Brevet FR2587722A1 — publié le 19870327

La présente invention concerne un procédé d'identification ou de diagnostic des maladies fongiques des plantes ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. On sait que les céréales sont affectées par certaines maladies dites maladies du pied, à savoir: - le piétin verse dû au Pseudocercosporella herpotrichoCdes - le rhizoctone dû au Rhizoctonia cerealis - les fusarioses dues aux Fusarium nivale, Fusarium roseum. Ces maladies, qui constituent ce qu'on appelle habituellement le complexe parasitaire du pied des céréales, posent souvent des problèmes de détermination par simple observation des symptômes, car ceux-ci se ressemblent beaucoup, sont souvent atypiques, variables selon les souches pathogènes. De plus ces maladies sont souvent associées sur les plantes. La détermination de la cause des nécroses sur céréales est nécessaire à plusieurs niveaux: - au niveau de la recherche des molécules actives contre ces maladies - pour le choix des implantations d'essais, c'est à dire de parcelles infectées par tel ou tel agent pathogène, - pour l'interprétation de l'efficacité des traitements appliqués sur les plantes. - au niveau de l'agriculteur, pour le bon choix des produits de traitements. Il existe donc un besoin de pouvoir disposer d'un test pratique de détermination des maladies du pied des céréales. Ce test doit être le plus simple et rapide possible afin d'être utilisable en station d'expérimentation ou en plein champ avec un matériel commode et fiable. La demanderesse a maintenant découvert que l'identification des maladies de ce complexe parasitaire peut être faite de manière sûre et commode à l'aide d'un dispositif comprenant une batterie de tests in vitro sur des milieux nutritifs sélectifs, chacun permettant le développement spécifique de chacun des champignons, à savoir: - un milieu *sélectif de Pseudocercosporella herpotrichoidesM c'est à dire inhibant ou freinant la croissance des Fusarium sp et Rhizoctonia sp et éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, sans gêner celle de Pseudocercosporella herpotrichoUdes (milieu appelé par la suite 'milieu piétin verse'). - un milieu 'sélectif du "Rhizoctonia sp' (notamment de URhizoctonia cerealis' c'est à dire inhibant ou freinant la croissance mycélienne des Fusarium sp, de Pseudocercosporella herpotrichoCdes, et éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, sans gêner celle de Rhizoctonia sp (milieu appelé par la suite milieu Rhizoctone"). - un milieu "sélectif des Fusarium" c'est à dire inhibant ou freinant la croissance de Rhizoctonia sp et de Pseudocercosporella herpotrichoCdes et, éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, et ne gênant pas la croissance des Fusarium sp notamment F. nivale et F. roseum (milieu appelé par la suite milieu Fusariose>). Ces milieux comprennent un milieu nutritif approprié à chacun des champignons, de préférence commun, et contenant des mélanges fongicides particuliers à savoir: a) Pour le milieu "piétin-verse", - soit de 160 à 240 ppm de O,O-diéthyl phthalimidophosphonothioate ou ditalimphos et de 4 à 6 ppm d'isopropylcarbamoyl-l-(dichloro-3,5 phényl)-3 hydantoine, ou d'une dose équivalente d'un (dichloro-3,5 phényl)-3 dicarboximide 1,2 A de formule Ci C] O' o c -, N R L A - soit le radical: -0 -C-R1 CH3 dans lequel R1 est le radical méthoxyméthyle (auquel cas le produit est communément appelé myclozoline) ou éthoxycarbonyle (auquel cas le produit est communément appelé chlozolinate) ou vinyle (auquel cas le produit est communément appelé vinchlozoline), - soit le radical: /R2 -C-R3 -C-R R5 dans lequel: - ou bien R2 et R5 sont au méthyle et R3 R4 forment ensemble une chaine méthylène (auquel cas le produit est communément appelé procymidone), - ou bien R2, R4 et R5 sont chacun un atome d'hydrogène, R3 est le radical vinyle ou métoxyméthyle (auquel cas les produits sont communément appelés respectivement dimétaclon et métoméclan), le composé A pouvant être remplacé par 24 à 36 ppm de dichloro-2,6 -paratolyl, O,O diméthylphosphorothionate ou tolclophos-méthyle. - soit de 24 à 36 ppm de tolclophos-méthyle et de 24 à 36 ppm de pentachloronitro-benzène (ou PCNB). b) Pour le milieu nrhizoctone": 0,4 