Brevet FR2590576A1 — publié le 19870529

La présente invention a essentiellement pour objet des peptides toxiques isolés à partir de venin de serpent et permettant l'arrêt de la croissance. Elle vise également des conjugués de ces peptides, ainsi qu'un procédé d'inhibition de la croissance d'un groupe prédéterminé de cellules, à l'aide de ces peptides. On sait que les agents toxiques peuvent trouver une grande variété d'utilisations. En particulier, lorsque l'agent cytotoxique est spécifique ou peut être modifié de façon à devenir spécifique pour des types de cellules ou de souches particuliers, l'agent cytotoxique peut être utilisé pour l'élimination d'un type de cellules ou de souches particulier d'une culture ou d'un tissu comportant une pluralité de différents types de cellules. Par exemple, dans le cas de malignités, il est désirable de pouvoir éliminer spécifiquement les cellules malignes, sans provoquer une mortalité sérieuse au niveau des cellules saines ou normales. Une source de toxines est constituée par le venin de serpent. Un certain nombre de toxines sont connues. Cependant, il y a encore intérêt à trouver des toxines supplémentaires de façon à augmenter le nombre de toxines disponibles pour une utilisation dans des applications particulières. Les toxines peuvent varier sur le plan de la réponse immunitaire à la toxine, de la facilité de couplage à d'autres réactifs, du site d'action de la toxine, ou analogues. Pour découvrir une nouvelle toxine à partir de venin de serpent, il faut procéder à des essais d'utilité, à des extractions extensives, à une purification, et à une analyse afin d'établir la pureté et la séquence d'acides aminés. Des peptides cytotoxiques isolés à partir du venin de plusieurs espèces de serpents à sonnette ont déjà été séquences, isolés et décrits. La myotoxine 2 2590576 dérive du venin du serpent à sonnette de prairie, Crotalus (Fox et autres, Biochemistry (1979) 18:678-83); la crotamine dérive du venin de serpent à sonnette d'Amérique du Sud, Crotalus durissus terrificus (Lauree et Hoppe-Seyler, Physiol. Chem. (1975) 356:213-15); et le peptide toxique C provient du venin du serpent à sonnette du Pacifique Sud, Crotalus viridis helleri (Maeda et autres, Toxicon (1978) 16:431 41). La présente invention concerne des nouveaux peptides cytotoxiques ou arrêtant la croissance des cellules, ces peptides se rapportant à un peptide isolé à partir du venin de serpent à sonnettes Diamondback de l'Ouest, Crotalus atrox. Les conjugués de ces peptides avec des éléments de liaison spécifiques, par exemple des ligands et des récepteurs, peuvent être utilisés pour éliminer sélectivement les cellules d'un mélange de cellules. Plus précisément, la présente invention vise des agents cytotoxiques comprenant un peptide d'approximativement 6 kilodaltons (kD) isolé à partir du venin de Crotalus atrox, des analogues cytotoxiques de ce peptide, et des conjugués des agents cytotoxiques avec des peptides, particulièrement des ligands et des récepteurs pour assurer une liaison spécifique à un élément de liaison complémentaire. La partie ou fraction active comporte au moins environ 15 acides aminés, habituellement au moins 25 acides aminés, plus habituellement au moins environ 35 amines aminés et pas plus d'environ 60 acides aminés, plus habituellement pas plus d'environ 50 acides aminés. Ces parties actives peuvent être réunies pour former une grande variété d'autres composés qui seront décrits par la suite. 