Brevet FR2586256A1 — publié le 19870220

Procédé de préparation de cellules vivantes enrobées pour leur exploitation biotechnologique. L'exploitation biotechnologique des cellules vivantes, qu'elles soient d'origine animale, végétale ou humaine, a connu récemment un développement important qui devrait s'amplifier dans les prochaines années. Une telle exploitation biotechnologique est effectuée dans le domaine médical pour la préparation de médicaments ou de vaccins, et dans le domaine des industries alimentaires, par exemple pour le brassage, ou pour la fermentation des vins. En général, les procédés proposés pour l'enrobage des cellules ont consisté à former un gel des cellules dans des capsules de polymère, par exemple de l'alginate de calcium. Ces procédés connus présentent divers inconvénients. La production industrielle de tels gels est très difficile et, en outre, la gélification a une action traumatisante sur les cellules. De plus, cette gélification nécessite une opération de stérilisation avant immobilisation. La présente invention vise pallier les inconvénients des procédés connus. A cet effet, le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait qu'on prépare une solution aqueuse homogène d'alginate d'un métal alcalin et de cellules, et on atomise ladite solution par une méthode de séchage par nébulisation (spray-drying). Le procédé selon l'invention, qui permet une fabrication industrielle continue, offre en outre l'avantage d'autoriser le maintien d'une plus grande concentration cellulaire par rapport à la technique de coagulation par le chlorure de calcium en supprimant une prolifération cellulaire à la périphérie des billes qui est par ailleurs gênante dans de nombreuses utilisations. En outre, la technique de nebuli- sation, par la possibilité d'obtenir des particules dans une gamme granulométrique plus étendue, permet la réduction du volume des réacteurs ainsi que l'amélioration des rendements due a l'augmentation de la surface spécifique des particules. Le procédé selon l'invention est donc d'une mise en oeuvre plus économique que les procédés connus et permet d'obtenir des cellules enrobées plus efficaces. Le procédé selon l'invention améliore en outre les temps de demi-vie des cellules et apporte les avantages, sur le plan physique, de la technique d'atomisation. En outre, il permet de travailler en milieu stérile et apporte une distribution homogène des cellules en croissance, ce qui assure une occupation optimale du volume des billes d'enrobage. De plus, la dissolution des lits des réacteurs est facilitée du fait de la réticulation moins importante du polymère et le procédé permet de travailler en milieu organique concentré. Les applications du procédé selon l'invention sont, comme on l'a indiqué plus haut, très nombreuses. On va étudier plus en détail ci-après la préparation de levures enrobées pour la refermentation de vins. Le Champagne et la plupart des vins mousseux sont préparés traditionnellement suivant une méthode dite "champenoise" qui consiste a faire refermenter en bouteille des vins sélectionnés, la prise de mousse s'effectuant par addition d'environ 22 a 24 g de sucre par litre et d'une quantité déterminée de levure. Pendant la fermentation, qui s'opère généralement en cave a une température ambiante de 120C a 180C, on obtient un dégagement de gaz carbonique produisant une pression de 5 a 6 x 105 Pa a l'intérieur des bouteilles placées horizontalement "sur lattes". Au cours du vieillissement, des lies fines qui résultent de la refermentation se déposent sur la paroi inférieure de la bouteille. C'est alors qu'interviennent les opéra tions de "remuage". Durant quelques mois, placées sur des pupitres, les bouteilles sont tournées manuellement chaque jour d'un huitième ou d'un quart de tour par le remueur qui relève également a intervalles réguliers l'angle d'inclinaison des bouteilles pour détacher les dépits de la paroi et les faire glisser peu a peu vers le bouchon. Ce procédé du remuage est long et coûteux car il exige une main-d'oeuvre qualifiée importante. Les bouteilles restent ensuite pendant quelques mois a la verticale, bouchon vers le bas. Lorsque les dépôts sont entièrement concentrés dans le goulot, intervient alors la phase de