Brevet FR2600671A1 — publié le 19871231

Procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules. La présente invention a trait à un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, en particulier d'éléments figurés du sang, de gamètes, d'embryons à un stade très précoce et, d'une façon générale, de cellules individuellement isolées ou sous forme d'ensembles à petits nombres de cellules, lesdites cellules pouvant être animales, végétales ou procaryotes. La conservation des cellules vivantes par le froid est un problème mal maitrisé à ce jour. On sait conserver certaines cellules telles que des gamètes, notamment des spermatozoides, à très basse température (azote liquide) mais avec des pertes importantes. La conservation d'embryons au niveau des toutes premières divisions cellulaires, destinés à la réimplantation, est également très difficile et s'accompagne d'un taux notable de perte. La conservation d'éléments figurés du sang1 et notamment d'érythrocytes, est encore plus délicate et, actuellement, cette conservation n'est possible que pendant quelques jours ou quelques semaines à température voisine de O-C. Les techniques de conservation au froid profond (azote liquide) de telles matières nécessitent des vitesses de réfrigération extrêmement rapides en présence d'agents cryoprotecteurs, notamment de glycérol, de dimethylsulfoxide, de propane-diol ou d'autres substances similaires, et ne sont applicables qu'à de faibles volumes. La présente invention se propose de fournir un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, qui permette de- conserver, avec un taux de perte particulièrement faible, pouvant même être presque nul, ces substances et matières à des températures suffisamment basses pour autoriser une conservation pendant plusieurs mois, voire davantage , et ceci pratiquement sans altération décelable ou gênante des propriétés intéressantes de ces matières ou substances. Un autre objectif de l'invention est de permettre de refroidir et conserver de grands volumes de ces matières sans recourir à des vitesses de refroidissement particulièrement importantes. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé qui soit simple à mettre en oeuvre et, de ce fait, soit susceptible d'une diffusion importante avec des moyens relativement peu élaborés. Un objectif particulier de l'invention est de fournir un procédé permettant la conservation cryogénique d'éléments figurés du sang tels que globules blancs, plaquettes et surtout érythrocytes, pendant une durée de plusieurs mois, et le réchauffage et la récupération de ces cellules sous forme utilisable, par une simple opération de lavage. L'invention a pour objet un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, caractérisé en ce que l'on dissémine ou disperse la substance ou matière dans une solution ou suspension contenant un biopolymère gélifiant tel qu'un collagène, ou un collagène modifié, ou un produit de dégradation du collagène, tel que de la gélatine, et que l'on refroidit l'ensemble pour provoquer la gélification jusqu'à une température basse, par exemple de l'ordre de -5.C à -40-C. La concentration en biopolymère gélifiant avant adjonction de la matière à conserver est, de préférence, comprise entre 0,1% et 3% ou plus en poids (g) par volume (1) pour le collagène et de 5% à 30% pour la gélatine. Le pH du milieu est avantageusement physiologique, et généralement compris entre 6 et 8. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré, le gel peut contenir un ose ou un polyose ayant tendance à former une solution très visqueuse et dont le point isoélectrique est relativement neutre. Le sucre préféré est le saccharose, d'autres sucres pouvant être, par exemple, le mannitol. La concentration de ce sucre est de préférence d'environ 30% ou plus. Lorsque l'on souhaite conserver des substances destinées à être ensuite administrées à l'homme, notamment par voie parentérale, par exemple intraveineuse, on peut avantageusement réaliser la conservation dans un gel de collagène humain, tel que par exemple un gel de collagène placentaire, de préférence hémocompatible enrichi en type IV, ou de collagène modifié chimiquement pour en supprimer les propriétés agrégantes, ou de gélatine d'origine animale ou humaine. A titre d'exemple, un gel contenant des éléments organiques, par exemple des globules rouges, comprenant notamment environ 1% de collagène ou 10% de gélatine et environ 30% de saccharose, la phase liquide étant constituée par un tampon neutre physiologique usuel convenable, est tout à fait adapté à la conservation des globules rouges pendant une durée de l'ordre de 3 mois ou plus. Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut mélanger, à température suffisamment élevée, par exemple à une température de 30 à 35-C, les divers constituants, à savoir les matières ou substances notamment cellules ou globules rouges à conserver, la phase liquide telle que le tampon physiologique, le biopolymère gélifiant tel que le collagène ou gélatine, et le saccharose et refroidir l'ensemble. Cependant, dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré pour les collagènes non fibrillaires ou pour la gélatine, on prépare, à une température supérieure à la température de gélification, de préférence 30 à 35il, une solution ou suspension contenant, dans la phase liquide, le biopolymère gélifiant tel que le collagène ou gélatine, le sucre tel que le saccharose, et l'on injecte dans cette solution ou suspension, une suspension de la matière organique à conserver telles que des cellules, cette dernière suspension étant à une température plus basse, de façon à provoquer, pendant l'injection et la dissémination ou diffusion de ces substances ou matières. organiques, un abaissement de la température de la suspension ou solution à gélifier, ce qui provoque rapidement la gélification, après quoi on passe au refroidissement proprement dit, de préférence lent si le milieu est très visqueux (par exemple de l'ordre de 5*C par minute), ou plus rapide, (par exemple de l'ordre de 50.C par minute) Si le milieu est moins visqueux. Pour les collagènes fibrillairess, dont la viscosité augmente avec la température jusque par exemple vers 37-C, on procède tout d'abord à un réchauffage jusqu'à la gélification en masse puis on effectue le refroidissement. Conformément à l'invention, on arrete le refroidissement au-dessus de la température à laquelle le gel peut subir une transition de phase irréversible, notamment par congélation à l'état cristallisé. Lorsque l'on veut récupérer la substance congelée pour l'utiliser, on réchauffe de façon usuelle, sans précaution particulière, le gel contenant la substance jusqu'à provoquer son passage en phase liquide, après quoi on récupère le. éléments désirables par tous moyens usuels tels que filtration, centrifugation et/ou lavage. Le cas échéant, on peut ajouter au milieu contenant le biopolymère, un solvant organique connu pour provoquer un état de surfusion, tel que par exemple le glycérol ou le dimethylsulfoxyde ou le propane-diol. Avec les agents quI', comme le propane-diol, exercent un effet sur la structure du collagène, il est indiqué d'augmenter la concentration en collagène utilisée. Il est ainsi possible d'augmenter encore l'abaissement de température, bien endessous des températures qu'il était possible d'obtenir jusqu à présent, en utilisant des solutions de ces solvants organiques. L'invention est particulièrement indiquée pour la conservation des éléments figurés-du sang tels que les érythrocytes, les différents types de globules blancs, notamment lymphocytes et granulocytes, les plaquettes, les ovocytes, les spermatozoldes, les embryons notamment au stade de la morula, les hybridomes, les souches et lignées cellulaires cultivables (par-exemples cellules humaines MRC 5 et VERO (de singe)), les parasites monocellulaires, les levures et les procaryotes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. ExemPle 1. On prépare une solution de 5 à 7% (en poids) de gélatine dans un tampon phosphate ou acétate à pH 7,0, à une température de 40il, que l'on ramène ensuite à 30vC On prépare d'autre part un culot d'érythrocytes frais, à une température de 4*C-. A l'aide d'une seringue, on injecte rapidement dans le milieu liquide contenant la gélatine, la suspension de cellules à raison de 1 ml de culot de globules rouges pour 2 ml de solution de gélatine. Les globules rouges se dispersent dans le milieu et la température descend à 20-C alors que se produit la gélification. On effectue ensuite un refroidissement lent à une vitesse de 5.C par minute. Le gel amorphe, vitreux, reste stable jusqu'à environ -10.C. La stabilité est très grande entre O et -8'C. On conserve un tel gel refroidi de -6-C à -8-C pendant deux mois. Après quoi on réchauffe le gel à 30ru, on récupère les érythrocytes par centrifugation, et les érythrocytes sont lavés en tampon physiologique. Les érythrocytes n'ont subi aucune hémolyse et présentent un aspect normal. ExemPle 2. On répète l'exemple 1 mais en ajoutant au milieu initial du saccharose jusqu'à une concentration finale de 30% en poids. Le gel peut etre refroidi sans inconvénient jusqu'à -20'C. Il reste très stable entre -10 et -15.C et peut facilement assurer la bonne conservation des globules rouges pendant au moins 3 mois. Le saccharose reste pris dans le gel et ne pénètre pratiquement pas dans les globules, qui n'ont donc pas à être traités spécialement pour l'élimination du saccharose, lors de la décongélation et de la récupération. Exemple 3. On répète l'exemple 2 mais en ajoutant au milieu