Brevet FR2586814A1 — publié le 19870306

Anticorps monoclonaux ant-i-protéines p 27 K et p 31 K de prosomes et leur application à titre de réactifs de diagnostic et/ou d'identification de cellules. La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux antiprotéines p 27 K et p 31 K de prosomes. Elle concerne également un procédé pour l'obtention de ces anticorps ainsi que leur application à titre de réactifs de diagnostic et/ou d'identification des cellules. Les prosomes sont des complexes ribonucléoprotéiniques RNP ou particules RNP, qui ont été récemment mis eh évidence par des méthodes biochimiques et ont été visualisées par microscopie électronique, notamment dans le cytoplasme des érythroblastes de canard et de souris et dans les cellules humaines Hela [définies par SPOHR et al. Eur. J. Biochem. 17,296-318, (1970)3.Aceteffet,onpeutse référer à l'article de Schmid et al. dans The EMBO Journal vol. 3 n 1, pages 29-34, 1984 cité dans la présente description à titre de référence. On a trouvé ces complexes associés à divers complexes RNP messagers (RNPm) libres, en particulier au RNPm de globine (20S) et à d'autres ARN messagers (ARNm) réprimés dans le cytoplasme des cellules aussi bien de canard, de souris, que des cellules Hela. De tels complexes ont été également trouvés dans le noyau de cellules. Le poids moléculaire des prosomes a été estimé à environ 600 000 daltons. Les prosomes sont des complexes extrê- mement stables. En effet, ils sont résistants à la ribonucléase, à la protéase K, aux solutions d'ions césium supérieures à 1M, et, chez les cellules citées ci-dessus, aux solutions détergentes à 1 % de "Sarkosyl" (N-laurylsarcosinate de sodium) qui dissolvent les autres constituants des RNPm réprimés. Ces complexes, qui présentent un coefficient de sédimentation de 19S environ, contiennent, selon le type de cellules et l'espèce, 1 à 12 petits ARN et un ou plusieurs membres d'une population caractéristique de protéines qui comporte aussi bien des membres spécifiques d'une espèce que des membres communs à toutes les espèces. Le poids moléculaire de ces protéines membres varie entre 19 000 et 50 000 et le nombre de molécules de protéines par prosome est de l'ordre de 20. La population de protéines prosomales comprend au moins membres distincts; en conséquence environ 25 différents types de prosomes peuvent exister au minimum. Différents travaux expérimentaux ont montré une distribu- tion différentielle des prosomes indiquant une spécificité physiolo- gique en corrélation avec l'état fonctionnel de la cellule et de l'organisme au cours du développement embryonnaire et de la différen- ciation cellulaire. Par exemple, dans l'épithélium d'embryons, on a observé un certain type d'antigène prosomal dans le noyau, puis ultérieurement dans le cytoplasme, puis dans des secteurs cytoplasmiques, en fonction des différents stades de la différenciation. D'autres essais ont montré que les prosomes semblent être impliqués dans la répression des ARNmin vivo et in vitro et qu'ils se trouvent associés aux pré-ARNm et aux ARNm, depuis le chromosome, le long des matrices nucléaires, puis cytoplasmiques. Leur capacité à inhiber la synthèse protéinique in vitro renforce cette hypothèse. Ils jouent donc un rôle important dans le contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes. Les comparaisons biochimiques et immunologiques ont montré une conservation évolutive de protéines prosomales. Ces protéines sont biochimiquement et immunologiquement apparentées aux protéines dites de choc thermique. Les prosomes constituent donc une nouvelle classe de composants cellulaires qui, par leur structure et leur présence, reflètent l'état physiologique d'une cellule donnée. Il s'est donc avéré nécessaire de disposer de moyens d'identification des prosomes notamment pour: A) à des fins expérimentales: 1) faire l'analyse des structures intimes des cellules vivantes humaines ou animales; 2) étudier le contrôle de l'expression des gènes après la trans- cription; et B) à des fins de diagnostic: 1) définir une perturbation de l'immunophénotype prosomal d'une cellule donnée par rapport à un état pathologique ou un pathogène; 2) identifier des cellules par rapport à leur stade de différen- ciation