Brevet FR2595827A1 — publié le 19870918

La présente invention est relative à une nouvelle méthode de dosage quantitatif de protéines antigéniques dans des coupes histologiques de tissus de provenance humaine, animale ou végétale, ou dans des cellules isolées de même provenance, par radio-immunocytochimie. Il existe déjà plusieurs méthodes de dosage quantitatif par immunocytochimie de protéines ou d'antigènes contenus dans des coupes histologiques ou dans des cellules iso lées. Cette technique consiste à faire réagir tout d'abord des cellules isolées ou des coupes histologiques de tissus avec un antisérum spécifique, puis à détecter les immunoglobulines fixées, en utilisant une immunoperoxidase en présence d'un chromogène approprié qui constitue un substrat pour la peroxydase. La coloration développée dans cette technique est analysée soit par une microdensitométrie assistée par ordinateur (Sternberger, N.H., Itoyama, Y., Kies, M.W. and Webster, H. de F. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2521-2524. Benno, R.H., Tucker, L.W.,Joh, T.H., and Reis,D.J. (1982) Brain Res. 246, 225-236. - Benno, R.H., Tucker, L.W.,Joh, T.H. and Reis,D.J. (1982) Brain Rei. 246, 237-247), soit par l'analyse d'images assistées par ordinateur (Gross, D.S. and Rothfeld, J.M. (1985) J. Histochem. Cytochem. 33, 11-20). Ces méthodes nécessitent un équipement sophistiqué et coûteux, qui n'est pas facilement disponible. Pour pallier ces inconvénients, la présente invention a pour but de pourvoir à une méthode de dosage quantitatif de protéines, faisant appel à un réactif radioactif spécifique et ne nécessitant que la mise en oeuvre d'un équipement simple. G.M. Wright et C.P. Leblond J. Histochem. Cytochem. (1980) 28, 1355-1358 ont décrit une méthode de détermination de la répartition de l'antigénicité du procollagène I, du procollagène III et du collagène IV à l'aide d'un réactif radioactif spécifique, à savoir la 125I-Protéine A (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) qui se complexe avec un anticorps primaire dirigé contre un procollagène type I ou III, ou un collagène IV. Le complexe est révélé par autoradiographie d'une émulsion sensible examinée sous microscope (grossissement de 1000). Toutefois ces Auteurs ne décri- vent pas la sensibilité de leur méthode, ni sa quantification. La présente invention a pour objet une nouvelle méthode de dosage quantitatif de protéines antigéniques contenues dans des substrats constitués soit par des coupes histologiques de tissus de provenance humaine, animale ou végétale, soit par une ou plusieurs cellules isolées de ces mêmes tissus, laquelle méthode est caractérisée en ce que l'on fait -réagir successivement avec lesdits substrats un anticorps primaire dirigé contre la ou les protéines antigéniques, puis un anticorps secondaire biotinylé dirigé contre l'anticorps primaire, puis enfin un composé caractérisé en ce qu'il possède deux fonctions : l'une de former un complexe très stable avec la biotine de l'anticorps secondaire, l'autre d'émettre un rayonnement radioactif qui est mesuré quantitativement par des techniques connues, pour réaliser le dosage de protéines antigéniques. L'anticorps primaire peut être constitué par un antisérum hyperimmun dirigé contre la ou les protéines antigéniques recherchées ou par un anticorps monoclonal dirigé contre la ou les protéines susdites. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé possèdant les deux fonctions susdites est de la 35S Streptavidine (commercialisée par Amershar Corporation) qui forme un complexe de haute affinité avec le groupe biotine de l'anticorps secondaire. Le rayonnement radioactif de l'isotope du soufre est mesuré par autoradiographie microscopique à l'aide d'émulsions photographiques appropriées. La présente invention a également pour objet un ensemble ou "kit" prêt à l'emploi pour la réalisation du dosage quantitatif d'une ou plusieurs protéines antigéniques contenues dans des cellules isolées ou dans des tissus, qui est caractérisé en ce qu'il comprend comme éléments essentiels - une pluralité de lames pour microscope, prêtes