Brevet FR2592717A1 — publié le 19870710

Réactif et Procédé nouveau Dour la détection d'un élément contenu dans un milieu biologique mettant en ieu la production d'un comPlexe aqalutinable. tel au'un comPlexe antlaène-anticorDs. La présente invention concerne un nouveau réactif biologique utilisable pour la détection d'un "élément" susceptible d'intervenir dans une réaction d'affinité avec un "contre-élément", cette réaction étant accompagnée de l'agglutination d'un complexe contenant l'élément et le "contre-élément". Elle concerne principalement un procédé de détection de l'élément susdit mettant en oeuvre le réactif selon l'invention, lequel contient alors le contre-élément". On entend par "élément", dans le cadre de cet exposé, toute substance, composition, particule capable d'intervenir dans un système ligand-affinant, notamment dans une réaction affine avec un "contre-élément". La généralité donnée au mot "élément" s'étend donc également à l'expression "contre-élément". De façon non limitative, "élément" et "contre-élément" peuvent être constitués par un antigène et un anticorps mutuellement complémentaires ou vice versa. I1 est bien connu que plusieurs techniques existent pour réaliser des dosages du type sus-indiqué. La détection repose sur la détection des agglutinats que forme l'antigène recherché avec l'anticorps du réactif (ou à l'inverse l'anticorps recherché avec l'antigène du réactif). Lorsque l'antigène et l'anticorps sont tous les deux solubles ou finement dispersés, il est également courant de fixer le contre-élément du réactif sur des particules support, par exemple en latex. D'autres supports sont également utilisés de façon courante. On mentionnera pour mémoire des globules rouges de mouton préalablement fixés. Quelle que soit la matière mise en oeuvre pour la formation des particules support, on apprécie que l'utilisation de ces particules facilite l'observation d'une agglutination et ce d'autant plus qu'il est en général possible de fixer des quantités relativement importantes du contre-élément sur les particules. L'agglutination peut alors conduire à des agrégats présentant une dimension apparente (notamment sous le microscope), par exemple de 10 à 20 fois supérieure à celle des particules non agglomérées. Parmi les techniques utilisées, on mentionnera la technique d'agglutination sur lame. Cette réaction implique alors la mise en contact d'une quantité limitée de réactif, en particulier de la suspension des particules portant le contre-élément au sein d'une solution avec une quantité également limitée d'un milieu biologique, de préférence fluide, et l'examen direct sur la lame, le cas échéant sous un microscope, de l'agglutination. Le mélange est alors soit retenu par capillarité sur la lame, soit - de préférence - dans une cavité peu profonde ménagée sur la lame, et propre à retenir le mélange réactif-fluide biologique. Une telle cavité présente, à titre d'exemple, un diamètre de 30 mm et une profondeur de 0,5 mm. Si l'observation de ces agglutinations ne pose pas de problème majeur pour l'oeil exercé du spécialiste, il n'en va pas toujours de même pour des personnes devant effectuer des dosages de façon occasionnelle dans des laboratoires de biologie médicale et surtout lorsque la quantité d'Antigène ou d'Anticorps à détecter est proche du seuil de détection (seuil de sensibilité) de la réaction et également lors de l'évaluation quantitative du complexe à tester. Le but de l'invention est par conséquent de fournir un réactif et un procédé perfectionnés facilitant l'observation des agglutinations éventuelles, en l'absence de la nécessité d'observations comparatives entre des dimensions apparentes de particules agglutinées ou non agglutinées. Le réactif selon l'invention pour la détection des éléments complémentaires d'une réaction affine par agglutination directe sur lame, contenant des particules support sur lesquelles est fixé l'un des éléments de la réaction affine au sein d'une solution contenant un colorant et dans lequel les particules sont en suspension ou susceptibles d'être mises en suspension, est caractérisé en ce que les particules support inerte ont une coloration - due à un contre-colorant - différente, éventuellement complémentaire de celle de la solution, l'association de ces deux