Brevet FR2596159A1 — publié le 19870925

25961.59 APPAREIL ET PROCEDE POUR LE DOSAGE DES POLYNUCLEOTIDES La présente invention a trait aux dosages biochimiques, et, en particulier, aux dosages suivant lesquels un marqueur capable d'émettre un rayonnement détectable est employé pour identifier un acide nucléique, et à la mesure de la concentration et de l'intercorrélation d'acides nucléiques et de fragments choisis. Une technique connue de dosage chimique et biochimique, telle que décrite dans les Brevets des Etats10 Unis d'Amérique n 4 133 639; 4 050 895; 4 321 057; 4 399 099; 4 447 546, et autres, comprend un système optique employant les principes de la spectroscopie de réflexion totale atténuée (RTA). Pour la cellule a RTA, un tel systeme optique utilise un guide d'ondes optiques, 15 typiquement. une plaque, une tige ou une fibre optique. Lorsque une extrémité de la cellule est éclairée par un rayonnement d'excitation, ce rayonnement est reéflechi totalement intérieurement, de façon à crer une onde évanescente a la surface de la cellule. Le rayonnement 20 d'excitation est choisi de telle sorte que l'onde évanescente excitera la fluorescence dans les substances à doser et localisées seulement dans une zone mince (typiquement, de quelques dizaines à une centaine de nanometres d'epaisseur) entourant la surface de la cellule. 25 La fluorescence résultante peut fournir des informations à partir desquelles la matière fluorescente peut être dosée,. De tels systèmes ont jusqu'a présent été employés pour doser, par exemple, des substances antigèniques, des produits chimiques et similaires. Il est également bien connu que l'information génétique gouvernant la synthèse des séquences d'acides aminés dans une protéine est portée par l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou ribonucléique (ARN), tout deux étant des molécules complexes, très longues, se présentant 35 habituellement sous la forme d'une double hélice. Comme on rencontre partout l'ADN ou l'ARN dans toute matière vivante sous des formes uniques pour chaque espèce, la nature de l'acide nucléique ou de ses fragments uniques (tous étant collectivement désignés ci-après par le terme "polynucléotides") peut servir & doser la présence d'une espèce donnée. Par exemple, tous les gènes viraux contiennent soit de i'ARN, soit de l'ADN. De tels acides nucléiques viraux peuvent être facilement isolés à partir du revêtement ou enveloppe protéique et ils sont présentement disponibles sous une forme hautement purifiée. Beaucoup 10 parmi les acides nucléiques viraux sont linéaires et à double brin électrophorétiques et autres techniques qui demandent du 30 temps pour une identification éventuelle. La présente invention a pour objectif principal'de proposer un appareil et un procédé de dosage des polynucléotides ou des fractions d'acide nucléique, ledit appareil et ledit procédé permettant d'identifier, rapidement et sans ambiguïté, la source génétique de la fraction. Un autre objectif important de la présente invention est de proposer un appareil et un procédé pour un tel dosage, lesquels puissent être utilisés directement sur un échantillon contenant des fragments d'acide nucléique, sans séparation préalable des fragments en groupes homogènes. Encore un autre objectif de la présente invention est d'appliquer au problème de la détection et de l'identification des acides nucléiques, la sensibilité et la simplicité des dosages par fluorescence employant des fibres optiques. On atteint ces objectifs, ainsi que d'autres, par l'invention, telle qu'elle est définie ici, d'un appareil et de procédés de dosage par fluorescence de polynucléotides ou de fragments ou fractions d'acide nucléique fixes ou liés à la surface d'une cellule de réflexion totale attenuée (RTA), allongée. Tout acide nucléique à double brin dans l'échantillon à doser est dénaturé, par exemple, par chauffage a environ 80 C, afin de former les simples brins de l'acide nucléique. On peut aider à la dénaturation en ajoutant des agents de chélation afin d'éliminer les ions stabilisants tels que Xg. Les simples brins peuvent se rompre en séquences de la longueur désirée sous l'effet d'enzymes de restriction appropriées connues. Des fractions choisies de simples brins d'acide nucléique à double brin, caractéristiques de l'espèce à identifier, séparées par exemple par chromatographie liquide ou par électrophorèse, sont fixées sur le cbté de moindre densité optique d'un interface à former entre des milieux d'indices de réfraction différents (par exemple, une cellule à RTA sous la forme d'un élément optique de type prisme, tige ou fibre, et un échantillon 30 liquide supposé contenir l'acide nucléique à doser). L'échantillon est alors graduellement refroidi au contact de l'interface; dans la mesure o une partie des simple brins d'acide nucléique de l'échantillon sont complémentaires de la fraction d'acide nucléique à simple brin initialement liée à l'interface, une partie de l'acide nucléique lié s'hybridera avec l'acide nucléique de l'échantillon. Quels que soient les polynucléotides qui ont renaturé avec les fractions liées sur la surface de la cellule, ils peuvent alors être colorés par un colorant fluorochrome spécifique des polynucléotides à double brin (par exemple, de préférence, sous forme dimére pour augmenter la spécificité et la stabilité de la liaison). En variante, pour une liaison par compétition, on peut utiliser des simples brins complémentaires prémarqués des polynucléotides, dont la présence est & doser dans l'échan10 tillon. Des appariements partiels peuvent être évincés par l'addition, à ce moment, d'une enzyme qui clive la double hélice partout o des fragments à simple brin dans l'échantillon ne forment pas de double brin avec les fractions liees. Une extrémité de la cellule est alors éclairée par 15 un rayonnement d'excitation qui est réfléchi totalement intérieurement dans la cellule, de façon à créer une onde évanescente à la surface de la cellule à RTA. Le rayonnement d'excitation est choisi de telle sorte que l'onde évanescente excitera le fluorochrome sur les 20 polynucléotides colorés,seulement dans la zone mince entourant