Brevet FR2604447A1 — publié le 19880401

La présente invention concerne un procédé de production de L-thréonine par fermentation. Divers procédés ont été conçus pour produire la L-thréonine, y compris un procédé dans lequel on utilise un mutant appartenant au genre Brevibacterium ou Coryne pacterium résistant à l'acide a-amino-ss-hydroxyvalérique (AHV) (voir la publication de brevet japonais n 26 708/70). Dans les procédés connus de production de la L-thréonine par fermentation, le rendement de la L-thréonine n'est pas suffisamment élevé. On s'efforce donc toujours d'améliorer le rendement de la production commerciale de la L-thréonine. Un des buts de L'invention est de fournir un procédé pour produire de La L-thréonine par fermentation, qui assure un rendement élevé en L-thréonine. Selon l'invention, ce but ainsi que d'autres a été atteint gracie à La découverte de souches du genre Brevibacterium et Corynebacterium qui produisent de la L-thréonine avec un rendement élevé, en particulier de souches que l'on a rendues résistantes à l'acide mycophénolique rappelé ci-aprés "MPA"). Ces souches se sont révélées capables de produire de la L-thréonine avec un rendement qui est supérieur à celui des micro-organismes précédemment connus producteurs de L-thréonine. Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant etre décrits de façon détaillée. Selon l'invention, on peut utiliser un microorganisme quelconque appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui résiste au MPA et qui est capable de produire de la L-thréonine, y compris les mutants dérivés par mutation par traitement avec des mutagènes chimiques ou des rayons X ou UV, ainsi que Les recombinants obtenus par fusion cellulaire, recombinaison ou similaires. On peut, pour obtenir les mutants selon l'invention, conférer la capacité de produire de la L-thréonine aux souches de type sauvage indiquées ci-après, puis leu- ccnférer une résistance au MPA IL est évasement possible d'obtenir des souches productrices de L-thréonine, ayant la capacité de produire de la L-thréonine et simultanément résistant au MPA, par induction de la résistance au MPA à partir d'un micro-organisme producteur de L-thréonine et sensible au MPA. Dans de nombreux cas, le rendement de la L-thréonine peut etre encore amélioré si le mutant utilisé est un mutant auxotrophe nécessitant de l'isoleu- cine, de la méthionine, de l'alanine, de L'acide diaminopimélique, de la lysine, de la Leucine ou similaires. Des exemples typiques des souches sauvages dont Les micro-organismes selon L'invention peuvent dériver comprennent les suivantes : Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Le nom chimique complet de l'acide mycophénolique est acide (E)-6-(1,3-dihydro-4-hydroxy-6-méthoxy- 7-méthyl-3-oxo-5-isobenzofuryl)-4-méthyl-4-hexénoi- que ; ou acide 6-(4-hydroxy-6-méthoxy-7-méthyl-3-oxo-5- phtalanyl)-4-méthyl-4-hexénoique. Sa structure est La suivante On pourra trouver une information complémentaire sur ce composé dans le Merck Index, 9ème édition (1976), pages 820-821. Les procédés d'induction de mutation et leur relation avec la résistance au MPA sont décrits ci-après. Procédé d'induction d'une mutation On met en suspension dans du tampon phosphate M/30, pour obtenir des suspensions contenant 109 cellules/ml, des cellules de Brevibacterium flavum ATCC 21269 (souche AHV-résistante dérivée d'ATCC 14067) et de CorY- nebacterium acetoacidophilum AJ 12315 (souche AHV-résistante dérivée d'ATCC 13870)cultivées sur gélose nutritive inclinée à 300C pendant 24 heures. On ajoute aux suspensions 250 Fg/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, puis on laisse le mélange reposer à 300C pendant 15 minutes. On lave ensuite les cellules avec le meme tampon par centrifugation. On ensemence avec les souches ainsi obtenues le milieu indiqué ci-dessous et on cultive à 310c pendant 5 heures. Compositiondu milieu de culture (pH 7,0) Ingrédients Teneurs Glucose 1,0 g/dl Urée 0,2 KH2PO4 0,1 MgS04.7H20 0,1 FeS04.7H20 0,002 MnS04.7H20 0,002 " Biotine 100 Fg/l Chlorhydrate de thiamine 100 MPA 0,2 g/dl Gélose 2,0 " On obtient Brevibacterium flavum AJ 12312 LFERM BP-1173] (résistant à l'AHV et au MPA) et Corynebacterium acetoacidoPhilum AJ 12316 (résistant