Brevet FR2596867A1 — publié le 19871009

La présente invention concerne un procédé immunologique de dosage de l'érythropoiétine, plus particulièrement un procédé perfectionné pour le dosage immunologique de l'érythropoiétine (ci-apres dénommee parfois "EPO") par une technique dite "en sandwich" utilisant un premier, un second et un troisième anticorps. L'EPO est principalement produite dans les reins et c'est une hormone ayant un poids moléculaire d'environ 40 000 et stimulant la formation des érythrocytes dans l'organisme. On sait que la quantité d'EPO augmente ou diminue dans les fluides de t'organisme dans le cas de diverses anémies et érythrocytoses, et par conséquent, il est très important de mesurer avec précision La quantité d'EPO dans les fluides de l'organisme pour le diagnostic de ces maladies du sang. On connaît divers procédés pour la détermination de L'EPO, par exemple une technique de dosage biologique utilisant de petits animaux (par exemple souris ou rat) Ccf. "Rinsho Kensa" (clinicat Test), vol. 22, n" 2, 1978), une technique de mesure de l'absorption de 59Fe dans les cellules de moelle osseuse de la souris (cf. J. Lab. CLin. Med., vol. 97, n" 2, p. 158-169, 1981) et unc technique utilisant des cellules de foetus de souris (cf. Acta Haematal JAPAN, vol. 44, n" 6, 1981). Le procédé de dosage biologique est le plus fiable, mais il a une sensibilité plus faible défavorable dans la détection et exige une longue durée pour la mesure et en outre il est coûteux parce qu'il utilise une grande quantité d'animaux. Recemment, on a développé un procédé immunologique, en particulier un dosage immunoenzymatique pour la détermination de substances qui sont présentes en très faibles quantités dans les liquides de l'organisme. Cependant, le dosage immunoenzymatique est moins sensible pour la détection des substances, par rapport au dosage radioimmunologique et, par conséquent,ses applications sont limitées. En particulier, l'EPO est contenueen très faibles quantités dans le sang normal, par exemple de 10 à 20 mU/ml (0,1 à 0,3 ng/ml) et, par conséquent, on a considéré jusqu'a présent très difficile de la déterminer par des dosages immunoenzymatiques connus. La demanderesse a étudié un dosage immunotogique perfectionné pour la détermination de lfEPO et trouvé un procédé perfectionné de dosage immunologique pour la détermination de L'EPO qui consiste à faire réagir un anticorps spécifiquement reactif avec l'EPO, fixé sur un support insoluble, un échantillon pour essai et un anticorps spécifiquement réactif avec L'EPO, marqué par une enzyme, en formant ainsi un complexe anticorps-EP0-anticorps fixé sur le support insoluble et à mesurer ensuite la quantité du produit marqué fixé sur le support insoluble (voir demande de brevet japonais n" 39687/1980).Cependant, dans ce procédé, l'anticorps spécifiquement réactif avec l'EPO a un titre plus faible et en conséquence, il peut ne pas être nécessairement approprié pour une mesure précise de la très faible quantité d'EPO dans l'échantillon de sang normal. On considère que le faible titre de L'anticorps réactif avec l'EPO est dû au métabolisme rapide de l'EPO dans le cas de l'immunisation d'animaux autres que l'homme avec l'EPO et en outre, au fait que les animaux auxquels on administre l'EPO réagissent physiologiquement avec l'EPO et qu'une anémie grave peut donc être induite. La demanderesse a encore étudié un procédé encore amélioré de sensibilité élevée pour le dosage immunologique de L'EPO, qui puisse être mis en oeuvre en une très courte durée et à bas prix dans un local d'essai habituel et a trouvé que le dosage souhaité peut être effectué par un procédé dit "en sandwich" utilisant un troisième anticorps marqué par une enzyme, qui