Brevet FR2595705A1 — publié le 19870918

La présente invention est relative à des nouveaux dérivés nDnapeptide éthylamide ou décapeptide amide de gonadolibêrine de formule générale (I), Glp-His-Irp-Ser-Tyr-Xl-X2-X3-Pro-X4 (I) dans laquelle, X1 est un groupe acide 2-aminobenzolque ou 3-aminobenzolque; X2 est un groupe leucyle, tryptophyle ou phénylalanyle; X3 est un groupe arginyle, leucyle ou glutaminyle; 10 et X4 est un groupe glycylamide ou éthylamide, ainsi qu'à leurs sels d'addition acides et à des préparations pharmaceutiques les contenant. Selon un autre aspect de l'invention, on fournit 15 un procédé pour préparer des nouveaux composés de formule générale (I) et leurs sels. Les abréviations utilisées dans les formules sont conformes à la nomenclature acceptée dans la chimie des peptides (voir J. Biol. Chem. 241, 527, 1966), par exemple). Les significations des abréviations utilisées dans la description sont donc les suivants: X -X- Glp His 25 Trp Ser Tyr Gly Phe 30 Leu Pro Glu Gln Arg 35 Mab :acide pyroglutamique:histidine:tryptophane: sérine:tyrosine glycine:phénylalanine:leucine:proline:acide glutamique:glutamine:arginine:acide 3-aminobenzolque (pyroglutamyl) (histidyl) (tryptophyl) (séryl) (tyrosyl) (glycyl) (phénylalanyl) (leucyl) (prolyl) (glutamyl) (glutaminyl) (arginyl) Aa: acide anthranilique Boc: ter-butyloxycarbonyle Bzl: benzyle DCC: dicyclohexylcarbodiimide DCU: dicyclohexylurée DIC: diisopropylcarbodiimide DMF: diméthylformamide DNP: dinitrophényle EA: éthylamide 10 Et: éthyle CLHP: chromatographie liquide haute performance Me: méthyle ONP:4-nitrophényle OPCP: pentachlorophényle 15 OPFP: pentafluorophényle TEA:triéthylamine TFA: acide trifluoroacétique THF: tétrahydrofuranne CCM: chromatographie sur couche mince 20 Tos: tosyle UV: ultraviolet Z: benzyloxycarbonyle La gonadolibérine (autres noms connus dans la littérature: hormone libérant la gonadotrophine,hormone libé25 rant les hormones folliculo-stimulante et lutéinisante [ILH/FSH-RH); chimiquement Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-LeuArg-Pro-Gly-NH2 7 et les dérivés connus de cette hormone ont en commun l'aptitude à libérer les hormones lutéinisante et folliculo-stimulante (LH et FSH). Au début des années 80, on a constaté que la structure de la gonadolibérine chez certains poissons et oiseaux est différente de celle de la gonadolibérine trouvée chez les mammifères /-J.A. King et R.P. Millar: J. Biol. Chem. 257, 10722 (1982); South-African J. of Science 78, 124 (1982); N. Sherwood et coll.: Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2794 (1983)]7. Ces différences touchent les aminoacides en position 8 dans le cas des oiseaux et les aminoacides en position 7 ou 8 respectivement dans le cas des poissons. On sait aussi dans la littérature, que des dérivés de gonadolibérine contenant des D-aminoacides avec une chaine latérale aromatique ou aliphatique hydrophobe à la place de la glycine en position 6, présentent un effet accru par rapport à celui qu'exerce la gonadolibérine -J. Sandow et coll.: "Control of Ovulation", Ed. Butterworth, London 1978, 10 49-70; A.V. Schally et coll.: Ann. Rev. Biochem., 47, 89 (1978)]. De plus, on sait que l'on peut augmenter l'activité biologique de la gonadolibérine à un niveau plus élevé en remplaçant le groupe glycinamide en position 10 par des groupes amides contenant une chaîne aliphatique /M. Fujino et coll.: J. Med. Chem. 16, 1144 (1973)7. Lors de recherches portant sur la teneur énergétique des diverses conformations possibles du décapeptide, F.A. Momany /-J. Amer. Chem. Soc. 98, 2990 (1976); et ibidem 98, 2996 (1976)7 a montré que la plus faible teneur en énergie est représentée par un arrangement spatial, dans lequel la molécule est pliée en '"U" (tour B) à l'emplacement de la glycine ou de l'D-alanine en position 6. R.M. Freidinger et coll. / Science 210, 656 (1980)/ ont préparé un dérivé de 25 GnRH de formule (IV), Glp-Fis-Trp-SerTyr-!HE CHI O=wX cx \CH2 E H 2.-1-r-AgCC (IV) FIC CE 3 3 dans laquelle ils ont fixé la structure spatiale en remplaçant la glycine en position 6 par un cycle y-lactame. L'activité biologique de ce composé était plus forte que celle de la gonadolibérine native. Le but de l'invention est de préparer des nouveaux dérivés de gonadolibérine qui présentent une efficacité biologique plus avantageuse que celle des composés connus et sont utiles pour la reproduction d'autres espèces comme des poissons et des amphibiens, en plus de celle des mammifères. L'invention a pour autre but de fournir un procédé dans lequel la glycine en position 6 est remplacée par un aminoacide d'un nouveau type, qui contient le cycle aromatique augmentant l'activité biologique, tandis que l'arrangement spatial particulièrement préféré est fixé et simultané15 ment, de supprimer le risque de racémisation. L'invention repose sur la constatation selon laquelle on peut atteindre le but ci-dessus en incluant un groupe acide 2-amino-benzolque (acide anthranilique) de formule (V), Gl p-Fi s-Trp-er-Tyr-B o> C(V) _2!T- GlyPro-Arg- Le--C Il O. ou un groupe acide de 3-aminobenzolque de formule (VI), G!