Brevet FR2588558A1 — publié le 19870417

La présente invention a pour objet une nouvelle protéine de mammifère ayant une activité immunomodulatrice et progestative, sa préparation et son application notamment comme médicament immunomodulateur, en particulier comme inhibiteur de la réaction de rejet des allogreffes. On sait que la pratique des greffes d'organes oblige à provoquer artificiellement une inhibition de l'immunité pour éviter la réaction de rejet de l'organe greffé. Cette inhibition des défenses immunologiques est obtenue par l'emploi de diverses méthodes : irradiation, chimiothérapie (agents alkylants, etc..), ou utilisation de certains antibiotiques tels que la cyclosporine. Cependant, l'emploi de ces méthodes d'inhibition de l'immunité présente des inconvénients. En effet, ces méthodes paralysent non seulement les défenses de l'organisme contre la greffe, mais aussi les défenses naturelles contre les agents infectieux. La nouvelle protéine objet de l'invention présente l'avantage de ne pas inhiber les défenses immunitaires autres que l'immunité de greffe. On sait d'autre part que la gestation représente pour l'immunologiste un paradoxe puisque le foetus, porteur d'antigènes étrangers, et assimilable à une allogreffe, est cependant toléré par la mère pendant toute la gestation. Ce paradoxe a conduit à étudier le mécanisme immunologique faisant obstacle au rejet du foetus par la mère, et plusieurs chercheurs ont démontré les propriétés immuno-suppressives de certaines protéines présentes principalement chez la femelle gestante et normalement absente chez la femelle non gestante et chez le mâle. C'est ainsi-qu'on a décrit une globuline associée à l'état de gestation, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 510.000, qui possède des propriétés immuno-suppressive in vitro ; voir par exemple Stimson et coll. FEBS Letters, Vol. 23, n"3, 298-302 (1972) ; Stimson, Clin. Exp. Immunol., 25, 199-206 (1976). On a également décrit une protéine dite PZP (Pregnancy Zone Protein) de poids moléculaire 359.000, liée à l'état hormonal de la gestation, présente également chez les femmes utilisant les pilules contraceptives, et qui inhibe in vitro la stimulation des lymphocytes par la phytohémagglutinine ; voir par exemple Von Schoultz et coll., FEBS Letters, Vol. 38, n01, 23-26 (1973). On a aussi décrit la dépression de l'activité lymphocytaire in vitro par deux facteurs sériques apparaissant au tout début de la gestation, le premier (poids moléculaire 180.000) apparaissant 6 heures après la fertilisation, le deuxième (poids moléculaire 40.000) apparaissant 4 à 5 jours après chez la souris ; voir par exemple Clark et coll., Clin. Exp. Immunol., 32, 318-323 (1978). La démonstration d'un phénomène de rejet maternel contre l'embryon et de l'inhibition de cette réaction n'a toutefois été faite, jusqu a présent, que chez un organisme ovovivipare, la salamandre ; voir par exemple Chateaureynaud et coll. J. Repr. Immunol., I, 47-60 (1979) et Badet et coll., Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 131D, 57-69 (1980). On a maintenant découvert une nouvelle protéine, présente chez les mammifères femelles gestantes, qui possède des propriétés, non spécifiques d'individus, d'inhibition du rejet des allogreffes. On désignera ici cette protéine par le sigle I.R.G. (inhibitrice du rejet de greffes). La présente invention a pour objet une protéine dite I.R.G. caractérisée par le fait - qu'elle est présente dans le sérum des femelles gestantes et normalement absente chez les mâles et les femelles non gestantes ; - qu'elle est présente dans le sérum des individus développant une réaction inflammatoire aiguë ; - qu'elle migre en électrophorèse avec les alpha2-macroglobulines ; - qu'elle a une masse moléculaire, mesurée par filtration sur gel de polyacrylamide, de 800.000 - 50.000 environ - qu'elle réagit spécifiquement avec des anticorps dirigés contre la fraction alpha2-macroglobuline des femelles gestantes ; - qu'elle inhibe de façon significative in vitro l'activité des lymphocytes cytotoxiques au cours d'une réaction lymphocytaire mixte secondaire - que, mélangée avec le complément, elle inhibe la réaction d'hémolyse des globules rouges de moutons sensibilisés ;; - qu'elle n'a pas d'activité antiprotéase - et que son administration in vivo prolonge de façon. significative la survie des allogreffes; ainsi que les analogues de cette protéine. Dans la présente demande, on désigne par "analogues" de la protéine I.R.G. tous fragments et tous peptides synthétiques ou semi-synthétiques contenant des