à L'AHV et au MPA) par sélection des souches ayant une forte productivité de la L-thréonine à partir des souches poussant sur le milieu gélosé ci-dessus. Au milieu de culture ci-dessus, on ajoute de plus 15 mg/dl de L-isoleucine et on cultive dans le m lieu, pour effectuer une mutation semblable à celle ci-dessus, Brevibacterium flavum AJ 12312 (souche AHVrésistante, nécessitant de l'isoleucine, dérivée d'ATCC 14067) et Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12317 (souche AHV-résistante, nécessitant de l'isoleucine, dérivée d'ATCC 13870). Par sélection des souches ayant une productivité accrue de la L-thréonine, on obtient ainsi Brevibacterium flavum AJ 12314 (résistant à L'AHV et au MPA et nécessitant de l'isoleucine) et Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12318 [FERM BP-1172] (résistant à L'AHV et au MPA et nécessitant de l'isoleucine). On compare la résistance au MPA des mutants ainsi obtenus à celle des souches parentes de la façon salivante. On met en suspension dans de L'eau stérilisée des cellules d'une souche cultivée sur gélose nutritive inclinée pendant 24 heures et on ensemence avec la suspension un milieu ajusté à pH 7,0 et contenant 0,5 g/dl de glucose, 0,2 g/dl d'urée, 0,15 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,3 g/dl de KH2P04, 0,1 g/dl de K2HP04, 0,01 g/dl de MgS04.7H20, 0,01 mg/dl de CaCl2.2H20, 100 Fg/l de biotine, 100 Fg/l de chlorhydrate de thiamine, 0,002 g/dl de FeS04.7H20, 0,002 g/dl de MnS04.7H20, 15 mg/dl de L-isoleucine (dans le cas d'un mutant nécessitant de l'isoleucine) et du MPA en une quantité indiquée dans le tableau 1. Après 24 heures de culture, on détermine la croissance de la souche par turbidimétrie. Tableau 1 Concentration du MPA () Souche 0 0,005 0,01 0,05 0,1 Brevibacterium flavum ATCC 21269 100 70 20 0 0 Brevibacterium flavum AJ 12312 FERM BP-1173 100 100 82 5 0 Brevibacterium f lavur AJ 12313 100 90 30 0 0 Brevibacterium flavum AJ 12314 100 100 100 20 5 Corynebacterium acetoacidoshi'um AJ 12315 100 60 10 0 0 Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12316 100 100 85 10 0 Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12317 100 90 20 0 0 Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12318 FERM BP-1172 100 100 100 40 8 Dans de nombreux cas on peut obtenir une amélioration complémentaire du rendement en conférant aux mutants ci-dessus des caractéristiques telles que La résistance à L'O-méthylthréonine, la résistance à la D-thréonine, la résistance à la -hydroxyleucine et la résistance à la vitamine P, lesquelles caractéristiques sont connues pour etre généralement efficaces pour accoutre encore la pr^auctivité de l-Lh ecnireF Les milieux de culture à utiliser pour les cultures de tels mutants peuvent etre les milieux ordinaires contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux, des substances nécessaires pour satisfaire aux besoins précités et, si nécessairc, d'autres microconstituants alimentaires organiques, tels que les vitamines, etc. On peut utiliser de préférence comme sources de carbone des hydrates de carbone, tels que le glucose et le saccharose, et des acides organiques, tels que l'acide acétique, etc.Des exemples des sources d'azote préférables comprennent l'ammoniaque, l'ammoniac gazeux, les sels d'ammonium et similaires. Des sels minéraux, tels que ceux apportant des ions potassium n e t magnésium, ainsi que des phosphates, sont ajoutés à la demande au milieu. La culture est de préférence effectuée en conditions aérobies. On peut obtenir les résultats préféra bles lorsqu'on effectue la culture à une température de 8 à 25"C en maintenant le milieu de culture à un pH de 4 à 8. Après 1 à 7 jours de culture, une quantité notable de L-thréonine est accumulée et la L-lysine n'est formée qu'en très faible quantité. La L-thréonine peut etre récupérée à partir du milieu de culture selon des procédés classiques, par exemple par emploi de résines échangeuses d'ions. Les mutants BP-1172 et BP-1173, qui ont été obtenus dans l'invention, ont été déposés conformément au Traité de Budapest le 22 septembre 1986 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciences and Technology, Ministre of International Trade and Industry (FRI), 