Brevet FR2607148A1 — publié le 19880527

La présente invention concerne un procédé biotechnique de préparation de l'enzyme invertase à partir de levure de boulanger, que l'on utilise de préférence dans l'industrie alimentaire. On connaît un grand nombre de procédés de préparation de l'invertase à partir de levures. Pour l'essentiel ces procédés se caracté- risent par les étapes opératoires suivantes: - Désagrégation des cellules de levure pour libérer l'invertase - Séparation de l'invertase d'avec les composants de la cellule - Concentration et purification de la solution con- tenant l'invertase - Stabilisation de l'invertase. On sait ainsi p. ex. effectuer une destruction de cellules au moyen de solvants organiques, p. ex. avec du toluène. Après la fin de la plasmolyse/au- tolyse on procède à une séparation des cellules de levure non dissoutes, p. ex. par filtration sous pression. Après un réglage correspondant de la valeur du pH de l'autolysat s'effectue l'obtention de l'inver- tase par l'intermédiaire d'une précipitation d'acétone à effectuer plusieurs fois. Après une étape supplé- mentaire de séparation et de dissolution, on débar- rasse des restes de solvant la solution d'invertase obtenue p. ex. au moyen d'un évaporateur sous vide et on concentre. Ensuite on stabilise avec du glycérol. (Waldschmidt - Leitz, E. et Balls, A.K. in Handbuch der Lebensmittelchemie Vol. II/2ème partie, Editions Spriniger, Berlin 1935, pp 734-738). Les inconvénients de ce procédé tiennent surtout à ce que de temps à autre des résidus de toluène toxique subsistent dans la solution d'inver- tase, en ce que la désagrégation des cellules est longue, ce qui accroît le danger de contamination, et en ce que les rendements et activités obtenus sont faibles, la dépense d'énergie étant relati- vement élevée. Le traitement additionnel de l'autolysat obtenu par l'addition de toluène au moyen de papaYne ainsi que par des mesures ultérieures comme l'ad- sorption sur alumine hydratée ou phosphate de calcium, l'élution avec une solution de lactate, de l'eau ou une solution de saccharose, la précipitation avec de l'alcool ou une solution de picrate, la dialyse et d'autres opérations de purification ne conduisent pas à un renforcement notable de l'effica- cité du procédé (Hartmeier, W. GORDIAN, 78, 320- 324 (1978)). Un autre procédé connu a été décrit dans le brevet de RDA N 1401. Après la culture de levure habituelle on procède à un enrichissement en substances actives (hexosidases) dans la masse de levure. Suit alors une concentration par séparation avec ensuite addition de corps à action libératrice comme le malt vert ou ses matières actives diastatiques y compris la cytase. La destruction cellulaire s'effectue par action d'ultrasons sur la masse de levure en rotation. Après la libération des corps contenus dans la levure s'effectue la séparation de la solution d'invertase des débris cellulaires et autres composants solides par une technique de séparation. La purification du suc celllulaire s'effectue à l'aide d'une résine échangeuse faiblement acide. L'inconvénient de ce procédé tient surtout au fait que l'importance de la dépense de technique indus- trielle et le mode de réalisation compliqué qui y est lié ainsi que la grande dépense d'énergie et le temps relativement long passé à la libération des corps contenus dans la levure avec le trop faible rendement ou activité que l'on peut atteindre pour l'invertase obtenue le rendent non rentable. On connaît en outre un procédé d'obtention d'invertase soluble à partir de levure tel que décrit dans le brevet allemand N0 26 626. Ce procédé se caractérise pour l'essentiel en ce que la plasmolyse et l'autolyse s'effectuent par l'action de cellulases, protéases et lipases sur les cellules de levure. Comme levure de départ on utilise la levure lyophilisée, qui est ensuite remise en suspension. Une fois réalisée la plasmolyse/au- tolyse s'effectue la séparation des fragments cellu- laires insolubles puis on sépare le filtrat dans l'extrait de levure et l'invertase au moyen d'une ultrafiltration. On procède ensuite à une stabilisa- tion ou standardisation de l'invertase au moyen d'une solution de glycérol ou de sorbitol. Il se révèle également dans ce procédé que la