Brevet FR2600892A1 — publié le 19880108

Le sujet de la présente invention concerne l'utilisation du fructose-l,6- diphosphate (FDP) pourlapréparationde compositions ayant une action protectrice contre l'effet toxique exercé sur le métabolisme et sur l'intégrité cellulaire par l'ad5 ministration prolongée de médicaments antitumoraux anthracyclines. L'invention concerne également les préparations pharmaceutiques correspondantes. Parmi les produits ayant une activité antitumorale, la doxorubicine (DXR) a un effet chimiothérapeutique important, et par 10 conséquent, elle est utilisée dans le traitement de plusieurs tumeurs solides et des lymphadénopathies malignes chez l'homme. Cependant, l'emploi d'un tel médicament est limité à cause de la cardiotoxicité de la molécule apparaissant à la suite de l'administration de celuici, cette cardiotoxicité pouvant être soit aig e soit chronique. La 15 cardiotoxicité aigUe est un phénomène transitoire qui apparalt immédiatement après (et dans certains cas même pendant) l'administration de DXR, qui peut être détecté de manière électrocardiographique, et qui semble être partiellement lié à une augmentation transitoire de la concentration plasmatique de l'histamine mise en circulation 20 par les mastocytes au contact de DXR. Au contraire, la toxicité chronique est une affection apparaissant en résultat de l'administration prolongée de DXR, et elle est caractérisée par la myocytolyse avec des régions nécrotiques bien détectables par voie histologique, etune insuffisance cardiaque congestive. Les mécanismes biochimiques de ces affections ont fait l'objet d'études de longue haleine qui ont fait ressortir l'altération 5 à la fois des paramètres morphologiques et métaboliques cellulaires, dont cependant l'origine n'est pas encore certaine. Des études plus récentes ont conduit à la conclusion que la cardiotoxicité de DXR est principalement due à la capacité de DXR elle même, à produire des types radicalaires de 02. Le radical 10 semiquinonique de DXR, produit "in vivo", subit en fait une oxydation monoélectronique, en utilisant l'oxygène comme un accepteur d'électrons selon le schéma suivant: DXR - + 2 DXR + Par conséquent, la réaction donne naissance au radical 15 semiquinonique de DXR et à l'anion superoxyde 02', démarrant une série de réactions en cascade qui conduisent à la formation d'autres types radicalaires de 02 tels que OH; H202, l'oxygène unitaire. L'augmentation endocellulaire de ces types radicalaires fortement réactifs provoque la peroxydation des lipides de la mem20 brane cellulaire et une modification importante de la structure quaternaire de ceux-ci; ceci entraine l'écoulement du cytoplasme et la mort de la cellule. La diminution des GSH au cours du traitement avec DXR et la faible activité des enzymes du myocarde destinées à éliminer 25 les radicaux de 02 (catalase, SOD, GSH-peroxydase) sont à la base de la spécificité de l'effet toxique de DXR sur le coeur. Des études exhaustives et plusieurs essais effectués par le déposant sur le fructose-1,6-diphosphate, ont conduit de manière surprenanteà déterminer l'existence d'une activité protectrice 30 préalablement inconnue du FDP, qui est confirmée par les expériences dont les résultats sont indiqués ci-après. Les essais cliniques réalisés, ont confirmé que le fructose-1,6diphosphate (FDP), par son interaction avec la membrane cellulaire, modifie la perméabilité ionique et entraine l'activation 35 de la phosphofructoquinase, avec une augmentation des concentrations de FDP endogènes et