Brevet FR2590172A1 — publié le 19870522

La présente invention se rapporte à un nouvel antigène commun de Pseudomonas aeruginosa (ci-après dési- gné par P. aéruginosa), efficace pour la protection contre l'infection provoquée par cet organisme. Dans la suite de la présente description cet antigène est désigné par PSC-A. P. aéruginosa était connu à l'origine comme étant une bactérie pathogène atténuée. Du fait de l'ac- croissement récent de la fréquence des mutations et proli- férations bactériennes résultant de l'administration de fortes doses d'antibiotiques, le nombre de patients infec- tés par P. aéruginosa, indépendamment des autres maladies infectieuses bactériennes, a notablement augmenté. P. aéruginosa provoque facilement une maladie infectieuse chez les patients dont la résistance à l'in- fection est amoindrie, et c'est pourquoi cette maladie est l'une des maladies infectieuses occasionnelles typiques. Les patients, dont il est question plus haut, comprennent ceux qui souffrent de cancer et reçoivent un traitement im- munosuppresseur, qui font l'objet d'implantation, qui souf- frent de brûlures, ainsi que les enfants en bas âge. Dès l'instant o elle se déclare,lamaladie ai- guë, provoquée par cette bactérie, a fortement tendance à se transformer en infection systémique. Aussi ne peut-on espérer un bon pronostic pour une telle maladie. C'est pourquoi figure-t-elle au nombre des maladies infectieu- ses, bactériennes, les plus difficiles à guérir. p. Les maladies infectieuses provoquées par/aéru- ginosa sont généralement difficiles à guérir pour les rai- sons suivantes: (1) cette bactérie est fortement résistante à presque tous les antibiotiques le plus souvent utilisés; (2) elle a tendance à devenir résistante aux antibioti- ques récemment élaborés, actifs contre P. aéruginosa; (3) il existe une fréquence d'apparition élevée des mala- dies infectieuses, provoquées par P. aéruginosa, qui ne peuvent être traitées de manière satisfaisante par une chimiothérapie utilisant ces antibiotiques. Se basant sur le fait qu'il y a une limite à la chimiothérapie des maladies infectieuses, provoquées par P. aéruginosa, dans l'utilisation d'antibiotiques, on a effectué plusieurs tentatives pour élaborer des vaccins ou des agents de protection contre l'infection, qui sont préparés à partir de constituants cellulaires de P. aéru- ginosa et sont utilisés pour accroître l'aptitude de l'h8- te à se protéger contre P. aéruginosa. Par exemple, le vaccin polyvalent PEV-01, pro- tégeant contre tous les sérotypes de P. aéruginosa, est préparé par purification de l'antigène superficiel de chaque sérotype de P. aéruginosa (un antigène spécifique pour chaque sérotype), et mélange de ces antigènes super- ficiels purifiés (Lancet II; 977, 1979). Après réalisation d'un essai d'application clinique de ce vaccin polyvalent à des patients souffrant de brûlures, il a été mentionné qu'il protégeait contre la septicémie provoquée par l'in- fection par P. aéruginosa. Cependant, la préparation de ce vaccin polyva- lent est compliquéedu fait du mélange de plus de 10 anti- gènes contre différents sérotypes de P. aéruginosa. En ou- tre, comme les antigènes spécifiques des différents séroty- pes, constituants de ce vaccin, sont des antigènes dits O existant dans les couches superficielles des cellules de P. aéruginosa, et sont composés de lipopolysaccharides ap- pelés endotoxine, ce vaccin provoque des effets secondai- rse locaux et systémiques inévitables, comme un effet pyro- gène intense. OEP (protéine endotoxine originale), qui se compose principalement de protéine, a été isolée sous forme d'antigène commun sérologique de P. aéruginosa par Homma et coll. Il a été mentionné que OEP agit comme un antigène protecteur commun à tous les sérotypes de P. aéruginosa et 90 172 peut être utilisé en tant que vaccin (Jpn. J. Exp. Med. 47, 393-402, 1977) . Homma et coll. pensent que OEP seul ne peut protéger de manière satisfaisante contre cette in- fection, et ils réalisent chaque expérimentation clinique au moyen d'un vaccin comprenant un mélange d'anatoxines, préparé par combinaison d'OEP avec 2 ou 3 constituants choisis parmi les protéase, élastase et anatoxine exo pro- venant de P. aéruginosa. Bien qu'il soit mentionné que ces vaccins présentent de bons effets dans quelques cas, ils ne sont pas d'usage courant à ce jour. Les autres vaccins de P. aéruginosa compren- nent les vaccins au ribosome, chacun ayant un effet spé- cifique vis-à-vis de chaque sérotype de bactérie, des vac- cins pileux, caractérisés par l'adhérence à la surface des membranes, et des vaccins flagellés qui arrêtent le mouve- ment des bactéries. Cependant, tous ces vaccins en sont en- core au stade expérimental. C'est pourquoi il n'est pas exagéré de dire que l'apparition d'excellents vaccins con- tre l'infection provoquée par P. aéruginosa, se fait tou- jours attendre. La présente invention est basée sur des cons- tatations faites au cours d'investigations réalisées afin de trouver un nouvel antigène inhibant l'infection, ayant par lui-même l'aptitude à protéger contre l'infection par P. aéruginosa, et agissant sur tous les sérotypes de cet organisme. La demanderesse a préparé avec succès un hybri- dome de souris qui produit un anticorps monoclonal pouvant réagir avec les sérotypes de P. aéruginosa. Elle a décou- vert d'abord que le constituant cellulaire de P. aérugino- sa correspondant à l'anticorps monoclonal ci-dessus, avait une grande capacité de protection