Brevet FR2588964A1 — publié le 19870424

La présente invention concerne un procédé permettant de déterminer l'aptitude que présente une macromolécule, d'abord a fixer sur elle un ligand transporté par une phase mobile venant en contact avec ladite molécule, puis à libérer ledit ligand. Elle concerne également un appareillage pour la mise en oeuvre de ce procédé. I1 est établi depuis fort longtemps que les macromolécules, en particulier les macromolécules biologiques, sont susceptibles d'établir des liaisons plus ou moins stables avec des ions et/ou des molécules présentant des masses beaucoup plus faibles. On designera, dans ce qui suit, par le terme "ligand", ces ions et petites molécules capables de venir se fixer sur les macromolécules. Dans la pratique, l'étude de la rétention des ligands ainsi définis par des macromolécules biologiques revêt une importance considerable dans des domaines très divers. On citera, par exemple, en médecine, l'étude du transport des principes actifs et des métabolites dans des liquides physiologiques et de leur fixation sur les protéines du sang, en biotechnologie, l'étude des réactions enzymatiques, dans le domaine des industries alimentaires, l'étude de la fixation et de la libération des éléments de la flaveur des aliments (comme les arômes) lors d'opérations technologiques, ainsi que l'étude du mode d'action des additifs alimentaires (comme les nitrites), et, en cosmétique, l'étude de la fixation et de la libération des parfums. Parmi toutes les associations envisageables, les interactions entre protéines et petites molécules sont généralement considérées comme ayant une grande importance et font, à l'heure actuelle, l'objet de nombreuses investigations. Comme exemples de protéines, on citera la sérumalbumine bovine, ainsi que les protéines alimentaires provenant d'isolats de végétaux, par exemple de soja et de pois. Ainsi, différentes techniques ont déjà été proposées pour évaluer la rétention d'un ligand par un substrat protéique. Cependant, toutes ces methodes actuellement en usage ne permettent cette évaluation que de facon ponctuelle ; il en résulte qu'à moins d'accroitre le nombre de mesures dans des proportions importantes, il n'est pas possible de juger de l'irréversibilité de la rétention et a fortiori de determiner l'allure de la désorption éventuelle. L'interaction de la sérumalbumine humaine avec plusieurs anions d'acides gras à longue chaine a été étudiée par la technique d'analyse par partage, par GOODMAN D.S., dans "J. Amer. Chem. Soc., Vol. 80, 3892-3898 (1958)". Cette technique expérimentale consiste à equilibrer des quantités variables de l'acide gras etudié entre deux phases, le n-heptane et une solution aqueuse de serumalbumine humaine dans un tampon phosphate. Pour atteindre l'équilibre, il n'a pas fallu moins de 48 heures, les ampoules renfermant les solutions à étudier devant par ailleurs être basculées à raison de 15 à 20 fois par minute. On voit donc les inconvénients que présente cette méthode, en dehors de l'inconvénient sus-indiqué, commun à toutes les méthodes actuellement connues. De meme,DAMODARAN S. et KINSELLA J.E. ont étudié, par la méthode de dialyse d'équilibre, l'interaction de cétones et aldéhydes avec des protéines de soja, comme cela est rapporté dans "J. Agric. Food Chem., 29, 1249-1253 (1981)". Dans cette methode, on utilise des cellules comportant chacune deux compartiments égaux séparés par une membrane. Dans une expérience typique, on place une quantite donnée de solution protéique dans l'un des compartiments et la même quantite d'une solution tampon contenant une quantite connue de ligand dans l'autre compartiment. On réalise simultanément la même opération dans d'autres cellules avec, a chaque fois, une quantite différente de ligand. On indique la également que l'on doit agiter les cellules pendant au moins 18 heures pour atteindre l'équilibre. Une foisce dernier atteint, on dose le ligand se situant dans chaque compartiment, la différence de concentration du ligand de part et d'autre d'une membrane représentant la quantité de ligand liée à la protéine. On connaît aussi la technique de l'analyse frontale utilisant la chromatographie