Brevet FR2601455A1 — publié le 19880115

Nouveaux réactifs biologiques en phase solide et leur procédé d'obtention. La présente invention a trait à de nouveaux réactifs biologiques en phase solide ainsi qu'â un procédé d'obtention de ces nouveaux réactifs. Le développement des recherches dans le domaine des molécules biologiques a conduit au développement de réactifs biologiques en phase solide constitués d'un support solide, le plus souvent de forme plane, mais pouvant également être particulaire, ou revêtir d'autres formes, support sur lequel se trouvent fixées des plages de substances réactives destinées à être mises en contact avec un milieu contenant des molécules biologiques qui doivent réagir avec la substance de test fixée sur le support solide. Il est alors possible, par des moyens divers, d'assurer une détermination quantitative, ou au moins qualitative, de la réaction qui s'est produite, et ceci dans des buts d'analyse pour le diagnostic, de recherche ou d'isolation de molécules biologiques. Les substances réactives de test fixées, en plage, sur le support solide1 sont extrêmement diverses mais, généralement, les substances utilisées sont des antigènes, anticorps ou haptènes. Les procédés de test utilisant de tels supports solides sont également divers et utilisent assez souvent des marqueurs de différentes natures (chimique, enzymatique, radioactive ou autres). L'un des problèmes principaux posés par la réalisation de tels réactifs en phase solide réside dans la difficulté de fixer à demeure, sur le support solide, la substance réactive de test, et ceci en quantité suffisante, en minimisant le plus possible le relargage de la substance de test pendant la réaction, et ceci sans dénaturer la substance réactive de test. Généralement, la fixation de la substance réactive de test sur le support solide s'effectue, après une éventuelle phase d'activation du support par des moyens quelconques, par imprégnation de la surface du support à l'aide de la substance réactive. De tels procédés sont par exemple décrits dans les demandes de brevets WO-A-84/03 151, EP-A-O 063 810 et FR-A-84 13144. Voir également I.C. SHEKARCHI et al. J. Clin. Microbiol. 1982, 1616, 1012-18. Une grande variété de supports solides ont déjà été proposés et utilisés tels que le verre, des supports de matière plastique, des gels, des supports fibreux et des supports à base de cellulose. Ainsi les demandes de brevet EP-A-O 063 810 et FR-A-84 13144 décrivent un réactif biologique dans lequel la substance réactive de test est fixée sur un support en nitrocellulose. Voir également V. HORESJSI et al. J. Immunol. Methods. 1983, 62(3), 325-9. D'une façon générale, les réactifs ainsi connus présentent des inconvénients liés aux difficultés susmentionnées et ne permettent pas une fixation parfaite de la substance réactive de test, ou bien ne permettent une telle fixation que pour certaines substances bien déterminées alors que, devant la multiplicité des nouvelles applications en matière de tests biologiques, il serait souhaitable de pouvoir préparer des réactifs avec des substances réactives extrêmement diverses tout en garantissant une fixation pratiquement parfaite, évitant tout risque de relargage, soit pendant le stockage, soit pendant la réaction biologique proprement dite. La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et de fournir de tels réactifs en phase solide, réactifs pouvant présenter des plages revêtues de substances réactives extrêmement diverses avec une densité importante de substance réactive et pratiquement sans risque de relargage. L'invention a pour objet de nouveaux réactifs biologiques en phase solide, du type comprenant un support à base de cellulose ou de polymère de synthèse sur lequel est fixée, en plage, au moins une substance réactive de test, caractérisés en ce que la substance réactive de test est reliée au support par le biais d'un complexe biotineavidine, la partie biotine étant liée à la substance réactive de test et la partie avidine étant reliée au support solide proprement dit. De façon particulièrement préférée, le support solide du réactif selon l'invention est constitué de nitrocellulose. Parmi les polymères de synthèse chimique, on préfère les Nylons. Les supports mis en oeuvre dans l'invention ne sont pas absorbants, l'avidine se fixant en surface. t'avidité de l'avidine pour la