Brevet FR2603805A1 — publié le 19880318

PROCEDE D'INACTIVATION PAR OZONOLYSE DE MICRO-ORGANISMES CONTAMINANTS PRESENTS DANS DES MATERIAUX BIOLOGIQUES ESSENTIELLEMENT PROTEIQUES, LES PRODUITS OBTENUS ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES ET ANALYTIQUES. _ _ _ _ _ __5_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ L'invention concerne un procédé d'inactivation par ozonolyse de microorganismes contaminants présents dans des matériaux biologiques essentiellement protéi10 ques, les produits obtenus, et leurs applications biolo10 giques et analytiques. On sait que les matériaux biologiques protéiques tels que le sang, les extraits ou broyats d'organes ou de tissus, d'origine animale ou humaine, renferment des micro-organismes qu'il convient d'inactiver pour 15 les applications biologiques ou analytiques de ces matériaux. Ils contiennent notamment des virus capables de franchir les filtres microporeux généralement utili20 sés pour leur stérilisation du point de vue bactériolo20 gique. Jusqu'à présent, les méthodes connues d'inactivation in vitro des micro-organismes présents dans les matériaux biologiques s'appliquent de préférence à des 25 préparations purifiées et font appel à des techniques physiques ou chimiques. Parmi les méthodes les plus utilisées, on citera: - l'action de la chaleur, généralement à 60'C, sur le matériau à l'état liquide ou sec, ce qui nécessite l'u30 tilisation d'un agent protecteur contre les effets thermiques susceptibles de déstabiliser la ou les protéines du matériau; l'action de détergents en présence de solvant, qui pose le problème de l'élimination du détergent qui peut 2-603805 s'avérer délicate lorsqu'on vise l'application thérapeutique des préparations traitées ou leur application pour la production de milieux de cultures cellulaires; - l'utilisation de rayonnement à haute énergie, qui peut entraîner la formation de radicaux libres et ainsi des polymérisations gênantes; - l'action d'un rayonnement ultra violet en présence de 0-propiolactone composé qui ne peut être utilisé que dans des conditions spécifiques, ou encore - la chromatographie d'interaction hydrophobe, utilisable essentiellement dans le cas de virus à enveloppe lipidique et dont la réalisation soulève fréquemment des difficultés techniques. D'une manière générale, ces méthodes entrai15 nent un effet dommageable sur les protéines de ces matériaux biologiques (perte d'activité de certaines enzymes, polymérisation, apparition de néo-antigènes, insolubilité partielle). De plus, elles imposent l'élimination dans une 20 étape supplémentaire, des produits à effet antiviral mis en oeuvre. Il faut également, avant par exemple tout emploi à des fins thérapeutiques, doser les résidus éventuels des agents d'inactivation virale, ce qui augmente le prix de revient du procédé. La recherche par les inventeurs de méthodes d'inactivation de microorganismes de mise en oeuvre plus aisée les a amenés à étudier l'action exercée par des agents oxydants tels que l'hypochlorite de sodium, l'acide peracétique et plus particulièrement l'ozone. L'action de l'ozone entraîne une ozonolyse des composés organiques à double liaison, Carbone-Carbone,ce qui conduit à des sous-produits tels que des peroxydes qui agissent sur les enzymes d'oxydo-réduction présents dans les systèmes biologiques (glutathion, oxydases, pe35 roxydases). Ces sous-produits agissent également au niveau des structures lipidiques, constituants principaux des membranes cellulaires. Elle entraine également le blocage des récepteurs N-acétyl glucosaminique, souvent présents à la surface des virus, ce qui empêche la fixation des particules virales à la surface de la cellule cible du virus. Il existe également un mode d'action indirect de l'ozone conduisant à une fragilisation des enveloppes des virus par fixation de l'ozone sur la phosphatédyl10 choline présente dans ces enveloppes. Il s'ensuit une diminution de la résistance de l'enveloppe du virus qui devient perméable aux. métabolites et aux enzymes-présents dans le milieu protéique infecté. Le virus est - alors inactive. Les effets de l'ozone indiqués ci-dessus ont été observés sur des virus en solution aqueuse ou tamponnée (S. Rilling, R. Viebahn: Praxis des OzonSauerstoff Therapie;Ewald Fischer Verlang 1985) . On a également rapporté dans cet article l'u20 tilisation de l'ozone pour hyperoxygéner un volume de sang anticoagulé, prélevé puis réinjecté au patient, afin de stimuler certains systèmes oxydo-réducteurs impliqués dans l'élimination de l'agent pathogène (ib. sup.) Mais dans cette application, l'ozone agit de façon non spécifique vis-à-vis des éléments du sang, ce dernier jouant essentiellement le rôle de véhicule du gaz. L'amélioration de l'état du malade, d'ailleurs difficile à évaluer par les méthodes disponibles, néces30 site une réponse métabolique de ce même malade. Il s'agit donc d'une action in vivo, inapplicable à l'inactivation in vitro de matériaux biologiques comme visée par l'invention. Pour réaliser une inactivation in vitro par 35 ozonolyse des micro-organismes contaminant un matériau biologique, il s'est avéré de manière inattendue que ce matériau devait être traité préalablement afin d'éliminer et/ou d'inactiver les systèmes oxydo-réducteurs susceptibles d'inhiber l'action oxydante de l'ozone. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'inactivation des micro-organismes contaminant des matériaux biologiques de nature essentiellement protéique, de grande efficacité, tout en préservant les propriétés fonctionnelles des protéines. Elle vise également à fournir un procédé de 10 mise en oeuvre simple impliquant l'utilisation d'un agent oxydant connu, à savoir l'ozone. L'invention vise en outre à fournir des produits utilisables en biologie ou à des fins analytiques, 15 ou encore pour la production d'un milieu de culture cellulaire dépourvus de contaminants plus spécialement de virus ou de champignons. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend: a/ - le fractionnement du matériau biologique de départ par précipitation ou extraction afin d'éliminer et/ou de déséquilibrer les systèmes d'oxydoréduction susceptibles d'inhiber l'action oxydante de l'ozone vis-à-vis des micro-organismes contaminants et, b/ - l'action d'un mélange 03/02 préparé à partir d'oxygène, de composition contrôlée, renfermant 10-3 Pg/ml à 150 pg/ml d'O3, de préférence 10 à 50 pg/ml. De manière avantageuse, on constate que l'élimination des systèmes d'oxydo-réduction précités, permet 30 de mettre à profit l'action spécifique de l'ozone en tant qu'inactivateur de micro-organismes. Certains de ces systèmes oxydo-réducteurs dont l'effet est une neutralisation de l'action de l'ozone sont par exemple des oxydoréductases ou des peroxydases. Suivant une disposition supplémentaire de l'invention, le matériau biologique de départ est utilisé sous forme liquide ou pulvérulente. Ainsi selon une première étape supplémentaire, on fait barboter dans le milieu biologique liquide ou on insuffle dans le milieu biologique pulvérulent un courant 03/02 jusqu'à saturation en 03 dudit milieu. Il est'avantageux de refroidir le milieu biologique liquide ou solide, à une'température compatible avec la phase liquide quand le milieu est liquide pour 10 augmenter la solubilité d'O3. Ce refroidissement est effectué plus spécialement à une température de l'ordre-de OC à 15 C dans le cas d'un milieu liquide et de l'ordre de 30 C à 15C dans le cas d'un milieu solide. Pour compléter l'inactivation et la stabilisation du produit final, on a recours à une étape supplémentaire de lyophilisation ou d'atomisation du milieu traité. Conformément à un mode particulier de réalisa20 tion de l'invention, on a recours à-une étape de traitement par des fréquences ultrasonores de l'ordre de 20 à 37 KHz en opérant à une puissance d'environ 40 à 1000 W appliquée simultanément au barbotage ou à l'insufflation de l'ozone. Ce traitement par les ultrasons, facilite la 25 disruption des enveloppes de virus tels que le Poliovirus I. Le matériau biologique de départ mis en oeuvre dans le procédé de l'invention est un matériau de nature protéique constitué par des extraits tissulaires, notam30 ment de placenta, des broyats d'organes purifiés, des dérivés sanguins tels que le sérum, le plasma ou le sang complet. Ces matériaux sont d'origine humaine ou animale. Selon un mode préféré de réalisation de l'in35 vention, on