Brevet FR2598633A1 — publié le 19871120

La présente invention se rapporte à des matières échangeuses de cations et aux procédés pour les former et plus particulièrement elle se rapporte à des matières de support d'échange de cations qui sont particulièrement bien 5 adaptées en tant que matériaux de garnissage pour chromatographie liquide. La chromatographie par échange d'anions et de cations à haute performance est devenue un outil puissant pour l'analyse et l'isolement des molécules biologiques. Des 10 revêtements échangeursde cations pour des milieux de chromatographie liquide à haute performance ont été synthétisés par plusieurs voies. La voie la plus simple est la silylation d'une surface de silice par un organosilane anionique. Cependant, de telles réactions sont réversibles 15 et peuvent laisser des silanols résiduels qui peuvent lier la protéine de manière irréversible. Bien que ce problème puisse être circonvenu par liaison d'une couche d'un polymère organique hydrophile sur la surface de la silice, ce processus ne donne pas la reproductibilité requise. Une autre voie pour 20 la synthèse d'un revêtement d'échange de cations consiste à débuter une réaction d'organosilane pour placer une fonction réactive sur une surface de silice. On fait alors réagir la silice fonctionnalisée avec un polymère préformé produisant une phase stationnaire polymérique liée de manière covalente. 25 La dernière étape modifie de plus le polymère ancré de manière qu'il soit anionique. Bien que le revêtement d'échange de cations produit soit stable et d'une forte capacité de liaison, ce procédé de préparation de revêtementsd'échange de cations 30 est assez long. Des travaux antérieurs de Alpert et Regnier avec la chimie de la polyéthylèneimine adsorbée, comme cela est décrit dans le brevet U.S. n 4.245.005, dont les enseignements sont incorporés ici à titre de référence, ont montré l'extrême 35 versatilité pour la synthèse des phases stationnaires d'échange d'anions. En utilisant la technologie d'adsorption existante étudiée par alpert et Regnier pour la synthèse de milieux polymériques adsorbés d'échange d'anions, les matières échangeuses de cations de l'invention ont été produites. La demande de brevet européen n 0 143 423 enseigne des matières échangeuses de cations produites à partir de polyéthylèneimine; cependant, la demande de brevet européen 0 143 423 prévoit une silice poreuse à laquelle un polyéthylèneiminopropyl silane non réticulé est lié de manière covalente, plutôt qu'adsorbé. Dans la demande de brevet européen n 0 143 423, on fait réagir un gel de silice particulaire avec un polyéthylèniminopropyl triméthoxy silane et l'ensemble polyéthylèniminopropylsilyl-silice lié de manière covalente et non réticulée peut être converti en une forme carboxylée faiblement acide par traitement conventionnel, par exemple, 15 avec un anhydride d'acide dibasique approprié dans un solvant organique inerte. La présente invention concerne des matières échangeuses de cations ainsi que des procédés de production de telles matières. Les matières échangeuses de cations de l'invention 20 sont bien adaptées en tant que matières de garnissage pour la séparation de protéines et de polymères biologiques dans une chromatographie liquide à haute performance. Pour produire les matières échangeuses de cations, on provoque d'abord l'adsorption d'une couche mince d'un adsorbat comprenant des groupes amines, de préférence de la polyéthylèneimine, sur une matière de support inorganique telle que de la silice, de l'alumine ou de l'oxyde de titane. Le revêtement adsorbé est alors facultativement réticulé par un agent réticulant tel qu'une résine époxy ou un bromure d'alcoyle. On fait alors réagir au moins un groupe amine du revêtement réticulé adsorbé, de préférence en présence d'un agent d'épuration des protons, avec une quantité de réactif suffisante pour produire au moins un groupe carboxyle. On fait de préférence réagir de nombreux groupes amines du revêtement 35 réticulé adsorbé avec une quantité de réactif suffisante pour produire des groupes carboxyles par dérivation des amines. Si le réactif utilisé est polyfonctionnel, alors il comprend de préférence un polymère hydrophile, et mieux un anhydride polymérique hydrophile et encore mieux un anhydride polyacrylique. Si le réactif utilisé est monofonctionnel, alors il comprend de préférence