- s--S e r- -5 (VI) H2S-Gly-Pro-Lrg-eLeu- à la place du groupe glycine en position 6 de la gonadolibérine. De plus, l'invention repose aussi sur la constata15 tion selon laquelle on peut encore augmenter l'efficacité de ces dérivés de gonadolibérine en remplaçant le groupe glycine amide en position 10 par un groupe alcoylamide contenant 1 à 4 atomes de carbone. Enfin, l'invention repose sur la constatation selon 20 laquelle on peut préparer des dérivés de gonadolibérine utiles pour reproduire d'autres espèces en plus des mammifères, en remplaçant les aminoacides en position 8 ou en positions 7 et 8 de la gonadolibérine par certains aminoacides. A partir de ces faits, on fournit un procédé de préparation des composés nonapeptide éthylamide ou décapeptide amide de formule générale (I), o X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis plus haut, et de leurs sels, qui comprend: a) la condensation des aminoacides protégés par la mise en oeuvre des combinaisons appropriées de condensations 30 par étapes et de fragments et l'élimination de groupes protecteurs; ou b) la condensation par étapes, selon la méthode de synthèse des peptides en phase solide, des aminoacides protégés sur un support solide dans un ordre approprié par la méthode du carbodiimide ou de l'ester actif, la séparation du produit final du support solide par coupure acide ou alcaline et l'élimination des groupes protecteurs qui est effectuée pendant, avant ou après la séparation de la résine. Un mode de réalisation particulièrement préféré des combinaisons selon le procédé a), comprend la condensation d'un pentapeptide azide de formule (II), Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) avec tétrapeptide ou un pentapeptide de formule générale (III), 10 Xl-X2-X3-Pro-X4, (III) o X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis plus haut. Dans le procédé b), il convient d'utiliser une résine benshydrylamine ou une résine de polystyrène chloro15 méthylé comme support solide (phase solide). Il est commode d'éliminer le produit final contenant les groupes protecteurs en effectuant la coupure avec de l'acide fluorhydrique et/ou en procédant à une éthylammonolyse. Le nona- ou décapeptide amide ainsi obtenu peut être transformé, si cela est désiré, en un sel d'addition acide, par réaction avec un acide acceptable du point de vue pharmaceutique ou bien, si cela est désiré, la base libre peut être libérée à partir du sel d'addition acide par réaction 25 avec une base. L'invention concerne aussi des compositions utiles à des fins thérapeutiques et/ou biologiques de reproduction, qui contiennent les composés de formule générale (I) ou un sel d'addition acide de celui-ci comme composant actif. De plus, l'invention se rapporte aussi à un procédé de préparation de ces compositions, qui comprend le mélange d'un composé de formule générale (I) ou d'un sel d'addition acide de celui-ci, avec les véhicules et/ou supports utilisés couramment pour obtenir une composition utile à des fins 35 thérapeutiques et/ou biologiques de reproduction. Dans le cas du bétail, les dérivés de gonadolibérine de formule générale (I) sont efficaces à des doses de à 200 pg par voie intramusculaire, souscutanée ou intraveineuse, tandis que dans le cas des poissons, ils sont actifs à des doses de 0,1 à 100 pg par voie intramusculaire ou souscutanée. Les grands avantages offerts par les nouveaux dérivés de la gonadolibérine de formule (I) et le procédé de la présente invention, sont les suivants: a) Les nouveaux dérivés de la gonadolibérine sont plus efficaces que les dérivés de gonadolibérine connus jusqu'à maintenant, encequi concerne les expériences biologiques de reproduction menées sur le bétail et les poissons. b) Les nouveaux substituants placés en position 6 ne 15 contiennent aucun centre d'asymétrie, si bien qu'aucune racémisation ne peut apparaître et que la préparation du produit final est plus facile et moins cooteuse. c) Les cotts de préparation des acides 2- et 3-aminobenzolques sont bien inférieurs à ceux des D-aminoacides 20 jouant un rôle analogue dans les. drivés connus de GnRH. d)Le composant pentapeptide de formïule (II) utilisé comme matière de départ dans le procédé a) est l'intermédiaire commun de chaque produit final. L'invention est illustrée par les exemples non25 limitatifs suivants, dans lesquels les valeurs Rf de chromatographie sur couche mince (CCM) ont (té déterminées sur des feuilles de Kieselgel (DC Alufolien, Merck) avec les systèmes solvants suivants, désignés par un numéro placé audessus des signes "Rf: L Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 30:20:6:11 2. Acétate d' éthyle/pyridine/acide acétique/eau 60:20:6: 11 3. Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 120.20:6:11 4. Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau24020:6:11 5. n-Butanol/acide acétique/eau/acétate d'éthyle 1:1:1:1 35 6. n-Butanol/acide acétique/eau 4:1:1 7. Isopropanol/acide acétique molaire 2:1 8. Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 5:5:1:3 9. Acétone/toluène 1:1 10. Chloroforme/acide acétique 24:2 11. Butanone/pyridine/eau 65:15:20 12. Chloroforme/méthanol/acide acétique 85:10:5 13. n-Butanol/acide acétique/ammoniaque (1 vol. d'hydroxyde d'ammonium concentré + 4 vol. d'eau)/eau 6:1:1:2 Exemple 1 Préparation de /Aa6, Gln8, desGly107-gonadolibérine éthylamide. Etape a): Préparation du Boc-His(DNP)-Trp-OMe (poids molé15 culaire: 622, 62) 21,12 g (50 mmoles) de Boc-His(DNP)-OH sont dissous dans 100 ml de DMF refroidis à 0 C, puis 10,32 g (50 mmoles) de DCC et 7, 66 g (50 mmoles) de N-hydroxybenzotriazole sont ajoutés sous agitation. Apres 10 minutes d'agitation à 0 C, 20 la DCU précipitée est séparée par filtration. La solution de 12,74 g (50 mmoles) de H-Trp-OMe, HC1 dans 70 ml de DMF est refroidie à 0"C, 6,94 ml (50 mmoles) de TEA sont ajoutés et après 5 minutes d'agitation, le chlorhydrate de triéthylamine précipité est séparé par fil25 tration. Les deux solutions ci-dessus sont combinées et agitées une nuit à 0 C. Le précipité de DCU est séparé par filtration et la solution est évaporée à siccité. Le résidu huileux est dissous dans 500 ml d'acétate d'éthyle et extrait 30 3 fois avec une portion de 100 ml d'une solution molaire de sulfate acide de potassium refroidie par la glace, puis 5 fois avec une portion de 100 ml de solution saturée de carbonate acide de sodium et enfin deux fois avec une portion de 100 ml d'une solution à 10 % de chlorure de sodium. La phase orga35 nique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre, filtrée et évaporée à siccité. Le résidu huileux est soigneusement trituré avec de l'éther de pétrole et la poudre obtenue