Brevet FR2589165A1 — publié le 19870430

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'épithéliums humains par- culture de cellules in vitro, tel que les épithéliums obtenus ne comportent pas d'antigènes de classe II D/DR à l'origine des rejets immunitaires des allogreffes, ainsi que les tissus épithéliaux obtenus par ce procédé et leurs applications. On sait que l'allogreffe d'un tissu provenant d'un individu génétiquement différent et n'ayant subi aucun traitement, est rejetée et on admet généralement que ce rejet est lie à la présence dans le tissu, naturel ou résultant d'une culture, de cellules dendritiques qui portent chez l'homme des antigènes de classe II D/DR. Dans la demande de brevet W085/00042, J.M. HEFTON décrit un procédé pour obtenir une culture de cellules d'épiderme humain ne comportant pas de cellules immunocompétentes qui consiste à mettre en culture les cellules après les avoir dissociées et traitées soit par une enzyme, telle que la DNase, pour détruire sélectivement les cellules immunocompétentes, soit par une protéine se fixant sélectivement sur les cellules immunocompétentes, telle que la glycoprotéine de tabac ou la rutine, pour ensuite séparer les cellules ainsi marquées, des autres cellules épidermiques. Par ailleurs, des méthodes permettant l'obtention d'un tissu reconstitué par culture de cellules humaines d'épithélium, ont été décrites. H. Green et Colt. dans US 4 016 036 ont montré que la culture-de kératinocytes humains dans un milieu nutritif contenant des fibroblastes d'origine murine, préalablement traités pour limiter leur pouvoir de multiplication, permet d'obtenir des colonies confluentes de cellules et meme un épithélium stratifié. Une telle méthode, particulièrement intéressante, a été appliquée avec succès à la préparation de tissus d'origine humaine qui n'ont pas été immédiatement rejetés après leur greffe à des souris; la couche épithéliale greffée avait été isolée du milieu de culture après un traitement avec la dispase, comme décrit dans US 4 304 866. Toutefois, même si le nombre de cellules dendriti ques associées aux kératinocytes obtenus dans ce type de culture, est limité, il en subsiste, la majorité du temps, une quantité suffisante pour que l'on ne puisse envisager d'utiliser le tissu ainsi préparé pour une allogreffe, chez un receveur n'ayant pas une bonne compatibilité HLA avec le donneur des cellules mises en culture. Le procédé de culture selon l'invention permet d'obtenir des tissus épithéliaux, dépourvus de cellules dendritiques et donc dont les antigènes de classe II sont absents; ces tissus seront avantageusement utilisés comme allogreffes pour la couverture des plaies étendues de la peau et autres muqueuses chez les brûlés ou blessés mais pourront aussi être employés pour étudier, in vitro, les activités dermatologiques de divers composés. Ce procédé consiste à cultiver dans des conditions classiques des cellules épithéliales humaines, à dissocier les cellules ainsi obtenues, puis à les congeler et décongeler avant de les faire multiplier dans un milieu nutritif, comportant des fibroblastes ne se multipliant pas, jusqu'à l'obtention d'un tissu cellulaire. Les moyens utilisables pour obtenir les cellules qui seront congelées sont multiples, du moment qu'ils permettent d'obtenir des cellules qui peuvent croître et se diviser. Dans le cas de la peau humaine, on sépare préalablement l'épiderme du derme sous-jacent, puis dissocie les kératinocytes, par exemple par trypsination avant de les -mettre ecuitureCete-trypsination est avantageusement effectuée en présence d'EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique), selon un procédé connu. On dissociera de même les cellules des autres muqueuses, telles que les muqueuses gingivales, du larynx ou du pharynx. La culture avant congélation est effectuée dans des conditions classiques, connues pour permettre la multiplication des cellules épithéliales humaines en culture. Le milieu nutritif, qui contient les acides aminés et vitamines indispensables, peut être par exemple celui connu sous le nom de milieu de Eagle modifié ou de milieu Eagle modifié par Dolbecco (DMEM). On ajoute de préférence dans ces milieux du sérum de veau foetal ainsi que du facteur de croissance épidermique (EGF). On sait que les conditions de pH, température et humidité sont importants pour une bonne culture, et différentes solutions ont été proposées à ce jour. Comme on a constaté que, lorsque la culture était effectuée en présence de fibroblastes préalablement traités pour bloquer leur multiplication, ou d'extraits de ces fibroblastes, les cultures étaient plus rapides et la confluence plus précoce, on préfère opérer dans ces conditions. On sait que le pouvoir de multiplication des fibroblastes est détruit par exposition des cellules à des rayonnements ionisants, rayons X ou gamma, à des