Brevet FR2598619A1 — publié le 19871120

Médicament antiviral à base d'acide nucleique modifié, et son procede de préparation. L'invention concerne un médicament antiviral à base d'acide nucléique moditié, et so procédé de préparation. Les antimétabolites agissent sur les cellules cancéreuses ou leucémiques en interférant dans le métabolisme des acides nucléiques. Mais la toxicité de ces produits limite leur emploi en thérapeutique des états malins. On sait que les antimétabolites tels que les antipuriques ou antipyrimidiques s'obtiennent par modification chimique des dérives de la purine ou ceux de la pyrimidine qui sont des métabolites naturels dans la biosynthèse des nucléoprotéines. Un but de l'invention est de proposer un médicament antiviral à base d'acide nucléique modifié Un autre but de l'invention est de proposer un tel médicament à base d'acide nucléique de cellules malades, afin de le rendre directement antagoniste de l'acide nucléique des cellules d'où il provient. Cette particularité est intéressante dans le cas du cancer,car l'ADN fait partie du gène du cancer. La présente invention a pour objet un médicament antiviral à base d'acide nucléique modifié, caractérisé en ce qu'il comporte, comme principe actif, l'acide nucléique, ADN ou ARN, de cellules, modifié par fixation de -SCN, dénommé rhodane, ou thiocyanogène,sur des bases puriques ou pyrimidiques. Selon d'autres caractéristiques de l'invention - l'acide nucléique est extrait de cellules malades de façon à donner au médicament une action spécifique, - le médicament présente un effet immunitaire car il suscite la création d'anticorps spécifiques. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du médicament antiviral à base d'acide nucléique, caractérisé par les étapes suivantes - l'acide nucléique extrait de cellules par voie classique est mis en solution dans l'eau et refroidi à 4'C , - on ajoute goutte à goutte sous agitation magnétique, pendant une heure, en maintenant la température au voisinage de 4"C, une solution contenant du thiocyanogène naissant, obtenue en mélangeant du brome, du thiocyanate de sodium et du méthanol saturé de bromure de sodium dans les proportions suivantes Thiocyanate de sodium 0,045 mole Brome 0,0155 mole Méthanol saturé de BrNa 12 ml - on neutralise le mélange réactionnel avec une solution de C03 Na2, M - l'acide nucléique modifié obtenu est précipité par addition de 7 volumes d'éthanol - le précipitat est remis en solution, puis on reprécipite par addition de 7 volumes d'méthanol - on renouvelle l'opération précédente pour réaliser en tout trois précipitations successives, tout en maintenant la température au voisinage de 4"C - on purifie par chromatographie sur colonne. L'invention a enfin pour objet l'application du médicament antiviral à base d'acide nucléique, ADN ou ARN, précité, au traitement des maladies de type viral comme les cancers, les leucémies, la sclérose en plaques, le sida , la poliomyélite, la variole, ou la grippe. L'invention est décrite ci-après avec référence aux dessins annexés sur lesquels La figure 1 représente l'indice mitotique de cellules d'embryon de souris en présence de thiocarbohydrazide à différentes concentrations La figure 2 représente l'indice mitotique de cellules d'embryon de souris en présence de thiocarbohydrazide à la concentration de 10-7, et d'ADN de thymus de veau rhodanè à la concentration de 10- G; La figure 3 représente l'indice mitotique de cellules d'embryon de souris en présence de thiocarbohydrazide à la dose de 1 mg/kg , et d'ADN de la leucémie L 1210 rhodané à la dose de 500 mg/kg. Dans la suite de la description, on utilise l'abréviation ADN pour l'acide desoxyribonucléique et l'abréviation ARN pour l'acide ribonucléique, le terme acide nucléique recouvrant indifféremment l'un et l'autre. Dans le cadre de la présente invention, on fixe la fonction rhodane En raison de la