Brevet FR2597605A1 — publié le 19871023

La présente invention a pour objet un nouveau matériau de chromatographie d'affinité et son application notamment à la séparation et à la purification des antigènes protéiques des bactéries appartenant au genre Bordetella. On sait que la culture de bactéries du genre Bordetella, par exemple Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis et Bordetélla bronchiseptica, permet l'obtention de la protéine F-HA (Filamentous hémagglutinin). De plus, la culture de B. pertussis permet également l'obtention d'une exotoxine protéique: la toxine pertussis, encore appelée LPF ou LPF-HA (Leukocytosis 10 Promoting Factor-Hemagglutinin). Ces protéines peuvent être utilisées notamment dans la préparation de vaccins acellulaires contre la coqueluche. La séparation et la purification des antigènes protéiques des bactéries du genre Bordetella pose des problèmes techniques difficiles à résoudre pour obtenir les antigènes purifiés avec de bons rendements. Généralement on utilise, lors de la purification, des techniques de chromatographie d'affinité. Dans la demande de brevet britannique n 2.015.531 on a préconisé l'utilisation d'un procédé de chromatographie d'affinité à l'aide d'un support polymérique insoluble sur lequel est fixée une sialoprotéine ou une autre 20 substance riche en acide sialique. La sialoprotéine permet de fixer sélectivement la toxine pertussis qui peut ensuite être éluée. Dans la demande de brevet européen n 0140386 on a décrit une méthode de chromatographie utilisant comme ligand sélectif pour la toxine pertussis une céruloplasmine dénaturée par la chaleur. On a maintenant découvert que, de façon surprenante, la toxine pertussis a davantage d'affinité pour les glycoprotéines désialylées immobilisées sur un support que pour les sialoprotéines, comme cela sera montré ci- après. Ce résultat est d'autant plus surprenant que, dans le cas o c'est la toxine pertussis qui est immobilisée sur un support, on avait observé 30 que la fétuine inhibe davantage la fixation de la fétuine marquée à l'iode 125 que l'asialofétuine (93% d'inhibition seulement par rapport à la fétuine; voir R.D. Sekura et al., "Pertussis Toxin Structural Elements involved in the interaction with cells",.. Proceeding of the Pertussis Toxin conference, Bethesda, Sept.20-21, 1984 edited by R.D. Sekura, J. Moss and M. Vaughan 1985, Academic Press Inc., pages 45-64. L'invention a pour objet l'utilisation, comme ligand de chromatographie d'affinité pour la toxine pertussis, d'une glycoprotéine désialylée. La glycoprotéine désialylée peut être choisie en particulier parmi la fétuine désialylée et l'haptoglobine désialylée. -2 - 2597605 On sait que la fétuine et l'haptoglobine contiennent des groupements oligo-osidiques sialylés; voir par exemple J.U. Baenztger et al, The Journal of Biological Chemistry, vol. 254, n 3, pp.789-795 (1979) et B. Nilsson et al, Proceedings of VI International Symposium on glycoconjugates (1981), pages 275-276. L'hydrolyse acide de la fétuine ou de l'haptoglobine selon les méthodes connues, convertit les structures osidiques sialylées en structures osidiques désialylées correspondantes, et on obtient ainsi l'asialofétuine ou l'asialo-haptoglobine. La fétuine et l'haptoglobine sont des produits commerciaux vendus notamment par la Société SIGMA. L'invention a également pour objet un nouveau matériau de chromatographie d'affinité constitué par un support solide sur lequel est fixé un ligand ayant une affinité pour la toxine pertussis, caractérisé par le fait 15 que ledit ligand est une protéine désialylée choisie parmi la fétuine désialylée et l'haptoglobine désialylée. Ces protéines sont soumises, avant ou éventuellement après couplage avec le support solide, à un traitement de désialylation. Cette désialylation est effectuée par hydrolyse douce selon les méthodes connues; voir par exemple SPIRO R.G. et al, J. Biol. Chem. 1974, 249, 5704-5717. 20 Le support solide sur lequel est couplée la protéine désialylée peut être tout support solide classique utilisé habituellement en chromatographie d'affinité. Le support est par exemple un support polymérique constitué par un 25 dérivé polyosidique, un polyacrylamide, un polymère ou copolymère contenant des motifs N-acryloyl-2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3propanediol tel que les supports vendus par I.B.F.