Brevet FR2598434A1 — publié le 19871113

La présente invention concerne de nouveaux agents immunostimulants dérivés du composé dénommé D.25. Le produit dénommé D.25 est le polysaccharide extrait des protéoglycanes membranaires bactériens composé essentiellement d'unité galactose et ayant un poids moléculaire de 30 + 10 kD. Ce polysaccharide a été décrit dans le brevet français n 84 13844, bien que le poids moléculaire soit présenté comme supérieur. Ce polysaccharide possède des propriétés immuno10 stimulantes, notamment vis-à-vis de l'induction d'interféron endogène et de l'activation des cellules NK (Natural Killers). Ce polysaccharide est préférentiellement isolé d'une souche mutante non capsulée et non pathogène de Klebsiella pneumoniae biotype a, déposée à la Collection Nationale de l'Institut 15 Pasteur sous le n 145-I-IP. La présente invention concerne des dérivés d'hémisynthèse de ce composé D. 25, plus particulièrement il s'agit de composés de type amide, ester ou éther du D.25 ainsi que les sels et dérivés d'ammonium quaternaire. Parmi ces composés, il faut citer les dérivés du D.25 avec des acides, des amines ou des alcools à chaîne grasse, c'est-à-dire présentant au moins 4 atomes de carbone alicyclique. Ce type de composés à chaîne lipophile modifie le caractère hydrophile du D.25 et donc son affinité et les interactions avec les membranes cellulaires. Le greffage sur cette molécule d'une partie hydrophobe permet d'augmenter et/ou de moduler sa capacité d'interaction avec la membrane des cellules immunocompétentes et donc ses propriétés immunostimulantes et adjuvantes. Ainsi, dans le cas des allergènes, comme par exemple ceux du pollen, du venin des hyménoptères, des acariens, 10 ou l'ovalbumine, qui pourront être avantageusement couples au D.25, les propriétés immunitaires des conjugués obtenus sont différentes de celles des allergènes initiaux. On peut ainsi orienter la réponse immunitaire vers une protection avec apparition d'IgG au lieu de la réponse allergique associée 15 à l'apparition d'IgE. Bien entendu, les chaînes peuvent comporter d'autres fonctions ou hétéroatomes selon la nature du composé désiré. D'autre part, parmi les dérivés du D.25, il faut 20 citer les conjugués du D.25 avec une drogue ayant une activité pharmacologique; dans ce cas, la drogue est fixée au D. 25 par l'intermédiaire d'un bras bifonctionnel comportant une fonction acide, amine ou alcool, comme indiqué précédemment, et une autre fonction dépendant de la drogue à conjuguer. 25 Parmi les composés en cause, on peut citer les dérivés de formules: /D.25/7-CO-NH-R (I) /5.257-NH2-C-R (II) O /D.257-o-R (III) dans lesquelles R est un radical aliphatique ou acyl pour (I) et (III) et amino pour (II) qui peut être substitué. Parmi les radicaux aliphatiques, il faut citer les radicaux alcoyles droits ou ramifiés, ayant de préférence de 1 à 30 atomes de carbone, de préférence de 4 à 16 atomes de carbone, ainsi que les radicaux alcényles et alcynyles ayant de 2 à 30 atomes de carbone et de préférence de 4 à 16 atomes de carbone. Parmi les radicaux acyles, on préfère les radicaux 10 correspondant aux radicaux aliphatiques précédents. Parmi les radicaux amino, il faut citer les radicaux amino correspondant également aux radicaux aliphatiques précédents. Les radicaux acyles ou amino peuvent également 15 correspondre à des peptides ou des protéines naturelles ou synthétiques. Parmi les substituants de R, on peut citer les radicaux amino primaire, secondaire ou tertiaire, les radicaux carboxyles, acyloxy et les radicaux aliphatique-020 et hydroxy. Les radicaux substituants de R sont, de préférence, des radicaux amino secondaire ou tertiaire, les substituants étant des radicaux aliphatiques qui peuvent être substitués comme défini précédemment par exemple: 25 _R' R = -(Alk)-N R" Alk est un radical alcoylène en C4 à C10,. R' et