Brevet FR2598634A1 — publié le 19871120

2598634La présente invention se rapporte à des matières en phase inverse et à des procédés pour leur production et, elle se rapporte plus particulièrement à des matières hydrophobes en phase inverse qui sont particulièrement bien adaptées en tant que matières de garnissage pour une chromatographie en phase inverse. La chromatographie en phase inverse de haute performance est devenue un outil puissant pour l'isolement des polypeptides naturels et synthétiques. Avec le développement des milieux macroparticulaires efficaces à larges pores et des phases mobiles capables de dissoudre de grands polypeptides dénaturés, des fragments de peptide peuvent être isolés à une pureté suffisante pour une analyse de la séquence. Les phases stationnaires les plus couramment utilisées dans des colonnes de chromatographie en phase inverse à base de silice sont des alcanes à chaîne droite de 4 à 18 atomes de carbone. Ces ligands alcoyles sont couplés de manière covalente à des groupes silanols à la surface de la silice 20 par réaction avec un alkylchlorosilane pour former une liaison siloxane. Cependant, du fait des limites stériques, l'addition de groupes alkyl silanes encombrants à la surface de la silice n'est pas quantitative et il reste un certain nombre de silanols libres. Ces fragments hydroxyles résiduels 25 peuvent être partiellement séquestrés dans une seconde réaction de recouvrement d'extrémité avec des chlorométhylsilanes. Des travaux récents ont montré que dans la chromatographie en phase inverse de certaines protéines de la 30 membrane, l'addition de 40 à 60 % d'acide formique à la phase mobile était requise pour solubiliser ces polypeptides très hydrophiles. L'utilisation de phases mobiles très acides présente un problème avec la génération courante des colonnes de chromatographie en phase inverse à base de silice. 35 Comme la liaison SiC est plus sensible à une attaque par les m électrophiles qu'une liaison C-C, les acides forts,tels que l'acide formique,peuvent scinder graduellement la liaison Si-C entre le support de silice et la phase stationnaire. Les travaux antérieurs de Alpert et Regnier avec la chimie de la polyéthylèneimine adsorbée comme cela est décrit dans le brevet U.S. n 4. 245.005, dont les enseignements sont incorporés ici à titre de référence, ont montré l'extrême versatilité pour la synthèse des phases stationnaires d'échange d'anions. En utilisant la technologie existante d'adsorption étudiée par Alpert et Regnier pour la synthèse des milieux polymériques d'échange d'anions avec adsorption, les matières de phase inverse de l'invention ont été produites. La présente invention offre des matières de phase 15 inverse ainsi qu'un procédé de production de ces matières. Les matières de phase inverse de l'invention sont bien adaptées en tant que matières de garnissage chromatographique pour la séparation des protéines, des polypeptides et autres polymères. Pour produire les matières de phase inverse, on provoque d'abord l'adsorption d'une première couche d'un adsorbat comprenant des groupes amines réactifs primaires et/ou secondaires, comme une polyéthylèneimine, sur une matière de support inorganique telle que la silice, l'alumine 25 ou l'oxyde de titane. On fait alors réagir les groupes amines de ce revêtement adsorbé avec une quantité d'un réactif hydrophobe suffisante pour effectuer la réticulation du revêtement. Si le réactif hydrophobe employé est capable de réticuler le revêtement tout en rendant, à leur tour, les amines de surface neutres à un pH acide, alors la totalité des amines réactives du revêtement adsorbé réagit de préférence avec le réactif hydrophobe. Si le réactif hydrophobe employé n'est pas capable de réticuler ce revêtement en ne laissant que les fonctionnalités neutres de surface, alors le réactif 35 hydrophobe est utilisé en une quantité qui ne convertira pas plus de 30 %,et mieux pas plus de 10 %,des amines primaires et secondaires réactives du revêtement adsorbé en amines tertiaires. On fait alors réagir au moins un groupe amine n'ayant