Brevet FR2601680A1 — publié le 19880122

La présente invention se rapporte à un nouvel inhibiteur de la synthèse protéique ainsi qu'à des méthodes pour son isolement, à son utilisation et aux compositions pharmaceutiques en contenant. 5 Des protéines qui inhibent la synthèse protéique dans les systèmes eucaryotes ont été trouvées dans les graines ou d'autres parties d'un certain nombre de plantes. Parmi ces protéines, la ricine, l'abrine et la modécine inhibent la synthèse protéique aussi bien dans les systèmes cellulaires que dans les systèmes acellulaires 10 et sont de ce fait hautement toxiques chez l'animal. D'autres au contraire, efficaces sur les systèmes acellulaires seulement, sont peu ou pas toxiques chez l'animal peut être parce qu'elles ne peuvent pénétrer dans les cellules. D'une façon générale, ces protéines inactivent de facon irreversible la sous unité ribosomale 60 S, qui se trouve dans l'impossibilité de réagir avec le facteur d'élongation 2. Par suite elles présentent un intérêt pour l'étude de la synthèse protéique et il a été proposé aussi de les utiliser pour combattre ies tumeurs. Une protéine de ce type sera désignée ci-après par le terme "Ribosome inactivating Protein" (RIP). La RIP la mieux connue est la Ricine qui est obtenue par extraction des graines de Ricin. Une autre RIP, la gélonine, a été décrite récemment et une revue sur les RIP a été publiée dans FEBS Letters, 1986, 195 (1,2), pages 1-8. Il a récemment été décrit une protéine extraite des racines de 25 Trichosanthes kirilowii, la trichosanthine, (Nature, 1986, 321, 477-478) montrant un certain degré d'homologie de séquence avec la sous unité A de la ricine D. On a maintenant trouvé que l'on peut extraire des graines de Trichosanthes kirilowii, une nouvelle RIP exceptionnellement puis30 sante, différente de la trichosanthine. Cette nouvelle RIP sera ciaprès désignée "trichokirine". Ainsi, la présente invention concerne, selon un de ses aspects, la nouvelle RIP dénommée trichokirine ayant les caractéristiques suivantes: 26 0 1680 C'est une Glycoprotéine: - ayant un poids moléculaire 28.000 + 3.000, déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (sodium dodécyl sulfate), - de point isoélectrique 9 1, - de contenu en sucres neutres: 1,1 à 0,6 % de mannose, - de composition en acides aminés:en 10 protéine + 20 %: Lys: 17,3; His: 1,1; Arg Thr: 18,9; Ser: 23, 4; Glx Gly: 16,0; Ala: 21,1; 1/2 Cys Val: 12,5; Met: 3,05; Ile 15 Tyr: 12, 1; Phe: 10,1; Trp 1,5 % en poids dont 0,3 à nombre résidus par mole de : 6,7;: 21,5; : 1,9;:15,7;: n.d.. Asx: 22,7; Pro: 8,0; Leu: 24,2; dans ce qui précède, Asx représente l'ensemble des résidus d'acide aspartique et d'asparagine et Glx l'ensemble des résidus d'acide glutamique et de glutamine 1/2 Cys représente l'acide cystéique et n.d. signifie non déterminé, les autres acides aminés étant désignés conformément aux recommandations de l'IUPAC et dont la séquence amino-terminale est: 1 10 Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly16 Thr-Ala-Ser-Tyr-Glu-Lys La composition en acides aminés a été déterminée par chauffage de la glycoprotéine à 1050C pendant 24 heures sous azote en présence d'acide chlorhydrique 6 N, de phénol à 1 % et de 2-mercaptoéthanol à 1 %. Les acides aminés ont été dérivés par le phénylisothiocyanate (PICT) en milieu alcalin. Les PICT-aminoacides ont été analysés par HPLC en phase inverse. L'acide cystéique a été déterminé après oxidation de la protéine avec l'acide performique (J. Biol. Chem. 1963, 238, 235-237). La séquence amino-terminale a été déterminée sur un microséquenceur commercialisé par Applied Biosynthesis à partir de 5 nmoles de protéine solubilisées dans une solution aqueuse d'acide acétique à 10 %. Les PICTaminoacides sont analysés par HPLC en phase inverse. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un 10 procédé pour l'obtention de la trichokirine caractérisé en ce que l'on extrait les graines de Trichosanthes kirilowii avec de l'eau en présence d'un tampon à pH 6,5-7,5, on élimine le matériau insoluble et on fractionne l'extrait par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide, en éluant avec une solution =am15 pon contenant du chlorure de sodium 0,3-0, 6 M à un pH de 7,2-7,7, on isole la fonction contenant la protéine inhibitrice, et on la purifie, les produits de bas poids moléculaire peuvent écre éliminés par dialyse de l'extrait. Par exemple, les graines de Trichosanthes kiriCowii, Je préférence après égrenage, sont broyées et extraites avec de i eau contenant un électrolyte par exemple du chlorure de sodium, et un tampon, par exemple à base dephosphate, à un pH voisin de la neutralité. Les matières insolubles sont ensuite éliminées par exemple par centrifugation et les substances de bas poids moléculaire sont éliminées de la solution par dialyse par exemple contre du tampon phosphate. L'extrait dialysé est alors soumis à un fractionnement, par exemple par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide telle que la carboxyméthylcellulose. L'élution, lorsqu'on utilise cette résine, peut être effectuée en utilisant un gradient linéaire de concentration, par exemple une solution aqueuse de'0 à 0,3 M chlorure de sodium. Normalement, 4 pics principaux sont élués et le 4ème pic élué par unesolution de concentration en chlorure de sodium de 0,03 à 0,11 M contient la plus grande partie de la trichokirine. La purification de la trichokirine peut être achevée par filtration sur gel, par exemple sur une colonne de Sephadex (marque déposée). La trichokirine peut être couplée aux haptomères par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié. Ainsi par exemple, la trichokirine peut être couplée à un anticorps par un pont disulfure selon des méthodes classiques. Pour cela, aussi bien la trichokirine que l'haptomère peuvent 10 être soumis à une réaction avec un réactif permettant d'introduire une chaîne portant un groupe disulfure. Un autre objet de l'invention est constitué par les dérivés modifiés de trichokirine contenant un groupe SH libre ou bloqué et plus particulièrement une S-acétylmercaptosuccinoyl de trichokirine 15 obtenue par traitement de la trichokirine par l'anhydride Sacétylmercaptosuccinique, ainsi que les dérivés de mercaptosuccinoyle correspondants préparés par action de l'hydroxylamine sur le dérivé Sacétyle. La méthode de préparation de la trichokirine ainsi modifiée est celle qui est couramment utilisée pour la préparation de 20 produits, notamment de protéines, activés. Ainsi, l'introduction du groupe Sacétylmercaptosuccinoyle sur un anticorps est décrite dans le brevet US 4. 340.535; l'introduction du groupe Sacétylmercaptosuccinoyle sur l'hydroxyle primaire d'un ionophore est décrite dans la demande de brevet européen 162.781 et l'introduction 25 du groupe Sacétylmercaptosuccinoyle sur la chaine A de la ricine est décrite dans la demande de brevet européen 169.114. Ces trichokirines modifiées peuvent être représentées par la formule: TK - (CO - CH - S - W)n (I) CH2COOH dans laquelle TK représente le radical de la trichokirine, W représente l'hydrogène ou le groupe acétyle et n peut varier entre 0,2 et 3, de préférence entre 0,4 et 1. La trichokirine de la présente invention inhibe les synthèses protéiques dans un lysat de réticulocytes avec une DIs0 de 2-4 ng/ml. Sur les cellules intactes, l'effet est de loin inférieur, avec une DI50 qui peut varier de 7 à plus de 100 microg/ml, selon la cellule examinée. Le tableau I montre l'effet de la trichokirine sur diverses cellules, notamment la DI50 (en micro.g/ml et en M.10-7) de l'inhibition de la synthèse protéique; celle-ci a été déterminée en appliquant la méthode décrite dans J. Biol. chem. (1984) 259 p.9359-9364. TABLEAU 1 ____________________________________________________7 : Cellule: DISO micro.g/ml: M.10-: :.... ........: .........:-...: : Fibroblastes humains: 3,9: 1,3: : Cellules TG: 7,5: 2,5: : Cellules NB 100: 10,3: 3,4: : (neuroblastome):: : Cellules JAR: 16,3: 5,4: : (coriocarcinome):: : : Cellules HeLa: 45,0: 15,0: : M 4039 (melanome): 9, 9: 3,3: ____________________________________________________Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 ISOLEMENT DE LA TRICHOKIRINE. A) Extrait brut. Des graines de Trichosanthes kirilowii (1,2 kg) sont broyées dans un appareil Ultraturrax avec 8 volumes de solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14 M contenant du tampon phosphate 5mM, pH 7,5. L'extraction est poursuivie pendant une nuit à 40 C sous agitation magnétique. Après élimination des résidus grossiers, on procède à une centrifugation à 10. 