Brevet FR2602858A1 — publié le 19880219

DESCRIPTION La présente invention est relative à un appareil de congélation de produits biologiques conditionnés en paillettes, du type comprenant une enceinte thermiquement isolée destinée à contenir un bain de liquide cryogénique. La congélation d'embryons, animaux ou humains, conditionnés en paillettes dans un liquide crycprotecteur, nécessite le respect d'un programme de température très précis adapté à l'embryon et à son conditionnement; il est issu de l'expérience, et doit être respecté scrupuleusement pour assurer la survie de l'embryon. A titre d'exemple, un programme de température corporte les phases principales suivantes: - une première descente en température depuis l'ambiante jusqu'à un palier de surfusion du liquide cryoprotecteur (-5 à -7 C), à une vitesse de quelques C/mn. - à cette température, on procède au "seeding", c'est-à-dire au déclenchement de la cristallisation par un apport frigorifique bref et intense, par exaemple en amenant au contact des paillettes une masse métallique préalablement refroidie. La température remonte alors à la température de cristallisation du milieu. - à partir de ce point, on reprend la descente en température à une vitesse de l'ordre de 0,2 à O,5 C/mn, jusque vers -35 C, température à laquelle les paillettes peuvent être immergées dans l'azote liquide, puis stockées en récipient crycbiologique. Si, coame c'est généralement le cas, plusieurs paillettes sont 25 congelées en même temps, on devra respecter une stricte hcmogénéité thermique entre toutes les paillettes, afin de pouvoir faire le seeding (automatique ou manuel) sur toutes les paillettes en même temps, et afin également de n'utiliser qu'une seule prise de température, placée par exemple dans une paillette tnmin, pour la caunande du programmateur de 30 température. Il existe de narbreux types de congélateurs biologiques utilisant canme source frigorifique l'azote liquide ou du froid mécanique du type à bain d'alcool. Certains appareils fonctionnant à l'azote liquide sont particulièrement bien adaptés, car ils permettent 35 d'enchainer dans une mâme enceinte la congélation et l'immersion finale dans l'azote liquide. Cependant, l'azote liquide est une source frigorifique puissante qui doit être mise en oeuvre avec précaution si l'on veut respecter précisément le programme défini, sur un grand nombre de paillettes en même temps. Des solutions existantes utilisent l'azote liquide de la façon suivante. Dans un premunier type d'appareils, les paillettes sont disposées dans une enceinte isolée, dans laquelle un ventilateur assure l'hawDgéngité thermique du gaz. De l'azote liquide est injecté dans l'enceinte, sous le contrôle du régulateur, et le ventilateur assure la 10 dispersion du liquide. Le congélateur est relié à un récipient d'azote liquide, qui doit être équipé d'un dispositif de pressurisation, et une électrovanne pilotée par le régulateur règle l'introduction d'azote dans 1 'enceinte. Ce type de matériel est bien adapté aux besoins actuels des 15 laboratoires spécialisés, mais le développement de la technique de congélation d'embryons nécessite des appareils qui, par leur faible prix, leur simplicité et leur robustesse, répondent mieux aux conditions particulières d'utilisation: congélation sur le terrain (à la ferme), matériel transportable, emploi par du personnel non spécialiste. Par ailleurs, on connait aussi des congélateurs o le refroidissement est assuré en utilisant simplement le gradient thermique dans les vapeurs audessus d'un bain d'azote liquide: les paillettes sont descendues progressivement dans les vapeurs, jusqu'à être immergées dans le liquide. Ces appareils sont simples, mais ils ne permettent pas 25 d'obtenir des pentes de refroidissement très faibles et parfaitement contrôlées,ce qui les rend inaptes à leur utilisation en congélation d 'embryons. L'invention a pour but de fournir un appareil transportable et autonmer, particulièrement simple et robuste de construction, permettant 30 à du personnel même non spécialiste de réaliser de façon fiable la congélation d'embryons. A cet effet, l'invention a pour objet un appareil du type précité, caractérisé en ce que l'enceinte contient un caisson de forme aplatie muni d'une isolation thermique moins performante que celle de 35 l'enceinte et comportant d'une part