Brevet FR2598621A1 — publié le 19871120

Nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques, procédé de préparation d'une telle fraction et son application à la préparation d'un vaccin cholérique oral. La présente invention a trait à une nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes, et destinée à être utilisée dans la préparation d'un vaccin cholérique oral Elle concerne également le procédé de préparation d'une telle fraction et le vaccin correspondant. Le choléra est une maladie qui se caractérise par une diarrhée infectieuse aiguë due à l'entérotoxine du vibrion cholérique et par une déshydratation extrêmement rapide Cette naladie, qui sévit principalement dans les pays pauvres et plus particulièrement en Asie du Sud-Est, au Bengladesh et dans toute l'Afrique, est souvent mortelle lorsqu'elle atteint des organismes mal nourris et affaiblis. Le développement des transports et des échanges interhumains ont facilité ces dernières années la diffusion des vibrions cholériques, créant des foyers secondaires et constituant une menace pour la santé de nombreux pays. On a cherché, depuis, à mettre au point un vaccin qui puisse efficacement protéger contre le choléra et qui soit facile à administrer. Pendant très longtemps, on a administré par voie parentérale des vaccins constitués de V. cholerae tués, sans avoir toutefois de certitude sur l'immunité que de tels vaccins pouvaient apporter. Des résultats d'études menés au Bengladesh, à Calcutta et aux Philippines et ayant porté sur plusieurs centaines de milliers de sujets ont clairement montré que ce type de vaccin, bien que provoquant une réponse sérologique importante, n'apportait pas une protection suffisante pour pouvoir modifier l'endémicité et l'épidémicité du choléra. Plus tard, la toxine cholérique ayant été reconnue comme la seule responsable de la maladie, on a espéré pouvoir se protéger contre le choléra, de la même manière que contre la diphtérie ou le tétanos, en vaccinant au moyen d'une anatoxine administrée par voie parentérale. Ce type de vaccination, bien qu'apportant une certaine protection contre le choléra, a été abandonné par suite d'une mauvaise tolérance et d'une durée de protection trop courte. C'est à la lumière d'études épidémiologiques, mais surtout au vu des résultats obtenus sur volontaires recevant une dose d'épreuve de vibrions cholériques, qu'il est apparu que la maladie elle-même apportait une protection efficace et de longue durée. Les recherches se sont alors orientées vers la mise au point de vaccins oraux tendant à reproduire la réponse immunitaire obtenue par la maladie, mais en évitant ses effets pathologiques. Ces effets étant strictement limités à la muqueuse de l'intestin grêle, c'est à ce niveau que l'on a cherché à provoquer une réponse immunitaire capable de s'opposer, soit au développement des vibrions1 soit à l'action de l'entérotoxine libérée. Les vaccins destinés à assurer une neutralisation de la toxine cholérique sont constitués de sousunités B de cette même toxine (choléragénoide) ou encore de procholéragénoide obtenu par chauffage contrôlé de la toxine. Ceux destinés à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae sont constitués de composants antigéniques de vibrions1 isolés ou en mélange, tels que flagelle, enzymes extracellulaires, adhésines, lipopolysaccharide, protéines de la membrane externe. Le brevet français n' 73 03734 décrit un vaccin de ce type constitué d'une fraction antigénique obtenue après lyse d'un culot bactérien dans le but dlen libérer le matériel endocellulaire. Il a été également proposé des vaccins oraux visant à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae, qui sont constitués par des germes tués ou par des germes vivants préparés à partir de mutants, soit hypotoxigéniques (M13), soit produisant une toxine exempte de fragment A et obtenue par clonage après mutation (Texas Star SR) ou par des techniques.de recombinaison génétique. Aucun de ces vaccins, toutefois, n' a réussi jusqu'ici à s'imposer, soit en raison de leur mauvaise tolérance, soit parce qu'ils ne confèrent pas une durée de protection suffisamment longue. Enfin, des vaccins combinant des dérivés de la toxine cholérique avec des constituants membranaires ou des germes entiers tués sont actuellement en développement. te demandeur s'est attaché à mettre au point un vaccin cholérique qui soit administrable par voie orale, donc facile à mettre en oeuvre, et qui puisse conférer une protection de longue durée. Un objectif de l'invention est de proposer une nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes et qui, lorsqu'elle est administrée par voie orale, est capable d'induire au niveau de l'intestin une réponse immunitaire locale s'opposant à la colonisation ultérieure par les V. cholerae vivants. Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation d'une telle fraction vaccinante. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un vaccin cholérique contenant comme principe actif ladite fraction. Le procédé de préparation de la fraction antigénique conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste - à cultiver des vibrions cholériques, de préférence dans un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer, dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigénique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe ; et - à soumettre le surnageant, après élimination des corps bactériens, par exemple par centrifugation, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins 100.000 environ. La séparation peut, de préférence, comporter une ultrafiltration à un seuil de coupure d'environ 10 000, suivie d'une diafiltration qui élimine tout le matériel provenant de lt culture et dont le poids moléculaire est inférieur à environ 100.000. De préférence, on complète la libération du complexe antigénique par un traitement à la chaleur en présence d'un agent dissociant, tel que l'acide citrique. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, dans une étape préliminaire, on prépare des inoculums en culture agitée et en milieu nutritif riche, à partir de souches de V. cholerae, de préférence de sérotypes Ogawa et Inaba, choisies parmi les souches pathogènes de caractère lisse. On ensemence, ensuite, à l'aide de ces inoculums, un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer. Un tel milieu peut être, par exemple, le milieu MSA qui présente, par litre, la composition suivante - Acide glutamique : 1,5 g - Caséine lactique : 0,8 g - Proline : 0,18 g - NaCl 10 g - KH2P04 : 0,45 g - MgS04 : 0,1 g. La culture est effectuée sous agitation pendant une durée comprise entre 6 et 24 heures et à une température comprise entre 30 et 35-C, le pH étant maintenu au-dessus de 7. En fin de culture, on ajoute un agent dissociant, tel qu'une solution d'acide citrique ou d'acide éthylène-diamine-tétraacétique. On abaisse le pH à environ 6, et on chauffe à une température comprise entre environ 40 et environ 60'C, la culture étant maintenue à cette température pendant environ 15 à 60 minutes. Après refroidissement, on effectue une centrifugation ou une filtration de manière à éliminer les corps bactériens. Le surnageant est ensuite recueilli et filtré sur une membrane de porosité Or 45 Le filtrat est soumis à une ultrafiltration dans laquelle on ne retient que la fraction possédant un poids moléculaire supérieur à 100 000, qui est ensuite soumise à une diafiltration éliminant le matériel de poids moléculaire inférieur à 100 000. La fraction recueillie est ensuite lyophilisée. Cette opération s'effectue, en général, en présence d'un adjuvant de lyophilisation tel que le mannitol. La fraction lyophilisée constitue le principe actif du vaccin cholérique conforme à l'invention. Cette fraction antigénique est constituée par un complexe composé de lipopolysaccharide de caractère smooth et de protéines de membrane externe, se présentant sous forme particulaire. La fraction antigénique lyophilisée constituant le principe actif du vaccin conforme à l'invention se caractérise par des propriétés biologiques tout à fait remarquables. Administrée à l'animal par voie orale, elle provoque - l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum, - une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées, - une inhibition de l'adhérence des V. cholerae sur la muqueuse intestinale, - une inhibition de la colonisation de l'intestin par le V. cholerae, - une production intestinale d'immunoglobulines spécifiques. Administrée à la souris par voie parentérale, elle la protège contre l'infection mortelle par le V. cholerae. Le vaccin cholérique conforme à l'invention se présente, soit sous la forme de comprimés, soit encore sous la forme de microgranules. Les comprimés sont obtenus en mélangeant le lyophilisat avec un excipient de compression, et sont ensuite enrobés d'une pellicule gastrorésistante. Dans le cas d'une présentation sous forme de microgranules, le lyophilisat est fixé sur la surface des microgranules par des techniques bien connues de l'homme de l'art. Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une pellicule qui leur confère la gastrorésistance et distribués en gélules. Cette dernière forme de présentation permet, d'une part, la ïnservation de toutes les propriétés biolo iquc du principe actif et, d'autre part, l'administration du vaccin sous forme protégée aux très jeunes enfants. D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif, et non limita- tif. Préparation du complexe lipopolysaccharide-protéines. On reprend une ampoule contenant sous forme congelée le V. cholerae, sérotype Ogawa, biotype eltor, par 2 à 3 ml de milieu VCM constitué, par litre, de - Baeto-tryptone (Difco) : 10 g - Extrait de levure : 1 g - Glucose - 1 g - NaCl : 5 g - K2HP04 : 2 g - MgS04 0,1 le pH étant ajusté à 8,5 avec NaOH, On ensemence au moyen de cette suspension un flacon de 5 litres contenant 3 litres de milieu VCM et on cultive pendant une nuit -sous agitation magnétique, à 20 22-C, à l'abri de la lumière et sous aération constituée par un bullage lent d air Cette culture sert à inoculer un fermenteur de 50 litres contenant 32 litres de milieu VCM.La culture est menée pendant 6 heures à 33-34-C sous agitation suffisante pour obtenir un vortex important. L'aération est apportée à raison de 35 l/h par balayage en surface. Le pH de la culture est maintenu au-dessus de 7,2 par apport de KOH 1 N. La culture obtenue sert à inoculer un fermenteur de 1500 litres contenant 900 litres de milieu MSA constitué, par litre, de - Acide glutamique : 1,5 g - Caséine lactique : 0,8 g - Proline : 0,18 g - NaCl : 10 g - KH2P04 : 0,45 g - MgS04 : 0,1 g - le pH.