Brevet FR2586426A1 — publié le 19870227

La présente invention se rapporte à un récipient de culture pour cultiver des micro-organismes sur deux milieux de culture distincts. L'invention se rapporte en outre à un récipient de culture pour cultiver des micro- organismes sur un milieu liquide et sur un milieu solide. L'invention est également relative à un système stérile intégré comprenant un milieu de culture solide et un mi- lieu de culture liquide. L'invention prévoit aussi un pro- cédé pour l'incubation d'un échantillon à examiner simul- tanément dans un milieu de culture liquide et sur un milieu de culture solide, ladite incubation étant effectuée dans un dispositif stérile intégral fermé. Les avantages de la culture de micro-organismes d'abord sur un milieu liquide, et par la suite sur un milieu solide, ont été reconnus dans l'art. On a proposé divers dispo- sitifs qui peuvent être classés en deux types de base: a) Un dispositif à un seul composant, comme décrit dans le brevet français n 2 381 103 de l'Institut Pasteur, déposé le 18.2.1977; celui-ci prévoit un récipient pour la culture biologique simultanée sur un milieu liquide et un milieu solide, le récipient contenant un milieu liquide à sa partie inférieure et un milieu solide dans la région d'embouchure d'un bouchon vissé fermant le goulot du ré- cipient. Ce dispositif présente 1' inconvénient d'une visibilité limitée du milieu de culture solide et on ne peut utili- ser qu'un seul milieu de culture solide. En outre, le dis- positif est prévu pour une stérilisation en autoclave et un assemblage aseptique. b) Un dispositif à deux composants, dans lequel un mi- lieu de culture liquide est prévu dans un premier réci- pient et un milieu de culture solide est prévu sur un élément de support dans un deuxième récipient, l'incuba- tion étant effectuée au premier stade dans le milieu li- quide; on attache les récipients entre eux, on met en contact le milieu solide avec le milieu liquide et l'in- cubation se poursuit sur le milieu solide. Le dispositif à deux composants présente l'inconvénient grave d'une contamination possible pendant la phase d'ou- verture du premier récipient et de raccordement du deuxiè- me. En outre, le milieu solide est stocké et transporté dans un récipient séparé et il risque de se détériorer par séchage partiel. Dans le dispositif à deux composants disponible dans le commerce, on rencontre également l'inconvénient d'une condensation dans la région du goulot après extraction de l'incubateur, qui a été signalé dans la littérature comme entraînant des difficultés. Les inconvénients des dispositifs connus à mi- lieux de culture jumelés sont évités à un degré élevé par le nouveau dispositif suivant l'invention, qui présente des avantages importants par rapport aux dispositifs exis- tants. L'utilisation de milieux de culture spéciaux qui peuvent être stérilisés par rayonnement gamma évite éga- lement la nécessité d'un passage en autoclave,de sorte qu'on obtient un dispositif de culture optimal. La présente invention a donc pour objet un dispo- sitif intégré de culture à récipient unique contenant un milieu de culture liquide et un milieu de culture solide. Le dispositif peut être utilisé avec un milieu liquide et un seul milieu solide ou une pluralité de tels milieux solides sur une pluralité de surfaces supports. Le ou les milieux de culture solides (ou semi- solides) sont supportés par un élément porteur allongé qui peut être subdivisé en une pluralité de zones pour supporter une pluralité de milieux de culture. Le récipient est avantageusement à goulot large et le bouchon tient l'élément porteur du ou des milieux solides. Le milieu liquide est prévu à la partie inférieu- re du récipient et il atteint un niveau inférieur au bord inférieur du support du milieu solide. Suivant un mode préférentiel de réalisation de l'in- vention, l'ensemble du dispositif est stérilisé par rayon- nement gamma, ce qui supprime la nécessité d'un passage en autoclave. Dans ce but, on utilise avantageusement des mi- lieux de culture tels que décrits et revendiqués dans le brevet britannique n 1 478 238, qui peuvent être stérili- sés par rayonnement gamma. On introduit le milieu de culture liquide dans le récipient, on insère le bouchon qui porte le support du milieu de culture solide (avec le ou les milieux de culture en place) et on ferme hermétiquement. Après stéri- lisation, le dispositif est prêt à l'utilisation. Il peut être stocké pendant des durées supérieures à six mois sans détérioration. On le stocke bien entendu en position verti- cale, de sorte que le milieu liquide est séparé du milieu solide. Lorsqu'on veut déterminer des micro-organismes, on introduit le sang ou un autre échantillon dans le réci- pient au moyen d'une aiguille de seringue, à travers le joint élastique prévu dans le bouchon, on le disperse dans le milieu liquide et on le laisse incuber dans celui-ci pendant un laps de