Brevet FR2603040A1 — publié le 19880226

La présente invention concerne la mise au point d'un vaccin contre la schistosomose. La schistosomose (ou bilharziose) est une maladie parasitaire des régions tropicales et sub-tropicales du monde entier (à l'exception de l'Amérique du Nord) ; elle s'étend même en Afrique du Nord ; il en existe un important forer en Egypte et quelques foyers ont été signalés en Espagne et au Portugal. Cette maladie affecte de 200 à 400 millions d'êtres humains. Le parasite responsable, le schistosome, est un petit ver plat dont le cycle de vie complexe passe par un hôte intermédiaire qui est un mollusque d'eau douce. Pour cette raison, on voit la maladie s'étendre avec la création des barrages et des réseaux d'irrigation destinés à la mise en valeur des contrées tropicales. On connait 5 types de schistosomes pathogènes pour l'homme : le plus répandu, S. mansoni, est commun à l'Afrique et l'Amérique ; 2 espèces, S. haematobium et intercalatum, se retrouvent seulement en Afrique et 2 autres, S. japonicum et mekongi, en Asie. La connaissance du cycle de vie du parasite est nécessaire à la mise au point d'une stratégie de prévention de la maladie. En effet, le parasite présente une adaptation quasi-parfaite aux défenses naturelles de l'site : quand il atteint le stade adulte, il échappe totalement aux mécanismes immunitaires et peut vivre de 5 à 20 ans, dans les vaisseaux sanguins proches de la paroi intestinale ou de la vessie, selon les espèces (S. mansoni ou S. haematobium respectivement). Le parasite ne se multiplie pas chez l'homme mais la femelle pond jusqu'à 3 000 oeufs par jour. Ces oeufs et les déchets du métabolisme du ver se retrouvent dans la circulation de l'hâte et provoquent des troubles divers (troubles intestinaux, urinaires, affaiblissement, anémie, formation de granulomes avec blocage des vaisseaux sanguins capillaires entraînant des fibroses tissulaires et en particulier des inflammations hépatiques graves). Les oeufs, pourvus d'un éperon, peuvent traverser la paroi intestinale ou vésicale où ils provoquent des microlésions, puis ils sont élimines. S'ils arrivent rapidement au contact de l'eau, ils y libèrent des larves ciliées (miradicium) qui nagent jusqu'à ce qu'elles pénètrent dans un mollusque. Dans cet hôte intermédiaire, la larve poursuit des cycles de multiplication asexuée qui donneront naissance à des cercaires qui seront libérées dans l'eau. (Un mollusque infecté par un seul miracidium peut produire plus de 50 000 cercaires en une vie de 8 à 10 mois). La cercaire est une larve nageante qui ne vit que 1 à 2 jours. Quand elle rencontre un mammifère, l'homme en particulier, elle pénètre au travers de sa peau. Dans la peau, elle se transforme en schistosomule, forme immature du parasite, qui va être entraîné dans la circulation sanguine, successivement vers le coeur, les poumons et enfin le foie. C'est dans la circulation hépatique que le parasite devient adulte. Le mâle et la femelle s'apparient la femelle s'installe dans un canal formé par le reploiement du corps du mâle et le couple se fixe définitivement dans un vaisseau sanguin abdominal où la femelle commence à pondre. La maturation complète du schistosomule en ver adulte prend une quinzaine de jours. Au stade adulte, le parasite a adsorbé à sa surface des molécules de son hôte et, grâce à ce camouflage, il échappe à ses mécanismes de reconnaissance et de défense immunitaires. De plus, le parasite sécrète des substances qui ont un pouvoir immunosuppresseur. Ainsi protégé, chaque couple de schistosomes peut vivre dans son hôte pendant de nombreuses années en pondant des millieurs d'oeufs chaque jour. Il existe un médicament efficace contre le parasite adulte, le Praziquantel, mais il coûte trop cher pour qu'on puisse envisager son usage généralisé dans les pays en voie de développement. De plus, il n'empêche pas la réinfection, or, en zone endémique, les populations sont en contact régulier avec des eaux contaminées par les larves. Le seul espoir sérieux de prévention de la maladie ne peut venir que de la mise au point d'un vaccin efficace contre la forme immature du parasite, le schistosomule. Ce vaccin devrait être administré aux jeunes enfants pour éviter l'infection primaire et aux individus déjà contaminés, après un traitement au Praziquantel pour prévenir la réinfection. Ce vaccin devrait contenir un (ou des) antigène(s) majeur(s) du schistosomule et induire une réaction immunitaire efficace contre la larve avant qu'elle n'échappe aux mécanismes de défense de l'hâte. Des travaux récents (voir revue par Capron et Dessaint - 1985) ont permis d'identifier un nombre limité d'antigènes protéiques présents à la surface du parasite et de sa larve et qui pourraient jouer un râle important dans l'induction d'une réponse immunitaire. L'un de ces antigènes a été mis en évidence par Ballout et al. (1985) : après immunisation