Brevet FR2587721A1 — publié le 19870327

La présente invention R pour.objet un procédé de préparation de l'acide 2-thieny; acétique en mettant en oeuvre une opération de fermentation. Cet acide ou le chlorure correspondant, occupe toujours une place privilégiée sur le marché des intermédiaires-chimiques. De 1970 à nos jours1 l'Industrie Pharmaceutique s'est inscrite comme première consommatrice dë ces dérivés qui interviennent dans la synthèse de certaines céphalos porines. EXEMPLE CEPHALORIPINE On connait différents procédés de fabrication notamment le brevet FR 2 377 398 (GB 1 573 882 ) Les procédés utilisés actuellement présentent l1inconvénient de prix de revient élevés, dans un contexte économique difficile. Malheureusement, la difficulté de greffer un reste acétique sur un noyau aromatique ou hétérocyclique demeure encore, avec pour preuve la littérature qui n'indique pas à ce jour de grandes nouveautés. Il en résulte que ce genre de synthèse s'effectue toujours selon les canevas réactionnels qui datent quelque peu (CARMACK et SPIELMAN, 1956 , SOUTHWICK, 1970 - STEINKOPH et WOLFRAM, 1924 - BLICKE et TSAO, 1944 - NIPPON SODA, 1977 ARNDT-EISTERT, 1949 - BLICKE et ZIENTY, 1948) ; d'où l'opportunité de tenter une aventure (aux risques calculés) dans une discipline nouvelle : la BIOTECHNOLOGIE. Conformément à la présente invention, on transforme le 2-acetyl thiophène, matière première classique peu coûteuse en acide 2-thienyl glyoxylique, par action de micromycetes, selon le schéma Il reste alors à réduire la fonction cétonique pour obtenir le composé cherché Toutefqis, il serait très surprenant que les micromycetes s'appliquent à réaliser très exactement et uniquement cette réaction et l'attention se porte tout naturellement sur d'autres métabolites résultant de la biotransformation du 2-acetyl thiophéne. Ainsi, parmi les produits que l'on peut obtenir concurre- ment, il en est un qui présente un grand intérêt, l'acide 2-thiophène carboxylique (plus généralement désigné sous l'appellation d'acide 2-thenoique) : ordinairement préparé par des méthodes chimique classiques (HARTOUGH et CONLEY, 1947 - SCHICK et HARTOUGH, 1948 CHALLENGER et GIBSON, 1940 - SCHLEUK et OCHS, 1915 - RINKES, 1934). Enfin, un travail trop poussé des Microorganismes peut donner naissance à quelques dérivés secondaires, peu souhaitables tel que par exemple-l'aldehyde 2-thenoique Pour rechercher les souches les plus adaptées et les meilleures conditions de réaction, on-a d'abord procédé sur des essais en culture solide en milieu glosé avec différentes souches d'origines diverses : sol,bois pourri, produits alimentaires, dans des milieux naturels, tels que l'extrait de malt, et des milieux artificiels tels que le milieu Galzy et Slonimsky (1957) désigné ci-après GS.On rappelle la composition globale de ce milieu Solution de sels minéraux 100 ml - Solution d'éléments rares 1 ml - Solution de FeCl3, 6 H20 à 200 mg/l 1 ml - Solution de vitamines 5 5 ml Solution de mésoinositol à 4 mg/ml 5 ml - Glucose 20 g - Eau distillée q.s,p. 1 litre à pH = 6 qui peut être utilisé avec ou sans glucose. La formule détaillée est bien connue de l'homme de l'art. Dans tous les cas, les essais sont effectués à une température de 22 - 24 C, avec de la lumière douze heures sur vingt quatre. On a observé d'abord la faible toxicité de l'acetyl thiophène (AT) dans lesdits milieux. Des essais ont été effectués avec des-concentrations d'AT variant de 0,01 à 1 gramme par litre, et il est apparu que la meilleure concentration serait de l'ordre de 0,5 g/l. Dans 90 % des cas, on a un bon développement et on a noté une inhibition avec le genus acremonium et plusieurs levures (Lipomyces). Des développements ont même pu entre observé' en