Brevet FR2606155A1 — publié le 19880506

La présente invention est relative à une méthode de détermination de la séquence d'un acide nucléique à l'aide d'un réactif immunologique spécifique. La présente invention est également relative à un procédé d'obtention de ce réactif immunologique. La présente invention est en outre relative à l'application de la méthode de détermination susdite au contrôle de la qualité de la production de vaccins ou d'autres produits biologiques à visées thérapeutiques ou industrielles. Les méthodes les plus utilisées actuellement pour déterminer la séquence de 1'ADN mettent en oeuvre des marqueurs radioactifs et se terminent par une autoradiographie d'un gel analytique de polyacrylamide. I1 s'agit essentiellement des méthodes décrites par SANGER et coll. CROC. NAT. ACAD. Sci. (USA), 74, 5463 (l977) et par h5AXAM et GILBERT îMETHODS IN ENZYMOLOGY, 65, (1980), 4993. La méthode de SANGER utilise une matrice simple brin portant le fragment à étudier et une courte séquence complémentaire servant d'amorce pour 1'ADN polymérase. L'incapacité de 1'ADN polymérase à fonctionner après l'incorporation des didéoxynucléosides triphosphates (ddNU) est utilisée dans cette technique. Ainsi, par exemple, l'addition de ddA et des quatre autres nucléotides au milieu réactionnel génère une série de fragments d'ADN tous identiques en 5' mais avec différentes extrémités 3' correspondant aux différentes positions de l'adénosine dans la séquence. Une électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide permet de séparer ces fragments d'ADN. Leur révélation est possible par autoradiographie grâce à l'incorporation de nucléotides radioactifs (32p) par 1'ADN polymérase. L'ADN simple brin servant de matrice à 1'ADN polymérase peut être obtenu de différentes façons. L'utilisation du bactériophage M13 est cependant la plus répandue en raison de la facilité de préparation de 1'ADN du phage sous forme simple brin. La méthode de MAXXH et GILBERT est une méthode chimique. Un fragment d'ADN double brin purifié est marqué en 5' par du 32p. Ce fragment est ensuite coupé par une enzyme de restriction pour donner naissance à deux fragments de tailles différentes. Ceux-ci sont isolés sur un gel de polyacrylamide préparatif puis soumis à des réactions chimiques de modifications partielles des quatre bases puis coupés spécifiquement à chacune de ces bases modifiées. Les produits de dégradation sont fractionnés en parallèle sur un gel analytique de polyacrylamide en condition dénaturante. L'autoradiographie du gel permet la lecture directe de la séquence du fragment marqué. Ces deux méthodes de détermination d'une séquence sont fiables et précises. Cependant l'utilisation de nucléotides marqués au 32p en fait des méthodes coûteuses (radioisotopes, films spéciaux ...) et nécessitant des moyens de protection importants. D'autre part, l'étape finale (autoradiographie) est lente : il est parfois néces-saire d'attendre deux semaines avant de pouvoir exploiter les résultats. De plus, le phénomène de radiolyse de 1'ADN nécessite un traitement immédiat des échantillons. C'est pourquoi il serait opportun de pouvoir utiliser des marqueurs non-radioactifs pour détecter les fragments d'ADU sur un gel de séquence. Dans ce sens, il a été proposé (Brevet français 2 519 005) de marquer des fragments d'ADN à au, moins une de leurs extrémités, par des ribonucléotides mcdifiés reconnaissables par des molécules affines et d'utiliser les fragments d'ADN modifiés de la sorte pour analyser la séquence de nucléotides dont ils sont constitués. Conformément à ce brevet, 1'ADN est modifié par un ribonucléotide dé préférence dérivé de 1'ATP lui-même modifié par une molécule chimique dénommée "groupe de modification, fixée de façon covalente sur la position 6 ou 8 de la molécule d'adénine de 1'ATP, par l'inter médiaire d'un bras de type -NH-(CH2)X-X ou -CO-(CH2)x-X, et de préférence constituée par un antigène ou un haptène susceptible d'être reconnu par un anticorps préalablement formé contre cet antigène ou contre cet haptène.L'ADN modifié conforme à ce brevet est utilisé pour analyser sa séquence de nucléotides en mettant en oeuvre la méthode MAXAM et GILBERT. Cependant la préparation de 1'ADN modifié tel que décrit dans ce brevet est une opération de modification chimique relativement complexe et d'autre part la molécule affine qui reconnaît le ribunucléotide modifié