est spécifiquement réactif avec L'immunoglobuline chez l'animal utilisé pour la préparation du second anticorps. L'invention a pour objet de proposer un procédé perfectionné pour le dosage immunologique de I'érythropofétine. L'invention a encore pour objet de proposer un dosage immunoenzymatique par une technique "en sandwich" pour la détermination de I'érythropoiétine dans les liquides de l'organisme. L'invention a en outre pour objet de proposer un dosage immunologique de L'érythropoiétine convenant pour le diagnostic de diverses maladies du sang tel Les qu'anémie et érythrocytose.Ces objets et avantages de L'invention et d'autres apparaîtront clairement à l'homme de l'art à la lecture de La description qui suit en référence à la figure unique du dessin annexé qui représente une courbe d'étalonnage standard de l'EPO utilisée selon l'invention. Le procédé de dosage immunologique de L'érythropoiétine selon l'invention consiste à faire réagir un premier anticorps spécifiquement réactif avec l'érythropoiétine, qui est fixé sur un support insoluble, avec un échantillon pour essai contenant de L'érythropoiétine et un second anticorps qui est spécifiquement réactif avec l'érythropoiétine et qui est préparé par immunisation d'une espèce animale différente de L'animal utilisé pour la préparation du premier anticorps ; à faire réagir avec une quantité déterminée d'un troisième anticorps marqué qui est spécifiquement réactif avec L'immunoglobuline de L'espèce d'animal qui est utilisée pour la préparation du second anticorps ; et ensuite, à déterminer La quantité de l'anticorps marqué fixé au support insoluble portant L'anticorps ou la quantité d'anticorps marqué non fixé. Selon le procédé de L'invention, même si le second anticorps spécifiquement réactif avec L'EPO a un titre plus faible, le titre peut être augmenté par utilisation du troisième anticorps marqué qui est spécifiquement réactif avec l'immunoglobuline de l'espèce d'animal utiliséepour la préparation du second anticorps, ce qui permet une détermination immunologique efficace de l'EPO. Le troisième anticorps peut être facilement préparé par immunisation d'une espèce d'animal, autre que l'espèce d'animal utiliséepour la préparation du second anticorps, avec L'immunoglobuline de cette dernière espèce d'animal, et le troisième anticorps ainsi obtenu a un titre beaucoup plus grand que celui du second anticorps. Le premier et le second anticorps utilisés selon L'invention sont préparés par immunisation d'espèces d'animaux differentes, autres que l'homme, par exemple lapin, vache, chèvre, mouton, cochon d'inde, etc., avec une EPO purifiée qui est obtenue à partir de L'urine de patients souffrant de panmyélophtisie (anémie aplastique) qui produisent une quantité relativement importante d'EPO. L'un ou L'autre des premier et second anticorps peut être un anticorps monoclonal.Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le premier anticorps est un anticorps préparé par immunisation d'une espèce d'animal telle que Le lapin, la chèvre ou la vache avec une EPO purifiée, le second anticorps est un anticorps monoclonal provenant de la souris et le troisième anticorps est un anticorps préparé par immunisation d'un animal autre que la souris avec une immunoglobuline de souris. La purification de l'EPO peut être mise en oeuvre par une combinaison de techniques connues de purification telles que chromatographie par affinité, filtration sur gel, etc. En vue d'obtenir un anticorps ayant une spécificité élevée, l'EPO est purifiée à un degré aussi élevé que possible. L'EPO purifiée est administréepar voie sous-cutanée à des animaux tels que lapin et vache et on les immunise ainsi pour préparer le premier et le second anticorps. Le