Brevet FR2601370A1 — publié le 19880115

VACCIN CONTRE LE MELANOME 1.- DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention a pour objet des formulations de vaccins qui peuvent induire une réponse immunitaire capable de détruire sélectivement les cellules de mélanome chez un individu vacciné. Un peptide ou une protéine apparenté à un antigène associé au mélanome est donc produit en grande quantité par des techniques de recombinaison du DNA et/ou par des méthodes de synthèse chimique. Le peptide ou la protéine de la présente invention peuvent être utilisés comme immunogenes dans la formulation d'un vaccin. Dans certains modes de réalisation o le peptide ou la protéine relative à un antigène associé à un mélanome est exprimé par un virus recombiné, le virus recombiné lui-même peut être utilisé comme immunogéne dans la formulation d'un vaccin. L'invention a également pour objet des procédés qui comprennent l'utilisation de techniques de DNA recombiné aussi bien que des procédés de synthèses chimiques qui permettent la production de peptides ou de protéines relatifs à l'antigène associé associé au mélanome en grandes quantités. On illustrera l'invention à titre d'exemple en utilisant comme immunogènes des peptides relatifs au p97, une sialoglycoprotéine cellulaire superficielle monomère dont le poids moléculaire apparent est légèrement inférieur à 97 000 daltons, qui est un composant cellulaire superficiel des cellules de mélanome. 2.- ARRIERE PLAN DE L'INVENTION 2.1. Antigènes associés à une tumeur Le travail avec des agneaux d'expérience, notamment avec des rongeurs, a montré que la plupart que des tumeurs induites par des virus oncogènes exprimaient des antigènes encodés par le génome viral et que l'immunisation avec ces antigènes pouvait conduire au rejet 30 d'une attaque ultérieure de cellules tumorales induites par le même virus. Bien que la majorité de ce travail ait été fait avec des 2 601370 souches de laboratoire de virus tel que le SV40, le virus du polynme et les virus de la leucémie de souris de Friend Moloney ou Rauscher, une transmission horizontale et verticale des virus oncogènes par nature a été démontrée; il est certain qu'un virus est actuellement 5 disponible dans le commerce qui est dirigé contre la leucémie et le sarcome du chat induits par un virus. Au contraire, l'étiologie virale de la plupart des cancers humains n'a pas encore été démontrée. Des exceptions notables sont représentées par le virus de l'hépatite (hépatome), le virus de 10 l'herpès simplex (carcinome cervical) et le virus d'Epstein Barr (carcinome nasopharyngé). Cependant, dans les deux dernières décades, il a été établi que quelques cellules tumorales humaines exprimaient des antigènes de tumeurs, c'est-à- dire des antigènes qui distinguent les cellules tumorales de leurs contreparties cellulaires normales; 15 quelques patients sont capables de construire des réponses immunitaires humorales, ou favorisées par une cellule, dirigées contre ces antigènes (Hellstrom et al. 1968, Nature, 220-1352; Morton et al., 1968, Science 162, 1279-1281; Shiku et al., 1976, J. Exp. Med. 144, 873-881). Quelques-unes des cibles de ces réponses immunitaires sont 20 des antigènes oncofétaux ou des antigènes de différenciation encodés par le génome humain (Hellstrom et al., 1970, Int. J. Cancer 6, 346-351). Jusqu'à tout récemment, la nature moléculaire des antigènes tumoraux était inconnue et le degré de spécificité tumorale des réactions immunologiques n'était pas clair. Des tentatives d'utiliser cette information à la mise au point d'essais de diagnostics du cancer ou de thérapeutiques du cancer ont, la plupart du temps, échouées. Etant donné que des régressions tumorales spontanées sont extrêmement rares, on peut également en conclure que les réponses 30 immunitaires démontrées in vitro étaient inefficaces in vivo; par exemple, alors que des anticorps et des lymphocytes obtenus à partir d'un patient souffrant du cancer pouvaient être efficaces pour tuer des cellules tumorales in vitro, la réponse immunitaire de ce même patient souffrant du cancer était sans effet in vivo. L'introduction par Kohler et Milstein de la technique des anticorps monoclonaux (1975, Nature 256, 495-497) a conduit à intensifier les recherches d'antigènes tumoraux humains puisqu'elle procurait les moyens de définir ces antigènes à la fois au niveau moléculaire et en ce qui concerne leur spécificité (Hellstromi et Brown, 1979, In "The Antigens", M. Sela, ed., Academic Press, Vol. V, 1-66). Ces dernières années, ont été décrits un grand nombre d'antigènes associés à des tumeurs, la plupart ayant été définis par des 5 anticorps monoclonaux de souris (Reisfeld et Sell, eds., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, pp. 1-609). Bien que sensiblement tous les'antigènes qui ont été bien caractérisés se soient avérés être des antigènes onconfétaux ou des 10 antigènes de différenciation et que l'on ait trouvé que leur spécificité vis-à-vis des tumeurs était plutôt quantitative que qualitative, plusieurs antigènes sont suffisamment spécifiques pour des cellules noeplasiques plutôt que pour des cellules normales (correspondant généralement à un facteur de 10 à 1 000 fois), pour être 15 utilisés comme cibles potentielles pour identifier des cellules tumorales et à des fins thérapeutiques. Des anticorps monoclonaux humains dirigés contre des antigènes tumoraux ont également été obtenus (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030). Ceci supporte la preuve citée ci-dessus que quelques patients souf20 frant du cancer construisent eux-mêmes une réaction immunitaire à leurs tumeurs. Plus de la moitié des antigènes cellulaires superficiels associés à une tumeur identifiés jusqu'à maintenant sont des protéines ou des glycoprotéines encodés par le génome humain (plutôt que des virus 25 andogènes ou exogènes), le reste étant des glycolipides résultant d'une expression anormale ou d'une régulation des glyosyles transférases. 2.2. Antigène p97 associé à un mélanome L'antigène p97 est un antigène associé à une tumeur qui a tout 30 d'abord été identifiée dans le mélanome humain en utilisant des anticorps monoclonaux (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. Sci. 255, 4980-4983; Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114-6118; Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2183-2187). L'antigène p97 a été étudié avec beaucoup de détail en ce 35 qui concerne son expression dans des tissus normaux et néoplasiques et il est présent dans la plupart des mélanomes humains et dans certains tissus fétaux, mais on n'en trouve que des traces dans les tissus adultes normaux (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 260 1370 USA 78, 539-543); Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29, 511-515). Le p97 a été utilisé comme cible pour un diagnostic par image des mélanomes dans des essais cliniques sur des êtres humains (Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 72, 2101-2114). Le p97 est une siologlycoprotéine cellulaire superficielle monomére dont le poids moléculaire apparent (MW) tel que mesuré par électrolyse au dodécylsulfate de sodium-gel de polyacrylamide (SDSPAGE) est légérement inférieur à 97 000 daltons. Les anticorps monoclonaux ont défini trois sites antigènes majeurs qui sont pré10 sents sur un fragment de tryptique stable de 40 000 daltons (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127, 539-546); cependant, la séquence complète du p97 n'a pas été encore indiquée. Au moins deux autres antigènes associés à un mélanome humaine caractérisé indépendamment, le gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114-6118) et 15 le gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35, 73-80) apparaissent être identiques au p97 tel que le montre l'analyse par immunoprécipitation séquentielle. La séquence d'aminoacide N-terminale du p97 est homologue à celle de la transferrine et, de même que la transferrine le p97 lie 20 le fer (Brown et al., 1982, Nature, London, 296, 171-173). L'analyse d'hybrides de cellules somatiques et une hybridation in situ ont montré que le gène de p97, de même que les gènes de la transferrine et du récepteur de la transferrine, étaient situés sur la région de chromosome 3q21-3q29 (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303, 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2752-2756). Ces observations suggèrent que le p97 joue un rôle dans le métabolisme du fer. 2.3. Vaccins contre le cancer Des études chez des animaux expérimentaux, habituellement des 30 souris, ont montré que l'immunisation à l'aide de cellules vivantes ou de cellules cancéreuses tuées pouvait conduire à un rejet d'une attaque ultérieure par des cellules cancéreuses viables. Des tentatives d'immunisation à l'aide de produits exempts de cellules ont généralement été moins réussies, mais quelques succès ont été enre35 gistrés. (Pour une revue, voie Hellstrom et Brown, 1979, dans The Antigens, M. Sela ed. Academic Press, Vol. V, 1-66). Dans de nombreux cas, les antigènes cibles responsables des effets de protection ont été encodés par des virus mais, dans de nombreux autres cas, la nature de l'antigène qui déclenche une réponse immunitaire de protection est inconnue. Des études sur les êtres humains sont beaucoup plus difficiles et l'efficacité des vaccins contre le cancer est contestée malgré les indications de quelques succès. Dans de nombreux cas, les préparations de vaccins ont été constituées de cellules tumorales irradiées ou de cellules tumorales tuées par exposition à certains agents chimiques. Etant donné que des antigènes humains associés à une tumeur n'ont pas été disponibles, il n'y a pas d'indication de leur 10 utilisation dans des vaccins. Une objection théorique majeure à l'utilisation proposée des vaccins contre le cancer chez les êtres humains est que les êtres humains qui sont "vaccinés" par exemple à l'aide de cellules cancéreuses tuées ou de préparations exemptes de cellules ne donneront pas 15 de réponse immunologiques parce que les antigènes tumoraux qui peuvent être les cibles de la réponse immunitaire sont présents, même s'il ne s'agit que de traces, dans quelques cellules normales et seront donc perçus par le système immunitaire comme faisant partie du "moi". La plupart, sinon tous, des antigènes détectés dans des 20 tumeurs humaines à l'aide d'anticorps monoclonaux sont également présents dans quelques tissus normaux et il y a peu de chance que les patients souffrant du cancer leur répondent avec efficacité in vivo. On a la preuve que les cellules suppresseurs jouent un rôle majeur dans la diminution de la réponse immunitaire aux antigènes tumoraux 25 (Nepom et al., 1983, Experientia, 39, 235-242). En outre, une réponse de cellule suppresseur induite par un jeu d'antigènes tumoraux par empêcher l'induction d'une réponse destructive de tumeur efficace à un autre jeu d'antigènes de tumeur qui, par elle-même, n'induirait pas de suppression (Hellstrom et al., 1983, in Biomembranes, A. 30 Nowotny ed., Plenum Press. pp.365-388). 2.4. Techniques de la recombinaison du DNA et du virus de la vaccine L'utilisation de la technologie de la recombinaison du DNA pour la production de vaccins fractionnaires, pour protéger, vis-à-vis de certaines infections, implique le clonage moléculaire et l'expression 35 dans un vecteur approprié d'une information génétique codant, pour des protéines, qui peuvent déclencher une réponse immunitaire dirigée contre la protéine de l'animal hôte. Une nouvelle approche a récemment été décrite qui est potentiellement utile dans la préparation de vaccins fragmentaires (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virnl. 49, 857-864; Panicali, D. et Paoletti E., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 4927-4931). Cette approche implique l'utilisation de virus de la vaccine comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Lors de l'introduction dans les animaux hôtes, le virus de la vaccine recombiné exprime le gène étranger inséré et déclenche, de ce fait, une réponse immunitaire de l'hôte à ces produits de gène. Etant donné que le virus de la vaccine recombiné vivant peut être utilisé comme vaccin, cette approche combine les avantages à la fois des vaccins fractionnaires et des vaccins vivants. Le virus de la vaccine contient un génome de DNA à doubles hélices linéaires d'approximativement 187 paires de kg base et il se reproduit au sein du cytoplasme des cellules infectées. Ces virus 15 contiennent un système enzymatique de-transcription complet (y compris les enzymes de terminaison, de méthylation et de polyadénylation) au sein du noyau du virus qui sont nécessaires aux propriétés infectieuses du virus. Les séquences de régulation de la transcription du virus de la vaccine, les promoteurs, permettent l'initiation 20 de la transcription par la RNA polymérase de la vaccine mais non par la RNA polymérase des cellules de l'hôte. L'expression du DNA étranger dans les virus de la vaccine recombinee nécessitent la liaison des promoteurs de la vaccine aux séquences du DNA codant la protéine du gène étranger. Les vecteurs de 25 plasmide, également appelés vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chimériques dans le virus de la vaccine. Un type de vecteur d'insertion est composé de: (a) un promoteur de virus de la vaccine comprenant le site d'initiation de la transcription; (b) plusieurs sites de clonages d'endonucléase de restriction unique situés en aval du site de départ de la transcription pour l'insertion des fragments de DNA étrangers; (c) du DNA de virus de la vaccine non essentiel, (par exemple le gène TK) flanquant le promoteur et les sites de clonage qui 35 dirigent l'insertion du gène chimérique dans la région non essentielle homologue du génome du virus; et (d) une origine bactérienne de réplique et un marqueur de résistance antibiotique pour la réplique et la sélection dans E. coli. Ces vecteurs sont, par exemple, décrits par lackett (Mackett et 1l., 1984, J. Virol. 49, 857-864). Des virus de la vaccine recombinés se préparent par transfection de plasmides d'insertion bactériens recombinés contenant le gène étranger dans des cellules infectées, au préalable, par le virus de la vaccine. Une recombinaison homologue a lieu à l'aide des cellules infectées et conduit à l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Les cellules infectées peuvent être criblées en utilisant des techniques immunologiques, un hybridation de DNA sur plaque, ou une 10 sélection génétique de virus recombinés que l'on peut ensuite isoler. Les recombinants de vaccine retiennent leurs fonctions essentielles et leurs propriétés infectieuses et ils peuvent être construits de façon à loger approximativement 35 kg base de DNA étranger. L'expression d'un gêne étranger peut se détecter par des essais 15 enzymatiques ou immunologiques (par exemple, immunoprécipitation, radioimmuno-essai ou immunotaches). Des glycoprotéines membranaires existant à l'état naturel préparées à partir de cellules infectées par une vaccine recombinée sont glycosylées et on peut les transporter à la surface de la cellule. On peut obtenir des niveaux d'expres20 sion élevés en utilisant des promoteurs énergiques ou en clonant des copies multiples d'un gène unique. 3.