Brevet FR2610639A1 — publié le 19880812

La présente invention concerne d'une manière géné- rale un procédé pour la reproduction ou multiplication en série ou en masse et la régéneration de plantes à partir de protoplastes de primordiums de pousses. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la production en série de plantes ligneuses par l'intermédiaire des primordiums de pousses et un procédé pour la régé- nération de plantes à partir de protoplastes de primordiums de pousses. Les procédés de reproduction en série des plantes ligneuses sont classés en deux procédés fondamentaux, à savoir la reproduction sexuée et la reproduction asexuée, comprenant le bou- turage et la culture de tissus. Dans la reproduction sexuée des plantes allogames, les caractères des plantes-mères ne sont pas nécessairement transmis à leurs descendants en raison de variations du pollen. Dans les cas d'hybrides interspécifiques et d'hybrides F1 produits par vigueur hybrideainsi que de plantes polyploides, le génotype de la plante mère ne peut pas être transmis à sa descen- dance sans modification. La reproduction asexuée comprend le bouturage aue l'or a longtemps utilisé de manière intensive comme procédé de multiplication pour obtenir des plantes excellentes. Cependant, le bouturage n'est pas approprié pour la reproduction de Dlantes ligneuses, à cause d'un plus faible taux de multiplicat- 'une plus faible aptitude à l'enracinement, de la nécessité o champ pour la production de morceaux de plantes pour le bouturage et de la saison limitée pour le bouturage. Par contre, récemment, les techniques de culture de tissus se sont rapidemment développées. Ellesontles inconvénients qu'une reproduction en série de plantes ayant les mêmes caractères que la plante mère est difficile parce que des aberrations chromosomiques et des mutations de gènes se produisent à une fréquence élevée pendant la régénération des pousses à partir des cals. En outre, dans de nombreux cas, la sous-culture à long terme du cal abaisse sa capacité de différen- ciation. Plus particulièrement, pour des arbres à feuilles larges tels que peuplier, eucalyptus, etc., on a cherché à obtenir une reproduction en série en utilisant des cultures de divers types 2610 6 3 9 d'organes tels que pointes de pousses, bourgeons axillaires, cotylédons hypocotyles, tiges, etc. Cependant, lorsque l'on part d'une extrémité de pousse, le même problème se produit puisque le cal est induit à partir de l'extrémité de la pousse et le cal est ensuite redifférencié en pousses. Par contre, dans le cas de l'in- duction directe de pousses adventices à partir de la tige, etc., c'est-à-dire de microreproduction en continu pour obtenir des pousses, les tiges ou analogues doivent être plantées à des inter- valles appropriés, ce qui a pour conséquence un inconvénient dans la reproduction en série à l'échelle industrielle. En outre, pour les gymnospermes comme les conifères, il est possible de produire un embryo de. Par exemple, Mostafa M. et autres (brevet US 4 217 730 délivré le 19 août 1980), ont pré- paré un emroryoade à partir de Pseudotsuaa menziesii par culture en suspension. Dans ce procéde, bien que le délai de régénération soit plus court que dans la culture de tissus classique (organogénèse) le taux de conversion de l'embryode en une plante complète ne dépasse pas 15 à 50 %. Un autre inconvénient de ce procédé est que, comme l'on utilise des cotylédons jeunes, une grande quantité de graines est nécessaire. Par conséquent, ce procédé ne constitue pas un procédé de reproduction en série sans graines pour l'obtention d'individus excellents. En conséquence, dans la culture de tissus classique, on n'a pas réalisé de technique de reproduc- tion en série, gérntiquement stable et rapide, pour les plantes ligneuses. Récemment, on a présenté pour la reproduction de plantes annuelles autres que les plantes ligneuses, un "procédé aux primerdiums de pousses" (Ryuso Tanaka et autres, Jpn. J. Genet. Vol. 58, pages 65-70, 1983; publication de brevet japonais non examinée n 59-132822; et publication de brevet japonais non exa- minée n 59-132823). Ce procédé aux primordiums de pousses est un procédé utilisant les extrémités de pousses. Dans ce procédé, on retire des extrémites de pousses d'une plante annuelle et on les soumet à la culture tournante dans un milieu artificiel dans des conditions particulières de température, d'éclairage et de vitesse de rotation, pour former des aggrégats globulaires de cellules contenant aes primordiums de pousses, que l'on cuLtive ensuite pour le bouturage pour obtenir à court terme une grande quantité de plantes jeunes conservant de manière stable les caractères génétiques de la plante- mère. La demanderesse a découvert que le "procédé aux primordiums de pousses" qui a déjà été appliqué à des plantes annuelles telles que melon