Brevet FR2594955A1 — publié le 19870828

AGENT DE DIAGNOSTIC, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SA METHODE D'EMPLOI La présente invention a pour objet un agent de diagnostic nouveau permettant de déterminer la présence de leucocytes dans les urines, que ces leucocytes soient consécutifs à une infection urinaire ou à une infection génitale. Elle a également pour objet un procédé de préparation dudit agent de diagnostic et une méthode faisant emploi dudit agent de détermination de la présence de leucocytes dans les urines. Diverses méthodes de détermination des leucocytes présents dans des liquides physiologiques et notamment dans l'urine sont connus. Ainsi, on connait du brevet britannique n0 1 128 371 un agent de détermination de la présence d'enzymes hydrolytiques dans des liquides physiologiques et un procédé pour sa préparation consistant à imprégner un support spongieux par des esters d'indoxyle ou de thio-indoxyle incolores, notamment d'un acétate, et éventuellement d'un tampon ou d'un oxydant. En présence d'enzymes hydrolytiques, les esters forment des groupes indoxyle ou thio-indoxyle libres et sous l'action de l'oxygène de l'air, ceux-ci conduisent à la formation d'une coloration foncée. Les composés revendiqués dans ce brevet antérieur ne semblent pas utilisa- bles pour un dosage de leucocytes et ne donnent lieu à aucune réaction même avec 10 000 leucocytes/pl (cf. brevt européen 012 957). D'autre part, on connaît du brevet européen 012 957 des agents de diagnostic, stables et donnant lieu à une indication rapide, permettant de mettre en évidence la présence de leucocytes dans des liquides physiologiques; ces agents de diagnostic contenant un support absorbant, une couche de film, un mélange pulvérulent, un lyophilisat, une subs- tance tampon et une solution ou un comprimé renfermant un ou plusieurs agents chromogénes, ces agents consistant en des esters d'indoxyle et/ou de thio-indoxyles avec des amino-acides et/ou des peptides dont l'atome d'azote est protégé par un groupe protecteur. En fait, ces substrats permettent de mettre en évidence des estérases (protéases) présentes dans les granulocytes neutrophiles, ainsi que des enzymes protéolytiques comme par exemple l'Alastase, la chymotrypsine, la trypsine dans des solutions aqueuses ou des liquides physiologiques tel plasma, sérum, liquide céphalorachidien, etc. A titre de support absorbant, est employé de préférence du papier-filtre, de la cellulose ou des toisons de fibres synthétiques, que l'on imprègne de solutions des réactifs nécessaires. En fait, l'imprégnation se fait en deux étapes successives, ce qui constitue des opérations complexes, mais encore la préparation du substrat necessite necessite un grand nombre de constituants. On connaît en outre l'article de G.G. GUILBAULT publié par la revue Analytical Letters 1(6), 365-379 (1968) ayant pour titre "Nméthylindoxylesters as substrates for cholinesterase". Cet article se réfère à un article d'ETTINGER et FRIEDLANDER dans Ber. 45, 2074 (1912) et à un article de HOLT dans Nature 169, 271 (1952) selon lequel l'acétate de N-méthylindoxyle constituerait un substrat fluorogéne idéal. Dans l'article de GUILBAULT précité, est décrit l'emploi d'acétate, butyrate ou propionate de N-méthylindoxyle pour déterminer la présence de cholinestérase ou de pseudo-cholinestérase (cholinestérase de sérum de cheval ou érythrocytes bovins), cette détermination étant effectuée par mesure de la fluorescence, obtenue après hydrolyse par la cholinestérase du N-méthylindoxyle, dans un spectrofluorométre. En fait, la méthode de détermination décrite dans cet article de GUILBAULT nécessite l'emploi d'un appareillage relativement compliqué. De plus, on opère sur des solutions d'esters de N-mrthylindoxyle qui présentent l'inconvénient d'être fortement instables du fait des taux élevés d'hydrolyse spontanée qu'elles présentent et de leur instabilité en solution. Par ailleurs, cet article de GUILBAULT ne mentionne en aucune facon l'emploi d'esters de Nméthylindoxyle pour la détermination de la présence de leucocytes dans des urines. La présente invention a pour objet un agent de diagnostic permet- tant de déterminer la présence de leucocytes dans les urines, cet agent étant stable, permettant l'obtention d'un diagnostic rapide, et diffé- rant totalement des agents de diagnostic connus. Elle se rapporte en outre à un procédé de préparation dudit agent de diagnostic et à une méthode de diagnostic faisant emploi dudit agent. L'agent de diagnostic nouveau selon la présente invention est formé de billes de matière plastique