dépense d'énergie est relativement importante. Les temps de désagrégation sont comme auparavant élevés (8-20 h), ce qui peut conduire à une contamination et ainsi à des pertes d'activité. En outre il y a dans l'utilisation de la lyophilisation de la levure et l'emploi d'une température élevée qui y est lié (jusqu'à 240 C) un danger d'inactivation partielle de l'enzyme. Dans les brevets d'Allemagne de l'Est N 110 425 et 116 135 sont décrits des procédés d'obten- tion d'extraits de levure, de glycane de levure, d'isolats de protéine de levure à teneur abaissée en acides nucléiques. Les cellules de levure (levure de bière ou de boulanger) sont alors désagrégées de façon connue p. ex. par homogénéisation sous pression, trituration dans un moulin à sable ou à colloïdes, pulvérisation au moyen d'ondes sonores, cycles répétés de congélation-rosée, enzymes lytiques, etc. On procède ensuite à un traitement thermique pour séparer l'acide nucléique de la protéine. On effectue alors une séparation, non décrite plus en détail, de la fraction de produit protéique insoluble d'avec la fraction soluble. L'obtention de l'extrait de levure, du glycane de levure et de l'isolat de protéine de levure avec teneur abaissée en acide nucléique s'effectue par centrifugation, concentration sous vide et dessication. Ces procédés servent en premier lieu à l'obtention d'isolats de protéine de levure à teneur abaissée en acide nucléique, en glycanes de levure et en extraits de levure. Les étapes du procédé se rapprochent certes pour l'essentiel de celles que l'on applique dans l'obtention d'invertase, mais on ne trouve dans les inventions aucune indication quant à une possi- bilité de transposition de l'enseignement recom-. mandé à l'obtention d'invertase. En particulier le procédé d'homogénéisation à haute pression recommandé de préférence pour la destruction cellulaire et le procédé de traitement thermique recommandé laissent apparaître des doutes quant à une préparation efficace de l'invertase. Le brevet allemand N 26 39 129 décrit des procédés de séparation d'enzymes dans lequel les enzymes sont solubilisées par désagrégation p. ex. de cellules de levure de bière et/ou traitement avec des détergents et dispersées avec les débris de cellules ou cellules entre différentes phases d'un système aqueux à plusieurs phases contenant au moins un corps à haut poids moléculaire parmi les groupes formés par des polyalcools, polyéthers, polyesters, polyvinylpyrrolidones et polysaccharides éventuellement substitués et au moins un sel inorga- nique, ou contenant au moins deux corps à haut poids moléculaire, puis les phases sont séparées entre elles p. ex. par précipitation, ultrafiltration, dialyse, perméation sur gel, adsorption, échange d'ions ou électrophorèse. Dans l'enseignement recommandé, il est certes dit que l'on peut obtenir n'importe quelles enzymes, mais concrètement on ne se réfère qu'aux pullulanases ou maltases. Les résultats atteints avec le procédé recommandé quant aux activités et aux rendements par rapport aux dépenses en moyens nécessaires ne peuvent cependant satisfaire. L'objet de l'invention consiste à mettre au point un procédé biotechnique économe en énergie pour la préparation d'invertase d'activité et de pureté élevées à partir de levure de boulanger, dans lequel on n'utilise pas de solvants organiques ou autres produits chimiques et/ou enzymes et l'on atteint des durées de préparation courtes. En outre le procédé, de par l'utilisation de dispositifs correspondants, doit être facile à maîtriser et peu compliqué, et doit pouvoir être mis en oeuvre de façon continue, et l'on doit simultanément obtenir un rendement élevé en invertase concentrée et pouvoir traiter plus avant les produits résiduaires ou sous- produits qui apparaissent. On rompt de façon continue les cellules de levure d'une suspension active de levure de bou- langer avec une substance de levure sèche (HTS) d'environ 10% et une température de 8-15 C dans un moulin à arbre, et les microbilles de verre présen- tent un diamètre de 0,5-1,2 mm et la vitesse de l'arbre d'agitation s'élève à 2500-400 tours/min. Dans un séparateur subséquent s'effectue de façon continue la séparation macroscopique entre débris cellulaires et solution