pas réagi et de préférence la totalité des groupes amines primaires et secondaires réactifs restants du revêtement adsorbé réticulé avec un réactif qui rendra ces amines neutres à pH acide. Un exemple d'un tel réactif est un anhydride. Un anhydride convertira l'amine réactive en un amide qui est neutre. En conséquence, la présente invention a pour objet une matière de phase inverse qui soit stable aux acides et reproductible. La présente invention a pour autre objet une telle matière de phase inverse ayant d'excellentes caractéristiques 15 chromatographiques. La présente invention a pour autre objet une telle matière de phase inverse simple et peu coûteuse à produire. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins annexes illustrant plusieurs modes de réalisation dans lesquels: - la figure 1 est un schéma illustrant un schéma réactionnel de l'invention; - les figures 2A et 2B sont des graphiques illustrant l'évaluation chromatographique de deux colonnes de phase inverse basée sur la séparation d'un mélange de protéines ovalbumine-albumine de sérum bovin; - la figure 3 est un graphique illustrant l'évaluation 30 chromatographique d'une colonne de phase inverse basée sur la séparation d'un mélange de protéines ribonucléaseinsuline-cytochrome c-albumine de sérum bovin-ovalbumine; et -les figures 4A et 4B sont des graphiques illustrant l'évaluation chromatographique de deux colonnes de phase inverse en se basant sur la séparation du produit de digestion du bromure de cyanogène de myoglobine du cachalot. La présente invention est particulièrement dirigée vers la préparation de matières de phase inverse qui sont particulièrement bien adaptées en tant que matière de garnissage pour la séparation des protéines, des peptides et autres polymères en chromatographie en phase inverse. Pour produire les matières de phase inverse, comme dans le brevet U.S. n 4 245 005, la surface d'une matière de support ayant une affinité pour un adsorbat est mise en contact avec un adsorbat comprenant des groupes amines 10 réactifs primaires et/ou secondaires de manière qu'un revêtement pelliculaire de l'adsorbat soit adsorbé à la surface par les forces électrostatiques. L'adsorbat est de préférence incorporé dans un solvant et l'adsorption peut être partiellement établie en contrôlant la polarité de ce solvant. 15 L'adsorption est d'autant plus forte que le solvant est moins polaire. Le solvant préféré est le méthanol. D'autres solvants appropriés comprennent le diméthylformamide et le dioxane acétonitrile. L'adsorbat contient au moins deux groupes fonctionnels, dont un coopère avec la surface de la matière 20 de support pour provoquer son adsorption et dont l'autre est utilisé pour la réticulation. Les adsorbats appropriés de l'invention sont la polyéthylèneimine, le 1,3-diamino-2hydroxypropane, la tétraéthylènepentamine et l'éthylènediamine. L'adsorbat préféré de l'invention contient très peu d'amines 25 tertiaires, s'il y en a, car les amines tertiaires (qui sont protonées et en conséquence positivement chargées au pH acide de l'éluent) transmettent un caractère hydrophile aux matières de phase inverse. La matière de support est de préférence une matière 30 de support inorganique comme la silice, l'alumine et l'oxyde de titane, la matière préférée de support étant la silice. Des exemples spécifiques de matières appropriées de support inorganiques sont Li-Chrospher Si 500 (diamètre de particule microns), Li-Chrosorb Si 100 (diamètre de particule 10 microns), Li-Chrospher Si 100 (diamètre de particule 10 microns), Chromosorb LC-6, Partisil 10, Vydac TPB, verre à pores contrôlés(diamètre de particule 5-10 microns; diamètre des pores 10 nm), l'alumine Sperisorb (diamètre de particule 10 microns; diamètre des pores 15 nm), de l'alumine basique Bio-Rad, Activité I (diamètre de particule 40 microns), de l'alumine acide Bio-Rad, Activité I (diamètre de particule 40 microns), de l'oxyde de titane Corning (maille 40/60; diamètre des pores: 40 nm), des gels de silice Amicon Matrex (marque déposée), de la silice plaquée de zirconyle (revêtement