Brevet FR2586427A1 — publié le 19870227

Séquences de nucléotides et de polypeptides issus du virus VISNA et leur application i des essais de diagnostic et a la production de compositions immunogènes L'invention concerne des séquences polypeptidiques déterminees utilisables pour le diagnostic des maladies- vétérinaires due CL des lentivirus Infectieux pour des moutons, plus particulièrement à. ceux du type connu sous la désignation VISNA (désignation qui sera reprise dans ce qui suit pour désigner ces lentivirus), ou de la présence d'anticorps contre ces VISNA dans des prélève ments biologiques, notamment des serums provenant de moutons qui avaient auparavant été exposés a ce virus.L'invention concerne également ces séquences polypeptidiques dans leur application à la constitution de principes actifs de vaccins contre les maladies vétérinaires induites par les VISNAS. L'invention concerne enfin aussi des séquences dd d'ADN codant pour ces polypeptides et les différents vecteurs modifiés par ces séquences d'ADN, qu permettent l'expression de ces séquences d'ADN dans des hôtes cellulaires compétnets préalablement transformés à l'aide de ces vecteurs modifiés I1 a en effet été reconnu que les Visnas pouvaient être pathogènes pour les moutons, ches lesquels ils induisent des infections progressives débilitantes. Le caractère pathogène des Visnas se manifeste par leur caractère léthal à l'égard des cultures in vitro de cellules animales. Le VISNA a été décrit pour la première fois en 1949 et tenu responsable de différentes maladies a caractère épidémique, qui se sont manifestées en Islande durant la période 1930 - 1950 (SIGURDS50N et al), (1957) J.. Neuropathol. Exp. Neurol. 16, 389 - 403). Ces maladies se manifestent par une inflammation du système nerveux central susceptible de conduire a une paralysie des animaux. L'évolution de la maladie est lente et le virus peut persister longtemps cfiez l'animal Une explication plausible à la persistance du virus chez l'hôte, même en présence d'une réponse immunitaire, et à l'évolution lente de la maladie, réside peut être dans la régulation en baisse ou de la restriction in vivo de l'expression des gènes viraux.Ces observations forment contraste avec la replication virale accélérée qui peut être induite in vitro (HAASE et al (1977) Science 195, 175-177). La base moléculaire détaillée sous-tendant ce phénomène n'est pas connue, mais le blocage de l'expression génétique in vivo se manifeste au niveau de la transcription (BRAHIC et al, 1981, Nature 292, 240-242). En culture sur tissu le virus VISNA est produit à partir d'un grand nombre de molécules d'ADN extrachromosomiques plus particulièrement décrites par HARRIS et al(1981) Virology 113,573-583 et HASSE et ai (1982) Virology 119, 399-410, HARRIS et al (1989) Proc.Natl.Acad.S. USA 81,7212. La morphologie du VISNA, les tailles de la glyco- protéine d'enveloppe et du génome et les compositions nucléotidiques de 1'ADN viral ont fait l'objet de nombreuses pub cations, par exemple THORMAR et al. (1961) Virology 14, 463475; COWARD et al, (1970) Virology 40, 1030-1038;HAASE et al C1974) Virology 57, 238-250; MARRIS et al déjà cité et VIGNE et al (1977), J. Virol. 