biotine et l'utilisation des complexes avidine dans des réactions biologiques sont assez bien connues. Voir BAYER E.A. et MEIR W., Methods of biochemical analysis (1970), volume 26. Toutefois, jusqu'à présent, ces connaissances n'avaient pas permis de réaliser des réactifs de test en phase solide supprimant les inconvénients de l'art antérieur et présentant les avantages de l'invention. L'invention a permis de constater que l'on pouvait réaliser des réactifs avec des substances de test extrêmement diverses, et ceci d'une façon simple, par le biais d'une liaison particulièrement solide qui s'établit entre l'avidine et le support, notamment de nitrocellulose, et ceci dans des conditions ne créant aucun préjudice aux liens existant entre la biotine et la substance réactivé de test proprement dite, celle-ci étant, bien au contraire, déployée et répartie de façon optimale dans l'espace pour faciliter la réaction biologique dans laquelle elle doit intervenir, ainsi que l'interprétation de cette réaction. Parmi les substances réactives de test des nouveaux réactifs selon l'invention, on peut citer pratiquement tous les antigènes et anticorps, les allergènes, des haptènes, ainsi qu'un grand nombre d'autres molécules biologiques telles que des protéines diverses, des enzymes, des cellules ou des fragments de membranes cellulaires. L'invention a également pour objet un procédé permettant d'obtenir les réactifs selon l'invention, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact un support à base de cellulose ou de polymère de synthèse, et notamment de nitrocellulose, avec de l'avidine, de la biotine et de la substance réactive. De préférence, on réalise, en phase liquide aqueuse, un mélange de substance réactive préalablement biotinylée et d'avidine que l'on amène à la concentration désirée et on réalise un dépôt du mélange sur la plage correspondante du support solide. On obtient ainsi un rendement nettement supérieur à celui obtenu dans le cas où on fixerait d'abord l'avidine sur la nitrocellulose, puis le complexe de substance réactive biotinylée sur le support ainsi revêtu d'avidine. La biotine peut également être utilisée sous forme de biotine modifiée, telle que par exemple la biotine hydrazine qui se fixe bien sur les sucres oxydés par le periodate, sur les aldéhydes et les carboxyles par une réaction carbodiimide, pour permettre une fixation au niveau des chaines glucidiques des glycoprotéines, préservant ainsi la structure protéique des sites immunologiquement ou biolo giquement actifs. Un bon mélange peut comporter avantageusement de l'ordre de 250 à 300 microgrammes /ml de substance biotinylée et -de 500 microgrammes d'avidine /ml environ, ce mélange pouvant ensuite être éventuellement dilué pour obtenir les concentrations désirées. Ce mélange est appliq, sur le support par simple dépôt, après quoi on le laisse sécher. Un lavage peut éventuellement être effectué ensuite. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. ExemPle 1. On réalise une préparation d'IgE humaine biotinylée par une technique classique. On effectue un mélange de cette IgE biotinylée (250-300 Hg/ml) et d'une préparation d'avidine à 500 Fg/ml (vendue par la société française IBF-POINTET GIRARD), le mélange étant dilué pour obtenir la concentration suivante : IgE biotinylée 125 à 150 P g/ml, avi dine 250 P g/ml. On réalise un dépôt de ce mélange à raison de 1 microlitre par plage de nitrocellulose MILLIPORE HAHY et on laisse sécher. On effectue ensuite une étude comparative de la stabilité de la fixation de l'IgE par le procédé selon l'invention, du dépôt de l'IgE biotinylée seule sur la nitrocellulose ou du dépôt de l'IgE seule sur la nitrocellulose. Le contrôle du relargage de l'IgE au cours des lavages et des incubations ultérieures est effectué à l'aide d'anticorps anti-IgE monoclonal. Quand il y a relargage d'IgE, celle-ci se fixe immunologiquement sur les spots d'anti-IgE, cette fixation pouvant alors être quantifiée au moyen d'une seconde anti-IgE marquée à la peroxydase. IgE biotinylée + avidine IgE biotinylée IgE IgE 75 84 76 anti IgE 0 34 42. On voit que le dépôt d'IgE biotinylée ou le dépôt d'IgE seule entraîne un relargage important de l'IgE qui est venue se fixer sur l'anticorps anti-IgE. Au contraire, le réactif selon l'invention ne produit aucun relargage. Par rapport aux autres techniques connues, le