 30,01 29,83 2q Leucine 2 D,1 94,7 86,7 - 30,07 f 30,29 Lysine I L * 77l 90,3!4,0 19,55 ,10 26 Méthionine 2 L 96,1 87>1 427 2 3, J 23,54 2? méthionine 2 D 95,2 9,l -10) 2 3,30 23,01 28 Méthionine 2 D,L 93,1 87,5 - 2330 23,15 29 Phénylal. 2 L 95>9 90,8 -3199 3q)50 9îlo Phénylal. 2 D 94,4 80,2 435,9 39,50 39,23 31 Pnhnylal. 2 D,L 97>1 10,1 - 39,50 32 Prline 2 L 96,2 85,1 -k443 2b6,6 26, 30 33 Praline 2 O 9533 87>2 '67,4 26 86 34 Praline Z DL q E t 261,6 26,È2 Serine 2 L. 94>3 07,20 -7,1 16,06 16,94 36 Serine 2 D 952 357,3 413D2 m6> 86 32A4 7,83 2,98 1 1 30 2,94 11,40 5,3& 6,21 4,32 5,74 5,87 5,85 5,82 5,?0 5,8? 5,85 6,03 5,77 4,44 7,7 4,40 7,683 4,70 5,44 4,63 5.56 4,70 5,44 1,59 5,50 4,79 5,4q 4,74 5,43 4,42 5,12 4,3 5,9i 442 5,12 4,30 5.i8 4Y4 51l2 4,44 5,c1? 4,51 6,27 4,50 6,15 4,51 6,27 4 5,6 20 4,5î 6,27 4>53 6,14 3,70 6,56 3,75 6,64 i70 6,56 ,11 5,24 3 A s 4,21 3,8a 3,97 4>92 3,97 3, E 3,66 3,69 3-75 3,69 3,64 3>5 3,40 3,41 3,50 3,17 3,54 4,25 4,16 425 4 36 4,45 MY5 6, 67 8,33 8,46 o,87 /6,34 6ijl6 6,57 6,46 6 42 r>53 8,50 6,2Q 6,01 6)13 S97 5)66 5,58 5,66 5,76 5;66 5,70 6,73 6067 6799 6 3 6 >9 6 80,2_5 7 5 TrouVe - Ctalc. Trouvé - C2Ic. - Trouvé - Calct. Trouvé - CetC. _ Trouvd - Cal. - Trouvé 1245 Calc. 12,54 Trouva 12,45 Calc. 12,29 TSuv@ 1245 Cetlc. 12 70 Trouve - Calc. - Tyrouv - talco - Trouvé - Calc. Trouvé - Calc. Trouvé - CTrc= Trouvé Calc. Trouve - TrouT -Cal., 17 05 37 Serine 2 DL ?94,7 e8 a 16406 33 Thréonine 2 L 96? 6 88y5 -27,0 21 11 21,26 39 Thréonine 2,L 96,0 0?4 - 21,11 21,01 Tryptophane 2 L 95,7 307 -3152 42,30 41,94 41 Tryptophane 2 4,1 07 431,5 3 4 1 2 D 9{)I V7? 131,5 &2,30 42,03 42 Tryptophane 2 DL 95)1 BO;? - 4230 42,03 43 Tyrosine 2- L 953 i1, 40 -10.1 37,32 44 Tyrosine 2 D 942,5 41,5 37,32 37,69 Tyrosine 2 DL. *37 90>3 - 37,32 36,96 46 Valine 2 97,3 87,3 425,4 25,62 47 vaeine 2 O -53 658,2 24,6 2b6,2 48 Valeincer c 26,38 49 V'lne 2 B,L 95,7 8,9> - 26,62 - 'I4 73 3,73 3,70 3973 4,43 4,38 4>43 4,46 4q20 jA5 4 20 4,23 4820 4?19 4,16 4,14 4104 4,18 4,14 ,-2 5,36 5,32 5,3 5,25 ,;A J ' 5,->: > â? g5G 6,40 6,16 6s23 6,16 6,22 U,97 0,01 9,97,90? 8697 9 12 4)94 4,90 4,64 4,80 4,84 6,21 6,14 jA 6,40 6,21 6,29 4,51 4 e52 4,17 4,23 4,17 3451 3,04 298B 3,v5 3,28 3,24 3,28 3,22 4,22 4,27 442 4,26 4 7 A 3 71!4 3 'n! 3) Qi 3e2p 4 X A 4, 17 */ 1 4 l 7,25 7,41 76,q 6,76 6701 4,95 6496 5}03 4 96 4,79 4 796 5,08 ,46 5 '1 D35 5527 i33 6,;87 Y1 4 72 6s97 6,7 Trouvë Trouvé - talc:. TraiC. Trouvë - Trouvé Tra!vdr - Cal c - Trouvé - Calc. Trouvé - talco Trouvé - Cal': - rolvé CI - Cal. Trouvé "rouvd _ T:euvé LEGENDE: AA = AMI NO-ACIDE AA/MFF = RAPPORT-MOLECULAIRE ENTRE L'AMINO-ACIDE ET L'ION MONOFLUOROPHOSPHATE Exemple 1 Sel mimrte de mionofluorophosphate de L-glutamine et de chlorure de sodium - PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de L-glutamine Dans un réacteur d'une capacité utile de 500 ml, muni d'un thermomètre, d'un agitateur mécanique, d'un entonoir goutte & goutte ' d'un joint pour le passage de gaz, on îet en suspension 29,2 g (0,2 mole) de 10 L-glutamine dans 190 cóè d'acétone anhydre obtenu prîalablement par distillation sur chlorure de calciumr. Dans un courant d'asote sec (ou d'un autre gaz inerte i condition çuil oit anhydre) et sous agitetion, la 3uspension est port3e à -5 C à l'aide d'un bain rfrig4rant. On comence & ce point, an maintenant cornstantes les conditions d4crites ci-dessus, additi n goutte & goutte de 10 g (0,1 mole) d'acide monofluorophopho rique aydre, qui est terminée au bout de 3 heaurSo Pour garantir la salification compllte, la nasse réaction= nelle est laissée sous agitation pendant 24 heures (les conditions sont mainenus constantes c'est-àdire agita- tion, temp&ratur '-5 C, courant dvazote sec) et ensuite filtrée rapideaent pour isoier le se en suspension. Le 25 g&teau humide obtenu, soigneusement pressé, est ensuite soché dans une étuve i vide i une température ne dépassent pas 45 C0 On obtient 37,07 g (94,57 % d'un produit bla o-o blanc crâme extrêmement hygroscopique. Le monofiorchosphate de L-glutamine, s'il est exposé 30 l'air, se transforme au bout de 10 à 15 minutes, selon les conditions d'humidité et de température ambiante, en une masse semi-solide pratiquement non utilisable et non identifiable analytiquement Le produit doit donc être utilisé immédiatement 35 apres dessication ou bien il devra être conservé sous il vide en présence d'agents dessicateurs. - PHASE B: Stabilisation par co-cristallisation avec le NaCl. Dans un réacteur d'une capacité utile de 500 cm3 5 muni d'un thermomètre et d'un agitateur mécanique, on dissout 11,05 g de chlorure de sodium (0, 189 mole) sous agitation et à la température de 60 C, dans 45 cm3 d'eau distillée. Une fois obtenue la solubilisation complète, on amène la température à 40 C et sous agitation, on 10 ajoute le plus rapidement possible 37,07 g (0,09457 mole) de monofluorophosphate de L-glutamine. La masse réactionnelle est maintenue sous agitation à 40 C jusqu'à ce que l'on obtienne la solubilisation complète du sel. A ce stade, on abaisse la température e 30oC et sous agitation lente on commence l'addition goutte à goutte de 450 cm3 d'acétone avec obtention résultante d'une suspension de cristaux du sel mixte. Le goutte à goutte de l'acétone est terminé au 20 bout de 6 heures, après quoi la masse cristalline en suspension est maintenue sous agitation à 300C pendant encore 18 heures. On refroidit à 5 C, on filtre par succion et on sèche jusqu'à l'obtention d'un poids constant dans une étuve à circulation d'air, à 50 C. 25 Le produit est blanc, cristallin, complètement stable dans les conditions normales d'environnement. On obtient 43,3 g (87,9 %); ]20 = + 5,9(C = 6,3 dans H20) Micro-analyses pour: Ci0Cl12FH22N4Na2O9P C% H% N% F% P% calc. 23,58 4,36 11,01 3,73 6,08 trouvé 23,18 4,41 10,92 3,76 6,12 titre argentimétrique des chlorures: 98,96 %. Exemple 2 Sel mixte de monofluorophosphate de D-glutamnine et de chlorure de sodium - PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de D-glutamine: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant à la place de la L-glutamine, la D-g!utamine. On obtient 36,45 g (93,0 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. - PHASE B: Stabilisation par co-cristallisation avec le NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 mais en utilisant 36,45 g de D- glutamine monofluorophosphate (0,093 mole) et 10,87 g de NaCl (0,186-mole). Le produit résultant est blanc, cristallin, complètement stable dans les conditions normales d'environnement. On obtient 40,6 g (85,8 %); t]20 = + 6,0(C - 1,75 dans H20) 20 Micro-analyses pour: C10 C12 FH22 N4Na2 09 P C% % N% - F% P calc. 23,58 4,36 11,01 3,73 6,08 trouvé 23,71 4,34 10,88 3,67 6,02 titre argentimétrique des chlorures: 98,37 %. 