Brevet FR2587707A1 — publié le 19870327

GLYCOPEPTIDE ET TOUTE COMPOSITION LE CONTENANT LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS ANTICOAGULANTES L'invention est relative à des molécules glyco- peptidiques présentant des propriétés biologiques leur permettant notamment de jouer un rôle régulateur vis-à- vis de la coagulation sanguine. L'invention vise également toute composition contenant ces molécules glycopeptidiques, ainsi que toute composition contenant ces molécules glycopeptidi- ques et possédant des propriété biologiques leur permet- tant de jouer un rôle vis-à-vis de la coagulation san- guine. De telles molécules glycopeptidiques peuvent être obtenues notamment à partir des myxobactéries qui produisent un mucus qui absorbe le rouge congo. On sait que l'héparine est sans doute à ce jour l'un des médicaments le plus largement utilisé dans l'application anticoagulante. Elle est en effet capable d'intervenir à plusieurs niveaux dans les cascades de réactions enzymatiques successives, qui sont normalement mises en jeu au cours de l'hémostase physiologique, dans toute situation susceptible d'entraîner une hypercoagu- labilité du sang. Elle est plus particulièrement capable de déprimer simultanément un grand nombre des facteurs de la coagulation intervenant dans la création et le maintien des différentes formes d'hypercoagulabilité. C'est évidemment pour pallier les effets d'hy- percoagulabilité que l'on a couramment recours aux puissantes propriétés anticoagulantes de l'héparine, en vue de ramener le mécanisme coagulationfibrinolyse à l'équilibre, chaque fois que celui-ci subit une pertur- bation importante, par exemple à l'occasion d'une in- tervention chirurgicale sur l'hôte. Il est cependant bien connu que ces tentatives de rééquilibrage sont extrêmement délicates et que, en conséquence, l'adminis- tration de doses trop élevées de médicament anticoagu- lant -ou l'insuffisante sélectivité de celui-ci- dans le but de prévenir les risques d'hypercoagulation, par exemple l'apparition de thromboses post-chirurgicales, peut finalement être à l'origine d'hémorragies graves: d'o la nécessité d'une surveillance constante des pa- tients traités et des ajustements nécessaires des doses administrées -en continu ou en discontinu- en fonction des résultats de tests, notamment de coagulabilité glo- bale, comme le temps de Howel, qui doivent être prati- qués à intervalles réguliers. On rappellera ci-après, dans les limites de ce qui est nécessaire pour la clarté de l'exposé, quelques unes des notions de base, et volontairement simplifiées, relatives à la coagulation. Le processus de coagulation comprend en effet trois phases généralement décrites comme successives, même si elles sont étroitement intri- quées: - la thromboplastinoformation, phase de forma- tion de prothrombinase (ou thromboplastine active); - la thrombinoformation, phase qui peut se résu- mer a Iatransformation de --la prothrombine en thrombine sous l'influence de la prothrombinase en présence de calcium ionisé et enfin - la fibrinoformation, phase au cours de laquel- le le fibrinogène sanguin est, sous l'effet de la throm- bine, transformé en fibrine, protéine qui tend à devenir insoluble. La formation de prothrombinase se fait, au cours de l'étape de thromboplastinoformation, essentiellement selon deux voies différentes: la voie intrinsèque ou endogène, et la voie extrinsèque ou exogène, lesquelles aboutissent à la formation de prothrombinases d'origines respectivement plasmatique et tissulaire, toutes deux susceptibles d'activer la prothrombine en thrombine ac- tive. La voie (ou système) intrinsèque ou endogène fait intervenir un grand nombre de facteurs ou proenzy- mes plasmatiques susceptibles d'être successivement ac- tivés (facteurs XII, XI, IX, VIII et X), o chaque pro- duit activé (facteurs XIIa, XIa, IXa, VIIIa et Xa) agit comme une enzyme capable d'activer la proenzyme suivan- te, le facteur X activé (Xa) intervenant alors, notam- ment par réaction avec le facteur V et un phospholipide d'origine plaquettaire, dans la production de prothrom- binase plasmatique endogène active. Le système extrinsè- que ou exogène, qui peut notamment se trouver sous la dépendance directe d'une lésion tissulaire, fait appel à un nombre plus limité de facteurs et comporte notamment la production de thromboplastine tissulaire qui, en com- binaison avec le facteur VII, peut, tout comme le fac- teur VIIIa, transformer le facteur X inactif en facteur Xa. La séquence d'activation de la prothrombine en thrombine est ensuite sensiblement la même que pour le système intrinsèque, mais le phospholipide est ici d'o- rigine tissulaire et non plasmatique. On peut donc, à la limite, exprimer l'idée que les deux voies, intrinsèque et extrinsèque, se rejoi- gnent au niveau de l'activation du facteur X (aussi ap- pelé facteur Stuart), les deux phases suivantes de la coagulation thrombinoformation et fibrinoformation- ne donnant alors plus lieu à une distinction entre voies intrinsèque et extrinsèque. L'aboutissement du processus de coagulation consiste dans la formation d'un caillot de fibrine inso- luble, destiné notamment à colmater la lésion à l'origi- ne du déclenchement de ce processus, par exemple au ni- veau d'un vaisseau sanguin. Ces processus de coagulation font normalement place ensuite à un processus, dénommé fibrinolyse, des- tiné à produire la lyse du caillot, notamment sous l'effet de la plasmine, enzyme qui n'existe normalement dans le sang circulant que sous la forme d'un précurseur inactif, le plasminogène, la fibrine elle-même consti- tuant néanmoins l'un des facteurs susceptibles de dé- clencher la transformation du plasminogène inactif en plasmine fibrinolytiquement active. En fait, bien que l'on ait, dans ce qui précède, présenté les systèmes de coagulation et de fibrinolyse comme deux processus se produisant successivement dans le temps, il n'en est pas normalement toujours ainsi dans la réalité. En fait, il s'agit de mécanismes équi- librés, selon des processus extrêmement complexes, sous la dépendance de facteurs activateurs et inhibiteurs harmonieusement opposés. Le déséquilibrage de ces méca- nismes, dans le sens d'une hypercoagulabilité, est alors susceptible d'entraîner des thromboses. A l'opposé, un déséquilibre dans le sens d'une hypocoagulabilité, expo- se l'hôte à des risques hémorragiques. En ce qui concerne les myxobactéries qui peuvent être utilisées pour la préparation des glycopeptides selon l'invention ou de toute composition les contenant, on rappellera ci-après les éléments suivants. L'ordre des myxobactérales (myxobactéries) est très homogène. Des études sur l'ordre des myxobactéries ainsi que sur la toxonomie des myxobactéries ont été effectuées par REICHENBACH H. et DWORKIN M., The Order Myxobacterales in the prokaryotes, a handbook on habitats, isolation and identification of bacteria, 20, p. 328-355, D. Mc CURDY H., Canadian Journal of Microbiology, vol. 15, 1969, p. 1 453-1 461. L'ordre des myxobactéries est constitué de bac- téries à Gram négatif, unicellulaires, aérobies stric- tes, mobiles par glissement et capables de former des fructifications contenant des formes de résistance ou myxospores. Elles vivent au détriment de macromolécules en excrétant de nombreux enzymes lytiques, ainsi que des antibiotiques et un mucus. Leur ADN présente une grande homogénéité de composition (66 à 72 % G + C). Les critères taxonomiques permettant de diffé- rencier les deux sous-ordres, quatre familles et douze genres qui les composent sont la forme des bactéries, des fructifications et des myxospores, leur composition en acides gras et la nature de leur mucus. On distingue deux sous-ordres d'après ce dernier critère: les Cystobacterinae et les Sorangiacae. Les Cystobacterinae produisent un mucus qui absorbe le rouge Congo alors que le mucus produit par les Sorangiacae ne l'absorbe pas. La famille des Myxococcacae à laquelle appartient l'espèce très connue Myxococcus xanthus fait partie des Cystobacterinae (Studies on the taxonomy of the Myxobacterials I. Recàrd- fCana&an isolates ard- survey of methods, H. Mc CURDY). L'homogénéité des propriétés des mucus excretés par les différentes espèces de Cystobacterinae est aussi soulignée par les expériences de Burchard (BURCHARD R. P., 1982, Trails following by gliding bacteria, Journal of Bacteriology, p. 943-950) montrant que la trace mu- queuse laissée par une espèce peut être semblable à cel- le de bactéries d'autres espèces ou genres voisins, de ce sous-ordre. Compte tenu de l'homogénéité de la composition et des propriétés du mucus excrété par les espèces du sous-ordre des Cystobacterinae, les résultats concernant une souche appartenant au sous-ordre des Cystobacterinae peuvent être considérés, à ce jour, comme valables pour toutes les espèces du sous-ordre