Brevet FR2608926A1 — publié le 19880701

La babésiose bovine est une importante maladie du bétail qui affecte annuellement environ 100 millions de têtes de bétail. I1 existe trois principales espèces qui causent la maladie, à savoir Babesia bovis et B. bigemina dansles régions tropicales etsemi-tropicales, par exemple l'Afrique, l'Australie etl'Amérique duSud, et Babesia divergens dans les régions tempérées de l'hémisphère nord o la maladie peut se rencontrer dans certaines régions de tous les pays du nord de la Méditerranée. Des vaccins au sang brut, préparés à partir de parasites légèrement atté- nués par rapide passage chez des veaux splénectomisés, sont employés en Australie, en Afrique du Sud et en Amérique du Sud, mais ils présentent de nombreux inconvénients, par exemple (a) ils peuvent déclencher la maladie dans certains cas, (b) ils provoquent la formation d'anticorps dirigés contre des composants du sang et (c) leur durée de conser- vation est courte. En conséquence, de gros efforts ont été faits dans certains pays (notamment en Australie) pour pro- duire un vaccin fiable, inactivé ou recombinant, contre B. bovis. Aucun vaccin n'est disponible contre B. divergens. Des travaux initiaux rapportés par D. Lewis, R.E. Purnell, D. Brocklesby, Research in Veterinary Science 26, 220-222, 1979, ont porté sur du sang infecté irradié par des rayons gamma (30 kilorads) en utilisant une source au cobalt 60. Les premières expériences, tant en laboratoire que sur le terrain, rapportées par S.M. Taylor, J. Kenny, R.E. Purnell, D. Lewis, Veterinary Records 106, 167-170, 1980, et S.M. Taylor, J. Kenny, R. E. Purnell, D. Lewis, Veterinary Records 106, 385-387, 1980, effectuées sur du bétail jeune ont été encourageantes, mais d'autres expé- riences rapportées par S.M. Taylor, J. Kenny, T. Mallon, Journal of Comparative Pathology 93, 391-396, 1983, ont montré que (a) un tel vaccin au sang irradié était instable pour un emploi chez le bétail adulte et (b) l'atténuation de B. divergens par un passage ne réduisait pas sa viru- lence. Ces défauts ont conduit à une focalisation des efforts en vue d'isoler de B. divergens un antigène protecteur qui puisse être utilisé dans un vaccin inactivé ou recombinant. Une série de purifications et d'essais de vaccins ont été effectués tant en laboratoire que sur le terrain, comme le rapportent S.M. Taylor, J. Kenny, T. Mallon, Journal of Comparative Pathology 93, 423-428, 1983, S.M. Taylor, J. Kenny, T.R. Mallon, C.T. Elliott, Veterinary Parasitology 16, 235-242, 1984, et S.M. Taylor, C.T. Elliott, J. Kenny, Journal of Comparative Pathology 96, 101-107, 1986, et ont montré qu'une immunité effective pouvait être induite. Selon un premier aspect de la présente invention, il est fourni un antigène de Babesia divergens, caractérisé en ce que son pI est de 6,3 et son poids moléculaire sur une colonne d'exclusion est de 47 800 10 % et en ce qu'il comprend une ou plusieurs protéines ayant un poids molécu- laire de 54 000 10 % après électrophorèse sur gel et formant deux ou plusieurs peptides ayant des poids moléculaires de 24 000 10 % et de 13 000 10 % après clivage par le dodécylsulfonate de sodium. Selon un deuxième aspect de la présente invention, il est fourni un vaccin contre Babesia divergens, comprenant une quantité efficace d'un antigène tel que défini ci-dessus. Selon un troisième aspect de la présente invention, il est fourni un procédé de préparation d'un antigène de Babesia divergens, sensiblement tel que décrit ci-après. L'invention est davantage illustrée par l'exemple suivant qui décrit la préparation d'un vaccin conformément à la présente invention. EXEMPLE L'antigène est préparé par extraction à partir de sang de boeuf fortement infecté par Babesia divergens. Les étapes indiquées ci-dessous sont suivies pour l'extraction. (a) On recueille plusieurs litres de sang infecté et on enlève les thrombocytes par défibrination, après quoi on rejette les thrombocytes. (b) On lave et concentre les érythrocytes infectés res- tants par centrifugations répétées dans une solution saline normale. (c) On met les érythrocytes concentrés en suspen- sion dans NaCl à 0,55 %. Il en