000 g à 0 C pendant 45 minutes. Le surnageant est décanté, à froid pour éliminer les graisses solidifiées puis les protéines sont précipitées par addition de sulfate d'ammonium jusqu'à saturation. Après centrifugation comme indiqué ci-dessus, le produit précipité est remis en suspension dans 1 litre de solution aqueuse 15 0,14 M de chlorure de sodium contenant du tampon phosphate SmM, pH 7,5. Le produit non dissous est éliminé par centrifugation dans les mêmes conditions que ci-dessus. Le surnageant est passé sur une colonne de Sephadex R G 25 coarse commercialisée par Pharmacia (95 cm x cm) équilibrée avec du tampon phosphate 3mM, pH 7,0 à température 20 ambiante et élué à la vitesse de 3 1 / heure. Le premier pic protéique est collecté; c'est l'extrait brut. B) Chromatographie d'échange d'ions. Les extraits bruts combinés de 2 opérations (provenant à l'origine de 2,4 kg de graines) sont additionnés de chlorure de sodium 25 jusqu'à une concentration finale de 30 mM et passés sur une colonne (17,5 cm x 5 cm) de CM-Sepharose RFast Flow commercialisée par Pharmacia, équilibrée avec du tampon phosphate 30mM, pH 7,0. Après lavage de la colonne avec le même tampon, la protéine liée est éluée par un gradient contenant de 30 à 110 mM de chlorure de sodium dans 30 le même tampon phosphate (volume 20 litres). Des fractions de 400 ml sont collectées à la vitesse de 1,2 litres par heure. On suit - l'élution en mesurant l'absorbance à 280 nm et la conductibilité de l'éluat. Les fractions montrant une activité inhibitrice de la synthèse protéique sont réunies (3,6 1) et amenées à pH 5,8 par de l'acide acétique. On passe la solution sur une colonne de SSepharose Fast Flow (6,6 cm x 5 cm) équilibrée avec le tampon acétate de sodium mM, pH 4,5. Après lavage de la colonne avec le même tampon, la protéine inhibitrice fixée est éluée par du tampon phosphate 20-mM, pH 7, 5 contenant du chlorure de sodium 0,5 M. La fraction correspondant au pic contenant la protéine inhibitrice (200 ml) est recueillie et dialysée contre 3 fois 50 1 d'eau distillée puis lyophilisée. On obtient ainsi 380 mg de 10 trichokirine brute. C) Filtration sur gel. La trichokirine obtenue ci-dessus est dissoute dans 50 ml de solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14 M. On élimine un insoluble par centrifugation à 20.000 g.pendant 30 minutes. Le surnageant est 15 passé sur une colonne de Sephadex G 50 coarse (95 cm x 5 cm) equilibrée avec un tampon phosphate 30 mM pH 7 à 4 C. On élue àla vitesse de 60 ml/heure. La fraction correspondant au pic contenant la protéine est collectée, dialysée et lyophilise comme indiqué cidessus. On obtient ainsi 267 mg de trichokirine purifiée. EXEMPLE 2: S-ACETYLMERCAPTOSUCCINOYL TRICHOKIRINE MERCAPTOSUCCINOYL TRICHOKIRINE. A 5,8 mg de trichokirine (0,215 micromole environ) dissoute dans 6 ml de tampon phosphate 125 mM pH 7 (soit 0,973 mg/ml, 0,036 micromole environ/ml) sont additionnés 100 microlitres d'une solution d'anhydride Sacétylmercaptosuccinique (SAMSA) à 10,5 mg/ml (60,33 micromoles/ml) dans le diméthylformamide. L'incubation dure une heure puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactif par dialyse contre du tampon phosphate 125 mM pH 7. On obtient ainsi 5,7 30 ml d'une solution de S-acétylmercaptosuccinates de trichokirine à 0,948 mg/ml. Par action de l'hydroxylamine et selon la méthode d'ELLMAN (Methods in Enzymology 25, 457, (1972)) on obtient du mercaptosuccinate de trichokirine, ou trichokirine activée, contenant 0,7 groupes SH libres par mole de trichokirine (dosage spectrophotométrique). Examinée par électrophorèse en gradient de polyacrylamide, cette protéine modifiée présente une seule bande de 5 poids moléculaire voisin de 28.000 + 3.000 identique à celle de la protéine native. EXEMPLE 3: CONJUGUE ENTRE L'ANTICORPS AT15E (ANTI-TH:Y 1.2) ET LA MERCAPTOSUCCINOYL TRICHOKIRINE. A) Préparation de l'anticorps ATS15E modifié. L'anticorps AT15E est un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène Thy 1.2 des lymphocytes murins. Cet anticorps est celui qui est décrit dans Journal of Immunology 122, 2491-8 (1979) et a été obtenu à partir de l'hybridome décrit dans Hybridoma 1(1); 13-17 (1981). A 3,7 ml d'une solution d'anticorps AT1SE à 3,55 mg/ml (soit 0,087 micromole) dans un tampon borate 0,1 M pH 8,8 est ajoutée 23 microlitres