Brevet FR2609723A1 — publié le 19880722

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une enzyme immobilisée ou d'un micro-organisme immobilisé, dans lequel on immobilise une enzyme ou un micro-organisme en utilisant de l'alginate de sodium, et l'ion baryum ou l'ion strontium. Des enzymes et des microorganismes immobilisés ont été préparés afin de permettre une utilisation continue par recyclage des enzymes ou des micro- organismes, ces derniers étant traités et piégés dans un certain espace afin de réagir de manière continue et être utilisés par recyclage. On a proposé des procédés de préparation d'enzymes ou de micro-organismes immobilisés, comprenant le procédé par liaison à un substrat, le procédé par polymérisation et réticulation, le procédé par inclusion en gel, etc. Parmi ceux-ci, le procédé par inclusion en gel immobilise les enzymes et les micro-organismes en les enfermant dans une matrice de gel de polymère, et on connaît déjà un procédé mettant en oeuvre de l'alginate de sodium, dans lequel on utilise en général le calcium comme agent gélifiant. Toutefois, le procédé d'immobilisation par inclusion en gel de l'art antérieur, utilisant de l'alginate de sodium et l'ion calcium, présente certains inccrvénients qui consiste en ce que la résistance du gel comprenant des sels d'alginate, diminue de manière importante sous l'influence des divers sels contenus dans le liquide réactionnel ou d'un changement de pH et en ce que le gel est dissous en présence d'agents chélatants, tels que l'ion phosphate, etc. On a donc fait des tentatives pour ajouter des quantités plus importantes d'ions calcium comme agent gélifiant, dans le liquide réactionnel afin d'accroitre la résistance du gel. Toutefois, bien que l'addition d'une quantité importante d'ions calcium améliore la résistance du gel, d'autres problèmes apparaissent. Cela apporte non seulement des effets nuisibles sur l'isolement et la purification des produits de réaction, mais cela inhibe également l'activité des enzymes, telle que la glucose isomérase, etc., ou des micro-organismes produisant ces enzymes, par exemple Streptomyces phaeochromogenes. Bacillus Coaculans, etc. La demanderesse a activement recherché des solutions possibles aux problèmes mentionnés ci- dessus, et elle a en conséquence fait les découvertes suivantes. Le rapport de composition entre les constituants de l'acide alginique, c'està-dire le rapport des groupes acide D-mannuronique (M) aux groupes acide L-guluronique (G) (rapport M/G), est critique pour la résistance du gel. Ce qui est particulièrement important, est non seulement le simple rapport M/G, mais également les rapports de composition entre (1) une partie consistant seulement en groupes M, (2) une partie consistant seulement en groupes G et (3) une partie consistant à la fois en groupes M et G. La fonction principale d'une séquence de groupes G consiste à se lier à un ion métallique d'unagent gélifiant pour former un gel résistant. On forme en outre une liaison plus résistante et plus stable entre la séquence de groupes G et l'ion métallique d'un agent gélifiant, lorsque l'ion métallique utilisé est l'ion barym ou l'ion strontium plutôt qu'en utilisant l'ion calcium comme dans l'art antérieur. Sur la base de ces découvertes, la Demanderesse a réalisé la présente invention. En d'autres termes, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une enzyme immobilisée ou d'un micro-organisme immobilisé, caractérisé en ce qu'après avoir ajouté une enzyme ou un micro-organisme dans une solution aqueuse d'alginate de sodium ayant un rapport M/G de 0, 01 à 0,8, on met en contact pour la gélifier, la solution m i x t e avec une solution aqueuse contenant l'ion baryum ou l'ion strontium. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés, sur lesquels: La figure 1 représente le degré de gonflement (poids/poids initial) de perles de gel d'alginate de baryum etdc perles de gel d'alginate de calcium dans un tampon de phosphate à divers pH; et La figure 2 illustre le degré de gonflement (poids/poids initial) de perles d'alginate de baryum et de perles d'alginate de calcium dans une solution tampon d'acide acétique et de barbital à divers pH. L'alginate de sodium utilisé dans la présente invention peut être choisi parmi un alginate de sodium commercialisé préparé par extraction d'acide alginique à partir d'algues brunes, et transformation de celui-ci en un sel de sodium. Il est nécessaire de choisir un acide alginique ayant un rapport M/G de 0,01 à 0,8, c'est-à-dire le rapport des groupes acide Dmannuronique (M) aux groupes acide L-guluronique (G) constituant l'acide alginique. Le rapport M/G est de préférence de 0,01 à 0,2. L'alginate de sodium avec un tel faible rapport M/G peut être choisi parmi ceux décrits ci-dessus qui sont commercialisés, mais il peut également être préparé en particulier par des procédés consistant à sélectionner un type d'algue ayant une teneur élevée en groupes G, certaines parties d'une algue (par exemple la tige) ayant une teneur élevée en groupes G ou la saison (de mai à août) au cours de laquelle l'algue est récoltée en vue d'une extraction, ou encore en mélangeant de l'alginate de sodium avec un produit à teneur élevée en groupes G. 0 Un alginate de sodium ayant une teneur en groupes G située dans la plage mentionnée ci-dessus, peut former un gel résistant qui est stable et résistant aux effets de la chaleur et/ou des agents chélatants, aux effets des électrolytes ou aux variations de pH. La Demanderesse a également trouvé, après des études plus détaillées du rapport M/G, qu'une partie classée de manière générale comme étant à groupes G, peut être divisée en deux types de séquences, l'une 2 consistant seulement en groupes G et l'autre consistant à la fois en groupes M et en groupes G, parmi ces deux types de séquences, la séquence de groupes G joue un rôle dans la formation d'un gel résistant par liaison avec un ion baryum ou un ion strontium. L'idée précitée d'utiliser de l'alginate de sodium ayant une teneur élevée en groupes G, c'est-à- dire un rapport M/G relativement faible et d'utiliser l'ion baryum ou l'ion strontium, provient de ces découvertes. La concentration d'alginate de sodium dans la solution dans laquelle on a ajouté une enzyme ou un micro-organisme, est de préférence de 0,5% (p/v) à 8% (p/v), plus particulièrement de 3% (p/v) à 6% (p/v). 260972? Il n'y a pas de limitation quant aux types d'enzymes ou de microorganismes qui peuvent être utilisés dans la présente invention. Des exemples d'enzymes comprennent les oxydoréductases, telles que l'alcool déshydrogénase, la D-amino acide oxydase, la catalase, etc., les tranférases, telles que transcétolase, l'adénylate kinase, l'hexokinase, etc., les hydrolases telles que la /f-galactosidase, la pénicillinase, la lipase, l'estérase, etc., les lyases, telles que la fumarase, l'aspartase, la thréonine aldolase, la d -tyrosinase, etc., les isomérases, telles que la glucose isomérase, l'alanine isomérase, etc., et les ligases telles que la glutathione synthétase, la glutamine synthétase, etc. Il n'y a pas de limitation particulière quant aux types de micro-organismes qui peuvent être utilisés dans la présente invention à condition qu'ils appartiennent au groupe comprenant les D bactéries, les levures, les champignons, les actinomycètes, etc., ayant une activité enzymatique. On peut également utiliser des organites cellulaires, des fractions de cellules, et des produits traités d'enzymes ou de micro-organismes ayant une activité enzymatique. Quand on immobilise une enzyme, la concentration préférée de l'enzyme est de 0,01% (p/v) à 20% (p/v), et lorsqu'on immobilise un micro-organisme, la concentration du