séquences peptidiques présentes sur la protéine I.R.G. ainsi que tous dérivés de ces fragments ou peptides, à conditions que ces fragments, peptides ou dérivés satisfassent aux conditions suivantes - ils inhibent de façon significative l'activité in vitro des lymphocytes cytotoxiques au cours d'une réaction lymphocytaire mixte secondaire ; et - leur administration in vivo prolonge de façon significative la survie des allogreffes. I1 convient de remarquer que, contrairement à 1'I.R.G., le sérum de femelle gestante n'a pas d'activité anti-complément et n'a pas d'activité anti-protéases, à l'inverse des mêmes fractions sériques chez les individus autres que les femelles gestantes. En outre l'I.R.G. n'inhibe pas les mécanismes de défense humorale (formation d'anticorps). L'invention a également pour objet un procédé de purification et d'obtention de la protéine I.R.G., ce procédé étant caractérisé par le fait - que l'on fractionne le sérum de mammifères femelles gestantes > et/ou d'animaux mammifères développant une réaction inflammatoire expérimentale, ou encore le sang placentaire, de façon à isoler des fractions migrant avec les alpha2-macroglobulines - et que l'on soumet lesdites fractions à un épuisement immunologique avec des anticorps IgG anti-sérum entier de mâle et/ou de femelle non gestante et/ou anti-(alpha2-macroglobulines) de mâle et/ou de femelle non-gestante pour recueillir les fractions ne réagissant pas avec lesdits anticorps. Le sérum de femelle gestante ne contient la protéine I.R.G. qu'après ur. certain temps, variable et facilement déterminable pour chaque espèce, après la fertilisation. Chez la ratte, ce temps est de l'ordre de 12 jours. Chez la femme, le taux d'I.R.G. augmente jusqu'au 3e mois de la grossesse puis reste stable jusqu'à 10 jours après l'accouchement. Les méthodes de fractionnement utilisées peuvent comprendre toute méthode connue de fractionnement des protéines du sérum ou du sang placentaire, comme par exemple la filtration sur gel, le relargage par les sels neutres, la précipitation fractionnée à l'aide d'un agent précipitant (tel qu'un alcool, un polyalkylène- glycol, ou le Rivanol), la chromatographie d'adsorption, la chromatographie sur résine échangeuse d'ions, la chromatographie d'affinité, etc.... Le principe de l'utilisation de ces méthodes de fractionnement des protéines est connu et ne sera pas rappelé ici. La filtration sur gel est effectuée par exemple sur gel de dextrane ou de polyacrylamide. Parmi les sels neutres utilisés pour le relargage, on citera par exemple le sulfate d'ammonium et les phosphates alcalins. La chromatographie d'adsorption peut être effectuée sur des supports tels que l'alumine, le phosphate de calcium, la silice, etc.. Les résines échangeuses d'ions sont par exemple des celluloses modifiées telles que la diéthylaminoéthyl cellulose ou la carboxyméthyl cellulose. Pour la chromatographie d'affinité on utilise un support pulvérulent inerte sur lequel on fixe par covalence, selon les méthodes connues, soit des anticorps dirigés contre la protéine I.R.C., soit des anticorps dirigés contre une fraction alpha2-macroglobulines de femelle gestante, soit des anticorps dirigés contre la fraction alpha2-macroglobulines de mâle et/ou de femelle non gestante. Dans les deux premiers cas, la protéine I.R.G. se fixe sur le support, dans les autres cas elle reste dans l'éluat. Pour concentrer la protéine obtenue on peut utiliser, outre les techniques de précipitation, la technique d'ultrafiltration. La technique d'épuisement immunologique consiste à mettre en contact la fraction protéique à purifier avec des anticorps dirigés contre au moins une fraction protéique analogue (par exemple une fraction d'alpha2-macroglobulines) provenant du sérum d'une femelle non gestante ou d'un morale, puis à recueillir la fraction protéique qui ne se fixe pas sur lesdits anticorps. Bien entendu, on peut utiliser des anticorps dirigés contre le sérum total de mâle ou de femelle non gestante. On peut en outre répéter l'opération avec des catégories d'anticorps différentes. Par exemple, on peut utiliser successivement des anticorps anti-(sérum total) de mâle, puis des anticorps anti-(alpha2-macroglobulines) de femelle non gestante. On peut aussi opérer par mélange de la fraction protéique à purifier avec une solution des anticorps, suivi de l'élimination, par exemple par centrifugation, des complexes immuns formés. Le surnageant contient alors la protéine I.R.G. purifiée. L'invention a également pour objet l'utilisation de la protéine I.R.G. ou de ses analogues, ou