25 Exemple 10 Sel mixte de monofluorophosphate de L-asparaqine et de chlorure de sodium - PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de L-aspargine: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant: L-asparagine: 26,4 g (0,2 mole) acétone anhydre: 170 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse sans changement. On obtient 34,46 g (94,62 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. - PHASE B: Stabilisation par co-cristallisation avec le NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant: monofluorophosphate de Lasparagine: 34,46 g (0,0946 mole) Chlorure de sodium: 11,06 cm3 (0,1892 mole) H20: 45 cm3 Acétone: 450 cm3 en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse sans changement. Exemple 13 Sel mixte de monôfluorophosphate de L-cvstdine et de chlorure de sodium: PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de L-cystéine: On répète le mode opération de l'exemple i en 20 utilisant L-cystéine: 24,2 g (0,2 mole) Tétrahydrofurane anhydre*: 145 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse inchangés. On obtient le tétrahydrofurane anhydre en le portant à reflux pendant 2 heures sur un filament de sodium puis en le distillant.On obtient 32,89 g (96,09 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. PHASE B: Stabilisation par co-cristallisation avec-NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant: monofluorophosphate de Lcystéine: 32,89 g (0,0961 mole) Chlorure de sodium: 11,24 g (0,1923 mole) H20 45 cm3 Tétrahydrofurane: 495 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse inchangés. Le produit résultant est blanc, cristallin, complètement stable dans les conditions d'environnement normales. On obtient: 37,59 g (85,18 %) []20 = +7,2(C = 10 dans HCl 1N) Micro-analyses pour: C6C12FH16N2Na207PS2 C% H% N% F% P% S% Calc. 15,69 3,51 6,10 4,14 6,75 13,97 Trouvé 15,79 3,55 6,04 4,05 6,62 14, 20 15 titre argentimétrique des chlorures: 99,21 %. Exemple 25 Sel mixte de monofluorophosphate de L-lysine et de chlorure de sodium PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de 20 L-lysine: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant: L-lysine: 15,0 g (0,1 mole) Méthyléthylcétone anhydre: 99 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions de- synthèse sans changement. On obtient 23,90 g (97,10 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. - PHASE B: Stabilisation par co-cristallisation 30 avec le NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 1, en utilisant: monofluorophosphate de L-lysine: 23,90 g (0,0971 mole) Chlorure de sodium: 11,35 g (0,1942 mole) H20: 45-cm3 Méthyléthylcétone: 450 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse sans changement. Le produit résultant est blanc, cristallin, complètement stable dans les conditions d'environnement normales. On obtient: 31,83 g (90,3 %); [î]20 = + 14(C = 7,3 dans H20)10 Micro-analyses pour: C6C12FH 16N2Na205P C% H% N% F% P% Calc. 19,85 4,44 7,72 5,23 8,53 Trouvé 20;10 4,40.7,83 5,36 8,50 titre argentimétrique des chlorures: 98,44 %. 15 Exemple 32 Sel mixte de monofluorophosphate de L-proline et de chlorure de sodium - PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de L-proline: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant: L-proline: 23,0-g (0,2 mole) acétone anhydre: 150 cm3 et en maintenant tous les autres réactifs et conditions 25 de synthèse sans changement. On obtient 31,76 g (96,18 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. - PHASE B: Essai de stabilisation par co-cristallisation avec NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant monofluorophosphate de L-proline: 31,76 g (0,0962 mole) Chlorure de sodium: 11,24 g (0,1924 mole) 35 H20: 45cm3 16 2599032 Acétone: 450 cm3 en maintenant tous les autres réactifs et conditions de synthèse sans changement. Le produit résultant est blanc à blanc crème, amorphe, extrêmement hygroscopique et n'est conservable que sous vide et en présence d'agents dessicateurs. On obtient: 36,59 g (85,1%); -]2 = 44,3 (C = 1,1 dans D HCl 0,5N) Micro-analyses pour: Cio0Cl2FH20N2Na2 07P C% H% N% F% P% Calc. 26,86 4,51 6,27 4,25 6,93 Trouvé- 26,38 4,58 6,15 4,21 6,86 titre argentimétrique des chlorures: 99,07 % 15 Exemple 34 Sel mixte de monofluorophosphate de D,L-proline et de chlorure de sodium - PHASE A: Préparation du monofluorophosphate de D,L-proline: On répète le mode opératoire de l'exemple 32 en utilisant & la place de la L-proline, de la D,L-proline. On obtient 31,83 g (96,39 %) d'un produit blanc ou blanc crème extrêmement hygroscopique. - PHASE B: Essai de stabilisation par 25 co-cristallisation avec le-NaCl: On répète le mode opératoire de l'exemple 32 en utilisant 31,83 g (0,0953 mole) de monofluorophosphate de D,L-proline (0,0964 mole) et 11,27 g de chlorure desodium (0,1928 mole) . Le produit résultant est blanc à blanc crème, amorphe, extrêmement hygroscopique et n'est conservable que sous vide et en présence d'agents dessicateurs. On obtient 37,24 g (86,4 %). Micro-analyses pour: 35 C10C12FH20N2Na20o7p C% H% N% F% P% Calc. 26,86 4, 51 6,27 4,25 6,93 Trouvé 26,62 4,53 6,14 4,22 6,80 titre