- RESUME DE L'INVENTION Sont décrites des formulations de vaccin que l'on peut utiliser pour induire une réponse immunitaire capable de détruire sélectivement des cellules de mélanome chez les individus vaccinés. Plus spécifiquement, les formulations de vaccin selon la présente invention contiennent un immunogène capable d'induire une réponse immunitaire dirigée contre un antigène associé au mélanome, par exemple l'antigène p97 associé au mélanome. Selon l'invention, toute une série de formulations de vaccin sont possibles. Par 30 exemple, l'immunogène d'un "vaccin fractionnaire" selon la présente invention contient un peptide ou une protéine relative au p97 qui peut entrer dans la formulation en même temps qu'un adjuvant approprié. Ces peptides ou protéines comprennent des séquences d'aminoacides provenant de tout ou partie de la séquence d'aminoacides du p97 sensiblement comme décrit dans 35 la figure 3, comprenant sans y être limité des séquences modifiées d'aminoacides dans lesquelles les restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents sont substitués par des résidus dans la séquence, ce qui conduit à un changement muet, et/ou des séquences d'aminoacides modifiées ou traitées, 260 1370 comme par exemple des séquences d'aminoacides glycosylés, des séquences d'aminoacides phosphorylés, etc., ou des séquences d'aminoacides chimiquement modifiés. Ci-après, les peptides ou protéines selon la présente invention qui sont relatifs à l'antigène p97 associé au mélanome, qu'ils soient altérés, non altérés, modifiés ou non modifiés seront désignés sous le noms de "peptides relatifs au p97". Lorsque le peptide relatif au p97 est un haptène (c'est-à-dire antigène mais non immunogène), l'haptène peut être conjugué à une molécule support qui lui confère des propriétés immunogènes. Les peptides relatifs au p97 selon l'invention peuvent se préparer en utilisant des techniques de recombinaison du DNA et/ou des méthodes de synthèse chimique. Lorsque les peptides relatifs au p97 sont synthétisés par voie chimique, ces peptides relatifs au p97 synthétiques peuvent comprendre des séquences d'aminoacides provenant des régions du p97 dont on 15 s'attend à ce qu'elles soient antigènes (Hopp et Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828). Lorsque les peptides relatifs au p97 selon la présente invention sont préparés en utilisant des techniques de recombinaison du DNA, une séquence de nucleotide qui encode tout ou partie du p97 est insérée dans un vecteur d'expression de recombinaison tel que, par exemple, un virus ou un plasmide qui, chez un hôte approprié, peut orienter l'expression d'un peptide relatif au p97 de telle sorte que l'on puisse le purifier à partir du milieu de culture. La séquence de nucleotide insérée provient de tout ou partie de la séquence de p97 sensiblement comme décrit dans la figure 3, y compris, sans y être limitées, les séquences de nucléo25 tide dans lesquelles des codons de nucleotide fonctionnellement équivalents sont substitués par des codons de la séquence conduisant à un changement muet; en d'autres termes, des codons différents qui encodent le même amino acide ou son équivalent fonctionnel, peuvent être substitués au sein de la séquence décrite dans la figure 3. Lorsque l'on utilise comme vecteur 30 d'expression un plasmide, on en préfère un qui convienne à l'expression dans des cellules eukaryotes, mais on peut également utiliser un vecteur d'expression prokaryote. Dans un autre mode de réalisation de l'invention o le vecteur d'expression est un vecteur recombiné, on peut formuler un vaccin sous la 35 forme d'un vaccin viral et, dans ce cas, l'immunogène comprend le virus recombiné qui exprime un peptide relatif au p97. Selon la nature du virus recombiné utilisé comme immunogène, on peut formuler soit un vaccin de virus inactivé, soit un vaccin de virus vivant. Une immunisation appropriée par les formulations de vaccin selon la présente invention peut conduire à l'induction d'une réponse immunitaire qui conduit à la destruction des cellules de mélanome chez le sujet immunisé. L'invention décrit également un système dans lequel on peut tester la 5 formulation de vaccin et elle indique comment on peut en effectuer le test. On peut, par exemple, évaluer l'efficacité des formulations de vaccin sur des modèles animaux, à l'origine des rongeurs, puis dans des primates non humains et finalement chez des humains, de préférence chez des patients qui sont en cours de rémission mais qui présentent une probabilité élevée de 10 récurrence à cause de micrométastases. 4.- BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente une auto-radiographie des produits de translation exempts de cellule du mRNA p97 résolu par SDS-PAGE. Sur la figure 1A, la bande 1 représente les produits de translation du mRNA enrichi en p97, 15 tandis que la bande 2 représente les produits de translation du mRNA non enrichi provenant chacun de 0,5 1pl de produit de translation total de 5 ng de mRNA. Sur la figure lB, la bande 1 représente les produits de translation du mRNA enrichi en p97, tandis que la bande 2 représente les produits de translation du mRNA non enrichi provenant chacun de 5 pl de produit de 20 translation de 5 ng de mRNA immunoprécipités à l'aide de sérum antip97. La figure 2 est une représentation schématique de la structure du mRNA de p97. Il y est indiqué l'arrangement de la région codante (de la séquence de signal à la séquence d'ancrage) et la région non codante (3'UT) aussi bien que la structure du domaine dupliquée du précurseur du p97 (barres ouvertes). Les emplacements des diverses séquences de reconnaissance de l'enzyme de restriction sont indiquées au-dessus du mRNA. Les positions relatives de quatre clones de cDNA sont indiquées en-dessous de la structure du mRNA. Le clone de cDNA p97-3a2f1 (3a2f1) est isolé à partir d'une bibliothèque de cDNA dans laquelle les cDNAs sont transcrits sur des 30 mRNAs enrichis en p97 amorcés par de l'oligo(T) et clonés dans du pBR322; tandis que les clones de cDNA p97-2fl (2fl), p97-ljl (ljl), et p9710al (O10al) sont séparés en amorçant la synthèse du cDNA par des oligonucléotides qui encodent les séquences de l'exon p97 et clonage des fragments de cDNA qui en résultent en lambda-gtlO. La figure 2A est une repré35 sentation schématique des clones de génomes B15, H17, B6.6 et E7. 7 qui ont été clones en lambda L47.1. La figure 3 représente la séquence de nucléotide du cDNA précurseur p97 humain et sa séquence d'aminoacides qui en est déduite. Les restes ) d'aminoacides N-terminaux déterminés au préalable par séquencage de protéines sont identiques à ceux prédits à partir de la séquence de nucléotide (restes d'aminoacides n 21 à 30). Les sites de glycosylation potentiels sur les restes d'aminoacides 38, 135 et 515 (barres ouvertes) et les régions d'ancrage membranaires au terminus-C (barres en traits pleins) sont également indiqués. Un signal de polyadénylation (AATAAA indiqué dans un encart) est détecté en position 3847 qui se trouve 50 paires de base en amont de la piste polyadénylée. La figure 4 représente une comparaison des séquences d'aminoacides 10 prédites du précurseur de p97 et celles d'une sérotransferrine humaine (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2732-2756; Davis et al. , 1985, J. Mol. Biol. 181, 111-121). Les résidus conservés ont été inclus dans des encarts. Les restes de tyrosine, d'histidine et d'arginine impliqués dans la liaison du fer par la transferrine (Mertz-Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145, 659-676) sont indiqués par des astérisques(*). La figure 5 est une représentation schématique d'un modèle bidimensionnel de la structure du p97 basé sur la présence de restes de cystéine conservés entre les éléments de la superfamille de la transferrine. Les trois sites potentiels de glycosylation sont indiqués par des astérisques(*). Le domaine d'ancrage de la membrane hydrophobe est apparent sur le terminus-C du p97 (COOH). La figure 6 est une représentation schématique de la structure génétique des: clones de cDNA p97 et fragment du clone génomique lambda E7.7 utilisé pour la construction du vecteur d'expression du p97; et le vecteur 25 d'expression pSV2p97a. On a utilisé les abréviations suivantes: E, EcoRI; P, PvuII; Sal, SalI; SstI; B, BamHI. La figure 7 donne les résultats d'une électrophorése sur gel dans la caractéristisation et l'immunopurification de la protéine du p97 recombiné. Un clone CHO transfecté (CH03+) et des cellules de mélanome humain SK-MEL 28 30 ont été marqués avec de la 35S-cystéine en présence (+TM) ou en l'absence (-TM) de tunicamycine (TM). Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 100 mm2 et on les laisse presque atteindre la confluence. On élimine le milieu et on le remplace par 3 ml de milieu exempt de cystéine avec ou sans addition de 1 pg/ml de tunicamycine. Apres 30 minutes à 37 C, 35 on ajoute pendant encore 6 heures 250 pCi par ml de L35S-cystéine (1016 Ci par mmole; Nex England Nuclear). La récolte des cellules, la préparation des lysats de cellules, l'immunoprécipitation et le traitement SDS-PAGE ne sont comme décrit ci-dessus. Les extraits sont immunoprécipités à l'aide 2 601370 il d'anticorps spécifiques du p97 et les protéines sont analysées par 61lectrophorèse SDS-gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). (a) SDS-gel de polyacrylamide tâché au bleu de Coomassie. Piste 1, marqueurs de protéine; piste 2, p97 immunopurifié répandu par des cellules B16 de souris transfectées; piste 3, cellules de SK-MEL 28 +TM; piste 4, cellules de SK-MEL 28 -TM; piste 5, cellules CH03+ +TM; piste 6, cellules CH03+ -TM. (b) autoradiographie du même gel comme en (a). La figure 8 donne les résultats d'une radio-immunoprécipitation du 10 p97 exprimé dans des cellules transfectées de cellules infectées par du Vp97aNY. Des cellules BSC sont infectées pendant la durée d'une nuit à l'aide de virus de la vaccine de type sauvage ou du virus de la vaccine recombinée p97. Ces virus ou la lignée de cellules transfectées CHO-p97.A sont incubés en présence de méthionine et de cystéine marquées par du 35S 15 avec ou sans tunicamycine à 2 pg/ml (Sigma). Les cellules sont lysées six heures plus tard, on les précipite à l'aide d'anticorps monoclonal 96, 5 et on les sépare par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10%. Le gel est autoradiographé pendant la durée d'une nuit. Le groupe traité à la tunicamycine est situé à la droite de chaque groupe. La figure 9 donne les titres d'anticorps dans le sérum de souris immunisées à l'aide de vaccins p97. Tp97 représente cinq souris immunisées à l'aide de 5 x 106 cellules M2svp97a.A irradiées (cellules de tumeur syngénique transfectées et exprimant le p97 superficiel) dans un adjuvant complet de Freund, et stimulées avec le même nombre de cellules dans une 25 solution saline tamponnée au phosphate. p97 représente un groupe de cinq souris immunisées à l'aide de 100 pg de protéine de p97 purifié dans de l'adjuvant de Freund complet et stimulées par 50 pg de protéine aqueuse. Vp97 représente un groupe de cinq souris immunisées et stimulées avec 107 unités formant une plaque de Vp97a-NY par scarification de leur queue. 30 La figure 10 donne l'effet thérapeutique de la vaccination de souris attaquées par une tumeur par un virus de la vaccine p97 recombiné (Vp97aNY). Les souris sont attaquées à l'aide de 105 ou 104 cellules tumorales exprimant le p97 (M2SVp97a.E) par voie intraveineuse. Deux jours plus tard, les souris sont inoculées par scarification de la queue soit à 35 l'aide de Vp97a-NY, soit de Vwt-NY. Les inoculations hebdomadaires par scarification de la queue sont répétées et l'on enregistre la survie des souris. 5.- DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet la préparation de vaccins pour la prévention ou le traitement des mélanomes. Elle est basée sur l'observation que les mélanomes possèdent des antigènes superficielscellulaires associés à une tumeur, par exemple l'antigène p97, qui sont présents en plus grande quantité dans les cellules de mélanome que dans les tissus normaux. Selon la présente invention, on prépare des peptides ou des protéines relatifs à l'antigène p97 associé au mélanome (c'est-àdire, des peptides relatifs au p97) en utilisant des techniques de recombinaison du DNA et/ou des techni10 ques de synthèse chimique. Les peptides relatifs au p97 selon la présente invention comprennent des séquences d'aminoacides dérivées de tout ou partie de la séquence d'aminoacides du p97 sensiblement comme indiqué sur la figure 3. Elles comprennent des séquences d'aminoacides provenant de la figure 3 qui ont été altérées par la substitution d'un ou de plusieurs restes d'aminoacides au sein de la séquence par un autre aminoacide d'une polarité semblable qui agit comme un équivalent fonctionnel, ce qui conduit à une altération muette. On peut sélectionner des substituts d'un aminoacide dans la séquence à partir d'autres membres de la classe à laquelle appartient l'aminoacide. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) 20 comprennent les suivants: alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phénylalanine, tryptophane, et méthionine. Les aminoacides polaires neutres comprennent les suivants: glycine, sérine thréonine, cystéine, tyrosine, asparagine et glutamine. Les aminoacides à charge positive (basiques) comprennent les suivants: arginine, lysine et histidine. Les aminoacides à 25 charge négative (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. En outre, les peptides relatifs au p97 selon la présente invention, qu'ils soient ou non altérés par la substitution de restes d'aminoacides, peuvent être encore modifiés ou traités par glycosylation, phosphorylation, etc. ou par des modifications chimiques. Ces peptides relatifs au p97 peuvent être utilisés comme immunogénes dans des formulations de vaccin qui déclenchent une réponse immunitaire dirigée contre des cellules de mélanome présentes dans le patient vacciné. Selon un mode de réalisation de la présente invention, on utilise des techniques de recombinaison du DNA pour insérer des séquences de nucléoti35 des en codant l'antigène du p97 dans des vecteurs d'expression qui vont orienter l'expression des peptides relatifs au p97 dans des cellules appropriées de l'hôte. Les séquences de nucleotides encodant l'antigène p97 comprennent des substances de nucléotides provenant de tout ou partie de la ]. séquence de nucléotide du p97 sensiblement comme indiqué sur la figure 3. A cause de la dégénérescence du code du DNA pour les aminoacides (c'est-àdire que la plupart des aminoacides peuvent être encodés par plus d'un codon) des codons fonctionnellement équivalents (c'est-à-dire des codons 5 différents qui encodent le même aminoacide ou son équivalent fonctionnel) peuvent être substitués au sein de la séquence de p97 décrite dans la figure 3, pourvu que la substitution conduise à un changement muet. Les systèmes vecteur d'expression-cellule haute qui contiennent une séquence de nucléotide encodant tout ou partie du p97 peuvent être utilisés pour préparer de grandes quantités de peptides relatifs au P97 pur in vitro et, dans ce cas, les produits du gêne peuvent être purifiés dans les cellules en culture et être utilisés comme immunogènes dans des formulations de vaccins fractionnaires. La purification du peptide relatif au p97 peut s'accomplir en utilisant toute une série de méthodes biochimiques, y compris une purification par immuno affinité en utilisant des anticorps monoclonaux. En outre, on peut faciliter la purification du peptide relatif au p97 en modifiant les séquences de DNA qui encodent le peptide relatif au p97 de telle sorte que les séquences responsables de l'ancrage de la protéine dans la membrane du plasma sont éliminées bien que les séquences 20 responsables du transport de la protéine vers la membrane cellulaire ne soient pas éliminées de telle sorte qu'il y a sécrétion d'une molécule antigène tronquée dans le milieu de culture par la cellule haute. Dans le cas de peptides relatifs au p97 produits par des cellules prokaryotes, un manque de modifications postérieures à la translation appropriée peut conduire à un produit antigéniquement inactif qu'il peut être nécessaire d'activer par des traitements chimiques ou autres appropriés. Dans certains modes de réalisation, o le vecteur d'expression est un virus, le virus lui-même peut entrer dans la formulation d'un vaccin. Dans ce cas, on peut préparer des vaccins de virus recombinés inactivés. Lorsque 30 le vecteur d'expression est constitué par un virus recombiné infectieux qui n'occasionne pas de maladie chez l'hôte ou par un vaccin viral inactivé ou par un vaccin viral vivant, on peut formuler une préparation qui procure une immunité sensible. Un vecteur d'expression particulièrement utile à cette fin est un virus de vaccine recombiné qui exprime les peptides relatifs au p97 selon la présente invention. A cette fin, une séquence de nucléotides codant pour tout ou partie de l'antigène p97 peut être insérée dans un vecteur de virus de vaccine capable d'orienter l'expression de la 260 13 70 séquence chez un hôte approprié. L'invention comprend l'utilisation d'autres vecteurs d'expression de virus comme vaccin, plus particulièrement des adénovirus. Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, la séquence d'aminoacide déduite du p97 peut être examinée pour détecter des séquences présentant des propriétés, particulièrement les propriétés hydrophiles, qui permettent de prédire la présence de cette séquence à la surface de la molécule de la protéine et d'indiquer ses propriétés antigènes et/ou immunogènes probables. Ces peptides relatifs au p97 peuvent 10 être synthétisés par voie chimique et utilisés comme immunogénes dans la formulation des vaccins. L'invention a également pour objet une méthode de préparation de peptides relatifs au p97 que l'on peut utiliser à d'autres fins qu'à la production d'un vaccin. Le peptide relatif au p97 peut être utilisé pour 15 immuniser des animaux, de façon à préparer des antisérums ou des anticorps monoclonaux spécifiques des cellules de mélanomes intéressantes. On peut les utiliser comme composants dans un essai de diagnostic ou à la purification par affinité d'anticorps radiomarqués liés à un médicament ou liés à une toxine à utiliserdans la thérapeutique du cancer. On démontre la présente invention à l'aide d'exemple dans lesquels on décrit la réalisation d'un vaccin à base de p97 dirigé contre le mélanome humain. Cependant, les méthodes et compositions décrits ici ne sont pas limitées à la réalisation de vaccin utilisant le p97, mais on peut les, appliquer à d'autres antigènes associés à des tumeurs. L'invention est présentée de la façon suivante, seulement à des fins de clarté de la description: (a) le nucleotide et la séquence d'aminoacide du p97; (b) peptides relatifs au p97 préparé par des méthodes de synthèses chimiques; (c) peptides relatifs au p97 préparé par expression de systèmes vecteurshôtes; (d) caractérisation immunologique des peptides relatifs au p97; et (e) formulation de vaccins. 