de fractions sériques la contenant, comme ingrédient actif dans un médicament immunomodulateur ayant notamment la propriété d'inhiber l'immunité de greffe sans af-fecter les autres défenses immunitaires, ou dans un médicament progestatif. Le médicament de l'invention est utilisable en particulier dans la prévention et le traitement des malades recevant des greffes d'organes. Le médicament de l'invention peut être administré notamment par voie parentérale. A cet effet, il peut etre présenté par exemple sous la forme de solutions injectables ou de poudres lyophilisées pour solutions injectables, ou encore sous la forme d'implants. Dans le cas d'une transplantation d'organe, l'administration du médicament de l'invention peut être effectuée selon des modalités diverses en fonction des techniques de dépression immunitaire utilisées par le médecin avant et apres la greffe. Le médicament de l'invention peut être administré avant la transplantation d'organes pour provoquer la dépression de l'immunité de greffe, et/ou après la transplantation, en relais ou avec d'autre médications suppressives de l'immunité. La posologie dépend notamment du mode d'administration et de la phase du traitement. Par exemple, chez l'homme, elle varie généralement de C,1 à 10 g de principe actif par jour chez l'adulte. On a découvert que chez les mammifères femelles faisant des avortements spontanés, la protéine I.R.G. est souvent absente. I1 est possible de favoriser le maintien de la gestation chez ces individus par administration d'I.R.C. L'invention a également pour objet l'utilisation de la protéine I.R.G. ou de ses analogues dans la préparation d'un médicament immunomodulateur ou progestatif. Les études effectuées ont montré que 1'I.R.G. apparaît dans le sérum non seulement lors de la gestation mais aussi, plus généralement, chez les mâles comme chez les femelles, lors de toute réaction inflammatoire naturelle ou provoquée artificiellement. On conçoit donc l'intérêt des anticorps dirigés soit contre des fractions sériques contenant la protéine I.R.G., soit contre la protéine I.R.G. purifiée, soit encore contre des déterminants antigéniques caractéristiques de cette protéine. En effet, non seulement ces anticorps peuvent servir à la purification ou à la détection de la présence ou de l'absence de la protéine I.R.G., mais aussi l'administration de ces anticorps permettra d'inhiber, lorsqu'elle est indésirable, la tolérance, acquise ou potentielle, vis-à-vis des alloantigènes, induite par l'I.R.G. apparaissant dans le sérum lors des processus inflammatoires.Les anticorps anti-I.R.G. ou les anticorps analogues apparaissent donc comme des agents thérapeutiques nouveaux permettant la prévention et le traitement des maladies consécutives à des processus inflammatoires et conduisant à des tolérances anormales vis-à-vis des alloantigènes, telles que des cancers, les maladies auto-immunes, etc... L'invention a donc pour objet des anticorps dirigés contre des fractions sériques contenant la protéine I.R.G., contre la protéine I.R.G., contre des analogues de cette protéine (tels que définis plus haut), ou contre des déterminants antigéniques caractéristiques de cette protéine (y compris des anticorps monoclonaux). Ces anticorps seront appellés ici "anticorps anti-I.R.G.", et englobent bien entendu les fragments Fab ou F(ab')2 correspondants obtenus par clivage enzymatique. L'invention s'étend aux anticorps anti-I.R.G. tels que définis précédemment mais modifiés par marquage avec un traceur radioactif, fluorescent ou enzymatique, obtenu selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués. Par exemple, le traceur peut être un traceur radioactif obtenu par échange isotopique avec un isotope radioactif de l'iode ou de l'indium. Le couplage des anticorps avec un agent traceur radioactif est connu en soi et peut être réalisé par exemple selon la méthode de GREEN'WOOD. Le couplage des anticorps avec un fluorochrome (par exemple isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine) est bien connu. Le couplage des anticorps avec un traceur enzymatique est également connu en soi et peut être réalisé par exemple en fixant l'enzyme sur les molécules d'immunoglobulines selon une méthode analogue à celle décrite par NAKANE, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22 : 1984-1991 (1974). L'enzyme est par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline. L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif, après réalisation d'un test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc ... L'invention s'étend