Brevet FR2590274A1 — publié le 19870522

Procédé de préparation industrielle d'un extrait de superoxyde dismutase L'invention a pour objet un procédé pour la préparation industrielle de la superoxyde dismutase (SOD) à partir de cellules animales. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé simplifié, rapide et avantageux du point de vue économique pour la production industrielle de la superoxyde dismutase à partir de cellules animales, notamment d'érythrocytes, et un concentré protéique nouveau, riche en superoxyde dismutase. On sait que la superoxyde dismutase est une enzyme qui catalyse la dismutation des ions radicalaires libres superoxydes selon la réaction 20 + 2H+ O2 + H202 I1 a été démontré que grâce à cette propriété, la superoxyde dismutase qui est connue en pharmacie sous le nom d'orgotéine, peut être efficacement utilisée dans le traitement de différentes maladies inflammatoires ainsi que de diverses maladies dues à la production de radicaux oxygène libres dans l'organisme ou à la surface de la peau. Depuis une quinzaine d'années, de nombreuses recherches ont été effectuées dans le but de mettre au point un procédé permettant d'obtenir une préparation de superoxyde dismutase de grande pureté, apte à être utilisée sans effets secondaires nuisibles, dans des compositions pharmaceutiques, notamment des solutions injectables. Les sources de superoxyde dismutase sont très variées. On peut par exemple l'extraire de certaines souches de bactéries. Toutefois, il semble particulièrement intéressant de l'extraire des cellules animales, notamment des cellules de certains mammifères, en particulier de cellules du foie et du coeur et surtout des érythrocytes des bovins, ovins, porcins et humains. Les techniques proposées jusqu présent pour extraire la superoxyde dismutase des cellules animales, notamment des érythrocytes, conduisent, au moins pour certaines d'entre elles, à un produit d'une pureté satisfaisante pour l'usage pharmaceutique, mais sont difficilement exploitables au plan industriel, en raison de leur complexité et/ou de leur prix de revient élevé. Ainsi Joe M. McCord et Irwin Fridovich g J. Biol. Chem. 244, 6049-6055 (1969)j décrivent l'extraction de la SOD, à l'échelle du laboratoire, à partir du sang de boeuf. Les globules rouges séparés du plasma par centrifugation sont lavés avec du sérum physiologique et lysés par de l'eau désionisée. Les cellules lysées sont ensuite traitées comme suit. L'hémoglobine est précipitée selon le procédé classique de Tsuchihashi L iochem. Z, lq9, 65 (1923)2, utilisant un mélange de chloroforme et d'éthanol (0,15 et 0,5 volumes respectivement). Le surnageant est ensuite séparé du précipité par centrifugation puis il est traité avec du K2HPO4, ce qui provoque une séparation en deux phases. L'enzyme se trouve dans la phase supérieure qui représente environ 40% du total. Le procédé prévoit une seconde centrifugation pour clarifier le liquide qui contient pratiquement la totalité de l'enzyme. La solution est ensuite refroidie à 4-C et la SOD précipitée avec 0,75 volume d'acétone froide.Après centrifugation, le précipité est dissous dans de l'eau distillée et dialysé contre du phosphate de potassium 2,5 mM d pH 7,4 pour être ensuite appliqué sur une colonne de chromatographie contenant de la DE-32 cellulose. La colonne est équilibrée avec le tampon utilisé pour la dialyse et éluée avec un gradient de phosphate de potassium dont la molarité varie entre 2,5 et 200mM. Une protéine de couleur bleue-verte (la SOD) est éluée dans un seul pic et ainsi séparée des autres protéines contaminantes. L'enzyme obtenue par cette technique est très pure. Toutefois, ce procédé ne peut être utilisé à l'échelle industrielle, pour les raisons indiquées ci-après. Le mélange obtenu après précipitation de l'hémoglobine devient très épais lorsqu'il est agité pendant 15 minutes. Meme si on ajoute, comme le proposent les auteurs, 0,1 vol. d'eau, le problème de la centrifugation n'est pas résolu. En effet, les assiettes des centrifugeuses à flux laminaire