Brevet FR2605839A1 — publié le 19880506

La présente invention a pour objet un procédé de régénération de plantes de tournesol, à partir de cellules ou de tissus, par embryogénèse somatique. La présente invention a aussi pour objet les plantes et graines de tournesol produites par cette méthode. Bien que l'on puisse régénérer des plantes à partir de cellules isolées ou de tissus d'un grand nombre d'espèces cultivées, les efforts avec le tournesol (Helianthus annus) ont souvent été vains. Quelques méthodes sont décrites dans la littérature, relatives à la régénération du tournesol par embryogénèse somatiques, mais ces méthodes ne concernent que de rares génotypes, ou des hybrides interspécifiques. Des explants sont cultivés sur un premier milieu qui induit la formation d'un cal. Le cal est ensuite transféré sur un second milieu qui induit la formation d'embryons somatiques et de plantules. Puis les plantules sont transférées sur un troisième milieu qui induit la formation de racines et, à ce stade, les plantes régénérées peuvent être plantées en terre. PATTERSON et EVERETT (Plant Sci., 1985, 42, 125) ont mis au point un milieu, optimisation de celui de GEORGIEVA-TODOROVA et al (Proc. 9th Int. Sunflower Conference, Torremolinos, Spain, 1980, 122) qui induit la régénération d'une espèce cultivée de tournesol, SS 415 B, par embryogénèse somatique à partir de fragments d'hypocotyles. Les explants sont cultivés à l'obscurité pendant 2 semaines, puis à la lumière pendant 2-4 semaines sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) modifié, complémenté à 40 mg/1 d'adénine sulfate, 1 mg/1 de 6-benzylaminopurine (BAP), lmg/l d'acide naphtalène acétique (ANA) et 0,1 mg/1 de gibbéreline (GA3). Pendant les 2 premières semaines il y a formation d'un cal friable, puis on voit apparaître à la lumière des taches vertes qui se transforment en pousses. Une étude anatomique révèle que ces taches vertes sont des embryons somatiques similaires aux embryons zygotiques. CHANDLER et JAN (Agronomy Abstr., 1983, 58) décrivent la régénération du tournesol à partir d'embryons immatures issus de croisements interspécifiques. Les embryons immatures (4 à 5 jours) sont placés sur le milieu de croissance décrit par CHANDLER et BEARD pour le sauvetage d'embryons (Crop Sci., 1983, 23, 1004). Après 2 à 3 semaines, les embryons qui ont grossi sont transférés sur différentes formulations ayant pour base le milieu MS, avec des doses variables d'auxine et de cytokinine. La production de plantes sur ces milieux suit différentes voies, y compris la germination directe ou l'induction de cal suivie d'organogénèse ou d'embryogénèse. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des concentrations d'acide indole acétique (AIA) et de kinétine entre O et 1 ppm. L'avantage de ce système est la production multiple de clones à partir d'un seul embryon. COOLEY et WILCOX (demande de brevet européen 0172-37) proposent un procédé appliqué à des cultivars de tournesol HA 89 et RHA 274 comprenant les trois étapes décrites ci-dessus et effectuées sur trois milieux de cultures distincts, les milieux de culture des deux premières étapes contenant nécessairement une hormone de type auxinique. Cependant ce procédé présente plusieurs inconvénients d'une part d'être applicable à des embryons de taille comprise dans une zone étroite (de 0,1 à 2 mm) donc avec peu de souplesse, d'autre part de nécessité un changement de milieu entre la première et la seconde étape, enfin que le taux de régénération des plantules obtenu reste encore très insuffisant. La présente invention concerne un procédé de régénération de cultivars de tournesol, plus simple et conduisant à des plantules de capacité améliorée de reprise en enflure en terre. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de régénération de cultivars de tournesol à partir d'embryons immatures, comprenant successivement: - une première étape de formation de cals embryogènes à partir de cellules ou de tissus par culture dans un milieu nutritif d'induction contenant une hormone; - une seconde étape de culture des cals embryogènes pour leur croissance, leur développement et leur germination dans un milieu contenant une hormone; - une troisième étape consistant en une culture permettant la croissance et le développement de plantes; caractérisé en ce que les deux premières étapes sont effectuées sur un milieu de même nature et que ce milieu contient une quantit& efficace d'une hormone de type cytokinine. Les tissus végétaux d'o on peut tirer des explants pour la production d'embryons somatiques proviennent de cultivars de tournesol Relianthus annuus utilisés dans les programmes de sélection. L'exemplification est faite avec deux cultivars mainteneurs HA 89 B et T 76 B et un cultivar restaureur, RT 26. La variété HA 89 B provient de Dade Counts, Floride, et les variétés T 76 B et RT 26 de Seedtec International Inc., Woodland, Californie. Les explants sont issus de plantes cultivées en serre et soumises à une fécondation contr6l&e. L'explant préféré pour la production de cals est l'embryon immature. Les embryons immatures avec péricarpes sont isolés des capitules de tournesol lorsqu'ils sont agis de 4 à 19 jours; leur taille est gén&ralement comprise entre 0,1 et mm. Les embryons immatures de taille importante peuvent être coupés en plusieurs parties égales selon des plans passant par l'axe gemmule radicule, ce qui multiplie le nombre de clones obtenus à partir d'un seul embryon. Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de la façon suivante: Des variétés de tournesol HA 89 B, T 76 B et RT 26 sont cultivées en serre (26'C, 40 000 lux, photopériode de 15 h par jour) et soumises à une fécondation contr8ôlée. Les embryons immatures sont prélevés 4 à 19 jours après pollinisation. Les graines détachées des capitules sont stérilisées par immersion 20 minutes dans une solution d'eau de javel commerciale à 3 C1 additionnée de quelques gouttes d'un mouillant Tween 80 condensat de 8-10 moles d'oxyde d'éthylène sur le nonylphénol, puis lavées 3 fois à l'eau distillée stérile. Les embryons sont ensuite isolés en conditions d'asepsie éventuellement coupés et déposés sur le premier milieu dit d'induction des embryons. Ce premier milieu comprend des sels minéraux, des vitamines, un acide aminé, du sucrose et une hormone en quantité suffisante pour la formation de cals. Les sels minéraux comprennent des sels de macro-élements et des sels d'oligo-éléments. Les macro-éléments utilisés dans ce premier milieu peuvent être choisis par exemple parmi les composés suivants: sulfate de magnésium, chlorure de calcium, phosphate monopotassique, nitrate de potassium et nitrate d'ammonium. Parmi les sels à base d'oligo-éléments on peut citer: l'acide borique, le sulfate de manganèse, le sulfate de zinc, le molybdate de sodium, le sulfate cuivrique, le chlorure de cobalt, l'iodure de potassium, et le chélate de fer Na EDTA. Cette combinaison de sels minéraux est connue sous le nom de Murashige et Skoog (MS). Des quantités préférées de macro-éléments et d'oligo-éléments pour un litre de milieu sont les suivantes: - 370 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, - 440 mg de chlorure de calcium d'hydraté, - 170 mg de phosphate monopotassique dihydraté, - 1900 mg de nitrate de potassium, 1650 mg de nitrate d'ammonium, - 6,2 mg d'acide borique, - 22,3 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté, - 8,6 mg de sulfate de zinc heptahydraté, - 0,25 mg de molybdate de sodium dihydraté, - 0,025 mg de sulfate cuivrique pentahydraté, - - 0,025 mg de chlorure de cobalt hexahydraté, - 0,83 mg d'iodure de potassium, - 36,7 mg de chélate de fer Na EDTA. Le premier milieu contient aussi des vitamines telles que l'acide nicotinique, la thiamine, la pyridoxine, le myo-inositol et un acide aminé tel que alanine glutamine, serine, tryptophane, cystéine et de préférence la glycine. Les quantités préférées de vitamines et d'acide aminé pour un litre de milieu sont: - 0,5 mg d'acide nicotinique, - 0,1 mg de chlorhydrate de thiamine, - 0,5 mg de chlorhydrate de pyridoxine, - 100 mg de myo-inositol, - 2 mg de glycine. Le sucrose contenu dans le premier milieu est présent à raison de 8 à 12 %, de préférence 9 Z. L'hormone du premier milieu, dont le choix est une caractéristique de l'invention, est de type cytokinine, par exemple la kinétine ou la 6-benzylaminopurine, et de préférence cette dernière. Généralement, des quantités de 0,5 à 1 mg par litre