Brevet FR2595100A1 — publié le 19870904

La présente invention est relative à la préparation de sondes moléculaires d'ADN spécifique utiles pour la détermination du sexe - ou sexage - d'embryons ou de foetus de mammifères, notamment du genre Bos, présentant des séquences d'ADN spécifique du sexe male. Le sexage des embryons et des foetus présente un grand intérêt à plusieurs égards. La détermination du sexe d'embryons humains permet une détection précoce de maladies génétiques graves liées au sexe de l'embryon. La détermination du sexe d'embryons d'animaux d'élevage (ou sexage) présente quant à elle un grand intérêt economique. Comme on le sait, le sexe (mule ou femelle) est déterminé par les chromosomes sexuels. Chez les mammifères la présence d'un chromosome Y est suffisante pour produire un phénotype male et il semble que les gènes déterminant le sexe presents sur le chromosome Y se comportent comme un trait génétique dominant. La première démarche adoptée pour la détermination précoce du sexe des embryons humains a donc consisté en une analyse chromosomique de cellules de liquide amniotique mises en culture. Cependant comme ce type d'analyse dure deux à trois semaines, il est apparu nécessaire de pourvoir à d'autres méthodes de détermination précoce du sexe d'embryons, susceptibles de donner des résultats plus rapides. I1 a été établi que la totalité du chromosome Y n'est pas impliquée dans la différenciation sexuelle. I1 a donc paru logique d'analyser les séquences présentes sur le chromosome Y et la première démarche dans ce sens a consisté à isoler et cloner 1'ADN du chromosome Y. C'est ainsi que KUNKEL et Al. (notamment dans BIOCHEM vol. 18, nO 15 p. 3343-3353, 1979) ont isolé des fragments de 3,4 -kilobases (kb) d'ADN de maies humains par coupure à l'aide d'endonucléases de restriction telles que HaeIII, EcoRI ou EcoRII et ont montré que 1'ADN répétifif spécifique du chromosome Y (ADN Y-it) est présent dans ces molécules de 3,4 kb. Cependant si les travaux de KUNKEL et Al. donnent des indications précieuses sur l'Qrganisa- tion de deux types de séquences répétitives, respectivement spécifique et non spécifique du chromosome Y, dans chaque molécule de 3,4 kb, ils ne sont pas utilisables directement dans le sexage. Les travaux de BISHOP et Al. (NATURE, vol. 303,30 Juin 1983, p. 831-832) ont visé à construire une librairie partielle du chromosome Y en utilisant un hybride de cellules somatiques contenant uniquement le chromosome Y humain sur une base murine, obtenu par fusion de lymphocytes humains males avec la lignée cellulaire murine RAG et contenant un nombre modal de quatre chromosomes Y humains par cellule ; ils ont extrait de l'hybride de 1'ADN de poids moléculaire élevé, et ont réalisé une digestion partielle à l'aide de l'enzyme de restriction MboI et ont cloné les fragments de 35-50 kb dans des bactéries Escherichia coli en utilisant le cosmide pJB8.Pour différencier les clones contenant des inserts d'ADN humains (dérivés d'Y) de ceux contenant de l'ADN murin, les colonies ont été testées à basse densité avec de l'ADN humain répétitif 32p-marqué, dans le but de ne détecter que les séquences répétitives et de créer la banque visée. Les Auteurs ont sélectionné parmi les clones recombinés des séquences d'ADN nonrépétitif dérivé de Y afin d'étudier l'organisation du chromosome Y humain au niveau moléculaire. Ces travaux dont l'intéret scientifique est déterminant, ne sont pas, eux non plus, directement utilisables pour le sexage des embryons de mammifères d'élevage. Plusieurs méthodes de détermination précoce du sexe d'embryons humains ont été proposées sur la base des travaux de KUNKEL et Al., c'est-à-dire en utilisant des séquences d'ADN spécifique du chromosome Y. En particulier LAU et Al. (THE LANCET, 7 Janvier 1984, p. 14-16) ont pro- posé un test de détermination du sexe chez l'embryon humain à l'aid d'une sonde isolée à partir de la séquence répétitive humaine de 3,4 kb dérivée de l'hétérochromatine du chromosome Y (méthode de KUNKEL et Ai.). Cette sonde a ensuite été hybridée à de 1'ADN isolé d'un petit nombre de cellules provenant de 0,2 ml de liquide amniotique.Le taux d'hybridation est 1000 fois plus grand à l'égard de 1'ADN génomique male (isolé de cellules de liquide amniotique) qu'à l'égard de 1'ADN génomique femelle. La méthode proposée par GOSDEN et