un monomère hydrophile et mieux un anhydride d'un monomère hydrophile. Alternativement, on fait réagir les groupes amines du revêtement adsorbé non réticulé, de préférence en présence 10 d'un épurateur de protons, avec une quantité d'un réactif polyfonctionnel suffisante pour réticuler simultanément ledit revêtement et produire au moins un groupe carboxyle. Le réactif polyfonctionnel comprend de préférence un polymère hydrophile, et mieux il comprend un anhydride polymérique hydrophile et 15 encore mieux un anhydride polyacrylique. En conséquence, la présente invention a pour objet une matière échangeuse de cations qui soit stable et reproductible. La présente invention a pour autre objet une telle matière échangeuse de cations qui ait une forte capacité de 20 charge et d'excellentes caractéristiques chromatographiques. La présente invention a pour autre objet une telle matière échangeuse de cations qui soit simple et peu coûteuse à produire. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins annexés illustrant plusieurs modes de réalisation et dans lesquels: les figures 1A, B, C et D sont des graphiques illustrant 30 l'évaluation chromatographique de quatre colonnes échangeuses de cations choisies, en se basant sur la séparation d'un mélange protéiné cytochrome c-lysozyme; la figure 2 est un graphique illustrant la rétention du lyzozyme en fonction du pH sur quatre colonnes échangeuses de 35 cations choisies; et les figures 3 (A,B) et (C,D) sont des graphiques illustrant l'évaluation chromatographique de deux colonnes échangeuses de cations choisies d'extrait de A. flos-aquae (algues) contenant le cytochrome c553. L'invention est particulièrement dirigée vers la préparation de matières échangeuses de cations qui sont particulièrement bien adaptées en tant que matières de garnissage pour la séparation des protéines et des polymères biologiques en chromatographie liquide. Pour produire les matières échangeuses de cations, comme dans le brevet U. S. n 4 245 005, la surface d'une matière de support ayant une affinité pour un adsorbat est mise en contact avec un adsorbat contenant des groupes amines de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé sur ladite surface par des forces électrostatiques. L'adsorbat est de préférence incorporé dans un solvant et l'adsorption peut être partiellement établie en contrôlant la polarité de ce solvant. Moins le solvant sera polaire, d'autant plus forte sera l'adsorption. 20 Un solvant approprié dans ce but est le méthanol. L'adsorbat contient au moins deux groupes fonctionnels, dont un coopère avec la surface de la matière de support pour provoquer son adsorption et dont l'autre est utilisé pour la réticulation. Bien que la polyéthylèneimine soit l'adsorbat préféré, d'autres adsorbats appropriés sont le 1,3-diamino-2hydroxypropane, la tétraéthylènepentamine et l'éthylènediamine. La matière de support est de préférence une matière 30 de support inorganique telle que la silice, l'alumine et l'oxyde de titane, la matière de support préférée étant la silice. Des exemples spécifiques de matières inorganiques appropriées de support sont LiChrospher Si 500 (diamètre de particule 10 microns), LiChrosorb Si 100 (diamètre de 35 particule 10 microns), LiChrospher Si 100 (diamètre de particule 10 microns), Chromosorb LC-6, Partisil 10, Vydac TPB, un verre à pores contr81és(diamètre de particule -10 microns, diamètre des pores 10 nm), de l'alumine Spherisorb (diamètre de particule 10 microns; diamètre des pores 15 nm), de l'alumine basique Bio-Rad, Activity I (diamètre de particule 40 microns), de l'alumine acide Bio-Rad, Activity I (diamètre de particule 40 microns), de l'oxyde de titane Corning (maille 40/60; diamètre des pores: nm), des gels de silice Amicon Matrex (marque déposée) , de la silice plaquée de zirconyle (revêtement de zirconium sur de la silice Vydac TPB) et de l'oxyde de magnésium. 