Brevet FR2600256A1 — publié le 19871224

La présente invention se rapporte à un médicament, ainsi qu'à une composition médicamenteuse, permettant, d'une part de traiter les tumeurs, et, d'autre part, de traiter les maladies infectieuses dues aux virus. Ce médicament est constitué par l'association d'une enzyme de dégradation d'un amino-acide et de l'amino-acide correspondant sous sa forme d'hydroxamate. Entrent notamment dans cette définition, les associations médicamenteuses suivantes: -L-asparaginase et D-aspartique acide P hydroxamate (DAH) -Phénylalanine ammuonialyase et DL-phénylalanine hydroxamate; -Tryptophanase et DL-tryptophane hydroxamate; et -Tyrosinase et L-tyrosine hydroxamate. On exposera ci-après, tout d'abord l'activité antitumorale de l'une de ces associations,à savoir, celle de 15 la L-asparaginase et du D- aspartique acide hydroxamate, et ensuite son activité antivirale. I - ACTIVITE ANTITUMORALE DE L'ASSOCIATION LASPARAGOT!ASE/D-ASPARTT UE ACIDE 8 HYDROXAMATE (DAH) La découverte de la L-asparaginase comme agent anticancéreux a ouvert la voie pour l'utilisation de métabolites physiologiques dont l'action repose sur la différence biochimique qualitative entre cellule tumorale et -cellule normale. Cela lui confère une sélectivité pour 25 certaines cellules tumorales. Bien que-seules les néoplasies lymphoïdes répondent au traitement à l'asparaginase de façon reproductible, d'autres tumeurs telles que mélanomes ou adénocarcinomes sont sensibles à l'action de la L-asparaginase. La L-asparaginase catalyse 30 principalement l'hydroLyse de la L-asparaginase en acide. aspartique et en ammoniaque. La L-asparagine n'est pas considérée comme un acide aminé essentiel pour les tissus normaux de mammifères. Cet acide aminé est synthétisé par l'asparagine synthétase à partir de l'acide Laspartique et 35 d'un groupement NH.:.. Des différents travaux, il ressort que l'activité asparagine synthétase est faible dans les 9845FR cellules tumorales, bien qu'elles aient un besoin important en asparagine et acide aspartique. Cette dépendance de l'appcrt extérieur er. asparagine des cellules tumorales explique en partie l'effet cytotoxique de la L-asparaginase pour ces cellules. Les premiers travaux ont été obtenus. en 1953 par Kidd qui utilisait le sérum de cobaye pour inhiber la croissance de lymphosarcome de Gardner (6C3HE-D> sur la souris C3H. En 1961, Broome JD. J. Exp. Med. 118: 121-148, 10 1963, démontre que l'agent antitumoral du sérum de cobaye est la L-asparaginase. En 1963, Mashburn L. T. et Wriston J.C. Arch. Biochem. Biophys. 105: 450-452, 1964, mettent en évidence l'activité inhibitrice de la L-asparaginase de Esche-richia coli sur la croissance du lymphosarcome 6C3HE-D. 15 Depuis lors, l'asparaginase de nombreuses sources a été purifiée. La plus grande majorité des travaux ont été réalisés avec la L-asparaginase purifiée d'Escherichia col4. Activité antitumcrale de la L-asparai-nase sur modèles 20 animaux L"activité de la L-asparaginase a été démontrée sur plus de 50 tumeurs murines, 3 tumeurs de rat et sur les lymphosarcomes du chien. La majorité des tumeurs sensibles à la L-asparaginase sont d'origine lymphoïde, d'étologie 25 cependant très diverses (irradiation, uréthanne, DMBA, virus). Parmi les différentes tumeurs greffées de la souris consanguine, utilisées pour l'évaluation préclinique des agents anticancéreux, la Lasparaginase a une activité seulement sur les tumeurs très sensibles aux agents cytostatiques, telles que les leucémies P388, carcinosarcome de Walker 256. Sur les modèles tumoraux, il a été fermement établi que les tumeurs rentrent en compétition avec l'hôte pour retenir les composés nitrogènes (Corrascosa JD et al. Cancer Res.: 3831-3835, 1984). Parmi ces composes, Corrascosa a montré, sur des souris inoculées avec les cellules tumorales de Erhlish, l'existence d'un transfert 9845FR très important de glutamine et asparagine, du plasma et du liquide ascitique de l'hôte via la tumeur. Les travaux de Roct et Broome (Broome J D et Schwartz J