Brevet FR2588016A1 — publié le 19870403

La présente invention concerne un procédé simple et efficace pour isoler la L-thréonine~pure de Liqueurs de fermentation par cristallisation directe, qui élimine les étapes fast- dieuses de purification associées aux procédés classiques. La L-thréonine est une substance nutritive intéressante pour les animaux et pour L'homme et il y a une demande continuelle pour la fourniture de cet aminoacide de haute qualité à faible coût. On a utilisé des procédés de synthèse chimique et de fermentation pour la fabrication de La L-thréonine. Pour l'iso- lement de la L-thréonine, la synthèse chimique exige la séparation de l'allo-isomère et la résolution optique du mélange racémique. Par contre, dans les procédés par fermentation, La purification de la L-thréonine exige des étapes fastidieuses telles que traitement par une résine échangeuse de cations, à cause des grandes quantités d'impuretés contenues dans la liqueur de fermentation. Dans Les procédés classiques de fermentation, le rapport pondéral des aminoacides autres que La L-thréonine contenus comme impuretés à la L-thréonineformée dans la liqueur de fermentation (rapport dénommé ci-après "O-AA/L-Thr") est de 20 % ou plus (ordinairement de 30 à 100 %). En outre, la liqueur contient également de grandes quantités de sels, de sucres, d'acides organiques, de pigments et d'autres impuretés. IL en résulte une cristallisation retardée, des difficultés dans la séparation des cristaux, une qualité du produit plus faible et d'autres problèmes ; par conséquent, ces impuretés doivent être éliminées par traitement par une résine échangeuse de cations afin d'obtenir des cristaux de L-thréonine de haute pureté.La purification utilisant une résine échangeuse de cations est fastidieuse, consomme de grandes quantités d'énergie et produit un volume accru de liqueur résiduaire. Au vu des difficultés de préparation de L-thréonine de haute pureté dans les procédés classiques de fermentation, on a toujours besoin de moyens nouveaux et plus efficaces pour cette purification. En conséquence, un objet de la présente invention est d'obtenir des cristaux de L-thréonine de haute pureté à partir de liqueurs de fermentation par cristallisation directe et sans avoir recours au traitement sur résine échangeuse de cations. Les objets ci-dessus et d'autreS qui apparaitront plus facilement à la lecture de la description qui suit ont été atteints par la découverte que l'on peut obtenir des cristaux de L-thréoninede haute pureté par cristallisation directe sans utiliser un traitement par résine échangeuse de cations si l'on utilise une liqueur de fermentation contenant au moins 3 g/dl de L-thréonineet de plus faibles quantités d'impuretés. La présente invention a été realisée sur la base de cette découverte. En particulier, la présente invention concerne un procédé pour purifier la L-thréonine, qui consiste à faire pousser, dans un milieu de production de L-thréonine,un micro-organisme ayant un rendement en L-thréonine de 3 g/dl ou plus et ayant un rapport O-AA/L-Thr de moins de 20 % ; à laisser accumuler La L-thréoninedans ledit milieu, à séparer les cellules microbiennes et les protéines présentes dans Ledit milieu ; et à concentrer ou à refroidir la liqueur de fermentation exempte de cellules microbiennes et de protéines obtenue, de manière à isoler des cristaux de L-thréonine. A titre d'exemples des micro-organismes utilisés dans le procédé selon l'invention, on peut mentionner les souches productrices de L-thréoninedu genre Escherichia Cbrevet japonais Kokai nO 131 397 (1980)3-obtenues à partir d'une souche résistante à L'acide a-amino-ss-hydroxyvalérique (ci-après dénommé en abrégé "AHV") ou d'une souche résistante à L'AHV et ayant besoin d'isoleucine Epublication de brevet japonais n" 26 709 (1970)3 et qui contiennent un plasmide (pBR322) portant un gène participant à la biosynthèse de la L-thréonine. Les micro-organismes utilisés dans le procéde selon l'invention sont capables de produire la L-thréonineen quantité d'au moins 3 g/dl dans une liqueur de fermentation. Le rapport O-AA/L-Thr ae moins de 20 % signifie que la quantité totale de L-aminoacides autres que la L-thréonineformés dans la liqueur de fermentation (ci-apres dénommés "O-AA") est de moins de 20 x par rapport au poids de L-thréonineproduite. On peut utiliser dans le procédé selon l'invention des milieux-de culture couramment utilisés pour la production de L-thréoninepar fermentation Divers types de sucres et d'acides organiques