Brevet FR2610948A1 — publié le 19880819

Le domaine technique de la présente invention est celui de l'isolement de gènes de structure de protéines à partir d'espèces végétales. Plus particulièrement, I'invention concerne le clonage de fragments d'ADN complémentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac et codant pour des épitopes communs aux nitrates réductases (NR) des plantes supérieures. L'invention concerne donc également les clones obtenus, I'ADNc isolé selon l'invention codant pour plus de 50 % de l'ARNm de la NR de tabac. La nitrate réductase (NR) est une enzyme clé qui rentre en jeu dans la première étape de l'assimilation du nitrate dans les plantes. Or, l'assimilation des nitrates constitue une étape limitante du développement des plantes. Par conséquent, le clonage du gène de structure de la NR et sa réintroduction dans une plante est du plus haut intérêt pour modifier les caractéristiques d'assimilation des nitrates par les plantes. Une majorité des plantes assimilent, par exemple, exclusivement au niveau foliaire. Mais il serait avantageux, pour certaines plantes, d'assimiler les nitrates au niveau racinaire, en particulier pour les espèces stockant leurs réserves dans les racines ou tubercules telles que la pomme de terre.En revanche, certaines espèces ligneuses, comme les arbres fruitiers, assimilent beaucoup de nitrates au niveau racinaire et leur assimilation foliaire serait mieux adaptée à la fructification. Chez les monocotylédones, les nitrates doivent être apportés à des stades critiques du développement, ce qui suggère que l'assimilation des nitrates n'est pas effectuée de façon uniforme dans le temps chez ces plantes. Certaines espèces ne semblent plus assimiler les nitrates lorsque les graines commencent à se développer, épuisant ainsi les réserves en azote réduit foliaire. Introduire des gènes de nitrate réductase dont "la mise à feu" sera différente de celle observée pour le gène résidant permettra d'obtenir des plantes ayant des caractéristiques de culture et de production améliorées. Dans le domaine de l'enzymologie (enzymes fixées), la nitrate réductase est une protéine qui porte dans sa structure quatre sites d'attachement de cofacteurs : NADH, FAD, cytochrome b557, cofacteur à molybdène (MoCo). L'obtention de fragments polypeptidiques correspondant à une partie de l'enzyme (synthétisée dans E. coli à partir de fragments d'ADNc grâce à l'emploi d'un vecteur d'expression) permet d'enx-lsager la mise au point de colonnes d'affinité pour ces molécules. La nitrate réductase catalyse une série d'étapes d'oxydoréduction (NADH = NAD FADHr FAD+) ; cyt b557 redut cyt b557 ox ; MoCo red MoCo ox NO3 aNO2 ; Fie3+ = Fe24).Ceci peut être utilisé, par exemple, pour éliminer les nitrites toxiques en les convertissant en nitrates, et aussi pour mesurer les concentrations de ces molécules grâce à son emploi dans des capteurs à sonde protéique (électrode à enzyme). Dans le domaine des cultures cellulaires, certaines lignées cellulaires ne produisent de métabolites secondaires que dans certaines conditions de croissance particulières (carence en sucres ou en source azotée). L'introduction de gènes de NR à expression contrôlée dans des cellules récipients NR obtenues par mutagénèse permettra d'induire à volonté une carence éventuelle en source azotée grâce à l'emploi de promoteurs adaptés et de favoriser ainsi la production de l'alcaloîde désiré. C'est pourquoi la présente invention concerne plus particulièrement un vecteur de clonage comportant un ADN complémentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac. Parmi ces vecteurs, il faut citer les vecteurs comportant un ADN complémentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac comportant, sur un fragment EcoRI/EcoRI de cet ADNc, dans l'ordre, les sites suivants Xmnl, Hindlil, Kpnl, EcoRi, ou Kpnl, Hindlil, Xmnl, EcoRI. Ces vecteurs sont, de préférence, des vecteurs constitué d'un phage dans lequel est inséré l'ADNc. Plus particulièrement, les ADNc isolés dans les exemples représentent plus de 50 % de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac. Les inserts d'ADNc ont, en général, plus de 1,6 kb. L'invention sera maintenant mieux comprise à la lumière de la description détaillée qui va suivre. Celle-ci comprend notamment une série d'exemples. Elle est faite en référence à des figures dans lesquelles sont présentés : - figure 1 : la traduction acellulaire dans un système réticulocyte de l'ARN messager codant pour l'apoenzyme NR ; les ARNm PolyA ont été isolés de jeunes feuilles de tabac et traduits en dehors de la cellule ; les produits de translation ont été fractionnés sur gel dénaturant polyacrylamide 5 96. - figure 2 : le criblage immunologique d'une banque d'ADNc de tabac. - figure 3 : le diagramme d'une famille de clones s'hybridant avec le fragment EcoRI de 1,6 kb. - figure 4 une analyse de "western blot" des protéines de fusion synthétisées par divers lysogènes. - figure 5 : I'inhibition de l'activité catalytique de la NR de tabac par des