Brevet FR2602681A1 — publié le 19880219

La présente invention concerne le domaine de biotechnologie, et plus précisément un procédé de préparation d'un vaccin recombinant contre l'hépatite B, trouvant une application dans la médicine pour la prophylaxie humaine par le vaccin. A l'heure actuelle un moyen efficace contre l'infection de masse pmrl'hépatite B est le vaccin. On connaît divers procédés de préparation de vaccins contre l'hépatite B, consistant en la culutre d'une souche 10 de levures productrice de l'antigène HBsAg sur un milieu nutritif avec destruction ultérieure des cellules de levures, isolement et purification de l'antigène. Ainsi par exemple, on connait un procédé de préparation du vaccin contre l'hépatite B(EP 0135435), consistant en l'expres15 sion de l'antigène HBsAg de la culture de Saccharomyces cerevisiae par les cellules de ATCC 20665 strain (souche) H52, pendant quatre jours. On fait incuber les cellules à la température de 28 C dans un secoueur pendant 8 heures. On place-ensuite la culture de cellules dans un fermenteur 20 contenant le milieu nutritif YEPD. On conduit le processus de fermentation à la température de 28 C sous agitation pendant 14 - 40 heures (pH = 5,0). 40 heures après on ajoute la culture à 100 1 de milieu YEPD et on réalise le processus dans le fermenteur sous agitation pendant 48 heures (pH = 5,0), à une concentration en 02 dissout de 20% de la saturation. Après le lav- de la masse de cellules avec une solution tampon de phosphate et conservation à une température de 2-8 C pendant 3 jours, on ajoute dans celle-ci 1% de PMSF jusqu'à une concentration finale en PMSF de 2mM. Puis on détruit les cellules dans un homogénéisateur. On obtient l'antigène HBsAg en concentration de 0,9 mg/l, la teneur en protéine totale étant de 1,523 g/l. On fait passer ensuite l'antigène HBsAg à travers l'oxyde de silicium, on lave avec une solution tampon de phosphate et on fait incuber 20 minutes à la température de 56 C dans une solution tampon à 5 mM de borate à pH = 9,1 contenant 10 0,25% en masse de désoxycholate. Après cela on purifie par chromatographie affinée dans une colonne contenant des anticorps contre HBsAg et on élue avec une solution 3M de thiocyanate d'ammonium à pH = 7,2. On dialyse ensuite contre la solution tampon de phosphate. On ajoute à la masse aqueuse l'hydroxyde d'aluminium, on porte le pH jusqu'à 6,7, on agite à la température ambiante, on centrifuge et on dilue avec une solution physiologique (solution à 0,85% de NaCl). Une autre variante de préparation du vaccin consiste en ce qu'on malaxe l'extrait de cellules 20 obtenu comme il est décrit plus haut, avec l'oxyde de silicium, on fait incuber pendant 2,5 h à une température de 37 - 39 C. On lave ensuite le mélange avec la solution tampon de phosphate, on élue l'antigène HBsAg avec une solution tampon à 0,05M de borate à un pH = 8,9 - 9,2 conte25 nant 0,25% en masse de désoxycholate. On centrifuge l'antigène obtenu. On enduit le surnageant sur une colonne de cellulose qui est préalablement traitée avec des solutions 5 mM de NaCl, 6,25 mM de Tris, 0,5 mM de MgC12. On réalise le processus à la température de 4 C et à un pH de 7,5. Puis on lave la colonne avec la même solution tampon et on élue avec une solution tampon 0,2 M de NaCl. La fraction non adsorbée renferme 7,95 mg d'antigène purifié HBsAg dans 13 mg de protéine totale. On place ensuite le matériel sur une colonne de Sepharose 6 B et on élue avec une solution tampon de phosphate (60 ml/h). On obtient la frac- tion purifiée après la dialyse de l'antigène, purifié sur le Sépharose 6B contre une solution 3M de thiocyanate d'ammonium dans la solution tampon de phosphate au pH de 7,2 pendant 16 heures. On élimine le thiocyanate d'ammonium par dialyse intense contre la solution tampon de phosphate. On dilue le produit purifié avec la solution tampon de phosphate, on adsorbe sur l'hydroxyde d'aluminium et on conduit le processus d'une façon analogue à la variante précédente. Le procédé indiqué prévoit l'utilisation de la chromatographie d'affinité laquelle