Brevet FR2588476A1 — publié le 19870417

La présente invention concerne un facteur qui inhibe la fixation des IgE sur les mastocytes, un procéde d'obtention de ce facteur et ses applications thérapeuti que s. On a mis en évidence ces dernières années chez les animaux et l'homme qu un certain nombre de macromolécules biologiques, notamment des protéines, jouant un rôle iliLpor tant dans le déclenchement ou la régulation de la réponse du système immunitaire et parmi celles-ci les interleukines et les interférons. L'absence de réponse immunitaire à une stimulation antigénique a fait aussi l'objet de nombreuses études et on a supposé que cette tolérance pouvait etre due soit à une inactivation directe des lymphocytes B (W.O. Weighle dans Adv. immunol. 16 61-114 ; 1973) soit â la stimulation des cellules suppressives (R.K. Gershon dans Contemp., Top. Immunobiol. 3,1-40 ; 1974). Plus récemment la présence, dans le sérum normal ou réaginique d'un facteur inhibant la réaction d'anaphylaxie passive cutanée chez le rat a été mise en évidence par W. Kônig et H.W. Henn, et confirmé par K. Théobald et W. Konig. Les résultats de leurs travaux sont décrits dans Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 58 183-194 (1979) et 70 1-11 (1983) ; les auteurs émettent l'hypothèse que ce facteur intervenant au stade de la libération des médiateurs, pourrait avoir un rôle régulateur sur le développement du syndrome allergique. On a maintenant mis en évidence un autre facteur d'origine biologique, qui pourrait jouer un rôle essentiel sur le développement de la réponse immunitaire ; c'est un facteur protéinique, qui est présent dans le sérum normal des mammifères et qui notamment inhibe la fixation des. IgE sur les mastocytes et la dégranulation de ces derniers. ; Ce facteur , comme toute protéine naturelle ,n' est pas rigoureusement identigue d'une espèce~animale à l'autre. Chez la souris, il est composé d'une protéine a caractère acide de masse moléculaire 76000 daltons associée å une autre proteine de masse moléculaire 69000 daltons ; il faut noter qu'une purification poussée des sérums enrichis dans ces fractions protéiniques entraîne la diminution de l'activité inhibitrice sur la fixation des IgE et que la fraction de masse 76000 daltons est à elle seule inactive. Ce facteur est stable à la chaleur ; son activité n'est pas modifiée par un chauffage du sérum qui le contient pendant 30 minutes à 56"C. Ce facteur n'est présent qu'en faible quantité dans le sérum normal des mammifères et un autre objet de l'invention concerne un procédé d'obtention du présent facteur d'inhibition qui consiste 1) à stimuler in vivo sa sécrétion par administration au mammifère d'un produit protéique extrait du pollen de graminées, telles que le dactyle, l'ivraie ou la phléole, produit connu pour son activité immunorégulatrice et décrit notamment dans la demande de brevet FR-A-2 523 976. 2) à isoler le facteur du sérum enrichi par des techniques classiques d'isolement des protéines, en tenant compte de l'acidité et de la masse moléculaire des constituants du facteur. Ce procédé de stimulation est particulièrement avantageux, puisqu'on a montré antérieurement que l'administration in vivo de l'extrait du pollen de dactyle, (appelé de PID dans ce qui suit), qui a une masse moléculaire/ 14000 daltons et un point isoélectrique de 4,6, ne déclenchait pas une réaction immunologique classique, c'est-à-dire une synthèse des immunoglobulines IgG et IgE, avec les habituelles manifestations pathologiques qui l'accompagnent; en -effet l'homme supporte parfaitement des injections de PID a des doses comprises entre environ 5 et 50 jig par traitement. L'isolement du facteur inhibant y est facilité lorsqu'on opère sur des sérums d'animaux prealablement traités à la PID. On peut aussi envisager la stimulation de la sécrétion tlu facteur inhibant objet de l'invention, in vltro, par culture de cellules convenables en introduisant dans le milieu de culture un extrait de pollen de graminée er p;lrticulirenlenc la PID. Un autre objet de l'invention est l'application du facteur inhibant au traitement ou à la prévention des maladies imlnunitaires allergiques et inflammatoires. On a, un effets montré que ce facteur peut agir sur la physio10gie du mastocyte, notamment en entrant en compétition avec les IgE lors de leur fixation sur les mastocytes; tachant que la fixation de l'IgE sur le mastocyte est a l'origine de certaines des