Brevet FR2601035A1 — publié le 19880108

PROCEDE DE PREPARATION DE L-LYSEWE DOXAIJE DE L'IIVBXTI0 La présente invention a trait à un procédé pour la préparation de L-lysine par fermentation. ART AXTERIBUR La L-lysine est un aminoacide essentiel qui est largement utilisé dans de nombreuses applications telles que, par exemple, la préparation de médicaments, d'additifs pour l'alimentation et la diététique et analogues. Il est connu de fabriquer la L-lysine par fermentation de souches de mutants obtenues à partir de certains microorganismes appartenant, par exemple, aux genres Corynebacterium, Brevibacterlum, Àrthrobacter, Bacillus, etc. De telles souches de mutants comprennent des souches de mutants requérant, par exemple, (1) de l'homosérine ou (2) de la méthionine et thréonine, etc. pour leur croissance et des souches de mutants résistantes à diverses substances. Parmi les procédés connus pour la fabrication de la Lysine, la publication de brevet Japonais 4993/84 décrit un procédé de fabrication de L-lysine caractérisé par la culture d'une souche.de mutant producteur de L-lysine du genre Brevibacterluin ou Corynebacterfum, dans un milieu de culture -pour former et accumuler la L-lysine et isoler la L-lysine résultante du milieu, ladite souche de mutant étant résistante aux analogues de la lysine ainsi qu'à au moins un composé ayant un squelette quinone ou quinoléine. Dans cet art antérieur, (A) l'expression "analogues de la lysine" désigne, par exemple, les S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine, a- halogénocaprolactame, ;-méthyllysine et analogues, ayant les caractéristiques suivantes (1) leur structure chimique est similaire à la structure chimique de la lysine; (2) ils sont capables d'inhiber la croissance des micro organismes des genres Brevibacterium, Corynebacterium et analogues; et (3) l'inhibition sus-mentionnée est supprimée par addition de L-lysine au milieu de culture; (B) les composés ayant un squelette quinone ou quinoléine sont exemplifiés par la 8-hydroxyquinoléine, l'acide 8-hydroxyquinoléine- 5-sulfonique, la 5,8-dioxy-6-amino-7-chloroquinoléine, la 1,4naphtoquinone, la 1,2-naphtoquinone, la 2,3-dichloronaphtoquinone, la 5-carboxy-3'-thia-6'-aza-2,3-cyclohéxènonenaphtalène-1,4-quinone, la B,,B,-bis Q-chloro-1,4- naphto- 2- qu inonyl) -L- lysine etla granaticine, qui présentent les caractéristiques suivantes (1) ils sont capables d'inhiber la croissance de micro organismes des genres Brevibacterfum et Corynebacterium; et (2) l'inhibition sus-mentionnée est au moins partiellement supprimée par addition de L-leucine au milieu de culture. Il existe un besoin constant de fournir un procède pour la production de L-lysine à faible coût et à l'échelle industrielle eu égard au fait que la L-lysine est très importante dans divers buts. La présente invention repose sur la découverte de la Demanderesse que la L-lysine peut être obtenue avec un rendement plus élevé en utilisant une souche de mutant du genre Corynebac=terium, Brevibacterium, Xicrobacterlum ou Artbrobacter, qui a été rendue résistante à la ss-naphtoquinoléine. OMET DE L'IJVEJTIOJ La présente invention concerne un procédé pour la préparation. de L-lysine par fermentation d'un microorganisme capable de procure de la lysine et choisi parmi l'ensemble comprenant les genres Corynebacterium, Brevfbacterfum, Xlorobacteriuin et Artnrobacter, dans un milieu de culture, suivant lequel on forme et accumule la L-lysine dans le milieu de culture et isole la L-lysine résultante dudit milieu de culture, caractérisé en ce que ledit microorganisme est résistant å la B-naphtoquinoléine. On a trouvé que l'inhibition de la croissance du microorganisme peut ne pas être éliminée même par addition de Lleucine au milieu de culture à la différence des composés quinones et quinoléines