Brevet FR2601678A1 — publié le 19880122

Peptides comprenant la séauence séryl-aspartyl-lysyl- rolvle. procedé Pour l'extraction du tétraDeDtide correspondant. et alications. notamment à la protection de la moelle osseuse au cours de traitements anticancéreux par la chimiothéraple L'invention a pour objet un nouveau tétrapeptide agissant en tant qu'inhibiteur de l'entrée. en cycle des cellules souches hématopoiétiques, les peptides de bas poids moléculaire contenant la séquence tétrapeptidique en question, ainsi que leurs dérivés usuels dans le domaine des peptides à activité biologique. L'invention a également pour objet un procédé pour l'extraction de ce tétrapeptide à partir de substances biologiques, notamment de moelle de veau foetal. Elle a en outre pour objet les applications de ces différents peptides en biologie et en médecine, notamment dans la protection de la moelle osseuse au cours de traitements anticancéreux par la chimiothérapie. L'utilisation des médicaments dans le traitement des cancers est limitée par leurs effets toxiques sur les tissus sains, et en particulier, sur le tissu hématopolétique. L'usage répété de ces drogues entraine dans un grand nombre de cas soit une aplasie médulaire létale, soit une leucémie secondaire, soit des séquelles hématologiques moins graves. Comme la plupart des médicament; anticancéreux n'agissent que sur les cellules en prolifération, les demandeurs ont pensé qu'il était possible de prévenir des dommages hématologiques en protégeant les cellules souches pluripotentes par des inhibiteurs de la prolifération. Les travaux effectués par les demandeurs et publiés précédemment (voir notamment E. Frindel et M. Guigon, Exp. Hemat., 5 (1977), 74-76, M. Guigon et E. Frindel, Bull. Cancer 68(2), (1981), 150-153, J. Wdzieczak-Bakala, M. Lenfant et M. Guigon, IRCS Med. Sci., 12 (1984), 868-869, J. Wdzieczak-Bakala, M. Guigon, M. Lenfant et E. Frindel, Biomed. Pharm., 12 (1983), 467-471, et M. Guigon, J. Wdzieczak-Bakala, J. Y. Mary-et M. Lenfant, Cell Tissue Kinet. 17 (1984), 49-55) ont montré qu'il était possible de réduire d'une façon significative, par administration d'un inhibiteur spécifique des cellules souches, la létalité observée chez les animaux au cours de traitements par la cytosine arabinoside (Ara-C), un médicament couramment utilisé en chimiothérapie du cancer, dont l'utilisation est limitée par son effet nocif sur la moelle osseuse. Cet inhibiteur spécifique qui est extrait de certaines substances biologiques, notamment de moelle osseuse ou de foie de foetus de veau, protège les cellules souches qui sont à l'origine de toutes les lignées sanguines. En effet, les études biologiques effectuées montrent que l'augmentation de survie observée peut être attribuée à une protection des cellules souches hémopolétiques, CFU-S (colon porming Units in the Spleen unités formant des colonies dans la rate), c'est-à-dire des cellules souches pluripotentes capables de donner naissance à des clones dans la rate des souris irradiées à dose létale, cette protection étant due au maintien desdites cellules hors du cycle cellulaire, par l'inhibiteur. Les documents publiés décrivent des techniques permettant d'obtenir des extraits plus ou moins purifiés contenant l'inhibiteur spécifique, mais dans tous les cas le produit finalement obtenu n'est pas homogène et les rendements sont peu satisfaisants. Il n'avait donc pas été possible jusqu'à présent d'isoler le principe actif et d'établir sa structure. Or les demandeurs ont maintenant mis au point un nouveau procédé d'extraction qui permet d'obtenir une fraction active homogène à partir d'une matière biologique, notamment de moelle de veau foetal. Ce procédé comprend essentiellement les étapes consistant à - broyer la matière de départ avec Si nécessaire délipidation, - mettre le produit obtenu en suspension dans du tampon à un pH voisin de 7, en présence d'un réactif réducteur soufré, notamment du dithioérythritol ou de préférence du mercaptoéthanol, - centrifuger l'homogénat à environ 15 000 g pendant au moins 1 heure, - soumettre le surnageant à une ultrafiltration sur membrane ayant une limite d'exclusion voisine de 10 000 daltons, - soumettre l'ultrafiltrat obtenu à une chromatographie sur tamis moléculaire de type gel de polyacrylamide, avec