H. Biochem. Biophys. Acta J.138: 637-639, 1967) montrent que les tumeurs sensibles à la L-asparaginase ont une activité faible ou nulle d'asparagine synthétase. En plus, les cellules lymphoïdes qui échappent à l'action de la L-asparaginase acquièrent une activité Lasparaginase synthétase importante (Horowitz B, Madras BK, Meister D. et al. Science 156: 53310 535, 1968). De ces travaux, il ressort que l'asparagine, synthétisée par les cellules tumorales ou venant de l'hôte, joue un rôle clé dans la croissance des cellules tumorales. Adamson R.H. et Fabro S. Cancer Chemother. Repond., : 617-626, 1968, ont étudié la relation dose-réponse de 15 la L-asparaginase. Une dose importahte de 1000 UI/kg produit la guérison de tous les animaux porteurs de leucémie L5184; cependant, l'injection de L-asparaginase en doses fractionnées sur plusieurs jours ne montre pas d'effet sur les animaux. Dowley W.C, Corwet J, Henson D. et al. Proc. 20 Soc. Exp. Biol. Med. 123: 133-137, 1966 montrent que des doses suffisantes d'asparaginase peuvent inhiber le développement, d'une tumeur, quel que soit son mode d'inoculation chez l'animal: sous-cutané, intraperitonéal, ou intracérébral. Comp!e-tenu que la L-asparaginase a un 25 poids moleculaire de 139 000 et ne traverse pas de facon importante la barrière hématocéphalique, on peut conclure que l'effet cytotoxique de la Lasparaginase se fait, soit par déplétion en asparagine du milieu sanguin suivie de sa déplétion dans le milieu céphalorachidien, soit par la présence d'un composé résultant de l'activité enzymatique dans le milieu sanguin et qui peut traverser la barrière hématoencéphalique. 9845FR Efficac!t de 1 L-asparaginase chez l'home La thérapie des maladies malignes avec la Lasparaginase présente une efficacité limitée pour différentes raisons. La grande majorité des néoplasies peuvent synthétiser la L-ASN et ne sont pas dépendantes de l'asparaginase du milieu. Comme il a été montré (Wood J S et Handschumacher R E. Ann. Physiol. 2l: 2940, 1974), les cellules lymphcïdes qui échappent à l'action de l'asparaginase ' acquièrent une activité L-asparagine synthètase importante. Cette augmentation d'activité se fait: - soit par dérépression dans la synthése de l'enzyme. Arfin et al., Proc. Tatl. Acad. Sci. USA T78: 57245728, 1981, ont montré que, dans des cellules d'ovaires de hamster chinois (CHO), cultivées en milieu déprimé en aspargine, -* l'augmentation d'activité ASN-synthétase s'acccpagne d'une diminution de l'activité asparaginyl tRNA synthétase; - soit par amplification du gène de l'enzyme. La déplétion en asparagine du milieu nécessite l'utilisation,.d'une part, de la L-asparaginase et, d'autre part, d'inhibiteurs de la L-asparagine synthetase. On - pouvait ainsi espérer que des inhibiteurs de la biosynthése de l'asparagine augmenteraient l'activité de l'asparaginase. Urew J.R. et al., Biochem. Pharmacol.,: i405-1410 ont -- étudié l'activité de divers inhibiteurs de l'asparagine * synthétase dont le mélange L-asparaginase avec le DL Paspartique acide hydraoxamate et une autre molécule qui s'est révélél plus active que celui-ci dans les essais préliminaires, le g-aspartylm-thylamide. Si ce dernier s'est 30 3 révélé actif sur des tumeurs lymphoblastiques de la souris dont certaines sont résistantes a l'asparaginase, l'association L-D-aspartylméthylamide/Lasparaginase n'a pas -* présenté l'activité attendue: aucune potentialisation de l'activité de l'un par rapport à l'autre n'a été observée; 9845FR en revanche, l'activité de l'asparaginase était diminuée en présence de cet inhibiteur. Sur ces bases théoriques, a été étudié -ce qui a permis de conduire à la présente invention- l'effet d'une molécule de D-aspartique acide 5 hydroxamate associée à la L-asparaginase, dans l'espoir de pouvoir accroître l'effet cytolytique de cette dernière sur des tumeurs sensibles, de contrôler le mécanisme biologique et génétique de résistance à celleci, et d'élargir, si possible, le spectre de la L10 asparaginase jusqu'aux tumeurs insensibles L'action de