Brevet FR2591485A1 — publié le 19870619

COMPOSITIONS STABILISEES CONTENANT L'ACTIVATEUR DU PLASMINOGENE DU TISSU HUMAIN La présente invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques contenant l'activateur du plasminogène du tissu humain protéique et sans danger aux sujets humains. L'instabilité de l'activateur du plasminogène vasculaire extrait des arbres vasculaires de cadavres humains est décrite par Aoki, J. Biol. Chem. d'arginine ON à 0,5X dans NaCl 0,6M. 2 591485 L'activateur du plasminogène du tissu humain, dérivé d'une source de tissu naturel, est décrit par Collen et aL. dans le Mémoire de la Demande de Brevet Européen n' 041766, publiée le 16 Décembre 1981, sur la base d'un premier dépôt du 11 Juin 1980. Les auteurs ont employé un schéma de purification qui fournit l'activateur du plasminogène du tissu, à des degrés de pureté relativement élevés. Collen et al. ont étudié la stabilité de préparations de leur activateur du plasminogène du tissu, qui était purifié, alors qu'il se trouvait aussi bien à l'état liquide qu'à l'état lyophilisé, et ils ont découvert que les formes lyophilisées étaient, à maintes reprises, instables, même lorsqu'elles étaient préparées à partir de solutions contenant NaCl 0,3X. Afin que des matières analogues à l'activateur du plasminogène du tissu soient proposées pour soigner le personnel et les patients, ces matières doivent être préparées sous la forme de compositions pharmaceutiques. De telles compositions doivent être stables pendant des périodes de temps appropriées, elles doivent être acceptables en elles-mêmes pour l'administration & des humains, et elles doivent pouvoir être facilement fabriquées. Un exemple d'une telle composition serait une solution destinée à une administration parentérale. Bien que dans beaucoup de cas, les formulations de solutions pharmaceutiques soient présentées sous la forme liquide, appropriée pour un usage immédiat, de telles formulations parentérales peuvent également être proposées sous la forme congelée ou sous la forme lyophilisée. Dans le premier cas, la composition doit être décongelée avant usage. La dernière forme est souvent utilisée pour rehausser la stabilité de l'agent médicinal contenu dans la composition, dans une plus large diversité de conditions de stockage, comme il est reconnu par l'homme du métier que des préparations lyophilisées sont généralement plus stables que leurs contre-parties liquides. De telles préparations lyophilisées sont reconstituées avant utilisation par l'addition d'au moins un diluant approprié, pharmaceutique- ment acceptable, tel que l'eau stérile pour injection ou une solution stérile de sérum physiologique, et similaires. Un but de la présente invention est de préparer des compositions stables d'activateur du plasminogéne du tissu humain, particulièrement celles qui se présentent sous une forme lyophilisée, stable. La présente invention est basée sur la découverte que l'inclusion d'arginine manière efficace, ces compositions et équivalents. En général, les compositions peuvent contenir d'autres composants dans des quantités, de préférence, ne dépréciant pas la préparation de formes lyophilisables stables et dans des quantités appropriées pour une administration pharmaceutique efficace et sans danger. Des plages de pH appropriées pour la préparation des compositions de l'invention sont celles d'environ 4 à environ 9, de préférence, étant donné que ces compositions sont destinées à des médicaments, dans l'intervalle des pH physiologiques, c'est-à-dire celui se situant autour de la neutralité. Dans cette plage de pH, l'arginine existe, à l'origine, sous la forme d'un cation protoné avec la charge nette +1, que l'on peut désigner comme étant l'"ion argininium). Le terme "arginine" est utilisé ici de façon interchangeable avec l'expression "ion argininium", parce S5 qu'en raison du pH du système, l'"ion argininium) est une