Brevet FR2599974A1 — publié le 19871218

La présente invention concerne l'utilisation de la phospholipase A2 (PhA2) pour la réalisation de composi tions thérapeutiques intervenant au niveau du système immunitaire. Au cours des vingt dernières années, le regain de la notion de réponse immune contre la maladie, et plus particulièrement le cancer, a énormément enrichi les concepts thérapeutiques. Cette notion a conduit à mettre en oeuvre, dans la pratique clinique, toute une série d'agents immuno-stimulants pour augmenter la réponse immunitaire, par exemple anticancéreuse. En fait, nombre de ces traitements n'agissent pas directement sur les réactions immunitaires mais stimulent les phagocytes, c'est-à-dire les polynucléaires et les macrophages, dont l'une des fonctions dans l'organisme est de phagocyter au niveau du foyer infectieux, l'antigène étranger. Les macrophages ont une autre fonction ils interviennent très tôt dans la reponse immunitaire en présentant l'antigène aux autres cellules lymphoides. La présente invention vise à utiliser les phospholipases dans le but de stimuler l'activité des macrophages et implique plus particulièrement la PhA2 La PhA2 est une enzyme lipolytique qui catalyse l'hydrolyse des phospholipides, libérant des lysophosphatides et des acides gras libres, principalement l'acide arachidonique. On sait que la PhA2 intervient dans la biosynthèse des prostaglandines et par là son activité est invoquée dans les situations où les prostaglandines sont connues pour intervenir (1). C'est ainsi en particulier qu'elle a un rôle dans l'activation plaquettaire par modification de la fluidité de leur membrane. Par contre, la littérature est muette sur l'effet de la PhA2 sur le métabolisme des macrophages à l'exception de l'article de WEIDEMAN (2), qui étudie la synthèse des prostaglandines et du thromboxane dans une population purifiée de macrophages et l'inhibition de la chimioluminescence par des prostaglandines de type E (la chimioluminescence est révélatrice de l'activité des macrophages). I1 conclut qu'on ignore à présent si l'activation de la phospholipase est impliquée dans l'inhibition de la chimioluminescence. I1 a été également publié (4), que la phospholipase C active la protéine Kinase C qui pourrait induire l'expression de récepteurs par 1'IL2 sur les lymphocytes T humains. D'autre part, il est connu que la lysolécitine et ses analogues synthétiques possèdent un effet, immunomodulateur (5). En particulier, le dernier stade de l'activation du complément qui entrain la lyse pourrait être médié par la génération locale de lysolécithine sur la membrane. Or la Demanderesse a mis en évidence ine nouvelle activité de la PhA2 en l'occurence une activation forte et reproductible des macrophages de souris. C'est pourquoi, la présente invention concerne l'utilisation de la PHA2 pour la préparation d'une composition théraseutique destinée au traitement de maladies impliquant une stimulation des macrophages et des polynucléaires Cette corposition sera utile dans le cas de nombreuses maladies connues pour affaiblir le système immunitaire ou dont l'origine est un affaiblissement du système immunitaire. I1 s'agira plus particulièrement d'une thérapie cytostatique, notamment à visée anticancéreuse. Cette comuosition pourra être utilisée dans un but curatif et/ou préventif. De préférence, selon la présente invention, la PhA2 est utilisée en association avec un immunomodulateur et/ou un agent