Brevet FR2598432A1 — publié le 19871113

L'invention concerne un nouveau procédé pour l'expression de gènes dans une levure, et des fragments d'ADN ainsi que des plasmides comprenant lesdits fragments d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé. Dans la description, on utilise entre autres les expressions suivantes: Région de promoteur: fragment d'ADN contenant un promoteur et des séquences cibles pour l'ARN polymérase ainsi que d'éventuelles régions d'activation comprenant des séquences cibles pour des effecteurs de transcription. Effecteur: substance exerçant directement ou indirecte15 ment une fonction régulatrice. Ainsi, les effecteurs comprennent également des substances agissant sur la concentration de substances exerçant directement ou indirectement une fonction régulatrice. Séquence leader: d'une façon générale, désigne une séquence d'ADN qui est transcrite en un ARNm, mais qui n'est pas traduite plus avant en protéine. La séquence amorce comprend ainsi le fragment d'ADN allant du point de départ de la transcription au codon d'initiation de traduction ATG. Séquence leader: dans le cadre de la pr6sente invention, 25 désigne un court fragment d'ADN comportant normalement -2 -70 paires de bases (pb) et comprenant des séquences cibles pour une régulation postérieure à la transcription, exercée par l'hème ou par l'intermédiaire de celui-ci. On utilise en outre les expressions suivantes, géné5 ralement connues du spécialiste en biologie moléculaire: Site d'addition CAP: le site o le 7méthyl-GTP est ajouté à l'ARNm correspondant. Séquence d'ADN ou segment d'ADN: arrangement linéaire de nucléotides reliés par des ponts phosphodiester entre 10 les atomes de carbone 3' et 5' de pentoses adjacents. Expression: processus subi par un gène structural pour produire un polypeptide. Il s'agit d'une combinaison de transcription et de traduction, ainsi que d'éventuelles modifications postérieures à la traduction. àios adjames(Fl:regi=ns): a-od.?Nencadrant des régions codantes. Les régions adjacentesen 5' contiennent un promoteur. Les régions adjacentes en 3' peuvent renfermer des signaux de terminaison de transcription, etc. Gène: séquanoe d'ADN composée de trois ou quatre parties, 20 (1) la séquence codante pour le produit génique, (2) les séquences dans la région de promoteur qui contrôlent l'expression ou la non-expression du gène, (3) les séquences à l'extrémité 3' qui contrôlent la terminaison de transcription et l'éventuelle polyadénylation, ainsi que (4) des 25 séquences intercalées s'il en existe. Séquences intercalées: séquences d'ADN à l'intérieur d'un gène, qui ne codent pour aucun fragment peptidique. Les séquences intercalées sont transcrites dans le pré-ARNm et sont éliminées par modification de l'ARN précurseur en 30 ARNm. Clonage: opération permettant d'obtenir une population d'organismes ou des séquences d'ADN provenant d'un tel organisme ou d'une telle séquence, par reproduction asexuée, ou plus particulièrement, l'opération d'isolement d'un orga35 nisme déterminé ou d'une partie de celui-ci, et la propaga- -3 tion de cette sous-fraction sous forme d'une population homogene. Séquence codante: séquence d'ADN déterminant la séquence d'acides aminés d'un polypeptide. ARN messager (ARNm): molécule d'ARN produite par transcription d'un gène et éventuelle modification d'ARN précurseur. La molécule d'ARN transmet le message génétique déterminant la séquence d'acides aminés d'un polypeptide, par traduction d'une partie de la molécule d'ARNm en ledit peptide. 10 Nucléotide: unité monomère d'ADN ou d'ARN, constituée d'un sucre (pentose), d'un phosphate et d'une base hétérocyclique azotée. La base est attachée au sucre par une liaison glucosidique (carbone 1' du pentose), et cette combinaison d'une base et d'un sucre est un nucléoside. La base 15 caractérise le nucléotide. Les quatre bases de l'ADN sont l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Les quatre bases de 'ARN sont A, G, C et l'uracile (U). Plasmide: séquence d'ADN bi-catenaire non chromosomique, comprenant un réplicon intact, de sorte que le plasmide est répliqué dans une cellule hôte. Lorsque le plasmide est introduit dans un organisme unicellulaire, les caractéristiques de cet organisme sont changées ou transformées sous l'effet de l'ADN du plasmide. Par exemple, un plasmide portant le gène codant pour la résistance à la tétracycline (TcR) trans25 forme une cellule qui était sensible à la tétracycline en une cellule qui est résistante à cet antibiotique. Une cellule tranformée par un plasmide est dite "transformée". Polypeptide: arrangement linéaire d'acides aminés reliés au moyen de liaisons peptidiques entre les groupes a-amino 30 et les groupes carboxy d'acides aminés adjacents. Recombinaison: création d'une nouvelle molécule d'ADN par combinaison de fragments d'ADN d'origine différente. Réplication: processus de reproduction de molécules d'ADN. -4 Réplicon: élément génétique capable d'autoréplication, possédant un point de départ de la réplication de l'ADN et des gènes spécifiant les fonctions nécessaires au contrôle de la réplication. Fragment de restriction: fragment d'ADN résultant de la coupure bicatenaire par une enzyme reconnaissant une séquence d'ADN cible spécifique. ARN polymérase: enzyme effectuant la transcription de l'ADN en ARN. Transformation: processus par lequel une celluleincorpore un plasmide. Traduction: le processus de production d'un polypeptide à partir d'ARNm, ou le processus par lequel l'information génétique présente dans une molécule d'ARNm dirige la séquence 15 d'acides aminés spécifiques au cours de la synthèse d'un polypeptide. Transcription: processus de synthèse d'une séquence d'ARN complémentaire à partir d'une séquence d'ADN. Vecteur: plasmide, ADN phagique ou autres séquences d'ADN capables de réplication dans une cellule hôte et comportant un site ou un petit nombre de sites de reconnaissance par une endonucléase, auxquels des séquences d'ADN peuvent être coupées d'une façon déterminable, sans perte concomitante d'une fonction biologique essentielle de l'ADN, telle que réplication, production de protéines périphériques, ni perte concomitante de sites de promoteurs ou de sites de liaison, et qui contiennent un marqueur approprié pour être utilisé dans l'identification de cellules transformées, sous la forme par exemple d'une résistance à la tétracycline ou d'une résistance à l'ampicilline. Un vecteur est fréquemment dénommé "véhicule de clonage". La production d'un produit biologiquement actif au moyen de la technologie de l'ADN recombinant est une opération complexe qui fait intervenir de nombreuses étapes de processus, 35 de l'initiation de la transcription à la réalisation finale -5 de la molécule biologiquement active. Un grand nombre de ces étapes de processus n'apparaissent pas chez des organismes procaryotes, ce qui fait que l'on doit utiliser dans de nombreux cas des organismes producteurs eucaryotes. Une levure est un organisme eucaryote, dont l'appareil de synthèse comprend un grand nombre des processus et des mécanismes de régulation caractéristiques des organismes supérieurs. En outre, les cellules