décrits dans ladite publication de brevet japonais 4993/84 précitée, å partir de laquelle il est clair que la ss- naphtoquinoléine n'est pas équivalente aux diverses quinanes et quinoléines des types connus décrits dans ladite publication japonaise en ce qui concerne l'inhibition de la croissance de microorganismes producteurs de L-lysine. Des exemples de microorganismes appartenant aux genres Corynebacterium, Brevibacterium, ETicrobacterlum ou Arthrobacter en tant que microorganismes de départ pour induire la souche mutante suivant l'invention, peuvent être les souches naturelles ou mutantes et comprennent, par exemple, des microorganismes qui requièrent divers nutriments (par exemple, au moins un élément choisi parmi l'homosérine, la méthionine, la thréonine, l'histidine, la proline, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la sérine, l'acide glutamique, l'acide pantothénique, le nicotinamide, l'acide acétique, l'adènine, l'hypoxanthine et l'inositol), des microorganismes qui sont résistants à divers aminoacides analogues (par exemple, au moins un élément choisi parmi les analogues de la lysine, de la thréonine, de la méthionine, de la leucine, de l'isoleucine, de la valine, de l'acide aspartique, du tryptophane et de l'histidine) et des microorganismes qui sont résistants à diverses autres substances (par exemple, au moins un élément choisi parmi les divers antibiotiques, les drogues "sulfa", divers aminoacides, composés quinone et quinoléine des types connus). Il est possible d'obtenir . une souche mutante qui peut être utilisée pour le but de la présente invention en conférant une résistance vis-à-vis de la 8-naphtoquinoléine aux souches parentes sus-mentionnées capables de produire la L-lysine. En variante, il est possible d'obtenir la souche mutante désirée capable de produire la L-lysine suivant l'invention en conférant la résistance sus-visée à divers nutriments, la résistance à divers analogues d'aminoacides ou la résistance à divers autres substances à un microorganisme résistant à la ss-naphtoquinoleine. Des exemples préférés de microorganismes qui peuvent être utilisés en tant que souches parentes pour l'obtention de la souche mutante de la présente invention comprennent les Corynebacterium glutamique ATCC 13032, Corynebacterfum glutamfcum H-9149 (FERS BP-158), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Brevfbacterium lactofennentum ATCC 13869 et Brevibacterluni flavum ATCC 14067, tous étant capables de produire de la L-lysine par fermentation. La souche mutante utilisable selon le but de itinvention peut être obtenue selon une méthode classique utilisée pour l'induction de souches mutantes telles que, par exemple, irradiation par rayonnements UV, traitement chimique, notamment au moyen de - méthyl-N'-nitro-s-nitrosoguanidine et analogues. La souche mutante désirée du microorganisme soumis à mutation - par isolation de la souche mutante que l'on a fait croître sur un milieu approprié, par exemple, un milieu minimal sur plaque d'agar contenant de la ss- naphtoquinoléine à une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la souche parente ( par exemple, plus de 40 ug/ml), eu égard à la résistance A la ss-naphtoquinolline et à la production de L-lysine.La souche microbienne mutante Corynebacterium glutamfoum H-4412 résistante a la ss-naphtoquinoléine, induite par mutation de la souche parente naturelle H-3149 a été déposée auprès du Bikoken (Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology), qui est un organisme gouvernemental japonais, et a reçu le numéro de dépôt FERA 3P-1O69 le 27 mai 1986. Comme milieu pour mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention, il est possible d'utiliser des milieux synthétiques et organiques contenant des quantités appropriées de sources assimilables de carbone