diminue l'antigènicité de HBsAg. De plus, au cours de l'élution de l'antigène, une désorption partielle des anticorps à partir du sorbant d'affinité est possible, ce qui est indésira15 ble dans le cas de préparation d'un médicament de vaccin pour l'homme(la présence d'anticorps étrangers augmente la réactogénicité du médicament). Outre cela, l'utilisation de substances toxiques de PMSF et du thiocyanate d'ammonium dans ledit procédé est inadmissible pour la 20 préparation du vaccin destiné à l'homme. On connait également un procédé de préparation et de purification de l'antigène contre 1' hépatite B apte à la production à grande échelle des vaccins contre l'hépatite B(EP, B N 0155007). Le procédé consiste en,5 ce qu'on réalise la culture de la souche de Saccharomyces cerevisiae productrice de l'antigène HBsAg avec adsorption ultérieure de HBsAg par destruction des cellules et le malaxage avec l'oxyde de silicium à la température dg 100C et avec addition de la solution tampon de phos30 phate. On conduit ensuite l'élution de HBsAg avec un mëlange d'une solution 0,05M de Na2CO3 ou de NaHCO3 (pH = ,5) et d'urée à la température de 37 C. On ajoute l'acide acétique à 10% au supernatant jusqu'à un pH = 7,2 et on concentre sur un ultrafiltre. On effectue la 35 filtration sur gel sur du Sépharose GL-6 B sur la solu- tion de phosphate et on élue avec la même solution tampon. On réalise ensuite la purification de l'antigène sur l'hydroxy-apatite. On conduit l'élution avec une solution 0,05 M de KC1 avec addition d'une solution 0,5 M tampon 5 de phosphate K. On obtient le produit visé avec un rendement de 46% en masse. Cependant, bien qu'on obtiennepar le procédé indiqué l'antigène HBsAg pure, son rendement n'est pas assez élevé. A l'étape finale on utilise la solution tampon de phosphate- K, ce qui est indési10 rable pour la préparation du vaccin destiné à l'homme vu sa toxicité. Aussi, connait-on un procédé de préparation du vaccin recombinant contre 1' hépatite B à partir d'une souche de levures-productrice de l'antigène HBsAg (Waurpber D. et e., PNAS, v. 82, 1985, pages 6830 à 6834), consistant à cultiver une souche-productrice de l'antigène dans un milieu à une teneur élevée en phosphore, on transfère des cellules dans un milieu à une basse teneur en phosphore pour la reproduction de HBsAg avec 20 un lavage ultérieur des cellules dans une centrifugeuse. Puis on dilue la masse de cellule libérée du milieu jusqu'au volume de départ avec la solution tampon de phosphate. On détruit les cellules à l'aide d'un homogénéisateur à haute pression et on dilue l'extrait obtenu con25 tenant 30 - 70 mg/ml de protéines 4 fois avec la solution tampon de phosphate contenant 0,1% de détergent Triton X-100. Après cela on centrifuge le mélange, on concentre fois le surnageant et on conduit ladia-filtoetin. par deux volumes de solution tampon de phosphate. On élimine 30 le détergent Triton X-100 à l'aide du sorbant XAD-2 et on centrifuge. On réalise ensuite une urification partielle en utilisant l'adsorption-élution à partir de l'oxyde de silice. On congèle le médicament obtenu à la température de 70 C. Après décongélation, on clari35 fie le médicament par centrifugation. On purifie le produit obtenu par chromatographie sur butylagarose ou par chromatographie par affinité. On obtient le produit visé avec le rendement de 29% en masse et à la teneur de 20% en masse en protéine impure. Le procédé 5 indiqué se caractérise par une multiplicité de stades, l'utilisation de supports contenant du bromure de cyanogène dangereux à l'homme. On obtient le produit visé à un bas rendement (29% en masse) et à une teneur en protéine impure de 20% en masse, ce qui rend impossible 10 son utilisation en qualité de vaccin. De plus, au cours de l'élution de HBsAg, on utilise des solutions, contenant les rhodanates, ce qui est aussi inadmissible pour la préparation du vaccin destiné à l'homme. On s'est donc proposé par modification des opéra15 tions technologiques de mettre au point un procédé permettant d'augmenter le rendement et la pureté du produit