la surface de la cellule à RTA. Si la longueur de chaîne s'ajuste à l'intérieur de la zone éclairée par l'onde évanescente, la fluorescence résultante est une mesure des polynucléotides à double brin liés à la surface 25 de la cellule, et, par là, une mesure de l'acide nucléique de l'échantillon complémentaire de l'acide nucléique préchargé sur la cellule à RTA. Les mesures de la durée de vie de la fluorescence peuvent également permettre de mesurer le rendement quantique du fluorochrome, et, par là, 30 le degré d'appariement entre les polynucléotides initialement liés à l'interface et ceux qui lui sont complexés à partir de l'échantillon. Ceci permet de distinguer parmi les émissions provenant du colorant spécifiquement lié, du colorant lié atypiquement ou moins spécifiquement, et du colorant non lié, améliorant ainsi les rapports signal/bruit de fond. D'autre obJectifs de l'invention en partie seront evidents et en partie apparaîtront ci-après. La présente invention a d'abord pour objet un appareil pour le dosage d'un polynucléotide sous la forme à simple brin, cbmprenant un marqueur fluorescent capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est excité par un rayonnement d'excitation, ledit appareil étant caractérisé par le fait qu'il comprend, en combinaison: - une cellule à réflexion interne totale atténuée, 10 optiquement transmettrice à la fois pour ledit rayonnement d'excitation et pour ledit rayonnement fluorescent; - un revêtement lié à une surface de ladite cellule, ledit revêtement comprenant un polynucléotide à simple 15 brin complémentaire, au moins en partie, du polynucléotide à simple brin que l'appareil est destiné a doser. Dans un mode de réalisation préféré, cet appareil comprend également: des moyens pour éclairer intérieurement ladite cellule par le rayonnement d'excitation, de façon à engendrer, au voisinage de ladite surface, une onde évanescente capable d'interagir avec ledit marqueur fluorescent afin qu'il émette le rayonnement fluorescent; - des moyens pour capter le rayonnement fluorescent produit par l'excitation dudit marqueur et sortant par une extrémité de ladite cellule; et - des moyens pour mesurer le rayonnement fluorescent capté. La présente invention porte également sur une cellule à réflexion interne totale atténuée, caractérisée par le fait qu'elle présente un revêtement lié à une surface de celle-ci, ledit revêtement comprenant un polynucléotide à simple brin. En particulier, ledit revêtement comprend une S5 fraction aromatique couplée audit polynucléotide à simple brin. Ladite fraction peut être couplée audit poly- nucleotide à simple brin par l'intermédiaire d'une liaison diazo. La cellule susindiquée peut également comprendre un colorant couplé à ladite surface suffisamment faiblement pour se dissoudre pratiquement immédiatement à partir de celle-ci par solvatation, ledit colorant étant un colorant qui se couplera spécifiquement à la forme à double brin seulement dudit polynucléotide, ledit colorant comprenant un chromophore qui émettra un rayonnement fluorescent dans une 10 première bande lorsqu'il sera soumis au rayonnement d'excitation dans une seconde bande. La fraction aromatique précitée peut être couplée à ladite surface par l'intermédiaire d'un espaceur, qui peut être un triméthoxysilane substitué par une chaîne de groupements méthylène; une paire de groupes époxy reliés par une chaîne à groupe(s) méthylène; une amine aliphatique; ou un triméthoxysilane présentant un groupe chlorobenzyle. Lorsque la fraction est couplée au polynucléotide à simple brin par l'intermédiaire d'une liaison diazo, celle-ci peut être couplée à de la polythymidine conjuguée avec la fraction polyadénine présente au début dudit polynucléotide à simple brin. En particulier, lesdites polythymidine et polyadenine conjuguées sont réticulées. La présente invention a egalement pour objet un 25 procédé de dosage, dans un échantillon liquide, d'un polynucléotide intéressant sous la forme à simple brin, ledit procéde étant caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à: - lier un polynucléotide à simple brin choisi à une 30 surface d'une cellule à réflexion interne totale atténuée, optiquement transmettrice, ledit polynucléotide à simple brin choisi étant complémentaire, au moins en partie, dudit polynucléotide intéressant; mettre en contact ladite surface présentant le polynucléotide lié,avec au moins ledit échantillon, dans des conditions suffisantes pour que le poly- *2596159 nucléotide à simple brin intéressant se renature avec ledit polynucléotide lié; - coupler au polynucléotide renaturé sur ladite surface de cellule, une fraction de colorant qui comprend un chromophore capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est soumis à un rayonnement d'excitation dans une bande de longueurs d'ondes prédéterminée; - éclairer intérieurement ladite cellule par ledit rayonnement d'excitation, de façon à engendrer, au voisinage de ladite surface, une onde évanescente capable d'interagir avec ledit chromophore afin qu'il émette le rayonnement fluorescent; - capter le rayonnement fluorescent produit par ir5 l'excitation dudit chromophore et le faire sortir par une extrémité de la dite cellule; et - mesurer le rayonnement fluorescent capté. En particulier: - ladite étape de mise en contact de ladite surface est 3 effectuée seulement avec ledit échantillon, de façon que le polynucléotide à simple brin qui se renature avec ledit polynucléotide lié provienne pratiquement uniquement dudit échantillon; et - le colorant utilisé pour colorer le polynucléotide renaturé est un colorant qui se couplera spécifiquement à la forme à double brin seulement dudit polynucléotide. Ladite étape de couplage comprend notamment les étapes consistant à colorer une quantité connue dudit 30 polynucléotide à simple brin choisi par un colorant fluorescent, et à ajouter la quantité connue de polynucléotide coloré audit échantillon avant de mettre en contact ladite surface avec ledit échantillon, de telle sorte que ledit polynucléotide à simple brin coloré entrera en compétition avec le polynucléotide à simple brin se trouvant initialement dans