par exclusion de taille, comme cela est rapporté par MORRIS M.J. et BROWN J.R. dans "J. Pharm. Pharmac., 29, 642-644 (1977)", qui ont étudié la liaison de principes médicamenteux aux proteines du plasma. Conformément a cette méthode, une colonne remplie d'une matière d'exclusion de taille ayant des pores suffisamment petits pour que seul le principe médicamenteux a l'état libre puisse pénétrer dans les pores, alors que la protéine et le complexe protEine-principe actif sont exclus. Un échantillon du mélange à analyser est injecté, de facon continue pendant un temps au moins égal au temps de rétention du principe actif, a l'entrée de la colonne. Au fur et à mesure que le front descend dans la colonne, le principe médicamenteux non lié est retardé par rapport à la protéine et au complexe protéine-principe actif. L'inconvénient majeur de cette méthode, qui s'ajoute a l'inconvénient sus-indiqué commune toutes les méthodes connues, est qu'on ne peut opérer qu'a des vitesses très lentes d'écoulement dans la colonne, et que l'analyse d'un simple échantillon nécessite environ 2 heures de chromatographie. Par ailleurs, tel que cela est rapporté dans "Journal of Chromatography, 288, 377-388 (1984)", SUN S.F., KUO S.W. et NASH R.A. ont étudié la liaison de la warfarine aux sérumalbumines humaine et bovine par HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). Lors de leurs expériences, des echantillons d'une solution protéique étaient préalablement équilibres avec des quantités variables de warfarine, puis injectés sur la colonne de filtration sur gel et élués par une solution de warfarine qui constituait la phase mobile. OELRICHS B.A., KRATZING C.C., KELLY J.D. et WINZOR D.J. ont utilisé la méthode d'ultrafiltration pour rechercher l'interaction de l'acide ascorbique avec la sérumalbumine bovine, comme cela est rapporté dans "Internat. J. Vit. Nutr. Res. 54, 61-64 (1984)" ; des solutions renfermant une même quantité de sérumalbumine et des quantités variables d'acide ascorbique sont introduites dans un dispositif d'ultrafiltration, puis les concentrations d'ascorbate dans l'ultrafiltrat et dans le mélange sont calculées. Quant à MILLS O.E. et SOLMS J. dans "Lebensm. -Wiss. U. -Technol. 17, 331-335 (1984)", ils ont étudié l'interaction d'éléments'de flaveur avec les protéines du petit lait par analyse de l'espace de tête en chromatographie en phase gazeuse. Les solutions protéine/élément de flaveur ont dû être agitées en continu pendant au moins 16 heures avant de pouvoir être analysées en chromatographie en phase gazeuse. En outre, pour déterminer la réversibilité de la liaison, des quantités aliquotes de solutions protéine/ligand ont été mélangées a de l'isooctane et la concentration du ligand dans la phase isooctane a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse, mais il a fallu auparavant que les mélanges de la solution protéine/ligand et de l'isooctane soient agités pendant 16 heures. En outre, ces techniques connues, dont on vient de voir qu'elles nécessitent, pour la plupart, d'avoir a equilibrer au préalable les systemes à étudier, ce qui demande beaucoup de temps en laboratoire, permettent difficilement de rendre compte, avec certitude, s'il y a eu ou non liaison irréversible du ligand sur la protéine. Ceci vient du fait que les évaluations ne sont faites que de manière ponctuelle et qu'on ne reproduit jamais l'image du comportement réel du ligand vis- -vis de la macromolécule (par exemple, libération d'un arôme dans la bouche pendant la mastication). De plus, les quantites de ligand mises en oeuvre ne sont parfois pas du tout representatives de certains phénomènes reels, pour lesquels ces quantités de ligand sont extrêmement faibles. La présente invention vise a surmonter les difficultés qui viennent d'etre exposées et propose une technique permettant de mesurer, de manière dynamique, très rapidement et tres précisément, la rétention réelle d'un ligand par une macromolécule. A cet effet, selon l'invention, une quantité connue de la macromolecule que l'on désire étudier est confinée, sous forme solubilisée, dans la cellule d'un dispositif d'ultrafiltration, en amont de la membrane d'ultrafiltration, -et