Brevet FR2600651A1 — publié le 19871231

La présente invention concerne un nouveau composé antibiotique et des procédés pour sa préparation. De manière plus particulière, l'invention concerne un nouveau composé antibiotique que l'on peut obtenir par la fermentation de microorganismes du genre Streptomyces. Le mémoire descriptif du brevet britannique né 2 166 436 et le mémoire descriptif du brevet européen né 170006 décrivent la production d'une classe de substances que nous avons appelées antibiotiques S541, que l'on peut isoler à partir des produits de fermentation de micro-organismes du genre Streptomyces. Nous avons découvert à présent un composé supplémentaire doté d'une-activité antibiotique, que l'on peut pré15 parer par l'isolement à partir d'une culture d'un microorganisme du genre Streptomyces ou par la modification chimique d'un composé appartenant aux Antibiotiques S541, comme on le décrit dans le présent mémoire. Par conséquent,suivant l'une de ses caractéris20 tiques, la présente invention a pour objet le composé répondant à la formule (I) OH CH3 %%CH3 H3 À C ( C É. .. 0 - (1). CH3 Une caractéristique particulièrement avantageuse du composé suivant la présente invention réside dans son aptitude à former des solides cristallins et la 15 portée de l'invention s'étend également aux composés de la formule (I) sous forme cristalline. On peut se servir de l'aptitude du composé à cristalliser comme d'une étape de purification au cours de sa préparation et en utilisant cette propriété, on 20 a-obtenu le composé de la formule (I) sous forme de solide cristallin possédant une pureté supérieure à %, plus particulièrement supérieure à 95.%. En raison de son aptitude à former un solide cristallin possédant une pureté très élevée, le composé 25 de la formule (I) est particulièrement intéressant à titre d'intermédiaire pour la préparation d'autres composés possédant une activité antibiotique. Le composé de la formule (I) lui-même possède également une activité antibiotique, par exemple une 30 activité anthelminthique, par exemple contre les nématodes et, plus particulièrement, une activité antiendoparasitique et antiectoparasitique. L'activité antibiotique du composé de la formule (I) peut, par exemple, être démontrée par son activité 35 in vitro contre des nématodes vivants, par exemple Caenorhabiditis elegans. Les ectoparasites et les endoparasites infectent les êtres humains et toute une série d'animaux et prévalent plus particulièrement chez les animaux fermiers comme les cochons, les moutons, le bétail, 5 les chèvres et la volaille (par exemple les poulets et les dindons), les chevaux, les lapins, le gibier à plumes, les oiseaux encagés et les animaux domestiques, comme les chiens, les chats, les cobayes, les gerbilles et les hamsters. L'infection parasitique du cheptel 10 vif, conduisant à l'anémie, la malnutrition et la réduction du poids est une cause majeure de pertes économiques de par le monde. A titre d'exemples de genres d'endoparasites infectant les êtres humains et/ou les animaux précités, 15 on peut citer ceux qui suivent: Ancylostoma, Ascaridia, AScaris, Aspicularis, Brugia, Bunostomum, CaDillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Loa, Necator, Nematodirus, Nematospiroides (Heligomoroides), Nipnostrongylus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria et Wuchereria. En exemples d'ectoparasites infectant des êtres humains et/ou des animaux, on peut citer des ectoparasites du type des arthropodes, comme les insectes mordants,: la lucilie, les puces, les poux, les mites, les insectes suçants, les tiques et d'autres diptères para30 sites. A titre d'exemples de genres d'ectoparasites de ce genre qui infectent les êtres humains et/ou les animaux, on peut citer ceux qui suivent:Ambvlomma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, 35 Dermatobia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhivicephalus, Sarcoptes, Stomoxys et Tabanus. En outre, le composé de la formule (I) est éga5 lement intéressant pour combattre des insectes, des acariens ou acarides et des nématodes parasites de l'agriculture, de l'horticulture, de l'industrie forestière ou sylviculture, de la santé publique et des produits conservés. On peut utilement traiter les or10 ganismes nuisibles ou parasites du sol et des plantes de culture, comprenant les céréales (par exemple blé, orge, mals et riz),les légumes (par exemple soja), les fruits (par exemple pommes, raisins et fruits citrus) comme aussi les plantes de culture à tubercules ou racines( par exemple betterave sucrière, pomme de terre). A titre d'exemples de tels organismes nuisibles ou parasites, on peut citer des aphidés et des mites des fruits, tels que Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae et des membres des genres Trialeuroides; des nématodes, comme des membres des genres Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne et Panagrellus; des lépi25 doptères, comme Heliothis, Plutella et Spodoptera; des charançons, comme Anthonomus grandis et Sitophilus granarius; des coléoptères des fleurs, comme Tribolium castaneum; des mouches,comme Musca domestica; des fourmis urticantes ou Solenopsis; des adèles; 30 Pear Psylla; Thrips tabaci; des blattes, comme Blatella germanica et Periplaneta americana; et des moustiques, comme Aedes aeMvpti. Conformément à la présente invention, nous proposons par conséquent le composé de la formule (I) 35 telle que précédemment définie, que l'on peut utiliser à titre d'antibiotique. De manière plus particulière, on peut l'utiliser pour le traitement des êtres humains et des animaux souffrant d'infections endoparasitiques, ectoparasitiques et/ou fongiques et dans le domaine de l'agriculture, de l'horticulture, de l'industrie forestière ou sylviculture, à titre de pesticide pour combattre des insectes, des acariens et des nématodes parasites. On peut également l'utiliser de façon générale à titre de pesticide pour com10 battre ou maîtriser des organismes nuisibles ou parasites dans d'autres circonstances encore, par exemple dans les magasins, les immeubles ou d'autres lieux publics, ou à l'endroit o vivent les parasites ou organismes nuisibles en question (leur biotope). En gé15 néral, on peut appliquer le composé soit à l'hôte (animal ou être humain, ou aux plantes ou autre végétation) ou aux organismes nuisibles ou parasites euxmêmes, ou à l'endroit o ils vivent (c'est-à-dire leur biotope). On peut présenter le composé suivant l'invention sous une forme convenant à l'administration de n'importe quelle manière convenable pour l'usage en médecine humaine ou vétérinaire et, par conséquent, la portée de la présente invention s'étend également aux 25 compositions pharmaceutiques comprenant le composé suivant la présente invention, adaptées à l'usage en médecine humaine ou vétérinaire. On peut préparer des compositions de ce genre pour l'usage de manière classique à l'aide d'un ou plusieurs véhicules ou excipients 30 appropriés. Les compositions suivant l'invention englobent celles qui se présentent sous une forme particulièrement appropriée à l'administration par la voie parentérale ( y compris intramammaire), orale, rectale, topique, ophtalmique, nasale, 35 génito-urinaire, ou sous forme d'implant. On peut présenter le composé de la formule (1) en vue de son usage en médecine humaine ou vétérinaire, suivant les procédés généraux décrits dans le mémoire descriptif du brevet britannique n 2 166 436. Les doses quotidiennes totales du composé suivant l'invention, que l'on utilise en médecine,tant humaine que vétérinaire, se situent, de manière appropriée, dans la plage de 1 à 2000 gg/kg de poids corporel, de préférence de 50 à 1000 