Brevet FR2586351A1 — publié le 19870227

Les endotoxines sont des macromolécules complexes compo- sées de lipide, glucide et protéine. On les trouve principa- lement dans la paroi de micro-organismes Gram négatifs, et on les désigne habituellement sous le nom de "lipopoly- saccharides". Ces macromolécules sont toxiques pour l'hôte et peuvent être mortelles. Par exemple, elles peuvent causer de graves chocs hypotensifs et également-provoquer dans l'organisme diverses réactions toxiques, résorption osseuse comprise. Dans la cavité buccale, les endotoxines sont consi- dérées comme un facteur important dans l'inflammation des gencives et dans la déperdition osseuse localisée, telle que la déperdition d'os alvéolaires. Théoriquement, les composés qui libèrent de l'oxygène devraient inactiver les endotoxines. Toutefois, en raison de la rapidité avec laquelle de nombreux composés dégageant de l'oxygène libèrent de l'oxygène, ceux-ci ont peu d'effet inhibiteur sur le développement des endotoxines. Les compo- sés qui libèrent plus lentement de l'oxygène devraient inhi- ber l'effet des endotoxines. Toutefois, leur efficacité est en général limitée, du fait que les conditions nécessaires à la libération de l'oxygène ne correspondent pas aux condi- tions régnant dans l'organisme. Comme iidiqué dans la demande de brevet aux Etats Unis N 726 545, déposée le 24 avril 1985, les mammifères, par -2- exemple, des rongeurs à l'homme compris, possèdent dans leur organisme des phosphatases alcalines et des phosphatases acides. Les composés de type peroxodiphosphate ont la pro- priété de libérer lentement de l'oxygène. La quantité d'oxy- gène libérée par ces composés représente un dixième de la quantité d'oxygène libérée par le peroxyde d'hydrogène. Seulement 50% environ de l'oxygène actif de ces composés sont libérés en 20 heures à 25 C, en présence de phosphatases alcalines ou de phosphatases acides. Les peroxodiphosphates (PDP) libèrent lentement du peroxyde d'hydrogène en présence de phosphatases, selon l'équation suivante: O O O Il Il phosphatases Il H O X4-O-P-O-O-P-O- -O-O-P-O- O H202 + po4 I I I O O O- o 0 0- dans laquelle X est un cation non toxique, pharmaceutique- ment acceptable, ou complète un fragment ester organique. La phosphatase responsable de la décomposition du peroxo- diphosphate est présente dans la salive ainsi que dans le plasma, les liquides intestinaux et les globules blancs. On a constaté que l'endotoxine bactérienne réagit également avec le PDP non altéré. Cette réaction se produit indépendamment de la présence de phosphatases, c'est-à-dire qu'elle a lieu également en dehors de l'organisme d'un animal à sang chaud. Toutefois, ce qui est très important, même en présence de phosphatase, la réaction a également lieu, lorsque des mammifères sont traités avec un PDP selon la présente invention; Il est souhaitable d'établir une poso- logie dans laquelle on continue le traitement jusqu'à inacti- vation des endotoxines. Un objet de la présente invention est de désactiver les endotoxines et inhiber ainsi leurs effets toxiques, tels qu'inflammation, résorption osseuse et chocs hypotensifs. La description ci-après fera apparaître d'autres objets de la présente invention. -3- Selon certains de ses objets, l'invention concerne unprocédé pourl'inhibitkndLichochypotensif et de la résorption osseuse localisée, provoqués par une endotoxine bactérienne, qui comprend la mise en contact d'un peroxodiphosphate non toxique, soluble dans l'eau, pharmaceutiquement acceptable, avec l'endotoxine, pour provoquer l'inactivation de ladite endotoxine bactérienne. Une technique pour la mise en évidence de l'inactivation de l'endotoxine consiste à inhiber l'induction de la produc- tion d'un facteur chimiotactique vis-à-vis de leucocytes poly- nucléaires, désigné ci-après par "PMN". Ce facteur peut être déterminé selon la méthode de chimiotaxie de Boyden, dans laquelle des