Brevet FR2603887A1 — publié le 19880318

Procédé de préparation de L-tryptophane et de DL-serine Le L-tryptophane est un aminoacide naturel essentiel et a de multiples possibilités d'utilisation comme supplément à des aliments et à des fourrages, entant donné que dans quelques protéines végétales il est un aminoacide limitant. C'est particulièrement le cas pour la protéine de mais et par une addition de L-tryptophane, on peut améliorer notablement la valeur physiologique nutritive de la protéine de mais. Cependant, -le L-tryptophane fabriqué actuellement est utilisé presque exclusivement dans des buts médicaux, dans la préparation de solutions d'infusion ou comme neurotransmetteur, puisque son utilisation dans le domaine des aliments et des fourrages se heurte à son prix trop élevé et par suite, il nta pas manqué de tentatives de préparer économiquement le L-tryptophane. Le brevet IN 61 235 de 1957 décrit un procédé microbien pour la préparation du L-tryptophane en partant de la L-sérine et de l'indole avec une mutante auxotrophe d'Escherichia coli ATCC 12783 et dans le brevet DE 28 41 642, on propose une mutante L-trvDtophane-auxotrophe d'Escherichia coli W 3110 pour la condensation biote ique de la L-sérine avec l'indole avec addition d'un surfactif non ionique ou l'utilisa- tion de cellules immobilisées. Au lieu d'Escherichia coli on peutaussi utiliser pour la synthèse biochimique du tryptophane, d'autres microorganismes contenant de la tryptophanesynthétase comme Proteus vulgaris IF0 3045 ou Pseudomonas Punctata tG 10243 (brevet JP 49 81 591). Un inconvénient de l'application de ce procédé connu réside dans les grandes depeUnses de fabrication de la L-sérine. Etant donné qu'on ne connåît pas encore de fermentation directe de sérine en partant du sucre, on obtient la L-sérine par conversion biochimique de la glycine, par dédoublement enzymatique de la DL-sérine ou par extraction en partant d'hydrolysat de protéines. La fibroïne de sotte et la kératine de laine ont une haute teneur en sérine mais aussi dans la protéine d'arachide ou de soja, la serine existe en assez grandes quantités. Par hydrolyse de ces protéines avec l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique, on obtient les aminoacides libres et lors de la neutralisation de ces hydrolysats, on peut précipiter et séparer les aminoacides difficilement solubles.Le filtrat ou le liquide d'écoulement de cette précipitation contient les aminoacides facilement solubles, notamment aussi la L-serine. L'isolement de la L-sérine en partant de ces liquides d'écoulement peut s'effectuer en passant par la précipitation du sel de sérine peu soluble de l'acide P-hydroxyazobenzene-p-sulfonique. Il faut ensuite décomposer ce sel par L'acétate de baryum (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, volume 3, page 2202). Ces procédés d'isolement de la L-sérine sont très coûteux. Le problème qui est à la base de l'invention est d'aménager un procédé de préparation de L-tryptophane et de DL-sérine de façon telle qu'il devienne possible d'obtenir économiquement avec une pureté suffisante une solution de L-serine qui puisse être utilisée pour la biosyn thèse du tryptophane. Pour la solution du problème ci-dessus, il est prévu qu'en partant d'eluats d'échangeurs d'ions provenant du traitement de jus fluide et épais que l'on obtient lors de la transformation de la betterave à sucre ou en partant d'autres liquides d'écoulement contenant de la sérine qui se présentent lors du désucrage de la mélasse, on obtient, à des pH de 5,5 à 6,5, au moyen de la chromatographie par exclusion d'ions, une solution de serine pauvre en cendre de leouelle on sépare ensuite par concentration la DL-sértne et on fait ré ir la solution concentrée de L-sérine qui reste sur l'indole et une suspension de cellules contenant de la tryptophanesynthétase pour obtenir le L-tryptophane. La découverte et le choix de la matière première appropriée pour la préparation de la solution de L-sérine ont une grande importance pour le procédé, étant donné que les liquides d'écoulement de l'hydroly- se des protéines ne sont disponibles que dans une mesure limitée et qu'en outre, les dépenses de matières premières et de préparation sont élevées. En face de cela, les liquides d'écoulement de la transformation å sucre et du désucrage de la mélasse sont