10 Après adsorption d'un revêtement pelliculaire d'un adsorbat comprenant des groupes amines à la surface de la matière de support, le revêtement adsorbé peut être réticulé par exposition de ladite surface à un agent réticulant tel qu'une résine époxy ou un bromure d'alcoyle, l'agent réticulant 15 préféré étant une résine époxy polyfonctionnelle. Des agents réticulants de résine époxy appropriés comprennent le 1,2-éthanedioldiglycidyléther, le 1,4-butanedioldiglicydyléther et le 1,3-diglycidylglycérol. Afin de produire une matière échangeuse de cations, on fait alors réagir au moins un groupe 20 amine, et de préférence de nombreux groupes amines, du revêtement réticulé adsorbé, de préférence en présence d'un épurateur des protons et de préférence dans un solvant aprotique sec tel que le diméthylformamide, avec une quantité d'un réactif suffisante pour produire au moins un et de 25 préférence plus d'un groupe carboxyle via dérivation des amines de surface. L'épurateur de protons comprend de préférence une amine tertiaire et mieux la diisopropyléthylamine. Le réactif qui réagit avec les groupes amines du revêtement adsorbé réticulé pour produire des groupes carboxyles peut 30 être monofonctionnel ou polyfonctionnel. Si le réactif utilisé est monofonctionnel, alors il comprend de préférence un monomère hydrophile, et mieux un anhydride d'un monomère hydrophile et mieux un anhydride cyclique d'un monomère hydrophile. Des exemples d'anhydrides de monomèresappropriés 35 sont l'anhydride glutarique, l'anhydride succinique, l'anhydride diglycolique et le dianhydride tétrahydrofuran 2, 3,4,5-tétracarboxylique. Si le réactif utilisé est polyfonctionnel, alors il comprend de préférence un polymère hydrophile et mieux un anhydride polymérique hydrophile et encore mieux un anhydride polyacrylique. Alternativement, après adsorption d'un revêtement pelliculaire d'un adsorbat comprenant des groupes amines à la surface de la matière de support, on fait réagir les groupes amines du revêtement adsorbé non réticulé, de préférence en 10 présence d'un épurateur de protons, avec une quantité d'un réactif polyfonctionnel suffisante pour réticuler ledit revêtement et produire au moins un et de préférence plus d'un groupe carboxyle par dérivation des amines de surface. De nouveau, l'épurateur de protons comprend de préférence une amine tertiaire et mieux la diisopropyléthylamine. Le réactif polyfonctionnel est de préférence un polymère hydrophile, mieux un anhydride polymérique hydrophile et encore mieux un anhydride polyacrylique. Si le réactif polyfonctionnel employé est un anhydride, une hydrolyse complète de tous les 20 anhydrides n'ayant pas réagi est assurée avec un traitement à l'acide dilué. L'invention sera mieux illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. Exemple 1 On a mis en suspension un gramme de silice Vydac 101TPB de ,5 pm (sphérique, 33 nm), dans 10 ml d'une solution dans le méthanol à 1% en poids/volume de polyéthylèneimine-18 (poids moléculaire moyen = 1800). Le revêtement adsorbé a alors été réticulé en utilisant 10 ml d'une solution à 5% volume/volume 30 de diglycidylglycérol dans le méthanol. On a placé 0,7 gramme de silice enduite et réticulée dans un four à 110 C pendant minutes. La silice sèche a alors été mise en suspension dans une solution consistant en 4 ml de diméthylformamide sec, 250 1l (sèche, redistillée) de diisopropyléthylamine (DIEA) et 35 200 mg d'anhydride succinique (SUC). Cette réaction d'acylation produit des acides carboxyliques par la dérivation des amines de surface. On a ajouté DIEA en tant qu'épurateur de protons car un acide pouvant titrer lés amines adjacentes (les rendant non réactives) est produit pendant la réaction de l'anhydride et de la silice enduite d'amine et réticulée. Cette réaction a été répétée trois fois en utilisant des anhydrides différents: anhydride diglycolique (DGA), anhydride glutarique (GLU) et dianhydride tétrahydrofuran -2,3,4,5 tétracarboxylique (TETRA) à la place de l'anhydride succinique. 10 On a permis aux réactions de se passer pendant une nuit à C. Chaque produit a alors été isolé sur un entonnoir en verre fritté et lavé, en succession, avec du méthanol, de l'eau, de la triéthylamine et du méthanol. Après séchage sous vide, ces matières ont été stockées dans un dessiccateur. 