Brevet FR2590675A1 — publié le 19870529

MELANGE D'ANTICORPS SPECIFIQUES DES BACTERIOPHAGES DE BACTERIES LACTIQUES ET SES APPLICATIONS A LA DETECTION ET A LA NEUTRALISATION DESDITS BACTERIOPHAGES La présente invention concerne un mélange d'anticorps spécifiques des bactériophages de bactéries lactiques et les applications de ce mélange à la détection et à la neutralisation desdits bactériophages. Les aliments fermentés, tels que le pain et le vin, constituent depuis des siècles, une des bases essentielles de l'alimentation humaine. L'obtention des aliments fermentés fait intervenir des micro-- organismes tels que les levures et les bactéries qui utilisent et transforment les substrats carbonés des matières premières en métabolites divers comme l'alcool et l'acide lactique; c'est ainsi que les bactéries lactiques, telles que Streptocoques lactiques, Lactobacilles, Pédiocoques et Leuconostocs, responsables de la fermentation lactique, transforment, par fermentation, les sucres tels que le lactose en acide lactique, et confèrent aux aliments fermentés des qualités organo-leptiques et alimentaires fortement amélio- rées et souvent nouvelles. Les bactéries lactiques interviennent ainsi dans la fabrication de nombreux produits alimentaires tels que les salaisons et les conserves, les marinades, les choucroutes, les fromages, les vins ainsi que dans l'obtention de divers produits fermentés particuliers à certains pays. Le succès des fabrications industrielles de ces aliments dépend donc étroitement de la bonne conduite du processus de fermentation lactique lui-même lié à une vitalité suffisante des souches bactériennes utilisées. Il arrive cependant que ces souches bactériennes (genre Strepto- ccocus, genre Lactobacillus, genre Pédiococcus, genre Leuconostoc) soient attaquées et détruites par des virus bactériophages, ce qui aboutit à un accident ou à une absence de fermentation et qui entraîne, par là même, des irrégularités de fabrication et des déclassements de production aux conséquences économiques importantes. Dans l'industrie laitière, divers procédés de lutte contre les attaques phagiques des bactéries lactiques ont été proposés avec des succès divers et irréguliers (milieux de culture carencés en tryptophane, utilisation de mélanges de souches bactériennes à sensibilité variable vis-à-vis des phages, etc...). A l'heure actuelle, les accidents de fabrications fromagères impu- tables à des infections phagiques des levains lactiques continuent à survenir et entraînent des pertes économiques importantes. D'autre part, l'absence de test spécifique approprié à une dé- tection précoce, rapide, simple et fiable de contaminants bactériophagiques dans les levains et dans les matières premières explique et entretient les difficultés actuelles des fabrications de produits fermentés. La présente invention s'est donné pour objet la mise au point d'un matériel et d'un procédé de détection utilisables industriellement dans le contrôle des matières premières et dans les suivis de fabrication, ainsi que la mise au point d'un produit et d'un procédé utilisables dans la lutte contre les bactériophages lactiques. Il s'agit, là, en effet, de voies nouvelles de progrès technique et économique susceptibles de satisfaire rapidement les besoins actuels des industriels. L'invention concerne un mélange d'anticorps spécifiques de bac- tériophages de bactéries lactiques des genres Streptocoque, Lactobacille, Pédiocoque et Leuconostoc, ainsi que ses applications à la détection et à la neutralisation desdits bactériophages. Le mélange d'anticorps anti-bactériophages lactiques selon l'in- vention est caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'animaux à l'aide d'antigènes constitués par des sérotypes de bactériophages lactiques rencontrés dans la nature ou en laboratoire et actifs contre les bactéries lactiques mésophiles et thermophiles telles que les Streptocoques lactiques, les Lactobacilles, les Pédiocoques et les Leuconostocs. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les antigènes utilisés dans l'immunisation sont constitués par un mélange de l'ensemble des différents sérotypes des bactériophages actifs contre les bactéries lactiques telles que les Streptocoques lactiques, Lactobacilles, Pédiocoques, Leuconostocs. Avantageusement, les anticorps sont polyspécifiques vis-à-vis des phages des bactéries lactiques, de nature polyclonale et obtenus par immunisation des ovidés, capridés, bovidés, et rongeurs. Selon un autre mode de réalisation, les anticorps sont de nature monoclonale et obtenus à partir de muridés. Les anticorps obtenus après immunisation, prélèvement et saignée d'animaux, sont ensuite fractionnés et titrés en vue d'obtenir une prépa- ration à haut titre neutralisant vis-à-vis des bactériophages des bactéries lactiques. L'invention concerne également l'utilisation du mélange d'anti- corps ainsi obtenus à titre curatif et neutralisant dans les milieux biolo- giques tels que les laits ou les cultures bactériennes initialement conta- minées par les bactériophages. L'invention concerne enfin l'utilisation dudit mélange d'anticorps dans la détection immunologique des bactériophages présents dans un milieu contaminé (levain, lait, lacto-sérum, etc...). La présente invention sera mieux comprise et ses avantages ressortiront bien des exemples qui l'illustrent, sans nullement la limiter. Exemple I: Préparation d'un mélange d'anticorps polyclonaux antibactériophages lactiques à usage curatif L'un des produits de l'invention est constitué par un mélange d'anticorps de bovins immunisés contre les bactériophages des bactéries lactiques (bactériophages spécifiques de Streptocoques lactiques, bactério- phages spécifiques de Lactobacilles, bactériophages spécifiques de Pédio- coques, bactériophages spécifiques de Leuconostocs) obtenus et utilisés comme suit: a) Préparation du mélange d'antigènes Selon l'invention, on utilise pour obtenir des anticorps polyspéci- fiques, des antigènes d'immunisation constitués par un mélange de l'en- semble des différents sérotypes de bactériophages lactiques existant soit dans les collections officielles, soit dans la nature (levains lactiques, laits, lacto-sérums, etc...). Ces différents sérotypes viraux constituent les antigènes et sont obtenus par multiplication sur des souches de bactéries lactiques produc- trices en phase exponentielle de multiplication infectées à raison de dix phages par bactérie. A la fin du cycle lytique, le milieu de culture est centrifugé à température ambiante à I 500 g pendant quinze minutes en vue de sédimenter les débris des corps bactériens lysés. Le surnageant contenant la suspension virale est ensuite concentré dix fois par ultra-filtration par exemple sur membrane Millipore à seuil de coupure 100 000. Le concentré viral ainsi obtenu est alors ultra-centrifugé sur gradient de saccharose. Le précipité viral purifié est dialysé contre de l'eau distillée afin d'éliminer le saccharose et il constitue la préparation enrichie, purifiée d'antigènes titrant généralement 101 particules virales par ml. b) Préparation du mélange d'anticorps Des bovins adultes, en bonne santé, indemnes de maladies infec- tieuses, vaccinés contre la fièvre aphteuse, de préférence de race homo- gène, sont utilisés pour l'immunisation. Celle-ci est entreprise par injection par voie sous-cutanée de 10 ml du mélange d'antigènes viraux adjuvés à volume égal par un mélange d'hydroxyde d'alumine et de saponine. Les bovins reçoivent des injections de rappel par voie sous cutanée les dixième, vingtième, trentième et quarantième jours suivants. Ils sont ensuite abattus et leur sang est recueilli sur solution anti-coagulante puis centrifugé sur décanteuse en vue d'obtenir le plasma. Celui-ci peut alors être fractionné par les techniques classiques chimiques en vue de l'obtention d'immuno-globulines purifiées (on peut, par exemple, utiliser un fractionnement par une solution de sulfate d'amonium saturé). Les immuno-globulines dialysées et purifiées ainsi obtenues sont concentrées par ultra-filtration sur membrane à seuil de coupure de 20 000 puis elles sont filtrées et stabilisées en solution à 100 grammes par litre. L'activité biologique de cette préparation est alors déterminée par neutralisation in vitro sur un mélange Streptocoques lactiques/bactério- phages et sur un mélange lactobacilles/bactériophages. Le titre inhibiteur de la préparation dans ces systèmes atteint généralement I 000 unités neutralisantes par ml d'anticorps. La préparation peut également être stabilisée par lyophilisation. c) Utilisation Ce mélange d'anticorps anti-bactériophages est utilisé comme additif neutralisant et curatif par adjonction dans les laits de vache destinés à la fabrication fromagère et contaminés par des bactériophages. Il doit, dans ce cas, être obligatoirement composé de protéines homologues à l'espèce qui a fourni le lait et doit répondre aux impératifs de non toxicité et d'activité des additifs alimentaires. Ce