Brevet FR2586700A1 — publié le 19870306

La présente invention est caractérisée par la culture d'une lignée cellulaire animale vectorisée par des milieux de culture enrichis en acides aminés, vitamines, oligo et macro-éléments, de plus par un tissu ou un organe réduit à l'état de poudre micronisée homologue au tissu ou à l'organe que l'on désire traiter. D'où l'originalité et le caractère nouveau de la présente invention. Les cultures cellulaires animales ou végétales doivent se développer dans un environnement contrôlé. Pour obtenir des cultures massives il est nécessaire de mettre les cellules en suspension. La ou les pièces affectées à ces cultures doivent être aseptiques et comprenant, Hotte à flux laminaire vertical ou horizontal avec aspiration ou expulsion totale ou partielle. I1 est donc utile et nécessaire de faire un choix sérieux en regard des différents produits à manipuler à protéger. Les microorganismes et produits pathogènes si ceux-ci sont utilisés doivent également être pris en considération dans le choix de ce type de matériel. Les flux laminaires bénéficient d'un classement par catégorie C, celle-ci en regard des manipulations et cultures que j'ai à effectuer, puis aussi en regard des micro-organismes que je pourrais être appelé à utiliser éventuellement. Les milieux utilisés pour les cultures cellulaires nécessitent un contrôle de qualité strict d'où nécessité d'une formulation stable. Les milieux et sérums devront donc être de haute qualité. Les cellules utilisées proviennent de "l'american type collection (ATCC)". La technique de laboratoire employée est simple mais demande beaucoup de soin de d'attention. La culture cellulaire se définie ainsi par 1) La lignée cellulaire. 2) Le milieu de culture. 3) La technique de culture (suspension monocouche), (j'ai choisi la culture en suspension). 4) La durée de la production, en vulgarisation la production. I1 y a trois types de cellules pour les cultures cellulaires, les cellules primaires, les lignées cellulaires pour cellules à durée limitée et longue durée donc avec un nombre important de passages. Les cellules primaires sont des cellules prélevées directement sur les organes ou tissus spécifiques. Elles sont considérées comme telles jusqu'à la première culture secondaire, ensuite elles deviennent une lignée cellulaire. J'utilise toutefois ces cellules primaires en tant que facteur enrichissant selon certaines conditions très rigoureuses expliquées dans la technique de cultures, ce qui représente une innovation. On définit ainsi le terne de lignée cellulaire par cellules pouvant supporter un nombre de passages in-vitro indéfini, une cellule doit en général pouvoir supporter au moins 70 passages au départ de la souche primaire avant que l'on puisse la désigner conne "lignée cellulaire" une lignée à durée limitée ne peut subir qu'un nombre limite de passage avant de mourir. I1 faut signaler qu'une cellule primaire avant de devenir une lignée cellulaire doit accepter certaines modifications de sa souche, lesquelles peuvent s'effectuer lentement ou très rapidement après quelques passages.Dans les lignées cellulaires la modification ou plus exactement la différence la plus connue est celle de la présence d'un nombre anormal de chromosomes et ce passage alors qu'au départ toutes les lignées cellulaires primaires comportent un nombre normal de chromosomes reste indiqué ou décrit pour le nom de "transformation". Une particularité importante les cellules primaires ne peuvent être réutilisées ou multipliées, on peut les considérer à usage unique (réactif) par contre les lignées cellulaires ont un pouvoir de multiplication. Je travaille la lignée cellulaire en sécurité lorsque j'ai effectué 10 passages à compter de la cellule primaire et ces cultures en suspens ion parce que plus facile à manipuler mais d'observation microscopique plus difficile. Cette suspension ne peut être obtenue qu'a l'aide d'un support.J'emploie dans ce cas le "superbead" de chez "Flow Laboratories". Par contre certaines cellules n'ont pas besoin de ce