de zirconium sur de la silice Vydac TPB), et de l'oxyde de 10 magnésium. Après adsorption d'un revêtement pelliculaire d'un adsorbat comprenant les groupes amines réactifs primaires et/ou secondaires à la surface de la matière de support, on fait réagir les groupes amines réactifs du revêtement adsorbé avec 15 une quantité d'un réactif hydrophobe suffisante pour effectuer la réticulation du revêtement. Si le réactif hydrophobe employé est capable de réagir avec les groupes amines pour réticuler le revêtement tout en rendant les amines neutres au pH acide, alors on fait de préférence réagir la totalité des 20 amines primaires et secondaires réactives du revêtement adsorbé avec le réactif hydrophobe. Si le réactif hydrophobe employé n'est pas capable de réticuler le revêtement tout en rendant les amines neutres au pH acide, alors le réactif hydrophobe est employé en une 25 quantité suffisante pour ne réagir qu'avec une portion des groupes amines réactifs primaires et/ou secondaires du revêtement adsorbé et il est de préférence employé en une quantité ne convertissant pas plus de 30 % des amines réactives primaires et/ou secondaires du revêtement adsorbé en amines tertiaires, et mieux en une quantité ne convertissant pas plus de 10 % des amines réactives primaires et/ou secondaires du revêtement en amines tertiaires. Des réactifs hydrophobes de ce type, appropriés à une réticulation du revêtement,comprennent des halogénures d'alcoyle comme des 35 bromures d'alcoyle, des chlorures d'alcoyle et des iodures d'alcoyle; et des résines époxy telles qu'une résine époxy polyfonctionnelle ayant pour formule A R X/C dans laquelle R comprend un radical organique hydrophobe tel que aryle ou alcoyle et mieux ayant pour formule: H H H I 1 1 H H H Si, après réticulation du revêtement adsorbé, il reste des groupes amines réactifs primaires et/ou secondaires dans 15 le revêtement adsorbé réticulé, alors on fait réagir au moins un groupe amine, de préférence un grand nombre de ces groupes amines et mieux la totalité des groupes amines,avec un réactif, de préférence hydrophobe,qui rendra les amines neutres à pH acide. Un exemple d'un réactif qui rendra les 20 amines neutres à pH acide est un réactif qui convertira ::: ' R1 C=R2 -CH2-CH2NH-CH2-CH2-en-CH2-CH2-N-CH2-CH 2 2 2 2 2 2. 2 2 dans laquelle R1 est un radical organique et R2 est O ou un élément d'un noyau aromatique contenant R1. Un tel réactif est un anhydride. Un anhydride formera des liaisons amides, qui sont neutres, avec ces amines. Par exemple, au moins un groupe amine réactif restant, et mieux de nombreux groupes amines réactifs restants, et de préférence la totalité des groupes amines réactifs restants primaires et secondaires du revêtement adsorbé réticulé peuvent réagir, de préférence en présence d'un épurateur de protons et de préférence dans un solvant aprotique sec tel que le diméthylformamide, avec une quantité d'anhydride suffisante pour former des liaisons amides avec les amines réactives. L'épurateur de protons comprend de préférence une amine tertiaire et mieux la diisopropyléthylamine. L'anhydride, qui est de préférence hydrophobe, a pour formule générale: O O I I R1 -C-O-C-R dans laquelle R1 et R2, qui peuvent être identiques ou 10 différents, comprennent des radicaux organiques et de préférence des radicaux organiques choisis dans le groupe consistant en alcoyle contenant 1 à 20 atomes de carbone, phényle, diphényle, naphtyle, etc. Les anhydrides appropriés comprennent l'anhydride benzoique, l'anhydride stéarique, 15 l'anhydride hexanoique et l'anhydride octanoique. Outre l'anhydride, un autre exemple d'un réactif qui réagira avec les amines réactives restantes du revêtement adsorbé réticulé pour rendre les amines neutres à pH acide est le chlorure cyanurique. L'invention sera mieux illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. Exemple 1 On a mis en suspension un gramme de silice Vydac 101TPB de 5,5 pm (sphérique, 33 nm) dans 10 ml d'une solution à 1% 25 (poids/volume) dans le méthanol de polyéthyièneimine-6 (poids moléculaire moyen = 