Brevet FR2588015A1 — publié le 19870403

La présente invention se rapporte à l'utilisation de microorganismes ayant une activité considérablement amplifiée de transaminase dans la production de L-aminoacides (ci-après "aminoacides"). Plus particulièrement, le gène codant pour cette activité de transaminase est transféré du génome bactérien d'origine aux plasmides en copies multiples. Les microorganismes transformés par ces plasmides recombinants présentent une activité considérablement accrue de transaminase en conditions appropriées. Par ailleurs, cette activité enzymatique est thermiquement stable. Par suite, dans la production d'aminoacides par transamination, les organismes génétiquement produits décrits ici dépassent significativement les isolats naturels. La transamination est normalement définie comme la réaction entre un aminoacide et un cétoacide qui a pour résultat le transfert des groupes amino et céto entre les deux matières premières. On sait que des cétoacides précurseurs peuvent être convertis enzymatiquement en aminoacides correspondants. Les enzymes qui interviennent dans le transfert réel de ces groupes sont alternativement appelées "transaminases" ou "aminotransférases". Comme exemple de ce type de réaction, le brevet US No. 3 183 170 (Kitai et autres) révèle la transamination de cétoacides précurseurs en présence d'un système multienzymes obtenu de diverses sources, comprenant des cellules bactériennes récoltées, des cellules séchées, des macérats de cellules ou des solutions d'enzymes. Le système multi-enzymes de Kitai et autres consiste en déshydrogénase, hydrogénase, transaminase, accepteurs d'hydrogène et système de transport d'électrons. Comme exemple, les gènes d'aminotransférase de E. coli ont été décrits dans "Escherichia coli Mutants Deficient in the Aspartate and Aromatic Amino Acid Aminotransferases" de Gelfand et autres, volumel30, pages 42940 (1977) et ont été désignés par ilvE, tyrB et aspC. On sait que la présence des gènes fonctionnels tyrB et aspC de E. coli allège l'auxotrophie pour la tyrosine, la phénylalanine ou l'acide aspartique. La demande de brevet européen No. 84100521.8 (publiée le 29 Août 1984 sous le No. 0 116 860) (G.D. Searle and Co.) révèle que les gènes d'aminotransférase ilvE, tyrB et aspC peuvent être isolés et utilisés pour construire des microorganismes recombinants capables de produire ces gènes produits d'aminotransférase. Les méthodes d'ADN recombinant sont utilisées pour construire une nouvelle souche microbienne comprenant un gène de transaminase thermiquement stable de Salmonella typhimurium en un nombre supérieur de copies que celui normalement trouvé sur le génome bactérien. Ce gène, codant pour une enzyme qui a été désignée par AT sty 2, est inséré dans un plasmide à copies multiples, et le plasmide recombinant est introduit dans un h8te approprié. Les niveaux élevés résultants du gène produit exprimé de transaminase dans l'h8te transformé provoquent une surproduction de L-aminoacide par transamination d'un donneur amino produit de manière exogène et d'un précurseur de cétoacide. L'enzyme thermiquement stable exprimée est par conséquent moins sensible à l'inactivation à l'exposition à des températures élevées. La bioconversion du précurseur par l'enzyme exprimée de cette invention donne des quantités commerciales considérablement élevées de l'aminoacide produit en comparaison avec les isolats naturels. La présente invention a pour objet principal une souche de microorganismes comprenant des copies multiples d'un gène de transaminase dont le produit thermiquement stable est responsable de la conversion stéréospécifique des alpha-cétoacides en aminoacides. Une telle souche présente un taux considérablement amélioré de conversion en aminoacide, nécessitant des temps sensiblement réduits de résidence dans le récipient réactionnel. Elle a pour autres objets de produire des microorganismes recombinants pouvant être immobilisés par des méthodes conventionnelles et qui expriment une transaminase qui a de meilleures caractéristiques de demi-vie, c'est-à-dire qui ne se dégrade pas ou n'est pas facilement inactivée, même après immobilisation. La présente invention a également pour objet de placer le gène de transaminase souhaité dans une construction plasmidique qui est à la fois structu- rellement stable et stable dans le nombre de copies afin de réduire les problèmes de-traitement associés aux délétions ou transpositions de la séquence d'ADN du gène, ou perte du plasmide. Un objectif supplémentaire est de placer le gène de transaminase sur un plasmide d'un nombre élevé de copies pour des niveaux élevés de l'enzyme exprimée. La présente invention a pour autre objet l'utilisation du gène de résistance à la spectinomycine supporté par un plasmide. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure I est une représentation schématique d'une carte de restriction partielle de pAH27; - la figure 2 est une représentation schématique d'une carte de restriction partielle de pGA108; et - la figure 3 est une représentation schématique d'une carte de restriction partielle de pGA115. Un gène thermiquement stable de transaminase de Salmonella typhimurium est cloné et exprimé dans un hôte pour une utilisation pour la production d'aminoacides. Le gène de transaminase est d'abord isolé et de préférence est lié dans un vecteur sélectionnable multicopie. Un hôte approprié est transformé par le vecteur recombinant contenant le gène de transaminase. La sélection du gène souhaité de transaminase est démontrée par complémentation d'un microorganisme hôte auxotrophe pour l'aminoacide souhaité et par la stabilité thermique de l'enzyme exprimée. Cette enzyme a été désignée par AT sty 2. Un hôte d'expression transformé par le gène de transaminase de S. typhimurium d'intérêt, ou une portion ou un extrait de l'hôte transformé, est capable de la production et de l'accumulation de l'aminoacide en présence d'un alpha-cétoacide précurseur et d'un donneur amino. Des catalyseurs ayant l'activité décrite de transaminase ont des demi-vies très étendues lorsqu'on les utilise pour cette bioconversion. Dans la description, les références au "gène de transaminase" sont considérées comme incorporant des fragments d'ADN comprenant le gène pour AT sty 2 lui-même, le gène plus ADN supplémentaire ou une portion fonctionnelle du gène de transaminase. Le gène de transaminase de AT sty 2 indiqué est le gène de S. typhimurium dont le produit d'expression est une enzyme de transaminase qui est caractérisée par une stabilité thermique et par la capacité de convertir rapidement un cétoacide précurseur en aminoacide correspondant. Le gène de transaminase est isolé directement du génome de S. typhimurium ou bien on peut l'obtenir de toute source pratique de matière génétique de S. typhimurium. Ce microorganisme est disponible au American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (le catalogue ATCC de 1985 donne la liste de 51 souches disponibles). Des souches sont également disponibles de divers laboratoires entreprenant des recherches sur S. typhimurium. Le génome ou matière génétique est partiellement digéré par l'endonucléase de restriction et des fragments d'une dimension pratique, comme environ de à 25 