des levures ont un temps 10 de génération court, et on dispose d'une expérience d'un millénaire pour l'utilisation d'une levure en tant qu'organisme de culture. Des facteurs absolument décisifs pour une synthèse biologique d'un produit génique recherché consistent en une possibilité et une amélioration de l'initiation de la transcription ainsi que de la régulation de l'expression du gène pendant et après la transcription. Ces fonctions sont remplies principalement par des régions adjacentesen 5'. Une grande variété de régions adja20 centes en5' de gènes de procaryotes et d'eucaryotes ont été séquencées, et oh a acquis une connaissance étendue, basée entre autres sur celles-ci, de la régulation de l'expression des gènes, et des sous-régions et des séquences qui sont rtents,:x la rgeu lation du gène. De grandes différences existent dans le mécanisme régulateur chez les procaryotes et chez les eucaryotes, mais il y a de nombreux traits communs dans ces deux groupes. La régulation de l'expression du gène peut avoir lieu au niveau de la transcription, et elle est alors exercée de préférence par la régulation de la fréquence d'initiation de transcription. Cette dernière est bien connue, et décrite entre autres par Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, vol. I, 1974; vol. II, 2ème édition, 1980; vol. III, 1977. Ou encore, la régulation peut être exercée au niveau post-transcription, par exemple la régulation de la fréquence -6 de l'initiation de traduction à la cadence de la traduction et de la terminaison de traduction. Les léghémoglobines sont des hémoprotéines monomères exclusivement synthétisées dans les nodosités de la racine, qui se développent par l'association symbiotique de Rhizobium avec les légumineuses. Un candidat logique pour un effecteur activant les gènes de léghémoglobines est l'hème produit chez Rhizobium et constituant le groupe prosthétique des léghémoglobines. La synthèse de plusieurs hémoprotéines chez 10 la levure Saccharomyces cerevisiae est aussi commandée par le taux d'hème intracellulaire qui forme également le groupe prosthétique de ces protéines. Ainsi, la transcription du gène de l'isocytochrome c est hèmedépendante, tandis que dans le cas de la catalase T1, la régulation par l'hème s'exerce a la fois au niveau de la transcription et au niveau posttranscription. Selon la présente invention, on présente la séquence de régions adjacentes en5' des quatre gènes de la léghémoglobinE de soja Lba, Lbcl, Lbc2 et Lbc3. Les séquences sont présen20 tées sur le diagramme des séquences ci-annexé, le diagramme 1, sur lequel les séquences sont alignées de telle façon que l'homologie apparasse clairement. Sur le diagramme des séquences, "-" indique qu'il n'y a pas de base présente à la position en question. Les noms 25 des gènes et les positions des bases, comptées en remontant à partir du codon d'initiation ATG,sont indiqués à la partie droite du diagramme des séquences. De plus, les séquences importantes ont été soulignées. Comme il apparaît d'après le diagramme des séquences, 30 un net degré d'homologie existe entre les quatre régions adjacentesen 5', et dans la position 23-24 pb en amont du site d'addition CAP, elles contiennent toutes une séquence TATATAAA correspondant à la boîte "TATA" qui est normalement située dans les cellules eucaryotes à un nombre de pb cor35 respondant en amont du site d'addition CAP. En outre, une -7 séquence CCAAG est présente à 64-72 pb en amont du site d'addition CAP, ladite séquence correspondant à la boîte "CCAAT" habituellement située à 70-90 pb en amont du site d'addition CAP. Du site d'addition CAP au codon d'initiation de traduc5 tion ATG, des séquences leader de 52-69 pb sont présentes, et montrent un net degré d'homologie d'environ 75-80%. Selon la présente invention, on a prouvé en outre, comme l'illustre par exemple Lbc3, que les régions adjacentes en ' des gènes de léghémoglobine de soja sont fonctionnellement 10 actives dans la levure. Cela a été démontré par fusion du gène de la chloroamphénicol acétyltransférase (CAT) de E. coli avec les régions adjacentesen 5' et 3' du gène Lbc3 de soja, de telle façon que l'expression du gène CAT était contrôlée par le promoteur Lb. Le fragment fusionnant a été 15 inséré dans le vecteur plasmidique de levure YEP 24, comprenant le gène URA-3 de levure en tant que marqueur déterminable. La souche de levure S. cerevisiae TM1 qui est URA-3 et qui est incapable de synthétiser l'hème en raison d'une mutation au niveau du gène de l'acide S-aminolévulinique synthétase (S-ALA), a été ensuite transformée avec la construction résultante. Les cellules de levures transformées ont fait preuve d'une activité de la CAT dans toutes les conditions de croissance examinées. On peut par conséquent en conclure que les régions adjacentes en5' des gènes de 25 léghémoglobine de soja sont fonctionnelles dans la levure. Selon la présente invention, on a en outre prouvé que les régions adjacentes en5' se comportent en tant que cibles pour une régulation exercée par ou par l'intermédiaire de l'hème intracellulaire. En effet, l'activité de la CAT est 30 20-40 fois plus élevée dans la levure S. cerevisiae TM1 cultivée en présence de (-ALA que l'activité de la CAT dans une levure cultivée en absence de ce précurseur d'hème dans ce milieu de culture. De semblables activités élevées de la CAT étaient présentes dans la levure S. cerevisiae TM1 35 cultivée en présence d'hème, de protoporphyrine IX ou de --8- l'analogue d'hème deutéroporphyrine IX. L'effet de l'hème sur l'activité de la CAT est spécifique, car la quantité de produit génique URA-3 reste constante dans toutes les conditions examinées. En outre, le degré de transcription ne change apparemment pas à la suite de la présence de l'hème, puisque le taux de CAT-ARNm se maintient constant, indépendamment de variations de la concentration de l'hème intracellulaire. On peut par conséquent en conclure que le mécanisme régulateur exercé par ou par l'intermédiaire de l'hème 10 a lieu au niveau post-transcription. L'accroissement constaté de l'activité de la CAT est dépendant de la synthèse protéique. La demi-vie de l'enzyme CAT est en outre indépendante de la présence de l'hème, et l'activité de la CAT in vitro n'est pas stimulée par l'hème. 15 En conséquence, il est très probable que l'hème contr8ôle l'expression du gène au niveau de la traduction. Une fusion de la région adjacenteen 5' de Lbc3 avec la région codante du gène de la néomycine phosphotransférase (néo) est contr8ôlée par l'hème exactement de la même façon que le gène CAT fusionné avec une région adjacente en5' du gène Lbc3. L'effet de l'hème n'est donc pas réalisé par une interaction de l'hème avec la séquence codante, mais plutôt par une interaction de l'hème avec les séquences adjacentesen 5' ou 3' de Lbc3, présentes dans le CAT-ARNm. L'expression d'un gène 25 ne contenant que la région adjacenteen 5' de Lbc3 et le gène néo est contr8ôlée d'une façon analogue par l'hème. L'effet de l'hème intracellulaire sur l'expression du gène peut donc être réalisée par l'intermédiaire d'une interaction avec la séquence leader. Les courtes séquencesleaders