3 2590576 Les peptides de cette invention présentent la formule suivante: pp1QC aa4aa5aa6GGaa9C aallaa 12aa 13aa 14 aa16aa 17 18 19 22 25 26 28 29 30 aal aa SDaa GKaa aa2 C 4aa28aa 9aa30 WKC5C6Kaa36aa37aa38aa39pp2 6 dans laquelle: ppl est le N terminal et peut être l'hydrogène, un acide aminé unique, en particulier un acide aminé polaire, plus particulièrement un acide aminé substitué par un hydroxyle ou un acide aminé basique, ou un polypeptide comportant de 2 à 20.et plus souvent de 2 à 10 acides aminés qui peuvent remplir une variété de fonctions, telles que celle d'un groupe de liaison, d'un groupe modificateur, ou analogue; pp est le C terminal et peut être le groupe hydroxyl terminal, un acide aminé unique, en particulier un acide aminé polaire, plus particulièrement un acide aminé contenant un groupe carboxamide, ou un polypeptide comprenant de 2 à 20 et plus souvent de 2 à 10 acides i aminés, qui peuvent remplir les mêmes fonctions que pp; Les lettres individuelles ont leur signification normale comme faisant partie du code des acides aminés à une seule lettre, qui est indiqué ci-dessous; Jusqu'à 5, habituellement pas plus d'environ 3, des acides aminés peuvent servir comme liaisons, de façon à constituer des délétions dans la structure; C1 avec C5, C2 avec C4, et C3 avec C6 forment des ponts de cystéine, lorsque des ponts de cystéine sont présents; aa est un acide aminé aromatique ou acide aliphatique, en particulier D, E, H; aa5 est un acide aminé basique ou polaire aliphatique, en particulier basique ou substitué par carboxamido, plus particulièrement N, Q, K, R; aa6 est un acide aminé aliphatique chargé, soit acide ou basique, particulièrement D, E, K ou R; aa9 est un acide aminé aromatique, particulièrement F, H, W, Y; aa11 est un acide aminé aliphatique chargé, en particulier un acide aminé basique, plus particulièrement K, R; aa12 est un acide aminé aromatique ou un acide aminé aliphatique polaire ou chargé, en particulier acide ou neutre, plus particulièrement substitué par hydroxy lorsqu'il est neutre, et comprenant F, H, W, Y, D, E, S, T; aa13 est un acide aminé chargé ou non polaire aliphatique, en particulier non polaire ou basique, comportant plus particulièrement de 4 à 6 atomes de carbone, et qui est L, I, V, K, R; aa14 est un acide aminé non polaire aliphatique, ayant en particulier de 4 à 6 atomes de carbone, à savoir, L, I, V; aa16 est un acide aminé non polaire aliphatique ayant de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier P, I, L, V; aa17 est un acide aminé polaire ou non polaire aliphatique de 3 à 5 atomes de carbone, en particulier substitué par hydroxy lorsqu'il est polaire, plus particulièrement S, T, A, P. V; aa18 est un acide aminé non polaire ou chargé aliphatique, en particulier basique lorsqu'il est chargé, et comportant de 3 à 6, habituellement de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier P, I, L, V, K, R; 2590576 aa9 est un acide aminé polaire aliphatique de 3 à 4 atomes de carbone, en particulier substitué par hydroxy, plus particulièrement S, T; aa22 est un acide aminé aromatique ou non polaire aliphatique, qui, lorsqu'il est aliphatique comporte de 5 à 6 atomes de carbone, et est constitué en particulier par F, I, L, V; aa25 est un acide aminé neutre aliphatique de 3 à 6 atomes de carbone, en particulier de 4 à 6 atomes de carbone, polaire ou non polaire, et qui, lorsqu'il est polaire, possède un atome de soufre, et est plus particulièrement représenté par M, I, L, V; aa26 est un acide aminé non polaire ou chargé aliphatique, qui est particulièrement acide lorsque polaire, et comprend de 2 à 5, habituellement de 2 à 4 atomes de carbone, et est représenté plus particulièrement par G, A, P, D, E; aa28 est un acide aminé chargé aliphatique de 4 à 6 atomes de carbone, qui peut être basique ou acide, particulièrement D, E, K, R; aa29 est un acide aminé aromatique ou aliphatique qui, lorsqu'il est aliphatique comporte de 3 à 5 atomes de carbone, et est représenté particulièrement par A, P, V, F, H, W, Y; aa30 est un acide aminé basique ou non polaire neutre et aliphatique, et qui, lorsqu'il est non