Brevet FR2599512A1 — publié le 19871204

La présente invention concerne un procédé et un appareil de lecture automatique d'une plaque de groupage tissulaire.tisstlaire. On utilise régulièrement, en histocompatibilité, la technique dite "micro-lymphocytotoxicité complément dépendante " qui se déroule en trois temps. En premier lieu on procède à une réaction antigène-anticorps qui consiste en une incubation de l'antigène figuré (1 microlitre de lympho cytes soit 2000 è 3000 cellules) avec un microlite d'antisérum anti-Rh.L.A. spécifique. Puis on procède è une cytolyse complément dépendante qui consiste à ajouter cinq microli- tres de complément de lapin dans le milieu réactionnel Après une deuxième incubation, il se produit une lyse membranaire aux endroits ou il y a eu formation préalable de complexe antigène-anticorps.Enfin on procède à une révéla tion de la cytolyse : l'appréciation de la lyse lymphocy- taire est quantifiée après coloration soit à l'aide de colorant vitaux (bleu trypan, éosine), soit par fluorochroma- sie ou bien encore par relargage de chrome 51. Le groupage tissulaire est réalisé dans une plaque dite de "TERASAKI" qui comprend 60 alvéoles réparties en une disposition matricielle de six colonnes et dix rangées. cette plaque permettant d'effectuer 60 réactions de ym- phocy;otoxicité. L'extrême polymorphisme du complexe majeur d'histocompartibilité oblige à multiplier es réactions : pour donner un ordre de grandeur, un groupage H.L.A. standard (A et B) nécessite de 2 à 4 plaques de TERASAKI, soit au total de 120 à 240 alvéoles Les limites de cette microtechnique sont d'ordre humain puisque la totalité des manipulations reste manuelle. On distribue, avec une micro-seringue, les cellules, le complément et le colorant, avec tous les risques possibles d'erreurs humaines. Toutefois la contrainte la plus importante est elle qui est relative à la lecture des réactIons. Cette lecture s'effectue à l'aide d'un microscope inversé en contraste de chase ou en immuno-fluorescence. On observe successivement les différentes alvéoles et pour chacune de celles-ci on quantifie le pourcentage de cellules lysées et on déduit, à partir du pourcentage de mort cellulaire, un classement dans une échelle allant d'un résultat négatif, à un résultat douteux, puis faiblement positif puis de plus en plus positif. Un tel procéder de lecture présente l'inconvénient que le temps de lecture ces réactions dans chaque alvéole est long, que le résultat obtenu est subjectif car il dépend de l'attention et de l'interprétation de l'observateur et que le procédé est difficileè mettre en oeuvre. L'attention de l'observateur est portée à son maximum et une fatigue visuelle s'installe progressivement, conduisantà certaines erreurs, et ceci quelque soit le type de révélateur utilisé pour diagnostiquer la mort cellulaire. Le risque d'erreur peut intervenir sur l'interprétation de la mort cellulaire, la position X Y de l'alvéole à examiner et la saisie écrite du résultat. La présente invention' vise à remédier à oes innnnvé- nients en procurant un procédé et un appareil permettant d'interpréter et d'automatiser la lecture d'ne plaque de groupage tissulaire. A cet effet ce procédé de lecture automatique d'une plaque de groupage tissulaire comportant un ensemble d'alvéoles contenant chacune un groupe de cellules vivantes d'aspect non uniforme et de cellules mortes d'aspect sombre et uniforme est caractérisée en ce que l'on analyse, au moyen d'une caméra photosensible, par une technique de reconnaissance de forme, chaque groupe de cellules contenues dans une alvéole, on transforme les images des cellules de chaque groupe en signaux électriques vidéo de natures différentes suivant qu'il s'agit de cellules vivantes ou mortes, on numérise ces signaux vidéo et on les stocke en mémoire en vue d'un traitement statistique. L'invention a également pour objet un appareil mettant en oeuvre le procédé susmentionné. On décrira ci-après,à titre d'exemple non limitatif, une forme d'exécution de la présente invention,en référence au dessin annexé sur lequel La figure 1 est un schéma synoptique d'un appareil de lecture automatique d'une plaque de groupage tissulaire. La figure 2 est une vue en plan schématique, à plus grande éch le, d'une alvéole de la plaque de groupage tissulaire, illustrant le balayage des images des cellules. Le procédé et l'appareil suivant l'invention seront décrits, dans ce qui va suivre, en se référant à la lecture d'une plaque de TERASAKI 1 comportant soixante alvéoles 2 réparties en six colonnes de dix alvéoles chacune. Toutefois l'invention peut aussi bien s' appliquer à des plaques de TERASAKI possédant un nombre d'alvéoles quelconque ainsi qu'à d'autres types de plaques et elle permet également l'étude d'images produites par une technique d'immunofluorescence. Chaque alvéole 2 comprend, dans sa partie centrale, un puits 3 ayant un diamètre de 1,3 mm par exemple. Chaque alvéole contient de 2000 à 3000 cellules regroupées dans le puits 3. Chaque groupe de cellules contenues dans un puits 3 comprend un certain nombre de cellules vivantes 4, c'est-àdire