Brevet FR2601957A1 — publié le 19880129

La présente invention concerne de nouveaux composés tétrapeptidiques, dérivés de la tuftsine, possédant une activité immunostimulante, leur procédé de préparation et leur application en thérapeutique humaine. La tuftsine, Thr-Lys-Pro-Arg, est un tétrapeptide naturel isolé par NAJJAR et coll. (Nature, (1970), 228,672-673) Ce produit, correspondant au résidu 289-292 de la chaîne lourde de gamma-globuline est libéré de sa chaîne porteuse par deux enzymes spécifiques. C'est un stimulant des fonctions biologiques des macrophages et en particulier de leur pouvoir phagocytaire. La tuftsine possède en outre des activités antibactérienne et antitumorale intéressantes et s'avère être un immunostimmulant très puissant. Toutefois, la tuftsine se trouve rapidement dégradée in vivo par hydrolyse de liaison peptidique, en tripeptide Lys-Pro-Arc inhibiteur des activités de la tuftsine. Compte tenu de cette dégradation, des modulations structurales ont été réalisées en remplaçant notamment la thréonine par différents acides aminés (1. FLORENTIN et coll. Annals of New orr. Academy of Sciences, (1983) vol.441, p.177-191). Dans le cadre de la présente invention, il a eté préparé de nouveaux composés à liaison peptidique modifiée, ces dérive tétrapep- tidiques répondent à la formule générale (I) dans laquelle R représente l'hydrogène, un groupe acyle ou alcoxycarbonyle contenant de I à 6 atomes de carbone. R' représente l'hydrogène ou un radical alcoyle linéaire ou rami fié contenant de 1 à 4 atomes de carbone R" représente la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide naturel ou de la Nor-leucine, ainsi que leurs sels d'addition avec des acides thérapeutiquement acceptables. R'; représente la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide naturel, il peut donc en particulier s'agir d'un atome d'hydrogène dans le cas de la glycine, d'un alcoyl linéaire ou ramifié en C1 à C6 dans le cas de la leucine, I'alanine et la valine, d'un aminoalcoyl en C1 à C4, par exemple dans le cas de la lysine, d'un hydroxyalcoyl en C1 à C4, par exemple dans le cas de I-a thréonine, ou encore d'un thioalcoyl en C1 à C4, par exemple dans le cas de la méthionine et de la cystéine. Tel qu'énoncé précédemment, la présente invention s'étend également aux sels d'addition avec des acides thérapeutiquement acceptables des dérivés tétrapeptidiques de formule I précitée. A titre d'exemples de ces sels on mentionnera en particulier les acétates, trifluoroacétates, sulfates, chlorhydrates, etc. A titre d'exemple particulier des dérivés tétrapeptidiques de formule I précitée, on mentionnera plus particulièrement les dérivés suivants - Thr-t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, trifluoroacétate 1 - Boc-Cly-' (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate 2 - For-NLe-'f > (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate 3 - Gly-t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, trifluoroacétate 4 Dans les dérivés ci-dessus, les acides aminés utilisés appartiennent tous à la série L. La présente invention concerne également un procédé pour la préparation des dérivés de formule générale I précitée. Conformément au procédé de l'invention, un aldéhyde de formule générale Il dans laquelle R' et R" ont les significations données à propos de la formule I et R représente un groupe de blocage en particulier un groupe t-BOC (tertiobutyloxycarbonyl) ou encore un groupe Z (benzyl oxycarbonyl), est condensé avec un tripeptide -Lys-Pro-Arg convenablement bloqué, puis réduit et éventuellement débloqué. La synthèse de l'aldéhyde de formule (11) peut être avantageusement obtenue par réduction de l'hydroxamate de formule générale (111) dans laquelle R' et R" ont les significations données à propos de la formule générale I et R représente un groupe de blocage, par exemple t-BOC ou Z. La synthèse de l'aldéhyde de formule 11, a partir de l'hydroxamate réduit par ALi H4, est décrite par FEHRENTZ, CASTRO, dans Synthesis, (1983), p.676-677. L'aldéhyde ainsi obtenu est ensuite condensé avec un tripeptide convenablement bloqué, et plus particulièrement: Lys(Z) Pro-Arg (NO2)-OBzl trifluoroacétate, obtenu selon BONNAUD et col 1. (Boll. Chim:. Farm.(l982), 121,p.550) qui après réduction par le cyanoborohydrure de sodium conduit aux composés de formule générale (I') dans laquelle :R,R',R" ont les significations données précédemment. La mise en oeuvre du procédé est ensuite éventuellement poursuivie par un déblocage des fonctions au moyen de procédés classiques de synthèse peptidique, par exemple par de l'hydrogène en présence d'un catalyseur. On indiquera ci-après à titre de simple illustration quelques exemples de synthèse du dérivé tétrapeptidique objet de la présente invention. EXEMPLE 1 : Thr-t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate I a) Boc-Thr-OBzl-t 'f' (CH2NH)-Lys(Z)-Pro-Arg-(NO2)-OBzl L'éther benzylique de Boc thréoninal (0,723g, 2,5 mmoles), obtenu par réduction à l'hydrure de lithium aluminium de l'hydroxamate (0,921g) est mis en réaction avec le trifluoro acétate de Lys(Z)-Pro-Arg-(NO2)-Bzl (0,737g, 1 mmole) dans le mélange méthanol-acide acétique 95/5 (40 ml), puis traité par NaBH3CN (0,180 g, 3 mmoles) sous agitation. Après 4 heures, le mélange réactionnel est concentré sous vide (T Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle (200 ml) lavé par une solution saturée de bicarbonate de sodium, à l'eau, à l'acide citrique 0,1 N, à l'eau, puis séché sur Na2SO4. Après concentration, le résidu est purifié par chromatographie sur Florisil(R) (élution AcOEt/MeOH). Après évaporation du solvant, le résidu donne une mousse par trituration. P.F. = 85 C d)D20 = 6 (CHCl3 C=0,5) CCM : CHCl3-MeOH(AcOH 85/10/5 - Rf : 0,40 b) Thr-t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, trif!uoroacétate I Le composé obtenu ci-dessus (0.295g, 0,4 mmole) est dissous dans le mélange butanol-acide acétique-eau 4/1/1 (60 ml) contenant 0,050g de Pd/BaSO4 10%. Ce mélange est hydrogéné sous agitation pendant 48 h. Après filtration du catalyseur e: concentration sous vide, le résidu est trituré à l'éther. La poudrc obtenue est purifiée par chromatographie sur Florisil(R) (éluant : AcOEt-Pyridine-AcOH-H2O 40/20/6/10), puis traitée pendant 30 minutes à l'acide trifluoroacétique (5 ml). Par addition d'éther éthylique, le composé précipite. Après lavage à l'éther et séchage, il est repris dans l'eau (50 ml) lavé à l'acétate d'éthyle, à l'éther, puis lyophilisé. P.F. = 55-60 C CCM : AcOEt-Pyridine-AcOH-H2O 10/20/5/15 Rf : 0,49 (&alpha;)D20 = -36 (H2O,C= 0,5). EXEMPLE 2 : Boc-Gly- # (CH2NH)-Lys-Pro-Arg. acétate 2 a) Boc-Gly- # (CH2NH)-Lys(Z)-Pro-Arg-(NO2)-OBzl Le Boc-glycinal (0,78g, 4,88 mmoles) obtenu à partir de l'hydroxamate correspondant est mis en réaction avec le trifluoroacétate de Lys(Z)-PLro-Arg-(NO2)-OBzl (2,55 g, 3,25 mmoles) dans l'acide acétique méthanolique à 1,5% (50 ml), puis traité au cyanoborohydrure de sodium (0,92 g, 14,6 mmoles). Le résidu est repris au bicarbonate de sodium 10%, extrait à l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau salée, séché sur Na2SO4, filtré, puis mis à sec pour donner une mousse gommeuse (2,9g). Cette mousse est purifiée par chromatographie sur