et de développement, par exemple identifier les cellules de type embryonnaire parmi des cellules adultes. On a maintenant trouvé des anticorps monoclonaux qui constituent d'excellents moyens d'identification des prosomes. Ces anticorps monoclonaux, objet de la présente invention, sont les anticorps monoclonaux anti-protéines p 27 K et p 31 K de prosomes. Par "protéine p 27 K" et "protéine p 31 K", on désigne dans la présente description respectivement les protéines prosomales de poids moléculaire 27 000 et 31 000. On a trouvé de façon surprenante que ces deux protéines sont présentes dans la population caractéristique de protéines des prosomes quelle que soit l'espèce. Les anticorps monoclonaux dirigés contre ces protéines sont d'excellents moyens d'identification des prosomes. La présente invention a donc pour objet les anticorps monoclonaux antiprotéines p 27 K et p 31 K de prosomes ainsi qu'un procédé pour leur obtention. Les anticorps monoclonaux anti-protéines p 27 K ou p 31 K sont produits par des lignées de cellules hybrides murines obtenues par fusion de cellules de myélome de souris avec des splénocytes de souris immunisées contre les protéines p 27 K ou p 31 K. La fusion de cellules de myélome de souris avec des splénocytes de souris immunisées a été proposée pour la première fois en 1975 par KOHLER et MILSTEIN [Nature 256 495-497 (1975)]. Cette technique de fusion, également dénommée "technique des hybri- domes" a été depuis largement utilisée pour la production d'anticorps monoclonaux. Cependant, à la connaissance de la demanderesse, on n'a jamais fabriqué par cette technique d'anticorps monoclonaux antiprotéines de prosomes ou de complexes apparentés. De plus, on notera que, même si cette technique est bien connue dans son principe, l'obtention d'anticorps monoclonaux spécifiques n'est pas évidente, dans la mesure o chaque antigène considéré a une cons- titution propre. Sous son aspect général, le procédé selon l'inven- tion pour l'obtention de lignées de cellules hybrides anti-protéines de prosomes comprend les étapes suivantes: 1) d'immunisation de souris avec une quantité donnée de la protéine p 27 K ou de la protéine p 31 K; 2) de prélèvement de la rate des souris immunisées et séparation des splénocytes; 3) de fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion; 4) de culture des celluLes hybrides obtenues dans un milieu sélectif sur lequel ne se développent pas les cellules de myélome non fusionnées, et en présence d'éléments nutritifs appropriés; ) de sélection des cellules produisant l'anticorps désiré et clonage de ces cellules. La première étape de ce procédé, à savoir l'immunisation des souris, est réalisée de manière à stimuler la mémoire des cellules pour la synthèse d'anticorps. Selon un mode opératoire préféré, le protocole d'immuni- sation consiste à injecter trois fois consécutives à des intervalles de 2 à 3semainoesenviron,paroiesous-cutanée et intrapéritonéale, une quantité donnée de la protéine de pr4osome et, 4 jours avant la fusion après une période de repos de 2 mois, à faire un rappel par voie intraveineuse et intrapéritonéale avec la même quantité de protéine de prosome. La quantité de protéine de prosome utilisée à chaque injection est avantageusement d'environ 20 à 50 pg par souris. Les souris ainsi immunisées sont ensuite sacrifiées et leurs rates sont prélevées et traitées dans un milieu approprié pour récupérer les splénocytes, par exemple dans le milieu RPMI 1640 tel que défini par exemple par MOORE et aI. "Culture of Normal Human Leucocytes" J.A.M.A 19_9 519-524, 1967. La fusion des cellules, qui constitue la troisième étape du procédé de l'invention, consiste à mélanger les splénocytes de souris immunisées contre une protéine de prosome et des cellules de myélome de souris selon la technique de KOHLER et MILSTEIN ENature 256,495-497 (1975)] en présence d'un promoteur de fusion, tel que par exemple le polyéthylèneglycol. On utilise avantageusement les cellules de myélome dans un rapport de 1:10 par rapportauxsplânocytes. Apres incubation sous agitation à 37 C pendant une minute en présence de polyéthylèneglycol, les cellules sont lavées dans le milieu RPMI 1640 et remises en suspension dans le même