est filtrée et séchée. Le produit cristallin ainsi obtenu est recristallisé à partir d'acétate d'éthyle/éther de pétrole pour donner le produit recherché avec un rendement de 27,70 g (89 %), p.f.: 119-122C. 22 = + 14,10 (c = 1, DMF) [iD 4 5 Rf4 = 0,62; Rf5 = 0,41. Etape b): Préparation du H-His(DNP)-Trp-OMe,2HCl /poids moléculaire: 522,49 (base libre); 595,41 (chlorhydrate) 7. ml d'une solution 4N d'acide chlorhydrique méthanolique sont ajoutés à une solution contenant 24,9 g (40 mmoles) du dipeptide de Boc-His(DNP)Trp-OMe dans 100 ml de méthanol. Le mélange est laissé 30 minutes à la température ambiante tandis que le chlorhydrate du dipeptide ester cristallise. Le précipité est filtré, lavé à l'éther et séché 20 pour donner 21,91g (92 %) de composé recherche, p.f.: 198-202 C. a]22 = 0,49o (c = 1, DMF) []D 3 4 Rf = 0,46; Rf = 0,18 25 Etape c): Préparation du Glp-His-(DNP)-Trp-OMe (poids moléculaire: 633,60) Le mélange contenant 4,85 g (36,8 mmoles) d'acide 30 L-pyroglutamique, 7,58 g DCC et 5,63 g de Nhydroxybenzotriazole dans 100 ml de DMF est ajouté à 5-10 C pendant 10 minutes, puis le précipité de DCU est filtré. 9,72 ml (70 mmoles) de TEA sont ajoutés à la solution de 20,84 g (35 mmoles) de H-His(DNP)-Trp-OMe,2HCl dans 35 100 ml de DMF. Après 5 minutes d'agitation, le chlorhydrate de triéthylamine précipité est filtré. Les deux solutions sont combinées et agitées à la température ambiante pendant une nuit. Le jour suivant, 90 ml d'acétone sont ajoutés et le précipité insoluble est filtré. Le résidu huileux obtenu après évaporation est soigneusement trituré avec de l'acétate d'éthyle, filtré et séché. Le produit cristallin sec est lavé 3 fois avec 25 ml d'eau à chaque fois et séché à nouveau. Le produit ainsi obtenu est recristallisé dans l'acétate d'éthyle chaud pour donner le composé recherché avec un ren10 dement de 18,42 g (83,1 %), p.f.: 148-151 C. Il 23 = +5,2 (c = 1, DMF) --x D 3 7 Rf3 = 0,53; Rf = 0,38 Etape d): Préparation de Glp-His-Trp-OMe (poids moléculaire: 466,50). Une solution contenant 15,84 g (25 mmoles) de tripeptide protégé GlpHis(DNP)-Trp-OMe dans 100 ml de DMF et 40 ml d'eau, est additionnée de 4 ml de mercaptoéthanol, puis le pH de la solution est ajusté à 8 par addition de TEA. La solution est laissée reposer à la température ambiante pendant 30 minutes puis évaporée sous pression réduite. Le résidu huileux est soigneusement trituré avec de l'éther, fil25 tré et séché. Le produit ainsi obtenu est dissous dans un petit volume de méthanol et cristallisé par addition d'éther. Les cristaux sont filtrés et séchés pour donner 10,92 g (93,6 %) du composé recherché, p.f.: 228-232 C. [a 22 = + 4 04 (c = 0,42, DMF) 30 2 Rf = 0,30 Etape e): Préparation du Glp-His-Trp-N2H3 (poids moléculaire: 466,51) 20 ml d'hydrazine hydratée à 98 % sont ajoutés à 259570-5 une solution contenant 9,33 g (20 mmoles) du tripeptide Glp-His-Trp-OMe dans 250 ml du méthanol. Le mélange est agité à 40 C pendant 3 heures, puis une nuit à la température ambiante. Le jour suivant, le précipité est filtré, lavé avec 5 du méthanol froid et séché pour donner 7,58 g (rendement de 81,2 %) du composé recherché; p.f.: 166-169 C. r 22 = -22,3 (c = 0,5, DMF) i 2 Rf = 0,50; Rf = 0,14. Etape f): Préparation de Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe (poids moléculaire: 716,8). La solution de 7,0 g (15 mmtoles) de Glp-His-Trp15 N2H3 [préparée selon l'étape e) ci-dessus / dans 60 ml de DMF est refroidie à 0 C et 7,5 ml (45 mmoles) d'une solution d'acide chlorhydrique 6N sont ajoutés sous agitation. Ensuite, une solution aqueuse concentrée de 1,035 g (15 mmoles) de nitrite de sodium est lentement ajoutée au mélange, lequel est 20 agité à 0 C pendant 15 minutes supplémentaires. Une solution de 4,78 g (15 mmoles de H-Ser-Tyr-OMe,HCl dans 15 ml de DMF) est ajoutée, puis le pH du mélange est ajusté à la neutralité par addition de 6,25 ml (45- mmoles) de TEA. Le mélange est agité à 0-4'C, pendant une nuit, puis évaporé à siccité sous pression réduite. Après une trituration soigneuse du résidu huileux avec de l'éther et un séchage, on obtient une poudre avec un rendement de 12,1 g (100 %) qui présente deux petites taches de contamination par CCM, cependant on peut la convertir sans purification préalable en l'hydrazide qui cristallise bien. Après recristallisation d'un échantillon dans du méthanol, le composé recherché fond à 188-190 C. [ 22 = _3,48 (c = 1, DMF) Df D 1 2 Rf = 0,58;Rf 0,26 Etape g): Préparation de Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 (poids moléculaire: 716,8) Après addition de 10 ml d'hydrazine hydratée à 98 % 5 à une solution contenant 12 g de pentapeptide ester Glp-His-TrpSer-Tyr-OMe brut en poudre, dans 200 ml de méthanol, le mélange est agité à 40 C pendant 3 heures. Le mélange est ensuite agité à la température ambiante pendant une nuit, puis le précipité cristallin est filtré et séché dans un dessicateur sur de l'acide sulfurique concentré. Les cristaux séchés sont dissous dans 250 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 0,5N, neutralisés à un pH 8 par addition d'une solution saturée de carbonate de sodium et laissés reposer à 0 C pendant 2 heures. Le précipité cristallin est filtré, 15 lavé avec de l'eau glacée et séché pour donner 6,12 g (rendement de 56,9 % calculé pour deux étapes ensemble) du composé recherché, p.f.: 205-206 C. 21 2 = 21,51 (c = 1, DMF) Rf = 0,39; Rf = 0,14. L'analyse de l'azote d'hydrazine a donné 3,79 % et 3,76 % (la valeur calculée est de 3,91 %). Etape h): Préparation de H-Gln-Pro-NHEt,TFA poids moléculaire: 367,3 (Boc: 370,49)/ g (70 mmoles) de proline éthylamide (obtenu par hydrogénation de 72 mmoles de Z-Pro-NHEt) sont dissous dans ml de DMF et le pH de la solution est ajoutée à 8 par addition de TEA. Une solution contenant 32 g (87 mmoles) de Boc-Gln-ONP dans 100 ml de DMF est ajoutée sous agitation. Le résidu huileux