polaire et neutre comporte de 4 à 6, habituellement de 5 à 6 atomes de carbone et est particulièrement représenté par I, L, V, K, R; aa36 est un acide aminé basique aliphatique, constitué particulièrement par K, R; aa37 est un acide aminé aromatique ou aliphatique qui, lorsqu'il est aliphatique comporte de 2 à 3 atomes de carbone et est représenté en particulier par G, A, F, H, W, Y; aa38 est un acide aminé non polaire ou polaire neutre aliphatique, de 2 à 4 atomes de carbone qui, lorsqu'il est polaire est en particulier substitué par hydroxy et est plus particulièrement G, A, P, S, T; a 39aa est un acide aminé non polaire aliphatique de 2 à 6 atomes de carbone, particulièrement de 2 à 3 atomes de carbone, et constitue en particulier G, A, P, I, L, V. Les groupes pour les divers acides aminés et les désignations à une lettre sont indiqués comme suit: aliphatique neutre non polaire polaire chargé acide basique aromatique G - glycine A - alanine P - proline V - valine I - isoleucine L - leucine S - sérine T - thréonine M - méthionine C cystéine G,A,P,V,I,L S,T,M,C,N,Q D,E K,R F,H,W,Y N - asparagine Q - glutamine D - acide aspartique E - acide glutamique K lysine R - arginine F - phénylalanine H - histidine W - tryptophane Y tyrosine 7 2590576 Les peptides qui présentent un intérêt particulier ont la formule suivante: S Q C E Q E G G FC R FL L H K V I C P S R T S D I GK L G C E P L W K C C K L S L M R W G G RWGG K dans laquelle, lorsque deux acides aminés sont indiqués au même emplacement ou site, l'un ou l'autre peut être présents à cet emplacement, mais on préfère que les acides aminés situés au-dessus de la ligne aillent ensemble et que les acides aminés en dessous de la ligne aillent ensemble. Il faut également noter que les susbtitutions conservatives sont permises. Par substitutions conservatives, on veut dire que les acides aminés suivants sur la même ligne peuvent être substitués l'un pour l'autre. G, A V, I, L D, E K, R S, T F, H, W, Y Le N terminal du peptide peut être bloqué ou non bloqué, le blocage nécessitant habituellement un acide aliphatique, par exemple l'acide acétique ou 8 2590576 l'acide formique, une alcoylation, etc... Les composés selon la présente invention sont stables à l'acide et à la chaleur comme il résulte des essais décrits plus loin dans la partie expérimentale. Le peptide arrêtant la croissance qui se produit naturellement et qui est pur à au moins 90%, de préférence 95%, plus préférablement 99% présente un intérêt particulier. Il peut être utilisé en tant que tel ou en combinaison avec d'autres toxines. Les composés cytotoxiques ou inhibiteurs de croissance selon cette invention peuvent être conjugués à une grande variété de ligands et de récepteurs par des techniques classiques. Les groupes fonctionnels nécessaires pour la liaison peuvent être constitués par une variété de groupes acides, tels que carboxyle, sulfonyle et phosphoryle, des combinaisons de thiol et oléfines, dithio, aldéhydes, groupes azo, groupes diazo ou analogues. On utilisera, pour la plus grande part, des composés difonctionnels que l'on peut faire réagir graduellement, bien que des composés difonctionnels qui réagissent simultanément peuvent également être utilisés. A titre d'illustration, ces réactifs peuvent comprendre le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, l'acide para- maléimidobenzoique, l'acide méthyldithioacétique, l'acide diazobenzoique ou analogues. La manière particulière qui est utilisée pour lier la fraction cytotoxique à un élément de liaison spécifique n'est pas critique. Des éléments de liaison spécifique seront constitués par des ligands et des récepteurs, si les éléments de liaison spécifique servent à procurer une liaison spécifique à une cible particulière. Par exemple, les cellules possèdent normalement des