Brevet FR2598156A1 — publié le 19871106

La présente invention concerne une glucose déshydrogénase qui a une haute réactivité et une haute spécificité pour le substrat glucose et sa production. La glucose déshydrogénase est une enzyme qui catalyse une réaction: bêtaD-glucose + NADP --> D-glucono-delta-lactone + * + NADP + H Récemment, dans le domaine de la chimie clinique, la détermination quantitative du glucose dans un échan10 tillon en utilisant la réaction enzymatique ci-dessus a été effectuée et la demande de glucose déshydrogénase se développe. On connaît déjà un procédé de production de glucose déshydrogénase par des micro-organismes, par exemple Bacillus megaterium (publication de brevet japonais nonexaminée N 58-201985), Bacillus cereus (publication de brevet japonais non-examinée N 57-16693) et Acetobacter, Acinetobacter, Gluconbacter ou Pseudomonas (publication de brevet japonais non-examinée N 59-25700). Toutefois, 20 ces procédés ont un certain nombre d'inconvénients. Par exemple la spécificité pour le substrat de la glucose déshydrogénase obtenue à partir de Gluconobacter est si large qu'elle présente une valeur de 227 pour le 2-déoxyglucose et de 95 pour la mannosamine, à comparer à celle de 25 100 pour le glucose. (Enzyme Handbook, page 43, Asakura Pub. Co. Tokyo, 1983). Un but de la présente invention est de fournir une nouvelle glucose déshydrogénase ayant une haute réactivité et une haute spécificité pour le substrat glucose. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé pour la production de glucose déshydrogénase. La présente invention concerne une glucose déshydrogénase ayant les propriétés biochimiques suivantes: 1) Action enzymatique: catalyse une réaction qui 35 produit de la glucono-delta-lactone et du NADP réduit -2 à partir de glucose et de NADP; et 2) Spécificité pour les substrats: ayant une spécificité pour le substrat glucose et pas de spécificité pour le substrat 2-déoxyglucose. De plus, la présente invention concerne un procédé de production de glucose déshydrogénase qui comprend la culture d'un micro-organisme producteur de glucose déshydrogénase appartenant au genre Cryptococcus dans un milieu nutritif et l'isolement de la glucose déshydrogénase 10 ainsi produite à partir de ce milieu de culture. Le micro-organisme producteur de glucose déshydrogénase peut être un micro-organisme appartenant au genre Cryptococcus, et est de préférence Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 Les propriétés taxonomiques de la souche ci-dessus sont illustrées comme suit. 1. Développement sur divers milieux: (1) Milieu liquide YM: Sur une culture de 3 jours à 25 C, les hyphes végé20 tatives sont sphériques à elliptiques, 2-5 x 4-5 gm. Développement par bourgeonnement multipolaire. Forme un précipité pulvérulent blanc. Une pellicule de revêtement annulaire se forme à partir du 5ème jour de culture. (2) Milieu de gélose YM: Colonie ronde avec bord entier. Bombement de forme convexe. Surface lisse. Chatoiement. Propriété butyreuse. Couleur blanche. (3) Culture inclinée sur milieu gélosé à l'extrait de pomme de terre: Pas de formation de pseudomycélium. 2. Formation d'ascospores: 3. Formation de ballistospores: 4. Propriétés physiologiques: (1) Conditions optimales de développement: 35 pH 5-9, température 24-30 C -3 (2) Domaine de développement: pH 4,5-11,5, température 19-33 C. (3) Assimilation de nitrates: (4) Dégradation des lipides: (5) Dégradation de l'urée: + (6) Liquéfaction de la gélatine: (7) Osmophilie ou osmotolérance: (8) Formation de caroténoides: (9) Formation d'acides organiques: (10) Formation de substance ressemblant à l'amidon: (11) Développement sur un milieu déficient en vitamines: + W (12) Utilisation de sources de carbone: Par fermentation: D-glucose D-galactose maltose sucrose lactose raffinose Par assimilation: D-arabinose + S L-arabinose + D-ribose D-xylose + W D-glucose + D-mannose D-galactose D-rhamnose + Dfructose L-sorbose maltose + sucrose + lactose mélibiose - -4 cellobiose tréhalose + raffinose + mélézitose + alpha-méthyl-Dglucoside + arbutine + dextrine amidon soluble + W inuline + W éthanol + adonitol + érythritol inositol + D-mannitol + D-sorbitol + dulsitol Dgluconate glycérol 2-céto-D-gluconate + DL-lactate succinate citrate Un micro-organisme tel que défini ci-dessus a été isolé à partir d'un échantillon de terre recueilli dans une porcherie à Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japon et fait partie des levures. Ces micro-organismes se développent par bourgeonnement multipolaire et ne forment pas d'ascospores, de ballistospores ni de pseudohyphes. Ils assimillent l'inositol. Ces caractéristiques 30 indiquent que le micro-organisme appartient au genre Cryptococcus. D'après les propriétés physiologiques du présent micro-organisme présentant un modèle d'assimilation de sources de carbone, pas d'assimilation de nitrate, le besoin de vitamines et pas de développement à 37 C, 35 cette souche est appelée Cryptococcus uniguttulatus et -5 répond à la désignation Cryptococcus uniguttulatus Y 0033. Cette souche a été déposée au Fermentation Research Institute comme collection de cultures permanentes et enregistrée sous le numéro FERM P-8709. La glucose déshydrogénase de la présente invention peut être produite par le procédé classique de production d'enzymes utilisant une culture de levure. La levure est inoculée dans un milieu et cultivée dans des conditions d'aération en immersion. Les sources nutritives pour le milieu sont des milieux classiques pour la culture de micro-organismes. Des sources nutritives sont des sources d'azote assimilables comme la liqueur de macération de mais,, la poudre de soja, l'hydrolysat de caséine, la peptone, l'extrait de 15 levures et l'extrait de viande. Des sources de carbone préférables sont des sources de carbone assimilables, par exemple des disaccharides comme le glucose, le maltose, le sucrose et le lactose et des dextrines, l'amidon, la mélasse, etc. On peut faire varier la température de culture suivant le développement des microorganismes et la production de glucose déshydrogénase, et elle est de 25 37 C, de préférence d'environ 30 C. La durée de culture dépend des conditions et est habituellement de 25 - 50 heures. La culture doit être terminée au stade de production maximale de l'enzyme. La glucose déshydrogénase est isolée à partir du milieu cultivé ainsi obtenu. Un exemple de l'isolement de l'enzyme consiste à traiter par filtration ou centrifu30 gation le milieu cultivé pour séparer le mycélium et à traiter le mycélium isolé par sonication, à la presse française ou par dislocation mécanique en utilisant des perles de verre, ou à l'autolyser avec un solvant organique pour obtenir une solution de glucose déshydrogénase brute. 35 La solution d'enzyme brute est chauffée à 50 C pendant - X -6 - 30 minutes et immédiatement centrifugée pour séparation de la solution surnageante. Une purification supplémentaire peut être effectuée par chromatographie par échange d'ions avec utilisation de DEAE-cellulose, DEAE5 Sepadex A-25, DEAE-Sepharose, CM- cellulose, CM-Sephadex C-25 ou CM-Sepharose CL-6B, en traitant ensuite par chromatographie sur hydroxylapatite, avec lyophilisation si nécessaire, pour obtenir une poudre de glucose déshydrogénase purifiée. L'exemple suivant illustre la présente invention, mais ne doit pas être considéré comme la limitant. Exemple - Production de glucose déshydrogénase par culture de Cryptococcus uniquttulatus Y 0033 FERM (1) La quantité de Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 15 FERM P-8709 prise par une boucle de platine a été inoculée dans un milieu aqueux (100 ml) comprenant 0,5 % de poudre d'extrait de levures, 1,0 % d'extrait de viande, 1,0 % de glucose, 0,15 % de KH2PO4, 0,033 % de CaC12-2H20, 0,05 % de MgSO4.7H20 et 0,2 % de NaCl dans un erlenmeyer, et le 20 