Brevet FR2601037A1 — publié le 19880108

- 1 La présente invention est relative à un peptide isolé de la protéine 28 KD de S. mansoni, qui porte un ou des épitopes et à son procédé d'isolement, ainsi qu'à des anticorps monoclonaux aptes à reconnaître les fractions anti5 géniques peptidiques ainsi isolées et à des compositions thérapeutiques propres à induire la synthèse d'anticorps neutralisants, lesquelles compositions comprennent ledit peptide seul ou en association avec d'autres substances appropriées. BALLOUL et Al. [MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITO10 LOGY, 17 (1985) p. 105-114] ont décrit la synthèse in vitro d'un antigène constitué par un polypeptide présentant un poids moléculaire de 28 KD et un point isoélectrique compris entre 6,3 et 6,8, qui constitue un produit de tradiction in vitro d'ARN total de Schistosoma mansoni. Les Auteurs ont poursuivi leurs recherche dans le but d'isoler à partir de ce polypeptide de 28 KD, et d'identifier l'épitope ou les épitopes peptidiques responsables des propriétés antigéniques. Il est connu d'analyser les peptides qui consti20 tuent des protéines isolées de gels de SDS, par digestion partielle desdites protéines par une protéase dans un tampon contenant du SDS; on obtient des produits de digestion partielle stables, qui se composent de nombreux peptides dont les poids moléculaires sont suffisemment élevés pour qu'il 25 soit possible de les séparer en gels de SDS acrylamide à 15% [CLEVELAND et Al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 252, p. 1102-1106, (1977)3. Les Inventeurs ont cherché à isoler, à partir de la protéine 28 KD de S. mansoni, le ou les peptides portant 30 l'activité antigénique anti-Schistosome que présente la protéine 28 KD, et ont fait application dans ce but des techniques d'isolement de fragments peptidiques par protéolyse décrits dans l'Art antérieur. La présente invention a pour objet un procédé 35 d'isolement d'un peptide portant au moins un épitope, par - 2 protéolyse, caractérisé en ce que l'on soumet la protéine 28 KD de S. mansoni à l'action de la protéase V8 en tampon Tris-HCl pH 6,8 contenant du SDS, en ce que la réaction de protéolyse est arrêtée par addition d'un mélange de 5 2-mercaptoéthanol et de SDS, puis on porte à ébullition à 100 C pendant un temps bref, pour recueillir un peptide dont on vérifie l'activité antigénique à l'aide des anticorps d'un sérum polyclonal ou d'anticorps monoclonaux. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé 10 conforme à la présente invention, la digestion enzymatique de la protéine 28 KD par la protéase V8 est réalisée pendant minutes à 30 C. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le mélange utilisé 15 pour arrêter la réaction de protéolyse comprend du. 2-mercaptoéthanol à raison de 1 pl pour 3 pl de SDS à 10%. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le tampon Tris-HCl dans lequel est dissoute la protéine 28 KD est un 20 tampon 100 mM à 125 mM et contient de 0,08 à 0, 12% de SDS. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, la vérification de l'activité antigénique du peptide isolé par protéolyse, qui est réalisée par "Western blotting" à l'aide d'un sérum polyclonal de rat, 25 de lapin ou analogue, anti-28 KD, révèle, à l'aide d'anticorps marqués par la peroxydase, dirigés contre des immunoglobulines de rat, de lapin, de souris ou analogue, un épitope peptidique de 6 KD. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préfé30 ré du procédé conforme à l'invention, la vérification.de l'activité antigénique du peptide isolé par protéolyse, qui est réalisée par "Western blotting" à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-28 KD révèle un épitope peptidique de 8 KD. La présente invention a pour objet un fragment pep35 tidique, caractérisé en ce qu'il est isolé de la protéine - 3 28 KD de S. mansoni, par protéolyse ménagée, en ce qu'il présente un poids moléculaire de 6 KD et en ce qu'il est reconnu par du sérum polyclonal de lapin, de rat ou analogue, anti-28 KD. La présente invention a également pour objet un fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il est isolé de la protéine 28 KD de S. mansoni par protéolyse ménagée, en ce qu'il présente un poids moléculaire de 8 KD et en ce qu'il est reconnu par un anticorps monoclonal anti-28 KD, d'isotype 10 IgG2a (W 2 AD 12). La présente invention a de plus pour objet un hybridome dénommé M 5 BD 9, qui fournit des anticorps monoclonaux d'isotype IgMqui reconnaissent l'antigène de 28 kDa. La présente