est dissous dans un mélange contenant 50 ml de TFA à 30 % dans du dichlorométhane et laissé reposer à la température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, 35 la solution est évaporée sous pression réduite et le résidu huileux est soigneusement trituré avec de l'éther. Le produit solide ainsi obtenu est lavé à l'éther et séché sous pression réduite pour donner 15,9 % (rendement de 62 %) du produit recherché, dont le point de fusion ne peut pas être mesuré en raison de son fort caractère hygroscopique. ] 20 = 44,4o (c = 1, méthanol) D Rf = 0,32; Rf7 = 0,37; Rf13 = 0,21. f f =f,3 Etape i): Préparation du Z-Leu-Gln-Pro-NHEt (poids moléculaire: 518,57) 7 g (26 mmoles) de H-Gln-Pro-NHEt,TFA sont dissous dans 50 ml de DMF, refroidis à 0 C, puis le pH de la solution 15 est ajusté à 8 par addition de TEA. Une solution contenant 14 g (27,3 mmoles) d'ester pentachlorophénylique de L-leu dans ml de DMF est ajoutée et agitée à 4 C pendant une nuit. Le jour suivant le mélange est évaporé sous pression réduite et le résidu est dissous dans 70 ml d'acétate d'éthyle. La solution organique est extraite à 3 reprises avec une portion de 15 ml de solution d'hydroxyde de sodium 0,01N froide, puis 3 fois avec une portion de 15 ml d'eau. Les extraits d'hydroxyde de sodium et aqueux sont combinés et lavés deux fois avec une portion de 10 ml d'acétate d'éthyle. Apres combinaison, la solution d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite. Le résidu est soigneusement trituré avec de l'éther, le produit solide ainsi obtenu est filtré, lavé à l'éther et séché sous pression réduite pour donner 10,4 g (rendement de 77 %) 30 du produit recherché, p.f.: 8488 C. Cal D = -32,80 (c = 1, méthanol) Rf2 = 0,90. f Etape j): Préparation de H-Leu-Gln-Pro-NHEt,HBr (poids moléculaire: 465, 5) ml d'une solution 4N d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial sont ajoutés à une solution contenant 7,6 g (14,6 mmoles) de ZLeu-Gln-Pro-NHEt dans 50 ml d'acide acétique glacial, puis le mélange est laissé reposer à la température ambiante pendant 90 minutes. Le mélange est lentement versé dans 800 ml d'éther refroidi par de la glace 10 sous agitation. Après 30 minutes, l'agitation est stoppée et le précipité décanté est filtré puis séché dans un dessicateur sur du pentoxyde de phosphore pour donner 7,9 g de produit recherché, p.f.: 147 C. [a] 20 _-72,8 (c = 1, acide acétique 2N) 15 2 Rf = 0,30; Rf = 0,82. Etape k): Préparation de l'acide Boc-anthranilique (poids 20 moléculaire: 237,27) Le pH d'une solution contenant 4 g (30 mmoles) d'acide anthranilique dans 20 ml de DMF est ajusté à 8 par addition de TEA. Après addition de 9 g de ter-butyloxy carbonate, le mélange réactionnel est agité une nuit à la tempéra25 ture ambiante. Le solvant est évaporé et le résidu huileux épais est dissous dans 50 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée 3 fois avec une portion de 20 ml d'acide sulfurique 0, 01N refroidi par de la glace, puis 3 fois avec une portion de 20 ml d'eau. La solution d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite. L'épais résidu huileux devient cristallin après séjour dans un réfrigérateur. Le produit recherché est obtenu avec un rendement de 5,7 g (80 %); p.f.: 91-93 C. 9 10 Rf9= 0,87; R = 0,79 f Etape 1): Préparation du Boc-As-Leu-Gln-Pro-NHEt (poids moléculaire: 603,85) La solution contenant 2,3 g (5 mmoles) de bromhy5 drate de H-Leu-Gln-Pro-NHEt dans 10 ml de DMF est refroidie 0 C, puis le pH de la solution est ajusté à 8 par addition de TEA. Apres l'addition de 750 mg (5,5 mmoles) de N-hydroxybenzotriazole et de 1,1 g (5,5 mmoles) de OCC, une solution contenant 1,3 g (5,5 mmoles) d'acide Boc-anthranilique dans 10 5 ml de DMF est lentement introduite, puis le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 48 heures. La DCU précipitée est filtrée, puis la solution est évaporée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 50 ml d'acétate d'éthyle et lavé trois fois avec une portion de 20 ml d'acide citrique à 10 %, puis trois fois avec une portion de 20 ml d'eau, 3 fois avec une portion de 20 ml de solution saturée de carbonate acide de sodium et enfin avec ml d'une solution saturée de chlorure de sodium. La couche d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhy20 dre et évaporée sous pression réduite. Le résidu huileux est soigneusement trituré avec de l'éther et le précipité jaune pale en poudre est filtré et lavé à l'éther pour donner 2,4 g (rendement de 80 %) du produit recherché, p.f.: 119-121 C. R 9 = 0,91 f L'analyse des aminoacides a donné les valeurs suivantes: Gln 0,97; Pro 1,03; Leu 1,00; Aa 0,92. 30 Etape m): Préparation du H-Aa-Leu-GlnPrcoyNHEt,TFA (poids moléculaire: 599,63) 603 mg (1 mmole) de Boc-Aa-LeuGln-Pro-NHEt sont dissous dans 10 ml d'une solution contenant 30 % d'acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane et la solution est agitée à la température ambiante pendant 20 minutes. Le TFA est ensuite rapidement chassé sous pression réduite, le résidu est mis en poudre par addition d'éther et séché pour donner le produit recherché avec un rendement de 5,15mg (86 %). Rf = 0,52 Etape n): Préparation du Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro10 NHEt (poids moléculaire: 1188,48) Une solution de 358 mg (0,5 mmole) du pentapeptide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 (préparé selon l'étape g) ci-dessus) dans 10 ml de DMF, est refroidie à 0 C et 0,34 ml d'acide chlorhydrique 6N, puis une solution aqueuse concentrée de 37,7 mg de nitrate de sodium sont versés goutte a goutte dans cette solution sous agitation. Apres une période de 5 minutes 230 mg (0,5 mmole) de tétrapeptide H-Aa-Leu-Gln-ProNHEt,TFA dissous dans le mélange de 1 ml de DMF et de 0,34 ml de TEA à 0 C sont ajoutés. Si cela est nécessaire, le mélange réac20 tionnel est neutralisé par addition de TEA et agité à 0 C pendant 2 heures, puis laissé se réchauffer à la température ambiante. Le DMF est chassé sous pression réduite et le résidu est séparé par chromatographie sur-une colonne Sephadex G-25 (2 x 95 cm), sous forme dissoute dans une solution d'acide 25 acétique 0,2N. La séparation est suivie par absorption UV (mesurée à 280 nm) et CCM. Les fractions appropriées sont recueillies et lyophilisées pour obtenir le produit recherché avec un rendement de 315 mg (52 %). Rf = 0,58; Rf = 0,83; Rf = 0,72. 