Brevet FR2586688A1 — publié le 19870306

ANTIBIOTIQUES PEPTIDIQUES L'invention a pour objet de nouveaux antibiotiques peptidiques et leur utilisation comme agents antimicrobiens et antitumoraux. La présente invention concerne également des méthodes de préparation de ces antibiotiques, de leurs intermédiaires et le nouveau microorganisme utilisé dans leur préparation par fermentation. Divers microorganismes ont été isolés d'échantillons du sol, cultivés dans un milieu synthétique et on a trouvé qu'ils donnaient naissance à des produits présentant une activité antibiotique. On a isolé une nouvelle espèce de bactéries, K481-B101, dans un échantillon du sol recueilli près du Parthénon à Athènes en Grèce et on a trouvé qu'il conduisait à un mélange de peptides présentant une activité antibiotique. C'est un objet principal de la présente invention que de procurer de nouveaux antibiotiques peptidiques particulièrement utiles comme agents antifongiques et antitumoraux. C'est également un objet de la présente invention que de procurer des méthodes convenant à la préparation de ces antibiotiques. Et c'est encore un objet de la présente invention que de procurer des compositions pharmaceutiques contenant ces antibiotiques. En accord avec les buts mentionnés ci-dessus, la présente invention a pour objet un composé de formule: CH3 OH H E ELc H-OH N R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-&H-ICO-NH N v CH3 dans laquelle: R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3-(CH2)8. Selon encore un autre aspect, la présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité de ces composés, seuls ou en combinaison, efficaces en tant qu'agents antifongiques et/ou anti- tumoraux en mème temps qu'un support pharmaceutiquement acceptable. Sous son aspect préparatif, la présente invention a pour objet une méthode de préparation d'un composé de formule CH3 OH H 1 E tH-OH _ o o OH R-CH=CH-CH=CH-CO-NE-CH-CO-N 0 CH3 dans laquelle: R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3(CH2)8, qui consiste à cultiver une espèce nouvelle de Polyangium brachysporum dans un milieu nutritif contenant une source assimilable de carbone et d'azote dans des conditions aérobies, à séparer le mycélium produit et à récupérer le composé dans le milieu nutritif. Sous un autre aspect de composition, la présente invention a pour objet les composés: OH H NH 2 Ol CH3 et CH3-iCHç-H-CO-NH O CH3 utiles comme intermédiaires dans la préparation des composés selon l'inven- tion et des méthodes de préparation de ces composés intermédiaires. Les figures 1, 2 et 3 représentent respectivement les spectres IR du BU2867T A, B et C. Les figures 4 et 5 représentent les spectres 1H-RMN et 13C-RMN du BU-2867T A. La caractérisation morphologique physiologique et sur le plan de la culture du K481-B101 a été faite par les méthodes décrites par: - McCurdy, Jr. H.D.: Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales. II, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J. Syst. Bacte- riol. 20, 283-296, 1970; - Reichenbach, H.: Nannocystis exedens gen. nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiaceae. Arch. Mikrobiol. 70, 119-138, 1970; - Christensen, P. and F. D. Cook: Lysobacter, a new Genus of non- fruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Intl. J. Syst. Bacteriol. 28, 367-393, 1978; et - Christensen, P.: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst. Bacteriol. 27, 122-132, 1977. - Maintenance and purification was by the procedures décrites par Petersen, J.E.: Isolation, cultivation and maintenant of the myxo- bacteria. Methods in Microbiology 3B, 185-210, 1969. Edit. J.R. Norris & D. W. Ribbons. Academic Press (Londres et New York); et - Reichenbach, H. & M. Dworkin: The Order Mixobacterales. The Proka- ryotes. Volume I: 328-355, 1981. Edit. M. P. Starr et al. Springer- Verlag (Berlin, Heidelberg et New York). La position taxonomique a été déterminée selon les descriptions du manuel de Bergey, 8ème Edition, 1974 et "The Prokaryotes, Vol. I'". Morphologie L'agar-agar de Casitone-Mg+, l'agar-agar de chitine, l'agaragar de cellule de levure et le mélange fumier de lapin pastillé-agaragar-eau ont été utilisés pour l'étude morphologique. Le K481-B101 est une bactérie gram-négative non-flagellée. Les cellules végétatives sont cylindriques (0,6 à 0,8 x 2 à 10 micromètres) avec des extrémités arrondies émoussées. Les cellules végétatives exécutent des mouvements de glissement lents et flexibles sur la surface humide du milieu d'agar-agar ou sur le milieu tendre d'agar-agar. Les myxospores diffèrent nettement des cellules végé- tatives, elles sont ovales ou sphériques, de 0,6 à 0,8 x 0,6 à 1,5 micro- mètres, réfringentes ou non et vont occasionnellement par paires. Le K481-B101 forme sur la plupart des milieux descriptifs d'agar- agar des sporanges sessiles qui enveloppent les myxospores. Les sporanges sont ovales, sphériques ou en forme d'oreiller, assez variables dans leurs dimensions, de 12 x 20 à 80 x 120 micromètres, souvent délimités par une enveloppe commune ou une couche gluante, à doubles contours et ils apparaissent seuls ou en grappe (sort). La morphologie du K481-B101 est représentée sur le tableau I. Caractéristiques de culture Le K481- B101 pousse modérément sur agar-agar de casitone-Mg++ (McCurdy 1969) et sur l'agar-agar de cellules de levure (Christensen et Cook, 1978), mais pousse mal sur agar-agar bacto-nutritif ou agar-agar d'infusion bacto- cardiaque. Des essaims rhizoTdes ou emplumés s'observent sur agar-agar mou YP (extrait de levure 0,3%, peptone 0,1%, NaCl 0,01%, agar-agar 0,3%, pH 6,6 à 6,8), mais pas du tout sur agar-agar de casi- tone-Mg++. Les colonies observées sur agar-agar de casitone-Mg++ sont circulaires, translucides ou d'un jaune vert pale et elles attaquent faiblement l'agar-agar, l'érodent ou y pénètrent. Les caractéristiques de culture sont représentées sur le tableau 2. Caractéristiques physiologiques Le K481-B101 hydrolyse l'amidon, la chitine, la gélatine ou la caséine, mais n'hydrolyse pas la cellulose et l'agar-agar. Il lyse les cellules de levure passées à l'autoclave, mais ne lyse pas les cellules vivantes de Micrococcus luteus. Le K481-B101 est mésophile et il est sensible au NaCl à 2%. Les caractéristiques physiologiques sont représen- tées sur le tableau 3. Concomitance des bactéries