(Institut Biologique Français) sous les désignations commerciales TRISACRYL. Parmi les dérivés polyosidiques utilisables on citera en particulier la cellulose, de dextran, l'agarose, le sépharose, l'amidon, ainsi que les dérivés polyosidiques modifiés par éthérification avec des dérivés d'alcool aminé. Ces dérivés polyosidiques modifiés répondent à la formule schématique R {(CH2)-N/ Jm dans laquelle R représente le reste du polyoside, n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, R1 et R2 représente un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxylé et m représente le nombre de groupements éthérifiants fixés sur la molécule 40 polyosidique. - 3 - 2597605 Parmi ces dérivés polyosidiques modifiés on citera par exemple la diéthylaminoéthyl cellulose (DEAE cellulose), le DEAE dextran, le DEAE amidon, etc... Les polymères utilisés comme supports peuvent être euxmêmes fixés 5 sur un support minéral poreux constitué par exemple par un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie, etc..... ou par des dérivés synthétiques ou naturels de ces oxydes tels que des verres, des silicates, des borosilicates, le kaolin, etc... Lesdits polymères peuvent être fixés sur le support minéral poreux 10 par imprégnation, le revêtement de polymère étant ensuite, si nécessaire, stabilisé par réticulation selon des méthodes connues. L'agent réticulant est par exemple un composé dicarbonylé, une halohydrine, un diépoxyde, etc... Les polymères supports peuvent également être fixés sur les supports minéraux par l'intermédiaire d'agents de couplage bifonctionnels. Les protéines désialylées peuvent aussi être fixées sur le support polymérique à l'aide d'un agent de couplage bifonctionnel approprié, selon les méthodes connues. Les agents de couplage sont par exemple des dérivés bifonctionnels tels que le bromure de cyanogène, des dialdéhydes, des diépoxydes, etc... Les protéines désialylées peuvent aussi être fixées directement sur un support minéral poreux. Par exemple, dans le cas d'un support de silice, on prépare un dérivé aminoalkylsilane de la silice, et on peut alors fixer la protéine désialylée sur l'aminoalkylsilane à l'aide d'un agent bifonctionnel tel que le 25 glutaraldéhyde; voir par exemple P.J. Robinson et al., Biochim. Biophys. Acta, 242, 659-661 (1971). Les protéines désialylées peuvent également être fixées sur des supports minéraux poreux selon la méthode décrite dans la demande de brevet français 77.28163 (n de publication 2.403.098). Ce procédé consiste a revêtir 30 un support minéral poreux d'un polymère polyosidique capable de donner lieu à la réaction de coupure oxydante des groupements glycol à l'aide d'agents oxydants tels que les periodates. On obtient alors un revêtement polycarbonylé et le ligand, par exemple la glycoprotéine désialylée, peut alors se fixer sur les groupements carbonylés formés. On peut ensuite, si désiré, réduire en 35 amine le groupement imine formé. L'invention a également pour objet un procédé de purification des antigènes protéiques des bactéries appartenant au genre Bordetella. Ce procédé consiste essentiellement à mettre en contact une solution contenant lesdits antigènes protéiques avec un support de chromatographie d'affinité tel que 40 défini précédemment, puis à recueillir ou à éluer les antigènes recherchés. -4- On peut ainsi séparer la toxine pertussis qui se fixe sur le support de chromatographie d'affinité tandis que le F-HA reste en solution, puis éluer la toxine pertussis à l'aide d'un agent d'élution approprié. On peut également utiliser le procédé de l'invention pour purifier 5 une fraction enrichie en F-HA de façon à la débarrasser de la toxine pertussis qu'elle est susceptible de contenir, cette dernière étant retenue par le support de chromatographie d'affinité. En séparant la solution obtenue après mise en contact avec le matériau de chromatographie, on obtient donc une solution purifiée de F-HA. La solution de départ à purifier peut tre par exemple