Brevet FR2610113A1 — publié le 19880729

Le domaine de la présente invention est, de manière générale celui de l'emploi de complexes de coordination carbonylés comme biosondes froides en utilisant la propriété unique des complexes des métaux carbonyles, à savoir l'existence de bandes IR; CO extrêmement intenses dans dans la région 2 libre 850 cl 1, en fait dans la "fenêtre" laissée libre dans les protéines. Cette particularité rend, en conséquence, les dérivés ainsi marqués utilisables pour toute analyse de mélanges de composés naturels. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-FT), convenablement adaptée, trouve idéalement à s'appliquer dans ce type de problème. Le développement de la méthode spectrale par IR-FT exige la synthèse spécifique de bioréactifs organométalliques présentant les meilleures spécifications de bioréactifs possibles. A cet effet, la demande de brevet français n" 82 16024 proposait des complexes d'oestrogène de métaux carbonyles comme biosondes froides pour le dosage de récepteurs hormonaux par IR-FT. La présente invention offre de nouveaux types de biosondes froides à base de complexes de coordination carbonylés présentant des vibrateurs CO intenses par l'introduction de petits clusters alcynes-métal carbonyle. On obtient ainsi des dérivés organométalliques par alkylation régiosélective à l'aide de carbocations dérivés d'alcynes complexés. Les complexes obtenus avec ces clusters alcynes-métaux carbonyles sont plus stables que ceux obtenus par complexation sans alkylation et s'appliquent à d'autres substances que les complexes d'oestrogène possédant des structures compatibles avec une chimie organique. Cette stabilité accrue permet en effet, comme on le verra plus loin, la synthèse d'antigènes porteurs d'entité alcyne-métal carbonyle. Ainsi, selon la présente invention, s'ouvre un nouveau champ d'application de ces dérivés organométalliques avec, notamment, la détection et le dosage d'anticorps. Plus précisément, les nouveaux types de biosondes froides selon l'invention ne concernent donc plus seulement les complexes d'oestrogènes, comme dans la demande de brevet nO 82 16024 avec le dosage de récepteurs hormonaux. mais encore la détection et le dosage de toxines et substances anabolisantes. Blen entendu, les oestrogènes synthétisés peuvent également servir d'antigènes. Parmi ces substances possédant des structures compatibles avec une chimie organométallique se trouvent, en effet, les mycotoxines alimentaires, en particulier celles de la série des zéranol, zéralone zéaralénol, zéaralénone. Ces substances souffrent de la limite des méthodes analytiques actuelles, soit en raison de seuils de détection trop élevés, soit de limitations légales liées à l'usage de la radioactivité. Le zéranol est un anabolisant utilisé pour la croissance des animaux dont la CEE prévoit la prochaine interdiction. L'efficacité d'une telle mesure dépend des moyens de contrôle dont on pourra disposer pour vérifier que ces mesures d'interdiction sont réellement appliquées. L'utilisation de l'lR-FT peut constituer une méthode originale, simple ét efficace si l'on sait fabriquer les antigènes organométalliques susceptibles d'être "reconnus" par des anticorps anti-anabolisants. Ces dosages requièrent des marquages judicieux de ces substrats par alkylation sélective à l'aide de cations organométalliques. Le cas de la zéaralénone et de ses dérivés illustre également parfaitement les considérations ci-dessus. Ce produit présente une basse toxicité aiguë. Il est utilisé avec ses dérivés dans l'élevage d'animaux à cause de ses effets oestrogéniques et anabolisants. En raison de sa persistance et de son transport dans la viande, cet usage de la zéaralénone et de ses analogues est source de préoccupations. De plus, la détection aussi bien que le dosage souffrent de sensibilités trop basses (2 000 ng/kg dans le maîs et le blé, 10 000 ng/kg dans le lait concentré) qui rendent difficile le contrôle. La zéaralénone (a) et le zéaralénol (b) présentent les structures suivantes Tandis que la zéaralénone (a) pollue naturellement- les céréales humides, le zéaralénol (b) anabolisant oestrogène autorisé, est obtenu par réduction catalytique de cette mycotoxine (a). L'emploi du zéaralénol dans les élevages de veaux, d'agneaux et de poulets doit