Brevet FR2610324A1 — publié le 19880805

La présente invention concerne un procédé mettant en oeuvre les techniques de manipulations génétiques. in vitro pour obtenir un arrangement de séquences d'acides déoxyriboucléiques permettant la biosynthèse de l'angiogénine humaine par une bactérie. L'angiogénine est une protéine constituée de 123 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 14400 dalt-ns qui a été mise en évidence à partir de cultures de la lig. : cellulaire HT 29 d'adénocarcinome humain du colon tJ.W. Fett et coll. Biochemistry (1985) 24, 5480-54863. Elle possède la propriété d'induire in vivo l'angiogénèse, c' est-a-dire la formation et la croissance des vaisseaux sanguins, ce phénomène étant mis en évidence au laboratoire sur les membranes chorioallantoidales d'embryons de poulets ou sur la cornée du lapin. L'angiogénèse est un phénomène intervenant durant l'embryo- génèse et durant de nombreux évènements de la vie adulte, notamment l'ovulation ou la cicatrisation. La croissance des tumeurs solides induit également l'angio génèse a la différence que celle-ci n'est plus contrôlée (J. Folkman, Advances in Cancer Research (1985), 43, 175-203). Une fois l'angio génèse tumorale commencée, elle continue jusqu'à l'éradication de la tumeur ou la mort du sujet. Dans ce qui suit la signification des termes techniques employés en biologie moléculaire sera supposée connue (cf. par exemple "Biologie Moléculaire du Gène", J. Watson, édition française Interéditions 1978). Les techniques de construction génétiques in vitro offrent à présent la possibilité de faire syuthétiser par un microorganisme. en particulier la bactérie Escherichia coli, n'importe quelle chaîne polypeptidique, et ce théoriquement en quantités illimitées (voir par exemple F. Gross et coll., 1979, Sciences de la Vie et Société, Documentation française Ed.). Les recherches en biologie moléculaire et la mise au point des techniques de séquençage de 1'ADN [F. Sanger et coll., J. Mol. Biol. (1975), 94, 441 ; A.M. Maxam et W. Gilbert, Pro. Natl. Acad. Sci. (US) (1977), 74, 560] ont permis de préciser l'organisation fonctionnelle et moléculaire du gène telle que l'avaient conçue F. Jacob et J. Monod [Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. (1961), 26, 193]. Ainsi, la région codante du gène est encadrée d'un codon dit "d'initiation de traduction" et d'un codon "d'arrêt de traduction". Le codon d'initiation a pour but de fixer un ARN de transfert porteur d'une formylméthionine. La channe polypeptidique s'allongera à partir de cette formylméthionine par attachements successifs des acides aminé correspondant à la séquence codée par le gène. Enfin, le codon d'arrêt provoquera un arrêt de l'allongement et la libération de la protéine synthétisée. D'autres séquences d'ADN sont essentielles dans l'expression du gène. Ainsi, on a pu définir des "promoteurs" comme étant des fragments d'ÂDN sur lesquels se fixe l'ARN polymérase, des "opérateurs" comme étant des fragments reconnus par des protéines régulatrices, ou des régions transcrites permettant la fixation des ribosomes. Ces signaux d'expression sont caractérisés par leurs propriétés fonctionnelles dans l'expression d'une protéine mais également par leurs séquences nucléotidiques, ce dont les techniques de recombinaison génétiques in vitro tirent profit pour placer une région codante quelconque sous leur contrôle, ceci grâce a l'emploi des "enzymes de restriction", qui coupent l'ADN en des sites spécifiques définis par leurs séquences nucléotidiques [S. Linn et W. Arber, Proc. Nucl. Acad. Sci. (1968), 59, 1300-1306 ; H.0.Smith et K.W. Wilcox, J. Mol. Biol., (1970), 51, 379-391 ; R. Roberts, Nucleic Acids Research, (1981), 9, 75-96]. Les techniques utilisées mettent en oeuvre l'utilisation concertée de ces enzymes pour couper l'ADN en des sites prédéterminés, et d'enzymes dites "ligases" pour lier les fragments entre eux [P.E. Loban et A.D. Kaiser, J. Mol. Biol., (1973), 78, 453-471]. L'ensemble est porté par des "vecteurs" (plasmides ou bactériophages) susceptibles