Brevet FR2586480A1 — publié le 19870227

PROCEDE POUR LE DOSAGE DU CYANAMIDE DANS DES VEGETAUX OU DES PARTIES DE VEGETAUX L'invention concerne un procédé pour le dosage du cyanamide dans des végétaux ou parties de végétaux, en particulier dans des fruits. D'après la demande de brevet de la RFA DEOS 31 50 404, le cyanamide peut être utilisé pour déclencher le dévelop- pement des bourgeons, en particulier dans les vignes et d'autres cultures fruitières. Pour des raisons de protec- tion de l'environnement, on souhaiterait connaître exac- tement la teneur résiduelle en cyanamide des végétaux traités. Jusqu'à maintenant, on ne connaît toutefois pas de méthode d'analyse praticable permettant de doser avec une exactitude suffisante le cyanamide à l'état de traces. Les méthodes d'analyse usuelles antérieures sont basées sur les fortes propriétés électrophiles du groupe cyano, et sur l'acidité qui en résulte des protons de NH du cyanamide, qui peuvent être substitués facilement en milieu alcalin. Dans une série de méthodes d'analyses (cf. R. Perotte, Gazz. Chim. Ital. 35,228 (1905)), on a exploité en particulier la formation du cyanamide d'argent pour le dosage. Toutefois, ces procédés ne permettent pas de doser de cyanamide à des teneurs de 0,1 %. Pour une série de procédés colorimétriques, le chlorocyanamide constitue le produit intermédiaire réactif permettant de doser le cyanamide. Mais ces procédés ne permettent pas non plus de dosages exacts lorsqu'il s'agit de traces. En milieu alcalin, le cyanamide peut être introduit en tant que ligand dans des ferricyanures; les complexes colorés formés dans ces conditions peuvent être utilisés pour le dosage du cyanamide à l'état de traces (cf. D.A. Buyske et V. Downing, Anal. Chem. 32, 1798 (1960)). L'inconvénient de ces procédés réside dans leur manque de spécificité; en effet, un certain nombre d'autres composés nucléophiles donnent la même réaction colorée. La séparation par conséquent indispensable de ces subs- tances gênantes avant la réaction colorée est assez pro- blématique. De même, les méthodes d'analyse par chromatographie sur papier et sur couche mince décrites antérieurement, dans lesquelles on utilise comme réactif coloré par exemple un 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate, ne sont pas suffisamment sensibles. La présente invention vise en conséquence à la mise au point d'un procédé pour le dosage du cyanamide dans des végétaux ou parties de végétaux, procédé qui ne pré- senterait pas ces inconvénients des procédés de l'art i5 antérieur et permettrait une mesure simple et sans problème avec une haute sensibilité et une exactitude suffisante, et qui serait également appropriée, en particulier, au domaine des traces. Ce but a été atteint conformément à l'invention a) en extrayant le cyanamide des végétaux, b) en le convertissant ensuite en milieu aqueux alcalin par réaction avec un 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate en la 4cyanimido-l,2-naphtoquinone et c) en séparant ce produit réactionnel par chromato- graphie en phase liquide sous haute pression (HPLC) sur une phase inversée, et d) en le dosant par spectrophotométrie à une longueur d'ondes de 480 nm ou 272 nm. Il a en effet été constaté que, de façon surprenante, le procédé selon l'invention permettait de doser le cyanamide de manière extrêmement spécifique et sensible même en présence de substances gênantes, par exemple des aminoacides. Conformément à l'invention, on broie ou hache les végétaux ou parties de végétaux, en particulier les raisins, à l'aide des appareillages industriels usuels et on isole le cyanamide, qui est alors à l'état de solu- tion aqueuse, par extraction à partir des fruits. Cette extraction se fait de préférence sous forme d'une extraction liquide-liquide. En tant que solvants pour l'extraction liquide-liquide tous les solvants organiques insolubles dans l'eau possédant un coefficient de partage suffisant à l'égard du cyanamide, comparativement à tl'eau, conviennent. On a obtenu des résultats particulièrement satisfaisants avec des esters tels que l'acétate d'éthyle ou des éthers tels que l'éther diéthylique. Le mode de réalisation del'extraction liquide-liquide peut être choisi à volonté. Dans le mode de réalisation le plus simple, le cyanamide est extrait dans l'un des appareils d'extraction