et d'azote, des substances minérales et divers autres nutriments requis pour la croissance du microorganisme. Les sources préférées de carbone comprennent, par exemple, le glucose, le fructose, le sorbitol, le glycérol, le saccharose, l'amidon, les hydrolysats d'amidon, les molasses, les Jus de fruits et divers autres carbohydrates, l'acide acétique, l'acide fumarique, l'acide lactique, l'acide maléique, et d'autres acides organiques, bien qu'il soit possible d'utiliser, si cela est souhaité, l'éthanol, le méthanol et d'autres alcools. Les sources préférées d'azote comprennent, par exemple, l'ammoniac, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium et divers autres sels d'ammonium d'acide mineraux, l'urée, les amines et autres composés contenant de l'azote les peptones, extrait de viande, extrait de levure, extrait de céréales ("corn steep liquor"), les hydrolysats de caséine, les hydrolysats de farine de soJa, corps cellulaires microbiens de microorganismes fermentés et leur hydrolysat, et analogues. Les substances minérales préférées sont notamment le monophosphate de potassium, le diphosphate de potassium, le phosphate de magnésium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc. Le milieu peut, si cela est souhaité, contenir une quantité appropriée des nutriments spécialement requis pour la croissance des microorganismes utilisés. Dans quelques cas, ces nutriments seront présents dans les sources sus-mentionnées contenant naturellement de l'azote. Dans d'autres cas, la production en L-lysine peut être améliorée par addition au milieu de certains additifs tels que, par exemple, divers antibiotiques, l'acide a-aminolactique, la cystine, la leucine, la liqueur de fermentation de la leucine, l'acide aspartique, l'acide glutamique et analogues. La culture peut être réalisée dans des conditions aérobies, par exemple, sous agitation ou par culture immergée avec aération et agitation, généralement à une température de 20-40- C à un pH de 3-9 (de préférence à pH sensiblement neutre) bien qu'il soit possible de mettre en oeuvre la culture selon d'autres conditions pour autant que le microorganisme puisse croître. Le pH du milieu peut etre ajusté, par exemple, par addition de carbonate de calcium, d'urée d'une solution d'un acide ou d'une base, d'un agent régulateur de pH et analogues. De façon usuelle, la culture est mise en oeuvre pendant une durée de 1 à 6 Jours qui est suffisante pour former et accumuler la L-lysine dans le milieu de culture. Quand la culture est achevée, on préfère écarter les corps cellulaires microbiens et autres précipités du milieu de culture. La L-lysine peut être isolée du surnageant selon une méthode classique, par exemple, par traitement au moyen d'une résine échangeuse d'ions, par concentration, par adsorption, par relargage, etc. Si désiré, on peut isoler la L-lysine des corps cellulaires microbiens selon uneméthode conventionnelle. De nombreux essais ont mis en évidence que l'on peut obtenir une augmentation du rendement de la production en L-lysine d'environ 10-25 % suivant le procédé de l'invention. Les exemples donnés ci-après illustrent l'invention de façon nullement limitative. EXEMPLE 1 On obtient la souche mutante Corynebacterivia glutamicum H4412 productrice de L-lysine et résistante à la ss-naphtoquinoléine selon la méthode suivante. Le Corynebacterium glutamicum H-3149 (FERS BP-158; souche naturelle de microorganisme résistante aux thialysine, rifampicine, streptomycine et 6-azauracil) que l'on utilise comme souche parente dans une solution tamponnée (pH 6,0) de 0,1E Tris-acide maléique à la concentration de 108 cellulestml, à laquelle on aJoute la N- méthyl-N'-nitro-F-nitrosoguanidine Jusqu'à une concentration finale de 0,2 mg/ml.On laisse la suspension cellulaire reposer à la température ambiante