Brevet FR2608767A1 — publié le 19880624

PROCEDE POUR LA DETECTION ET LE DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-(SPOROZOAIRES DE P.FALCIPARUM) DANS LE SANG HUMAIN ET TROUSSE DE DIAGNOSTIC POUR METTRE EN OEUVRE CE PROCEDE La présente invention concerne un nouveau procédé immuno-enzymatique pour le diagnostic du paludisme dans le sang humain, ainsi qu'une trousse de diagnostic pour mettre en oeuvre ce procédé. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de détection et de dosage des anticorps anti-(sporozoaires de P. falciparum) dans le sang, le sérum et/ou le plasma humains. Le paludisme représente une des plus sérieuses maladies parasitaires, et frappe chaque année des centaines de millions de personnes, surtout dans les régions tropicales d'Asie, d'Afrique et d'Amérique, provoquant une mortalité infantile élevée. L'agent étiologique du paludisme est un protozoaire appartenant au genre plasmodium, qui est transmis à l'homme par la piqûre d'un moustique anophèle. Parmi les centaines d'espèces de plasmodium existant dans la nature, seules quatre sont pathogènes pour l'homme: Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax et Plasmodium falciparum. En particulier, ce dernier représente l'espèce la plus répandue et provoque le plus de cas de mobidité et de mortalité associés au paludisme. La détection des anticorps antisporozoaires dans le sang d'individus suspectés d'être atteints de paludisme constitue un paramètre clinique essentiel pour le diagnostic du paludisme et pour l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin antipaludéen. En général, le diagnostic des infections paludéennes est effectué par examen du sang au microscope, ou par des procédés immunologiques basés sur des mesures de fluorescence (IFA), de radioactivité (IRMA) et d'activité enzymatique (EIA). L'examen microscopique du sang est toutefois difficile et inapplicable pour une investigation épidémiologique, au cours de laquelle il faut examiner des centaines de milliers d'échantillons. D'autre part, les procédés immunologiques IRMA et IFA ne sont pas beaucoup plus adaptés, car, en plus du fait qu'ils exigent de longues durées de mise en oeuvre, ils sont compliqués en raison du grand nombre d'étapes qu'ils exigent et de l'utilisation de substances instables et nocives pour l'homme. Parmi les procédés immuno-enzymatiques EIA, le plus couramment utilisé est l'essai ELISA, qui comporte: a) la fixation, par absorption ou par liaison chimique covalente, d'un antigène naturel ou synthétique sur un support solide; b) le blocage des sites résiduels sur le support par une protéine convenable; c) l'incubation de l'antigène lié au support, avec le sérum étudié; et d) l'addition successive d'un anticorps anti- (immunoglobuline humaine), lié à un enzyme détecteur, et d'un substrat incolore pour l'enzyme, qui, en cas de réaction positive du sérum, donne un produit coloré. Cet essai, bien qu'il permette de surmonter quelques-uns des inconvénients des procédés IRMA et IFA, grâce à l'utilisation de substances stables et non radio- actives, exige cependant de longues durées de mise en oeuvre (environ 6 heures) et l'utilisation de réactifs, comme l'enzyme-anticorps antiimmunoglobuline, que l'on ne peut obtenir que par des procédés complexes et coûteux. On a donc besoin d'un procédé de diagnostic rapide, peu coûteux et sensible, utilisable pour une détection de masse dans les régions o le paludisme règne de façon endémique, ou bien dans les régions o il faut exercer un contrôle précis afin de localiser les foyers d'infection et d'empêcher leur extension. Ce besoin est satisfait, selon la présente invention, grâce à un nouveau procédé immuno-enzymatique qui utilise un conjugué enzyme-antigène synthétique, capable de former un complexe stable anticorps-antigène- enzyme avec les anticorps anti-sporozoaires, ainsi que des protéines qui se lient, avec beaucoup d'affinité, aux anticorps anti-sporozoaires dudit complexe. Par conséquent, un objet de la présente invention est un procédé immunoenzymatique pour la détection et le dosage d'anticorps anti-(sporozoaires de P. falciparum) dans des échantillons de sang humain et/ou de ses dérivés, procédé qui comporte: l'incubation de ces échantillons, en présence d'un conjugué enzyme-antigène synthétique, capable de former un complexe stable anticorps-antigène synthétique-enzyme avec les anticorps anti-sporozoaires, sans que soit annihilée l'activité enzymatique; la liaison des anticorps anti-sporozoaires dudit complexe avec des protéines qui sont adsorbées sur un support solide ou liées de façon covalente à celui-ci; et enfin, la détermination de l'activité enzymatique du complexe lié aux protéines, par addition d'un substrat enzymatique incolore capable de donner, en cas de réaction positive, un produit coloré. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation dudit conjugué enzyme détecteur-antigène synthétique pour la préparation d'une trousse de diagnostic du paludisme. D'autres objets de la présente invention apparaîtront de façon évidente à la lecture de la description et des exemples. Le conjugué enzyme-antigène synthétique, convenable pour le procédé conforme à la présente invention, est formé d'un enzyme et d'un polypeptide séquentiel, capable de reconnaître les anticorps antisporozoaires et de s'y lier. En particulier, selon la présente invention, le polypeptide séquentiel est (Asn-Ala-Asn-Pro)n, o n a une valeur comprise dans l'intervalle allant de 3 à 40, de préférence de 10 à 20, et ce polypeptide reproduit exactement le segment polypeptidique de la protéine circumsporozoaire naturelle de la membrane du sporozoaire de P. falciparum. La présence, dans ce polypeptide, de seulement deux groupes chimiques terminaux fonctionnels, NH2 et COOH, le rend particulièrement convenable pour la préparation du conjugué conforme à la présente invention, puisque cela rend possible la formation d'une liaison covalente stable entre le polypeptide et l'enzyme, sans être préjudiciable à l'activité catalytique de cet enzyme. On prépare ledit polypeptide sous forme pure et avec un rendement élevé, selon le procédé décrit dans la demande de brevet européen publiée sous le numéro 209 643, par polymérisation du polypeptide HCL.H-Asn-Ala-Asn-Pro- OPCP, dans un solvant polaire inerte, en présence d'une base organique tertiaire. Les enzymes utiles pour la préparation du conjugue de la présente invention sont choisis parmi ceux capables d'agir sur un substrat chromogène en donnant une réaction colorée. Des exemples de ces enzymes sont une peroxydase, une a-galactosidase, et une phosphatase alcaline. De préférence, on utilise une peroxydase. Selon la présente invention, on prépare le conjugué enzyme-antigène synthétique par un procédé qui comporte: 1) l'oxydation de l'enzyme purifié dans une solution 0,1 M de NaHCO3, en présence d'un agent oxydant tel que par exemple le métaperiodate de sodium, à la température ambiante (20-25'C) et dans l'obscurité, pendant environ 2 heures; 2) l'addition, à cette solution, du polypeptide dissous dans une solution de NaHCO3 (pH 9, 2), en un rapport molaire polypeptide/enzyme d'environ 40/1, et le maintien de la solution résultante au repos pendant environ 16 heures, à température ambiante et dans l'obscurité; 3) l'addition, à la solution obtenue, d'un agent réducteur tel que par exemple NaBH4, et finalement, 4) la séparation du conjugué polypeptide-enzyme. En particulier, selon un mode de réalisation pratique de la présente invention, on prépare un conjugué dans lequel le polypeptide est (Asn-AlaAsn-Pro)i? et l'enzyme est une peroxydase. Le degré de conjugaison, c'està-dire le rapport molaire du polypeptide à l'enzyme dans le conjugué, est de 0,9-0,92, valeur voisine de celle attendue (1) pour le conjugué pur. L'activité spécifique de la peroxydase, déterminée par spectrophotométrie à 405 nm comme le décrit H. Galloti (1979), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17 1-7, vaut 75 % de celle de l'enzyme non conjugué. Selon le procédé de la présente invention, on fait incuber ledit conjugué, dans une solution tampon, pendant environ 15 à 30 minutes, avec un échantillon de sang humain entier, de sérum humain ou de plasma humain. On fait ensuite incuber le mélange réactionnel pendant 20 à minutes supplémentaires, sur un support solide sur lequel la protéine A se trouve adsorbée et/ou liée par liaison covalente. On sait que cette protéine se lie avec beaucoup d'affinité aux