Brevet FR2603898A1 — publié le 19880318

La présente invention est relative à l'isolement d'un nouveau virus anticulicidien et à son application comme moyen de lutte contre les moustiques. Un virus baptisé MAV : t5Osquito Africain Virus, a été découvert par les Inventeurs sur une lignée cellulaire d'Aedes aegypti, dans les conditions suivantes Les Inventeurs maintiennent dans un Insectarium situé à l'institut Pasteur à DAKAR (SENEGAL) une colonie d'Aedes aegypti qu'ils utilisent pour obtenir la réplication de diverses souches de virus amaril; les moustiques inoculés sont broyés et leurs broyats sont ensemencés sur diverses cultures de cellules d'insectes pour obtenir une quantité de virus amaril suffisante pour effectuer des études biochimiques. C'est sur une de ces lignées cellulaires (Ae. aegypti, Clone C17, Deubel et Digoutte, Am. J. Trop. Med.Hyg., 1981, 30, 1060-1070) que le virus MAV a été découvert : il se développait sur ces cellules conjointement avec le virus amaril : sa constante de sédimentation (36S) est voisine de celle du virus amaril et, de ce fait, les empreintes d'oligonucléotides T1 du virus amaril sont systématiquement contaminées par ce virus. L'importante diminution de la longévité des individus d'une colonie d'Aedes aegypti infectés par ce virus a conduit les Inventeurs à tester celui-ci pour en évaluer l'éventuelle pathogénicité, car si celle-ci était confirmée, ce virus pourrait constituer un nouveau moyen de lutte contre le redoutable vecteur que constitue Aedes aegypti. Toutefois, pour que ce virus puisse être utilisé contre Ae. aegypti, il doit répondre à deux conditions : la dépendance de l'hôte ne doit pas être sous dépendance génétique, ce qui, comme pour les insecticides, aboutirait à la sélection de souches résistantes; il doit d'autre part être inoffensif pour les vertébrés. Les Inventeur s ayant pu établir que le virus UAV qu'ils ont identifié est hautement pathogène vis-à-vis d'Aedes aegypti, il s'est avéré alors important de pouvoir disposer de quantités suffisamment grandes de ce virus pour permettre de pourvoir à des moyens de lutte anticulicidienne comprenant le virus FEV et notamment des suspensions virales de titre élevé obtenues par inoculation à des insectes ou à des lignées continues d'insectes. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de culture du virus !EV (tdosquito Africain Virus), qui est caractérisé en ce que le virus est cultivé sur des cellules d'insectes, dans un milieu de culture approprié, en ce que, environ à la 6e heure de culture, on prélé- ve le surnageant de culture, on le concentre et on le purifie dans un gradient de saccharose, pour isoler le virus. Confonnérnent à l'invention, les cellules d'insectes sont oens- tituées par des lignées continues de cellules d' insectes du type des Aedes, notamment d'Ae. aegypti, albopictus ou pseudoscutellaris. Pour l'étude biochimique et-morphologique du virus MAV, il s'est avéré opportun de séparer le surnageant de culture de la culture cellulaire environ à la 6e heure de la culture, car il a été observé par les Inventeurs qu'en condition de cycle unique dans des cellules d'insectes, telles qu'une lignée de cellules d'Aedes albopictus, clone C6/36 (obtenue par IGARACHI : "Isolation of a Singh's Aedes albopictus cell clone sensitive to dengue and chikungunya viruses" J. gen. Viril.; 1978, 40, 531-544), le titre viral du surnageant de culture atteint un maximum de 8,8 UFP, à la 6e heure et que le titre décroit parallélement à l'apparition de l'effet cytopathogène, qui est rapide sur les cellules susdites. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le surnageant de culture est concentré à l'aide de polyéthylèneglycol de poids moléculaire élevé, notamment de polyéthyléneglycol 6000. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le milieu de culture est avantageusement du milieu minimum essentiel additionné de 2% de sérum de foetus de veau. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préfé ré du procédé conforme à la présente invention, le milieu de culture est avantageusement du milieu de Leibovitz additionné de 10% de sérum de veau foetal, de glutamine et d'antibiotiques. La technique de purification dans un gradient de saccharose est adaptée de la technique décrite par VEZZA et Al. "Characterization of the viral RNA species of prototype dengue viruses" Am. J. trop. Med. Hyg., 1980, 29, 643-652. La souche de virus MAV a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganis- mes (cNcrl) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR de PARIS, sous le N" I-591 en date du 29 Atout 1986. Le virus MAV isolé conformément à la présente invention, se présente sous une forme