usuels ou obtenu par agitations répétées de la phase aqueuse avec le solvant approprié. Dans un mode de réalisation préféré, la solution aqueuse contenant le cyanamide est séparée des résidus insolubles de fruits et le cyanamide est ensuite isolé par extraction liquide- liquide, de préférence sur un adsorbaht solide; les agents d'extraction à cet effet sont également les solvants orga- niques insolubles dans l'eau mentionnés ci-dessus ou leurs mélanges. L'adsorbant solide consiste de préférence en kieselguhr, en particulier en terre de diatomées, mais en principe on peut utiliser d'autres adsorbants, par exemple du gel de silice et analogues. Après isolement du cyanamide, éventuellement accom- pagné d'autres constituants des végétaux, on élimine le solvant organique puis on fait réagir le l,2-naphtoquinone- 4-sulfonate en solution aqueuse alcaline avec le cyanamide. Pour parvenir à une réaction aussi rapide que possible, on choisit un pH de 8 à 12, de préférence de 9,5 à 10,5. Le réglage du pH peut être réalisé avec les réactifs alcalins usuels comme l'hydroxyde de potassium ou de sodium ou le carbonate de sodium ou de potassium. La température de réaction constitue également un facteur important à l'égard de la vitesse de réaction. Elle doit se situer entre 10 et C, de préférence entre 80 et 120 C d'une part pour que la réaction soit relativement rapide et d'autre part pour éviter une décomposition du cyanamide ou du produit de la réaction entre le cyanamide et le l,2-naphtoquinone-4- sulfonate. La quantité de 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate mise en oeuvre, de préférence à l'état de sel de sodium, dépend essentiellement de la teneur en cyanamide de l'échan- tillon. Le 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate doit être présent au moins en quantité stoechiométrique pour rendre possible une réaction quantitative avec le cyanamide. De préférence, on utilise un excès de réactif de 10 à 1000 fois par rapport à la teneur attendue en cyanamide. La concentration de la solution du 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate peut varier dans des limites étendues. Elle est de préférence de 500 à 1500 mg pour 1000 ml de la solution de réaction. Lors de la réaction du cyanamide avec le 1,2-naphto- quinone-4-sulfonate en milieu alcalin, il se forme le sel de sodium ou de potassium de la 4-cyanimido-l,2-naphtoqui- none, un colorant rouge orangé. A côté de cela, il se forme en plus des produits secondaires qui doivent être séparés dans une chromatographie en phase liquide sous haute pression (HPLC) subséquente. Pour préparer cette chromatographie, on laisse refroidir la solution aqueuse de réaction, on ajoute de préférence un sel de tétraalkyl- ammonium puis on extrait le sel de tétraalkylommonium de la 4-cyanimido-l, 2-naphtoquinone par un solvant organique insoluble dans l'eau. Le sel de tétraalkylammonium améliore la rétention du dérivé de naphtoquinone lors de 1'HPLC à phase inversée effectuée subséquement et facilite ainsi une séparation des produits secondaires. On peut utiliser à cet effet les sels de tétraalkylammonium usuels portant des groupes alkyle identiques ou différents contenant chacun de 1 à environ 12 atomes de carbone, par exemple des groupes méthyle; éthyle, propyle, butyle, et/ou octyle, avec les anions usuels, par exemple fluorure, chlorure, bromure, iodure, hydroxyde, acétate et sulfate-acide. Le bisulfate de tétrabutylammonium et le chlorure de méthyl-trioctyl- ammonium se sont révélés particulièrement appropriés. En tant que solvants pour l'extraction de la 4- cyanimido-l,2-naphtoquinone on retient surtout des hydro- carbures chlorés comme le dichlorométhane, le chloroforme ou le tétrachlorure de carbone. Mais on peut également utiliser d'autres solvants, par exemple des hydrocarbures (tels que le toluène). Après extraction de la 4-cyanimido-l,2-naphtoquinone et le cas échéant des produits secondaires, on élimine totalement le solvant, par exemple à l'évaporateur rotatif, et on reprend le résidu par l'éluant prévu pour la chroma- tographie en phase liquide à haute pression. Avant envoi à l'appareil d'HPLC le mélange liquide est avantageusement débarrasé des particules solides éventuelles sur un filtre à membrane. C'est au moment de la chromatographie en phase liquide sous haute pression effectuée