support. I1 faut signaler que certaines cellules peuvent avoir des comportements qui ne sont pas semblables avec des modes de culture différents, c'est pourquoi et comme je l'ai cité ci-dessus, il estpréférable de travailler avec des cellules en suspension que mono-couches en regard des résultats qui peuvent variés d'une technique de culture par rapport à l'autre. Certes les mono-couches sont plus facilement observables surtout lorsqu'il peut y avoir des modifications cytologiques de plus qu'elles se réalisent plus facilement par fixation d'une façon indépendante. I1 est intéressant de noter également que certaines lignées cellulaires ont tendance à proliférer en excès, tandis que d'autres ne présentent aucune caractéristique particulière jusqu'au stade où elles deviennent confluentes. Une remarque très importante ne jamais travailler dans le laboratoire de production avec deux lignées cellulaires dans le même temps, afin d'éviter le risque de contaminations croisées, tous les locaux doivent d'ailleurs être cloisonnés. Ces lignées en culture doivent être continuellement surveillées jour et nuit avec des vérifications régulières, car elles se dédoublent tous les 3, 4 ou 5 jours, il n'y a donc aucun jour de repos possible, l'on peut bien sûr choisir des lignées cellulaires qui peuvent être fractionnées irrégulièrement ce qui réduit l'imposition ci-dessus mais peut provoquer des risques et des inconvénients. Lorsque la lignée cellulaire est en culture, il faut obligatoirement disposer d'un matériel pour 7 jours consécutifs, cela est très important. Les milieux de culture sont généralement définis par la lignée cellulaire employée.Dans notre cas ceux-ci ont été choisi selon ce critère, explications fournies dans la technique de fabrication. L'eau utilisée pour les cultures cellulaires est de l'eau purifée par osmose inversée et de l'eau ultra pure. Les bases, sérums, additifs, tampons sont sélectionnés, définis avec des critères de pureté et en fonction de lignée cellulaire choisie.-Toute la stérilisation est effectuée par filtration sur membrane, filtre apyrogène pour l'eau et les milieux également. Les sérums utilisés soit sélectionnés égalementenregard de la lignée cellulaire avec des propriétés de compatibilité les additifs incorporer aux milieux suivant une technique aseptique, les tampons idem. La température de stockage de ces produits conformes aux spécifications,l'enceinte à flux laminaire doit comprendre un passage pour le gaz à travers un filtre stérilisant approprié.L'incubateur à C o 2 s'il est nécessaire, toutefois très utile, lorsque l'on utilise du bicarbonate de sodium comme tampon. Tout le matériel agitateur de plaques, système de filtration et de pipettage, plaques et boîtes de culture, verrerie, doivent faire l'objet de la meilleure, attention pour maintenir l'aseptie, tous les flacons doivent être rincés à l'eau ultra pure, auparavant nettoyés avec un détergent "Flow 7x" spécialement étudié pour les cultures cellulaires. Les flacons peuvent être à usage unique, j'utilise cette technique. En résumé un stock important doit être mis en place, car une culture commencée ne peut s'arrêter. Les souches cellulaires peuvent être congelées dans l'azote liquide, ce moyen permet d'éviter les risques de perte par infection ou modification génétique anormale, c'est également un moyen de contrôle, aussi l'on peut au bout de 10 passages congelés un échantillon de la culture donnant la possibilité de contrôler une modification toujours possible pour la suite de la culture puis de réexaminer alors l'échantillon de départ prélevé, Ainsi en procédant par étapes il est possible de déceler où peut se situer cette modification. J'ai rencontré dans mes expérimentations le problème de la croissance lente qui peut et doit être évitée, il faut alors nécessairement vérifier la qualité de l'eau, le pouvoir tampon, vérifier le milieu, le PH, l'osmosalité, le sérum, le support de croissance, la présence d'endotoxines, la contamination, la concentration, la méthode de lavage des flacons de verre, la