Brevet FR2599382A1 — publié le 19871204

Procédé de orécaration de -diglycérides contenant en Dosition 2 un reste d'acide gras Dolv-insaturé, et produits obtenus. La présente invention concerne un procédé de préparation de diglycérides contenant en position 2 du glycérol, un acide gras poly-insaturé (contenant de 2à 6 doubles liaisons), elle concerne également les produits obtenus par ce procédé. Il est difficile d'obtenir, par synthèse chimique, des produits d'estérification du glycérol dans lesquels un acide gras poly-insaturé est positionné uniquement en position 2 de la molécule de glycérol. Or, on sait que de tels produits dans lesquels l'acide gras insaturé peut être, par exemple, de l'acide dihomo-ylinoténique (20:3 n-6),de l'acide arachidonique (20:4 n-6), de l'acide eicosapentaénoique (20:5 n-3) ou de l'acide docosahexaénoique (22:6 n-3) peuvent présenter un grand intérêt biologique. La présente invention décrit un procédé permettant l'obtention de ces produits par voie enzymatique. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que - on utilise, comme produit de départ, un mélange de phospholipides extrait de tissus animaux, ces phospholipides étant dispersés dans de l'eau, - la suspension obtenue est traitée par un sel de cation divalent de façon à provoquer une floculation des phospholipides en agré gats macroscopiques, - on ajoute au milieu obtenu une quantité de phospholipase C corres pondant à environ 0,1 unité pour 1,5 mg de phospholipides, - le précipité obtenu est filtré sur papier, et on recueille, dans le papier, des diglycérides dont la position 2 est estérifiée par un acide gras poly-insaturé. Le produit de départ est ur mélange de phospholipides extrait de tissus animaux par des méthodes connues, par exemple par macération des tissus broyés dans des solvants convenables tels que chloroforme-méthanol ou hexane-isopropanol. Les phospholipides, qui peuvent être séparés des lipides apolaires par précipitation à L'acétone, sont des composés que l'on peut représenter schématiquement par la formule suivante dans laquelle X peut être de la choline, de l'éthanolamine, de la sérine, de l'inositol ou du phosphatidyl-glycérol, R1,de façon très générale, est un acide gras saturé tel qu'acide palmitique ou stéarique, ou un acide gras monoinsaturé tel qu'acide oléique, R2 est un acide gras insaturé, dont la plus grande proportion est constituée d'acides gras poly-insaturés. On conçoit que selon le tissu animal utilisé comme source d'extraction des-phospholipides, et éventuellement selon le procédé mis en oeuvre pour cette extraction, les produits de départ décrits par la formule (I), qui sont presque toujours des mélanges, auront des compositions différentes. Dans la présente invention, le mot diglycéride signifie donc soit, exceptionnellement, un produit chimique pur, soit,le plus souvent, un mélange. Dans une première opération, les phospholipides sont mis en suspension dans de liteau par agitation intense ; la dispersion est favorisée par l'utilisation d'ultrasons. Dans une deuxième opération, la suspe sion obtenue est traitée par un sel de cation diva lent (Ca++, Mu++, Zn jusqu'à apparition d'un début de floculation. L'expérience prouve qu'on utilise de l'ordre de 1 à 5 mmol du cation divalent pour 250 mg de phospholipide. C'est ensuite sur la suspension floculée, ou en cours de floculation, que l'on réalise la réaction enzymatique. Cette réaction d'hydrolyse libère un diglycéride et est réalisée à l'aide d'une phospholipase C, produit connu excrété par certains micrc-organismes (Bacillus cereus, par exemple) dans un milieu de culture convenable. Cette réaction enzymatique se déroule très rapidement (durée de l'ordre de 5 à 15 minutes) à température ordinaire ou proche de l'ordinaire (entre environ 15 et 50"C) et à pH compris entre 6,5 et 8. On utilise environ 0,1 unité d'enzyme pour traiter 1,5 mg de phospholipides. A la fin de la réaction, on obtient un précipité que l'on peut filtrer et qui se trouve être constitué essentiellement par le diglycéride (ou un mélange de diglycérides), de formule : ainsi que par les phospholipides non-substrats de la.phospholipase C. Dans le filtrat, on trouve l'enzyme utilisé qui peut être récupéré, régénéré et réutilisé. On notera que le procédé, selon l'invention, permet en outre, du fait de la présence, en fin de réaction, de phospholipides non hydrolysés,de réaliser,en même temps que la préparation de diglycérides, un fractionnement du produit de départ et de récupérer certaines catégories de phospholipides. Par exemple, la phospholipase C de Bacillus cereus n'hydrolyse que très peu le phosphatidylinositol et les cardiolipides, et pas du tout la sphyngomyéline. Ces phospholipides sont aisément séparés des diglycérides par précipitation dans l'acétone. Les diglycérides obtenus peuvent être utilisés sous cette forme, ou être transformés en monoglycérides ayant en positif. 