Brevet FR2586564A1 — publié le 19870306

Composés immuno-suppresseurs et leur procédé de préparation L'invention concerne des composés immuno-suppresseurs et leur procédé de préparation. Dans la suite de la description, il est question d'agents ou de substances ayant une propriété dite immuno suppressive, il est convenu que cette propriété est soit immuno-suppressive, soit immuno-épressive, soit immuno-modulatrice, sans qu'il soit nécessaire de le rappeler à chaque fois, Dans le cas de greffe d'organes ou de transplantation de cellules, par exemple de moëlle osseuse, on constate de la part de l'organisme recevant la greffe ou le transplant un phénomène de rejet. Pour combattre ce phénomene de rejet, on utilise soit un sérum antilymphocytaire, soit des substances immuno-suppressives. Un sérum antilymphocytaire est en général très spécifique et son efficacité reste aléatoire. Les substances immuno-suppressives sont au contraire non spécifiques, mais toxiques.C'est pourquoi les résultats observés ne sont pas à la hauteur des espérances. Un but de la présente invention est de proposer des composés immuno-suppresseurs utilisables pour le conditionnement des transplantations d'organes divers et des greffes de moëlle osseuse, notamment dans le cas du traitement de leucémies, de cancers solides, du sida ou de la sclérose en plaques. La présente invention a pour objet des composés immuno-suppresseurs caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la combinaison par liaison chimique d'un anticorps antilymphocytaire et d'une substance immuno-suppressive. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ces composés caractérisé en ce que la combinaison est réalisée en solution aqueuse et en présence de N, N' dicyclohexyl-carbodiimide. Selon l'invention, les composés immuno-suppresseurs sont obtenus en combinant, par une liaison chimique, un anticorps antilymphocytaire et une substance immunosuppressive. I1 faut d'abord remarquer que tous les anticorps antilymphocytaires (gamma-globulines) comprennent la tyrosine et les fonctions amine et hydroxyle, libres, qui permettent d'assurer une liaison chimique avec une substance immuno-suppressive, Les substances immunosuppressives sont natureiles ou d'origine chimique, et elles portent en général une fonction amine ou carboxyle, libre. Si ce n1 est pas le cas, on leur adjoint une telle fonction au préalable. La combinaison d'un anticorps antilymphocytaire et d'une substance immuno-suppressive est réalisée soit par liaison peptidique, soit par diazotation. Dans le premier cas (liaison peptidique) on part par exemple d'un anticorps antilymphocytaire portant le radical - NH2 symbolisé par "Anticorps-NH2" et d'une substance immunoauppressive ou agent portant le radical -COOH symbolisée par "COOH-Agent". Le résultat de la combinaison par liaison peptidique peut s'écrire : "Anticorps-NH-CO-Agent". Dans le second cas (diazotation), c'est la tyrosine que contiennent tous les anticorps qui sert à la liaison. On part d'un anticorps symbolisé par "Anticorps et d'une substance immuno-suppressive symbolisée par "NH2-Agent'1. Le résultat de la combinaison par diazotation peut s'écrire "Anticorps - Agent" La double liaison entre les atomes d'azote est labile par des enzymes qui provoquent une hydrolyse et la libération in situ de l'agent, l'anticorps ayant joué le rôle préalable de vecteur spécifique pour l'agent. Ce rôle de vecteur est très utile car si, en cours de traitement, une substance immuno-suppressive devient inefficace par accoutumance, on peut la remplacer par une autre en combinaison avec le même vecteur. Les anticorps antilymphocytaires sont obtenus par l'une des'trois méthodes suivantes - immunisation de lapins. On injecte par voie intramusculaire à des lapins, pendant 4 semaines, trois doses hebdomadaires de 30 mg d'antigènes (lymphocytes), avec addition de l'adjuvant de Freund. Le sérum est collecté au 9e jour après la derniere injection. On isole les anticorps antilymphocytaires (gamma-globulines) par précipitation a l'éthanol, selon la technique de Deutsch. - hybridation cellulaire. L'hybridation de lymphocytes avec des cellules de myélome permet d'obtenir des anticorps monoclonaux antilymphocytaires. - génie génétique. Des anticorps provenant du sérum de lapins, sont inclus dans des bactéries (par exemple Escherichia Coli) pour une reproduction cellulaire rapide. Ensuite, on extrait les anticorps en plus grande quantité. Comme substance immuno-suppressive, on peut utiliser par exemple le melphalan, ou N-N'para di (chloro-éthyl)-amino-L-phénylalanine, ou bien la mercapto-6-purine. La combinaison par liaison chimique des anticorps antilymphocytaires et des substances immuno-suppressives se déroule de la manière suivante, pour chacun de ces deux exemples. Exemple 1 - Melphalan. 10 mg de melphalan sont dissous dans un mélange d'eau et de propylene-glycol. On y ajoute une solution aqueuse de 150 mg de gamma-globulines contenant 20 mg de N,N'dicyclohexyl-carbodiimide. Le résultat de la combinaison par liaison chimique est le suivant Exemple 2 - Mercapto-6-purine. 10 mg de mercapto-6-purine sont dissous dans le liquide de Hanks additionné de bicarbonate de sodium a 1 %. On ajoute les gamma-globulines en solution aqueuse a pH=8,6 en présence de 20 mg de N,N'dicyclohexyl-carbodiimide en solution aqueuse, sous agitation magnétique. On agite le mélange 370C pendant une heure. On refroidit a 40C et la partie insoluble est éliminée par centrifugation. Le résultat de la combinaison par liaison chimique est le suivant Les composés immuno-suppresseurs selon l'invention sont applicables en cas de greffe ou transplantation d'organes (rein, coeur,...) ou de moëlle osseuse. Ces greffes de moëlle interviennent notamment dans le cadre de la thérapie des leucémies, des cancers solides, du sida et de la sclérose en plaques. La combinaison d'un anticorps spécifique et d'une substance immuno-suppressive est tres intéressante dans la mesure où l'anticorps joue le rôle de vecteur pour le composé, et où la libération de la substance immuno-suppressive intervient in situ. Ces deux caractéristiques permettent un meilleur contrôle de la réponse immunitaire. REVENDICATIONS 1/ Composés immuno-suppresseurs caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la combinaison par liaison chimique d'un anticorps antilymphocytaire et d'une substance immuno-suppressive. 2/ Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la substance immuno-suppressive est la N,N'para di (chloro-éthyl) amino-L-phenylalanine ou melphalan. 3/ Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la substance immuno-suppressive est la mercapto-6-purine. 4/ Procédé de préparation des composés selon la revendication 1 caractérisé en ce que la combinaison est réalisée en solution aqueuse et en présence de N,N'dicyclohexylcarbodiimide. 5/ Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la liaison chimique est une liaison peptidique. 6/ Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la liaison chimique est obtenue par diazotation.