Brevet FR2598514A1 — publié le 19871113

I PROCEEDE DE DOSAGE IMMUNOLOGIQUE DES HORMONES THYROIDIENNES T3 ET/OU T4- UTILISANT LA THYROGLOBULINE La présente invention a pour objet un procédé de dosage immunologique des hormones thyroïdiennes T3 et/ou T4. c5 La glande thyroïde est une glande endocrine située à la base du cou qui synthétise deux hormones peptidiques, la triiodothyronine T3 et La thyroxine T4 par condensation de deux molécules de thyrosine iodée qui sont la monoiodothyrosine et la diiodothyrosine. Cette synthèse a lieu à partir d'une protéine thyrod;dienne, la thyroglobuline qui est également la forme de réserve des hormones thyroïdiennes. La libération de ces hormones dans la circulation sanguine se fait par un processus protéolytique et ces hormones sont transportées par trois protéines sériques: la TBG (thyroxine binding globuline), la TBPA (thyroxine binding prealbumin) et l'albumine. Les formes libres et liées des hormones coexistent toutefois dans le sang dans un état d'équilibre dynamique régi par la loi d'action de masse. Les hormones thyroïdiennes exercent leur activité sur la majorité des tissus à l'exception du cerveau; ainsi, elles stimulent la consommation en oxygène de la plupart des cellules, participent à la régulation du métabolisme des lipides et des glucides et sont nécessaires à l'évolution d'une croissance 25 normale. Cependant, il est généralement admis que seules les formes libres de l'hormone sont biologiquement actives et peuvent pénétrer dans les cellules pour exercer Leur action physiologique. Aussi, des procédés permettant de doser non seulement 30 la concentration totale des hormones T et T mais aussi La 3 4 concentration de ces hormones sous forme libre sont d'un grand intérêt pour le diagnostic de l'hyperthyro;die ou de l'hypothyroTdie car La détermination du taux de T et/ou de T total peut conduire à des erreurs de diagnostic d'hyperthyrodie total peut conduire & des erreurs de diagnostic d'hyperthyroidie ou d'hypothyroïdie provoquée par une altération des protéines de transport. En effet, La concentration des protéines de Liaison peut augmenter par exempLe Lors de La grossesse, Lors de maladies hépatiques et Lors de prises d'oestrogènes ou d'opiacés, et Le taux de T ou de T totaL augmente aLors de ce fait de façon 4 3 concomitante, ce qui peut conduire à un diagnostic d'hyperthyroïdie aLors que Les taux de T ou T Libre sont 3 4 normaux et que le patient présente un état euthyro'dien. Inversement, Le taux de T ou T4- total peut Itre 3 4 abaissé par La diminution du taux des protéines Liantes, ce qui -: - pourrait conduire à un diagnostic d'hypothyroTdie aLors que Le taux de T ou'de T Libre est normal. 3 4 - Aussi, il est préférable de pouvoir déterminer Les taux de T-.: ou de T Libres pour mieux apprécier L'état du patient, 3 4 ceux-ci1 pouvant Otre déterminés soit directement, soit à partir des concentrations totales en T et T et de L'indice de 3 4 saturation des protéines porteuses. Les faibles taux des hormones thyroïdiennes T et T 3 4 rencontrés dans Les sérums humains ou animaux nécessitent L'empLoi de méthodes de dosages sensibles. Les méthodes couramment utiLisées pour des dosages de ' *.: cea type font appeL aux techniques immunoLogiques. Parmi cellesci, 'on a utilisé tout d'abord Les dosages radioimmunoLogiques utilisant de La T ou T marquée à L'iode 125. Plus récemment, on 4 3 25. a développé des-techniques de dosage enzymoimmunoLogique, soit en phase hétérogène, soit en phase homogène; Parmi Les méthodes en phase homogène, on connaet des dosages basés sur La polarisation de fluorescence, sur le _ *:. -;: _transfert de fluorescence ou sur une inhibition de L'enzyme. Ces 30. dosages ont L'avantage de pouvoir Itre complètement automatisés, -, Parmi Les méthodes en phase hétérogène, on connait un procédlé de dosage de La T ou La T Libre ou totale qui* consiste 3 4 à mettre en compétition T ou T et une quantité connue de T ou 3 4 3 T4..marquée par une enzyme pour un nombre Limité de sites anticorps spécifiques de l'hormone (H.V. Weetall et ai Clin. Chem. Vol.28, nO4 (1982), p.666-671; SCHALL et al., Clin. Chem., 1978, 24, 1801-1804; et ALBERT et al., Ed.S.B. Pal, 1978, p. 153-174). Pour réaliser le même type de dosage en phase 5 hétérogène, on pourrait aussi envisager de mettre en compétition l'hormone à doser et une quantité déterminée d'hormone fixée sur un support solide pour une quantité limitée de sites actifs d'un anticorps marqué spécifique de l'hormone. (Masao Ito et al., Clin. Chem. 30/10, 1682-1685 (1984) et Gnemmi et ai., Enzyme 10 Labelled Immunoassay of Hormone and Drugs, 1978, Walter de Gruyter et Co. Berlin-New-York). Cependant, ces deux modes de dosage en phase hétérogène sont difficiles à mettre en oeuvre avec les hormones T3 et T4, car celles-ci perdent généralement leur activité antigénique 15 lorsqu'on les fixe sur un support solide ou leur activité biologique et/ou antigénique lorsqu'on les couple à une macromolécule. De plus, lorsque l'on veut utiliser cette méthode pour le dosage de la T3 et/ou de la T4 sous forme libre, il est nécessaire que les molécules de T et/ou de T marquées ne soient 3 4 pas reconnues par les protéines de transport des hormones T et T. En revanche, on pourrait réaliser le dosage en couplant chimiquement l'hormone T ou T à une poudre mais dans ce cas la 3 4 réalisation du dosage pose des problèmes de lavage. La présente invention a précisément pour objet un procédé de dosage immunologique des hormones thyroïdiennes T et/ou T4 qui permet de résoudre les problèmes évoqués ci-dessus. Selon l'invention, le procédé de dosage immunologique de la thyroxine T et/ou de la triiodothyronine T présentes sous 4 3 forme libre, c'est-à-dire non liées aux protéines vectrices, dans un milieu réactionnel, se caractérise en ce qu'il consiste à mettre en compétition T et/ou T à doser avec de la 3 4 thyroglobuline pour les sites d'anticorps anti-T et/ou anti-T 3 4 présents en quantité limitée, et à déterminer ensuite soit la 35 quantité de thyroglobuline fixée aux anticorps anti-T et/ou :i. l - 1. anti-T, soit La quantité de thyrogLobuLine non fixée aux anticorps anti-T et/ou anti-T 3 4 On précise que dans La suite du texte, Les termes "sous forme Libre" appliqués à T et T signifient qu'iL s'agit de T 3 4 3 et T non Liées aux protéines vectrices. Ceci est aussi bien vaLabLe pour le dosage de la T ou T Libre que pour le dosage de 3 4 La T ou T totale tel que connu dans La littérature. 3 4 Le procédé de L'invention consiste ainsi à utiLiser La thyrogtobutine comme compétiteur pour la réaction de compétition 10 vis-à-vis des sites anticorps. Ceci permet d'obtenir de nombreux avantages car la thyrogLobuLine peut être fixée sur une phase sotide ou Itre couptée à une moLécute ou un atome marqueur, tout en étant toujours reconnue par des anticorps anti-T et anti-T 3 4 Par aitteurs, te dosage n'est pas perturbé par les protéines de -::15 transport des hormones T et T4, puisque L'on utiLise comme compétiteur ta thyrogLobuline au Lieu d'hormones T et/ou T 3 4 marquées ou des anticorps marqués. La thyrogtobutine est une glycoprotéine de structure compLexe qui est te produit de départ de la synthèse des hormones T 'et T et contient de ce fait Les séquences de ces hormones. 