Brevet FR2608169A1 — publié le 19880617

MODULE DE CULTURE DE MICRO-ORGANISMES. La présente invention se rapporte à des modules de culture de micro-organismes utilisables aussi bien en laboratoire que dans l'industrie. Afin de cultiver des micro-organismes en atmosphère contrôlée, et donc en milieu isolé par rapport à l'air ambiant, on dispose en laboratoire de récipients fermés communiquant de manière appropriée avec - une source d'un mélange gazeux déterminé et un évent pour les gaz à évacuer, - des moyens pour introduire, renouveler, et va cuer, de manière continue ou discontinue, le mi lieu de culture et, à partir duquel les micro organismes se développent, - des moyens pour prélever, de manière continue ou discontinue, les micro-organismes en suspension dans le surnageant. Ces différents systèmes de culture se caractérisent par un rapport des volumes du milieu liquide de culture et de l'atmosphère gazeuse, relativement important. Ceci n'autorise pas ltobtention d'une quantité importante de matériel biologique ou cellulaire, où alors, il est nécessaire d'accroitre le nombre de récipients de culture, et donc la complexité de l'ensemble. La présente invention a pour objet un module de culture de micro-organismes, permettant dans un volume global relativement faible d'obtenir un volume gazeux comparable au volume du milieu de culture en développement. Selon l'invention, le module comprend un récipient de forme substantiellement plate, c'est-à-dire s'étendant dans l'espace selon deux dimensions, appelées ciaprès pour les commodités de la description, "largeur" et "longueur", et une troisième dimension, appelée ciaprès "hauteur", substantiellement inférieure à la longueur et à la largeur. Ce récipient comprend - une paroi latérale, un fond et un dessus - une pluralité de cloisons selon la longueur, dis posées entre le fond et le dessus, et distribuées selon la largeur ; ces cloisons déterminent entre elles et avec la paroi latérale une pluralité de canaux selon la longueur. Les différentes cloisons comportent chacune à une extrémité une ouverture complète, c'est-à-dire s'étendant entre le fond et le dessus du récipient. Et toutes les différentes ouvertures sont alternées, selon la largeur, d'un côté et de l'autre des différentes cloisons, et déterminent ainsi un passage en serpentin du premier canal vers le dernier canal selon la largeur. Il doit être entendu que les termes "largeur" et "longueur", employés ci-après, ne préjugent pas des dimensions relatives du récipient, ces deux termes étant employés à titre de commodité, comme dit plus haut. Grâce à l'invention, pour une faible surface développée du récipient de culture proprement dit, et donc un faible encombrement, il est possible d'obtenir une couche de milieu de culture peu épaisse, en relation avec un volume sensiblement équivalent de l'atmosDhère gazeuse. L'interface milieu de culture/atmosphère gazeuse, particulièrement développée selon l'invention, et homogène quelque soit l'endroit considéré du passage en serpentin, apparait particulièrement favorable au déve loppement des micro-organismes. Les autres avantages de la présente invention seront mieux compris grâce à la lecture de la description suivante, par référence aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 représente une vue en coupe d'un module de culture selon l'invention, suivant le plan de coupe I-I montré à la figure 2 - la figure 2 représente une vue en coupe du même module selon le plan de coupe II-II montré à la figure 1, - la figure 3 représente une vue en coupe du même module selon le plan de coupe III-III montré à la figure 1. Le module de culture selon les figures 1 à 3 a une forme générale parallélépipédique aplatie, et comporte un corps central, ayant la forme d'un profilé en matière plastique, transparente, thermiquement stable, par exemple en polycarbonate. Dans ce corps central, il faut distinguer, d'une part le récipient destiné à la culture des micro-organismes, référencé (2), et d'autre part, deux parties externes (31) et (32), disposées de part et d'autre du récipient (2), dont le rôle sera explicite ci-après. Le récipient s'étend dans l'espace selon trois dimensions, à savoir une première dimension, appelée ciaprès "largeur" et correspondant à la verticale de la figure 1, une deuxième dimension appelée ci-après "longueur" et correspondant à l'horizontale de la figure 1, et une troisième dimension, appelée ci-après "hauteur", et correspondant à la verticale des figures 2 et 3. Le récipient comporte une paroi de fond (4) et une paroi de dessus (5), ainsi qu'une paroi latérale (7), ayant en section horizontale la forme d'un rectangle. A l'intérieur du récipient (2), entre les parois de fond (4) et de dessus (5), sont disposées une pluralité de cloisons (6a à 6d), dont certaines seulement ont été représentées aux figures 1 à 3 ; ces cloisons s'étendent selon la longueur et sont distribuées selon la