Brevet FR2599513A1 — publié le 19871204

La présente invention concerne de nouveaux anti corps monoclonaux contre les récepteurs d'IgE de lymphocytes humains, c'est-à-dire des anticorps mono clonaux dirigés contre le récepteur du fragment Fc d'IgE humaine, présent sur les cellules lymphoïdes. (ces récepteurs sont désignés par Fc, R II). La présente invention concerne également généralement des hybridomes susceptibles de produire de tels anticorps, les ensembles ou "kits" utilisant de tels anticorps, par exemple pour tester ou détecter la présence de ces récepteurs sur des cellules, et les facteurs liant l'IgE (désignés généralement par IgE BF). Il est bien connu dans ce domaine technique, qu'il est possible d'obtenir une lignée de cellules capables de produire un anticorps homogène, c'est-à-dire noclonal. La technique de base a été décrite initialemE: par Kohler et Milstein,(Nature 256, 1975) et comprend la fusion de cellules de myelome de souris avec des cellules de rate et la sélection de clones capables de produire l'anticorps désiré. Cette procédure générale a également été décrite dans les brevets US No. 4 364 932, No. 4 364 934, 4 364 935, No. 4 364 937 et No. 4 361 550. Bien que la méthode générale soit connue depuis quelques années, la préparation et la sélection de chaque hybridome approprié présente ses propres difficultés. I1 n'y a en effet aucune certitude de trouver un hybridome convenable et, également il n'y a pas de certitude que l'hybridome produise un anticorps ayant les propriétés désirées. Les anticorps monoclonaux ont une diversité d'emplois. en particulier pour l'isolation et la purification des protéines pour lesquelles ils sont spécifiques, pour leur titration, par exemple dans un nécessaire ou kit de diagnostic (voir par exemple la demande PCi /GB 80/00239, cublication No. 1d082/01773). Le récepteur pour le fragment Fc d'immunoglobuline E (FcF RI,) est une glycoprotéine exprimée sur la surface de certaines cellules humaines. Ce récepteur a la faculté de lier l'IgE et par conséquent peut être considéré comme un facteur liant l'IgE (IgE BF). Les facteurs "suppresseurs" liant l'IgE pourraient être d'un intérêt considérable dans la thérapie de maladies liées à des taux élevés d'IgE, telles que les rhinites allergiques, les dermatites atopiques et l'asthme. Les facteurs potentiateurs liant l'IgE d'autre part, pourraient avoir une utilité particulière dans le traitement de conditions où des taux accrus d'IgE pourraient être requis (par exemple, l'élimina tion de parasites) . Des recherches ont donc été réalisées pour l'obtention de tels facteurs,-mais la disponibilité d'anti- corpF monoclonaux (Mabs) pourrait être d'uneaide considéra ble pour la mise au point d'essais immunochimiquës spéw_.fiques et sensibles. La présente invention a donc pour objet de proposer des anticorps monoclonaux inhibant la liaison d'IgE soluble aux lymphocytes humains, des anticorps monoclonaux contre les récepteurs d'IgE de lymphocytes, leur procédé de préparation, des hybridomes les produisant, des essais ou tests les utilisant-(pour détecter leur présence sur des cellules) et des kits ou ensembles les utilisant pour la détection de forme soluble (par exemple, dans des fluides humains ou dans les surnageants de culture). Des anticorps monoclonaux conformes à la présente invention sont caractérisés en ce qu'ils inhibent la liaison de IgE soluble aux lymphocytes humains, et en ce qu'ils sont identiques- ou similaires aux anticorps mono clonaux produits à partir d'hybridomes préparés par les étapes successives suivantes . a) la culture dans divers récipients de culture d'hybridomes préparés par fusion de cellules de myelome de souris avec des cellules de rate de souris immunisées par des injections de cellules qui expriment fortement le récepteur à l'IgE, telles que RPMI 8866, de préférence dans un milieu éliminant les cellules de myelome non fusionnées et les cellules de rate non fusionnées,par exemple un milieu HA ; b) on teste les surnageants de cellules d'hybridomes de chaque récipient relativement à la présence d'anticorps inhibant la liaison d'IgE auxdites cellules ; c) on sélectionne les hybridomes produisant les anticorps inhibant la liaison de IgE auxdites cellules ; d) on réalise un clonage de ces hybridomes sélec tionnés, de préférence par la technique de dilution limite, ces clones étant ainsi choisis pour préparer les anticorps monoclonaux par culture de ceux-ci. Ces anticorps monoclonaux sont de préférence des immunoglobulines de la sous-classe IgG1. Selon une caractéristique