Brevet FR2608624A1 — publié le 19880624

La présente invention concerne un procédé de transfor- mation de cellules de Bacillus thuringiensis. Les termes "transformer" et "transformation", utilisés dans la présente invention, sont destinés à concerner un mé- canisme de transfert génétique dans lequel on introduit de l'ADN exogène dans une bactérie receveuse, en introduisant ainsi des modifications génétiques dans ladite bactérie re- ceveuse. Les Bacillus thuringiensis (BT) sont des bactéries Gram positives contenant une protéine cristalline, la 8-endo- toxine (DET), qui est toxique vis-à-vis des larves d'un cer- tain nombre d'insectes. Suivant les sous-espèces, BT est utilisé comme pesticide biologique sélectif contre diffé- rents nuisibles. Les sous-espèces thuringiensis, alesti et dendrolimus sont, par exemple, pathogènes contre les lépido- ptères; les sous-espèces israelensis, darmstadiensis 73-E- 10-2, kyushuensis et morrisoni PG14 le sont contre les di- ptères; la sous-espèce tenebrionis l'est contre les coléo- ptères; les sous-espèces kurstaki HD-1, kenyae, aizawai et colmeri le sont contre les lépidoptères et les diptères, tandis que les sous-espèces dakota, indiana, tokokuensis et kumamotoensis ne sont pas connues pour être toxiques vis-è-vis de tous les nuisisses. D'un point de-vue industriel et écologique, il est sou- haitable de disposer de pesticides biologiques additionnels ayant un spectre d'activité différent, par exemple supérieur ou plus large. On peut, par exemple, atteindre ce but en mettant au point de nouveaux isolats à partir de la nature, par conju- gaison de bactéries ou par transformation de bactéries. Ainsi, on a récemment isolé de nouvelles souches de BT ayant une activité intéressante (par exemple var. tenebrio- nis ayant une activité contre les coléoptères) et il a éga- lement été fait état de récents succès concernant la conju- gaison de souches de BT. La transformation des bactéries offre l'avantage qu'el- le permet, si elle est couronnée de succès, d'introduire une information génétique spécifique dans des bactéries. Ainsi, un gène codant pour une DET a été cloné dans di- vers microorganismes tels que Escherichia coli, Bacillus subtilis et Pseudomonas fluorescens, et même dans des plan- tes supérieures (tabac), par des techniques d'ADN recombi- nant, plus spécifiquement par transformation. Ces organismes manipulés génétiquement produisent ce- pendant de faibles quantités de DET comparées aux quantités produites par des souches de BT naturelles. L'importance commerciale de ces organismes est donc discutable, au moins aussi longtemps qu'aucun moyen n'aura été trouvé pour amé- liorer l'expression de l'ADN exogène encodant pour la DET. Il semblerait donc indiqué d'essayer d'obtenir une meilleure expression de gènes exogènes (ADN) en utilisant une bactérie BT comme bactérie receveuse dans des techniques de transformation. Les techniques de transformation connues sont essen- tiellement réalisées à l'aide de cellules ou de proto- plastes. La transformation de cellules implique la présence de cellules compétentes, c'est-à-dire de cellules à un état physiologique précis permettant la liaison et l'absorption d'ADN exogène. On ne dispose cependant d'aucune preuve de l'existence de cellules de BT compétentes. On a fait état du succès de la transformation de proto- plastes de BT par l'ADN avec des rendements seulement très faibles, à savoir sensiblement plus faibles que ceux obtenus avec la transformation de B. subtilis. Les rendements fai- bles peuvent être dus en partie à la régénération médiocre des protoplastes, y compris du protoplaste transformé. Bien que Shall et coll. (Fundamental and applied aspects of invertebrate Pathology - Aspects fondamentaux et appliqués de la pathologie des invertébrés -, édité par R. A. Samson, J.M. Vlak et D. Peters, 1986, page 402) annoncent qu'ils ont optimisé la procédure employant des protoplastes et qu'ils ont mis au point des milieux de régénération améliorés pour transformer BT ou B. cereus avec le plasmide ADN, ils ne