largeur, pour déterminer entre elles et avec la paroi latérale (7) du récipient une pluralité de canaux (8a) à (8d) allongés selon la longueur. Chaque cloison comporte, d'un côté une ouverture complète (9a à 9d) s'étendant entre le fond (4) et le dessus (5) du récipient, et de l'autre côté uo ouvertu- re partielle (10a à 10d), s'étendant entre le fond (4) du récipient et une zone intermédiaire située entre le fond (4) et le dessus (5) du récipient. Selon l'invention, les différentes ouvertures complètes (9a à 9d) sont alternées d'un côté et de l'autre des cloisons (6a à 6d), selon la largeur , on obtient ainsi un passage -(11) en forme de serpentin depuis le premier canal (8a) jusqu'au dernier canal (8d) du recipient. Les deux parois latérales selon la largeur sont obtenues par jonction avec le récipient (1) de deux pièces de fermeture (12) et (13) comportant chacune une âme (12a, 13a) et deux bords (12b,i3b), (12c,13c) en contact avec le dessus (5) et le fond (4) du récipient. Deux joints d'étanchéité (14,15) ayant chacun la forme d'une bande, et en silicone, sont disposés chacun entre les deux bords (12b,12c) et (13b,13c) de la pièce de fermeture (12,13), l'épaisseur de la paroi de fond (4) et celle de la paroi de dessus (5) du récipient. Les pièces de fermeture (12) et (13) sont légèrement cintrées ,de telle sorte que la partie centrale de ces pièces soit rapprochée du récipient (1) alors que leurs extrémités sont au contraire écartées de trois à quatre millimètres du même récipient. Cette concavité permet, lorsque l'on serre les boulons (22) décrits ciaprès, d'appliquer les joints d'étanchéité (14,15) avec une pression égale sur toute la largeur du module (1). Deux cloisons supplémentaires (16) et (17), s'étendant selon la longueur, sont disposées de part et d'autre du récipient selon la largeur, et à l'extérieur de ce dernier. On obtient ainsi deux canaux externes supplémentaires (18) et (19), autorisant le passage de deux tirants (20) et (21), permettant au moyen de boulons (22) ou écrous à oreilles d'assembler de manière amovible les pièces de fermeture (12) et (13) entre elles et avec le récipient (1). Grâce à des perçages (23) de diamètre adapté, dans l'âme (12a et 13a) des pièces de fermeture (12) et il est possible de passer des capteurs à travers les joints (14 et 15) jouant le râle de septum. Ces capteurs permettent, par exemple, de mesurer de façon continue le pH du milieu, la température, le pourcentage de gaz dissout, afin d'effectuer un réajustement de ces paramètres en cours de culture. D'autres percages (23) dans l'âme (12a et 13a) des pièces de fermeture permettant de faire des prélèvements de cellules et de milieu, à. l'aide d'une seringue et d'une aiguille, à des fins d'analyse ou de mesure de croissance. A titre d'exemple, un module tel que précédemment décrit peut avoir les dimensions suivantes - longueur : 35-40 cm, - largeur : 29 cm, - hauteur : 16 mm, et dans une telle cellule, il est possible d'introduire une couche d'un milieu de culture ayant cinq à six millimètres d'épaisseur tandis que la couche gazeuse représente environ dix millimètres d'épaisseur , au total, dans un tel module, il est possible d'obtenir 500 ml, et beaucoup plus en empilant les modules les uns sur les autres par exemple. Lorsque le module de culture contient le milieu liquide de croissance des microorganismes, les ouvertures partielles (10a à 10d) sont obturées par le liquide. L'atmosphère gazeuse comprise entre la surface du liquide et la paroi de dessus (5) détermine, de ce fait, un serpentin. Le liquide peut à l'inverse communiquer d'un canal à l'autre par les deux extrémités de ces mêmes canaux. Le module qui vient d'être décrit présente en outre les avantages suivants 1 - sa stérilisation est particulièrement simple, puisqu'il ne présente aucune partie saillante , il n'est en particulier pas nécessaire d'envelopper ce module dans un emballage stérile 2 - en affectant l'ouverture (23a) à l'introduction du mélange gazeux et l'ouverture (23d) à l'évacuation de l'atmosphère gazeuse obtenue dans le récipient de culture, on obtient un gazage homogène et complet de ce dernier 3 - en correspondance, on peut affecter les ouvertures (23c) et (23d) au remplissage et au renouvellement du milieu de culture , il suffit pour cela d'incliner lentement le module, de telle sorte que le surnageant présent dans tous les canaux (8a à 8d) se rassemble au voisinage des pièces de fermeture (12) ou (13), une communication du surnageant entre les différents canaux étant obtenue grâce aux ouvertures partielles (10a à 10d) ; on peut ensuite collecter le surnageant ainsi rassemblé au moyen d'une aiguille hypodermique introduite dans un orifice (23c) ou (23d) 4 - un tel module peut être nettoyé facilement, puisqu'il suffit de démonter l'ensemble, en dévissant les boulons (22), et de passer un ecouvillon de part en part dans chaque canal (8a à 8d). Un module de culture