15 On a déterminé la capacité de lier l'acide picrique dans mg de chacune des matières échangeuses de cations résultantes. L'ion d'acide picrique s'apparie avec les amines accessibles (non ionisées)mais non pas avec les amides. Par conséquent, la quantité d'acylation peut être déterminée sous 20 la forme du pourcentage de perte des amines pouvant s'apparier aux ions après dérivation. Un spectrophotomètre modèle 55 de Perkin-Elmer a été utilisé pour mesurer les concentrations de l'acide picrique. Les résultats de la détermination de l'acide picrique sont 25 donnés au tableau I. Tableau I Evaluation des phases stationnaires d'échange de cations avec adsorption synthétisées d'anhydrides cycliques demonomères tR(mn) R CTYc Anhydride utilisé %SUB Hbcec (mg/g) CYTc LYS LYS Succinique 80 42 6,6 15,2 11,4 Glutarique 69 39 10,3 15,2 6,4 Diglycolique 86 51 9,0 12,4 5,2 Dianhydride tétrafuran35 2,3,4,5-tétracarboxylique 74 41 11.6 21.0 4 5 - _ _, A, v Le terme % SUB est le pourcentage de substitution déterminé à partir de déterminations de capacité d'appariement de l'ion d'acide picrique avant et après dérivation: % SUB = [p mole amine/g avant-p mole amine/g après] X 100 P mole amine/g avant En général, on a pu acyler environ soixante-dix pour cent des amines de surface (tableau I). De légers écarts par rapport à ce nombre (selon l'anhydride) résultent soit d'imprécisions de la mesure ( I 5%) ou de variations de réactivité. Comme il 10 y a eu adsorption de l'acide picrique pour tous les revêtements ci- dessus, des amines étaient entremêlées de fragments carboxyles. Cependant, ces matières échangeuses de cations n'ont pas lié l'hémoglobine à pH 8 (pH auquel l'hémoglobine est chargée négativement), indiquant que ces amines ne sont pas accessibles à des grandes molécules comme la protéine, mais ne sont accessibles qu'à de petites molécules telles que l'acide picrique. On a ensuite déterminé 50 mg de chacune des matières échangeuses de cations pour leur capacité à lier des macro20 molécules (hémoglobine bovine brute type II à pH 5,5 de manière que la protéine soit positivement chargée). On a utilisé, pour mesurer les concentrations en hémoglobine, un spectophotomètre modèle 55 de Perkin-Elmer. Les matières échangeuses de cations synthétisées avec l'anhydride glutarique, l'anhydride succinique et le dianhydride tétrahydrofuran- 2,3, 4,5-tétracarboxylique ont toutes lié environ 40 mg d'hémoglobine par gramme de matière de support enduite. La matière échangeuse de cations d'anhydride diglycolique a lié légèrement plus d'hémoglobine, éventuellement du fait d'une augmentation de la dérivation (tableau I). La capacité de ces matières à lier l'hémoglobine à pH 5,5 a été utilisée pour démontrer la capacité de liaison par échange de cations de la protéine (Hb cec). Ensuite, on a introduit 0,5 g d'anhydride succinique (SUC), d'anhydride glutarique (GLU), d'anhydride diglycolique (DGA) et de dianhydride tétrahydrofuran-2,3,4,5-tétracarboxylique (TETRA) comme matières échangeuses de cations, dans des colonnes individuelles de 0,41 x 5 cm, DI, pour une évaluation chromatographique (voir tableau I et figures 1A, B, C). La chromatographie a été accomplie (avec un système Constametric LDC I et IIIG avec un "Gradient Master", Laboratory Data Control, Riviera Beach, Floride, E.U.A.), en utilisant, comme éluant, un gradient linéaire de 20 minutes de 0,01 mole de NaOac (pH 5,5) à 0,5 mole de NaCl dans 0,01 mole de NaOac (pH 5,5) à un débit de 1 ml/mn. L'échantillon de test analytique (20 jpl) consistait en 3 mg/ml de cytochrome c (CYTc-coeur de cheval, pI = 9,2) et 5 mg/ml de 10 lysozyme (LYZ - blanc d'oeuf, pI = 11) ainsi qu'une trace d'acide ascorbique pour empêcher l'oxydation. La détection a été surveillée à A234 au moyen d'un détecteur d'ultraviolets Altex modèle 153 (Anspec, Ann Arbor, Michigan, E.U.A.). Les temps de rétention ( R) des pics de CYTc et LYZ sont donnés au tableau I et montrés graphiquement à la figure 1 o le temps en minutes est donné sur l'axe des abscisses et l'absorbat sur l'axe des ordonnées. La résolution (R au tableau I et à la figure 1)entre CYTc et LYZ a été calculée selon l'équation: t À Rs = 2( R2- R1)/(AtR+AtR2) s 2 1 122 Les symboles tR et tR sont les temps de rétention de chaque pic tandis que NR1 et tR2 sont les largeurs des pics. Les indices 1 et 2 indiquent les premier et second pics 25 s'éluant de la colonne. La plus haute valeur de R a été s obtenue sur la colonne SUC. Cela résulte de la sélectivité unique plutôt que de la largeur réduite du pic. Bien que le lysozyme soit fortement retenu, CYTc s'est élué avant (figure 1C). La performance de la matière d'anhydride succinique était également remarquable pour des raisons économiques, c'est-à-dire que c'est le moins coûteux des anhydrides. Exemple II Un anhydride polyacrylique (PAA) a été synthétisé en pesant cinq grammes d'acide polyacrylique (poids moléculaire 2000, longueur