élution par une solution diluée d'acide acétique, - soumettre la fraction active recueillie à un fractionnement sur un support en phase inverse en silice greffée par. des résidus aliphatiques, notamment en C18, en répétant de préférence au moins une fois cette étape; et - soumettre a nouvelle fraction active recueillie à une chromatographie liquide haute pression sur colonne en phase inverse en silice greffée par des résidus aliphatiques, notamment en C18, pour obtenir une fraction active homogène. La 1fraction active est identifiée par des tests biologiques, notamment tels que decrits dans la partie expérimentale qui suit. Un exemple détaillé, non limitatif, de mise en oeuvre de ce procédé d'extraction est donné dans la partie expérimentale du présent mémoire. La combinaison de différentes techniques d'analyse, notamment RMN, spectrométrie de masse et analyse du contenu en acides aminés par chromatographie liquide haute pression (HPLC) a permis de déterminer la structure du produit homogène ainsi isolé. Ce produit est un tétrapeptide acétylé de masse moléculaire 487, répondant à la formule Ser (N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH ou N-acétyl-séryl-aspartyl-lysyl-proline. Les résultats décrits antérieurement ne permettaient pas de penser que l'activité observée des extraits plus ou moins purifiés obtenus pouvait être due à un tétrapeptide du type susindiqué. En effet, on avait notamment constaté un effet protecteur du mercaptoéthanol sur la fraction inhibi- trice qui semblait dû à la présence de groupes thiol dans la molécule d'inhibiteur, la présence de tels groupes ayant été établie dans la fraction inhibitrice relativement purifiée obtenue précédemment (voir IRCS Med. Sci. 12, (1984), 868-869). De même, des résidus de sucres ayant été détectés, on pensait que le principe actif pouvait être de type glycopeptide, cette supposition étant confortée par le fait que l'inhibiteur en question peut être classé parmi les chalones ou anthormones et que la plupart des substances de ce type sont glycosylées. L'invention a donc pour objet le tétrapeptide Ser-Asp-Lys-Pro-OH et ses dérivés usuels dans la chimie des peptides à usage biologique, notamment ses dérivés acétylés et méthylés, notamment le dérivé monoacétylé sur l'azote terminal, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. L'invention a en outre pour objet les peptides de poids moléculaire inférieur à 2000 comprenant la séquence -Ser-Asp-Lys-Proainsi que leurs dérivés usuels dans la chimie des peptides à usage biologique, notamment leurs dérivés acétylés et méthylés, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Le tétrapeptide Ser-Asp-Lys-Pro-OH peut être obtenu par extraction à partir de matières biologiques, notamment à partir de foie ou de moelle de veau foetal. Il peut notamment être obtenu par le procédé décrit de façon générale plus haut et plus en détail dans la partie expérimentale. Il est alors sous forme acétylée (en position N-terminale) et peut être utilisé tel quel ou bien être désacétylé selon des techniques classiques dans la chimie des peptides. Il peut également être obtenu par synthèse peptidique. Les peptides de poids moléculaire inférieur à 2000 tels que définis plus haut peuvent être obtenus par allongement de la chaîne peptidique -Ser-Asp-Lys-Pro- obtenue par extraction, ou plus simplement par synthèse peptidique "totale". L'inhibiteur obtenu selon l'invention ne semble pas présenter de spécificité d'espèce (dans les essais décrits ici il est extrait de la moelle-de foetus de veau et actif chez la souris) ; il est donc envisageable de l'utiliser, ainsi que ses dérivés (c'est-à-dire ses dérivés de substitution et les peptides comprenant sa séquence), de même que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dans de nombreuses applications médicales et biologiques, chez l'homme et l'animal. Ces composés peuvent être utilisés pour la protection de la moelle osseuse au cours des traitements anticancéreux par la chimiothérapie. Dans ce cas ils sont avantageusement formulés à l'état de poudre et administrés, en présence d'adjuvants et/ou excipients usuels, par voie-i.v ou s. cl au cours du traitement chimiothérapeutique. La fréquence des administrations et la quantité de produit administré dépendent