Brevet FR2599149A1 — publié le 19871127

REACTIF POUR RENDRE TRANSPARENTS DES MILIEUX BIOLOGIQUES ET SES APPLICATIONS ANALYTIQUES. L'invention a pour objet un réactif pour la transparisation de milieux biologiques et ses applications analytiques. On sait que de nombreux milieux biologiques présentent une opalescence naturelle rendant impossible toute mesure spectrophotométrique directe. Un traitement préalable doit être appliqué pour transpariser le milieu, c'est-à-dire pour le rendre 10 transparent, en lui conférant une faible absorbance, inférieure à 0,1 unité de densité optique entre 400 et 800 nm environ. Dans le cas par exemple du lait, la turbidité observée est due essentiellement à la présence de 15 phosphocaséinates de calcium et aux globules gras. Des réactifs, constitués par des mélanges de solvants, ont été proposés pour la dissolution des constituants colloïdaux. Ainsi, Bosset et al ont étudié la dissolution 20 intégrale du lait-au moyen de solvants mixtes tels que les mélanges soude/eau/n-butylamine ou soude/eau/tétrahydrofurane ( voir références bibliographiques (1) et (2) en fin de description). Ces solvants permettent de doser les protéines 25 totales du lait par la méthode dite de Biuret, mais présentent l'inconvénient de rendre nécesssaire une forte dilution du lait. Un autre réactif de transparisation du lait a été décrit par Linden et al (3). Ce réactif, appelé 30 ci-après réactif de Linden, est constitué par un mélange de n-butylamine/cyclohexanone/octylphénol de polyoxyéthylène (tel que celui commercialisé sous la marque Triton X). Il présente l'avantage d'entraîner une transparisation rapide en ne nécessitant qu'une faible 35 dilution. Toutefois, la viscosité, même dans le mélange final transparisé, est élevée, de l'ordre de 1,1i%. à 20'C, ce qui le rend difficile à manipuler. En outre, son agressivité s'avère importante vis-à-vis de polymè5 res plastiques. Les instruments de mesure à base de tels polymères ne peuvent donc pas être utilisés. L'agressivité de ce solvant s'exerce également à l'égard des bactéries présentes dans le milieu biologique. Il faut alors effectuer les mesures rapidement, avant la lyse 10 des cellules. De plus, de par sa composition, ce réactif ne permet pas de déterminer certains paramètres. Ainsi il n'est pas approprié à la détermination du taux de groupements aminés dans un échantillon étant donné qu'il renferme lui-même une amine qui peut interférer lors 15 d'une mesure avec ceux de l'échantillon. Les développements des travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amené à élaborer un nouveau réactif applicable à la transparisation du lait et de tout autre milieu biologique sous forme d'émulsion ou de 20 suspension. Ce réactif dépourvu de n-butylamine, constituant principal du réactif de Linden décrit ci-dessus, comporte une combinaison de constituants permettant d'obtenir des effets nouveaux avantageux. En particulier, les inventeurs ont constaté que l'utilisation en 25 combinaison de certains constituants permet de disposer d'un réactif de transparisation de plus grande stabilité, d'agressivité moindre, de viscosité réduite et de supprimer les incompatibilités dans la détermination de certaines fonctions dans des milieux 30 biologiques. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau réactif de transparisation permettant d'éliminer instantanément -la turbidité d'un milieu biologique donné, plus aisé à manipuler grâce à une viscosité ré35 duite et de très grande stabilité. Elle vise également l'utilisation de ce réactif pour réaliser des analyses physiques, chimiques et biologiques de milieux biologiques opalescents, plus spécialement de produits alimentaires ou de suspensions obtenues à partir de produits alimentaires ou encore de produits cosmétiques. Le réactif de transparisation de l'invention, à base d'un mélange de solvants, est caractérisé en ce 10 qu'il renferme en combinaison: - une cétone aliphatique constituant un solvant lipophile, soluble en milieu aqueux, stable et permettant une mesure dans le proche UV, - un agent détergent tensio-actif