disponibles en grandes quantités en tant que déchets. Dans la betterave à sucre, ies aminoacides se pressentent sous forme libre et lors de l'extraction du sucre, ils passent dans le Jus brut. Ces aminoacides sont, pour le technicien du sucre, de "l'azote nuisible" puisqu'ils empêchent la cristallisation du sucre.On a étudié en détail les composés azotés qui se pressentent en plus grande quantité, comme la bétaïne, la glutamine, l'acide glutamique et l'acide aspartique, tandis que l'on nta guère consacre d'attentions aux aminoacides se pressentant en moindres quantités. Cependant, lors d'expériences pour l'isolation de ces aminoacides en partant des liquides d'écoulement de la transformation de la betterave à sucre, on a constaté que quelques-uns de ces aminoacides sont partiellement racémisés. Lors de l'étude de la sérine par chromatographie liquide à haute pression sur des colonnes Chical, on a constaté une teneur en DL-sérine de 20 à 30 %.Cette présence jusqu'ici inconnue de sérine racémique dans la mélasse de betterave à sucre rend difficile le travail d'isolement de la L-sérine. La mélasse de betterave à sucre contient environ 48 % de saccharose, 10 % de constituants de cendre et environ 4 % d'aminoacides. On peut effectuer le dé sucrage de la mélasse soit en précipitant le saccharose au moyen de calcium ou de sels de baryum ou en séparant les constituants autres que sucres par chromatographie liquide. Ce dernier procédé de séparation est décrit dans les brevets DE 22 32 093, 22 31 784, 22 57 864 et 26 62 211. Comme phase stationnaire, on utilise ici des échangeurs d'ions et comme phase mobile on verse alternativement de la mélasse diluée et de l'eau. Dans le liquide d'écoulement des colonnes de séparation, on retire des fractions riches en sucre et des fractions pauvres en sucre.Certains liquides d'écoulement qui ont une haute teneur en aminoacides sont des matières premières préféren villes pour l'obtention en série prévue selon l'invention. Lors de la séparation chromatographique selon le principe du procédé d'exclusion d'ions, on sature un échangeur de cations des ions de la solution à filtrer. Dans ce système, les électrolytes forts amenés traversent l'échan- geur sans modification, tandis que les électrolytes faibles ou les non-électrolytes sont absorbés par la gangue de l'échangeur. En éluant ensuite par l'eau, on sépare à nouveau ces corps adsorbés de la gangue de l'échangeur. Dans l'alternance de chargement avec la substance et d'élution par l'eau, on peut donc obtenir une séparation des électrolytes et des non-électrolytes. De façon entièrement nouvelle et inattendue, on a pu, lors de la séparation chromatographique des liquides d'écoulement contenant de la sérine, sur un échangeur de cations sous la forme sodium, non seulement obtenir la séparation de l'électrolyte fort mais aussi séparer dans une large mesure la sérine du saccharose et des autres aminoacides. Par cette séparation chromatographique selon l'invention, on peut multiplier par 10 à 15 la teneur en sérine relativement à la solution initiale.Etant donné que dans ce procédé, pour la chromatographie par échange d'ions, on n'utilise pas d'agent de régénération, ce nouveau procédé de séparation est très peu polluant et ne charge pas les eaux usees. Le pH de la solution versée a une influence notable sur la séparation de la sérine. On a trouvé que le pH doit se situer entre 5,5 et 6,5. On a obtenu les meilleurs résultats de séparation au voisinage du point isoélectrique de la sérine, soit pH 5,7. Un autre paramètre important est la température de la colonne de séparation. Pour obtenir un bon rendement de séparation et pour éviter les contaminations microbiologiques on opère, de préférence, à une température de 80 à 90 C. Comme échangeur de cations, on utilise, de préférence, des résines de polystyrène ayant une réticulation DVB de 4 à 7 %. La grosseur de grain doit être de 0,3 à 0,5 mm et 90 % des grains de résine doivent se situer dans une gamme de 20 % de la grosseur moyenne de grain. Un autre problème à résoudre est la commande du liquide d'écoulement pour la séparation des différentes fractions. La réaction connue de décèlement des aminoacides au moyen de la coloration par la ninhydrine n'a pas pu être utilisée à cause de la coloration propre du substrat et d'autres réactions de décèlement, par exemple