600). La suspension a été dégazée, soumise à agitation et on l'a laissée reposer pendant minutes à température ambiante. La silice a alors été isolée dans un entonnoir en verre fritté et séchée. Le revêtement adsorbé a alors été reticulé en une pellicule en le transférant dans un ballon contenant 10 ml d'une solution à 5 % (volume/volume) de EPON 828 (diépoxyde de biphényle ayant la structure: H H H / \ | 1 o 4} - I C.Tji 0 H H H H H H - obtenu de Polyscience, Inc.), dans le méthanol, en dégazant, en soumettant à agitation et en permettant à la suspension de reposer pendant une nuit à température ambiante. A la finde cette période, le ballon a été chauffé sur de la vapeur pendant 30 minutes. La silice enduite, réticulée, a été isolée dans un entonnoir en verre fritté, lavée au méthanol et placée dans un four à 100 C pendant une heure. Bien que cette silice réticulée et enduite soit suffisamment hydrophobe pour être non mouillable, une chromatographie d'un 10 mélange d'essai de protéines en utilisant une colonne de 0,46 x 5 cm garnie d'environ 500 mg de cette matière était inacceptable. Apparemment, les amines dans le revêtement (qui sont protonées et, en conséquence, positivement chargées au pH de l'éluant acide) transmettent un caractère 15 hydrophile suffisant à la matière de garnissage pour que les protéines ne soient pas fortement retenues. Dans un effort pour rendre la silice enduite réticulée plus hydrophobe, les amines primaires et secondaires résiduelles ont été acylées en transférant la silice enduite 20 et réticulée à un ballon contenant 5 ml de diméthylformamide sec, 400 mg d'anhydride benzoique et 250 pl de diisopropyléthylamine (DIEA). Cette réaction ajoute simultanément des groupes phényles et élimine les amines par formation de liaison amide. On a ajouté DIEA en tant qu'épurateur de protons car 25 un acide pouvant titrer les amines adjacentes (les rendant non réactives) est produit pendant la réaction de l'anhydride et de la silice enduite réticulée. Après dégazage et agitation, cette suspension a été chauffée dans un bain d'huile à 60 C pendant une nuit. La silice benzoylée, enduite 30 de polyamine, a été isolée dans un entonnoir en verre fritté, lavée totalement avec du méthanol et séchée dans un dessiccateur sous vide. L'acylation des amines primaires et secondaires résiduelles dans le revêtement réticulé a servi à réduire simultanément la charge positive et à introduire 35 une hydrophobicité additionnelle. On a utilisé l'anhydride benzoîque pour l'acylation de manière que le groupe ajouté soit compatible avec la structure de EPON 828. Malheureusement, les amines tertiaires initialement présentes dans la polyéthylèneimine et celles produites pendant l'étape de réticulation resteront dans le revêtement car ces fragments ne peuvent être acylés. Un schéma illustrant le schéma réactionnel de la matière de phase inverse de PEI adsorbée de cet exemple est montré à la figure 1. Les chiffres arabes désignent les étapes de réaction et les chiffres romains 10 désignent les produits réactionnels. Exemple 2 L'analyse élémentaire de la matière de revêtement de polyéthylèneimine hydrophobe adsorbée (PEI) de l'exemple 1 (PEI-Phényle) a indiqué une charge de carbone de 12 % 15 (voir tableau I). Tableau I Données d'analyse élémentaire Matière de C C1 Perte nette2 Masse totale perdue garnissage (%) (%) (mgC/g Support) (%) SynChropak RP-8 2,8 1,04 1,76 63,0 PEI-Phényle 12,0 11,6 0,4 3,3 Analyse des milieux après traitement avec 40 % d'acide formique pendant 24 heures à 60 C. 2 Obtenue en soustrayant la teneur en carbone après traitement 30 à l'acide formique, de la charge initiale de carbone. Cette charge de carbone est sensiblementsupérieure aux 2,8 % obtenus avec la silice SynChropak RP-8 (milieux de phase inverse liés à l'organosilane du commerce obtenus de SynChrom, Inc., Linden, IN.). Ces résultats suggèrent que le revêtement de PEI-Phényle est plus épais. Bien qu'une épaisseur accrue de la couche puisse ajouter de la stabilité au revêtement, cela consomme également du volume des pores et de l'aire superficielle. La