Brevet FR2596988A1 — publié le 19871016

Procédé de préparation de lipides riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne La présente invention a trait à un procédé de préparation de lipides riches en acides gras polyinsaturés à chaîne longue et particulièrement en acides arachidonique C 20:4 n-6 (ARA), di-homo-gammalinolénique C 20:3 n-6 (DHL) et docosahexaénoique C 22:6 n-3 (DHA). Les acides gras polyinsaturés à chaine longue et, notamment, les acides ARA, DHL ET DHA sous forme libre ou conjuguée, constituent des compléments nutritifs particulièrement intéressants pour des préparations diététiques administrées par voie orale ou par sonde. En effet, ces nutriments trouvent des applications dans les traitements de carences en acides gras essentiels liés à certains phénomènes pathologiques tels que notamment des troubles métaboliques situés principalement au niveau des 15 désaturases (enzymes limitantes de la biosynthèse des acides gras essentiels à partir de l'acide linoléique), de tels troubles étant observés, notamment, chez des enfants prématurés,chez des personnes âgées et chez les sujets soumis de façon prolongée à une alimentation artificielle ou 5 encore chez les enfants atteints de mucoviscidose. Les sources généralement utilisées pour obtenir des préparations riches en de tels lipides, par exemple le foie de porc, sont relativement onéreuses. C'est pourquoi on a déjà proposé de préparer 10 des extraits riches en acide arachidonique à partir du placenta. Ainsi la demande de brevet français 2 553 261 déposée le 14.10.1983 décrit un lait artificiel pour l'alimentation de nouveaux-nés, caractérisé en ce qu'il contient au moins les phospholipides d'un extrait lipidique de placenta, de 15 telle sorte que la teneur en acide arachidonique soit de l'ordre de 1 %. Ce document ne précise cependant pas de quelle partie placentaire les lipides se trouvent extraits. Le demande de brevet européen 0 082 818, déposée le 15 décembre 1982, décrit un procédé pour l'obtention de 20 lipides d'origine humaine et du lacto-N-norhexaosyl céramide obtenus à partir du placenta, convenablement broyé. L'extraction est effectuée au chloroforme-méthanol. Un tel procédé présente cependant l'inconvénient de ne pas permettre l'extraction simultanée 25 des protéines du sang placentaire telles que les immunoglobulines, l'albumine, l'hémoglobine ou la globine. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de préparation d'acides polyinsaturés à chaîne longue et notamment d'acides 30 ARA, DHL et DHA, en particulier d'origine humaine, à concentration élevée et à un prix de revient abaissé. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé permettant la préparation simultanée des autres produits de haute valeur ajoutée présents dans le 35 placenta et notamment les IgG, l'albumine, l'hémoglobine, la globine et les protéines du sang placentaire en général. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un procédé de préparation permettant de réaliser des fractions ayant une teneur particulièrement élevée en acide arachidonique, y compris sous forme libre ou ester éthylique. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'extraits placentaires riches en acides gras polyinsaturés à chaîne longue, notamment en acides ARA, DHL et DHA, caractérisé en ce que l'on sépare le sang d'origine 10 placentaire d'avec le tissu placentaire et que l'on extrait au moins une fraction lipidique de ce sang. De façon particulièrement avantageuse, on peut procéder à l'extraction, non pas du liquide sanguin obtenu directement après séparation d'avec le tissu placen15 taire, mais de fractions résultant d'opérations de séparation de constituants, notamment protéiques, du sang - placentaire. On peut ainsi, grâce à l'invention, obtenir des quantités notables en acides gras désirés et, notamment, en acides ARA, DHA et DHL, tout en séparant et purifiant