Brevet FR2593289A1 — publié le 19870724

La présente invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité dismutasique, ainsi que le coffret de réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre dudit procédé Celui-ci est applicable a tous les milieux biologiques. On entend ici par "activité nismutasique", toute substance capable de disputer l'anion superoxyde. On sait que les superoxyde dismutases (SOCs) catalysent la réaction suivante le caractère instable dusubstrat radical o2 explique que de nombreuses méthodes de dosage des SODs ont été proposées jusqu'ici - Les techniques enzymatiques de type indirect bont basées @@ l'inhibition, par les SODs, de la réaction entre C , prov@nant d'un système producteur donné (enzymatique, photochimique, chimique), et une substance détectrice (cytochrome c, nitro bleu de tétrazolium (NBT), hydroxylamine, sulfite, adrénaline, luminol). Ces techniques présentent des caractères de spécificité et/ou de sensibilit insuffisants. - Les méthodes directes (spectrophotométrie, résonance magnétique nucléaire, résonance paramagnétique électronique) nécessitent un appareillage couteux, peu compatible avec une utilisation de routine. - Les méthodes radio-immunologiques (R.I.A.) et immunc-enzymologiques conduiser,t a l'estimation de l'ensemble des formes dismutasiques active et inactive . En outre, les techniques R.t.A. sont pénalisées par les contraintes liées à l'utilisation des isotopes radio-actifs. Selon la présente invention, on propose une technique enzymatique de type indirect, basée sur le principe d'inhibition de chimiluminescence. Cette technique particulière de dosage est déjà connue ; elle consiste à a) mélanger un échantillon de la substance dont l'activité dismutasique doit entre dosée avec un réactif chim,luminescent bj mesurer l'inhibition de la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent, que l'on provoque en introduisant, dans le mélange préparé précédemment, un système capable de fournir des ions o2; ; et c) déduire de la mesure ainsi effectuée la concentration recherchée en activité dismutasique. Il faut remarquer que des techniques de dosage des SODs basées sur inhiLition de chimiluminescence ont eté décrites auparavant. Cependant, celles-ci font appel à des réactifs differents, a production de étant assurée par le système xarthine-xanthine oxydase (X - XA) et la détection par le lumino (Puget K., Michelson A.M., 1974, biochimie, 56, 1255-1251). Cette réaction présente l'inconvénient majeur de ne pas être applicable aux bilieux biologiques bruts. En outre, le luminol reconnaît préférentiellement l'eau oxygénée et la réaction précitée est de réalisation délicate. Par ailleurs, sa sensibilité est de l'ordre de 100 picogrammes. La présente invention repose sur le choix d'un système capable de fournir des ions o2 qui renc la technique de dosage susindiquée, d'une part, particuli8rement sensible surtout dans la mesure où l'on choisit également le réactif chimiluminescent, et, d'autre part, également particulièrement spécifique, dans la mesure où l'on réalise, préalablement a la n:ise en oeuvre du dosage proprement dit, une iirmuno-extracticn par fixation des dismutases sur une phase solide sur laquelle est immobilisé un anticorps anti-dismutase.Les presents inventeurs ont pu en effet mettre au point un procédé d'immuno-extraction, applicable au laboratoire à des fins analytiques, qui permet la différenciation des différentes isoenzymes des SODs. La réalisation d'une telle immuno-extract n conduit donc a une spécificité absolue, le dosage selon l'invertion étant alors applicable, de manière simple et reproductible, aux milieux biologiques les plus divers, particulièrement à ceux d'origine extracellulaire humaine. Ce plus, la mise en oeuvre du dosage selon la présente invention est particuli8rement aisée. La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé pour le dosage d'une activité dismutasique, comprenant les étapes a) a c) susindiquées et caractérisé par le fait que l'on utilise, comme système