Brevet FR2602242A1 — publié le 19880205

THYMIDINE KINASE DE TYPE FOETAL PURIFIEE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne en tant que nouveau produit industriel la thymidine kinase de type foetal purifiée. Elle concerne également le mode d'obtention de ce produit et plus particulièrement son procédé de purification. Ce produit est utile (i) dans le domaine des dosages, notamment celui des dosages immunologiques mettant en oeuvre des réactions antigè10 ne-anticorps, et (ii) en thérapeutique dans l'obtention d'anticorps intervenant en tant que médicaments. ART ANTERIEUR On sait que la thymidine kinase (en abrégé TK), enzyme responsable de la phosphorylation de la thYmi15 dine en thymidine-5'-monophosphate (en abrégé d.TMP), joue un rôle important dans la synthèse de l'ADN et, par conséquent, dans la multiplication cellulaire. Son activité est élevée dans les tissus en voie de prolifération ou de régénération et dans les cellules infec20 tées par des virus. On sait également que deux isoenzymes de la TK ont été mises en évidence dans les cellules eucaryotes: la thymidine kinase de type foetal (désignée ciaprès "thymidine kinase foetale" ou TK-F) et la thymidine kinase de type adulte (désignée 25 ci-après "thymidine kinase adulte" ou TK-A). La TK-F est présente dans les tissus embryonnaires et a été décelée dans les tissus cancéreux dans les cas de cancers hormonaux-dépendants, notamment les cancers du sein et de la prostate; voir à ce sujet l'article 5 de J.L. Javré et al., Bull. Cancer (Paris) 73 (No. 1), pages 8-16 (1986) intitulé "Mise en évidence de la thymidine kinase de type foetal dans les cancers du sein", et l'article de J.L. Javré et al. soumis à publication dans Cancer Research et intitulé "Presence of fetal 10 thymidine kinase in human breast cancers". On sait également que la synthèse de la TK-F in vivo est fortement augmentée par les hormones sexuelles dans leurs propres organes-cibles, la prostate et l'utérus; voir à ce sujet l'article de M. Bourtourault et al., J. Steroid Biochem., 21 (No. 5), pages 613-620, (1984) intitulé: "Stimulation by 17Festradiol of thymidine kinase activity in the rat uterus", et l'article de G. Gayet et ai., The Prostate 7, pages 261-270, (1985) intitulé: "Induction of 20 thymidine kinase of fetal type by androgens in the rat prostate". On sépare la TK-F de la TK-A par électrophorèse ou chromatographie au moyen d'une résine échangeuse d'anions,par exemple par 25 électrophorèse sur gel d'acrylamide et, mieux, par chromatographie sur gel DEAEcellulose ou gel DEAESephadex commercialisé par la Société dite Pharmacia, l'isoenzyme foetale ayant une mobilité nulle ou faible et l'isoenzyme adulte une mobilité rapide. La TK-F ainsi isolée, qui a une activité enzymatique par mg de l'ordre de 2 unités internationales, ne convient pas pour (i) réaliser des dosages plus précis, et surtout (ii) préparer des anticorps polyclonaux et mieux monoclonaux anti TK-F utiles dans le 35 domaine du diagnostic, d'une part, et dans le domaine thérapeutique, d'autre part. OBJET DE L'INVENTION Suivant un premier aspect de l'invention on propose, en tant que produit industriel nouveau, une TK-F purifiée ayant une activité enzymatique nettement supérieure à la TK-F isolée jusqu'à présent selon les modalités de l'art antérieur. Il existe un besoin en TK-F purifiée en particulier dans le domaine du diagnostic. En effet l'acti10 vité de la TK-F varie d'un cancer à l'autre. L'activité de la TK-F étant faible dans les cellules en phase Go et élevée dans les cellules en phase S, il y a tout lieu de penser que les cancers présentant une faible activité TK-F sont dans un état quiescent, alors que les cancers ayant une activité TK-F élevée sont en voie de prolifération. Le dosage de la TK-F dans les cancers