d'être introduits dans une bactérie telle que E. coli selon des procédés connus, et de s'y maintenir lors de la multiplication des bactéries hôtes [S. Cohen et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. (1973), 70, 3240-3244]. Ainsi la présente invention concerne un procédé permettant d'induire la biosynthèse de l'angiogénine humaine dans un microorganisme. L'invention consiste à synthétiser chimiquement la séquence codante de l'angiogénine humaine de sorte que celle-ci contienne les codons les plus fréquemment utilisés chez E. coli puis à lier cette séquence codante à des signaux permettant une e ression importante et régulée chez E. coli. Une bactérie hôte, telle que E. coli, contenant ce gène, produit un taux d'angiogénine important après induction dans des conditions définies. Il a été rapporté R.G. Schoner et coll., Biotechnology (1985), 3, 151-1543 que les protéines hétérologues synthétisées a haut niveau chez E. coli se trouvent dans la cellule sous forme d'aggrégats insolubles. Ce même phénomène est observé dans le cas de l'angiogénine. Il en résulte que l'angiogénine humaine synthétisée chez E. coli ne peut pas être purifiée par des méthodes classiques de purification. En revanche, il a été montré que le processus de dénaturation-renaturation d'une protéine est réversible sous certaines conditions et de nombreuses protéines ont pu être transformées en leur forme native après dénaturation et réduction contrôlées in vitro. C'est le cas, par exemple, de la tryptophanase d'E. coli, du chymotrypsinogène, de l'anhydrase carbonique, de la ribonucléase, du lysozyme et de l'inhibiteur trypsique de pancréas bovin [J. London et coll., Eur. J. Bioch. (1974), 47, 409-415 ; G. Orsini et M.E. Goldberg, J. Biol. Chem. (1978), 253, 3453-3458 ; K.P. Wong et C. Tanford, J. Biol. Chem. (1973), 248, 8519-8523 ; C.B. Anfisen et E. Haber, J. Biol. Chem. (1961), 236, 1361-1363 ; V.P. Saxena et D.B. Wetlaufer, Biochemistry (1970), 9, 5015-5022 ; T.E. Creighton et coll., J. Mol. Biol. (1974), 87, 563-577]. La présente invention concerne également un procédé permettant de modifier, par dénaturation et renaturation contrôlée, la conformation de l'angiogénine humaine produite par voie microbiologique selon le procédé de la presente invention ou par toute autre méthode conduisant a une angiogénine humaine non-native, afin que la protéine ainsi produite possède une structure tridimensionnelle identique a celle de la protéine native d'origine naturelle. Dans ce qui suit seront décrits successivement les constructions et les conditions d'expression du gène de l'angiogénine ainsi que les procédés de purification, de dénaturation et de renaturation sous me forme active de l'angiogénine produite. Les techniques classiques de purification de plasmides, de préparation des cellules compétentes pour la transformation par la méthode au Cal2, sont décrites dans le manuel de laboratoire T. Maniatis et coll., Molecular cloning, (1982), Cold Spring Harbour Laboratory. Les séquences d'ADN ont été déterminées par la méthode de Sanger [A.J.H. Smith, Methods in Enzymol. (1980), 65, 499-559]. Les protocoles de clonage dans M13 ainsi que les phages M13mpll, M13mp19 et les souches JM101 et JM103 sont décrits tMessing et coll., Nucleic Acid Res. (1981), 9, 309-321 ; C. Yanisch-Perron et coll., Gene (1985) 33, 103-119]. Les endonucleases de restriction (New England Biolabs) ont été utilisées selon les conseils du fabricant. Le tampon utilisé pour les ligatures a la composition suivante : Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 15 mM, ATP 1 mM, pH 7,5.Le tampon de phosphorylation des oligonucléotides a la composition suivante : Tris-HCl 5 mM, MgCl2 1 mM, DTT 0,6 mM, pH 7,5. A - Synthèse et assemblage de la séquence codante de l'angiogénine La présente invention concerne une séquence nucléotidique du gène de l'angiogénine qui est intrinsèquement différente de la séquence publiée par K. Kurachi et coll., Biochemistry (1985), 24, 5195-5499 et qui a été optimisée pour l'expression du gène chez