immunoglobulines immunosélectionnées par adsorption sur des plaques formées par des phages lambdaGTl I et 13-29 en présence d'lPTG. - figure 6 : une analyse de "northern blot" des séquences d'ARNm s'hybridant avec le fragment EcoRI de 1,6 kb. - figure 7 : une analyse de "southern blot" des séquences génomiques de tabac homologues du fragment EcoRI de 1,6 kb. De façon générale, le processus expérimental repose sur le fait que les ARN messagers codant l'apoenzyme de nitrate réductase du tabac peuvent être traduits dans un système acellulaire. Des fractions d'ARNm polyA+ de la plage 23-32s d'un gradient de saccharose ont été utilisées pour construire une banque d'ADNc dans le vecteur d'expression lambdaGTl I avec une efficacité de clonage d'environ 4 104 recombinants/ng d'ARNm. Les clones recombinants ont été triés avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la nitrate réductase de mais qui réagit spécifiquement avec les nitrates réductases de dicotylédones. Parmi 240 000 plages de lyse de recombinants, 8 clones ont été isolés contenant des inserts de tailles s'étalant de 1,6 kb à 2,1 kb et ayant en commun des homologies de séquences. 7 de ces clones contenaient un fragment EcoRI de 1,6 kb interne commun. L'identité de ces clones a été confirmée de la manière suivante : une protéine de fusion de 170 kd pouvant être induite par IPTG et reconnue par l'anticorps de la NR de lapin a été exprimée par un dérivé de lysogène à partir d'un des recombinants. Les anticorps couplant les protéines fusionnées ont été élués et se sont révélés inhibiteurs de l'activité catalytique de la NR de tabac. Les anticorps monoclonaux dirigés contre la NR ont aussi été capables de coupler les protéines hybrides. Quand on a utilisé le fragment EcoRI de 1,6 kb comme sonde pour les expériences de "northern blot", on a détecté un signal correspondant à un ARN de 3,5 kb dans les préparations d'ARNm de N. plumbaginifolia et de tabac mais aucune hybridation croisée avec des ARNm de mals n'a été détectée. La sonde s'est hybridée avec des séquences à faible nombre de copies dans les taches génomiques d'ADN de tabac. EXEMPLE I EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT DE L'ARNm PolyA+ L'ARN total a été extrait des tissus de feuilles de tabac selon une procédure proche de Chirgwin (Biochemistry 18, 5294-5299 (1979). Des feuilles de tabac ont été gelées dans N2 liquide et broyées dans un mortier. La poudre a été mélangée rapidement avec 100 ml de tampon Tris-HC1 pH 8,0 50 mM contenant de l'EDTA 10 mM, du thiocyanate de guanidinium 5 M, du sodium N laurylsarcosine 2 96 et du 2-mercaptoéthanol 5 96 (v/v). Après incubation à 650C pendant 20 minutes et centrifugation à 20 000 g pendant 30 minutes, les surnageants ont été ajustés à 0,1 g/ml de CsCI et étalés sur des coussins de 1 2 ml de C3Cl 5,7 M et EDTA 50 mM, pH 8,0 dans des tubes de 30 ml de polyallomères. Les tubes ont été centrifugés pendant 20 heures à 25 000 rpm dans un rotor SW27 à 15 C. Les culots d'ARN ont été dissous dans du Tris 10 mM pH 8,0 et EDTA 1 mM, et du SDS 0,05 96 et mis en incubation à 55oC pendant 30 minutes en présence de 200 pg/ml de protéinase K. Après le traitement PMSF pour désactiver la protéinase K, des échantillons ont été extraits par le phénol, phénolchloroforme, chloroforme et précipité éthanol. Le rendement était en général de 200 à 4 300 pg d'ARN total par gramme de tissu frais. Les ARNm PolyA ont ete purifiés par deux cycles de sélection d'une colonne d'oligocellulose (PL biochemical) selon la procédure de Bantle (1978) (Anal.Biochem. 70, 75-85) comprenant une étape de dénaturation de l'ARN dans du DMSO 80 , à 55 C pour le second cycle de sélection. Les ARNm PolyA+ représentaient en général 1 à 1,2 96 de l'ARN de feuille total et contenaient moins de 10 96 d'ARN ribosomal. On a fractionné les ARNm PolyA+ (100 lig/tube) sur des gradients de saccharose linéaires de 12 ml de 5 à 20 96 faits dans un tampon TE par centrifugation pendant 16 heures à 100 000 g dans un rotor S > '40 selon la procédure décrite par Commere dans Plant. Sci. (1986) 44, 191-203. EXEMPLE 2 TRADUCTION ACELLULAIRE D'ARNm ET IMMUNOSELECTION DES PRODUITS DE TRADUCTION (figure 1) Des ARNm PolyA4 totaux ou fractionnés ont été traduits dans un système de traduction acellulaire de reticulocyte de lapin (Amersham) utilisant de la méthionine marquée S35 (900 Ci mmole, 1 mCi/ml, Amersham). On a ajouté environ 0,05 à 0,1 pg d'ARNm et 1,2 uCi de méthionine S35 par ul de lysat. Après incubation pendant 1 heure à 302C, des prélèvements du mélange de traduction ont été analysés par SDS-PAGE. Les produits de traduction correspondant à 50 lug de lysat ont été immunosélectionnés pour des fragments de polypeptides de NR en les passant à travers une colonne de protéine A-Sepharose 4B sur laquelle 20 cil d'antisérum spécifique de NR avaient été fixés dans du tampon TNE (50 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, Tween 20 0,5 96 (w/v), 150 mM NaCI, NaN3 0,2 %). Après adsorption du lysat dilué dans le tampon TNE, la