l'analyse aut atique des aminoacides, ont donné de si grands retards de temps qu'elle n'étaient pas utilisables pour la commande du processus. On a trouvé, de façon surprenante et imprévisible, que par mesure simple de densités et de conductivité, on peut obtenir une séparation très précise de la fraction sérine. Le processus de séparation est illustré par la figure 1.Pour la mesure de densité, on a utilisé la vapeur Bx usuelle dans l'industrie du sucre et on a indiqué la conductivité en pS. Comme on peut le voir par la figure 1, la densité et la conductivite augmentent fortement au début du processus de séparation, atteignent un maximum et diminuent alors rapidement et arrivent, par un point d'inflexion, à un plateau qui descend jusqu'a la fin du cycle. Au point d'inflexion de ces valeurs mesurées se trouve aussi le point d'intersection de la fraction sérine. Par cette mesure simple, une commande directe du processus de séparation est devenue possible. Outre la fraction sérine, on obtient encore une fraction contenant du sucre avec le reste des non-sucres. Cette fraction contenant du sucre, après la concentration, peut être utilisée dans l'industrie des fourrages ou dans l'industrie de la fermentation.Pendant le processus de séparation, on retire aussi d'autres fractions intermédiaires comme le Recyclage 1 et le Recyclage 2 et on les recycle vers le cycle de séparation suivant. Lors du processus de séparation, on obtient des solutions de sérine pauvres en cendre ou des fractions de sérine de grande pureté, en partant de ces solutions doit s'effectuer la séparation de la D-sérine car lors de l'utilisation de la solution de sérine pour la préparation de tryptophane on ne fait réagir que la L-sérine. Pour la séparation de la D-sérine, on a trouvé une solution étonnamment simple. Par concentration de la fraction de sérine à 35 % de substance sèche et ensuite refroidissement à 20 C, on a pu séparer le gros de la D-sérine en tant que DL-sérine par filtration. Toutefois, lors de l'examen de la DL-sérine cristallisée, il est apparu qu'elle contenait comme impureté de la tyrosine et étant donné que la tyrosine est un aminoacide très difficilement soluble, on ne peut pas, par simple recristallisation, obtenir une purification satisfaisante.Lors de recherches, on a constaté que les aminoacides aromatiques, phénylalanine et tyrosine, sont adsorbés sélectivement par des échangeurs d'anions fortement basiques. La sérine n'est que légèrement adsorbée par les échangeurs d'anions et refoulée de l'échangeur par la tyrosine fixée. Pour éviter des pertes de sérine, on a réglé le rapport tyrosine-échangeur d'ions de t on telle que par mole de la tyrosine à éliminer, on puisse utiliser 2 litres d'échangeur d'ions. De la solution de DL-sérine exempte de tyrosine, on a tiré, par concentration et cristallisation, de la DL-sérine pure. Outre l'utilisation de la solution de L-sérine pour la préparation de tryptophane, on peut aussi, en concentrant davantage la solution, cirstalliser la L-sérine et la purifier par recristallisation. Dans la biosynthèse connue du L-tryptophane en partant de la L-sérine et de l'indole, on utilise des microorganismes contenant de la tryptophanesynthètase. La culture ou l'immobilisation de ces microorganismes ne font pas l'objet de l'invention, mais seulement l'utilisation de la solution de sérine préparée selon l'invention pour la condensation biochimique en L-tryptophane. Par la forte concentration de sérine dans cette solution, cette réaction est très efficace et par addition des quantités stoechiométriques d'indole et de sérine à une suspension de cellules, on obtient le tryptophane à de si fortes concentrations qu'il cristallise et peut être séparé en même temps que les cellules. On concentre la liqueur-mère restante et on récupère l'éthanol ajouté. Après le refroidissement de cette liqueur-mère concentré, on cristallise et on sépare une deuxième fraction de tryptophane brut. On utilise alors, de préférence, la liqueur-mère concentrée restante comme supplément pour fourrages. Lorsqu'on utilise des liquides d'écoulement provenant d'hydrolysat de protéines et contenant de la sérine, on peut aussi isoler de ces liqueurs-mères d'autres aminoacides selon des procédés connus. On dissout le tryptophane brut dans l'eau chaude et on sépare les cellules après addition