Brevet FR2585707A1 — publié le 19870206

-1 Procédé de préparation de monosialoganglioside La présente invention concerne un procédé pour préparer du monosialoganglioside. Ganglioside signifie un membre d'une classe de glycosphingolipides que l'on trouve en abondance dans les cerveaux humains et animaux et est représenté par la formule générale suivante: Gall- 3GalNAcBl-- 4GalBl4GlcBl -lCer 3 3 cxli at a2 (NeuNAc) (NeuNAc) (1) n m dans laquelle GalNAc signifie Nacétylgalactosamine, Gal représente galactose, Glc remplace glucose, NeuNAc est l'acide N-acétyl- et/ou N-glycolylneuraminique (appelé simplement dans ce qui suit "acide sialique"), Cer re- présente céramide, m signifie un nombre entier de O à 3 inclus et m remplace un nombre entier de O à 3 inclus. Selon le nombre et la ou les positions liées du résidu ou des résidus d'acide sialique, qui sont l'un de ses composants, il y a de nombreuses espèces moléculaires. En conséquence, le terme "ganglioside" tel qu'utilisé ici est une désignation générale pour celles-ci. j Les composés de type ganglioside peuvent être classés de façon sommaire selon le nombre de résidus d'acide sialique liés par molécules, en monosialogan- glioside (abréviation: GM), disialoganglioside (abré- viation: GD), trisialoganglioside (abréviation: GT) et tétrasialoganglioside (abréviation: GQ) dans lequel quatre résidus d'acide sialique sont liés. Ils peuvent en outre être classés selon la position ou les positions du ou des résidus d'acide sialique liés. Les espèces molé- culaires suivantes de ganglioside sont ainsi connues: GM1 [n=O, m=l dans la formule générale (1)] en tant que GM, GDla (n=l, m=1) et GDlb (n=o, m=2) en tant que GD, GTlb (n=l, m=2) en tant que GT, et GQ1b (n=2, m=2) en tant que GQ, etc. Par ailleurs, l'indice de GM1 indique que les quatre saccharides de l'oligosaccharide de base sont tous contenus. L'oligosaccharide formé par élimination du Gal terminal à partir de GM1 est appelé "GM2", et l'oligosaccharide obtenu en éliminant en outre GalNAc est appelé "GM3". De plus, le saccharid formé par élimination complète du résidu d'acide sialique est appelé asialo GM1 ou GA1. Dans les années récentes, on a entrepris d'élucider l'action du ganglioside dans les organismes vivants. On a rapporté que le GM1 est efficace pour restaurer et traiter les désordres des systèmes nerveux central et périphérique [voir par exemple Acta Neuro- pathologica, 62 46-50 (1983); Agnati, L.F. et coll., Acta Physilogica Scandinavica, 119, 347-363 (1983)]. En Italie, un mélange gangliosidique contenant du GM1 est commercialisé sous la dénomination commer- ciale "Cronacial" en tant que médicament thérapeutique pour des désordres nerveux périphériques. Une demande de brevet relative à ce mélange a été déposée (à présent brevet japonais mis à la disposition du public n'34912/1977). On sait, en tant que procédé classique pour la formation du GM1 à partir d'une espèce gangliosidique autre que le GM1, faire réagir la neuraminidase, une désialidase, sur l'espèce gangliosidique [par exemple Richard Kuhn et coll., Chemishe Berichte, 96, 866 (1963)]. l'ar ailleurs, il a été également rapporté que du GcM1 a été formé sans utiliser aucune enzyme [S. Ando, et coll., The Journal of Biological Chemistry, 254(23), 12224-12229 (1979)]. Plus précisément, il a été rapporté qu'un mélange de GTlai GTlb, GDlb, GDla et GM1 a été obtenu en maintenant du GQ à pH 3 et 80C pendant 30 minutes dans une solution aqueuse d'acide formique. Selon le chromatogramme en couche mince dans ce rapport, la proportion de GM1 dans le mélange ainsi obtenu est toutefois extrêmement faible et une confirmation supplémentaire est par conséquent nécessaire en ce qui concerne la formation de GM1. On sait également que le ou les résidus d'acide sialique du ganglioiside sont éliminés par acidolyse [voir par exemple, E. Klenk, Hoppe-Seyler'sZeitschrift fur Physiologische Chemie, 270, 185(1941); et L. Sven- nerholm, et coll., The Journal of Biological Chemistry, 248, 740(1973)]. Quoi qu'il en soit, ces procédés de l'art antérieur ont pour but d'éliminer tout l'acide sialique et les produits de la réaction sont le GA1 et des