visé. La solution consiste en ce que dans le procédé de préparation du vaccin recombinant contre l'hépatite B renfermant la culture de la souche de levure-productrice de l'antigène HBsAg successivement sur un milieu nutritif enrichi d'une source de phosphore, puis sur un milieu nutritif assurant la reproduction de l'antigène, avec destruction ultérieure des cellules de levures, l'isole25 ment, la purification de l'antigène et l'obtention du produit visé, conformément à l'invention, on utilise en qualité de milieu nutritif assurant la reproduction de l'antigène, un milieu nutritif ne contenant pas de sources de phosphore, et on effectue simultanément l'isolement 30 et la purification de l'antigène par chromatographie d'adsorption sur des silices poreuses avec ultracentrifugation subséquente avec un gradient de densité de 1,1 1,3 kg/dm3. Il est avantageux d'utiliser en qualité de silices 35 poreuses des silices avec une dimension de pores de 1500- 260268 1- 2000 À. Il est préférable de conduire la désorption lors de la chromatographie avec une solution tampon de bicarbonate à un pH de 9,1 - 9,5. Cela permet d'augmenter le rendement en antigène HBsAg jusqu'à 90%. Pour augmenter le degré de pureté de l'antigène il est rationnel de réaliser la centrifugation avec un gradient de densité d'une solution à 50% de tartrate de potassium ou de sodium et d'une solution à 25% de glycérine, le rapport des composants indiqués étant de 1: I. 10 Le degré de pureté augmente alors de plus de 2 fois et le rendement en activité d'antigène de 10 - 20% (par comparaison avec le procédé connu). Afin d'augmenter le rendement en produit visé au stade de destruction des cellules de levures, il est avantageux d'introduire un détergent, en qualité duquel on utilise de préférence le Tween-80. Cela permet d'accroitre le rendement en antigène HBsAg de plus de 2 fois comparativement au procédé connu. Le procédé revendiqué permet d'obtenir le produit visé avec un rendement de 60 - 67% en masse et à une pureté élevée (teneur en impuretés de protéine étant de 10%). Le procédé revendiqué est mis en oeuvre de la manière suivante. On conduit la culture d'une souche de levures con25 tenant le plasmide recombinant avec le gène HBsAg et capable de produire le HBsAg immunogène. En qualité de telle souche de départ on peut utiliser n'importe quelle souche de levures connue productrice de l'antigène HBsAg, par exemple la souche de Saccharomyces cerevisiae DBY 746/pNKVG 46, obtenue par inclusion d'un plasmide transformé pà4MVG 46 dans la souche réceptrice DBY 746. Le plasmide pNMVG 46 est obtenu par modification au moyen de génie génétique à partir du plasmide connu de pADC-47 (Molekulyarnaya genetika, mikrobiologia i virusologia, 35 1986, N 8, pages 12 - 19). On réalise la culture de la façon suivante. On ensemence 3 - 5 grandes colonies de la souche de départ de levures productrices de l'antigène HBsAG sur un milieu nutritif enrichi d'une source de phosphore. On con5 duit la culture à une température de 30 - 32 C et sous agitation pendant un jour jusqu'à l'obtention d'une concentration de 2 - 6.107 cel/ml. Après cela,tout le volume de culture est transféré dans un milieu nutritif assurant la reproduction de l'antigène. On effectue la culture dans ledit milieu à la température de 30 C, sous aération de l'air, pendant 24 heures jusqu'à une concentration de 1,8 - 2, 1.107cel/ ml. On réalise le contrôle de la pureté de la culture 15 par voie microscopique. On récolte ensuite les cellules par centrifugation à la température de 4 C. On soumet ensuite les cellules à la désintégration ou à la congélation à la température de -40 C. Avant la destruction, on décongèle la masse de cellules, si elle était congélée, et on dilue dans une solution tampon. On peut réaliser la destruction à l'aide par exemple de billes de verre de 0,5 mm de diamètre, en triturant les cellules de levures ou dans un désintégrateur à haute pression, dans lequel les cellules se détruisent à une pression de 500 - 1000 25 atm. On achève la désintégration après la destruction de % de