résistance aux acides des matières de garnissage de PEIPhényle et de SynChropak RP-8 a été recherchée en plaçant 50 mg de chaque matière dans ml d'acide formique aqueux à 40 % (volume/volume), o l'on avait ajouté quelques gouttes de diméthylformamide en tant qu'agent mouillant. Après chauffage pendant 24 heures à 60 C, 10 les deux échantillons d'essai ont été réisolés sur un filtre de verre fritté, totalement lavésau diméthylformamide puis avec de l'acétone, et séchés dans un dessiccateur. Une analyse du carbone élémentaire a montré que ce traitement à l'acide formique provoquait une perte de 63 % de la phase liée des 15 milieux de Synchropak RP-8 tandis que seuls 3,3 % étaient enlevés des milieux enduits de PEI-Phényle (tableau I). Ces résultats suggèrent qu'un fonctionnement prolongé des colonnes de phase inverse d'organosilane en conditions fortement acidesaura pour résultat une perte sensible de la 20 phase liée du support. Au contraire, des revêtements adsorbés o la phase organique ne contient que des liaisons C-C ou C-N sont bien plus résistants aux acides. La résistance accrue aux acides de la matière de PEI-Phényle permettra l'utilisation de phasesmobilestrès acides en chromatographie 25 sans craindre d'extraire la phase liée. Par ailleurs, de tels acides pourraient être utilisés par routine pour un nettoyage de la colonne et une dépyrogénation. Exemple 3 On a déterminé 50 mg de la matière de PEI-Phényle de 30 l'exemple 1, pour sa capacité à lier l'acide picrique (tableau II). - TABLEAU II Comparaison des milieux de PEI-Phényle Silice à SynChropak RP-8 Matière de IPC1 L,BSA tRBSA Rs garnissage (pmoles amine/g) (mg/g) (mn) (BSA/OVA) SynChropak RP-8 169 15,4 2,9 PEI-Phényle 170 84 11,0 2,8 1Capacité d'appariement de l'ion d'acide picrique. 2Capacité de charge statique de l'albumine de sérum bovin par gramme de silice enduite. L'ion d'acide picrique s'apparie avec les amines accessibles mais non pas avec les amides. La determination de l'acide picrique a indiqué que le revêtement de PEI-Phényle contenait pmoles d'amines pouvant s'apparier à l'ion par gramme de silice (tableau II),ce qui correspond à 2,2 moles de l'amine par m. Un spectrophotomètre de rayons ultraviolets visibles Varian 634 (Varian, Walnut Creek, CA,E.U.A) a éte utilisé 20 pour mesurer les concentrations de l'acide picrique. Exemple 4 On a déterminé 50 mg de la matière de PEi--Phényle de l'exemple 1 et 50 mg des milieux SynChropak RP-8 pour leur capacité à lier l'albumine de sérum bovin (BSA) par un mécanisme d'adsorption hydrophobe. On a formé une solution à mg/ml de BSA dans 0,1% d'acide trifluoroacétique en utilisant quelques gouttes d'acétonitrile pour rendre les particules hydrophobes mouillables. Cette solution a alors été ajoutée aux deux échantillons de la matière de PEI-Phényle et 30 des milieux de SynChropak RP-8. On a laissé les échantillons se stabiliser pendant 15 minutes pour assurer une adsorption complète. BSA a alors été désorbée des différents milieux en utilisant 60% d'acétonitrile dans 0,1% d'acide trifluoroacétique. Les résultats de la détermination de liaison de BSA sont donnés 35 au tableau II. On a utilisé un spectrophotomètre à rayons ultraviolets visibles Varian 634 pour déterminer les concentrations dans la détermination de liaison de BSA. La matière de PEI-Phényle a lié moins de BSA que la matière de SynChropak RP-8 et cela peut être dû au fait que le revêtement de PEI-Phényle semble être plus épais, consommant ainsi du volume des pores et de l'aire superficielle. Exemple 5 On a introduit environ 500 mg de la matière de PEI-Phényle de l'exemple 1 et de la matière SynChropak RP-8 10 dans des colonnes individuelles de 0, 41x5 cm DI pour la chromatographie isocratique des petites molécules. Ces colonnes ont alors été utilisées pour la chromatographie d'échantillons de 10 pg de benzylamine, de phényléthanol et d'acide benzoique. La chromatographie a été accomplie (avec un système LDC Constametric I et III G avec un Gradient Master obtenu de Laboratory Data Control, Riviera Beach, FLoride, E.U.A.) en utilisant, comme