Brevet FR2601033A1 — publié le 19880108

L'alpha1 -antitrypsine (alpha1-AT) est l'inhibiteur de protéase le plus abondant dans le plasma. L'inhibition de cette protéasesérine joue un rôle important dans le contrôle-de l'élastase neutrophile humaine et du facteur XIa. Le centre réactif de l'alpha1-AT est formé par les deux résidus amino-acides appelés P1 et P'1. La nature du résidu P1 détermine la spécificité de l'inhibition par l'alphal-AT et le remplacement de la méthionine P1 naturelle par l'arginine (alpha1-AT Met358 --> Arg358) produit un IO inhibiteur qui présente une affinité largement augmentée pour la thrombine avec une réduction concomitante dans l'affinité pour l'élastase neutrophile humaine. Le variant alpha1-AT(Met358 --w Arg358) est également capable d'inhiber efficacement des enzymes de 15 phase ae contact de la protéolyse du plasma, ceci en contraste avec la protéine native. L'inhibition de la kallikréine et du facteur XIa est augmentée entre 20 000 et 000 fois respectivement par la présence de l'arginine en position 358. Le facteur XII activité (XIIf) est également inhibé efficacement, l'alphal-AT native ne présente aucune activité à l'égard de cette protéase. Comme les protéases du système de phase de contact sont activées dans les maladies telles que les chocs septiques, les attaques 5 d'angio-eodème héréditaire et les syndromes de détresse respiratoire des adultes, l'administration de l'alphal-AT (Met 58 - Arg358) peut être très efficace dans le contrôle de ces maladies. L'alpha1-AT qui Be trouve dans le plasma est 10 glycosylée. Il est donc souhaitable que l'alpha1-AT (Met358 -Arg) produite pour utilisation in vivo soit également modifiée de cette façon. De même, la Demanderesse ayant démontré l'intérêt d'utiliser d'autres variants de l'alpha1 -AT, il est également intéressant de pouvoir préparer ces variantes sous forme 15 glycosvlée. Il s'agit notamment des variants tronqués: (delta Glu1 I Gly5) alphajAT qui seront notés delta 1 -5_ alphaTAT ainsi que des variants de alphaTAT ou de alpha-AT mutés en position 357 et/ou 357 1 38357 35 358 notés LAA352 alpha-AT AA358 J alphal-AT ou (AA357 AA35 alpha1AT. En particulier, outre les variants Arg358, les variants suivants sont intéressants comme cela est démontré dans le brevet WO 86 00337: (Gly358), (Ala 358) (Ile358) (Val 358), (Leu 358) et (Phe358 qui peuvent également être tronqués. En plus le variant (Lys 358 alpha1-AT présente un intérêt comme inhibiteur spécifique de la plasmine. Enfin, les variants en position 357 tels que Ala357 30 sont également intéressants en particulier le variant 357 358 Ala357, Arg35 qui présentent des propriétés améliorées par rapport au variant Arg358 décrit précédemment. Ces variants sont préparés selon l'invention par culture de cellules eucaryotes en particulier des cellules 35 de mammifères incorporant un bloc d'expression du gêne correspondant au variant désiré. En particulier, ce bloc d'expression est situé sur vecteur viral, particulièrement un poxvirus tel que la vaccine. Il s'agit d'un vecteur viral d'expression de l'a!Pha1-AT ou 5 d'un variant de l'alpha-AT choisi parmi: CAA3572alpha^T, 3A 2alp358 ATappaa.AT AA358alphaAT 5A 57 AA358 alphalAT et les variants correspondantOde la forme tronquée Edelta 1-457alpha1AT ainsi que Ldelta 1 _53alpha^T caractérisé en ce qu'il est constitué d'un virus hybride de la vaccine qui compor10 te une séquence d'ADN codant pour l'alpha1-AT ou ledit variant de l'alpha-AT inséré dans une partie -non essentielle du géno.,e du virus et sous le contrôle d'une séquence d'expression efficace dans la vaccine. Ce type de construction a déjà été décrit par la Demanderesse notamment dans les brevets WO 85/04810 et WO 85/05376. L'expression