kilobases, sont isolés. Ces fragments sont alors liés à des vecteurs appropriés pour permettre l'isolement des clones actifs de transaminase qui expriment le gène produit thermiquement stable. Lorsque des vecteurs clonant lambda tels que ceux décrits ci-dessous sont choisis, l'endonucléase de restriction Sau 3A est utilisée car les vecteurs lambda acceptent les fragments générés par Sau 3A pour former des librairies relativement erratiques. Dans le mode de réalisation préféré, des hôtes négatifs à l'aminotransférase de E. coli sont utilisés de manière pratique pour déterminer la complémentation. On obtient une souche de E. coli qui est aspC-tyrB-ilvE-, c'est-à-dire une souche qui manque de toute activité de transaminase. La souche DG30 de E. coli K-12 décrite par Gelfand et autres, J. Bacteriology, "Escherichia coli Mutants Deficient in the Aspartate and Aromatic Amino Acid Aminotransferases,", Volume 130, pages 429-40 (1976), peut être utilisée. Cette souche est disponible au E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut. DG30 est auxotrophe pour la tyrosine, la phénylalanine et l'acide aspartique. Alternativement, on peut utiliser la souche DG44 de E. coli K-12, également disponible au E. coli Stock Center. DG44 est aspC-tyrB et est auxotrophe pour l'acide aspartique, la tyrosine et la phénylalanine. D'autres souches auxotrophes peuvent être obtenues ou créées. Les souches DG30 et DG44 de E. coli négatives à la transaminase se transforment à de très faibles fréquences, ce qui diminue la possibilité de détecter des clones ayant une activité de transaminase. Comme le lambda phage peut effectuer la transduction de ces hôtes à une fréquence bien supérieure, la probabilité d'isoler des clones actifs à la transaminase est fortement accrue avec l'utilisation des vecteurs clonant lambda. I1 est tout à fait préférable d'utiliser une construction de phage qui peut exister sous la forme d'un plasmide à de basses températures et sous la forme d'un phage lytique à des températures supérieures. Cette approche de "phasmide" est préférée pour l'efficacité de la transduction et pour l'isolement facile de l'ADN contenant un gène de transaminase identifié par technique conventionnel de récupération des plasmides, bien que cela ne soit pas requis pour la mise en pratique de la présente invention. La tentative du phasmide ainsi que le procédé de construction des vecteurs clonant lambda appropriés sont décrits en détail dans S. Elledge et autres, J. Bacteriology, "Phasmid Vectors for Identification of Genes by Complementation of Escherichia coli Mutants", Volume 162, pages 777-83 (1985). Avant d'utiliser les h8tes négatifs à la transaminase de E. coli pour sélectionner la librairie de phages recombinants, la souche de l'h8te est préparée par transformation avec un plasmide contenant un gène qui exprime le répresseur lambda sensible à la température. En présence du répresseur sensible à la température, le lambda phage décrit peut exister sous la forme d'un plasmide environ 30 C et sous la forme d'un phage lytique à environ 37 C. Un plasmide approprié par lequel on peut transformer les auxotrophes de E. coli est le plasmide pSE103 contenant le gène ci857 qui exprime le répresseur lambda sensible à la température. La construction de ce plasmide est décrite dans l'article cité ci-dessus de Elledge et autres. Tout plasmide contenant le gène cI857 peut être utilisé. La seule condition est la présence du répresseur lambda sensible à la température lui-même. C'est une condition indispensable de la présente invention que le catalyseur exprimé de transaminase ne soit pas soumis à une dégradation ou une inactivation rapides aux températures d'utilisation. Cette stabilité thermique augmentera sensiblement la demi-vie d'utilisation du biocatalyseur à des températures dans la gamme d'environ 10 C à 42 C. De plus, l'enzyme thermiquement stable sera moins susceptible à une inactivation à des températures typiquement utilisées pour l'immobilisation, qui peuvent atteindre environ 45 à 50 C. Une détermination de production d'aminoacides par inactivation à la chaleur est utilisée pour sélectionner les clones contenant la transaminase recombinante. Cette détermination permet une différenciation entre les gènes de transaminase qui sont sensibles à la chaleur et ceux qui sont stables à la chaleur. Des cellules soniquées sont mises en contact avec l'alpha-cétoacide et un donneur amino (par exemple l'acide aspartique), avant et après choc thermique à des températures d'environ 55 C pendant 20 à 30 minutes. La capacité de convertir par voie enzymatique le précurseur en acide aminé après ce traitement est mesurée en déterminant l'aminoacide produit, par exemple par HPLC. Les clones qui présentent cette capacité contiennent le gène AT sty 2 souhaité. L'alpha-cétoacide choisi pour une utilisation avec ce procédé dépendra de l'aminoacide qui est le produit souhaité. Par exemple, l'acide phénylpyruvique est converti en L-phénylalanine, l'acide alpha-cétoiso- caproique en L-leucine, l'acide alpha-cétoisovalérique en L-valine, l'acide alpha-céto- D-méthyl valérique en L-isoleucine, l'acide pyruvique en L-alanine, l'acide oxaloacétique en acide L-aspartique, l'acide: -hydroxy- alpha-cétobutyrique en L-thréonine, l'acide p-hydroxy- phénylpyruvique en L-tyrosine, l'acide indole pyruvique en L-tryptophane, et autres. Comme on peut le voir, des précurseurs conventionnels de Laminoacide sont utilisés dans le procédé de l'invention. Cependant, on a démontré que l'enzyme AT sty 2 avait une activité particulièrement élevée dans la conversion de l'acide phénylpyruvique en L-phénylalanine. Bien entendu, ces précurseurs peuvent être utilisés aussi bien dans la détermination de la production de -'amrinoacide par inactivation à la chaleur et dans la production du L-aminoacide souhaité. Après avoir isolé les clones thermiquement stables actifs à la transaminase, la confirmation est faite pour garantir que l'activité est le résultat de la présence d'un phasmide recombinant contenant le gène AT sty 2 plut8t qu'un révertant chromosomique. On fait croître les clones et l'on induit la production de phages à environ 420C. Les titres-de phages sont mesurés pour assurer qu'il en existe de grandes quantités. Ensuite, les vecteurs phasmidiques considérés comme comprenant le gène AT sty 2 sont isolés des clones sous une forme plasmidique. Les plasmides isolés sont introduits dans une souche de E. coli négative à la transaminase en utilisant des processus standards, par exemple, le processus de transformation décrit par Maniatis et autres dans "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", pages 250-51 (Cold Spring Harbor Laboratory 1982), ou les processus de transduction décrits par Davis et autres dans Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor 1980). Seule la matière génétique comprenant un gène fonctionnel de transaminase complémentera les lésions de la souche hôte, la libérant de son auxotrophie. En effet, seuls les transformants comprenant un gène exprimé de transaminase peuvent croltre sur des plaques de milieu minimum sans aminoacides supplémentaires. On peut en déduire que les plasmides dans ces clones comprennent et expriment un gène de transaminase, car