précisent pas la nature de l'optimisation ou de l'amélio- ration. Les fréquences de transformation indiquées par Shall et coll. sont donc difficiles à interpréter. La présente invention a maintenant pour objet un pro- cédé amélioré de transformation de BT. Il est basé sur la découverte que les microorganismes de BT développent ce que l'on appelle un statut de compétence lorsqu'ils sont intro- duits dans un milieu aqueux hypertonique. Le terme "hypertonique", tel qu'il est utilisé dans la présente invention, concerne un milieu qui est hypertonique vis-à-vis des milieux de BT classiques (culture ou crois- sance cellulaire). Le procédé de l'invention met en jeu les étapes qui consistent: a) à cultiver des cellules de BT dans un milieu aqueux hy- pertonique, b) à introduire dans la culture cellulaire obtenue dans l'étape a), et en présence de polyéthylène-glycol, de l'ADN exogène tout en maintenant l'état hypertonique, et c) à isoler et à remettre en suspension les cellules de BT ainsi traitées dans un milieu aqueux hypertonique pour per- mettre l'expression. En principe, on peut employer tout composé qui ne tra- verse pas la membrane cellulaire semi-perméable et qui n'est pas métabolisé par, ou toxique vis-à-vis de, la cellule de BT, pour obtenir l'état hypertonique recherché. En général, l'état hypertonique recherché est avantageusement obtenu à l'aide de saccharides, en particulier de mono- ou de di- saccharides, qui ne sont pas métabolisés par BT. Des exemples convenables de ces saccharides sont le saccharose et le lactose. La concentration des saccharides à employer pour obte- nir l'état hypertonique recherché est avantageusement de l'ordre de 0,4M de saccharides par litre de milieu aqueux, ou supérieure. En général, on obtiendra de bons résultats avec des concentrations essentiellement isotoniques vis-à- vis du cytoplasme de BT. Cet état osmotique est en général obtenu avec une concentration de 0,4M à 0,5M de saccharides par litre de milieu aqueux. Des concentrations supérieures en saccharides peuvent être cependant employées, mais elles n'offrent en général aucun avantage. Le terme "hypertonique" employé ci-dessous concerne un état ou un milieu tel que défini ci-dessus. Il est important que les conditions hypertoniques soient essentiellement maintenues d'un bout à l'autre des différentes étapes a) à c) du procédé. Les milieux aqueux hypertoniques doivent être essen- tiellement neutres, c'est-à-dire qu'ils doivent avantageuse- ment avoir un pH de 7 2, mieux encore de 7 1. En plus des saccharides (servant à maintenir l'état hy- pertonique) et des tampons éventuels (servant à maintenir un état essentiellement neutre du milieu) d'autres ingrédients peuvent être et seront ajoutés, par exemple pour permettre la croissance et le développement de la culture de BT, le cas échéant, etc. Ces ingrédients supplémentaires sont classiques et connus de l'homme de métier; ils comprennent, par exemple, des nutriments et des sels. Des exemples de nutriments convenables sont, par exemple, l'extrait de boeuf, l'extrait de levure, les pep- tones, les tryptones, les acides aminés (par exemple le tryptophane), les nucléosides comme la thymidine et ana- logues. Des exemples de sels convenables sont NaCl et MgCl2,6H20. Un milieu hypertonique convenable peut contenir de 0,05 à 0,1M de sels par litre. Les sels engloberont de préférence les sels de magnésium, comme MgC12,6H20. La culture cellulaire de BT (produit de départ) est avantageusement préparée et cultivée dans des conditions classiques, c'est-à-dire sous aération et à la température ambiante, dans un milieu nutritif approprié, par exemple dans le milieu minimal décrit par J. Spizizen dans Proc. natl. Acad. Sci. (Wash), 44, 171-175 (1958), éventuellement supplémenté par des acides aminés, des sels, par exemple des quantités catalytiques de sel de manganèse tel que MnSO4, etc. Il est avantageux d'employer, dans l'étape a), une cul- ture de cellules de BT qui se trouve dans la phase de crois- sance exponentielle. La culture de cellules de BT fraîchement