sont très vite colmatées. Les centrifugeuses à pots ou à tambours doivent être continuellement vidées d'un culot très dur à décrocher, qui représente environ 30% du volume total. Les grandes machines de type éboueuses ou clarificateur (fabriquées par Kraus Maffei) sont inutilisables du fait qu'elles dégagent trop de vapeurs de solvants. La centrifugation nécessaire pour clarifier la phase liquide contenant la SOD, obtenue après traitement par K2HPo4, complique également la mise en oeuvre de ce procédé. Enfin, la purification finale utilisant un gradient de concentration du tampon demande des installations compliquées et une surveillance importante, avec intervention de personnel qualifié. Les demandeurs se sont fixé pour but de remédier, au moins en partie, aux inconvénients exposés cidessus et de mettre au point un procédé simplifié, avantageux du point de vue économique, permettant d'obtenir, à l'échelle industrielle, de la SOD à partir de cellules animales. Dans une première étape de leurs recherches en vue de simplifier le procédé de McCord et Fridovich, les demandeurs ont établi que, dans des conditions bien précises qu'ils ont déterminées, il était possible de précipiter en bloc la majeure partie des substances protéiques autres que la SOD, notamment l'hémoglobine, à partir d'un lysat de globules rouges ou d'un autre extrait de cellules animales, sans qu'il soit nécessaire d'avoir recours à une centrifugation. Ces conditions bien précises consistent à traiter le lysat ou l'extrait, à la température du réfrigérateur (environ 4*C), par addition rapide d'au moins 0,7 volume, de préférence de 0,8 volume, d'un mélange chloroforme/éthanol ou chlorure de méthylène/éthanol dans les proportions de 2 à 7:5 en volumes. Dans ces conditions, les substances telles que l'hémoglobine précipitent en bloc sous forme de "gâteau" dur qui reste au fond du récipient. Des particules plus légères décantent encore par repos pendant quelques heures, par exemple une nuit. Le surnageant obtenu se prete sans autre modification à la phase suivante de séparation, à savoir le relargage par un sel. Ce relargage est effectué par addition de 200 à 400 g/l, de préférence 300 g/l, de phosphate disodique ou dipotassique. Dans une deuxième étape de leurs recherches, les demandeurs ont établi qu'a ce stade, selon l'invention et contrairement à ce qui se passait selon la technique antérieure, il n'est pas nécessaire de centrifuger pour clarifier le liquide obtenu par le traitement de relargage. Il suffit d'attendre qu'un anneau brunâtre contenant la majeure partie des impuretés se forme (repos d'environ 2 heures) entre les deux phases liquides qui se séparent. Quelques impuretés se déposent aussi au fond des récipients. La phase supérieure contient la SOD dans de l'éthanol aqueux. Elle est refroidie à environ 4-C et traitée par 0,6 à 1, de préférence 0,75 volume d'acétone refroidie aux environs de la la même température pour précipiter la SOD. Dans une troisième étape de leurs recherches, les demandeurs ont établi qu'il était possible d'extraire la SOD avec une grande pureté à partir de l'extrait brut obtenu par dissolution dans l'eau du précipité obtenu lors du traitement à l'acétone, par simple chromatographie éventuellement précédée d'une dialyse, sans avoir recours à un gradient de concentration, et sans qu'il soit nécessaire de concentrer ou de lyophiliser au préalable l'extrait brut.Cette simplification considérable du traitement de l'extrait brut est rendue possible d'une part grâce aux qualités particulières de cet extrait brut, améliorées par rapport à celles de l'extrait de l'art antérieur grâce aux modifications apportées selon l'invention à son procédé de préparation et d'autre part, grâce à un choix particulier tant de la colonne de chromatographie que des caractéristiques du tampon utilisé pour équilibrer la colonne et pour l'éluer. Ce choix particulier consiste à utiliser une colonne échangeuse d'ions de faible force ionique de type DEAE (c'est-à-dire contenant des groupes diéthylaminoéthyle), telle