très hétérogène et peu usuelle pour un virus, représentée à la figure 1 annexée, qui montre des virions de 50 nm de diamètre, plats, déprimés au centre et apparaissant de face ou de profil, ce qui donne l'impression de polymorphisme évoquée plus haut. La photographie du virus MAV représentée à la figure 1 a été obtenue au microscope électronique, dans le surnageant de culture cellulaire, à un grossissement de x 225 000, avec une coloration négative au phosphotungstate de sodium. Les Inventeurs ont étudié 1'ARN du virus MAV en utilisant les techniques mises au point par DEUBEL et Al. pour le virus amaril [DEUBEL et Al. "Preliminary characterization of the ribonucleic acid of yellow fever virus" Ann. Virol. (Inst. Pasteur), 1983, 134E, 581-5883 et ils ont déterminé la composition protéique du virion par électrophorèse en gel de polyacrylamide selon la technique de LAEMMLI "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", NATURE (Londres), 1970, 227, 680-685. Le virus MAV est caractérisé en ce que son ARN est monocaténaire, non infectieux lorsqu'il est hautement purifié, de constante de sédimentation égale à 36S en gradient de saccharose, possédant une extrémité adénylée et en ce qu'il exerce un effet cytopathogène rapide sur des cellules d'Aedes, et notamment d'Aedes albopictus. Le virus MAV est en outre caractérisé en ce que son virion possède trois protéines majeures, de masses moléculaires apparentes de 50, 50,5 et 24,5 KDaltons. Les masses moléculaires apparentes susdites ont été déterminées par la technique de LAEMMLI citée plus haut, les trois protéines majeures ayant été identifiées par marquage à la (35S) méthionine. Les Inventeurs ont mis en évidence les caractéristiques physico-chimiques du nouveau virus isolé conformément à la présente invention; ces caractéristiques sont réunies dans le Tableau I qui va suivre. TABLEAU I Caractères physico-chimiques du virus MAV Titre en UFP/ml* Témoin obtenu conformément à I'invention 5 x 107 Ether 10% 5,1 x 107 NP 40 0,5% 4,8 x 107 pH 3 50 50"C 1 heure | 4,2 x 107 * Le titre est obtenu par la méthode des plages sur cellules C6/36 mise au point par IGARACHI (cf. cité), sous agarose; la lecture se fait par coloration des cellules au rouge neutre après 48 heures. Le virus MAV isolé conformément à la présente invention, se caractérise donc en outre par le fait qu'il est sensible aux pH acides, mais résistant à l'éther, aux détergents non ioniques et à la température. Les Inventeurs ont en outre procédé à une étude de la pathogénicité du virus MAV sur une colonie d'Aedes aegypti. Le compte-rendu de cette étude expérimentale est donné ci-après. ETUDE EXPERIMENTALE SUR AEDES AEGYPTI: 1. Méthodologie La souche de moustiques utilisée est une colonie d'Ae. aegypti, forme domestique, récoltée à Ngoyé (Région de Diourbel, Sénégal) en 1981 et entretenue depuis en insectarium. Une série de 100 femelles (série B) a été inoculée par voie intrathoracique avec une suspension de virus; parallèlement une série témoin de 100 femelles également a été inoculée avec le seul diluant (série A). Le nombre de moustiques survivants a été noté chaque jour jusqu'au 21e jour par un observateur qui ignorait quelle était la série infectée. La descendance de ces deux séries a été suivie jusqu'à la deuxième génération, en s'attachant à évaluer la fécondité des femelles et la mortalité de chacun des stades. Une troisième série (série C) a été constituée par 200 larves néonates placées dans de l'eau ayant servi à élever les larves de la série B et contenant encore 7 cadavres de larves. La mortalité a été notée jusqu'à l'éclosion des adultes. 2. Résultats Les principaux paramètres étudiés sont donnés au Tableau Il ci-après. TABLEAU II Principaux paramètres étudiés montrant l'influence du virus MAV sur Ae. aegypti Série A Série B Rapport Signifi B/A cation* I. Femelles inoculées - taux de mortalité quotidien JO à J2 (mortalité due à l'inoculation) 0,152 0,300 1,94 NS J2 à J8 (incubation) 0,002 0,019 9,50 S J8 à J21 (infection) 0,008 0,204 25,50 HS - fécondité (nombre d'oeufs par femelle) première ponte 32,5 41,3 1,27 NS deuxième ponte 41,9 19,7 0,47 S II. Première génération - % d'éclosion des oeufs 92,3 65,3 0,70 S - % de mortalité des stades préimaginaux par rapport aux oeufs pondus 27,9 76,6 2,75 HS par rapport aux oeufs éclos 19,9 64,2 3,23 HS - % de mortalité des imagos au 21e jour 9,1 29,0 3,19 HS - % de mortalité au 21e jour de la vie adulte par rapport aux oeufs pondus 34,5 83,4 2,42 HS - fécondité (nombre d'oeufs par femelle) première ponte 12,1 7,1 0,59 deuxième ponte 16,1 8,7 0,42 S Série A Série B Rapport Signifi B/A cation* III. Deuxième génération - % d'éclosion des oeufs 75,3 