être réglémenté en France et dans la CEE où des commissions ont pour objectifs de déterminer les seuils d'action toxique et hormonale de ce produit et de proposer des méthodes analytiques de contrôle ; la finalité étant la santé du consommateur. Un dosage radio-immunologique est envisageable pour mesurer les taux de zéaralénol sérique chez des enfants atteints de maturité sexuelle précoce à la suite d'une alimentation ainsi contaminée. Le seuil de détection actuel étant de 0,5 mg/ml, il est souhaitable d'atteindre 25 pg/ml, mais la méthode radio-immunologique nécessite pour la détection de traces l'utilisation d'anticorps et de traceurs radioactifs à haute activité spécifique difficile d'accès. C'est pourquoi la présente invention propose donc un nouveau dosage de très faibles quantités de substances d'intérêt biologique telles que, par exemple, du zéaralanol atteignant cette sensibilité et évitant l'appel à la radioactivité dont les inconvénients ont été énumérés plus haut. La chimie des métaux carbonyles apporte une réponse inédite à ce problème. Le but est de réaliser à moindre coût, avec de meilleures sensibilité et répétabilité, un dosage simple par exemple du zéaralanol dans le sérum, les tissus animaux et les aliments. Cette démarche est directement transposable aux autres mycotoxines alimentaires. L'introduction de clusters alcynes-métal carbonyle permet de synthétiser des bioréactifs organométalliques présentant, outre une bonne stabilité, un pouvoir de reconnaissance spécifique par rapport aux anticorps dans le cas d'infrarouge "immuno-assay" (IR-IA) ou aux récepteurs dans le cas de dosages hormonaux, ansi que des vibrateurs CO intenses. Mais, ces clusters offrent, de plus, la possibilité d'une alkylation sélective sur des fonctions éthers d'énols par rapport à un noyau aromatique activé par des substituants donneurs, notamment en utilisant un cation organométallique complexé en présence d'hexaméthyldisilazane et, partant, la possibilité de déprotection finale de la fonction phénol. En outre, ces clusters offrent la possibilité de décomplexation de précurséurs alcynes-cobalt carbonyle, ce qui permet d'accéder, à partir du dérivé acétylénique libre, à d'autres complexes métaux carbonyles des groupes VI, Vll, Vlll, IX du~ Tableau Périodique et donc d'utiliser ces biosondes froides en analyse. L'invention a donc pour objet des complexes de bioréactifs complexés par un composé organométallique. On entend par "bioréactif" toute substance d'intérêt biologique. Selon une caractéristique essentielle de l'invention, le composé organométallique comporte un cluster alcyne de métal de transition carbonyle. Avantageusement, l'alcyne consiste en un dérivé proparg le, celui-ci donnant des cations particulièrement alkylants et stables. Outre les oestrogènes et déprisés d'oestrogène choisis parmi les oestradiols, oestrones et leurs dérivés de formules sont donc également particulièrement intéressants, selon l'invention, des toxines et particulièrement les zéranol, zéralone, zéaralénone, zéaralanol et leurs dérivés de formules 1, II, 111 et IV respectivement dans lesquelles R et R' sont des radicaux protecteurs ou un groupement hydroxaîcoxy. Comme cela a été indiqué précédemment, il est possible d'utiliser des dérivés de ces composés. En particulier, il est possible, si cela est nécessaire, de protéger certaines des fonctions hydroxy afin d'améliorer la stabilité des composés, par exemple par éthérification à l'aide de déridés de type silane ou par des groupements alkyle ou alkoxf en C1 à C7. plus particulièrement en C1 pour les dérivés de l'oestradiol et en C14 et C16 pour les dérivés des zéranol et zéaralénol. Se sont révélés particulièrement intéressants, les composés lorsque R est un radical silyloxy ou un radical HO(CH2)n, n étant compris entre 1 et 7. Dans la limite de la définition générale, il est possible d'utiliser, dans les composés selon l'invention, un composé organométallique de métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, l'osmium. Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment CO, CS, CSe, CNR1, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényle, R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5 et R2, R3, R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2C1)2. Les composés métaux-carbonyles peuvent comporter plusieurs métaux et jusqu'à 12 ligands. La complexation selon l'invention peut avoir lieu sur le noyau aromatique ou en alpha de la fonction cétone ou du radical hydroxy libre. Pour ce faire, I'invention a également pour objet un procédé de préparation de complexe de bioréactifs, caractérisé en ce qu'on fait réagir le bioréactii avec un cation alcynique complexé par un composé de métaux-carbonyles en présence d'acide tétrafluoroborique. Mais, de manière très intéressante, la complexation a lieu sélectivement en alpha de la fonction cétone ou du radical hydroxy libre par rapport au noyau aromatique et de manière stéréospécifique. Pour ce faire, on transforme la fonction cétone sous forme d'éther d'énol. Avantageusement, on fait réagir la fonction éther d'énol sur un cation alcyne-métal carbonyle en présence d'hexaméthx Idisilazane (HMDS). Dans ces procédés, un solvant avantageux est le chlorure de méthylène. Selon la présente invention, on peut procéder à une décomplexation d'un premier composé de métaux-carbonyles sur la triple liaison C-C, puis une recomplexation en un deuxième complexe d'oestrogène avec un deuxième composé de métaux-carbonyles sur la triple liaison C-C. Pour obtenir une complexation en alpha du radical hybroxy libre, on peut procéder à une décomplexation de la triple liaison C-C d'un premier complexe d'un composé de métaux-carbonyles en alpha d'une fonction cétone, puis une réduction de la fonction cétone en alcool, puis une recomplexation de la triple liaison C-C en alpha du radical hydroxy libre. La décomplexation de la triple liaison du complexe a lieu par action de sels ferriques dans l'éthanol. La complexation selon l'invention des dérivés zéranol et zéaralénol peut également avoir lieu en position 7. Pour ce faire, on fait réagir la zéralone ou zéaralénone sur un composé organomagnésien acétylénique pour obtenir un éthynyl zéranol ou zéaralénol, on libère les fonctions phénols, puis on complexe au niveau de la triple liaison C-C par un métal-carbonyle. II est possible aussi de fixer une triple liaison éloignée de plusieurs atomes de la position 7 en transformant la fonction cétone de la zéralone et de la zéaralénone en oxime acide et en effectuant un couplage avec l'amine propargylique. La complexation de ces antigènes conduit à des antigènes métaux-carbonyles avec des dérivés, par exemple, du Co, Mo, W. Os. L'invention a également pour objet l'application des complexes obtenus pour des dosages d'anticorps par IR-IA et de récepteurs biologiques par la méthode déjà décrite dans le brevet n 82 16024. L'invention sera maintenant explicitée par les exemples suivants et la figure 1 qui représente le spectre IR du produit 28b. EXEMPLE I SYNTHESE SELECTIVE DE BIOREACTIFS 191ETAEX CARBON'd LE9 DE L'OESTRADIOL EN POSITION 2,4 A L'AIDE DE CATIONS PROPARGYLIQUES CONlPLEXES L'expérience montre qu'il est nécessaire de protéger la fonction phénol -pour obtenir des produits suffisamment stables pour être utilisés dans les conditions des tests biologiques. On a choisi le groupe protecteur propanol-l qui conduit au dérivé qui a un haut pouvoir de reconnaissance vis à vis des récepteurs de I'oestradiol (RBA - 35 96). A partir de (2) la propargylation par le cation in situ se produit en 2 et 4 avec un bon rendement. On a utilisé les cations propargyliques dicobalt hexacarbonyle. La propargylation conduit aux dérivés organométalliques (3) et (4) Dans un tube de Schlenck, préalablement séché et purgé par de l'argon, on introduit 1,6 cm3 du complexe éthéré de l'acide tétrafluoroborique et 3 cm3 d'éther dialkylique (préalablement distillé sur du sodium et de la benzophénone). On ajoute alors goutte à goutte une solution de 0,22 g d'alcool propargylique dicobalt hexacarbonyle dans 3 cm3 d'éther éthylique. Il se forme une huile rouge insoluble.On additionne alors goutte à goutte 0,2 g (0,6.10 3 mol.) de (2) en solution dans 5 cm3 de chlorure de méthylène (préalablement distillé sur hydrure de calcium). Après 2 à 3 heures, l'ensemble forme une solution rouge brique, indiquant que tout le cation formé a réagi. Celle-ci est lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium et évaporation du solvant, on obtient 0,4 g d'une huile rouge. Les produits (3) et (4) (R = H) sont séparés par chromatographie