désignation équivalente. Pour conserver la neutralité 4 2 2591485 électrique, l'ion argininium doit être compensé par une quantité équivalente d'une espèce ionique chargée de façon contraire (c'est-à-dire chargée négativement), que l'on peut désigner comme contre-ions". La combinaison de l'ion argininium, d'autres espèces cationiques, et des divers contre-ions peut être désignée comme étant un "système tampon contenant des ions argininium". Des contre-ions acceptables comprennent ceux qui sont pharmaceutiquement acceptables et, en outre, ceux qui sont capables d'aJuster la température d'affaissement ou eutectique apparente de la composition, de telle sorte que la composition soit particulièrement appropriée pour une lyophilisation aisée. Des exemples de tels contre-ions sont les ions acétate, phosphate, citrate, succinate, sulfate, tartrate, malate, maléate, carbonate, et similaires, ainsi que leurs équivalents fonctionnels. Un exemple de contre-ion qui ne convient pas bien est l'ion chlorure. Comme mentionné ci-dessus, les inventeurs ont découvert que l'inclusion d'arginine (sous la forme d'ions argininium) dans des compositions pharmaceutiques de t-PA augmente, de façon marquée, la solubilité et la stabilité de t-PA dans ces compositions. Les concentrations en arginine peuvent se situer dans la plage allant d'environ 0,02X à 1X, de préférence, d'environ 0,05X à environ 1,0X et, de façon davantage préférée, d'environ 0,1X à environ 0,5X dans la solution administrée, et/ou, dans le cas d'une préparation lyophilisée, dans la solution de prélyophilisation. En outre, les compositions améliorées peuvent, de façon facultative, comprendre au moins un détergent non- ionique, tel que le polysorbate 20, le polysorbate 80 et similaires, en des quantités d'environ 0,001 à environ 1 pour cent, afin de rehausser encore la stabilité du t-PA. De plus, d'autres excipients pharmaceutiquement acceptables,, bien connus de l'homme du métier, peuvent également faire partie de telles compositions. Ceux-ci peuvent comprendre, par exemple, divers agents épaississants, agents tampons additionnels, agents chélatants, antioxydants, agents conservateurs, cosolvants, et similaires; des exemples spécifiques de ceux-ci peuvent comprendre le mannitol, les sels de trométhamine ("tampon Tris"), l'édétate disodique, la gélatine, l'albumine du sérum humain et d'autres polypeptides, divers peptides de faible masse moléculaire, tels que la glycylglycine, et autres. De façon surprenante,les compositions de t-PA de la présente invention ne nécessitent pas l'utilisation de concentrations élevées en chlorure de sodium, c'est-à-dire d'environ 0,3X ou au-dessus. En fait, des concentrations élevées en ions chlorure sont préjudiciables à l'aptitude à la lyophilisation de ces compositions améliorées. Bien qu'une petite quantité d'ions chlorure soit tolérées, de faibles concentrations sont préférées, par exemple, inférieures à environ 0,3X, et elles sont, de préférence, non supérieures aux taux physiologiques normaux, c'est-à- dire de NaCl environ 0,12x. De la façon la plus préférée, l'ion chlorure est exclu de la composition. Une "quantité pharmaceutiquement efficace" de t-PA désigne la quantité qui fournit un effet thérapeutique dans divers régimes d'administration. Les compositions de l'invention peuvent être préparées avec des teneurs en t-PA d'au moins environ 0,1 mg/ml, jusqu'à environ 50 mg/ml, de préférence, d'environ 0,4 mg/ml à environ 5 mg/ml. Pour l'utilisation de ces compositions dans l'administration à des patients humains souffrant d'infarctus du myocarde, par exemple, ces compositions peuvent contenir d'environ 0,4 mg/ml à environ 3 mg/ml de t-PA, ce qui correspond au taux de dosage envisagé de façon courante pour un tel traitement. Les compositions de l'invention, y compris les formes lyophilisées, sont préparées en général par formulation des composants au moyen des techniques