également aux anticorps anti-I.R.G. monoclonaux obtenus selon la technique connue des hybridomes au départ des lymphocytes prélevés sur des animaux immunisés selon la méthode qui sera décrite ci-après. L'invention s'étend en outre aux anticorps anti-I.R.G. polyclonaux ou monoclonaux, marqués ou non, fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques, techniques d'immunofluorescence, techniques immunoenzymatiques). Ledit support solide peut être réalisé avec tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer les anticorps par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux solides utilisables pour fixer les anticorps par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés (diéthylamino-cellulose ou diéthylaminodextran), etc Le support solide peut se présenter par exemple sous forme de disques, de tubes, de baguettes, de billes, ou de plaques de microtitration. Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les anticorps sur le support solide sont des dérivés bifonctionnels tels que des dialdéhydes, des quinones, etc... Les anticorps peuvent également être fixés sur des supports solides minéraux, par exemple selon les méthodes décrites dans les brevets français 2.319.176, 2.403.556 et 2.403.098. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des anticorps tels que définis ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on immunise des animaux par administrations répétées, selon les méthodes connues, d'I.R.G. de fractions sériques enrichies en I.R.G., ou de fragments antigéniques d'I.R.G. éventuellement couplés à une macromolécule, puis que l'on recueille les anticorps sériques desdits animaux immunisés, et que, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique selon les méthodes connues et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus. Pour recueillir les anticorps sériques, on utilise les techniques classiques de fractionnement permettant d'isoler les immunoglobulines. Pour obtenir l'I.R.G. animale destinée à l'immunisation, on peut induire chez l'animal la formation d'I.R.G. en provoquant une réaction inflammatoire expérimentale. L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps anti-I.R.G. comme agents de purification ou de détection de 1'I.R.G., et aussi comme médicaments dans la prévention et le traitement des maladies consécutives à des processus inflammatoires et caractérisées par une tolérance anormale vis-à-vis des allo-antigènes. Les anticorps anti-I.R.G., éventuellement fixés sur un support, sont utilisables comme réactifs dans toutes les techniques fondées sur la réaction antigène-anticorps, notamment les dosages radio-immunologiques, les techniques d'immunofluorescence, les techniques immuno-enzymatiques, les techniques d'immunodiffusion et les techniques d'ismunoélectrophorèse. Par exemple, pour détecter ou doser 1'I.R.G. ou un de ses analogues en solution, on peut utiliser les techniques immunoenzymatiques connues (notamment un test ELISA). On met en contact la solution à tester avec un support adsorbant de façon à adsorber l'antigène (I.R.G.), s'il est présent. On ajoute une première solution d'anticorps spécifiques anti-I.R.G. tels que ceux définis ci-dessus. On rince et on ajoute ensuite une deuxième solution d'anticorps, qui sont cette fois des anti-immunoglobulines marquées par un traceur enzymatique, ces anti- immunoglobulines étant dirigées contre les anticorps de l'espèce animale ayant servi à préparer les anticorps de ladite première solution. On rince à nouveau le support. I1 suffit ensuite de révéler la présence des anticorps marqués éventuellement fixés sur le support pour savoir si 1'I.R.G. était présente ou non. Les médicaments à base d'anticorps anti-I.R.G. sont administrés par voie parentérale, locale, etc.. A cet effet, ils sont présentés par exemple sous la forme de solutions injectables, de préparations lyophilisées pour solutions injectables, de pommades, d'implants, etc.. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1. Purification de la protéine I.R.G. de rat I. ANIMAUX Les animaux utilisés sont des rats de souche pure SISTAR/FURTH, FISCHER/344 (IFFA-CREDO), WAG et FISCHER (fournis par l'institut de recherche sur le cancer de VILLEJUIF), pesant 150-200 grammes. Il. SERIES EXPERIMENTALES A. GESTATION ALLOGENIQUE : (Femelle FISCHER/344 X mâle 'ISTAR/FURTH) On appelle jour 1 de la gravidité, celui de la mise en évidence d'un bouchon vaginal ou de la présence des spermatozoides dans le frottis vaginal le lendemain de la mise au mâle. Le sang est prélevé aux 6 , 9 , 15 et 19 jours de la gestation et 1er, 3e, 5e et 7e jours du post-partum. B. DECIDUOME EXPERIbNTAL : (Femelles pseudogestantes) L'état de la pseudogestation est induit chez des rattes FISCHER/344 par ligature utéro-tubaire au 2e jour de la gestation pour empêcher les ovules fécondées de descendre dans les cornes utérines et de s'implanter. L'équilibre hormonal progestérone-oestrogène est celui de la gestation vraie. La réaction déciduale est obtenue par traumatisme mécanique chez ces femelles pseudogestantes par insertion le 5e jour (jour de l'implantation de l'oeuf chez la femelle gestante d'un fil dans chaque corne utérine. Le sang est prélevé les 6e, 9e, 12e jours de la pseudogestation. C. INDUCTION D'UNE REACTION INFLAMMATOIRE "AIGUE" L'enrichissement sérique en alpha2-macroglobuline a été réalisé chez le mâle FISCHER/344 normal par injection sous-cutanée bilatérale de 2 x 0,5 cm9 d'essence de térébenthine (induction d'une inflammation "aiguë") associée à l'administration intra-musculaire de 5 mg d'acétate de cortisone. Le sérum inflammatoire est prélevé 48h après ces injections. III. FILTRATION SUR GEL La filtration sur gel de polyacrylamide commercialisé sous la marque Ultrogel AcA22 (IBF) de gamme de fractionnement (100 000 - 1 200 000) a été utilisée. La colonne 100 x 1,6 cm (LKB) a été préparée avec un tampon phosphate 0.05M, NaCl 0,25M, pH 8,0. Le calibrage de la colonne a été effectué avec des protéines de référence. Un volume de 2 cm3 de sérum de rat est déposé sur la surface du gel par un adaptateur lié à une pompe péristaltique (volume total du gel :180cm3). Les différents sérums subissent auparavant une dialyse contre le tampon de départ (tampon phosphate 0.05M, Nacl 0.25M, pH 8.0) pendant 2 heures. L'élution est effectuée dans le même tampon phosphate pH 8,0. Le volume de chaque fraction recueillie est de 5 ml. Les fractions sériques (I, II, III, IV, etc...) recueillies sont concentrées jusqu'au volume initial (2ml.), par ultra-filtration sur membrane Millipore 100 x M (Amicon). On mesure leur absorption à 280mu. IV. ANALYSE ELECTROPHORETIQUE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE. Résultats Du 12e jour de gestation au 7e jour post-partum, le sérum de femelles allogestantes et le sérum de femelles en post-partum montrent la présence d'une bande protéique supplémentaire dans la fraction IV (zone de gammaglobulines IgM). Le sérum d'inflammation "aiguë" de mâle et le sérum de femelle pseudogestante ont montré une bande protéique supplémentaire dans la fraction IV, qui est comparable à celle observée dans le sérum de femelle allogestante. V. DETERMINATION DES POIDS MOLECULAIRES Le poids moléculaire de la bande protéique caractéristique de la gestation est déterminé par la comparaison de la mobilité électrophorétique en gel avec celle des protéines de référence. Cette bande protéique a une mobilité RF 0,11 et son poids moléculaire est approximativement 840.000 Daltons. VI. EPUISEhENT IMMECOLOGIQUE Immunisation de lapins contre la fraction IV La fraction sérique IV (50-200ug) de mâle normal FISCHER/344 est mélangée avec l'adjuvant de Freund complet. L'émulsion qui en résulte est injectée par voie intra-dermique. Les injections sont répétées tous les dix jours par voie intra-musculaire à dose protéique de 50g en adjuvant de Freund incomplet. Le prélèvement de sang a lieu une semaine après la quatrième injection. Les IgG spécifiques de l'immun sérum obtenu sont précipités par le sulfate d'ammonium et purifiés sur DEAE cellulose. On prépare de façon analogue un immun sérum de lapin contenant des IgG dirigées contre la fraction sérique IV de rattes non gestantes. TECHNIQUE D'EPUISEMENT IMMUNOLOGIQUE 100r;l d'antigène (fraction sérique) de femelle allogestante sont ajoutés à 300pl d'immun sérum spécifique. Le mélange est laissé 1 heure à température ambiante et 2 heures à + 40C., puis centrifugé 15 minutes à 3000g. Le procédé est répété en ajoutant 1 volume d'immunsérum à 1 volume de surnageant. Après une nuit à + 40C, on centrifuge 15 minutes à 3000g, et on recueille le surnageant. On opère de même avec les fractions sériques de femelle pseudogestante et de mâle développant une inflammation aiguë. VII. CARACTERISATION DE LA PROTEINE a) IMSUNO-DIFFUSION EN GLOSE Après épuisement immunologique soit de la fraction IV de femelle allogestante, soit de la fraction IV du sérum de femelle pseudogestante (déciduome) soit de la même fraction de sérum d'inflammation "aiguë" par l'immun-sérum anti-(fraction IV) de mâle normal, on n'observe plus qu'un seul arc de précipitation pour la fraction sérique IV épuisée de