oncostatique à propriétés immunomodulatrices. Le choix de l'agent associé et les quantités respectives de chacun des composés dans l'association dépendent bien entendu de la thérapeutique envisagée. Ainsi, la PhA2 peut être associée au dimycolate de tréhalose (TDM), à la bestatine ou l'aclacinomycine. L'association de la PhA2 avec l'un ou plusieurs de ces immunomodulateurs constitue un produit de combinaison de deux agents thérapeutiquement actifs. Les deux agents sont de préférence utilisés simultanément. Mais il peut arriver que dans certaines thérapies, notamment cytostastigues, il soit nécessaire de les utiliser de façon séparée ou étalée dans le temps. La composition -thérapeutique selon la présente invention comporte en outre un support ou un excipient, pharmaceutiquernent acceptable, dont le choix est fonction de la voie d'administration et du dosage choisis. La voie parentérale est choisie de préférence, notamment la voie intra-veineuse. La posologie doit encore être déterminée en fonction de chaque maladie à traiter mais sera de toute façon laissée en partie à l'appréciation du praticien. Ceci provient du fait que les produits à activité immunomodulatrice sont utilisés dans des gammes de dosage très vastes, ceci sera particulièrement vrai pour les PhA2 dont la toxicité est très faible. La composition comporte en outre, éventuellement, un agent permettant de véhiculer le ou les principes actifs à l'endroit infectieux, ou le cas échéant, au niveau de la tumeur. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples et figures suivants qui prouvent l'action immunomodulatrice de la PhA2 en mesurant la réac activité immunologique après 1'inDection de la PhA2 dans divers tests : réponse humorale et cellulaire, activité des macrophages. Les figures jointes représentent pour la figure 1, la chimioluminescence des cellules péritonéales après injection de PhA2 ; réponse en fonction de la dose de PhA2 t pour la figure 2, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris après injection de TDM et de PhA2 ; réponse à la réinjection de PhA2 pour la figure 3, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris qui ont reçu du TDM etiou de la PhA2 pour la figure 4, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris qui ont reçu de la bestatine et/ou de la PhA2 pour la figure 5, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris qui ont reçu de l'aclacinomycine et/ou de la PhA2 pour les figures 6A et 6B, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris qui ont reçu du LPS et/ou de la PhA2 ; ; pour la figure 7, la chimioluminescence de cellules péritonéales de souris qui ont reçu du diéthyl thiocar bamate et/ou de la PhA2 pour la figure 8, l'inhibition par l'aspirine de la chimioluminescence stimulée par la PhA2 ; pour la figure 9, l'inhibition par l'indométacine de la chimioluminescence stimulée par la PhA2 pour la figure 10, la chimioluminescence des cellules mononuclées de sang périphérique de singe après injec tion de PhA2 les figures 10A, 10B, 10C, 10D montrent l'augmentation de chimioluminescence des cellules mononuclées de sang périphérique de singe, prélevé 30 minutes après linjec- tion i.v. de PhA2 ; la figure 11 montre l'augmentation par la PhA2 de la capacité des macrophages péritonéaux à fixer lanti- gène. EXEMPLE 1 Modification de l'activit6 macrophagique des cellules péri tonéales Chimioluminescence La chimioluminescence est une bonne mesure de l'activité métabolique, donc