Brevet FR2592884A1 — publié le 19870717

La jacinthe d'eau, Eichornia crassipes, est une plante aquatique de l'ordre des Pontédériales, famille des Pontédériacées, qui regroupe 25 a 30 espèces d'hydrophytes d'eaux douces et marécageuses en zones chaudes et tempérées La présente invention concerne a titre de produit industriel nouveau, un extrait de jacinthe d'eau renfermant des peptides L'invention vise également le procédé pour la préparation d'un extrait de jacinthe d'eau renfermant des peptides, ainsi que l'utilisation de cet extrait, comme produit favorisant la multiplication cellulaire végétale et en particulier la germination des graines de plantes On sait que la jacinthe d'eau, est une plante aquatique dont la croissance peut être très rapide lorque certaines conditions de culture sont réalisées ainsi la demanderesse a décrit dans sa demande de brevet français n4 2 559 639 du 17/2/1984 un procédé et une installation permettant de cultiver et d'obtenir de la jacinthe d'eau avec d'excellents rendements. Grâce à ces excellents rendements. il est possible d'envisager de cultiver industriellement la jacinthe d'eau pour pouvoir utiliser cette plante dans différentes applications et en particulier l'alimentation du bétail. Par ailleurs, la demanderesse a montré dans sa demande de brevet français nO 85 14055 du 23/9/1985 que lorsque la jacinthe d'eau était cultivée au moyen dune solution nutritive, bien définie, il était possible de l'enrichir notablement en protéines. La demanderesse a montré en outre dans la demande de brevet précitée que le jus extrait de la jacinthe d'eau obtenu par broyage et pressage de cette dernière, et riche en protéines et éléments minéraux, avait une action stimulante sur la croissance des plantes. La demanderesse a poursuivi ses recherches afin d'identifier les composés contenus dans la jacinthe d'eau, qui sont responsables de l'action stimulante sur la croissance des plantes, en vue d'obtenir un extrait de jacinthe d'eau comprenant lesdits composés à une teneur enrichie, de façon à obtenir un extrait ayant une action nettement accrue a l'égard de la croissance des plantes. La demanderesse a ainsi découvert au travers de travaux effectués par le groupe de recherches en biologie et chimie des végétaux marins (Professeur Louis CODOMIER et M. Gilles SAUBES > , à l'Université de Perpignan, qu'en soumettant la jacinthe d'eau à un traitement d'extraction particulier, il était possible d'obtenir un extrait enrichi en peptides qui présente une action nettement favorable a l'égard de la multiplication cellulaire végétale. De préférence, cet extrait de jacinthe d'eau renferme plus de 50X en poids de peptides. Cet extrait est de préférence constitué par un extrait des pétioles ou des parties blanches de la jacinthe d'eau. I1 a été constaté en effet que ces parties de la jacinthe d'eau renfermaient nettement plus de peptides que les autres parties de la jacinthe d'eau qui sont constituées essentiellement par les limbes. L'invention vise également un procédé pour la préparation d'un extrait de jacinthe d'eau enrichi en peptides. Selon l'invention, on sélectionne pour l'extraction les parties de la plante qui se sont révélées avoir une concentration en peptides supérieure à celle du reste de la plante, telles que les pétioles et les parties blanches. Ce procédé comprend de préférence les étapes suivantes : - on lyophilise des pétioles ou des parties blanches de jacinthe d'eau, - on broye lesdits pétioles ou parties blanches, - on traite le broyat avec un mélange d'méthanol et de chloroforme, - on filtre, - on évapore jusqu'a siccité le filtrat, - on traite l'extrait sec obtenu par de l'eau et de l'éther pour obtenir une phase aqueuse et une phase éthérée, - on traite la phase aqueuse avec du butanol pour obtenir une phase aqueuse et une phase butanolique, et - on évapore