peuvent être utilisés comme sources de carbone. On peut utiliser comme sources d'azote le gaz ammoniac, l'ammoniaque aqueuse et les sels d'ammonium. Ces substances nutritives peuvent être ajoutées en une fois au milieu de culture initial ou bien peuvent être ajoutées par portions à mesure que la fermentation avance. En outre, on peut ajouter au milieu, si nécessaire, des ions inorganiques tels que des ions phosphate, des ions ferreux, des ions magnésium et des ions potassium. En outre, on peut aussi utiliser,si nécessaire, des substances nutritives organiques telles que des vitamines et des aminoacides. L'oxygène est fourni pendant la fermentation de manière que la pression partielle de L'oxygène dissous soit dans la gamme de 0,01 à 0,17 bar. On obtient les meilleurs résultats si la fermentation est mise en oeuvre à une température dans la gamme de 27 à 37"C et à un pU réglé de S à 8. On peut obtenir la L-thréonineavec un rendement élevé en continuant la fermentation pendant une durée de 1 à 5 jours dans les conditions décrites ci-dessus. On utilise des techniques courantes pour récolter la L-thréonine accumulee dans le miLieu. L'élimination des cellules microbiennes de La liqueur de fermentation peut etre effectuée par n importe quelle technique connue telle que centrifugation, filtration sous pression, filtra- tion sous pression réduite et filtration sur membrane par exemple microfiltration et ultrafiltration). Le pH de la liqueur de fermentation traitée pour L'élimination des cellules microbiennes n'est pas spécifié, mais doit être de préférence dans la gamme de 3 à 7. Les protéines peuvent Autre éliminées par filtration sur membrane, telle que microfiltration, ultrafiltration et osmose inverse. Ou bien encore, Les protéines peuvent etre d'abord coagu lées par chauffage ou addition d'un agent coagulant (par exemple, un agent tensioactif) puis séparation en utilisant les techniques décrites ci-dessus pour l'élimination des cellules microbiennes. Il est également possible d'éliminer simultanément les cellules microbiennes et les protéines par une combinaison des techniques connues mentionnées ci-dessus. La liqueur de fermentation debarrassée des cellules microbiennes et des protéines ainsi obtenue a un rapport OAA/L-Thr -et une teneur en autres impuretés teilles que sels, sucres, acides organiques et pigments, extrêmement faibles par rapport à une liqueur de fermentation classique traitée de La meme manière que ci-dessus. It n'y a pas de limitation particulière quant à la technique de concentration. Par exemple, on peut adopter la concentration sous pression réduite à température élevée, la concentration par congélation ou la concentration par osmose inverse, soit seule, soit en combinaison pour effectuer la concentration et la cristallisation en discontinu ou en continu. IL n'y a pas non plus de-limitation spécifique quant à La technique de refroidissement ; la température de refroidissement, la vitesse de refroidissement, le degré de concentration et autres conditions optimales doivent être décidés en fonction de la facilité de séparation soiide/liquide et de la vitesse élevée de cristallisation. Il est également possible de combiner L'étape de concentration avec l'étape de refroidissement en faisant circuler la liqueur mère dont on a isolé Les cristaux de L-thréonine. Le procédé selon l'invention donne de la L-thréonine de haute pureté avec un rendement très élevé. Lorsque l'on traite une liqueur de fermentation classique selon le procédé de purification de l'invention, le rendement en produit contenant plus de 90 x de L-thréonine est de 50 à 70 %. Au contraire, la liqueur de fermentation utilisée dans le procédé selon l'invention donne des produits de meme pureté avec un rendement de 80 x ou plus (environ 80 à 90 %). Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On place 1,2 l du milieu de culture d'ensemencement indiqué dans le tableau 1 dans un petit récipient de 3 l et on stérilise sous pression à 1150C pendant 15 min. On inocule ce milieu avec une souche productrice de L-thréoninequi contient le plasmide pBR322 portant un gène participant à la biosynthèse de la L-thréonine et qui a été produite à partir de Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900) et on cultive à 31,5 C pendant 4 h en agitant (1000 tr/min ; aération : 1/3 vv ; pH 7,0) ce qui donne une solution de culture m d'ensemencement Dans un Fermenteur de 20 I, on place 4,8 4 diun milieu di- d production de L'thréonine préparé de manière que la compo- sition