d'eau, mais, riz, liseron, Swertia Paoaver, etc., est également applicable aux plantes ligneuses vivaces (publication de brevet japonais non examinée ni 62-55020). Le primordium de pousse est un corps ou organe de reproduction et par reproduction des primordiums de pousses, on peut produire un grande nombre de clones à partir de la plante mère. Dans le procédé aux primordiums de pousses, jusqu'à présent,on cultive en culture stationnaire les primordiums de Dousses pour le bouturage sur un milieu solide tel qu'un milieu gélosé. Dans cette culture stationnaire, cependant, le taux de production de pousses ne dépasse pas environ 30 %. Comme un protoplaste n'a pas de paroi cellulaire, il est capable de fusion cellulaire ou bien l'on peut y introduire des gènes intéressants. Si des plantes peuvent être régénérées à partir d'un protoplaste ainsi manipulé, il est possible de créer des plantes nouvelles, par exemple des plantes donnant un rendement plus élevé et un goût meilleur et présentant une plus grande résis- tance aux parasites et aux mauvaises conditions atmosphériques, etc. Dans les plantes herbacées, de nombreuses espèces sont capables de reproduction à partir des protoplastes. Cependant, pour les plantes ligneuses, une reproduction du protoplaste en une plante ne réussit qu'avec des espèces limitées telles que l'oranger "Trovita" (Kobayashi, S. et autres, Jpn. J. Breeding, Vol. 34, supplément 2, pages 32-33, 1984), le mûrier à papier (Oka S. et K. Oyama, JDn. J. Breeding, Vol. 34, supplément 2, pages 26-27, 1984; publication de brevet japonais non examinée nc 61-192283), le peuplier (Ito, K. et autres, inventeurs de la présente demande, demande de brevet japonais n 61-64800; Russel, J.A. et B.H. McCown, Plant Sci. 46, pages 133-142, 1986); Le bois de santal (Rao, RS; et P. Ozias-Akins, Protoplasma, 124, pages 80-86, 1985) et Ulmus (Sticklen,M.B. et autres, Plant Sci., 47, pages 29-34, 1986). Une raison de ceci peut être que les protoplastes isolés sécrètent des substances telles que des polyphénols dans le milieu pendant la culture, et que les substances sécrétées ont un effet nuisible sur la survie et la division cellu- laire, conduisant à une inhibition de la régénération de la plante. Pour surmonter cet inconvénient, récemment, on uti- lise principalement pour les monocotylédones un embryon pas mûr ou une inflorescence pour former un cal embryogène et, à partir du cal, on prépare des protoplastes et on les cultive pour régénérer les plantes. Cependant, ce procédé a l'inconvénient que la prépa- ration du matériau de départ est longue, le procédé ne peut être mis en oeuvre que pendant une saison limitée et il est difficile de disposer de matériaux stables en raison de mutations génétiques se produisant pendant la formation du cal (ou callus). Il est donc souhaitable de mettre au point des matériaux qui soient génétiquement stables et capables de différen- ciation et qui puissent se multiplier en grande quantité. En conséquence, la présente invention propose un procédé pour la production de protoplaste comprenant les étapes suivantes: on prépare des primordiums de pousses; on traite les primordiums de pousses avec au moins une enzyme; et on sépare les protoplastes. En outre, la présente invention propose un procédé pour la formation d'un cal comprenant les étapes suivantes: on prépare des primordiums de pousses; on traite les primordiums de pousses avec au moins une enzyme pour préparer des protoplastes; et on cultive lesprotoplastesdans un milieu artificiel contenant des hormones végétales et des sels inorganiques comme ingrédients principaux pour former un cal. En outre, la présente invention propose un procédé pour la régénération d'une plante comprenant les étapes suivantes: on prépare des primordiums de pousses par culture tournante d'une pousse d'une plante; on traite les primordiums de pousses avec au moins une enzyme pour préparer des protoplastes; on cultive les protoplastes dans un milieu artificiel contenant des hormones végétales et des acides inorganiques comme ingrédients principaux pour former un cal; et on fait incuber le cal dans un milieu de régénération pour régénérer les pousses. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit en référence aux dessins annexes, dans lesquels la figure 1 est une photographie montrant l'aspect des pousses obtenues par culture stationnaire de primordiums de pousses de peuplier dans un milieu liquide selon l'exemple 1; la figure 2 est une photographie montrant des pousses régénérées à partir de protoplastes, deux semaines après l'inoculation d'un milieu de régénération de pousses avec une culture de protoplastes; et la figure 3 est une photographie montrant des plantes entières ayant à la fois des pousses et des racines qui ont poussé à partir des pousses représentées à la figure 2, deux semaines après la transplantation des pousses dans un milieu d'enra- cinement. Selon un mode de mise en oeuvre de la présente in- vention, pour reproduire en série une plante ligneuse à l'état génétiquement stable, on stérilise les pousses et on les sépare de la plante ligneuse et on les transfère dans un milieu artifi- ciel contenant des sels inorganiques et des hormones de croissance végétales comme ingrédients principaux et on les soumet à la culture tournantesous éclairage pour former des primordiums des pousses et on soumet ensuite les primordiums à la culture stationnaire dans un milieu liquide contenant comme ingrédients principaux des sels inorganiques et des hormones de croissance végétales pour régéné- rer des plantes. Les plantes ligneuses auxquelles peut s'e-liquer le procédé de l'invention comprennent, mais sans limita, les arbres à feuilles larges persistantes tels qu'eucalyptus, acacia, caoutchouc, caféier; les arbres à feuilles larges caduques tels que peuplier, chêne (Quercus), laquier japonais, les arbres frui- tiers tels qu!oranger, citronnier, pommier, poirier, pêcher, avo- catier, kiwi, plaqueminier, noyer, vigne, figuier, amandier et manguier; et les arbres à fleurs tels que rosier, camélia, abri- cotier japonais (ume) et cerisier. Préparation des primordiums de pousses. On sépare des extrémités de pousses d'un arbre à bois (ligneux),on les stérilise dans une solution stérilisante et on les lave à fond à l'eau stérilisée. On sépare aseptiquement au stéréomicroscope les extrémités des pousses des morceaux de pousses stérilisés et on transplante les extrémités des pousses dans un milieu liquide artificiel contenant des sels inorganiques et des hormones végétales de croissance. Si nécessaire, ou si on le préfère, on ajoute au milieu liquide une substance organiques stimulant la différenciation, comme le lait de noix de coco. La composition des sels inorganiques et organiques contenus dans le milieu liquide artificiel dépend des espèces de plantes à traiter, mais il consiste fondamentalement en un milieu B5 de Gamborg modifié (ci-après en abrégé milieu B5). Les hormones de croissance végéta-les comprennent des auxines telles qu'acide naphtalèneacétique (NAA), acide 2,4- dichlorophénoxyacétique (2,4-D), acide indole-3-acétique (IAA), acide indole-3-propionique (IPA), acide indole-3-butyrique (IBA), acide phénylacétique (PAA), acide benzofuranne-3-acétique (BFA), acide phénylbutyrique (PBA), etc.; et les cytokinines telles que 6benzylaminopurine (BA), kinétine, KT-30 (Kyowa Hakko, Japon), zéatine (Z), etc. La culture tournanteest mise en oeuvre à une tempé- rature constante entre 15 et 300C, de préférence entre 25 et 30 C. A une température plus basse, la reproduction est retardée; et à une température trop élevée, la croissance est mauvaise et ins- table. L'éclairage est mis en oeuvre de préférence en con- tinu à une intensité de 2 000 à 20 000 lux en utilisant tampe fluorescente. Une intensité d'éclairage plus élevée ou z faible a un effet nuisible sur la croissance des primordiums des pousses. La culture tournanteest essentielle pour assurer une croissance suffisante des primordiums; c'est-à-dire que dans une culture stationnaire, on ne peut obtenir qu'une mauvaise crois- sance des primordiums. Pour la croissance tournante, par exemple, on utilise un appareil de culture tournante(Nippon Ika Kikai Seisakusho, Japon) ayant un plateau circulaire rotatif d'un diamètre d'environ 100 cm. Des tubes à essais contenant le milieu dans lequel une pousse est transplantée sont fixés sur le plateau circulaire rotatif de telle manière que les tubes soient parallèles à l'axe de rotation du plateau circulaire et que les tubes soient constamment dans la même direction pendant la rotation du plateau circulaire. Les tubes sont éclairés par le dessus. La vitesse de rotation du pla- teau est de préférence pas plus de 0,5 à 5 tr/min. Une vitesse de rotation trop élevée donne beaucoup de cals et une vitesse de ro- tation trop faible donne beaucoup de branches précoces, ce qui a dans les deux cas pour conséquence une mauvaise formation de pri- mordiums. Lorsque L'on applique la technique de reproduction de l'invention au peuplier, à l'eucalyptus et à L'acacia, on obtient des primordiums poussant activement et le primordium résultant est hémisphérique. Le primordium de pousse de peuplier et d'euca- lyptus est un bloc vert avec un cal dans sa portion de base. Le primordium de pousse de l'acacia est magenta noirâtre avec un cal à sa partie de base. On notera que ces primordiums ont continué à se reproduire pendant 19 à 21 mois et se reproduisent encore active- ment. Le primordium de pousse possède dans son état ini- tial une surface lisse ayant des saillies d'un diamètre de 40 à pim. La saillie comporte des cellules polyédriques qui se di- visent verticalement, tangentiellement, obliquement et d'autres manières. Le