Brevet FR2603382A1 — publié le 19880304

La présente invention concerne un procédé de détection immunologique de la leucose bovine. Elle vise aussi les moyens pour la mise en oeuvre de ce procédé et leur application dans le domaine de la prophylaxie. On sait que la leucémie - ou leucose - bovine également connue sous le nom de lymphosarcome bovin est une maladie enzootique dont l'agent responsable n'est connu que depuis plusieurs années. Il s'agit d'un rétrovirus, à savoir le virus de la leucémie bovine (par abreviation BLV). Ce virus appartient du reste à la grande famille des virus leucémogènes et sarcomatogènes des poissons, des oiseaux et des mammifères (y compris un isolat récent d'origine humaine). On sait aussi démasquer la présence de l'agent viral chez les bovins grâce à la réaction immunitaire qu'ils développent en conséquence de l'infection. Toutefois, les techniques mises en oeuvre sont de sensibilités très différentes. Il s'agit par exemple de l'essai radioimmunologique (RIA), du test d'immunofluorescence, du test d'immunodiffusion (ID) ou du test EPI Or, des études seroépidémiologiques conduites en France par le demandeur ont révélé que le BLV était endémique dans plusieurs régions. Par ailleurs, des enquêtes répétées effectuées à l'aide du test EPI dans certaines autres régions ont montré qu'environ 50 % des troupeaux de bovins sont contaminés. La transmission du virus s'opère de l'animal contaminé à l'animal sain (contagiosité de mode horizontal) et l'animal est sensible pendant toute la durée de sa vie. Enfin, bien que nombre de bovins restent des porteurs sains, il a été démontré que lorsque la leucose se développe chez un animal, le troupeau qui l'héberge voit survenir de nombreux autres cas de leucémie (troupeaux à haut risque). Une conséquence de ce fait est que, chaque fois qu'un animal devient leucémique, l'ensemble du troupeau auquel il appartient est menacé d'élimination. Il n'est donc pas surprenant que, sur le plan économique, la leucémie bovine soit un problème important qui revêt une particulière gravité dans la menace qu'il fait porter sur les troupeaux qui peuvent être appelés à disparaitre en quelques années. Il est donc souhaitable de disposer d'un moyen de prophylaxie basé par exemple sur l'immunodiffusion. Toutefois, une telle mesure n'a de réelle chance de succès que si elle s'appuie sur une méthode très sensible, ce qui implique, soit d'améliorer considérablement une telle méthode immunodiffusion, soit de mettre au point une autre technique. Cette dernière ne pourra s'imposer que dans la mesure où elle réunira plusieurs avantages dont notamment la sensibilité, la spécificité, la rapidité de mise en oeuvre, la facilité d'exécution et un prix relativement modique. Plusieurs laboratoires se sont intéressés dans le monde, et en particulier aux Etats-Unis d'Amérique, en République Fédérale d'Allemagne et en Italie, à l'emploi de la méthode ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) pour la détection de l'infection par le BLV et plusieurs tests ont été développés à cet effet. Toutefois, ceux-ci requièrent tous une quantité importante d'antigènes et ils sont difficilement praticables à grande échelle. Il a bien été antérieurement proposé d'avoir recours à une telle technique ELISA dans laquelle l'antigène (le BLV) est fixé au fond de puits de plaques ELISA, le sérum à tester y étant ajouté, cette opération étant suivie d'une durée d'incubation visant à fixer les anticorps anti-BLV éventuellement présents. Ces anticorps sont ensuite révélés par des anti-gamma-globulines bovines marquées avec de la peroxidase ou avec de la galactosidase dont la présence est révélée par une réaction colorée. Bien que cette technique se soit montrée intéressante et précieuse au niveau du laboratoire de recherche, elle ne semble pas avoir d'avenir industriel en raison des fortes quantités (1 ag) d'antigène viral nécessaire et du coût très élevé de production et de purification du virus. Or la présente invention vise un procédé ayant pour résultat d'amplifier la réaction antigèneanticorps, permettant ainsi de conserver une haute sensibilité aux tests tout en utilisant une quantité réduite (5 à 10 ng) d'antigène. Ceci est possible gracie à la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre certaines protéines majeures du BLV. Il s'ensuit que le procédé selon l'invention consiste 1. A fixer au fond de puits de plaques ELISA un anticorps monoclonal dirigé contre un seul site (épitope) de protéine majeure (p24) du BLV. 2. A faire incuber l'anticorps monoclonal anti-p24 avec les protéines non purifiées du BLV, conduisant ainsi à une fixation élective de la p24. 