l'auxotrophie de l'hôte est délivrée. Ayant identifié les clones contenant le phage hybride avec le gène de transaminase thermiquement stable souhaité, des phages de ces clones subissent une transduction dans un hôte contenant un gène cI857 chromosomique afin d'empêcher la contamination par le plasmide d'origine, c'est-à-dire pSE103, lors de l'isolement de l'ADN phasmidique recombinant. Les cellules ayant subi la transduction sont incubées à des températures suffisantes pour induire la production du phage et la lyse (c'est-à-dire 37 C). On isole ainsi le phage contenant le gène souhaité. Cela confirme l'état extrachromosomique du gène souhaité de transaminase. Le phage isolé peut être utilisé pour la production de cartes de restriction, si on le souhaite, et pour le sous-clonage en un vecteur à multiples copies. Dès que la matière génétique a été isolée qui comprend le gène AT sty 2, il est souhaitable de transférer le gène à un plasmide d'un nombre élevé de copies. Des copies multiples du plasmide dans l'h8te transformé assureront des copies multiples du gène de transaminase. De cette manière, l'activité de transaminase de chaque cellule peut être accrue de multiples fois. Il peut également être souhaitable, à ce moment, de réduire la dimension du fragment d'ADN recombinant par scission avec des endonucléases de restriction. Le fragment d'ADN contenant le gène de transaminase est sous-cloné en un vecteur à multiples copies appropriées à la transformation de la souche de l'h8te souhaité. I1 est préférable d'utiliser un plasmide sélectionnable, par exemple un plasmide avec des gènes de résistance aux antibiotiques permettant la sélection biologique et le maintien du plasmide. Si E. coli doit être le microorganisme h8te, un vecteur particulièrement approprié est le plasmide pBR322, qui porte des gènes pour la résistance à l'ampicilline (Apr) et à la tétracycline (Tcr) et qui sera typiquement présent en environ 10 à 20 copies. Lorsque l'on utilise la résistance aux antibiotiques pour le maintien du plasmide, seuls des microorganismes qui maintiennent le plasmide (avec son ou ses gènes de résistance aux antibiotiques et également avec le gène de transaminase) crottront dans un milieu auquel l'antibiotique approprié a été ajouté. D'autres antibiotiques ou d'autres procédés pour le maintien des plasmides et la stabilité peuvent être utilisés, si on le souhaite. Le fragment d'ADN isolé ci-dessus qui a été déterminé comme contenant le gène de transaminase AT sty 2 de S. typhimurium est lié au plasmide choisi par des méthodes conventionnelles. Le fragment peut être excisé du phasmide recombinant isolé ci-dessus par digestion avec une enzyme appropriée de restriction. Le fragment excisé d'ADN est alors lié au plasmide choisi. Les cartes de restriction partielle des plasmides préparés selon cette description sont montrées aux figures 1 et 2. La figure i représente l'analyse des enzymes de restriction du plasmide pAH27 préparé aux exemples IV et V. Les figures 2 et 3 représentent l'analyse d'enzymes de restriction des plasmides pGA108 et pGA115, respectivement, préparés aux exemples VI et VII. En référence au mode de réalisation préféré, o l'on utilise lambda SE4 (voir exemple I) ou une construction semblable, le gène Spr est placé à proximité du gène de transaminase et il faut prendre soin de choisir une endonucléase de restriction appropriée qui excisera un fragment d'ADN contenant les deux gènes. Un plasmide qui contient le gène Spr en amont du gène de transaminase AT sty 2 s'est révélé donner une performance remarquable et est la construction tout à fait préférée. La spectinomycine est bien appropriée au maintien ou à la conservation du plasmide du fait de son relativement faible prix et de sa durabilité. De plus, l'expression du gène de transaminase peut être améliorée par le promoteur r du gène Spr. Dans tous les cas, ce mode de réalisation a pour résultat des niveaux élevés de manière inattendue de l'expression de la transaminase et de stabilité. Afin de confirmer que le plasmide recombinant contient le gène souhaité de transaminase, le plasmide peut être de nouveau isolé et introduit dans une souche négative à la transaminase, comme on l'a décrit ci-dessus. Seuls les organismes qui ont reçu le plasmide avec le gène de transaminase formeront des colonies sur un milieu minimum. Une confirmation supplémentaire peut être obtenue par une croissance de manière à choisir le plasmide lui-même. Par exemple, si le plasmide contient des gènes codant pour la résistance à la spectinomycine, la croissance sur des plaques contenant cet antibiotique confirme la présence du plasmide. Dans le mode de réalisation tout à fait préféré de la présente invention, le olasmide est préparé comme décrit aux exemples I à IV. En effet, le fragment d'ADN contiendra à la fois le gène AT sty 2 thermiquement stable de S. typhimurium et le gène de résistance à la spectinomycine. Le vecteur plasmidique préféré est pBR322 et la souche du microorganisme hôte préférée est E. coli. Il en résulte des niveaux élevés et stables de manière inattendue de l'activité de transaminase. Cela est inhabituel du fait de la dimension relativement grande du fragment d'ADN, dont on pourrait s'attendre à ce qu'elle ait pour résultat un faible nombre de copies et par conséquent de faibles niveaux d'expression. De plus, on pourrait s'attendre à ce qu'un plasmide de cette dimension soit relativement instable. Cependant, des tentatives pour diminuer la dimension du fragment d'ADN et du plasmide (exemple VI) ont eu pour résultat une diminution de l'activité de transaminase (exemple VIII) et de la stabilité. Une fois que le gène AT sty 2 est placé sur le plasmide souhaité, le plasmide recombinant est introduit dans l'hôte souhaité. Les souches de E. coli sont des hôtes particulièrement appropriés du fait de la profusion de renseignements concernant leur manipulation. Par ailleurs, comme on l'a indiqué ci-dessus, l'introduction du gène de transaminase de S. typhimurium dans E. coli s'est révélée avoir pour résultat des niveaux inhabitdel& ment--et-nespSrément élevés et stables d'expression. Une souche de Salmonella peut elle-même être utilisée pour l'hôte, si on le souhaite. Une souche de microorganismes nouvellement créée de cette invention comprend des copies mutiples placées sur le plasmide du gène AT sty 2 thermiquement stable de S. typhimurium et présente une augmentation multiple de l'activité de transaminase en comparaison avec les isolats naturels. Les microorganismes recombinants sont préparés en les faisant croître dans des conditions appropriées à la maximisation de l'activité de transaminase dans les cellules. En général, les conditions conventionnelles pour obtenir la croissance de cellules saines seront appropriées. En effet, on peut faire croître les microorganismes à un pH d'environ 6,5 à environ 8, de préférence d'environ 7 à 8. La température doit être d'environ 20 à 42 C, de préférence d'environ 370C. Des milieux conventionnels de croissance peuvent être utilisés pour préparer les cellules recombinantes de cette invention. Les milieux doivent contenir une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et, si on le souhaite, d'autres aliments organiques ou inorganiques mineurs