capable de fournir des ions O2-, un solvant aprotique alcalinisé. Conformément à une caractéristique importante du procédé selon la présente invention, on choisit, comme solvant aprotique, le diméthylsulfoxyde. Il serait toutefois possible d'utiliser d'autres solvants aprotiques, par exemple le tétrahydrofuranne. Le diméthylsulfoxyde apparaît toutefois comme le solvant aprotique préféré. A ce sujet, il faut souligner que l'utilisation du diméthylsulfoxyde en milieu alcalinisé, connu comme système producteur de a été décrite pour le dosage de la Cu SOD (Hyland K, Voisin E, Banoun H., Hauclair C., 1983, Analytical Biochemistry, 135, 280-287). Cependant, le système détecteur utilisé dans ce cas (cytochrome c) conduit a une sensibilité comparable a celle des autres techniques de type indirect (100 ng). Par ailleurs, conformément à la présente invention, on choisit, comme agent alcalinisant, de préférence l'hydroxyde de sodium ou bien l'hydroxyde de potassium. Il est cependant exclu d'utiliser une amine comme agent alcalinisant du fait que les groupements aminés inhibent la réaction de détection chimiluminescente de manière non spécifique. Dans le cas où l'on utilise le diméthylsulfoxyde comme solvant aprotique, on prépare avantageusement le système capable de fournir des ions O en mélangeant le diméthylsulfoxyde avec une solution aqueuse d'un agent alcalinisant, à raison de 0,5 à 25% en volume, de préférence 1X en volume, de ladite solution aqueuse par rapport au volume de diméthylsulfoxyde, 'a concentration finale en agent alcalinisant dans le mélange étant comprise entre 0,5 et 10 mlllimoles, etant de 5 millimoles de préférence. Les études préliminaires ont montré que le diméthylsulfoxyde, conservé sans précautions particulières, n'induit la réponse chimiluminescente du réactif chimiluminescent que pendant une période courte de quelques heures. Cette instabilite, liée à la présence de C02 atmosphérique, dissous dans le diméthylsulfoxyde alcalin, peut être corrigée en équilibrant ce dernier avec une atmosphère dépourvue de CC2. Celle-ci peut être obtenue par passage de l'air au travers d'une colonne de chaux sodée. De cette maniere, le dîméthylsulfoxyde alcalinisé et décarbonaté est utilisable, durant une période minimale de deux semaines, sans chute significative de la réponse du réactif chimiluminescent. Conformément à la présente invention, ce dernier est tres avantageusement constitué par la lucigénine (N - methyl acrydinium). On pourrait, utiliser, comme réactif chimiluminescent, le luminol (hydrazide cyclique de l'acide amino-3 orthophtalique), mais on obtiendrait, sur le plan de la sensibilité du système de dosage, des résultdts beaucoup moins performants. On décrira ci-apres un exemple de procédure optimisée de dosage de l'activité SOD L'échantillon à analyser (100 microlitres) et la solution de lucigénine (fournie par "LKB") dans le tampon véronal 0,1 M, acide éthylènediaminet6tracétique (EDTA) Na2 0,1mM, pH 9 (100 microlitres, 10-5 M), sont mélangés dans un tube disposé dnas la chambre de mesure d'un luminomètre (PICOLITE, PACKARD INSTRUMENT). Un dispositif d'injection automatique permet alors l'addition du diméthylsulfoxyde (FLUKA) alcalin stabilisé (100 microlitres) en 0,04 seconde. L'émission des photons est mesurée avec un délai de 9 secondes après l'injection, pendant une durée de 5 secondes. Une unité d'activité enzymatique est définie coe la quantité de SOD provoquant une inhibition de la réponse chimiluminescente de la lucigénine de 50%. On constate que ce mode opératoire est caractérisé par sa grande rapidité de mise en oeuvre (au total 14 secondes pour une mesure) et par la possibilité d'automatisation Le système diméthylsulfoxyde lucigénine n phase liquide présente les caractéristiques suivantes A - Sensibilité : La figure 1 du dessin annexé montre les courbes d'inhibition de chimiluminescence obtenues avec des préparations de SODs purifiées de différentes origines. Les Cu SODs bovine et humaine ont été purifiées à partir d'érythrocytes. La Cu