Brevet FR2594848A1 — publié le 19870828

Procédé de détermination des concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt en plaque et boite utilisée dans ce procédé. La présente invention est relative à un pro- cédé de détermination des concentrations de microbes par un procédé de dépôt sous forme de plaque, qui consiste à mettre un échantillon et un milieu sous forme de plaque dans une boîte, à laisser le milieu se solidifier, et à faire incuber la plaque solidi- fiée, puis à dénombrer les colonies de la plaque. L'invention concerne également une boite qui convient pour déterminer des concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt sous forme de plaque. En microbiologie laitière et alimentaire, en microbiologie médicale, ainsi qu'en microbiologie générale, on effectue en général la détermination du nombre de microbes contenus dans un échantillon au moyen de procédés sur plaque avec dilution. Nombre des procédés comparatifs, dits internationaux, sont de ce type. Dans des procédés sur plaque avec dilution, on inocule un certain volume.d'un échantillon à exa- miner ou une dilution de celui-ci dans une boite de Pétri. C'est ainsi, par exemple, que l'on verse de 10 à 15 ml d'un milieu de culture stérile susceptible de se solidifier (gaélose) et ayant une température de 45 + 1 C sur l'échantillon. On mélange immédiate- ment l'échantillon au milieu et on laisse la solidi- fication s'effectuer à la température ambiante sur une surface horizontale. On peut aussi mélanger l'échantillon et le milieu avant le dépôt en'plaque. Le milieu solidifié forme une couche d'une épaisseur uniforme sur la boite. Les plaques solidifiées sont retournées sens dessus-dessous et placées dans un incubateur (incubation). Les températures d'incuba- tion (par exemple 10 C, 30 C, 37 C, 44 C, 55 C) et la durée d'incubation (par exemple 2, 3, 6 et 10 jours) dépendent du procédé appliqué, principalement du grcupe de microbes à examiner. Les boites sont en position horizontale pendant l'incubation. Apres l'incubation, on dénombre les colonies dans la boîte de Pétri. Connaissant la quantité de l'inoculum de l'échantillon et les rapports de dilu- tion, on peut déterminer le nombre de microbes par unité de volume ou par unité de poids de l'échantil- lon, habituellement exprimé en microbes/ml ou en microbes/g, à partir du nombre de colonies dénombra- bles. Le milieu peut contenir une diversité d'agents nutritifs aussi grande que possible pour que des types de microbes de l'échantillon aussi nom- breux que possible aient les conditions de croissance requises (ce que l'on appelle un dénombrement total des colonies). On peut également restreindre les agents nutritifs du milieu ou ajouter au milieu des composés connus d'inhibition de la croissance. On désigne ces milieux comme étant des milieux sélec- tifs et leur but est de permettre de distinguer un certain groupe de microbes. On peut effectuer le dénombrement à l'oeil (au moyen de dispositifs auxiliaires connus) ou au moyen de divers dispositifs électriques de dénombre- ment (dispositifs automatiques de dénombrement de colonies). Une grande concentration de colonies dans la boite impose des limites au dénombrement. Il est cou- rant d'inclure dans le dénombrement seulement des plaques dont la quantité de colonies ne dépasse pas une limite déterminée; c'est ainsi, par exemple, qu'avec des plaques ayant un diamètre de 9 cm, on considère que la limite supérieure est de 300 colo- nies. Pour pouvoir examiner des échantillons ayant une grande concentration de microbes, il est néces- saire d'utiliser des techniques de dilution. En pra- tique, il est habituellement toujours nécessaire d'utiliser des dilutions dans le travail de dépôt sous forme de plaque. La préparation des dilutions successives représente de 70 à 90 % du temps de tra- vail requis pour tout le stade de dépôt sous forme de plaque (en fonction de la dilution dont on croit avoir besoin). D'une manière correspondante, la subs- tance dont on a besoin est un multiple de nombre de dilutions. Les procédés antérieurs en plaque avec dilu- tion ont ainsi l'inconvénient d'exiger la préparation de grandes successions de dilutions et la culture de plusieurs dilutions. Il faut un grand nombre de boi- tes à cet effet; en outre, on a besoin de beaucoup d'espace d'incubation. En d'autres termes, les procé- dés sont compliqués et prennent du temps. L'invention vise un procédé