30 L'analyse des aminoacides a donné les valeurs suivantes: Ser 0,91; Gln 2,03; Pro 0,95; Leu 1,00; Tyr 1,00; His 1,02; Trp 0,81; Aa 0,95. Exemple 2 Préparation de / Aa6, desGly 07-gonadolibérine éthylamide Etape a): Préparation de Z-Arg(NO2)-Pro-NHEt (poids moléculaire: 465,47). 7,33 g (29,7 mmoles) de Z-Arg(NO2)-OH et 1,034 g de N-hydroxy-benzotriazole sont ajoutés à une solution contenant 3,24 g (22,8 mmoles) de proline éthylamide dans 70 ml de THF. 10 Le mélange réactionnel est refroidi dans un bain d'eau glacée et 5,34 g (25,8 mmoles) de DCC dissous dans 50 ml de THF sont ajoutés par portions sous agitation. Le mélange est agité sous refroidissement avec de la glace pendant 5 heures, à la température ambiante pendant 20 heures supplémentaires, puis filtré et lavé avec du THF. Le filtrat est évaporé sous pression réduite, le résidu est dissous dans du chloroforme et successivement lavé à trois reprises avec une portion de ml d'un mélange 1:5 d'hydroxyde d'ammonium et d'eau, deux fois avec une portion de 20 ml d'eau, trois fois avec une portion d'acide chlorhydrique 1N et enfin deux fois avec une portion de 20 ml d'eau. La solution chloroformique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, filtrée, lavée avec du chloroforme, puis le filtrat est évaporé. Le résidu est dissous dans un mélange de 35 ml de THF et de 50 ml d'acétate 25 d'éthyle, filtré et lavé avec 30 ml d'un mélange 1:2 de THF et d'acétate d'éthyle. Après évaporation de la solution, 100 ml d'éther éthylique sont ajoutés au résidu mousseux solide. Le produit ainsi obtenu est filtré, lavé à l'éther et séché sous pression réduite pour donner 9,69 g (rendement 30 de 98 %) du produit recherché, p.f.: 125 C. = -42,5 (c = 1, méthanol) La]D = ' 3 12 Rf= 0,5; Rf 0,72 Etape b): Préparation du Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt (poids moléculaire: 578,65) Une solution contenant 5,6 g (11,73 mmoles) du dipeptide éthylamide protégé Z-Arg(N02)-Pro-NHEt dans 30 ml d'acide acétique glacial est additionné de 55 ml d'une solution 4N d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial. Le mélange réactionnel est laissé reposer à la température ambiante pendant 90 minutes, puis 250 ml d'éther absolu sont 10 ajoutés et le mélange est laissé pendant une heure. Le surnageant est décanté du précipité et 100 ml d'éther sont ajoutés au résidu. Apres 15 minutes de repos, le mélange est filtré et soigneusement lavé à l'éther. La substance hydroscopique solide est séchée sur du pentoxyde de phosphore et de l'hydroxyde de sodium sous pression réduite. Un produit légèrement hygroscopique est ainsi obtenu avec un rendement de 6,44 g. 6,04 g (11,0 mmoles) de bromhydrate de dipeptide éthylamide ci-dessus sont mis en suspension dans 150 ml de 20 chloroforme et 5,5 ml de TEA sont ajoutés. La suspension se dissout lentement,une quantité supplémentaire de TEA (2,5 ml) est ajoutée pour obtenir une dissolution complète. Ensuite, une solution contenant 6,4 g de Z-Leu-OPCP dans 65 ml de chloroforme est ajoutée, goutte à goutte dans le mélange réac25 tionnel et celui-ci estagité une nuit. Le jour suivant, le mélange est successivement extrait avec de l'acide chlorhydrique IN, puis une solution saturée de chlorure de sodium et une solution d'hydroxyde d'ammonium 2N et enfin encore avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase 30 organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite. Le résidu est soigneusement trituré avec de l'éther. Le produit solide ainsi obtenu est filtré, lavé à l'éther et séché sous pression.réduite pour donner 5,5 g (rendement de 84,6 %) d'un produit brut. Le tripeptide éthylamide protégé obtenu est dissous dans 30 ml d'acétate d'éthyle sous un chauffage doux, clarifié avec du charbon actif et lavé deux fois avec des portions de 10 ml d'acétate d'éthyle. Le filtrat est additionné-peu a peu de 75 ml d'éther éthylique. Le précipité huileux prend vite en masse. Apres 2 heures de repos, le mélange est filtré, lavé avec un mélange 2:3 d'acétate d'éthyle et d'éther, puis avec de l'éther et séché sous pression réduite pour donner 4,7 g (rendement de 74,3 %) du composé recherché; 6.f.: 116-118 C. 20: 57,0o (c = 1, méthanol) Rf3 = 0,74; Rf4 = 0,49. Etape c): Préparation de H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt,HBr (poids moléculaire: 537,4) Une solution contenant 1,18 g (2 mmoles) du tripeptide Z-LeuArg(NO2)-Pro-NHEt dans 10 ml d'une solution d'acide bromhydrique dans l'acide acétique glacial est agitée 20 à la température ambiante pendant une heure. Apres addition de 100 ml d'éther anhydre, le précipité ressemblant à une poudre est filtré et la poudre jaune pale ainsi obtenue est séchée dans un dessicateur. Le composé recherché est ainsi obtenu sous forme d'un produit hygroscopique jaune pale avec 25 un rendement de 1,30 g. Rf = 0,14. Etape d): Préparation du Boc-Aa-OPFP (poids moléculaire: 30 403,32). La solution de 2,4 g (10 mmoles) d'acide Boc-anthranilique dans 20 ml de THF est refroidie à 0 C, puis 2,2 g (11 mmoles) de DCC et 2,0 g de pentafluorophénol dissous dans ml de THF sont ajoutés sous agitation. Le mélange est agité à 0 C pendant 3 heures, puis à la température ambiante pendant une nuit. La solution est filtrée, le précipité est dissous dans 30 ml d'acétate d'éthyle et successivement lavé 3 fois avec une portion de 10 ml d'acide citrique à %, 3 fois avec une portion de 10 ml d'eau froide, 3 fois 5 avec une portion de 10 ml de solution saturée de carbonate acide de sodium et enfin 3 fois avec une portion de 10 ml d'eau. La phase d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, filtrée et évaporée sous pression réduite. Maintenu a + 4 C, le rédidu huileux devient cristallin. Le 10 produit recherché est ainsi obtenu avec un rendement de 3,06 g (76 %). 