Brevet FR2596414A1 — publié le 19871002

La présente invention concerne une nouvelle lignée cellulaire permettant la production de protéines. De façon générale, l'invention fournit, à titre de nouveaux hybridomes, ceux obtenus a partir de 5 lymphocytes d'animaux transgéniques, en particulier de souris transgéniques portant un gène codant pour la séquence d'une protéine donnée permettant ainsi d'isoler cette dernière. De façon plus particulière, l'invention 10 fournit de nouveaux hybridomes résultant de la fusion, avec des cellules de myélomes, de lymphocytes de rate de souris transgénique comprenant, intégré dans leur chaine d'ADN les séquences régulatrices d'un gène fonctionnant de préférence à haut niveau dans lesdits lymphocytes. 15 fusionnées aux séquences codant pour une protéine donnée d'un autre gène, avec ou sans fragment codant pour un signal peptidique. Plus particulièrement encore, l'invention fournit de nouveaux hybridomes résultant de la fusion 20 avec des cellules de myélome de lymphocytes de rate de souris transgénique ayant intégré dans leur ADN un gène de fusion consistant en 2kb de séquences régulatrices en position 5' du gène H-2K fusionnées aux séquences codantes du gène de l'hormone de croissance humaine 25 (hGH). L'invention vise également de façon générale un procédé d'obtention de protéines à partir de tels hybridomes. La présente invention est fondée sur le fait 30 que si l'on utilise un gène de fusion spécifiquement exprimé dans les lymphocytes de souris transgéniques, ces lymphocytes peuvent être immortalisés par fusion avec un myélome convenable pour donner des hybridomes produisant une protéine codée par ledit gène de fusion. Le processus auquel on a recours pour obtenir des cellules immortalisées produisant une protéine donnée peut être schématisé de la façon suivante: 1) On construit un gène de fusion comprenant les séquences régulatrices (promoteur-activateur) fonctionnelles dans les lymphocytes et les séquences codantes de la protéine à produire. 2) On introduit ce gène de fusion dans le génome d'une souris notamment par microinjection dans le pronucléus d'oeufs fécondés ou par toute autre méthode physique, chimique ou biologique aboutissant à l'intégration stable du gène de fusion dans le patrimoine 10 génétique de la souris. A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet GB-84.24.757 déposée le ler octobre 1984. 3) On fusionne les lymphocytes de la souris transgénique ainsi obtenue avec un myélome pour donner 15 les hybridomes transgéniques désirés. 4) On traite les ascites provenant de ces hybridomes pour en extraire la protéine désirée. A titre illustratif de ce processus conduisant comme produit intermédiaire à un hybridome particulier 20 conforme à l'invention. on a obtenu des souris transgéniques après microinjection d'un gène de fusion consistant en 2kb de séquences régulatrices de la partie b ' du gène H- 2Kb incluant son promoteur, fusionnées aux séquences codantes du gène hGH. Une telle construction 25 correspond au plasmide p H-2 K-hGH déposé à la CNCM sous le N* I 520. Cette construction est illustrée à la figure 1 annexée. En se référant à cette figure, le fragment de 30 Bam HI 2.15 Kb du plasmide (1) MThGH111 comprenant le gène de structure hGH est inséré entre les sites BglII et BamHI du vecteur PC o obtenir le plasmide pBXGH. Le fragment Hind III-Nrul de 2Kb du promoteur H-2Kb(3) est sous-cloné au site Hind III du plasmide (2) pSei; le plasmide résultant est