flagellées et occurrence de variants spontanés Sur la culture initiale, on observe la concomitance de bactéries gramnégatives flagellées en forme de bâtonnets. Le K481-B101 se purifie assez bien en combinant les techniques classiques de dilution et de sépa- ration de cellules uniques par traitement aux ultra-sons, traitement par choc thermique ou sensibilité aux antibiotiques (par exemple, acide pipé- midique à 50 mcg/ml) en utilisant le myxospore ou un organe sporogène. Une culture non purifiée de K481-B101 donne lieu à la formation de variants mucoTdes qui forment une colonie blanchâtre en forme de d6me entourée d'un halo. Les cellules végétatives de ces variants mucoTdes sont un peu plus grandes que la souche d'origine et elles ont des dimensions de 0,8 à 1,0 x 2,0) 3,5 micrométres. La grappe de sporanges (sorus) est formée, en majorité, par des variants mucoTdes. Position taxonomique Le K481-B101 est une bactérie glissante susceptible de se diviser que l'on a isolé dans un échantillon de sol. Les caractéristiques majeures de diagnostic de la souche sont les suivantes: Cellules végétatives 1). cylindriques, de diamètre uniforme 2). extrémités non biseautées 3). susceptibles de pénétrer dans un milieu d'agar-agar 4). rouge congo, non adsorbé Myxospores 1). se différencient des cellules végétatives 2). ovales ou sphériques 3). réfringentes ou non Sporanges 1). sessiles 2). ovales, sphériques ou irréguliers 3). souvent délimités par une enveloppe commune ou une couche gluante 4). à double contour 5). jaunes pales (manque d'une couleur distincte) 6). apparaissant seuls ou en grappes (sori) Caractéristiques et physiologiques et de culture 1). en colonies jaune d'or a blanchâtre 2). les colonies attaquent faiblement l'agar-agar, l'érodent ou y pénètrent 3) . chitinolytiques mais non cellulolytiques 4). lysent des cellules de levure, mais ne lysent pas du Micrococcus luteus Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et de culture mentionnées ci-dessus du K481-B101 indiquent que le K481-B101 se classe dans l'ordre des Myxobacterales. Parmi les genres de Myxobacterales, les genres Myxococcus, Archangium et Cystobacter se différencient du K481-BI01 par leurs cellules végétatives biseautées et la morphologie des organes sporogones. Les genres Melittangium, Stigmatella et Chondromyces diffèrent du K481-B101 par leurs sporanges à tiges. Le K481-B101 est semblable aux genres Polyangium et Nannocystis. Le K481B101 ressemble au genre Nannocystis par les formations des myxospores ovales ou sphériques et par les sporanges ovales ou sphériques mais il diffère de ce dernier par les cellules végétatives cylindriques de diamètre uniforme et le manque d'aptitude à attaquer, éroder l'agar-agar et à y pénétrer. Le K481-B101 ressemble au genre Polyangium par ses cellules végétatives cylindriques à extrémités arrondies émoussées, la formation prédominante de myxospores non-fringents et les sporanges ovales ou sphériques à double contour. Sur la base des résultats des études compara- tives avec les genres de l'ordre Myxobacterales, on considère que le K481B101 est à classer comme une espèce du genre Polyangium. Parmi les espèces de Polyangium, le P. luteum est semblable au K481-B101 par la dimension des cellules végétatives, la couleur et la forme des sporanges et la couleur des colonies végétatives. Cependant, le K481-B101 diffère du P. luteum par les myxospores ovales ou sphériques qui sont très contractées et par le manque d'aptitude 3 lyser les cellules bactériennes vivantes telles que, par exemple, les cellules de Micrococcus luteus. On en conclut donc que le K481-B101 est une nouvelle espèce du genre Polyangium dans la famille des Polyangiaceae, de l'ordre des Myxobacterales et on propose de le désigner sous le nom de Polyangium brachysporum sp., nov. La souche type est le n K481-B101 (souche unique) dont la culture a été déposée à l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le nO d'accès ATCC 53080. Cellules végétatives Myxospores Sporanges TABLEAU 1 Morphologie du K481-B101 gram-négatives, cylindriques à extrémités arron- dies émoussées (0,6 à 0,8 x 2,0 a 10 micromètres), rouge congo non adsorbé. se distinguent des cellules végétatives. très rétrécies, devenant ovales ou sphériques, 0,6 a 0,8 x 0,6 a 1,5 micromètres, non-fringentes. Une incubation prolongée donne des cellules réfrin- gentes. sessiles, apparaissant seuls ou en grappe. De forme ovale, sphérique ou forme d'oreiller ou informes. De dimensions variant considérablement, 12 x 20 à 80 x 120 micromètres. Délimités par une enveloppe commune ou une couche gluante. A double contour. Incorporés à l'agar-agar. Des grappes de deux à dix sporanges ou plus ont des dimensions totales de 50 à 300 micromètres. Micr Forn Suri El é' Bord Pror Coul Pigm Croi rocolonies: sur agar-agar de chitine après incubation pendant deux semaines. On observe une disposition en palissade ou en zig-zag des chaînes de cellules végétatives en périphérie. On observe un mouvement glissant des cellules isolées, mais on n'observe pas de mouvement des masses de cellules. TABLEAU 2 Caractéristiques de culture des colonies de K481-B101 sur agar-agar de casitone-Mg++ (McCurdy, 1969) à 28 C pendant six jours me: circulaire face: lisse, par la suite partiellement ridée vation: importante dure: entièrement ou quelque peu irrégulière et absence de saillie distincte en forme de langue, de plume ou de rhizoTde priétés optiques: semitransparente ou opaque leur des colonies: jaune verdâtre pale nent diffusible: aucun issance sur agar-agar de chitine après incubation à 28 C pendant trois semaines: mince, translucide, jaune pale ou incolore. Epaisse, opaque jaunatre en périphérie. Formation concentrique de sporanges faible attaque, érosion ou pénétration dans l'agar-agar. TABLEAU 3 Caractéristiques physiologiques du K481-B101 et blanc en périphérie, Hydrolyse de: - amidon soluble - amidon de pomme de terre - CMC sodium cellulose - agar - chitine - alginate de sodium - polypectate de sodium gélatine - caséine + + + + + + Tableau 3 (suite) Croissance sur: - agaragar de citrate de Simon - agar-agar de citrate de Christensen - selt d'agar-agar de glucose ammonium - selt d'agar-agar d'asparagine ammonium Production de: - indole - H2S - acétoTne (réaction de VP) - uréase oxydase - catalase Action lytique sur: - cellules