troisième anticorps, spécifiquement réactif avec L'immunoglobuline de l'espèce d'animal utiliséepour la préparation du second anticorps, est préparé par immunisation d'un animal autre que l'animal utilisé pour la préparation du second anticorps avec une immunoglobuline purifiée de ce dernier animal. L'anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec l'EPO est préparé de manière connue, par exemple par immunisation d'une souris BALB/C avec uneEPO purifiée, isolement des cellules spléniques de la souris immunisée, fusion des cellules avec des cellules de myélome en utilisant le polyéthylèneglycol et clonage répété des cellules fusionnées dans le milieu HAT. Le premier anticorps tel que prépare ci-dessus est fixé sur un support insoluble. Le support insoluble consiste en un tube de polystyrène, des perles de polystyrène, des fragments de silicone, des microplaques, etc., de préférence un tube de polystyrène ou des perles de polystyrène. La fixation du premier anticorps sur le support insoluble est mise en oeuvre par combi- naison de techniques chimiques ou physiques connues.Par exemple, le procédé physique consiste à dissoudre le premier anticorps dans une solution tampon appropriée, à y ajouter le support insoluble, à laisser reposer le mélange entre OOC et la température ambiante pendant plusieurs heures à une nuit, de préférence à 4-20"C pendant 4-16 h, à laver l'anticorps fixé au support insoluble résultant avec une solution saline physiologique, etc. pour donner L'anticorps fixé au support insoluble désiré (ci-après dénommé simplement "anticorps fixé sur support"). L'anticorps fixé sur support peut être conservé de manière stable pendant au moins un an par addition d'un stabilisant tel que la serum-albumine de boeuf. Le troisième anticorps marqué par une substance de marquage (ci-apres dénommé simplement "anticorps marqué") est préparé de la manière suivante. Le troisième anticorps est un anticorps contre l'immunoglobuline d'une espèce d'animal utilisée pour la préparation du second anticorps spécifiquement réactif avec l'EPO. Par exemple, lorsque le second anticorps est un anticorps monoclonal provenant de la souris, le troisième anticorps est un anticorps contre I'immunoglobuline de souris et,lorsque le second anticorps est un anticorps préparé en utilisant un lapin, le troisième anticorps est un anticorps contre l'immunoglobuline de lapin. Les substances de marquage utilisées dans cette invention comprennent les enzymes, les isotopes, les substances fluorescentes, les substances métalliques, etc.Les substances de marquage préférées sont les enzymes telles que peroxydase, phosphatase alcaline, B-galactosidase, glucoseoxydase, acide glucose-6-phosphorique-déshydrogénase, glucosedéshydrogénase, etc., parmi Lesquelles on préfère en particulier la peroxydase, la glucose-oxydase et l'acide glucose-6-phosphoriquedéshydrogénase. Le marquage du troisième anticorps par les enzymes peut être mis en oeuvre par des techniques connues, par exemple par oxydation de la chaine de sucre de l'enzyme par l'acide periodique et fixation du groupe aldéhyde produit sur le groupe amino du troisième anticorps, ou encore par introduction d'un groupe maléimido dans l'enzyme et ensuite fixation du groupe avec te groupe thiol du troisième anticorps. En utilisant l'anticorps fixé sur un support et L'anticorps marqué préparés ci-dessus, la détermination de l'EPO peut être mise en oeuvre de la manière suivante. Tout d'abord, on fait réagir L'anticorps fixé sur un support avec un échantillon pour essai contenant de l'EPO et le second anticorps spécifiquement réactif avec l'EPO à 0-500C pendant une heure à une nuit, de préference à 15-37"C pendant 2-4 h. L'échantillon d'essai contenant de