Brevet FR2598622A1 — publié le 19871120

AdJuvants imunologiques pour vaccins polysaccharidiques La présente invention a trait d'une manière générale à de nouveaux adjuvants immunologiques pour vaccins polysaccharidiques. Selon un autre aspect elle concerne de nouveaux systèmes immunologiques comprenant des antigènes polysaccharidiques en association avec certains adjuvants biologiques dans des systèmes d'émulsion lipidique ou sur des gouttelettes d'huile. Selon encore un autre aspect, elle vise une méthode selon laquelle les antigènes polysaccharidiques sont rendus plus immunogènes quand 10 ils sont associés avec les adJuvants précités. Avant la présente invention, il a été signalé dans la littérature que les antigènes polysaccharidiques stimulaient premièrement les anticorps IgX sans ou avec peu de réponse IgG. En outre, il a été difficile d'obtenir une réponse amnastique ou une 15 mémoire immunologique avec des antigènes polysaccharidiques chez l'homme et chez l'animal de façon expérimentale. En conséquence, l'immunité induite par l'utilisation d'antigènes polysaccharidiques est de courte durée. De plus, les vaccins polysaccharidiques ne se sont pas révélés de façon tangible être très 20 immunogènes chez les Jeunes enfants. Par suite, il existe un besoin d'une méthode suivant laquelle les antigènes polysaccharidiques pourraient être rendus plus immunogènes et stimuler ainsi encore plus la production d'anticorps, y compris une réponse IgG et une mémoire immunologique. Dans son aspect le plus large, la présente invention vise de nouveaux adJuvants immunologiques pour antigènes polysaccharidiques, des procédés pour la préparation de ces adjuvants, et, leur utilisation pour rendre les antigènes poly5 saccharidiques plus immunogènes. L'invention vise donc, comme indiqué ci-dessus, de nouveaux adjuvants immunologiques pour antigènes polysaccharidiques, leurs procédés de préparation et leur utilisation. L'adjuvant immunologique qui est utile pour augmenter la réponse 10 immune vis-a-vis d'antigènes polysaccharidiques comprend: (1) un système d'émulsion choisi parmi l'ensemble constitué par: (A) un système d'émulsion lipidique ( LES) contenant (a) une huile métabolisable, (b) un polyol de bas poids moléculaire, et 15 (c) la lécithine, ou (B) un système d'émulsion huile-dans- eau (0/V) contenant (a) une huile légère hydrocarbonée nonbiodégradable ou une huile biodégradable, et (b) un détergent, (2) une endotoxine détoxifiée raffinée (RDE), et, le cas échéant (3) du dimycolate de tréhalose (TDE). La présente invention préconise ainsi un procédé suivant lequel les antigènes polysaccharidiques sont rendus plus iunogènes quand ils sont associés avec certains adjuvants 25 biologiques dans un système d'émulsion lipidique biodégradable ou un système d'émulsion huile-dans- eau. Les réponses immunes résultant des antigènes polysaccharidiques et des systèmes d'ajuvants suivant l'invention diffèrent de façon notable des réponses induites par l'antigène seul par divers aspects. On a observé que l'antigène complété par un adJuvant stimule plus la production d'anticorps, (illustrée par des mesures de titres élevés, que l'antigène seul. De plus, le mélange antigène adJuvant stimule la production d'anticorps de la classe IgG avec un titre plus élevé que celui obtenu avec l'antigène seul. On a également observé que le mélange antigène adJuvant suivant l'invention fait preuve d'une mémoire immunologique, mise en évidence par une 10 réponse anticorps plus importante après une seconde injection de l'antigène que celle obtenue après la première immunisation. Avant la présente invention, aucun adjuvant d'un type quelconque n'a été signalé comme étant un immunopotentiateur efficace d'antigènes purement polysaccharidiques, On préconise ici 15 un moyen pour augmenter le caractère immunogène d'antigènes polysaccharidiques qui n'existait pas Jusqu'à présent. On propose selon l'invention des adjuvants qui sont utiles pour stimuler aussi bien les première et seconde (i.e. la mémoire immunologique) réponses