de milieu conviennent. Une gélose telle que le Phytagar ou le Gelrite est utilisé pour rendre le milieu solide. Une concentration finale de 0,6 Z pour le Phytagar ou de 0,3 Z pour le Gelrite donne de bons résultats. Le pH du milieu peut varier de 5,0 à 6,3 et est de préférence 5,5. Le milieu est stérilisé en autoclave à l'exception des hormones qui sont stérilisées par filtration sur membrane microporeuse. Les embryons immatures, déposés sur ce premier milieu, sont cultivés pendant environ 2 à 3 semaines à l'obscurité, à 26 C. Pendant cette période les embryons zygotiques se développent et des embryons somatiques apparaissent au niveau de l'hypocotyle. Ensuite, les embryons somatiques peuvent être isolés et déposés sur le deuxième milieu dit milieu de croissance des plantules. Le cal embryogène ou les embryons isolés sont cultivés sur le second milieu pendant 2 à 3 semaines à 26 C à la lumière (1500 lux) avec une photopériode de 12 à 16 h par jour, de préférence 16 h par jour. Pendant cette période, les embryons germent et les plantules formées développent éventuellement des racines. Le deuxième milieu contient, comme le premier milieu, des sels minéraux, des vitamines, un acide aminé, du sucrose et une hormone. Les sels minéraux comprennent des sels de macro-éléments et des sels d'oligo-éléments. Les macro-éléments, les oligo-éléments, les vitamines et l'acide aminé sont les mêmes que dans le premier milieu, en concentrations identiques. Le sucrose est présent en quantité de préférence inférieure à celle du premier milieu par exemple de 2 à 4 %, de préférence 3 Z. L'hormone utilisée est une cytokinine, de préférence identique à (mais pouvant être différent de) celle du premier milieu de préférence la 6benzylaminopurine. Généralement des quantités de 0,1 à 0,5 mg par litre conviennent. Une gélose telle que Phytagar ou le Gelrite est utilisée pour rendre le milieu solide. Une concentration finale de 0,6 Z pour le Phytagar et de 0,3 % pour le Gelrite donne de bons résultats. Le milieu est stérilisé comme précédemment, et a un pH de 5,0 à 6,3, avec une préférence pour un pH de 5,5. Après 2 à 3 semaines sur le second milieu, les embryons somatiques isolés ont germé et se sont transformés en plantules de 2 à 5 cm. Les plantules qui ont développé des racines peuvent être passées en terre, dans un mélange de tourbe, vermiculite, sable fin (3:2:1) contenu dans des Jiffypots; les pots sont placés dans un bac rempli de sable humide et recouverts d'un sac de polyéthylène transparent pour maintenir un haut degré d'humidité. L'ensemble est placé dans une chambre climatique à 15 C (6000 lux), avec une photopériode de 12 à 16 h par jour, de préférence 15 h par jour. Après 10 jours, les plantes sont passées dans des pots plus grands et cultivées en serre à 26 C (40 000 lux), avec une photopériode de 12 à 16 h par jour, de préférence 15 h par jour. Les plantes qui n'ont pas développé de racines peuvent être soit greffées sur des jeunes plantes cultivées en serre selon une méthode classique (cf. , par exemple, HABERMANN et WALLACE, Amer. J. Bot., 1958, 45, 479) soit transférées pour une période de 10 à 20 jours sur un milieu d'enracinement, ou troisième milieu. Le troisième milieu comprend des sels minéraux, des vitamines et du sucrose. Les sels minéraux comprennent des sels de macro-éléments et-des sels d'oligo-éléments. Les macro-éléments utilisés dans ce troisième milieu peuvent être choisis parmi les composés suivants: sulfate de magnésium, chlorure de calcium, phosphate monosodique, nitrate de potassium, et sulfate d'ammonium. Parmi, les sels à base d'oligo-éléments, on peut citer l'acide borique, le sulfate de manganèse, le sulfate de zinc, le molybdate de sodium, le sulfate cuivrique, le chlorure de cobalt, l'iodure de potassium et le chélate de fer Na EDTA. Cette combinaison de sels minéraux est connue sous le nom de BS. Les quantités préférées de macro-éléments et d'oligo-éléments pour un litre de milieu sont les suivantes: - 250 mg de sulfate de magnésium heptahydrati, - 150 mg de chlorure de calcium dihydraté, - 169 mg de phosphate monosodique monohydraté, - 3 000 mg de nitrate de potassium, - 3 mg d'acide borique, - 13,2 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté, - 