gly- cosphingolipides neutres formés par élimination de saccharides 1-3 à partir de l'oligosaccharide de base. Ils ne visent pas à former du GM1. En tant que sources fournissant du ganglioside qu'on emploie actuellement dans l'industrie, on utilise des cervelles de bovins, de porcs et analogues. Le ganglioside que l'on peut obtenir à partir de ces cervelles contient en général des espèces moléculaires de ganglioside autres que le GM1 dans des proportions supérieures au GM1. La demanderesse a obtenu du ganglioside sous une forme purifiée au moyen d'un procédé connu en soi dans la technique, à savoir, en déshydratant de la cervelle de bovin au moyen d'acétone, en l'extrayant au moyen d'un mélange de solvants constitué de chloroforme, de méthanol et d'eau par le procédé proposé par Svennerholm et coll. [Biochemical et siopiyysica Acta, 617, 97-109 (1980)] , en transformant l'extrait dans une solution aqueuse de ganglioside par la distribution de Folch [J. Folch, The Journal of Biological Chemistry, 226, 497-509 (1957)], en le purifiant par chromatographie sur DEAE-Sephadex-A25 [R.W. Ledeen, et coll., Journal of Neurochemistry, 21, 829 (1973)], et en le soumettant encore à une chromatographie sur colonne de gel de silice. La composition du ganglioside purifié comme indiqué plus haut est de 14 % de GM1, 45 % de GDla, 10 % de GDlb, 22 '% de GTlb et 2 % de GQ1b. Dans la préparation de ganglioside décrite ci- dessus, à savoir le "Cronacial", la teneur en GM1 est de 21 % selon la fiche explicative de la préparation. Si les espèces moléculaires de ganglioside autres que le GM1 dans le mélange gangliosidique peuvent être converties en GM1, le composant efficace peut être obtenu de façon correspondante avec un volume plus grand. Bien que le GM1 puisse être formé en faisant agir la neuraminidase sur le ganglioside, cette enzyme est coûteuse et par conséquent ce procédé ne semble pas être un procédé avantageux du point de vue économique. La présenté demanderesse a effectué une étude comparative en ce qui concerne l'aptitude à l'hydrolyse d'espèces moléculaires variées de ganglioside et de mélanges gangliosidiques. Elle a ainsi constaté que la susceptibilité à l'hydrolyse diffère d'une espèce moléculaire à une autre. Plus précisément, la vitesse de réaction du GDla pour donner le GM1 et celle du GM1 pour donner le GA1 sont différentes bien que ces réactions soient les mêmes en ce qu'un acide sialique est éliminé à partir de la molécule dans chacune des réactions. On a trouvé que la vitesse de réaction du GDla pour donner le GM1 est grande alors que la vitesse de réaction du GM1 pour donner le GA1 est faible. Des résultats similaires ont également été observés en ce qui concerne une autre espèce moléculaire du ganglioside, le GTlb' La demanderesse a ensuite étudié les conditions de l'hydrolyse plus en détail. Il en est résulté qu'elle a trouvé les conditions d'hydrolyse dans lesquelles les espèces moléculaires du ganglioside autres que le GM1 sont soumises à hydrolyse et par conséquent converties en GM1 mais le GM1 reste plutôt stable, ce qui a conduit à la réalisation de l'invention. Plus précisément, on a découvert que le GM1 est formé avec une vitesse de conversion élevée lorsqu'une solution de ganglioside est additionnée d'un aciàe, si cela est nécessaire, et est ensuite chauffée à une tem- pérature convenable à pH 3,5-7, ce qui a permis de réaliser la présente invention. Selon le procédé de l'invention, plus de 50 % des espèces moléculaires du ganglioside autres que le GM1 peuvent être convertis en GM1 qui présente une utilité élevée sous forme de médicaments, au moyen du procédé simple dans lequel une solution de ganglioside est chauffée après l'ajustement de son pH. Le procédé de l'invention est par conséquent un procédé efficace en tant que procédé de préparation du GM1. Les objets, caractéristiques et avantages de la présente invention indiqués plus haut et d'autres encore apparaitront à la lecture de la description suivante. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé pour la préparation de monosialoganglioside, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement l'étape consistant à chauffer du ganglioside à une température supérieure à 50'C dans un milieu liquide contenant de l'eau. Le pH du milieu liquide se situe de préférence dans la gamme de 3,5 à 7. Le milieu liquide contient de préférence un alcool ou du chloroforme. Le procédé selon l'invention sera décrit plus en détail dans ce qui suit. Le ganglioside utilisable de façon convenable en tant que matière de départ pour la préparation du GM1 est du ganglioside de type gangliotétraose. Les autres espèces moléculaires de ganglioside ne sont pas consi- dérées comme convenant totalement mais on ne risque aucun problème ou inconvénient même s'ils sont en mélange. En tant qu'espèces moléculaires de ganglioside utilisables en tant que matières brutes dans la mise en oeuvre de l'invention, on peut mentionner les espèces moléculaires de ganglioside dans lesquelles deux résidus d'acide sialique ou plus sont liés par molécule de gangliotétraose, les mélanges de telles espèces molécu- laires de ganglioside, les mélanges gangliosidiques des mélanges susmentionnés et de GM1 mélangé dedans, du ganglioside brut contenant ces espèces moléculaires de ganglioside à des teneurs plus faibles, et ainsi de suite. Avant tout, ces espèces moléculaires de ganglio- side sont dissoutes dans un solvant. Bien que l'eau convienne le mieux comme solvant, on peut également utiliser de l'eau contenant un solvant organique. En tant que solvant on peut mentionner le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le tétrahydrofuranne, le diméthylsulfoxyde, le chloroforme ou analogues. On peut les utiliser soit seuls soit en combinaison. Il est habituellement préférable d'utiliser l'eau comme solvant mais lorsque le ganglioside de départ est brut et présente une faible solubilité dans l'eau, de meilleurs résultats peuvent être obtenus lorsqu'un solvant orga- nique est utilisé de façon convenable. On ajoute ensuite un acide à la solution de ganglioside pour ajuster son pH à 3,5-7 si nécessaire. En tant qu'exemple d'acide utilisable ici, on peut mentionner un acide organique tel que l'acide formique, l'acide acétique ou l'acide propionique ou un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique. Lorsqu'un sel de métal alcalin tel que le sel de sodium ou de potassium ou un sel de métal alcalino- terreux tel que le sel de calcium ou de baryum du ganglioside brut, est utilisé en tant que matière de départ, on ajoute un acide à sa solution afin d'ajuster le pH de la solution à une valeur prédéterminée. Toutefois, lorsque du ganglioside purifié par absorption de ganglioside sur une résine échangeuse d'ions anionique et élution subséquente de celui-ci au moyen d'acétate d'ammonium ou du ganglioside de type sel d'ammonium obtenu par traitement de ganglioside par une résine échangeuse de cations (de type NH4) est employé en tant que matière brute, le pH de sa solution est pratiquement neutre, c'est-à-dire dans la gamme de 6-7. Il n'est par conséquent pas nécessaire d'ajouter un quelconque acide. Il est préférable de conduire la réaction à une température inférieure lorsqu'elle est effectuée à un pH faible mais de conduire la réaction à une température su- périeure lorsqu'elle est effectuée à un pH plus élevé. Il est nécessaire de chauffer à une temperature supérieure à 'C. Le pH du mélange réactionnel tombe au fur et à mesure que la réaction s'effectue. Lorsque le pH est ajusté à un niveau inférieur, l'importance de cette chute de pH est plus faible. Il est toutefois préférable que le pH ne tombe pas au delà de 3,5 pendant la réaction. Il est par conséquent recommandable d'ajouter un alcali pour éviter tout excès de chute du pH, si nécessaire. La durée de chauttage peut aller de 30 minutes jusqu'à 30 heures, habituellement de 1 heure à 15 heures. Le degré de progression de la réaction et le contrôle des produits de la réaction sont effectués de la manière suivante. Un mélange réactionnel et une espèce moléculaire standard purifiée de ganglioside, chacun en une quantité prédéterminée, sont "développés" au moyen d'un chroma- tographe en couche mince et, après les avoir colorés avec le réactif au résorcinol, on les mesure au moyen d'un chromatoscanner