de rats par des extraits de S. ir-ansoni purifiés sur gel, les anticorps induits reconnaissent un antigène de 28 kd, appelé p28, qui est présent sur les formes adulte et larvaire du parasite. Ces mêmes anticorps reconnaissent un produit de traduction in vitro desRNAm extraits du parasite adulte et une des protéines externes du schistosomule, identifiée par marquage à 1'125in Ces anticorps anti-p28, bien qu'ils ne puissent pas par eux-mêmes neutraliser le schistosomule, activent la réponse cellulaire cytotoxique qui peut tuer les schistosomules. Un échantillon de la protéine p28 purifiée a été inocule à des rats et des souris ; les animaux immunisés ont développé un haut degré de protection contre une infection expérimentale par les schistosomules (Balloul et al. 1986). Cet ensemble d'observations met en évidence l'importance de l'antigène p28 dans l'induction d'une réponse immunitaire protectrice. La présente invention concerne l'identification et la détermination de la séquence du cADN qui code pour l'antigène p28 ou au moins pour un polypeptide qui comprend les épitopes de p28 qui sont reconnus par des anticorps dressés contre la protéine p28 native. C'est pourquoi la présente invention concerne tout d'abord la séquence d'ADN codant pour la protéine p28 mature tel que décrit à la figure 1. La présente invention concerne également la protéine dont la synthèse est dirigée par ce cADN, synthèse qui peut être effectuée dans différentes cellules hôtes, bactéries, levures ou cellules supérieures, en fonction du vecteur dans lequel le cADN est inséré et des signaux de contrôle de l'expression sous lesquels il est placé. La protéine selon la présente invention peut présenter une structure primaire identique à celle de la protéine p28 native, présente dans le schistosomule, mais elle peut aussi être un dérivé de celle-ci ou une protéine p28 incomplète mais comprenant les épitopes importants pour la reconnaissance par les anticorps et donc pour l'induction de l'immunité. Cette protéine ou la protéine incomplète peut encore être fusionnée à une autre protéine (ou fragment de protéine), suite à une manipulation génétique des segments d'ADN correspondants, destinée à favoriser une meilleure expression de la protéine dans la cellule hôte ou éventuellement à provoquer son excrétion hors de la cellule. Les technologies permettant le clonage et l'expression d'un gène étranger dans différentes cellules hôtes sont connues de i'homme de métier. Elles seront illustrées dans les exemples ci-après, étant entendu que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés. L'expression du gène correspondant à p28 dans une bactérie, en l'occurence E.coli, a été obtenue avec un vecteur comprenant le promoteur de lambda et le CIIrbs comme site de fixation des ribosomes. La protéine hybride obtenue comporte une partie de la protéine CII et la protéine p28 ou une partie de celle-ci. Dans le cas où l'hâte est une levure, par exemple S. cerevisiae, il est possible d'utiliser un vecteur plasmidique de levure comportant une origine de réplication fonctionnelle dans la levure, par exemple l'origine de réplication du plasmide 2 et, un gène de sélection tel que URA3. Dans le cas présent, le promoteur utilisé est celui du gène PGK avec la partie 5' du gène PGK qui conduit soit à une protéine fusionnée, soit à une protéine mature. Enfin, lorsque l'hâte est une cellule de mammifère, on utilisera de préférence comme vecteur d'expression un poxvirus, par exemple le virus de la vaccine dans lequel le gène codant pour la protéine sera placé sous le contrôle d'une séquence d'expression de ce gène par le poxvirus. Ce virus recombinant comportera le gène codant pour une protéine selon l'invention inséré de préférence dans le gène TK de la vaccine et-sous le contrôle d'un promoteur fort tel que le promoteur de la protéine 7,5 K de la vaccine.Le gène codant pour la protéine selon l'invention pourra également être fusionné à unerégion codant pour une séquence signal fonctionnelle, par exemple la séquence signal de l'interleukine 2, pour assurer l'excrétion de la protéine hors de la cellule, dans ce cas la protéine correspondante sera une protéine hybride comportant une partie de protéine non originaire des schistosomules. L'invention concerne également les cellules hôtes transformées par les vecteurs d'expression des protéines selon la présente invention ainsi qu'un procédé de prépa ration de telles protéines, caractérisé en ce qu'on cultive ces cellules hôtes et que l'on récupère les protéines selon 1' invention. Bien entendu, les méthodes de culture, de récupé ration et de séparation des protéines dépendront de l'hâte mais sont connues de l'homme de métier. Enfin, la présente invention concerne des coflpo- sitions pharmaceutiques utiles comme vaccins contre la schistosomose, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins une protéine ou un poxvirus selon