utilisé pour modifier 1'ADN, et qui a une affinité spécifique pour le groupe de modification du nucléotide pour réaliser la reconnaissance sélective de 1'ADN modifié, est essentiellement un anticorps défini comme "préalablement formé contre cet antigène", lorsque le groupe de modification du ribonucléotide initial est un antigène, ou contre les haptènes. Ce brevet indique d'ailleurs que ces anticorps sont disponibles dans le commerce. La fixation de nucléotides de façon covalente et individuelle sur l'albumine bovine au moyen de la technique d'oxydation périodique a été décrite par Erlanger EPNAS, 52, p. 68, 19643. Ainsi qu'il est bien connu, la technique de production des anticorps monoclonaux a été décrite par Koler et Milstein Nature, 256, 495, 19753. Le transfert d'ADN depuis les gels d'agarose sur des filtres de nitrocellulose a été décrit par Southern E1975, J. mol. biol. 98, 503-5073 et par Thomas t1980, PNAS, 77, 520l-5205 et le transfert d'ADN depuis des gels de polyacrylamide par Church et Gilbert L1984-, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 1981). Les Inventeurs ont trouvé à présent qu'il est possible d'utiliser des anticorps monoclonaux dirigés contre les nucléotides d'un acide nucléique qui codent une séquence d'amino-acides, en tant que réactif propre à déterminer la séquence d'un acide nucléique. La mise en oeuvre de l'inven tion permet de se passer des éléments radioactifs proposés conformément à 1' Art Antérieur, dont l'utilisation était onéreuse et longue et qui nécessitaient le respect de consignes de sécurité contraignantes. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des moyens propres à-permettre la détermination de la séquence d'un acide nucléique, qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les nucléotides radioactifs proposés dans l'Art Antérieur, en ce qu'ils introduisent dans les méthodes de détermination de la séquence des acides nucléiques, une simplification considérable tant par eux-mêmes que par leur facilité de mise en oeuvre, à quoi s'ajoutent leurs grandes sensibilité et fiabilité et leur absence de toxicité. La présente invention a pour objet un réactif immunologique utilisable pour la détermination de la séquence d'un acide nucléique et notamment d'un ADN, caractérisé en ce qu'il est constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques qui reconnaissent les bases naturelles présentes dans les acides nucléiques et notamment les ADN, et obtenu selon un mode de réalisation avantageux à partir d'hybridomes résultant de la fusion de splénocytes, ou d'autres cellules lymphoïdes appropriées, de souris immunisées, et de cellules de myélome, de préférence non secrétant, appropriées. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le réactif immunologique est obtenu par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de splénocytes ou analogues de souris immunisées contre des antigènes constitués par des dérivés de l'al- bumine bovine ou ovine portant une, plusieurs ou la totalité des bases naturelles présentes dans les acides nucléiques, en mettant en oeuvre une technique de couplage appropriée. Les techniques de couplage utilisées de préférence sont celles décrites par exemple dans STOLLAR t"The Antigens", M. . SELLA, Vol. I (1973) Al. Inc.J. Selon un mode de réalisation préféré du réactif immunologique conforme à l'invention, celui-ci présente une affinité supérieure à 106N-1. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du réactif immunologique conforme à l'invention, qui est caractérisé en ce que les splénocytes, ou lymphoSdes analogues, de souris immunisées contre des dérivés d'albumine portant une, plusieurs ou la totalité des bases présentes dans un acide nucléique et notamment un ADN, sont fusionnés avec des cellules myélomateuses appropriées, de préférence d'un myélome non sécrétant, en présence de polyéthylèneglycol, en ce que les hybridomes obtenus qui sé crétent des anticorps spécifiques anti-acides nucléiques. sont clonés, en ce que la production de ces anticorps est réalisée par culture des hybridomes clonés, en ce que les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques sont recueillis, puis purifiés et contrôlés quant à leur monoclonalité par immunodiffusion et/ou par enzymo-immunologie. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, les cellules lymphoïdes, telles que les splénocytes, utilisées pour la fusion proviennent de souris préalablement immunisées contre les antigènes constitués par de l'albumine portant des nucléosides ou dérivés analogues, l'opération d'hybridation par fusion avec les cellules myélomateuses étant précédée d'une première étape au cours de laquelle au moins l'un des nucléosides (adénosine, cytidine, méthyluridine, uridine, guanosine) ou leurs dérivés phosphorylés sont fixés par covalence sur de l'albumine bovine ou ovine, puis d'une deuxième étape au cours de laquelle les dérivés d'albumine obtenus au cours de la première étape sont injectés à des souris pour immuniser ces dernières, l'étape d'immunisation se terminant par le prélèvement de splénocytes chez ces souris en vue de la troi siéme étape, qui est l'étape d'hybridation de ces cellules avec des cellules myélomateuses. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, les hybridomes clonés sont cultivés en liquide d'ascite. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, les hybridomes clonés sont cultivés en culture cellulaire in vitro. La présente invention a également pour objet une méthode de détermination de la séquence d'un acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend - une première étape qui consiste a cloner l'acide nucléi que ou les fragments d'acide nucléique à analyser, à culti ver ces clones, à en extraire les brins monocaténaires qui sont alors repliqués après quoi les fragments obtenus sont séparés par électrophorèse, - une deuxième étape qui consiste à incuber le support où se trouvent les fragments d'acide nucléique avec des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques, - une troisième étape qui consiste à révéler par toute métho de appropriée la fixation de ces anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques sur les fragments d'acide nucléique, - une quatrième étape qui consiste en la détermination de la séquence faite par la lecture des bandes correspondant aux nucléotides dans les canaux de migration. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de cette méthode de détermination de la séquence d'un acide nucléique, la deuxième étape peut être précédée d'une étape supplémentaire qui consiste à transférer l'acide nucléique ou les fragments d'acide nucléique sur un support adapté (nylon, nitrate de cellulose) par une méthode appropriée. La présente invention a en outre pour objet une trousse - ou kit - prête à l'emploi pour la détermination de la séquence d'acides nucléiques et notamment d'ADN, laquelle trousse est caractérisée en ce qu'elle contient - une quantité appropriée éventuellement subdivisée en doses unitaires suffisantes pour une opération de séquençage, d'anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques et notamment anti-ADN, utilisables en tant que réactif immunologique pour la réalisation dudit séquençage, - éventuellement une quantité appropriée, subdivisée le cas échéant en doses unitaires suffisantes pour une opération de séquençage, d'anticorps anti-IgG marqués par une enzyme pour la révélation de la réaction antigène-anticorps entre l'acide nucléique à étudier et le réactif immunologique, - éventuellement des quantités appropriées de tampons, di luants, solvants, papiers-filtres ou membranes de support, nécessaires à la mise en oeuvre de la méthode de séquençage conforme à l'invention. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne-constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 Obtention d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux spécifiques des bases puriques ou pyrimidiques 1) Préparation des antigènes On fixe par covalence et individuellement les nucléosides adnosine, guanosine, cytidine, 5-méthyluridine et uridine sur de l'albumine bovine ou de l'albumine du blanc d'oeuf de poule d'une manière connue en elle-même, par oxydation périodique, dans des conditions permettant de fixer au moins 5 molécules de nucléosides par molécule de protéine. 2) Immunisation des souris Les dérivés obtenus selon l'Exemple 1 sont injectés à des souris balb/c femelles agées de 12 semaines. Les souris sont préalablement saignées à la veine de l'oeil, le sérum recueilli constituera le témoin avant im munisation. Les souris reçoivent 2 injections plus une injection de rappel. 1ère injection : Sont injectés 200 pl d'adjuvant complet de freund additionné à 300 pg d'antigène couplé représen tant 10 à 15 pg d'antigène pur. Les injections sont faites en multipoints par Voie sous-cutanée sur le dos. 2ème injection : 15 jours plus tard, les mêmes doses d'antigène par la même voie en présence d'adjuvant incom plet de freund sont injectées. 