argentimétrique des chlorures: 98, 12 %. Les activités biologiques que les produits objets de la présente invention sont capables d'exercer sur le tissu ostéocartilagineux, ont été estimées aussi bien "in vitro" qu"in vivo". Les résultats obtenus et les procédés employés sont décrits ci-après: 10 A) Activité "in vitro" A1) Stimulation de la synthèse des glucosaminoqlycanes dans les cultures de fibroblastes d'embryons de souris - Estimation effectuée par fixation de -5-S. On sait que les fibroblastes embryonaires sont les cellules dont les différenciations successives donnent naissance aux divers types de tissus conjonctifs 9 de telles celules cependant représentent un mod@le expérimental très utile dans l'estimation prl!fna. des effets pharmaco-biologiques éventuels,quc'i!s cient positifs ou négatifs) exercés par une plusieurs substances sur des tissus dérivant d'un tel substrat cellulaire, y compris le tissu ostéocartilagineuxo Nous mentionnons ici 1es procédés et les résultats 25 d'un test relatif à la fixation de 35S dans les mucopolysaccharides (glucosaminoglycanes) sulfatés (principalement sulfate de condroltine) aussi bien au niveau cellulaire qu'extracellulaire et o par conséquent ladite fixation de 35S est proportionnelle & la 30 vitesse à laquelle les GAG sont synthétisés par les fibroblastes. Dans ce but, les cultures primaires de fibroblastes d'embryons de souris (souche C57BL/6 stCrl) prélevées sur la mère au 18ème jour de gravidit, ont été préparées par dissociation mécanique et enzymatique des embryons dans le mélange Trypsine Versene Miture (Microbiological Associates). Le milieu de culture est celui de Eagle modifié par Dulbecco, et complété par 15 % de sérum foetal de veau. L'atmosphère d'incubation est constituée par 5 % d'anhydride carbonique dans l'air à 37oc. Après 24 heures d'inoculation, le milieu est remplacé par un nouveau milieu contenant le produit à l'étude et le précurseur radioactif (Na235SO4) pour la mesure de la 1o synthèse des glucosaminoglycanes solubles et tissulaires. On laisse en incubation pendant 24 heures supplémentaires puis le milieu de culture (contenant les GAG solubles) et les fibroblastes (contenant les GAG tissulaires) sont séparés. Les GAG solubles sont isolés du mimieu de culturGe par précipitation avec une solution glacée d'acide trichloro-acétique à 5 O dans H2O tandis queles fibreo plastes résiduels, contenant les GAG tissulaires, après lavages répétés avec du sérum physiologique, sont solubi- lisés par le DIMILUME ou le VERSENE. La quantitde 35S incorporée aussi bien dans les GAG solubles que dans les GAG tissulaires est comptée selon les méthodes usuelles de scintillation et exprimée en CPM (coups par minute). On a utilisé cinq répliques pour chaque échantili lon de façon à permettre une estimation statistique suffisante. Les résultats obtenus pour les produits objets de la présente invention sont donnés dans les tableaux 1 et 2. Note concernant les tableaux 1 et 2 Le degré de signification statistique a été évalué suivant le test t de Student, par conséquent dans les colonnes marquées par t, on reporte les valeurs du "t" de Student pour la comparaison entre les valeurs 35 considérées et dans les colonnes marquées "p"', la probabilité statistique pour que les valeurs comparées appartiennent à la même population; donc le terme N.S. signifie que statistiquement les valeurs comparées ne peuvent pas être considérées comme différentes. On suppose au contraire que deux séries de valeurs sont statistiquement différentes lorsque p, en fonction de la valeur de "t" et des degrés de liberté, est de 0,05. LÉGENDE, CPM = COUPS PAR MINUTE E.T., ECART TYPE T.N.T. = TÉMOINS NON TRAITÉS TABLEAU 1 - ACTIVITÉ DES PRODUITS DE L'INVENTION SUR LA SYNTHÈSE DES GLUCOSAMINOGLYCANES TISSULAIRES (INSOLUBLES) DANS LES CULTURES "IN VITRO" DE FIBROBLASTES D'EMBRYON DE SOURIS. i T I -. Concen- Con:cen- J concen- Concen- tration trCon Synthèse des GAG tlssulaires %pal omn C.c e n tton!atio n (pm Composms Amino-acides Forme tration tration de fluor de fluor pm) rappor le l'exemple 1X/mi) (J 1 2 3 4 9 g 1 1 Il 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 31 Glutamine Glutamine Alanine Alanine Alanine Arginine Acide aspart. Acide aspart. Acide aspart. Asparagine Asparagine Asparagine Cystéine Cystéine Cystine Cystine Acide glutam. Acide glutan. Acide glutam. Glycine Histidine Hydroxyproline Leucine Leucine Lysine Méthionine Méthionine Méthionihe Phénylalanine Phénylalanine Phénylalanine L D L D,L L L D D.L L D D,L' L D,L L D L D D,L L trans L L D,L L L D D.L L D D.L 12,7 12)7 9,9 9,9. 9J9 9,B 12,1 12,1 12, 1 12,0 12,0 12,0 11,5 11,511,4 11)4 * 12,8 12,8 12,8 9,2 9,3 12,0 12,0 12,0 9,1 12,9 12,9 12,9 13,7 13,7 13,7 2,5xIO II il il il ill il il il il II il t, i l Il Il Il " ! !t 'I Il it i' il fi II Il I! g' I! It II Il II I tl -2 0,475 il il il il il l! fi Il 'i il t! il gl l1 il Il il Tt!l 1l l! Il il !l et Il tl g' I II 'I g, t' 'I t' t' i' 215x102 Il Il Il It fi Il lI It - Il Il il Il il. l Il g il I t I 11 l' gl It il Il fi il fi il il il 5410+419 7900+627 6450+438 5110.378 4880+431 4940+391 39304315 4790+525 4520+393 4800+411 6400+566 5310+559 5820.375 6240.592 5870+718 5810+407 4770+432 6200+576 5550+366 5670+363 6020+499 4210.304 50104539 6710+631 6170+422 6650+321 5060.455 5070.540 5880+524 59R0.513 5270.420 586C-6E51 3730 1,71 0,53 0,88 0,82 2,682 0,92 1,55 1,04 I 40 0,14 QlO 0)73 0,69 0,69 1>06 1,11 0,25 0,47 DJ 94 2,32 0,59 1,72 1,28 2 35 0,57 0,50 0370 0)86 0,24 0>58 0 o05 Il. S. N.S. N.S. N.S. N.S. 0,05 N.S. N.S. iN. S. N.S. N. S. i.S. N. S. i:. S. N. S. iN. S. 8.5. N|.s. N.S. fiI. S. 0,05 N.5. il.S. il.S. 0,05 IN.S. N.S. 11. S.;. S. I. S. 46,0 19,? - 5>5 - 9)8 - 8,7 -27>4 -11,5 -16,5 -11,3 418)3 - 1,8 + 776 J 3 * 8>5 -, 7?..74 --11)8 +.4,6 4 2:6 À 4,8 11)3 -22)2 - 7,4 424)O 414j0 22 >9 - 6,5 -6>3 - 6:,3. e7 8 7 283 À8>3 - _ Concen- ConcenConcen- Concen- -ro rSynthèses des GAG tissulaires A h pa concen- concen- tration tration Composés Amino-acide Forme tration tration de fluor de fluor(Cp>) rapport de l'exemple Moyenne + E.T.aux ____/____]) pn ( /M ôitu) / Moyenne + E.T. t, t.n.t. 32 Proline t 11,2 " n n 7450+486 3,18 0,05 37"7 33 Proline D 11,2 " " " 6380f 642 I,27 N.S. 417, 34. Proline D,L 11,2 " "l " 71204542 2,50 0,05 431.,6 Serine L 10,7 " " " 59004550 0,7! N.S. 4 91 36 Serine D 10,7 " "5750P547 0,49 1. S. G,3 37 Serine D,L 10,7 " " "l 52504397 028 IN.S. - 3, 0 38 Thréonine L 11,4 " " " 47904394! 