de formulation pharmaceutique généralement disponibles, connues GO 2591485 en soi. De la même façon, les modes opératoires et l'équipement de lyophilisation standard bien connus dans la technique sont employés. Une méthode particulière pour la préparation d'une composition pharmaceutique de t-PA de l'invention consiste à employer un t-PA purifié (conformément à n'importe quel schéma standard de purification des protéines) dans l'une quelconque parmi plusieurs méthodes d'échanges de tampons connues, telles que la filtration sur gel. Cette méthode préférée a été utilisée pour isoler et purifier le t-PA utilisé comme matière de départ dans les études de stabilité et de solubilité qui suivent. Le t-PA utilisé dans la méthode préférée a été obtenu à partir de Cellules Ovariennes de Hamster Chinois modifiées par recombinaison génétique (cellules CHO) capables d'exprimer le t-PA sous forme d'un produit secrété dans le milieu de culture des cellules CHO. La Société déposante a découvert l'effet démontrable que les compositions pharmaceutiques de t-PA présentent une activité biologique stabilisée de façon significative, lorsqu'un tampon contenant des ions argininium en est un composant, et que de telles formulations ne nécessitent pas de chlorure de sodium pour la stabilité, bien que des concentrations en sel inférieures à 0,3X puissent être employées. Dans un mode de réalisation préféré, la concentration en ions chlorure est de 0,1ix ou moins. Dans la plage des pH se situant autour de la neutralité, par exemple, à un pH d'environ O & 8, la solubilité du t-PA est accrue par la présence d'ions argininium, de sorte qu'il est soumis à la formulation dans des concentrations relativement élevées, même sans la présence de ce que la technique a considéré comme nécessaire, soit des quantités stabilisantes élevées de sels. Telles qu'elles sont utilisées ici, les expressions "activateur du plasminogène du tissu humain", "t-PA humain" ou "t-PA" signifient l'activateur du ?5 2591485 plasminogène extrinsèque (de type tissu)humain, produit, par exemple, par extraction à partir d'une source naturelle et purification (on se reportera à Collen et aL., supra.), et par des systèmes de cultures cellulaires recombinants, tels que ceux décrits ici. Sa séquence et ses caracté- ristiques sont énoncées, par exemple, dans le Xémoire de la Demande de Brevet Européen n 93 619 (publiée le 9 novembre 1983) sur la base d'un premier dépôt du 5 mai 1982, incorporé ici par référence. On se reportera également au Mémoire de la Demande de Brevet Européen n 41766 (publié le 16 décembre 1981) sur la base d'un premier dépôt du 11 juin 1980, et à RiJken et aL. Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), également incorporés ici par référence. Les expressions couvrent de la même façon les équivalents d'activateur du plasminogène de tissu humain biologiquement actifs, différant par au moins un acide aminé dans la séquence globale, ou dans les motifs de glycosylation, dont on pense qu'ils sont dépendants des conditions de culture spécifiques utilisées et de la nature de l'hôte à partir duquel l'activateur du plasminogène de tissu est obtenu. A. Figures La figure 1 illustre le stabilité du t-PA dans diverses formulations. La figure 2 illustre l'effet de la concentration en arginine sur la solubilité du t-PA. La figure 3 illustre les limites de solubilité du t-PA dans diverses concentrations de tampons phosphate d'argininium à pH 6,4 *C. B. Lyophilisation La lyophilisation, ou séchage par congélation, de la composition est effectuée au moyen de modes opératoires et d'équipements bien connus de l'homme du métier. De façon typique, une composition est d'abord congelée à une température située au-dessous de sa température 8 2591485 d'affaissement ou eutectique apparente. Le vide est ensuite appliqué, et de la chaleur est appliquée aux plateaux du lyophiliseur, afin d'éliminer la glace