Brevet FR2607807A1 — publié le 19880610

L'immunité naturelle est la propriété particulière que possède l'organisme d'un individu à se défendre contre les agressions microbiennes ou virales . Cependant, si l'individu est affaibli par une maladie, une opération, s'il est cirrhotique, diabétique, cancéreux, etc.... l'organisme ne pourra le défendre Pour pallier le déficit immunitaire d'un individu, or. développe actuellement des techniques destinées à provoquer l'immunité artificielle active au moyen de vaccins, ou passive par injection de sérums ou solutions immuno-spécifiques Parmi tous les sérums ou solution immuno spécifiques employés on synthétise actuellement des complexes organiques de cobalt préparés à partir d'acrylamine En effet, on a noté que sur des leucocytes mis préalablement en contact avec des germes définis comme des s~aphylocogues ares ou des sa7mc.el7es, le complexe acrylamine - cobalt exaltait l'activté bactéricide des leucocytes. Par exemple , sur un mélange tamponné contenant 10.000 leucocytes 3 par mm et 20 germes par leucocyte, on introduit, après numération, le complexe acrylamine-cobalt. Après incubation pendant 18 h. à 370C et agitation lente , on effectue une numératior. de germes selon les méthodes habituelles . On constate que par rapport au mélange témoin qui n'a pas reçu de complexe acrylamine-cobalt les germes ont pratiquement disparus D'autres essais ont été pratiqués sur des souris contaminées par des cellules cancéreuses hautement pathogènes. On a constaté que l'injection de complexe de cobalt fait décilitre rapidement la quantité de cellules cancéreuses. L'élimination est totale en 10 jours tandis que les leucocytes réapparaissent 50 % des souris ainsi traitées guérissent, tandsi que les témoins meurent On peut ainsi apprécier l'importance du complexe acrylaminecobalt dans les traitements immunologiques . Pour préparer le complexe on utilise le procédé suivant : on mélange en milieu anhydre , à 700C , des polyc? avec une amine primaire ou secondaire . Le précipité cristallisé obtenu est lavé dans un solvant du type éthanolamine séché, puis redissous dans l'eau distillée . Cette solution aqueuse est mélangée à une solution diluée de sel de cobalt en excès . Le précipité obtenu est remis en solution aqueuse avec un excès d'éthanolamine et soumis à une oxydation anodique afin d'amener les sels cobalteux à la valence supérieure . Les sels cobaltigues obtenus in situ au niveau de l'anode forment avec l'acrgla;-ne un complexe cobaltique .Ce dernier doit être purifié et caractérisé avant son utilisation médicale La présente invention concerne les procédés de purification et de caractérisation de ce complexe cobaltique Le nouveau procédé de purification et d'identificatior, de l'acrylamine de cobalt est caractérisé en ce qu'il comporte une purification par électrodialyse, sulvie d'une séparation par électrophorèse descendante dans une solution de chlorure de sodium dilué, le complexe isolé est identifié par un contrôle spectrophotométrique d'absorption sur la longueur d'ondes de 320 et 535nu La présente invention ainsi définie rpésente de nombreux avantages et notamment - une grande efficacité de purification puisque le produit obtenu peut être directement utilisé en injection - une facilité de mise en oeuvre des techniques de purification qui peuvent aisément être automatisées - une asepsie des techniques appliquées - un faible coût de mise en oeuvre - une grande spécificité de caractérisation Le procédé de purification et de caractérisation du complexe acrylamine - cobalt sera mieux compris grâce à la description du procédé mis en oeuvre qui n'est présenté qu'à titre d'exemple nor. limitatif , notamment en ce qui concerne les moyens d'identification du complexe obtenu La solution acrylanine cobaltique située dans le compartiment anodique de la cuve d'électrolyse, où elle a subi l'oxwdation, est reprise, filtrée et concentrée par distillation sous vide, par exemple , afir; d'obtenir un volume de solution minimal débarassé de toute trace d'hypochlorite ou de chlorate Ce complexe est ensuite dilué au moyen d'acide chlorhydrique afin d'obtenir une solution acide décinormale . La solution acide est versée dans le compartiment central d'une cuve d'électrolyse divisée en trois compartiments Le compartiment cathodique et sa cathode en platine