colorations conférant audit réactif, lorque la suspension est formée, une couleur monochromatique apparente différente des colorations respectivement dues au colorant et au contre-colorant. On obtient ainsi un réactif prêt à l'emploi, le cas échéant après une agitation extemporanée pour reconstituer la suspens ion monochromatique sensiblement homogène (pour le cas où les particules auraient déposé dans les fioles de réactifs du fait d'un stockage prolongé). Par exemple, le réactif est formé d'une association de particules bleues sur lesquelles est fixé le contre-élément de la réaction, au sein d'une solution jaune, le réactif prenant alors, le cas échéant après agitation, une couleur monochromatique s'étageant entre le vert et le marron clair, en particulier lorsqu'elle est observée à l'oeil nu. Selon une variante du réactif, celui-ci est en fait constitué par l'association de la susdite suspension avec le colorant normalement affecté à la solution, par exemple sous forme de nécessaire ou "kit". Le colorant, alors en fait "dissocié" des autres éléments du réactif, est dans ces conditions destiné à n'être mélangé que de façon extemporanée avec les autres éléments du réactif, au moment de la mise en contact de celui-ci avec le milieu biologique à étudier (ou même par l'intermédiaire du milieu biologique contenant éventuellement le contre-élément à détecter lorsque ce milieu a été coloré, également de façon extemporanée, avec ledit colorant). Cette variante du réactif, pour moins préférée qu'elle soit de façon générale, peut néanmoins le devenir dans des cas particuliers, par exemple lorsque le colorant utilisé ne présente pas une stabilité suffisante, dès lors que le réactif selon l'invention peut quelquefois rester en stock pendant des durées prolongées. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on met en contact, de préférence sur une lame, du milieu biologique, de préférence fluide (par exemple 50 pl) avec le réactif à l'état de suspension (par exemple 50 pl aussi) et en ce que l'on imprime à la lame (ou à la surface supportant le mélange formé entre le fluide biologique et le réactif) un mouvement qui n'exerce aucun effet sur les particules en suspension dans le mélange en l'absence d'agglutination, de sorte que la coloration monochromatique apparente est alors conservée, ce mouvement tendant en revanche, lorsque des agglutinats de particules se forment au sein du mélange, à provoquer des déplacements différentiels de ces agglutinats vis-à-vis des particules non agglutinées, déplacements différentiels qui se manifestent alors par l'apparition sur la lame d'un bichromatisme au sein du mélange de réaction. Ce bichromatisme est alors visible à l'oeil nu. En variante, le procédé selon l'invention comprend également l'addition extemporanée du colorant normalement affecté à la solution (voire par l'intermédiaire du milieu à étudier alors coloré au préalable) au susdit mélange de réaction, avant que soit imprimé à ce dernier le mouvement tendant à provoquer les mouvements différentiels susdits des agglutinats éventuellement formés. En général, on imprime à la lame un mouvement rotatif lent, le cas échéant avec une légère inclinaison, variant périodiquement avec le mouvement rotatif ou circulaire, ces mouvements provoquant alors, lorsque des agglutinats se sont formés, le susdit déplacement différentiel, et par conséquent l'apparition d'un bichromatisme, sous l'effet de forces assimilables à une force centrifuge. En particulier, on observe la formation, à la périphérie du mélange, d'une coloration dominante correspondant à la coloration initiale des particules et, au centre du mélange, une coloration correspondant à celle de la solution elle-même. Dans le cas de l'exemple précédent, la présence de l'élément recherché dans le fluide biologique, par exemple un sérum, se manifeste par une concentration de particules agglomérées à dominante bleue à la périphérie (apparition d'un anneau périphérique bleu) du mélange fluide-suspension initial retenu sur la lame, tandis qu'apparait de façon concomitante une plage centrale à dominante jaune. Il va de soi que les caractéristiques de la suspension doivent être telles qu'elles permettent le résultat recherché, à savoir le maintien de l'homogénéité de la suspension, à l'occasion