utilise comme matériau de départ la fraction cryoprécipitée et/ou la fraction surnageante telles qu'obtenues par congélation d'un plasma à une température d'environ -20' C. puis décongélation lente jusqu'à 2'C à 4 C. Cette technique de congélation et décongélation largement utilisée pour obtenir le produit appelé 5 cryoprécipité est décrite dans:Striker MH, Waldmann AA. Blood Fractionation, dans: Kirk RE, Othmer DF, ed. Encyclopedia of Chemical Technology et dans New York: John Wiley and Sons 1978: 25-61; On rappelle que le cryoprécipité présente la 10 composition suivante: - fibrinogène 15 g/l - facteur XIII, 200 50 p/ml - la fibronectine 7,5 0,5 g/1 - protéines totales 25 5 g/1 - protéines coagulables 50 à 60% Le temps de coagulation avec 5 u/ml de thrombine est de 10 sec. Le traitement de congélation puis décongélation du plasma permet d'agir au niveau des systèmes oxy20 do-réducteurs susceptibles d'inhiber l'action oxydante de l'ozone. Grâce à l'élimination ou au déséquilibre de ces systèmes, il est possible d'obtenir une action spécifique de l'ozone sur les microorganismes contaminants. D'une manière générale, les micro-organismes sont constitués par des virus ou des champignons. L'action virucide de l'ozone opère ainsi en particulier sur le virus HIV (agent causal du sida) le phage T4, le virus VSV (virus de la stomatite vésiculeuse). L'invention vise également les matériaux biologiques tels qu'obtenus après traitement par l'ozone. Les produits sont alors dépourvus des systèmes oxydo-réducteursinhibiteurs vis-à-vis de l'action de l'ozone. Ils sont caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de 35 micro-organismes contaminants, ce qui permet de les utiliser directement à des fins biologiques ou analytiques ou pour la production de milieux de culture cellulaire. D'autres caractéristiques et avantages de 5 l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent relatifs à l'inactivation de virus ajoutés dans des préparations de cryoprécipité et de surnageant de plasma. Dans les exemples qui suivent, des séries témoins infectées non traitées par l'ozone (témoins posi10 tifs) sont introduites, ainsi que des témoins négatifs, non inoculés, afin de faciliter l'interprétation des résultats. EXEMPLE 1 Une suspension de protéines à la concentration 15 de 20 g/l contenant un mélange de fibrinogène, fibronectine, facteur XIII, albumine et immunoglobulines G, obtenue par resuspension d'un cryoprécipité, est additionnée d'une suspension virale contenant du phage lambda pour arriver à une concentration finale dans le 20 mélange de 7.107 particules virales par ml. On congèle puis on lyophilise la suspension ainsi contaminée. Un mélange 03/02 contenant 12 pg/ml d'O3 et obtenu à partir d'un générateur branché sur une bouteille d'O2, est insufflé dans un flacon contenant le 25 cryoprécipité désséché et pulvérisé, refroidi à O C pendant 15 minutes. On remet en suspension au volume original du cryoprécipité, dans un milieu tamponné puis on titre les virus résiduels par la méthode des plages de lyse sur 30 étalement de bactéries E. Coli Q 358. Le taux de virus survivants montre une diminution de 2 log10 par rapport au flacon témoin lyophilisé mais non traité par 03. EXEMPLE 2 Un plasma frais obtenu sur anticoagulant est 35 infecté par une suspension de retrovirus HIV correspondant à une activité de réverse'transcriptase (RT) de 1,4 106 cmp/poche (la RT est l'enzyme essentielle pour la répplication des retrovirus). Une partie du plasma contaminé est traitée directement par l'ozone, puis congelée et décongelée lentement. Malgré ces conditions habituelles pour la formation d'un cryoprécipité, celui-ci n'est pas- obtenu. La détermination des virus résiduels de ce plasma est 10 faite en rapport avec l'activité de RT, qui est proche de 130.000 cpm/ml au 13ème jour après mise en incubation dans une culture de lymphocytes. La valeur de l'activité de RT du plasma témoin étant de 175 000 cpm/ml on constate que l'inactivation n'est pas significative. L'autre partie du plasma infecté puis congelé, est décongelée pour obtenir un cryoprécipité et un surnageant séparé du cryoprécipité. Ce surnageant est traité par barbotage d'un mélange 03/02 à 12 pg/ml d'O3 