rayons ultraviolets ou encore par traitement des cellules avec des composés chimiques qui endommageront l'ADN, tels que les agents alkylants, et il suffit d'introduire dans le milieu de culture une quantité donnée de fibroblastes ayant subi l'un de ces traitements. Après deux semaines environ, lorsque la culture de cellules épithéliales arrive à confluence, ou quelque temps avant, on sépare les cellules du milieu et les dissocie avant de les mettre en suspension dans un milieu convenant à l'éta- pe suivante de congélation/décongélation. Cette étape dont les deux parties peuvent être plus ou moins séparées dans le temps est fondamehtale; en son absence, il subsisterait une certaine quantité de cellules dendritiques même dans les subcultures de cellules épithéliales et donc des risques de rejet non négligeables dans le cas d'allogreffes. C'est un des mérites de l'invention d'avoir mis en évidence comment supprimer toute trace de cellules porteuses de marqueurs d'histocompatibilité, permettant de greffer les tissus obtenus en culture à un individu quelconque, sans aucune relation avec le donneur des premières cellules initialement mises en culture. Les conditions de congélation et décongélation ne sont pas critiques dans la mesure où elles préservent la via bilité des cellules. Le refroidissement des cellules qui ont été dissociées en cas de confluence de la culture, par exemple par trypsination, ou encore mécaniquement, doit être rapide. I1 suffit que la suspension de cellules soit portée au moins quatre heures à -200C pour que les cellules dendritiques disparaissent, mais on préfère une conservation d'au moins 24 heures à -700C. Les cellules peuvent aussi être conservées plusieurs semaines, et même plusieurs mois avant décongélation; dans ce cas, on les conservera à la température de l'azote liquide, aux environs de -1500C à -1950C.La possibilité de conserver les cellules pendant des durées prolongées est une autre conséquence avantageuse du procédé selon l'invention. On peut ainsi constituer des stocks de cellules épithéliales qui pourront être utilisées sous forme de tissus qui seront obtenus après seulement quelques jours de culture. Parmi les milieux liquides convenant à la congélation de suspensions cellulaires, on préfère tout particulièrement pour les kératinocytes une solution de DMEM contenant 50 % (v/v) de sérum de veau foetal (SVF) et 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les suspensions cellulaires sont congelées dans des ampoules scellées de 1 ml à 5 ml; leur réchauffement sera réalisé de façon classique, assez rapidement, par exemple par immersion dans un bain à 370C. Les cellules décongelées sont séparées du milieu de conservation, par centrifugation, puis ensemencées sur un milieu nutritif, éventuellement enrichi en sérum de veau foetal et en facteur de croissance épidermique et contenant des fi fibroblastes qui ont subi un traitement supprimant leur pouvoir de multiplication; le nombre de fibroblastes, de préférence du type 3T3, d'origine murine est de 1 fois à 20 fois celle des cellules décongelées ensemencées. La densité d'ensemencement et classique de 10 4 à 10 5 cellules par cm2 et l'atmos phère des enceintes de culture est enrichie en vapeur d'eau et C02, à raison de 10 % en volume environ de C02 et H20 tant que la culture n'est pas confluente, puis de 5 % de C02 ensui te. Le temps pour atteindre la confluence de la culture est fonction de la densité d'ensemencement initiale et de la nature du milieu nutritif. On obtient en général la confluence en quelques jours mais il est possible de prélever la couche de cellules formée pour utilisation, même avant la phase de confluence. Le très court délai s'écoulant alors entre la décongélation et l'obtention d'un tissu greffable est un autre avantage de l'invention. En l'absence d'une étape de congélation entre la culture primaire et la sub-culture, le nombre de cellules dendritiques exprimant les antigènes de classe II ne diminue que très lentement dans le temps, sans en disparaître totalement; ainsi, après 4 semaines d'une subculture de keratinocytes, en présence de fibroblastes irradiés, il reste encore environ 0,5 % de cellules dendritiques.Si ces kératinocytes sont congelés et décongelés avant la sub-culture, un prélèvement de la culture mis en contact avec les lymphocytes allogéniques dans le système de la culture mixte lympho-épidermique ne déclenche aucune réaction immunitaire, dès la première semaine de culture comme par la suite. Le tissu cellulaire est détaché de la surface du récipient de culture par tout moyen propre à le separer sans dissocier les cellules épithéliales. La séparation est facilitée en utilisant l'action d'une enzyme protéolytique et tout particulièrement la dispase, comme il est décrit dans le brevet US 4 304 866.Le transfert du tissu au lieu d'application est effectué avantageusement