5.1. Analyse de séquence de l'antigène p97 associé au mélanome La séquence de nucléotide du gène codant pour le p97 et sa séquence d'aminoacide dérivée sont décrites dans la figure 3. Des séquences fonctionnellement équivalentes entrent dans le cadre de la présente invention. Ces séquences comprennent, sans y être limité, des séquences de nucléotides comprenant tout ou partie dp la séquence de nucléotide décrite sur la figure 3 qui sont altérées par la substitution de différents codons qui encodent le même reste d'aminoacide ou un reste fonctionnellement équivalent, donnant ainsi lieu à un changement muet, aussi bien que des séquences d'aminoacide comprenant tout ou partie de la séquence d'aminoacide décrite sur la figure 3, qui soit altérée par la substitution de reste d'aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence donnant ainsi lieu à un changement muet et de leurs dérivés qui sont modifiés ou 10 traités par exemple par glycosylation, phosphorylation, etc. ou par d'autres modifications chimiques. Les sous-sections ci-dessous décrivent la stratégie que l'on a utilisée pour déterminer la séquence du p97 telle qu'elle est décrite dans la figure 3 aussi bien que des techniques variantes que l'on 15 pourrait utiliser pour déterminer la séquence du p97 ou d'autres antigènes de tumeurs qui pourraient être utiles à la formulation de vaccins. 5.1.1. Identification et caractérisation de l'antigène p97 associé à un mélanome L'activité et la séquence d'aminoacide de l'antigène p97 associé au mélanome n'étaient pas connues. Il en résulte que l'identification de l'antigène p97 s'est faite en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. On peut utiliser un certain nombre de techniques pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques du p97. On 25 peut, par exemple, utiliser la technique d'hybridome mise au point par Kohler et Milstein (1975, Nature 250, 495-497) de la façon suivante: des souris ou des rats sont immunisés à l'aide de cellules de mélanome humain et les lymphocytes recueillis dans les animaux immunisés sont fusionnés avec des cellules de myélomes; ou encore on 30 peut fusionner des lymphocytes provenant de patients atteints par un mélanome avec des cellules de myélomes (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45, 3951), ou la technique de préparation d'anticorps monoclonaux en utilisant le virus d'Epstein-Barr (Cole et al., 1985, The EBV35 Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Incl., pp. 77-96) peut être utilisée pour produire des anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. En tous cas, les hybridomes qui en résultent sont criblés pour la préparation d'anticorps qui se lient aux cellules de mélanome, mais ne se lient pas aux cellules normales. Les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 décrit ci-dessus peuvent être utilisés de toute une série de façon pour faciliter l'identification, la caractérisation, le clonage et l'expression de séquences de nucléotides qui autorisent la préparation de peptides et de protéines relatifs à l'antigène p97 en grande quantité. On peut, par exemple, utiliser les anticorps monoclonaux pour donner une caractérisation supplémentaire de l'antigène p97 par radiomarquage de toutes les protéines produites par la cellule tumorale, immunoprécipitation de la protéine tumorale à l'aide de l'anticorps monoclonal utilisé pour identifier l'antigène p97 et fractionnement des protéines immunoprécipitées par électrophorèse sur gel. Les antigènes 15 protéines sont identifiés sous la forme de bandes distinctes sur l'autoradiographie qui en résulte (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255, 4980-4983). En outre, les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 peuvent être utilisés de la façon suivante, pour faciliter le clonage: (a) pour immunopurifier des polysomes en vue d'identifier et d'obtenir des transcription de mRNA présents dans la cellule de mélanome qui encodent l'antigène p97; (b) pour identifier des clones dans une bibliothèque d'expression de cDNA qui expriment des peptides ou des protéines relatifs à 25 l'antigène p97; (c) pour purifier l'antigène p97 en vue de préparer d'autres anticorps monoclonaux ou antisérums à utiliser dans les deux applications précédentes; ou (d) pour identifier des cellules dans lesquelles le gène de l'anti30 gène p97 a été introduit par transfection. On peut également utiliser les anticorps monoclonaux pour faciliter la caractérisation structurelle et immunochimique de l'antigène p97, de façon à identifier des domaines extra-cellulaires et antigènes de la molécule et pour purifier la molécule en vue de 35 l'analyse de séquence de l'aminoacide (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539543); Brown et al., 1982, Nature, London, 296, 171-173). Une caractérisation supplémentaire du p97 implique la déterrination de la localisation cellulaire et une cartographie des déterminants antigènes et des domaines fonctionnels. Une localisation sous-cellulaire peut se déterminer par microscopie d'immunofluores5 cence et par des expériences de fractionnement cellulaire. Les antigènes, tel que le p97, qui sont présents à la surface des cellules sont ceux que l'on préfère pour la confection des vaccins bien que des antigènes intracellulaires puissent également être utiles. Si l'on dispose d'anticorps monoclonaux multiples, on peut cartographier 10 les déterminants antigènes par des expériences de concurrence dans lesquels chaque anticorps est radiomarqué et testé pour en déterminer.la concurrence avec chacun des autres anticorps. Certains domaines de la molécule peuvent s'identifier pardigestion limitée en présence de protéases ce que l'on fait suivre d'une SDS-PAGE. Ces données, toutes 15 ensemble, devraient permettre l'identification de régions de la molécule qui sont les plus immunogènes. Si les anticorps monoclonaux sont obtenus par immunisation à l'aide de cellules intactes, alors il est d'autant plus vraisemblable que ces régions de la molécule soient extra-cellulaires et utiles à la confection d'un vaccin. Une analyse de séquence d'aminoacide permet une identification non ambiguë de la protéine et sa comparaison avec d'autres protéines (Brown et al., 1982, Nature, London, 196, 171-173). Si la protéine comprend plus de 50 restes d'aminoacides, il peut être faisable de ne déterminer qu'une partie de la séquence d'aminoacide, le plus souvent 25 la séquence N- terminale. L'antigène de protéine destiné au séquencage d'aminoacide peut être purifié à partir de lysats de cellules par chromatographie d'immunoaffinité à l'aide de l'anticorps monoclonal, ce que l'on fait suivre d'une SDS-PAGE préparative. La séquence N-terminale de l'aminoacide de la protéine purifiée est ensuite déterminée en utilisant un séquenceur automatique d'aminoacides, de préférence un appareil en phase gazeuse pour des raisons de plus grande sensibilité. 5.1.2. Identification, clonage et séquencage du DNA codant pour l'antigène p97 associé à un mélanome 35 Les premières études de clonage se sont concentrées sur des protéines abondantes, telles que par exemple globine et ovalbumine, dont les mRNAs constituaient souvent de 10 à 50% du mRNA total. Ces mRNAs pouvaient être purifiées jusqu'à l'homogéneité par fractionnement de dimension et l'on a utilisé des échantillons de cDNAs purs pour cribler des bibliothèques de quelques centaines de clones par hybridation de colonies. Pour des protéines dont les mRNAs consti5 tuent de 1 à 10% du mRNA total, on peut utiliser une hybridation différentielle à l'aide de deux échantillons de cDNA dans lequel l'un des échantillons de cDNA contient la sequence intéressante et l'autre sert de contrôle négatif. Les RNAs messagers codant pour des protéines peu abondantes telles que les antigènes associés à une tumeur qui 10 peuvent constituer aussi peu de 0,01% du mRNA cellulaire, sont beaucoup plus difficiles à cloner parce que l'on doit cribler des dizaines de milliers de clones et les échantillons de cDNA ne vont pas donner un signal d'hybridation spécifique. On peut apporter un certain remède à ces deux problèmes en enrichissant le mRNA en 15 séquence intéressante. Diverses approches utilisées pour cloner le DNA codant l'antigène p97 associé à un mélanome humain sont décrites ci-dessous. Les clones qui en résultent sont analysés en vue d'identifier un clone ou des clones qui recouvrent la région de codage entière du p97. Les inserts de nucléotides p97 des clones ainsi identifiés peuvent alors être séquences par n'importe qu'elle méthode connue dans l'état de la technique. Les diverses approches sont décrites avec plus de détail ci-dessous. (a) Séparation du mRNA par immunopurification de polysome Dans cette technique, on purifie les polysomes (qui sont constitués de mRNA, ribosomes et chaînes de polypeptides naissantes) par chromatographie d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps qui reconnaissent des déterminants antigènes présents sur les chaînes naissantes. Dans de nombreux cas, les anticorps monoclo30 naux obtenus par immunisation à l'aide de cellules intactes ou d'extraits de cellules reconnaissent les antigènes dans leur conformation native mais ils ne sont pas appropriés pour l'immunopurification d'un polysome puisqu'il y a une chance significative que les déterminants antigènes reconnus puissent ne pas 35 être présents dans les chaînes naissantes. Etant donné que la translation démarre au terminus-N du polypeptide, les épitopes prochent du terminus-C sont vraisemblablement absents de la majorité des chaînes naissantes. On évite ce problème, soit en ]9 utilisant des anticorps qui reconnaissent les épitopes N-terminaux, soit en préparant des polysomes provenant de cellules traitées à l'aide d'un inhibiteur de synthèse de protéine qui bloque la terminaison. Un problème plus sérieux consiste en ce que les protéines mûres diffèrent des chaines naissantes à cause de modifications postérieures à la translation. Ce problème est particulièrement aigu pour des protéines cellulaires superficielles qui sont plus intensément modifiées par élimination des peptides signaux, addition de chaînes latérales d'hydrates de carbone et formation de ponts disulfures. Si on utilise un antisérum polyclonal pour l'immunopurification d'un polysome, la différence de propriété antigène entre les chaînes naissantes et entre la protéine finale peut être de peu de conséquences puisque, pendant l'immunisation, le lapin ou tout autre animal n'est exposé non seulement à la protéine initiale mais aussi aux formes partiellement ou complètement dénaturées, notamment si l'on a utilisé un adjuvant de Freund. Même si ces anticorps ne représentent qu'une fraction mineure de la population d'anti20 corps, il peut y en avoir encore suffisamment de présents pour lier les chaînes naissantes. Malheureusement, la préparation d'un antisérum polyclonal présentant une faible abondance de protéines peut être extrêmement difficile. Bien que l'on puisse utiliser un anticorps monoclonal pour purifier l'antigène en vue 25 d'immunisations ultérieures, chaque gramme de cellules cultivées ne fournit qu'un microgramme d'antigène. Ceci suffit pour immuniser plusieurs souris, mais est à peine suffisant pour un seul lapin. Une autre solution à ce problème est d'obtenir un 30 anticorps monoclonal qui reconnaisse des déterminants antigène présents dans des chaînes naissantes par utilisation d'antigènes p97 dénaturés comme immunogênes utilisés pour préparer l'anticorps monoclonal. Dans l'exemple de la présente invention, toute une série d'anticorps monoclonaux qui reconnaissaient trois épitopes distincts sur le domaine N-terminal de 40 000 daltons de poids moléculaire de la molécule de p97 étaient disponibles et on a utilisé un ensemble d'anticorps monoclonaux présentant, chacun, une spécificité différente dans l'espoir que l'un d'entre eux ou plus se lieraient à des chaines naissantes. Les anticorps choisis étaient hautement spécifiques du p97 en ce sens que chacun d'entre eux immunoprécipitait une seule raie du p97 à partir d'un lysat de cellule entière radiomarquee et qu'ils avaient de hautes affinités de liaison. Pour le projet de clonage, on a choisi trois anticorps IgG2a, chacun spécifique des trois épitopes. En général, on peut augmenter les chances de succès en utilisant un certain nombre d'anticorps dirigés contre les épitopes distincts. Lorsque l'on utilise des anticorps monoclonaux, reste la question de savoir comment on peut prédire si un anticorps monoclonal ou une combinaison de ces anticorps va reconnaître la chaine naissance et convenir ainsi à l'utilisation dans l'immunopurification d'un polysome. Une approche consiste à déterminer 15 si l'anticorps monoclonal immunoprécipite l'antigène qui a été transféré dans le système de lysats de réticutocyte en s'appuyant sur l'hypothèse que le produit de translation in vitro, n'étant pas traité, va ressembler aux chaines naissantes. Une approche alternative consiste à procéder à l'immunoprécipitation 20 d'un polysome à petite échelle et ensuite d'utiliser une translation in vitro pour déterminer si l'espèce de mRNA intéressante a été enrichie. Lorsque l'on utilise une technique d'immunopurification d'un polysome, il est important de surveiller la purification en 25 mesurant l'activité du mRNA. Ceci peut se faire en transférant le mRNA dans un système de lysats de réticulocyte et en analysant les produits de la translation par SDSPAGE. Bien que l'antigène associé à une tumeur puisse être un composant trop mineur des produits de la translation du mRNA non enrichi pour 30 être perçu parmi les centaines d'espèces plus abondantes, il devrait être détectable dans les produits de translation provenant des échantillons de mRNA enrichi. Ou encore, on peut utiliser le système de translation d'oocyte Xenopus si un immuno-essai sensible est disponible pour détecter l'antigène, 35 associé à une tumeur, transféré. Pour le p97, on a utilisé à cette fin, un immuno-essai de double déterminant extrêmement sensible (DDIA) qui emploie deux anticorps monoclonaux spécifiques de deux épitopes différents du p97. On peut utiliser pour 1 'inrlunopurification du polysome une protéine A liée au Sépharose. L'adsorbant de protéine A présente deux applications dans ce mode opératoire. La première est de purifier les anticorps monoclonaux des fluides d'ascites bruts, ce qui en élimine l'activité contaminante de ribonucléase. L'adsorbant de protéine A est ensuite utilisé en conjonction avec les anticorps purifiés pour immunopurifier les polysomes portant la chaîne naissante spécifique. Le transfert du mRNA dans un système de lysats de 10 réticulosyte permet la caractérisation biochimique du produit de translation aussi bien qu'une évaluation de sa pureté. (b) Echantillons d'oligonucleotide Une autre méthode que l'on peut utiliser en accord avec la présente invention pour cloner le cDNA codant pour un anti15 gène associé à une tumeur telle que, par exemple le p97, consiste à déterminer une séquence partielle ou complète d'aminoacide de l'antigène et à synthétiser un échantillon d'oligonucléotide sur la base de la séquence de nucléotide déduite de la séquence d'aminoacide. On peut alors utiliser l'oligonucléotide comme amorce de synthèse du cDNA et comme échantillon pour cribler la bibliothèque de cDNA qui en résulte. Par conséquent, on peut commodément purifier la proteine de p97 associée au mélanome à partir des lysats de cellules de mélanome par chromatographie d'affinité à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique (Brown 25 et al., 1982, Nature, London 296, 171-173). Une séquence de nucléotide codant pour une partie de la séquence d'aminoacide déterminé est alors synthétisée et on peut l'utiliser comme amorce et/ou comme échantillon. Des parties de séquence d'aminoacide contenant des restes d'aminoacides codés par un simple 30 codon par deux codons conviennent au mieux à cette fin. Une approche consiste à synthétiser une séquence plus longue, typiquement de 25 à 60 nucléotides, qui représente la séquence de codage la plus probable sur la base de la fréquence d'usage de codon connue chez les êtres humains. L'utilisation de deux oligonucléotides synthétiques sur la base de différentes parties d'une séquence d'aminoacide facilite le criblage en permettant l'identification de signaux d'hybridation positifs résiduels. En outre, l'utilisation de conditions d'hybridation qui minimise l'effet de la teneur en GC sur le point de fusion des hybrides de DNA facilite également le criblage. Une fois que l'on a obtenu par cette méthode un clone partiel de cDNA, on peut l'utiliser comme échantillon pour aider à l'obtention d'un clone de cDNA de longueur complète. (c) Bibliothèques d'expression de cDNA On a mis au point des vecteurs de clonage qui permettent l'expression de l'insert du cDNA dans les bactéries. Une approche que l'on peut donc utiliser pour obtenir des clones