contre l'infection par tous les sérotypes de P. aéruginosa. Plus particulièrement, au cours d'une étude réalisée afin de préparer un hybridome pouvant produire un anticorps monoclonal anti-P.aéruginosa, par fusion cel- lulaire entre des cellules spéniques de souris immunisées avec P. aéruginosa et des cellules de myélome de souris, la demanderesse a réussi à produire une lignée de cellules hybrides capable de produire un anticorps monoclonal apte à réagir avec tous les sérotypes de P. aéruginosa (dési- gnée ci-après par hybridome producteur de C-Ab). Après quoi, la demanderesse a isolé et purifié le constituant cellulaire de P. aéruginosa correspondant à l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome producteur de C-Ab (ci-après désigné par C-Ab), à l'aide de la chromatographie par affinité utilisant l'immobilisation par C-Ab. L'anti- gène commun pouvant réagir avec C-Ab, ainsi obtenu, s'a- vère être une substance totalement nouvelle, composée de protéines, très faiblement toxique, et présentant une ex- cellente aptitude, au cours de l'expérimentation animale, à protéger contre l'infection par tous les sérotypes de P. aéruginosa. La nouvelle substance selon l'invention, dé- signée ci-après par PSC-A et dont les propriétés-physico- chimiques sont décrites plus loin, est un nouvel antigène commun de P. aéruginosa, qui protège contre l'infection provoquée par ce micro-organisme, et qui est obtenu à par- tir d'un extrait de ce même micro-organisme. La présente invention concerneégalement un procédé de préparation de PSCA à partir d'un extrait exempt de cellules, obtenu par broyage de P. aéruginosa suivi de centrifugation, d'isolement, et de purification par chromatographie d'affinité avec immobilisation de l'an- ticorps monoclonal ayant une affinité spécifique pour l'an- tigène commun PSC-A. Elle concerne également un agent pour la protection contre l'infection provoquée par P. aérugi- nosa, renfermant en tant que constituant actif, l'antigène commun PSC-A. La figure annexée représente un spectre dans l'ultra-violet de PSC-A, avec en abscisse la longueur d'onde et en ordonnée la capacité d'absorption. L'invention est décrite concrètement dans ce qui suit. Toutes les souches de P. aéruginosa utilisées dans la présente invention sont fournies conformément à la classification sérologique dans le tableau 1. Il existe différentes théories concernant la classification de P. aéruginosa. Les souches de P. aéruginosa utilisées au cours de l'invention sont classées selon la classifica- tion sérologique donnée dans le rapport du comité de séro- recherche de la Japan P. aéruginosa Society (Japan J. Exp. Med. 46, 329 1976). Toutes les souches appartenant aux groupes A à M, selon cette classification, peuvent être utilisées en tant que sérotype spécifique de P. aérugino- sa, selon l'invention. On utilise cette classification car on pense que c'est la meilleure. Mais si l'on considère que de nouveaux critères de classification puissent être adoptés dans le futur, on peut dire que les souches de P. aéruginosa qui peuvent être utilisées dans la présente in- vention, comprennent toutes les souches bactériennes ayant PSC-A comme antigène protecteur contre l'infection. Ainsi, les souches bactériennes pouvant être utilisées conformé- ment à l'invention ne sont pas limitées à celles qui ap- partiennent aux groupes ci-dessus de A à M, ou à celles qui peuvent être classées selon ce critère de classifica- tion. Ici, parmi les souches de P. aéruginosa appartenant aux groupes A à M, et énumérées dans le tableau 1, la plu- part des souches IID sont enregistrées à l'American Type Culture Collection (catalogue of BACTERIA-PHAGES-DNA VEC- TORS, 16ème Edition, page 136, 1985), qui est un organisme américain pour la préservation des souches bactériennes, et elles peuvent être fournies par cet organisme. Tableau I Classification établie par Japan P. aéruginosa Souches Society A P. aeruginosa IID 1001 (ATCC 27577) B IID 1002, ATCC 27578, IID 1007 ATCC 27583,IID 1013, ATCC 27589, IID 5004 C " IID 1003,ATCC 27579,IID 1037, IID 1021 D " IID 1004 (ATCC 27580) E " ATCC 27581, IID 1130, PA 103 F " IID 1006 (ATCC 27582) G " ATCC 10145, ATCC 27584, P 28 H " IID 1009 (ATCC 27585) I " ATCC 27586 J " IID 1011 (ATCC 27587) K " IID 1012 (ATCC 27588) L " IID 1014 (ATCC 27590) M " IID 5018 La préparation et la propriété de l'anticorps monoclonal C-Ab, ayant une affinité spécifique pour PSC-A, et utilisé au cours de la chromatographie par affinité pour isoler et purifier PSC-A, sont décrites dans l'exem- ple expérimental 1. EXEMPLE EXPERIMENTAL 1 Production, Préparation et Propriété de l'anticorps mono- clonal C-Ab Un hybridome producteur de C-Ab est obtenu con- formément au procédé bien connu de Kohler, Milstein et coll. Nature, 256, 495, (1975). Après avoir préparé une émulsion de P. aéruginosa ATCC 27581 (type E), traité avec 0,3% de formol, avec de l'adjuvant incomplet de Freund, on l'admi- nistre par voie intrapéritonéale à une souris femelle BALB/C(agée de 7 semaines) toutes les deux semaines, pour un total de 5 reprises, afin de réaliser l'immunisation. Puis, 5 x 103 cellules spléniques de souris, recueillies 4 jours après l'immunisation finale, et 5 x 107 cellules de myélome de souris NS-1, sont soumises à une fusion cellulaire en présence de polyéthylene glycol à 50% afin de produire un hybridome. L'hybridome ainsi préparé est alors versé sur une microplaque à fond plat comportant 96 creux, et l'on cultive sur milieu de Dulbecco MEM addition- né de 10% de sérum foetal de bovidé renfermant du HAT (hy- poxanthine, aminoptérine et thymidine), à 37 C, en présen- ce de 5% de C02. Pour les creux,dans lesquels on observe la prolifération de l'hybridome, la présence dans la solu- tion de culture de l'anticorps monoclonal anti-P. aérugi- nosa est déterminée par "Dot Immunobinding Assay" qui est un immunodosage d'enzyme LAnal. Biochem. 