colonne a été lavée avec du tampon TNE contenant de la méthionine froide 1 mM et du NaCI 1 M, ainsi que du tampon Tris-Hcl 50 mM pH 7,5. Le matériau lié à la protéine A a été ensuite élué et dénaturé dans un tampon Laemmli pour SDS-PAGE. Le criblage immunologique d'une banque d'expression d'ADNc demande que le nouveau produit de traduction puisse être reconnu par les anticorps spécifiques dressés contre des chaînes polypeptidiques développées dans des cellules d'eucaryotes. Ces anticorps peuvent ne pas reconnaître les chaînes d'antigènes non modifiés synthétisés dans l'hôte de clonage E. coli. La démonstration préalable de la faisabilité de cette approche dans le cas de la NR a été obtenue en montrant qu'un anticorps polyclonal contre la NR de mais (alpha MNR) pouvait être utilisé pour immunosélectionner une chaîne de polypeptides de NR de tabac parmi les produits de traduction acellulaire d'ARN PolyA+ total extrait des feuilles (Figure 1). L'anticorps polyclonal a été dressé contre la NR de feuille de mais. L'anticorps polyclonal a reconnu spécifiquement la NR de tabac dans les "western blots" et les produits de traduction acellulaire correspondants dans les lysats de réticulocyte de lapin. Les signaux obtenus étaient très faibles, la NR représentant 2 à 5/10 000 du total des protéines de feuille de tabac solubles. Les produits de traduction acellulaire ont migré près des sous-unités d'enzyme de 110 kd. Des résultats semblables avaient été obtenus antérieurement avec l'ARNm de NR de mais. EXEMPLE 3 CONSTRUCTION DE BANQUES D'ADNc DE FEUILLES DE TABAC DANS LE PHAGE lambdaGTl I On a synthétisé des ADNc selon Gubler et Hoffmann (1983) (Gene 25, 263-269) avec les modifications suivantes : 200 ng d'ARNm PolyA+ total ont été dénaturés par chauffage à 70"C pendant 2 minutes dans de l'eau et soumis à une réverse-transcription à pH 8,3 en utilisant 14 U de reverse transcriptase AMV (GenoFit) dans un volume final de 40 jil en présence de 0,1 pg d'oligo dT (15 mere, Pharmacia) à 42"C pendant 40 minutes. L'efficacité de la synthèse du premier brin variait entre 8 et 25 96. Le second brin a été synthétisé à partir du premier en présence de 0,8 U de RNAse H (BRL), et 4 U de ligase d'ADN de E. coli (Biolabs), utilisant 40 U d'ADN poll holoenzyme (Amersham) dans un volume final de 90 ul. L'incubation a été effectuée à 12"C pendant I heure et ensuite à 16"C pour I heure de plus. Les extrémités de l'ADN double brin ont été polies par incubation avec une unité d'ADN polymérase T4 à 37"C pendant 15 minutes. L'efficacité de la synthèse du deuxième brin était proche de 100 96. L'ADNc obtenu (environ 100 ng) a été ensuite méthylé avec 20 U d'EcoRI méthylase. Pour améliorer l'efficacité du clonage (10 fois) une étape de digestion des régions simple brin a été incluse dans la procédure de synthèse de l'ADNc entre les étapes de polissage et de méthylation. Les ADNc ont été traités par 2 U de nucléase S1 (Boehringer) dans un volume de 100 pI pendant 15 minutes à 30"C en vue d'éliminer les extrémités anormales.Ceci a conduit à une baisse de 5 96 de la quantité de matière à haut poids moléculaire dans la préparation de l'ADNc. Après addition de "linkers" d'EcoRI à l'ADNc (12 mers phosphorylés, PL, Biochemicals) et deux digestions successives avec EcoRI concentré, les ADNc ont été fractionnés sur une colonne Sephacryl S-300 et la matière correspondant aux ADNc supérieurs à 0,5 kb a été collectée. L'ADNc a été ligaturé avec le vecteur lambdaGTl 1 desphosphorylé coupé avec EcoRI dans les conditions spécifiées par Young (1983) (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 1194-1198). Le mélange de ligation a été encapsidé en utilisant les lysats d'encapsidation disponibles dans le commerce (Gigapack, Stratagene Cloning System, Clontech Labs. CA). Les banques ont été examinées quant à leur proportion de recombinants sur souche RY1088 en présence d'Xgal et IPTG. Elles contenaient 70 à 80 96 de plaques blanches. Une proportion significative de ces plaques blanches détectées dans les premières banques a tourné au bleu pâle après nouvel examen sur souche RY1090, et manquait d'inserts détectables. On a trouvé que ceci était en relation avec la faible élimination de petits fragments et "linkers" d'ADNc par chromatographie sur colonne Sépharose 4B et était amélioré par l'utilisation de Séphacryl 9300. Après optimisation, les rendements étaient d'environ 50 000 à 100 000 plaques blanches par ng de d'ADNc parmi lesquelles 50 96 contenaient des inserts détectables. Une banque d'ADNc enrichie en séquence d'ARNm de haut poids moléculaire a été réalisée comme suit. On a fractionné 100 pg d'ARNm sur un gradient de saccharose et on a collecté la région 23-32s (10 pg). Cette fraction a été ensuite fractionnée dans un gel d'agarose 1,5 96 contenant 10 mM d'hydroxyde de méthylmercure. La plage correspondant aux poids moléculaires 2-5 kb a été découpée, les ARNm élués, extraits au phénol et utilisé (100 ng) pour construire une banque d'ADNc. Le vecteur de clonage lambdaGTl I a été choisi