coupé par Hind III 25964 14 et accolé à l'adaptateur XhoI. Le fragment XhoI-SalI portant le promoteur H-2Kb est coupé et inséré dans le plasmide pBXGH coupé par XhoI donnant ainsi le plasmide pH2Kb-hGH. Les traits fins de la figure 1 représentent 5 les séquences pBR322; les arcs en traits accentués sont l'illustration des séquences H-2K et les arcs en traits moins accentués sont l'illustration des séquences hGH. La position de l'initiation de la transcription à partir du promoteur H-2Kb ainsi que le codon ATG du gène hGH sont 10 indiqués sur cette figure. La séquence au niveau de la jonction H-2Kb/hGH est illustrée à la figure 2. La localisation des deux sondes PvuII utilisées pour la détection des souris transgéniques (B = 1050 bp) et pour l'analyse a la nucléase S1 (A = 1510 bp) sont illustrés 15 par les flèches indiquées sur cette figure. Le gène de structure hGH est utilisé comme gène marqueur en raison du fait que la présence de l'AONhGH et de l'ARN messager correspondant (ARNm) peut être facilement révélée en utilisant une sonde spécifique 20 de hGH. De plus, si l'hGH-ARNm est correctement traduit et que l'hormone est sécrétée dans le sang, on doit (1,4) constater une augmentation de la croissance(). Pratiquement, pour obtenir des souris transgéniques, on procède à une microinjection d'ADN dans 25 le pronucléus d'un oeuf fécondé d'une souris femelle (C57 X SJL/J) croisée avec un mâle de la même lignée comme décrit par exemple par 3.W. GORDON et F.H. RUDDLE, "Gene Transfer into Mouse Embryos: Production of transgenic Mice by Pronuclease Injection" dans Methods in 30 Enzymology 101, pages 411-433 (1983). De cette expérimentation, on constate que toutes les souris transgéniques (13/13) qui se sont développées à partir de ces oeufs contiennent de l'hGH dans leur sérum en une quantité comprise entre 8 et 35 150000 ng/ml telle que déterminée par un essai spécifique radio-immunologique; neuf d'entre elles se sont 1 1 15 développées de façon beaucoup plus importante que leurs congénères. Toutes les cellules des souris transgéniques présentent le gène de fusion injecté intégré dans leur ADN. De plus, l'analyse à la nucléase SI a montré que i'ARN messager de hGH se forme dans les dix-organes des souris géantes testés avec une expression maximale dans 1es organes hématopojétiques. La rate d'un animal (FI-H2K hGH 36) a été utilisée pour produire des hybridomes par fusion avec le myélome X63-Ag8-653(5 Ce myélome est HGPRT sensible et il ne produit in vitro et in vivo aucune chaine d'immunoglobuline de souris. Cette fusion a été réalisée par une méthode chimique utilisant le PEG 1000 dilué à 50 Z dans du milieu de culture sans sérum. La technique prévoit le mélange d'une cellule de myélome pour 10 splénocytes, le culot cellulaire étant traité avec le PEG selon la technique de Kôhler et Milstein (5); les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu de culture sélectif additionné de 10 Z de sérum de cheval ne permettant que la croissance des hybridomes.. Les clones obtenus sont entretenus dans des milieux de culture additionnés de sérum de cheval et éprouvés pour leur activité de production d'hormone de croissance dans le liquide surnageant. Trente six clones indépendants ont été ainsi éprouvés. Tous se sont avérés être positifs 13 d'entre eux donnent de 3 à 10 ng/ml et 18 de 10 à 40 ng/ml et 5 de 40 à 160 ng/ml (voir tableau I ci-après). La variation constatée entre les différents 30 clones quant à cette production est