l'invention dans un sup port pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne en particulier des vaccins vivants, caractérisés en ce qu'ils comportent des virus de la vaccine recombinants vivants qui expriment la protéine selon l'invention, présentés dans un support pharmaceutiquement acceptable. De préférence, ces vaccins seront sous forme administrable par exemple par injection. Le support pharmaceutiquement acceptable pourra être un support aqueux pour injection. Le processus de vaccination devra être adapté au type de vaccin utilisé (protéine ou virus vivant). Enfin, la présente invention concerne des antisérums dressés contre une protéine selon la présente invention. Dans la présente invention les séquences de nucléotides des gènes ou d'acides aminés des protéines qui sont représentés dans les figures ne seront pas reprises mais sont partie intégrante de l'invention et de la présente description. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Les figures ci-annexées sont les suivantes La figure 1 représente la séquence complète du cADN déduite des séquences de STG06, XTG08, STGO9, XTG10 et XTG11. La phase ouverte de lecture qui commence au 7ème nucléotide code pour un polypeptide de 211 acides aminés, d'un poids moléculaire de 28 kd. La figure 2 représente la construction de pTG44 par intégration d'un insert EcoRI de ATG06 dans pTG1924. pTG1924 est un dérivé de pTG908 avec un site EcoRI mis en phase, situé à 46 pb en aval du codon initiateur de CII. pTG44 code pour une protéine fusionnée cII/p28 d'un poids moléculaire de 25 kd. La figure 3 représente la séquence de la protéine de fusion cII/p28 codée par le bloc d'expression inséré dans pTG44. La figure 4 représente des extraits totaux et fractions insolubles des extraits de E. coli TGE901 pTG44 après électrophorèse en gel d'acrylamide-SDS et coloration au bleu de Coomassie. La flèche indique la position de la protéine de 25 kd. A. extrait total de TGE901 pTG44 à 300C B. fraction non soluble du même extrait C. extrait total de TGE901 pTG44 après induction pendant 7 heures à 370C D. fraction non soluble du même extrait E. extrait total de TGE901 pTG44 après induction pendant 7 heures à 420C F. fraction non soluble du même extrait G. fraction F. solubilisée en SDS 0,2 % H. extrait total de culture contrôle de TGE901 pTG1924 après 7 heures à 420C I. fraction non soluble du même extrait. La figure 5 représente des extraits de S. cerevisiae TGY1sp4 produisant la protéine p28 codée par les constructions pTG1885 et pTG1886, après électrophorèse en gel d'acrylamide-SDS et coloration au bleu de Coomassie. A. extrait de TGY1sp4/pTG1885 (protéine non fusionnée de 28 kd) B. extrait de culture témoin TGY1sp4 C. extrait de TGYîsp4/pTG1886 (protéine fusionnée de 30 kd). La figure 6 représente des extraits de E. coli et S. Cerevisiae produisant une protéine de 28 kd fusionnée ou mature, analysés en "Western blot" avec des anticorps de lapin spécifiques de la p28 native. Les anticorps fixés sont reconnus par des anticorps anti-lapin, marqués à la biotine et ce complexe est ensuite révélé par un réactif streptavidine-peroxydase et une coloration par HRP (bio Rad). A. extrait total de coli TGE901 pTG44 B. fraction non soluble du même extrait C. extrait tdal de S. cerevisiae, TGY1sp4/pTG1885, produi sant la protéine mature D. extrait total de S. cerevisiae produisant la protéine mature fusionnée aux 22 premiers acides aminés de PGK, TGY1sp4/pTG1886 E. extrait de S. cerevisiae témoin négatif F.G. mêmes extraits que C et D, 2 fois moins concentrés. La figure 7 représente la mise en phase du site EcoRI par mutagénèse dirigée dans la région du cADN correspondant aux 9 premiers acides aminés de l'interleukine 2 humaine. La figure 8 représente la construction de pTG45 et pTG46 par insertion des fragments EcoRI de ATG06 et XTG09 dans le site EcoRI de pTG188-I (voir construction de la figure 7) La figure 9 représente la structure de la protéine de fusion IL2/p28 codée par pTG45. On remarque la présence d'un peptide signal qui permet l'excrétion d'une protéine de 24 kd comprenant la plus grande partie de p28. La figure 10 represente la structure de la protéine de fusion IL2jp28 codée par pTG46. Le peptide signal permet l'excrétion d'une protéine de 16 kd qui contient la partie centrale de l'antigène p28. La figure 11 représente l'insertion dans un plasmide portant le gène vaccinal TK, du gène codant pour IL2/p28 placé sous le contrôle du promoteur vaccinal 7,5 K. Insertion de ce bloc d'expression dans le génome viral par double recombinaison entre les séquences TK. La figure 12 représente.la détection des protéines sécrétées dans le milieu de culture de cellules BHK21 infectées par les virus recombinants W .TG.p28 Sm-l et W .TG.p28 Sm-2, par l'anticorps de lapin ou de rat spécifique de la p28 native A et D surnageant de VV.TG.p28Sm-1 B et E surnageant de VV.TG.p28Sm-2 C et F