Al. (THE LANCET, 10 mars 1984, p. 540-541) qui est la méthode des "DOT BLOT" utilise une sonde spécif i- que du chromosome Y, dénommée pHY2,1 précédemment décrite par ces Auteurs. Cette sonde s'hybride à de 1'ADN provenant d'une biopsie de villosités choriales d'un embryon humain maire. LAMAR et PALMER (CELL, vol. 37, Mai 1984, p. 171177) ont cherché à développer une méthode générale de clonage de 1'ADN du chromosome Y chez la souris. La méthode proposée par ces Auteurs consiste à fragmenter 1'ADN de foie de souris femelles par sonication et à digérer complètement de 1'ADN de souris males par MbOI. Un échantillon de 1'ADN femelle fragmenté et 1'ADN male digéré sont mélangés dans une proportion de 100:1. Le mélange est dénaturé et réassocié à un Cot=1320 dans un tampon approprié : dans ces conditions, 95 % de 1'ADN est sous forme double brin.Ceux-ci sont constitués d'ADN femelle homogène, de double-brins hétérogènes male-femelle correspondant aux séquences communes aux deux sexes et enfin de duplex spécifiques males. Les double-brins sont isolés par chromatographie sur colonne d'hydroxylapatite. Ils sont recombinés dans le plasmide pBR 322. Les plasmides recombinants sont utilisés pour transformer des bactéries Escherichia Coli HB 101 compétentes. Environ 100 000 clones (Ampr-TetS) ont été testés, parmi lesquels 3 000 contiennent de 1'ADN présumé spécifique du chromosome Y. Trois de ces sondes se sont révélées etre spécifiques de la souris male, ce qui tendrait à démontrer une spécificité d'espèce des sondes moléculaires d'ADN male. La présente invention s'est donné pour but de pourvoir d'une part à des sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, présentant des séquences d'ADN spécifique du sexe male, et d'autre part àuneméthode de détermination du sexe de ces animaux à l'aide des sondes susdites, qui répondent de façon satisfaisante aux besoins de la technique considéree en ce qu'elles permettent le sexage d'embryons bovins et analogues à partir d'un petit nombre de cellules embryonnaires, n' excédant pas 500 à 1000, permettant la détermination du sexe des embryons à un stade précoce du développement, avec un taux de fiabilité de 100 %. La présente invention a pour objet une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, caractérisée en ce qu'elle présente un profil d'hybridation, déterminé par hybridation de ladite sonde avec de 1'ADN génomique male digéré par une enzyme appropriée, qui fait apparaître la présence d'au moins une bande spécifique du génome male des mammifères considérés. Selon un mode de réalisation avantageux de la sonde moléculaire conforme à la présente invention, son profil d'hybridation, déterminé par hybridation de ladite sonde avec de 1'ADN génomique male digéré par EcoRI, fait apparaître la présence d'une bande de l'ordre de 7 kb qui est spécifique du génome male du genre Bos. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la sonde moléculaire conforme à la présente invention, elle comprend 49 paires de bases dont la séquence en nucléotides est la suivante 5' 3' ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT ou un fragment de ladite séquence comportant au moins 11 nucléotides, laquelle sonde est désignée par la dénomination b.c.1.2. Sa séquence en nucléotides a été determinsse par la méthode de MAXAM et GILBERT CMETHODS ENZYMOL..65. 499 (1977)J. L'hybridation de la sonde b.c.1.2 avec de 1'ADN génomique male digéré par EcoRI révèle la présence d'une bande de 7 kilobases (kb) absente de 1'ADN génomique femelle. La présente invention a également pour objet des procédés de préparation d'une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos. Selon un aspect de la présente invention, un pro- céde de préparation d'une telle sonde moléculaire,qui réalise la réassociation de segments d'ADN génomique rendus simple brin, à partir d'un mélange d'ADN male et femelle dans lequel 1'ADN femelle est en grand excès (de l'ordre de 100 parties pour 1 partie d'ADN male), est caractérisé en ce qu'il comprend : - une première étape au cours de laquelle de 1'ADN gnomique femelle provenant de lymphoeytes pérîpheriques desdits mmrdfères est coupé par sonication en fragments oe 200 à 550 paires de bases (pb), puis mélangé dans une proportion de l'ordre de 100:1, à de 1'ADN génomique male provenant également de lymphocytes périphériques, digéré