globules blancs de lapin sont attirés (chimio- taxie) par le facteur induit par l'endotoxine qui est produit dans leut voisinage. Dans la méthode de Boyden, lorsqu'on met à incuber un lipopolysaccharide (endotoxine) bactérien avec du sérum provenant d'un mammifère, il se produit la réac- tion suivante: incubation pendant sérum + endotoxine 1 heure à la temfacteurs chimiotactiques pérature de l'or- pour le PMN ganisme On étudie le phénomène de chimiotaxie en utilisant des chambres de Boyden, comme décrit par Cates et coll., dans "Procédé de la chambre de Boyden modifié, pour la mesure de la chimiotaxie due au PMN" (Modified Boyden Chamber Method for Measuring PMN Chemotaxis, Leucocyte Chemotaxis, Methods, Physiology and Clinical Application, édité par Gallin et Quie, Raven Press, New York, 1978, p 67-71). Lorsque l'endo- toxine provoque la chimiotaxie, comme dans la présente inven- tion, il est possible de déterminer quantitativement le pour- centage d'inhibition en utilisant l'essai de chimiotaxie de Boyden. On peut introduire des endotoxines dans l'organisme d'un animal à sang chaud, en mettant à profit la présence de -4- celles-ci dans la paroi de microorganismes Gram négatifs, tels que Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. a.), Escherichia coli (E. coli), Bacteroides melanenoqenicus (B. mel.) et Salmonella typhi (S. typhi). L'endotoxine buccale isolée à partir de A. a. a une action toxique sur les os alvéolaires. L'endotoxine non buccale purifiée à partir de E. coli peut se révéler mortelle pour l'hôte. D'autres techniques connues pour la mise en évidence de l'inhibition de la production d'endotoxines sont exécutées en faisant appel à la résorption d'un milieu de culture-d'os; on peut également utiliser un essai de mortalité d'embryons de poulet. On inhibe efficacement la réaction toxique par traite- ment de l'endotoxine in situ dans un hSte à sang chaud avec une quantité efficace inhibitrice d'un composé à base de peroxodiphosphate non toxique, soluble dans l'eau, pharma- ceutiquement acceptable. Dans l'organisme, le peroxodiphos- phate réagit avec l'endotoxine sous forme d'une molécule intacte, tout en inactivant le composé à base de peroxodi- phosphate. Comme l'endotoxine est inactivée, cela montre que l'endotoxine réagit avec le peroxodiphosphate. En général, environ 0,1-7% du composé à base de peroxo- diphosphate dans un véhicule pharmaceutique, comme par exemple en solution, sont efficaces à une posologie d'environ 0,2-14 mg par kg de poids corporel. L'efficacité de l'inhi- bition peut être mise en évidence par l'effet de diminution de l'endotoxine, et on la détermine quantitativement en se basant sur l'inhibition de la chimiotaxie vis-a-vis du PMN. Des composés à base de peroxodiphosphate caractéris- tiques, non toxiques, solubles dans l'eau, pharmaceutiquement acceptables, sont les sels de métaux alcalins-(par exemple de lithium, de sodium et de potassium), les sels de métaux alcalino-terreux (par exemple de magnésium, de calcium et de strontium) et les sels de zinc, d'étain et d'ammonium -5quaternaire, ainsi que les esters d'alkyle en C112 d'adénylyle, de guanylyle, de cytosylyle et de thymylyle. Parmi les cations inorganiques on préfère les métaux alcalins, le sel de potassium en particulier. Le peroxodiphosphate tétrapotassique est un solide blanc cristallin, non hygros- copique, stable, inodore, finement divisé, fluide, ayant un poids moléculaire de 346,35 et une teneur en oxygène actif égal à 4,6%. Le peroxodiphosphate tétrapotassique est soluble dans l'eau à 47-51%, à 061'C, mais insoluble dans les solvants courants tels qu'acétonitrile, alcools, éthers, cétones, diméthylformamide, diméthylsulfoxyde et similaires. Une solu- tion aqueuse à 2% a un pH d'environ 9,6, et une solution saturée de peroxodiphosphate tétrapotassique a un pH 1 d'environ 10,9. Une solution à 10% dans de l'eau n'a pas montré, à 25 C, de