contenant de l'invertase. Pour éviter les pertes de rendement en enzyme, on arrête l'introduction de la suspension avant le déschlammage (Entschlammung) et on lave le rotor pendant environ 5 minutes avec de l'eau, l'espace de décantation n'étant vidé que lorsque de l'eau claire sort lors de l'écoulement du séparateur. La filtration par clarification continue, qui vient ensuite, de la solution contenant de l'in- vertase, s'effectue sur un filtre stratifié, les couches de filtre présentant une perméabilité de 425-475 l/h.m2. On dispose alors endessous du côté clair des couches de filtre du papier-filtre, les couches de filtre étant humidifiées avant le début de la filtration pendant environ 20 minutes. La différence de pression entre l'entrée et la sortie du filtre ne doit pas être supérieure à 200-250 kPa pendant la filtration. Le filtre stratifié est monté de manière qu'outre le processus de filtration un circuit fermé soit possible, si bien qu'on évite l'apparition d'une surpression pouvant aboutir à endommager les plaques de filtration. Le reste de la solution d'in- vertase à clarifier subsistant de par le mode de conduite du cycle est de nouveau soumis à une sépa- ration. La purification, la concentration et la stérilisation de la solution d'invertase s'effectuent sur une installation combinée d'ultra- et de micro- filtration. L'unité de séparation d'ultrafiltration est disposée par rapport à l'unité de séparation de microfiltration de manière que la solution soit d'abord purifiée et concentrée sur l'unité de sépara- tion d'ultrafiltration puis conduite à la stérili- sation en passant par l'unité de séparation de la microfiltration. La perméabilité des membranes d'UF utilisées dans l'unité de séparation de l'ultrafiltration s'élève à 80-140 l/h.m2, la pression d'entrée s'élevant à environ 0,15-0,4 et la pression de sortie à environ 0,1-0,3 MPa. Pour accroître la stabilité mécanique des membranes planes on introduit entre les membranes et les plaques de dérivation de la filtration un tissu de soutien, par exemple un textile non tissé. La solution d'invertase est concentrée à environ 1/10 par l'unité de séparation de l'ultra- filtration. Pour poursuivre la purification du concentré de solution d'invertase, on procède à une diafiltration additionnelle sur l'unité de séparation de l'ultra- filtration. On dilue alors le concentré avec de l'eau dans un rapport 1:1 et on diafiltre dans le cycle jusqu'à ce qu'on atteigne à nouveau le volume de départ de concentré. Après cette ultra- et diafiltration on introduit la solution purifiée de concentré d'invertase dans l'unité de séparation de la microfiltration aux fins de séparation des protéines dénaturées contenues dans la solution ainsi que des microorga- nismes. Le diamètre des pores de la matière de micro- filtration utilisée s'élève à 0,2 um, et l'on ne doit pas dépasser une pression d'entrée de 0,3 MPa. Pour accroître la stabilité mécanique de la matière filtrante utilisée, on utilise un tissu de soutien, comme il est dit dans l'unité de séparation de l'ultra- filtration. Avec la stabilisation subséquente, en soi connue, on règle la solution à une activité d'environ 1500 U.ml-1 et on la rend apte à la conservation. Le procédé selon l'invention convient parti- culièrement pour préparer des préparations d'invertase d'activité spécifique élevée (400-800 U/mg) pour lesquelles, dans des buts analytiques, existe un intérêt particulier, en ce que la diafiltration est répétée 3 à 8 fois de la manière décrite ci- dessus. Le rendement en solution d'invertase stabi- lisée au glycérol obtenu selon le mode opératoire mentionné ci-dessus s'élève à 75% par rapport à la levure de boulanger active employée. EXEMPLE DE REALISATION L'exemple de réalisation est explicité à l'aide d'une figure dans laquelle les signes de référence repré- sente les éléments suivants. On met 120 kg de levure de boulanger active (HTS 30-33%) conservée à 24 C avec 240 1 d'eau dans un récipient de mélange et de mise en équilibre de température 1. Au bout d'environ 30 minutes apparaît une suspension de levure homogène de HTS 10-15%, que l'on conserve à une température située entre et 12 C. La suspension refroidie est alors ajoutée par l'intermédiaire d'une pompe de dosage 