Brevet FR2590022A1 — publié le 19870515

Cette invention concerne un procédé pour assurer une fixation de petites molécules présentes dans les tissus humains, animaux ou végétaux afin de pouvoir les révéler tout en respectant la structure histologique des tissus. Les petites molécules biogènes, c'est à dire présentes dans les tissus, dérivent des acides aminés constitutifs des protéines. Leur poids moléculaire varie.habituellement entre 30 et 500 Dalton. Les petites molécules sont en interactions non covalentes avec les protéines cellulaires. Elles sont très diffusibles ; pour les révéler, il est nécessaire de les conjuguer par liaisons convalentes aux protéines qui les entourent. La liaison covalente se fait habituellement avec un ou des agents couplants réagissant sur la petite molécule et les protéines. Il est ainsi créé une liaison covalente entre chacune des petites molécules et les protéines environnantes. Les agents couplants intervenant dans le procédé original que nous décrivons sont : un aldéhyde et un alcool. Les aldéhydes sont le glutaraldéhyde ou le formaldéhyde, agents bifonctionnels permettant la conjugaison ou ïe couplage des petites molécules sur les protéines. En général la réaction se fait sur des groupements aminés primaires portés par les petites molécules et les résidus aminés libres des protéines environnantes. Pour étendre ce procédé de fixation habituel à d'autres petites molécules porteuses de groupements chimiques de type alcool ou ester (et non pas seulement aminés) nous avons ajouté à ces aldéhydes, employés habituellement, un alcool très réactif, comme l'alcool allylique, qui va permettre de former des composés chimiques instables des hémiacétals et acetals très réactifs. Dans des proportions définies d'aldéhyde et d'alcool, il est possible de fixer les molécules porteuses de ces groupements alcool et ester aux protéines environnantes. Les hémiacétals et acétals formés lors du mélange d'alcool et d'aldéhyde sont tres réactifs et réagissent par transestérification sur des esters et les alcools à pH alcalin. Ce procédé implique de fixer le tissu avec un volume d'aldéhyde et d'alcool calculé en fontion du poids du tissu pour realiser correctement le couplage entre la petite molécule et les protéines environnantes. Le volume exprimé en millilitres est égal à 4 à 16 fois le poids du tissu exprimé en grammes. Ainsi nous couvrons par ce procédé un large spectre de couplage incluant les molécules porteuses d'amines primaires, d'un groupement alcool et/ou ester. Exemples de fixation simultanée de plusieurs molécules DOPAMINE porteuse d'un groupement aminé ACETYLCHOLINE porteuse d'un groupement ester. Le procédé décrit est appliqué par exemple à un cerveau de rat (poids 20 à 30 gr) Après anesthésie de l'animal, celui-ci est cannulé en intracardiaque et une pompe permet de délivrer différentes solutions en continu avec un débit indiqué sur le schéma 1 300ml/min solution B (40ml) l I 300ml/min 1 300ml/min I 150mi/min solution A (SOml3 solution C (40ml) solution C (100mol) solution C (400ml) Solution A : cacodylate 0,1M, métabisulfite de Na 10g/l, pH 6,2 Solution B : cacodylate 0,lM, alcool allylique 0,5M, pH 12,4 Solution C : cacodylate 0,lu, métabisulfite de Na 10g/l, Glutaraldéhyde 5%, pH 7,5 La solution A permet de chasser des vaiseaux sanguins tous les éléments cellulaires (globules rouges et blancs). La solution B d'alcool allylique et C de glutaraldéhyde en mélange de même volume et à pH final alcalin (pH 7,5 à 12) permettent la désacétylation des petites molécules, la formation des hémiacétals et des acétals et la réaction de fixation des petites molécules porteuses d'un groupement aminé ou groupement alcool ou groupement ester. Comme la solution A, ce mélange des solutions B et C doit être très rapidement mis au contact du tissu pour éviter la diffusion des petites molécules hors des cellules et donc permettre la fixation rapide de ces molécules sur les protéines. Dans ces conditions, il est nécessaire d'ajouter au mélange un protecteur des noyaux des catécholamines, par exemple le métabisulfite de