de cDNA 10 pour des protéines associées à une tumeur telle que par exemple le p97 consiste à préparer une bibliothèque de cDNA par transcription inverse du mRNA (enrichi ou non enrichi) isolé de cellules de mélanome comme on l'a décrit ci-dessus en utilisant des amorces d'oligo(T)-nucléotides ou les amorces d'oligonucléo15 tides synthétiques décrits ci-dessus et à cribler cette librairie avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine p97 associée au mélanome. Des clones qui contiennent du DNA codant pour les épitopes reconnus par l'anticorps monoclonal dans une orientation correcte et dans le cadre de lecture correcte exprimeront des peptides ou des protéines relatives à la protéine p97 associée au mélanome et on peut les identifier en transférant les protéines exprimés par le clone sur un filtre de nitrocellulose et en faisant incuber le filtre en présence de l'anticorps, ce que l'on fait suivre d'un développement à l'aide 25 d'un réactif anti-immunoglobuline marqué. Un problème potentiel réside dans le fait que de nombreux anticorps monoclonaux échouent à reconnaitre la protéine exprimée par les bactéries parce que, dans de nombreux cas, seule une partie du cDNA sera contenu dans l'insert et les bactéries ne traitent pas les protéines de la même façon que ne le font les cellules eukaryotes. Ce problème est particulièrement aigu pour les protéines cellulaires superficielles de tumeur qui sont plus intensément modifiées par l'enlèvement des peptides signaux, addition de chaînes latérales d'hydrates de 35 carbone et formation de ponts disulfures. Il peut alors être nécessaire de créer des anticorps monoclonaux qui soient connus pour reconnaître l'antigène dénaturé ou pour préparer des antisérums polyspécifiques par immunisation à l'aide d'un antigène purifié. Une fois que l'on a identifié un virus ou plasmide recombiné dont on pense qu'il contient un insert de cDNA prove5 nant d'un antigène p97 associé à un mélanome, on peut utiliser l'insert de cDNA pour cribler d'autres bibliothèques en vue d'identifier soit des clones de longueur complète, soit encore un groupe de clones qui s'étend sur la longueur complète du cDNA qui code le p97. L'identité du cDNA cloné peut s'établir par analyse séquentielle et par comparaison de la séquence d'aminoacide N- terminale déduite avec celle déterminée par analyse séquentielle directe d'aminoacide de la protéine du p97. (d) Clonage de génome La méthode suivante permet le clonage du DNA en utili15 sant un anticorps monoclonal dirigé contre un déterminant antigène qui n'est présent que la protéine d'origine et qui n'est pas présent dans les chaînes naissantes ou dans une protéine exprimée dans les bactéries. A cette fin, on introduit du DNA provenant de la cellule de mélanome humain dans des cellules L de souris par transfection. Ensuite, les cellules de souris qui expriment l'antigène p97 associé à un mélanome sont séparées soit en utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence, soit par identification immunologique de colonies qui produisent des peptides relatifs au p97 en utilisant des 25 anticorps monocolonaux marqués dirigés contre le p97 pour détecter des peptides sur des répliques de colonies transférées sur des filtres an tissu de polyester. Plusieurs passessuccessives de transfection peuvent être nécessaires pour éliminer des séquences de DNA non relatives à une séquence humaine. On prépare alors une bibliothèque de génomes dans un vecteur phage lambda et on crible pour détecter la présence de clones contenant des séquences humaines répétitives qui apparaissent dans les introns de la plupart des gènes. Une fois que l'on a identifié un clone de génome, on peut l'utiliser comme échantillon 35 d'hybridation pour identifier des clones de cDNA contenant le DNA qui code pour le p97. 2 6 0 1 3 70 5.2. Synthèse de fragments d'antigène de l'antigène p97 associé à un mélanome et évaluation de ses propriétés immunogènes On peut utiliser des peptides synthétiques comme immunogènes pour déclencher une réponse immunitaire dirigée contre la protéine d'origine qui puisse procurer un certain degré de protection contre un certain nombre d'agents pathogènes. Ces séquences de peptides sont choisies parmi la séquence d'aminoacide connue de l'antigène de protéine par identification de sections d'aminoacides qui sont, vraisemblablement, présentes à la surface de la molécule de protéine 10 et exposées au milieu externe. Ceci s'obtient le plus communément par une analyse sur ordinateur de la séquence d'aminoacide en utilisant des paramètres d'hydropathie établis pour les aminoacides. On peut également utiliser des critères supplémentaires tels que, par exemple, la structure secondaire réduite ou la flexibilité. Par conséquent, des peptides synthétiques comprenant de 5 à restes d'aminoacide de la protéine p97 associée au mélanome peuvent être testés pour en déceler les propriétés immunogènes sur des animaux de l'expérience (habituellement des souris ou des lapins). Ces peptides synthétiques comprennent, sans y être limités, tout ou 20 partie de la séquence d'aminoacide sensiblement comme elle est décrite sur la figure 3, y compris les séquences altérées dans lesquelles les restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui conduit à un changement muet, et/ou des séquences modifiées ou traitées telles 25 que, par exemple, des séquences glycosylées, des séquences phosphirinées, etc. ou des séquences chimiquement modifiées. Ces peptides relatifs au p97 sont utilisés soit seuls, soit couplés à une protéine vecteur telle que, par exemple une hémocyanine keyhole limpet (KLH). Dans l'un et l'autre cas, on peut si on veut utiliser un adjuvant, ceci est toutefois préférable. Les animaux immunisés sont stimulés et testés pour détecter la présence d'anticorps dirigé contre le peptide d'immunisation. Ces anticorps comportant un antipeptide sont testés pour déceler la présence d'anticorps qui lie la protéine p97 d'origine. Dans le cas d'antigènes associés à une tumeur telle que, par 35 exemple p97, il est également intéressant de tester une réponse cellulaire immunitaire en étudiant, par exemple, l'hypersensibilité de type retard (DTH) ou en étudiant la prolifération stimulée par un antigène in vitro, les cellulesT cytolytiques ou le rejet de tumeur chez un modèle approprié. Un modèle approprié pourrait être constitue par une tumeur de souris exprimant l'antigène associé à une tumeur humaine résultant d'une transfection avec un vecteur artificiel d'expression de cDNA approprié. Le but est d'identifier des peptides qui déclenchent une réponse immunitaire vigoureuse dirigée contre l'antigène p97 associé à un mélanome. Une fois identifiés, on peut préparer ces peptides en grande quantité par des méthodes de synthèse chimique connues dans l'état de la technique. Ou encore, on peut préparer les peptides identifiés en grande quantité en exprimant les séquences de nucléotides qui codent ces peptides dans des systèmes de cellules vecteurs d'expression-h6tes. 5.3. Préparation de peptides relatifs au p97 à l'aide de systèmes vecteurs d'expression-hôte On peut préparer des protéines et des peptides en grande quantité en insérant des séquences de codage de nucléotides dans un vecteur d'expression approprié qui est à son tour introduit dans des cellules hôtes convenables comprenant, sans y être limitées, des bactéries, des levures, des cellules d'insectes et des cellules de 20 mammifères. Bien que les hôtes bactériens présentent de nombreux avantages, ils ne traitent pas de façon appropriée de nombreuses protéines eukaryotes et ils conviennent moins que les cellules eukaryotes pour l'expression de protéines associées à une tumeur. Cependant, les protéines recombinées préparées dans les bactéries 25 peuvent être utiles pour l'induction de réponse des cellules-T puisque l'on pense que ces réponses nécessitent la dégradation initiale de l'antigène de protéine. Pour exprimer les peptides relatifs au p97 dans un système vecteur-hôte, des séquences de nucléotides codant l'antigène p97 associé au mélanome ou une partie de celui-ci, sont insérées dans un vecteur d'expression approprié. Les séquences de nucleotides comprennent, sans y être limitées, tout ou partie de la séquence de DNA du p97 sensiblement comme décrite dans la figure 3, y compris des séquences altérées dans lesquelles un ou plusieurs codons au sein de 35 la séquence est remplacé par un codon qui encode le même reste d'aminoacide ou un reste fonctionnellement équivalent, ce qui conduit à un changement neutre ou muet dans la séquence. Le vecteur d'expression contient les éléments nécessaires pour la transcription et la 2 60 1 370 2ú translation de la séquence de codage de protéines insérées. Ces élémnents varient par leur intensité et leurs spécificités. Selon le système hôte-vecteur utilisé, on peut utiliser l'un quelconque de toute une série d'éléments de transcription et de translation conve5 nables. Par exemple, lorsque l'on opère un clonage dans des systèmes de cellules de mammifères, on peut utiliser des promoteurs séparés du génome de cellules de mammifères (par exemple un promoteur de métallothionéine de souris) ou provenant de virus qui croissent dans ces cellules (par exemple, du promoteur 7,5K de virus de vaccine). On peut également utiliser des promoteurs préparés par-des techniques de recombinaison du DNA ou des techniques de synthèse pour réaliser la transcription des séquences insérées. Des signaux d'initiation spécifiques sont également nécessaires pour une translation efficace des séquences de codage de protéines 15 insérées. Ces signaux comprennent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. Dans le cas o soit le gène, soit la séquence de cDNA sont insérées dans un vecteur d'expression approprié, on peut n'avoir pas besoin de signaux de contrôle de translation supplémentaire. Cependant, dans le cas o l'on insère qu'une partie de la 20 séquence de codage, on peut avoir besoin de signaux de contrôle de translation exogènes, y compris du codon d'ATG. Le codon d'initiation doit, en outre, être en phase par rapport au schéma de lecture des séquences de codage de protéines pour garantir la translation de la totalité de l'insert. Ces séquences de contrôle de translation exogènes et ces codons d'initiation peuvent être de toutes sortes d'origines, à la fois naturelles et synthétiques. L'une quelconque des méthodes connues des spécialistes d'insertion de fragments de DNA dans un vecteur peuvent être utilisées pour réaliser des vecteurs d'expression contenant un gène chimérique constitué de signaux de transcription et de translation appropriés etles séquences de codage de protéine. Ces méthodes peuvent comprendre les techniques de DNA de recombinés utilisés in vitro, les techniques synthétiques et les techniques de recombinaison in vivo (recombinaison génétique). Les vecteurs d'expression comprennent, sans y être limités, les vecteurs suivants et leurs dérivés: virus de vaccine, adénovirus, virus d'insectes, vecteurs de levures, vecteurs de bactériophages et vecteurs de DNA de plasmides. Le clonage et l'expression des gènes dans des systèmes bactériens est bien connu dans l'état de la technique. Par exemple, lorsque l'on clone dans un E. coli, ses bactériophages ou ses promoteurs de plasmides, par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur recA, le promoteur de RNA ribosomique, les promoteurs PR et PL du coliphage lambda et d'autres, comprenant -au5 sans y être limités, le lacuv, le promoteur hybride trop-lacuv (tac), ompF, lia, lpp, peuvent être utilisés pour orienter des niveaux élevés de transcription du segment de DNA adjacent. Cependant, étant donné les différences de traitement entre les cellules 10 prokaryotes et eukaryotes, il peut être préférable d'exprimer les peptides relatifs au p97 selon la présente invention dans des cellules eukaryotes. Les méthodes les mieux établies d'expression des protéines dans des cellules eukaryotes sont: (a) l'introduction du gène dans la cellule en même temps qu'un gène 15 de résistance au médicament que l'on fait suivre d'une sélection avec le médicament en obtenant, de préférence, une amplification par exemple avec le système dihydrofrolaté réductase-méthotrexate; (b) expression du cDNA dans un vecteur de plasmide basée souvent sur le pBR322, en utilisant un promoteur eukaryote énergique et 20 d'autres séquences de régulation; (c) expression du cDNA dans un vecteur de virus provenant souvent du SV40 en utilisant, à nouveau, des promoteurs énergiques, dans ce cas un promoteur SV40. Les vecteurs de plasmides recombinés sont souvent utilisés pour produire des lignées de cellules qui produisent la protéine pendant une longue période de temps, tandis que les vecteurs SV40 sont souvent utilisés pour obtenir une expression transitoire. Bien que l'on ait le plus souvent utilisé comme hôtes des cellules de mammifères, les cellules d'insectes et, dans quelques cas, les cellules de 30 levures, peuvent également convenir. Quelques-unes sont des décrites plus en détail ci-dessous. Pour construire un virus de la vaccine recombiné exprimant l'antigène p97 associé au mélanome, on peut lier la séquence codant le cDNA au promoteur 7,5K du virus de la vaccine pour former un gène 35 chimérique. Ce gène chimérique est flanqué d'une séquence virale de vaccine supplémentaire homologue du gène de thymidine kinase viral, supporté par le vecteur plasmide du DNA. La construction du gène chimérique implique l'utilisation à la fois de signaux de contrôle naturels et synthétiques pour la transcription et la translation de la séquence d'antigène associée à une tumeur. Le gène chimérique est alors introduit dans des vecteurs d'expression du virus de la vaccine par une recombinaison in vivo entre la région de thymidine kinase homologue présente à la fois sur le vecteur plasmide et le génome du virus de la vaccine. Ces virus recombinés contenant le gène chimérique sont capables d'orienter l'expression des peptides relatifs au p97 chez un hôte infecté et on peut les utiliser comme composants d'un vaccin. Dans les cas o l'on utilise un vaccin un adénovirus comme vecteur d'expression, la séquence de DNA intéressante est liée à un complexe de contrôle transcription/translation d'adénovirus, par exemple les séquences du dernier promoteur et du leader tripartite. Ce gène chimérique est alors inséré dans le génome de l'adénovirus 15 par une recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome viral, par exemple région E1 ou E3) conduira à un virus recombiné-viable et capable d'exprimer le peptide relatif au p97 chez des hôtes infectés. Actuellement, on dispose de deux souches d'adénovirus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccin pour le personnel immunitaire. Ce sont des candidats de choix pour être utilisés comme vecteurs d'expression de la séquence de DNA à insérer. Un autre système d'expression que l'on pourrait utiliser pour -exprimer les peptides relatifs au p97 est un système d'insecte. Dans 25 un tel système, on utilise le virus de la polyhédrose nucléaire de l'Autographa californica (AcNPV) comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus croit dans des cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence intéressante de DNA peut être clonée dans des régions non essentielles (par exemple le gène de polyhédrine) du virus qui sont placées sous le contrôle d'un promoteur d'AcNPV (par exemple le promoteur de polyhédrine). Une insertion réussie de la séquence de DNA conduit à une inactivation du gène de polyhédrine et à la production de virus recombiné non occlus (c'est-à-dire un virus auquel fait défaut le revêtement protéiné codé pour lui par le gène 35 de polyhédrine). Ces virus recombinés sont alors utilisés pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles s'exprime le gène inséré. On peut, en outre, choisir des souches de cellules qui modulent l'expression des séquences insérées ou modifient et transforment le gène chimérique produit de la façon spécifique souhaitée. L'expression de certains promoteurs peut être améliorée en présence de certains inducteurs (par exemple des ions zinc et cadmium pour des promoteurs de métallothionéine). On peut donc contrôler l'expression d'une protéine transformée par génie génétique. Ceci est important si. la protéine produite par le gène cloné est mortelle pour les cellules de l'hôte. En outre, des modifications (par exemple, glycosylation, 10 phosphorylation, etc.) et un traitement (par exemple une coupure) des protéines produites sont importantes pour la structure et la fonction de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques de traitement postérieur à la translation et de modification des protéines. On peut choisir des lignées 15 de cellules ou des systèmes hôtes appropriés pour garantir la modification et le traitement correct de la protéine étrangère exprimée. Dans le mode de réalisation particulier décrit ici pour le p97, on a lié la séquence de cDNA p97 à un vecteur d'expression de plasmide provenant du pBR322 qui contient, comme promoteur la métallo20 thionéine. La séquence de codage entière du p97, y compris le peptide signal et la membrane ancre est insérée dans le vecteur. 