Brevet FR2600673A1 — publié le 19871231

-PROCEDE PERFECTIONNE DE MICROENCAPSULATION DE MICROORGANISMES DANS UNE MATRICE DE POLYSACCHARIDE. La présente invention concerne un procédé de microencapsulation de microorganismes dans une matrice de polysaccharide oui permet d'obtenir un inoculum facile d'emploi et de manutention, sans Derte de viabilité au cours du stockage. On a déjà proposé de déshydrater les microorganismes à l'état de dormance, c'est-a-dire dans un état où ils sont capables d'être revitalisés mais n'assurent plus les fonctions habituelles de la vie, notamment la reproduction. On a essaye divers procédés de déshydratation : par séchage dans un courant d'air sec ou par atomisation. Dans le US-A-3.168.796 on décrit un procédé de séchage par lyophisation. On a également proposé d'incorporer le microorganisme dans une matrice d'un polymere qui soit biodégradable et non polluant. Le brevet US-A-4.155.737 décrit un procédé d'inclusion de bacte- ries rhizosphériques dans un gel de polyacrylamide et de silice.Le FR-B-2.320.349 concerne un procédé de microencapsulation dans un gel de polysaccharide selon lequel on fait subir au polysaccharide une réticulation au moins partielle. Dans le FR-B-2.453.215 on décrit un procédé dans lequel on prépare d'abord un milieu de culture que l'on ensemence avec le microorganisme désiré, puis on dissout le polymère dans un milieu de culture. La réticulation peut être effectuée par un sel métallique. Le produit obtenu est ensuite rincé et séché. Le polysaccharide utilisé peut être un hétérosaccharide de type anionique résultant de la fermentation des hydrates de carbone par un micro organisme du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou des chamoignons aDpartenant au genre Sclérotum. Il peut également être un polymère issu de gommes naturelles ou biosynthétiques de provenances diverses : algues (alginates), carraghénanes, agar), exsudats de plantes (gommes karaya, adragante, arabi que) et de graines (guar, caroube). Le sel métallique utilisé peut être un sel de fer ou d'aluminium. De façon connue le procédé de microencapsulation dans un pol-ysac- charide peut être utilisé pour le traitement de bactéries, de levures, de champignons destinés a des usages divers tels que - la détoxification des sols, - l'oxydation ou la réduction de fer, soufre, Mn..., - la fixation d'azote atmosphérique libre ou symbiotique, - la dislocation des phosphates, - la vinification. La présente demande concerne un procédé perfectionné de microencapsulation dans un polysaccharide qui améliore encore la résistance à la déshydratation et la viabilité au stockage des microorganismes. La présente invention concerne un procédé perfectionné de microencapsulation de microorganismes dans une matrice de polysaccharide au moins partiellement polymérisé à l'aide d'un sel métallique, caractérisé par la combinaison des mesures suivantes - on prépare une culture de microorganisme dans un fermenteur en présence d'oxygène, - on arrête l'arrivée d'oxygène et on ajoute au milieu de culture le poly saccharide, - on applique sur la surface du mélange une surpression de 0,2 a 1,9 bar, - on introduit le mélange sous pression dans un dispositif comprenant au moins une buse calibrée ayant un diamètre de 0,1 à 0,8 mm, - à l'aide de la (ou des) buse(s) on projette le mélange sous forme de gouttes dans une solution d'un sel minéral, - on rince le gel obtenu et on le sèche. De préférence on ajoute au milieu de culture le polysaccharide sous une agitation de 300 à 1 000 t/min. et on arrête l'agitation avant d'appliquer une surpression sur la surface du mélange. Le produit obtenu après microencapsulation se trouve sous forme de petites billes de gel parfaitement individualisées et de taille homogène. On a vérifié que moins de 2 % des microorganismes ne sont pas microencapsulés et que, plus généralement, la perte est inférieure a 0,3 %. Le fait que l'on effectue la culture du microorganisme et son encapsulation dans le même fermenteur permet, en minimisant les manipulations de réduire les risques de contamination. L'agitation est poursuivie jusqu'à complète homogénéisation. La pression appliquée sur la surface du mélange après arrêt de l'agitation est comprise