d'animaux à sang chaud aux vaccins contenant des 20 antigènes polysaccharidiques de différentes sources. Par exemple, les antigènes polysaccharidiques que l'on peut utiliser avec les adjuvants de l'invention comprennent ceux qui sont purifies à partir de capsules de bactéries telles que Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitldis, Klebslella pneumoniae, 25 Salmonella typhi ou Hemophilus influenzae. D'autres antigènes polysaccharidiques, tels que ceux obtenus à partir de capsules ou parois cellulaires de champignons ou de parois cellulaires de z bactéries Gram- et Gram+,peuvent également être utilisés avec les adjuvants suivant l'invention. La seule exigence en ce qui concerne l'antigène polysaccharidique réside dans le fait que la réponse iruine développée par un tel antigène est une de celles qui peuvent être augmentées par la présence d'un adjuvant approprié. Comme indiqué précédemment, on connaît un grand nombre d'antigènes polysaccharidiques qui stimulent le système immune. Cependant, la réponse anticorps qui en résulte est principalement 10 du type IgX sans la capacité d'induire une mémoire immunologique en tant que réponse secondaire. Par conséquent, dans la présente invention une émulsion (LES ou 0/V) est formée laquelle contient l'antigène polysaccharidique et l'adjuvant biologique. Ceci découle de la présentation de l'antigène sous une forme 15 particulaire aux cellules du système immune, de la libération lente de l'antigène pour le système immune et de la stimulation des cellules productrices impliquées dans la réponse immune. Comrnme indiqué ci-dessus l'adJuvant immunologique suivant l'invention comprend deux éléments. Le premier élément est soit un 20 système d'émulsion lipidique (LES) soit un système d'émulsion huile-dans-eau (0/V) . Le second élément est un ou plusieurs adjuvants biologiques d'endotoxine détoxifiée raffinée. Le système d'émulsion lipidique (LES) contient une huile métabolisable, un polyol de bas poids moléculaire et de la lécithine. De façon 25 pratique, on a trouvé que l'huile métabolisable utilisée dans le LES est de préférence une huile grasse constituée principalement de diglycérides et triglycérides des acides oléique et linoléique. Sont particulièrement préférées les huiles grasses végétales telles que celles contenues dans, ou obtenues à partir de l'huile d'arachide, l'huile de graines de tournesol, l'huile de graines de carthame, l'huile de maïs et analogues. D'autres huiles telles que 5 l'huile d'olive, huile de graines de coton ou le squalène peuvent également être utilisées dans les adjuvants de la présente invention. Il est préférable que l'huile soit métabolisable, compatible avec les composants du système d'émulsion et l'adjuvant bactérien lui-même, et efficace en association avec les autres 10 ingrédients pour augmenter la réponse immune vis-à-vis des antigènes polysaccharidiques. En pratique une grande variété de polyols peut être utilisée dans le système d'émulsion lipidique. Les polyols utilisés sont des polyols de bas poids moléculaire qui sont 15 liquides, miscibles avec l'huile métabolisable, et dans lesquels l'ingrédient lécithine est soluble. Les polyols appropriés comprennent notamment les éthylèneglycol, 1,2-propanediol, 1,3propanediol, glycérine, 1,4-butanediol, 1,3-butanediol, 1,2,4butanetriol, 1,5pentanediol et analogues. Comme indiqué ci-dessus le troisième ingrédient du LES est la lécithine. Le terme "lecithine" tel qu'utilisé dans la description et les revendications englobe tout phospholipide de formule générale: CH20R, CHOR2 1 CH20PO2OHR3 o Ri et R2 sont des restes d'acides contenant Jusqu'à 22 atomes de carbone, et R3 est le reste de la choline. Ces phospholipides sont en général un mélange de diglycérides d'acides gras (acide stéarique, acide palmitique, acide linoléique ou acide 10,linolénique) liés à l'ester de l'acide phosphorique avec la choline. De façon pratique, on a trouvé que la portion non aqueuse du système d'émulsion lipidique doit, de préférence, comprendre