vivantes de souches de Micrococcus luteus - cellules de levure passees à l'autoclave Réactions: coagulation du lait: - peptonisation du lait: + tolérance a NaCl: croissance: sur NaCl 1,0% ai tolérance au pH température de croissance + + + + + Ju moin1 pas de croissance: NaCl a 2,0% ou : intervalle de croissance: pH 5,5 faible croissance: pH 5,0 pas de croissance: pH 4,5 et 11,5 s plus a 10,5 : croissance maximum: 37 C intervalle de croissance: 15 C A 42 C pas de croissance: 10 C et 45 C réaction d'oxydation ou de fermentation: oxydante (en milieu de Hugh et Leifson) Production d'antibiotique: On propage la culture de base de Polyangium brachysporum K481-B101 à 28 C pendant trois jours sur milieu d'agar-agar incliné composé d'amidon soluble à 0,5%, glucose 0,5%, extrait de viande 0,1%, extrait de levure 0, 1%, Nz-case 0,2%, NaCl 0,2%, CaCO3 0,1% et agar-agar 1,6% (pH 7,0). Un morceau d'une culture réussie sur agar-agar incliné est utilisee pour inoculer le milieu végétatif constitué de 2% d'amidon de mais, 3% de farine de soja, 0,3% de MgSO4.7H20 et 1% de CaCO3 (pH 7,0, avant stérilisation). Après incubation à 28 C pendant trois jours sur agitateur rotatif (250 tr/mn), on met 5 ml de la culture dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu de production ayant la même composition que le milieu végétatif. On surveille la production d'antibiotique par la méthode de diffusion sur disque d'agar-agar sur papier en utilisant le Candida albicans A9540 comme organisme test. On poursuit la fermentation pendant quatre jours à 28 C sur un secoueur rotatif et la production d'antibiotique atteint son maximum de 100 mcg/ml. On effectue également la fermentation dans un fermenteur en cuve agitée. Une portion de 500 ml de la culture d'ensemencement obtenue par fermentation en flacon est utilisée pour inoculer 10 litres du milieu de production dans un récipient de 20 litres. On effectue la fermentation à 28 C avec agitation a 250 tr/mn et aération au débit de 10 1/mn. La pro- duction d'antibiotique atteint son maximum de 150 mcg/ml après une fermen- tation de quarante heures. Séparation et purification de l'antibiotique: On centrifuge le bouillon de séparation (48 l) à l'aide d'une cen- trifugeuse sharpless. Le gâteau mycénien est homogénéise a l'aide de 7 1 de méthanol et on agite le mélange pendant une heure. Après élimination des insolubles par filtration, on évapore l'extrait au méthanol en une solution aqueuse que l'on rassemble avec le filtrat du bouillon et on extrait avec du n-butanol (24 1). L'extrait est concentre a 0,5 1 que l'on verse dans du n-hexane (3,5 1) sous agitation pour précipiter l'antibiotique brut (41 g) . On passe ce solide en chromatographie sur une colonne de gel de silice C200 (760 ml), on élue à l'acétate d'éthyle et avec une quantité croissante de méthanol (O a 50%). La bioactivité éluée est détectée par un essai sur disque de papier en utilisant comme organisme de test le Candida albi- cans A9540. On rassemble les fractions actives et on évapore en une poudre jaune pale (13 g) du complexe de BU-2867T. On passe une partie de 200 ml de ce solide en chromatographie sur colonne à phase inverse (C18, 100 ml) en utilisant comme éluant un mélange éthanol-eau (3/7 à 5/5). On surveille l'éluant par un essai antifongique et par TLC (silane, EtOH/H20 = 55/45). On rassemble les premières fractions actives et on évapore sous pression réduite, ce qui donne du BU-2867T A solide blanc pur (61 mg) que l'on cristallise dans du méthanol aqueux et il se dépose des aiguilles incolores (34 mg). Une évaporation de la seconde et de la troisième fractions actives donne respectivement du BU-2867T B (1 mg) et C (11 mg). On cristallise le BU-2867T C dans le méthanol sous la forme de fines aiguilles. Une répéti- tion de la chromatographie en phase inverse ci-dessus donne un total de 3, 9 g de BU-2867T A, 44 mg de BU-2867T B et 342 mg de BU-2867T X. Caractérisation de l'antibiotique On isole les BU-2867T A et C sous la forme d'aiguilles incolores tandis que l'on obtient le BU-2867T B sous la forme d'une poudre amorphe blanche. Ils sont facilement solubles dans le méthanol, l'éthanol, le n-butanol et le diméthylsulfoxyde, légèrement solubles dans le chloroforme, l'acétonitrile et l'acétate d'éthyle et pratiquement insolubles dans le n-hexane et l'eau. Ils donnent une réponse positive aux réactifs de Rydon- Smith et se colorent par pulvérisation d'iode ou d'acide sulfurique sur une plaque de TLC. Ils sont négatifs à la réaction à la ninhydrine, à la réaction de Sakaguchi, à la réaction à l'anthrone et à la réaction de Dragendorff. On analyse respectivement le BU-2867T A, B et C comme ayant respectivement la formule C27H44N406, C2gH46N406 et C29H48N406, par spectrométrie de masse et par microanalyses. Les spectres UV des trois composants dans le méthanol présentent un maximum unique à 261 nm, qui ne dérive pas en solution acide ou alcaline. Les données physico-chimiques du BU-2867T A, B et C sont résumées dans le tableau 4. Leur spectre IR sur KBr (figures 1, 2 et 3) présentent des raies amidiques intenses aux environs de 1630 et 1540 cm'1 et une absorption OH et/ou NH à 3300 cm'1. Le spectre 1H-RMN du BU-2867T A (figure 4) révèle la présence de six protons olefiniques (6: 6,16, 6,20 (2H), 6,28, 6,49 et 7,09 ppm) et quatre protons amidiques (&: 7,49, 7,82, 7,87 et 8,72 ppm). Deux groupes méthyliques (6: 0,93 ppm, t et 1,07 ppm, d) sont également observés dans le spectre. Le spectre 13C-RMN du BU-2867T A (figure 5) montre plus de vingt-trois signaux de carbone comprenant quatre carbones carbonyles, six carbones oléfiniques et trois carbones méthyliques. Les BU-2867T B et C présentent des spectres 13C-RMN très semblables a celui du BU-2867T A exception faite de la présence de deux carbones oléfiniques de plus dans le BU-2867T B et de deux carbones méthyléniques de plus dans le BU-2867T C que dans le BU-2867T A. On chauffe le BU-2867T A à reflux en présence de HCl 6N pendant seize heures. Apres élimination du produit lipophile (V) par extraction à l'acé- tate d'éthyle, on concentre l'hydrolysat en un résidu huileux que l'on passe en chromatographie sur résine échangeuse d'ions Dowex 50W x 4 par développement en présence d'un tampon pyridine-acide formique-acide aceti- que (0,1 t 0,2M, pH 3,1 t 5,1). Par surveillance au réactif de ninhydrine, quatre