2 mg de sulfate de zinc heptahydrati, - 0,25 mg de molybdate de sodium dihydraté, - 0,025 mg de sulfate cuivrique pentahydraté, - 0,025 mg de chlorure de cobalt hexahydraté, - 0,75 mg d'iodure de potassium, - 40 mg de chélate de fer Na EDTA. Le troisième milieu contient aussi des vitamines. Ce sont l'acide nicotinique, la thiamine, la pyridoxine et le myoinositol. Les quantités préférées de vitamines sont, pour un litre de milieu: - 1 mg d'acide nicotinique, - 10 mg de chlorhydrate de thiamine, 1 mg de chlorhydrate de pyridoxine et, - 100 mg de myo-inositol. Le troisième milieu contient également du sucrose et du charbon activé. Le sucrose est présent par exemple à raison de 1 à 2 Z, de préférence 1 Z, et le charbon activé à raison de 0,1 Z. Une gélose telle que le Phytagar ou le Gelrite est utilisée pour rendre le milieu solide. Une concentration finale de 0,5 Z pour le Phytagar et de 0,25 Z pour le Gelrite est suffisante. Le pH du milieu peut varier de 5,0 à 6,0 et est de préférence 5,0. Le milieu est stérilisé en autoclave. Les plantes sont cultivées sur ce milieu pendant 2 à 3 semaines à 26'C à la lumière (1500 lux), avec une photopériode de 12 à 16 h par jour, et de préférence 16 h par jour. Les plantes forment alors des racines, et peuvent être passées en terre. Les plantes obtenues par ce procédé peuvent être phénotypiquement différentes du matériel de départ, du fait du stress in vitro. Les plantes sont pollinisées à la main et conservées jusqu'à la récolte des graines. Quelques unes des graines sont plantées pour l'analyse des nouveaux plants de tournesol et la sélection d'éventuels mutants intéressants qui sont alors intégrés dans un programme de sélection variétale. La présente invention sera décrite de manière plus complète mais non limitative dans les exemples ci-dessous: Exemple I - Préparation des solutions mères a) Solution mère de B5 Une solution mère de B5, 10 fois concentrée, est préparée en dissolvant un sachet de milieu B5 sans sucrose de Flow Laboratories (contient les sels minéraux du B5, 1 mg d'acide nicotinique, 1 mg de pyridoxine HC1, 10 mg de thiamine HCl et 100 mg d'inositol, concentration finales) dans 1 000 ml (volume final) d'eau distillée et déionisée. La solution mère est divisée en aliquotes de 100 ml et conservée à - 20 C. b) Solution mère de BAP La solution de BAP à 1 g/1 est préparée en dissolvant 100 mg de 6-benzylaminopurine dans quelques ml d'HCl 0,15 N, en chauffant légèrement, et en diluant à 100 ml avec de l'eau distillée et déionisée. Cette solution est stérilisée par filtration sur une membrane Minisart NML 0,2 p (Sartorium) avant son addition aux premier et deuxième milieux. Exemple II - Préparation des milieus a) Premier milieu ou milieu d'induction des embryons Il est préparé par dissolution d'un sachet de milieu de Murashige et Skoog sans sucrose de Flow Laboratories (contient les sels minéraux de MS, 0,1 mg de thiamine HC1, 0,5 mg d'acide nicotinique, 0,5 mg de pyridoxine HC1, 2 mg de glycine et 100 mg d'inositol) et 90 à 120 g de sucrose dans de l'eau distillée et déionisée. Le pH est ajusté à 5,5 avec de la soude 0,1 N, le volume amené à 1 litre, et après addition de 6 g de Phytagar (Gibco) ou 3 g de Gelrite (Kelco), le mélange est autoclav4 20 minutes à 120 psi. Quand le milieu est tiède on y ajoute 0,5 à 1 ml de la solution de BAP (2,2 - 4,4 uM) stérilisée comme décrit plus haut. Le mélange est ensuite coulé en boites de Pétri. b) Deuxième milieu ou milieu de croissance des plantules. Le deuxième milieu est préparé de façon identique au premier milieu, en dissolvant ensemble un sachet de milieu MS, 30 g de sucrose et 6 g de Phytagar ou 3 g de Gelrite dans un litre d'eau, et en ajoutant après autoclavage 0,1 à 0,5 ml de la solution de BAP stérile (0,44 - 2,2 "M). Le milieu est coulé dans des boites Plantcon (Flow Laboratories). c) troisième milieu ou milieu d'enracinement Le troisième milieu est préparé en ajoutant 10 à g de sucrose à 100 ml de la solution mère de B5, dans de l'eau distillée et déionisée. Le pH est ajusté à 5,0 par de la soude 0,1 N, puis le volume est amené à 1 litre et on ajoute, au mélange 5 g de Phytagar et 1 g de charbon activé. Après autoclavage le milieu est coulé dans des Mason