ensuite sur une phase inversée, de préférence sur une phase inversée C-B du commerce, qu'il y a séparation des produits de la réac- tion. En tant que phase mobile on utilise de préférence un mélange usuel pour la chromatographie de paires d'ions, de préférence un mélange d'un sel de méthyl-trioctylammo- nium et de méthanol/eau/tampon phosphaté (à des proportions relatives de 800:100:50 à 600:350:50). Dans ce cas, le tampon au phosphate a de préférence un pH de 7,0 et consiste, comme habituellement, en phosphate disodique et phosphate monopotassique. La quantité du sel de méthyl-trioctyl- ammonium, par exemple le chlorure, se situe normalement entre 0,1 et 2,0 g pour 1000 ml de la solution de méthanol/ eau/tampon phosphaté. Le dosage spectrophotométrique du dérivé de 4-cyanimido-1,2-naphtoquinone peut être effectué à une longueur d'ondes de 480 nm ou 272 nm. Par comparaison de la hauteur du pic avec celui obtenu au moyen d'une solution étalon (à 0,01 mg de cyanamide), on peut alors déterminer la teneur en cyanamide. Le procédé selon l'invention permet de doser le cyanamide de mamière relativement simple et sans problème jusqu'à une limite inférieure de dosage de 0,01 à 0,05 ppm. Les figures 1 à 4 du dessin annexé sont des chroma- togrammes d'HPLC obtenus conformément à l'invention et présentés à titre d'exemples. La figure 1 est un chromatogramme qui a été obtenu par deux passages d'une solution étalon à une teneur de microgrammes de cyanamide. Le pic A est le pic du cyanamide et le pic B des produits secondaires ou des réactifs; la figure 2 est un chromatogramme obtenu à partir de raisins mûrs non traités. Les pics B sont des pics parasites dûs à des constituants de la plante; la figure 3 est un chromatogramme d'HPLC correspon- dant obtenu à partir de raisins mûrs, traités auparavant par du cyanamide. On constate qu'il n'y a pratiquement plus de cyanamide: on ne retrouve que les pics parasites B; La figure 4 représente des chromatogrammes qui ont été obtenus à partir de raisins non traités auxquels on a ensuite ajouté 10 microgrammes de cyanamide. Ici encore, le pic A est celui du cyanamide et les pics B sont des pics parasites. L'exemple qui suit illustre l'invention sans toutefois en limiter sa portée. EXEMPLE A) Préparation de l'échantillon On broie 50 g de raisins dans un mixer puis on rince avec un peu d'eau en transférant dans un erlenmeyer de 250 ml qu'on place pendant 5 mn dans un bain à ultrasons. On centrifuge ensuite et on sépare par décantation le surnageant. On lave le précipité à deux reprises avec 20 ml d'eau à chaque fois et on centrifuge. On règle les surna- geants combinés à pH 5,8-6,2 par NaOH et on les concentre à un volume final d'environ 20 ml sur l'évaporateur rotatif à une température de bain maximale de 35 C. on reprend alors la solution contenant l'échantillon par 10 g du pro- duit du commerce Extrelut (de la firme Merck, Art. n 11738) et on applique l'ensemble quantitativement sur une colonne prête à l'emploi contenant de la terre de diatomées (marque commerciale CT 2050 de la firme TCT) chargée au préalable de 10 ml d'eau. On commence immédia- tement à éluer à l'aide de 400 ml d'acétate d'éthyle. On élimine l'ester sur évaporateur rotatif à une température maximum de 35 C en ajoutant 30 ml d'eau. La solution ré- siduelle est utilisée pour la réaction subséquente avec le 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate. B) Réaction et dosage A la solution-échantillon, on ajoute 5ml de la solu- tion de naphtoquinone-sulfonate (à la concentration de 1 g de 1,2naphtoquinone-4-sulfonate pour 100 ml d'eau) et ml d'une solution de carbonate de sodium à la concentra- tion de 0,2 mole/litre et on chauffe pendant 5 mn à une température de 100 C au bain d'huile. On refroidit ensuite la solution d'échantillon à température ambiante à l'aide d'un bain de glace et on le transfère quantitativement (rinçage avec quelques ml d'eau) dans une ampoule à décanter à agitation. On agite à 4 reprises avec 30 ml à chaque fois de dichlorométhane en ajoutant chaque fois d'lml d'une solution de sulfate acide de tétrabutylammonium (à la con- centration de 0,1 mole/litre). On évapore à sec sur l'éva- porateur rotatif à 35 C les phases organiques combinées. On reprend le résidu par 5ml de méthanol, et après filtration sur un filtre à membrane, on le