cellules. Il est avantageux, pour augmenter le rendement en produit visé au stade de destruction des cellules, d'introduire un détergent, de préférence tel que le Tween-80. Le rendement en antigène HBsAg augmente 30 alors de plus de deux fois. On congèle les cellules détruites, on décogèle et puis on clarifie par centrifugation à la température de 4 C. On soumet le surnageant (extrait clarifié) contenant l'antigène recombinant HBsAg à la chromatographie 35 d'adsorption sur les silices poreuses. Pour la chromatographie d'adsorption on utilise de préférence des silices (verres macroporeux) avec des pores ayant une dimension de 1500 à 2000 À. De tels sorbants présentent la capacité maximale par rapport au HBsAg recombinant qui s'accumule sous forme de particules d'une dimension de 1822 nm et constitue moins de 1% dans l'extrait clarifié de cellules de levure. Après l'adsorption de HBsAg sur le sorbant, qui passe de quelques heures jusqu'à un jour sous agita10 tion continue, on précipite le sorbant, on lave avec quelques volumes de solution tampon de phosphate et on transfère dans la même solution tampon dans la colonne, on lave de nouveau avec la solution tampon de phosphate jusqu'à l'indice constant de l'extinction à 280 nm. 15 Après le lavage, on désorbe l'antigène HBsAg avec la solution tampon à un pH = 9 - 10. On réalise de préférence la désorption de l'antigène avec une solution tampon de bicarbonate ayant un pH de 9,1 - 9,5. On a, dans ce cas, le rendement maxi20 mal en antigène HBsAg (d'environ 90%), ce qu'on n'atteint pas en utilisant d'autres solutions tampon pour l'adsorption. On réunit les fractions d'éluats contenant l'antigène HBsAg, on concentre au besoin par ultrafiltration 25 et on centrifuge avec un gradient de densité de 1,1 1,3 kg/dm3. Il est avantageux de conduire l'ultracentrifugation dans l'intervalle de densité d'une solution à 50% de tartrate de potassium ou de sodium et d'une solution à 25% de glycerine, avec un rapport des 30 solutions indiquées de 1: 1. L'utilisation du gradient de tartrate glycerine permet comparativement à d'autres gradients d'obtenir le médicament purifié au maximum en conservant son activité antigène. L'emploi d'un tel gradient augmente la purification du médicament de 35 plus de 2 fois et le rendement en activité antigènze de - 20%. Le rendement final-en produit visé augmente respectivement. Après l'ultracentrifugation, on fractionne le gradient, on détermine le titre de HBsAg dans les frac3 tions, on réunit les fractions contenant HBsAg et on dialyse contre une solution à 0,8 à 0,9% de NaCl dans une solution tampon 0,02 M de phosphate à un pH de 7,4 - 7,6. On dilue la préparation dialysée jusqu'à une con10 centration de 40 + 6 pg/ml de HBsAg, on stérilise par microfiltration, on sorbe sur l'hydroxyde d'aluminium et on conditionne en ampoules. Une dose de vaccin renferme environ 15 pg/ml de HBsAg et 10% au plus d'impuretés protéiques sorbées sur 1 mg d'hydroxyde d'alu15 minium. Le vaccin obtenu est stérile, atoxique, ne contient pas d'antigènes viraux étrangers. La haute immunogénicité du vaccin obtenu est confirméedans les essais sur les animaux et les hommes. Dans les essais sur les animaux (cobayes) immu20 nisés avec une desséries expérimentales de vaccins, obtenus par le procédé revendiqué, on a décelé les anticorps à l'antigène HBsAg chez tous les animaux, en hauts titres (320 - 650 UI). Quarante volontaires ne contenant pas d'anticorps 25 à l'antigène HBsAg ont été vaccinés avec le vaccin obtenu parle prccédérevendiqué. On réalisait la vaccination trois fois dans les intervalles entre 1lre et 2eme vaccination - de un mois, entre 2ème et 3ème de six mois. Le sang des volontaires a été analysé quant 30 à la teneur en antigène HBsAg chaque mois. On a noté une basse réactogénéité du vaccin comparativement aux vaccins connus. Un mois après la deuxième vaccination on a décelé les anticorps chez 30% de volontaires inoculés et un 35 mois après la troisième vaccination (8 mois après le début des inoculations) les anticorps ont été trouvés chez 92% de volontaires