à l'emploi, qui ont été préalablement traitées par un milieu approprié tel qu'un milieu de Denhardt et acétylées par de l'anhydri de acétique dans de la triéthanolamine, - un fixateur des cellules infectées prelevées sur les lames, - une quantité appropriée de sérum normal, - une quantité appropriée d'un anticorps primaire dirigé con tre la ou les protéines antigéniques recherchées, - une quantité appropriée d'un anticorps secondaire biotiny lé, dirigé contre l'anticorps primaire, - un composé qui possède deux fonctions : l'une de former un complexe très stable avec la biotine de l'anticorps secon daire, l'autre d'émettre un rayonnement radioactif qui est mesuré quantitativement par des techniques connues. Selon un mode de réalisation préféré de cet ensemble ou "kit", le composé possédant les deux fonctions susdites est de la 35S Streptavidine. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'application de la méthode de dosage quantitatif conforme à la présente invention et à l'aide des Figures 1 à 3 annexées qui représentent sous la forme de graphiques le dosage quantitatif d'antigènes des capsomères du virus TMEV par radioimmunocytochimie. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les dessins annexés sont données uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 DOSAGE QUANTITATIF PAR RADIO-IMMUNOCYTOCHIMIE D'ANTIGENES DE CAPSOMERES DU VIRUS DE THEILER 1. Préparation de cellules de rein de hamster nouveau-né (cellules BHK-21) infectées par la souche DA du virus de Theiler, sur des lames de microscope 1- La souche DA de TMEV a été soumise à une purification par la méthode des plages à trois reprises sur des cel lules de reins de hamster nouveau-né (cellules BHK-21). 2- Des lames de microscope ont été nettoyées et traitées par du milieu de Denhardt (constitué par 0,02% BSA, 0,02% polyvinylpyrrolidone, 0,02% Ficoll, 3xSSC), puis fixées par un mélange 3:1 volume/volume d'éthanol-acide acétique, pendant 20 minutes, puis, après séchage à l'air, acétylées par la méthode d'HAYASHI et Colt. par de l'anhydride acétique ajouté jusqu'à 0,25% (v/v), dans de la triéthanolamine 0,1M,pH8. Le traitement préalable des lames est décrit dans "Methods in Viro logy, Vol. VII, Chapitre 7 "Detection of viral nucleic acids by in situ Hybridization" (1984) Academic Press Inc. Ed., sous la signature de A. HAASE, M. BRAHIC, L. STOWRING et H. BLUM. 3 Des cellules BHK-21 ont été infectées à des m.o.i. ("multiplicity of infection") de 0,25, 0,50, 7, 2 et 4 P.F.U. ("plaque forming unit") par cellule. Les cellu les ont été récoltées par trysinisation 1 heure après l'infection, cette durée étant suffisante pour permet tre une pénétration complète de l'inoculum. Les cellules ont été lavées par une solution saline tamponnée au phosphate (Pi/NaCl) et déposées sur les lames traitées, comme indiqué en 2 ci-dessus, en uti lisant une cytocentrifugeuse, puis après séchage pen dant quelques minutes à l'air, elles ont été fixées par traitement pendant 20 minutes par un fixateur glacé contenant 0,5% de paraformaldehyde, 0,58 de glutaralde hyde, un tampon phosphate (0,1M;pH 6,0), 1,6% de gluco se, 0,002% de CaCl2, 1% de dimethylsulfoxyde, préparé comme décrit dans "Morris,R.G. and Barber,P.C. (1983) J. Histochem. Cytochem. 31, 263-274" et dénommé fixa teur PGF. Après la fixation, les cellules ont subi une trempe par immersion pendant 20 minutes dans de l'éthanolamine glacée (0,15M ; pH 7,5), suivie de 2 lavages pendant 5 minutes dans du Pi/NaCl. Les cellules ont été ensuite deshydratées en les plongeant une fois dans de l'étha nol à 70%, deux fois dans de l'éthanol à 95%, une fois dans de l'éthanol à 100%, deux fois dans du xylène à 100%, chaque étape de déshydratation ayant une durée de 5 minutes environ, après quoi les cellules déshydratées ont été enrobées de paraffine en les immergeant pendant 10 minutes, à deux reprises dans de la paraffine (de marque "Paraplast") à 62"C. Avant d'effectuer les analyses de ces cellules stoc kées, on en élimine la paraffine par immersion dans du xylène puis de l'éthanol à 100%. 