toxicité des flacons plastiques, les filtres de l'équipement à flux laminaire, la température de l'incubateur, le nombre de passage, le taux de croissance et autres besoins. L'énnemi le plus redoutable est la contamination et toute culture contaminée doit être jetée obligatoirement. Si malgré ces contrôles la contamination se répète, il faut nécessairement vérifier d'une façon soigneuse les incubateurs, l'autoclave, les enceintes à flux laminaire, les procédés de filtration et même les récipients de stockage : une lignée cellulaire contaminée, comme il est indiqué ci-dessus doit être jetée, mais ai aucune souche de remplacement n'est disponible, l'on peut essayer d'effet tuer une décontamination par lavage de la lignée, puis la réimplanter dans une solution antibiotique. Cette lignée cellulaire ainsi lavée et réimplantée, sera rincée et repiquée dans un milieu cette fois sans antibiotique.Ce procédé que j'ai appliqué plusieurs fois comme essais expérimentaux a été répété pendant 8 passages jusqu'à l'obtention sans contamination ne m'a pas toujours donné entière satisfaction, car certaines décontaminations ne réussissent pas toujours disons 1 pour 4 ce qui donne un résultat négatif, mais l'essai peut être tenté. Il est donc absolument nécessaire de suivre toutes les recommandations indiquées dans ce descriptif pour mener à bien une culture cellulaire. Technique de contrôle pour la contamination par mycoplasmes. Différents prélèvements sont opérés dans la culture après chaque passage pour la recherche de mycoplasmes par coloration au "fluorochrome!'. Les cellules sont incubées dans des boites traitées pour la culture cellulaire pendant 5 jours. Pour colorer au fluorochrome il est nécessaire de fixer les cellules. La préparation colorée est ensuite examinée au microscope pour détecter toute fluorescence extra-nucléaire. Technique de contrôle par hémocytomètre. Ne pas trop remplir la chambre, laisser la suspension cellulaire se déposer par capilarité. Compter les cellules dans le carré central et dans les quatres carrés d'angle. Les cellules touchant les lignées supérieures droites du périmètre ne seront pas comptées, celles touchant les lignées inférieures gauches seront comptées. Les cellules mortes se colorent en bleu, le prélèvement de la suspension cellulaire diluée étant auparavant colorée au "TRYPAN Bleu". Le nombre de cellules dans un grand carré sera de : N/5, le nombre de cellules par ml de suspension diluée : 104 N, et le nombre de cellules / Nl de suspension non diluée 104 y . 5 Technique de conseXvation des cellules vivantes. Refroidir la suspension dans un bain d'eau glacée et y ajouter de la glycérine ou du diméthylsulphoxide (D M S O). J'utilise du D M S O pour obtenir une concentration finale de 10 %. La concentration des cellules en suspension devra atteindre 2,5 - 4,0 x 106 cellules viables / ml. Transférer la suspension se trouvant dans un bain d'eau glacée à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille 18 g (rose) dans une ampoule stérile, puis sceller l'ampoule, mettre ensuite l'ampoule dans une boite de polystyrène de 5 x 10 cm d'épaisseur. Fermer la boîte et la mettre au congélateur à -70'C pendant 2 heures. Le taux de refroidissement est de 1'C par minute. Conserver ensuite l'ampoule seule dans un container à azote liquide. Technique de remise en vie des cellules congelées. Il faut lorsque l'on retire l'ampoule du container porter des gants et un masque car il est à craindre qu'une ampoule mal scellée ou non étanche peut exploser en raison du choc thermique. Faire dégeler le contenu de l'ampoule dans un bain d'eau à 37 C, bien nettoyer l'extérieur de cette ampoule à l'aide d'alcool à 70 % puis laisser sècher à température ambiante. Casser l'extrémité de l'ampoule et transférer stérilement le contenu de l'ampoule à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille 18 gr (cône rose) dans un flacon de culture si ce contenu est destiné à celle-ci. Si le contenu est destiné à une culture, il faut ajouter dans le flacon récepteur du prélèvement, du