les 20 constituants intéressants du sang et, notamment, l'albumine, les gammaglobulines, l'hémoglobine et la globine. Dans un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, on prépare une fraction riche en globulines par un procédé de fractionnement alcoolique, du type méthode 25 de Cohn ou de Taylor, de façon à former un précipité contenant les globulines. Le précipité est remis en suspension et la fraction restant insoluble est recueillie, par exemple par centrifugation, le surnageant étant traité de façon usuelle pour la préparation des globulines. On procède ensuite à l'extraction de la fraction lipidique du culot de centrifugation. Il est ainsi possible d'obtenir une quantité notable d'acides ARA, DHL et DHA. Dans un second mode de mise en oeuvre de 35 l'invention, qui peut d'ailleurs être cumulé avec le premier, le surnageant de l'étape initiale d'un procédé de précipitation alcoolique, qui contient l'albumine ainsi que l'hémoglobine, est soumis à une précipitation, par exemple au chloroforme, permettant de précipiter l'hémoglobine placentaire. On procède ensuite à l'extraction de la fraction lipidique à partir de ce précipité contenant l'hémoglobine placentaire et l'on obtient egalement une quantité notable d'acides ARA, DHL et DHA. Dans un troisième mode de mise en oeuvre, qui 10 permet de récupérer sous forme non dénaturée l'albumine, l'hémoglobine et, si on le désire, les gamma-globulines, on soumet le liquide sanguin à une étape de clarification préalable, de préférence à pH acide, permettant d'obtenir un précipité, le surnageant pouvant ensuite être soumis à une 15 chromatographie sur support chromatographique échangeur d'anions permettant de séparer l'albumine et le mélange immunoglobulines-hémoglobine sous forme non dénaturée. Le précipité provenant de l'étape de clarification est alors soumis à une étape d'extraction lipidique 20 permettant d'obtenir un extrait riche en acides ARA, DHL et DHA. L'extraction de la fraction lipidique riche en acides gras polyinsaturés à longue chaîne peut avantageusement être effectuée par les moyens classiques déjà 25 décrits: extraction par solvants à l'état liquide (mélanges hexane-isopropanol ou chloroformeméthanol) ou à l'état supercritique (dioxyde de carbone). L'invention a également pour objet les fractions riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne, 30 obtenues par le procédé selon l'invention. Ces extraits se caractérisent notamment par une teneur très élevée en acide arachidonique pourant facilement être supérieure à 25 % de la masse des acidet gras présents; par une teneur en acide DHL pouvant être 35 comprise entre 2 et 12 % de la masse des acides gras présents; par une teneur en acide DHA pouvant tre comprise entre 1 et 6 % de la masse des acides gras présents. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante faite à titre non limitatif. Exemple 1. Quinze tonnes de placenta congelé sont broyées et décongelées à 10'C dans un volume de 10 m3 de solution contenant 6 g/l de chlorure de sodium à 8 % d'alcool éthylique. Après élimination des tissus par pres10 sage, le bloc de globulines est précipité en 24 heures d'après la méthode de Taylor à pH neutre et à -5'C par addition d'alcool jusqu'à un taux de 25 % environ. L'albumine reste dans le surnageant. Le précipité de globulines est recueilli par 15 centrifugation et il est ensuite dispersé à pH 4,8 dans environ 10 000 litres d'une solution contenant 4 g/l de chlorure de sodium, à une température de 2'C. La fraction insoluble forme une suspension d'environ 1.200 litres, appelée ci-après précipité B1, et 20 recueillie par centrifugation et le surnageant qui contient les gamma-globulines est soumis à un fractionnement ultérieur permettant la préparation des gamma-globulines. Le précipité B1 est soumis à une extraction par 18 volumes du mélange hexane-isopropanol (3:2). La phase 25 supérieure est lavée par une solution aqueuse de sulfate de sodium. On obtient ainsi une fraction lipidique particulièrement riche en acides gras polyinsaturés à chaîne longue et notamment en acides ARA, DHL et DHA. La composition de cette fraction lipidique est précisée dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1: Composition en principaux acides gras des fractions lipidiques du précipité B1. !