Brevet FR2594444A1 — publié le 19870821

i "PlasmidepWS101, procédé pour son obtention et son utilisation". L'invention concerne le plasmide pWS101, qui est obtenu à partir d'un gène de la levure Saccharomyces cerevisae ainsi que son utilisation pour la production de l'enzyme L-aspartate:2-oxogluta- rate-aminotransfèrase E.C.2.6.1.1. Cet enzyme est nécessaire dans la chimie clinique pour la fabrication des sérums de contrêle. Elle a été jusqu'ici isolée à partir de coeurs de porcs. Ce type de fabrication est onéreux, et la quantité produite est limitée par l'utilisation de coeurs de porcs comme matière de départ. L'invention a en conséquence pour objet de réaliser une possibilité d'extraire une importante quantité de l'enzyme L-aspartate:2-oxoglutarate- aminotransfèrase, E.C.2.6.1.1. de façon telle que cette fabrication puisse être obtenue à un moindre coût et en relativement peu de temps, ainsi que d'une façon plus simple et avec un degré de pureté plus élevé. Ce résultat est obtenu suivant l'invention, au moyen du plasmide pWS101 qui présente les caracté- ristiques suivantes: 1) Il peut être multiplié dans des microorganismes de l'espèce Saccharomyces cerevisiae et de l'espèce Escherichia coli; 2) Le gène ASPS, de Saccharomyces cerevisiae, qui code pour l'enzyme L-aspartate:2-oxoglutarate- aminotransfèrase, E.C.2.6.1.1., apporte: 3) un vecteur d'"amorçage" avec une région centromère (CEN4) de Saccharomyces cerevisiae (YCp50). La production microbienne de l'enzyme que l'on vient de mentionner est rendue possible grâce à ce plasmide. Les étapes opérationnelles encore nécessaires pour arriver du plasmide pWS101 à l'enzyme désiré constituent des techniques standard de la génétique moléculaire des levures. L'essentiel, dans la fabrication de l'enzyme, est le clonage moléculaire du gène de la levure Saccharomyces cerevisiae qui code pour l'enzyme dans un vecteur plasmide qui peut être multiplié dans une levure et la bactérie Escherichia coli. Le procédé suivant l'invention, pour la fabrication du plasmide pWS101 est caractérisé par les étapes suivantes: a) Amplification et préparation du vecteur YCp50, qui peut être multiplié dans une levure et dans Escherichia coli, à partir de la souche 290A d'Escherichia coli et coupure avec l'endonucléase de restriction BanHI, b) la levure chromosomique -ADN est digérée partielle- ment avec l'endonucléase de restriction Sau3a, la grosse fraction, entre 3 paires de kilobases (Kbp) et 9 Kbp est ensuite introduite (addition ligase) dans le vecteur coupé de l'étape a), c) avec cette préparation (addition ligase), on trans- forme la souche Escherichia coli 290A de la façon connue, d) on réunit au moins 10 000 transformants sensibles à la tétracycline de l'étape c) et ensuite, prépare le mélange de plasmide après multiplication, e) avec le mélange de l'étape d), qui constitue une série assemblée de gènes de levure, on transforme un mutant de levure ura-3-asp5 (WS8106-58), f) on sélectionne les transformants uracilprototrophes et aspartateprototrophes de l'étape e), g) avec l'extrait d'un tel transformant, on transforme Escherichia coli 290A et prépare finalement le plasmide ainsi isolé de la levure. En plus de la fabrication de l'enzyme mentionné ci-dessus, le plasmide pWS101 peut aussi être utilisé pour la fabrication microbienne d'aminoacides. On isole le ADN chromosomique d'une levure d'une souche aspartateprototrophe quelconque et le purifie partiellement (Cryer, D. R., Eccleshall, R., et Marmur, 3.; Meth. Cell. Biol. 12, (1975> page 39). On mettra au point, à petite échelle, les conditions propres à une digestion incomplète avec l'endonucléase de restriction Sau3A (Maniatis, T., Fritsch, E.F., et Sambrook, 3.; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (1982) Cold Spring Harbor Publ., New York) coupera avec deux concentrations différentes, appropriées, une assez grande quantité de ADN de levure avec Sau3A, séparera le ADN dans un gel à 0,5 % d'agarose, et le rendra visible par coloration avec du bromure d'éthidium. La fraction majeure sera coupée entre 3 et 9 kbp, les morceaux d'agarose seront transférés dans un tube de dialyse et soumis à une électroélution. L'ADN sera purifié sur une colonne à jeter (Elutip de Fa Schleicher & Schuell) précipité avec de l'éthanol et repris dans un tampon de ligase. Le vecteur utilisé pour établir le banc de gènes était, dans le cas spécial qui se présente, le plasmide YCp50. Ce plasmide contient à coté de points de réplication reconnus d'Escherichia coli et de Saccharomyces cerevisiae (ORI ou ARS), les gènes E. Coli pour la résistance à la tétracycline ou à l'ampicilline, le gène de levure URA3 ainsi que la région centromère du chromosome 4 (CEN4) (Kuo, C.L., et Campbell, 3.