2. Préparation d'anticorps primaires dirigés contre les pro téines du TMEV 10 Un antisérum hyperimmun contre les protéines de TMEV a été obtenu par purification du TMEV à partir de surna geant de culture de cellules BHK, comme décrit dans BRAHIC, STROOP et BARINGER, "tell" (1981) 26, p. 123 128. Un lapin albinos néo-zélandais a été immunisé par in jection dans les coussinets des 4 pattes, de 150 pg d'une émulsion du virus purifié dans de l'adjuvant com- plet de Freund. Un mois plus tard, l'animal a reçu un rappel de 100 pg de virus purifié dans 300 pl de Pi/NaCl injecté par voie intraveineuse. L'antisérum a été recueilli 10 jours plus tard. Cet antisérum total se lie fortement aux protéines VP1 et VP2 du capsomère et faiblement à la protéine VP3 du capsomère, comme cela est montré par une immunoprécipi tation (1immunoblotting") d'un lysat de cellules BHK infectées. 2- Les antisérums contre les protéines virales purifiées VP1, VP2 et VP3 ont été préparés de la manière sui vante - Les cellules BHK confluentes, de 14 flacons de 75cm2, ont été infectées à un m.o.i. ("multiplicity of in fection") de 10 P.F.U./cellule. Le milieu et les débris de cellules ont été récoltés après 15 heures d'incubation à 37"C. Du Triton X100 a été ajouté jusqu'à une concentration finale de 0,5% et le mélange a été centrifugé à 10000 rpm pendant 10 minutes, à 4C. Le surnageant est percolé lentement (10 ml/heure) à travers une colonne (remplissage de 10 ml) d'immunoglobulines anti-TMEV purifiées à par tir de l'antisérum total décrit plus haut et couplé à une résine Sépharose 4B activée au bromure de cyano gène (CNBr). La colonne a été lavée avec plusieurs volumes de Pi/NaCl, 0,5 NaCl, 0,5% Triton X100 et les effluents sont jetés. Les produits fixés par affinité à la co lonne sont élués en faisant bouillir la résine pen dant 5 minutes dans 13 ml de TrisHCl 80mM à pH 6,8 et contenant 3% de SDS et 0,1% de glycérol. Après sépa ration de la résine et de l'éluant liquide par cen trifugation, les protéines en solution dans l'éluant ont été précipitées par 3 volumes de méthanol à -20'C pendant 1 heure. La solution restante a été centrifu gée à 10000 rpm pendant 10 minutes à 4"C et le culot est dissous dans un tampon approprié Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-682 , puis le tout est porté à ébullition pendant 3 minutes et déposé sur un prépa ratif en plaque (13x14x0,15cm) de gel SDS-acrylamide. Après électrophorèse, le gel est coloré au bleu de Coomasie, puis décoloré, et enfin plongé 2 fois tren te minutes dans du Pi/NaCl. On observe 3 bandes importantes à des positions qui correspondent aux protéines VP1, VP2 et VP3. Chacune de ces 3 bandes est récoltée et mise séparément dans 10 ml de Pi/NaCl avec 0,1% de SDS et éluée sous agi tation une nuit durant, à la température ambiante. Après un brève centrifugation, les surnageants ont été recueillis et les culots élués une seconde fois comme décrit ci-dessus. Les protéines présentes dans les surnageants sont précipitées au méthanol, comme décrit ci-dessus, après avoir ajouté 40 pl de sérum sanguin de lapin blanc de Nouvelle-Zélande en tant que protéines sup ports. Après centrifugation, les culots ont été dissous dans 1 ml de Pi/NaCl, C,18 SDS, émulsionnés dans 1 ml d'adjuvant complet de Freund et injectés dans les coussinets des pattes de lapins blancs de Nouvelle Zélande. Un mois plus tard, les animaux sont de nou veau inoculés avec 100 pg d'antigènes purifiés comme décrit ci-dessus. Les antisérums sont obtenus 10 jours plus tard. La spécificité de chacun de ces 3 antisérums a été vérifiée par immunoprécipitation à l'aide dsun lysat de cellules BHK infectées. Chaque antisérum reconnait exclusivement son antigène correspondant et ne se fixe pas à d'autres protéines virales ou cellulaires. 