gg/kg et on peut les 10 administrer en doses subdivisées, par exemple de 1 à 4 fois par Jour. On peut présenter le composé conforme à la présente invention de n'importe quelle manière commode convenant à son utilisation dans le domaine horticole 15 ou agricole et, par conséquent, la portée de la présente invention s'étend-également aux compositions comprenant le composé suivant l'invention, adaptées à l'usage dans le domaine horticole ou agricole. Ces compositions comprennent des types secs ou liquides, 20 par exemple des poussières, comprenant des concentrés ou bases pour poussières, des poudres,y compris des poudres solubles ou mouillables, des granulés, comprenant des microgranules et des granules dispersibles, des pilules, des produits fluides, des émulsions 25 comme des émulsions diluées ou des concentrés émulsionnables, des bains ou compositions de trempage, comme des bains ou compositions de trempage pour racines et semences, des produits pour traiter des semences, des boulettes ou grains pour traiter des se30 mences, des oléo-concentrés, des oléo-solutions, des injections, par exemple des injections pour tiges ou souches, des sprays, des fumées et des brouillards. De manière générale, des compositions de ce genre comprennent le composé en association avec un diluant ou véhicule approprié. Des véhicules et diluants de ce genre sont décrits dans le mémoire descriptif du brevet britannique nÀ 2 166 436. Dans les compositions concernées, la concentration en matière active fluctue généralement de 0,01 à 99 % et, de préférence, de 0,01 % à 40 %, en poids. Les produits du commerce sont généralement fournis sous la forme de compositions concentrées à diluer Jusqu'à une concentration convenable, variant, par exemple, de 0, 001 à 0,0001 % en poids, en vue de 10 leur emploi. La dose à laquelle on applique le composé dépend d'un certain nombre de facteurs, comprenant le type d'organisme nuisible ou de parasite impliqué et le degré d'infestation constaté. Cependant, dans l'en15 semble, une application de 10 g/h à 10 kg/h convient parfaitement; de préférence, on applique de 10 g/h à 1 kg/h pour combattre des mites et des insectes et de 50 g/h à 10 kg/h pour combattre des nématodes. Pour l'utilisation dans le domaine de la méde20 cine vétérinaire et dans le domaine horticole et agricole, il peut être souhaitable d'employer le bouillon de fermentation entier à titre de source du composé actif. Il peut également être commode d'utiliser le bouillon séché (contenant les mycéliums) ou d'employer 25 les mycéliums séparés du bouillon et pasteurisés, ou, mieux encore, séchés, par exemple par séchage par pulvérisation, par congélation ou par roulage. Si on le souhaite, le bouillon ou les mycéllums peuvent être présentés sous la forme de compositions comprenant des diluants, excipients ou véhicules inertes classiques, tels que décrits plus haut. On peut administrer le composé antibiotique suivant l'invention, ou bien l'utiliser, en combinaison avec d'autres ingrédients actifs. De manière plus particulière, on peut utiliser le composé antibiotique suivant la présente invention en même temps que des composés Antibiotiques S541 ou avec d'autres composés antibiotiques; Ceci peut se produire, par exemple, lorsque l'on utilise le bouillon de fermentation entier sans séparation préalable du composé suivant l'invention ou lorsque l'on fait réagir des produits de fermentation bruts, conformément à un procédé suivant l'invention, sans séparation préalable ou subséquente; ceci peut être préférable, 10 par exemple, en vue de l'usage agricole du composé, o il est important de maintenir de faibles coûts de production. On peut préparer le composé suivant l'invention par les procédés décrits ci-dessous. Par conséquent, conformément à une caractéristique de la présente invention, celle-ci a pour objet un procédé de production du composé de la formule (I), caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à cultiver un micro-organisme du genre Streptomvces, ca20 pable de produire le composé de la formule (I) et, si on le souhaite, à en isoler le composé précité. On peut aisément identifier des micro-organismes capables de produire le composé suivant l'invention en utilisant un test à petite échelle et en analysant 25 un échantillon d'essai obtenu à partir de la fermentation du micro-organisme, par mise en oeuvre d'une chromatographie en phase liquide à haute performance. En général, le micro-organisme que l'on utilise pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la pré30 sente invention sera une souche du genre Streptomyces capable de produire le composé de la formule (I) et peut être, par exemple, un micro-organisme appartenant à l'espèce Streptomyces thermoarchaensis ou Streptomyces cvaneogriseus noncvanogenus. A titre 35 d'exemples particuliers de souches convenables, on peut citer Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 (-déposé le 10 septembre 1984_7, Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 et NCIB 12114 (-tous déposés le 26 Juin 1985_7 Streptomyces cyaneogriseus nonoyanogenus NRRL 15773 ('déposé le 3 mai 1984_7 et des mutants de toutes ces souches. Des mutants des souches susmentionnées peuvent surgir spontanément ou peuvent se produire par mise en oeuvre de toute une série de procédés, y compris ceux esquissés dans Techniques for the Development of Microorganisms par H.I. Adler dans "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Vienne 1973, p. 241, International Atomic Energy Authority. Ces procédés comprennent une 15 irradiation ionisante, des méthodes chimiques, par exemple le traitement par la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG), la chaleur, des techniques génétiques, comme la recombinaison, la transduction, la transformation, la lysogénisation et la conversion 20 lysogénique et des techniques sélectives pour des mutants spontanés. Des mutants qui conviennent tout particulièrement bien à la mise en oeuvre dans le procédé suivant la présente invention sont ceux qui ne produisent pas 25 de quantités substantielles des composés du type 50hydroxy- ou 50-méthoxy- antibiotiques S541 décrits dans le mémoire descriptif du brevet britannique n 2 166 436. Les mutants à pouvoir affaibli de formation de composés antibiotiques S541 constituent une autre 30 caractéristique de la présente invention. Les mutants capables de produire le composé de la formule (I) mais à pouvoir affaibli de formation des composés antibiotiques S541 décrits dans le mémoire descriptif du brevet britannique n 2 166 436 peuvent 35 être aisément identifiés en réalisant un test à petite échelle et en analysant un échantillon d'essai obtenu à partir de la fermentation du micro-organisme, par mise en oeuvre d'une chromatographie en phase liquide à haute performance. Suivant une autre de ses caractéristiques, la présente invention a aussi pour objet des matières génétiques de mutants à pouvoir affaibli de formation de composés antibiotiques S541, qui participent à la synthèse du composé de la formule (I). De telles ma10 tières peuvent s'obtenir en se servant de techniques d'ingéniérie génétique classique comme on va les décrire Juste ci-dessous. Une souche particulièrement préférée, capable de produire le composé de la formule (I) et à pouvoir affaibli de formation de composés Antibiotiques S541, est constituée par Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 -déposée le 15 septembre 1986 à la collection permanente de cultures de l'organisme suivant:National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Royaume-Uni et ses mutants. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 et ses mutants forment une caractéristique supplémentaire de la présente invention. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 possède des caractéristiques essentielles sensi25 blement similaires à celles décrites à propos de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 dans le mémoire descriptif du brevet britannique né 2 166 436. Cependant, on peut distinguer Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 de Streptomyces thermoarchaensis 30 NCIB 12015 par le fait que NCIB 12334 ne produit que peu ou pas de composés antibiotiques S541 décrits dans le mémoire descriptif du brevet britannique n 2 166 436 dans les, conditions de fermentation quiy sont présentées. Des mutants de Streptomyces thermoarchaensis 35 NCIB 12334 peuvent surgir spontanément ou peuvent être préparés par les procédés décrits immédiatement cidessus. Suivant une autre de ses caractéristiques, la présente invention a pour objet la matière génétique de Streptomvces thermoarchaensis NCIB 12334 et ses mutants, qui participent à la synthèse du composé de la formule (I). Une matière de ce genre peut être obtenue en utilisant des techniques d'ingéniérie génétique classiques, y compris celles esquissées par D.A. Hopwood 10 dans "Cloning genes for Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces Spp.:Production of a hybrid antibiotic" p. 409-413 dans Microbiology 1985, éd. L. Lieve, American Society of Microbiology, Washington D.C. E.U.A., 1985. On peut avoir recours à des techniques de ce genre d'une manière similaire à celle antérieurement décrite pour le clonage de gènes biosynthétiques d'antibiotiques, y compris les gènes biosynthétiques pour l'actinorhodine (Malpartida, F. et Hopwood, D.A. 1984, Nature 309, p. 462-464), l'rythromycine (Stanzak, 20 R. et coll., 1986, Biotechnology, 4, p. 229-232) et une enzyme importante intervenant dans la production de pénicilline et de céphalosporine dans Acremonium chrysogenum (Sansom, S.M. et coll., 1985, Nature, 318, p. 191-194). La matière génétique de Streptomyces thermoarchaensis ainsi obtenue peut s'utiliser, par exemple, pour l'amélioration de la souche, pour la production d'enzymes biosynthétiques en vue d'applications in vitro ou pour engendrer de nouveaux antibiotiques par l'introduction d'une telle matière dans des organismes autres que Streptomyces thermoarchaensis. La production du composé suivant l'invention par fermentation d'un organisme du type Streptomyces approprié peut s'effectuer par mise en oeuvre de moyens classiques, c'est-à-dire par la culture de l'organisme 35 du type Streptomvces en présence de sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux. On peut fournir des sources assimilables de carbone, d'azote et de minéraux à l'aide de substances nutritives simples ou complexes. Les sources de carbone comprennent généralement le glucose, le maltose, l'ami5 don, le glycérol, les mélasses, la dextrine, le lactose, le saccharose, le fructose, des acides carboxyliques, des acides aminés, des glycérides, des alcools, des alcanes et des huiles végétales. Les sources de carbone constituent généralement de 0,5 à 10 % en poids 10 du milieu de fermentation. Les sources d'azote comprennent en général la farine de soja, les liqueurs de macération ou drèches de mais, les produits solubles de distillation, les extraits de levure, la farine de graines de coton, les 15 peptones, la farine d'écales de noix broyées, l'extrait de malt, les mélasses, la caséine, des mélanges d'aminoacides, l'ammoniac (gaz ou solution), des nitrates ou sels d'ammonium. On peut également utiliser de l'urée ou d'autres amides. De manière générale, les sources 20 d'azote constituent de 0,1 à 10 % en poids du milieu de fermentation. Les sels minéraux nutritifs que l'on peut incorporer au milieu de culture comprennent les sels généralement employés, capables d'engendrer des ions sodium, 25 potassium, ammonium, fer, magnésium, zinc, nickel, cobalt, manganèse, vanadium, chrome, calcium, cuivre, molybdène, bore, phosphate, sulfate, chlorure et carbonate. Un agent anti-mousse peut être présent pour mattriser un moussage excessif et on peut l'aJouter par intervalles selon les besoins. La culture de l'organisme Streptomyces se réalise généralement à une température de 20 à 50 C, de préférence de 25 à 40eC, plus particulièrement aux en35 virons de 340C et elle a avantageusement lieu sous aération et agitation, par exemple par remuage ou secouage. On peut initialement inoculer le milieu d'une faible quantité d'une suspension du micro-organisme sporulé, mais, afin d'éviter un retard de croissance, 5 on peut préparer un inoculum végétatif de l'organisme en inoculant la forme sporulée de l'organisme à une faible quantité du milieu de culture, et on peut transférer l'inoculum végétatif ainsi obtenu dans le milieu de fermentation, ou, plus avantageusement encore, dans 10 un ou plusieurs étages d'ensemencement, o la poursuite de la croissance se produit avant de procéder au transfert dans le milieu de fermentation principal. On réalise généralement la fermentation dans une gamme de pH de 5,5 à 8,5, de préférence de 5,5 à 7,5. Il peut être nécessaire d'ajouter de l'acide au milieu de fermentation de façon à maintenir le pH dans la plage voulue. Des acides convenables que l'on peut ajouter comprennent des acides aqueux, comme l'acide sulfurique, ou des acides gras, comme l'acide valérique ou l'acide 20 isobutyrique ou leurs mélanges. La fermentation peut se réaliser pendant une période de 2 à 10 Jours, par exemple environ 5 Jours. Lorpqu'il est souhaitable de séparer le composé suivant l'invention de la fermentation entière, on peut 25 y procéder par des techniques de séparation et d'isolement classiques. Le composé conforme à la présente invention est contenu, de manière prédominante, dans les mycéliums des cellules, mais on peut le trouver également dans le bouillon de fermentation et on peut aussi appliquer les techniques d'isolement au bouillon de fermentation avant ou après la clarification. Il faut comprendre que le choix des techniques d'isolement peut varier entre de larges limites. On peut isoler et séparer le composé suivant l'invention par toute une série de techniques de frac- ticnnement, par exemple l'adsorption-élution, la précipitation, la cristallisation fractionnée, l'extraction par solvant et la répartition liquide-liquide, que l'on peut combiner de diverses façons. L'extraction par solvant, la répartition entre deux solvants qui ne sont pas miscibles ou qui ne sont seulement que partiellement miscibles l'un avec l'autre et la chromatographie se sont révélées convenir tout particulièrement bien pour l'isolement et la sé10 paration du composé suivant l'invention. Après la fermentation, on peut récolter les mycéliums (éventuellement après traitement par un floculant ou par un acide Jusqu'à ce que le pH du milieu de fermentation soit inférieur à 6, ou, après chauffa15 ge, ou, de préférence, chauffage et addition d'acide) en ayant recours à des techniques classiques, par exemple la filtration ou la centrifugation. Ensuite, on peut par exemple extraire le composé suivant l'invention des mycéliums à l'aide d'un solvant organique 20 approprié, comme une cétone, par exemple l'acétone, la méthyléthyl cétone ou la méthylisobutyl cétone; un hydrocarbure, par exemple l'hexane; un hydrocarbure halogéné, par exemple le chloroforme, le tétrachlorure de carbone ou le chlorure de méthylène; un alcool, 25 par exemple le méthanol ou le propane-2-ol; un diol, par exemple le propane-1,2-diol ou le butane-1,3-diol; un ester, par exemple l'acétate de méthyle ou l'acétate d'éthyle; ou leurs mélanges. Il faut bien comprendre que si les mycéliums contiennent des quantités impor30 tantes d'eau, il