particulière ce D'invention, les anticorps précités sont l'anticorps monoclonal Mab 25 produit par l'hybridome 9P25 A3/13 déposé à l'Institut Pasteur sous le No. I-548 et l'anticorps monoclonal Mab 135 produit par l'hybridome 9P135 D6/5 déposé à l'Institut Pasteur sous le No. I=549. Les essais pour les IgE BF solubles peuvent être de deux types, l'essai par compétition ou l'essai par double sandwich (qui nécessite deux anticorps monoclonaux liant différents épitopes- de l'antigène considéré. Dans l'essai par compétition, un facteur liant l'IgE humain marqué, par exemple avec une enzyme (par exemple E. coli h -galactosidase) ou un radioisotope est en compétition avec un facteur non marqué (présent dans l'échantillon à tester ou un standard) pour se lier à un anticorps monoclonal lié à un support solide. Ceci nécessite seulement un anticorps monoclonal. Afin de produire des anticorps monoclonaux spécifiques pour des facteurs liant l'IgE humaine, des souris ont été immunisées avec des cellules exprimant à leur surface de telles molécules avec une densité élevée.ALternativement, des souris peuvent être immunisées avec des facteurs liant l'IgE soluble. Détection des récepteurs FcE R II humains et choix d'une lig cellulaire exprimant Fc #R II à haute densité . La lignée de cellules humaines RPMI 8866 est connue comme exprimant FcF RI, avec une densité relativement élevée. Un essai a été établi pour permettre de détecter Fc ERII. Brièvement, les cellules à tester sont incubées successivement avec IgE, - un anticorps anti-IgE monoclonal (ou polyclonal), des microsphères fluorescentes . couplées avec un anticorps anti immunoglobuline de souris (ou de lapin). Le pourcentage de cellules liant les microsphères fluorescentes (correspondant au pourcentage de cellules -exprimant-le récepteur Fc & RII)est déterminé par cytométrie de flux (cytofluorométrie). Une description plus jétaillée de ce processus sera donnée ci-après. Cet essai s'est avéré convenable pour la détection de facteurs liants l'IgE.La pré-incubation d'IgE avec un facteur liant 1@IgE conduit à une diminution de la liaison de igE à son récepteur si bien que le pourcentage de . cellules liant les microsphères fluorescentes est plus faible. Ce travail démontre que RPMI 88 & 6 était la meilleure lignée de cellules pour l'immunisation de souris puisque vcomportant un nombre élevé de récepteurs. Les anticorps monoclonaux contre les récepteurs FcE RI, peuvent être criblés pour leur faculté d'inhiber la liaison de IgE aux cellules RPMI 8866. Les cellules sont d'abord incubées avec l'anticorps monoclonal à tester et on ajoute ensuite l'IgE. Les autres étapes sont effectuées de la façon décrite ci-après. Procédé de cytométrie de flux pour la détection de PC RI_, et de facteurs liant l'IgE utilisant des microsphères fluorescentes . Matériels et méthodes . Anticorps et protéines -: On a purifié de l'IgE humaine myelomateuse par chromatographie par échange-d'ions(DEAE 52) en utilisant un gradient de NaCl (0,01M - 0,3M, pH 7,2). Par marquage par le nitrate d'argent de gel d'électrophorèse en polyacrylamide(SDS-PAGE), on a déterminé que l'IgE était pure et non contaminée par d'autres protéines. Pour détecter l'IgE, un anticorps monoclonal anti- IgE (Hybritech Inc., La Jolla, CA) et un anticorps polyclonal anti-IgE ont été utilisés. L'anti-sérum polyclonal a été préparé en immunisant des lapins à l'aide d'IgE PS purifiée,et on a rendu l'anti-sérum monospécifique pour IgE par passage sur colonne immunoabsorbante de IgG, IgA et IgM (Affigel-10 Biorad, Richmond, CA). Un anti-sérum de lapin anti-Ig de souris et un anti= sérum de chèvre anti-Ig de lapin ont été préparés. Les fractions IgG ont été isolées par chromatographie sur colonne en utilisant le Trisacryl GF 05 et le DEAP Trisacryl (Industrie Biologique Française, Genevillier@ France). IgG, IgA et IgM humaines ont été purifiées à partir de myelome ou de sera de Waldenstrdm en utilisant la chromatographie par échange d'ions selon des processus normalisés. Cellules . On a utilisé les cellules suivantes : WIL2WT (une lignée de cellules lymphoblastoïdes infectées par le-virus d'Epstein-Barr (EBV);Daudi (un lymphome de Burkitt), Molt 4 (leucémie T), HL60 (leucémie promyelomonocytique) et U937 (une lignée de cellules promonocytiques);ces cellules proviennent de l'ATCC (American Type Culture Collection ; Rockville, Maryland). Les cellules RPMI 8866 (une lignée de cellules lymphoblastoïdes infectées par l'EBV) ont été gracieusement fournies par le Docteur K. Ishizaka. UD38 est une lignée de