manifestations pathologiques de la réaction immunitaire, notamment inflammatoires, tout compose de l'invention susceptible de diminuer la quantité d'IgE se fixant sur les mastocytes, modifiera favorablement l'intensité de la réponse de l'organisme A l'introduction d'un antigène. Le facteur peut aussi être utilisé selon l'invention comme réactif de laboratoire pour faciliter l'étude de la réaction immunitaire, mettre en évidence les récepteurs membranaires des mastocytes aux IgE, ou permettre la recherche in vitro de molécules de synthèse bloquant ces récepteurs. Enfin, un autre objet de l'invention est constitué par les anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre le facteur inhibant et leurs applications comme agents thérapeutiques ou de diagnostic. Ces anticorps peuvent être obtenus de façon classique : ~,extsraction du sérum d'animaux immunisés contre le facteur inhibiteur pour les anticorps polyclonaux, obtention à partir d'hybridomes pour les anticorps monoclonaux. Ces anticorps peuvent être utilisés à la détection et au dosage hu facteur inhibant1 par les methodes habituelles, cpmme les méthodes radioinimunologiques ou immunoenzymati- que s.. Ils peuvent aussi être utilisés comme agent therapeutique, pour le traitement des allergies, seuls ou associés avec leur antigène , En effet, on a mis en évidence que les anticorps anti-facteur inhibant ont une action directe sur les mastocytes et les polynucléaires basophiles; ils inhibent leur dégranulation provoquée par les allergènes, in vitro et même in vivo lorsqu'ils sont injectés localement par voie intradermique.De plus,ces anticorps augmentent l'inhibition que le facteur exerce sur la dégranulation de ces mêmes cellules; on a montré que lorsqu'un mélange de ce facteur et d'anticorps anti-facteur, incubé durant l heure,est injecté par voie intradermique chez le rat, l'inhibition de la réaction d'anaphylaxie passive cutanée est supérieure à celle observée avec le facteur inhibant seul. Dans ce qui suit, on décrit l'obtention du facteur selon l'invention chez la souris et la mise en évidence de son activité inhibitrice de la fixation de 11IgE sur le mastocyte par le test de réaction d'anaphylaxie passive cutanée chez le rat. Préparation de l'agent de stimulation (PID) On isole un extrait soluble de pollen de Dactylis glomerata en agitant l heure à température ambiante une suspension de 50 mg de pollen dans 500 bl d'eau distillée avant de centrifuger 5 mn à 12000 g. La solution est soumise à une première séparation par isoélectrofocalisation préparative sur gel d'agarose, de préférence de type Sephadex (R) ~NEF, commercialisé par Pharmacia, dans un gradient de pH de 3 à 10 (5 mm d'épaisseur ; 2% de Pharmalytes (R) PH 3-lO,comnercialisé par Pharmacia). La partie de gel correspondant à un pH compris entre 4 et 5 est focalisée de nouveau.La zone correspondant à un point isoélectrique de 4,6 est isolée,le gel d'agarose éliminé et le produit dialysé contre l'eau distillée ISOLEMENT DU FACTEUR INHIBANT A) Obtention du sérum-enrichi On stimule la libération du facteur par administration de l'agent précédemment obtenu à deux lots de souris Lot l:des souris de souche Balb/c recoivent 3 injections, une par semaine,par voie intraveineuse de l fg de PID dans du sérum physiologique. Le sang des animaux est prélevé le 21ème jour et le sérum isolé. Lot 2 :des souris de souche Balb/c reçoivent à 21 jours d'intervalle une injection intraveineuse de 10 yu8 de PID adsorbé sur 2 mg de phosphate d'aluminium, puis une injection de rappel, intrapéritonéale, au bout de 15 jours. Le sang des animaux est prélevé 7 jours après la dernière injection B)Purification du facteur inhibant. Les sérums des souris traitées par la PID, ou de souris normales, sont précipités au sulfate d'ammonium; on isole trois fractions différentes; l'une est le précipité isolé par centrifugation après addition de (NH4)2S04 pour obtenir une concentration de 50%; la seconde est le précipité isolé lorsqu'on augmente la concentration en sulfate jusqu a 70%,après isolement du premier précipité;enfin la dernière,qui est le surnageant restant,ne présente aucune activité bloquante. Les précipités ,provenant de 50 ml de sérum, sont redissous dans 20 ml de tampon phosphate et les deux solutions sont dialysées contre un tampon TRIS-HCl (0,01 M; pH 5,5)pendant 24 heures, puis les solutions sont chromatographiées sur des colonnes de DEAE-cellulose. (TRIS est mis pour tris-hydroxyméthylaminométhane et DEAE pour diéthylaminoéthyl). Dans le cas de la fraction précipitée par (NH4)2S04 à 50%, la colonne (1,6 x 40 cm) équilibrée avec le tampon TRlS-HCl est chargée avec 800 mg de précipité préalablement dialysé et l'élution est réalisée avec le même tampon;une fraction F1, contenant 477 mg de protéines est isolée; l'élution est alors continuée en appliquant un gradient linéaire en chlorure de sodium de O à lM; aucune des 4 fractions ainsi isolées de 38,5 mg, 100 mg, 81mg et 93 mg n'est active. 