dirige sur l'appareilà HPLC. On analyse de la même manière, à titre d'étalon, 0,01 mg de cyanamide. C)Conditions de la chromatographie Appareil ou système d'HPLC: kontron HPLC 600 Détecteur UV/VIS: Kontron LC 720 ( réso- lution digitale 0,001 AE) : 0,5 g de chlorure de méthyl-trioctyl- Phase mobile ammonium en solution dans 1000 ml d'un mélange méthanol/ tampon phosphaté, 1:1. Tampon phosphaté: mélange de 610 ml de la solution I et 390 ml de la solution II. Solution I: 11,8 g de phosphate disodique dissous dans l'eau à volume final de 1000 ml. Solution II: 9,0 g de phosphate monopotassique dissous dans l'eau à volume final de 1000 ml. Colonne de séparation : ZorbaxC8,4,6 x 250 mm (de la firme Du Pont Instr.) Vitesse de passage: 0,8 à 1,2 ml/mn Longueur d'ondes de mesure: 485 nm D) Interprétation L'interprétation se fait selon l'équation suivante: HP x E ppm de Cy = HPxE HCP x P ppm de Cy = teneur en cyanamide de l'échantillon, en mg/kg HP = hauteur de pic du signal donné par l'échantillon E = quantité de cyanamide dans l'étalon, en micro- grammes = hauteur de pic du signal comparatif HPC = poids de l'échantillon, en g p REVENDICATIONS 1. Procédé pour doser le cyanamide dans des végétaux ou parties de végétaux, caractérisé en ce que: a) on extrait le cyanamide des végétaux, b) on le fait réagir ensuite en milieu aqueux alcalin, avec u 1,2naphtoquinone-4-sulfonate, pour former du 4-cyanimido-1,2-naphtoquinone. c) on sépare ce produit de réaction par chromatogra- phie en phase liquide sous haute pression sur une phase inversée, et d) on le dose par spectrophotométrie à une longueur d'ondes de 485 nm ou 272 nm. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare un extrait aqueux des végégaux d'o l'on sépare le cyanamide par extraction liquide-liquide. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on extrait le cyanamide dissous dans l'eau à l'aide de solvants organiques insolubles dans l'eau. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on utilise comme solvant l'acétate d'éthyle ou l'éther diéthylique. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'on isole le cyanamide par extrac- tion liquide-liquide sur un adsorbant solide. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on utilise en tant qu'adsorbant solide du kieselguhr, en particulier de la terre de diatomées. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on effectue la réaction du cyana- mide avec le 1,4-naphtoquinone-sulfonate dans un intervalle de pH de 8 à 12, de préférence de 9,5 à 10,5. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en de que l'on effectue la réaction du cyanamide l1 avec le 1,2-naphtoquinone-4-sulfonate à une température - comprise entre 10 et 150 C, notamment entre 80 et 120 C. 9. Procédé selon l'une des revendications i à 8, caractérisé en ce que l'on ajoute le 1,2-naphtoquinone 4-sulfonate en quantité au moins stoechiométrique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le produit de la réaction du cyanamide avec le 1,2-naphtoquinone-sulfonate est mis en oeuvre dans la chromatographie en phase liquide sous haute pression à l'état de sel de tétraalkylammonium. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que, pour la préparation du sel de tétraalkylammo- nium, on utilise le bisulfate de tétrabutylammonium ou le chlorure de méthyl-trioctylammonium. 12. Procédé selon l'une des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que l'on extrait le sel de 4-cyanimido-l,2naphtoquinone dumilieu aqueux alcalin à l'aide d'un solvant organique tel qu'un hydrocarbure chloré, en particulier le chlorure de méthylène. 13. Procédé selon l'une des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que la chromatographie en phase liquide sous haute pression est effectuée sur une phase inversée C-8. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que phase mobile pour la chromatographie en phase liquide sous haute pression, un mélange d'un sel de méthyl-trioctylammonium et d'une solution méthanol/eau/tampon phosphaté (dans des propor- tions relatives de 850:100:50 à 600:350:50). 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le tampon phosphaté est à pH 7,0. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on utilise de 0,1 à 2,0 g de sel de méthyl- triocty3lammonium pour 1000 ml de la solution méthanol/ eau/tampon phosphaté.