de l'activité des macrophages, car elle évalue tous les radicaux oxydants libérés au mo ment où les cellules péritonéales phagocytent le zymosan. Ce test rapide a permis de définir la dose active de PhA2 et de répondre à plusieurs questions. Les cellules péritonéales sont mises en suspension à la concentration de 106 cellules par ml dans une solution de Hanks sans rouge de phénol. La chimioluminescence est mesurée par un photomultiplicateur LKB 1250 connecté à un pico-ampèremètre. Pour ce faire, un ml de suspension péri tonéale est mis dans-une cuvette maintenue à 370C dans une enceinte à l'abri de la lumière avec 20 iii de luminol (5 amino-2,3 dihydro 1-4 phthalazinedione, PM 177,2, Sigma) d'une solution-mère à 5 x 10-6M dans du liquide Hanks sans rouge de phénol. Quand l'émission lumineuse est stabilisée, on ajoute soit 100 l de Zymosan (Sigma), soit 10 ng d'acé tate de phorbol myristate.Le Zymosan avait été opsonisé de la façon suivante : 60 mg sont dispersés dans 15 mi de milieu de Hanks sans rouge de phénol additionné de 10 % de sérum de souris. On incube 60 min à 370C, puis on lave trois fois à 400 x g pendant 5 min, et on remet en suspen sion dans 4 ml de solution de Hanks sans sérum. La solu tion est stockée à -2O0C. * Relation dose-réponse La figure 1 montre les résultats d'une expé rience dans laquelle trois doses de PhA2 ont été injectées par par voie i.p. 30 min avant le prélèvement des cellules par lavage péritonéal : 0,35 U, 0,7 U et 1,4 U par souris. La dose optimum due0,7 U a été utilisée dans les expériences ultérieures. * Répétition des doses La figure 2 montre les résultats d'uhe expé rience dans laquelle la PhA2 a été injectée au jour O à un certain nombre de souris. L'activité péritonéale est mesurée. Quant elle est revenue à la normale, on a ré injecté la PhA2 et observé une nouvelle augmentation de la réponse. * Association avec d'autres immunomodulateurs Cinq immunomodulateurs ont été étudiés. Dans les conditions expérimentales, la réponse de trois d'entre eux, le dimycolate de tréhalose (TDM), la bestatine et l'aclacinomycine, a été augmentée par l'injection de PhA2. Au contraire, la PhA2 n'a pas d'effet sur les cellules péritonéales de souris ayant reçu de faibles doses de LPS. Elle augmente légèrement la réponse de souris ayant reçu du diéthyl thiocarbamate (DTC), mais moins que ne l'aurait fait la PhA2 injectée seule (figures 3,4,5,6,7). * Sensibilité à l'indométacine ou à l'aspirine Sans chercher à étudier le mécanisme d'action de la PhA2, il parait facile, puisque c'est une enzyme qui intervient dans la synthèse de prostaglandine, de vérifier si l'effet adjuvant est sensible aux inhibiteurs de prostaglandines que sont l'indométacine et l'aspirine. Les cellules péritonéales de souris reçoivent 0,7 unités de PhA2 30 minutes avant prélèvement, et les inhibiteurs sont ajoutés in vitro dans le tube où se développe la réaction de chimioluminescence à la concentration de 50 mg/ml pour l'aspirine soluble et de 20 g/ml pour l'indométacine. Les figures 8 et 9 montrent que l'émission de chimioluminescence a été complètement inhibée. Formation d'ions superoxydes La quantité d'ions superoxyde formés, révélatrice de l'activité des macrophages est mesurée par réduction du ferricytochrome C.106 cellules péritonéale en suspension dans de la solution de Hanks sans rouge de phénol sont mises en boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre. On leur ajoute 100 l d'une solution