SOD murine et la Mn SOD humaine ont été isolées à partir d'homogénats hépatiques. La Mn SOD extraite de culture d'Escherichia coli est un don généreux de A.M. MICHELSON (Institut de Bioloyie Physico-chimique-PARIS). Les sensibilités obtenues, correspondant a une réponse de 5% varient entre 10 picogrammes (0,3 femtomole), pour les dismutases à cuivre (rat, homme, boeuf), et 0,5 nanogramme, pour la Mn SOD humaine. Le tableau 1 ci-après resume la comparaison des seuils de détection obtenus avec les différentes techniques de dosage des SODs. TABLEAU 1 SYSTEME SENSIBILITE PRODUCTEUR/DETECTEUR (CuSOD) Rboflavine/NBT environ 50 ng X-XO/cytochronie c 50 ng DMSO/cytochrome c 100 ng X-XO/luminol 0,1 ng Méthode de la présente invention 0,01 ng Il apparaît ainsi que la technique de dosage conforme à la présente invention est : - 104 fois plus sensible que les techniques enzymatiques classi, ues utilisant les systèmes X-XO/cytochrome c, riboflavine/NBT ou UMSO/cytochrome C ; - 10 fois plus sensible que la technique X-XO/luminol ; et - 5 à 10 fois plus sensible que les dosages radio-immunologiques ou immuno-enzymatiques déjà décrits. De la même manière, l'activité spécifique enzymatique des enzymes varie entre 0,5 x 107 unités mg-1 pour les Cu SODs et 2,8 x 105 unités mg-1 1 pour la Mn SOC humaine. Ces valeurs sont à comparer avec celles obtenues avec les techniques enzymatiques classiques (Mn SOD : 1500 unités mg-1 ; Cu SOD :-3000 unités mg-1). B - Action du cyanure L'incubation des préparations enzymatiques avec du cyanure de potassium (5mM). conduit à une inactivation de l'enzyme à cuivre humaine supérieure à 99,52, alors que l'enzyme à manganèse subit une inhibition beaucoup moins marquée, de l'ordre de 10 (figure 1). Ceci correspond aux données couramment établies. C - Spécificité Cette caractéristique est illustrée par la figure 2 qui représente des courbes d'inhibition de chimiluminescence du système diméthylsulfoxyde/lucigénine par la Cu SOD bovine, par la sérum albumine bovine (FLUKA), la mîcroperoxydase (SIGMA), la catalase bovine (FLUKA), la céruléoplasmine (FLUKA) et la glutathion peroxydase murine purifiée à partir d'homogénats hépatiques. On constate donc que d'autres métalloprotéines et la sérum albumine bovine ne présentent que de faibles interférences dans le système diméthylsulfoxyde/lucigenine : - inférieure à 10 5 pour l'albumine bovine, - inférieure à 10 4 pour la glutathion peroxydase et la céruléoplasmine,et - inférieure à 10 3 pour la catalase bovine et la microperoxydase. La détermination des SODs à l'aide du système diméthylsulfoxyde/lucigénine présente donc des caractéristiques intéressantes par rapport à celles des autres systèmes de dosage type enzymatique. Ces caractéristiques intéressantes ont permis, en particulier, la détermination directe des activités dismutasiques cyanosensibles (Cu SOD) et insensibles (Mn SOD), dans les homogénats bruts, hépatiques, rénaux et cérébraux de rats soumis pendant trois semaines à un régime carencé ou non en cuivre, corrélativement avec la mise en oeuvre du dosage radio-immunologique. L'application du système diméthylsulfoxyde/iucigénine a ainsi permis de montrer - la similitude des valeurs des activités spécifiques enzymatiques mesurées : - soit directement sur l'homogénat brut tissulaire ; dans ce cas, l'activité spécifique enzymatique est obtenue par conjonction des techniques enzymatiques et radio-immunologiques ; - soit sur la protéine Cu SOD purifiée ; l'activité spécifique est alors obtenue par conjonction de la technique enzymatique et du dosage colorimétrique de la protéine ; - une diminution de l'activité SOD cyanosensible particulièrement marquée dans les homogénats hépatiques des rats soumis à un régime carencé en cuivre sans modification de l'activité Mn SOD cyanoinsensible. Cette variation est parallèle à celle mesurée par dosage radio-immulologique. Il apparaît donc que la technique utilisant directement le système diméthylsulfoxydellucigenine, qui fait l'objet de la présente invention, peut être