est lavée en continu avec une phase mobile (solution tampon), dans laquelle le ligand est injecté. Dans ces conditions, la macromolécule va jouer le rôle d'une phase stationnaire qui va retenir le ligand pendant un temps plus ou moins long, suivant le débit de la phase mobile et l'affinité de la macromolécule pour le ligand considére. Les concentrations instantanées de ligand dans la phase mobile sont déterminées en aval de la membrane d'ultrafiltration, à l'aide des moyens de détection classiques de la chromatographie liquide.Le profil d'élution obtenu en présence d'une quantité connue de macromolécule est comparé avec le profil témoin obtenu pour le même ligand, dans les mêmes conditions expérimentales, mais sans macromolécule-. La comparaison de ces profils d'élution permet, d'une part, de déterminer la proportion du ligand fixé de maniere irréversible sur la macromolécule, et, d'autre part, d'avoir accès aux paramètres qui définissent l'équilibre macromolécule-ligand. On voit, par ailleurs, que l'on peut, sans inconvénient, injecter de tres faibles quantités de ligand dans la phase mobile, si on le souhaite, afin d'obtenir une représentation correcte de certains phénomènes réels. La présente invention offre aussi l'avantage complémentaire que la inacromolécule peut être réutilisée et réétudiée, ce qui est intéressant notamment dans le cas où l'on veut se rendre compte de l'influence d'un paramètre sur le systeme, par exemple, l'influence du pH sur l'aptitude de la macromolécule a lier le ligand. On est sûr alors de travailler sur un meme échantillon de macromolécule. La presente invention a donc d'abord pour objet un procédé permettant de déterminer l'aptitude que présente une macromolécule, d'abord a fixer sur elle un ligand transporte par une phase mobile venant en contact avec elle, puis a libérer ledit ligand, caractérise par le fait a/ on dispose dans la cellule d'un dispositif d'ultrafiltration, une membrane d'ultrafiltration capable de retenir ladite macromolécule et de laisser passer ledit ligand b/ on prépare une solution de concentration déterminée en ladite macromolécule et on introduit une quantité déterminée de ladite solution dans ladite cellule, afin d'emprisonner dans cette dernière, en amont de ladite membrane, une quantite déterminée de ladite macromolécule c/ on fait traverser ladite cellule par ladite phase mobile, cette derniere étant introduite en amont de ladite membrane et extraite en aval de cette derniere ; d/ on introduit, dans ladite phase mobile, en amont de ladite cellule, une quantité déterminée dudit ligand ; e/ on détecte les valeurs d'un paramètre relié à la concentration dudit ligand dans la phase mobile extraite de ladite cellule, en fonction du temps ; f/ on reproduit les étapes c/ a e/ dans les mêmes conditions operatoires, excepte que la cellul.e ne renferme pas ladite macromolécule ; g/ on compare les resultats obtenus à la fin des étapes e/ et f/ et on en déduit les parametres concernant l'affinité dudit ligand pour ladite macromolécule et la vitesse de desorption du ligand lié réversi- blement a ladite macromolécule. Conformément a un mode particulier de réalisation du procédé selon la présente invention, on extrait en continu du compartiment de la cellule situé en amont de la membrane une fraction de la solution renfermant la macromolécule à étudier, pour la recycler dans ledit compartiment. De préférence, on recycle une fraction de l'ordre de 15 à 25%, et notamment de 20%, de la solution contenue dans le compartiment amont de la cellule. Il peut s' avérer utile d'homogeneiser le courant d'alimentation de la cellule et le courant de recyclage, dans une chambre de mélange, avant leur introduction dans ladite cellule. En outre, on peut introduire le ligand dans la phase mobile soit d'une facon intermittente, soit d'une facon continue. Dans ce deuxième cas, on peut avantageusement introduire le ligand dans la phase mobile avant mise en circulation de celle-ci. On détermine la concentration du ligand dans la phase mobile extraite de la cellule par un moyen habituellement utilisé en chromatographie en phase liquide, comme l'absorption U.V., l'émission fluorimétrique, la