pour construire des banques d'ADNc car on pensait que les fréquences d'ADNc de NR seraient très faibles et qu'il faudrait cribler de grandes banques. Des banques d'ADNc total ont tout d'abord été construites. Les efficacités initiales de clonage et les proportions de recombinants véritables étaient faibles (moins de 10 000 clones/ng d'ADNc) quand on a suivi la procédure de Gubler et Hoffmann (1983) pour la synthèse des ADNc. L'efficacité de clonage a été accrue en incluant un traitement de nucléase S1 doux entre les étapes de "healing" et de méthylation de la synthèse d'ADNc et a permis d'obtenir un rendement de clonage supérieure à 105 recombinants /ng d'ADNc.La qualité des banques d'ADNc a aussi été améliorée en fractionnant les ADNc après addition de "linkers" sur des colonnes Sephacryl S300 à la place de colonnes Sepharose 4B. Comme l'ARNm codant pour la NR était considéré comme devant être d'une taille supérieure à 3 kb, des préparations d'ARNm ont été fractionnées sur un gradient de saccharose et des molécules avec une constante de sédimentation s'étalant entre 23-32s ont été recueillies. Ces ARNm ont été fractionnés ultérieurement sur un gel d'hydroxyde de méthylmercure et les ARNm migrant dans le domaine de 3 à 4 kb ont été utilisés pour construire une banque d'ADNc (4.105 clones, 70 96 de recombinants). Ces deux étapes de purification représentaient un enrichissement de 5 à 10 fois en ARNm de NR. EXEMPLE 4 AMPLIFICATION ET CRIBLAGE IMMUNOLOGIQUE DES BANQUES (figure 2) Les banques ont été amplifiées sur souche RY1088 à une densité de 3.104 à 109 pFu par boîte de 90 mm. Les plaques ont pu croître à 42"C pendant 4 heures. II en a résulté une amplification de 1 000 fois. Les banques amplifiées ont été étalées sur souche RY1090 à une densité de I à 1,5.104 pFu par boîte de 90 mm et ont pu se développer à 42"C pendant 3-4 heures. Des filtres de nitrocellulose (Millipore HATF) ont été imprégnés dans de l'IPTG 10 mM puis séchés.Les plages recouvertes de ces filtres ont été mises en incubation pendant la nuit à 37"C puis réfrigérées à 4"C. Les filtres correspondants ont été bloqués avec de la BSA 3 96 dans du TBS pendant 30 minutes, mis en incubation avec l'antisérum (dilué 1/200 dans du TBS) pendant 1-2 heures et lavés trois fois dans TBS contenant du Tween 20 à 0,05 96. Les filtres ont été mis en incubation avec du 1125-protéine A, 0,5 pCi dans du TBS contenant 50 g/l de lait écrémé et du Tween 20 à 0,05 9o pendant 1-2 heures, lavés trois fois dans du TBS contenant du lait et du Tween 20 puis deux fois dans du TBS. Toutes ces étapes ont été exécutées à température ambiante.Les filtres ont été autoradiographiés sur film Kodak XAR5 avec un écran amplifiant Dupont Cronex pendant 18-24 heures. Une moyenne de 1 à 3 taches ont été détectées sur les filtres. Les parties correspondant à ces taches ont été prélevées avec des pipettes Pasteur par l'extrémité large et mises à incuber toute une nuit à 4"C dans 1 ml de diluant lambda. Environ 3 000 plaques par partie ont été retriées pour confirmation. Deux cycles de triage supplémentaire à basse densité (100-200 plaques/boîte) ont été nécessaires pour purifier les recombinants jusqu'à homogénéité. Bien qu'il soit spécifique pour la NR de tabac dans des extraits de feuilles de tabac, I'anticorps alphaMNR a reconnu plusieurs protéines d'E. coli dans des expériences "western blot" (figure 4). Ceci se traduisait par des bruits de fond importants quand les banques étaient filtrées immunologiquement. L'anticorps alphaMNR a donc été mis en incubation avec de grandes quantités d'extraits de protéines bruts d'E. coli et s'est confirmé comme encore capable de détecter de la NR de tabac au niveau du ng. Parmi un total de 40 clones initialement sélectionnés par triage de 240 000 plaques de recombinants, il clones exprimant de manière reproductible un signal par retriage ont été ensuite purifiés jusqu'à homogénétité.Ceci a demandé, le cas échéant, pour le clone 13-29 à forte expression, le dépôt, le prélèvement et l'amplification de plaques isolées en l'absence d'une induction IPTG pour empêcher l'apparition de clones sans expression pendant la croissance des plaques (figure 2). EXEMPLE 5 PREPARATION D'ADN DE PHAGE ET SOUS-CLONAGE DES INSERTS La procédure de production de phages sur milieu LB solide contenant du glucose et unification par centrifugation sur gradient de densité de chlorure de césium est pour l'essentiel celle de Huynh et al. (1983) (DNA cloning a practical approach IRL Press, Oxford). L'ADN a été extrait à partir de 1012 phages par traitement avec du formamide 50 96 dans du Tris HCI 0,2 M pH 8,5, EDTA 20 mM pendant 2 heures à température ambiante. L'ADN a été précipité à l'éthanol, dissous dans un tampon TE contenant 100 pg/ml de protéinase K et mis à incuber 2 heures à 37"C. Après extraction de l'éthanol, I'ADN a été précipité et utilisé pour une analyse de restriction. Les fragments EcoRI excisés du vecteur ont été sous-clonés dans le site EcoRI desphosphorylé du plasmide pUC9 selon des procédures