119, 142-147 (1982)], désigné ci-après comme étant le procédé DIBA. Le procédé DIBA est réalisé à l'aide d'une plaque à micro- titre à 96 creux, selon le mode opératoire suivant. Une membrane filtrante de nitrocellulose (3,1 mm2), préparée par immobilisation de 0,4 gg par point de P. aéruginosa traité avec 0,3% de formol (utilisé coimme antigène), est mise à incuber avec 100 il de la solution de culture ci- dessus, à température ambiante pendant 30 minutes, avant d'être mise à incuber pendant 30 minutes avec un anticorps d'immunoglobuline de souris anti-lapin marqué de peroxyda- se (fabriqué par Dako). La membrane filtrante de nitrocel- lulose est alors mise à réagir avec du chloro-4 naphtol en tant que substrat pour la peroxydase. On enregistre un ré- sultat positif lorsqu'on observe une tâche bleu foncé sur la membrane filtrante, par immobilisation de l'antigène. Lorsque la production de l'anticorps monoclonal est déce- lée dans la solution de culture, l'hybridome est à nouveau soumis au clonage par dilution limitante. On fait prolifé- rer l'hybridome monoclonal ainsi obtenu, dans un flacon, et l'on implante l'hybridome monoclonal ayant proliféré dans la cavité abdominale d'une souris DALB/C, traitée avec du Pristane (Aldrichi Company), un immuno-supres- seur. Le fluide ascitique de la souris traitée ainsi est appliqué à une chromatographie par affinité à l'aide de Protéine A-Sépharose (Pharmacia Company) afin de préparer un anticorps monoclonal purifié. Parmi les hybridomes ainsi obtenus, qui peuvent produire différents anticorps monoclonaux anti-P. aéruginosa, la demanderesse a trouvé un hybridome producteur de C-Ab qui peut donner un anti- corps monoclonal C-Ab réagissant avec tous les sérotypes de P. aéruginosa. Les réactivités de ce C-Ab vis-à-vis de plusieurs sérotypes de P. aéruginosa, déterminées par le procédé DIBA, sont représentées dans le tableau 2. Ce C-Ab présente des affinités presque égales contre tous les sérotypes de P. aéruginosa. En outre, ce C-Ab ne réagit ni avec l'endo- toxine provenant du sérotype E de P. aéruginosa liposac- charide, préparé à partir de la souche ATCC 27581 (souche N-10) de P. aéruginosa par le procédé de Morrison (J.Biol. Chem., 250, 2911, 1977)_, ni avec OEP [préparé à partir de la souche ATCC 27581 (souche N-10) de P. aéruginosa par le procédé de Homma et coll. (Japan J. Exp. Med., 42, 23, 1972)]. Ce résultat indique que PSC-A a des propriétés différentes de celles de ces substances. L'anticorps monoclonal C-Ab, de l'exemple ex- périmental 1 ci-dessus, ainsiqu'il est décrit en détail ci-après, est essentiel pour la purification, afin d'a- voir un rendement élevé de PSC-A à partir de P. aéruginosa. Il est habituel que C-Ab puisse être utilisé de préférence après avoir été immobilisé avec un support comme Affigel- 10 (Bio-Rad Company) ou BrCN-Sepharose (Pharmacia Company). L'anticorps utilisé pour la préparation de PSC-A ne se limite pas au C-Ab de l'exemple expérimental 1, et l'on peut utiliser avantageusement, pour le procédé selon l'invention, tout anticorps possédant une affinité spécifique pour PSC-A. Par exemple, on peut utiliser pour la chromatographie par affinité des anticorps monoclonaux ayant chacun une affinité spécifique pour PSC-A, et qui sont produits par un hybridome obtenu par fusion cellulai- re entre des cellules de myelome et des cellules lymphoi- des B productrices d'anticorps anti-PSC-A provenant d'un animal récemment immunisé avec du PSC-A isolé selon les exemples 1 à 3, ou un animal ou un humain stimulé avec du PSC-A in vitro, ou des cellules de type prolifération obtenues en infectant avec du virus EB des cellules lym- phoides B humaines pour produire l'anticorps anti-PSC-A. En outre, on peut également utiliser,comme anticorps pour la présente invention, des mélanges de ces anticorps, ainsi que l'anticorps polyclonal anti-PSC-A obtenu à par- tir du serum d'un animal immunisé avec PSC-A. (Voir à la page suivante le Tableau 2) TABLEAU 2 Souche Sérotype P. aeruginosa IID1001 A I " IID1002 B " IID1007 B " IID1013 B " IID5004 B " IID1037 C " IID1004 D " IID1130 E " ATCC27581 E " PA103 E " IID1006 F " ATCC27584 G " -ATCC10145 G P-28 G " IID1009 H ATCC27586 I " IID1011 J " IID1012 K " IID1014 L " IID5018 M Titre de C-Ab déter- miné par le procédé DIBA X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 54 X 102 X 102 X 102 X 102 X 102 x l02 x io2 X 102 X 102 X 102 X 102 * 1 La cellule microbienne provenant de chaque sérotype de P. aéruginosa traité avec 0,3% de formol, est pi- quetée sur une membrane filtrante de nitrocellulose. * 2 Classification de la Japan P. aéruginosa Society. * 3 L'hybridome producteur de C-Ab est implanté dans la cavité abdominale d'une souris BALB/C (âgée de 8 se- maines) pour obtenir le fluide ascitique, qui est ensuite centrifugé (30000 X g, pendant 20 minutes à 4 C), et la partie surnageante est utilisée pour son activité. Le titre d'anticorps de C -Ab pour chaque souche est exprimé en tant que multiple maximal de la dilution de C-Ab (partie surnageante des ascites), pour laquelle on observe une tache bleu foncé sur une membrane filtrante de nitrocellulose. Un procédé de base pour la production de PSC-A est décrit ci-après. Les souches de P. aéruginosa utilisa- bles pour la production de PSC-A sont décrites plus haut. On peut utiliser des procédés classiques de culture de P. aéruginosa et de broyage des cellules microbiennes. Pour le milieu,peuvent servir un bouillon d'infusion de coeur, un bouillon d'infusion coeur-cerveau (fabriqué par Eiken Kagaku), un bouillon nutritif, ou un milieu synthétique préparé selon le procédé de Homma et coll. (J. Biochem. 