E. coli. En effet cette séquence nucléotidique de l'angiogénine, représentée par la Figure 1, a été définie dans le but d'exprimer l'angiogénine dont la séquence en acides aminés a été publiée par D.J. Strydom et coll., Biochemistry (1985), 24, 5486-5494, a partir des codons les plus fréquemment utilisés chez E. coli [T. Maruyama et coll., Nucl. Ac. Res. (1986), 14, rl51]. Cette séquence nucléotidique originale de l'angiogénine a été réalisée par l'assemblage de huit oligonucléotides, représentés sur les Figures 1 et 2, qui ont été synthétisés par voie chimique et dont la taille est comprise entre 86 et 107 mer. De plus, on peut remarquer sur la Figure 1 que des extrémités cohésives BamHI, EcoRI et SacI ont été définies afin de permettre un ssemblage en deux étapes de la séquence complète de l'angiogénine. a - Synthèse des oligonucléotides Les huit oligonucléotides qui ont servis à l'assemblage du gène de l'angiogénine, ont été synthétisés par la méthode des phosphoramidites [t.J. Bride et M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. (1983), 24, 245] au moyen du synthétiseur Pharmacia (Modèle Gene Assembler) pour les oligonucléotides A, B, C, D et G et du synthétiseur Biosearch (Modèle 8600) pour les oligonucléotides E, F et H, selon les indications des fabricants. Les oligonucléotides ont été purifiés sur gel d'acrylamide 15 %. b - 1ère étape d'assemblage Les oligonucléotides ont été phosphorylés par traitement avec la T4 DNA kinase. Les oligonucleotides A, C, E, G ont été appariés respectivement avec les oligonucléotides B, D, F et H dans des conditions stoechiométriques. L'hybridation des oligonucléotides a été réalisée dans des tubes Eppendorf immergés dans un bécher contenant environ 100 cm3 d'eau portée a 800C que l'on laisse revenir à une température voisine de 20"C. Les fragments A-B et C-D ont été ligaturés en présence de T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mpl9 au préalable digérée par les enzymes BamHI et EcoRI. Les fragments E-F et G-H ont été ligaturés en présence de T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mpl1 coupée par les enzymes EcoRI et SacI. Les plasmides recombinants obtenus appelés M13A-D et M13E-H ont servi à transfecter respectivement des cellules de JM103 et JM101 rendues compétentes par la méthode au CaCl. Ces plasmides ont été purifiés, soit sous la forme d'ADN simple brin et leur séquence a été vérifiée, soit sous la forme d'ADN double brin pour la suite des constructions. c - 2ème étape d'assemblage Let formes réplicatives de M13A-D et M13E-H ont été digérées par Ex wu et BstEII. Dans le cas de M13A-D un fragment de 189 paires de bases a été purifié sur gel d'acrylamide. Dans le cas de M13E-H, deux fragments de 45 et environ 7300 paires de bases ont été copurifiés par précipitation à l'éthanol après extraction avec un mélange phénol-chloroforme (1-1 en volumes). Les trois fragments ont été rassemblés et ligaturés en présence de T4 DNA ligase. Après transfection de JM101, des clones contenant la forme réplicative appelée M13A-H ont été obtenus. La séquence codante complète du gène de l'angiogénime portée par M13A-H a été vérifiée avant son insertion dans un vecteur d'expression. B - Construction du vecteur d'expression de l'angiogénine 1 - Isolement des signaux d'expression Les signaux d'expression décrits dans la présente invention sont - la région opérateur/promoteur de l'opéron trpLEDCBA d'Escherichia coli qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant modulable par la concentration en acide aminé tryptophane dans le milieu de culture, - le site de fixation des ribosomes du gène cil du bactériophage lambda dépourvu de la séquence tR1 qui permet une initiation de la traduction efficace de l'ARN messager, - les terminateurs T1 et T2 de l'opéron rrnB qui permettent un arrêt de la transcription du gène situé en amont. On note que les plasmides contenant le promoteur Ptrp doivent être propagés dans des souches de E. coli contenant le gène répresseur sauvage trpR afin que le promoteur Ptrp ne s'exprime