microbe est de préférence de 0,01% (poids humide/v) à 50% (poids humide/v). Quand on immobilise une bactérie vivante, la plage de concentration du micro-organisme au moment de l'immobilisation peut être plus large dans la mesure o le nombre de bactéries vivantes dans le gel peut être accru en cultivant le micro-organisme immobilisé dans un milieu de culture approprié. On prépare une solution aqueuse contenant des ions baryum en vue d'une gélification, en dissolvant un sel de baryum dans de l'eau. Des exemples spécifiques de sels de baryum, comprennent le chlorure de baryum, le nitrate de baryum, l'acétate de baryum, etc., et parmi ceux-ci le chlorure de baryum est approprié en raison de son faible coût. De manière analogue, des exemples de ses de strontium, comprennent le chlorure de strontium, le nitrate de strontium, l'acétate de strontium, etc., et le chlorure de strontium est particulièrement adapté en raison de son faible coût. La concentration en ions baryum ou en ions strontium utilisée dans la présente invention est de 0,01 M à 1,0 M, de préférence de 0,02 M à 0,5 M. Le procédé de préparation du gel peut être choisi parmi les procédés (1) à (3) suivants en fonction de l'application de l'enzyme immobilisée ou du micro-organisme immobilisé. (1) Par addition goutte à goutte d'une solution mixte d'alginate de sodium et d'une enzyme ou d'un micro-organisme (désignée ci-dessous par solution mixte) à partir de l'embouchure d'une seringue, d'une pipette, etc., dans une solution aqueuse contenant des ions baryum ou des ions strontium, on peut obtenir un produit immobilisé sous la forme d'une perle. (2) En expulsant à force de manière continue, ladite solution mixte à partir de l'embouchure d'une seringue, ou d'une pipette, etc., dans une solution aqueuse contenant des ions baryum ou des ions strontium, on peut obtenir un produit immobilisé sous la forme d'une fibre. 3 5 (3) En mettant ladite solution mixte en contact avec des ions baryum ou des ions strontium dans une solution aqueuse après que ladite solution mixte ait été déposée sur une plaque plate ou incorporée par imprégnation dans du papier filtre ou de la gaze, on peut obtenir un produit immobilisé sous la forme d'une membrane. Dans chacun des procédés décrits ci-dessus, des conditions telles que la durée du contact avec les ions baryum ou les ions strontium, le pH, la température, etc., doivent être choisies dans une gamme de conditions appropriées qui n'affectent pas de manière nuisible l'activité de l'enzyme ou du microbe. La durée du contact de ladite solution mixte avec une solution aqueuse' contenant des ions baryum ou des ions strontium, est normalement choisie de 0,5 à 24 heures, le pH étant de 3 à 11 et la température de 4 à 50 C. On examine ci-dessous par des essais de mesure du degré de gonflement du gel, la stabilité du gel obtenu par la présente invention. Essais 1. Stabilité d'un gel dans une solution de phosphate (degré de gonflement) Dans 10 ml d'une solution aqueuse de KH2PO4 à 0,1 M, on a introduit six perles de gel (0 = 3 mm), préparée en ajoutant goutte à goutte une solution aqueuse d'alginate de sodium à 1,5% dans une solution aqueuse de chlorure de baryum 0,3 M. La solution a été maintenue à 30"C pendant 24 heures et on a ensuite déterminé le degré de gonflement des perles de gel (poids des perles de gel/poids initial des perles de gel). Les résultats sont mentionnés dans le tableau 1. Tableau 1 Résultats Résultats d'essai comparatifs Rapport M/G 0,3 1,2 Degré de gonflement 1,3 3,4 (dissolution partielle) 2. Stabilité du gel dans une solution alcaline (degré de qonflement) Dans des échantillons de 10 ml de solution- tampon de phosphate et de solution-tampon de barbital et d'acide acétique, on a introduit six perles de gel, préparées chacune à partir d'alginate de baryum (0 = 3 mm) selon un procédé analogue à