qui pallie les inconvénients mentionnés cidessus et qui permet de déterminer des concentrations de microbes d'une ma- nière simple et fiable. Ceci est obtenu au moyen du procédé suivant l'invention qui est caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger le milieu et l'échan- tillon pour obtenir un mélange homogène dont la con- centration de microbes est constante, et à faire se solidifier le milieu de façon que l'épaisseur de cou- ches du milieu varie d'une manière réglée. L'idée de base de l'invention est de faire se solidifier dans une boite un milieu contenant des microbes de manière que l'épaisseur de couche du milieu solidifié varie d'une façon déterminée. On peut faire se solidifier le milieu dans une boîte unique en faisant en sorte que l'épaisseur de couche soit déterminée au moyen de la géométrie de la boite. Quand l'épaisseur de couche du milieu varie d'une partie de la boite à une autre, la quantité des colonies varie d'une manière correspondante. On peut également appliquer l'idée de base en plaçant le mélange de l'échantillon et du milieu dans des boites de Pétri classiques en des quantités différentes, d'une manière déterminée de façon préci- se. Ceci donne une série de plaques ayant des épais- seurs de couche différentes. Mais le procédé tel quel n'offre pas d'autre avantage de rationalisation que celui de n'avoir plus à effectuer des dilutions successives. Suivant l'idée de base de l'invention, on distingue des colonies développées après incubation en des densités différentes au stade du dénombrement, la densité étant la plus basse dans les couches de gélose les plus minces, et la plus grande dans les couches les plus épaisses et variant avec la géomé- trie du milieu dans les zones ayant une épaisseur de couches intermédiaires. Quand l'échantillon et le milieu (gélose) sont mélangés soigneusement avant le dépôt en forme de plaque, leurs quantités étant connues et la géométrie du milieu et de la boite étant réglée mathématiquement, il est facile de déterminer la concentration de microbes de l'échan- tillon. On peut utiliser, pour la détermination, toute information correspondant à des normes micro- biologiques attestées: on ne prend en considération que des colonies qui se distinguent nettement dans les zones de la plaque qui ont une épaisseur de cou- che différente. Le gradient d'épaisseur de couche détermine le gradient de densité des colonies et ceci est pris en compte pour le calcul mathématique du dénombrement des colonies. Au stade du-dépôt en forme de plaque il est important que les boites soient placées sur une surface bien horizontale. Les avantages du procédé de dépôt en forme de plaque suivant l'invention sont: 1. Aucune dilution successive n'est nécessai- re, parce que la densité des colonies est suffisam- ment faible pour pouvoir être dénombrée au moins dans certaines parties de la plaque, en raison de l'épaisseur de couche variable du milieu de culture. En comparaison des procédés antérieurs, on gagne de à 90 % de temps de travail, parce qu'on n'a pas besoin d'effectuer des dilutions successives. 2. L'économie sur le milieu de culture est pro- portionnelle aux dilutions successives dont on a besoin dans les procédés antérieurs (ainsi que, en conséquence, au nombre de boites en parallèle dont on a besoin). 3. Si l'on utilise des boites à jeter, les économies de matière sont proportionnelles au nombre de dilutions successives nécessaires dans les procé- dés antérieurs. 4. L'espace d'incubation dont on a besoin est réduit d'une manière considérable,parce que l'on n'a pas besoin de boites parallèles qui sont néces- saires dans le cas de dilutions successives. Il en va de même directement pour les salles de travail et les équipements dont on a besoin. 5. Il n'est pas nécessaire de dénombrer les colonies sur toute la boîte; on obtient un matériau à colonies suffisant pour la détermination à partir des zones et des secteurs de dénombrement déterminés par la géométrie du fond de la botte. L'opération de dénombrement est également simplifiée et est accélé- rée par l'élimination de la dilution et de ses con- séquences. 