analogue à celle que l'on obtient normalement lorsqu'on mesure les quantités d'anticorps monoclonaux obtenus au moyen d'hybridomes classiques. Après une opération de sous-clonage, deux des hybridomes produisant les quantités les plus importantes 35de hGH dans leur surnageant le cas du A15-9. Ces résultats peuvent être avantageusement comparés à ceux obtenus précédemment par transfection du (6,7> gêne hGH dans des cellules eucaryotes Tableau 1 Production de hGH par transhvbridomes et 15 ascites en dérivant A B c Am nq1mi ous-clones ng/ml Fluide ascit/ml 2 0].' invention1 A1 317 A6 8,4 A17 7,4 A15.9 148 A15.9 15.200 A9 11,2 A15.10 76 A15.10 10.000 A14 30 B9 19,8 BlO 20,9 B6.4 158 B6.4 21,200 30.. 0 0 = 7 A: A: :: k : ) a De: :: S n 10 : DE f,: " A: * S,' 15 : SiS A: :, . . | : 9 0 00 20 , : - -,: E: 'a 0,., ' '-: : 25 i, , A: Si. . . W:, X :. 0 30 :: : ; A:; t -. X Ans:0. 35 X C: 0 f . :,. ., t : f:i ad:, :S: Ainsi, selon la présente invention, il est possible d'immortaliser par fusion avec un myélome des lymphocytes porteurs d'un gène de fusion avec un promoteur fonctionnel pour obtenir la protéine codée par ledit gène de fusion. A titre de variante, une construction d'un gène de fusion comprenant des séquences régulatrices activatrices autre que H2K comme par exemple celles d'un gène d'immunoglobuline tel que le gène p qui code pour une chaine lourde d'immunoglobuline (IgM) peut (8,9> également être utilisée.(8O9) n peut alors s'attendre à ce que toute autre protéine soit sécrétée en quantité appréciable constituant ainsi un moyen industriel d'obtention d'une telle protéine. C'est ainsi en particulier que l'on peut obtenir l'Interféron à partir d'un hybridome provenant de la fusion avec des cellules de myélome de lymphocytes de rate de souris transgénique ayant intégré dans leur génome un gène comprenant les séquences régulatricesactivatrices, à savoir les séquences d'un gène d'immunoglobuline (tel que le gène u qui code pour une chaine lourde d'immunoglobuline) fusionné avec les parties codantes du gène de l'Interféron telles que décrites dans la demande de brevet EP77670. De même, il est possible d'obtenir la production d'un peptide spécifique du polio-virus type 1 correspondant à la séquence de la région 93/104, à savoir Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu tel que décrit dans la demande de certificat d'addition français N' 83.10778 déposée le 29 juin 1983. Egalement, il est possible de réaliser la synthèse de l'antigène de surface HBs du virus de l'hépatite B en intégrant dans le plasmide utilisé pour l'obtention des souris transgéniques les séquences décrites dans la demande de brevet français N' 79.21811: -4. c%J LOC ( O, Lsb O i - D E . e :UV E, E- Ut Q. Uv U4 Eq- u VE U U$4 O U 1 VU E-. E- UV '- VU 4> Q O V VU ó3-..--V - VU E O "E- P 0 UV O4 U SV Q. UV > C g O U EE- VUF O' t. O3 OU E- Fx :- - óU 4> V U OI VU O' V > VU $4 U VU $4 UE. EW U 4,J VU UV 04 uVCD t- 43 h3 O I) E. 0 E- $4 UV O $0 4 VU VU $4 UV 4> E-. 0 V e E-Q V o UV $4i UV s_ 0 0 rr Ez ta q V O U O' N UV '4 UV Q. " UVl >' óE-.4 C. VU E-. V " E- O Vn U 4> VU E- tUV UVo u V.4 F E-4" VE- O > USl)t 1ó UVfQ t E-. VeCdU 1E - * UV t O 3 0 VU-- 00. _t O > Ut UV4> XrE"> e"E 4 Ev .4 o VU Q UV o u O U O V Q rS Ci. "F V " E CD 0 0 Q E- F V >:w "Ez $ OO k "Ed O xE. E- V U -4 E> VU E$4 E, UV WE E-.u o VU 3 >1. JJE E-- V$ O >s V. O 3 Q. "-4 Ed Ct VU O > VU E- 0 FZO u $C4 ED 4 " -. UV $ 4f 4 ZE4 "O w E- V" a " *ovU 94 Fz P 00o"E :3 E COO O UV "> E- 4 UV ó> V U. * n. 4 8óU *.0- 1-4' . b C U 4 U i. O UV Q C ' $4 U E n -' .:$4 " n> U $ * u a C 2 c" ou = s 6' 3S U E, UV -4 C U O V U4 VU 00 VU E-" CI ) a n $ s4 VUE, V U gel. U C O F rS O.