standards. EXEMPLE 6 REACTIFS IMMUNOLOGIQUES POUR LE TRIAGE DES BANQUES La purification de la nitrate réductase du mais et l'obtention de l'anticorps polyclonal du lapin (alphaMNR) contre cette enzyme ont déjà été décrites. Pour neutraliser les immunoglobulines anti E. coli contre l'anticorps alphaMNR, le sérum a été dilué 5 fois dans du TBS BSA et mis à incuber avec deux volumes d'un lysat frais d'E. coli (20 mg/ml protéine) préparé par décongélation et sonication de cellules BNN97 en phase de croissance exponentielle et induites pour la production de lambdaGTII, 90 minutes avant récolte. Après incubation pendant 2 heures à 4"C en brassant, le mélange a été centrifugé dans des tubes Eppendorf et la procédure d'addition de lysats et clarification a été répétée deux fois. Le sérum résultant a été maintenu à 4"C avec de l'azide et a pu être utilisé plusieurs fois pour le triage. EXEMPLE 7 ANALYSE DES CLONES RECOMBINANTS (fiRure 3) Les clones purifiés ont été testés quant à la présence d'inserts d'ADN par digestion d'EcoRI. 7 clones (13-18, 13-20, 13-27, 13-29, 13-33, 13-34, 13-36) contenaient un insert d'EcoRI de 1,6 kb similaire, bien qu'ils donnaient des signaux de différentes intensités par détection immunologique. Le fragment d'EcoRI de 1,6 kb du clone 13-36 a été sous-cloné dans du pUC9 et utilisé comme sonde pour l'étude d'homologies d'inserts parmi les 10 autres recombinants. 7 clones (13-18, 13-20, 13-27, 13-28, 13-29, 13-33, 13-34) se sont hybridés par croisement avec cette sonde. Le clone 13-28 contenait un insert EcoRI de 2 kb. La structure et l'orientation des ADNc dans le site de clonage du vecteur ont été étudiées en utilisant les enzymes de restriction Kpnl et Sstl. On a trouvé que la taille des inserts dans la majorité des recombinants était supérieure à 1,6 kb donc que le fragment EcoRI de 1,6 kb était interne aux ADNc et entouré de petits fragments d'ADNc qui n'avaient pas été vus sur les digestions d'EcoRI, colorées de bromure d'éthidium, des ADN des phages recombinants. Les inserts ont été trouvés orientés dans les deux directions possibles.Des diagrammes physiques de 3 de ces inserts sont présentés figure 3. De leur comparaison on peut conclure que 2,1 kb d'ARNm ont été clonés. L'absence de certains sites de restriction dans les fragments d'EcoR1 de 1,6 kb dans l'insert du clone 13-28 suggère une hétérogénéité parmi les populations d'ARN étudiées. Les 3 clones recombinants restants contenaient des petits inserts hétérologues. EXEMPLE 8 EXPRESSION D'UNE PROTEINE DE FUSION DANS LE CLONE RECOMBINANT 13-29 (figure 4) Des lysogènes de phages 13-29 et 13-36 portant des inserts orientés dans les directions opposées ont été construits dans une souche RY1089. Ces lysogènes ont été testés quant à l'expression d'une protéine hybride par analyse de "western blot" (figure 4). En utilisant l'anticorps polyclonal alphaMNR, une protéine de poids moléculaire d'environ 175 kd a été trouvée dans les extraits d'un lysogène pour phage 13-29 induit avec IPTG, mais cela n'a pas été le cas pour les contrôles non induits. Cette protéine hybride a aussi été détectée par coloration au bleu de coomassie d'extraits fractionnés du SDS-PAGE correspondant (figure 4). Aucune protéine hybride n'a été détectée dans un lysogène pour phage le 13-36. Ces résultats concordent avec l'insert du clone 13-29 qui est intégré en phase avec la séquence codante de la beta-galactosidase et codant pour une chaîne polypeptidique de taille approximative de 60 kd compatible avec la taille de l'insert d'ADNc correspondant. L'isolement par criblage immunologique du clone 13-36 portant un insert orienté à l'opposé du gène de beta-galactosidase, et l'étude du lysogène correspondant, confirment la faible expression des séquences insérées sous le contrôle d'un autre promoteur de phage dans lambdaGTl 1, comme cela a été discuté par Lapeyre (1985) (Theses Université de Toulouse, Rangueil, France). L'absence de détection de protéines hybrides dans les "western blots" d'extraits d'un lysogène du clone recombinant 13-36 peut être attribué au bas niveau d'expression de cette protéine hybride. Les lysogènes ont été obtenus par infection de la souche RY1089 HFI par des phages recombinants. Des extraits bactériens ont été obtenus à partir de lysogènes induits ou non par IPTG comme décrit par Riva, 1985, Thèses PhD, Université Paris VI, France). Les extraits ont été analysés par électrophorèse SDS-PAGE, des expériences du "western blot" des protéines fractionnées sur nitrocellulose par électrotransfert, immunodétection avec l'antisérum alphaMNR et un deuxième antisérum de mouton dirigé contre les IgG de lapin couplé avec de la peroxydase (Cherel, 1985, Biochem. Biophys. Res. Comm., 129, 686-693). EXEMPLE 9 CONFIRMATION DE L'IDENTITE DES ADNc CLONES PAR IMMUNOSELECTION bES ANTICORPS INHIBANT L'ACTIVITE DE LA NITRATE REDUCTASE DE TABAC (figure 5) Bien que l'antisérum alphaMNR utilisé pour le criblage ait semblé plutôt spécifique à l'égard de la NR de tabac, I'antisérum peut avoir contenu une