milieu, puis mises en culture sur un milieu sélectif approprié pour La croissance des cellules hybrides. Comme les cellules de myélome sont dépourvues de l'enzyme hypoxanthine-guaninephosphoribosyl-transférase, elles ne se reproduisent pas sur les milieux contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine. En conséquence, le milieu sélectif pour la croissance des cellules hybrides contiendra avantageusement de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine. Les cellules produisant l'anticorps anti-protéine de prosome sont ensuite sélectionnées et clonées. L'obtention de quantités importantes d'anticorps monoclonaux peut être réalisée soit par culture in vitro des cellules hybrides ainsi sélectionnées, soit en les injectant à des souris et en récoltant après environ 15 jours leurs liquides ascitiques qui contiennent l'anticorps recherché. Les anticorps monoclonaux ainsi obtenus sont avantageusement conservés par congélation, par exemple à -20 C. Les protéines p 27 K et p 31 K sont extraites des prosomes par électrophorèse sur gel, lesquels ont été préalablement séparés des autres complexes cellulaires par fractionnement en gradient de saccharose. L'obtention des protéines p 27 K et p 31 K consiste donc en: - 1) la séparation des prosomes des autres complexes cellulaires par fractionnement par centrifugation différentielle et en gradient de saccharose et récupération des particules ayant un coefficent de sédimentation de 19S environ. 2) extraction de la protéine recherchée par électro- phorèse sur gel. L'obtention des prosomes de canard et de souris a été décrite en détail par SCHMID et al. dans The EMBO Journal vol. 3 n 1 pages 29-34, 1984. Les prosomes de cellules Hela ont été obtenus selon le mode opératoire décrit ci-après: 1) des surnageants post-mitochondriaux ont été préparés à partir de cultures de cellules Hela selon le procédé décrit par GANDER et aL. (Eur. J. Biochem. 38_443-452). 2) des préparations de polyribosomes et des particules post-ribosomales ont ensuite été préparées selon le procédé décrit par VINCENT et al. [Eur. J. Biochem., 112, 617-633]. 3) les complexes ribonucléoprotéiniques cytoplasmiques libres ont été fractionnés par sédimentation de culots de particules post-ribosomales remises en suspension dans des gradients de saccharose isocinétiques 15 à 28 % (en poids/poids) dans du tampon à faible teneur en sel et ayant la composition ci-après: 10 mM de triéthanolamine-HCl (pH 7,4), 50 mM de KCl, 5 mM de 2-mercaptoéthanol. Un tel fractionnement a été réalisé dans un rotor "Beckman" zonal de type Ti 14, pendant 15 h à 41 000 rpm et à 4 C; 4) les particules sédimentant dans la gamme 15 à 30 S ont été ensuite rassemblées et concentrées par centrifugation à vitesse élevée dans un rotor "BECKMAN" type Ti 60 pendant 18 h à 48 000 rpm et à 4 C; ) le culot de centrifugation a été mis sur gradient de saccharose (5 à 21 % poids/poids) en présence de KCl à concentration de 0,5 M (Rotor SW 41 37 000 rpm, 17 h, 4 C) et la fraction sédimen- tant à environ 19S a été receuillie. Dans tous les cas, les protéines prosomales sont extraites de ces fractions et identifiées en utilisant des techniques connues d'électrophorèse sur gel, par exemple l'électrophorèse sur gels monodimensionnels de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS) selon LAEMMLI [Nature 227 680-685, 1970] ou l'électrophorèse sur gels bidimensionnels telle que décrite par O' FARRELL et al. [Cell 1_2 1133-1142, 1977]. Les marqueurs de poids moléculaire utilisés dans ces électrophorèses peuvent être les composés ci- après: la phosphorylase b(94 K), la sérumalbumine bovine (68 K), l'ovalbumine (43 K), l'anhydrase carbonique (31 K), l'inhibiteur de la trypsine de soja (21 K) et la lactalbumine (14 K). On notera que, selon une variante de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'immunisation des souris peut être réalisée non pas avec les protéines p 27 K ou p 31 K elles-mêmes mais avec les prosomes entiers, auquel cas il est nécessaire de sélectionner ultérieurementf les cellules hybrides produisant Les protéines p 27 K et p 31 K par un test ELISA (test de dosage immunoenzymatique sur immunoadsorbant). Comme on l'a indiqué précédemment, les anticorps monoclonaux selon