pas de façon constitutive. il a été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que l'introduction de la s- uence codante de l'angiogénine entre le site de fixation des ri or s du gène cil, situé après la région opérateur/promoteur O/+~rp, et la région contenant les terminateurs T1 et T2 permet une expression à haut niveau de cette protéine chez E. coli. 2 - Construction du vecteur d'expression Le plasmide utilisé pour la construction du vecteur d'expression de l'angiogénine est le plasmide "pXL276", utilisé pour la production chez E. coli de la sérum-albumine humaine recombinante dont la Figure 3 donne une représentation schématique et dont la construction a été décrite dans la demande de brevet européen EP 198 745. Ce plasmide a été digéré par l'enzyme EcoRV puis une délétion a été obtenue par action de l'exonucléase Bal31. Cette délétion couvre une région comprise entre les nucleotides 2442 et 4577 de la séquence de "pXL276", cette region n'ayant aucune influence sur l'expression de l'albumine. Dans cette délétion a été inséré un raccord BamHI (5'-CGCGGATCCGCG-3'). Le plasmide résultant a été appelé "pXL534", et il est représenté sur la Figure 4. A partir du plasmide "pXL534" un fragment de 124 paires de bases EcoRI-NdeI portant la séquence O/Ptrp et le site de fixation des ribosomes du gène cil, ainsi qu'un fragment de 3125 paires de bases EcoRI-HindIII portant des régions essentielles à la réplication du plasmide et les terminateurs T1 et T2, ont été purifiés. A partir du plasmide M13A-H, un fragment de 415 paires de bases NdeI-HindIII portant la séquence codante de l'angiogénine a également été purifié. Ces trois fragments ont été ligaturés en présence de T4 DNA ligase. Le plasmide ainsi construit, appelé "pXL694,, est représenté sur la Figure 4. Sur ce plasmide, il a été vérifie que la séquence nucléotidique du gène codant pour l'angiogénine est identique à celle attendue. C - Extraction et renaturation de I'angiogénine chez E. coli 1 - Conditions de la culture On utilise la souche G2077 qui dérive de la souche E. coli B 54125 (collection de l'institut Pasteur) par transformation avec le plasmide "pXL694". Ce plasmide contient le gène fonctionnel de l'angiogénine sous contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane O/Ptrp. L'expression de l'angiogénine est donc déréprimée lorsque la bactérie est cultivée en absence de tryptophane [B.P. Nichols et C. Yanofsky, Methods in Enzymol. (1983), 101, 155]. On peut procéder de la façon suivante. A partir d'un réisolement récent de la souche G2077 sur milieu solide LB-Ap [Bactotryptone (Difco) : 10 g/l, Extrait de levure (Difco) : 5 g/l, NaCl : 5 g/l, Ampicilline : 100 mg/l], on prépare une préculture en milieu liquide synthétique contenant du tryptophane à la concentration de 100 mg/l. Le milieu synthétique est par exemple du milieu M9 contenant du glucose à 0,4 Z, des casaminoacides à 0,4 % et de l'ampicilline à 100 mg/l selon J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbour Laboratory, New-York. La préculture est agitée pendant 16 heures à 370C. Cette préculture est ensuite utilisée pour inoculer au 1/100 un litre du même milieu synthétique ne contenant plus cette fois de tryptophane. La culture de production est agitée dans un erlenmeyer à 37"C avec un suivi de la multiplication cellulaire durant le temps nécessaire pour atteindre la fin de la phase exponentielle de croissance (environ 6 heures). La turbité de la culture est alors comprise entre 3 et 4 unités de densité optique à 610 nm. Les rendements obtenus sont de l'ordre de 5 à 10 mg d'angiogénine par litre de culture et par unité de densité optique, ce qui représente au moins 5 % des protéines totales. 