d'une solution de N-succinimidyl 3(pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionate à 5,5 mg/ml dans l'éthanol. L'incubation dure 30 minutes puis l'excès de réactif est éliminé 20 par dialyse contre du tampon phosphate 125 m. pH 7. Après dialyse la solution protéique est centrifugée et l'on obtient 3,3 ml d'une solution à 3,4 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol on constate que l'on a obtenu un anticorps activé portant 3,2 grou25 pements disulfure mixte par mole d'anticorps. B) Préparation de l'immunotoxine (conjugué). A 1,9 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenu (soit 0, 043 micromole) on ajoute 5 ml de la solution de trichokirine modifiée précédemment obtenue (soit 0,183 micromole) et on incube 20 30 heures à 25 C en présence de 350 microlitres d'une solution aqueuse molaire d'hydroxylamine. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur colonne de Séphadex G200 avec mesure de la densité optique de l'effluent à 280 nm. Le regroupement des fractions conte- nant à la fois l'anticorps et la TK conduit à 20 ml d'une solution d'immunotoxine à 0,215 mg/ml (soit 4,3 mg). Cette solution contient 0,045 mg/ml de trichokirine modifiée couplée à l'anticorps. Le taux de couplage moyen dans cette préparation est de 1,5 TK par mole d'anticorps. TESTS D'ACTIVITE DES IMMUNOTOXINES. L'une des propriétés de la trichokirine est d'inhiber la synthèse des protéines dans les cellules eucaryotes. Les tests réalisés sont 10 donc des tests d'inhibition de la synthèse protéique: - soit sur un modèle acellulaire, - soit sur un modèle cellulaire. A) Le modèle acellulaire: activité inhibitrice de la toxine. Le protocole in vitro utilise des fractions subcellulaires de foie de rat convenablement complémentées et capables d'incorporer la 14Cphénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel, l'acide polyuridilique. Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14C-phénylalanine 20 est une adaptation de la méthode décrite dans BBA 312, 618-615 (1973), mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. L'échantillon contenant la trichokirine est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon tris-HCl 5OmM pH 7,6 contenant du 25 mercapto-2 éthanol à 0,2 % et de la sérum albumine bovine à 15 microgrammes/mi. A partir des données de comptage on calcule, par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur, le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine pour chaque milieu réactionnel. L'ensemble des valeurs obtenues permet de déterminer la concentration de trichokirine (ou CI50) qui inhibe 50 % de l'incorporation de la 14C-phénylalanine dans les conditions de l'essai. Pour la trichokirine native on a ainsi déterminé que la CI50 est égale 50 à 7.10-1 M, et que celle de la trichokirine modifiée est égale à 2,8 1010 mole/litre. La modification n'entraine donc pas de perte importante d'activité de la trichokirine. B) Cytotoxicité spécifique de l'immunotoxine à trichokirine sur modèle cellulaire. L'activité biologique de la trichokirine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire de systèmes eucaryotes. La technique utilisée met en oeuvre un modèle cellulaire dans lequel on mesure 10 l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire T2, issue d'une leucémie T de souris qui exprime l'antigène de surface Thy 1.2. Les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier à différentes concen15 trations puis, en fin d'incubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de 14C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la procédure décrite dans Journal of Biolugical Chemistry 1974, 249(II), 3557-3562, utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du 20 taux de synthèse protéique. La détermination de la radiocativiré incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets doses présentant en absisse la concentration molaire en trichokirine 25 des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation par les cellules témoins cultivées en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concen30 tration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI50). Le tableau 2 représente les valeurs de CI50 obtenues dans la même expérience avec l'immunotoxine à trichokirine d'une part, la trichokirine non couplée d'autre