à deux longueurs d'onde pour déterminer leurs quantités [Seitaimaku Jikkenho (Vital Membrane Experimentation Procedures), Vol. I, Special Edition of "Tanpaku, Kakus4n, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes", The Kyoritsu Publishing Co., Ltd, 205(1974)]. Lorsque des conditions convenables sont choisies pour l'hydrolyse, environ 65 % des espèces moléculaires de ganglioside autres que GM1 sont converties en GM1. Lorsque l'hydrolyse est terminée, le mélange réactionnel est neutralisé par de l'ammoniaque aqueuse et le GM1 est ensuite fractionné et purifié par une méthode connue [par exemple, Momoi, et coll., Biochimica et Bio- physica Acta, 441, 448-497(1976)]. Plus précisément, on fait passer le mélange réactionnel neutralisé à travers une colonne de DEAE-Sephadex A25 (de type CH3COO-) puis on élue avec de l'acétate d'ammonium 0,05 N/méthanol. Après dialyse et relargage des fractions de GM1, on le purifie encore à travers une colonne d'acide silicique (Iatrobeads) pour obtenir le GM1. Le rendement atteint une valeur aussi élevée que 50 à 54 % de sa valeur stoechiométrique. Les exemples suivants, non limitatifs, sont des- tinés à mieux expliquer l'invention. E:XEMPLE 1 On dissout 6,0 g du sel de sodium d'un mélange ganglicsidique obtenu à partir de cervelle de bovin et contenant 14 ' % de GM1 dans 188 ml d'eau puis on ajoute 12 ml d'acide acétique 0,1 N. Le pH de la solution résultante est de 4,81. La solution est chauffée à 80'C pendant 6 heures puis refroidie. Son pH est de 4,31. Par analyse du mélange réactionnel, on trouve que la quantité de GM1 a augmenté de 3,7 fois par rapport à ce qu'elle était avant la réaction. Le mélange réactionnel est neutralisé par de l'ammoniaque aqueuse 0,1 N puis on le fait passer à travkrs 600 ml de DEAE-Sephadex A-25 (CH3COO). On fait passer successivement à travers la colonne de l'eau (1 1), du méthanol (1,5 1), du chloroforme-méthanol (1:1) (0,7 1) et du méthanol (1 1) pour laver la colonne. La colonne est ensuite éluée par 2 1 d'une solution 0,05 N d'acétate d'ammonium dans le méthanol. Le GM1 est élué dans les fractions 500-1750 ml de l'éluat. Ces fractions de GM1 sont concentrées jusqu'à siccité puis on les dissout dans 150 ml d'eau. Après dialyse et relargage de la solution résultante, on la concentre jusqu'à siccité. Le poids à sec est de 3,2 g. On reprend ensuite dans 150 ml de chloroforme- méthanol-eau (55:45:2) puis on fait passer à travers une colonne qui est garnie de 600 ml d'acide silicique (Iatrobeads) et a été équilibrée avec le même solvant. La colonne est soumise à un gradient d'élution avec des solvants, c'est-àdire 1 1 de chloroforme-méthanol-eau (55:45:2) et 1,25 1 de chloroformeméthanol-eau (10:90:2). Les fractions de GM1 résultantes sont concen- trées jusqu'à siccité. Le résidu est dissous dans une faible quantité de chloroforme-méthanol (2:1), puis on ajoute 300 ml d'acétone. La solution résultante est refroidie par de la glace et on fait précipiter les cristaux résultants par centrifugation. Après avoir éliminé le surnageant, les cristaux sont séchés pour obtenir 2,65 g de GM1. EXEMPLE 2 Dans 400 ml d'eau, on dissout 800 mg de sel d'ammonium (pureté: 99 % ou supérieure) de GDla' Le pH de la solution résultante est de 6,17. La solution est chauffée à 100'C pendant 5 heures. L'analyse du mélange réactionnel montre que du GM1 a été formé en une quan- tité de 66 % de sa quantité stoechiométrique. La solution réactionnelle est traitée de la même manière que dans l'exemple 1 pour isoler et purifier le GM1 et on obtient ainsi 360 mg de GM1 (rendement: 154). EXEMPLE 3 Un gramme du sel de sodium d'un mélange ganglio- sidique contenant 14 % de GM1 est dissous dans 100 ml d'eau et on fait passer la solution résultante, en l'espace de deux heures, à travers une colonne garnie de 10 ml d'une résine échangeuse d'ion, "Amberlyst 15" (de type NH4). La résine est lavée avec 200 ml d'eau, l'effluent sortant de la colonne et le liquide de lavage sont combinés puis dilués à un volume total de 500 ml pour préparer une solution aqueuse du sel d'ammonium de ganglioside. Cette solution a un pH de 6,66. La solution est chauffée à 80'C