surnageant de culture infectée par un W sauvage A, B, C détection par des anticorps de lapin D, E, F détection par des anticorps de rat. Les numéros correspondent à des isolements indépendants. La figure 13 représente la détection d'anticorps antip28 par test "Western blot" avec la protéine p28 native, dans les sérums de rats immunisés avec la protéine cII/ p28 synthétisée par E.coli. -NRS : sérum de rat contrôle, non inoculé -SR28-20,J8, J11, J16, J23 : sérum de rats récoltés 8, 11, 16 et 23 jours après l'inoculation de la protéine cII/p28 -SR28 : sérum de rat inoculé avec la protéine p28 native. La figure 14 représente l'activité biologique des mêmes sérums que dans la figure 13, mesurée dans un test de cytotoxicité-éosinophile-dépendante contre les schistosomules (voir tableaux I, Il et III). - SR28-20 représente l'antisérum dirigé contre un frao- ment cloné de 20 kDa correspondant à l'antigène 28 kDa de S.mansoni récupéré à différents temps après la seconde injection -SR-28 représente l'antisérum dirigé contre p28 native et récupéré 14 jours après la seconde injection. EXEMPLE 1 Identification et clonage d'un cADN codant pour une protéine p28. La stratégie choisie pour cloner le gène codant pour un antigène p28 dont la séquence n'est pas connue a été d'identifier les produits d'expression dans E. coli d'une banque de cADN de schistosomes, à l'aide d'anticorps polyclonaux spécifiquement dressés contre la p28. Ces anticorps ont été induits par immunisation de lapins et de rats avec des extraits du parasite S. mansoni adulte, fractionnés sur gel. Préparation de la banque de cADN A partir de l'ARN extrait de schistosomes adultes, on synthétise le brin d'ADN complémentaire par l'action de la transcriptase réverse de MLV. L'ADN rendu double brin par l'action du fragment Klenow de la polymérase de coli est ensuite traité à la nucléase S1 pour rendre ses extrémités franches. On sélectionne sur gradient de sucrose les fragments correspondant à la taille recherchée, c'est-à-dire entre 500 et 4 000 pb. On ajoute à ces fragments une queue de résidus dG et on les insère dans le site EcoRI du dérivé du phage lambda gt 10 (Huynh, 1984), par l'intermédiaire d'un adaptateur synthétique 5'-AATTCCCCCCCCCCC-3' (Le Bouc et al. 1986). Après ligation, les phages recombinants sont empaquetés in vitro. Une banque de 2.106 phages ainsi constituée est ensuite amplifiée par inoculation dans E. coli POP 101 (Lathe, 1977). Après amplification, les phages sont concentrés au PEG, purifiés par deux centrifugations en gradient de ClCs et leur ADN est extrait. Les inserts de cADN sont récupérés par digestion par EcoRI et purifiés sur gradient de sucrose. Les fractions de 500 à 2 000 pb sont ensuite insé rye'dans un vecteur d'expression, le dérivé du phage lambda gt 11 qui permet l'expression de gènes étrangers sous le contrôle du promoteur lac, après fusion du cADN avec le gène de la ss-galactosidase de E. coli (Young et Davis, 1983). Criblage de la banque et sélection de candidats Un échantillon de cette banque en-lambda gt 11 est inoculé sur la souche de E. coli Y1090 (Young et Davis, 1983) à une dilution représentant 1.105 phages par botte de 90 mm de diamètre. L'induction de l'expression de la protéine sous contrôle du promoteur lac est déclenchée à 420C en présence d'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside. Les protéines synthétisées sont adsorbées sur filtres de nitrocellulose pour être incubées en présence de l'anticorps de lapin spécifique de p28. Les anticorps fixés sont reconnus par un second anticorps anti-lapin, marqué à la biotine ; ce complexe est ensuite révélé par une réaction à la streptavidine-peroxydase puis une coloration par HRP (Bio Rad). Cette détection par anticorps permet d'identifier les phages recombinants dont l'insert de cADN dirige la synthèse d'une protéine ou fraction de protéine portant des épitopes reconnus par les anticorps spécifiques anti-p28. Une première sélection conduit à 3 isolats indépendants, lambda TG06 lambda TG08 et lambda toue9, oui contiennent des inserts de cADN de 650, 700 et 350 paires de bases respectivement. Les séquences nucléotidiques des inserts portés par ces candidats se chevauchent et comprennent une région qui pourrait correspondre à la région C-terminale d'une protéine hypothétique, d'un poids moléculaire de 28 kd. Un nucléotide synthétique 5'-GGARTAGTTGGTTTGATT-3', marqué au 32p, complémentaire de l'extrémité 5' de la région codante de l'insert du lambda TG06 a été synthétisé et utilisé pour effectuer un nouveau criblage de la banque de cADN dans lambda gt 10. De cette faucon, deux nouveaux candidats ont pu être isolés, lambda TG10 et lambda TG11 , qui contiennent tous deux une séquence nucléotidique complète codant pour une protéine de 211 acides aminés et correspondant à un PM de 28 kd. Dtermination de la séquence du cADN porté par les phages recombinants et de la protéine