3. A faire réagir le sérum bovin à tester et les nombreux épitopes de la p24 qui ne sont pas liés à l'anticorps monoclonal. 4. A faire réagir des anti-gamma globulines bovines marquées à la peroxidase, puis 5. A procéder à la réaction colorée avec un réactif approprié. Suivant une autre caractéristique, l'hybridome produisant l'anticorps monoclonal anti p24 est celui déposé le 30 juillet 1986 auprès de la C.N.C.M. sous le numéro d'enregistrement I-590-30.07.86. Un tel anticorps est de préférence obtenu de la façon suivante Des souris BALB/C ont été hyperimmunisées avec des injections répétées de p24 purifiées (25 ag par injection). Les cellules spléniques ont été fusionnées avec des cellules de myélome SP2/0 en présence de PEG (polyéthylèneglycol). Après sélection des hybrides en microplaques et milieu HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine), les cellules productrices d'anticorps ont été repérées à l'aide d'un conjugué anti-gammaglobulines murines dans un test ELISA. Les hybridomes producteurs ont été testés pour leur capacité à produire des anticorps anti-p24. Pour cela, un test ELISA spécifique de la p24 a été utilisé et les résultats contrôlés par un essai radioimmunologique. Les colonies d'hybrides producteurs ont été enfin clonés deux fois par la méthode des dilutions limites en milieu chimiquement défini SFM-2 ("sérum free medium nO 2"). Huit cultures ont été sélectionnées. Parce que les immunoglobulines sécrétées peuvent reconnaitre non seulement un épitope de la p24 mais également ce même épitope présent sur d'autres protéines, une caractérisation supplémentaire des anticorps a été réalisée. Les protéines de BLV purifiées ont été soumises à migration par électrophorèse unidimensionnelle et transférees sur papier de nitrocellulose. Ce papier imprégné des protéines du BLV immobilisées a été mis à réagir en milieu liquide avec les différents anticorps. Les anticorps fixés ont été révélés par coloration histochimique. Les résultats ont montré que certains anticorps reconnaissent non seulement la p24 mais d'autres protéines contenues dans l'extrait viral, que certains anticorps ne réagissent que faiblement, enfin que l'anticorps produit par l'hybridome déposé à la C.N.C.M. et dont il est fait référence ci-dessus reconnait fortement la bande p24 et aucune autre. C'est la raison pour laquelle cet hybridome a été choisi. La production, la concentration et la purification de l'anticorps correspondant ont été réalisées comme suit L'hybridome est cultivé en suspension agitée en SFM-2 ("serum free medium NO 2") jusqu'à saturation. Le milieu est ensuite centrifugé deux fois (3000 g et 10000 g). Au milieu de culture ainsi centrifugé est ajouté goutte à goutte, sous agitation, un volume d'une solution de sulfate d'ammonium saturée. Le milieu est soumis à agitation douce à 40C pendant 12 heures puis centrifugé (10000 g, 30 mn). Le culot est repris dans de l'eau distillée et dialysé contre du PBS (tampon phosphate) Les anticorps sont enfin purifiés sur colonne de DE52 (diethylaminoethyl cellulose DE52). . Le rendement moyen de la purification est de l'ordre de 20 ssg/ ml de milieu de culture. La nature de l'anticorps a été déterminée en ELISA de façon connue en soi. Il s'agit d'IgG1. Pour ce qui est de la préparation de l'antigène pour ELISA, on procède de la façon suivante Des cellules chroniquement infectées par le BLV (FLK-BLV) sont cultivées dans des unités de production (Multitray) jusqu'à densité maximale. Le milieu de culture (SFM-2 contenant 0,5 * de sérum foetal de veau et 1,5 % de. sérum de veau nouveau-né) est rejeté. Les cellules sont détachées de leur support à l'aide d'une solution de trypsine et soumises à deux centrifugations successives (4000 g, 10 mn et 7500 g, 10 mn) à 40C. Le culot cellulaire correspondant à un multitray est repris dans 3 ml de tampon PBS. Les cellules sont éclatées à l'aide d'un potter à