soustlasse mineure d'immunoglobuline reconnaissant d'autres protéines de tabac. Ceci pourrait conduire à l'isolement de "faux positifs". Pour tester cette possibilité, des cellules de la souche RY1090 d'E. coli ont été infectées par des phages lambdaGTl 1 et 13-29. Après induction par IPTG, les protéines synthétisées ont été transférées sur des filtres de nitrocellulose. Les anticorps de contrôle (alpha SO) et polyclonaux (alphaMNR) ont été mis en incubation avec les filtres et les immunoglobulines immunosélectionnées correspondantes ont été éluées des filtres à pH faible. Ces anticorps sélectionnés ont été ensuite analysés quant à leur faculté d'inhiber l'activité réductrice de nitrate de la NR de tabac. Comme on peut le voir figure 5, les protéines exprimées par le clone 13-29 ont pu se lier spécifiquement, dans le sérum alphaMNR, avec les anticorps inhibiteurs de la NR de tabac. Une inhibition à 40 96 de l'activité de la NR de tabac a été obtenue avec une dilution à 1/200 des immunoglobulines sélectionnées, ce qui est raisonnablement en accord avec l'activité inhibitrice du sérum alphaMNR (70 96 d'inhibition à dilution 1/200 pour le sérum). Ceci suggère également que la quantité de protéines hybrides disponibles pour l'immunosélection dépassait largement la quantité d'immunoglobulines adsorbée dans le sérum.Il a été trouvé que, certainement, I'antisérum alphaMNR déjà utilisé pour la confirmation immunologique des clones positifs, était inapproprié pour le triage supplémentaire des nouveaux recombinants, probablement à cause d'une diminution de son titre en immunoglobulines dirigées contre la NR. EXEMPLE 10 RECONNAISSANCE DE LA PROTEINE HYBRIDE EXPRIMEE PAR LE CLONE 13-29 PAR DES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA NITRATE REDUCTASE (tableau 1) Trois anticorps monoclonaux de NR dressés contre la NR de tabac et mais (tableau 1) ont été utilisés pour caractériser davantage les protéines hybrides. L'anticorps monoclonal 96(9)25 reconnait la NR naturelle d'une variété de plantes et est inhibiteur de l'activité de l'enzyme. Les anticorps monoclonaux 7(1 13)NP15 et 24(48)NPl9 reconnaissent la NR naturelle du tabac mais n'ont pas d'incidence sur l'activité de I'enzyme. Pour contrôle, on a utilisé un anticorps monoclonal GET dirigé contre l'enveloppe glycosylée d'un coronavirus de porc. Les résultats sont reproduits au tableau 1.Parmi les quatre anticorps monoclonaux testés, les clones 96(9)25 et 24(48)NP19 ont reconnu spécifiquement les déterminants antigéniques d'un extrait d'un lysogène pour le clone 13-29, fabriqué dans la souche RY1089. Aucune reconnaissance significative n'a été détectée pour les clones 7(ll3)NPl5 et GET. L'anticorps monoclonal 96(9)25 a une affinité supérieure pour la NR de tabac que l'anticorps monoclonal 24(48)NP19. La reconnaissance de la protéine hybride par ces deux anticorps monoclonaux suggère une situation semblable. Au moins deux épitopes différentes peuvent être détectées sur la protéine hybride qui sont ainsi reconnues sur la NR de tabac.L'absence de l'épitope reconnue par l'anticorps monoclonal 7(113)NP15 montre aussi, comme prévu, que la NR de tabac et la protéine hybride sont antigéniquement différentes, à cause de l'absence d'une partie de la séquence codante de la NR dans l'ADNc clone. La méthode d'immunosélection des anticorps reconnaissant les protéines hybrides exprimées par les recombinants est la suivante Des clones lambdaGTl 1 du type sauvage et recombinant ont été déposés sur la souche RY1090 dans des boîtes de 90 mm. Après lyse confluente en présence d'lPTG, les protéines des plages ont été transférées sur nitrocellulose. Deux transferts de nitrocellulose ont été saturés pendant 1 heure avec de la BSA 30 mg/ml et après lavage dans du PBS, ils ont été mis à incuber dans les antisérums (5 ml) alphaSo ou alphaMNR dilués à 1/00. Après incubation et lavage des filtres avec PBS, les anticorps adsorbés sur les filtres ont été élués par une incubation de 30 secondes dans 5 ml d'un tampon pH 2,2 de HC1-glycine 0,2 M. Après retrait du filtre, le tampon d'élution a été rapidement neutralisé avec du Tris base et l'antisérum alphaSo non-immun a été ajouté dans un volume final de 10 ml à une dilution de 1/200 fois. Les protéines éluées ont été concentrées et dialysées contre PBS en utilisant une cellule Amicon équipée d'une membrane PM30. Différentes concentrations de ces échantillons ont été ajoutées à une préparation de NR de tabac purifiée, préparée par chromatographie d'affinité. Après 5 minutes d'incubation, l'activité de la NR a été analysée. La méthode des mesures ELISA d'affinité des anticorps monoclonaux pour les protéines de fusion est la suivante L'isolement et la caractérisation de l'anticorps monoclonal 96(9)25 fixant le site actif de NR de différentes plantes ont déjà été décrites par Cherel (1985). Plusieurs anticorps monoclonaux reconnaissant l'enzyme du tabac ont été obtenus en utilisant une méthode semblable. La mesure ELISA d'affinité des anticorps monoclonaux pour les protéines de fusion a été réalisée en utilisant un test à deux sites selon la procédure décrite par Cherel (1986) (Plant. Physiol. 