cellules lymphoblast oides infectées par l'EBV qui a été préparée par le Docteur F. Rousset après infection de cellules B de sang périphé rique normal avec l'EBV. Toutes les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 (Flow, Irvine, Ecosse) additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé par chauffage (Flow) j 2 mM g1 utamine (Flow), 100 U par ml de pénicilline et 100 yg par ml de streptomycine (Flow). Couplage de protéines à des microsphères. Un dissout 0,1 mg de la protéine à coupler dans 1 ml d'une solution de EDAC ( chlorohydrate de N-(3-diméthyl- aminopropyl)-N'-éthyl-carbodiimide) (0,1 mg/ml d'eau distillée). On ajoute 100 pl de microsphères(traitées aux ultrasons lmn dans Bransonic 321) (Fluoresbrite carboxylâte , diamètre 0,57 p, Polyscience, Warrington, PA, ref 15700). La . suspension est incubée durant une nuit à 4 C sur une table basculante. Après cette incubation, les microsphères sont centrifugées (10000 g, 5 mn) et lavées trois fois avec PBS-BSA (une solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% d'albumine de sérum bovin). Les microsphères sont enfin maintenues à 4 C dans PBS-BSA additionné de 15m'' d' azide de sodium. La suspension est traitée aux ultra sons pendant une minute avant chaque expérience. Protocole de marquage. On ajuste le nombre de cellules à 107/m1 dans PBS-BSA. 5 x 105 cellules (50 pl) sont distribuées dans chacun des 96 puits coniques de plaques de microtitration (Flow, Reference 7632105). Les cellules sont d'abord incubées 45 minutes avec de l' IgE monomerique (0,5 à 2 pg pour 5 x 105 cellules). Les cellules sont ensuite lavées avec PBS-BSA. Un anticorps polyclonal anti-IgE dilué de façon appropriée (par exemple 1/2000) est ajouté. Après 45 minutes, les cellules sont lavées avec PBS-BSA. On ajoute des microsphères anti- Ig de lapins (dilution 1/50). Cette suspension de cellules est déposée sur 3 ml de FCS filtré et inactivé par chauffage dans des tubes coniques (Falcon référence 2099). Après centrifugation à 100X g pendant 15 mn, le surnageant est aspiré doucement et on ajoute PBS-BSA (150,o1/puits) aux échantillons de cellules qui, après mise en suspension sont analysés par cytométrie de flux. Toutes les étapes sont effectuées à 4 C. Analyse de fluorescence. L'analyse de fluorescence a été effectuée avec un fluorographe, FACS 440 (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA), équipé d'un laser à argon 5 U,I, à 488 nm, 0,5 W. Les paramètres de fluorescence ont été réunis en utilisant un amplificateur logarithmique après avoir considéré la combinaison de la dispersion de lumière front-le (FLS) et là dispersion de lumière perpendiculaire ' ) qui était utilisée pour distinguer les cellules viables des cellules non-viables. Les données ont été stockées en liste et analysées avec un PDP 11/23. Immunisation de souris et production d'hybridomes secrètant -des anticorps monoclonaux spécifiques des récepteurs Fc. RI,. 1. Des souris sont immunisées trois fois avec 50x106 cellules RPMI 8866 injectées par voie intrapéritonéale avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le type de souris utilisé n'est pas critique et de bons résultats sont obtenus avec des femelles BALB/c.- Le nombre d'injections et la quantité de cellules administrées doivent être tels que le nombre de splénocytes produisant des anticorps spécifiques des cellules soit suffisant. Le sérum des souris convenable- mentimmunisées inhibe la liaison de l'IgE aux cellules RPMI. 8866. . Les souris immunisées sont sacrifiées,leurs rates son-- prélevées et des suspensions cellulaires de rate sont préparées. Cette procédure est effectuée suivant des techniques bien connues. 3. Les cellules de rate sont fusionnées avec des cellules de myelome de souris. La technique de fusion de cellules de myelome avec des cellules de rate est bien connue. De manière préférée, la fusion est réalisée par incubatior d'un mélange des deux types de cellules avec un agent pros Leur de fusion approprié, par exemple du poly- éthylène-glycol (PEG) ayant un-poids moléculaire moyen d'environ 1000 à environ 4000-(PEG 1000). Plusieurs lignées cellulaires de myelome de souris sont connues et facilement disponibles. On préfère des lignées de cellules déficientes en HGPRT (HGPRT = hypoxanthine Guanosyl Phosphoribosyl Transférase) et qui ne survivent donc pas dans du HA (milieu de culture comprenant de l'hypoxanthine et de l'azaserine). De préférence, la lignée de cellules de myelome utilisée devrait être du type qui ne sécrète pas, c'est-à-dire qui ne produit pas elle-même d'anticorps. Une lignée cellulaire appropriée pour le but de l'invention est la lignée de cellules dénommée NS1. Ces cellules ont été dérivées des cellules de myelome P3/X63-A8 par Kohler Milstein. 