Brevet FR2588383A1 — publié le 19870410

La présente invention est relative a un nouveau procédé de récupération et de dosage de microquantités d' acide désoxyribonucléique (ADN) dans un liquide biologique acellulaire en particulier le plasma sanguin. Le dosage de 1'ADN circulant et notamment de 1'ADN présent dans le sang, en position extra-cellulaire, présente un grand intérêt tant sur le plan physiologique que sur le plan pathologique. 1. Sur le plan physiologique, la présence d'ADN circulant chez des personnes "en situation normale" peut dépendre de deux types de phénomènes qui peuvent être qualifiés de passifs ou d'actifs. D'un côté, en effet, la mort cellulaire est un phénomène physiologique normal et permanent qui peut se traduire au delà de la lyse cellulaire, par la libération dans le sang d'une certaine quantité d'acides nucléiques. D'un autre côté, il est possible que la présence d'ADN dans le sang soit (en partie) le résultat d'un phénomène actif d'excrétion de 1'ADN par certaines cellules. Ce processus pourrait (pour certains auteurs) représenter un mécanisme d'information ou de communication inter-cellulaire. 2. D'un point de vue pathologique, il est possible que dans certaines circonstances, 1'ADN circulant puisse se trouver "anormalement présent" (soit d'un point de vue quantitatif, soit d'un point de vue qualitatif) dans le sang. La signification de ce phénomène n'est pas univoque a) Il est possible que 1'ADN circulant puisse jouer un rôle pathogène. Plusieurs mécanismes peuvent être invoqués (i) présent dans le sang en quantité anormalement élevée, 1'ADN circulant peut perturber du fait de ses propriétés physico-chimiques (notamment de sa haute viscosité) le fonctionnement normal de la micro-circulation dans certains tissus et/ou organes. Celez peut être le cas par exemple au cours de la mise en oeuvre de traitements cytolytiques chez des patients atteints de néoplasie ou de leucémie (ii) 1'ADN peut être également responsable de l'activation de mécanismes pathogènes telle l'activation des systèmes de la coagulation et du complément (iii) on peut encore supposer que 1'ADN puisse, dans certaines circonstances, jouer un rôle pathogène du fait de propriétés "génétiques" spécifiques, en s'intégrant au génome de l'hôte par un phénomène semblable à une transformation ; (iv) enfin, 1'ADN circulant pourrait jouer un rôle pathogène par I'intermédiaire de la formation de complexes immuns ADM-anticorps anti-ADN. C'est le mécanisme physiopathologique qui a été retenu depuis une vingtaine d'années pour expliquer le développement des lésions tissulaires (en particulier glomerulaires) apparaissant chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) ainsi que chez les souris développant de manière spontanée des maladies lupiques comparables, telles les souris NZBxNZW.La mise en évidence in vitro d'une affinité particulière de 1'ADN pour le collagène pourrait expliquer la généralisation au sein de l'organisme des dépôts de tels complexes et suggère que, dans certaines circonstances, 1'ADN adsorbe sur des structures collagéniques pourrait jouer le rôle d'immunoadsorbant vis à vis d'anticorps anti-ADN libres. I1 faut ajouter que les résultats d'études expérimentales effectuées chez des souris "non lupiques" infectées par des endotoxines bactériennes ou infectées par Escherichia coli suggèrent que la formation de complexes ADN-anticorps anti-ADN peut également jouer un rôle pathogène lors du développement de diverses glomérulonéphrites a complexes immuns. b) A côté de la possibilité du rôle pathogène que peut jouer 1'ADN circulant,la présence "anormale" d'ADN (sur un plan quantitatif ou qualitatif) peut revêtir une signification étiopathogénique ou physiopathologique. I1 est possible tout d'abord que, au cours de certaines affections (infectieuses en particulier), 1'ADN "spécifique d'un agent pathogène" (viral par exemple) puisse être présent dans le sang. La détection et l'identification de cet ADN peut revêtir alors un intérêt étiologique. I1 a, par exemple, été montré que des patients porteurs chroniques de l'antigène de l'hépatite B possèdent dans leur plasma de 1'ADN circulant capable de s'hybrider avec de 1'ADN extrait de particules virales du virus de l'hépatite B.D'un autre côté, il est également possible que la libération dans le sang d'ADN en quantité anormalement élevée traduise des processus pathologiques précis. On peut envisager par exemple qu'une atteinte inflammatoire vasculaire s'accompagne du passage "rapide" de matériel nucléaire dans le sang du fait de l'absence de 'filtre enzymatique tissulaire" et de la libération "directe" de matériel nucléaire dans le secteur vasculaire. Compte tenu de l'intérêt que présente le dosage de 1'ADN circulant, différentes