Brevet FR2587360A1 — publié le 19870320

L'invention concerne un procédé pour la rupture par voie enzymatique des enveloppes du pollen de fleurs constituées par de la cellulose en vue d'obtenir ainsi une libération accrue des principes immédiats du pollen. I1 est connu que les pollens de fleurs occupent depuis toujours une position solide dans la médecine populaire, des propriétés bénéfiques pour la santé leur étant généralement attribuées par administration orale. Cependant, il est également connu que la plupart des pollens de fleurs de la flore européenne possèdent une enveloppe de cellulose extrêmement stable qui ne peut absolument pas être dissoute ou rompue dans le tractus gastro-intestinal humain. C'est pourquoi, on a également tenté, par un traitement mécanique, par exemple par une micronisation, d'obtenir une biodisponibilité améliorée des principes immédiats du pollen. Toutefois, en comparant par chromatographie en couche mince les quantités d'acides aminés libres dans le cas des pollens nan traités et micronisés, on ne note pas de différences significatives. On connait par la demande EP-A-0069 995 un procédé qui prévoit l'attaque enzymatique du pollen de fleurs. I1 y est proposé, entre autres, de faire agir des enzymes telles que par exemple la cellulase pendant 1 à 14 jours sur les parois des grains de pollen. Ce procédé est très long et fournit un produit qui n'est pas satisfaisant en ce qui concerne les propriétés sensorielles. De plus, une vérification de l'exemple de la publication préalable mentionnée dans lequel est utilisée de la cellulase, conduit à un produit ayant une teneur insuffisante en acides aminés. Si l'on peut attribuer aux constituants du pollen des propriétés bénéfiques pour la santé, il existe un besoin pour la libération, de façon optimale, des constituants des pollens de fleurs par une rupture efficace. On vient de trouver à présent que ce problème peut être résolu par une attaque biologique enzymatique des enveloppes en cellulose des pollens de fleurs à l'aide d'enzymes capables de dégrader la cellulose, de préférence des cellulases, en traitant une suspension aqueuse de pollen de fleurs pendant moins de 24 heures. Avec la cellulase - MKC 4000 (fabricant, Miles Kali Chemie) disponible dans le commerce, on peut déjà, après un temps d'incubation de 2 heures, mettre en évidence à l'aide de divers paramètres une nette rupture du pollen. Le mélange de substance pollinique rompue par voie enzymatique et d'eau peut ensuite être transformé, de façon connue en soi, en un produit pulvérulent stable par des-procédés de déshydratation ménagés tels que le séchage par atomisation ou la lyophilisation. Pour le procédé conforme à l'invention, les paramètres opératoires suivants, pris isolément ou en combinaison, se sont révélés appropriés - concentration d'enzyme : 2 à 200 g d'enzyme/kg de pollen, de préférence 10 à 200 g/kg. - température : 10 à 70"C, de préférence 20 à 50"C. - durée inférieure à 24 heures, de préférence de 0,5 à 20 heures, en particulier de 1 à 16 heures. Le produit obtenu selon le procédé conforme à l'invention se caractérise par au moins un des paramètres suivants pouvant être déterminés par voie analytique - fraction d'acides aminés libres (déterminée à l'aide d'un analyseur d'acides aminés) d'au moins 3,5% en poids, de préférence d'au moins 4% en poids par rapport à la prépara tion de pollen de fleurs séchée. - aminogramme (rapporté à la teneur globale en acides aminés libres) - proline : 60% en poids au maximum, de préférence 55% en poids au maximum. - acides aminés restants : au moins 40% en poids, de préfé rence au moins 45% en poids. - fraction extractible par le chloroforme (teneur en lipides) d'au moins 3,5% en poids,de préférence d'au moins 4,5% en poids. Pour la détection de la rupture enzymatique du pollen, les échantillons suivants ont été soumis à un examen comparatif: échantillon l:préparation de pollen de l'exemple 1 attaquée par voie enzymatique,conformément à l'inven tion, échantillon 2: préparation de pollen micronisée du commerce, échantillon 3: petits grains de pollen naturels broyés au mortier,non traités par ailleurs, échantillon 4: préparation obtenue selon le mode opératoire de l'exemple 3 de la EP-A-0069 995 Détermination par chromatographie en couche mince des quantités accrues d'acides aminés libérés On a utilisé des plaques de gel de silice prêtes à l'emploi "Merck". Eluant: n-butanol 80: acide acétique glacial 20: eau 20 Quantité déposée: 100 microgrammes Etalement de la tache: 2 x 9 cm Détection: pulvérisation de réactif à la ninhydrine "Stahl n0176". Les échantillons des préparations de pollen citées ont été mis en suspension dans de l'eau(l:lO)et chromatographiés à 37"C après un temps d'incubation de 15 minutes. Contrairement aux échantillons 2 et 3,le pollen ayant subi une attaque enzymatique (échantillon 1) révélait, après développement et détection, un accroissement du nombre de bandes d'acides aminés. Aussi ,les bandes d'acides aminés présentes à l'état naturel sont elles considérablement renforcées en ce qui concerne leur intensité (voir figure 1 où le chromatogramme en couche mince présente les valeurs Rf suivantes: 0,53, 0,41, 0,33, 0,25, 0,18, 0,13, 0,03. En revanche, la préparation micronisée.du commerce présentait à peu près le même chromatogramme pauvre en bandes d'acides aminés que la préparation de pollen naturelle. Caractérisation gravimétrique de l'extraction par solvant des constituants du pollen Les échantillons des préparations de pollen considérées ont été mis en suspension dans de l'eau à 37"C (1:10) et filtrés après 15 minutes. Le poids a été déterminé