Brevet FR2599380A1 — publié le 19871204

La présente invention concerne un procédé pour l'exportation de protéines chez Escherichia coli. I1 est connu depuis maintenant un certain temps de faire synthétiser des protéines par la bactérie E. coli en utilisant des vecteurs d'expression tels que pBR322. Toutefois, l'un des inconvénients des procédés est que les protéines ainsi synthétisées ne sont pas exportées par la bactérie. Ceci conduit à des difficultés au niveau de la purification de la protéine synthétisée. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé permettant l'exportation des protéines chez E. coli qui permet de purifier très facilement la protéine obtenue. Plus particulièrement, la présente invention concerne un bloc ' d'exportation d'une protéine déterminée chez E. coli caractérisé en ce qu'il comporte au moins la séquence suivante Phos Sc X - PhoS correspond au gène PhoS ou à une partie de ce gène assurant son exportation, ledit gène étant dépourvu de codon stop, - Sc correspond à une séquence codant pour un ou plusieurs amino-acides clivables chimiquement ou enzymatiquement pour libérer le produit du gène X, - X correspond au gène codant pour la protéine déterminée et dépourvu de séquence codante similaire à la séquence Sc. Le bloc d'exportation selon l'invention sera, de préférence, inséré dans un vecteur plasmidique de E. coli, lequel comportera une origine de réplication fonctionnelle de cette bactérie. Bien entendu, les vecteurs selon la présente invention peuvent comporter d'autres éléments qui sont maintenant connus dans le domaine des ADN recombinants, à savoir notamment les différents éléments nécessaires à l'expression des gènes PhoS et X, c'est-à-dire essentiellement un promoteur, un site d'initiation de la traduction, ainsi qu'éventuellement différentes séquences permettant une régulation si cela est nécessaire. En outre, il peut être intéressant de prévoir un gène marqueur codant, par exemple, pour la résistance à r r un antibiotique tel que les gènes Ampr ou Tetr. Ces différents éléments sont connus et ne seront pas décrits en détail ci-après. Pour ce qui concerne les éléments essentiels caractéristiques de la présente invention, l'utilisation du gène PhoS présente de nombreux avantages. En effet, il s'agit là d'une protéine affine pour le phosphate dont la synthèse et la structure présentent des caractéristiques très intéressantes. Tout d'abord, la production de cette protéine est inductible en milieu carencé en phosphate et représente alors un très fort pourcentage des protéines totales synthétisées. L'hyperproduction obtenue après clonage du gène PhoS dans un vecteur multicopie n'est pas léthale pour la cellule. Enfin, cette protéine ne comporte aucune méthionine en dehors de la séquence signal clivée lors de l'exportation, ceci présente un grand intérêt dans l'application particulière qui en est faite ci-après. En effet, la séquence mentionnée précédemment permet de préparer une protéine fusionnée contenant le produit du gène PhoS fusionné avec le produit du gène X, c 'est-à-dire la protéine désirée. Cette protéine fusionnée est exportée vers l'espace périplasmique et peut donc être récupérée par choc osmotique. Comme elle comporte, en outre, d'après la structure précédente, un site de clivage entre les deux éléments protéiques, il est possible d'effectuer ce clivage et de récupérer par là même la protéine X. Bien que l'on préfère utiliser le gène PhoS complet, il est néanmoins possible de n'utiliser qu'une partie de ce gène, en particulier il est possible d'utiliser le gène PhoS tronqué d'une partie de son extrémité 3'. De façon générale, on préfèrera ne tronquer l'extrémité 3' que de quelques codons lorsque cela est nécessaire pour l'obtention de structures C-terminales particulières. Bien entendu, le gène PhoS ne doit pas comporter de codon stop, de façon à permettre la fusion avec la protéine X. Pour ce qui concerne la séquence Sc de clivage, il peut s'agir d'une séquence codant pour un ou plusieurs amino-acides qui peuvent être clivés chimiquement ou enzymatiquement. Le site de clivage le plus simple est évidemment, pour l'instant, la séquence ATG correspondant au codon start du gène X qui code pour la méthionine, laquelle peut être scindée à l'aide du bromure de cyanogène. Cette scission doit pouvoir s'effectuer uniquement entre les deux protéines fusionnées, ceci implique donc que le gène X ne comporte pas de séquence codant pour la méthionine. Ceci peut être réalisé en effectuant, pour certains gènes, des mutations ponctuelles par des techniques qui sont connues de l'homme de métier, en particulier par des mutations utilisant des oligonucléotides synthétiques. Les exemples ci-après ont été effectués avec le gène GRF, mais il est bien entendu possible d'utiliser d'autres gènes codant pour des protéines d'intérêt industriel. L'invention concerne des souches d'E. coli, éventuellement phoS , transformées par les vecteurs décrits précédemment, ainsi qu'un procédé de préparation de protéines dans lequel on cultive les souches d'E. coli transformées et on récupère la protéine fusionnée dans le surnageant du choc osmotique, ladite protéine étant ensuite clivéesau niveau du site de clivage (Sc). I1 est intéressant d'ajouter du phénylméthanesulfonyl-fluorure (PMSF) à la concentration de 2 mM au milieu de culture 2 heures après transfert des bactéries sur milieu limitant en phosphate. Ceci contribue à a.meliorer considérablement la stabilité de la protéine fusion. Le PMSF est ensuite utilisé dans les étapes de purification. Un procédé particulièrement intéressant pour la séparation de la protéine fusionnée consiste à utiliser une colonne immuno-absorbante sur laquelle est fixé un anticorps anti-PhoS. Ceci permet de séparer aisément la protéine fusionnée du milieu pour effectuer le clivage. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention mais ne la limitent évidemment aucunement. EXEMPLE 1 Le système modèle utilisé concerne la production du peptide GRF tGrowth Hormone Release Factor) contenant 44 acides aminés. Le gène synthétique de GRF a été purifié à partir du plasmide 196.1. Ce gène code pour une protéine GRF modifiée dans laquelle la méthionine interne nO 27 a été remplacée par une leucine et une méthionine a été introduite à l'extrémité amino-terminale. Le plasmide 196.1 a d'abord été hydrolysé par EcoRI, traité à la polymérase Klenow pour supprimer l'extrémité adhésive, puis coupé avec l'enzyme SalI. Le gène GRF obtenu a ensuite été introduit dans le multisite de clonage du vecteur pUC12 (Vieira J. et Messing J. (1982) Gene 19, 259-268) comportant 11 sites de restriction uniques codant dans les 3 phases et permettant ainsi de conserver la phase de lecture avec le gène PhoS. Dans ce but, le vecteur pUC12 a été hydrolysé avec BamHI traité à la polymérase Klenow, puis avec l'enzyme SalI. Le gène GRF a ensuite été introduit dans puy12 en utilisant une ligase (figure 1). Des souches d'E. coli C600 et JM83 ont été transformées avec le plasmide obtenu. La séquence du fragment du clone positif SmaI (marquée au 32p en 5')-HincII a été vérifiée par la technique Maxam-Gilbert. Une mutagénèse dirigée, destinée à introduire un site unique de restriction, juste avant le codon stop du gène PhoS a ensuite été réalisée. Dans ce but, le fragment PstI-EcoRI du vecteur pSN 5182 (Anemura M., Shinagawa A., Makino K., Otsuji N. et Nakata A. (1982) J. Bacteriol. 152, 692-701) a d'abord été introduit dans le vecteur M13mp9 (Messing J. et Vieira J. (1982) Gene 19, 269-275) pour obtenir RFR311. Le simple brin contenant le fragment a alors été préparé. La mutagénèse a ensuite été réalisée avec un oligonucléotide comme indiqué ci-dessous - - - Tyr - - - Stop - - - Stop - - - TAC TAA TAA ) (séquence PhoS) - - - TAC TAA ) (oligonucléotide) Tyr t Val Stop SnaBI Le procédé de sélection utilisé est celui qui est indiqué à la figure 2. On obtient ainsi plusieurs clones dans lesquels le premier codon stop de PhoS a été remplacé par le codon GTA (codant pour la valine) et -un site SnaBI a été créé. Le fragment de restriction muté PstI-EcoRI a été réinséré dans le plasmide pSN 5182. Le fragment SmaI-HincII de pUC12 GRF, contenant le gène synthétique pour GRF, a alors été introduit dans le site SnaBI de pSN5182 muté. La construction suivante est ainsi obtenue Tyr I Gly Asp Gln Phe I Met - GRF - Stop TAC I GGG GAT CAA TTC ATG PhoS PHOS phots | Gly Asp Glr, Phe Met CNBr Le clivage au CNBr de la protéine fusion peut alors fournir le peptide GRF. Ce système est généralisable et peut être appliqué pour produire et exporter n'importe quel peptide dans le périplasme. La présence d'une méthionine unique en position NH2-terminale permet la récupération facile du peptide à condition qu'il ne comporte pas de résidus méthionine internes. Le plasmide 196.1 est obtenu à partir du plasmide pBR322 par clonage du gène synthétique GRF (commercialisé par Creative Biomolecules, 385 Oyster Point Blvd, South San Francisco, CA 94080, USA) entre les sites EcoRI et SalI. Le gène tS est décrit dans les articles suivants : Surin et al. (1984) J. Bacteriol. 157, 772-788 Magota et al. (1984) J. Bacteriol. 157, 909-917. REVENDICATIONS 1) Bloc d'ADN destiné à l'exportation d'une protéine déterminée chez E. coli, caractérisé en ce quiil comporte au moins la séquence suivante Phots Sc X - PhoS correspond au gène PhoS ou à une partie de ce gène assurant son exportation, ledit gène étant dépourvu de codon stop, - Sc correspond à une séquence codant pour un ou plusieurs amino-acides clivables chimiquement ou enzymatiquement pour libérer le produit du gène X, - X correspond au gène codant pour la protéine déterminée et dépourvu de séquence codante similaire à la séquence Sc. 2) Vecteur d'exportation caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide qui comporte un bloc d'exportation selon la revendication 1 et au moins une origine de réplication dans E. coli. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que Sc est une séquence codant pour la méthionine. 4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que Sc correspond à un codon ATG notamment le codon start du gène X. 5) Vecteur selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le gène X est le gène du peptide GRF. 6) Souche d'E. coli transformée par un vecteur selon l'une des revendications 2à 5. 7) Procédé d'obtention d'une protéine déterminée caractérisé en ce qu'on cultive une souche d'E. coli selon la revendication 6 sur un milieu de culture, en ce qu'on récupère la protéine fusionnée produit du gène PhoS et du gène X à partir du surnageant du choc osmotique et en ce qu'on clive cette protéine fusionnée pour récupérer la protéine déterminée. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine fusionnée est isolée par passage sur une colonne d'immuno-absorbant anti-phoS qui fixe la portion fusionnée qui est ensuite clivée. 9) Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que, lorsque Sc code pour la methionine, on clive la protéine fusionnée par CNBr. 10) Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture est carencé en phosphate. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu de culture carencé en phosphate contient du phénylméthane-sulfonyl-fluorurè (PMSF).