14, 1519-1529, La présente invention découle de la découverte du caractère fiautement hydrophile de la glyco-protéine d'enveloppe qui est à la base des applications qui ont été mentionnées plus haut et de certains fragments polypeptidiques (ou glycopeptSdiques) normalement contenus dans le glycopeptide de l'enveloppe, dont l'hydrophilie est telle qu'ils sont eux-mêmes applicables aux mêmes fins, Tes structures - au moins l'ossature polypeptidique de la glycoprotéine d'enveloppe ou des fragménts sus-indiquds, ont été révélées à l'occasion du séquencage des génomes du VISNA, qui a a été réalisé dans les conditions qui seront rappelées plus loin. L'invention concerne donc plus particulièrement un polypeptide ou protéine (ou encore la glycoprotéine cor respondante) purifiable ou purifié , caractérisé par los- sature polypeptidique suivante 1 10 20 30 40 50 60 MASKESKPSR TTWRDMEPPL RETWNQVLQE LVKRQQQEEE EQQGLVSGKK KSWVSIDLLG 70 80 90 100 110 120 TEGKDIKKVN IWEPCEKWFA QVVWGVLWVL QIVLWGCL@W EVRKGNQCQA EEVIALVSDP 130 140 150 160 170 180 GGFQRVQHVE TVPVTCVTKN FTQWGCQPEG AYPDPELEYR NISREILEEV YKQDWPWNTY 190 200 210 220 230 240 MWPLWQMENM RQWMKENEKE YKERTNKTKE DIDDLVAGRI RGRFCVPYPY ALLRCEEWCW 250 260 270 280 290 300 YPESINQETG HAEKIKINCT KAKAVSCTEK MPLAAVQRVY WEKEDEESMK FLNIKACNIS 310 320 330 340 350 360 LRCODEGKSP GGCVOGYPIP KGAEIIPEAM KYLRGKKSRY GGIKDKNGEL KLPLSVRVWV 370 380 390 400 410 420 RMANLSGWVN GTPPYWSARI NGSTGINGTR WYGVGTLHHL GYNISSNPEG GICNFTGELW 430 440 450 460 470 480 IGGDRFPYYY KPSWNCSQNW TGHPVWHVFR YLDMTEHMTS RCIQRPKRHN ITVGNGTITG 490 500 510 520 530 540 NCSVTNWDGC NCTRSGNHLY NSTSGGLLVI ICRONSTITG IMGTNTNWTT MWNIYQNCSR 550 560 570 580 590 600 CNNSSLDRTG SGTLGTVNNL KCSLPHRNES NKWTCKSQRD SYIAGRDFWG KYKAKYSCES 610 620 630 640 650 660 NLGGLDSMMH QQMLLQRYQV IRVRAYTYGV VEMPQSYMEE RGENRRSRRN LORKKRGIGL 670 680 690 700 710 720 VIVLAIMAII AAAGAGLGVA NAVOQSYTRT AVOSLANATA AOQEVLEASY AMVQHIAKGI 730 740 750 760 770 780 RILEARVARV EALVD*MMVY QELDCWHYQH YCVTSTRSEV ANYVNWTRFK DNCTWOOWEE 790 800 810 820 830 840 EIEQHEGNLS LLLREAALOY HIAORDARRI PDAWKAIQEA FNWSSWFSWL KYIPhIIMGI 850 860 870 880 890 900 VGLMCFRILM CVISMCLOAY KQVKQIRYTQ VTVVIEAPVE LEEKQKRNGD GTNGCASLEH 910 920 930 940 950 960 ERRTSHRSFI QIWRATWWAW KTSPWRHNWR TMPYITLLPI LVIWOWMEEN GWNGENQHKK 970 980 0 0 0 0 KKERVDCODR EQMPTLENDY VEL étant entendu que dans la formule qui précède, on fait application de la nomenclature internationale désignant chacun des aminoacides naturels par une lettre unique, notamment selon le tableau des correspondances qui suit Méthionine L Leucine I Isoleucine V Valine F Phenylalanine S Sérine P Proline T Thréonine A Alanine Y Tyrosine a Histidine Q Glutamine N Asparagine K Lysine D Acide Aspartique E Acide glutaminique C Cystéine w Tryptophane R Arginine G Glycine L'invention concerne plus particulièrement encore des polypeptides hydrophiles caractérisés par des séquences polypeptidiques (ou glycoprotéiniques) communs avec certains de ceux qui sont contenus dans la séquence de polypeptide entier ci-dessus. Il s'agit notamment de polypeptides caractérisés par les séquences (b) 101 à 290 (c) 101 à 656 (d) 550 à 656 Ce) 671 à 831 (f) 671 à 740 (g) 859 à 983 étant entendu que les séquences dont question ci-dessus découlent de la lecture de la formule globale indiquée cidessus et de l'adoption de la numérotation des aminoacides qui y est indiquée. Par exemple la séquence (b) s'étend entre l'aminoacide E portant le numéro 101 dans la formule sus-indiquée jusqu'à l'aminoacide K portant le numéro 210 Des glycoprotéines préférées (ou les polypeptides correspondants) sont encore cellesqui sont identifiées dans le tableau I ci-après, notamment celles auxquelles correspondent les désignations gp 15d, gp 135, gp- 70, gp 39 et gp 44. Mais l'invention concerne aussi tout polypeptide comprenant au moins 10 aminoacides, de