08 Il.S. -11,5 39 Thréonine D,i 11, 4 4960.436 0,74 i. S. - 8,3 Tryptophane L 15,6 " " " 4170301 2, 0,05 -22, 9 41 Tryptophane D 15,6 4090498 2,03 I. S. -2, 4 42 Tryptophane DL 156 " 4440369 1,74 I.S. -17, 43 Tyrosine L 14,5 i n *. 5780+440 0261 L.S. + 6,8 44 Tyrosine D 14,5 " 4 n 4350_ 211 2731 0,OS -19,6 Tyrosine D,L 14,5 [t t, 4650452 i 1 4, tl. S. -1 4,0 46 Valine L 11,3 " " 5900C1f;4,7 0,80 I.S. 4 90 47 Valine D 113 t ' n 505+4472 0,4 a 11.S. - 4, 8 48 Valine D,L 11,3 l 545044,2 0.07 I.. S 0,7 N2FP3 - 3,6. . n. 63704451 156 1.-S..17,7 NF_ - - 1205 2 3570+257 3,4 0 001 -340 _ Glutamine L 6535 1,25x10- 0,2375 1125x10 7200*559 2, 0,05 433 1 _ _ _ _ _ - - _ _ _ _. _ _ - _ _ _ I 7200L 59 _ _ _ [ 0 _ _ TABLEAU 2 - ACTIVITÉ DES PRODUITS DE L'INVENTION SUR LA SYNTHÈSE DES GLUCOSAMINOGLYCANES SOLUBLES DANS LES CULTURES "IN VITRO" DE FIBROBLASTES D EMBRYON DE SOURIS Composés% le l'exemple Amino-acides I i Contr. n.t. 2 3 4 5 6 7 e 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 I Glutamine Glutamine Alanine Alanine Alanine Arginine Acide aspart. Acide aspart. Acide aspart. Asparagine Asparagine Asparagine CystSine:ysteine Cystine Cystine Acide glutam. Acide glutam. Acide glutam. Glycine Histidine Hydroxyproline Leucine Leucine Lysine Méthionine Méthionine Méthionine Phénylalanine Phénylalanine Phénylalanine __ D L D, DL 3'. L D DDT L D Dt L DOL t D L D DL t 3 trans L L t. 0,L D.D,L L D D,L Forme Concentration (/.]) - 12,7 12,7 9,9 9?9 9,9 9,8 12p1 12,1 12, 1 12)0 1290 12Do 1115 l1 2 9 12,8 1298 2,a 9,2 9,3 12,0 12,0 9)1 12,9 12,9 12,9 13)7 1337 13s7 Conçentration (PH/at) -2 X1O il tl ti f1 'I il t It il I tl Z1 it 33 Il il ilil Il tl Il tl '1 si il Il il tt i Concentration de fluor (e/-1) Concentration de fluor tEcq/ml) 0,t75 il il il., il Il il Il Il I! il ci Il Il el il W tIl il 'l Il t' il fi Il 'i I ! I I I! tt 't Synthèses des GAG tissulaires (Cpm) Moyenne + E.T. -+ - I -2 2,5r0O il il il il il il i, Il il Il il Il II il tl il Il Il Il Il ii!' Il t' fi Il Il Il iI Il Il t 5280.413 9890+921 69204518 5710+486 5090,360 55804624 4030+367 4520+376 4300+408 4740.487 - 6750+460 5640+623 56804660 65304346 62004719 4780+47& 4730-498 59304592 54204510 5200+713 5770.413 4240.413 5570.58& 4860-62B8 49704633 58B0.515 E504.68 5420-423 5370C519 4870+4.20 4eq90.539 4720+319 4 15 7 0)35 2,4.8 0,35 0 y40 1,36 1,69 0)90 2,38 2,32 1,11 C,79 -0)85 0,90 0)21 O,09 O84 2D22 O)40 056 0,65 0,14 0)69 0,57 1,07 I 0701 0>05 FI' S; 01,05 Il. S. N.S. f;. s, 1o,5 :,. S. I;. S 4;. S. 0F05 N. S. l.S. I;. s. l. S. i. S. Su.. s1.. Il. 5. 1(. S. ?i. S. l. S. I,. S. Il.. I *0 487,3 4,B 753 31 I 8,1 -3,6 4 5,7 -23,7 -14p4 -leG I - 102I -10,2t | 27B8 468 7>6 -2,7/ 1- 975 -2,7 |.).7 | - 5,9 10.,,B + 7:,0 - 29)7 + 1>,7 - 7,8 2>7 - 7,L 1- 7wllé l 1ç( I i pax rapport auxt.n.t. t.n. t.. - ! . J CConcen- oncen- Concen- -Concen- Synthèses des GAG- tissulaires Apar Composes Amino-acide Forme tration tration tration tration (Cpm) rapport de l'exempl j{tl (./] de fluor de fluor ax I/.]) (,v./,l): (/.l) Moyene 4 E-.T.i [ 32 Proline L 11,2 n 7830:691 3,17 0,05, 4B,3 3 3 Proline O Jl)2 mt: - f 33 Proline D 11,2 " n" -' I6080.+650 1,04 N.S..15) ? 34 Proline Di 11,2 n G?6720+464 2,32 0,05 +27,3 Serine L 10)7 " " " 5520_512 0,36 N.S. + 4,5 36 Serine D 10)7 " " " 47404537 0>75,.S. 10,2 37 Serine D0, 10,7 n " 536045 563 0,11 N.;S. + 1)5 38 Thréonine L 1114 f i 5690+743 048 N.S-. + 7,8 39 Threonine D,L 11,4 n It 550D4623 0.J29 N. S. 4 ? Tryptophane L 15,6 n n 4290.406 171 Il. S. - 1IB 41 Tryptophane 15,6 4520+298 49.S. -14 j6 fi 41)9 If.S. -14 42 Tryptophane D,L 15,6: ' n 4600+ 444 121 NS- 19 1.,21 N:. S. -12 g 43 Tyrosine L 14,5, 44 Tyrosine L. 14, 5: 5470+653 0)25 N. S. + 3>6 44 Tyrosine D 145,t " " 4180+498 1I70 Nf.5. 20>8 - Tyrosine D,1L 145 " n. 460583 0,93 I.S. -11,9 11 650+583 0)9 3 il., ,-1 4.6 valine I 3 f 46 Vaine t 11,3 '" " " n 5650+419 0,Q3 N.S. S 7.0 47 ? Valine. O11)3 fi - 47 Valine.0D 11>3 "f ln:5700+313 0,81 I. S. + R,0 48 Valine D,L 11,3 ti 5940530 098 f.S. Na FP3O H2 P3 _ - 3,6 " " " 6010:583 1I00 U.S. 413>8 NaF - 1,05 ", ,. N-2 -2 3220+51 3,80 0,> 01 -39 >0 Glutamine L 6,35 1>25xl0O 0,2375 1,25x10-2 E350.1089 2,64 00Q5,581] _I _: _ 24 2599032 24 Comme on peut le noter dans les tableaux 1 et 2, certains des produits objets de la présente invention stimulent la synthèse des glucosaminoglycanes sulfatés aussi bien-extracellulaires qu'intracellulaires dans les 5 cultures "in vitro" de fibroblastes d'embryon de souris. Cette stimulation pour certains d'entre eux est même hautement significative dans l'estimation statistique (voir les exemples 1, 2, 10, 13, 25, 32, 34) et cefait prend une importance particulière si l'on considère que parmi les causes concomittantes fondamentales dans la survenue de maladies dégénératives du type ostéoarticulaire, comme par exemple l'arthrose et l'ostéoporose, on peut identifier aussi bien la synthèse réduite que la dégradation accrue des mucopoly15 saccharides (glucosaminoglycanes) (et en-particulier du sulfate de condroitine) contenus dans de tels tissus. I1 est évident par conséquent que les substances capables de stimuler la synthèse des mucopolysaccharides aussi bien & l'intérieur qu'à l'extérieur des cellules 20 sont en mesure d'exercer un effet positif dans le traitement des dysfonctions mentionnées ci-dessus. " Il est intéressant de noter que lé monofluorophosphate de sodium, à la même concentration molaire que les produits de l'invention, n'est pas en