femelle allogestante ou pour la fraction sérique IV épuisée de femelle porteuse d'un déciduome ou de mâle ayant subi une inflammation "aiguë". b) ANALYSE IMESNO-ELECTROPHOREIIQUE Les résultats précédents sont confirmés par l'analyse immur.o-électrophorétique. Les fractions sériques IV (de femelle gestante ou pseudo-gestante, ou d'inflammation aiguë) épuisées avec l'immun-sérum anti-fraction IV de mâle montrent un seul arc de précipitation principale. c) ETUDE ELECTROPHORETIQUE La fraction sérique IV épuisée de femelle allogestante avec l'immun sérum anti-fraction IV de mâle est étudiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide 4 à 12%, qui révèle une seule bande protéique d'une mobilité RF 0,17- et de poids moléculaire 760 000 Daltons, comparable aux fraction sériques IV épuisées de décidualisation et d'inflammation. EXEMPLE 2 En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, au départ d'un pool de sérums de femmes enceintes (entre le 3e et le 9e mois de grossesse), on a obtenu une fraction protéique analogue à 12 fraction IV de l'exemple 1. Par épuisement immunologique avec des anticorps de lapin dirigés contre le sérum total d'homme et avec des anticorps de lapin dirigés contre la fraction sérique d'alpha2-macroglobuline de femmes non gestantes, on a obtenu une protéine I.R.G. purifiée ayant des caractéristiques analogues à celles de la protéine décrite à l'exemple 1. EXEMPLE 3 . Etude de la protéine I.R.G. INHIBITION "IN VITRO" DE LA REPONSE T CYTOTOXIQUE ALLOSPECIFIQUE La réponse T cytolytique se développe au cours d'une réaction lymphocytaire mixte secondaire unidirectionnelle. Pour cela, des cellules spléniques sont prélevées chez des rats mâles Fischer, 5 jours après la pose d'ur. greffon de peau de rat Wag. Ces cellules immunisées (2 x 106) sont incubées en présence d'un même nombre de cellules spléniques de rat Wag traitées à la mitomycine C (cellules stimulantes), dans un volume total de 2 ml de RPMI 1640 (Eurobio) additionné de tampon HEPES (20 mM), de 2-mercaptoéthanol (5 x 10 M) d'antibiotiques, et de 5% de sérum de rat inactivé par la chaleur.Après 7 jours de culture à 370C dans une atmosphère humide contenant 5% de C02, l'activité cytolytique des cellules répondeuses est étudiée en CML (lympholyse à médiation cellulaire) contre des cellules péritonéales de rat Wag préalablement stimulées par la phytohémagglutinine et marquées au Chrome 51, le rapport cellules tueuses/cellules cibles étant de 100/1.Après une incubation de 6 heures à 370C, la quantité de chrome 51 relarguée dans le surnageant est mesurée et le pourcentage de cytotoxicité calculé d'après la formule cpm expérimental - cpm spontané x 100 cpm incorporé sur les cellules cibles La fraction sérique examinée pour son activité immunosuppressive est ajoutée à une concentration finale de 5% (100 pl) soit au début de la culture lymphocytaire mixte (temps zéro), soit après le 7e jour de la culture durant la dernière heure de l'incubation. Dans les deux cas, les cellules sont lavées avant la mesure de leur activité cytolytique.Le pourcentage d'inhibition de la cytotoxicité est calculé d'après la formule % cytotoxicité en présence de la fraction sérique 100 - ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ % cytotoxicité en absence de la fraction sérique Les fractions sériques examinées sont la fraction IV du sérum de rat mâle développant une inflammation aiguë, la même fraction purifiée (par épuisement immunologique), et la fraction IV purifiée de femelle gestante. Les résultats sont résumés dans les tableaux I et II ci-après. Des résultats analogues ont été obtenus avec les fractions sériques de rattes femelles pseudogestantes et de femmes enceintes. TABLEAU I FRACTIONS No. EXP. SERIQUES DE TESTEES l 2 3 4 CYTOTUXICITE INHIBITION Témoins 46.28 56.48 56.46 50.46 52.42 + 4.97 Fr. IV T 16.87 14.07 17.25 12.72 15.22 + 2.40 70.96 + 1.70 Fr. IV TP 12.92 10.90 15.15 15.85 13.70 + 1.12 73.86 + 2.95 Fr. LV gP 11.22 12.32 14.50 13.22 12.81 t 0.75 75.56 + 0.75 Les fractions sériques purifiées sont ajoutées au temps O de la RLM. Résultats significatifs p Fr. IV T : fraction IV d'inflammation aiguë Fr. IV gP : fraction IV purifiée de femelle gestante Fr. IV TP : fraction IV purifiée d'inflammation aiguë RLM : réaction lymphocytaire mixte TABLEAU II FRACTIONS No. EXP. SET TIQUES DE TESTEES 1 2 3 4 CYTOTOXICITE INIIIBITION Témoin 46.28 56.48 56.46 50.46 52.42 + 4.97 -Fr. IV T 18.88 18.30 18.95 16.10 18.05 + 0.66 65.56 + 0.50 Fr. IV TP 18.15 15.10 17.10 13.22 15.89 + 1.09 69.68 + 1.22 . . ~ ~ ~~ Fr. IV gP 13.37 13.90 