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, (1982), page 4243). D'autres fecteurs sont également possibles. (Botstein, D., et Davis, R.W. In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces - Metabolism and Gene Expression, Strathern, J.N., 3ones, E.W. et Broach, 3.R. (Ed.), (1982), Cold Spring Harbor Laboratory Publ., New York, page 607). Le vecteur utilisé ici se distingue par un faible nombre de copies, mais par une stabilité mitotique élevée. Le plasmide YCp50 est amplifié dans E. Coli (Chloramphenicol-Technik nach Maniatis, T., Fritsch, E.F., et Sambrook,; 3. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Publ., New York) et préparé par une lyse alcaline (Birnboim, H.C., et Doly, 3., Nucl. Acids Res. 7, (1979), page 1513). Il est coupé complètement avec l'endonucléase de restriction BamHl dans le gène de résistance à la tétracycline, traité avec une phosphatase alcaline pour éviter la religation (Chaconas, G., et van de Sande, 3.H.; Methods Enzymol. 65, (1980), page 75) et après précipitation à l'éthanol, est repris dans un tampon de ligase. L'ADN de levure, partiellement digéré, est soumis à une ligation à 7 C pendant la nuit, dans le vecteur ainsi traité. On transforme, avec le mélange de ligation, une souche d'E. coli inapte à la recom- binaison (290A, désignation de dépôt DSM 3616, déposée comme souche contenant un plasmide pour la rendre résistante à l'ampicilline (Calziumchlorid-Technik: Dagert, M., et Ehrlich, S.D.; Nature 275 (1978), page 104). On met au point à petite échelle, les conditions-qui donnent des fréquences élevées de formations de transformants et des fréquences élevées d'insertion (proportion élevée de colonies sensibles à la tétracycline parmi les transformants). Avec les rapports en quantités ainsi vérifiées, on effectue une transformation à grande échelle, au moins 10 000 transformants sensibles à la tétracycline, sont réunis en les retirant des plaques par lavage. On prépare le plasmide à partir d'un certain nombre d'entre elles pour vérification. L'importance des insertions est déterminée et doit se situer en moyenne en-dessous de 4 kbp. La série de gènes de levure assemblés ainsi obtenue est conservée sous la forme de mélange de trans- formants à environ -70 C. (milieu suivant Beggs, 3.D., Nature 275 (1978) page 104), on procèdera à un ensemen- cement avec des échantillons de ce mélange pour la préparation du plasmide, et les plasmides seront préparés à partir des cellules de la phase de croissance fixe. Avec ce mélange de plasmide, on transformera, suivant la technique à l'acétate de lithium (modifiée par Ito H., Fukuda Y., Murata K., et Kimura A., 3. Bacteriol. 153, (1983), page 163; en variante: Sphâroblastierungsméthode, suivant Hinnen A., Hicks, 3.S. et Fink, G.R., Proc Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), page 1929), une souche de levure uracil- et aspartate- auxotrophe (WS8106-5B ura3-52 asp5, DSM 3617). A partir des transformants uracil- et aspartato-trophes obtenus ainsi, on obtiendra un extrait (Cellules de la phase de croissance logarithmique), le plasmide-ADN sera enrichi et préparé, la souche E. Coli 290A est par suite transformée pour la résistance à l'ampicilline, et l'on prépare le plasmide de ce transformant. Les propriétés de ce plasmide (pWS101) pour complémenter la mutation asp-5 est confirmée en renouvelant la transformation de levure. Le plasmide est schématisé sous la forme d'une carte avec les enzymes de restructions (figure). Le gène ASP5 code pour l'enzyme Glutamate- oxalacétate-transaminase (GOT, L-Aspartate:2-oxoglutarate aminotransfèrase (E.C.2.6.1.1.). L'activité de cet enzyme dans les extraits de levure (préparation suivant Sigurdson D.D., Gaarder M.E. et Livingston D.E., Mol. Gen. Genet. 