3. Radio-immunocytochimie des cellules BHK préparées sur des lames de microscope selon le 1" de l'Exemple 1 La paraffine a été enlevée des lames en les plongeant 2 fois dans du xylène et 2 fois dans de l'éthanol absolu (5 minutes chaque fois). La réhydratation et la perméabilisa tion des cellules ou tissus ont été obtenues en plongeant les lames successivement dans du Pi/NaCl pendant 5 minutes, dans du Pi/NaCl, 0,1% Triton X100 pendant 4 minutes, dans du Pi/NaCl deux fois 5 minutes chaque fois. On a fait réagir les cellules perméabilisées, successivement avec i) du sérum normal de chèvre (dilué 25 fois dans du Pi/NaCl), ii) un antisérum primaire de lapin tel que l'un des trois préparés ci-dessus, dilué 300 fois, iii) des IgÇ anti-lapin biotinylées, préparées chez la chèvre (commercialisées par Vector Laboratories) di luées 7200 fois, iv) de la 35S Streptavidine 300 Ci/mMole (commercialisée par Amersham) à une concentration finale de 0,5yCi/ml. Toutes les dilutions des antisérums et de la Streptavidine ont été effectuées à l'aide de sérum normal de chèvre dilué 25 fois dans du Pi/NaCl. Toutes les étapes de ce procédé ont été réalisées à la température ambiante pendant 30 minutes excepté l'incubation avec la 35S Streptavidine qui a duré 20 minutes. Entre les étapes ii), iii) et iv), les lames ont été lavées 5 minutes dans du Pi/NaCl à température ambiante. Après l'étape iv), les lames ont été lavées 4 fois, 5 minutes chaque fois, puis une fois une minute, dans du Pi/NaCl durant la nuit. Les lames ainsi lavées ont été déshydratées en les plongeant 2 fois dans de l'éthanol à 70% contenant 0,3 M d'acétate d'ammonium et 1 fois dans de l'éthanol à 95% contenant 0,3 M d'acétate d'ammonium. Après séchage à l'air, les lames ont été immergées dans une émulsion radiophotographique NTB-2 KODAK diluée (1:1) par de l'acétate d'ammonium 0,3 M, après séchage de l'émulsion les lames ont été exposées pendant des durées appropriées dans des bol- tes noires, au bout desquelles elles ont été développées dans du révélateur KODAK D-19, puis fixées par du fixateur KODAK et colorées avec du colorant de Giemsa (pour les cellules BHK), comme décrit par A. Haase, M. Brahic, L. Stowring and H. Blum in Methods in Virology, eds Maramo rosh, K and Koprowski, H (Academic Press, San Diego) vol. 7, p. 189-226. Comme pour les procédés d'immunocytochimie connus, les concentrations des antisérums primaire et secondaire doi vent être optimisées, afin d'obtenir le signal maximum et le bruit de fond minimum. 4. Dosage quantitatif par radioimmunocytochimie Le caractère quantitatif de la méthode de dosage selon l'invention a été établi de la manière suivante Des cellules BHK-21 ont été infectées par du TMEV à un m.o.i. de 0,25, 0,5, 1, 2, et 4 PFU par cellule. Les cel lules ont été récoltées par trypsinisation, une heure après l'infection, ce qui est un temps suffisant pour per mettre la pénétration complète de l'inoculum. Un aliquot de chaque récolte a été utilisé pour extraire le RNA total et pour quantifier le nombre moyen de génomes viraux observé par cellule en utilisant des méthodes connues (Brahic M., Haase A.T., et Cash, E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 5445-5448). Ce nombre est proportionnel au m.o.i. et 1 PFU corres pond à 560 molécules de RNA viral. Un autre aliquot de chaque récolte a été déposé sur des lames de microscope et traité selon le procédé de l'invention décrit dessus. Trois antisérums primaires différents ont été utilisés dans cette expérience a) un antisérum total dirigé contre le TMEV, b) un antisérum dirigé contre la protéine VP1, c) un antisérum dirigé contre la protéine VP2. Des cellules BHK non infectées témoins ont été soumises parallèlement au même procédé selon l'invention, afin de mesurer le bruit de fond. Dans chaque cas, on a déterminé le nombre moyen de grains révélés par autoradiographie, par cellule et par minute d'exposition autoradiographique et en comptant les grains de 40 cellules prises au hasard sur la lame, à l'aide d'un microscope. Ces valeurs en nombre de grains par rapport aux valeurs de m.o.i. en PFU sont représentées à la Figure 1 annexée. Le bruit de fond, déterminé à partir des cellules non infectées a été soustrait dans chaque cas. Les points de la Figure 1 correspondent à la moyenne de 3 expérimentations indépendantes pour chaque valeur de m.o. i. Les lignes droites de la Figure 1 annexée ont été calculées par régression linéaire. Les coefficients