du sein et de la prostate présente donc un grand intérêt pour mesurer l'état prolifératif des cancers. De plus le dosage de la TK-F au moyen 20 d'anticorps anti TK- F levés contre la TK-F purifiée constitue un élément d'appréciation sur l'évolution de la maladie cancéreuse et par suite d'aide à l'orientation thérapeutique. Suivant un second aspect de l'invention on pré- 25 conise un procédé pour l'obtention de ladite TK-F purifiée, ledit procédé mettant en oeuvre le couplage de la TK-F, que l'on veut purifier, avec la thymidine, puis le clivage du complexe résultant (thymidine-TK-F) pour recueillir la TK-F purifiée. Suivant encore un autre aspect de l'invention on préconise l'utilisation de la TK-F purifiée pour l'obtention d'anticorps anti TK-F, ces anticorps étant destinés à un usage diagnostic, d'une part, et à un usage thérapeutique, d'autre part. On a en effet trou35 vé de façon surprenante que l'administration d'anti- corps anti TK-F chez des patients atteints d'un cancer hormono-dépendant (notamment un cancer du sein ou de la prostate) a un effet thérapeutique bénéfique. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Conformément à l'invention on préconise, en tant que produit industriel nouveau, une TK-F purifiée, qui n'avait pas encore été obtenue jusqu'à présent, utile dans le domaine des dosages et celui de l'obtention d'anticorps anti TK-F, ladite TK-F puri10 fiée étant caractérisée en ce qu'elle a une activité enzymatique spécifique par mg supérieure ou égale à 5000 unités, de préférence supérieure ou égale à 8000 unités, et mieux supérieure ou égale à 10 000 unités. Le Rf électrophorétique (à pH d'environ 8,6), en milieu non dénaturant (par exemple dans les tampons A et B décrits ci-après),est d'environ 0,15 pour une TK-F purifiée ayant une activité enzymatique spécifique par mg de l'ordre d'environ 11.800 unités. L'activité enzymatique spécifique est exprimée, comme cela est l'habitude en unités enzymatiques par mg de protéine. Une unité de TK-F dite internationale correspond à 1 nanomole de nucléotides synthétisés par mg de protéine et par minute. En d'autres termes l'ac25 tivité enzymatique peut être exprimée en nmoles/mg de protéine/min. Pour comparaison on verra ci-après à l'exemple 1 que - l'activité en milieu biologique d'origine est de 30 1,03 nmoles/mg protéine/min.; - l'activité après chromatographie sur DEA-Sephadex est de 2,08 nmoles/mg protéine/min. ; - l'activité de la TK-F purifiée est de 11 875 nmoles/mg/protéine/min. Le procédé de préparation de la TK-F purifiée, que l'on préconise selon l'invention, dans lequel on réalise le couplage de la TK-F, que l'on veut purifier, avec la thymidine, puis le clivage du complexe thymidine-TK-F résultant, est caractérisé en ce que a) on réalise le couplage thymidine- TK-F, par mise en contact de la TK-F à purifier avec de la thymidine préalablement fixée sur un premier support convenable, b) on réalise l'élution de la TK-F ainsi liée au moyen d'un éluant convenable contenant 10 de la thymidine, puis c) on effectue le clivage du complexe thymidine- TK-F ainsi élué au moyen d'un second support qui est différent du premier support et adsorbe sélectivement la thymidine 15 dudit complexe thymidine-TK-F. Le meilleur mode de mise en oeuvre de ce procédé consiste en une chromatographie d'affinité qui comprend un mécanisme dit de compétition. Ainsi au stade a) on fait passer la TK-F que l'on veut purifier 20 sur une résine appropriée préalablement couplée avec de la thymidine. La thymidine liée à ladite résine fixe la TK-F qui est retenue, alors que les impuretés de nature protéinique qui polluent ou souillent la TK-F ne se fixant pas à la thymidine ne sont pas 25 retenues. Au stade b) la TK-F fixée au support par l'intermédiaire de la thymidine préalablement