2 d'un moulin à arbre fonctionnant de façon continue 3. La désagrégation des cellules de levure s'effectue alors dans un récipient de broyage d'environ 3 litres refroidi avec de l'eau, qui est rempli avec environ 2400 g de microbilles de verre de 0,8 à 1 mm. La vitesse de l'arbre d'agitation s'élève à environ 3000 tours/rainet le débit de la suspension à 16 1/h. La suspension de levure désagrégée s'écoule par l'intermédiaire du dispositif d'écoulement supérieur du récipient de broyage dans un récipient de mélange et de mise en équilibre de la température 4. Par l'intermédiaire d'une pompe de dosage 5 on introduit la suspension dans un séparateur 6. On sépare ici la plus grande partie des débris cellu- laires d'avec la solution contenant l'invertase. De l'écoulement du produit du séparateur 6 s'écoule la phase largement débarrassée des débris cellu- laires dans un récipient intermédiaire 7. La vitesse d'introduction de la suspension à séparer s'élève i1 à environ 50 1/h. Le séparateur 6 est ici à déschlam- mer à chaque fois au bout d'environ 3/4 d'h. Pour éviter de plus grandes pertes de rendement en enzyme, on arrête avant le déschlammage l'introduction de la suspension de levure et on lave le rotor avec de l'eau jusqu'à ce que de l'eau claire sorte à l'écoulement du produit. On introduit alors l'eau de réglage et on vide la boue. A partir du récipient intermédiaire 7 on cunduit la solution contenant l'invertase à l'aide d'une pompe de dosage 8 à un filtre stratifié 9 pour procéder à une clarification par filtration. La clarification s'effectue par l'utilisation de couches de filtre de type KP-10 A (40 x 40 cm) ayant une perméabilité d'environ 450 l/h.m Pour accroître la qualité de la filtration, on dispose sous le côté clair des couches de filtre du papier filtre Niederschlag 291 (40 x 40 cm). Avant le début de la filtration on humidifie les couches de filtre introduites pendant environ 20 minutes. On règle la vitesse de filtration à environ -100 1/h. La différence de pression maximale entre l'entrée et la sortie de la filtration ne doit pas ici être supérieure à 200 ou selon les cas 250 kPa. Le filtre stratifié 9 est ici monté de manière qu'outre le processus de filtration on a une circulation moyenne, si bien qu'on évite l'appa- rition d'une surpression, qui peut conduire à une destruction précoce de la matière filtrante. Le résidu, subsistant de par le mode de circulation, de la solution contenant de l'invertase à clarifier, est de nouveau conduit vers le séparateur 6 après la fin de la clarification par filtration. - On transfère la solution à traiter plus avant dans un récipient intermédiaire 10. Les étapes ultérieure de purification, concentration et stéri- lisation de la solution contenant de l'invertase s'effectuent dans une installation spéciale d'ultra- microfiltration combinée 11. Le paquet de plaques se trouvant sur un support est utilisé avec une surface de filtration de 5 m2 pour l'ultrafiltration et de 4 m2 pour la microfiltration. Pour l'unité de séparation de l'ultrafiltration 12 on utilise des membranes UF d'une perméabilité de 80-140 1/h.m2 de type CAM- UF-120-CP (VEB Zellstoff- und Zellwollewerke Witten- berge). Ce type assure une sélectivité par rapport à l'invertase de plus de 99%. Pour accroître la stabilité mécanique on dispose en outre entre la membrane et la plaque de dérivation de filtration un tissu de soutien de textile non tissé. A travers l'unité de microfiltration 13 est tendu un microfiltre pour traces de noyaux fait de polyester (ZfK AdW Rossendorf) ayant un diamètre de pores de 0,2 um. Pour accroître la sta- bilité cette matière de filtration est renforcée d'un textile non tissé. A partir du récipient intermédiaire 10 on pompe la solution contenant l'invertase à l'aide d'une pompe de dosage 14 à travers un réfrigérant à double tube 15 dans l'unité d'ultrafiltration 12. On conduit la solution selon le principe de répartition sur les plaques de filtre, o les molé- cules ayant un poids moléculaire supérieur à 150 000 sont retenues. La vitesse d'écoulement de perméation se situe ici à environ 80-140 1/h à une pression de départ de 0,1-0,3 MPa. L'activité d'invertase dans le produit de perméation se situe ici en-dessous de 0,5%. La solution