5.3.1. Identification des vecteurs d'expression recombinès capables derpliiuer et d'orienter l'expression des séquences de DNA _ _ _ _qt_n_.e - - - - - - - --- _ _ _ _ _ d_p97 On peut identifier les vecteurs d'expression contenant des inserts de gêne extérieurs par trois approches générales: (a) hybridation DNA-DNA; (b) présence ou absence de fonction d'un gène marqueur; et (c) expression des séquences insérées. Dans la première approche, la présence d'un gène extérieur inséré dans un vecteur d'expression peut se détecter par hybridation DNA-DNA en utilisant des échantillons comprenant des séquences qui sont homologues à l'insert du gène étranger. Dans la seconde approche, le système vecteur recombiné/hôte peut être identifié et choisi sur la 35 base de la présence ou de l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur" causée par l'insertion des gènes dans le vecteur (par exemple activité de thymidine kinase, résistance aux antibiotiques, phénotype de transformation, etc.). Par exemple, si le gène étranger 3C est inséré dans la séquence du gène marqueur du vecteur, les recombinés contenant l'insert du DNA peuvent s'identifier par l'absence de la fonction du gène marqueur. Dans la troisième approche, les vecteurs d'expression recombinés peuvent s'identifier en essayant le gène étranger produit exprimé par le recombiné. Ces essais peuvent être basés sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du gène produit. Par exemple, lorsque l'on construit un virus de vaccine recombiné selon la présente invention, le gène chimérique contenant la 10 séquence de codage est inséré dans le gène de thymidine kinase, ce qui inactive le virus et le dote d'un phénotype TK. Ces recombinés sont sélectionnés pour leur aptitude à donner naissance, dans des milieux contenant de la 5bromo-déoxyuridine à un nucléoside analogue qui est mortel pour les cellules TK, mais non pour les cellules--TK. 15 Les recombinés sont encore identifiés par hybridation DNA-DNA en utilisant un échantillon de cDNA spécifique de la protéine associée à une tumeur.-Le virus recombiné TK peut s'isoler par purification sur plaque et l'on prépare des charges à partir de cellules cultivées infectées. On peut tester l'aptitude du virus recombiné à induire la 20 synthèse des peptides relatifs au p97. A cette fin, on peut faire pousser des cellules infectées en présence d'aminoacides radiomarqués; ensuite, on teste les lysats et les fractions sous- cellulaires des cellules infectées radiomarquees par immunoprécipitation à l'aide d'anticorps dirigés contre l'antigène p97 initial associé à un mélanome. Les produits immunoprécipités sont résolus par SDS-PAGE. On peut également tester les cellules infectées par immunofluorescence en utilisant un anticorps monoclonal. Les cellules dans lesquelles on a introduit un vecteur plasmique par transfection peuvent facilement s'identifier par analyse FACS ou 30 par des essais de liaison de réplique de colonies de cellules sur tissus de polyester. La quantité de peptides relatifs au p97 présent peut se déterminer par radio-immuno-essai quantitative et on peut déterminer sa localisation sous-cellulaire par fractionnement cellulaire et par microscopie d'immunofluorescence. La structure du peptide relatif au p97 exprimé peut se déterminer par SDS-PAGE et par analyse séquentielle d'aminoacide. 5.3.2. Purification du peptide relatif au p97 provenant de systines vecteurs d'expression-hôte De nombreux antigènes associés à une tumeur tels que, par exemple, le p97 sont des glycoprotéines cellulaires superficielles et ils contiennent un peptide signal N-terminal et un peptide ancre C-terminal (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol, 181, 111-121). Lorsqu'elle est exprimée dans un vecteur appropriée, on s'attend à ce que la cellule change de lieu pour venir ô la surface de la cellule. Pour faciliter la purification de la protéine, il peut être préférable de 10 détruire la séquence du DNA qui code pour la région ancre de la membrane, de telle sorte que la protéine mûre soit libérée dans le milieu de culture. On peut purifier le peptide relatif au p97 à partir de ses cellules hôtes par lyses en présence d'un détergent que l'on fait 15 suivre d'une chromatographie d'affinité en utilisant des anticorps monoclonaux. Si l'on doit purifier une protéine tronquée dans le milieu de culture, il est préférable d'utiliser du milieu exempt de sérum et, ensuite, d'utiliser une chromatographie d'affinité en présence d'anticorps monoclonaux. Il est important de pouvoir éluer 20 l'antigène dans l'adsorbant anticorps sans réduire ses propriétés antigènes ni le dénaturer. On peut y arriver en augmentant ou en abaissant le pH ou en utilisant un chaotrope. Il peut être nécessaire de sélectionner un anticorps qui libère l'antigène dans des conditions relativement modérées. L'antigène purifier par affinité 25 peut encore être purifié ultérieurement par HPLC. 5.4. Caractérisation immunologique des peptides relatifs au p97 L'aptitude de l'antigène synthétique ou recombiné de déclencher une réponse antitumeur peut s'évaluer initialement sur des animaux expérimentaux. On y parvient en construisant un système de modèle dans lequel-la protéine humaine p97 associée à un mélanome s'exprime dans des cellules de la souche inbred appropriée de l'espèce expérimentale. Les animaux sont ensuite immunisés ô l'aide du peptide relatif au p97 selon la présente invention, par des protocoles divers et on teste, ensuite, le développement des anticorps dirigés contre 35 l'antigène p97 associé à un mélanome, l'immunité d'origine cellulaire telle que, par exemple, l'hypersensibilité de type retard vis-à-vis de l'antigène p97 et l'aptitude à rejeter une attaque de cellules tumorales syngéniques viables exprimant l'antigène p97. En outre, on peut réaliser des essais in vitro d'immunité cellulaire pour mesurer la prolifération des lymphocytes en réponse aux peptides relatifs au p97 et l'aptitude des lymphocytes provenant d'animaux immunisés ou de patients humains souffrant d'un mélanome à tuer des cellules tumo5 raies exprimant l'antigène p97. En outre, en immunisant des souris avec du p97 de souris, on est capable de déterminer dans quelle mesure il est possible d'induire une réponse immunitaire à un antigène qufest présent en quantité traces dans des tissus normaux. On peut utiliser des primates non humains pour établir la sécurité des peptides relatifs au p97 selon la présente invention. A cette fin, on peut immuniser les animaux en utilisant des protocoles que l'éthique permettrait d'appliquer à des patients humains atteints par un cancer et, ensuite, les tester comme décrit ci-dessus sauf que les expériences de transplantation de tumeurs de serait pas réalisa15 bles car elles nécessitent l'utilisation de souches inbred. La sécurité du mode opératoire d'immunisation se détermine en examinant l'effet de l'immunisation sur la santé générale des animaux immunisés (changement de poids, fièvre, appétit, comportement, etc.) et en examinant les changements pathologiques lors de l'autopsie. Finalement, le peptide relatif au p97 selon la présente invention peut être testé sur des patients humains atteints par le cancer. Après un test en phase I initiale sur des patients souffrant d'un cancer avancé pour en établir l'absence de toxicité, on pourrait tester des patients atteints d'un cancer en cours de rémission mais 25 pour lesquels il y aurait une probabilité élevée de récurrence. On évaluerait leur réponse immunitaire comme décrit ci-dessus pour des primates non humains, sauf que l'on examinerait l'effet du traitement sur une maladie établie ou sur la fréquence de récurrence. Dans le cas du p97 antigène de mélanome, on examinera aussi les naevi bénins 30 (taches de naissance) qui expriment l'antigène. 5.5. Formulation d'un vaccin Le but de ce mode de réalisation de la présente invention est de préparer, par des techniques de DNA synthétiques, un peptide synthétique, une protéine purifiée ou un virus recombiné que l'on peut utiliser comme immunogène et comme vaccin pour protéger des patients souffrants du cancer avec un risque élevé de récurrence de leur maladie, pour traiter une maladie établie et, finalement, pour vacciner profilactiquement des individus à haut risque. En fait, on 26013?0 * peut utiliser l'antigène p97 associé à un mélarionie synthétique ou recombiné, en combinaison avec d'autres irnmunogènries, pour préparer des vaccins polyvalents de prévention du mélanome et d'autres cancer. Des exemples de diverses formulations de vaccin sont discutées ci-après. 5.5.1. Formulations de vaccin viral Lorsque l'on prépare le peptide relatif au p97 selon la présente invention à l'aide d'un virus recombiné, on peut établir la formulation soit d'un vaccin viral recombiné vivant, soit d'un vaccin viral 10 recombiné inactive. Le choix dépend de la nature du virus recombiné utilisé pour exprimer le peptide relatif au p97. Lorsque le virus recombiné est infectieux pour l'hôte à immuniser, mais n'occasionne pas de maladie, un vaccin vivant est préférable parce que sa multiplication chez l'hôte conduit à un stimulus prolongé de nature et 15 d'importance semblable à ce qui se produit avec des infections souscliniques naturelles et cela confère, de ce fait, une immunité importante de longue durée. Lors de son introduction dans un hôte, le virus recombiné infectieux peut exprimer le peptide relatif au p97 à partir de son gène' chimérique et stimuler, de ce fait, une réponse 20 immunitaire. Le virus recombiné peut être utilisé par lui-même comme vaccin préventif contre le mélanome. La préparation de ces virus recombinants à utiliser dans ces formulations peut impliquer à la fois des systèmes in vitro (par exemple des cellules de culture de tissus) et in vivo (par exemple un animal hôte naturel tel que des vaches). On peut adapter des méthodes classiques de préparation et de formulation de vaccins de la variole à la formulation de vaccin de virus recombinés vivants. Des vaccins de virus vivants polyvalents peuvent se préparer à partir d'un virus unique ou de plusieurs virus infectieux recombinés 30 qui expriment une variété d'antigènes de différentes cellules tumorales ou cancéreuses. Par exemple, on peut fabriquer un virus de vaccine (qui peut loger approximativement 35 kg base de DNA étranger) de telle sorte qu'ils contiennent des séquences de codage pour d'autres épitopes; un tel virus recombiné peut être utilisé par lui-même comme immunogène dans un vaccin polyvalent. Ou encore, on peut faire entrer un mélange de virus de vaccine et/ou d'autres virus, chacun étant capable de diriger l'expression d'un différent gène codant pour différents épitopes dans la formule d'un vaccin polyvalent. Que le virus-recombiné soit infectieux ou non vis-à-vis de l'hâte à immuniser, on peut préparer une formulation de vaccin inactive. Les vaccins inactivés sont "morts" dans le sens o leurs propriétés infectieuses ont été détruites, habituellement par traitement au formaldehyde. Idéalement, on détruit les propriétés infectieuses d'un virus sans affecter le capside, ou les protéines de l'enveloppe, qui représente le support des propriétés immunogènes du 10 virus. Pour préparer des vaccins inactivés, il faut faire croitre de grandes quantités de virus recombinés dans une culture pour procurer la quantité nécessaire des antigènes pertinents. On peut utiliser un mélange de virus inactivés qui exprime différents épitopes pour la formulation de vaccins (polyvalents). Dans quelques cas, ceci peut 15 être préférable à des formulations de vaccins vivants à cause des difficultés potentielles dues aux interférences réciproques des virus vivants administrés ensemble. Dans l'un ou l'autre cas, le virus recombiné inactivé ou un mélange de virus devrait être formulé à l'aide d'un adjuvant convenable pour améliorer la réponse immunolo20 gique à leurs antigènes. Les adjuvants convenables comprennent, sans y être limités, des gels minéraux, par exemple de l'hydroxyde d'aluminium; des substances tensio-actives par exemple de la lysolécithine; des polyols pluroniques; des polyanions; des peptides et des émulsions huileuses. On peut utiliser de nombreuses méthodes pour introduire les formulations de vaccin décrites ci-dessus. Ces méthodes comprennent, sans y être limitées, les voies intradermiques, intramusculaires, intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées et intranasales. Lorsque l'on utilise une formulation de vaccin de virus recombiné 30 vivant, on peut l'introduire par la voie naturelle d'infection du virus de type sauvage apparenté qui a été utilisé pour réaliser le virus recombiné dans la formulation de vaccin. 5.5,2. Formulations de vaccin sous-unitaire En variante des vaccins à base de virus, le peptide apparenté au 35 p97 peut être utilisé lui-même comme immunogêne dans les formulations de vaccins sous-unitaires. Les vaccins sous-unitaires comprennent uniquement le matériel immunogéne pertinent nécessaire pour immuniser un hôte. Par conséquent, le peptide relatif au p97 peut être purifié partir de recombinés qui expriment le peptide. Ces recombinés comprennent l'une quelconque parmi les cellules cultivéesinfectées par des virus décrites ci-dessus, des bactéries transformées ou des levures transformées. Dans un autre mode de réalisation de la pré5 sente invention, on peut synthétiser, par voie chimique, les peptides ou les protéines relatifs au p97. Lorsque les peptides relatifs au p97 sont purifiés à partir de recombinés ou de produits de synthèse chimique, on peut ajuster le produit final à une concentration appropriée et le faire entrer dans la formulation d'un adjuvant de 10 vaccin convenable quelconque et l'emballer pour l'utilisation. Les adjuvants convenables comprennent, sans y être limités: les gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium; les substances tensioactives, par exemple la lysolecthine. les polyols pluroniques; les polyanions; les peptides et les émulsions d'huile. Le peptide relatif 15 au p97 peut également être incorporé dans des liposomes ou être conjugué à des polysaccharides et/ou à d'autres polymères pour être utilisés dans une formulation de vaccin. Dans les cas o le peptide relatif au p97 est un haptène, c'est-à-dire une molécule qui est antigène parce qu'elle peut réagir 20 sélectivement avec des anticorps cognate, mais non immunogène en ce sens qu'il ne peut pas déclencher une réponse immunitaire, l'haptène peut être lié par covalescence à un support ou à une molécule immunogène et on peut faire entrer le support d'haptène dans une formulation utilisable comme vaccin; par exemple, une grande protéine telle 25 que, par exemple, une albumine de sérum de protéine, peut conférer des propriétés immunogènes à l'haptène qui lui est couplé. 6.- EXEMPLE: ANTIGENE p97 ASSOCIE A UN MELANOME Dans l'exemple décrit cidessous, des clones de cDNA provenant de diverses régions du mRNA de p97 sont mis bout à bout et insérés dans un vecteur d'expression qui oriente l'expression d'un peptide relatif au p97. Les peptides relatifs au p97 produits par l'ensemble vecteur d'expressioncellule hôte peuvent entrer dans la formulation d'un vaccin. 6.1. Purification du mRNA de p97 Des polysomes sont préparés à partir de cellules de mélanome 35 SK-MEL28 (Carey et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 32703282) par précipitation au magnésium. A partir de cette préparation, on purifie des polysomes portant des chaînes naissantes de p97 par incubation en présence de trois anticorps monoclonaux Ig2a (96,5, 118,1, 133,2) spécifiques d'épitopes distincts de p97 (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255, 4980-4983; Brow et al., 1981, J. Immunol. i27, 539546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7R, 539-543; Plowmian et al., 1983, Nature, London 303, 70-72) ce que l'on fait suivre d'une chromatographie d'affinité sur Sépharose garnie de protéines A. On élue le mRNA enrichi en p97 en utilisant de I'EDTA et on le purifie-par chromatographie d'affinité sur oligo(T)-cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD). Dans une expérience typique, 150 unités E260 de polysomes donnent 260 ng de mRNA enrichi en p97, ce qui représente 0,23% du mRNA total. Lorsqu'on le transpose dans des oocytes de Xenopus et que l'on en essaie le p97 comme décrit (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303, 70-72), le mRNA enrichi en p97 donne 80 pg p97 par ng de mRNA, tandis que le mRNA non enrichi en p97 ne donne que 0,44 pg de p97 par ng de mRNA, ce qui montre que l'activité du mRNA de p97 a été enrichie 180 fois. Le rendement d'activité 15 du mRNA en p97 est de 42%. Une transposition dans le système lysats de réticulocyte (Pelham et Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67, 247-256) montre que le mRNA enrichi en p97 à coder pour un polypeptide majeur ayant un poids moléculaire apparent de 80 000 daltons, ceci étant indiqué par analyse par SDS-PAGE, polypeptide qui n'était 20 pas détectable dans les produits de translation du mRNA non enrichi et qui était immunoprécipité par un antisérum spécifique du p97 (figure 1). On en conclut que ceci était le précurseur non glycosylé du p97. 