ne contiennent pas de codon d'initiation de traduction. Le mécanisme régulateur exercé par ou par l'intermédiaire de l'hème intracellulaire n'est par conséquent pas apprenté à des mécanismes régulateurs faisant intervenir des faux codons d'initiation (voir mémoire 35 de Hunt, T., Nature, 316, 580-581 [1985]). Le mécanisme régu- -9- lateur décrit dans le cadre de la présente invention est exercé par ou par l'intermédiaire de l'interaction de l'hème avec une séquence leader et constitue par conséquent un nouveau mécanisme régulateur. La présence de plasmides dans une cellule se trouvant dans un milieu naturel confère à la cellule une propriété qui n'est avantageuse pour la cellule que dans certaines conditions. Les propriétés codées par des plasmides peuvent être paremmple la résistance à un antibiotique présent dans le milieu ambiant. Cependant, la présence d'un plasmide et la synthèse des produits géniques codés par le plasmide surcharge le métabolisme énergétique de la cellule et l'appareil de synthèse protéique, et une cellule contenant un plasmide est par conséquent évincée et perdue dans un environ15 nement ne nécessitant pas les propriétés codées par le plasmide. L'instabilité mentionnée ci-dessus est encore accrue par l'utilisation de plasmides en tant que vecteurs pour la synthèse d'un produit génique recherché, qui n'est pas normalement produit par la cellule en question. Cela implique que des cellules synthétisant un tel produit doivent être soumises à une pression de sélection afin d'assurer que le produit génique recherché peut encore être synthétisé. La méthode précédente de réalisation d'un haut degré d'expres25 sion d'un produit génique déterminé consiste dans la régulation de l'expression par un puissant promoteur provoquant une concentration élevée de l'ARNm qui est traduit dans le produit génique en question. Cependant, une concentration élevée du produit génique 30 peut également être obtenue par une traduction plus efficace de l'ARNm en question. Cela implique que la synthèse du produit génique est contrôlée à la fois au niveau de la transcription et au niveau de la traduction, ce qui signifie que la charge génétique sur une cellule synthétisant un produit 35 génique déterminé peut être distribue sur deux activités -1 0 au lieu d'une,comme cela est effectué habituellement. Les deux activités peuvent par conséquent être manipulées de telle façon que le même résultat en ce qui concerne la concentration du produit génique puisoe être obtenu bien que 5 le promoteur ne soit pas aussi puissant que les promoteurs utilisés habituellement. Une telle distribution des deux activités implique que la cellule n'est pas aussi chargée génétiquement que lorsque la synthèse du produit génique n'est contrôlée que par un seul promoteur puissant. Il en 10 résulte que la pression sélective exercée sur la cellule en question peut être réduite. Il est en outre important d'obtenir l'utilisation la plus rationnelle pour la cellule du métabolisme énergétique et de l'appareil de synthèse protéique dans la phase 1 o a lieu la synthèse du produit génique recherché. Une telle utilisation rationnelle du métabolisme énergétique et de l'appareil de synthèse protéique est améliorée de préférence par l'optimisation des dernières étapes de la synthèse d'un produit génique, plutôt que par l'optimisation des étapes 20 initiales. Une caractéristique importante d'un système d'expression de gène est par conséquent que l'expression du produit recherché peut être accrue, d'une expression initialement basse à une surproduction, par une manipulation de l'environnement 25 externe de la cellule, comme décrit par la présente invention. En outre, une optimisation inductible des étapes de synthèse postérieures à la transcription, qui a été décrite par la présente invention,est plus avantageuse qu'une optimisation induite de la transcription. Les méthodes précédentes pour l'expression de gènes dans des levures utilisent divers promoteurs et vecteurs d'expression; voir par exemple EP 120 551 A2, o est décrite l'utilisation de promoteurs de levure GAPDH ou PyK, ainsi que des vecteurs d'expression comprenant ces promoteurs. -1 1 GB 2 137 208 décrit en outre l'utilisation du promoteur GAL1 dans divers vecteurs d'expression. Lorsqu'on utilise ces promoteurs connus, l'expression ne peut être accrue que par l'augmentation de la fréquence de l'initiation de transcription. L'utilisation de ces promoteurs implique par conséquent une charge 'g6nétique élevée sur la cellule, une utilisation non rationnelle du métabolisme énergétique et de l'appareil de synthèse, ainsi qu'une instabilité résultante, nécessitant une forte pression sélective 10 sur l'organisme hôte lors de l'utilisation de ces promoteurs. L'objet de la présente invention est par conséquent de décrire un procédé d'utilisation de promoteurs actifs dans des levures, ainsi que des séquences leaders soumettant d'une façon nouvelle l'expression du gène subséquent à une 15 régulation au niveau post-transcription. D'autres objets de la présente invention consistent à fournir des combinaisons du promoteur et de la séquence leader, ces combinaisons ayant été obtenues à partir de régions adjacentes en 5' de gènes de léghémoglobine de plantes et s'étant révélées être fonction20 nelles dans des levures, de même qu'un objet de l'invention est de fournir des plasmides comprenant la combinaison cidessus de promoteur et de séquences leader. Le procédé selon la présente invention, d'expression de gènes dans une levure par introduction dans une cellule 25 de levure, d'un fragment d'ADN recombinant contenant à la fois le gène à exprimeret une région adjacenteen 5' comprenant une séquence de promoteur, et par culture des cellules de levures transformées dans un milieu de croissance, est caractérisé par l'utilisation, en tant que segment d'ADN 30 recombinant, d'un segment dont la région adjacenteen 5' comprend un premier fragment d'ADN contenant une séquence de promoteur en combinaison avec un second fragment d'ADN contenant une séquence leader contrôlée au niveau posttranscription par un hème, des analogues d'hème ou des pré35 curseurs d'hème. De cette façon, il est possible d'obtenir -12 une synthèse d'un produit biologiquement actif par insertion d'un gène en aval de la combinaison et dans un vecteur approprié qui est capable de réplication dans la levure. Ce procédé permet un accroissement de l'expression d'un gène recherché, 5 par un nouveau mécanisme régulateur agissant au niveau posttranscription. Il en résulte en particulier que l'on obtient une surcharge génétique réduite de la cellule hôte et une utilisation optimale de l'appareil de synthèse protéique et du métabolisme énergétique de la cellule hôte, et par conséquent une stabilité accrue du vecteur d'expression dans la cellule hôte. Une réalisation particulière du procédé selon l'invention utilise en tant que premier fragment d'ADN une séquence de promoteur ayant été isolée ou synthétisée, à combiner 1 à une seconde séquence leader ayant été isolée ou synthétisée. De cette façon, il est possible de combiner toute séquence leader provenant de levures, de plantes ou