11 jours après les animaux qui présentent une activité anticorps sérique suffisante reçoivent par voie intravei neuse 200 pg antigène couplé (7 à 10 pg d'antigène pur) émulsionné dans de l'eau physiologique. Trois jours après cette dernière injection, les animaux sont saignés à blanc, les rates sont prélevées et la fu sion est réalisée. Les sérums des souris sont testés en cours d'immunisation à l'aide d'une technique enzymoimmunologique en utilisant les dérivés d'albumine précités comme antigènes. Lorsque le titre en anticorps sériques spécifiques des bases puri ques et pyrimidiques atteint une valeur constante, un pla teau, les souris sont sacrifiées et leur rate prélevée. 3) Fusion 107 cellules de myélomes de souris balb/c Ag8 x 63-6-5-3, sont mélangées à 4 x 107 cellules spléniques ceci consti tuant les proportions de base - généralement toutes les cellules d'une rate sont utilisées pour la fusion -. Ce mélange est centrifugé. Le culot cellulaire est traité avec du polyéthylèneglycol 1000 - (PEG 1000) ajouté goutte à goutte (400 pl) pendant 30 secondes. La suspension ainsi obtenue est laissée à la température du laboratoire 3 mi nutes, puis on ajoute en 5 minutes 1 ml de milieu de cul ture (DMEM ou RPMI 1640) additionné de 10% de sérum de cheval et de milieu HAT. Puis à nouveau 10 ml de ce même milieu goutte à goutte. La suspension ainsi obtenue est complétée avec le même mi lieu au volume désiré, de telle sorte que l'on obtienne une concentration de 105 cellules de myélomes utilisées à l'origine par ml. Les cellules sont distribuées en plaques linbro de 24 puits à raison de 1 ml par puits. Après 10 à 15 jours les puits présentant une importante croissance cellulaire sont débarrassés de leurs surnageants. Ces derniers sont examinés pour mesurer leur activité anticorps spécifique. Les puits positifs sont clonés par la méthode de dilution limite - cette méthode consiste à préparer une dilution de cellules à raison d'une cellule par 200 pl de milieu de culture. La suspension cellulaire ainsi obtenue est dis tribuée à raison de 100 pl par puits dans une plaque de culture de 96 puits. Ainsi nous obtenons une-distribution d'une cellule tous les 2 puits. Après 15 jours à 3 semai nes, les clones qui se sont développés sont repiqués indi viduellement dans des plaques de 24 puits. Après 3 à 4 jours les surnageants de ces clones sont à nouveau exa minés pour leur activité anticorps. Les puits positifs sont retenus et constituent les clones producteurs de l'anticorps spécifique attendu. La -produc- tion de ces anticorps est ensuite réalisée soit par pro duction de liquide d'ascite par injection de cellules dans le péritoine de souris histocompatibles, soit par culture cellulaire in vitro et récupération des surnageants. 4) Sélection des clones La sélection des clones obtenus et la caractérisation des anticorps sont effectuées par voie immunoenzymatique en immobilisant sur plaque de microtitration ou membrane de nitrocellulose l'acide nucléique ou les bases couplées à l'albumine. Sont sélectionnés les clones réagissant positivement avec l'acide nucléique et ayant une affinité au moins égale à 106M-1 pour la ou les bases de l'acide nucléique. EXEMPLE 2 Analyse de la séquence d'un ADN 1) Fragmentation, clonage, replication de 1'ADN Les premières étapes de la méthode permettant l'analyse des séquences des nucléotides contenus dans un ADN à dou ble brin sont celles décrites par Sanger. L'ADN à analyser est fragmenté par sonication, par hydro lyse partielle par la DNase I ou par hydrolyse spécifique par des enzymes de restriction. Les fragments ainsi obte nus sont clonés dans le bactériophage M13, puis on cultive le phage en milieu liquide, on concentre les phages libé rés dans ce milieu et on extrait 1'ADN monocaténaire. Cet ADN est ensuite repliqué in vitro en présence des 4 didé oxynucléosides trisphosphates en utilisant une amorce d'oligonucléotides et d'ADN polymérase I. Le contenu des 4 tubes est analysé sur gel de polyacrylamide dans les conditions décrites par Maxam et Gilbert pour séparer les différents fragments d'ADN par ordre de taille et en dif férentes bandes. 