6.2. Préparation et construction de clones de cDNA Deux techniques décrites ci-dessous sont utilisées pour construire des clones de cDNA transcrits à partir des sections de mRNA isolées ci-dessus. 6.2.1. Construction de clones de cDNA amorcés _parolioo(Tj Le mRNA enrichi en p97 préparé ci-dessus est utilisé comme section d'amorcage dans la synthèse du cDNA amorcé par oligo(T). Le cDNA est cloné dans du pBR322 de la façon suivante: pour la synthèse de la première section de cDNA, du mRNA enrichi en p97, les quatre dNTPs et oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) sont incubés en présence de transcriptase inverse (Molecular Genetic Resources). 35 La seconde section est synthétisee par incubation avec le grand fragment de polymérase de DNA de E. coli (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) et le cDNA à double hélice est digérée en présence de nucléases S1 (don de D. Durnam of The Fred Hutchisen Cancer Research Center, Seattle, WA). On procède ensuite à une terminaison-dC du cD[;A à l'aide d'une déoxynucléotidyle transférase terminale (Bethesda Research Labs, Bethesda MD), on consolide par une digestion-PstI, on procède à une terminaison-dG pBR322 (Bethesda Research Labs, Bethes5 da MD) (Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727-3731) et on l'utilise pour transformer du RR1 de E. coli traité par CaCl2. Le DNA provenant de colonies de bactéries transformées est mis sur papier (Taub et Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126, 222-230) et on crible par hybridation différentielle avec des échantillons de 10 cDNA synthétisés sur des sections de mRNA enrichi en p97 et non enrichi. Un clone de 243 paires de base (bp), le p97-3a2f1, est identifié et il s'attache par hybridation au cDNA enrichi en p97, mais ne s'attache pas de façon détectable au cDNA non enrichi et il sélec15 tionne également le mRNA de p97 dans des expériences de transposition à sélection par hybride. Un signal de polyadénylation (AATAA) et une piste poly(A) sont présents à la troisième extrémité du cDNA (voir figure 2). Nick a transposé du p973a2f1 hybridé de façon cent fois plus intense sur du miRNA enrichi en p97 que sur du mRNA de mélanome 20 non enrichi et ne l'a pas transposé de façon détectable sur du mRNA fibroblaste. Une analyse par tache de Northern à l'aide de cDNA cloné servant d'échantillon a identifié un mRNA d'approximativement 4 kilobase (kb) qui était présent dans des cellules de mélanome SK-MEL28 et absent des fibroblastes. 6.2.2. Clonage degénomesm de p97 et utilisation d'oliqonucléotides ynthtiuespour amorcer une synthse__de cDNA Des tentatives d'obtention de clones de cDNA s'étendant à plus d'une kb du site de polyadénylation ont échouée, éventuellement à cause d'une région à teneur élevée en GC (plus de 80%) possédant une 30 structure secondaire importante. Le clonage de génome a été utilisé pour remédier à ce problème. Quatre clones de génome se recouvrant sont isolés dans des librairies de lambda L47,1 contenant du DNA SK-MEL28, fractionnées selon leur dimensions, enrichis en fragments de restriction de p97 spécifiques. Ces quatre clones de génome recouvrent 28 kb et ils contiennent la totalité de la région codante du p97, y compris la région de régulation du gène. Les clones de génome tels qu'ils sont arrangés en séquence de 5' à 3' sont: lambda B15, lambda H17, lambda B6,6 et lambda E7,7. La nomenclature est 15 20 25 30 35 constituée d'une lettre qui se réfère à l'enzyme de restriction utilisée pour produire le fragment et le chiffre indiquant la dimension en kg base du fragment qui a été cloné dans le lambda L47,1. Ainsi, en partant du terminus 5', le clone lambda B15 contient un fragment de p97 BamHI de 15 kb; le clone lambda H17 contient un fragment de p97 HindIII de 17 kb; le clone lambda B6 contient un fragment de p97 BamHI de 6,6 kb et le clone lambda E7,7 contient un fragment de p97 EcoRI de 7,7 kb (voir figure 2A). Les fragments de restriction des clones qui s'attachent par hybridation au mRNA de p97 de 4 kb sur des taches de Northern sont séquencés et on identifie des exons de p97 à l'aide d'une recherche assistée par ordinateur d'une homologie entre les séquences de codage prédites et la séquence d'aminoacide de la transferrine humaine et de la transferrine de poulet (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79, 2504-2508; Jetsch et Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122, 291-295). Trois oligonucléotides synthétiques, dont les séquences sont basées sur des séquences d'exons de génomes de p97 sont utilisés pour amorcer une synthèse de cDNA sur du mRNA de SK-MEL28 et le cDNA qui en résulte est cloné de la façon suivante dans du lambda-gt10: le cDNA de p97 est soumis à une terminaison-dG et on le lie avec un oligonucleotide de montage (AATTCCCCCCCCCCCC) et de lambda-gt 10 qui a été restreint à l'aide de EcoRI. L'oligonucleotide de pontage permet l'insertion et la liaison de la séquence de cDNA soumis à une terminaison-dG dans le site EcoRI du lambda-gt 10. Le phage lambda est emballé (Grosveld et al., 1981, Gene 13, 227-237), et il est plaqué sur E. coli C600 rK mK+hfl. On crible les librairies de cDNA en lambda-gt 10 pour l'insert de p97 par hybridation de plaques avec comme échantillon des fragments d'exons de génome. Les échantillons sont marqués avec du p32-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/mmole) par translation de nick à une activité spécifique de 5 10 x 108 cpm/Pg. Trois clones de cDNA se recouvrant (O10al, ljl, 2fl) s'étendant sur 2 368 nucleotides du mRNA du p97, y compris la totalité de la région de codage, sont identifiés en utilisant comme échantillons des fragments spécifiques d'exons de p97 (figure 2). 6.3. Analyse séquentielle du DNA de p97 Des inserts de cDNA sont excisés et sous-clonés dans un plasmide vecteur pEMBL18 (Dente et al., 1983, Nucleic Acides Res. 11, 1645- 1655) dans du E. coli pour propagation ultérieure et cartographie de restriction. On sous-clone également du cDNA dans un vecteur de clonage phage m13nmp18 (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33, 103-119) et on le séquence en utilisant la méthode du dioxyde de Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463:5467). Les clones de M13 contenant des grands inserts sont séquences par des suppression de génération en utilisant de la DNase I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158, 539549) ou l'exonucléase III (Hexikoff, 1984, Gene 28, 351-359) et en utilisant des amorceurs d'oligonucléotide 10 synthétiques à 21 motifs. La séquence de cDNA de p97 est représentée sur la figure 3. Un cadre de lecture ouvert de 2 214 nucleotides s'étend du premier ATG, la séquence enroulée qui se conforme avec la séquence d'initiation du consensus déterminé par Kozak (Kozak, 1980. Nucleic Acids Res. 8, 127-142), jusqu'au TGA en position 2 215. Le clone de cDNA le plus en ' contient un supplémentaire de 60 nucléotides en amont de l'ATG d'initiation. La région non codante en 3' du mRNA de p97, qui n'a pas été obtenu sous la forme de clone de cDNA, est identifiée comme un simple exon de génome contenant 1 667 nucléotides. Les résidus 20 à 20 32 de la séquence d'aminoacide prédite sont identiques à la séquence d'aminoacide N- terminal connue du p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296, 171-173) ce qui prouve l'identité du cDNA cloné. En outre, le poids moléculaire prédit du précurseur est de 80 196 daltons, en bon accord avec le poids moléculaire observé du produit de 25 translation in vitro. 6.4. Construction d'un plasmide d'expression recombiné contenant la séquence de codage du p97 La grande dimension du gène de p97 nécessite un assemblage des clones de cDNA que l'on obtient par amorçage spécifique du mRNA de 30 mélanome à l'aide d'une transcriptase inverse. Les trois clones lambda-gt 10 de cDNA (10al, ljl et lfl; voir figure 2) qui englobent la région de codage depuis le peptide signal à travers la séquence de membrane ancre sont utilisés. L'insert p97 du clone 10al est excisé par digestion présente de EcoRI et la séquence oligo(dG) à l'extré35 mité 5' du cDNA 10al est éliminée par digestion en présence d'exonucléase III, ce qui engendre le clone 10alb, avec un site HindIII de bp en amont de la méthionine d'initiation-de la préprotéine du p97. Les inserts de p97 des trois clones de cDNA 10alB, ljl et 2fl et le clone de génome E7,7 sont liés ensemble au site dans une restriction PvuII, SstI et EcoRI et on les insert dans les sites HindIIIEcoRI du plasmide vecteur pEMBL18 (Dente et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11, 1645-1655) comme représenté sur la figure 2. La construction finale, le p97b, contient l'insert p97 de 4,4 kb dans le plasmide vecteur pEMBL18 que l'on utilise pour transformer les E. coli HB101. L'insert dans p97b contient 30 bp de la région non transposée 5' du mRNA de p97, la séquence de codage entière et la région 3' non transposée délimitée par un site 5' HindIII et un site 3' EcoRI. 10 L'insert de p97 de 4,4 kb est excisé du p97b en même temps de HindIII et EcoRI et les extrémités sont introduites en utilisant le fragment de Klenow de la polymérase du DNA de E. coli. Le fragment à extrémités émoussées est introduit dans le site unique SmAI dans le vecteur d'expression de cDNA eukaryote 1995.12 pUC13, dérivé du 15 vecteur mThGH-112 (Palmiter et al., 1983, Science 222, 809-814), obtenu chez le Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle, Washington). Ces vecteurs utilisent le promoteur de métallothionénine de souris pour exprimer des gènes étrangers dans des cellules eukaryotes. La construction dans laquelle l'insert de p97 est en orientation correcte est identifiée par analyse de restriction et désignée sous les noms de pMTp97b. Le plasmide recombiné est transféré dans les cellules LMTK et les transfectants sont sélectionnés par croissance dans du milieu HAT. Les clones prélevés dans la boite transfectée sont dispersés dans des plaques de microtests à 96 puits et le milieu de culture usé et les lysats obtenus provenant des plaques de réplique sont essayés pour déterminer le p97 par essai immunoradiométrique à deux sites. Les sous-clones sont redispersés et retestés. Le clone TKMp97-12 qui exprime approximativement 4 000 000 de molécules de p97 par cellule 30 est cultivé, induit à l'aide de cadmium et utilisé comme source de p97 pour l'immunisation. 6.5. Immunisation de souris avec des peptides relatifs au p97 On cultive des cellules de TKMp97-12, on les induit avec du cadmium et (14,4 g) en sont lysés par incubation, pendant 10 minutes, 35 sur de la glace en présence de 70 ml de TNEN (Tris à 20 mM-HCl, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, NP-40 à 0,5%); Le lysat est ultracentrifugé à 200 000 x g pendant 45 minutes à 4 C et l'on fait passer la moitié du lysat sur une colonne d'immuno-affinité de I mlni spécifique du p97 (fragment FAB de l'anticorps 96,5 couplé au Sépharose). On lave énergiquement l'inmmuno-absorbant tout d'abord avec du TNEN et, finalement, avec du Tris 20 Mn-HCl, pH 6,8. Pour l'immunisation, 0,5 ml de la colonne d'immuno-affinité absorbé, préparé comme décrit ci-dessus, sont mélangés avec 0,5 ml de Tris 20 MnHCl, pH 6,8, et émulsionnés à l'aide de 1 ml d'adjuvant de Freund complet. Quatre souris BALB/c reçoivent 0,4 ml de l'émulsion par voie intrapéritonéale. Trois semaines plus tard, les souris sont 10 stimulées à nouveau avec un quart de cette quantité d'antigène dans de l'adjuvant de Freund incomplet. Les souris de contrôle sont immunisées avec de l'anticorps de souris non relatif au p97 passé sur colonne d'immunoaffinité qui a, par ailleurs, été traité de façon identique. Quatre des souris immunisées au p97 et deux souris de 15 contrôle sont saignées une semaine après le traitement de stimulation. On test dans le sérum la présence des anticorps dirigés contre le p97 par immunoprécipitation à partir des cellules de mélome SK-MEL radio-iodées que l'on fait suivre d'une SDS-PAGE. Les résultats montrent que les sérums provenant des quatre souris immunoprécipitent 20 le p97 tandis que les sérums de contrôle sont négatifs. On teste également dans les sérums la présence des anticorps dirigés contre le p97 en utilisant un essai ELISA sur des cellules de mélanome SK-MEL 28 fixées au glutaraldéhyde (20 000 cellules par puits de microtest). On incube les cellules fixées en présence de 0, 05 ml de sérum dilué 1/10 000, pendant une heure à la température ambiante, on lave et on incube ensuite pendant une heure à la température ambiante en présence de 0,05 ml d'un mélange péroxydase de raifort-IgG de chèvre conjugué anti souris (Southern Biotech). Les densités optiques (lues à 490 nm) des sérums provenant des souris immunisées au p97 sont de 30 0,350, 0,243, 0,343, 0,200, tandis que la densité optique des sérums provenant des contrôles sont de 0,036 et 0,057. 6.6. Caractérisation du p97 6.6.1. Structure du p97 On détermine la structure du p97 à partir de la séquence d'ammi35 noacide du précurseurde p97 qui comprend quatre domaines structurels. Etant donné que le résidu 20 de la séquence de précurseur correspond au N-terminus du p97 mûr, les résidus d'aminoacide 1 à 19 42 2601370 constituent probablement un peptide signal, conclusion qui est supportée par sa longueur et sa nature hydrophobe. Les aminoacides 20-361 et 362373 constituent deux domaines homologues de 342 et 352 aminoacides chacun. Les sites potentiels de glycosylation liée à l'azote lié à l'atome existent aux positions 38 et 135 dans le domaine N-terminal et en position 515 dans le domaine C-terminal. On pense finalement que les aminoacides 714-738, région de résidus en prédominance non chargée et hydrophobe, ancrent le p97 dans la membrane cellulaire (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181, 111-121) et peuvent s'étendre dans le cytoplasme. La structure du domaine du p97 est supportée par les expériences de digestion à la protêase. La digestion du p97 en présence de trypsine, de papaïne (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127, 539-546) ou de thrombine donne lieu à la formation d'un fragment antigène glycosylé d'un poids moléculaire approximatif de 40 000 daltons. On purifie le fragment à partir d'un digesta de thrombine de p97 que l'on a marqué métaboliquement à l'aide de 35S-méthionine ou 35S-cystéine et séquencé comme décrit (Brown et al., 1982, Nature, London 296, 171-173). On identifie des résidus de cystéine aux positions 7 20 et 17 et des résidus de méthionine aux positions 2 et 20. On obtient des résultats identiques avec du p97 intact et ces résultats sont en accord complet avec la séquence N- terminale du p97 prédit à partir de la séquence de cDNA. On en conclut que le fragment résistant à la protéase de 40 000 daltons de poids moléculaire correspond au domaine 25 N-terminal du p97. On a été incapable d'isoler le domaine C-terminal du p97 peut être parce qu'il est sensible à la protéase. 6.6.2. Homoloqiedu p97 avec la transferrine Une recherche de la bibliothèque de la séquence d'aminoacide de la Protein Identification Resource (Release 5,0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London 290:8) montre que le p97 présente un homologie frappante avec trois membres de la superfamille de la transferrine: transferrine de sérum humain, lactotransferrine humaine et transferrine de poulet (37 à 39% d'homologie, voir figure 4). Etant donné que la transferrine humaine et la transferrine de poulet présentent, l'une avec l'autre, une homologie de 50%, le p97 doit avoir divergé de la transferrine de sérum il y a plus de 300 millions d'années. Le 260 1370 p97 renferme 14 résidus de cystéinre situés dans des positions honolnogues dans chaque domaine. La transferrine humaine contient toutes ces cystéines dans des positions homologues dans les deux domaines, tandis qu'à la lactotransferrine humaine et à la transferrine de poulet ne manquent que deux de ces résidus de cystéine (dans leurs domaines C- terminaux). A la différence du p97, ces protéines contiennent de 4 à 7 cystéines supplémentaires dans leurs domaines C-terminaux qui ne renferment pas d'éléments correspondants dans le domaine N-terminal. La transferrine humaine contient également deux extra10 cystéines uniques dans son domaine N-terminal. Les positions de la plupart des disulfures dans la transferrine de sérum humain, la lactotransferrine et la transferrine de poulet, ont été déterminées directement (McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2504-2508), Metz-Boutique et al. , 1984, Eur. J. Biochem. 