mesure de stimuler d'une façon significative la synthèse des GAG, qu'ils soient solubles ou tissulaires; Le fluorure de sodium, également à la même concentration, exerce même une action dépressive due à l'évidence à la toxicité vis à vis des fibroblastes. Les mêmes considérations s'appliquent pour d'autres composés objets de l'invention qui ne stimulent pas significativement ou qui dépriment même la synthèse des GAG d'embryon de souris. Il faut signaler enfip que le sel mixte de monofluorophosphate Lglutamine et de chlorure de sodium (exemple 1) présente la plus puissante activité stimulante sur les GAG aussi bien solubles que tissulaires; cette activité conserve sa valeur significative statistique même en réduisant de 50 % la concentration du produit dans le bain de culture. A2) Stimulation de la synthèse des glucosaminoClycanes dans des cultures de cartilage articulaire de rat - Estimation effectuée par incorporation de 3--5S Comme cela a déjà été dit ci-dessus, les fibro10 blastes sont des cellules embryonnaires indifférenciées, dont proviennent pendant le développement foetal tous les tissus de genèse des mésenchymes, normalement déterminés sous le nom générique de tissu conjonctif; de telles cellules sont très utiles dans les tests préliminaires parce qu'elles sont relativement faciles à manipuler et capables de garantir une bonne reproductibilité expérimentale; cependant elles n'ont pas les caractéristiques morphologiques d'un tissu et par conséquent les résultats obtenus de façon préliminaire 20 sur des cultures "in vitro" de ce type n'ont pas une valeur absolue mais doivent être confirmés sur des cultures "in vitro" de tissu conjonctif proprement dit; cela a été fait en prenant en considération aussi bien les produits les plus intéressants de la présente invention (exemples 1, 2, 10, 13, 25, 32,34), que ceux qui agissent en déprimant d'une façon significative la synthèse des GAG aussi bien tissulaires que solubles (exemple 6), de même que le monofluorophosphate-de sodium et le fluorure de sodium à titre de comparaison. Les procédés utilisés sont décrits ci-après, les résultats obtenus sont illustrés dans le Tableau 3: Des rats femelles d'un poids moyen de 220 g ont été sacrifiés par trauma crânien et on a prélevé les capsules articulaires cartilagineuses des épiphyses 35 fémorales proximales (tête du fémur), Des groupes de six échantillons ont été incubés dans 5 ml de milieu Dulbecco's modified MEM de la Microbiological Associates, complété par 15 % de sérum foetal de veau, 500 unités/ml de pénicilline G potassique et 500 Mg/ml 5 de streptomycine sulfate & 37C pendant 16 heures dans une atmosphère contenant 15 % de C02. On avait préalablement ajouté au milieu 5 pci/ml de Na235S04 (activité spécifique 92 pci/mmole) et les - différents produits étudiés aux concentrations voulues. 10 Après la période d'incubation, les échantillons ont été lavés, traités par le mélange Trypsin-Versene mixture (500 mg de trypsine 1/250 + 200 mg de Versene/litre de solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium) pendant une heure à 37OC, relavés plusieurs fois avec du sérum physiologique, solubilisés chacun avec 0,5 ml de HCl 6N à 95'C pendant 3 heures et après addition de 20 ml de Dimilume Packard, soumis à l'analyse par scintillation pour déterminer, au moyen de la quantité de 35S incorporé dans les glucosamino20 glycanes du tissu cartilagineux, l'effet des produits objets de la présente invention sur. la synthèse mucopolysaccharidique (voir tableau 3). Note pour le tableau 3 Pour la signification de t et p, voir la note aux 25 tableaux 1 et 2. TABLEAU 3 - ACTIVITE DE CERTAINS PRODUITS DE L'INVENTION SUR LA SYNTHÈSE DES GLUCOSAMINOGLYCANES EN CULTURE IN VITRO DE CARTILAGE ARTICULAIRE DE RAT GLYCANES EN CULTURE INVITRO' DE CARTILAGE: ARTICULAIRE DE RAT Composée Concen- Concen- concen- Cocen- synthses des GAG tissulaires Apar trati}oncn nCtonen de l'exemple Amino-acide tration tration tration a (Cpm rapport -ration tlratione tration defluorMoyenne ET tC!P t.n.t. orde fluor2 de fluor E aux m] (p,il)MyL T.n.t. l 32 34 13 25 Na FPO 2 3 Glutamine Glutamine Proline Proline Asparagine Cystéine Lysine Arginine L D L D,L L L L 6,35 12,70 25,40 6,35 12170 25,40 ,60 11,20 22y40 11,20 22 40 6,0 12,0 24,0; ,75 11,5023,00 4,55 9,10 18,20 1B80 3,60 7,20 0152 1,05 2 10 4,45 e,90 17,80 -2 1>-25x10 -2 2,5 xlQ 2 xlO Ijl25X]O'2 2,5 xIO-2 x10-2 2 1,25x10 2 2,5 xlO I 25xlO 2,5 x 10 _ -2 x1o -2 1,25x10-2 2,5 xlO2 -2 xlO 1725x 10o 11,25x10-2 2,5 xlO- 2 5 xlO:2 -2 1>25x10 2 2j5 x 10 x10-2 1, 25x10' 2,5 xIO 5 xIO 1>25x10:2 2,5 x0:2 'x10 s l-2 1,25x10 1,. - - 2 2,5 xlO-2 5 x102 0,2375 0o4750 0,95000,23 75 0,4750 D,9500 0,2375 0, 750 0,9500 0,2375 0,4750 0,950D 0,2375 0,1750 0,95000,2375 0,4750 0,9500 0,2375 0,4750 0D9500 0>2375 0,4750 0,9500 0,2375 0,4750 0>9500 0,2375 0,4750 0,9500 -2 1,25x10 2 2,5 xlD -2 : x10 ' 1,25X10-2 2,5 xlO2 5 xlO-2 tic 2 -2 ]1 25xlO 2 2,5 xlO -2 x10 x -2 1,25x10-2 2,5 X102 5 xlO'2 -2 1,25x10 -2 21, 525x 10 -2 2)5 x10O -2 x105 x o02 -2 1,252102,5 xO 2 x10O 1,25x102,5 x10' 5 xlO0 -2 1,25x10 2, 10 xlO'2 -2 x-2 2,5 x105 xlO 125004 605 1 6175+ 734 184504 924 2175841:215 14817+ 686 15925+ 694 16742. 783 1600+1001 16600*1076 17741+ 927 13975+ 557 1&850+ 901 16217+. 451 13708+ 958 14817+ 725 '2. 786 14300+ 631 15667+ 64-1 14650. 769 13425+ 937 14117. 960 15175* 562 12933+ 579 1:3100+ 696 130e3+ 675 10658+ 426 E600. 314 7416. 561 i1458I. 84 10883. 702 11050. 615 : 3,106 5,39 6,82 2,19 3,72 4,28 1,80 3,32 4,73 1,79 2,17 4,93 1,07 2,21 3,57 3,59 2.,20 o,: 3 0,83 4 9e3 1,42 3,24 0752 0,65 0,64 2,21 5,72 6,16 I>00 1 74 1,68 0,01 O,OQI 0,001 f. S. 0,01 I.S. Il. S. 07001 O:001 fi.S N. S. Il. S.. S, S. 0,01 N.S. ooi N.S. N.S. 01001 0,01 N. S. 1;.5. 