invention a également pour objet un 5 hybridome dénommé W 2 AD 12, déposé à la CNCM le 9 Mai 1986 sous le n 1-553, qui fournit des anticorps monoclonaux d'isotype IgG2a qui reconnaissent une bande correspondant à un fragment peptidique de 8 KD, isolé par protéolyse ménagée du polypeptide 28 KD de S. mansoni. Conformément à la présente invention, les hybridomes M 5 BD 9 et W 2 AD 12 sont obtenus en procédant comme suit: Les anticorps monoclonaux dirigés contre le groupe de protéines de 28 kDa de Schistosoma mansoni ont été obtenus par 25 hybridation cellulaire homologue rat x rat utilisant la souche myelomateuse de rat LOU IR983F [Bazin et coll. 1980 Ann. Immunol. (Institut Pasteur) 131 D: 359, et des cultures spleniques de rat LOU immunisés par 50 pg du groupe de protéines de 28 kDa de S. mansoni, en présence d'adju30 vant complet de Freund, en deux injections sous-cutanées de pg, à quinze jours d'intervalle. Après fusion, les cellules productrices d'anticorps anti28 kDa ont été sélectionnées par des tests radioimmuno35 - 4 logiques sur plaques. Un homogenat de vers adulte est fixé sur des plaques de polyvinyle, puis mis en contact avec les anticorps présents dans les surnageants des cultures d'hybrides. La liaison antigène-anticorps est ensuite révélée 5 par addition d'un second anticorps marqué à l'iode 125I, dirigé contre les IgG de rat. Les cellules positives dans ce test ont été clonées par la méthode de la dilution limite. La présente invention a, en outre, pour objet une 10 composition vaccinante contre S. mansoni qui est caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragment peptidique isolé de 28 KD de S. mansoni par protéolyse ménagée, associé à un véhicule approprié. Selon un mode de réalisation avantageux de la com15 position vaccinante conforme à la présente invention, celleci contient au moins un fragment peptidique de 6 KD et/ou de 8 KD, associé à un véhicule approprié. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition vaccinante conforme à la présente invention, 20 celle-ci contient au moins un fragment peptidique isolé de 28 KD de S. mansoni par protéolyse ménagée, associé à l'épitope de l'antigène 38 KD, ainsi qu'à un véhicule approprié. L'épitope de l'antigène de PM 38 KD est un oligosaccharide qui fait l'objet de la Demande de Brevet français 25 ne 86 06281 du 30 Avrl 1986 au nom des Demanderesses. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide d'un exem30 ple de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention et d'exemples de caractérisation de l'activité antigénique du peptide conforme à l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple de mise en oeuvre, est donné uniquement à titre d'illus35 tration de l'objet de l'invention, dont il ne consitue en au- - 5 cune manière une limitation. EXEMPLE 1 - PREPARATION DU PEPTIDE ISOLE DE LA PROTEINE 28 KD DE S. MANSONI Etape I: Préparation de l'antigène de 28 KD de S. Mansoni Des vers adultes de S. mansoni (souche portoricaine) collectés par perfusion de la veine forte chez des hamsters dorés, ont été homogénéisés dans du tampon PBS dans un homogénéiseur POTTER-ELVEHSEM et l'homogénéisat à été centrifugé à 5000 tours/minute 10 pendant 20 minutes. Environ 2 mg d'antigènes ont été fractionnés sur des gels de polyacrylamide à 13% en plaques, en utilisant le système tampon discontinu de Laemmli [décrit par LAEMMLI, NATURE (1970), 227, 15 p. 680- 685]. Après électrophorèse, les gels ont été colorés par du bleu brillant de COOMASSIE. Les bandes colorées ont été découpées au scalpel et transférées dans un gel d'élution constitué par des coulées de gel de 20 support. L'élution a été effectuée à 40-60 V pendant 6 à 12 heures. La vitesse de l'élution est fonction du pourcentage du gel qui se sépare et de la dimension moléculaire des protéines que l'on élue. La migra25 tion des échantillons a été stoppée à l'interface des couches de NaCL 2M-glycérol. Lorsque tous les peptides ont été élues dans la couche de glycérol, l'électrophorèse a été stoppée et les échantillons ont été retires à l'aide d'une 30 pipette PASTEUR. Les échantillons ont alors été dialysés contre de l'eau pour éliminer le SDS et les sels, avant d'être concentrés par lyophilisation. Les protéines fractionnées ont alors été réanalysées sur du gel de polyacrylamide à 13%, en 35 plaque. - 6 La protéine de PM 28 KD obtenue par la technique de fractionnement qui vient d'être décrite, et qui est caractérisée en ce qu'elle induit une réponse d'anticorps et en ce que son antisérum immuno5 précipite