par l'endonuciéase SAU 3A pour libérer des fragments de restriction à extrémités cohésives, de taille comprise environ entre 40 et 1650 pb ; - une deuxième étape au cours de laquelle ledit mélange d'ADN, après avoir été extrait d'une manière connue en elle-meme par un mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique et précipité par l'éthanol, est dénaturé à 100 C puis réassocié à 68 C pendant 22 heures dans un tampon contenant 2M(NH4)2SO4, 50 mM phosphate de sodium (pH = 6,8) et 5 mM EDTA ; - une troisième étape au cours de laquelle 1'ADN double brin réassocié est mélangé avec un plasmide tel que le plasmide pUC9 (Ampr-Lac Z préalablement linéarisé par l'endonucléase BamHI et dephospho- rylé par de la phosphatase alcaline, en présence de ligase T4 qui réalise l'insertion de 1'ADN dans le plasmide, par contact pendant 16 heures à 16 C; - une quatrième étape au cours de laquelle les plasmides recombinants obtenus lors de l'étape précédente, sont utilisés pour transformer des cellules d'Escherichia coli rendues hautement compétentes, les clones recombinants (Ampr Lac Z) étant obtenus dans une proportion d'environ 200 clones pour 2 ml de suspension de cellules bactériennes. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de préparation de la sonde moléculaire conforme à l'invention, les cellules bactériennes d'Escherichia coli sont rendues hautement compétentes, préalablement a l'insertion des plasmides recombinants, par traitement pendant dix minutes a 0 C par un milieu comprenant : 10 mM K-Mes (pH = 6,2), 100 mM RbC12, 45 mM MnCl2, 3 mM Co(NH3)6 C13. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, les bactéries transformées sont étalées sur un milieu gélosé contenant de l'Ampicilline et du X-gal (ou 5-bromo-4-chloro-3-indolyl B-D-galacto-pyranoside) à faible concentration dans du diméthylformamide, les colonies bactériennes isolées (Amp La Z ) sont repiquées individuellement, puis ampli- fiées en vue de la préparation de minilysats, puis chaque plasmide isole est digéré par l'endonucléase Pvu2, marqué au 32p et hybridé avec de 1'ADN génomique provenant de lymphocytes périphériques de bovins ou de mammifères similaires et 1'ADN de ces animaux est digéré par l'endonucléase EcoRI qui génère des fragments de restriction de taille variable. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ces fragments sont séparés par migration électrophorétique sur gel d'agarose. Selon un autre aspect du procédé de préparation d'une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, une telle sonde est obtenue par synthèse, le procédé de synthèse étant caractérisé en ce que la séquence en nucléotides que comprend ladite sonde est synthétisée par la technique de phosphoramidite en phase solide. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse de I'oligonucléotide qui entre dans la composition de la sonde moléculaire conforme à l'invention, la synthèse proprement dite est suivie d'une étape de purification qui consiste en une séparation de l'oligonucléotide d'une taille donnée recherché, associé à des oligonucléotides de taille intermédiaire, par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, puis repérage de la bande de l'oligonucléotide pur recherché, à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de gel de silice, fluorescente à 254 nm, découpage de cette bande et élution de 1'ADN dans une solution appropriée, puis récupération de 1'ADN pur synthétisé. Selon un autre mode de mise en-oeuvre préféré du procédé de synthèse de la sonde moléculaîre conforme à l'invention, cette dernière est marquée au 32p après purification de l'oligonucléotide de synthèse. La présente invention a également pour objet la mise en oeuvre des sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment du genre Bos, pour la détermination du sexe d'embryons et de foetus desdits mammifères, lequel procédé de détermination est caractérisé en ce qu'une sonde conforme à l'invention, hybridée à un filtre préhybridé de manière appropriée connue en elle-meme, lorsqu'elle est réassociée à de 1'ADN génomique de mammifères du genre Bos, male et femelle, préalablement transféré sur un filtre approprié, après avoir été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose, s'hybride exclusivement à 1'ADN génomique male, et cette hybridation est mise en évidence par autoradiographie et/ou par sonde froide, par la présence de signaux d'hybridation en forme de bandes [SOUTHERN (J. Mol. Biol. 98, 503 (1975) Selon un mode de réalisation de la méthode de détermination du sexe - ou sexage - d'embryons et de foetus des mammifères susdits, 1'ADN génomique dont la reconnaissance doit etre effectuée par la sonde conforme à l'invention est de 1'ADN génomique male et femelle obtenu par digestion de lymphocytes périphériques desdits mammifères par l'endonucléase EcoRI. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de sexage conforme à l'invention, 1'ADN à reconnaItre est contenu dans des lymphocytes périphériques des mammifères susdits, déposés sur membrane (Dot-Blot), sous forme de gouttes après avoir été soniqués. Selon encore un autre mode de réalisation de la méthode de sexage conforme à l'invention, 1'ADN à reconnaI- tre est contenu dans le chromosome Y desdits mammifères, observé sur métaphases, auquel cas le sexage est réalisé par hybridation dite in situ. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de sexage conforme à l'invention, 1'ADN à reconnaitre est contenu dans des noyaux interphasiques desdits mammifères, auquel cas le sexage est réalisé par hybridation dite in situ. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise a l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. I1 doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune maniere une limitation. EXEMPLE 1 PREPARATION DE SONDES CONFORMES A L'INVENTION La technique mise en oeuvre permet de cloner 1'ADN présent dans le génome male et absent du génome femelle et a ainsi permis de construire une librairie d'ADN spécifique du bovin maie. CONSTRUCTION DE LA LIBRAIRIE D'ADN SPECIFIQUE DU MALE 1 mg d'ADN génomique femelle provenant de lymphocytes périphériques est coupé par sonication en fragments de 200 a 550 paires de bases (pb). 10 ug d'ADN génomique male provenant de lymphocytes périphériques sont digérés par l'endonucléase SAU 3A (Boehringer), libérant ainsi des fragments de restriction à extrémités cohésives,de taille comprise environ entre 40 et 1 650 pb. Ces deux types de fragments sont mélangés dans la proportion suivante : ADN femelle : ADN maie = 100 : 1. Après extraction par le mélange phénol-chloroformealcool isoamylique et précipitation à l'éthanol absolu, le mélange des deux ADN est dénaturé à 100 C pendant 10 mn puis réassocié à 68 C pendant 22 heures dans un tampon contenant 2M (NH4)2SO4, 50 mM phosphate de sodium (pH = 6,8-) et 5 mM EDTA.-Un aliquot (1 Vg)d'ADN double brin réassocié est mélangé avec 100 ng de plasmide pUC9 (Ampr-Lac Z ) préalablement linéarisé par l'endonucléase Bam H1 (Boehringer) et déphosphorylé par la phosphatase alcaline (CIP Boehringer). L'insertion de 1'ADN bovin male dans le plasmide est effectuée avec de la ligase T4 (Biolabs) à 16 C pendant 16 heures. Les plasmides recombinants sont utilisés pour transformer 2 ml de bactéries Escherichia coli-JM83 rendues hautement compétentes par traitement par un milieu contenant : 10 mM K-Mes (pH = 6,2),100 mM RbC12, 45 mM MnCl2, 3 mM Co(NH3)6C13 pendant 10 mn à 0 C. Les bactéries ainsi transformées sont étalées sur du milieu LB-Agar contenant 100 vg/ml d'Ampicilline et 2 kl/ml de X-gal (5-bromo-4-chloro 3-indolyl-E-D-galacto-pyranoside) a 2 % dans le diméthylformamide. Approximativement 200 clones (Ampr-LacZ-) ont été obtenus. EXEMPLE 2 ANALYSE DE LA LIBRAIRIE Afin de rechercher la présence d'inserts d'ADN bovin mâle, chaque clone est repiqué individuellement et les plasmides sont isolés des bactéries par minilysat. Chaque plasmide isolé est digéré par l'endonucléase Pvu2 (Boehringer) et analysé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % (30 volts - 16 h). Cinquante clones, parmi les 200 analysés, contiennent de 1'ADN bovin (insert). La spécificité des inserts ainsi produits a été démontrée par hybridation avec de 1'ADN génomique (lymphocytes) mâle et femelle digéré par l'endonucléase EcoRI (Boehringer) et transféré après électrophorèse sur du papier DBM tu des membranes HYBOND (AMERSHAM) selon la technique de SOUTHERN. L'hybridation de la sonde b.c.1.2 avec de 1'ADN génomique mâle digéré par EcoRI révèle la présence d'une bande de 7,0 kilobases (kb) absente de 1'ADN génanicue femelle. Ce résultat a été confirmé par l'étude de 12 animaux males et 13 femelles (p EXEMPLE 3 PREPARATION DE L'ADN GENOMIQUE BOVIN L'ADN bovin de mdle et de femelle est purifié a partir de 5x107 lymphocytes périphériques. Les cellules sont incubées a 42 C pendant 18 heures sous agitation lente dans 10 ml de solution de lyse [10 mM Tris-HCl pH7,5, 10 mM thylènediaminetétraacétate- Na2 (EDTA), 50 mM Nazi, 0,4 % dodécyl sulfate de sodium plus 2 mg de protéinase K (Boehringer)]. 