ledit échantillon,au cours du processus de renaturation. Ladite étape de liaison comprend notamment la liaison & ladite surface d'une amine aromatique, et, ensuite, le couplage, par liaison diazo, de ladite amine aromatique audit polynucléotide à simple brin choisi; ladite amine aromatique peut être couplée à ladite surface par l'intermédiaire d'une molécule d'espaceur, dont on a cité des exemples ci-dessus. Le couplage, par liaison diazo, est notamment formé tout d'abord par conversion de ladite amine en un groupement diazo, par couplage dudit groupement diazo à de la polythymidine, et par la conjugaison de ladite polythymidine avec une fraction polyadénine présente au 15 debut dudit polynucleotide à simple brin choisi. Ladite amine peut être convertie en un groupement diazo par un traitement par un halogénure de diazonium. Par ailleurs, le procédé peut comprendre l'étape de réticulation de ladite polyadénine par ladite polythymidine. L'etape de mesure comprend notamment la mesure de l'intensité dudit rayonnement fluorescent, ou encore la mesure de la durée de vie de l'évanouissement de la fluorescence dudit rayonnement fluorescent. La présente invention a également pour objet un appareil pour le dosage d'un polynucléotide sous la forme à double brin, comprenant un marqueur fluorescent capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est excité par un rayonnement d'excitation, ledit appareil étant caractérisé par le fait qu'il comprend, en combinaison: - une cellule à réflexion interne totale atténuée, en verre, optiquement transmettrice à la fois pour ledit rayonnement d'excitation et pour ledit rayonnement fluorescent; - un revêtement comprenant des molécules dudit polynucléotide à double brin liées chacune de façon covalente à un site unique respectif sur la surface de ladite cellule, par l'intermédiaire d'une molécule espaceur couplée à une séquence polyT-polyA liée de façon irréversible au voisinage de l'extrémité de ladite molécule présentant une chaîne polyadenine. Pour mieux faire comprendre l'objet de la présente invention, on en décrira plus en détail ci-après des modes de réalisations particuliers en référence au dessin annexé sur lequel: - la Figure 1 est une vue en coupe longitudinale d'un 10 nécessaire de dosage appliquant les principes de la présente invention; et - la Figure 2 est une vue en bout du mode de réalisation de la Figure 1. On soulignera que dans la description détaillée de 15 l'appareil conforme à la présente invention, la désignation de parties de l'appareil comme étant des parties "superieures" et "inférieures) est entièrement faite pour raisons de commodité et pour rapporter la description aux représentations schématiques du dessin. Il sera entendu que l'appareil peut fonctionner dans n'importe quelle position ou orientation et il est du domaine de la présente invention de procéder ainsi. Il sera également.entendu que la représentation donnée sur les Figures est schématique et qu'aucune tentative n'a été faite pour indiquer des échelles 25 ou rapports réels. La présente invention repose sur un rayonnement d'excitation réfléchi totalement intérieurement le long d'une cellule à- RTA, ledit rayonnement d'excitation excitant la fluorescence qui revient par effet tunnel dans 30 la cellule, et sur la détection de cette fluorescence, le tout tel que décrit de façon générale dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n' 406 324, déposée le 9 août 1982, et cédée au cessionnaire de la présente demande de brevet, et à laquelle on peut faire référence pour disposer de plus de détails sur le mode de fonctionnement de la présente invention sur le plan optique. Sur la Figure 1, on a représenté, en vue en coupe longitudinale, un nécessaire de dosage 20 réalise conformément aux principes de la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, le coffret 20 comprend une cellule à RTA 22, une enceinte 24 et des moyens d'assemblage 26. La cellule 22 est, de préférence, constituée par un corps optiquement transparent, sensiblement cylindrique, allongé, se présentant typiquement sous la forme d'une tige 10 ou d'une fibre optique, s'étendant depuis son extrémité proximale ou face d'entrée 28 à une extrémité distale ou terminale 30. La cellule 22 est adaptée pour propager sur sa longueur, par l'intermédiaire de multiples réflexions internes totales, des rayonnements optiques entrant par la 15 face 28 à l'intérieur d'un angle solide établi à symétrie sensiblement de rotation autour de l'axe longitudinal de la cellule. Si la. cellule est une fibre, comme cela est représenté sur la Figure 1 (et pour faciliter la description, la cellule 22 sera ci-après désignée comme telle dans le présent contexte), comme cela est bien connu dans la technique de l'optique des fibres, l'angle de réception maximal en ce qui concerne l'axe de la fibre, B, pour le rayonnement entrant dans la fibre et se propageant ainsi à l'intérieur de celle-ci, est établi par 25 les indices de réfraction de la fibre et du milieu environnant. Sur sa face 28, la surface de la fibre est typiquement plane, elle est disposée perpendiculairement à l'axe longitudinal de la fibre, et elle est, de préférence, fortement polie afin de minimiser les imperfections et défauts de surface qui tendraient à disperser le rayonnement d'excitation incident. Pour un rayonnement se propageant initialement à travers un milieu d'indice de réfraction nO, arrivant sur une fibre d'indice de réfraction nl, par ailleurs entourée par une matière d'indice de réfraction n2, l'angle de réception maximal est tel que défini par l'équation suivante: (1) ON = no sinB (n1 - n22)1/2 équation dans laquelle ON représente ce que l'on appelle l'ouverture numérique de la fibre. A titre d'exemple, sans que cela n'apporte une quelconque limitation, la fibre 22 peut être n'importe laquelle parmi un grand nombre de matières optiquement transparentes, telles que le verre, le quartz, le polypropylène, les polyoléfines, le Nylon, ousimilaires, choisies pour présenter un indice de réfraction 10 supérieur à celui de l'échantillon liquide à doser. Ce dernier est typiquement une solution aqueuse présentant un indice