le surnageant de culture de bactéries du genre Bordetella ou une solution de toxine pertussis ou de F-HA partiellement purifiée. Pour purifier la toxine pertussis sur le support de chromatographie d'affinité de l'invention, on utilise une solution de départ dont le pH a été 15 ajusté à une valeur de 6-8, de préférence 7. La-quantité de support de chromatographie d'affinité utilisée est fonction du volume de surnageant initial et/ou de la concentration en toxine pertussis dans le milieu de culture ou dans la fraction utilisée comme produit de départ. Le contact est effectué en bain ou en colonne, à une température de 20 2-300C. A. JtA. C.JCL ta J4ttLC 1 L L..COt -A. Li -.L.OLjL 35 40 chromatographie d'affinité de l'invention, on peut utiliser par exemple une solution tampon contenant, à une concentration suffisante, des sels etjou agents chaotropiques classiques, par exemple le chlorure de magnésium, ou bien un tampon carbonate ayant un molarité supérieure à 25mM et dont le pH est de l'ordre de 8,3 à 11,6. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 Purification de toxine pertussis par chromatographie d'affinité sur Sépharose 4B - asialofétuine. a) Adsorption de la toxine pertussis sur le gel de chromatographie d'affinité. Une fraction enrichie en toxine pertussis obtenue après centrifugation et concentration d'une suspension bactérienne de Bordetella pertussis phase I, cultivée en fermenteur de 30 litres est passée sur une colonne de 4 cm de diamètre contenant 120ml de support de chromatographie Sépharose 4B couplé à l'asialofétuine, avec un débit de 6 ml/cm2/heure. Le Sépharose 4-B a été couplé à l'asialofétuine de la façon suivante. - 5 - 2597605 g de Sépharose-4B activé au CNBr (Pharmacia) sont mis à gonfler dans 6 litres de HCl lmM pendant 15 minutes environ. Le gel est ensuite lavé 3 fois par 6 litres de HC1 lmM. 400 ml d'une solution contenant lmg/ml d'asialofétuine, NaHCO3 0,1 M et NaCl 0,5 M sont ajoutés au gel. Le mélange est laissé à réagir à + 4 C pendant une nuit sous agitation douce. 125ml d'une solution d'éthanolamine 5 M pH 8,0 sont ajoutés au mélange. Après 4 heures d'incubation à température ambiante, le gel est lavé successivement par 500ml de tampon acétate de sodium 0,1 M pH 4,0 contenant NaCl 1 M puis par 500ml de tampon Tris-HCl 50mM pH 7,5 contenant 10 NaCl 1 M. Ce cycle de lavage est répété trois fois. Le gel est ensuite lavé trois fois par 500ml de tampon Tris-HCl 50mM pH 7, 5 en présence d'un conservateur tel le merthiolate à une concentration de 1/10 000 (p/v). Le gel de Sépharose 4B couplé à l'asialofétuine est conservé à +4 C 15 dans un tampon tel qu'un tampon Tris-HCl 5OmM pH 7,5 en présence d'un conservateur, le merthiolate par exemple. L'asialofétuine utilisée comme ligand dans la chromatographie d'affinité a été obtenue de la façon suivante: Une solution aqueuse de fétuine (fétuine type III, Sigma) est 20 hydrolysée par H2SO04 0,05N pendant 1 heure à 80 C. Après hydrolyse, la solution est dialysée contre plusieurs bains d'eau distillée pendant 24 heures à + 4 C afin d'éliminer les acides sialiques libres. La solution d'asialofétuine peut être concentrée par ultrafiltration à l'aide d'un système équipé de membranes dont le seuil de coupure est égal à 10 000. L'élimination des acides sialiques est contr8lée par un dosage colorimétrique spécifique des acides sialiques sur la protéine après et avant hydrolyse. b) Elution de la toxine pertussis Le gel est lavé avec deux volumes de colonne de tampon Tris-HCl 5OmM 30 pH 7,5, c'est-à-dire jusqu'à disparition complète de l'absorption UV à 278 nm, puis avec un volume de colonne de tampon Tris-HCl 50mM pH 7,5 contenant NaCl 1 M. La toxine pertussis est éluée avec 400 ml de tampon carbonate 100 mM pH 9,6. La densité optique et l'activité hémagglutinante des fractions 35 collectées en sortie de colonne sont mesurées. Les fractions contenant le principe actif, c'est-à-dire celles possédant une forte activité hémagglutinante non inhibée par le cholestérol, sont réunies. La toxine pertussis est ensuite précipitée par le sulfate d'ammonium 40 à une concentration finale correspondant à 70% de la saturation. - 6 - 2597605 La toxine