conforme à l'invention a ete utilisé pour la culture à grande échelle du parasite "Plasmodium falciparum", selon le processus suivant. Le milieu est constitué de RPMI 1640 (GIBCO GRAND ISLAND, NEW YORK) tamponné à pH = 7,2, auquel on ajoute 10 % de sérum humain, 5 % d'hématies humaines du groupe A+ et 1% d'une solution de Néomycine (GIBCO). Le remplissage est effectué par gravité à l'aide d'un perfuseur stérile à usage unique monté sur une aiguille hypodermique piquée à travers le joint de silicone (15) et un orifice (23c ou 23d). Le matériel parasitaire (souche SGE 1 provenant de GAMBIE) est ajouté au milieu de manière à obtenir une parasiténie de départ de 0,2 X à 5%.On injecte ensuite le mélange gazeux (3 X 02; 7 % C02 ; 90 % N2) à travers le septum (14) et un orifice (23a ou 23b).L'évolution de la parasiténie à 37" est contrôlée en effectuant des prélèvements à la seringue de la couche inférieure d'hématies. Pour renouveler le milieu, le surnageant est éliminé par gravité comme pour le remplissage. I1 suffit d'incliner à vitesse très lente, le et module de culture jusqu'à 30 environ et de régler la position de l'aiguille, au travers d'un orifice (23c ou 23d), afin de ne collecter que le surnageant. Cette opération est immédiate puisque les hématies ne sont pas remises en suspension. Le milieu neuf est ensuite ajouté comme précédemment et le mélange est homogénéisé à l'aide de l'agitateur. Lorsque la parasiténie atteint un seuil suffisant, on collecte séparément le milieu et les hématies. Les traces d'hématies parasitées restantes suffisent pour réensemencer une nouvelle culture. Dans le cas de la souche SGE 1 on obtient, après 48 heures de culture, une parasiténie de 5 à 8 % en partant de 0,2 % à 0,5 %, soit un taux de multiplication de 15 à 30 par cycle. De même que pour la boîte de Petri, il est possible de n'effectuer un renouvellement du milieu que tous les trois jours en doublant la concentration en glucose.(4g/l) et en augmentant le pouvoir tampon par additions d'HEPES (25 mM). Par contre, plusieurs essais ont montré que l'agitation périodique du milieu (journalière ou plurijournalière)'ne modifie pas le taux de multiplication. Ce mode de culture permet d'accumuler rapidement de grands volumes de surnageant duquel sont extraits les exoantigènes (5.10.11). REVENDICATIONS 1/ Module de culture de micro-organismes, comprenant un récipient (1) pour la réception d'un milieu de culture, de forme substantiellement plate, c'est-à-dire s'étendant dans l'espace selon deux dimensions (largeur et longueur) et une troisième dimension (hauteur) substantiellement inférieure aux deux autres, comprenant une paroi latérale (7), un fond (4) et un dessus (5), caractérisé en ce que le récipient comporte entre le fond et le dessus une pluralité de cloisons (6) selon la longueur, distribuées selon la largeur, et déterminant entre elles et avec la paroi latérale une pluralité de canaux (8) selon la longueur, et les différentes cloi sons comportent chacune à une extrémité une ouverture complète (9) s'étendant entre le fond et le dessus du récipient, les différentes ouvertures étant alternées d'un côté et de l'autre des différentes cloisons, selon la largeur, pour déterminer un passage (11) en serpentin du premier canal vers le dernier canal selon la largeur. 2/ Module de culture selon la revendication 1, Ca- ractérisé en ce que chaque cloison comporte à l'autre extrémité une ouverture partielle (10) s'étendant entre le fond du récipient et une zone intermédiaire entre le fond et le dessus. 3/ Module selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux parois latérales selon la largeur sont obtenues par jonction avec le récipient d'une pièce de fermeture (12,13) comportant en section droite une âme (12a,13a) et deux bords (12b,13b, 12c,13c) en contact avec le dessus et le fond dudit récipient. 4/ Module selon la revendication 3, caractérisé en ce que un joint d'étanchéité (13,14) est disposé entre les deux bords de la pièce de fermeture, l'épaisseur de la paroi de fond (4) et celle de la paroi de dessus (5) du récipient. 5/ Module selon la revendication 4, caractérisé en ce que le joint d'étanchéité joue le rôle de septum, grâce à des perçages (23) ménagés dans l'âme des pièces de fermeture, autorisant par exemple le passage des tiges creuses, telles que des aiguilles de seringues hypodermiques. 6/ Module selon la revendication 3, caractérisé en ce que grâce à deux cloisons supplémentaires (16,17), selon la longueur, de part et d'autre du récipient selon la largeur, on ménage deux canaux externes (31,32) supplémentaires pour le passage de deux tirants (20,21) respectivement, permettant d'assembler de manière amovible les pièces de fermeture entre elles et avec le récipient. 7/ Module selon la revendication 1, caractérisé en ce que le récipient consiste en un profilé en matière plastique, transparente, thermiquement stable, notamment en polycarbonate.