procédé selon l'invention permet, pour un résultat final identique quant au nombre de molécules d'IgE fixées sur une bandelette de cellulose, d'économiser jusqu'à 40% d'IgE. Exemple 2. On répète l'exemple 1 mais en remplaçant le support de nitrocellulose par un support de cellulose BIORAD Trans Blot (vendu par la société française Touzard et Matignon). Les essais comparatifs démontrent également l'absence de relargage. Exemple 3. On répète l'exemple 1 en remplaçant la nitrocellulose par un support de nitrate de cellulose SARTORIUS SM 11306-0,45u, ou SARTORIUS SM 12500-12u, et ceci avec des résultats similaires. Exemple 4. On répète l'exemple 1 en remplaçant le support de nitrocellulose par un support en ester de cellulose MILLIPORE GSWP 02500 et l'on n'assiste qu'à un faible relargage comparé au relargage en cas de fixation d'IgE biotinylée seule. Exemple 5. On répète l'exemple 1 en remplaçant le support de nitrocellulose par un support constitué d'une bandelette de Nylon Pall Biodyne vendue par la société Pall. On obtient des résultats similaires. Des résultats similaires sont également obtenus en utilisant une bandelette de Nylon AMF Cuno Zetabind, vendue par la société française Promafluid, de Compiègne. Le tableau ci-dessous regroupe les études comparatives de stabilité entre les réactifs selon les exemples 1 à 5 de l'invention, d'une part, et un réactif ne comprenant qu'un dépôt d'IgE biotinylée, d'autre part. Chaque matériau ayant été testé indépendamment des autres, les chiffres du tableau n'ont pas de valeurs comparatives d'une ligne à l'autre. mélange avidire + IoE biotine IgE biotine IgE anti IgE IgE anti IgE Nitrocellulose 4ILLIPORE HAHY 105 0 76 42 Cellulose BIORAD Transblot 65 0 57 32 Nitrate de cellulose SARTORIUS SN 11306-G,45u 58 0 94 28 Nitrate de oellulos SARTORIUS SN 12500-l2u 54 0 84 35 Ester de cellulose MILLIPORE GSWP 02500 81 2 117 61 Nylon P.EL Biodine 49 0 75 18 selon AMF CuNO Zetabind 57 0 73 26 ExemPle 6. On répète les conditions de l'exemple 1 avec une IgC monoclonale humaine, en ajustant la proportion biotine/avidine. On dépose 1 microlitre du mélange sur le support solide. Une immunoglobuline monoclonale ainsi fixée est reconnue par un anticorps anti IgG humaine de sérum de lapin marqué à la peroxydase et révélé par une réaction chimique de coloration. Les extraits d'allergènes se laissent également fixer après biotinylation. REVENDICATIONS 1. Nouveaux réactifs biologiques en phase solide, du type comprenant un support à base de cellulose ou de polymère de synthèse sur lequel est fixée, en plage, au moins une substance réactive de test, caractérisés en ce que la substance réactive de test est reliée au support par le biais d'un complexe biotine-avidine, la partie biotine étant liée à la substance réactive de test et la partie avidine étant reliée au support solide proprement dit. 2. Réactifs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le support est un support en nitrocellulose. 3. Réactifs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le support est en cellulose, nitrate de cellulose ou ester de cellulose. 4. Réactifs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le support est en Nylon. 5. Réactifs de test comprenant, complexée à la biotine, une substance choisie dans le groupe formé par les antigènes, anticorps, allergènes,haptènes, enzymes, cellules, fragments de membranes cellulaires. 6. Procédé d'obtention d'un nouveau réactif biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact un support à base de cellulose ou de polymère de synthèse, avec de l'avidine, de la biotine et de la substance réactive. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on réalise, en phase liquide aqueuse, un mélange de substance réactive préalablement biotinylée et d'avidine et que l'on réalise un dépôt du mélange sur la plage correspondante du support solide. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les proportions de substance biotinylée et d'avidine sont dans le rapport de 125 à 250 microgrammes de substance biotinylée et 250 microgrammes d'avidine. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce quel'on laisse simplement sécher le réactif après le dépôt du mélange sur la plage correspondante du support solide. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on effectue ultérieurement un lavage du support revêtu de la substance.