l'absence de glucose.De bons développements ont été obtenus notamment avec les souches - Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma - Mucor - Basidiomycetes - Candida, Cryptococcus, Saccharomyces Ces souches ont alors été utilisées pour poursuivre les essais en milieu liquide à la concentration de 0,5 g/l. Des essais ont été effectués pour déterminer les paramètres à utiliser - La valeur des cultures en milieu solide - le milieu de culture à utiliser - le pH - la concentration en glucose - le temps de fermentation avant l'addition de 2 AT à la culture - le temps au bout duquel la réaction est complète ou doit être arrêtée. On a essayé deux sortes de milieux 1) des milieux complexes : extrait de malt, soja, amidon 2) des milieux synthétiques : GS, Czapek-dox, acide tar trique. Les concentrations de glucose (ou saccharose) essayées ont été 0 - 5 - 10 ou 20 g/l et le pH : 4,6 - 6 ou 7. Le substrat : 2 acetyl thiophène a été ajouté au début ou après quelques jours de culture, par exemple 1 - MALT 4811 8 d 2 - GALZY - Glucose 10 g/l 3 - GALZY - sans glucose 4 - CULTURE EN 2 TEMPS GALZY - Glucose 20 g/l 4d I - inoculation AT - 2-acetyl tbiophene s. = echantillonage Avant inoculation, les champignons ont été développés sur milieu solide (malt) avec 0,01 gl; de 2-RT pour favoriser l'induction. La température était de 240 C. Le milieu était agité à la cadence de 180 RPM, et la concentration du 2-AT dans le milieu liquide était 0,5 g/l. L'extraction a été faite à pH 213 avec de l'acétate d'ethyle redistillé. Les résultats ont été observés en chromatographie sur plaque (couche mince). La séparation complète du 2-AT et de ses métabolites a été difficile avec un seusystème de solvant. Le tableau suivant indique les distances de migration des différents métabolites dans les 6 systèmes de solvant suivants 'Solvant AT ATG Ac.T. Ald.T. Alc.T. A Chloroforme 50 Acétate d'ethyle 40 0,93 ,17 0,81 0,92 0,78 Acide acetique 10 B Benzene 90 0,34 0 0 0,45 0,15 Chloroforme 19 C Cyclohexane 30 Formiate d'ethyle 20 0,52 0,17 0,41 0,55 0,46 Acide formique 2 D Cyclohexane 30 Acétate d'ethyle 20 0,66 0,30 0,64 0,61 0,53 Acide formique 2 E Cyclohexane 30. Acétate d'ethyle 20 9,67 0 0,54 0,65 0,60 Acide acétique 2 F Toluene 50 Acétate d'éthyle 45 0,77 0,36 9,73 0,80 0,69 Acide formique 5 AT = 2-acetyl thiophène ATG = acide 2-thienyl glyoxyolique Ac.T. = 2-thiophène carboxylique = acide Thenoique Ald.T.= Aldehyde 2-thenoique Alc.T. = Alcool thenylique Après différents essais, on a choisi deux systèmes de solvants, l'un après l'autre, dans la même direction. On a obtenu les résultats suivants Solvant AT MG Ac.T. Ald.T. Alc.T. I - C 0.52 0.17 0.41 0.55 0.46 2 - B 0.62 0.17 . 0.41 0.71 0.17 1 - D 0.63 0.26 0.60 0.61 0.53 2 - B 0.76.. 0.26. 0.60 0.70 .0.01 1 - F 0.74 0.34 0.68 0.80 0.69 2 - B 0.82. 0.32. .0.69. 0.79 . 0.61 I - A 0.93 0.17 0.81 0.92 " 0.78 2 -.8 0.90... .0.17... 0.85 . 0.82 . 0.68 Les meilleurs résultats ont été obtenus avec l'extrait de malt, le soja et le milieu GS. On a préféré ce dernier parce que l'extraction et la purification des métabolites étaient plus faciles à faire qu'avec les milieux complexes. Le pH le plus favorable est voisin de 6. L'addition de 2-AT doit être faite de préférence 48 heures après inoculation avec une concentration de sucre de 5 g/l. La prise d'échan tillon est faite 7 à 8 jours après inoculation. Dans ces conditions, on a procédé alors à des essais de selection de souche en milieu GS, à pH 6 et avec 5 g/l de glucose. Des flacons de 250 ml contenant 50 ml de milieu ont été inoculés de champignons développés sur extrait de malt pendant une semaine, avec 0,05 g/l de 2-AT. Au bout de trois jours en a ajouté du 2-AT pour porter la concentration à 0,5 