de la mise en contact avec le fluide biologique, pour le cas où ce dernier ne contiendrait pas l'élément à détecter et, au contraire, la rupture de l'homogénéité de la suspension, accompagnée d'agrégats de tailles plus importantes, pour le cas où le fluide biologique contenait bien l'élément à détecter. De telles observations peuvent être faites, par exemple dans le cas d'essais de détection mettant en jeu des essais d'agglutination directe entre des anticorps fixés sur les particules support, par exemple des anticorps de lapin anti-hCG, et l'élément recherché dans le milieu biologique étudié (sérum ou urine) en l'occur- rence la choriongonadotropine humaine (hCG). Bien entendu, les résultats de la lecture de la réaction peuvent aussi être inversés, par exemple dans des essais mettant en jeu une inhibition de l'agglutination. Dans le cas de l'exemple qui précède, ce serait le cas si les particules support portent ellesmêmes de l'hCG et si l'essai de détection comprend (1) la mise en contact préalable du milieu à étudier avec des anticorps de lapin anti hCG et (2) la mise en contact du mélange obtenu avec le réactif contenant les particules support (les opérations (1) et (2) pouvant le cas échéant être simultanées). Si le milieu à étudier contenait l'hCG, l'absence d'agglutination (et par conséquent l'absence d'apparition de bichromatisme) résulte de l'agglutination préférentielle par les anticorps de l'hCG soluble, contenue dans le milieu. Au contraire l'absence d'hCG dans le milieu étudié se manifestera par une lecture d'agglutination (apparition de bichromatisme) en raison de l'agglutination alors produite entre les anticorps et l'hCG "insolubilisée" retenue sur les particules support. Pour que les conditions susdites quant à l'homogénéité apparente de la suspension soient remplies, il est avantageux d'utiliser des particules ayant des dimensions suffisamment petites, pour échapper à l'action des forces appliquées sur elles en l'absence d'agglutination, notamment pour obtenir l'effet différentiel dont question plus haut. De ce point de vue, il sera avantageux d'utiliser des particules ayant des tailles au plus égales à 10 microns, notamment comprises entre 0,1 et 1 micron. Il est également souhaitable que les proportions volumiques des particules vis-à-vis du volume total du réactif soient suffisantes pour qu'apparaisse à l'oeil le monochromatisme apparent distinct des colorations propres aux particules et à la solution respectivement. Avantageusement, ces proportions volumiques varient de 0,25 à 2,5 % (volume/volume) des particules prises dans leur ensemble vis-à-vis de la totalité du réactif. De nombreux colorants peuvent être utilisés, tant pour le colorant que le contre-colorant. La seule condition à laquelle ces colorants doivent répondre est qu'ils n'interfèrent pas avec la réaction affine recherchée. Les particules porteuses, avantageusement en latex (ayant par exemple un diamètre moyen de 0,81 ), de l'un des éléments intervenant dans la réaction affine sont avantageusement colorées dans leur masse dans le procédé selon l'invention. En général, le colorant mis en oeuvre pour la coloration des particules support n'est pas susceptible d'affecter la fixation et les propriétés du contre-élément, normalement mis en oeuvre dans la réaction affine sur laquelle repose la détection. Il en va évidemment de même pour ce qui est du colorant de la solution au sein de laquelle est réalisée la suspension du réactif.En cas de doute (le cas échéant dans le cas de certains couples "élément-contre élément"), on peut au préalable faire quelques essais comparatifs de contrôle avec des réactifs classiques non colorés pour le vérifier. Les colorants utilisés sont normalement sans effet sur les modes de fixation classiques (tels que fixation par réticulation par le glutaraldéhyde) du contreélément, par exemple antigène, anticorps, lectine ou sucres sur les particules. A titre d'exemples, on mentionne dans le tableau ci-après, quelques couples avantageux de colorant et contre-colorant, respectivement utilisables pour la production de réactifs conformes à l'invention. TABLEAU Coloration Colorant utilisé dans la des particules solution bleue - Acide picrique (jaune) - Eosine - Trythosine - orange G - etc. rouge - Noir amido - Bleu de