400 mg de la fraction Fl, sont ensuite dialysés contre un tampon phosphate (0,0175 M; pH 6,3) et introduits sur une colonne DEAE-cellulose équilibrée avec ce même tampon,qui est alors utilisé comme éluant. On isole ainsi deux fractions A et B qui contiennent respectivement 70 mg et 80 mg de protéines; ltélution est ensuite reprise avec un gradient linéaire en chlorure de sodium de concentration O à l M; la première fraction C, qui contient 72 mg de protéines, est seule active; les 2 fractions suivantes de 62 mg et 80 mg ne présentent aucune activité inhibitrice La fraction C est ensuite soumise à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide/dodécylsulfate de sodium pour séparer ses composants suivant leur masse moléculaire.On isole ainsi 4 bandes principales de masse moléculaire 76000, 55000, 46000 et 26000 daltons, après une nuit d'électrophorèse à 10 V/cm; les bandes à 55000 et 26000 daltons sont des formes dissociées des immunoglobulines et les deux autres bandes représentent seules le facteur inhibant objet de l'invention. Dans le cas de la fraction précipitée par (NH4)2S04 à 70%,on a introduit 940 mg du culot protéique dissous dans un tampon phosphate (0,0175 M; pH 6,3) et dialysé, sur une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec le même tampon. L'élution avec ce tampon a donné 4 fractions inactives respectivement de 12 mg , 40 mg, 43 mg et 66,5 mg;l'élution a ensuite été reprise avec un gradient linéaire de NaCI de O à 1M. On a ainsi isolé 6 fractions (Nos 5 à 10) respectivement de 23 mg , 8 mg, 49mg, 140 mg, 150 mg et 331 mg ; la fraction 6 est la plus active,tandis que les fractions 5 et 7 présentent une certaine activité.Ces trois fractions présentent en électrophorèse sur gel de polyacrylamide/sodium dodécylsulfate deux bandes intenses, correspondant aux masses moléculaires 69000 et 76000 daltons, et qui correspondent aux protéines du facteur inhibant, objet de l'invention;;la bande à 69000 n'est pas de la sérum albumine .On déduit de ces deux préparations, l'activité inhibitrice et maximale lorsque à la bande de 76000 daltons est ajoutée la bande 69000 daltons ou la ban-de 46000 daltons. Mise en évidence de l'activité inhibitrice de la fixation des IgE sur les mastocytes On a étudié l'action des différentes fractions de sérum isolées sur la réaction d'anaphylaxie passive cutanée chez le rat,provoquée par des anticorps IgE de souris immunisées. Des rats Lewis sont sensibilisés par injection intradermique de sérums de souris qui ont été immunisées contre l'extrait soluble de pollen de Dactylis glomerata ou contre d'autres allergènes tels que ltovalbumine, l'antigène Dfll d'acarien, le dinitrophénol conjugué à la sérum albumine bovine , par injection de 10 t'g d'allergène adsorbé sur 2 mg d'AlPO4 . Les sérums sensibilisants sont injectés à différentes dilutions dans la peau du rat et 2 heures après la sensibilisation on effectue une injection intraveineuse de 2 mg du meme allergène en mélange avec du colorant Bleu Evans. La plus forte dilution donnant une tache bleue de 5 mm a été définie comme égale au titre d'anaphylaxie passive cutanée (PCA) du sérum de souris étudié.Les résultats exprimés en logarithme ont fait l'objet d'une analyse statistique qui a confirmé leur valeur significative. Le titre en IgE des sérums obtenus après sensibilisation par l'extrait soluble de Dactylis glomerata était de 1/810. La mise en évidence de l'effet inhibiteur du facteur sérique selon l'invention sur la réaction d'anaphylaxie passive cutanée a été réalisée comme suit A. Dans une première série d'expériences, on a mélangé 50 ul des échantillons de sérum à étudier, contenant le facteur inhibant, avec 200 rl d'une série de dilutions au 1/3 des sérums de souris immunisées contre l'extrait soluble de Dactylis glomerata et on a injecté ce mélange par voie intradermique à des rats de souche Lewis. On a utilisé comme échantillons les sérums des souris des lots l