2 - Lyse des cellules et récupération de l'angiogénine insoluble Après la culture de production, les ce @@@ @ sont collectées puis lysées, par exemple par sonication. A l'échtlie du laboratoire, il a été utilisé un sonicateur Branson (Modèle B30, Proscience, France) après avoir concentré 30 fois les cellules dans le tampon PBS (KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,25 g/l). Le cassage des cellules est effectué à 0 C en mode continu (2 impulsions de 5 minutes). On peut également prétraiter la suspension cellulaire concentrée en présence de lysozyme de blanc d'oeuf pendant 10 minutes à une température voisine de 200C avant la sonication. Les protéines hétérologues exprimées à haut niveau chez E. coli se retrouvent très souvent sous la forme d'aggrégats insolubles dans le cytoplasme [R.G. Schoner et coll., Biotechnology, (1985), 3, 151-154]. Dans les conditions d'expression utilisées, c est aussi le cas pour l'angiogenine. Cela permet de réaliser une étape purification importante en centrifugeant le lysat cellulaire et en récupérant le culot de centrifugation obtenu après un cycle de lavage dans le tampon PBS. L'angiogénine représente dans le culot entre 30 et 50 Z des protéines totales. 3 - Solubilisation de l'angiogenine par dénaturation réduction L'angiogénine contenue dans le culot de sonication peut être entièrement solubilisée, en conditions réductrices, par addition d'un agent chaotropique tel que le chlorhydrate de guanidine 6M. Ces conditions assurent une dénaturation complète de la chaine polypeptidique et une réduction de tous les ponts disulfures inter- et intramoléculaires [G. Orsini et M.E. Goldberg, J. Biol. Chem. (1978), 253, 3453-3458]. Dans le cas de l'angiogenine, le tampon de solubilisation suivant a ére utilisé : chlorhydrate de guanidine 6M, phosphate de potassium 0,1M, B-mercaptoéthanol 0,1M, pH 7,5. Le culot de sonication a et( repris dans ce tampon de sorte que l'angiogénine soit présente à la concentration de 1-5 mg/cm3. La suspension est agitée doucement dans un récipient scellé à 40C pendant 18 heures. La solution obtenue est alors presque limpide et les résidus insolubles sont éliminés par centrifugation. 4 - Renaturation de l'angiogénine humaine obtenue par voie microbiologique De nombreuses protéines peuvent revenir in vitro à leur forme native, qui est la conformation thermodynamiquement favorisée, après dénaturation et réduction contrôlées de la protéine [C.B. Anfisen et E. Haber, J. Biol. Chem. (1961), 236, 1361-1363 C.B. Anfisen, Science (1973), 181, 223-230 ; V.P. Saxena et D.B. Wetlaufer, Biochemistry (1970), 9, 5015-5022]. Plus particulièrement dans le cas de l'angiogenine, il a été montré, et c'est ce qui constitue un autre objet de la présente invention, qu'il est possible d'obtenir de l'angiogénine parfaitement soluble à haute concentration (10 mg/cm3) dans un tampon non dénaturant et non réducteur en faisant subir à la protéine une série de changements d'états l'amenant dans l'état final dans sa conformation native. Dans les paragraphes précédents ont été décrites les étapes qui ont permis l'obtention d'angiogénine concentrée à 1-5 mg/cm3 sous une conformation dénaturée et réduite. Dans ce qui suit sont décrits les procédés permettant l'obtention d'angiogénine humaine produite par voie microbiologique dans sa conformation native. La renaturation de la protéine a été obtenue par dilution au 1/100 du mélange de dénaturation-réduction dans le tampon : Tris HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. La dilution est effectuée lentement sous agitation douce à 40C. Cette solution est ensuite laissée à l'air sans agitation à 40C pendant 24 heures. Dans ces conditions, il a été montré que l'angiogénine se trouve essentFellement dans la fraction soluble. La solution ainsi obtenue p serte une légère opalescence blanchâtre qui peut être éliminée par centrifugation. Le culot de centrifugation contient, en particulier deux protéines de E. coli de Mr voisin de 40 000 qui représentent la contamination protéique majeure de I'angiogénine dans la fraction insoluble du lysat cellulaire.On réalise donc une étape de purification supplémentaire de l'angiogénine en même temps que sa renaturation. La molarité en NaCl de la solution d'angiogénine est portée à 1M puis cette solution est concentrée, sur le concentrateur Amicon (modèle DC2) équipé d'une cartouche de type HlP3-20, jusqu'à