Brevet FR2601038A1 — publié le 19880108

PROCEDE POUR DOSER UN ACIDE AMINE, NOTAMMENT ESSENTIEL, INCLUS DANS UNE CHAINE PROTEIOUE. La présente invention est relative à un procédé p-,ar doser un acide arriiné, notamment essentiel, inclus dans une chaîne protéique. L'organisme, tant humain qu'animal est capable de synthétiser des acides aminés à partir des nutriments, mais pas tous ; ces derniers, qui sont fonction des espèces, doivent alors être présents dans la nourriture : ils sont appelés acides aminés essentiels ou indispensables. Ainsi, l'homme ne peut synthétiser les dix acides aminés suivants arginine, histidine, isoleucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, thryptophane et valine. Les protéines contenues dans un produit protéique comprennent des chaines polypeptidiques qui résultent de l'union de deux ou de plusieurs acides aminés par enchaînement peptidique, et, parfois, d'autres corps non-peptidiques qui forment leur groupement prosthétique. Les principales protéines utilisées en alimentation, tant humaine qu'animale, présentent comme facteur limitant primaire, par exemple, la lysine dans le cas des protéines d'origine céréalière, et la méthionine dans le cas des protéines animales, des légumineuses ou des graines oléagineuses. Aussi est-il nécessaire de pouvoir déterminer la quantité exactement contenue en un acide aminé donné, afin de supplémenter correctement la ration alimentaire : en effet, les acides aminés ajoutés sont très souvent d'origine synthétique et donc d'un coût élevé. Jusqu'à maintenant, on a utilisé des méthodes essentiellement chimiques pour doser des acides aminés contenus dans un aliment : ceci permet de connaître la quantité maximum apportée par cet aliment pour les différents acides aminés qu'il contient. De telles méthodes sont, par exemple, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie en phase liquide et l'isotachophorèse. Ces méthodes chimiques ont pour inconvénient principal de ne pas permettre de déterminer la quantité réelle d'acides disponibles sur le plan biologique c'est-à-dire la quantité que l'homme et/ou l'animal extraiera effectivement du produit protéique ingéré. En effet, les protéines, par leur radical amine libre, peuvent réagir lors des traitements thermiques plus ou moins intenses auxquels sont soumis les aliments les contenant, avec les groupements réducteurs des sucres ou des produits d'oxydation des matières grasses, de façon à donner des produits de réaction de Maillard. Ces produits, qui contiennent donc des acides aminés, ne sont pas assimilables tant par l'homme que par l'animal : les acides aminés contenus sont donc perdus, et il n'existe actuellement aucune mesure qui permet d'en connaitre la quantité de façon rapide et peu coûteuse. Ainsi qu'on aura pu le comprendre, il apparait que la supplémentation des rations alimentaires, notammènt animales, en acides aminés essentiels présente un certain caractère aléatoire du fait du manque de méthodes pour déterminer la quantité exacte d'acides aminés effectivement disponibles. Dans le cas de la lysine, acide aminé essentiel notamment dans l'alimentation des porcs, un certain nombre de méthodes chimiques ou enzymatiques a été étudié afin de déterminer la partie disponible de celle-ci : un certain nombre de ces méthodes est regroupé dans l'article intitulé "ASSESSING PROTEIN QUALITY OF PROTEIN RICH FEED INGREDIENTS" de M. COON Craig N., paru dans "In proceedings 1984 Georgia Nutrition Conference for the Feed Industry, pages 11 - 19 (1984)". Parmi ces méthodes, on relève celle mise au point par l'équipe HSU et al. qui consiste à soumettre un produit protéique à une hydrolyse multi-enzymatique et à mesurer la chute de pH intervenant après un délai de dix minutes. Ce complexe enzymatique, trypsine-chymotrypsine-peptidase, permet en effet de libérer les groupes carboxyliques et par là-même de rendre la lysine terminale dans une chaine polypeptidique. D'après les auteurs, il existe une bonne corrélation entre le pH de la solution protéique et la digestibilité apparente in-vivo chez les rats. Cette méthode est certes rapide, mais les études statistiques ont montré qu'elle n'était pas fiable. C'est pourquoi, un des buts de la présente invention