proprIété pseudo-halogène du rhodane, ce radical -SCN se fixe sur la molécule d'acide nucléique tout comme le brome ou l'iode. Le processus operatoire est le suivant 1- Obtention des acides nucléiques. On isole les acides nucléiques a partir de thymus de veau, de réticulosarcome ST4 (à virus oncogène a ARN) et de la leucémie L 1210, par la méthode classique, utilisant le C1Na, M, pour 1'ADN, et le CîNa, 0,14 M, pour l'ARN, de Wirsky et Pollister modifiée. La partie protéinique est enlevée par le phénol. La phase aqueuse contenant l'acide nucléique et un peu de phénol dissous, est purifiée par 5 lavages à l'éther. L'excès d'éther dissous est éliminé par barbotage d'azote privé d'oxygène à l'aide du pyrogallol. Chaque échantillon obtenu, contenant la même quantité aliquote d'azote et de phosphore,est étudié au point de vue spectre d'absorption aux rayons ultraviolets. 2- Modification des acides nucléiques par fixation de la fonction rhodane SCN. Les différents acides nucléiques sont mis en solution dans l'eau et refroidis à 4-C. On ajoute goutte à goutte sous agitation magnétique une solution contenant le thiocyanogène naissant. Le thiocyanogène naissant a été préparé en mélangeant le brome, le thiocyanate de sodium et le méthanol saturé de bromure de sodium dans les proportions suivantes Thiocyanate de sodium 0,045 mole Brome 0,0155 mole Méthanol saturé de BrNa 12 ml La réaction dure une heure sous agitation magnétique tout en maintenant la température au voisinage de 4-C. On neutralise le mélange réactionnel avec une solution de CO3Na2, M. L'acide nucléique modifié obtenu est précipité à la fin de la réaction par addition de 7 volumes d'éthanol. On remet en solution puis on reprécipite de nouveau par 7 volumes d'éthanolpar volume . Trois précipitations successives sont nécessaires , en maintenant la température à 4-C. Pour parfaire la purification, les échantillons sont soumis à la chromatographie sur colonne Sephadex 2. 3- Etude des acides nucléiques modifiés sur le réticulosaroome ST4 et la leucémie L. 121. Les divers acides nucléiques modifiés sont administrés par voie intrapéritonéale le lendemain de la transplantation de la tumeur ST4 ou de la leucémie L 1210. Leurs effets sur ces tumeurs sont évalués au point de vue survie des animaux , poids moyen des tumeurs et poids moyen de la rate. On étudie aussi l'évolution de la polynucléose, de la mononucléose et de la thrombocytose. a) Etude de la survie des animaux traités ou non. On sait que le réticulosarcome ST4 tue la souris Swiss porteuse entre le 12e et le 15e jour après la transplantation alors que la leucémie L 1210 tue la souris hybride DBA/2 x C57B16 au 7è jour après la transplantation. Le tableau 1 montre que certaines souris traitées par l'ADN de thymus de veau modifié survivent jusqu'au 18è jour, si on l'injecte à la dose de 5 mg par kilo.A la même dose, 1'ADN de thymus de veau non modifié ne montre pas de différence par rapport aux témoins : toutes les souris meurent au 14e jour. Le tableau II montre que l'ADN de thymus de veau ainsi que 1'ADN de thymus de veau rhodané, à la dose de 5 mg par kg, ne prolongent pas la survie chez les souris porteuses de la leucémie L 1210 .Cependant l'ADN isolé de la leucémie L 1210 et rhodané, à la dose de mg par kilo, produit une survie chez les souris traitées jusqu'au 11è jour. b) Etude de l'évolution hematologlque Le tableau III montre que le réticulosarcome ST4 représente une polynucléose de l'ordre de lll.GOO à 160.000 par mm3 entre le 11 jour et le 13e jour chez les témoins non traités. Au 13e jour, la polynucléose de souris traitées par l'ADN de thymus de veau à la dose de 500 mg par kilo est de 12.000 et celle de souris traitées par l'ADN de -thymus de veau rhodané, à la même dose, est de l'ordre de 44.18 par mm3. Le tableau IV montre que chez les souris porteuses de la leucémie L 1210 et non traitées, la polynucléose et la