jusqu'à siccité cette phase butanolique. L'invention vise également l'utilisation de l'extrait de jacinthe d'eau conforme à l'invention ou obtenu selon le procédé précité, comme produit favorisant la multiplication cellulaire végétale et en particulier favorisant la germination des graines de plantes. D'autres particularités et avantages de l'invention apparaltront encore dans la description ci-aprbs. La figure unique annexée est un chromatogramme en couche mince montrant trois zones dilution correspondant a trois familles de peptides contenus dans l'extrait de jacinthe d'eau obtenu selon l'invention. On décrit ci-après a titre d'exemple non limitatif, le mode opératoire du procédé de préparation d'un extrait de jacinthe d'eau riche en peptides. Les différentes parties Climbes, pétioles, parties blanches) de la jacinthe d'eau sont lyophilisées et broyées séparément puis mises en agitation pendant une heure avec un mélange de chloroforme et d'éthanol dans le rapport de concentration l/1. On filtre le mélange résultant sur un verre fritté nQ 2, on évapore le filtrat jusqu'à siccité et on reprend le broyat restant avec un nouveau mélange de chloroforme et d'méthanol (1/1), tout en agitant. La mSme opération est renouvelée trois fois, comme indiqué sur le schéma récapitulatif ci-après. Partie de la jacinthe d'eau lyophilisée Broyage Agitation 1 h avec EtOHfCHCls (1/1) Filtration Broyat Solution Broyat chloroforme éthanol ss | Agitation 1 h avec EtOHSCHCIR (1/1) Filtration Solution chloroforme Broyat Méthanol Agitation 1 h avec EtOH/CHClR (1/in Filtration Solution M W chloroforme Résidu éthanol Sécher à l'étuve puis ss puis peser Extrait total sec Résidu sec d'extraction Ainsi en partant de 31,15 g de pétioles lyophilisés et en utilisant deux litres du mélange chloroforme éthanol (i/i) on obtient 5,582 g d'extrait sec. Dans les mêmes conditions, en partant de 32,37 g de parties blanches, on obtient 4,188 g d'extrait sec. Dans les mimes conditions, en partant de 45,8 g de limbes, on obtient 7,947 g d'extrait sec. Dans une seconde étape du mode opératoire, on effectue sur l'extrait sec obtenu à la fin de la première phase, une extraction séparative de façon à obtenir les substances liposolubles et les substances alcoolo-solubles. Lors de cette étape, on traite l'extrait sec par de l'eau et de l'éther pour obtenir une phase aqueuse et une phase éthérée. On traite ensuite la phase aqueuse avec du butanol pour obtenir une phase aqueuse et une phase alcoolique et on évapore jusqu'à sec cette phase alcoolique. Comme précédemment on répète cette opération plusieurs fois. On donne ci-après le schéma de cette extraction séparative. Extrait total sec Repris Repris avec de l'eau et de l'éther en ampoule à décanter > Phase supérieure Phase inférieure (*thErbe) (aqueuse) Laver sur Lavezà l'éther Sécher sur Renouveler 2 fois sulfate de l'opération maqnéciiunt puis - Phase supérieure Phase inférieure filtration (6thXrXe) (aqueuse) sur fritté 4 évaporation. Laver au butanol Extrait éthéré Phase supérieure Phase sec (partie alcoolosoluble) inférieure (aqueuse) Renouveler 2 fois l'opération Phase supérieure Phase inférieure (partie alcoolosoluble) (aqueuse) évaporer à sec Protéines Sucres Partie alcoolosoluble sèche I Reprendre au butanol élimination des sels puis évaporer à sec} hydrosolubles restants Extrait butanolique sec On obtient ainsi un extrait éthéré sec et un extrait butanolique sec. En partant de 5,582 8 d'extrait sec obtenu a partir des pétioles, on obtient 0,988 g d'extrait éthéré sec en utilisant un litre d'éther et 0,148 g d'extrait butanolique sec en utilisant un litre de butanol. En partant de 4,188 g d'extrait sec obtenu a partir des parties blanches, on obtient 0,661 g d'extrait éthéré et 1,048 g d'extrait butanolique. En partant de 7,947 g d'extrait sec obtenu a partir des limbes, on