1 mg de ribonucléase A (Boehringer) dans 1 ml de 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 1 mM EDTA, est ajouté en 1 heure à 37 C, suivi d'une seconde digestion par la Protéinase K (1 mg, 1h à 42 C). Les lysats sont extraits 3 fois avec 15 ml d'un mélange composé de phénol : chloro forme : alcool isoamylique (3:1:0,01 v/v) saturé avec 0;2 M Tris-HCl pH 7,5. Les phases aqueuses sont lavées 3 fois avec une solution chloroforme - alcool isoamylique (1:0,04). L'ADN est précipité avec 2 volumes d'éthanol absolu en présence de 150 mM NaCl et lavé avec de l'méthanol à 80 % dans l'eau. DIGESTION PAR LES ENDONUCLEASES DE RESTRICTION Des échantillons de 15 ug d'ADN bovin sont digérés à 37 C pendant 18 heures avec l'endonucléase de restriction EcoRI (Boehringer) dans le tampon d'incubation contenant 100 mM Tris-HCl, 50 mM Nazi, 10 mM MgCl2, pH 7,5. La digestion complète est obtenue avec un total de 6-10 unités par g de 1'ADN ajouté en 3 fois. Les fragments de 1'ADN digérés sont soumis à une séparation électrophorétique en gel d'agarose de 0,7 % dans du tampon 0,04 M Tris-CH3COOH pH 8, 0,002 M EDTA. Le calibrage du gel est obtenu en incluant un échantillon de 1'ADN de phage-Lambda digéré par Hind III. TRANSFERT Les fragments de 1'ADN contenu dans le gel sont dépurinés pendant 15 mn à température ambiante dans du 0,25 M HC1, dénaturés en 0,5 M NaOH + 1,5 M Nazi, puis neutralisés par passages successifs dans du 1,5 M tampon phosphate pH 5,5 (3x15 mn) puis 0,15 M pH 5,5 (2x15 mn). Une membrane (Hybond-N Amersham ou Pail-Biodyne-A Flobio) en 'hylon"est ensuite placée sur le gel et par capillarité les fragments de 1'ADN contenu dans le gel sont transférés sur la membrane. Après 16 heures de transfert en 20 x SSC, la membrane est lavée dans du 2 x SSC, séchée à l'air puis placée pour 2 heures dans un four à 80 C. MARQUAGE DE LA SONDE AU 32 100 à 200 ng de sonde b.c.1.2 sous un volume de 1 à 5 Li sont ajoutés au mélange réactionnel suivant 50 M de dATP (1 p1), 50 vM de dTTP ( 1 p1), 50 pM de dCTP (1 l), 50uCi de &alpha;-32p-dGTP (5 (5 l),2 l) , 2 ulde tampon de réaction contenant 500 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM HgC12, 100 mM B-mercaptoéthanol. La réaction est effectuée à 16 C pendant 1 heure 30, puis arrêtée par addition de 200 ul de la solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 80 mM EDTA, 0,5 % dodécyl sulfate de sodium. La sonde radiomarquée est séparée des nucléotides par passage sur une colonne (10 cm x 1 cm) de Sephadex G100 (Pharmacia) et éluée par du tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA. Les fractions d'élution contenant le plus de radioactivité sont ensuite poolées. PREHYBRIDATION ET HYBRIDATION Les filtres (blots) sont préhybridés à 42 C pendant 4-10 heures avec un mélange contenant 50 % v/v de formamide désionisée, 1 M NaCl, 0,2 % de solution de Denhart, 2,5 % de sulfate de dextran, 0,1 % de dodécyl sulfate de sodium et 0,5 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué. L'hybridation est réalisée dans le meme mélange excepté le sulfate de dextran qui est à 5 9 et le Nacra à 0,5 M. La sonde radiomarquée ac 32P dénaturée à îcr pendant 10 min est ajoutée dans le mélange d'hybridation a 1x 106 cpm/ml, ce qui représente environ 10 ng de sonde par ml. L'hybridation est réalisée à 42 C pendant au moins 18 heures. Après l'hybridation, les filtres sont lavés une première fois à 65 C pendant 30 mn dans du tampon 2 x SSC (0,3 M NaCl et 0,03 M Citratedesodium)+ 0,1 % SDS puis encore 30 mn dans le meme tampon dilué 10 fois (0,2 x SSC).Les filtres sont ensuite placés dans une cassette équipée des intensificateurs "Zronex" (DUPONT), mise en contact avec un film KODAK XAR-5 pour l'autoradiographie pendant 6 à 24 heures à -70 C. DESHYBRIDATION Elle est réalisée en lavant les filtres à 37 C pendant 30 mn avec du 0,4 NaOH,puis dans une solution contenant 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % (v/v) dodécyl sulfate de sodium, 0,1 x SSC. PREPARATION