éluant, une solution à 1:9 de méthanol:eau (pH7) à un débit de 0,5 ml/mn. La rétention du phényléthanol dans 100% de méthanol a été utilisée pour 20 to. La valeur de k' a été déterminée par la formule: k'= (t - t)/t dans laquelle tRest le temps de rétention du soluté et tO est le temps de vide. Comme on peut s'y attendre, la benzylamine a été de préférence retenue sur la colonne de SynChropak RP-8, probablement par suite des interactions du silanol (tableau III). Tableau III Chrumatographie isocratique de petites molécules Matière de garnissage SynChropak RP-8 PEI-Phényle k' Benzylamine Phényléthanol Acide benzoîque 2,93 0,27 0,12 0,52 ,97 Le phényléthanol a été faiblement retenu sur les deux colonnes (tableau III). L'acide benzoîque a été préférentiellement retenu sur la colonne de PEI-Phényle apparemment du fait de l'interaction de l'acide carboxylique avec les amines tertiaires résiduelles dans la phase liée (tableau III). A pH neutre, la charge résiduelle dans la colonne et son signe sont indiqués par les caractéristiques exagérées de rétention de la base aromatique ou de l'acide. Exemple 6 Un échantillon d'essai analytique consistant en 140 pg d'ovalbumine (OVA) et 100 pg d'albumine de sérum bovin (BSA) a été chromatographié sur les deux colonnes de PEI-Phényle et SynChropak RP-8 de l'exemple 5 en utilisant les instruments de chromatographie de l'exemnple 5 et en utilisant, comme éluant, un gradient linéaire de 20 minutes de 0,1% d'acide trifluoroacétique à 60% d'acétonitrile dans 0,1% d'acide trifluoroacétique à un débit de 1 ml/mn. La détection était à A254, surveillée par un détecteur Spectroflow 773 (Kratos, Ramsey, New Jersey, E.U.A.). Le temps de rétention (tR) des 20 pics de OVA et BSA est donné au tableau II et montré graphiquement à la figure 2 o le temps est indiqué en abscisses, 1'absorbat à 254 nm ainsi que le pourcentage d'acétonitrile dans 0,1 % de TFA sont donnés en ordonnées La résolution (Rs au tableau II et à la figure 2) entre OVA 25 et BSA a été calculée selon l'équation: Rs = 2( R2 - tR1 (/\t + R2 s R tR2- Les symboles tR ettR sont les temps de rétention de chaque pic tandis que A tR et tR sont les largeurs des pics. 30 1 2 Les indices 1 et 2 se réfèrent aux premier et second pics s'éluant de la colonne. Sur la base de la sélectivité et de la résolution, les colonnes de SynChropak RP-8 et PEI-Phényle étaient essentiellement équivalentes pour la séparation de l'ovalbumine et de l'albumine de sérum bovin. Cependant, la colonne de PEI-Phényle était moins rétentrice car les deux 15 20 30,35 protéines se sont éluées plusieurs minutes plus tôt que sur les milieux RP-8. Comme la densité de surface des groupes phényles sur le revêtement de PEI-Phényle adsorbé semble être plus importante que la densité de l'alkylsilane du revêtement de SynChropak RP-8, une rétention diminuée résulte probablement de la plus grande polarité du ligand phényle. La rétention réduite peut être avantageuse avec de grands polypeptides qui ont une solubilité limitée dans des solvants organiques. Plus particulièrement, une élution peut être obtenue à une plus faible concentration du solvant organique. Dans le cas o cela est désavantageux, on peut circonvenir à une rétention diminuée en utilisant un agent d'appariement d'ions plus hydrophobe (tel que l'acide heptafluorobutyrique). Exemple 7 Un échantillon d'essai analytique consistant en 75 pg de ribonucléase (RNase), 75 pg d'insuline, 40 pg de citochrome c (CYTc), 75 pg de BSA et 125 pg de OVA a été chromatographié sur la colonne de PEI-Phényle de l'exemple 5 en utilisant l'appareil de chromatographie et de détection de l'exemple 6 et en utilisant un gradient linéaire de 40 minutes de 0,1% d'acide trifluoroacétique à 50% d'acétonitrile dans 0,1% d'acide trifluoroacétique à un débit de 0,5 ml/mn comme éluant. Les résultats de la séparation chromatographique sont montrés graphiquement à la figure 3 o l'absorbance à 254 nm et le pourcentage d'acétonitrile dans 0,1% de TFA sont montrés en ordonnées. Exemple 8 On a préparé un produit de digestion de bromure de cyanogène