Brevet FR2599752A1 — publié le 19871211

La présente invention concerne un nouveau variant de l'alpha1 - antitrypsine humaine. Différents variants de l'alpha1- antitrypsine humaine ont déjà été décrits, notamment dans la demande de brevet WO/86 00337. La fonction principale de l'alpha1- antitrypsine (alpha1 -AT) est l'inhibition de l'élastase neutrophile dans les poumons. L'alpha1- AT ne présente aucun rôle in vivo 10 dans la régulation de la protéase de coagulation, thrombine, pas plus que des protéases de contact de phase, facteur XII et kallikréine. Toutefois, la substitution du radical Met en position P1 du centre réactif de (Met 358)alpha-1 ATpar une 15 arginine conduit à une inhibition efficace de ces protéases, ce qui met en évidence le rôle critique du radical en P1 dans l'inhibition spécifique. On a pu mettre, en outre, en évidence que le radical en P2 (position 357 de l'alphaI -AT) est également important. 20 Tout d'abord pour maintenir une conformation appropriée des centres réactifs et, ensuite, en influençant les propriétés d'inhibition. Par exemple, l'antithrombine III (ATIII), qui est un inhibiteur spécifique de la thrombine in vivo, présente un radical Arg (site préféré de clivage pour la thrombine) en position P1 et un radical Gly en position P2. L'inhibiteur C1, qui est in inhibiteur prédominant de la kallikréine et du facteur XII, présente également un radical arginine en position P1 mais un radical Ala en position P2. L'inhibiteur Cl est, in vivo, relativement inefficace à l'égard de la thrombine, ce qui reflète peut-être une dimension de site actif plus petit 10 dans le cas de cette enzyme. L'objet de la présente invention est un nouveau variant de l'alpha1-AT humaine dans lequel les sites P1 et P2 ont été modifies de façon à tenter de limiter la dimension de la cible sur ce variant. L'invention concerne un variant en position 357 de l'alpha_1 AT humaine ou du (deltaGlu -- Gly5)alpha -AT. En remplaçant la proline en position 357 par un radical Ala, on recrée le centre réactif de l'inhibiteur Cl et on dirige le variant inhibiteur vers la kallikréine au lieu de 20 la thrombine. C'est pourquoi la présente invention concerne plus particulièrement un nouveau variant (Ala357,Arg358)alpha1-AT à titre d'inhibiteur de la kallikréine et qui peut être utilisé à titre de médicament comme cela sera décrit ci-après. Mais, l'invention concerne également les variants (Ala357) des différents variants décrits dans le brevet W0 86 00337, en particulier, (Ala357) (deltaGlul--Gly5)alpha1-AT, ainsi que les variants correspondants en position 358, (Gly358), (Ala358), (Il 358) (Val358), (Leu358) et (Phe358). L'invention concerne aussi bien les variants sous leur forme glycosylée que non glycosylée. La kallikréine est une protéase sérique qui est impliquée à la fois dans l'initiation de la coagulation et dans la fibrinolyse. Elle est également responsable du clivage, à partir du kininogène de la bradykinine, qui est un oligopeptide très actif jouant un rôle essentiel dans différents processus, notamment inflammatoires, et dans la réponse à la douleur. Ona montré également que la bradykinine pourrait participer à la régulation de la pression sanguine. L'inhibiteur C1 est le principal inhibiteur plasmatique de la kallikréine. Une déficience en cet inhibiteur conduit à une activation non régulée de la prékallikréine et du facteur XII qui conduit à un angiooedème héréditaire. Comme cela a été montré dans le brevet mentionné précédemment,l'(Arg358) alpha 1-AT est plus efficace que l'inhibiteur C1 dans l'inactivation à la fois de la kallikréine (activité 4,1 fois supérieure) et facteur XIIF (activité 11,5 fois plus élevée). C'est pourquoi la protéine (Arg 58) alpha1-AT semble avoir les caractéristiques d'un produit pour le traitement de l'angio-oedème héréditaire. Toutefois, cette molécule présente également une activité antithombinique très importante et il peut être intéressant, dans certains cas, d'avoir des variants différents possédant un mode d'action plus spécifique; c'est ce qui est proposé dans le cadre de la présente invention. 357 358-A Le nouveau variant(Ala 57,Arg358)alpha1- AT 25 présente une activité inhibitrice de la kallikréine très améliorée en présentant, au contraire, des propriétés anti-thrombiniques très faibles. Un tel produit peut être utilisé à titre de médicament inhibiteur de la kallikréine, par exemple pour 30 une thérapie de remplacement des déficiences en inhibiteur Cl. Il est également possible de prévoir son utilisation dans le traitement des chocs septiques et également pour la régulation de la pression sanguine et le traitement des hypertensions. 