d'animaux, qui est soumise dans des conditions naturelles à une régulation post-transcription indiquée plus haut, avec tout promoteur 20 de levure, promoteur de plante ou autre promoteur approprié qui est fonctionnel dans une levure. Selon une réalisation particulière du procédé selon l'invention, la concentration intracellulaire de l'hème est augmentée par addition au milieu de culture de sources de 2 carbone, en particulier de sources de carbone non fermentables, qui donnent des concentrations intracellulaires d'hème augmentée De cette façon, on obtient une induction de l'expression du gène recherché, par addition d'une source de carbone au milieu de croissance. On peut citer comme exemples de telles sources de carbone le glycérol et le succinate, qui sont particulièrement préférés car ce sont des sources de carbone peu coûteuses et facilement disponibles. On peut en outre utiliser l'éthanol. Dans certaines conditions, la levure elle-même peut produire cet éthanol au cours de sa croissance. Une fois la croissance 35 terminée, l'éthanol est utilisé, ce qui permet l'accroissement de la traduction. -13 Selon une réalisation particulière, on obtient le meme effet en augmentant la concentration intracellulaire de l'hème par addition au milieu de croissance d'une ou de plusieurs substances choisies parmi l'hème, des analogues d'hème et des précurseurs d'hème. On peut citer comme exemple d'analogue d'hème la deutéroporphyrine IX, et comme exemple d'un précurseur d'hème, l'acide (-aminolévulinique. Une réalisation particulière du procédé selon l'invention utilise un fragment d'ADN comportant une séquence de promoteur et une séquence amorce, ledit fragment d'ADN étant identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentes en5' de gènes de léghémoglobine de plantes, de gènes de levures ou d'autres gènes soumis à une régulation d'expression dans des conditions naturelles, ladite régulation 15 de l'expression étant exercée par ou par l'intermédiaire de l'hème intracellulaire. De cette façon, on parvient à un accès aisé à une combinaison de séquences leaders et de séquences de promoteurs, ladite combinaison s'étant rév6lée selon la présente invention être fonctionnelle dans une 20 levure. On peut citer comme exemples de tels fragments d'ADN, les quatre régions adjacentes en5' des gènes de léghémoglobine de soja, à savoir, Lba comportant la séquence: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG 30 AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G, -14- Lbcl comportant la séquence: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT AATCTCTAGT GTCTATTTAC CTTTAATATT ATTATATCCT TTTCCAAACC TGTAGATTTA S CTTCAGAAA AGTAATTACA TAATAAACTT TAAAATCAAA TATTGGGTGA AATCTCATAG TTATTAGTAA AGTCTGCATG GAAAGGGAGC GAATGTTAAA TAATTATGTT TACATGAAAA AATACTTAAA ATATTTATTT 10 TAGGATTTTG AAAAGATCAT CACAAGCCAA GAGAAACTTA ATATAAACAT GTATTGGATG TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TTTTGTTGAA CCGGTGAGAA CAACCCCACA TTTATTTATT TAAAGATAGT CTTTTTTATA TGAAGCCATT AAATTTAACT AAGTGTGATA CATACAAAAA GCTTAATTGA T'GGCTCTTCG AGTTGTAAAC TGAAGTTATT TAAAAAAGTA CATACATACA GCCTTCTCGT AAAAAGAATA TATTTATTTT GAACATCATT TTTTTTGTTA AAATAATTTG TAACAATAGA TTATATTTTA AATACTTTTA TTAACTGAAA TCATGCCGAT TTTCTCACTC GCATAACTTG GAAAAGAAAT TTTAAAAAAA GTTTTACACA CTGTTATATC TACAAAGGAG TTATTTATTA CCCTTTTCAT GGCTCAAGTT GAGAGTTTTC TTTCGATTAA AATTCAGAAT ATTATTTGAT TGACACCCTC CAAGCCTTCT CATTGAACAA ATG, Lbc2 comportant la séquence: TCGAGTTTTT TTTATTCGGC ATCCCCACCC TTATTTCTTA ATAGTGAACA TTATATTTTT ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT CTCCACAAGC TCTATATAAA CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGGTGAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA TATG, et Lbc3 comportant la séquence: rAiTGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAAAAGAAAT CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG. TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA -15 Une autre réalisation du procédé selon l'invention utilise un fragment d'ADN identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentes en5' du gène YEP Lb CAT comprenant la séquence: TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAATTCTAAA CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA Encore une autre réalisation du procédé selon l'invention oaisteenun procédé de préparation d'un polypeptide par intro20 duction d'un plasmide recombinant dans une cellule de levure, caractérisé par l'utilisation en tant que plasmide recombinant, d'un plasmide contenant une séquence de promoteur et une séquenceleader dans un fragment d'ADN comportant une région adjacente en5' d'un gène de léghémoglobine de plante. 25 Une autre réalisation du procédé selon l'invention vise un procédé d'utilisation en tant que plasmide recombinant, d'un plasmide contenant une séquence de promoteur et une séquence amorce dans un fragment d'ADN comportant une région ajacente en5' ainsi qu'une région adjacente en3' d'un, gène 30 de léghémoglobine de plante. La présente invention concerne également un fragment d'ADN à utitlser-en tant que second fragment d'ADN lorsqu'on effectue le procédé elonijwenticn ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il consiste en un court fragment d'ADN transcrit en un brin d'ARN messager qui est une cible pour une régulation exercée -16 par ou par l'intermédiaire de l'hème intracellulaire. On peut citer comme exemples de tels fragments d'ADN, des fragments d'ADN identiques àprovenant de ou comprenant une séquence leader provenant de gènes de lèghémoglobine de plante, de gènes de levures ou d'autres gènes, dans lesquels ladite séquence leader est, dans les conditions naturelles, une cible pour une régulation exercée par ou par l'intermédiaire de l'hème intracellulaire. On peut citer comme exemples de ceux-ci des fragments d'ADN selon l'invention, qui sont 10 identiques à, qui proviennent de ou qui comprennent une séquence leader provenant de gènes de léghémoglobine de soja, à savoir, Lba, comportant la séquence: AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG, Lbcl, comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG, Lbc2, comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG, et kc3,comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG. Un autre exemple d'un tel fragment d'ADN est un fragment qui est identique à, provient de ou comprend la séquence 30 leader du gène YEP Lb CAT, comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG La présente invention concerne en outre des fragments 35 d'ADN comprenant la combinaison d'un premier fragment d'ADN -17 et d'un second fragment d'ADN et qui doivent être utilisés lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ces fragments d'ADN sont caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence de promoteur et une séquenceleader, et qu'ils sont identiques à, proviennent de ou comprennent des régions adjacentesen 5' de gènes de léghémoglobine de plante. On peut citer comme exemples de tels fragments d'ADN selon l'invention, des fragments d'ADN comprenant une séquence 10 de promoteur et une séquence leader, et qui sont identiques à, proviennent de ou comprennent des régions