de chaîne de 28) dans un ballon à fond rond 5 de 100 ml puis en le plaçant dans un bain d'huile à 180 C. Le ballon a alors été connecté à une pompe à vide et évacué pendant trois heures. Le solide jaune résultant a été enlevé du ballon et stocké dans un dessiccateur. L'analyse par RMN a montré que 79% des carboxyles s'étaient déshydratés, ce qui correspond à environ 11 fonctions anhydrides par molécule du polymère. On a mis en suspension 0,7 gramme de silice Vydac 101 TPB de 5,5 p (sphérique, 33 nm) dans 10 ml d'une solution à 1 % poids/volume dans le méthanol de polyéthylèneimine-18 15 et on a laissé reposer à température ambiante pendant minutes. La silice adsorbée a été réisolée sur un entonnoir de verre fritté et placée dans un four à 1100C pendant 30 minutes. Le milieu sec a alors été transféré à un ballon à fond rond de 50 ml contenant 4 ml de diméthylformamide 20 sec, 250 1pl de diisopropyléthylamine redistillée sèche et mg de l'anhydride polyacrylique ci-dessus préparé (1,2% PAA). Cette réaction a été répétée deux fois encore en utilisant des quantités différentes d'anhydride polyacrylique: 100 mg d'anhydride polyacrylique (2,4% PAA) et 200 mg d'anhydride polyacrylique (4,7% PAA). On a laissé les réactions se passer pendant une nuit à 600C. Chaque produit a alors été isolé sur un entonnoir de verre fritté et lavé en succession avec du méthanol, de l'eau, de la triéthylamine et du méthanol. Après séchage sous vide, ces matières ont été stockées dans un 30 dessiccateur. On a déterminé, pour leur capacité de lier l'acide picrique, 50 mg de chacune des matières échangeuses de cations résultantes synthétisées avec diverses concentrations de l'anhydride polyacrylique. Les résultats de la détermination sont donnés au tableau II. Tableau II Evaluation des phases stationnaires d'échange de cations avec adsorption synthétisées de l'anhydride polyacrylique tR (mn) R CYTc PAA(% poids/volume) % SUB Hb ec(mg/g) CYTc LYS LYS Hcec(/)s Y 4,7 59 59 10,6 NE CO 2,4 68 54 8,8 15,4 6,6 1,2 55 36 6,6 10,6 4,9 De manière intéressante, le pourcentage d'acylation de ces matières échangeuses de cations était plus faible que celui obtenu avec les anhydrides de monomères de l'exemple 1. L'accès du grand anhydride polyacrylique aux amines en phase stationnaire peut être empêché pour des raisons stériques. Comme il n'y avait pas de liaison de l'hémoglobine échangeuse d'anions, les matières échangeuses de cations ont été supposées réticulées de manière adéquate sans charge 20 positive résiduelle accessible. On a ensuite déterminé 50 mg de chacune des matières échangeuses de cations d'anhydride polyacrylique pour leur capacité de liaison par échange de cations de la protéine (Hbcec) en utilisant l'hémoglobine (bovine brute type II) 25 ce à un pH tampon de 5,5. Les résultats de cette détermination sont donnés au tableau II. La liaison de l'hémoglobine a augmenté avec la concentration de l'anhydride polyacrylique. La plus grande valeur a été obtenue sur la matière synthétisée avec la plus forte concentration (4,7 % PAA). Cette matière et la matière préparée avec 2,4% de PAA a lié plus d'hémoglobine que la matière échangeuse de cations d'anhydride diglycolique produite à l'exemple I. Comme la totalité des matières échangeuses de cations de l'exemple I et de l'exemple II part d'un intermédiaire commun (c'est-à-dire 35 la polyéthylèneimine non réticulée adsorbée sur de la silice Vydac), la capacité accrue de liaison de l'hémoglobine semble se relater directement au rapport de l'amide aux groupes carboxyliques de PAA lié de manière covalente. L'anhydride polyacrylique est un polymère linéaire. m5 Contrairement aux anhydrides de monomères de l'exemple I o le groupe carboxyle doit être à cinq atomes de la surface, les longueurs de l'acide polyacrylique (tiges et boucles) peuvent atteindre le volume des pores de la silice. L'existence de telles structures donne à la surface une topographie dentelée, augmentant efficacement l'aire superficielle. Comme la capacité de liaison est directement en rapport avec cette dernière, il en résulte une augmentation. La matière échangeuse de cations réticulée avec 1,2% de PAA a lié 36 mg d'hémoglobine par gramme du support enduité, ce qui 15 était comparable à la matière échangeuse de cations d'anhydride monomère de l'exemple I. A de plus faibles concentrations de l'anhydride polyacrylique, les