15.45 17.98 15.17 + 0.90 70.06 + 0.75 Les fractions fractions sériques purifiées sont ajoutées au jour 7 de la RLN résultats significatifs p Fr. IV T : fraction sérique d'inflammation aiguë Fr. IV gP: fraction IV purifiée de femelle gestante Fr. IV TP: fraction IV purifiée d'inflammation aiguë EXEMPLE 4 : Etude de l'inhibition de l'activité du complément in vitro On utilise le sérum de rattes allogestantes Fischer/344 accouplées à des mâles Wistar, prélevé aux jours 9, 12, 15 et 19 de la gestation, ainsi que des sérums de femmes enceintes depuis 3 à 9 mois et de femmes enceintes en préavortement spontané. Pour extraire et purifier les fractions correspondant à la protéine IRG, on opère comme à exemple 1. L'inhibition du complément a été mesurée par la méthode classique de l'hémolyse en plaques de microtitration. RESULTATS Le sérum ou des fractions des sérums de rats femelles allogestantes ou de femmes enceintes ajoutés au milieu contenant des hématies de mouton sensibilisées par des IgG de lapin anti-mouton n'a pas d'activité inhibitrice sur le complément de cobaye. L'incubation préalable (lh à 370C) des sérums entiers ou de ceux de mâle ne modifie pas la réaction de lyse immune. Mais après incubation préalable de la fraction I.R.G. avec le conplément, on constate que 1) il y a inhibition de l'activité complémentaire par l'I.R.G. 2) il y a augmentation de l'activité anti-complémentaire de ces fractions après purification ; 3) la fraction correspondant à l'I.R.G. des sérums ce rats mâles, de rats femelles vierges ou de femmes enceintes sur le point d'avorter n'entrasse pas de modifications de l'activité complémentaire. On a recherché en outre si la protéine I.R.G. possède une activité anti-protéase. Lorsque l'I.R.G. est incubée avec de la trypsine et un petit substrat (le T.A.M.E.) ou un gros substrat (caséine), on constate que : 1) l'I.R.G. n'inhibe pas l'activité de la trypsine mais au contraire l'augmente 2) l'I.R.G., après incubation avec la trypsine et ses substrats, garde ses propriétés anti-complémentaires ; 3) la fraction de sérum de rat mâle correspondant à l'I.R.G. inhibe l'activité de la trypsine ; elle a donc une activité anti-protéase. L'I.R.G. de gestation serait donc un activateur des protéases induisant comme la plasmine soit l'activation dc C î dans la voie classique et du C3 dans les voies classique et alterne. Cette propriété n'est trouvée que dans le sérum de femelles gestantes normales. EXEMPLE 5 : Etude in vivo INHIBITION DU REJET D'ALLOGREFFES CUTANEES, AVEC MAINTIEN DES DEFENSES IMMUNITAIRES AUTRES QU'ANTI-GREFFES. Des rats Fisher/344 reçoivent le jour 0 un greffon de peau de rat Wag de 1 cm de diamètre dans la région sous scapulaire. Le greffon étant maintenu par six points de suture, le jour du rejet est défini comme celui où le greffon nécrosé se détache de son lit (14,5 jours après la pose du greffon chez les témoins). Les receveurs de l'allogreffe sont traités avec au total 0,5 ml de la fraction sérique répartis en plusieurs injections intraveineuses effectuées avant et après la greffe. Les résultats sont résumés dans le Tableau III (page suivante). En administrant la même quantité d'I.R.G. répartie en plusieurs injections (8 injections intra-veineuses aux jours J-3, J-2, J-1, 5+3 et J+5 à J+7, + 3 injections locales sous le greffon à J+5 et J+7), le temps moyen de survie du greffon a été de 30,60+0,30 jours (limites extrêmes des temps de rejet : 29 à 31 jours). En administrant la même quantité d'I.R.G. répartie en plusieurs injections (7 injections intraveineuses aux jours J-3, J-2, J-1, J+1, J+3, J+5, J+6 et 4 injections locales de J+7 à J+10), les limites extrêmes des temps de rejet ont été de 45 à 51 jours. Des expériences préliminaires sur la qualité des défenses de l'organisme avant et après une allogreffe chez le rat avec ou sans injection d'I.R.G. - injection de glycoprotéines de membrane de T. equiperdum (Botat 1), réputée comme stimulant les défenses humorales, - infestation avec un parasite non mortel (Plasmodium berghei berghei), ont montré que les défenses ne sont pas modifiées lorsque l'allogreffe est précédée et suivie d'injections d'I.R.G. On rappellera ici que chez le rat l'infestation par Plasmodium berghei est une maladie curable et que la résistance à la maladie fait appel aux défenses immunitaires cellulaire et humorale. EXEMPLE 6 : Préparation d'anticorps anti-I.R.G. On immunise des lapins contre la protéine I.R.G. de ratte obtenue à l'exemple 1. La technique d'immunisation et de purification des gammaglobulines est analogue à celle décrite à