des Cystobacterinae (Myxococcus, Corallococcus, Angiococcus, Archangium, Cystobacter, Melihangium, Stigmatela) ainsi que pour certains mutants de l'une de ces souches sauvages. Les myxobactéries ont fait l'objet de nombreuses publications, notamment relativement à leur secrétion abondante qui contient des antibiotiques, des protéines et un mucus polysaccharidique (cf. J. W. SUTHERLAND and S. THOMSON, Journal of General Microbiology, 1975, 89, 124-132) comparisons of polysaccharides produced by Myxococcus strains). Mais, compte tenu de la complexité de cette se- crétion, on n'a encore à ce jour jamais isolé d'extraits de cette secrétion, même a fortiori mis en évidence de propriétés biologiques particulières. Or, la Société Demanderesse a trouvé de façon inattendue en étudiant les secrétions du milieu de cul- ture de myxobactéries dont le mucus absorbe le rouge Congo, des molécules glycopeptidiques possédant une activité biologique, notamment vis-à-vis de la coagula- tion sanguine. L'invention a pour but de fournir des principes actifs de médicaments (et les médicaments eux-mêmes) qui permettent de remédier au moins en partie aux difficul- tés énoncées à propos de l'héparine, notamment qui soient capables de permettre un rééquilibrage éventuel et/ou un contrôle plus aisé, au prix d'une moindre sur- veillance clinique du système coagulation-fibrinolyse chez des patients affectés d'une pathologie de la coa- gulation ou ayant subi un traitement, tel qu'une inter- vention chirurgicale, qui les exposent à des risques d'hypercoagulabilité. L'invention concerne plus particulièrement des glycopeptides, et toute composition les contenant, exer- çant un effet régulateur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, cependant par la mise en jeu d'actions inhibitrices différentes de celles de l'héparine, voire plus sélecti- ves que celles de l'héparine. L'invention a également pour objet de fournir des glycopeptides ou toute composition les contenant, présentant des propriétés anticoagulantes et d'innocuité vis-à-vis des cellules endothéliales. L'invention a donc pour objet de fournir un principe actif particulièrement intéressant vis-à-vis des propriétés anticoagulantes dont les propriétés sont stables et qui n'est pas toxique. L'invention a également pour objet de fournir des principes actifs anticoagulants qui peuvent être obtenus à l'aide de produits extrêmement courants et peu onéreux. L'invention a pour objet de fournir des glyco- peptides et toute composition les contenant présentant des propriétés anticoagulantes et qui peuvent être pro- duits en masse, de façon simple et rentable à l'échelle industrielle. L'invention a pour objet des glycopeptides ca- ractérisés par les propriétés suivantes: - leur poids moléculaire est compris d'environ 1 000 à environ 5 000 daltons; - les résidus sucres contenus sont des hexoses et des hexoses aminés, appartenant au groupe constitué par le mannose, le glucose, le galactose, la galactosa- mine, la glucosamine; - leur comportement en chromatographie HPLC n'est pas modifié par le sodium dodécylsulfate; - leur pH isoélectrique est d'environ 3,6; - ils sont anticoagulants sur sang total à par- tir d'une concentration d'environ 80 mg/ml; - ils entraînent un allongement du temps de céphaline-kaolin; - ils entraînent un allongement du temps de thrombine; - ils inactivent le facteur Xa. Plus particulièrement, les glycopeptides selon l'invention ont la composition suivante: - environ 70-80 % (en poids) de résidus d'acides aminés; - environ 30-20 % (en poids) de motifs sucres, lesquels motifs sucres sont constitués par environ 60 à environ 65 % (en poids) de sucres neutres et environ 35 à environ 40 % (en poids) d'osamine. La composition des motifs de sucres neutres est constituée par environ 30 à 35 % (en poids) de glucose, environ 15 à environ 20 % (en poids) de mannose, environ à environ 15 % (en poids) de galactose. La composition des osamines comprend d'environ à environ 25 % (en poids) de glucosamine et d'environ à environ 15 % (en poids) de galactosamine. _ 20-- Le s--glycopeptides selon l'invention peuvent pré- senter également les caractéristiques suivantes: - un titre anti-IIa est d'environ 8,5 UI/mg, - un titre anti-Xa est d'environ 180 UI/mg. Pour vérifier la composition des glycopeptides selon l'invention, on peut par exemple avoir recours aux méthodes suivantes. La composition en acides aminés peut être déter- minée par une méthode classique, telle que la méthode de LOWRY 0. H., ROSEBROUGH N. J., FARR A. L., RANDAL R. J. dans J. Biol. Chem., 193, 265-273, 1951. La composition en sucres de cette molécule peut être déterminée par une méthode classiquement utilisée dans laquelle on a recours à l'anthrone comme réactif, telle qu'elle est décrite notamment dans uDetermination of dextran with anthrone", Analyt. Chem., 25, p. 1 656- 1 681, SCOTT T. A. and MELVIN, 1953. Le réactif utilisé dans cette méthode, à savoir l'anthrone, est particulièrement sensible aux hexoses. Le pH isoélectrique peut être déterminé par électrofocalisation telle qu'elle est décrite dans Anders Winter, Krishna Ek and Ulla-Birgitta Anderson: Analytical Electrofocusing in thin layers of polyacry- lamide gels, LKB Application note 250, 1977. L'homogénéité peut également être déterminée par électrofocalisation selon la méthode dont la référence est mentionnée ci-dessus. En ce qui concerne le temps de thrombine (temps anti-IIa), qui est un type de mesure reflétant plutôt l'action des glycopeptides sur l'inhibition du facteur IIa, on se reportera aux ouvrages suivants: CAZENAVE, Introduction à l'étude de l'hémostase et de la thrombo- se, 1982; CAEN J., LARIEU N. J. et SAMAMA N., L'hémos- tase, méthodes d'exploration diagnostiques pratiques, 1980. En ce qui concerne le temps de céphaline-kaolin qui est un type de mesure reflétant plutôt l'action des glycopeptides sur l'inhibition du facteur IIa activé, on se reportera également aux ouvrages cités ci-dessus. En ce qui concerne le temps de Quick et le temps anti-Xa, on se reportera aux ouvrages cités ci-dessus. L'invention concerne également un procédé, pour obtenir de tels glycopeptides, ce procédé étant caracté- risé par: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles- ci; - l'élimination à partir du surnageant des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons; - l'élimination à partir du surnageant des substances insolubles dans l'eau; - et la récupération de la fraction du surna- geant débarrassée des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons et débarrassée des substances insolubles dans l'eau; - la purification de cette fraction par chro- matographie sur colonne de pseudo-affinité; - la purification subséquente de la susdite fraction par chromatographie sur colonne de gel de polymère réticulé de dextrane. La matière première à partir de laquelle les glycopeptides de l'invention peuvent être obtenus peut être constituée par le surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles-ci, les Cystobacterinae étant caractérisées par le fait qu'elles produisent un mucus qui absorbe le rouge Congo. Le milieu de culture de ces Cystobacterinae peut être constitué par un milieu solide ou liquide. On a de préférence recours à un milieu de cultu- re liquide. La souche de myxobactéries utilisée est avanta- geusement constituée par une souche de Mvxococcus xanthus. La souche utilisée est par exemple la Mvxococcus xanthus CM011, qui dérive de la souche I448, par l'in- sertion (n' 11) d'un transposon Tn5, selon la technique classique décrite dans "Introduction of transposon Tn5 into Myxococcus for analysis of developmental and other non selectable mutants", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 425-429. La souche I448 a fait l'objet d'un dépôt le 3 mai 1985, à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75015 PARIS (France). Cette insertion confère à la souche notamment la capacité de produire 50 % de plus de sucres dans le mi- lieu que la souche d'origine. A titre d'exemple, on peut également utiliser la souche DK1622, telle que décrite par D. KAISER dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5 952-5 956, 1979. Une telle souche peut être cultivée en milieu liquide, agité, constitué de Bactocasitone tamponnée commercialisée par la Société Difco. En ce qui concerne la séparation du surnageant, on prélève celui-ci de préférence au début de la phase stationnaire de croissance des myxobactéries, en d'au- tres termes, à la fin de la phase exponentielle de croissance. Les phases d'élimination des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons,.ainsi que la phase d'élimination des substances insolubles peuvent être inversées. Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, on élimine d'abord les substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons. Pour éliminer les substances de poids molécu- laires inférieurs à environ 1 000 daltons, on peut avoir recours à de l'alcool éthylique pur. L'addition d'alcool conduit à l'obtention d'un précipité qui contient les substances de poids molécu- laires supérieurs à environ 1 000 daltons, notamment les glycopeptides selon l'invention, tandis que les substan- ces de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons, passent dans l'alcool. La phase de traitement à l'alcool a également pour but de concentrer le surnageant débarrassé des substances de poids moléculaires inférieurs à 1 000 daltons. La phase de traitement à l'alcool peut être effectuée plusieurs fois, si l'on souhaite concentrer davantage. De façon avantageuse, on traite le surnageant deux fois à l'alcool, ce qui signifie qu'après avoir obtenu un premier précipité à l'alcool, on le resolubi- lise dans l'eau, la phase aqueuse obtenue étant retrai- tée par une nouvelle addition d'alcool. On peut ensuite laver le précipité obtenu ci- dessus à l'acétone, pour délipider partiellement, puis à l'éther, notamment pour sécher. Après le traitement à l'acétone et à l'éther, on laisse avantageusement sécher le précipité. La phase d'élimination des substances insolubles dans l'eau peut avoir lieu en suspendant le précipité séché dans de l'eau distillée, puis en effectuant une centrifugation. Par substances insolubles, on désigne dans ce qui précède et dans ce qui suit, les substances faible- ment solubles en milieu aqueux, et qui deviennent inso- lubles au cours de différentes étapes de procédé, en raison des phases de concentration. On peut ensuite laver les substances insolubles avec de l'eau distillée et recentrifuger. 2 5 Puis, on a avantageusement recours à un traite- ment de purification pour éliminer les traces d'alcool, d'acétone et d'éther éventuellement utilisés dans les étapes précédentes. Ce traitement de purification est avantageuse- ment constitué par une ultrafiltration. Cette étape de purification est avantageusement suivie d'une phase de concentration, par exemple sur membrane. Le produit obtenu à l'issue de cette étape de concentration peut être conservé après lyophilisation ou évaporation sous vide. La phase d'élimination des substances insolubles peut avoir lieu à un moment quelconque entre la sépara- tion du surnageant et la purification par chromatogra- phie de pseudoaffinité, et a lieu de préférence après le séchage qui suit le lavage à l'acétone et à l'éther. La phase d'élimination des substances insolubles peut également avoir lieu après l'obtention du lyophili- * sat, lequel est dissous dans l'eau, et centrifugé pour éliminer les substances insolubles. En ce qui concerne la chromatographie de pseudo- affinité, elle désigne une chromatographie dans laquelle n'intervient pas seulement l'affinité, mais aussi la charge, et l'hydrophobicité des éléments chromatogra- phiés (cf. L. AMOURACHE et T. A. VIJAYALAKSHMI, Affinity chromatography of kid chimosin on histidyl-sepharose, Journal of Chromatography, 303, 285-290, 1984). On effectue avantageusement cette chromatogra- phie de pseudo-affinité sur une colonne d'histidyl- (sépharose 4B). On utilise avantageusement du NaCl environ 0,1 M dans un tampon acétate à un pH d'environ ,5. Cette chromatographie donne plusieurs fractions. On recueille la fraction présentant des propriétés anticoa- gulantes, telles que mesurées selon le test de coagula- tion sur sang total décrit ci-après. On passe ensuite la fraction anticoagulante sur une colonne de gel de polymère réticulé de dextrane, tel que celui commercialisé sous le nom Sephadex G-25 par la Société Pharmacia Fine Chemicals. Cette chromatographie permet notamment de se débarrasser du NaCl utilisé dans la chromatographie de pseudo-affinité et donne également plusieurs pics parmi lesquels l'un correspond aux glycopeptides de l'inven- tion possédant des propriétés anticoagulantes. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'obtention des glycopeptides de l'invention comprend: - la séparation du surnageant provenant d'un mi- lieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles-ci, laquelle culture est au début de la phase stationnaire de crois- sance; - l'addition d'alcool au susdit surnageant, ce qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient les glycopeptides selon l'invention et qui est débarras- sé des substances de poids moléculaires inférieurs à en- viron 1 000 daltons; - le lavage du susdit précipité à l'acétone, puis à l'éther, puis le séchage du précipité; - la dissolution dans l'eau distillée du susdit précipité séché; - l'élimination des substances insolubles dans l'eau, notamment par centrifugation et l'obtention d'une solution contenant les glycopeptides de l'invention et débarrassée des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, et des substances inso- lubles dans l'eau; - la purification par ultrafiltration et la concentration de la solution obtenue ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d.'une fraction contenant les gly- copeptides; - la conservation de la susdite fraction par lyophilisation ou évaporation sous vide; - la purification par chromatographie sur co- lonne de pseudo-affinité de la susdite fraction; - la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel de polymère réticulé de dex- trane, notamment de gel commercialisé sous le nom Sephadex. Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, celui-ci comprend en plus des étapes ou phases décrites ci-dessus, une étape d'élimi- nation des protéines. Cette étape a lieu avant l'étape de purification par chromatographie, à un moment quel- conque entre la séparation du surnageant du milieu de culture des myxobactéries et la purification par chro- matographie sur colonne de pseudo-affinité. L'élimination des protéines peut avoir lieu par exemple en utilisant du phénol, mais peut également avoir lieu en utilisant une membrane qui permet d'éli- miner les substances de poids moléculaires supérieurs à 000 daltons. Si on utilise le phénol pour éliminer les pro- téines, il se produit un précipité qui contient les protéines à éliminer, tandis que les glycopeptides selon l'invention se trouvent dans la phase aqueuse obtenue. Le phénol utilisé est du phénol d'environ 40 à environ 70 % (poids/volume) et est de préférence du phé- nol à environ 50 % (poids/volume). Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles- ci; - l'élimination à partir du surnageant ainsi récupéré: des protéines, des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, des substances insolubles dans l'eau; pour donner l'extrait brut, - la purification par chromatographie sur co- lonne de pseudo-affinité de l'extrait brut; - la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel commercialisé sous le nom Sephadex. Un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, pour obtenir le glycopeptide selon l'in- vention, comprend les étapes suivantes: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries appar- tenant au groupe produisant un mucus colorable au rouge Congo, laquelle culture est au début de la phase sta- tionnaire de croissance; - l'addition au surnageant de phénol à 50 % (poids/volume), qui conduit à: l'obtention d'un précipité contenant les protéines; et à l'obtention d'une phase aqueuse conte- nant les glycopeptides selon l'invention; - la séparation des phases et la récupération de la phase aqueuse qui contient les glycopeptides selon l'invention; - l'addition d'alcool à la susdite phase aqueuse qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient les glycopeptides selon l'invention et qui est débarras- sé des protéines et des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons; - le lavage du susdit précipité à l'acétone, puis à l'éther, puis le séchage du précipité; - la dissolution dans l'eau distillée du susdit précipité séché; - l'élimination des substances insolubles dans l'eau, notamment par centrifugation et l'obtention d'une solution contenant les glycopeptides de l'invention et débarrassée des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, des protéines et des substances insolubles dans l'eau; - la purification par ultrafiltration et la concentration de la solution obtenue ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'un extrait brut contenant les glycopeptides; - la conservation du susdit extrait brut par lyophilisation ou évaporation sous vide; - la purification par chromatographie sur co- lonne de pseudo-affinité de l'extrait brut; - la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel commercialisé sous le nom Sephadex. De façon avantageuse, le traitement à l'alcool de la phase aqueuse contenant les glycopeptides selon l'invention peut être effectué successivement deux fois. De façon avantageuse, on peut laver avec de l'eau distillée les substances insolubles