résulte la lyse des érythro- cytes non infectés. (d) On centrifuge de nouveau les cellules res- tantes à 2100 q pour séparer tous les érythrocytes non infectés restants des érythrocytes infectés. Une rotation lente agit sur les premiers qui forment un culot. On retire les érythrocytes infectés restant en suspension, puis on les concentre et les lave par centrifugation à 4200 g. (e) On lyse les cellules infectées par sonication. (f) On soumet le lysat brut à une électrofocali- sation préparative à large plage (pH 3-10). Toutes les pro- téines du genre hémoglobine migrent vers la moitié alcaline du gel, et les antigènes vers la zone acide. (g) On sépare par élution les antigènes de la portion acide du gel et les soumet à une électrofocalisa- tion préparative à plage étroite (pH 3,5-7,7). On divise le gel en dix fractions. Une analyse immunologique par taches selon la méthode de Western a montré que le principal anti- gène protecteur est présent dans les fractions 1-5, que l'on recueille. (h) On rassemble les fractions 1-5 et les fait passer dans une colonne d'exclusion pour chromatographie en phase liquide à haute pression. Il en résulte cinq pics (y compris les ampholines). La protéine antigénique a été identifiée dans le pic 1 avec un poids moléculaire de 47 800 daltons, et on peut l'isoler en recueillant le pic correspondant. L'antigène a été caractérisé par les paramètres suivants: (a) pI 6,3. (b) Poids moléculaire sur une colonne d'exclusion de 47 800 10 %. (c) Après électrophorèse sur gel, la protéine a un poids moléculaire de 54 000 10 % et après clivage par le dodécylsulfate de sodium, des composés de plus petit poids moléculaire sont formés, notamment un ou plusieurs pep- tides ayant un poids moléculaire de 24 000 10 % et un ou plusieurs peptides ayant un poids moléculaire de 13 000 10 %. On a mélangé la protéine avec 1 mg d'un adjuvant de type saponine (Quil A - Superfos) et on a constaté qu'elle induisait une protection contre l'infection par toutes les souches testées jusqu'à présent de Babesia divergens. L'antigène peut être employé à des fins diagnos- tiques dans des épreuves selon la méthode ELISA pour la recherche d'anticorps dirigés contre B. divergens. REVENDICATIONS 1. Antigène de Babesia diveraens, caractérisé en ce que son pI est de 6,3 et son poids moléculaire sur une colonne d'exclusion est de 47 800 10 %, et en ce qu'il comprend une ou plusieurs protéines ayant un poids molécu- laire de 54 000 10 % après électrophorèse sur gel et for- mant deux ou plusieurs peptides ayant des poids moléculaires de 24 000 10 % et de 13 000 10 % après clivage par le dodécylsulfate de sodium. 2. Antigène de Babesia divergens selon la reven- dication 1, caractérisé en ce qu'il est extrait de sang de bovin infecté. 3. Procédé pour produire un antigène de Babesia diveraens, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre du sang infecté par Babesia divergens à une électrofocalisation et à extraire l'antigène d'une zone acide qui en résulte. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules non infectées sont séparées des cel- lules infectées avant l'électrofocalisation. 5. Procédé selon la revendication 3 ou la revendi- cation 4, caractérisé en ce que le sang est lysé avant l'électrofocalisation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 5, caractérisé en ce que l'électrofocalisation est effectuée dans la plage de pH de 3 à 10. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 6, caractérisé en ce que les antigènes sont extraits par une électrofocalisation effectuée dans la plage de pH de 3,5 à 7,7. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 7, caractérisé en ce que l'antigène a un pI de 6,3 et un poids moléculaire de 47 800 10 %. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 8, caractérisé en ce que l'antigène comprend une ou plusieurs protéines ayant un poids moléculaire de 54 000 10 % après électrophorèse sur gel. 10. Vaccin contre Babesia divergens, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène tel que revendiqué dans la revendication 1 ou 2 ou tel que produit par le procédé reven- diqué dans l'une quelconque des revendications 3 à 10.