des concentrations cellulaires de ATP. A travers les recherches faites, on a montré que FDP protège les mastocytes isolés du rat contre la libération d'histamine induite par différentes stimulations chimiques, parmi lesquelles DXR, 5 et inhibe la production des superoxydes induite par des esters de phorbol (PMA) dans les leucocytes polynucléaires isolés de l'homme. D'autres expériences effectuées sur des systèmes cellulaires isolés montrent que la présence de FDP dans le milieu d'incubation ne diminue pas la quantité de DXR qui pénètre à l'intérieur 10 des cellules. Alors apparaît clairement l'emploi extrêmement avantageux de FDP comme moyen de protection contre la cardiotoxicité induite par l'administration prolongée de DXR dans tous ces cas o il est nécessaire de diminuer les complications apparaissant comme la consé15 quence de l'administration prolongée des médicaments antitumoraux anthracyclines à des malades souffrant de pathologies néoplastiques. A présent, la présente invention sera décrite en détail, au simple moyen d'un exemple non limitatif, comme suit. Exemple On effectue les essais sur 100 souris Swiss (50 mâles et 50 femelles) pesant 19 - 21 g. (Charles River), alimentées selon un régime type de laboratoire (Nossan - marque déposée d'aliments pour animaux) et avec de l'eau ad libitum (à volonté), maintenues dans des conditions contr8ôlées d'humidité et de température. La doxorubicine utilisée est celle fabriquée comme matière première par "Farmitalia Carlo Erba". On partage les animaux en deux groupes de traitement, formés chacun de 8 souris: Groupe 1: 0,9 % de NaCl Groupe 2: FDP à la dose de 750 mg/kg On administra NaCl et FDP journalièrement par voie intrapéritonéale, 5 jours par semaine. On donne DXR aux deux groupes, deux fois par semaine, en l'administrant par voie intrapéritonéale à la dose de 2 mg/Kg. 35 Les jours o on administre DXR, on administre les trai- tements 20 minutes avant l'infusion du médicament antitumoral. On tue deux animaux de chaque groupe, respectivement 1, 2, 3, 4 semaines après l'administration de DXR. On répète ce modèle de traitement de manière à avoir 10 animaux pour chaque semaine pour 5 chaque groupe de traitement. On utilise les 20 animaux restant, non soumis au traitement pour déterminer les valeurs de base des paramètres à étudier. On tue les animaux par. décapitation, et on recueille le sang dans des tubes à essais héparinés. On prélève les coeurs et 10 les foies, on les congèle dans de l'azote liquide puis on les homogénéise dans 1,15 % de KC1 froid en -utilisant un homogénéisateur "Ultra Turrax" (Janke et Kunkel). Après avoir pris certaines quantités pour la détermination des protéines, on ajoute aux échantillons,X - 100 Triton (marque déposée) à une concentration finale de 1 %. On détermine 15 les paramètres suivants: glutathion réduit (GSH) - peroxydation lipidique déterminée en malondialdéhyde (MDA) - glucose-6-phosphate déshydrogénase (G - 6 - PDH) 6-phosphogluconate déshydrogénase (6 - PGHD) 20 - catalase On centrifuge le sang recueilli et on détermine les valeurs des paramètres déterminés sauf la peroxydation lipidique par rapport aux globules rouges préalablement lavés, tassés et hémolysés avec de l'eau distillée. De plus, on détermine l'activité de 25 la deshydrogénase lactique (LDH) dans le plasma. On effectue toutes les mesures par spectophotométrie au moyen d'un spectophotomètre Beckman DU - 8. On effectue tous les essais le jour même o les animaux sont tués. On enregistre les données sur des fiches individuelles