immunoglobulines humaines, sauf IgM et IgG3, et qu'elle forme donc un complexe stable avec les anticorps antisporozoaires liés au conjugue enzyme-antigène. Les supports solides utiles pour le procédé conforme à la présente invention sont des matières polysaccharides, comme la cellulose et l'agarose, et des matières plastiques. A la fin de la réaction, et après les lavages appropriés, on ajoute au mélange une solution qui contient le substrat enzymatique chromogène et H202, et on observe le développement d'une couleur au bout de 2 à 3 minutes. Dans le cas o l'on analyse du sang entier, le mélange initial, avant d'être mis en présence de la protéine A, est centrifugé ou filtré, afin que les substances restant en suspension soient éliminées. La valeur de seuil, c'est-à-dire la quantité minimale de sérum positif qui engendre le développement d'une couleur visible à l'oeil nu, est respectivement égale à 0,1 pl et 0,4 pl, pour deux sérums étudiés. En outre, on n'observe pas de développement de couleur pour l'essai à blanc, constitué par le mélange contenant le conjugué sans les échantillons de sang et/ou de ses dérivés, pour le sérum et le plasma de personnes en bonne santé, pour le sang entier non infecté par le paludisme, hémolysé ou non, et pour les y globulines (Globuman - Bern). Ceci indique l'absence complète d'interférences dans le procédé conforme à la présente invention. La possibilité d'un déroulement rapide, prenant environ 60 minutes, à comparer aux 6 heures exigées par l'essai ELISA, et l'utilisation d'un petit nombre de réactifs, c'est-à-dire seulement le conjugué enzyme- antigène et les protéines, constituent des avantages particuliers du procédé conforme à la présente invention. Un avantage considérable de ce procédé consiste en outre dans la possibilité de détecter et de doser les anticorps anti-sporozoaires dans le sang entier. Ceci est dû à la stabilité élevée du conjugué de la présente invention, face aux protéases contenues dans le sang. En outre, le procédé conforme à la présente invention est absolument spécifique; en effet, tous les échantillons qui se sent révélés positifs lors des essais IRMA, IFA et ELISA, confirment leur caractère positif lorsqu'on Jes analyse par le présent procédé. Par conséquent, le procédé conforme à la présente invention convient particulièrement pour une étude épidémiologique du paludisme, et en particulier pour la détection de masse des infections paludéennes dans les régions manquant d'unités et de structures sanitaires. Les exemples expérimentaux suivants servent à illustrer l'invention sans la limiter. Exemple 1 Préparation du conjugué (Asn-Ala-Asn-Pro)1 7 -perox - dase L'enzyme peroxydase (Sigma) est purifié et lyophi- lisé avant d'être conjugué avec le peptide. On dissout ensuite 10 mg d'enzyme pur (E) dans 1 ml d'une solution de NaHCO3 0,1 M, et on l'oxyde avec 1 ml d'une solution de NaIO4 16 mM (métaperiodate de sodium), à la température ambiante (20-25'C) et dans l'obscurité, pendant 2 heures. A la fin de cette période, on ajoute au mélange réactionnel 1 ml d'une solution de NaHCO3 (pH 9,2) contenant 70 mg de peptide (Asn-Ala-Asn-Pro)17 (P), ce qui donne un rapport molaire peptide/enzyme égal à 40/1. On transfère quantitativement le mélange ainsi obtenu dans une pipette de Pasteur, fermée à son extrémité avec de la laine de verre, et on y ajoute 500 mg de Sephadex G-25 (Pharmacia Uppsala) en poudre; puis on laisse la pipette reposer à la température ambiante et dans l'obscurité pendant 16 heures supplé- mentaires. Au mélange réactionnel que l'on soutire de la pipette, on ajoute 150 pl d'une solution de NaOH 0,1 mM, contenant 5 mg/ml de NaBH4, et 30 minutes après, on y rajoute 450 pl de la mime solution. Au bout d'environ 1 heure, on équilibre le mélange, qui contient le conjugué enzyme-peptide (E-P) et le peptide et l'enzyme qui n'ont pas réagi, avec une solution tampon d'a:étate de sodium 5 mM, pH 4,4, dans une colonne garnie de Sephadex G-10, équilibrée au préalable avec la même solution tampon. On charge ensuite le mélange dans une colonne (0,9 x 10 cm) de carboxy- méthyle-cellulose (CM-cellulose), équilibrée avec une solution tampon d'acétate de sodium 5 mM, pH 4,4, on l'élue avec une solution tampon d'acétate de