de ferricytochrome C (Sigma, PM 12 384) à 1 mg/ml pour obtenir une solution finale de 80 mM. La production de O2- est stimulée par 100 ;1 de zymosan ou de PAR On incube les cellu-les pendant 90 min à 37 C dans une étuve à CO2 à 5 %. Les surnageants sont alors centrifugés à 2000 x g pendant 5 mLX décantés puis maintenus à 40C jusqu'à la lecture de leur absorption à 550 nm dans un spectrophotomètre à absorption. Le blanc est constitué par une solution de ferrocytochrome C incubée dans les mêmes conditions sans cellule péritonéales. La quantité d'O2- produits est calculée selon l'équation = = 2,1 x 104M 1 cm Les résultats sont exprimés en nanomoles de 02- pour 106 cellules.La spécificité de la réaction a été confirmée par l'addition de 300 unités/ml de superoxyde dismutase (type I, Sigma), ce qui permet de vérifier que la réduction du ferrocytochrome C est bien due aux ions O2 Les résultats sont consignés sur le tableau 1. La PhA2 a stimulé la libération de superoxydes par les cellules normales et également par les cellules déjà stimulées par le TDM (p EXEMPLE 2 : Modification de la réponse humorale L'antigène est le globule rouge de mouton (0,5 ml d'une suspension à 10 % injectée par voie i.p.). Les cellules formatrices de plage de lyse dans la rate sont énumérées au cinquième jour selon la technique de Cunningham. La phopholipase A2 est injectée (0,7 U i.p.) 30 min avant les globules rouges de mouton. * Modification de la réponse de souris normale ou immuno stimulée Le tableau 2 rapporte les résultats obtenus dans quatre expériences différentes dans lesquelles étaient inclus des groupes déjà soumis à un adjuvant. La PhA2 a augmenté de façon constante la réponse de souris normale. Il semble d'autre part que la PhA2 puisse stimuler la réponse des souris déjà stimulées, mais que l'effet alors obtenu a un maxium identique à celui obtenu par la PhA2 seule, comme s'il y avait un maximum de stimulation auquel l'organisme puisse répondre (tableau 2). * Modification de la réponse de souris immunodéprimées 2,5 mg d'hydrocortisone irmomodépresseur ont été injectés à chaque souris i.p. la veille du jour d'injection des globules rouges de mouton. La PhA2 est injectée 30 min avant l'antigène. Le tableau 3 montre que l'immunodépression induite par l'hydrocortisone est légèrement moins profonde si les souris ont reçu de la PhA2. Il resterait donc quel ques cellules cibles résistantes à la cortisone sur lesquelles la PhA2 pourrait agir. EXEMPLE 3 Modification de la réponse mitogénique Addition de la phospholipase à la culture in vitro * Réponse proliférative aux antigènes d'histocompatibilité La PhA2 a été ajoutée à la culture au début de celle-ci. Au bout de 5 jours on mesure la prolifé ration en ajoutant de la thymidine traitée pendant les huit dernières heures (tableau 4). Aucune modification n'a été observée. * Réponse proliférative à la phytohemagglutinine (PHA) Elle est étudiée après l'addition de PhA2 (0,17 U par puits) à la culture de cellules spléniques de souris normales ou traitées quatre jours auparavant avec du TDM (50 g) injecté i.p. La multiplication spon tanée des cultures témoins est plus faible ou inchangée. La multiplication en présence de PHA est plus faible dans les cultures de cellules spléniques provenant de souris traitées à la PhA2 (tableau 5). Injection de la PhA2 vivo (30 minutes avant le prélè- vement des cellules pour le test) * Réponse proliférative à la phytohémagglutinine Le TDM est