jouant le rôle de liant, à base d'un dérivé de polyoxyalcoylène non io15 nique ou d'un sel alcalin amphotère, - une base et/ou un agent tensio-actif ayant un effet dénaturant vis-à-vis des structures conformationnelles des constituants du milieu biologique à analyser. D'une manière avantageuse, l'utilisation en combinaison de ces éléments conduit à un réactif permettant d'obtenir instantanément la transparisation d'un milieu donné, de stabilité améliorée par rapport aux réactifs 25 connus. De plus, on observera que ce réactif est dépourvu de n-butylamine ce qui permet d'éviter les inconvénients d'odeur de ce produit et toute interférence avec les amines d'un milieu dont on souhaite déterminer le 30 taux en amines. Contrairement aux réactifs connus, il n'entraîne pas d'hydrolyse du réactif d'Ellman, le dithio-bis-2-nitrobenzoyle ou DTNB et permet ainsi de déterminer le taux de SH ou de S-S par exemple du lait. De préférence, la cétone aliphatique est choisie 35 parmi les cétones présentant une constante diélectrique E de l'ordre de 18,5. Il s'agit notamment de cétones à chaine linéaire, renfermant au plus 4 atomes de carbone. Une cétone préférée est constituée par la butanone-2. Cette cétone présente l'avantage d'une densité relativement faible et d'un paramètre de solubilité dans l'eau élevé. Une autre cétone appropriée est constituée par la pentane-dioneo. L'agent détergent tensio-actif est un dérivé de polyoxyalcoylène non ionique du type éther, alcool ou ester ou un sel alcalin amphotère. Cet agent sert de liaison entre les phases aqueuses, contenant les protéines, et les phases lipi15 diques. Un dérivé- particulièrement préféré est le polyoxyéthylène p,toctylphénol tel que celui commercialisé sous la marque Triton X. Ce produit présente l'avantage d'être le moins 20 dénaturant, le plus aisément disponible et d'un faible coût. D'autres dérivés de polyoxyalcoylène sont cependant appropriés, parmi lesquels on citera: - le polyoxyéthylène nonylphénol tel que celui 25 commercialisé sous la marque Triton N, - le polyoxyéthylène alcool tel que celui commercialisé sous la marque Brij, - le polyoxyéthylène ester de sorbitol tel que celui commercialisé sous la marque Tween, - le polyoxyéthylène ester d'acide gras (monolaurate) tel que celui commercialisé sous la marque Span. Parmi les sels alcalins amphotères, on citera le désoxycholate de sodium et le diiodosalicylate de 35 lithium. Comme indiqué ci-dessus, le réactif de l'invention renferme également, en combinaison avec le solvant lipophile et l'agent détergent tensio-actif définis dans ce qui précède, une base et/ou un agent tensio-actif à effet dénaturant. De préférence, la base est constituée par de la soude. On constate en effet que les ions sodium exercent un effet favorable sur la désagrégation des micel10 les des protéines du milieu biologique à analyser et les rendent solubles. L'agent tensio-actif est un sel de sodium, de préférence en particulier le dodécyl sulfate de sodium. Un tel produit permet de neutraliser les charges 15 électriques des protéines ce qui supprime les interactions entre les protéines. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif de transparisation comprend de la butanone-2, du Triton X, de la soude et/ou du dodécylsulfate 20 de sodium. La combinaison de ces éléments- conduit à un réactif stable à température ambiante, qui se conserve bien à l'état congelé. Au contact de cette combinaison, on constate 25 également une grande stabilité du milieu biologique à étudier ce qui laisse le temps de faire les mesures nécessaires en série. Un autre avantage du réactif réside dans sa viscosité, de l'ordre de 0,97 Pq. à 20 C, qui est donc ré30 duite par rapport à celle du réactif à base de n-butylamine de l'art antérieur décrit ci-dessus. Les proportions relatives de ces constituants sont ajustées en fonction du taux de protéines et de lipides du milieu biologique à analyser. Ainsi, avec un 35 milieu pauvre en lipides le taux de solvant lipophile pourra être considérablement abaissé. D'une manière générale, les quantités de solvant lipophile