structures de tiges et boucles peuvent ne pas être prédominantes, car il y a moins de compétition pour les amines de surface et les 20 molécules d'anhydride polyacrylique réagissent intensément. On a introduit environ 0,5 g de chacune des matières échangeuses de cations d'anhydride polyacrylique dans des colonnes de 0,41x5 cm pour une évaluation chromatographique. La chromatographie a été accomplie avec les intruments de chromatographie et l'appareil de détection de l'exemple I en utilisant un gradient linéaire de 20 minutes de 0,01 mole de NaOac (pH 5,5) à 1 mole de NaCl dans 0,01 mole de NaOac (pH 5,5) à un débit de 1 ml/mn en tant qu'éluant. L'échantillon d'essai analytique (10 pl) consistait en CYTc et LYZ avec une trace d'acide ascorbique comme à l'exemple I. Les temps t de rétention (tR) des pics de CYTc et LYZ ainsi que la résolution (calculée comme à l'exemple I) entre CYTc et LYZ sont donnés au tableau II et les temps de rétention des pics de CITc et LYZ sur une matière de 1,2% de PAA sont montrés 35 graphiquement à la figure 1. Les temps de rétention de CYTc et du lysozyme ont accru avec la concentration de PAA. En fait, le lysozyme n'a pu être élué de la colonne de 4,7% PAA avec une mole de NaCl et il a fallu 0,77 mole de NaCl pour la désorption de la colonne de 2,4% PAA. Ces valeurs sont sensiblement plus importantes que celles obtenues avec les colonnes de l'exemple I. Bien que la colonne fortement rétentrice de 4,7% puisse ne pas être chromatographiquement pratique parce qu'elle est trop rétentrice, elle peut trouver une utilisation pour l'immobilisation de la protéine. Des 10 polypeptides cationiques, comme les anticorps, pourraient être fortement adsorbés à la matrice pour une chromatographie d'immuno-affinité. En utilisant un gradient linéaire de minutes de 0 à 1 mole de NaCl, la résolution entre CYTc et LYZ a varié de "l'infini" sur la colonne à 4,7% de PAA à une 15 valeur de 4,9 sur la colonne à 1,2% de PAA. La colonne à 4,7% de PAA a donné une valeur indéfinie de Rs, du fait de la rétention infinie de LYZ. La colonne à 1, 2% de PAA a donné la faible valeur de R en conditions spécifiées; cependant, cette s valeur a atteint 6,1 lorsque la pente du gradient a diminué 20 de un-demi (voir figure 1D). Exemple III On a chromatographié environ 20 pl d'un échantillon d'essai semblable à celui de l'exemple I de CYTc et LYZ avec une trace d'acide ascorbique, sur les colonnes d'anhydride glutarique, d'anhydride succinique et d'anhydride diglycolique de l'exemple I et la colonne de 1,2% d'anhydride polyacrylique de l'exemple II à plusieurs valeurs du pH de l'éluant (autres conditions constantes). Dans tous les cas, la rétention était inversement en rapport avec le pH (la figure 2 montre la rétention du lysozyme seul). Ce comportement résulte d'une augmentation de la charge positive nette de la protéine tandis que le pH de l'éluant baisse en-dessous du point isoélectrique. Un examen plus précis montre que la colonne de l'anhydride glutarique est la plus sensible au pH. Comme l'anhydride glutarique contient un groupe méthylène supplémentaire, une interaction coopérative hydrophobe -ionique peut en être responsable. Cette expérience a servi à définir la plage générale de pH de fonctionnement de ces matières échangeuses de cations. Une résolution de 4 ou plus entre CYTc et LYZ a -été obtenue entre pH 5,5 et 7,5. Exemple IV On a choisi la colonne d'anhydride succinique de l'exemple I et la colonne à 1,2% d'anhydride polyacrylique de l'exemple II en tant que milieux représentatifs pour le fractionnement d'un mélange de protéines brutes. L'échantillon consistait en un extrait de la cyanobactérie Aphanizomenon flos-aquae contenant le cytochrome c553 (CYTc553). Cette 553 c553 protéine avait un point isoélectrique de 9,3, un poids moléculaire de 11 000 et des propriétés spectrales uniques. 