de réfraction proche de 1,S33. Il sera également entendu que la matière de la fibre 22 est également choisie comme etant relativement insoluble dans et non réactive avec 15 l'échantillon liquide. Alors que l'on peut faire varier la taille de la fibre 22 comme on le désire, il aété trouvé qu'une fibre ou tige d'environ 1 mm à quelques centaines de microns de diamètre sur une longueur aussi petite que 5 mmn convient pour la plupart des dosages, étant cependant entendu qu'une telle longueur et qu'un tel diamètre sont donnés simplement comme exemples, sans être limitatifs. - Dans un mode de réalisation préféré dans lequel la fluorescence, provoquée à la surface de la fibre par le rayonnement d'excitation descendant dans la fibre, est captée ou observée à la même extrémité proximale de la fibreque celle à laquelle le rayonnement d'excitation est injecté, on souhaite empêcher un rayonnement parasite de redescendre la fibre depuis la face 30 à la face 28. En conséquence, la face 30 peut être conformée pour évacuer la 30 lumière arrivant sur elle intérieurement, mais, de préférence, elle est revêtue par une matière en accord avec l'indice de réfraction du milieu entourant la face 30, une telle matière étant à la fois non fluorescente et absorbante vis-à-vis du rayonnement d'excitation. De façon typique, 35 une résine époxy chargée de noir de carbone remplit une telle fonction. Dans un mode de réalisation donne à titre d'exemple, il est propose que la partie active de la surface de la fibre soit définie par la région activée sur laquelle le dosage doit être effectué. Pour activer la surface de la partie active de la fibre 22, on traite cette dernière, de façon typique, pour la doter d'un revêtement 32 en fixant tout d'abord, à la surface de la fibre, une amine aromatique en tant qu'agent procurant un couplage, par liason diazo, à l!acide nucléique ou au polynucléotide à simple brin. L'amlne aromatique doit être couplée a la surface de la fibre par l'intermédiaire d'un espaceur, de telle sorte que l'amine soit libre de réagir sans être stériquement gênée par le verre. Beaucoup parmi ces techniques de couplage par un espaceur que l'on peut employer sont bien connues, comme!5 cela est montre dans les Exemples suivants: EXEMPLE I Les fractions hydroxyle présentes sur la surface du verre (ci-après identifié par la lettre "V") peuvent être couplées avec un triméthoxysilane substitué par une chaîne de groupes méthylène présentant un groupe amine aromatique à son extrémité, d'une manière typique, (CH30) 3Si- (CH2)6- -NH2 10 On peut se procurer ce réactif dans le commerce auprès de la Société "Petrarch Chemical Company". Le réactif, lorsqu'il est en solution, de préférence, tamponnée à pH 8, réagira avec les groupes hydroxyle sur le verre (V), afin d'éliminer du méthanol et de former une liaison siloxane, de la façon suivante: (1) V(OH) 3 + (CH30) 3Si- (CH2) 6NH2 V03-S i- (CH2) 6> NH2 EXEMPLE II En variante, on peut coupler la surface du verre avec un réactif formé par deux groupes époxy reliés par une 25 chaine méthylène. Par exemple, par utilisation d'un excès du réactif dans une solution fortement alcaline (typiquement, NaOH), afin d'empêcher trop des deux extrémités de chaque molécule de réactif de se coupler au verre, la réaction suivante se produira pour former une 30 liaison éther: (2) VOH + CH2-CH2- (CH2) 4-2-CH2 O O V-CH2-CHCE- (CH2) 4-O2-CH2 Si on fait réagir alors ce dernier intermédiaire sur un reste sulfhydryle ou un thiol, on forme une liaison thioéther, de la façon suivante: SE NH2 Vo(3) -CH2-CHO- (CH2) 4-COE2-H2 +S VO -H2- CHCH (CH 2) 4-OE CH-M 2-S EXEMPLE III On peut obtenir encore un autre couplage par l'intermédiaire d'une liaison amine aliphatique, de la façon 15 suivante: 4) V(OH) 3 + (CH30)3- Si(CH2) 3-NH2 P VOSi- (CH2) 3-NH2 Au produit reactionnel précédent, on ajoute, à 20 pH 8, un excès d'isothiocyanate double avec une chaîne méthylène intermédiaire afin de former une liaison thiourée: (5) VO3Si(CH2) 3-NH2 + NCS-(CH2)6-NCS VO3S i- (CH2) 3-NH-C-NH- (CH2) 6-NCS Il S L'addition d'un excès d'amine aromatique double, à pH 8, achève la formation du produit aromatique désiré, soit: of (6) VO3Si- (CH2) 3-NH-CNH-(CH2) 6-NCS + NH2 -0 -NH2s MO3Si- (CH2) 3-NH-C-NH-(CH2) 6-NCS-NH-&>-H2 EXEMPLE TV Une quatrième technique de couplage du verre, conduisant à un produit exceptionnellement stable, est de traiter le verre, à pH 8, par un triméthoxysilane présentant un groupe chlorobenzyle: (7) MDH + (CH30)3-SiCH2. OCe2C1 > 1-3-V3-S i-CH2-( -CH2C1 On fait réagir le produit réactionnel, à pH 9, avec une amine aromatique présentant un groupe nitro: (8) V03- Si-CH2- _ -CH2Cl C NH2-(CH2) 2-D-NO2 ND3-S i-CH2- CHC-O 2- NHCH2)2- -N2 LO De là, le produit réactionnel est traité par un agent réducteur puissant, tel que le dithionite de sodium, à pH 6, afin de réduire le groupe nitre en une amine aromatique, de la façon suivante: (9) V03-S i-CH2 Ij -CH2-NH-(CH2) 2- -N02 + Na2S2O4 VO3 -S i-cH2- @ C$2-NH(CH2)2- r -NH2 L'amine aromatique, produite par l'une quelconque 30 des techniques précédentes, peut être utilisée pour lier l'acide nucléique à simple brin désiré. Comme étape préliminaire, on doit traiter l'amine aromatique lié au verre (ci-après désignée par VA- NH) par de l'acide nitreux(solution de nitrite acide), aux environs de 0'C, Ceci produit un intermédiaire que l'on fait ensuite réagir, à pH 8, avec la poly-T (10) VA- Q -NH2 + HNO- + + VA @ -NuN TTT - * U-eD- N-NTTT On sait que les cellules tendent à produire des brins d'acide nucléique espacés les uns des autres par des brins courts de polyadénine. Par conséquent, on fait alors réagir ce dernier produit avec la fraction adénine typiquement présente au début d'une molécule d'acide nucléique à simple brin (ci-après désignée par AAA- NUC), intéressante pour former la fraction d'acide nucléique liée & la surface de la fibre. Four autant que l'adénine soit le conjugue de la thymidine, cette dernière formera un double brin e. ++ présence de Kg, à pH 7, à la température ambiante, afin.de 2C former une liaison. (11) VA- -NaN-TTT + AAA(NUC) Y 'A- v -N N-, (NUC) La liaison à double brin peut alors être rendue permanente par