Brevet FR2600078A1 — publié le 19871218

Procd de prparation de facteur XIII partir du placenta. Procédé de préparation de facteur XIII à partir du placenta. La présente invention a trait à un procédé de préparation de facteur XIII ou d'une fraction enrichie en facteur XIII à partir du placenta. Le facteur XIII ou facteur stabilisant de la 5 fibrine joue un rôle essentiel dans la coagulation du sang, en réticulant et consolidant le caillot formé, après avoir été lui-même activé par la thrombine, assurant ansi un arrêt durable de l'hémoragie. Ce facteur a également une action importante dans les mécanismes de cicatrisation en 10 favorisant la prolifération des fibroblastes et la reconstitution du tissu conjonctif lésé. Le facteur XIII présente un intérêt thérapeutique chez les patients qui souffrent d'un déficit héréditaire ou acquis en facteur XIII et présentent des 15 symptômes hémorragiques. Il peut être également chirurgie pour compenser une baisse post-opératoire du taux de facteur XIII sanguin et favoriser une cicatrisation rapide. L'administration de facteur XIII donne des résultats également intéressants dans le traitement de la sclérodermie systémique. Par ailleurs, le facteur XIII peut être utilisé dans les compositions de colle biologique à base de fibrinogène comme facteur de consolidation. Le placenta représente la source de facteur XIII la plus intéressante du point de vue économique et on connaît déjà plusieurs procédés d'isolation du facteur XIII à partir de cette source. Ainsi, le brevet US 4.285.933 décrit un procédé de concentration du facteur XIII à partir d'une fraction brute globulinique obtenue après extraction du sang placentaire à l'aide d'une solution saline, et séparée d'une fraction brute riche en albumine, parprécipitation à pH de 6 15 à 9 en présence de 4 à 9% d'un polymère ou co-polymère alkylène oxyde tel que le Pluronic, le surnageant étant amené à une concentration de 20 à 30% de ce polyol pour précipiter une fraction riche en facteur XIII qui est ensuite traitée par des étapes connues de chromatographie 20 sur colonnes échangeuses d'ions, dialyse et filtration stérilisante: Un tel procédé présente l'inconvénient de mettre en oeuvre une étape de fractionnement du sang placentaire au sulfate d'ammonium, procédé peu intéressant pour la 25 récupération ultérieure de l'albumine qui constitue une protéine d'intérêt thérapeutique et économique majeur du placenta. En outre, les gamma-globulines, qui constituent un autre composant protéinique d'intérêt majeur, sont perdues en partie. Le brevet belge 777.135 décrit un procédé consistant également à procéder à une extraction en solution saline du sang contenu dans la matière placentaire, puis à précipiter la fraction riche en facteur XIII à 1, 'aide delactate de diamino-éthoxy-aeridine (rivanol), après quoi le 35 facteur XIII est purifié à partir de ce précipité à l'aide d'un procédé de fractionnement par le sulfate d'ammonium, suivi d'une filtration sur gel et d'une précipitation à l'état d'euglobuline. Le brevet belge 777.136 décrit un procédé similaire dans lequel le précipité obtenu lors de l'étape de 5 précipitation au rivanol est traité par un procédé de fractionnement usuel à l'alcool, suivi d'une filtration sur gel et d'une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. Dans ces deux procédés, la récupération ultérieure de l'albumine et des gamma-globulines est égale10 ment difficile et ne peut pas être complète. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de préparation de facteur XIII permettant d'assurer une récupération optimale de l'albumine et des gamma-globulines ainsi que 15 d'autres constituants intéressants du placenta. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé qui puisse être mis en oeuvre de façon particulièrement économique. Un autre objectif encore de l'invention est 20 de fournir un tel procédé permettant d'améliorer la stabilité du facteur XIII, non seulement pendant les opérations de purification mais- également après la fin de ces opérations. L'invention a pour objet un procédé de 25 préparation de facteur XIII à partir du placenta dans lequel on efectue une extraction du sang placentaire, caractérisé en ce que l'on prépare, directement à partir du sang placentaire, un précipité alcoolique riche en facteur XIII et que l'on soumet ensuite ce précipité à une purification pour 30 purifier le facteur XIII obtenu. La teneur en facteur XIII de ce précipité est de l'ordre de 40 à 60% du facteur XIII contenu dans le sang placentaire initial. Dans une première forme de réalisation, on 35 effectue une précipitation alcoolique selon la méthode de TAYLOR pour précipiter le bloc des globulines, l'albumine restant dans le surnageant, après quoi on reprend le bloc de globulines et l'on sépare les gamma-globulines d'avec la fraction insoluble restante qui constitue la fraction riche en facteur XIII. La reprise du bloc de globulines en solution s'effectue de préférence à un pH acide compris entre 4,6 et 5,4 de préférence 4,8 à une température comprise entre O et 10'C, de préférence O'C et une concentration en chlorure de sodium de O à 10 g/l, de préférence 4 g/1 et avec un taux 10 d'alcool résiduel de 2 à 8%, de préférence 3,5%. De préférence, dans un premier mode de mise en oeuvre, après avoir décongelé le placenta broyé à basse température, on extrait le sang placentaire à une température comprise de préférence entre O et 10'C à l'aide 15 d'eau ou d'une solution aqueuse contenant éventuellement un sel, de préférence le chlorure de sodium à une concentration de 4 à 10 g/1 et éventuellement un alcool, de préférence l'éthanol, à une concentration de 8 à 15%, de préférence 12% vol/vol si l'on utilise un litre de solution extractive pour 20 1kg de placenta. Après élimination du tissu par pressage, on précipite le bloc de globulines à pH neutre compris entre 6, 5 et 7,5 et à basse température entre O et -8'C, par exemple -5 ou -6'C, par addition d'alcool jusqu'à un taux de l'ordre de 25% (vol/vol). Le précipité de globulines est 25 recueilli puis dispersé en solution saline à un pH acide et à basse température et la fraction insoluble est recueillie, par exemple par centrifugation. La fraction soluble qui contient les gamma-globulines peut être soumise au fractionnement à l'alcool de TAYLOR. Dans un second mode de mise en oeuvre, on précipite une fraction insoluble directement à partir de l'extrait placentaire débarrassé du tissu en solution alcoolique à environ 7% et à température abaissée. Pour cela, on élimine le tissu par pressage et on procède à une 35 étape de clarification à pH acide de préférence entre 4,6 et ,4, notamment 5,1, de préférence en solution alcoolique à 7%, à température de préférence entre O et 10'C, par exemple 2'C, permettant d'obtenir un précipité que l'on recueille par centrifugation. Ce précipité constitue la fraction riche en facteur XIII. Le surnageant qui contient les gamma5, globulines et l'albumine peut être soumis au fractionnement ultérieur habituel de TAYLOR. Le précipité formant la fraction riche en facteur XIII contient également une quantité notable de lipides, quel que soit le mode de mise en oeuvre de 10 l'invention. Le précipité riche en facteur XIII peut ensuite être traité par tout procédé usuel de purification du facteur XIII. On le reprend de préférence d'abord en tampon phosphae à pH 7,2 après quoi on le soumet à des 15 opérations de purification usuelles, par exemple au rivanol, au sulfate d'ammonium, puis chromatographie. Pour augmenter la stabilité du facteur XIII, on peut avantageusement ajouter, au début et/ou pendant les étapes de préparation, un agent chelatant de calcium tel que 20 l'EDTA (sel sodique de l'acide éthylène diamine tétraacétique) ou un citrate. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1. 