Brevet FR2610477A1 — publié le 19880812

Souche de Bacillus subtilis et prévention de la contamination par l'aflatoxine dans Les céréales et les noix. La présente invention concerne la prévention microbiologique de La contamination par l'aflatoxine dans Les céréales et les noix, en particulier certaines souches de BaciLLus subtilis capables d'inhiber la croissance des champignons qui produisent L'afLatoxine, désignés ci-après sous Le nom de "champignons produisant de l'aflatoxine", et en outre de supprimer la production d'aflatoxine par ceux-ci. L'invention concerne plus particulièrement les souches Bacillus subtilis NK-330 et NK-C-3 et Leurs mutants. L'aflatoxine est un des cancérigènes les plus puissants parmi ceux connus jusqu'à présent. L'aflatoxine est un métabolite secrété par les champignons produisant de l'aflatoxine tels qu'Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus et l'on connaît également plusieurs homologues de celle-ci, parmi lesquels l'aflatoxine B1 et l'aflatoxine G1. Parmi les céréales alimentaires telles que le blé, l'orge, le riz, le mais etc., et les noix alimentaires telles que noisettes, amandes, noix du Brésil, arachides etc., on a trouvé des cas de contamination par l'aflatoxine (cf. Am. Assoc. CereaL Chemists Inc., 595(1974); Am. Assoc. Cereal Chemists Inc., 603(1975); JAOCS, 980A, December (1981); J. Agric. Food Chem. 26, 249 (1978); Dtsch Lebensm. Rudsch., 76 47(1980); Lebensm. -Wiss. u.- TechnoL., 14 252(1981), et on suppose que des champignons produisant de l'aflatoxine se sont répandus autour des régions o ces plantes sont cultivées et ont produit. Comme ces céréales et ces noix contaminées par L'aflatoxine posent un sérieux problème sanitaire, un grand nombre de pays réglementent strictement L'importation des céréales,et des noix contaminées et leur interdisent de pénétrer dans leurs territoires. Lorsque Les céréales et noix sont cultivées dans un champ infecté par les champignons produisant de l'aflatoxine, la probabilité que les céréales et noix obtenues soient également contaminées par l'aflatoxine est très élévée. En particulier, dans les zones tropicales et subtropicales, un grand nombre de champs se sont révélés infectés et contaminés par ces champignons produisant de l'aflatoxine. La prévention de la contamination par l'aflatoxine des céréales et noix, et la fourniture de céréales et de noix exemptes de cette aflatoxine cancérigène est une mesure urgente. Il est connu que l'aflatoxine peut être éliminée dans le sol (cf. Soil Sci. Soc. Am. J., 44, 1237 (1980)), et l'on suppose que la cause en est l'absorption de l'aflatoxine sur le sol et la participation de certains microbes à l'élimination de l'aflatoxine. En outre, il a été signalé que de nombreux microbes peuvent réduire en laboratoire la quantité d'aflatoxine présente dans une solution aqueuse d'essai dans laquelle est dissoute l'aflatoxine (cf. J. Bact., 93, 464 (1967; J. gen. Microbiol., 54, 185 (1968); Naturwissenschaften, 62, 537 (1975); Proc. Japan. Assoc. Mycotoxicol., 12, 33 (1980". Parmi ces microbes, Flavobacterium aurantiacum, Bacillus megaterium, Corynebacterium rubrum, Penicillium islandicum, Stachybotrys lobulata, Cunninghamella echinulata Streptococcus lactis etc. ont été signalés jusqu'à présent comme des microbes éliminant modérément l'aflatoxine dans la solution d'essai. Cependant, un grand nombre des réductions de l'aflatoxine par les microbes mentionnés ci-dessus sont dues à l'absorption de l'aflatoxine sur les parois cellulaires des microbes (cf. J. gen. Microbiol., 54, 185 (1968); J. Bacteriol., 93, 464 (1967)) et en outre l'élimination de l'aflatoxine a eu lieu dans une solution d'essai expérimentale la contenant. Si l'on se réfère à ces publications, l'élimination de l'aflatoxine des céréales et des noix poussant dans les champs et la prévention de la contamination par l'aflatoxine de ces céréales et de ces noix n'ont pas encore été effectivement réalisées en utilisant les microbes précités. En outre, l'élimination de l'aflatoxine des céréales et noix produites peut exiger une grande quantité de microbes, ce qui ne convient pas pour des substances alimentaires. De plus, il est difficile d'éliminer complètement l'aflatoxine qui est présente au coeur des céréales et des noix. Par ailleurs, on ne sait pas si ces microbes sont inoffensifs ou non pour l'homme lorsqu'ils sont appliqués aux substances alimentaires. Ils peuvent éventuellement comprendre des microbes causant des problèmes hygiéniques tels que la pathogénicité. De plus, il peut y avoir une espèce telle que Streptococcus lactis qui a des exigences nutritionnelles particulières, et par conséquent ne convient pas pour le traitement des céréales et des noix alimentaires. La demanderesse a étudié des microorganismes présents dans le sol dans diverses régions pour mettre au point un procédé de prévention de la contamination des céréales et des noix par l'aflatoxine en utilisant un microbe qui est sûr et inoffensif pour l'homme même lorsqu'il est appliqué aux substances alimentaires, et en conséquence elle a trouvé des souches appartenant à Bacillus subtilis, qui ont eu jusqu'à présent des rapports étroits avec le domaine de L'industrie aLimentaire, LesqueLLes souches peuvent réduire La quantité d'aflatoxine dans La soLution aqueuse et inhiber à La fois La croissance des champignons produisant de L'afLatoxine et Leur production d'aflatoxine. D'autre part, R. Mann et coLL. (Z. Lebensm. Unters. -Forsch., 163j, 39 (1977))indiquent qu'iL existe des souches capables d'éliminer L'afLatoxine parmi B. subtiLis (ATCC 6633 et ATCC 9372). R. Mann et coLL. indiquent en outre que 40 à 50% de L'afLatoxine ont disparu dans une soLution d'aflatoxine pendant jours. Cependant, à un teL