techniques, colorimétriques, fluorimétriques ou immunologiques ont été proposées. Cependant, l'utilisation de ces techniques,en perticu- lier pour le dosage de 1ADN plasmatique, rencontre des limites et présente des difficultés : ces difficultés ou limites se rapportent essentiellement à la spécificité, à la sensibilité et au caractère quantitatif des méthodes proposées. a) La spécificité : deux aspects concernant le problème de la spécificité doivent être considérés ; (i) de nombreuses substances peuvent interférer avec les méthodes colorimétriques (telle la classique méthode de Burton),fluorimétriques ou immunologiques. Dans ces conditions, ne peuvent être considérés comme interprétables que les résultats des méthodes comportant un dosage contrôle de 1'ADN après traitement des échantillons par une préparation purifiée de désoxyribonucléase ; (ii) le second aspect à considérer est le fait qu'il devrait être nécessaire de déterminer avec exactitude si 1'ADN "spécifiquement" mis en évidence (ou dosé) dans le sang se trouvait bien en situation extracellulaire au moment du prélèvement et ne provenait pas de la lyse artificielle des cellules nuclées du sang. b) La sensibilité : les méthodes ci-dessus mentionnées possèdent une sensibilité limitée qui ne permet en aucune manière de doser 1'ADN circulant chez les sujets normaux. La sensibilité maximale rapportée dans la littérature est de 20 à 50 ng/ml pour 1'ADN en double hélice et de 100ngXml pour 1'ADN en simple hélice (STEItaMAI4, ARTH. RHEUM. 1982, 25, 1425-143C),concentrations qui ne sont pas atteintes chez les sujets normaux. c) Le caractère quantitatif : les techniques immunologiques qui sont parmi les plus sensibles ne sont pas quantitatives et ce, pour plusieurs raisons i) le principe même de la méthode peut faire que celle-ci n'est à la base que semi-quantitative C'est le cas de la contre-immunoélectrophorèse ii) la taille des molécules d'ADN est très variable et pour une même quantité d'ADN, le nombre de molécules pouvant réagir avec le "substrat immunologique" (les anticorps anti-ADN en l'occrrrence) est variable d'un échantillon à l'autre (iii) certaines substances (telles des proteines capables de fixer 1'ADN de manière spécifique ou non) peuvent interférer dans le dosage. Pour surmonter ces limites et difficultés, il a été proposé de purifier les préparations d'ADN plasmatique préalablement à leur dosage, en les débarrassant des divers constituants qui les accompagnent dans le plasma, en particulier des protéines. D'autre part, il a été proposé (cf. RAPTIS et al. J. CLIN. INVEST., 66, Décembre 1980, 13911399) de quantifier et de caractériser 1'ADN plasmatique normal et 1'ADN plasmatique provenant de patients atteints de lupus érythémateux systémique (SLE) après l'avoir purifié et l'avoir marqué in vitro en utilisant la technique de "Dlick Translation"-elle-même décrite précédemment dans RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 113, 237 - 251- Comme on le sait, le marquage à l'aide de la technique de "Nick Translation" consiste à incorporer des molécules de désoxyribonucléotides dans 1'ADN. Cette technique utilise deux enzymes, la désoxyribonucléase et l'ADN-polymérase d'Escherichia coli. La désoxyribonucléase réalise des coupures -ou nicks- dans les brins d'ADN. L'ADN-polymérase peut alors, sous l'effet de son activité exo.nucléasique 5'-3', détacher des nucléotides du côté 5'- de la coupure. L'élimination des nucléotides et l'addition séquentielle de nucléotides sur le côté 3'- entrainent la progression de la coupure ("Translation") le long de 1'ADN. En remplaçant les nucléotides pré-existants par des nucléotides marqués soit par un isotope radioactif soit par une substance pouvant être révélee à l'aide d'une réaction enzymatique, il est possible de préparer des ADN marqués d'activité spécifique très élevée, l'activité spécifique de 1' ADN étant fonction de l'activité spécifique des substrats et de l'étendue du remplacement des nucléotides. Alors que RIGBY et Al. ont utilisé comme matière première,de l'ADN d'origine cellulaire, RAPTIS a appliqué la technique de"Nick Translationin vitro à de 1'ADN circu lantplasmatiquepurifié, pour obtenir un ADN marqué in vitro qui, en raison de sa radioactivité très élevée, permet une très grande sensibilité de mesure. Selon RAPTIS et Al. la réaction de"Nick Trains la tion"doit être réalisée dans un milieu contenant 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de 2-mercaptoéthanol, 5 mM de MgC12 et 50 vg/ml de BSA (sérum-albumine bovine) mis en contact avec 0,25 nmoles de chacun des quatre dXTP marqués, par réaction, et 1U/réaction (ou 0,1 p1) de préparation enzymatique (ADN-polymérase), tandis que le produit résultant est extrait à deux reprises