Brevet FR2597483A1 — publié le 19871023

La présente invention a pour objet un nouvel hexapeptide, la réalisation de la synthese de ce nouvel hexapeptide, la mise en évidence des propriétés diurétiques et natriurétiques de ce nouvel hexapeptide, ainsi que les compositions pharmaceutiques diurétiques et natriodiurétiques contenant le nouvel hexapeptide ou certains de ses fragments et dérivés. Certaines expérimentations réalisées sur des extraits naturels de la lymphe de chien ont permis de mettre en évidence que ces extraits présentaient une activité diurétique. Selon la présente invention on a procédé â l'extraction d'un hexapeptide à partir de la lymphe de chien, le H-Ala-Ser Asp-Glu-Thr-Gly-OH, dont la séquence H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly correspond à la séquence C terminale de la céruloplasmine. Selon la présente invention, on a réalisé la synthèse de ce nouvel hexapeptide, et on a mis en évidence ses propriétés diurétiques et natri rétiques. Le nouvel hexapeptide selon l'invention a la structure suivante : H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-OH dans laquelle Ala représente la L-Alanine, Ser représente la L-Serine, Asp représente l'acide L-Aspartique, Glu représente l'acide L-Glutamique, Thr représente la L-Threonine, Gly représente la Glycine, et dans laquelle la chaîne aminoacide présente à son extrémité gauche une terminaison amine et à son extrémité droite une terminaison carboxylique. La formule développée est la suivante Le poids moléculaire de l'hexapeptide selon l'invention est de 578,5. Le spectre de Résonance Magnétique Nucléaire du proton à 300 MHz de l'hexapeptide de l'invention en solution dans le Diméthylsulfoxyde (DMSO) deutéré met bien en évidence selon le tableau donné ci-après la présence de toutes les fonctions de I ' hexapep- tide. Spectre de RMN du proton à 300 MHz de l'hexapeptide en solution dans le DMSO deutéré Déplacements chimiques trouvés 6 (en ppm par rapport au TMS), attribution des raies et comparaison avec les références données par : "K. WUTRRICH NMR in Biological Research Peptides and Proteins North Holland Publishing Co. (Amsterdam)". nombre attribution référence 8.60 1 8.35 1 7.95 2 5NH 7.83 à 8.21 7.80 1 4.55 1 4.40 1 4.30 i 5 cl CH 4.34 à 4.63 4.15 1 4.00 1 3.90 1 ss CH Thr 3.93 3.70 2 &alpha; CH2 Gly 3.76 3.60 2 ss CH2 Ser 3,60 2.55 2,44 2.65 2 ss CH2 Asp 2.70 2.25 2 Y CH2 Glu 2.26 2 CH2 Glu 1.87 1.30 3 + CH3 Ala 1.22 1.05 3 &gamma;; CH3 Thr 1.07 Par ailleurs l'Aminogramme de l'hexapeptide de l'invention après hydrolyse chlorhydrique tel qu'il est représenté dans la figure 1, avec en ordonnées la densité optique sous une lumiere monochromatique de longueur d'onde à 440 nm, et en abscisses le temps de rétention, fait bien apparaître la présence de 6 acides aminés ainsi que leurs proportions équimoléculaires. Les références 1 à 6 correspondent respectivement aux acides Asp, Thr, Ser, Glu, Gly, Ala. Selon la présente invention, on a également mis en évidence l'activité diurétique ou natriodiurétique des fragments dipeptides du nouvel hexapeptide, à savoir, les dipeptides H-Thr-Gly-OH, H-Asp-Glu-OH, H-Ala-Ser-OH. On a également étudié l'activité diurétique ou natriodiurétique des sels dérivés prodrogues de l'hexapeptide et de ses segments ou résidus, des isomères de position ol et t sur l'acide asparti- que, dans lesquels les terminaisons ont été remplacées par un acide aminé, un peptide, un ester, un acyle, une amide, ou tout autre groupe protecteur. De même on a étudié l'activité des sels de cuivre des composés ci-dessus. Les expérimentations ont également porté sur un dérivé particulier du dipeptide H-Asp-Glu-OH, à savoir, l'acide N acétyl-Laspartyl-L-glutamique, sous sa forme suc i, et sous sa forme , et sous la forme de ses sels. Les sels de cuivre de la forme oz ont été particulièrement étudiés. On a également étudié l ' activitE de certains homologues du dipeptide ot H-Asp-Glu-OH, commè le dérivé o( N-acétyl-Asp-Asp obtenu par le remplacement dans le ot N acetyl-Asp-Glu de l'acide glutamique par l'acide aspartique, et le o & N acétyl- Asp-Arg obtenu par le remplacement de l'acide glutamique par l'arglnine, ainsi que leurs isomeres de