primordium de pousse à ce stade (primordium primaire) s'est progressivement allongé et, lorsque son diamètre atteint 200 à 1 000 pm, le primordium se différencie en deux couches, à savoir un système épidermique et un système de cortex. La couche externe comprend une ou deux couches cellulaires pour lesquelles on observe seulement la division périclinale. La couche interne présente à l'intérieur de la couche externe comprend un grand nombre de cellules assez grosses etdans ces cellules, on observe un grand nombre de chloroplastes bien développésde vacuoles et de granules de stockage. Cependant, le primordium à ce stade (primordium secondaire) présente une élévation trapézoidale d'un diamètre de 400 à 2 000 pm. A ce stade, plusieurs primordiums primaires sont fraîchement produits à partir de la surface péri- phérique de l'éLévationtrapézoidale. Par les stades mentionnés ci-dessus, le nombre de primordiums quadruple en un mois. On notera que,dans le cas de sous-culture de primordiums une fois 26 10639 par mois, la vitesse de mutation est aussi faible que de l'ordre de o10-6, et la même que la vitesse de mutation naturelle. Ceci signifie que la technique aux primordiums de l'invention fournit une reproduction en série rapide et génétiquement stable oes plantes. Production de pousses à partir du primordium Les primordiums de pousses qui ont ainsi poussé sont ensuite soumis à la culture stationnaire dans un milieu liquide sem- blable à celui utilisé pour la formation des primordiums de pousses, à une température de 15 à 30-C et sous éclairage à une intensité de I 00C à 4 O00 lux pour former un grand nombre de petites pousses. Ensuite, les pousses sont transplantées dans un milieu d'enracinement pour la roduction des racines des pousses, ce qui donne des olantes complètes. Il faut laisser passer environ 3 mois depuis Le début de la culture stationnaire pour former une plante complète. Les plantes résultantes sont totalement identiques aux plantes- mères en ce qui concerne le génotype, le type chromosomique et le phéenotype. Selon un second mode de mise en oeuvre de l'inven- tion, on traite les primordiums avec une enzyme pour isoler des protosLastes, on cultive les protoplastes dans un milieu artificiel contenant comme ingrédients principaux des sels inorganiques et des horrones de croissance végétales et ensuite on cultive le cal dans un milieu de régénération pour produire des plantes. Les plantes auxquelles peut s'appliquer le procédé de l'invention comprennent, mais sans limitation, les arbres à feuilles larges persistantes tels qu'eucalyptus, acacia, hévéa et caféier; les arbres à feuilles larges caduques tels que peuplier, paulownia, chêne (Quercus), laquier japonais; les conifères utiles tels que pin, cèdre du Japon, cyprès du Japon, sapin, mélèze du Japon; les arbres fruitiers tels qu'oranger, citronnier, pommier, pêcher, avocatier, kiwi, plaqueminier, noyer, vigne, figuier, aman- dier et manguier; et les arbres à fleurs tels que rosier, camélia, abricotier du Japon (ume) et cerisier. Outre les arbres à bois mentionnes ci-dessus, on citera aussi lesplantes herbacées, par exemple les fleurs telles que pétunia et cosmos; et les cultures telles que tabac, lin, riz, blé, tomate, épinard et soja. Dans ce mode de mise en oeuvre, on peut préparer les primordiums par le même mode opératoire que décrit ci-dessus. Préparation de protoplastes On homogénéise dans un homogénéiseur un poids pré- déterminé de primordiums dans une "solution de lavage" contenant de l'acide 2-morpholino-éthanesulfonique monohydraté (ME) et CaCL2,H20. La solution de lavage peut contenir, outre les compo- sants mentionnés ci-dessus, du sorbitol, du saccharose ou du glucose comme agent osmotique et de la polyvinylpyrrolidone ou du dextranesulfate de calcium comme additif. On filtre à travers un tamis en Nylon (marque déposée) le produit homogénéisé contenant les primordiums broyés et on lave à fond les primordiums récupérés avec la solution de lavage. On ajoute au produit lavé une solution d'enzymes contenant une enzyme d'hydrolyse de la pectine telle que pectolyase et une enzyme d'hydrolyse de la cellulose pour la diges- tion des parois cellulaires te-le qu'une cellulase, par exemple la Cellulase Onozuka RS, ainsi que du mannitol, du MES et CaCl2,2H20, et on secoue le mélange à 20-30 C pendant 24 à 48 heures à -30 tr/min pour isoler les protoplastes. On peut utiliser le Macerozyme R-10 comme enzyme d'hydrolyse de la pectine et la Cel- lulase Onozuka R-10 comme enzyme de digestion des parois cellu- laires. Culture des protoplastes On cultive ensuite les protoplastes ainsi préparés dans un milieu de culture de tissus de plantes pour former le cal ou callus. Le milieu de culture de tissus de plantes est choisi selon la naturedes protoplastesà cultiver et consiste par exemple en milieu de Murashige-Skoog, etc., avec