vaccinés, le titre d'anticorps correspondait alors à 300 - 700 UI (tandis que le titre de protection des anticorps constitue 10 UI). Pour mieux faire comprendre la présente invention, on donne ci-après les exemples de réalisation concrets du procédé. Exemple 1 Trois colonies de cellules de levures Saccharo10 myces cerevisiae (de 4 5 mm de diamètre) de la souche DBY 746/pNMVG 620, obtenue à partir de la souche DBY 746 par inclusion du plasmide transformé pNMVG 20 (Granovsky N. N. et al.., Molekulyarnaya genetika, mikrobiologia i virusologia, 1986, N 8, pages 12 - 19) sur 15 l'agar à 2%, sont ensemencées dans 200 ml de milieu nutritif liquide de composition suivante (par 1): KH2P04 0,9 - 1,1 g NaCl 0,095 - 0,10 g glucose 19 - 21 g MgSO4 0,45 - 0,55 g CaC12 0,095 0,105 g asparagine 2,1 - 2,2 g Vitamines: thiamine 190 - 210 pg riboflavine 190 - 210 pg pyridoxine 190 - 210 pg acide nicotinique 190 210 pg acide para-aminobenzoique 190 - 210 pg pantothénate de calcium 190 - 210 pg inositol 9 - 11 mg biotine 1,9 - 2,1 pg Micro-éléments: K J 99 101 pg HBO3 9,9 - 10,1 pg MnSO4 9,9 - 10,1 pg 2602681- (NH4)2MoO4 9,9 - 10,1 pg FeSO4 49 - 51 pg On fait incuber la culture dans un secoueur à 300 - 350 t/min., à la température de 30 C'pendant un 5 jour. La concentration en cellules au bout de culture est de 2,6 x 107 cel/ml. On transfère la culture obtenue par voie stérile dans unfenmu e de 9 1 de milieu nutritif de composition suivante (par 1): KCl 0,9 - 1,1 g NaCl 0,095 - 0,10 g glucose 19 - 21 g MgSO4 0,45 - 0,55 g CaCl2 0,095 0,105 g asparagine 2,1 - 2,2 g Vitamines: thiamine 190 - 210 pg riboflavine 190 - 210 pg pyridoxine 190 - 210 pg acide nicotinique 190 210 pg acide para-aminobenzoique 190 - 210 pg pantothénate de calcium 190 - 210 pg inositol 9 - 11 mg biotine 1,9 - 2,1 pg Micro-éléments: KJ 99 101 pg HBO3 9,9 - 10,1 pg MnSO4 9,9 - 10,1 pg (NH4)214MoO4 9,9 - 10,1 pg FeSO4 49 - 51 pg On conduit l'incubation pendant 26 heures. L'intensité d'aération pendant l'incubation (rapport air: milieu) constitue 1: 2,5. La concentration en cellules du milieu au bout d'incubation atteint 2,1 x 10 cel/ml. On précipite les cellules par centrifuga- à 10000 x g pendant 20 minutes à la température de +4 C. On resuspend les cellules précipitées dans une solution tampon 0,02 M de phosphate de sodium, 0,5 M de NaCl, au pH de 7,5 de 100 ml de volume et on dé5 truit à l'aide de billes de verre pendant 2 heures. On précipite les cellules détruites par centrifugation à 10000 x g, à la température de 4 0C pendant minutes. On vidange le surnageant, on ajoute de nouveau au précipité 100 ml de solution tampon et on 10 répète la procédure encore deux fois. On congèle ensuite le surnageant réuni à 40 C pendant 14 heures. On clarifie encore une fois le surnageant décongélé par centrifugation sous le même régime. On obtient 280 ml d'extrait clarifié de cellules à la teneur en 15 antigène HBsAg de 5 g/ml (d'après l'activité antigénique). On ajoute à la préparation obtenue un verre macroporeux au diamètre de pores de 1050 X. On regénère préalablement le verre et on trempe dans l'eau 20 distillée. Le volume de verre macroporeux constitue cm3. On maintient le ballon avec la suspension à la température de +4 C pendant 10 heures. Après l'adsorption, la teneur en antigène HBsAg du surnageant correspond à 0,04 pg/ml. On purge le surnageant, et on 25 lave deux fois le sorbant avec la solution tampon de phosphate (rapport 1: 1), en l'ajoutant du verre après la précipitation entière. Puis on transfère le sorbant dans la colonne, on lave la colonne avec la solution tampon de phosphate pour éliminer la majorité 30 d'impuretés, après quoi on fait passer à travers la colonne une solution tampon désorbant HBsAg: 0,05 M tris - HC1, pH = 9. On réunit l'éluat dans les fractions de 4 ml de volume, dans lesquelles on détermine l'antigène HBsAg. On réunit les fractions, on obtient 35 64 ml d'éluat contenant 18 pg/ml de HBsAg (teneur en HBsAg des fractions est déterminée par la méthode immunofermentaire. Le rendement en HBsAg constitue 80% de l'activité antigénique