3 4 Cependant, on ne pouvait supposer que dans cette structure compLexe, ces séquences soient reconnues par des anticorps spcécifiques des hormones T et T. En effet, Les études portant 3 4 sur La structure de ta thyrogLobuline comme celte publiée par C. 25-Marriq et at. dans Eur. J. Biochem. 111, 33-47 (1980) ont simplement montré qu'it existait dans cette structure plusieurs sites de formation des hormones T et T et que La biosynthèse de 3 4 L'hormone T ne pouvait sans doute se produire que dans une zone bien déLimitée de La moLécuLe, tandis que La biosynthèse de.' 30 L'hormone T pouvait prendre place sur un nombre pLus important de sites. Les résuLtats de cette étude démontraient que La thyrogtobutine ne présentait pas de réactivité vis-à-vis des anticorps anti-T ou anti-T 3 4 Dans te procédé de L'invention, on peut utitiser de La * 35 thyrogtobutine provenant de différentes espèces animates, par exempLe de la thyroglobuline de boeuf ou de la thyroglobuline de porc. On peut utiliser par ailleurs de la thyroglobuline sous différentes formes, par exemple sous forme monomère, sous forme 5 native, sous forme dénaturée, sous forme polymérisée ou hydrolysée. Le procédé de l'invention peut être utilisé pour déterminer, soit la concentration totale en T4 ou T3 d'un échantillon biologique, soit la concentration en T4 ou T3 libre 10 de cet échantillon. En effet, comme on l'a vu ci-dessus, le procédé de dosage de l'invention permet de doser la T et/ou la T libre. Cependant, dans le cas o l'on veut déterminer la concentration totale en T4 ou T3 d'un échantillon, on soumet celui-ci à un traitement pour libérer les hormones T et T liées 3 4 à des protéines porteuses de l'échantillon. Ce traitement peut consister en l'addition d'un inhibiteur de la liaison de T et/ou T avec leurs protéines vectrices, cet inhibiteur étant par exemple l'acide salicylique, du merthiolate ou l'acide 8-anilino1-naphtalène sulfonique (ANS). A l'aide de ce traitement 20 l'échantillon peut être utilisé directement dans le procédé de dosage de l'invention. Aussi dans la suite du présent texte, on entendra par dosage de T3 et/ou T4, aussi bien le dosage de la concentration totale en T et/ou T que le dosage de la concentration en T 3 4 3 et/ou T libre. Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on effectue tout d'abord une réaction de compétition entre la T et/ou la T à doser et la thyroglobuline pour les sites des anticorps anti-T et/ou anti-T présents en quantité limitée. A 3 4 la fin de cette réaction, on obtient donc de la thyroglobuline liée aux anticorps, de la T3 et/ou de la T4 liée aux anticorps, ainsi que de la thyroglobuline libre et de la T et/ou T libre. 3 4 La quantité de thyroglobuline liée aux anticorps dépend de la quantité de T et/ou T présente dans l'échantillon et cette 435 quantité de thyrog3obuine iée diminue orsque a quantité de T quantité de thyroglobuline liée diminue lorsque la quantité de T 1 0 7135 2 598514 et/ou T augmente. Aussi, pour doser La quantité de T et/ou T présente dans L'échantitton, on détermine La quantité de thyrogtobutine liée aux anticorps ou La quantité de thyrogtobutine sous forme Libre. Cette détermination peut Itre effectuée par Les méthodes classiques employées dans Les dosages immunologiques, méthodes qui font appel, soit à un marquage de L'un des composés utiLisés pour La réaction de compétition, par exempLe dans ce cas ta thyrogLobuLine ou Les anticorps anti-T et/ou anti-T4, soit à.'utilisation de composés additionnels marqués qui soient susceptibLes de se fixer sur ta thyrogtobutine Liée aux anticorps ou sur La thyrogtobuLine Libre. GénéraLement, ces composés additionneLs sont constitués par des anticorps marqués spécifiques des y'-gtobutines de L'espèce ayant produit Les anticorps anti-T et/ou anti-T4, par de L'anti-thyrogtobuLine marqué ou par des anticorps anti-T et/ou des anticorps anti-T. On peut aussi utiLiser comme composés additionneLs des systèmes comprenant un composé marqué et une protéine, par exempte Les systèmes anticorps biotinyLés marqués-avidine en utiLisant égaLement dans te dosage des anticorps antiT et/ou anti-T biotinyLés. Pour cette 3 4 détermination, te marquage de La thyrogtobutine ou des différents anticorps est réatisé par des méthodes cLassiques. Aussi, dans La suite du présent texte, te terme "marqué" appLiqué à La thyrogLobutine ou à différents types d'anticorps, signifie que La thyrogLobutine ou Les anticorps ont été modifiés par un éLément marqueur qui peut être par exempte un radloéLément, un étément f tuorescent, un étément Luminescent, une enzyme, un chromophore fLuorescent, un chromophore absorbant La Lumière, La biotine, etc. Pour réatiser pLus faciLement cette détermination de La quantité de thyrogtobuLine Liée aux anticorps ou de La thyrogtobutine sous forme Libre, on peut utiLiser des méthodes cLassiques de dosage en phase hétérogène qui permettent de séparer La thyrogtobutine Liée aux anticorps de La thyrogtobutine libre. Toutefois, on peut aussi utiliser dans l'invention des méthodes de dosage en phase homogène qui ne comportent pas une telle séparation. Lorsqu'on réalise le dosage en phase hétérogène, on utilise une phase solide sur laquelle est immobilisée soit la thyroglobuline, soit les anticorps anti-T3 et/ou anti-T4. Les phases solides susceptibles d'être utilisées peuvent être de différents types. Ainsi, on peut utiliser des 10 phases solides macroscopiques, constituées par des tubes, des billes ou des ailettes réalisés en polymère ou en d'autres matériaux. Les polymères susceptibles d'être utilisés sont par exemple le polystyrène, les polyamides, le polypropylène, les polyoxyméthylène et les copolymères de styrène. On peut aussi utiliser des phases solides microscopiques, finement divisées contenant de la thyroglobuline ou des anticorps anti-T3 ou antiT4, par exemple des poudres, des agrégats, en polymère, en protéine ou en d'autres matériaux. De 20 telles phases peuvent être constituées par de la thyroglobuline ou des anticorps anti-T ou anti-T rendus insolubles par des 3 4 procédés physicochimiques ou immunologiques. Ces phases solides microscopiques peuvent être obtenues par exemple en formant dans le milieu réactionnel un précipité constitué par un réseau 25 d'anticorps anti-IgG et IgG provenant de la même espèce que les anticorps anti-T3 et/ou anti-T4 utilisés pour le dosage, ce réseau étant capable de retenir les complexes thyroglobulineanti-T3, thyroglobuline-anti-T4, T 3-anti-T3 et/ou T 4-anti-T4. Ce 3 4 3 3 4 t 4.C réseau peut, par exemple, être formé d'antisérum de mouton anti30 IgG de lapin et d'IgG de lapin dans le cas o les anticorps antiT et/ou anti-T proviennent du lapin. 