cette association DAH/L- asaparaginase sur plusieurs types de cellules tumorales et normales a donc été étudiée aussi bien in vitro que in vivo. A - ETUDE EN CULTURE CELLULAIRE L'effet de l'association précitée a été étudié in 15 vitro sur diverses lignées cellulaires obtenues à partir de tumeurs humaines et fibroblastes de poumon foetal humain diploïde (ERC5>. Parmi les tumeurs humaines, on a observé un arrêt de la synthèse de l'ADN, aussi bien sur les tumeurs solides: carcinome de tumeur mammaire L!210 (Figure 1!. Légende de 1a figure 1: - en abscisses: Temps de contact de différentes cellules avec l'association L-asparaginase/DAH; - en ordonnres: Incorporation de:H-thymidine. - -1 - XCF 7; 2- RBL 5; 3 - BLôO; 4 - L1210; HT29; 6 - NTerDau; 7 - Ewing. 30 - En prenant les cellules de mélanome comme exemple, on a observé une faible inhibition de la croissance dans un milieu dépourvu en asparagine. Cette faible inhibition pouvait être en relation avec la capacité pour ces cellules 9845FR de synthétiser la L-asparagine par la L-asparagine synthétase, comme il a été démontré par Horowitz et al un milieu dépourvu en asparagine + DAH Légende de la figure 2: - en abscisses: Temps de contact (heures> des cellules avec 20 différentes conditions de culture. - A - cellules de mélanome NterDau; - B - cellules normales XRC5. - en ordonnées: nombre de cellules vivantes * milieu normal contrôle; X milieu plus L-asparaginase 25 0,4 U/ml; O milieu plus DAH 400 >X; [ milieu déprimé en asparagine; E milieu déprimé en asparagine plus DAH 400 jM; milieu avec L-asparaginase 0,4 U/ml plus DAH 400 Ad. L'effet inhibiteur total de la croissance des cellules tumorales est dépendant de la dose (Figure 3) et du temps de contact avec les cellules. Dès 2 heures de contact de l'association avec les cellules leucémiques L1210, on observe une mort cellulaire qui s'accroit au cours de la culture des cellules (Figure 4). Un contact de 20 heures aboutit à une mort cellulaire totale pour ces cultures. 9845FR En revanche, l'esscciation asparasinase/DAH prc-'cque un arré-t de la sy. nthese de L'ADN des ce!lulee ncr.r-. _ XC'-= M.,_?.n cu- cela accodoa-Ene de crt ciluaire pour des doses allant Jusqu'a 2X 2 6 heures, * 8 heures, 4 20 heures;.. - enr. ordonnées: pourcentage de survie des cellules leucémiques L1210. - en abosci4sses: Tems de contact des cellules normes _C5 25 avec di-ffrentes concentrations de D-aspary7l hdr-.-- - te ajouté à 0,4 U/ml d'asparaginase: témoin; cellules C25 cltivé_es avec 0,4 U/mi dasparaginase plus S aszartil hydroxam.te 100 p; F 200 pE; A 400; 0X 800gM; - L N 1 2 ln; -30 en ordonnées: nombre de cellules vivantes. Il a, par ailleurs t observ--é aue les au-res associations précitées provocuent le m-m-em.fet cyoioyicue sur cellules tumorales.et cy.os.atiue réesble su cellules normales. B - ETUDFS IN VIVO SUR DES MODELES MUJRTNS Compte tenu des résultats in vitro, l'activité antitumorale de cette association médicamenteuse a été étudiée sur trois modèles tumoraux murins: L1210, RBLS, B16. Les cellules leucémiques L1210 sont maintenues par passages intrapéritonéaux dans la souris DBA/2. Le nombre de cellules utilisées pour les essais thérapeutiques est de 5.10: cellules par souris. Les cellules de lymphome murin RBL5 sont 10 maintenues par passages intrapéritonéaux successifs chez la souris C57bl6 et injectées, pour les essais, à la dose de '3 cellules par souris. Les cellules de mélanome murin B16 sont maintenues par passages subcutanés chez la souris C57bl6 et injectees intrapéritonéalement à 10' pour les 15 essais L'activité antitumorale expérimentale des drogues a été évaluée en comparant les durées de survie des animaux auxquels sont injectées les cellules tumorales avec ou sans drogue. Une augmentation de 30% de la durée 'de survie des souris traitées par une drogue par rapport aux témoins non 20 traités est considérée comme significative. Dans lé cas de traitement par une association de drogues, il y a synergie pharmacologique lorsque l'augmentation de la survie des souris