4. Les cellules de rate fusionnées sont cultivées dans plusieurs récipients séparés (par exemple dans des plaques à 24 puits) selon des procédures standards. Les cultures de cellules obtenues à l'étape 3 sont des mélanges de cellules de rate fusionnées(cellules hybridomes), de cellules de rate non fusionnées et de cellules de myelome non fusionnées. De préférence, la culture est réalisée dans un milieu qui éliminera la lignée de cellules de myelome non fusionnées, par exemple dans un milieu HA. Ces cellules de rate non fusionnées qui ne sont pas malignes mour ront normalement après une courte période de temps, tandis que les cellules fusionnées, qui sont 4PRT+, peuvent croître dans un milieu HA. 5. On teste les surnageants des cellules d'hybridome dans chaque récipient pour déterminer la présence d'anticorps anti-Fc,#. RII,Les hybridomes sont criblés pour leur faculté d'inhiber la liaison d'IgE aux cellules RPMI 8866. Cet essai peut être convenablement réalisé par l'essai de bille décrit ci-dessus. 6. Des hybridomes produisant les anticorps désirés sont sélectionnés et sont ensuite clonés de préférence par .la technique de dilution 'l imite. 7. Les anticorps désirés sont produits au moyen d'hybridomes sélectionnés. Cette production peut être réalisée in vitro par la culture de l'hybridome dans un milieu approprié suivi par l'isolement de l'anticorps, mais cette méthode peut ne pas produire des quantités suffisantes. Pour la production de quantités plus importantes de l'anticorps, on préfère utiliser une méthode in vivo . L'hybridome est injecté dans le péritoine d'une souris où il provoquera la production de fluides ascitiquescontenant des quantités substantielles de l'anticorps désiré, qui est ensuite isolé selon des procédures standards. Caractéristiques des hybridomes produits . 1. Inhibition de la liaison-d'IgE. Deux hybridomes, 9P25 et 9P135, qui produisent deux clones 25 et 135 D6/5 respectivement, ont été sélectionnés puisqu'ils produisent des anticorps monoclonaux (désignés respectivement par Mab 25 et Mab 135) qui inhibent la liaison de l'IgE aux cellules RPMI 8866. (voir tableau I). Ces deux anticorps sont de la famille IgG,. . Tableau I . Inhibition de la liaison de IgE par les anticorps 25 et Mab 135 sur la lignée de cellules RPMI 8866 C- c+ Mab 25 - Mab 135 t: 82 29(71,6) 56,3 (34,7) Les valeurs sont données en pourcentages. Les chiffres qui sont donnés sans parenthèse représentent le pourcentage de cellules positives et les chiffres donnés entre parenthèses représentent le pourcentage d'inhibition. c- : contrôle négatif obtenu par incubation de cellules RPMI 8866 avec un anticorps polyclonal anti-IgE (1/1000) et des microsphères recouvertes d'immunoglobulines anti-IgG de lapins. c+ : contrôle positif obtenu par incubation de cellules RPMI 8866 avec 1 pg d'IgE, d'anticorps polyclonal anti-IgE et de microsphères recouvertes d'immunoglobulinps anti-Ig G de lapins. 2. Fixation des anticorps à différentes lignees cellulaires . a) Aspects techniques. Des lignées cellulaires sont maintenues dans le milieu de culture standard RPMI 1640 décrit ci-dessus. L'analyse cytofluorographique d'anticorps monoclonaux se liant aux lignées cellulaires a été réalisée par immunofluorescence indirecte avec des immunoglobulines de chèvre anti-Ig de souris conjuguées à de la fluorescéine (G/M FITC) (Grub Laboratories, Vienne, Autriche) en .utilisant un cytofluoro- graphe ou FACS 440. En bref, 5 X 105 cellules ont-été traitées avec 0,15 ml du Mab (dilué ou non dilué ), incubées à 4 C pendant 30 minutes, et lavées deux fois. Les cellules ont été ensuite mises en réaction avec 0,15 ml d'une dilution à 1:40 de G/M FITC à 4 C pendant 30 minutes, centrifugées, et lavées trois fois. Les cellules ont . ensuite été analysées au moyen d'un cytofluorographe FACS 440, et l'intensité de fluorescence par cellule a été enregis trée sur u n analyseur de -hauteur d'impulsion. Le marquage non spécifique était obtenu en utilisant 0,15 ml d'ascite- `ilué 1:500 d'une souris ayant subi une injection intrapéritone e avec un clone d'hybride non producteur. b) Mab 25 (Tableau II). Cet anticorps ne se lie pas aux cellules Molt 4 (une lignée de cellules T leucémiques) ; ou Daudi (un lymphome de Burkitt) et à un nombre important de clones de cellules T humaines dépendant de l'Interleukine 2 (IL2) différent (bien qu'or. ait découvert