83, 711-718, 1978). Ce milieu synthétique sans protéine est de beaucoup préférable car il n'existe pas de possibilité de contamination par les protéines, du constituant micro- bien dans le milieu. Il s'avère préférable que la tempéra- ture du milieu se situe entre 25 et 37 C, et le pH entre 6,5 et 8,5. La culture doit se dérouler sous aérobie. Par exemple, il est recommandé de secouer la culture dans son récipient, ou de l'agiter de manière à l'aérer. La durée de la culture exerce une influence sur le rendement en PSC- A obtenu à partir de P. aéruginosa. Il est habituellement préférable que cette durée soit de 16 à 24 heures. Par exemple, après avoir secoué à 37 C pendant 24 heures une culture sur milieu synthétique (pH 7,4) de Homma et coll., on obtient par centrifugation ou filtration les cellules * microbiennes voulues. A ce moment, il est possible de ré- cupérer ces cellules microbiennes après qu'elles aient été désactivées par traitement avec une petite quantié de formol. Les cellules microbiennes ainsi obtenues sont a- lors suffisamment mélangées avec de l'eau ou une solution tampon convenable, avant d'être broyées par un DYNOMILL (un appareil à ultrasons) avec refroidissement à une tem- pérature inférieure à 10 C. La suspension ainsi obtenue est alors décantée et soumiseà centrifugation pour donner un extrait de PSC-A exempt de cellules. La centrifugation de la suspension est réalisée à 39000 X g pendant 30 minu- tes, et l'on recueille la partie surnageante. Lors de la préparation d'une suspension par broyage des cellules mi- crobiennes de P. aéruginosa par une machine, le taux d'ex- traction de PSC-A peut être encore amélioré par addition d'une petite quantité d'un agent tensio-actif comme Triton X-100, d'un agent de chélation comme EDTA, ou d'une enzyme comme lysozyme, désoxyribonucléase ou ribonucléase. L'extrait exempt de cellules, utilisé au cours de la présente invention, correspond à une fraction qui est préparée par élimination des cellules microbiennes non broyées, des cellules microbiennes partiellement broyées, et de la fraction insoluble de la fraction de paroi de cellules provenant de la suspension, par centri- fugation, aussi élevée que possible. PSC-A brut peut être obtenu de cet extrait exempt de cellules, en soumettant celui-ci à une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions, ou à une chromatographie de filtration sur gel. PSC-A peut être facilement obtenu avec un rendement élevé correspondant au procédé utilisé selon l'invention, par isolation et purification de PSC-A par application de l'ex- trait exempt de cellules à une colonne par affinité, pré- parée par immobilisation d'un anticorps monoclonal comme C-Ab. Il est préférable d'utiliser un anticorps monoclonal comme C-Ab, ayant une affinité spécifique pour PSC-A et ayant été préalablement immobilisé avec un support conve- nable comme Affigel ou BrCN-Sepharose, ainsi qu'il a été dit précédemment, pour isoler et purifier PSC-A. La colonne par affinité,sur laquelle est appliqué l'extrait exempt de cellules, est ensuite soigneusement rincée avec un tampon neutre à un pH de 6 à 8, afin d'éluer les impuretés autres que PSC-A qui ne sont pas liées à l'anticorps monoclonal immobilisé ci-dessus. Ensuite, on utilise sur cette co- lonne, pour dissocier et éluer PSC-A lié à l'anticorps monoclonal, un tampon d'intervalle de pH faible, utilisé pour dissocier le complexe antigène-anticorps, comme 50 mM de serum physiologique tamponné à HClglycine (pH 3). L'éluat ainsi préparé est alors ajusté à un pH neutre, et la solution neutralisée est dialysée contre de l'eau distillée. Puis le dialysat est lyophilisé et donne une poudre pure de PSC-A. La concentration de PSC-A dans le filtrat provenant de la culture peut être négligée aussi long- temps que des cellules microbiennes sont obtenues en tant que produit de culture habituel de bactéries vivantes. Ce- pendant, quand une grande quantité de PSC-A a été trans- férée des cellules microbiennes dans le filtrat, en rai- son de la mort ou de l'autolyse des cellules microbien- nes par une longue durée de culture, il est possible de récupérer le PSCA purifié par application de la partie surnageante, obtenue par centrifugation du filtrat ci- dessus, sur une colonne par affinité préparée par immobi- lisation de l'anticorps monoclonal ci-dessus à affinité spécifique pour PSC-A. Afin d'éluer efficacement et d'éliminer les impuretés autres que PSC-A de la colonne par affinité, sur laquelle a été appliqué l'extrait exempt de cellules mentionné plus haut, il est recommandé de rincer cette colonne avec un tampon neutre et une petite quantité d'un agent tensio-actif comme Triton X 100. Les propriétés chimiques et biophysiques de PSC-A, obtenu par purification dans l'exemple 1, sont in- diquées dans ce qui suit. PSC-A,obtenu dans les exemples 2 ou 3, présente également les mêmes propriétés. 