représente plus de 40%/ de la réponse obtenue par chacun des produits. - Les trois modèles murins étudiés montrent une résistance au traitement avec la L-asparaginase seule ou du %. DAH seul (Figures 6-7-8>. En revanche, le traitement avec l'association Lasparaginase-DAH, dans les-conditions qui ont été définies, met en évidence une synergie pharmacologique avec une augmentation de la survie des souris ainsi traitées de plus.de 120% (courbes 9-10-11) 9845FR )- en abcissee: survie des scurt' ,. après traitement avec: - L-asparaginase: 200 UI/kg injectée 2 fois par jour pendant 5 jours; - DAH: 600 mg/kS par.jour pendant 5 jours; lO - Figure 7: Courbe de survie des souris C57bl6 inoculées avec les cellules B16 de' mélanome (!0'e cellules dans 0,5 mi ?IP) après traitement avec: - L-asparaginase: 200 Ui/kg 2 fois par jour 15 - 15- pendant 5 jours; - DAH: 600 mg/kg par jour pendant 5 jours; -Figure S Courbe de survie des souris C57'ol6 'inoculées avec les cellules de lymphome murin RBLS (10e cellules dans 0,Sml 20 IP) après traitement avec - L-aszaraginase: 200 UI/kg 2 fois par jour oendant 5 jours; - DA: 600 mg./k pendant 5 jours; - Figure 9: Courbe de survie des souris DBA/2 inoculees avec les celluies Li2l! -, 4- FR 2-600256 - Figure 10: Courbe de survie des souris C57bl6 inoculées avec les cellules de mélanome B16 (10 cellules dans 0,5 ml) après traitement avec l'association L-asparaginase et le DAH, administrés aux jours 1,2,3 --7,8, 9 - 15,16,17 aux doses suivantes: - L-asparaginase: 200 UI/kg/jour, - DAH: 600 mg/kg/jour; - Figure 11:. Courbe de survie des souris C57bl6 inoculées avec 10 les cellules RBL5 (10' cellules dans 0,5 ml) après traitement avec la.L-asparaginase et le DAH, administrés aux jours 1,2,3 - ",8,9 - 14415, aux doses suivantes: L-asparaginase: 200 UI/kg/jour - DAH: 600 mg/kg/jour; 2') en ordonnées.: pourcentage de souris vivantes. Les groupes traités et non traités contiennent 8 souris. Des résultats ci-dessus, il ressort que l''association L-asparaginase/DAH est capable d'inhiber -sélectivement la croissance de cellules tumoraies aussi variées que tumeur du sein, du colon, mélanome et lymp'home, alors qu'elle provoque un arrêt.du cycle cellulaire de la cellule normale. L'addition simultanée des deux composés - est indispensable aussi bien pour leur effet cytolytique sur les cellules tumorales que cytostatique sur'cellulesnormales. L'asparaginase présente un rôle particulier qui ne se limite pas pour des cellules tumorales à la déplétion en ASN du milieu. '' L'effet cytolytique de l'association est, dans certaines conditions, irréversible sur les cellules tumorales alors qu'il est réversible sur les cellules normales. 9845FR ki L'activité antitumorale de l'association Lasparaginase et DAH, étudiée sur trois modèles murins, montre une synergie pharmacologique avec une augmentation de la survie des souris traitées de plus de 120%. II - ACTIVITE ANTIVIRALE DE L'ASSOCIATION L-ASPARAGINASE/ D-ASPARTIQTTE ACIDE B HYDROXAMATE (DAH) Bien que des progrès aient été accomplis en ce qui concerne la lutte contre les infections virales, on ne dispose pas encore d'une gamme d'agents antiviraux aussi 10 étendue, sure et efficace que le sont, par exemple, les antibiotiques. De par leur mode d'action, les agents antiviraux peuvent être classés, d'une façon large, en trois categories, les frontières entre celles-ci étant souvent 15 arbitraires: - la première catégorie, a savoir celle des agents chimiques, constitue le groupe le plus étendu et celui qui se développe le plus vite. Etant donné que les virus sont des parasites intracellulaires obligés, 20 l'efficacité de ces agents est déterminée par leur capacité à différencier le métabolisme viral du' métabolisme cellulaire, autrement dit le métabolisme de la cellule infectée et celui de la cellule non infectée. En d'autres termes, la caractéristique 25. essentielle de ce groupe d'agents est leur spécificité d'action. Celle-ci détermine en même temps la force et la faiblesse de ces agents, car, s'ils sont souvent très efficaces, du fait qu'ils peuvent inhiber spécifiquement une enzyme virale, leur spectre d'action 30 est généralement très limité et ils finissent souvent par sélectionner des variants viraux résistants, de la même manière que le font les antibiotiques avec les bactéeries (De Clercq E., Biochem. J.205: 1-13, 1982; 9845FR Becker Y. et Hadar' J., Pro. Med. Vircl. 