est préférable d'utiliser un solvant miscible à l'eau, comme le méthanol ou l'acétone. De manière générale, plus d'une extraction des mycéliums est nécessaire pour obtenir une récupération optimale. On peut récupérer le composé suivant l'in35 vention à partir des extraits au solvant, sous forme d'une préparation brute, en éliminant le solvant, par exemple par évaporation ou par précipitation, par exemple en versant l'extrait au solvant dans de l'eau. En alternative, l'extrait au solvant initial peut, après réduction du volume du solvant, par exemple par évaporation, lui-méme être extrait par un second solvant qui n'est pas miscible ou seulement partiellement miscible au premier. Si l'extraction initiale des mycéliums s'effectue avec un solvant miscible avec l1 10 eau,comme le méthanol ou le propane-1, 2-diol, le second solvant peut alors être, de manière appropriée, un solvant non miscible à l'eau, comme l'hexane, le chloroforme, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle ou l'éther de pétrole ou leurs mélanges,une quantité suf15 fisante d'eau étant ajoutée à l'extrait initial pour assurer la non miscibilité avec le second solvant et pour régler la répartition du composé antibiotique entre les phases. Par le choix approprié des solvants miscible à l'eau et non miscible à l'eau et par la ma20 nipulation de la teneur en eau du solvant miscible à l'eau, un certain nombre de transferts du composé antibiotique du solvant miscible à l'eau au solvant non miscible à l'eau et vice versa sont possibles. En alternative, on peut faire passer l'extrait au solvant 25 initial sur un lit d'une résine échangeuse d'ions, comme l'IRA 68 ou une résine non fonctionnelle, telle que XAD-1180 (Rohm et Haas) pour purifier davantage l'extrait. On peut récupérer le composé antibiotique à partir de la solution au solvant finale par évaporation du solvant, par précipitation ou par adsorption sur un support solide approprié, en fonction de la nature du solvant final. La purification et/ou la séparation du composé 35 suivant l'invention peuvent en outre s'effectuer par des techniques classiques, comme, par exemple, la chromatographie ( y compris la chromatographie en phase liquide à haute performance) sur un support approprié, comme la silice; une résine d'adsorption macro5 réticulaire non fonctionnelle, par exemple des résines en polymère de styrène-divinylbenzène réticulé, comme l'Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-16 ou XAD-1180 (Rohm et Haas Ltd) ou Kastell S112 (Montedison); un polymère de divinylbenzène - styrène substitué,par exem10 ple un polymère de diviniylbenzène-styrène halogéné(par exemple bromé), tel que Diaion SP207 (Mitsubishi); un dextrane réticulé compatible avec un solvant organique, comme le Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), ou sur des supports de phase inverse, comme la silice liée 15 à un hydrocarbure, par exemple la silice liée à un hydrocarbure en C18. Le support peut se présenter sous la forme d'un lit ou être plus avantageusement tassé dans une colonne. On charge généralement une solution du composé 20 de la formule (I) dans un solvant approprié, par exemple le dichlorométhane, le tétrahydrofuranne, l'éther de pétrole, l'acétonitrile, le chloroforme, l'acétate d'éthyle ou leurs mélanges sur une colonne de chromatographie, par exemple une colonne de silice ou de Sephadex, si on le souhaite, après avoir d'abord réduit le volume de solvant. On peut facultativement laver la colonne et l'éluer ensuite avec un solvant de polarité appropriée, par exemple des alcools, tels que le méthanol; des hydrocarbures, par exemple l'hexane ou l'éther de pétrole; des esters, tels que l'acétate d'éthyle, des cétones, telles que l'acétone, des éthers, tels que l'éther diéthylique;l'acétonitrile; ou des hydrocarbures halogénés, comme ledichlorométhane ou le chloroforme. On peut également utiliser 35 des combinaisons de ces solvants ou leurs combinaisons avec un solvant polaire, par exemple l'eau. La présence du composé suivant l'invention au cours des procédés d'extraction/isolement peut être surveillée par des techniques classiques, comme une chromatographie en phase liquide à haute performance ou par spectroscopie UV ou en utilisant les propriétés du composé décrit dans la suite du présent mémoire. Lorsqu'on obtient le composé suivant l'invention sous la forme d'une solution dans un solvant organique, par exemple après purification par chromatographie, on 10 peut éliminer le solvant par des procédés classiques, par exemple par évaporation, de façon à obtenir le composé sous une forme solide ou cristalline. Le composé suivant l'invention a été isolé sous la forme d'un solide par une combinaison appropriée 15 des procédés susmentionnés. Il faut comprendre que l'ordre dans lequel on réalise les étapes de purification susmentionnées et le choix des étapes auxquelles on a recours peuvent varier entre de larges limites. Suivant un autre procédé conforme à la présente 20 invention, on peut préparer le composé de la formule (I) par l'oxydation d'un composé de la formule (II) CH -CH3 H_0 2 ( ICH3 CH3 H %0C3 I) IH HCII(CH8)2 0N On peut réaliser la réaction dans un agent oxydant servant à convertir un radical hydroxyle allylique secondaire en un groupe oxo, si bien que l'on obtient le composé de la formule (I). Comme agents oxydants appropriés, on peut citer, par exemple, des oxydes de métaux de transition, comme le bioxyde de manganèse et l'oxygène atmosphérique, en présence d'un catalyseur approprié, comme un métal finement divisé, par exemple le platine. On utilisera habituellement l'agent oxydant en excès par rapport à la quantité stoechiométrique. On peut commodément réaliser la réaction dans un solvant approprié que l'on peut choisir parmi une cétone, par exemple l'acétone; un éther, par exemple l'éther diéthylique, le dioxanne ou le tétrahydrofuranne; un hydrocarbure, par exemple l'hexane; un hydrocarbure halogéné, par exemple le chloroforme ou le chlorure de méthylène; ou un ester, par exemple l'acétate d'éthyle. On peut également utiliser des combinaisons 20 de ces solvants, seuls ou avec de l'eau. On peut réaliser la réaction à une température de -50'C à +50 C, de préférence de O à 30 C. On peut préparer le composé intermédiaire de la formule (II) de la manière décrite dans le mémoire 25 descriptif du brevet britannique n 2 166 436. On peut obtenir le composé de la formule (I), préparé par fermentation ou à pattir d'un composé de la formule (II) suivant les procédés décrits plus haut, que ce soit sous forme de solution ou de solide brut, sous forme cristalline en utilisant des procédés classiques. Ainsi, par exemple, on peut parvenir à la cristallisation à partir d'une solution du composé, par exemple par repos dans un solvant convenable (par exemple un alcool, tel que le méthanol ou le propane35 2-ol; l'acétonitrile; un hydrocarbure, tel que l'hexane; ou un éther, tel que l'éther diéthylique, l'éther isopropylique ou l'éther de pétrole), éventuellement combiné à de l'eau. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention. Toutes les températures y sont indiquées en OC. *L" désigne le litre. Le facteur A est le composé de la formule (II). On peut préparer le facteur A de la façon indiquée dans le mémoire descriptif du brevet britannique n 2 166 436. 