addition d'hormones végé- tales, c'est-à-dire d'auxines telles qu'acide naphtalèneacétique (NAA), acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) ou acide indole- acétique (IAA) et de cytokinines telles que benzylaminopurine (BA), kinétine, KT30 ou zéatine. Le milieu peut être un milieu liquide ou un milieu solide tel qu'un milieugélosé. En outre, le milieu contient de préférence également 0,001 à 0,05 % d'un agent de support tel que Gelrite, pour supporter les protoplastes dans un récipient ce culture. De préférence, la culture est mise en oeuvre au départ dans l'obscurité et la pièce de culture est pro- gressivement éclairée à mesure que les protoplastes poussent. La température de culture est de préférence de 20 à 30 C, mieux encore de 25 à 28 C. Lorsque l'on utilise un milieu gélosé, on ajoute au milieu gélosé fondu par chauffage la suspension de proto- plastes préparée séparément et on refroidit le milieu pour soli- difier le milieu et maintenir les protoplastes en suspension. Lorsque l'on utilise un milieu liquide, il est néces- saire d'empêcher l'effet toxique des polyphénols sécrétés oar les protoplastes et la coagulation des protoplastes en suspension qui peut avoir un effet nuisible sur la division cellulaire et la survie des protoplastes. Le "GELRITE" (Kelco, USA) mentionné ci-dessus est un produit contenant comme ingrédients principaux des polysaccha- rides produits par sécrétion extracellulaire par Pseudomonas elodea. Par addition de GELRITE à un milieu liquide à faible concentration, il se forme dans le fond du récipient de culture une couche de GELRITE gélifié et les protoplastes adhèrent à cette couche et sont supDortés Dar cette couche de GELRITE gélifié. En conséquence, lorsque l'on remplace le milieu liquide par un milieu liquide frais, les protoplastes ne sont pas éliminés avec le milieu usé. Régénération de la plante Le callus (cal) produit par les protoplastes comme décrit ci-dessus est cultivé dans un milieu de régénération, par exemple un milieu B5 de Gamborg ou un milieu de Murashige-Skoog additionné d'hormones végétales, c'est-à-dire des auxines telles qu'acide naphtalèneacétique (NAA) ou acide 2,4-dichlorophénoxy- acétique (2,4-D), acide indoleacétique (IAA) et une cytokinine telle que benzylaminopurine (BA), KT-30, kinétine ou zéatine, pour produire facilement des pousses,et ensuite des racines. De cette manière, la plante entière est régénérée à partir des Drotoplastes. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. ExempLe 1 Plante utilisée pour l'expérience Populus charkowiensis X P caudina, OP20 Préparation des primordiums On coupe des morceaux supérieurs d'une longueur d'environ 20 mm dans une branche verte d'un peuplier en croissance active et on les stérilise pendant 5 minutes dans l'éthanol à 70 %, ensuite pendant 15 min dans une solution d'hypoçhlorite de sodium diluée 7 fois et on lave à l'eau stérile. Ensuite, dans une pièce propre, ventilée, on retire des morceaux stérilisés des pointes (ou extrémités) de pousses ayant une pointe de croissance et d'une longueur de 0,5 à 1 mm au stéréomicroscope en utilisant des bru- celles et un scalpel. Les pousses retirées sont ensuite trans- plantées dans un milieu de Gamborg modifié ayant la composition indiquée dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Milieu B5 de Gamborg modifié pour le peuplier Composant Concentration (mg/l) NaH2PO4,2H20 150 KNO3 2500 (NH4)2S04 134 MgSO4,7H20 250 CaCl2 150 Fe-EDTA 40 MnSO4,4H20 10 H3BO 3 ZnSO4,7H20 2 Na2MoO4, 2H20 0,25 CuSO4,5H20 0,025 CoCl2,6H20 0,025 KI 0,75 Acide nicotinique 1 Thiamine,HCl 10 2610 639 (suite) Composant Concentration (mg/l) Pyridoxine,HCl 1 Myo-inositol 100 Saccharose 30 000 Acide naphtalèneacétique 0,02-0,2 6-benzy laminopurine 0,2-0,4 (ou KT-30) (0,2) pH 5,5-5,8 Avant l'expérience principale, on a effectué une expérience préalable pour déterminer une combinaison de types d'hormones et deLeursconcentrationsdans le milieu artificiel qui donneraient la croissance la plus élevée et la plus stable des primordiums. Les résultats sont indiqués dans les tableaux 2 et 3 ci-dessous. Tableau 2 Combinaison des concentrations de NAA et de BA dans le milieu artificiel pour peuplier (mg/l) Concentration Concentration de BA - de NAA 0,05 0,1 0,2 0,4,0 0,02 O 0 0,05 o 0,1 0,5 1,0 NAA = acide naphtalèneacétique SA = 6-benzylaminopurine o = combinaison efficace 2610 6 3 9 Tableau 3 Combinaison des concentrations de NAA et de zéatine dans le milieu arficiel pour peuplier Concentration Concentration de Z de NAA 0,05 0,1 0,2 0,4 1,0 o0 0,02 0,2 0 2,0 4,0 NAA = acide naphtalèneacétique Z = zéatine o = combinaison efficace On met en oeuvre la culture dans 25 ml du milieu B5 modifié dans un tube à essais ayant un diamètre de 30 mm et une longueur de 200 mm à une température de 280C, une intensité d'éclai- rage de 2 000 à 20 000 