183 (1981) page 59) peut être déterminée d'une façon simple au moyen d'un test que l'on peut se procurer dans le commerce (BOEHRINGER, Mannheim), le mutant asp5 utilisé ne possède, sans plasmide, aucune activité GOT décelable, si toutefois, on le transforme avec le plasmide pWS101, il peut être observé une activité GOT significative. Grâce à la présence de ce plasmide dans une souche haploïde qui possède déjà une activité GOT, cette activité est augmentée d'un facteur 2. Les souches de E. coli (290A) et de S. cerevisiae (WS8106-5B) transformées avec le plasmide pWS101 sont déposées dans la Collection allemande des Microorganismes, Gôttingen, Grisebachstr. 8, sous les N DSM 3616 et DSM 3617. Comme suivant une certaine probabilité, le plasmide se détruira spontanément, on dispose ici aussi des souches de départ mentionnées: sans plasmide, la souche 290A est sensible à la tétracycline, la souche WS8106-5B a besoin d'uracil et d'aspartate. Le procédé suivant l'invention est exposé plus en détail d'après les étapes d'un exemple de réalisation décrites ci-après. Exemple de réalisation: 1. Préparation de l'ADN à partir de 1 litre de culture de levure (Saccharomyces cerevisiae) dans la phase de croissance logarithmique. 2. Mise au point des conditions d'une digestion partielle avec l'endonucléase de restriction Sau3A (BOEHRINGER Mannheim). 3. Conditions de digestion choisies: a) 200 pg ADN + 5,6 unités Sau3A b) 200 pg ADN + 2,8 unités Sau3A dans chaque fois 2 ml de tampon Sau3A (20 mM TRIS-HC1, mM NaCl, 6 mM MgC12, pH 7,5) 1 h d'incubation à 37 C, arrêt de la réaction par refroidissement sur glace et addition d'EDTA (concentration finale 2mM) puis extraction par le chloroforme, précipitation par l'éthanol. Réception dans TE (100 mM TRIS-HC1, 10 mM EDTA, pH 8). 4. Réunion des différents échantillons de ADN digérés différents, traitement de 200 pg de ces derniers dans un gel d'agarose à 0,5 % (18 h, 35 V, 4 C, Tampon de TRIS-borate-bromure d'éthidium), coupure de la fraction majeure entre 3 et 9 kbp (mesuré par rapport au Standard de grandeur X-HindIII, Boehringer, Mannheim), transfert dans un tube de dialyse, électroélution (3 h, 100 V, dont 3 min avec inversion des pôles). 5. Elimination du tampon du tube de dialyse, purification et concentration de l'ADN sur une colonne jetable (Elutip de Schleicher et Schuell), précipitation par l'éthanol et reprise sur tampon ligase (20 mM TRIS-HC1, 10 mM MgC12, 10 mM dithioérythritol, 0,6 mM ATP, pH 7,6). 6. Amplification du plasmide vecteur YCp50 sur une souche E. coli 290A (Technique au chloramphénicol), préparation à partir de 1 1 de culture logarithmique (Lyse alcaline), purification sur chlorure de césium- centrifugation aux gradients de densité (36 h, 45 000 tpm), après dialyse et précipitation par l'éthanol, reprise sur un tampon BamHl (10 mM TRISHC1, 100 mM NaCl, 5 mM MgC12, lmM mercaptoéthanol, pH 8,0). 7. Digestion totale du plasmide avec l'endonucléase de restriction BamHl (BOEHRINGER, Mannheim) à 37 C, pendant une nuit, extraction avec du chloroforme, précipitation avec de l'éthanol, reprise dans 50 pl de tampon de phosphatase (50 mM TRIS-HC1, 1 mM MgC12, 0,1 mM ZnC12, 1 mM spermidine). 8. Mise au point des conditions de ligation à petite échelle, on a choisi ensuite: 3 pg plasmide YCp50-ADN + 3 pg ADN de levure partielle- ment digérée + 5 unités ligase T4-ADN (Renner), dans le tampon de ligase, 100 pl. Incubation 16 h à 7 C. 9. Transformation de la souche E. Coli 290A avec cette préparation (chaque fois 10 pl d'échantillon), environ 70 % des transformants résis- tant à l'ampicilline étaient sensibles à la tétracycline. 10. Préparation comme échantillon du plasmide de 10 transformants sensibles à la tétracycline, détermination de la dimension d'insertion d'après la digestion EcoRl (BOEHRINGER Mannheim), elle se situe en moyenne vers 4,5 kbp. 11. On enlève des plaques, par lavage, 30 000 colonies et les conserve, sous la forme de suspension à -70 C (Milieu suivant Beggs 3.D. Nature 275 (1978) page 104). Culture d'échantillons de cette suspension pendant la nuit, sur des plaques (environ plaques LB avec de l'ampicilline). Préparation du mélange de plasmide (lyse alcaline, épuration du gradient chlorure de césium). 