transparente ou translucide sur laquelle est fixé comme substrat le dérivé chimique consistant en ester de Nméthylindoxyle obtenu à partir d'acide comportant 1 à 5 atomes de carbone. De préférence, l'agent de diagnostic précité est formé d'une seule bille contenue dans un tube ou une éprouvette transparent dont le diamètre est légèrement supérieur au diamètre de la bille. Selon une forme d'exécution dudit agent, la matière plastique est formée de polystyrène. De préférence, lesdites billes ont en général un diamètre compris entre 5 et 15 mm et de préférence compris entre 6 et 10 mm. De préférence, ledit substrat de l'enzyme consiste en acétate de Nmethylindoxyle. La présente invention a encore pour objet un procédé de prépara- tion dudit agent de diagnostic qui consiste a immerger, à l'abri de la lumière, des billes de polystyrène du commerce dans une solution d'un solvant compatible, ne solubilisant pas le polystyrène, et d'ester de Nméthylindoxyle obtenu à partir d'un acide comportant 1 à 5 atomes de carbone, puis, après immersion, a sécher les billes ainsi traitées dans un courant froid d'un gaz inerte vis-à-vis dudit agent. Selon une forme de réalisation dudit procédé, le solvant est formé d'alcool éthylique et il contient une proportion desdits esters comprise entre 8 mg/ml d'alcool éthylique à 95% et la teneur à saturation dans cet alcool, et de préférence comprise entre 20 et 45 mg/ml d'alcool éthylique à 95%. De préférence, ledits ester est un acétate. Selon une autre forme de réalisation, les billes ont un diamètre compris entre 5 et 15 mm, et de préférence de l'ordre de 6-à 10 mm. Lors de l'imbibition, le rapport volumique bille/solution précitée est compris entre 1/6 et 1/20 et de préférence entre 1/8 et 1/12. De préférence, ledit agent de diagnostic, formé d'une seule bille ainsi traitée, est introduit dans un tube ou éprouvette dont le diamètre est légèrement supérieur à celui de la bille, un agent tampon à base de phosphate pouvant éventuellement également être ajouté initialement dans le dit tube. La présente invention a encore pour objet un test de détermination de la présence des leucocytes dans les urines, consistant à verser dans ledit tube contenant la bille formant l'agent de diagnostic une faible quantité d'urine, l'éventuelle coloration verdâtre obtenue après repos étant caractéristique de la presence de leucocytes. En fait, le caractère transparent et translucide des billes aide à obtenir un effet de renforcement de la couleur; en effet, l'observateur en regardant la bille voit simultanément la partie de la bille qui lui fait directement face et la partie de la bille se trouvant de l'autre côté, ce qui renforce l'effet de coloration et donc la lisibilité du test de détermination effectué. Il semble que l'addition d'un agent tampon à base de phosphate dans le tube permette d'accélérer le temps de réponse du test. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLE 1 On prépare des billes de 6,4 mm de diamètre par trempe dans une solution formée de 750 mg d'acétate de N-méthylindoxyle/20 ml d'alcool éthylique à 95%, le rapport du volume bille/solution = 1/10. On laisse l'inhibition se poursuivre à l'abri de la lumière pendant 30 minutes puis, après séparation des billes, on les sèche dans un courant d'air froid. On plonge une de ces billes dans un tube ou éprouvette dans lequel on verse un volume de 250 p1 d'urine pour couvrir la bille, le diamètre du tube ou éprouvette employé étant de + 9 mm. Après une demi-heure, on obtient une coloration verte, caractéris- tique de la présence d'enzymes leucocytaires dont la présence est recherchée dans les urines infectées. - Un test témoin éventuel effectué sur bille identique traitée sur une urine ayant été chauffée pendant 2 minutes par un bain d'eau bouil- lante pour détruire toute activité enzymatique, montre qu'aucun change- ment de coloration ne se produit. EXEMPLE 2 On prépare des billes de 8,0 mm de diamètre par trempe dans une solution formée de 450 mg d'acétate de N-méthylindoxyle/20 ml d'alcool éthylique à 95%, le rapport du volume bille/solution = 1/7. On laisse l'inhibition se poursuivre à l'abri de la lumière pendant 30 minutes puis, après séparation des billes, on les sèche dans un courant d'air froid. On plonge une de ces billes dans un tube ou éprouvette dans lequel on verse un volume de 350 pl d'urine pour couvrir la bille, le diamètre du tube ou éprouvette employé étant de + 11 mm. Apres une demi-heure, on obtient une coloration verte, caractéris- tique de la présence d'enzymes leucocytaires dont la présence est recherchée dans les urines