lux et une vitesse de rotation de 2 tr/min. Le quarantième jour après le début de la culture, on obtient des conglomérats de primordiums verts ayant un diamètre d'environ 10 mm. Les conglomérats de primordiums verts poussant sont ensuite divisés en conglomérats ayant un diamètre d'environ à 10 mm et les conglomérats divisés sont transplantés dans un milieu fraîchement préparé ayant la même composition que ci-dessus. De cette manière, lorsque l'on a obtenu des conglomérats de pri- mordiums, le nombre de primordiums de pousses est quadruplé chaque mois. En conséquence, après une durée de n mois, le nombre de primordiums est multiplié par 4 (n = nombre de mois après la culture). Ensuite, on transplante les primordiums ainsi obte- nus dans un milieu de formation de pousses. Production de pousses à Dartir des primordiums La culture de primordiums préparée par culture tour- nantecomme décrit ci-dessus est ajustée à une température de 28 C, une intensité d'éclairage de 1 000 à 4 000 lux (16 heures de lu- mière et 8 heures d'obscurité alternativement) et cultivée comme culture stationnaire liquide. Apres trois semaines de culture, à 15 pousses de 3 à 5 mm ont été produites par primordium (voir figure 1). Apres encore quatre semaines de culture, la pousse a poussé jusqu'à une dimension de 10 à 15 mm et elle est ensuite coupée de sa portion de base et transportée dans un milieu de formation de racines comprenant un milieu de base B5 de concentra- tion moitié (les hormones ont été supprimées du milieu B5 modifié) additionné de 6 g/l de gélose. La pousse transplantée forme des racines satisfaisantes après trois semaines de culture. Ce mode opératoire selon l'invention donne un taux de production de pousses de 50 %. Par contre, un mode opératoire comparatif dans lequel les primordiums sont transplantés directement dans le milieu de gélose sans être soumis au procédé de culture en liquide ne donne qu'un taux de production de pousses de 30 %. Les plantules qui ont poussé sont transplantées dans un pot contenant de la vermiculite etaprès adaptation des plan- tules sous une faible intensité d'éclairage pendant 2 semaines, le pot est transféré dans une serre et on fait pousser les plantules en plantes saines selon une technique classique. Exemple 2 Plante utilisée pour l'expérience Eucalyptus saligna, E. grandis Préparation des primordiums Les extrémités d'une longueur d'environ 10 mm sont coupées d'une branche poussant activement d'une plante de 3 ans et stérilisées par l'éthanol à 70 % pendant 30 secondes,puis par une solution d'hypochlorite de sodium diluée 10 fois pendant minutes et lavées à l'eau stériLe. On retire les bouts des pousses des morceaux supérieurs stérilisés et on transplante les pousses dans un milieu artificiel seLon le même mode opéra- toire que décrit à l'exemple 1I pour le peuplier. La composition du milieu artificiel est identique à celle utilisée pour le peu- plier (tableau 1),sauf la combinaison des hormones végétales. La combinaison des hormones végétales est déterminée par une expé- rience préliminaire. Comme indiqué dans le tableau 4 ci-dessous, une combinaison de 0 à 0,02 mg/l d'acide naphtaLèneacétique et de 0,02 à 0,2 mg/l de 6-benzyLaminopurine est efficace. Tableau 4 Combinaison des concentrations de NAA et de BA dans le milieu artificiel pour eucalyptus (mg/l) Concentration Concentration de BA de NAA 0 0,02 0, 2 2,0 4,0 0 0,02 O O 0,2 2,0 4,0 NAA = acide naphtalèneacétique BA = 6-benzylaminopurine o = combinaison efficace Dans le cas de l'eucalyptus, il faut laisser passer 6 mois avant qu'il se forme des conglomérats de primordiums ayant un diamètre d'environ 10 mm. Ce délai est beaucoup plus long que celui pour le peuplier. Cependant, après ce stade, le nombre de pri- mordiums quadruple chaque mois, comme pour le peuplier. Production de pousses à partir des primordiums La culture de primordiums de pousses préparée par culturetournante comme décrit ci-dessus est ajustée dans les mêmes conditions que décrit ci-dessus pour le peuplier pour former des pousses. Les pousses ainsi formées sont traitées selon le même mode opératoire que décrit pour le peuplier pour former des racines qui poussent en plantules. Ce mode opératoire selon l'invention donne un taux de production de pousses d'environ 30 %. Par contre, un modeopératoire comparatif,dans lequel les primordiums sont directement transplantés dans le milieu de gélose sans la culture liquide, donne un taux de pousse de 10 % seulement. ExempLe 3 * Plante utilisée pour L'expérience Acacia auriculiformis Préparation des primordiums On coupe des extrémités supérieures d'environ 10 mm de long d'une branche poussant activement d'une plante de 3 ans et on les stérilise selon le même mode opératoire que celui décrit pour l'eucalyptus. Les conditions de culture sont les mêmes que pour l'eucalyptus sauf que la