milieu de culture en quantité suffisante pour diluer au 1/10e le D M S 0. Si la culture demande une suspension plus faiblie, centrifuger la suspension à la vitesse de 200 g / 6 minutes avant d'être remise en suspension dans un nouveau milieu de culture. Très souvent j'ai remarqué qu'il était dans ce dernier cas nécessaire d'incuber à 37 C, qu'une atmosphère de 5 % de C 02 , 95 % d'air est utile pour l'obtention d'un Ph adéquat pour la croissance. Au bout de 24 heures il est nécessaire de remplacer le milieu par un nouveau et remettre les cellules en incubation. Culture en suspension. Les cultures en suspension sont envoyées par le fournisseur des souches à raison de 1 x 106 cellules viables par ml. Dès réception il faut les incuber à 37 C. Je contrôlais la viabilité des cellules par coloration mais il faut auparavant amener celle-ci à la température ambiante. Toutes les cultures cellulaires expédiées par les fournisseurs doivent comprendre le nombre de passages -Date d'inoculation -Date de mise en culture - milieu de croissance confluence et numération. Les flasks d'expédition sont complètement remplis de milieu de culture, ils peuvent être réutilisés après décantation pour par exemple des repiquages. Méthode de prélèvement d'un tissu ou d'un organe animal pour vectorisation dans la culture cellulaire. 1) Anesthésier l'animal avec injection intramusculaire ou sous péritonéale avec membutal ( 1 ml par 2 kgs) 2) Désinfecter la peau à l'alcool, inciser avec instruments stériles pour accéder à l'organe ou tissu désiré. 3) Enlever tissu ou organe avec nouveau jeu d'instruments stériles. Déposer ceux-ci dans un flacon stérile ou une boite de pétri (de grand diamètre) stérile également. (Les tissus ou organes sont découpés en morceaux de 2 à 3 mm de côté. 4) Transférer ces morceaux dans un erlenmeyer contenant un barreau magnétique 5) Introduire dans l'erlenmeyer une solution de Earle (sans calcium et magné sium) qui est une solution saline équilibrée et une solution de streptomycine (pénicilline de 4 %, pourcentage par volume). 6) Mettre sous agitation et laver 2 fois avec les mêmes solutions. Jeter après lavage ces solutions, sauf prélèvement. 7) Ajouter ensuite 10 ml par gramme de milieu Earle sans calcium, ni magnésium, auquel il faut ajouter 20 ml de trypsineet 4 % de streptomicine, pénicilline pourcentage par volume. Agiter le tout pendant 15 mn environ, enlever le li quide surnageant. Laisser reposer. 8) Prélever aseptiquement du flacon le prélèvement et le laver 2 fois avec de l'eau ultra pure dans laquelle on ajoute 2 % de sérum de veau nouveau né (pourcentage par volume). 9) Prendre aseptiquement du flacon le prélèvement, le transférer dans une ou plusieurs boites de pétri stériles, faire sècher à l'étuve à 40 10) Après sèchage, broyer et réduire en poudre micronisée à 0,2 micron avec appareillage sous contrôle stériel, conserver au congélateur à - 20'C. 11) Il est possible de lyophiliser le produit sans chercher à une réduction micronisée après broyage. 12) Le prélèvement est prêt pour être introduit dans les cultures cellulaires, Technique de fabrication pour lignées cellulaires vectorisées. 1) Prélever l'organe ou le tissu chez l'animal selon les conditions indiquées par la technique ou méthode de prélèvement d'un tissu ou d'un organe animal pour vectorisation dans la culture cellulaire de peser après le prélèvement l'organe ou tissu. La technique de fabrication reprend donc à partir du n de référence 6 de la méthode de prélèvement. 2) Ajouter dans le flacon contenant le prélèvement 10 ml par gramme de milieu Earle toujours sans calcium, ni magnésium, puis 10 Z (pourcentage par volume) de trypsine, rouge de phénol laquelle doit être à 2,50 / (P/V) 1250, également 4 S (P/V) de streptomicine/ pénicilline. Agiter le flacon quelques minutes à vitesse réduite, laisser reposer, enlever le surnageant. 3) Ajouter dans le flacon contenant le prélèvement 20 ml de trypsine par gramme de prélèvement et agiter pendant 15 mn à 37'C. Laisser déposer et rejeter le liquide surnageant, ce qui permet d'enlever les globules rouges. 