Florisil(R) (élution AcOEt/MeOH 95/5 puis 20/10), puis mis à sec (1,32 g). P.F. = 90-92 C CCM : AcOEt-MeOH 80/20 - Rf : 0,35 b) Boc-Gly- t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate Le composé ci-dessus (exemple 2a) (1,22 g, 1,5 mmole) est dissous dans le mélange BuOH-AcOH-H2O 4/1/1 (25 ml) contenant 0,3 g de Pd/BaSO4 1096 puis hydrogéné sous agitation pendant 48 heures. Après filtration du catalyseur et concentration sous vide, le résidu est repris à l'eau, lavé à l'acétate d'éthyle et mis à sec. Le produit brut est purifié par chromatographie DCCC (butanol-acide acétique-eau 5/1/4) P.F. = 90 C CCM : AcOEt-pyridine-AcOH-H2O 20/20/5/15 R.F. : 0,46 Analyse : C24H46N8O6, 4 CH3COOH, 2 H2O Calculé C 46,93 H 8,12 N 13,68 Trouvé 46,40 8,01 13,70 Le composé 4 est obtenu par traitement de 2 à l'acide trifluoroacétique (30 minutes) et précipitation à l'éther. EXEMPLE 3: Formyl NLe -t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate 3 a) Boc-NLe-t (CH2NH)-Lys(Z)-P ro-Arg-(N02)0Bzl Le Boc-Nor-leucinal (1,8g, 8,38 mmoles) est mis en solultion avec le trifluoroacétate de Lys(Z)-Pro-Arg-(NO2)-OBzl (4,05g, 5,58 mmoles) dans l'acide acétique méthanolique à 1,5%, puis traité par NaBH3CN (1,60g, 25 mmoles). Après mise à sec, le résidu est repris par une solution de bicarbonate de sodium à 10%, extrait à I'acétate d'éthyle, lavé à l'eau salée, séché, filtré et mis à sec. La purification par chromatographie sur Florisil(R) (élution AcOEt/MeOH 95/5, 90/10, 80/20) donne apres mise à sec une mousse blanche (3,3 g). P.F. = 90-91 C CCM : AcOEt-MeOH 90/10 - Rf : 0,15 b) Formyl NLe- # (CH2NH)-Lys(Z)-Pro-Arg-(NO2)-OBzl Le composé obtenu à l'exemple 3a) (I,lg, 1,15 mmole) est traité à l'acide trifluoroacétique (15 mi). précipité à l'éther, essoré et séché sous vide pour donner le composé NLe-t (CH2NH)-Lys(Z)-Pro-Arg (N02)-OBzl sel de trifluoroacétate (P.F. = 115 C). Ce produit (lg, 1 mmole) est dissous dans le DMF (5ml) puis additionné de diisopropyléthylamine (0,4 rail, 2,26 mmoles) et de formyl oxy trichloro 2,4,5-benzène (0,306g, 1.356 mmole). Après une nuit à température ambiante sous agitation, le DMF est évaporé et le résidu repris à l'acetate d'éthyle, lavé par NaHCO3 10%, acide citrique 10%, eau salée et eau. Le produit brut obtenu après séchage, filtration et m:ise à sec, est cristallisé dans l'éther éthylique (0,65g). P.F. = 12000 CCM : CHC13-MeOH (90/10) - Rf : 0,20. c) Formyl NLe-t (CH 2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate Le dérivé formyl obtenu précédemment (0,60g, 0,766 mmole) est dissous dans le mélange BuOH-AcOH-H2O 4/1/1 (12 ml) contenant 0,20g de Pd/BaSO4 10% 1096 puis hydrogéné pendent 48 heures. Après filtration et mise à sec, le résidu est repris à l'eau et lavé à l'acétate d'éthyle. Le composé brut ainsi obtenu (0,4g) est purifié par chroma tographie DCCC (butanol-acide acétique-eau 4/1/5). P.F. = N 80" CCM : AcOEt-pyridine-AcOH-H2O 20/20/10/10 (silice) Rf : 0,12 (ninhydrine, UV). analyses pour : C23H44N805, 4CH3COOH, 2 H2O Calculé : C 47,20 H 8,18 N 14,20 Trouvé : 47,24 8,16 14,45 L'évaluation du profil pharmacologique et plus spécialement des propriétés immunostîmulantes a été réalisé selon les tests suivants en comparaison avec la tuftsine d'après le protocole de I. FLORENTIN et coll. 1) Effet sur la chimioluminescence induite par la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris. Les animaux sont traités par 25 pg de produit (i.p.). La chimioluminescence induite par les macrophages traduit leur capacité de phagocytose de particules de zymosan opsonisé. Les résultats montrent une stimulation très nette dès le premier jour et