Brevet FR2590272A1 — publié le 19870522

La présente invention est l'obtention d'un complexe biologique, protéolytique, enzymatique de souche pure. Il s'agit d'un produit élaboré par des microorganismes unicellulaires spécialement adaptés à opérer des transformations biochimiques ou produire des secrétions en utilisant soit un tissu végétal ou animal, ou encore un ou des organes frais très finement broyés, lesquels sont introduits dans un milieu de culture en dose croissantes. L'on obtiendra ainsi par cette technique un produit vectorisé spécialement conçu pour traiter un tissu, un organe homologue. Souches pures utilisées : Définition et caractères Micromonospora chalcéa : (réf : foulerton) orskov 1923. Non pathogène. Action protéolytique intense. Aérobie. T optimum de développement 30 C à 35 C. Gram positif. Se cultive sur gélose nutritive. Gélose trypto-caséinesoja-milieu synthétique-milieu d'enrichissement. Achromobacter superficialis : (Réf. Jordan 1890) Bergey 1923 non pathogène. les glucides ne sont pas fermentés. Les acides aminés en composition de milieu synthétique peuvent servir de source d'azote et de carbone. Le soufre minéral peut servir de source de S' Aérobie. T optimum 25 C à 30 C. Se cultive sur gélose inclinée - gélose tryptone caséine-soja-milieu d'enrichissement. L'utilisation de microorganismes ou bactéries pour élaborer des produits assimilables directement par suite de l'effet vecteur, est une technique de pointe extrèmement compétente et valable. L'originalité du produit, le caractère nouveau qu'il présente sont l'association de deux bactéries, l'une apportant un complexe protéolytique, enzymatique, l'autre une synergie renforçant ainsi le premier potentiel, mais avec en plus une action sur le parasitisme ; ce qui à ce jour n'a pas été réaliser. La Bioconversion, issue de la biotechnologie, utilisant la matière vivante pour dégrader, synthétiser et produire les matériaux en vue d'une activité industrielle avec un bon rendement économique, n'a pas une technique comparable à celle de ce produit, la technicité de ce dernier étant dissemblable. Le complexe protéolytique-enzymatique, produit par l'association des micro-organismes cités à pour but le traitement de certaines affections de la peau ayant un rapport direct avec la dermatologie et les traitements cosmétiques concernant l'entretien du corps humain, d'autres applicationssont possibles dans le domaine médical, vétérinaire, agronomique, elles feront l'objet de certificats d'addition dans les délais réglementaires. Les substrats utilisés sont décrits dans la liste des milieux de culture et leur emploi dans la technique de fabrication. Ces substrats ont été déterminés d'une façon précise et étudiés en regard de la capacité d'accumulation du cytoplasme des microorganismes, respectant ainsi l'équilibre nécessaire entre le milieu exocellulaire et endocellulaire. Ces substrats contiennent les aliments constitutifs de la matière vivante bactérienne, de plus comme ces microorganismes ont un pouvoir de dégradation de substances chimiques d'ou l'obtention de source d'énergie pour la cellule, ces substrats ont dans leur composition les aliments énergétiques indipensables. La présence de ces aliments constitutifs et énergétiques n'est pas uniquement nécessaire, il faut que les conditions physico-chimiques soient compatibles avec le mode de vie de ces microorganismes (température PH). La vie ou la croissance de ceux-ci peut-être ralentie ou même arrêtée malgré l'apport de besoins nutritifs satisfaisants, s'il n'y a pas respect des facteurs cités ci-dessus. Les microorganismes choisis sont mésophiles et ont un PH par les milieux de 7-7,5, avec une tolérance à variation de 6 à 9 toutefois cette variation crée une sensibilité dans le milieu qu'il faut éviter. Les nutriments des substrats qui pénètrent sélectivement dans la cellule bactérienne en franchissant la barrière plasmique vont subir une réaction de dégradation (catabolisme) d'ou l'énergie utile à la cellule, des métabolites pour les réactions de synthèse (anabolisme). Ces bactéries sont des chimioorganotropnes hétérotrophes qui par l'apport du composé organique vont créer une source énergétique importante. Elles ont des exigences strictes. L'Azote sera fourni par les acides aminés présents dans les milieux, le phosphore par le composé organique, également le soufre par l'ajout aux milieux de culture et par moyen séparé sous forme d'une solution. Les éléments minéraux contenus dans les milieux ou substrats sont nécessaires à l'état de traces, les ions vont constituer