qui peuvent être requis pour la croissance de l'organisme hSte sélectionné. En général, les directives suivantes sont appropriées. Comme source de carbone, on peut utiliser des sucres fermentables. Comme sources d'azote, l'urée, des hydrolysats de protéines, des sels d'ammonium d'acides organiques (comme l'acétate d'ammonium ou l'oxalate d'ammonium) et/ou des sels d'ammonium d'acides inorganiques (comme le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium) peuvent être satisfaisants. Des éléments inorganiques (comme le phosphate de potassium ou le phosphate de magnésium) - et/ou des vitamines (comme la thiamine, la biotine) peuvent être ajoutés. Le choix spécifique des composants des milieux de croissance dépendra du microorganisme hôte choisi. Les cellules sont récoltées après croissance et soit les cellules ou une portion ou un extrait de celles-ci peuvent être utilisés dans la bioconversion d'un cétoacide précurseur et d'un donneur amino en aminoacide correspondant. Tout procédé pratique ou processus peut être utilisé qui met l'enzyme de transaminase en contact avec le précurseur et le donneur amino. Par exemple, des cellules entières, des cellules soniquées ou des extraits d'enzymes (bruts ou purifiés) peuvent être utilisés. Alternativement, la bioconversion peut être entreprise par fermentation d'une culture vivante, croissant de manière active avec le précurseur et le donneur amino ajoutés au milieu de croissance. Il peut être préférable d'immobiliser les cellules ou l'enzyme pour une utilisation dans un réacteur discontinu ou continu. De cette manière, l'utilisation de l'activité de transaminase des cellules ou de l'enzyme peut être rendue maximale, tout en minimisant simultanément la manipulation et en éliminant les besoins des milieux de croissance et les conditions. La transaminase thermiquement stable de la présente invention est idéale pour une immobilisation par des méthodes nécessitant des températures élevées. Même après avoir été soumise aux températures requises pour l'étape d'immobilisation, une activité sensible de transaminase est conservée. Les cellules ou enzymes immobilisées peuvent être mises en contact directement avec une solution du précurseur et du donneur amino. Le rapport molaire du donneur amino au cétoacide précurseur, c'est-à-dire de l'acide aspartique à l'acide phényl- pyruvique, doit être d'environ 1:1 à environ 1,5:1. Les souches de microorganismes de cette invention offrent des avantages significatifs dans la conversion des alpha-cétoacides en aminoacides. L'activité de transaminase est telle que l'allure de conversion en aminoacides est très rapide. Cela permet la réduction des temps de résidence dans le récipient du réacteur. On peut résoudre les problèmes associés à la rupture du précurseur, à leur tour, en réduisant le temps de réaction. Les souches de microorganismes ceux de cette invention produisent une enzyme de transaminase caractérisée par une longue demivie, étendant fortement la durée utile du catalyseur. La quantité et la stabilité de l'activité de transaminase dans les cellules sont fortement améliorées par les techniques recombinantes décrites ici. Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas en limiter le cadre. Les abréviations suivantes ont été utilisées dans toute la description de l'invention: Apr - résistant à l'ampicilline ATP - adénosine triphosphate C - degré (s) Celsius ADN - acide désoxyribonucléique DTT - dithiothréitol EDTA acide éthylènediamine tétraacétique g - gramme (s) HPLC - Chromatographie liquide haute pression IAA - alcool isoamylique kb - kilobase (s) M - mole (s) mM - millimole (s) pg - microgramme (s) ).l - microlitre (s) mn minute (s) nm - nanomètre (s) DO - densité optique UDO - Unités de densité optique P-5-P - Pyridoxal-5-phosphate PEG - polyéthylène glycol t/mn tours par minute SDS - dodécyl sulfate de sodium Spr - résistant à la spectinomycine TCA - acide trichloroacétique Tcr - résistance à la tétracycline Tcs - sensible à la tétracycline TES - chlorure de Tris-EDTAsodium Tris - tris(hydroxyméthyl)-aminométhane. Les milieux, tamrpons ou solutions concentrées ont été préparés pour une utilisation dans les exemples. Tous ont été produits avec de l'eau désionisée. Milieu minimum MgS04. 7H20 0,20 g/1 Citrate monohydraté 2,00 g/1 K2HP04 10,00 g/1 NaNH4HP04.4H20 3,50 g/i Glucose 0,50 % Succinate 0,25 % Malate 0,25 % Histidine 0,10 mg/ml Arginine 0,10 mg/ml Asparagine 0,10 mg/ml Glutamine 0,10 mg/ml Isoleucine 0,10 mg/ml Leucine 0,10 mg/ml Valine 0,10 mg/ml Acide glutamique 0,10 mg/ml Alpha-céto-glutarate 1,00 mg/ml Thiamine-HCl 0,01 mg/ml Agar noble (Difco) 1,50 % Les quatre premiers ingrédients ont été mélangés et passés à l'autoclave à 121 C pendant 15 0_ _ _ 3Q minutes pour les stériliser. L'agar a été passé à l'autoclave séparément. Les composants stérilisés ont été mélangés et refroidis puis les ingrédients ont été ajoutés. Milieu complexe (bouillon de Luria) Bactotryptone (marque déposée) (Difco) Extrait de levure Bacto (marquedéposée) (Difco) NaCl NaOH ,0 g/l ,0 g/l ,0 g/l 1,5 ml/l Le milieu a été passé à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes pour le stériliser. On l'a utilisé sous forme liquide ou sous la forme de plaques solides, qui ont été préparées par solidification avec 1,5% d'Agar noble (Difco). Tampon de lysozyme Tris-HC1 (pH 8,0) Na2EDTA NaCl1 Saccharose Lysozyme ,0 mM ,0 mM ,0 mM ,0 % 1,0 mg/ml On a ajouté le lysozyme avant utilisation. Tampon de SDS SDS (10%) 20,0 ml Na2EDTA (500,OmM) (pH 8,0) 20,0 ml TES 120,0 ml Tampon de TES Tris-HCl (pH 7,5) NaCl Na2EDTA (500,0 mM) (pH 8,0) Tampon de ligase ATP DTT Tris-HCl (pH 7,8) MgCl2 0,020 M 0,100 M 0,005 M 1,0 mM ,0 mM ,0 mM ,0 mM Milieu modifié de Lowry Bactotryptone (marque déposée)(Difco) Extrait de levure Bacto (marque déposée) (Difco) NaCl1 KH2PO4 K2HP04 MgS04.7H20 ,00 g/l ,00 g/l ,00 g/l 0,50 g/l 4,00 g/l 0,25 g/l. On a fait passer le milieu à l'autoclave à C pendant 20 minutes pour le stériliser. Solution de transaminase Acide phénylpyruvique Acide aspartique ZnSO4. 7H20 Pyridoxal-5-phosphate 31,00 g/l 28,90 g/l ,00 g/l 0,02 g/l La solution aqueuse a été préparée et son pH ajusté à 7,8 avec NaOH. Réactif (exemple IV) Pyridoxal-5-phosphate 2,5 mg Alpha-céto-glutarate 105,0 mg L-phénylalanine 245,0 mg Phénazine méthosulfate 3,0 mg Tétrazolium bleu Nitro 24,0 mg On a produit, des ingrédients ci-dessus, une quantité de 50,0 ml du réactif, on a ajouté 0,1 mole de KHPO4 (un mélange de-K2HPO4 et de KH2PO4 aux proportions i0 suffisantes pour donner le pH indiqué), tout en agitant, pour mettre le mélange à pH 7,5. Exemple I. (isolement d'un gène de transaminase) Une librairie génétique de Salmonella t phimurium sous la forme du phage hybride lambda SE4 a été obtenue de G. Walker, Massachusetts Institute of Technology. On a construit lambda SE4 en liant le plasmide à l'origine de la réplication et le gène de résistance à la spectinomycine (Spr) du plasmide pDPT427 à faible nombre de copies dans lambda 1059. Le tout est décrit dans "Phasmid Vectors for Identification of Genes by Complementation of Escherichia coli Mutants" de S.Elledge et autres, J. Bacteriology, volume 162, pages 717-83 (1985). Cette construction lambda en présence du répresseur lambda