injecté aux souris (50 g par souris i.p. au jour 4). La PhA2 (0,7 U i.p. par souris) est injec tée une demi-heure avant le prélèvement. Le tableau 6 montre que l'incorporation de thymidine tritiée est en général plus faible dans les cultures contenant des cellules splé niques de souris traitées par la PhA2, qu'il s'agisse de l'incorporation spontanée ou de la réponse à la PHA ou à la ConA. Les réponses augmentées par la PhA2 le sont dans les groupes traités par le TDM (exp. n 2, 3 et 4). * Réponse aux antigènes d'histocompatibilité Une culture mixte a été faite avec des cellules spléniques C57B1/6 normales ou traitées et cellules spléniques B6D2F1 dont la pro lifération est empêchée par irradiation. La réponse proliférative des cellules C57B1/6 est mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée. La cytotoxicité développée dans ces cultures contre les antigènes DBA2 a été mesurée en les incubant pendant 6 heures avec des blastes DBA/2. Sur le tableau 7, nous voyons que la réponse proliférative des cellules de souris traitées par la PhA, est moins forte que celles des souris normales mais que la cytotoxicité développée dans les cultures est plus ou moins régulièrement augmentée dans les groupes qui reçoivent adjuvant et PhA2. Les résultats se sont révélés particulièrement reproductibles avec la bestatine. EXEMPLE 4 Modification de l'intensité de la destruction in vivo de cellules L1210 Les souris (DBA/2xC57B1/6)Fî reçoivent par voie i.p. 107 cellules L1210 marquées au125IUdR et la radioac tivité présente dans la souris est comptée pendant quatre jours consécutifs. Les souris ont reçu soit du TDM (50 ;,g/souris i.p. au jour 4), seul ou avec de la PhA2, soit de la PhA2 (0,7 U/souris) préalablement chauffée à 560 pendant une demi-heure, dans l'espoir de reproduire les conditions expérimentales de la première ohservation (inactivation du facteur du venin de cobra, 560 une demi-heure pour introduire un témoin négatif par le FVC) (tableau 8). La destruction des cellules L1210 de ce dernier groupe est significativement plus importante. Le tableau 9 rapporte les résultats obtenus dans une autre expérience où l'injèction de PhA2 une demi-heure avant les cellules leucémiques à des souris traitées par la bestatine a fortement augmenté la destruction des cellules injectées. EXEMPLE 5 Modifications de l'intensité de l'immunisation antileucémique Des souris (DBA/2xC57 B1/6)F1 ont été immunisées par quatre injections i.p. de 706 cellules L1210 très fortement irradiées. Une semaine plus tard, elles reçoivent 105 cellules L1210 viables. Un groupe reçoit de la PhA2 une demi-heure avant chaque immunisation. Les animaux témoins non immunisés sont morts en 7 + 3 jours. Les animaux immunisés seulement avec les cellules L1210 irradiées sont morts au 15ème (+ 4) jour. Les animaux immunisés avec les cellules L1210 irradiées et la PhA2 sont morts en 30 jours et l'un d'entre eux a survécu (plus de 90 jours). EXEMPLE 6 Modlfication de la chimioluminescence des cellules mononuclées du sang périphérique après l'injection i.v. de phospholipase A2 à un singe Dix ml de sang ont été prélevés sur bille de verre par ponction veineuse à un singe (Bicêtre), puis 80 U de PhA2/m2 lui ont été injectés par voie i.v. Une heure plus tard, on prélève à nouveau 10 ml de sang sur billes de verre et on défibrine soigneusement. Les cellules mononuclées sont séparées sur gradient de Ficoll,numérées agrès coloration au rouge neutre. On utilise 