10 Exemple 1 On a agité du facteur A (250 mg) dans de l'éther (30 ml) avec du bioxyde de manganèse actif (1,0 g) pendant 2,75 heures. On a filtré le mélange à travers un tampon de Kieselguhr et on a évaporé le filtrat de 15 façon à obtenir le composé suivant l'invention sous la forme d'une mousse (240 mg). On a cristallisé une partie de cette mousse dans de l'éther de pétrole de façon à obtenir des microcristaux, X max (EtOH) 240,5 nm (El 495);valeurs 6 (CDC13) 6,58 (s; 1H), 2,60 (m; 1H) 20 1,89 (s; 3H), 1,62 (s; 3H), 1,53 (s; 3H), 1,05 (d 6; 3H), 1,00 (d 6; 3H), 0,96 (d 6; 3H) et 0,80 (d 6; 3H); m/z englobe 610, 592, 574, 441, 265, 247, 237, 219 et 151. Exemple 2 On a inoculé des spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 à de la gélose inclinée, réalisée à partir des ingrédients qui suivent: gL-1 Extrait de levure (Oxoid L21) 0,5 Extrait de malt (Oxoid L39) 30,0 Peptone mycologique (Oxoid L40) 5,0 Gélose No. 3 (Oxoid L13) 15,0 Eau distillée Jusqu'à 1 litre 35 pH 5,4 On a incubé les cultures à 28eC pendant 10 jours. On a ensuite recouvert la culture inclinée mère de 6 ml d'une solution à 10 % de glycérol et on l'a grattée avec un outil stérile pour libérer les spores et le mycélium. On a transféré des fractions aliquotes de 0,4 ml de la suspension de spores ainsi obtenue dans des chalumeaux de polypropylène stériles que l'on a ensuite thermo-soudés et conservés dans de la vapeur d'azote liquide Jusqu'au moment voulu. On a inoculé deux flacons d'Erlenmeyer de 250 ml, contenant 50 ml de milieu d'ensemencement constitué des ingrédients qui suivent: gL-1 DGlucose 15,0 Glycérol 15,0 Peptone de soJa 15,0 NaCl 3,0 CaC03 1,0 Eau distillée Jusqu'à 1 L C-Le pH inajusté du milieu était de 6,7 et on l'a aJusté au pH de 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium aqueux avant le passage à l'autoclave. Le pH du milieu après passage à l'autoclave était de 7,3_7, de 0,2 ml de la suspension de spores prélevée d'un cha25 lumeau. On a incubé les flacons à 28eC pendant 2 Jours sur un appareil secoueur tournant à 250 tpm avec un mouvement orbital d'un diamètre de 50 mm. On a utilisé le contenu des deux flacons pour 30- inoculer un appareil de fermentation ou fermenteur de L, contenant 40 L du même milieu d'ensemencement, complété de polypropylène glycol 2000 (0,06 % v/v). On a ajouté du polypropylène glycol 2000 selon les besoins au cours de la totalité de la fermentation pour maltriser le moussage. On a réalisé la fermenta- tion à 28eC, sous agitation et aération suffisant à maintenir un taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % de saturation. Après 24 heures de fermentation, on a transféré une fraction de 9 L de bouillon dans un fer5 menteur de 700 L contenant 450 litres de milieu, constitué comme suit: gT1 D-glucose 2,8 Dextrine de malt (MD30E) 27,8 Arkasoy 50 13,9 Mélasses 1,7 K2HPO4 0,14 CaCO3 1,39 Silicone 525 (Dow Corning) 0,06 % (v/v) Ajusté à un pH de 6,5 avant la stérilisation. On a réalisé la fermentation à 280 sous agitation et aération. On a ajouté du polypropylène glycol 20 2000 à titre d'agent anti-mousse selon les besoins et on a maintenu la valeur du pH à 7,2 par l'addition de H2S04 Jusqu'à la récolte. On a récolté le bouillon de fermentation après 5 Jours. On a clarifié le bouillon (450 L) sur une cen25 trifugeuse Westfalia KA 25 et on a déplacé la couche surnageante résiduelle avec de l'eau (20 L). On a agité les cellules récupérées (25,5 kg) pendant I heure avec un mélangeur Silverson modèle BX, dans une quantité de méthanol suffisant à donner un volume total de 75 L. On a filtré la suspension et on a réextrait le résidu solide avec du méthanol (35 L) et on l'a filtré. On a dilué les filtrats réunis (87 L) avec de l'eau (40 L) et on a extrait le tout par de l'éther de pétrole 60-80 (30 L). Après 30 minutes, on a séparé les phases sur 35 une centrifugeuse Westfalia MEM 1256 et on a ré- extrait la phase méthanolique inférieure par de l'éther de pétrole 600800 (30 L) après l'addition d'eau (40 L). Apres séparation, on a de nouveau extrait la phase inférieure par de l'éther de pétrole 60e-80* (30 L). On a concentré les phases à l'éther de pétrole réunies (85 L) par trois passages à travers un évaporateur à pellicule balayée Pfaudler 8,8-12v-27 (fraction de vapeur 0,1 bar, température de vapeur 20 , température de vapeur d'eau 127e). On a séché le concentré (9 L) 10 avec du sulfate de sodium (2 kg) et on l'a ensuite concentré sous pression réduite à 40 dans un évaporateur à pellicule rotative. - On a dissous le résidu huileux (130 g) dans du chloroforme de façon à obtenir un volume de 190 ml et 15 on a appliqué ces 190 ml à une colonne de silice 60 (Merck 7734) tassée (200 x 4 cm) dans du chloroforme. On a lavé la colonne avec du chloroforme (500 ml) et on l'a éluée avec un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle (3:1) et on en a recueilli des fractions 20 d'approximativement 40 ml après une fraction préalable de 1400 ml. On a réuni les fractions 32-46 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (21,2 g). On a réuni les fractions 47-93 et on les a évaporées de fa25 çon à obtenir une huile (20,1 g) que l'on a dissoute dans un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle (3:1) Jusqu'à un volume de 50 ml, volume que l'on a appliqué à une colonne de silice 60 (Merck 7734) tassée (200 x 4 cm) dans un mélange de chloroforme et d'acétate 30 d'éthyle (3:1) et on a recueilli des fractions d'approximativement 40 ml après une fraction préalable de 1400 ml. On a réuni les fractions 22-36 et on les a évaporées de façon à obtenir une huile (3,1 g) que l'on a ajoutée à l'huile obtenue à partir des fractions 35 32-46 de la première colonne. On a dissous les huiles -oeJeo suamWej; sap Tuanoj e ja 019 q aiTeinogiom uoT un puuop e 'I- assem ap aTdooso.oads eBi *(9m ") uoTIua. -uTl ap 9sodmoo aI 9uuop e salnuTm i' m luenl9 soTd sap oaAe saTungi suoTIOej sap uoTIeodeApq *mu 8çZ B Anl aTdoosoloads o zed aouem.o;ad annetq i apTnbTI asked ua aeTdei2o:em -oqo q auuoloo eB ap luenTlts aeqTqem Bt 9TTa.ans e uo oo00'g OO'O 00' ú 00'0 00'0ú 06'6 Z 00'0ú 0' 1 oo'loç O UOT. (00 ' O OO' -oa uT,p agana ( 00'0 00'0 (uTm/lm) Tq9qa (uTu) a5Cna :uaATns Fnl suuoq. oz -Tpuoo sel sUBp '( :a) nea,p %a alTa.%TUO9Oep a2uei9m un oaeA auuoloo EB gnTI e uo %pa alnuTm aunp aoedsa,t suep auuoloo eB SUBp (lm ) UOlTTTUeqO9.,t ap SuoToBa; sap 9dlmod e uo '('pl *das asesd 'mm Oz x mmoz) z-sao SS qJosTaaJdS np ans uoT%,ezedgd ap aouem.o;aad aneu S q apTnbTI aseqd ua aSTdeisoamoigo aun s asTmunos;a Toueq.gm np suep alnossTp E UO,8 anb aTTnq aun 9uuop e %enlPl ap uoTnlgil '(%Tl ap samnIoA Z) (1:ú) alúqgp a.el9oep %a aizooaoolqo ap a2ue9Im un oaae 9nI9 e,l uo *a (%TI ap samn-oA z) auseqmo.zolqoTp np oawe %TI O0 al 9Aei e uo 'au qpmozoItqoTp np suep 99se. (i LL soN za '4wlSV ' qsaem o z-oL) 09 oj0.a aoTITs ap 1as ap (mo z'z x Oú) auuoIoo aun n a anse9peqo aTnsua a UOI anb uoTInlos 'aueqp9moaolqoTp ap amnIoA Ig29 un suep anossTp e UOI anb alTnq aeun t apua2ua a uoba; ap UOT. -esTll.s;To seqde azqm znanbTl eI 9zodeA9 e uo *JaslTttesTJo 9SslBI e UO, I anb %a pneqo ( Im oz) to-Z-ausdood np si apno e al.Tnsua e uos anb uo-. nlos ' (lm il) luelT;noq Tou9eqlpm np suep seçungi LS9009Z mm o0 P aplqumTp unp qq.To:auaoxa aun oeAe (u:m/sanol 5ú O0Z) $T4e.o., nenooes un ans uoT4.l.T2 snos ' snon z ap apol,zad aun %uepued 98Z e uoove; enbaqo eqnouT e uo *(y naTITm np lm og unoeqo:uvuauoo) sa-zlTmTs suoouTj -al.enb ap unoeqo suep anbT4dase aaqTuem ap Tm '1 ga,; -suez B uo alanbul ap Inoq ne apoTZagd 'sanor z 1uep Oú -uad *8Z e. luamaouamesuap uooul; el gqnouT e uo (e8 Bs selnuTm 51) eaeloo:nel e aeessed el 4ueve S'9 e fsn v Hd ' 1 e,nbsnr aeplITsTp nBS O,;z Z7anbTuo;ins 5z aueddod(ouTloqd. xom-N)- epToE_7 sco0 5Z'I, -' úODeD '1 sesaq.1aq ap sessBeIN 'ZI - 05 Xosaxv oz oll- Soúcx auTai-xap 0 lqR esoonT[2-C V naTITN : na'[tm ap lm O:ueualuoo Im o5z ap.aam 51 -uaz.p uoouT$ un, aTnoouT,nod ssTTITn e sal uo;a (lm I) a-,ods sel ple2uoogp e uo 'Z aldmaxa,T 3p 510ZI 9IDI sTsueeBqouo,@eoqa saoàmoae.azs np sodo.d