obtenue après la clarification par filtration est concentrée par l'ultrafiltration à 1/10e de son volume. On dilue ensuite le concentré obtenu après l'ultrafiltration, avec de l'eau dans un rapport 1:1 et on le diafiltre en vue d'une puri- fication ultérieure dans le cycle, à travers l'unité de séparation de l'ultrafiltration 12, jusqu'à ce que le volume de départ du concentré soit à nouveau atteint. Par le blocage du cycle d'ultrafiltration, le concentré ultra- ou selon les cas diafiltré qui se trouve dans le récipient intermédiaire 10 est transporté par l'intermédiaire d'une pompe de dosage 16 en passant par le réfrigérant 15 vers l'unité de microfiltration 13. Là les protéines dénaturées contenues dans le concentré ainsi que les microorganismes qui affectent la qualité du produit, sont séparés. La surface de filtration active mentionnée ci-dessus est réglée à un débit d'environ 20 1/h, la pression d'entrée ne devant pas être supérieure à 0,3 MPa. On introduit la solution d'invertase puri- fiée, concentrée et stérilisée dans un récipient de mélange et de mise en équilibre de la tempéra- ture 17 et on l'y mélange avec du glycérol dans un rapport 1:1 et on l'y stabilise. Le rendement de la solution d'invertase stabilisée s'élève à kg (75% par rapport à la levure de boulanger active utilisée). REVENDICATION Procédé biotechnique de préparation d'invertase à partir de levure de boulanger active, dans lequel on met en suspension de la levure de boulanger active avec une substance sèche de levure (HTS) de 30- 33% à l'aide d'eau à une HTS d'environ 10% et à une température de 10-12 C, caractérisé en ce qu'on brise les cellules de levure de cette suspension dans un moulin à arbre en soi connu 3 à l'aide de microbilles de verre ayant un diamètre de 0,5 à 1,2 mm et une vitesse de l'arbre d'agitation de 2500-4000 tours/rmin de façon continue, puis en ce qu'on obtient dans un séparateur en soi connu 6 une solution contenant de l'invertase, o avant le déschlammage on arrête l'écoulement de la suspension et on lave le rotor avec de l'eau jusqu'à ce que de l'eau claire apparaisse à l'écoulement du produit, puis en ce qu'on soumet la solution à une clarification par filtration en soi connue à l'aide d'un filtre strati- fié 9, o les couches de filtre présentent une per- méabilité de 425-475 1/h.m2,on soutient les côtés clairs des couches de filtre en outre avec du papier-filtre et avant le début de la clarification par filtration on humidifie ces couches de filtre pendant environ 20 minutes avec de l'eau, la différence de pression entre l'entrée et la sortie du filtre pendant la filtration n'est pas supérieure à 200-250 kPa, le filtre stratifié est monté de manière qu'à côté du processus de filtration un fonctionnement en. cycle soit possible et le résidu de la solution d'invertase à clarifier subsistant est à nouveau soumis à une séparation, puis la solution est conduite à une installation combinée d'ultra- et de micro- filtration 11 de manière que la solution traverse tout d'abord l'unité de séparation de l'ultrafiltra- tion 12, soit soumise dans le cycle à une diafiltration, puis conduite à l'unité de séparation de microfiltra- tion 13, o la perméabilité des membranes UF employées dans l'unité de séparation de l'ultrafiltration s'élève à 80-140 l/h.m2, la pression d'entrée s'élève à 0,15-0,4 et la pression de sortie à 0,1- 0,3 MPa, un tissu de soutien, par exemple de textile non tissé, est disposé entre membranes et plaques de dérivation de filtration, la solution est tout d'abord concentrée par l'unité de séparation de l'ultrafiltration 12 à environ 1/10, puis le concentré est dilué avec de l'eau dans un rapport 1:1 et dia- filtré dans le cycle jusqu'à ce que le volume de départ de concentré soit à nouveau atteint, puis la solution de concentré d'invertase purifiée est conduite à travers l'unité de séparation de la micro- filtration 13, o le diamètre des pores de la matière de microfiltration utilisée s'élève à 0,2 uLm et la pression d'entrée n'est pas supérieure à 0,3 MPa et la matière filtrante est munie dans l'unité de séparation de l'ultrafiltration 12 d'un tissu de renforcement, puis la solution de concentré d'in- vertase est stabilisée, standardisée et confectionnée de façon connue.