que certains d' entre eux étaient faiblement positifs). Il se lie aux lignées de cellules B lymphoblastoïdes infectées par l'EBV . I1 se lie faiblement à la lignée de cellules myelomonocytiques U937. La liaison de cet anticorps aux lignées de cellules est en relation avec leur expression de récepteursFcE R II- Notes du tableau II * déterminé par l'essai sur microsphères (bille) décrit précédemment. ** clone L243 provenant de Becton Dickinson. Les antigènes DR sont des antigènes d'histocompatibilité de classe II. c) Mab 135 (tableauII). cet anticorps ne se lie pas aux cellules Molt 4 mais se lie aux cellules de Daudi ainsi qu'à tous les clones de cellules T et FcE RII-négatives dépendant de IL 2 qui ont été testées. Il se lie également à toutes les lignées de cellules lymphoblastoides infectées par l'EBVqui ont été testées et à toutes les lignées de cellul----B non infectées par l'EBV, M014 et BME. I1 se lie faible- ,t à U937. En résumé, l'anticorps monoclonal Mab 135 est capable d'empêcher la liaison de IgE aux cellules positives à Fca RI, ; et il reconnait également les déterminant antigéniques qui sont présents sur les cellules n'exprimant pas de Fcs R II. 3. Fixation des Mabs aux cellules de sang humain, d'amygdale et de rate. a) aspects techniques. Des cellules mononucléées de sang, d'amygdale et de rate ont été isolées selon des procédures standards. Les amygdales ont été obtenues par amygdalectomie d'enfants présentants des amygdalites chroniques et les rates ont été obtenues à partir de spécimens provenant de patients à traumatisme. Les rates et amygdales ont été transformées en suspensions cellulaires ( dans du PBS ) par compactage à travers un tamis. Ces suspensions de cellules ainsi que le sang dilué (dans du PBS) ont été ensuite déposés sur Ficoll-Hypaque et centrifugées (en suivant la technique de Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (supp.97) : 77, 1968). Les cellules mononucléées ont ont été récoltées à l'interface du Ficoll et lavées avec PBS. L'analyse cytofluorographique des anticorps monoclonaux a été réalisée pour toutes les populations de cellules par immunofluorescence indirecte de la même façon que décrite précédemment. On a également effectué une analyse par fluorescence double afin de déterminer à quelle sous- population de cellules les anticorps monoclonaux se lient. Le protocole expérimental est décrit dans le tableau III. Les données sont résumées dans les tableaux IV, V et VI. Tableau III Processus de double marquage de cellules avec deux anticorps monoclonaux 1. G: ajuste les cellules à 107 /ml dans du PÈS, BSA, 1%, Azide 0,01%. 2. On ajoute le premier anticorps monoclonal à une concentration appropriée dans 40 u1 à la suspension de cellules (dans des puits de plaques de microtitration). 3. On incuoe 15 minutes à 4 C. 4. On lave deux fois avec PBS, BSA 1%, azide 0,01%. 5. On remet les cellules en suspension dans 100 Nl d'une dilution 1/150 dans du PBS des fragments F(ab') 2 d'immuno globulines de chèvre anti-Ig-de souris conjugués avec le FITC (Grub) Vienne, Autriche). 6. On incube 15 à 30 minutes à 4 C. 7. On lave deux fois dans PBS-BSA-azide. 8. On remet les cellules en suspension dans 100 u1 PBS-BSA contenant 1% de sérum de souris. 9. On incube 20 minutes à 4 C et on lave deux fois. 10. 0n remet les cellules-en suspension dans 40 Nl PBS-BSA. 11. On ajoute le second anticorps monoclonal conjugué avec la biotine. 12. On incube 15 minutes à 4 C. 13. On lave deux fois avec PBS-BSA-azide. 14. On remet les cellules en suspension dans .4, u1 de PBS-BSA-azide et on ajoute de l'avidine conjugué à de la phycoérythrine (Becton Dickinson). 15. On lave deux fois et on remet les cellules en suspension dans 250 u1 de PBS-BSA. 16. On analyse avec un cytofluorographe. Dans les tableaux IV à VI le signe - indique les cellules réagissant négativement (anticorps monoclonal non lié) et le signe + indique les cellules réagissant positi vement (anticorps monoclonal fixé). Leu 1 est un anticorps monoclonal commercialisé par Becton Dickinson qui se lie spécifiquement aux cellules T. B2 est un anticorps@monoclonal commercialisé par Coulter Immunology qui se lie spécifiquement aux cellules B. Anti-DR est l'anticorps monoclonal défini dans le tableau II. Leu h13 est un anticorps monoclonal commercialisé par Becton Dickinson qui se lie spécifiquement aux monocytes. Tableau .!V Pourcentage de cellules de rate fixant les Mabs Mab 25 _ Mab 135 Cellules positives 4.8 52.2 - 67.3 4.8 15.3 48.3 Leu 1 (31.6) + 27.9 36.4 - 39.2 47.4 10.1 B1 (54.8) + 56.4 4.4 300 