perte d'oxygène actif au bout de 4 mois, et à 50'C, une solution à 10% a montré une perte d'oxygène actif de 3% en l'espace de 6 mois. Parmi les composés organiques, on préfère ceux confé- rant des propriétés hydrophobes, tels que les radicaux alkyle en C1_12, et ceux qui facilite l'absorption rapide du fragment peroxodiphosphate par les cellules, tels que les esters dLadénylyle, de"guanylyle, de cytosylyle et de thymylyle. Le peroxodiphosphate peut être administré par voie orale ou générale pour inhiber une secrétion excessive de PTH dans l'organisme. Les véhicules pharmaceutiques appropriés pour l'adminis- tration orale sont des comprimés enrobés composés d'une substance qui résiste à la décomposition par les acides gastriques au pH régnant dans l'estomac (environ pH 1-3), car le peroxodiphosphate serait inactivé par ces acides gas- triques. Par contre, les véhicules dans lesquels sont incor- porés des granules comprimés de la substance solide consti- tuée du sel d'acide peroxodiphosphorique, sont dissous par les liquides intestinaux qui ont un pH plus élevé (environ pH 5,5-10), et n'inactivent pas le peroxodiphosphate, le laissant sensible à l'action enzymatique des phosphatases présentes chez l'homme ou d'autres animaux à sang chaud. Une solution souhaitable d'enrobage pour comprimés est compo- sée d'un ester d'acide gras, tel que le stéarate de n-butyle (normalement environ 40-50, de préférence environ 45 parties en poids), d'une cire telle que la cire de carnauba (norma- lement environ 15-25, de préférence environ 20 parties en poids), d'un acide gras tel que l'acide stéarique (normale" ment environ 20-30 parties, de préférence 25 parties en poids), et d'un ester de cellulose, tel que l'acétophtalate de cellulose (normalement 5-15, de préférence environ 10 parties en poids) ainsi-que d'un solvant organique (norma- lement environ 400-900 parties). D'autres susbtances d'enro- bage souhaitables comprennent la gomme-laque et des copoly- mères d'anhydride maléique et de composés éthyléniques, tels que le polyvinylméthyléther. De tels enrobages diffèrent de comprimés qui sont décomposés dans la cavité buccale, du fait que la substance constitutive des comprimés contient norma- lement environ 80-90 parties en poids de mannitol et environ 30-40 parties en poids de stéarate de magnésium. Les granules de peroxodiphosphate incorporés, dans les comprimés sont obtenus. par mélange d'environ 30-50 parties en poids de peroxodiphosphate avec environ 45-60 parties en poids d'un sucre polyhydroxylé solide tel que le mannitol, et imprégnation avec environ 20- 35 parties en poids d'une solution d'un sucre polyhydroxylé tel que le sorbitol, tamisage à la taille voulue, mélange avec environ 20-35 parties en poids d'un liant tel que le stéarate de magnésium et compression des granules en comprimés à l'aide d'une pas- tilleuse. On enrobe les granules comprimés par pulvérisa- tion sur ceux-ci d'une mousse ou d'une solution de l'agent d'enrobage, puis séchage pour éliminer le solvant. De tels comprimés diffèrent des comprimés sécables, qui sont carac- téristiquement des granules comprimés dépourvus d'enrobage protecteur spécial. Pour l'administration du peroxodiphosphate avec un schéma posologique prescrit, une dose efficace va, dans le cas d'administration par voie orale, d'environ 0,1 à 6 g par kg de poids corporel par jour; dans le cas d'administra- tion par voie générale, comme par injection intramusculaire, intrapéritonéale ou intraveineuse, la dose va environ de 0,1 à 2 g par kg de poids corporel par jour. Les solvants apyrogènes physiologiquement acceptables sont des véhicules appropriés pour être utilisés de la façon reconnue dans la technique pour l'administration par voie générale. Une solution salée tamponnée au phosphate à un pH physiologique d'environ 7 à 7,4 est le véhicule préféré pour l'administration par voie générale. De tels solvants sont différents