et d'agent tensio-actif détergent sont ajus5 tées l'une par rapport à l'autre. De même la quantité de base est ajustée par rapport à celle de l'agent tensioactif dénaturant. L'un de ces groupes, à savoir solvant lipophile et agent détergent tensioactif d'une part, base et/ou 10 agent dénaturant d'autre part est présent à raison d'au moins 15 %, et d'au plus 85%. On obtient une réaction de transparisation appropriée en mélangeant tout d'abord le solvant lipophile à raison de 15 à 85% en volume, et l'agent détergent 15 tensio-actif à raison de 85 à 15% en volume. La base est utilisée à raison de O à O,5N et l'agent dénaturant à raison de 15 à 0% en volume. Grâce à son pouvoir dissolvant élevé, le réactif de l'invention s'avère particulièrement approprié à la 20 transparisation de milieux biologiques aux fins d'analyses. Il permet en effet une dissolution intégrale des constituants protéiques et lipidiques et ne nécessite qu'une faible dilution. Il est ainsi possible d'effectuer rapidement et directement des dosages spectromé25 triques et ce jusque dans le proche UV étant donné sa faible absorbance entre 330 et 800 nm. Parmi les applications analytiques, on peut citer: - le dosage de groupes spécifiques, tels que des 30 fonctions amines afin d'étudier notamment l'affinage de fromages à pâte molle, des groupements sulfhydriles et des ponts disulfures,ce qui permet d'apprécier le degré de chauffage d'un échantillon, d'éléments minéraux par exemple Ca, Fe, Mg, Cl ou NO3, - la détermination des activités enzymatiques par exemple, dans le lait et les produits laitiers, de la phosphatase alcaline, de la peroxydase pour contrôler un traitement thermique, des protéinases et de la P-Dgalactosidase pour contrôler par exemple la qualité de la matière première, -le dénombrement des micro-organismes présents dans un milieu avec identification, l'étude des courbes de croissance de germes. Ces études permettent notamment d'estimer la vitesse de croissance de bactéries lacti10 ques dans un levain de laiterie, d'identifier, par analyse d'image, certaines souches, après transparisation de laits, levains, yaourts ou autres produits laitiers, de mettre en évidence l'agressivité du réactif de transparisation envers les bactéries (l'observation au micro15 scope électronique de la lyse de cellules apparaît beaucoup moins rapide qu'avec les réactifs connus). Ces mesures peuvent être' effectuées sur tout produit renfermant des protéines et des lipides, plus spécialement des produits alimentaires tels que les 20 produits laitiers, les laits entiers, écrémés, demiécrémés, en poudre, le lactosérum, les fromages,les levains, les produits carnés, les produits en émulsion du type eau dans l'huile, ou encore des produits cosmétiques notamment les crèmes, aux fins de vérification de 25 l'absence de produits toxiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent, et en se référant aux figures 1 à 5 - la figure 1 représentant les photos d'une 30 bactérie du lait avant transparisation, 1 heure après transparisation respectivement avec le réactif antérieur de Linden et avec le réactif de l'invention, - la figure 2, des courbes concernant les propriétés spectrales de différents laits industriels 35 transparisés, - la figure 3, la courbe obtenue en dosant le taux de groupes NH2 dans des fromages, et - les figures 4 et 5, respectivement les courbes spectrométriques et néphélémétrique de vitesse de croissance d'une bactérie lactique. Exemple 1: Préparation d'un réactif de transparisation et application à l'analyse du lait. On élabore un réactif formé du mélange 10 quaternaire suivant-: - soude 0, 1 N, - butanone -2, - Triton X-100, - SDS à 1 %. Dans un tube à essai, on ajoute 2 ml de ce mélange à 1 ml d'échantillon de lait écrémé ou demiécrémé, ou 0,5 ml d'échantillon de lait entier ou 1 ml de suspension dans l'eau chaude de produits laitiers (yaourts à 10 %, fromages à pâtes fraîches à 10 %, fro20 mages à pates molles ou à pates pressées à 5 %, crème à % en émulsion). On incube'2 à 5 mn dans un bainmarie à 37C 1. L'absorption résiduelle, dans le cas