par sublimation, avec une température de plateau et une pression de chambre qui sont aJustées de telle sorte que la température de la masse congelée reste au-dessous de la température d'affaissement ou eutectique apparente Jusqu'à ce que pratiquement toute la glace soit éliminée. Apres cette phase de "séchage primaire", la température de plateau peut être élevée à nouveau (avec ou sans changement de la pression de chambre) et l'humidité résiduelle du gâteau séché par congélation est éliminée. C. Essai S-2288 Un substrat peptidique synthétique, le S-2288 (H- D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide.2HCl) est hydrolysé par le t-PA formant la p-nitroaniline colorée et un tripeptide. L'absorbance différentielle maximale entre le substrat et le produit (pnitroaniline) se produit à 405 nm. La production de p-nitroaniline est contrôlée spectrophotométriquement en suivant l'absorbance à 405 nm en fonction du temps. La pente résultante de l'absorbance en fonction du temps est proportionnelle à l'activité du t-PA. Cet essai est conduit à 37 * 0,2'C. Pour cet essai, 20-100 microlitres d'un échan- tillon de t-PA donné ont été aJoutés à 1,2 ml de mélange réactionnel contenant S-2288 0,33 mN, tampon Tris 0,067X (pH 7,4), NaCl 0,07X et mis à incuber à 37'C pendant 10 minutes. La-modification de l'absorbance a été surveillée pendant 1 minute et l'activité a été calculée à partir de l'absorbance à 405 nm à l'aide de l'équation suivante, standardisée par le fabricant: à DO x 793,65 (facteur de dilution) Activité (UI; unités internationales) = --------------------------------------------- temps d'incubation x volume de l'échantillon - D. Exemples Exemple 1. Le t-FA purifié a été dilué de façon à donner une concentration finale de 0,2 mg/ml, divisé en parties aliquotes et dialysé contre les tampons présentés dans le Tableau 1. TABLEAU 1 Tampon de Dialyse contenant Concentration de Dialyse 0,01% de Polysorbate 80 NaCI Arginine (sous forme de chlorhydrate) 1. Phosphate de Sodium O,01X pH 6, - 2. Phosphate de Sodium 0,01X pH 6, 0,12> 0,2X 3. Phosphate de Sodium 0, 01M pH 6, - 0,2X 4. Acétate de Sodium 0,01X pH 5, - - 5. Acétate de Sodium 0,01X pH 5, 0,12M 0,2X 6. Acétate de Sodium 0,1OX pH 5, - 0,2M Après dialyse, les échantillons ont été centrifugés et le surnageant a été lyophilisé en parties aliquotes de 1 ml. Les échantillons lyophilisés ont été reconstitués avec de l'eau et soumis à l'expérience pour rechercher leur activité de t-PA dans l'essai S2288. Chaque échantillon reconstitué a été ensuite placé à 3S'C et expérimenté à divers moments. Les résultats de cette expérience sont présentés sur la Figure 1. Comme on peut le voir, les systèmes ne contenant pas d'arginine n'empêchent pas la perte de l'activité du t-PA avec le temps. L'activité du t-PA dans les échantillons contenant de l'arginine 0,2X, ou de l'arginine 0,2X plus des quantités physiologiques de chlorure, conserve presque toute l'activité du t-PA initiale après incubation pendant 4 jours à 37'C. Ces résultats 2591485 démontrent que l'arginine 0,2K, avec ou sans NaCl, stabilise, de façon significative, le t-PA. Exemple 2. La stabilité du t-PA, en tant que fonction de la concentration en arginine, a été déterminée par la mesure de la vitesse de perte de l'activité du t-PA à diverses températures. Formulations: 1. 0,355 mg/ml de t-PA Phosphate de Na 0,05X pH 6,2 Arginine 0,05X sous forme de chlorhydrate 2. 