Brevet FR2589480A1 — publié le 19870507

La présente invention concerne un procédé biolo- gique de préparation de N-(N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-1) L-phénylalaninate de méthyle. Le N-(N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-1) L-phényl- alaninate de méthyle, désigné ci-après NZAPMe, largement décrit dans la littérature, est une matière première pré- cieuse pour accéder au N-(L-aspartyl-1) L-phénylalaninate de méthyle, communément appelé aspartame, doué de proprié- tés édulcorantes remarquables (brevet des Etats-Unis d'Amé- rique N 3 492 131 et R.H. Mazur et al., J. Amer. Chem. Soc., 1969, 91, 2684). On sait accéder au NZAPMe par des procédés soit chimiques, soit biologiques. Les très nombreux procédés chimiques connus font généralement intervenir une condensation peptidique clas- sique entre les deux acides aminés constitutifs, associée éventuellement à une succession de blocage et de déblocage de certains de leurs sites réactifs, de manière à atteindre la configuration souhaitée (brevet français No 2 091 628). L'obtention par voie biologique du NZAPMe est connue par D.D. Petkov et al., Tetrahedron Letters, 1984, (34) 3751; J. Isowa et ai., Tetrahedron Letters, 1979, 2611; K. Oyama et al., J. Org. Chem., 1981, 46, 5241 et J. Chem. Soc. (B), 1981, 356; les brevets français N 2 328 695, 2 378 747 et 2 453 137; les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 129 945 et 4 129 946; les de- mandes de brevet européen N 0 075 160 et 0 099 585 et les demandes de brevet japonais N 80(55)-19051 et 80(55)-74492. Selon cet état de la technique, on accède au NZAPMe en faisant réagir, à un pH convenable et générale- ment dans un milieu aqueux tamponné, une métalloprotéinase sur un mélange d'acide N-benzyloxycarbonyl aspartique, racémique ou lévogyre désigné ciaprès DL- ou L-ZAspOH et de phénylalaninate de méthyle racémique ou lévogyre, dési- gné ci-après DL- ou L-HPhOMe. Les métalloprotéinàses uti- lisées possèdent un ion métallique dans le centre actif et sont des enzymes provenant de micro-organismes tels que des protéases neutres de ray fungus, Prolisine, Thermoly- cine, Collagénase, Cortulus atroxprotéase. Il est égale- ment possible d'utiliser des enzymes bruts tels que Thermo- ase, Tacynase-N, Pronase ou des protéases issues de sou- ches de Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas telles que la souche de Bacillus N 36 Ferm P-4736 ou de certains champignons notamment des Aspergillus. Par ailleurs, on sait que sous certaines condi- tions de culture, le micro-organisme Micrococcus caseoly- ticus, isolé dans du lait de vache, produit un système protéolytique, désigné ci-après SP, d'o l'on peut ex- traire une protéase neutre, unique, protéolytique et exo- cellulaire, désignée ci-après P, de poids moléculaire compris entre 35000 et 41000, présentant la presque tota- lité de l'activité protéolytique (M. Desmazeaud et al., Ann. Bio. Anim. Biochem. Biophys., 1968, 8, 419-429 et 565-577 et European J. Biochem. 1971, 19, 51-55). Or la Demanderesse a découvert avec étonnement que cette protéase P fournit économiquement, facilement et avec de bons rendements du NZAPMe lorsqu'on la fait réagir sous certaines conditions sur un mélange de LZAspOH et de DL-HPhOMe. La présente invention a donc pour objet un pro- cédé de préparation biologique de NZAPMe par action d'une protéase sur un mélange de L-ZAspOH et de DL-HPhOMe carac- térisé en ce que la protéase est la protéase protéolyti- que exocellulaire neutre extraite d'une culture de Micro- coccus caseolyticus. La protéase neutre protéolytique exocellulaire, P, est obtenue à partir du surnageant de culture à pH 7,0 de la souche de Micrococcus caseolyticus déposée dans la Collection Nationale de Culture de Micro- organisme à l'Institut Pasteur à Paris sous le N 1194 le 28 avril 1982. Après élimination des bactéries par centrifuga- tion, ce surnageant est traité par du sulfate d'ammonium puis le précipité obtenu est dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et ensuite cette solution est soumise à une ultrafiltration puis à une lyophilisa- tion. On isole ainsi une poudre constituée par un système protéolytique, désigné ci-après SP, contenant, entre au- tres, la protéase P. Cette protéase P est ensuite purifiée d'abord par chromatographie sur diéthylaminoéthyl-cellulose en exploitant la propriété que SP n'est pas retenu sur la colonne équilibrée avec du tampon tris-(hydroxyméthyl)- aminométhane (désigné TRIS)-maléate 50 mM alors qu'il est retenu lorsque la colonne est équilibrée en tampon TRIS- maléate 5 mM. Puis cette purification est terminée par une chromatographie sur gel (Sephadex G 100 commercialisé par Pharmacia- France S.A. à 78391 Bois d'Arcy, France) préparé en tampon TRIS-maléate 5 mM à pH 7,0. Un exemple d'une telle préparation du système protl.olytique, SP, est