position. La synthèse de l'hexapeptide a pu être effectuée à partir de dérivés d'acides aminés convenablement protégés. Les réactioins de couplage choisies ont été effectuées de façon qu il n'y ait pas de possibilité d'altération des centres d'asymétrie. Différentes méthodes peuvent être utilisées et trois d'entre elles sont décrites ci-après dans des exemples de préparations de 1' hexapeptide, et de ses segments dipeptidiques, H-Thr-Gly-OH, H-Asp-Glu-OH, et de leurs sels et dérivés, tels que l'acide N acétyl L-aspartyl-L-glutamique sous ses formes &alpha; et Exemple No. 1:Préparation de 1 'hexapeptide L-Alanyl-L-Seryl L-aspartyl-L-glutamyl-L-Thréonyl-Glycine (H-Ala Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-OH) par la méthode sur support solide (noté - 5) ) de Merrifield Le dérivé FMOC-Gly-R (FMOC = 9-fluorenylmethoxycarbonyl) contenant 0,6 millimole de glycine par gramme fut le point de départ pour la réalisation de cinq cycles de couplage analogue au premier qui nous est décrit complètement ci-après. Il comprend les étapes sui vantes - déprotection du FMOC par une solution de pipéridine à 50% dans le chlorure de méthylène. - lavages au chlorure de méthylène, diméthylformamide, eau/dioxane 1/1, diméthylformamide et chlorure de méthylène - couplage avec FMOC-Thr-(tBu)-OH, 2,5 fois en exces pendant 2 heures en présence de dicyclohexylcarbodiimide ( DCCI 2,5 équi valents) et d'hydroxybenzotriazole (HOBT 3,5 équivalents) dans le chlorure de méthylène avec une petite quantité de diméthyl formamide pour solubiliser l'HOBT - lavages au chlorure de méthylène, diméthylformamide, chlorure de méthylène, éthanol et à ncuveau chlorure de méthylène - recouplage dans les mêmes conditions que le couplage avec aupara vant déprotonation éventuelle des fonctions amines libres par la dilsopropyléthylamine en solution à 0,75 % dans le chlorure de méthylène, puis lavages au chloroforme et au chlorure de méthylène - acétylation par l'anhydride acétique en présence de DIPAE pendant 20 minutes dans le mélange DMF/CH2CL2 - lavages au DMF, éthanol, chlorure de méthylène. Le rendement de chaque couplage a été estimé , 99,5 % d'après le test colorimétrique de Kaiser. Au cinquieme cycle on utilise le dérivé BOC-Ala-OH au lieu du dérivé FMOC et on obtient finalement le dérivé peptide résine suivant BOC-Ala-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Glu (OtBu) Thr (tBu)-Gly La coupure du peptide de la résine et la dèprotection finale ont été réalisées en une seule opération d'une heure dans l'acide trifluoracétique (TFA) à 80% dans le chlorure de méthylène. La solution dans le TFA a été concentrée sous bon vide, le résidu dissous dans l'acide acétique et précipité dans un mélange 1/1 éther éthylique/éther de pétrole. Le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton à 300 MHz dans le DMSO deutéré du produit obtenu correspond bien à celui de l'hexapeptide. I1 en est de même pour l'aminogramme. Exemple No. 2 : Préparation du dipeptide-L Thréonyl-Glycine (H-Thr-Gly-OH) Le couplage a été réalisé dans le chlorure de méthylène entre le benzyloxycarbonyl L Thréonine (Z Thr OH) et le tosylate de glycinate de benzyle (TosOH, H-Gly-OBZl) par addition d'un équivalent de dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) et un équivalent de triéthylamine (TEA). La déprotection a été réalisée par l'hydrogène en présence de charbon palladié à 10% dans un mélange méthanol-acide acétique. Le peptide libre a été cristallisé dans l'acétone anhydre. Exemple No. 3 : Préparation du dipeptide Acide L-Aspartyl-L-Gluta mique (H-Asp-Glu-OH) Ce dipeptide fut obtenu à partir de l'anhydride N formyl-L aspartique par couplage avec l'acide L glutamique en solution dans l'eau à 0 C, le pH étant maintenu a 8,5 par addition automatique de soude 10 N. L ' &alpha; N formyl peptide obtenu cristallise avec séparation de l'isome- re i après déminéralisation de la solution. La déformylation finale a été réalisée à 65 C en présence d'acide chlorhydrique N/5. L ' 0( peptide a été cristallisé sous forme de sel dissodique. Exemple No. 4 : Préparation du dipeptide N-acétyl-L-Aspartyl-L Glutamique (N-Ac-Asp-Glu) Ce dérivé a été préparé de la même façon que le précédent