3 4 Dans le cas o l'on utilise des phases solides finement divisées, on peut séparer la phase solide du milieu liquide dans lequel a été effectuée la réaction de compétition par des 35 techniques classiques, par exemple par centrifugation. En revanche, dans Le cas o L'on utiLise Les phases soLides du type tube, billes ou aiLettes, Le processus de séparation est pLus simple, en particulier lorsque ces phases solides sont solidaires des tubes o L'on effectue La réaction. On décrit ci-après différents modes de réalisation du dosage de L'invention en phase hétérogène. I. Do.._ s ú__tvú29!obuline immobiLisée surunúehase solide. Pour réaliser ces dosages, on fixe généralement La 10 thyroglobutine sur Les phases solides décrites précédemment en utilisant une solution de thyrogLobutine, par exempte de thyrogLobuline de boeuf ou de porc que L'on met en contact avec la phase solide pendant une durée suffisante qui peut aller d'une heure à une nuit, à diverses températures, afin de fixer La 15 quantité vouLue de thyrogtobuline. Cette quantité dépend en particulier du temps de contact et de La température utilisés. Ces phases solides sur LesqueLLes est immobilisée La thyrogLobuline peuvent *tre utilisées pour doser séparément ou simultanément La triiodothyronine et La thyroxine. Pour doser La thyroxine T seuLe, on met en contact L'échantitton contenant La T4 à doser avec La thyroglobutine immobilisée et une quantité Limitée d'un anticorps anti-T4, et on détermine ensuite La quantité d'anticorps anti-T fixée à La thyroglobuline immobilisée. Pour doser La triiodothyronine T seuLe, on met en contact l'échantillon contenant La triiodothyronine à doser avec La thyroglobuLine immobilisée et une quantité Limitée d'anticorps anti-T3, et on détermine ensuite La quantité d'anticorps anti-T 3 3 fixés à la thyroglobutine immobilisée. Dans Les deux cas, on peut déterminer facilement La quantité d'anticorps anti-T ou anti-T fixés à La thyroglobuline 4 3 immobilisée en utilisant comme anticorps des anticorps anti-T et/ou antiT monoclonaux ou potyclonaux marqués ou Leurs fragments. De préférence, on utilise comme marqueur une enzyme telle que le peroxydase de raifort, qui peut Otre couptée facilement aux anticorps utilisés et dont l'activité enzymatique peut être déterminée dans de bonnes conditions par des méthodes colorimétriques simples. On peut aussi utiliser d'autres enzymes, par exemple la P-galactosidase ou une phosphatase alcaline. Dans les deux dosages décrits ci-dessus, on peut aussi utiliser un second anticorps pour révéler la quantité d'anticorps anti-T3 ou anti-T4 fixes sur la thyroglobuline immobilisée, ou la 10 quantité de thyroglobuline qui n'est pas liée aux anticorps antiT3 et/ou anti-T4. Dans ce cas, les anticorps anti-T ou anti-T 3 4 constituent un premier anticorps et l'on utilise un second anticorps marqué capable de se fixer sur le premier anticorps ou 15 sur la thyroglobuline. A titre d'exemple, le second anticorps peut être un anti-T3 ou T4 marqué qui viendra se fixer sur les sites T ou T de la thyroglobuline n'ayant pas réagi. -3.4 De cette façon la réaction de la T3 ou de la T4 avec les anticorps anti-T ou anti-T n'est pas perturbée puisqu'il 20 n'est pas nécessaire de modifier chimiquement ces anticorps pour les marquer. Toutefois, selon une variante de réalisation, adaptée à l'utilisation de marqueurs fluorescents, le premier anticorps peut être marqué par un chromophore fluorescent et le second 25 anticorps par un chromophore absorbant la lumière de façon à détecter la quantité d'anticorps fixés sur la thyroglobuline par extinction de la réaction de fluorescence en utilisant la méthode décrite dans le brevet américain 4 174 384. Pour doser simultanément la thyroxine T et la triiodothyronine T3, on met en contact L'échantillon à doser contenant T3 et T4 avec de la thyroglobuline et des quantités limitées d'anticorps anti-T et d'anticorps anti-T et on 3 4 détermine ensuite la quantité d'anticorps anti-T fixés à la thyroglobuline, et la quantité d'anticorps anti-T fixés à la 35 thyroglobuline. 4 Dans ce cas, on peut utiliser comme précédemment des anticorps anti-T3 et des anticorps anti-T4 marqués, mais IL est nécessaire qu'iLs soient marqués par des atomes et/ou des molécules différentes. A titre d'exemple, les anticorps anti-T peuvent être marqués par La AgaLactosidase et tes anticorps anti-T peuvent être marqués par une phosphatase aLcaLine ou inversement, comme il est décrit par C. Blake et aL. dans Clinical Chemistry, vol.28, nO7, (1982), p.1469-1473. Dans ce dernier dosage, on peut aussi révéler les quantités d'anticorps anti-T et anti-T fixés sur La 3 4 thyrogtobuline en utilisant un second groupe d'anticorps marqués. Dans ce cas, les anticorps anti-T et anti-T introduits en 3 4 quantité Limitée constituent respectivement les premier et 15 deuxième anticorps, et L'on utilise un troisième anticorps marqué capable de se fixer de façon spécifique sur le premier anticorps anti-T et un quatrième anticorps marqué capable de se fixer de façon spécifique sur le deuxième anticorps anti-T4, Les troisième et quatrième anticorps étant marqués de façon différente. Dans ce cas, les marqueurs utilisés peuvent être en particulier des enzymes, par exemple le couple p-galactosidasephosphatase alcaline. IX. Dosageenhasehétér2gène avec anticorpEs- immobilisés sur une Ehase solide Dans ces dosages, Les anticorps sont fixés sur une phase solide qui peut être constituée comme précédemment par une phase macroscopique ou microscopique en polymère ou en d'autres matériaux et les anticorps immobilisés peuvent être utilisés pour doser séparément ou simuLtanément la triiodothyronine et La 30 thyroxine. Dans ce cas, le mode de dosage est le même, mais pour pouvoir déterminer la quantité de thyrogLobuline fixée aux anticorps anti-T et/ou anti-T, iL convient d'utiliser soit un second groupe d'anticorps marqués capables de se fixer 35 spécifiquement sur un autre site réactif de la thyroglobuline, À soit de la thyroglobuline marquee. Lorsqu'on utilise un second groupe d'anticorps, ceux-ci peuvent être constitués par des anticorps anti-T3 marqués et/ou anti-T4 marqués, qui sont capables de se fixer spécifiquement sur un autre site réactif de la thyroglobuline. Dans Le premier cas qui est adapté au dosage immunologique de la thyroxine T4, on met en contact la thyroxine à doser avec de la thyroglobuline, une quantité limitée d'anticorps anti-T fixés sur une phase solide et des anticorps anti-T3 et/ou anti-T4 marqués, et on détermine ensuite la quantité d'anticorps anti-T3 et/ou anti-T4 marqués fixés sur le support solide par l'intermédiaire de la thyroglobuline. Dans le cas o le procédé est destiné au dosage immunologique de la triiodothyronine T3, on met en contact la triiodothyronine à doser avec de la thyroglobuline, une quantité limitée d'anticorps anti-T fixés sur une phase solide et des anticorps anti-T4 et/ou anti-T3 marqués, et on détermine la quantité d'anticorps anti-T4 et/ou anti-T3 marqués fixes sur le support solide par l'intermédiaire de la thyroglobuline. Lorsque l'on utilise de la thyroglobuline marquee, on met en contact l'échantillon liquide contenant la thyroxine T (ou la triiodothyronine T) à doser avec de la thyroglobuline marquée et des anticorps anti-T (ou anti-T) immobilisés sur un 4 3 support solide et on détermine ensuite la quantité de 25 thyroglobuline marquée fixée sur ledit support. De préférence, on utilise de la thyroglobuline marquée par une enzyme qui peut être couplée à la thyroglobtîline soit directement, soit par l'intermédiaire d'un anticorps antir thyroglobuline, c'est-à-dire un composé conjugué thyroglobuline30 anticorps antithyroglobuline-enzyme. Les deux types de dosage en phase hétérogène décrits ci-dessus peuvent être effectués avec des dispositifs classiques, en particulier avec des tubes à l'intérieur desquels est disposée une phase solide qui peut soit être la paroi du tube lui-même, 35 soit être insérée dans celui-ci par exempte sous la forme d'un dispositif à ailettes comme il est décrit dans la demande de brevet européen EP-A-O 097 573 déposée le 9 juin 1983 au nom du C.E.A. Pour ces dosages, on fixe tout d'abord sur la phase sotide la thyroglobuline (ou Les anticorps anti-T et/ou anti3 T4), puis on introduit dans le tube l'échantiLton liquide à doser et les anticorps anti-T et/ou anti-T (ou La thyroglobutine). 