1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-Machi, Tsukuba-Gun, Ibaragi-Ken 305, Japon et ont reçu Les numéros FERM BP indiqués ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Après avoir ajusté à 7,0 le pH de 20 ml de milieu de culture (stérilisé séparément) contenant 10 g/dl de glucose, 4 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 g/dl de KH2P04, 0,1 g/dl de MgS04.7H20, 0,1 mg/dl de FeS04.7H20, 0,1 mg/dl de MnS04.4H20, 100 Fg/l de biotine, 100 Fg/L de chlorhydrate de thiamine, 80 mg de N/dl d'hydrolysat acide de protéines de soja et 5 g/dl de carbonate de calcium, on les introduit dans une fiole cylindro-conique de 50 ml puis on stérilise par chauffage.On ensemence le milieu avec une anse de platine de chacune des souches indiquées dans le tableau 2, puis on cultive avec agitation pendant 4 jours en maintenant La température du milieu à 31,5 C. Dans chaque milieu de culture de La L-thréonine s'accumule en les quantités indiquées dans le tableau 3. On cultive AJ 12312 de la meme façon que ci-dessus pour obtenir 1 I de bouillon de culture et on en élimine Les cellules par centrifugation. On fait passer le surnageant à travers du Dia-Ion SK-B (résine échangeuse d'ions fortement acide). On lave la résine à L'eau et on élue avec de l'ammoniaque 2 N. On concentre ensuite L'élut pour obtenir 6,2 g de cristaux de L-thréonine. Tableau 2 Quantité de L-thréonine Souche Caractéristiques accumulée (g/l) ATCC 21269 AHVr 9,3 AJ 12312 FERM BP-1173 AHVr, MpAr 12,5 AJ 12313 AHVr, île 14,0 AJ 12314 AHVr, Ile-, MPAr 16,2 AJ 12315 A'HVr 8,6 AJ 12316 AHVr, MpAr 12,0 AJ 12317 AHVr, île 13,0 AJ 12318 FERM BP-1172 AFVr, Ile-, MpAr 15,0 AHVr : résistant à l'AHV MPAr : résistant au MPA île :Nécessitant de l'isoleucine Exemple 2 Aprés avoir ajusté à 7,0 le pH de 50 ml d'un milieu d'ensemencement contenant 5 g/dl de glucose, 0,2 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g/dL d'urée, 0,15 g/dl de KH2P04, 0,04 g/dl de MgS04.7H20, 100 Fg/l de chlorhydrate de thiamine, 300 Fg/l de biotine, 140 Fg/dl (en azote total) d'hydrolysat acide de protéines de soja, on Les place dans un flacon de Sakagucni de 500 mî puis on stérilise par chauffage. On ensemence Le milieu avec une anse de platine de chacune des souches indiquées dans le tableau 3, puis on cultive avec agitation pendant 18 heures et on maintient la température du milieu à 31,5 C. D'autre part, après avoir ajusté à 7,0 le pH de 285 ml de milieu de culture contenant 2 g/dl de glucose, 1 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,15 g/dl de KH2P04, 0,04 g/dl de MgS04.7H20, 1 mg/dl de FeS04.7H20, 1 mg/dl de MnS04.7H20, 50 FgXl de biotine, 500 Fg/l de chlorhydrate de thiamine, 32 mg/dl Cen azote total) d'hydrolysat acide de protéines de soja et 40 mg de L-isoleucine, on les introduit dans un fermenteur de 1 000 ml, puis on stérilise par chauffage. On ensemence le milieu avec 15 ml de chaque bouillon de culture d'ensemencement. On introduit dans le milieu de culture une solution mixte contenant un mélange d'acétate et d'acétate d'ammonium dans un rapport de 1/0,2 et on maintient Le milieu de culture à pH 7,5 dans des conditions de culture aérobies pendant 3 jours. L'accumulation de L-thréonine et le rendement en acétate (en poids) figurent dans le tableau 3. Tableau 3 L-thréonine Rendement en Souche Caractéristiques accumulée acétate () ATCC 21269 .Vr 15,0 11,0 AJ i2312 AHVr, MPA 21,0 14,0 FERM BP-1173 AJ 12313 AHVr, île 21,5 14,3 AJ 12314 AHVr, Ile-, MpAr 25,0 17,2 Bien entendu diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédé dés qui viennent d'etre décrits uniquement à titre d'exemples non Limitatifs sans sortir du cadre de L'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de L-thréonine par fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans un milieu de culture d'un micro-oryanismes du genre Brevibacterium ou Corvnebacterium résistant à L'acide mycophénolique et capable de produire de ta L-thréonine, l'accumuLation de la L-thréonine dans le milieu, puis la récupération de La L-thréonine qui y est accumulée. 2. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est choisi dans le groupe constitué par les micro-organismes ayant les caractéristiques d'identification FERM BP-1172 et FERM BP-1173.