peptide décrit dans l'exemple No. 3, à partir de l'anhydride N acétyl aspar tique. Le mélange d'isomères omet et ss ( &alpha; 70%, ss 30% 30%) a été séparé pour isoler l'isomère p pur. L'activité diurétique et natriodiurétique des composés de l'invention a été déterminée par la mesure de la diurèse de groupe de deux rats mâles Wistar (200 g.) éveillés, à jeun depuis 18 heures mais hydratés. Ces rats étaient auparavant choisis. Pour cela huit jours avant l'essai, ils subissaient un test de diurèse. Les animaux qui s'écartaient de la norme n'étaient pas utilisés pour les mesures d'activité. Le jour de l'essai, chaque rat était gavé par sonde oesophagienne avec une solution de CINa à 9 /00 à raison de 4% du poids corporel (V/poids). Immédiatement après, ces animaux recevaient par voie intrapéritonéale - le lot témoin 2ml de NaCl à 9"/00 - les lots essais 2 ml d'une solution de NaCl à 9 /oo renfermant le peptide à tester. La posologie est rapportée en mg/kg; l'effet sur la diu rèe est exprimé en pourcentage par rapport à la diurèse du lot témoin mesurée pendant 4 heures apures l'administration intrapéritonéale. L'excrétion sodée est exprimée en mEq/h/kg. La mesure de sodium a été réalisée au photomètre à flamme après dilution de l'urine au 1/100. L'activité natriurétique est calculée en pourcentage par rapport à 1 'excrétion sodée des rats témoins. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant. RESULTATS OBTENUS Posologie - Dose 0,1 mg/Kg/jour Produits expérimentés activité activité diurétique natriurétique H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-OH + 50 à 60 % + 33 % (TFA) H-Asp-Glu-OH 2 Na + + 50 % + 30 HBr, H-Thr-Gly-OH + 30 % 0 Mélange des isomères &alpha;; et F de -N-Ac-Asp-Glu + 60 % + 50 % (d > 70 % , 15 30 %) Sels de Cuivre du Mélange N-Ac-Asp-Glu + 60 % + 60 ( 70 %, > 30 %) Isomère pur 0 0 N-Ac-L-Asp-L-Gl u N-Ac-Asp-Asp-OH O 0 N-Ac-Asp-Arg-OH - 8 % 0 Il ressort du tableau des résultats des expérimentations que l'hexapeptide selon l'invention présente une très bonne activité diurétique (+ 50 à 60 %) et une bonne activité natriurétique (+ 33%), que le dérivé dipeptide H-Asp-Glu-OH présente la même activité que l'hexapeptide et correspond bien de ce fait à la séquence active de 1' hexapeptide. Les autres fragments dipeptides de l'hexapeptide, tels que le dipeptide H-Thr-Gly-OH, présentent une activité diurétique moindre (+ 30 %) et ne présentent pas d'activité natriurétique. Par ailleurs les résultats des expérimentations montrent bien que les dérivés du fragment actif dipeptide H-Asp-Glu-OH, conservent la même remarquable activité diurétique et natriurétique que le fragment dipeptide H-Asp-Glu-OH lui-même. En particulier le dérivé acyle dans son mélange d'isomères o( et F montre une excellente activité diurétique et une excellente activité natriurétique. Les sels de cuivre de ce dernier composé présentent une activité diurétique et natriurétiq ue encore meilleure. Par opposition, lorsque l'on modifie la structure du dipeptide H-Asp-Glu-OH en remplaçant l'acide glutamique par un autre acide aminé tel que l'acide aspartique ou l'arginine, les composés obtenus ne présentent plus aucune activité intéressante, ainsi que le montrent les résultats obtenus pour les dérivés Ac Asp-Asp-OH et Ac-Asp-Arg-OH. De même il apparaît clairement que seuls les isomères ifs des peptides de la présente invention peuvent présenter -une activité diurétique et natriurétique intéressantes, alors que les isomères ne montrent aucune activité. Enfin si l'on compare l'activité diurétique et natriurbti- que des produits de la présente invention avec celle d'un agent diurétique connu tel que le furosemide, on constate que pour obtenir une activité comparable à celle des produits de la présente invention administrés à une dose journalière de 0,1 mg/kg, il est nécessaire d'administrer 10 a 15 mg/kg de furosémide. Ceci signifie que les peptides selon la présente invention sont 100 à 15 0 fois plus actifs que le furosémide, ce qui est tout à fait remarquable. Les peptides selon la présente invention peuvent être utilisés comme composés actifs dans des préparations pharmaceutiques presentant des propriétés diurétiques ou