pertussis ainsi purifiée induit une forte lymphocytose et sensibilise les souris CFW à l'histamine à la dose de 0,04 pg/souris. La capacité de la toxine d'induire la formation de clusters sur des cellules CH0 est caractérisée par une activité spécifique de l'ordre de 65 000 à 260 000 CPU/mg. Les résultats de contr8les physico-chimiques et d'activités biologiques (dosages colorimétriques des éventuels contaminants, ADN, ARN, sucre; dosage du taux d'endotoxine, électrophorèse en milieu SDS ou en milieu acide, etc..) sont en faveur d'une préparation finale homogène renfermant un 10 principe actif hautement purifié. Les analyses de la teneur en toxine pertussis dans le surnageant de culture initial et dans le précipité final indiquent un rendement de purification supérieur à 90%. EXEMPLE 2 Purification de toxine pertussis par chromatographie d'affinité sur Sphérosil DEAE dextran-asialofétuine. a) Adsorption de la toxine sur le gel de chromatographie d'affinité. Le pH de la fraction obtenue après centrifugation et concentration 20 d'une suspension de Bordetella pertussis phase I est ajusté à 7,0 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 5 N. La fraction est passée sur une colonne de 2cm de diamètre contenant 60ml de support de chromatographie Sphérosil DEAE dextran couplé à l'asialofétuine, avec un débit de -2 -1 ml x cm x heure Le Sphérosil DEAE dextran (support constitué de billes de silice XOC 005 recouvertes avec un minimum de DEAE dextran réticulé) a été couplé à l'asialofétuine de la façon suivante: Le Sphérosil DEAE dextran est soumis à une oxydation ménagée afin de créer des fonctions aldéhydiques capables de réagir avec des groupements 30 aminés du ligand. L'asialofétuine en solution à 4mg/ml dans le tampon phosphate 10 mM pH 8, 0 est mis en contact avec le gel pendant 15 heures à température ambiante. Le gel est ensuite lavé par les solutions suivantes: - tampon phosphate 10 mM pH 8,0 - glycocolle 20g/l, NaCl 0,17 M - citrate de sodium 0,05 pH 2,8, HCl 0,1 N. b) Elution de la toxine pertussis Le gel est lavé par 120ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 puis par ml de tampon Tris-HCl 50mM contenant du NaCl 1 M. La toxine pertussis est 40 éluée par le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contenant MgCl2 4 M. La densité - 7 - 2597605 optique à 278 nm et l'activité hémagglutinante des fractions collectées en sortie de colonne sont mesurées. Les fractions contenant le principe actif, c'est-à-dire celles possédant une activité hémagglutinante élevée non inhibée par le cholestérol, sont réunies. Le mélange obtenu est dessalé par filtration sur gel sur une colonne de Séphadex G-25 (7,5 x 45 cm, PHARMACIA) équilibrée avec le tampon Tris-HCl 50mM pH 7,5. L'élution est réalisée avec ce même tampon. La densité optique à 278 nm et l'activité hémagglutinante des fractions collectées en sortie de colonne sont mesurées. Les fractions 10 contenant la toxine pertussis, c'est-Aà-dire celles possédant une activité hémagglutinante élevée, sont réunies. Le principe actif est précipité par le sulfate d'ammonium par addition lente sous agitation de 47g de (NH4)2SO4 par 100 ml de solution. L'analyse des propriétés biologiques et physico-chimiques montre que le 15 produit obtenu est un principe actif hautement purifié. EXEMPLE 3 Elimination d'éventuelles traces de toxine pertussis dans une fraction enrichie en F-HA. Les procédés classiques de purification du F-HA, comme celui décrit par exemple dans la publication de SATO Y., COWELL J.L., SATO H., BURSTYN D.G. and MANCLARK C.R. "Separation and purification of the hemagglutinins from Bordetella pertussis" Infect. and Immun., 1983, 41, 1, 313-320, comportent une 25 étape de désorption du F-HA à partir d'un support chromatographique tel l'hydroxyapatite avec le tampon phosphate 100 mM pH 7,0 contenant NaCl 0,5 M. La densité optique à 278 nm et l'activité hémagglutinante des fractions recueillies en sortie de la colonne d'hydroxyapatite sont mesurées. Les fractions contenant le F-HA, c'est-à-dire celle possédant une activité 30 hémaggutinante élevée et inhibée par le cholestérol, sont regroupées. Dans la présente invention, afin d'éliminer