Brevet FR2595714A1 — publié le 19870918

Deux gènes codant pour les formes a et 3 de l'interleukine-l humaine ont été décrits par les spécialistes cf. par exemple March et coll., Nature 315, 641-647 (1985). La demande de brevet européen publiée sous le 5 numéro 200.986 du 12 novembre 1986, inventeurs Gubler et coll. décrit le clonage et l'expression de l'interleukine-l humaine recombinante, c'est-à-dire l'interleukine-l humaine qui est produite par voie microbienne. Le procédé de purification qui y est décrit reconnaît 10 qu'il existait un problème de par l'insolubilité de cette protéine dans les cellules hôtes bactériennes. On pense que ce problème d'insolubilité est dû à la production de ri\, eaux élevés de protéines dans un environnement qui apparemment n'est pas favorable à un repliement convenable des protéines. Les problèmes de repliement des protéinesse manifestent dans la formation d'inclusions dans les bactéries. Ces corps d'inclusion ne peuvent être dissous que dans des agents fortement dénaturants comme l'urée et le chlorhydrate de guani20 dine. -2 Les procédés de purification utilisant ces agents dénaturants forts fournissent de l'interleukine-l humaine recombinante purifiée. Cependant, pour des raisons que l'on ne comprend pas entièrement mais dont on pense qu'elles ont un lien avec le repliement de la protéine dans cet environnement non biologique, les niveaux d'activité spécifique observés pour les molécules purifiées n'excèdent pas environ 6 x 106 unités/ mg. Ainsi, un objectif de l'invention était de mettre au point un 10 procédé de purification pour l'interleukine-l humaine recombinante, en particulier l'interleukine-lO recombinante permettant la purification et la solubilisation de la protéine désirée dans un système tampon biologiquement compatible, donnant ainsi un produit ayant une 15 activité spécifique accrue. La présente invention fournit un procédé perfectionné pour produire de l'interleukine-l humaine recombinante, en particulier l'interleukine-lo humaine, plus particulièrement l'interleukine-le humaine ayant la 20 fréquence d'acides aminés présentée dans la figure 1, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène, essentiellement dépourvue d'endotoxine et ayant une activité spécifique accrue, en particulier une activité spécifique d'au moins 5 x 107 unités/ mg. En outre, l'invention concerne l'interleukine-l humaine recombinante produite par le présent procédé, c'est-a-dire l'interleukine-l humaine produite par voie microbienne, essentiellement dépourvue d'endotoxine, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène et ayant une activité spécifique d'au moins environ 5 x 107 unités/ mg. Ladite interleukine-l humaine peut être utilisée comme agent pharmaceutique pour le traitement et la prévention des maladies. En outre, l'invention concerne - 3 les compositions pharmaceutiques contenant ladite interleukine-1 humaine. Pour des raisons évidentes pour les spécialistes, l'interleukine-l humaine de l'invention peut contenir un résidu méthionine addition5 nel à son extrémité N. Un aspect important de l'invention vient de la découverte inattendue selon laquelle une proportion substantielle de l'interleukine-1 humaine recombinante exprimée chez un hôte bactérien, p. ex. E. coli, est 10 présente dans la fraction cytosol soluble même si l'activité spécifique dans cette fraction est bien inférieure à celle qui est contenue dans les corps d'inclusion extraits à l'urée. De plus, non seulement l'interleukine-l humaine se trouve dans le cytosol, 15 mais de façon extrêmement surprenante, on a en outre découvert qu'on peut la purifier à partir du cytosol dans un procédé simple de séparation chromatographique sur colonne en deux ou le cas échéant en trois étapes. Dans la première étape du procédé de l'invention, 20 on obtient la fraction cellulaire soluble en fracturant les hôtes microbiens transformés qui ont été cultivés dans des conditions choisies de manière à provoquer l'expression du gène introduit codant pour l'interleukine-l humaine et cette