R" sont H, alcoyle en C1 à C16 ou hydroxyéthyle, ainsi que les radicaux acyles correspondants. Comme précédemment, les substituants de R peuvent être les radicaux acyles ou amino correspondant à des peptides ou des protéines naturelles ou synthétiques. Parmi les composés en cause, il faut citer ceux 5 dans lesquels R comporte comme substituant une drogue ayant une activité du même type que l'activité du D.25, ou une activité associée, par exemple l'acide rétinolque. Par"activité associée", on entend désigner, soit une activité complétant celle du D.25, soit une activité 10 exaltant l'activité du D.25. Il peut, enfin, s'agir de composés destinés à vectoriser le D.25 ou bien, au contraire, à être vectorisés par le D.25. Dans le cas o R comporte un peptide ou une protéine, il s'agit de préférence d'un peptide ou d'une protéine présentant en elle-même une activité antigénique, immunogénique et/ou allergénique, par exemple, dont les propriétés sont modulées ou modifiées par conjugaison avec le D.25. Les composés selon la présente invention sont 20 plus particulièrement des immunomodulateurs et des adjuvants destines à être utilisés comme médicaments dans les applications thérapeutiques ci-après: immunostimulants des défenses immunitaires non spécifiques, ò adjuvants pour les vaccins microbiens ou viraux, 25. anticancéreux, inducteurs d'interféron endogène, activateurs du système NK et des lymphocytes cytotoxiques. "carrier" sur lequel peuvent être couplés des allergènes tels que ovalbumine, allergènes d'accariens, d'hyménoptères, 30 de pollen. Les composés selon l'invention peuvent être obtenus par des procédés connus. En particulier, il est possible de coupler le /D.257 et la fraction dérivée tel que R-X par les procédés de couplage mis en oeuvre dans la synthèse des peptides que X soit une fonction amine ou acide. Ainsi, on peut faire réagir le composé D.25 avec le composé R-X en présence d'un agent de couplage tel qu'une carbodiimide, après avoir si nécessaire activé 10 une ou plusieurs fonctions et protégé d'autres fonctions, comme cela est connu dans ce type de synthèse. Il est possible également de mettre en oeuvre les techniques de couplage connues, telles que le couplage avec le glutaraldéhyde. Pour obtenir des éthers, il peut être nécessaire d'activer les groupes hydroxyles; il s'agit là d'une technique connue dans la synthèse des sucres. L'invention concerne également l'utilisation de ces nouveaux dérivés à titre d'agents immunostimulants, 20 immunomodulateurs et adjuvants. En particulier, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comportant au moins un tel agent, et, de préférence, un composé immunogénique ou un produit cytotoxique. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE 1 PROCEDE DE FABRICATION DU D.25 1) Isolement du protéoglycane membranaire brut 1.1) La biomasse de la souche de Klebsiella pneumoniae 145-I-IP est dispersée dans du tampon Tris-HCl (10 mM) pH 7,0 glacé contenant NaCl (0,15 M), puis soumise à un broyage mécanique destiné à rompre les parois cellulaires. 1.2) Le lysat bactérien est clarifié par centrifugation continue à 15 000 g et le surnageant recueilli. 1.3) Le surnageant est traité par addition d'acide trichloracétique, q.s. p. 5 % (P/V),à froid pour éliminer les impuretés (acides nucléiques et protéines) par précipitation. 