81, 376-378). Les réactifs ont été versés dans les plaques de microtitrage dans l'ordre suivant : anticorps monoclonal du fluide ascitique, extrait d'E. coli de lysogène, antisérum alphaMNR et IgG anti-lapin, conjugué d'alkaline phosphatase. TABLEAU I MESURE ELISA DE L'AFFINITE DES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA NR, POUR LES PROTEINES HYBRIDES EXPRIMEES PAR LE CLONE 13-29 Anticorps Spécificité Extraits bactériens testés apres induction IPTG Monoclonal RY1089 (lambdaGTll) RY1089 (13-29 96(9)25 NR de tabac et 0,06 0,457 malus naturelle 7(113)NP15 NR de tabac 0,019 0,004 naturelle 24(48)NPI9 NR de tabac 0,031 0,272 naturelle GET Coronavirus de 0,003 0,057 porc EXEMPLE Il ANALYSES "NORTHERN" et "SOUTHERN BLOT" (Figures 6 et 7) I ) Analyse de "Northern blot" d'ARNm s'hybridant avec le fragment EcoRI de 1,6 kb (figure 6) Les ARN messagers ont été extraits de feuilles de tabac, de mais et de N. plumbaginifolia, recueillies sur des plantes cultivées dans un milieu contenant du nitrate. Les "northern blot" des ARNm fractionnés sur des gels de formaldéhyde-agarose ont été sondés avec l'insert d'ADNc de 1,6 kb (figure 6). Un signal d'hybridation a été détecté après 3 jours d'exposition dans des préparations de tabac et N. plumbaginifolia. Aucun signal n'a été détecté, même après exposition prolongée dans le cas des ARNm de mais. L'hybridation des mêmes taches avec une unité de répétition (motif) d'ADN de blé a montré que les ARNm homologues à l'insert de 1,6 kb avaient migré légèrement plus vite que l'ARN ribosomal de 28 s. Une taille de 3,5-3,6 kb était assignée aux ARNm quand les migrations étaient exécutées dans des gels de méthylmercurhydroxyde dans des conditions totalement dénaturées en présence de marqueurs de poids moléculaire d'ADN monobrin. 2) Analyse de "southern blot" des séquences Rénomiques homologues au fragment EcoRI de 1,6 kb (figure 7) La complexité génomique des séquences homologues du fragment d'EcoRI de 1,6 kb a été étudiée en utilisant l'ADN extrait du tabac. Les résultats de "southern blot" effectuée dans des conditions stringentes sont présentés figure 7. Les signaux correspondant aux petits nombres de copies de séquences correspondantes ont été détectés dans les digestions comme le suggérait la comparaison avec les signaux d'hybridation obtenus en sondant avec un motif d'ADNr de blé. Quand l'ADN génomique était coupé par EcoRI, un signal était détecté dans les positions d'un fragment de 3,4 kb et un de 5 kb, et une hybridation faible était aussi observée correspondant à un fragment de 2,9 kb. Deux gènes de structure fonctionnels sont censés être présents dans le génome du tabac.Le fait que le fragment EcoRI de 1,6 kb soit interne à l'ADNc suggère que des séquences intervenant doivent être présentes dans la zone correspondante d'au moins un des deux gènes de structure. 3) Méthode d'expérimentation "northern et southern blot" Les ARNm ont été fractionnés par électrophorèse dans des gels d'agarose 1,5 96 d'hydroxyde de méthylmercure 10 mM pour le dosage précis des poids moléculaires ou dans des gels d'agarose 1,5 96 formaldéhyde 3,0 96 pour les expériences banales. Après fractionnement les ARNm ont été transférés sur des membranes Hybond C (Amersham) selon Thomas (1980) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205). L'ADN total a été extrait de jeunes feuilles de tabac selon le mode opératoire décrit par Dellaporta (1983) (Plant. Mol. Biol. Reporter, 1, 19-21), purifié par centrifugation d'équilibre de gradient de CsCI, et utilisé pour l'analyse "southern blot" conformément à Deshayes (Embo. 3. 4, 2731-2737 (1985). Les "northern et southern blots" ont été identifiés à l'aide de sondes comportant le fragment EcoRI de 1,6 kb d'un phage 13-29 purifié par centrifugation de gradient de saccharose ou avec le pTA71 marqué au phosphore 32 portant un insert d'ADNr de blé de 9 kb. L'hybridation a été effectuée dans du formamide 50 96 à 45"C et lavé dans des conditions stringentes (3 lavages à température ambiante dans SDS 0,1 96, 2xSSC, suivis par 2 lavages de 30 minutes à 65"C dans SDS 0,1 96, 0,2xSSC, selon Maniatis (1982) (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory). LEGENDES DES FIGURES - Figure 1: traduction acellulaire dans un système de réticulocyte de l'ARNm codant pour l'apoenzyme NR. Les ARNm polyA+ ont été isolés de jeunes feuilles de tabac et traduits en dehors de la cellule. Les produits de traduction ont été fractionnés sur gel dénaturant de polyacrylamide 5 96. Ligne I : Phosphorylase B (C 14) Ligne 2: Produits de traduction immunosélectionnés avec l'anticorps polyclonal alphaMNR Ligne 3 : Produits de traduction immunosélectionnés avec un anticorps polyclonal de lapin non-immune (alphaSo) Linge 4 : Produits de traduction totale. - Figure 2 : Triage immunologique de la banque d'ADNc du tabac. Isolement (A) et purification (B, C et D) jusqu'à homogénité du clone riembinant 