degré de réduction, on ne peut pas s'attendre à une élimination substantielte de L'afLatoxine des céréaLes et des noix poussant dans Les champs. D. T. WickLow et coLL. (PhytopathoLogy, , 761 (1980) indiquent qu'AspergiLLus fLavus peut voir sa prolifération et son activité de production d'aflatoxine inhibées en présence simultanément d'AspergiLLus niger ou de Trichoderma viride. Mais Les microorganismes de La présente invention sont des bactéries non des moisissures comme dans L'articLe de D.T. WickLow et colL. La présente invention fournit des souches bactériennes de BaciLLus subtiLis qui peuvent inhiber la prolifération des champignons produisant de L'afLatoxine, en supprimant La production d'afLatoxine par Les mêmes champignons, et réduire La quantité d'aflatoxine. Dans Les modes de réalisation préférés de L'invention, ces souches sont désignées par NK-330 et NK-C-3 et Leurs mutants. En outre, L'invention fournit un procédé pour éviter La contamination par L'afLatoxine des céréales et noix en Leur appliquant Les souches de B. subtiLis mentionnées ci-dessus. 2610 4 7 7 Les souches de Bacillus subtilis, NK-330 et NK-C-3 qui inhibent le développement des champignons produisant de l'aflatoxine et suppriment la production d'aflatoxine par les champignons ont été découvertes au cours ou à la fin d'une sélection d'échantillons de sol. Leurs caractéristiques microbiennes sont énumérées ci-dessous. Caractéristique Souche NK-330 Souche NK-C-3 (1) Forme et taille bâtonnet bâtonnet des cellules 0,4-0,6pxl,8-2,2p O,4-O,6jx1,8-2,2p (2) Polymorphisme des aucun aucun ceLlules (3) Motilité positive positive (4) flagellation péritriche péritriche (5) Spore 0,8-1,8p 0,8-1,8J (6) Position des spores centrale centrale (7) Coloration Gram positive positive (8) Coloration résistant négative négative aux acides (9) Colonie sur plaque cercle un peu cercle un peu de bouillon gélose irrégulier blanc irrégulier laiton à incolore extrêmement ptle (10) Réduction du nitrapositive positive te (11) Test VP positif positif (12) Hydrolyse de l'amipositive positive don (13) Utilisation de positive positive l'acide citrique (14) Oxydase négative positive (15) Catalase positive positive (16) Développement en positive positive milieu aérobie (17) Développement en négatif négatif milieu anaérobie (18) Développement positif positif à pH 5,7 (19) Développement dans positif positif NaCl à 7X (20) Test OF O(oxydant) O(oxydant) (21) Formation d'acide (21-1) D- glucose positive positive t21-2) L-arabinose positive positive 21-3) D- mannitol positive positive (21-4) D-xylose positive positive Z610477 Sur la base des caractéristiques microbiennes ci-dessus, les deux souches de la présente invention sont identifiées comme étant Bacillus subtilis en se référant à l'ouvrage de Bergy Manual of determinative Bacteriology, 8th and Manual for the Identification of Medical Bacteriology (Cowan & Steel), 2è éd. Elles ont été déposées au Fermentation Research Institute, Tsukuba, Ibaraki au Japon, avec les numéros d'inscription FERM P-9162 (date du dépôt: 30janvier 1987) et FERM P-9404 (date de dépôt: 6 juin 1987), respectivement, qui ont été ensuite transformés le 27 novembre 1987 en les numéros d'inscription FERM BP-1580 et FERM BP-1581, respectivement, aux termes du Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt de Microorganismes en vue de la Procédure des Brevets. B. subtilis NK-330 (FERM BP-1580) est différent de B. subtilis NK-C-3 (FERM BP-1581) par la couleur de la colonie sur le milieu de bouillon gélose et dans la réaction avec l'oxydase. Les activités inhibitrices de ces deux souches NK-330 et NK-C-3 sur les champignons produisant de l'aflatoxine sont confirmées en les passant sur un milieu pomme de terre, dextrose, gélose. Chacune des souches ci-dessus peut inhiber efficacement la germination de spores des champignons produisant de l'aflatoxine (A. flavus NRRL 3357 et A. parasiticus NRRL 29999) sur le milieu pomme de terre, dextrose, gélose additionné d'une culture liquide de ces souches comme il est indiqué dans les exemples 1 à 4 décrits ci-dessous. D'autre part, après inoculation des souches conformes à l'invention, dans un milieu de culture de bouillon nutritif additionné d'aflatoxine B1 suivie d'une incubation à 30 C pendant une semaine, les 261047? souches éliminent environ 85% de l'aflatoxine B1, comme il est indiqué dans Les exemples 5 et 6 décrits ci-dessous. Ce résultat est très supérieur à celui de R. Mann et coLl., d'après lequel B. subtilis ATCC 6633 et ATCC 9372 n'ont éliminé qu'environ 40 à 50% de l'aflatoxine initiale après incubation pendant 3 semaines. En outre, les souches de B. subtilis de l'invention peuvent inhiber remarquablement la germination de spores des champignons produisant de l'aflatoxine lorsqu'ils sont inoculés à l'arachide et au mais stérilisésen même temps que les champignons produisant de l'aflatoxine, comme il est indiqué dans les exemples 7 à 12. Une telle activité inhibitrice ne se trouve dans aucune autre souche telle que B. subtilis IAM 1026, comme il est indiqué dans les exemples comparatifs 12, 14, 16, 18, 20 et 22 décrits ci-dessous. En outre, chacune des souches NK-330 et NK-C-3 possède une activité d'inhibition de la production de l'aflatoxine par les champignons produisant de l'aflatoxine dans le sol, et en conséquence une activité de prévention de la contamination de l'arachide enfouie dans le sol par l'aflatoxine, comme il est indiqué dans les exemples 13 à 16 décrits ci-dessous. Conformément à la présente invention, la lutte contre la contamination par l'aflatoxine des céréales et noix peut être effectuée en les traitant avant ou après la récolte par les souches de B. subtilis de l'invention. Par exemple, en pulvérisant sur le champ dans lequel les céréales et noix sont cultivées et en pénétrant dans celui-ci, leur protection contre la contamination par l'aflatoxine est réalisable d'une manière simple, et il est possible SR 4189 JP MDT d'inhiber la prolifération des champignons produisant de l'aflatoxine au moment du séchage des récoltes et d'éviter la contamination par l'aflatoxine. Dans la présente invention, une culture liquide de souches de B. subtilis avec ou sans séparation des corps bactériens est également active pour inhiber la croissance des champignons produisant de l'aflatoxine et pour supprimer la production de l'aflatoxine par les champignons. En conséquence, dans la présente invention, l'application de souches de B. subtilis sur des céréales et des noix désigne les applications non seulement des corps bactériens en eux-mêmes, mais également de la culture liquide des souches de B.subtilis de l'invention. La présente invention sera décrite plus en détail en se référant aux exemples et exemples comparatifs ci-dessous. Activité d'inhibition de la germination de spores d'Aspergillus parasiticus NRRL 2999. Exemplel. Dans 1OOml d'un milieu liquide pomme de terre, dextrose, on inocule une anse d'une souche NK-330 de Bacillus subtilis, FERM BP-1580, et on la fait incuber sur un agitateur rotatif à une température de 30 C pendant 2 jours. On sépare les bactéries ainsi incubées par centrifugation sous 8000g. Dans la culture liquide restante,on ajoute une gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l, puis on la stérilise en autoclave à 121 C pour préparer un milieu de culture en boite. On étale des spores Aspergillus parasiticus souche NRRL 2999 sur la culture en boite ci-dessus et on les cultive pendant 9 jours à 25 C. On détermine le nombre de spores ayant germé et la taille de la colonie et ceci figure dans le tableau 1 ci-dessous. A titre de comparaison, on étale les mêmes spores sur un milieu de culture en boîte préparé en ajoutant la gélose au dextrose pomme de terre pulvérulente dans La même quantité au milieu de culture Liquide pomme de terre dextrose dans lequel la souche NK-330 n'a pas été cultivée (exemple comparatif 1). En outre, on prépare un milieu de culture en boîte en utilisant de L'eau à la place du milieu liquide pomme de terre dextrose et en y ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l comme dans l'exemple 1, et on étale par dessus les spores d'A. parasiticus NRRL 2999 après quoi on les cultive. (Exemple comparatif 2). Tableau 1 Nombre de Taille de spores ayant la colonie germé Exemple 1 39 1-2mm Exemple comparatif 1 140 6-10mm Exemple comparatif 2 160 5-12mm Dans l'exemple 1 dans lequel la souche NK-330 de B. subtilis a été préalablement cultivée dans Le milieu de culture, la germination des spores des champignons produisant de l'aflatoxine est extrêmement faibLe par comparaison avec les exemples comparatifs 1 et 2 dans lesquels on n'a pas mis à incuber la souche NK-330 de B. subtilis, et en outre SR 4189 JP MDT La taille de la colonie de l'exemple 1 était plus faible que celles des exemptes comparatifs 1 et 2. C'est-à-dire que la germination des spores dans l'exemple 1 a été réduite de 72,1% par comparaison avec l'exemple comparatif 1 et de 75,6% par comparaison avec l'exemple comparatif 2 en ce qui concerne le nombre de spores ayant germé. Exemple 2. Dans 10OmL d'un milieu liquide à La pomme de terre dextrose, on inocule une anse d'une souche NK-C-3 de Bacillus subtilis, FERM BP-1581 et on la fait incuber sur un agitateur rotatif à une température de 30 C pendant 2 jours. On sépare les bactéries ainsi incubées par centrifugation sous 8000g. Dans la culture liquide restante, on ajoute une gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l, puis on la stérilise en autoclave à 121 C pour préparer un milieu de culture en boite. On étale des pores d'Aspergillus parasiticus souche NRRL 2999 sur la culture en boîte ci-dessus et on les cultive pendant 9 jours à 25 C. On détermine le nombre de spores ayant germé et la taille de la colonie, et ceci figure dans le tableau 2 ci-dessous. A titre de comparaison, on étale les mêmes spores sur un milieu de culture en boite préparé en ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente dans la même quantité au milieu de culture liquide à la pomme de terre dextrose dans lequel la souche NK-C-3 n'a pas été cultivée (exemple comparatif 3). En outre, on prépare un milieu de culture en boite en utilisant de l'eau à la place du milieu liquide pomme de terre dextrose et en y ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l comme dans l'exemple 2, et on étale les spores d'A. parasiticus NRRL 2999 sur celui-ci, après quoi on les cultive. (Exemple comparatif 4). Tableau 2 Nombre de Taille de spores ayant la colonie germé Exemple 2 15 1-2mm Exemple comparatif 3 50 6-10mm Exemple comparatif 4 53 5-12mm Dans L'exemple 2, dans lequel la souche NK-C-3 de B. subtilis a été préalablement cultivée dans le milieu de culture, la germination des spores des champignons produisant de l'aflatoxine est extrêmement faible par comparaison avec les exemples comparatifs 3 et 4 dans lesquels la souche NK-C-3 de B. subtilis n'a pas été mise à incuber, et en outre, la taille de la colonie de l'exemple 2 était plus faible que celles des exemples comparatifs 3 et 4. C'est-à-dire que la germination des spores dans L'exemple 2 était réduite de 70,0% par comparaison avec L'exemple comparatif 3 et de 71,7% par comparaison avec L'exemple comparatif 4 en ce qui concerne le nombre de spores ayant germé. Activité d'inhibition de la germination des spores d'Aspergittus flavus NRRL 3357. Exempte 3. Dans un milieu liquide pomme de terre dextrose, on inocule une anse d'une souche NK-330 de Bacillus subtilis, FERM