préférence au moins 5d aminoacides contenus à l'intérieur des précédents.. Tous ces polypeptides sont en effet caractérisés par une hydro- philie importante, qui les rend utilisables pour la réalisa-* tion d'essais de diagnostic ou en tant que principes actifs immunogènes dans les conditions qui seront décrites plus loint Naturellement 1' invention concerne aussi tout polypeptide équivalent doté de propriétés immunologiques semblables; doit être considéré comme équivalent tout polypeptide qui est reconnu par les anticorps produits à l'égard des polypeptides qui résultent des définitions qui précèdent. Il s'agit donc de polypeptides qui peuvent différer par certains aminoacides, dès lors que ces différences n'altèrent pas les propriétés immunologiques globales des polypeptides ainsi modifiés, dans les conditions définies dessus, Il va sans dire que sont inclus parmi les polypeptides équivalents tous les polypeptides qui présentent des propriétés immunogènes semblables, c'est à dire la propriété commune d'induire in vivo des anticorps susceptibles de reconnaitre les protéines d'enveloppe des VISNAS.Cette déE nition d'équivalence s'étend naturellement aussi à des polypeptides dont les extrémités seraient prolongées par un ou plusieurs aminoacides distincts de ceux qut, éventuel lement, les prolongent dans la séquence naturelle de la glycoprotéine d'enveloppe et qui n'interfèrent pas avec les propriétés immunogènes sus-définies, ainsi qu'aux polypeptides hybrides, notamment dans la mesure où la partie polypeptidique ajoutée aurait entre autres effets celui de renforcer l'immunogénicité recherchée, ne serait-ce qu'en raison du poids moléculaire plus élevé que possède alors l'hybride. Cette définition s'étend encore à tout polypeptide dcté des mêmes propriétés immunogènes couplé de façon covalente ou autre à un support de poids moléculaire élevé, par exemple une protéine immunologiquement neutre, telle qu'un sérum albumine ovine (lorsque L'on envisage l'administration du polypeptide en question au mouton) ou tel qu'un polymère synthétique d'aminoacides, par exemple une polylysine. L'invention concerne encore les séquences d'ADN correspondants (en particulier des cADNs correspondants) qui consistent en tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du Visna et qui s'étend du nucleotide N 5956 jusqu'au nucléotide N 8gG4 des figures 1 à 6 ci-annexées. L'invention s'étend également à toute séquence d'ADN codant pour les mêmes polypeptides notamment toute séquence d'ADN différant de la précédente par des séquences nucléotidiques distinctes codant toutefois, soit pour les polypeptides précédemment définis, soit pour les polypeptides équivalents sus-mentionnés, lesdites séquences pouvant etre oh- tenues soit à partir des génomes de variants du virus, soit par clonage des séquences correspondantes dans un vecteur et excision ultérieure de ces sequences à partir des vecteurs amplifiés obtenus, soit encore par synthèse chimique de po lynucléotides. Des polynucléotîdes types préférés sont ceux dont les structures correspondent aux polynucléotides qu s'étend dent respectivement entre approximativement les nucléotides d'extrémité portant les numéros suivants dans les figures i à6 : (a) 5956 - 8904 (b) 6256 - 6826 Cc) 6256 - 7924 (d) 7606 - 7924 (e) 7969 - 8176 (f) 7969 - 8176 Cg) 8532 - 8904 L'invention concerne également tout vecteur (ADN reccobinant) modifié par l'une ou l'autre des séquences d'ADN sus-définis ou des fragments de oelles-ci, et aptes à transformer un