entre 0,2 et 1,9 bar. Elle dépend de la nature et de la concentration du polysaccharide utilisé: Elle doit permettre une extrusion correcte. La pression utilisée est, par exemple, voisine de 0,5 bar pour des solutions d'alginate de sodium à 10 g/l. Le diamètre des buses utilisées est compris entre 0,1 et 0,8 mm, de préférence compris entre 0,1 et 0,5 mm. Lorsque les buses ont un diamètre inférieur a 0,1 mm les risques de bouchages sont élevés. Pour un diamètre supérieur à 0,5 mm la durée de survie des microorganismes diminue et pour un diamètre supérieur à 0,8 mm la durée de survie du microorganisme est trop faible. En effet, une moins bonne réticulation du gel peut diminuer l'effet protecteur de celui-ci sur les microorganismes. Les sels ajoutés pour effectuer la polymérisation Deuvent être un sel de fer, de manganèse, d'aluminium, de baryum, de strontium, de zinc ou de cuivre. On utilise de oréférence un sel de calcium : chlorure ou sulfate. La figure 1 représente schématiquement un appareil permettant la mise en oeuvre de la Drésente invention. La culture du microorganisme est effectuée dans un fermenteur à double enveloppe (1) relié a un manomètre (14) qui comprend une canne de prélèvement (11), une turbine actionnée par un moteur (12), une conduite d'alimentation en air comoortant un filtre à air (13), une conduite de sortie d'air munie d'un condenseur (15). Des tubulures (16) sont prévues pour les mesures de pH, de concentration en oxygène, etc. Le dispositif de dispersion du gel (2) comDrend plusieurs buses calibrées (20) et une cuve (21) munie d'un agitateur (22). On prépare dans le fermenteur (1) le milieu de culture du microorganisme utilisé. On introduit ensuite dans le fermenteur (1) de l'air oen- dant un temos déterminé, à un débit déterminé par la conduite munie du filtre (13). On soumet également, de préférence, le milieu de culture a une forte agitation à l'aide de la turbine actionnée par le moteur (12) pour améliorer le transfert d'oxygène. On arrête l'arrivée d'oxygène et on introduit le Dolymère lorsque la biomasse arrive à un niveau de croissance déterminé qui varie selon le microorganisme utilisé. Par exemple dans le cas d'Azosoirillum liooferum on introduit le polysaccharide alors que la biomasse est en phase stationnaire depuis plus de 10 heures.En effet cette bactérie synthétise alors un polymère de réserve : le poly-B-hydroxybutyrate qui favorise ensuite la survie lors du séchage. Cette phase stationnaire est conduite en limitation d'oxygène (taux d'oxygène dissous voisin de O). Par contre pour Enterobacter cloacae on peut introduire le polymère dès la fin de la phase exponentielle de croissance. Lorsque le polymère ajouté est entièrement dissout on applique une surpression d'air. On branche alors le dispositif de dispersion du gel sur la canne plongeante de prélèvement (10) ou sur une vanne de fond. Le mélange bactéries" milieu de culture, polymère est alors projeté sous forme de fins jets dans la solution de sel contenue dans la cuve (21) agitée par l'agitateur (22). La réticulation du polymère est instantanée et on obtient de petites billes de gel parfaitement individualisées et de taille homogène. Selon un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention le gel est rincé avec de l'eau stérile. Selon un mode de mise en oeuvre préféré le gel est rincé avec une solution contenant un sucre tel que le glucose. On a noté que dans le cas de certains microorganismes tels que Azospirillym, cette addition améliore la survie du microorganisme au séchage et au stockage. il faut noter que l'addition de sucre à la solution de sel n'apporte aucune amélioration à la survie du microorganisme. Le gel est alors, de façon connue, soumis à un traitement de dessication à l'aide d'un courant d'air sec, par atomisation ou par lyophilisation. On obtient les meilleurs résultats en utilisant pour le séchage une étuve dans laquelle on peut régler le taux d'humidité. Les exemples donnés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 - Azospirillul brasilense sp7 L'Azospirillum brasilense est cultivé dans un milieu contenant par litre MgS04, 7H20 200 mg NaCl 100 mg CaCl2 20 mg FeS04, 7H20 10 mg Na2M004, 2H20 2 mg Extrait de levure 