sur plaque de silice (éluant CH2CH2/MeOH: 98/2). Les produits (3) et (4) sont obtenus en proportions équivalentes avec un rendement global de 50 9O. IR (3) et (4) CH2C12 CO 2083, 2020, 2005, 1990 cm-1 RMN CDCl3 (3) lH(s) 7,08 ; lH(s) 6,60 ; lH(s) 6,00 ; 2H(s) 4,07 ppm (4) lH(d) 7,27 ; 7,17 ; 1H(d) 6,80 ; 6,70 ; 1H(s) 6,00 ; 2H(s) 4,20 ppm Masse sur le produit décomplexé (3) M 368 (4) M 368. Le Schéma réactionnel est donc le suivant Co2(CO)6 1. HOCH2-C CR (2) HBF4-éther (3) et (4) 2. CH2Cl2 3. OH en effet, R-C tC-CH2-CH éther R C=C-CH2 +BF4 Co2(CO)6 La décomplexation de (3) et (4) par des sels ferriques en solution dans I'éthanol conduit aux produits (3') et (4') : Ces dérivés acétyléniques permettent alors d'accéder à d'autres types de composés métaux carbonyles dérivés du molybdène h1O2Cp2(CO)6 ou de I'osmium Os3(CO)12. par exemple. EXEMPLE 2 PROPARGYLATIQN SELECTIVE DE LA POSITION 16 alpha' DE L'OESTRADIOL Dans cette demande de brevet, la position alpha désigne une régiospécificité par rapport à un carbone adjacent, et alpha' ou beta' concernent des stéréospécificités différentes sur un carbone et désignent des faces. En faisant réagir en suspension dans le chlorure de méthylène le cation propargylique dicobalt hexacarbonyle sur l'éther d'énol sililé d'un dérivé protégé de l'oestrone (5) OSiMe3 16 4 avec, par exemple, RO 2 (5) R bu(Me)2Si (5a) -CH3 (5b) -CH2OCH3 (5c) on obtient les produits résultant d'une propargylation compétit.ve en position 2, 4, 16 : (6) (7) (8) Pour (5a) (5b) les produits (6), (7), (8) sont obtenus en-égales proportions. Dans le cas de (5c) seul le produit (6) est formé. Or, le groupe protecteur méthylméthoxy-éther est particulièrement intéressant puisqu'il permet de retrouver facilement la fonction phénol en milieu acide sans toucher au cluster.On a donc cherché une méthode sélective d'alkylation en 16 en présence de ce groupe protecteur du phénol de l'oestrone. Les ions carboniums (9) réagissent facilement avec les amines primaires et secondaires, même encombrées, et sur les amines aromatiques comme la pyridine. Il a donc été essayé d'utiliser le cation (10) comme agent de propargylation sélective des éthers d'énols. Ces expériences ont échoué pour la tertiobutylamine, la diisopropylamine, la pyridine. Par contre, avec l'hexaméthyldisiîazane (HMDS) on a pu obtenir une réaction très sélective de l'éther d'énol avec un rendement dépassant 50 wO en produit isolé (5). La réaction est régiosélective et stéréospécifique puisque l'orientation de l'attaque conduit exclusivement au produit 16 alpha'. Proparg);lation en position 16 alpha' - obtention de (7) R = CH2OCH3 0,3 g (1,65 mmol.) de Na N(SiMe3)2 sont dissous dans 5 mlde THF (préalablement distillé sur sodium, benzophénone) à température ambiante. 0,24 g (0,75 mmol.) de méthyìméthoxy-éther-oestrone sont ajoutés en solution dans 3 ml de THF. Le mélange est agité 20 minutes puis 0,4 ml de chlorotriméthylsilane sont additionnés. Après 25 minutes, le solvant est évaporé, repris par de l'étherdiéthylique et versé dans de l'eau. La solution éthérée est lavée avec une solution saturée de NaHCO3 puis d l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium, le soldant est évaporé et on obtient une huile jaune. La RMN montre que la transformation en éther d'énol est quasi quantitative et que l'huile contient deux équivalents d'hexaméthyldisilazane. Ce matériau est donc utilisé tel quel pour la réaction de propargylation. Le cation (9) est préparé dans l'éther à partir de 0,24 g (0,75 mmol.) d'alcool propargylique complexé et du complexe éthéré de l'acide tétrailuoroborique. (9) est abondamment lavé à l'éther puis séché sous vide et mis en suspension dans 5 ml de chlorure de méthylène. L'éther d'énol avec Z équivalents d'HMDS est ajouté à 0 C en solution dans 3 ml de chlorure de méthylène. La réaction est immédiate. Après 15 minutes. la solution rouge brique est versée dans de l'eau, lavée axec NaHCC3 puis avec de l'eau jusqu'à pH neutre, séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant est évaporé. En chromatographie de couche mince sur silice on observe une tache rouge majoritaire (Rf 0,50 pour éther 1, pentane 4). Le produit brut est adsorbé sur de la silice (colonne 225 x 35 mm) et élué avec un mélange pentane-éther (5:1). Après que la première