adjacentes en ' des gènes de léghémoglobine de soja, à savoir, Lba, comportant la séquence: GAGATACATT 15 GATATATACC TCTTTTATTT ATTTTGAAAA GGTTAAATCT GTAGAGTCTA AAAGTTGGTT TTTTTTTTGG CTAACCATAT 20 TAATTAAAAA TCATCATGCT TGGTTTTCTC TTGTTGCATA AAAGAAATAT ATAATAATCT TTCTCGTATA TTATAAAAAA CATGCTCTTT CATAGTGCCT CATAAAATTT TTTCTCGAGG ATTAATAGTT TAAATTTAGA ATTATTTGAT GATTGACACC ACTCTCCAAG ACTTGCATCG G, CTCTAGTGTC CTGTTATTTT GACTTTATTT GACAATTTTC CTATTCAATA ACCTTAATAG AAGAAAGGAA ATGTTTATAT ACAACACTTC TAAATTTTTT CTCCACAAGC CCCTCTATAT AACAATTAAT TATTTATTAT TTCAATCTTG TTTTAAAAAA TGTTTCCTTT ATTTGGGCTC TAGAGAATAG ATGTTAAAAA GAAAACTGAA AATTATTTT' AAAAGATCGT CAAGAGAAAC AAACAAATAT AGAAATAACA TTTATCTGGT TAGATTTACT AATAAAGTGA TTCATCATTG AATTTAATTA AGAGTCTTGG CTGTGATATT AATAAATAAA TTAATTTGAT TGTTTCTTCT ACATAAGCTT TGGAGTGAAG GAAAATTAAA Lbcl, comportant la séquence: TTCTCTTAAT AATCTCTAGT CTTTAATATT TTTCCAAACC ACTTCAGAAA 30 TAATAAACTT TATTGGGTGA TTATTAGTAA GAAAGGGAGC TAATTATGTT AATACTTAAA TAGGATTTTG CACAAGCCAA 35 ATATAAACAT TAGAAAATAA ACAATGGAGT GTCTATTTAC ATTATATCCT TGTAGATTTA AGTAATTACA TAAAATCAAA AATCTCATAG AGTCTGCATG GAATGTTAAA TACATGAAAA ATATTTATTT AAAAGATCAT GAGAAACTTA GTATTGGATG CAAAAAAAAG TTTTGTTGAA CCGGTGAGAA CAACCCCACA TTTATTTATT TAAAGATAGT CTTTTTTATA TGAAGCCATT AAATTTAACT AAGTGTGATA CATACAAAAA GCTTAATTGA TGGCTCTTCG AGTTGTAAAC TGAAGTTATT TAAAAAAGTA CATACATACA GCCTTCTCGT AAAAAGAATA TATTTATTTT GAACATCATT TTTTTTGTTA AAATAATTTG TAACAATAGA TTATATTTTA AATACTTTTA TTAACTGAAA TCATGCCGAT TTTCTCACTC GCATAACTTG GAAAAGAAAT TTTAAAAAAA GTTTTACACA CTGTTATATC TACAAAGGAG TTATTTATTA CCCTTTTCAT GGCTCAAGTT GAGAGTTTTC TTTCGATTAA AATTCAGAAT ATTATTTGAT TGACACCCTC CAAGCCTTCT CATTGAACAA ATG, -18 Lbc2, comportant la séquence: rCGAGTTTTT TTTATTCGGC - ATCCCCACCC TTATTTCTTA 5 ATAGTGAACA TTATATTTTT ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT 10 CTCCACAAGC TCTATATAAA CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGGTGAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA TATG, et Lbc3, comportant la séquence: TATGAAGATT GTACTATTTA 15 GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT 20 GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAAAAGAAAT CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG. TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA Un autre exemple d'un tel fragment d'ADN selon l'invention est un fragment d'ADN qui est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes en 5' du gène YEP Lb CAT comportant la TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA s6quence: AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA -19 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG En outre, l'invention concerne tout plasmide à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et caractérisé en ce qu'il comprend un premier fragment d'ADN 15 tel que défini plus haut, ou une combinaison d'un premier fragment d'ADN et d'un second fragment d'ADN, également tel que défini plus haut. Des plasmides appropriés selon l'invention sont YEP Lb CAT et YEP 5 Lb Km. Les plasmides selon l'invention permettent un haut degré d'expression d'un produit 20 génique recherché, par insertion de séquences codantes pour ces produits géniques. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 Détermination de la séquence de régions adjacentes à 5' de qgènes de léghémoglobine de soja Les quatre gènes de léghémoglobinecesoja(glycioe nu. var. Evaw)Ib, hknl, 2etI3 proviennent d'une collection de gènes de soja, comme décrit par Jensen, E.0. et coll., Nature, 291, 3817, 30 677679 (1981). On isole les régions adjacentesen 5' des quatre gènes de léghémoglobine de soja, comme décrit par Jensen, E.0, Thèse de doctorat, Institut for Molekyloer Biologi, Arhus Iniversitet (1985), et on détermine les séquences des quatre régions adjacentesEn 5', en utilisant la méthode de terminaison de chaîne didéoxy, telle que décrite par Sanger, F., -20 J. Mol. Biol., 143, 161 (1980), et elles sont indiquées sur le diagramme des séquences. Exemple 2 Construction de YEP Lb CAT On a effectué la construction dans une série d'étapes, comme décrit ci-dessous: Sous-clonaqe du gène Lbc3 On a isolé le gène Lbc3 sue un fragmientz.de_ restriction par EcoRI de 12 kb, provenant d'une collection d'ADN de soja, qui a été décritr- par Wiborg et coll. dans Nucl. Acids Res., , 3487. Une section du fragment est indiquée en haut du diagramme 2. Ce fragment a été digéré par les enzymes indiquées, de façon à être soudé ensuite à pBR322, comme indiqué sur le diagramme. Les plasmides Lbc3HH et Lbc3HX résultants ont été ensuite digérés par PvuII et ressoudés, ce qui a conduit aux deux plasmides dénommés pLpHH et pLpHX. Sous-clonage des séquences adjacentes à 5' provenant du gène Lbc3 Comme indiqué sur le diagramme 3, on a utilise a cette fin pLpHH. On a ouvert ce plasmide au moyen de PvuII et on l'a traité par l'exonucléase Bal3l. On a interrompu la réaction à divers instants, et les plasmides raccourcis ont été soudés dans des fragments provenant de pBR322. Ces fragments avaient été traités auparavant comme indiqué sur le diagramme 3, de manière à posséder à une extrémité une séquence d'ADN TTC--AAG--Après le soudage, une digestion par EcoRI.a eu lieu, et les fragments contenant des séquences adjacentes à 5' ont été soudés dans pBR322 digéré par EcoRI. Ces plasmides ont été transformés dans E. coli K803, et on a examine les plasmides présents dans les bactéries transformées, par analyse des séquences. Un plasmide, à savoir p213 5' Lb, isolé à partir d'une des bactéries transformées, contenait une séquence adjacente à. 5', se terminant 7 pb avant le codon -21 d'initiation ATG de Lb, de telle façon que la séquence est constituée comme suit: séquence de Lbc3 (2 kb) adjacente En 5' --- AAAGTAGAATTCTAAAATG. Sous-ólonage de la région adjacente en 3' du gène Lbc3 On a utilisé à cette fin pLpHX qui à été digéré par XhoII. Les extrémités ont été partiellement complétées et on a éliminé l'ADN en excès, comme indiqué sur le diagramme 4. Le fragment indiqué a été soudé dans pBR322, qui avait été 10 prétraité comme indiqué sur le diagramme. La construction a été transformée dans E. coli K803. L'une des bactéries transformées contenait un plasmide dénommé Xho2a-3'-Lb. Comme la séquence de reconnaissance par XhoII est située immédiatement après le codon d'arrêt de Lb (voir diagramme 2), 15 le plasmide contenait environ 900 pb de la région adjacente En3', et la séquence débutait par GAATTCTACAA---. Construction de la cassette de promoteur Lb On a mélangé un fragment EcoRI/SphI provenant de Xho2a-3'Lb avec un fragment BamHI/EcoRI provenant de p213-5'Lb. Ces deux fragments ont été soudés par les points de coupure BamHI/SphI dans un dérivé de pBR322 dans lequel la séquence de reconnaissance par EcoRI avait été enlevée (voir diagramme 4). Les plasmides soudés ont été transformés dans E. coli K803. Un plasmide contenu dans une des bactéries 25 transformées contenait les fragments corrects, et il a été dénommé pEJLb 5'-3'-1. Construction du gène chimère Lb/CAT On a isolé le gène CAT de pBR322 sur plusieurs fragments de restriction relativement courts, comme indiqué sur le diagramme 5. On a isolé la région codante 