infectées. Un test témoin éventuel effectué sur bille identique traitée sur une urine ayant été chauffée pendant 2 minutes par un bain d'eau bouillante pour détruire toute activité enzymatique, montre qu'aucun changement de coloration ne se produit. EXEMPLE 3 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 précité à la différence cependant, qu'en même temps que l'urine infectée, sont versés dans le tube ou éprouvette contenant la bille également 20 ml d'une solution 0,2pM d'un tampon phosphate de pH = 7,5. On constate que le temps pour l'obtention de la couleur obtenue dans l'exemple 1 est ramené à 20 minutes. EXEMPLE 4 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 précité à la différence cependant, qu'en même temps que l'urine infectée, sont versés dans le tube ou éprouvette contenant la bille également 25 ml d'une solution 0,2pM d'un tampon phosphate de pH = 7. On constate que le temps pour l'obtention de la couleur obtenue dans l'exemple 1 est ramené à 21 minutes. EXEMPLE 5 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 précité à la différence cependant, que l'acétate de N-méthyl indoxyle est remplacé par le propylate de N-méthyl indoxyle. On constate que le temps pour l'obtention de la couleur est de l'ordre de celui de cet exemple 1. EXEMPLE 6 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3 précité à la différence cependant, que l'acétate de N-méthyl indoxyle est remplacé par le propylate de N-méthyl indoxyle. On constate que le temps pour l'obtention de la couleur est de l'ordre de celui de cet exemple 3. R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- A titre de produit nouveau, un agent de diagnostic caractérisé en ce qu'il est formé de billes de matière plastique transparente ou translucide sur lesquelles est fixé comme substrat le dérivé chimique consistant en ester de N-méthylindoxyle obtenu à partir d'acide organique comportant 1 a 5 atomes de carbone. 2. - Produit nouveau selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière plastique est formée de polystyrène. 3. - Produit nouveau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites billes ont en général un diamètre compris entre 5 et mm et de préférence compris entre 6 et 10 mm. 4. - Produit nouveau selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit substrat de l'enzyme consiste en acétate de N-méthylindoxyle. 5. - Produit nouveau selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de diagnostic précité est formé d'une seule bille contenue dans un tube ou une éprouvette transparent dont le diamètre est légèrement supérieur au diamètre de la bille. 6. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à immerger, à l'abri de la lumière, des billes de polystyrène du commerce dans une solution d'un solvant compatible, ne solubilisant pas le polystyrène, et d'ester de N-méthylindoxyle obtenu à partir d'un acide organique comportant 1 à 5 atomes de carbone, puis, après immersion, à sécher les billes ainsi traitées dans un courant froid d'un gaz inerte vis-à-vis dudit agent. 7. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant est formé d'alcool éthylique et en ce qu'il contient une proportion dudit ester comprise entre 8 mg/ml d'alcool éthylique à 95% et la teneur à saturation dans cet alcool, et de préférence comprise entre 20 et 45 mg/ml d'alcool éthylique à 95%. 8. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon la revendication 6 ou 7, lesdits esters étant des acétates. 9. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que les billes ont un diamètre compris entre 5 et 15 mm, et de préférence de l'ordre de 6 à 10 mm. 10. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que lors de l'imbibition, le rapport volumique bille/solution précitée est compris entre 1/6 et 1/20 et de préférence entre 1/8 et 1/12. 11. - Procédé de préparation de l'agent de diagnostic selon une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que ledit agent de diagnostic, formé d'une seule bille ainsi traitée, est introduit dans un tube ou éprouvette dont le diamètre est légèrement supérieur à celui de la bille, un agent tampon à base de phosphate pouvant éventuellement également être ajouté initialement dans le dit tube. 12. - Méthode de détermination de la présence des leucocytes dans les urines, à l'aide de l'agent de diagnostic selon une quelconque des revendications 1 à 6 précitées, consistant à verser dans ledit tube contenant la bille formant l'agent de diagnostic une faible quantité d'urine, l'éventuelle coloration verdâtre obtenue après repos étant caractéristique de la présence de leucocytes.