0,498 mg/ml de t-PA Phosphate de Na 0,03M pH 0,2 Arginine 0,2X sous forme de chlorhydrate Des parties aliquotes de 0,5 ml de solution avec les formulations ci-dessus ont été versées, de façon aseptique, dans des flacons en verre de 2 ml et scellées. Les flacons ont été placés à 25', 37', 45'C. Deux flacons de chaque solution ont été prélevés comme échantillons & 0, , 55 et 160 Jours; et l'activité du t-PA a été mesurée & l'aide de l'essai S2288. Le logarithme népérien du % d'activité restant a été porté en fonction du temps (Jours> pour chaque température, à partir de quoi la constante de vitesse a été calculée par une analyse de régression linéaire. Les constantes de vitesse (k) pour la perte de la stabilité du t-PA à deux concentrations en arginine différentes et à diverses températures sont présentées dans le Tableau 2 il 2591485 TABLEAU 2 Effet de l'Arginine sur la stabilité du t-PA k (jour-1) Arginine 25-C 37'C 45'C Formulation Phosphate de Na 0,05X, pH 6,2 0,05X 0,00137 0,0102 0,0167 Phosphate de Na 0,03M, pH 6,2 0,20X 0,00043 0,00569 0,01272 Comme on peut le voir, l'arginine 0,2X produit des constantes de vitesse qui sont plus petites que celles obtenues dans l'arginine 0,05X A chacune des températures indiquées, ce qui indique qu'une augmentation de la concentration en arginine augmente la stabilité du t-PA. La stabilité du t-PA est également dépendante de la concentration en agents tensio-actifs non-ioniques. Les données sont dans le Tableau 3. Le t-PA a été précipité par dialyse contre un tampon succinate de Na 0, 01X à un pH de 6,0. Le précipité de t-PA a été recueilli par centrifugation à partir de l'échantillon dialysé. Ce précipité a été redissous dans la formulation ci-dessous contenant des concentrations variables en polysorbate 80. SO Formulation: Arginine 0,2X sous forme de chlorhydrate Phosphate de Na 0,02X pH 7,2 Polysorbate 80 (0,0005 à 0,10 pour cent) Les solutions ont été versées, de façon aseptique, dans des flacons et placées à 35'C et 40'C. Deux flacons ont été prélevés comme échantillons à chaque point du temps 12 2591485 et l'activité enzymatique a été recherchée à l'aide de l'essai S2288. Les constantes de vitesse ont été calculées par des analyses de régression linéaire de la courbe lOg (activité du t-PA) en fonction du temps pour chaque température, et sont présentées dans le Tableau 3. TABLEAU 3 Effet du Polysorbate 80 sur la Stabilité du t-PA Polysorbate 80 k (jour 1) % *C 40'C 0,0005 0,0055 0,0106 0,005 0,0049 0,0091 0,01 0,0043 0,0088 0,025 0,0040 0,0081 0,05 0,0041 0,0077 0,10 0,0037 0,0075 Ce tableau démontre qu'au fur et à mesure que la concentration en polysorbate 80 augmente, la constante de vitesse (k) diminue. Ceci indique qu'on obtient davantage de stabilité avec davantage de polysorbate 80. Exemple4. Des solutions de t-PA ont été préparées par dialyse de t-PA purifié contre la formulation tampon au 3 phosphate d'argininium ci-dessous, en faisant suivre par une dilution avec encore du tampon à la concentration finale désirée en t-PA. Formulation tampon: Arginine 0,20X Acide phosphorique 0,18X Polysorbate 80 0,01% pH 6 13 2591485 Des parties aliquotes de chaque préparation ont été versées, de façon aseptique, dans des flacons de 5 ou ml, lyophilisées et scellées. Les flacons ont été placés à plusieurs températures. Deux flacons par formulation ont été prélevés comme échantillons à chaque point de temps et l'activité du t-PA, déterminée par l'essai S2288. Les résultats sont dans le Tableau 4. TABLEAU 4 Stabilité du t-PA dans la Formulation Lyophilisée % Restant (moyenne de 2 essais t-PA * Temps écart type) (mg/ml) pH (mois) 5'C.25C 30'C 35'C 40'C 1,0 6,0 2,0 102,5 0,0 103,3 2,5 - 102,6 3,0 2,0 6,0 2,0 111,3 0,7 111,1 0,1 - 114,6 2,2 ,0 6,0 2,0 112,0 0,3 112,7 0,6 - 112,3 1,4 1,0 6,0 3,5 98,2 1,3 96,0 1,7 97,7 0,1 Concentration de t-PA dans la solution avant lyophilisation Ces données démontrent que le t-PA est stable sous la forme lyophilisée. Exemple 5. Une solution contenant du t-PA à raison d'approximativement 0,3 à 0,5 mg/ml a été dialysée contre du phosphate de sodium 10 mH, pH 7,5, du polysorbate 80 à 0,01%, contenant diverses concentrations en arginine sous la forme de chlorhydrate. Une matière insoluble a été éliminée par centrifugation pendant 2 minutes dans un dispositif microfugation Eppendorf. La quantité de t-PA qui restait en solution a été recherchée par l'essai S-2288. Les résultats sont présentés sur la Figure 2. 