l'EPO consiste en sérum, plasma sanguin, urine, etc. Le premier anticorps à fixer sur un support insoluble et le second anticorps doivent être préparés en utilisant des espèces d'animaux différentes L'une de l'autre. Si le premier anticorps et le second anticorps sont préparés en utilisant des animaux de la même espèce, le troisième anticorps marqué, contre une immunoglobuline de l'animal précédent, se fixera de manière non specifique indépendamment de la quantité d'EPO présentedans l'échantillon d'essai et il est donc impossible de mesurer la quantité d'EPO. Par la réaction ci-dessus, l'anticorps fixé sur support est lié avec le second anticorps proportionnellement à la quantité d'EPO. On fait réagir avec le produit de reaction résultant le troisième anticorps marqué,à 0-500C pendant une heure à une nuit, de préférence à 15-37"C pendant 2-4 h, le troisième anticorps marqué étant fixé sur le support portant l'anticorps proportionnellement à la quantité d'EPO. Enfin, on mesure la quantité de l'anticorps marque fixé sur le support portant L'anticorps et on calcule la quantité d'EPO contenue dans L'échantillon d'essai à partir de la courbe d'étalonnage qui a été précédemment tracée en utilisant un échantillon standard d'EPO. Lorsque la substance de marquage est une enzyme, on mesure l'activité enzymatique et lorsque la substance de marquage est un isotope, on compte la radioactivité. Selon la présente invention, le titre de L'anticorps est augmenté par le troisième anticorps et par conséquent, il peut être utilisé pour le dosage de L'EPO avec une sensibilité élevée même en quantité aussi faible que 10 à 20 mU/ml (0,1 à 0,3 ng/ml) dans le sang normal auquel les techniques connues ne pouvaient pas être appliquées. Ainsi donc, le procédé selon L'invention est utile pour le dosage de I'érythropoiétine dans les liquides de l'organisme et convient donc pour le diagnostic de diverses maladies du sang telles qu'anémie et érythrocytose, dans lesquelles le niveau d'érythropoiétine est inhabituellement accru ou diminué. Les exemples suivants illustrent L'invention sans toutefois en Limiter la portée. Exemple 1 (a) Préparation de l'anticorps fixé sur un support Préparation de l'anticorps polyclonal : On prépare l'anticorps polyclonal contre l'erythropoSétine en immunisant trois fois un lapin avec une EPO purifiée (provenant d'un patient souffrant d'anémie) de la manière suivante et on traite l'ant;- sérum résultant de la manière habituelle pour préparer l'IgG purifiée. Première immunisation : On dissout 400 pg/ml d'EPO purifiée dans une solution saline tamponnée au phosphate (STP) et on mélange la solution avec La même équiquantité d'adjuvant de Freund pour donner une émulsion. On injecte 1,5 ml de L'émulsion par voie sous-cutanée à un lapin d'environ 2 kg en 10 à 15 points le long de la colonne vertébrale. Seconde immunisation : Deux semaines après la première immunisation, on injecte 1 ml de la même émulsion que ci-dessus en 10 à 15 points de la même manière que dans la première immunisation. Troisième immunisation : Encore deux semaines après, on prépare une émulsion en utilisant une solution à ?00 pg/ml d'un anticorps dans la STP de la même manière que décrit dans la première immunisation et on injecte de manière analogue 1 ml de l'émulsion en 10 points. La veille de la troisième immunisation, on recueille une petite quantité de sang de L'animal et on détermine l'activité anti-EPO du sérum. Une semaine après la troisième immunisation (immunisation finale), on termine la récolte de sang et on soumet le sang recueilli à la séparation du sérum pour donner un sérum anti-EPO. On prépare une IgG anti-EPO à partir du sérum anti-EPO par une technique connue, c'est-à-dire en le soumettant à