g/l. es flacons ont. été secoués à 180 RPM à une température de 24 .C et l'on a pris les échantillons sept jours plus tard. L'extraction et la chromatographie ont été faites comme indiqué plus haut. La concentration de glucose a été déterminée par technique UT. Le spectre de masse et la chromatographie gaz-liquide ont été faits avec des molécules silylées; des échantillons ont été séchés et ajoutés à 100 p i de pyridine sèche et 200 pl de BSTFA (dérivé fluoré). La silylation a été faite a température ambiante pendant au moins 2 heures avant l'analyse par chromatographie gazeuse. D'une manière générale, on a observé la formation de chlamydospores. Le poids frais varie de 2 g/l à 88 g/l suivant le champignon. On a observé aussi l'acidification du milieu. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant Genre N sommation Production de ou de totale ATG Ac.T. Autres groupe souche d'AT Aspergillus 25 4 6 2 4 Penicilllum 65 21 i2 25 5 Mucorales 31 6 - 7 2 Basidiomycetes 22 2 5 1 2 Yeasts 22 6 4 4 1 Autres 274 67 39 27 13 lotes 459 106 66 66 27 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de L'acide 2-thieny; acétique et ses dérivés, caractérisé en ce que l'on utilise comme matière de départ le 2-acétyl-thiophène que-l'on oxyde' avec formation d'acide 2-thiényl glyoxylique et d'acide thénoique par action de micromycetes, dans une opération de fermentation, selon le schéma :: dont la fonction cétonique est ensuite réduite par voie chimique pour obtenir le composé cherché.:. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est conduite en milieu liquide de Galzy et Slonimsky avec une concentration en acetyl thiophène comprise entre 0,1 et 1 g/litre, de préférence de l'ordre de 0,5 g/litre. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pH du milieu est voisin de 6. 4. Procédé selon une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que pour une phase initiale le milieu reçoit au départ une inoculation de micromycetes et d'acétylwthiophène, à une concentration de 0.01 g/litre, puis au'bout d'une période de deux à quatre jours, dans une phase secondaire, la concentration d'acétyl thiophène est portée à 0,5 g/l. On peut en conclure que l'cetyl Thiophène n'est pas une substance très toxique dans ces conditions d'expérimentation. La production de métaboaites- (acide thienyl glyoxyolique, acide thénoique et autres) a été détectée par chromatographie en couche mince. L'Aureobasidium Pullulans a été observé comme la souche la plus active. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt au Laboratoire Hollandais Centraalbureau voor Schimmelculture - Oosterstraat 1 - 3740 AG BAARN -. Ce champignon est également conservé au Laboratoire de Botanique, Cryptogamie, Biologie cellulaire et génétique, de l'unité de Formation à la recherche (FR) de Pharmacie, de l'université Scientifique et Médicale de Grenoble sous la référence CMPG 374 (collection Mycologie Pharmacie Grenoble). Ce champignon est capable de consommer complètement l'acetyl thiphène et produit à la fois de l'TG et de l'AC. T. Ce dernier a été identifié par spectre de masse ce qui n'est pas possible pour l'ATG qui est détruit dans cette opération. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que dans la première phase le milieu comporte du glucose, à une concentration égale ou inférieure à 20 g/X, et que dans la phase secondaire, le milieu ne comporte pas de glucose. 6. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micromycète est choisi dans le groupe constitué par les champignons - Aspergillus,Fusarium, Penicillium, Trichoderma - Mucor - Basidiomycetes - Candida, Cryptococcus, Saccharomyces 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le micromycète est l'aureobasidium pullulans.