3 4 La T et/ou La T présente dans L'échantiLlon et La 3 4 thyrogtobuline entrent en compétition pour les sites anticorps et une certaine proportion d'anticorps vient se fixer sur La thyroglobuline immobilisée (ou une partie de La thyroglobuline vient se fixer sur Les anticorps immobilisés). Après cette opération, on élimine du tube la phase liquide, puis on Lave la phase soltide et on détermine La quantité d'anticorps fixée sur La 15 phase solide (ou la quantité de thyroglobuline fixée sur la phase solide) en utilisant les méthodes de révélation classiques qui ont été décrites précédemment, soit l'utiLisation d'anticorps anti-T et/ou anti-T (ou de thyroglobuline) marqués, soit 3 4 l'utilisation d'un second groupe d'anticorps marqués. Lorsqu'on utilise un second groupe d'anticorps marqués, ceux-ci peuvent Etre ajoutés, soit pendant La réaction de compétition, soit après l'opération de Lavage de la phase solide. Pour chaque type de dosage, on effectue ces opérations sur des échantillons contenant des quantités connues de T et/ou de T4, afin d'établir une courbe d'étalonnage et on se reporte ensuite à cette courbe d'étalonnage pour déterminer La teneur en T et/ou T d'un échantillon. 3 4 1Ill- _Osa_.esenphase homo.qne Selon l'invention, on peut aussi réaliser le dosage de 30 la thyroxine ou de La triiodothyronine en phase homogène en utilisant la mène réaction de compétition entre La T ou La T à 3 4 doser et la thyroglobuline. Dans ce cas, on peut utitiser par exemple trois modes opératoires différents. Selon un premier mode opératoire, on utitise de La 35_ thyroglobuLtne marquée par une enzyme telle que la malate déshydrogénase qui présente La propriété d'avoir une activité enzymatique plus faible lorsqu'elle est couplée avec la thyrogLobuline. En revanche, La fixation d'un anticorps anti-T sur le complexe thyroglobuline-malate déshydrogénase rétablit 5 partiellement l'activité initiale. De ce fait, on peut réaliser le dosage en phase homogène car l'activité enzymatique décroÂtra en fonction de la quantité de T4 ou T3 présente dans l'échantillon à doser. Dans ce cas, on met en contact le composé conjugué thyroglobuline-malate déshydrogénase, l'anticorps anti10 T4 (ou anti-T3) avec l'échantillon contenant l'hormone T4 (ou T3) à doser et le substrat permettant de déterminer l'activité enzymatique (acide malique). On effectue ensuite directement dans te mélange réactionnel une mesure de cinétique en temps fixé par mesure à 340 nm correspondant à L'apparition de NADH. Selon un second mode opératoire, on utilise de la thyrogobuline couplée à un phosphonate qui est capable d'inhiber de façon irréversible l'acétyl cholinestérase quand il n'est pas combiné à un anticorps anti-T4 (ou antiT3). Dans ce cas, on met en contact l'échantillon à doser avec La thyroglobuline couplée 20 au phosphonate et des anticorps anti-T (ou antiT) en quantité 4 3 limitée. De la sorte, les complexes anti-T (anti-T) thyroglobutine phosphonate sont en partie dissociés et thyroglobuline phosphonate exerce son action inhibitrice. On détermine alors la quantité de thyroglobuLine phoshonate fixée 25 aux anticorps anti-T4 (ou anti-T3) en révélant par une méthode colorimétrique la quantité d'acétyl cholinestérase inhibée en utilisant comme substrat l'iodure d'acétyl A-CméthyLthiocholine) et en effectuant la Lecture à 415 nm. Selon un troisième mode opératoire, on utilise de la 30 thyroglobuline couplée à un fluorochrome tel que la fluorescéine dont la fluorescence augmente quand ce composé est couplé à l'anticorps correspondant. Dans ce cas, on met en contact L'échantillon à doser avec La thyroglobuLine marquée à La fluorescéine et des anticorps anti-T4 (ou anti-T 3) puis on 35 détermine La polarisation de fluorescence du mélange réactionneL qui est inversement proportionnel à la quantité de T4 (ou T 3) à doser fixée au composé thyroglobuline-fluorescéine. La présente invention a encore pour objet un procédé de fixation d'anticorps anti-T3 et/ou anti-T4 sur un support solide, qui peut être utilisé en particulier pour purifier les anticorps anti-T3 et/ou anti-T. Ce procédé de fixation d'anticorps anti-T et/ou anti3 T sur un support solide consiste à fixer tout d'abord sur ledit support de la thyroglobuline et à mettre ensuite en contact le support sur lequel est fixée la thyroglobuline avec une solution desdits anticorps anti-T3 et/ou anti-T4. Un tel support solide peut aussi être utilisé pour 15 purifier les anticorps anti-T et/ou anti-T. En effet, iL suffit 3 4' de mettre en contact une solution contenant lesdits anticorps avec un support solide sur lequel est fixée de la thyroglobuline pour isoler ces anticorps; on peut ensuite récupérer les anticorps ainsi fixés par mise en contact du support avec une 20 solution appropriée, par exemple d'acide chlorhydrique, de glycine, d'urée ou de NaSCN. Les anticorps anti-T3 et les anticorps anti-T4 utilisés dans le procédé de l'invention peuvent être des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux. Les anticorps polyctonaux peuvent être obtenus par hyperimmunisation de moutons ou de lapins à L'aide de composés conjugués de T ou T avec de la sérumalbumine de boeuf préparés 3 4 par exemple par la méthode au carbodiimide. On recueittlle les immonoglobulines de L'antisérum par 30 précipitation à l'acide caprylique selon la méthode décrite par Steinbuch et at. dans C.R. Soc. Biol. Paris 164, 296-301, 1970. Les anticorps poLyclonaux peuvent être ensuite marqués par une enzyme telle que La peroxydase de raifort en utiLisant La méthode au periodate de sodium décrite par WiLson N.B. et Nakane P.K. 35 dans W.Knapp, K. Holubar, G. Wick (Eds.). Elsevier/north Holland Biomedical Press, 1978, pp.215-224. On peut aussi préparer La fraction Fab' des !98514 immunoglobulines de l'antisérum en soumettant les IgG purifiées à une digestion pepsique suivie d'une réduction par la 2mercaptoéthylamine. La fraction Fab' ainsi produite peut être ensuite marquée par une enzyme telle que la peroxydase de raifort 5 en utilisant la méthode au maléimide décrite par Ishikawa et al. - J. Immunoassay, 1983, 4/3. Lorsqu'on utilise des anticorps monoclonaux, ceux-ci peuvent être produits en utilisant la technique décrite par Kohler G. et MElstein C. dans Nature 256, pp.495-497, 1975. Cette 10 technique consiste pour l'essentiel à injecter à une souris ou à un autre animal convenable de la thyroxine ou de la triiodothyronine, par exemple sous la forme d'un composé conjugué T3 ou T4 -sérumalbumine de boeuf. La souris est ensuite sacrifiée et des cellules prélevées sur sa rate sont fusionnées à des 15 cellules de myélome. Il en résulte une cellule hybride appelée "hybridome" qui se reproduit in vitro. La population d'hybridomes est sélectionnée et manipulée de manière à isoler des clones individuels dont chacun élabore une espèce unique d'anticorps relative à la thyroxine ou à la triiodothyronine injectée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence au dessin annexé sur lequel les figures 1 et 2 sont des courbes illustrant le dosage de la thyroxine T par le procédé de l'invention, les figures 3 et 4 sont des courbes illustrant le dosage de la triiodothyronine T par le procédé de l'invention, la figure 5 est une courbe illustrant le dosage de la T par le procédé de l'invention et la figure 6 est une courbe illustrant un dosage de T4 utilisant de la thyroglobuline marquee. 