atteignant son maximum au bout de 7 à 10 jours. Les composés revendiqués ont une activité équivalente ou supérieure à la tuftsine. jour après injection pic de chimioluminescence (10-9A) 3 3 7 10 14 Contrôle 1,2 Tuftsine 3,2 7,2 7,0 6,1 6,1 1 2,9 5,7 7,9 7,4 6,4 3 3,1 5,2 8,8 8,0 6,4 4 3,1 5,3 7,9 8,0 6,2 2) Effet sur l'activité NK L'activité cytotoxique des cellules NK péritonéales ou de rate vis-å-vis des cellules YAC-l a été étudiée après injection de produit (25 pg i.p.). Les composés ont montré une augmentation sensible du pouvoir cytotoxique des cellules NK. Cette stimulation décroît rapidement après le 7ème jour. Applications thérapeutiques Compte tenu des propriétés pharmacologiques mises en évidence, les composés de la présente invention peuvent être utilisés en thérapeutique seuls ou associés à d'autres principes actifs dans les traitements des affections faisant apparaître des déficiences immunitaires. Les compositions pharmaceutiques contenant, à titre de principe actif, au moins un dérivé tétrapeptidique de formule générale I contiennent en outre un véhicule destiné à l'administration de ces compositions par voie orale, inlrapéritonéale ou intraveineuse. REVENDICATIONS 1/ Dérivés tétrapeptidiques répondant à la formule générale (1) dans laquelle R représente l'hydrogène, un groupe acyle ou alcoxycarbonyle contenant de 1 à 6 atomes de carbone R' représente l'hydrogène ou un radical alcoyle linéaire ou ramifié contenant de 1 à 4 atomes de carbone, et R" représente la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide naturel ou de la Nor-leucine, ainsi que leurs sels d'addition avec des acides thérapeutiquement acceptables. 2/ Dérivés tétrapeptidiques de formule générale (I) selon la revendication 1, caractérisés en ce que R" représente - un atome d'hydrogène, - un alcoyle linéaire ou ramifié en C1 à C6, - un aminoalcoyle en C1 à C4, - un hydroxyalcoyle en C1 à C4, ou - un thioalcoyle en C1 à C4. 3/ Dérivés tétrapeptidiques de formule générale (I) selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi - Thr-t (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, trifluoroacétate i - Boc-Gly- + (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate 2 - For-NLe-+ (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, acétate Gly- # (CH2NH)-Lys-Pro-Arg, trifluoroacétate 4. 4/ Procédé de préparation des dérivés de formule générale (I) selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que l'aldéhyde de formule générale (Il): dans laquelle R' et R" ont les significations données à la revendication 1, et R représente un groupc ce blocage, est condensé avec un tripeptide Lys-Pro-Arg convenablement bloqué, puis réduit et éventuellement débloqué. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'aldéhyde de formule générale (II) est obtenu par réduction de l'hydroxamate de formule générale (III) : dans laquelle R' et R" ont les significations données à la revendication 1, et R représente un groupe de blocage. 6/ A titre de médicaments nouveaux utiles en thérapeutique et notamment dans les troubles immunitaires, les dérivés selon l'une des revendications I à 3. 7/ Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent comme principe actif au moins un dérivé selon l'une des revendications j 2 3. 8/ Compositions pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles contiennent un véhicule destiné à leur administration par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse. 9/ Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisées en ce qu'elles contiennent d'autres principes actifs associés aux dérivés selon l'une des revendications I à 3.