correspondante La séquence complète du cADN (confirmée par la détermination de la séquence des différents candidats) et la structure primaire en acides aminés qui en découle sont présentées dans la figure 1. Ce résultat et les travaux publiés actuellement ne fournissent aucune information sur la séquence N-terminale du premier produit de traduction du gène natif ni sur l'existence éventuelle d'un précurseur et d'un peptide signal précédant la protéine mature. Toutefois, la localisation exacte du premier aminoacide n'est pas essentielle dans le contexte de l'invention car la stratégie adoptée pour l'isolement de ce gène et pour son expression comprend la recherche des épitopes majeurs qui sont présents dans la p28 et qui sont reconnus par le système immunitaire de l'hâte. Cet argument sera utilisé dans les exemples suivants qui décrivent l'expression des épitopes importants dans différents organismes. Expression de l'antigène p28 La stratégie générale développée pour l'expression des épitopes antigéniques présents dans la p28 a été de fusionner le fragment cloné de cADN dans la phase de lecture correcte à une séquence nucléotidique codant pour la région N-terminale d'une protéine efficacement exprimée et bien caractérisée. La protéine hybride obtenue ainsi sera en général reconnue par les anticorps dressés contre la p28 mature native et on peut espérer qu'elle induise une réponse immunitaire contre le parasite. Avec cette hypothèse de travail différents systèmes d'hôtes ont été utilisés pour analyser les propriétés immunogéniques des protéines de fusion, à la fois in vivo et in vitro, et seront développés dans les exemples suivants. EXEMPLE 2 Expression dans E. coli Pour obtenir l'expression d'un antigène p28 dans E. coli, un dérivé du plasmide d'expression pTG908, décrit dans la demande de brevet 83 00909, a été utilisé pour synthétiser une protéine de fusion dont la structure est indiquée dans la figure 3. Le vecteur pTG908 contient une origine de réplication, le promoteur PL du bactériophage lambda et la séquence de fixation des ribosomes de cII incluant l'extrémité N-terminale du gène cII avec des sites de restriction appropriés en aval du signal d'initiation de la traduction. Le site BamHI à 39 pb en aval du codon ATG a été utilisé pour insérer un site EcoRI au moyen d'un adaptateur double brin comprenant les oligomères suivants 5'-dGATCCGAATTCG-3' 3'-GCTTAAGCCTAGd-5' Le plasmide résultant, pTG1924, contient un site EcoRI unique avec le codon GAA en phase avec le codon d'initiation du gène cII. Tous les inserts de cADN provenant des recombinants lambda gtîl qui ont donné un signal positif après sélection avec le sérum anti-p28 ont été insérés directement dans ce site. Quand l'insert se retrouve dans l'orientation correcte, ceci donne une séquence de nucléotides codant pour l'extrémité N-terminale du gène cII et continuant en phase avec la séquence de cADN codant pour l'antigène p28 ou pour une partie de celui-ci. Une des constructions plasmidiques résultantes, pTG44, contenant l'insertion dans ce site EcoRI du fragment dérivé de lambda TG 06 est représentée à la figure 2. La séquence de la protéine de fusion cII-p28 avec un poids moléculaire calculé de 25 kd est donnée à la figure 3. Une culture de E. coli N4830 transformée par pTG44 est mise en croissance sur milieu LB jusqu'à une DO600 de 0,2 puis la synthèse de la protéine de fusion est induite par une augmentation de température à 420C, pendant les 8 heures suivantes. En fin de culture, les extraits cellulaires ont été analysés sur gel d'acrylamide-SDS par coloration au bleu de Coomassie (figure 4). Le produit de fusion cIIp28 est récupéré dans la fraction non soluble obtenue après lyse des cellules par sonication. La protéine est récupérée avec une pureté de l'ordre de 80 % par extraction de la fraction non soluble en présence de 0,2 % de SDS. Une analyse par "Western blot" de la préparation finale montre que cette protéine particulière est efficacement reconnue par les anticorps de lapin dressés contre l'antigène de la p28 native (figure 5). EXEMPLE 3 EXPRESSION DANS-LA LEVURE S. CEREVISIAE Deux types de constructions ont été réalisées pour exprimer le cADN de p28 dans la levure : la première aboutit à une protéine de fusion comprenant, du côté N-terminal, les 22 premiers acides aminés de la phosphoglycérate kinase (PGK) de levure ; la seconde donne une protéine semblable à la protéine maturenaturelle. - CONSTRUCTION D'UN VECTEUR PORTANT UNE FUSION DE GENES CODANT POUR PGK ET p28 (pTG 1886) 10) L'insert EcoRI du lambda TG10 contenant le cADN de la protéine p28 a été introduit dans un plasmide navette coli-levure, pTG 836. ce plasmide est un dérivé de pBR322 qui contient l'origine de réplication du plasmide de levure 2 microns, le gène URA 3 (brevet 84.12598) et le gène PGK de levure (Hitzemann et al. 1982). un site unique EcoRI a été introduit entre le site BamHI (situé 20 codons en aval du codon initiateur de PGK) et le site Sall (présent dans la séquence du pBR322), par insertion d'un adaptateur synthétique 5'. GATCTGAATTCAGATCTC- 3' 3' - ACTTAAGTCTAGAGAGCT- 5' le plasmide résultant est le pTG 1880 l'insertion du fragment EcoRI de lambda TG10 dans le site EcoRI de pTG 1880, dans l'orientation correcte donne le pTG 1883. 