sodium 65 mM, pH 4,4, et on le débarrasse des sels qu'il contient sur une colonne de Sephadex G-10 équilibrée avec de l'eau distillée. L'éluat contenant le composé E-P et l'enzyme qui n'a pas réagi est lyophilisé. Le peptide qui n'a pas réagi est élué au préalable avec la solution tampon de charge, et son intégrité est analysée par spectroscopie I.R. Il en résulte que l'on obtient le même spectre pour le peptide élué et pour le peptide utilisé comme matière première. Il est donc possible de conclure que le peptide n'a pas subi d'altérations au cours de la réaction de conjugaison et que le peptide lié à l'enzyme est donc intact. On détermine le degré de conjugaison E-P, c'est-à- dire le rapport molaire du peptide à l'enzyme dans le conjugué, en calculant l'augmentation de la teneur en résidus d'acides aminés Asn, Ala et Pro dans le mélange contenant E-P et E libre, par rapport à l'enzyme initial E. On effectue l'analyse des acides aminés, après hydrolyse acide de E-P + E et de E avec HCl 6N à 100'C, pendant 24 heures et à l'intérieur d'ampoules scellées, à l'aide d'un analyseur automatique d'acides aminés Beckman. Puisque l'on connaît la composition en acides aminés des deux isoenzymes peroxydases (B et C) présents dans E initial (Shannan L.M. et al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2166), il est possible de calculer, pour un rapport moléculaire E/P de 1, correspondant au conjugué pur E-P, une augmentation théorique des teneurs en résidus Asp, Ala et Pro de 63 %, 68 % et 100 %, respectivement. Pour les acides aminés indiqués ci-dessus, on a trouvé des augmentations respectives de 58 %, 62 % et %, ce qui correspond à un rapport molaire E/P de 0,90- 0,92, approximativement équivalent au rapport calculé pour le conjugué pur. L'activité spécifique résiduelle de l'enzyme peroxydase lié au peptide, déterminée par spectrophotométrie à 405 nm avec de l'acide 2,2'-azino- di(3-éthyl-benzothiazolyl-sulfonique) (ABTS) 1,7 nM et H202 0,83 mM dans un tampon phosphate 50 mM, pH 6,0 (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-7, 1979), est approximativement égale à 75 % de celle de l'enzyme initial. Exemple 2 Pour cet essai, on a utilisé les sérums de huit personnes atteintes de paludisme, les plasmas héparinisés de quatre donneurs en bonne santé, les sérums de trois personnes en bonne santé, et un échantillon de sang complet d'une personne atteinte de paludisme, en mélangeant, en rapport volumique 1:1, les sérums des personnes atteintes de paludisme avec le sang entier, hémolysé ou non, d'une personne en bonne santé. A 100 pl de tampon phosphate 10 mM, pH 7,5, contenant 0,15 M de NaCl, 0, 05 % de Tween-20 (PBS-T) et ng de conjugué E-P, on ajoute de 1 à 5 p1 de sang, de plasma ou de sérum de personnes en bonne santé; ou 10 il de PBST contenant respectivement 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; ou 3,2 pl de sérum provenant de personnes atteintes de paludisme. On laisse les solutions reposer à la température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Dans le cas du sang entier, la solution est centrifugée ou filtrée, afin que les matières en suspension soient éliminées. Ensuite, on transfère lesdites solutions dans des micro-pipettes incolores et transparentes, en matière plastique, contenant de la laine de verre à leur extrémité, et par-dessus, une couche constituée d'une quantité d'environ 6 1pl de Protéine A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Uppsala) , lavà au préalable avec PBS-T. On laisse passer les solutions, par gravité, pendant une période de 20 à 30 minutes, on lave les micro- colonnes trois fois avec 300 pl de PBS-T à chaque fois et deux fois avec 200 pl de PBS à chaque fois (tampon sans Tween-20). Ensuite, dans chaque micro-colonne, on ajoute 200 pl d'une solution de substrat de 4-chloro-1-naphtol (Biorad) et de H202, que l'on prépare en mélangeant, au moment de l'emploi, une partie en volume de 4-chloro-1- naphtol (Biorad) (3mg/ml dans du méthanol froid) et 5 parties en volume d'une solution de 6 1pl de H202 à 30 % (v/v) ajoutée à 10 ml de PBS. Au bout de 2 à 3 minutes, on observe le développement d'une couleur bleu foncé pour les échantillons positifs. La valeur de seuil, c'est-à-dire la quantité