OOC. L'ensemble est soumis à une centrifugation (2500 g, 10 mn) à 40C pour éliminer les débris. La quantité de protéines est estimée par la méthode de Lowry. L'ensemble est ensuite réparti par aliquots conservés à -300C. Les avantages du procédé selon l'invention sont en particulier les suivants 1. L'anticorps monoclonal choisi est immuable dans sa reconnaissance de l'antigène et, de plus, il reconnait un site antigénique d'une protéine du BLV dont on sait qu'elle ne possède aucune communauté antigénique avec les protéines internes des rétrovirus des autres mammifères. La technique est donc hautement spécifique et ses résultats très reproductibles. 2. La quantité d'antigène nécessaire est très faible et ne requiert que du virus, éclaté, mais non purifié. C'est en effet l'anticorps monoclonal qui sélectionne l'épitope correspondant à la p24 du virus. Des expériences préliminaires ont montré que la réaction peut s'opérer avec quelques nanogrammes de BLV alors qu'il faut au moins 1 ssg de BLV par puits dans les techniques ELISA conventionnelles, soit 100 à 1000 fois plus d'antigène purifié. 3. La réaction sérologique est considérablement amplifiée. En effet, chaque molécule de l'anticorps monoclonal fixe une molécule de p24 alors que chaque molécule de p24 va fixer autant de molécules d'anticorps conventionnel anti-BLV qu'il y a d'épitopes accessibles correspondant aux paratopes de l'antisérum. L'exemple suivant est donné à titre illustratif et non limitatif d'un protocole de réalisation du test ELISA avec l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé à la C.N.C.M. sous le NO I-590-30.07.86. a) déposer 25 ng de l'anticorps dans 100 l de tampon CBC-0,05 % Tween 80 par puits de plaque EIA 96 cupules b) incuber 16 heures à 40C ; c) laver trois fois avec un tampon PBS0,05 % de Tween 20 d) saturer chaque puits avec 100 l de SFM-2 e) incuber 1 heure à 370C f) laver trois fois comme en c) g) ajouter 25 g d'extrait cellulaire par puits dans 100 al de tampon PBS-0,05 % Tween 20 h) incuber 1 heure à 370C i) laver trois fois comme en c) j) ajouter le sérum à tester sous un volume de 100 al en commençant par la dilution 4 et en continuant par des dilutions de base log2 k) incuber deux heures à 37"C 1) laver trois fois comme en c) m) ajouter 100 al d'une dilution appropriée de Fab anti-IgG de boeuf conjugué à la peroxidase n) incuber 30 mn à 37 C o) laver trois fois comme en c) p) ajouter 100 iil par puits de substrat ABTS q) incuber 30 à 45 mn r) effectuer une mesure de l'absorbance à 415 nm. Un sérum est déclaré positif lorsque son absorbance à d = 4 est au moins égale à 2 fois l'absorbance à la même dilution d'un pool de sérums négatifs. Le titre d'un sérum positif correspond à la valeur de la dilution à laquelle l'absorbance est au moins égale à celle du ool e sérums negatifs à la dilution 4. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toutes modifications utiles pourront y être apportées sans sortir de son cadre. C'est ainsi en particulier que le procédé de l'invention pourra être mis en oeuvre en association ou en combinnison avec un autre anticorps spécifique du sérum de bovin à tester comme par exemple des anticorps monoclonaux anti-Gp51, protéine caractéristique de la leucémie bovine. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection immunologique de la leucose bovine, caractérisé en ce qu'il consiste a) à fixer au fond de puits de plaques ELISA un anticorps monoclonal dirigé contre un seul site (épitope) de protéine majeure (p24) du BLV ; b) à faire incuber l'anticorps monoclonal anti-p24 avec les protéines non purifiées du BLV, conduisant ainsi à une fixation élective de la p2-4 ; c) à faire réagir le sérum bovin à tester et les nombreux épitopes de la p24 qui ne sont pas liés à l'anticorps monoclonal ; d) à faire réagir des anti-gammaglobulines bovines marquées à la peroxidase ou à la galactosidase ; puis e) à procéder à la réaction colorée avec un réactif approprié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-p24 est associé ou combiné à un autre anticorps monoclonal spécifique du sérum de bovin à tester. 3. Anticorps monoclonal anti-p24 pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que c'est l'anticorps produit par l'hybridome déposé à la C.N.C.M. sous le NO I-590.30.07.86.