mononucléose sont élevées et sont respectivement de 40.200 et 30.300 par mm3 au 5è jour après la transplantation. L'ADN de thymus de veau à la dose de 5 mg par kilo ne modifie pas cette hyperleucocytose, tandis que i'ADN de leucemie L 1210 rhodané, à la méme dose, a sur elle une action légère, c'est-à-dire 28.200 et 27.300 par mm3 au 5è jour. La thrombocytose des souris traitées par 1' ADN de thymus normal ou de leucémie L 1210 rhodané est plus élevée que celle des souris témoins au 5è jour après la transplantation. c) Etude du poids moyen des tumeurs et du poids moyen de la rate Les tumeurs et la rate de chaque souris ont été prélevées à la mort des animaux puis pesées. Leur poids moyen est représenté dans le tableau V et le tableau VI. On a ensuite comparé l'activité antimitotique de ces diverses substances sur les cellules cultivées in vitro. Les diverses cultures cellulaires d'embryons de souris ou de réticulosarcome ST4 ont été effectuées après trypsinisation dans un milieu à base d'hydrolysat de caséine de Lépine et coll. Les cellules sont colorées par la méthode de May-Grunwald et Giemsa.Les substances étudiées sont ajoutées aux cultures après confluence des cellules et la coloration a été effectuée après 5 heures de contact. L'étude cytostatique des ADN normaux et modifiés a été faite comparativement avec celle du thiocarbohydrazide. La figure 1 montre que l'indice mitotique des cellules d'embryons de souris baisse progressivement de la concentration 10-e de thiocarbohydrazide à la concentration de 10-6, avec diminution simultanée du pourcentage de prophase, métaphase, anaphase et télophase. La figure 2 montre que le thiocarbohydrazide et l'ADN de thymus de veau rhodané, aux concentrations respectives de 10-' et 10-6, presentent un indice de prophase sensiblement normal (18,1 p. i, et 17,6 p. le) et un indice de métaphase notablement diminué. La figure 3 montre les effets stathmocinétiques du thiocarbohydrazide et de l'ADN de la leucémie L 1210 rhodané : l'action est moins marquée pour le thiocarbohydrazide par rapport à celle de l'ADN de la leucémie L 1210 rhodané, en ce qui concerne la diminution de l'indice de prophase et celui de métaphase. En conclusion : les acides nucléiques isolés du réticulosarcome ST4 et de la leucémie L 1210 et modifiés par le thiocyanogéne-SCN présentent une activé antinéoplasique respectivement sur les tumeurs d'où ils ont été isolés. L'étude stathmocinétique de ces acides nucléiques modifiés par fixation de la fonction rhodane, qui est connue comme ayant les propriétés de pseudo-halogène, a montré une action significative sur les indices de prophase et de métaphase. Ces différents acides nucléiques modifiés agissent sur les cellules cancéreuses ou leucémiques comme antagonistes de leurs propres ADN en interférant, en tant que gênes, dans le codage pour la biosynthèse de protéines cellulaires. Les acides nucléiques isolés des tumeurs forment les gènes du cancer, ce qui fait que la modification de leur structure par l'adjonction d'un radical rhodane confère à ces macromolécules la propriété d'.;n vaccin moléculaire. Les acides nucléiques isolés des tumeurs et chimiquement modifiés selon l'invention peuvent être utilisés en immunothérapie active comme un vaccin d'un type nouveau qu'on peut appeler vaccin moléculaire. Le médicament à base d'acide nucléique modifié selon l'invention, par la fixation d'un radical-SCN, est particulièrement actif sur les maladies de type viral parmi lesquelles ont peut citer : les cancers, les leucémies, la sclérose en plaques, le sida, la poliomyélite, la variole , ou la grippe. I1 va de soi que pour chaque maladie, l'acide nucléique utilisé est extrait de cellules atteintes par la maladie correspondante, pour avoir - une action spécifique. Tableau I.