celui décrit ci-dessus. La solution a été maintenue à 30"C pendant 24 heures et on a ensuit déterminé le degré de gonflement des perles de gel (poids des perles de gel/poids initial des perles de gel). Les résultats sont illustrés sur la figure 1 et sur la figure 2 avec ceux obtenus avec l'alginate de calcium dans l'art antérieur. Comme cela apparaît sur la figure 1, dans une solution-tampon de phosphate, des perles de gel d'alginate de calcium avec un rapport M/G de 0,2 et 0,3 sont toutes dissoutes à un pH qui n'est pas inférieur à 3, et les perles de gel d'alginate de baryum de la présente invention avec un rapport M/G de 0,3, avaient un degré de gonflement d'environ 1,5. Toutefois, avec des perles d'alginate de baryum ayant un rapport M/G de 1, 2, c'est-à-dire en dehors de la plage de rapport M/G selon la présente invention, le degré de gonflement devient aussi important que 5. D'un autre côté, dans une solution-tampon de barbital et d'acide acétique, les perles de gel d'alginate de baryum de la présente invention ayant un rapport M/G de 0,3, avaient un degré de gonflement inférieur à 1,5 même à un pH qui n'est pas inférieur à 4, tandis que les perles de 'gel d'alginate de baryum ayant un rapport M/G de 1,2 et les perles de gel d'alginate de calcium ayant un rapport M/G de 0,3 et de 1,2, avaient des degrés de gonflement respectifs deux fois plus importants. Exemple La présente invention est illustrée de manière spécifique à l'aide des exemples non limitatifs suivants. La résistance des perles de gel à laquelle on se réfère dans les exemples et les exemples comparatifs suivants, a été exprimée sous la forme de la charge par unité de surface en section transversale en considérant le diamètre de la perle, et elle a été obtenue à l'aide de l'équation mentionnée ci-dessous. Equation: Charge nécessaire pour briser les perles (g)x 100 (diamètre des perles (cm)x 0,5) x 3,14 Exemple 1, exemple comparatif 1 On a dissous 1,0 g d'alginate de sodium ayant un rapport M/G de 0,3 dans 25 ml d'eau. Dans cette solution, on a ajouté pour préparer une solution mixte, 6 g d'une bactérie congelée contenant de la glucose isomérase obtenue en cultivant Streptomyces Phaeochromoqenes (fabriqué par Godo Shusei; activité: 550 U/g de bactérie congelée). La solution mixte a été ajoutée goutte à goutte dans une solution aqueuse de chlorure de baryum 0,3 M à travers une embouchure de 1 mm de diamètre intérieur afin de préparer des perles de gel. On a ensuite poursuivi l'agitation à C pendant deux heures pour achever la gélification. On a filtré et lavé plusieurs fois avec de l'eau pour obtenir 30 ml d'actinomycètes immobilisés. On a déterminé l'activité de la glucose isomérase des actinomycètes immobilisés, à l'aide de la quantité de fructose produite à 70 C dans une solution-tampon de phosphate 0,1Md'unpH de 7,0 en utilisant du glucose sous la forme d'une solution 0,1 M comme substrat. Les résultats ont révélé une activité de 62,7 (U/ml d'actomycètes immobilisés). Le rendement d'activité était de 57,0%. A titre de comparaison, on a utilisé de l'alginate de sodium ayant un rapport M/G de 0,2 pour obtenir des actynomycètes immobilisés suivant un procédé analogue à celui décrit ci-dessus. L'activité était de 62,7 U/ml. Le rendement d'activité était de 57,0%. La résistance des perles de gel d'actinomycètes immobilisés ainsi obtenues, est mentionnée dans le tableau 2. Tableau 2 Exemple 1 Exemple comparatif 1 Rapport M/G 0,3 1,2 Résistance des perles de gel l,75x 105Pa 1,57x 105Pa Exemple 2, exemple comparatif 2 On a dissous 1,0 g d'alginate de sodium ayant un rapport M/G de 0,3 dans 25 ml d'eau. Dans cette solution, on a ajouté 0,25 g d'une poudre à base de P galactosidase diluée et partiellement purifiée (fabriquée par ICN Nutritional Biochemical, activité ill à 25C et à un pH de 7,5: 80000 U/g) afin de préparer une solution