la précipitation par le sulfate d'ammonium à 50 X et au fractionnement par chromatographie sur DEAE-cellulose, en rejetant les substances non adsorbées sur la DEAE-cellulose. On ajoute ensuite une solution de 20 ml du premier anticorps dans NaHC03 0,1 M à 100 perles de polystyrène de 6,4 mm de diamètre et on laisse reposer le mélange à 4"C pendant 16 h et on le lave par une solution saline physiologique pour donner un anticorps fixé sur des perles de polystyrène. (b) Préparation de l'anti-IaG de souris marqué oar la peroxydase A 5 mg de peroxydase (fabriquée par Toyo Boseki K.K.), on ajoute 0,2 ml de Nais, 0,06 M et on fait réagir le mélange à temperature ambiante pendant 20 min, puis on le dialyse contre un tampon à l'acétate de sodium (pH 4) pendant une nuit. Après la dialyse, on règle le mélange à pH 9,5 et on y ajoute 5 mg d'anticorps de lapin anti-IgG de souris (fabriqué par DAKO CoD et on fait réagir le mélange à la température ambiante pendant 2 h. On réduit le mélange de réaction par Le borohydrure de sodium.On soumet tout le mélange de réaction à la filtration sur gel de Sephadex G-20d'et on recueille les fractions actives pour donner l'anti-IgG de souris marqué par la peroxydase. (c) Dosage de L'EPO On utilise comme second anticorps un anticorps monoclonal de souris anti-EPO (comme décrit dans la première publication de brevet japonais n 155395/1984). On ajoute l'anticorps fixé sur une perle de polystyrène préparé en (a) ci-dessus, 50 pl d'un échantillon d'essai contenant de l'EPO et 200 ul de tampon au phosphate 0,01 M à un tube de polystyrène (12 x 75 mm) et on fait réagir le mélange à 37"C pendant 2 h et on lave avec une solution saline physiologique. On y ajoute 250 u1 de L'anticorps monoclonal anti-EPO dilué 1 000 fois et on fait réagir le mélange à 37 C pendant 2 h, puis on le lave avec une solution saline physiologique. Séparément, on dilue 700 fois l'anti-IgG de souris marque par la peroxydase préparé en (b) ci-dessus dans un tampon au perphosphate à 0,5 % de sérum-albumine de boeuf. On ajoute 250 pl de l'anticorps marqué dilué ainsi obtenu au tube de polystyrène ci-dessus et on fait réagir le mélange à 37 C pendant 2 h puis on le lave avec une solution saline physiologique. On ajoute ensuite 500 p1 d'un tampon au citrate contenant 3 mgiml de o-phénylènediamine et 0,02 % de H202 et on fait reagir le mélange à la température ambiante pendant 1 h. On arrête la réaction par addition de 2 ml de H2SO4 1N. On mesure l'absorbance du mélange de réaction à 492 nm. La courbe d'étalonnage standard d'EPO résultante est représentée dans la figure annexée. On calcule d'après la figure une sensibilité de détection de l'EPO de 10 mU/ml. Exemple 2 (a) Préparation de l'anticorns fixé sur support A 100 perles de polystyrène de 6,4 mm de diamètre, on ajoute 20 ml d'une solution d'un anticorps monoclonal de souris anti EPO (décrit dans la 1ère publication de brevet japonais 155395/1984) dans NaHC03 0,1 M et on laisse reposer le mélange à 4"C pendant 16 h puis on le lave avec une solution saline physiologique pour donner l'anticorps fixé sur perles de polystyrène désiré. (b) PréDaration de L'anti-laG de laDin marqué par la peroxydase On répète l'exemple 1 (b), sauf qu'on utilise un anticorps de mouton anti-IgG de lapin ffabriqué par Cappel Co.) au lieu de L'anti-IgG de souris (fabriqué par DAKO CoD pour préparer l'anti-IgG de lapin marqué par la peroxydase recherché. (c) Dosaae de l'EPo Le second anticorps utilisé est un anticorps de lapin préparé comme à l'exemple 1 (a). On ajoute l'anticorps fixé sur une perle de polystyrène préparé comme en (a) ci-dessus, 50 ul d'un échantillon d'essai contenant de l'EPO et 200 u1 de tampon au phosphate 0,01 M à un tube de polystyrène (12 