> 1 UV>. VU $4 3 U Q. V U E--. $ 4 UV$4 VU $4 VU4> UVOt. 00. > e e OU V o VU u VU o. E-, > c., $4% c 0. $4 1-4 :r Cr H o cn 4> 4-) CD 4"-> C $4 (.) 4. E 'W nD 4-i> H h H 4 0 O Q' 4- H4 4 4> 43 0 >0 e-H I-' Cr 0 C rl X 4j 434 V b --, 11 EO a EO Q EO E- W: $4 --o *0 43 u 4> c -.4 o> o> 43.o> -.-4 43 $4 O E Q..4> -'4 Q. r- ui r' M _.- to N- O ln Mt C'est ainsi que les produits obtenus à partir de culture de transhybridomes peuvent être utilisés comme les produits naturels obtenus par purification classique ou des produits synthétiques obtenus par les méthodes de génie génétique dans les mêmes applications, à savoir: préparation d'Ag vaccinants, d'Ag immunogenes et d'Ag utilisables comme réactifs de diagnostic, préparation de protéines ou peptides à intérêt thérapeutique ou biologique. REFERENCES 1. PALMITER R.D., NORSTEDT G., GELINAS R.E., HAMMER R.E. et BRINSTER R.L., Science, 222, 809-814, 1983 2. HERBOMEL P., BOURRACHOT 8. et YANIV M., Cell, 39, 653-662, 1984 3. KIMURA A., ISRAEL A., LE BAIL O. et KOURILSKY P., Cell, 1986 (sous presse) 10 4. PALMITER R.D. et al., Nature, 300, 611-615, 1982 5. KOHLER G. et MILSTEIN C., Nature, 256, 495-497 (1975) 6. ROBINS D.M., PAEK I., SEEBURG P.H. et AXEL R., Cell, 29,. 623-631 (1982) 7. LUPKER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981) 8. 3. BANER3I, L. OLSEN and W. SCHAFFNER, Cell, 33, 729, (1983) 9. S. GILLIES, S. MORRISON, V. OI, S. TONEGAWA, Cell, 33, 25 717 (1983) REVENDICATIONS 1. Hybridomes, caractérisés en ce qu'ils résultent de la fusion avec des cellules de myélomes, de lymphocytes de rate de souris transgénique comprenant, 5 intégré dans leur chaine d'ADN un gène fonctionnant dans lesdits lymphocytes, portant les séquences régulatrices de la région 5 de ce gène et fusionnées aux parties codantes pour une protéine donnée d'un autre gène, avec ou sans fragment codant pour un signal peptidique. 2. Hybridomes selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils résultent de la fusion avec des cellules de myélome d'un gène consistant en 2kb de la séquence en position 5' du gène H-2K porteur de ses séquences régulatrices et fusionné aux séquences codantes 15 du gène hGH (gène de l'hormone de croissance humaine). 3. Plasmide p H 2 K-hGH déposé à la C.N.C.M. sous le N*I 520 entrant dans la construction de l'hybridome selon la revendication 2. 4. Procédé d'obtention d'un hybridome selon 20 l'une quelconque des revendications t à 3, caractérisé en ce qu'on construit un gène de fusion comprenant les séquences régulatrices (promoteur-activateur) actives dans des lymphocytes et les séquences codantes de la protéine à produire; on introduit ce gène de fusion dans 25 le génome d'une souris par microinjection dans le pronucléus des oeufs fécondés et on fusionne les lymphocytes de la souris transgénique ainsi obtenue avec le myélome donnant ainsi les hybridomes transgéniques désirés. 35 5. Procédé d'obtention d'une protéine donnée, caractérisé en ce qu'on traite les ascites provenant d'un hybridome selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour en extraire ladite protéine. 6. Sous-clones dérivant de l'hybridome selon la revendication 2 déposés à la C.N.C.M. sous le N'I 535. 7. Sous-clones dérivant de l'hybridome selon la revendication 2 déposés à la C.N.C.M. sous le N'I 536'.