modification de l'indice de réfraction, le dosage d'un composé radioactif ou touteautre technique de détection. En règle générale, on choisit, comme phase mobile, une solution dont le pH a été ajuste. Pour des raisons de commodité, on fait généralement circuler la phase mobile a un débit constant, mais ceci ne comporte aucun caractère d'obligation. La présente invention a également pour objet un appareillage pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus ; cet appareillage étant caractérisé par le fait qu'il comprend al un premier réservoir destiné à renfermer la solution de la macromolécule à étudier ; b/ un second réservoir destiné à renfermer la phase mobile ; ci une cellule d'ultrafiltration équipée d'une membrane d'ultrafiltration capable de retenir ladite macromolécule et de laisser passer le ligand ; d/ une première canalisation d'alimentation reliant ledit premier réservoir a l'entrée de ladite cellule ; e/ une seconde canalisation d'alimentation reliant ledit second réservoir a l'entrée de ladite cellule ; f/ une canalisation d'extraction connectée à la sortie de ladite cellule ; ; g/ un moyen permettant d'introduire une quantité déterminée de ligand dans ladite seconde canalisation d'alimentation hi un moyen de mise en circulation des courants d'alimentation et d'extraction i/ un moyen permettant de détecter en continu les valeurs d'un paramètre relié à la concentration du ligand dans la phase mobile circulant dans ladite canalisation d'extraction ;; j/ un moyen permettant de calculer, a partir des valeurs ai-nsi détectées, les paramètres concernant l'affinité dudit ligand pour ladite macromolécule et la vitesse de désorption du ligand lié reversiblement kl éventuellement, une canalisation de recyclage permettantd'extraire une fraction de la solution de la macromolécule a étudier, contenue dans le compartiment de la cellule d'ultrafiltration se situant en amont de la membrane, et de la renvoyer dans ledit compartiment, un moyen de mise en circulation du courant recyclé étant interposé sur ladite canalisation de recyclage ; et 1/ éventuellement, une chambre de mélange disposée en amont de ladite cellule d'ultrafiltration et recevant les courants provenant de ladite canalisation de recyclage et de ladite seconde canalisation d'alimentation de ladite cellule. On peut prévoir que les premiere et seconde canalisations d'alimentation aient en commun leur section connectee à l'entrée de la cellule, un moyen permettant de relier tour a tour les premier et second réservoirs à l'entrée de ladite cellule. Le moyen de mise en circulation des courants dtalimentation de la cellule et, éventuellement, la chambre de mélange sont alors interposes sur la section commune des -prem-iere et seconde canalisations d'alimentation. Dans le cas où on effectue une introduction du ligand dans la phase mobile d'une facon intermittente, le moyen g/ précité consiste avantageusement en une vanne d'injection disposee juste en amont de la cellule d'ultrafiltration. Pour mieux faire comprendre l'objet de la presente invention, on décrira plus en détail ci-apres, à titre indicatif et non limitatif, et en référence au dessin annexé, d'une part, un mode particulier de réalisation d'un appareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et, d'autre part, l'étude d'un système vanilline-serumalbu- mine bovine (B.S.A.), réalisée à l'aide de cet appareillage. Sur le dessin sus-indiqué - la figure 1 est une vue schématique de l'appareillage utilisé ; et - la figure 2 représente les courbes d'elution de la vanilline obtenues respectivement en la presence et en l'absence de B.S.A.. I - Description de l'appareillage utilisé Cet appareillage, représenté schematiquement sur la figure 1, comporte une cellule d'ultrafiltration 1 dont la membrane "Millipore type PCAC 04710" permet une coupure théorique a 1000 du poids moléculaire, cette membrane 2 étant supportée par un disque en acier inoxydable "Millipore type XX 44 047 00". En amont de la cellule d'ultrafiltration 1, est dispose un injecteur 3 constitué par une vanne "Rhéodyne modèle 7125", munie d'une boucle d'échantillonnage de 100 ciel. La connection 4 entre l'injecteur 3 et la cellule