BP-1580, et on fait incuber dans un agitateur rotatif à une température de 30 C pendant 2 jours. On sépare les bactéries ainsi incubées par centrifugation sous 8000g. Dans la culture liquide restante, on ajoute une gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/1L, puis on stérilise en autoclave à 121 C pour préparer un milieu de culture en boite. On étale des pores d'Aspergillus flavus souche NRRL 3357 sur la culture en boite ci-dessus et on les cultive pendant 9 jours à 25 C. On détermine le nombre de spores ayant germé et la taille de la colonie et ceci figure dans le tableau 3, ci-dessous. A titre de comparaison, on étale les mêmes spores sur un milieu de culture en boite préparé en ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente dans la même proportion au milieu de culture liquide pomme de terre dextrose dans lequel la souche NK-330 n'a pas été cultivée (exemple comparatif 5). En outre, on prépare un milieu de culture en boite en utilisant de l'eau à la place du milieu liquide pomme de terre dextrose et en lui ajoutant de la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l comme dans l'exemple 3, et on étale les spores d'A.flavus NRRL 3357 sur celui-ci après quoi on les cultive. (Exemple comparatif 6). t Tableau 3 Nombre de Taille de spores ayant la colonie germé Exemple 3 56 1-2mm ExempLe comparatif 5 260 5-7mm Exemple comparatif 6 230 5-9mm Dans l'exemple 3, dans lequel la souche NK-330 de B. subtilis a été préalablement cultivée dans le milieu de culture, la germination des spores des champignons produisant de l'aflatoxine était extrêmement faible par comparaison avec les exemples comparatifs 5 et 6, dans lesquels la souche NK-330 de B. subtilis n'avait pas été mise à incuber, et en outre, la taille de la colonie de l'exemple 3 était plus faible que celles des exemples comparatifs et 6. C'est-à-dire que la germination des spores dans l'exemple 3 a été réduite de 78,5% par comparaison avec l'exemple comparatif 5,et de 75,7%par comparaison avec l'exempLe comparatif 6 en ce qui concerne le nombre de spores ayant germé. Exempte 4. Dans lOOm de milieu Liquide pomme de terre dextrose, on inocule une anse d'une souche NK-C-3 de BaciLLus subtilis, -FERM BP-1581, et on fait incuber sur un agitateur rotatif à une température de 30 C pendant 2 jours. On sépare les bactéries ainsi incubées par centrifugation sous 8000g. Dans la culture liquide restante, on ajoute une gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l, puis on stérilise en autoclave à 121 C pour préparer un milieu de culture en boite. On étale des spores d'Aspergillus flavus souche NRRL 3357 sur la culture en boite ci-dessus et on les cultive pendant 9 jours à 25 C. On détermine le nombre de spores ayant germé et la taille de la colonie et ceci figure dans le tableau 4 ci-dessous. A titre de comparaison, on étale sur un milieu de culture en boite préparé en ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente dans la même quantité au milieu de culture liquide pomme de terre dextrose dans lequel la souche NK-C-3 n'a pas été cultivée (exemple comparatif 7). En outre, on prépare un milieu de culture en boîte en utilisant de l'eau à la place du milieu liquide pomme de terre dextrose et en lui ajoutant la gélose à la pomme de terre dextrose pulvérulente à raison de 39,6g/l comme dans l'exemple 4, et on étale les spores d'A. flavus NRRL 3357 sur celle-ci, après quoi on les cultive (exemple comparatif 8). Tableau 4 Nombre de Taille de spores ayant la colonie germé Exemple 4 29 1-2mm Exemple comparatif 7 150 5-7mm Exemple comparatif 8 163 5-9mm Dans l'exemple 4, dans lequel la souche NK-C-3 de B- subtilis a été préalablement cultivée dans le milieu de culture, la germination des spores des champignons produisant de l'aflatoxine était extrêmement faible par comparaison avec les exemples comparatifs 7 et 8 dans Lesquels la souche NK-C-3 de B. subtilis n'a pas été mise à incuber et en outre la taille de la colonie de L'exemple 4 était plus faible que celles des exemples comparatifs 7 et 8. C'est-à-dire que la germination des spores dans l'exemple 4 était réduite de 80,7% par comparaison avec l'exemple comparatif 7 et de 82,2% par comparaison avec l'exemple comparatif 8 en ce qui concerne le nombre de spores ayant germé. Activité de réduction de L'aflatoxine en solution aqueuse. Exempte 5. Dans 5ml d'un milieu de culture de bouillon nutritif, on ajoute environ 30pg d'aflatoxine B1 dissoute dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), après quoi, on inocule environ 106 cellules de Bacillus subtilis souche NK-330. On détermine la quantité d'aflatoxine B1 dans le milieu de culture aqueux avant et après l'incubation en agitant à 30 C pendant 7 jours. Les résultats sont donnés dans le tableau 5. Dans l'exempte comparatif 9, la quantité d'aflatoxine B1 a été déterminée de la même manière que dans l'exemple 5, mais en utilisant un milieu de culture exempt de B. subtilis NK-330. Tableau 5 Quantité d'aflatoxine B1 (ppm) Jours 0 7 Exemple 5 4,7 0,3 1 0 Exemple comparatif 9 4,7 2,0 Comme le montre le tableau 5, la quantité d'aflatoxine B1 dans le milieu de culture après l'incubation pendant 7 jours comme dans l'exemple était fortement réduite, de 85% par comparaison avec l'exemple comparatif 9 au 7è jour (réduction de 93,6% par comparaison avec le jour 0), ce qui signifie que l'activité de réduction de l'aflatoxine dans la solution aqueuse de B. subtilis souche NK-330 est très élevée. ExemptLe 6. Dans 5ml d'un milieu de culture de bouillon nutritif, on ajoute environ 30pg d'aflatoxine B1 dissoute dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), après quoi on inocule environ 106 cellules de Bacillus subtiLis souche NK- C-3. La quantité de l'aflatoxine B1 