-Etude de la survie des souris porteuses de sarcome ST4 traitées ou non. Traitement 1erj 9èj 11èj 12èj 13èj 14èj 15èj 16èj 17èj 18 èj 19 èj Témpins 10 10 10 9 4 3 0 NLN de thymue de veau 10 10 10 8 5 2 0 500 mg/kg ADN de thymus de veau rbho- 10 10 10 9 6 6 5 5 5 4 0 dané 500mg/kg Tableau II.- Etude de la survie des souris porteuses de la leucémie L 1210. Traitement 1erj 4èj 5èj 6èj 7èj 8èj 9è 10èj 11èj 12èj 13èj 14èj Témoins 10 10 10 2 1 0 ADN de thy mus de veau 10 10 4 3 0 500mg/kg ADN de thymus de veau 10 10 10 5 4 1 0 rhodané 500mg/kg ADN de leu cémie L1210 10 10 10 4 1 0 ADN de leu cémie L 1210 rhodené 10 10 10 8 7 7 5 4 4 0 500mg/kg Tableau III. - Etude hématologique du réticulosarcome ST@ traité ou non. Traitement 1erj- 3èj- 5èj- 7èj- 8èj- 9èj- 11èj- 13èj- 15èj- 17èj Témoins M-2000 3.000 4.200 6.600 5.000 7.200 7.600 P-2500 4.200 13.000 48.000 66.800 110000 162000 ADN de thy- M-3200 5.400 6.400 6.200 7.200 6.400 6.800 mes de veau P-5700 8.200 17.900 38.100 58.900 90.200 120.000 500mg/kg ADN de thy M-2400 4.400 5.500 6.600 8.200 7.700 8.800 8.300 10.200 mus de veau P-8200 5.400 7.700 10.100 38,400 37.500 44.100 50.200 73.300 500mg/kg Tableau IV.-Etude de la leucémie L 1210 traitée ou non. Traitement 1èrj- 3èj- 5èj- 7èj- 9èj M-10-300 6.000 30.00 Témoins P-13.100 7.900 40.200 T-1.100.000 1,300.000 505.000 ADN de thy- M-9.900 8.700 33.000 mus de veau P-13.100 12.100 32.200 500mg/kg T-1.200.000 1.300.000 820.000 ADN de leu- M-11.100 14.300 27.300 29.100 32.400 cèmie 1. 1210 P-9.000 6.700 28.200 31.200 33.400 rhodané T-1.200.000 1.100.000 920.000 950.000 870.000 500 mg/kg Tableau V.-Effets sur le réticulosarcome ST. Traitement - Poids moyen des Poids moyen de la @@@@@ement porus @@ yeu des polds moyen de la tumeurs. rate. Témoins 1.1510 g 218 mg ADN de thymus de veau 500mg/kg 1,600 g 230 mg ADN de thymus de veau rhodané 1,100 g I70 mg 500 mg/kg Tableau VI. - Effets sur la leucémie L I2IO. Traitement Poids moyen des Poids moyen de la tumeurs. rate. Temoins 194mg 316mg ADN de thymus 108mg 250mg de veau 500mg/kg ADN de leucémie 1. 1210 rhodané 110mg 230mg 500 mg/kg ADN de leucémie 1. 1210 195mg 325mg 500 mg/kg Revendications 1. Médicament antiviral à base d'acide nucléique modifié, caractérisé en ce qu'il comporte, comme principe actif, l'acide nucléique, ADN ou ARN, de cellules, modifié par fixation de -SCN, dénommé rhodane, ou thiocyanogène, sur des bases puriques ou pyrimidiques. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique est extrait de cellules malades de façon à donner au médicament une action spécifique. 3. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un effet immunitaire par la création d'anticorps spécifiques. 4. Procédé de préparation du médicament antiviral à base d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérise par les étapes suivantes -l'acide nucléique extrait de cellules par voie classique est mis en solution dans l'eau et refroidi à 4"C , - on ajoute goutte à goutte sous agitation magnétique, pendant une heure, en maintenant la température au voisinage de 4"C, une solution contenant du thiocyanogéne naissant, obtenue en mélangeant du brome, du thiocyanate de sodium et du méthanol saturé de bromure de sodium dans les proportions suivantes Thiocyanate de sodium 0,045 mole Brome 0,0155 mole Méthanol saturé de BrNa 12 ml - on neutralise le mélange réactionnel avec une solution de C03 Na2, M - l'acide nucléique modifié obtenu est précipité par addition de 7 volumes d'éthanol - le précipitat est remis en solution, puis on reprécipite par addition de 7 volumes d'méthanol - on renouvelle l'operation précédente pour realiser en tout trois précipitations successives, tout en maintenant la température au voisinage de 4C - on purifie par chromatographie sur colonne. 5. Application du médicament antiviral à base d'acide nucléique, ADN ou ARN, selon la revendication 1 au traitement des maladies de type viral comme les cancers, les leucémies, la sclérose en plaques, le sida, la poliomyélite, la variole, ou la grippe.