préparée est ensuite diluée dans un milieu hypertonique à une concentra- tion cellulaire de départ essentiellement inférieure à 109 cellules par ml, par exemple de 104 à 106 cellules par ml, et la culture cellulaire est cultivée, dans ledit milieu hy- pertonique, jusqu'à ce que l'on obtienne un milieu de concentration cellulaire légèrement inférieure à 109 cel- lules par ml, par exemple de 108 à 5.108 cellules par ml. Le milieu hypertonique employé pour diluer la culture de cellules de BT fraîchement préparée est avantageusement à -40 C, par exemple à 37 C. On laisse ensuite la culture s'effectuer à cette température. Il est bien évident qu'il faut garantir une aération poussée. Une légère quantité de silicone est avantageusement ajoutée au milieu de culture cellulaire pour empêcher le moussage. Lorsqu'on atteint la concentration cellulaire finale souhaitée (légèrement inférieure à 109 cellules par ml), on peut traiter les cellules de BT compétentes ainsi préparées avec l'ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG), selon l'étape b) du procédé de l'invention. Il est toutefois avantageux de traiter les cellules de BT compétentes obtenues selon l'étape a) de l'invention avec des concentrations modérées de lysozyme dans un milieu hy- pertonique et d'isoler et de remettre en suspension les cel- lules de BT traitées au lysozyme dans un milieu hyperto- nique, avant de les soumettre au processus b). La quantité de lysozyme à employer doit être inférieure à celle qu'on uti- lise normalement pour préparer des protoplastes. Cette quan- tité (concentration) dépendra bien entendu de divers fac- teurs comme la pression osmotique du milieu, sa température, la durée de réaction souhaitée, etc. En général, une concen- tration convenable en lysozyme est de 20 à 300 gg, par exemple de 200 gg, par ml de milieu aqueux hypertonique (ce qui est essentiellement inférieur aux 2 à 15 mg par ml qui seraient normalement nécessaires pour des applications concernant des protoplastes). Il faut garantir une distribu- tion adéquate du lysozyme dans le milieu de culture cellu- laire. La durée de réaction dépendra donc de la concentra- tion et de la qualité de la solution de lysozyme employée. La durée de réaction optimale peut être déterminée par des essais standards. La température réactionnelle est avantageusement com- prise entre 20 et 40 C, de préférence supérieure à la tempé- rature ambiante, par exemple d'environ 37 C. Pendant le traitement au lysozyme, il faut maintenir l'état hypertonique, tel que défini ci-dessus. Le traitement au lysozyme est ensuiteterminé par centri- fugation de la suspension cellulaire et remise en suspension des agrégats dans le milieu hypertonique, avantageusement à la température ambiante. La culture des cellules de BT ainsi préparée - obtenue selon l'étape a), éventuellement suivie du traitement au ly- sozyme - est ensuite traitée avec de l'ADN, par exemple le plasmide ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG). Dans ce but, l'ADN, ainsi que le PEG, sont employés en suspen- sions/solutions dans des solutions hypertoniques, de sorte que la pression osmotique de la suspension cellulaire de- meure essentiellement inchangée après l'addition d'ADN et de PEG à cette suspension cellulaire. La quantité de PEG employée sera avantageusement choi- sie de telle sorte que sa concentration dans la culture de cellules de BT se situe dans l'intervalle de 100 à 400 g par litre, par exemple à 300 g par litre de milieu de culture cellulaire. L'étape de transformation b) peut être essentiellement réalisée dans les conditions connues comme étant appropriée aux procédés classiques de transformation des protoplastes. En conséquence, le choix de la quantité appropriée et du type approprié de PEG et de la quantité appropriée d'ADN à employer peut être effectué convenablement par l'homme du métier de la transformation des protoplastes. Ainsi, un exemple de PEG utilisable dans ce procédé est le PEG 6000. Des quantités d'ADN de 100 ng à 20 gg pour 108 à 109 cellules de BT donneront