en le plaçant sur un rectangle de gaze vaselinée, ce qui le consolide mécaniquement et évite sa déshydratation. I1 peut être conservé à 370C en atmosphère enrichie en C02 durant quelques heures mais sa conservation prolongée est aussi possible à des températures inférieures à -1500C, et c'est un autre mérite de l'invention d'avoir mis en évidence que les tissus ainsi conservés pouvaient, immédiatement après leur réchauffement, être greffés sur des receveurs sans histo-compatibilité spécifique avec le donneur initial. Le tissu est posé sur un support pour être congelé, ce qui facilite les manipulations. On préfère comme support la gaze vaseliné, mais un support en collagène, ou biomatériau conviendrait aussi. L'ensemble tissu reconstitué et support est introduit dans une solution dont la composition empêchera l'éclatement des cellules soumises au froid. Plusieurs mélanges convenant à cet effet sont connus; on peut citer par exemple la solution de DMEM avec 50 % (v/v) de SVF et 10 % (v/v) de DMSO ou une solution de tampon phosphate (ph = 7,2) contenant 3 % (v/v) d'albumine et 10 % (v/v) de DMSO. On préfère refroidir le tissu par paliers; ainsi les enceintes fermées, telles que des sacs plastiques soudés contenant la solution de congélation dans laquelle a été im mergé le tissu épithélial sur un support, sont amenées rapidement à -500C, par introduction dans une enceinte à cette température puis après 1 heure à 2 heures, refroidies à une température inférieure à -700C. On préfère refroidir jusqu'à -1500C, étant donné la facilité d'obtention et de maintien d'une telle température avec des bains d'azote liquide. Dans ces conditions, les tissus peuvent être conservés au moins douze mois, sans aucune altération apparente de leurs pro priétés. Dans ce qui suit, on décrit un exemple de mise en oeuvre particulier de l'invention, du stade de prélèvement de l'épithélium à l'allogreffe. A - PRELEVEMENT D'EPITHELIUM ET DISSOCIATION DES CELLULES. 2 Un morceau de peau de 2 cm2 environ, prélevé sur un donneur, est introduit dans du tampon phosphate stérile (pH = 7,2). Dans ce milieu, on élimine le derme et effectue plusieurs lavages de l'épiderme avec un tampon phosphate salin, puis le dilacère dans 10 ml de solution aqueuse à 0,1 % de trypsine (p/v). La suspension des f-ragments est ensuite introduite dans un flacon de trypsination avec 10 ml de solution de trypsine à 0,1 % et 10 ml de solution aqueuse d'EDTA à 0,02 % (p/v) à 370C. On récolte les cellules dissociées, toutes les trente minutes par centrifugation du surnageant, tandis que 15 à 18 ml de solution de trypsine (0,1 %) + EDTA (0,02 %) sont versés sur les fragments résiduels. B - CULTURE PRIMAIRE. Les cellules épidermiques ainsi obtenues sont ensemencées en flacons de culture cellulaires à raison de 0,5 x 2 îO5 à 2 x 106 cellules par 75 cm sur une couche de fibroblas- tes 3T3 irradiés , avec 20 ml de milieu de culture. Le milieu est composé d'un mélange de milieux DMEM et Ham's F12 (75/25) avec 10 % (v/v) SVF, 1 % (p/v) pénicilline/streptomycine et une quantité inférieure à 1 % d'hydrocortisone, toxine cholérique, insuline, adénine, transferrine, triiodothyronine, EGF. La culture est effectuée à 370C dans une atmosphère enrichie en C02 (10 %) et H20 (10 %). Le milieu nutritif est changé tous les deux jours. L'irradiation des fibroblastes a été réalisée avec une source au césium (dose 6000 rads) sur une culture à confluence, ou presque, réalisée sur un milieu nutritif à base de DMEM + 10 % SVF; cette irradiation a été effectuée quelques heures avant l'introduction des 3T3 dans le milieu de culture 6 primaire, où ils ont été ensemencés à raison de 1,5 à 2 x-106 2 cellules pour 75 cm , dans 20 ml du milieu nutritif. Lorsque la culture de cellules épidermiques arrive à confluence, ou presque, c'est-à-dire après 10 jours, on récolte les cellules et les dissocie en les mettant au contact d'une solution de trypsine (0,1 %) contenant de 1'EDTA (0,02 %) durant 15 minutes à 370C. Les cellules sont ensuite lavées avec du milieu de culture avant d'être mises en suspension dans le milieu de congélation. C - CONGELATION/DECONGELATION. On introduit 2 x 106 cellules par ampoule en verre de 2 à 4 ml avec une solution de DMEM contenant pénicilline/ streptomycine (1%), SVF (50 %), DMSO (10 %). Les ampoules scellées sont portées en quelques m- nutes à -700C et conservées 24 heures à cette température. Elles peuvent alors être décongelées ou amenées à -1500C, en les plongeant dans des vapeurs d'azote liquide, pour une conservation prolongée. La dEcongelation est effectue en quelques minutes en plongeant les ampoules directement dans un bain à 370C. D - SUBCULTURES. Les cellules décongelées sont ensemencées en flacons de culture dans des conditions identiques à celles décrites à l'étape B, mais à ce stade, la densité d'ensemencement est telle qu'il peut y avoir jusqu'à 10 fois plus de fibroblastes que de cellules épidermiques. La culture est réalisée comme précédemment en atmosphère enrichie en C02 et H20, à 370C. Pour une densité d'ensemencement correspondant à 5 cellule épidermiques décongelées sur 75 2 2 x 105 cellules épidermiques décongelées sur 75 cm on ob- tient la confluence en 10 à 13 jours; alors que pour 4 x 105 cellules, la confluence est obtenue en 8 à 11 jours et pour 106 en 7 jours E - ISOLEMENT DU TISSU EPITHELIAL. Lorsqu'on a obtenu la confluence, on lave les cultures avec une solution de DMEM (10 ml par boîte de 75 cm) et ajoute 15 ml de solution à 2,5 mg/ml de la protéase, appe lée "dispase II", commercialisée par Boehringer Mannheim. 