essentiellement de la cinétique des cellules souches qui peut varier suivant l'agent thérapeutique, sa posologie et le protocole de son utilisation. D'autres modes "d'administration" peuvent être envisagés, par exemple celui consistant à faire produire l'inhibiteur dans l'organisme du patient en ayant recours aux techniques du génie génétique, par exemple par l'intermédiaire de bactéries. Le tétrapeptide et ses dérivés selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisés pour l'obtention d'anticorps spécifiques pour le dosage du taux d'inhibiteur circulant chez les patients et la détermination de son rôle dans certaines maladies du système hématopolétique, ainsi qu'au cours de greffes de moelle. L'usage de ces anticorps, dans le cas d'hyperproduction de l'inhibiteur liée à des pathologies, peut également être envisagé. Extraction du PePtide N-acétvl-servl-asPartyl-lvsvl- doline. La matière première est constituée de moelle osseuse de veau foetal conservée congelée. A chacune des étapes décrites ci-dessous, les fractions isolées sont additionnées de mercaptoéthanol à la concentration finale 10 2 M. 5 kg de tissu sont broyés au moyen d'un homogénéisateur de type Waring blender (3 fois, 60 sec.) dans 40 1 de tampon phosphate 102M, pH 7,2 en présence de mercaptoéthanol 10 2 M à 4'C. La suspension est centrifugée à 15 000 g pendant 1h30. Le surnageant recueilli est ultrafiltré sur membrane de type Sartorius 121 36 qui permet de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire et dont la limite d'exclusion est de 104 daltons. L'ultrafiltrat est concentré 20 fois par évaporation sous vide au moyen d'un évaporateur de type *flash évaporateur" (LUWA). Le concentré est ensuite lyophilisé. Le rendement est de 16,5 g/kg et la fraction est active chez la souris à raison d'environ 20 mg/souris (activité déterminée selon l'un ou l'autre des protocoles décrits plus loin). La poudre lyophilisée (50 g) est ensuite redissoute dans 200 ml d'une solution d'acide acétique 10 2M (pH 3) puis centrifugée (10 min, 15 000 g). Le surnageant est chromatographié sur une colonne de tamis moléculaire de type Biogel P-2, ayant environ 0,07 à 0,04 mm "d'ouverturede maille* (200-400 mesh) (BIORAD), de dimensions 12,5 X 100 cm, et élué avec 20 1 d'acide acétique 10 2M (débit 400 ml/heure). La fraction active est éluée au rapport d'élution Ve/Vo 1,2-1,8, Ve étant le volume d'élution et Vo le volume mort de la colonne. Le rendement est de 250 mg/kg de matière de départ et la fraction est active chez la souris à raison d'environ 5 pg/souris. La fraction active (10 mg) est ensuite dissoute dans 1 ml d'eau, puis fractionnée successivement sur deux cartouches de support en phase inverse en silice greffée avec des résidus aliphatiques en C18 de type Sep-pak C-18 (WATERS). Les cartouches sont éluées dans l'ordre avec - 2 ml de H20 - 2 ml d'un mélange H20/CH30H(50/50) - 2 ml de CH30H La fraction active éluée avec le mélange H2O/CH30H (50/50) est ensuite concentrée sous vide, à une température d'environ 20'C sur un appareil de type Speed Vac, puis lyophilisée. La purification est poursuivie par chromatographie liquide haute pression sur une colonne analytique en phase inverse en octadécyl-silice de type ODS Hypersil C-18, (250 X 4,6 mm) 5p (SFCC). L'élution est effectuée avec le mélange H2O,CF#COOH 0,1 %-MeOH (80-20) ou le mélange H20,CF3COOH 0,1 s-CH3CN (95-5) avec un débit de 1 ml/min. La détection des fractions est effectuée par mesure de l'absorption à 215 nm. Les résultats obtenus sont les suivants 1. Solvant (H20,CF3COOH 0,1 )/CH30H, [80/20] débit 1 ml/min ; temps de rétention : 6 min : 1 pic homogène. 2. Solvant H20,CF3COOH 0,1 5e CH3CN, [95/5) débit 1 ml/min ; temps de rétention : 18 min : 1 pic homogène. On constate que ce procédé permet d'obtenir un produit homogène dont la structure est déterminée comme indiqué plus loin. Le rendement global est de 60 pg/kg de matière de départ. La fraction est active chez la souris à raison d'environ 100 ng/souris. Détermination de la structure du PrinciPe actif: 1. Analvse des acides aminés Après hydrolyse acide, l'analyse par HPLC des dérivés formés par réaction avec l'orthophtaldialdéhyde permet de constater la présence de lysine, acide aspartique et sérine. L'analyse du produit à l'aide d'un analyseur d'acides aminés, après hydrolyse acide et oxydation par l'hypochlorite de sodium permet de constater la présence de proline et de confirmer la présence d'acide aspartique, sérine et lysine. 