initial du glycérol, à une concentration finale de 30% en volume. Le refroidissement est effectué à une vitesse de 5iC par minute jusqu'à -40-C. Sa stabilité est très grande à une température comprise entre -22 et -30iC. Le glycérol qui se trouve ainsi pris dans le réseau polymérique gélifié, osmotiquement inactif r ne diffuse pratiquement pas dans les érythrocytes. Lorsque ceux-ci sont récupérés après réchauffage, ils présentent un aspect normal. ExemPle 4. On prépare une solution de collagène placentaire humain type I +III dans le même tampon à 10vC à pH 7 pour obtenir une concentration de 0,5% (en poids/volume) de collagène. On ajoute un volume équivalent de culot de globules rouges à température ambiante. On porte à 37-C, provoquant la gélification et on refroidit jusqu'à -15-C. Les résultats sont identiques à ceux de l'exemple 1. Exemple 5. On prépare une solution de collagène humain ou animal de type I dans le même tampon à une température de 40-C à pH 7, pour obtenir une concentration de 3% (en poids/volume) de collagène. On répète, avec cette solution, les conditions de l'exemple 1 et on obtient des résultats similaires. Exemple 6. On répète les conditions de l'exemple 5 avec du collagène de type IV, sans dépasser 30-C, avec des résultats similaires. Exemple 7. On répète les conditions de 11 exemple 5 avec du collagène animal ou humain de type I modifié par succinylation. Les résultats sont similaires. Exemple 8. On répète l'exemple 5 mais en ajoutant au milieu inital du saccharose, dans les conditions de l'exemple 2. On obtient des résultats similaires à ceux de l'exemple 2. Exemple 9. On répète l'exemple 6 mais en ajoutant au milieu initial du glycérol, dans les conditions de l'exemple 3, avec des résultats similaires. Exemple 10. On reprend les conditions de l'exemple 1 en remplaçant les globules rouges par une suspension de plaquettes. Exemple 11. On reprend les conditions de l'exemple 1 en remplaçant les globules rouges par une suspension de globules blancs. Exemple 12. On répète les conditions de l'exemple 6 en remplaçant les globules rouges par des globules blancs. ExemPle 13. On répète les conditions de l'exemple 7, mais sans dépasser 30-C, et en remplaçant les globules rouges par des globules blancs. REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, caractérisé en ce que l'on dissémine ou disperse la substance ou matière à conserver dans une solution ou suspension contenant un biopolymère gélifiant tel qu'un collagène ou un collagène modifié ou un produit de dégradation de collagène tel que de la gélatine et que l'on refroidit l'ensemble pour provoquer la gélification, jusqu'à une température basse 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après la gélîfiction, on refroidit le gel jusqu à une température de l'ordre de -5C à -40-C. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène modifié. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de hiopolymère est-à base de gélatine. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène de type I, I + III, ou encore IV. 7. Procédé selon l'une des revendications 3, 4 ou 6, caractérisé en ce que la concentration de collagène est de 0,1 à 3% en poids/volume. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration en gélatine est de 5 à 30% en poids/volume. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le gel contient un sucre, notamment le saccharose. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration de sucre est d'environ 30% ou plus. 11. Procédé selon l'une quelconque -des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le gel contient un solvant organique provoquant un état de surfusion, notamment le glycérol, le propane-diol ou le dimethylsulfoxyde. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on prépare, à une température supérieure à la température de gélification! une phase liquide contenant le biopolymère gélifiant, en ce que l'on disperse la substance ou matière à conserver, à une température plus basse, dans cette phase pour provoquer la gélification, et en ce que l'on procède ensuite au refroidissement. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, notamment pour les collagènes fibrillaires, caractérisé en ce que l'on prépare, à une température inférieure à la température de gélification, une phase liquide contenant le biopolymère gélifiant, en ce que l'on disperse la substance ou matière à conserver, que l'on provoque une aumentation de température jusqu'à gélification, puis que l'on procède ensuite au refroidissement. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les matières ou substances sont des cellules, notamment éléments figurés du sang, gamètes, embryons, hybridomes, souches et lignées cellulaires notamment MRC 5 et VERO, parasites monocellulaires, levures et procaryotes.