et la modification post -traductionnelle correcte de différentes protéines étrangères dans les cellules de mammifères, en utilisant le Virus de la vaccineont été décrites à plusieurs reprises. Pour ce faire, le gêne correspondant au variant dérivé de l'alpha1-AT est inséré de préférence dans une partie du génome non essentielle du virus de la vaccine et de façon encore préférable dans un gêne marqueur tel que le gêne TK. L'insertion dans ce gêne supprime son expression et les cellules transfectés par le virus correspondant, peuvent être sélectionnées comme cela sera décrit ci-après. Le bloc d'expression comprendra de préférence une séquence assurant l'expression du gêne en cause dans les 30 cellules après transfection, en particulier le gêne codant pour le variant de l'alpha1-AT sera sous la dépendance d'un promoteur de la vaccine tel que le pro.cteur du gêne 7,5 K qui sera noté P 7,5 K. Des cellules de mammifères, notamment des cellules BHK infectées par le vecteur virus hybride décrit précédemment produisent des variants de l'alphal-AT si elles sont cultivées sur des milieux de culture appro5 priés. Les vecteurs en cause sont en général obtenus par co-transfectiond'un virus vaccine sauvage et d'un plasmide portant les éléments évoqués précédemment, le virus hybride est constitué in vivo, par recombinaison, cette technologie est décrite dans les brevets cités précédemment. L'invention concerne également l'alpha1-AT et les variants de l'alpha-AT glycosylé ainsi obtenue, ces produits pouvant être séparés du milieu de culture par des procédés connus dans la technologie des protéines. Il s'agit en particulier des variants - AA357 _/ alpha -AT L AA358 7 alpha-AT - 357 358 AA357 AA358 alpha.-AT et des variants Édelta 1-+5 Jalpha1-AT correspondant ainsi 20 que des variants Fdelta 1-+5 Yalpha.-AT, ces variants étant glycosylset dépourvus de résidu Met à l'extrémité 3'. Parmi ces variants, il faut citer les variants: E Ala357 Arg 3587alphaTAT glycosylé delta 1 _ 5 7 rg3587alpha1-AT glycosylé [delta 1 _ 517 EAla357Arg358 7 alpha{AT glycosylé, et rArg358 alpha1-AT glycosylé. Ces variants de l'alphaiAT seront utiles comme médicaments en particulier pour le remplacement de l'alpha1 AT obtenue par extraction à partir du plasma,et certains 30 d'entre eux comme inhibiteurs de la kallikreine. Les exemples suivants sont destinés plus particulièrement à mettre en évidence les constructions utilisables dans le cadre de la présente invention. EXEMPLE 1: CONSTRUCTION DE l'ADN DE pTG1952 Le plasmide pTG1952 a la structure suivante: à l'extrémité 5' du cADN de 1'alpha1-AT se trouve la séquence signal (se), une séquence qui est responsable de l'exportation de la. protéine vers l'extérieur de la cellule. Pendant la maturation de la protéine, cette séquence est clivée pour produire la protéine native. Cette construction contient également le codon arginine à l'aminoacide 358. Le clivage de ce plasmide par BglII produit un fragment de 1,3 kb contenant l'ensemble du cADN de l'alpha1AT et la séquence signal. EXEMPLE 2 PREPARATION DE pTG1954 (figure 1) Le plasmide pTG186 contient le gène codant pour la protéine de la thymidine kinase du virus de la vaccine. Un fragment d'ADN de petite taille contenant le promoteur 7,5 K du virus de la vaccine (VP) et un "polylinker" possédant différents sites de restriction dont BamHI ont été placés dans le gène de la thymidine kinase comme cela est indiqué ci-après. Le fragment 1,3 kb BglII de pTG1952 est inséré dans le site BamHI de pTG186 pour produire le plasmide pTG1954. 