microorganisme compétent ou une culture cellulaire appropriée, notamment d'eucaryotes supérieurs, en vue de les rendre aptes à exprimer ladite séquence L'invention concerne aussi des virus modifiés entiers dont le génome est constitué par 1'ADN recombinant du genre en question, et ce tout particulièrement lorsque ce virus modifié est directement applicable à la constltution de "vaccins vivants" efficaces contre le visna. Un tel virus est par exemple un virus hybride de la vaccine. Ce virus hybride se différencie du virus courant de la vaccine par l'incorporation à son génome d'une séquence d'ADN codant pour l'un des susdits polypeptides et par le fait qu'elle est exprimée (ou en lieu et place de tout ou partie) au niveau de ses propres protéines d'enveloppe. L'invention concerne encore les compositions vacci- nantes chez l'animal, contenant une dose efficace de l'un ou de plusieurs des polypeptides ou glycoprotéines qui ont été définies dans ce qui précède, ou un virus modifié entier du genre de celui envisagé dans l'exemple précédent, Elle concerne encore des compositions de diagnostic in vitro pour la détection d'anticorps anti-visna dans des prélèvements Biologiques, notamment de sérums sanguins effectués sur l'animal. Ces compositions sont par exemple utilisables dans des essais du type ELISA, et mettent en jeu à titre de principe actif l'un ou plusieurs des polypeptides sus-indiqués (notamment l'un ou plusieurs des poly- peptides a)à g) identifiés plus hante le cas échéant en combinaison avec l'un de ceux qui répondent aux désigna- tions gp 15a, gp 135, gp 7a, gp 39 et gap 44 dans le tableau F ci-après. Les compositions préférées de diagnostic selon l'invention contiennent de préférence aussi, en associaticn avec l'un ou avec plusieurs des polypeptides précédents, un ou plusieurs polypeptides codes par gènes gag du génome visna, par exeeple l'une au moins des protéines correspondant aux p.55, p.16, p.25 (désignée parfois par "p.30 par d'autres auteurs),et o.l4 dans le tableau I ci-après, et dont les séquences peptidiques découlent par consequent des figures 1 à 6. D'autres caractéristiques de l'invention appa rairont encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles le génome (ou le cADN résul tant de la transcription réverse de 1'ARN viral) du visna a été cloné et séquencé, et des conditions dans lesquelles les princip ales protéines ou glycoprotéines vi rales ont été identifiées. Des compositions préférées contenant un ou plu sieurs des polypeptides ou glycoprotéines seront étalement indiquées, ainsi que leurs conditions d'utilisation pour la réalisation d'essais de diagnostic in vitro et ou pour la production de principes immunogènes vaccinants. I1 a déjà été fait référence dans ce qui précède aux figures 1 à 6 qui consistent en la reproduction de la formule du génome total du visna étudié. La séquence (écrite sous forme d'ADN) a été construite à partir des clones VL et VS mentionés plus loin. La numérotation commence au niveau du site de tête (en anglais "cap site") lequel a été déterminé expérimentalement. On y a également indiqué des éléments génétiques importants tels que les LTRs, les principlaes phases de lecture ouverte (abbréviation de l'expression anglaise correspondante "open reading frame") ainsi que les sites SstI de clonage. La figure 7 concerne l'organisation génétique du virus visna . Les codons d'arrêts présents dans chacune. des phases de lecture y apparaissent sous forme de traits verticaux, La flèche au début de chaque orf