25:1-44, 1980); - la deuxieme catégorie es t ccrn.ituee Far les stimulateurs du systeme immurn. Kis à part les differents types de vaccins, ce grouse est constitue par des agents capables d'activer les défenses non spécifiques (macrophages, cellules "tueuses" naturelles) ou plus rarement, les défenses spécifiques (lymphocytes "B" ou "T") de l'organisme. Pour la plupart, ces agents sont encore en phase expérimentale. Contrairement aux agents chimiques, les - caractéristiques essentielles de leur mode d'action sont leur spectre d'action très large et le fait qu'ils ne peuvent pas sélectionner de variants résistants. 15 Cependant, ils sont, pour. l'intant, en nombre limite et peu efficaces, bien que des progrès aient été récem.ent accomplis dans ce sens (Koff W.C.,Showalter S. D.-, Hampar B. et Fidler I. J., Science 2.2: 495-4G6, 1985). la troisième catégorie est celle des inducteurs de l'état cellulaire antiviral, groupe qui comprend t'interfèron (IT), les inducteurs d'IFN et les substituts 'IFl. il s'agit d'un groupe encore tres réduit -e substances au. se caractérsent comme 25. éveillant dans les cellules un eta de résistance à l'infection virale. Ces agents cumulent la pu-i5sance de l'action au niveau cellulaire des agents chimiques et le spectre d'action très large des activateurs du système immun. Du fait qu'ils agissent sur toutes les * -cellules, qu'elles aient été infectées ou non, un élément déterminant-de leur efficacité est leur faible pouvoir toxique envers les cellule:s. I1 a maintenant été découvert que i'association du D-asoarticue acide Dhrdroxamate et de la L-asparaginase 35e faon toale la inhibe de façon totale la multiolication virale. 9845FR On peut penser que cette association de substances appartient a la troisieme categorie sus-indiquée des agents artiviraux, bien que son mode precis d'action n'ait pas encore eté totalement élucide. 1'/ Une expérience in vitro a permis de mettre en évidence que l'association D-aspartique acide 3 hydroxamate (DAH)/Lasparaginase provoque une inhibition très significative de deux virus pourtant très éloignés à plusieurs égards, l'un étant un virus à ARN (rougeole) et l'autre, un virus à ADN 10 HSV.: Des cellules VERO (lignée de cellules "normales") ont été infectées par le virus de l'herDés simplex du type 1 (F.SV.1) ou par le virus de la rougeole a une multiplicité d'infection d'une particule 15 infectieuse par cellule. Les cellules infectées ont été traitées par DAH/L-asparaginase aux doses indiquées sur la-figure.12. L'inhibition observée semble apparaître brusquement après avoir depassé une concentration "seuil" située autour de 400uX1 20 de DAH en présence de 0,4U/ml de l'enzyme L-asparaginase. -Le fait que la concentration optimale soit la même pour les deux virus testés, qui comme indiqué ci- dessus, sct res adifferents, est en faveur d'une action de 25 l'association au niveau cellulaire, action capable d'éveiler un état de résistance envers les virus infectants;. 2'/ Des expériences ont été menées pour déterminer l'effet du temps de prétraitement, ou du traitement post-infection 30 avec cette association DAH/L-asparaginase Les cellules VERO infectées par l'HSU.1 à une multiplicité de 1 PFU/ml, ont été prétraitées ou post-traitees par l'association DAH/L-asparginase aux doses respectives de 600 ju et de 0,4 U/ml de L-asparaginase. La production virale a éte 9845FR comparée avec un témoin traité. Les résultats sont indiqués sur la figure.13. - On constate que le prétraitement (entre -24 heures et 0) provoque une inhibition de la multiplication qui *5 atteint plus de 4 logs. à -24 heures et près de 3 logs à -6 heures. Apres l'infection, l'effet inhibiteur est significatif jusqu'à environ 6 heures (prés de 2 logs) et diminue par la suite. 