d'ultrafiltration 1 est constituée par un tube en acier inoxydable de 6,35 mm de diamètre extérieur. L'appareillage comporte un réservoir 5 destiné a renfermer une solution de B.S.A. de concentration connue et un réservoir 6 de phase mobile, à savoir une solution aqueuse à pH ajusté, qui servira a éluer le ligand, en l'occurence la vanilline. Les réservoirs 5 et 6 sont reliés chacun a l'injecteur 3 par une canalisation en deux sections, respectivement 7-8 et 9-8, la section commune 8 étant celle reliée a l'injecteur 3. Une vanne 10 est prévue pour connecter ou bien les troncons 7 et 8 lorsque l'on souhaite charger la cellule 1 en la solution de B.S.A. à etudier, ou bien les troncons 9 et 8, lorsque l'on doit effectuer les élutions. Sur le troncon 8 sont interposés successivement une pompe 11 et une chambre de mélange 12, la chambre de mélange étant situé? entre la pompe 11 et l'injecteur 3; On a utilisé dans le cas présent une pompe "KONTRON, modèle 411", qui est une pompe doseuse de H.P.L.C. Conviendraient également des pompes volumétriques de moyenne pression. Quant a la chambre de mélange utilisée, elle consistait en une capsule en acier inoxydable 316 résistant a la pression, un barreau magnétique revêtu de Téflon étant mis en rotation a l'intérieur de ladite capsule a une vitesse optimale. Cette chambre de mélange 12 sert en fait à mélanger le courant d'alimentation provenant de la canalisation 9-8 et un courant provenant d'une canalisation de recyclage 13 provenant du compartiment la de la cellule 1 situé en amont de la membrane 2. Sur la canalisation 13, est interposée une pompe 14 de même type que la pompe 12. Sur la canalisation 15 de sortie de la cellule 1, est disposé un détecteur 16 qui consiste en l'occurence en un spectrofluorimetre du type "KONTRON S.F.M. 25" dont le rôle est de déterminer les concentrations instantanées de vanilline dans la phase mobile. Cet effluent est ensuite mis au rebut ou récupéré en 17. Un moyen de calcul 18,. en l'occurence un microordinateur "APPLE 2E" est interfacé avec le détecteur 16 pour permettre le pilotage é distancent l-a collecte des données digitalisées et pour realiser leur traitement. II - Mode operatoire Première étape : Initialisation du systeme. On choisit la valeur théorique du-débit de la phase mobile (tampon). En général, cette valeur est de 0,25 ml/mn. On choisit la valeur du taux de recyclage. Le plus souvent, cette valeur est 20%. On met en route les pompes 11 et 14. On met en route le détecteur 16 ainsi que le moyen de calcul 18. Deuxième étape : Etablissement de la courbe d'solution du ligand (vanilline) dans le systeme en l'absence de B.S.A. (profil de référence). On introduit la vanilline dans la phase mobile ; de facon typique, on injecte, dans l'injecteur 3, 100 ul d'une solution aqueuse de vanilline a 0,125% en poids (soit à 1,25 g/l ou 0,033 M en concentration moléculaire). Dans ce cas, la quantité totale de vanilline introduite est donc de 125 ug. On mesure le paramètre caractéristique du ligand permettant d'évaluer sa concentration. Dans le cas de l'appareillage utilisé, on obtient une transmission toutes les 12 secondes d'une valeur pondérée de l'émission fluorimétrique. Le débit de l'effluent est de 0,2 ml/mn (soit 0,25 (1 - 0,2) ml/mn). Le volume total d'effluent collecté est de 30 ml. Troisieme étape : Charge du système avec la protéine a étudier (B.S.A.). On arrête la circulation de la phase mobile. On introduit dans le système une solution de la protéine a étudier ; en l'occurence, on introduit 15 ml d'une solution aqueuse tamponnee de B.S.A. a 0,5% en poids (soit a 5 g/l ou 0,075 mM en concentration moléculaire). te tampon utilisé est le même que celui de la phase mobile. Dans ce cas, la quantité totale de B.S.A. introduite dans le système est de 75 mg. Les conditions de débit sont identiques a celles utilisées a la deuxième étape. On rétablit la circulation de la phase mobile et on fait suivre d'une étape de rincage (environ 5 ml du tampon utilisé). Quatrième étape : Réalisation de la mesure. On procède comme indiqué a la deuxieme étape. Cinquième étape : Comparaison des données relatives au profil temoin et à la mesure. On transforme les