des véhicules humidifiants utilisés caractéristi- quement dans des dentifrices. On prépare normalement une telle solution par stérilisation d'eau distillée déâsonisée, vérification de la non pyrogénicité de celle-ci au moyen de l'épreuve du lysat d'amibocytes de limule (LAL), décrite par Tsuji et coll. dans Pharmaceutical Manufacturing, octobre 1984, p 35-41, puis addition à celle-ci d'un tampon phosphate (par exemple pH environ 8,5-10), préparé dans de l'eau stérile apyrogène, et d'environ 1-100 mg du dérivé peroxodiphosphate et de chlorure de sodium à une concentration d'environ 0,5-1,5% en poids. On peut placer la solution dans des flacons pour l'utilisation, après l'avoir stérilisée à nou- veau en la faisant passer à travers un filtre stérilisant. Ou encore, on peut utiliser d'autres solutions, telles que la solution de Ringer, contenant 0,86% en poids de chlorure de sodium, 0,03% en poids de chlorure de potassium et 0,033% en poids de chlorure de calcium. -8- On illustre l'invention à l'aide des'exemples non limi- tatifs ci-après, qui montrent que le composé à base de peroxodiphosphate (PDP) inhibe la chimiotaxie provoquée par le facteur produit par l'endotoxine dans le sérum et inhibe la toxicité de l'endotoxine vis-àvis des os. Exemple 1 On obtient du PMN à partir de la cavité péritonéale de lapins blancs adultes de variété Nouvelle-Zélande, 12 heures après injection intrapéritonéale de 200 ml d'une solution contenant 0,2% de glycogène dans une solution salée isoto- nique stérile (0,85% de NaCl). On recueille les cellules (PMN) à partir de l'exsudat provenant de la cavité périto- néale des lapins, et on les purifie comme décrit par Taichman et coll. (Arch. Oral Biol., 21, p 257, 1976). De l'endo- toxine bactérienne purifiée provenant de E. coli, fournie par Associates of Cape Cod Inc., Woods Hole, Maine, USA, est prétraitée avec différentes concentrations de PDP (sel tétrapotassique) pendant une heure à 37 C. On effectue ensuite l'essai de laL.chimiotaxie avec des endotoxines traitées et des endotoxines non traitées, en utilisant une chambre de Boyden, comme décrit plus haut. Les résultats sont récapitulés dans les tableaux 1 et 2. -9- Traitement Tableau 1 Valeur moyenne de la chimiotaxie du PMN migrant + EC* Diminution de la chimiotaxie (%) 1. Témoin** 2. Sérum*** et 1 ng/ml d'endotoxine 3. 0,5% de PDP et sérum*** 4. Endotoxine (1 ng/ml) prétraitée avec 0,5% de PDP et sérum** 5. Endotoxine (0,5 ng/ml) prétraitée avec 0,5% de PDP et sérum** 6. Endotoxine (0,25 ng/ml) prétraitée avec 0,5% de PDP et sérum** 139 4,2 343,0 36,7 142,5 12,0 188,0 +1-8,4 154,0 2,8 138,5+2,8 -44%par rapport à (2) -56% par rapport à (2) -60% par rapport à (2) * EC= écart-type ** milieu= solution de Earl contenant 10% d'albumine de sérum bovin *** sérum= sérum humain (normal). Les résultats indiqués dans le tableau 1 montrent que, comme prévu, l'endotoxine déclenche une libération impor- tante d'un facteur qui augmente la chimiotaxie du PMN (traitement N 2); le PDP (0,5%) n'a pas d'effet sur le PMN (traitement N 3); et les endotoxines prétraitées avec du PDP présentent des activités chimiotactiques nettement dimi- nuées (traitements N 4, 5 et 6). Ces résultats montrent qu'un traitement de l'endotoxine avec du PDB inactive l'effet bio- logique de la toxine. -10- Exemple 2 Le tableau 2 donne les résultats obtenus dans d'autres essais effectués avec la chambre de Boyden comme dans l'exemple 1. Le PDP utilisé est sous forme de sel tétrapotassique. Traitement Tableau 2 Valeur moyenne de la chimiotaxie du PMN migrant + EC Diminution de chimiotaxie (%) 1. Milieu témoin (comme dans l'exemple 1) 2. Endotoxine (1 ng/ml) et sérum* 3. PDP (0,5%) et sérum* 4. Endotoxine (1 ng/ml) pré- traitée avec 0,5% de PDP et sérum* 5. Endotoxine (1 ng/ml) pré- traitée avec 0,25% de PDP et sérum* 6. Endotoxine (1 ng/ml) pré- traitée avec 0,1% de PDP et sérum* 136,5 6,3 329,0 139,5 39,5 4,9 