fraction est séparée des matières 25 cellulaires insolubles, y compris les corps d'inclusion, dans lesquels les spécialistes de la technique antérieure pensaient que se trouvait la grande majorité de l'interleukine-1 (rHIL-l) humaine exprimée. La rupture des cellules peut s'effectuer par des 30 techniques bien connues des spécialistes comme par exemple par utilisation de dégradation enzymatique -4 p. ex. avec un traitement au lysozyme, par rupture physique en utilisant un broyeur à bouletsou un dispositif analogue ou mieux par traitement aux ultra-sons. La séparation du cytosol soluble d'avec des matières cellulaires insolubles s'effectue le plus commodément par centrifugation, p. ex. à 20 000 g pendant environ in. On soumet alors le surnageant contenant la fraction cytosol contenant le rHIL-l soluble à une filtration sur gel utilisant une solution de sel tamponnée pour 10 l'élution. Une colonne appropriée à cette étape du procédé est une colonne de SephacrylTM S-200 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suède). On dose les fractions de chromatographie sur gel contenue dans ladite solution de sel tamponnée de préfé15 rence dans une solution de NaCI tamponnée avec tris/ HCl, pH 8,0, qui peut contenir un stabilisateur de protéine comme l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). On dilue les fractions biologiquement actives combinées avec une quantité supplémentaire de solution de sel tamponnéeet on les utilise dans la seconde étape du procédé de l'invention. Le dosage des fractions chromatographiques peut facilement s'effectuer par des procédés bien connus des spécialistes. Un dosage approprié est le dosage de prolifération des thymocytes murins (dosage LAF) décrit par Mizel et coll., 3. Immunol. 120, 1497-1508 (1987). La seconde étape du procédé fait intervenir une chromatographie par échange d'ions, de préférence sur une colonne de DEAE-cellulose et en utilisant un gra30 dient croissant de concentration de sel dans une solution tamponnée. Dans un mode de réalisation préféré, -5 ledit gradient est un gradient de NaCI allant de O à 600 mM dans un tampon tris/ Hcl, 25 mM, pH 8,1. Dans la purification à grande échelle, après centrifugation pour enlever les débris cellulaires, on enlève les acides nucléiques dans la fraction cytosol par une précipitation au sulfate de streptomycine. On ajoute 1/ 10 de volume (du surnageant) de solution de sulfate de streptomycine à 10 % p/ v. On maintient le pH à 6,2 à 6,4 avec de l'acide acétique 10 1 H. On fait tourner la suspension à 20 000 g pendant min. On concentre les protéines dans la solution de surnageant résultante en ajoutant du sulfate d'ammonium à une saturation de 60 %. On fait tourner la suspension à 20 000 g pendant 30 min. et on dissout la pastille résultante dans un volume minimum de NaCl 800 mM, tris/ HC1 25 mM, pH 8,0. Dans certains cas, en particulier dans les essais par gradation, on peut porter les niveaux d'endotoxine en ce point au-dessus des niveaux permissibles. Ainsi, 20 on peut introduire une troisième étape optionnelle pour enlever l'endotoxine. On peut employer à cet effet des procédés connus des spécialistes bien qu'un procédé préféré selon l'invention fasse intervenir le passage de lasolution de produit (dilué 1:1 v/ v avec 25 du tris/ HC1 25 mM, pH 8,1) provenant de l'étape de chromatographie à la DEAE à travers une colonne remplie de DetoxiGelTl (Pierce Chemical Company, Rockford, Ill) en utilisant les instructions fournies par le fabricant. On peut employer l'interleukine-l humaine purifiée de l'invention comme agent pharmaceutique de façon -6 connue pour stimuler le système immun d'un malade comme, par exemple, en améliorant la réponse de défense de l'hôte aux agents pathogènes, en agissant comme adjuvant de vaccin et en accroissant la défense de l'hôte contre les maladies néoplasiques. D'autres applications cliniques comprennent la favorisation de la cicatrisation des blessures par stimulation de la prolifération des fibroblastes et amélioration de la guérison des malades souffrant