1.S. Il. S. o;001 O7001 R.S. 1:.5S. N. S.5 O 429,4 *7,6 +74,1 +lB,5 427,4 +33,9 416,8 432,B +41,9 +18,a +29,7 4 9,7 418>5,28,3 41E44 425,3 +17,2 + 7ó4 412,9.21), + 3,5 + 4,8 + L,7 -14,7 -31,2 -40,7 - E, _2 7 Q - Il! B -]37 -I) 5 ______________ 1 - N.5 Les' résultats figurant au tableau 3 confirment au niveau tissulaire et au moins qualitativement, ce qui a déjà été précédemment observé au niveau extracellulaire et intracellulaire sur des cultures "in vitro" de fibroblastes embryonnaires. Les produits les plus actifs dans la stimulation de la synthèse des GAG cellulaires confirment leur activité également au niveau tissulaire; c'est ainsi que le sel mixte de la L-glutamine (exemple 1) présente 10 une activité puissante fonction de la dose et statistiquement significative à-toutes les doses essayées, en confirmant par-là, au moins au point de vue de l'activité sur le tissu cartilagineux, qu'elle est la molécule la plus intéressante parmi toutes celles décrites. De 15 même, les dérives de la D-glutamine (exemple 2), L et D,L proline (exemples 32-34), L-asparagine (exemple 10) et L-lysine (exemple 25) confirment les activités précédemment vérifiées tandis que le sel mixte de la L-cystéine présente un effet qui ne dépend pas de la 20 dose et qui nécessiterait un approfondissement ultérieur, par contre la L-asparagine qui, elle, exerce une activité dépressive au niveau cellulaire, confirme cette tendance uniquement à un niveau d'orientation par ailleurs très faible, ne dépendant pas de la dose et en 25 tout cas sans signification statistique. Même dans le cas du monofluorophosphate de sodium et du fluorure de sodium, on a confirmé les résultats expérimentaux précédents en ce sens que le premier, au moins au niveau cartilagineux (cellulaire et tissu30 laire), ne semble pas produire d'effet tandis que le second confirme son action dépressive et par conséquent toxique, ce qui semblerait poser un point d'interroga- tion sur son emploi thérapeutique largement répandu. B) Activité "in vivo" Ostéoporose d'immobilisation chez le rat: Un type quelconque de test pharmacologique "in vitro", pour précis et raffiné qu'il soit, prête toujours le flanc à nombreuses incertitudes dérivant du fait évident que le modèle expérimental dans la 5 condition "in vitro" est bien loin de la réalité physiologique effective, et que par conséquent ce type de réponse biochimique vis-à-vis de substances en phase d'étude, doit toujours être pris avec beaucoup de circonspection et même confirmé par des tests 10 convenables "in vivo". Quelques uns parmi les composés les plus intéressants de la présente invention, possédant des activités "in vitro" extrêmement intéressantes aussi bien au niveau cellulaire que tissulaire dans la stimulation 15 de la synthèse et de l'incorporation des glucosaminoglycanes, ont été expérimentés'également "in vivo" dans un test qui reproduit d'assez près une dysfonction bien connue qui frappe le tissu ostéo-articulaire. Ce syndrome connu sous le nom d'ostéoporose est caracté20 risé macroscopiquement par des os d'une consistance spongieuse avec des lacunes dans le tissu ostéolde bien identifiables aussi bien radiologiquement qu'histologiquement. Cette situation déterminée par une minéralisation irrégulière de la matrice ostéoide, 25 conséquence d'un dysmétabolisme de la matrice ostéolde elle-même, provoque dans les os des sujets atteints de cette maladie, une diminution d'élasticité ainsi que de résistance aux efforts avec pour conséquence de hautes incidences de fracture qui ensuite ne se soudent 30 complètement que difficilement. Pour confirmer également "in vivo" les résultats mis en évidence par les tests "in vitro", certains des produits les plus intéressants décrits dans l'invention, en association avec un sel de calcium, ont été essayés 35 dans le test d'ostéoporose induite du rat. En même temps et toujours en association avec un sel de calcium, on a essayé également le monofluorophosphate de sodium, le fluorure de sodium et l'un des produits de la présente invention qui démontrait dans lestests in-vitro une activité dépressive et non stimulante. Deux groupes d'animaux ont été également traités respectivement par le dérivé de la Nglutamine (exemple 1) seul et avec un sel de calcium seul. La méthode, les paramètres pris en considération dans l'estimation finale et les résultats obtenus sont décrits ci-après. Des rats femelles, Sprague Dawley, provenant de l'élevage Charles-RiverItalia, âgés de deux mois de vie 15 et d'un poids moyen d'environ 200 g, sous anesthésie & l'éther et trichotomie soignée ont été soumis à une incision cutanée intéressant tout le membre postérieur gauche pour permettre un décollement de la peau; le nerf sciatique a été isolé et coupé ainsi que le nerf 20 fémoral qui est bien mis en évidence dans la région antéro-médiale de la cuisse. Le pied a été désarticulé et le membre a été enroulé en prenant une position d'immobilisation presque complète. Cette situation provoque, dans le membre postérieur gauche, une ostéo25 porose évidente avec les conséquences déjà décrites. Les animaux ainsi préparés ont été traités par voie orale avec les substances étudiées quotidiennement pendant 60 jours. Les doses employées ont été celles correspondant à 0,35 mg/kg de fluor et 12,5 mg/kg de calcium. Le 30 calcium a été administré sous forme de chlorure de calcium tandis que le groupe témoin a été traité simplement par du sérum physiologique. Après 60 jours, les animaux ont été sacrifiés et on a prélevé, pour l'estimation, le tibia du membre 35 immobilisé (postérieur gauche) et du membre contro- T neaelqe al XTOA d a 4 ap uoTIeOT;Tu6Ts eT Inod : 9 4; 5 -P xnealqe4 sep a4om Es xnealqu sel suep splaodae 4uos s4e4Tnspz se, inaneiuor 'Z mnTOIeD ap queanod ua aneuae.Z *HR'jSKV ap TuiuozTaoq ea.4moutuXp n ne aan.dn. op aaueqo el V aou;sTsH 'I : sueAFTns set 4uaTeT9 uoT4q gpTsuoo ue sTad saz;9.md saq 'xnuuTue ot ap 9soduio;mi9 adnoa6 anb]qD (4Toap anaTaglsod) quepuodsaeoo rurpeT. Zú066SZ TABLEAU 5 - TENEUR EN Z DE CALCIUM DANS LES TIBIAS DE MEMBRES IMMOBILISÉS DE RATS TRAITÉS PAR LES SUBSTANCES DE L'INVENTION - COMPARAISON AVEC LES TIBIAS CONTROLATÉRAUX NON IMMOBILISÉS