2) Transfert des fragments d'ADN On transfère au moins en partie les fragments d'ADN, sépa rés par électrophorèse, sur une feuille de nitrate de cel lulose, de nylon ou sur un support analogue. Ce transfert peut être réalisé soit par simple diffusion en appliquant la feuille sur le gel de polyacrylamide, soit par électro élution en utilisant un appareil constitué de 2 électrodes en graphite et analogue à -celui décrit par JK Andersen (J. Biochem Biophys, 1984, 10, 203-209) pour le transfert électrophorétique des protéines.On préfère la seconde possibilité pour son efficacité, en effet il est possible de transférer en 30 minutes au moins 90% des fragments d'ADN constitués de 26 à 516 nucléotides à partir d'un gel de polyacrylamide à 6% dont l'épaisseur est égale à 1,5 mm en utilisant une différence de potentiel de 110 V et du trisborate EDTA comme tampon d'électroélution. 3) Incubation de la membrane avec la solution contenant les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques La membrane de nitrocellulose est incubée avec les anti corps monoclonaux anti-nucléosides (1-100 pg/ml) dilués dans une solution composée de NaC1 0,15 M; tampon Tris-HCl pH 8 0,02 M; Tween 20 0,1%; albumine bovine 1%. L'excès d'anticorps monoclonaux est éliminé par un lavage avec la solution décrite ci-dessus. 4) Révélation des anticorps anti-nucléosides Les anticorps fixés spécifiquement sur les fragments d'ADN sont ensuite révélés en trempant la membrane successive ment dans une solution d'anticorps anti-IgG de souris cou plés à la phosphatase alcaline, dans une solution de lava ge, puis dans une solution contenant le substrat appro prié. A titre d'exemple, on peut utiliser le mélange suivant pour révéler la présence de la phosphatase alcaline 0,1 M Tris-HCl pH 9,5 contenant 0,1 M NaCl; 0,05 M MgC12; 0,33 mg de nitroblue de tétrazolium/ml et 0,16 mg de 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolylphosphate par ml. 5) Détermination de la séquence de 1'ADN Cette détermination se fait par lecture à l'oeil nu de l'ordre des bandes correspondant aux nucléotides dans les canaux de migration. La méthode de détermination de la séquence d'un ADN comporte de nombreuses applications dont quelques exemples seront cités ci-après 1) Lors du transfert de gènes par ingéniérie génétique, il est indispensable de s'assurer de la stabilité de la sou-- che cellulaire qui exprime la protéine intéressante. De plus, lors de la construction génétique, il est nécessaire de vérifier si le fragment d'ADN cloné est inséré dans le bon sens et en phase pour permettre la traduction d'une protéine active. La présente invention constitue donc un apport décisif pour contrôler la qualité de la production, par ingéniérie génétique, de vaccins viraux, bactériens ou parasitaires, d'hormones et de protéines intéressant l'in dustrie agro-alimentaire. 2) Pendant la production d'une souche virale, les mutations qui apparaissent (délétion, inversion ...) peuvent changer les caractéristiques de la souche et par conséquent la qualité du vaccin. La méthode de détermination de la sé quence d'un ADN conforme à la présente invention permet de contrôler certaines caractéristiques de la souche au ni veau de l'acide nucléique. 3) Au cours de la diffusion des virus dans la nature, ceux-ci subissent des mutations qui peuvent être à l'origine d'échecs de vaccination, qui se sont effectivement pro duits. Ceci se traduit par l'existence de malades parmi la population vaccinée. Une surveillance épidémiologique mo léculaire à l'aide de la technique conforme à l'invention permet d'améliorer le vaccin et de le rendre plus effi cace. REVENDICATIONS 1') Réactif immunologique pour la détermination de la séquence d'un acide nucléique et notamment d'un ADN, caractérisé en ce qu'il est constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques qui reconnaissent les bases naturelles présentes dans les acides nucléiques et notamment les ADN et obtenus à partir d'hybridomes résultant de la fusion de splénocytes ou autres cellules lymphoïdes appropriées, de souris immunisées, et de cellules de myélome, de préférence non sécrétant, appropriées. 2') Réactif immunologique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de splénocytes ou analogues de souris immunisées contre des antigènes constitués par des dérivés de l'albumine bovine ou ovine portant une, plusieurs ou la totalité des bases naturelles présentes dans les acides nucléiques. 3 ) Réactif immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il présente une affinité supérieure à 106M-1. 