en général de bons résultats. L'incubation est avantageusement réalisée sous agita- tion modérée à la température ambiante. Le temps d'incuba- tion nécessaire est court, en général de l'ordre de quelques minutes (voir l'exemple). La suspension comprenant les cellules transformées est ensuite traitée à l'aide de procédés connus, à condition que l'état hypertonique du solvant des cellules soit maintenu (dans le cas o elles sont en solution/suspension). Ainsi, la suspension est, par exemple, diluée dans une solution hy- pertonique, la suspension est mélangée, centrifugée et les agrégats remis en suspension dans le milieu hypertonique. La suspension résultante est ensuite incubée à une tem- pérature de 20 à 400C, par exemple à 37 C, pour permettre l'expression. La suspension est avantageusement aérée, par exemple à l'aide d'un bain marie agité. Un temps d'incu- bation approprié est de 30 minutes à 5 heures, mieux encore compris entre 2 et 4 heures, par exemple 3 heures. On peut ensuite placer des dilutions appropriées des cultures cellulaires ainsi obtenues dans des boîtes de Pétri pour déterminer les unités formant colonie (CFU). On peut déterminer la fréquence de transformation par des procédés connus employant des techniques standard, comme des boîtes de Pétri contenant un antibiotique, l'observation visuelle, etc. Le procédé de la présente invention permet la transfor- mation de cellules de BT avec des rendements élevés. La transformation permet le clonage de gènes de bibliothèques de génomes dans des cellules de BT, le clonage et l'expres- sion de gènes de DET dans BT, le clonage et l'expression de gènes de DET modifiés in vitro et in vivo dans BT, la syn- thèse de polypeptides utiles, etc. Lorsque les cellules de BT transformées sont destinées à être utilisées comme pesticides biologiques, elles sont avantageusement employées sous forme de compositions insec- ticides, par exemple sous forme de suspensions concentrées ou sous forme de poudres. Ces compositions peuvent être ob- tenues d'une manière classique. Dans l'exemple non limitatif suivant, les produits de départ (cellules de BT et plasmide ADN) sont choisis de telle sorte que les résultats ne soient pas ambigus et ne puissent être dus à une interaction du plasmide; les cel- lules de BT utilisées comme produit de départ ne contiennent pas de plasmides, le plasmide ADN utilisé comme agent de transformation encodant pour la résistance à la tétracy- cline. On remarquera que d'autres cellules de BT et/ou d'ADN exogènes, en particulier un plasmide ADN, peuvent être uti- lisées dans le procédé de l'invention avec des résultats analogues. Les températures sont exprimées en centigrades et les parties en poids, sauf indication contraire. Exemple Produits de départ Souche: Bacillus thuringiensis, sous-espèce kurstaki HD1 cry B (obtenue auprès de M.-M. Lecadet, Institut Pas- teur, Paris), ne contenant pas de plasmides. ADN: pBC16.1 (Kraft. J. et coll. (1978) Molec. gen. Genet. 162; 59-67), extrait de HDI cry B (pBC16.1), dans le- quel il a été introduit par conjugaison par adaptation cellulaire avec B. subtilis BD224 (pBC16.1), codant pour la résistance à la tétracycline. Milieux SA Trp: Milieu minimal spizizen (Spizizen J. (1958) Proc. natl. Acad. Sci. (Wash.) 44; 171-175) supplémenté par des Casaminoacides à 1% (Difco), 5 x 10-6M de MnSO4 et 20 ig/ml de tryptophane. Milieu hypertonique (MH): Extrait de boeuf 1,50 g/1 Peptone 5,00 g/1 NaCl 3,50 g/1 Saccharose 171,15 g/1 Acide maléique 2,32 g/1 MgCl2,6H20 4,07 g/l pH 6,7 Milieu Luria (LA): Tryptone 10 g/1 Extrait de levure 5 g/1 NaCl 10 g/1 Gélose (Difco Bacto) 15 g/1 Thymidine 20 mg/1 Antibiotiques: Tétracycline, 10-100 wg/ml sur des boites au milieu Luria Solutions SMM: Saccharose 171,15 g/1 Acide maléique 2,32 g/l MgCl2,6H20 4,07 g/l- pH 6,5 PEG: PEG 6000 40 g SMM qsp 100 ml Lysozyme: 2 mg/ml dans MH, fraîchement préparé. Procédé On prépare une culture d'une nuit de HD1 cry B dans 15 ml de SA Trp et on la fait croître sous aération à 20 C. La len- demain matin, la culture est