1.4) Le précipité est éliminé par centrifugation 10 continue à 15 000 g. Le surnageant limpide est recueilli puis neutralisé par NaOH. 1.5) La solution est alors dialysée puis concentrée par ultrafiltration continue sur membranes Millipore coupant à 10 000 Daltons. * La solution concentrée obtenue à ce stade correspond au protéoglycane membranaire brut. 2) Isolement de la fraction polysaccharidique brute 2.1) Hydrolyse alcaline ménagée du protéoglycane membranaire: cette opération est destinée à dépolymériser 20 le protéoglycane membranaire brut pour libérer la fraction polysaccharidique, dans les conditions suivantes: La solution concentrée de protéoglycane membranaire brut obtenue précédemment est additionnée de NaOH concentré pour avoir une concentration finale de 0,5 M en NaOH. On hydrolyse ensuite pendant 1 heure à 56 C. Apres refroidissement rapide, la solution est neutralisée par HCl. 2.2) La solution neutralisée est clarifiée par filtration sur filtrepresse puis concentrée par ultrafiltration sur membrane Millipore coupant à 10 000 Daltons. * La solution concentrée obtenue à ce stade correspond à la fraction polysaccharidique brute. 4,P 7 2598434 3) Purification de la fraction polysaccharidique 3.1) Le concentrat obtenu au paragraphe 2.2 est soumis à une première chromatographie sur colonne moulée avec du Sephacryl S 1 000 (Pharmacia) dans le tampon Tris- HCl 5 (10 mM) pH 7, ce qui permet d'éliminer les contaminants de haut poids moléculaire contenus dans le pic d'exclusion. 3.2) Le pic d'élution de la colonne contenant la fraction polysaccharidique est encore faiblement contaminé par des protéines de poids moléculaire très proche (70 000 à 10 100 000). Ces protéines sont hydrolysées 2 heures à 37 C par action de la protéinase K à 50 gg/ml dans le tampon Tris-HCl (10 mM) pH 7 contenant EDTA (1 mM). 3.3) Les protéines contaminantes dont le poids moléculaire a été réduit par protéolyse sont séparées de la 15 fraction polysaccharidique par chromatographie sur colonne de Sephacryl S 200 (Pharmacia) dans l'eau distillée. 3.4) Le pic d'élution contenant la fraction polysaccharidique purifiée est recueilli, puis concentré par ultrafiltration sur membrane Millipore coupant à 10 000 daltons. 20 4) Obtention du D.25 à partir de la fraction polysaccharidique La fraction polysaccharidique obtenue au paragraphe 3.4 renferme quelques molécules d'acidesgras qui sont éliminés après hydrolyse acide ménagée pour libérer des sites de couplage en vue de la préparation des dérivés d'hémisynthèse 25 du D.25. 4.1) La solution concentrée obtenue au paragraphe 3.4 est additionnée d'acide acétique concentré à raison de 1 % (V/V) puis chauffée à 90 C pendant 90 minutes. 4.2) Après refroidissement rapide, les substances 30 lipidiques dissociées du D.25 précipitent et sont séparées par centrifugation. 4.3) Le surnageant ainsi obtenu est neutralisé par NaOH dilué puis dialysé et concentré par ultrafiltration sur membrane Millipore coupant à 10 000 daltons. 4.4) La solution concentrée est filtrée sur membrane 0,2 Nm puis le filtrat est lyophilisé. * Ce lyophilisat correspond au D.25 faisant l'objet de la présente invention et à partir duquel seront réalisés les dérivés d'hémisynthèse. Son poids moléculaire est alors voisin de 30 10 kD. 10 EXEMPLE 2 STRUCTURE DU D.25 La structure du D.25 comporte, d'une part une chaîne polysaccharidique linéaire constituée par la répétition environ 5 fois d'un motif monomérique de 10 sucres, et, d'autre part, d'une séquence de liaison unique, plus complexe, à laquelle sont liées de courtes chaînes peptidiques. L'unité monomérique répétitive de la chaîne polysaccharidique linéaire ne renferme que du galactose sous forme pyrane et furane dans les proportions suivantes: 20 3 B Gal p, 3 a Gal p, 2 B Gal f, 2 a Gal f. La séquence de cette unité monomérique est la suivante: /-PS_7 =... 7_ Gal p -, Gal f - a Gal p 1,3 1,3 1,3 B Gal p - a Gal f - o Gal p - a Gal f - B Gal p 1,3 1,3 1,3 1,3 - a Gal p -b Gal f -7- structure de liaison 1,3 1,3 1,3 0. 