présente dans le milieu de culture aqueux est déterminé avant et après l'incubation en agitant à 30 C pendant 7 jours. Les résultats sont donnés dans le tableau 6. Dans l'exemple comparatif 10, la quantité de l'aflatoxine B1 était déterminée de la même manière que dans l'exemple 6, mais en utilisant un milieu de culture exempt de B. subtilis NK-C-3. TabLeau 6 Quantité d'aflatoxine B1 Jours 0 7 Exemple 6 4,7 0,36 Exemple comparatif 10 4,7 3,0 Comme le montre le tableau 6, la quantité de l'aflatoxine B1 présente dans le milieu de culture après incubation pendant 7 jours dans l'exemple 6 était fortement réduite, de 88% par comparaison avec l'exemple comparatif 10 au 7è jour (réduction de 92,3% par comparaison avec le jour 0), ce qui signifie que l'activité de réduction de l'aflatoxine dans la solution aqueuse de B. subtilis souche NK-C-3 est très éLevée. Activité d'inhibition de La production d'aflatoxine par Aspergillus fLavus NRRL 3357 dans L'arachide. Exemple 7. On plonge de petits grains d'arachide, variété Natalcommon, récoltés en 1985 en Afrique du Sud, dans de l'eau pendant 2h environ (taux d'absorption d'eau: environ 50%), puis on introduit dans un Erlenmeyer 15g des arachides trempées, après quoi on stérilise à 121 C pendant 15 min en autoclave. On inocule la souche NK-330 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, à l'arachide stérilisée, en même temps que la souche NRRL3357 d'Aspergillus flavus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En incubant à 25 C, on détermine en fonction du temps la quantité d'aflatoxine B1 (tableau 7) dans l'arachide, et l'on trouve que dans l'arachide à laquelle on a ajouté B.subtilis NK-330, la production d'aflatoxine B1 est remarquablement réduite par comparaison avec celle de l'exemple comparatif 11. C'est-à-dire que la souche NK-330 inhibe efficacement la production de l'aflatoxine B1. Par ailleurs, on a déterminé dans l'exemple comparatif 11 la quantité d'aflatoxine B1 alors que B. subtilis NK-330 n'était pas inoculée mais que seule A. flavus NRRL 3357 était inoculé. Dans l'exemple comparatif 12, la souche B. subtilis NK-330 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibée la production de l'aflatoxine B1. TabLeau 7 Quantité d'aflatoxine B1 (ppm) Jours 3 5 7 Ex. 7 N.D.* 2,1 2,1 5,5 Ex. comp. 11 5,0 55,0 34,9 25,3 Ex. comp. 12 1,6 44,8 62,0 24,3 *N.D. signifie que l'aflatoxine n'a pas été détectée. Exemple 8. On plonge dans de l'eau de petits grains d'arachide, variété Natalcommon, récoltés en 1985 en Afrique du Sud, pendant environ 2 heures (taux d'absorption d'eau: environ 50%), puis on introduit g des arachides trempées dans un erlenmeyer, après quoi on stérilise à 121 C pendant 15 min dans un autoclave. On inocule la souche NK-C-3 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, à l'arachide stérilisée en même temps que la souche NRRL 3357 d'Aspergillus flavus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En incubant à 25 C, on détermine la quantité d'aflatoxine B1 (tableau 8) en fonction du temps, et on trouve que dans l'arachide à laquelle B. subtilis NK-C-3 a été ajouté, la production d'aflatoxine B1 est remarquablement réduite par comparaison avec celles de l'exemple comparatif 13. C'est-à-dire que la souche NK-C-3 a inhibé efficacement la production d'aflatoxine B1. Par ailleurs, l'exemple comparatif 13 a déterminé la quantité d'aflatoxine B1 alors que l'on n'avait pas inoculé B.subtilis NK-C-3 mais que seul A. flavus NRRL 3357 avait été inoculé. Dans l'exemple comparatif 14, la souche B. subtilis NK-C-3 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibé la production de l'aflatoxine B1. Tableau 8 Quantité d'aflatoxine B1 (ppm) - Jours 3 5 7 9 Ex. 8 N.D.* N.D.* N.D.* N. D.* E x.D. Ex. comp. 13 6,0 70,0 42,7 30,1 Ex. comp. 14 1,2 43,5 58,3 27,4 N.D.* signifie que l'aflatoxine n'a pas été détectée. Activité d'inhibition de la production de l'aflatoxine par Aspergillus parasiticus NRRL 2999 dans L'arachide. Exemple 9. On plonge de petits grains d'arachide, variété Natalcommon, récoltés en 1985 en Afrique du Sud, dans de l'eau pendant environ 2 heures (taux d'absorption d'eau: environ 50%), puis on introduit g de l'arachide trempée dans un Erlenmeyer après quoi on stérilise à 121 C pendant 15 min dans un autoclave. On inocule la souche NK-330 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, à l'arachide stérilisée en même temps que la souche NRRL 2999 d'Aspergillus parasiticus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En faisant incuber à 25 C, on détermine en fonction du temps les quantités d'aflatoxine B1 (tableau 9) et d'aflatoxine G1 (tableau 10) dans l'arachide, respectivement, et l'on trouve que dans l'arachide à laquelle B. subtilis NK-330 a été ajouté, la production à la fois d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1 a été remarquablement réduite par comparaison avec celles de l'exemple comparatif 15. C'est-à-dire que la souche NK-330 a efficacement inhibé la production de l'aflatoxine B1 et de l'aflatoxine G1. Par ailleurs, l'exemple comparatif 15 a déterminé La quantité d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1, alors que B. subtilis NK-330 n'était pas inoculé, mais que seul A. parasiticus NRRL 2999 était inoculé. Dans l'exemple comparatif 16, la souche de B.subtilis NK-330 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibé la production d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1. Tableau 9 Tableau 10 Quantité d'aftatoxine iB1 Quantité d'aflatoxine G1 (ppm) (ppm) Jours 3 5 7 9 Jours 3 5 7 9 Ex. 9 N.D.