d'un lait écrémé varie de 0,010 à 0, 098 entre 800 et 330 nm ce qui 25 permet d'effectuer des réactions colorimétriques qui peuvent être lues au spectromètre d'absorption moléculaire. Sur la figure 1, on a représenté les photos (a) de spectrococcus thermophilus CNRZ 302 30 présente dans le lait, (b) de ces bactéries 1 heure après transparisation par le réactif de Linden de l'art antérieur, (c) I heure après transparisation avec le réactif de l'invention. -Les résultats obtenus montrent que les bactéries ne sont pratiquement pas lysées lorsqu'on utilise le réactif de l'invention (voir photo lc) alors que cette lyse apparaît nettement en examinant la photo lb obtenue après transparisation avec le réactif connu. Ces résultats mettent donc en évidence la faible agressivité du réactif de l'invention. Sur la figure 2, on a rapporté les courbes illustrant les propriétés spectrales de différents laits 10 industriels transparisés. La courbe 1 correspond à celle du réactif pur et les courbes 2, 3 et 4 à celles d'un lait frais écrémé, d'un lait UHT écrémé et d'un lait surchauffé écrémé. L'examen de ces courbes montre la faible absorbance du réactif de l'invention. 15 Exemple 2: Application du réactif de l'exemple 1 au dosage d'enzymes dans le lait. Application au dosage de l'activité Phosphatasique: 1' Principe La phosphatase alcaline hydrolyse son substrat, le p-nitrophénylphosphate disodique. La libération du p-nitrophénol est suivie par spectrométrie après dissolution totale de tous les composants du milieu réaction25 nel par le réactif de l'invention. 2' Réactifs On utilise les réactifs suivants: - solution aqueuse tampon de diéthanolamine 24,3. 10-3 mol/l, pH 10,6, - substrat: pnitrophénylphosphate 5.10-3 mol/l final dans la solution tampon décrite ci-dessus, - - réactif de l'exemple 1. 3' Mode opératoire On introduit dans un tube à essai 0,5 ml de lait dilué au 1/100ème et 1 ml d'une solution substrat. Après agitation, on laisse incuber à 37'C pendant 15 mn, puis on ajoute 2 ml de réactif. On agite, et on lit dans un intervalle de temps de 5 mn l'extinction de la solution à 420 nm, à 37'C. 4-Expression des résultats On dose un témoin sans incubation: L'activité phosphatasique est exprimée en p mole de p-nitrophénol libérée par ml de lait en fonction du temps. La valeur moyenne trouvée sur 22 laits de grand mélange est de 55 p moles de 4 nitrophénol libéré/ml lait/15 mn. Application au dosage de l'activité Peroxvdasicue: 1 Principe Cette méthode repose sur la décomposition de l'eau oxygénée par la peroxydase et fixation de l'oxygène atomique sur un accepteur. La mesure du colorant ainsi produit se fait par spectrométrie après dissolution totale des divers com20 posants du milieu réactionnel par le réactif de l'invention. 2' Réactifs On utilise les réactifs suivants: - solution aqueuse de pphénylène diamine,2HCl à 2 % filtrée (P.E.D.), - eau oxygénée à 10 % V/V, - solution aqueuse de NaOH 3,1 mol/l, - réactif de l'exemple 1 à pH apparent 13,7. 30 3' Mode opeSatoire On amène le pH du P.E.D. à 7 avec la solution aqueuse de NaOH ci-dessus. On introduit dans un tube à essai 0,5 ml de lait dilué au 1/10ème, puis on ajoute 0,5 ml de la solution de P.E.D. pH 7, puis 0,2 ml de la solution H202. Après agitation, on ajoute 0,2 ml de la solution 1 1 NaOH et 2 ml du réactif de l'invention. On agite le mélange et on lit l'extinction de la solution à 470 nm, à 37'C. On place un témoin avec du lait bouilli en suivant le même mode opératoire dans la cuve de référence du spectromètre. 4 Résultats La mesure de l'activité peroxydasique est exprimée en unité activité arbitraire par ml de lait en 10 fonction du temps Une unité arbitraire par ml de lait est égale à une augmentation de l'absorbance de 1/1000ème d'unité selon les conditions opératoires précédentes. La valeur moyenne observée sur 22 laits de grand mélange = 410 unités. Application au dosage de l'activité protéinasique Dar l'utilisation des substrats synthétiques spécifigues. 