des moyens de support de paillettes dans un plan horizontal, et d'autre part des myens de chauffage de la paroi inférieure et/ou du couvercle du caisson. Dans un mode de réalisation avantageux, lesdits toyens de support sont thermiquement isolants et sont adaptés pour porter toutes les paillettes dans un plan horizontal unique. Dans ce cas, les paillettes peuvent être 5 disposées entre deux plaques horizontales i diatement adjacentes aux paillettes,prévues à l'intérieur du caisson. Un exemple de réalisation de l'invention va maintenant être décrit en regard des dessins annexés, sur lesquels: - la figure 1 est une vue en coupe verticale d'un appareil de congélation 10 conforme à l'invention; la figure 2 est une vue partielle à plus grande échelle d'une variante, prise en coupe suivant une ligne correspondant à la ligne II-II de la figure 1; - la figure 3 est une vue analogue à la figure 2 d'une autre variante; 15 - la figure 4 est une vue de dessus de l'objet de la figure 3. L'appareil de congélation d'embryons représenté à la figure 1 camprend une enceinte extérieure 1 munie d'une isolation thermique 2 à hautes performances, et un caisson 3 muni d'une isolation thermique 4 à performances nettement inférieures. Le caisson 3 a une fonrme parallélépipédique aplatie et comprend essentiellement une cuve 5 et un couvercle amovible 6 tous deux en métal de forte épaisseur, par exemple de l'ordre de plusieurs millimètres, cette épaisseur étant la mêe pour toutes les faces de la cuve et pour le couvercle, pour des raisons de ccmnodité de fabrication. La cuve 5 coprend un fond horizontal 7 sur la face inférieure duquel est collée une résistance électrique en film 8, et des parois latérales 9A, 9B. Elle est emboitée dans une cuvette 10 en matière isolante, par exemple en mousse de matière plastique rigide, laquelle est elle-nmne emboîtée dans une cuvette Il en tôle. Cette dernière est fixée 30 à la branche horizontale inférieure 12 de deux supports 13 en L, la branche verticale 14 de ces supports traversant à coulissement deux orifices prévus dans le couvercle amovible 15 de l'enceinte 1. Des moyens non représentés permettent de positionner les supports 13 à plusieurs hauteurs, de façon à pouvoir disposer le caisson 35 3 dans au moins trois positions différentes dans l'enceinte 1, à savoir une position haute proche du bord supérieur des parois latérales de l'enceinte, une position interédiaire représentée à la figure 1, et une position basse proche du fond inférieur de l'enceinte. Par ailleurs, l'isolation 4 du caisson est caoplétée par une plaque 16 en matière isolante fixée sur la face externe du couvercle 6. Parallèlement à deux faces latérales 9A du caisson, il est prévu dans celui-ci deux porte-paillettes horizontaux 17. Chaque portepaillette est constitué d'une réglette en matière isolante, par exemple en matière plastique, posée sur le fond 7 et fixée par ses extrénités aux deux autres faces latérales 9B du caisson. Ces réglettes comportent dans 10 leur face supérieure une série d'évidements tranversaux semi-circulaires 18, alignés coaxialement deux à deux. Ainsi, une série de paillettes 19, constituées de longs tubes de faible diamètre en matière plastique, peuvent être disposées parallèlement les unes aux autres, en une seule couche horizontale, chacune des paillettes étant portée par un évidement 15 18 d'un porte-paillette 17 et par l'évidement associé de l'autre portepaillettes. La hauteur du caisson n'est que légèrement supérieure à celle des porte-paillettes munis des paillettes 19. En fonctionnement, on remplit partiellement l'enceinte 1 d'azote liquide, de façon à constituer un bain 20 de ce corps jusqu'à une 20 hauteur prédéterminée; on dispose dans chaque paillette, à une distance donnée de ses extrémités, un embryon à congeler, on charge les paillettes dans le caisson, et l'on dispose le caisson 3 ainsi chargé et muni de son couvercle dans sa position internédiaire, ou il baigne entièrement dans les vapeurs froides d'azote qui surmontent le bain 20. Les paillettes se 25 trouvent alors dans un même plan horizontal, et tous les embryons sont sensiblement alignés le long d'une même droite horizontale. Soit par les entrées de chaleur naturelles, soit au moyen d'une résistance électrique 21 prévue près du fond de l'enceinte 1, on assure dans celle-ci une évaporation constante