* 0,4 1,3 0,9 Ex. 9 N.D. * 0,3 2,6 1,8 Ex. comp. Ex. comp. 1,5 22,5 62,0 44,0 15 1,6 44,8 145,0 60,0 Ex. comp. Ex. comp. 16 3,0 31,1 90,0 52,2 16 4,5 71,0 252,0 76,9 *N.D. signifie que L'aflatoxine n'a pas été détectée. Exempte 10. On plonge de petits grains d'arachide, variété Natalcommon, récoltés en 1985 en Afrique du Sud, dans de l'eau pendant environ 2 heures (taux d'absorption d'eau: environ 50%), puis on introduit g de l'arachide trempée dans un Erlenmeyer, après quoi on stérilise à 121 C pendant 15 min dans un autoclave. On inocule la souche NK-C-3 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, à l'arachide stérilisée en même temps que la souche NRRL 2999 d'Aspergillus parasiticus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En faisant incuber à 25 C, on détermine en fonction du temps la quantité d'aflatoxine B1 (tableau 11) et d'aflatoxine G1 (tableau 12) dans l'arachide, respectivement, et l'on trouve que dans l'arachide à laquelle on a ajouté B. subtilis NK-C-3, la production à la fois d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1 est remarquablement réduite par comparaison avec celles de l'exemple comparatif 17. C'est-à-dire que la souche NK-C-3 a inhibé efficacement la production d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1. Par ailleurs, l'exemple comparatif 17 a déterminé la quantité d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1, alors que B. subtilis NK-C-3 n'avait pas été inoculé, mais que seul A. parasiticus NRRL 2999 avait été inoculé. Dans l'exemple comparatif 18, la souche B. subtilis NK-C-3 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibé la production d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1. Tabteau 11i Tableau 12 Quantité d'aflatoxine B1 Quantité d'aftatoxine 6G (pp.) Jours 3 5 7 9 Jours 3 5 7 9 Ex. 10 N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* Ex. 10 N. D.* N.D.* N.D.* N.D.' Ex. comp. Ex. comp. 11.7 5,0 54,0 34,2 25,1 17 7,3 127,0 84,0 57,6 Ex. comp. Ex. comp. 18 3,0 31,1 90,0 52,2 18 2,3 86,4 92,5 68,9 *N.D signifie que L'afLatoxine n'a pas été déectée. Activité d'inhibition de La production de L'aftatoxine par AsperqilLus fLavus NRRL 3357 dans Le mais. ExempLe 11. A 15g de grains de mais stérilisé de la même manière que dans l'exemple 7, on inocule la souche NK-C-3 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, en même temps que la souche NRRL 3357 d'Aspergillus flavus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En faisant incuber à 25 C, on détermine en fonction du temps la quantité d'aflatoxine B1 (tableau 13) dans le mais, et l'on trouve que dans le mais auquel on a ajouté B. subtilis NK-C-3,la production d'aflatoxine B1 est remarquablement réduite par comparaison avec celle de l'exemple comparatif 19. C'est-à-dire que la souche NK-C-3 a inhibé efficacement la production de l'aflatoxine B1 par A. flavus NRRL 3357 dans le mais. Par ailleurs, l'exemple comparatif 19 a déterminé la quantité d'aflatoxine B1 alors que B. subtilis NK-C-3 n'avait pas été inoculé, mais que seul A. Flavus NRRL 3357 avait été inoculé. Dans l'exemple comparatif 20, la souche B. subtilis NK-C-3 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibé la production d'aflatoxine B1. Tableau 13 Quantité d'afLatoxine B1 (ppm) Jours 3 5 7 9 Ex. 11 N.D.* t.r. ** N.D.* N.D.* Ex. com. 19 4,8 63,9 43,8 37,6 Ex. comp. 20 1,0 45,8 51,7 32,2 *N.D. signifie que l'aflatoxine n'a pas été détectée **t.r. signifie que l'on n'en a détecté que des traces. Activité d'inhibition de la production d'aflatoxine par Aspergillttus parasiticus NRRL 2999 dans le mais. Exemple 12. A 15g de grains de mals stérilisé de la même manière que dans l'exemple 7, on inocule la souche NK-C-3 de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par Erlenmeyer, en même temps que la souche NRRL 2999 d'Aspergillus parasiticus, environ 20 spores par Erlenmeyer. En faisant incuber à 25 C, on détermine en fonction du temps les quantités respectives d'aflatoxine B1 (tableau 14) et d'aflatoxine G1 (tableau 15) dans Le mais, et L'on trouve que dans Le mais auquel on a ajouté B. subtilis NK-C-3, la production à la fois d'aflatoxine B1 et d'afLatoxine G1 est remarquablement réduite par comparaison avec celles de l'exemple comparatif 21. C'est-à-dire que la souche NK-C-3 a inhibé efficacement la production de l'aflatoxine B1 et de L'aflatoxine G1 par A. parasiticus NRRL 2999 dans le mais. Par ailleurs, l'exemple comparatif 21 a déterminé la quantité d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1 alors que B. subtilis NK-C-3 n'avait pas été inoculé, mais que seul A. parasiticus NRRL 2999 avait été inoculé. Dans l'exemple comparatif 22, la souche B. subtilis NK-C-3 a été remplacée par la souche B. subtilis IAM 1026. Bien que la souche IAM 1026 appartienne à B. subtilis, elle n'a pas inhibé la production d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1. TabLeau 14 Tableau 15 Quantité d'aftatoxine B1 Quantité d'aflatoxine G61 (ppa) (ppm) Jours 3 5 7 9 Jours 3 5 7 9 Ex. 12 N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* Ex. 12 N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* Ex. comp. Ex. comp. 21 3,1 67,4 38,7 30,0 21 8,7 110,3 90,6 50,7 Ex. comp. Ex. comp. 3 22 1,7 43,9 59,2 41,3 22 5,6 39,3 78,9 62,4 *N.D signifie que L'aftatoxine n'a pas été détectée. Activité d'inhibition de La production d'afLatoxine par AspergiLLus fLavus NRRL 3357 dans L'arachide enfouie dans Le sot. Exempte 13. On introduit environ 25g d'une terre de culture du commerce dans un Erlenmeyer de 500 ml, et on la stérilise en autoclave à 121 C pendant une heure. Puis on lui inocule la souche Aspergillus flavus NRRL 3357, environ 20 spores par Erlenmeyer, ainsi que la souche Bacillus subtilis NK-330, environ cellules par Erlenmeyer. On ajoute ensuite 15g d'arachide stérilisée de l'exemple 7 qui a été récoltée en Afrique du Sud, et on les enfouis dans la terre de culture. L'incubation