sensible à la température peut exister sous la forme d'un plasmide, c'est-à-dire à l'état lysogénique, à de basses températures et à l'état lytique à de hautes températures. L'ADN de Salmonella typhimurium a été partiellement digéré par l'endonucléase de restriction Sau 3A et des fragments de 12-17 kb ont été isolés. Lambda SE4 a été digéré par l'endonucléase de restriction Bam HI. Les fragments d'ADN de Salmonella ont été liés au lamnbda SE4 linéaire. Après emballage in vitro, les phages recombinant contenant les fragments d'ADN de 12-17 kb ont été choisis. Pour ces étapes, les processus décrits dans l'article de Elledge et autres ont été suivis. Les phages recombinants choisis ont été introduits dans E. coli M5158 après passage à travers un lysogène P2. Les phages recombinants lambda SE4 ont été isolés de E. coli M5158 en utilisant une induction à haute température. On a fait croître les cellules à 30 C jusqu'à la phase moyenne logarithmique (D0 550-0,4), elles ont été déplacées à un shaker à bain d'eau de 43 C pendant 30 minutes puis incubées à 37 C pendant environ 2 heures. On a ajouté CHCl3 après incubation. On a récupéré des concentrations de 1,0 x 104 à 5,0 x 108 phages/ml. Avant sélection de la librairie de phage lambda, les souches DG30 et DG44 de E. coli K-12, toutes deux obtenues du E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, ont été transformées par le plasmide pSE103 (obtenu de G. Walker et décrit par Elledge et autres) contenant le gène cI857 qui exprime le répresseur lambda sensible à la température. De plus, pSE103 porte le gène de résistance à la kanamycine (Kmr) pour la conservation du plasmide. Lorsque les souches transformées de E. coli (DG30/pSE103 et DG44/pSE103) ont subi une transduction avec le lambda phage recombinant obtenu ci-dessus, lambda a pu être maintenu à l'état lysogénique à de basses températures et à l'état lytique à de hautes températures. Les souches DG30 et DG44 de E. coli K-12 sont décrites dans Escherichia coli Mutants Deficient in the Aspartate and Aromatic Amino Acid Aminotransferases", de Gelfand et autres, J. Bacteriology, Volume 130, pages 429-40 (1977). La souche DG30 est sensible à lambda et négative à l'arninotransférase (c'est-à-dire aspC- tyrB-ilvE). La souche DG44 a le génotype de DG30 à l'exception qu'elle est ilvE+; en effet, les caractéristiques la concernant sont qu'elle est sensible à lambda et aspC tyrB ilvE+. Le gène ilvE code l'aminotransférase de l'aminoacide à chaîne ramifiée. La transduction et la complémentation des cellules DG44 de E. coli contenant le répresseur sensible à la température par la banque de lambda ont été accomplies comme suit: on a fait croître DG44/pSE103 à 30 C dans un bouillon de Luria contenant 50,0 pg/ml de kanamycine et 0,2% de maltose jusqu'à une phase de croissance logarithmique moyenne (environ D0550 =0,4). La culture a été centrifugée et remise en suspension dans 1/10 volume du bouillon de Luria. Une portion de 0,1 ml de la culture de cellules a subi une transduction avec la librairie de phage recombinant lambda SE4 isolée ci-dessus en utilisant une multiplicité d'infection de 0,5. Après avoir ajouté le lambda phage, les cultures ont été incubées à 30 C pendant 30 minutes sans agitation, puis lavées deux fois avec 1,0 ml d'une solution contenant 10,0 mM de Tris et 10,0 mM de MgSO4 (pH 7,5). Les cellules ont été centrifugées et remises en suspension dans 0,1 ml de la même solution et plaquées sur le Milieu Minimum, c'est-à-dire un milieu manquant de phénylalanine, de tyrosine et d'acide aspartique. Les plaques ont été incubées à 30 C jusqu'à ce que des colonies apparaissent sur les plaques, environ 4 jours. Les seuls clones capables de croltre sur ce Milieu Minimum sont ceux contenant le lambda phage recombinant la transaminase. Exemple II. (détection de l'activité de transaminase thermiquement stable). Les clones de l'exemple I ont été déterminés afin de choisir ceux contenant un gène codant pour une enzyme de transaminase présentant une stabilité thermique, c'est-à-dire l'enzyme AT sty 2. On a fait croÂtre les souches à examiner dans un bouillon de Luria à 30 C pendant une nuit. Les cellules ont été soniquées et chaque échantillon a été réparti en deux portions. Une portion (environ 1,0 ml) a été maintenue sur de la glace pendant 23 minutes en tant que témoin. L'autre (environ 1,0 ml) a été incubée dans un shaker à bain d'eau à 55 C pendant 23 minutes. A 0,5 ml de chaque portion (c'est-à-dire le témoin et la portion chauffée pour chaque clone), on a ajouté 4,5 ml d'une solution formée de 90,0 ml d'acide aspartique (0,1 M), 30,0 mg de P-5-P, et 1860,0 mg d'acide phénylpyruvique. On a incubé à 30 C. Des échantillons ont été prélevés initialement à 60 minutes, et la réaction arrêtée par addition de 40,0 pl de TCA (solution concentrée à 50%) par échantillon de 0,8ml. Les échantillons ont été analysés à la recherche de la phénylalanine par HPLC. Deux clones désignés par DG44-I et DG44-IV présentent nettement une activité de transaminase thermiquement stable, avec environ 75% de l'activité de transaminase conservée après chauffage, en comparaison à la portion témoin. Exemple III. (Confirmation du phage hybride contenant une activité d'aminotransférase). Les clones DG44-I et DG44-IV de l'exemple II ont été testés pour confirmer que l'expression de la transaminase était le résultat du phage hybride contenant le gène AT sty 2, plut8t qu'un agent de réversion chromosomique. On a fait croître les clones sur des milieux complexes et on a induit la production de phages. De chaque clone, on a détecté les concentrations de phage d'environ 2,0 x 103 phages/ml. Les phages isolés ont subi une transduction en DG44/pSE103 et DG30/pSE103 de E. coli, chacun contenant le répresseur lambda sensible à la température. Les cellules ont été plaquées sur le milieu minimum (c'est-à-dire un milieu manquant de phénylalanine, tyrosine et acide aspartique), et incubée à 30 C. Au bout de 5 jours, des clones DG44pSE103 recomplètés étaient apparents et une incubation prolongée a également révélée des clones DG30/pSE103 recomplètés. Une détermination de la production de phénylalanine par inactivation à la chaleur comme décrit à l'exemple II a été accomplie et tous les clones ont montré une activité de transaminase stable à la chaleur. Pour obtenir de grandes quantités d'ADN contenant le gène AT sty 2, des préparations de plasmide à grande échelle ont été effectuées par le processus suivant. Un milieu complexe avec 50;O pg/ml de spectinomycine a été inoculé de cellules ayant subi une transduction et on a incubé pendant une nuit. Les cellules ont été centrifugées et la boulette remise en suspension dans 4,0 ml d'un tampon de lysozyme et placée dans un tube de centrifugeuse Sorvall SS-34. La suspension de cellules dans le lysozyme a été incubée à 37 C pendant 15 minutes et l'on a ajouté 16,0 ml de tampon SDS sous une légère agitation jusqu'à ce qu'elle soit limpide. On a ajouté 5 ml de NaCl à 5 Met on a incubé à -20 C pendant une heure avec ensuite centrifugation dans un rotor SS-34 à 20 000 t/mn pendant 30, 0 minutes. On a ajouté 5 ml de PEG du type 8000 à 50%, dans le liquide surnageant qui a subi une incubation sur de la glace pendant 1 heure, on a centrifugé à 