étant ajusté à 8,4 par KOH, et 100 litres de milieu VCM. On cultive pendant IR. heures à une température de l'ordre de 33-34'C, le pH étant maintenu audessus de 7,2 par addition de KOH 1 N. L'oxygène dissous est maintenu à- 50 's de la saturation par apport d'air en profondeur, et agitation à 750 t/mn. Après ce laps de temps, on ajoute une solution d'acide citrique à 125 g/l jusqu'à ce que le pH de la culture soit abaissé à 6,0 et on élève la température de la culture à 55-C. On maintient cette température pendant 45 mn puy5 on refroidit la culture à environ 10'C. On effectue ensuite immédiatement la centrifugation en continu et sous refroidissement. On recueille le surnageant et on filtre à + 4-C sur membrane de porosité 0,45r. L'ultrafiltration-concentration est effectuée sur membrane possédant un point de coupure PM 100 000. On élimine l'ultrafiltrat jusqu a ce que le volume de la préparation. atteigne 10 litres. On y ajoute un même volume de solution de NaCI à 8,5 g/l stérile et on poursuit l'ultrafiltration pour ramener le volume du rétentat à 10 litres. On répète 5 fois cette dernière opération et on ajuste le volume de préparation à 20 litres au moyen d'une solution de mannitol stérile et de concentration telle que la concentration finale en mannitol soit égale à 20 g/l. La préparation est ensuite soumise à une lyophilisation en vrac de 48 heures comportant une dessiccation secondaire de 24 heures à 30'C. On procède, de la même façon, avec le V. cholerae, sérotype Inaba, biotype eltor, et on mélange les lyophilisats obtenus à partir des deux souches. La présentation du vaccin sous forme de microgranules gastrorésistants se fait par fixation du mélange de lyophilisats à la surface de microgranules neutres de 1 mm de diamètre et essentiellement constitués d'amidon, en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art. Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une enveloppe constituée d'acétophtalate de cellulose. Ils contiennent 50 mg de mélange de lyophilisats par gramme de microgranules termines Caractérisation du complexe lipopolysaccharideprotéines. Le complexe lipopolysaccharide-protéines libéré dans le milieu de culture se présente sous forme particulaire. Le caractère particulaire du complexe est mis en évidence par l'examen au microscope électronique. La préparation se présente sous forme de vésicules de diamètre compris entre 20 et 100 nm après coloration négative au phosphotungstate. Association lipopolysaccharide-protéines. Cette association de composants peut être mise en évidence par le fait que ce complexe présente une vitesse de sédimentation et une densité différentes de celles de ses composants isolés. Une ultracentrifugation de 65 heures à 39.000 t/mn sur un gradient de saccharose 40-60 , effectuée sur la préparation obtenue comme il a été indiqué plus haut, montre que le complexe possède une densité de flottation de 1,21 alors que le lipopolysaccharide isolé à partir de la même préparation montre une densité de 1,19. Les vitesses de sédimentation déterminées par ultracentrifugation en gradient de saccharose 5-15 % sont respectivement de 30 S pour le complexe de lipopolysaccharide-protéines conforme à l'invention et de 20 S pour le lipopolysaccharide extrait de ce complexe. Cette association lipopolysaccharide-protéines peut être encore mise en évidence par le fait que la dose nécessaire à l'apparition d'un pouvoir vibriocide dans le sérum de lapins ayant reçu la préparation par voie orale est au moins 40 fois inférieure à celle du lipopolysaccharide extrait du V. cholerae. Nature des constituants lipopolysaccharide (LPS) du V. cholerae de ~caractère lisse. On extrait du complexe lipopolysaccharideprotéines obtenu comme on l'a indiqué plus haut, le lipopolysaccharide par la technique de Westphal et on soumet celui-ci à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dissociant selon la méthode de Laemmli. Après oxydation par le periodate, les constituants sont révélés par une coloration au nitrate d'argent. Le profil électrophorétique obtenu est caractéristique du LPS de V. cholerae de caractère lisse. On note que les préparations vaccinales contenant du LPS ne présentant pas le profil du caractère smooth ne possèdent pas les activités biologiques recherchées protéines de membrane externe du V. cholerae. Ces protéines participent à la réponse immunitaire induite par le complexe