65,2 0,87 NS - % de mortalité des stades préimaginaux par rapport aux oeufs pondus 60,1 61,0 1,01 NS par rapport aux oeufs éclos 47,0 40,2 0,85 NS IV. Larves infectées par voie orale (série C) - % de mortalité des stades préimaginaux 19,9 54,5 2,74 HS * NS = non significatif S = significatif ? = non concluant HS = hautement significatif. Les résultats obtenus sont également illustrés par les figures 2 et 3 annexées dans lesquelles - la figure 2 représente le nombre d'insectes Ae. aegypti adultes survivants en fonction du temps, et - la figure 3 représente la survie des stades préimaginaux de ces insectes, en fonction du temps. Les principales conclusions sont les suivantes 1-) Le virus est hautement pathogène par voie intrathoraci que. 29) il est transmis d'une génération à l'autre comme le mon trent les taux de mortalité de la première génération. 3 ) Le virus semble entraîner une diminution de la fécondité, bien que ce phénomène soit moins net que son rôle sur la longévité. 40) Les larves peuvent s'infecter par voie orale : série C. 50) Le virus, très résistant à la températîre ambiante, a un haut pouvoir contaminateur : les résultats non significa tifs, sensiblement identiques à ceux de la série B, ob servés à la deuxième génération sont très probablement dus à une contamination de la série témoin qui a été éle vée dans la même salle que la série B1 mais avec un maté riel différent. 6e) Le virus a été régulièrement retrouvé chez 10 femelles de la deuxième génération (série B). I1 ressort des résultats décrits dans ce qui précède que le virus MAV découvert par les Inventeurs en tant qu'agent contaminant de cultures de cellules d'insectes, et plus particulièrement d'Ae. aegypti, et isolé conformément à la présente invention, est propre à constituer un agent efficace de lutte contre certains insectes vecteurs d'épidémies et notamment contre des moustiques tels qu'Ae. aegypti, qui un vecteur majeur d'arbovirus. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1*) Nouveau virus anticulicidien, dénommé MAV, isolé de cultures d'insectes, notamment du type des Aedes. 2') Virus MAV anticulicidien, caractérisé en ce que son ARN est monocaténaire, en ce que cet ARN est non infectieux, en ce que sa constante de sédimentation est égale à 36S en gradient de saccharose, en ce qu'il possède une extrémité adénylée et en ce que ce virus exerce un effet cytopathogène sur les cellules d'Aedes. 30) Virus MAV anticulicidien selon la revendication 2, caractérisé, en outre, en ce que son virion possède trois protéines majeures, de masses moléculaires apparentes de 50, 50,5 et 24,5 KDaltons. 40) Virus MAV selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, également caractérisé par le fait qu'il est sensible aux pH acides, mais résistant à l'éther, aux détergents non ioniques et à la température. 50) Composition de lutte contre les insectes, et notamment contre les insectes du genre des Aedes, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que constituant actif, une quantité appropriée de virus MAV selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 60) Suspension virale de lutte anticulicidienne, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par inoculation du virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, à des insectes, notamment du type des Aedes, ou à des lignées continues de cellules desdits insectes. 70) Procédé de culture du virus MAV (Mosquito African Virus), dont une souche a été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR de PARIS, sous le N I-591 en date du 29 Août 1986, caractérisé en ce que le virus est cultivé sur des cellules d'insectes, dans un milieu de culture approprié, en ce que, environ à la 6e heure de culture, on prélève le surnageant de culture, on le concentre et on le purifie dans un gradient de saccharose, pour isoler le virus. 89) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le surnageant de culture est concentré à l'aide de poîyéthylèneglycol de poids moléculaire élevé, notamment de polyéthylèneglycol 6000. 90) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que le milieu de culture est avantageusement un milieu minimum essentiel additionné de sérum de foetus de veau à concentration finale par exemple de 2%. 100) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture est avantageusement du milieu de Leibovitz additionné de sérum de veau foetal à concentration finale par exemple de 10%, de glutamine et d'antibiotiques. 110) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que les cellules d'insectes sont constituées par des lignées continues de cellules d'insectes du type des Aedes, notamment d'Ae. aegypti, albopictus ou pseudoscutellaris.