les antigènes 28 KD correspondants parmi les produits de traduction in vitro aussi bien d'ARN de vers adulte et d'ARN de Schistosomules de S. mansoni, est retenue pour être traitée conformément à l'Etape II ci-dessous. Etape II: Isolement par protéolyse d'un peptide de la protéine 28 KD de S. mansoni pg de protéine de 28 KD sont dissous dans 30 pl de tampon 125 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant 0,1% de dodécysulfate de sodium (SDS). On ajoute 1 pg de protéase V8 et la digestion enzymatique de l'antigène de 28 KD est réalisée à 37 C pendant 30 minutes, au bain-marie. La réaction est arrêtée par l'addition de 1 pl de 2-mercaptoéthanol et de 3 pl de SDS à 10%. L'ensem20 ble est porté à 100 C au bain-marie durant 6 minutes. On recueille des échantillons constitués par un peptide dont on détermine les propriétés antigéniques. EXEMPLE 2 - ANALYSE DE LA REPONSE ANTIGENIQUE DU PEPTIDE DE L'EXEMPLE 1 pg du peptide obtenu à l'Exemple 1 sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 20%. Le peptide ainsi fractionné est transféré sur une feuille de nitrocellulose comme 30 décrit par TOWBIN et Al. ú1984, J. Immunol. Methods 72, p. 471). La feuille de nitrocellulose est tout d'abord saturée par une solution de BSA 3% tamponnée par du phosphate mono- et disodique 10 mM pH 7,2 contenant 35 0,15 M NaCl - 50 pl d'anticorps, lesquels anticorps -7 sont soit des anticorps d'un sérum polyclonal de rat ou de lapin, soit des anticorps d'ascite monoclonale, soit des anticorps obtenus à partir d'un hybridome, spécifiquement d'hybridome W 2 AD 12, 5 M 5 BD 9, dont l'obtention est décrite à l'Exemple 4 ci-après. Antigène et anticorps sont laissés en contact durant une nuit à température ambiante, pour obtenir un "Western blot" qui est lavé trois fois trente 10 minutes en tampon phosphate. Des anticorps marqués par la peroxydase (fournis par PASTEUR PRODUCTION) dirigés soit contre des immunoglobulines de lapin (dans le cas des anticorps polyclonaux), soit contre des imimunoglobulines de rat (dans le cas des anticorps monoclonaux), sont ensuite ajoutés et incubés avec le "blot" durant 2 heures. Trois nouveaux lavages sont réalisés et la présence des immuno-complexes est révélée par l'addition d'une solution contenant 20% de méthanol froid, 30 mg de 4-chloro-1-naphtol, 0,1% d'H202 pour 100 ml de tampon 20 phosphate, 0,15 M NaCl. Le "Western blotting" est représenté à la Figure 1 annexée dans laquelle: - le bloc 1 représente dans sa partie inférieure le peptide isolé par protéolyse, conforme à l'inven25 tion et à sa partie supérieure la protéine 28 KD; - le bloc 2 représente le "blot" obtenu avec un sérum de lapin sain; - le bloc 3 représente le "blot" obtenu avec des anticorps monoclonaux provenant de I'hybridome 30 W 2 AD 12; - le bloc 4 représente le "blot" obtenu avec du sérum polyclonal de lapin anti-28 KD. Ce "Western blotting" montre que l'anticorps monoclonal W 2 AD 12 porteur d'une activité cytotoxique vis-à-vis 35 de la larve post-infestante de Schistosoma mansoni reconnaît - 8 un fragment de 8 kDa dérivé de la protéine de 28 kDa. La reconnaissance par un anticorps de classe anaphylactique suggère l'importance de ce peptide dans l'induction d'une réponse protectrice visà-vis de S. mansoni. L'épitope porté par un fragment de 6 kDa, reconnu par le sérum de lapin n'est pas reconnu par l'anticorps monoclonal de rat suggérant que la reconnaissance de tel ou tel épitope de l'antigène de 28 kDa est spécifique d'espèce. EXEMPLE 3 - CONTROLE DE LA RECONNAISSANCE DU PEPTIDE ANTI10 GENIQUE CONFORME A LA PRESENTE INVENTION PAR LES ANTICORPS MONOCLONAUX A. La recherche d'un épitope peptidique de taille restreinte parmi les produits de protéolyse de l'antigène de 28 KD, a permis de révéler un fragment de 8 KD reconnu spécifique15 ment par l'anticorps monoclonal d'isotype IgG2a, obtenu à partir de l'hybridome W 2 AD 12. L'activité cytotoxique (illustrée dans le Tableau I ciaprès) de cet anticorps monoclonal dans des tests in vitro impliquant des éosinophiles, suggère l'importance du ou 20 des épitopes portés par ce peptide de 8 KD. // - 9 TABLEAU I Cytotoxicité dépendante d'éosinophiles Etude de l'anticorps monoclonal W 2 AD 12 Source d'anticorps a Pourcentage de cyto- b toxicité i S.D. - Sérum de rat porteur de la tumeur sous-cutanée d'hybride 66,9 26,0 W 2 AD 12 - Sérum de rat porteur de la tumeur sous-cutanée des 7,3 1,06 cellules IR983F - Sérum de rat immunisé par la protéine 28 kDa 69,9 22,9 - Sérum de rat infecté depuis 4 semaines par S. mansoni 