4-) Procédé de préparation d'un réactif immunologique constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques qui reconnaissent les bases naturelles présentes dans les acides nucléiques et notamment les ADN, caractérisé en ce que les splénocytes ou lymphoïdes analogues de souris immunisées contre des dérivés d'albumine portant une, plusieurs ou la totalité des bases présentes dans un acide nucléique et notamment un ADN, sont fusionnés avec des cellules myélomateuses appropriées, de préférence d'un myélome non sécrétant, en présence de polyéthylèneglycol, en ce que les hybridomes obtenus qui sécrétent des anticorps spécifiques anti-acides nucléiques sont clonés, en ce que la production des anticorps est réalisée par culture des hybridomes clonés, en ce que les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques sont recueillis, puis purifiés et contrôlés quant à leur monoclonalité, par immunodiffusion et/ou par enzyme immunologie. 5g) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules lymphoïdes, telles que les splénocytes, utilisées pour la fusion proviennent de souris préalablement immunisées contre les antigènes constitués par de l'albumine portant des nucléosides ou dérivés analogues, l'opération d'hybridation par fusion avec les cellules myélomateuses étant précédée d'une première étape au cours de laquelle au moins l'un des nucléosides (adénosine, cytidine, méthyluridine, uridine, guanosine) ou leurs dérivés phosphorylés sont fixés par covalence sur l'albumine bovine ou ovine, puis d'une deuxième étape au cours de laquelle les dérivés d'albumine obtenus dans la première étape sont injectés à des souris pour immuniser ces dernières, l'étape d'immunisation se terminant par le prélèvement de splénocytes chez ces souris en vue de la troisième étape, qui est l'étape d'hybridation de ces cellules avec les cellules myélomateuses. 60) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les hybridomes clonés sont cultivés en liquide d'ascite. 7ç) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les hybridomes clonés sont cultivés en culture cellulaire in vitro. 80) Méthode de détermination de la séquence d'un acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes successives suivantes - une première étape qui consiste-a cloner l'acide nucléique ou les fragments d'acide nucléique à analyser, à cultiver ces clones, à en extraire les brins monocaténaires qui sont alors repliqués après quoi les fragments obtenus sont sépa rés par électrophorèse, - une deuxième étape qui consiste à incuber le support où se trouvent les fragments d'acide nucléique avec des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques, - une troisième étape qui consiste à révéler par toute métho de appropriée la fixation de ces anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques sur les fragments d'acide nucléique, - une quatrième étape qui consiste en la détermination de la séquence faite par la lecture des bandes correspondant aux nucléotides dans les canaux de migration. 9g) Méthode de détermination de la séquence d'un acide nucléique suivant la revendication 8, caractérisée en ce que la deuxième étape peut être précédée d'une étape sup- plémentaire qui consiste à transférer l'acide nucléique ou les fragments d'acide nucléique sur un support adapté choisi dans le groupe des composés comprenant le nylon et le nitrate de cellulose, par une méthode appropriée. 100) Trousse - ou kit - prête à l'emploi pour la détermination de la séquence d'acides nucléiques et notamment d'ADN, laquelle trousse est caractérisée en ce qu'elle contient - une quantité appropriée éventuellement subdivisée en doses unitaires suffisantes pour une opération de séquençage d'anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques et notamment anti-ADN, utilisables en tant que réactif immunologique du dit séquençage, - éventuellement une quantité appropriée, subdivisée le cas échéant en doses unitaires suffisantes pour une opération de séquençage, d'anticorps anti-IgG marqués par une enzyme pour la révélation de la réaction antigène-anticorps entre l'acide nucléique à étudier et le réactif immunologique, - éventuellement des quantités appropriées de tampons, di luants, solvants, papiers-filtres ou membranes de support nécessaires à la mise en oeuvre de la méthode de séquençage conforme à la présente invention.