x 75 mm) et on fait réagir le mélange à 370C pendant 2 h et on le lave avec une solution saline physiologique. On y ajoute 250 ul du second anticorps (dilué 500 fois par un tampon au phosphate 0,01 M) et on fait réagir le mélange à 370C pendant 2 h puis on le lave avec une solution saline physiologique. On dilue 500 fois L'anti-IgG de lapin marqué par la peroxydase préparé.en (b) ci-dessus avec un tampon au perphosphate à 0,5 % de sérum-albumine de boeuf. On ajoute 250 ul de l'anticorps marqué dilué ainsi obtenu au tube de polystyrène ci-dessus et on fait réagir le mélange à 370C pendant 2 h puis on le lave avec une solution saline physiologique. On ajoute ensuite 500 ul de tampon au citrate contenant 3 mg/ml de o-phénylénediamine et 0,02 % de H202 et on fait réagir le mélange à la température ambiante pendant 1 h. On arrête la réaction par addition de 2 ml de H2S04 IN. On mesure l'absorbance du mélange de réaction à 492 nm. On peut deceler l'EPO par cette technique à la teneur de 25 mU/ml. Exemole 3 (a) Préparation d'anti-IaG de souris maraué par la qlucoseoxvdase A 10 mg de glucose-oxydase (fabriquée par Toyo Boseki K.K.),on ajoute par portions 2 mg de N-C4-succinimidoxycarbonyl- cyclohexyl)-maléimide à un intervalle de 5 min et on soumet le mélange de réaction à une filtration sur gel en utilisant du "Sephadex G-25" (marque déposée) et on recueille puis on concentre les fractions d'enzyme. On y ajoute 10 mg d'une fraction d'IgG obtenue par réduction d'anticorps de lapin anti-IgG de souris fabriqué par DAKO Co.) et on fait réagir le mélange à 4"C pendant une nuit. On soumet le mélange de reaction à la filtration sur gel de "Sephadex G-200" (marque déposée) et on recueille les fractions actives pour donner L'anti-IgG de souris marqué par la glucoseoxydase. (b) Dosaqe de 1'EPO On ajoute l'anticorps fixé sur une perle de polystyrène préparé à l'exemple 1 (a), 50 ul d'un échantillon d'essai contenant de l'EPO et 200 u1 de tampon au phosphate 0,01 M à un tube de polystyrène (12 x 75 mm) et on fait réagir le mélange à 37"C pendant 2 h et on le lave avec une solution saline physiologique. On y ajoute comme second anticorps 250 pl d'un anticorps monoclonal anti-EPO (décrit dans la première publication de brevet japonais 155395/1984) dilué 1 000 fois dans un tampon au phosphate 0,01 M et on fait reagir le mélange à 37"C pendant 2 h et ensuite on le lave avec une solution saline physiologique. Séparément, on dilue 400 fois l'anti-IgG de souris marqué par la glucose-oxydase préparé en (a) ci-dessus avec un tampon au perphosphate à 0,5 X de sérum- albumine de boeuf. On ajoute 250 ul de l'anticorps marqué dilué ainsi obtenu au tube de polystyrène ci-dessus et on fait réagir le mélange à 370C pendant 2 h et ensuite on le lave avec une solution saline physiologique.Séparément, on y ajoute 250 ul d'un substrat contenant 0,1 % d'acide p-hydroxyphenylacétique, 0,002 X de peroxydase et 2 % de glucose et on fait réagir le mélange à 30"C pendant 1 h. On arrête la réaction par addition d'un tampon glycine NaOH. On mesure la fluorescence du mélange de réaction à une longueur d'onde d'excitation de 320 nm et à une longueur d'onde de fluorescence de 450 nm. Selon ce procédé, on peut déceler l'EPO à 120 mU/ml. Exemple 4 (a) Préparation d'anti-1G de souris maraué Dar l'acide slucose-6-ohosDhoriaue-déshvdrosénase (G6PDH) A 5 mg de G6PDH (fabriquée par Toyo Boseki K.K.), on ajoute 2 mg de N-(4-succinimidoxycarbonyl-cyclohexyl)-maléimide et on fait réagir le mélange à 30"C pendant 1 h. On soumet le mélange de réaction à La filtration sur gel de "Sephadex G-25" (marque déposée) et on recueille puis on concentre les fractions d'enzyme. On y ajoute 5 mg d'unelgG préparéepar réduction d'un anticorps de