4) Rajouter de la trypsine en solution (20 ml par Gr) agiter à 37 C pendar,t 30 mn environ. Laisser reposer les gros débris du prélèvement et décanter la suspension cellulaire à travers une gaze stérile dans un tube à centrifuger, ajouter environ 10 % (P/v) de sérum de veau nouveau né pour arrêter l'action )trypsine. 5) Il est nécessaire de rejeter cettre trypsination, avec les gros débris restants dans le flacon afin d'éliminer complètement les cellules et obtenir uniquement des fibres cellulaires. 6) Centrifuger la suspension à environ 200 gr pendant 10 minutes et rejeter le surnageant. 7) Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture "milieu essen- tiel minimum de Eagle pour cultures en suspension. 8) Faire le comptage des cellules viables avec un indicateur coloré (Tripan Bleu) et hémocytomètre. 9) Diluer la suspension -dans un milieu BME sels de Hanks à raison de 2 à 3 x 106 cellules pr ml. Ajouter à ce milieu 10% de sérum de veau foetal (P/V) et une solution de pénicilline (streptomycine, à 2 % à 5 000 / ml pour la pénicilline et 5 000 microgramme / ml pour la streptomycine, puis 10 ml d'une solution à 20 % du prélèvement micronisée. 10) Incuber pendant 96 heures à 37'C. 11) Après incubation remplacer le milieu BME avec sels de Hanks par un autre milieu BME mais avec sels de Earle auquel on ajoute 10 % de sérum de veau foetal, plus une solution à 2 % d'antibiotique, pénicilline / streptomycine, et 20 ml d'une solution à 30 % du prélèvement micronisé. 12) Incuber à nouveau dans incubateur pendant 72 heures à 37 'C. 13) L'incubateur C 02 doit être réglé à 37'C et à 95 % d'air et 5 % de C o2. 14) Après incubation de 72 heures a 37 C, partager la suspension en X parts égales, introduire (ces parts en volume et poids du récipient avec son contenu) dans des erlenmeyers, y ajouter 200 ml du milieu BME avec sels de Parle, 10 % de sérum de veau foetal, 5 % de milieu nutritif de HAM, maintenir dans une pièce stérile ces cultures, avec un pourcentage de C 2 égale et non supérieur à 5 %. La lumière par tubes fluorescents genre type gros lux mazda doit éclairer le local des cultures d'une façon identique à la lumière du jour à compter -du lever du soleil, jusqu'à son coucher. Le tout règler par horloge.La température du local doit être à 37 C, l'air conditionné et ventilé (climatisation) doit être stérile. Ces condition permettront jusqu'au produit final de réussir ce qui est nécessaire et utile à la croissance, la multiplication des cellules de la lignée cellulaire. 15) Cette dernière culture cellulaire représente un passage, il est nécessaire pour obtenir un produit final d'effectuer 10 passages. 16) A chaque passage doubler les milieux, pour les solutions, milieu nutritif et prélèvement en poudre explications données ci-dessous en exemple pour les sels de Earle la progression sera de 200-400-800-1 600-3 200-6 400 etc. Pour le sérum de veau foetal progression par 5, soit : 10-15-20-25-30-35-40 45-50. Pour le milieu nutritif progression par 5, soit 5-10-15-20-25-30-35-40-45-50. Pour le prélèvement en poudre micronisé celui-ci ne sera ajouté qu'à compter du 4e passage, 6e passage, 8e passage. Au 4e passage 20 ml d'une solution à 40 Z Au 6e passage 40 ml d'une solution à 40 % Au 8e passage 80 ml d'une solution à 40 % 17) Le temps nécessaire entre chaque passage est de 4 jours. 18) Tous les 4 jours, il faudra nécessairement transférer le contenu des récipients, dans d'autres récipients adéquats contenant déjà les solutions et milieux prêts doublés. Il ne faut pas pour des raisons de manipulation prendre des récipients de grand volume il suffit d'effectuer à chaque fois les calculs utiles. Le produit final pour une production de 110 litres doit se trouver réparti en 110 flacons de 1 litre. 