Brevet FR2598513A1 — publié le 19871113

-1 La présente invention est relative à des nouveaux anticorps anti- levure capables de reconnaître plusieurs levures, à des lignées cellulaires hybrides produisant de tels anticorps, à la préparation desdits anticorps, à leurs utili5 sations et leur application à.la détection et éventuellement à la numération de levures. Il est usuel dans l'industrie agro-alimentaire, de réaliser la détection de microorganismes dans les produits alimentaires par des techniques microbiologiques classiques. 10 Certes, la culture des microorganismes constitue la meilleure méthode de détection; cependant une telle méthode a pour inconvénient d'être longue puisqu'elle nécessite de 24 à 72 heures pour donner des résultats utilisables et, de plus, elle ne peut être mise en oeuvre que dans des laboratoires 15 spécialisés dans la culture des microorganismes. Il s'est donc avéré nécessaire de pouvoir disposer de méthodes très sensibles et plus rapides, pouvant être mises en oeuvre sans nécessiter l'intervention de laboratoires spécialisés. C'est ainsi qu'a été proposée l'applica20 tion des méthodes -immunoenzymatiques mises au point pour le diagnostic des maladies de l'homme et des maladies de l'animal, à la détection de microorganismes toxiques dans les produits alimentaires. Comme on le sait, les méthodes immunoenzymatiques 25 sont des méthodes qui utilisent un marqueur enzymatique fixé à un anticorps, un antigène ou un haptène, dont la présence permet, par un artifice technique, la détection de la réaction antigène-anticorps qui serait autrement invisible, ainsi que la quantification des composants de cette réaction. La 30 méthode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), qui est une méthode en phase hétérogène, s'applique plus précisément au titrage spécifique des anticorps. Le principe de la méthode ELISA est le suivant: des anticorps spécifiques contenus dans un liquide biologique à tester, sont mis en présence 35 d'une quantité déterminée d'antigène fixé sur un support -2 solide; après incubation et élimination par lavage des produits n'ayant pas réagi, un anticorps anti-espèce marqué par une enzyme et dirigé contre l'anticorps recherché, est ajouté, puis un substrat spécifique de l'enzyme est également 5 ajouté: sa dégradation faitapparaitre un produit coloré; l'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'enzyme qui réagit et donc à la quantité d'anticorps présent dans la solution testée (cf. les travaux d'AVRAMEAS et URIEL en 1966 et de NAKANE et PIERCE également en 1966 et.10 les travaux d'ENGVALL et PERLMANN en 1971). Les méthodes immunoenzymatiques ont trouvé un champ d'application privilégié très étendu dans la détection ou la quantification des virus pathogènes chez l'homme et chez l'animal; elles sont cependant également mises en oeuvre 15 dans des domaines tels que la bactériologie, la biologie chimique, la parasitologie, la mycologie, l'endocrinologie. L'extension de ces méthodes a la détection de microorganismes p&thogènes ou indésirables dans les aliments a donné lieu un certain nombre de publications: cf., en particulier, 20 entre -autres: BORAKER et Al., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol. 14, N' 4,. Oct.1981, p.396-403, concernant l'application de la méthode ELISA à la détection d'anticorps de Brucella abortus dans le lait; NOTERMANS et Al. HEALTH LABORATORY SCIENCE, 15, 1978, p.28-31 et KUO et Al. JOURNAL 25 OF FOOD PROTECTION, 43, N- 5, 1980, p.404-413 pour l'application à la détection des entérotoxines des staphylocoques l'aflatoxine Ml dans le lait. Bien qu'il existe des travaux effectués principalement par l'équipe de BIGUET et Al. sur les précipitines qui apparaissent au cours de l'immunisation du lapin contre de la levure Candida albicans, ces travaux, qui utilisent la technique de limmunoélectrophorese qui ne présente aucun des 35 avantages de sensibilité et de rapidité de la technique -3 ELISA, n'envisagent ni ne suggèrent aucune application pratique. Cependant les résultats que permet d'obtenir le test ELISA sont susceptibles de donner lieu à des 'faux posi5 tifs", c'est-à-dire à des réactions avec d'autres organismes que ceux que l'on cherche à détecter. Pour éviter l'apparition de ces faux positifs, il faut purifier les anticorps mis en oeuvre, ce qui est réalisé par élimination, dans les antisérums, des fractions d'anticorps indésirables, ce qui est 10 également réalisé de façon optimale par la formation d'anticorps monoclonaux qui sont des anticorps de spécificité absolument unique en raison de leur mode d'obtention. Un test immunoenzymatique de détection de bacilles pathogènes toxiques tels que des Salmonelles, dans des produits alimen15 taires, à l'aide d'un anticorps monoclonal d'immunoglobuline A de cellules de myélome MOPC467, a été décrit dans ROBISON et Al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vo'.45, N 6, Juin 1983, p.1816-1821. La présente invention vise à permettre la détection 20 et éventuellement la quantification de levures présentes dans les substances les plus diverses, aussi bien dans le cas o les levures sont des constituants de ces substances, que dans le cas o elles en sont des contaminants. Les levures sont des microorganismes de grande 25 taille délimités par une paroi riche en polysaccharides. Selon la taxonomie, il existe trois groupes de levures; les Ascomycètes, les Basidiomycètes, les Fungi imperfecti, regroupant environ 400 levures. Leur reproduction peut être de type végétatif avec formation possible d'un 30 mycelium, ou de type sexué. Les levures comprennent notamment les genres suivants: Candida, Saccharomyces, Trichosporon, Debaryomyces, Torulopsis, Brettanomyces, Hansenula, Kloeckera, Nadsonia, Pichia (PROCESS BIOCHEMISTRY, November 1970 35 "Immunological methods in Industry" I. CAMPBELL - p.48). --4 Un produit alimentaire peut être contaminé par une ou par plusieurs levures; il faudrait donc pouvoir disposer, pour réaliser le test de détection immunoenzymatique, non seulement d'anticorps spécifiques de la levure qui a servi à 5 les produire, mais également, d'anticorps dirigés contre d'autres levures. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps aussi bien polyclonaux que monoclonaux, qui répondent à un besoin important, qui est 10 celui de la détection de la présence de levures et notamment de levures contaminantes toxiques, dans différentes substances et notamment dans des produits alimentaires, qui permettent de détecter la présence dans ces derniers de plusieurs levures, et qui permettent la réalisation d'un test 15 immunologique sensible et rapide, ne nécessitant pas l'intervention de spécialistes et, par suite, apte à etre mis sous Àla forme d'une trousse de détection aisément utilisable par un personnel sans formation. La présente invention a pour objet des anticorps 20 pour la détection et le cas échéant la numération de levures, caractérisés en ce qu'ils sont polyspécifiques c'est-à-dire Capables de reconnaître non seulement la levure utilisée pour les préparer, mais également d'autres levures, différentes de la première par leur genre et/ou leur espèce. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps polyspécifiques anti-levure sont capables de reconnaître au moins une première et une deuxième levures prises dans le groupe qui comprend notamment les levures des genres Candida, Saccharomyces, Trichosporon, Debaryomyces, 3È Toru!opsis et Cryptococcts. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la première et la deuxième levures sont d'un genre et/ou d'une espèce différents. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la 35 présente invention, les anticorps polyspécifiques anti-levure - 5 sont capables de reconnaître une première levure de même espèce que la levure utilisée pour préparer lesdits anticorps, prise dans le groupe de levures qui comprend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis, 5 Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans, et au moins une autre levure, différente par son genre et/ou son espèce, de la levure utilisée pour les préparer, et prise dans le groupe des levures qui com10 prend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans. Selon un autre mode de réalisation avantageux de 15 l'invention, les anticorps polyspécifiques anti-levure sont constitués par une composition comprenant en combinaison au moins deux préparations d'anticorps polyspécifiques tels que définis plus haut, dans le but d'étendre le domaine de détection de ladite composition d'anticorps. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps polyspécifiques antilevure sont constitués par des anticorps obtenus par immunisations répétées d'animaux vertébrés pris notamment dans le groupe qui comprend le lapin, la chèvre et la souris, par in25 jections d'au moins une levure et prélèvement chez lesdits animaux de sérum ou d'ascites présentant une activité antilevure polyspécifique àa l'égard d'une pluralité de levures. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits anticorps sont obtenus par immunisation 30 d'animaux vertébrés appropriés, par injection de cellules de levures préalablement tuées par voie chimique et/ou thermique. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, les anticorps polyspécifiques anti-levure 35 sont constitués par des anticorps monoclonaux obtenus à par- 15 2: 25 30 -6 tir de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules lymphoïdes d'animaux vertébrés immunisés contre au moins une levure, et de cellules d'animaux vertébrés immortalisées. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les anticorps monoclonaux sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris de préférence non secrétantes et de splénocytes de souris immunisées contre des levures. Selon une modalité avantageuse de l'invention, les anticorps monoclonaux sont obtenus à partir de lignées cellulaires de cellules hybrides, déposées sous les Ne 1-500, 1-501 et 1-509, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris, de préférence non secrétantes, et de splénocytes de souris immunisées contre des levures par des injections répétées de Debaryomyces hansenii. Selon encore une autre modalité avantageuse de l'invention, les anticorps monoclonaux sont obtenus par culture des cellules hybrides dans un milieu sélectif contenant des éléments nutritifs appropriés et sur lequel ne se développent pas les cellules de myélome non fusionnées, sélection des cellules produisant l'anticorps désiré et clonage des cellules sélectionnées. Selon une autre modalité de l'invention, les anticorps sont fragmentés par voie enzymatique ou chimique. Selon encore une autre modalité de l'invention, les anticorps ou leurs fragments sont modifiés par marquage et/ou fixés sur un support solide. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, les anticorps polyspécifiques sont capables de reconnaître au moins deux levures différentes et ne donnent pas de réactivité croisée avec les ferments lactiques, ce qui permet de les utiliser pour la détection de levures contaminantes dans les produits alimentaires obtenus par fermentation lactique. -7 La présente invention a également pour objet les lignées cellulaires de cellules hybrides déposées sous les N 1-500 et No 1-501 en date du 6 décembre 1985 et N 1-509 en date du 22 janvier 1986 auprès de la Collection Nationale de 5 Culture des Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur, à partir desquelles sont obtenus les anticorps monoclonaux conformes à l'invention. Les lignées cellulaires 1-500, 1-501 et 1-509 peuvent être caractérisées comme suit: - elles sont obtenues à partir de cultures d'hybridomes résultant d'une fusion somatique entre splénocytes de souris Balb/c et cellules de myélome. vecteur PIE non sécrétantes (respectivement DG3 et IG7) dans un milieu de culture constitué par un milieu RPMI 1640 additionné de L-glutamine, de 15 streptomycine, de pénicilline, de pyruvate de sodium et de sérum de veau foetal, pH 7,2, à une température de 370C, le repiquage étant effectué dès que la culture atteint 0,8.106 cellules/ml dans le milieu de culture. La présente invention a également pour objet des 20 procédés de préparation d'anticorps polyspécifiques antilevure, caractérisés en ce que l'on réalise tout d'abord, au cours d'une première étape, l'immunisation d'animaux vertébrés appropriés, par des injections répétées, selon des modalités connues en elles-mêmes, de cellules de levures prises 25 dans le groupe qui comprend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans, puis en ce que l'on poursuit le traitement, au cours d'une 30 seconde étape, pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, les cellules de levures utilisées au cours de la première étape de celui-ci, pour l'immunisation 35 desdits animaux sont des cellules préalablement tuées par traitement thermique et/ou chimique. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, au cours de la première étape, pour la première injection auxdits animaux, les cellules de levures sont mises en suspension dans l'adjuvant complet de Freund ou en solution physiologique, et la deuxième injection et les injections éventuelles suivantes sont réalisées avec des cellules de levure en suspension dans de l'adjuvant incomplet de Freund ou en solution physiolo:10 gique. Selon un autre mode de mrise en oeuvre pr'f'ré du procédé conforme à l'invention, la seconde étape de celui-ci consiste à prélever du sang de l'animal immunisé et à en séparer le sérum qui contient les anticorps polyclonaux recher1$ chés. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le sérum séparé au cours de la seconde étape est trait' par chromatographie d'affinité pour recueillir la fraction d'anticorps spécifiques du sérum, dont l'utilisation 20_ permet d'augmenter la sensibilité de la détection des levures dans les milieux soumis aux tests de détection des levures. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, la seconde étape de celui-ci comprend un premier stade qui consiste à prélever 7 25 les lymphocytes de l'animal immunisé, un second stade qui consiste à fusionner en présence d'un promoteur de fusion approprié, lesdits lymphocytes avec des cellules de myélome d'animaux de la même espèce que ceux immunisés, sélectionnées pour leur sensibilité à l'aminoptérine, et à cultiver les.30'- cellules hybrides fusionnées, dans un milieu et pendant un temps appropriés, un troisième stade au cours duquel les clones résultant du second stade et produisant des anticorps anti-levure, sont clonés dans des milieux de culture appropriés. Conformément à une disposition avantageuse de ce 2 98513 -9 mode de mise en oeuvre, au cours d'un quatrième stade de la seconde étape, les clones sont injectés à des animaux de la même espèce que ceux utilisés pour l'immunisation, sensibilisés par un agent approprié pour former des ascites qui con5 tiennent des quantités importantes des anticorps monoclonaux anti-levure recherchés. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la-présente invention, au cours d'une troisième étape, les anticorps polyspécifiques anti-levure sont soumis 10 à un traitement propre à rendre visible la réaction ultérieure anticorps-antigènes de détection de levures dans un milieu à tester, lequel traitement consiste à les marquer avec un agent traceur et/ou à les fixer sur un support solide. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, les anticorps polyspécifiques obtenus sont soumis à un traitement d'immunoabsorption par des levures susceptibles de donner lieu à une réaction croisée, pour donner lieu à des anticorps monospécifiques qui 20 reconnaissent une seule levure. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les anticorps monospécifiques ainsi obtenus peuvent être éventuellement fragmentés, marqués ou non, et éventuellement fixés sur un support solide. La présente invention a pour objet un procédé de détection et éventuellement de numération de levures présentes normalement ou éventuellement contenues en tant que contaminants dans un produit à tester, caractérisé en ce que les anticorps ou leurs fragments, conformes à l'invention, sont 30 mis en oeuvre d'une manière connue en elle-même, dans une méthode de titrage des anticorps utilisant des immunoglobulines marquées soit par des radioisotopes (méthode radioimmunologique), soit par des substances fluorescentes (immunofluorescence), soit par des enzymes (méthode de titrage immunoenzymatique dite méthode ELISA) soit par des particules À - -10collo!dales telles que l'or. Conformément à la présente invention, ledit procédé de détection et éventuellement de numération de levures est appliqué à la détection qualitative et/ou quantitative de levures dans des produits alimentaires, une application particulière concernant les produits lact's tels que fromages, yaourts, crèmes desserts, etc... Outre l'application décrite ci-dessus, les anticorps anti-levure conformes à la présente invention conviennent à l'utilisation dans un procédé d'élimination des antigènes correspondants présents dans une substance a épurer, en phase non aqueuse, lequel est caractérisé en ce que lesdits anticorps sont fixés à un support insoluble en phase aqueuse pour réaliser l'immunocaptage, l'immunoabsorption ou l'immunoaffinité desdits antigènes. En outre, il est clair que les anticorps conformes la présente invention, de même que les lignées cellulaires dont ils sont issus, s'appliquent à la détection qualitative et/ou quantitative de levures à des fins d'analyses dans les domaines les plus divers, parmi lesquels on peut citer la biologie clinique, la médedine, la biologie générale, l'agronomie, la zoologie, la physiologie végétale et la mycologie. Pour la mise en oeuvre de l'invention, l'on a avantage à procéder comme suit les animaux immunisés sont par exemple des lapins, des chèvres, des souris, etc Les anticorps de l'invention peuvent être des immunoglobulines G ou M. Dans le cas o l'on préfère obtenir les anticorps - 30 sous la forme d'immunoglobulines G (IgG), le procédé d'immu{. nisation est alors réalisé de façon à provoquer une réponse - immunitaire secondaire, selon les méthodes connues. On peut par exemple injecter l'immunogène une fois par semaine pendant trois semaines, puis faire un rappel au bout de deux ou trois mois. On administre l'immunogène par exemple par injec- -11- tion intradermique, sous-cutanée ou intraveineuse. L'immunisation est de préférence effectuée avec des levures tuées, par exemple par la chaleur ou par voie chimique. Anticorps polyclonaux Pour recueillir les anticorps sériques des animaux immunisés, on utilise les techniques connues de fractionnement permettant d'isoler les immunoglobulines. Pour sélectionner les anticorps qui sont capables 10 de reconnaître au moins deux levures, on fait réagir la pré15 ú)98513 -12 paration des anticorps selon les techniques immunologiques connues basées sur la réaction antigène-anticorps, avec au moins une levure autre que celle ayant servi à l'immunisation, que l'on souhaite pouvoir détecter à l'aide de l'anti5 corps préparé. Anticorps monoclonaux Pour préparer des anticorps monoclonaux, on prélève des cellules lymphoïdes chez un animal immunisé, on fusionne, selon les techniques connues, lesdits lymphocytes avec des 10 Cellules cultivables in vitro en présence d'un promoteur de fusion, et on sélectionne les cellules hybrides ainsi obtenues sécrétant des anticorps répondant aux critères mentionfés précédemment. L'invention s'étend à des lignées cellulaires hy-5 brides sécrétant des anticorps anti-levures tels que définis précédemment, capables de reconnaître au moins deux levures. Les cellules mères utilisées dans l'opération de fusion cellulaire sont par exemple des splénocytes que l'on :recueille selon les techniques usuelles. :20 On effectue ensuite l'étape de fusion des lymphocytes prélevés, avec des cellules provenant de lignées mono.