pendant 8 heures et le mélange réactionnel est analysé. On trouve ainsi que la quantité de GM1 a augmenté jusqu'à 3,6 fois sa quantité avant la réaction. Le pH du mélange réactionnel est de 4,46. La solution réactionnelle est isolée et purifiée de la même manière que dans l'exemple 1, pour obtenir 432 mg de GM1. EXEMPLE 4 Un gramme du sel de sodium d'un mélange ganglio- sidique contenant 14 % de GM1 est dissous dans 400 ml d'eau puis on ajoute de l'acide chlorhydrique dilué pour ajuster son pH à environ 6,5. On ajoute alors de l'eau pour amener le volume total à 500 ml. La solution résultante dont on trouve que le pH est de 6,47 est chauffée à 100'C pendant 2 heures. L'analyse du mélange réactionnel montre que la quantité de GM1 a augmenté jusqu'à 4,0 fois sa quantité avant la réaction. Son pH est de 5,61. Le mélange réactionnel est ensuite traité de la même manière que dans l'exemple 1 et on obtient ainsi 450 mg de GM1. EXEMPLE 5 Les réactions sont effectuées en utilisant de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique, de l'acide formique et de l'acide acétiqu, de la même manière que dans l'exemple 4. Les mélanges réactionnels résultants sont analysés. Les résultats des essais figurent dans le tableau I. ABLEAU I Ln 0o o pH ajusté avant Chauffage Quantité de GM formée ACIDE chauffage par rapport à celle Température (+C) Durée (h) avant Le chauffage Acide chlorhydrique 4,5 100 0,5 3,8 Acide sulfurique 6,47 100 4 3,6 Acide formique 6,27 1i0 7,6 idem 4,26 100D 0,5 3,2 Acide acétique 6,36 i00 4 4, 2 idem 3,96 80 0,5 4,0 EXEMPLE 6 mg du sel d'ammonium du GDla sont ajoutés à ml de méthanol ayant une teneur en eau de 0,2 % puis on les fait réagir à 100'C pendant 8 heures dans un au- toclave. L'analyse du mélange réactionnel montre que du GM1 a été formé en une quantité de 70 % de son rendement stoechiométrique. EXEMPLE 7 mg du sel d'ammonium du GDia sont ajoutés à 100 ml de méthanol contenant 10-4 mole d'acide acétique et ayant une teneur en eau de 0,2 % puis on les fait réagir à 100'C dans un autoclave. On prélève périodiquement des échantillons du mélange réactionnel pour analyser la quantité de GM1 formée en termes de sa proportion () par rapport à son rendement stoechio- métrique. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II qui suit: TABLEAU II Durée de réaction Proportion (%) de GM1 (h) formé ________________________________________________________ 1 35 3 59 63 8 64 EXEMPLE 8 mg du sel sodium de ganglioside contenant 14 % de GM1 sont ajoutés à un mélange 6:4:1 de chloro- forme, méthanol et eau, lequel mélange contient 10- 5 mole d'acide acétique. On fait réagir à 100'C pendant 8 heures dans un autoclave. L'analyse du mélange réaction- nel montre que la quantité de GM1 a augmenté jusqu'à 4,6 fois sa quantité avant la réaction. EXEMPLE COMPARATIF 200 mg du sel d'ammonium du GDla sont dissous dans 100 ml d'acide formique 0,O1 N. La solution résultante dont le pH est de 3,13 est chauffée à 100'C pendant 80 minutes. L'analyse du mélange réactionnel montre que la quantité de matière de départ GD la restant encore dans le mélange réactionnel est de l'ordre de traces et que la quantité de GM1 formée est aussi faible que 7 % de son rendement stoechiométrique. Un chromato- gramme en couche mince du mélange réactionnel développe une couleur avec le réactif à l'orcinol. On observe un certain nombre de taches mais les produits de réaction principaux sont des glycolipides neutres ne présentant pas de résidus d'acide silicique, tels que le GA1. L'invention ayant maintenant été décrite en détail, il apparaîtra à l'homme du métier que de nombreux changements et modifications peuvent lui être apportés sans sortir de l'esprit ou du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de monosialogan- glioside, caractérisé en ce qu'il comprend essentiel- lement l'étape consistant à chauffer du ganglioside à une température supérieure à 50'C dans un milieu liquide contenant de l'eau. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu liquide se situe dans la gamme de 3,5 à 7. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en que le milieu liquide contient un alcool ou du chloroforme.