sodium car, à ce pH, les petites molécules porteuses de noyaux catéchols seraient rapidement oxydées et donc non détectables. Pour assurer une bonne préservation du tissu et éviter les réactions chimiques réversibles avec les esters et les alcools , les tissus sont fixés par la solution C contenant simplement un aldéhyde. Pour illustrer cette invention, il est possible de détecter un ensemble des petites molécules décrites dans les trois pages suivantes. L'utilisation de techniques immunocytochiniques avec des anticorps spécifiquement dirigés contre chacune de ces petites molécules conjuguées par l'un/ou l'autre des agents couplants décrits dans le procédé, permet de détecter dans les tissus, ces petites molécules. Après fixation des petites molécules et des tissus, un anticorps spécifique d'une petite molécule est appliqué sur le tissu. Après reconnaissance de la petite molécule fixée par son anticorps spécifique, des anti-immunoglobulines spécifiques d'espèces, marquées, sont appliquées sur le tissu. Ainsi la petite molécule fixée est spécifiquement révélée. Ce procédé de fixation s'applique également aux mêmes petites molécules exogènes, marquées isotopiquement ou non, captées sélectivement par les tissus. La révélation pourra se faire par une méthode immunocytochimique ou autoradiographique. DERIVES CATECHOLAMINERCIQUES lalari CH,- CH--E, 121 COO- t ~ F -tyrtsne ON ,- cH,--E, ttc CHrCH,-NHi CHCH - -O, Ph-","In'a',',"'e I ~~ Hotcnrcnl-W, | 9 hw / HOI Im- tvrcnml -c-wc, ' I P' ylunrna 1 0 { Ptyrgi j t .0-OH > CHa-CH I -A o" ttc Cao I. ~CH,~H, ; -Cao HO NO 4 CH,-CH,-HH, pctr amenZ O:. -on on Dr C-CH,-HH, ' me-h CH ,- > -, l CH, noiT:-oc,- m -oc, rAgrcwrtnrl -E-CH, I, DERIVES INDOLEALKYLAMINERGIOUES S CH,-CH-NH -COS u NH COO ITRYPTOPHANI NH,/1 COO IHIC-CH,-CH,- 'NH I il N/ .oH ITAMINE 1 IS-HYOROXYTRYPTOPHANt-l NI X CH,- NH, ; 1 coo\\ ISEROTONINT CH,-CH, H, CH?-CH,-NH,-CH-CH-NH3 00 ISEROtONINtJ CH, - CH,- NH1 CO-CH, IS-METHOXYTRYPTAMINE HO -CH,- CH,- NH- CO- CH, r E YL SEROTONINÊ7HH CH, MELATONIN H3C - 0H1 CH1- CH, - NH-CO-CH, IMELATONINER H,C-O m CH2-CH2-NH-CO-CH, ACIDES AMINES ET DERIVES TAURINE SO3-(CH2)2-NH3+ HYPOTAURINE SO2H-(CH2)2- NH3- CYSTEINE p-ALANINE COO-(CH2)2- NH3+ G.A.B.A. COO-(CH,),-N , GLU TAMATE ASPARTATE GLYCINE COO--CH2-NH2+, ACETYLCHOLINE REVENDICATIONS ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ 1. Produit permettant de fixer les petites molécules présentes dans les tissus humains, animaux ou végétaux tout en respectant la structure histologique desdits tissus, CARACTERISE EN CE QU'il est constitué d'un mélange d'agents couplants formés d'un aldéhyde et d'un alcool et permettant le couplage des petites molécules sur les tissus. 2. Produit selon la revendication 1, CARACTERISE EN CE QUE le volume du mélange appliqué sur le tissu est calculé en fonction du poids du tissu. 3. Produit selon la revendication 1, CARACTERISE EN CE QU'un agent anti-oxydant est additionné au mélange pour préserver la structure moléculaire des petites molécules. 4. Produit selon la revendication 1, CARACTERISE EN CE QUE le pH du mélange est compris entre 7,5 et 12. 5. Produit selon la revendication 1, CARACTERISE EN CE QUE l'aldéhyde du mélange est du glutaraldéhyde et/ou du formaldéhyde. 6. Produit selon la revendication 1, CARACATERISE EN CE QUE l'alcool du mélange est un alcool allylique. 7. Produit selon la revendication 2, CARACTERISE EN CE QUE le rapport entre le volume de mélange d'agents couplants en millilitres et le poids du tissu en grammes est compris entre 4 et 16. 8. Produit selon la revendication 3, CARACTERISE EN CE QUE le susdit agent anti-oxydant est un sel de sodium, de potassium ou de lithium. 9 Produit selon la revendication 8, CARACTERISE EN CE QUE le susdit sel est un métabisulfite de sodium. 10. Application du produit selon l'ensemble des revendications 1 à 9, sur des tissus humains, animaux ou végétaux, unis ou pluricellulaires, pour la révélation par immunocytochimie ou par autoradiographie de petites molécules présentes dans lesdits tissus et d'un poids mocéculaire comprie entre 30 et 500 Dalton.