-clonales cultivables in vitro, par exemple des cellules de:myélome. On choisit de préférence, mais non limitativement, des cellules de myélome non sécrétantes. La fusion des cellules est une technique bien connue qui consiste essentiellement à mélanger des lymphocytes de l'animal immunisé et les cellules immortalisées pro,venant de lignées monoclonales, en présence d'un agent promoteur de fusion qui peut être, par exemple, le poly'thylène30 glycol. On opère par exemple par la technique de KOHLER et KILSTEIN, NATURE, 256, 495-497 (1975). Après incubation dans des conditions convenables, les cellules sont lavées et mises en culture sur un milieu sélectif permettant la croissance des cellules hybrides uni35 quement. Il est connu par exemple que les cellules de mye- 2.,98513 -13 lome, qui sont dépourvues de l'enzyme hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase, ne se reproduisent pas sur les milieux contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine. Dans ces conditions, les cellules n'ayant pas fu5 sionné ne peuvent pas se reproduire sur le milieu sélectif utilisé. Les cellules de myélome utilisées dans le procédé de l'invention sont par exemple des cellules de myélome de souris PIE gracieusement fournies par F. GIDOSSI DISA (Insti10 tut J. Monod, Paris). Ces cellules non sécrétantes ont été sélectionnees pour leur sensibilité à l'aminoptérine et cultivées sur un milieu approprié contenant des substances nutritives. Un tel milieu peut être constitue par exemple d'un milieu RPMI 1640 défini par exemple par Moore et al. (Culture 15 of Normial Human Leucocytes, J.A.M.A. 199, 519-524, 1967) contenant 10 % de sérum de veau foetal, 2mM de glutamine, 1mM de pyruvate de sodium, 100 UI/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine; ce milieu sera dénommé ci-après milieu RPMI complet. On sélectionne ensuite, après un temps de culture suffisant (par exemple 15 jours après la fusion) les surnageants de culture contenant des anticorps anti-levure répondant aux critères mentionnés ci-dessus. Pour mettre en oeuvre cette sélection, on utilise les méthodes immunologiques clas25 siques fondées sur la réaction antigène-anticorps. On utilise par exemple un test immuno-enzymatique. On effectue ensuite le clonage des cellules retenues à chaque étape des différents critères de sélection. Le clonage peut être effectué par la méthode des dilutions limites décrite par OI et HERZENBERG in: "Selected Methods in Cellular Immunology", Eds. B.B. Mishell & S.M. Shrigi (Freeman, San Francisco) p.351, 1980. Le clonage est avantageusement effectué dans des microplaques et les puits desdites microplaques contenant des clones uniques sont ensuite sélectionnés et leurs surnageants - 1 -14 sont testés, par exemple à l'aide d'un test ELISA, pour ne retenir dans un premier temps que les clones sécrétant des anticorps-anti-levure qui ont une haute affinité pour la levure utilisée pour l'immunisation, et qui sont stables. Pour obtenir des quantités importantes d'anticorps monoclonaux antilevure, on peut aussi procéder à des formations d'ascites, par exemple en injectant par voie péritonéalè des cellules hybrides monoclonales après stimulation des animaux par injection péritonéale de tétraméthyl10 pentadécane. Après un temps suffisant, on récolte le fluide ascitique qui contient des quantités importantes de l'anticorps antilevure recherché. Les anticorps obtenus selon le procédé conforme à la présente invention peuvent être conservés par exemple par 15 congélation à -20C. Après de fréquentes décongélations et congélations on n'a pas observé de diminution notable de leur titre. Les anticorps anti-levures polyclonaux ou monoclonaux conformes à l'invention peuvent être marqués ou non, et 20 ils peuvent éventuellement être fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques, techni25 ques d'immunofluorescence, techniques immunoenzymatiques, notamment). Ledit support solide peut être réalisé en tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer les anticorps par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux solides utilisables pour fixer les anticorps par cova35 lence à l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notam- i; ', 1 -15 ment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés (diéthylaminoéthylcellulose ou diéthylaminoéthyldextran), etc... Le support solide peut se présenter par exemple sous forme de disques, de tubes, de baguettes, de billes, ou de plaques de microtitration., Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les anticorps sur le support solide sont des dérivés bifonctionnels tels que des dialdéhydes, des quinones, etc... Les anticorps peuvent également être fixés sur des 10 supports solides minéraux, par exemple selon les méthodes décrites dans les Brevets Français 2.319.176, 2.403.556 et 2.403.098. Les anticorps selon l'invention conviennent particulièrement bien pour la détection de levures, par exemple 15 des levures susceptibles de contaminer les produits alimentaires, notamment par les techniques d'immunofluorescence, les techniques immunoenzymatiques, en particulier la méthode ELISA, et les techniques radioimmunologiques, directes ou indirectes. A cet effet, les anticorps conformes à l'invention sont modifiés par marquage, notamment avec un traceur radioactif (tel que l'iode ou l'indium, par exemple), fluorescent (par exemple isothiocyanate de fluoresceine ou de rhodamine), chromogène, enzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline) 25 ou colloïdal (or par exemple). L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif dans la réalisation de ce test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par 30 fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc... En outre, avec les anticorps polyclonaux et monoclonaux, cette détection peut être quantitative et permet donc d'effectuer des numérations de levures dans des produits o elles sont des constituants normaux ou des contaminants, 35 par exemple par les techniques immunologiques. -16 L'invention concerne également l'utilisation des anticorps anti-levure tels que définis ci-dessus, dans la détection qualitative et/ou quantitative de levures, en particulier dans des produits alimentaires, qu'il s'agisse de 5 levures normalement présentes ou de levures susceptibles de contaminer lesdits produits. L'invention s'étend à des coffrets de détection immunologique qui contiennent, a titre de réactif immunplogique, au moins un anticorps, en particulier un anticorps mo10 noclonal tel que défini précédemment. Bien entendu ces coffrets comprennent également les réactifs couramment utilisés dans les détections de ce type, a savoir a) pour les tests par immunofluorescence, des anticorps cou15 plés à un fluorochrome ainsi que des tampons et des supports appropriés; b. pour les tests par voie enzymatique: des anticorps couplés à l'enzyme, les agents révélateurs de l'activité enzymatique, les tampons et les supports appropriés; c) pour les tests radioimmunologiques, des anticorps modifiés par un marqueur radioactif, ainsi que les tampons et supports appropriés. L'invention concerne, en particulier, l'application des anticorps polyclonaux et monoclonaux tels que définis ci-dessus, à la détection de levures dans les produits laitiers frais (lait, crème, fromages frais, yaourts, desserts lactés, etc...). Dans le cas de produits pâteux ou gélifiés, la mise en oeuvre du procédé de détection des levures peut éventuel30 lement être précédée d'une mise en condition telle que mise en suspension ou en solution dans un solvant aqueux, du produit à tester. Dans le cas ou il s'agit de détecter des levures contaminantes, on peut ensuite recueillir les levures conta35 minantes éventuellement présentes dans la solution ou suspen- ^. 