0 0 Q 0o 44c 0J os o ON - > I a2 aa m 0 l'extrémité de la chaîne polysaccharidique lindaire. Elle contient des résidus glucose, galactose, glucosamine, heptose et acide mannodéoxyoctulosonique. De courtes chaînes peptidiques sont liées à cette structure. La séquence probable est la suivante: /-PS_7 - a Glc p -- a Gal p - a Hep p - a Hep p 1,3 1,2 1,3 1,3 l NH a Glc p NH2 a Hep a Oc.A- Man Oc. A 7 1,5 2,7 4 2 Man Oc. A aOl, Il a, tA C, l, IgJ 15 Abréviations: e Gal p = Galactopyranose a Gal p = a Galactopyranose B Gal f = B Galactofuranose a Gal f = a Galactofuranose a Glc p = a Glucopyranose a Glc p, NH2 = a Glucosamine a Hep p = a Heptose (D. Mannoheptose) Man Oc. A = 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid Les aminoacides suivants composent les chaînes peptidiques associées: Acide aspartique (3) Acide glutamique (2) Sérine (1) Proline (1) Glycine (1,5) Alanine (2) Valine (1) Leucine (1) Lysine (1) EXEMPLE 3 COUPLAGE DU N-BUTYRAMIDE AU D.25 (N-butyramide = CH3-CH2-CH2-CONH2; PM = 87,12) a) 100 mg de D.25 sont dissous dans 5 ml d'eau distillée et le pH de la solution est ajusté à pH 4,5 par HCl dilué. b) 3 mg de N-butyramide sont dissous dans 1 ml d'eau distillée. On ajoute à cette solution 1 ml d'une solution aqueuse à 6 mg/ml d'EDCI (1-éthyle-3-(3-diméthyl10 aminopropyl)-carbodiimide hydrochloride). Le pH est ajusté à pH 4,5 puis on agite pendant 1 heure à température ambiante. Les deux solutions (a) et (b) sont mélangées puis agitées pendant 1 nuit à température ambiante. Le complexe D.25-butyramide ainsi formé est 15 ensuite débarrassé des excès de réactifs par chromatographie sur une colonne de Séphadex G.25 (Pharmacia) de 2 x 60 cm dans l'eau distillée. Le pic d'exclusion contenant le complexe D.25butyramide est recueilli puis lyophilisé. 20 EXEMPLE 4 COUPLAGE DE L'OCTYLAMINE AU D.25 (octylamine = CH3(CH2)6-CONH2; PM = 129,2) a) 100 mg de D.25 sont dissous dans 5 ml d'eau distillée et le pH de la solution est ajusté à pH 4,5 par 25 HCl dilué. b) 5 mg d'octylamine sont dissous dans 4 ml d'alcool éthylique puis on ajoute à cette solution 1 ml d'une solution aqueuse contenant 20 mg de CMCI (1-cyclohexyle3-(2morpholinoethyl)-carbodiimide). Le pH est ajusté à 4,5 30 puis on agite pendant 1 heure à température ambiante. Les deux solutions (a) et (b) sont mélangées puis agitées pendant 1 nuit à température ambiante. L'excès de réactifs est ensuite séparé du complexe par chromatographie sur une colonne de Séphadex LH-20 (Pharmacia) préalablement équilibrée avec de l'éthanol à 50 %. Le pic contenant le complexe est recueilli au volume d'exclusion et le complexe est précipité par addition de 4 volumes d'acétone. Le précipité est recueilli par filtration, lavé par l'acétone puis séché sous vide sur P205. EXEMPLE 5 COUPLAGE DE L'ACIDE DODECANOIQUE AU D.25 (acide dodécanoique = CH3(CH2)10-COOH; PM = 200,32) a) 100 mg de D.25 sont dissous dans 5 ml d'eau distillée. b) 5 mg d'acide dodécanoique sont dissous dans ml de THF (tétrahydrofuranne) puis on ajoute à cette solution 15 6 mg de EEDQ (Néthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline). On agite 1 heure à température ambiante. Les deux solutions (a) et (b) sont mélangées et agitées une nuit à température ambiante. L'excès d'acide gras non lié est ensuite éliminé 20 au moyen de plusieurs extractions au chloroforme et le complexe D.25-acide dodécanolque est dialysé contre l'eau distillée puis lyophilisé. EXEMPLE 6 COUPLAGE D'UN DIAMINOSPACER AU D.25 POUR PERMETTRE LE COUPLAGE 25 ULTERIEUR DE SUBSTANCES AYANT UN CARBOXYLE LIBRE (exemple: couplage 1,4-diaminobutane-D.25 = D.25-DAMB) mg de D.25 et 300 mg de diaminobutane dans 50 ml de tampon phosphate de potassium (0,1 M) pH 6,1 sont additionnés de 300 mg de EDC (1-éthyl-3-(3-déméthylamino30 propyl)-carbodiimide, HCl). Après deux heures d'agitation à température ambiante, le mélange est dialysé contre du tampon NaHCO3 (0,05 M) pH 8,3 à 4 C, changé plusieurs fois pour éliminer les réactifs en excès. Le dialysat est lyophilisé = D.25-DAMB. EXEMPLE 7 COUPLAGE D'UNE POLYLYSINE AU D.25-DAMB OBTENU A L'EXEMPLE 7 mg de D.25-DAMB et 60 mg de polylysine de PM 5 000 - 10 000 dans 5 ml d'eau distillée sont additionnés de 20 mg de cyanamide (Sigma). Après agitation 1 nuit à température ambiante le mélange est dialysé contre de l'eau distillée et le pic contenant le complexe (1 pic d'élution) est recueilli puis lyophilisé: D.25-polylysine. EXEMPLE 8 REALISATION D'UN DERIVE D.25-DAMB-ACIDE RETINOIQUE mg de D.25-DAMB et 5 mg d'acide rétinoique sont dissous dans 3 ml de tétrahydrofurane. On ajoute à cette solution 18 mg de DCCI (dicyclohexylcarbodiimide) puis on laisse en agitation pendant 18 heures à température ambiante. 