4 ' Exemtel --Dosae-- de-la-th-yoxine T totale 1 Préparation des réactifs. a) Préparation du--su-22Eoú-t solide contenant la thrúo2lobuline. On utilise de la thyroglobuline de boeuf ou de porc, produite ou purifiée à partir de la glande thyroïde selon le 35 procédé de "Proceedings of the Society for Experimental Biology 15 20 30 35 an Medicine", 29, (1931-32), qui est dissoute à raison de 5mg.ml-1 dans un tampon phosphate de sodium (0,1 mol.; pH 7,2), et conservée à -200C. Le support solide est constitué par un dispositif à ailettes en polyamide ayant la forme d'une hélice à 5 paLes de 2,5 cm de surface qui est placé dans un tube à fond plat tel que celui décrit dans le brevet européen EPAO097573 du C.E.A. Pour fixer la thyroglobuline on dilue tout d'abord la solution de thyroglobuline au moyen du mime tampon phosphate pour obtenir une concentration de 0,025 mg.ml1 et on remplit le tube de cette solution. Après l'avoir maintenue à la température ambiante pendant une nuit, on retire la solution et on lave plusieurs fois le dispositif à ailettes avec le mime tampon -1 phosphate (0,1 mol.l; pH 7,2) et on le conserve à 40C dans ce mime tampon. Dans le cas o l'on utilise de la thyroglobuline de boeuf ou de porc, la quantité fixée sur l'ailette est de 2/zg. b) PrÉ_aration des anticorDs anti-T4 cou2és à une enzxme consti___earalaeroxïdase de raifort. On prépare tout d'abord un composé conjugué immunogène thyroxine-sérumaLbumine de boeuf (SAB) par une réaction catalysée par ta carbodiimide entre les groupements carboxylique et/ou amine de la thyroxine et les groupements amine et/ou carboxylique de la sérumatbumine de boeuf. Dans ce but, on dissout 20mg de T dans 20mt de NaOH à -1 4 0,01 mol.l, on ajoute 10% de diméthylformamide, puis on mélange cette solution avec 40mg de sérumalbumine de boeuf. Après dissolution, on ajoute 80 mg de 1-éthyl-3(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide (EDCI) et on ajuste le pH à 8,5 avec HCL 0,5 N. On laisse incuber le mélange pendant 10 à 12h à la température ambiante, puis on le dialyse une nuit contre une solution de NaCI -1 à 140 mot.l. On obtient ainsi un composé conjugué thyroxine sérum albumine de boeuf que l'on lyophilise et conserve à -200C. On immunise des moutons par injections intradermiques de I mg de ce composé conjugué après l'avoir émulsifié dans de l'adjuvant complet de Freund. On répète ces injections tous les mois pendant 8 mois et on prélève le sang par ponction dans la veine jugulaire. On évalue le titre de l'antisérum par dosage radioimmunologique. Ce titre est défini comme étant la dilution 125 finale capable de lier 50% de l'activité d'un traceur T I. On obtient un antisérum ayant un titre de 1/50 000 et une constante -9 -1 d'affinité de 5.10 mol. On prépare une fraction enrichie en immunoglobuline IgG à partir du sérum de mouton anti-T selon la méthode à l'acide caprylique de Steinbuch et Audran, Archives of Biochemistry and Biophysis, 1979, 134, 279-284. On ajoute à 10 ml de sérum, 20 ml de tampon acétate de -1 sodium (0,06 mol.l; pH 4) et 0,68 ml d'acide caprylique (pureté 96%), en ajoutant l'acide caprylique goutte à goutte et 15 sous agitation constante. On maintient l'agitation pendant 30 min. à la température ambiante et on centrifuge le mélange pendant 10 min. à 10000g. On filtre le surnageant qui contient les IgG sur papier, puis on dialyse une nuit à 40C contre un -1 tampon phosphate de sodium (17,5 mmol.l; pH 6,5). On recueille 20 ainsi 400 mg d'IgG que l'on purifie par passage sur une colonne de cellulose équilibrée avec un tampon phosphate de sodium (17,5 -1 mmol.l); pH 6,5). On vérifie la pureté de la fraction d'IgG recueillie par électrophorèse contre un immunosérum de lapin antiprotéines de mouton. On obtient ainsi des IgG purifiées ayant 25 un degré de pureté supérieur à 90%. A partir de cette fraction d'IgG on forme le composé conjugué anti-T peroxydase de raifort en utilisant la méthode au periodate de sodium décrite par M.B. Wilson et P.K. NAKANE dans W. Knapp, K. HOLUBAR et G. WICK (Eds), Immunofluorescence and 30 related staining techniques Elseviet/North Holland Biomedical Press, 1978, p.215-224. Après La réaction de couplage, on réduit par NaBH et on purifie le composé conjugué par précipitation au sulfate d'ammonium (NH4) SO et on Le conserve en fractions aliquotes à -2042C avec 1 de srumalbumine de boeuf. -20oc avec 1% de sérumaîbumine de boeuf. Lors de L'utilisation, on dilue l'IgG anti-T marquée à & la peroxydase de raifort dans un mélange contenant 1% de sérumalbumine de boeuf et de L'ANS (0,04%) dans du tampon -1 phosphate (0,1 mol.l; pH 7,2). c) Preéaration des échantillons standard. Pour préparer les échantillons standard, on dissout de la thyroxine T à une concentration de I mg/ml dans de la soude 0,01 N. On dilue ensuite les échantillons pour obtenir les concentrations désirées en utilisant pour ces dilutions un pool de sérum humain débarrassé de T par traitement au charbon à -1 4 raison de 100 mg/ml pendant une nuit à +4 C, suivi de deux centrifugations et d'une filtration sur un tamis de 0,22 micromètre. 2 D sageenzymoimmunologgu__(T4_ totale). On introduit dans des tubes à fond plat comportant chacun un dispositif à ailettes revêtu de thyroglobuline de porc des volumes de 10 ou 20 microlitres d'échantillons standards ayant respectivement des concentrations en T de O; 25; 50; -1 -1 4 ; 250,g/l et 20 mg/dl (blanc). On introduit ensuite dans chacun des tubes 0,5 mil de IgG anti-T marquée à la peroxydase de raifort après l'avoir dilué à 20 microgrammes/ml dans le diluant décrit précédemment. On laisse incuber pendant une heure à la température ambiante, puis on aspire la phase liquide présente dans chacun des tubes et on lave les dispositifs à ailettes deux fois avec de l'eau distittllée contenant 0,05X de Tween 20. On détermine alors l'activité enzymatique liée aux ailettes en ta révélant par addition de 0,5 mt de la solution substrat -1 constituée par du tampon phosphate citrate de sodium (0,1 mol.l -1 -1 * pH 5,5) contenant 5,5 mmol.l d'eau oxygénée et 3g.l de bichlorhydrate d'orthophénylène diamine (pH final 5 0,1) et on maintient Les tubes à la température ambiante et à l'obscurité pendant 30 min. On arrête alors la réaction par addition de 1 à 2 mt de HCtlN et on mesure les absorbances à 492 nm. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure I qui représente l'évolution de l'absorbance à 492 nr en fonction de la concentration en T des échantillons, et correspond à la courbe d'étalonnage du dosage. A l'aide de cette courbe on détermine la concentration en T de l'échantillon à doser. Dans cet exemple, on a optimisé le dosage en effectuant -1 les mêmes opérations sur des échantillons standard à Ong.ml de T4 en utilisant des dispositifs à ailettes ayant des concentrations différentes en thyroglobuline de porc ou de boeuf. Ces concentrations différentes sont obtenues en préparant le dispositif à ailettes selon le même mode opératoire que cetui 0 décrit ci-dessus en 1. a) mais en utilisant des concentrations différentes en thyroglobuline de la solution de fixation. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 qui représente l'absorbance à 492 nm en fonction de la concentration en thyroglobuline ( pg.m1) de la solution utilisée pour la préparation du support solide. La courbe I illustre les résultats obtenus avec la thyroglobuline de boeuf et la courbe 2 illustre les résultats obtenus avec la thyroglobuline de porc. Au vu de cette figure, on remarque que te plateau d'absorption est obtenu pour des concentrations voisines de -1 !0 O,01mg.ml1 dans les deux cas. Au vu des résultats donnés sur la figure 2, on constate que la thyroglobuline de porc a plus de capacité de 4fxation d'anticorps anti-T que celle de boeuf. Si l'on répète ces opérations en utilisant dans les 5 échantillons standard de la thyroglobuline de boeuf ou de la thyroglobuline de porc au lieu de T, on peut calculer les équivalents réactionnels en thyroxine 4 de ces deux thyroglobulines. Ainsi, on trouve que la thyroglobuline de boeuf contient 700 ng de T pour 5 mg de thyroglobuline, soit 0,14 mol 0 de T par mol de thyroglobuline. Dans le cas de la thyroglobuline de porc, celle-ci contient l'équivalent de 0,6 mol de T par mol de thyroqlobuline. Exemple 2: Dosage de la triiodothyronine T totale. Dans cet exemple, on suit le même mode opératoire que 5 dans l'exemple 1, pour déterminer la concentration en B 8940.3 MDT triiodothyronine d'échantiLLons, en utilisant comme anticorps anti-T des IgG anti-T coupLés à La peroxydase de raifort obtenus de La même façon que Les IgG anti-T coupLés à La peroxydase de raifort. Ce support soLide est constitué par des billes de polystyrène revêtues de thyrogLobuLine de boeuf par immersion pendant une heure à 450C dans un tampon phosphate de sodium (0,1 -1 moL.L; pH 7,2) contenant 0,1 mg.mL de thyrogLobuLine de boeuf. Après pLusieurs Lavages au moyen du mime tampon, on 10 conserve Les bittes à +40C dans Le même tampon contenant 0,01% de ThimérosaL. Avant utilisation, on sature Les biLLes avec une -1 solution de BSA à 1% dans du PBS (pH 7,2; 0,1 mot.L-) pendant une demi-heure. On utiLise Les mêmes diLuants et te même mode de À5 préparation des échantiLLons standard. Pour Le dosage, on introduit dans des cupuLes 0,1 mL d'échantitLon standard ou d'échantiLLon à doser et 0,3 mL d'IgG anti-T marquée à La peroxydase de raifort diLuée au 1/2000 dans Le diLuant, ce qui correspond à une dilution de 1/20000 de L'antiséru. initial, ainsi que Les bittes revêtues de thyrogtobuLine de boeuf. On Laisse incuber pendant 2h à La température ambiante puis on extrait Les biLLes, on Les Lave 3 fois avec 5 mL d'eau distilLée, et on Les transfère dans des tubes en polystyrène jetable. On détermine aLors L'activité 25 enzymatique des biLLes utilisant Le même mode opératoire que dans l'exempte I mais en utilisant seulement 0,3 mL de La solution substrat. Comme dans L'exemple 1, la réaction est arrêtée au bout d'une demi-heure par addition de lmt de HCL 1N. Les résultats obtenus pour divers échantiLtons 30 standards sont donnés sur La figure 3 qui représente L'absorbance à 492 nm en fonction de La concentration en T (en ng.mL) ce qui correspond à La courbe d'étalonnage en T 3 L'aide de cette courbe, on peut déterminer La concentration en T de L'échantiLLon à doser. 3.5 Dans cet exempte, on a optimisé te dosage en effectuant les mêmes opérations avec des échantillons standards contenant -1 -1 soit O ng.ml de T3, soit 5 ng.ml de T en utilisant des 3 3 bittlles de polystyrène ayant des concentrations différentes en thyroglobutine de boeuf. Les résultats obtenus sont donnés sur la 5 figure 4 o la courbe 3 représente les variations de l'absorbance -1 des échantillons à O ng.ml de T en fonction de la concentration en thyroglobuline de boeuf de la solution utilisée -1 pour la préparation des billes (en ig.ml, et La courbe 4 -1 représente l'absorbance des échantillons contenant 5 ng.ml de T en fonction de la concentration en thyroglobuline de boeuf de la -1 solution utilisée pour la préparation des billes (en pg.ml). On répète encore ces opérations comme dans l'exemple 1 en utilisant des échantillons standards contenant de la thyroglobuline de boeuf au lieu de triiodothyronine, et on 15 détermine ainsi à partir de la courbe d'étalonnage de la figure 3, t'équivalent réactionnel en triiodothyronine de la thyroglobuline de boeuf. On trouve ainsi que la thyroglobuline de boeuf contient l'équivalent de O,06mole de T3 par mole de thyroglobuline de boeuf. On répète le même mode opératoire en utilisant un support solide constitué par des billes de polystyrène recouvertes de thyroglobuline de porc. Les résultats obtenus dans ces conditions sont équivalents. e!le__ 3:Dosage de la thyrine T 4-libre. Dans cet exemple, on suit le même mode opératoire que dans l'exemple 1 en utilisant des ailettes en polypropylène recouvertes de thyroglobuline de porc. Les échantillons standards sont préparés comme dans le cas de l'exemple I dans une gamme de 0 à 50 picogrammes de T libre par ml. L'étalonnage en T libre 4 4 est fait par une technique de référence. Le composé conjugué anti-T4/enzyme est formé à partir de la fraction Fab' de l'antisérum produit en immunisant des moutons comme dans l'exemple 1. Cette fraction Fab' est obtenue à partir de l'IgG produite dans l'exemple I par digestion pepsique 35 suivie d'une réduction à l'aide de 2-mercaptoéthylamine. Pour réaliser La digestion pepsique, on ajoute 0,125 ut de NaCL à 2 * -, -1 -1 mot.t et 2 mg de pepsine à 2,5 eL d'IgG à 20 *g.mt. On Laisse incuber le mélange pendant 24h à 370C et on arrite la digestion par addition de soude 1N jusqu'à L'obtention d'un pH de 8. Après centrifugation, on fiLtre Le surnageant sur une colonne ULtrogeL ACA44 et on éLue Les fragments par un tampon phosphate de sodium -l (0,1 moL.L; pH 6). On recueiLle ainsi 12 mg de Fab' dans 20 et que L'on concentre 10 fois avec du poLyéthyLène glycol de masse moLécuLaire 35000. On réduit ensuite La fraction ainsi obtenue en Fab' en ajoutant 0,22 ml de 2- mercaptoéthytamine à 0,1 -1 -1 ot..L dans un tampon phosphate de sodium (0,1 moL.t)-acide éthyLènediaminetétraacétique (EDTA) (5 mmol.L) ayant un pH de 6. On Laisse incuber Le mélange pendant lh30 à 370C, puis on filtre La solution sur colonne Séphadex 625 avec le môme tampon phosphate