Brevet FR2586563A1 — publié le 19870306

-1- La présente invention concerne des lectines- facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae ainsi que l'application de certains récepteurs immobilisés pour la préparation de ces facteurs et leur mise en évidence ou leur dosage. Plus particulièrement, il s'agit de la mise en évidence et de la caractérisation de lectines-facteurs d'attachement chez Neisseria gonorrhoeae d'origines diver- ses: souches de différentes collections de référence ainsi que souches responsables de gonococcies localisées et souches responsables de gonococcies disséminées. Ces facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae du type lectine ont pu être mis en évidence grâce à leur propriété d'adhésion à des récepteurs immobilisés sucrés, en particulier des récepteurs de type glucosamine ou maltose. La fixation des sucres précédents sur des supports immobilisants tels que l'agarose permet de purifier les lectines-facteurs d'attachement. Ces lectines-facteurs d'attachement, en raison de leur propriété antigénique, et/ou de leur activité de type lectine, peuvent être utili- sées dans des compositions pharmaceutiques, elles-mêmes ou les anticorps correspondants, soit à titre curatif, soit à titre préventif, pour le traitement ou surtout la prévention des infections gonococciques et également des infections mixtes avec d'autres bactéries, anaérobies par exemple. Ces lectines-facteurs d'attachement sont particu- lièrement intéressantes étant donné la recrudescence mon- diale actuelle de la gonococcie et de ses forme asymptoma- tiques. Ces lectines-facteurs d'attachement pourront en- trainer une rupture de la chaîne épidémiologique soit par l'établissement d'un diagnostic de laboratoire, soit, et surtout, par la mise au point d'un produit pharmaceutique préventif. -2- La présente invention concerne également un pro- cédé de préparation de ces lectines-facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae, caractérisé en ce que: a) des extraits protéiques de la membrane externe de Neisseria gonorrhoeae sont préparés puis solubilisés, b) ces extraits sont mis en présence de récepteurs sucrés immobilisés, c) puis les lectines-facteurs d'attachement ainsi fixées aux récepteurs sont séparés. Parmi les récepteurs sucrés immobilisés utilisa- bles dans le cadre de ce procédé, il faut citer plus par- ticulièrement les récepteurs sucrés immobilisés sur sup- port agarose de type glucosamine, maltose. Les récepteurs immobilisés peuvent se présenter sous une forme quelconque; en particulier, ils peuvent être utilisés sous forme de colonne ou bien mis en oeuvre par "batch". Enfin, les propriétés de fixation de ces lectines- facteurs d'attachement et leur spécificité permettent d'en- __ -Uvisager des procédés de dosage ou de mise en évidence de Neisseria gonorrhoeae notamment dans les produits patholo- giques. Ces procédés de mise en évidence de Neisseria gonorrhoeae comporteront au moins une étape de fixation des lectines-facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae sur un sucre récepteur de types glucosamine ou maltose, ce sucre récepteur étant de préférence immobilisé sur un sup- port tel qu'un support d'agarose. Les lectines-facteurs d'attachement présentant des propriétés antigéniques, il est possible de les mettre en évidence et/ou de les doser par des procédés immunologiques, en particulier par des procédés d'immunoélectrophorèse et immunoenzymatique. -3- Dans le cadre d'un dosage de type immunologique, on pourra doser ou mettre en évidence la présence de Neisseria gonorrhoeae dans un prélèvement en recherchant la disparition du précipité caractéristique antigène/ anticorps dans le prélèvement soumis préalablement à un traitement afin de libérer ces lectines-facteurs d'attache- ment de la membrane externe du gonocoque et à l'action d'un sucre récepteur fixant lesdites lectines-facteurs d'attachement. Il est également possible de metre en évidence les précipités spécifiques antigènes/anticorps correspon- dant aux lectines-facteurs d'attachement à partir du pré- lèvement ayant été soumis au traitement d'extraction de ces facteurs pariétaux puis ayant été traités par des ré- cepteurs sucrés immobilisés, lesdits récepteurs sucrés im- mobilisés étant séparés puis remis en solution pour libérer les éventuelles lectines-facteurs d'attachement. Bien entendu, la présence ou au contraire l'absen- ce de ces lectines-facteurs d'attachement caractérisées par des méthodes immunologiques mettant en oeuvre les réactions antigènes/anticorps peuvent être de types très varies, il peut en particulier s'agir d'immunoélectrophorèse telle que l'immunoélectrophorèse de type "lineabsorption" ou toute autre méthode immunologique bien connue de l'homme de métier. Enfin, il est possible d'élaborer des anticorps contre les antigènes des lectines-facteurs d'attachement par des procédés connus, lesdits anticorps étant également uti- les à titre de composants thérapeutiques et de réactifs pour le diagnostic. Les exemples suivants sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. -4- Sur les figures ci-annexées: - la figure 1 représente les immunoélectrophorèses quanti- tatives linaires de type "line-absorption" sur Neisseria gonorrhoeae pour les sérotypes: A figure la B figure lb - la figure 2 représente des immunoélectrophorèses comme la figure 1 mais pour les sérotypes: C figure 2a D figure 2b - la figure 3 représente une chromatographie d'affinité d'un extrait protéique de Neisseria gonorrhoeae. Exemple 1: Cet exemple a pour objet la mise en évidence des lectines-facteurs d'attachement décrits précédemment. Les sept sucres suivants ont été testés: maltose, galactosyl- amine,fucosylamine, glucosamine, acetylglucosamine, D ga- lactosamine, thiogalactoside. Ces sucres ont été fixes sur des billes d'agarose par des techniques connues de l'homme de métier. Pour la mise en oeuvre de l'exemple proprement dit une suspension bactérienne de 0,5 ml a été mise en contact avec 0,5 ml de sucre immobilisé sur des billes. Apres incubation, les billes ont été lavées puis colorées et observées au microscope. Suivant les sucres, deux cas se sont présentés. Pour les billes recouvertes d'a-D gluco- samine ou de maltose, Neisseria gonorrhoeae adhérait sur ces billes. Par contre, pour les autres sucres, aucune adhésion du gonocoque n'était observée. Afin de mettre en évidence la spécificité de ces fixations, la possibilité d'inhiber la fixation du gonocoque a été étudiée en faisant incuber préalablement la suspension de Neisseria gonorrhoeae avec un sucre libre correspondant au sucre fixé mis en oeu- vre dans l'étape suivante. Les résultats observes avec des -5- souches de référence de deux collections et des souches sauvages sont identiques et mettent en évidence la fixa- tion spécifique de ces lectines-facteurs d'attachement. La fixation était en effet inhibée uniquement si le sucre libre correspondant au mélange d'incubation étant ajouté en concentration suffisante (25 mg/ml). L'inhibition n'é- tait réalisée avec aucun autre sucre. Donc, il existe à la surface du gonocoque des lectines-facteurs d'attachement qui permettent l'adhésion sur des récepteurs immobilisés. Ceux-ci possèdent entre autres des résidus glucosamine et maltose. Ceci permet la purification de ces lectines-fac- teurs par chromatographie d'affinité sur des récepteurs sucrés immobilisés. Exemple 2: - Les extraits antigéniques pariétaux solubilisés du gonocoque ont été soumis à une immunoélectrophorèse type "line-absorption". Les mélanges antigéniques étaient incor- porés à des bandes d'agarose, ils migraient dans les gels contenant les antisérums polyvalents correspondants et quand un antigène rencontrait son anticorps spécifique à la con- centration appropriée du point d'équivalence, une ligne de précipitation était obtenue. Les figures 1 et 2 schémati- sent l'interprétation des résultats observés. Dans ces immunoélectrophorèses, les antigènes (Ag) étaient constitués par des extraits pariétaux (p) solubilisés de quatre souches de référence de gonocoque (GEIZER A, B, C, D), les anticorps (As) correspondaient aux antisérums spécifiques des extraits pariétaux. Les puits contenaient les sucres immobilisés sui- vants: puits 3: glucosamine, puits 7: galactosamine, puits 8: maltose. Pour les quatre sérotypes de GEIZER tes- tés, les résultats obtenus sont identiques: absorption des lignes de précipitation avec les sucres immobilisés maltose glucosamine uniquement. Exemple 3: Cet exemple montre la purification des facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae sérotype C de GEIZER réalisé par chromatographie d'affinité sur colonne agarose- glucosamine. Cette purification a été effectuée à partir de l'extrait protéique pariétal solubilisé du gonocoque: après fixation des lectinesfacteurs d'attachement sur les récepteurs sucrés immobilisés et élimination dans le pre- mier pic de la figure 3 des protéines n'interréagissant pas avec le sucre fixé, ces lectines-facteurs d'attachement étaient éludes par une solution de glucosamine à 0,25 M dans le deuxième pic. Ces lectines-facteurs d'attachement per- mettent de proposer: des explications concernant les interactions h8te-gonoco- que au niveau des cellules épithéliales de l'urètre et du rhinopharynx, des thérapeutiques curatives mais surtout préventives en raison des propriétés antigéniques de ces facteurs d'at- tachement, 20. des techniques nouvelles de diagnostic des infections gonococciques. _7-_ REVENDICATIONS 1. Lectines-facteurs d'attachement de la membrane externe de Neisseria gonorrhoeae autres que les protéines majeures (protéine II par exemple). 2. Lectines-facteurs d'attachement de Neisseria gonorrhoeae, selon la revendication 1, qui sont fixées sur des récepteurs sucrés tels que glucosamine ou maltose. 3. Récepteurs d'attachement spécifiques des lectines-facteurs d'attachement selon l'une des revendica- tions 1 et 2. 4. Anticorps dressés contre les lectines-facteurs d'attachement selon l'une des revendications 1 et 2. 5. Procédé de préparation des lectines-facteurs d'attachement selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que: a) on prépare à partir d'une souche de gonocoque un extrait antigénique pariétal, solubilisé ultérieurement, b) on met cet extrait en présence d'un récepteur sucré immobilisé, c) puis on sépare les lectines-facteurs d'attachement fixées sur ledit récepteur. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le récepteur sucré immobilisé comporte au moins un sucre tel que la glucosamine et le maltose. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sucre est choisi parmi l'a-D-glucosamine ou le maltose. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le support immobilisant le sucre est l'agarose. 9. Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif au moins une lectine-facteur d'attachement ou un récepteur ou leurs analogues spécifiques ou un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4. -8- 10. Procédé de mise en évidence et/ou de dosage des gonocoques dans un milieu, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de fixation des lectines- facteurs d'attachement des gonocoques sur un sucre. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le sucre est fixé sur un support. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le support est un support d'agarose. 13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le procédé mis en oeuvre est un pro- cédé de dosage immunologique. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le procédé mis en oeuvre comporte une étape d'im- munoélectrophorèse.