9 10 Rf = 0,90; Rf 0,85. Etape e) Préparation de Boc-Aa-Leu- Arg(NO2)-Pro-NHEt (poids moléculaire: 675,75). Une solution contenant 1,07 g (2 mmoles) du sel de tripeptide H-LeuArg(NO2)-Pro-NHEt,iBr dans 5 ml de DMF est refroidie à 0 C, puis additionnée de 0,28 ml (2 mmoles) 20 de TEA et de 806 mg (2 mmoles) de Boc-Aa-OPFP dissous dans ml de DMF. Le pH de la solution est ajusté à 8 par addition de TEA, la solution est laissée réchauffer, puis agitée à C pendant 48 heures, tandis que le pH est maintenu à environ 8 par addition de TEA. Le DMF est chassé sous pres25 sion réduite, le résidu est dissous dans 50 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement 3 fois avec une portion de ml d'acide citrique à 10 %, 3 fois avec une portion de 20 ml d'eau, 3 fois avec une portion de 20 ml de solution saturée de carbonate acide de sodium et enfin avec 20 ml 30 d'une solution saturée de chlorure de sodium. La solution d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu huileux est soigneusement trituré avec de l'éther et le produit solide ainsi obtenu est filtré pour donner 1,05 g 35 (rendement de 77,8 %) du produit recherché. 3 9 10 Rf3 = 0,90; Rf9 = 0,91; Rf1 = 0,96. Etape f): Préparation du Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt (poids moléculaire: 630, 74). Une solution contenant 1,0 g (1,5 mmole du tétrapeptide Boc-Aa-LeuArg(NO2)-Pro-NHEt dans 50 mi d'acide acétique à 50 % est hydrogénée en présence de 400 mg de catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon pen10 dant 4 heures. Le catalyseur est ensuite séparé par filtration, la solution est évaporée et le résidu est soigneusement trituré avec de l'éther pour obtenir 779 mg (rendement de 82,5 %) du composé recherché. Rf2 = 0,45. Etape q): Préparation du H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt,(TFA)2 (poids moléculaire: 724,67). 630 mg (1 mmole) d tétrapeptide Boc-Aa-Leu-Arg-Pro20 -NHEt sont dissous dans 5 ml de TFA et agités à la température ambiante pendant 20 minutes. Le TFA est rapidement chassé sous pression réduite et le résidu est mis en poudre avec de l'éther, puis filtré et séché pour donner 648,5 mg (rendement de 89,5 %) du composé recherché. 25 2 Rf = 0,34; R = 0,76. Rf2 Etape h): Préparation de Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt, CH3CO2H (poids moléculaire: 1276,54). 30 La solution de 358 mg (0,5 mmole) de pentapeptide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 Lpréparé selon la procédure de l'étape g) de l'Exemple 1] dans 10 ml de DMF est refroidie à -10 C et additionnée d'abord de 0,34 ml d'acide chlorhydrique 6N et ensuite d'une solution aqueuse concentrée de 37 37,7 mg de nitrite de sodium, introduits goutte à goutte sous agitation. Après une période de 5 minutes, une solution contenant 362,3 mg (0,5 mmole) du tétrapeptide H-Aa-Leu-ArgPro-NHEt,(TFA)2 dans 1 ml de DMF et 0,34 ml de TEA préparé à -10 C sont ajoutés. Le mélange est agité à -5 C pendant une heure, à 0 C pendant une heure supplémentaire, puis laissé se réchauffer a la température ambiante. Le DMF est chassé sous pression réduite et le résidu est dissous dans de l'acide acétique 0,2N, puis purifié par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 (2x95 cm). Les fractions appropriées sont collectées et lyophi10 lisées pour donner 365,7 mg (rendement de 57,3 %) du composé recherché. Rf = 0,65; Rf6 = 0,49; Rf8 = 0,69. L'analyse des aminoacides a donné les valeurs suivante Ser 0,87; Glu 0,99; Pro 1,02; Leu 1,00; Tyr 0,97; His 1,03; 15 Trp 0,82; Aa 0, 91; Arq 1,01. Exemple 3 Préparation de la (Mab6)-gonadilibérine Etape a): Préparation de l'acide de Boc-3-amino-benzoique (Boc-Mab) (poids moléculaire: 237,25). 1,0 g (7,5 mmoles) d'acide 3-amino-benzoique est dis sous dans 10 ml de DMF et le pH de la solution est ajusté à 8 par addition de TEA. Ensuite, 2,5 g de ter-butyloxy carbonate sont ajoutés et le mélange est agité pendant un jour. Le mélange de réaction est traité selon la procédure qui est décrite 25 dans l'étape k) de l'Exemple 1 pour donner 1,4 g (rendement de 80,9 %) du composé recherché, p.f.: 92 -. R 10 = 0,88; Rf10 = 0,84. f Etape b): Préparation de Boc-Mab-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 30 (poids moléculaire: 704,78). Une solution contenant 1,5 g (2,5 mmoles) du H-Leu-Ara(NO2)-Pro-Gly-NH2, TFA /M. Yanaihara et coll.: J. Med. Chem. 16, 373 (1973)] dans 10 ml de DMF est refroidi à 0 C et le pH de la solution est ajusté à 8 par addition de TEA. 35 Ensuite, 383 mg (2,5 mmoles) de N-hydroxy- benzotriazole et 515 mg (2,5 mmoles)de DCC sont ajoutés à la solution, puis 593 mg (2,5 mmoles) de Boc-Mab dissous dans 3 ml de DMF sont ajoutés goutte à goutte et lentement. Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 48 heures, puis la DCU précipitée est filtrée et la solution est évaporée sous pression réduite. Le résidu huileux est dissous dans ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement 3 fois avec une portion de 10 ml d'acide citrique à 10 %, 3 fois avec uneportion de 10 ml d'eau, 3 fois avec une portion de 10 ml de solution saturée de carbonate acide de sodium. La phase acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite. Après trituration complète du résidu huileux avec de l'éther, le précipité cristallin blanc est filtré et lavé à l'éther pous donner 1,2 g 15 (rendement de 68 %) du composé recherché, p.f. 132-133 C. Rf = 0,43. Etape c): Préparation du Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 20 (poids moléculaire: 659,78) Le groupe protecteur est éliminé à partir de 1,0 g (1,5 mmole) du pentapeptide Boc-Mab-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 selon la procédure qui est décrite dans l'étape f) de l'Exemple 2 pour donner 775 mg (78,3 %) du composé recherché. 