combinaison d'hormones végétales dans le milieu artificiel est de (1) 0,02 mg/L d'acide 2,4-dichlorophénoxy- acétique et 0,02 mg/l de 6-benzylaminopurine ou (2) 0,02 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et 0,2 mg/l de 6-benzylamino- purine, et la vitesse de rotation est de 2 tr/min. Les primordiums ainsi obtenus sont brun noirâtre. Bien qu'il faille laisser passer environ 6 mois avant la formation de conglomérats de primordiums d'un diamètre d'environ 10 mm, les primordiums sont ensuite quadru- plés chaque mois, comme pour le peuplier. Production de pousses à partir des primordiums La culture de primordiums préparée par culture rota- tive comme décrit ci-dessus est ajustée dans les mêmes conditions que décrites ci-dessus pour le peuplier et l'eucalyptus, pour mettre en oeuvre une culture stationnaire liquide pour la forma- tion de pousses. Ce mode opératoire donne un taux de production de pousses d'environ 20 %. Par contre, un mode opératoire comparatif, dans lequel les primordiums sontdirectementtransplantésdansle milieu degélosesans laculture liquide,nedonne que 5 % de pousses. Les pousses ainsi obtenues sont mises à prendre racine par le même mode opératoire que pour le peuplier et elles poussent pour donner des plantules. Comme on le voit dans les exemples 1 à 3 selon le procédé de l'invention, il est possible d'entretenir et reproduire des plantes ligneuses sous une forme végétative à un état généti- quement stable pendant une durée de plusieurs années et, lorsque 26 10 6 3 9 cela est nécessaire, de produire efficacement un grand nombre de clones d'une plante. Le taux de reproduction est très élevé; c'est-à-dire quedans le cas des arbres à feuilles larges, il est possible de produire 4 12, c'est-à-dire 17 x 106 primordiums à partir d'une pousse en un an. Bien que le procédé de l'invention ait été expliqué en utilisant des arbres à feuilles larges, le procédé de l'inven- tion peut s'appliquer bien entendu aussi aux conifères. Exemple 4 Plante utilisée pour l'expérience Populus charkowiensis X P. caudina, OP20 Préparation des primordiums On coupe deux extrémités de branches d'un peuplier, on les stérilise par l'éthanol à 70 % et par une solution d'hypo- chlorite de sodium diluée 7 fois et ensuite on retire aseptiquement des deux bouts de branches les extrémités de pousses ayant une longueur d'environ 0,5 mm et on les transplante dans un milieu B5 de Gamborg additionné de 0,05 mg/l d'acide naphtalèneacétique et 0,4 mg/l de benzyladénine (pH 5,6). On soumet ensuite ce milieu à la culture tournante à une température de 28 C, une intensité d'éclai- rage de 20 000 lux et une vitesse de rotation de 2 tr/min. Au quarantième jour après le début de la lure, on obtient des conglomérats de primordiums verts d'un diamètre d'environ 10 mm. Apres trois semaines, on divise le conglomérat qui a poussé en conglomérats d'un diamètre d'environ 5 à 10 mm, que l'on soumet à la sous-culture pendant 2 semaines et on les utilise pour isoler les protoplastes. Isolement et préparation des protoplastes On place I g de primordiums après sous-culture pendant 2 semaines dans 15 ml d'une "solution de lavage" contenant de l'acide 2-morpholinoéthanesulfonique monohydraté (MES) 10 mM, CaCL2,2H20 10 mM, et 13 % de mannitol (pH 5,6) et on traite le tout dans un homogénéiseurà 20 000 tr/min pendant 10 secondes pour former de petites sections d'une dimension d'environ I mm. Le pro- duit ainsi traité est filtré à travers une toile de Nylon pour récupérer une fraction de cellules que l'on lave ensuite deux fois avec la solution de lavage. 2610 6 3 9 On ajoute au produit lavé 20 ml d'une solution enzymatique contenant 1 % de Cellulase Onozuka RS, 0,05 % de pecto- lyase Y-23, CaCL2,2H20 10 mM, du MES 10 mM et 13 % de mannitol et on fait incuber dans l'obscurité à 20-30 C à une fréquence d'agi- tation de 20 à 30 tr/min pendant 24 à 48 heures. Après le traite- ment enzymatique, on filtre la suspension sur une étoffe de Nylon pour éliminer les blocs cellulaires non digérés et on centrifuge le filtrat à 100 x g pendant 3 minutes pour séparer les protoplastes de la solution d'enzymes. On lave ensuite les protoplastes avec la solution de lavage et on les utilise pour une nouvelle culture. Culture des protoolastes et régénération des plantes On cultive les protoplastes dans un milieu ayant la composition indiquée dans le tableau 5 ci-dessous. Tableau 5 Composition du milieu de culture des protoplastes (Milieu B5 de Gamborg) Composants Concentration (mg/l) KNO3 2 500 (NH4)2SO4 134 MgSO4,7H20 250 MnSO4,H20 10 ZnSO4,7H20 2 CuSO4,5H20 0,025 CaCl2,2H20 150 CoCL2,6H20 0,025 KI 0,75 NaH2PO4,H20 150 H3BO3 3 Na,MoO4,2H20 0,25 Fe-EDTA 40 Thiamine,HCl 10 Acide nicotinique 1 Pyridoxine,HCl 1 Myo-inositol 100 2610 6 3 9 suite (Milieu B5 de Gamborg) Composants Concentration (mg/l) (Autres composants) NAA 0,1 BA 0,5 2,4-D 