DES Dot-Blot 1) Dot-Blot ADN génomique. L'ADN génomique des bovins mâle et femelle a été soniqué pendant 5 min (Branson Sonifier B-15) puis dilué avec 1'ADN du sperme de saumon soniqué dans des proportions telles que la quantité de 1'ADN totale du dépit soit de 2 vg. La ganinie de concentration ep ADN bovin était de 1 g 0,5 g, 0,25 g, 0,1: g et 0,05 g pour un dépit de 1 l. Après le dépôt de l'ADN sur les membranes Pall Biodyne A celles-ci sont traitées avec 0,5 N NaOH + 1,5 NaCl pendant 5 min puis neutralisées avec 1,5 M tampon phosphate pH 5,5 pendant 2 x 5 min et 0,3 M tampon phosphate pH 5,5 pendant 5 min encore. Les membranes sont par la suite sechées sur Whatman 3MM,puis 1'ADN est fixé à 80 C pendant 2 heures. Les filtres prêts à l'emploi sont conservés dans la solution de préhybridation à 4 C. 2) Dot-Blot des cellules bovines. Les lymphocytes périphériques du bovin mâle et femelle ont été soniqués pendant 6 minutes puis traités par la protéinase K (Boehringer) 1 heure à 42 C. La gamme de dilution correspondant à : 1x106, 5x105, 1x105, 5x104, 1x104 et 5x103 cellules dans 2 p1. L'ADN du sperme de saumon soniqué est ajouté pour compléter à 2 ug de 1'ADN total. Après le dépôt de 1'ADN sur membranes Pall-Biodyne A le traitement est identique à celui de dot-blot ADN génomique. Hybridations des dot-blots et visualisation des signaux sont les memes que pour les blots en général. EXEMPLE 4 SYNTHESE ET PURIFICATION DE L'OLIGONUCLEOTIDE DE SYNTHESE La synthèse chimique de l'oligonucléotide correspondant à la séquence déterminée auparavant a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique "Applied Biosystems" selon la technique de phosphoramidite en phase solide. La réaction étant efficace à 95-97 % à chaque stade, il est donc nécessaire de purifier le produit final (sonde b.c.1.2 - 49 mer) des oligonucléotides intermédiaires. Environ 7 mg du melange d'oligonucléotides dans 60 p1 H2O sont séparés par électrophorèse dans le gel de 20 % polyacrylamide + 8 M urée à 700 V, 38mA pendant 3 heures. La bande correspondant au 49 mer est repérée à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de qel de silice, fluorescente à 254 nrn (merck). Cette tartie du qel est Recoupc-e puis 1'ADN éludé dans 1,5 ml de la solution 0,5 M CH3COONH4 + 5 mM EDTA sous agitation à 37 C pendant 16 heures. Le surnageant est concentré à environ 300 p1 et l'urée est éliminée par chromatographie sur une colonne 10 cm x 1 cm de Sephadex G-50 (Pharmacia) équilibré avec le tampon 10 mM Tris-HC1 pH 7,5 + 1 mM EDTA. L'ADN ainsi isolé est lyophilisé et conservé à - 20 OC. MARQUAGE RADIOACTIF (32 P) DE LA SONDE b.c.l.2 DE SYNTHESE (Monobrin). 1D à 20 pM de la sonde b.c.1.2 dans un volume de 3 pi sont ajoutés à 23 pi du mélange réactionnel composé de : 100 mM dithiotréitol (2,5 pi), 10 mM spermidine (2,5 p1), tampon d'incubation 500 mM Tris-HCl pH 7,5 + 100 mM MgC12 (2,5 pi), 100 uCi(o - 32p) adénosine triphosphate - ATP 3000 Ci/mmol (Amersham) et 20 U T4 polynucléotide kinase (Boehringer). Après incubation de 30 min à 37 C la réaction est arrêtée avec 2 pi 400 mM EDTA et l'oligonucleo- tide marqué est séparé de 1'ATP par chromatographie sur colonne avec Sephadex G-50. EXEMPLE 5 SEQUENCAGE - PREPARATION DU PLASMIDE b.c.1.2 EN WE DU SEQUENCAGE DE SES 2 BRINS. a) Brin inférieur (sens 3' ,5') Trente microgrammes de plasmide b.c.1.2 sont digérés par l'endonuclease Hind III pendant 3 heures à 37 C. L'enzyme est éliminée par extraction avec le mélange phénol : chloroforme : alcool isoamylique (3 : 1 : 0,01 v/v). L'ADN est ensuite précipité dans 1 volume d'isopropanol en présence de 0,3M CH3,COONa, puis lavé dans de l'éthanol 80 % dans l'eau. L'ADN du plasmide linéarisé est marqué en 3' par l'enzyme terminal transférase avec du dideoxyadEno^,-ne tri phosphate 32p (AS=3000 Ci/mM) selon la technique du Kit n N 4020 de chez AMERSHAM. DNA du plasmide 40 pi ddATP (125 uCi) 13 pi Tampon Amersham x 10 10 pi Eau distillée 95 pi Solution enzymatique 5 pi AMERSHAM Incubation 1H a 37 C. Le plasmide marqué est ensuite séparé du nucléotide par passage sur Sephadex G75 puis digéré par l'endonucléase EcoRI qui génère 2 fragments de taille 2,6 et 0,1 kb respectivement. Le fragment de 0,1 kb contenant l'insert b.c.1.2 est isolé par électrophorèse en gel d'agarose 2 t. I1 est ensuite purifié par passage sur laine de verre et extraction