et 2 , définis précédemment,à différentes dilutions, ou des sérums de souris normales. Dans le cas où le mélange était incubé 1 heure à 37"C avant son administration, les résultats ont été plus nets On a ainsi montré: a) que l'inhibition de la réaction anaphylactique est pour les animaux du lot l, fonction de la quantité de sérum mélangée, et que la dilution du sérum au 1/5 est plus active, b)qu'en pratiquant la stimulation antigénique à des moments différents après la sensibilisation (de 2 à 48 heures),l'activité inhibitrice du sérum des souris du lot 2 était maximale de 2 à 8 heures après la sensibilisation et diminuait ensuite légèrement jusqu'à 48 heures, pour finalement rester constante, tandis que l'intensité de la réaction anaphylactique n'évolue pas entre 2 et 48 heures après la sensibilisation. En outre, le sérum des animaux du lot 2 était plus actif que celui du lot l,ce qui traduit l'intérêt de la stimulation de la sécrétion du facteur par la PID en présence d'un adjuvant . Par ailleurs, le sérum de souris normales a provoqué une légère inhibition,ce qui indique la présence du facteur inhibant, même chez les animaux non traités. Enfin,les sérums de souris traitées par la PID et contenant le facteur inhibant ne donnent aucune réaction anaphylactique chez le rat, après leur injection à cet animal B.Une autre série d'expériences a consisté à pratiquer d'abord une injection intradermique de l'échantillon de sérum à étudier sur des rats Lewis puis à administrer au même endroit,mais seulement 3 heures après,le sérum des souris immunisées contre le pollen de Dactyle; l'injection déclenchante était faite 2 heures après.On a ainsi montré que le sérum normal n'inhibe la réaction anaphylactique qu'à faible dilution (1/5 ou 1/10) tandis que le sérum des animaux du lot 2,stimulés par administration de PID, est encore actif après dilution au 1/1000,son activité étant maximale à la dilution 1/5. On a enfin vérifié que ni le sérum normal, ni le sérum des animaux stimulés n'avait une activité inhibitrice de la réaction anaphylactique lorsqu'ils étaient administrés postérieurement à la sensibilisation cutanée des rats (3 heures après). Les résultats obtenus dans ces trois séries d'essais montrent que l'effet inhibiteur du facteur selon l'invention sur la réaction anaphylactique, ne se manifeste que lorsque ce facteur se trouve sur la membrane du mastocyte cutané avant ou en même temps que les IgE. Ce facteur joue donc un rôle fondamental au niveau de la fixation des IgE aux mastocytes, sans pour autant que l'inhibition de la fixation soit due à sa complexation aux IgE puisqu'on a montré que les sérums des animaux traités à la PID n'ont aucune réactivité d'anticorps anti-IgE X ceci implique que le facteur selon l'invention a pour cible le mastocyte et le basophile. REVENDICATIONS l.Facteur protéique inhibant la fixation des IgE aux mastocytes 2.Facteur murin selon la revendication l, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine acide de masse moléculaire 76000 daltons et une protéine acide de masse moléculaire 69000 daltons. 3.Facteur murin selon la revendication 1 ,caractérisé en ce qu'il comprend une protéine acide de masse moléculaire 76000 daltons et une protéine acide de masse moléculaire 46000 daltons. 4.Anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre un facteur protéique décrit dans l'une des revendications 1 à 3. 5.Procédé biologique d'obtention d'un facteur décrit dans l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on stimule la sécrétion biologique du facteur en administrant au sujet une protéine tirée du pollen d'une graminée, tel que le dactyle, de masse moléculaire 140CO et de point isoélectrique 4,6, avant d'extraire le facteur du sérum du sujet traité. 6.Composition pharmaceutique pour le traitement des manifestations allergiques , caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'un facteur défini dans l'une des revendications 1 à 3 associé à un véhicule phar maceutiquement acceptable, en combinaison ou non avec un anticorps décrit à la revendication 4. 7.Compositions pharmaceutique pour le traitement des phénomènes inflammatoires, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'un facteur défini dans l'une des revendications l à 3 associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8.Application des anticorps tels que décrits à la revendication 4 à la détection et au dosage des facteurs protéiques des revendications 1 à 3.