19) Pendant la durée de temps entre chaque passage soit 4 jours, les cultures doivent être agitées chaque jour toutes les 2 heures pendant 5 minutes et ceci jour et nuit. 20) Des fin de production cellulaire, centrifuger aseptiquement chaque flacon dans un tube à centrifuger en laissant environ 10 ml du milieu fluvial avec les cellules en suspension qui sont mises en masse cellulaire dans ces tubes. Ajouter (après avoir prélevé le tout et mis dans un flacon stérile de 50 ml à large ouverture) 30 ml d'eau ultra pure, agiter pendant 2 minutes environ. Dès fin de l'agitation, faire subir la technique "ultra-sons" aux cellules jusqu'à éclatement de la membrane cytoplasmique. 21) Recueillir la totalité de la solution qui a été passée à la technique ultrasons et la transférer stérilement dans un récipient de grand volume pour être conservée dans un congélateur à -20 C. 2?) Ce produit peut être congelé jusqu'à 160 C si l'on désire une véritable congélation et conservation. 23) Toutes les conditions de culture ont été réunies pour obtenir un produit final biologiquement pur. 24) Toutes les opérations de contrôle sont effectuées comme précisé dans la présente demande, chaque jour, avec prélèvement d'échantillon à chaque passage. 25) Le local pour la culture d'une lignée cellulaire a été crée à Rennes avec un aménagement particulier, qui a nécessité par la Sté Mazda une étude particulière de tubes fluorescents. L'éclairage, l'intensité, les couleurs, ont été étudiées par moi-même pour la croissance et la multiplication des cellules, selon la luminosité du jour et de la nuit, le tout règlé par système d'horlogerie en regard des saisons, du soleil, de la lune, un nombre de 160 tubes a été nécessaire, la climatisation, l'air, le Co2 ont fait l'objet d'une étude identique. Pour maintenir dans le local d'une façon constante l'équilibre nécessaire soit 95 % d'air et 5 % de Co2 avec une température de 37'C, l'air venant de l'extérieur était filtré, ensuite climatisé, et repris par flux laminaire soufflant vers l'avant. Un autre flux laminaire se trouvait dans le local pour les manipulations de milieux, solutions, et cultures cellulaires. Milieux de croissance pour les cultures cellulaires et autres produits utilisés pour les cultures, prélèvements d'organes et tissus. 1) Milieu essentiel minimum pour cultures en suspension, ajouter 10 % de sérum de veau foetal. 2) Milieu de base Eagle avec sels de Earle contenant 10 % veau foetal (sérum) 2 m M glutamine, 1 % amino acides non essentiels. 3) Milieu essentiel minimum avec sels de Hanks contenant 10 % veau foetal (sérum), 2 mM glutamine, 1 % amino acides non essentiels. 4) Milieu (mélange nutritif de HAM) assoçiation d'acides aminés, oligo et macro éléments, sans bicarbonate de sodium et L glutamine. 5) Milieu essentiel minimum de Eagle pour cultures en suspension. 6) Sérum de veau nouveau né exempt de mycoplasmes et de virus, à utiliser à la dose de 2 Z (P/V) à conserver au congélateur à -20 C (certificat de qualité nécessaire). Conditions exigées pour ces milieux de culture. Doivent être stérilisés par filtration sur membrane 0,2 micron. Pour les produits en poudre être repris par l'eau ultra-pure et stérilisés par filtration. Pour la L. glutamine, ajouter celle-ci au milieu uniquement au moment de l'usage . Ne pas stocker à des températures supérieures à -10'C, vu l'instabilité de ce produit à des températures plus élevées. L'eau doit être apyrogène et contenir moins de 1 PPM de particules solides et moins de 0,1 PPM de métaux lourds. La purification de l'eau doit être effectuée par osmose inversé ou est désionisée, puis stérilisée par filtration à travers une membrane de 0,2 micron. TRYPSINE doit être sans magnésium, sans calcium et rouge de phénol, expédition congelée avec carbo-glace. Trypan bleu, solution å 0,5 % (P/V). Bicarbonate de sodium, solution à 7,5 % (P/V) (citer ici, mais peu utilisé, préférable agir avec tampon HEPES). Amino acides essentiels, en solution. Tampon HEPES, 1 M (spécialité Flow) PH 7,2 - 7,4 à 37 C, il peut être ajouter du bicarbonate de sodium à ce tampon, mais la concentration ne devra pas dépasser 0,85 gr/L. Antibiotiques : En solution pour éviter la toxicité avec les antibiotiques pour les cultures cellulaires en suspension. Il ne faut pas dépasser pour la pénicilline