de myoglobine de cachalot en scindant la myoglobine du cachalot au bromure de cyanogène. La myoglobine, qui contient deux résidus de méthionine et un heme, donne 3 fragments de peptides (résidus de CB1 1-55, résidus de CB2 56-131 et résidus de CB3 132-153) et un noyau de porphyrine. Un échantillon d'essai analytique consistant en 300 pg du produit de digestion de bromure de cyanogène de myoglobine de cachalot a été chromatographié sur les deux colonnes de PEI-Phényle et SynChropak RP-8 de l'exemple 5 en utilisant les instruments de chromatographie de l'exemple 5 et en utilisant, comme éluant, un gradient linéaire de 20 minutes de 0,1% d'acide heptafluorobutyrique (HFBA) à 60% ou 80% d'acétonitrile dans 0,1% de HFBA à un débit de 1 ml/mn. L'acide heptafluorobutyrique a été utilisé en tant qu'agent d'appariement des ions dans ce cas, parce que TFA a produit une rétention insuffisante sur la colonne de PEI-Phényle. La détection était à A230,surveillée par un détecteur Spectroflow 773. Les résultats de la séparation chromatographique sont montrés graphiquement à la figure 4. La colonne de PEI-Phényle et la colonne de SynChropak RP-8 ont présenté de bonnes caractéristiques de résolution et de rétention pour la 15 séparation des composants majeurs de l'échantillon. La matière de garnissage de PEIPhényle était de nouveau moins rétentrice, ne nécessitant que 50% d'acétonitrile pour éluer le dernier pic tandis que 80% d'acétonitrile étaient nécessaires sur la colonne RP-8. De manière intéressante, le support de 20 PEI-Phényle a offert une sélectivité légèrement différente pour la chromatographie du fragment de heme. Il y a eu élution en tant que second pic de la colonne de RP-8 et en tant que dernier pic de la colonne de PEI-Phényle. L'élution retardée résulte probablement des interactions d'empilement entre les groupes aromatiques de la matière de PEI-Phényle et du noyau de porphyrine. RE V E N D I C AT I ON S ___________________________ 1. Procédé de production d'une matière de phase inverse,caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support ayant une surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de ladite matière de support en contact avec un adsorbat comprenant des groupes amines primaires et/ou secondaires réactifs de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé à ladite 10 surface par desforces électrostatiques; c) réticuler ledit revêtement adsorbé par réaction d'une portion des groupes amines réactifs dudit revêtement avec un premier réactif hydrophobe; et d) faire réagir au moins un groupe amine réactif restant dudit revêtement réticulé adsorbé avec une quantité d'un second réactif hydrophobe,suffisante pour rendre l'amine neutre à pH acide. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la matière de support est une matière de support inorganique choisie dans le groupe consistant en silice, alumine et oxyde de titane. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'adsorbat contient quelques amines tertiaires, s'il y en a. 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'adsorbat est choisi dans le groupe consistant en polyéthylèneimine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, tétraéthylènepentaimine et éthylènediamine. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'adsorbat est incorporé dans un solvant et l'adsorption est au moins partiellement établie en contrôlant la polarité du solvant. 6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'à l'étape c, la quantité du premier réactif hydrophobe utilisé ne convertit pas plus de 30% de ces amines réactives du revêtement adsorbé en amines tertiaires. 7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le premier réactif hydrophobe est choisi dans le groupe consistant en résines époxy, bromures d'alcoyle, chlorures d'alcoyle et iodures d'alcoyle. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le premier réactif hydrophobe comprend une résine époxy polyfonctionnelle ayant pour formule H H H r A 11 A_ C -O C--, I A- 0 --C-/\ H H H 9. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'à l'étape d, sensiblement la totalité des groupes amines réactifs restants du revêtement réticulé absorbé réagissent avec une quantité d'un second réactif hydrophobe suffisante pour rendre lesdites amines neutres à pH acide. 10. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'à l'étape d, le groupe amine réactif restant du revêtement 20 adsorbé réticulé réagit avec une quantité d'un anhydride suffisante pour former une liaison amide avec ladite amine, ledit anhydride ayant pour formule: O O l l R1 -C-O-C-R2 dans laquelle R1 et R2 comprennent des radicaux organiques. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'à l'étape d, sensiblement la totalité des groupes amines réactifs restants du revêtement adsorbé réticulé réagissent avec une quantité de l'anhydride suffisante pour former des liaisons amides avec lesdites amines. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications ou 11, caractérisé en ce qu'un épurateur de protons comprenant une amine tertiaire est ajouté à la réaction de l'amine avec l'anhydride. 13. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que R et R peuvent être identiques ou différents et ils R 2 sont choisis dans le groupe consistant en alcoyle contenant jusqu'à 20 atomes de carbone, phényle, diphényle et naphtyle. 14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la matière de phase inverse est utilisée en tant que matière de garnissage en chromatographie en phase inverse. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que la matière de garnissage chromatographique est utilisée pour séparer des protéines, des polypeptides et autres polymères. 16. Procédé de production d'une matière de phase inverse caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support de silice ayant une surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de ladite matière de support en contact avec un adsorbat comprenant de la polyéthylèneimine de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit 20 adsorbé sur la surface par les forces électrostatiques; c) faire réagir une portion des groupes amines réactifs du revêtement adsorbé avec une quantité d'un époxyde difonctionnel de bis-phényle suffisante pour effectuer la réticulation du revêtement; et d) faire réagir les groupes amines réactifs restants du revêtement adsorbé réticulé avec une quantité d'anhydride benzoîque suffisante pour former des liaisons amides avec les amines. 17. Procédé de production d'une matière de phase 30 inverse caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support ayant une surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de la matière de support en contact avec un adsorbat comprenant des groupes amines 35 primaires et/ou secondaires réactifs de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé à la surface par les forces électrostatiques; et c) faire réagir lesdits groupes amines du revêtement adsorbé avec une quantité d'un réactif hydrophobe suffisante pour réticuler le revêtement tout en rendant les amines neutres à pH acide. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la matière de support est une matière de support inoganique choisie dans le groupe consistant en silice, alumine et oxyde de titane. 19. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en 10 ce que l'adsorbat contient quelques amines tertiaires, s'il y en a. 20. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que l'adsorbat est incorporé dans un solvant et l'adsorption est au moins partiellement établieen contrôlant 15 la polarité dudit solvant. 21. Matière de support de phase inverse caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 8 à 13. 22. Matière de phase inverse caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 17 ou 19. 23. Procédé selon la revendication 1 caractérise en ce qu'à l'étape d un grand nombre des groupes amines réactifs restants du revêtement adsorbé réticulé réagissent avec une quantité d'un second réactif hydrophobe, suffisante pour rendre les amines neutres à pH acide. 24. Matière de phase inverse caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 23.