d'azote, par exenple de l'ordre 30 de 1 1/h,.de façon à créer autour du caisson un apport constant de frigories servant à la congélation des paillettes. L'isolation 4 du caisson est choisie de manière telle que la vitesse de descente en tem_érature à l'intérieur de celui-ci provoquée par cet apport de frigories soit légèrement supérieure à la plus grande 35 vitesse requise dans le programme de congélation considéré, soit quelques degrés C/mrun. Pour ajuster la vitesse de descente en température à la valeur prescrite, on apporte en outre au caisson un flux de chaleur par effet Joule ccmmnandé de façon précise au moyen de la résistance 8, par l'intermédiaire de fils (non représentés) s'étendant dans les supports 13 5 jusqu'à une source de courant électrique (non représentée) extérieure à l'enceinte 1. Cet apport de chaleur est homogénéisé ou diffusé sur toute la surface du fond 7 du caisson par la forte épaisseur de ce fond, et il est coanandé par un régulateur (non représenté) à partir des données de température fournies par un thermo-couple (non représenté) dont est 10 équipée l'une des paillettes. Ainsi, les paillettes sont confinées dans un espace restreint presque isotherme mais dans lequel se produit tout de mnme une certaine convection naturelle de bas en haut, et les paillettes ne sont soumises, du point de vue thermique, qu'à cette seule convection naturelle. Grace à la manière dont sont assurés les apports de froid et de chaleur, les surfaces isothermes sont pratiquement horizontales dans tout le caisson, et en particulier, coempte tenu de la disposition des paillettes en une seule couche horizontale, toutes les paillettes sont à chaque instant à une température uniforme. Ceci rend possible l'obtention 20 précise du programme de température prescrit pour toutes les paillettes sinultanéIent, la température des paillettes étant régulée à chaque instant par la régulation de la puissance dissipée dans la résistance 8, à partir des données correspondant à une seule des paillettes. Lorsqu'une température de surfusion choisie (par exemple - 7 C) est atteinte, on remonte le caisson jusqu'à sa position supérieure, et l'on ouvre le couvercle 15 de l'enceinte. Le caisson se trouve alors dans un environnement constitué d'un mélange d'azote froid et d'air ambiant, à une température voisine de cette température de surfusion. On ouvre ensuite le couvercle 6 du caisson, et l'on procède au 30 seeding en amenant au contact de toutes les paillettes, à l'emplacement des embryons, une barre métallique horizontale, dite "inducteur thermique", préalablement refroidie dans de l'azote liquide. Ensuite, on referme le caisson puis l'enceinte 1, on redescend le caisson à sa position intermédiaire, et l'on poursuit le progranmme de 35 descente en tepérature cOnne précédemment jusqu'à une température déterminée de congélation (par exemple -35 C). Enfin, on descend le caisson jusqu'à sa position basse pour l'immerger dans le bain 20 d'azote liquide et assurer la phase finale de la congélation des embryons, ayant leur transfert dans un récipient de stockage cryobiologique. L'appareil ainsi décrit est éconranique, robuste et fiable grâce à l'absence totale de pièces en mouvement telles que moteur, ventilateur, électrovannes ou organes d'agitation. La figure 2 illustre une variante qui permet d'améliorer encore l'hormogénéité des descentes en température des différentes paillettes en 10 assurant positivement la présence d'un isotherme horizontal à leur niveau, au moins à l'emplacement des embryons. Pour celà, on dispose horizontalement, juste au-dessus et juste au-dessous de la couche des paillettes, deux plaques métalliques de faible épaisseur, par exemple de 5/20 à 1 mm d'épaisseur, qui ne sont pas en contact thermnnique avec le 15 caisson 3. Dans l'exemple de la figure 2, la plaque inférieure 22, légèrement barmbée vers le haut, est fixée par deux côtés opposés aux deux porte-paillettes 17, dont l'un porte une cornière 23 servant à positionner longitudinalement une extrémité des paillettes. A mi-distance entre les porte-paillettes, ce qui correspond à 20 l'emplacement des embryons, cette plaque 22 se trouve au niveau de la génératrice inférieure des évidements 18 et donc des paillettes 19. La plaque supérieure 24 a une dimension, dans le sens longitudinal des paillettes, légèrement inférieure à