se rapporte au résidu méthionine La figure 8 est représentative du profil hydro pathique du précurseur du polypeptide d'enveloppe du visna. Les profils hydrophiles au dessus de la ligne médiane) et hydrophobes (au dessous de la ligne médiane) ont été calculés selon la méthode de KYLE et DOOLITTLE, 1982), J.Mol. Biol. 157 105-132 en utilisant une fenetre de 6 aminoacides, Les sites vraisemblables de N-glycosylation sont marqués d'une tete de flèche. Le codon stop Zen phase" est marqué TGA. Les sites possibles de modification sont repérés par des flèches; ceux qui conduisent à des protéines de membrane externe ou à des protéines transmembranaires sont repérés par les lettres R et K (R = ArgF K = Lys). PROCEDURES EXPERIMENTALES Séquençage de l'ADN: Le génome du virus a été cloné dans deux fragments VS (0,5 pb) et VL (8,6 pb) HARRIS et al (1984) Poc. Natl. Acad. Sci. USA 81. VS a été séquencé au niveau de ses deux brins par la méthode de dégradation chimique de MAXAM et GILBERT (1980) Meth Enzy. 449 - 560). VL a été ligaturé sur lui-même, traité aux ultrasons et fractionné sur gel d'agarose à bas point de fusion. Des fragments de 500-1000 pb (paires de bases) ont été purifiés, réparés aux extrémités avec un fragment de KLENOW issu de l'ADN polymérase I de E.coli (6h 16 C) ligaturés dans un ADN de M13mp8 (MESSING et VIERA, 1982) ... préalablement traité par de la phosphatase intestinale de veau et clivé par SmaI, et transférés dans une souche de E.coli TGI. Les recombinants ont été triés par hybrididation in situ en utilisant un fragment VL purifié marqué au 3 en tant que marqueur.Des brins monocaténaires utilisables comme matrices (templates) ont été préparés à partir de plaques présentant des signaux d'hybridation positifs et par la procédure des terminaisons didéoxy de channes (SANGER et al 1977) en utilisant de l'alpha35SdATP (AMERSHAM 400, Ci/mmol) et un gradient de gel tamponné CBIGGEN et al 19,83). Les autoradiographies ont été lues en utilisant le digitiseur GRAFBAR et les séquences ont été compilées sur un Staden adapté par B. CAUDRON (Staden 1982). Chaque nucléotide a été séquencée en moyenne 7,7 fois. Les séquences anbigües attribuables à des artefacts de compression ont été résolues en utilisant de l'inosine au lieu de la guanosine. dans les réactions de séquençage selon MILLS et KRAMER (1979). Réaction endogène du Visna: cADN d'arrêt fort. Une bande de virus centrifugée dans un gradient a été récupérée dans un coussin de sucrose à 15% et incubée pendant 1 heure à 370C dans un tampon Tris-HC 50 mM pH 8,1, 8 mM MgC12, la mM DTT, 0,02% Triton X-100 contenant 100 microM respectivement de dATP, dGTP, dTTP et 10 microM de dCTP, 1 microCi/microlitre d'alpha 32P dCTP (32QQ Ci/mmol,NEN), 100 microgrammes/ml d'actinomycine D. La réaction a été arrêtée par addition d'EDTA,de SDS et de pronase aux concentrations finales respectives de 20 mM, 0,5% et 500 ug/ml et incubation a 370C pendant 15 minutes.Après extraction au phénol et du chloroforme, 1'ARN précipité a été hydrolysé pendant 1 heure à 500C dans une solution de 0,3 M NaoH, 3 mM EDTA. Après neutralisation et précipitation les produits ont été analysés sur des gels de séquençage en utilisant des marqueurs de tailles appropriées La séquence du cADN du vIsna découle des figures 1 à 6 Son génome comporte 9202 nucléotides. L'organisation de ses phases de lecture ("orfs") ouverte apparait à la figure 7. L'orf le plus proche de l'extrémité 5' correspond aux gènes "gag" qui codent les nucléoprotéines. Le second orf