aminoacides I, II, III et IV élues dans cet ordre sont isolés et cristallisés sous la forme de leurs chlorhydrates. On identifie l'amino- acide I ({a 5 : -12,7 dans HC! SN) conmme étant la L-thréonine par ses propriétés physico-chimiques. Le spectre 1H-RMN et le EI-MS (M+ + 1:m/z 134) de l'aminoacide II indique qu'il s'agit d'un mélange de diastéreoisom.res d'acide 4-amino-3-hydroxy-n-valérique, Konishi, M.; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K. Asama, H. Tsukiura, T. Naito & H. Kawaguchi: Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin, II. Structure determination of tallysomycine A and B. J. Antibiotics 30, 789-805, 1977, et son identité est confirmée par une comparaison directe avec l'échantillon authentique. A L'aminoacide III, on assigne la formule moléculaire C5HgN02 par analyse élémentaire et spectrométrie de masse EI (M+: m/Z 115). Son spectre 1H-RMN indique la présence d'un méthyle ( 1,50 ppm, d, I = 6,0 Hz), un méthyle (6: 4,0-4,2, m) et deux protons transolefiniques (6: 6,05 ppm, d, I = 15,0 Hz et 6,57 ppm, d-d, I = 6,0 et 15, 0 Hz). Ces données spectrales indiquent nettement que pour III, il s'agit d'acide 4-amino-2(E)-penténoTque, Honore T.; H. Hjeds, P. KrogsgaaedLarsen et T.R. Christiansen: Synthesis and Structure-Activity Studies of Analogs of ramino-butyric acid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13:429-434, 1978. A III, on assigne la configuration 2(S) sur la base de son pouvoir rotatoire spécifique ({(}2,5: _6 dans HCl, 5N). On détermine que l'aminoacide IV représente la 4-hydroxylysine sur la base de son analyse élémentaire (C6H14N203), de EI-MS (M + 1: m/z 163) et de son spectre 1H-RMN( & 1,8- 2,1 ppm, 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t et 3,6-4,3 ppm, 2H, m) et la formation du dérivé r-lactone (\C=O: 1770 cm-1) par traitement a l'aide de HCl 6N. Izumiya N.; Y. Fujita, F. Irreverre & B. Witkop: The Synthesis of Erythro- rhydroxy-L-lysine and its Non-occurrence in Collagen. Biochemistry 4, 2501-2506, 1965, indique la muta-rotation des 4-hydroxy-lysines et la dérive observée pour IV indique une configuration L-érythro. Ainsi, on établit que la structure de l'aminoacide IV est celle de l'érythro-4-hy- droxy-L-lysine. La fraction acide lipophile (V) obtenue par l'hydrolyse acide ci- dessus par du diazométhane, ce qui donne un ester méthylique huileux (VI) après purification chromatographique. Son spectre UV ()naxMeOH: 260 nm, E: 22 000), EI-MS (M+: m/z 210) et 1H-RMN (quatre -CH=, un C-CH3 et six CH2-) indique que pour VI il s'agit de 2,4-dodécadiénoate de méthyle. La magni- tude de la constante de couplage rend évident que les doubles liaisons ont toutes deux une géométrie trans. L'acide initial V est donc l'acide 2(E), 4(E)-dodécadiénoTque, Burden, R.S. & L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new series of alka-2,4-dienoic tyramine- amides from Anacyclus pyrethrum D.C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969: 2477-2481, 1969. I: L-threonine CH3-CH-CH-COOH OH NH2 II: acide 4-amino-3-hydroxy-n-valérique CH3-CH-CH-CH2-COOH NH20H III: acide 4(S)-amino-2(E)-penténoTque CH3-CH-CH=CH-COOH NH2 IV: érythro-4-hydroxy-L-lysine NH2-CH2-CH2-CH-CH2-CH-COOH OH NH2 V: 2(E),4(E)-dodécadiénoTque CH3-(CH2)6-CH=CH-CH=CH-COOH Le BU-2867T A présente la formule moléculaire C27H44N406 et il renferme six carbones olefiniques et quatre carbones amidiques par son spectre 13C-RMN. Il apparaît donc que l'aminoacide II est un artéfact produit par hydrata- tion de l'aminoacide naturel III pendant l'hydrolyse acide. L'antibiotique devrait être un peptide cyclique puisqu'il est négatif à la réaction à la ninhydrine et ne présente aucune fonction titrable lors d'une dosage potentiométrique. Ceci est encore confirmé par le fait que le BU-2867T A donne un dérivé de di-O-acetyle (EI-MS: M+ = m/z 604, 1H- RMN: 2,02 ppm, 3H et 2,08 ppm, 3H) par acetylation dans la pyridine. Le spectre de masse de l'acétate indique également des ions fragmentaires intenses m m/z 179 et 322 qui suggèrent la présence de la séquence V + I + dans l'antibiotique. On soumet le BU-2867T A a une dégradation enzymatique en présence de ficine dans un tampon de phosphate O,01M (pH 7,0). Apres acidification à pH 2,2, on extrait le mélange réactionnel à l'aide de n-butanol et on obtient un composé acide (VII). Une extraction ultérieure de la solution aqueuse à pH 10,0 à l'aide de n-butanol donne une substance positive a la ninhydrine (VIII). Il apparaît que le composé VII est la 2,4dodécadiénoyl- threonine (V + I) par son spectre IR \C=O: 1720 & 1650 cm-1), EI-MS (M+ - H20: m/z 279 et M+ - Thr: m/z 179) et son spectre 1H-RMN. La structure est encore confirmée par le fait que VII donne I et V par hydrolyse dans HCl, 6N. Lorsqu'on traite à reflux dans HCl 6N, le composé VIII donne les aminoacides II, III et IV, ceci étant révélé par TLC. Dans le EI-MS de VIII, on trouve l'ion moléculaire a m/z 241, ce qui indique une structure peptidique cyclique. Le spectre 1H-RMN (270 MHz dans DMSO-d6) manifeste deux protons NH amidiques à 7,43 ppm (triplet) et 9,10 ppm (large) en accord avec la structure cyclique ci-dessus. Une expérience approfondie de découplage révèle que le groupe aminé de III et le groupe &-aminé de IV sont liés aux carbonyles pour former des amides tandis que le groupe oaminé de IV est libre. Ainsi, on assigne à VII et VIII les structures cidessous: H3 cfHOH vii CH EE - I VII CH3- (CH2) 6-CHH-CH-CE-CO-NE- H-COOH H H VII NH2 _ VIII tH CE3 Les composés VII et VIII s'obtiennent également lorsque l'on soumet le BU-2867T A à une dégradation ou e une hydrolyse enzymatique à l 'aide de papaTne ou de chymopapane. Un mélange de BU-2867T A (4 g) et de papaîne (sigma P-3375, 50 g) dans 20 1 de méthanol aqueux à 10% est agité à 28 C pendant vingt-deux heures. On acidifie ensuite le mélange à pH 3 à l'aide d'acide acétique et on extrait à l'acétate d'éthyle (10 1). Une évaporation de l'extrait donne une huile (6,3 g) que l'on passe en chromatographie sur gel de silice (Wakogel C-200, 250 ml) en présence d'un mélange de CH2Cl2 et de méthanol (9/1), de qui donne un composé huileux semi-pur VII (3,3 g). Une chromatographie ultérieure de l'huile à l'aide de Sephadex LH-20 et une cristallisation ultérieure donne des aiguilles incolores de VII pur, 1,15 g (rendement 50%), point de fusion 90 à 91 C. {a}27 + 17,4 (C 0,5, MeOH). D A l'analyse, on constate que le produit obtenu présente la formule: C16H27N04. H20 et l'on obtient les valeurs suivantes: C H N - calculées........... 