dégorgeage qui consiste a expulser les dépôts suivant une technique appropriée. Une liqueur de dosage ou d'expédition vient compléter et égaliser le niveau du vin dans les bouteilles. Parallèlement a la méthode champenoise, réservée aux produits de qualité supérieure, il existe également une technique dite "en cuves closes" moins consommatrice de temps, de place et de main-d'oeuvre, donc moins onéreuse, pour la production de vins mousseaux courants. Dans cette méthode plus simple, il subsiste néanmoins un dépôt de levure qui doit être éliminé par filtration avant la mise en bouteilles. Pour des raisons économiques, des recherches ont déjà été entreprises pour simplifier ou éliminer les opérations classiques de remuage. C'est ainsi que le brevet français nO 78.22131 publié sous le nO 2 432 045, a proposé d'inclure la levure de refermen tation dans une matrice polymère et de sédimenter cette levure par gravité sur le bouchon des bouteilles position nées dès l'origine sur le bouchon, ce qui permet d'élimi ner les opérations de remuage. Cependant, ce procédé connu n'a pu être mis en pratique du fait de divers inconvénients qu'il présente. En parti culier, une turbidité excessive du vin est liée au dévelop pement, en cours de refermentation, de levures libres à l'intérieur des bouteilles. Ceci est consécutif au relar gage des cellules incluses dans le milieu et aubourgeon- nement aléatoire non contrôlable des cellules qui restent actives à la surface des matrices de polymère. En outre, la polymérisation de la matrice ne peut se faire que par une coagulation qui nécessite des adjuvants chi miques. Outre qu'ils sont traumatisants pour les levures, ils aboutissent à la présence d'un additif non encore ad mis par la réglementation oenologique. La mise en oeuvre du procédé décrit dans le brevet nO 78.22131 exige une phase de lavage et de réactivation des levures, source de manipulations peu pratiques. De plus, un risque de pollution bactérienne est inhérent au produit organique lui-même qui évolue tout au long de sa fabrication dans un milieu humide. Il est accru par la multiplicité des phases du procédé. Enfin, la conservation, le conditionnement, le stockage et le transport sont difficiles, du fait de la structure aqueuse du produit élaboré. Selon le procédé de l'invention, on prépare une solution aqueuse homogène d'alginate d'un métal alcalin et de cellules1 dans le cas des vins une levure, et on atomise ladite solu tion par une méthode de séchage par nébulisation (spraydrying). Avantageusement, l'alginate est de l'alginate de sodium. De préférence, on incorpore dans la solution aqueuse une charge minérale et organique, constituée en particulier de phosphates et de saccharose, afin d'augmenter la taille des particules et la densité de la poudre. L'invention concerne également les levures enrobées obtenues par le procédé précédent. Les levures selon l'invention permettent d'obtenir une grande limpidité du vin après fermentation. En effet, la température à l'intérieur de la tour de séchage (1400C à 1600C) neutralise les levures présentes à la surface des gouttelettes nébulisées. Ces levures, replongées dans un milieu liquide nutritif, ne se redéveloppent pas en rebourgeonnant. En outre, la nature même du polymère utilisé favorise la limpidité, du fait que l'alginate de sodium est utilisé pour la clarification des vins. De plus, la présence de phosphates et de saccharose a l'intérieur du produit de l'atomisation permet d'induire, au contact des levures, la production d'enzymes immédi atement opérationnelles ou mobilisables, ce qui améliore les conditions de refermentation par induction enzymatique. Par ailleurs, le produit de l'atomisation est directement utilisable par addition dans les bouteilles. Sa densité autorise une sédimentation plus rapide que dans les mé thodes traditionnelles. En conséquence, le procédé de re fermentation est simplifié par l'utilisation des levures enrobées selon l'invention. De plus, le risque de pollution bactérienne est diminué du fait que le produit de l'atomisation est sec (humidité inférieure a 4%) et le procédé limite le nombre de manipulations. Le produit de l'atomisation reste sec aussi longtemps qu'il est conservé, stocké ou transporté à l'abri de