e aTiop ellaao g aiTulTmTs aaqTuem aunp 'OLZ- e % oz e To.zaoXI2 np suep sa-ods ap suoTsuadsns ap emuoj snos 7úú1Z, gION Ol;Tsuaeteoq.1om, zetq: saoAmoluaals,zAeSuoo B U0 ú alamaaxf 6g - 65Z S ZZI? 99 5 Z65: e sanbTlsTJ91a S90093 On a ensuite inoculé deux fermenteurs d'ensemencement de 7 L d'environ 80 ml Z-2 % (v/v)_7 de l'inoculum rassemblé des flacons secoueurs. Chaque fermenteur de 7 L contenait 4 L de milieu B: Milieu B gL-1 Méritose 45,0 Arkasoy 50 18,0 Mélasses de betteraves 2,2 K2HPO4 0,18 CaCO3 (Analar) 1,8 Silicone 1520 (Dow Corning) 2,5 ml dans 4 L Eau distillée jusqu'à 4 L avec pH ajusté à 6,5 avant le passage à l'autoclave (45 min à 1240). On a réalisé la fermentation à 280 sous agitation et aération. On a inoculé un fermenteur de 700 L de 5,4 litres transférés de manière aseptique à partir des récipients d'ensemencement au bout de 24 heures. Le fermenteur contenait 450 L de milieu B dans lequel on avait remplacé le CaCO3 (Analar) par de la craie Sturcal et on a ajouté 250 ml de silicone 1520. On a ajusté le pH à 6,5 en se servant d'H2S04 concentré avant de procéder à la stérilisation in situ pendant 30 min à 1210. En outre, on a inoculé trois fermenteurs de 70 L de 800 ml (2 % v/v) transférés aseptiquement à partir du récipient d'ensemencement au bout de 24 heures. Chaque récipient contenait 35 L de Milieu B tel que décrit plus haut, 25 ml de silicone 1520 étant 30 aJoutés avant de procéder à la stérilisation in situ (30 minutes à 121'). On a procédé aux fermentations subséquentes à 340 sous agitation et aération. On a aJouté du polypropylène glycol 2000 servant d'agent antimousse, suivant les besoins, au cours de la totalité des fer- mentations et on a maintenu le pH à 7,4 par l'addition d'un mélange d'acide valérique et d'acide isobutyrique 75:25 Jusqu'à la récolte. Après 120 heures, on a rassemblé les contenus des fermenteurs (600 L), on les a mélangés à de la Décalite (3 kg) et filtrés à travers de la cellulose (24 kg, Rettenmaier BEOO) sur un filtre rotatif sous vide. On a conservé la pâte cellulaire récupérée (45 kg) à -20. On a mis la pate cellulaire congelée en suspension dans du méthanol (55 L) et on l'a laissée décongeler. Après 30 minutes à 5 , on a filtré la suspension à travers un lit de cellulose. On a remis le résidu en suspension dans du méthanol ( 50 L), on a filtré la suspension à travers un lit de cellulose et on a procédé à un lavage avec du méthanol (10 L). On a dilué les filtrats et les liqueurs de lavage réunis (116 L) avec de l'eau (22 L) et on les a extraits avec de l'éther de pétrole à 600 - 80 (100 L). On a 20 concentré l'extrait à l'éther de pétrole sous faible pression (approximativement 0,15 bar) dans un évaporateur à pellicule balayée. On a extrait le concentré (8,4 L) à trois reprises par du propane-1,2diol (3 x 4,2 L). On a agité 25 les extraits réunis (13,5 L) par de l'acétate d'éthyle (22 L) et de l'eau (12 L) et on les a ensuite laissé décanter et on a séparé les phases. On a lavé la phase supérieure (17,5 L) à deux reprises avec de l'eau (12 L et 10 L) et on a séché la phase organique supé30 rieure résiduelle Jusqu'à obtenir une huile (112 g). On a dissous l'huile dans du dichlorométhane (500 ml) et on l'a chromatographiée sur une colonne (425 mm x 45 mm en diamètre) de gel de silice Merck 60 (type 7734) tassé dans le même solvant. On a lavé la colonne avec du dichlorométhane (500 ml) et on l'a en- suite éluée avec un mélange de dichlorométhane et d'éther diéthylique (400 ml de 9:1 v/v respectivement). On a séché l'éluat de façon à obtenir un goudron de teinte Jaune pale (54 g). (a) On a dissous une fraction (1,2 g) du goudron dans de l'acétonitrile (5 ml) et on l'a chromatographiée sur une colonne (340 mm x.25 mm en diamètre) de Sephadex LH20 qui avait été tassée dans de l'acétonitrile et éluée avec ce produit. On a séché la fraction s' 10 éluant entre 110 ml et 130 ml et on l'a redissoute dans de l'acétonitrile (2,5 ml). On a dilué une fraction (2 ml) de cette solution avec une solution aqueuse à 70 % d'acétonitrile ( 2 ml contenant 1,4 ml d'acétonitrile). On a ensuite chromatographié cette solution 15 en deux parties égales sur une colonne (250 mm x 25 mm en diamètre) de Spherisorb S5 ODS2 avec une solution aqueuse à 70 % d'acétonitrile servant de solvant d'élution. On a recueilli la matière s'éluant entre 0,8 L et 0,95 L à partir des deux essais et on l'a diluée avec 20 de l'eau (environ 0,9 L). On a repompé cette solution dans la même colonne de S5 ODS2 et on a élué la colonne avec de l'acétonitrile. On a éliminé l'acétonitrile par évaporation et on a séché l'échantillon par voie azéotropique à partir d'un mélange d'acétone et de cyclo25 hexane, de manière à obtenir le composé suivant l'invention (33 mg) sous la forme d'un solide. Les spectres de résonance magnétique nucléaire, UV et de masse du solide, étaient compatibles avec ceux du produit de l'exemple 1. (b) On a séché une fraction du goudron (4,32 g) dissous dans de l'éther diéthylique, de façon à obtenir un produit solide que l'on a redissous dans de l'acétonitrile à une concentration de 300 mg/mL. On a mélangé cette solution (8,5 mL) à un égal volume d'acétonitrile 35 à 75 % v/v dans de l'eau et on a chromatographié le tout en neuf fractions sur une colonne de Spherisorb ODS-2 (250 mm x 20 mm). On a élué les divers constituants (25 mL/min) avec de l'acétonitrile à 75 %. On a recueilli le picséluant entre 0,51 L et 0,61 L de chaque essai et on a réuni les pics. On a mélangé la masse ainsi obtenue à un égal volume d'eau et on l'a réadsorbée sur la môme colonne de Spherisorb. On a élué la colonne avec de l'acétonitrile. On a chauffé l'éluat Jusqu'à 45e et on a aJouté de l'eau Jusqu'à 10 ce que l'éluat se troublât tout Juste. On a alors refroidi le tout Jusqu'à 4 et on l'a laissé cristalliser. On a séparé les cristaux par filtration et on les a séchés de façon à obtenir le composé suivant l'invention (0,26 g). L'analyse du solide par chroma15 tographie en phase liquide à haute performance analytique à phase inverse a révélé la présence de 4 % d'impuretés sur base de l'absorption totale à 238 nm. SPECTRE DE RMN 1H Le spectre de rmn 1H à 200 MHz d'une solution 20 dans le deuterochloroforme comprenait des signaux à environ les positions suivantes: 6,55 (s élargi; 1H) 1,88 (s élargi; 3H) ,86 (d15; 1H) 1,60 (s; 3H) ,72 (dd 15,11; 1H) 1,52 (s; 3H) 1,03 (d7; 3H) 1,00 (d7; 3H) 0,95 (d7; 3H) 0,79 (d6; 3H) SPECTRE DE RMN 13C Le spectre de rmn 13C à 25,05 MHz d'une solution dans le deutérochloroforme présentait des signaux à environ les positions suivantes: Lk, %a 61Z '/úZ 'tZ '.,ifz '65Z '59Z 'Za 'úfz f '0'7 'zl, 0 '09ff 'fL9 'Z65 z/m q sa,';eq -uam2e.; suoT sap %a o09 Z/az/m q eTeInOIOm uoT un 9uuop B uo.TInlosgiz alqTej q *I*' assem ap alToads ae' ssvw [a suosas *(o-o),_mo 966 4a(a9ngn uoo auoi1.o) 8L91 '(xaasa) oLL/ '(H0) 0oSú uoiTAua es sapueq sap;Teua.zdmoo (%. = o) am.zo; -omoaq aT suep uoTn0os aunp UOI ailoeds ae' I STd&OaES 605 'S mu 17'017?Z uoTAuap x Nm y un. Tvepssod (% wo'o = o) toueq9m ae suep A'fln ae.zads a'I *eaTelo sed %uanbgsuoo.ed:seau 9%ToTdTInm Bs,a ssod -jadns xneuSTs sznaTsnId ap q. Tlns 1'9ú g oTd ae' (b) (b) (b) (b) (b) (P) (1) (P) (p) (s) (8) (9) (p) (P) (p) (s) O"',1 0'1. 