mixte. Cette solution a été ajoutée goutte à goutte dans une solution aqueuse de chlorure de strontium à 0,3 M à travers une embouchure de 1 mm de diamètre intérieur pour préparer des perles de gel. On a poursuivi l'agitation à 25 C pendant deux heures pour obtenir une gélification complète. On a ensuite filtré et lavé plusieurs fois pour obtenir ml de /-galactosidase immobilisée. L'activité de la /-galactosidase immobilisée a été déterminée à l'aide de la quantité de glucose produite à un pH de 7,5 et à une température de 25 C en utilisant du lactose sous la forme d'une solution à 9% (p/v) comme substrat, les résultats ont révélé une activité de 520 (U/ml de 5 galactosidase immobilisée). Le rendement d'activité a été obtenu par l'équation mentionnée ci-dessous. (A de t -gal. immob.) x (Y de 6-gal. immob.) (A de -gal. util.) x (Y de f_gal.util.) x100 Abréviations: A = activité; Y = rendement; AY = rendement d'activité: immob. = immobilise; util. = utilisée; -gal = / -galactosidase. A titre de comparaison, on a utiliséde 1'alginate de sodium ayant un rapport M/G de 1,2 pour obtenir de la f -galactosidase immobilisée selon un procédé analogue à celui décrit ci-dessus. L'activité était de 520 (U/ml de e -galactosidase immobilisée), et le rendement d'activité était de 65%. La résistance des perles de gel de - galactosidase immobilisée aiinsi obtenues, est mentionnée dans le tableau 3. Tableau 3 Exemple 2 Exemple comparatif 1 Rapport M/G 0,3 1,2 Résistance des perles de gel 7 x 104 Pa 6300 Pa Le gel d'enzymes immobilisées ou de micro- organismes immobilisés, obtenu selon le procédé de préparation de la présente invention, a une résistance nettement plus importante que ceux préparés selon les procédés par inclusion en gel de la technique antérieure en utilisant de l'alginate de sodium et des ions calcium et il est stable même lorsqu'il est exposé à des variations ou à la présence d'agents chélatants tout en permettant une utilisation à long terme sans rencontrer de problèmes tels que l'obturation, etc. quand on l'introduit dans une colonne afin de réagir de manière continue avec un écoulement. Le procédé d'immobilisation de la présente invention présente en outre l'avantage consistant en ce qu'il permet de procéder à l'immobilisation en une étape sans nécessiter d'opérations complexes. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une enzyme immobilisée ou d'un microorganisme immobilisé, caractérisé en ce qu'après avoir ajouté une enzyme ou un micro-organisme dans une solution aqueuse d'alginate de sodium ayant un rapport des groupes acide D-rnrirn1noe (M) aux groupes acide Lguluronique (G) M/G de 0,01 à 0,08, on met en contact pour la gélifier,la sItDiun mdxte acr m cbn a?ïe caubatfltl'in bryn u l'in sLtrlm. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport M/G est de 0,01 à 0,2. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration d'acide alginique dans la solution aqueuse d'acide alginique contenant une enzyme ou un micro-organisme, est de 0,5 à 8% (p/v). 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration d'acide 2O alginique est de 3 à 6% (p/v). 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration d'enzyme ou de micro-organisme dans la solution aqueuse d'acide alginique contenant l'enzyme ou le micro-organisme, est respectivement de 0,01 à 20% (p/v) ou de 0,01 à % (p/v). 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse contenant des ions baryum ou des ions strontium, est une solution aqueuse d'un sel de baryum soluble ou d'un sel de strontium soluble. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met en contact une solution aqueuse d'alginate de sodium contenant une enzyme ou un micro-organisme, avec une solution aqueuse contenant des ions baryum ou des ions strontium pendant 0,5 à 24 heures à un pH de 3 à 11 et à une température de 4 à 50C.