ET AVEC LES TIBIAS DE MEMBRES IMMOBILISÉS D'ANIMAUX NON TRAITÉS, PRIS COMME TÉMOINS OSTÉOPOROTIQUES. - T. I- î i Composé le l'exemple t.n.t. : I + CaClI x. 32 + CaCI2 Ex. 10 + CaCI x. 6 + CaC12 a FPO +CaC2 2 3 2 aFCaCl 2 - CaCi2 ! Amino-acide Résistance A la charge de rupture (en kg) Comparaison entre les groupes des tibias droits et gauches Comparaison des Comparaison des tibias gauches entre tibias droits entre les animaux traités les animaux traités Forme Tibia gauche immobilisé moyenne + E.T. Tibia droit libre Moyenne + E.T. et les témoins non traité6- et les témoins non I - 1c -ral-es à ilI t n & h _. Glutamine Proline Asparagine Arginine Glutamine L L L t 16,13+0,55 18194.0,55 18,76+0,42 18,59:0,29 18,84*0>46 18,21:0,34 17)44+0. ,34 16,76+0,43 17,69+0,33 19>07+0,64 19,44:0,61 1899 0)50 ID;19,14+0,49 18,910+D34 19,240,47 19, 21ú0,50 18,960,42 19,19+0,39 3,50 0,60 0,32 0,96 0,12 1,79 2,94 3,68 2,96 0,01 N.S. N.S.. N.S. Il. S. il. S. 0,05 0,01 0,01 I.' F 1 -i *1; 1 - 1 jp 3,62 3,80 3,98 3,79 3,24 *2,03 0,491 2:,44z 0,01 0)01 0,001 0,01 0,01 N.S. H.S. 0,05 0,42 0>09 0>09 0,22 0,21 0,17 0:,11. 0,17 It. S. Ki. S. N.S. fi. S. Il. S. N.S. f;. S. i:. S. I;. S. L - - - - _ _ _ _ _ _ _ _ t _ _ _ _ _ _ _ __y - - I I-- - ' -:2599032 TABLEAU 4 - RESISTANCE A LA CHARGE DE RUPTURE DE TIBIAS-DE MEMBRES IMMOBILISES DE RATS TRAITÉS PAR LES SUBSTANCES DE L'INVENTION - COMPARAISON ENTRE LES TIBIAS CONTROLATÉRAUX NON IMMOBILISES AVEC LES TIBIAS DE MEMBRES IMMOBILISES D ANIMAUX NON TRAITÉS, PRIS COMME TÉMOINS OSTÉOPOROTIQUES. Résistance à la charge de Comparaison entre Comparaison des Comparaison des Composés rupture (en kg) les groupes des tibias gauches entr tibias droits entrr l'exemple Amino-acide Forme. - ,: tibias droits les animaux traités Ies animaux traitèf Tibia gauche Tibia droit et gauches et les témoins non et les témoins non tibat6 grauce iiadri immobilisé libre traité oyenne + E.T. Moyenne + E.T. -. - -t p t p!t t, p n.t. 4 38+0,37 6,39g0,51 3,19 0,01 - 1 * C 2CI Glutamine L 6,32+0,48 6118.0,52 0,20 N.S. 3,18 0,01 0,29 fi.S. I+CaCI2 32 + CJC1 Proline L 6)190j.39 6,44.0,44 0744 N.S. - 3,33 0,01 0)07.S. l0+CC2 07adgn + CCI2 Asparigine L 6,08!0>30 6,24.0,49 0 27 N.S. 3>55 0>01 0,22 Il.S. 6 * CaCI2 Arginine L 6,13+0,52 6,47+0,37 0,52 N.S. 2,72 0,05 0>12 f;.S. FPO +CaC12 - - 5,82*0,27 6,31+0,48 0,90 N.S. 311 0>01 01ll l1.S. 3 2 CaC12 - 5,19+0j32 6,26.0 34 2,31 0,05 1-66 t.S. 0,21 il.S. CCI -] 4,72+0,30 6)071*040 2,69 0,05 0)70 IJ.S...49 Il.S. 2 Glutamine 541034 63030 2 205.S. 02 I Glutamine t 5,41.0 34 6,38:0,30 2, 16 0,05 2,05 N.S. 0,02 fi S TABLEAU 6 - LONGUEUR (EN MM) DE TIBIAS DE MEMBRES IMMOBILISÉS DE RATS TRAITÉS PAR LES SUBSTANCES DE L'INVENTION - COMPARAISON AVEC LES TIBIAS CONTROLAT RAUX NON IMMOBILISÉS ET AVEC LES TIBIAS DE MEMBRES IMMOBILISÉS D'ANIMAUX NON TRAITÉS, PRIS COMME TÉMOINS OSTÉOPOROTIQUES. I is Compar_ Comparaison des _Résistance A la charge de Comparaison entre Coparson des omparaison des Composé *..rupture (en kg).......les groupes des tibias gauches entre tibias droits entre tibias droits et les animaux traités les animaux traités l'exemple Amino-acide Forme Tibia gauche sTibia droit g e et les témoins non t les témoins non Tibia droit traités traités immobilisé libre moyenne + E.T. Moyenne +.T. _ _ _ _ _t P t p t X Ct.n.t. 32,4+0,40 39,3.0,46 10,40 0,001 Ex. I * CaCI2 Glutamine L- 325.+0y51 39,640,27 12,31 0,001 0,14 H.S. 0,56. S. Ex.32 + CPCI2 Proline L 32,0ú0j26 38,9.0)43 13),1 0001o 0,74 Il.S. 0,64. . tx. I0 + CaCI Asparagine L 32,7.0,43 39440,23 13,74 0,001, 0,46 N.S. 0,19 fi.S. 2 gnie yLi Ex. 6 + CaCI Arginine L 32,7+0,35 39,1+0,23 15,24 0,001 0,50 Il.S. 0,39 N. S. 12 FPO3*CaCi2 2 3 FPO3+CC2 32,440,43 39,5:0,29 13,66 0,001 4,7x10- Il. S. 0,36 ilS. N+CaC1 - -_ 32j5.0,55 39J 64354 9,26 0$001 0 14 Il. S. 0,42 1. S. _ CaCI - - 31 9:+054 39r,3 i69 8,46 0,001 0O69 N.S. 0>02 ll.S. r:x. i L aGuteie 32)2+0j35 39,2+0,23 16),1 0,001 0,17 N.S. 0,19 Il.S. ______ _____ ______ ____ _____ ______ _____ __ * _ _____, * I Des résultats figurant aux tableaux 4, 5 et 6, il résulte à. l'évidence que dans les os des membres immobilisés suivant la méthode déjà décrite, il se crée une ostéoporose nette caractérisée par une résistance diminuée à la charge de rupture, par une diminution de la teneur en calcium présent et par un raccourcissement de l'os lui-même. L'effet des substances objets de la présente invention, particulièrement si elles sont associées à 10 des sels de calcium, est également clair, étant donné qu'on peut observer comment la résistance à la charge de rupture des os des membres intéressés, chez les animaux traités est significativement supérieure & celle constatée chez les animaux non traités et telle par ailleurs qu'elle ne présente aucune différence avecla résistance des tibias contro-latéraux droits. On peut faire des remarques analogues en ce qui concerne la teneur en calcium. En effet, pour confirmer les résultats relatifs à la charge de rupture, l'administration des sels mixtes 20 décrits dans l'invention est enmesure de maintenir inchangé le métabolisme minéral à tel point qu'il n'est pas possible de déterminer de différence significative pour le paramètre considéré entre les tibias immobilisés et controlatéraux à l'intérieur des groupes; par contre, les différences de-minéralisation entre les tibias immobilisés des témoins et ceux des animaux traités par les produits de l'invention associés à des sels de calcium, sont hautement significatives. En ce qui concerne la longueur, on note au 30 contraire que tous les os des membres immobilisés, qu'ils appartiennent aux groupes témoins ou traités, sont significativement plus courts que les membres correspondants controlatéraux. Ce fait, cependant, peut être dû à un défaut intrinsèque du modèle expérimental 35 qui oblige le membre enrobé à une immobilité pratique- ment absolue avec des effets importants sur la croissance des os des sujets encore jeunes et en voie de développement