environ 30 à environ 60 % en poids d'huile métabolisable, environ 15 30 à environ 60 % en poids de polyol et environ 1 à environ 15 % en poids de lécithine. Pour illustrer la préparation du système d'émulsion lipidique, on dissout 1 partie (10 g) de lécithine stérile dans 10 parties (100 g) de glycérine blanche sous chauffage doux à 60' C, 20 sur une plaque chaude sous agitation magnétique. Avant utilisation, on fait passer la glycérine à travers un tamis filtrant ayant un diamètre d'ouverture de maille de 0,2 pm, pour stériliser. On place ensuite le mélange de glycérine et lécithine dans un récipient stérile pour malaxage,aJoute lentement 10 25 parties (100 g) d'huile d'arachide (stérilisée par passage à travers un filtre de 0,2 pm) tout en maintenant une agitation vitesse modérée. Comme indiqué ci-dessus, le premier ingrédient de l'adjuvant immunologique peut être un système d'émulsion huiledans-eau (O/V) au lieu d'un système d'émulsion lipidique. Le système 0/V peut être constitué d'une huile métabolisable telle 5 que le squalène, or d'une huile non- métabolisable telle que le squalane, l'huile minérale légère, le 7-n- hexyloctadecane, l'huile minérale Conoco superoil ou Drakeol 6 VR (produite par la société dite Pennreco Company, Butler, Pa.). L'émulsion huile-dans-eau contient également un détergent. La quantité de détergent se situe 10 de façon typique entre environ 0,02 et 0,20 % en volume, et de préférence entre environ 0,1 et 0,2 % en volume par rapport à la portion aqueuse de l'émulsion. Tout produit détergent usuel peut être utilisé, notamment le Tween-80 et l'Arlacel (de la société dite Atlas Chemical Company). Le volume de l'huile doit se situer 15 entre environ 0, 5 et 3 X du volume total de l'émulsion. Bien entendu, les ingrédients intervenant dans le LES et l'O/W sont hautement raffinés et sont d'une qualité pharmaceutiquement acceptable. Le deuxième élément de l'adjuvant immunologique est un 20 adjuvant bactérien détoxifié raffiné tel que l'endotoxine détoxifiée raffinée. L'endotoxlne détoxifiée, abrégée ci-après en RDE, est obtenue à partir de souches de mutant Re de Salmonella. L'endotoxine détoxifiée peut également être obtenue à partir d'autres entérobactériacées telles que décrites dans le document 25 US-A4 436 728 qui est incorporé ici a titre de référence. L'endotoxine détoxifiée peut également être préparée par des techniques de synthèse et de génie génétique. I LO Un autre aspect du second élément est l'addition éventuelle de diaycolate de tréhalose (TDX). Le TDX peut être obtenu à partir d'une mycobactérie quelconque, notamment X. aviuu, N. phlei, X. tuberculoses (souches H37RV et Ayoma B), X. borvis BCG, Z. uegmtis, X. Kansaii, X. bovinis; le TDX peut également être obtenu à partir de Nocardia rubra et Corynebacterium diphtheriae. Le TDX peut également être préparé comme décrit dans le document US-A-4 505 900 délivré le 19 mars 1985. La préparation de vaccins polysaccharidiques comprenant le LES est la suivante. Le second élément (RDE et, le cas échéant, TDX) dissous dans le mélange chloroforme-méthanol 4:1 est placé dans une ampoule stérile et le solvant évaporé sous un courant d'azote stérile. On ajoute l'antigène polysaccharidique dans du sérum physiologique stérile au second élément, puis on mélange soigneusement. De façon pratique à trois volumes du mélange adjuvant bactérien/antigène polysaccharidique on aJoute un volume du mélange de LES préparé comme indiqué ci-dessus; et le mélange eauhuile résultant est mélangé dans une centrifugeuse ou un mélangeur J4squ'à ce que l'on obtienne une émulsion de couleur blanc-laiteux. Le mélange des deux composants pour obtenir l'émulsion est généralement effectué en 2 à 5 minutes. La concentration de l'antigène polysaccharidique dans l'émulsion finale se situe entre environ 0,1 à 1 000 pg / 0,2 ml (i.e. 0,5 à 5 000 pg/ml); la concentration de RDE se situe entre environ 25 et environ 200 pg/ 0,2 ml (i.e. 125 à 1 000 pg/ml); et la concentration de TDX, quand il est présent, se situe entre environ 