traitement des conjugués adénine-thymidine par du psoralène (S-lactone de l'acide hydroxy-6 benzo5 furannacrylique) ou autre agent de réticulation. Le psoralène est préféré parce qu'il est relativement nonvolatil et qu'il est facilement activé par le rayonnement 30 ultraviolet. Bien que la réaction soit bien connue, son utilisation pour rendre une hybridation irréversible est estimée être nouvelle. Pour une hybridation appropriée, le segment d'ADN lié doit présenter une longueur d'au moins 10 bases, bien qu'un nombre plus important puisse être requis pour une spécificité raisonnable. On verra.que cette technique lie la partie de l'ADN non utilisée dans sa reconnaissance, à savoir, la chaîne de polyadenine au début. L'objectif à atteindre en procédant ainsi est d'éviter des problèmes provoqués par une fixation possible de la liaison diazo à une partie de la séquence de reconnaissance de l'acide nucléique à simple brin lié. En d'autres termes, la réaction avec le psoralène permet la fixation à une extrémité de la séquence d'acide nucléique sans obstruction du site de reconnaissance. A défaut du renforcement procuré par le traitement au psoralène, la dénaturation romprait l'acide. Naturellement, si on s'attend à ce que le type de problème susindiqué ne se produise pas, on peut éliminer cette étape supplémentaire. Les concentrations des produits chimiques employés pour former le revêtement 32 dépendent empiriquement du type 15 particulier de la liaison de revêtement à former et de la nature de la fraction d'acide nucléique que l'on désire lier dans le revêtement. Cependant, on soulignera que les sites réactifs (à savoir, les sites de la fibre sur lesquels le revêtement contient les fractions d'acide nucléique & simple 20 brin liées, avec lesquelles on se propose d'hybrider les fragments d'acide nucléique complémentaires) doivent, en moyenne, être espacées de plusieurs (par exemple trois, ou davantage) fois le diamètre moyen de 1 nm d'un double brin d'ADN typique. Si la concentration des sites est moins dense, la réaction d'hybridation finale avec le revêtement sera spatialement ou stériquement gênée et, elle peut ainsi se dérouler trop lentement pour de nombreux obJectifs. Le mode opératoire de liaison précédent présente un certain nombre de caractéristiques souhaitables. Il procure une liaison forte au verre. Cette liaison est irréversible même dans des conditions de dénaturation et elle est photostable. Le fait de prévoir un espaceur entre la surface à RTA et la chaîne moléculaire permet un accès facile (pour une cinétique de diffusion raisonnable) et suffisamment d'espace pour les flexions de chaîne, qui font partie du processus d'hybridation. Le chaînon poly Apoly T assure que la chaîne sera liée en un emplacement unique, conservant de ce fait le besoin de flexibilité de chaîne pour une cinétique d'hybridation raisonnable. Ce chaînon assure également que le site de reconnaissance soit exclu de l'emplacement de liaison. L'enceinte 24 est un tube allongé, creux, de préférence, mais non nécessairement, optiquement transparent, et elle est formée d'une matière qui est' relativement insoluble et chimiquement non réactive avec le liquide à tester. D'une manière typique, l'enceinte 24 est 10 simplement un tube de verre présentant un diamètre intérieur supérieur au diamètre extérieur maximal de la fibre 22, et, elle est, de préférence, dimensionnée de façon à délimiter un volume prédéterminé entourant au moins le revêtement 15 activé 32 sur la fibre 22. Dans un mode de réalisation préféré, l'espacement entre la surface revêtue de la fibre 22 et la paroi interne de l'enceinte 24 peut être de dimensions capillaires. Des moyens d'assemblage 26 sont prévus pour 20 maintenir la fibre 22 et l'enceinte 24 fixes l'une par rapport A l'autre, suivant lesquels, en particulier, l'enceinte est espacée de la fibre de telle sorte que le volume d'échantillon délimite prédétermine puisse entourer la région activée sur la surface de la fibre, et que l'extrémité d'entrée de la fibre soit maintenue de façon précise pour permettre une injection optimale de lumière dans la fibre. En conséquence, la fibre peut être maintenue par les moyens d'assemblage au voisinage soit de la face 28, soit de la face 30. Toutefois, un contact entre la fibre et 30 les moyens d'assemblage au voisinage de la face 28 tend à réduire l'ouverture numérique, dans la mesure o l'indice de réfraction du matériau d'assemblage est généralement supérieur à n1. Pour résoudre ce problème, d'une manière typique, la fibre peut être revêtue, au moins près de l'extrémité de la fibre dans laquelle le rayonnement se propage, par un gainage, typiquement en un polymère transparent, de masse moléculaire élevée, disposé pour obtenir un milieu à indice de réfraction faible, interposé entre le bâti et la fibre. Pour éviter des problèmes dus à un bâti voisin de l'extrémité proximale de la fibre, les moyens d'assemblage de la Figure 1 sont représentés simplement sous la forme d'un berceau 36, dont l'une (38) de ses parties est couplée à et supporte l'enceinte 24, son autre partie (40) étant couplée à et supportant un manchonsupport 42 dans lequel l'extrémité distale 30 de la fibre 22 10 est montée de façon fixe. Le matériau dans lequel le manchon 42 est formé n'est pas important du point de vue de l'optique, mais il doit être relativement chimiquement non réactif avec l'échantillon liquide a doser. Dans le mode de réalisation de la Figure 1, l'enceinte 24 et la fibre 22 sont représentées assemblées de telle sorte que les axes longitudinaux à la fois de l'enceinte et de la fibre soient sensiblement horizontaux, la fibre 22 étant ainsi en porte à faux de façon à s'étendre intérieurement dans l'enceinte 24, avec l'extrémité 28 se projetant à l'extérieur de celle-ci, 2 la fibre 22 étant maintenue avec un espacement par rapport à la surface interne de l'enceinte 24. Dans ce mode de réalisation particulier, l'enceinte 24 est ouverte à ses deux extrémites, permettant ainsi au liquide d'être introduit ou extrait par l'une ou l'autre extrémité. Dans la mise en oeuvre du mode de réalisation de la Figure 1, le revêtement 32 de la fibre 