pendant 0,5 h, puis on l'enduit sur une plaque d'agar ayant un milieu minimal de composition suivante qui contient de la ss-naphtoquinoléine A une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la souche parente (40 pg/ml). Après culture à 30' C pendant 3 jours, la souche mutante désirée est séparée des colonies, qui se sont developpées, par rapport à la résistance à la ss-naphtoquinoléine. Elle a été identifiée en tant que Corynebacterlum glutamicuin H-4412. Cette souche mutante est nettement différente de la souche parente H-3149 eu égard à la résistance d la ss-naphtoquinoléine et à une meilleure productibilité en L-lysine comme indiqué dans le tableau I ci-après. Composition du milieu minimal (plaque d'agar) : Glucose 10 g/l; NH4Cl 1 g/l; urée 2 g/l; KH2PO4 1 g/l; K2HPOd 3 g/l; XgSO4,7H=O 0,4 g/l; FeSO4,7H2O 10 mg/l; MnSO4,4H2O 4 mg/l; biotine 50 pg/l; acide nicotinique 5 mg/l; ZnSO4,7H20 1 mg/l; CuSO4, 5H2O lmg/l; (NH4)6Mo7O24,4H2O lmg/l; agar 2X (pH 7,0). TABLEAU I ss-naphtoquinone ( g/ml) O 30 40 Souche H-3149 ++ + Souche H-4412 ++ ++ + Notes : ++ = croissance complète + = croissance faible - = pas de croissance Exemple 2 On place la souche Corynebacterium glutamlcum H-4412 (FERM BP-1069) sur un milieu d'ensemencement (20 ml) dans un Erlenmeyer de 300 ml, ledit milieu ayant la composition suivante : glucose 40 g/l, urée 3 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, K2HPO4 0,5 g/l, XgS04î7H-0 0,5 g/l, biotine 50 ug/l, peptone 20 g/l et extrait de levure 5 g/l (pK 7,2). Après 24 h sous agitation (200 tours par minute) à 30' C la culture (2 ml) est transféree dans un Erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu (20 ml; pH 7,2) ayant la composition suivante molasses (100 g/l; concentration calculée en glucose), sulfate d'ammonium (40 g/l), KH2POo (0,5 g/l), MgSO4,7H2O (0,5 g/l) et CaCO (30 g/l) pour nouvelle culture à 32' C pendant 4 jours sous agitation (220 tours par minute). Après la fin de la culture, la Llysine qui s'est accumulée dans le milieu représente 52 g/l de chlorhydrate de L-lysine (détermination selon la méthode par réaction colorée au moyen de cuivre/ninhydrine). Par comparaison, la souche parente H-3149 cultivée comme décrit ci-dessus donne 44 g/l de chlorhydrate de L-lysine. Le bouillon de culture résultant (1 litre) est centrifugé pour obtenir le surnageant. Après ajustement du pH à 1,5 au moyen d'acide sulfurique, on fait passer le surnageant à travers une colonne garnie de Diaion SK-1B (sous forme H-; il s'agit d'une résine échangeuse d'ions fortement acide fabriquée par la société dite XITSUBISHI KASEI KOGYO K.K. de Tokyo) pour adsorber la L-lysine sur la résine. On lave la colonne à l'eau et élue au moyen d'ammoniaque 2N pour obtenir des fractions contenant de la lysine qui sont recueillies, combinées et concentrées. Après ajustement du pH à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique, on refroidit la solution concentrée tout en ajoutant de l'méthanol de façon à obtenir des cristaux de L- lysine (41 g). REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de L-lysine par fermentation d'un microorganisme capable de produire de la L-lysine et choisi parmi l'ensemble comprenant les genres Corynebacterlum, Brevibacterium, Xicrobacterium et Artirobacter, dans un milieu de culture, suivant lequel on forme et accumule la L-lysine dans le milieu de culture et isole la L-lysine résultante dudit milieu de culture, caractérisé en ce que ledit microorganisme est résistant à la ss-naphtoquinoléine. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la culture dudit microorganisme est effectuée à une température de 20-40 C C à un pH de 3-9 pendant 1 à 6 jours. 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le microorganisme est la souche Corynebacterfum glutamfoum H-4412 (FERX BP-1069).