200 000 cellules par test. un en mesurera la chimioluminesceace. La Figure 10 montre le développement de la chimioluminescence en fonction du temps. La PhA2 injectée par voie intraveineuse stimule l'intensité de la réponse des cellules mononucléées du sang circulant. EXEMPLE 7 Modification de l'activité phagocytaire des cellules mononucléées du sang périphérique après l'injection i.v, de phospholipase A2 à un singe Les cellules péritonéales sont lavées deux fois dans du milieu de Hanks et mises à adhérer sur des lamelles de 12/12 mm pendant 30 minutes à 370C dans une étuve humi difiée avec 5 % de CO2. Les lamelles sont soigneusement lavées pour éliminer les cellules non adhérentes avec de la solution de Hanks à 370C et recouvertes de 0,6 ml de sérum frais, autologue ou témoin, contenant 2 x 106 Candida albicans par ml. Ce Candida avait été isolé de cultures de sang d'un malade leucémique et maintenu sur milieu de Sabouraud (Institut Pasteur Production).Les lamelles sont incubées à nouveau à 370C pendant 30 minutes pour permettre aux cellules adhérentes d'ingérer les Candida. Les lamelles sont rincées avec de la solution de Hanks à 370C pour éliminer les Candida non ingérés, séchées à l'air,colorées par Giemsa et montées sur lames porte-objet après avoir été renversées. Chaque préparation est lue indépendamment par deux observateurs avec un microscope à contraste de phase à fort grossissement. Trois cent cellules sont examinées par test. On calcule le pourcentage de cellules ayant phagocyté au moins un Candida et l'index phagocytaire qui est le nombre moyen de Candida phagocytés par macrophage, c'est-à-dire le nombre total de Candida phagocytés divisé par le nombre de macrophages totaux. Les résultats sont consignés dans le tableau 10. Le pourcentage de cellules ayant ingéré au moins un Candida et l'index phagocytaire sont augmentés après administration de PhA2. EXEMPLE 8 Modifications de l'activité immunologique des macrophages péritonéaux après injection in vivo de PhA2: étude de leur capacité à présenter l'antigène aux cellules ganglionnaires Les macrophages interviennent très t8t dans la réponse immunologique en présentant l'antigène aux autres cellules lymphoides. Nous avons mesuré cette activité en faisant ingérer de l'hémocyanine (KLH =keyhole limpet hemocyanine) à des cellules péritonéales d'animaux traités ou non par la PhA2, et en injectant ces cellules dans le coussinet plantaire des pattes postérieures de souris. Ces cellules induisent une réponse primaire au niveau des ganglions poplités. Une semaine plus tard, on prélève les ganglions, prépare des suspensions cellulaires, et provoque in vitro une réponse secondaire en cultivant ces cellules avec l'antigène. L'incorporation de thymidine tritiée mesure la multiplication des cellules lymphoides. Les courbes (fig.11) obtenues avec les quatre doses de KLH montrent quelles suspensions de cellules lymphoides de souris injectées avec 105 macrophages répondent beaucoup plus fortement lorsque ces macrophages proviennent de souris traitées par la PhA2 que lorswueceux-ci proviennent de souris normales. La réponse des souris injectées avec la plus forte quantité de macrophages traités est inférieure à celle des souris injectées avec les macrophages de souris normales, ce qui est une observation fréquente : une trop forte stimulation ou un nombre trop élevé de cellules entraine une diminution de la réponse. Pour conclure, l'activité immunodulatrice