Brevet FR2604784A1 — publié le 19880408

La présente invention concerne un procédé de préparation d'échantillons notamment de faibles volumes, pour la centrifugation et l'ultracentrifugation de liquides. La centrifugation et l'ultracentrifugation de faibles volumes de liquide se fait traditionnellement dans des tubes fermés à une extrémité et remplis par l'autre extrémité. Le liquide à centrifuger est introduit à laide d'une pipette dans le tube, qui est ensuite introduit dans un alvéole d'un rotor angulaire, horizontal, vertical ou à godets mobiles. Le rotor est alors mis en rotation et l'accélération centrifuge engendrée provoque une migration plus ou moins rapide, en fonction de leur densité relative, des différents constituants de l'échantillon. Dans certains domaines, tels que la biochimie, et notamment l'étude des médiateurs du système nerveux central, l'expérimentateur ne dispose que d'échantillons de très faibles volumes. Les plus petits tubes disponibles actuellement ont une capacité de 2oe?l. Des tubes plus petits présentent des difficultés de remplissage, le diamètre intérieur étant nettement inférieur au diamètre des gouttes de liquide obtenues à l'aide des pipettes. Cela nécessite des pipettes de très faible diamètre, impliquant une grande dextérité de l'expérimentateur. On a également proposé dans l'art antérieur, de préparer l'échantillon en remplissant par aspiration un tube capillaire en verre ou pyrex, et en en scellant une extrémité par la chaleur ou avec une pâte spéciale. Cette technique ne permet pas de centrifuger des volumes inférieurs à 5rl, et n'est pas utilisable en ultracentrifugation, car l'accélération centrifuge très importante entrain des pertes d'étanchéité, voire des ruptures du scellage. De plus, la récupération des couches de constituants formées après séparation par centrifugation est difficile à réaliser. La présente invention a pour objet de remédier à ces inconvénients, et présente, en outre, de nombreux avantages pour l'expérimentateur. Pour la préparation dé l'échantillon selon le procédé de l'invention, on introduit un liquide.à centrifuger dans un segment de tube ouvert aux deux extrémités. Les tubes seront choisis du type non rigide, de façon à pouvoir être pliés sans casser. Pour la préparation de faibles volumes de liquide à centrifuger, on choisira des tubes capillaires. Les tubes seront avantageusement constitués par des cathéters de polyéthy lène, de polypropylène ou de polyamide. Les segments de tube ont une longueur comprise de préférence entre 20 mm et 100 mm, et leur diamètre intérieur est compris entre 0,2 mm et 5 mm de préférence. L'introduction du liquide à centrifuger dans le segment de tube capil laire se fait préférentiellement par aspiration à travers ledit segment de tube, en créant une dépression à l'une de ses extrémités, à l'aide d'une pipette ou d'une seringue par exemple. Lorsque l'introduction du liquide est réalisée, le tube capillaire est plié en un point, symétrique par rapport aux extrémités de la colonne de liquide, de façon à former au moins une paire de branches jointives. Cette opération sera facilitée par le marquage avant remplissage du ou des points de pliage du tube capillaire. Ce marquage sera réalisé par un prépliage du segment de tube capillaire, de façon à créer un point de pliage préférentiel. On veillera à placer la colonne liquide ainsi introduite de façon sen siblement centrée par rapport au tube capillaire. Le point de pliage est déterminé par le centre de gravité de la colonne de liquide. Dans le cas d'un liquide de concentration homogène, le segment de tube est plié en son centre coïncidant avec le centre de la colonne pour former deux branches égales. Les branches ainsi formées sont maintenues accolées à l'aide d'un court manchon en plastique qui est mis en place par enfilage sur les branches jointives du segment de tube, ou par un adaptateur comportant un alvéole de dimensions correspondantes à celles du tube capillaire replié. Le segment de tube plié est ensuite mis en place dans la centrifugeuse. On étendra ici le terme de "centrifugeuse" aux ultracentrifugeuses et aux microcentrifugeuses. I1 peut être mis en place selon une génératrice intérieure du tube dans un tube à paroi épaisse, utilisé habituellement pour la centrifugation. I1 sera maintenu par un bouchon bloquant les branches libres contre les parois du tube à paroi épaisse. Le tube à paroi épaisse sera de préférence rempli d'un liquide de densité proche de celle du liquide à centrifuger, de façon à diminuer les déformations du tube capillaire. Le tube à paroi épaisse est ensuite placé dans l'alvéole d'un rotor. L'axe de l'alvéole est contenu-dans le plan formé par l'axe de rotation du rotor et une génératrice du rotor. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, un tube capillaire plié est introduit dans l'alvéole d'un adaptateur comportant au moins un alvéole d'introduction. Cet adaptateur est réalisé en matière plastique, du type polyéthylène, polypropylène, polycarbonate ou polyamide, par moulage par injection ou par usinage. L'alvéole d'introduction a une profondeur inférieure à la longueur d'une branche de segment de tube plié, et une profondeur supérieure à la longueur de la colonne liquide dans les branches du tube capillaire. La section de l'alvéole est ajustée, de façon à permettre l'introduction du tube capillaire par son extrémité pliée, par glissement axial, et à assurer un bon maintien du tube capillaire lorsqu'il est en place. La section aura une forme oblongue ou circulaire, la plus grande dimension étant sensiblement égale au double du diamètre extérieur du tube capillaire employé, dans le cas d'un segment de tube replié pour former une seule paire de branches, et le petit axe ayant une dimension sensiblement égale à la largeur du tube capillaire à l'endroit de la pliure. L'alvéole pourra être rempli d'eau ou d'un liquide ayant une densité proche de celle du liquide à centrifuger, de façon à éviter les gonflements du tube capillaire et présente avantageusement un fond plat. Les tronçons libres des branches ouvertes à leurs extrémités, dépassant de l'alvéole, sont repliés sur la face supérieure de l'adaptateur qui comportera un méplat, de façon à empécher une déformation axiale des branches de tube capillaire sous l'effet de l'accélération centrifuge. Les branches libres pourront, en outre, être repliées dans des gouttières ou des alvéoles d'insertion. L'adaptateur est placé dans l'alvéole d'un rotor. Sa forme extérieure est dans ce cas sensiblement cylindrique, et ses dimensions correspondent à la taille des tubes habituellement utilisés, ou à la taille des alvéoles des rotors de type connu. L'adaptateur peut également prendre la forme d'un bloc à glissière présentant des règlettes latérales s'adaptant dans les gorges verticales d'un rotor de centrifugeuse. Selon une variante de la présente invention, l'adaptateur constitue un portoir s'adaptant dans une cavité d'un rotor de type zonal. Selon un exemple de réalisation, le portoir présente la forme extérieure d'une couronne ou d'une partie de couronne cylindrique et comporte des alvéoles radiaux. Selon une autre forme de réalisation, le portoir présente la forme d'une couronne ou partie de couronne cylindrique et comporte des alvéoles inclinés dont l'orifice d'introduction des tubes capillaires est orienté vers l'axe de rotation.- Les portoirs selon ces deux modes de réalisation sont introduits dans la cavité creuse formée dans un rotor de centrifugeuse, construit sur le modèle des rotors zonaux de microcentrifugeuses. Après introduction des tubes capillaires pliés dans la centrifugeuse, le rotor est mis en rotation et la centrifugation s'effectue de façon connue. Après l'arrêt du rotor, le tube capillaire est retiré de son alvéole et les différents constituants, séparés en fonction de leur densité, forment des couches d'épaisseur variable dans les branches capillaires. Ces couches peuvent etre isolées et récupérées selon des techniques connues. Selon un exemple de réalisation préféré, on sectionne le tube capillaire entre deux couches de la colonne liquide, à l'aide d'un outil tranchant du type lame de rasoir. On isole ainsi le constituant séparé par centrifugation, sans risquer de le polluer par les autres couches, et avec des pertes minimales. Selon une variante, on sectionne le tube capillaire au niveau de la pliure, et on récupère les:couches séparées en injectant un gaz inerte ou de l'air, par l'extrémité ouverte de la branche libre, et on recueille succéssivement les différentes couches par l'extrémité sectionnée de la branche. I1 est bien entendu possible