0,5 mg KH2P04 400 mg K2HP04 600 mg Malate de Na 5 g NH4Cl 5 g H20 QSP litre Le débit d'air et la vitesse d'agitation sont tels que la concentration en 02 dissout soit de 30 t. Le pH de départ était de 6,8, il a évolué jusqu'à 7,2 puis il a été maintenu à cette valeur par addition d'acide maléique. La microencapsulation est effectuée avec une solution d'alginate de sodium à raison de 10 g/l. On agite le mélange à une vitesse de 600 t/min. On soumet la solution à une pression de 0,5 bar puis on la disperse dans une solution de CaCl2 à 20 g/l pour le gel 1 6 gll pour le gel 2. On rince les gels obtenus a l'eau puis on les sèche à liait. Le stockage a été effectué à température et à humidite ambiantè. La figure 2 montre la viabilité d'Azospirillum brasilense sp7 en fonction du temps de stockage. Sur la courbe on a porté en ordonnée le nombre de germes viables calculé en bactéries par gramme de gel sec et en abscisse le nombre de jours. Exemple 2 - Azospirillum lipoferum crtl L'Azospirillum lipoferum crtl est un microorganisme isolé ae la rhizosphère du maïs. Le milieu de culture est identique à celui donné dans l'exemple 1 sauf que - le malate de Na est remplacé par 30 g de glucose, - il y a 3 g d'extrait de levure au lieu de 0,5 g. Le pH du milieu a été maintenu à 7,1 par addition de NaOH IN. L'agitation du mélange après addition du polymère et la pression exercée sur la surface du mélange sont les mêmes que dans l'exemple 1. La réticulation a été effectuée dans CaCl2 à 6 g/l, le gel 1 à été rincé à l'eau et le gel 2 avec de l'eau glucosée à 10 g/l. Les 2 gels ont été séchés par étuvage à une température de 30 C avec une humidité relative de 30 %. On a mesuré la densité cellulaire à différents stades du procédé. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après. TABLEAU Densité cellulaire Gel Gel avant sur gel sur gel sur gel sur gel f inclusion humide sec sec 1 1,2 1010 c/ml 2,1 1010 c/ml 1,5 105 c/ml 7,5 106 c/ggs 1 2 |1,2 1010 c/ml 1,5 1010 c/ml t 1,7 109 c/ml 8,7 1010c/ggs ggs : gramme de gel sec. ml : ml de solution initiale. Exemple 3 - Enterobacter cloacae crt3 Ce microorganisme a également été isolé de la rhizosphère du maïs. il a subi le même traitement que le gel de l'exemple J sauf que le milieu de culture contient 3 g de peptone. A partir d'une culture contenant 1,4 x 1010 bactéries par ml on obtient un gel sec contenant 1,8 x 1011 c/g.g.s. après séchage et 5.1010 c/g.g.s. après 3 semaines de stockage. REVENDICATIONS 1. Procédé perfectionné de microencapsulation de microorganismes dans une matrice de polysaccharide au moins partiellement polymérisée 'a l'aide d'un sel métallique, caractérisé par la combinaison des mesures suivantes - on prépare une culture de microorganisme dans un fermenteur en présence d'oxygène, - on arrête l'arrivée d'oxygène et on ajoute au milieu de culture le polysaccharide, - on applique sur la surface du mélange une surpression de 0,2 à 1,9 bar, - on introduit le mélange sous pression dans un dispositif comprenant au moins une buse calibrée ayant un diamètre de 0,1 à 0,8 mm, - à l'aide de la (ou des) buse(s) on projette le mélange sous forme de gouttelettes dans une solution d'un sel minéral, - on rince le gel obtenu et on le sèche. 2. Procédé perfectionné selon la revendication 1 dans lequel on ajoute le polysaccharide au milieu de culture sous une agitation de 300 à 1 000 t/min. avant d'appliquer une surpression sur la surface du mélange. 3. Procédé perfectionné selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel le diamètre des buses utilisées est compris entre 0,1 et 0,5 mm. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le sel utilisé est du chlorure ou du sulfate de calcium. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel le microorganisme est Azospirillum lipoferum et on introduit le polysaccharide alors que la biomasse est en phase stationnaire depuis plus de 10 h. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel le microorganisme est Enterobacter cloacae et on introduit le polysaccharide dès la fin de la phase exponentielle de croissance de la biomasse. 7. Procédé selon l'une quelconque des, revendications 1 à 6 dans lequel le rinçage est effectué avec une solution de glucose.