la distance séparant les deux portepaillettes. Elle est plane et horizontale et est fixée à 25 la face inférieure d'une plaque de mousse souple parallélépipédique 25 elle-nme fixée à la face inférieure du couvercle 6 du caisson et thermiquement isolante. Lorsque l'on charge le caisson avec les paillettes, la zone de celles-ci contenant les embryons vient au contact de la plaque inférieure 30 22 puis, lorsque l'on referme le couvercle 6, la plaque supérieure 24 vient s'appuyer légèrement, avec une force limitée par l'élasticité de la plaque de mousse 25, contre les paillettes. Pendant la descente en température, les plaques 22 et 24, étant conductrices thermiquement, définissent chacune une surface isotherme, ce qui assure une très grande 35 hcmogénéité de température des embryons. Ceci resterait d'ailleurs vrai si les plaques n'étaient pas au contact des paillettes mais, grâce à ce contact, ces plaques procurent, de par leur inertie thermnique, une meilleure régulation de la seconde descente en température après le seeding. Dans la variante des figures 3 et 4, la plaque 22 est plane, et la plaque 24 est simplement posée sur les paillettes. De plus, la plaque 5 24 présente une fenêtre transversale 26 qui laisse apparaître toutes les paillettes au droit de l'emplacement des embryons, ce qui permet d'effectuer le seeding sans retirer cette plaque. En variante encore, la face supérieure du couvercle 6 du caisson peut être elle aussi pourvue de moyens de chauffage tels qu'une 10 résistance en film collée, l'apport de chaleur étant alors réalisé sur les deux grandes faces du caisson. Cette seconde résistance est particulièrement souhaitable dans une variante de l'appareil (non représentée) dans laquelle le couvercle 6 est dépourvu de toute isolation thermique. REVEDICATIONS 1.- Appareil de congélation de produits biologiques conditionnés en paillettes (19), du type cacprenant une enceinte (1) 5 thenniquement isolée destinée à contenir un bain (20) de liquide cryogénique, caractérisé en ce que l'enceinte contient un caisson (3) de forre aplatie muni d'une isolation thermique (4) noins performante que celle (2) de l'enceinte (1) et comportant d'une part des moyens (17) de support de paillettes dans un plan horizontal, et d'autre part des moyens 10 (8) de chauffage de la paroi inférieure (7) et/ou du couvercle (6) du caisson. 2. - Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens de support (17) sont thermnniquement isolants et sont adaptés pour porter toutes les paillettes (19) dans un plan horizontal 15 unique. 3.- Appareil suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le caisson (3) est porté par un support (13) permenttant son positionnement à plusieurs hauteurs différentes dans l'enceinte (1). 4.- Appareil suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la ou chaque paroi (6,7) du caisson (3) pourvue de moyens de chauffage (8) camprend des moyens de diffusion de la chaleur dans son plan. 5.- Appareil suivant la revendication 4, caractérisé en ce que 25 le caisson (3) camprend des parois en métal de forte épaisseur. 6.- Appareil suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le couvercle (6) du caisson (3) est dépourvu d'isolation thermique et est équipé de moyens de chauffage. 7.- Appareil suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, 30 caractérisé en ce que les moyens de chauffage (8) sont constitués par une résistance électrique plane collée sur la face externe de la paroi associée (6,7). 8.- Appareil suivant la revendication 2, caractérisé en ce que les paillettes (19) sont disposées entre deux plaques horizontales 35 (22,24) inmédiatement adjacentes aux paillettes, prévues à l'intérieur du caisson (3). 9.- Appareil suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'une au moins des plaques (22,24) est en contact avec les paillettes (19). 10.- Appareil suivant l'une des revendications 8 et 9, 5 caractérisé en ce que la plaque supérieure (24) présente une fenêtre (26) perpendiculaire à la direction longitudinale des paillettes (19). 11.- Appareil suivant l'une quelconque des revendications 8 à , caractérisé en ce que la plaque inférieure (22) est solidaire du caisson (3) tandis que la plaque supérieure (24) est portée par le 10 couvercle (6) du caisson par l'interédiaire d'un support thermiquement isolant (25) cédant élastiquement.