par du phénol redistillé. L'ADN plasmatique soumis à la réaction de"Nick Translation"est obtenu selon RAPTIS et Al. à partir de plasma dilué 4 fois dans 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8,5, 20 mM d'EDTA contenant 1 % de dodécylsulfate de sodium,puis incubé (20 ml) avec 50 ml de pronase, pendant 4 heures à 370C, l'incubation étant suivie d'extractions séquantielles avec du phénol, un mélange 24::1 de chloroforme et d'alcool isoamylique, et de l'éther, de dialyse contre 20 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA, d'une digestion de l'extrait par 10 Vg/ml de ribonucléase pancréatique pendant 30 minutes à 370C et éventuellement d'une étape de purification comprenant une adsorption sur une colonne de BND-cellulose à pH 8,1 et une élution, d'une précipitation par de l'éthanol, suivie d'une remise en suspension du résidu solide dans 100 ul de tampon Tris-HCl, 10 mM, pH 7,6 et 1 mM d'EDTA. Enfin, la détermination de la radioactivité des fractions résultant de l'analyse par sedimentation neutre par un gradient de saccharose et de fractions résultant de l'analyse par centrifugation à l'équilibre dans du CsCl, comparée à une courbe standard des comptages/minute obtenus en fonction de la quantité d'ADN de phages X utilisée dans chaque réaction de Nick Translation, permet d'obtenir la quantité d'ADN, à condition que celle-ci se trouve dans une gamme comprise entre 0,01 et 0,1 ijg d'ADN de phages A. Cette méthode relativement peu sensible et passablement complexe, est issue de la méthode de RIGBY et Al. qui, si elle préconise la méthode relativement simple de comptage de la radioactivité sur des disques de papier-filtre, utilise cependant comme mélange réactionnelpour la"Nick Translation",pour 120 p1, 50 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 5 mM de MgC12, 15 M de dTTP et de dGTP et 15 à 20 M de [&alpha;;32P] dCTP, avec une concentration d'ADN de l'ordre de 15 g/ml, et une incubation d'une minute à la température ambiante avec 1,33 ng dans 10 p1 d'ADN-ase I activée, puis à 140C avec 6 vg (4 p1) d'ADNpolymérase I suivies de l'adjonction de 60 ijl d'EDTA 0,25 M (pH 7,4) (éventuellement suivie d'une extraction par du phénol) et d'un chauffage de 10 minutes à 680C. Cette méthode peut être mise en oeuvre sur de faibles volumes, de l'ordre du microlitre, mais elle est inutilisable pour le but que s'est fixée la présente invention, à savoir la récupération de microquantités d'ADN dans un milieu biologique liquide acellulaire. La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur, notammenten ce que le nouveau procédé conforme à la présente invention - est réellement quantitatif, ce que ne sont pas les methodes basées sur des réactions immunochimiques telles que la réaction d'inhibition de la fixation de 1'ADN décrite par LEON et Al. dans 1'Article cité plus haut, ou la méthode de contre-immunoélectrophorèse décrite par DAVIS.- et DIVIS dans ARTH. RHEUM. (1973), 16, 52-58 - est spécifique de 1'ADN et ne peut être influencé ni par des anticorps anti-ADN ou d'autres protéines qui fixent 1'ADN, qui peuvent interférer dans les tests basés sur des réactions immunologiques, ni par des substances suscepti bles d'interférer dans les tests colorimétriques ou fluo rimétriques précédemment décrits (cf. notamment, STEINMAN, J. CLIN, INVEST. (1975), 56, 512-515) - ne requiert que quelques microlitres de plasma, est rapide, fiable et est d'une très grande sensibilité, et peut être mis en oeuvre simultanément sur de nombreux échantillons. La présente invention a pour objet un procédé de récupération et de dosage de microquantitês d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, qui est caractérisé en ce qu-'il comprend les étapes successives suivantes - une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser 1'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ), pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la totalité de 1'ADN ;; - une deuxième étape de récupération de 1'ADN de ladite solu tion aqueuse, qui consiste à précipiter 1'ADN par adjonc tion à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un agent de précipitation avantageusement constitué par un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le tampon Tris-hydroxyaminométhane ou analogue ; - une troisième étape, de marquage par "Nick translation", de 1'ADN récupéré, qui consiste à incuber 1'ADN avec un ou plusieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués et avec de l'ADN-polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxy aminométhane, le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5-merceptoéthanol et le glycérol ;; - une quatrième étape de dosage de 1'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur incorporé à 1 lDN. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récupéré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d1au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radioactif, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN, consiste à compter la radioactivité présente sur un filtre de papier sur lequel a été déposé 1'ADN marqué et qui a éventuellement subi des lavages par des agents de lavage appropriés, puis a été séché, par comptage direct ou après immersion dans un liquide scintillant, en fonction de la nature du radioisotope de marquage. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réalisé au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN consiste à révéler 1'ADN après fixation du complexe enzymatique approprié, en présence d'un substrat chromogène. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les nucléotides incorporés dans 1'ADN sont marqués par la biotine et l'enzyme utilisée pour sa ou leur détection est liée à l'avidine. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le liquide biologique acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel on cherche à doser 1'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, avec de l'acide éthylènediamine tétra acétique (EDTA) pour obte nit lue concentration finale d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 mM (pH 8 environ) et la solution obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon approprié tel que Tris-hydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8 environ, notamment. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de coprécipitation introduit au cours de la deuxième étape du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gélatine, les diamines telles que la spermidine, les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse, des protéines comportant des groupes réactifs possèdant des charges positives tels qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour 1'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick translation". Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé, conforme à la présente invention, l'agent de précipitation mis en oeuvre au cours de la seconde étape du procédé, est de l'éthanol. Selon une modalité particulière de ce mode de mise en oeuvre, l'éthanol ou autre alcool inférieur utilisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de centrifuga tion, en quantité appropriée pour obtenir une concentration finale en éthanol égale ou supérieure à 66 %. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, la phase aqueuse contenant 1'ADN, un agent de précipitation et un agent de coprécipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation de 1'ADN et le précipité est lavé par une nouvelle addition d'éthanol ou autre agent de précipitation analogue, puis la solution obtenue est à nouveau centrifugée et le précipité, essentiellement constitué par de 1'ADN, est récupéré. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, 1'ADN précipité est récupéré par addition d'eau, éventuellement sous agitation. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" est effectué, au cours de la troisième étape du procédé, par incubation de 1'ADN récupéré, avec 2 à 50 picomoles d'un ou de plusieurs desoxynucléotides-triphosphates marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxynucléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogranames de désoxyribonucléase I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxyaminométhane (5-12mM), de chloruredemagnésium (2-5mM), de B-mercapto-éthanol (7-15mM), d'albumine bovine (20-60 microgrammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume). Selon une modalite avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'incubation ?st réalisée dune température comprise entre 15 et 370C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est déposé 1'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une solution de forte molarité permettant d'éliminer les nu nucléotides marqués non incorporés à 1'ADN tout en conservant sur le filtre la totalité de l1ADN marqué. Outre les dispositions qui precedent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulière- ment le nouveau procédé de récupération et dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, conforme aux dispositions qui précèdent, les analyses biologiques utilisant ce procédé, ainsi que les situations physiologiques élucidées et les diagnostics établis grâce au procédé conforme à la présente invention. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complement de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre et d'application du procédé objet de la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de 11 invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 Récupération et dosage de microguantités d'ADN présentés dans du plasma sanguin 1ère étape Dans un tube conique en polypropylène de 1,5 ml (tube Eppendorf) on mélange 10 p1 de plasma prélevé sur acide éthylènediaminetétraacétique et 50 pl d'acide éthy lènediaminetétraacétique à 15 mM. On ajoute 25 microlitres de phénol saturé par du Trishydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8. On mélange. Après incubation de 3 minutes, à la température de la pièce, on centrifuge 5 minutes à 12 000 g. 2ème étape a) une solution mère de gélatine (DIFCO) à 5 % en (poids/volume) dans de l'eau bidistillée, est chauffée à 1100C pendant 30 minutes. b) 40 microlitres de la phase supérieure (phase aqueuse) sont transférés dans un autre tube Eppendorf contenant 10 1 de la qélatine préparée comme ci-dessus,à 0,3% (poids/volume) dans du tampon Trishydroxyaminométhane 0,0025 M, pH 8.0n ajoute 105 micro litres d'éthanol absolu à -200C. Le tube est agité, incubé 5 minutes à 40C puis centrifugé 15 minutes à 40C à 12 000 g. Le surnageant est éliminé par pîpetage et après addition de 200 microlitres d'éthanol à 85 % à -200C, le tube est immé diatement centrifugé dans les mêmes conditions que précédem ment. Le surnageant est totalement éliminé par pipetage puis séchage sous vide. 25 microlitres d'eau bidistillée à 600C sont ajoutés et le tube est incubé 2 å 3 minutes à 600C puis centrifugé quelques secondes et placé à 40C. 3ème étape L'ADN dissous dans 25 microlitres d'eau bi distillée est incubé dans 25 microlitres contenant 17 pico moles de désoxyribocytidine 5' triphosphate marqués au tri tium et 100 picomoles de désoxyriboadénine triphosphate, de désoxyriboguanine triphosphate et de désoxyribothymine triphosphate, 0,25 Unités d'ADN polymérase I et 5 picogrammes de désoxyribonucléase I, du trishydroxyaminométhane (7,5 mM), du chlorure de magnésium (3,5 mM), du Beta-mercaptoéthanol (10 mM), de l'albumine bovine (50 microgrammes/ml) et du glycérol (0,5 %, poids/volume). Les tubes sont incubés 1,5 heure à 370C. 4ème étape Les 50 microlitres de la réaction sont déposés 2 sur un carré de papier Whatmann DE 81 de 2,25 cm . Le filtre est séché puis placé dans un bécher et lavé sous agitation rotative, successivement 3 fois 5 minutes par 100 ml de solution de formate d'ammonium (HCOONH4) 0,3 M et d'hydrogène phosphate disodique (Na2HPO4) 0,01 M pH 7,8 2 fois 5 minutes par 100 ml d'éthanol à 95 % et 1 fois 5 minutes par 50 ml de diéthyléther. Le filtre est séché à la chaleur puis placé dans un tube pour comptage radioactif, contenant 5 ml de liquide scintillant ("Ready Solve" Beckman, par exemple).Dans ces conditions, l'activité spécifique obtenue pour une efficacité de comptage de 30 % environ, est de 10 000 à 15 000 cpm par nanogramme d'ADN et la radioactivité retenue sur le filtre non spécifiquement en l'absence d'ADN est de 30C à 600 cpm. Exemple 2 Dosage d'ADN dans le plasma de souris auxquelles avait été injec-té un lipopolysaccharide d'ori gine bactérienne. Pour déterminer l'efficacité du procédé conforme à la présente invention dans le cadre de recherches physiologiques et pathologiques, on a effectué une estimation en série de 1'ADN présent dans le plasma de souris ayant reçu une injection d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne / connu comme capable d'entraîner dans le sang de ces souris la libération massive d'ADN en position extra-cellulaire, FOURNIÉ & Al. J. Exp. Méd. 140, 1189-1206 7. L'expérimentation a été menée comme suit des souris femelles de race C57B1/6 âgées de 8 semaines ont reçu une injection de 100 ssg d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne dans les conditions décrites par FOURNIÉ & Al. (référencé ci-dessus). Des prélèvements de sang ont été collectés par ponction à partir des sinus orbitaux, à différents intervalles de temps après l'injection du lipopolysaccharide et 1'ADN libéré dans le plasma a été dosé par le procédé conforme à la présente invention, respectivement 2h, 4h, gh, 1Oh, 12h, 18h | après l'injection du 2 jours, 3 jours et 7 jours 3 lipopolysaccharide Les dosages effectués ont fait ressortir une augmentation significative de 1'ADN circulant déjà 2h après l'injection du lipopolysaccharide ; ; la présence de quantités élevées d'ADN (supérieures à 1 ssg/ml) de 10 à 18 h parès l'injection du lipo polysaccharide ; la persistance d'une augmentation significative de 1'ADN dans le plasma au jour 3 le retour à des taux normaux d'ADN au jour 7. Exemple 3 Vérification de la précision du dosage effec tué par le procédé conforme à la présente invention Pour vérifier la valeur du procédé conforme à la présente invention, de 1'ADN a été évalué dans un échantillon de plasma dans lequel avait été ajoutée une quantité connue d'ADN. La