après lavage du résidu de filtration et séchage à 70"C jusqu'à poids constant. Dans le cas de la préparation de pollen rompu, préparée selon l'invention, on a déterminé une fraction de 80% de constituants de pollen hydrosolubles. Par contre, le produit à base de pollen micronisé du commerce ne comportait qu'une fraction hydrosoluble d'en viron 60%, de l'ordre de grandeur du pollen non traité. Caractérisation gravimétrique des quantités accrues de corps lipidiques libérés et extractibles par le chloroforme Les échantillons des préparations de pollen citées ont été mis en suspension dans de l'eau à 37"C (1:10) et extraits par du chloroforme. Après séchage de la phase chloroformique avec du sulfate de sodium anhydre, l'agent d'extraction a été chassé par évaporation et le résidu a été séché jusqu'à poids constant. La préparation de pollen attaquée conformément à l'invention offrait, par rapport à la préparation du commerce micronisée et de la forme de pollen naturelle, un accroissement de la quantité de lipides libérée d'environ 50%. Analyse des acides aminés L'échantillon la (correspondant à l'exemple 3) et l'échantillon 4 ont été traités selon le mode opératoire qui suit et ensuite analysés sur l'analyseur d'acides aminés automatique LC 2000 de la firme Biotronik. Environ 1,5 g de préparation de pollen de fleurs ont été pesés avec précision, mis à digérer dans 30 ml d'eau et additionnés d'acide trichloracétique 3 molaire en vue de la précipitation des protéines éventuellement présentes. On a ensuite complété à 100 ml avec de l'eau et filtré. 0,4 ml ont été prélevés à partir de la solution filtrée au moyen d'une pipette et additionnés de 5 ml de tampon de dilution. A partir de là, 0,1 ml a été injecté dans l'analyseur d'acides aminés. On a obtenu les résultats suivants Echantillon Acides aminés Praline Autres acides Proline utres )acides totauxl) aminés aminés2 la 4,69 2,14 2,55 46 54 4 3,24 2,29 0,95 70 30 1) rapportés à la préparation de pollen sèche à 100% 2) rapportés aux acides aminés totaux à 100% Exemple 1 1 kg de grains de pollen est mis en suspension dans 3 1 de tampon au phosphate à pH 4,5, incubé pendant 16 heures à 40"C avec 0,025 kg de cellulase MKC type PK (Miles-Kali-Chemie), puis lyophilisé. On obtient un produit jaune couvert d'une croûte qui fournit, après passage à travers un tamis de 0,8 mm, une poudre à écoulement libre. Exemple 2 1 kg de grains de pollen est mis en suspension dans 5 1 de tampon au phosphate à pH 4,5, incubé pendant 5 heures à 454C avec 0,05 kg de cellulase MKC type PK (Miles-Kali-Chemie) et ensuite séché par atomisation. On obtient une poudre jaune brun à écoulement libre. Exemple 3 1,6 kg de pollen de fleurs sont mis en suspension dans 6,4 kg d'eau, incubés pendant 4 heures à 44"C avec 0,075 kg de cellulase MKC type PK (Miles-Kali-Chemie), puis séchés par atomisation. On obtient une poudre jaune brun à écoulement libre. Revendications 1. Préparation de pollen de fleurs pouvant être obtenue par traitement du pollen de fleurs à l'aide d'enzymes capables de dégrader la cellulose, caractérisée par une teneur en acides aminés libres d'au moins 3,5% en poids, de préférence d'au moins 4-,0% en poids. 2. Préparation de pollen de fleurs selon la revendication 1, caractérisée par la répartition des acides aminés de 60% en poids au maximum, de préférence de 55% en poids au maximum de proline et d'au moins 40% en poids, de préférence d'au moins 45% en poids d'autres acides aminés, rapportés à la teneur totale en acides aminés libres. 3. Préparation de pollen de fleurs pouvant être obtenue par traitement du pollen de fleurs à l'aide d'enzymes capables de dégrader la cellulose, caractérisée par une teneur en lipides extractibles par le chloroforme d'au moins 3,5% en poids, de préférence d'au moins 4,5% en poids. 4. Préparation selon l'une des revendications précédentes pouvant être obtenue par traitement à l'aide de cellulase. 5. Préparation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par un chromatogramme en couche mince avec les valeurs Rf suivantes : 0,53, 0,41, 0,33, 0,25,-0,18 0,13, 0,03, mesurées avec : n-butanol 80: acide acétique glacial 20: eau 20 comme éluant. 6. Préparation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par une fraction hydrosoluble d'au moins 80% en poids. 7. Remède ou médicament caractérisé en ce qu il contient une préparation selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Aliment pour sportifs, ou fortifiant caractérisé en ce qu'il contient une préparation selon l'une des revendications 1 ?' 6. o. Revitalisant caractérisé en ce qu'il contient une préparation selon l'une des revendications 1 à 6. 10. Procédé pour l'obtention de préparations selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on traite du pollen de fleurs pendant moins de 24 heures en présence d'eau à l'aide d'enzymes dégradant la cellulose, de préférence de la cellulase et déshydrate, de façon ménagée, le mélange résultant. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise 2 à 200 grammes d'enzyme par kilogramme de pollen de fleurs. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'on effectue le traitement à une température de 10 à 70"C, de préférence de 20 à 50"C. 13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'on effectue le traitement pendant 0,5 à 20 heures, de préférence pendant 0,5 à 16 heures. 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'on effectue la déshydratation ménagée par lyophilisation ou par séchage par atomisation. 15. Utilisation des préparations conformes à l'une des revendications 1 à 6 pour la préparation d'agents selon l'une des revendications 7 à 9.