la part nécessaire à la constitution d'enzymes, à l'activation des réactions enzymatique et aussi à la constitution de facteur de croissance, il doit trouver celuici préformé dans le substrat, ce qui est notre cas par notre composition d'acides aminés et de vitamines - leurs concentrations sont infimes (N parltre) Les microorganismes sélectionnés ont une tolérance aux variations de concentration ionique elles sont aérobies et consomment de l'oxygène pendant leurs activités métaboliques et leur développement. Pour atteindre le cytoplasme, les nutriments doivent franchir la membrane cytoplasmique. Ces nutriments sont représentés par de grosses molécules qui vont être scindés en molécule plus petites par des enzymes secré tées par la cellule bactérienne (enzymes exocellulaire) ces petites molécules seront ensuite transformés par les enzymes intracellulaires à l'in térieur de la cellule. La membrane cytoplasmique sélectionne les molécules en utilisant celles qui sont utiles, empêchant ainsi la pénétration de constituants qui n'ont pas de valeur potentielle se trouvant dans le milieu exocellulaire. La membrane plasmique perméable à l'eau et à une certaine grandeur de molécules organiques joue donc un rôle physiologique capital en procédant à des échanges sélectifs entre le milieu exocellulaire et endocellulaire. Ces échanges se font par une pénétration active grâce a des perméases, lesquelles sont comparables à des systèmes enzymatiques. Les milieux nécessaires aux besoins nutritionnels de l'espèce que nous cultivons sont des milieux synthétique, donc des solutions de composés chimiques définis en quantité définie, lesquels sont adaptés d'une part aux besoins nutritionnels de chaque micro-organisme mais aussi du but recherché. Comme nous utilisons des souches pures, il est pratiquement inutile pour des contrôles d'utiliser des milieux d'isolement, ou d'identification. Les principales applications du produit sont dirigées vers l'industrie des cosmétiques, et les traitements afférants à ceux-ci à la dermatologie. La médecine générale fera l'objet d'un certificat d'addition pour la définition de l'application dans certaines maladies avec des organes frais différent de celui utilisé en vectorisation pour les cosmétiques et la dermatologie. Industries des cosmétiques Incorporation du produit dans les productions industrielles des cosmétiques (crèmes, lait, masques, produits capillaires, lotions sans alcool produits de massage). Traitements Dans les - raffermissements des seins - diminution et atténuation des rides et ridules - rougeurs diffuses - irritations - dartes - acné juvénile - couperose - peau rugueuse - équilibre de la peau, revitalisation - peau terne - présence de squames - réhydratation de la peau - sécheresse de la peau après maladie ou accouchement. - rétablissement des affaiblissements du tonus des couches supérieurs de l'épiderme. - stabilisation de la production de sébum - protection interne du film lipidique - cheveux secs, gras, cassants, - perte des cheveux - intolérance aux produits cosmétiques - équilibration de la peau avec diminution de la ou des carences de la peau d'ou amélioration de son tonus chez les personnes agées, d'ou une certaine forme de rajeunis sement de la couche épidermique. Dermatologie En dermatologie le produit peut-être introduit dans des produits de traitements. Par sa composition il apportera les éléments indispensables au traitement recherché, il aura un effet protecteur et renforçateur sur les éléments présents. I1 peut être aussi appliqué seul au départ du traitement, il apportera un renforcement de l'équilibre ou un rétablissement de celui-ci causé par la maladie, une meilleure résistance à la sensibilisation, l'éviction du besoin de la réhydratation, du rétablissement des affaiblissement du tonus des couches (couche basale - derme - hypoderme), de l'irritabilité avec démangeaisons par sa composition protéolytique et enzymatique dont une de ses actions est de renforcer les défenses de l'organisme dans notre cas la peau, contre l'agression extérieur microbienne. Mode d'emploi - A incorporer au mélange pour des produits industriels à raison de 2 %. - Seul sous forme liquide pour les traitements, plusieurs applications sont nécessaires pour un traitement dont l'effet pourra être cons tater après 15 jours, à raison d'une application par jour. Les ap plications doivent être faites le soir. Dermatologie A incorporer au mélange pour des produits industriels à raison de 5X Dans certaines productions ne pas incorporer le produit à une température supérieure à 40 C. Le produit peut-être - lyophilisé - congelé à - 180 C Milieux de culture utilisés pour la fabrication - Gélose nutritive (achat : institut Pasteur - Sérieux ou autre So ciété). cette gélose peut-être achetée déshydratée, la couler en boite de pétri selon les techniques habituelles (il est possible d'acheter des boites coulées, donc prêtes à l'emploi). - Célose tryptone - caséine - soja - idem pour les fournisseurs même technique; même forme. Milieu synthétique N'1 : L - Leucine.......................... Leucine 0,1371 grs DL - Isoleucine 0,0762 grs Acide DL - Glutamique 0,2285 grs L - Arginine HCL - ..... 0,0457 grs DL - phénylalanine 0,06855 grs L - tyrosine 0,0762 grs L - tryptopphane 0,0229 grs L - histidine H cl................... cl 0,0567 grs L - Cystéine H cl................... cl 0,1189 grs Glutathion 0,0595 grs Adenine 0,0095 grs Guanine 0,00095 grs Uracile 0,00095 grs Pyridoxine H cl...................... cI 0,008 grs Thiamine 0,008 grs Ca pantothénate 0,008 grs Glutamine 0,300 grs Putrescine 0,00298 grs Hématine 0,0238 grs Lysine 0,0002 grs Agar 10 grs Pour 1 litre d'eau déminéralisée. Milieu synthétique N 2 : na olcate............................ olcate 0,0048 grs fe so4 7 H 20........................ 20 0,00114 grs mg so 4 7 H 20....................... 20 0,180 grs na H CO2............................. C02 0,225 grs na acétate........................... acétate 0,0419 grszn so4 7 H 20........................ 20 0,0342 grs K H2 PO 4.............................. 4 0,940 grs K 2 HPO 4.............................. 4 3,300 grs na cl.................................. cI 8,000 grs glucose 3,810 grs Pour 1 litre d'eau distillée. Milieu de gélose à l'ADN Milieu de l'institut Pasteur fourni en gélose prête à l'emploi ou gélose déshydratée. Milieu d'enrichissement polyvitaminique (en grs par litre) eau déminéralisée. Chlorhydrate de cystéine 25,9 grs L - cystine............................. cystine 1,10 grs Chlorhydrate de guanine 0,03 grs Chlorydrate de thiamine 0,003 grs NAD 0,25 grs Nitrate ferrique 0,02 grs Acide-para-amino-benzolque 0,013 grs Adénine 1,00 gr L - Glutamine 10,00 grs Vitamine B 12........................... 12 0,010 grs Saccharose 4,00 grs Milieu d'enrichissement. Enzyme protéolytique (papaine)(institut Pasteur fourni cette enzyme en ampoule de 1 ml). Milieu peptone papainique de soja (fournisseur Institut Pasteur) 5 grs par litre - milieu très soluble et limpide Milieu de culture au soufre 500 mgr (soufre) eau ultra pure 1 000 ml. Organes frais réduits en petits éléments par technique de microbroyage, ou produits opothérapiques en poudre, selon production envisagée (fournisseur BIOCAR, ou autres Sociétés fournisseurs). Technique de fabrication. Ensemencer séparément chaque souche dans la gélose nutritive par stries en un certain nombre de boites de pétri que l'on ne peut définir ici. Les boites de pétri n'ayant pas été achetées précoulées, donc coulées pour la fabrication devront subir un contrôle en incubant 9 37 pendant 48 heures les boites à l'étuve. Auparavant les boites et la gélose auront été stérilisées à l'autoclave à 120'C pendant 20 minutes. Faire la solution de gélose selon la technique marquée sur la boite de gélose déshydratée. Incuber chaque boite de pétri à l'étuve en regard de la T exigée pour chaque souche pendant 5 jours et plus s'il y a lieu. Prélever les colonies développées et les ensemencer sur tryptone caséîne soja, même condition que ci-dessus pour le milieu de culture si celuici n'est pas acheté pré-coulé. Le nombre de boites de pétri à ensemencer est à déterminer en rapport du développement important des colonies sur la gélose. Incuber pendant 5 jours et plus s'il y a lieu, chaque souche séparé en regard des T exigées pour chaque souche. Micromonospora T 35 C Achromobacter T 30 'C Réaliser la préparation du milieu synthétique N'1 et N 2. Mettre en solution le milieu d'enrichissement polyvitaminique avec 1 litre d'eau déminéralisée. Mettre en solution le milieu d'enrichissement d'enzyme protéolytique. Mettre en solution le milieu de culture au soufre. Mettre en solution le milieu papainique de soja, introduire dans la solution polyvitaminique et le milieu au soufre, puis ajouter le milieu synthétique N 2. Agiter vigoureusement jusqu a complète dissolution le récipient contenant cette solution doit être opaque. Prélever les bactéries développées sur la tryptone-caseîne-soja et les ensemencer sur un nouveau milieu de tryptone-caseîne-soja, dans lequel on a introduit auparavant lorsque le produit après l'autoclavage de la tryptone caséine-soja seule est à une température de 45 C l'organe réduit en éléments ou le produit opothérapique qui est choisi pour l'application du produit, soit 5 grs répartis dans toutes les boites, le nombre de boites est en regard de la production des colonies. L'incubation en rapport des T exigées pour chaque souche et celleci pendant 10 jours. Ajouter dans cette préparation le milieu synthétique N'1 après l'apport de l'organe ou produit opothérapique. Prendre la solution papanique de soja dans laquelle à été solubiliser le complexe polyvitaminique lui-même solubilisée dans 1 litre d'eau déminéralisée. Ajouter à cette solution l'organe réduit en poudre ou le produit opothérapique qui a été choisi précédemment soit 100 grs. Laisser en contact, faire des agitations vigoureuses successives plusieurs fois par jour, soit 1 agitation toutes les 2 heures et ceci pendant 5 Jours. Le récipient contenant cette solution totale doit être opaque. Ensemencer cette dernière solution avec toutes les colonies prélevées dans la dernière culture à la tryptone-caséine-soja. Agiter pendant 1 journée par agitation toutes les 2 heures soit 4 agitations pour que le mélange soit bien homogène. Ajouter l'enzyme protéolytique à cette dernière préparation soit 2 ampoules de 1 ml, agiter le tout pendant 5 minutes vigoureusement. Laisser cette préparation en contact pendant plusieurs jours dans un local stérile sous flux laminaire, ou dans l'enceinte d'un flux laminaire en marche, ou encore dans une hotte stérile, dès I'émanatlon d'odeurs, filtrer selon technique matériel sartorius pour filtration microbiologique. Le filtrat recueilli subit l'utilisation des ultra-sons, appareil réglé à la fréquence d'éclatement des membranes cytoplasmiques des bactéries, et obtenir ainsi le complexe protéolytique, enzymatique provenant du contenu intra-cellulaire des bactéries. Le produit est ensuite désodorisé par une huile essentielle déterpénée soluble dans le produit. Cette huile essentielle est adaptée aux destinées du produit fabriqué. Pour obtenir la solubilisation de l'huile essentielle, dans le produit, elle est solubiliser dans de l'huile de noisette vierge. REVENDICATIONS 1) Complexe biologique, protéolytique, enzymatique, de souche pure, caractérisé par l'apport d'un tissu, ou organe végétal ou animal, ou d'une poudre opothérapiques. 2) Complexe biologique, protéolytique, enzymatique caractérisé par substrats ou milieux de culture spécifiques pour la croissance des bactéries de l'association. 3) Complexe biologique, protéolytique, enzymatique, caractérisé par une technique ultra sonique d'éclatement de la paroi et de la membrane cellulairepermettant ainsi de receuillir le contenu intracellulaire dans un solvant de grande pureté. Le solvant est de l'eau ultra-pure, obtenue par un matériel de laboratoire fabriqué à cet effet. L'eau de base utilisée est de l'eau de Volvic, sélectionnée par ses qualités propres. 4) Complexes biologiques, protéolytique, enzymatique caractérisé par sa fabrication en présence d'une hotte à flux laminaire dans un local ou l'air doit être stérile, puis climatisé par régulateur pour maintenir la température nécessaire exigée par les bactéries de l'association. 5) Complexe biologique, protéolytique, enzymatique se caractérise par l'association des deux bactéries qui font l'objet de deux cultures de souche séparé, pour des raisons de température. 6) Complexe biologique, protéolytique, enzymatique caractérisé par ses nombreuses applications dans les domaines cosmétiques, dermatologiques. - diminution et atténuation des rides et des fines ridules - raffermissement des seins - équilibre de la peau, revitalisation - acné juvénile - couperose - irritation - dartres - présence de squames - réhydratation de la peau, manque de souplesse, manque d'élasticité. - stabilisation de la production de sébum - protection externe du film lipidique - traitement des cheveux secs, cassants, perte de cheveux - en dermatologie en tant que matière première de base au départ de traitement prescrit par le dermatologue. 7) Complexe biologique naturel, protéolytique, enzymatique caractérisé en ce que dans sa fabrication rentre un micro-broyat (organe frais) qui est du derme de sanglier. 8) Complexe biologique naturel, protéolytique, enzymatique, caractérisé par sa non toxicité, pas de risque d'allergie, ni de réactions secon daires. 9) Ce produit n'est pas un médicament, mais un produit parapharmaceutique, effet vecteur par bactéries ensemencées sur organe frais dont les constituants sont identiques à ceux du tissu à traiter.