de charbon activé et d'adjuvants de filtration. On concentre sous vide la solution de tryptophane décolorée, on la refroidit et on sépare le tryptophane cristallisé. Dans le cas d'utilisation pour des solutions d'infusion, il faut que le L-tryptophane soit exempt de substances pyrogènes Celles-ci sont des endotoxines provenant des microorganismes utilisés pour la réaction et eltsprovo- quent lors de l'infusion de fortes réactions de fièvre. Etant donné que ces substances pyrogènes ayant un poids moléculaire de 10 000 ne peuvent pas être sûrement utilisées par intrafiltration, on a essaye différents adsorbants. L'adsorbant recherché doit adsorber seulement les substances pyrogènes et non le tryptophane.Cette condition a été remplie par un oxyde d'aluminium activé de façon acide, Selon l'invention, on fait s'infiltrer la solution aqueuse de tryptophane décolorée sur une colonne contenant de l'oxyde d'aluminium et ensuite, pour élimi- ? les particules d'oxyde d'aluminium, on la filtre à nouveau sur un filtre stérile à couches. On concentre alors la solution filtrée dans les conditions stériles usuelles et on obtient du L-tryptophane exempt de pyrogènes. Exemple d'exécution 1 On emplit une colonne en verre à double paroi mesurant 850 x 40, avec 1000 ml d'échangeur de cations sous la forme sodium. Sur un thermostat, on chauffe à 85" C la double paroi de la colonne de séparation. Ensuite, on verse à une vitesse de 6 ml/mn 120 ml d'un produit d'écoulement contenant de la sérine à raison de 60 % de saccharose et 4 % de sérine sèche provenant du désucrage de la mélasse, que l'on a réglé à un pH de 6,0 et au bout de 20 minutes s'effectue l'amenée d'eau entièrement désionisée en l'espace de 85 minutes. Ensuite, avec l'amenée du prochain liquide d'écoulement contenant de la sérine, commence un nouveau cycle. Les solutions sortant de la colonne de séparation s'écoulent de façon continue par un appareil de mesure de densité et de conductivité et les valeurs mesurées sont transmises à un traceur. Par l'intermé diaire d'un microprocesseur, d'après les valeurs mesurées de densité et de conductivité, on sépare les fractions suivantes - 50 minutes fraction de non-sucres et de saccharose - 10 minutes recyclage 1 - 30 minutes fraction de sérine - 15 minutes recyclage 2 On amène la fraction de recyclage 1 en même temps que le liquide d'écoulement suivant contenant de la sérine et on amène la fraction de recyclage 2 en même temps que l'eau.On ramène la fraction de non-sucres au processus de désucrage et on traite ensuite comme suit la solution de sérine à 40 % de sérine sèche 3000 g de solution de sérine sont concentrés à 450 g et refroidis à 20 C avec agitation, la DL-sérine cristallisée est séparée par filtration, est diluée dans 500 ml d'eau à 90 C, 3 g de charbon actif sont ajoutés et le mélange est filtré. Le filtrat est transporté à 40 C, par une colonne en verre, avec 50 ml d'un échangeur d'anions fortement basique de type gel et la solution purifiée libre de tyrosine est concentrée à 150 g, refroidie et la DL-sérine cristallisée est séparée par filtration. Après séchage, on obtient 13 g de DL-sérine pure.La solution concentrée de L-sérine subit le traitement ultérieur suivant D'après des procédés connus, une mutante appropriée de EscheYichia coli est cultivée dans une solution nutritive sous conditions aérobies et les cellules s'y étant développées sont recueillies du milieu de culture par centrifugation. 50 g de la masse de cellules recueillie par centrifugation sont mis en suspension dans un réacteur agitateur avec 400 g de la solution de sérine, 10 g de sulfate d'ammonium et 10 mg de phosphate de pyridoxale sont ajoutés, un pH de 8,0 étant réglé par addition d'ammoniaque. A cette suspension est ajoutée, sous agitation, une solution de 60 g d'indole dans 300 ml d'éthanol, la vitesse d'addition étant réglée de telle manière que la teneur en indole libre dans la solution de réaction reste inférieure à 1,5 g/litre. La réaction se déroule à 35 C pendant 40 heures. A la fin de la réaction, la solution est réglée à un pH de 4,0 avec de l'acide phosphorique, chauffée à 50 C etlO g de charbon actif sont ajoutés. Les cellules coagulées sont alors séparées ensemble avec le tryptophane séparé par cristallisation. Rendement : 200 g de tryptophane I brut. La lessive-mère de tryptophane brut est