22 est formé par l'une quelconque parmi un certain nombre de fractions d'acide nucléique à simple brin. Ces dernières sont liées comme décrit précédemment pour procurer des sites de fixation sur la fibre pour les fractions d'acide nucléique de l'échantillon, et les fractions fixées sont ensuite mesurées par coloration. L'échantillon est d'abord traité par des techniques connues pour concentrer l'acide nucléique potentiel (si nécessaire), et, ensuite, les capsides virales ou les structures cellulaires biologiques sont lysées, par exemple, par choc osmotique, détergent ou autres agents lysants pour libérer les acides nucléiques. L'échantillon est ensuite soumis au traitement qui dénaturera tout acide nucléique à double brin libéré et rompra la chaîne de l'acide nucléique en fragments. Par exemple, l'ADN à double brin peut être dénaturé simplement par traitement par de la chaleur modérée (75'C) et par 1'EDTA. L'utilisation de +±sn l'EDTA élimine également les ions Xg, si ces derniers-sont présents, soit de l'échantillon, soit de l'étape de liaison 10 polyadénine/thymidine; une telle élimination est fortement souhaitable pour empêcher les ions métalliques de renaturer l'acide nucléique à simple brin. Naturellement, on peut employer des techniques enzymatiques connues de dédoublement de l'ADN pour fragmenter l'acide nucléique. L'ordre dans 15 lequel la fragmentation et la dénaturation se produisent n'est pas important pour la présente invention. L'échantillon est ensuite injecté dans l'espacement 44 entre l'enceinte 24 et la fibre 22, par exemple, à l'aide d'une seringue hypodermique, l'échantillon 20 étant maintenu dans l'espacement 44 par les ménisques formés aux extrémités opposées de l'enceinte 24. On laisse incuber l'échantillon dans l'espacement 44 comme on le désire pour permettre a la matière à doser dans l'échantillon liquide de diffuser vers et de renaturer ou de compléter les fractions 25 d'acide nucléique dans le revêtement 32. La réversibilité des réactions de conjugaison des acides nucléiques procure une limite controlee d'avidité à la sensibilité du système, en particulier, si le système est rincé pour éliminer l'acide nucléique simplement absorbé mais non conjugué. 30 Cette différence d'avidité entre l'absorption et la conjugaison peut être augmentée, si, avant le lavage, des composés de la famille du psoralène sont ajoutés à l'échantillon. De tels composés se lieront aux régions d'acide nucléique à double brin, et, sous exposition à la 35 lumière, serviront à réticuler, de façon irréversible, ces régions à double brin. 2596 159 L'acide nucléique renaturé à double brin est coloré, de préférence, par ensemencement de la solution d'échantillon directement par un colorant fluorochrome présentant une grande avidité pour et spécifique de l'acide 5 nucléique à double brin. Les colorants préférés présentent plus d'un site de liaison indépendant de l'acide nucléique pour augmenter l'avidité et réduire ainsi la concentration et le fond de colorant libre. Des colorants typiques utiles dans la présente invention sont le bromure d'éthidium, l'acridine 10 orange (Color Index C.I. n' 46005), la quinacrine, le bromure de diéthidium, la diacridine orange, les divers hétérodimères, et similaires. Le bromure d'éthidium présente une plage optimale des longueurs d'ondes d'excitation allant de 480 à 550 pm et une plage optimale de 15 longueurs d'ondes de fluorescence allant de 580 à 650 um. La structure du bromure d'éthidium est estimée comme étant la suivante: B H2 N kH2 N C2H5 En variante, pour réduire l'instabilité possible du réactif, le colorant peut âtre apporté initialement sous une forme tres faiblement pré-liee seulement & la fibre, de telle sorte qu'il se libérera dans l'eau en quelques millisecondes. Le colorant choisi est, de préférence, un 30 colorant à partir duquel le signal de fluorescence est fortement influencé par la liaison et, par conséquent, par le degré auquel les deux chaînes d'acide nucléique sont hybridées; de tels colorants sont connus de façon courante comme étant des colorants fluorochromes. Pour les colorants 35 fluorochromes, tels que le bromure d'éthidium et l'acridine orange ou leurs dimères, la concentration requise pour l'échantillon dans l'espacement 44 peut être faible, c'est- -10 -14 à-dire comprise entre environ 10 10 et 10 M. On soulignera que la surface de la solution injectée dans l'espacement 44 est estimée contenir environ six ordres de grandeur de plus d'acide nucléique à simple brin qu'il n'est présent au sein de la solution. Par conséquent, il y aura un taux de recombinaison d'acide nucléique supérieur à l'interface de la solution et de la fibre, et le colorant se liera préférentiellement aux doubles brins formés sur la fibre, lesquels brins sont les seuls éclairés. Le colorant flotte librement avant la réction entre l'acide nucléique soumis à l'essai et le réactif sur la fibre, et c'est un marqueur pour la forme conjuguée seulement. Farce que le colorant est un fluorochrome, il est par nature moins efficace non lié que 15 lié. L'utilisation de la forme dimère du colorant sert à procurer une liaison plus forte qui élève au carré l'avidité du colorant pour l'acide nucléique à double brin. Par conséquent, avec les colorants dimères, on obtient une augmentation de la sélectivité vis-à-vis de l'ADN à double 20 brin, et un fond amoindri puisque moins de colorant libre n'est requis au sein de la solution, procurant ainsi un rapport signal à bruit très élevé. L'appareil est couplé à un fluorimètre 4S, de telle sorte que la face d'entrée 28 puisse être éclairée par 25 un rayonnement, typiquement capable d'exciter ou de provoquer la fluorescence dans le revêtement 32 par une onde évanescente accompagnant la transmission du rayonnement descendant de la fibre. La fluorescence provoquée dans le complexe marqué au niveau du revêtement 32 revient alors par 30 effet tunnel dans la fibre à partir de la matière excitée et, ensuite, sort par la face 28 pour être lue par le fluorimètre 43. L'intensité de la fluorescence sera proportionnelle à la quantité d'acide nucléique à double brin présent et, de ce fait, elle est fonction de la