donné dans la demande de brevet français N 82.07883 publiée sous le N 2 525 865 et pour ce qui est de la protéase P par M. Desmazeaud et al., Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys., 1968, 8, 565-577. Selon une variante du procédé de la présente in- vention, on peut remplacer avantageusement la protéase P par le système protéolytique SP tel que défini précédem- ment. L'activité protéolytique soit de la protéase P, soit du système protéolytique SP est déterminée par mesure (variation de la densité optique à 280 nm) de la quantité de caséine hydrolysée soit par P, soit par SP (non préci- pitable par l'acide trichloracétique) dans des conditions standard. Une unité d'activité protéolytique, désignée ci- après U, est définie comme la quantité d'enzyme qui, agis- sant dans les conditions du dosage, provoque une variation de la densité optique à 280 nm de 0,001 unité de densité optique par minute, à la température de 30 C. La technique de préparation par voie biologique du NZAPMe étant bien connue en elle-même, les exemples donnés ci-après ne sont mentionnés que pour illustrer la substitution de la protéase utilisée dans ces procédés par soit le système protéolytique SP, soit la protéase P, ex- traits d'une culture de Micrococcus caseolyticus. Habituellement, on fait réagir durant une à cent heures, à une température comprise entre 10 et 450C et à un pH compris entre 4 et 8, la protéase P ou le système pro- téolytique SP sur une solution tamponnée de L-ZAspOH et de DL-HPhOMe, en présence éventuellement d'ions calcium. Au fur et à mesure de l'avancement de la condensation, le produit cherché précipite sous la forme d'un adduct connu 1:1 avec le D-HPhOMe qu'il suffit, en fin de réaction, d'isoler par filtration puis de transformer par des métho- des connues en soi en NZAPMe pur. Selon le procédé de l'invention, la protéase P ou le système protéolytique SP condense sélectivement le L-ZAspOH sur le L-HPhOMe si bien que le procédé peut être mis en oeuvre au départ d'au moins deux moles de DL-HPhOMe par mole de L-ZAspOH engagé. La condensation enzymatique est habituellement réalisée en solution aqueuse diluée, avantageusement en solution 0,05 à 1 molaire de L-ZAspOH, en présence de pro- téase P ou du système enzymatique SP, à raison de 500 à 000 U par mole de L-ZAspOH. Le L-ZAspOH et le DL-HPhOMe sont des produits d'accès facile, largement décrits dans la littérature. Avantageusement, on utilise le chlorhydrate de DL-EPhOIle et dans ce cas, le milieu réactionnel est ajusté au pH désiré par de la soude 2N. Les exemples suivants sont donnés à titre illus- tratif et nullement limitatif de l'invention. Exemple 1 On abandonne 15 heures à 30 C une solution ajus- tée à pH = 6,7 contenant: - 1 mmole (215 mg) de chlorhydrate de DL-phényl- alaninate de méthyle, - 0,5 mmole (133,5 mg) d'acide L-N-benzyloxycar- bonyl aspartique, - 25 000 U d'enzyme P extrait du bouillon de cul- ture de Micrococcus caseolyticus, dans 5 ml d'une solution de tampon de chlorhydrate de TRIS mM à pH 6,7 contenant du chlorure de calcium à la con- centration 1,5 mM. Au fur et à mesure de l'avancement de la conden- sation, il se forme un précipité que l'on filtre en fin de réaction. On isole ainsi 230 mg (0,375 mmole) de l'adduct 1:1 de N-(N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-1) L-phénylalani- nate de méthyle et de D-phénylalaninate de méthyle qui fournit après traitement par 0,5 ml d'acide chlorhydrique iN en suspension dans 5 volumes d'eau à 20 C, 161 mg soit 0,375mmole de N-(N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-1) L-phényl- alaninate de méthyle pur soit un rendement de 75 % de la théorie calculée par rapport à l'acide L-N-benzyloxycar- bonyl aspartique mis en oeuvre. Exemple 2 On reproduit l'exemple 1 en utilisant 14 000 U du système protéolytique SP au lieu de 25 000 U d'enzyme P. On obtient ainsi en fin de réaction du N-(N-benzyloxycar- bonyl L-aspartyl-1) L-phénylalaninate de méthyle pur avec un rendement de 60 % de la théorie calculée par rapport à l'acide L-N-benzyloxycarbonyl aspartique mis en oeuvre. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limi- tatif et que toute modification, notamment au niveau des équivalences, pourra y être apportée sans toutefois sor- tir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation biologique de N-(N- benzyloxycarbonyl L-aspartyl-1) L-phénylalaninate de mé- thyle par action d'une protéase sur un mélange d'acide L-Nbenzyloxycarbonyl aspartique et de DL-phénylalaninate de méthyle caractérisé en ce que la protéase est la pro- téase protéolytique exocellulaire neutre extraite d'une culture de Micrococcus caseolyticus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase protéolytique exocellulaire neutre est mise en oeuvre sous la forme du système protéolytique extrait d'une culture de Micrococcus caseolyticus.