fraction colorée soit passée, on change le mélange éluant (pentane-éther 2:1) et on collecte un produit (0,38 g, 8G %) pur par chromatographie sur couche mince. IR CH2C12 CO 2090, 2055, 2020, 2000, 1760 cm-1 RMN 250 MHz CDC13 : 1H 7,21 ppm (d) ; 1H 6,81 (d,d) ; 1H 6.79 (dl 1H 6,07 (s); 2H 5,07 (s); 3H 3,38 (s); 1H 3,31 (d,d); 2H 2,81 (d,d); 1H 2,61 (d,d) ; 1H 2,47(m); 1H 2,3(m); 1H 2,12(m); 4H 1,85(m) 5H 1,43 (m) ; 3H 0;89 (s). Masse M + NH4 + 656 (produit décomplexé) 352 - M + H+ 353 M + NH4+ 370. EXEMPLE 3 RECOMPLEXATION DE (7) Le dérivé (7) est préalablement décomplexé avant que de réduire la fonction cétone en alcool (voir plus loin), le produit résultant (I I) o % cH2-ccH X)* cii2cH R --CH) (b) -CH20CH3 (c) est alors réduit par NaBH4 en milieu alcoolique, cette réaction conduit à deux produits en quantités équivalentes résultant probablement d'une attaque compétitl\e de l'ion hydrure sur les faces alpha' et beta'. Un seul de ces produits, le 160(-propargyl 17 -ol (12) conserve la fonction acétylénique et peut être recomplexé par différents métaux carbonyles, par exemple Co2(CO)g, Mo2Cp2(CO)6, Os3(CO)12, permettant d'obtenir respectivement (16), (17) et (18) R = CH3 (b) Mx(CO)y = -Co2(CO)6 (16) CH2OCH3 (c) -Mo2Cp2(CO)4 (17) -Os3(CO)10 (18) Pour (16c), (17c) et (18c) on obtient facilement l'oestradiol substitué en 16 alpha'. Par traitement en milieu acide (HBF éthanol. eau). on obtient respectivement (19), (25) et (21) Mx(CO)y = -Co2(CO)6 (19) -Mo2Cp2(CO)4 (20) -Os 3(CO) 10 (21) DECOMPLEXATION DE (7) EN (11) Toutes les décomplexations des dérivés alcy nes-métaux- -carbonyles sont effectuées dans les mêmes conditions. On donne à titre d'exemple celle de (7) en (11). 0,19 g de (7) (û,3C mmol.) sont dissous dans 3 ml d'éhter, on ajoute 1 mmol. de nitrate ferrique dans 10 ml d'éthanol et on laisse réagir au réfrigérateur toute une nuit. La solution est diluée avec de l'eau et extraite à l'éther, la solution éthérée est ensuite séchée, le solvant évaporé. Le produit est purifié par chromatographie sur plaque de silice (éluant éther 2, pentane 3). Le rendement est de 80 %. Masse M + H 353 M + NH4+ 370 M+ 352. RMN 250 MHz CDCL3 : 1H 7,19 ppm (d) ; 1H 6,82 (d,d) ; 1H 6,8 (d) 2H 5,15 (d) ; 3H 3,47 (d) ; 2H 2,90 (d,d) ; IH 2,72 (m) ; 1H 2,6 (m) 3H 2,2 à 2,45 (m) ; 4H 2,00 (m) ; 1H 1,94 (t) ; 5H 1,52 ppm (m) 1H 0,96 ppm (s). EXEMPLE 4 OBTENTION Dt 16 alpha' -PROPARGYLDlCOBALT- HEXACARBONYLOESTRADlOL (16) 0,08 g de (11) sont dissous dans 5 ml d'éthanol absolu et on ajoute 0,07 g de NaBH4. Le mélange est agité pendant la nuit. après 16 heures on ajoute de l'eau et on laisse 2 heures. Il apparaît un précipité blanc. Le tout est extrait au chlorure de méthylène, lavé avec une solution d'acide chlorhydrique puis neutralisé et séché. Le solvant est évaporé. Le produit brut est chromatographié sur des plaques de silice (éther I, pentane 1). Deux produits sont séparés. L'un ne présente plus de proton acétylénique en RMN mais 11 y a des protons vinyliques dans le spectre. L'autre présente toujours un proton acétylénique, en infrarouge la bande cétone a disparu. Après 5 jours, le produit acétylénique cristallise (masse M+ 35H M + H 355, M + NH 372), 0,035 g sont dissous dans 1 ml de CH2C12 et 0,045 g de cobalt octacarbonyle sont ajoutés. Après 2 heures le solvant est évaporé, le résidu est repris dans du pentane auquel on additionne quelques gouttes d'éther. La solution est filtrée sur une courte colonne de florisil. Le solvant est évaporé et le produit chromatographié sur plaque de silice (éluant éther). La bande rouge est récupérée (16c). (16c), environ 0,07 g. est dissous dans 3 ml d'un mélange 1:1 éthanol-THF. 5 gouttes de HBF4 Et20 sont ajoutées à la température ambiante, après 10 minutes un produit plus polaire rouge apparaît sur plaque de silice (éluant éther 1, pentane 1). Après 20 heures la réaction est presque complète. Le mélange est versé dans l'eau, extrait au chlorure de méthylène, après séchage on chromatographie sur plaque de silice en éluant à l'éther. La bande rouge majoritaire est récupérée, elle conduit à une huile rouge qui cristallise doucement. Le rendement est de 80 %. RMN 250 MHz (CDC13): 1H 7,07 (d) ; 1H 6,81 (d,d) ; 1H 6,54 (d) ; 1H 6,03 (t) ; 1H 4,54 (s) ; 1H 3,40 (d) ; 1H 3,29 (d,d) ; 1H 2,84 (d,d) 1H 2,82 (q) ; 2H 2,26 (m) ; 3H 1,93 (m) ; 7H (1,7 à 1,2); 3H 0,80 (t). Masse après décomplexation M+ 310. EXEMPLE 5 SYNTHESE D'ANTlGENES ORGANOMETALLIQUES DANS LA SERIE DE L'alpha- ZERANOL (22), DE LA ZERALONE (23) ET DE LA ZEARALENONE (23') A priori la complexation du noyau par un groupe cobalt tricarbonyle paraît l'approche la plus évidente. Cependant son utilisation est limitée par le fait que le produit organométallique résultant n'est pas très stable (il faut alors protéger les fonctions phénols). C'est pourquoi on a orienté le travail sur l'alkylation du noyau par des ions carbéniums organométalliques et l'aîkylatîon sélective des positions alpha de la zeralone (23) et sur la complexation des éthynylzéranol alpha' et beta'. Propargylation du noyau aromatique en 13 et 15 Comme pour l'oestradiol, il faut au préalable protéger la fonction phénol libre pour obtenir des produits stables. Le schéma réactionnel est le suivant Par exemple R - CH3, R' . CH3 (al R - H, R' ; (CH2130H (b) Pour (22a) on obtient (24a) avec l'introduction du groupe propargylique complexé en 13. Pour (22b), la substitution électrophile aromatique se produit en position 13 et 15. Propargylation des positions 6 et 8 La réaction du cation (9) sur l'éther d'énol obtenu à partir de (23), R = CH3, R' = CH3, conduit dans les conditions habituelles à la substitution du noyau aromatique en position 13. Dans les mêmes conditions avec l'éther d'énol dérivé de l'oestrone, on obtient une compétition entre l'attaque sur le noyau et sur l'éther d'énol. La réaction devient régio sélective sur l'éther d'énol en utilisant le cation (9) en présence d'hexaméthyldisilazane. Le schéma réactionnel est le suivant et le mode opératoire est similaire Obtention des éthynvis zéranols alpha' et beta' complexés A partir de (23) avec, par exemple, R = R' = t.but-diméthylsilyl. il est facile d'obtenir les deux éthynyls zéranols protégés alpha' et beta' par action du magnésium acétylénique. Les deux isomères alpha' et beta' sont séparés par chromatographie sur plaque de silice. Les fonctions phénols sont libérées par action du fluorure de potassium. (26) alpha' et beta' peuvent alors être complexés par des métaux carbonyles. Co2(CO)8, Mo2Co2(CO)6, Os3(CO)12 pour donner respectivement (27) alpha', beta', (28) alpha', beta' et (29) alpha', beta'. De la même manière, les composés (24) et (25), après avoir été décomplexés par action de sels ferriques dans l'éthanol, peuvent être recomplexés par des métaux carbonyles du molybdène et de l'osmium. A partir des dérivés 26 alpha et beta complexés par MoCp2(CO)4, on obtient les dérivés (27a et b) résultant de la déshydratation par catalyse acide des alcools acétyléniques complexés Préparation des éthynyls zéranols (26) alpha', beta' 0,32 g de zéralone (23) (I mmol.) en solution dans 2 ml de THF sont ajoutés à une suspension de 100 mg de NaH dans 3 ml de THF. Après une vive effervescence un précipité blanc se forme. On agite 2 heures puis on ajoute 0,6 g de tbume2 SiCI (4 mmol.) en solution dans 2 ml de THF. Il se produit une vigoureuse réaction. Le précipité se dissout et on obtient une suspension laiteuse. Après addition d'eau, le produit est extrait à l'éther, la solution est lavée, séchée et le solvant évaporé. Après plusieurs heures, le produit cristallise.On vérifie par RMN que les deux fonctions phénols sont protégées, le rendement est de 100 %. A I mmol. de l'éther de la TBMS zéralone dissous dans 5 ml de THF on ajoute un excès de Grignard de l'acétylène et laisse à réagir 12 heures. Le mélange réactionnel est additionné dans une solution diluée d'acide chlorhydrique, extraite à l'éther, lavée, séchée. On obtient environ 0,7 g d'une huile jaune, présentant en RMN dans CDCl3 deux signaux pour un proton acétylénique à 2,4 ppm. Sur couche mince de silice (éther 1 pentane 1) on observe deux taches (Rf 0,5 et 0,6). Les deux produits sont séparés sur 6 plaques préparatives de silice (éther I, pentane 1). Le rendement en produits isolés alpha' et beta' est de 66 92. Les fractions phénols sont libérées par action de Bu4N'F en solution dans le THF suivie d'une hydrolyse à l'eau. Masse M+ 346 M + H 347, M + NH4 364. Préparation d'antigènes métallocarbonyles (28a et 28b) dérivés de la zéralone (23a) et de la zéaralénone (23b) Les dérivés (28a et 28b) non complexés sont facilement obtenus à partir des zéralone (23a) et zéaralénone (23b) par action de carboxyméthoxylamine dans la pyridine, I'oxime acide obtenue est alors couplée à l'amine propargylique par la méthode classique (hydroxy succinimide et carbodiimide dans le THF suivi de l'addition de l'amine propargylique en présence de triéthylamine). La complexation est effectuée suivant les méthodes habituelles et les produits purifiés par chromatographie sur colonne de silice (éluant CH2C12) sont identifiés au RMN, IR et masse. EXEMPLE 6 TESTS IMMUNOLOGIQUES On a étudié le comportement des antigènes organométalliques dérivés du zéranol vis-à-vis d'anticorps du zéranol fournis par le Laboratoire de Biochimie de l'Université de Brest (D. Thavenot et R. Morfin, Applied and Environmental Microbiology, 1983, 45, 16-23). Pour cela, on a effectué des courbes de compétition entre le zéranol-3H et des molarités croissantes des dérivés organométalliques (27 et 26). Les résultats montrent que tous les complexes sont compétiteurs du (3H)-zéranol, donc se fixent sur les anticorps. Les pourcentages de réactions croisées obtenues varient entre 17 et 5 %. Ceci indique la possibilité d'utiliser ces antigènes pour le dosage immunologique du zéranol. D'autre part le spectre infra-rouge en micropastille de VBr du complexe 28b est représenté sur la figure . Les bandes caractérlstiques du greffon organométallique apparaissent à 2094, 2051 et 2024 cm . Ces bandes que l'on retrouve dans tous les complexes de ce type sont nettement plus intenses que toutes les autres bandes du spectre et sont situées dans une zone où les protéines n'absorbent pas. METHODOLOGIE DES TESTS BIOLOGIQUES EFFECTUES ET RESULTATS L'affinité des hormones modifiées pour le récepteur de l'oestradiol est déterminée par un test de compétition entre ces hormones et l'oestradiol tritié. Pour cela, des fractions de cytosol (surnageant 105 000Xg) sont incubées en présence d'une concentration fixe d'oestradiol tritié (2.10 9) et de concentrations variables de l'hormone à tester (9 points entre 10 8 et 10 7). On détermine ainsi la valeur de RBA ("Relative Binding Affinity") qui est le rapport X 100 de la concentration d'oestradiol non radioactif déplaçant 50 % de la liaison spécifique de l'oestradiol a son récepteur sur la molarité d'hormone modifiée déplaçant 50 % de cette liaison. Plus la valeur de RBA est élevée plus l'hormone à tester à de l'affinité pour le récepteur de l'oestradiol. Produit RBA 3'(acétylénique en 2) 2,5 % 4'(acétylénique en 4) 2,5 % 3(complexé en 2) 0,001 4(complexé en 4) I,9 % 19(acétylénique en 16) 1,2 % zéranol 32,5 90. REVENDlCATIO I) Complexe constitué d'un bioréactif complexé par un composé organométallique, caractérisé en ce que ledit composé organométalliquc comporte un cluster alcyne-métal carbonyle. 2) Complexe selon la revendication I, caractérisé en ce que l'alcyne est un dérivé propargyle. 3) Complexe selon la revendication I, caractérisé en ce que le bioréactif est un oestrogène ou dérivé d'oestrogène. 4) Complexe selon la revendication I, caractérisé en ce que le bioréactif est une mycotoxine alimentaire. 5) Complexe selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'oestrogène est choisi parmi l'oestradiol, I'oestrone et leurs dérivés. 6) Complexe selon l'une des revendications 1, 2 et 4, caractérisé en ce que la mycotoxine est choisie parmi le zéranol, la zéralone. le zéarélénol, la zéaralone et leurs dérivés. 7) Complexe selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le bioréactif est un oestrogène avec pour formules: dans lesquelles R est un radical protecteur ou un groupement hydroxy alcoxy. 8) Complexe selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que la mycotoxine alimentaire a pour formules dans lesquelles R et R' sont des radicaux protecteurs ou groupements hydroxy alcoxy. 9) Complexe selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que R et R' sont des dérivés du type silane ou des groupements alkyle, alcoxy ou hydroxyalcoxy en C1 à C16. 10) Complexe selon la revendication 7, caractérisé en ce que R et R' sont des groupements alkyle. alcoxy ou hydroxyalcoxy en C1. 11) Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que R et R' sont des groupements alkyle, alcoxy ou hydroxyalcoxy en C14 à C16. 12) Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés des métaux des groupes VI, VII, VILS, IX de la classification périodique. 13) Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés d'un ou plusieurs métaux choisis parmi le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, I'osmium. 14) Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ligands des métaux des composés organométalliques sont choisis parmi CO, CS, CSe, CNR1, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényl, R1 étant un radical alkyle ou -COR5, R2, R3, R4 et R5 étant choisis parmi les radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, et les radicaux alkyle ou alcoxy substitué ou non substitué et les atomes d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2C1)2. 15) Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bioréactif est complexé sur un noyau aromatique, ou en alpha d'une fonction cétone ou d'un radical hydroxy libre. 16) Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bioréactif est complexé sélectivement en alpha de la fonction cétone ou du radical hydroxy libre par rapport au noyau aromatique, et stéréospécifiquement. 17) Complexe selon l'une des revendications 8 à 15, caractérisé en ce qu'il est alkylé-complexé en position 7 du zéranol ou du zéaralénol. 18) Complexe selon l'une des revendications 8 à 15, caractérisé en ce qu'il est alkylé complexé en position 7 de la zéaralénone et la zéralone dont la fonction cétone a été transformée en fonction oxime acide, cette dernière ayant été ensuite couplée avec une amine proparg!- lique. 19) Procédé de préparation de complexes selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir dans un solvant le bioréactif ou un dérivé avec un cati on alcynique complexé par un composé de métaux-carbonyles. 20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le cation alcynique complexé par un composé de métaux de transition est obtenu en faisant réagir l'alcool alcynique complexé par le composé de métaux-carbonyles en présence d'acide tétrafluoroborique. 21) Procédé selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que le bioréactif a une fonction cétone que l'on transforme sous forme d'éther d'énol. 22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la réaction de complexation du bioréactif et du cation alcynique complexé par un composé de métaux-carbonyle a lieu en présence d'hexaméthyldisilazane. 23) Procédé selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que le solvant est le chlorure de méthylène. 24) Procédé de préparation de complexes selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on fait réagir la zéralone et la zéaralénone sur un composé organomagnésien acétylénique pour obtenir un éthynyl zéranol ou zéaralénol, on libère les fonctions phénols puis on complexe au niveau de la triple liaison C-C par un métal-carbonyle. 25) Procédé de préparation de complexes de la zéralone et de la zéaralénone selon la revendication 18 par formation de leur oxime acide, puis leur couplage sous forme d'amide à l'amine propargylique et leur complexation suivant les revendications précédentes. 26) Procédé selon l'une des revendications 19 à 25. caractérise en ce qu'on procède à une décomplexation d'un premier composé de métaux-carbonyles sur la triple liaison C-C, puis une recomplexation en un deuxième complexe d'oestrogène avec un deuxième composé de métauxcarbonyles sur la triple liaison C-C. 27) Procédé selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'on procède à une décomplexation de la triple liaison C-C d'un premier complexe d'oestrogène d'un composé de métaux-carbonyles en alpha d'une fonction cétone, puis une réduction de la fonction cétone en alcool, puis une recomplexation de la triple liaison C-C en alpha du radical hydroxy libre. 28) Procédé selon l'une des revendications 26 et 27, caractérisé en ce que la décomplexation de la triple liaison du complexe d'oestrogène a lieu par action de sels ferriques dans l'éthanol. 29) Application des complexes d'oestrogènes selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on les utilise pour des dosages de récepteurs biologiques par IR-FT. 3f) . Application des complexes métaux-carbonyles comme antigènes organométalliques selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on les utilises pour le dosage d'anticorps par IR-FT.