2 Rf2 = 0,52. Etape d): Préparation du H-Mab-Leu-Afg-Pro-Gly-NH2,(TFA)2 (poids moléculaire: 753,72) Une solution contenant 670 mg (1 mmole) de pentapeptide amide Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 dans 5 ml. de TFA est agitée à la température ambiante pendant 20 minutes, puis le TFA est éliminé sous pression réduite. Le résidu huileux est trituré avec de l'éther pour donner un produit ressemblant à une poudre, qui est filtré et séché pour donner 689 mg (91,5 %) du composé recherché. Rf! = 0,50; Rf = 0,53; Rf7 = 0,42. Etape e): Préparation du Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (poids moléculaire: 1244,39) Une solution contenant 358 mg (0,5 mmole) de pentapeptide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 (préparé selon la procédure de l'étape g) de l'Exemple 1) dans 10 ml de DMF, est refroi10 die à - 10 C et ensuite, 0,34 ml d'acide chlorhydrique 6N, puis une solution aqueuse concentrée de 37,7 mg de nitrite de sodium sont ajoutés qoutte à goutte. Apres une période de 5 minutes, 377 mg (0,5 mmole) du pentapeptide H-MabLeu-Arg-Pro-Gly-NH2(TFA)2 dissous dans 1 ml de DMF et refroidis à 15 10 C, sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à 0 C pendant 2 heures puis laissé se réchauffer à la température ambiante. Le jour suivant, le mélange est exposé sous pression réduite. Le décapeptide résiduel brut est purifié par chromatoqraphie sur colonne Sephadex G-25 (2 x 95 cm) avec un 20 mélange 15:1:4:20 de butanol /propanol/acide acétique/eau. La teneur en composant des fractions est suivie par CCM et absorption UV. La fraction contenant le décapeptide est lyophilisée, puis l'opération est répétée avec de l'acide acétique dilué. Le produit recherché est obtenu avec un rende25 ment de 323 mg (52 %). 2 7 Rf = 0,31; Rf = 0,49;Rf8 0,62. L'analyse des aminoacides a donné les valeurs suivantes: Ser 0,91; Glu 1, 03; Pro 0,97; Gly 1,10; Leu 1,00; Tyr 0,97; His 1,05; Trp 0,87; Mab 0,90; Arg 1,11. Exemple 4 Préparation de (Aa)-gonadolibérine (poids moléculaire 1244,39). a) Synthèse: Le composé est préparé selon la méthode utilisée couramment de la synthèse des peptides en phase solide 2 errifield, R.B.: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)7. On fait gonfler 0,75 g (0,3 mmole) d'une résine benzhydrylamine,HCl (0,4 mmole/g, Pierce) dans du dichlorométhane pendant 2 heures. Ensuite, le cycle suivant est répété en cours de l'acylation avec les aminoacides: Etape Réactif et opération Durée d'agitation I J (minutes) - Du--daitto 1 CH2C12, 2 Mélange 67 % de 3 Mélange 67 % de 4 CH2C12, CHC13, 6 Mélange % de 3 lavages contenant 33 % CH2Cl2 contenant 33 % CH2C12 3 lavages de TFA et de TFA et 2 lavages contenant 10 % de TEA et CHC13, 2 lavages 7 CHC13, 2 lavages 8 Ethanol, 2 lavages 9 CH2C12, 2 lavages 3 équivalents de Boc-aminoacide dissous dans un mélange de CH2C12-DMF, 3 équivalents de DCC ou de DIC 30 dissous dans CH2C12 il CH2C12, 2 lavages 12 Ethanol, 2 lavages - variable Un test à la ninhydrine est effectué après chaque 35 étape /E. Kaiser et coll.: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)); c7,, le cycle ci-dessus est répété à partir de l'étape 5 lorsqu' un groupe amino libre est détecté. Apres la dernière étape, le poids de la résine portant la peptide Gelp-His(Tos}-Trp-Ser(oBzl)Tyr(oBzl)-Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly indique 5 que le rendement du produit recherché est de 344 mg (65 % en AW). (Le poids moléculaire du peptide protégé est de 1764,92). Etape b): Coupure avec del'acide fluorhydrique. Les groupes protecteurs sont éliminés et le peptide est simultanément détaché de la résine en une seule étape avec de l'acide fluorhydrique anhydre liquide r S. Sakakibara et coll.: Bull. Soc. Japan 40, 2164 (1967) 7. Le système résine-peptide obtenu dans l'étape a) précédente est addi15 tionné de 5 ml d'anisol et de 100 ml de dithiothreitol. Ensuite, 20 ml d'acide fluorhydrique sont condensés dans le mélange et l'agitation poursuivie pendant une heure. Après cette période, l'acide fluorhydrique est éliminé par un courant d'azote, le résidu est mis en suspension dans de l'éther absolu et filtré. Le résidu solide est lavé avec de l'acide acétique à 50 % et le filtrat est évaporé à une température de 37 C. Le décapeptide,HF ainsi obtenu, est soumis directement à une chromatographie sur gel. Etape c): Chromatographie sur gel. Le produit obtenu dans l'étape b) eft purifié sur une colonne Sephadex G25 (2,5 x 100 cm) avec de l'acide acétique à 20 % comme éluant. La séparation est suivie par absorption UV (mesurée à 280 n) et CCM. Les fractions conte30 nant le décapeptide sont collectées et lyophilisées pour donner le produit purifié avec un rendement de 202 mg (54 %). Etape d): CLHP préparative. Une colonne CLHP préparative (2,5 x 45 cm) de Type 35 C18-gel de silice LRP-1 (13-24 pm, Whatman) est utilisée à ce propos. L'équilibre est établi avec un mélange contenant % de méthanol et 85 % d'une solution d'acide acétique à %. Apres obtention de l'équilibre, 202 mg du produit purifié par chromatographie sur gel sont appliqués en solution dans le mélange ci-dessus. L'élution est effectuée avec une série de gradient linéaire commencée avec un mélange contenant 15 % de méthanol et 85 % d'acide acétique a 20 %, puis avec un mélange contenant 25 % de méthanol et 75 % d'acide acétiaue à 20 %, continuée avec un mélange contenant 40 % de méthanol et 60 % d'acide acétique à 20 % et finie avec un mélange contenant 80 % de méthanol et 20 % d'acide acétique à 20 %. Ces opérations sont conduites à un débit de 2ml/minute sous une pression de 3, 5.105Pa. Les fractions sont examinées à 280 nm et leur contenu est contrôlé par 15 CCM. La /Aa6 -gonadolibérine finale pure ainsi obtenue représente 123 mg (61,0 %) après lyophilisation, p.f.: *-192 C. a] 20 = -63,2 (c = 1, acide acétique O.1N) Rf =0,17 L'analyse des aminoacides a donné les résultats suivants: Ser 0,92; Glu 1,03; Pro 1,1; Gly 0,97; Leu 1,00; Tyr 0,95; His 1,08; Trp 0,83; Aa 0,90; Arg 1,05. 