9 G 5 13 -17 sion examinée, par filtration ou par centrifugation, notamment. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, qui vont suivre. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exem10 ples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Préparation d'anticorps polyclonaux chez le lapin. 1. Immunisation On a injecté à des lapins au temps zéro 6.107 levures tuées, en adjuvant complet de Freund, en injection intra-dermique multi-points. Les levures sont tuées par la chaleur (autoclavage 20 à 120 C pendant 20minutes). Au temps trois semaines, un rappel est effectué. Pour cela, 6.107 levures sont administrées, avec de l'adjuvant incomplet, en injection sous-cutanée. Le sang est ensuite prélevé tous les 15 jours et on 25 en sépare le sérum. Les lapins ont été immunisés avec l'une des levures suivantes: Candida pseudotropicalis: référence CBS 607; Candida tropicalis: référence CBS 94 Debaryomyces hansenii: référence CBS 770; Candida albicans: référence CBS 562. 2. Essai de réponse polyclonale Les sérums obtenus ont été testés pour déterminer leur activité anti-levure par la méthode immunoenzymatique 35 connue sous le nom de technique ELISA. 2._98513 -18 Environ 5.105 levures de l'espèce utilisée comme antigène dans le protocole d'immunisation, sont séchées une nuit à 41C sous un volume de 50pl de solution saline tamponnée au phosphate (P.B.S.) dans les micropuits d'une plaque 5 Dynatech Immulon. Pour éviter une adsorption non spécifique des anticorps, les puits sont saturés à température ambiante pendant une heure avec du P.G.T. (phosphate-gélatine-Tween), c'est-à-dire de la gélatine à 0,25% et du Tween 20 à 0,1% dans du P.B.S. "Tween 20" est une marque commerciale pour un tensioactif non ionique, le polyoxyéthylène sorbitan monolaurate. Le sérum à tester est ensuite dilué de puits en puits sous un volume de 50p1. L'incubation est réalisée à température ambiante pendant 1 heure. Après lavage des micropuits avec du P.G.T., 50p1 d'une dilution au 1/500 d'immunoglobulines de mouton anti-immunoglobulines de lapin couplées à la peroxydase sont ajoutés. Une série de temoins négatifs a été préparée en incubant le conjugué ci-dessus dans des puits 20 qui ont été incubés avec un sérum pré-immun de lapin, dilué dans les mêmes conditions que le sérum à tester. Après une heure d'incubation avec le conjugué, les puits sont lavés trois fois avec du P.B.S. et on ajoute ensuite le substrat enzymatique (2,5mM H202 et 2mM de 25 2,2,-azino-di-(3-éthyl-benzothiazoline-acide sulfonique) dans un tampon acétate-phosphate, pH=6,5). Après 30 minutes, la densité optique de chaque puits est lue dans un lecteur optique Dynatech. Cette technique ELISA est utilisée pour tester les 30 sérums polyclonaux par réaction homologue et par réactions croisées avec des levures différentes de l'antigène utilisé lors de l'immunisation. Les résultats obtenus avec les anti-sérums anti-C. pseudotropicalis, anti-C. tropicalis, anti-C. albicans et 35 anti-D. hansenii,sont réunis dans le TABLEAU I qui va suivre. -19 TABLEAU I Pourcentage de réaction croisée de 4 antisérums de lapins hyperimmuns ANTI-C. ANTI-C. ANTI-D. ?qICRO-ORGANSME GROUPE ' 0PIEDCA TOPCLAISAS ASEI TRTOPICALIBCS i CANDIDA PSEUDOTROPICALIS FI 100 8 6 I5 CANDIDA TROPICALIS FI 100 100 100 100 CANDIDA ALBICANS FI 100 100 100 100 DEBARYOMYCES HANSENII A 100 66 73 100 TRICHOSPORON CUTANEUM FI 85 16 21 23 TORULOPSIS GLABRATA FI 26 43 64 38 CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS FI 15 4 0 5 SACCHAROMYCES CARLSBER- A 100 16 7 15 GENSIS SACCHAROMYCES CEREVISIAE A 20 5 3 21 SACCHAROMYCES CEREVISIAE A 85 14 6 15 MUTEE STREPTOCOCCUS THERMOPHI- 13* 0 0 0 LUS LACTOBACILLUS BULGARICUS 13* 0 0 0 * pourcentage déterminé sur les deux souches en mélange. e FI = fungi imperfecti; A = ascomycetes. Le pourcentage de réactivité croisée est calculé par rapport à la levure utilisée pour l'immunisation (à la35 quelle on attribue la valeur 100). : 3 _ 2u_13 -20 Les microorganismes testés sont les suivants: D. hansenii (souche CBS 770); C. tropicalis (souche CBS 94); Ferment lactique (CO 32) : mélange de Streptococcus thermo5 philus et de Lactobacillus bulgaricus (fourni par BSN); C. pseudotropicalis (souche CBS 607); C. albicans (souche CBS 562); S. cerevisiae mutée au niveau de sa paroi (souche LB650); T. glabrata (souche CBS 138); 10 Tr. cutaneum (souche CBS 2466); Cr. neoformans (souche CBS 464); S. cerevisiae (souche CBS 1171); S. carlsbergensis (souche CBS 7003). La référence CBS signifie CENTRAALBUREAU VOOR 15 SCHIMMELCULTURES, BAARN (PAYS-BAS). La souche LB6-50 est une souche de S. cerevisiae mutée au niveau de sa paroi (fournie par University of California, Biochemistry Department, BERKELEY, Cal.94720 C.E. BALLOU Bc 50). 3. Détection de levures par la technique ELISA Des tests de détection des levures ont été réalisés afin de déterminer la sensibilité de la technique ELISA lors de l'utilisation de sérums polyclonaux, en utilisant du sérum de lapin anti-C. tropicalis. Le protocole décrit précédemment 25 est légèrement modifié: les levures homologues sont diluées de puits en puits, puis séchées dans les plaques noires Dynatech. Les micropuits sont saturés avec le tampon P.G.T. durant 1 heure, puis on ajoute 50pl d'une dilution fixe de sérum de lapin anti-levure. - 30 Après une heure, l'anticorps de mouton antiimmunoglobulines de lapin, couplé à la phosphatase alcaline, est ajouté. L'incubation est réalisée à température ambiante. Après trois lavages en P.B.S., le substrat enzymatique est ajouté (diéthanolamine 1M, MgCl2 5mM, 4 méthyl35 umbelliferylphosphate 0,1mM, pH 9,8). La lecture est effec- -21 tuée sur un lecteur Microfluor Dynatech. La sensibilité de la détection des levures est augmentée par purification des immunoglobulines par chromatographie sur colonne échan4euse d'ions: DEAE TRISACRYL. Les IgG de lapin sont éluées avec un tampon Nacl mM; Tris 25mM pH 8,8. La courbe de quantification de levures C. tropicalis par la fraction anticorps d'un sérum de lapin anti-C. tropicalis, est représentée à la figure unique annexée, avec 10 en abscisse le nombre de levures et en ordonnée la densité optique; dans le cas représenté le seuil minimal de détection s'est avéré être de 200 levures environ. EXEMPLE 2: Préparation d'anticorps monoclonaux. 