50 à 400 pg/ 0,2 m1 (i.e. 250 à 2 000 pg/ml). L5 Bien que le rapport optimal des deux phases de l"'adjuvant immunologique contenant la forme LES soit d'environ 3 volumes de solution physiologique d'adjuvant bactérien détoxifié/antigène polysaccharide pour environ un volume de système d'émulsion 5 lipidique, le rapport du système d'émulsion lipidique à la solution d'adjuvant / antigène peut varier d'environ 1/1 & environ 1/8, le rapport 1/3 étant le rapport préféré. Une illustration du système huile-dans-eau est la suivante: 5 mg de RDE et 10 mg de TDX, chaque produit étant 10 dissous dans le mélange chloroforme-méthanol 4:1, sont introduits dans un homogénéisateur de tissus de 350 ml (homégénéisateur Bellco). On évapore le solvant du mélange RDE/TDX au moyen d'un courant d'azote stérile. On ajoute ensuite 2 ml d'huile stérile [huile minérale Drakeol 6 VR (Penreco Company, Butler, PA), huile 15 minérale légère, squalane, squalène, 7-n- hexyloctadécane], on homogénéise le mélange pendant une minute au moyen d'un homogénéisateur Jusqu'à ce qu'une densité dite de pâte huileuse (en anglais: oil-paste constitency) soit obtenue. On introduit alors dans l'homogénéisateur 98 ml de sérum physiologique 20 contenant 0,2 % de Tween-80. Au moyen d'un homogènéisateur, le mélange résultant est homogénéisé pendant environ 4 à 5 minutes Jusqu'à ce que l'on obtienne une émulsion. On ajoute une quantité appropriée d'antigène polysaccharidique dans de l'eau à l'émulsion liquide; le produit ainsi 25 obtenu est ensuite mélangé par aspirations et injections successives au moyen d'une seringue et d' une aiguille de calibre pendant au moins 2 minutes Jusqu'à ce que l'émulsion résultante ait un aspect laiteux fin (en anglais: cloudy-milky appearance). L'émulsion huile-dans-eau peut le cas échéant être lyophilisée. On introduit 5 ml d'émulsion dans une ampoule de 5 sérum Vheaton de 10 ml. L'ampoule est congelée dans un congélateur Revco à -95' C et lyophilisée dans un récipient stérile au moyen d'un dispositif de lyophilisation Labconoco. L'ampoule est bouchée stérilement. L'émulsion lyophilisée RDE/TDX est reconstituée par injection de 5 ml d'eau stérile contenant la concentration désirée 10 en antigène polysaccharidique. Le contenu de l'ampoule est émulsifié par aspirations et injections successives au moyen d'une seringue pendant au moins 2 minutes Jusqu'à ce que l'émulsion résultante ait un aspect laiteux fin. Selon l'un des procédés sus-décrits (i.e. avec LES ou O/W) 15 on obtient des émulsions de la solution aqueuse d'antigène polysaccharidique donnant une libération lente de l'antigène, une prolongation de la stimulation antigénique et une stimulation cellulaire au voisinage de l'antigène induite par le ou les adJuvant(s) bactérien(s) détoxifié(s). Cette combinaison 20 d'activité augmente la réponse de l'hôte à l'antigène comme démontré par les tableaux des exemples ci-après. Comme indiqué ci-dessus, l'adjuvant immunologique selon l'invention peut contenir le cas échéant du dimycolate de tréhalose en plus de l'endotoxine détoxifiée raffinée. Le 25 dimycolate de tréhalose (TDX) peut être obtenu comme indiqué dans US-A-4 505 900 à partir d'organismes tels que par exemple M. aviu.o, X.phlei, X. tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), il K. bovis -BCG, X.smegmatis, I.-kansasii, Nocardia rubra, X.bovinis et Corynebacterium dipbtheriae. Les bactéries telles que K. avium sont cultivées, récoltées puis tuées à la chaleur. La masse cellulaire est ensuite extraite 5 avec plusieurs solvants pour conduire à l'isolation d'une fraction active soluble dans le (ou les) solvant(s). Cette fraction est ensuite purifiée au moyen de plusieurs extractions avec un ou plusieurs solvant(s) pour donner le TDX brut. (Voir l'article intitulé "Biologically Active Components from Mycobacterial Cell 10 Valls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P3; Azuma et al., Journal of the National Cancer Institute, volume 52, pages 95-101, 1974, incorporé ici à titre de référence). Comme