12 tonnes de placenta humain congelé sont broyés et décongelées à une température inférieure à 10'C dans un volume de 12.000 litres de solution aqueuse contenant 6 g/l de chlorure de sodium et 12% d'alcool éthy30 lique. Après élimination du tissu par pressage, le bloc de globulines est précipité d'après la méthode de TAYLOR à un pH neutre et à -6C par addition d'éthanol jusqu'à un taux d'environ 25%. L'albumine reste dans le surnageant. On recueille par centrifugation le précipité de globulines que l'on disperse à pH 4,8 dans environ 10.000 litres d'une solution à O'C contenant 4 g/l de chlorure de sodium. La fraction restant insoluble, qui est dénommée ci-après précipité B1, est recueillie par centrifugation. Le sur5 nageant qui contient les gamma-globulines est soumis au fractionnement à l'alcool de TAYLOR permettant. de récupérer de manière optimale les gamma-globulines. On procède ensuite à une extraction d'une partie aliquote du précipité B1 par 5 à 10 volumes de tampon 10 phosphate 50 mM à pH 7,2, contenant 2 g/l d'EDTA. Après centrifugation, on recueille le surnageant qui contient le facteur XIII. L'activité de ce surnageant en facteur XIII est mesurée à l'aide d'un test de dissolution d'un caillot 15 de fibrine par l'acide monochloracétique. Une unité correspond à l'activité d'un ml du placenta obtenu d'un pool de donneurs. Le rendement mesuré est de 1.155 unités/kg de placenta avec une activité spécifique de 537 unités/g de 20 protéines (valeurs moyennes obtenues à partir de 11 lots de 12 tonnes de placentas). Le facteur XIII présent dans cet extrait de précipité B1 représente environ 40% du facteur XIII contenu dans le placenta. Exemple 2. On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1 en ajoutant de l'EDTA à la solution de 6 g/i de chlorure de sodium contenant 12% d'alcool éthylique dans laquelle on broie et décongèle le placenta de façon à obtenir une con30 centration de 1 à 2 g/l d'EDTA. On ajoute également de l'EDTA à 1 à 2 g/l au volume de solution à 4 g/l de chlorure de sodium dans laquelle on disperse le bloc de globulines. La stabilité de l'extrait phosphate du précipité B1 dans le temps a été déterminée de la façon suivante: l'activité en facteur XIII est mesurée, comme dans l'exemple 1, sur l'extrait fraîchement obtenu, puis à nouveau après une journée de repos à 20C. La baisse 5 d'activité observée dans ce laps de temps sur l'extrait obtenu dans cet exemple est égale à 21% contre 75% dans l'exemple 1 (valeurs moyennes sur 4 essais); Exemple 3. 3 tonnes de placenta humain congelé sont 10 broyées et décongelées à une température inférieure à 10'C dans un volume-de solution contenant 12% d'alcool éthylique. Après élimination du tissu par pressage, on procède à une étape de clarification. Pour cette étape de clarification, on abaisse 15 le pH à 5,1 à une température de 2'C. On recueille la partie insoluble par centrifugation. Cette fraction insoluble est appelée "nouveau précipité Bi". Le surnageant, qui contient les gammaglobulines et l'albumine, est soumis aux étapes de frac20 tionnement de TAYLOR usuelles permettant la préparation de fractions purifiées de gamma-globulines et, en combinaison avec d'autres méthodes connues, d'albumine. Le "nouveau précipité Bi" est extrait par 5 à 10 volumes de tampon phosphate de 50 mM à pH 7,2 contenant 25 de 1 à 2 g/l d'EDTA. On mesure son activité comme dans l'exemple 1. Les résultats sont portés dans le tableau 1 qui relate, plus précisément, les résultats de deux essais A et B. TABLEAU 1 ACTIVITE FACTEUR XIII (U /kg placenta) STADE - - - - - - - - - - - - - ___ESSAI A ESSAI B Sang placentaire 2.160 (100 %) 3.147 (100 %) Nouveau précipité Bl 94C ( 43 %) 1.580 ( 50) Entre parenthèses: le rendement d'extraction du facteur XIII Exemple 4 Un extrait en 10 volumes de tampon phosphate obtenu comme dans l'exemple 2 et appelé ci-après "EXTRAIT Bi" est purifié comme suit: Après ajustement du pH à 7,0 20 avec de l'acide chlorhydrique dilué on ajoute à une température de + 4'C du rivanol en