temps adéquat (de quelques heures jus- qu'à 24 heures environ). La durée préférée est généralement de 6 à 8 heures environ. A ce moment,on renverse la bouteille et le milieu solide est mis en contact avec le milieu liquide, puis on remet le récipient en position verticale normale et l'incubation se poursuit. A la fin de la période d'incubation, on inspecte visuellement, de l'extérieur, la surface du milieu solide et on détermine facilement si des colonies de micro-organis- mes se sont développées sur le milieu solide. La bouteille est conçue de sorte aue, en cas de buée ou de condensation sur la surface intérieure de la bouteille qui pourrait g%- ner l'examen, on peut incliner légèrement la bouteille et la condensation est lavée par le bouillon de culture sans que le liquide ne touche la surface de l'agar. Si c'est le cas, on peut ouvrir le récipient et extraire les bactéries pour d'autres examens classiques. Le support du ou des milieux de culture est si- tué au centre du récipient et la visibilité est donc très bonne. Comme le récipient est large, on peut rincer les parois avec le milieu liquide s'il se produit de la buée. et cela sans que ce liquide touche le milieu solide. Le dispositif à récipient unique supprime le risque de contamination à la fin de l'incubation dans le milieu liquide. On a trouvé que le nouveau dispositif peut être utilisé avec divers milieux de culture, tels que, par exemple: a) bouillon de soja tryptique modifié/gel de soja tryptique modifié; b) bouillon de Columbia modifié/gel de Columbia modifié; c) bouillon d'infusion de coeur et cerveau modifié/gel d'infusion de coeur et cerveau modifié; d) bouillon de soja tryptique modifié/gel de chocolat modifié. Ces milieux sont utilisés pour des cultures aé- robies et dans ce cas le récipient de culture est avanta- geusement pourvu (avant la stérilisation) d'une atmosphère gazeuse appropriée contenant une quantité adéquate de gaz carbonique. Des exemples de milieux de culture pour des iden- tifications anaérobies sont: a) bouillon d'infusion de coeur et cerveau à supplément modifié/gel d'infusion de coeur et cerveau à supplément modifié; b) bouillon d'infusion de coeur et cerveau à supplément modifié/gel de chocolat modifié. On peut également utiliser d'autres milieux nu- tritifs et l'on peut se reporter, par exemple, au brevet britannique précité concernant la production de milieux stérilisés par rayonnement gamma. Tous les milieux résistent aux effets nocifs du rayonnement gamma jusqu'à une dose d'au moins 3,5 Mrad et -cela assure la stérilisation complète de l'intérieur du dispositif de culture. On a effectué de nombreux essais, sans résultats positifs erronés; le dispositif intégré à un seul récipient et milieux à deux phases évite le risque de contamination qui peut se produire avec les dispositifs à deux récipients. Les milieux modifiés indiqués plus haut suppor- tent la croissance même de 0,1 unité de formation de colo- nie (U.F.C.) par ml et on peut atteindre une croissance de bactéries anaérobies, sur la surface du milieu nutritif à phase solide, qui est aussi bonne que celle qu'on peut ob- tenir dans des conditions anaérobies strictes sur des cou- pelles de Pétri. Dans le cas à la fois des milieux aérobies et anaérobies, un milieu gazeux approprié (qui est généralement de l'air enrichi avec 10% enyiron de gaz carbonique pour les milieux aérobies, et de l'azote avec 10% environ de gaz carbonique pour les milieux anaérobies) est introduit dans le flacon avant la stérilisation. Ces résultats sont supérieurs à ceux qu'on pouvait obtenir jusqu'ici dans des dispositifs de culture à deux pha- ses. On a effectué des essais avec une grande gamme de micro-organismes et on a obtenu des résultats satisfai- sants, pratiquement sans résultats positifs erronés. Cela s'applique également à la culture de micro-organismes ana- érobies qui peuvent se développer en colonies visibles sur la phase solide. On peut prévoir deux milieux de culture solides différents sur les côtés opposés de l'élément sup- port. Si celui-ci est de forme triangulaire ou carrée, on peut utiliser simultanément trois ou quatre milieux. Dans la plupart des cas, les milieux de culture utilisés (liqui- de et solide) sont les mêmes ou similaires. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du com- plément de description ci-après qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une coupe longitudinale partiel- le d'un récipient de culture conforme à l'invention; la figure 2 est une coupe transversale du dis- positif de la figure 1; la figure 3 est une coupe longitudinale partiel- le d'un autre type de récipient conforme à l'invention; la figure 4 est une vue en perspective d'un élé- ment support pour deux milieux de culture identiques ou différents; et la figure 5 est une vue d'un autre récipient conforme à l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Comme représenté sur les figures 1 et 2, le dispositif de culture comprend un récipient transparent 11, pourvu d'un goulot large 12 comportant un filetage ex- térieur 13, et un organe de fermeture 14 constitué par un bouchon à filetage intérieur 16 et dans lequel est étroi- tement ajusté un joint 17 en matière élastique, par exem- ple du caoutchouc ou une matière plastique appropriée, qui est en contact avec l'extrémité supérieure du goulot du flacon et qui procure une fermeture hermétique. Le bou- chon comporte une partie centrale 18 se prolongeant vers le bas, qui supporte une tige 19 à laquelle est attaché le support allongé 20 du milieu de culture solide. Ce sup- port présente un rebord circonférentiel, qui lui donne une configuration en coupelle dans laquelle on peut verser le milieu nutritif qui se solidifie dans ledit élément sup- port. Ce support peut présenter une configuration analogue sur sa face arrière qui peut alors être utilisée pour le même milieu nutritif ou pour un milieu différent. Comme représenté, le récipient est prévu pour être rempli jusqu'à un niveau 21 avec un milieu nutritif liquide 22, un espace adéquat étant laissé entre la sur- face supérieure du liquide et l'extrémité inférieure du support du milieu de culture solide. Dans un récipient de mm environ de diamètre et de 120 mm environ de hauteur, une quantité de 50 ml environ de milieu de culture liquide est satisfaisante. Dans ce cas, on utilise un bouchon de mm de diamètre environ. Il est entendu que les dimen- sions sont indiquées à titre d'illustration seulement. La figure 3 représente un dispositif de culture analogue qui comprend un récipient conique transparent 31, en verre ou matière plastique, à goulot large 32, compor- tant un bouchon 33 avec un joint intérieur 34 et une partie se prolongeant vers le bas qui supporte, par l'intermé- diaire d'une tige 36, une palette 37 supportant le milieude culture. Le support est avantageusement fabriqué en une matière plastique inerte. Ce support peut comporter une surface traitée de manière à procurer une meilleure adhé- rence du milieu de culture. Egalement dans ce mode de réa- lisation, le milieu nutritif liquide 38 est introduit jus- qu'à un niveau bien au-dessous de l'extrémité inférieure de l'élément support 37. Le dispositif est utilisé de la même manière que celui qui est illustré par les figures 1 et 2. On introduit les milieux de culture dans le réci- pient et dans le support, o on laisse le milieu solide se solidifier pendant qu'il est en position horizontale. A- vant assemblage et fermeture étanche, on ajuste l'atmos- phère gazeuse dans le récipient selon l'utilisation prévue et on stérilise le dispositif en position verticale par une irradiation ionisante, de préférence une irradiatioh gamma. Après introduction de l'échantillon au moyen d'une aiguille de seringue à travers le joint 34, on mélange le milieu liquide avec l'échantillon. Celui-ci peut être une quantité de quelques millimètres cubes de sang ou d'un autre fluide. Après incubation pendant 4 à 8 heures environ, on examine le milieu liquide pour toutes les variations (couleur, consistance, dégagement de gaz), on met en con- tact le milieu nutritif solide avec le liquide et l'incuba- tion est poursuivie. Le milieu solide peut être mis en con- tact à intervalles prédéterminés avec le milieu liquide. Après un premier laps de temps prédéterminé, on inspecte visuellement le milieu de culture solide et les colonies peuvent être extraites pour une autre évaluation classique. On peut utiliser le nouveau dispositif pour une grande variété d'applications. Il convient pour des cul- tures de sang ou pour des cultures d'autres liquides phy- siologiques. On peut l'utiliser pour vérifier la stérilité de solutions destinées à l'injection, par exemple des solu- tions de perfusion, des solutions d'alimentation, des solu- tions de dialyse. ainsi que de l'eau et Dour d'autres con- trôles de l'environnement, et pour le contrôle de stérilité de produits pharmaceutiques et alimentaires, etc. Le dispositif stérilisé possède une durée de vie adéquate au stockage, sans aucune détérioration apparente ou perte d'efficacité. De tels dispositifs peuvent être fournis dans une grande variété de formes et de dimensions, en fonction de l'utilisation envisagée. La description ci- dessus est seulementdonnée à titre d'exemple et il est entendu qu'on peut apporter des modifications dans la forme,la dimension et l'agencement des composants, sans s'écarter de la pré- sente invention. Un autre mode de réalisation d'un dispositif de culture conforme à l'invention est représenté sur la figure (et la figure 5a qui est une coupe à travers le disposi- tif de la figure 5). Le dispositif représenté sur la figure 5 comprend une bouteille en matière plastique à fond carré 51, dans lequel est placé le milieu de culture liquide 52, et à par- tie supérieure conique 53 qui se raccorde à un goulot 54 comportant un filetage extérieur 55 sur lequel est monté un