20) Le bloc d'expression PGK-p28 porté par ce plasmide va être repris pour être inséré dans un vecteur d'expression de levure, le pTG 848 (brevet 85.06672). Ceci nécessite une manipulation intermédiaire dans le phage M13 un fragment HindIII-BglII contenant le bloc d'expression PGK-p28 est inséré dans le M13TG131 (Kieny et al. 1983) entre les sites HindIII et BamHI, pour donner le M13TG1884. cette construction permet, par l'existence de sites de restriction voisins, de récupérer le même bloc d'expression sous forme de fragment SmaI-BglII. ce fragment est ensuite introduit entre les sites SmaI et BglII du vecteur d'expression pTG848. le plasmide résultant est le pTG1886. 3 ) La levure TGY1sp4 a été transformée avec ce plasmide pTG1886. Des extraits cellulaires bruts de ces cultures ont été analysés par électrophorèse sur gel d'acrylamide - SDS et par la technique de "Western blot" Les figures 5 et 6 montrent clairement l'apparition d'une nouvelle bande protéique d'un PM de 30 kd, comme attendu pour la protéine de fusion PGK-p28 et qui est reconnue par les anticorps dressés contre la p28 native extraite des schistosomes. - CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION PORTANT SEULEMENT LE cADN DE p28, SOUS LE CONTROLE DU PROMOTEUR PGK 10) Dans la construction M13TG1884 décrite plus haut, le codon initiateur de la protéine p28 est précédé des 22 premiers codons du gène PGK et de 8 codons dus à la technique de clonage (en particulier les résidus dC).Ces 90 paires de bases additionnelles ont été délétées par mutagénèse in vitro du M13TG1884 simple brin en présence de l'oligonucléotide 5' -CAACAAAATATAAACCTGoeGAGCATATC-3' qui correspond aux 16 premiers nucléotides de la séquence leader du mRNA du PGK suivi des nucléotides du début de la séquence codante de p28 ; entre ces 2 séquences se trouve l'ATG qui colncide à la fois avec l'ATG initiateur du PGK et celui de p28. 20) Le dérivé correctement délété, M13TG1884m a été digéré par SmaI et BlgII et le fragment portant le cADN de p28 non fusionné, placé sous le contrôle du promoteur de PGK, a été inséré dans le vecteur d'expression pTG848 (comme décrit plus haut), pour donner le pTG1885. 30) La levure TGY1sp4 a été transformée avec:ce plasmide pTG1885. Des extraits cellulaires bruts de ces cultures ont été analysés par électrophorèse sur gel d'acrylamide-SDS et par la technique de "Western blot". Les figures 5 et 6 montrent clairement l'apparition d'une nouvelle bande protéique d'un PM de 28 kd et qui est reconnue par les anticorps dressés contre la p28 native extraite des schistosomes. EXEMPLE 4 EXPRESSION DANS UN VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANT Les oNDN portés par les plages lambda TG06 et TG09 ont été introduits dans des vecteurs appropriés pour pouvoir ultérieurement être insérés dans le génome du virus de la vaccine et, ainsi, être exprimés dans des cellules de mammifères. Les vecteurs selon la présente invention dérivent des vecteurs qui ont été mis en oeuvre pour l'expression de l'interleukine-2-humaine (voir brevet FR NO 85 09480 ). On a ainsi construit un dérivé de pTG188 qui contient un site EcoRI dans une région de la séquence nucléotidique qui correspond à 9 aminoacides en aval du résidu alanine N-terminal de l'interleukine-2 native (figure 7). Les inserts de cADN de lambda TG06 et lambda TG09 ont été insérés en orientation correcte entre les sites EcoRI de pTG188-I pour donner les plasmides pTG45 et pTG46 qui codent pour une protéine de fusion IL-2/p28 d'un poids moléculaire de 24 kd et 16 kd respectivement (figure 8), comme cela est représenté figures 9 et 10. La présence d'un peptide signal en amont de la construction permet la sécrétion de la protéine dans le milieu de culture. Les parties importantes des plasmides pTG45 et pTG46 comportent le gène viral TK interrompu par la séquence codant pour la protéine de fusion IL2-p28, placée sous le contrôle d'un promoteur efficace, celui de la protéine vaccinale 7,5K. Ces séquences insérées dans le gène TK de la vaccine peuvent être transférées dans le génome du virus de la vaccine par une double recombinaison réciproque (figure 11) comme cela a été décrit précédemment (Panicalli et Paoletti, 1982 ; Mackett et al., 1982 t Kieny et al., 1984). Les virus recombinants Vv.TG.p28Sm-1 et VV.TG.p28Sm-2 contenant les cADN dérivés de lambda TG06 et lambda TG09 respectivement sont utilisés pour infecter une monocouche de celluls BHK21. Après 24 heures à 370C, le surnageant de la culture est testé pour déterminer la présence de