lapin anti-IgG de souris (fabriqué par DAKO Co.) et on fait réagir le mélange à 4"C pendant une nuit.On soumet le mélange de réaction à la filtration sur gel d"'Ultrogel AcA44" (marque déposée, fabriqué par LKB, Stockholm, Suède) et on recueille les fractions actives pour donner l'anti-IgG de souris marqué par la G6PDH. (b) Dosage de L'EPO On ajoute 50 u1 du premier anticorps préparé à l'exemple 1 (a) dans des godets d'une microplaque de polystyrène (fabriquée par Coaster Corp.) et on fait réagir le mélange à 40C pendant une nuit on le lave avec une solution saline physiologique. On ajoute à chaque godet 50 ul d'un échantillon d'essai contenant de L'EPO et on fait réagir le mélange à 37"C pendant 2 h et ensuite on le lave avec une solution saline physiologique. On utilise comme second anticorps un anticorps monoclonal de souris anti-EPO (décrit dans la première publication de brevet japonais 155395/1984) et on le dilue 1 000 fois avec un tampon au phosphate 0,01 M. On ajoute 50 ul de L'anticorps dilué dans les godets ci-dessus et on fait réagir le mélange à 37"C pendant 2 h et on le lave avec une solution saline physiologique. Séparément, on dilue 750 fois l'anti-IgG de souris marqué par la G6PDH préparé en (a) ci-dessus avec un tampon au phosphate contenant 0,5 X de sérum-albumine de boeuf.On ajoute 50 u1 de l'anticorps marqué dilué ainsi obtenu dans Les godets et on fait réagir le mélange à 37"C pendant 2 h et ensuite on le lave avec une solution saline physiologique. Ensuite, on ajoute dans chaque godet 200 ul d'un substrat contenant 30 mM d'acide glucose-6-phosphorique et 2 mM de nicotinamide-adenine-dinucléotide (NAD) et on fait réagir le mélange à 370C pendant 30 min. On ajoute le mélange de réaction à un substrat pour analyse spectrale qui contient de la Luciférase (fabriquée par Toyo Boseki K.K.), de la NAD réduit-flavinemononucléotide (NADH-FMN) oxyde-réductase (fabriqué par Toyo Boseki K.K.), du flavine-mononucléotide (FMN) et du décanal et on mesure le NAD réduit (NADH) par l'émission de luminescence au moyen d'un appareil de mesure TD-4000 (fabriqué par Laboneience Co.). En conséquence, on peut doser l'EPO à une teneur de 5 mU/ml. Il est entendu que L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le dosage immunologique de l'érythropoiétine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un premier anticorps, spécifiquement réactif avec l'érythropoiétine, qui est fixé sur un support insoluble, avec un échantillon pour essai contenant de I'érythropoiétine et un second anticorps,qui est spécifiquement réactif avec l'érythropoiétine et qui est préparé par immunisation d'un animal d'une espèce différente de L'animal utilisé pour la préparation du premier anticorps ; à faire réagir avec une quantité déterminée d'un troisième anticorps marqué, qui est spécifiquement réactif avec L'immunoglobuline de l'animal de l'espèce utilisée pour la préparation du second anticorps ; et à déterminer ensuite la quantité de l'anticorps marqué fixé au support insoluble portant l'anticorps ou la quantité d'anticorps marqué non fixé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support insoluble est choisi parmi un tube de polystyrène, des perles de polystyrène, des fragments de silicone et des microplaques. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que le troisième anticorps marqué est marqué par une substance choisie parmi les enzymes, les isotopes, les substances fluorescentes et les substances métalliques. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la substance de marquage est choisie parmi la peroxydase, la phosphatase alcaline, la ss-galactosidase, la glucose-oxydase, l'acide glucose-6-phosphorique-déshydrogénase et la glucose-déshydrogénase.