4È: 2599752 Les exemples ci-après sont destinés plus particulièrement à illustrer d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention sans toutefois en limiter aucunement la portée. EXEMPLE 1 EXPRESSION DE L'ALPHA 1-AT MODIFIEE DANS E. COLI Les plasmides et matériaux génétiques utilisés dans ces constructions ont déjà été décrits dans la demande de brevet mentionnée précédemment. MUTAGENESE DU GENE HUMAIN DE L'ALPHA 1-AT Le remplacement du résidu Met358 de alpha1- AT par l'arginine et du résidu Pro35 par Ala a été effectué par mutagénèse directe à l'aide d'oligonucléotides. Le cADN de l'alpha1- AT cloné a été sous-cloné 15 dans le vecteur M13 et l'ADN du phage monobrin a été utilisé comme modèle pour un oligonucléotide complémentaire synthétique contenant la modification souhaitée 5' GATAGACCTAGCTATGGCC 3'). Le second brin est synthétisé en utilisant la polymérase de Klenow, puis on effectue une transformation et les plaques 20 contenant le gène muté sont identifiées par criblage à l'aide de lbligonucléotide. Les mutations sont confirmées par séquençage direct. séquence d'origine Ala Ile Pro Met Ser Ile 25 GCC ATA CCC ATG TCT ATC séquence mutée Ala Ile Ala Arg Ser Ile GCC ATA GCT AGG TCT ATC Cette technologie a été décrite en détail dans le brevet mentionné précédemment. Le fragment du variant alpha1- AT est ensuite introduit dans le plasmide pTG983 comme cela a été décrit dans le brevet précédent. On obtient ainsi un plasmide dénommé pTG1946 qui est identique au plasmide pTG983 à l'exception du gène alpha- AT qui a été modifié sur la position 357 et 358. Dans ce qui suit les plasmides utilisés sont les suivants: pTG983 (alpha AT non modifiée) pTG1900 (Arg3;8 alpha1- AT) pTG1946 {Ala357 Arg358 alpha1- AT). EXPRESSION DE L'ALPHA1 -AT MODIFIEE DANS E. COLI Le variant selon la présente invention,obtenu par fermentation de bactéries E. coli transformées par pTG1946, a été comparé avec pTG983 et pTG1900. Des extraits soniqués clarifiés ont été préparés à partir de cultures induites de E. coli TGE900 contenant 15 l'un des trois plasmides précédents. Des aliquotes d'extraits sont testées pour leur capacité à inhiber l'élastase neutrophile humaine (cette technique ayant déjà été décrite). Les courbes d'inhibition représentées à la 20 figure 1 montrent que,par rapport à l'alpha1- AT normale (Met358 alpha1- AT), le variant selon la présente invention (Ala357 Arg3-5alpha1- AT est incapable d'inhiber l'élastase neutrophile. L'activité antikallikréine est évaluée en 25 mesurant à 410 nm le taux résiduel d'hydrolyse de la chromosyme PK (benzoyl-Pro-Pre-Arg 4 nitroanilide-acétate, Boehringer Mannheim). 2,6 pmoles de kallikréine plasmatique'humaine sont préincubées à 37 C avec une quantité croissante d'inhibiteur dans le tampon phosphate Na 0,1 M-NaCl 0,15 M. Après 30 minutes, la réaction est arrêtée en ajoutant 900 gmoles de substrat (concentration finale 0,5 mM) et l'activité enzymatique résiduelle est déterminée. 6 2599752 La figure 2 montre que le variant(Ala357,Arg358 alpha1- AT est capable d'inhiber rapidement la kallikréine. Les courbes d'inhibition de thrombine (figure 3) et la comparaison avec l'alpha1- AT(Arg358)indiquent que le 357 358 variant(Ala357,Arg358)alpha1AT inhibe seulement très faiblement la thrombine humaine. Le composé selon l'invention peut donc être utilisé dans une thérapie de substitution de l'inhibiteur C1 En utilisant la technique décrite précédemment 10 et les procédés décrits'dans le brevet WO 86 00337, on obtient les autres variants revendiqués. La souche suivante a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 15. souche E. coli TGE900 pTG1946 le 6 juin 1986 sous le n 1-560. REVENDICATIONS 1) Variant en position 357 de l'alpha1antitrypsine humaine ou du (deltaGlul-- Gly5)alpha1-AT humaine. en ce qu'il caractérisé 2) Variant selon la revendication 1, caractérisé s'agit d'un variant en position 357 et 358. 3) Variant selon l'une:des revendications 1 et 2, en ce qu'il s'agit d'un variant Ala357. 4) Variant de l'alpha1-AT humaine de formule: (Ala357,Arg358)alpha1-AT. ) A titre d'inhibiteur de la kallikréine, le variant selon la revendication 4. 6) A titre de médicament, un variant selon l'une des revendications 1 à 4. 7) A titre de médicament, le variant: (Ala357 Arg358)alpha-AT (Ala,Arg) alpha1A.