s'effectue à 25 C. La quantité d'aflatoxine accumulée dans l'arachide est déterminée et les résultats sont donnés dans le tableau 16. Comme le montre le tableau 16, la production de l'aflatoxine dans l'exemple 13 est remarquablement inhibée par comparaison avec l'exemple comparatif * 23 dans lequel la souche NK-330 n'a pas été inoculée. Tableau 16 Quantité d'aflatoxine (ppm) Aflatoxine B1 Jours 5 7 Ex. 13 3,0 4,5 Ex. comparatif 23 28,0 30,3 ExempDe 14. On introduit dans un Erlenmeyer de 500mL environ 25g d'une terre de culture du commerce et on la stérilise en autoclave à 121 C pendant une heure. Puis on lui inocule la souche Aspergillus flavus NRRL 3357, environ 20 spores par Erlenmeyer, ainsi que la souche Bacillus subtilis NK-C-3, environ celluLes par Erlenmeyer. On lui ajoute ensuite g de l'arachide stérilisée de l'exemple 7, qui a été récoltée en Afrique du Sud, et on l'enfouit dans la terre de culture. L'incubation est effectuée à 25 C. La quantité d'aflatoxine accumulée dans l'arachide est déterminée et les résultats sont donnés dans le tableau 17. Comme le montre le tableau 17, la production de l'aflatoxine de l'exemple 14 est remarquablement inhibée par comparaison avec l'exemple comparatif 24 dans lequel la souche NK-C-3 n'a pas été inoculée. Tableau 17 Quantité d'aflatoxine (ppm) Aflatoxine B1 Jours 5 7 Ex. 14 2,6 4,1 Ex. comparatif 24 32,5 39,8 Activité d'inhibition de la production d'aflatoxine par Aspergillus parasiticus NRRL 2999 dans Les arachides enfouies dans le sol. Exemple 15. Dans un Erlenmeyer de 500ml, on introduit environ 25g d'une terre de culture du commerce et on la stérilise en autoclave à 121 C pendant une heure. Puis on lui inocule la souche Aspergillus parasiticus NRRL 2999, environ 20 spores par Erlenmeyer, ainsi que la souche Bacillus subtilis NK-330, environ 200 cellules par Erlenmeyer. On y ajoute ensuite 15g des arachides stérilisées de l'exemple 7, qui ont été récoltées en Afrique du Sud, et on les enfouit dans la terre de culture. L'incubation est effectuée à 25 C. La quantité d'aflatoxine accumulée dans les arachides est déterminée et les résultats sont donnés dans le tableau 18. Comme le montre le tableau 18, la production de l'aflatoxine dans l'exemple 15 a été remarquablement inhibée par comparaison avec l'exemple comparatif dans lequel la souche NK-330 n'a pas été inoculée. Tableau 18 Quantité d'aflatoxine (ppm) Aflatoxine B1 Aflatoxine G1 Jours 5 7 5 7 Exemple 15 2,0 2,2 2,8 3,3 Exemple comparatif 14,0 12,0 25,1 22,3 ExempLe 16. Dans un Erlenmeyer de 500ml, on introduit environ 25g d'une terre de culture du commerce et on la stérilise en autoclave à 121 C pendant une heure. Puis on lui inocule la souche Aspergillus parasiticus NRRL 2999, environ 20 spores par Erlenmeyer, ainsi que la souche Bacillus subtilis NK-C-3, environ 200 cellules par Erlenmeyer. On lui ajoute ensuite 15g des arachides stérilisées de l'exemple 7, qui ont été récoltées en Afrique du Sud, et on les enfouit dans la terre de culture. L'incubation est effectuée à 25 C. La quantité d'aflatoxine accumulée dans les arachides est déterminée et les résultats sont donnés dans le tableau 19. Comme le montre le tableau 19, la production de l'afLatoxine dans l'exemple 16 a été remarquablement inhibée par comparaison avec l'exemple comparatif 26, dans lequel la souche NK-C-3 n'a pas été inoculée. Tableau 19 Quantité d'aflatoxine (ppm) Afatoxine B Aflatoxine GB1 Jours 5 7 5 7 Exemple 16 1,0 1,3 2,0 2,2 Exemple comparatif 26 18,8 11,3 24,5 21,4 Activité inhibitrice du liquide surnageant d'une culture de B. subtilis NK-330 pour la production d'aflatoxine par A. parasiticus NRRL 2999 dans du mais brut non stérilisé. Exemple 17. On inocule 10ml d'un liquide de pré-incubation de Bacillus subtilis NK-330 à un litre de milieu liquide pomme de terre dextrose dans un fermenteur à bocaux. L'incubation de l'inoculant est commencée à pH 6, 7, et maintenue pendant 5 jours à une température de 30 C, avec une aération de 500ml/min et une agitation à 150 tours/min. En soumettant la culture liquide obtenue à une centrifugation sous 1000g, on a séparé les bactéries pour obtenir le liquide surnageant sur la culture. Après avoir concentré le liquide surnageant dans un évaporateur puis l'avoir lyophilisé, on a préparé 10g d'un résidu séché. Le résidu séché du liquide surnageant a été ajouté au mais brut non autoclavé (non stérilisé) à raison de 0,5% en poids, puis on lui a encore ajouté Aspergillus parasiticus NRRL 2999 à raison d'environ spores par Erlenmeyer contenant 10og du mais brut. Ensuite on a fait incuber le mélange à 25 C et on a déterminé la production d'aflatoxine 81 et d'aflatoxine G1 en fonction du temps. Les résultats sont donnés dans les tableaux 20 et 21. A titre de comparaison, on a également effectué un témoin en répétant cet exemple 17 mais alors que la souche NK-330 de B. subtilis n' avait pas été inoculée. Tabl.e à au 20= Tableau 21l Aftatoxine B1AfLatoxine G (parties par miLLiard) (parties par mitiard) Jours 3 5 9 Jours 3 5 9 Ex. 17 7 15 8 Ex. 17 10 22 13 1Témoin 700 900 750 Témoin 600 1800 900 1 0 Activité inhibitrice du liquide surnageant d'une culture de B. subtilis NK-330 pour la production d'aflatoxine par A. flavus NRRL 3357 dans du mais brut non stérilisé. Exemple 18. Un liquide de pré-incubation de Bacillus subtilis NK-330, 10ml, a été inoculé à un litre de milieu liquide pomme de terre dextrose dans un fermenteur à bocaux. L'incubation de l'inoculant a été commencée à pH 6,7 et maintenue pendant 5 jours à une température de 30 C, sous une aération de 500ml/min et avec une agitation de 150 tours/min. En soumettant la culture liquide obtenue à une centrifugation sous 1000g, les bactéries ont été séparées pour obtenir le liquide