de corrélation sont de 0,902, 0,846, 0,933 (P 1%) respectivement pour l'antisérum total, l'antisérum dirigé contre la protéine VP1 et l'antisérum dirigé contre la protéine VP2. Les courbes de la Figure 1 annexée fournissent une estimation de la sensibilité de la méthode de dosage selon l'invention dans ce cas particulier. La courbe référencée 1 concerne l'antisérum total dirigé contre les protéines du TMEV, la courbe 2 concerne l'antisérum dirigé contre la protéine VP1 des capsomères du TMEV, et la courbe 3 concerne l'antisérum dirigé contre la protéine VP2 des capsomères du TMEV. Les capsomères de picornavirus sont composés de 60 copies de chaque protéine VP1, VP2, etc ... Les Inventeurs ont pu détecter la fixation de la 35S Streptavidine à des cellules contenant 140 copies de RNA viral, 1 heure après l'infection par le TMEV. Ils ont, en conséquence, été capables de détecter un seuil minimum de 8400 copies par cellule, de la protéine VP1 ou de la protéine VP2. Ce niveau de sensibilité est similaire à celui obtenu par immunocytochimie avec l'amplification obtenue par le complexe avidin biotin selon Brahic M et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 5445-5448. Il faut remarquer que la méthode de dosage par radio immunocytochimie conforme à l'invention donne des résul tats quantitatifs relatifs, ou permet de comparer les re sultats entre cellules, mais que l'on pourrait obtenir des résultats quantitatifs absolus après un calibrage par la technique Elisa ou par radioimmunologie. EXEMPLE 2 DOSAGE QUANTITATIF DE LA SYNTHESE DES PROTEINES DES CAPSOMERES DU VIRUS DE THEILER DANS DES CELLULES BHK INFECTEES CULTIVEES IN VITRO Des cellules BHK ont été infectées à un m.o.i. de 3 P.F.U./cellule par la suspension de virus décrite à l'Exemple 1. Les cellules ont été récoltées 1, 2, 3, 4 et 6 heures après l'infection, déposées sur des lames de microscope et soumises au dosage quantitatif par radio-immunocytochimie décrit à l'Exemple 1, en utilisant des antisérums immuns contre les protéines VP1, VP2 et VP3. Des cellules BHK non infectées ont été traitées parallèlement, pour servir de témoins. La fixation par radioactivité a été déterminée par comptage des grains révélés par autoradiographie pour des cellules choisies au hasard. La Figure 2 montre le résultat de ce comptage. La courbe ré- férencée 4 concerne l'antisérum primaire anti-VP2, la courbe 5 concerne l'antisérum primaire anti-VP3, la courbe 6 concerne l'antisérum primaire anti-VP1. La quantité d'antigènes par cellule décroît entre 1 et 2 heures après l'infection, reflétant probablement la dégradation des capsomères. La synthèse n'a été détectée qu'entre 2 et 3 heures après l'infection. On a observé un triplement linéaire de la quantité d'antigènes par cellule entre 3 et 6 heures après l'infection. Les protéines VP1, VP2 et VP3 qui se sont accumulées dans les cellules infectées ont été synthétisées à la même vitesse, ce qui était prévisible si l'on considère que les protéines de capsomères de picornavirus sont tradui tes sous la forme d'un précurseur de polyprotéines. Bien que la Figure 2 montre que la teneur moyenne en protéines de capsomères par cellule augmente régulièrement en fonction du temps, il se produit des variations d'une cellule à l'autre, à un même stade d'infection.Cette synthèse asynchrone des antigènes des capsomères dans la population cellulaire avait déjà été observée précédemment dans la méthode de détection par l'immunoperoxydase et elle reflète une replication asynchrone du RNA viral. EXEMPLE 3 DOSAGE QUANTITATIF DE LA SYNTHESE DES PROTEINES VP1, VP2 ET VP3 DE CAPSOMERES DU VIRUS DE THEILER DANS LES CELLULES DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL (CNS) DE SOURIS SOUFFRANT D'UNE INFECTION PERSISTANTE La teneur en RNA viral de cellules infectées est limitée à quelques centaines de copies de génomes au cours de l'infection persistante de CNS de souris par du virus de Theiler. Comme on le sait, la majorité de ces cellules (90%) ne synthétise pas d'antigènes de capsomères, ainsi que le montre l'article de Cash, E., Chamorro, M. et Brahic, M. (1985), Virology 144, 290-294. Il a donc paru important aux Inventeurs de mesurer la quantité de synthèse de capsomères dans la fraction de cellules infectées (10%) qui sont positives à immunoperoxydase, en dépit de leur faible teneur en RNA viral. Le dosage quantitatif par radio-immunocytochimie conforme à la présente invention permet une telle mesure par comparaison de la quantité de la 35S Streptavidine fixée aux cellules infectées dans le CNS et de 35S Streptavidine fixée aux cellules BHK infectées in vitro. 