74,3 23,5 - Sérum de rat sain 5,0 4,2 Les tests de cytotoxicité sont réalisés selon les conditions décrites par Capron et Coll. [Eur. J. Immunol., 8, 127-133, 1978]. a) Les schistosomules sont présensibilisés pendant 18 heures, en présence de 100 pl des différents 25 sérums (dilution finale 1/16) chauffés 1 heure à 56 C, b) Le pourcentage de cytotoxicité (moyenne écarttype de la moyenne) est mesuré après 48 heures d'incubation des schistosomules sensibilisés en 30 présence de cellules péritonéales de rat sain (rapport cellules effectrices/cible = 6000/1). Le sérum de lapin anti-28 KD ne reconnait pas le ou les épitopes portés par ce peptide, mais reconnait un autre peptide, de 6 KD. L'anticorps monoclonal de W 2 AD 12 reconnait les deux - peptides du groupe d'antigènes de 28 KD. B. L'anticorps monoclonal d'isotype IgM, obtenu à partir de l'hybridome M 5 BD 9 ne reconnait qu'une seule des deux protéines du groupe à 28 kDa. La Figure 2 annexée montre les résultats de "Western blotting" du groupe d'antigènes de 28 kDa conforme à l'invention avec des anticorps monoclonaux de M 5 BD 9, de W 2 AD 12 et avec du sérum polyclonal de lapin, tels que relatés ci-dessus. - 11 REVENDICATIONS 1) Procédé d'isolement d'un peptide portant au moins un épitope, par protéolyse, caractérisé en ce que l'on soumet la protéine 28 KD de S. mansoni à l'action de la pro5 téase V8 en tampon Tris-HCl pH 6,8 contenant du SDS, en ce que la réaction de protéolyse est arrêtée par addition d'un mélange de 2-mercaptoéthanol et de SDS, puis on porte à ébullition à 100 C pendant un temps bref, pour recueillir un peptide dont on vérifie l'activité antigénique à l'aide des 10 anticorps d'un sérum polyclonal ou d'anticorps monoclonaux. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la digestion enzymatique de la protéine 28 KD par la protéase V8 est réalisée pendant 30 minutes à 300C. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendica15 tions 1 et 2, caractérisé en ce que le mélange utilisé pour arrêter la réaction de protéolyse comprend du 2-mercaptoéthanol à raison de lpl1 pour 3 pl de SDS à 10%. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tampon Tris-HCl dans 20 lequel est dissoute la protéine 28 KD est un tampon 100 mM à mM et contient de 0,08 à 0,12% de SDS. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la vérification de l'activité antigénique du peptide isolé par protéolyse, qui est 25 réalisée par "Western blotting" à l'aide d'un sérum polyclonal de rat, de lapin ou analogue, anti-28 KD, révèle, à l'aide d'anticorps marqués par la peroxydase, dirigés contre des immunoglobulines de rat, de lapin, de souris ^. analogues, un épitope peptidique de 6 KD. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la vérification de l'activité antigénique du peptide isolé par protéolyse, qui est réalisée par "Western blotting" à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-28 KD révèle un épitope peptidique de 8 KD. 7) Fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il est - 12 isolé de la protéine 28 KD de S. mansoni, par protéolyse ménagée, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en ce qu'il présente un poids moléculaire de 6 KD et en ce qu'il est reconnu par du sérum polyclonal de lapin, de rat ou ana5 logue, anti-28 KD. 8) Fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il est isolé de la protéine 28 KD de S. mansoni, par protéolyse ménagée, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en ce qu'il présente un poids moléculaire de 8 KD et en ce qu'il 10 est reconnu par un anticorps monoclonal anti-28 KD, d'isotype IgG2a (W 2 AD 12). 9) Hybridome dénommé W 2 AD 12, déposé à la CNCM le 9 Mai 1986 sous le n 1-553, qui fournit des anticorps monoclonaux d'isotype IgG2a qui reconnaissent une bande corres15 pondant à un fragment peptidique de 8 KD, selon les revendications 7 et 8 respectivement, isolés par protéolyse ménagée du polypeptide 28 KD de S. mansoni. ) Composition vaccinante contre S. mansoni, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragment pepti20 dique isolé de 28 KD de S. mansoni, par protéolyse ménagée, associé à un véhicule approprié. 11) Composition vaccinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragment peptidique de 6 KD et/ou de 8 KD, associé à un véhi25 cule approprié. 12) Composition vaccinante selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragment peptidique isolé de 28 KD de S. mansoni par protéolyse ménagée, associé à l'épitope de 30 l'antigène 38 KD, ainsi qu'à un véhicule approprié.