est de proposer un procédé pour doser un acide .aminé,notamment essentiel, inclus dans une chaîne protéique, qui est rapide, fiable, de mise en oeuvre simple, et économique. Ce but, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour doser un acide aminé qui est inclus dans une chaîne protéique, consistant, en une. première étape, à couper cette chaine protéique en chaînons de façon que le groupe acide de l'acide aminé à doser soit en -position terminale des charnons, lequel procédé est caractérisé, selon la présente invention, par le fait que, dans une deuxième étape, on libère cet acide aminé des chainons et que, dans une troisième étape, on dose l'acide aminé ainsi libéré. Avantageusement, au cours de la première étape, on soumet la chaîne protéique à une hydrolyse multi-enzymatique à pH contrôlé. De préférence, dans la deuxième étape, on libère l'acide aminé terminal des chaînons par une hydrolyse enzymatique à pH contrôlé. L'acide aminé à doser est, avantageusement, choisi dans le groupe constitué par la lysine et l'arginine. Dans ce cas, l'hydrolyse multi-enzymatique est effectuée avec un mélange comprenant de la peptidase, de la trypsine et de la chymotrypsine. Elle est réalisée à un pH compris entre .7,5 et 8,5, pendant une durée comprise entre 1 et 4 heures, et à une température comprise entre 300C et 400 C. De préférence, l'hydrolyse enzymatique, permettant de libérer l'acide aminé terminal, est réalisée au moyen d'une carboxypeptidase telle que la carboxypeptidase3, Elle est effectuée à un pH compris entre 7,5 et 8,5 pendant une durée comprise entre 1 et 3 heures, et à une température comprise entre 250C et 400C. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acide aminé à doser est la lysine, et l'on dose la lysine libérée au moyen d'une électrode à L. lysine oxydase. Les exemples de réalisation ci-après, qui n'ont aucun caractère limitatif, permettront de mieux rendre l'homme du métier capable de mettre en oeuvre cette invention. Exemple 1 : Dosage de la lysine contenue dans des farines de viande. On prélève 13 échantillons de farine de viande, dont on veut déterminer la quantité de lysine disponible. Tout d'abord, par la méthode d'hydrolyse acide bien connue de l'homme du métier, on dose le pourcentage en poids de protéine brute, c'est-à-dire totale, contenu dans chaque échantillon, ainsi que celui de la lysine totale. Afin de doser la lysine disponible pour chaque échantillon, on soumet, tout d'abord chacun d'eux à une hydre~ lyse multi-enzymatique en utilisant une suspension comprenant, pour un millilitre, 1,48 mg de trypsine pancréatique porcine (type IX, commercialisée par la société SIGMA) titrant 15 310 BA EE (BA EE = Nd-Benzoyl-L-arginine éthyl ester hydrochloride) unités par mgde protéines, 4,23 mg de chymotrypsine pancréatique bovine (type II, commercialisée par la société SIGMA) titrant 45 unités par mg de protéines et 1,73 mg de peptidase intestinale porcine (grade III, commercialisée par la société SIGMA sous la dénomination commerciale P 7500) titrant 50 unités par mg de solide. On utilise 1 ml de cette suspension multi-enzymatique pour 100 ml de suspension protéique : cette dernière est préparée dans une solution tampon de phosphate,borate et tris-acétate, à raison de 6,25 mg de protéines par ml. Cette hydrolyse multi-enzymatique est effectuée au bain-marie à une température de 370C environ, pendant une durée de 1 à 4 heures. Le pH est maintenu entre 7,5 et 8,5 grâce à la solution tampon de la suspension protéique. Puis on centrifuge pendant 10 minutes à 4 000 G (533 240 m/s2) ; on filtre et on recueille le filtrat. On prélève 6 ml de ce filtrat, que l'on ajoute à 5,6 ml du tampon décrit ci-dessus. Dans ce filtrat, la lysine disponible est rendue terminal des chaînons polypeptidiques du fait de la spécificité d'action des enzymes de la solution multi-enzymatique : c'est-à-dire qu'un chainon comporte à une de ses extrémités la lysine, le radical acide de celle-ci étant libre. On soumet ensuite -cette solution à une hydrolyse enzymatique au moyen de 0,4 ml d'une solution de carboxy peptidase B pancréatique titrant 500 unités par mg et commer cialisée par la société MERCK ou un produit équivalent. Cette hydrolyse est