un volume final de 100 cm3. On procède à une seconde concentration, par ultrafiltration au moyen de filtres Millipore (modèle Immersible CX-10) jusqu'à un volume final de 10-15 cm3. La solution concentrée d'angiogénine est ensuite dialysée 24 heures à 40C contre le tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5, puis 24 heures contre de l'eau distillé. il se forme alors un précipité blanchâtre qui est éliminé par centrifugation. Il a été montré que l'angiogenine reste dans la fraction soluble, ce qui indique que l'étape de dialyse contre l'eau distillée constitue une étape de purification supplémentaire. La solution finalement obtenue contient de l'angiogénine renaturée à une concentration de l'ordre de 1 mg/cm3. Cette solution aqueuse d'angiogénine est-ensuite dialysée pendant 24 heures contre le tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, glycérol 50 %, pH 8,0 ; elle peut alors être conservée à -200C. 5 - Etudes analytiques et activités biologiques de l'angiogénine humaine obtenue par voie microbiologique a - Etudes analytiques La pureté de la solution d'angiogénine est estimée supérieure à 80 Z sur gel d'acylamide-SDS. Cette solution a été repurifiée par HPL: "reverse phase" au moyen de la colonne C3RP (BECKMAN) dans les conditions suivantes (Figure 5) - débit : 1 cm3/minute - détection : 215 nm - pression : 38 atm - pression maxi. : 80 atm - température : 300C - phase mobile : (eau, acide trifluoroacétique 0,07 %) - gradient : 0 min à 50 min : 0 à 50 Z d'acétonitrile contenant 0,07 Z d'acide trifluoroacétique 50 min à 55 min : 50 à 100 Z d'acétonitrile contenant 0,07 Z d'acide trifluoroacétique Dans ces conditions, l'angiogénine est éluée à 25,4 minutes. Les fractions 24 à 26 minutes sont collectées. Le produit, de haute pureté, a pu être soumis au séquençage et la séquence des 19 premiers acides aminés a été déterminée. Cette séquence correspond à celle de l'angiogénine, ce qui confirme que le gène synthétique qui fait l'objet de la présente invention exprime correctement l'angiogénine humaine chez E. coli. b - Caractéristiques biologiques L'angiogénine humaine est connue pour avoir deux activités biologiques. C'est tout d'abord un facteur d'angiogénèse, c'est-à-dire qu'elle stimule in vitro l'apparition de vaisseaux sanguins et leur prolifération sur la membrane chorioallantoldale d'embryons de poulets [J.W. Fett et coll., Biochemistry (1985), 24, 5480-5486]. Mais il a été montré que l'angiogenire humaine possède également une activité ribonucléasique caractéristique [R. Shapiro et coll., Biochemistry (1986), 25, 3527-3532]. Il a été montré que l'angiogénine humaine produite par voie microbiologique possède également ces deuxactivités biologiques. Mise en évidence de l'activité ribonucléasique caractéristique de l'angiogénine Dans un volume réactionnel de 7 jil, 10 pg d'ARN ribosomaux d'E. coli (Pharmacia Ref. 27-2508-01) sont inc es à 370C pendant 90 minutes dans le tampon (Tris-HCl 30 mM, NaC 3C-nM, pH 7,5) en présence d'angiogénine (5 ng à 1 pg) purifiée par HPLC "phase reverse". La réaction est arrêtée par ajout du tampon de dépôt (50 % formamide franchement déionisée, 48 % glycérol, 2 Z phosphate de sodium 1M, pH 7,5, 0,02 % bleu de bromophénol). Les échantillons sont déposes sur gel d'agarose 2 Z. Le tampon d'électrophorèse est du phosphate de sodium 10 mM, pH 7,5. Le gel est coloré au bromure d'éthidium après l'électrophorèse. Une hydrolyse significative est observée dès 5 ng d'angio génine avec apparition de fragments d'ARN dont la taille reste compatible avec leur détection sur gel d'agarose 2 t. Stimulation angiogénique sur membranes chorioallantoldales d'embrevons de poulets L'activité angiogénique a été mise en évidence par le test CAM décrit par J.M. Fett et coll., Biochemistry (1985), 24, 5480-5486. Dix oeufs ont été utilisés pour chaque concentration d'angiogenine à tester et pour les contrôles. Après trois jours d'incubation, une fenêtre de 1-2 cm2 est pratiquée dans la coquille de l'oeuf embryons. L'oeuf est ensuite scellé avec un film