2. SPectroscoPie RMN La RMN à une et å deux dimensions (H20 et D20) montre la présence de quatre acides aminés (proline, lysine, acide aspartique, sérine) et d'un groupement acétyle. Le NH2 de la chaine latérale de la lysine et le OH de la sérine sont libres, les NH2 des parties acides aminés de la sérine, de la lysine et de l'acide aspartique sont substitués une fois. La structure probable est celle d'un peptide acétylé sur le NH2 terminal. 3 SPectrométrie de masse Les techniques de spectrométrie de masse (SM) en FAB toast Atom Bombardment) ont montré que ce peptide a une masse moléculaire (M + 1) de 488. Une étude de la séquence des acides aminés par une variante de la spectrométrie de masse, à savoir la technique dite MS-MS, a permis d'établir que la structure primaire complète du peptide -est Ser(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH pescriDtion des essais bioloaiaues L'activité biologique des fractions est mesurée par des essais in vive d'inhibition de l'entrée en cycle des CFU-S induite par une injection d'Ara-C. Les CFU-S de la souris, normalement quiescentes, entrent en cycle après une injection d'Ara-C. Les demandeurs ont montré que lorsque l'inhibiteur est injecté 6 heures après la drogue, il empêche l'entrée des CFU-S en synthèse de ADN (phase S). Le nombre des CFU-S est déterminé par la technique de J.E.Till et E.A. McCulloch, Radiat. Res., 14, (1961), 213-222, dont le principe repose sur la capacité des CFU-S de former des colonies macroscopiques dans la rate. Ces colonies sont des clones issus d'une CFU-S. La proportion des CFU-S en phase S est déterminée par la métode de A.J. Becker et coll., Blood, 161 (1965), 296-308, basée sur le principe des suicides cellulaires. L'incubation des cellules avec une solution de thymidine tritiée (précurseur de l'ADN) conduit à la mort sélective des cellules en phase de synthèse d'ADN par intégration d'une dose létale de radioactivité (tritium) dans la molécule d'ADN. Les essais sont effectués sur des souris SPF (Specific Sathogen Eree) de souche Balb/C ou CBA, agrées de 2 à 3 mois. 1. Les groupes témoins reçoivent par voie i.p. le traitement suivant Temps O : Ara-C (10 mg - protocole I ou 20 mg - protocole II) dissous dans 0,2 ml de sérum physiologique Temps 6 h : sérum physiologique 0,2 ml Temps 8 h : sacrifice (protocole I) Temps 12 h : sacrifice (protocole II). 2. Les groupes traités reçoivent par voie i.p. Temps O : Ara-C (10 mg - protocole I ou 20 mg ; protocole II) dissous dans 0,2 ml de sérum physiologique. Temps 6 h : fraction à tester dissoute dans 0,2 ml de sérum physiologique. Temps 8 h : sacrifice (protocole I). Temps 12 h : sacrifice (protocole II). Protocole I Protocole II 0 6 8 12 heures I r I I t t Ara-C Inhibiteur \/ Détermination du nombre de CFU-S en cycle. Pour chacun des groupes la moelle osseuse des animaux est collectée et mise en suspension dans 2 ml de milieu 199 (EUROBIO). Après -numération et dilution appropriée, 2 aliquotes de 5 X 106 cellules nuclées sont incubées à 37iC pendant 20 min soit avec 1ml de milieu 199 (Essai A), soit avec 1 ml de thymidine tritiée (200 pCi) (Essai B). Une suspension cellulaire de 0,2 ml contenant 8.104 à 1,2.105 cellules nuclées est injectée par voie intra-veineuse dans le sinus-rétro-orbital des animaux receveurs irradiés (9 Gy, 8 souris par point expérimental). Neuf jours plus tard les souris receveurs sont sacrifiées, leur rate prélevée et fixée dans le liquide de Bouin (acide picrique à 1 % : 720 g ; formol: 240 g acide acide acétique 4 g pour 1 1 de liquide). Après quelques heures de fixation, les nodules visibles macroscopiquement sont dénombrés. Si N et N'sont les nombre moyens de nodules obtenus sur les rates des receveurs ayant reçu les cellules provenant des essais A et B respectivement, la proportion des CFU-S en phase de synthèse d'ADN est calculée par la formule N-N' de CFU-S en S = ----- x 100 N Résultats 1. Inhibition de l'entrée en cYcle des CFU-S. Au cours de chaque étape de purification, on isole une fraction active vis-à-vis de ce test. Toutefois une activité particulièrement intéressante