correspond au gène "pol", qui code les protéases, la reverse transcriptase et les endonucléases/ intégrase. La séquence fait apparaître un troisième orf Q séparant l'orf "pol" et l'orf "env" codant pour les glycoprotéines d'enveloppe. L'organisation génétique du visna est donc du type 5'-gag-pol-Q-env-3'. Les coordonnées et les poids molé culaires calculés pour les principaux orfs résultent du tableau I TABLEAU 1 - Coordonnées et Poids moléculaires calculés pour les phases de lecturé ouverte "orfs" du visna PROTEINE C O O R D O N N E E S N CALCULE HYPOTHESES quant aux poids Acide nucléique Aminoacides Aminoacides poids moléculaire moléculaires de la proteine correspondante gag (précurseur) 489-1814 1-442 442 49808 p55 gag (N terminal) 489-917 1-143 143 16266 p16 gag (novau) 918-1577 144-363 220 24768 p25 gag (NBP) 1578-1814 364-442 79 8810 p14 pol 1691-5005 1-1105 1105 126492 Q 4965-5654 1-230 230 28448 S 5657-5938 1-94 94 11267 env (précurseur) 5956-8904 1-983 983 114604 gp150 env (mature) 6256-8904 101-983 883 102899 gp135 env (membrane extérieure) 6256-7923 101-656 556 64044 gp70 env (transmembranaire) 7924-8904 657-983 327 37984 gp39 gp44. Coordonnées appréciées à partir du codon d'initiation jusqu'au dernier codon à l'exception de pol pour lequel elles sont indiquées pour la totalité de l'"orf" Les observations suivantes peuvent être faites concernant le gène env. I1 correspond nettement au gène viral codant pour les protéines d'enveloppe, étant donné la présence du 28 sites possibles de N-glycosylation du type Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, avec X étant 1 un quelconque des acides aminés naturels, et de trois régions hydrophobes typiques des précurseurs de protéines rétrovirales d'enveloppe, selon SEIKI et al (1983) Proc Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618-3622 et KIYOKAWA et al, (1984). Proc. Natl. Acac.Sci. USA 81, 6202-6206. Le premier codon ATG est situé au niveau du huitième codon et les séquences qui l'entourent sont conformes à celle d'un initiateur typique selon KIZAK (1984), Nucl. Acids. ReS. 12, 857872. Le précurseur d'env est exceptionnellement long (983 acides aminés; poids moléculaire calculé; 115 kD). Les trois régions hydrophobes apparaissent dans le profil hydropathique de la figure 7. La première région hydrophobe (environ 25 acides aminés, au niveau des résidus 78 - 100) correspond proba vilement au peptide signal qui contribue au transport de la protéine à la membrane cellulaire. I1 est remarquable que cette séquence n'est pas N-terminale irais est suivie d'une longue séquence peptidique très hydrophile de 78 acides aminés. La seconde région hydrophobe (13 acides aminés, au niveau des résidus 658-679) est précédée d'un peptide très caractéristique contenant une séquence Arg-Lys-Lys- Arg pouvant représenter le site de clivage conduisant à la protéine mature (WH2-terminale) et dune protéine transmembranaire (COOH-terminale) La troisième région hydrophobe (19 acides aminés; résidus 832-850) correspond vraisemblablement à un segment transmembrannaire Les séquencesintermédiaires ou extérieures à ces régions hydrophobes sont d'un intérêt particulier pour la constitution soit de principes immunogènes in vivo, utilisables pour la constitution de compositions de vaccins. En particulier les séquences nucléotidiques codantes correspondantes peuvent être introdui.tes dans des vecteurs autorisant leur expression, dès lors qu'elles sont placées sous le contrôle d'un promoteur approprié, par exemple un promoteur