25 Exemples 5 et 6 Les composés suivants sont préparés selon la procédure qui est décrite dans l'Exemple 4: N0 de Nom du composé Rf Rendement l'Exemple I I, /-Aa6 7 /Aa.Trt.Leu 7- JV gonadolibérine 0,57 35 % 6 /- Mab6, Phe7, Gln8? gonadolibérine 0,63 43 % Les analyses d'aminoacides des composés des Exemples 5 et 6 ont fourni les valeurs rassemblées dans le Tableau suivant: N0 de 1' EXemple Ser Glu Pro Gly Leu Tyr Phe His Trp Aaiab 0,91 1,02 0,97 1,00 0,98 1,03 - 0,93 1,82 0,96 6 0,93 2,02 1,12 1,00 - 0,97 1,07 0,95 0,87 0,89 Exemple 7 Préparation de solutions à injecter par voie intra-musculaire, souscutanée ou intraveineuse. a) Le dérivé de gonadolibérine de formule générale 15 (I) est dissous à une concentration de 1 à 10 mg/ml dans de l'eau distillée, une solution saline physiologique ou une solution aqueuse tamponnée. La solution est stérilisée par filtration, puis des volumes contenant 50 à 500 pg du dérivé de gonadolibérine sont introduits dans des ampoules lyophili20 sées et les ampoules sont fermées hermétiquement. Avant administration, le contenu des ampoules est converti en une solution franche par addition de 1 à 10 ml d'eau distillée et un volume contenant la dose désirée est alors injecté. b) Une solution saline physiologique ou d'alcool benzylique, respectivement, contenant le dérivé de gonadolibérine de formule générale (I) à une concentration de 20 à 500 pg/ml, est introduite dans des ampoules qui sont ensuite fermées hermétiquement. Les solutions ainsi obtenues peuvent 30 être administrées directement. REVENDICATIONS 1. Dérivés nonapeptide éthylamide ou décapeptide amide de gonadolibérine de formule générale (I), Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xl-X2-X3-Pro-X4 (I) dans laquelle, est un groupe acide 2-aminobenzolque ou 3-aminobenzolque, X2 est un groupe leucyle, tryptophyle ou phénylalanyle; X3 est un croupe arginyle, leucyle ou glutaminyle; et X4 représente un groupe glycylamide ou éthylamide ainsi que leurs sels d'addition acides. 2. Composition pharmaceutique libérant les hormones lutéinisante et folliculo-stimulante, qui comprend comme composant actif, un dérivé de gonadolibérine, de formule géné15 rale (I), o X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1 ou un sel d'addition acide de celuici en mélange avec des supports et/ou des additifs utilisés couramment dans l'industrie pharmaceutique. 3. Composition à des fins biologiques de reproduc20 tion, qui comprend comme composant actif, un dérivé de gonadolibérine de formule générale (I) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1, ou un sel d'addition acide de celui-ci en mélange avec des supports et/ou des additifs utilisés couramment dans la médecine vété25 rinaire. 4. Procédé de préparation des nouveaux dérivés de gonadolibérine de formule générale (I), Glp-His-TrD-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4 (I) dans lequel X1 estungrouped'acide 2-aminobenzolque ou 3-aminobenzoique; X2 est un groupe leucyle, tryptophyle ou phénylalanyle; X3 est un groupe arginyle, leucyle ou glutaminyle; et X4 représente un groupe glycylamide ou éthylamide, et de leurs sels d'addition acides, qui comprend: a) la condensation des aminoacides éventuellement protéags par condensation par étapes et/ou de fragments et l'élimination éventuelle des groupes protecteurs, ou b) la condensation par étapes, selon la méthode de synthèse des peptides en phase solide, des aminoacides éventuellement protégés sur un support solide dans l'ordre approprié, la séparation du produit final de support solide par coupure acide ou alcaline et l'élimination éventuelle des groupes protecteurs pendant, avant ou après le décrochage de la résine. 5. Procédé suivant la revendication 4, procédé a) qui comprend la condensation d'un pentapeptide azide protégé de formule (II), Glp-His-TrpSer-Tyr-N3 (II) avec un tétrapeptide ou un pentapeptide de formule générale (III), Xl-X2-X3-Pro-X4 (III) o X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1. 6. Procédé suivant la revendication 4, procédé b) qui comprend l'utilisation d'une résine benzhydrylamine ou d'une résine de polystyrène chlorométhylé comme support solide. 25 7. Procédé suivant la revendication 4, procédé b) qui comprend la séparation du produit final contenant les groupes protecteurs du support solide, par traitement avec l'acide fluorhydrique ou par réalisation d'une éthylammonolyse. 8. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique libérant les hormones lutéinisante et folliculostimulante, qui comprend le mélange, à titre de composant actif, d'un dérivé de gonadolibérine de formule générale (I), o X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendica35 tion 1 ou d'un sel d'addition acide de celui-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, préparé selon la procédé a) ou b) de la revendication 4, avec des supports et/ou des additifs utilisés couramment dans l'industrie pharmaceutique et leur transformation en composition pharmaceutique. 9. Procédé de préparation d'une composition convenable à des fins biologiques de reproduction, qui comprend le mélanQe, à titre de composant actif, d'un dérivé de gonadolibérine de formule générale (I), dans laquelle X1, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1 10 ou d'un sel d'addition acide de celui-ci, préparé selon le procédé a) ou b) de la revendication 4, avec des supports et/ou des additifs couramment utilisés dans la médecine vétérinaire et leur transformation en composition utile pour la reproduction des vertebrés. 15