- - - - - - - - - -- - - - - - - - - - ---------------------! Nature de l'aci- Phospholipides: Acides gras: Esters de ga de gras. libres éthyliques! :0 0,2: 0,3: 0,5 16:0 34,0 32,3 8,7 16:1: 3,0: 3,7 18:0: 15,6 13,6 4,0 ;18:1 n-9 12,0: 20,0 15,8 18:2 n-6 8,5 10,3 15,2 :2 n-6 0,5: 0,6: 1,0 :3 n-6: 3,8 2,7 8,0 :4 n-6 13,6: 10,9: 33,6 ! 22:4 n-6: 1,3 0,9 1,5 22:5 n-6 0,7: 0,9: 0,7 22:5 n-3: 1,5 0,4 0,9 22:6 n-3 3,8: 3,5: 2,0 I 20 Légende des produits soulignés :3 n-6 Acide di homo gamma linoléique :4 n6 Acide arachidoniaue 22:6 n-3 Acide docosa hexaénoique On peut ainsi obtenir environ 130 grammes d'acide arachidonique par tonne de placenta, cet acide arachidonique (20:4 n-6) se trouvant disponible dans les fractions lipidiques majeures, à savoir les phospholipides, les acides gras libres et, en quantité particulièrement impor30 tante, sous forme d'ester éthylique, ce qui est particulièrement surprenant puisque l'acide arachidonique, qui se trouve en position 2 dans les phospholipides, ne parait pas pouvoir être hydrolysé en l'absence d'un traitement enzymatique approprié. Exemple 2. Le surnageant de la précipitation de Taylor :: - i g. - 8- 0' ú-u' 9:7 i ": *'Q ú-u :EE i 9 ZZi I'i 9 1':U 9-U s: jT _9U: Z i I L'881 9-U Z: r 9' 9 'ti9 U OC 9-U 7':07 t 1'8T: 9oi9-U 7:91 i9'LT 6-u 1:81 i :9: t 1'S 'E'1: 9- ':O1 t 8'T 1'91t ap alnq1eN i -tldGU TqI9'BOWq:9TdTld: S-:nTpd SUOT9D Sp s0 sGpTD-P xnrdTDUtlTd U;G UOT4TSOdWIOD Z nr;Dlqrl5 snossap-T;: z n1eaoqP al ans qleleddr nuaqqo -Tui4xa,- 1 3p lfiSp s ea -CPDL ua ll',TqTsodmo.- 7e wnipos O ap Gqp;lrns ap agneanb-e uoTznlos aun ared agA.ul qsa aana) laadns sssqd ea(7z: C) JOUPdO-TdoC -T-;DuPX;tl z)fmL-am np ú;auin-roA 82 L ad uoTqDvj4xp eun -P STuWnO!z qse DqdTnaid aD t -' eTTUquoed 4Ueup4UOD aqTdTO9ld ap inoC apd sauuoq t7 aadtDas ep iud S6 aiAlTj Ins -PTdL sunos UOTuPl;IT un iDTnsup ú nbDT;a uo -OZ UOsTAU apI ainqpaladmz 9un ú Ilb 1a5 >;DwIO}oIoIlD ne uoTqp4TIdDaid aun e STwos qsa 'alTUUaD'e'd UTinfuEs aIpTnbT np 0u'rqol ouia;lq ? aUTnQlp, q ua ou ua UTUOTD Tnb I aldwaxaI ap L 88696SZ sqF Sp; 6 sapTo:sb uOT;pTdydoqS:U OgafaTIdl ino tEd suuoei dnD p;u44nuaN; ro.Tm -eladua aunOBOB /B T7' T awod04 np uOnTPTdTI 1 suIusans siur'nossaPT EaruI ntIqwP apTIb np auiqedde0uIa1o a au-1.nqiToi umwcu[qiog uuuooUz tb' aîTdwTx.d ap 88696SZ On voit là également que l'on obtient une quantité particulièrement importante d'acide arachidonique, notamment dans la fraction des acides gras libres. On peut ainsi extraire de 90 à 98 grammes d'acide arachidonique par tonne de placenta. Exemple 3. Le liquide sanguin séparé du tissu placentaire par presssage comme dans l'exemple 1 est d'abord soumis à une étape de clarification dans laquelle le liquide 10 sanguin est additionné d'acide acétique ou chlorhydrique N, indifféremment, pour ajuster le pH à 5,10 sous agitation à 0'C. Après deux heures d'attente, la suspension est injectée à 300 1/heure sur centrifugeuse. On obtient ainsi un précipité de l'ordre de 7 à 10 kg pour 150 kg de placenta 15 humain. Le surnageant est ensuite traité pour la séparation de l'albumine ou de l'hémoglobine native comme décrit dans le brevet français n' 83-11323 du 7 juillet 1983. Le précipité provenant de l'étape de clarification, intitulé "nouveau précipité Bi", est soumis à une 20 extraction par 18 volumes du mélange hexane-isopropanol 3:2). La phase supérieure est lavée par une solution aqueuse de sulfate de sodium. La composition en acide gras des principales fractions lipidiques de l'extrait est représentée dans le 25 tableau 3 ci-dessous. Tableau 3: Composition en principaux acides gras des fractions lipidiques du nouveau précipité B1. 