de SV40, et suivies des sites de terminaison et de polyadénylation approprié, les vecteurs en question étant alors utilisables pour la transformation de cultu res cellulaires compétentes. Des vecteurs de ce type sont illustrés par exemple dans l'ouvrage intitulé "Advances in Hepatitîs Research" (Progrès de la Recherche relative à l'Répatite) publié par Francis V.CHISARI et édité par Masson Publishing USA, Inc. Les séquences selon la présente invention se prêtent particulièrement à la cons truction de vecteurs du type de ceux décrits par B. MOSS et al dans le chapitre intitulé "Expression of Hepatitis B virus Surface Antigen by Infectious Vaccinia virus Hybrids" (Expression de l'antigène de surface du virus de 1' hépatite B par des hybrides infectieux du virus de la vaccine). En particulier il est remarqué que l'une quel conque des séquences nucléotidiques sus-définies peut être insérée dans le gène TK du virus de la vaccine, sous le contre direct de son promoteur. Les produits d'expression des séquences nucléo tidiques peuvent également être utilisés dans des essais de diagnostic in vitro. On peut se reporter à la descrip tion de la demande de brevet européen N 84 401834 quelle décrit des techniques qui peuvent entre trans posées efficacement dans le cadre de la présente invention, par remplacement des extraits viraux ou protéines virales issus du virus LAV par les susdits produits d'expression. L'invention concerne enfin les anticorps poly clonaux ou monoclonaux qui peuvent être produits selon des techniques classiques contre les divers polypeptides pris e e n considération dans le cadre de la présente demande et, notamment leur application à la copposition de sérums anti-visna pour ox*at- tre les infections virales chez les animaux porteurs du virus L'invention concerne encore les séquences nucléotidiques spécifiques identifiées dans le tableau I, ainsi que les polypeptides correspondants Elle s'étend encore aux fragments ayant des séquences communes avec des polypeptides. Tous les polypeptides dont il est question dans cette demande sont accessibles par synthèse chimique, en mettant en oeuvre des procédés classiques dans la chimie des protéines I1 en est encore de même des séquences polynucléotidiques envisagées dans le cadre de la présente demande de brevet. L'invention concerne encore la totalité de la séquence nucléotidique du cADN dérivé du génome du visna, à l'exception des séquences nucléotidiques 24-528 et 91299202, qui, considérées isolément, ne sont pas susceptibles d'entrer dans le domaine de protection couvert par la présente demande de brevet. Les références bibliographiques incomplètes et auxquelles référence a été faite dans la partie intitulée "Procédures Expérimentales" sont encore indiquées ci-après: MESSING et al (1982), Gene 19,269-276; SANGER et al (1977); Proc.Natl Acad*Sci. U.S.A. 74, 5463 - 5467; BIGGEN et al (1983) Proc.Natl Acad. Sci U.S.A. 80 , 3963-3965 STADEN et al (1982) - article intitulé "Codon Reference and its use in identifying protein codîng regions in long DNA sequences. The applications of computers to research on nucleic acids" (Codons préférés et leur utilistation pour l'identification des régions codant pour des protéines dans de longues séquences d'ADN. Les applications des ordinateurs à la recherche sur les acides nucléiques) édité par D. SCULL et R.J ROBERTS, IRL Press , Oxford et Washington D.C. pp. 141-156) MILLS et al (1979, Proc.Natl.Acad.Sci, USA 76,2232-2235 REVENDICATIONS 1 - Polypeptide, protéine ou glycoprotéine caractérisées par la structure polypeptidique suivante 1 10 20 30 40 50 60 MASKESKPSR TTWRDMEPPL RETWNOVLOE LVKROOOEEE EQQGLYSGKK KSWVSIDLLG 70 80 90 100 110 120 TEGKDIKKVN IWEPCEKWFA OVVWGVLWVL OIVLWGCLMW EVRKGNOCQA EEVIALVSDP 130 140 150 160 170 180 GGFQRVOHVE TVPVTCVTKN FTQWGCQPEG AYPDPELEYR NISREILEEV YKODWPWNTY 190 200 210 220 230 240 HWPLWQMENM RQWMKENEKE YKERTNKTKE DIDDLVAGRI RGRFCVPYPY ALLRCEEWCW 250 260 270 280 290 300 YPESINOETG HAEKIKINCT KAKAVSCTEK MPLAAVORVY WEKEDEESMK FLNIKACNIS 310 320 330 340 350 360 LRCODEGKSP GGCVOGYPIP KGAEIIPEAM KYLRGKKSRY GGIKDKNGEL KLPLSVRViV 370 380 - 390 400 410 420 RMANLSGWVN GTPPYWSARI NGSTGINGTR WYGVGTLHHL GYNISSNPEG GICNFTGELW 430 440 450 460 . 470 480 IGGDRFPYYY KPSWNCSONW TGHPVWHVFR YLDMTEMMTS RCIORPKRHN ITVGNGTITG 490 500 510 520 530 540 NCSVTNWDGC NCTRSGNHLY NSTSGGLLVI ICRONSTITG IMGTNTNWTT MWNIYQNCSR j50 560 570 580 590 600 CNNSSLDRTG SGTLGTVNNL KCSLPHRNES NKWTCKSORD SYIAGRDFWG KVKAKYSCES 610 620 630 640 650 660 NLGGLDSMMH OOMLLQRYOV IRVRAYTYGV VEMPOSYMEE RGENRRSRRN LORKKRGIGL 670 680 690 700 710 720 VIVLAIMAII AAAGAGLGVA NAVOQSYTRT AVOSLANATA AOQEVLEASY AMVOHIAKGI 730 740 750 760 770 780 RILEARVARV EALVD*MMVY QELDCWHYQH YCVTSTRSEV ANYVNWTRFK DNCTWOOWEE 790 800 810 820 830 840 EIEDHEGNLS LLLREAALQV HIAQRDARRI PDAWKAIOEA FNWSSWFSWL KYIPhIIMGI 850 960 870 880 890 900 VGLMCFRILM CVISMCLOAY KQVKQIRYTO VTVVIEAPVE LEEKOKRNGD GTNGCASLEH 910 920 930 940 950 960 ERRTSHRSFI OIWRATWWAW KTSPWRHNWR TMPYITLLPI LVIWOWMEEW GWNGENOHKK 970 980 0 0 0 0 KKERVDCODR EOMPTLENDY VEL 2 - Séquence polypeptidique ou glycoprotéinique dont l'ossature polypeptidique est constituée par l'une des séquences qui s'étendent respectivement entre les aminoacides d'extrémité (b) 101 à 290 Cc) 101 à 656 (d) 550 à 656 (e) 671 à 831 (f) 671 à 740 (g) 859 à 953 les numérotations des aminoacides étant conformes à celles utilisées dans l'ossature polypeptidique de la revendication 1. 3 - Des fragments de polypeptides contenus à l'intérieur de ceux définis dans les séquences de la revendication 2 et qui comprennent au moins 10 amino acides, de préférence au moins 50 aminoacides 4 - Polynucléotides dont les structures correspondent à ceux qui s'étendent respectivement entre les nucléotides d'extrémité portant les Nos suivants dans les figures l-a à : (a) 5956 - 8904 (b) 6256 - 6826 (c) 6256 - 7924 (d) 7606 - 7924 (e) 7969 - 8176 (f) 7969 - 8176 (g) 8532 - 8904 5 - Composition de diagnostic, utilisable notamment dans le test ELISA pour la détection dans un prélè- vement biologique animal d'anticorps contre le VISNA, caractérisée en ce que ce principe actif est constitué par un au moins des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. Composition de diagnostic selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient , outre l'un au moins des polypeptides ou fragments de polypeptides selon la revendication 5, au moins l'un des polypeptides codés par la région "gag" de l'ADN du VISNA, notamment les glycoprotéines gp 150, gp 135, gp 7Q, gp 39 et gp 44 ou des fragments de celles-ci. 7 - Composition immunogène contenant un polypeptide, une protéine ou une glycoprotéine contenant l'os sature polypeptidique répondant à l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8 - ADN recombinant contenant une séquence nucléotidique conforme à la revendication 4 recombiné avec un ADN dirigé ou génome du VISNA. 9 - Culture cellulaire transformée par cet ADN recombinant et capable d'exmprimer le polypeptide codé par la susdite séquence nucléotidique.