part. TABLEAU 2 : Produits: Concentration inhibitrice 50: : IT à trichokirine: 2 x 10-0 M: ::: : Trichokirine: 2 x 10-6 M: On peut constater que l'IT à trichokirine a une très forte activité cytotoxique qui est plus de 10.000 fois supérieure à celle de la trichokirine non couplée. Cette nouvelle classe d'immunotoxines peut être utiiisée pour le traitement des affections cancéreuses ou non, pour lesquelles les 15 cellules à détruire seraient reconnues par l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Les modalités optimales d'administration ainsi que la durée du traitement devront être déterminées dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les produits biologiquement actifs de l'invention peuvent être formulés pour l'administration par toute voie convenable. Le plus souvent le principe actif sera administré par injection et il sera formulé dans un liquide stérile apyrogène, de préférence de l'eau qui peut contenir des sels physiologiquement acceptables tels que des 25 tampons ou du chlorure de sodium de façon à obtenir une solution isotonique. Pour un traitement antitumoral, la dose journalière de trichokirine conjuguée à un anticorps, est de préférence comprise entre 1 et 100 mg, avantageusement de 5 à 50 mg et par exemple de 10 mg 30 environ. Les unités de dosage contenant la trichokirine sous forme de conjugué, par exemple des ampoules pour injection, contiendront donc habituellement de 1 à 100 mg de conjugué de trichokirine. 260 1 680 REVENDICATIONS 1. Protéine inhibant les ribosomes, nommée trichokirine, ayant les caractéristiques suivantes: c'est une glycoprotéine: - ayant un poids moléculaire 28.000 + 3.000 déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium; - de point isoélectrique 9 + 1; - de contenu en sucres neutres de 1,1 à 1,3 % en poids dont 0,3 10 à 0,6 % de mannose; - de composition en acides aminés, en nombre de résidus/mole de protéine avec un écart en plus ou en moins de 20: Lys: 17,3; His: 1,1; Arg: 6,7; Asx: 22,7; Thr: 18,9; Ser: 23,4; Glx: 21,5; Pro: 8,0; Gly: 16,0; Ala: 21,1; 1/2 Cys: 1,9; Val: 12,5; Met: 3,05; Ile: 15,7; Leu: 24,2; Tyr: 12,1; Phe: 10,1; Trp: n.d.. telle que Asx est l'ensemble de résidus d'acide aspartique et d'asparagine Glx est l'ensemble de résidus d'acide glutamique et de glutamine et n.d. signifie non déterminé. - dont la séquence amino-terminale est: 1 10 Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly16 Thr-Ala-Ser-Tyr-Glu-Lys ainsi que ses dérivés modifiés contenant un groupe SH libre ou bloqué. 2. Mercaptosuccinates de trichokirine de formule: TK -( CO - CH - S - W) CH2COOH 2. dans laquelle TK représente le radical de la trichokirine, W représente l'hydrogène ou le groupe acétyle et n peut varier entre 0,2 et 3. 3. Mercaptosuccinates de trichokirine selon la revendication 2 caractérisé en ce que, dans sa formule, n varie entre 0,4 et 1. 4. Mercaptosuccinates de trichokirine selon l'une des revendications 10 2 ou 3 caractérisé en ce que, dans sa formule, W est l'hydrogène et n est 0,7. 5. Mercaptosuccinates de trichokirine selon l'une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que, dans sa formule, W est acétyle et n est 0,7. 6. Procédé pour la préparation de la trichokirine, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait des graines de Trichosanthes kirilowii par une solution aqueuse tamponnée à pH 6,5-7,5, on élimine le matériau insoluble et on fractionne l'extrait brut par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions 20 faiblement acide, en éluant avec une solution tampon contenant du chlorure de sodium 0,3 - 0,6 M à un pH do 7,2-7,7, et on récupère la fraction protéique inhibitrice et purifie la protéine par filtrati.on sur gel. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'on élimine 25 de l'extrait par dialyse, les produits de faible masse moléculaire. 8. Procédé pour la préparation de trichokirinesmodifiéesdécritesdans l'une des revendications 2 à 5 caractérisé en ce qu'on fait réagir sur la trichokirine l'anhydride S30 acétylmercaptosuccinique. 9. Utilisation de la trichokirine ou de ses dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation des conjugués, par couplage aux haptomères. 260 1680 10. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif une immunotoxine à trichokirine selon la revendication 1.