30 INature de l'aci- PhosphOlipides: Acides gras: Esters !de gras: libres : éthyliques !---------------- ---------------:-------------------------15:0 0,2 0,7 0, 2 16:0 20,4 5,1 31,8 16:1 4,0 1,5 !18:0 15,0: 11,8: 2,0 18:1 n-9 12,4 17,8 8,4 18:2 n-6 10,2: 17,7: 12,5 :2 n-6 0,3 0,2 0,3 :3 n6 3,6: 3,4 11,4 t 20:4 n-6 15,7 11,7 52,5 22:4 n-6 1,6: 1,4: 1,5 22:5 n-6 1,0 1,5 0,5 22:5 n-3 0,7: 0,4: 0,8 22:6 n-3 2,8 1,3 1,4 On remarque que la fraction ester éthylique est plus riche en acide 20:3 n-6 et 20:4 n-6 que la fraction décrite dans l'exemple 1 et correspondant au précipité B1. On peut ainsi, à partir du "nouveau précipité 20 Bi", obtenir 160 grammes environ d'acide arachidonique par tonne de placenta mise en oeuvre. En résumé, l'invention montre qu'il est possible de produire des quantités importantes de lipides placentaires et notamment de lipides polyinsaturés à chaîne 25 longue (ARA, DHL et DHA) en particulier de 160 à 220 grammes d'acide arachidonique par tonne de placenta, et ceci en permettant simultanément d'obtenir les fractions protéiques, notamment les globulines, l'albumine, l'hémoglobine et la globine, sans perte quantitative ni qualitative au niveau de 30 ces fractions. REVENDICATIONS. 1. Procédé de préparation d'extraits placentaires riches en acides gras polyinsaturés à chaîne longue, notamment en acides ARA, DHL et DHA, caractérisé en ce que 5 l'on sépare le sang d'origine placentaire d'avec le tissu placentaire et que l'on extrait au moins une fraction lipidique de ce sang placentaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait une fraction lipidique à 10 partir d' au moins une fraction résultant d'opérations de séparation d'autres constituants, notamment protéiques, du sang placentaire. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on prépare une fraction riche en 15 globuline par un procédé de fractionnement alcoolique formant un précipité en suspension et que l'on recueille la fraction restant insoluble, après quoi on procède à l'extraction des lipides de ladite fraction. 4. Procédé selon l'une quelconque des reven20 dications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on prépare une fraction riche en albumine et hémoglobine par un procédé de fractionnement alcoolique et que l'on procède à une précipitation de l'hémoglobine, après quoi on procède à l'extraction de la fraction lipidique du précipité contenant 25 l'hémoglobine placentaire. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le surnageant contenant l'albumine et l'hémoglobine est soumis à une précipitation au chloroforme. 6. Procédé selon la revendication 2, 30 caractérisé en ce que l'on soumet le liquide sanguin à une étape de clarification permettant d'obtenir un précipité et que l'on soumet ledit précipité à une étape d'extraction lipidique. 7. Procédé selon la revendication 6, 35 caractérisé en ce que l'étape de clarification est effectuée à pH acide. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on effectue l'extraction de la fraction lipidique par un mélange de solvants dans l'état liquide et/ou supercritique. 9. Fraction lipidique d'origine placentaire, riche en acides polyinsaturés à chaine longue, notamment en acides ARA, DHL et DHA, préparée par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Fraction selon la revendication 9, 10 caractérisée par une teneur en acide arachidonique supérieure à 25 % de la masse des acides gras totaux. i1. Fraction selon la revendication 9, caractérisée par une teneur en acide di-homo-gammalinolénique comprise entre 2 et 12 % de la masse des acides 15 gras totaux. 12. Fraction selon la revendication 9, caractérisée par une teneur en acide docosa hexaénoique comprise entre 1 et 6 % de la masse des acides gras totaux.