9'51 Z'ZZ 6'ZZ 6'9Z 8'9A 011,9 0'W8 ol z9 9'66 17'Il oz 6'o 1.2I 61 kZk l/'0ç1, (&) (;) (.) (P) (.) (P) (p) (.) (S) (P) (9) (S) (P) (P) (9) (s) 1'9 1,'017 9'917 1'7' 917 9'99 9'89 ú'69 6'69 6'9ú 8'L6 t 17' " L. fiú Iq 6y' I LI 6' 6 t' O1 O1 L S 90 0 9 Z MICROANALYSE La microanalyse a donné C 70,95 %, H 8,33 %. (Prévu C 70,82 %, H 8,20%). Exemple 4 On a utilisé 1 ml d'une suspension de spores de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 (préparée de la manière décrite à l'exemple 3) pour inoculer un flacon secoueur d'une contenance de 250 ml contenant 10 du Milieu A (50 ml, pH ajusté A 6,5 avant le passage à l'autoclave). On a incubé le flacon à 280 pendant 2 Jours sous agitation au secoueur rotatif (250 tours/ min)avec un excentrique d'un diamètre de 50 mm. On a transféré des fractions de 1 ml de l'inoculum développé 15 en l'espace de deux Jours dans chacun de six flacons similaires contenant du Milieu A (50 ml) et on l'a fait fermenter de la même manière pendant deux Jours. On a ensuite inoculé un fermenteur (20 L) contenant du Milieu B (12 L, pH aJusté à 6,5 avant la stérilisation à 121 pendant 30 minutes) d'environ 300 ml j %(v/v)_7 de l'inoculum rassemblé des flacons secoueurs. On a réalisé la fermentation à 28e sous agitation et aération pendant 24 heures. On a inoculé un fermenteur (700 L) contenant du 25 Milieu B (450 L, pH ajusté à 6,5 avant la stérilisation à 121À pendant 30 minutes) de 12 L de l'inoculum développé au bout de 24 heures. On a réalisé la fermentation à 340 sous agitation et aération et on a réglé le pH Jusqu'à une valeur de 7,4 avec de l'H2S04 à 10 %. 30 Après 90 heures, on a filtré le bouillon récolté (400 L) à travers de la cellulose (Rettenmaier BEOO) avec un mélange de Décalite (2 kg) et de cellulose (2 kg) servant d'adjuvant de filtration. On a mis la pâte cellulaire récupérée en suspension dans du méthanol 35 (environ 100 L) et on l'a filtrée après environ 45 minutes. On a ré-extrait les cellules avec du méthanol (environ 50 L). On a dilué les extraits réunis (145 L) avec de l'eau (35 L) et on les a extraits avec de l'hexane sur un appareil Robatel LX204, en ajoutant de 5 l'eau au troisième stade d'extraction. On a concentré l'extrait à l'hexane (145 L). On a extrait le concentré (2 L) à trois reprises avec des fractions de 1 L de propane-1,2-diol. On a rassemblé les extraits (3,16 L) et on les a mélangés 10 à de l'acétate d'éthyle (3,34 L) et de l'eau (3,0 L). On a récupéré la couche supérieure d'acétate d'éthyle et on l'a lavée à l'eau. On a chassé l'acétate d'éthyle et on a soumis l'huile résiduelle à une distillation azéotropique avec de l'acétone Jusqu'à obtenir une 15 mousse sèche (71 g). On a dissous le solide dans du méthanol (300 ml) et de l'eau (32 ml) et on a appliqué la solution à une colonne (4,6 L, 12,8 x 36 cm) de silice pour phase inverse Prep 40 Whatman ODS3. On a élué la colonne avec 20 un mélange de méthanol et d'eau (9:1) et on a rassemblé les fractions séluant entre 8,6 L et 10,2 L et on les a concentrées Jusqu'à ce qu'un précipité commençât à se former. Apres repos Jusqu'au lendemain à 40, on a séparé le solide par filtration et on l'a séché sous 25 vide. On a dissous une partie du solide (8,5 g) dans un mélange d'acétonitrile (140 ml), de tétrahydrofuranne (17 ml) et d'eau (13 ml). On a ensuite chromatographié des fractions (5,0 ml) de cette solution sur une co30 lonne (25 x 2,1 cm) de Spherisorb ODS2 (5 A) en utilisant un mélange d'acétonitrile et d'eau (4:1) comme solvant d'élution, aJouté au débit de 25 ml/min. On a rassemblé les pics émergeant entre 9,8 min et 13,6 min (2, 75 L), on les a dilués avec de l'eau (1,5 L) et 35 on a subdivisé la solution en trois fractions. On a repompé chaque fraction dans la colonne et on l'a éluée avec de l'acétonitrile. On a ensuite rassemblé les trois échantillons, on les a évaporés en un produit solide et on a recristallisé celui-ci dans de l'acétonitrile de façon à recueillir des cristaux du composé suivant l'invention (4,8 g). L'analyse du produit solide par chromatographie en phase liquide à haute performance analytique, en phase normale et en phase inversée a révélé la présence de moins de 10 2 % d'impuretés. *Exemple 5 On a acidifié du bouillon récolté (25 L, préparé suivant le procédé décrit à l'exemple 3) Jusqu'à un pH 15 de 3 avec de l'acide sulfurique à 15 % v/v et on l'a ensuite chauffé à 90" pendant 15 minutes avant d'en entreprendre la filtration à travers un lit d'hyflo. On a agité la pâte cellulaire (1556 g) avec du méthanol (3,9 L) pendant 30 minutes, on a filtré la suspension 20 et on a remis le résidu solide en suspension dans du méthanol (3,9 L) et on a refiltré la suspension ainsi obtenue. On a agité les filtrats réunis à un pH de 4 avec de l'acide sulfurique à 15 % v/v et on les a fait passer sur un lit de résine IRA 68 (cycle acétate, 25 750 ml) à raison de 3750 ml/h. On a lavé la colonne avec du méthanol et on a concentré les produits issus de la percolation méthanolique réunis Jusqu'à 3,5 L et on a ajouté cette dernière quantité simultanément avec de l'acide sulfurique à 0,1 % v/v (10,5 L) à de 30 l'acide sulfurique à 0,1 % (50 ml) froid (environ 50) et agité. On a agité la suspension pendant 10 minutes, on l'a filtrée et on a lavé la suspension solide avec de l'eau froide avant de la sécher. Le solide sec contenait 12,9 g du composé suivant l'invention par com35 paraison sur chromatographie en phase liquide à haute performance avec un échantillon authentique. Exemple 6 On a acidifié le bouillon récolté (25 L, préparé suivant le procédé décrit à l'exemple 3) Jusqu'à un pH de 3 avec de l'acide sulfurique à 15 % v/v et on l'a ensuite chauffé Jusqu'à 90 C pendant 15 minutes avant de procéder à la filtration à travers un lit d'hyflo. On a agité une partie de la pâte cellulaire (500 g) avec du méthanol (750 ml) pendant 30 minutes, on a filtré la suspension et on a remis le résidu solide en suspension dans du méthanol (750 ml) et on l'a filtré. On a dilué le filtrat réuni (1,5 L) avec de l'eau (617 ml) et on l'a extrait par trois fractions aliquotes d'hexane (706 ml). On a rassemblé les extraits 15 hexaniques réunis (2790 ml) et on en a concentré une fraction (1390 ml) Jusqu'à 250 ml et on a fait passer le produit concentré sur un lit de résine XAD 1180 (10 ml) dont la préparation avait eu lieu dans de l'hexane, au débit de 50 ml/h. On a lavé la résine avec 20 de l'hexane (10 ml) et on a concentré les extraits hexaniques Jusqu'à 20 ml. On a chargé une fraction (10,2 ml) des extraits hexaniques concentrés sur une colonne (100 ml) de gel de silice Crossfield SD 210, préparé dans de l'hexane. On a lavé le lit avec de l'acétone 25 à 5 % v/v dans de l'hexane (700 ml) au débit de 100 ml/h et on a procédé à l'élution avec de l'acétone à % v/v dans de l'hexane à raison de 100 ml/h. On a surveillé l'éluat par chromatographie en phase liquide sous haute performance et on a rassemblé les fractions contenant le composé suivant l'invention et on les a évaporées de façon à recueillir une huile. On a dissous l'huile dans du méthanol (150 ml) et de l'eau (70 ml), puis on a procédé à une évaporation du méthanol sous vide de façon à laisser subsister 35 un solide que l'on a séparé par filtration et séché. Le solide'sec contenait 0,21 g du composé suivant l'invention par comparaison sur chromatographie en phase liquide à haute performance avec un échantillon authentique. Ce qui suit sont des exemples de compositions conformes à l'invention. Le terme "Ingrédient actif" tel qu'utilisé cidessous désigne le composé suivant l'invention. Injection parentérale à doses multiples , L xP/ Limites Ingréuii.i& actif 4,0 0,1 - 7,5 % p/v Alcool benzylique 2,0 Triacétate de glycéryle 30,0 15 Propylène glycol Jusqu'à 100,0 On dissout l'ingrédient actif dans l'alcool benzylique et le triacétate de glycéryle. On ajoute du propylène glycol et on l'amène au volume indiqué. On 20 stérilise le produit par des procédés pharmaceutiques classiques, par exemple par filtration stérile ou par chauffage dans un autoclave et on procède ensuite à l'emballage aseptique. Spray du type aérosol % r/r Limites Ingrédient