145, 65915 676; Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel) 39, 135-141; MacGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3543-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem. 122, 297-303; Williams, 1974, Biochem J. 141, 745-752). On peut donc prédire la présence de 7 liaisons disulfures dans chaque domaine du p97 (voir figure 5). L'homologie d'aminoacide entre les domaines du p97 (46% obtenus par insertion de 7 vides de 9 restes) est plus frappante que celle que l'on rencontre dans la transferrine humaine (43% - 16 vides, restes) ou la transferrine de poulet (35% - 12 vides, 49 restes). Etant donné l'importante homologie de séquence entre le p97 et la 25 transferrine et les schémas apparemment semblables de déroulement, basés sur la conservation des cystéines, on pense que si l'on peut raffiner la structure présente actuelle des rayons-X à faible résolu de la transferrine (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281, 157158) il peut être possible d'en déduire la structure tridimension30 nelle du p97. 6.6.3. Fonctions du.p97 Son appartenance à la super famille de la transferrine, son aptitude à lier le fer (Brown et al., Nature, London 296, 171-173) et sa localisation de chromosomes commune avec la transferrine et le récepteur de transferrine (Plowman et al., 1983, Nature, London 303, -72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2752-2756) supportent toutes un rôle du p97 dans le transport du fer. On pense 2 601370 que la poche de liaison du fer de la transferrine contient 2-3 tyrosines, 1-2 histidines et une seule arginine de liaison du bicarbonate (MetzBoutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145, 659-676). La conservation de ces aminoacides dans le p97 supporte son rôle propose 5 dans le métabolisme du fer (voir figure 4). Le p97 étant une molécule analogue à la transferrine liée à la membrane et ne présentant pas d'homologie avec le récepteur de transferrine (Scheider et al., 1984, Nature, London, 311, 675-678), son rôle dans le métabolisme cellulaire du fer peut différer de celui joué par la transferrine de sérum 10 qui circule et le récepteur cellulaire de la transferrine. L'expression du cDNA de p97 clone dans les cellules eukaryotes permettra un examen expérimental de ces propriétés fonctionnelles. 6.6.4. Conclusion Sur la base de ces données, il est clair que l'on a obtenu du 15 cDNA construit pour le p97 associé au mélanome et que ce cDNA peut s'exprimer efficacement dans des cellules de mammifères pour produire des quantités importantes de p97 antigène. 7.- EXPRESSION DU p97 CLONE ET TEST DU VACCIN Les expériences détaillées ici décrivent l'expression de la protéine 20 du p97 clone et le test de son vaccin. L'expression de la protéine de p97 sous sa forme telle que sécrétée (par le clone B16svp97a.14 de cellules de souris transfectée) a permis la purification de quantités de l'ordre du milligramme de la protéine du p97 dans toute sa longueur. La protéine sous forme purifiée est utilisée pour tester in vitro l'induction de l'immunité 25 cellulaire et pour tester son potentiel comme vaccin fractionnaire. Le gène de p97 produit est également exprimé à la surface de cellules de mélanome de souris à métastases procurant un modèle pour le test de l'efficacité du vaccin dans la prévention de la croissance d'une tumeur dans un système syngénique. Le gène de p97 est inséré dans un virus recombiné de vaccine vivant pour être utilisé comme une formulation de vaccin capable d'engendrer une immunité cellulaire efficace. Le virus de la vaccine recombiné, Vp97a-NY, est évalué pour en déterminer son aptitude à procurer une immunité chez les souris en utilisant toute une série d'essais pour démontrer l'immunité humorale et cellulaire. En utilisant le modèle de tumeur de souris syngénique décrit ci-dessus, il a été démontré que le vaccin à base de virus recombiné Vp97a-NY procurait un effet de protection contre les attaques par 260 1370 une cellule tumorale. Le vaccin procure également un effet thérapeutique chez les souris o existent des métastases du poumon en cours de croissance, proprieté analogue à l'utilisation proposée du vaccin pour la génération d'une réponse antitumeur immunothérapeutique chez les patients humains souffrant d'un mélanome avec une tumeur existante. Outre les études sur les souris, o il n'existe que 91% d'homologie entre le p97 humain et la protéine homologue de souris (sur les régions examinées jusqu'à maintenant), le vaccin à base de Vp97a-NY a également été testé sur des primates non humains. Il y a une homologie beaucoup plus proche entre le p97 humain et la forme simiesque de la protéine (telle que ceci est révélé par la réactivité réciproque au niveau de l'anticorps monoclonal). Etant donné la difficulté potentielle dans la production d'une réponse immunitaire dirigée contre une protéine du "soi", le singe Macaque étroitement apparenté a été utilisé pour tester les propriétés immunogènes 15 du vaccin Vp97a.NY. Le vaccin de vaccine recombiné a été testé sur des singes et il a été démontré qu'il induisait une immunité humorale dirigée contre la protéine du p97. Jusqu'à maintenant, les singes n'ont pas présenté de symptômes notoires d'effets secondaires néfastes provenant de l'exposition au vaccin, après qu'ils aient reçu deux inoculations du virus 20 de la vaccine recombiné vivant sur une période de six semaines. 7.1. Expression du plasmide Le plasmide d'expression entraîné par le sv2, promoteur prématuré du SV-40, a été construit à partir du p97a clone du plasmide du cDNA qui est semblable au plasmide p97b, sauf que l'on utilise entièrement 25 la région 3'UT (figure 6). Tous les clones de cDNA sont à l'origine isolés des bibliothèques gtlO lambda à l'aide de liens EcoRI-dG (9-17) synthétiques comme décrit ci-dessus. Les inserts sont excisés par EcoRI et on les sousclone en pEMBL18+ pour une propagation et une caractérisation ultérieures. Le clone 10al est souscloné dans M13mpl8 30 et une forme RF est digérée en présence-de BamHI et SphI, traitée brièvement à l'aide d'Exonucléase III, amortie à l'aide de nucl-éase S1, traitée à l'aide de Klenow et resoumis à liaison. Plusieurs plaques sont isolées et séquencées, sur l'une d'entre elle, on a éliminé la queue dG et l'on a retenu 33 bp de la région p97 5' non traduite insérée dans le site HindIII du M13mpl8. Un RF de ce sousclone (10ala) est utilisé pour donner naissance au cDNA p97 intact; par ailleurs, tous les fragments sont isolés des sousclones du plasmide. Le fragment 550 bp HindIII-PvuII provenant du 10ala et du fragment 735 bp PvulI-SalI provenant du ljl sont isolés sur des gels d'aaarose LMP et remis en liaison dans du pEMBL18+ sur les sites SalI et HindIII, ce qui donne lieu au p5'p97. Le clone génomique E7.7 du pEMBL18+ est digéré jusqu'à la fin à l'aide de EcoRI et il est partiellement digéré à l'aide de SstI, et le fragment de 4,5 kb est séparé par fractionnement sur agarose LMP à 0,8%. Ce fragment 3' de 4, 5 kb est remis en liaison avec le fragment Sstl de 404 bp provenant du 2fl et 10 lefragment BamHI-SstI de 535 bp provenant du ljl dans du pEMBL18+ sur les sites SalI et EcoRI, ce qui donne naissance au p3'p97. Le fragment HindIII-SalI de 1 285 bp du p5'p97 est alors resoumis à liaison dans du p3'p97, ce qui donne le pp97a. Le fragment EcoRIHindIII partiel provenant de ce clone est inséré dans du pSV2neo 15 (Southern et coll., 1982, J. Mol. App. Genet. 1, 327-341) sur les sites HindIII et EcoRI, ce qui élimine la région de codage de néomycine et les séquences fragment de SV40/polyA tout en retenant le promoteur prématuré du SV-40 et le stimulateur de 72 bp, le p97 5'UTR de 33 bp, la région de codage entière du p97, le 3'UTR et le DNA 20 flanquant le 3' de 1,4 kb. Le plasmide qui en résulte prend la désignation de pSVp97a. Le plasmide entrainé au sv2 est transfecté par précipitation au phosphate de calcium dans toute une série de lignée de cellules - eukaryotes et les cellules qui s'expriment sont clonées et choisies 25 en utilisant la cotransfection d'un marqueur dominant pouvant être sélectionné. Pour parvenir à cela, des cellules d'ovaire d'hamster chinois (CHO) sont cultivées dans du milieu F1 de Hank contenant 15% de sérum de veau fétal (FCS), 4 mM de L-glutamine, 1,3 mM de proline et des antibiotiques. Des cellules B16 sont cultivées dans du milieu 30 RPMI contenant 0,15% de bicarbonate et des cellules 1735 dans du milieu DMEM (Gibco) supplémentés tous les deux de 15% de FCS et d'antibiotiques.. Les cellules sont transfectées par une technique au phosphate de calcium modifié (Wigler M. et coll., 1978, Cell, 14, 725-731) à l'aide de 20 Ilg par plaque de DNA de plasmide pSV2p97a et 35 0,5 Pg soit de pSV2DHFR, soit de pSV2neo respectivement. Tous les plasmides sont linéarisés sur le site EcoRI. Des transfectants 260 1370 stables sont sélectionnés en utilisant du milieu à base d'llyl)poyanthine négative (HAT-) pour les cellules CHO et 0,5 Pg/ml de geneticine (G418, Gibco) pour les cellules B16 et 1735. Les cellules survivantes commencent à former des colonies visibles 7 jours après 5 la transfection et on les recouvre de filtres de polyester stérile maintenus en place par des billes de verre. On laisse les filtres en place pendant 5 jours, on laisse pousser les cellules dans la matrice de polyester, ce qui créé une réplique des colonies sur la plaque. On enlève alors les filtres et on les utilise pour un essai de liaison 10 de cellules vivantes en présence d'anticorps monoclonal anti-p97 iodé. Dix microgrammes d'anticorps monoclonal marqué sont incubés avec jusqu'à 20 filtres dans 10 ml de FCS à 4 C pendant 1 heure. Les filtres sont lavés énergiquement dans une solution saline de phosphate tamponné, séchés et exposés au film XAR-5 pendant la durée d'une nuit à -70 C. Ensuite, les filtres sont tachés à l'aide de bleu de méthylène à 7% pour visualiser les colonies de cellules. Dans toutes les lignées de cellules utilisées, les cellules s'exprimant contenaient de la protéine de p97 antigène à la surface des cellules. Dans des cellules transfectées par du B16, du p97 est libéré 20 dans le milieu, constatation unique pour ce type de cellule. La sécrétion du p97 permet la purification de la protéine p97 sur toute la longueur dans le milieu des cellules. Le clone B16SVp97a.14 exprime approximativement 4 Pg/ml de p97 dans le milieu usé. Le p97 recombiné est purifié à partir du milieu usé du clone B16SVp97a.14 25 transfecté qui répand de grandes quantités d'antigènes p97 dans le milieu. Les cellules sont maintenues proches de la confluence (10 cellules) dans des flacons à rouleaux de 850 cm2 en ajoutant continuellement de petites quantités de milieu frais. Elles continuent à répandre de l'antigène sans se détacher pendant des semaines, ce qui 30 permet une récolte continue et une congélation du milieu usé. La purification du p97 s'accomplit par chromatographie d'immuno-affinité en utilisant du Sepharose lié à des fragments Fab d'anticorps monoclonal 96,5. A cette fin, on fait passer 3 litres de milieu usé sur une série de trois colonnes de 30 ml. La première contient 15 ml de 35 Sephadex G-25 superfin (Pharmacia), la seconde contient 20 ml de Sepherose 4b (Pharmacia) et la troisième contient 8 ml de Sepharose activée au bromure de cyanogène (Sigma) conjuguée à des fragments Fab 4P d'anticorps monoclonal 96,5 (10 mg de protéine/ml de Sepharose). Ensuite, on lave énergiquement la colonne d'affinité à l'aide de PBS froid et l'on élue l'antigène à l'aide de 30 ml de citrate 0,1M à pH 5, et 30 ml de citrate 0,1M à pH 4. Il apparaît que ces conditions n'altèrent pas l'immunoréactivité de l'antigène lorsque l'on accomplit une élution complète de l'antigène à partir de l'anticorps monoclonal 96, 5. Les deux élutions sont neutralisées respectivement avec 3,0 ml et 4,5 ml de Tris 2M à pH 8. L'éluat purifié est concentré en utilisant un appareil d'Amicon équipé d'un filtre PMIO et on 10 lave à l'aide de deux volumes de 10 ml de PBS, ce qui laisse un rendement final de 4,95 mg dans 4,5 ml, ceci étant déterminé par un essai de Bradford (Biorad). On fait passer 15 Pg du produit sur SDS-PAGE (figure 7) et on visualise à la fois par bleu de Coomassie et par tâche à l'argent. Un immuno-essai à double déterminant (DDIA) 15 (Brown et coll., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 539) donne une confirmation indépendante de la quantité molaire de la protéine purifiée. Des préparations de contrôle sont effectuées en parallèle avec du milieu usé provenant de la lignée de cellules B16 qui lui a donné naissance et ceci ne montre aucune protéine détectable. Dans une préparation ultérieure, on purifie 30 mg de protéine de p97 pur à % à partir de 300 mg de fragments Fab d'anticorps monoclonal 96,5 conjugué à du Sepharose. La protéine p97 purifiée est immunogène, procurant une forte réponse d'anticorps chez une souris immunisée par la protéine, ceci étant décrit dans la section 7.3. ci-après; 7.2. Construction et expression du virus de la vaccine p97 recombinée La région de codage du p97 est insérée en coupant du p97a à l'aide de HindIII, en transformant les extrémités en extrémités émoussées et en opérant une liaison dans le pGS-20 vecteur d'insertion de la vaccine (Mackett et coll., 1984, J. Virol., 49, 857-864) 30 qui a été ouvert sur son site SmaI. Le vecteur PGS-20 utilise le promoteur 7,5 K et il contient des séquences de flanquage provenant du gène de la kinase thymidine de la vaccine (TK). Un virus recombiné est produit par la méthode de Mackett et coll., voir ci- dessus, et l'on isole du Vp97a-NY qui amène les cellules infectées à exprimer la 35 protéine du p97 de la dimension correcte et donne la glycosylation (figure 8). L'expression de surface du p97 est également confirmée dans des cellules infectées par le virus p97 recombiné (Tableau I) ci-dessous. TABLEAUl I EXPRFSSION DE LA SURFACE DU p97 DE CELLULES DE SOURIS TRANSFECIEES 1ET DE CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINEE ET DE CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINEE 15 20 25 30 35 !!!! !Ty d cell e! Virus utilisé pour! Molécules de p97 exprimées! Type e ccule infecter la cellule! par cellule !!!! !!!! M2SVp97a.A aucune! 3 210 000! !!!! ! M2svp97a.E/F2 i aucune! 434 000! !!!! M2 parent! aucune! 2 000-! !!!! ! BSC I aucune! 5 590! !!!! BSC! vaccine Vwt-NY 5 220 BSC! vaccine Vp97a-NY! 1 140 000 i..: Les cellules sont rapidement traitées à la trypsine, lavées et réparties en parties aliquotes entre des tubes contenant 103, à 104 ou cellules. Des cellules supports ne s'exprimant pas sont ajoutées aux tubes avec un nombre de cellules plus faibles de telle sorte qu'un total de 105 cellules soit utilisé par tube. On incube 1 x 106 cpm d'anticorps monoclonal iodé 96,5 (123 ng) dans un volume total de 50 111, les cellules étant sur la place pendant 60 minutes. On lave les cellules et on centrifuge 4 fois dans du PBS + du sérum de veau fétal à 10%, ensuite on remet en suspension et on compte dans un compteur gamma Micromedic 4/600plus. (-) signifie moins que. 7.3. Le virus de la vaccine p97 recombinée est immunogène chez la souris L'inoculation de souris à l'aide de Vp97a-NY engendre une forte réponse d'anticorps humorale. Les souris sont immunisées une fois, on rappelle une fois à quatre semaines et on saigne à cinq semaines. Les titres sont évalués par ELISA, en utilisant des plaques revêtues d'antigène et une protéine A conjuguée à une peroxydase de raifort comme réactif de détection. Les données sont transformées en équivalents d'anticorps monoclonal par comparaison avec une courbe standard pour la liaison ELISA produite en utilisant de l'anticorps monoclonal 133.2 anti-p97. Les résultats montrent une forte induction de l'anticorps du sérum (figure 9). L'immunite cellulaire se détecte en (PLpwu) alal;uoD ap uaow dw: aL aed aua6Llue2, ap unDeqD sa[LnwLs sanbLLdnapenb szLnd sap wdD sap auuaú ow tL; u2SL^Lp ua satnDleD quos uoLleajLLoAd ap saLpuL sal '108ú SI uewXDag ap anazdwoD un suep aonLiL4do Ljaedde un luesLL;n ua aldwoD uo Ba aHd saLnlLaD ap Jlna9loDa. un,p apLeL ? a4LODaB UO '(4ÀaLDnN SE puL16u3 MaN) aaLLLl auLpLtwq ap s;Lnd/L3n SZ ap apLeL g b ou anoC aL saunaq 9 gu2puad uoLsLndwL jed saanbiew zuos saanMLnD sal w O x s'g e loueuqloLdeDaw-Z;La aeuoqueDLq 'auLwenL6 'auLDúwol -d;aJs/auL.L3LDuad '%S'o e alPwMou SLanOS ap wnaas ap aluawalddns IWdU ap Lw Z'Zo suvp 'puoI puoj e s;qnd 96 ap sanbeLd sap suep s4Lnd aed 0ú aanlnD ua saSLui UOs saLnlla0D O1 aDuaLAadxa a34a3 supp aLQlguoD ap aJ;L e saasLL;fn luos saALeu sa2 ap saLnlLaD saa pae1 snld auLumas aun saani a asop awaw eL DaAe pae snld sLow un saaLadde'AN-eL6dA njd auLqwoDaa snitA OI DaAe ananb 2L ap UOL; eDSLaes ed saaLnDouL sLnos ap iLled P saaLosL.uos sa;e ap saLnLLaD sao Z i i i i i i i i iú; (o0) auL6Lpop saaLp ;; -PUUL saLeaownL saLnLLag i i ii i Z i 98i (boî) L6d aL ed saa i i 9' i ii i -DaJ.sueJ saaLpeL anbLu i 0Z -96uús anawnq ap saLnLLa3 i i i 16 i Li i Z j 1 6; ( Lt/njd LOI) AA xne a^L;L i ; -DeUL auLDDeA 2L ap snflLA i i úi i i i ú i bb i(L/6rl S) i i i i i S1 i i 9 i i (LW/6 oz) i i i i i ii ZV i (Ltw/6rlO) i i i i i iZ i LZ; ( (Lw/6d ú) L6d ap auLa-;od i i i i i i os i i (Lw/B 0i) v uo3 i o' i i i i a3LgoQ4 i 6d saauLqwoDal i ap saleu ap saastunwwL sa;eà ap i uoLeLnWLlS i sanLLaD sap UOL i; saLntLaD sap uoLlU i ap aua6LluV i - pJ4Loàd ap aLpu[ i -apLLoàd ap aDLpuI i i i i S SIMfOS 30 S3.LVU 30 S3llA139 30 NOIIV3I-IIAnd 30 IVSS3 II nlV3iUVI (II neaLqel) uoLleLniu.Ls ap aua6L'ue awuwos a.LLnd L6d 3p auL a',od ap apL, L e Oal.LA U. L UOL$. luLLOd ap Lessa un lus.LL.L;n Os OúlO 9Z 260137G Les résultats rPportés sur le Tableau Il indiquent que les cellules T prolifèrent en réponse à l'antigène de la protéinp du p97. En vue de déterminer si des cellules auxiliaires sont également stimulées par le virus recombiné dans des cellules de rates provenant de souris immunisées, les cellules sont stimulées in vitro et on essaye dans le surnageant la production d'interleukine-2 (IL-2), facteur auxiliaire de cellule T. Les cellules de rates sont mises en culture à partir de souris immunisées deux fois au préalable à l'aide de vaccine Vp97a-NY recombinée ou de vaccine d'origine. On incube 10 105 cellules pendant 48 heures dans 0,2 ml de milieu identique à celui utilisé pour les essais de prolifération dans des plaques de 96 puits à fond rond, en présence ou en l'absence de l'antigène de stimulation. On recueille les surnageants, on rassemble ceux qui proviennent de quatre puits et on congèle avant l'essai de l'IL-2. 