l'invention conviennent pour la détection ou l'identification des prosomes par les techniques de détermination immunologiques classiques, telles que l'immunofluorescence, les techniques immunoenzymatiques ou radioimmunologiques. L'application des anticorps monoclonaux selon l'invention présente une importance considérable aussi bien dans le domaine de la recherche expérimentale en biologie que dans le domaine de la recherche médicale, notamment du cancer, et en clinique pour le diagnostic de maladies par immunophénotypie différentielle. Par exemple, dans le domaine de la recherche expérimentale en biologie, les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés pour la caractérisation de la structure, de la fonction et de la synthèse des prosomes, en tant que complexes physiologiques ubiquitaires. En particulier, la cytolocalisation différentielle de types individuels de prosomes, selon les méthodes de fraction- nement de cellules et de biochimie, ou par immunofluorescence sur des cellules intactes ou des coupes de tissus, peut être facilitée d'une manière importante grâce aux anticorps selon l'invention. En biologie du développement, étant donné la présence ou l'absence de prosomes et la cytolocalisation caractéristique de prosomes spécifiques dans des cellules de type spécifique, les anticorps monoclonaux prosomaux sont utiles pour la caractérisation, l'identification et le suivi de cellules spécifiques dans le dévelop- pement embryonnaire, permettant ainsi d'établir en quelque sorte une microanatomie dynamique, fonction du développement. Dans la mesure o les prosomes sont impliqués dans le contrôle différentiel de l'expression des gènes, les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés comme sondes moléculaires pour analyser les mécanismes sous-jacents de la régulation cellulaire. 2s86814 Dans le domaine de la recherche médicale, Les anticorps monoclonaux selon l'invention permettront d'établir, par immuno- phénotypie différentielle, un véritable atlas de distribution des antigènes prosomaux selon le type de cellules, de tissus spécifiques et le stade de différentiation des cellules. La modification de cette distribution dans le cas de pathologies touchant à la régulation et donc à l'état physiologique des cellules pourra être identifiée à l'aide des anticorps monoclonaux selon l'invention. Pburle diagnostic clinique de pathologies d'origine diverse, lesanticorps monoclonauxselon l'invention vont devenir des outils indis- pensables. En effet,ils permettent de reconnaitre rapidement, dans des coupes de tissus prélevés par exemple parbiopsie,et dans les fluides physiologiques, la présence et la distribution de cellules déviant de la normale. On pourra ainsi automatiser par cytofluorimétrie dif- férentielle le diagnostic de pathologies nécessitant actuellement une haute expertise en cytologie et microanatomie. En ce qui concerne le cancer, les anticorps selon l'invention peuvent être très utiles pour détecter dans le sang périphérique la présence de cellules à un stade de développement précoce. En effet, le sang périphérique normal ne contient qu'un nombre très petit de cellules précoces. Par contre, dans un sang périphérique de leucémiques, on a noté la présence de cellules précoces en nombre important. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs ci-après. Exemple 1 Préparation des anticorDs anti-Drotéines p 27 K et D 31 K de prosomes de canard. On a dissocié par traitement à l'aide de KCl 0,5 M les RNPm globine 20S de canard obtenus selon le mode opératoire décrit par VINCENT et al. dans [Eur. J. Biochem. 112, 617-633 (1980)] en quatre sous-complexes majeurs de coefficient de sédimentation 4S, 13s, 16S et 19S (prosome). Pour obtenir des anticorps contre les protéines spécifiques de prosome, on a injecté à des souris Balb/c 20 pg de prosome (particule de sédimentation 19S obtenue ci-dessus) par voie intrapéritonéale et sous-cutanée en présence d'adjuvant de Freud selon le protocole d'immunisation défini précédemment. Une semaine après la seconde injection, le sérum de souris a été prélevé et la présence d'anticorps a été détectée par les techniques ELISA et d'immunoélectrotransfert. Deux mois après la troisième injection, on a effectué