15 A l'état réduit, le spectre d'absorption visible présente des maxima à 280, 410 et 553 nanomètres. L'extrait de cellules brutes a été partiellement traité par ultrafiltration (membrane de coupure d'un poids moléculaire de 30 000). Le filtrat résultant, qui contenait 20 moins de 0,5 mg/ml de la protéine, a été recueilli et ajusté à pH 7. Une aliquote de 80 pl de ce mélange a alors été introduite sur chaque colonne échangeuse de cations (0,41x5 cm). Comme à l'exemple I, une chromatographie a été accomplie en utilisant un gradient linéaire de 20 minutes de 0,01 mole de 25 NaOac (pH 7) à 0,5 mole de NaCl dans 0,01 mole de NaOac (pH 7) à un débit de 1 ml/mn en tant qu'éluant. Une surveillance de longueur d'onde double (à 260 et 410 nm) a été accomplie avec un système de détection HP 1040 A (Hewlett Packard, Corvallis, Oregon, E.U.A.). Le signal à 260 nm détecte toutes les protéines, tandis que le signal à 410 nm surveille celles qui contiennent les noyaux de polyporphorine (comme CYTc5553). L'examen du chromatogramme obtenu à partir de la colonne d'anhydride succinique (à 260 nm) montre un nombre 35 sensible dematières adsorbant les ultraviolets (figure 3A). Cependant, le petit pic éluant à 8,5 minutes a été identifié comme étant CYTc335 (figure 3B) en se basant sur ses propriétés spectrales. Le rapport d'absorbance 553/280 au sommet du pic était de 0,4. Comme une valeur de 1 est considérée comme étant pure à 90%, des impuretés sont encore présentes. Néanmoins, en jugeant de la surface du pic de CYTc553 relativement aux surfaces restantes de pic, on a obtenu une purification sensible. Une chromatographie sur la colonne à 1,2% d'anhydride polyacrylique en conditions identiques a donné des résultats similaires (figure 3C). En général, ce support était légèrement plus rétenteur que la colonne d'anhydride succinique et également légèrement plus sélectif, séparant le mélange en 12 pics distincts en comparaison à 10. De nouveau, CTYc553 a été identifié par son absorbance visible à un temps de rétention de 9,4 minutes. L'analyse spectrale au sommet du pic a donné un rapport d'absorbance de 553/280 d'environ 0,45. R E V E N D I C A T IONS 1. Procédé de production d'une matière échangeuse de cations,caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support ayant une surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de ladite matière de support en contact avec un adsorbat comprenant des groupes amines de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé sur ladite surface par des forces électrostatiques; et 10 c) faire réagir les groupes amines du revêtement adsorbé avec une quantité d'un réactif polyfonctionnel, suffisante pour réticuler ledit revêtement et produire au moins un et de préférence de nombreux groupes carboxyles. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réactif polyfonctionnel comprend un polymère hydrophile. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'un épurateur de protons comprenant une amine tertiaire est ajouté à la réaction de l'amine et du réactif polyfonctionnel à l'étape c précitée. 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la matière de support est une matière de support inorganique choisie dans le groupe consistant en silice, alumine et oxyde de titane. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 1 ou 2 caractérisé en ce que l'adsorbat est choisi dans le groupe consistant en polyéthylèneimine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, tétréthylènepentaimine et éthylènediamine. 6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'adsorbat est incorporé dans un solvant et l'adsorption 30 est au moins partiellement établie en contrôlant la polarité dudit solvant. 7. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le polymère hydrophile comprend un anhydride polymérique. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce 35 que l'anhydride polymérique comprend un anhydride acrylique. 9. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la matière échangeuse de cations est utilisée en tant que matière de garnissage en chromatographie liquide. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la matière de garnissage chromatographique est utilisée pour séparer des protéines ou autres polymères biologiques. 11. Procédé de production d'une matière échangeuse de cations caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support de silice ayant une 10 surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de ladite matière de support en contact avec un adsorbat comprenant de la polyéthylèneimine de manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé sur la surface par des forces électrostatiques; et c) faire réagir ledit revêtement de polyéthylèneimine adsorbé en présence d'un épurateur de protons avec une quantité d'anhydride polyacrylique suffisante pour réticuler ledit revêtement et produire des groupes carboxyles. 