rapide. Il faut également faire ressortir que, parmi les traitements pris comme termes de comparaison, seul celui qui combine le monofluorophosphate de sodium à des sels de calcium est en mesure de développer, au moins sur le tissu osseux, une activité analogue à celle des composés de l'invention. Le chlorure de calcium seul, se montre absolument inefficace tandis que l'association fluorure de sodium/ chlorure de calcium, tout en présentant une orientation positive pour les paramètres considérés ne met en aucun cas en évidence des résultats sûrement acceptables à un 15 point de vue statistique significatif. Enfin, sont particulièrement intéressants les résultats obtenus en administrant le produit décrit dans l'exemple I non associé au sel de calcium; en effet, bien qu'il ne soit pas capable de répéter l'effet obtenu 20 en association, ce produit possède cependant une activité évidente aussi bien dans la normalisation de la résistance à la charge de rupture des os des membres immobilisés par rapport à ceux des témoins que dans l'augmentation et dans ce cas d'une façon statistique25 ment significative, d'une telle résistance par rapport aux membres immobilisés du groupe témoin. Même au niveau de la teneur en calcium, l'effet, au moins à titre de tendance est évident et ce résultat porte à la conclusion que très probablement le sel mixte est 30 capable de provoquer au niveau physiologique une meilleure utilisation du calcium, qu'il soit endogène ou exogène. Les composés selon les exemples 1 - 48, mais de préférence les sels mixtes de chlorure de sodium et l'ion monofluorophosphate avec la L-glutamine (exemple 1), la D-glutamine (exemple 2), la L-asparagine (exemple ), la L-cystêine (exemple 13), la L- lysine (exemple ), la L-proline (exemple 32) et la D,L-proline (exemple 34), peuvent être avantageusement administrés sous des formes pharmaceutiques pour la voie orale et à des dosages correspondant & une quantité de fluor comprise entre 5 et 10 mg eten association avec des sels de calcium équivalant à une quantité de calcium comprise entre 100 et 250 mg, dans tous les syndromes 10 dérivant de la minéralisation défectueuse du tissu ostéolde (comme par exemple l'ostéoporose), comme co- adjuvants dans le traitement de trauma osseux ou dans le décours post- opératoire d'interventions chirurgicale sur les tissus ostéo-articulaires. 15 38 2599032 REVENDICATIONS 1. Composés répondant & la formule générale: AAn FP03.2NaCl dans laquelle: AA est un amino-acide de la série L;D ou D,L; n est un entier ayant la valeur 1 ou 2. 2. Composé selon la revendication 1, constitué par un sel mixte de monofluorophosphate de L-glutamine et de chlorure de sodium. 3. Composé selon la revendication 1, constitué par un sel mixte de monofluorophosphate de D-glutamine et de chlorure de sodium. 4. Composé selon la revendication 1, constitué par un sel mixte de monofluorophosphate de L-asparagine et 15 de chlorure de sodium. 5. Composé selon la revendication 1, constitué par un sel mixte de monofluorophosphate de L-cystéine et de chlorure de sodium. 6. Composé selon la revendication 1, constitué par 20 le sel mixte de monofluorophosphate de L-lysine et de chlorure de sodium. 7. Composé selon la revendication 1, constitué par le sel mixte de monofluorophosphate de L-proline et de chlorure de sodium. 8. Composé selon la revendication 1, constitué par le sel mixte de monofluorophosphate de D,L-proline et de chlorure de sodium. 9. Composés selon une quelconque des revendications 1 i 8, comme agents de traitement des 30 syndromes dégénératifs de l'os. 10. Composés répondant & la formule générale: AAn FPO3 dans laquelle AA est un aminoacide de la série L;D; et D,L et n est un entier de valeur 1 ou 2. 11. Composés selon la revendication 10, comme 39.2599032 produits intermédiaires dans la préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 12. Procédé de préparation de sels mixtes de l'ion monofluorophosphate avec -des amino-acides et de chlorure de sodium, répondant à la formule générale: AAn FPO3. 2NaCl dans laquelle AA est un amino-acide,de la série L;D; ou D,L et n est un entier ayant la valeur 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes 10 consistant à a) salifier l'amino-acide choisi avec= l'acide monofluorophosphorique dans un solvant organique non hydroxylé et séparer de la masse réactionnelle le sel simple répondant àla formule générale 15 AAn FPO3 b) dissoudre dans l'eau ledit sel simple en présence de chlorure de sodium et reprécipiter le sel mixte de chlorure de sodium au moyende l'addition d'un solvant miscible à l'eau. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel le solvant organique non hydroxylé utilisé dans l'étape a) est choisi dans le groupe constitué par l'acétone, la méthyl- éthylcétone, le tétrahydrofurane et l'acétonitrile. 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13 dans lequel la réaction de salification est effectuée en additionnant l'acide monofluorophosphorique à une suspension de l'amino-acide choisi dans le solvant, maintenue à une température entre 0 et - 10 C sous agitation et le fluorophosphate ainsi obtenu est séparé par filtration et séchage sous vide à température non supérieure à 50 C. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, dans lequel, dans l'tape b), le monofluorophosphate d'amino-acide est additionné à une solution aqueuse de chlorure de sodium, sous agitation, en maintenant la température de 35 à 45 C et la précipitation du sel mixte est effectuée par addition d'un solvant choisi dans le groupe comprenant l'acétone, la méthyléthylcêtone, l'éthanol, l'acétonitrile et le tétrahydrofurane. 16. Composition pharmaceutique pour le traitement des syndromes dégénératifs de l'os, et contenant comme principes actifs au moins un sel mixte de monofluoro10 phosphate d'un amino-acide avec du chlorure de sodium selon l'une quelconque des revendications 1 A 8, seul ou en association avec des sels de calcium. t