récepteurs et des antigènes de surface qui sont caractéristiques d'un type de cellules particulier. Ainsi, en utilisant des récepteurs ou des ligands appropriés conjugués à l'agent toxique, l'agent toxique peut être de préférence dirigé vers les cellules qui possèdent l'élément de liaison spécifique réciproque. Divers composés qui peuvent être utilisés comme ligands comprennent des stéroides, une lipoprotéine de faible densité, des facteurs-de croissance, des protéines virales etc... Par contraste avec cela, soit des récepteurs naturels ou de préférence des immunoglobulines ou leurs fragments peuvent être utilisés, si les récepteurs sont dirigés vers des antigènes de surface spécifiques. Les immunoglobulines d'intérêt comprennent IgA, IgD, IgM, IgE, et IgG, de préférence IgG, y compris l'un quelconque des sous-types. Les immunoglobulines peuvent provenir de n'importe quelle source convenable, particulièrement l'être humain ou les souris. Les immunoglobulines peuvent provenir des hybridomes, des cellules transformés, par exemple des lymphocytes transformés EBV, ou peuvent être obtenues par la technologie d'ADN recombinant. En particulier, des régions variables de souris peuvent être réunies à une région constante d'un être humain ou d'un autre h8te pour donner des immunoglobulines chimériques.qui peuvent donner une antigénicité plus faible. En outre, l'immunoglobuline entière n'a pas besoin d'être utilisée, mais on utilisera plut8t des fragments de celle-ci, tels que Fab, F (ab')2, Fv, ou analogues. Le ligand et la toxine peuvent être unis par des liaisons qui sont stables dans la cellule cible ou instable, de sorte que la toxine et le réactif ciblant peuvent être séparés dans la cellule. D'une manière désirable, la toxine subira une endocytose, de façon à effectuer son action d'une manière intracellulaire. Si l'agent de ciblage n'affecte pas d'une manière néfaste l'activité toxique de la toxine, il ne sera pas nécessaire d'avoir une liaison clivable. Si une liaison clivable est désirée, on peut utiliser commodément une liaison de disulfure, laquelle peut être réduite dans la cellule h8te. Les conjugués peuvent impliquer une grande variété de rapports entre l'agent de ciblage, l'élément de liaison spécifique et la toxine. Habituellement, il y a au moins une toxine par agent ciblant, mais pas plus d'environ une toxine par 0,5 kilodalton (kD) d'agent ciblant. Habituellement, il y aura au moins une molécule de toxine par 100 kD d'agent ciblant, plus souvent au moins une molécule par 50 kD d'agent ciblant. Si l'agent ciblant est petit, et tel qu'un hapten de faible poids moléculaire, il peut y avoir deux ou plus de ligands par toxine, habituellement pas plus d'environ 5 ligands par toxine. Les composés selon cette invention peuvent être utilisés in vitro ou in vivo. Pour une utilisation in vitro, ils peuvent être utilisés pour détruire sélectivement des cellules qui peuvent 8tre distinguées des autres cellules dans une culture ou un tissu. Les composés de l'invention peuvent être ajoutés au milieu suivant des quantités suffisantes pour détruire les cellules non désirées. Par exemple, pour détecter les antigènes particuliers d'histocompatibilité, on peut ajouter des réactifs contenant des anticorps spécifiques pour l'antigène particulier d'histocompatibilité. En ajoutant un colorant qui sera seulement absorbé par les cellules mortes, la présence du colorant dans les cellules sera indicative du type particulier d'histo- compatibilité. La quantité de réactif ciblé peut être variable d'une manière importante et sera optimisée pour des situations particulières dans l'utilisation in vitro. Il ne faut pas utiliser trop de réactif de ciblage de façon à produire une liaison non spécifique et des faux positifs, alors que trop peu de réactif ne doit pas