45 à 60 minutes après l'addition, la culture qui a été maintenue à 370C est séparée de la dispase, rincée plusieurs fois avec du DMEM et détachée du substrat on depose ensuite sur le rectangle de culture épidermique ainsi obtenu, un morceau de gaze vaselinée, on fait adhérer et on dépose le tissu sur la gaze par retournement. L'ensemble peut être conservé quatre heures en atmosphère enrichie en C02 avant application du greffon sur une plaie. Sa conservation prolongée nécessite une nouvelle étape de congélation. F - CONSERVATION PROLONGEE ET APPLICATION. 2 20 à 30 cm de tissu épidermique reconstitué, sur son support de gaze vaselinée, sont introduits dans 30 à 50 ml de solution de DMEM ou de tampon phosphate (pH = 7,2) contenant de la pénicilline/streptomycine et 10 % de DMSO dans une enceinte métallique à fermeture étanche, sous atmosphère stérile. Les enceintes sont refroidies brutalement à -500C et laissées 1 h 30 à cette température avant d'être plongées dans l'azote liquide. Pour la décongélation, les enceintes sont sorties de l'azote liquide et introduites dans un bain à 370C. Après décongélation, en quelques minutes, on sort les lambeaux de tissu épidermique fixés sur la gaze du liquide de conservation et après 10 minutes à 370C en atmosphère stérile, ils sont appliqués sur les plaies à recouvrir. Des lambeaux de peau ainsi préparés, obtenus soit après l'étape E, soit après conservation prolongée, ont été greffés chez des individus génétiquement différents du donneur initial, sans aucune compatibilité ni pour les groupes sanguins, ni pour les antigènes de classe I ou II. Aucun signe de rejet clinique n'a été constaté sur une période supérieure à six mois, bien que l'identité de la peau greffée reste celle du donneur. Les contrôles in vitro, effectues par cultures mixtes entre les kératinocytes de la greffe et les lymphocytes des receveurs, ont confirmé l'absence de réponse de ces derniers à la présence des cellules étrangères même après 2 mois. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de tissus épithéliaux par culture de cellules dissociées, prélevées sur un donneur, comportant une primo culture et une subculture, caractérisé en ce que, entre les deux étapes de culture, on effectue la congélation jusqu'à au moins - 2O0C puis la décongélation des cellules en suspension dans un milieu nutritif. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la subculture est effectuée sur un milieu nutritif comportant des fibroblastes, qui ne sont plus susceptibles de se multiplier. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture primaire et la sub-culture sont effectuées sur un milieu nutritif comportant des fibroblastes, qui ne sont plus susceptibles de se multiplier. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, dans lequel les fibroblastes ont été irradiés. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules dissociées sont congelées dans une solution de DMEM contenant du serum de veau foetal et du diméthylsulfoxyde. 6. Tissus épithéliaux obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Tissus épithéliaux de culture dépourvus de cellules dendritiques immunocompétentes de classe II. 8. Cellules epidermiques congelées pour l'obtention de tissus epithéliaux de culture. 9. Allogreffe d'épiderme humain obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 10. Allogreffe selon la revendication 9, provenant de la décongélation d'un tissu épithélial, conforme à l'une des revendications 6 ou 7, qui a été conservé à une température inférieure à -150 C. 11. Allogreffe selon la revendication 9 ou 10, preparée par le procédé qui consiste à 1) prélever un fragment de peau et isoler les cellules de l'épiderme par trypsination, 2) cultiver ces cellules sur un milieu nutritif en présence de fibroblastes ayant perdu leur pouvoir de multiplication, dans une atmosphère contenant du C02 et H20 3) congeler une suspension des cellules obtenues, 4) décongeler les cellules rapidement; 5) cultiver les cellules dans les mêmes conditions qu'à l'étape 2 jusqu'à l'obtention d'un tissu épithelial, 6) séparer le tissu du récipient de culture par traitement avec une protéase.