finale aprs addition de la solution de culture d'ensemence- ment soit celle indiquée dans le tableau 1. Après avoir stérilise ce milieu de culture à 115 C pendant 15 min1 on ajoute 1,2 l de la solution de culture d'ensemencement obtenue ci-dessus et on continue la fermentation à 31,5 C pendant 72 h en agitant (350 tr/min ; aération : 1/3 vv ; pH : 6,0). m Pendant La fermentation, on ajoute à la solution de culture un milieu contenant 300 g/l de glucose et 100 g/l de sulfate d'ammonium, préalablement stérilisé sous pression à 1150C pendant 15 min, de manière que la concentration en glucose ne dépasse pas 3 g/dl. A la fin de la réaction, la quantité de L-thréonine accumulée dans la liqueur de fermentation atteint 4,8 g/dl. La mesure de La teneur en O-AA au moyen d'un analyseur automatique d'aminoacides (Hitachi, modèle 835) révèle que le rapport O-AA/L-Thr est de 7 %. Tableau 1 Composition Milieu de culture Milieu de produc d'ensemencement tion Glucose 30 g/l 30 g/l Sulfate d'ammonium 10 g/l 10 g/l Phosphate monopotassique 1 g/l 1 g/l Sulfate de magnésium 1 g/l 1 g/L Extrait de levure 2,5 g/L - Acide ribonucléique 2 g/l 2 g/l L-proline 0,45 g/l 0,90 g/l L-isoleucine 0,10 g/l 0,20 g/l L-méthionine 0,10 g/l 0,20 g/l Acide L-aspartique 0,10 g/l 0,20 g/l Chlorhydrate de thiamine 1 mg/l 1 mg/l Sulfate ferreux 10 mg/l 10 mg/l Sulfate de manganèse 10 mg/l 10 mg/l On centrifuge 5 l de cette liqueur de fermentation, on recueille le liquide surnageant et on ajoute 5 ml d'une solution à 10 % de chlorure de benzalconium. On chauffe le mélange à 800C pendant 30 min, on refroidit à la température ambiante, on agite pendant 30 min avec 20 g de charbon actif et on filtre. On concentre le filtrat sous pression réduite jusqu' ce que le poids total ait réduit à 550 9, on refroidit Ienterr-nt la suspension cristalline résultante de 60 à c pendant e nuit et on recueille par centrifugation les cristaux qui se sont szarés et on l s lave avec une faible quantité d'eau.Le séchage sous pression réduite à 800C oendant 3 h donne 213 g (rendement : 88,5 %) de cristaux de L-thréonine ayant une pureté de 99,7 t. Exemple 2 On fait pousser Escherichia coli AJ11333 (FERM P-4899) de la même manière qu'à l'exemple 1. A la fin de la réaction, la quantité de L-thréonine accumulée dans la liqueur de fermentation atteint 3,1 g/dl. La mesure de la teneur en O-AA au moyen d'un analyseur automatique d'aminoacides (modèle 835 de la Société Hitachi) révèle que le rapport O-AA/L-Thr est de 18%. On centrifuge 5 1 de la liqueur de fermentation résultante et on recueille le liquide surnageant et on le traite de la même manière qu'à l'exemple 1, sauf que l'on continue la concentration jusqu a ce que le poids total soit réduit à 390 g et on refroidit à 10 C le concentré ainsi préparé. On obtient ainsi 127 g (rendement 81,3 %) de cristaux de L-thréonineayant une pureté de 99,2 %. Exemple comparatif 1 On place 1,2 l d'un milieu de culture d'ensemencement représenté dans le tableau 2 dans un petit récipient de 3 l et on stérilise sous pression à 115"C pendant 15 min. On inocule ce milieu avec une souche de Brevibacterium lactofermentum productrice de L-thréonineAJ11178 (FERM P-4180) et on continue la culture à 31,5"C pendant 24 h en agitant (1000 tr/min ; aération : 1/2 VVm ; m pH : 7,0) ce qui donne une solution de culture d'ensemencement. Dans un fermenteur de 20 I, on place 4,8 l d'un milieu de production de L-threonine préparé de manière que La composition finale après addition de la solution de culture d'ensemen cernent soit celle indiqué dans le tableau 1. Après avoir stérilisé ce milieu de culture à 1150C pendant 15 min, on ajoute 1,2 l de la solution de culture d'ensemencement obtenue ci-dessus et on continue la culture à 31,5 C pendant 72 h en agitant (350 tr/min ; aération : 1/2 VVm ; pH : 7,0). A La fin de la réaction, la quantité de L-thréonine accumulée dans la liqueur de fermentation atteint 3,0 g/dl. A mesure de la teneur en O-AA par un analyseur automatique d'aminoacides (modèle 835 de la Société Hitachi) révèle que le rapport O-AA/L-Thr est de 93 X. Tableau 2 Composition Mi Lieu de culture Milieu de produc d'ensemencement tion Glucose 30 g/l 100 g/L KH2P04 1,5 g/L 1,5 g/L MgS04.7H20 0,4 g/L 0,4 g/L FeS04.7H20 0,01 g/L 0,01 g/l MnS04.4H20 0,01 g/l 0,01 g/L (NH452So4 30 g/l Urée 3 g/I L-isoleucine 0,3 g/l Biotine 200 pg/l 100 pg/l Chlorhydrate de thiamine 300 pg/L 1000 g/L Hydrolysat de protéines de soja* 20 mL/l 5 ml/l * Teneur en azote : 64 g/L On centrifuge 5 L de la Liqueur de fermentation