mélange peut également être utilisé comme un additif curatif de fabrication lors de la préparation industrielle de levains lactiques contaminés par les bactériophages. Exemple 2: Préparation d'anticorps monoclonaux anti-bactériophages lactiques à usage diagnostic a) La préparation d'anticorps monoclonaux fait appel à l'immuni- sation de souris, par exemple de la lignée Balb/c, immunisées à raison de 0,1 ml, par voie intrapéritonéale d'un mélange de suspensions de différents sérotypes de bactériophages lactiques obtenus dans les conditions de l'exem- ple I (a). Les souris immunisées peuvent être sacrifiées 10 à 15 jours plus tard. Leur rate est prélevée, dissociée et leurs lymphocytes sont fusionnées avec une lignée de myélome de souris, puis mis en culture, en micro-plaques, sur milieu HAT sélectif. Après plusieurs jours de culture, l'activité immunologique anti-phages des surnageants est contrôlée et les clones producteurs d'anti- corps anti-phages sont ré-isolés puis multipliés par ascite induite chez la souris. Le liquide d'ascite induite par les hybridomes sécrétants est alors récolté puis purifié par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux actifs contre les différents antigènes de bactériophages sont alors mélangés et utilisés pour la fabrication du test diagnostic. b) Utilisation Selon un exemple non limitatif, ces anticorps monoclonaux anti-bactériophages lactiques sont greffés dans des concentrations optimales par réaction chimique à la glutaraldéhyde sur des micro-billes de polyacry- lamide métallisées (billes de polyacrylamide métallisées contenant des particules de fer par exemple). Ces micro-billes à anticorps greffés sont utilisées pour fixer les antigènes bactériophagiques éventuellement présents dans un lait ou dans une culture de levains contaminés. La réaction antigènes-anticorps est ensuite mise en évidence par une réaction immuno-enzymatique simple ou amplifiée à l'aide d'un anti- corps anti-phages couplé à une enzyme capable de dégrader un substrat en fournissant une réaction colorée (réaction Elisa). Les différentes étapes de la réaction Elisa peuvent être réalisées de manière simplifiée à l'usine grâce à un aimant qui accélère le contact et la séparation des billes de polyacrylamide métallisées et sensibilisées par les anticorps monoclonaux. Ce test immunologique de type Elisa, fourni à titre d'exemple, peut aussi faire appel, dans le cadre de l'invention, à un mélange d'anticorps antibactériophages lactiques polyclonaux obtenus par exemple chez le lapin, le mouton ou le bovin, comme indiqué précédemment. - REVENDICATIONS - 1- Mélange d'anticorps anti-bactériophages lactiques, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'animaux à l'aide d'antigènes constitués par des sérotypes de bactériophages lactiques rencontrés dans la nature ou en laboratoire et actifs contre les bactéries lactiques mésophiles et thermophiles telles que les Streptocoques lactiques, les Lactobacilles, les Pédiocoques et les Leuconostocs. 2- Mélange selon la revendication 1, caractérisé en ce que les antigènes utilisés dans l'immunisation sont constitués par un mélange de l'ensemble des différents sérotypes des bactériophages actifs contre les bactéries lactiques telles que les Streptocoques lactiques, Lactobacilles, Pédiocoques, Leuconostocs. 3- Mélange selon la revendication I et la revendication 2, carac- térisé en ce que les anticorps sont polyspécifiques vis-à-vis des phages des bactéries lactiques, de nature polyclonale et en ce qu'ils sont obtenus par immunisation des ovidés, capridés, bovidés, et rongeurs. 4- Mélange selon la revendication 1 et la revendication 2, carac- térisé en ce que les anticorps sont de nature monoclonale et en ce qu'ils sont obtenus à partir de muridés. 5- Mélange selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que les anticorps obtenus après immunisation, prélèvement et saignée d'animaux, sont ensuite fractionnés et titrés en vue d'obtenir une préparation à haut titre neutralisant vis-à-vis des bactériophages des bactéries lactiques. 6- Application à titre curatif et neutralisant dans les milieux biologiques tels que les laits ou les cultures bactériennes initialement contaminées par les bactériophages du mélange selon l'une quelconque des revendications I à 5. 7- Application à la détection immunologique des bactériophages présents dans un milieu contaminé (levain, lait, lacto-sérum, etc...) du mélange selon l'une quelconque des revendications I à 5.