un rappel par voie intraveineuse et intrapéritonéale avec la même quantité de prosome etquatre jours plus tard, les souris ont été sacrifiées.leurs rates prélevées et les splénocytes (108) fusionnés avec des cellules (107) de myélome de souris PAI [fournies parle laboratoire de T. STAEHELIN de HOFFMANN-LA-ROCHE, Bâle (Suisse)]selon la méthode de KOHLERet MILSTEINen utilisant du polyéthylèneglycol comme promoteur de fusion. Les cellules produisant les anticorps anti-protéines de prosome ont ensuite été sélectionnées sur un milieu sélectif et clonées par la méthode des dilutions limitantes. La détection des cellules hybrides produisant des anti- corps a été effectuée par la méthode ELISA et la méthode d'immuno- électrotransfert. Pour ces deux tests, on a utilisé la particule RNPm globine 20S comme antigène et sélectionné avec cet antigène les clones positifs, c'est-àdire les clones produisant des anticorps contre les protéines de prosome p 27 K et P 31 K. Sur la figure 1 annexée, on a représenté: - le profil de sédimentation de la particule RNPm globine S de canard dans un gradient de saccharose en présence de 0,5 M KCl, observé à 254 nm (figure 1A), - la photographie du gel SDS- polyacrylamide monodimension- nel des protéines de la fraction du gradient représenté en A, colorées par du bleu de Coomassie (figure 1B). Sur cette figure, M indique les marqueurs de poids moléculaires et la zone 3-6 correspond aux protéines du prosome de canard, - la photographie des protéines d'un gel homologue au gel représenté en B après transfert sur papier de nitrocellulose et réaction successive (ELISA) avec les anticorps monoclonaux anti- protéine p 27 K (figure 1C1) et anti-protéine p 31 K (figure 1C2) selon le même mode opératoire que celui décrit dans l'exemple 2 ci-après. Exemple 2 Mise en évidence du caractère universel des protéines 27 K et 31 K à l'aide d'anticorps monoclonaux obtenus à l'exemple 1. Pour montrer la spécificité et l'universaLité des anticorps monoclonaux obtenus, les protéines de prosome de canard, de souris et de cellules Hela, obtenues après dissociation en gradient de saccharose dans du chlorure de potassium 0,5 M, ont été soumises à une électrophorèse sur gel monodimensionnel et colorées au bleu de Coomassie. Des protéines de gels homologues ont été transférées du gel sur du papier de nitrocellulose par inmuno- électrotransfert selon 1 a technique de TOWBIN et aL. [Proc. NatL. Acad. Sci. USA 76 4350-4354]. Après le transfert, le papier de nitrocellulose a été plongé pendant une nuit à 4 C dans du tampon phosphate PBS contenant 3 % de sérumalbumine bovine pour éliminer les produits de réaction non spécifiques. Le papier a ensuite été incubé une nuit à 18 C avec l'anticorps anti-protéine p 27 K ou anti-protéine p 31 K provenant du fluide ascitique dilué dans du PBS (1:600). Le papier a été ensuite lavé 4 fois avec du PBS, puis incubé pendant trois heures avec un anticorps marqué à la peroxydase (Anticorps de chèvre anti-IgG de souris) dilué dans du PBS (1:1000) et contenant du sérum de chèvre à 10 %. Après la réaction, le papier a été à nouveau lavé avec du PBS et la réaction enzymatique a été révélée avec du 4-chloro-1-naphtol pendant 5 à min. Dans cet essai, les anticorps anti-protéine p 27 K et p 31 K de prosome de canard obtenus à l'exemple 1 ont réagi positi- vement avec les protéines de prosome de canard,de souris et de cellules Hela. Sur la figure 2 annexée, on a représenté: - en A la photographie du gel d'électrophorèse des protéines d'érythrocytes de canard (a), d'érythrocytes de souris (b) 258-6814 et de cellules Hela (c), après coloration au bleu de Coomassie, M représente les marqueurs de poids moléculaire; - eh B la photographie des protéines d'un gel homologue après transfert sur papier de nitrocellulose et réaction avec l'anticorps monoclonal anti-protéine p 31 K, - en C la photographie desdites protéines après transfert sur papier de nitrocellulose et réaction avec l'anticorps monocLonal anti-protéine p 27 K. ExempLe 3 Utilisation des anticorps monoclonaux anti-protéines p 27 K et p 31 K pour l'identification de prosomes. ' Des études par cytoimmunofluorescence ont été effectuées avec différents types de cellules pour l'identification des