12. Avec le produit obtenu, transformation de la souche de levure WS81065B (ade2-1 ura3-52 aps5), par le procédé à l'acétate de lithium, 200 ml de culture logarithmique sont transformés avec au total 40 pg ADN, ensuite, sont passés des plaques sur un milieu exempt d'uracil et d'aspartate (milieu suivant Sherman F., Fink, G.R., et Laxrence, C.W., Methods in Yeast Genetics. Laboratory Manuel, (1971), Cold Spring Harbor Laboratory, New York). 13. A partir des transformants ainsi obtenus, il est fabriqué, par digestion avec le symolyase (SEKAGAKU KOGYO, par l'intermédiaire de BAYER) un extrait, le plasmide-ADN est enrichi par des étapes de dénaturation- renaturation, précipité par l'éthanol, et utilisé pour la transformation d'E. coli (290A). Préparation du plasmide à partir d'un transformant, la schématisation de ce plasmide sous forme de carte au moyen d'enzymes de restriction (figure). 14. La possibilité de complémenter, avec ce plasmide, une mutation asp5 de levure a été confirmée en renouvelant la transformation de levures. On a ensuite mesuré, dans l'extrait de levure, les activités suivantes de l'enzyme, codée ASP5, glutamato-oxalacétate- aminotransfèrase (BOEHRINGER Mannheim, GOT Nonotest): WS8106-5B (sans plasmide) = O, c'est-à-dire 2 unités/g protéine WS8106/5B (pWS101) = 53 unités/g protéine. Détermination des protéines par rapport au standard albumine (Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., et Randall, R.J., 3. Biol. Chem. 193, (1951), page 265). Dans une souche haploide, qui possède déjà une activité GOT, l'activité est augmentée par le plas- mide: indépendamment de la valeur absolue de départ, cela représente, comme on s'y attendait, une augmentation de facteur 2. Exemple: WS8069/115 (ASP5, sans plasmide) = 61 unités/g protéine WS8069/115 (ASP5, pWS101 = 126 unités/g protéine. Figure: carte provisoire de restriction du plasmide pWS101. Longueur des fractions conforme à l'échelle, localisation des gènes inexacte (suivant Kuo, C.L. et Campbell, 3.L., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 79, (1982), page 4243). Enzymes de restriction EcoR1, Sall, Xhol de Fa. BOEHRINGER, Mannheim. REVENDICATIONS 1) Plasmide pWS101 caractérisé en ce que: 1) il peut être multiplié dans des microorganismes de l'espèce Saccharomyces cerevisiae et de l'espèce Escherichia coli, 2) il apporte le gène ASP5 de Saccharomyces cerevisiae, qui code pour l'enzyme L-aspartate:2-oxoglutarate- aminotransfèrase, E.C.2.6.1.1., 3) à un vecteur d'amorçage comportant une région centromère (CEN4) de Saccharomyces cerevisiae (YCp5O). 2) Procédé pour la fabrication du plasmide pWS101 suivant la revendication 1, caractérisé par les étapes de a) amplification et préparation du vecteur YCp50, qui peut être multiplié dans une levure et dans Escherichia coli, à partir de la souche 290A d'Escherichia coli, et coupure avec l'endonucléase de restriction BamHI, b) la levure chromosomique -ADN est digérée partiellement avec l'endonucléase de restriction Sau3A, la grosse fraction, entre 3 paires de kolobases (kbp), et 9 kbp est ensuite introduite (addition ligase) dans le vecteur coupé de l'étape a), c) avec cette préparation (addition ligase), on transforme la souche Escherichia coli 290A de la façon connue, d) on réunit au moins 10 000 transformants sensibles à la tétracycline de l'étape c) et ensuite, prépare le mélange de plasmide après multiplication, e) avec le mélange de l'étape d, qui constitue une série assemblée de gènes de levure, on transforme un mutant de levure ura-3-asp5 (WS8106-58), f) on sélectionne les transformants uracilprototrophes et aspartate-prototrophes de l'étape e), g) avec l'extrait d'un tel transformant, on transforme Escherichia coli 290A et prépare finalement le plasmide ainsi isolé de la levure. 3) Utilisation du plasmide pWS101 pour la production de l'enzyme L-aspartate:2-oxoglutarate- aminotransfèrase E.C.2.6.1.1. (GOT), à l'aide de levures. 4) Utilisation du plasmide pWS101 pour la fabrication microbienne d'acides aminés.