couplée audit support, est éluée au moyen d'un éluant contenant de la thymidine libre. Le stade b) comprend le mécanisme dit de compétition, la TK-F liée à la thymidine fixée au support se couplant avec la thymidine libre de l'éluant. L'éluat ainsi recueilli contient le complexe thymidine--TK-F ainsi formé. Au stade c) on déstabilise ledit complexe 35 thymidine-TK-F en adsorbant la thymidine sur un 260t242 second support sélectif della thymidine. En pratique le support préféré du stade c) est un gel d'Epoxy-Sepharose commercialisé par la société dite Pharmacia sous la nomenclature d' Epoxy5 Sepharose 6B. Ce gel est préalablement couplé à la thymidine selon une méthode connue, notamment celle décrite par P. Grâbner et al. J. Biol. Chem., 259, pages 8012-8014, (1984) ou une méthode similaire. Le support préféré du stade c) pour fixer la thymi10 dine est une composition comprenant du charbon, du dextran et de la gélatine. La TK-F purifiée est ensuite isolée notamment par centrifugation de l'éluat qui la renferme avec ledit second support utilisé au stade c). La TK-F'de départ est une substance protéinique d'origine animale (obtention à partir de tissu foetal animal, notamment de foie de foetus de rongeur tel que le rat), d'origine humaine (obtention à partir de tissu cancéreux humain), ou encore d'origine synthétique 20 (obtention par génie génétique notamment). La TK-F ainsi purifiée est utile selon l'invention pour l'obtention d'anticorps anti TK-F, de préférence des anticorps monoclonaux plutôt que des anticorps polyclonaux. Ces anticorps sont obtenus selon 25 une méthode classique connue en soi. Par exemple on innocule ladite TK-F purifiée à une souris, prélève la rate de l'animal immunisé, extrait les lymphocytes de la rate, fusionne lesdits lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponen30 tielle, à raison de 5 à 20, de préférence 10.lympho- 260t242 cytes par cellule de myélome, sélectionne les hybridomes secréteurs ainsi obtenus afin d'obtenir des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec la TK-F mais pas avec la TK-A, développe des tumeurs ascitiques chez la souris avec des clones sélectionnés, récupère les liquides d'ascite contenant les anticorps, purifie les anticorps monoclonaux ainsi obtenus. Pour réaliser des dosages soit afin de détec10 ter la présence ou l'absence de TK-F dans un tissu, soit encore d'évaluer quantitativement la teneur en TK-F dans ledit tissu on fixe l'anticorps anti TK-F sur un support approprié (billes de verre, de polystyrène, parois de récipient, etc.) pour obtenir un 15 matériel (1) Support-anti TK-F on met ensuite ce matériel en contact avec un milieu 20 susceptible de contenir de la TK-F, la présence de ladite TK-F donnant le complexe (2) Support anti TK-F-TK-F Ce complexe constitue un "signal" que l'on "amplifie" selon une méthode connue en soi pour visualisation et/ou détection avec un conjugué marqué anti TK-F:: [par exemple, méthode EIA (notamment EIA-sandwich ou EIAcompétition) selon laquelle on couple le complexe 2 30 avec un conjugué enzymatique approprié, méthode RIA comprenant le couplage dudit complexe 2 avec un conjugué marqué au moyen d'un isotope radioactif, méthode de fluorescence comprenant le couplage dudit complexe 2 avec un conjugué marqué à la fluorescéine]. L'amplification 35 peut également être réalisée par agglutination ou 1602t42 encore selon une méthode ERICA mettant en oeuvre des cellules. Selon l'invention on préconise des trousses ou kits de dosage comprenant les moyens réactifs re5 quis pour mettre en oeuvre des réactions antigèneanticorps, notamment les réactions suivantes: (a) Support--anti TK-F + TKF support-anti TK-F-TK-F (b) Support-anti TK-F-TK-F + anti TK-F:: supportanti TK-F-TK-F-anti TK-F:: Selon l'invention on préconise une composition thérapeutique renfermant en association avec un exci15 pient physiologiquement acceptable, une quantité thérapeutiquement efficace d'anti TK-F. On vise en particulier l'utilisation d'anticorps anti TK-F pour l'obtention d'un médicament anticancéreux destiné à une utilisation thérapeutique vis20 à-vis des cancers du sein et de la prostate. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation, l'ensemble de ces éléments n'étant pas limitatifs mais donné à titre 25 d'illustration. EXEMPLE 1 Isolement et purification de TK-F de foie de foetus de rat 1) Homogénéisation Les tissus de foie de foetus de rat sont homogénéisés au Polytron dans la solution tampon: Tris10 mM, MgCl2 10 mM, NaF 5 aM et emercaptoéthanol 0,4 mM à pH 7,5 (Tampon A). 2) Préparation du cytosol L'homogénat résultant est centrifugé successi- t242 vement à 800 x g et 12 000 x.g pendant 10 min. dans une centrifugeuse réfrigérée. Le surnageant obtenu à 12 000 x g est, ensuite, centrifugé à 105 000 x g pendant 45 min. à +5 C dans une ultra- centrifugeuse Beckman, type L8-55. Le surnageant obtenu à 105 000 x g (cytosol) constitue la source de TK-F. Un dosage de l'activité enzymatique spécifique de la TK-F est effectué sur une partie aliquote du cytosol; cette activité est de 1,03 mmoles/mg/min. 3) Isolement de la TK-F La TK-F est isolée par chromatographie sur gel de DEAE-Sephadex A50 (commercialisé par la société dite Pharmacia). Le gel de Sephadex est mis à gongler dans le tampon A. Après élimination des particu15 les fines par sédimentation le gel est déposé dans une minicolonne de 7 cm x 1 cm. 800 pl de gel sont introduits dans la colonne. Après préparation de la colonne de gel, une partie aliquote du cytosol est déposée sur le gel. La TK-F est éluée par passages 20 successifs de 4 volumes (4 x 500 pl) de tampon A. Les élutions successives sont effectuées par centrifugation de la colonne à 200 x g dans une centrifugeuse réfrigérée. L'élution-centrifugation accélère l'élution et évite la dénaturation de la TK-F. Un do25 sage de l'activité enzymatique de la TK-F est effectué sur une partie aliquote de l'éluat et l'éluat restant est lyophilisé. A-ce stade l'activité enzymatique est de 2,08 nmoles/mg/min. 4) Purification de la TK-F La purification est effectuée par chromatographie d'affinité sur un gel d'époxy-Sépharose 6B (commercialisé par la société dite Pharmacia) couplé à la thymidine. Le couplage de la thymidine au gel de Sépharose est effectué en milieu alcalin, à pH 12,0 et à 250C pendant 24 h selon une technique dérivée de 280 242 celle de P. Grôber et al. précité. Le taux de couplage de la thymidine est de 9 PM par ml de gel. Le gel est lavé par du tampon Tris 10 mM, MgC12 10 mM, NaF PM, B-merdaptoéthanol 0,4 mM, ATP 1 mM, à pH 7,5 (Tampon B). 3 ml de gel sont déposés dans une colonne de 10,6 cm de hauteur et 0, 6 cm de diamètre. Le lyophilisat renfermant la TK-F est repris par de l'eau distillée et déposé sur le gel d'affinité. La pénétration de l'échantillon est effectuée à la vitesse de 10 1,2 ml par heure. Le gel d'affinité est lavé par du tampon B pour éliminer les protéines non fixées sur le gel. Leur élution est effectuée à la vitesse de 1,2 ml par heure, puis-de 4 ml par heure. La totalité des protéi15 nes non retenues par le gel sont éluées par un volume de 24 ml du tampon B. L'élution de la TK-F est effectuée par passage, sur le gel d'affinité de 4,5 ml de tampon: Tris mM, MgCl2 10 mM, NaF 5 pM, e-mercaptoéthanol 0,4 mM, 20 ATP 1 mM et thymidine radio-inerte 10 mM,à pH 7,5. L'élution est effectuée avec un débit de 0,5 ml par heure. L'éluat ainsi obtenu contient le complexe thymidine-TK-F. ) Elimination de la thymidine radio-inerte L'élimination de la thymidine radio-inerte est effectuée par passage de l'éluat obtenu