pour chaque animal en particulier. On évalue la valeur des différences 30 entre les groupes de traitement et les valeurs de base, et celle des différences entre les deux groupes de traitement selon l'essai à un échantillon de Wilcoxon. Dans le modèle expérimental choisi, l'effet toxique de l'administration prolongée de DXR est indiqué par une altération des 35 G - 6 - PDH et 6 PGDH des érythrocytes et du foie,par la catalase des érythrocytes et du coeur, par la LDH du plasma et par la peroxydation lipidique du myocarde. Le tableau 1 montre les valeurs pour les érythrocytes des G - 6 - PDH, 6 PGDH et de la catalase dans l'ensemble des groupes de traitement (NaCl et FDP). Le tableau 2 montre les valeurs de LDH totale dans le plasma pour les deux groupes de traitement. Le tableau 3 montre les valeurs des activités enzymatiques de certainesenzymes du métabolisme hépatique des deux groupes 10 de traitement. Le tableau 4 montre les valeurs de certains paramètres du métabolisme du coeur. L'administration de DXR affecte de manière importante, par rapport aux valeurs de base, les activités érythrocytaires de 15 G - 6 - PDH et 6 PGDH la quatrième semaine et de la catalase la deuxième, troisième et quatrième semaine. L'activité de la LDH totale du plasma augmente toutes les quatre semaines par rapport aux valeurs de base. L'activité de la G - 6 - PDH hépatique se révèle être 20 nettement différente par rapport à la valeur de base, la quatrième semaine. La peroxydation lipidique totale cardiaque et la catalase augmentent de manière importante par rapport à la valeur de base dès la première.semaine d'expérimentation. Dans le groupe au FDP, juste les activités de la LDH totale du plasma à la quatrième semaine, de la peroxydation lipidique totale du coeur à la deuxième et à la quatrième semaine, et l'activité de la catalase du coeur sur l'ensemble des quatre semaines d'expérimentation, se révèlent être nettement différentespar rapport aux valeurs 30 de base. En comparant les deux groupes de traitement, on fait ressortir des différences importantes dans les activités érythrocytaires de la G - 6 PDH à la quatrième semaine, de la 6 - PGDH à la deuxième, troisième et quatrième semaines, et de la catalase à la 35 deuxième, troisième et quatrième semaines. L'activité de la LDH totale du plasma se révèle être nettement différente dans les deux groupes de traitement pour l'ensemble des quatre semaines d'expérimentation. Les activités des G - 6 - PHD et 6 - PGDH hépatiques arrivent à être nettement différentes dans les deux groupes de traitement à la quatrième semaine. La comparaison entre les valeurs de la peroxydation lipidique du coeur entre les deux groupes de traitement fait ressortir des différences importantes dans l'ensemble des quatre semaines d'expérimentation. L'activité de la catalase du coeur se révèle être nettement différente la troisième et la quatrième semaine d'expérimentation. Les données indiquées ci-dessus montrent clairement deux phénomènes distincts: le déclenchement des lésions induites par l'administration prolongée de DXR; l'action protectrice du traitement 15 répété avec FDP. Dans le modèle expérimental, la toxicité de DXR se révèle à la fois au niveau hématique et au niveau tissulaire (foie, coeur). Dans les globules rouges, l'administration de DXR provoque une augmentation des activités des enzymes clés du processus 20 des pentosephosphates (G - 6 PDH et 6 - PGDH) du fait d'une augmentation dans la tension d'oxydation. L'augmentation, en LDH plasmatique totale dépendant