1. Immunisation On a immunisé des souris femelles Balb/c en leur injectant une fois par semaine pendant trois semaines consécutives, par voie intra-veineuse, 107 levures, tuées par la chaleur par autoclavage à 120'C pendant 20 minutes. Après une période de repos de trois mois, les souris ont eu un rappel 20 par voie intra-veineuse avec la même quantité de levures trois jours avant le prélèvement des splénocytes pour la fusion. La levure utilisée pour l'immunisation a été: Debariomyces hansenii. 2. Fusion Des cellules de myélome de souris PIE sont utilisées pour la fusion. Elles ont été sélectionnées pour leur sensibilité à l'aminoptérine et cultivées sur le milieu RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal, 2mM de glutamine, lmM 30 de pyruvate de sodium, 100 UI/ml de pénicilline et 100g/ml de streptomycine. Les splénocytes ont été dispersés par injection du milieu RPMI exempt de sérum dans la rate des souris hyperimmunisées et lavés trois fois dans du milieu RPMI avant 35 fusion. 2j98513 -22 Les cellules de myélome et les splénocytes ont été ensuite fusionnés dans un rapport de une cellule de myélome pour 10 splénocytes, en présence de 41% de polyéthylèneglycol d'un poids de 1500 (Merck) selon la méthode de KOHLER et 5 MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975), puis lavées dans le milieu RPMI et remises en suspension dans 100ml du milieu RPMI complet. Les cellules ont ensuite été redistribuées dans des microplaques Nunclon (24 puits par plaque) à raison de 1ml/puits contenant 2,2.105 cellules. Après 24 heures, on a 10 ajouté lml/puits de milieu constitué du milieu RPMI complet contenant 0,1mM d'hypoxanthine, 0, 4pM d'aminoptérine et 16pm de thymidine. Des parties aliquotes de milieu sélectif ont été remplacées les 3ème, 6ème et 10ème jours après la fusion. Après 15 jours, les hybridomes survivants ont été 15 cultivés sur le milieu RPMI complet, complété avec de l'hypoxanthine et de la thymidine et, 15 jours après la fusion, on a recherché la présence d'anticorps antilevures dans les surnageants de culture. Les clones ont été ensuite cultivés progressivement sur le milieu RPMI complet normal. Les cultures positives ont été clonées par la méthode des dilutions limites selon OI V.T. et HERZENBERG, L.A. 1980 Immunoglobulin-producing hybrid cell lines, in "Selected Methods in Cellular Immunology" (Eds. Mishell, R.B. and Shrigi, S.M., p.351, Fillman, San Francisco). Les cellules ont été redistribuées dans les puits d'une microplaque Nunclon, à raison de 0,5 cellule en moyenne par puits, avec 3.105 thymocytes à titre de cellules nutritives. Après 10 jours, les puits contenant des clones uniques ont été sélectionnés et 5 jours plus tard, les surnageants 30 ont été testés pour déterminer la présence d'anticorps antilevures. Trois clones issus d'une culture primaire positive, ont été sélectionnés et injectés à des souris Balb/c pour obtenir de grandes quantités d'anticorps. A cet effet, des sou35 ris femelles agées Balb/c ont été stimulées par une injection -23 intrapéritonéale de 0,3 ml de tétraméthylpentadécane. Après 4 jours, 20 millions de cellules hybrides ont été injectées aux souris. Au bout de 15 jours, les fluides d'ascites ont été récoltés et leur activité anti-levure a été testée. Les clones de cellules hybrides qui ont été déposés auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-501 le 6 décembre 1985 (IG7), 1-500 le 6 décembre 1985 (DG3) et 1-509 le 22 janvier 1986, résultent de la fusion de cellules de 10 myélome telles qu'identifiées plus haut avec des splénocytes de souris immunisées par D. hansenii. 3. Caractérisation des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA Les anticorps obtenus selon l'exemple 2 ont été 15 testés pour déterminer leur activité anti-D. hansenii par la méthode immunoenzymatique connue sous le nom de méthode ELISA, décrite précédemment. Les micropuits d'une plaque Immulon Dynatech ont été incubés avec 5.105 levures D. hansenii et séchés une 20 nuit. Les puits sont ensuite saturés avec le tampon P.G.T. puis incubés avec 50p1 de surnageant de culture d'hybridome ou de fluide ascitique durant 1 heure à température ambiante. Les puits sont alors lavés et on ajoute 5041 d'immunoglobulines de lapin anti-immunoglobuline de souris marquée 25 à la peroxydase, diluées au 1/500. Après 1 heure d'incubation, trois lavages au P.B.S. sont effectués et le substrat est ajouté. Afin de sélectionner les anticorps permettant de rechercher la présence de levures dans le yaourt, les surna30 geants de culture d'hybridome sont également testés sur Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus. Dans ce cas, le test ELISA doit être négatif, afin d'éliminer tout anticorps susceptible de présenter une quelconque réaction croisée ultérieure lors de la recherche de levures contami35 nantes dans le yaourt. -24 Les clones retenus doivent donc reconnaître D. hansenii et ne pas présenter de réaction croisée avec les ferments lactiques. Les hybridomes BC4, IG7, DG3 et IE3 présentent ces deux caractéristiques simultanément. Le clonage, réalisé comme décrit précédemment, a permis d'obtenir 35 clones dont trois ont été propagés en * ascites (désignés par DG3, IE3, IG7). 4. Caractérisation des anticorps monoclonaux obte10 nus à partir des fluides ascitigues. Les isotypes des anticorps monoclonaux obtenus dans les fluides ascitiques ont été déterminés par la méthode ELISA indirecte en utilisant des anticorps polyclonaux monospécifiques de lapin contre les différents isotypes d'immuno15 globulines murines. Les fluides ascitiques obtenus après injection d'un clone contiennent des anticorps anti-D. hansenii. Les anticorps monoclonaux anti-D. hansenii ont ensuite été testés par la méthode ELISA afin de déterminer 20, s'il existe ou non des r actions croisées envers des levures différentes. Dans cette expérience, on utilise 500.000 levures par puits. Le fluide ascitique est dilué au 1/2000 ou au 1/10.000. Les résultats obtenus montrent que les anticorps 25 monoclonaux reconnaissent D. hansenii, C. pseudotropicalis, C. albicans, C. tropicalis, T. glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharomyces carlsbergensis, avec des intensités comparables. D'autres levures telles que S. cerevisiae et Cryp30 tococcus neoformans, sont moins bien reconnues. La majorité des ferments lactiques, notamment les ferments lactiques utilisés en France dans la préparation industrielle du yaourt, n'est pas reconnue. Ces résultats sont représentés dans le Tableau II 35 ci-après. -25 TABLEAU II Pourcentage de réaction croisée des surnageants de culture (BC4) et d'anticorps monoclonaux (IG7,DG3,IE3) anti-D. hansenii envers différentes levures et ferments lactiques [ MICRO-ORGANISME GROUPE BC4 IG7 DG3 IE3 l,.... DEBARYOMYCES HANSENII A 100 100 100 100 CANDIDA TROPICALIS FI 84 80 90 64 CANDIDA PSEUDOTROPICA- FI 77 105 75 47 LIS CANDIDA ALBICANS FI 95 140 80 87 TORULOPSIS GLABRATA FI 92 95 86 45 TRICHOSPORON CUTANEUM FI 120 100 77 91 CRYPTOCOCCUSNEOFORMANS FI 18 13 0 0 SACCHAROMYCES CARLS- A 82 100 95 100 BERGENSIS SACCHAROMYCES CERE- A 32 32 18 50 VISIAE SACCHAROMYCES CERE- A 100 120 121 130 VISIAE MUTEE STREPTOCOCCUS THERMO- L* 0 0 0 0 PHILUS LACTOBACILLUS BULGA- L* 0 0 0 0 RICUS LACTOBACILLUS ACIDO- L 0 0 0 0 PHILUS LACTOBACILLUS BREVIS L 0 0 0 0 LACTOBACILLUS HELVE- L 0 0 0 0 TICUS LACTOBACILLUS HELVE- L 0 0 0 0 TICUS VAR. JUGURTI LACTOBACILLUS LACTIS L 0 0 0 0 LACTOBACILLUS CASEI L 11 21 16 16 RHAMNOSUS LACTOBACILLUS CASEI L 27 33 40 23 CASEI BIFIDOBACTERIUM L 0 13 14 0 BIFIDUM FI = fungi imperfecti; A = ascomycetes; L = bactéries lactiques. * communément utilisées en fermentation yaourtière. 