natriodiurétiques. Etant donné que ces peptides sont des produits naturels constitués de L-aminoacides et sont graduellement hydrolysés dans l'organisme en produisant des L-aminoacides ou d'autres peptides, ils présentent une tres faible toxicité. Ils ne stimulent pas la production d'anticorps et ne provoquent pas de chocs anaphylactiques. Leurs remarquables propriétés diurétiques et natriodiurétiques et cette absence de toxicité, leur permettent d'être les ingre- dients actifs de compositions pharmaceutiques. La dose journalière en composés actifs qui peut être administrée est située entre 0,1 mg/kg et 0,6 mg/kg et se situe de préférence à 0,3 mg/kg. Les compositions pharmaceutiques diurétiques et natriodiurétiques contenant les peptides de l'invention, peuvent être administrées, comme le sont les autres compositions pharmaceutiques contenant des peptides, en particulier par voie parentérale, par exemple par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou intramusculaire. L'unité thérapeutique pour administration par voie intrapéritonéale contient environ 5 mg de substance active. Les compositions pharmaceutiques peuvent également être administrées par voie orale. REVENDICATIONS 1) Un hexapeptide ayant la structure suivante : H-Ala Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-OH dans laquelle Ala représente la L-Alanine, Ser représente la L-Sérine, Asp représente l'acide L-Aspartique, Glu représente l'acide L-Glutamique. Thr représente la L-Threonine, Gly represente la Glycine, et dans laquelle la chaîne aminoacide présente à son extrémité gauche une terminaison amine et à son extrémité droite une terminaison carboxylique, de formule développée ainsi que les sels de ce peptide. 2) Les dérivés prodrogues de l'hexapeptide selon la revendication 1, dans lesquels les terminaisons ont été remplacées par un acide aminé, un peptide, un ester, un acyle, une amide, ou tout autre groupement protecteur. 3) Composition diurétique et natriurétique contenant l'he xapeptide ou un de ses sels, selon la revendication 1, comme subs tance active. 4) Composition diurétique et natriurétique dans laquelle la substance active est un dipeptide de structure H-Asp-Glu-OH résultant de la fragmentation de l'hexapeptide selon la revendication 1, et dans laquelle Ssp représentei'acideL-Aspartique, Glu représente l'acide L-Glutamique, ou un de ses sels. 5) Composition diurétique dans laquelle la substance active est un dipeptide de structure H-Thr-Gly-OH résultant de la fragmentation de l'hexapeptide selon la revendication 1 et dans laquelle Thr représente la L-Thréonine, Gly représente la Glycine, ou un de ses sels. 6) Composition diurétique dans laquelle la substance active est un dipeptide de structure H-Ala-Ser-OH résultant de la fragmentation de l'hexapepide selon la revendication 1, et dans laquelle Ala repré sente la L-Alanine, Ser représente la L-Sérine, ou un de ses sels. 7) Compositions diurétiques ou natriodiurétiques contenant comme substance active les dérivés prodrogues de l'hexapeptide selon la revendication 1, et de ses segments peptidiques, dans lesquels les terminaisons ont été remplacées par un acide aminé, un peptide, un ester, un acyle, une amide, ou tout autre groupement protecteur. 8) Compositions diurétiques et natriurétiques dans lesquelles la substance active est le dérivé acides( -N-acétyl-L-aspartyl-L-glutami- que du dipeptide de structure H-Asp-Glu-OH résultant de la fragmentation de l'hexapeptide selon la revendication 1, ou ses sels. 9) Compositions diurétiques ou natriodiurétiques contenant comme substances actives les sels ou complexes de cuivre des composés actifs présents dans les compositions selon les revendications 2 à 7. 10) Compositions diurétiques et natrîurétiques contenant comme substances actives les sels ou complexes de cuivre de l'acide i -N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamique dérivé du dipeptide H-Asp-îlu-OH résultant de la fragmentation de l'hexapeptide selon la revendication 1. 11) Compositions diurétiques ou natriodiurétiques selon l'une quelconque des revendications 2 å 8, caractérisées en ce que 1' unité thérapeutique administrable contient environ 5 mg de substance active.