que celles qui sont commercialisées par la société Pharmacia, en particulier sous la dénomination commerciale DEAE-Sephacel et à travailler à une valeur de pH de 7,3 à 8,3, de préférence de 7,8, la conductivité du tampon d'équilibrage étant sensiblement égale à la conductivité de l'extrait brut et la conductivité du tampon d'élution étant sensiblement double de celle du tampon d'équilibrage. L'invention a donc pour objet un procédé pour la préparation industrielle d'un extrait de superoxyde dismutase (SOD) à partir d'un lysat de globules rouges ou d'un autre extrait de cellules animales, selon lequel les cellules sont débarrassées de la majeure partie des substances protéiques autres que la SoD par précipitation par un solvant, la SOD est relarguée de sa solution au moyen d'un sel minéral puis est précipitée par l'acétone, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant 8 : 1) traiter, à la température du réfrigérateur (environ 4-C), le lysat ou l'extrait par addition rapide d'au moins 0,7 volume, de préférence de 0,8 volume, d'un mélange chloroforme/éthanol ou chlorure de méthylène/éthanol dans les proportions de 2 à 7:5, de préférence 3::5, en volumes pour précipiter en bloc la majeure partie des substances protéiques autres que la SOn 2) après repos, traiter le surnageant obtenu sous 1) par addition de 200 à 400 g/l, de préférence 300 g/l, de phosphate disodique ou dipotassique 3) laisser reposer jusqu'a obtention d'un anneau brunâtre séparant les deux phases liquides met et 4) traiter la phase liquide supérieure refroidie à environ 4*C par 0,6 à 1, de préférence 0,75 volume d'acétone refroidie à la même température pour précipiter la SOD. L'extrait de SOD ainsi obtenu n'est pas encore suffisamment purifié pour être utilisé dans tous les types de préparations pharmaceutiques, notamment injectables. Toutefois, il représente un produit industriel nouveau qui peut être conservé en solution aqueuse congelée ou lyophilisée et être utilisé notamment dans des préparations pharmaceutiques à usage externe. Comme il a été indiqué plus haut, ce produit présente déjà une pureté telle qu'il conduit après un traitement simple, explicité plus haut, à une préparation de SOD présentant une grande pureté. L'invention vise également ce produit industriel nouveau, à savoir une préparation brute de superoxyde dismutase extraite de cellules animales, notamment d'érythrocytes, se présentant sous forme de solution verdâtre dans l'eau, congelée ou à l'état lyophilisé, caractérisée en ce qu'elle présente une activité spécifique dans la gamme de 2000 à 2500 unités par mg de protéine (méthode riboflavine-nitrobleu tétrazolium) et, selon l'électrophorèse sur polyacrylamide, ne contient ni albumine ni catalase et donne essentiellement une bande principale suivie d'une bande de faible importance. L'invention vise en outre un procédé pour l'obtention d'une préparation de superoxyde dismutase convenant à l'usage pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à chromatographier, éventuellement après diminution de sa teneur en sels minéraux, la préparation brute de superoxyde dismutase décrite cidessus, sur une colonne échangeuse d'ions de faible force ionique de type DEAE-Sephacel, à une valeur de pH de 7,3 à 8,3, de préférence de 7,8, la conductivité du tampon d'équilibrage étant sensiblement égale à la conductivité de l'extrait brut et la conductivité du tampon d'élution étant sensiblement double de celle du tampon d'équilibrage. L'invention vise enfin un procédé pour la préparation industrielle d'un extrait de superoxyde dismutase (SOD) convenant à l'usage pharmaceutique à partir d'un lysat de globules rouges ou d'un autre extrait de cellules animales, selon lequel les cellules sont débarrassées de la majeure partie des substances protéiques autres que la SOD par précipitation par un solvant, la SOD est relarguée de sa solution au moyen d'un sel minéral puis est précipitée par l'acétone, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1) traiter, à la température du réfrigérateur (environ 