Brevet FR2601679A1 — publié le 19880122

La présente invention a pour objet des produits, appartenant à la classe des immunotoxines, obtenus par couplage covalent entre, d'une part la trichosanthine ou la trichokirine telle quelle ou convena5 blement modifiée (ci-après désignée par le symbole A) et, d'autre part un anticorps ou fragment d'anticorps, utilisé sous sa forme naturelle ou correctement modifié (ci-après désigné par le symbole P), possédant la capacité de reconnaître sélectivement un antigène porté par les cellules à détruire visées. Le couplage entre les 2 protéines 10 peut être réalisé soit par l'intermédiaire d'une liaison disulfure soit par l'intermédiaire d'une liaison thioéther. Ainsi, la présente invention a pour objet, selon un de ses aspects, une immunotoxine formée par couplage d'un anticorps P avec la trichosanthine ou la trichokcirine, protéines extraites de la plante 15 Trichosanthes kirilowii, ayant la formule statistique suivante: P' - W - A' (I) dans laquelle P' représente le radical d'une protéine qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convenablement modifié, privée d'au moins l'une de ses fonctions propres 20 et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. A' représente le radical d'une protéine qui est la trichosanthine ou la trichokirine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'au moins une de ses fonctions propres et dans laquelle les autres groupes fonctionnels sont éventuellement 25 bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant au moins un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont l'un des atomes de soufre est soit celui des cystéines de P et A, soit est lié aux fonctions propres de P et/ou de A par des structures d'espacement portant un groupe fonctionnel lié auxdites fonctions propres de P 30 et/ou A. Par liaison thioéther entre deux protéines on entend une liaison du type: -S N-E-Y-Z0 on dans laquelle Z, Y et E sont tels que définis ci-dessous. D'une façon préférentielle, la présente invention concerne une 10 immunotoxine de formule statistique: P' - W' - A' (II) dans laquelle P' et A' sont tels que définis ci-dessus et W' représente une structure covalente choisie parmi: (a) un groupement de formule: 15 0 -(Z'-Y'-E')nSN N-E-Y-Z20 0 (b) un groupement de formule: o -Z-Y-E-N( S-(E'-Y'-Z')n0 o (c) un groupement de formule: -Z"-Y'-E'-S-S-(E-Y-Z)nn (d) un groupement de formule: -(NH-y'-E')-S-S-(E-Y-Z)nou: - Z et Z' identiques ou différents représentent les fonctions propres des protéines A et P, choisies parmi l'atome d'oxygène pro15 venant de l'hydroxyle de l'un des résidus de tyrosine; le groupe carbonyle provenant de l'un des carboxyles terminaux ou des carboxyles libres des acides aspartiques et/ou glutamiques de A et de P; le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation de la structure glucidique de P par l'acide 20 périodique; et le groupe -Nl{- provenant de l'une des amines terminales de A et de P ou de l'une des amines en position epsilon de l'un des résidus de lysine; - Z" est tel que défini ci-dessus pour Z et Z' mais ne peut pas être -NH-; - Y et Y' représentent des groupes engagés dans une liaison covalente avec l'une quelconque des fonctions Z, Z' et Z" des protéines A et P; - E et E' représentent des structures d'espacement inertes; - n représente zéro ou 1. Les immunotoxines de la présente invention sont représentées par les formules (I) et (II) ci-dessus en forme simplifiée,mais il est entendu qu'il peut-y avoir plusieurs structures W ou W' liées à une même molécule de P et/ou de A, et donc plusieurs A liés à un seul P et réciproquement; le nombre de ponts dépendant du procédé de couplage et du nombre de fonctions propres de P et de A. Ainsi, les formules statistiques I et II représentent aussi ces produits et leurs 10 mélanges, qui répondent à la formule P' (W'-A')m dans laquelle m est un nombre entier ou fractionnaire, inférieur ou supérieur à 1. Par exemple, si une immunotoxine est formée par couplage de la trichosanthine ou de la trichokirine avec l'anticorps P (par exemple l'anticorps T10l) par l'intermédiaire d'une structure covalente bivalente ayant un groupe disulfure dont un soufre est celui d'une cystéine de la trichosanthine ou de la trichokirine et l'autre est lié aux oxygènes phénoliques des tyrosines de l'anticorps P par un groupe oxopropylique, elle aura la formule statistique: P'(0-C0-CH2-CH2-S-S-A')t dans laquelle t représente le nombre des tyrosines de l'anticorps (par exemple de l'anticorps T10l) intervenues dans le couplage. L'immunotoxine ainsi obtenue correspond à un produit de formule (II), o: - P' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de l'anti25 corps T10l privé de t fonctions phénoliques de ses tyrosines; - A' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de la trichosanthine ou de la trichokirine privé de la fonction thiol d'une de ses cystéines; - W' est le groupement (c): -Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- o Z" est l'oxygène des hydroxyles phénoliques intervenus dans le couplage, Y est -CO-, E est la structure d'espacement inerte -CH2-CH2 et n est zéro. Particulièrement préférées sont les immunotoxines formées par une ou plusieurs structures contenant la trichosanthine ou la trichokirine et un anticorps P, représentées par la formule statistiS que: P(W' - A')m (III) dans laquelle P', W' et A' sont tels que définis ci-dessus et m représente le nombre de fonctions propres de la protéine P intervenues dans le couplage. Le nombre m varie de 0,3 à 12, de préférence 10 de 0,5 à 10. L'expression "m varie de 0,3 à 12, de préférence de 0,5 à 10" signifie que la valeur de m est statistique car dans la population des molécules d'anticorps le couplage ne se produit pas d'une façon homogène. Le nombre m peut donc ne pas être entier. La valeur de m dépend notamment des anticorps utilisés, plus particulièrement de leur poids moléculaire. Ainsi, si comme anticorps P de départ on utilise un fragment Fab ou Fab', la valeur de m pourra varier entre 0,3 et environ 2; si l'on utilise un fragment F(ab')2, m pourra varier entre 0,5 et environ 4; pour un anticorps du type IgG, la valeur de m sera entre 0,5 et 6; enfin, pour un anticorps IgM, la valeur de m pourra varier entre 1 et 12. Il est cependant préférable que le degré de substitution sur l'anticorps P soit tel qu'il conduise à une valeur de m non 25 inférieure à 0,5 et non supérieure à 10. Plus généralement, les structures (I) et (II) ci-dessus représentent des formules statistiques écrites de façon simplifiée, comme il a été spécifié ci-dessus. D'une façon analogue, les formules (IV), (V) et (VI) ci-dessous 30 sont également statistiques -lorsque, le cas échéant, n est 1- car les réactifs de couplage sont préparés à partir de populations de protéines P1 et P2 qui ont toutes exactement les mêmes propriétés que celles prises en compte ci-dessus pour l'anticorps P. que ces protéines P1 et P2 soient elles-mêmes l'anticorps P ou la protéine extraite de Trichosanthes kirilowii. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la structure (I) ci-dessus, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine P1, qui est indifféremment soit la trichosanthine ou la trichokirine éventuellement modifiées, 10 soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'au moins un groupe thiol libre attaché à ladite protéine P1 directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement, avec une protéine P2, différente de P1, qui est indifféremment soit la trichosanthine ou la trichokirine éventuellement modifiées, soit un anticorps ou fragment 15 d'anticorps, porteuse d'un groupement capable de couplage avec le thiol libre de la protéine P1 de façon à former une liaison thioéther ou disulfure. Selon un aspect préférentiel, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la structure 20 (II), dans laquelle P', W' et A' sont tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine de formule: Pl'-(Z-Y-E)n-SH (IV) avec une protéine de formule statistique: P2'-Z'-Y'-E'-G (V) o Pi' et P2' représentent les radicaux des protéines P1 et P2 liés aux fonctions propres desdites protéines ou les radicaux de l'une des protéines Pl ou P2 provenant de l'ouverture des structures glucidiques des anticorps ou fragments d'anticorps par action de 26O t679 l'acide périodique, Z,Z', Y,Y', E et E' sont tels que définis cidessus et G représente un groupe: E -N ou un groupe -S-S-X, o X est un groupe activateur. Autant P que A sont donc des protéines qui présentent indifféremment: (1) la ou les fonctions thiol qui participent au couplage'; (2) un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir 15 avec les fonctions thiol ci-dessus pour former une liaison disulfure ou thioéther. Selon la présente invention lesdites fonctions thiol et groupements fonctionnels sont ceux des protéines P ou A natives, ou bien ils y sont introduits artificiellement. Pour des raisons de clarté on précise ci-après la signification des symboles utilisés pour désigner les protéines ci-dessus ou leurs radicaux et des expressions utilisées pour désigner les différents symboles. Le symbole P représente une protéine choisie parmi tout anticorps 25 ou fragment d'anticorps ou toute immunoglobuline ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule dérivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels, y compris des structures glucidiques qu'el es portent, sous réserve que la protéine ainsi choisie reste capable de reconnaître 30 sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigène et notamment des cellules cancéreuses. Le symbole A représente une protéine qui est la toxine trichosanthine ou la trichokirine telle qu'elle peut être directement obtenue à partir de Trichosanthes Kirilowii ou toute molécule 5 dérivant de ces toxines par modification artificielle de tout groupement fonctionnel porté par cette protéine sous réserve que la protéine ainsi choisie présente encore la propriété d'inhiber la synthèse protéique ribosomale des cellules eucaryotes, telle que l'on peut la mettre en évidence dans un modèle d'étude acellulaire. Le symbole P' représente un radical dérivé de la protéine P cidessus, telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symboie A' représente un radical dérivé de la protéine A ci15 dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole Pl représente une des protéines A et P telles que définies cidessus qui porte des fonctions thiol libres, attachées à 20 ladite protéine directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement. Le symbole P2, différent de P1, représente une des protéines A et P telles que définies ci-dessus, qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols libres. Le symbole Pl' représente le radical de la protéine P1 lié aux fonctions propres de la protéine Pl notamment les fonctions SH (de la cystéine), NH2 (terminal de la protéine ou dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques) ou le radical de la protéine P1, prove30 nant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide périodique lorsque Pl désigne un anticorps ou fragment d'anticorps. Le symbole P2' représente le radical de la protéine P2 lié aux groupes fonctionnels caractéristiques NH{2 (terminal de la protéine Qu dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques). Par exemple, Pl'-SH représente-la protéine Pl (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la trichosanthine ou trichokirine dans laquelle les groupes SH des cystéines sont libres et les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. De la même façon, Pl'-CO- représente la protéine P1, dans la10 quelle son groupe carboxylique terminal ou les groupes carboxyliques de ses acides glutamiques et aspartiques sont couplés avec un groupement qui apporte un groupe SH introduit artificiellement. Encore, P2'-NH- représente la protéine P2 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la trichosanthine ou trichokirine) dans laquelle son groupe amino terminal ou les groupes amino de ses lysines sont attachés à un groupement susceptible de couplage avec le thioi de la proteine Pl. Lm terme "'structure d'espacement inerte" tel qu'utilisé ici pour E et E' désigne un radical organique bivalent inerte vis-à-vis des 20 réactifs utilisés dans le procédé, tel qu'un groupe alkylène à chaine droite ou ramifiée contenant de 1 à 15 atomes de carbone, qui peut contenir une ou plusieurs doubles liaisons ou qui peut être interrompu par des atomes d'oxygène ou qui peu: être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, tels que des groupes 25 méthoxy, des groupes carboxyles libres ou estérifiés, des groupes dialkylamino, des groupes carbamates. Le même terme désigne également un groupe arylène contenant de 6 à 15 atomes de carbone qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes comme indiqué ci-dessus pour le groupe alkylène. L'expression "groupe fonctionnel capable de se lier d'une façon covalente" telle qu'utilisée ici pour Y et Y' désigne tous les groupes susceptibles de réagir avec les fonctions propres des protéines P1 et P2 pour donner une liaison covalente. Ainsi, les groupes -COet -(C=NH)- sont des groupes fonctionnels convenables susceptibles de se lier aux amines libres, aux thiols et aux hydroxyles phénoliques des protéines. De même, le groupe -NH - est un groupe fonctionnel convenable susceptible de se lier aux groupes carboxyliques libres 5 des protéines. Le groupe =N- est un groupe fonctionnel convenable, susceptible de se lier aux deux atomes de carbone des structures glucidiques des protéines P1 ou P2 après oxydation avec les ions périodate lorsque P1 ou P2 représentent un anticorps ou fragment d'anticorps. L'expression "fonction propre des protéines" telle qu'utilisée ici pour Z, Z' et Z", désigne les radicaux provenant des groupes caractéristiques des acides aminés formant les protéines P1 et P2, telles que l'atome d'oxygène provenant des hydroxyles des acides aminés tyrosine et éventuellement sérine, le groupe carbonyle prove15 nant du carboxyle terminal ou des carboxyles libres des acides aspartique et glutamique, le groupe -NH- provenant de l'amine terminale des protéines ou des lysines, l'atome de soufre provenant du thiol de la cystéine. La même expression désigne également le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une 20 des structures glucidiques des protéines P1 ou P2 par traitement avec les ions periodate lorsque P1 ou P2 représente un anticorps ou fragment d'anticorps. Le terme "radical activateur", tel qu'utilisé ici pour X, désigne un groupement lié à un pont -S-S- capable de réagir avec un thiol li25 bre pour former un disulfure avec libération de X-SH. Des radicaux activateurs convenables sont les groupes pyridyl-2 et pyridyl-4, non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle; le groupe phényle non substitué ou, de préférence, substitué par un ou des halogènes ou des groupes 30 nitro, alcoxy, carboxyle ou alcoxycarbonyle; ou un groupe alcoxycarbonyle tel que méthoxycarbonyle. Les termes "alkyle" et "alcoxy" désignent des groupes contenant jusqu'à 5 atomes de carbone. 26 0 1679 Le terme "alkylène" désigne des groupements aliphatiques saturés, à chaîne droite ou ramifiée contenant jusqu'à 10 atomes de carbone pouvant être substitués par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes tels que les groupes alcoxycarbonyle. La trichosanthine est une protéine inactivant les ribosomes (RIP) extraite des racines de Trichosanthes Kirilowii décrite dans Nature (1,2), 321 (1986). Par extraction des graines de Trichosanthes Kirilowii on obtient une nouvelle RIP exceptionnellement puissante, 10 différente de la trichosanthine. Cette nouvelle RIP, nommée trichokirine", a les caractéristiques suivantes: - Glycoprotéine ayant un poids moléculaire 28.000 + 3.000, déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (sodium dodécyl sulfate), 15 - de point isoélectrique 9 + 1, - de contenu en- sucres neutres: 1,1 à 1,5 " en poids dont 0,3 à 0,6 "O de mannose, - de composition en acides amines: nombre de résidus par mole de protéine + 20 %: Lys: 17,3; His: 1,1; Arg: 6,7; Asx: 22,7; Thr: 18,9 Ser: 23,4; Glx: 21, 5; Pro: 8,0; Gly: 16,0; Ala: 21,1; 1/2 Cys: 1,9; Val: 12;5; Met: 3,05; Ile: 15,7; Leu: 24,2; Tyr: 12,1; Phe: 10,1; Trp: n.d.. tel que Asx est l'ensemble des résidus d'acide aspartique et d'asparagine Glx est l'ensemble des résidus d'acide glutamique et de glutamine 1/2 Cys est déterminé comme étant les résidus d'acide 30 cystéique et n.d. est non déterminé - de séquence amino-terminale: 1 10 Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly16 Thr-Ala-Ser-Tyr-Glu-Lys La composition en acides aminés est déterminée par chauffage à C pendant 24 heures sous azote en présence d'acide chlorhydrique 6 N, phénol à 1 % et 2-mercaptoéthanol à 1 %,. Les acides aminés sont dérivés par le phénylisothiocyanate (PICT) en milieu alcalin. Les 10 PICT aminoacides sont analysés par HPLC sur phase inverse. La cystéine a été déterminée après oxydation de la protéine avec l'acide performique (J. Biol. Chem. 238, 235-237 (1963)). La séquence amino-terminale est déterminée avec un microséqenceur commercialisé par Applied Biosynthesis, à partir de 5 nmoles de protéine solubilisées dans une solution d'acide acétique à 1.. Les PICT-aminoacides sont analysés par HPLC sur phase inverse. La trichokirine est obtenue par un procédé caractérisé en ce que l'on extrait des graines de Trichosanthes kirilowii avec de l'eau en présence d'un tampon à pH 6,5-7,5, on élimine le matériau insoluble, 20 on fractionnrme l'extrait brut par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide, en éluant avec une solution tampon contenant du chlorure de sodium à un pH de 7,2-7,7 et on isole la fraction contenant la protéine inhibitrice et la purifie. Par exemple, les graines de T. kirilowii, de préférence après 25 égrenage, sont broyées et extraites avec de l'eau contenant un électrolyte, par exemple du chlorure de sodium, et un tampon, par exemple untampon phosphate, à un pH voisin de la neutralité. Les matières insolubles sont éliminées par exemple par centrifugation et les substances de bas poids moléculaire sont éliminées de la solution 30 par dialyse par exemple contre du tampon phosphate. L'extrait dialysé est alors soumis à un fractionnement, par exemple par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide telle que la carboxyméthylcellulose. L'élution peut être effectuée en utilisant un gradient linéaire de concentration par exemple une solution aqueuse de 0 à 0,3 M de chlorure de sodium. Normalement, 4 pics principaux sont élues et le pic IV élué par une concentration en chlorure de sodium de 0,03 à 0,11 M contient la plus grande partie de la trichokirine. La purification de la trichokirine peut être effectuée par filtration sur gel par exemple sur une colonne de Sephadex (marque déposée). La trichokirine peut être couplée aux haptomères par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié selon le procédé décrit ci-dessus. La trichokirine inhibe les synthèses protéiques dans un lysat de réticulocytes avec une DIs0 de 2-4 nano.g/ml. Sur les cellules 15 intactes, l'effet est de loin inférieur, avec une DI.0 qui peut varier de 7 à plus de 100 micro.g/ml, selon la cellule examinée. Le tableau 1 montre l'effet de la trichokirine sur diverses cellules, notamment la DI (icro.. et en M..10-') de l'inhibition de la synthèse proteicue; celle-ci a été deétermlnée en 20 appliquant la méthode décrite dans J. Biol. Chem. 259, 9359-9354 (1984). 260 1 6 7 9 TABLEAU 1 : Cellule: DI0 micro.g/ml: M.10-7: :.... ........: . . .......: ....: : Fibroblastes humains: 3,9: 1,3: : Cellules TG: 7,5: 2,5: : Cellules NB 100: 10,3: 3,4: : (neuroblastome):: : : Cellules JAR: 16,3: 5,4: : (coriocarcinome):: : : Cellules HeLa: 45,0: 15,0: : M 4039 (melanome): 9, 9 3,3 ____________________________________________________ La prépa ation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des cellules cancéreuses humaines a été largement mentionnée dans la littérature scientifique et beaucoup de ces anticorps sont maintenant disponibles commercialement. Le couplage chimique entre la trichosanthine ou la trichokirine 20 et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) peut être réalisé selon le procédé de la présente invention par des modes opératoires qui: - préservent les activités biologiques respectives des deux composants du conjugué: l'anticorps et la trichosanthine ou la trichokirine, - assurent au procédé une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage, permettent de maîtriser la valeur du rapport toxine/anticorps dans le conjugué obtenu, - conduisent à un produit stable et soluble dans l'eau. Parmi les modes opératoires répondant à ces caractéristiques, il faut prévilégier ceux qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonc- tions thiol pour l'établissement de la liaison entre les 2 protéines. En effet, ces fonctions thiol se prêtent particulièrement bien à l'établissement, soit de liaisons disulfure, soit de liaisons thioéther qui satisfont les unes comme les autres aux conditions générales ci-dessus. D'une façon générale, pour la bonne conduite des réactions de couplage entre protéines et en vue d'éliminer notamment les réticulations anarchiques, il importe que l'une des protéines à cou10 pler et elle seule porte la ou les fonctions thiol à mettre en oeuvre, alors que l'autre protéine et elle seule porte une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les thiols en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9 et à une température ne dépassant pas 300C, pour fournir une liaison covalente stable et définie. Les caractéristiques des protéines Pl et P2 utilisées comme produits de départ sont illustrées en détail ci-après. La structure d'espacement E peut être rempiacée par les structures préférentielles R et R8 qui ne sont données qu'à titre d'exemple. CAS DE LA PROTEINE Pl. Cette protéine étant dans tous les cas celle qui porte la ou les fonctions thiol qui participeront au couplage, la situation se présente de façon diverse selon la nature de cette protéine Pl. A) La protéine P1 porte naturellement un ou plusieurs radicaux thiol utilisables pour permettre le couplage à la protéine P2: c'est 25 notamment le cas si la protéine P1 est le fragment d'anticorps connu sous la dénomination de F(ab)', tel qu'il est classiquement obtenu par protéolyse limitée de l'anticorps en présence de pepsine, suivie d'une réduction du (ou des) ponts disulfure entre chaînes lourdes. C'est également le cas si la protéine P1 est la trichosanthine ou 30 la trichokirine ou un dérivé de l'une de ces toxines o l'un au moins des groupements thiol portés par les résidus cystéine de la toxine native est libre et accessible au couplage chimique. Dans tous les cas, la protéine P1 porteuse de son (ou de ses) groupement(s) thiol naturel(s) peut être utilisée dans cet état pour l'étape de couplage. B) La protéine P1 ne porte pas naturellement de radicaux thiol utilisables pour permettre le couplage à la protéine P2: - c'est notamment le cas si la protéine P1 est une immunoglobuline native, un anticorps entier ou un fragment d'anticorps et notamment l'un des fragments couramment dénommés F(ab)t2 ou F(ab); 10 - un autre cas o la protéine P1 ne porte pas naturellement de fonction thiol utilisable pour le couplage est celui o cette protéine P1 est la trichosanthine ou la trichokirine o chacun des résidus de cystéine est soit bloqué par alkylation, soit inaccessible à la modification chimique. Dans tous les cas, il conviendra alors d'introduire artificiellement sur de telles molécules une ou plusieurs fonctions thiol aptes à permettre le couplage. Trois types de réactions peuvent être utilisés de préférence pour l'introduction de fonctions thiol: 1 - Le premier type de réaction est l'action de l'anhydride Sacétylmercapto succinique qui est capable d'acyler des fonctions aminées de la protéine. On pourra ensuite libérer les fonctions thiol par élimination du radical acétyl protecteur, par action de l'hydroxylamine, ainsi que cela a été décrit (Archivs of Biochemistry 25 and Biophysics, 119, 41-49, (1967)). On pourra même, dans le cas o la (ou les) fonction(s) thiol ainsi introduite(s) sous forme protégée doivent réagir ultérieurement avec un radical disulfure mixte activé, se dispenser de la déprotection préalable par l'hydroxylamine; en effet, la réaction de formation de la liaison disulfure utilisant les 30 réactifs objet de la présente invention se produit aussi bien avec le radical S-acétyl qu'avec le thiol libre. D'autres méthodes décrites dans la littérature scientifique peuvent aussi être utilisées pour l'introduction de fonctions thiol sur la protéine à modifier. 260 1.679 Une protéine P1 modifiée particulièrement avantageuse est un Sacétylmercaptosuccinate de trichokirine obtenu par traitement de la trichokirine avec l'anhydride S-acétylmercaptosuccinique, ainsi que le mercaptosuccinate correspondant préparé par action de l'hydroxylamine sur le dérivé S-acétyle. Cette trichokirine modifiée peut être représentée par la formule TK - (CO - CH- S - W) CH2COOH dans laquelle TC représente le radical de la trichokirine, W représente l'hydrogène ou le groupe acétyle et n peut varier entre 0,2 et 3, de préférence entre 0,4 et 1. 2 - Le deuxième type de réaction consiste à faire réagir la protéine par ses groupements carboxyliques avec une molécuie diaminée 15 symétrique présentant un pont disulfure, de formule: H2N-R -S-S-R -N'2 1 1 dans laquelle R est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. La réaction se fait de préférence avec la cystamine R1 = -(CH2)2- en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre, de l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: 25 Pl'-CONH-R1-S-S-R1-NH2 (Ia) Pl'-CO-NH-R -S-S-R -NH-CO-P'l (Ib). Un tel produit de réaction peut être alors utilisé de deux manières a) Si dans les formules Ia et Ib, la protéine P'l est la trichosanthine ou la trichokirine ou l'un de leurs dérivés, le milieu réactionnel obtenu estsoumis sans fractionnement à l'action d'un réducteur, tel que le mercapto2 éthanol, ce qui conduit à l'obtention d'un dérivé protéique unique de formule générale: Pl'-CONH-R 1-SH Le produit ainsi obtenu est alors purifié par dialyse ou filtration sur gel. b) Si dans les formules Ia et Ib, le radical P'1 est le radical de la protéine P1 constitué par un anticorps ou l'un de ses fragments, le milieu réactionnel obtenu sera utilisé tel quel pour le couplage en utilisant alors une méthode d'échange thiol/disulfure par exemple celle décrite par Gilliland et Collier (Cancer Research, 40, 15 3564, (1980)). 3 - Le troisième type de réaction consiste à utiliser des motifs glucidiques naturellement présents sur les anticorps pour fixer le radical porteur du thiol que l'on se propose d'introduire. La protéine est alors soumise à une oxydation par les ions periodate 20 afin de faire apparaitre des fonctions aldéhyde sur les motifs glucidiques. La réaction est arrêtée par addition d'un réactif qui consomme le périodate restant, par exemple un excès d'éthylène glycol et les sous-produits sont éliminés par dialyse ou tout autre traitement approprié. Le produit obtenu est traité par une molécule 25 diaminée symétrique présentant un pont disulfure, de formule générale H2N-R1-S-S-R1 -NH2 dans laquelle R1 est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. Les produits d'addition formés sont alors réduits en amines secondaires ou tertiaires par action d'un hydrure métallique convenable, notamment le borohydrure de sodium. La réaction se fait de préférence avec la cystamine / Ri=-(CH2)2- / et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre de l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: OH / CH Pl' N-R-S-S-R1-NH2 IIa CH OH OH CH /CH CH Pl' N-R,-S-S-Ri-N Pl' Lib \ CH / CH / OH OH Le milieu réactionnel pourra alors être traité exactement comme indiqué ci-dessus pour les produits caractérisés par les structures Ia ou Ib, o P'l représente un anticorps ou fragment d'anticorps. 20 Dans les deux derniers types de réaction d'introduction artificielle de groupements thiols décrits ci-dessus (ceux utilisant un réactif disulfure diaminé symétrique), il est préférable que la protéine P1 mise en oeuvre ne possède ni groupes SH libres, ni groupes aminés libres. Dans le cas de la trichosanthine ou de la trichokirine et de leurs dérivés cela peut toujours être réalisé par alkylation du ou des SH naturels,obtenue par réaction avec un réactif usuel des thiols tel que le N-éthylmaléimide ou l'acide iodacétique ou I'un de ses dérivés et par méthylation des NH2 naturels selon le procédé de 30 méthylation réductive décrit par MEANS et FEENEY (Biochemistry 7, 2192, (1968)). On peut.introduire ainsi dans la trichosanthine ou la trichokirine un ou plusieurs radicaux méthyle par mole. La protéine ainsi modifiée conserve l'intégralité de ses propriétés biologiques 5 et notamment sa capacité à inhiber la synthèse protéique ribosomale dans les cellules eucaryotes. Dans le cas des anticorps ou fragments d'anticorps et plus généralement de toutes les substances du premier groupe tel que défini précédemment qui ne possèdent pas de groupements SH natu10 rellement libres, il conviendra de procéder à une méthylation réductive, par exemple selon la méthode de MEANS et FEENEY: on peut ainsi habituellement introduire plusieurs dizaines de radicaux méthyle par mole d'anticorps sans modifier sa capacité à reconnaître sélectivement un antigène à la surface des cellules porteuses de cet 15 antigène. CAS DE LA PROTEINE P2. Cette protéine est dans tous les cas celle qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols de la protéine P1 pour former une liaison soit disulfure, soit thioéther. Ces groupements fonctionnels, toujours artificiellement introduits sur la protéine P2, diffèrent selon que l'on cherche à obtenir un couplage par liaison disulfure ou par liaison thioéther et sont choisis comme indiqués ci-après. A) Cas de la liaison disulfure. La préparation du conjugué peut alors être représentée par le schéma: Pl'(Z-Y-E)n-SH + P2'-Z'-Y'-E'-S-S-X > Pl'-(Z-Y-E)n-S-S-E'-Y'-Z'-P2' + X-SH La protéine P'2 substituée par un atome de soufre activé est ob30 tenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution à l'aide d'un réactif lui-même - porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma: P2 + L-Y'-R-S-S-X * P2'-Z'-Y'-R-S-S-X dans lequel: - P2 désigne la protéine à substituer; - L-Y' représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine. Le groupement fonctionnel L-Y' est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, on retiendra particulièrement a) Les fonctions aminées terminales des chaînes peptidiques ou les fonctions aminées latérales des radicaux lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, L-Y' pourra notamment représenter: - un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide; - un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir 20 directement avec les fonctions aminées pour les acyler; - un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitroou dinitro-phényle ou encore un ester de N-hydroxy succinimide qui peut réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler; - un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel, par exemple, l'anhydride succinique qui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides; - un groupement imidoester, 26 0 1679 NH -C (L = OR2, Y = -(CNH)-) OR2 o R2 est un groupe alkyle, qui réagit avec les groupes aminés de la protéine P2 selon la réaction: H HN N P2'-NH2 + C-R -. P2'-NH-C-R + R OH R20 o R3 représente le groupe -R-S-SX; b) les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cas L-Y' pourra notamment représenter un groupement 15 imidazolyl-1 carbonyl, réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction: P2'OH + N-CO-R - > P2'-OCO-R + NH 4 4 N--/ o le 1-imidazolyle est L, le groupe CO est Y' et R4 est le groupe -R-S-S-X. Le radical -S-S-X désigne-un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En particulier, dans ce disulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4, éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène ou carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle, tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne la structure d'espacement (indiqué comme E dans la formule générale II ci- dessus) capable de porter simultanément les substituants Y' et S-S-H. Il devra être choisi de 5 façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe -(CH2)n avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe: R. - CH I CH I R6 dans lequel R désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et R. désigne un substituant inerte vis-àD vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe carbamate - N- C - O _R o R7 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé L-Y'-R-S-S-X avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à-une concentration finale pouvant atteindre 20 % en 25 volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire, tel que le butanol tertiaire ou 10 % en volume lorqu'il s'agit du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30 C, pendant un temps variant de 1 heure à 24 heures. La solu10 tion aqueuse obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. B) Cas de la liaison thioéther. La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir 15 Pl'-(Z-Y-E)nSH avec la protéine P2 sur laquelle aura n préalablement été introduit un ou plusieurs radicaux maléimide. La réaction est alors représentée par le schéma suivant cité comme exemple: o Pl'-(Z-Y-E)n-SH + P2'-Z'-CO-R8-N X o / S-(E-Y-Z)nPl' P2'-Z'-CO-R8-N o0 dans lequel: 260167 9 - R8 représente une structure d'espacement, aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 15 atomes de carbone, inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement; - Z' représente des groupes variables selon le type de groupement fonctionnel de la protéine P2 intervenant dans le couplage. Ainsi Z' = oxygène dans le cas d'un ester sur le phénol d'un résidu tyrosyle; Z' = NHI dans le cas du couplage d'un groupement carboxylique activé sur un groupement aminé de la protéine; Z' = NH-CH2 dans le cas de la réaction d'une chlorométhylcétone sur un groupement aminé de la protéine. La protéine P2 substituée par le ou les groupes maléimide est obtenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protéine P2 cor15 rectement protégée, par substitution de fonctions convenables de la protéine à l'aide d'un réactif-lui-même porteur du groupement maléimide. Parmi ces fonctions convenables, on retiendra particulièrement: a) Les fonctions aminées terminales des chaines peptidiques ou 20 les fonctions aminées latérales des résidus lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, le réactif porteur du radical maléimide pourra être: - soit un réactif de formule générale: o0 L-CO-R8 - dans laquelle L-CO- représente: soit un groupe carboxylique, la réaction étant alors effectuée après activationde la fonction carboxylique en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau, tel que l'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, soit un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para5 nitro ou dinitrophényle, ou encore un ester de Nhydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler. La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvitica Chimica Acta 58, 531-541 (1975). D'autres réactifs de 10 la même classe sont commercialement disponibles. soit un réactif de formule générale: o Il NC1c:2-C0-Rs-N capable de réagir avec les groupements aminés de la protéine P2 selon le schéma: P2'NH2 + ClCH 2-C0-R -N 0 on b) Les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, le réactif porteur du radical maliimide pourra être un réactif de formule générale: O o C N- CO- R--N Il 2 0 réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction: o0 i! D N-CO-R8-N" + P2'OH N,/ P2'-O-CO-R s-N + N 0 La réaction des réactifs porteurs de maléimide avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique 20 miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteindre 20 % en volume lorqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou 10 % en volume lorsqu'il s'agit du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps 25 variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux dérivés protéiques en solu- 1 67 9 tion aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30 C, pendant un temps variant de 1 heure à 24 heures. La solution obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les 5 produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. Parmi les composés de la présente invention, sont particulièrement convenables ceux de formule (II) dans laquelle W' représente un des groupements (a), (b), (c) et (d) ci-dessus, o E et 10 E' représentent un groupe -(CH2)p-, p étant un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe: -CH CH2COOH Ainsi des dérivés de protéine particulièrement intéressants sont 15 représentés par la formule statistique: P2" - 0 - CO - E - G (VI) dans laquelle: - P2" représente le radical d'une protéine choisie parmi: tout anticorps ou fragment d'anticorps ou toute immunoglobuline ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule dérivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels; la trichosanthine ou la trichokirine ou toute molécule dérivant des dites toxines par modification artificielle de 25 l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels; ledit radical étant la protéine privée d'un ou plusieurs groupes hydroxyles phénoliques des tyrosines; - l'atome d'oxygène est celui des groupes hydroxyles phénoliques manquant dans le radical P2"; - E et G sont tels que définis ci-dessus. Particulièrement préférés sont les composés de formule (VI) dans laquelle E représente un groupe -(CH2)p-, o p est un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe -CHCH2COOH et G est un groupement de structure -S-S-X, o X est un radical activateur choisi parmi les groupes 2-pyridyle et 4-pyridyle non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alcoxycarbonyle, le groupe phényle non substitué ou substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alcoxy, carboxyle cu alcoxycarbonyle, ou un groupe alcoxycarbonyle. * Les produits de formule (VI) sont préparés en faisant réagir un produit de formule: P2"-OH, dans laquelle P2" est tel que défini 15 ci-dessus et le groupe hydroxyle étant i'hydroxyle phénolique manquant dans les tyrosines du radical P2", avec un composé de formule (VII) ci-dessous N-CO-E-G (VII) N--/ à une température de 10 à 400C dans un solvant aqueux contenant éventuellement un solvant organique miscible à l'eau, tel que par exemple un solvant éthéré comme le dioxanne ou le tétrahydrofuranne. Les exemples qui suivent permettent de mieux comprendre l'inven25 tion sans en limiter la portée. L'anticorps monoclonal AT15E, est dirigé contre l'antigène Thy 1.2 des lymophocytes murins. Cet anticorps est celui décrit dans Journal of Immunology 122, 2491-8, (1979) et a été obtenu à partir de l'hybridome décrit dans Hybridoma 1 (1), 13-17 (1981). 260 1 679 Dans les exemples, la trichokirine est désignée par l'abréviation TK. EXEMPLE 1: ISOLEMENT DE LA TRICHOKIRINE. A) Extrait brut. Des graines de Trichosanthes kirilowii (1,2 kg) sont broyées dans un appareil Ultraturrax avec 8 volumes de solution de chlorure de sodium 0,14 M contenant du tampon phosphate 5mM, pH 7,5. L'extraction est poursuivie pendant une nuit à 4 C sous agitation magnétique. 10 Après élimination des résidus grossiers, on procède à une centrifugation à 10.000 g à 0 C pendant 45 minutes. Le surnageant est décanté à froid pour éliminer les graisses solidifiées puis les protéines sont précipitées par addition de sulfate d'ammonium jusqu'à saturation. Après centrifugation comme indiqué ci-dessus, le produit 15 précipité est remis en suspension dans 1 litre de solution aqueuse 0,14 M de chlorure de sodium contenant du tampon phosphate 5mM, pH 7,5. Le produit non dissous est éliminé par centrifugation dans les mêmes conditions que ci- dessus. Le surnageant est passé sur une colonne de Sephadex G 25 coarse (95 cm x 10 cm) équilibrée avec du tam20 pon phosphate 5mM, pH 7,0 à température ambiante et élué à la vitesse de 3 1 / heure. Le premier pic est collecté. B) Chromatographie d'échange d'ions. Les extraits combinés de 2 opérations (provenant à l'origine de 2,4 kg de graines) sont additionnés de chlorure de sodium jusqu'à une 25 concentration finale de 30 mM et:passés sur une colonne (17,5 cm x 5 cm) de CM-Sepharose Fast Flow équilibrée avec du tampon phosphate mM, pH 7,0. Le produit non fixé est élué avec le même tampon. La protéine liée est éluée par un gradient contenant de 30 à 110 mM de chlorure de sodium dans le même tampon phosphate (volume 20 litres). 30 Des fractions de 400 ml sont collectées à la vitesse de 1,2 litres par heure. L'absorbance à 280 nm et la conductivité de l'éluat sont controlées. Les fractions montrant une activité inhibitrice de la synthèse protéique sont réunies (3,6 1) et acidifiées à pH 5,8 par de 26 0 1679 l'acide acétique. On passe la solution sur une colonne de S-Sepharose Fast Flow (6,6 cm x 5 cm) équilibrée avec le tampon acétate de sodium mM, pH 4,5. Après lavage avec le même tampon, la protéine fixée est éluée par du tampon phosphate 20 mM, pH 7,5 contenant du chlorure de sodium 0,5 M. La fraction correspondant au pic contenant la protéine (200 ml) est recueille et dialysée contre 3 fois 50 1 d'eau distillée puis lyophilisée. On obtient ainsi 380 mg de trichokirine. 10 C) Filtration sur gel. La trichokirine obtenue ci-dessus est dissoute dans 50 ml de solution de chlorure de sodium 0,14 M. On élimine un insoluble par centrifugation à 20.000 g pendant 30 minutes. Le surnageant est passé sur une colonne de Sephadex G 50 coarse (95 cm x S cm) équilibrée 15 avec le tampon phosphate 5mM, pH 7,0 à 4 C. On élue à la vitesse de ml/heure. La solution correspondant au pic contenant la protéine est collectée, dialysée et lyophilisée comme indiqué ci-dessus. On obtient ainsi 267 mg de trichokirine purifiée. EXEMPLE 2: S-ACETfD!LRCAPTOSUCCINOYL DE TRICHOKIRINE 20 M.RCAPTOSUCCINOYL DE TRICHOKIRINE. A 5,8 mg du trichokirine (0,215 micromole) dissoute dans 6 ml de tampon phosphate 125 mN pH 7 (soit 0,973 mg/ml, 0,036 micromole environ/ml) sont additionnés 100 microlitres d'une solution d'anhydride Sacétylmercaptosuccinique (SAIMSA) à 10,5 mg/ml (60,33 micromoles/ml) dans le diméthylformamide. L'incubation dure une heure puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactif par dialyse contre du tampon phosphate 125 mM pH 7. On obtient ainsi 5,7 ml d'une solution de Sacétylmercaptosuccinoyl de trichokirine à 0,948 mg/ml. Par action de l'hydroxylamine et selon la méthode 30 d'ELLMAN (Methods in Enzymology 25, 457, (1972)) on obtient le mercaptosuccinoyl de trichokirine contenant 0, 7 groupes SH libres par mole de trichokirine (dosage spectrophotométrique) . Examinée par électrophorèse en gradient de polyacrylamide cette protéine modifiée présente une seule bande de poids moléculaire voisin de 28.000 + 3.000 identique à celle de la protéine native. EXEMPLE 3: CONJUGUE ENTRE L'ANTICORPS AT15E (ANTI-THY 1.2) ET DU MERCAPTOSUCCINATE DE TRICHOKIRINE. A) Préparation de l'anticorps ATS15E modifié. L'anticorps ATS15E est un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène Thy 1.2 des lymphocytes murins. Cet anticorps est celui qui est décrit dans Journal of Immunology 122, 2491-8 (1979) et a été 10 obtenu à partir de l'hybridome décrit dans Hybridoma 1(1); 13-17 (1981). A 3,7 ml d'une solution d'anticorps AT15E à 3,55 mg/ml (soit 0,087 micromole)-dans un tampon borate 0,1 M pH 8,8 est ajoutée 25 microlitres d'une solution de N-succinimidyl-3(pyridyl-2 15 disulfanyl)-3 propionate à 5,5 mg/ml dans l'éthanol. L'incubation dure 30 minutes puis l'excès de réactif est éliminé par dialyse contre du tampon phosphate 125 mM pH 7. Apres dialyse la solution protéique est centrifugée et l'on obtient 3,3 ml d'une solution à 3,4 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 3,2 groupements disulfure mixte activé par mole d'anticorps. B) Préparation de l'immunotoxine (conjugué). A 1,9 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenu 25 (soit 0, 043 micromole) on ajoute 5 ml de la solution de trichokirine modifiée précédemment obtenue (soit 0,183 micromole) et on incube 20 heures à 25"C en présence de 350 microlitres d'une solution molaire d'hydroxylamine. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur colonne de Séphadex G200 avec mesure de la densité opti30 que de l'effluent à 280 nm. Le regroupement des fractions contenant à la fois l'anticorps et la TK conduit à 20 ml d'une solution d'immunotoxine à 0,215 mg/ml (soit 4,3 mg). Cette solution contient 0,045 mg/ml de trichokirine modifiée couplée à l'anticorps. 260 1 679 Le taux de couplage moyen dans cette préparation est de 1,5 TK par mole d'anticorps. TESTS D'ACTIVITE DES IMlUNOTOXINES. L'une des propriétés de la trichokirine est d'inhiber la synthèse des protéines dans les cellules eucaryotes. Les tests réalisés sont donc des tests d'inhibition de la synthèse protéique: - soit sur un modèle acellulaire, - soit sur un modèle cellulaire. 10 A) Le modèle acellulaire. Le protocole in vitro utilise des fractions subcellulaires de foie de rat convenablement complémentées et capables d'incorporer la 14Cphénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel. l'acide polyuridilique. Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14C-phénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans Biochimica et Biophysica Acta 312, 618-615 (1973), mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de 20 rat. L'échantillon contenant la trichokirine est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon tris-HCl 50mM pH 7,6 contenant du mercapto-2 éthanol à 0,2 %,O et de la sérum albumine bovine à 15 microgrammes/ml. A partir des données de comptage on calcule, par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur, le 25 pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine pour chaque milieu réactionnel. L'ensemble des valeurs obtenues permet de déterminer la concentration de trichokirine (ou CI 0) qui inhibe 50 ' de l'incorporation de la 14Cphénylalanine dans les conditions de l'essai. Pourla 30 trichokirine native, on a ainsi déterminé que la CI50 est égale à 7.10-1l M, tandis que celle de la trichokirine modifiée est égale à 2,8 10-10 mole/litre. La modification n'entraîne donc pas de perte importante d'activité de la trichokirine. 2 6 0 16 7 79 B) Cytotoxicité spécifique de l'immunotoxine à trichokirine sur modèle cellulaire. L'activité biologique de la trichokirine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire de systèmes eucaryotes. La technique utilisée met en oeuvre un modèle cellulaire dans lequel on mesure l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire T2, issue d'une leucémie T de sou10 ris qui exprime l'antigène de surface Thy 1.2. Les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier à différentes concentrations puis, en fin d'incubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de 14C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la 15 procédure décrite dans Journal of Biological Chemistry 249(II), 3557-3562, (1974), utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les ceilules entieres isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets doses présentant en abcisse la concentration molaire en trichokirine des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI50). Le-tableau 2 représente les valeurs de CI50 obtenues dans la même expérience avec l'immunotoxine à trichokirine d'une part, la trichokirine non couplée 30 d'autre part. 26 0 16 79 TABLEAU 2 : Produits: Concentration inhibitrice 50: S:..........: ...............: : IT à trichokirine: 2 x 10-10 M: ::: : Trichokirine: 2 x 10-6 M ____ ___---__ ____ ____ ____--- ------------------------10 On peut constater que V'IT à trichokirine a une très forte activité cytotoxique qui est plus de 10.000 -ois supérieure à celle de la trichokirine non couplée. EXEMPLE 4: CONJUGUE ENTAE L'ANTICORPS AT15E (ANTI-T-Y 1.2) ET LE (PYRIDYL-2 DISULF._NYL)-3 PROPIONATE DE 15 TRICHOKIRINE. A) Préparation de l'anticorps modifié. A 20,1 mg d'une solution d'anticorps AT15E à 4,02 mg/mi (soit 0,134 micromoles) sont ajoutés 50 microlitres d'une solution d'anhydride Sacétylmercaptosuccinique (SAMSA) à 35 mg/ml dans le 20 diméthylformamide. Le milieu réactionnel est incubé 2 heures 30 à C puis purifié de l'excès de réactif par dialyse contre du tampon phosphate 125 mM pH 7. On obtient 4,5 ml d'une solution à 3,7 mg/ml. A 4,5 ml de cette solution d'anticorps sont ajoutés 200 microlitres d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine 1 M. Après une incubation de 2 heures à 25 C le milieu réactionnel est purifié par dialyse de l'hydroxylamine contre du tampon phosphate 125 mM pH 7. Par dosage spectrophotométrique des groupements SH libérés par la méthode d'Ellmann, on constate que l'on a obtenu un IgG portant 3,8 groupements SH par mole d'anticorps. B) Préparation du réactif de couplage. Il s'agit de l'imidazole dérivé de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique dont la méthode de préparation a déjà été décrite dans la demande de brevet européenne n 0619111. 215 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique sont dissous 10 dans0,5 ml de tétrahydrofuranne. A cette solution sont ajoutés 203 mg de CDI (carbonyl diimidazole). Le mélange est agité 15 mn à 25 C. On observe un dégagement gazeux de C02. Le milieu réactionnel est utilisé directement et immédiatement sans purification. C) Modification de la trichokirine. A 5 mg de TK dans 5 ml de tampon phosphate 125 mM pH 7 (soit 0,185 micromoles) sont ajoutés 18,5 microlitres de la solution de THF. On laisse le mélange incuber 15 minutes à 25 C puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactif par dialyse con.re du tampon phosphate 125 m. pH 7. Après centrifugation (15 mn 15000 RPM) 20 on obtient 4,4 ml d'une solution de TK modifiée à 0,94 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol on constate que l'on a obtenu une TK portant 0,6 groupement activateur par mole de TK. D) Préparation de l'immunotoxine. A 0,5 ml de la solution d'anticorps précédemment obtenu (soit 0,012 micromoles) on ajoute 1,8 ml de la solution de TK (soit 0,063 micromoles). On laisse le mélange incuber 20 heures) à 300C. Le milieu réactionnel est purifié par passage sur une colonne ACA44, commercialisé par IBF-Rhone-Poulenc, et l'élution est suivie 30 par mesure de la densité optique de J'effluent à 280 nm. L'élution est réalisée à l'aide de tampon PBS (phosphate salin). On obtient 6,6 ml d'une solution d'immunotoxine à 0,146 mg/ml (soit 0,966 mg). Cette solution contient 0,022 mg/ml de TK modifiée. Le taux de couplage moyen de cette préparation est de une TK par mole d'anticorps. 260 1679 E) Test d'activité de l'immunotoxine obtenue. La mesure de l'activité cytotoxique de l'immunotoxine est réalisée selon la même procédure que celle décrite dans l'exemple 3. Le tableau 3 représente les valeurs de CI$0 obtenues dans la même expérience avec l'immunotoxine à trichokirine conjuguée par les tyrosines d'une part, la trichokirine non couplée d'autre part. TABLEAU 3 _______________________________________________10: Produits: Concentration inhibitrice 50: ImmunotoxineIT: 3 x 10-0 M :: Trichokirine: 3 x 10-6 M: ----------_---------- - - - ---------- --On peut constater que i'IT préparée par la conjugaison de l'anticorps anti Thy 1.2 à la trichokirine par ses résidus tyrosine a une très forte activité cytotoxique qui est 10.000 fois supérieure à celle de la trichokirine non couplée. Cette nouvelle classe d'immunotoxines peut être utilisee pour le traitement des affections cancéreuses ou non pour lesquelles les cellules cibles à détruire seraient reconnues par l'anticorps ou le fragment d'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Les modalités optimales d'administration ainsi que la durée du traitement devront être déterminées dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les produits physiologiquement actifs de l'invention peuvent être formulés pour l'administration par toute voie convenable. Le plus souvent le principe actif sera administré par injection et il 30 sera formulé dans un liquide stérile apyrogène, de préférence de l'eau qui peut contenir des sels physiologiquement acceptables tels que des tampons ou du chlorure de sodium de façon à obtenir une solution isotonique. Pour un traitement antitumoral, la dose journalière de trichosanthine ou de trichokirine en tant que conjugué est de préférence comprise entre 1 et 100 mg, avantageusement de 5 à 50 mg et par exemple de 10 mg environ. Les unités de dosage contenant la trichosanthine ou la trichokirine sous forme de conjugué, par exemple des ampoules pour injection, contiendront donc habituellement de 1 à 100 mg de conjugué. REVENDICATIONS 1. Immunotoxine formée par couplage d'un anticorps avec la trichosanthine ou la trichokirine, ayant la formule statistique suivante: P' - W - A' dans laquelle P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convenablement modifié, privée d'une ou plusieurs fonctions pro10 pres et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués; A' représente le radical d'une protéine A qui est la trichosanthine ou la trichokirine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel d'autres groupes fonctionnels 15 sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant au moins un groupe thioéther ou un groupe disulfure dohnt un des atomes de soufre, soit est celui des cystéines de P et A, soit est lié aux fonctions propres de P et/ou A par des structures d'espacement portant un groupe fond20 tionnel lié auxdites fonctions propres de P et de A. 2. Immunotoxine selon la revendication 1 caractérisée en ce que A' est le radical de la trichokirine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée. 3. Immunotoxine selon l'une des revendications 1 ou 2 ayant la for25 mule statistique suivante: P'(W - A')n n dans laquelle W est tel que défini ci-dessus; n varie de 0, 2 à 3 P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convena- blement modifié, privé d'une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués; A' représente le radical d'une protéine qui est telle S quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. 4. Immunotoxine selon la revendication 3 ayant la formule statistique suivante: P'-(N'H-CO-CH2CH2-S-S-CH-CO-NH-TK') 2 2 n CHCOOH dans laquelle P' et n sont tels que définis dans la revendication 3 et TK' est le radical de la trichokirine telle queile, privée d'une ou plusieurs fonctions NHo. 5. Immunotoxine selon la revendication 3 ayant la formule statistique suivante: P '-(NH-CO-CH2CH 2-S-S-CH2C{2-CO-0-TK') dans laquelle P' et n sont tels que définis dans la revendication 3 et TK' est le radical de la trichokirine telle quelle, privée 20 d'une ou plusieurs fonctions OH. 6. Procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la formule statistique suivante: P' - W - A' dans laquelle P' représente le radical d'une protéine qui est un 25 anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convenablement modifié, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués; A' représente le radical d'une protéine 26016 7 9. A qui est la trichosanthine ou la trichokirine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant au moins un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont l'un des atomes de soufre est soit celui des cystéines de P et A, soit est lié aux fonctions propres de P et/ou A par des structures d'espacement portant un groupe fonc10 tionnel lié auxdites fonctions propres de P et/ou de A; caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine Pl, qui est indifféremment soit la trichosanthine ou la trichokirine éventuellement modifiées, soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'au moins un 15 groupe thiol libre attaché à ladite protéine P1 directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'expacement, avec une protéine P2, différente de Pl, qui est indifféremment soit la trichosanthine ou la trichokirine éventuellement modifiées, soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'un groupement 20 capable de couplage avec le thiol libre de la protéine P1, de façon à former une liaison thioéther ou disulfure. 7. Compositions pharmaceutiques contenant en tant que principe actif une immunotoxine selon une quelconque des revendications 1 à 5.