6. Tout le procédé, y compris le dénombre- ment des colonies, peut être mécanisé et rendu auto- matique pour l'essentiel en utilisant et en modifiant des techniques antérieures. Les concentrations de microbes obtenues au moyen du procédé suivant l'invention sont extrêmement bien corrélées aux résultats obtenus au moyen de pro- cédés antérieurs. Le procédé peut remplacer tous les procédés antérieurs sur plaque avec dilution. L'invention vise également une boite qui convient pour la détermination de concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt sous forme de plaque, qui consiste à déposer un échantillon et un milieu sous forme de plaque, à laisser le milieu se solidifier et à faire incuber la plaque solidifiée, puis à dénombrer les colonies de la plaque. La boite est caractérisée en ce que sa forme est telle, qu'après le dépôt de l'échantillon et du milieu sous forme de plaque, il se forme dans la botte une couche solidifiée ayant une épaisseur variant de manière réglée. L'idée de base de l'invention, c'est-à-dire que l'épaisseur du milieu solidifié dans la boîte varie d'une manière réalable et connue, peut être réalisée en utilisant des boites d'un type nouveau: la boite a une forme telle qu'après que le mélange d'un échantillon et d'un milieu a été mis sous forme de plaque sur une surface horizontale, il se forme dans la boîte une couche solidifiée dont l'épaisseur varie d'une manière réglée. Ce type nouveau de boite peut être par exemple rond, comme une boite de Pétri classique, ou rectangulaire par exemple. L'épaisseur de couche du milieu est ajustée à une valeur souhai- tée, en donnant à la surface du fond d'une boîte ronde une forme sphérique ou asphérique répondant à une loi mathématique, cette forme pouvant être mon- tante ou descendante. On peut faire également monter ou descendre le fond d'une boîte ronde en munissant la boite de surfaces horizontales planes concentri- ques de forme annulaire avec une surface plane cir- culaire au milieu. Le fond d'une boite rectangulaire peut s'élever d'une manière linéaire le long d'un arc de cercle, ou suivant une autre courbe mathéma- tique. Il est également possible de munir le fond d'une boîte rectangulaire de surfaces planes rectangu- laires pour le faire s'élever. Une boîte de forme préférée est en rectangle. La aéométrie de la boite peut aussi être donnée au moyen de cloisons de hau- teurs différentes placées sur son fond. L'épaisseur de couche minimale du milieu peut être, par exemple, de 1 mm et l'épaisseur maximale de 10 mm dans les boites suivant l'invention. Tous les avantages procurés par le procédé suivant l'invention peuvent être obtenus au moyen de ce type de boite. On n'a pas besoin d'effectuer de dilutions successives et les économies de matériaux, de milieu et d'espace d'incubation sont considéra- bles en comparaison des procédés antérieurs. Quand on utilise une boite ayant la forme d'un rectangle, on a automatiquement besoin de moins de milieu, au plus de 50 % environ du milieu que nécessite une botte de Pétri, et l'espace d'incubation dont on a besoin, calculé en surface, est inférieur de plus de 20 % à celui de boites rondes. C'est pourquoi il est très avantageux, sui- vant l'invention, d'utiliser une boite ayant la for- me d'un rectangle. En outre, il vaut mieux mélanger correctement l'échantillon (inoculum) et le milieu utilisé avant le dépôt sous forme de plaque. Au dessin annexé, donné uniquement à titre d' exemple: les figures 1A, 2A, 3, 4A, 5, 6 et 7 sont des vues en coupe verticale de divers modes de réa- lisation de la boite suivant l'invention et des milieux respectifs, et les figures lB, 2B et 4B sont des vues en plan des boites respectives. Les figures 1A et lB représentent une boite 1 qui est ronde, telle que vue par le haut, et dont un fond la tourne sa convexité vers le haut. Le mi- lieu est désigné par le numéro de référence 2. On voit, aux figures, que quand l'épaisseur de couche du milieu augmente vers la périphérie extérieure de la boite, d'une manière connue déterminée par la géométrie du fond de la boite, la densité des colo- nies augmente d'une manière correspondante. Les figures 2A et 2B représentent une boite 11 qui diffère de la précédente par le fait que son fond lla tourne sa convexité vers le bas, et en con- séquence l'épaisseur de couche du milieu 2 et, d'une manière correspondante, la densité des colonies, est la plus élevée au milieu de la boite en diminuant vers les bords de la boite. La figure 3 représente une boite 21 dont un fond 21a est formé de surfaces planes horizontales qui sont disposées concentriquement, de sorte que la forme du fond change par paliers. La boite est ainsi munie de zones circulaires d'épaisseur de couche