1) Poids moléculaire Environ 15000 (selon l'électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS). Cn n'observe qu'une bande unique tein- tée par "coomassie brilliant blue R 250", au cours de l'électrophorèse à polyacrylamide (PAGE) réalisée dans chacune des conditions suivantes. Résultat pH 9,5 gel à 7% Rf = 0,86 pH 9,5 gel à 10% Rf = 0,80 pH 9,5 gel à 12% Rf = 0,78 2) Teneur en protéine, sucre et hexosamine Pourcentage de protéine: 55% d'après l'analyse colorimétri- que par hydrolyse utilisant ninhydrine, avec comme étalon l'albumine de serum de bovidé (Anal.Biochem.,49, 95, 1972); 2% d'après le procédé de Lowry modifié, avec comme étalon l'albumine de serum de bovidé (Anal. Biochem.,69, 646, 1975); 24% d'après le dosage de liaison de protéine, avec comme étalon l'albumine de serum de bovidé (Anal.Biochem., 72, 248, 1976). Pourcentage de sucre: 3 à 5% d'après le procédé phénol- acide sulfurique, avec comme étalon le glucose (Anal.Chem., 28,350,1956). Pourcentage d'hexosamine: Inférieur à 1% d'après le procédé de Rondle, Morgan, avec comme étalon la glucosa- mine (Biochem.J., 61, 586, 1955). 3) Teneur en lipide: 7 à 10% d'après le procédé modifié de Bligh, Dyer (Can.J. Biochem.Physiol., 37, 911, 1959). La tache d'origine est colorée lorsque l'extrait au chlo- roforme/méthanol de PSC-A (procédé modifié de Bligh, Dyer) est développé par une chromatographie en couche mince sur gel de silice, à l'aide d'un mélange éther de pétrole/ éther/acide acétique, dans la proportion 80/20/1, avant d'être coloré par traitement avec une solution d'acide sulfurique à 50%, avec chauffage. 4) Aspect et solubilité L'agent est une poudre jaune pâle, soluble dans l'eau, le serum physiologique et le tampon phosphate, et sa so- lubilité dans l'eau est égale ou supérieure à 1 mg/ml. Il est presqu'insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'hexane et le chloroforme. ) Réactions colorées Les réactions de Lowry, de Folin, à la ninhydrine, au phénolsulfate et à l'anthrone-sulfate, donnent un résul- tat positif, tandis que la réaction d'Elson-Morgan donne un résultat négatif. 6) Point isoélectrique pH 3,8 à 4,2 (électroconcentration sur agarose) 7) Stabilité Il est stable en solution aqueuse neutre, à température ambiante pendant au moins 24 heures 8) Spectre dans l'ultra-violet L'absorption maximale se produit à environ 272 nm, comme indiqué dans la figure 1. 9) Activité enzymatique Il ne provoque pas de décomposition de la caséine ni du collagène. 10) Propriétés a) Lorqu'on ajoute 10 gg/ml de PSC-A à des cellules L d'une lignée cellulaire dérivée de tissu connectif de souris, avant de cultiver pendant 24 heures, ou que l'on ajoute 2 gg/ml de PSC-A à des cellules leucocytes prove- nant de la rate d'une souris normale avant de cultiver pendant 24 heures, on constate que PSC-A ne présente au- cune toxicité directe vis-à-vis de ces cellules. b) Dans le cas d'une solution préparée par dissolution de PSC-A dans du sérum physiologique, et dans le cas d'une émulsion préparée par mélange de PSC-A avec de l'adjuvant de Freund complet ou incomplet, un anticorps pouvant réa- gir avec P. aéruginosa apparaît dans le serum d'une souris immunisée avec PSC-A. De plus, PSC-A traité avec l'enzyme protéolytique pronase, ou chauffé à 100 C pendant 10 mi- nutes, ne réagit pas avec un serum provenant d'une souris immunisée avec PSC-A non traité. c) L'anticorps monoclonal de souris,ayant une affi- nité spécifique pour PSC-A, ne réagit ni avec l'antigène commun bien connu de P. aéruginosa, OEP, ni avec l'endo- toxine de P. aéruginosa (lipopolysaccharide). Lorsqu'on l'utilise pour protéger contre l'in- fection provoquée par P. aéruginosa, il est préférable que cet agent soit administré par injection. En pratique, on peut utiliser une solution ou une préparation lyophi- lisée obtenue à partir de PSC-A seul ou en combinaison avec additifs et excipients habituels. Il est possible d'incorporer PSC-A dans une émulsion de type huile-dans- l'eau ou de type eau-dans-l'huile. PSC-A peut être aussi utilisé par scellement dans un liposome constitué de phos- pholipide et de cholestérol, ou par fixation sur la sur- face externe de la membrane du liposome. Le dosage et la voie d'administration du PSC-A peuvent être choisis de manière adéquate. Le dosage préfé- ré est de 0,001 à 10 mg/kg du poids du corps. La voie d'administration peut être percutanée, souscutanée, intra- veineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale. PSC-A présente un pouvoir antigène qui se mani- feste dans le vaccin et induit la production à concentra- tion élevée d'un anticorps de P. aéruginosa dans le serum de souris ou de cobaye, immunisé avec du PSC-A. En outre, PSC-A est fortement efficace pour protéger l'animal contre l'infection par P. aéruginosa.Par exemple, des souris immunisées avec PSC-A ne sont pas in- fectées par une dose léthale de chacun des sérotypes de P. aéruginosa et peuvent vivre après avoir été traitées avec cet organisme. Cela montre la remarquable aptitude de PSC-A à protéger contre l'infection par P. aéruginosa. PSC-A a une faible toxicité aiguë: lorsqu'on l'administre par voie intraveineuse à des souris, on cons- tate que sa DL50 est supérieure à 5 mg/kg. Ce produit n'exerce aucune toxicité directe sur les cellules anima- les. Il ressort des constatations ci-dessus que PSC-A s'avère être un agent très intéressant pour protéger contre l'infection provoquée par P. aéruginosa. Dans ce qui suit, sont décrits, dans les exem- ples le procédé de fabrication de PSC-A, et dans les exem- ples expérimentaux l'utilité de PSC-A pour protéger contre l'infection par P. aéruginosa. EXEMPLE 1 Préparation de PSC-A à partir de P. aéruginosa de sérotype E Le milieu de culture de P. aéruginosa renferme, par litre, 20 g de glutamate de sodium, 5 g de glycérine, 0,1 g de MgSO4.7H20, 0,55 g de KH2PO4, 5,6 g de Na2HPO4. 