10000 t/mn pendant 10,0 minutes et le liquide surnageant a été rejeté. La boulette a été doucement dissoute dans 5,0 ml de tampon TES et l'on a ajouté 0,33 ml d'une solution à 2,0 mg/ml de RNase. On a incubé à 65 C pendant 20 à 30 minutes. A chaque tube, on a ajouté et mélangé 9,3 g de chlorure de césium. Le volume final a été ajusté à 10, Oml par tube en utilisant in tampon TES. Ensuite, on a ajouté 100,0 pl de bromure d'éthidium à 10,0 mg/ml, à chaque - tube, et on a mélangé. Chaque échantillon a été chargé dans un tube d'ultracentrifugeuse à autoobturation et on a centrifugé pendant environ 48,0 heures à 40 000 t/mn à 4 C. La bande plasmidique a été recueillie au moyen d'une seringue et le bromure d'éthidium a été enlevé par extraction avec IAA. Les échantillons ont été dialysés pendant une nuit dans une solution tampon de 10 mM de Tris-HC1 et 10,0 mM de EDTA (pH 8,0) avec plusieurs changements du tampon. De plus, des phasmides ont été isolés des clones DG44-I et DG44-IV en utilisant l'isolement rapide de plasmides suivant. On a fait croître les cellules pendant une nuit dans 5,0 ml d'un bouillon de Luria avec pg/ml de kanamycine. La culture a été centrifugée pendant 10 minutes à 10 000 t/mn et la boulette a été remise en suspension dans 1,4 ml de tampon de lysozyme, que l'on a alors subdivisé en deux portions de 0,7 ml (A et B) et que l'on a placé dans des tubes de microfugeuse de Eppendorf. Les cellules ont été incubées à 37 C pendant 20 minutes puis l'on a ajouté 40, 0 pl de SDS à %, à chaque tube de microfugeuse tout en mélangeant par inversion. Ensuite, on a ajouté 60 pl de NaCl à 5M, à chaque tube, et on a mélangé par inversion. Les tubes ont été centrifugés pendant 15 minutes dans une microfugeuse et le liquide surnageant (contenant l'ADN plasmidique) décanté dans les tubes frais, en prenant soin de ne retirer aucun précipité. Au liquide surnageant on a ajouté 5,0 pl d'une solution à 2,0 mg/ml de RNase. On a incubé à 37 C pendant 15 minutes puis extrait une fois avec un volume égal de phénol: CHCl3 (1:1) et une fois avec un volume égal de CHC13:IAA (24:1). Les tubes ont été remplis d'éthanol froid, mélangés et incubés pendant 1 heure à -20 C. Les échantillons ont été microfugés pendant 5 minutes et le liquide surnageant a été déversé. Le précipité restant dans les portions A et B pour chaque clone après second microfugeage a été combiné en ajoutant 100 pl d'eau à chacune, en dissolvant les boulettes et en combinant dans un tube de 200 pl, o l'on avait ajouté 20 yl d'acétate de sodium à 3 M (pH 5,5) et 0,5 ml d'éthanol froid. Les échantillons ont été microfugés pendant 5 minutes, le liquide surnageant rejeté et la boulette remise en suspension dans 150 jl d'une solution tampon de 10,0 mM de Tris-HC1l et 10,0 mM de EDTA (pH 8,0). Les échantillons (20 pl chacun) ont été disposés sur des gels agarose. DG44/pSE103, également préparé par le processus qui vient d'être décrit, a été utilisé comme témoin sur les gels agarose. C'était la souche h8te dont la transduction avait été effectuée à l'origine par le phage hybride sans contenir le phasmide lambda. Le témoin a montré deux bandes, correspondant à l'ADN chromosomique et au plasmide pSE103. Pour les échantillons DG44-I et DG44-IV, une troisième bande, de plus de 50 kb, est apparue, correspondant au grand phasmide, comme on pouvait s'y attendre. Les phages de DG44-I et DG44-IV ont été désignés par lambda SE4 AH-I et lambda SE4 AH-IV, respectivement. Exemple IV (Sous-clonage du gène de transaminase thermiquement stable en plasmide à copies multiples en utilisant l'endonucléase Hind III) Le gène AT sty 2 stable à la chaleur de S. typhimurium a été subcloné de l'ADN du lambda phage hybride SE4 AH-IV en utilisant l'endonucléase Hind III. On a préparé un produit de digestion complète du phage hybride par l'endonucléase Hind III. L'analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN de iambda SE4 AH-I a révélé que deux sites de Hind III, séparés d'environ 17 kb, chevauchent le gène de transaminase et le gène de résistance à la spectinomycine (Spr) (figure 1). Le plasmide pBR322 a également subi une digestion par Hind III. Le fragment d'ADN de 17 kb de l'ADN du phage hybride a été lié au site unique de Hind III de pBR322, inactivant le gène de résistance à la tétracycline, mais laissant intact le gène de résistance à l'ampicilline (Apr). On s'attendait par conséquent à ce que les microorganismes transformés contenant les plasmides hybrides présentent le phénotype SprAprTcs. La ligature a été accomplie par incubation d'un mélange de 1,0 pg de l'ADN de pBR322 déphosphorylé par Hind III, de 1,0 pg de l'ADN de lambda SE4 AH-IV scindé par Hind III, de 25,0 1l de tampon de ligase et d'une unité d'ADN ligase T4 (E.C. 6.5.1.1) à 16 C pendant une nuit. Après incubation, le mélange de ligature a été transformé en cellules compétentes DH2 de E. coli. La souche DH2 a été obtenue du E. coli Genetic Stock Center. La souche DH2 a été choisie parce qu'elle est recA-, ce qui signifie que le plasmide est relativement stable et ne se combinera pas au génome. La transformation a été effectuée par le processus suivant: On a fait croître DH2 dans un bouillon de Luria à 37 C sous une agitation vigoureuse jusqu'à D0550=0,5, puis on a refroidi sur de la glace et on a centrifugé pendant 10 minutes à 7000 t/mn dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 ml. La boulette a été remise en suspension dans un volume égal de 0,1 M de MgC12 stérile froid (4 C). Le mélange a été centrifugé comme ci-dessus et la boulette remise en suspension dans un demi-volume de 0,1 M de CaCl2 (4 C) et refroidie sur de la glace pendant 20 minutes. Cette suspension a été centrifugée comme ci-dessus et remise en 25880-15 suspension dans 1/20 volume de 0,1 M de CaCl2 froid (4 C). On a ajouté un volume de 0,2 ml de ces cellules compétentes, à un tube stérile contenant le mélange réactionnel de ligature décrit au paragraphe qui précède. La suspension ADN/cellules a été incubée sur de la glace pendant 30 minutes puis pulsée à la chaleur à 42 C pendant 2 minutes. Les cellules ont été diluées 10 fois avec le bouillon de Luria et ont subi une incubation à 37 C pendant 2 heures pour permettre l'expression du plasmide. Les cellules ont été plaquées sur des plaques de bouillon de Luria contenant 50 ug/ml de spectinomycine (0,1 ml de la suspension de cellules par plaque) et incubée à 37 C pendant 16-24 heures. Des colonies de Spr ont été disposées sur des plaques séparées de bouillon de Luria contenant soit 50 pg/ml d'ampicilline, 20 pg/ml de tétracycline ou 50 pg/ml de spectinomycine. 