jars. Une variante liquide du troisième milieu comprend uniquement les sels minéraux du B5 et 1 Z de sucrose, à pH ,0. Le mélange est distribué par fractions de 10 ml dans des tubes de verre contenant des ponts de papier filtre, selon la méthode décrite par CHANDLER et BEARD (Crop Sci., 1983, 23, 1004), puis autoclavé. Exemple III Les embryons immatures avec leurs péricarpes sont séparés du capitule de tournesol (Helianthus annuus, var. T 76 B) quand ils atteignent 0,5 à 1,5 mm. Les graines sont stérilisées 20 minutes dans une solution d'eau de javel à 3"C1, et rincées à l'eau distillée. Les embryons immatures sont séparés de leurs enveloppes et déposés en boites de Pétri sur le premier milieu. Le premier milieu est préparé de la façon décrite ci-dessus, avec 90 g de sucrose et 0,5 mg/1 de BAP (2,2 uM). Les boites de Pétri sont incubées à l'obscurité pendant 3 semaines pour induire la formation d'embryons somatiques. A ce stade, les embryons somatiques qui ont commencé à germer sont séparés de l'embryon zygotique et déposés sur le second milieu, dans des boites Plantcon. le second milieu, préparé comme décrit plus haut, contient 0,1 mg de BAP par litre, soit 0,44 uM. Les embryons sont cultivés à la lumière pendant 3 semaines, et se différencient en plantules. - Les plantules de 2 à 5 cm de hauteur sont ensuite transférées sur le troisième milieu pour initier la il formation des racines. Le troisième milieu, préparé comme décrit précédemment contient de préférence 10 g de sucrose. Dans le cas du milieu gélifié, l'addition de 1 g/l de charbon activé élimine l'influence résiduaire du BAP fourni par le milieu précédent (MAENE et DEBERGH, PLant Cell Tissue Organ Culture, 1985, 5 23-33) et favorise une croissance rapide des racines. Après environ 2 semaines, les plantules peuvent être passées en terre. Si les plantules ont commencé à développer des racines sur le deuxième milieu, elles peuvent être mises en contact du troisième milieu liquide, selon la technique décrite par CHANDLER er BEARD (Crop Sci. 1983, 23, 1004). Ce dispositif permet un développement important du système racinaire, et évite de blesser les racines lors du passage en terre. Exemple IV Les embryons immatures de Helianthus annuus, var. HA 89 B, sont prélevés quand ils atteignent 0,1 à 0,5 mm et déposés, avec l'endosperme, sur le premier milieu. Le premier milieu contient 90 g de sucrose et 0,5 mg de BAP par litre, soit 2,2 uM. Après 3 semaines à l'obscurité, les embryons somatiques sont isolés et déposés sur du premier milieu frais, toujours à l'obscurité. Des embryons somatiques secondaires vont se former sur les embryons isolés. Après 8 semaines à l'obscurité, les embryons somatiques secondaires sont isolés et déposés sur le deuxième milieu. Le deuxième milieu contient 30 g de sucrose et 0,1 mg de BAP par litre (0,44 pM). Les plantules qui vont se développer pourront ensuite être transférées sur le troisième milieu, liquide ou gélifié, pour s'enraciner. Elles seront ensuite passées en terre. Exemple V Les embryons immatures de Helianthus annuus, var. HA 89 B, sont prélevés 19 jours après pollinisation; ils ont une taille de 5 mm. Ils sont séparés de leurs enveloppes et, avant d'être déposés sur le premier milieu, ils sont coupés en quatre parties égales, longitudinalement, selon deux plans perpendiculaires entre eux et parallèles à l'axe gemmule-radicule. Dans ce cas, le premier milieu contient 90 g de sucrose et 1 mg de BAP par litre. Après 3 semaines à l'obscurité, les embryons somatiques sont isolés et déposés sur le deuxième milieu. Le deuxième milieu contient 30 g de sucrose et 0,5 mg de BAP par litre. Les plantules qui vont se développer pourront ensuite être transéférées sur le troisième milieu ( liquide ou gélifié) pour s'enraciner, puis passées en terre. Les plantules qui n'ont pas fait de racines peuvent être greffées sur une jeune plante, selon la méthode décrite par HABERMANN et WALLACE (Amer. J. Bot., 1958, 45, 479). Exemple 6-22 Les exemples ci-dessous donnent une idée non - exhaustive des combinaisons que l'on peut effectuer en utilisant les différentes modalités décrites. Milieu I Milieu II I I I I I I IBAPI I IBAPI I IExem-lVarii-lTaillel Sec-lMilieu lSucro-img/ iMilieu ISucro-Img/ EnraciI Iple | té 12 (mm)Itionslde baselse Z | 1 Ide baselse Z I l Inement | II I I I I I I I I II II I I I I I I I I II I 6 1 76 B 1 I 1 1 1 1 1 1+3% su- I I I I I I I I I I Icrose+1 I I I I II 1 I I0,5 BAPI 1 " " - " 1 1 1 " " 1 1 III S s 1 8 I"I - "905 "I "...III L 1 9 " " - S I 9 1MS | " 1 III S | 10 " " - " | 12 10,51 " " 10,ll III S 211 1" " - " " I" I " I " III L 1 12 " 1 13 |" " " I" " | III L L 1 14 |", 5 + | 1 9 10,51 " 10,51 III S 1 15 1" 1" | + | "I " 1 1 1 ' |'III L " I_16 IRT 26 1 4.1,5 |- I MS I 12 10,51 MS I 3 10,l1 III L | 1 17 89 B I | 18 " I. 1 19 " " - " " I" I " 1 III L 20 " - 5 + I " 9 10,51 " " I " III S I 21 " " + -" 1 " I " - " "III L 22 " >5 + " 9 1 " " I "ZIII S I II I I I I I I I I I * Le milieu MS modifié contient 600 mg de chlorure de calcium dihydrate, 1260 mg de nitrate de potassium, 1100 mg de nitrate d'ammonium et 250 mg de myo-inositol par litre de milieu. Les autres éléments restent inchangés. III S = milieu III solide III L - milieu III liquide REVENDICATIONS 1) Procédé de régénération de cultivars de tournesol Helianthus annuus par embryogénèse somatique à partir de cellules ou de tissus comprenant successivement: - une étape de culture de tissus de tournesol dans un milieu nitritif d'induction contenant une hormone pour la formation de cals embryogènes et d'embryons somatiques, et la croissance des dits embryons; - une seconde étape consistant en une culture permettant la germination des dits embryons et leur développement en plantes éventuellement pourvues de racines, sur un milieu dit de croissance des plantules; - éventuellement une troisième étape pour la croissance ou la formation des racines des dites plantes sur un milieu dit d'enracinement; caractérisé en ce que les deux premières étapes sont effectuées sur un milieu de même nature et que ce milieu contient une quantité efficace d'une hormone de type cytokinine. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les dits tissus sont des embryons immatures. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que l'hormone est choisie dans le groupe comprenant la kinitine, la 6-benzyl aminopurine, la 2-isopentyladénine et la zéatine. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'hormone est la 6-benzylaminopurine à des concentrations de 0,1 à 8,uM dans les ler et 2ème milieux. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les concentrations de 6-benzylaminopurine sont de 2, 2 - 4,4 puM dans le premier milieu, et de 0,44 - 4,4 uM dans le deuxième milieu. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les deux premiers milieux contiennent du sucrose, à des concentrations de 8 % - 12 % dans le premier milieu et de 2 % - 4 % dans le deuxième milieu. 7) Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les concentrations en sucrose sont de 9 % dans le premier milieu et de 3 % dans le deuxième milieu. 8) Procédé selon l'une revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'on utilise comme premier milieu un milieu de type Murashige et Skoog (MS). 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le second milieu contient des sels minéraux, des vitamines et une acide aminé en quantités identiques à celles du premier milieu. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on met en culture des embryons immatures âgés de 4 à 19 jours, et de taille comprise entre 0,1 et 5 mm, et que lesdits embryons peuvent être découpés en plusieurs fragments rigénérables. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'on utilise les cultivars T 76 B, 89 B ou RT 26. 12) Procédé selon les revendications 1 et 11, caractérisé en ce que, après la seconde étape, les plantes obtenues sont mises en culture d'induction racinaire. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que, après la seconde étape, les plantes porteuses de racines sont passées en terre et incubées dans une chambre climatique à 15"C, avec une intensité lumineuse de 6000 lux et une photopériode de h par jour. 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que, après la seconde étape, les plantes obtenues sont greffées. ) Un plant de tournesol produit par le procédé selon l'une des revendications 1 à 14. 16) Les graines produites par le plant de tournesol selon la revendication 15.