10 20 30 35: 1 -26 Les anticorps testés sont ceux de BC4 et des clones IG7, DG3 et IE3. Les microorganismes testés sont les mêmes que dans l'Exemple 1, sauf en ce qui concerne les ferments lactiques qui, outre ceux mentionnés à l'Exemple 1, sont les suivants: Lactobacillus acidophilus BSN E027 Lactobacillus brevis BSN H001 Lactobacillus helveticus BSN D013 Lactobacillus helveticus var. jugurti BSN D008 Lactobacillus lactis BSN B043 Lactobacillus casei rhamnosus BSN F005 Lactobacillus casei casei BSN F001 Bifidobacterium bifidum BSN I010 EXEMPLE 3: Recherche de levures dans le lait. La technique de détection des levures dans le lait se fait par la méthode ELISA. Le lait contaminé est dilué dans une solution saline (P.B.S.), est réparti sous 50p1 dans les puits d'une plaque Dynatechn, puis est séché pendant une nuit à 41C. Un témoin négatif de lait non contaminé est traité dans les mêmes conditions. Les puits sont saturés pendant une heure avec du P.G.T. Un sérum polyclonal de lapin anti-levures est ajouté sous 50p1 et au 1/400e dans les puits. Il est incubé pendant une heure à température ambiante. Après lavage des micropuits avec du P.G.T., 50p1 d'une dilution au 1/500e d'immunoglobulines de mouton antiimmunoglobulines de lapin couplées avec de la peroxydase sont ajoutés. Après une heure d'incubation avec le conjugué, les puits sont lavés avec du P.B.S., et on ajoute le substrat enzymatique ABTS (2,2' azino di 3 éthyl benzothiazoline-acide sulfonique). Après 30 minutes, la densité optique de chaque puits est lue dans un lecteur optique Dynatech. 2 598513 -27 REVENDICATIONS 1. Anticorps pour la détection et le cas échéant la numération de levures, caractérisés en ce qu'ils sont polyspécifiques, c'est-à-dire capables de reconnaître non seule5 ment la levure utilisée pour les préparer, mais également d'autres levures, différentes de la première par leur genre et/ou leur espèce. 2. Anticorps polyspécifiques anti-levure selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont capables de 10 reconnaître au moins une première et une deuxième levures prises dans le groupe qui comprend notamment les levures des genres Candida, Saccharomyces, Trichosporon, Debaryomyces, Torulopsis et Cryptococcus. 3. Anticorps polyspécifiques selon l'une quelconque 15 des revendications 1 et 2, caractérisés en ce que la première et la deuxième levures sont d'un genre et/ou d'une espèce différents. 4. Anticorps polyspécifiques anti-levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce 20 qu'ils sont capables de reconnaître une première levure de même espèce que la levure utilisée pour préparer lesdits anticorps, prise dans le groupe de levures qui comprend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cu25 taneum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans et au moins une autre levure différente par son genre et/ou par son espèce, de la levure utilisée pour les préparer, et prise dans le groupe de levures qui comprend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropi30 calis, Candida tropicalis, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans. 5. Anticorps polyspécifiques anti-levure caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une composition compre35 nant en combinaison au moins deux préparations d'anticorps -28 polyspécifiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans le but d'étendre la polyspécificité de ladite composition d'anticorps. 6. Anticorps polyspécifiques anti-levure selon 5 l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps obtenus par immunisations répétées d'animaux vertébrés pris notamment dans le groupe qui comprend le lapin, la chèvre et la souris, par injections d'au moins une levure et prélèvement chez lesdits 10 animaux de sérum ou d'ascites présentant une activité antilevure polyspécifique à l'égard d'une pluralité de levures. 7. Anticorps selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'animaux vertébrés appropriés, par injection de cellules de levures préala:15 blement tuées par voie chimique et/ou thermique. 8. Anticorps selon les revendications 6 et 7, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps polyclonaux contenus dans le sérum des animaux immunisés. 9. Anticorps selon l'une quelconque des revendica20 tions 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines résultant de la fusion de cellules de myélome de souris de préférence non secrétantes et de lymphocytes de souris immunisées contre des 25 levures. 10. Anticorps monoclonaux selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides, désignée sous les N I-500, 1-501 et 1-509, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris non secrétantes et de splénocytes de souris immunisées contre des levures par des injections répétées de Debaryomyces hansenii. 11. Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisés en ce qu'ils sont 35 obtenus par culture des cellules hybrides dans un milieu s6- -29 lectif contenant des éléments nutritifs appropriés et sur lequel ne se développent pas les cellules de myélome non fusionnées, sélection des cellules produisant l'anticorps désiré et clonage des cellules sélectionnées. 12. Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisés en ce qu'ils sont fragmentés par voie enzymatique ou chimique. 13. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisés en ce qu'ils sont modifiés par 10 marquage et/ou fixés sur un support solide. 14. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître au moins deux levures différentes et ne donnent pas de réactivité croisée avec les ferments lactiques, ce qui 15 permet de les utiliser pour la détection de levures contaminantes dans les produits alimentaires obtenus par fermentation lactique. 15. Lignées cellulaires de cellules hybrides utiles pour la préparation d'anticorps polyspécifiques monoclonaux 20 selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par culture et clonage de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules lymphoïdes d'animaux appropriés, préalablement immunisés par injections répétées de levures appropriées, avec des cellules 25 de myélome d'animaux de même espèce que les animaux immunises. 