correspondant à la géométrie du fond. Les figures 4A et 4B représentent une boite 31 qui a la forme d'un rectangle,vue par le haut, et dont la forme du fond 31a varie d'une manière linéaire. L'épaisseur de couche augmente d'un petit côté à l'autre de la boite et la quantité des colo- nies augmente d'une manière correspondante. La figure 5 représente une boite 41 dont le fond 41a s'élève suivant un arc, le gradient d'épais- seur de couche et le gradient de densité des colonies variant d'une manière correspondante. La figure 6 représente une boite 51 dont le fond 5la est formé de surfaces planes rectangulaires, de sorte qu'il s'élève par paliers. Des zones d'épaisseur de couche correspondant à la géométrie du fond de la boite sont ainsi formées dans la boite. La figure 7 représente une boite 61 dont le fond est muni de cloisons 61a. Le mélange d'échantil- lons et de gélose est introduit dans un compartiment 1, une partie du mélange s'en écoulant dans un compar- timent 2, etc., de manière à former des zones d'épaisseur de couche distinctes. L'invention est illustrée, d'une manière plus détaillée, par les exemples suivants. Exemple 1 On inocule aseptiquement (une anse ou une micropipette), 1 'l d'un échantillon de lait à 12 ml de gélose normalisée de dénombrement en plaque, stérile et fondue (telle que FIL-IDF 100:1981) conte- nue dans un tube à essai stérile et on refroidit à une température de 45 C. Après l'inoculation, on agite le mélange de l'échantillon et de la gélose correc- tement, par exemple dans un mélangeur de tube à essai. Après avoir effectué le mélange, on met le mélange d'échantillon et de gélose sous la forme d'une plaque dans une boîte rectangulaire à fond mon- tant formé de surfaces planes horizontales et rec- tangulaires. La boite comprend cinq surfaces planes dont chacune a une dimension de 4 cm2 Les surfaces planes s'élèvent par paliers de 2 mm de hauteur. Une quantité de liquide de 12 ml, qui est le volume de gélose de l'exemple, remplit la boite décrite de façon à y former cinq secteurs de surface égale, mais ayant des épaisseurs différentes de couche de gélose. Les épaisseurs de couche sont de 2 mm dans le Secteur I, de 4 mm dans le Secteur II, de 6 mm dans le Secteur III, de 8 mm dans le Secteur IV et de 10 mm dans le Secteur V; les quantités de gélose (et les quantités d'échantillons) étant d'une manière correspondante: I 0,80 ml (0,066 1l), II 1,60 ml (0,133.1), III 2,40 ml (0,199 1), IV 3,20 ml (0,266 1) et V 4, 00 ml (0,333 E1). La surface totale de gélose des secteurs, après le dépôt sous forme de plaque, est de 20 cm2. Les quantités de gélose et d'échantillon dans les secteurs sont également indi- quées au tableau 1. On ferme la boîte à l'aide d'un couvercle et on la soumet à une incubation en position horizontale pendant 72 + 2 heures à une température de +30 + 1 C. On calcule les résultats séparément pour cha- que secteur en divisant le nombre des colonies dénom- brables dans chaque secteur (en pratique, inférieur à 40 colonies par secteur) par la quantité d'échan- tillon spécifique à chaque secteur; dans le présent exemple, la quantité d'échantillon est de 0,066 o1 ou de 0,000066 ml dans le Secteur I, et de 0,333 4.1 ou de 0,000333 ml dans le Secteur V. En conséquence, si le nombre des colonies dans le Secteur I est de 3, il y a 3 colonies par 0, 000066 ml, soit environ 45.000 colonies par ml; et si le nombre des colonies dans le Secteur V est de 17, il y a 17 colonies par 0,000333 ml, soit environ 50.000 colonies par ml. Le résultat donne directement la quantité de microbes de l'échantillon par ml. Les nombres de colonies dans les secteurs et les résultats calculés sur cette base sont consignés au tableau 2. On peut utiliser l'information obtenue de tous les secteurs dénombrables dans le résultat, en calculant la valeur moyenne des résultats obtenus, à partir de chaque secteur. Tableau 1 Secteur Gélose Echantillon % (A = 4 cm2) (ml) (ml) d'échantillon V 4,00 0,000333 33 IV 3,20 0,000266 28 III 2,40 0,000199 20 II 1,60 0,000133 13 I i 0,80 0,000066 6 Tableau 2 CPS iQuantité de microbes x 1000 Modification des CPS de l'échantillon microbes X 103/ml I II III IV V I II III IV V Exemple 2 On inocule aseptiquement l'échantillon à de la gélose en un rapport de dilution de 10-4 (10 I1 de l'échantillon original pour 100 ml de gélose). Après l'inoculation, on mélange efficacement le mé- lange de gélose et d'échantillon et on le