1- La souche de TMEV a été préparée conformément au 1- de l'Exemple 1. 2e Les lames pour microscopes ont été préparées conformé ment au 2 de l'Exemple 1. 3 On a inoculé à 6 souris de race SJL/J âgées de 3 à 4 semaines, par voie intracrânienne, 40 pl d'une solution saline tamponnée au phosphate (Pi/NaCl) contenant 104 P.F.U. de TMEV. 2,5 mois après l'inoculation, tous les animaux inoculés présentaient des lésions intenses d'inflammation et de démyélidation du système nerveux central (CNS). 4e Les souris ont été sacrifiées 2,5 mois après inocula tion, par perfusion sous anesthésie avec 20 ml de Pi/NaCl, suivie de 20 ml du fixateur PGF, glacé (décrit au 3e de l'Exemple 1). La dissection de leur moelle épinière, puis la fixation de celle-ci par sec tions longitudinales de 10 pm et l'enrobage dans de la paraffine, puis la préparation de coupes histologiques sur lames de microscope ont été effectuées comme décrit dans Brahic, M., Haase, A.T. and Cash,E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5445-5448. 2. Radio-immunocytochimie des cellules de moelle épinière préparées selon le point 1. Les antisérums primaires VP1, VP2, VP3, préparés dans l'exemple 1 point 2 ont été utilisés comme dans l'exemple 1 point 3. Les lames sont restées dans des boîtes noires avec une du rée d'exposition de 5 jours, puis elles ont été dévelop pées et fixées, et examinées systèmatiquement au microsco pe. La proportion de cellules donnant naissance à des grains autoradiographiques par section de moelle examinée était très voisine de la proportion de cellules colorées par la méthode de l'immunoperoxydase et variait considéra blement d'une souris à l'autre, comme cela avait déjà été observé par Cash, E., Chamorro, M. and Brahic, M. (1985) Virology 144, 290-294, pour le RNA viral. La Figure 3 montre la répartition des protéines VP1, VP2 et VP3 dans la population des cellules infectées. Par sou ci de simplification, les résultats obtenus pour les 6 souris sont combinés en un histogramme unique pour chaque antigène. La quantité d'antigène par cellule est exprimée comme étant le nombre de grains révélés par autoradiographie par cellule et par minute d'exposition. Dans chaque cas, la répartition est homogène avec un maximum nettement perceptible. La quantité d'antigènes correspondant au maximum a été comparée au taux de synthèse d'antigènes observé durant un cycle lytique viral dans des cellules BHK (Figure 2). Dans tous les cas, il s'est avéré être équivalent à celui observé au tout début de la synthèse des protéines virales pendant un cycle lytique (3 heures après l'infection).Ces résultats démontrent que la synthèse des trois protéines principales des capsomères est minimale dans les cellules du CNS et si on rapproche ces résultats de ceux décrits dans l'Article précité paru dans Virology, ils montrent que ladite synthèse est quantitativement audessous du seuil de détection par l'immunoperoxydase et même dans des cellules qui sont positives à l'immunoperoxydase, la quantité d'antigène est très faible, ce qui démontre clairement que le cycle de réplication du virus est restreint dans le CNS aussi bien en termes de synthèse du RNA qu'en termes de synthèse des protéines des capsomères. Ceci pourrait expliquer la survie de la cellule hôte et la persistance du virus de Theiler dans le CNS grâce à la protection contre les mécanismes de défense immunitaire que lui procurerait cette restriction. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Méthode de dosage quantitatif de protéines antigéniques contenues dans des substrats constitués soit par des cou pes histologiques de tissus de provenance humaine, animale ou végétale, soit par une ou plusieurs cellules isolées de ces mêmes tissus, laquelle méthode est caractérisée en ce que l'on fait successivement réagir avec lesdits sub strats, un anticorps primaire dirigé contre les ou une des protéines antigéniques, puis un anticorps secondaire bio tinylé dirigé contre l'anticorps primaire, puis enfin un composé caractérisé en ce qu'il possède deux fonctions l'une de former un complexe très stable avec la biotine de l'anticorps secondaire, l'autre d'émettre un rayonnement radioactif qui est mesuré quantitativement par des techni ques connues, pour réaliser le dosage desdites protéines ant igéniques. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé possèdant les deux fonctions est de la 35S Streptavidine. 3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps primaire est un anti corps monoclonal. 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que le rayonnement radioactif est mesuré par autoradiographie. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisée en ce que l'anticorps primaire est un antisérum immun dirigé contre les protéines du TMEV (virus d'encéphalomyélite murine de Theiler). 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisée en ce que l'anticorps primaire est un antisérum hyperimmun dirigé contre la protéine VP1 du cap somère du TMEV. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisée en ce que l'anticorps primaire est un antisérum hyperimmun dirigé contre la protéine VP2 du cap sombre du TMEV. 8) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisée en ce que l'anticorps primaire est un antisérum hyperimmun dirigé contre la protéine VP3 du cap somère du TMEV. 9) Méthode selon l'une quelconque des revendications 6, 7 ou 8, caractérisée en ce que les sérums hyperimmuns dirigés sélectivement contre une des protéines VP1, VP2, VP3 sont préparés par hyperimmunisations obtenues à partir de cha que protéine purifiée VP1, VP2 ou VP3. 10)Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que les protéines VP1, VP2 et VP3 sont purifiées à partir d'un lysat de cellules BHK ("baby hamster kidney") infec té par le TMEV, par chromatographie d'affinité, à l'aide d'une résine couplée par du bromure de cyanogène à des im munoglobulines anti TMEV total, puis séparées par électro phorèse sur une plaque préparative de gel SDS acrylamide. 11)Ensemble ou Zkitz prêt à l'emploi pour la réalisation d'un dosage quantitatif d'une ou de plusieurs protéines antigé niques contenues dans des cellules isolées ou des tissus, caractérisé en ce qu'il comprend comme éléments essen tiels : - une pluralité de lames pour microscope, prêtes à l'em ploi, qui ont été préalablement traitées par un milieu approprié, tel qu'un milieu de Denhardt, et acétylées par de l'anhydride acétique dans de la triéthanolamine, - un fixateur des cellules infectées prélevées sur les la mes, - une quantité appropriée de sérum normal, - une quantité appropriée d'un anticorps primaire dirigé contre la ou les protéines antigéniques recherchées, - une quantité appropriée d'un anticorps secondaire bioti nylé dirigé contre l'anticorps primaire, - un composé qui possède deux fonctions l'une de former un complexe très stable avec la biotine de l'anticorps secondaire, l'autre d'émettre un rayonnement radioactif qui est mesuré quantitativement par des techniques connues. 12)Ensemble ou "kit" selon la revendication -11, caractérisé en ce que le composé qui possède les deux fonctions est de la 35S Streptavidine. 13)Ensemble ou "kit" selon l'une quelconque des revendica tions 11 ou 12, caractérisé en ce que l'anticorps primaire est un anticorps monoclonal. 14)Ensemble ou "kit" selon l'une quelconque des revendica tions 11 ou 12, caractérisé en ce que l'anticorps primaire est dirigé contre les protéines du capsomère du virus TMEV. 15)Ensemble ou "kit" selon l'une quelconque des revendica tions 11 ou 12, caractérisé en ce que l'anticorps primaire est dirigé contre une seule des protéines du capsomère du TMEV, à savoir la protéine VP1 ou VP2 ou VP3.