22 clones Spr r r ont présenté le phénotype Ap Sp. Tous à l'exception d'un de ceux-ci était Tcs. Un isolement rapide du plasmide a été accompli r r sur les clones AprSpr, en suivant les processus décrits à l'exception III. Une électrophorèse sur agarose d'un produit de digestion d'endonucléase de restriction par Hind III de ces préparations d'ADN a révélé que quatre clones contenaient le schéma de fragments d'ADN attendu: un fragment d'environ 17 kb (gène de transamninase) et un fragment de 4,3 kb (pBR322). Les quatre clones contenant un plasmide ont été soumis à une détermination qualitative de transaminase. On a fait croître les cellules à tester pendant 1 nuit dans un milieu complexe avec 50,0 pg/ml de spectinomycine. On a ajouté une quantité de 25-45 pl de la suspension de cellules à une coupelle de titrage à 24 puits, avec 450 pl du Réactif (exemple IV). La coupelle a été soumise à incubation pendant environ 2 heures à 37 C. Une couleur bleue a indiqué l'activité de transaminase. Les quatre clones se sont révélés avoir une activité considérablement améliorée de transaminase (par exemple par l'intensité de la couleur) en comparaison à la souche parente, DH2 de E. coli, la souche parente donnant des valeurs d'activité d'environ +1 et les clones donnant des valeurs d'activité relative d'environ +5. Les quatres clones ont été désignés par DH2/pAH5, DH2/pAH17, DH2/pAH18 et DH2/pAH27. L'un des clones, DH2/pAH27 a été irrévocablement déposé au Americain Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pour une mise à la disposition du public, et a reçu le numéro d'accession ATCC 53248. Exemple V. (analyse de restriction du plasmide de l'exemple IV) Trois des plasmides de l'exemple IV ont semblé avoir la même dimension d'insert et la même orientation, déterminées par double digestion par enzyme de restriction et sensibilité à la tétracycline. L'un d'entre eux, désigné par pAH27, a été soumis à l'analyse de restriction par digestion complète avec chacune des neuf endonucléases de restriction, dont la liste est donnée au tableau I. Les fragments résultants ont été résolus par taille sur des gels agarose d'électrophorèse. Les six premières endonucléases du tableau I ont coupé pAH27 pour produire 3 à 8 fragments. Ces fragments, dans chaque cas, ont atteint 21- 22 kb pour le plasmide hybride correspondant grossièrement à l'insert de 17 kb et au pBR322 de 4,3 kb. Tableau I. Endonucléase Fragments Pvu I Taille du fragment (kb) 7,2, 1,7, 4,4, 1,5 4, 0, 1,0, 2,5 1,0 Pvu II Cla I Sal I Bam HI Bgl II Bcl I Pst I Eco RI 8,0, 4,5, 4,3, 2,3, 2,0 7,4, 5,0, 4,7, 4,0 7,6, 7,0, 5,0, 1,3 9,5, 6,6, 5,0 , 1,0, 1,0 Les relations et les distances entre les sites de restriction ont ainsi été déterminées par double digestion à l'endonucléase. La carte résultante de restriction est montrée sur la figure 1. Exemple VI. (sous-clonage du gène de transaminase thermiquement stable en plasmide à copies multiples en utilisant l'endonucléase Sau 3A) Le gène de transaminase stable à la chaleur a également été subcloné du lambda SE4 AH-IV phage hybride en utilisant l'endonucléase de restriction Sau 3A. Lambda SE4 AH-IV désigne le phage obtenu du clone DG 44-IV des exemples II et III. Un produit de digestion partielle du phage hybride par l'endonucléase Sau 3A a été préparé, en surveillant pour obtenir des fragments d'ADN dans la gamme de dimension de 4 à i2 kb. Le plasmide pBR322 a été ouvert au site de Bam HI et les fragments de Sau 3A du phage hybride ont été insérés en utilisant les processus de l'exemple IV. L'insertion des fragments au site Bam HI de pBR322 a inactivé le gène Tcr mais a laissé le gène Apr intact. On ne s'attend pas à ce que ces clones soient résistants à la spectinomycine parce que de plus petits fragments d'ADN contenant le gène de transaminase ont été insérés. Après ligature, le mélange a été transformé en cellules compétentes de E. coli DG 30 (négatives à l'aminotransférase), par le processus de l'exemple IV, à l'exception que l'on a fait croître les cellules jusqu'à DO 550=0,25. Les cellules ont été plaquées sur des plaques de bouillon de Luria contenant 50,0 pg/ml d'ampicilline puis disposées en tâches sur des plaques semblables contenant de l'ampicilline et de la tétracycline pour tester le phénotype AprTc et on les a plaquées sur le milieu minimum pour tester la complémentation de l'auxotrophie. Un isolement rapide des plasmides a été accompli sur les clones AprTcs en suivant les processus décrits à l'exemple III. Une électrophorèse sur agarose d'un produit de digestion de l'endonucléase de restriction Hind III des plasmides de treize clones AprTcs a déterminé que deux clones contenaient des plasmides hybrides (désignés par pGA115 et pGA108) avec respectivement des insertions de 8,3 kb et 9,4 kb. Ces clones ont été soumis à la détermination quantitative de l'exemple IV et ont donné des valeurs améliorées d'activité d'environ + 2 à +3. Pour démonter que l'activité de transaminase était dérivée des plasmide +ybrides, on a isolé pGA1i5 et pGA108 par le processus de l'exemple III et on les a réintroduits dans des hôtes DG30 (négatifs à l'aminotransférase) par le processus de transformation de l'exemple IV, en faisant croître les cellules jusqu'à DO 550=0,25. Après transformation par les plasmides pGA108 ou pGA115 isolés, les hôtes DG30 ont été libérés de leur auxotrophie. L'un des clones, DH2/pGA115 a été déposé irrévocablement au Americain Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pour une mise à disposition du public, et a reçu le numéro d'accession ATCC 53247. Exemple VII. (analyse de restriction des plasmides de l'exemple VI). Les plasmides pGA108 et pGA115 de l'exemple IV ont été soumis à une analyse de restriction par digestion complète avec les endonucléases de restriction dont la liste est donnée au tableau II. Les fragments résultants ont été résolus par dimension ou taille sur des gels d'électrophorèse d'agarose. Les fragments, dans chaque cas, se sont additionnés jusqu'à la dimension approximative du plasmide, correspondant grossièrement à un insert de 8,3 kb (pour pGA115) ou un insert de 9,4 kb (pour pGA108) et le le pBR322 de 4,3 kb. TABLEAU II. Endonucléase Fragments Taille du fragment (kb) pGA115 (12,6kb): Pst I Sal I Hind III Eco RI Cla I Bgl II Bam HI pGA108 (13,7kb): Mr... T __ Sal I Pst I Cla I Eco RI Hind III Bam HI Bcl I 6,5, 7,7, 6,9, 12,6 12,6 6,2, 6, 3, 8,2, 7,4, 13,7 13,7 13,7 4,5, 1,6 4,9 ,6 3,4, 2,3, 1,8 ,3, 1,2, 0,9 3,8, 1,7 6,3 Les relations et distances entre les sites de restriction ont été déterminées par plus ample fragmentation en utilisant des digestions doubles à l'endonucléase. Les cartes résultantes de restrictions sont montrées aux figures 2 et 3. Exemple IX. (Augmentations relatives de l'activité de transaminase). Une détermination quantitative a été accomplie pour mesurer les augmentations relatives de l'activité de transaminase de E. coli DH2 à E. coli DH2/pAH27, et de E. coli-DG 30 et DG27 à E. coli DG 30/pGA108 et DG30/pGA115. La détermination colorimétrique au chlorure ferrique pour l'acide phénylpyruvique (processus décrit ci-dessous) mesure la capacité d'un extrait sans cellules à catalyser la réaction suivante: alpha- cétoglutarate + L-phénylalanine glutamate + phénylpyruvate. Des extraits sans cellules de chaque souche ont été préparés en soniquant les cellules, puis en centrifugeant à 15 000 t/mn pendant une heure dans un rotor SS-34. Un échantillon de chacun des extraits sans cellules a été combiné par une solution de substrats de P-5-P, alpha-cétoglutarate et Lphénylalanine et on a incubé dans un bain d'eau à 37 C en diluant avec 0, 25 mole de phosphate de potassium selon la nécessité. On a fait tourbillonner les échantillons toutes les 10 minutes. Au bout d'une heure, on a prélevé un échantillon de 50,0 ul, on l'a ajouté à 50,0 ml d'une Solution de Développement et on fait tourbillonner. Au bout de 5,0 minutes, la densité optique à 640 nm a été lue. Par cette détermination, on a déterminé les activités relatives de chaque souche montrée au tableau III. 25. 