adaptée aux milieux biologiques à concentration en SOD suffisamment élevée pour rendre négligeables les interférences liées aux autres protéines. De même que pour les autres techniques enzymatiques, la distinction entre enzymes cyanosensible et cyanoinsensible n'est cependant pas absolue, ce qui diminue la précision des résultats. En fait, le développement de toute méthode de dosage des SODs utilisable dans un but de diagnostic clinique passe par la mise au point de techniques applicables aux milieux sériques et, surtout, urinaires d'origine humaine. Malgré des caractéristiques particulièrement favorables, le dosage par inhibition de chimiluminescence ne peut résoudre ces problèmes. En effet, d'une part,la concentration en SOD plasrriatique est très faible par rapport à celle des proteines interférentes, et, d'autre part, les composes azotés urinaires de faible poids moléculaire (urée, créatinine) interfèrent fortement dans le dosage. Ces raisons expliquent que le développement nécessaire d'une technique d'immuno-purification sur phase solide dont la mise en oeuvre doit précéder celle du système diméthylsulfoxyde/lucîqénine. Les présents inventeurs ont trouvé une solution à ce problème, c'est pourquoi il est propose, conformément à la présente invention une technique originale a'isolation de toute activité dîsmutasique, sur un support immunologique, sans perte importante d'activité enzymatique, la détermination de l'activité dismutasique s'effectuant après libération de celle-ci de son support immunologique. Le prccéde selon l'invention, lorsqu'il est appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique, est caractérisé par le fait qu'on met a incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasique à doser en présence d'un support solide pourvu d'un anticorps ayant une spécificité anti-dismutase, on lave ledit support, on mét en contact ledit support lavé avec une solution d'élution et on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. Des exemples de modes opératoires pour une telle immuno-extraction sont les suivants A - PrPFaration des anticorps Les anticorps polyclonaux anti-SODs bovine et humaine ont été obtenus respectivement par immunisation de lapins et de cobayes à l'aide Cu SODs bovine et humaine purifiées. Les préparations d'enzymes ont été administrées toutes les quatre semaines, par voie sous-cutanée à la dose de 500 microgrammes de protéines émulsifiées dans l'adjuvant complet de FREUND. Des titres appreciables d'anticorps ont été obtenus après la quatrième injection, le sang des animaux étant prélevé dix jours apres l'immunisation. Les gammaglobulines de lapin ont été purifiées par passage sur DEAE Sephacel.Les gammagloabulines de cobaye ont été chtenues après précipitation du sérum à l'aide de SO4(NH4)2, a 33% de saturation. Les titres des anticorps ont été déterminés sel on des techniques radio-immunologiques déjà décrites (1 Baret A, Michel P., Imbert M.R.. Morcellet J.L. et Michelsun A.M., 1979, Biochem. Clophys. Res. Commun., 88, 337-345 ; 20 Baret A, Schiavi P., Michel P., Michelson A.M., Puget K., 1980, SEBS Lett., 112, 25-29). B - Préparation des tubes revètus d'anticorps anti-SODs Les tubes revêtus d'anticorps anti-Cu SODs ont été obtenus par fixation non spécifique des immunoglobulines G sur des tubes en polystyrène à haute capacité d'absorption pour les protéines. 300 ul de dilution d'anticorps dans le tampon carbonate 0,1M pH 9,6 sont incubés à + 4 C durant 18 à 24 heures. Le surnageant est écarté, puis les phases sont traitées avec une solution de sérum albumine bovine (0,3%) dans l'eau distillée additionnée de 0,1% d'acide de sodium. Les tubes sont conservés à + 4 C jusqu'à utilisation. C - immuno-extraction des CuSOCs L'échantillon à doser (300 microlitres), dilué de manière appropriée, est mis à incuber dans les tubes revêtus d'anticorps anti-Cu SODs bovine ou humaine, durant deux heures à 37 C, Les tubes sont ensuite rincés quatre fois par 2 ml de tampon véronal, puis une solution d'élution (300 microlitres) est alors