dans le surnageant clarifié. On enduit l'éluat obtenu sur le gradient de saccharose (à 25 - 55%, sur densité 1,1 - 1,26 kg/dm3) par 10 ml d'éluat sur 24 ml de gradient, préparé sur la solution tampon de tris-HCl. On conduit l'ultracentrifugation à 95000 x g et à 4 C pendant un jour, après quoion fractionne les gradients et on détermine dans ceux-ci HBsAg. On réunit les fractions contenant l'antigène, on dialyse contre la solution tampon de phosphate au pH = 7,6. On obtient définitivement 16 ml de médicament contenant 42 pg/ml de HBsAg. Le rendement en HBsAg constitue 58% de celui enduit sur le gradient. On stérilise le médicament, en le faisant passer à travers les filtres, on dilue au double avec l'hydroxyde d'aluminium à la concentration de 2 mg/ml et on verse par 1 ml une heure après dans des ampoules. Préalablement, avant le malaxage avec l'hydroxyde d'alu20 minium, on détermine les impuretés par électrophorèse. Leur teneur ne dépasse pas 15% de la teneur totale en protéines. On obtient finalement un médicament contenant pg/ml de HBsAg, 1 mg/ml d'hydroxyde d'aluminium dans 25 la solution tampon de phosphate au pH de 7,6. Le rendement final en produit visé (par rapport à l'extrait de cellules clarifié) constitue 47%. Exemple 2 On obtient l'extrait clarifié de cellules de la.30 souche de levures DBY 746/pNMVG productrice de HBsAg comme dans l'exemple 1, sauf le fait que les cellules sont détruites par pression dans un désintégrateur spécial. La concentration finale en antigène HBsAg de l'extrait clarifié (surnageant) constitue 5 pg/ml. Pour la 35 chromatographie d'adsorption on utilise un verre macro- -2602681 poreux avec un diamètre de pores de 1900 . On ajoute à 280 ml d'extrait clarifié de cellules 70 cm3 de verre macroporeux préalablement humidifié dans l'eau. Après heures de malaxage on lave deux fois le sorbant avec la solution tampon de phosphate, comme dans l'exemple 1, et on le transfère dans la colonne. On lave la colonne avec la solution de tampon de phosphate jusqu'à l'obtention du coefficient d'extinction constant à 280 nm, puis on désorbe HBsAg comme dans l'exemple 1. On obtient 30 ml d'éluat contenant 40 pg/ml d'antigène. Cela correspond à 86% de l'activité de départ dans l'extrait de cellules clarifié. On réalise l'ultracentrifugation, la dialyse, la stérilisation et le conditionnement du médicament comme dans l'exemple 1. Le rendement final en antigène du vaccin constitue 56% de la teneur dans l'extrait clarifié, la quantité d'impuretés étant de 10% de la teneur totale en protéine. Exemple 3 On obtient l'extrait clarifié de cellules de la souche-productrice de HBsAg comme dans l'exemple 1. On conduit l'adsorption de l'antigène sur les verres macroporeux d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 2. Pour la désorption de l'antigène HBsAg 25 on utilise une solution tampon 0,05 M de bicarbonate et pH = 9,1. On récolte l'éluat dans les fractions de 4 ml de volume et on détermine dans celles-ci l'activité antigénique de HBsAg. On obtient 28 ml d'éluat à l'activité antigénique de 45 pg/ml, ce qui correspond 30 à 90% de l'activité de départ de HBsAg. Après l'ultracentrifugation, stérilisation et conditionnement le rendement en antigène du vaccin a constitué 63% (de la teneur en extrait clarifié de cellules), la teneur en impuretés protéiques ne dépassait pas 10% de la teneur 35 en protéine totale. Exemple 4 On réalise l'obtention de l'extrait clarifié de cellules de levures de la souche-productrice de HBsAg et la chromatographie d'adsorption d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 3. On réalise l'ultracentrifugation de l'éluat obtenu contenant l'antigène HBsAg dans le gradient de densité en utilisant en qualité de gradient lourd une solution à 50% de tartrate de potassium-sodium, et en qualité gradient léger-une solution à 25% de glycérine dans la solution tampon de phosphate au pH = 7,8. On effectue l'ultracentifugation pendant 18 heures à 90000 x g et à la température de 4 C. Le fractionnement de gradients, la détermination de l'antigène HBsAg et la dialyse