actif 0,1 0,01 - 2,0 % p/p Trichloréthane 29,9 Trichlorofluorométhane 35,0 Dichlorodifluorométhane 35,0 On mélange l'ingrédient actif au trichloréthane et on l'introduit dans le récipient pour aérosol. On purge l'espace de tête avec le propulseur gazeux et on sertit la soupape en position. On introduit le poids voulu de propulseur liquide sous pression à travers la 35 soupape. On équipe le dispositif des moyens d'actionnement et de chapeaux de soupape. Comprimé Frocéd' ce fgic:.i Cellulose microcristalline Jusqu'à un poids de noyau 10 de comprimé de 450 mg. On ajoute une quantité suffisante de pâte à % d'amidon A l'ingrédient actif pour produire une masse humide convenant à la granulation. On prépare les granules et on les sèche en utilisant un séchoir 15 à plateau ou à lit fluidifié. On tamise à travers un crible, on ajoute les ingrédients résiduels et on transforme le tout en comprimés par compression. Si on le souhaite, on enrobe les noyaux de comprimés d'une pellicule en utilisant de l'hydroxy20 propylméthyl cellulose ou toute autre matière filmogène ou feuillogène similaire en utilisant un système à solvant aqueux ou non aqueux. On peut incorporer un plastifiant et un colorant approprié à la solution d'enrobage par une pellicule. Comprimé vétérinaire pour l'utilisation dans le cas de petits animaux /domestiques Procédé de fabrication - granulation à l'état sec Ingrédient actif 50,0 Stéarate de magnésium 7,5 Cellulose microcristalline Jusqu'à un poids de noyau de comprimé de 75,0 On mélange l'ingrédient actif au stéarate de magnésium et à la cellulose microcristalline. On tasse 35 le mélange en tiges. On brise les tiges en les faisant passer à travers un granulateur rotatif de façon à obtenir des granules fluides. On les comprime en comprimés. On peut ensuite enrober les noyaux de comprimés 5 d'une pellicule,si on le souhaite, de la manière décrite plus haut. InJection intramammaire vétérinaire mg/dose Limites Ingrédient actif 150 mg 0,05-1,0 g Polysorbate 60 3,0 % p/p Cire d'abeille 6,0 % p/p Jusqu'à 3g Jusqu'à 3 ou 15 g Huile d'arachide 91,0 % p/p On chauffe l'huiled'arachide, la cire d'abeille et le polysorbate 60 jusqu'à 160 C sous agitation. On maintient le tout à 160 C pendant deux heures et on le refroidit ensuite Jusqu'à la température ambiante sous agitation. On ajoute l'ingrédient actif de ma20 nière aseptique au véhicule et on le disperse en utilisant un mélangeur à grande vitesse. On raffine par passage à travers un broyeur à colloldes. On introduit le produit de manière aseptique dans des seringues en matière plastique stériles. 25 Potion vétérinaire orale %p /v Limites Ingrédient actif 0,35 0,01 - 2 % p/v Polysorbate 85 5,0 Alcool benzylique 3,0 Propylène glycol 30,0 Tampon au phosphate à pH 6,0 - 6,5 Eau Jusqu'à 100,0 On dissout l'ingrédient actif dans le polysorbate 85, l'alcool benzylique et le propylène glycol. 35; On ajoute une partie de l'eau et on aJuste le pH à 6,0 - 6,5 avec un tampon au phosphate, si cela se révèle nécessaire. On complète Jusqu'au volume final avec de l'eau. On introduit le produit dans le récipient à potion. Pâte vétérinaire orale % P/P Limites Ingrédient actif 7,5 1 - 30% p/p Saccharine 25,0 Polysorbate 85 3,0 Distéarate d'aluminium 5,0 Huile de noix de coco fractionnée Jusqu'à 100,0 On disperse le distéarate d'aluminium dans l'huile de noix de coco fractionnée et le polysorbate 15 85 par chauffage. On refroidit le tout Jusqu'à la température ambiante et on disperse la saccharine dans le véhicule huileux. On répartit l'ingrédient actif dans la base.On introduit le produit dans des seringues en matière plastique. Granules pour administration vétérinaire par les aliments % ^/D Limites Ingrédient actif 2,5 0,05-5 % P/P Sulfate de calcium, hémi-hydraté Jusqu'à 100,0 On mélange l'ingrédient actif au sulfate de calcium. On prépare les granules en mettant en oeuvre un procédé de granulation à l'état humide. On sèche en utilisant un séchoir à plateau ou à lit fluidisé. On introduit le produit dans le récipient approprié. 10 Concentré émulsionnable Ingrédient actif 50 g Emulsif anionique 40 g (par exemple phényl sulfonate CALX) Emulsif non ionique 60 g (par exemple Syperonic NP13) Solvant aromatique (par exemple Solvesso 100) Jusqu'à I litre. On mélange tous les ingrédients, on les agite Jusqu'à dissolution. Granules (a) Ingrédient actif 50 g Résine de bois 40 g Granules de gypse (20-60 mesh) Jusqu'à I kg (par exemple Agsorb 100A) (b) Ingrédient actif 50 g Syperonic NP13 40 g Granules de gypse (20-60 mesh) Jusqu'à I kg. On dissout tous les ingrédients dans un solvant volatil, par exemple le chlorure de méthylène et on 25 ajoute la solution à des granules tournant dans un mélangeur. On sèche pour chasser le solvant. REVENDICATIONS 1. Le composé de la formule (I) OH CH CH3 / II). C-H3 10 CH3 H I 2. Le composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme cristalline. 3. Le composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme cristalline possédant une pureté supérieure à 90 %. 4. Composition convenant à l'usage en médecine humaine, caractérisée en ce qu'elle contient une quan20 tité efficace du composé suivant la revendication 1, en même temps qu'un ou plusieurs véhicules et/ou excipients. 5..Composition convenant à l'usage en médecine vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace du composé suivant la revendication 1, en même temps qu'un ou plusieurs véhicules et/ou excipients. 6. Composition pour combattre des organismes nuisibles, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace du composé suivant la revendication 1, en même temps qu'un ou plusieurs véhicules et/ou excipients. 7. Procédé pour combattre des organismes nuisibles dans le domaine agricole, horticole ou fores35 tier, ou dans des magasins, des immeubles, ou d'autres lieux publics, ou des endroits o vivent les organismes nuisiblea, caractérisé en ce qu' on applique une quantité efficace du composé suivant la revendication 1 aux plantes ou à toute autre végétation, 5 ou aux organismes nuisibles eux-mêmes ou à l'endroit o ils vivent. 8.- Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que les organismes nuisibles sont des insectes, des acariens ou des nématodes. 9.- Procédé de préparation du composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que: (a) on cultive un micro-organisme du genre Streptomyces et, si on le souhaite, on en isole le composé en question, le micro-organisme utilisé étant un mutant 15 d'une souche capable de produire le composé de la formule (I)qui ne produit pas de quantité substantielle de composés du type 5p-hydroxy- ou 5p-méthoxy S541; ou (b) on oxyde le composé du type 50-hydroxy correspondant. 20 10.- Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'organisme est un mutant d'une souche de Streptomyces thermoarchaensis ou Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus capable de produire le composé de la formule (I), qui ne produit pas de quantité substantielle de composés 5p-hydroxy ou 59méthoxy antibiotiques S541. 11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le mutant est le Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 ou un mutant de celui-ci. 30 12.- Mutant d'une souche d'un microorganisme du genre Streptomyces capable de produire le composé suivant la revendication 1, qui ne produit pas de quantité substantielle de composés 50-hydroxy ou 50méthoxy S541, et le matériel ou la matière génétique 35 de celui-ci,qui participe à la synthèse du composé suivant la revendication 1. 13.- StrePtomyces thermoarchaensis NCIB 12334 et ses mutants et la matière ou matériel génétique de ceux-ci qui participe à la synthèse du composé suivant la revendication 1.