60,93 9,27 4,44 - trouvées............ 61,34 9,03 4,20 EI-MS: m/z 279 (M±H20) UV À axMeOH nm (e): 260 (28 000). IR vmax (KBr) cm-1: 3520, 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630, etc. 1H-RMN (80 MHz, DMSO-d6): s 0,88 (3H, t); 1,06 (3H, d); 6,20 (3H, m); 7,00 (1H, m); 7,84 (1H, d, NH); etc. Apres extraction à l'acétate d'éthyle, on concentre la solution aqueuse acide à siccité. On dissout le résidu (36 g) dans 50 ml d'eau, on ajuste à pH 9,0 et on applique sur une colonne de silice en phase inverse (C18, Merck, 1,6 l) et on développe avec de l'eau. Les fractions contenant le composés VIII sont rassemblées et concentrées sous vide. On passe le résidu en chromatographie sur Sephalex LH-20 (250 ml) avec 50% et ensuite sur silice en phase inverse (C18) en présence d'eau acide (pH 3,0 par HCl dilué), ce qui donne du chlorhydrate de VIII pur. 747 mg (rendement 35%). Point de fusion 190 C (dec.). {a}26 -113 (C 0,5, H20). EI-MS: m/z 241 (M+) UV_:Yabsorption finale. - - IR vmax (KBr) cm-1: 3400, 1660, 1620, 1530, etc. H-RMN (80 MHz, DMSO-d6): 6 1,27 (3H, d); 1;4-1,8 (4H); 2,98 (2H, m); 4,52 (1H, m); 6,19 (1H, d); 6, 45 (1H, d-d); 7,43 (1H, t, NH); 9,46 (1H, d, NH). A l'analyse, on constate que le produit obtenu présente la formule: C1lH9N30.HC1.H20 et l'on obtient les valeurs suivantes: C H N Cl calculées........... 44,67 7,50 14,21 11,99 - trouvées............ 45,04 7,82 13,81 12,55 Le BU-2867T A étant négatif à la ninhydrine et ne présentant aucun groupe dosable, sa structure est logiquement celle quel'on construit en liant VII et VIII par une liaison peptidique. Par chauffage en présence de HCl 6N, les BU-2867T B et C donnent, tous les deux, le même complexe aminoacide que celui que l'on obtient a partir de BU-2867T A. Les parties acides gras des deux antibiotiques sont extraites de l'hydrolysat, on traite a l'aide de diazométhane et on isole sous la forme d'esters méthyliques, IX (e partir de BU-2867T B) et X (à partir de BU-2867T C). Ils retiennent la raie maximum UV caractéristique (AmaxMeOH: 260 nm), que l'on observe pour leurs antibiotiques d'origine. Le EI-MS de IX donne un ion moléculaire à m/z 236, ce qui suggère un ester d'acide C14 présentant trois doubles liaisons. Les spectres UV et 1H-RMN montrent, distinctement, une structure d'acide 2(E), 4(E)- diénoTque et la troisième double liaison que l'on isolera dans IX. Une ozonolyse de IX suivie d'une dégradation par réduction de l'ozonide donne un n-hexanal que l'on sépare et identifie comme étant la 2,4- dinitrophényl-hydrazone (EI-MS M+: m/z 280). Ces preuves indiquent que IX représente le 2(E), 4(E), 8-tétradécatriénoate de méthyle. Le poids moléculaire de l'ester X (ElI-MS; M+ m/z 238) est trouvé comme étant égal a 28 unités (C2H4) de plus que celui du VI, ce qui reflète la différence de formule moléculaire observée entre BU-2867T A et C. Ceci, combiné avec les données de 1H-RMN et UV indique que X représente le 2(E), 4(E)- tétradécadiénoate de méthyle. Les résultats des expériences ci-dessus indiquent les structures suivantes pour le BU-2867T A, B et C: H E o CH3 - structure - point de f {a24 (c - microanaly calculée 30. trouvées - EI- MS m/z -)maxMeOH n - PLC: plaque s EtOH-H20 - PLC: lichroso EtOH-H20 R = CH3- (CH2) 6- R = CH3- (CH2)4-CH=CH-(CH2) 2- R CH3-(CH2) 8- TABLEAU 4 Propriétés physico-chimiques des BU-2867T A, B et C BU-2867T A . ... aiguilles incolores Fusion....... 259 - 261 C 0,5 MeOH)... -111 rse pour: C27H44N406.1/2H20 s........... C 61,22; H 8,56; N 10,58 C 60,90; HFI 8,65; N 10,47 . ... 520 (M+) lm (S)....... 261 (35 000) silanisée Rf i (55/45)... wrb Rp-18 Rt I (65/35).... 0,45 6,43 BU-2867T A BU-2867T B BU-2867T C - structure............. - point de fusion....... - {c4 (c 0,5 MeOH)... - microanalyse pour: calculées........... trouvées.. ..........DTD: - EI-MS m/z............. - naxMeOH nm (e)....... - PLC: plaque silanisée Rf EtOH-H20 (55/45).... - PLC: 15. lichcrosorb Rp-18 Rt EtOH-H20 (65/35).... TABLEAU 4 (suite) BU-2867T B poudre blanche 232 - 234 C -92 C29H46N406À 3/2H20 C 60,71; H 8,61; N 9,77 C 60,89; H 8,31; N 9,23 546 (M+) 261 (28 000) 0,41 7,93 - BU-2867T C - structure............. aiguilles incolores - point de fusion....... 273 - 275 C - {44 (c 0,5 MeOH)... -104 - microanalyse pour: C29H48N406 calculées........... C 63,48; H 8,82; N 10,21 À trouvées............ C 63, 48; H 8,91; N 10,16 - EI-MS m/z............. 548 (M+) -;axMeOH nm ( E).... . 261 (36 000)..DTD: - PLC: plaque silanisee Rf EtOH-H20 (55/45).... 0,34 - PLC: 30. lichcrosorb Rp-18 Rt EtOH-H20 (65/35).... 11,33 Une dégradation enzymatique du BU-2867T par la Pseudomonas acylase donne des produits différents de ceux obtenus par hydrolyse à l'aide de ficine ou de papaTne décrites ci-dessus. On fait fermenter la souche de Pseudomonas Pa-129 dans 10 1 de milieu contenant 2% d'amidon soluble, 0,2% de glucose, 3% de farine de soja, 1% de CaCO3 et 0,3% de MgSO4.7H20 à 37 C pendant trois jours et l'on recueille les cellules par centrifugation. Apres lavage par deux fois avec une solution saline (1 1), on remet les cellules en suspension dans 0,75 1 de solution saline. On mélange la suspension de cellules avec une suspension, préalablement passée à l'autoclave (1,5 1), d'alginate de sodium (75 g) et de cellulose-CM (75 g) et l'on verse le mélange dans 30 1 d'une solution de CaCl2 0,1M avec agitation. Le gel piégé par les cellules est durci par agitation en présence d'une solution de glutaraldéhyde à 25% et on le verse dans une colonne (4,0 x 175 cm). On fait passer une solution de BU-2867T A (1,5 g) dans du méthanol aqueux à 20% (30 l) é travers la colonne à un débit de 0, 4 à 0,8 1 par heure. Les effluents recueillis sont ensuite passés à travers une résine d'Amberlite IRC-50 (forme NH4+ 70%, pH 6,7, 300 ml) et une colonne HP-20 (300 ml) successivement. On lave la colonne IRC-50 à l'eau et on développe ensuite avec du NH40H 1,5N. On rassemble les fractions positives à la ninhydrine, on concentre et on lyophylise, ce qui donne un solide jaune pâle (800 mg) que l'on charge sur une colonne de silice en phase inverse (C18, 250 ml). On développe la colonne à l'aide d'eau sous pression moyenne