quantité relative d'acide nucléique s'appariant, présente dans l'échantillon initial. Il y aura une erreur dans les donnes précédentes due à la variation du rendement quantique du colorant, qui peut refléter le degré de perfection de l'appariement par hybridation. Une manière de corriger une telle erreur est de faire une mesure supplémentaire de la durée de vie de la fluorescence qui est proportionnelle au rendement quantique. Le rapport de l'intensité du signal à la durée de vie est indépendant du rendement quantique et, de ce fait, il ne comporte pas l'erreur. Les valeurs réelles de la durée de 10 vie peuvent servir également de mesure du degré de corrélation des brins d'acide nucléique les uns avec les autres. La durée de vie de la fluorescence naturelle peut être définie comme le temps nécessaire pour que la fluorescence s'évanouisse, après cessation de l'excitation, depuis son maximum I jusqu'à une valeur de I/e, o e représente la base népérienne. En utilisant des techniques connues et un appareil connu, on peut déterminer la durée de vie de la fluorescence en éclairant d'abord la matière par 20 un rayonnement d'excitation rapidement modulé pour le colorant fluorochrome employé, par exemple, un rayonnement d'amplitude fluctuante, comme celui provenant d'un laser ou d'une diode electroluminescente DEL au dessous du seuil, et, ensuite, en mesurant l'amplitude de modulation de la 25 fluorescence engendrée. Un autre procédé de dosage avec l'appareil de la présente invention consiste à effectuer un type de dosage par liaison par compétition. Dans ce dernier, une quantité connue du polynucléotide à simple brin, que l'on cherche à identifier ou à mesurer, est marqué d'une manière connue, de préférence, avec l'un quelconque parmi un grand nombre de colorants fluorescents fonctionnalisés connus. Une première mesure est faite du rayonnement fluorescent total à partir d'une telle quantité marquée, par un fluorimètre approprié, 35 à des fins d'étalonnage. Une quantité connue du polynucléotide marqué est alors ajoutée à la solution d'échantillon. Le mélange des polynucléotides marqué et non marque est alors place en contact avec une cellule à RTA, et on laisse s'effectuer la compétition pour les sites d'hybridation, la cellule etant préparée et éclairée comme décrit ci-dessus. Une mesure est alors faite de l'intensité de la fluorescence provenant de la cellule. Le rapport de cette dernière intensité de fluorescence & l'intensité mesurée pendant l'étalonnage est alors proportionnel & la quantité de polynucléotide non marqué présent dans 10 l'échantillon. Il est bien entendu que les modes de réalisation ci-dessus décrits ne sont aucunement limitatifs et pourront donner lieu à toutes modifications désirables, sans sortir pour cela du cadre de l'invention. Z596159 REVENDICATIONS 1 - Appareil pour le dosage d'un polynucléotide sous la forme à simple brin, comprenant un marqueur fluorescent capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est excité par un rayonnement d'excitation, ledit appareil étant caractérisé par le fait qu'il comprend, en combinaison: une cellule à réflexion interne totale atténuée (22), optiquement transmettrice à la fois pour ledit rayonnement d'excitation et pour ledit rayonnement fluorescent; - un revêtement (32) lié à une surface de ladite cellule (22), ledit revêtement (32) comprenant le polynucleotide a simple brin complémentaire, au moins en partie, du polynucléotide à simple brin que l'appareil est destiné à doser. 2 - Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend: - des moyens pour éclairer intérieurement ladite cellule 20 (22) par le rayonnement d'excitation, de façon à engendrer, au voisinage de ladite.surface, une onde évanescente capable d'interagir avec ledit marqueur fluorescent afin qu'il émette le rayonnement fluorescent; - des moyens pour capter le rayonnement fluorescent produit par l'excitation dudit marqueur et sortant par une extrémité (28) de ladite cellule (22); et - des moyens pour mesurer le rayonnement fluorescent capté. 3 - Cellule à réflexion interne totale atténuée, caractérisée par le fait qu'elle présente un revêtement (32) lié à une surface de celle-ci, ledit revêtement (32) comprenant un polynucléotide à simple brin. 4 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 3, caractérisée par le fait que ledit 26 2596159 revêtement (32) comprend une fraction aromatique couplée audit polynucléotide à simple brin. - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 4, caractérisée par le fait que ladite fraction est couplée audit polynucléotide à simple brin par l'intermédiaire d'une liaison diazo. 6 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle comprend un colorant couplé à ladite surface suffisamment faiblement pour se dissoudre pratiquement immédiatement à 10 partir de celle-ci par solvatation, ledit colorant étant un colorant qui se couplera spécifiquement à la forme à double brin seulement dudit polynucléotide, ledit colorant comprenant un chromophore qui émettra un rayonnement fluorescent dans une première bande lorsqu'il sera soumis au rayonnement d'excitation dans une seconde bande. 7 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 4, caracterisée par le fait que ladite cellule (22) est optiquement transmettrice à la fois 20 pour le rayonnement d'excitation et pour le rayonnement fluorescent. 8 - Cellule à réflexion interne totale attenuée selon la revendication 4, caractérisée par le fait que ladite fraction aromatique est couplée à ladite surface par 25 l'intermédiaire d'une molécule d'espaceur. 9 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 8, caractérisée par le fait que ledit espaceur est un triméthoxysilane substitué par une chaine de groupements méthylène, 10 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 8, caractérisée par le fait que ledit espaceur est forme d'une paire de groupes époxy reliés par une chaîne à groupe(s) méthylène. 11 - Cellule à réflexion interne totale atténuée 35 selon la revendication 8, caractérisée par le fait que ledit espaceur est une amine aliphatique. -27 2596159 12 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 8, caractérisée par le fait que ledit espaceur est un triméthoxysilane présentant un groupe chlorobenzyle. 