3'/ D'autres expériences, qui ont été effectuées, montrent10 que l'inhibition observée est indépendante de la multiplicité d'infection,au moins jusqu'à une multiplicité de dix particules infectieuses par cellule. Le niveau d'inhibition maximal observé est égal, sinon supérieur, à celui obtenu avec les meilleurs inhibiteurs de la multiplication virale dont on dispose aujourd'hui. Le faible taux, voire l'absence de toxicité de l'association DAH/L-asparaginase pour les cellules (infectées ou non), mérite également d'être souligné. Il convient également de préciser que chacun des 20 composants de cette association considéré isolément ne présente aucun effet antiviral (Goswani B.B., Gosselin H., Kubach J.L. et Sarma O.K. Virology 137: 400-407, 1984). La présente invention a égalemert pour objet une 25 nouvelle composition médicamenteuse, synergique, destinée notamment traitement des tumeurs,et au traitement des maladies infectieuses dues aux virus, caractérisée par le fait qu'elle comprend, à titre d'agents actifs'd'une part, une enzyme de dégradation d'un amino-acide et,d'autre part, 30 ledit amino-acide sous forme hydroxamate, présentés simultanément ou séparément. Des exemples de telles associations de principes actifs sont indiqués ci-dessus. Chaque principe actif se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée à dissoudre extemporanément dans une solution physiologique en vue de l'injection, soit simultanée, soit séparée, des deux principes actifs 984-FR L'administration s'effectue par voie parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, dans le liquide céphalorachidien, etc) Les concentrations respectives des principes actifs dans les solutions d'injection sont les suivantes: L-asparaginase: 200 IU/1 DAH: 0,6 à 1,2 g/1 Par ailleurs, la composition de l'invention peut également contenir des additifs inertes ou pharmaco10 dynamiquement actifs. 9845FR EVEN-' CAT TO8.TS 1 - Médicament, caractérisé par le fait qu'il consiste en l'associLation d'une enzyme de dégradation d'un amino-acide et dudit amino-acide sous forme hydroxamate 2 - Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en l'association de la L-asparaginase et du Daspartique acide e hydroxamate -(DAH> 3 - Médicament selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'il consiste en l'association de la phenylalanine ammnonialyase et du DLphénylalanine hydroxamate. 4 - Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en l'association de l5 ia tryptophanase et du DL-tryptophane hydroxamate. - 5 - Xédicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en l'association de la tyrosinase et du L-tyrosine hydroxamate. X - 'édicament selon l'une des revendications 1 à20 5, caractérisé par le fait qu'il est destiné au traitement des tumeurs. T - Xedicament selon l'une des revendications 1 à , caractérisé par le fait qu"il est destine au traitement des maladies infectieuses dues aux virus..25 .25. 8 - Composition médicamenteuse synergique, destinée notamment au traitement des tumeurs et au traitement des maladies infectieuses dues aux virus, -.caractérisée par le fait qu'elle comprend, à titre d'agents actifs, d'une part, une enzyme de dégradation d'un amino30 acide, et, d'autre part, ledit amino-acide sous forme hydroxamate, présentés séparément ou simultanément 9 - Composition médicamenteuse selon la revendication 8, caractérisée par le -fait que chaque principe actif se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée à dissoudre extemporanément dans une solution 9845FR physiologique en vue de l'injection, soit simultanée, soit séparée. - Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait que les concentrations respectives des principes actifs dans les solutions d'injection sont les suivantes: Lasparaginase: 200 IU/l D A H: 0,6 à 1,2g/1 11 - Composition selon l'une des revendications 8 10 à 10, caractérisée par le fait qu'elle contient des additifs inertes ou pharmacodynamiquement actifs. 9845FR