Brevet FR2593393A1 — publié le 19870731

La présente invention concerne l'activateur tis- sulaire du plasminogene et en particulier des formulations pharmaceutiques contenant un activateur tissulaire du plas- minogène, leur preparation et leur amploi en médecine humaine et vétérinaire. I1 est admis qu'il existe un équilibre dynamique entre le système enzymatique capable de former des caillots sanguins - le système coagulateur - et le système enzyma- tique capable de dissoudre les caillots sanguins - le sys- tême fibrinolytique - qui maintient un lit vasculaire entiè- rement dégagé. Pour limiter la perte de sang par une bles- sure, des caillots sanguins sont formés dans les vaisseaux lésés. Après la réparation naturelle de la blessure, les caillots sanguins superflus sont dissous par l'action du système fibrinolytique. Des caillots de sang peuvent occa- sionnellement se former sans blessure traumatique et peu- vent se loger dans des vaisseaux sanguins majeurs en provo- quant une obstruction partielle ou même totale du courant sanguin. Lorsque cela se produit dans le coeur, le poumon ou le cerveau, il peut s'ensuivre un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire ou un ictus cérébral. L'ensemble de ces cas constitue la cause principale de morbidité et de mortalité dans les nations industrialisées. Les caillots sanguins sont constitués d'un réseau fibreux qui est susceptible d'être dissous par une enzymepro- téolytique, la plasmine. Cette enzymeest dérivéed'une pro-enzyme inactive, le plasminogène, un composant du plasma sanguin, par l'action d'un actlvateur de plasminogène. Il existe chez les mammifères deux activateurs de plasminogène immu- nologiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plas- minogène, également connu en tant qu'urokinase, est une enzyme produite par le rein qui peut être isolée de l'urine. On peut également la préparer à partir d'un certain nombre de cultures tissulaires comme sources. L'activateur extrin- sèque du plasminogène, également connu en tant qu'activateur vasculaire du plasminogène et qu'activateur tissulaire du plasminogène (AP-t), peut être isolé de nombreux homogénats tissulaires (notamment d'utérus humain), de la paroi des cellules vasculaires et de certaines cultures cellulaires. En plus de ces deux types d'activateurs du plasminogène, il existe également un produit bactérien, la streptokinase, qui est préparé à partir de streptocoques bêta-hémolytiques. Un inconvénient majeur de l'urokinase et de la streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non juste à l'emplacement du caillot sanguin. Elles peuvent, par exemple, détruire d'autres protéines du sang, telles que le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, en réduisant ainsi le pouvoir de coagulation du sang et en augmentant de ce fait le risque d'hémorragie. Par contre, l'activité biologique de AP-t dépend de la pré- sence de fibrine à laquelle il se lie et o il est active. L'activité maximale se développe ainsi au seul emplacement d'un caillot sanguin, c'est-à-dire en présence du réseau f-brineux à dissoudre, et ceci écarte largement le risque d'hémorragie. Le principal mode d'administration de AP-t est la perfusion intravasculaire, ce qui nécessite de formuler AP-t en une solution à usage parentéral. I1 est généralement souhaitable qu'une solution à usage parentéral ait une con- centration élevée de médicament. La raison en est que le médecin ou le vétérinaire peut alors obtenir la concentra- tion requise dans toute situation donnée en diluant la solution avec un supplément de solvant ou milieu. De plus, il est à déconseiller d'administrer un grand volume de solu- tion à un malade atteint de troubles cardiaques ou rénaux car cela imposerait au coeur ou aux reins des efforts encore plus grands. Il faut donc maintenir le volume à un minimum en utilisant une formulation plus concentrée. En même temps, toute solution à usage parentéral de ce type doit être sta- ble en ce sens que le médicament ne doit avoir aucune ten- dance sensible à précipiter de la solution que ce soit à l'entreposage ou pendant une quelconque opération de dilution. Un certain nombre de solutionsde AP-t à usage parentéral ont été décrites en termes généraux dans les documents EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A- 113 319, EP-A-123 304, le brevet japonais publié 57-120523 (demande 566936) et le brevet japonais publié 58-65218 (demande 56-163145). Ces formulations sont des solutions salines aqueuses de AP-t, dont le pH est à peu près neutre, et présentent l'inconvénient que la solubilité de AP-t dans ces solutions