39.5 - 5 40.7 Anti-DR (61.3) + 58.3 5.0 1.7 57.6 - 90.0 4.5 47.6 47.8 Leu M3 (5.6) - + 4.4 1.1 1.3 3.3 Contrôle 0,7 Tableau V. Pourcentage de cellules d'amygdale fixant les Mabs Mab 25 Mab 135 Cellules positives 9:4 33.2 53.4 9.4 26.2 27.6 Leu 1 (40.3) + 37.2 "4 .2' - 50.1 4.4 60.4 9.1 B1 (41.6) + 39.2 6.3 3.1 26.8 - 50.7 62.3 Anti-DR (43.8) + 9 1 .8 7.5 2.5 35:2 - 90.5 7.6 65.1 33.9 Leu M3 (2.0) + 1.9 1.0 Contrôle 0,9 Tableau 1!T Pourcentage de cellules mononucléées de sana périphérique fixant les Mabs Mah- 25 Mab 135 Cellules positives 4.0 7.3 - 28.6 5.7 28.1 7.3 Leu 1 (67.5) + 65.7 64.6 - 90.3 87.6 5.1 Bi (8.1) + 6.6 3.1 1.6 5.7 - -76.5 78.5 Anti-DR (20.1) + 19.9 3.6 13.4 8.1 - 84.9 4.3 80.1 8.2 Leu M3 (12.0) 9.7 1.1 9.5 2.2 Controle Q,7 b) Mab 2-5. Cet anticorps se lie approximativement à 4% des cellules mononucléées du sang, 4,8% des cellules mon o n u c 1 éées de la rate et 9,4% des cellules mononucléées d'amygdale. Il ne se lie pas aux cellules T (Leu'l positive I1 se lie de façon préférentielle aux cellules B (B1 positive ) mais pas à toutes les cellules parmi celles-ci. Cet anticorps marque également certains lymphocytes non-T non-B, certaines cellules Leu M3+ (spécifiques des monocytes) certaines cellules Leu M3_. c) Mab 135 Cet anticorps se lie approximativement à 7,3% des cellules mononucléées du sang, 52,2% des cellules mononucléées de la rate et 33,2% de cellules mononucléées d'amygdale. Il ne se lie pas aux cellules T Leu 1 posi tive) . I1 se lie à pratiquement toutes les c--lules B (B1 positive) et à une fraction des monocytes (Leu M3 positive). Il se lie à pratiquemE.it toutes les cellules mononucléées d'amygdale et de rate exprimant le DR mais seulement à une fraction des cellules exprimant le DR du sang. 4. Fixation des Mabs aux cellules mononucléées activées par des mitogènes a) Aspects techniques. Des cellules mononucléées du sang périphérique isolées sont mises en suspension à raison de 5 x 105 cellules/ml dans un milieu de culture (RPMI 1640 + glutamine 2 mM + pénicilline (100 U/ml) + streptomycine (100 yg/ml) + 10% de sérum foetal de veau) en présence des agents mitogènes suivant . Phytohémagglutinine 1% (PHA) (GIBCO, Grand Island) ; concanavaline A 10,pg/ml (Con A) (Pharmacia, Upp-sala, Suède) f Stachylococcus aureus souche Cowan-I, 0,01% (SAC) (Pansor hn , Calbiochem, La Jolla, Ca), Mitogène du Pokeweed,dilution à 1/100 (PWM) (GIBCO, Grand Island, NY): Les cellules ont été récoltées cinq jours plus tard, lavées trois fois et marquées avec les anticorps monoclonaux décrits précédemment. Les données sont fournies dans le tableau VII. Tableau VII Fixation des anticorps monoclonaux Mabs 25 et 135 aux cellules mononucléées du sang périphérique stimulées pendant cinq jours avec des mitogènes variés. CONTROLE Mab 25 Mab 135 CON . 3,6% 2,3% 42,8% PHA 5,9% 5,9% 49,3% Exemple 1 PWM 1,1% 4,2% 28,8 COWAN 7,7% 21,056 23,8% CON A ND ND ND PHA 4,7% 16,4% 52,2% Exemple 2. PWM 0,8% 1,4% 42,5% COWAN 4,1% 3,2% 20,5% b) Mab 25 Son expression sur les cellules est seulement faiblement ou très faiblement accrue par activation mitogénique. c) Mab 135 Le pourcentage de cellules ayant réagi avec-Mab 135 est accru par stimulation mitôgénique. 5. A nalyse par immunoprécipitation des antigènes reconnus p ar Mabs a) Aspects techniques a1) Marquage_des cellules 50 à 100 x 106 cellules RPMI 8866 ont été préalablement lavées deux fois avec du PBS puis mises à nouveau en suspension dans 2 ml de PBS . A cette suspension on a ajouté les réactifs suivants : 0,5 - 1 mci Na 125I (Amersham), 100 N1 lactopéroxidase à 5 mg par ml (Calbioçhem) et 50 u1 d'H202 (0,03% dans de l'eau). La suspension a été agitée pendant 3 minutes à température ambiante. On a ajouté à nouveau 100 pl de lactopéroxidase et 50 Nl d'H202. La suspension est à nouveau agitée pendant 3 minutes à température ambiante. Cette étape est répétée une fois de plus et les cellules sont finalement lavées avec du PBS contenant 5 mM de KI. Les cellules marquées s t ensuite mises à nouveau en suspension à raison de 5 x .