est isolé par une membrane échangeuse d'ions cationique , le compartiment anionique et son anode en platine est isolé par une membrane échangeuse d'ions anionique .Les compartiments anodique et cathodique reçoivent une solution pure d'acide chlorhydrique décinormale;le compartiment central contient la solution acrylamine-cobalt . On applique entre les électrodes une tension de polarisation de 4 v 5. Afin d'éviter l'élévation de température dûe à la chute ohmigue à l'intérieur de la cuve et l'évaporation de la solution , celle-ci est maintenue à 200C au moyen d'un bain thermostaté L'opération d 'électrodialyse est poursuivie -en contrôlant l'intensité du courant débité . Lorsque cette intensité diminue on arrête l'opération La solution du compartiment central est alors reprise et neutralisée avec une solution de soude jusqu'à pH = 7 .On titient ainsi un complexe acrylamine-cobalt dilué dans une solution décinorma e de chlorure de sodium La solution acrylamine cobalt ainsi obtenue est purifiée au moyen d'une électrophorèse descendante ou chromatoélectrophorétique Cette solution est alors placée dans un réservoir situé au-dessus du papier électrophorétique tendu verticalement . A la base de ce papier on a pratiqué un découpage en languettes triangulawres De chaque côté du papier est appliquée une tension continue de polarisation au moyen d'électrodes de platine la solution placée dans le réservoir s'écoule lentement sur le papier , dans le sens descendant, selon un écoulement laminaire A l'intérieur de la chambre de migration on entretient un champ électrique transversal et continu de 100 v par rapport au sens d'écoulement du liquide . Les molécules du complexe acrylamine-cobalt sont, de ce fait déviées de leur trajectoire normale vers la tension anodique et l'angle de cette déviation est uniquement fonction de la mobilité électrophorétique de la fraction considérée En l'occurence, seul le complexe acrylamine-cobalt migre vers la zone anodique du papier et s'écoule dans la languette triangulaire correspondante . A la sortie de la chambre électro ph oréti que, on recueille le complexe purifié qui est évacué goutte à goutte au moyen d'une pompe péristaltique Le complexe est généralement récupéré au travers de 2 ou 3 languettes triangulaires et est soumis à un contrôle au moyen d'un spectrophotomètre d'absorption sur la longueur d'ondes caractéristique de 320 et535 nm. La hauteur du pic permet de déterminer la concentration de la solutisn Revendication 1 Nouveau procédé de purification et d'identification de l'acrylamine de cobalt à action immuno stimulante caractérisé en ce qu'il comporte une purification par électrodialyse suivie d'une séparation par chromato électrophorèse et identifié par spectrophotométrie d'absorption Revendication 2 Nouveau procédé de purification et d'identification de l'acrylamine de cobalt à action immunostimulante caractérisé en ce que l'excès d'ions cobalt est éliminé au moyen du traitement de la solution par électrodialyse en milieu acide chlorhydrique décinormal, la solution a purifier étant placée dans le compartiment central d'une celluel d'électrodialyse, le compartiment anodique et le compartiment cathodique de cette cellule étant isolés du compartiment central respectivement par des membranes échangeuses d'ions anioniques et cathionique entre les électrodes de platine en maintenant une tension continue de polarisation de 4,5 v, la cellule étant maintenue à 2O0C au moyen d'un bain thermostaté Revendication 3 Nouveau procédé de purification et d'identification de l'acrylamine de cobalt à action immuno stimulante caractérisé en ce que le complexe est isolé au moyen d'une chromato électrophorèse, la solution d'acrylamine-cobalt neutralisé diluée dans un électrolyte de chlorure de sodium décinormal s'écoule suivant un régime laminaire sur un papier électrophoréti que vertical, à l'intérieur d'une chambre refroidie où est entretenu un champ électrique transversal , les molécules d'acrylamine-cobalt migrant vers le compartiment anodique où elles sont récupérées au moyen de pompe péristaltique Revendication 4 Nouveau procédé de purification et d'identification de lacrylamine-cobalt à action immuno stimulante caractérisé en ce que le complexe est identifié au moyen d'une spectrophotométrie d'absorption sur la longueur d'ondes de 320 et 535 nm