obtenues et procéder à une centrifugation. Exemple 1 L'exemple 1 ci-après est relatif à l'obtention d'un glycopeptide selon l'invention. La souche de myxobactéries utilisée est la souche Myxococcus xanthus CM011. Les cellules sont cultivées en milieu liquide (10 g/l de Bactocasitone commercialisé par Difco; 8 mM SO4Mg; Tris [(hydroxyméthyl)amino-méthane _ pH 7,6 mm; tampon phosphate pH 7,6 1 mM) à 30 C sous forte aération (agitation rotative à 300 rpm en erlen ou fer- menteur de 7 1). On prend la culture de myxobactéries en début de phase stationnaire de croissance et on centrifuge à 8 000 g pendant environ 5 minutes pour éliminer les bac- téries et récupérer le surnageant du milieu de culture. On ajoute au surnageant un volume de phénol à % (poids/volume) dans l'eau distillée. On agite énergiquement et on laisse agir à 60'C pendant 5 minutes. - On refroidit directement à O'C dans un mélange réfrigérant (glace + eau) et on laisse reposer pour séparer la phase aqueuse du précipité qui s'est formée suite à l'addition de phénol. On prélève la phase aqueuse qui contient le glycopeptide selon l'invention, on centrifuge à 1 500 g à O'C pendant 2 à 3 minutes et on récupère la phase aqueuse. On effectue un second traitement au phénol en ajoutant du phénol à 50 % à la phase aqueuse qui vient d'être obtenue. On traite ensuite la phase aqueuse avec 5 volu- mes d'alcool 95' à -20'C pendant une nuit, ce qui permet de précipiter le glycopeptide de l'invention et d'élimi- ner le phénol et de concentrer. On centrifuge à 3 000 g et à OC pendant 15 mi- nutes. On resuspend le précipité dans un petit volume d'eau distillée et on reprécipite avec 3 volumes d'al- cool 95 à -20'C (comme précédemment). On lave le précipité obtenu à l'acétone, ce qui permet notamment de délipider partiellement, d'éliminer le phénol restant éventuellement, puis à l'éther (à -20'C), ce qui permet d'éliminer le phénol restant éven- tuellement et on laisse sécher par exemple sur une pail- lasse à flux laminaire. On redissout le précipité dans l'eau distillée. On élimine les substances insolubles dans l'eau par centrifugation pendant 4-5 minutes à 160 g. On lave les substances insolubles avec de l'eau distillée et on centrifuge comme précédemment. On ultrafiltre pour éliminer notamment l'alcool, l'acétone et l'éther et on concentre par exemple en utilisant une membrane Amicon 1OOOD. On obtient ainsi ce que l'on a précédemment ap- pelé l'extrait brut qui contient le glycopeptide selon l'invention. La figure 1 représente la courbe 1 relative à la chromatographie de pseudoaffinité sur histidyl- (sépharose-4B) de l'extrait brut. On a représenté sur l'axe des abscisses, les vo- lumes d'élution en ml et sur l'axe des ordonnées, à droite, la concentration molaire en NaCl et sur l'axe des ordonnées à gauche, la densité optique mesurée à 280 nm. La colonne utilisée a pour dimensions 1 x 25 cm. L'échantillon est constitué par 25 mg d'extrait brut lyophilisé dans 1 ml de tampon. L'éluant est constitué par du tampon acétate 0,1 M. Le pH est de 5,5 et le gradient de NaCl est un gradient par palier de O à 0,75 M. Le débit est de 12 ml à l'heure. Cette séparation conduit à l'obtention de cinq fractions correspondant aux cinq pics respectivement dé- signés par I, II, III, IV et V sur la figure 1. Le pic II obtenu avec NaCl 0,1 M dans le tampon correspond à une fraction présentant des propriétés an- ticoagulantes et contient le glycopeptide selon l'inven- tion. La figure 2 représente la courbe 2 relative à la filtration sur gel commercialisé sous le nom Séphadex G-25 des différentes fractions obtenues par histidyl- sépharose. On a représenté sur l'axe des abscisses le volu- me d'élution en ml, sur l'axe des ordonnées, la densité optique mesurée à 280 nm. La colonne a une dimension de 1 x 22 cm. L'éluant est constitué par de l'eau distillée et le débit est de 16 ml/heure. Le glycopeptide selon l'invention correspond au pic représenté par II(2) sur la figure 2. La flèche (1) indique le début de chaque élu- tion. La pureté du glycopeptide selon l'invention est vérifiée par électrofocalisation (cf. Anders Winter, Krishna Ek, Ulla-Birgitta Anderson, Analytical Electro- focusing in thin layers of polyacrylamide gels, LKB Application Note 250, 1977). Le glycopeptide selon l'invention représente en- viron 2 % du susdit extrait brut. ExemDle 2 Cet exemple est relatif à l'obtention du glyco- peptide obtenu à partir de l'extrait brut mentionné ci-dessus. On a isolé le glycopeptide selon l'invention à partir de l'extrait brut obtenu notamment comme indiqué ci-dessus, à l'aide d'une colonne de silice connue sous la désignation (C8-RP300), en fonction de l'hydrophobi- cité. En présence ou absence de SDS (sodium dodécyl sulfate), il présente essentiellement deux pics conte- nant à la fois des résidus sucres et peptides. Le gly- copeptide selon l'invention est contenu dans la fraction correspondant au pic le plus hydrophile (65 % en masse), la fraction correspondant à l'autre pic contient un principe coagulant. Le sodium dodécyl sulfate élimine l'activité an- ticoagulante du premier pic, mais n'en modifie pas la migration. -Exemple 3 Cet exemple est relatif à l'obtention des gly- copeptides selon l'invention en ayant recours au procédé indiqué cidessus dans lequel on effectue uniquement la précipitation à l'alcool. Ce procédé ne diffère de celui déjà décrit à l'exemple 1 que par l'élimination de l'étape correspond- ant à la précipitation à l'aide du phénol. La séparation du glycopeptide est rendue possible par une chromatogra- phie de pseudo-affinité sur un gel d'histidyl-sépharose suivie par une filtration sur gel G-25 dans les condi- tions déjà décrites à l'exemple 1. L'homogénéité du pro- duit a été vérifiée par électrofocalisation et son pH isoélectrique déterminé (environ 3,6). On indique ci-après, en détail, les protocoles d'extraction et de purification. - On prend la culture de Mvxococcus xanthus CMO11 au début de la phase stationnaire de croissance. - On élimine les cellules par centrifugation à 8 000 g pendant 5 minutes et on récupère le surnageant. - On traite le surnageant avec 3 volumes d'al- cool à 95'C et on laisse pendant 2 heures ou une nuit à -20'C pour séparer le précipité formé de la phase aqueu- se. - On centrifuge la phase aqueuse à 8 000 g pen- dant 15 minutes et on élimine la phase aqueuse. - On resuspend le précipité dans de l'eau dis- tillée. - On reprécipite la phase aqueuse avec 3 volumes d'alcool à 95'C à -20'C pendant 2 heures. - On lave le précipité obtenu à l'acétone puis à l'éther. - On laisse sécher le précipité sur une paillas- se à flux laminaire à la température ambiante. - On suspend le précipité dans de l'eau distil- lée. - On élimine les substances insolubles dans l'eau par centrifugation pendant 4-5 minutes à 160 g. - On lave les substances insolubles avec de l'eau distillée et on centrifuge comme précédemment. - On filtre la solution sur une membrane Amicon 1000D, à la température ambiante. - On lyophilise, ce qui conduit à l'obtention d'un lyophilisat. - On procède ensuite à une chromatographie de pseudo-affinité du lyophilisat sur histidyl-(sépharose 4B). - On procède ensuite à une filtration sur une colonne de gel commercialisée sous le nom Sephadex G-25 des différentes fractions obtenues sur histidyl- (sépharose-4B). Le gel utilisé est la sépharose-4B, commercia- lisée par Pharmacia Fine Chemicals, couplée à un ligand L-histidine, commercialisé par la Société Sigma. On a représenté respectivement sur les figures 3 et 4, les courbes relatives à la chromatographie de pseudo-affinité et de filtration sur gel G-25, pour l'obtention du glycopeptide selon l'invention. La figure 3 représente les trois pics (I, II, III) obtenus par la séparation sur histidyl-(sépharose 4B). On a représenté sur l'axe des abscisses le vo- lume d'élution exprimé en ml, sur l'axe des ordonnées, à droite, la concentration en NaCl et à gauche la densité optique à 280 nm. La colonne utilisée a comme dimensions 2,5 x 16 cm. L'échantillon est constitué par 1 g de lyophi- lisat dans 10 ml de tampon. L'éluant est un tampon acétate 0,1 M, pH 5,5, le débit est de 48 ml/heure. L'élution est faite avec un gradient de NaCl (0-0,75 M) dans le tampon. C'est dans la fraction correspondant au pic III que se trouve le glycopeptide présentant des propriétés anticoagulantes selon l'invention, éluée avec NaCl 0,1 M dans le tampon. La fraction correspondant au pic III obtenu sur séparation histidyl(sépharose 4B) est concentrée par ultrafiltration sur membrane Amicon 1000D et est filtrée sur gel G25. La figure 4 représente la filtration sur gel G-25 du pic III obtenue précédemment. On a représenté en abscisses le volume d'élution exprimé en ml, et en ordonnées, la densité optique à 280 nm. La colonne utilisée est une colonne de 1x25 cm. L'éluant est de l'eau distillée. Le débit est de 16 ml/heure. Le glycopeptide présentant des propriétés anti- coagulantes selon l'invention, correspond au pic III3. Analyse du alvcoDeDtide - La fraction peptidique a été mise en évidence après dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry. Selon cette méthode, le glycopeptide contient 79-80 % (en poids) de résidus acides aminés. La partie glucidique du glycopeptide de l'in- vention correspond à 20 % environ (en poids) de glucides totaux. La fraction glucidique a été analysée par chro- * matographie en phase gazeuse après méthanolyse. La technique de méthanolyse est la suivante. Pour déterminer la composition de 20 pg de su- cres: - on met 2 pg de mésoinusitol (témoin interne) à 18 ml dans de l'eau distillée; - on lyophilise; - on met 500 pl de méthanol anhydre 0,5 N/HCl et on laisse à 95'C pendant 24 heures; - on sort les tubes du four pour arrêter la mé- thanolyse, on laisse refroidir à la température ambiante et on neutralise jusqu'à ce que le pH final soit de 6-7; - on met 20 pl d'anhydride acétique dans le mé- lange, on agite et on laisse réagir pendant une nuit; - on centrifuge à 250 g, on élimine l'insoluble et on ajoute sur le surnageant de l'heptane (250 pl), on agite et on enlève l'heptane qui est non miscible avec le méthanol, afin d'extraire les traces de lipides; - on répète cette extraction plusieurs fois; - on sèche à l'azote; - on silyle pour stabiliser les produits et les rendre plus volatils; - on met 100 pl de pyridine et 100 pl de BSTFA (CN,O-bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide), on lais- se à l'obscurité pendant 4 heures; - on injecte sur une colonne de OV101 Cp Sil 5 CB Chrompach, la température est programmée de 120 à 240'C, à raison de 2'C/mn, sous un débit de gaz vecteur (azote) de 10 ml/mn. La composition centésimale (en poids) de cette fraction en résidus sucres est donnée dans le tableau suivant. Glc Man Gal Glc Nac Gal Nac 34,9 % 16,3 % 11,4 % 23,3 % 14,1 % 62,6 % de sucres neutres 37,4 % d'osanines Glc = glucose Glc Nac = glucosamine Man = mannose Gal Nac = galactosamine Gal = galactose Homoaénéité du Droduit L'homogénéité du glycopeptide obtenu est véri- fiée par électrofocalisation sur gels d'acrylamide 5 %, à deux gradients de pH (3,5-10) et (2,5-5) selon les protocoles des Sociétés LKB et de Pharmacia Fine Chemicals. (Les kits de calibration pour la détermina- tion du point isoélectrique sont fournis par Pharmacia Fine Chemicals). ProDpriétés des alvcopeDtides selon l'invention L'effet des glycopeptides sur la coagulation a été investigué et leurs propriétés anticoagulantes ont été déterminées par un ensemble de tests de coagulation. L'héparine qui a été utilisée à titre de compa- raison est de l'héparine commercialisée par CHOAY S. A., de 10 300 daltons et de 173USP. On rappelle qu'une unité internationale (UI) est définie comme étant la quantité de substance (en l'occu- rence de glycopeptide) qui attaque une micromole de substrat par minute et qu'une unité catalytique (Ukat) est la quantité de substance (en l'occurence de glyco- peptide) qui attaque une mole de substrat par seconde. Le glycopeptide selon l'invention à propos du- quel les résultats figurent ci-après est celui obtenu dans l'exemple 3. Eprouvé sur du sang total, le glycopeptide s'est révélé anti-coagulant à partir d'une concentration de -80 pg/ml. A titre de comparaison, l'héparine, anti- coagulant largement employé en médecine, est anticoagu- lante à partir de 77 pg/ml. L'exploration de la voie endogène de la coagulation a révélé un allongement du temps de céphaline-kaolin, du temps de thrombine et une inactivation du facteur Xa. Il faut ajouter qu'aucun signe de cytotoxicité n'a été constaté par des tests préliminaires effectués invitro sur des fibroblastes de poumon de poulet. Ces différents résultats proviennent des essais tels que décrits ci-dessous. 1' Mesure de l'activité anticoagulante sur le sang total Le protocole est le suivant: - on utilise une boite commercialisée sous le nom Nunc, par la Société Polylabo, à 4 cupules; dans la première cupule, on met 0,2 ml de solution tampon phos- phate (PBS) pH 7,2; dans la deuxième cupule, on met 0,2 ml d'héparine à 10 UI/ml dans le PBS; dans la troisième et la quatrième cupules, on met 0,2 ml de glycopeptide à concentration variée; on incube à 37C pendant 10 minutes; - on ajoute 0,2 ml de sang directement prélevé,. on agite et incube à 37'C; après 5 à 6 minutes, le sang se coagule dans le PBS, alors qu'il reste à l'état flui- de en présence de l'héparine et du glycopeptide à partir d'une concentration de 70-80 pg/ml. 2' Temps de céDhaline-kaolin Le protocole pour mesurer le temps de céphaline- kaolin (ou APTT: activated partial thromboplastin time) est le suivant: à 0,1 ml de PPP (plasma pauvre en plaquettes), on ajoute 0,1 ml de tampon Michaelis pH 7,3 ou 0,1 ml de glycopeptide à différentes concentrations dans le tampon Michaelis (CAEN J., LARIEU N. J. et SAMANA N., L'hémos- tase, méthodes d'exploration diagnostiques pratiques); - on incube pendant 3 minutes à 37'C; - on ajoute 0,1 ml d'activateur (céphaline + kaolin) commercialisé sous le nom C. K. Prest 2r par la Société Diagnostica Stago et 0,1 ml de CaCl2 M/40; - on mesure le temps de coagulation à l'aide d'un coagulomètre. 3' Temps de Xa Le protocole pour mesurer le temps de Xa est le suivant: on mélange 35 pl de Xa (7 nano Ukat/ml) (commercialisé sous le nom Coatest, par la Société Kabi Diagnostica), dans du tampon Michaelis et 65 pl de tam- pon ou de glycopeptide selon l'invention dans le tampon; - on laisse incuber pendant 5 minutes à 37'C; - on ajoute 100 pl de CaCl2 M/40 et 100 pl de PPP en même temps; - on mesure le temps de coagulation. On établit une courbe étalon en remplaçant le glycopeptide par le même volume de tampon et en utili- sant différentes concentrations de Xa. 4' Temps de thrombine (IIa) Le protocole pour mesurer le temps de thrombine est le suivant: - à 0,2 ml de PPP, on ajoute 0,1 ml de tampon ou de glycopeptide à différentes concentrations dans le tampon Michaelis à pH 7,33; - on incube pendant 5 minutes à 37C; - on ajoute 0,1 ml de thrombine (commercialisée par la Société La Roche) à 20 UI/ml dans le tampon Michaelis; - on mesure le temps de coagulation. On établit un étalonnage en remplaçant le gly- copeptide de l'invention par le même volume de tampon, et en utilisant différentes concentrations de thrombine (5, 10, 15, 20, 30 UI/ml). Résultats 1' APTT ou temps de céphaline-kaolin Les résultats relatifs au temps de céphaline- kaolin exprimés pour des concentrations différentes de glycopeptide selon l'invention, sont rassemblés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Moyenne des temps de coagu- lation (en se- des) * Témoin Concentration finale de :: glycopeptide dans la solution :: (pg/ml) :: :: _. __. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ :: :::: : : O:10 : 20: 40: 50: 75: 80 ,07: 37,3: 36,2: 45,1: 48: 67,5: :: -.....-....._... _ :: ::::. :, * * i ::::::::00 ::: : :: : : 40,07: 37,3: 36,2: 45,1: 48: 67,5: u : ===: *= * 0. :: ::3: : : - :: -:::: I La courbe de la figure 5 représente la variation du temps de céphaline-kaolin exprimé en secondes (en or- données) en fonction de la concentration en pg/ml (en abscisses) de glycopeptide selon l'invention. Les résultats du tableau 1, ainsi que ceux de la figure 5, montrent que le composé selon l'invention pro- longe le temps de coagulation à partir de 30 pg/ml. Au- delà de cette concentration, le glycopeptide selon l'invention prolonge le temps de coagulation jusqu'à empêcher complètement la formation du caillot à partir de 80 ug/ml. 2' Activité anti-Xa On a rassemblé dans le tableau 2 ci-après, les résultats relatifs au temps de Xa pour des concentra- tions variables en glycopeptide selon l'invention. _ V TABLEAU 2 Moyenne des temps de coagu- lation (en se- des) : Témoin: Concentration finale de :: glycopeptide dans la solution :: (Pg/ml) :: :::_::-- _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ :O: 15: 30 45: 60: 75 : - -: .. ...:.... ** * X :25,6: 26,6: 33,6: 109: Co :: ::: v = On a rassemblé dans le tableau 3 ci-après les résultats relatifs au temps de coagulation pour des con- centrations différentes en Xa (exprimé en nanounités ca- talytiques par ml: nUkat/ml). Les résultats de ce ta- bleau ont servi à établir la courbe d'étalonnage. TABLEAU 3 La figure 6 représente la variation de la quan- tité de Xa inactivé exprimée en nanounités catalytiques par ml (en ordonnées) en fonction de la concentration exprimée en pg/ml de glycopeptide selon l'invention (en Concentration:: :: de Xa: 7,5: 5: 3,5: 2,5 en qUkat/ml:: : :::: Temps de Xa:: en secondes: 24,63: 28,35: 31,05: 38,75 (moyennes): :::: abscisses). Les résultats des tableaux 2 et 3, ainsi que la figure 6, montrent que le glycopeptide selon l'invention inactive le Xa, cette inactivation croissant avec la concentration de glycopeptide selon l'invention mise en oeuvre. Ainsi, 1 mg de glycopeptide selon l'invention inactive environ 142 nano unités catalytiques de Xa, ce qui correspond à environ 8,5 unités internationales. Cette activité constitue 5 % de l'activité anti-Xa de l'héparine standard, fabriquée et commercia- lisée par la Société CHOAY de 10 300 D et qui présente un titre 173 USP. Ce résultat montre la différence de comportement du glycopeptide selon l'invention par rapport à l'héparine sur le facteur Xa. 3 Activité anti-IIa (antithrombiaue) On A rassemblé dans le tableau 4 ciaprès les résultats relatifs au temps de coagulation (en secondes) pour des concentrations différentes en glycopeptide se- lon l'invention (en Pg/ml). TABLEAU 4 :Concentration en glycopeptide pg/ml :::::: : O: 10: 40: 80: 100: 200 :::::: Temps de: 7,85: 8,45: 11,7: 25,2:67,86: coagulation (en: ::::: secondes): ::: :: :35 On a rassemblé dans le tableau 5 ci-après les On a rassemblé dans le tableau 5 ci-après les résultats relatifs au temps de IIa pour des concentra- tions différentes en IIa, exprimées en UI/ml. Les ré- sultats de ce tableau ont servi à établir la courbe d'étalonnage. TABLEAU 5 Concentration:: :: en IIa: 30: 20: 15: 10 (UI/ml) :_______.____.____.__----:__ Temps de IIa:: :: en secondes: 4,85: 8,45: 10,6: 13,9 (moyennes)::: : ::: : Sur la figure 7, on a représenté -la variation de la quantité de thrombine (IIa) inactivée en unités in- ternationales par ml (en ordonnés) en fonction de la concentration en pg/ml de glycopeptide selon l'invention (en abscisses). La courbe de la figure 7 montre que le glycopep- tide selon l'invention présente une nette activité anti- thrombotique, même à faibles concentrations. Cette activité reste différente de celle de l'héparine standard CHOAY dont l'activité antithromboti- que est d'environ 3 500 UI/mg. Le glycopeptide selon l'invention présente une activité vis-à-vis du facteur IIa de 5 % par rapport à celle de l'héparine, c'est-à-dire une activité d'environ 180 UI/mg. Ce résultat montre la différence de comportement des glycopeptides selon l'invention par rapport à l'hé- parine sur le facteur IIa. Conclusion Les résultats présentés ci-dessus montrent que les mécanismes d'action de l'héparine et du glycopeptide de l'invention sont tout à fait différents, puisque les résultats obtenus sur les facteurs étudiés (IIa, Xa) sont différents. L'invention vise également toute composition contenant le glycopeptide selon l'invention, notamment toute composition présentant des propriétés anticoagu- lantes et contenant le glycopeptide selon l'invention. L'invention vise plus particulièrement les com- positions contenant le glycopeptide selon l'invention, lesquelles compositions contiennent d'environ 6 à envi- ron 30 % de sucres, d'environ 50 à environ 80 % de ré- sidus acides aminés. Une composition de l'invention contient avanta- geusement environ 27 % de sucres, environ 55 % de rési- dus acides aminés, environ 3 % de lipides. Un exemple de composition contenant le glyco- peptide de l'invention peut être tel que la fraction sucre contienne environ 18 % de galactose, environ 36 % de mannose, environ 26 % de glucose, environ 8 % de galactosamine, environ 10 % de glucosamine. Les résidus acides aminés peuvent être dosés par la méthode de Lowry. Les sucres peuvent être dosés par la méthode à l'anthrone. De façon avantageuse, les compositions selon l'invention contenant le glycopeptide et présentant des propriétés anticoagulantes sont anticoagulantes à partir de 3 mg/ml et: - entraîne une réduction du temps de céphaline- kaolin, - entraîne un allongement du temps de Quick, - active le facteur XIIa, - entraîne un allongement du temps de thrombine, - inactive le facteur Xa. De façon avantageuse, les compositions de l'in- vention contiennent des molécules de poids moléculaires d'environ 1 000 à environ 30 000 daltons. L'invention vise en particulier les compositions du type de l'extrait brut mentionné ci-dessus. L'invention concerne en particulier les composi- tions dénommées ci-après extraits bruts, susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé compre- nant les étapes suivantes: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des cystobacterinae ou de mutantes de celles- ci; - l'élimination à partir du surnageant ainsi récupéré des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons; - l'élimination à partir du surnageant des pro- téines; - l'élimination à partir. du surnageant des substances insolubles dans l'eau. L'ordre dans lequel les trois étapes relatives respectivement à l'élimination des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000, des protéines et des produits insolubles dans l'eau n'intervient pas. La matière première à partir de laquelle le gly- copeptide de l'invention peut être obtenu peut être constituée par le surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries, du sousordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles-ci. Les sous-bacterinae se distinguent par le fait qu'elles produisent un mucus qui absorbe le rouge Congo. Le milieu de culture de ces Cystobacterinae peut être constitué par un milieu solide ou liquide. On a de préférence recours à un milieu de cultu- re liquide. La souche de myxobactéries utilisée est avanta- geusement constituée par une souche de Myxococcus xanthus. La souche utilisée est par exemple la MYxococcus xanthus CM011, qui dérive de la souche I448, déposée le 3 mai 1985, par l'insertion (n' 11) d'un transposon Tn5 (selon la technique décrite dans "Introduction of trans- poson TnS into Myxococcus for analysis of developmental and other non selectable mutants", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 425-429. Cette insertion confère à la souche la capacité de produire 50 % de plus de sucres dans le milieu que la souche d'origine. A titre d'exemple, on peut également utiliser la souche DK1622, telle que décrite dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5 952-5 956, 1979. Une telle souche est cultivée en milieu liquide, agité, constitué de Casitone Difco tamponné. En ce qui concerne la séparation du surnageant, on prélève celui-ci de préférence au début de la phase stationnaire de croissance, en d'autres termes, à la fin de la phase exponentielle de croissance. On a de préférence recours dans une première étape, à l'élimination des protéines, puis à l'élimina- tion des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons, puis à l'élimination des substances insolubles dans l'eau. L'élimination des protéines peut avoir lieu en utilisant du phénol. Le phénol permet de faire précipiter les protéi- nes et la phase aqueuse contient les compositions selon l'invention. Le phénol utilisé est avantageusement du phénol % (poids/volume). L'élimination des protéines peut également avoir lieu par filtration sur membrane, par exemple sur mem- brane de 10 000 daltons, notamment membrane de la marque AMICON 30D commercialisée par AMICON. L'élimination des substances de poids molécu- laires inférieurs à environ 1 000 peut être effectuée en utilisant de l'alcool éthylique pur. L'addition d'alcool précipite les substances de poids moléculaires supérieurs à environ 1 000, tandis que les substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000, se retrouvent dans l'alcool. La phase de traitement à l'alcool a également pour but de concentrer. Le précipité obtenu grâce à l'alcool peut être resolubilisé dans l'eau, la phase aqueuse obtenue étant retraitée par une nouvelle addition d'alcool, si l'on désire concentrer davantage. On peut ensuite laver le précipité obtenu ci- dessus à l'acétone, pour délipider partiellement, puis à l'éther, notamment pour sécher. On redissout le précipité dans de l'eau distil- lée. L'élimination des produits insolubles peut être effectuée par centrifugation du précipité redissout. Puis, on a avantageusement recours à un traite- ment de purification pour éliminer l'alcool ainsi que l'acétone et l'éther éventuellement utilisés dans les *étapes précédentes. Ce traitement de purification est avantageuse- ment constitué par une ultrafiltration sur membrane, notamment 1 000 daltons; cette étape d'ultrafiltration est aussi une étape de concentration. Cette étape de purification est avantageusement suivie d'une phase de concentration, par exemple sur membrane. En ce qui concerne la phase d'élimination des insolubles, elle peut également avoir lieu après l'étape de purification et de concentration mentionnée ci- dessus. Le produit brut selon l'invention peut notamment être conservé après lyophilisation ou évaporation sous vide. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend: - la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries appartenant au groupe produisant un mucus colorable au rouge congo, laquelle culture est au début de la phase stationnaire de crois- sance, - l'addition au surnageant de phénol à 50 % (poids/volume), ce qui conduit à l'obtention d'une phase aqueuse contenant la composition de l'invention et un précipité contenant les protéines; - la séparation des phases et la récupération de la phase aqueuse qui contient la composition selon l'in- vention, - l'addition d'alcool à la phase aqueuse débar- rassée des protéines, ce qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient la composition selon l'invention, débarrassé des substances de poids moléculaires infé- rieurs & environ 1 000 daltons; - le lavage du susdit précipité à l'acétone, puis à l'éther, puis le séchage, - l'élimination des insolubles dans l'eau par dissolution du précipité obtenu ci-dessus, puis centri- fugation, - la purification et la concentration de la phase obtenue cidessus par ultrafiltration, - la conservation de l'extrait brut par lyo- philisation ou évaporation sous vide. On donne ci-après le protocole détaillé de l'obtention d'une composition selon l'invention conte- nant le glycopeptide selon l'invention. On prend la culture en début de phase station- naire de croissance et on centrifuge à 8 000 g pendant 5 minutes pour éliminer les bactéries et récupérer le surnageant du milieu de culture. On ajoute au surnageant un volume de phénol à % (poids/volume) dans l'eau distillée. On agite énergiquement et on laisse agir à 60'C pendant 5 minutes. On refroidit directement à O'C dans un mélange réfrigérant (glace + eau) et on laisse reposer pour séparer la phase aqueuse du précipité qui s'est formé suite à l'addition de phénol. On prélève la phase aqueuse qui contient la composition de l'invention, on centrifuge à 1 500 g à O'C pendant 2 à 3 minutes et on récupère la phase aqueuse. On effectue un second traitement au phénol 50 %. On précipite la composition de l'invention de la phase aqueuse en la traitant avec 5 volumes d'alcool 95' à -20'C pendant une nuit, ce qui permet ainsi d'éliminer le phénol et de concentrer. On centrifuge à 3 000 g et à O'C pendant 15 mi- nutes. On resuspend le précipité obtenu ci-dessus dans un petit volume d'eau distillée et on reprécipite avec 3 volumes d'alcool 95 à -20'C (comme précédemment), ce qui permet encore d'éliminer le phénol et de concentrer. On lave à l'acétone, ce qui permet notamment de délipider partiellement, d'éliminer le phénol restant éventuellement, puis à l'éther, ce qui permet d'éliminer le phénol restant éventuellement (à -20'C) et on laisse sécher sur une paillasse à flux laminaire. On redissout dans l'eau distillée. On élimine les substances insolubles dans l'eau par centrifugation pendant 4-5 minutes à 160 g. On lave les substances insolubles avec de l'eau distillée et on centrifuge comme précédemment. On ultrafiltre notamment sur une membrane Amicon 1000D pour éliminer notamment l'alcool, l'acétone, l'é- ther et pour concentrer. On obtient la composition selon l'invention que l'on peut lyophiliser pour conserver. En ce qui concerne les cellules utilisées, elles sont cultivées en milieu liquide (10 g/l de Bactocasitone commercialisé par Difco; 8 mM SO4Mg; Tris pH 7,6 10 mm; tampon phosphate pH 7,6 1 mM) à 30'C sous forte aération (agitation rotative à 300 rpm en erlen ou fermenteur de 7 1). Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé d'obtention des compositions de l'invention correspond au procédé décrit ci-dessus dans lequel on remplace l'étape phénolique par une déprotéinisation partielle par ultrafiltration. Résultats bioloqiaues de la composition de l'invention obtenue par le procédé comportant la Précipitation à l'aide de phénol On donne ci-après les résultats biologiques de la composition de l'invention obtenue par le procédé ci-dessus décrit dans lequel on a recours à la précipi- tation à l'aide de phénol. 1' Coagulation sur sanq total Elle est effectuée selon le protocole indiqué à propos du glycopeptide. La concentration à partir de la- quelle la composition obtenue par le procédé comportant la précipitation à l'aide de phénol est anticoagulante est de 3 mg/ml. 2' APTT ou temDs de céphaline-kaolin Les résultats relatifs au temps de céphaline- kaolin sont rassemblés dans le tableau 6 ci-après qui exprime le temps de céphaline-kaolin (en secondes) en fonction des concentrations différentes de la composi- tion de l'invention (en pg/ml). TABLEAU 6 : Moyenne des temps de coagulation en secondes :_ _ _ _._44,7- 46 - 45._ _ _ : 44,7 - 46 - 45. Témoin (tampon de Michaelis) Concentration de la composition dans le tampon (pg/ml) ,2 1 000 1 500 Les résultats du tableau montrent qu'il y a ré- duction du temps de céphaline-kaolin. 3 Temps de quick Les résultats sont donnés dans le tableau 7 dans lequel on a exprimé le temps de Quick pour des concen- trations variables de la composition de l'invention. TABLEAU 7 Témoin (tampon de Michaelis) Concentration de la composition dans le tampon (mg/ml) : Moyenne des temps de : coagulation en secondes : 14,1 - 14,2 - 14 13,9 1 000 16,6 1 500 17,7 L'amélioration de la voie exogène montre que la composition de l'invention rallonge le temps de Quick et que cet effet est proportionnel à la concentration. 4' Temps de Xa Les résultats concernant le temps de Xa sont rassemblés dans le tableau 8 ci-après qui exprime le temps de Xa pour des concentrations variables en compo- sition de l'invention. TABLEAU 8 Moyenne des temps de coagulation en secondes : 18,1 - 17,9 - 18 D'après ce tableau, il résulte que la composi- tion selon l'invention prolonge le temps de coagulation Témoin (tampon de Michaelis) Concentration de la composition (pg/ml) 19,8 1 000 1 500 23,6 33,3 en inactivant le facteur Xa. Ainsi 1 000 pg/ml de com- position inactivent 3,5 nanounités catalytiques de Xa. ' Test de cvtotoxicité Ce test a été effectué in vitro sur des fibro- blastes de poumons d'embryon de poulet à 14 jours d'in- cubation. Le milieu de culture utilisé est le BME (base- médium-Eagel) contenant 2 % de tricine, 2 % de bicar- bonate de sodium, et 10 % de sérum de veau foetal (Eurobio). Pour effectuer ce test, on utilise des boites de cultures Nunc (commercialisées par Polylabo) à 4 cupu- les. Dans chaque cupule, on introduit le même nombre de cellules (environ 20 000 cellules/ml de milieu BME). On incube à 37C pendant 24 heures. On rince doucement 2 ou 3 fois la culture avec le même milieu. Dans deux cupules prises comme témoins, on in- troduit 1 ml de BME et dans les deux autres la compo- sition de l'invention dissoute dans le même volume de milieu. Différentes concentrations de polysaccharide ont été essayées: 20, 40, 60, 80 et 100 pg Geq/ml de BME, 1 pg Geq/ml représentant la quantité d'hexose de l'ex- trait. Le comportement des cellules en présence du produit, en comparaison avec le témoin, suivi en micro- cinéma-vidéo à la température de 37C (chambre de prise de vue thermostatée) a permis de montrer qu'aucun signe de cytotoxicité n'était constaté. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques associant les susdits glycopeptides de l'invention et susdites compositions les contenant, avec un véhicule pharmaceutique. 2587707, Les glycopeptides de l'invention et les composi- tions les contenant sont particulièrement adaptés au contrôle (préventif ou curatif) de la coagulation san- guine chez l'homme ou l'animal, notamment dans ceux des cas o l'hôte est soumis à des risques d'hypercoagula- bilité, plus particulièrement ceux résultant d'une per- turbation de la phase extrinsèque susdite, par exemple comme conséquence d'une libération par l'organisme de thromboplastine, par exemple de thromboplastine tissu- laire (interventions chirurgicales, processus athéroma- teux, développement de tumeurs, perturbations des méca- nismes de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques, etc.). Les glycopeptides de l'invention et les composi- tions les contenant peuvent être sous forme de prépara- tions administrables par voie orale ou rectale, en uti- lisant des solides ou des liquides appropriés pour un te-l1-type ud-'adiini-stration ou sous forme de préparations injectables stériles contenant au moins l'une quelconque des compositions selon l'invention, en association avec des véhicules liquides appropriés stériles, de préféren- ce isotoniques. D'autres formes appropriées de préparations consistant en pommades dans lesquelles les glycopeptides selon l'invention et les compositions les contenant sont associés avec des véhicules en pommade. On notera que les doses auxquelles les glycopep- tides de l'invention et les compositions les contenant sont utilisés sont déterminées selon la nature de la maladie qui afflige le patient et les conditions parti- culières de.santé. les dosages appropriés sont déterminés par le médecin, comme la pratique l'exige dans ces domaines d'application. L'invention concerne également encore l'appli- cation des compositions selon l'invention à la consti- tution de réactifs biologiques utilisables au labora- toire, notamment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'acti- vité anticoagulante. REVENDICATIONS 1. Glycopeptides caractérisés par les propriétés suivantes: - leur poids moléculaire est compris d'environ 1 000 à environ 5 000 daltons; - les résidus sucres contenus sont des hexoses et des hexoses aminés, appartenant au groupe constitué par le mannose, le glucose, le galactose, la galactosa- mine, la glucosamine.; - leur comportement en chromatographle HPLC n'est pas modifié par le sodium dodécylsulfate; - leur pH isoélectrique est d'environ 3,6; - ils sont anticoagulants sur sang total à par- tir d'une concentration d'environ 80 pg/ml; - ils entraînent un allongement du temps de céphaline-kaolin; - ils entraînent un allongement du temps de thrombine; - ils inactivent le facteur Xa. _ 2. Glycopeptides selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce qu'ils ont la composition suivante: - environ 70-80 % (en poids) de résidus d'acides aminés; - environ 30-20 % (en poids) de motifs sucres, lesquels motifs sucres sont constitués par environ 60 à environ 65 % (en poids) de sucres neutres et environ 35 à environ 40 % (en poids) d'osamines. 3. Glycopeptides selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce que: - la composition des motifs sucres neutres est constituée par environ 30 à 35 % (en poids) de glucose, environ 15 à environ 20 % (en poids) de mannose, environ à environ 15 % (en poids) de galactose; - la composition des osamines comprend d'environ à environ 25 % (en poids) de glucosamine et d'environ à environ 15 % (en poids) de galactosamine. 4. Glycopeptide caractérisé en ce qu'il est ob- tenu par le procédé caractérisé par: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles- ci; - l'élimination à partir du surnageant des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons; - l'élimination à partir du surnageant des substances insolubles dans l'eau; - et la récupération de la fraction du surna- geant débarrassée des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons et débarrassée des substances insolubles dans l'eau; - la purification de cette fraction par chro- matographie sur colonne de pseudo-affinité; - la purification subséquente de la susdite fraction par chromatographie sur colonne de gel de polymère réticulé de dextrane, notamment de gel com- mercialisé sous le nom de Sephadex. 5. Glycopeptides selon la revendication 4, ca- ractérisés en ce que la souche utilisée est une souche de Myxococcus xanthus ou un mutant de celle-ci. 6. Glycopeptides selon la revendication 5, ca- ractérisés en ce que la souche est la souche Myxococcus xanthus CM011, qui dérive de la souche déposée à la CNCM sous le numéro I448, par l'insertion d'un transposon Tn5. 7. Glycopeptides selon la revendication 4, ca- ractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé comprenant: - la séparation du surnageant provenant d'un mi- lieu de culture de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles-ci, laquelle culture est au début de la phase stationnaire de crois- sance; - l'addition d'alcool au susdit surnageant, ce qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient les glycopeptides selon l'invention et qui est débarras- sé des substances de poids moléculaires inférieurs à en- viron 1 000 daltons; - le lavage du susdit précipité à l'acétone, puis à l'éther, puis le séchage du précipité; - - a -dissolution dans l'eau distillée du susdit précipité séché; - l'élimination.des substances insolubles dans l'eau, notamment par centrifugation et l'obtention d'une solution contenant les glycopeptides de l'invention et débarrassée des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, et des substances inso- lubles dans l'eau; - la purification par ultrafiltration et la concentration de la solution obtenue ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une fraction contenant les gly- copeptides; - la conservation de la susdite fraction par lyophilisation ou évaporation sous vide; - la- purification par chromatographie sur co- lonne de pseudo-affinité de la susdite fraction; - la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel de polymère réticulé de dex- trane, notamment de gel commercialisé sous le nom Sephadex. 9. Glycopeptides selon la revendication 4, ca- ractérisés par le procédé comprenant: - la séparation et la récupération du surnageant -2587707 provenant d'un milieu de cultures de myxobactéries du sous-ordre des Cystobacterinae ou de mutants de celles- ci; - l'élimination à partir du surnageant ainsi récupéré: des protéines, des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, des substances insolubles dans l'eau pour donner l'extrait brut; - la purification par chromatographie sur colon- ne de pseudo-affinité de l'extrait brut; - la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel de polymère réticulé de dextra- ne, notamment de gel commercialisé sous le nom Sephadex. 9. Glycopeptides selon la revendication 8, ca- ractérisés par le procédé comprenant: - la séparation et la récupération du surnageant provenant d'un milieu de cultures de myxobactéries ap- partenant au groupe produisant un mucus colorable au rouge Congo, laquelle culture est au début de la phase stationnaire de croissance; - l'addition au surnageant de phénol à 50 % (poids/volume), qui conduit à: 25. l'obtention d'un précipité contenant les pro- téines; et à l'obtention d'une phase aqueuse contenant les glycopeptides selon l'invention; - la séparation des phases et la récupération de la phase aqueuse qui contient les glycopeptides selon l'invention; l'addition d'alcool à la susdite phase aqueuse ce qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient les glycopeptides selon l'invention et qui est débarras- sé des protéines et des substances de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 daltons; - le lavage du susdit précipité à l'acétone, puis à l'éther, puis le séchage du précipité; - la dissolution dans l'eau distillée du susdit précipité séché; - l'élimination des substances insolubles dans l'eau, notamment par centrifugation et l'obtention d'une solution contenant les glycopeptides de l'invention et débarrassée des substances de poids moléculaires infé- rieurs à environ 1 000 daltons, des protéines et des substances insolubles dans l'eau; - la purification par ultrafiltration et la concentration de la solution obtenue ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'un extrait brut contenant les glycopeptides; - la conservation du susdit extrait brut par lyophilisation ou évaporation sous vide; - la purification par chromatographie sur co- lonne de pseudo-affinité de l'extrait brut; _- la purification subséquente par chromatogra- phie sur colonne de gel de polymère réticulé de dex- trane, notamment de gel de Sephadex. 10. Composition caractérisée en ce qu'elle contient les glycopeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Composition selon la revendication 10, ca- ractérisée en ce qu'elle contient environ 10 % à environ % de résidus sucres et d'environ 55 % à environ 80 % de résidus acides aminés exprimés en % en poids. 12. Composition selon la revendication 11, ca- ractérisée en ce qu'elle contient: - environ 27 % de sucres, - environ 55 % de résidus acides aminés, - environ 3 % de lipides. 13. Composition selon la revendication 12, ca- ractérisée en ce qu'elle est anticoagulante à partir de 3 mg/ml et: - entraîne une réduction du temps de céphaline- kaolin, - entraine un allongement du temps de Quick, - active le facteur XIIa, - entraîne un allongement du temps de thrombine, - inactive le facteur Xa. 14. Composition selon la revendication 12, ca- ractérisée en ce qu'elle est obtenue par mise en oeuvre du procédé comprenant les étapes suivantes: - la récupération du surnageant provenant d'un milieu de cultures de myxobactéries appartenant au groupe produisant un mucus colorable au rouge congo, la- quelle culture est au début de la phase stationnaire de croissance; l'addition au surnageant de phénol à 50 % (poids/volume), ce qui conduit à l'obtention d'une phase aqueuse contenant la susdite composition et d'un préci- pité contenant les protéines; - la séparation des phases et la récupération de la phase aqueuse qui contient la susdite composition; - l'addition d'alcool à la phase aqueuse débar- rassée des protéines, ce qui conduit à l'obtention d'un précipité qui contient la susdite composition; - l'élimination des substances insolubles dans l'eau par dissolution du précipité obtenu ci-dessus, puis centrifugation; - la purification et la concentration de la phase obtenue ci-dessus par ultrafiltration; - la conservation de l'extrait brut par lyophi- lisation ou évaporation sous vide.