de la dose totale de DXR administrée, indique sans erreur possible la lésion produite par la toxicité du médicament antitumoral sur l'in25 tégrité cellulaire. L'analyse par électrophorèse met en évidence une augmentation dans les iso-enzymes hépatiques et cardiaques, ce qui confirme un organotropisme de l'anthracycline. Dans le foie, DXR provoque une augmentation des activités de G - 6 - PDH et de 6 - PGDH comme la conséquence de l'induction 30 du système hépatique microsomal. De même, au cours de cette expérimentation, il est prouvé que la toxicité de DXR provoque une lésion plus importante vis à vis de l'intégrité et de la fonctionnalité des cellules du myocarde. L'augmentation de 3,5 fois les valeurs de base, de l'ac35 tivité de la catalase, met en évidence la quantité importante de H202 provenant de la dismutation spontanée ou catalysée par le SOD cardiaque, des superoxydes produits par l'accumulation,dans le tissu du myocarde de concentrations élevées de DXR. Au contraire, la conduite de tous les paramètres modifiés 5 par DXR, c'est à dire l'ensemble des paramètres en rapport avec les érythrocytes et les tissus, est affectée positivement par le traitement avec FDP. La non activation des globules rouges du processus des pentose-phosphates (G - 6 - PDH et 6 - PGDH) est une conséquence de 10 l'activation de la glycolyse contrôlée par le FDP administré, qui règle positivement la phosphofructoquinase, empêchant ainsi l'oxydation du glucose par un processus différent du processus glycolytique. La diminution de la lésion des tissus induite par DXR, suite au traitement avec FDP, est clairement montrée par les valeurs 15 de la LDH plasmatique, qui sont indicatives de la nécrose cellulaire. Dans le groupe traité au FDP, on n'enregistre pas de variations importantes par rapport à la valeur de base jusqu'à la troisième semaine d'administration de DXR. L'action protectrice du FDP évite toute augmentation 20 des activités enzymatiques des enzymes du processus des pentose-phosphates dans le foie. Le mécanisme selon lequel le FDP agit probablement sur ces paramètres, est toujours lié avec son aptitude à stimuler le métabolisme cellulaire du glucose. L'effet protecteur du FDP apparaît de manière plus probante au niveau cardiaque, là o est plus 25 évidente la lésion provenant de l'administration prolongée de DXR. L'activité de la catalase augmente par rapport à la valeur de base dans le groupe au FDP, mais elle se révèle être deux fois moindre que la valeur trouvée dans le groupe au NaCl. Une situation analogue se produit pour la peroxydation lipidique, qui est certainement l'in30 dice biochimique de base de l'intégrité structurale et par conséquent fonctionnelle de la membrane cellulaire. En fait, la valeur du MDA évaluée dans le groupe au FDP, la quatrième semaine d'expérimentation, est inférieure à la moitié de la valeur du MDA dans le groupe au NaCl. Tableau 1 Effet de 700 mg/kg, i. p. (intrapéritonéale) de FDP et de 0,9 %, i. p. de NaCl sur la lésion provoquée par l'administra- tion prolongée de 2 mg/kg, i. p., de DXR, sur les activités de cer5 taines enzymes du métabolisme relatif aux érythrocytes chez la souris 15 20 Valeurs moyennes et d. s. Semaines G - 6 - PDH 6 - PGDH Catalase Traitements de traitement (UI/g Hb) (UI/g Hb) (UIx10O3/g Hb 0 (n = 20) 43,85 8,59 81,57 ( 9,31) (3,47) (17,78) 1 (n = 10) 38,38 8,51 80,02 (15,21) (3,21) (31,01) FDP 2 (n = 10) 40,70 6,61* 81,98* (14,54) (2,43) (15,76) 3 (n = 10) 41,26 7,22* 82,52* ('7,91) (2,35) (30,94) 4 (n = 10) 42,30* 7,27* 80,16* (7,34) (2,40) (14,01) 0 (n = 20) 1 (n = 10) NaCl 2 (n = 10) 3 (n = TO) 4 (n = 10) 43,85 ( 9,31) 43,73 (22,21) ,39 (14,18) 43,52 ( 7,48) 53,94 + (7,48) 8,59 (3,47) 8,69 (5,17) 9,45 -(2,90) ,18 (3,93) 11,94 + (2,82) 81,57 (17,78) 107,63 (35,95) 106,13 + (20,98) 109,54 + (25,67) 107,38 + (20,01) * p Tableau 2 Effet de 750 mg/kg, i. p., de FDP et 0,9 %, i. p., de NaCl,caOEtre la lésion induite par l'administration prolongée de 2 mg/Kg i. p., de DXR, sur l'activité totale de la LDH plasmatique chez la souris. 