16. Lignées cellulaires de cellules hybrides selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles résultent de la culture et du clonage de cellules hybrides résultant de 30 la fusion de splénocytes de souris immunisées par des injections répétées de D. hansenii, avec des cellules de myélome de souris sensibles à l'aminoptérine et en ce qu'elles ont été déposées en date du 6 décembre 1985 sous les N1I-500, 1-501 et en date du 22 janvier 1986 1-509, auprès de la 35 Collection Nationale de Culture des Microorganismes tenue par -30 l'Institut Pasteur. 17. Procédé de préparation d'anticorps polyspécifiques anti-levures, caractérisé en ce que l'on réalise tout d'abord, au cours d'une première étape, l'immunisation d'ani5 maux vertébrés appropriés, par des injections répétées, selon des modalités connues en elles-mêmes, de cellules de levures prises dans le groupe qui comprend Debaryomyces hansenii, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Trichosporon cutaneum, Saccharo10 myces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Cryptococcus neoformans, puis en ce que l'on poursuit le traitement, au cours d'une seconde étape, pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé 15 en ce que les cellules de levures utilisées au cours de la première étape de celui-ci, pour l'immunisation desdits animaux sont des cellules préalablement tuées par traitement - thermique et/ou chimique. 19. Procédé selon la revendication 17 ou la reven20 dication 18, caractérisé en ce qu'au cours de la première étape, pour la première injection auxdits animaux, les cellules de levures sont mises en suspension dans l'adjuvant complet de Freund ou en solution physiologique, et la deuxième injection et les injections éventuelles suivantes sont réalisées avec des cellules de levure en suspension dans de l'adjuvant incomplet de Freund ou en solution physiologique. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 a 19, caractérisé en ce que la seconde étape de celui-ci consiste à prélever du sang de l'animal immunisé et à en séparer le sérum qui contient les anticorps polyclonaux recherchés. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le sérum séparé au cours de la seconde étape est traité par chromatographie d'affinité pour recueillir la fraction anticorps spécifiques du sérum, dont l'utilisation 2b)8513 -31 permet d'augmenter la sensibilité de la détection des levures dans les milieux soumis aux tests de détection de levures. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la seconde étape de 5 celui-ci comprend un premier stade qui consiste à prélever les lymphocytes de l'animal immunisé, un second stade qui consiste à fusionner en présence d'un promoteur de fusion approprié lesdits lymphocytes avec des cellules de myélome d'animaux de la même espèce que ceux immunisés, sélectionnées 10 pour leur sensibilité à l'aminoptérine et à cultiver les cellules hybrides fusionnées, dans un milieu et pendant un temps appropriés, un troisième stade au cours duquel les clones résultant du second stade et produisant des anticorps anti-levures, sont clones dans des milieux de culture appro15 priés. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'au cours d'un quatrième stade de la seconde étape, les clones sont injectés à des animaux de la même espèce que ceux utilisés pour l'immunisation, sensibilisés par un agent 20 approprié pour former des ascites qui contiennent des quantités importantes des anticorps monoclonaux antilevures recherchés. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, caractérisé en ce qu'au cours d'une troisième 25 étape, les anticorps polyspécifiques anti-levure sont soumis à un traitement propre à rendre visible la réaction ultérieure anticorpsantigène de détection de levures dans un milieu à tester, lequel traitement consiste à les marquer avec un agent traceur et/ou à les fixer sur un support solide. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, caractérisé en ce que les anticorps polyspécifiques obtenus sont soumis à un traitement d'immunoabsorption par des levures susceptibles de donner une réaction croisée, pour donner lieu à des anticorps monospéci35 fiques qui reconnaissent une seule levure. -32 26. Anticorps monospécifiques obtenus par le procédé selon la revendication 25, non fragmentés ou fragmentés, marques ou non marqués, éventuellement fixés sur un support solide. 27. Procédé de détection et éventuellement de numération de levures présentes normalement ou éventuellement contenues en tant que contaminants dans un produit à tester, caractérisé en ce que les anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou 26, ou leurs fragments, sont mis 10 en oeuvre d'une manière connue en elle-même, dans une méthode de titrage des anticorps utilisant des immunoglobulines marquées notamment par des radioisotopes, des substances fluorescentes, des enzymes ou des particules colloïdales. 28. Application du procédé de détection et éven15 tuellement de numération de levures selon la revendication 27, à la détection qualitative et/ou quantitative de levures dans des produits alimentaires et/ou des substances biologiques. 29. Application selon la revendication 28, à la dé20 tection qualitative et/ou quantitative de levures dans des produits lactés contenant des ferments lactiques avec lesquels les anticorps anti-levures mis en oeuvre ne donnent pas de réactions croisées. 30. Coffret ou trousse de détection par voie immu25 nologique de levures dans des substances biologiques ou alimentaires, caractérisé en ce qu'il contient outre des tampons et des supports appropriés, une quantité appropri e d'anticorps anti-levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou 26, et des agents de mise en évidence de la réaction 30 antigène-anticorps qui caractérise le procédé de détection par voie immunologique selon la revendication 27. 31. Coffret selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins une levure de référence. 32. Coffret selon l'une quelconque des revendica- ?598513 -33 tions 30 et 31, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, un anticorps anti-immunoglobulines de souris marqué par des marqueurs pris dans le groupe qui comprend les radioisotopes, les fluorochromes, les enzymes ou un agent colloïdal. 33. Application des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou 26, dans un procédé d'élimination des antigènes correspondants présents dans une substance à épurer, en phase non aqueuse, lequel est caractérisé en ce que lesdits anticorps sont fixés à un support 10 insoluble en phase aqueuse pour réaliser l'immunocaptage, l'immunoabsorption ou l'immunoaffinité desdits antigènes.