effectuée au bain-marie pendant une durée de 1 à 3 heures et à une température d'environ 370C. On obtient ainsi une solution contenant notamment de la lysine libre ou lysine disponible que l'on peut doser avec une électrode à L. lysine oxydase. Les résultats de ces mesures sont regroupés dans le tableau I ci-dessous. On calcule le pourcentage de lysine digestible en effectuant le rapport de la lysine disponible à la lysine totale en pourcent en poids. TABLEAU I Echan-Protéine Lysine Lysine disponible Lysine di tillon brute brute P.B % en Z de P.B. oestible Z 1 54,40 2,52 1,67 66,27 2 54,40 2,04 1,50 73,55 3 50,00 1,98 1,51 76,46 4 53,20 2,03 1,74 63,70 5 53,40 2.63 1,61 61,50 6 53,20 2,65 1,20 67,50 7 59,60 2,54 2,62 79,68 8 55,60 2,48 1,71 69,09 9 56,40 2,63 1,B3 71,62 10 60,00 2,54 1,36 65,48 11 55,1D | 2,73 1,70 62,27 12 58,B0 2,85 2,03 71,35 13 61,20 2,76 2,20 79,65 Le pourcentage de lysine totale et de lysine disponible est exprimé par rapport à la quantité de protéine brute (PB). Exemple 2 : Dosage de la lysine contenue dans du gluten de mais. On effectue les mêmes dosages qu'à l'exemple 1, et selon le même protocole, afin de déterminer les pourcentages en poids de protéine brute, de lysine totale et de lysine digestible par rapport à la quantité de protéine brute, et de lysine digestible pour 6 échantillons de gluten de mals. Les résultats de ces mesures sont regroupés dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Ech. PB % . Lys. tot. % B Lys. dispos % Lys. dig. % 1 61,6 0,973 0,86 88,39 2 61,8 0,985 0,9 91,37 3 59,4 0,874 0,88 100,0 4 60,6 0,874 0,88 100,0 5 64,6 0,968 0,93 97,75 6 62,6 0,925 0,91 98,39 Exemple 3 : Dosage de la lysine contenue dans du soja. On effectue les mêmes dosages qu'à l'exemple 1 et selon le même protocole afin de déterminer les pourcentages en poids de protéine brute, de lysine totale et de lysine disponible par rapport à la quantité de protéine brute, et de lysine digestible pour 7 échantillons de soja. On a également déte rminé la digestibilité in vitro de la lysine en utilisant la méthode décrite par HSU et al. L'ensemble de ces résultats est regroupé dans le tableau III ci-après. TABLEAU III Digestibilité Ech. protéine Lys. Tot. Lys. disp. Lysine in vitro % % P.B. % P.B. digestible % 1 84,85 5,57 4,46 80,07 2 84,30 5,49 4,42 3 84,30 5,42 4,40 81,18 4 84,48 5,45 4,60 84,80 5 84,66 5,70 4,79 84,03 6 84,66 5,72 4,88 85,31 7 84,12 5,88 4,15 70,58 REVENDICATIONS 1. Procédé pour doser un acide aminé, notamment essentiel, inclus dans une chaine protéique, consistant, en une première étape, à couper ladite chaine en chainons de façon à mettre en position terminale des chainons l'acide aminé à doser, caractérisé par le fait que dans une deuxième étape on libère ledit acide aminé desdits chainons et que, dans une troisième étape, on dose ledit acide aminé ainsi libéré. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans la première étape, l'on soumet la channe protéique à une hydrolyse multi-enzymatique à pH contrôlé. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que, dans la deuxième étape, l'on libère l'acide aminé terminal par une hydrolyse enzymatique à pH contrôlé. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'acide aminé à doser est choisi dans le groupe constitué par la lysine et l'arginine. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'hydrolyse multi-enzymatique est effectuée avec un mélange comprenant de la peptidase, de la trypsine et de la chymotrypsine, et à un pH compris entre 7,5 et 8,5. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'hydrolyse multi-enzymatique dure entre 1 et 4 heures, et est effectuée à une température comprise entre 300C et 400C. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'hydrolyse enzymatique est effectuée avec la carboxypeptidase 3 , et à un pH compris entre 7,5 et 8,5. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydrolyse enzymatique dure entre 1 et 3 heures, et est effectuée une température comprise entre 250C et 400C. 9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé p.? le fait que l'acide aminé à doser est la lysine. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la lysine libérée est dosée avec une électrode à L. lysine oxydase.