à 0,6 ppm de benzimidazole-2 carbamate de méthyle (ou carbendazim) ou une dose équivalente d'un de ses précurseurs, comme le (butylcarbamoyl-l benzimidazolyl-2) carbamate de méthyle (ou bénomyl), le O-phénylène-4,4' bis (thiallophanate de méthyle) ou d'éthyle (ou respectivement thiophanate méthyle et éthyle) et le (furyl-2) benzimidazole (ou fubéridazole), le carbendazime ou ses précurseurs étant associés à 0,4-2 ppm de l[N-propyl-N-2-(2,4,6-trichlorophénoxy) éthylcarbamoyl] imidazole ou prochloraz. c) Pour le milieu "fusariose": de 1,6 à 2,4 ppm de 1-[2-(2,4 dichlorophényl)n-pentyl]-l-H-1,2,4 triazole (ou penconazol) ou 4 à 6 ppm d'alcool (RS) -2,4 difluoro (1 H, 1,2,4-triazol-l-ylméthyl) benzhydrylique (ou flutriafol) et de 4 à 6 ppm d'iprodione ou d'une dose équivalente d'un (dichloro-3,5 phényl)-3 dicarboximide 1,2 de formule A ci-dessus, ou encore une association de 16 à 24 ppm de polyoxin et 56 à 84 ppm de tétrachloro isophthalonitrile ou chlorothalonil. Selon une variante de l'invention le milieu piétin verse" peut également contenir 8 à 12 ppm de carbendazim ou l'un de ses précurseurs indiqués cidessus afin de détecter des souches.,résistantes à ce type de fongicides. Comme milieu nutritif, on peut utiliser tout milieu gelosé approprié de culture des champignons concernés par exemple mélange Sabouraud ou P.D.A (potato dextrose agar). L'invention porte également sur un dispositif utilisable pour mettre en oeuvre le procédé d'identification selon l'invention. Le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend at. moins 3 zones (appelées ci-après zones sélectives) contenant respectivement un des trois milieux sélectifs du piétin-verse, du rhizoctone et des fusarium, et éventuellement au moins une autre zone dite témoin dépourvue de fongicide (mais pouvant contenir un antibiotique) ainsi que, éventuellement, une zone contenant un milieu sélectif du piétin-verse additionné de 5 à 50 ppm de carbendazime ou d'un de ses précurseurs. Selon une variante de ce dispositif les diverses zones sont simplement juxtaposées (milieux nutritifs sélectifs en contact les uns avec les autres) ou bien dissociées en compartiments distincts comprenant chacun l'un des dits milieux nutritifs sélectifs. Il peut donc s'agir d'une batterie de récipients contenant les milieux réactifs (nutritifs sélectifs) sous forme d'un ensemble facilement manipulable ou transportable. I1 peut s'agir d'un récipient en une matière inerte, par exemple en verre ou en matière plastique, comprenant un fond et des parois définissant au moins quatre compartiments. Chacune des zones sélectives du dispositif selon l'invention contient habituellement un mélange de milieu nutritif avec chacun des milieux décrits ci-dessus. Ces milieux de culture sont obtenus d'abord en mélangeant soigneusement les milieux nutritifs pouvant également contenir des antibiotiques tels que streptomycine, pénicilline, auréomycine, pimaricine etc... avec des solutions par exemple dans l'acétone ou des dispersions aqueuses des matières actives fongicides ci-dessus. Le remplissage de chaque compartiment se fait manuellement ou automatiquement par injection (par exemple sous pression et à chaud, ce qui permet une bonne homogénéité du mélange. Celle-ci est d'ailleurs vérifiée à l'aide d'une solution colorée). Selon une variante de l'invention le milieu nutritif sélectif imprègne un support poreux, tel qu'un buvard. Cet arrangement peut d'ailleurs être obtenu ou bien par coulée d'un milieu nutritif sélectif sur le support poreux, ou bien par réhydratation d'un support poreux imprégné puis déshydraté. Le dispositif décrit ci-avant est généralement muni d'un couvercle (ou tout autre moyen d'isolement de l'extérieur): il peut être constitué d'une boite de Pétri compartimentée, est alors prêt à l'emploi. Cet emploi, qui constitue le procédé d'identification ou de diagnostic selon l'invention, consiste à prélever un tronçon de la tige de céréale malade, qu'on lave à l'eau puis trempe dans un désinfectant de surface, tel que eau de Javel, permanganate de potassium, éthanol ou analogue. On rince puis coupe la tige en trois partie, chacune d'elle étant placée ensuite dans chacun des compartiments. On couvre avec le couvercle et laisse incuber pendant 10 jours à température ambiante à la lumière naturelle ou artificielle. Au bout de dix jours, on observe le développement des champignons recherchés par évaluation oculaire de la croissance mycélienne dans chaque compartiment exprimée en pourcentage par rapport à la croissance du témoin. Ce pourcentage est éventuellement transformé en notation à l'aide d'une grille de lecture qui peut faire partie du dispositif selon l'invention. Lorsqu'on utilise un dispositif selon l'invention comprenant plusieurs zones sélectives ayant un point commun, le dispositif selon l'invention permet le dépot d'un fragment végétal unique sur ce point commun, et l'on se borne alors à observer le développement (ou l'absence de développement) sur au moins l'une des zones sélectives en contact avec le fragment végétal déposé. -7 Selon encore une variante de l'invention, les milieux nutritifs sélectifs sont obtenus peu avant emploi par mise en contact d'un milieu nutritif simple (c'est à dire non sélectif, ou dépourvu de fongicide) avec un support poreux (buvard ou autre) imprégné de fongicides d'identification (et éventuellement d'eau). Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention à l'aide d'un dispositif adapté. 10..... = . Exemple 1: On utilise une batterie de boites de Pétri. contenant chaucune un milieu nutritif P.D.A. contenant un mélange antibiotique de 100 ppm de streptomycine, 50 ppm de pénicilline et 50 ppm d'auréomycine, et respectivement a) pour la boite contenant le milieu "piétin verse", un mélange de 200 ppm de ditalimphos et 5 ppm d'iprodione; b) pour la boite contenant le milieu Urhizoctone", un mélange de 0,5 ppm de carbendazim et 0,5 ppm de prochloraz; c) pour la boite contenant le milieu "fusariose" 2 ppm de penconazol et de 5 ppm d'iprodione. -?" Ces trbis boites sont soit utilisées en laboratoire ou contenues 'ans un récipient plus large pouvant être commodément emmené en plein air. On prélève 3 tronçons de tige de blé, variété NEBRASKA portant des traces non différentiées de maladie du pied des céréales, de 0,3 à 0,5 cm chacun, que l'on rince à l'eau puis lave avec une solution d'hypochlorite de sodium à 2 % de chlore actif pendant deux minutes, puis on lave à l'eau et sèche sur papier filtre.. . -, On dépose ensuite un tronçon dans chacune des trois boites et on laisse incuber pendant 10 jours à température ordinaire, à la lumière naturelle. On note alors l'aspect des thalles et leur rayon. 2S87722 L'évaluation du développement mycénlien dans chaque boite est effectuée à l'oeil nu et les déterminations effectuées sont vérifiées au miscroscope. Les opérations sont effectuées en Juin et Juillet sur trois séries de tiges de blé variété Nébraska - Lutin - Corin, prélevée chacune en fonction d'une première évaluation empirique supposant la présence d'une des 3 maladies du pied plutot que les deux autres. Dans ces conditions on obtient la répartition des diagnostics effectués par maladies observées en pourcentage d'inhibition: Il I Complexe de IDivers, Bactéries I Il Maladie seule I 2 maladies I levure, pas I Il P | R I F IP + F I R + PFI d'action I Il I I I I I l P 1180% 8% 8% II 8 % I 8 %I I 4 % I I. I I I Il I I I. I I R II 190 %1 4 % I% 2 % I 1 % Il lI i I l Il I II I II Il I 190 % I 8% I I 2% I Il l I I I l P = Piétin verse; R = Rhizoctone; F = Fusariose Exemple 2: On obtient des résultats très satisfaisants en opérant comme à l'exemple 1, en remplaçant dans le milieu "piétin verse" l'iprodione par 30 ppm de tolclophos méthyle. Exemple 3: On opère comme à l'exemple 1 en additionnant au milieu piétin verse tel que défini 10 ppm de carbendazim. De plus, en appliquant des souches de Pseudocercosporella herpotrichoCdes de laboratoire résistantes au carbendazim, on observe que ce champignon se développe bien sur le milieu piétin verse selon l'invention. Exemple 4: On opère comme à l'exemple 1 en utilisant comme matières actives fongicides 20 ppm de polyoxin et 70 ppm de chlorothalonil. Ces exemples montrent clairement la simplicité et la commodité du procédé selon l'invention qui peut être facilement mis en oeuvre, par une personne meme peu expérimentée. Ce procédé peut s'appliquer à l'identification des maladies ci-dessus pour toutes plantes concernées en particulier les céréales blé triticale, avoine, orge, seigle. Cette technique est particulièrement efficace pour des déterminations précoces à un stade o l'identification distinctive de chacune des maladies du complexe parasitaire des maladies du pied des céréales est très difficile voire impossible par l'agriculteur moyen. REVENDICATIONS 1) Procédé d'identification de chacune des maladies du complexe parasitaire des maladies du pied des céréales, caractérisé en ce qu'on met en contact des parties de tiges malades de céréales respectivement en contact avec chacun des trois milieux de culture in vitro spécifiques de chacune des maladies à savoir: a) un milieu *Piétin verse", sélectif de Pseudocercosporella herpotrichoCdes", c'est à dire inhibant ou freinant la croissances des Fusarium sp et Rhizoctonia sp et éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, sans gêner celle de Pseudocercosporella herpotrichoCdes. - b) un milieu "Rhizoctone", sélectif du Rhizoctonia sp notamment de Rhizoctonia cerealis, c'est à dire inhibant ou freinant la croissance mycélienne des Fusarium sp et de Pseudocercosporella herpotrichoides et éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, sans gêner celle de Rhizoctonia sp, - c) un milieu "Fusariose", sélectif des Fusarium, c'est à dire inhibant ou freinant la croissance de Rhizoctonia sp et de Pseudocercosporella herpotrichoCdes et éventuellement d'autres champignons pathogènes ou non, et ne gênant pas la croissance des Fusarium sp notamment F. nivale et F. roseum. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le "milieu piétin verse" contient - soit de 160 à 240 ppm de ditalimphos et de 4 à 6 ppm d'iprodione, ou d'une dose équivalente d'un (dichloro 3,5 phényl)-3 dicarboximide 1,2 A de formule Q o, /N/ R C1 J ci O A - soit le radical: -o I -C-R CH3 dans lequel R1 est le radical méthoxyméthyle ou éthoxycarbonyle ou vinyle, - soit le radical: R2 -C-R3 I -C-R R5 dans lequel: - ou bien R2 et R5 sont un méthyle et R3 R4 forment ensemble une chaine méthylène, - ou bien R2, R4 et R5 sont chacun un atome d'hydrogène, R3 est le radical vinyle ou métoxym6thyle, l'iprodione ou le composé A pouvant être remplacé par 24 à 36 ppm de dichloro-2,6 -paratolyl, 0,0 diméthylphosphorothionate. - soit de 24 à 36 ppm de tolclophos méthyle et de 24 à 36 ppm de pentachloronitro benzene. 3) Procédé selon l'une des revendications i et 2, caractéris6 en ce que le milieu Rhizoctone" contient de 0,4 à 0,6 ppm de carbendazim ou une dose équivalente d'un précurseur de carbendazim ainsi que 0,4 à 0,6 ppm de prochloraz. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le "milieu Fusariose contient de 1,6 à 2,4 ppm de penconazol ou 4 à 6 ppm de flutriafol et de 0,4 à 0,6 ppm d'iprodione ou une dose équivalente de composé A ou contient de 16 à 24 ppm de polyoxyne et 56 à 84 ppm de chlorothalonil. ) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu Piétin verset contient en outre de 8 à 12 ppm de carbendazim ou une dose équivalente d'un précurseur de carbendazim. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que les milieus de culture contiennent un milieu nutritif approprié pouvant contenir des antibiotiques. 7) Dispositif pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 3 zones (appelées ci-après zones sélectives) contenant respectivement un des trois milieux sélectifs du piétin-verse, du rhizoctone et des fusarium, et éventuellement au moins une autre zone dite témoin dépourvue de fongicide (mais pouvant contenir un antibiotique) ainsi que, éventuellement, une zone contenant un milieu sélectif du piétin-verse additionné de 5 à 50 ppm de carbendazime défini ou d'un de ses précurseurs. 8) Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que I desiverses zones --sont juxtaposées (milieu nutritifs sélectifs en contact les uns avec les autres). 9) Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que les diverses zones sont dissociées en compartiments distincts comprenant chacun un des milieux nutritifs sélectifs. ) Dispositif selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comdprend une batterie de récipients contenant les milieux réactifs sous forme d'un ensemble facilement transportable et manipulable.