bouchon 56 muni d'un joint intérieur, non représenté, qui procure une fermeture hermétique entre le bouchon 56 et le goulot 54. A partir du joint, un élément support 57 est dirigé vers le bas et il porte un élément rectangulai- re 58 qui est du type représenté sur la figure 4 et qui supporte avantageusement sur chacune de ses deux faces un milieu de culture solide différent. Comme on le voit sur la figure 5, l'élément 58 se prolonge profondément dans la partie conique 53 et il se termine au-dessus du niveau du milieu de culture liquide 52. On prépare le dispositif de culture comme indiqué plus haut à propos des figures précédentes et on établit dans le récipient une atmosphère gazeuse dé- sirée. Après stérilisation,de préférence par irradiation gamma, le dispositif de culture est prêt à l'emploi. Après incubation, il se forme généralement des gouttelettes sur les parois latérales, qui gênent l'inspec- tion visuelle sur la croissance sur le milieu de culture solide. Grâce à l'inclinaison de la paroi latérale de la par- tie conique, on peut incliner le récipient et rincer les parois latérales avec le milieu de culture liquide sans que celui-ci touche le milieu de culture solide. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion n'est pas limitée à ses modes de réalisation et d'ap- plication qui viennent d'être décrits; elle en embrasse toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit des hom- mes de l'art, sans s'écarter du cadre de l'invention. Revendications 1. Dispositif fermé stérile intégral pour la cul- ture simultanée de micro-organismes sur un milieu nutritif solide et sur un milieu nutritif liquide, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient transparent unique (11) comportant une partie supérieure allongée large et une par- tie inférieure plus large qui est prévue pour contenir le milieu nutritif liquide (22), ladite partie supérieure étant munie à son sommet d'un bouchon de fermeture (15) et d'un joint de fermeture hermétique (17), ladite structure de bouchon et de joint supportant un élément support allon- gé (20) se prolongeant vers le bas pour le milieu nutritif so- lide, cet élément support étant sensiblement parallèle à l'axe central du récipient (11) et s'étendant dans une par- tie substantielle de la partie supérieure du récipient, ledit élément support se terminant au-dessus du niveau du milieu liquide, et des moyens étant prévus pour l'introduction d'un échantillon biologique dans le récipient de culture. 2. Dispositif de culture suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le récipient comprend une partie inférieure larqe et un goulot allongé (12). 3. Dispositif de culture suivant la revendica- tion 1, caractérisé en ce que la partie supérieure (53) du récipient est de forme conique, permettantl'inclinaison du récipient pour éliminer les gouttelettes qui adhèrent à la partie supérieure après culture, sans mettre en con- tact le milieu solide avec le milieu liquide. 4. Dispositif de culture suivant la revendica- tion 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le support (20) du miiieu olide-porte un rilieu nutritif solide distinct sur chacune de ses surfaces opposées. 5. Dispositif suivant la revendication 2, carac- térisé en ce qu'il est stérilisé par une irradiation ioni- sante, de préférence une irradiation gamma. 6. Dispositif suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient un'milieu gazeux en fonction des micro-organismes à déterminer, par exemple de l'air et du gaz carbonique pour des micro-orga- nismes aérobies et de l'azote ou un autre gaz inerte et du qaz carbonique pour des micro-organismes anaérobies. 7. Dispositif suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de culture introduit avant la stérilisation est un milieu modifié de manière à fournir un milieu approprié après stérilisation par irradiation ionisante. 8. Procédé pour la détermination de la présence et pour l'identification de micro-organismes dans des liqui- des physiologiques ou dans des produits pharmaceutiques, alimentaires, industriels et analogues, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire un échantillon liquide à tra- vers le joint d'un dispositif de culture suivant l'une quelconque des revendications 1 à7,à mettre en contact l'é- chantillon avec le milieu de culture liquide et disperser l'échantillon dans ce milieu, à faire incuber pendant' une du- rée prédéterminée, a mettre en contact le milieu nutritif, solide avec le milieu liquide placé dans le même récipient, continuer l'incubation pendant une durée prédéterminée, età déterminer après ce laps de temps si des colonies sont pré- sentes sur le milieu solide et, si oui, évaluer ces colo- nies par des techniques classiques. 9. Procédé suivant la revendication 8, caracté- risé en ce que le milieu de culture solide est mis en con- tact de façon répétée avec le milieu liquide pendant la période d'incubation du milieu solide.