de la PhA2 se traduit par une stimulation de l'activité macrophagique des cellules et de la réponse immunitaire du type humorale. Par contre, la PhA2 n'agit pas sur la division cellulaire, ou l'inhibe légèrement.C'est donc très certainement grâce à la stimulation de l'activité des macrophages que la PhA2 augmente la destruction des cellules leucémiques et l'intensité de l'immunisation antileucémique. Des tests effectués chez le singe confirment ces résultats. TABLEAU 1 -MODIFICATIONS DE L'ACTIVITE DES MACROPHAGES APRES L'INJECTION DE PHOSPHOLIPASE A2A LA SOURIS. SUPEROXYDES Mol pour 106 cellules TEMOINS 0,39 # 0,07 } p 0,01 PhA2 0,61 # 0,06 TDM 0,58 # 0,11 } p } p 0,001 } p 0,01 TDM PhA2 0,86 # 0,09 TABLEAU 2 -MODIFICATION DELA REPONSE SPLENIQUE AUX GLOBULES ROUGES DE MOUTON PAR L'ADMINISTRATION DE PHOSPHOLIPASE A2. CELLULES FORMATRICES DE PHAGES PAR RATE # SD TRAITEMENT EXP. N 1 EXP. N 2 EXP. N 3 EXP. N 4 TEMOIN 13.200 # 8000 6226 # 3719 25.800 # 4400 32.000 # 7800 PhA2 104.000 # 12.800 17.733 # 923 60.600 # 4000 55.600 # 3400 TDM 74.400 # 11.200 23.600 # 2050 54.400 # 4500 TDM + PhA2 103.302 # 8000 32.666 # 4670 68.200 # 5000 ACLA 31.200 # 4000 26.000 # 2116 32.200 # 9300 ACLA + PhA2 38.664 # 5600 26.666 # 6201 42.400 # 4600 BESTATINE (1 g) BESTATINE # PhA2 TABLEAU 3 - MODIFICATION PAR L'ADMINISTRATION DE PHOSPHOLIPASE A2 DE LA REPONSE AUX GLOBULES ROUGES DE MOUTON DEPRIMEE PAR L'HYDROCORTISONE. CELLULES FORMATRICES DE PHAGES PAR RATE # SD EXP. N 1 EXP. N 2 TEMOIN 39.400 # 3400 28.600 # 6600 PhA2 50.000 # 3000 37.600 # 6600 HYDROCORTISONE (2,5 mg J-1) 2080 # 720 680 # 320 HYDROCORTISONE + PhA2 4840 # 1580 1950 # 700 TABLEAU 4 - MODIFICATION DE LA REPONSE MITOGENIQUE PAR L'ADDITION DE PHOSPHOLIPASE A2 A LA CULTURE. REPONSE AUX ANTIGENES D'HISTOCOMPATIBILITE. EXP. N 1: CELLULES BALB/C+B6D2F1 IRRADIEES EXP. N 2: CELLULES C3H+B6D2F1 IRRADIEES CPM # SD CPM # SD TEMOIN 3946 # 525 TEMOINS 61.982 # 13.472 PhA2 0,02 Unités 3505 # 191 PhA2 0,002 Unités 49.932 # 9512 0,03 Unités 3097 # 483 0,01 Unités 49.411 # 10.492 0,07 Unités 2875 # 462 0,02 Unités 57.736 # 14.239 0,14 Unités 3295 # 327 0,05 Unités 40.406 # 13.642 0,10 Unités 43.398 # 8183 TABLEAU 5 - MODIFICATIONS DE LA REPONSE MITOGENIQUE PAR L'ADDITION DE PHOSPHOLIPASE A2 A LA CULTURE. REPONSE A LA PHYTOHEMAGGLUTININE. CPM # SD SANS PHA AVEC PHA TEMOIN 11.219 40.920 PhA2 0,17 Unités 6581 27.573 TDM J-4 50 g 6782 29.006 TDM + PhA2 8055 19.316 TABLEAU 6 - MODIFICATIONS DE LA REPONSE DES CELLULES SPLENIQUES A LA PHA APRES L'INJECTION IN VIVO DE PHOSPHOLIPASE A2 EXP. N 1 EXP. N 2 EXP. N 3 EXP.N 4 INCORPORATION SANS PHA AVEC PHA SANS PHA AVEC PHA SANS PHA AVEC PHA SPONTANEE AVEC PHA AVEC ConA TEMOIN 11.129 36.603 23.263 36.575 37.232 36.575 13.787 73.616 4359 # 200 # 4875 # 12.000 # 2537 # 5631 # 2307 PhA2 5700 27.573 7374 26.734 7374 23.049 14.318 73.580 5373 # 300 # 556 # 967 # 1606 # 967 # 5641 # 1783 # 11.501 # 1118 T@M 6802 29.015 6941 17.836 6941 17.829 13.326 69.321 4445 # 881 # 3478 # 1129 # 1464 # 1129 # 2210 # 6165 # 1661 TDM PhA2 8115 23.562 8547 29.085 12.248 23.893 9807 90.769 5811 # 96 # 784 # 118 # 3566 # 4582 # 5755 # 1321 # 6432 # 989 ACLA 11.083 62.443 6370 # 2769 # 3958 # 1860 ACLA 8113 48.767 4565 # 1104 # 5830 # 1340 BESTATINE 11.417 62.100 9863 # 731 # 7473 # 1261 BESTATINE + PhA2 9493 64.553 7770 # 1638 # 5013 # 3811 TABLEAU 7 - MODIFICATION DE LA REPONSE SPLENIQUE AUX ANTIGENES D'HISTOCOMPATIBILITE APRES L'INJECTION IN VIVO DE PHOSPHOLIPASE