être l1 utilisé, ce qui pourrait résulter dans des faux négatifs étant donné le niveau bas de liaison, qui'ne peut pas être immédiatement détecté. Pour une utilisation in vivo, le conjugué peut être administré par voie parentale ou par injection, en particulier par voie intraveineuse. La quantité de conjugué employé peut varier d'une manière importante, en fonction de la nature de la cellule qui doit être tuée, de l'étendue de la population cellulaire, de la résistance de la cellule au conjugué, de l'efficacité du conjugué et analogues. Lorsqu'on procède à une administration sur un site autre qu'un site spécifique, habituellement, la quantité de protéine variera d'environ 1 pg à 10 mg, habituellement jusqu'à 2 mg, par kilogramme de poids du corps de l'h8te. Pour un site spécifique, la quantité de protéine sera dans la partie inférieure de l'intervalle de concentration. Le conjugué peut être administré dans un milieu physiologiquement acceptable, tel qu'un milieu salin tamponné de phosphate, un milieu salin ou un autre véhicule convenable. Sous la forme de poudre, le conjugué peut être mélangé avec d'autres matériaux qui peuvent permettre de diriger la composition vers un organe particulier, un relâchement prolongé ou analogue. La manière selon laquelle les compositions protéiniques peuvent être administrées à un h6te se trouve dans de nombreux exemples de l'art antérieur et ne sera pas décrite avec plus de détail. Parmi les cellules cible qui sont d'un intérêt particulier, on peut citer les cellules tumorales et les microorganismes pathogènes. On peut également citer comme étant d'un intérêt particulier en raison de leur existence importante: les cellules de carcinome des poumons; les cellules du cancer rectal et du colon; du cancer de la poitrine; du 12 2590576 carcinome de l'utérus; du carcinome de la prostate; du cancer des reins et de la vessie; du lymphome; de la leucémie; et de la maladie de Hodgkins. A titre d'illustration des microorganismes pathogènes on citera des protozoaires, tels que Plasmodium vivas, P. maleriae, P. ovale et P. falciparum, I hy'ic It= 1 j e -fil le----zp Klebsiella et Neisseria, les bactéries Gram-positives, et analogues. On décrira maintenant la partie expérimentale de cette invention et tout d'abord la purification du peptide arrêtant la croissance à partir du venin de Crotalus atrox. Le composé de peptide brut fut obtenu par un lait de venin de crotalus atrox et clarifié par centrifugation à faible vitesse avant lyophilisation. Le venin séché sous congélation fut dissous (lOmg/ml) dans de l'acide acétique 1M et le matériau insoluble fut éliminé par centrifugation à faible vitesse. Une purification initiale a été réalisée en appliquant l'échantillon suivant des quantités de 7,5 ml dans une colonne Bio-Gel P10 équilibrée avec de l'acide acétique 1M et des fractions furent recueillies (3,5 ml), et les aliquots furent éliminés et lyophilisés. Des aliquots furent initialement testés pour l'inhibition de la synthèse d'ADN dans des cultures de cellules de carcinome des poumons humains A549. Brièvement parlant 2x104 cellules A 549 furent ensemencées sur des plaques ou lames à 96 puits et après fixation, les cellules furent traitées avec des fractions appropriées de colonne. Cinq jours plus tard, les puits furent soumis à des impulsions de déoxyuridine 125I et la synthèse d'ADN mesurée par rapport aux puits témoins en se basant sur l'incorporation de la 125Idéoxyuridine. Deux pics importants d'inhibition furent observés. Un premier pic 13 2590576 d'activité inhibitrice de faible poids moléculaire éluant à proximité du pic marqueur d'insuline 6 000 M fut - r ensuite purifié en utilisant la chromatographie liquide à haute pression (HPLC). L'échantillon fut lyophilisé et remis en suspension dans de l'acide trifluroacétique 