sont réalisés comme dans l'exemple I. On obtient 12 ml de médicament d'antigène à l'activité de 82 pg/ml, ce qui correspond à 76% de l'activité antigénique appliquée sur le gradient. Le rendement final en antigène HBsAg du vaccin correspond à 68% par rapport à l'extrait clarifié, et 20 la teneur en impuretés protéiques constitue 5% de la protéine totale. Exemple 5 On obtient l'extrait clarifié de cellules de levures de la souche productrice d'une façon analogue 25 à celle décrite dans l'exemple 1, à cette différence près que dans la solution tampon de phosphate avec lequel on dilue les cellules avant la destruction, on ajoute le Triton X-100 jusqu'à la concentration finale de 0,2% en masse. Après la clarification, on obtient 30 250ml d'extrait contenant 8 pg/ml d'antigène HBsAg. On purifie l'extrait clarifié obtenu comme dans l'exemple 4. On obtient 16 ml de médicament à l'activité d'antigène de 82 pg/ml. On réalise la dilution, la stérilisation et le conditionnement du vaccin comme 2602681- dans l'exemple 1. Exemple 6 On obtient l'extrait clarifié de cellules de levures d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1, sauf le fait qu'on ajoute le détergent 5 Tween-80 dans la solution tampon de phosphate jusqu' à la concentration de 1% en masse. Après la clarification on obtient 280 ml d'extrait de cellules à la concentration en antigène de 10 pg/ml. On purifie l'extrait obtenu par chromatographie d'adsorption et 10 par ultracoetrifugation comme dans l'exemple 4. On obtient 18 ml de médicament à la concentration antigénique de 104 pg/ml. On effectue la dilution, la stérilisation et le conditionnement du médicament comme dans l'exemple 1. Exemple 7 Pour lpa I- tipt du vaccin recombinant on utilise la souche recombinante de levures-DBY 746/pNiMVG 46 productrice de l'antigène HBsAg (N.N. Granovsky et a. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologia i virusologiea, 1986, N 8, pages 12 à 19). On conduit le processus de l'obtention de l'extrait clarifié d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. On obtient 250 ml d'extrait clarifié à la teneur en antigène HBsAg de 30 pg/ml. On conduit ensuite le pro25 cessus comme dans l'exemple 4. On obtient 6 ml de médicament t l'activité de l'antigène HBsAg de 760 pg/ml. Le rendement final en antigène du vaccin constitue 61% (de la teneur en antigène de l'extrait de cellules clarifié). 17. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un vaccin recombinant contre 1' hépatite B, renfermant la culture d'une souche de levures productrice de l'antigène HBsAg successivement dans un milieu nutritif enri5 chi d'une source de phosphore, puis dans un milieu assurant la reproduction de l'antigène, avec la destruction ultérieure des cellules de levures, avec isolement, purification de l'antigène et obtention du produit visé, caractérisé en ce qu'à titre de mi10 lieu nutritif assurant la reproduction de l'antigène, on utilise un milieu nutritif ne renfermant pas de sources de phosphore, et on conduit l'isolement et la purification de l'antigène simultanément par chromatographie d'adsorption sur des silices poreuses avec ultracentrifugation ultérieure avec un gradient de densité de 1,1 - 1,3 kg/dm3. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de silices poreuses on utilise des silices ayant une dimension de pores de 1500 à 20 2000 . 3. Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on conduit la désorption pendant la chromatographie avec une solution tampon de bicarbonate à un pH de 9,1 - 9,5. 4. Procécé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on réalise l'ultracentrifugation avec un gradient de densité d'une solution à 50% de tartrate de potassium ou de sodium et d'une solution à 25% de glycérine dans un rapport entre les composants 30 indiqués de 1: 1. 5. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, pour augmenter le rendement en produit visé au stade de destruction des cellules de levures, on introduit un détergent. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'à titre de détergent on utilise le Tween-80.