-J6 cellules par ml dans du PBS contenant 0,5% de Nonidet P-40, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF), I1,01 M d'hydrochlorure de benzamidine, 0,05M d'acide aminocaproique, 20 mM d'iodoacétamide, 10 ug/ml de leupeptine, 1 ug/ml de pepstatine et 100 yg/ml d'inhibiteur de trypsine de soja, et sont incubées à 0 C pendant 20 minutes. Les cellules sont centrifugées à 3000Xg pendan*'- 20 minutes et le surnageant est stocké à -70 C. Le lysat est clarifié par centrifugation à -100000X g pendant 30 minutes. a2) Immunoprécipitation d'antigènes de membrane Les lysats sont d'abord traités durant la nuit avec un ascite contenant un anticorps monoclonal non concerné. Ensuite, une immunoglobuline de lapin anti-Ig de souris couplée à des particules traitées au formaldéhyde de Staohylococcus aureus souche Cowan est ajoutée. Après centrifugation le lysat est prêt pour l'immunoprécipitation, qui est réalisée de la même façon que dans l'étape préliminaire de clarification à l'exception que l'anticorps monoclonal non concerné est remplecé La-- l'anticorps 2 tester. b) Mab 25 Cet anticorps précipite spécifiquement une molécule 42-44 Kd qui correspond à la donnée établie pour FcE RI, en utilisant la chromatographie par affinité sur IgE immobilisée. c) Mab 135 Il immunoprécipite trois entités moléculaires différentes : une molécule 44-46 Kd (qui peut être différente de celle précipitée par-Mab 25) et également des molécules d'environ 35 Kd et environ 30 Kd. 6. Détermination de l'affinité (Ka) de Mab 25 . L'affinité de Mab 25 pour son antigène de surface de cellule spécifique a été réalisée conformément à la technque de Trucco et de Petris (Immunological Mëthods, Vol -II, Ed : I. Lefkovits, B. Pernis, Academic press, 198:. pp. 1-26). a. Aspects techniques . - -Marquage à l'iode de Mab 25 . 50 yg de Mab 25 dans 500 Jul de PBS sont mélangés- avec 1 mCi de Na 125I (5.y1) et chloramine T (5 )i1 à raison de 0,8 mg par ml dans du PBS). Après une période d'incuba tion de 10 minutes à température ambiante sous agitation modérée, on a ajouté 5 Nl de bisulphite de sodium (1mg/ml dans PBS) et 250,ul d'ovalbumine (5% dans PBS) pour stopper la réaction. La solution est ensuite passée à travers une colonne PD10 (Pharmacie, Suède) pré-équilibrée avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20 (Merck, Allemagne de l'Ouest) et 1% d'albumine de sérum bovine. Cette étape permet la récupération de l'anticorps iodé sans iode libre. - Détermination de l'affinité et du nombre de récepteurs . Des concentrations successives (0,1,ug à 4 rg) de Mab 25 iodé sont ajoutées à 10b cellules RPMI 8866 dans un volume total de 1 ml-de milieu RPMI 1640 contenant 2% de BSA. Pour des concentrations en anticorps de 0,3, 0,5 et 1,uç@~ , des tubes supplémentaires sont préparés dans lesquels Mab 25 non marqué est ajouté dans un excès de 500 fois afin de déterminer la liaison à l'anticorps non spécifique. L'incubation dure trois heures à 4 C. Les cellules sont enfin lavées trois fois et la radioactivité du culot final de cellules est déterminée par un compteur à rayons gamma. Les données ont été finalement présentées en utilisant l'analyse normalisée de Scatchard. 7.b. Affinité et nombre de récepteurs de Mab 25 . L'affinité de Mab 25 pour le récepteur Fco RI, de cellules RPMI 8866 est de 1,2 x 108M 1 et on a identifié 435 000 récepteurs. Kit ou ensemble de détection de récepteurs FcL R II Détection de FcE RI, sur des cellules de sang périphérique. Les essais traditionnels de rosette IgE suggèrent que certains patients présentent des cellule mononucléées de sang exprimant le Fco RTT de façon accrue- nticorps Mab 25 confère une détermination beaucoup-plus exacte de l'expression de Fc E R II e- est utile dans ce type d'investi gation clinique. La détermination de l'expression de Fc` R II sur les cellules mononuclées de sang est utile dans un-certain nombre de situationscliniquesen relation avec l'atopie. L'anticorps Mab 25 peut être rendu disponible sous une forme lyophilisée soit non-marqué mais accompagné d'un anticorps anti-Ig de souris marqué de façon appropriée, soit marqué avec le FITC ou la biotine. Pour détecter la biotine, on peut utiliser de l' avidine marquée par le FITC ou par la phycoérythrine. - Détection de Fc ERII sur des clones de cellules T humaines . On a démontré pour les rongeurs que les cellules T positives à Fc RI, jouent un rôle majeur dans la régulation de la synthèse de l'IgE. L'anticorps Mab 25 est maintenant utilisé pour établir des clones de cellules T humaines dépendant d'IL2 exprimant le Fc @ RI,. De tels clones pourraient s'avérer être des outils particulièrement intéressants pour élucider la régulation de la production de l'IgE chez l'homme. Kit ou ensemble de détection de Fco RI, soluble essai de compétition . L'anticorps Mab 25 est couplé à des billes ou dans des puits de plaques de microtitration. Les échantillons à tester pour la présence de Fc, R II soluble ou d'une prépa ration standard de Fc, R II sont d'abord incubés avec une quantité connue de F c R II soluble marqué. Après incubation, ils sont transférés sur les billes ou dans les puits précités et mis en réaction avec l'anticorps non solubilisé. Le récepteur soluble marqué peut être soit i) un récepteur FcE R II recombinant iodé par 125I ; ii) un produit de fusion artificiel entre F CE R II et une enzyme telle que par exemple E. coli @5 - galactosidase ; ou iii) un FcF R II . couplé à de la- biotine. Dans le cas i) la réaction sera contrôlée par un comptage de rayons gamma ; dans le cas _.