concentrée à 300 g par distillation de l'éthanol, est refroidie à température ambiante et une deuxième fraction de tryptophane brut est séparée. Rendement : 20 g de tryptophane II brut. 220 g de tryptophane brut sont dilués dans 4000 ml d'eau à 70 C, 20 g de charbon actif et 50 g de Kieselguhr sont ajoutés et la substance cellulaire est filtrée. La solution filtrée et décolorée est alors transportée avec 50 ml d'oxyde d'aluminium au moyen d'une colonne et ensuite filtrée au moyen d'un filtre à membrane stérile. La solution non pyrogénée est concentrée à 500 ml dans le vaporisateur rotatif, refroidie, le tryptophane est séparé par filtration et est séché sous vide à 80 C. On obtient 70 g de L-tryptophane pur non pyrogéné. Exemple d'exécution 2 Un jus léger de la fabrication de sucre est transporté dans deux échangeurs de cations fortement acides reliés l'un à la suite de l'autre, présentant chacun un volume d'un litre, jusqu'a ce que le pH à la sortie du premier échangeur de cations soit descendu de 2,0 à 3,0. Ensuite, les deux échangeurs de cations sont débarrassés du petit jus et sont rincés à l'eau. Le deuxième échangeur de cations monté à la suite, sur lequel se trouve la majeure partie des aminoacides, est régénéré avec 1,5 1 de 1 N soude caustique ou de solution de 1 N amino-acide et est rincé à l'eau. Eluat et eau de lavage sont alors concentrés ensemble à environ 15 % de substance sèche, et cette solution avec environ 2 % de sérine sèche est alors traitée conformément à l'exemple d'exécution 1. Exemple d'exécution 3 1000 g de déchets de laine sont hydrolysés avec 5 1 de 6N acide chlorhydrique pendant 8 heures à 105 C au recyclage. Les humines dégagées sont filtrées, et, sous agitation, l'hydrolysat d'acide chlorhydrique est neutralisé à un pH de 5,0 à 6,0 par addition prudente de carbonate de sodium. Après refroidissement à température ambianté et un temps de cristallisation de 48 heures, les aminoacides difficilement solubles, séparés par cristallisation, et la lessive-mère sont traités avec environ 5 % de sérine sèche conformément à l'exemple d'exécution 1. Des écoulements subsistant après séparation du tryptophane brut, d'autres amino-acides peuvent être récupérés de manière connue, par exemple par chromatographie à échange d'ions. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de L-tryptophane et de DL-sérine, caractérisé en ce qu'en partant d'èluats d'échangeurs d'ions provenant du traitement de jus fluide et épais que l'on obtient lors de la transformation de la betterave à sucre ou en partant d'autres liquides d'écoulement contenant de la sérine qui se présentent lors du dé sucrage de la mélasse, on obtient, à des pH de 5,5 à 6,5, au moyen de la chromatographie par exclusion d'ions, une solution de sérine pauvre en cendre de laquelle on sépare ensuite par concentration la DL-sérine et on fait réagir la solution concentrée de L-sérine qui reste sur l'indole et une suspension de cellules contenant de la tryptophanesynthètase pour obtenir le L-tryptophane. 2) Procédé, suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les écoulements contenant de la sérine sont chromatographiés sous forme de sels à une température de 80 à 90" C au moyen d'un échangeur de cations. 3) Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la séparation chromatographique de la sérine est commandée par la densité et par la conductivité de la solution d'écoulement. 4) Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fraction de sérine est concentrée, en ce que la DL-sérine cristallisée est séparée, en ce qu elle est diluée dans l'eau, en ce qu'elle est purifiée par traitement au moyen d'un échangeur d'anions fortement basique, et en ce qu'ensuite elle est recristallisée. 5) Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le L-tryptophane recristallisé est séparé, ensemble avec les cellules après addition de charbon actif et d'adjuvants de filtration, et en ce qu'une deuxième fraction de tryptophane brut est retirée de la lessive-mere par une évaporation complémentaire. 6) Procédé, suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le L-tryptophane est dilué dans l'eau, est filtré, en ce que la solution décolorée est traitée avec de l'oxyde d'aluminium actif, et en ce que, par une concentration suivie d'une cristallisation, du L-tryptophane non pyrogéné est obtenu.