décrit par Azuma et al.; le TDX brut peut être ensuite purifié par chromatographie centrifuge avec gel de silice 15 microparticulaire pour donner le TDX purifié. La purification du TDN peut également être réalisée selon le procédé décrit dans la demande de brevet américaine pendante n' 372 84, déposée le 29 avril 1982 par la demanderesse. Quand il intervient dans le système d'adJuvant, le TDX est 20 utilisé à une concentration d'environ 50 à 5 000 pg/ml, et de préférence d'environ 250 à environ 2 000 pg/ml. Comme indiqué ci-dessus, les adjuvants immunologiques suivant l'invention en association avec divers antigènes polysaccharidiques augmentent la réponse immune vis-à-vis de tels 25 antigènes et sont par suite utiles dans un grand nombre de vaccins en thérapeutique humaine et vétérinaire. En pratique, on a trouvé que l'endotoxine détoxifiée raffinée doit être avantageusement utilisée à une teneur d'environ 25 à environ 200 pg par dose, une réponse imune particulièrement accrue étant obtenue avec une teneur d'approximativement 100 pg par dose. Les dimycolates de tréhalose sont de préférence utilisés à une teneur d'environ 50 à 5 environ 400 pg par dose. Si nécessaire, on peut utiliser d'autres ingrédients ou additifs en association avec les adjuvants suivant l'invention. Dans les exemples qui suivent,les essais d'héagglutination passive mettant en oeuvre du dextrane et des 10 polysaccharides SSS III ont été réalisés comme indiqué ci-après. Protocole d'essai d'hémagglutination passive 5. ml d'une solution d'HX à 10 % lavés comme ci-dessus. On mélange soigneusement et incube pendant 0,5 h à 37' C. On lave la solution dextrane-lX 5 fois dans du sérum physiologique puis remet les 20 hématies en suspension à la concentration de 10 %. En utilisant une plaque de microtitration de 96 puits à fond en forme de V, on dilue les échantillons de sérum 2 fois au moyen d'un tampon physiologique contenant 0,5 % d'albumine sérique bovine (BSA). Le volume final dans chaque puits est de 50 pl1. On 25 aJoute dans chaque puits 50 pl de dextrane-Hi( à 0,5 %. On incube chaque plaque à la température ambiante pendant une nuit. A un Jeu de plaques de titration identique, on ajoute 50 pl de 2mercaptoéthanol O,1X après dilution des échantillons de sérum puis aJoute 50 pl de HM revêtues de dextrane. Protocole d'essai d'hémagglutination passive (RA) au moyen de polysaccharide SS III On lave 5 ml d'HX avec un sérum physiologique (0,85 %) 5 fois. On dissout le polysaccharide SSS III dans du sérum physiologique à 1 mg/ml. A 0,5 ml d'HM conditionnées (en anglais: to 0.5 ml of packed sheep red blood cells) on ajoute: 1') 1 ml de 10 sérum physiologique et 2') 1 ml de SSS III dans du sérum physiologique (l mg). Le mélange résultant est doucement agité et on aJoute goutte à goutte tout en maintenant l'agitation 1 ml de chorure chromique (CrCl3, 6H2-O) à 0,1 % dans du sérum physiologique. On laisse reposer le mélange à la température 15 ambiante pendant cinq minutes. On lave 5 fois dans du sérum physiologique les HM revêtues de SSS III puis on les remet en suspension dans du sérum physiologique à une concentration cellulaire de 10 %. Le sérum provenant de chaque souris de chaque groupe est 20 dilué de moitié successivement dans des plaques de titration de 96 puits àa' fond en forme de V. La dilution de départ est de 1:10 et le volume final de sérum dilué est de 50 pl par puits. Dans chaque puits contenant le sérum dilué on aJoute 50 pl de HM revêtues de SSS III (suspension cellulaire à 0,5 %) et on 25 incube les plaques à la température ambiante pendant une nuit. A un Jeu de plaques de titration identique, on aJoute 50 pl de 2- mercaptoéthanol 0,1M après dilution des échantillons de sérum, puis aJoute 50 ml de HI revêtues de SSS III Dans les exemples qui suivent, le dextrane, le palmitoyldextrane et le polysaccharide de capsule (SSS III) de Streptococcus pneumoniae ont été fournis par le Dr. P.J. Baker du Laboratory of Microbial Immunity du "National Institute of Health", Bethesda, Maryland. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de 10 réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEIPLE I On administre à des souris BALB/C (6 animaux par groupe) une injection sous-cutanée (0,2 ml/animal) de ce qui suit: Groupe 1: 100 pg de dextrane dans du sérum physiologique; Groupe 2: 100 pjg de dextrane plus 50 pg de RDE dans du sérum physiologique; Groupe 3: 100 pg de dextrane plus 50 pg de RDE dans ?o du sérum physiologique émulsifié avec un volume identique d'émulsion lipidique LES; Groupe 4: 100 pg de dextrane émulsifié dans une ampoule contenant une émulsion huile-danseau lyophilisée de 50 pg de RDE + 50 pg de 25 TDX; Groupe 5 groupe ne recevant aucun antigène. Le vingtième Jour après la première immunisation, toutes les souris de chaque groupe recoivent une seconde injection préparée de façon identique à la première injection. Les échantillons de chaque sérum sont recueillis par saignements à des instants différents après immunisation. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau I. TABLBAU I Titres d'hémagglutination (HA) passive de sérum de souris iumnisées avec du dextrane (antigène polysaccharidique) seul ou en association avec RDE ou d'autres adjuvants dans divers types de solutions. Titres HA respectifs (Jours après immunisation) Groupe Traitement 6 16 30 48 I Dextrane 163(15)b 340(33) 672(54) 240(60) 2 Dextrane+RDE 800(50) 1228(126) 2368(248) 1386(168) 3 Dextrane+RDE 928(76) 2668(660) 3200(400) 2816(232) +(LES) 4 Dextrane+RDE 373(10) 1120(88) 1813(173) 1493(163) +TDN (O/N) Pas de 20(10) 40(20) 40(20) 10(10) Dextrane Notes: (a): chaque groupe recevant l'antigène a reçu une injection souscutanée à J = 0 et à J = 20; (b): les résultats sont exprimés sous forme de titre respectif 25 (en anglais: reciprocal) moyen pour_ chaque groupe; la dilution de départ pour chaque échantillon de sérum était de 1:10; les nombres entre parenthèses sont les titres moyens des sérums traités avec le 2- mercaptoéthanol O, 1N. Ils représentent les réponses IgG. EXERPLE 2 On administre à des souris BALB/C par injection souscutanée (0,2 ml) un antigène polysaccharidique Groupe 5: groupe non immunisé. Chaque groupe comprenait 10 animaux agés de 6 à 8 semaines. Les souris de chaque groupe ont reçu le 21ème Jour une 1 1 seconde injection souscutanée de SSS III (0,5 pg/animal) énmlsifié dans une émulsion huile-danseau de RDE/TDN. Dans le tableau qui suit les parenthèses représentent le titre moyen des m"mes sérums après traitement avec le 2-mercaptoëthanol 0, 1X. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU I I 15 20 25 Titres d'hémagglutination (HA) passive de sérum de souris lImunisées avec 0,5 pg d'antigène polysaccharidique de pneumocoque (SSS III> seul ou en association avec RDE et d' autres adjuvants. Titres HA respectifs (jours après immunisation) Groupe traitement 7 14 28 42 1 SSS III 240(28)'>b 56(17) 520(164) 182(40) 2 SSS III+RDE 792(104) 240(58) 960(400) 1296(480) +TDX (huiledans-eau) 3 SSS III+RDE 1472(232) 448(120) 1152(672) 1536(736) +LES 4 SSS III+RDE 80(10) 23(12) 100(26) 62(8) +Alhydrogel Pas de SSS III 10(0) 20(15) 20(10) 10(0) Notes: (a) SSS III est le polysaccharide de capsule purifié de Streptococcus pneumoniae de type III. Les souris sont immunisées par administration sous-cutanée les Jours J = O et J=21. (b) Les résultats sont exprimés en titre moyen respectif pour chaque groupe. La dilution de départ pour chaque échantillon de sérum est de 1:10. Les nombres entre parenthèses sont les titres moyens des sérums traités avec le 2-mercaptoéthanol 0,lX. BIJIPLE 3 On administre à des souris BALB/C par injection souscutanée (0,2 ml/animal) l'antigène polysaccharidique SSS III seul ou en association avec RDE dans le système d'adjuvant d'émulsion lipidique LES. Chaque souris reçoit une seconde injection de SSS 15 III (0,5 pg) en association avec l'émulsion huile-dans-eau du mélange RDE/TDM le 21ème Jour après la première immunisation. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau III. 20 TABLEAU III Titres d'hémagglutination passive (HA) de sérums de souris immunisées avec différentes doses d'antigène polysaccharidique de 25 pneumocoque (SSS III) en association avec RDE dans le système d'émulsion lipidique (LES). Titres HA (Jours après respectifs immunisation) Groupe Traitement Dose 7 14 28 42 (PE) (jig) 1 SSS III- 0,5 240(28)b 56(17) 520(64) 182(40) 2 SSS III 0,5+100 1472(232) 448(12) 1152(672) 1536(736) + RDE 3 SSS III 0,5+50 3104(240) 624(144) 1152(640) 1280(800) +RDE 4 SSS III 0,25+100 512(84) 168(50) 1152(386) 800(220) + RDE SSS III 0,25+50 304(48) 144(34) 928(320) 928(144) lotes: (a) SSS III est le polysaccharide de capsule purifié de Streptacoccus pneumoniae de type III. Les souris sont immunisées par administration sous-cutanée les Jours J = 0 et J=21. (b) Les résultats sont exprimés en titre moyen pour chaque échan 20 tillon de sérum prélevé par saignement. Les nombres entre parenthèses sont les titres moyens des sérums traités avec le 2mercaptoéthanol 0,1X. Ils représentent les réponses IgG. REVENDICATIONS 1. Adjuvant immunologique pour augmenter la réponse immune vis-à-vis d'antigènes naturels ou polysaccharidiques, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) un système d'émulsion choisi parmi l'ensemble constitué par: (A) un système d'émulsion lipidique ( LES) contenant (a) une huile métabolisable, (b) un polyol de bas poids moléculaire, et (c) la lécithine, ou (B) un système d'émulsion huile-dans- eau (0/W) contenant 10 (a) une huile légère hydrocarbonée nonbiodégradable ou une huile biodégradable, et (b) un détergent, (2) une endotoxine détoxifiée raffinée (RDE), et, le cas échéant (3) du dimycolate de tréhalose (TDM). 2. Adjuvant suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'huile métabolisable est une huile grasse d'origine végétale comprenant principalement des diglycérides et triglycérides. 3. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'huile métabolisable ou biodégradable 20 est l'huile d'arachide, l'huile de graines de tournesol, l'huile de graines de carthame, l'huile de maïs, l'huile d'olive, l'huile de graines de coton ou le squalène. 4. Adjuvant suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'huile non-biodégradable est une huile minérale légère, le 25 squalène, le 7-n-lexyloctadécane ou une huile minérale. 5. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le système d'émulsion lipidique comprend environ 30 à environ 60 % en poids d'huile étabolisable, environ 30 à environ 60 % en poids de polyol de bas 5 poids moléculaire et environ 1 à environ 15 % en poids de lécithine. 6. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le système d'émulsion huile-dans-eau comprend environ 0,5 à environ 3% d'une huile légère hydrocarbonée 10 nonbiodégradable ou d'une huile biodégradable et un détergent. 7. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il contient un antigène polysaccharidique. 8. Adjuvant suivant la revendication 7, caractérisé en ce 15 que l'antigène et l'endotoxine détoxifiée raffinée sont contenus dans un sérum physiologique stérile. 9. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentration de l'antigène dans le sérum physiologique stérile est d'environ 0,1 à environ 5 000 pg/ml et la concentration de l'endotoxine détoxifiée raffinée dans le sérum physiologique stérile est d'environ 125 à environ 1 000 ug/ml. 10. AdJuvant suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le système d'émulsion lipidique 25 comprend environ 30 à environ 60 % en poids d'huile métabolisable environ 30 à environ 60 Z en poids de polyol de bas poids moléculaire et environ 1 à environ 15 % en poids de lécithine, et il/2r 000 T UOJTAUa v g5I UOiTAue, p:u'4 alTuas anbiToloTsXqd mn.gs ai surp a9uTj.zl a8Txo%.p auTxolOpua,I ap UOTl-juaoUOD VI a piu2r o0 0 uoiThua V 5'0 uoiTAua,p 4uev: aj.xjqs anbTSoloTsúqd mnies al suvp euçgTjUV,î ap UOTv.z;ueouoo e 'I.uas.a;gp un; e alqepe.agpoTq aITnq aun no aIqepe.z2ppoTq-uou aquoq.ieooipXq aiaQ2 alTnq aun,p % ú C ú'0 UOiTAue puaidmoo nra-supp-aliTnq uoTslnm;,p aaIsis al 2 Z9 86S;Z