12. Procédé de production d'une matière échangeuse de 20 cations caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) prévoir une matière de support ayant une surface avec une affinité pour un adsorbat; b) mettre la surface de ladite matière de support en contact avec un adsorbat comprenant des groupes amines de 25 manière qu'un revêtement pelliculaire dudit adsorbat soit adsorbé à la surface par des forces électrostatiques; c) forcer ledit revêtement adsorbé à ladite surface à y être réticulé; et d) faire réagir au moins un et de préférence de nombreux groupes amines dudit revêtement réticulé adsorbé avec une quantité d'un réactif suffisante pour produire un et de préférence de nombreux groupes carboxyles. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'un épurateur de protons comprenant une amine tertiaire est 35 ajouté à la réaction de l'amine et du réactif à l'étape d. 14. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que la matière de support précitée est une matière de support inorganique choisie dans le groupe consistant en silice, alumine et oxyde de titane. 15. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'adsorbat précité est choisi dans le groupe consistant en polyéthylèneimine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, tétraéthylènepentamine et éthylènediamine. 16. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en 10 ce que le réactif de l'étape d précitée est polyfonctionnel. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le réactif polyfonctionnel comprend un polymère hydrophile. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en 15 ce que le polymère hydrophile comprend un anhydride polymérique. 19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'anhydride polymérique comprend un anhydride polyacrylique. 20 Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que le réactif de l'étape d est monofonctionnel. 21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce le réactif monofonctionnel comprend un monomère hydrophile. 22. Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce 25 que le monomère hydrophile comprend un anhydride cyclique monomère. 23. Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que l'anhydride monomère est choisi dans le groupe consistant en anhydride glutarique, anhydride succinique, anhydride diglycolique et dianhydride tétrahydrofuran-2,3,4,5-tétracarboxylique. 24. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que le revêtement adsorbé est réticulé par exposition de la surface à un agent réticulant choisi dans le groupe consistant 35 en résine époxy et bromure d'alcoyle. 25. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'adsorbat est incorporé dans un solvant et o l'adsorption est au moins partiellement établie en contrôlant la polarité dudit solvant. 26. Matière échangeuse de cations caractériséeen ce qu'elle est préparée par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 27. Matière échangeuse de cations caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé selon la revendication 12. 10 28. Matière échangeuse de cations selon la revendication 27 caractérisée en ce que le réactif est polyfonctionnel. 29. Matière échangeuse de cations selon la revendication 28 caractérisée en ce que le réactif poly15 fonctionnel comprend un anhydride polymérique hydrophile. 30. Matière échangeuse de cations selon la revendication 27 caractérisée en ce que le réactif est monofonctionnel. 31. Matière échangeuse de cations selon la revendication 30 caractérisée en ce que le réactif monofonctionnel comprend un anhydride cyclique monomère hydrophile. 32. Matière échangeuse de cations selon la revendication 27 caractérisée en ce que la matière de support est une matière de support inorganique choisie dans le groupe consistant en silice, alumine et oxyde de titane. 33. Matière échangeuse de cations selon la revendication 27 caractérisée en ce que le revêtement adsorbé est réticulé par exposition de la surface à un agent 30 réticulant choisi dans le groupe consistant en résine époxy et bromure d'alcoyle. 34. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'à l'étape d précitée la totalité des groupes amines réactifs de revêtement réticulé adsorbé, à l'exception de ceux qui ne sont pas accessibles aux grandes molécules comme la protéine, réagissent avec le réactif pour produire des groupes carboxyles.