15 20 Valeurs moyennes et d. s. Semaines de LDH Traitements traitement (UI/1 plasma) 0 (n = 20.) 211, 12 (49,95) 1 (n = 10) 226,19 * (41,59) FDP 2 (n = 10) 267,84 * (71,24) 3 (n = 10) 280,42 * (75,50) 4 (n = 10) 302,13 * + (42,38) 30 NaCl 0 (n = 20) 1 (n = 10) 2 (n = 10) 3 (n = 10) 4 (n = 10) 211,12 (49,95) 361,22 + (54,60) 379,41 + (76,36) 402,73 + (86,23) 410,98 + (61,66) * p Tableau 3 Effet de 750 mg/kg, i. p., de FDP et de 0,9 %,-i. p., de NaCl contela lésion induite par l'administration prolongée de 2 mg/kg, i. p., de DXR, sur les activités de certaines enzymes du méta5 bolisme hépatique chez la souris. 15 20 Valeurs moyennes et d. s. Semaines de G - 6 - PDH 6 - PGDH Traitements traitement (UI/g protéines) (UI/g protéines) 0 (n = 20) 3,86 3,.67 (1,42) (1,28) 1 (n = 10) 3,40 3,25 (1,44) (0,89) FDP 2 (n = 10) 3,60 3,26 (1,64) (1,20) 3 (n = 10) 3,35 3,15 (1,14) (1,14) 4 (n = 10) 3,48 * 3,11 * (1,30) (1,33) 30 35 NaCl 0 (n = 20) 1 (n = 10) 2 (n = 10) 3 (n = 10) 4 (n = 10) 3,89 (1,42) 4,37 (1,59) 4,60 (2,25) 4,15 (1,79) ,84 + (2,15) 3,67 (1,28) 3,92 (1,33) 4,09 (1,98) 3,27 (1,38) 4,50 (0,84) * p Tableau 4 Effet de 750 mg/kg, i. p., de FDP et de 0,9 %, i. p., de NaCl cotrela lésion induite par l'administration prolongée de 2 mg/kg, i. p., de DXR, sur certains paramètres du métabolisme cardia5 que sur la souris. 15 20 Valeurs moyennes et d. s. Semaines de Peroxydation lipidique Catalase Traitements TRAITEMENT (Nombre de moles MDA/g (UI x 10 /g prot.) prot.) 0 (n = 20) 27,86 14,75 (7,56) (8,31) 1 (n = 10) 33,53 * 23,14 + (9,05) (10,90) FDP 2 (n = 10) 36,44 * + 25,81 + (4,72) (10,29) 3 (n = 10) 37,32 * 20,55 * + (15,69) ( 4,67) 4 (n = 10) 43,82 * + 23,92 * + (12,12) ( 6,32) O (n = 201 (n = 10) 27,86 ( 7,56) 14,75 ( 8,31) NAC1 2 (n = 10) 3 (n = 10) 47,83 + ( 5,37) 54,29 + ( 5,01) 83,90 + (23,79) 28,36 + (10,87) 26,66 + (13,11) 37,51 + ( 6,74) ,13 + ( 5,00) 4 (n = 10) 88,64 + 1 1 ( 9,52) 35 * p L'importance de ces résultats est liée à la large utilisation des médicaments antitumoraux anthracyclines, et par conséquent à la possibilité offerte par la présente invention de prévenir l'apparition des effets secondaires nuisibles, grâce au traitement avec 5 le fructose1,6-diphosphate, dans de nombreuses situations thérapeutiques. REVENDICATIONS 1 - Utilisation du fructose-1,6-diphosphate pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour la protection contre la toxicité provoquée par l'administration des médicaments antitumoraux anthracyclines. 2 - Composition pharmaceutique à activité protectrice contre les lésions induites par l'administration des médicaments antitumoraux anthracyclines caractérisée en ce qu'elle comprend le sel de sodium du fructose-1,6diphosphate, en poudre lyophile et un solvant convenable pour une administration intraveineuse. 3 - Composition pharmaceutique à activité protectrice contre les lésions induites par l'administration des médicaments anthracyclines caractérisée en ce qu'elle comprend une solution aqueuse de sel de sodium du fructose-1,6-diphosphate.