20 L'orientation du fragment BglII inséré est étudié en utilisant le site BamHI dans le cADN de alpha1AT et est telle que l'amino-acide terminal de cette séquence de cADN est proximale au promoteur viral VP. EXEMPLE 3 TRANSFECTION DE pTG1954 DANS LE VIRUS DE LA VACCINE La production et la sélection des virus de vaccine recoebinants K- en utilisant pTG1954 ont été effectuées en utilisant des tecliiques comues qui sont dmcrites notamment dans les brevets PCTr FR 85/00096 et WD 85/05376. 8 plaques sont choisies et utilisées pour infecter des mono-couches de cellules BHK en culture tissulaire. L'ADN est préparé à partir des cellules infectées avec des recombinants du virus de la vaccine Té par des techniques connues. Apres restriction avec HindiI, l'ADN est soumis à l'électrophorèse sur un gel d'agarose à 0, 8 %.L'ADNq 35 est transféré sur nitrocellulose et le gène de l'alpha-;i détecté avec avec des olignucléotides spécifiques phosphorylúS a_.?P Les 8 virus recombinants TK sont trouvés avoir intégré le cADN de l'alphal-AT dans le gene TK. L'un de ceux-ci est choisi pour plus ample étude. EXEMPLE 4 ESSAI D'UN MILIEU APRES INFECTION DES CELLULES BHK AVEC UN RECOMBINANT VACCINE CONTENANT pTG1954 Inhibition de la thrombine Après incubation à 37 C pendant 24 heures, le milieu est centrifugé pour éliminer les cellules et les débris cellulaires et des aliquotes sont testées pour leur capacité à inhiber la throrbine. L'essai est effectué dans des cuvettes de 1 ml 15 dans une solution contenant 150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,0 et 0,1 % de PEG (tampon TB). La thrombine (240 mU) est incubée dans le tampon TB avec différentes quantités de milieu pendant 20 minutes à température ambiante. La quantité d'activité thrombinique demeurant est mesurée en utilisant du substrat (Chromozyme TH Boehrimser mannheim; 100nananmDles) eten mesurant le changement dans la densité optique à 410 nanomètres après 4 minutes. La courbe obtenue à partir d'une expérience typique est indiquée à la figure 2A. 50 % d'inhibition avec cette quantité de thrombine (240 mU) est obtenue avec 150 gl de rdiieu. La couar G--O représente le virus recoebinant et x-x le virus sauvage. Inhibition de la kallikréine L'inhibition de la kallikréine est effectuée de manière similaire. la Kallikréine (4 mU) est incubée avec différentes quantités de milieu pendant 30 minutes à température ambiante dans des cuvettes contenant du tampon kallikréine (0,1 M phosphate de sodium (pH 6,5); 0,15 M NaCl). Les essais de l'activité résiduelle de kallikréine sont effectués par addition de substrat (225 nanomoles) et les changements dans la densité optique à 410 nanomètres sont mesurés après 4 minutes. La courbe obtenue à partir d'une expérience typique est représentée à la figure 2B. 50 % d'inhibition avec cette quantité de kallikréine (4 mU) est obtenue avec 120 il de milieu dans ce cas. EXEMPLE 5 IMMUNOPRECIPITATION D'ALPHA1-AT (ARGININE VARIANT) MARQUE AU S PRODUIT PAR DES CELLULES DE MAMMIFERES Des mono-couches de cellules BHK sont infectées avec 0,2 pfu de virus vaccine recombinant puis incubées pendant 6 heures à 37 C dans 1 ml de milieu contenant 100 gCi 35 de méthionine S. Un contrôle est effectué avec un virus vaccine sauvage. Le milieu collecté comme précédemment et soumis à un challenge avec anticorps anti-alpha1 antitrypsine comme suit. A 1 ml de milieu on ajoute du tampon RIPA (1MKCl, 2 % Triton X-100, 100 mM Tris pH 8,0) et 5 gl d'anticorps alpha-antitrypsine (Dako Immunoglobulins, Danemark) et le mélange est incubé pendant 2 heures à 25 C.' 50 Al de tampon RIPA contenant de 8 mg de protéine A sepharose pré- équilibré sont alors ajoutés et le mélange est incubé avec une agitation éventuelle pendant 1 heure à 25 C. La sépharose protéine A est alors collectée par centrifugation et le culot est lavé 5 fois avec 0,5 M KCl, 25 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,5 % Triton