minimale de sérum positif qui engendre une bande bleue facilement visible, était de 0,1 pl à 0,4 pl, pour deux sérums positifs testés. On a vérifié la spécificité du test sur un échantillon positif de sérum de personnes atteintes de paludisme (développement d'une bande bleue avec E-P), en utilisant, dans un essai, 200 ng d'enzyme libre dans E-P, et dans un autre essai, un grand excès (3 pg) (environ fois) de P libre, en compétition avec le présent conjugué E-P (200 ng). A la fin de la réaction, on n'a pas observé de développement de couleur. On n'a pas non plus observé de développement de couleur dans les microcolonnes, pour l'essai à blanc, dans lequel on utilise le mélange réactionnel avec E-P sans addition de sang, de sérum ou de plasma, ni pour le sérum ou le plasma de personnes en bonne santé, ni pour le sang entier non infesté de paludisme, ni pour les y- globulines humaines (Globuman - Berne) testées en une quantité équivalente à environ 6 p1 de sérum. Ceci indique l'absence complète d'interférences dans l'essai utilisant le conjugué E-P. On a déterminé par spectrophotométrie la stabilité de l'enzyme peroxydase lié au peptide (E-P), en effectuant des mesures, pour des temps allant de 0 à 2 heures, sur une solution de PBS-T (100 1pl) contenant 200 ng de E-P, à laquelle on a ajouté des échantillons de sérum ou de plasma. Après 2 heures, les résultats obtenus indiquent une activité de peroxydase inchangée. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détection et le dosage d'anticorps anti-(sporozoaires de P. falciparum) dans des échantillons de sang humain et/ou de ses dérivés, caractérisé en ce que: a) on fait incuber ces échantillons avec un conjugué enzyme-antigène synthétique, capable de former avec les anticorps anti-sporozoaires présents dans l'échantillon un complexe stable enzyme-antigène synthétique-anticorps, sans que l'activité enzymatique soit annihilée; b) l'anticorps dudit complexe est lié avec des protéines adsorbées sur un support solide et/ou chimiquement liées à ce support, et finalement, c) l'activité enzymatique du complexe lié aux protéines est déterminée, par addition d'un substrat enzymatique incolore capable de donner, en cas de réaction positive, un produit coloré. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène synthétique est le polypeptide séquentiel (Asn-Ala-Asn-Pro)n dans lequel n a une valeur située dans l'intervalle allant de 3 à 40, et en ce que la protéine est la protéine A. 3. Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que n est situé dans l'intervalle allant de 10 à 20. 4. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est choisi dans le groupe constitué par les enzymes capables de donner une réaction colorée avec un substrat spécifique. 5. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est une peroxydase et/ou une phosphatase alcaline. 6. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on prépare le conjugué en faisant réagir, en phase homogène dans une solution de NaHC03, à température ambiante (20- 'C) et dans l'obscurité, l'enzyme oxydé avec un excès molaire du polypeptide (Asn-Ala-Asn-Pro)n, n ayant les valeurs indiquées. 7. Procédé conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que le rapport molaire du polypeptide à l'enzyme dans le conjugué est égal ou approximativement égal à 0,92. 8. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans l'étape (a), on effectue la réaction à température ambiante (20-25'C), pendant un temps de réaction situé dans l'intervalle allant de 15 à 30 minutes. 9. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support solide est en un polysaccharide ou en une matière plastique. 10. Procédé conforme à la revendication 9, caractérisé en ce que le polysaccharide est de la cellulose ou de l'agarose. 11. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans l'étape (b), on effectue la réaction à la température ambiante (20-25'C), pendant un temps de réaction situé dans l'intervalle allant de 20 à 30 minutes. 12. Trousse de diagnostic pour la détection et le dosage d'anticorps anti(sporozoaires de P. falciparum), caractérisée en ce que l'on y utilise le conjugué enzyme- antigène synthétique défini dans la revendication 1, ainsi que des protéines.