5' sur un fragment AluI qui a été ensuite soudé dans pBR322, et traité comme indiqué sur le diagramme. On a transformé celui-ci dans E. coli K803, et on a sélectionné une bactérie transformée qui contenait un plasmide dénommé Alu11. On a isolé la région 35 codante 3' sur un fragment TaqI. On a traité ce fragment -22 par l'exonucléase Ba131, à la suite de quoi on a ajout6 des éléments de liaison EcoRI. Cela a été suivi d'une digestion par EcoRI et d'un soudage dans pBR322 digéré par EcoRI. Ce dernier a été transforme dans E. coli K803 et on a analysé 5 les bactéries transformées. Un plasmide, Taq 12, contenait la région codante 3' du gène CAT, plus des séquences adjacentes en3' de 23 pb, de manière a se terminer ensuite par la séquence suivante, CCCCGAATTC.Les.fragments suivants ont été ensuite soudés ensemble dans pEJLb5'-3'-l digéré par EcoRI: le fragment EcoRI/PvuII provenant de Alu11, le fragment PvuII/DdeI provenant de pBR322 et le fragment DdeI/EcoRI provenant de Taq 12. Ce dernier a été transformé dans E. coli K 803. Une bactérie transformée qui a été sélectionnée contenait le plasmide correct, dénommé pEJLb5'-3' CAT 15. Clonage du gène chimère Lb/CAT dans un plasmide de levure On a isolé le gène chimère sur un fragment BamHI/Sphl provenant de pEJLb 5'-3' CAT 15 et on l'a soudé dans le plasmide de levure YEP24 coupé avec les mêmes enzymes. Après la transformation dans E. coli K803, on a examiné une bac20 térie transformée qui avait été sélectionnée. Celle-ci contenait le plasmide YEP LbCAT représente sur le diagramme 6. * Ce plasmide a été transformé à nouveau dans les souches de levures Scaccharomyces cerevisiae DBY747 et TM1. Exemple 3 Construction de YEP 5Lb Km On a isolé le gène de la néomycine phosphotransferase (NPTII) provenant de pKM2 (Beck et coll., Gene 19, 327). On a isolé de ce gène la région codante 5' sur un fragment Sau3A, comme indiqué sur le diagramme 7, et on l'a ensuite 30 soudéedans pBR322, ce qui a conduit à un plasmide dénommé Sau 13. On a isolé la région codante 3' et la région adjacente du gène NPTII sur un fragment PvuII. On a soudé ce dernier en même temps qu'un fragment EcoRI/PvuII provenant de Sau 13 dans pEJLB 5'-3'-1 digéré par EcoRI/PvuII. Après transforma35 tion dans E. coli K803, on a sélectionne une bactérie -23 transform6e qui contenait le plasmide correct, à savoir pEJLb 5' Km 1. Ce plasmide a été ultérieurement digéré au moyen de BamHI et partiellement au moyen de PvuII, de telle façon que la séquence complète de Lb adjacente en5' + la 5 séquence NPTII codante étaient présentes sur un fragment BamHI/PvuII. Ce fragment a été soudé dans YEP24 digéré par BamHI/PvuII, ce qui a donné le plasmide YEP 5Lb Km, représenté sur le diagramme 8. Ce plasmide a été transformé dans la souche de levure Saccharomyces cerevisiae TM1. 10 Exemple 4 Effet de la source de carbone sur l'expression de CAT On cultive Saccharomyces cerevisiae DBY747 contenant le plasmide YEP Lb CAT, dans un milieu minimal additionné de 2% d'une source de carbone. On récolte les cellules à 15 une densité cellulaire de 5 x 106 cellules/ml. On mesure l'activité de la CAT comme décrit par Walker, Edlund, Boulet et Rutter, Nature, 306, 557 (1983). On indique dans le tableau 1 l'activité de la CAT en fonction de la source de carbone. L'activité la plus élevée, 20 obtenue par culture sur succinate ou sur glycérol, a été fixée arbitrairement à 100%. Tableau 1 Source de carbone Activité Succinate 100 Glycérol 100 Glucose 28 Saccharose 18 Exemple 5 Effet de précurseurs d'hème et d'analogues d'hème sur l'induc30 tion de l'expression du gène On cultive Saccharomyces cerevisiae TM1 contenant le plasmide YEP Lb CAT, dans un milieu minimal additionn6 de 2% de glucose et de 0,1% de Tweene, plus 20 >ig/ml d'ergostérol et 50 pg/ml de méthionine, ainsi qu'un des analogues d'hème 35 ou précurseurs d'hème suivants. On ajoute, respectivement, -24 de la deuteroporphyrine IX (dp) et de la protoporphyrine (pp) à une concentration finale de 5 ug/ml. On ajoute de l'hémine à une concentration finale de 5 ug/ml. On ajoute de l'acide S-aminolévulinique (S-ALA) à une concentration finale de 50 ug/ml. Dans le tableau 2, on indique l'activité, respectivement, du précurseur d'hème et de l'analogue d'hème, exprimée par l'activité de la CAT. L'activité la plus élevée, obtenue par addition de S-ALA ou de dp, a été fixée arbitrairement 10 à 100%. Tableau 2 Inducteur Activité de la CAT Glucose + f-ALA 100 Glucose + dp 100 Glucose + pp 50 Glucose + hémine 25 Glucose 5 Exemple 6 Insertion d'éléments de liaison dans la séquence leader Deux éléments de liaison d'ADN de synthèse ont été insérés: l'un immédiatement avant le codon d'initiation contenant la séquence de reconnaissance par l'enzyme BglII, et l'autre en amont du site d'addition CAP contenant la séquence de reconnaissance pour KpnI (voir diagramme 9, sur lequel la 25 nouvelle construction pEJ 5'-3' CAT101 est comparée à la construction initiale). Une comparaison de l'expression des deux constructions montre (essai comme dans l'exemple 5): Glucose Glucose + hème Induction CAT15 0,11 6,01 x 55 CAT101 0,22 1,72 x 8 Les nombres indiques les nombres de nmoles de chloramphénicol qui ont réagi par mg de protéine par minute. Cela indique que deux changements spécifiques dans la 35 région 5' aboutissent à une réduction de l'induction par -25 l'hème, qui passe de x55 à x8. Exemple 7 Remplacement de la région 5'de Lbc3 par une région correspondante, provenant du gène ILV1 de S. Cerevisiae La totalité de la région 5' de Lbc3 est retirée de CAT101, par coupure par BamHI et BglII. On insère à la place un fragment d'ADN de 765 pb, provenant du gène ILV1, contenant la séquence de promoteur et la séquence leader. Cette construction est dénommée PEJ CAT-BD. Dans une autre construction, on retire le promoteur de Lbc3, en laissant la séquence leader. Cela est réalisé par coupure de CAT101 par BamHI et KpnI. Ce fragment est remplacé par un fragment de 670 pb, provenant de ILV1, le promoteur sans la séquence leader. Ce plasmide est dénommé 15 PEJ CAT-KN. On représente schématiquement les constructions: promoteur séquence leader séquence codante CAT-BD CAT-KN ILV1 CAT CAT ILV1 Lbc3 lI//liiii //' La comparaison des séquences est illustrée sur le dia25 gramme 10. Examen de l'expression Glucose Glucose + hème Induction CAT-BD 1089 1162 aucune CAT-KN 789 1581 x 2 (Mêmes unités que dans les essais précédents). La seule différence entre les deux constructions est l'origine de la séquence amorce. Ce résultat indique que la séquence amorce de Lbc3 est nécessaire pour l'induction. Le taux d'induction n'est toutefois pas aussi élevé que pour 35 CAT101, qui est le matériau de départ. Cela peut être dû -26 au fait que la construction débute 13 nucléotides plus près du codon ATG et manque donc de 13 nucléotides d'ARNm, ce qui peut être important pour l'induction. Tous ces essais indiquent clairement que l'induction par l'hème est liée à la séquence leader! de Lbc3. Il doit être bien entendu que la description qui précède n'a été donnée qu'à titre illustratif et non limitatif et que toutes variantes ou modifications peuvent y être apportées sans