et l'on rassemble les êluats positifs a la ninhydrine et l'on concentre, ce qui donne un solide blanc d'amine Lthréonylcyclique (XI, 612 mg). Rendement 62%. Point de fusion 170 C. {a27 -157 (C 0,5, H20). EI-MS: m/z 342 (M+) UV: absorption finale. IR vmax (KBr) cm'1: 3350, 3280, 1650, 1620, 1530, etc. 1H-RMN (80 MHz, DMSO-d6): ô 1,05 (3H, d); 1,21 (3H, d); 1,4-2,2 (4H); 4,35 (2H, m); 4,47 (1H, m, OH); 4,62 (1H, d, OH); 6,16 (1H, d); 6,42 (1H, d-d); 7,36 (1H, t, NH); 7,97 (1H, d, NH); 8,62 (1H, d, NH). OH XI CH3-CH-CH-CO-N N OH NH2 2 IC3 CH3 La colonne HP-20 obtenue ci-dessus est développée à l'eau (1 1) et ensuite à l'aide d'un mélange de NaOH, 0,1N et de méthanol (1/2). On rassemble les fractions contenant l'acide 2,4-dodécadiénoique (V), on concentre A 300 ml et on acidifie à pH 2,0. On extrait cette solution à l'aide d'acé- tate d'éthyle (300 ml) et de n-butanol (100 ml). Une évaporation de l'ex- trait acétate d'éthyle donne un résidu huileux que l'on passe en chromato- graphie sur une colonne de Sephalex LH-20 (800 ml). Par élution au méthanol et surveillance des élutions par adsorption UV à 260 nm, on concentre les éluats appropriés, ce qui donne des plaques incolores de V pur (259 mg). Rendement 53%. Point de fusion 48-490C. XmaxMeOH nm (e): 258 (24 000). IR vmax (KBr) cm-1: 1680, 1630, 1605, 1410, 1300, etc. 1H-RMN (80 MHz, CD30D): ô 0,89 (3H, t); 2,0 (10H); 2,12 (2H, m); ,75 (1H, d); 6,16 (2H, m) ; *7,21 (1H, m). On identifie ce composé comme étant l'acide 2,4-dodécadiénoTque obtenu par hydrolyse acide du BU-2867T A. On concentre l'extrait au n-butanol sous vide et on lyophilise pour récupérer le produit de départ, le BU- 2867T A (160 mg, 11%). Il apparalt d'après la discussion ci-dessus que les composés VIII et XI sont des intermédiaire valables, utiles dans la préparation des divers composés antibiotiques selon la présente invention. Une acylation classique a l'aide, par exemple, d'un anhydryde mixte, d'un acide carboxylique avec un carbonate d'alkyle acide (HOCOOR) donne lieu à la formation de la liaison peptidique requise, Advanced Organic Chemistry, Fieser & Fieser, pages 1039-1046, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965. On peut protéger les groupes hydroxyles d'une façon convenable, par exemple sous la forme d'éthers tôtrahydropyranyle ou tbutyle. Une acylation du groupe aminé de VIII par les acides: - CH3-(CH2)6-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3 COOH - CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3 COOH et - CH3-(CH2)8-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3 COOH donne respectivement les BU-2867T A, B et C. On prépare, par exemple, le BU-2867T A par couplage de VII et de VIII. Un mélange de VII (15 mg), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (10 mg) et 1-hydroxy-1,2,3-benzotriazole (8 mg) dans 2 ml de diméthylformamide est agité pendant deux heures à la température ambiante. On ajoute, ensuite, au m1élange du composé VIII (10 mg) et on poursuit l'agitation pendant la durée d'une nuit. On concen- tre la solution d'un résidu que l'on passe en chromatographie sur silice en phase inverse (C18, 50 ml) avec élution avec du méthanol à 80%. On évapore les éluats actifs et l'on purifie le résidu par HPLC préparative (colon- ne SSD-ODS-842), phase mobile: méthanol aqueux ? 90%). Une évaporation de la fraction du pic actif donne du BU-2867T A (7,4 mg, rendement 28%) qui est en tout point identique à l'antibiotique naturel. TLC (silanisé, EtOHH20 = 55/45). Rf: 0,45. HPLC (Lichrosorb RP-18, EtOH-H20 = 65/35) Rt: 6,43 mn. On peut également préparer le BU-2867T A par couplage de V avec XI. Une solution dans le diméthylformamide (1 ml) de V (3,4 mg), N,N'-dicyclo- hexylcarbodiimide (3,7 mg) et de 1-hydroxy-1,2,3-benzotriazole (2,8 mg) est agitee pendant deux heures à la température ambiante. On ajoute du XI (5 mg) à la solution et l'on maintient le mélange agité pendant encore trois heures et on concentre sous vide. On dissout le résidu dans du méthanol et on purifie par HPLC préparative en utilisant la même colonne et la même phase mobile que ce que l'on a décrit ci-:dessus. BU-2867T A, 4 mg, rendement 45%. Son identité avec le BU-2867T A naturel est confirmée par comparaison directe. On peut préparer le composé XI à partir du composé VIII en utilisant des modes opératoires classiques. A un mélange agité de N-t-butoxycarbo- nyl-L-threonine (44 mg), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (40 mg) et de 1hydroxy-1,2,3-benzotriazole (30 mg) dans du diméthylformamide (4 ml), on ajoute du composé VIII (40 mg) à la température ambiante. On concentre le mélange sous vide en un résidu que l'on passe en chromatographie sur colonne de silice en phase inverse (C18, 40 ml) en présence d'un mélange de méthanol et d'eau (rapports 1/9 a 2/3). On rassemble les fractions appro- priees, on concentre sous vide et on lyophilise, ce qui donne le N-BOC-L- threonyl-VIII (= BOC-XI). 51 mg, rendement 69%. vc=o KBr: 1690 et 1640 cm'1. 1H-RMN (80 MHz): a ppm dans DMSO-d6: 1,00 (3H, d); 1,22 (3H, d); 1,35 (9H, s); 6,11 (1H, d); 6,33 (1H, d-d); etc. Un mélange de BOC-XI (36 mg) et d'acide formique (1 ml) est agité pendant une heure à la température ambiante. On le concentre, on le dilue avec de l'eau (1 ml), on ajuste a pH 10,0 et on applique sur une colonne de silice en phase inverse (C18, 20 ml). Par développement à l'eau et surveillance de l'éluat e l'aide du test à la ninhydrine, on rassemble les éluats appro- priés et on lyophilise, ce qui donne du composé XI sous la forme de solide blanc. 25 mg, rendement 88%. vc=o KBr: 1650 cm-1. 1H-RMN (80 MHz): s ppm dans DMSO-d6: 1,04 (3H, d); 1,22 (3H, d); 6,14 (1H, d); 6,42 (1H, d-d); 7,35 (1H, t, NH); 7,98 (1H, d, NH); 8,65 (1H, d, NH); etc. EI-MS: M+ m/z 342. Il est ainsi possible de préparer les composés antibiotiques selon la présente invention par réaction des composés VIII et XI avec les acides appropriés quel que soit leur origine. En outre, les composés VIII et XI, composés selon la présente invention, notamment ceux produits avec des rendements élevés, peuvent être utilisés pour préparer d'autres composés selon la présente invention. Par exemple, le BU-2867T A que l'on obtient avec des rendements élevés par fermentation, peut être utilisé pour pré- parer le BU-2867T B et BU-2867T C par hydrolyse enzymatique et couplage avec l'acide souhaité comme illustré ci-dessus. Le rendement en BU-2867T et la distribution des fractions A, B et C obtenues par fermentation comme décrit ci-dessus, peuvent être modifiés par addition de diverses matières grasses et huiles et de certains agents tensio-actifs au milieu dans lequel on cultive le Polyangium brachyspo- rum K481-B101. Par exemple, l'addition d'huile de soja, d'huile mats, d'huile d'olive, d'huile végétale hydrogénee, de lard et de suif dans une moindre mesure, augmente le rendement total en BU-2867T obtenu. Les matiè- res grasses et huiles à heute teneur en acide linoléique (C18:2) telles que, par exemple, l'huile de soja, l'huile de mats et le lard conduisent a une augmentation de la formation du BU-2867T préparé. Des huiles telles que, par exemple, l'huile d'olive présentant une teneur élevée en acide oléique (C18l:1) conduisent a une augmentation de la proportion de BU2867T C formé. Les huiles végétales hydrogénées riches en acide stéarique (C18:0) augmentent seulement la quantité de BU-2867T A formé. Activité antimicrobienne Les concentrations inhibitrices minimum (MICs) de BU-2867T A, B et C, sont déterminees pour divers micro-organismes par une méthode de dilution en série sur agar-agar. De l'agar-agar nutritif (Eiken) est utilisé pour les bactéries et de l'agar-agar de dextrose Sabouraud (Difco) pour les champignons. La dimension de l'inoculum est ajustée à 104 CFU/ml pour les bactéries et à 105 à 107 CFU/ml pour les champignons. Le tableau 5 montre les activités anti-bactériennes in vitro des BU-2867T A, B et C. Les composés A et C ne donnent. pas d'inhibition de la croissance a la fois des bactéries gram-positives et des bactéries gram- négatives a une concentration de 50 mcg/ml, tandis que le composé B pré- sente une activité modérée vis-a-vis de quelques bactéries gram-positives. Les activités antifongiques des composés de BU-2867T sont indiquées sur le tableau 6. Les composés C présentent une activité antifongique puissante contre des champignons pathogènes uniquement importants tels que, par exemple, les Candida albicans, Crysptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes et Mucor spinosus. Les composés A et B sont un peu moins actifs que le composant C mais leurs spectres antifon- giques sont semblables à celui de ce dernier. TABLEAU 5 Spectre antibactérien des BU-2867T Organisme gram-positif staphylococcus aureus Il Il " " staphylococcus epidermidis il Il streptococcus faecalis micrococcus luteus bacillus subtilis Organisme gram-négatif escherichia coli klebsiella pneumoniae proteus mirabilis proteus vulgaris morganella morganii serratia marcescens enterobacter cloacae pseudomonas aeruginosa 209P Smith Bx-1633 D153 A22152 A 9612 NIHJ D-11 A9554 A9436 A9553 A20222 A9659 A9930 BU-2867T A >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 MIC (mcg/ml) BU-2867T B 3,1 6,3 ' >50 j >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 milieu: agar-agar nutritif BU-2867T C >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 TABLEAU 6 Activité antifongique des BU-2867T Organisme test candida albicans if i j cryptococcus neoformans l IlII aspergillus fumigatus If " aspergillus flavus I fusarium moniliforme piricularia oryzae trichophyton mentagrophytes blastomyces dermaditis sporothrix schenckii petriellidium boydii mucor spinosus IAM 4888 A 9540 D 49 IAM 4514 IAM 2530 IAM 2034 FA 21436 A 2284 D 91 D155 N 4329 IFO 8144 IFO 8158 IFO 8073 IFO 5317 BU-2867T A 3,1 1,6 1,6 1,6 >50 >50 >50 >50 1,6 MIC (mcg/ml) BU-2867T B 3,1 1,6 3,1 3,1 >50 >50 12,5 12,5 >50 >50 0,8 milieu: agar-agar de dextrose Sabouraud Activité antitumorales Les activités antitumorales des BU-2867T A, B et C sont déterminées sur des souris CDF1 et BDF1 males. Une leucémie lymphocytique P388 (souris CDF1 et BDF1) et une leucémie lymphoTde L1210 (souris BDF1) sont inoculees par injection intrapéritoneale de 0,8 ml de fluide ascitique dilué contenant respectivement 106 et 105 cellules par souris. Un mélanome mélanotique 816 (souris BDF1) est implanté par voie intra-péritonéale à l'aide de 0,5 ml d'un bouillon de tumeur A 10%. Les produits à tester sont dissous dans une solution saline à 0,9% contenant 10% de diméthylsulfoxyde et l'on en administre des doses progressives par voie intra-péritoneale a des souris, vingt- quatre heures après implantation de la tumeur. On teste, A titre de comparaison, soit de l'olivomycine (NSC 38270), soit de la mitomycine C à titre de composé de référence dans les expériences. Les BU-2867T A, B et C manifestent une activité antitumorale vis-e-vis de la leucémie P388 par le programme de traitement n l (une fois par jour, les jours n l, 4 et 7). Le tableau 7 montre les résultats obtenus sous la forme d'augmentation du temps de survie moyen (MST) des animaux de test (T) et de contrôle (C) pour divers régimes de dosage exprimés en rapport en %. BU-2867T C 1,6 0,8 3,1 3,1 0,8 0,8 >50 >50 1,6 6,3 >50 >50 0,2 i Les valeurs des rapports en % de 125 et au-dessus indiquent un effet antitumoral significatif. TABLEAU 7 Activité antitumorale des BU-2867T contre la leucémie P388 T/C en % de MST (dose en mg/kg/j, ip) 3 1 0,3 0,1 BU-2867 A 140 130 120 BU-2867 B 165 140 120 BU-2867 C 155 130 Olivomycine A 140 135 100 Les BU-2867T A et C sont extrêmement actifs contre la leucémie P388 par le programme de traitement n02 (une fois par jour, les jours n l à n 09); le BU-2867T A est moins actif contre la leucémie L1210 et le mélano- me B16. Le tableau 8 montre les résultats obtenus pour divers programmes de régime de dosage a nouveau exprimés en augmentation du rapport de pourcen- tage de temps de survie moyen, des valeurs de 125 et plus indiquant un effet antitumoral significatif. TABLEAU 8 Activité antitumorale des-BU-2867T A et C T/C en % de MST (dose en mg/kg/j, ip) 2 1 0,5 0,25 0,13 0,063 0,031 leucémie P388 BU-2867T A 67 228 186 156 147 136 109 BU-2867T C 234 189 175 159 153 123 100 Mitomycine C 290 240 170 150 130 115 leucémie L1210 BU-2867T A 129 118 118 106 Mitomycine C 140 141 129 129 106 mélanome B16 BU-2867T A Tox. 125 116 113 100 Mitomycine C 63 181 163 141 131 La toxicité aiguë des BU-2867T A et C est déterminée sur des souris mâles ddY par une administration intrapéritonéale unique. Les valeurs LD50 sont respectivement de 8,1 mg/kg et 25 mg/kg. Les composés pharmacologiquement actifs selon la présente invention peuvent être transformés par des méthodes classiques de pharmacie galénique en préparations pharmaceutiques pour administration orale ou parentérale, par exemple, à des mammifères y compris aux humains. Les excipients clas- siques sont des substances supports organiques ou minérales pharmaceutique- ment acceptables convenant à l'application parentérale, entérale ou topique qui ne réagissent pas de facon nuisible avec les composés actifs. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables convenables comprennent, mais n'y sont pas limités, l'eau, les solutions salines, les alcools, la gomme arabique, les huiles végétales, les polyéthylène glycols, la gélatine, le lactose, l'amylose, le stéarate de magnésium, le talc, l'acide silicique, le pétrolatum, les huiles parfumées, les monoglycérides et diglycérides d'acides gras, les esters d'acides gras de pentaérythritol, l'hydroxymé- thyle cellulose, la polyvinylpyrrolidone, etc. Les préparations pharmaceu- tiques peuvent se stériliser et, si on le désire, on peut les mélanger avec des agents auxiliaires, par exemple, des lubrifiants, des agents de préser- vation, des stabilisants, des agents mouillants, des émulsifiants, des sels destinés à influencer la pression atmosphérique, des tampons, des colo- rants, des parfums et/ou des substances aromatiques et analogues qui ne réagissent pas de façon nuisible avec les composés actifs. Pour l'application parentérale, il convient particulièrement d'em- ployer des solutions stériles et injectables, de préférence des solutions huileuses ou aqueuses, aussi bien que des suspensions, des émulsions ou des implants, y compris les suppositoires. Les ampoules représentent des unités de dosage commodes. Pour l'application entérale, il convient particulièrement d'employer des pastilles, dragées, suppositoires ou cachets renfermant du talc et/ou un support A base d'hydrate de carbone ou un liant ou analogue, le support étant de préférence du lactose et/ou de l'amidon de maTs et/ou de l'amidon de pomme de terre. On peut utiliser un sirop élixir ou analogue lorsque l'on emploie un véhicule édulcoré. Les compositions à libération prolongée peuvent se formuler, y compris celles dans lesquelles le composé actif est protégé à l'aide de revêtement à dégradation différentielle, par exemple par micro-encapsulation, revêtements multiples, etc. Généralement, les composés selon la présente invention sont dispensés sous une forme de dosage unitaire dans un support pharmaceutiquement acceptable comprenant la dose requise. La dose des composés selon la présente invention est généralement comprise entre 5 et 250 mg/j lorsqu'on l'administre à des patients, par exemple des êtres humains pesant 75 kg. Les doses et les régimes convenables pour un sujet donné peuvent se déter- miner en utilisant des considérations classiques, par exemple, par compa- raison habituelle des diverses activités du composé en référence et d'un antibiotique ou d'un agent antitumoral connu, par exemple au moyen d'un protocole pharmacologique classique approprié. A partir de la description qui précède, le spécialiste peut facile- ment évaluer les caractéristiques essentielles de la présente invention et, sans se départir de l'esprit et de la portée de celle-ci, il peut apporter divers changements et modifications à l'invention pour l'adapter à divers usages et conditions. REVENDICATIONS 1.- Composés de formule: E dans laquelle: R représente CH3-(CH2)6, CH3(CH2)4-CH=CH(CH2)2 2.- Le composé selon la revendication 1, dans CH3-(CH2)6. 3.- Le composé selon la revendication 1, dans CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2. 4.- Le composé selon la revendication 1, dans ou CH3-(CH2)8. lequel R représente lequel R représente lequel R représente CH3-(CH2)8. 5.- Une méthode de préparation d'un composé de formule: H E CH3 dans laquelle: R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3- (CH2)8 qui consiste à cultiver une espèce nouvelle de Polyangium brachysporum dans un milieu nutritif contenant une source assimilable de carbone et d'azote dans des conditions aerobiques, à séparer le mycélium produit et à récupé- rer le composé dans le milieu nutritif. 6.- Une méthode selon la revendication 5, dans laquelle le Polyangium brachysporum sp. nov. est la souche K481-B101. 7.- Une méthode selon la revendication 6, dans laquelle la souche K481- B101 est encore caractérisée conmme étant ATCC 53080. 8.- Une méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'on ajoute une matière grasse ou une nuile au milieu nutritif. 9.- Une méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que les mycéliums séparés sont extraits a l'aide d'un solvant organique et les extraits sont rassemblés au milieu nutritif avant la récupération du composé. 10.- Une méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé est récupéré dans le milieu nutritif par extraction a l'aide d'un solvant organique. 11.- Une méthode selon la revendication 5, dans laquelle la prépara- tion du composé est surveillée en utilisant comme organisme de test le Candida albicans. 12.- Le micro-organisme Polyangium brachysporum sp. nov. 13.- Polyangium brachysporum souche K481-B101. 14.- Une culture biologiquement pure du micro-organisme Polyangium brachysporum sp. nov. 15.- Un composé de formule: H NE> CH3 16.- Un procédé de préparation d'un compose de formule: 0E H N NH2 N o E CH3 qui consiste a hydrolyser un composé de formule: H dans laquelle R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3-(CH2)8, en présence de ficine, de papaTne ou de chymopapaTne. 17.- Le composé de formule: H CH3. E 18.- Une méthode de préparation d'un composé de formule: H E O CH3 qui consiste à hydrolyser un composé de formule: H E CH3 en présence de Pseudomonas acylase. 19.- Une composition antifongique comprenant une quantité efficace en tant que antifongique d'au moins un compose de formule: H E E CH3 dans laquelle R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3(CH2)8, en méme temps qu'un support pharmaceutiquement acceptable. 20.- Composition antitumorale comprenant une certaine quantité d'au moins l'un des composés de formule: H CH3 dans laquelle R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH(CH2)2 ou CH3-(CH28, efficace en temps qu'agent antitumoral dans un support pharmaceutiquement acceptable.