l'humidité, ce qui facilite considérablement sa manipulation. De préférence, on prépare une solution d'alginate de métal alcalin par dissolution dans l'eau, avec une concentration comprise entre 0, 1% et 10%, encore mieux entre 0,5b et 3%, on place en suspension dans de l'eau une quantité de 1% a 50%, encore mieux de 5% a 40%. de levure, on mélange cette suspens ion extemporanément à la solution d'alginate, de manière à obtenir une solution homogène, puis on atomise ladite solution par séchage par nébulisation (spray-drying). De préférence, l'écart de températures au cours du séchage est compris entre 400C et 1000C, afin de préserver les levures. Le temps de séjour en chambre de séchage, qui est de quelques fractions de secondes, n'entraîne pas de dénaturation notable des levures. Pour éviter l'incorporation de particules trop petites qui ne couleraient pas dans le vin, l'invention prévoit également d'obtenir des particules de dimension vouge par utilisation de tout procédé industriel connu à cet effet, ou bien de tamiser les particules obtenues pour éliminer les particules trop petites, ou bien de procéder a un second enrobage des particules. L'exemple suivant fait bien ressortir les caractéristiques du procédé selon l'invention et des levures enrobées qu'il permet d'obtenir. 1. Composants: a) Quantités pour essai: 200 g de levure en suspension dans 1.105 ml d'eau 40 g d'alginate de sodium 1.275 ml d'eau. b) Levure: La levure utilisée est de la levure sèche de champage pour vinification et prise de mousse; du type Saccharomyces Bayanus préparée par la firme LALLEMAND INC. de Montréal (Canada). 2. Résultats de la nébulisation (voir tableau annexé). 3. Application a la préparation des champagnes et vins mousseux. Les essais de refermentation effectués sur un vin de Loire (sucre résiduel: env. 0,50 g/l - PH: env. 3) ont donné une pression de 5,6 bars et une concentration de sucre résiduel de 0,7 à 0,8 g/l, mettant en évidence une prise de mousse totale. T A B L E A U Températures Dénomination Appareil Dispersion Entrée Sortie T Aspect Observations % humidité Microscope L 1 Buchi Buse réguli ère et ronde 125 C 65 C 60 C Poudre 4 % Particules L 2 Buchi Buse réguli ère et ronde 140 C 70 C 70 C Poudre 4 % Particules L 3 Buchi Buse réguli ère et ronde 145 C 80 C 65 C Poudre Récupération 4,6 % Particules parois cyclone L 4 Niro Turbine 145 C 75 C 70 C Poudre 4 % Particules L 5 Niro Turbine 140 C 70 C 70 C Poudre 4 % Particules Remarque: L'état de poudre correspond à un produit sec au toucher, ne collant pas aux doigts mais d'aspect compact et ne s'écoulant pas (test des sabliers). Ces produits placés dans une coupelle et laissés sans protection sur la paillasse, conservent pendant 48 h l'état dit de poudre. Au-delà, ces produits constituent une croûte, s'effritant assez facilement au toucher. Revendications. 1. - Procédé de préparation de cellules vivantes enrobées, caractérisé par le fait qu'on prépare une solution aqueuse homogène d'alginate d'un métal alcalin et de cellules, et on atomise ladite solution par une méthode de séchage par nébulisation (spray-drying). 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont des levures. 3. - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'alginate est de l'alginate de sodium. 4. - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on prépare une solution d'alginate de métal alcalin par-dissolution dans l'eau, avec une concentration comprise entre 0,1t et 10%, encore mieux entre 0,58 et 3%, on place en suspension dans de l'eau une quantité de 1% a 50%, encore mieux de 5% a 40%, de levure, on mélange cette suspension extemporanément a la solution d'alginate,, de manière a obtenir une solution homogène, puis on atomise ladite solution-par séchage par nébulisation (spray-drying). 5. - Procédé selon l'une des revendications 1 a 4, caractérisé par le fait qu'on fait subir aux cellules au moins un second enrobage. 6. - Procédé selon l'une des revendications 1 a 5, caractérisé par le fait.qu'on incorpore dans la solution aqueuse une charge minérale et organique, constituée en particulier de phosphates et de saccharose. 7. - Cellules vivantes enrobées, caractérisées par le fait qu'elles sont obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.