Brevet FR2610633A1 — publié le 19880812

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un concentré d'4 1-antitrypsine à partir de plasma humain,le produit ainsi obtenu et son utilisation à des fins thérapeutiques. Les inhibiteurs de protéase du plasma jouent un rôle primordial dans le contrôle de l'action des enzymes protéolytiques et possèdent ainsi une action régulatrice dans la formation des tissus conjonctifs, ainsi que dans la coagulation, la fibrinolyse et la formation de kinine. L'&l 1-antitrypsine ou AAT, glyco- protéine produite dans le foie, est ainsi un inhibiteur d'élastase neutrophile, enzyme mise en jeu dans la pro- téolyse des tissus conjonctifs, plus particulièrement du poumon. Une déficience en AAT peut conduire à des affections pulmonaires telles que l'emphysème. On a donc pensé à soigner des patients présentant une telle déficience par administration d'AAT. Toutefois il est nécessaire de disposer à cette -.d'un produit de haute pureté susceptible d'être obtenu avec un rendement significatif dans les centres de traitement du plasma humain. On a ainsi proposé des techniques de préparation d'AAT, qui n'ont toutefois permis d'aboutir qu'à des degrés de pureté assez faibles, de l'ordre de 60 à 70 % et qui nécessitent l'utilisation de fractions de plasma peu courantes. De telles techniques sont notamment décrites dans l'article de Coan et al ( Vox Sang. 48 33-342, 1985) et dans celui de Glaser et al (Anal. Biochem. 124, 364-371, 1982). Il serait donc intéressant de disposer d'une technique de préparation d'AAT de haute pureté, susceptible d'être mise en oeuvre à l'échelle industrielle, utilisant des fractions de plasma aisément disponibles dans les centres de fractionnement importants. La Demanderesse a ainsi découvert qu'il était possible de préparer de l'AAT de degré de pureté supérieur ouégal à 80 % par des techniques chromatogra- phiques utilisant une fraction de plasma couramment obtenue dans les centres de fractionnement produisant de l'albu- mine et qui est en fait un sous-produit, précédemment rejeté, de la préparation de celle-ci. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'un concentré d't 1antitrypsine (AAT) à partir de plasma humain, caractérisé en ce qu'on soumet à une purification par voie chromatographique un surnageant A ou A+ I selon la nomenclature de Kistler et Nitschmann jusqu'à obtention d'un concentré ayant une teneur en AAT de 80 % au moins. Ce procédé permet d'obtenir, avec un rendement de l'ordre de 50 %,une AAT pure à 80 % au moins, et ayant conservé une forte action inhibitrice à l'encontre de la trypsine et de l'élastase. La préparation du surnageant utilisé se fait par précipitation à l'éthanol, à un pH voisin de la neutralité ou légèrement acide, d'un plasma ayant été soumis à un traitement de cryoprécipitation. On met avantageusement en oeuvre une double précipitation à l'éthanol pour séparer un surnageant de caractéristiques correspondant au surnageant A selon la nomenclature de Kistler et Nitschmann (Vox Sang. 7, 414-424, 1962) que l'on sépare de l'éthanol, par exemple par diafiltration. On peut également utiliser un surnageant obtenu par une précipitation simple à l'éthanol, corres- pondant au surnageant A+I selon la nomenclature de Kistler et Nitschmann rappelée ci-dessus. A partir du surnageant obtenu on sépare par chromatographie d'échange d'anions, une frac- tion riche en albumine, qui peut être utilisée pour récupérer cette protéine, et une fraction riche en AAT. On purifie ensuite celle-ci après concentration et dialyse et éventuellement addition d'un stabilisant, par chromatographie d'exclusion stérique pour éliminer les contaminants de poids moléculaire élevé. Après cette purification on inactive de préférence les virus éventuellement présents, tels que les virus de l'hépatite ou du SIDA, par chauffage enmilieu liquide en présence de stabilisant. La température utilisée de préférence est comprise entre 50 et 70 C et est plus particulièrement voisine de 60 C. Le temps de chauffage est de l'ordre de quelques heures: des résultats satisfaisants ont été obtenus entre 8 et 12 h et en particulier pour environ 10 h. Le stabilisant utilisé est très préféren- tiellement le sorbitol qui donne des résultats largement supérieurs à ceux obtenus avec les stabilisants utilisés normalement pour ce type de produits tels que l]ucose ou le saccharose. On utilise le sorbitol à raiso... 60 à % (poids/volume). Après diafiltration pour éliminer le stabilisant et ajuster la teneur en protéine à environ g/l on met le concentré en ampoules et on lyophilise. Cette concentration peut éventuellement être portée à 60 g/l afin d'assurer une dose de 1 g par flacon de 20 ml. Le produit ainsi obtenu peut être utilisé pour le traitement des affections pulmonaires, notamment chez les patients présentant une déficience marquée en AAT. La posologie à utiliser est d'environ mg/kg de poids corporel par semaine, par voie intraveineuse. Il est également possible d'administrer ce produit sous forme d'aérosol. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. A) Préparation du concentré. On prépare le surnageant riche en albumine et AAT en précipitant à l'éthanol à 10 %, à pH 7,4, un plasma ayant subi une cryoprécipitation et en reprécipitant le premier surnageant obtenu par de l'éthanol à 19 %, à pH 5,85, à une température de + 1 C. Après centrifugation, on élimine l'étha- nol par diafiltration et on dilue jusqu'à une teneur en protéines d'environ 15 g/l. On sépare l'albumine de l'AAT sur une colonne de DEAE Sepharose CL-6B Fast Flow (Pharmacia) équilibrée à pH 5,2 à 6 par un tampon à l'acétate de sodium. Par élution à l'acétate de sodium 0,15 M on récupère une fraction riche en AAT. La frac- tion d'AAT est stabilisée dès sa sortie de colonne DEAE par une remontée à 6,5 et par adjonction de gly- cocolle à raison de 5 g/l. Après concentration à 45 g/1 environ et dialyse, on purifie par chromatographie sur Séphacryl S-200. On effectue l'inactivation virale par chauffage à 60 C pendant 10 h en présence de 65 % de sorbitol (pourcentage exprimé en poids/volume). On ajoute de préférence du glycocolle à raison de 1 g/l (concentration finale) afin de stabiliser l'AAT lors de la lyophilisation et pour favoriser la mise en solution du produit lors de l'uti- lisation. Après diafiltration pour éliminer le sorbitol et ajuster la teneur en protéines à environ g/l on met le concentré en ampoules de 50 ml et on - lyophilise. B) Analyse du concentré. On détermine par immunophélométrie (sur ICS Beckmann) la composition en protéines du pro- duit, qui est la suivante (exprimé en g/fil): Protéines 28 AAT 24,8 Albumine 0,65 Haptoglobine 0,6 N2 HS glycoprotéine 1,3 AT III 0,18 IGA 0,08 Transferrine 0,1 42 macroglobuline O Les contaminants les plus importants sont l'. 2HS glycoprotéine (environ 4,6 %), l'albumine (2,3 %), l'haptoglobine (2,1 %) et l'antithrombine III (0,6 %). Ces résultats sont confirmés par contrôles électrophorétiques. C) Détermination de l'activité du concentré 1) Capacité inhibitrice de la trypsine Cette caractéristique a été déterminée selon deux méthodes, la méthode "BAPNA" et la méthode "Chromozyme" décrites respectivement par Erlanger et al. (Arch. Biochem. Biophys. 95, 271-278, 1961) et Mullins et al. (Clin. Chem. 30, 1857-1860, 1984). Les résultats obtenus selon les deux méthodes après correction pour tenir compte de la concen- tration en AAT, correspondent aux valeurs connues pour l'AAT sérique native soit 1,3 + 0,1. 2) Capacité inhibitrice de l'élastase Cette caractéristique a été déterminée selon la méthode décrite par Beatty et al (J. Biol. Chem. 255, 3931-3934, 1980). La valeur obtenue pour la constante d'association (kass) de l'AAT produite avec de l'élastase porcine est de 2,24 105 M-1 m-. Cette vnInour nat Rnm- blable à celle de l'AAT sérique native, telle qu'indiqué notamment dans la publication de Beatty et al référencée ci-dessus. Les résultats obtenus pour la détermi- nation de l'activité du concentré montrent que le traite- ment d'inactivation virale n'a pas eu d'influence négative sur celle-ci. Les essais pharmacologiques et cliniques réalisés ont montré que l'AAT produite selon l'invention était dépourvue de toxicité et parfaitement tolérée par voie intraveineuse. Sa durée de demi-vie est de l'ordre de 6 à 7 jours ce qui est largement supérieur aux résultats obtenus pour des concentrés préparés par d'autres procédés et notamment à partir de fractions de plasma différentes. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un concentré d'ô, 1 -antitrypsine (AAT) b partir de plasma humain, caractérisé en ce qu'on soumet b une purification par voie chromatographique un surnageant A ou A + I selon la nomenclature de Kistler et Nitschmann jusqu'à obtention d'un concentré ayant une teneur en AAT de 80 % au moins. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification est faite par deux séparations chromatographiques successives. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on sépare par chromatographie d'échange d'anions le surnageant A ou A + I en une fraction riche en albumine et une fraction riche en AAT et on purifie la fraction riche en AAT par chromatographie d'exclusion stérique. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on soumet le concentré obtenu à une inactivation virale pr traite- ment thermique en milieu liquide en présence d'un steL__sent. 5.- Procédé selon la reven=icaeion 4, CEar:eérisé en ce que le stabilisant est le sreitc!. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise o60 à 70 % de seritol (en poids/volume). 7.- Nouveau médicament caractérisé en ce qu'il consiste en un concentré d'AAT obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6. 8.- formes phermaceutiques appropriées à l'administration d'un médicament selon la revendication 7.