antigènes prosomaux. Dans une première étape, on a fait un frottis de cellules qui ont été fixées à l'aide de paraformaldéhyde 3 % dans du PBS pendant 15 min à la température ambiante. Après cette étape de fixation, les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de "Triton X 100" pendant 5 min et ensuite préincubées avec 1 % de sérum de lapin et 0,1 % de sérum albumine bovine dans du PBS pour éliminer les réactions non spécifiques. Après quatre lavages successifs avec du PBS, les cellules ont été incubées pendant 1 h dans une chambre humide avec l'anticorps monoclonal anti-protéine p 27 K ou l'anticorps monoclonal anti- protéine p 31 K. Les cellules ont été ensuite lavées 3 fois pendant min et incubées avec un second anticorps marqué à la fluorescéine (anticorps de lapin anti-IgG de souris - FITC) pendant 30 min à l'obscurité. On a ensuite observé au microscope optique les cellules et déterminé les cellules contenant des protéines prosomales, ces cellules étant les cellules fluorescentes. Cet essai a été effectué avec des cellules de sang périphérique de canard et des cellules Hela. Les figures 3 et 4 annexées sont les photographies des cellules observées au microscope. Sur ces figures: - la photographie 3A1 est celle des cellules de sang périphérique de canard qui ont réagi avec L'anticorps anti- protéine p 27 K. - la photographie 3A2 est celle des cellules de sang périphérique de canard qui ont réagi avec l'anticorps anti- protéine p 31 K. Sur ces deux photographies, on constate que les cellules adultes ne sont pratiquement pas fluorescentes alors que les cellules jeunes/plus ou moins fluorescentesmontrent la présence de protéines prosomales dans une intensité et une distribution fonction de leur degré de différenciation et du type d'anticorps monoclonal utilisé. - la figure 4(B1) est celle des cellules Hela incubées avec l'anticorps monoclonal anti-protéine p 27 K. - la figure 4(B2) est celle des cellules Hela incubées avec l'anticorps monoclonal anti-protéine p 31 K. Dans ce cas, toutes les cellules sont fluorescentes et contiennent donc toutes des protéines prosomales. On notera que La coloration diffère selon le type d'anticorps prosomal utilisé. Cet essai montre que les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés pour étudier la différentiation des cellules vivantes humaines ou animales. R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Anticorps monoclonaux anti-protéines p 27 K et p 31 K de prosomes. 2. Procédé pour l'obtention d'anticorps monoclonaux anti-protéines p 27 K et p 31 K de prosomes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) d'immunisation de souris avec une quantité donnée de la protéine p 27 K, de la protéine p 31 K ou d'un prosome; 2) de prélèvement de la rate des souris immunisées et séparation des splénocytes; 3) de fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion; 4) de culture des cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif sur lequel ne se développent pas les cellules de myélome non fusionnées, et en présence d'éléments nutritifs appropriés; ) de sélection des cellules produisant l'anticorps désiré et clonage de ces cellules. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'immunisation consiste à injecter trois fois consécutives à des intervalles de deux à trois semaines environ, par voie sous-cutanée et intrapéritonéale, une quantité donnée de la protéine de prosome et, 4 jours avant la fusion après une période de repos de 2 mois, à faire un rappel par voie intraveineuse et intrapéritonéale, avec la même quantité de protéine de prosome. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la fusion est réalisée en utilisantlescellules de myélome de souris dans un rapport de 1:10 par rapport auxsplênocytes et du polyethylene-glycol comme promoteur de fusion. 5. Lignées de cellules hybrides murines produisant des anticorps antiprotéines p 27 K et p 31 K de prosomes obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4. 6. Application des anticorps monoclonaux selon la revendication 1 à l'identification de cellules vivantes humaines ou animales. 7. Application des anticorps monoclonaux selon la revendication 1 pour le diagnostic des maladies par immunophénotypie différentielle.