est faible en l'absence d'une augmentation de la concentration ionique. En conséquence, soit les formula- tions ont de basses concentrations en AP-t, ce qui nécessite dans certains cas d'administrer des volumes inopportunément grands de solution à un malade, soit elles sont hypertoniques, ce qui peut être préjudiciable aux hématies au moment de l'administration. On a maintenant découvert que la solubilité de AP-t dans une solution aqueuse à usage parentéral peut être améliorée si le pH de la solution se situe dans une plage acide, et que l'acidité de cette solution ne crée pas de difficultés physiologiques lors de l'administration. Par conséquent, la présente invention fournit une solution aqueuse de AP-t à usage parentéral, dont le pH est de 2 à 5. I1 résulte de la meilleure solubilité de AP-t que la solution à usage parentéral de la présente invention est capable d'atteindre de fortes concentrations en AP-t sans aucun risque sensible que AP-t précipite de la solu- tion. De plus, on a constaté que la concentration en AP-t d'une telle solution peut être facilement réduite par dilu- tion avec de l'eau à pH neutre ou acide, là encore sans aucun risque sensible que AP-t précipite. La présente inven- tion propose donc une solution à usage parentéral qui dis- pose d'une plus grande souplesse de maniement et d'emploi par les médecins et les vétérinaires. Le AP-t à utiliser dans la présente invention peut être n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement au AP-t des mammifères, et en particulier des êtres humains, et il englobe les formes avec et sans glycosylation. Il peut s'agir de AP-t à une ou deux chaînes, ou d'un mélange de ceux-ci, comme décrit dans le document EP-A-112-122, et, dans le cas de AP-t humain totalement glycosylé, son poids moléculaire apparent sur gel de polyacrylamide est d'environ 70 000 et son point isoélectrique est compris entre 7,5 et 8,0. De préférence l'activité spécifique du AP-t est d'environ 500 000 UI/mg (Unités Internationales/mg, l'Unité Internationale étant une unité d'activité définie par WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Londres, NW3 6RB, Royaume-Uni). La séquence d'amino-acides de AP-t correspond de préférence sensiblement à celle qui est exposée sur la figure 1des dessins annexés. Il s'agit donc d'une séquence identique à celle de la figure 1 ou comportant une ou plu- sieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélique ou autre, la séquence résultante ayant au moins 80 %, et de préférence %, d'homologie avec la séquence de la figure 1 et con- servant essentiellement les mêmes propriétés biologiques et immunologiques que cette protéine. En particulier, la séquence de AP-t est identique à celle de la figure 1 ou bien est la même à la différence que l'amino-acide de la 245ème position à partir de la sérine N-terminale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement totalement dépourvue des trois pre- miers amino-acides ou contenant éventuellement une présé- quence N-terminale polypeptidique additionnelle consistant en Gly-Ala-Arg. La séquence d'amino-acides représentée sur la figure 1 contient trentecinq résidus de cystéine et a donc la capacité de former dix-sept ponts disulfure. Sur la base de l'analogie faite avec d'autres protéines dont la struc- ture a été déterminée plus en détail, la figure 2 montre la structure proposée pour la séquence (résultant de la formation de ponts disulfure) située entre l'amino-acide de la 90ème position et la proline C-terminale. On est moins sûr de la structure de la région N-terminale bien que quel- ques propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; et Proc. Natl. Adad. Sci., 1984, 81, 5355-5359). Les caractéristiques les plus importantes de la structure de AP-t sont les deux régions en anneau (situées entre les 92ème et 173ème amino-acides et entre les 180ème et 261ème amino-acides) qui sont cause de la liaison de la protéine à la fibrine, et la région des sérine-protéases qui constitue la majeure partie la chaîne B et qui est cause de l'activation du plasminogène. Les amino-acides particu- lièrement importants des sérine-protéases sont la triade catalytique His/Asp/Ser. Dans AP-t, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 37lème et 463ème positions. Le pont disulfure reliant les résidus de cystéine aux 264ème et 395ème posi- tions est également important en ce sens qu'il maintient ensemble les chaines A et B dans la forme bicaténaire de AP-t. Sur les figure 1 et 2, les codes conventionnels à une et trois lettres ont été employés pour désigner les résidus d'amino-acides comme suit: Asp D Aclde aspartlque Ile I Isoleucine Thr T Thréonine Leu L Leucine Ser S Sérine Tyr Y Tyrosine Glu E Acide glutamique Phe F Phénylalanine Pro P Proline His H Histidine Gly G Glycine Lys K Lysine Ala A Alanine Arg R Arginine Cys C Cystéine Trp W Tryptophanne Val V Valine Gln Q Glutamine Met M Méthionine Asn N Asparagine On peut obtenir le AP-t par l'une quelconque des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur. Par exemple, on peut l'obtenir à partir d'une lignée cellulaire normale ou néoplasique du genre décrit dans Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41 766 ou EP-A- 113 319. On préfère cependant que AP-t soit préparé à par- tir d'une lignée cellulaire cultivée transformée ou trans- fectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recom- binant comme décrit par exemple dans les documents EP-A- 93 619; EP-A-117 059 ou EP-A-117 060. On préfère en parti- culier l'utilisation de cellules d'ovaire de hamster chi- nois (OHC) pour la production de AP-t, et que ces cellules soient dérivées de la manière décrite dans Molecular and Cellular Bioloqy, 1985, 5(7), 1750-1759. Selon cette méthode, le gène cloné est transfecté conjointement au gène codant la dihydrofolate-réductase (dhfr) dans des cellules dhfr de OHC. Les transformants exprimant dhfr sont sélectionnés sur des milieux manquant de nucléosides et sont exposés à des concentrations croissantes de méthotrexate. Les gènes de dhfr et AP-t sont ainsi amplifiés conjointement en con- duisant à une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des taux élevés de AP-t. De préférence, on purifie le AP-t en utilisant n'importe laquelle des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur, par exemple les techniques décrites dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid., 1981, 256(13), 7035- 7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 ou GB-A-2 122 219. Il apparaît n'y avoir aucune limite supérieure à la solubilité de AP-t dans la solution à usage parentéral. Aux concentrations très élevées, comme de plus de 000 000 UI/ml (Unités Internationales/ml), la solution devient simplement visqueuse sans aucune précipitation sensible de AP-t. On peut faire varier dans de larges limi- tes la concentration de AP-t dans la solution à usage paren- téral, par exemple de 50 000 à 50 000 000 UI/ml. Afin de tirer le meilleur parti de la présente invention, on pré- fère que la concentration de AP-t soit supérieure à 000 UI/ml, plus particulièrement supérieure à 500000 UI/ml, et mieux encore supérieure à 1000000 UI/ml. On pré- fère au mieux que la concentration de AP-t soit supérieure à5 000000 UI/ml. La limite supérieure du pH de la solution à usage parentéral est, de préférence, de 4,5. En fait, le pH se situe de préférence de 2,5 à 4,0, mieux encore de 2,8 à 3,5, et au mieux à environ 3,0. On obtient commodément le pH désiré de la solution à usage parentéral en utilisant un acide minéral ou organique physiologiquement acceptable. Des exemples de tels acides sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide nitrique, ainsi que l'acide citrique, l'acide tartrique et l'acide benzènesulfonique. Parmi ceux-ci, on préfère l'acide chlorhydrique. Bien qu'une certaine quantité d'un cosolvant phy- siologiquement acceptable puisse éventuellement être pré- sente en addition u l'eau, on préfère que le milieu de formation de la solution à usage parentéral soit totale- ment ou presque totalement aqueux. La solution à usage parentéral peut être hyper- tonique, hypotonique ou isotonique vis-à-vis du sérum san- guin du malade. Pour éviter des effets secondaires indési- rables, il est cependant préférable que la solution à usage parentéral soit isotonique, bien que des écarts mineurs n'aient pas une grande incidence physiologique. Une solution à usage parentéral sensiblement isotonique peut être prépa- rée grâce à l'incorporation d'un agent physiologiquement acceptable qui est capable d'élever la pression osmotique de la solution jusqu'au niveau requis. Des exemples de tels agents sont bien connus en pratique et comprennent le dex- trose (sous forme anhydre ou monohydratée) et le chlorure de sodium, et leurs mélanges. La concentration de l'agent dans la solution à usage parentéral sera évidemment diffé- rente d'un agent à l'autre. Dans le cas du chlorure de sodium, la concentration est de préférence de 7 à 10 mg/ml, et mieux encore d'environ 8,5 mg/ml, concentration qui est celle de ce que l'on nomme une solution physiologique saline.