les dernières traces de toxine pertussis éventuellement présentes, le mélange des fractions contenant le F-HA est passé sur une colonne de Sépharose 4Basialofétuine. Le F-HA est élué directement, alors que les éventuelles traces de toxine sont retenues sur 35 la colonne. Le F-HA est alors précipité par le sulfate d'ammonium en ajoutant lentement, sous agitation, 47g de (NH4)2SO4 pour 100ml de solution. Le F-HA ainsi purifié n'induit ni lymphocytose, ni sensibilisation A l'histamine à la dose de 100Pg/souris. A la concentration de 100opg/ml, le F-HA 40 ne provoque pas de modification dans l'aspect du tapis cellulaire constitué de - 8- 1 - 1 - 1 cellules d'ovaires de hamster (CHO), c'est-à-dire la formation d'amas - cellulaires dits "clusters" caractéristiques de la présence de toxine pertussis. Son activité spécifique hémagglutinante mesurée sur érythrocytes d'oie est de l'ordre de 250 000 à 500 000 unités HA/mg de protéine. Cette activité est totalement inhibée par le cholestérol. EXEMPLE 4 Etude comparative de la capacité de fixation de la toxine pertussis par les supports de chromatographie d'affinité à base de fétuine et 10 d'asialofétuine. Un gel de chromatographie d'affinité a été préparé par immobilisation d'asialofétuine sur du Sépharose-4B activité au CNBr(Pharmacia) selon la technique décrite à l'exemple 1. Parallèlement, de façon analogue, un gel de chromatographie 15 d'affinité a été préparé avec de la fétuine. La fixation de la fétuine et la fixation de l'asialofétuine ont été réalisées dans des conditions expérimentales identiques de façon à obtenir sur les gels des densités de ligand comparables. Une étude comparative de la capacité des gels obtenus a été réalisée. Les résultats sont résumés dans le '20 tableau suivant dans lequel on a attribué arbitrairement l'efficacité 100% pour le gel à l'asialofétuine. - N 1;1:. , ; Il e 1 :.25 : Capacité relative: :: du gel (%) : FétuineSépharose-4B 79 : Asialofétuine-Sépharose-4B: 100 Les valeurs indiquées sont le résultat de deux déterminations. Chaque expérience a été réalisée en parallèle sur les deux types de supports en les mettant en contact avec un mîme volume de surnageant de culture contenant de la toxine pertussis. La quantité de toxine pertussis éluée a été 35 déterminée par un dosage de protéine et par une méthode immunoenzymatique (ELISA). o - 9 - 2597605 REVENDICATIONS 1. Utilisation, comme ligand de chromatographie d'affinité pour la toxine pertussis, d'une glycoprotéine désialylée choisie parmi la fétuine désialylée et l'haptoglobine désialylée. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ladite protéine est l'asialofétuine. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait ladite protéine est l'asialo-haptoglobine. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ladite protéine désialylée est fixée sur un support solide. 5. Matériau de chromatographie constitué par un support solide sur lequel est fixé un ligand ayant une affinité pour la toxine pertussis, caractérisé par le fait que ledit ligand est une protéine désialylée choisie 15 parmi la fétuine désialylée et l'haptoglobine désialylée. 6. Matériau selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ladite protéine désialylée est fixée sur un support polymérique. 7. Matériau selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ledit support polymérique est fixé sur un support minéral poreux. 8. Procédé de purification des antigènes protéiques des bactéries du genre Bordetella, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact une solution contenant lesdits antigènes protéiques avec un matériau de chromatographie d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 5 à 7, puis à recueillir ou à éluer les antigènes recherchés. 25 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'après mise en contact de ladite solution avec le matériau de chromatographie, on élue la toxine pertussis. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la solution de départ est une fraction enrichie en F-HA, et qu'après mise en 30 contact de ladite solution avec le matériau de chromatographie, on sépare une solution purifiée de F-HA débarrassée de toxine pertussis.