4*C) le lysat ou l'extrait par addition rapide d'au moins 0,7 volume, de préférence de 0,8 volume, d'un mélange chloroforme/éthanol ou chlorure de méthylène/éthanol dans les proportions de 2 à 7:5, de préférence 3::5, en volumes pour précipiter en bloc la majeure partie des substances peptidiques autres que la SOD 2) après repos, traiter le surnageant obtenu sous 1) par addition de 200 à 400 g/l, de préférence 300 g/l, de phosphate disodique ou dipotassique 3) laisser reposer jusqu'à obtention d'un anneau brunâtre séparant les deux phases liquides 4) traiter la phase liquide supérieure refroidie à environ 4-C par 0,6 à 1, de préférence 0,75 volume d'acétone refroidie à la même température pour précipiter la SOD ; et 5) chromatographier, éventuellement après diminution de sa teneur en sels minéraux, la SOD ainsi précipitée, sur une colonne échangeuse d'ions de faible force ionique de type DEAE-Sephacel, à une valeur de pH de 7,3 à 8,3, de préférence de 7,8, la conductivité du tampon d'équilibrage étant sensiblement égale à la conductivité de l'extrait brut et la conductivité du tampon d'élution étant sensiblement double de celle du tampon d'équilibrage. Selon l'invention on utilise de préférence, en tant que cellules animales, des globules rouges, notamment des globules rouges provenant de sang de boeuf, en raison de la grande disponibilité et du coût peu élevé de ce produit. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui suit d'un exemple non limitatif de mise en oeuvre de l'invention. Exemple On utilise comme matière première de départ du sang de boeuf. 1. Hémolyse du sana de boeuf 400 l de sang de boeuf prélevés à partir de l'artère carotide de 40 animaux sont recueillis dans du tampon citrate pour empêcher la coagulation. Les globules rouges sont séparés du plasma par centrifugation en continu à faible vitesse et recueillis directement dans un égal volume de solution physiologique de chlorure de sodium à 0,9 t. dans de grands récipients en matière plastique. Cette opération est répétée deux fois pour éliminer toute trace de plasma, mais dans la dernière étape les cellules sont ajoutées à un volume égal d'eau désionisée pour provoquer leur lyse.Après mélange, on laisse la lyse s'effectuer pendant 2 heures à environ 4*C (température du réfrigérateur). 2. Elimination de l'hémoglobine par traitement par le mélanae chloroforme/éthanol Le lysat de cellules est brièvement agité, par exemple à la main, avant l'addition rapide de 0,8 volume de mélange 3:5 en volumes de chloroforme/éthanol. Dans ces conditions, un précipité se forme immédiatement qui sédimente au fond du récipient sous forme de "gâteau" dur, sans qu'il soit besoin de centrifuger. Ce "gâteau" est rejeté. Après deux heures, le surnageant translucide ne contient plus que des traces d'une suspension floculeuse et peut être utilisé tel quel pour le traitement ultérieur. Ce surnagéant peut être conservé plusieurs heures à la température ambiante sans inconvénient pour 1 'enzyme. 3. Purification de l'enzyme Par relaraaae et PréciDita- tion à l'acétone La purification du surnageant se poursuit par relargage au moyen de 300 g/l de K2HPO4, dans une grande colonne de séparation, à la température ambiante. Deux couches de liquides se forment en l'espace d'environ deux heures. La couche supérieure contient l'enzyme en solution eau-éthanol, la couche inférieure est une solution concentrée de sel. Les deux couches sont séparées par un anneau brunâtre contenant une grande partie des impuretés, d'autres impuretés se déposent éventuellement à la base de la couche inférieure. La phase inférieure et l'ensemble des impuretés sont rejetés. La phase supérieure contenant l'enzyme est refroidie à environ 4C et traitée, dans une colonne de séparation, par 0,75 volume d'acétone refroidie par de la glace. Un précipité gris-blanc sédimente par gravité et est recueilli au bout d'une heure sous forme d'une suspension. Le solvant résiduel (environ 20 1 dans le cas du traitement de 400 1 de sang) est éliminé par centrifugation à faible vitesse (4000 tr/min, 10 minutes, 4 C). Le culot qui contient l'enzyme "brute" est dissous dans 4 1 d'eau désionisée. La concentration totale en protéines est alors d'environ 4 g/l. 4. Purification finale par adsorption sur colonne de DEAE-Senhacel (dénomination commerciale de la société Pharmacia) et élution en une étape. La teneur en phosphate de potassium de la solution d'enzyme brute est abaissée, de telle sorte qu'elle soit inférieure à 10 mM (ce qui correspond à une conductivité inférieure à 1,8 mSiemens à 20-C), par ultrafiltration contre de l'eau au moyen d'un filtre de type PTGC 00005 Pellicon 210K commercialisé par la société Millipore (retenant les molécules de masse molaire supérieure à 10 oOo daltons). Des quantités aliquotes d'un litre de la solution d'enzyme brute sont appliquées sur des colonnes de 5 x 13 cm de DEAE-Sephacel équilibrées avec du tampon phosphate de potassium 10 mM, à pH 7,8 et 4-C. Un anneau brunâtre d'environ 0,5 cm de haut reste adsorbé au sommet de la colonne et le tiers supérieur de celle-ci présente la couleur bleu-vert caractéristique de la SOD. L'enzyme est éluée avec du tampon phosphate 20 mM à pH 7,8. L'élution de l'enzyme commence après l'écoulement d'un volume "vide" de 240 ml ; les fractions correspondant au pic de concentration sont rassemblées dans 200 mi de tampon d'élution qui contiennent environ 80 % de l'enzyme purifiée. Les 20 se restants peuvent être élués de la colonne dans 500 ml du même tampon et, si on le désire, rechromatographiés sur une autre colonne du même type. Résultats La préparation de SOD "brute" obtenue par précipitation à l'acétone est une solution verdâtre ayant une activité spécifique dans la gamme de 2000 à 2500 unités /dosage riboflavine-nitrobleu tétrazolium (NBT)/ par mg de protéine. Selon l'électrophorèse sur polyacrylamide, cette préparation ne contient ni albumine ni catalase et donne, dans cette analyse, une bande principale suivie d'une bande mineure, ainsi que de faibles traces d'impuretés. L'analyse par chromatographie liquide-haute performance (HPLC) sur colonne de type Aquapore AX-300, commercialisée par la société Kontrvn, en phase Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, avec un gradient de NaCl de o à 0,15 M en 30 min, à un débit de 1,Q ml/min, à 280 nm, montre un pic principal accompagné de deux pics mineurs. L'enzyme purifiée est bleu-vert et présente une activité spécifique dans la gamme de 2600 à 3200 unités (dosage riboflavine-NLT) par mg de protéine. Contrairement à ce qui est observé avec la matière brute, l'éiectrophorèse sur gel de polyamide ne révèle que la bande principale et une seconde bande mineure. L'analyse par HPLC montre un seul pic. L'enzyme possède un spectre d'absorption UV caractéristique avec un épaulement à 258 nm et un maximum large à 280 nm en lumière visible. Efficacité du Procédé selon l'invention Ce procédé fournit 35 à 40 mg d'enzyme brute dont 20 à 25 % sont perdus au cours de la purification. Il fournit donc de 26 à 32 mg d'enzyme purifiée par litre de sang. Le procédé de McCord-Fridovich qui ne peut être mis en oeuvre qu'à l'échelle du laboratoire fournit environ 30 mg d'enzyme purifiée. Les rendements des deux procédés par rapport aux quantités de sang utilisées sont donc tout à fait comparables. Par ailleurs, le procédé de McCord-Fridovich fournit 90000 unités de SOD pour 30 mg de protéine, soit 3000 unités de SOD pour i mg, ce qui est également tout à fait comparable à l'activité spécifique de 2600 à 3200 unités de la SOD purifiée, obtenue selon l'invention. En conclusion, le procédé selon l'invention permet, grâce à l'ensemble des simplifications qu'il introduit, d'obtenir une SOD de grande qualité, comparable à celle obtenue par le procédé complexe, de l'art antérieur le plus proche, et ceci avec un rendement équivalent. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation industrielle d'un extrait de superoxyde dismutase (SOD) à partir d'un lysat de globules rouges ou d'un autre extrait de cellules animales, selon lequel les cellules sont débarrassées de la majeure partie des substances protéiques autres que la SOD par précipitation par un solvant, la SOD est relarguée de sa solution au moyen d'un sel minéral puis est précipitée par l'acétone, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1) traiter, à la température du réfrigérateur (environ 4 C), le lysat ou l'extrait par addition rapide d'au moins 0,7 volume, de préférence de 0,8 volume, d'un mélange chloroforme/éthanol ou chlorure de méthylène/é- thanol dans les proportions de 2 à 7:5, de préférence 3::5, en volumes pour précipiter en bloc la majeure partie des substances protéiques autres que la SOD 2) après repos, traiter le surnageant obtenu sous 1) par addition de 200 à 400 g/l, de préférence 300 g/l, de phosphate disodique ou dipotassique 3) laisser reposer jusqu'à obtention d'un anneau brunâtre séparant les deux phases liquides 4) traiter la phase liquide supérieure refroidie à environ 4-C par 0,6 à 1, de préférence 0,75 volume d'acétone refroidie à la même température pour précipiter la SOD. 2. Préparation brute de superoxyde dismutase extraite de cellules animales, notamment d'érythrocytes, se présentant sous forme de solution verdâtre dans l'eau, congelée ou à l'état lyophilisé, caractérisée en ce qu'elle présente une activité spécifique dans la gamme de 2000 à 2500 unités par mgde protéiniméthode riboflavine-nitrobleu tétrazolium) et, selon l'électrophorèse sur polyacrylamide, ne contient ni albumine ni catalase et donne essentiellement une bande principale suivie d'une bande de faible importance. 3. Procédé pour l'obtention d'une préparation de superoxyde dismutase convenant à l'usage pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à chromatographier, éventuellement après diminution de sa teneur en sels minéraux, la préparation brute de superoxyde dismutase décrite ci-dessus, sur une colonne échangeuse d'ions de faible force ionique de type DEAE Sephacel, à une valeur de pH de 7,3 à 8,3, de préférence de 7,8, la conductivité du tampon d'équilibrage étant sensiblement égale à la conductivité de l'extrait brut et la conductivité du tampon d'élution étant sensiblement double de celle du tampon d'équilibrage. 4. Procédé pour la préparation industrielle d'un extrait de superoxyde dismutase (SOD) convenant à l'usage pharmaceutique à partir d'un lysat de globules rouges ou d'un autre extrait de cellules animales, selon lequel les cellules sont débarrassées de la majeure partie des substances protéiques autres que la SOD par précipitation par un solvant, la SOD est relarguée de sa solution au moyen d'un sel minéral puis est précipitée par l'acétone, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1) traiter, à la température du réfrigérateur (environ 4iC) le lysat ou l'extrait par addition rapide d'au moins 0,7 volume, de préférence de 0,8 volume, d'un mélange chloroforme/éthanol ou chlorure de méthylène/éthanol dans les proportions de 2 à 7:5, de préférence 3::5, en volumes pour précipiter en bloc la majeure partie des substances peptidiques autres que la SOD 2) après repos, traiter le surnageant obtenu sous 1) par addition de 200 à 400 g/l, de préférence 300 girl, de phosphate disodique ou dipotassique 3) laisser reposer jusqu'à obtention d'un anneau brunâtre séparant les deux phases liquides 4) traiter la phase liquide supérieure refroidie à environ 4-C par 0,6 à i, de préférence 0,75 volume d'acétone refroidie à la même température pour précipiter la SOD ; et 5) chromatographier, éventuellement après diminution de sa teneur en sels minéraux, la SOD ainsi précipitée,sur une colonne échangeuse d'ions de faible force ionique de type DEAE-Sephacel, à une valeur de pH de 7,3 à 8,3, de préférence de 7,8, la conductivité du tampon d'équilibrage étant sensiblement égale à la conductivité de l'extrait brut et la conductivité du tampon d'élution étant sensiblement double de celle du tampon d'équilibrage. 5. Procédé selon l'une des revendications 1,3 ou 4, caractérisé en ce que les cellules animales sont des globules rouges, notamment de sang de boeuf.