-Dans le cas du dextrose anhydre, la concentration est de préférence de 30 à 70 mg/ml, et mieux encore d'environ 50 mg/ml. Au cas o il est nécessaire de réduire la concentration de AP-t dans une solution à usage parentéral sensiblement isotonique, on préfère que cette dilution soit effectuée avec une solu- tion aqueuse du même agent à la même concentration afin de conserver une solution sensiblement isotonique. La solution à usage parentéral peut éventuellement contenir des additifs couramment associés aux formulations de ce type. AP-t a en outre tendance à être adsorbé sur les surfaces de verre et de matières plastiques et il peut donc être souhaitable d'incorporer un surfactif à la solution à usage parentéral pour empêcher ou minimiser cette adsorption. Des exemples de surfactifs sont les dérivés polyoxyéthyléniques d'esters partiels d'acides gras formés avec des anhydrides de sorbitol, tels que ceux vendus sous la marque commerciale "Tween 80". 2593N393 L'un des avantages sur;renantz de la prrsente in- vention, hormis la forte augmentation de solubilité de AP-t, est que l'e-nloi d'une solution acide à usage paren- téral, dont le pH- se situe dans les limites définies ici, apparaît n'exercer aucun effet physiologique défavorable par administration au malade. Il semblerait que le courant sanguin soit capable d'une façon générale d'élever le pH de la solution jusqu'à neutralité presque aussitôt que le contact est réalisé, le AP-t étant rapidement distribué dans le courant sanguin. On préfère cependant que ce pro- cessus ne soit sensiblement freiné d'aucune façon et que la solution à usage parentéral ne contienne pas d'agent tampon fort. Un agent tampon faible qui n'inhibe pas nota- blement ce processus oeut toutefois être incorporé et en fait AP-t luimême agit à pH acide comme son propre agent tampon faible. En outre, la sérum-albumine humaine est capable d'agir comme agent tampon faible. En raison de la solubilité fortement accrue de AP-t dans la solution à usage parentéral de la présente inven- tion, il est inutile d'incorporer une matière additionnelle, telle que la lysine ou l'ornithine ou un de leurs sels, pour accroître la solubilité de AP-t. La solution à usage parentéral peut être préparée selon les procédés et techniques préparatoires classiques de la pharmacie en utilisant AP-t sous forme d'une solution ou d'un solide purifiés. La présente invention propose par conséquent un procédé pour préparer une solution aqueuse de AP-t à usage parentéral, comme définie ici, qui consiste à: (i) obtenir une solution purifiée de AP-t et échanger le milieu pour un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5; ou (ii) dissoudre AP-t dans un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5; et stériliser la solution résultante. ti, La purification de AP-t peut comporter comme stade final l'élution de la protéine d'une colonne de chro- matographie sous forme d'une solution contenant un agent tampon fort. Comme mentionné précédemment, on préfère que la solution à usage parentéral ne contienne pas d'agent tampon fort et, par conséquent, un moyen commode pour pro- céder à son élimination tout en échangeant le milieu est d'effectuer une dialyse. On peut s'y prendre en utilisant un tube de dialyse ou un rein artificiel dans lesquels la solution purifiée est dialysée contre un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5. Il peut être souhaitable, notamment si la concentration de AP-t dans la solution purifiée est élevée, d'ajuster tout d'abord le pH de la solution de sorte qu'il soit de 2 à 5. Un autre moyen pour procéder à l'élimination d'un agent tampon fort tout en échangeant le milieu consiste à soumettre la solution purifiée à une fil- tration sur gel et développer la colonne avec un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5. On peut de préférence recueillir AP-t sous forme d'un solide précipité à partir d'une solution purifiée en ajustant le pH à environ 5,5, en refroidissant la solution juste au-dessus de son point de congélation, et en séparant la protéine, par exemple par centrifugation. On peut ensuite dissoudre le solide précipité dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, d'une manière classique. La stérilisation de la solution résultante peut être effedtuée de façon classique, par exemple par stéri- lisation par filtration. La solution à usage parentéral est normalement présentée dans des récipients stériles et scellés en verre ou matière plastique. Elle peut aussi être présentée sous formes à dose unitaire, par exemple dans des ampoules,fla- cons ou dispositifs d'injection à usage unique, ou sous des formes à doses multiples, par exemple dans des sachets ou flacons pour perfusion. Le volume de solution à présen- ter dans ces récipients peut varier dans de larges mesures mais il est commodément de 0,5 à 20 ml. Afin de stabiliser AP-t, la solution à usage parentéral est de préférence congelée et maintenue à -10 à -30 C. L'activité biologique qu'exerce AP-t en dissol- vant le réseau flbrlneux des caillots sanguins est à l'ori- O10 gine de son utilité dans le traitement de troubles thrombo- tiques (The Lancet, 7 novembre 1981, 1018-1020; ibid., 13 avril 1985, 842847 The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; et ibid., 1985, 312(14), 932-936). La présente invention propose par conséquent une méthode pour le traitement d'un trouble thrombotique chez un mammi- fère, qui consiste à administrer au mammifère une solu- tion aqueuse à usage parentéral de AP-t telle que définie ici. Dans l'alternative, il est également proposé une solution aqueuse à usage parentéral de AP-t, telle que définie ici, destinée à être employée en médecine humaine ou vétérinaire, notamment dans le traitement d'un trouble thrombotique. Des exemples particuliers de troubles thromboti- ques sont connus en pratique et comprennent l'infarctus du myocarde, la thrombose des veines profondes, l'embolie pulmonaire et l'ictus cérébral. Le principal mode d'administration de AP-t est la perfusion intravasculaire, notamment intraveineuse, bien qu'il soit concevable d'employer d'autres modes d'adminis- tration, tels que l'administration intramusculaire. Les perfusions intravasculaires sont normalement effectuées en utilisant la solution à usage parentéral contenue dans un sachet ou un flacon ou encore dans une seringue à perfusion actionnée électriquement. La solution peut être délivrée au malade à partir du sachet ou du flacon sous l'effet d'un écoulement par gravité ou en utilisant une pompe de perfu- sion. L'utilisation de systèmes de perfusion à écoulement par gravité ne donne pas suffisamment d'emprise sur la vitesse d'administration de la solution à usage parentéral et on préfère donc l'utilisation d'une pompe de perfusion, notamment avec des solutions dont la concentration en AP-t est relativement élevée. On préfère cependant encore plus l'utilisation d'une seringue à perfusion actionnée électri- quement qui donne une emprise encore meilleure sur la vi- tesse d'administration. La quantité de AP-t qui est efficace pour traiter un mammifère atteint d'un trouble thrombotique est évidem- ment fonction d'un certain nombre de facteurs comprenant, par exemple, l'âge et le poids du mammifère, le cas précis qui nécessite le traitement et sa gravité, le mode d'admi- nistration, et cette quantité sera en fin de compte laissée à l'appréciation du médecin ou vétérinaire traitant. On peut cependant s'attendre à ce qu'une quantité efficace pour dissoudre un thrombus d'artère coronaire, par exemple, se situe en général de 150 000 à 450 000 UI/kg de poids corpo- rel du malade et par heure. Ainsi, pour un être humain adulte de 70 kg, une quantité efficace par heure sera en général de 10 000 000 a 30 000 000 UI, notamment d'environ 20 000000 UI, et cette quantité peut être administrée avec ou sans dose d'amorcage. On peut également s'attendre à ce que la posologie soit moindre pour certaines affections tnrcmbotiques, telles que la thrombose de veine profonde et l'ictus cérébral aigu, ou pour maintenir simplement le dégagement d'une artère coronaire qui est déjà sous une nouvelle perfusion. Dans ces circonstances, une quantité efficace est en général de 7000 à 36 000 UI/kg de poids corporel du malade et par heure. Les exemples non limitatifs suivants illustrent ia presente invention. i Exemple 1 On purifie par voie chromatographique une récolte clarifiée de AP-t, tirée d'une lignée de cellules de OCH transformée et cultivée ayant été dérivée selon la techni- que de Molecular and Cellular Biology, 1985,5(7), 1750-1759, et on recueille le AP-t sous forme d'une solution aqueuse à pH 5,5 contenant du citrate de sodium 0,17M et 0,01 % de Tween 80 en poids par volume. On ajuste le pH de la solu- tion à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique et concentre la solution résultante par ultrafiltration en utilisant une cartouche H-10 (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, Angleterre). On obtient ainsi une solution aqueuse purifiée concentrée de AP-t (2500000 UI/ml), con- tenant du citrate de sodium 0,1M, du chlorure de sodium 0,23M (résultant de l'addition d'acide chlorhydrique) et 0,01 % de Tween 80 en poids par volume, et dont le pH est de 3,0. On place cette solution dans un tube de dialyse ayant un poids moléculaire critique d'environ 14000 etla dialyse à 4"C contre quatre fois 50 volumes de solution physiologique saline(0,85 % de chlorure de sodium en poids par volume) stérilisée par filtration contenant 0,01 % de Tween 80 en poids par volume et ajustée à pH 3,0 avec de l'acide chlorhydrique concentré. On laisse chaque étape de dialyse s'effectuer pendant 12 heures. Après avoir récupéré la solution aqueuse du sac de dialyse, on la stérilise par filtration et la dilue avec de la solution physiologique saline pour qu'elle contienne 500 000 UI/ml de AP-t. On -in- troduit ensuite la solution à usage parentéral résultante dans des flacons de verre que l'on obture, puis que l'on congèle et conserve à -20 C. Exemple 2 On purifie par voie chromatographique une récolte clarifiée de AP-t, tirée d'une lignée de cellules de OCH transformée et cultivée ayant été derivée selon la techni- que de >!olecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, et on recueille le AP-t sous forme d'une solution aqueuse à pH 5,5 contenant du citrate de sodium 0,17M et 0,01 % de Tween 80 en poids par volume. On ajuste le pH de la solu- tion à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique et concentre la solution résultante par ultrafiltration en utilisant une cartouche H-10 (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, Angleterre). On purifie davantage la solu- tion aqueuse concentrée en l'appliquant à une colonne de filtration surgel (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Suède) et en éluant avec une solution saline à 0,85 % à pH 3,0 contenant 0,01 % de Tween 80 en poids par -volume. On obtient ainsi une solution aqueuse hautement purifiée de AP-t que l'on concentre une fois de plus en utilisant un rein artificiel à usage unique. On fait précipiter AP-t de la solution en portant le pH à 5,5 avec de l'hydroxyde de sodium et en maintenant la suspension à 4 C pendant 2 heures. On sépare le AP-t par centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4WC. On redissout le culot de AP-t dans une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85 % en poids par volume contenant 0,01 % de Tween 80 en poids par volume et dont le pH est ajusté à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique. Le volume de la solution saline utilisée est celui qui convient pour obtenir une concentration de AP-t comprise entre 7500000 UI/ml et 10 000000 UI/ml. Ondilue cette solution de AP-t avec davantage de solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85 % en poids par volume conte- nant 0,01 % de Tween 80 en poids par volume dont le pH est ajusté à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique, et également avec une quantité suffisante d'une solution de mannitol à % en poids par volume dans la même solutionsaline acide pour obtenir des concentrations finales de 5 000000 UI/ml de AP-t et de 25 mg/ml de mannitol. On stérilise la solu- tion résultante par filtration et la distribue en volumes de 1 rml dans des flacons de verre que l'on congèle et con- serve à -20 C. Exemple 3 L'efficacité thrombolytique de la solution à usage parentéral de l'Exemple 1 a été évaluée dans un mo- dèle in vivo de thrombose de veine jugulaire. (a) Mode opératoire: Le mode opératoire expérimental était essentiel- lement conforme à celui décrit par Collen et coll. (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376). On a laissé dégeler la solution à usage parenté- ral de l'Exemple 1 et l'a diluée avec une solution saline isotonique stérile ajustée à pH 3,0 et contenant 0,01 % de Tween 80, de façon à obtenir une solution suffisante pour une perfusion en 2 heures de 500 000 UI/kg de AP-t. La per- fusion était faite par une canule dans la veine fémorale droite. On s'est servi dans cette étude de trois lapins blancs de Nouvelle-Zélande. Après la perfusion, on a estimé le degré de thrombolyse. (b) Résultats: Le pourcentage de thrombolyse était de 22,3 4,1, ce qui démontre l'effet thrombolytique de la solution à usage parentéral de l'Exemple 1. De plus, on n'a observé aucune réaction défavorable associée à la perfusion de cette solution. ]6 REVENDICATIONS 1. Solution aqueuse à usage parentéral d'activa- teur tissulaire du plasminogène, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 5. 2. Solution à usage parentéral'selon la revendi- cation 1, caractérisée en ce que l'activateur tissulaire du plasminogène est soit sous forme monocaténaire, soit sous forme bicaténaire. 3. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 1 ou 2, caractérisée en ce que l'activateur tissu- laire du plasminogène présente la séquence d'amino-acides suivante: SerTyr Gin Val lie Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Giy Arg Ala Gin Cys His Ser Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu lie Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln Gly lie Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met lie Leu lie Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Met Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg lie Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp lie Ala Ser His Pro Tr? Gin Ala Ala lie Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys GlyI Gly lie Leu Dle Ser Ser Cys Trp lie Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val lie Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Val Glu ys Tyr lie Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Lau Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lle Arg Asp Asn Met Arg Pro ou présente la même séquence d'amino-acides mais o l'amino- acide de la 245ème position à partir de la sérine N-termi- nale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'au- tre séquence étant éventuellement totalement dépourvue des trois premiers amino-acides ou comportant éventuellement une préséquence polypeptidique N-terminale additionnelle de Gly-Ala-Arg. 4. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'activateur tissulaire du plasminogène est tiré d'une lignée cellulaire cultivée transformée ou transfectée ayant été dérivée par une technique d'ADN recombinant. 5. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce que sa concentration en activateur tissulaire du plasmino- gène est supérieure à 100000 UI/ml. 6. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 5, caractérisée en ce que sa concentration en acti- vateur tissulaire du plasminogène est supérieure à 500 000 UI/ml. 7. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 6, caractérisée en ce que sa concentration en acti- i ei vateur tissulaire du plasminogène est supérieure à 1000 000 UI/ml. cation vateur UI/ml. 8. Solution à usage parentéral selon la revendi- 7, caractérisée en ce que sa concentration en acti- tissulaire du plasminogène est d'environ 5 000 000 9. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 4,5. 10. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 9, caractérisée en ce que son pH est de 2,5 à 4,0. 11. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 10, caractérisée en ce que son pH est de 2,8 à 3,5. 12. Solution à usage parentéral selon la revendi- cation 11, caractérisée en ce que son pH est d'environ 3,0. 13. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le milieu est totalement ou presque totalement aqueux. 14. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent physiologiquement acceptable qui rend la solution sensiblement rum sanguin humain. 15. Solution à usage cation 14, caractérisée en ce acceptable est le chlorure de 1l6. Solution à usage cation 14, caractérisée en ce acceptable est le dextrose. 17. Solution à usage isotonique vis-à-vis du sé- parentéral selon la revendi- que l'agent physiologiquement sodium. parentéral selon la revendi- que l'agent physiologiquement parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent tensio-actif. 18. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendication précédentes, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement non tamponnée. 19. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement exempte de lysine, d'ornithine ou d'un sel de celles-ci. 20. Solution aqueuse saline à usage parentéral d'activateur tissulaire du plasminogène, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 5. 21. Procédé pour préparer la solution à usage parentéral de l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il consiste à: (i) obtenir une solution purifiée d'activateur tissulaire du plasminogène et échanger le milieu pour un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5; ou (ii) dissoudre l'activateur tissulaire du plasmi- nogène dans un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5; et stériliser la solution résultante. 22. Méthode pour le traitement d'un trouble throm- botique chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle con- siste à administrer au mammifère la solution à usage paren- téral de l'une quelconque des revendications 1 à 20. 23. Solution à usage parentéral selon l'une quel- conque des revendications 1 à 20, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être employée en médecine humaine ou vétéri- naire, notamment dans le traitement d'un trouble thrombo- tique. 24. Récipient obturé contenant la solution à usage parentéral de l'une quelconque des revendications 1 à 20 et 23.