la protéine de fusion IL-2/p28, ceci par adsorption sur filtre de nitrocellulose et incubation avec des anticorps de rat ou de lapin, spécifiques de la p28 native. La détection des anticorps fixés est effectuée par incubation avec un antisérum biotinylé dressé contre les immunoglobulines totales de rat ou de lapin ; ce complexe est ensuite révélé par une réaction à la streptavidine-peroxydase et une colo- ration finale en présence d'un réactif colorant HRP (Bio-Rad). Aussi bien pour VV.TG.p28Sm-1 que Vv.TG.p28Sm-2, des antigènes spécifiques (plus de 100 ng/ml) peuvent être détectés (figure 12) dans le milieu de culture et ceci pour différents recombinants indépendants, alors que les surnageants de cellules infectées uniquement avec le virus sauvage ne donnent pas de signal significatif. EXEMPLE 5 VACCINATION DES ANIMAUX AVEC L'ANTIGENE p28 PRODUIT PAR MANIPULATION GENETIQUE L'effet biologique des protéines recombinantes contenant un ou plusieurs épitopes majeurs de p28 native a été analysé en comparaison avec la réponse observée après immunisation de rats avec la p28 native mature isolée d'extraits totaux de parasites adultes. Les protéines de fusion produites à la fois par les microorganismes tels que E. coli ou S. cerevisiae ou par un virus de la vaccine recombinant peuvent être utilisées pour une telle approche, mais seuls les résultats obtenus avec la protéine de fusion cII/p28 sont explicités ci-après. - IMMUNISATION DES RATS 20 rats mâles "Fisher" âgés de 3 mois sont immunisés par injection intrapéritonéale avec 50 ssg d'une protéine de fusion cII/p28 (exemple 2) en présence d'adjuvant de Freund. Les animaux reçoivent une seconde dose après 2 semaines et les antisérums sont prélevés à partir du jour 8. 4 "pools" de sérums comprenant 5 échantillons chacun sont essayés en 3 fois pour tester la présence d'anticorps reconnaissant la protéine p28 native et la cytotoxicité des sérums à l'égard des schistosomules. - DETECTION DES ANTICORPS SPECIFIQUES Les sérums des rats immunisés avec la protéine cII/p28 extraite de E. coli sont évalués dans un test de "Western-blot" pour leur réaction contre la p28 d'un extrait total de parasites adultes, séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. La figure 13 montre une reconnaissance non ambiguë de la protéine p28 native par ces sérums. L'intensité maximale de cette réponse est atteinte au jour 23 et est pratiquement égale à celle observée avec les sérums d'animaux immunisés avec l'antigène natif. - EVALUATION DE LA CYTOTOXICITE DEPENDANTE DES EOSINOPHILES Les mêmes sérums ont été évalués dans un test de cytotoxicité dépendante des éosinophiles, selon la technique décrite par Capron et al. (1981) 50 schistosomules de S. mansoni sont incubés en présence de chaque sérum à tester (non chauffé), ou des contrôles appropriés, et en présence d'éosinophiles (cellules péritonéales non adhérentes de rat Lou contenant de 40 à 70 % d-eosinophiles). Le mélange réactionnel comprend 6000 cellules effectrices pour 1 schistosomule, dans un volume total de 200 ssl. Après 48 heures d'incubation à 370C, le pourcentage de mortalité des schistosomules est évalué par examen au microscope. Les résultats présentés dans le Tableau I montrent clairement la présence d'un facteur cytotoxique capable d'induire un haut taux de mortalité des schistosomules, taux très proche de celui induit par un sérum de rat infecté par S. mansoni. - MISE EN EVIDENCE DU ROLE D'IgE SPECIFIQUES DANS LA REACTION DE CYTOTOXICITE Le même test de cytotoxicité a été effectué avec du sérum chauffé (2 heures à 560C) et avec du sérum chauffé additionné de complément. Les résultats présentés dans le Tableau II montrent que le facteur responsable de la cytotoxicité est thermosensible et que cette perte d'activité ne peut pas etre compensée par l'addition de complément. De plus, on peut éliminer sélectivement les IgE des sérums à étudier par une adsorption par un antisérum de chèvre spécifique des IgE de rat, couplé à du sépharose B. Les sérums ainsi traités, puis dialysés, sont testés pour leur activité cytotoxique dépendante des éosinophiles. Le Tableau III montre que la déplétion sélective des sérums de rats en IgE empêche l'expression de la cytotoxicité. Celle-ci est donc bien spécifique des IgE des sérums de rats immunisés par la protéine cII/p28. Dépôt de souche La souche suivante a été déposée à la Collection Nationale de Culture de Microoraanismes, 28 rue du Docteur Roux 75724 PARIS Souche de Ecoli N 4830 mentionnée dans l'exemple 2 transformée par le plasmide pTG44 NO de dépôt I 562 Tableau I Test de cytotoxlcité dépendante t'éosinophiles Etude des sérums de rats immunisé6 par la protéine cII/p28 produite dans E. coli. Source d'anticorps Dilution finale Z de cytotoxicité après du sérum 48 heures d'incubation Sérum de rat immunisé par cII/p28, récolté au jour JS 1/16 60.5 + 2.5 1/32 55.5 + 5 1/64 6.5 + 6.5 J10 1/16 85.5 