mélange a été soumis à une culture à secousses à 30 C pendant 50 heures. Le bouillon de culture a été centrifugé (4500 tpm, 10 minutes) pour donner un mycélium. Le mycélium en suspension dans une solution 10 mM de tampon phosphate (pH 7,0, 10 ml) a été disloqué en utilisant un homogé25 néiseur Brown et centrifugé(15 000 tpm, 10 min) pour séparation du résidu mycélien de façon qu'on obtienne la solution surnageante (10 ml, 0,6 unité par ml). (2) La quantité de Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 prise par une boucle de platine a été inoculée 30 dans un milieu aqueux (100 ml) comprenant 0,5 % de poudre d'extrait de levures, 1,0 % de casamino acide, 2,0 % de sucrose, 0,15 % de KH2PO4, 0,033 % de CaC12-2H20, 0,05 % de MgSO4.7H20 et 0,2 % de NaCl dans un erlenmeyer, et le mélange a été soumis à une culture à secousses à 30 C pendant 50 heures. On a traité le bouillon de culture de la -7 même manière qu'en (1) ci-dessus pour obtenir une solution d'enzyme brute (10 ml, 14 unités/ml). (3) La quantité de Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 prise par une boucle de platine a été inoculée 5 dans un milieu aqueux (100 ml) comprenant 0,5 % de levure, 1,0 % d'extrait de bonite, 1,0 % de maltose, 0,15 % de KH2PO4, 0,033 % de CaC12.2H20, 0,05 % de MgSO4 7H20 et 0,2 % de NaCl dans un erlenmeyer, et le mélange a été soumis à une culture à secousses à 30 C pendant 50 heures. 10 On a traité le bouillon de culture de la même manière qu'en (1) ci-dessus pour obtenir une solution d'enzyme brute (10 ml, 6 unités/ml). (4) La solution d'enzyme brute (150 ml) obtenue à partir d'un bouillon de culture (1050 ml) préparé de la 15 même manière qu'en (2) ci-dessus a été chauffée à 50 C pendant 15 minutes et centrifugée (4500 tpm, 10 min.). La solution surnageante ainsi obtenue a été passée à travers une colonne (4,8 x 4 cm) de DEAE-Sepharose C L-6B pour adsorption de l'enzyme et éluée avec les solutions 20 de 0,1 M KCl (100 ml), 0,2 M KCl (100 ml) et 0,3 M KCl (100 ml). La glucose déshydrogénase a été éluée à 75 ml de 0,3 M KC1. La solution d'enzyme a été traitée avec une membrane diaflow (Amicon Co.) pour élimination des sels et adsorbée sur une colonne (4,8 x 1 cm) d'hydroxylapatite (Sigma Chem. Co.) qui a été éluée avec une solution tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, 50 ml), une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 7,0, 50 ml) et une solution tampon phosphate 0,3 M (pH 7,0, 50 ml). La glucose déshydrogénase a été éluée à 20 ml de solution tampon phosphate 0,3 M pour 30 donner une solution d'enzyme (20 ml, 23,6 unités/ml). La glucose déshydrogénase obtenue a les propriétés suivantes: (1) Action enzymatique: Catalyse une réaction qui produit de la glucono35 deltalactone et du NADP réduit à partir de glucose et de -8 NADP comme représenté ci-dessous. CHPH C@ 1 Ho. cil OH At ol + NADPH + l+' bêta-D-glucopyranose D--glucono-deltalactone (2) Stabilité au pH: Activité restante de l'enzyme (1 unité/ml, solution tampon 40 mM) après traitement à 53 C pendant 10 minutes. Comme représenté sur la figure 1, l'enzyme est stable à des pH de 6,0 à 7,0. Sur la figure: o - o: tampon diméthylglutarate, e - e: tampon phosphate, A A: tampon Tris-HCl. ( Les significations sont les mêmes pour toutes les autres figures ci-après, à moins de spécification contraire). (3) pH optimal: pH 6 - 8 comme représenté sur la figure 2. Sur la figure: A -: tampon acétate. (4) Stabilité à la chaleur: Activité restante de l'enzyme (1 unité/ml, solution tampon phosphate 40 mM, pH 6,0) après traitement à diverses températures pendant 10 minutes. Comme représenté sur la figure 3, l'enzyme est stable jusqu'à 500C. (5) Température optimale: environ 550C comme repré20 senté sur la figure 4. (6) Poids moléculaire: 11 x 104 11000 (mesuré par Sephacryl S-200 superfin) (7) Point iso-électrique: pH 4,9 + 0,5 (8) Valeur de Km: 2,6 x 10-3 2,6 x 10-4M (glucose) 25 4,6 x 10-6 f 