1- Principe Les activités protéolytiques sont mises en évidence par l'emploi de différents substrats de synthèse appartenant à la série des 4nitroanilides, qui sont hydrolysés au cours de l'incubation. La mesure se fait 25 par spectrométrie après dissolution totale du milieu réactionnel par le réactif de l'invention. 2' Réactifs On utilise les réactifs suivants: - solution tampon pH'8: 30. triethanolamine 0,094 mol/1, azide de sodium 0,02 %. - substrats: L-alanine-4-nitroanilide ou N-acétyl-L-alanine-4-nitroanilide par exemple. Le substrat est dissous dans le tampon à la 35 concentration de 5.10-3 mol/i final. - le réactif de l'exemple 1. 3 Mode opératoire On mélange dans un tube à essai 0,5 ml de lait et 1,5 ml du tampon-substrat. On agite et on laisse incuber de O à 24 heures à 37'C. On ajoute 2 ml de réactif de l'invention, on soumet à agitation puis on laisse 15 mn à 37C. On procède à une lecture de l'extinction de la 10 solution à 410 nm, à 37'C. 4' Expression des résultats Un témoin est dosé selon le même mode opératoire mais sans incubation. Les résultats sont exprimés en p moles de 4-ni15 troaniline libérée par ml de lait en fonction du temps. 15 La valeur moyenne trouvée sur 22 laits de grand mélange est de - 1 000 pmole/ml lait/24 h pour le substrat Lalanine-4-nitroanilide, - 800 pmole/ml lait/24 h pour le substrat N20 acétyl-L-alanine-4-nitroanilide. Exemple 3: Application du réactif de l'exemple 1 au dosage des groupements sulfhydriles dans les laits. 25. A 1 ml d'échantillon (lait dilué au 1/2 dans un tampon pH 8 Gly 92 mMTris 1 mM), on ajoute 1 ml d'urée 8 M (dans le tampon pH 8), puis 50 pl de réactif DTNB (4 mg de 5.5'-dithio-bis-2-nitrobenzoate par ml). On incube 10 mn à température ambiante, puis on ajoute sous.agitation 2 ml du réactif de transparisa30 tion. On laisse 2 mn à 37'C, puis dans un intervalle de mn, on effectue une lecture à 412 nm. On obtient les résultats suivants: lait frais écrémé 1,90 pg SH/g de lait, lait instantané écrémé 1,47 pg SH/g de lait, lait UHT écrémé 55 g SH/g de lait. lait UHT écrémé 0,55 pg SH/g de'lair. Exemple 4: Application du réactif de l'exemple 1 au dosage de groupements NH2 dans les laits et fromages. A 1 ml d'échantillon (lait dilué au 1/10e, suspension de fromage à 1 % dans l'eau chaude), on ajoute 1 ml de réactif TNBS (acide trinitro-benzène sulfonique à 0,1 % dans NaHCO3 4 % pH 8). - On incube 2 h à 37'C, puis on ajoute 1 ml de 10 tampon NaHCO3 4 % pH 8, 5, on ajoute 0,5 ml d'HCl 0,1 N, et 1,5 ml de réactif de transparisation. On laisse le mélange 2 mn à 37C, puis dans un intervalle de 30 mn, on effectue une lecture à 420 nm. On a représenté sur la figure 3, les courbes de 15 mesure du taux de NH2 avec un brie de lait pasteurisé (courbe x- x) et un brie de lait cru (courbe * -)par semaine par rapport au taux de NH2 du glycocolle exprimé en méq. x 10-5M. (De manière classique, les résultats obtenus avec chaque solution de brie sont appréciés en 20 fonction d'une courbe étalon établie avec le glycocolle en opérant dans les mêmes conditions). D'une manière avantageuse, une telle détermination du taux de groupe -NH2 peut donc être effectuée en utilisant le réactif de l'invention pour transpariser un 25 milieu biologique opalescent. EXEMPLE 5: Estimation de la vitesse de croissance de bactéries. On rapporte sur les figures 4 et 5 les résultats obtenus avec Streptococcus thermophilus CNRZ 302 en opé30 rant selon Kouomègne et al (4). La figure-4 correspond à la mesure de la densité optique à 650nm en fonction du temps en heures et la figure 5 à la mesure de la tension enregistrée au néphélémètre laser en fonction du temps en heures. Sur ces figures, les courbes *-N corespondent au logarithme du nombre de bactéries dénombrées en fonction du temps et les courbes 4- aux mesures effectuées avec du lait transparisé conformément à l'invention. 