5 Saccharose 10 000 Mannitol 90 000 pH 5,6 On prépare d'abord un milieu B5 de Gamborg ayant une concentration double (2 fois). On prépare également une solu- tion de Gelrite contenant 9 % de mannitol et 0,005 % de Gelrite (pH 5,6), on la passe à l'autoclave et on la refroidit complète- ment. On mélange la suspension de protoplastes avec la solution de Gelrite dans un rapport 1:1 en volume et on verse chaque fois 3 ml du mélange dans une boîte de Petri ayant un diamètre de 6 cm. On cultive les protoplastes d'abord dans l'obscurité et ensuite sous un éclairage progressif à 28 C pendant 25 jours. On transplante ensuite successivement tous les jours lesprotoplastesayant ainsipoussé dans des milieux contenant une concentration décroissante de 6 %, 3 % et O % de mannitol et une concentration décroissante d'auxines et 3 % de saccharose pour former des cellules. Après 2 mois, on transplante le callus dans un milieu de régénération des pousses contenant le milieu B5 de Gamborg, 0,02 mg/l d'acide naphtalèneacétique, 0,02 g/l de benzyl- adénine, 3 % de saccharose et 0,4 % de gélose, et on cultive à 28 C dans des conditions d'éclairage de 16 heures à la lumière et 8 heures dans l'obscurité. Deux semaines après la transplantation, les pousses sont régénérées comme indiqué à la figure 2. Les pousses sont ensuite transplantées dans un milieu de prise de racines comme indiqué dans le tableau 6 ci-dessous pour produire des plantes ayant des racines comme indiqué à la figure 3. 2610 6 3 9 Tableau 6 Milieu pour La prise de racines Composants Concentration (mg/l) Milieu B5 de Gamborg (Autres composants) NAA O à 0,1 Saccharose 10 000 Gélose 4 000 pH 5,6 Exemple comDaratif On coupe une tige du même peuplier à maturité qu'à l'exemple 4 et on coupe la tige pour obtenir un morceau de 2 cm de long que l'on stérilise selon une technique classique et que l'on pèle ensuite pour exposer le cambium. On plonge le morceau pelé dans le milieu B5 de Gamborg additionné de 0,1 mg/L d'acide naphtalèneacétique comme auxine, 0,2 mg/L de benzylaminopurine (ou 0,02 mg/L de KT-30) comme cytokinine, 3 % de saccharose et 0,8 % de gélose pour former des pousses. Le trente-cinquième jour après le bouturage, on isole les protoplastes des pousses. En d'autres termes, on découpe la pousse en morceaux de 1 mm de long et on soumet les morceaux au même traitement enzy- matique et au lavage comme décrit à l'exemple 4 pour isoler et préparer les protoplastes. En conséquence, on obtient 106 proto- plastes à partir de I g de la pousse. Lorsque l'on cultive les protoplastes isolés selon le même mode opératoire que décrit à l'exemple 4 pendant 2 ou 3 jours, certains des protoplastes ont gonflé. Bien que l'on observe une ou deux divisions, les protoplastes sont devenus bruns et coagulés le vingtième jour et en conséquence, il est impossible de continuer la culture. Comme on le voit d'après l'exemple 4, bien qu'il soit très difficile de régénérer des plantes à partir de protoplastes préparés directement à partir de tissus de plantes ligneuses, il 2610 6 3 9 devient facile de régénérer des plantes à partir des protoplastes préparés par L'intermédiaire des primordiums des pousses à partir d'une plante Ligneuse et, en conséquence, l'invention propose un procédé très prometteur pour créer de nouveLLes races de plantes. Il est entendu que L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illus- tration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifi- cations et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la régénération des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend ies étapes suivantes: on prépare les primordiums des pousses par culture tournante d'une pousse d'une plante; on traite les primordiums avec au moins une enzyme pour préparer les protoplastes; on cultive les protoplastes dans un milieu artificiel contenant comme ingrédients principaux des hormones végétales et des sels inorganiques pour former le callus; et on fait incuber le callus dans un milieu de régénération pour régénérer les pousses. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est mise en oeuvre en présence d'un agent de support. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de support est le Gelrite. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu artificiel est choisi parmi le milieu B5 de Gamborg et le milieu MS de Murashige-Skoog. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'hormone végétale dans le milieu artificiel est choisie parmi les auxines, les cytokinines et leurs mélanges. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la culture est mise en oeuvre à une température comprise entre 20 et 30 C. 7. ' Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de régénération est choisi parmi le milieu B5 de Gamborg et le milieu MS de Murashige-Skoog, tous deux additionnés d'auxines et de cytokinines.