2 un acide gras insaturé ou en triglycérides ayant en position 2 un acide gras insaturé. L'exemple non limitatif suivant illustre l'invention. 10 g de foie de porc fraies sont broyés dans un mélange de chloroforme et de méthanol et les lipides totaux extraits par la méthode classique de Bligh et Dyer. L'extrait lipidique brut renferme 250 mg de lipides. Après précipitation à l'acétone, on recueille, par filtration, 230 mg de phospholipides pratiquement purs. Le solvant évaporé, ces phospholipides sont dispersés dans de l'eau à l'aide d'ultrasons et un sel d'ion divalent (CaCI2 ou MgCl2),en solution lui-même dans l'eau, est ajouté. Le pH de la solution est ajusté à 7,5 et la phospholipase de Bacillus cereus est ajoutée (16 unités). Après 15 min d'incubation à 35"C, en maintenant le pH à 7,5, la suspension est filtrée sur papier : le residu resté sur le filtre renferme 150 mg de diglycérides, dont plus de 95 % sont de la configuration 1,2. Les phospholipides n'ayant pas subi l'hydrolyse enzymatique (cardiolipides, phosphatidyl-inositol et sphingomyéline) représentent environ 50 mg et sont éliminés par précipitation dans l'acétone. Le tableau I donne la composition en acides gras des diglycérides obtenus, en comparaison de celle des phospholipides de départ : Tableau I Composition en pourcentage des acides gras des phospholipides avant hydrolyse enzymatique par la phoscholioase C et des dislycérides obtenus. Acide gras | Phospholipides Diglycérides 16:0 18,7 20,0 18:0 20,0 26,1 18:1 10,7 12,4 18:2 n-6 12,5 13,3 20:3 n-6 1,2 1,1 20:4 n-6 15,6 14,5 20:5 n-3 0,6 0,9 22:5 n-3 2,8 2,6 22:6 n-3 1,2 1,2 A titre indicatif, près de 30 % des diglycérides obtenus contiennent de l'acide arachidonique (20:4 n-6) en position 2. REVENDICATIONS 1. Procéde-de préparation de diglycérides ayant, en position 2, un reste d'acide gras poly-insaturé, caractérisé en ce que - on utilise comme produit de départ une dispersion, dans l'eau, de phospholipide(s) extrait de tissus animaux,- - ladite suspension est traitée par un sel de cation divalent de façon à provoquer une floculation dudit phospholipide, - on ajoute au milieu obtenu une quantité de phospholipase C correspondant a environ 0,1 unité de phospholipase pour 1,5 mg de phospholipide floculé, - on filtre le précipité obtenu et on recueille le produit solide filtré. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la suspension de départ est obtenue par agitation intense du mélange phospholipide-eau, ladite agitation étant réalisée de préférence par ultrasons. 3. Procédé selon L'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit cation divalent est choisi parmi le Ca le Mg++ et le zinc++ et que l'on utilise de 1 à 5 mmoL environ de cation divalent pour 250 mg de phospholipide. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction avec la phospholipase C est effectuée entre 15 et 50"C environ et a un pH compris entre 6,5 et 8 environ. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, carac térisé en ce que la phospholipace C est récupérée dans le filtrat résultant de l'étape de séparation, par filtration, du diglycéride obtenu. 6. Diglycérides comportant, en position 2, un reste d'acide gras poly-insaturé, caractérisés en ce qu'its sont obtenus seLon le procédé de L'une des revendications 1 à 5. 7. Diglycêrides selon la revendication 6, caractérisés en ce que le radical poly-insaturé en position 2 est un radical provenant d'un acide tel que l'acide dihomo-y-linolénique. de L'acide arachidonique, de L'acide eicosapentaénoSque ou de l'acide docosahexaénoique. 8. Utilisation des diglycérides selon l'une des revendications 6 et 7, pour la préparation de monoglycérides présentant en position 2 un acide gras poly-insaturé ou de triglycérides présentant, en position 2, un acide gras poly-insaturé.