plastique et remis en incubation pendant 7 jours. Les échantillons à tester sont déposés sur un support Thermanox (Flow Laboratories Inc.) coupé en quatre, séchés sous une hotte à flux laminaire et déposés sur la membrane chorioallantoldale dans des conditions steriles. Les oeufs sont incubés pendant 4 jours et sont examinés journellement. Deux jours après le dépôt, une néovascularisation radiale caractéristique apparaît. Deux jours plus tard, les membranes sont prélevées, fixées avec une solution de formaline 10 Z et examinées. Une activité angiogénique est observée pour des doses comprises entre 2,5 ng et 20 ng par oeuf. Ces resultats sont en accord avec ceux qui ont été décrits dans le cas de l'angiogénine naturelle isolée à partir de cellules tumorales humaines [J.W. Fett et coll., Biochemistry (1985), 24, 5480-5486]. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation microbiologique de l'angiogénine humaine caractérisé en ce que l'on cultive une bactérie capable d'assurer le maintien d'un plasmide contenant un promoteur inductible, le site de fixation des ribosomes d'uc gène traduit avec efficacité et la séquence codante de l'angiogéni".e humaine précédée d'un codon d'initiation ATG. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plasmide contient comme promoteur celui de l'opéron "tryptophane" Ptrp. 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plasmide contient comme site de fixation des ribosomes celui du gène cil du bactériophage lambda ne contenant pas la séquence tRI de fin de transcription. 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plasmide contient le promoteur Ptrp, le site de fixation des ribosomes du gène cli du bactériophage lambda ne contenant pas la séquence tR1 de fin de transcription et la séquence codante de l'angiogenine précédée d'un codon d'initiation ATG. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la bactérie est choisie parmi les souches d'E. coli. 6 - Le plasmide "pXL694" caractérisé en ce qu'il contient le promoteur Ptrp, le site de fixation des ribosomes du gène cil du bactériophage lambda ne contenant pas la séquence tR1 de fin de terminaison et la séquence codante de l'angiogénine humaine précédée du codon d'initiation ATG. 7 - Procédé de préparation de la forme renaturée de l'angiogénine humaine caractérisé en ce que l'on convertit la molécule insoluble obtenue selon le procédé de la revendication 1 en une molécule renaturée et Soluble par application d'une méthode de dénaturation et renaturation qui permet un réarrangement des structures secondaires et tertiaires de la chaîne polypeptidique. 8 L'angiogénine humaine lorsqu'elle est obtenue selon le procédé de la revendication 1. 9 - La forme active de l'angiogénine humaine lorsqu'elle est obtenue selon le procédé de la revendication 7. 10 - Le gène de l'angiogénine humaine caractérisé par la séquence suivante 1 10 20 30 40 ATG CAG GAC AAC TCT CGT TAC ACC CAC TTC CTG ACC CAG CAC TAC Met Gln Asp Rsn Ser Rrg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gln His Tyr 50 60 70 80 90 GAC GCT AAA CCG CAG GGT CGT GAT GAC CGT TRC TGC GAA RGC ATC Asp Ala Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile 100 110 120 130 ATG CGT CGT CGT GGT CTG RCC TCT CCG TOC AAA GAC RTC ARC RCC Met Arg Arg Arg Gly Leu Thr Ser Pro Cys Lys Asp Ile Rsn Thr 140 150 160 170 180 TTC RTC CAC GOT ARC RAR CGT TCT RTC AAA OCT RTC TGC GAA ARC Phe lie His Gly Rsn Lys Ara Ser lie Lys Aig lie Cys Glu Asn 190 200 210 220 AAA ARC GGT AAC CCG CR6 CGT GAR ARC CTG CGT RTC TCT AAA TCT Lys Asn Gly Asn Pro His Ara Glu Asn Leu Rrg lie Ser Lys Ser 230 240 250 260 270 TCT TTC CAG GTT ACC ACC TGC AAA CTG CRC GGT GGT TCT CCG TGG Ser Phe Gln Val Thr Thr Cys Lys Leu His Glg Gly Ser Pro Trp 280 290 300 310 CCG CCg TGC CAG TAC CGT GCT ACC GCT GGT TTC CGT @AC GTT GTT Pro Pro Cys Gln Tyr Arg Ala Thr Rla Gly Phe A@@ @sn Vol Vol 320 330 340 350 360 GTT GCT TGC GAA AAC GGT CTG CCG GTT CAC CTG GAC CAG TCT ATC Val Ria Cys Glu Asn Gly Leu Pro Ual His Leu Asp Gin Ser lie 370 TTC CGT CGT CCG TAA Phe Arg Arg Pro ***