8015 25880 15 TABLEAU III. (activités comparatives de transaminase) Souche DH2 Activité relative DH2/pAH27 DG 30 DG 27 DG 30/pGA108 DG 30/pGA115 0o 11,6 13,7 Exemple X. (Stabilité de pAH27). La stabilité du plasmide pAH27 en présence et en l'absence de spectinomycine en tant que pression sélective a été recherchée. A des ballons bosselés à secousses de Erlenmeyer de 500 ml, on a ajouté des portions de 100 ml d'un milieu modifié de Lowry, avec et sans 50 ppm de spectinomycine. Les ballons ont été inoculés avec 1,0 ml d'une suspension de cellules préparée en lavant deux plaques en pente de DH2/pAH27 (exemple IV), ayant cru à 37 C pendant 48 heures, avec 16 ml d'une solution saline à 0,9%. Les ballons à secousses ont été incubés à 37 C à 250 t/mn. Au bout de 24 heures, des ballons frais à secousses ont, été inoculés par transfert en série. Ce transfert en série a été répété toutes les 24 heures. Les activités de transaminase des cellules complètes ont été déterminées toutes les 24 heures. Au bout de 5 jours du transfert en série, l'activit& moyenne des ballons reproduits a indiqué que 93% du taux initial 1C spécifique de production de phénylalanine était conservé en présence de spectinomycine, en opposition à 42% en son absence. Cela démontre que le plasmide pAH27 était maintenu de manière stable dans E. coli DH2 en utilisant ppm de spectinomycine dans le milieu de culture. Détermination colorimétrique au chlorure ferrique de 1'acide phénylpyruvique, sel de sodium. Principe: L'acide phénylpyruvique (PPA) forme un complexe bleu avec les ions ferriques. L'intensité de la couleur bleue est proportionnelle à la quantité de PPA présent. Réactifs: 1. Solution de Developpement (SD) (1000 ml). Mélanger les ingrédients suivants et refroidir à température ambiante dans un bain de glace. Ajouter les contenus à un ballon volumétrique de i litre et atteindre le volume par de l'eau désionisée. Ingrédients: 0,5 g de FeCl3. 6H20; 20,0 ml d'acide acétique glacial; 6GO0ml de diméthyl sulfoxyde; 200,0 ml d'eau désionisée. 2. Solution standard Na-PPA (10 g/l - ajouter 500,0 mg de Na-PPA.H20 à 50, 0 ml d'un tampon T:ris/HCl à 0,1 M (pH 8,0) à 34 C. Agiter jusqu'à dissolution. Placer la solution dans un ballon volumétrique de 50,0 ml et complèter au volume avec un tampon Tris HCI. Stocker sous réfrigération. Pour un tampon à 0,1 mole de Tris/HC1: ajouter 900,0 ml d'eau désionisée à 12,11 g de Tris; ajuster le pH à 8,0 avec HC1; verser dans iun ballon volumétrique; ajouter de l'eau désionisée jusqu'à 100O0ml. Courbe de calibrage. Ajouter la solution standard de Na-PPA et 5,0yl de la Solution de Développement à des tubes de spectrophotomètre en verre. Mélanger avec tourbillons. Laisser reposer pendant 5 minutes (en commençant à compter le temps à l'addition de SD au premier tube). Lire la densité optique (DO) à 640 nm. Préparer une courbe de calibrage standard de Na-PPA.H20 (l'axe vertical est l'absorbance; l'axe horizontal représente *mg de Na-PPA.H20/ml SD). Standard Na-PPA mg Na-PPA.HO20 par ml SD 1 0,01 y1 0,02 pl 0,03 20 Fi 0,04 pl 0,05 pl 0,06 25880 15 Calcul: Na-PPA.H20 = (mg/ml) DO x 100 x dilution pente par rapport à courbe standard ou PPA (g/l) DO x 100 x dilution pente par rapport à courbe standard x 164,4 204,1 REVENDICATIONS 1. Souche d'un microorganisme hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide recombinant contenant un fragment d'ADN qui contient un gène de Salmonella typhimurium codant pour une enzyme de transaminase thermiquement stable. 2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit d'expression dudit gène catalyse la transamination stéréospécifique d'un alpha-cétoacide et d'un donneur amino en L-aminoacide correspondant. 3. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite enzyme de transaminase est AT sty 2. 4. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment d'ADN peut atteindre jusqu'à environ 25 kilobases. 5. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit plasmide recombinant est un plasmide à copies multiples. 6. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit plasmide recombinant contient un ou plusieurs gènes qui confèrent, à l'autre, une résistance à un ou plusieurs antibiotiques. 7. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit plasmide recombinant présente l'une des cartes de restriction selon les figures 1, 2 et 3. 8. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est déposée sous le numéro ATCC 53247 ou 53248. 9. Plasmide recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un gène de transaminase de Salmonella typhimurium dont le gène produit présente la 2580O15 caractéristique de stabilité thermique et de capacité à relever un microorganisme hôte de l'auxotrophie pour la phénylalanine, la tyrosine et l'acide aspartique. 10. Plasmide recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que le gène produit est l'enzyme AT sty 2. 11. Plasmide ayant la caractéristique de la présence d'un gêne codant pour l'enzyme de la transaninase de Salmonella typhimurium caractérisé ef ce qu!il est préparé par: (a) isolement des fragments du génome de Salmonella typhimurium par digestion avec l'endonucléase de restriction, (b) ligature desdits fragments en lambda phage, (c) transformation d'une souche négative à la transaminase de E. coli par un plasmide contenant un gène qui exprime le répresseur lambda sensible à la température, (d) transduction de la souche transformée de E. eoli par le phage hybride préparé à l'étape (b), (e) identification des clones contenant un phage hybride avec-le gène de transaminase thermiquement stable, (f) isolement d'un fragment d'ADN comprenant le gène de transaminase, et (g) ligature desdits fragments d'ADN dans un plasmide. 12. Plasmide selon la revendication 11, caractérisé en ce que le produit d'expression dudit gène est thermiquement stable. 13. Plasmide selon la revendication 11, caractérisé en ce que le produit d'expression dudit gène est l'enzyme AT sty 2. 14. Procédé de production d'une enzyme de transaminase thermiquement stable caractérisé en ce qu'il consiste à mettre une souche d'un microorganisme hôte transformé contenant un ou plusieurs plasmides recombinants qui comprennent un ADN codant pour l'enzyme de la transaminase thermiquement stable de Salmonella typhimurium en culture. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que ladite enzyme est AT sty 2. 16. Procédé de production de L-aminoacides caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) choisir une souche d'un microorganisme h8te transformé contenant un ou plusieurs plasmides comprenant un gène de transaminase thermiquement stable de Salmonella typhimurium, et (b) mettre lesdits microorganismes h8tes ou une portion ou un extrait de ceux-ci en contact avec un alpha-cétoacide et un donneur amino pour former le L-aminoacide correspondant. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le produit d'expression dudit gène est l'enzyme AT sty 2. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que des cellules entières de la souche choisie ou une portion ou un extrait de celles-ci sont immobilisés.