est observée avec la fraction homogène obtenue selon l'invention, comme le montre le tableau suivant Inhibition de l'entrée en cycles des CFU-S par injection de 100 ng par souris de la fraction homogène obtenue selon l'invention, selon le protocole II. . de CFU-S en Traitement synthèse d'ADN Ara-C (20 mg) 43~9 Ara-C (20 mg) + inhibiteur (100 ng) 7-+4,3 2. Activité sur la survie des animaux traités avec des doses létales d'Ara-C. Les animaux reçoivent des doses fractionnées d'Ara-C (4 X 925 mg/kg) aux temps 0, 7, 24 et 30 heures. La fraction testée est administrée en 1 fois 26 heures après la première injection d'Ara-C. La survie des animaux est estimée 15-30 jours après le traitement. Dans ce protocole comportant des injections répétées, létales d'Ara-C, il a été montré que l'administration concomitante d'inhibiteur permettait la survie définitive d'un grand nombre d'animaux. Les résultats obtenus sont comparables à ceux observés lorsque l'on procède à une greffe de moelle allogénique des animaux traités, au lieu d'utiliser l'inhibiteur. Protocole 0 7 24 26 30 heures I I I I I t t t t t Ara-C Ara-C Ara-C Ara-C Inhibiteur 3. Absence d'activité de la fraction inhibitrice sur la répression de tumeurs EMT6. Le traitement des animaux porteurs de la tumeur EMT6 par 4 injections successives d'Ara-C aux temps 0,7, 24 et 30 heures suivies d'une injection de l'inhibiteur 26 heures après la première injection de l'Ara-C, n'empêche pas l'action curative de l'Ara-C vis-à-vis des cellules tumorales et permet la survie des animaux traités de façon comparable aux résultats obtenus suite à une greffe de moelle. 4 Toxicité La fraction inhibitrice est dépourvue de toxicité vis-à-vis des CFU-S et n'entraîne aucune létalité chez les souris traitées, aux doses utilisées. REVENDICATIONS 1. Tétrapeptide répondant à la formule Ser-Asp-Lys-Pro-OH et ses dérivés usuels dans la chimie des peptides à usage biologique, notamment ses dérivés acétylés et méthylés, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2 Tétrapeptide répondant à la formule Ser-(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables. 3. Peptides de poids moléculaire inférieur à 2000 comprenant la séquence -Ser-Asp-Lys-Prpainsi que leurs dérivés usuels dans la chimie des peptides à usage biologique, notamment leurs dérivés acétylés, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 4. Procédé pour l'extraction du tétrapeptide selon la revendication 2, à partir de matières biologiques, notamment à partir de foie ou de moelle de veau foetal, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à - broyer la matière de départ avec si nécessaire délipidation, - mettre le produit obtenu en suspension dans du tampon à un pH voisin de 7, en présence d'un réactif réducteur soufré, notamment du dithioérythritol ou de préférence du mercaptoéthanol, - centrifuger l'homogénat à environ 15 000 g pendant au moins 1 heure, - soumettre le surnageant à une ultrafiltration sur membrane ayant une limite d'exclusion voisine de 10 000 daltons, - soumettre l'ultrafîltrat obtenu à une chromatographie sur tamis moléculaire de type gel de polyacrylamide, avec élution par une solution diluée d'acide acétique, - soumettre la fraction active recueillie à un fractionnement sur un support en phase inverse en silice greffée par des résidus aliphatiques, notamment en C18, en répétant de préférence au moins une fois cette étape; et - soumettre la nouvelle fraction active recueillie à une chromatographie liquide haute pression sur colonne en phase inverse en silice greffée par des résidus aliphatiques, notamment en C18, pour obtenir une fraction active homogène. 5. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que principe actif, au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 3. 6. Médicament, notamment pour la protection de la moelle osseuse au cours de traitements anticancéreux par la chimiothérapie, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme d'une poudre destinée à l'administration par voie i.v ou s.c en présence d'adjuvants et/ou excipients usuels, contenant, en tant que principe actif1 au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 3. 7. Utilisation des composés selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production d'anticorps spécifiques.