obtient 3,17 g d'extrait éthéré et 2,518 g d'extrait butanolique. Les analyses effectuées sur les extraits secs éthérés n'ont pas permis de déceler la présence de peptides. Les analyses effectuées sur les extraits secs butanoliques sont décrites ci-aprbs Ces extraits secs butanoliques ont fait l'objet d'analyses par chromatographie en couche mince, en utilisant une couche de silice telle que commercialisée par la société MERCK sous la référence bOF254 et en utilisant en tant qu'éludant un mélange de butanol, deau et d'acide acétique dans le rapport 4/1/1.La migration a été effectuée sur 10 cm. Sur la figure annexée, on a représenté les chromatogrammes obtenus pour les trois extraits secs butanoliques, à savoir celui obtenu a partir des limbes On constate sur les chromatogrammes P (pétioles) et PB (parties blanches); trois zones 1, 2, 3 d'élution. Ces trois zones 1, 2, 3 ont été révéléespar un réactif contenant 0,2 g de ninhydrine dans 100 cm3 d'éthanol a 95X qui donne a ces zones une coloration rouge révélant la présence de groupes NH libres. La présence de peptides dans les extraits butanoliques des pétioles (P) et des parties blanches (PB) est confirmée par les tests de révélation à l'acide sulfurique et à la cuve à chlore (caractéristiques des peptides). chaque zone 1 2, 3 correspond un rapport de rétention RF (distance origine-centre de la tache/distance origine-front du solvant) qui définit la position de la zone d'élution sur la plaque chromatographique. Pour les pétioles (P) comme pour les parties blanches (PB), les rapports de rétention sont les suivants RF1 = 0,14 (zone 1) RF2 = 0,23 (zone 2) RF3 = 0,35 (zone 3). La présence de zones peptidiques est moins nette dans le cas de l'extrait provenant des limbes (L). Les essais effectués ont également montré que chaque extrait sec butanolique contient en moyenne 607. en poids de mélange peptidique. Ces extraits secs butanoliques ont fait l'objet de tests de germination sur des graines de persil. Ces tests sont décrits ci-après. Ces tests ont été réalisés en utilisant les extraits secs butanoliques obtenus à partir des pétioles et des parties blanches de la jacinthe d'eau. Dans 10 bottes de Péri dont le fond est recouvert de papier filtre, on a versé 10 ml du mélange suivant Milieu de KNOP, solution de fer EDTA (5 ml/l et oligo-éléments (1 ml/l). La composition du milieu de KNOP était la suivante Pour 10 1 Ca(NO3)2, 4 HO 100 g KNO3 25 g MgSOo 25 g KH=POo 25 g Ce milieu est dilué au 1/10 pour son utilisation. La composition de la solution de fer EDTA était la suivante Pour 1 I FeSO4 5,57 g Na2 EDTÀ 7,45 g On a déposé 20 graines de persil dan chaque boite de Pétri. Deux de ces boîtes ont servi de témoins. Dans les huit autres boîtes on a rajouté 10 ml d'une solution aqueuse renfermant les peptides conformes à l'invention, extraits de la jacinthe d'eau, aux concentrations suivantes témoin 1, 0,9 mg/l (1), 1,8 mg/l (1) 0,9 mg/l (3), 1,8 mg/l (3 > témoin 2, 0,9 mg/î (1 > , 1,8 mg/l (1) 0,9 mg/l (3), 1,8 mg/l (3). (entre parenthèses : référence de la zone d' élution) On a constaté que la germination des graines de persil était plus rapide dans les boîtes de Pétri renfermant les peptides que dans les deux boîtes témoins. On a également observé que la germination était plus rapide dans les boîtes contenant les peptides provenant de la zone dilution 1 que dans les boîtes contenant les peptides provenant de la zone d'solution 3. D'autres tests ont été effectués en utilisant les peptides de la zone d'solution 1 dans les concentrations suivantes : 0,9 mg/l. 2,7 mg/l, 5,4 mg/l et 10,8 mg/l. Il a été constaté que la vitesse de germination la plus rapide était obtenue aux concentrations comprises entre 2,7 mg et 5,4 mg/l, bien que les résultats soient meilleurs avec une concentration égale à iO,8 mg/l qu'avec ,9 mg/l. Les tests précités montrent donc