4,6 x 10-7M (NADP) (mesurée dans tampon Tris-HCl, pH 7,5) (9) Effet d'ions métalliques et d'agents tensio-actifs: Indiqué dans le tableau 1. -9 (10) Spécificité pour les substrats: Indiquée dans le tableau 2. (substrat 50 mM, enzyme 0,005 U, 10 min.). L'activité enzymatique et l'activité restante sont mesurées par la méthode de détermination suivante. Méthode de détermination: tampon 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5) 0,4 ml mM NADP 0,05 % Triton X-100 0,01 0,5 M glucose 0, 1 eau purifiée 0,44 1,0 Le mélange réactionnel ci-dessus (1,0 ml) est mis en pré-incubation à 37 C pendant 2 - 3 minutes. On y ajoute la 15 solution d'enzyme (20 4l) et on fait incuber à 37 C pendant minutes et on mesure la densité optique à 340 nm. Une unité est définie par la quantité d'enzyme qui produit 1 gmole de NADP réduit en une minute. TABLEAU I Conc. Activité relative Pas d'addition - 100 % KCl 10 mM 99,2 NaCl 10 100 NH4Cl 10 100,8 MrCl- 10 102,6 CaC12 BaCl2 ZnC2 ZnC12 102,3 98,4 4,9 MnC12 NiC12 CuCl2 CoC12 HgCl2 AlCl3 49,6 89,7 o 102,7 o 103,1 -10 TABLEAU I (suite) FeC13 Na2WO4 Na2 4 K2CrO4 EDTA Nonidet P-40 Adekatol PC-8 Adekatol SO-120 Tween 80 Bridge 35 Triton X100 Nikkom HCO-100 0,1 % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ,5 97,7 2,3 101 236 231 251 201 193 215 221 TABLEAU II Substrat Activité relative (%) glucose 100 glucose-l-phosphate 0 glucose6-phosphate 0 fructose 0 galactose 0 xylose 19 lactose 0 maltose 0 sucrose 0 2-déoxy-glucose trace* 2-déoxy-ribose 0 cellobiose trace* glucosamine trace* Aucune action importante n'a été observée en raison de l'impureté dans le substrat par rapport à la réactivité sur le glucose (activité relative 100). -11 Comme illustré ci-dessus, la présente invention fournit une nouvelle glucose déshydrogénase et sa production. Si on compare la présente nouvelle glucose déshydro5 génase à une enzyme connue antérieurement telle qu'une enzyme dérivée de Bacillus cereus (Methods in Enzymology, Vol. 9, page 109), la valeur de Km de l'enzyme de la présente invention est très basse (2,6 x 10-3 M), tandis que celle de l'enzyme connue antérieurement est plus élevée 10 (2 x 10-2 M), c'est-à-dire que la première est environ dix fois plus active que cette dernière, ce qui révèle la nature supérieure de la glucose déshydrogénase de la présente invention. Brève explication des dessins: Fig. 1: Stabilité au pH de la glucose déshydrogénase, Fig. 2: pH optimal de la glucose déshydrogénase, Fig. 3: Stabilité à la chaleur de la glucose déshydrogénase et Fig. 4: Température optimale de la glucose 20 déshydrogénase. -12 REVENDICATIONS 1. Glucose déshydrogénase ayant les propriétés biochimiques suivantes: 1) Action enzymatique: catalyse une réaction qui produit de la glucono-deltalactone et du NADP réduit à partir de glucose et de NADP; et 2) Spécificité pour les substrats: ayant une spécificité pour le substrat glucose et pas de spécificité pour le substrat 2-déoxyglucose. 2. Une glucose déshydrogénase selon la revendication 10 1, caractérisée en ce qu'elle a les propriétés suivantes: (1) pH optimal: pH 6 - 8, (2) température optimale: environ 55 C, (3) stabilité au pH: stable aux pH 6, 0 - 7,5, (4) poids moléculaire: 11 x 104 11000 (5) valeur de Km: 2,6 x 10-3 2,6 x 10 -4M (glucose) 4,2 x 10-6 4,2 x 10-7M (NADP) et (6) point iso-électrique: 4,9 0,5. 3. Un procédé de production de glucose déshydrogénase 20 qui comprend la culture d'un micro-organisme producteur de glucose déshydrogénase appartenant au genre Cryptococcus dans un milieu nutritif et l'isolement de la glucose déshydrogénase ainsi prQduite à partir du milieu cultivé. 4. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de glucose déshydrogénase appartenant au genre Cryptococcus est Cryptococcus uniguttulatus. 5. Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que Cryptococcus uniquttulatus est Crvptococcus 30 uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709.