12H20, 17,26 mg de Ca(NO3)2.4H20 et 50 gg de FeSO4.7H20 et l'on ajuste à pH 7,6. Après avoir cultivé P. aéruginosa ATCC 27581 (type E) sur un milieu nutritif à l'agar à 37 C une nuit durant, on met les cellules microbiennes en suspension dans du serum physiologique. Puis on ensemence 0,5 ml de cette suspension dans un flacon de Sakagushi renfermant ml du milieu synthétique décrit précédemment, et l'on effectue une culture secouée à 37 C pendant 16 heures. On ajoute ensuite 1,2 ml de formol dans ce flacon et l'on mélange vigoureusement avec la culture avant de laisser à température ambiante pendant 1 heure. Puis on soumet cette culture à une centrifugation (12000X g, 30 minutes) afin de recueillir les cellules mi- crobiennes. Après quoi, par rinçage des cellules microbien- nes avec du serum physiologique et de l'eau distillée, on obtient à partir de 15 1 de milieu de culture, 55 g de cel- lules humides. Les cellules ainsi obtenues sont alors mi- ses en suspension dans 220 ml de tampon Tris-HCl 20 mM (pH 8) renfermant 2% de Triton X 100 et 10 mM de EDTA, avant d'être broyées avec un DYNO-MILL (perles de 0,1 mm de dia- mètre) pendant 3 minutes sous refroidissement. Puis, la suspension de cellules microbiennes broyées ainsi préparée est abandonnée à 4 C, et l'on re- cueille la partie surnageante par décantation. Le résidu est mis en suspension dans 500 ml du tampon ci-dessus, et l'on répète une fois le mode opératoire ci-dessus.Les parties surnageantes ainsi recueillies sont alors rassem- blées et centrifugées (39000 X g, 30 minutes). Puis on ap- plique 720 ml de partie surnageante à une colonne par af- finité chargée d'Affigel-10, immobilisé avec de l'anti- corps monoclonal C-Ab (dimensions de la colonne, 22 X 40mm; mg de C-Ab sont liés à 1 ml d'Affigel-10). Cette colonne est ensuite rincée avec 100 ml de tampon Tris-HCl 20 mM (pH 8) renfermant 0,5% de Triton X 100, et 100 ml du même tampon seul, et l'on élue avec ml de serum physiologique tamponné avec glycine7HCl mM (pH 3). L'éluat ainsi obtenu est alors neutralisé avec une solution aqueuse 1 N de carbonate acide de so- dium, et dialysé contre de l'eau distillée à 4 C pendant 24 heures. Ensuite, on lyophilise le dialysat pour obtenir 4,7 mg de poudre pure de PSC-A. EXEMPLE 2 Préparation de PSC-A à partir de P. aéruginosa de sérotype G P. aéruginosa ATCC 27584 (type G) est soumis à une culture secouée en milieu synthétique, comme dans l'e- xemple 1, à 37 C pendant 20 heures. Le mode opératoire qui suit est réalisé comme dans l'exemple 1, et l'on obtient 306,2 mg de PSC-A à partir de 58,2 g de cellules microbien- nes humides. La composition de PSC-A en amino-acides est dé- terminée par un analyseur automatique d'amino-acides (IRICA- A-5500) et les résultats sont reportés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Composition de PSC-A en amino-acides Amino-acide -Mole %* Lysine 10,07 Histidine 0,06 Arginine 1,45 Acide aspartique ou asparagine 5,63 Thréonine 5,07 Sérine 3,59 Acide glutamique ou glutamine 15,44 Proline 2, 17 Glycine 7,42 Alanine 20,27 Cystéine 0,00 Valine 11,57 Méthionine 1,45 Isoleucine 4,18 Leucine 7,10 Tyrosine 0,46 Phénylalanine 1,94 Tryptophane** 2,12 *basé sur analyse reproduite d'hydrolysats de 24, 48 et 72 heures (dans HCl 6N à 105 C) **déterminé par un procédé spectrophotométrique (Anal.Chem. 29, 1193, 1957) EXEMPLE 3 Préparation de PSC-A à partir de P. aéruginosa de sérotype I P. aéruginosa ATCC 27586 (type I) est soumis à une culture secouée en milieu synthétique, comme dans l'exemple 1, à 37 C pendant 20 Heures. Le mode opératoire qui suit est réalisé comme dans l'exemple 1, et l'on ob- tient 28 mg de PSC-A à partir de 305 g de cellules micro- biennes humides. EXEMPLE 4 Solution On dissout dans 10 ml de sérum physiologique, 1 mg de PSC-A obtenu dans l'exemple 2, et la solution ainsi préparée est soumise à une filtration aseptique au travers de Nuclepore N 20 (fabriqué par Nuclepore Company). Un échantillon de 1 ml du filtrat ainsi obtenu est alors versé dans une fiole sans laisser se produire de contami- nation par les bactéries, et l'on a une solution de PSC-A. EXEMPLE 5 Préparation lyophilisée On dissout dans 10 ml d'eau distillée, 10 mg de PSC-A obtenu dans l'exemple 3, et on ajoute à cette so- lution 500 mg de mannitol, puis on filtre au travers d'un Nuclepore N 20. On verse alors dans chaque fiole un échan- tillon de 1 ml de filtrat ainsi obtenu, sans laisser se produire de contamination par les bactéries avant d'effec- tuer la lyophilisation et l'on obtient une préparation lyophilisée de PSC-A. EXEMPLE 6 Emulsion On dissout dans 0,5 ml de sérum physiologique, 1 mg de PSC-A obtenu dans l'exemple 3, et l'on ajoute à cette solution 0,5 ml d'une solution mixte comprenant de la paraffine liquide et de l'Arlacel (fabriqué par Arlacel A. Atlas Chemical Industries) dans la proportion de 8,5 à 1,5, afin d'obtenir une émulsion de type eau-dans-l'huile. EXEMPLE EXPERIMENTAL 2 Propriété antigène de PSC-A chez la souris Des quantités égales d'adjuvant incomplet de Freund et d'une solution de PSC-A, provenant respectivement de l'exemple 1 et de l'exemple 2, dans du sérum