t 0.5 1/32 76 + 3.5 1/64 57 + 4.7 J16 1/16 85.5 + 0.5 1/32 78 + 6 1/64 52 t 3 J23 1/16 88 + 3.5 1/32 92 + 0 1/64 52 + 11.5 Sérum de rat infecté par 1/16 97 + 1 S. mansoni Sérum de rat sain 1/16 0 Tableau Cytotoxicité dépendante d'éosinophiles Etude de la participation du complément Sérum de rat immunisé par la protéine cII/p28 X de cytotoxicité après produite par E. coli (dilution finale : 1/16) 48 heures d'incubation 16 jours après lmmunisation Sérum non chauffé 85.5 t 0.5 Sérum chauffé 26.5 + 5.5 Sérum chauffé + complément de cobaye 38.5 t 0.5 Sérum chauffé + complément de cobaye chauffé 21.5 t 1.5 Tableau III Cytotoxicité dépendante d'éosinophiles Etude de la participation des anticorps d'ieotype IgE Source d'anticorps Z de cytotoxicité après 48 heures d'incubation Sérum de rat immunisé par cII/p28 produite dans E. coli, récolté au jour J16 48.5 J23 40 Sérum de rat sain 0 Effluent de colonne anti-IgE J16 0 J23 0 Sérum de rat sain o BIBLIOGRAPHIE Capron, A. et Dessaint, J.P. (1985) Ann. Rev. Immunol. 3, 455-476 Balloul, J.M., Pierce, R.J., Grzych, J.M. et Capron, A. (1985) Mol. Biochem. Parasitol. 17, 105-114 Balloul, J.M., Grzych, J.M., Pierce, R.J. et Capron, A. (1986) soumis pour publication Young, R.A. et Davis, R.W. (1983) Science 222, 778-782 Huynh, T.V. in DNA Cloning Techniques : A Practical Approach (Glover, D., Ed.) IRL Press, Oxford (1984) Le Bouc, Y., Dreyer, D., Jaeger, F., Binoux, M. et Sondermeyer, P. (1986) FEBS Lett. 196, 108-112 Lathe, R. et Lecocq, J-P. (-1977) Virology 83, 204-206 Hitzemann, R.A., Hagie, F.E., Hayflick, J.S., Chen, C.Y., Seeburg, P.H. et Derynck, R. (1982) Nucleic Ac. Res. 10, 7791-7808 Kieny, M.P., Lathe, R. et Lecocq, J-P. (1983) Gene 26, 91-99 Smith, G.L., Mackett, M. et Moss, B. (1983) Nature 302, 490-495 Panicalli, D. et Paoletti, E. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 Mackett, M., Smith, J.L. et Moss, B. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 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Immunol. 126, 1764-1768 REVENDICATIONS 1.- Protéine qui comprend les épitopes de la protéine p28 qui sont reconnus par les anticorps dressés contre la protéine p28 native. 2.- Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine hybride comportant une partie de protéine non originaire des schistosomules. 3.- Protéine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence complète de la protéine p28. 4.- Protéine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est d'origine bactérienne. 5.- Protéine selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est préparée à tartir de levures ou de cultures cellulaires. 6.- Poxvirus caractérisé en ce qu'il comporte un gène codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 placé sous le contrôle des éléments qui permettent l'expression de ce gène par le poxvirus. 7.- Poxvirus selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit poxvirus est le virus de la vaccine. 8.- Poxvirus selon la revendication 7, caractérisé en ce que les éléments qui permettent l'expression du gène comportent le promoteur viral du aène 7,5K de la vaccine. 9.- Cellule incorporant un bloc ou vecteur d'expression d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5. 10.- Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie transformée par un plasmide comportant le gène codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 sous le contrôle d'un promoteur bactérien. 11.- Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure transformée par un plasmide comportant le gène codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 sous le contrôle d'un promoteur de levure. 12.- Cellule de mammifère infectée par un poxvirus selon l'une des revendications 6 à 8. 13.- Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu approprié une cellule selon l'une des revendications 9 à 12 et que l'on récupère ensuite ladite protéine. 14.- Séquence d'ADN codant pour la protéine p28 selon la revendication 1. 15. - Séquence d'ADN selon la figure 1. 16. - Composition pharmaceutique destinée notamment à la prévention de la schistosomose, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif au moins une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 ou un poxvirus selon l'une des revendications 6 à 8. 17. - Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif un poxvirus selon l'une des revendications 6 å 8, vivant. 18. - Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif un poxvirus selon l'une des revendications 6 à 8, tué. 19. - Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable à l'homme ou à l'animal. 20. Anticorps dressés contre une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 ouinduit par un poxvirus selon l'une des revendications 6 à 8. 21. - Application des anticorps selon la revendication 20 ou de la protéine selon l'une des revendications 1 à 5 à titre d'agents de diagnostic de la schistosomose.