13 - Cellule à réflexion interne totale atténuée selon la revendication 5, caractérisée par le fait que. ladite liaison diazo est couplée & la polythymidine conjuguée avec la fraction polyadénine présente au début dudit polynucléotide & simple brin. 14 - Cellule à réflexion interne totale atténuée 10 selon la revendication 13, caractérisée par le fait que lesdites polythymidine et polyadénine conjuguées sont réticulées. - Procédé de dosage, dans un échantillon liquide, d'un polynucléotide intéressant sous la forme à simple brin, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à: - lier un polynucléotide à simple brin choisi à une surface d'une cellule à réflexion interne totale atténuée (22), optiquement transmettrice, ledit 20 polynucléotide à simple brin choisi étant complémentaire, au moins en partie, dudit polynucléotide intéressant; mettre en contact ladite surface présentant le polynucléotide lié avec au moins ledit échantillon, dans des conditions suffisantes pour que le polynucléotide à simple brin intéressant se renature avec ledit polynucléotide lié; - coupler au polynucléotide renaturé sur ladite surface 30 de cellule, une fraction de colorant qui comprend un chromophore capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est soumis à un rayonnement d'excitation dans une bande de longueurs d'ondes prédéterminée; - éclairer intérieurement ladite cellule (22) par ledit rayonnement d'excitation, de façon à engendrer, au 28 2596159 voisinage de ladite surface, une onde évanescente capable d'interagir avec ledit chromophore afin qu'il émette le rayonnement fluorescent; - capter le rayonnement fluorescent produit par l'excitation dudit chromophore et le faire sortir par une extrémité (28) de la dite cellule (22); et - mesurer le rayonnement fluorescent capté. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérise par le fait que: ladite étape de mise en contact de ladite surface est effectuée seulement avec ledit échantillon, de façon que le polynucléotide à simple brin qui se renature avec ledit polynucléotide lié provienne sensiblement uniquement dudit échantillon; et - le colorant utilisé pour colorer le polynucléotide renaturé est un colorant qui se couplera spécifiquement à la forme à double brin seulement dudit polynucléotide. 17 - Procedé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que ladite étape de couplage comprend les étapes consistant à colorer une quantité connue dudit polynucléotide a simple brin choisi par un colorant fluorescent, et à ajouter la quantité connue de polynucléotide coloré audit échantillon avant de mettre en 25 contact ladite surface avec ledit échantillon, de telle sorte que ledit polynucléotide à simple'brin coloré entrera en compétition avec le polynucléotide à simple brin se trouvant initialement dans ledit échantillon au cours du processus de renaturation. 18 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que ladite étape de liaison comprend la liaison à ladite surface d'une amine aromatique, et, ensuite, le couplage, par liaison diazo, de ladite amine aromatique audit polynucléotide à simple brin choisi. 35 19 - Procéde selon la revendication 18, caractérisé par le fait que ladite amine aromatique est couplée à ladite surface par l'intermédiaire d'une molécule d'espaceur. - Procédé selon la revendication 19, caractérise par le fait que ledit espaceur est un triméthoxysilane substitué par une chaîne de groupements méthylène. 21 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que ledit espaceur est formée d'une paire de groupes époxy reliés par une chaîne à groupe(s) méthylène 10 22 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que ledit espaceur est une amine aliphatique. 23 - Procédé selon la revendication 19, caractérise par le fait que ledit espaceur est un triméthoxysilane présentant un groupe chlorobenzyle. 24 - Procedé selon la revendication 18, caractérisé par. le fait que ledit couplage par liaison diazo est formé tout d'abord par conversion de ladite amine-en un groupement diazo, par couplage dudit groupement diazo à de 20 la polythymidine, et par la conjugaison de ladite polythymidine avec une fraction polyadénine présente au début dudit polynucléotide à simple brin choisi. - Procédé selon la revendication 24, caractérise par le fait que ladite amine est convertie en un 25 groupement diazo par un traitement par un halogénure de diazonium. 2 - Procede selon la revendication 24, caractérisé par le fait qu'il comprend l'étape de réticulation de ladite polyadénine par ladite polythymidine. 30 27 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'étape de mesure comprend la mesure de l'intensité dudit rayonnement fluorescent. 28 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'étape de mesure comprend la 35 mesure de la durée de vie de l'évanouissement de la fluorescence dudit rayonnement fluorescent. -2596159 29 - Procédé selon la revendication 15, caractérise par le fait que ledit colorant-est un colorant dimére. - Procédé selon la revendication 29, caractérisé par le fait que ledit colorant est le bromure de diéthidium. 31 - Procédé selon la revendication 29, caractérisé par le fait que ledit colorant est le diacridine orange. 32 - Appareil pour le dosage d'un polynucléotide sous la forme à double brin, comprenant un marqueur fluorescent capable d'émettre un rayonnement fluorescent lorsqu'il est excité par un rayonnement d'excitation, ledit appareil étant caractérisé par le fait qu'il comprend, en 15 combinaison: - une cellule à réflexion interne totale atténuée (22>, en verre, optiquement transmettrice à la fois pour ledit rayonnement d'excitation et pour ledit rayonnement fluorescent; - un revêtement (32) comprenant des molécules dudit polynucléotide à double brin liées chacune de façon covalente à un site unique respectif sur la surface de ladite cellule (22), par l'intermédiaire d'une molécule espaceur couplee à une séquence polyTpolyA liée de 25 façon irréversible au voisinage de l'extrémité de ladite molécule présentant une chaîne polyadénine.