et la streptomycine (les deux antibiotiques choisis) et plus particulièrement lorsque les milieux contiennent du sérum. Pénicilline en unités par ml 100 u/ml,streptomycine en microgramme par ml 100/ ml. Une augmentation de ces unités peut provoquer une réduction de la multiplication des cellules. Sérum Conservés à -20'C dans un congélateur, le sérum doit être exempt de bactériophages, de mycoplasmes de virus. Cette garantie très importante doit faire l'objet d'un certificat vu la nécessité du sérum pour la croissance et la survie des cellules. NOTA : Il existe des milieux préparés, contenant tous ces produits sauf la trypsine. J'ai utilisé les deux à savoir préparés ou non. Tableau concernant le stockage des produits qui viennent d'être énumérés lorsque ceux-ci sont achetés séparément. Antibiotiques conservés à - 20'C durée 1 an L glutamine conservés à - 20'C durée 1 an Vitamines concentrées conservés à - 20'C durée 1 an Amino acides essentiels conservés à - 20 C durée 1 an sérum conservés à - 20'C durée 1 an Utilisation d'un détergent pour la verrerie de laboratoire et autres instruments nécessaires à la culture cellulaire. Conditions : Conserver à la température ambiante PH proche de la normale 7 Biodégradable Séchage en quelques minutes Solubilité maximum Dispersion des solides en suspension et défloculation. Inoffensif pour le verre Pas de toxicité Très efficace Chimiquement sêr à manipuler Pas d'opposition au développement des cultures cellulaires en tubes, flacons, boîtes. A utiliser à la dose de 5 à 10 % pour lavage classique de la verrerie. NOTA : S'il y a saleté grasse ou huileuse, laisser en contact une nuit puis chauffer la solution à la limite de l'ébullition puis jeter,passer ensuite dans eau ultra pure dans cuve à ultra-sons pendant 30mn. Auparavant rincer abondamment en cinq rinçages puis 3 rinçages à l'eau ultra pure. Remarques sur la verrerie Lavage avec solution à 5% de détergent. Toute la verrerie doit être autoclavée à 130 C pendant 10 minutes, mais doit subir auparavant un trempage en bac à ultra-sons avec eau ultra pure pendant 30 minutes. Moyens de contrôle des lots de cultures cellulaires au départ de la culture et en production terminée avant éclatement de la membrane avec gros matériel utilisé Prélever dans la production finale 100 ml, répartir en 4 flacons stériles de 25 ml chacun. Incuber pendant 7 jours à 31 C. Prélever dans chaque flacon 10 ml. Repiquer dans un milieu (bouillon) de tryptone soja et un bouillon à l'acide thioglicolique (ces bouillons s'achètent préparés) puis remettre en incubation pendant 10 jours à 31'C. Ce qui donne 8 milieux recevant chacun 10 ml soit 8 flacons. Chaque flacon est examiné chaque jour, pour la recherche d'une contamination biologique. I1 faut noter que pendant la multiplication des cellules jusqu'à la production finale, des contrôles s'effectuent pour détecter une éventuelle contamination par les mycoplasmes ou l'apparition d'un louche, il est nécessaire pour un contrôle supplémentaire d'effectuer celui-ci sur la fin de production. Si l'on obtient un résultat douteux dans cette finalité, il est nécessaire de recommencer les mêmes tests sur des nouveaux flacons. La moindre contamination détectée , tout le lot doit être détruit. Contrôler le PH pendant toute la multiplication et ceci jusqu'au produit final, ceci tous les 2 jours et 2 fois par jour. Déterminer chaque jour et jusqu'au produit final la taille des cellules, leur morphologie, la présence d'anomalie oblige l'arrêt immédiat de la production et la recherche de celle -ci. Contrôle du nombre de cellules au ml par hemocytomètre tous les trois jours. Contrôle de l'aspect de la culture cellulaire. Dosage des acides aminés par Kit spécial. Détection des mycoplasmes par colorimètre. Système de contrôle en cas de modification cellulaire par prévention en congélation azote liquide après 10 passages, ce qui donne la possibilité d'avoir un échantillon de référence. Contrôle de la ou des pièces où s'effectuent les cultures cellulaires par disposition boites de pétri gélosées (ces boîtes s'achètent prêtes à l'emploi) aux angles. Toute contamination doit arrêter les cultures. Le flux laminaire doit être de classe III (vertical) pour les manifestations nécessaires aux cultures. L'air doit être ventilé par un autre flux laminaire, air pulsé vers l'avant. La climatisation par climatiseur commandée par horloge. Originalité très importante L'éclairage commandé par horloge respectant d'une façon précise l'éclairage du jour et de la nuit par action croissante et décroissante selon le lever et le coucher du soleil (la luminosité) et ceci par tubes spéciaux type mazda adaptés au spectre de la lumière en couleur. Incubateur à Co2 réglable en température, en Co2 en regard celui extérieur, humidité. Etuve à 37 C type bactériologique. Etuve de séchage allant jusqu'à 180', ventilé. Matériel de congélation compagnie des produits oxygénés type minicoul (congélation à -70*C). Pompe à vide et petit compresseur de laboratoire. Microscope avec écran télévision (monitoring) et (appareillage microphotographique. Autoclave sur pied (modèle courant) Etuve à germination. Matériel à ultra-sons pour éclatement membranes cellulaires. Applications des cultures cellulaires animales vectorisées Les cultures cellulaires animales vectorisées trouvent leurs applications dans les industries suivantes Pharmaceutiques, produits vétérinaires, cosmétique, agro-alimentaire, diétitique. En effet, ces cultures cultivées sur milieux spéciaux dans lesquels sont introduits un tissu ou un organe réduit à l'état micronisé provenant d'un prélèvement sur un animal vivant anesthésié, prélèvement choisi en regard, donc homologue d'un tissu ou d'un organe à traiter, donne l'ouverture 9 de très nombreuses possibilités d'actions préventives ou curatives que l'on ne peut situer ici car elles ne peuvent se définir positivement ou négativement qu'en rapport de la demande. La lignée cellulaire cultivée est elle même issue, selon la technique de la culture cellulaire animale, du même prélèvement, toutefois, dans des conditions particulières de culture. Cette technique de prélèvement avec sa lignée représentant un caractère nouveau, auquel s'ajoute en plus l'effet vecteur. Note importante Cultures cellulaires végétales vectoriées. Le prélèvement au lieu d'être un prélèvement animal, est un tissu ou organe végétal homologue. Les milieux de culture ne sont pas identiques mais composés de micro et macro-éléments donc de solution nutritive. La technique de fabrication est la même que pour la culture cellulaire animale vectorisée. REVENDICATIONS 1) Lignée cellulaire animale cultivée avec milieu spécial dans lequel est introduit sous forme micronisée un tissu ou un organe animal. 2) La lignée cellulaire cultivée, caractérisée par le tissu ou l'organe provenant du même animal par prélèvement d'où effet vecteur. 3) Les cultures cellulaires vectorisées sont caPactérisées par la culture réunissant toutes les conditions d'aseptie nécessaires pour mener à bien ces cultures sans contamination, à savoir température à 37 C, apport utile pour développement des cellules en intensité lumineuse, apport d'air stérile et renouveler à 95 % et 5 % de Co2, le tout régulé par système d'horlogerie. 4) Le local pour l'intensité lumineuse, nécessaire à la multiplication et à la croissance des cultures cellulaires, est caractérisé par l'équipement de 160 tubes fluorescents spéciaux étudiés par MAZDA, éclairant les cultures cellulaires à tous les niveaux pour une part, d'autre part cette intensité lumineuse du jour et de la nuit, c'est à dire en respectant les heures du lever du soleil, son coucher pour le jour, la lune idem ou le degré d'obscurité de la nuit. Cette action commandée par un système d'horlogerie est donc croissante, décroissante, le cycle du lever et du coucher du soleil, est ainsi respecté. 5) Les applications possibles caractérisées par ces cultures vectoriées sont très vastes et ne peuvent s'établir qu'en regard de la demande dans les industries pharmaceutiques, vétérinaires, cosmétiques. diététiques, agroalimentaires.