Brevet FR2595713A3 — publié le 19870918

FR 2595713 A3 19870918 FR 8603432 A 19860311 La présente invention a pour objet un milieu de culture pour bactéries coliformes utilisable notamment dans le dispositif de détection et de comptage de bactéries décrit dans le brevet N" 85.11583 du 26 juillet 1985 de la Demanderesse. Le brevet principal a pour objet un dispositif automatique de détection et de comptage de bactéries coliformes en milieu aqueux dans lequel on détecte la présence de ces bactéries dans un échantillon d'eau, auquel est ajouté un milieu nutritif adéquat, par la présence d'hydrogène moléculaire généré par ces bactéries et détecté au moyen d'une électrode de platine dont le potentiel est comparé en permanence à celui d'une électrode de référence, ce dispositif comprenant au moins une cuve d'incubation munie d'une résistance chauffante extérieure, fermée par un couvercle, à l'intérieur de laquelle sont disposés, portés par le couvercle, une électrode combinée de mesure de potentiel, trois tubulures d'injection, une thermistance de contrôle et de régulation de chauffage de la cuve et un détecteur de niveau. Le milieu nutritif utilisé dans le dispositif ci-dessus peut être choisi parmi les milieux de culture habituels pour bactéries à base de peptone, lactose et d'extrait de viande, tels que ceux disponibles dans le commerce, par exemple : bouillon lactosé BCP (Institut Pasteur), bouillon lactosé bilié au vert brillant (Difco), Brain-heart Infusion (Biomérieux), Lactose Broth (Difco), E.C. Medium (Difco), Lauryl-tryptox Broth ("LTB") (Difco). Or, la Demanderesse ayant étudié l'influence de substances susceptibles de modifier le métabolisme de l'hydrogène chez les bactéries, a maintenant trouvé que l'utilisation d'un formiate dans le milieu de culture permet une augmentation inattendue de l'activité biologique de la culture et, par suite, de meilleurs résultats dans les appareils de détection et de comptage de bactéries. L'invention a donc pour objet un milieu de culture pour bactéries coliformes, utilisable notamment dans le dispositif automatique de détection et de comptage de bactéries selon le brevet principal N 85.11583, sous forme d'une comDosition aqueuse comprenant du lactose, de la peptone, de l'extrait de viande et des sels minéraux, et il est caractérisé en ce qu'il contient en outre un formiate alcalin ou alcalino-terreux, notamment du formiate de sodium. La composition selon l'invention contient deux groupes de substances - le substrat (nourriture des bactéries) qui permet d'assurer la fonction de croissance. La présence de ces substances (ou de molécules analogues) est nécessaire. I1 s'agit : du lactose, de la peptone, de l'extrait de viande. Le lactose est le plus important car il contribue à la spécificité de la mesure.L'utilisation de ces substances est classique dans les milieux utilisés en laboratoire; et - des substances qui ont pour effet d'accélérer la réponse de l'appareil de détection et de comptage des bactéries, sans que l'on sache de façon précise si elles agissent sur la vitesse de croissance des bactéries, la production d'hydrogène par bactérie ou la réponse du capteur (électrode de platine) par action sur le système électrochimique. I1 s'agit notamment du chlorure et du formiate de sodium. Dans le cas du formiate, ce qui est important c'est l'anion formiate. La présence simultanée de toutes ces substances, en particulier aux valeurs de concentrations indiquées ci-dessous est nécessaire pour obtenir de bons résultats - peptone, lactose et extrait de viande 10 à 20 g/l. L'efficacité croît avec la concentration jusqu'à ce que celle du mélange atteigne environ 15 à 20 g/l du mélange. Si on en utilise davantage le résultat n'est pas meilleur. Si on en utilise moins il est moins bon. Par exemple pour un essai typique on augmente ce temps de réponse de 10% si on n'utilise que 10 g/l et de 20% si on en utilise que 5 g/l; - il en est de même pour le chlorure de sodium dont l'effet se sature au-delà d'une concentration de 5 g/l. Si on n'en utilise que 2 g/l le temps de réponse augmente de 10% et il augmente de 20% si on n'en utilise pas; on utilisera de préférence de 3 à 10 g/l; - la situation est différente pour le formiate où il y a un optimum de concentration qui se situe à une concentration d'environ 0,5 g/l. Le temps de réponse augmente de 10% si on en utilise 0,15 g/l ou 1,25 g/l. I1 augmente de 20% si on n'en utilise pas ou si on en utilise 2 g/l. On peut donc considérer que la fourchette optimale se situe entre 0,4 et 0,6 g/l. Les concentrations