l'exemple 1. On obtient une préparation de gammaglobulines anti-(I.R.G. de ratte) permettant par exemple de purifier ou de détecter cette protéine I.R.G. TABLEAU III LIMITES EXTREMES TEMPS MOYEN TRAITEMENT No. ALLOCREFFE DES TEMPS DE REJET DE SURVIE DE CREFFE ECART TYPE Sérum phy- 10 13 - 15 14.50 + 0.34 siologique (temoins) Fr. IV g 10 17 - 21 20.71 + 1.01 Fr. IV T 1 10 21 - 27 24.00 t 0.5B Fr. IV g : fraction sérique purifiée de femelle gestante Fr. IV T : fraction sérique purifiée d'inflammation aiguë Résultats significatifs : p REVENDICATIONS 1. Protéine I.R.G. caractérisée par le fait - qu'elle est présente dans le sérum des femelles gestantes et normalement absente chez les mâles et les femelles non gestantes - qu'elle est présente dans le sérum des individus développant une réaction inflammatoire aiguë - qu'elle migre en électrophorèse avec les alpha2-macroglobulines - qu'elle a une masse moléculaire, mesurée par filtration sur gel de polyacrylamide, de 800.000 - 50.000 environ - qu'elle réagit spécifiquement avec des anticorps dirigés contre la fraction alpha2-macroglobuline des femelles gestantes - qu'elle inhibe de façon significative in vitro l'activité des lymphocytes cytotoxiques au cours d'une réaction lymphocytaire mixte secondaire - que, mélangée avec le complément, elle inhibe la réaction d'hémolyse des globules rouges de moutons sensibilisés - qu'elle n'a pas d'activité antiprotéase - et que son administration in vivo prolonge de façon significative la survie des allogreffes; ainsi que les analogues de cette protéine. ainsi que les analogues de cette protéine, lesdits analogues étant tous fragments et tous peptides synthétiques ou semi-synthétiques contenant des séquences peptidiques présentes sur la protéine I.R.G. ainsi que tous dérivés de ces fragments ou peptides, à conditions que ces fragments, peptides ou dérivés satisfassent aux conditions suivantes - ils inhibent de façon significative l'activité in vitro des lymphocytes cytotoxiques au cours d'une réaction lymphocytaire mixte secondaire - leur administration in vivo prolonge de façon significative la survie des allogreffes. 2. Procédé de purification et d'obtention de la protéine I.R.G., caractérisé par le fait - que l'on fractionne le sérum de mammifères femelles gestantes, et/ou d'animaux mammifères développant une réaction inflammatoire expérimentale, ou encore le sang placentaire, de façon à isoler des fractions migrant avec les alpha2-macroglobulines ; - et que l'on soumet lesdites fractions à un épuisement immunologique avec des anticorps IgG anti-sérum entier de mâle et/ou de femelle non gestante et/ou anti-(alpha2-macroglobulines) de mâle et/ou de femelle non-gestante pour recueillir les fractions ne réagissant pas avec lesdits anticorps. 3. Utilisation de la protéine I.R.G. ou de ses analogues, ou de fractions sériques la contenant, comme ingrédient actif dans un médicament immunomodulateur ayant notamment la propriété d'inhiber l'immunité de greffe sans affecter les autres défenses immunitaires, ou dans un médicament progestatif. 4. Utilisation de la protéine I.R.G. ou de ses analogues dans la préparation d'un médicament immunomodulateur ou progestatif. 5. Anticorps anti-I.R.G. caractérisé par le fait qu'ils sont dirigés contre la protéine I.R.G. ou contre ses analogues tels que définis dans la revendication 1, ou contre des déterminants antigéniques caractéristiques de cette protéine, lesdits anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, étant éventuellement marqués et/ou fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigène-anticorps. 6. Procédé de préparation des anticorps de la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on immunise des animaux par administrations répétées, selon les méthodes connues d'I.R.G., de fractions sériques enrichies en I.R.G., ou de fragments antigéniques d'I.R.G. éventuellement couplés à une macromolécule, puis que l'on recueille les anticorps sériques desdits animaux immunisés, et que, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique selon les méthodes connues et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus. 7. Utilisation des anticorps anti-I.R.G. tels que définis dans la revendication 5, comme agents de purification ou de détection de l'I.R.G., ou comme médicaments dans la prévention et le traitement des maladies consécutives à des processus inflammatoires. 8. Médicament caractérisé par le fait qu'il contient comme ingrédient actif la protéine I.R.G. ou ses analogues, tels que définis dans la revendication 1, ou des anticorps anti-I.R.G.