ï) la réaction sera contrôlée par mesure optique des subs:rats de dégradation spécifiques de l'enzyme (par exemple la réaction sera contrôlée par @-galactosidas=) ; dans le cas iii) la réaction sera contrôlée par mesure optique des substrats de dégradation spécifiquespour l'enzyme qui a été couplée à de l'avidine spécifique de biotine. Dans tous les cas, la présence du récepteur soluble dans l'échantillon à tester induira une décroissance dans le signal observé. 8. Isolement du Fc. RII avec le Mab 25 immobilisé . Les cellules RPMI 8866 lavées sont solubilisées comme décrit précédemment avec le tampon à base de Nonidet P40. Cet extrait cellulaire est passé sur une colonne de chromatographie d'Affigel 10 (Biorad, Richmond, Ca) sur lequel l'anticorps purifié selon les méthodes classiques a été couplé en suivant les recommandations du fabricant. Les colonnes sont ensuite lavées avec le tampon de lyse de façon à éliminer les protéines non fixées. L'élution de la protéine reconnu par le Mab 25 est réalisée par un tampon glycine HCl (pH 2,8). Après analyse par SDSPAGE, on a pu mettre en évidence dans l'éluet une protéine de poids moléculaire 42-44Kd suffisamment pure pour permettre le séquençage. R E V E N D I C A T I 0 N S --------------------------- 1. Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils inhibent la liaison de l'IgE soluble aux lymphocytes humains,-et en ce qu'ils sont identiques ou similaires aux anticorps monoclonaux produits à partir d'.hybridomes préparés par les étapes successives suivantes a) la culture dans divers récipients de culture d'hybridomes préparés par fusion de cellules de myelome de souris avec des cellules de rate de souris immunisées par des injections de cellules qui expriment fortement le récepteur à l'IgE telles que RPMI 8866,de préférence dans un milieu éliminant les cellules de myelome non fusionnées et les_cellules de rate non fusionnées, par exemple un milieu HA ; b) on teste les surnageants de cellules c_ nybridomes de chaque récipient relativement à la présence d'anti corps inhibant la liaison d'IgE auxdites cellules ; c) on sélectionne les hybridomes produisant les anticorps inhibant la liaison de l'IgEauxdites cellules ; d) on réalise un clonage de ces hybridomes sélec tionnés, de préférence par la technique de dilution limite, ces clones étant ainsi choisis pour préparer les anticorps monoclonaux par culture de ceux-ci. 2. Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit des anticorps de la sous-glasse IgGl suivants a) anticorps monoclonal Mab 25 produit par l'hybridome 9P25 A3/13 déposé à l'Institut Pasteur sous le No.I-548, b) anticorps monoclonal Mab 135 produit par l'hybridome 9P135 D6/5 déposé à l'Institut Pasteur sous le No.I-549. 3. Hybridomes monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles de produire les anticorps monoclonaux tels que définis à la revendication 1 ou 2. 4. Nouveaux hybridomes monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi le groupe consistant de a) hybridome monoclonal 9P25 A/13 déposé à l'Institut. Pasteur sous le No. I-548 ; b) hybridome monoclonal 9P135 D6/5 déposé à l'Institut Pasteur sous le No. I-549. 5. Utilisation de l'anticorps monoclonal tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, pour tester des cellules portant des récepteurs Fce R II humains. 6. Utilisation de l'anticorps monoclonal Mab 25,.tel que défini à la revendication 2 pour immunoprécipiter et isoler une' molécule de membrane 42-44 Kd qui est le récepteur Fc @ RII. 7. Utilisation de l'anticorps monoclonal Mab 135 tel ..ue défini à la revendication 2 pour immunoprécipiter tro,s molécules de membrane ayant des poids moléculaires dans les régions de 44-46, 35 et 30 Kd, respectivement. 8. Utilisation de l'anticorps monoclonal Mab 25 tel que défini à la revendication 2 pour un immuno.essai de compétition pour la détection d'un récepteur Fc, RI, soluble et des facteurs liant l'IgE. 9. Utilisation de l'anticorps monoclonal Mab 25 tel que défini à la revendication 2, pour établir des lignées cellulaires T dépendant d'IL2 humaines portant un récepteur Fc rÉ RII.