13-29., la procédure de triage mettant en jeu la protéine A [ I]. Les phages ont été étalés à des densités de 12 000 pFu (A), 5 000 pFu (B) et 300 pFu (C et D) par boîte de 90 mm. - Figure 3 : Diagramme physique d'une famille de clones s'hybridant avec le fragment EcoRI de 1,6 kb. La plage correspondant au site de clonage du vecteur a été grossie. Les orientations des inserts ont été préservées. - Figure 4 : Analyse de "Western blot" de protéines de fusion synthétisées par différents lysogènes. Des extraits ont été préparés à partir de cultures induites pour la phase lytique en l'absence (-) ou en présence (+: 1 heure ou ++ : 2 heures) d'lPTG. Ensuite, les gels d'électrophorèse SDS PAGE ont été, soit colorés avec du bleu de Coomassie (lignes 1,3), soit transférés sur une feuille de nitrocellulose (ligne 4-9). Des taches se sont révélées avec l'antisérum alphaMNR. Deux bandes correspondant à l'immunodétection de protéines E. coli ont été détectées dans tous les extraits. Lignes 2 et 5 : lambdaGTll ; Ligne 6 : clone 13-36 ; Lignes 3, 7, 8 et 9 : clone 13-29 Ligne 4 : correspond à de la NR de maTs purifiée. - Figure 5 : Inhibition de l'activité catalytique de la NR de tabac par des immunoglobulines immunosélectionnées par adsorption sur plaques formées par des phages lambdaGTIl et 13-29 développés en présence d'lPTG. Les immunoglobulines ont été ajoutées dans le mélange d'incubation d'enzyme à la dilution indiquée, basée sur la quantité initiale d'antisérum utilisée pour l'adsorption sur plaques de phage. Immun-antisérum alphaMNR adsorbé sur les plaques lambdaGTl 1 (.) ou sur les plaques de clones recombinants 13-29 ( ) ; Non immun-antisérum alphaSo adsorbé sur des plaques de clones 13-29 (O). Une petite, mais significative, stimulation de l'activité de la NR a été induite en ajoutant de l'antisérum non-immun (alphaSo) dans la préparation de NR. Ceci est attribué à un effet stabilisant des protéines de sérum sur l'enzyme. L'activité spécifique de l'extrait était de 0,4 uM NO2/g protéine/minute. - Figure 6 : Analyse de "Northern blot" des séquences d'ARNm s'hybridant avec le fragment EcoRI de 1,6 kb. L'ARN total a été extrait de feuilles de tabac (T), de N. plumbaginifolia (P) et de plantules de mais (1V1) cultivées sur un milieu contenant du nitrate. Les ARNm polyA+ ont été purifiés à partir de ces échantillons. Lignes 1 et 10 : ARN de mais total (5 pg) et ARN de tabac total (2 pg) coloré avec du bromure d'éthidium Lignes 2 et 9 : Les mêmes échantillons sondés sur "Northern blot" avec le fragment d'ADN de blé du plasmide PAT71 ; Lignes 3 à 8 1,Northern blot" de polyA+ ARNm sondés avec le fragment EcoRI de 1,6 kb du phage 13-36 sous-cloné dans pUC9 (a.s. 109 cpm/pg, 1 semaine d'autoradiographie) ; 3 et 4: 1 et 2 pg d'ARNm de mals, 5 et 6: 1 et 2 pg d'ARNm de tabac, 7 et 8 : 2 et 5 lig d'ARNm de N. plumbaginifolia. - Figure 7 : Analyse de "Southern blot" des séquences génomiques de tabac homologues au fragment EcoRI de 1,6 kb. Ligne I : marqueurs de poids moléculaire Ligne 2 10 pg d'ADN génomique de tabac digéré avec EcoRI, sondé avec le fragment EcoRI de 1,6 kb du phage 13-29 (a.s. 109 cpm/pg, 3 jours d'autoradiographie) Ligne 3 : I jjg du même ADN coupé par EcoRI sondé avec les séquences d'ADNr du blé de plasmide pTA71 (a s. 108 cpm/pg, I jour d'autoradiographie). REFERENCES BANTLE J.A., MAXWELL I.H. et HAHN W.E. (1978) Anal. Biochem. 70, 75-85. CAMPBELL W.H. et SMARELLI J. (1983) Phytochem 225, 2375-2382. CHEREL 1., GROSCLAUDE J. et ROUZE P. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm., 129, 686-693. CHEREL 1., MARION-POLL. A., MEYER C. et ROUZE P. (1986) Plant Physiol., 81, 376-378. CHIRGWIN J.M., PRZYBYLA A.E., MacDONALD R.J. et RUTTER W J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299. COMMERE B., CHEREL 1., KRONENBERGER J., GALANGAU F. et CABOCHE M. (1986), Plant Sci., 44, 191-203. DELLAPORTA S.L., WOOD J. et HICKS J.B. (1983) Plant Mol Biol. Reporter, I, 19-21. DESHAYES A., HERRERA ESTRELLA L. et CABOCHE M. 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REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage comportant un ADN complémentaire de I'ARNm de la nitrate réductase de tabac. 2) Vecteur de clonage comportant un ADN complémentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac comportant sur un fragment EcoRI/EcoRI de cet ADNc, dans l'ordre, les sites suivants : Xmnl, HindI Il, Kpnl, EcoRI. 3) Vecteur de clonage comportant un ADN complémentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac comportant sur un fragment EcoRI/EcoRI de cet ADNc, dans l'ordre, les sites suivants : Kpnl, HindI Il, Xmnl, EcoRI. 4) Vecteur de clonage selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'ADNc est inséré dans un phage. 5) Vecteur de clonage selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'insert d'ADNc est d'au moins 1,6 kb. 6) Vecteur de clonage selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'insert d'ADNc code pour plus de 50 96 de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac.