Brevet FR2600252A1 — publié le 19871224

La présente invention se rapporte à un médicament, ainsi qu'à une composition médicamenteuse, permettant, d'une part, de traiter les maladies infectieuses dues aux virus, et, d'autre part, de traiter les tumeurs malignes. Ce médicament est le L-glutamique acide y monohydroxamate (GAH), de formule: HOOC- 2)CH- (CH:):>-CONHOH L'acide glutamique monohydroxamate est typiquement 10 formé par la réaction d'un groupe acyle activé avec l'hydroxylamine suivant la réaction: HOOC-(NH2)CH-(CH2)2-COX + NH2OH - HOOC-(NH2)CH-(CH2)m-CONHOH + HX, COX pouvant être un acide, amine, ester, anhydride. Ce composé peut aussi être préparé par voie 15 enzymatique à partir de l'acide L-glutamique, avec la glutamine synthétase. On exposera ci-après, tout d'abord son activité antivirale et ensuite, son activité antitumorale. I - ACTIVITE ANTIVIRALE DU L-GLUTAMIQUE ACIDE Y 20 MONOHYDROXAMATE Bien que des progrès aient été accomplis en ce qui concerne la lutte contre les infections virales, on ne dispose pas encore d'une gamme d'agents antiviraux aussi étendue, sûre et efficace que le sont, par exemple, les 25 antibiotiques. De par leur mode d'action, les agents antiviraux peuvent être classés, d'une façon large, en trois catégories, les frontières entre celles-ci étant souvent arbitraires: - La première catégorie, à- savoir celle des agents chimiques, constitue le groupe le plus étendu et celui qui se développe le plus vite. Etant donné que les virus sont des parasites intra-cellulaires obliges, l'efficacité de ces agents est déterminée par leur 35 capacité à différencier le métabolisme viral du métabolisme cellulaire, autrement dit, le métabolisme de la cellule infectée et celui de la cellule non infectée. En d'autres termes, la caractéristique essentielle de ce groupe d'agents est leur spécificité d'action. Celle-ci détermine en même temps la force et la faiblesse de ces agents, car s'ils sont souvent très efficaces, du fait qu'ils peuvent inhiber spécifiquement une enzyme virale, leur spectre d'action est généralement très limité et ils finissent souvent par sélectionner des variants viraux résistants, de la même 10 manière que le font les antibiotiques avec les bactéries (De Clercq E., Biochem. J. 205: 1-13, 1982; Becker Y. et Hadar J., Prog. Med. Virol. 26: 1-44, 1980). - La deuxième catégorie est constituée par les stimu15 lateurs du système immun. Mis à part les différents types de vaccins, ce groupe est constitué par des agents capables d'activer les défenses non spécifiques (macrophages, cellules "tueuses" naturelles) ou, plus rarement, les défenses spécifiques (lymphocytes "B" ou 20 "T") de l'organisme. Pour la plupart, ces agents sont encore en phase expérimentale. Contrairement aux agents chimiques, les caractéristiques essentielles de leur mode d'action sont leur spectre d'action très large, et le fait qu'ils ne peuvent pas sélectionner de.variants 25 résistants. Cependant, ils sont, pour l'instant, en nombre limité et peu efficaces, bien que des progrès aient été récemment accomplis dans ce sens (Koff W.C., Showalter S.D., Hampar B. et Fidler I.J., Science 228: 495-496, 1985). - La troisième catégorie-est celle des inducteurs de l'état cellulaire antiviral, groupe qui comprend l'interféron (IFN), les inducteurs d'IFN et les substituts d'IFN. Il s'agit d'un groupe encore très réduit de substances qui se caractérisent comme éveillant-dans les cellules un état de résistance à l'infection virale. Ces agents cumulent la puissance de l'action au niveau cellulaire des agents chimiques et le spectre d'action très large des activateurs du système immun. Du fait qu'ils agissent sur toutes les cellules, qu'elles aient été infectées ou non, un élément déterminant de leur efficacité est leur faible pouvoir toxique envers les cellules. Selon la présente invention, on a découvert que le L-glutamique acide X monohydroxamate inhibe de façon totale la multiplication virale. On peut penser que cette 10 substance appartient à la troisième catégorie sus-indiquée des agents antiviraux, bien que son mode précis d'action n'ait pas encore été totalement élucidé. - Une expérience in vitro a permis de mettre en évidenceque le Lglutamique acide Y monohydroxamate provoque 15 une inhibition très significative de deux virus pourtant très éloignés à plusieurs égards, l'un étant un virus à ARN (rougeole) et l'autre, un virus à ADN Des cellules VERO (lignée de cellules "normales") 20 ont été infectées par le virus de l'herpès simplex du type 1 particules infectieuses par cellule. Le niveau d'inhibition maximal observé est égal, sinon supérieur, & celui obtenu avec les meilleurs inhibiteurs de la multiplication virale dont on dispose aujourd'hui. Le faible taux, voire l'absence, de toxicité du-GAH pour les cellules (infectées ou non) mérite également d'être souligné. II - ACTIVITE ANTITUMORALE DU L-GLUTAMIOUE ACIDE Y MONOHYDROXAMATE Depuis une vingtaine d'années, il a été montré le 15 rôle essentiel de la glutamine comme source d'énergie pour les cellules tumorales, alors que, dans. les cellules normales, le glucose est principalement utilisé. Cette utilisation importante de la glutamine par les cellulescancéreuses a même pu être reliée au degré de malignité, 20 étant donné qu'on sait déjà qu'il existe une bonne corrélation entre le degré de malignité des cellules d'hépatome et l'activité de la glutaminase. Ce rôle essentiel de la glutamine tient à sa participation dans les voies de bio-synthèse des protéines, des purines, des 25 pyrimidines et du métabolisme énergétique, La chimiothérapie s'est tournée vers l'utilisation d'analogues d'acides aminés comme agents anticancéreux pour mimer l'effet de l'acide aminé tout en espérant bloquer son action. La glutamine s'est trouvée un acide aminé de choix, du fait que son importante utilisation par la cellule tumorale et la diversité de ses voies d'utilisation intracellulaire. De nombreux analogues de cet acide aminé ont passé le stade clinique, tels que acivicin amino-3-chloro-4,5-dihydro-5-isoxazoleacétique>, DON L'action du GAH, qui est un autre analogue de la glutamine, a été étudiée sur plusieurs types de cellules tumorales et normales, aussi bien in vitro que in vivo, ce qui a donné naissance & ce second aspect de la présente invention. A - ETUDE IN VITRO: INHIBITION DE LA CROISSANCE DES CELLULES TUXORALES PAR GAH L'effet du GAH a été étudié sur diverses lignées cellulaires obtenues à partir de tumeurs humaines et fibroblastes de poumon foetal humain (MRC5). Parmi les tumeurs humaines, on a observé un effet inhibiteur total sur la synthèse de l'ADN, aussi bien de tumeurs solides: carcinome de tumeur mammaire , que de 15 lymphomes: cellules de tumeurs de Burkitt, cellules de lymphome murin RBL5 ou de leucémie L1 210 (Figure 2) Légende de la Figure 2 - Abscisses: temps de contact des différentes cellules avec le le L-glutamique acide Y monohydroxamate: 20 1 - L1210 2 -'BL60 3 - NterDau 4 - B16 - Ordonnées:incorporation de ='H-thymidine. Dans ce qui suit, les concentrations du GAH sont en micromoles ou millimoles par litre de milieu cellulaire Sur une lignée de mélanome prise comme exemple, on peut voir que l'effet inhibiteur est dépendant de la dose (Figure 3), mais également du temps de contact. Dès 2 heures de contact des cellules de mélanome avec 1,5 mn de GAH, il y - a mort cellulaire, qui s'amplifie jusqu'à 72 heures de culture des cellules tumorales, puis les cellules échappent à cette inhibition drogue de 400 pK Légendes des Figures 3 à 5 À Figure 3 - Abscisses: temps de contact des cellules de mélanome 10 avec différentes concentrations de GAH: * Témoin sans GAH; cellules de mélanome cultivées avec GAH: 25 pMi; * 100 yX; /A 200 pX; A 400 pM; 800ooyM; * 1 mM; $ 1,5 mM - Ordonnées: nombre de cellules vivantes. 15 Figure 4 - Abscisses: temps de culture des cellules de mélanome après différents temps de contact avec 1,5 m] GAH: Témoin cellules sans GAH;Cellules de mélanome incubées 20 avec GAH pendant: 2 heures-; Q 4 heures; À 8 heures; i 12 heures; Q 16 heures; 24 heures; % 30 heures. - Ordonnées: pourcentage de survie des cellules de mélanome. Figure 5 Abscisses: temps de contact des cellules de mélanome avec différentes concentrations de GAH: À 400 4X; 0 1 mN; X 1,5 m - Ordonnées: pourcentage de survie des cellules de 30 mélanome & 72 heures. En revanche, le GAH provoque un arrêt de synthèse de l'ADN des cellules normales]RC5, sans que cela s'accompagne de mort cellulaire pour des doses allant jusqu'à 800 yM (Figure 6). On observe un effet cytostatique sur les cellules normales qui est réversible après élimination de la drogue. La croissance des cellules MRC5 dans un milieu déprimé en glutamine est aussi arrêtée, avec, cependant, un décalage dans l'inhibition par rapport à l'effet du GAH. La réversion de la croissance des cellules 5 normales cultivées dans un milieu déprimé en glutamine est efficace par addition de glutamine, alors que la croissance de cellules traitées avec le GAH ne reverse pas par addition de glutamine (Figure 7). Il s'agit probablement de deux mécanismes d'action différents. 10 Légendes des Figures 6 et 7: Figure 6: - Abscisses:temps de contact des cellules normales MRC5 15 avec différentes concentrations de GAH À Témoin sans GAH; cellules MRC5 cultivées avec GAH: R; a 100 Hi; A 200jMx; A 400 0; 0800 HM; * 1 mM; a 1,5 m- Ordonnées: nombre de cellules MRC5 vivantes, 20 Figure 7 - Abscisses: temps de culture des cellules MRC5: 1. avec différentes conditions de culture témoin MRC5 milieu normal milieu déprimé en glutamine 25 milieu normal avec D-glutamyl acide D (GAH 2. après élimination des différentes drogues et addition O milieu normal MRC5 témoin milieu avec glutamine 2mM 30 milieu normal milieu GAH + glutamine 2mM - Ordonnées: nombre de cellules vivantes. 260 0252 B -ETUDES IN VIVO SUR MODELES MURINS DE GAH Compte tenu des résultats in vitro, l'activité anti-tumorale de GAH a été étudiée sur deux modèles tumoraux murins: leucémie L1 210 et mélanome B16. Pour la leucémie Ll 210, maintenue par passage intra-péritonéal chez la souris DBA/2, le nombre de cellules utilisées pour les essais thérapeutiques est de 5.101 cellules par souris. Pour le mélanome B16, maintenu par passages souscutanés successifs, la dose injectée par voie intrapéritonéale pour les essais thérapeutiques est de 10 cellules par souris. Les résultats positifs qui ont été obtenus sont 15 exprimés par le pourcentage d'augmentation de la survie, considérant comme significative une augmentation de 30%. Les résultats obtenus démontrent une activité antitumorale de GAH Légendes des Figures 8 et 9 Figure 8: Courbe de survie des souris DBA/2 inoculées avec Ll 210 (5x105 cellules dans 0,5 ml IP) après traitement avec L-glutamique acide monohydroxamate: 1200 mg/kg/jour, les jours 1, 2, 3, 4; et 600 mg/kg/jour, les jours 8, 9, 10 (les groupes sont constitués de 8 souris.). - Abscisses: jours après l'inoculation de cellules tumorales - - Ordonnées: pourcentage de souris vivantes. Figure 9: Courbe de survie des souris C5bl6 inoculées avec les cellules de mélanome B16 (10 cellules dans 0,5 ml IP)après traitement avec GAH:1200 mg/kg/jour, les jours 1, 2, 3, 4; 600 mg/kg/jour, les jours 8, 9, 10, 11-; et 300 mg/kg/jour, les Jours 16, 17, 18, 19 (les groupes traités et non traités sont- de 6 animaux). - Abscisses: jours après l'inoculation de cellules tumorales - Ordonnées: pourcentage de souris vivantes En conclusion, le L-glutamique acide Y monohydroxamate montre une activité cytotoxique sur différentes lignées de tumeurs humaines, sans que l'on puisse donner des précisions sur son mécanisme d'action et 10 sur le système enzymatique cible. La sélectivité d'action (cytolytique et irréversible sur cellules normales) laisse à penser que le GAH utilise une différence métabolique entre cellule tumorale et cellule normale. 15 La présente invention a également pour objet une nouvelle composition médicamenteuse, destinée notamment au traitement des maladies infectieuses dues aux virus, ainsi qu'au traitement des tumeurs, caractérisée par le fait qu'elle comporte, dans un support pharmaceutiquement acceptable, le L-glutamique acide y monohydroxamate. La composition de l'invention peut également contenir des additifs inertes ou pharmacodynamiquement actifs. La composition médicamenteuse de l'invention se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée, constituée par le principe actif (GAH), à dissoudre extemporanément dans une solution physiologique, en vue de l'injection. Dans les deux cas (traitement des maladies infectieuses et traitement des tumeurs), le médicament s'administre en effet 30 par voie parentérale par exemple (intraveineuse, intrapéritonéale, dans le liquide céphalo-rachidien etc..). Pour l'injection, le principe actif est dissous & raison de 0,6 à 1,2 g/l dans la solution physiologique. Par ailleurs, la composition de l'invention peut également contenir des additifs inertes ou pharmacodynamiquement actifs. REVENDICATIONS 1 - Médicament, caractérisé par le fait qu'il consiste en le L-glutamique acide X monohydroxamate. 2 - Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est destiné- au traitement des maladies infectieuses dues aux virus. 3 - Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est destiné au traitement des 10 tumeurs. 4 - Composition médicamenteuse, caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, dans un support pharmaceutiquement acceptable, le L-glutamique acide Y monohydroxamate. 5 - Composition médicamenteuse selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle est destinée au traitement des maladies infectieuses dues aux virus. 6 - Composition médicamenteuse selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle est destinée au traitement des tumeurs. 7 - Composition médicamenteuse selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée cornstituée 25 par le principe actif, à dissoudre extemporanément dans une solution physiologique, en vue de l'injection. 8 - Composition médicamenteuse selon la revendication 7, caractérisée par le fait que le principe - actif est dissous à raison de 0,6 à 1,2 g/l de la solution 30 physiologique. 9 - Composition selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisée par le fait qu'elle contient des additifs inertes ou pharmacodynamiquement actifs.