n'ayant pas réagi, qui ont un aspect non uniforme, et un nombre différent de cellules mortes 5 qui sont caractérisées par un aspect sombre et uniforme. Le diamètre moyen de chaque cellule est de l'ordre de 8 à 10 micromètres et le dessin de la figure 2 n'est évidemment pas à l'échelle. Suivant l'invention on analyse chaque alvéole 2 au moyen~d'une caméra photosensible 6 placée au-dessus de la table 7, orientée verticalement en direction de cette table et qui inspecte successivement les diverses alvéoles 2 de la plaque de TERASAKI 1. A cet effet la plaque 2 est portée par une table mobile 7 à mouvements croisés X,Y, es mouvements X et Y étant commandés respectivement par deux moteurs 8 et 9. La table 7 peut, naturellement, être mobile dans une seule direction dans le cas où une rangée unique d'alvéoles 2 doit être analysée. L'appareil comporte par ailleurs un ensemble 10 ue traitement ces informations comprenant essentiellement une mémoire d'irdge 11 et un microprocesseur 12, cet ensemble 10 étant relié également à un terminal à clavier 13. De préférence la caméra 6 d'analyse des images est constituée par une caméra linéaire à 1024 pixels. Toutefois on peut utiliser aussi bien, en tant que caméra 6, n'importe quelle caméra vidéo, LCD du type matriciel ou encore un capteur du type CCD linéaire à nombre depixels différent de 1024. Le capteur CCD à 1024 pixels est indiqué schématiquement en 6a sur la figure 2. Pour -procéder à une analyse d'un groupe de cellules 4,5 contenues dans une alvéole 2, on place le puits correspondant 3 sous la caméra 6 et on procède à une analyse de l'ensemble des cellules 4,5 par lignes successives, en déplacant la table dans la direction Y qui est perpendiculaire au capteur linéaire 6a. Le di-amètre d'un puits 3 étant de 1,3 mm on limite le champ optique de la carréra 6 à 1 mm, dans les deux directions X et Y, autrement dit l'analyse s'effectue uniquement dans un carré de côté a= lmm qui est inscrit dans le cercle délimitant le puits 3. La précision de la mesure dans le sens X est donné par les caractéristique-s de la caméra 6. Dans le cas d'un capteur linéaire CCD à 1024 pixels, cette précision est égale à 1/1024 m soit environ 1 micromètre. Pour conserver la même précision dans la direction Y, la table 7 a axone une précision de mise-en position de 1 micromètre dans le sens Y. Le diamètre d'une cellule étant de- l'ordre de 8 micromètres, sa surface est donc de l'ordre de 50 micromè- tres carré, en assimilant une cellule à un cercle. Ceci signifie que l'image d'une cellule est donnée par 50 pixels. La caméra 6 transforme l'image en signaux éleetri-. ques vidéo v qui sont une fonction linéaire de l'information lumineuse incidente, c'est-à-dire de l'image des cellules 4 et 5. La sortie de la caméra 6 est reliée à la mémoire 11 dans laquelle les signaux vidéo sont numérisés sur t bits (64 niveaux de gris). Ces signaux sont ensuite analysés en temps réel et stockés éventuellement dans une mémoire d'écran, ce qui permet d'avoir un affichage de l'image traitée sur l'écran du terminal 13. L'ensemble de traitement d'informations 10 permet ensuite, à partir de la détermination automatique du nombre de cellules vivantes 4 et du nombre de cellules mortes 5 dans un mêhe puits 3, de donner le pourcentage de mort cellulaire. REVENDICATIONS 1.- Procédé de lecture automatique d'une plaque de groupage tissulaire (1) comportant un ensemble d'alvéoles (2) contenant chacune un groupe de cellules vivantes (4) d'aspect non uniforme et de cellules mortes (5) d'aspect sombre et uniforme, caractérisé en ce que l'on analyse, au moyen d'une caméra photosensible (6), par une technique de reconnaissance de forme, chaque groupe de cellules contenues dans une alvéole (2), on transforme les images des cellules de chaque groupe en signaux électriques vidéo (v) de natu res~différentes suivant qu'il s'agit de cellules vivantes ou mortes, on numérise ces signaux vidéo et on les stocke en mémoire en vue d'un traitement statistique. 2.- Appareil de lecture automatique d'une plaque de groupage tissulaire (1) comportant un ensemble d'alvéoles t2) contenant chacune un groupe de cellules vivartes (4 d'aspect non uniforme et de cellules mortes (5) d'aspert sombre et uniforme, caractérisé en ce qu'il comprend une table (7) supportant la plaque de groupage tissulaire (1), des moyens ( & 9) pour déplacer cette table (7) suivant au moins une direction X, Y, une caméra photosensible .6) placée au-dessus de la table (7), orientée verticalem.er.t en direction de cette tableet qui inspecte successivement les diverses alvéoles (2) et un ensemble (10) de traitement des informations comprenant essentiellement une mémoire d'image (11) et un microprocesseur (12), cet ensemble (10) étant relié également à un terminal à clavier (13), cet ensemble (10) de traitement étant connecté à la caméra (6) pour recevoir de celle-ci des signaux électriques vidéo, les transformer en signaux numériques et effectuer un calcul statistique sur les signaux numérisés. 3.- Appareil suivant la rerendication 1 caractérisé en ce que la caméra (6) comprend un capteur linéaire (6a) du type CCD.