données brutes en donnees corrigées en soustrayant les bruits de fond inhérents au detecteur. On normalise les données en soustrayant le volume mort du système. On juxtapose les graphes. On calcule les paramètres classiques (coefficient global de liaison, nombre théorique des sites de fixation) au moyen des fichiers numériques de données. On estime la rétention irreversible par comparaison des surfaces comprises sous les deux courbes. On estime la quantité de ligand liée réversiblement par comparaison des surfaces comprises entre les deux courbes. On peut recommencer des expériences à partir de la quatrième étape si l'on souhaite modifier les conditions de pH, à partir de la troisième étape si l'on souhaite modifier des paramètres relatifs à a protéine, à partir de la deuxième étape si l'on souhaite modifier notablement la gamme de concentrations du ligand ou changer la nature du ligand. III - Exploitation des résultats On a pu tracer les deux courbes d'élution représentées sur la figure 2. Sur le graphique de cette figure 2, la zone comportant des hachures obliques correspond a la fixation de la vanilline sur la B.S.A. ; quant à la zone comportant des hachures verticales, elle correspond a la libération de la vanilline par la B.S.A.. La comparaison des surfaces de ces zones permet de déterminer la proportion de vanilline fixée de maniere irréversible sur la B.S.A.. En l'occurence, le rapport de ces surfaces présente une valeur très proche de 1, ce qui veut dire qu'il ne s'est pratiquement pas formé de liaisons irréversibles. Les courbes de la figure 2 permettent aussi d'avoir accès aux paramètres qui définissent l'équilibre B.S.A.-vanilline. Ainsi, si l'on considere les points P, P1 et P2 montrés sur la figure 2, les points P1 et P2 étant pris dans les parties commencantes d'elution respectives, le rapport, R, de la distance du point P1 au point P a la distance du point P2 au point P permet de calculer la fraction de la vanilline liée à la B.S.A. a partir de la formule % du ligand lie = 100 (1 - R). REVENDICATIONS 1. Procédé permettant de déterminer l'aptitude que présente une macromolécule, d'abord à fixer sur elle un ligand transporté par une phase mobile venant en contact avec elle, puis à libérer ledit ligand, caractérisé par le fait que a/ on dispose, dans la cellule (1) d'un dispositif d'ultrafiltration, une membrane d'ultrafiltration (2) capable de retenir ladite macromolécule et de laisser ledit ligand ; b/ on prépare une solution de concentration déterminée en ladite macromolécule et on introduit une quantité de ladite solution dans ladite cellule (1), afin d'emprisonner dans cette dernière, en amont de ladite membrane (2), une quantité déterminée de ladite macromolécule ; cl on fait traverser ladite cellule (1) par ladite phase mobile, cette derniere étant introduite en amont de ladite membrane (2) et extraite en aval de cette dernière ;; d/ on introduit, dans ladite phase mobile, en amont de ladite cellule (1), une quantité déterminée dudit ligand ; e/ on détecte les valeurs d'un parametre relié à la concentration dudit ligand dans la phase mobile extraite de ladite cellule (1), en fonction du temps ; f/ on reproduit les étapes c/ à e/ dans les mêmes conditions opératoires, excepté que la cellule (1) ne renferme pas ladite macromolécule ; g/ on compare les résultats obtenus à la fin des étapes el et f/ et on en déduit les paramètres concernant l'affinité dudit ligand pour ladite macromolécule et la vitesse de désorption du ligand lie réversiblement à ladite macromolécule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on extrait en continu du compartiment (la) de la cellule (1) situé en amont de la membrane (2), une fraction de la solution renfermant la macromolécule à étudier, pour la recycler dans ledit compartiment (la). 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on recycle une fraction de l'ordre de 15 à 252 de la solution contenue dans le compartiment amont (la) de la cellule (1). 4. Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on homogénéise le courant d'alimentation de la cellule (1) et le courant de recyclage, dans une chambre de mélange (12), avant leur introduction dans ladite cellule (1). 