précédemment sur un culot de charbon-dextrannegélatine (charbon 1% en poids, dextran T70 0,1% en poids et gélatine 0, 2%/ en poids dans du tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,5). Le mélange est agité au vortex pendant 10 min. à 0 C puis centrifugé à 800 x g pendant 10 min. Le surnageant renferme la TK-F purifiée. Son dosage est effectué sur une partie aliquote du surnageant. L'activité enzymatique de la TK-F ainsi purifiée est de 11 875 nmoles/mg/min. 35 Le rendement en activité total est de 7,4 %. ?60tt42 Le taux de purification est de l'ordre de 11 530 fois, et le Rf électrophorétique de la TK-F purifiée (déterminé en milieu non dénaturant) est de 0,15à pH 8,6. EXEMPLE 2 Technique de dosage de l'activité de la TK-F A 20 pl de l'extrait renfermant la TK-F, on ajoute 5 il de tampon Tris-HCl (pH 7,8) 200 mM renfermant 76 mM de MgCl2, 160 mM de phosphoglycérate, mM d'ATP et 40 à 50pM de [2-14c]-thymidine (activi10 té spécifique 54-58 mCi/mmole; i.e. environ 2 x 108 à 2,15 x 10 Bq/mmole). Le milieu réactionnel est incubé à 37 C pendant 25 min puis la réaction est stoppée par addition de 10 pl de ClO4H 2,1 M et centrifugation à 2400 x g pendant 10 min. 10 pl du surna15 geant de centrifugation sont, ensuite, utilisés pour la séparation, par électrophorèse haute tension, des nucléotides synthétisés. La séparation des d-TMP,d-TDP et d-TTP (thymidine-monophosphate, -diphosphate, et triphosphate) est effectuée sur papier Whatman 3MM, 20 en tampon citrate à pH 4,1 sous 47 volts par cm de longueur de papier, pendant 30 min et à 3 C. Après séchage de l'électrophorégramme puis repérage sous U.V. des nucléotides témoins, le papier est découpé en bandelettes de 2,5 cm de largeur par 0,5 cm de hauteur et celles-ci sont transférées dans des fioles de comptage de la radioactivité renfermant 10 ml de liquide scintillant (Ready-solv EP, Beckman). EXEMPLE 3 Contrôle de la pureté de la TK-F par électrophorèse 30 sur gel de polyacrylamide L'électrophorèse est effectuée dans un gel de polyacrylamide en gradient linéaire de 10 à 15 % en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS), sur plaque verticale. La migration des protéines est effectuée 35 dans du tampon Tris 12 g yoo,glycine 28,8 g o0, et SDS 0,1 g % à pH 8,7 sous 70 volts pendant 12 h. Les protéines provenant du cytosol et de l'éluat DEAE-Sephadex sont colorées par une solution de Bleu de Coomassie R 250 à la concentration de 0,5 g 5 dans 250 ml de méthanol à 90 %. La coloration des protéines obtenues après chromatographie d'affinité est effectuée par la méthode de coloration à l'argent selon la technique de P. Tunon and K.E. Johansson, J. Biol. Chem. and Biophys. Methods., 9, pages 171-179, 10 (1984). EXEMPLES 4 et 5 En procédant comme indiqué à l'exemple 1, mais en remplaçant les tissus de foie de foetus de rat par des tissus cancéreux humains de sein et de prostate 15 on obtient une TK-F purifiée analogue à celle du foie de foetus de rat, et ayant sensiblement les mêmes propriétés (activité enzymatique, Rf) que ladite TK-F purifiée de foie de foetus de rat. On observe en particulier pour l'ensemble des produits des exemples 1, 4 et 5 que contrairement à celle de la TK-A, l'activité de la TK-F n'est pas inhibée par le d-CTP, et que la mobilité électrophorétique de la TK-F en gel de polyacrylamide et à pH 8,6 est 25 nulle ou très faible alors que la TK-A présente une mobilité rapide. Ces deux isoenzymes ont, aussi, des comportements différents sur colonne de DEAE- Sephadex ou DEAE-cellulose. La TK-F n'est pas retenue sur ce type de résine et elle est éluée par des solutions de 30 faible force ionique. La TK-A est retenue sur ces résines et ne peut être éluée que par des solutions de force ionique élevée. Le comportement électrophorétique et chromatographique indique donc que la TK-F a un caractère alcalin et la TK-A un caractère acide. 