valeur trouvée a été comparée à celle obtenue pour le plasma seul (c'est-a-dire sans addition d'ADN) et à la valeur obtenue pour un échantillon d'ADN traité de façon analogue. Le Tableau I ci-dessous fait apparaître les résultats suivants TABLEAU I Dosage d'ADN dans des échantillons de plasma (1) Plasma(2) seul Plasma ADN seul + ADN froid cpm(3) 1527 352 7438 818 6206 663 ng(4) 0,17 0,04 0,83 0,09 0,69 0,07 ng 0,17* 0,04 0,83 * 0,09 0,69 * 0,07 (1) Le dosage de 1'ADN a été effectué sur les 2/3 de i : 15 1 de plasma (plasma seul) ii : 15 iil de plasma auquel avait été ajouté 1,5 ng d'ADN froid iii : 1,5 ng d'ADN froid après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol en présence de gélatine en tant qu'agent coprécipitant, conformément à l'invention La réaction de"Nick Translation" a été effectuée en 1 heure à 370C. (2) Plasma humain prélevé chez un sujet sain (3) Résultats calculés à partir de 4 prélèvements, exprimés comme étant la moyenne t une déviation standard de cpm du 3H dCTP incorporé. Ces résultats sont corrigés 3 pour la fixation non spécifique du H dCTP libre sur des filtres DE81 (411 + 37). (4) Nanogrammes d'ADN trouvés dans les échantillons trai- tés (moyenne t une déviation standard de 4 prélève ments) calculés à partir de l'activité spécifique (9003 t 212 cpm/ng) obtenue sur un échantillon stan dard de 1 ng d'ADN marqué par "Nick translation" en présence de gélatine. Les résultats réunis dans le Tableau I cidessus font apparaître que 1. L'ADN peut etre détecté dans le plasma, 2. La quantité d'ADN trouvée dans les échantillons pré parés par addition d'ADN froid à un plasma, est con forme aux valeurs trouvées dans le plasma seul et dans les échantillons d'ADN seul. A noter que le pourcentage de récupération d'ADN radiomarqué (68 t 8 n = 8) et le pourcentage de récupération de 1'ADN marqué par "Nick Translation" après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol (67 t 9 ; n = 8) sont similaires. Le pourcentage de récuparation de 1'ADN radiomarqué, est identique pour tous les échantillons, qu'ils aient été traités en présence ou en l'absence de plasma. I1 ressort des exemples d'application qui précèdent que le procédé qui fait l'objet de la présente invention permet de doser quantitativement 1'ADN dans le plasma et constitue un procédé facile à mettre en oeuvre, pouvant être exécuté à l'aide d'un kit de"Nick Translation" disponible dans le commerce et ne requérant qu'un appareillage pour le comptage d'échantillons radioactifs. Le procédé conforme à la présente invention est reproductible, suffisamment sensible pour détecter de 1'ADN dans des échantillons de 10 p1 à des concentrations comprises entre 12 et 800 ng/ml, encore qu'il puisse détecter des concentrations d'ADN moindres, aussi basses que 1,5 ng/ml, avec cependant une reproductibilité des résultats d'un échantillon à l'autre moins bonne que des concentrations inférieures à 12 ng/ml. Le procédé conforme à la présente invention semble présenter une spécificité très grande à l'égard de 1'ADN : l'incorporation de dCTP tritié dans des échantillons de ARN est 104 inférieure à ce qu'elle est dans les échantillons d'ADN, ceci étant probablement lié à une contamination des préparations d'ARN par de 1'ADN. Le procédé conforme à l'invention permet de récupérer pratiquement la totalité de 1'ADN contenu dans le plasma, qui est intégralement marqué par "Nick Translation". En outre, le procédé conforme à la présente invention est plus rapide que les procédés proposés dans l'Art antérieur et permet de marquer 1'ADN extrait du plasma, par Nick Translation, en moins de 4 heures. Le procédé conforme à la présente invention devrait, en raison des avantages qu'il présente, dont certains ont été précisés dans ce-qui précède, permettre une meilleure compréhension de la signification pathophysiologique de l'augmentation des taux d'ADN plasmatique chez l'homme aussi bien que dans des conditions expérimentales et devrait être un outil de grande valeur pour l'étude des maladies du type lupus dans le développement desquelles sont impliqués des complexes ADN-anti-ADN et plus généralement pour l'établissement notamment, de diagnostics d'affections bactériologiques, virologiques, parasitologiques, génétiquement transmises, cancéreuses ou vasculaires. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes - une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquidé biologique acellulaire dans lequel on veut doser 1'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraactique (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ), pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la tota lité de 1'ADN - une deuxième étape de récupération de 1'ADN de ladite solu tion aqueuse, qui consiste à précipiter 1'ADN par adjonction à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un agent de précipitation avantageusement constitué par un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le tampon Tris-hydroxyaminométhane ou analogue - une troisième étape, de marquage par "Nick Translation", de 1'ADN récupéré, qui consiste à incuber 1'ADN avec un ou plu sieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués et avec de 1'ADN polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxyaminométhane, le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5 merceptoéthanol et le glycérol - une quatrième étape de dosage de 1'ADN qui consiste à doser 1'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur in corporé à 1'ADN. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récu péré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d'au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radioactif, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN, consiste à compter la radioactivité présente sur un filtre papier sur lequel a été déposé 1'ADN marqué et qui a subi des lavages par des agents de lavage appropriés, puis a été séché, par comptage direct ou après immersion dans un liquide scintillant, en fonction de la nature du radioisotope de marquage. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réalisé au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN consiste à révéler 1'ADN après fixation du composé enzymatique approprié, en présence d'un substrat chromogène. 4. Procédé selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le liquide biologique acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel on cherche a doser 1'ad, est mélangé à raison de quelques microlitresf au cours de la première étape du procédé, avec de l'acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) pour obtenir une concentration finale d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 mSI (pH 8 environ) et la solution obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon approprié tel que Tris-hydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8 environ, notamment. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de coprécipitation introduit au cours de la deuxième étape du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gélatine, les diamines telles que la spermidine, les acides ribonucléiques, des polynucldotides de synthèse, les protéines comportant des groupes réactifs possèdant des charges positives telles qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour 1'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick Translation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent de précipitation mis en oeuvre au cours de la deuxième étape du procédé, est de l'éthanol. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'éthanol ou autre alcool inférieur utilisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de centrifugation, en quantité appropriée pour obtenir une concentration finale en éthanol égale ou supérieure à 66 %. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la phase aqueuse contenant 1'ADN, un agent de précipitation et un agent de coprécipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation de 1'ADN. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le précipité est lavé par de l'éthanol ou autre agent de précipitation analogue, puis la solution obtenue est à nouveau centrifugée et le précipité, essentiellement constitué par de l'ADN, est récupéré. 10. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 9, cardctérié en ce que 1t ADN précipité est récupéré par addition d!eau. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,caractérisé en ce que le marquage par"Nick Translation" est effectué, au cours de la troisième étape du procédé, par incubation de 1'ADN récupéré, avec 2 à 50 picomoles d'un ou de plusieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxynucléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogrammes de désoxyribonucléase-I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxyaminométhane (5-12 mM), de chlorure de magnésium (2-5 mM), de B-mercapto-éthanol (7-15 mMJ, d'albumine bovine (20-60 microgrammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume). 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée à une température comprise entre 15 et 370C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures. 13. Procédé selon l'une quelconque des reven aications 1 à 12 caractérisée en ce qu'au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est déposé 1'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une solution de forte molarité permettant d'éliminer les nucléotides marqués non-incorporés à 1'ADN tout en conservant sur le filtre la totalité de 1'ADN marqué.