X-100 et 2 fois avec 2 x 10 mM Tris KCl pH 8,8. Les culots sont dissous dans 100 il de tampon Laemmli et 20 il sont chargés sur un gel de polyacrylamide à 10 % qui est ensuite autoradiographié après fluorographie. D'après un profil de gel typique {Figure 3) et en comparaison avec une immunoprécipitation utilisant l'antitrypsine-alpha1 marquée méthionine obtenue à partir d'un extrait bactérien, on peut voir qu'une protéine est 5 spécifiquement précipitée à partir du milieu de cellules infectées avec les virus vaccine recombinants. Cette protéine n'est pas présente dans les extraits cellulaires à partir de virus de la vaccine sauvage. Toutefois, cette protéine reconnue par les anticorps anti-alphal-AT est plus 10 brande que celle qui est trouvée dans les extraits cellulaires bactériens, ceci constitue une indication que l'alphal-AT variant arginine produite dans les cellules de mammifères a été glycosylée. EXEPLE6: En utilisant à la place du plasmide pTG1952, les plasmides décrits au brevet WO 86 00337, on obtient les variants correspondants glycosylés. Par exemple pTG1981 qui est identique à pTG 1954, sauf que le gène introduit à tAla357- Arg358 7 alphal-AT 20 a été construit de la même façon. Les résultats des essais d'inhibition de la thrombine et de la Kallikréine pour le surnageant ont été représentés à la figure 4. Comme cela a été observé avec /Ala357 - Arg358 alpha1-AT produit par E. Coli, le produit 25 secrété à partir de cellules BHK est activé sur la Kallikréine mais a peu ou pas d'activité inhibitrice à l'égard de la thrombine. REVENDICATIONS 1. Vecteur viral d'expression de 1'alpha -AT ou d'un variant de l'alphalAT choisi parmi: IjA 5 alphal-AT, AA358 357a358..7357hAA-3T8 AA3587alpha1AT AA35 7 AA358_7alpha1-AT et les variants correspondantsde la forme tronquée Ladelta 1-+ 5 5 alpha1-AT ainsi que ( delta 1 *5 7alpha1-AT, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un virus hybride de la vaccine qui comporte une séquence d'ADN codant pour ledit variant de l'alphal-AT inséré dans une partie non essentielle du génome du virus et sous le contrôle d'une séquence d'ex10 pression efficace dans la vaccine. 2. Vecteur viral d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'alphal-AT ou pour ledit variant est précédé d'au moins une partie de la séquence signal. 3. Vecteur viral d'expression selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est insérée dans le qène TK. 4. Vecteur viral d'expression selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'et:20 pression comporte au moins un promoteur de la vaccine. 5. Vecteur viral d'expression selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur est le promoteur du gêne 7,5 K. 6. Cellules de mammifères transfectées par un 25 vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Cellules selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit de cellules BHK. 8. Procédé de préparation de variants de l'alpha 1-AT, caractérisé en ce qu'on cultive des ce!ll''_sE 30 transfectées selon l'une des revendications 6 et 7 sur un milieu approprié et l'on récupère le variant de 1 'alpha1AT obtenu. 9. Variants de l'alphal-AT 357 AA57 _ alpha1-AT 5 ú AA358 7 alphal-AT 357 358 CAA AA357 AA358_7 alpha -AT et les variants de [delta 1 - 5] alpha1-AT correspondant ainsi que le variant [ delta 1-- 53jalpha1-AT, ces variants étant sous forme glycosylée. 10. Variants selon la revendication 9 357 358 E Ala357 Arg 87alpha1-AT glycosylé ú-delta 1-- 5_7 -Arg358 alpha1-AT glycosylé L'delta 1- -5 J CAla357Arg358 alpha1AT glycosylé. + jArg 358 7-alpha1-AT glycosylé. 11. A titre d'inhibiteur de la kallikreine un variant selon la revendication 10. 12. A titre de médicament un variant selon l'une des revendications 9 à 11.