trouvées optimales dans la cellule lors de la mesure sont les suivantes - peptone : 7,5 g/l - lactose : 7,5 g/l - extrait de viande : 4,5 g/l - chlorure de sodium : 5 g/l - formiate de sodium : 0,5 g/l Selon l'invention, on propose également un concentré du milieu de culture, par exemple à 400 g/l, sous forme liquide (grâce à la forte solubilité des substances utilisées), facile à ajouter et doser, permettant une autonomie importante dè l'appareil avec-une capacité de réactif de faible volume. A titre d'exemple, la composition du milieu concentré peut être la suivante - lactose : 150 g - peptone : 150 g - extrait de viande : 90 g - chlorure de sodium : 100 g - formiate de sodium : 10 g - eau : 1 litre L'addition de ces constituants aboutit à la production de 1,25 litre de solution. Cette solution concentrée correspond aux proportions données précédemment pour les concentrations optimales. Le conditionnement de cette solution concentrée en poche plastique (type poche à sang) permet d'effectuer une stérilisation du milieu de culture directement dans la poche grâce à l'irradiation par rayons y . Le milieu stérilisé n'est jamais en contact avec l'extérieur et ne peut se contaminer bactériologiquement. D'autre part sa forte salinité due à la concentration élevée utilisée réduirait les risques d'altération du milieu (fermentation et/ou altération des résultats) en cas de contamination bactérienne accidentelle du milieu. Le milieu de culture selon l'invention a été comparé au milieu utilisé par WILKINS et au milieu de base (Bouillon lactosé de l'Institut Pasteur) dans des conditions rigoureusement identiques (salinité de l'eau étuaiée), dans le dispositif décrit dans le brevet principal. Les résultats sont les suivants Temps de réponse pour 1 bactérie coliforme/ 100 ml Utilisation du milieu Difco 1110 mn (t) LTB (Wilkins) (18h30) Utilisation du milieu de base 1050 mn (Bouillon lactosé Pasteur) (17h30) (Bouillon lactosé Pasteur) (17h30) Utilisation du milieu de (Bouillon lactosé + NaCl + 600 mn formiate de Na) (10h) (*) Ce temps apparemment élevé par rapport à celui indiqué par Wilkins dans ses publications peut résulter à la fois de l'influence de la minéralisation de l'eau étudiée et surtout du choix du saut du potentiel de l'électrode de platine considéré comme indicateur de l'apparition d'hydrogène spécifique à la présence de bactéries coliformes (200 mV). Le gain de temps qui résulte du choix d'un saut potentiel beaucoup plus faible (10 à 30 mV) est compensé par une perte importante de sélectivité vis-à-vis des bactéries coliformes. I1 existe en effet une possibilité d'artefacts si l'on prend comme critère de sélection un trop faible saut de potentiel. Le milieu de culture selon l'invention permet donc soit un gain de temps de réponse de 46% par rapport au milieu utilisé par Wilkins, à sélectivité et fiabilité de résultat identique, soit un-gain de fiabilité du résultat à temps de réponse identique. De plus, la stabilité et la compatibilité des réactifs de base a permis d'élaborer un milieu de culture fortement concentré dont la faible consommation (6 ml/analyse) permet une autonomie de fonctionnement élevée pour l'appareil (2 mois) sans recharge de réactifs. Le milieu nutritif concentré peut être conditionné sous poche déformable stérile de 2,8 litres. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture pour bactéries coliformes utilisable dans le dispositif automatique de détection et de comptage de bactéries selon l'une quelconque des revendications du brevet principal N" 85.11583, sous forme dtune composition aqueuse comprenant du lactose, de la peptone, de l'extrait de viande et des sels minéraux, caractérisé en ce qu'il contient en outre un formiate alcalin ou alcalino-terreux. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient de 10 à 20 g/l de l'ensemble peptone, lactose et extrait de viande. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient de 3 à 10 g/l de chlorure de sodium. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient de 0,4 à 0,6 g/l de formiate de sodium. 5. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend environ 7,5 g/l de peptone, environ 7,5 g/l de lactose, environ 4,5 g/l d'extrait de viande, environ 5 g/l de chlorure'de sodium et environ 0,5 g/l de formiate de sodium. 6. Concentré de milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est composé d'environ 150 g de lactose, d'environ 150 g de peptone, d'environ 90 g d'extrait de viande, d'environ 100 g de chlorure de sodium et d'environ 10 g de formiate de sodium pour un litre d'eau.