0,05% (TFA) dans de l'eau purifiée en colonne (Water's Associates). Le matériau insoluble fut éliminé par centrifugation et l'échantillon fut injecté dans une colonne C18-Novapak. L'échantillon fut élué avec un gradient linéaire de 20 à % d'acétonitrile dans du TFA 0,05%, suivant un débit de lml/min à 22 C. Chaque peptide absorbant A214 fut recueilli séparément et les aliquots testés pour l'inhibition de la synthèse d'ADN. Le peptide élué par 54% d'acétonitrile inhibait la synthèse d'ADN des cellules A549; aucune inhibition n'a été vue en utilisant d'autres fractions de colonne. Le SDS-PAGE de cette activité indiquait une bande unique à tache d'argent; aucune autre bande n'a été visualisée sur ce gel, ce qui suggère que le peptide a été purifié jusqu'à l'homogénéité. On décrira maintenant la morphologie des cellules inhibées. Les cellules inhibées montraient un changement morphologique frappant 24 heures après traitement avec ce peptide qui a été appelé "peptide d'arrêt de la croissance" (GAP). Les fibroblastes non transformés et les cellules tumorales humaines furent inhibées dans cet essai (50% de cellules semées) pour une concentration en peptide d'approximativement 100 ng/ml. Les cellules après traitement sont devenues rondes et la plupart des protusions en forme de dendrite étaient absentes d'une manière notable; cependant, les cellules adhéraient encore à la plaque ou lame. Cet effet était irréversible étant donné que le lavage des cellules traitées et la remise dans un milieu frais contenant 10% de sérum n'a pas permis aux cellules de retrouver leur phénotype d'origine. On décrira maintenant la structure chimique du peptide GAP. La séquence d'acides aminés du peptide GAP fut déterminée par analyse de microséquence des peptides obtenus à partir des produits de digestion enzymatique du GAP S-carboxamido-méthylé et réduit avec (a) la lysine-C endoprotéinase; (b) la trypsine TPCK (L-(1-tosylamido-2- -phényl)-éthyl-chlorométhyl cétone); et (c) staphylocoque aureus V8. Les fragments de peptide furent purifiés par chromatographie HPLC inverse, en utilisant des solvants volatils. Les peptides bloqués dans la zone amino terminale furent incubés dans du HC1 12N à la température ambiante pendant 16 heures. Les échantillons furent ensuite séchés par lyophilisation. Les peptides furent soumis à une dégradation Edman automatique dans l'appareil de mesure de séquence de protéine en phase gazeuse, connu sous la dénomination Modèle 470A (Applied Biosystems, Inc). Les acides aminés de phénylthio- hydantoine furent analysés par chromatographie HPLC. La séquence des amino acides du peptide GAP est la suivante: S QC E Q E G G F q R F L L C P S R T S D I G K L II,l I GCEPLWKCCKRWGG G C E P L W K C C K R W G G La structure fut déterminée par analyse de microséquence. Brièvement parlant, le GAP fut réduit avec du dithiothréitol, et fut Scarboxamidométhylé avec de l'iodoacétamide, et un aliquot de 10% fut soumis à une dégradation Edman automatique. Aucun acide aminé N-terminal fut détecté, même lorsque plusieurs cycles de dégradation Edman furent réalisés, ce qui suggère que le groupe terminal amino du peptide GAP est bloqué. Un aliquot de 45% de GAP S-carboxamidométhylé fut digéré avec un enzyme de lysine-C. Les peptides Ki-24 et K25-32 furent séparés par chromatographie HPLC. Les peptides K33-35 et K36-39 ne furent pas retenus par la colonne et furent élués sous la forme d'un mélange. Aucun essai n'a été fait pour purifier ces peptides. Un aliquot de 50% de peptides K1- 24 et K25-32 respectivement fut soumis à la dégradation Edman. Aucun acide aminé N-terminal fut détecté lorsque K1-24 fut séquencé. L'aliquot de 50% restant de K1-24 fut par la suite digéré avec de la trypsine-TPCK. Les peptides tryptiques T1-11, T12-18 et T19-24 furent séparés par chromatographie