solution à 30 g/l pour obtenir un taux final'de 1,5 g/1. Le précipité obtenu est séparé par centrifugation puis extrait à pH 7,2 par 10 volumes d'une solution à-25 g/l de chlorure de sodium et 2 25 g/l d'EDTA. On sépare l'insoluble par centrifugation et mesure l'activité du surnageant, appelé ci-après "EXTRAIT Rivanol", comme expliqué dans l'exemple 1 pour l'extrait du précipité B1 en tampon phosphate; les résultats obtenus lors de 3 expériences séparées sont reportés dans le tableau 30 2. TABLEAU 2 EXTRAIT B1 ACTIVITE FACTEUR 'III If EXTRAIT RIVPNOL ACTIVITE FACTEUR 'III 10 U/Kg placenta Activité spéc. U/Kg placenta Activité spéc. U/g protéine U/g protéine Essai 1 Essai 2 ssai 3 2.157 (100 %) 1.698 (100 %) 1.826 (100 %) 455 483 292 1.412 (65 %) 879 (52 %) 1.454 (80 %) 1.032 729 1.237 Entre parenthèse: le rendement de purification Exemple 5 Un extrait en 10 volumes de tampon phosphate est obtenu comme dans l'exemple 1, c'est-à-dire sans addition d'EDTA à l'extraction du sang placentaire et du bloc 20 des globulines. Il est purifié par le rivanol comme dans l'exemple 4. La stabilité de l'extrait rivanol dans le temps est mesurée comme indiqué dans l'exemple 2 pour l'extrait du précipité B1. La baisse d'activité observée est égale à 78 % contre 15 % en moyenne pour les essais 1, 2 et 3 de 25 l'exemple 4. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de facteur XIII à partir du placenta dans lequel on effectue une extraction du sang placentaire, caractérisé en ce que l'on prépare, 5 directement à partir du sang placentaire extrait, un précipité alcoolique riche en facteur XIII et que l'on soumet ensuite ce précipité à une purification pour purifier le facteur XIII obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, 10 caractérisé en ce que l'on effectue une précipitation alcoolique du bloc des globulines, après quoi on reprend le bloc globulines en solution et l'on sépare les globulines d'avec la fraction insoluble restante, laquelle constitue la fraction riche en facteur XIII. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on précipite le bloc de globuline à pH neutre, compris entre 6,5 et 7,5, basse température, comprise entre O et -8'C notamment - 5'C et addition d'alcool notamment éthanol selon la méthode de Taylor, de 20 préférence à un taux de l'ordre de 25 % Vol/Vol. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de clarification à pH acide du sang placentaire et que l'on récupère le précipité obtenu qui constitue la fraction riche en facteur 25 XIII. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape de clarification s'effectue en solution alcoolique de l'ordre de 7 %, -à température abaissée comprise entre O et 10'C, de préférence + 2'C pH 30 acide compris entre 4,6 et 5,4, de préférence 5,1. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fraction riche en facteur XIII est soumise à des étapes de purification supplémentaires, notamment de précipitation au rivanol. 7. Procédé seon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on ajoute, au début et pendant l'étape de préparation un agent tel que de l'EDTA ou citrate, pour augmenter la stabilité du facteur XIII. 8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on reprend le bloc de globuline à pH 5 acide entre 4,6 et 5,4, notamment 4,8, à température comprise entre O et 10'C, notamment O'C et à une concentration en chlorure de sodium de O à 10 g/l, notamment 4 g/1 avec un taux d'alcool résiduel de 2 à 8 %, notamment 3,5 %. 9. Procédé selon l'une quelconque des reven10 dications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on extrait le sang placentaire du placenta à une température comprise entre O et 10'C à l'aide d'eau ou d'une solution acqueuse, notamment de chlorure de sodium à une concentration entre 4 et 10 g/l. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution acqueuse contient de l'alcool, notamment l'éthanol à une concentration de 8 à 15 %, notamment 12 %.