diluée à 50-100 fois dans un milieu MH préchauffé, jusqu'à une concentration cellulaire de départ de 7,5 x 105 par millilitre. On ajoute 2 il de si- licone pour empêcher le moussage. La culture croit 370C sous aération modérée pendant trois heures et demie, à savoir jusqu'à une concentration cellulaire de 2,5 x 108 - 3 x 108 par ml. Le lysozyme est ajouté jusqu'à une concentra- tion finale de 200 gg/ml et 1 ml de suspension cellulaire est incubé pendant 30 minutes à 37 C, dans un bain marie agité (150 t/min). La suspension cellulaire est ensuite cen- trifugée pendant une minute sous 10 000 G et les agrégats sont remis en suspension dans 1 ml de MH frais à la tempéra- ture ambiante. On ajoute 0,5 ml de suspension cellulaire à 50 1i de SMM, auxquels ont été ajoutés 100 ng-10 lig de plasmide ADN. Les cellules sont transformées par addition de 1,5 ml de so- lution de PEG, agitation modérée et incubation de 2 min. à la température ambiante. On ajoute 5 ml de MH à la suspension cellulaire, que l'on mélange doucement mais à fond et que l'on centrifuge pendant 20 minutes sous 3000 G. On remet les agrégats en suspension dans 0,6 ml de MH et on incube pendant 3 heures à 37 C dans un bain marie agité (150 t/m:ip)pour permettre l'expression. On place les dilutions appropriées dans des boîtes au milieu Luria pour dé- terminer les CFU et dans des boîtes à longue durée d'action contenant de la tétracycline pour la sélection de la sub- stance transformatrice. On obtient 1-2 x 103 substances transformatrices par ig de plasmide ADN intact, avec une fréquence de 5x10-5 - 10-4. R E V E N D I C A T I ONS 1.- Procédé de transformation de cellules de Bacillus thu- ringiensis, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent: a) à cultiver des cellules de Bacillus thuringiensis dans un milieu aqueux hypertonique, b) à introduire dans la culture cellulaire obtenue dans l'étape a), et en présence de polyéthylène-glycol, de l'ADN exogène tout en maintenant l'état hypertonique, et c) à isoler et à remettre en suspension les cellules de Ba- cillus thuringiensis ainsi traitées dans un milieu aqueux hypertonique pour permettre l'expression. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on traite la culture de cellules de Bacillus thuringiensis de l'étape a) avec des concentrations modérées de lysozyme, tout en maintenant les conditions hypertoniques, et en ce que l'on isole les cellules de Bacillus thuringiensis ainsi traitées et on les remet en suspension dans un milieu aqueux hypertonique avant le traitement selon les étapes b) et c). 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on obtient l'état hypertonique en employant des saccharides qui ne sont pas métabolisé-s par Bacillus thu- ringiensis. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on emploie au moins 0,4M de saccharides par litre de mi- lieu aqueux. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la concentration initiale en cel- lules de Bacillus thuringiensis introduite dans l'étape a) est de 104 à 106 cellules par ml de milieu et en ce que les cellules sont cultivées jusqu'à une concentration de 108 à un peu moins de 109 cellules par ml de milieu. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à , caractérisé en ce que la concentration en lysozyme est de 20 à 300 microgrammes par ml de milieu aqueux. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu hypertonique a un pH dans l'intervalle de 6 à 8. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu hypertonique comprend un sel de magnésium. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est réalisé à une température comprise entre 20 et 40 C. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on emploie 100 nanogrammes à 20 microgrammes d'ADN pour 108 à 109 cellules de Bacillus thu- ringiensis. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on emploie 100 à 400 g de poly- éthylène-glycol par litre de culture cellulaire. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on maintient l'état hypertonique de l'étape c) pendant 30 minutes à 5 heures.