HPLC et soumis à une dégradation Edman. Aucun acide aminé N-terminal fut détecté lorsqu'un aliquot de 50% du peptide T111 fut séquencé, ce qui suggère que Ti-11l est le peptide N-terminal de K1-24. L'aliquot restant de 50% de T1-11 fut par la suite débloqué avec du HC1 12N et la séquence de T1-11 traité à l'acide fut déterminéeo T12- 18 contenait un résidu d'arginine C-terminal et fut donc supposé comme étant le peptide carboxyl-terminal de K1-24. Le peptide K25-32 fut complètement séquencé. Les données présentées supportaient la séquence de l'acide aminé proposé de GAP à partir des résidus 1-32. L'aliquot restant de 45% du GAP S-carboxamido- méthylé fut digéré avec Staphylocoque aureus V8. Les peptides E1-6, E7-21 et E22-39 furent séparés par chromatographie HPLC. Un aliquot de 50% des peptides E1-6, E7-21 et E22-39 fut soumis à une dégradation Edman. Aucun acide aminé N-terminal fut détecté pour le peptide E1-6. Les séquences complètes de E7-21 et E22-39 étendaient la structure proposée du GAP à partir des résidus 1-39 et confirmaient les attributions ou suppositions faites pour les peptides T12-18, T19-24 et K25-32. Un aliquot de 50% du peptide El-6 fut par la suite débloqué avec du HC1 12N, possiblement par l'intermédiaire d'un déplacement de N-O acétyle catalysé par acide, en Ser-1. La séquence de E1-6 traité par l'acide fut déterminée. La possibilité demeurait que des peptides additionnels pouvaient être présents dans la structure au-delà du résidu Gly-39, étant donné qu'aucun traitement par carboxypeptidase du GAP confirmait Gly-39 comme un acide aminé C-terminal. Cependant, l'homologie de séquence extensive entre le peptide GAP et la Crotamine, la Myotoxine A et le peptide toxique C conduit à la crédibilité de la structure proposée. Structurellement, le peptide GAP appartient à la famille des toxines du serpent à sonnettes, un groupe de polypeptides causant la dégénération des muscles par détérioration du réticulum endoplasmique comme cible primaire. La comparaison du GAP avec toutes les séquences de protéine contenues dans le "Protéine Sequence Database"(PIR Release 5, Mai 1985), n'a pas révélé une homologie extensive avec une autre séquence connue. Les séquences de GAP et les toxines de serpent à sonnette peuvent être alignées de sorte que les résidus de cystéine montrent des positions homologues en insérant deux délétions entre les résidus 10 et 11 du GAP. La présence de six résidus de demi-cystine dans le GAP suggère trois ponts de disulfure dans le polypeptide. La séquence d'acides aminés indiquée ci-dessus peut varier d'une manière importante tout en retenant la structure de conformation et l'activité cytotoxique. Les toxines selon cette invention peuvent être utilisées à la place de toxines telles que la ricine, la toxine diphtérique, l'abrine et analogues selon une méthodologie connue. Voir par exemple Jansen et autres, Recept Mediated Binding Intern, Toxins Horm. Proc. 1980 (Pub. 1981) 351-356 (C.A. 95:126185u); Masuho et autres., Biochem Biophys. Res. Comm. (1979) 90:320-326; brevet américain No. 4 340 535. Bien que la présente invention ait été décrite en détail dans un but d'illustration et avec des exemples pour clarifier sa compréhension, il est bien entendu que des modifications peuvent être réalisées si on les exécute suivant son esprit. REVENDICATIONS 1. Peptide toxique de formule: pp1QC aa4aa5aa6GGaa9C aallaa 12aa 13aa 14C3aa 16aa17 1 23 aa18aa19SDaa22GKaa25aa26C aa28aa29aa30 WKC5C6Kaa36 aa37aa38aa39pp2 6Ka aa ap dans laquelle: _ pp est le N terminal et est l'hydrogène ou une chaîne d'acides aminés comprenant entre 1 et 20 acides aminés; - _ pp2 est le C terminal et peut être un groupe hydroxyle, ou une chaîne d'acides aminés de 1 à 20 acides aminés; les lettres individuelles ont leur signification normale