15 L'essai de l'IL-2 utilise 104 cellules CTLL d'une lignée de cellules de souris que l'on a fait jeûner, préalablement traitées à l'IL-2, dans chaque puits en faisant varier les dimensions du surnageant d'essai à l'aide de milieu de Click en triple. Une courbe standard est construite à l'aide d'IL-2 recombiné obtenu chez Genentech, CA. 20 Les cellules CTLL sont marquées par impulsion à l'aide de thymidine selon la technique d'essai de prolifération habituel dans les dernières 6 heures d'une incubation de 24 heures et ensuite on récolte et on compte comme décrit pour les méthodes d'essai de prolifération. Les résultats indiqués dans le Tableau III indiquent que la produc25 tion d'IL-2 à partir de cellules de rates de souris immunisées par du virus de la vaccine p97 recombinée est stimulée in vitro par le p97. TABLEAU III STIMULATION DE LA PRODUCTION D'IL-2 PAR DES CELLULES DE RATES IMMUNISEES AU p97 !!!! Immunogène de Stimulus in vitro Unités d'IL-2 produites i vaccination !!!! !!!! Vp97a-NY! Protéine p97 (20 Pg/ml)! 4,4! !!!! Vp97aNY! Milieu! 0,25! !!!! Vwt-NY! Protéine p97 (20 ig/ml)! 0,25! Vwt-NY!!!0, 25 ! Vwt-NY! Milieu! 0,25! !..! 2 601370 t-) L En outre, une réponse d'hypersensibilité de type retard est mesurée en utilisant l'essai de gonflement de la plante du pied chez des souris inoculées par du Vp97a-NY. Cinq souris (souche C3H/Hen) par groupe sont inoculées par scarification de la queue à l'aide de 5 virus de la vaccine recombiné ou de virus de la vaccine de la souche d'origine. Six jours plus tard, les pattes arrière de chaque souris sont attaquées par inoculation de 20 Pl de PBS ou 20 Pl de cellules dans du PBS (5 x 105 cellules par souris). Les plantes de pied sont mesurées 24 heures plus tard dans un essai en double aveugle en utilisant un micromètre de Fowler. L'épaisseur de la plante du pied injectée au PBS est soustraite de l'épaisseur mesurée pour le pied expérimental de chaque souris et les écarts moyens aussi bien que les écarts standards du gonflement supplémentaire de la plante du pied sont calculés. Les résultats représentés sur le Tableau IV montrent 15 l'induction d'une réponse d'hypersensibilité de type retard spécifique au p97 chez la souris immunisée à l'aide du virus de la vaccine de p97 recombiné. TABLEAU IV GONFLEMENT DE LA PLANTE DE PIED SPECIFIQUE DE L'ANTIGENE CHEZ 20 DES SOURIS IMMUNISEES AU p97 I Immunogène de!! AntigèneGonflement de la plante ! vciain!!! !vaccination Atgn des pieds (mm x 10-2)! !!! ! Vp97a-NY! Cellules de tumeur syngéni-! 40,3 (+/- 6,8)! que transfectées au p97! I I I ! Vp97a-NY! Cellules de tumeur syngéni-! 3,0 (+/- 2,8) !! nique d'origine! !!! ! ! Vwt-NY! Cellules de tumeur syngéni-! 1,5 (+/- 2,3) que transfectées au p97 ! Vwt-NY! Cellules de tumeur syngéni-! 5,5 (+/- 5,0) !! que d'origine!! !!! ! 7.4. Protection et thérapeutique à l'aide de virus de vaccine p97 sur 35 un modèle de tumeur de souris Pour évaluer l'efficacité de la vaccination, on vaccine des - souris avec divers protocoles en utilisant le virus de la vaccine p97 recombiné selon l'invention et on les attaque ensuite à l'aide d'une cellule tumorale syngénique transfectée au p97 (M2SVp97a.2E). A cette i i i i i i i i i i i i i i i 9/S i sOi x 1 i 0 i aAL6N t/O i soi x I i I i AN-PL6dA 1/0 i O1 1 I i ÀN-eL6dA ú/E i sOI x S i Z i 16d ap auLa-OJd i i i b/O i 01SOxI i I i L6dBBU!?6dA 01/6 i sOI X S i Z i AN-ZMA i i i saaBtpuau anbLua6uú s ú/O i sO x S i Z i aouLw ap saLnLLa3 i i i OI/6 i OX x i I i i AN-eL6dA S/I i 01 X 9 i Z i AN-eZ6dA ?,! i i i i i i i i i i i I I i i i i i aquap.LAa uownod np i anbezep i SUOL4es i i i ase4sezaw aun Iuepuas i saLnLLaD i -unWuuL,p 1 uLD32A i i -pad sLnos ap aaqwoN i ap asoo i aaqwoN i i i i i i i z6d n0 WVd S331D31SNV 1 3WONV13W 30 S3nbIN39NAS S310ll33 30 3QIV,1 V S33NIDDVA SIfnOS 30 3nfV lV A nV31OVI A neaLqei aL ans sanbLpuL;uos s4e;Lnsau sal 'apuIp aaua,p sagoLoD suownod sap ans nu L!aO,L ? saLqsLA^ sanawn. saL atDaap uo,L Ls aAt.Lsod auwwoD aalou.sa sinos aun *suownod saL aaL;aa uo la jnawn. eL ied anbe;;e,L saide snoC 9I sLynos SaL aLjuDes uo 'uaH/Hú3 anbLua6uús sLinos ap ananb eL ap auLaA eL suep saa DaCuL quos Lnb SaLnLLa sO I x 1 no sO1 x S 'asnauLaA -ejuL inawnl ap sasop xnap aSLLL;n uo ULewnq awOUeLaw np L6d ap aua6Lup,p p;jsuap aun e %uaLP^Anba no aLnLLaD àed saLnDaLow 000 00 uoILAua 'L6d ap uaRow neaA^u un awLadxa 3Z2eL6dASZW auopLD aL 'lnawnl eL ap anbel;e,L anod asL Ln LnLa; a sauuoL; aLas;uos;uew -tpdxa,s sauoLD ap aLaas aun alnol 'OAS inaLpalue ana;owoad aL aed utePua uoLssajdxa,p aplwseLd un suep nua;uoD uLeuwnq L6d np a6epoD ap aDuanbas eL ap pLetL e uoLtDajsue,; aed (stynos ap awOuellaw ap aLapow) SúLj-ZW ap atLaed e aaedaad anbL4elseapw analnI ap auoLD '3z'el6dAszW ap UOLODarut jed UOeUL2uDDeA aaaLuap eL ap ajLns eL e sauLewas xnap aêaSLULWmpe;sa asnauLaAPeJUL aLeBownl aLnLLaD aed anbe;le aun punaij ap IueAnCpP,L ap suep aLePUO lade2xuL aLOA Jed saIlnpOJ;uL saaLpPJaL SELI-ZW fnalwnl ap SaLnLLaD 901 x S no aLj.L.nd L6d ap euLaioad ap 6d OOI DaAv no 'ananb eL ap uoIeDLJieDS ed (,N-;M\) auL5Lao,p atnos eL ap ap Pe,L ? no N- e2L6dA autqwoDaa 4uetAA aJLDDeA eL ap snJLA ap apLe, p saasLLunIimuL 4uos splnos sap 'ULJ i i i i i i SE OZ i 9z oz g OZú ú OfZ Les résultats représentés sur le Tableau V démontrent qu'il y a un effet de production considérable exercée par deux immunisations du Vp97a-NY alors qu'aucun effet protecteur ne se remarque avec le vaccin de protéine p97 purifié (en dépit du titre d'anticorps extrê5 mement élevé déclenché). L'aptitude du virus recombine à produire une immunité cellulaire peut être responsable de l'immunité de protection contre une tumeur. Dans une expérience thérapeutique, les souris sont inoculées à l'aide d'une faible dose de cellules tumorales exprimant le p97 et 10 ensuite, deux jours plus tard, on leur inocule du vaccin de vaccine recombinée. Les souris sont attaquées à l'aide de 105 ou 104 cellules tumorales exprimant du p97 (M2SVp97a.E)par voie intraveineuse. Deux jours plus tard, les souris sont inoculées par scarification de la queue, soit avec du Vp97a-NY, soit du Vwt-NY. On répète les inocula15 tions hebdomadaires par scarification de la queue et on note la survie des souris. Les résultats indiqués sur la figure 10 indiquent que l'effet thérapeutique de la vaccination par le virus de la vaccine de p97 recombiné chez la souris présentant une métastase existante dans le poumon. 7.5. Le virus de la vaccine du p97 recombiné est immunogène pour des singes macaques Deux Macaca fasicularis (singe macaque) sont scarifiés l'un et l'autre avec 2 x 108 unités de formation de plaque (pfu) de vaccine recombinée Vp97a-NY ou la même dose de vaccine de la souche d'ori25 gine. Deux semaines plus tard, on teste les sérums par ELISA pour en déterminer les titres de vaccine et de p97. Les résultats indiqués dans le Tableau VI indiquent que les anticorps humoraux dirigés contre le p97 peuvent être détectés deux semaines après une simple inoculation par du Vp97a-NY. 8.- DEPOT DES MICRO-ORGANISMES La souche suivante de E. coli portant le plasmide indiqué a été déposée à l'ATCC Rockville, MD et on lui a donné le numéro d'accès suivant: Souche de E. coli Plasmide N d'accès E. coli HB 101 p97b 53 403 Le virus de la vaccine recombiné suivant a été déposé à l'ATCC, Rockville, MD, et on lui a donné le numéro d'accession suivant: - Virus Numéro d'accession Vp97aNY VR 2159 ' Les lignées suivantes de cellules portant les plasmides indiqués ont eté déposées à l'ATCC, Rockville, MD, et on leur a assigné le numéro d'accès suivant: Lignée de cellule Plasmide N d'accès TKMp97- 12 (cellule de souris) pMTp97b CRL 8985 B16SVp97a.14 (cellule de mé- pSVp97a CRL 9304 lanome de souris) TABLEAU VI TITRES D'ANTICORPS DANS LE SERUM CHEZ DES SINGES INOCULES PAR DE LA VACCINE 20 !t! Titre d'anti-vaccine! Titre anti-p97 (Pq/ml! Immunogène/semaine! (dilution de sérum à! équivalents d'anti!iI! 2 fois la dose de fond)! corps monoclonal) !!! ! !!! ! ! Vp97a-NY/semaine O! 1/20! 0,54 ! Vp97a-NY/semaine 2! 1/2000! 6,54! !!! ! ! Vwt-NY/semaine O i 1/20 0,50 !!! ! ! Vwt-NY/semaine 2! 1/2000! 0,34! !!! ! !! !! La portée de la présente invention n'est pas limitée par les micro25 organismes et les cellules déposées puisque le mode de réalisation que l'on a déposé n'a qu'un sens uniquement d'illustration d'un aspect de la présente invention et tous les micro-organismes ou cellules fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de la présente invention. Naturellement, diverses modifications de l'invention en plus de celles décrites et repré30 sentées ici, sont apparentes au spécialiste à partir de ce qui précède et des dessins joints. Ces modifications entrent, bien entendu, dans le cadre des revendications jointes. Il est également entendu que toutes les dimensions de paires de base indiquées pour les nucléotides sont approximatives et sont données à des 35 fins de description. REVENDICATIONS 1.- Peptide ou protéine antigène sensiblement pur relatif à l'antigène p97 associé à un mélanome. 2.- Peptide ou protéine selon la revendication 1, renfermant une 5 séquence d'aminoacide comprenant la séquence d'aminoacide sensiblement comme décrite sur la figure 3, ou une portion antigène de celle-ci. 3.- Peptide ou protéine selon la revendication 1 ou 2, ce peptide ou cette protéine étant purifié à partir d'une cellule cultivée contenant une séquence de nucléotide encodant le peptide ou la protéine qui est sous le 10 contrôle d'une seconde séquence de nucleotide qui régule l'expression du gène de telle sorte que le peptide ou la protéine soit exprimé la cellule cultivée. 4.- Peptide ou protéine selon la revendication 3, dans laquelle la cellule cultivée comprend un micro-organisme. 5.- Peptide ou protéine selon la revendication 4, dans laquelle le micro-organisme comprend une bactérie. 6.- Peptide ou protéine selon la revendication 4, dans laquelle le micro-organisme comprend une levure. 7.- Peptide ou protéine selon la revendication 3, dans laquelle la 20 cellule cultivée comprend une lignée cellulaire animale. 8.- Peptide ou protéine selon la revendication 3, dans laquelle la cellule cultivée comprend une lignée cellulaire d'insecte. 9.- Peptide ou protéine selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le peptide ou la protéine est synthétisé par voie chimique. 10.- Virus recombiné dans le génome comprenant une séquence de nucléotide encodant un peptide ou une protéine antigène relative à l'antigène du p97 associé à un mélanome ou une portion antigène de celui-ci qui soit sous le contrôle d'une seconde séquence de nucléotide qui régule l'expression du gène de telle sorte qu'un peptide ou une protéine relatif à l'antigène p97 30 associé à un mélanome soit exprimé chez un hâte infecté par le virus. 11.- Virus recombiné selon la revendication 10, dans lequel la séquence de nucléotide encodant un peptide ou une protéine antigène relatif à l'antigène du p97 associé à un mélanome comprend la séquence de nucleotide sensiblement telle que décrite dans la figure 3 ou une portion quelconque 35 de cette séquence encodant un peptide ou une protéine antigène. 12.- Virus selon la revendication 10 ou 11, comprenant un virus à enveloppe. 13.- Virus selon la revendication 12, comprenant un virus de vaccine. 2 6 0 1370 14.- Virus selon la 15.- Virus selon la 16.- Virus selon la polyhydrolyse nucléaire. 5 17.- Virus selon la 18.- Virus selon la phage. revendication revendication revendication revendication revendication ou 11, comprenant un virus nu. 14, comprenant un adénovirus. 10 ou 11, comprenant un virus de 16, comprenant un baculovirus. 10 ou 11, comprenant un bactério- 19.- Virus selon la revendication 18, comprenant un phage lambda. 20.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène 10 comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 1 ou 2, mélangée à un support pharmaceutique. 21.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 3, mélangée avec un support pharmaceutique. 22.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 4, mélangée avec un support pharmaceutique. 23.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendica20 tion 5, mélangée avec un support pharmaceutique. 24.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 6, mélangée avec un support pharmaceutique. 25.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène 25 comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 7, mélan,ée avec un support pharmaceutique. 26.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 8, mélangée avec un support pharmaceutique. 27.- Formulation de vaccin fractionnaire dans lequel l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 9, mélangée avec un support pharmaceutique. 28.- Formulation de vaccin de virus vivant, comprenant les virus recombinés de la revendication 10 ou 11, dans laquelle le virus est infec35 tieux sans occasionner une maladie chez un hâte à vacciner. 29.- Formulation de vaccin de virus vivant, comprenant les virus recombinés de la revendication 28, dans laquelle le virus recombiné comprend un virus à enveloppe. 30.- Formulation de vaccin de virus vivant, comprenant les virus recombinés de la revendication 29, dans laquelle le virus à enveloppe comprend un virus de vaccine. 31.- Formulation de vaccin de virus vivant, comprenant les virus recombinés de la revendication 28, dans laquelle le virus recombiné comprend un virus nu. 32.- Formulation de vaccin de virus vivant, comprenant les virus recombinés de la revendication 31, dans laquelle le virus nu comprend un adénovirus. 33.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 10 ou 11, dans un état non-infectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 34.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 12, dans un état non15 infectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 35.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 13, dans un état noninfectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 36.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 14, dans un état noninfectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 37.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 15, dans un état noninfectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 38.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 16, dans un état noninfectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 39.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus-recombiné selon la revendication 17, dans un état non30 infectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 40.- Formulation de vaccin de virus inactivé comprenant une dose efficace du virus recombiné selon la revendication 18, dans un état noninfectieux, mélangée à un support pharmaceutique. 41.- Vecteur de DNA recombiné comprenant du p97b. 42.- Organisme unicellulaire contenant le vecteur de DNA recombiné selon la revendication 41. 43.- Bactérie contenant le vecteur de DNA recombiné selon la revendication 41. 44.- Bactérie selon la revendication 43, comprenant l'Escherichia coli tel que déposé à l'ATCC et portant le numéro d'accès 53403 ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de celui-ci obtenu par génie génétique. 45.- Vecteur de DNA recombiné comprenant du pMTp97b. 46.- Lignée cellulaire contenant le vecteur de DNA recombiné selon la revendication 45. 47.- Lignée cellulaire selon la revendication 45, comprenant le TKMp97-12 tel que déposé à l'ATCC et auquel on a donné le numéro d'accès CRL 8985 ou un mutant, un recombinant ou-un dérivé de celui-ci obtenu par 10 génie génétique. 48.- Un vecteur de DNA recombiné comprenant le pSVp97a. 49.- Une lignée de cellules comprenant le vecteur de DNA recombiné selon la revendication 48. 50.- Une ligéne de cellules selon la revendication 49, comprenant du 15 B16SVp97a.14 tel que déposé à l'ATCC et ayant reçu le numéro d'accession CRL 9304 ou un mutant, un recombiné ou un dérivé de celui-ci obtenu par génie génétique. 51.- Le virus selon la revendication 13, comprenant du virus Vp97a-NY tel que déposé à l'ATCC et ayant reçu le numéro d'accession VR 2159, ou un 20 mutant, un recombiné ou un dérivé de celui-ci obtenu par génie génétique.