ajoutée. Cette solution est constituee de tampon véronal 0,1M, acide éthylénediamine tétracétique (EDTA) disodique Na2 10 4M, pH 9, contenant soit 0,5% de monolaurate de sorbitan polyoxyéthyléné (TWEEN 20) - cas du tube revêtu d'anticorps anti-Cu SOC bovine - , soit 100 microgrammes/ml de papaïne - cas du tube revêtu d'anticorps anti-Cu SOD humaine. Une incubation de 20 minutes à 50 C (Cu SOD bovine), ou de 30 minutes à 37 C (Cu SOD humaine) est alors pratiquée. Le dosage par inhibition de chimiluminescence est mis en oeuvre directement sur la phase liquide. D - Mise en oeuvre du système diméthylsulfoxyde/lucigénine apres immuno-extraction de la SOD 1 - Dosage de la SOD bovine La figure 3 montre la courbe d'étalonnage du système de dosage de la Cu SOD bovine, mis en oeuvre apres immuno-extraction sur tubes revêtus d'anticorps anti-Cu SOD bovine spécifique, puis élution de l'activité enzymatique sous l'influence conjointe de la chaleur (50 C ; vingt minutes), et d'un tampon véronal 0,1M acide éthylènediamine tétracétique Na2îO M pH 9, contenant 0,5% de TWEEN 20. La sensibilite obtenue (15 picogrammes de Cu SOD bovine) est très élevée et correspond à celle obtenue par mise en oeuvre directe du système en phase liquide. Ces résultats montrent que la procédure d'immuno-purification et de dosage par inhibition de chimiluminescence avec le système selon la présente invention permet de doser l'activité SOD avec un rendement voisin de 100%. 2 - Dosage de la Cu SOD humaine Un système similaire, utilisant une phase solide recouverte d'anticorps anti-Cu SOD humaine obtenu chez le cobaye, permet le dosage de l'enzyme humaine (figure 4), avec une sensibilité de 50 picogrammes. Cependant, l'activité SOD est eluee de la paroi du tube par mise en oeuvre à 37 C d'une solution de papaïne (100 microgrammes/ml) dans le tampon véronal 0,1M, acide éthylènediamine tétracétique Na10-4M, pH 9. Dans ces conditions, la papaïne n'entraine aucune inactivation significative de l'activité SOD, tout en favorisant son passage de la phase solide à la phase liquide, probablement sous forme liée à des fragments Fab. En réalite, la procédure de décrochage de la phase liquide dépend des caractéristiques de chaque antisérum utilisé et il importe de pouvoir sélectionner des anticorps de forte capacité et de faible affinité. La technique proposée selon la présente invention permet donc le dosage spécifique de la Cu SOD dans les milieux biologiques extracellulaires humains. L'application la plus directe dans le domaine clinique concerne le diagnostic des insuffisances renales. Les travaux effectués à l'aide d'une méthode radio-immunologique, montrent en effet que toute souffrance rénale s'accompagne précocément d'une excrétion urinaire anormale de Cu SOD (voir tableau 2). 800 600 400 200 100 80 60 40 20 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 SOD/ TEMOINS I.R LIT N I C. N A G N I C. N. II C. N. III G.N. HEM H.T.A. H.T.A. DIAB D@AB PATHOL PA@@@ pen. RV@@ sans CREA. profondes @Wpiquen PROT Inolére n@@@@ @@@ @@@. @@. @@@ K MYELOM MEPAT INVLRS n 102 43 34 37 8 31 34 23 7 36 58 68 74 57 7 26 27 33 X 1.01 152,24 1,84 20,95 1,34 4,25 17,32 27,42 15,96 1,74 1,86 62,77 23,55 1,70 3,16 59.07 2,45 1,59 # 0,53 135,72 1,06 31,55 0,52 8,68 25,20 68,75 19,12 1,75 1,70 98,77 42,38 1,15 4,07 170,7 2,53 0,83 TABLEAU 2 Le tableau ci-dessus donne la concentration urinaire de la Cu SOD immunoréactive mesurée par radio-immunologie, exprimée en microgrammes d'enzyme par millilnole de créatinine. LIT. : lithiases ; N.I : Néphrites intersticielles ; G.N.A. Glomérulonéphrites aiguës ; G.N.I. : Glomérulonéphrites sans lésions importantes ; G.N.Il : Glomérulonéphrites a dépôts mésangiaux d'IyA G.N.III : G.N. extramenbraneuses, G.N. lupiques ; HEM. PROT. : hématuries et protéinuries transitoires isolées ; H.T.A. : Hypertensions artérielles essentielles isolées ou associées à diverses affections (Diabète, G.N.) DIAB. : Diabètes avec et sans atteinte rénale, insulinodependants ou non insulinodépendants ; MYELOM. : Myelomes ; PATHOL. HEPAT. : Pathologie hépatique ; PATHOL. DIVERS : Pathologies diverses (inflammation, goutte, lithiase vésiculaire, syndrome vertigineux, goitre). La technique d'inhibition de chiriiluminescence peut être appliquée au milieu urinaire. La figure 4 montre en effet que les courbes de dilution d'urine humaine normale ou prélevée chez un sujet insuffisant rénal sont parallèles à celles obtenues avec la Cu SOD purifiée. De plus, le taux de Cu SOD obtenu dans les urines de sujets insuffisants rénaux est très augmenté en comparaison avec celui obtenu dans le cas d'individus en bonne santé. Une grande difficulté dans l'interprétation du dosage des protéines specifiques de faible poids moléculaire, pour le diagnostic des maladies rénales, tient dans leur instabilité liée à la présence des autres constituants urinaires (urée, créatinine) ou surtout du pH.La figure 5 montre l'évolution de la concentration de Cu SOD mesurée par inhibiticn de chimiluminescence avec le système selon la présente invention, ce en fonction du temps. La stabilité est complète lorsqu'une urine humaine normale, surchargée en enzyme purifiée, est incubée à 37 C durant 24 heures. Un résultat similaire est obtenu avec une urine non surchargée, obtenue chez un sujet insuffisant rénal. On vient de décrire le dosage de la dismutase au cuivre dans les milieux biologiques, par inhibition de chimiluminescence mis en oeuvre après immuno-extraction. Ce même système peut bien entendu etre appliqué a toute autre activité dismutasique ; en particulier, les différentes isoenzvmes des superoxydes dismutases (Mn SOD ; Fe SOD ; ...) peuvent également être dosées selon cette technique, ainsi que les complexes métalliques de faible poids moléculaire : pénicillanine-Cu, histidine-Cu, tyrosine-Cu, salicylate-Cu, etc... De plus, on peut envisager l'utilisation de ce même système dans tous les cas OU l'activité dismutase est représentée par un dérivé de couplage de la superoxyde dismutase constituant un traceur immuno-enzymatique. Deux possibilités sont données à titre illustratif - couplage SOD-antigène : l'activité SOD est fixée, puis éluée d'une phase solide supportant l'anticorps spécifique (ce système constitue alors un dosage par competition) ; - couplage SOD-anticorps monoclonal : l'activité SOD est fixée sur la phase solide supportant elle-meme un anticorps monoclonal par l'intermédiaire de l'antigène à doser, savant d'être éluée (il s'agit alors d'un système "sandwich"). Dans le premier cas, le procédé de dosage conforme à la présente invention, appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique couplée avec un antigène ou un haptène, est caractérisé par le fait qu'on met à incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasique à doser en présence d'un support solide pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène, on lave ledit support, on met en contact ledit support lavé avec une solution d'élution et on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. Dans le deuxième cas, le procedé de dosage conforme à la présente invention, appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique couplée avec un anticorps monoclonal, est caractérisé par le fait que l'on met à incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasique à doser en presence d'un support solide pourvu d'un autre anticorps monoclonal capable de fixer l'antigène specifique de l'anticorps monoclonal qui est couplé avec l'activité dismutasique à doser, on lave ledit support, on met en contact le support lave avec une solution d'élution, puis on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. La présente invention a également pour objet le coffret de réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être défini. Ce coffret est caractérisé par le fait qu'il comprend - un réatif chimiluminescent ; et - un système capable de fournir des ions O comprenant un solvant aprotique, notamment, le diméthylsulfoxyde en milieu alcalin. Dans le cas préfére où l'on pratique une immuno-extraction préalablement au dosage, le coffret de réactifs selon la présente invention comprend, en outre - un support solide, tel qu'on tube, pourvu d'un anticorps , et - une solution d'élution. REVENC i CAT IONS 1 - Procédé pour le dosage d'une activité dismutasique, comprenant les tapes consistant a : a) mélanger un échantillon de la substance dont l'activité dismutasique doit être dosée avec un réactif chimiluminescent ; b) mesurer l'inhibition de la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent que l'on provoque en introduisant, dans le mélange préparé à l'étape a), un système capable de fournir des ions 02 ; et c) déduire de la mesure ainsi effectuée la concentration recherchée en activité dismutasique, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme système capable de fournir des ions O-, , un solvant aprotique en milieu alcalin. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme solvant aprotique, le diméthylsulfoxyde. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme agent alcalinisant, l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. 4 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on prépare le système capable de fournir des ions o2 en mélangeant le diméthylsulfoxyde avec une solution aqueuse d'un agent alcalinisant, à raison de 0,5 à 25% en volume de ladite solution aqueuse par rapport au volume de diméthylsulfoxyde, la concentration finale en agent alcalinisant dans le mélange étant comprise entre 0,5 et 10 millimoles. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on utilise un système capable de fournir des ions o2, la concentration finale en agent alcalinisant étant d'environ 5 millimoles et le volume de la solution aqueuse dudit agent alcalinisant étant de 1% par rapport au volume de diméthylsulfoxyde introduit. 6 - Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait qu'on utilise le diméthylsulfoxyde alcalinisé, alors qu'il est équilibré avec une atmosphère dépourvue de gaz carbonique. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'on utilise la lucigénine comme réactif chimiluminescent. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique, caractérisé par le fait qu'on met à incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasiqueà doser en présence d'un support solide pourvu d'un anticorps ayant une spécificité anti-dismutase, on lave ledit support, on met en contact le dit support lavé avec une solution d'solution et on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. 9 - Procedé selon l'une des revendications 1à 7, appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique couplée avec un antigène ou un haptène, caractérisé par le fait qu'on met à incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasique à doser en présence d'un support solide pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène, on lave ledit support, on met en contact ledit support lavé avec une solution d'élution et on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. iO - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, appliqué au dosage spécifique d'une activité dismutasique couplée avec un anticorps monoclonal, caractérisé par le fait que l'on met à incuber l'échantillon renfermant l'activité dismutasique à doser en présence d'un support solide pourvu d'un autre anticorps monoclonal capable de fixer l'antigène spécifique de l'anticorps monoclonal qui est couplé avec l'activité dismutasique à doser, on lave ledit support, on met en contact le support lavé avec une solution d'élution, puis on effectue le dosage par inhibition de chimiluminescence sur la phase liquide résultante. 11 - Coffret de réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'il comprend - un réactif chimiluminescent ; et - un système capable de fournir des ions G2 comprenant un solvant aprotique en milieu alcalin. 12 - Coffret selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le solvant aprotique est le diméthylsulfoxyde. 13 - Coffret selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps ; et - une solution d'élution.