physiologi- que, son$nélangées pour préparer des émulsions du type eau- dans-l'huile. Après avoir immunisé deux fois, avec chacune des émulsions ci-dessus, à intervalle d'une semaine, (10 gg par souris de PSC-A sont administrés à chaque immunisation par voie intrapéritonéale), à un groupe com- prenant 5 souris femelle BALB/C, âgées de 8 semaines, on recueille le sang de chaque souris par saignée à l'oeil (20 il) 4 jours après la dernière immunisation. Le titre en anticorps anti-P. aéruginosa dans le serum de la souris est déterminé par le procédé DIBA décrit dans l'exemple expérimental 1. Les résultats sont représentés dans le ta- bleau 4. Après réalisation de l'immunisation avec PSC-A, on décèle dans le serum un titre élevé en anticorps. Les anticorps ne sont pratiquement pas décelés dans les souris non immunisées. (Voir le Tableau 4 à la page suivante). TABLEAU 4 Immunogène PSC-A de l'exemple 1 Numéro de la souris Titre en anticorps dans le serum de souris déterminé par le procédé DIBA* IID 1002 53X1 02 53X102 53X102 53X102 53X102 ATCC 27581 ATCC 10145 54X102 54X102 53X102 53X102 54X102 54X102 53xO02 53X102 53X102 54X102 ATCC 27586 54X102 54X102 53X102 53M 2 53X102 53X102 6 53X102 53X102 54X102 53X102 7 53X102 53X102 53X102 53X102 PSC-A 8 53X102 54X102 54X102 53X102 de l'exemple2 3 2x30 3 2 3 2 9 53exemp3 2 5 3X10 2 5310 5X102 53X102 53X102 53X102 * Le titre en anticorps est déterminé par le procédé DIBA utilisant des cellules de P. aéruginosa traitées avec 0,3% de formol, IID 1002 (type B), ATCC 27581 (type E), ATCC 10145 (type G) et ATCC 27586 (type I). Le titre en anticorps pour chaque souche bactérienne est exprimé en tant que le multiple maximal de dilution du serum de souris pour lequel on observe une tache bleu foncé sur une membrane filtrante de nitrocellulose. t'a na o N Nto C> ri EXEMPLE EXPERIMENTAL 3 Effet de PSC-A sur la protection contre l'infection provo- quée par P. aéruginosa (1ère Partie) Après avoir immunisé à deux reprises 2 grou- pes comprenant chacun des souris femelles BALB/C âgées de 8 semaines, avec chacune des deux émulsions indiquées dans l'exemple expérimental 2, à une semaine d'intervalle (on administre par voie intrapéritonéale, pour chaque immuni- sation, 10 gg de PSC-A par souris), on contamine chaque souris avec P. aéruginosa (5 x DL50) une semaine après la dernière immunisation. On utilise pour provoquer l'infec- tion deux souches de P. aéruginosa: PAl03 (type E) et P 28 (type C). Chacune de ces souches est cultivée sur un milieu agar-infusion de coeur (fabriqué par Eiken Ka- gaku) une nuit durant, on recueille et dilue avec du sérum physiologique. Ensuite, 5 parties de mucine sont ajoutées à 100 parties de cette suspension bactérienne, et chaque souris reçoit par voie intrapéritonéale une quantité cor- respondante à 5 DL50 de cette suspension bactérienne ainsi préparée. Pour le groupe témoin, on administre au lieu de PSC-A, du sérum physiologique seul. Le nombre de souris restant dans chaque groupe, les jours suivant l'infection * par P. aéruginosa,sont comptés et les résultats sont re- portés dans le tableau 5. Ainsi, il s'avère que PSC-A est efficace pour protéger contre l'infection provoquée par P. aéruginosa. (voir le tableau 5 à la page suivante). Groupes d'essai Témoin I Groupe I Groupe II Témoin II Groupe III Groupe IV Immunogène PSC-A de l'exemple 1 PSC-A de l'exemple 2 PSC-A de l'exemple 1 PSC-A de l'exemple 2 TABLEAU 5 P. aéruginosa Survie après 7 ___ jours PA103 0/5 (type E) "i 5/5 i! /5 P28 (type G) 0/5 /5 /5 Taux de survie(+) o EXEMPLE EXPERIMENTAL 4 Effet de PSC-A sur la protection contre l'infection provo- quée par P. aéruginosa (2ème Partie) On dissout le PSC-A obtenu dans l'exemple 3 dans du sérum physiologique pour préparer une solution échantillon. Après avoir immunisé à quatre reprises avec la solution ainsi préparée, à des intervalles de 1 semaine, deux groupes comprenant chacun 5 souris BALB/C femelles, âgées de 8 semaines (pour chaque immunisation on adminis- tre par voie sous-cutanée à chaque souris 20 Fg de PSC-A), on contamine ces deux groupes avec deux souches de P. aé- ruginosa constituées respectivement de PA103 (type E) et P28 (type G).Une suspension bactérienne de chacune de ces souches est préparée de la manière décrite dans I'exemple 3, et chaque souris est contaminée par voie intrapérito- néale avec une quantité triple de la DL50 de cette sus- pension bactérienne. Pour le groupe témoin, on administre au lieu de PSC-A du sérum physiologique. Il ressort du tableau 6 que PSC-A protège-ef- ficacement contre l'infection provoquée par P. aéruginosa. !, TABLEAU 6 Groupes Immunogène P. aéruginosa Survie après Taux de d'essai utilisé 7 jours survie(+) Témoin - PA103 0/5 0 I (type E) Groupe PSC-A de I l'exemple " 4/5 80 Témoin - P28 0/5 0 II (type G) Groupe PSC-A de " 5/5 100 II l'exemple EXEMPLE EXPERIMENTAL 5 Effet de PSC-A sur la protection contre l'infection provoquée par P. aéruginosa (3ème partie) PSC-A de l'exemple 1 et celui de l'exemple 2 sont dissous séparément dans du sérum physiologique pour préparer des solutions échantillon. Deux groupes, compre- nant chacun 15 souris femelles,âgées de 6 semaines, sont immunisées à trois reprises avec chacune des deux solutions échantillon à des intervalles d'une semaine (pour chaque immunisation on administre par voie intrapéritonéale 30 g de PSC-A à chaque souris). Une semaine après la dernière immunisation, chaque souris est contaminée avec P.aéru- ginosa: on utilise deux souches de P. aéruginosa pour cela, la souche PA103 (type E) et la souche P28 (type G) comme dans les exemples expérimentaux 3 et 4. Après avoir préparé des suspensions de ces souches, comme dans l'exem- ple expérimental 3, on contamine chaque souris par voie intrapéritonéale avec une quantité de suspension de PA103 et de P28 correspondant respectivement à 3 fois et 5,5 fois la DL50. Pour le groupe témoin, on administre au lieu de PSC-A du serum physiologique seul.