méthyl - Bleu d'Evans - Bleu du Nil bleue - Particules rouges REVENDICATIONS 1 - Réactif pour la détection des éléments complémentaires d'une réaction affine par agglutination directe sur lame, contenant des particules support sur lesquelles est fixé l'un des éléments de la réaction affine au sein d'une solution contenant un colorant et dans lequel les particules sont en suspension ou susceptibles d'être mises en suspension, caractérisé en ce que les particules support ont une coloration - due à un contre-colorant - différente, éventuellement complémentaire de celle de la solution, l'association de ces deux colorations conférant audit réactif, lorque la suspens ion est formée, une couleur monochromatique apparente différente des colorations respectivement dues au colorant et au contre-colorant. 2 - Réactif selon la revendication 1, qui se présente sous forme de nécessaire ou "kit", dans lequel le colorant normalement affecté à la solution est dissocié des autres éléments du réactif, ce colorant étant alors mélangeable avec ces derniers de façon extemporanée. 3 - Réactif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport volumique des particules support vis-à-vis du volume total du réactif varie de 0,25 à 2,5 0. 4 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les particules support, de préférence en latex, ont une taille inférieure à 10 microns, notamment comprise entre 0,10 et 1 micron. 5 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules support colorées sont constituées de micelles de latex d'un diamètre de 0,81 micron. 6 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'élément de la réaction affine fixé sur les particules support peut être un antigène ou un anticorps, ou toute autre substance entrant dans un système ligand-affinant. .7 - Procédé de détection de la présence dans un milieu biologique, de préférence un fluide, d'un élément auquel correspond le contre-élément d'une réaction affine s'accompagnant de la formation d'un complexe agglutinable, comprenant la mise en contact, de préférence sur une lame, dudit milieu biologique avec un réactif se présentant alors sous la forme d'une suspension, au sein d'une solution, de particules support, notamment en latex, sur lesquelles est fixé le susdit contre-élément, ce procédé étant caractérisé en ce que la solution est colorée par un premier colorant et en ce que les particules ont une coloration distincte, due à un contre-colorant, le colorant et le contre-colorant étant respectivement tels, éventuellement complémentaires entre eux, que la suspension ait une couleur monochromatique apparente distincte des colorations tant de la solution que des particules, et en ce que l'on imprime à la lame un mouvement tendant à provoquer des déplacements différentiels des agglutinats de particules éventuellement formés vis-à-vis des particules non agglutinees, déplacements différentiels qui se manifestent alors par l'apparition sur la lame d'un bichromatisme au sein du mélange de réaction, ce mouvement restant cependant sans effet sensible sur les particules non agglutinées. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier colorant est amené extemporanément au mélange de réaction, soit directement, soit par l'intermédiaire du milieu biologique auquel a au préalable été ajouté ledit premier colorant. 9 - Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'on imprime à la lame un mouvement rotatif provoquant le susdit déplacement différentiel sous l'effet de forces assimilables à une force centrifuge. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que que les particules non agglutinées ont des tailles, et par conséquent des masses, suffisamment faibles pour être insensibles aux effets du susdit mouvement différentiel. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les dimensions des particules sont au plus égales à 10 microns, notamment comprises entre 0,1 et 1 micron. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que le rapport volumique entre les particules et le volume total du réactif varie de 0,25 à 2,5 . 13 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que l'élément à détecter est constitué par un antigène ou un anticorps et en re que le réactif comporte, fixé sur lesdites particules, l'anticorps ou l'antigène correspondant.