14 2591485 Une concentration aussi faible que 50 mM d'arginine augmente, de façon significative, la solubilité de t-PA. (La très petite augmentation de solubilité apparente à des concentrations en arginine supérieures est un artefact, dû au fait que la concentration initiale de t- PA dans la matière de départ était seulement de 0,3 à 0,5 mg/ml et, de ce fait, une solubilité limite n'a Jamais été atteinte.) Du t-PA a été précipité par dialyse contre un tampon de succinate de sodium 0,01X à pH 6. Le précipité résultant a été isolé par centrifugation, ensuite une quantité mesurée de cette matière a été équilibrée dans 1 ml du système tampon désiré pendant 20 heures à 5'C sous agitation. Les systèmes tampon étudiés ont été préparés par titrage de l'arginine avec l'acide phosphorique de façon à produire un système de phosphate d'argininium à pH 6,0. Des solutions mères ont été diluées avec de l'eau pour obtenir des solutions tampons finales contenant de l'arginine 0,10 à 0,20 X (sous la forme d'ions argininium). Après un équilibrage avec le système tampon désiré, la préparation de t-PA résultante a été centrifugée pour éliminer toute matière non soluble, ensuite, les surnageants ont été soumis à l'expérience pour le t-PA soluble par l'intermédiaire de l'essai S2288. Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Si le t-PA est totalement soluble à la concentration en t-PA initialement aJouté, alors la concentration de t-PA soluble doit être la même que celle ajoutée. Réciproquement, si le t-PA n'est pas totalement soluble à la concentration initialement ajoutée, la concentration en t-PA soluble sera alors inférieure à celle ajoutée. La Figure 3 montre que le t-PA est soluble dans du phosphate d'arginine 100 mX pH 6,0 Jusqu'à environ 2 mg/ml, et qu'à une concentration 2591485 supérieure en phosphate d'arginine, la solubilité est rehaussée d'une façon marquée. En particulier, dans du phosphate d'arginine 200 mX pH 6,0, le t-PA est touJous totalement soluble même à environ 54 mg/ml, et, de façon manifeste, la solubilité limite est considérablement supérieure à cela. Exemple 7. Le système au phosphate d'argininium ci-dessous a été préparé comme solution de prélyophilisation. Solution de Prélyophilisation mgLmi t-PA 2,5 L-arginine 87,1 Acide Phosphorique 26,8 Polysorbate 80 0,1 pH 7,2 Après une filtration stérile, des parties aliquotes d'approximativement 20 ml ont été versées dans des flacons de 50 cm. La lyophilisation a été ensuite effectuée comme suit: a) Les flacons ont été placés dans le lyophiliseur et congelés à -50'C (température de plateau) à la pression ambiante pendant 10 heures. b) On a fait le vide (pression de chambre de 13,33 Pa (100 im Hg)) et la température de plateau a été élevée de 10'/heure Jusqu'à 7'C, puis maintenue à cette valeur pendant 41 heures. c) La température de plateau a été ensuite portée & +35'C et la pression de la chambre abaissée à 6,67 Pa (50 jm de mercure), et le système a été maintenu dans cet état pendant 14 heures. Les flacons ont été ensuite bouchés, on a laissé la pression revenir à l'ambiante, et les flacons ont été retirés du lyophiliseur. Exemplea. L'effet du chlorure de sodium sur la qualité des gâteaux de phosphate d'arginine lyophilisé a été examiné. Des échantillons d'arginine 0,8 X (pH 7) et d'arginine 0,2 X dépend de la concentration en arginine. TABLEAU 5 Qualité du Système Tampon d'Argiline Lyophilisé contenant des Condentrations Choisies en Chlorure de Sodium Qualité du aâteau Chlorure de Sodium mM Initiale Arqinine 0,8M Au bout de 2 Mois à la Température Ambiante Arginine 0,2M Arainine 0o,8M Arginine 0,2M Masse vitreuse, rétrécie; pas de gâteau Gâteau blanc; légère fusion sur les bords du gâteau Gâteau blanc; bords vitreux légèrement rétrécis Gâteau blanc; légèrement rétréci Masse granulaire, rétrécie; pas de gâteau Gâteau blanc ayant un aspect