avec le mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique. Le fragment purifié est séquencé selon la méthode de MAXAM et GILBERT modifiée par la Société N.E.N. L'analyse des fragments à séquencer est effectuée par électrophorèse en gel de 0,2 mm à 5 %, 8 % et 12 % de polyacrylamide sur une cuve Macrophore LKB [GAROFF et ANSORGE, Analytical Biochemistry 115 (450-457) 19800. Selon les concentrations, les temps de migration ont été 6H-7H et 2H. Les gels sont ensuite fixés avec de l'acide acétique 10 % pendant 10 mn, lavés à l'eau, puis séchés à température ambiante. L'autoradiographie du gel est effectuée sur film URNO HS 90 pendant des temps d'exposition de 24, 48 et 72 heures. b) Brin supérieur (sens Mêmes techniques, sauf que la première enzyme de digestion est EcoRI et la deuxième PVUII. La détermination de la séquence en nucléotides de la sonde b.c.1.2, obtenue à partir de lymphocytes périphériques de mammifères du genre Los, qui est composée des 49 paires de bases suivantes 5' 3 ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT a permis de synthétiser la sonde conforme à l'invention comme décrit à l'Exemple 4 ci-dessus. La sonde b.c.1.2 conforme à l'invention est d'une grande sensibilité puisque des tests réalisés sur membranes PALL BIODYNE ont montré que 50 ng d'ADN bovin sont une quantité suffisante pour obtenir un signal positif. Bien que la description qui précède ait esser.- tiellement fait état du rôle joué par la sonde b.c.l.2 pour la détermination du sexe des bovins, l'on comprendra aisément que ce rôle puisse s'étendre à d'autres animaux dans la mesure où ces derniers présentent des séquences d'ADN spécifique du sexe mdle similaires à celles des bovins , de même, le rôle de la sonde b.c.1.2 tel que décrit dans ce qui précède, est uniquement donné à titre d'exemple non limitatif et peut s'étendre à la recherche d'autres séquences spécifiques du sexe male. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome mdle de mammifères, notamment du genre Bos, caractérisée en ce qu'elle présente un profil d'hybridation, déterminé par hybridation de ladite sonde avec de 1'ADN génomique male digéré par une enzyme appropriée, qui fait apparaître la présence d'au moins une bande spécifique du génome male des mammifères considérés. 2. Sonde moléculaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que son profil d'hybridation, déterminé par hybridation de ladite sonde avec de 1'ADN génomique male digéré par EcoRI, fait apparaître la présence d'une bande de l'ordre de 7 kb qui est spécifique du génome male du genre Bos. 3. Sonde moléculaire selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend 49 paires de bases dont la séquence en nucléotides est la suivante 5' 3 ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT ou un fragment de ladite séquence comportant au moins 11 nucléotides, laquelle sonde est désignée par la dénomination b.c.1.2. 4. Procédé de préparation d'une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, par réassociation de segments d'ADN génomique, rendus simple brin, à partir d'un mélange d'ADN male et femelle dans lequel 1'ADN femelle est en grand excès, de l'ordre de 100 parties pour 1 partie d'ADN maie, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : - une première etape au cours de laquelle de 1'ADN génomique femelle provenant de lymphocytes périphériques desdits mammifères,est coupé par sonication en fragments de 200 à 500 paires de bases (pb), puis mélangé dans une proportion de l'ordre de 100:1, à de 1'ADN génomique mdle provenant également de lymphocytes périphériques, digéré par l'endonucléase SAU 3A pour libérer des fragments de restriction à extrémités cohésives, de taille comprise entre 4G et 1650 pb ; - une deuxième étape au cours de laquelle ledit mélange d'ADN, après avoir été extrait d'une manière connue en elle-meme par un mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique et précipité par l'ethanol, est dénaturé à 100 C puis réassocié à 68 C pendant 22 heures dans un tampon contenant 2M (NH4)2SO4, 50 mM phosphate de sodium (pH = 6,8) et 5 mM EDTA ; - une troisième étape au cours de laquelle 1'ADN double brin réassocié est mélangé avec un plasmide tel que le plasmide pUC9 (Ampr-LacZ+) préalablement linéarisé par l'endonuciéa- se BamHI et déphosphorylé par de la phosphatase alcaline, en présence de ligase T4 qui réalise l'insertion de 1'ADN dans le plasmide, par contact pendant 16 heures à 16 C - une quatrième étape au cours de laquelle les plasmides recombinants obtenus lors de l'étape précédente, sont utilisés pour transformer des cellules d'Escherichia coli rendues hautement compétentes, les clones recombinants (Ampr-Lac Z ) étant obtenus dans une proportion d'environ 200 clones pour 2 ml de suspension de cellules bactériennes. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les cellules bactériennes d'Escherichia Coli sont rendues hautement compétentes, préalablement à l'insertion des plasmides recombinants, par traitement pendant 10 minutes à 0 C par un milieu comprenant : 10 mM K-Mes (pH = 6,2), 100 mM RbCl2, 45 mM MnC12, 3 mM Co(NH3)6C13. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que les bactéries transformées sont étalées sur un milieu gélosé contenant de l'Ampicilline et du X-gal (ou 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-6-D- galacto-pyranoside) à faible concentration dans du diméthylformamide. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les colonies bacté riennes isolées (Ampr-Lac Z ) sont repiquées individuellement, puis amplifiées en vue de la préparation de minilysats, puis chaque plasmide isolé est digéré par l'endonucléase Pvu2, marqué au 32p et hybridé avec de 1'ADN génomique provenant de lymphocytes périphériques de bovins ou de mammifères similaires et 1'ADN de ces animaux est digéré par l'endonucléase EcoRI qui génère des fragments de restriction de taille variable. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les fragments de restriction de taille variable obtenus sont séparés par migration électrophorétique sur gel d'agarose. 9. Procédé de préparation d'une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, caractérisé en ce que ladite sonde est obtenue par synthèse par la méthode de phosphoramidite en phase solide. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la synthèse de l'oligonucléotide qui entre dans la composition de la sonde moléculaire est suivie d'une étape de purification qui consiste en une séparation de l'oligonucléotide associé d des oligonucléotides de taille intermédiaire, par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, puis repérage de la bande de l'oligonucléotide pur recherché, à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de gel de silice, fluorescente à 254 nm, découpage de cette bande et élution de 1'ADN dans une solution appropriée, puis récupération de 1'ADN pur synthétisé. 11. Procédé selon les revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la purification de l'oligonucléotide 32 de synthèse est suivie de son marquage au P. 12. Application de la sonde moléculaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à la détermination du sexe d'embryons ou de foetus de mammifères, notamment du genre Bos, caractérisée en ce que ladite sonde hybridée à un filtre préhybridé de manière appropriée connue en elle-meme, lorsqu'elle est réassociée à de 1'ADN génomique de mammifères du genre Bos, male et femelle1 préalablement transféré sur un filtre approprié, après avoir été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose, s'hybride à 1'ADN génomique male, et cette hybridation est mise en évidence par autoradiographie et/ou par sonde froide par la présence de signaux d'hybridation sous la forme d'une bande de 7 kb spécifique. 13. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que 1'ADN génomique dont la reconnaissance doit etre effectuée par la sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, est de 1'ADN génomique male et femelle obtenu par digestion de lymphocytes périphériques desdits mammifères par l'endonucléase EcoRI. 14. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que 1'ADN à reconnattre est contenu dans des lymphocytes périphériques des mammifères susdits, déposés sur une membrane ou un filtre approprié. 15. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que 1'ADN à reconnattre est contenu dans le chromosome Y desdits mammifères, observé sur métaphases, auquel cas le sexage est réalisé par hybridation dite in situ. 16. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que 1'ADN à reconnaître est contenu dans des noyaux interphasiques desdits mammifères, auquel cas le sexage est réalisé par hybridation dite in situ.