35 Le pH de la TK-F serait, dans l'état actuel des 260t242 connaissances, de 9,0-9,7 et celui de la TK-A de 5,05,7. Suivant l'invention, on préconise en tant que produits industriels nouveaux les anticorps anti TK-F levés contre la TK-F purifiée conforme à l'invention obtenue à partir d'une source quelconque, notamment une TK-F purifiée d'origine animale ou humaine. Comme indiqué ci-dessus, les anticorps anti TK-F, notamment les anticorps monoclonaux anti TK-F, 10 levés contre la TK-F purifiée sont particulièrement utiles dans le domaine des dosages. De préférence, la TKF purifiée utilisée pour l'obtention desdits anticorps monoclonaux est d'origine animale (notamment le tissu de foie foetal de rongeur) ou humaine (notamment de tissu 15 cancéreux humain). REVENDICATIONS 1. Thymidine kinase de type foetal (TK-F) purifiée, caractérisée en ce qu'elle a une activité enzymatique par mg supérieure ou égale à 5000 unités, 5 de préférence supérieure ou égale à 8000 unités, et mieux supérieure ou égale à 10 000 unités. 2. TK-F purifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce que son activité enzymatique par mg est de l'ordre d'environ 11 800 unites. 3. TK-F purifiée selon la revendication 2, caractérisée en ce que son Rf électrophorétique, en milieu non dénaturant, est de l'ordre de 0,15 à pH d'environ 8,6. 4. Procédé de préparation de TK-F purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans 15 lequel on réalise le couplage de la TK-F, que l'on -veut purifier, avec la thymidine, puis le clivage du complexe thymidine-TK-F résultant, caractérisé en ce que a) on réalise le couplage thymidine-TK-F, par mise en contact de la TK-F à purifier avec de la thymidine préalablement fixée sur un premier support convenable, b) on réalise l'élution de la TK-F ainsi liée au moyen d'un éluant convenable contenant 25 de la thymidine, puis ?60t242 c) on effectue le clivage du complexe thymidine--TK-F ainsi élué au moyen d'un second support qui est différent du premier support et adsorbe sélectivement la thymidine dudit complexe thymidine--TK-F. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le premier support est l'époxy-sépharose 6. Procédé selon la revendication 4, caracté10 risé en ce que l'élution des impuretés protéiniques premier non retenues sur le /support couplé à la thymidine est effectuée avec un tampon Tris 10 mM, MgC12 10 mM, NaF uM amercaptoéthanol 0,4 mM et ATP 10 mM, à pH 7,5. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'élution de la TK-F fixée à la thymidine du support couplé à ladite thymidine est effectuée avec un tampon Tris 10 mM, MgCl2 10 mM, NaF 5 iM, 6mercaptoéthanol 0,4 mM, ATP 1 mM et thymidine 10 mM 20 à pH 7,5. 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le second support est une composition comprenant 1 % en poids de charbon, 0,1 % en poids de dextran et 0,2 % en poids de gélatine dans du tampon 25 Tris-HCl 10 mM à pH 7,5. 9. Utilisation de la TK-F purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite TK-F est utilisée pour l'obtention d'anticorps, de préférence monoclonaux, anti TK-F. 260f242 10. Utilisation selon la revendication 9 d'anticorps monoclonaux anti TK-F, caractérisé en ce qu'elle a trait à l'obtention d'un médicament anticancéreux destiné à une utilisation en thérapeutique vis à vis des cancers de la prostate et du sein. 11. Anticorps anti TK-F, caractérisé en ce qu'il est levé contre la TK-F purifiée selon la revendication 1. 12. Anticorps anti TK-F selon la revendication 10 11, utile dans le domaine des dosages, caractérisé en ce qu'il est monoclonal, et, en ce qu'il a été levé contre la TK-F purifiée selon la revendication 1 obtenue à partir d'une source animale ou humaine.