Brevet FR2589673A1 — publié le 19870515

La présente invention concerne une composition pour le marcottage et le bouturage des plantes,et en particulier des pommiers porte-greffe tels que les pommiers M9 et M26, permettant d'aboutir à l'obtention de plantes chimériques. La production sur une grande échelle de portegreffesnécessite d'avoir recours à la multiplication végétative, notamment par bouturage ou par marcottage. Dans le bouturage, un fragment du végétal est placé en terre de façon à ce qu'il puisse émettre des racines. Dans le marcottage, on favorise la formation de racines sur le tronc, les branches ou les rejets, sans détachement de la souche mère. On sépare, ensuite, ces éléments lorsque les racines sont développées ; après plantation, ces marcottes donnent naissance à de nouvelles plantes. Les techniques qui permettent la préparation de plusieurs sujets à partir d'une seule souche mère sont réalisables seulement pour un nombre d'espèces limité, et encore, dans certaines espèces, seules certaines variétés peuvent être marcottées ou bien ne peuvent être marcottées que difficilement, même avec l'emploi de substances améliorant le marcottage. Les pommiers des clones M9 et M26 sont très utilisés en tant que porte-greffes. Toutefois, il est bien connu que certains porte-greffes, le porte-greffes M9 en particulier, s'enracinent très mal. Le porte-greffes M9 est très difficile à marcotter ou bouturer et son rendement de marcottage est assez faible, ce qui nuit en partie à son développement en arboriculture, bien qu'il soit, par ailleurs, tout à fait adapté à la culture en plantation dense et présente de précieuses qualités. La présente invention concerne de nouvelles compositions de bouturage et de marcottage qui assurent un développement racina ire très rapide des marcottes et permettent d'augmenter, en outre, le nombre de marcottes par souche-mère. Plus particulièrement, il s'agit de compositions pour le bouturage et le marcottage des plantes, caractérisées en ce qu'elles comportent un inoculum bactérien avec un plasmide comportant au moins une partie fonctionnelle du Ri T-DNA et un support acceptable pour le bouturage et le marcottage. Par "partie fonctionnelle du Ri T-DNA", on entend désigner la région du plasmide Ri assurant l'induction de racines (Ri = foot inducing"). Ce plasmide Ri peut jouer le rôle de vecteur et éventuellement contenir, en plus du Ri T-DNA, d'autres gènes homologues ou hétérologues destinés à conférer un phénotype particulier notamment aux racines de la plante. La bactérie à partir de laquelle on réalise l'inoculum est, de préférence, Agrobacterium. En particulier, l'espèce Agrobacterium rhizogenes est utilisée. Ces compositions sont utilisables pour un grand nombre de plantes et en particulier pour la production industrielle de porte-greffes tels que les pommiers M9 et M26. Elles conduisent à l'obtention de plantes chimériques, c'est-à-dire de plantes dont on a modifié un ou plusieurs caractères génétiques. Ces caractères génétiques modifiés sont, bien sûr, fonction des gènes introduits dans le plasmide Ri. En particulier, -lorsque ce plasmide comporte uniquement la partie fonctionnelle du Ri T-DNA, le système racinaire des plantes traitées est considérablement développé. Ces compositions peuvent se présenter sous des formes diverses, les bactéries doivent être sous forme viable, c'est-à-dire par exemple sous forme lyophilisée ou ayant subi une simple dessication sous vide, ou dans un milieu de conservation qui pourra servir de support. Le support peut être également une solution de reconstitution de bactéries lyophilisées et/ou comporter des éléments favorisant l'adhérence des bactéries au tronc lors du marcottage. Les bactéries A. rhizogenes sont connues et peuvent être obtenues dans des collections ou isolées de la nature par des procédés connus. L'utilisation des compositions selon l'invention est possible aussi bien in vîvo que in vitro : il suffit de l'inoculer au niveau d'une incision de la tige principale, ou des branches, selon des techniques de bouturage et marcottage connues. Dans le cas des pommiers porte-greffe, l'inoculation se fait, de préférence, à des intervalles de la tige principale espacés d'environ 15 à 25 cm ; de cette façon, de nombreuses inoculations sont possibles sur la tige principale d'un seul pommier et permettent d'obtenir de nombreux sujets. Le mode d'utilisation détaillé de l'inoculum selon la présente invention apparat à la lecture des exemples suivants en se référant aux figures annexées sur lesquelles . la figure 1 représente une plante chimérique obtenue à partir d'une marcotte excisée d'un pommier M9 traité par A. rhizogenes souche A4 en chambre climatisée ; . la figure 2 représente le système racinaire de la plante chimérique de la figure 1 ; . la figure 3 représente les résultats d'une électrophorèse effectuée sur les extraits de pommiers chimériques M26 (A) et M9 (B) Matériel végétal Les pommiers M9 sont disponibles dans le commerce et sont cultivés dans des pots en serre ou à l'extérieur. La variété M26 est propagée in vitro en utilisant des techniques connues. Souches bactériennes Les souches de A. rhizogenes A4 et 8196 sont des isolats standards. EXEMPLE 1 INOCULATION EN SERRE OU EN CHAMBRE CLIMATISEE (MACRO-BOUTURAGE) Des pommiers (variété M9) dont la hauteur est approximativement de 1,5 m s'étant développés en pots ont été inoculés aux internoeuds par A. rhizogenes souche A4, sur les branches principales ou secondaires, de préférence se3xdaires et ayant environ 30-40 cm de longueur, en faisant une incision verticale avec un scalpel qui est enduit de l'inoculum. Cette induction est réalisée en grattant avec le scalpel une culture de A. rhizogenes développée pendant 2 à 4 jours à 280C dans un milieu standard en boîte de Pétri. Ces incisions ont été