5.Les résultats obtenus sur ces courbes montrent qu'il est possible d'évaluer rapidement le nombre de germes présents dans le lait. REFERENCES BIBLIOGRAPHIOUES (1) Bosset J.O. Blanc, B.H. et Plattner E. Trav. Chim. Aliment. Hyg. (1977), 68 225-239. (2) Bosset, J.O. Blanc B.H. et Plattner E., Trav. Chim. Aliment. Hyg. (1977), 68, 504-512. (3) Linden G, Humbert G, Desnouveaux R. et Picard J. Le Lait (1982), 62, 209-219. (4) Kouomègne R., Bracquart P; et Linden G, Le Lait (1984), 64, 418-435. REVENDICATIONS 1. Réactif à base d'un mélange de solvant, pour la transparisation d'un milieu biologique, caractérisé en ce qu'il renferme en combinaison -: une cétone aliphatique constituant un solvant lipophile, soluble en milieu aqueux, stable et permettant une mesure dans le proche UV, = un agent détergent tensio-actif jouant le rôle de liant, à base d'un dérivé de polyoxyalcoylène non ionique ou d'un sel alcalin amphotère, - une base et/ou un agent tensio-actif ayant un effet dénaturant vis-à-vis des structures conformation15 nelles des constituants du milieu biologique à analyser. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cétone aliphatique est choisie parmi les cétones présentant une constante diélectrique de l'ordre de 18,5. 3. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la cétone est une cétone à chaîne linéaire, renfermant au plus 4 atomes de carbones de préférence le butanone-2. 4. Réactif selon l'une quelconque des revendi25 cations 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent détergent tensio-actif est un dérivé de polyoxyalcoylène non ionique du type éther, alcool ou ester ou un sel alcalin amphotère. 5. Réactif selon la revendication 4t caractérisé 30 en ce que l'agent détergent tensio-actif est constitué par le polyoxyéthylène p,t-octylphénol tel que celui commercialisé sous la marque Triton X. 6. Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent détergent tensio-actif est choisi parmi le polyoxyéthylène nonylphénol tel que celui 35 commercialisé sous la marque Triton N, le polyoxyéthylène alcool tel que celui commercialisé sous la marque Brij, le polyoxyéthylène ester de sorbitol tel que celui commercialisé sous la marque Tween, le polyo5 xyéthylène ester d'acide gras (monolaurate) tel que celui commercialisé sous la marque Span. 7. Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent détergent tensio-actif est un sel alcalin amphotère choisi parmi le désoxycholate de 10 sodium et le diiodosalicylate de lithium. 8. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la base est de la soude. 9. Réactif selon l'une quelconque des revendi15 cations 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif est un sel de sodium, de préférence le dodécyl sulfate de sodium. 10. Réactif pour la transparisation d'un milieu biologique, caractérisé en ce qu'il comprend de la 20 butanone-2, du Triton X, de la soude et/ou du dodécylsulfate de sodium. 11. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un des groupes, à savoir solvant lipophile et agent détergent 25 tensio-actif d'une part, base et/ou agent dénaturant d'autre part est présent à raison d'au moins 15%, et d'au plus 85%. 12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le solvant lipophile est présent à 30 raison de 15 à- 85% en volume, l'agent détergent tensio-actif de 85 à 15% en volume, la base de 0 à 0,5N et l'agent dénaturant de 15 à 0% en volume. 13. Application du réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à la transparisation, aux fins d'analyse, de produits renfermant des protéines et 35 des lipides, plus spécialement des produits alimentaires tels que les produits laitiers, les laits entiers, écrémés, demi-écrémés, en poudre, le lactosérum, les fromages, les levains, les produits carnés, les produits 5 en émulsion du type eau dans l'huile, ou encore des produits cosmétiques notamment les crèmes. 14. Application selon la revendication 13 pour le dosage de groupes spécifiques tels que des fonctions amines, des groupements sulfhydriles et des ponts 10 disulfures ou des éléments minéraux, pour la détermination des activités enzymatiques par exemple, dans le lait et les produits laitiers, de la phosphatase alcaline, de la peroxydase, des protéinases et de la 2-D-galactosidase, pour le dénombrement 4es micro- organismes présents dans un milieu avec identification de ces micro- organismes et l'étude des courbes de croissance de germes.