surnageant sur la culture. Apres avoir concentré le liquide surnageant dans un évaporateur puis l'avoir lyophilisé, on a préparé 10og d'un résidu séché. Le résidu séché du Liquide surnageant a été ajouté au mais brut non autoclavé (non stérilisé) à raison de 0,5% en poids, puis on lui a encore ajouté Aspergillus flavus NRRL 3357 à raison d'environ 200 spores par Erlenmeyer contenant 109g du mais brut. On a ensuite fait incuber le mélange à 25 C et on a déterminé la production d'aflatoxine B1 en fonction du temps. Les résultats sont donnés dans le tableau 22. A titre de comparaison, un témoin a également été effectué en répétant cet exemple 18, alors que la souche NK-330 de B. subtilis n'avait pas été inoculée. Tableau 22 Aflatoxine B1 (parties par mittlliard) Jours 3 5 9 Ex. 18 10 20 17 Témoin 470 1200 800 Activité inhibitrice du liquide surnageant d'une culture de B. subtilis NK-C-3 pour La production d'aftatoxine par A. parasiticus NRRL 2999 dans du mais brut non stérilisé. Exempte 19. Un liquide de pré-incubation de Bacillus subtilis NK-C-3, 10ml, est inoculé à un litre de milieu liquide pomme de terre dextrose dans un fermenteur à bocaux. L'incubation de l'inoculant est commencée à pH 6,7 et maintenue pendant 5 jours à une température de 30 C, sous une aération de 500ml/min, avec une agitation de 150 tours/min. En soumettant la culture liquide obtenue à une centrifugation sous 1000g, on a séparé les bactéries pour obtenir le liquide surnageant sur la culture. Apres avoir concentré le liquide surnageant dans un évaporateur puis l'avoir lyophilisé, on a préparé g d'un résidu séché. Le résidu séché du liquide surnageant a été ajouté au mais brut nonautoclavé (non stérilisé) à raison de 0,5% en poids, puis on lui a encore ajouté Aspergillus parasiticus NRRL 2999 à raison d'environ spores par Erlenmeyer contenant 10g du mais brut. On a ensuite fait incuber le mélange à 25 C, et on a déterminé la production d'aflatoxine B1 et d'aflatoxine G1 en fonction du temps. Les résultats sont donnés dans les tableaux 23 et 24. A titre de comparaison, on a également effectué un témoin en répétant cet exemple 19, mais sans inoculation de la souche NK-C-3 de B. subtilis. Tableau 23 Tableau 24 Af lttxn AfatoxineGAfatxine 1 (parties par miltLiard) (parties par milliard) Jours 3 5 9 Jours 3 5 9 Ex. 19 20 50 40 Ex.19 10 17 12 Témoin 300 460 310 Témoin 180 580 400 Activité inhibitrice du liquide surnageant d'une culture de B. subtilis NK-C-3 pour La production d'aflatoxine par A. flavus NRRL 3357 dans du mais brut non stérilisé. Exempte 20. On inocule un liquide de pré-incubation de Bacillus subtilis NK-C-3, 10ml, dans un litre de milieu liquide pomme de terre dextrose dans un fermenteur à bocaux. L'incubation de l'inoculant est commencée à pH 6,7 et maintenue pendant 5 jours à une température de 30 C, sous une aération de 500ml/min et avec une agitation de 150 tours/min. En soumettant la culture liquide obtenue à une centrifugation sous 1000g, on sépare les bactéries pour obtenir le liquide surnageant sur la culture. Après avoir concentré le liquide surnageant dans un évaporateur, puis l'avoir lyophilisé, on prépare og de résidu séché. Le résidu séché du liquide surnageant est ajouté au mais brut non autoclavé (non stérilisé) à raison de 0,5% en poids, puis on lui ajoute encore Aspergillus flavus NRRL 3357 à raison d'environ 200 spores par Erlenmeyer contenant 10g du mals brut. On fait ensuite incuber le mélange à 25 C, et l'on détermine la production d'aflatoxine B1 en fonction du temps. Les résultats sont donnés dans le tableau 25. A titre de comparaison, on effectue également un témoin en répétant cet exemple 20 mais sans inoculer la souche NK-C-3 de B subtilis. SR 4189 JP MDT Tableau 25 AfLatoxine B1 (parties par milliard) Jours 3 5 9 Ex. 20 5 34 43 Témoin 280 720 640 REVENDICATIONS 1. Souche de Bacillus subtilis, caractérisée par Le fait qu'eLLe inhibe le développement de champignons produisant de l'aflatoxine ainsi que leur production d'aflatoxine. 2. Souche de Bacillus subtilis suivant la revendication 1, qui est en outre caractérisée par les faits que (a) elle réduit la quantité d'aflatoxine dans une solution aqueuse en contenant et (b), lorsqu'elle est incubée sur des céréales et des noix en même temps que les champignons produisant de l'aflatoxine, elle inhibe la production d'aflatoxine par ces champignons, et en outre elle inhibe le développement de ces champignons. 3. Souche de Bacillus subtilis suivant la revendication 1 ou 2, qui est une souche NK-330 de Bacillus subtilis ou un de ses mutants. 4. Souche de Bacillus subtilis suivant la revendication I ou 2 qui est une souche NK-C-3 de Bacillus subtilis ou un de ses mutants. 5. Souche de Bacillus subtilis suivant la revendication I ou 2, dans laquelle les champignons produisant de l'aflatoxine comprennent Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus. 6. Procédé de prévention de la contamination par l'aflatoxine de céréales et de noix, caractérisé par le fait qu'une souche de Bacillus subtilis conforme à la revendication 1 est appliquée sur les céréales et les noix. 7. Procédé suivant la revendication 6, dans lequel la souche de Bacillus subtilis est une souche NK-330 de Bacillus subtilis ou un de ses mutants. 8. Procédé suivant la revendication 6, dans lequel la souche de Bacillus subtilis est une souche NK-C-3 de Bacillus ou un de ses mutants. 9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8 qui précèdent, dans lequel la souche de Bacillus subtilis est appliquée avant ou après récolte des céréales et des noix. 10. Procédé suivant La revendication 9, dans lequel la souche de BaciLlus subtilis est pulvérisée sur ou introduite dans le champ sur lequel les céréales et les noix sont cultivées.