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 4, caractérisé par le fait qu'on introduit le ligand dans la phase mobile d'une facon intermittente. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 et 4, caractérisé par le fait qu on introduit le ligand dans la phase mobile d'une faon continue. 7. Procedé selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'on introduit le ligand dans la phase mobile avant mise en circulation de celle-ci. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 et 7, caractérisé par le fait qu'on détermine la concentration du ligand dans la phase mobile extraite de la cellule (1) par un moyen habituellement utilisé en chromatographie en phase liquide,comme l'absorption U.V., l'émission fluorimétrique, la modification de l'indice de réfraction, le dosage d'un composé radioactif ou toute autre technique de détection. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 et 8, caractérisé par le fait qu'on choisit, comme phase mobile, une solution dont le pH a été ajusté. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 et 9, caractérisé par le fait qu'on fait circuler la phase mobile à un débit constant. 11. Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé tel que defini à l'une des revendications 1 a 10, caractérisé par le fait qu'il comprend a/ un premier réservoir (5) destiné a renfermer la solution de la macromolécule à étudier b/ un second réservoir (6) destiné à renfermer la phase mobile ; c/ une cellule d'ultrafiltration (1) équipée d'une membrane d'ultrafiltration (2) capable de retenir ladite macromolécule et de laisser passer le ligand d/ une première canalisation d'alimentation (7-8) reliant ledit premier réservoir (5) a l'entrée de ladite cellule (1) e/ une seconde canalisation d'alimentation (9-8) reliant ledit second réservoir (6) a l'entrée de ladite cellule (1) f/ une canalisation d'extraction (15) connectée à la sortie de ladite cellule (1) ;; 9/ un moyen (3) permettant d'introduire une quantité déterminée de ligand dans ladite seconde canalisation d'alimentation (9-8) ; h/ un moyen (11) de mise en circulation des courants d'alimentation et d'extraction (7-8 ; 9-8 ; 15) ; i/ un moyen (16) permettant de détecter en continu les valeurs d'un paramètre relié a la concentration du ligand dans. la phase mobile circulant dans ladite canalisation d'extraction (15) jl un moyen (18) permettant de calculer, à partir des valeurs ainsi detectées, les paramètres concernant l'affinité dudit ligand par ladite macromolécule et la vitesse de désorption du ligand lié réversiblement ;; k/ éventuellement, une canalisation de recyclage (13! permettant d'extraire une fraction de la solution de la macromolécule à étudier, contenue dans le compartiment (la) de la cellule d'ultrafiltration (1) se situant en amont de la membrane (2), et de la renvoyer dans ledit compartiment (la), un moyen (14) de mise en circulation du courant recyclé étant interposé sur ladite canalisation de recyclage (13) 1/ éventuellement, une chambre de mélange (12) disposée en amont de ladite cellule d'ultrafiltration (1) et recevant les courants provenant de ladite canalisation de recyclage (13) et de ladite canalisation d'alimentation (9-8) de ladite cellule (1). 12. Appareillage selon la revendication 11, caractérisé par le fait que les première (7-8) et seconde (9-8) canalisations d'alimentation ont en commun leur section (8) connectée a l'entrée de la cellule (1), un moyen (10) permettant de relier tour a tour les premier (5) et second (6) réservoirs à l'entrée de ladite cellule (1). 13. Appareillage selon les revendications 11 et 12 prises simultanement, caractérisé par le fait que le moyen (11) de mise en circulation des courants d'alimentation de la cellule et, éventuellement, la chambre de mélange (12) sont interposés sur la section commune (8) des première (7-8) et seconde (9-8) canalisations d'alimentation. 14. Appareillage selon l'une des revendications 11 à 13, permettant une introduction du ligand dans la phase mobile d'une facon intermittente, caractérisé par le fait que le moyen (3) consiste en une vanne d'injection disposée juste en amont de la cellule d'ultrafiltration (1).