sortir pour autant du cadre de l'invention, tel que 10 défini dans les revendications ci-annexées. Ainsi, l'invention, n'utilise pas exclusivement des régions adjacentesen 5' de gènes de léghémoglobine de soja. Il est bien connu que les gènes de léghémoglobine de toutes les légumineuses ont la même activité (voir Appleby, dans 1 The Biology of Nitrogen Fixation, Edité par A. Quispel, North Holland Publishing Company, Amsterdam, Oxford (1974) p 499-554), et il a été prouvé en outre, qu'en ce qui concerne le gène PvLbl du haricot, il existe un net degré d'homologie avec les séquences de Lbc3 du soja. L'invention comprend 20 donc l'utilisation de régions adjacentes en 5' de gènes de léghémoglobine pour tous les végétaux. Selon l'invention, il est également possible d'utiliser de tels fragments provenant de plantes, d'animaux ou de levures qui, dans les conditions naturelles, exercent directement 25 ou indirectement la nouvelle activité régulatrice décrite selon la présente invention. Cela s'applique en particulier à de tels fragments qui peuvent être isolés à partir de fragments d'ADN provenant de collections de gènes, par hybridation avec des séquences marquées provenant de régions adja30 centes en5' de gènes de léghémoglobine de soja. Il est bien connu qu'il est possible de modifier des séquences de nucléotides dans des sous-régions non essentielles de régions adjacentes en5', sans que cela provoque un changement d'activité ni de susceptibilité à la régulation 35 promoteur. Il est également bien connu qu'en modifiant les -27 séquences de sous-régions importantes de régions adjacentes en5', il est possible de modifier les affinités de liaison entre séquences de nucléotides et les facteurs ou effecteurs nécessaires pour l'initiation de la transcription et l'ini5 tiation de la traduction, et qu'il est possible par consequent d'améliorer l'activité et/ou la susceptibilité à la régulation du promoteur. Naturellement, la présente invention englobe également l'utilisation de telles séquences modifiées de régions adjacentes en5'. On peut mentionner en particulier 10 l'utilisation de séquences leaders qui ont été prolongées au-delà de la longueur naturelle, dans la mesure o l'utilisation d'un tel fragment fait de l'expression d'un produit génique recherché le sujet de la nouvelle régulation selon la présente invention. -28 REVENDICATIONS 1. Procédé d'expression de gènes dans une levure par introduction dans une cellule de levure, d'un fragment d'ADN recombinant contenant à la fois le gène à exprimE et une région adjacente 5' comprenant une séquence de promoteur, et par culture des cellules de levures transformées dans un milieu de croissance, caractérisé par l'utilisation, en tant que segment d'ADN recombinant, d'un segment dont la région adjacenteen 5' comprend un premier fragment d'ADN contenant une séquence de promoteur en combinaison avec un second fragment d'ADN contenant une séquence leader contrôlée au niveau post-transcription par un hème, des analogues d'hème ou des précurseurs d'hème. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par 1 l'utilisation, en tant que premier fragment d'ADN, d'une séquence de promoteur ayant été isolée ou synthétisée, pour la combinaison avec le second fragment d'ADN. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par l'utilisation, en tant que second fragment d'ADN, d'une 20 séquence leader ayant été isolée ou synthétisée,pour la combinaison avec le premier fragment d'ADN. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par l'accroissement de la concentration intracellulaire d'hème par addition au milieu de croissance de sources de carbone qui provoquent un accroissement de la concentration intracellulaire de l'hème. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la source de carbone est choisie parmi le glycérol, du succinate ou l'éthanol. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par l'accroissement de la concentration intracellulaire d'hème par addition au milieu de croissance d'une ou de plusieurs substances choisies parmi l'hème, des analogues d'hème et des précurseurs d'hème. -29 7. Procéd6 selon la revendication 6, caractéris6 par l'utilisation, en tant qu'analogue d'hème, de la deutéroporphyrine IX et/ou, en tant que précurseur d'hème, de l'acide t-aminolévulinique. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN comprenant une séquence de promoteur et une séquenceleaider -, et étant identique a, provenant de ou comprenant des régions adjacentes en 5' de gènes de léghémoglobine de plante, de gènes de levure ou d'autres gènes soumis dans les conditions naturelles à une régulation de l'expression exercée par ou par l'interm6diaire d'hème intracellulaire. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN identique à, provenant 15 de ou comprenant des régions adjacentesen 5' de gènes de léghémoglobine de soja. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentesen 5' du gène Lba 20 comportant la séquence: GAGATACATT GATATATACC TCTTTTATTT ATTTTGAAAA GGTTAAATCT GTAGAGTCTA 25 AAAGTTGGTT TTTTTTTTGG CTAACCATAT TAATTAAAAA TCATCATGCT TGGTTTTCTC TTGTTGCATA 30 AAAGAAATAT ATAATAATCT TTCTCGTATA TTATAAAAAA CATGCTCTTT CATAGTGCCT CATAAAATTT TTTCTCGAGG ATTAATAGTT TAAATTTAGA ATTATTTGAT GATTGACACC ACTCTCCAAG ACTTGCATCG G. CTCTAGTGTC CTGTTATTTT GACTTTATTT GACAATTTTC CTATTCAATA ACCTTAATAG AAGAAAGGAA ATGTTTATAT ACAACACTTC TAAATTTTTT CTCCACAAGC CCCTCTATAT AACAATTAAT TATTTATTAT TTCAATCTTG TTTTAAAAAA TGTTTCCTTT ATTTGGGCTC TAGAGAATAG ATGTTAAAAA GAAAACTGAA AATTATTTTT AAAAGATCGT CAAGAGAAAC AAACAAATAT AGAAATAACA TTTATCTGGT TAGATTTACT AATAAAGTGA TTCATCATTG AATTTAATTA AGAGTCTTGG CTGTGATATT AATAAATAAA TTAATTTGAT TGTTTCTTCT ACATAAGCTT TGGAGTGAAG GAAAATTAAA 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentes en 5' du gène Lbcl comportant la séquence: -30- TTCTCTTAAT AATCTCTAGT CTTTAATATT TTTCCAAACC ACTTCAGAAA TAATAAACTT TATTGGGTGA TTATTAGTAA GAAAGGGAGC TAATTATGTT AATACTTAAA TAGGATTTTG CACAAGCCAA ATATAAAC.'T TAGAAAATAA ACAATGGAGT GTCTATTTAC ATTATATCCT TGTAGATTTA AGTAATTACA TAAAATCAAA AATCTCATAG AGTCTGCATG GAATGTTAAA TACATGAAAA ATATTTATTT AAAAGATCAT GAGAAACTTA GTATTGGATG CAAAAAAAAG TTTTGTTGAA CCGGTGAGAA CAACCCCACA TTTATTTATT TAAAGATAGT CTTTTTTATA TGAAGCCATT AAATTTAACT AAGTGTGATA CATACAAAAA GCTTAATTGA TGGCTCTTCG AGTTGTAAAC TGAAGTTATT TAAAAAAGTA CATACATACA GCCTTCTCGT AAAAAGAATA TATTTATTTT GAACATCATT TTTTTTGTTA AAATAATTTG TAACAATAGA TTATATTTTA AATACTTTTA TTAACTGAAA TCATGCCGAT TTTCTCACTC GCATAACTTG GAAAAGAAAT TTTAAAAAAA GTTTTACACA CTGTTATATC TACAAAGGAG TTATTTATTA CCCTTTTCAT GGCTCAAGTT GAGAGTTTTC TTTCGATTAA AATTCAGAAT ATTATTTGAT TGACACCCTC CAAGCCTTCT CATTGAACAA ATG. 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentesen 5' du gène Lbc2 comportant la séquence: TCGAGTTTTT TTTATTCGGC ATCCCCACCC TTATTTCTTA ATAGTGAACA TTATATTTTT 20 ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT CTCCACAAGC TCTATATAAA __ CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGGTGAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA TATG. 13. Procédé selon la revendication 9, caractérise par l; TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA -31 - AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. 14. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par l'utilisation d'un fragment d'ADN identique à, provenant de ou comprenant des régions adjacentesen 5' du gène YEP Lb CAT 15 comportant la séquence: TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAATTCTAAA CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA *CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA 15. Proc6dé selon la revendication 1, pour la préparation d'un polypeptide par introduction d'un plasmide recombi30 nant dans une cellule de levure, caractérisé par l'utilisation, en tant que plasmide recombinant, d'un plasmide contenant une s6quence de promoteur et une séquence leader dans un fragment d'ADN comportant une région adjacente én5' d'un gène de légh6moglobine de plante. -32 16. Procéd6 selon la revendication 15, caract6risé par l'utilisation, en tant que plasmide recombinant, d'un plasmide contenant une séquence de promoteur et une séquence leader dans un fragment d'ADN comportant une région adjacente en 5' ainsi qu'une région adjacente en3' d'un gène de léghémoglobine de plante. 17. Fragment d'ADN comprenant une séquence leader. et à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il 10 est un court fragment d'ADN transcrit en un brin d'ARNm qui est une cible pour une régulation exercée par ou par l'intermédiaire d'hème intracellulaire. 18. Fragment d'ADN selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend une séquence leader provenant de gènes de léghémoglobine de plante, de gènes de levures ou d'autres gènes, dans lesquels ladite séquence leader est, dans les conditions naturelles, une cible pour une régulation exercée par ou par l'intermédiaire d'hème intracellulaire. 19. Fragment d'ADN selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend une séquence leader provenant de gènes de léghémoglobine de soja. 20. Fragment d'ADN selon la revendication 19, carac25 térisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend la séquence leader provenant du gène Lba comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG. 21. Fragment d'ADN selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend la séquence leader provenant du gène Lbcl comportant la séquence: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG. -33- 22. Fragment térisé en ce qu'il la s6quence leader quence: d'ADN selon la revendication 19, caracest identique à, provient de ou comprend provenant du gène Lbc2 comportant la se- AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG. 23. Fragment t6ris6 en ce qu'il 10 la séquence leader quence: d'ADN selon la revendication 19, caracest identique à, provient de ou comprend provenant du gène Lbc3 comportant la sé- AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG. 24. Fragment téris6 en ce qu'il la séquenceleader la séquence: d'ADN selon la revendication 19, caracest identique à, provient de ou comprend provenant du gène YEP Lb CAT comportant AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG 25. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 4, , 6, 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence 2 de promoteur et une séquence leader, et qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes en 5' de gènes de léghémoglobine de plante. 26. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 4,5, 30 6, 7, 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de promoteur et une séquence leader, et qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentesen 5' de gènes de léghémoglobine de soja. -34 27. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes e,1 5' du gène Lba comportant la séquence: GAGATACATT GATATATACC TCTTTTATTT ATTTTGAAAA GGTTAAATCT GTAGAGTCTA AAAGTTGGTT TTTTTTTTGG CTAACCATAT TAATTAAAAA TCATCATGCT TGGTTTTCTC TTGTTGCATA ATAATAATCT TTCTCGTATA TTATAAAAAA CATGCTCTTT CATAGTGCCT CATAAAATTT TTTCTCGAGG ATTAATAGTT TAAATTTAGA ATTATTTGAT GATTGACACC ACTCTCCAAG ACTTGCATCG CTCTAGTGTC CTGTTATTTT GACTTTATTT GACAATTTTC CTATTCAATA ACCTTAATAG AAGAAAGGAA ATGTTTATAT ACAACACTTC TAAATTTTTT CTCCACAAGC CCCTCTATAT AACAATTAAT TATTTATTAT TTCAATCTTG TTTTAAAAAA TGTTTCCTTT ATTTGGGCTC TAGAGAATAG ATGTTAAAAA GAAAACTGAA AATTATTTTT AAAAGATCGT CAAGAGAAAC AAACAAATAT AGAAATAACA TTTATCTGGT TAGATTTACT AATAAAGTGA TTCATCATTG AATTTAATTA AGAGTCTTGG CTGTGATATT AATAAATAAA TTAATTTGAT TGTTTCTTCT ACATAAGCTT TGGAGTGAAG GAAAATTAAA 15 AAAGAAATAT G. 28. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes en5' du gène Lbcl comportant la séquence: TTCTCTTAAT AATCTCTAGT CTTTAATATT TTTCCAAACC ACTTCAGAAA TAATAAACTT TATTGGGTGA TTATTAGTAA GAAAGGGAGC TAATTATGTT AATACTTAAA TAGGATTTTG CACAAGCCAA ATATAAACAT TAGAAAATAA ACAATGGAGT GTCTATTTAC ATTATATCCT TGTAGATTTA AGTAATTACA TAAAATCAAA AATCTCATAG AGTCTGCATG GAATGTTAAA TACATGAAAA ATATTTATTT AAAAGATCAT GAGAAACTTA GTATTGGATG CAAAAAAAAG TTTTGTTGAA CCGGTGAGAA CAACCCCACA TTTATTTATT TAAAGATAGT CTTTTTTATA TGAAGCCATT AAATTTAACT AAGTGTGATA CATACAAAAA GCTTAATTGA TGGCTCTTCG AGTTGTAAAC TGAAGTTATT TAAAAAAGTA CATACATACA GCCTTCTCGT AAAAAGAATA TATTTATTTT GAACATCATT TTTTTTGTTA AAATAATTTG TAACAATAGA TTATATTTTA AATACTTTTA TTAACTGAAA TCATGCCGAT TTTCTCACTC GCATAACTTG GAAAAGAAAT TTTAAAAAAA GTTTTACACA CTGTTATATC TACAAAGGAG TTATTTATTA CCCTTTTCAT GGCTCAAGTT GAGAGTTTTC TTTCGATTAA AATTCAGAAT ATTATTTGAT TGACACCCTC CAAGCCTTCT CATTGAACAA ATG. 29. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes en 5' du gène Lbc2 comportant la séquence: -35- úUGAGTTTTT TTTATTCGGC ATCCCCACCC TTATTTCTTA ATAGTGAACA TTATATTTTT ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT CTCCACAAGC TCTATATAAA CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGGTGAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA TATG. 30. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentesen 5' du gène Lbc3 comportant la séquence: TATGAAGATT GTACTATTTA 1 GTAGATTTAT ATAAAAATAG AAATATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT 20 GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAAAAGAAAT CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG. TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA 31. Fragment d'ADN à utiliser lors de la mise en oeuvre du proc6dé selon la revendication 14, caract6risé en ce qu'il est identique à, provient de ou comprend des régions adjacentes en 5' du gène YEP Lb CAT comportant la s6quence: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT -36- TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAGTA 10 TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA TTATTCTGAT AGTTGTTGCA GAATTCTAAA CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA CACTCTTCAA TAACTTGCAT ATG AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATA TA TTTGAAAAGA ACAAGCCAAG GCCTTCTATA TGAACAATTA CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA TAAATAAGTA ATAGAAATAA 32. Plasmide qui peut être utilisé lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend un premier 15 fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 24 ou un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 25 à 31. 33. Plasmide selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il est YEP Lb CAT. 34. Plasmide selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il est YEP 5 Lb Km.