Brevet FR2605109A1 — publié le 19880415

_21 _ La présente invention concerne un procédé de dosage de l'hormone parathyroidienne, ou parathormone (PTH) dans un échantillon biologique. - La PTH est une hormone polypeptidique synthétisée par les glandes parathyroidiennes. On la trouve essentiel- lement dans le sang, soit entière, soit sous la forme de fragments. Ces fragments peuvent être actifs (terminaison NH2) ou inactifs (terminaison COOH). La PTH est très vite dégradée dans le sang (demi- vie inférieure ou égale à 20 minutes). La PTH possède des actions physiologiques variées; elle intervient notamment dans le métabolisme du calcium et du phosphore et favorise l'absorption intestinale de la vitamine D; la régulation de la sécrétion de la PTH est liée à la fraction ionisée du calcium plasmatique. Les dérèglements des glandes parathyro!des sont de deux ordres: les hypofonctionnements ou hypoparthyroidie et les hyperfonctionnements ou hyperparathyroidies; ces dernières peuvent être"secondaires" ou réactionelles dans le cas d'un appauvrissement du sang en calcium; elles peuvent aussi être "primaires", dues notamment à des tumeurs parathyroidiennes, et ayant alors de grandes manifestations osseuses ou viscerales. Pour détecter tous ces dérèglements, et en parti- culier pour détecter à temps une tumeur, il est nécessaire de pouvoir évaluer la concentration en parathormone dans un échantillon biologique, plus particulièrement dans le sang, le sérum ou le plasma. La technique de dosage connue pour être la plus appropriée est une technique immunologique. Il est connu aussi que la performance d'un immuno- essai de la parathormone repose sur sa capacité à discri- miner les patients atteints d'hyperparathyroidie, notam- ment primaire, et les patients normaux. Or, pour la plupart des dosages, on note l'ap- parition d'échantillons "faussement positifs" dans la po- pulation normale, rendant la discrimination entre normaux et hyperparathyroldie primaire à l'aide d'immuno-essais extrêmement hasardeuse. Cette élévation anormale des taux de parathor- mone chez des sujets normaux est due à la présence de pro- téines interférentes dans le plasma ou de protéines vec- trices de la parathormone qui joueraient un rôle de réser- voir à parathormone. La présente invention propose un procédé per- mettant d'éliminer ces interférences. Pour ce faire, l'é- chantillon biologique dans lequel on doit effectuer le dosage, est préalablement soumis à un extraction des pro- téines interférentes ou vectrices de la PTH. Cette extraction est réalisée à l'aide de poly- éthylène glycol (PEG), qui sera, de préférence du PEG 6000. A la suite de ce traitement par le PEG, on effectue selon la présente invention un dosage par une technique immunologique connue, de préférence par une tech- nique radio-immrunologique. L'échantillon biologique utile au procédé de dosage selon la présente invention est, de préférence, un échantillon sanguin, serique ou plasmatique. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples et de la figure unique qui représente les teneurs en PTH établies: - Q avant, et W après, le traitement de l'échantillon plasmatique par le PEG 6000 chez 22 sujets normaux (colonne de gauche) et chez 13 sujets atteints d'hyperthyroidie primaire (colonne de droite). 2605 109 -3- EXEMPLE 1: SCHEMA DE L'ESSAI Traitement des échantillons par le PEG 6000 Dans un tube à essai en polystyrène, on ajoute 0,2 ml de PEG 6000 (40 % poids/volume) à 0,4 ml de préparation d'éta- lonnage ou d'échantillon plasmatique. Après avoir vortexé le contenu des tubes, ceux-ci sont centrifugés durant 15 minutes à une vitesse de-3000 tours/ minute. Le surnageant de chaque tube est alors'récupéré et employé pour le dosage. Dosage de la parathormone présente dans le surnageant à l'aide d'un radioimmuno-essai L'antisérum utilisé a été obtenu chez le lapin par immuni- sation avec de la parathormone bovine. La préparation de référence a été réalisée avec le fragment synthétique 44-68 de la parathormone humaine. Du fragment synthétique 44-68 tyrolisé en position 43 a été marqué à l'iode 125. 0,1 ml de surnageant (préparation de référence à différentes doses ou échantillons plasmatiques) et 0,1 ml d'antisérun dilué sont incubés durant 1 nuit à 4 C. On ajoute ensuite 0,1 ml de traceur (+0,02 pci). Après une incubation de 4 heures à 4 C, un antisérum dirigé contre les gamma-globulines de lapin et contenant du PEG 6000 (6 % poids/volume) est ajouté à tous les tubes. Apres une incubation de 20 minutes à température ambiante, tous les complexes antigène-anticorps sont précipités. Les tubes sont centrifugés durant 15 minutes à 3000 tours/minute et la radioactivité continue dans le culot est déterminée. Une courbe de référence est construite et les concentra- tions en parathormone contenues dans les échantillons sont déterminées par interpolation à partir de cette courbe. - 4 - EXEMPLE 2: RESULTATS OBTENUS A L'ISSU DE L'ESSAI SCHEMA- TISE A L'EXEMPLE 1 22 plasmas de sujets normaux et 13 plasmas de sujets atteints d'hyperparthyroldie primaire ont été dosés avant et après traitement par le PEG 6000. Comme montré sur la figure en annexe, 5 des 22 patients normaux dont les taux de parathormone sont supérieurs à 500 picogrammes/ml (pg/ml) présentent une diminution im- portante en taux de parathormone après traitement au PEG. Pour les 17 autres cas normaux, on note également une légère diminution des taux de PTH après traitement. Par contre, chez les patients atteints d'hperparthyroidie primaire, on observe après traitement au PEG 6000 une aug- mentation importante des taux de parathormone chez 2 pa- tients dont les valeurs en parathormone sont déjà fort élevées avant traitement. Une diminution du taux de para- thormone après traitement est observée chez un patient. Dans les autres cas d'hyperparathyroidie primaire ana- lyséson n'observe pas de variation significative avant et après traitement par le PEG 6000. Le tableau ci-dessous résume les valeurs moyennes, extrêmes obtenues dans les différents cas. Sujets normaux Sujets hlperparathyroïdiens (n = 22).primaires (n = 13) Avant traitement:Après traitement Avant traitement:Après traite- au PEG 6000 au PEG 6000 au PEG 6000:ment au PEG, Valeur moyenne t ng/ml) * 531 153 606: 671 Extrême (ng/ml) 252 - 2043 100 - 236 308 - 1956:279 2585 -5 -2605 Il en résulte donc, après traitement des échantillons par le PEG, et contrairement aux résultats obtenus sans extrac- tion, une parfaite discrimination entre population normale et population de sujet atteints d'hyperpaÉhyroIdie primaire. - 6 - REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage du type immuno-essai permettant d'évaluer la concentration en PTH dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'échan- tillon biologique est, préalablement au dosage propre- ment dit, soumis à une extraction des protéines interfé- rentes ou vectrices de la PTH à l'aide de PEG. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le PEG est du PEG 6000. 3. Procédé sel6n la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'échantillon biologique est du sang, du sérum ou du plasma. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'immuno-essai est un radio-immuno- essai.