de façon critique d'une 10 malnutrition protéique. L'interleukine-l humaine de l'invention peut être administrée à des mammifères homéothermes pour les applications cliniques indiquées cidessus. L'administration peut se faire par n'importe quel procédé clas15 sique comme par application parentérale par voie intraveineuse, souscutanée ou intramusculaire. Il est clair que la dose requise varie avec l'état particulier traité, la gravité de l'état, la durée du traitement et le procédé d'administration. On peut obtenir une for20 me posologique appropriée à l'application pharmaceutique à partir d'interleukine-l humaine lyophilisée filtrée de façon stérile et reconstituée avant l'emploi de façon classique. Les spécialistes savent également introduire des tampons, des stabilisateurs, des bacté25 riostats et d'autres additifs classiquement employés dans les formes posologiques parentérales pharmaceutiques. Exemple 1 On cultive des cellules d'E. coli transformées avec un vecteur d'expression codant pour l'interleukine-lt - 7 humaine recombinante (rHILla) dans des conditions permettant l'expression de la rHIL-lt. On recueille les cellules puis on les congèle. Pourla purification de rHILla, on dégèle les cellules d'E. coli con5 gelées dans du tris-/ HCl 30 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM (dans un rapport de 1:5 p/ v). On brise les cellules en suspension avec un appareil Branson Cell Disruptor 350 (traitement aux ultrasons). On enlève par centrifugation à 20 000 g les cellules brisées et toute rHIL-lt "insoluble" éventuelle sousforme de corps d'inclusion. On applique le surnageant contenant la rHIL-le ' soluble dans une colonne de filtration sur gel (SephacrylTM S-200)(figure 2). On équilibre la colonne dans du tris/ HCl 30 mM, pH 8,0, HaCl 800 mM, EDTA 5 mM. 15 On rassemble les fractions biologiquement actives, on dilue à 1:3 v/ v avec du tris/ HCl 30 mM, pH 8,0, et on chromatographie sur DEAE-cellulose (échangeuse d'anions DE 53, Whatman Ltd) en utilisant un gradient linéaire de NaCI 0-800 mM dans tris/ HCl 25 mM, pH 8,1 20 (figure 3). On recueille plus de 50 % de l'activité biologique avec une activité spécifique de 0,4 à 1,0 x 107 unités/ mg de protéine. La pureté de la protéine est confirmée par analyse par électrophorèse sur gel de SDS- polyacrylamide (SDS-PAGE) comme il est dit 25 par Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970) (figure 4) et chromatographie en phase liquide à haute pression (CLHP - IHPCL) à phases inversées. Après chromatographie au SephacrylTM S-200, on contamine la rHIL-la avec de 1000 à 2 000 unités d'endotoxine par ml mais la chro30 matographie à la DEAE aboutit à une réduction de 99 % de l'endotoxine. On montre que l'activité biologique est stable pendant au moins 3 moins lorsqu'on conserve la protéine à 40C. Exemple 2 On réalise le procédé ci-dessus par gradation pour produire 32 mg de rHIL-la essentiellement pure. On traite 100 g de pâte cellulaire par le procédé de Manton-Gaulin (Heth. Enzymology 22, 482-484 -1971-) et on traite le produit soluble résultant avec du sulfate de streptomycine et du sulfate d'ammonium pour enlever les acides nucléiques et concentrer la protéine. On chromatographie la protéine resolubilisée résultante sur une colonne de SephacrylTM de 10 litres dans une solution de sel tamponnée On chromatographie alors la matière purifiée dans une colonne de DEAEcellulose. La protéine est pure à plus de 95 % comme on le détermine par SDS-PAGE. L'activité totale obtenue 15 est de 1,6 x 109 unités avec une activité spécifique moyenne de 5 x 107 unités/ mg. Cependant, par opposition à l'essai pilote initial, cette matière est quelque peu contaminée par de l'endotoxine (jusqu'à 500 unités d'endotoxine par ml). On peut facilement enlever 20 cette impureté d'endotoxine en faisant passer la solution de protéine sur une colonne remplie de DetoxigelTM en suivant les instructionsdu fabricant. Description des dessins. La figure 1 montre la séquence d'acides aminés 25 de HIL-lit. La figure 2 fournit un chromatogramme