-On compte le nombre 2S90172 de souris restant dans chaque groupe 7 jours après la con- tamination par P. aéruginosa, et les résultats sont repor- tés dans le tableau 7. Il s'avère que PSC-A protège effi- cacement contre l'infection provoquée par P. aéruginosa. TABLEAU 7 Groupes Immunogène P.aéruginosa Survie après Taux de d'essai utilisé 7 jours survie(+) Témoin - PA103 0/15 0 I (type E) Groupe PSC-A " 15/15 100 I de l'exem- ple 1 Groupe PSC-A de " 15/15 100 II l'exemple Témoin - P28 1/15 6,7 II (type G) Groupe PSC-A de " 12/15 80 III l'exemple Groupe PSC-A de " 11/15 73,3 IV l'exemple EXEMPLE EXPERIMENTAL 6 Toxicité On administre par voie intra-veineuse à un groupe comprenant 6 souris femelles BALB/C,agées de 5 semaines, une solution préparée par dissolution de PSC-A de l'exemple 3 dans du serum physiologique. De manière identique, on administre par voie intra-veineuse,à un autre groupe de souris, du LPS extrait de E. coli (lipopo- lysaccharide fabriqué par Sigma Company, serotype N 0111-: B4). On observe, pendant les 24 heures qui suivent l'ad- ministration intra-veineuse le niveau des DL50 de PSC-A et de LPS.Les résultats sont reportés dans le tableau 8.Con- trairement à LPS, PSC-A ne présente qu'une faible toxicité. TABLEAU 8 Echantillon DL50 par administration intraveineuse PSC-A > 5 mg/kg LPS de E. coli ( 0,1 mg/kg EXEMPLE EXPERIMENTAL 7 Action pyrogène On administre par voie intra-veineuse à un groupe comprenant trois femelles de lapin blanc japonais, une solution préparée par dissolution de PSC-A de l'exem- ple 3 dans du serum physiologique. On opère de la même ma- nière avec un autre groupe de lapins qui reçoit par voie intraveineuse du LPS extrait de E. coli. La température du corps de chaque lapin est successivement mesurée depuis 2 heures avant l'administration jusqu'à 6 heures après. Les résultats sont reportés dans le tableau 9. On constate que l'action pyrogène de PSC-A est inférieure à celle de LPS. TABLEAU 9 Echantillon Dose minimale pour une augmenta- tion de 0,6 C de la température du corps PSC-A > 1 x 102 gg/kg LPS de E. coli 1 x 10-3 g/kg Revendications 1. Nouvel antigène commun de Pseudomonas aéruginosa, désigné par PSC-A, efficace pour protéger contre l'infec- tion provoquée par P. aéruginosa, caractérisé par les pro- priétés biophysicochimiques suivantes: 1) Poids moléculaire: environ 15 000; 2) Teneur en protéine, sucre et hexosamine: Teneur en protéine de 55% d'après l'analyse colorimétrique par hydrolyse, utilisant la ninhydrine; Teneur en sucre de 3 à 5%; Teneur en hexosamine égale ou inférieure à 1%; 3) Teneur en lipide: 7 à 10%; 4) Aspect et solubilité: Le produit est une poudre jaune pâle, soluble dans l'eau, le sérum physiologique et le tampon phosphate, et sa solu- bilité dans l'eau est égale ou supérieure à 1 mg/ml. Il est pratiquement insoluble dans le méthanol, l'éther, l'he- xane et le chloroforme; ) Réactions colorées: La réaction de Lowry-Folin, la réaction à la ninhydrine, la réaction au phénol-sulfate et celle à l'anthrone-sulfate donnent un résultat positif, tandis que la réaction de Elson-Morgan donne un résultat négatif; 6) Point isoélectrique: pI = 3,8 à 4,2 (électroconcen- tration sur agarose); 7) Stabilité: Le produit est stable en solution aqueuse neutre à tempé- rature ambiante pendant au moins 24 heures; 8) Spectre dans l'ultraviolet: Une absorption maximale se produit-à environ 272 nm; 9) Activité enzymatique: Il ne décompose ni la caséine ni le collagène; ) Propriétés: a) Lorsqu'on ajoute 10 gg/ml de PSC-A à des cellules L d'une lignée cellulaire dérivée de tissu connectif de sou- ris, avant de cultiver pendant 24 heures, ou que l'on ajoute 2 gg/ml de PSC-A à des cellules leucocytes pro- venant de la rate d'une souris normale, avant de cultiver pendant 24 heures, on constate que PSC-A ne présente au- cune toxicité directe vis-à-vis de ces cellules; b) Dans le cas d'une solution préparée par dissolution de PSC-A dans du sérum physiologique, et dans le cas d'une émulsion préparée par mélange de PSC-A avec de l'adjuvant de Freund complet ou incomplet, un anticorps pouvant réa- gir avec P. aéruginosa apparait dans le sérum d'une souris immunisée avec PSC-A. De plus, PSC-A traité avec l'enzyme protéolytique pronase, ou chauffé à 100 C pendant 10 minu- tes, ne réagit pas avec un sérum provenant d'une souris immunisée avec PSC-A non traité; c) L'anticorps monoclonal de souris ayant une affinité spécifique pour PSC-A, ne réagit ni avec l'antigène commun bien connu de P. aéruginosa, OEP, ni avec l'endotoxine de P. aéruginosa (lipopolysaccharide). 2. PSC-A selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de P. aéruginosa. 3. Procédé de préparation de PSC-A selon la reven- dication 1 ou 2, caractérisé en ce que, après avoir broyé des cellules de P. aéruginosa, on soumet à une centrifuga- tion pour produire un extrait exempt de cellules, d'ou l'on isole et purifie PSC-A par une chromatographie par af- finité, utilisant l'immobilisation de l'anticorps monoclo- nal ayant une affinité spécifique pour PSC-A.