comme indiqué dans le code à une lettre des acides aminés; jusqu'à 5 des acides aminés désignés avec des numéros peuvent servir de liaisons; lorsque des ponts de cystéine sont présents, C1 s'apparie avec C5, C2 avec C4, et C3 avec C6; aa4 aa est un acide aminé aromatique ou acide aliphatique; aa5 est un acide aminé basique ou polaire aliphatique; aa est un acide aminé chargé aliphatique; aa9 est un acide aminé aromatique; aal est un acide aminé basique aliphatique; aa2 est un acide aminé aromatique ou un acide aminé chargé ou polaire aliphatique; aa13 est un acide aminé chargé ou non polaire aliphatique; aa14 est un acide aminé non polaire aliphatique; aa16 est de 4 à 6 atomes de aa17 est un acide aminé carbone; non polaire aliphatique un acide aminé polaire ou non polaire aliphatique de 3 à 5 atomes de carbone; aa18 est un acide aminé basique ou non polaire aliphatique de 3 à 6 atomes de carbone; aa19 est un acide aminé polaire aliphatique de 3 à 4 atomes de carbone; aa22 est un acide aminé aromatique ou non polaire aliphatique; aa25 est un acide aminé neutre aliphatique de 3 à 6 atomes de carbone; aa26 est un acide aminé non polaire ou chargé aliphatique de 2 à 5 atomes de carbone; aa28 est un acide aminé chargé aliphatique de 4 à 6 atomes de carbone; aa29 est un acide aminé aliphatique de 3 à 5 atomes de carbone ou un acide aminé aromatique; aa30 est un acide aminé basique ou non polaire aliphatique de 4 à 6 atomes de carbone; aa36 est un acide aminé basique aliphatique; aa37 est un acide aminé aliphatique de 2 à 3 atomes de carbone ou un acide aminé aromatique; aa38 est un acide aminé neutre aliphatique de 2 à 4 atomes de carbone; et aa39 est un acide aminé non polaire aliphatique, - le N-terminal dudit peptide pouvant 8tre bloqué ou non bloqué. 2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le N- terminal n'est pas bloqué. 3. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ppl est l'hydrogène et pp2 est hydroxyle. 4. Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le N-terminal est bloqué. 5. Peptide répondant à la formule suivante: S Q C E Q E G G F C R FL L H K V I C S R T S D I G K L G C E P L W K C C K L S L M R W G G RWGG K caractérisé en ce que lorsque deux acides aminés sont indiqués au même emplacement ou site, l'un ou l'autre acide aminé peut être présent. 6. Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que seulement les acides aminés du haut sont présents. 7. Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que seulement les acides aminés du bas sont présents. 8. Conjugué de peptide, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide toxique suivant la revendication 1, relié de manière covalente à un élément d'une paire de liaison spécifiques. 9. Conjugué de peptide toxique selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit élément de ladite paire de liaison spécifique est un ligand. 10. Conjugué de peptide toxique selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit élément de ladite paire de liaison spécifique et un récepteur. 11. Conjugué de peptide toxique suivant la revendication 10, caractérisé en ce que ledit récepteur est un anticorps. 12. Conjugué de peptide toxique caractérisé en ce qu'il comprend une toxine provenant de Crotalus atrox reliée de manière covalente à un élément d'une paire de liaison spécifique. 13. Procédé pour inhiber la croissance d'un groupe prédéterminé de cellules dans un mélange de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à combiner ledit mélange de cellules avec un conjugué de peptide toxique selon la revendication 10, le récepteur précité étant spécifique pour un antigène sur la surface dudit groupe de cellules suivant une quantité suffisante pour arrêter la croissance desdites cellules, grâce à quoi la croissance de ces cellules est inhibée.