place dans des boites de Pétri classiques en des quantités de 2, 5, 10, 20, 40 et 60 ml, de sorte que les quanti- tés de l'échantillon d'origine soient de 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml et 0,006 ml respectivement. On fait incuber les boites et on dénombre les colonies. On transforme les nombres de colonies comptées dans les boites en la densité de microbes de l'échantillon d'origine, par la formule suivante: Densité de microbes _ de l'échantillon densités de colonies dénombrées quantité de l'échantillon d'origine Les résultats sont consignés au tableau 3. Tableau 3 Colonies dans les boites (quantités de mélange CPSx1000 d'échantillon et de gélose) 2 ml 5 ml 10 ml 20 ml 40 ml 60 ml 1 3 5 10 20 30 4 10 20 40 80 120 10 25 50 100 200 300 20 50 100 200- (400) (600) (40) (100) 200 (400) - - 300 (60) (150) 3C0 - - - 500 (100) (250) (S00) - - (20 __ (500)___ Les parenthèses au tableau signifient qu'il n'est pas possible de compter ces densités de colo- nies dans les boites. Quand on utilise des boites de Pétri ayant un diamètre de 90 mm, le fond de la botte est complètement recouvert de gélose seulement dans des bottes contenant 10 ml de gélose ou davantage. Le procédé de dénombrement normalisé de plaque est décrit dans les documents bibliographiques suivants: 1. FIL-IDF 100:1981 Liquid Milk Enumeration of Microorganisms Colony Count Technique at 30 C. 2. ISO/DP 6610 ibid. 3. APHA American Public Health Association Standard Methods for the Examination of Dairy Products 14ième dition 1978, p. 77 à 93. Plato Loop Method: 1. APHA 14ikmeed. p. 315 à 317. 2. Thompscn, Donnelly & Black 1960 A Platé Loop Method for Determining Viable Counts of Raw Milk. 3. J. Milk Food Technol. 26: 156 à 171. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination des concentra- tions de microbes par un procédé de dépôt en pla- que, qui consiste à mettre un échantillon et un milieu sous forme de plaque dans une boite, à lais- ser le milieu se solidifier et à incuber la plaque solidifiée, puis à dénombrer les colonies de la pla- que, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger le milieu et l'échantillon afin d'obtenir un mélange homogène dont la concentration de microbes est cons- tante et à faire se solidifier le mélange de manière que l'épaisseur de la couche du milieu varie d'une manière réglée. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste à faire se solidifier le milieu dans une boite unique dont l'épaisseur de cou- che est réglée au moyen de la géométrie de la boite. 3. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste à faire se solidifier le milieu dans plusieurs boites, l'épaisseur de la cou- che étant réglée au moyen de la dimension de la boite et/ou du volume du milieu. 4. Boite qui convient pour déterminer des concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt en plaque qui consiste à mettre un échantillon et un milieu sous forme de plaque dans la boite, à laisser se solidifier le milieu et à faire incuber la plaque solidifiée, puis à dénombrer les colonies' de la plaque, caractérisée en ce que la forme de la boite est telle que, après le dépôt sous la forme de plaque de l'échantillon et du milieu, il se forme dans la boîte une couche solidifiée ayant une épaisseur va- riant de manière réglée. 5. Boîte suivant la revendication 4, caracté- risée en ce qu'elle a une section droite ronde. 6. Boîte suivant la revendication 4, caracté- risée en ce qu'elle a une section droite rectangu- laire. 7. Boîte suivant la revendication 4, caracté- risée en ce que son fond est concave. 8. Boite suivant la revendication 4, caracté- risée en ce que son fond est convexe. 9. Boîte suivant la revendication 4, caracté- risée en ce que son fond s'élève d'une manière liné- aire. 10. Boîte suivant la revendication 4, carac- térisée en ce que son fond s'élève suivant un arc de cercle. 11. Boite suivant la revendication 5, carac- térisée en ce que son fond est montant ou descendant, la boîte étant munie de surfaces planes horizontales annulaires concentriques, avec une surface plane cir- culaire au milieu. 12. Boîte suivant la revendication 6, carac- térisée en ce que le fond est montant en étant formé de surfaces planes rectangulaires. 13. Boîte suivant la revendication 4, carac- térisée par une cloison ou par plusieurs cloisons de hauteurs différentes, qui est, ou qui sont montées sur la partie de la boîte en formant le fond.