de sodium-EDTA. On obtient ainsi 10,5 mg de la fraction Fab'. Il- 1:, _.._.i Cette fraction d'anticorps est aLors marquée par La peroxydase de raifort de la façon suivante. On dissout tout d'abord 14 mg de peroxydase de raifort -1 dans 2,1 et de tampon phosphate de sodium (0,1 mol.l; pH 7). On dissout séparément 7,5 mg de N-succinimidyL-4-(N-maléimidométhyt) cyclohexane-1-car4oxylate dans 0,18mL de diméthyLformamide. On mélange ensuite les deux solutions et on Les Laisse incuber sous agitation pendant 45 min. à 300C. Après centrifugation, on filtre le surnageant sur une colonne de Séphadex 625 et on élue avec un tampon phosphate de sodium (0,1 -1 moL.t; pH 6) ce qui permet d'obtenir une solution de peroxydase maléimide ayant une concentration en peroxydase de -1 raifort de 5,2 mg. mL. On méLange aLors 10 mg de cette solution -1 dans I mt de tampon phosphate de sodium (0,1 mol.L; pH 6) avec -1 ,5 mg de fragments Fab' dans I 1mL de tampon EDTA (5 mmoL.L) -1 phosphate de sodium (0,1 moL.L) (pH 6) et on Laisse Incuber pendant une heure à 300C. On fittre aLors Le composé conjugué Fab'-peroxydase de raifort sur une colonne d'ULtrogeL et on éLue -1 avec un tampon phosphate de sodium (0,1 moL.L; pH 6,5). Le premier pic correspond au conjugué qui a un poids moléculaire de 100000. (Volume d'élution: 90 ml). Pour réaliser le dosage, on introduit dans des tubes contenant les ailettes de polypropylene recouvertes de 5 thyroglobuline de porc, 0,05 ml d'échantillon standard ou d'échantillon à doser et 0,5 ml du conjugué Fab' anti-T -1 4 peroxydase de raifort dilué au 300 ng.ml dans un tampon -1 phosphate de sodium (0,1 mol.l; pH 7,2) contenant 0,1% de sérumalbumine de boeuf. On laisse incuber pendant 3h à 370C, puis 10 on élimine le liquide des tubes et on lave deux fois les ailettes à l'eau distillée. On détermine alors l'activité enzymatique des ailettes en ajoutant 0,5 ml de la solution substrat utilisée dans l'exemple 3 et on laisse incuber pendant 30 min. à la température ambiante. On arrête alors la réaction par addition d'1 ml 15 d'acide oxalique 1N et on détermine la densité optique à 492 nm. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 5 qui correspond à la courbe d'étalonnage du dosage. Exem -__:_Dosage de la thyroxine T 4_totale. Pour ce dosage, on suit sensiblement le même mode 20 opératoire que dans l'exemple 3 mais en utilisant des billes de polystyrène recouvertes de thyroglobuline de boeuf et les anticorps anti-T marqués à la peroxydase de raifort de l'exemple 1. Pour le dosage, on introduit dans des tubes contenant les billes de polystyrène 0,05 ml d'échantillon standard ou 25 d'échantillon à doser et 0,3 ml du composé conjugué anti-T peroxydase de raifort dilué au 20 p//ml dans un tampon phosphate -1 de sodium (0,1 mol. l; pH 7,2) contenant 1% de SAB et 0,04% de ANS. On laisse incuber pendant 1h à la température ambiante. sépare le liquide des billes et on lave celles-ci deux fois à 30 l'eau distillée. On détermine alors l'activité enzymatique pr addition de 0,3 ml du substrat utilisé dans l'exemple 3 et on laisse incuber pendant 30 min à la température ambiante. on arrête alors la réaction par addition d'1 cm d'acide oxalique 1N et on détermine la densité optique à 492 nm. 35 ExemLe 5 _:bDosage_ de la throxine T4 totale. Dans cet exemple, on réalise te dosage en phase hétérogène en utilisant de la thyroglobuline marquée par une enzyme et des anticorps anti-T immobilisés sur un support solide réalisé en polypropylène. a) Er_.r aration deanticorps anti-T immobilisés. On fixe tout d'abord Les anticorps anti-T qui ont été préparés de la mime manière que dans l'exemple 1, sur les supports en polypropylène en immergeant 100 supports dans 100 mI d'une solution d'anti-T contenant 0,03 mg/ml d'IgG anti-T en 4 4 agitant le mélange réactionnel pendant 18h à la température ambiante. On Lave ensuite les supports avec il de pBS et on les recouvre avec de la BSA à 0,1X dans du PBS pendant 4h à la température ambiante. On les rince ensuite à l'eau distillée, on les lyophilise puis on les stocke dans des bouteilles en.15 polyéthylène à La température ambiante. b) r.._aration de la thzogIL2buline marguée. On prépare ensuite de la thyroglobuline marquée à ta peroxydase de raifort de La façon suivante. On active 100mg de peroxydase de raifort avec du glutaraldéhyde à 1% en utilisant la 20 méthode d'Avrameas et Ternynck décrite dans Immunochemistry, vol.8, p.1175 (1971). On fait passer ensuite la peroxydase de raifort activée au gLutaraldéhyde sur une colonne de Séphadex G25 (2,5x20 cm) équilibrée avec une solution saline et on recueille Les fractions qui ne sont pas de couleur brune. On ajoute à 4,5ml 25 de La solution de peroxydase de raifort activée lmL de solution de carbonate bicarbonate (1 M; pH 9,5), puis on ajoute goutte à goutte à la solution sous agitation 3 mg de thyroglobuline dissoute dans une solution de carbonate bicarbonate 1M, pH 9,5. On agite le mélange réactionnel pendant 5h à la température 30 ambiante et on le Laisse pendant une nuit à 40C. On concentre ensuite La solution de composé conjugué thyrogLobu[ine-péroxydase de raifort à 2 mt par dialyse contre du polyéthylène glycol PEG 35000 sec et on purifie le conjugué par filtration sur Sepharose 48. On purifie ensuite le composé conjugué sur une colonne de Sépharose en réalisant l'élution avec un gradient discontinu allant de O à 50% d'éthylène glycol dans une solution saline. On vérifie le profil d'élution en déterminant l'activité enzymatique. Les pics contenant le composé conjugué thyroglobuline- peroxydase de raifort sont stabilisés par addition de 1% de.SA et 0,01% de thimérosal mélangés avec un volume égal de glycérol et stockés à -20 C. c) Préparation des échantillons standard de T4. On prépare ceux-ci en utilisant Le même mode opératoire 10 que dans l'exemple 1. d) Do2sa!g9e!2 i 9mmunologigue. On introduit dans des tubes un polystyrène contenant les supports en polypropylene revêtus d'anticorps anti-T4, 0,025 ml d'échantillon standard et 0,5 ml du conjugué thyroglobuline15 peroxydase de raifort dilué dans PB à 1% BSA et 0,04% de L'ANS. On laisse incuber pendant une heure à la température ambiante, puis on vide Les tubes et on lave deux fois les supports en polypropylene avec 5ml d'eau distillée contenant 0,05% de Tween 20. On introduit alors dans chaque tube 0,5ml du substrat 20 fraichement préparé utilisé dans l'exemple 1 et on maintient les tubes à la température ambiante et dans l'obscurité pendant 30 min. On arrête alors la réaction enzymatique par addition de lml d'acide oxalique 1N et on mesure les absorbances à 492 nm contre un blanc qui correspond à un échantillon standard ayant une 25 concentration en T de 200 mg par litre. Les résultats obtenus avec l'échantllon standard sont donnés sur la figure 6 qui représente l'absorbance à 492 nm en fonction de la concentration en T (en Fg/l) standard, ce qui donne la courbe d'étalonnage en T. A L'aide de cette courbe, on peut déterminer ensuite la concentration en T- de l'échantillon à doser en effectuant Les mômes opérations que précédemment, en déterminant L'absorbance à 492 nm et en se reportant à la courbe d'étalonnage pour trouver la concentration en T correspondant à cette absorbance. & l. l l -. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage imunoLogique de La thyroxine T et/ou de La trilodothyronine T présentes sous forme Libre dans un échantitLon, caractérisé en ce qu'iL consiste à mettre en compétition T et/ou T à doser avec de La thyrogLobuLine pour 3 4 Les sites d'anticorps anti-T et/ou anti-T présents en quantité 3 4 Limitée et à déterminer ensuite, soit La quantité de thyrogLobutine fixée aux anticorps anti-T et/ou anti-T4, soit La 34 quantité de thyrogLobuLine non fixée aux anticorps anti-T et/ou anti-T4. & 2. Procédé seLon La revendication 1, caractérisé en ce que ta thyrogtobutine est immobilisée sur une phase soLide. 3. Procédé selon La revendication 2, caractérisé en ce que La phase soLide contenant La thyrogLobuLine immobiLisée est constituée par de La thyrogLobuLine rendue insoLubte par un procédé physicochimique ou immunoLogique. 4. Procédé de dosage immunotogique de La thyroxine T seLon La revendication 2, caractérisé en ce qu'it consiste à mettre en contact L'échantitton contenant La T à doser avec La thyrogLobuLine immobilisée et une quantité timitée d'anticorps anti-T et à déterminer ensuite La quantité d'anticorps anti-T 4 4 fixés à La thyrogtobuLine immobiLisée. 5. Procédé de dosage immunoLogique de La triiodothyronine T selon La revendication 2, caractérisé en ce - qu'it consiste à mettre en contact L'échantiLLon contenant La trliodothyronine à doser T avec La thyrogtobuLtine immobiLisée et une quantité Limitée d'anticorps anti-T et à déterminer ensuite ta quantité d'anticorps anti-T fixés à La thyrogLobuLtine i-mobitisé.3 ImmobtiLisée. à 1 - lt-- 6. Procédé de dosage immunologique de La thyroxine T 4 et de La trilodothyronine T seton La revendication 2, caractérisé en ce qu'iL consiste à mettre en contact L'échantiLLon à doser contenant T et T avec La thyrogLobuLine 3 4 ImmobiLisée et une quantité Limitée d'anticorps anti-T3 et d'anticorps anti-T et à déterminer ensuite la quantité d'anticorps anti-T3 fixes à la thyroglobuline et la quantité d'anticorps anti-T4 fixes à la thyroglobutine. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 5 et 5, caractérisé en ce que les anticorps anti-T3 et/ou les anticorps anti-T sont des anticorps marqués. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que les anticorps anti-T ou anti-T constituent un premier anticorps et en ce que l'on utilise un 10 second anticorps marqué capable de se fixer sur le premier anticorps. 9. Procédé selon l'une quelconque'des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que les anticorps anti-T ou anti-T 3 4 constituent un premier anticorps, en ce que l'on utilise un 15 second anticorps capable de se fixer sur le premier anticorps et en ce que le premier anticorps est marqué par un chromophore fluorescent et le second anticorps par un hromophore absorbant la lumière. 10. Procédé selon la revendication 6, caracterisé en ce 20 que les anticorps anti-T et les anticorps anti-T sont marqués 3 4 par des atomes et/ou des molécules différents. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les anticorps anti-T et les anticorps anti-T sont 34 marqués par deux enzymes différentes. 12. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les anticorps anti-T constituent un premier anticorps et les anticorps anti-T4 constituent un deuxième anticorps, et en ce que l'on utilise un troisième anticorps marqué capable de se fixer de façon spécifique sur le premier anticorps et un quatrie 30 anticorps marqué capable de se fixer de façon spécifique sur le deuxième anticorps, les troisième et quatrième anticorps étarnc marqués de façon différente. 13. Procédé de dosage immunologique de la thyroxine 4 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à 35 mettre en contact la thyroxine à doser avec de la thyroglobuline, à : : t L. ES..CLMF: - U 0 S :, 0 x : D ' 10 . s -'. ' s-0 . . . . :, : . . : " 0 - -20 * S . :: -. X :: g * - 7. 0 0 30 , ? .. : X -.:, v | : 0: -f :, : X f '0: :: à: Dû:0 i une quantité limitée d'anticorps anti-T fixes sur une phase solide et des anticorps anti-T3 ou anti-T4 marqués, et à déterminer ensuite La quantité d'anticorps anti-T ou anti-T 3 4 marqués fixes sur le support soLide par l'intermédiaire de la thyroglobutine. 14. Procédé de dosage immunologique de la triiodothyronine T selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact la triiodothyronine à doser avec de la thyroglobuline, une quantité limitée d'anticorps antiT3 fixes sur une phase solide, et des anticorps anti-T4 ou antiT3 marqués, et à déterminer la quantité d'anticorps anti-T4 u anti- T marqués fixes sur le support solide par l'intermédiaire de la thyroglobuline. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7, 8, 10 et 12 à 14, caractérisé en ce que les anticorps marqués sont des anticorps modifiés par un élément marqueur choisi parmi Les radioéléments, les éLéments fluorescents, les éléments luminescents, les enzymes, les chromophores fluorescents, les chromophores absorbant la lumière, la protéine A marquée au PAP, l'avidine et la biotine. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'élément marquant est la peroxydase de raifort. 17. Procédé de dosage immunoLogique de la thyroxine T ou de La triiodothyronine T selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon contenant la thyroxine T (ou la triiodothyronine T) à doser avec de la 4 3 thyroglobuline marquée et des anticorps anti-T (ou anti-T) immobilisés sur une phase solide, et on détermine ensuite a quantité de thyroglobutine marquée fixée sur ledit support. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la phase sotide contenant les anticorps anti-T (ou anti4 T3) imobilisés est constituée par des anticorps anti-T (ou anti-T3) rendus insolubles par un procédé physicochimique ou immunologique. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que La thyroglobuline est marquée par une enzyme. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la thyroglobuline marquee est un composé conjugué thyroglobline anticorps anti-thyroglobuline-enzyme. 21. Procédé de dosage immunologique de la concentration totale en thyroxine T4 et/ou en triiodothyronine T3 d'un échantillon bioloogique, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à l'échantillon au moins un inhibiteur de la liaison de T3 et/ou T4 avec leurs protéines vectrices pour libérer la T3 et 10 la T liéeslet à soumettre l'échantillon au procédé de dosage immunologique selon L'une quelconque des revendications 1 à 20. 22. Procédé de fixation d'anticorps anti-T et/ou antiT4 sur un support soLide, caractérisé en ce qu'iL consiste à fixer tout d'abord sur Ledit support de la thyroglobuline et à 15 mettre ensuite en contact Le support sur Lequel est fixée La thyroglobutine avec une solution desdits anticorps anti-T et/ou anti-T4. 23. Procédé de purification d'anticorps anti-T et/ou anti-T4, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une 20 solution contenant lesdits anticorps avec un support solide sur LequeL est fixée de La thyroglobuline, et à récupérer ensuite les anticorps anti-T et/ou anti-T fixés sur ledit support. 3 4