188,0 9,8 206,5 17,6 231,0 17,6 * sérum= voir exemple 1. Les résultats figurant dans le tableau ci-dessus montrent qu'une concentration minimale efficace de PDP aussi faible que 0,1% inactive l'activité biologique de l'endotoxine. -43,0% -37% -30% -11- Exemple 3 Effets du PDP sur l'activité de l'endotoxine dans un système de culture d'os On utilise l'essai dans lequel une endotoxine isolée à partir d'Acintobacillus actinomycetemcomitans Y4 (AaY4) pro- voque la résorption osseuse dans un système de culture d'os (Kiley et Holt, Infect. Immun., 30 362-373, 1980), pour déter- miner si le PDP inactive l'endotoxine provenant de AaY4, dans son action provoquant la résorption osseuse. On prépare une culture d'os embryonnaires de rat, comme décrit par Raisz, J. Clin. Invest., 44:103116 (1965), par injection de 45CaC12 à des rates au dix-huitième jour de gestation. Le dix- neuvième jour, on sacrifie les rates, puis on prélève les radius et les cubitus des embryons, avec leurs extrémités cartilagineuses, et pour la culture, on les place dans du milieu BGJ (Gibco, Buffalo, NY, USA) à 37 C, avec 5% de CO2. Le milieu est enrichi avec 5% de sérum foetal de veau. chauffé (57 C pendant 3 heures). On place les os, à raison de 4 par cupule, dans des bottes à 24 cupules (Nunc, Gibco) contenant 0,5 ml de milieu par cupule. On compare la libéra- tion de 45Ca dans les milieux de culture à partir d'os mis à incuber en présence d'un composé d'essai, à la libération de 45Ca à partir d'os mis à incuber dans des milieux témoins, et les résultats de la résorption osseuse sont exprimés par ce rapport. L'endotoxine provenant de AaY4 est fournie par l'Ecole Dentaire de l'Université de Pennsylvania. L'endotoxine de AaY4 est traitée avec différentes concentrations de PDP (sel tétrapotassique) à 37 C. On élimine le PDP en excès à l'aide d'une membrane de dialyse (limite de poids molécu- laire: 3 500). Cela permet au PDP non réactif d'être éliminé par diffusion, tandis que l'endotoxine, ayant un poids molé- culaire supérieur à 3 500, est retenue à l'intérieur de la poche. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 3. :1 -12- Tableau 3 Traitement Nombre 45Ca libér' Essai/ Niveau de de rats % EC témoin signification 1. Témoin 6 30,11 1,98 2. 10eg/ml d'endo- toxine de AaY4 6 85,46 4,71 2,87 0,16 97% par rapport à 1 3. 10 Pg/ml d'endo- toxine prètraitée avec 100 pg de PDP 6 78,47 2,9 2,61 0,1 non sign. 4. 10,pg/ml d'endo- toxine pr6traitée avec 1000 pg de PDP 6 31,98 4,27 1,06 0,14 97% par rapport à 2 Les r6sultats montrent que l'endotoxine provenant de AaY4 provoque d'une façon significative la résorption osseuse (comparaison de 1 et 2), tandis qu'un prétraitement de l'endo- toxine avec 1000 pg/ml de PDP (0,1%) inhibe efficacement l'activité de résorption osseuse manifestée par l'endotoxine. Les résultats ci-dessus, obtenus dans les exemples 1-3, illustrent les effets du PDP têtrapotassique et d'autres sels à base de PDP, non toxiques, solubles dans l'eau, pharmaceu- tiquement acceptables, tels que les sels d'autres métaux alcalins, les sels de métaux alcalino-terreux, le sel de zinc et le sel d'6tain, ainsi que des peroxodiphosphates d'alkyle en C1_12 et autres composés organiques à base de PDP, compre- nant en particulier les esters d'adénylyle, de guanylyle, de cytosylyle et de thymylyle, ainsi que les sels d'ammonium quaternaire du PDP, dans l'inhibition de la chimiotaxie pro- voqu6epar le facteur engendré par l'endotoxiné-dans le sérum, et l'inhibition de la toxicité de l'endotoxine vis-à- vis des os, chez le rat, le lapin et les mammifères en général. REVENDICATION Composition pharmaceutique pour le traitement du choc hypotensif et de la résorption osseuse localisée, provoquée par des endotoxines bactériennes, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'ingrédient actif un peroxodi- phosphate non toxique, soluble dans l'eau, pharmaceutique- ment acceptable.