que les peptides contenus dans la jacinthe d'eau et obtenus par extraction butanolique présentent une action efficace à l'égard de la multiplication cellulaire végétale. L'extrait de jacinthe d'eau, riche en peptides, conforme a l'invention, peut ainsi être commercialisé sous forme de produit sec ou dilué dans de l'eau et éventuellement mélangé avec d'autres substances, en tant que produit destiné à l'agriculture ou à l'horticulture pour favoriser la germination des plantes et/ou la croissance de celles-ci. bien entendu l'extrait peptidique conforme à l'invention peut également être obtenu à partir du jus de pressage de jacinthe d'eau ou de parties de celle-ci, tel que décrit dans la demande de brevet français nv 85 14055 du 23/9/1985. Dans ce cas, on soumet le jus de pressage a un procédé d'extraction analogue a celui décrit. REVENDICATIONS 1. A titre de produit industriel nouveau, un extrait d'une plante aquatique de l'ordre des pontédêriales, du type hydrophyte d'eau douce, telle que la jacinthe d'eau, plante ci-après désignée par jacinthe d'eau, caractérisé en ce qu'il contient des peptides. 2. Extrait de jacinthe d'eau conforme à la revendication 1, caractérisé en ce quil est enrichi en peptides et renferme plus de 50X en poids de peptides. 3. Extrait de jacinthe d'eau, conforme a l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un extrait de pétioles de jacinthe d'eau. 4. Extrait de jacinthe d'eau conforme à l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un extrait de parties blanches de jacinthe d'eau. 5. Extrait de jacinthe d'eau conforme à lune des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il est obtenu par extraction au butanol d'une partie au moins de jacinthes d'eau préalablement broyées. 6. Extrait de jacinthe d'eau conforme a l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend trois familles différentes de peptides. 7. Extrait de jacinthe dleau conforme a la revendication 6, caractérisé en ce que les trois familles de peptides correspondent à trois zones peptidiques différentes révélées par chromatographie en couche mince, ces trois zones présentant des rapports de rétention (RF) égaux respectivement à 0,14 ; 0,23 ; O,S5 sur une couche chromatographique en silice commercialisée par la société MERCK sous la référence bOM254 et en utilisant comme gluant un mélange de butanol, d'eau et d'acide acétique dans le rapport 4fiel. 8. Procédé de préparation de l'extrait conforme å lune des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on sélectionne pour l'extraction les parties de la plante qui se sont révélées avoir une concentration en peptides supérieure à celle du reste de la plante, telles que les pétioles et les parties blanches. 9. Procédé conforme à la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on lyophilise des pétioles ou des parties blanches de jacinthe d'eau, - on broie lesdits pétioles ou parties blanches, - on traite le broyat avec un mélange d'éthanol et de chloroforme - on filtre, - on évapore jusqu'à siccité le filtrat, - on traite l'extrait sec obtenu par de l'eau et de l'éther pour obtenir une phase aqueuse et une phase éthérée, - on traite la phase aqueuse avec du butanol pour obtenir une phase aqueuse et une phase butanolique, et - on évapore jusqu'à siccité cette phase butanol i que 10. Un extrait de jacinthe d'eau résultant du procédé selon l'une des revendications 8 ou 9. 11. Utilisation de l'extrait de jacinthe d'eau conforme à l'une des revendications 1 à 7, ou obtenu selon le procédé conforme à l'une des revendications 8 ou 9, comme produit favorisant la multiplication cellulaire végétale. 12. Utilisation de l'extrait de jacinthe d'eau conforme à l'une des revendications 1 à 7, ou obtenu selon le procédé conforme à l'une des revendication 8 ou 9, comme produit favorisant la germination des graines de plantes.