résultante et on recueilLe Le Liquide surnageant et on traite de la même manière qu'à L'exemple 1 sauf que l'on continue la concentration jusqu'à ce que le poids total soit réduit à 580 g et on refroidit à 200C le concentré ainsi prépare. On obtient ainsi 84 g (rendement : 53,4 %) de cristaux de L-thréonined'une pureté de 95,3 %. Exemple comparatif 2 On inocule un milieu de culture d'ensemencement préparé de la meme manière qu'à l'exemple comparatif 1 avec une souche productrice de L-thréonineAJ11173 (FERM P-4165) dérivée de Brevibacterium flavum nc 2247 (ATCC 14067), ce qui donne une solution de culture d'ensemencement. Dans un fermenteur de 20 l, on place 4,8 l d'un milieu de production de L-thréoninepréparé de manière que la composition finale après addition de la solution de la culture d'ensemencement soit celle indiquée dans le tableau 3 ci-après. Après avoir stérilisé ce milieu de culture à 115"C pendant 15 min, on ajoute 1,2 l de la solution de culture d'ensemencement obtenue ci-dessus et on continue la fermentation à 31,5"C pendant 72 h en agitant (350 tr/min ; aération : 1/2 VVm ; pH : 7,7). Pendant la fermentation, on ajoute à la solution de culture un milieu contenant 700 g/l d'acide acétique, préaLablement stérilisé sous pression à 115"C pendant 15 min, de manière que la concentration d'acide acétique scit dans la gamme de 0,3 à 0,8 g/dl. A la fin de la réaction, la quantité de L-threonine accumulée dans la liqueur de fermentation atteint 4,2 g/dl. La mesure de ta teneur en O-AA par un analyseur automatique d'aminoacides (modèle 835, Société Hitachi) révèLe que le rapport O-AA/L-Thr est de 33 %. Tableau 3 Composition Concentration GLucose 30 g/l KH 2P04 3 g/l MgeO4.7H20 0,4 g/l FeS04.7H20 0,01 g/l MnS04.4H20 0,01 g/l Urée 5 g/l CH3COONa 4,1 g/l CH3 COONH4 4 g/l (NH4)2S04 10 g/l L-isoleucine 0,5 g/l Biotine 50 pg/l Chlorhydrate de thiamine 5000 pg/l Hydrolysat de protéines de soja* 5 ml/l * Teneur en azote : 64 g/l On centrifuge 5 l de la liqueur de fermentation résultante et on recueille le liquide surnageant et on le traite de la même manière qu'à L'exemple 1, sauf que l'on continue la concentration jusqu a ce que le poids total soit réduit à 650 g et on refroidit à 100C le concentré ainsi préparé. On obtient ainsi 150 g (rendement : 70,5 %) de cristaux de L-thréonine d'une pureté de 98,7 %. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préféres décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la purification de la L-thréonine, caractérisé en ce qu'il consiste : à faire pousser dans un milieu de production de L-thréonine un micro-organisme ayant un rendement en L-thréonine de 3 g/dl ou plus et produisant moins de 20 % de L-aminoacides autres que la L-thréonine, par rapport au poids de L-thréonine formée ; à laisser accumuler la L-thréonine dans ledit milieu ; à éliminer les cellules microbiennes et les protéines présentes dans ledit milieu ; et à concentrer ou à refroidir la liqueur de fermentation debarrassée de cellules microbiennes et de protéines ainsi obtenue, de manière à isoler des cristaux de L-thréonine. 2. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi les souches du genre Escherichia productrices de L-thréoninedérivées d'une souche résistante à L'acide u-amino-8-hydroxyvalérique (AHV) ou d'une souche résistante à L'AHV et ayant besoin d'isoleucine, qui contient un plasmide pBR322 portant un gène participant à La biosynthèse de la L-thréonine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fournit de l'oxygène pendant la fermentation de manière que la pression partielle de l'oxygène dissous soit dans la gamme de 0,01 à 0,17 bar. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit est mis en oeuvre à une température de 27 à 37"C et à un pH réglé de 5 à 8. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rendement en produit contenant plus de 90 % de L-thréonine est de 80 % ou plus. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rendement en produit contenant plus de 90 % de L-thréonine est de 80 à 90 % en poids. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est une souche productrice de L-thréoninequi contient un plasmide pBR322 portant un gêne participant à la biosynthèse de la L-thréonineet qui est dérivée de E. coli AJ11334 (FERM P-4900). 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est une souche productrice de L-thre.oninequi contient un plasmide pBR322 portant un gène participant à la biosynthèse de la L-thréonineet qui est dérivée de E. coli AJ11333 (FERM P-4899).