15 On ajoute ensuite 3 ml d'eau distillée puis on procède à une série d'extraction par le chloroforme pour extraire l'excès de réactifs. Le dérivé D.25-acide rétinoique présent dans la phase aqueuse est dialysé contre de l'eau distillée puis lyophilisé. EXEMPLE 9 COUPLAGE DE L'OVALBUMINE (ova) AU D.25 mg de D.25 et 100 mg d'ova sont dissous dans 10 ml d'eau distillée. Le pH de la solution est amené à 4,7 avec HCl 0,1 N. On ajoute à cette solution 1 ml d'une solution 25 contenant 0,5 mg de CMCI (1-cyclohexyl-3(2-morpholinoéthyl)carbodiimide). On agite alors pendant 1 heure à température ambiante en maintenant le pH à 4,7 puis une nuit à + 10 C. Le conjugué D.25-ova est purifié par chromatographie sur colonne de Sephacryl S-200 (Pharmacia) en tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. Le pic contenant le conjugué D.25-ova (premier pic d'élution) est recueilli, dialysé, puis lyophilisé. Le conjugué ainsi obtenu contient 1 molécule d'ovalbumine par molécule de D.25. REVENDICATIONS 1) Dérivé polysaccharidique caractérisé en ce qu'il s'agit d'un amide, d'un ester, d'un éther, d'un sel ou d'un dérivé d'ammonium quaternaire du D.25 avec une amine, un acide ou un alcool. 2) Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé est obtenu avec une amine, un acide ou un alcool gras. 3) Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amine, l'acide ou l'alcool contient au moins 10 4 atomes de carbone alicyclique. 4) Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amine, l'acide ou l'alcool est couplé avec une drogue ayant une activité pharmacologique. ) Dérivé selon la revendication 1, caractérisé 15 en ce qu'il présente la formule: / D.25 7-CONH-R () /-D.25 7-NH-CO-R (II) i/ D.25 _7-0-R (III) dans lesquelles R est un radical aliphatique ou acyl pour (I) et (III) et amino pour (II) qui peuvent être substitués. 6) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les substituants éventuels sont choisi parmi les radicaux amino primaire, secondaire ou tertiaire, les radicaux carboxy, acyloxy ou alcoxycarbonyl, les radicaux 25 hydroxy et aliphatique-oxy. 7) Dérivé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que le radical R comporte de 1 à 30 atomes de carbone alicyclique. 8) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé 30 en ce que le radical R comporte de 4 à 16 atomes de carbone alicyclique. 9) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que R est le radical d'un peptide ou d'une protéine. 2598434 ) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le substituant de R est le radical d'un peptide ou d'une protéine. 11) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que: R R R = (alk)-N. alk est un radical alcoylène en C4 à C10, R' et R" sont, indépendamment, H, alcoyle en C1 à CO10 ou hydroxyéthyle, ou bien une drogue. 12) Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que: / D.25_7-C-NH-C-C H 0 0 / D.25_7-C-NH-C-C H. Il SI 7 15 0 O /- D.25 7-NH-C-C12H23 _/ D.25_7-c-NH-C4H8-NH2 o / D.25_7-C-NH-C4H8-NH-C-Ret 0 0 D.25_/7-C-NH-C 4H8-NH-C-PolyLys O O /D.25 7-allergène Ret étant le radical de l'acide t4tinoique, 20 PolyLys étant le radical de la polylysine. 13) Agent immunostimulant selon l'une des revendications 1 à 12. 14) Composition thérapeutique comportant au moins un agent selon la revendication 13. 15) Composition selon la revendication 14, comportant en outre un composé immunogénique ou un produit cytotoxique.