recouvertes par des bandes de film PVC (Scel-o-frais Les racines adventives ont été formées après 3 ou 4 semaines, moment auquel le film PVC a été enlevé êt remplacé par de la tourbe humide qui était maintenue en place par une autre bande PVC. Celle-ci a été remplacée à son tour par un pot en plastique tendu pour faciliter la mise en place et contenant de la tourbe humide. Quelques semaines plus tard, lorsque des racines abondantes ont envahi le substrat, le pot en plastique a été enlevé en coupant la tige au ras du bas du pot. Les marcottes excisées ont été mises en pots et maintenues dans une chambre de croissance pendant 5 semaines, à une hygrométrie de 80 %, sous les conditions récapitulées dans le tableau suivant : PRE- JOUR PRE- NUIT JOUR JOUR NUIT NUIT Heures 3 10 3 8 Température ( C) 20 25 20 17 Intensité lumineuse (lux) 4 750 9 500 4 750 0 On obtient de cette façon une multitude de marcottes qui s'enracinent et se développent. Comme on le voit sur la figure 1, aucune modification n'apparatt au niveau de la partie aérienne de la plante chimérique obtenue. Le système racinaire, par contre, s'est considérablement développé du fait de l'intégration du plasmide Ri dans son génome (figure 2). EXEMPLE 2 INOCULATION IN VITRO (MICRO-BOUTURAGE) ç es pousses de pommiers (variété M26) sont propagées in vitro de façon végétative dans des conditions telles que les racines ne se forment pas mais que de multiples pousses soient produites. Après 1 mois, quand les extrémités des pousses sont dans une phase de croissance rapide, la base de la tige est inoculée avec une pâte de bactéries enlevée par grattage de la surface d'une culture de A. rhizogenes (souche 8196) sur milieu solide. Les pousses inoculées sont transférées dans un milieu sans substance de croissance et cultivées pendant 16 heures de jour durant, à 23OC, 1 800 lux. Après 5 jours, les cultures sont transférées à 370C pour éliminer les bactéries. Les racines se développent en moins de 2 semaines et les plantules sont transférées dans des pots en serre ou à l'extérieur. EXEMPLE 3 31) L'efficacité de la formation de racines adventives sur les pommiers jeunes (clone M9) en serre varie selon la saison de l'année. En été, 100 % des inoculations ont produit des racines. 80 % de celles-ci donnent des plantes viables après excision des marcottes et transfert en pots. Ces jeunes plantes ont des systèmes de racines transformés, ainsi que cela est démontré par la production de mannopine et d'agropine et la présence du T-DNA du plasmide Ri, et gardent les caractéristiques apparentes de la pousse de la plante qui était inoculée à l'origine. La morphologie des systèmes racinaires est modifiée ; par exemple, ces racines sont très ramifiées et montrent souvent un comportement plagéotropique. 32) Les pommiers produits in vitro (clone M26) ont été similaires à ceux produits en serre, avec des racines abondantes, et parfois un comportement géotropique altéré. Ces plants ont été comparés aux plants contrôle pendant une période de 3 ans et n'apparaissent en aucun cas désavantagés par leurs systèmes racinaires transformés. Les compositions selon l'invention permettent ainsi une production massive de plantes par reproduction végétative, en particulier une production massive de porte-greffes. 33) On a réalisé une électrophorèse à haute tension (coloration au nitrate d'argent) pour démontrer la production de mannopine et/ou d'agropine dans le système racinaire des plantes transformées, et l'absence de mannopine et/ou d'agropine dans la partie aérienne desdites plantes. Les résultats de cette électrophorèse sont visibles sur la figure 3 : la figure 3A concerne les essais effectués in vitro avec la variété M26 ; la figure 3B concerne les essais effectués en serre avec la variété M9. Dans les deux cas, "std" représente les témoins en mannopine et agropine extraits à partir de calles induites par A. tumefaciens souche A66. Pour la figure 3A, la colonne 1 représente les résultats obtenus à partir d'un extrait de feuilles sur une plante chimérique (variété M26) traitée in vitro par microbouturage avec A. rhizogenes souche 8196 ; les colonnes 2 à 6 représentent les résultats obtenus à partir d'extraits de racines sur plusieurs plantes chimériques traitées de la même façon ; ceux-ci révèlent nettement la présence de mannopine dans les extraits racinaires et l'absence de mannopine dans les extraits foliaires. Pour la figure 3B, les colonnes 1 et 2 révèlent la présence d'agropine et de mannopine dans les racines formées par macro-bouturage sur les pommiers M9 à l'aide de A. rhizogenes souche A4. REVENDICATIONS 1) Composition pour le marcottage et le bouturage de plantes, caractérisée en ce qu'elle comporte un inoculum bactérien avec un plasmide comportant au moins une partie fonctionnelle du Ri T-DNA et un support acceptable pour le marcottage et le bouturage. 2) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie utilisée est Agrobacteriurn, et en particulier A. rhizoenes. 3) Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'inoculée est sous forme viable. 4) Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inoculum est sous une forme lyophilisée ou sous une forme ayant subi une simple dessication sous vide. 5) Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le support comporte un milieu de conservation de 1'inoculum. 6) Application de la composition selon l'une des revendications 1 à 5 au marcottage et au bouturage des plantes, in vivo et in vitro, caractérisée en ce qu'on l'inocule au niveau d'incisions des tiges principales ou secondaires des plantes. 7) Application de la composition selon l'une des revendications 1 à 5 au marcottage et au bouturage chez le pommier de la lignée M9, caractérisée en ce que l'inoculation selon la revendication 6 est faite à des intervalles d'environ 15 à 25 cm.