vitreux Gâteau blanc ayant un aspect vitreux Gâteau blanc, très rétréci Comme au départ Comme au départ Comme au départ Comme au départ Comme au départ Film vitreux au fond du flacon; pas de gâteau Masse vitreuse à blanche au fond du flacon Masse blanche dans le flacon Gâteau blanc; très légèrement rétréci Gâteau blanc; très légère- ment rétréci Gâteau blanc, très rétréci Gâteau blanc, très rétréci Comme au départ Comme au départ Gâteau blanc; très légèrement rétréci Gâteau blanc, très rétréci Comme au départ Léger rétré- cissement additionnel 0, 1 F1 0, 01 Encore rétréci Encore rétréci on Co Ln 18 2591485 Il est bien entendu que les modes de réalisation de l'invention ci-dessus décrits ont été donnés & titre indicatif et non limitatif, et que des modifications peuvent être apportées sans que l'on s'écarte pour autant du cadre de l'invention. 19 2 2591485 REVENDICATIONS 1- Composition pharmaceutique, caractérisée par le fait qu'elle comprend une quantité pharmaceutiquement efficace d'activateur du plasminogène du tissu humain et un tampon pharmaceutiquement acceptable contenant des ions argininium, ladite composition présentant une concentration en ions chlorure inférieure à environ 0,3 B. 2 - Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle se trouve à l'état congelé. 3 - Composition selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'elle est convertie en une forme lyophilisée. 4 - Composition séchée par congélation, caractérisée par le fait qu'elle résulte de la lyophilisation d'une composition congelée telle que définie à la revendication 2. - Composition selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisée par le fait que la forme lyophilisée est reconstituée. 6 - Composition selon l'une des revendications 1 à , caractérisée par le fait que le tampon d'argininium est autre que le chlorure d'argininium. 7 - Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait que le tampon est fourni par l'ion arginninum et par un contre-ion capable d'ajuster la température d'affaissement de la composition pour placer celle-ci dans un état facilement lyophilisable. 8 - Composition selon la revendication 7, caractérisée par le fait que le contre-ion est choisi dans le groupe constitué par les ions citrate, phosphate, tartrate, sulfate, malate, maléate et succinate. 9 - Composition selon la revendication 7, caractérisée par le fait que le contre-ion est choisi dans le groupe constitué par les ions citrate et phosphate. 2591485 - Composition selon la revendication 7-, caractérisée par le fait que le contre-ion est l'ion phosphate. 11 - Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée par le fait que l'activateur du plasminogène du tissu humain présente une concentration d'au moins environ 0,1 mg/ml et que l'ion argininium présente une concentration d'environ 0,05 à environ 1,0 X. 12 - Composition selon la revendication 11, caractérisée par le fait que l'activateur du plasminogène du tissu humain présente une concentration d'au moins environ 0,4 mg/ml à environ 5,0 mg/ml et que l'ion argininium présente une concentration d'environ 0,1 à environ 0,5 X. 13 - Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée par le fait qu'elle présente un pH allant approximativement d'environ 4 à environ 9. 14 - Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée par le fait qu'elle est diluée avec un diluant pharmaceutiquement acceptable. - Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée par le fait qu'elle contient un détergent non-ionique constituant d'environ 0,001 à i % de ladite composition. 16 - Procédé pour la préparation de la composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 15, caractérisée par le fait qu'il comprend les étapes consistant à formuler le tampon le t-PA et le tampon contenant les ions argininium. 17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait qu'il comprend la lyophilisation de la composition.