de la filtration sur gel de cytosol à i. coli contenant la rHIL-lI soluble sur SephacrylTM S-200. L'éluant est le tris/ HCl 30 me, pH 8,0, HaCl 800 mM. On quantifie -9 l'activité d'IL-1 de fractions aliquotes par le dosage LAF. La figure 3 présente un chromatogramme de la chromatographie à la DEAE-cellulose de la masse SephacrylTM S-200 de fractions actives IL-1. On élue la rHIL-la avec un gradient de sel courant de O à 800 mM de NaCl dans tris/ HCl de 25 mM, pH 8,1. On evalue l'activité biologique d'échantillons de chaque fraction par le dosage LAF. La figure 4 met en évidence la purification de rHIL-lc. On analyse par SDS-PAGE des échantillons provenant de différents stades de la purification de rHIL-lt. (A) M: marque d'échelle; P: pastille résultant 15 de la centrifugation d'une suspension cellulaire traitée aux ultra- sons; S: fraction cytosol; fractions 64 - 69 et fractions 70 - 77: fractions individuelles 64 à 77 (marquées par I) résultant de la chromatographie sur colonne à SephacrylTM S-200. (B) M: marque d'échelle; O: fractions rassemblées provenant de la chromatographie sur colonne TMH Sephacryl S-200; 0*: fractions rassemblées provenant de la chromatographie sur colonne à SephacrylTM S- 200 diluée à 1:3 v/ v avec tris/ HCI 30 mM, pH 8,1; 25 fractions 60 - 65 et fractions 66 - 73: fractions individuelles 60 à 73 (marquées par |) résultant de la chromatographie à la DEAE-cellulose. Les mobilités électrophorétiques des protéines marqueuses à la verticale de M (phosphorylase b - 10 (Mr = 94 000 sérum albumine de boeuf ([i1r = 67 000), ovalbumine (Mr = 43 000), anhydrase carbonique (Mr = 30 000), inhibiteur de la trypsine de soja (Mr = 20 OO0) et a-lactalbumine (Mr = 14 000)) sont indiquées par leur valeur de Mr (x 103) suivies par des flèches. - i1 REVENDICATIOtIS 1. Interleukine-1 humaine produite par voie microbienne essentiellement dépourvue d'endotoxine, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène et ayant une activité spécifique d'au moins environ 5 x 107 unités/ mg. 2. Interleukine-l humaine selon la revendication 1 qui est l'interleukine-lc humaine. 3. Interleukine-1 humaine selon la revendication 1 10 ayant la séquence d'acides aminés présentés dans lafigure 1. 4. Interleukine-1 humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comme agent pharmaceutique. 5. Procédé pour produire une interIeukine-1 humaine 15 selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, procédé dans lequel on brise les cellules microbiennes qui ont été transformées avec un vecteur d'expression contenant le gène pour l'interleukine-1 recombinante humaine, et o l'expression dudit gène 20 était induite, on sépare les matières cellulaires insolubles d'une fraction cytosol, on soumet ladite fraction cytosol à une filtration sur gel en utilisant une solution de sel tamponnée, on conjugue les fractions biologiquement actives à partir de 25 ladite filtration sur gel et on les soumet à une chromatographie d'échange d'ions en utilisant un gradient de concentration croissante de sel dans une solution tamponnée. - 12 6. Procédé de la revendication 5 o lesdites cellules microbiennes sont brisées par traitement aux ultrasons. 7. Procédé des revendications 5 ou 6 o ladite filtra5 tion sur gel est effectuée sur une colonne de SephacrylTM S-200 et ladite solution de sel tamponnée est une solution de H-aCl tamponnée avec tris/ HC1. 8. Procédé des revendications 5 à 7 o ladite chroma10 tographie d'échange d'ions est faite en utilisant une colonne de DEAE-cellulose et ledit gradient de concentration croissante de sel dans une solution tamponnée est un gradient de NaCl 0800 mM dans un tampon tris/ HC1. 9. Composition pharmaceutique contenant une interleukine-l humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 10. Application d'une interleukine-l humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour le 20 traitement et la prévention des maladies. 11. Interleukine-l humaine lorsqu'elle est préparée selon un procédé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5 à 8.