pendant 30 minutes à O'C. L'activité RT titrée dans une 20 culture de lymphocytes montre un taux nul par rapport au surnageant témoin non traité par l'ozone (176 OO0 cpm/ml au 13ème jour). Le cryoprécipité, remis en suspension dans un tampon citrate-salin, est divisé en deux parties. La première partie est traitée à l'état liquide par le mélange gazeux 03/02 selon le procédé décrit, puis congelé et lyophilisé. Le produit sec est reconstitué par 10 ml d'eau distillée et 0,6 ml sont prélevés et mélangés à 0,6 ml de throm30 bine à 5 u/ml. Le caillot formé est mis à incuber dans ml de milieu contenant 5.105 lymphocytes. On ne met en évidence aucune activité RT, même au 20ème jour après la mise en culture. La deuxième partie du cryoprécipité est lyophilisée, puis, après pulvérisation, traitée par insufflation du mélange 03/02 à 12 pg/ml d'O3, pendant 30 minutes à O'C. On dissout à nouveau le produit sec traité mais on ne met en évidence aucune activité RT, même après 20 jours de mise en culture. Afin d'étudier l'effet du traitement par l'ozone, on réalise l'expérience suivante: - Le cryoprécipité remis en solution dans un tampon contenant de l'aprotinine à 2000 unités inhibitrices de protéases (UIP) possède des propriétés particulières d'adhésivité et de coagulabilité. On connaît son utilisation sous forme de colle biologique et le contrôle 15 d'efficacité de cette colle, par la mesure de la force de traction nécessaire à l'arrachement d'une pièce de peau de souris, encollée sur le dos de l'animal sacrifié. Sans traitement, la valeur moyenne d'un échan20 tillon de cryoprécipité utilisé pour collage est de 116 g/cm. Après traitement à l'état liquide, la force d'ar2 rachement est de 122,5 g/cm2. Ceci montre que le cryoprécipité n'est pas modifié par le traitement à l'ozone, quant à ses proprié25 tés adhésives. REVENDICATIONS 1/ - Procédé d'inactivation par ozonolyse de mi5 cro-organismes contaminants présents dans des matériaux biologiques essentiellement protéiques, caractérisé en ce qu'il comprend: a/ le fractionnement du matériau biologique de départ par précipitation ou extraction afin d'éliminer 10 et/ou de déséquilibrer les systèmes d'oxydo-réduction susceptibles d'inhiber l'action oxydante de l'ozone visà-vis des microorganismes contaminants et, b/ l'action d'un mélange 03/02 préparé à partir d'oxygène de composition contrôlée, renfermant 10 3 15 à 150 pg/ml d'o3 2/ - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise le matériau biologique de départ sous forme liquide ou pulvérulente, et qu'on fait barboter ou qu'on insuffle le mélange 03/02 de préfé20 rence sous agitation jusqu'à saturation du milieu liquide ou solide. 3/ - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par l'étape supplémentaire de refroidissement du milieu liquide ou solide, à une température compatible 25 avec, pour le milieu liquide, son maintien en phase liquide notamment de l'ordre de 0 à 15 C, pour le milieu solide la température étant de l'ordre de -30 à 15'C. 4/ - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par l'étape supplémentaire 30 de lyophilisation ou d'atomisation du milieu traité. / - Procédé selon l'une quelconque des:revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape réalisée simultanément au barbotage ou à l'insufflation de traitement du milieu par des fréquences 35 ultra-sonores de l'ordre de 20 à 37 KHz, en opérant à une puissance d'environ 40 à 1000 W. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à , caractérisé en ce qu'il est appliqué à un matériau biologique de départ constitué par des extraits tissu5 laires ou des broyats d'organes purifiés, d'origine humaine ou animale. 7/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à , caractérisé en ce qu'il est appliqué à un matériau biologique de départ constitué par du sang ou un dérivé 10 sanguin tel que le sérum. 8/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à , caractérisé en ce qu'il est appliqué à la fraction cryoprécipitée (CP) et/ou à la fraction surnageante (PDC) issues -d'un plasma congelé puis décongelé lente15 ment. 9/ - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les microorganismes présents dans le milieu sont des virus ou des champignons.