de mesurer directement l'épaisseur des différentes couches si le tube capillaire employé est transparent. Selon une autre variante, le tube capillaire plié est placé dans l'alvéole d'un rotor. Le rotor, pour la mise en oeuvre de cette variante, comporte un ou plusieurs alvéoles dont l'axe est contenu dans le plan formé par l'axe de rotation du rotor et une de ses génératrices. Ces alvéoles peuvent hêtre obliques, horizontaux ou verticaux. La section des alvéoles correspond aux dimensions des tubes capillaires pliés. Le rotor est réalisé selon les techniques connues de l'art antérieur. La présente invention concerne également des segments de tube prépliés pour la mise en oeuvre du procédé de préparation. D'autres exemples de réalisation et avantages ressortiront de la description qui va suivre et s'appuyant sur les figures suivantes La figure 1 représente une vue shématique d'un segment de tube plié La figure 2 représente une vue shématique d'un premier exemple de réalisation d'un adaptateur. La figure 3 représente une vue shématique d'un autre exemple de réalisation d'un adaptateur à glissières. La figure 4 représente-une vue en coupe d'un portoir selon l'invention. La figure 1 représente un segment de tube (1), dans lequel on a introduit un liquide à centrifuger formant une colonne liquide (2) dont on a ajusté la position symétriquement par rapport au segment de tube (1). Le liquide à centrifuger est formé d'une solution de la substance à étudier dans un milieu de densité déterminé, préparé selon les techniques connues. On peut bien entendu envisager toutes les variantes de préparation, et notamment réaliser des gradients de densité ou préparer des solutions en vue d'une centrifugation isopycnique. Le segment de tube capillaire (1) est plié en un point de pliage (3) sensiblement symétrique par rapport à la colonne de liquide (2), afin de former deux branches (4) réunies par la zone de pliage (5).Les deux branches (4) peuvent être maintenues accolées, à l'aide d'un manchon (6) d'un diamètre sensiblement égal au double du diamètre extérieur du tube capillaire. Il est bien sur possible de plier le tube capillaire (1) en plus d'un point de pliage (3) de façon à former plusieurs paires de branches (4). Le tube capillaire plié ainsi obtenu peut être placé dans un tube de centrifugeuse et maintenu par coincement des extrémités libres (7) des branches (4) entre ledit tube et un bouchon. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le tube capillaire plié est introduit dans un adaptateur (8) comportant au moins un alvéole longitudinal (9) représenté sur la figure 2. La profondeur de l'alvéole est supérieure à la longueur de la colonne liquide (2) présente dans les branches (4), et inférieure à la longueur totale des branches (4), de façon à laisser dépasser deux extrémités libres (7) qui sont repliées sur la face supérieure (10) de l'adaptateur (8). Des rainures (11) facilitent la mise en place de ces extrémités libres (7) sans qu'elles ne dépassent de la surface supérieure de l'adaptateur . Ces rainures (11) communiquent avec deux gouttières (12) pratiquées sur le côté de l'adaptateur et destinées à recevoir l'extrémité ouverte des branches (4). La mise en place du tube capillaire plié se fait de la façon suivante le tube est introduit par son extrémité pliée dans l'alvéole ; lorsqu'il arrive en contact avec le fond plat de l'alvéole, les tronçons des branches dépassant la surface de l'adaptateur sont repliés et introduits dans la rainure (11), et les extrémités des tronçons dépassant les côtés de l'adaptateur sont insérés dans les gouttières (12). Ces gouttières peuvent être disposées de part et d'autre de l'adaptateur, symétriquement par rapport à l'axe, ou encore disposées côte à cote de façon à permettre une insertion des extrémités libres (7) en position accolée. Selon un exemple de réalisation, le segment de tube capillaire (1) présente une longueur de 90 mm, et un diamètre interne de 0,38 mm, et un diamètre externe de 1,09 mm. On introduit le liquide à centrifuger de façon à former une colonne d'une longueur de 50 mm. Après pliage au centre du segment, on obtient deux branches contenant chacune environ 11lu1 de liquide. Le tube plié est introduit dans un adaptateur cylindrique d'un diamètre externe de 10 mm et d'une longueur de 34 mm. L'alvéole (9) dont le grand axe a une dimension de 2,2 mm et une profondeur de 30 mm et un petit axe de 1,2 mm est de forme oblongue. Le méplat (11) a une profondeur de 1 mm. Les gouttières (12 ont une profondeur de 1 mm et une longueur de 16 mm. L'adaptateur est introduit dans un tube d'un diamètre intérieur de 11 mm et une profondeur de 35 mm. Selon un autre mode de réalisation représenté sur la figure 3, l'adaptateur (8) comporte deux règlettes (13) susceptibles de glisser dans la gorge verticale d'un rotor de centrifugeuse. La face supérieure comporte au moins un alvéole et une ou plusieurs rainures communiquant avec un alvéole (15) d'insertion cylindrique, de diamètre sensiblement égal au diamètre extérieur du tube capillaire et de profondeur équivalente à la profondeur de l'alvéole (9). Le ou les tubes pliés sont introduits dans les alvéoles (9) et les extrémités libres (7) des branches sont insérées dans les alvéoles d'insertion (15). La force centrifuge qui s'exerce sur les deux extrémités libres (7) est sensiblement égale à celle s'exerçant sur les branches (4) dans l'alvéole (9). On crée ainsi une tension évitant les déformations axiales des branches lors de l'ultracentrifugation. Dans tous ces exemples de mode de réalisation, les angles vifs pouvant exister au sortir de l'alvéole (9) sont éliminés pour éviter de sectionner le tube capillaire (1) lorsque les forces centrifuges s'exercent sur les branches (4) et sur leurs extrémités libres (7). Lorque l'adaptateur (8) est mis en place dans le rotor, la face supérieure est en position verticale et fait face à l'axe de rotation du rotor. La face supérieure comporte plusieurs alvéoles (9) permettant ainsi la centrifugation simultanée de plusieurs échantillons. Les rotors à gorges peuvent recevoir plusieurs adaptateurs à règlettes. La figure 4 représente un portoir (14) destiné à être inséré dans une cavité formée dans un rotor zonal. Le portoir (14) est constitué d'un secteur de couronne rigide comportant des alvéoles (9). Ces alvéoles peuvent être soit horizontaux, soit inclinés. L'ouverture (15) des alvéoles (9) est toujours orientée vers l'axe de rotation du rotor. Le portoir comporte sur sa face interne une gouttière (12) verticale faisant communiquer les ouvertures (15) avec la face supérieure. Cette gouttière permet la mise en place des extrémités libres du tube (1) qui sont maintenues par le fait que la face verticale intérieure (16) du portoir s'applique exactement contre la surface extérieure du noyau du rotor. Les extrémités libres dépassant la face interne du portoir sont, lors de la centrifugation, plaquées sur la face supérieure sous l'effet de la force centrifuge. Ces extrémités libres exercent ainsi une tension évitant la déformation longitudinale du segment de tube contenant la colonne liquide. Ces différents types d'adaptateurs sont réalisés en polyéthylène ou en polypropylène ou en matière plastique plus dense du type polycarbonate ou polyamide pour les adaptateurs à alvéoles horizontaux. Dans la description qui va suivre, on présentera un exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention dans le domaine de la biochimie, et notamment de l'isolement de lipoprotéines dans un sérum humain. On prépare une solution contenant 4L1 1 de sérum et 41 de bromure de sodium de densité 1,4 molaire. On introduit par aspiration cette solution dans un cathéter de diamètre intérieur de 0,58 mm et d'une longueur de 60 mm, que l'on plie en son milieu pour former deux branches contenant chacune une colonne de liquide d'une longueur de 15 mm environ. Le cathéter plié est mis en place dans un adaptateur, d'une longueur de 85 mm et comportant un alvéole d'une profondeur de 20 mm. L'adaptateur est mis en place dans l'alvéole d'un rotor de dimension approprié, ledit rotor étant équilibré de façon connu par d'autres adaptateurs identiques. La centrifugation est réalisée à 240 000 g pendant une durée de 4 à 6 heures. On recueille les lipoprotéines dans la couche supérieure des colonnes d? liquide, en sectionnant le cathéter à l'aide d'un outil tranchant du type lame de rasoir ou ciseaux, à 1,5 mm de l'extrémité supérieure de la colonne de liquide. Les fractions de lipoprotéines recueillies sont pratiquement exemptes de protéines telles que l'albumine, lesdites protéines étant sédimentées au fond du cathéter. Pour obtenir le même degré de pureté avec des procédés classiques, le temps de centrifugation devrait être de 24 à 48 heures. De nombreuses variantes du procédé et des modes de réalisation peuvent être envisagés sans pour autant sortir de la portée de la présente demande. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'échantillons pour la centrifugation ou l'ultracentrifugation de liquides à l'aide d'une centrifugeuse ou ultracentrifugeuse à rotor, caractérisé en ce que - le liquide à centrifuger est introduit dans un segment de tube non rigide (1), ouvert aux deux extrémités (7), - ledit segment de tube est plié en au moins un point de pliage (3) pour former au moins une paire de branches (4), - les branches (4) de tube (1) ainsi formées sont maintenues accolées, - le tube plié est placé dans le rotor d'une centrifugeuse. 2) Procédé de préparation d'échantillons pour la centrifugation ou l'ul- tracentrifugation de liquides à l'aide d'uns centrifugeuse à rotor selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide à centrifuger est introduit dans un segment de tube capillaire non rigide (1). 3) Procédé de préparation d'échantillons pour la centrifugation ou l'ul- tracentrifugation de liquides selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le segment de tube partiellement rempli est plié en deux sensiblement au milieu de la colonne de liquide (2). 4) Procédé de préparation d'échantillons pour la contrifugation ou l'ul tracentrifugation de liquides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les branches (4) du tube (1) sont maintenues accolées à l'aide d'un adaptateur (8) comportant au moins un alvéole d'introduction (9), dont la section correspond à la section extérieure des branches (4) du tube plié, et dont la profondeur est inférieure à la longueur des branches (4), et supérieure à la longueur de la plus grande colonne liquide (9) contenue dans lesdites branches (4). 5) Procédé de préparation d'échantillons pour la centrifugation ou l'ultracentrifugation de liquides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tube (1) est maintenu plié par un alvéole (9) d'un rotor, le profil dudit alvéole correspondant aux dimensions du tube plié. 6) Segment de tube pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit segment de tube est pré-plié. 7) Adaptateur pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est réalisé en matière plastique. 8) Adaptateur (8) selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un alvéole de maintien des extrémités libres (7) des branches (4). 9) Adaptateur (8) selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une gouttière latérale (12) pour l'insertion des extrémités libres (7) des branches (4). 10) Adaptateur (8) selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, carac- térisé en ce qu'il comporte au moins une rainure (11) reliant l'alvéole d'introduction du tube plié et les moyens d'insertion des branches libres du tube plié, la profondeur de ladite rainure étant sensiblement égale au diamètre extérieur du tube (1). 11) Adaptateur (8) selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que les dimensions extérieures dudit adaptateur correspondent aux dimensions extérieures d'un tube pour microcentrifugeuse. 12) Adaptateur (8) selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que les dimensions extérieures dudit adaptateur correspondent aux dimensions extérieures d'un alvéole de rotor. 13) Adaptateur (8) selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il est solidarisé avec le rotor d'une centrifugeuse à l'aide d'une règlette (13) 14) Rotor pour centrifugeuse ou ultracentrifugeuse pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte un alvéole (9) destiné à recevoir un tube (1) plié. 15) Adaptateur (8) pour la mise en oeuvre de la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est réalisé en matière plastique formant un portoir s'adaptant dans une cavité d'un rotor de type zonal, ledit portoir comportant au moins un alvéole d'introduction de tube plié. 16) Portoir selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un alvéole horizontal, une rainure verticale reliant l'orifice de l'alvéole et la partie supérieure du portoir, ladite rainure (12) ayant une profondeur sensiblement égale au diamètre extérieur du tube (1).