lipopolysaccharideprotéines. Ce rôle des proteines est mis en évidence par les faits suivants - la dénaturation des protéines par chauffage, par exemple à une températule de l'ordre de 100-C pendant 30 minutes, détruit totalement les propriétés vaccinantes, - administré par voie orale au lapin , le complexe lipopolysaccharide-protéines provoque la sécrétion intestinale d'immunoglobulines spécifiques des protéines entrant dans la composition du complexe. La mise en evidence de ces immunoglogulines est effectuée par la technique d'"immunoblot" sur les protéines du complexe, après que celles-ci ont été séparées par électrophorèse en gel polyacrylamide mono- ou bidimensionnelle. On observe, enfin, que le pouvoir vibriocide des sérums de lapins vaccinés par voie orale n'est inhibé qu'en partie seulement lorsque ces sérums sont additionnés de r.ps extrait de V. cholerae, alors que ce pouvoir vibriocide est totalement inhibé par la présence du complexe. L'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dissociant des protéines du complexe vaccinant permet de mettre en évidence une série de polypeptides de poids moléculaires compris entre 28 000 et 70 000 daltons. Propriétés biologiques. Les propriétés biologiques du principe actif ont été mises en évidence par une série d'expérimentations effectuées sur l'animal auquel a été administré soit le principe actif lui-même, soit le vaccin correspondant, et dont les résultats sont rapportés ci-dessous. A - Pour mettre en évidence les propriétés biologiques du principe actif, on a effectué ces essais a) Administré par voie parentérale aux souris, il i e protège contre l'infection mortelle par le V. chol erae. En appliquant les conditions recommandées par i 'OMS pour 1 / b) Administré par voie sous-cutanee à des lapins, le principe actif induit une forte réponse en anticorps vibriocides. On observe qu'après injection d'une quantité de principe actif équivalente au 1/20 de la dose humaine, les titres en anticorps vibriocides sont supérieurs à 50 000. Ces titres sont semblables à ceux obtenus par l'injection d'une dose humaine de vaccin composé de germes tués. c) Administré par voie orale à des lapins, le principe actif sous forme de suspension (c'est-à-dire présenté sous forme non gastrorésistante) induit une apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum de ces animaux. On administre par voie orale à des lapins des doses croissantes en deux prises espacées de 7 jours. Les titres en anticorps vibriocides des sérums recueillis 14 jours après la dernière administration montrent un effet dose linéaire. A titre de comparaison, l'administration de doses croissantes de LPS extrait de V. cholerae induit des anticorps vibriocides, mais à des doses 40 fois supérieures. B - Administré par voie orale à l'animal, le vaccin provoque a) l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum à des taux élevés. Des lapins reçoivent 200 mg de microgranules a .J O et J 7. On a procédé au titrage des anticorps à J 21. On obtient les titres suivants : Ogawa Inaba titre des sérums titre des sérums lapin n0 avant apres avant après immunisation inunisation 5316 6317 6318 6319 6320 (40 20480 6321 b) une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées. On immunise des lapins par une dose humaine de vaccin à J O et J 7. Environ 25 jours après, on ligature des anses intestinales dans lesquelles on injecte des doses croissantes de V. cholerae. 16 à 18 heures après, les volumes sécrétés sont mesurés. On observe une forte diminu tion des volumes sécrétés chez les animaux immunisés les les nombres de germes injectés nécessaires pour obtenir la sécrétion de 1 ml de liquide par cm d'intestin sont respectivement animaux témoins 10 9 animaux immunisés 10 c) un effet anti-adhérence et un effet anticolonisation de l'intestin par le V. cholerae. On administre par voie orale à des lapins 200 mg de microgranules à J O et J 7 ; 5 jours après la dernière administration, on opère les animaux et on introduit 109 V. cholerae vivants dans leur duodénum après avoir ligaturé l'intestin grêle au niveau du caecum. Après 2 à 3 heures de contact, on retire la ligature. 16 à 18 heures après, on dénombre les V. Cholerae dans l'iléon et le jéjunum. On obtient des résultats significativement différents chez les animaux immunisés et chez les animaux témoins. lapins aanbre de germes/g d'intestin Ogawa Inaba iléon jéjunum iléon jéjunum témoins lo8 107 108 107 immunisés 103 102 105 103 d) production intestinale d'IgA spécifiques. On administre à des lapins 200 mg de microgranu]es aux jours J 0, J 7 et J 14. On procède ensuite au titrage des IgA spécifiques présentes dans le liquide intestinal et la muqueuse intestinale, par méthode ELISA. On utilise le complexe antigénique comme phase solide. Seules les IgA spécifiques présentes dans l'échantillon prélevé se fixent sur cette phase solide et sont révélées au moyen d'anticorps de chèvre anti-IgA de lapin conjugués à la peroxydase. Après révélation de la réaction enzymatique, on obtient les résultats suivants lapins Extrait de muqueuse intestinale dilution 1/20-D.O. mesurée b 425 nm immunisés 1,80 témoins 0,1. Dosage Les microgranule, contenant par exemple 50 mg ou plus de mélange de lyophilisats par g de microgranules, sont conditionnés en gélules gastrorésistantes contenant 200 mg de microgranules. A titre d'exesmple, la vaccination petit se faire par absorption d'une gélule à J 0, J 7 et J 14, avec un rappel par exemple entre six mois et un an. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une fraction antigénique destinée à être utilisée comme principe actif dans un vaccin cholérique oral, caractérisé en ce qu'il consiste - à cultiver des vibrions cholériques dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigénique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe, et - à soumettre le surnageant, après élimination des corps bactériens, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins environ 100.000. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on complète la libération du complexe antigénique par un traitement à la chaleur en présence d'un agent dissociant. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en que l'agent dissociant est de l'acide citrique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que 1 étape de séparation comporte une ultrafiltration à un seuil de coupure d'environ 100 00, suivie d'une diafiltration qui élimine tout le matériel provenant de la culture et dont le poids moléculaire est inférieur à environ 100.000. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on cultive les vibrions dans un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, dans une étape préliminaire, on prépare des inoculums en culture agitee et en milieu nutritif riche, à partir de souches de V. cholerae de sérotypes Ogawa et Inaba choisies parmi les souches pathogènes de caractère lisse et en ce que l'on ensemence ensuite, à l'aide de ces inoculums, un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la culture est effectuée sous agitation pendant une durée comprise entre 6 et 24 heures et à une température comprise entre 30 et 35'C, le pH étant maintenu au-dessus de 7. 8. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'en fin de culture, on ajoute un agent dissociant, tel qu'une solution d'acide citrique jusqu'à abaissement du pH à environ 6, en ce que l'on chauffe la culture à une température comprise entre 40 et 60iC et en ce que l'on maintient cette température pendant 15 à 60 minutes. 9. Fraction antigénique obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. Fraction antigénique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un complexe particulaire de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère smooth et de protéines de membrane externe. 11. Fraction antigénique selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisée en ce qu'elle comporte un complexe de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère lisse et de protéines de membrane externe qui se présente sous la forme de vésicules de diamètre compris entre 20 et 100 nm. 12. Fraction antigénique selon l'une quelconque des revendications 9 à 1t, caractérisée en ce que, - lorsque le complexe est soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dissociant les protéines du complexe, celle-ci permet de mettre en évidence une série de polypeptides de poids moléculaire compris entre 25000 et 75000 daltons, - lorsqu'elle est administrée par voie orale à l'animal, elle provoque l'apparition dans le sérum d'un titre élevé en anticorps vibriocides, elle protège contre l'infection expérimentale dans le test de l'anse ligaturée, elle inhibe l'adhérence des V. cholerae sur la paroi intis tinale, elle inhibe la colonisation de l'intestin par les V. cholerae, elle provoque la sécrétion intestinale d'immunoglobulines spécifiques, - lorsqu'elle est administrée à la souris par voie parentérale, elle protège celle-ci contre l'infection mortelle par le V. cholerae, - lorsqu'elle est chauffée à une température de l'ordre de 100-C pendant une durée de l'ordre de 30 minutes, elle perd ses propriétés vaccinantes. 13. Fraction antigénique selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle est lyophilisée en présence d'adjuvant de lyophilisation, tel que le mannitol. 14. Application de la fraction antigénique définie dans l'une des revendications 9 à 13 à la préparation d'un vaccin cholérique oral. 15. Vaccin cholérique oral, caractérisé en ce qu'il contient, comme principe actif, un complexe de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère lisse et de protéines de membrane. 16. Vaccin cholérique oral selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est constitué de la fraction de surnageant de culture possédant un poids moléculaire supérieur à 100 000. 17. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un comprimé. 18. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de microgranules, recouverts d'une pellicule gastro-résistante et qui peuvent être distribués en gélules.