A2. EXP.N 1 EXP.N 2 EXP.N 3 CPM # SD % RELARGAGE 59Cr CMP # SD % RELARGAGE 59Cr CPM # SD % RELARGAGE 59Cr RAPPORT 50:1 RAPPORT 50:1 RAPPORT 50:1 TEMOIN 3774 # 1050 15 16.216 # 1589 16 18.877 # 3262 30 PhA2 4026 # 970 26 9443 # 1399 17 12.869 # 4924 32 TDM 8446 # 1031 26 22.302 # 694 30 15.929 # 2829 30 TDM PhA2 5817 # 1086 23 19.869 # 1823 28 22.764 # 6149 45 BESTATINE 4026 # 970 26 20.275 # 1283 20 19.002 # 3954 35 BEST.PhA2 2611 # 459 40 20.288 # 2842 40 15.869 # 3506 48 ACLA 2541 # 1148 27 20.271 # 1242 27 16.131 # 2426 27 ACLA PhA2 2370 # 16 -10 11.243 # 3122 37 13.142 # 2749 37 TDM : 50 g par souris Bestatine : 5 g par souris Aclacinomycine : 4 mg/kg TABLEAU 8 - EFFET DE LA PHOSPHOLIPASE A2 SUR L'INTENSITE DE LA DESTRUCTION IN VIVO DE CELLULES L1210PAR DES SOURIS TRAITEES PAR DES ADJUVANTS. % DE PERTE DE RADIOACTIVITE MESUREE DE J 1 à J 3 J 1 à J 4 TEMOINS 0,910 0,84 TDM 1,030 1,552 TDM PhA2 1,003 0,991 PhA2 activée 1,846 (&alpha; DESTRUCTION IN VIVO DE CELLULES L1210 PAR DES SOURIS TRAITEES PAR DES ADJUVANTS. % DE PERTE DE RADIOACTIVITE MESUREE DE J 1 à J 3 J 1 à J5 TEMOINS 1,474 1,381 TDM 2,087 1,635 TDM PhA2 1,983 1,598 LPS 1,286 1,302 LPS PhA2 1,307 1,127 BESTATINE 1,678 1,597 BEST, PhA2 2,661 (&alpha; ACLA 1,852 1,480 ACLA PhA2 1,672 1,146 TABLEAU 10 PHAGOCYTOSE DES CANDIDA PAR LES CELLULES MONONUCLEEES DU SANG -PERIPHERIQUE DE SINGE AVANT ET APRES INJECTION I.V. DE PHOSPHOLIPASE. % DE CELLULES AYANT INCERE INDEX AU MOINS UN CANDIDA PHACOCYTAIRE AVANT 88.9 1.48 APRES 98.12 2.28 BIBLIOGRAPHIE (1) J.L. NINNEMANN Prostaglandins and immunity Immunology Today 1984, 5, 170 173. (2) M.J. WEIDEMANN, B.A. PESKAR K. WROGEMANN. E. th.RIETSCHEL H.STAUDINGER, H. FIS CHER Prostaglandin and thromboxane synthesis in a pure macro phage population and the inhibition by E type Prostaglandins, of chemiluminescence. FERS Letters 1978, 89, 136-140. (3) V.M. COGGESCHAL, J.C.CAMBIER B cell activation, V.I. Effects of exogenous diglycerides and modulators ôf phospholipid metabolism suggest a cen tral role for diacyglycerol generation in transmembrane signaling by Mig. J. Imr, nol 1985, 134, 101. 107. (4) J.M. DEPPER, W.J. LEONARD, M. KRONKE P.D. NOGUCHI, R.E. CUNNINGHAM, T.A. WALDMANN, w.C. GREENE Regulation of Interleukin 2 receptors expression : effects of phorbol diester, phospholipase C and reexposure to -lectin antigen. J. Immunol 1984, 133 6 3054.306. (5) P.G. MUNDER, M.MODELELL, R. ANDREESEN, H.U. WELTZIEN, O. WESTPHAL Lysophosphatidycholine (lysolecithin, and its synthetic analogues. Immunomodulating and other biologic effects. Springer seminors in Immunopathology 1979, p 177-193. REVENDICATIONS 1. - Utilisation de la PhA2 pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à la stimulation des macrophages. 2. - Utilisation de la PhA2 pour la préparation dune composition thérapeutique destinée au traitement des cancers. 3. - Utilisation de la PhA2 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu il s'agit du traitement des leucémies. 4. - Association thérapeutique contenant la PhA2 et un agent immunomodulateur et/ou un agent oncostatique à propriétes immunomodulatrices sous forme d'une combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. 5. - Association thérapeutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent immunomodulateur est choisi parmi le dimycolate du tréhalose, la bestatine et l'aclacinomycine. 6. - Composition thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable.