Brevet FR2586699A1 — publié le 19870306

Fractions de-lait. procédé d'obtention de ces fractions et milieux de cultures cellulaires renfermant ces fractions. L'invention a pour objet des fractions de lait utllisables notamment comme milieux de cultures cellu- laires, leur procédé d'obtention et les milieux de cultures les renfermant. On salt que de nombreux milieux de cultures cellulaires sont supplémentés en sérum, mettant ainsi à profit les propriétés d'induction de croissance cellu- la:re de divers 'acteurs qu'ils renferment. Compte tenu cependant du coût élevé du sérum, divers substituts ont été envisagés, notamment un autre fluide corporel, à savoir le lait. Dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, N' 10, p. 5057-5061, Octobre 1978, Klagsbrun rapporte des 2O résultats de travaux effectués- avec du lait humain, qui ont montré un effet de stimulation de la synthese d'ADN et de la divlslon cellulaire de fibroblastes BALB/c 3T3. Par gel filtration, un facteur mitogêne de poids molé- cula:re 'PM) de 14 000 à 18 OO0 daltons a été isolé. Dans des articles postérieurs, notamment dans Journal cf Oell Biology, vol. 88, Février 1981, p. 294-300, et dans Jourr.al of Cellular Physiology 109: 123-234 (1981), Steimer et coll. soulignent cependant 3C que le lat, et dans une moindre mesure le cclostrum, sont déficlents en facteurs d'attachement présents dans le sérux tels que la fibronectine. Il s'ensuit que, dans le cas de culture de cellules non transformées dans des milieux de cultures supplémentés' en lait, il est néces- saire de prêtraiter les plaques de culture avec de la fIbronectine pour permettre l'attachement des cellules. Les resultats rapportés montrent toutefois que, même dans ces conditions, les lignées cellulaires normales de fibroblastes ne prolifèrent pas de manière appréciable. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à constater qu'il est possible de disposer d'un substitut de sérum économique et de grande effica- cité en fractionnant le lait dans des conditions déter- minees. L'invention a donc pour but de fournir des frac- tions de lait utilisables en remplacement du sérum dans les milieux de cultures cellulaires. Elle vise également à fournir un procédé d'ob- tention, de mise en oeuvre aisée, de ces fractions. Elle vise en outre à fournir des milieux de cul- tures cellulaires artificiels, économiques, de grande efficacité. Le terme "lait", tel qu'utilisé dans la des- cription et les revendications, désigne aussi bien le lait de vache que le lait d'autres mammifères tels que chevre, brebis, buflonne, jument, yack ou chamelle. Les fractions de lait de l'invention sont carac- térisées en ce qu'elles sont formées de constituants ayant un PM d'au moins environ 27 000 et qu'elles sont essentiellement dépourvues de lipides insolubles du type de ceux éliminables par ultracentrifugation ou analogue et des inhibiteurs de poids moléculaire inférieur à en- viron 1000. Ces fractions contiennent les protéines so- lubles du lait, en particulier des glycoprotéines, les immunoglobulines, principalement des IgG, A et M, de la sérumalbumine, des protéases et des peptones. D'une manière surprenante, l'addition à des mi- lieux de culture conventionnels, qui sont donc dépourvus du facteur mitogène évoqué ci-dessus, de fractions de ce type conduit cependant à une stimulation de la crois- sance des cellules. La prolifération cellulaire observée est supérieure à celle obtenue avec des fractions for- mées de constituants de PM inférieur à 27 000 ou encore avec du lait entier non fractionné, ce que ne laissaient prévoir les indications figurant dans le brevet US 4 440 800 du 2 Mars 1981 au nom de Klegsbrun. En effet, selon ce brevet, les protéines ayant un poids molécu- laire supérieur au facteur mitogène ci-dessus sont con- sldérées comme des protéines inactives. Or, les travaux des inventeurs ayant abouti à la mise au point de cette invention montrent au contraire l'efficacité des frac- tions de poids moléculaire élevé, plus spécialement su- pérleur à 50 000. Ainsi, des fractions préférées sont formées de constituants de PM supérieur à 50 000 environ. D'autres fractions préférées présentent des PM de 27 000 à 50 000 environ. Ces fractions sont soit en- tières renfermant en mélange les constituants dont les PM sont supérieurs à 50 000, ou bien s'étagent de 27 000 à 50 000, soit fractionnées dans cet intervalle de PM. D'une manière avantageuse, ces différentes frac- tions sont débarrassées de molécules à effet inhibiteur de PM inférieur à 1000. Les fractions de l'invention sont constituées par des fractions de lait frais, de lait pasteurisé, sous forme liquide concentrée ou lyophilisée. Selon un autre aspect, les fractions de l'in- vention sont du type de celles obtenues après ultracen- trifugation pour éliminer des lipides insolubles. L'ul- tracentrifugation est réalisée selon les méthodes clas- slques et notamment a une température inférieure à l'am- biante, en particulier inférieure a 10'C, notamment de l'ordre de 4'C, pendant une durée de l'ordre de minutes notamment à environ 100000 g (ce qui correspond à 20 000 tours environ par minute) récupération de la phase limpide intermédiaire et ultrafiltration membrane ayant l'intervalle de de cette un seuil 000 à 27 phase intermédiaire sur une de coupure approprié dans 000 daltons. Conformément au procédé de l'invention, on soumet une phase limpide de lait, renfermant les protéines solubles du lait, telle qu'obtenue par ultra- centrifugation du lait et séparation à partir des dif- férentes phases obtenues, à une ultrafiltration avec une membrane à seuil de coupure de 50 000 à 27 000 daltons environ. On notera que l'utilisation de la phase limpide ci-dessus permet une stérilisation plus aisée par fil- tration. De préférence, on sépare tout d'abord à l'aide d'une membrane à seuil de coupure de 50 000 daltons la fraction de lait formée de constituants de PM supérieur à 50 000, puis on soumet la fraction restante à une ultrafiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure approprié pour l'obtention d'une fraction formée de constituants présentant des PM dans l'intervalle de PM désiré jusqu'à 50 000 daetons. La fraction obtenue apres ultratiltration est concentrée. Avant d'étre stérilisée, la raction est avantageusement préfiltrée par exemple sur un filtre de d-menslons de pores de 0,45 w environ-. La fraction peut être conservée par congélation par exemple à -80'C environ jusqu'à son utilisation. Au moment de l'utilisation, celle-ci est diluée et avanta- geusement filtrée sur filtre d'environ 0,22 a. La phase de lait limpide mise en oeuvre dans l'étape d'ultrafil!ratlon est obtenue avantageusement en soumettant le la:it à au moins une opération d'ultracen- tr:fugationr.. L'ultracentrifugation est réalisee plus speé:calement à 27 00D0 t/mn environ durant 60 mn environ, à une température inférieure à l'ambiante, avantageuse- ment inférieure à 10'C, notamment de l'ordre de 4C. Le lait mis er. oeuvre est constitué plus spécia- lement par du lait frais. Il peut s'agir également de lait pasteurisé. Comme l'ont montré les résultats des essais efectués par la demanderesse, les fractions de lait ainsi obtenues exercent un effet de stimulation de la synthèse d'ADN et de la division cellulaire plus important que celui obtenu avec du lait entier ou des fractions de PM inférieur à27 OOO. L'addition des fractions de l'invention à des milieux de culture conventionnels permet d'élaborer des milleux de culture artificiels, économiques par rapport à ceux supplémentés en sérum. L'invention vise donc des milieux de cultures cellulaires caractérises en ce qu'ils comprennent un milieu de base conventionnel supplémenté à l'aide d'une fraction selon l'invention en une quantité suffisante pour permettre de réduire ou de supprimer l'utilisation de sérum tout en exerçant un effet activateur sur la pro!ifération cellulaire. Selon le type et les besoins des cellules, le milieu de base est supplémenté, de manière classique, en sources de carbone et d'énergie différentes. En outre, l'addition d'antibiotiques permet d'éviter les contaminations. D'une manière générale, on sait que tous les facteurs de croissance exercent une action biphasique sur la croissance cellulaire. A faible concentration, ces facteurs activent la croissance cellulaire jusqu'à une concentration optimale. Au-delà de cette concentra- tion et à forte concentration, ils inhibent la crois- sance. La concenzrau onr en fractions de lait des mi- li:eux de cultures de l'r.ventlon sera aisément déter- minée par l'homme de l'art compte tenu du type des cellules à cultiver. Des milieux de cultures préférés, particuliè- rement appropriés notamment à la croissance d'hybridomes et de fibroblastes, comprennent un milieu de base supplémenté à l'aide de fractions de lait formées de constituants de P supérieur à 50 000. con.stituants de PM supérieur à 50 000. -. Des concentrations d'environ 10 % (vol/vol) permettent d'obtenir d'une manière générale une activité maximale. Ainsi, la stimulation de la synthèse d'ADN est supérieure à 50 % avec de telles fractions par rapport à celle obtenue avec la phase limpide non fractionnée. De telles fractions présentent une activité d'au moins 86 % par rapport à un sérum de veau foetal (SVF) alors que des fractions formées de constituants de PM inférieur à 000, en particulier inférieur à 10 000 et même à 1000 entrainent seulement une stimulation inférieure à 15 % par rapport à SVF. L'addition de 1 à 10 % (vol/vol) de sérum peut é-re avantageuse pour obtenir une aclvité maximale du m'lieu de culture et/ou pour des cultures à long terme, ce qui constitue une réduction appréciable de la quan- tite de sérum a utiliser par une culture cellulaire donnée. Il apparait ainsi qu'une fraction par exemple formée de constituants de PM supérieur à 50 000 daitons, à une concentration de 10 %, additionnée de 1 % de SVP, présente une activité équivalente à celle obtenue avec un milieu contenant 10 % de SVP. L'invention fournit donc des moyens pour réduire le cot des milieux de culture en diminuant la quantité de sérum à utiliser. Ces milieux sont mis en oeuvre avec avantage pour la culture de cellules d'eucaryotes, entre autres, hybrldomes, 'fibroblastes, hépatocytes, lymphcIdes, cel- lules épithéliales. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention sont donnés dans la description des exemples qui suivent et apparaîtront égalemer.t en se référant aux fi- gures: - la figure 1 représentant les courbes de varia- tion du nombre de cellules d'hybridomes par ml en fonc- tion du temps, - et la figure 2 représentant les courbes de va- riation du nombre de cellules de fibroblastes ayant in- corporé la thymidine tritiée en fonction de la concen- tration de la fraction testée. Exemple 1: Fractionnement de lait frais de vache. En opérant dans des conditions aseptiques, on recueille du lait frais 60 heures environ après le début de la lactation dans des flacons stériles fermés ensuite hermétiquement. Le lait recueilli est soumis à deux opé- rations d'ultracentrifugation, puis à une ultrafiltra- tion. a/ Ultracentrifugation. Le lait frais est soumis à une opération d'ul- tracentrifugation (ultracentrifugeuse Beckmann Model L2-65B rotor SW27), à deux reprises, à 100 000 g (20 000 tours/minute)durant 60 minutes à 4'C. Après l'ultracentrifugation, trois phases appa- raissent, à savoir -: - une phase supérieure ou phase lipidique pré- levée avec précaution afin de ne pas troubler l'ultra- centrifugat, - une phase intermédiaire limpide, prélevée et conservée à 4"C avant l'étape d'ultrafiltration; cette phase est appelée ci-après LFLac, - une phase inférieure ou caséinique. b/ Ultrafiltration. On filtre 170 ml de LFLac dans une cellule Amicon (modèle 402 75 PSI MAX) sous agitation constante, sous une pression de 4 bars. Les membranes utilisées sont des membranes Millipore à seuil de coupure de 50 000 daltons et le cas échéant pour effectuer des essais comparatifs de 27 000 et 1000 daltons. L'ultrafiltration sur membrane 50 000 est arrê- tée lorsque les volumes du retentat et de l'ultrafiltrat sont respectivement de 1/7 et 6/7 du volume initial. Le retentat contenant les fractions renfermant les molé- cules de PM supérieur à 50 000 (désignées ci-après LFLac )(concentration x 7) est congelé à -80'C en aliquotes de 5 ml. L'ultrafiltrat est soumis le cas échéant à une deuxième ultrafiltration sur une membrane à seuil de coupure de 27 000 daltons. Le volume initial est de :60 ml. 30 ml de reterntat sont recueillis et lavés; ils cont:ennent les fractions renfermant les molécules com- prises entre 27 000 et 50 000 daltons (concentration x 4). Ces fractions sont appelées ci-après LFLac 50-27. Aux fins d'utilisation dans des essais comparat-ifs, l'ul-rafltrat à PM inférieur à27 OO0 dal- -ons est soumis à une troisième ultrafiltration sur une membrane de 100 dalzons. Le reentat et l'ultrafiltrat recueil'is contiennent respectivement des _ fractions er.enfermant des molécules à PM compris entre 1000 et 000 daltons, fractions LFLac 10-1, et des fractions LFLac formées de molécules à PM inférieur à 1000 dal- -tons. Les retentats et ultra-iltrat-s sont conservés congelés à -80'C en aliquotes de 5 ml. r.emn'e 2 - Fractonnement de lait de vache pasteurisé. On prépare les deux fractions suivantes: - une fraction LPLacúE, en opérant comme pour le la 'at frais, puis en ster'lisant sur membrane 0,45; cette fraction est constituée par la phase intermédiaire limpide obtenue après ultracentrifugation; - la fraction LPLac 50 par ultracentrifugation puis passage su: membrane à seuil de coupure 50 000 et récupération du -retentat formé de produits de PM supé- rieur à 50 000. Exemple 3: Utilisation de fractions de lait frais selon l'invention comme milieu de culture d'hvbridomes. On indique ci-après a) la nature des hybridomes utilisés dans les essais dont les résultats sont rappor- tés dans cet exemple, b) la nature du milieu de culture et c) les méthodes de mesure de la croissance cellu- laire. a) Hvbrdomes. Les hybridomes sont issus d'une hybridation en- tre les cellules de myélomes Ag 8 de souris et de plas- mocytes secrétant des anti-B lactoglobulines bovines. Les cellules d'hybridomes mises en oeuvre sont en phase de croissance exponentielie dans un milieu avec 10 % de SVF. Ces cellules sont réparties sur une micro- plaque de 24 puits à raison de 105 cellules/puits dans ul de milieu supplémenté et renferment les dif'é- rents produits à tester. b) Milieu de culture. Le milieu de base utilisé est le milieu synthé- tique RPKI 1640 (commercialisé par Boehringer). -Ce mi- lieu renferme: - des acides aminés (excepté la L-glutamine en raison de son instabilité); - du rouge de phénol (indicateur de pH); - un tampon bicarbonate (NaHCO3) qui sert à maIntenir le C02 présent dans le milieu en équilibre ainsi qu'au métabolisme de certaines cellules. Ce milleu est suppéementé afin de répondre a la composltion suivante: RPMI 1640 500 ml L-glutamine 200 mM 5 ml Glucose 30 % 5 ml Pyruvate 1 % 6 ml 0-mercaptoéthanol 5 Pl/ml 1 ml Pérnicilline 100 p/zl 400 Pl Streptomycine 100 PIg/ml 200 pl c) Mesure de la croissance cellulaire. a) On détermine la quantité d'ADN synthétisé en fonction du temps avec différentes concentrations des fractions à tester en effectuant un comptage de radio- act:vité après incorporation de thymidine tritiée. Après l'ajout des fractions à tester, les cul- tures sont mises à incuber pendant 24 heures à 37C. Ces 24 heures représentent un cycle cellulaire. Au bout de 24 heures, la thymidine tritiée (so- lut;on aqueuse de 20 Ci/mmole Amersham) est ajoutée à une concentration de 1 pCi/ml. 50 pl sont ajoutés aux cultures d'hybridomes. On laisse le milieu incuber pen- dan= 18 à 20 heures à 37'C. Après incorporation de la thymidine tritiée, les cellules sont récupérées pour être comptées (compteur: !Liqude scintilla=ion spectrometer Packard Tri-card). On effectue un comptage de la radioactivité (rayonnement B étis par le tritium) dans le compteur. Aux fins d'analyse et de comparaison des résul- tats, une standardisation a été effectuée par rapport à un milieu de référence constitué par un milieu RPMI renfermant 10 % de SVF. On utilise SVF commercialisé par Doehringer Mannheim GmbH, filtré sur membrane 0,22 pm avant d'étre ajouté au milieu. Les essais effectués à différentes concentra- rions de LFLac 50 montrent que cette fraction stimule l'Lncorporation de thymidlne tràti&e à partir d'une concen:ra:tion de 10 %. ) La cinétique de croissance est réalisée par comptage des cellules en fonction du temps et de la concentration des produits à tester. Deux modes opératoires sont rapportés, l'un com- prenant un changement régulier de milieu toutes les 48 heures et le deuxième étant réalisé sans changement de milieu de culture jusqu'à épuisement. La croissance est étudiée sur milieu RPMI sup- plémenté avec les milieux à tester. Il s'agit de plusieurs mélanges: soit SVF 1 À seul, soit SVF 10 À seul, soit LFLac 50 10 À + SVF 1 %. 1) Sans changement de milieu. 2.105 cellules sont placées dans 8 ml de milieu de croissance dans une boîte de 25 cm2 (Falcon). Les cellules sont en phase exponentielle de croissance. Le comptage est réalisé toutes les 24 heures jusqu'à épuisement du milieu qui vire au jaune. 2) Avec changement de milieu. Dans ce cas, on met en culture 6.105 cellules dans 30 ml de milieu de croissance. Après 48 heures d'incubation, on retire 20 ml de milieu très doucement afin de ne pas mettre les cellules en suspension. On agite les 10 il qui restent au fond de la boite et on en prélève une goutte pour le comptage. On rajoute enfin 20 ml de milieu de croissance trais. On effectue la même opération toutes les 48 heures pendant 3 à 4 jours. - Dans le tableau 1 qui suit, on rapporte les va- leurs moyennes du nombre de cellules par ml obtenues sur un nombre n de cupules. Le comptage est effectué au mi- croscope à grossissement x 125. TABLE.AU 1 Heures 48 96 120 144 168 Fractions LFLac 50 10% * SVF 1 40x104 2Czx105 26x10o5 42x10 18x105 SVF 1% 24x104 92x105 92x1o4 76x104 52x104 Ces résultats montrent que LFLac 50 10 % en pré- sence seulement de SVF 1 % entraine une prolifération cellulaire importante et ce, avantageusement, & long terme. La comparaison des résultats obtenus avec SVF 1 % et SVF 10 % permet d'établir les rapports suivants: Prolifération maximale sur LFLac 50 10% + SVF 1% ___________________- -_-- =0,39 Prolifération maximale sur SVF 10% Prolifération maximale sur LFLac 50 10% + SVF 1% _--=_--- = 29 Prolifération maximale sur SVF 1% Sur la figure 1, on a également rapporté les courbes de variation en fonction du temps (en heures) du nombre de cellules d'hybridomes par ml dans le cas de la croissance sur SVF 10 % (courbe t), sur SVF 1 %. + LFLac 10 t (courbe ') et sur SVP 1 %. l'examen de cette figure met en évidence l'ensemble des résultats consi- dérés ci-dessus. * Exemrle 4 * Utilisation de fractions de ai t pasteursé selon l'invention pour des cultures d'hvbridomes à long terme. On effectue les cultures dans un milieu RPMI 1640 contenant LPLac > ZV' 000 10 % + SVF 1 % changé ré- gulièrement. La prolifération cellulaire est maintenue pendant plusieurs semaines. Exemrle Uti'isat:on de fract:ons de laent fra!s selon l'inver.tion comme milieux de culture de fibroblastes. Les résultats rapportées ci-après concernent des cellules de fibroblastes obtenues à partir d'une biopsie de peau d'un enfant de 4 ans, entre le 7ème et le 9ème passage. Le milieu de culture utilisé pour les fibro- blastes est beaucoup moins riche et n'est supplémenté qu 'avec de la Lglutamine et des antibiotiques (dans la t586699 même proportion que pour les hybridomes). - Les fibroblastes détachés et dissociés sont ré- partis dans les 24 puits des microplaques à raison de 3 à 4.104 cellules/ml et à raison de 1 ml par puits. Ils sont laissés 24 heures dans le milieu RPMI 1640 supplé- menté de 10 % de SVF pour fixation, puis lavés deux fois avec 2 ml de milieu RPMI et remis 48 heures dans le mi- lieu sans sérum, ce qui les synchronise en phase Go/Gl. Toutes les expériences se font sur des cellules non confluentes. On mesure l'incorporation de thymidine tritiée en opérant comme décrit pour les hybridomes dans l'exem- ple 4, le temps d'incubation avec les fractions testées étant de 48 heures. Dans le' tableau 2 suivant, on indique les acti- vités moyennes standardisées (coups par 5 minutes de thymidine tritiée incorporée avec standardisation par rapport à un milieu de référence constitué par un milieu RPMI renfermant 10 % de SVF) à différentes concentra- tions de SVF et de LFLac 50. TABLE:AU 2 Concentrations Milieu 1% 5 % 10 % 20 % seul Fractions SVF 1 628 3 014 3 445 5 306 168 LFLac 50 758 2 486 2 951 3 497 168 Les résultats standardisés permettent d'observer une incorporation de thymidine tritiée importante avec la fraction LFLac 50; cette incorporation augmente pro- portionnellement à la quantité de fraction ajoutée au milieu. A une concentration de 10 % de LFLac 50, la stimulation de synthèse de DNA des cellules équivaut à 86 % de celle observée avec SVP 10 % (vol/vol). Ces résultats sont également illustrés par la figure 2 qui comprend les courbes de variation, en fonc- tion de la concentration des fractions à tester, de l'activité moyenne standardisée de la culture cellulai- re, la courbe ' concernant la croissance sur SVF, la courbe O la croissance sur LFLac 50 et la courbe ' la croissance sur SVF 1 % + LFLac 50 10 %. Une série d'expériences similaires a été réali- sée avec des fractions LFLac 50 10 % en présence de SVF % et à titre de comparaison avec SVF 10 % et avec SVF 1 5. On rapporte dans le tableau 3 suivant le nombre de celluies/ml (moyenne de deux essais) à différents temps. TABLEAU 3 Beures 48 96 120 144 168 Fractions ________________________________________________________ SVF 10 % 64.104 86.105 11.106 94.105 63.105o LFLac 50 % * 40.1o04 20.105 26.105 42.105 18.10 SVF 1 % SVF 1 % 24.104 92.105 92.104 76.'104 52.104 Les résultats obtenus montrent que 10 % de LFLac supplémenté de 1 % de SVF présentent une activité équivalente à 10 % de SVF. Exemnle 6 - Utilisation de fractions de lait rasteurisé avec un système de fibro2!aZtes fixés synchronisés. On étudie l'incorporation de thymidine tritiée en opérant comme décrit ci-dessus. Les résultats obtenus montrent également que LPLac E (phase intermédiaire obtenue après ultracentri- fugation, non fractionnée) est moins actif que la frac- tion du même lait ne contenant que les molécules de PM supérieur à 50 000 daltons. - REVENDICATIONS 1. Fractions de lait, caractérisées en ce qu'elles sont formées de constituants ayant un PM d'au moins environ 27 000 et qu'elles sont essentiellement dépourvues de lipides insolubles du type de ceux éli- minables par ultracentrifugation. 2. Fractions selon la revendication 1, carac- térisées en ce qu'elles sont formées de constituants de PM supérieur à 50 000 environ. 3. Fractions selon la revendication 1, carac- térisées en ce qu'elles sont formées de constituants de PM de 27 000 à 50 000 environ. 4. Fractions selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont soit entières, renfermant en mélange les constituants dont les PM sont supérieurs à 50 000, ou bien s'étagent de 27 000 à 50 000, soit fractionnées dans cet intervalle de PM. 5. Fractions de lait selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de fractions de lait frais, de lait pasteurisé, sous forme liquide concentrée ou lyophilisée. 6. Fractions de lait, caractérisées en ce qu'elles sont de type de celles obtenues par ultracen- tr:fugation à une température inférieure à l'ambiante, en particulier inférieure & 0o'C, notamment de l'ordre de 4'C, pendant une durée de l'ordre de 60 minutes, à 27 000 tours environ par m:nute, récupération de la phase intermédiaire et ultrafiltration de cette phase intermédiaire sur une membrane ayant un seuil de coupure approprié dans l'intervalle de 50 000 à 2 000 daltons. 7. Procédé de préparation de fractions selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on soumet une phase limpide de lait, renfermant les protéines solubles du lait, telle qu'obtenue par les prot6ines solubles du lait, telle qu'obtenue par ultracentrifugation du lait et séparation & partir des différentes phases obtenues, a une ultrafiltration avec une membrane à seuil de coupure de 50 000 & 27 000 daltons environ. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on sépare tout d'abord à l'aide d'une membrane i seuil de coupure de 50 000 daltons la fraction de lait formée de constituants de PM supérieur à 50 000, puis on soumet la fraction restante & une ultrafiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure approprié pour l'obtention d'une fraction formée de constituants pré- sentant des PM dans l'intervalle de PM désiré jusqu'à 000 daltons. - 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la fraction obtenue après ultrafiltration est concentrée, préfiltrée puis stérilisée. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 7 à 9, caractérisé en ce que la phase de lait limpide mise en oeuvre dans l'étape d'ultrafi=tration est obtenue avantageusement en soumettant le lait à au moins une opération d'ultracentrifugation, l'ultracen- tr:fugation étant réalisée plus spécialement à 27 OO0 t/mn environ durant 60 mn environ, à une température inférieure à l'ambiante, avantageusement inférieure à 'C, notamment de l'ordre de 4'C. 11. Milieux de cultures cellulaires caractérisés en ce qu'ils comprennent une fraction de lait selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 12. Milieux de cultures selon la revendication i1, caractérisés en ce qu'ils renferment environ 10 À des fractions de lait. 13. Milieux de cultures selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisés en ce qu'ils renferment en outre 1 à 10 À de sérum. 14. Application des milieux de cultures selon l'une quelconque des:evendications 11 à 13 à la culture de cellules d'eucaryotes.