Brevet FR2592060A1 — publié le 19870626

MOLECULE DE SYNTHESE DE NATURE CASEINIQUE, RICHE EN METHIONINE ET PROCEDE D'OBTENTION A L'ECHELLE DE LA PRODUCTION INDUSTRIELLE La caséine est une protéine qui joue un rôle essentiel dans l'alimentation animale, surtout chez les animaux monogastriques tels que les chiens, les porcs, les volailles par exemple. Elle est présente à l'état naturel dans l'organisme mais elle est à elle seule impuissante à donner à l'animal tous les éléments dent il a besoin, surtout quand son organisme est soumis à des agressions physiologiques : performances musculaires, infection, etc. Cela provient du fait que si la caséine contient un grand nombre d'acides aminés essentiels, elle est en revanche pauvre en méthionine, puisqu'elle ne comprend que 2,5 % de cette dernière. La présente invention remédie à ce défaut grâce à une molécule nouvelle, proche de la caséine et enrichie en méthionine. Les effets bénéfiques directs de cette molécule sont assortis d'un avantage économique provenant d'un procédé d'obtention performant et bon marché. L'invention présente en outre l'avantage de pouvoir mettre en oeuvre un procédé de fabrication économique, donnant au produit fini un prix de revient très bas. A cette fin, l'invention a pour objet une molécule de synthèse caractérisée en ce qu'elle est de nature caséinique et qu'elle est enrichie de méthionine. Selon une caractéristique de l'invention, cette molécule comprend nd la séquence d'acides aminés suivante ALA-LEU-PRO-MET-MET-PHE-TRP-SER-THR-PRO-LEU-TYR-GLN-ASP-GLN-GLN- GLU-MET-MET- VAL-LEU-LYS-ARG-H IS-SER-MET-MET-VAL-LEU-PHE-AFN-GLN-ALA-GLN- ARG-MET-LEU- I LE-VAL-SER-THR-GLU-GLU-MET-MET-TYR-AkG-LEU-GLU-MET-SER-ALA- LEU-PRO. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de telles molécules, caractérisé en ce que l'on insère par voie biologique dans la chatne de l'acide désoxyribonucléique contenant la séquence d'un fragment de caséine, des codons de méthionine, que l'on combine la chat- ne obtenue à la chaîne de l'acide désoxyribonucléique du plasmide de bactéries d'Eschérichia-Coli, bacille Gram négatif afin de recombiner le patrimoine génétique de ces bactéries, puis qu'on place celles-ci dans des conditions de milieu favorables à leur multiplication pour obtenir le clonage de la molécule d'acide désoxyribonucléique recomtinée, puis qu'après lyophilisation on conditionne des doses destinées à être incorporées à des aliments pour animaux. Selon d'autres caractéristiques de ce procédé - afin de couper l'acide désoxyribonucléique contenant la séquence de la caséine et les fractions insérées de méthionine, par catalyse d'endo nucléases dans un plasmide, ainsi que cela est connu en soi, on uti lise l'endonucléase éco-R I. - le plasmide utilisé est celui connu sous la désignation de pFC 101. On va maintenant décrire plus en détail la molécule obtenue et donner un exemple de mise en oeuvre du procédé. La molécule de nature caséinique conforme à l'invention, c'est-àdire enrichie de fractions de méthionine, est composée des acides aminés suivants ALA- LEU- PRO-MET-MET-PHE-TRP-SER-THR-PRO-LEU-TYR-GLN-ASP-GLN-GLN- GLU-MET-MET-VAL-LEU-LYS-ARG-HIS-SER-MET-MET-VAL-LEU-PHE-AFN-GLN-ALA-GLN- ARG-MET-LEU-ILE-VAL-SER-THR-GLU-GLU-MET-MET-TYR-ARG-LEU-GLU-MET-SER-ALA- LEU-PRO. Le tableau de correspondance en est : TYR .................... TYROSINE ALA *. ALANINE ASP .................... ACIDE ASPARTIQUE ASN ASPARGINE SER .................... SERINE THR .................... THREONINE VAL .................... VALINE GLU ............ ACIDE GLUTAMIQUE GLN ................... GLUTAMINE GLY * GLYCINE LEU o LEUCINE ILE .................... ISOLEUCINE PHE .................... PHENYL-ALANINE MET .................... METHIONINE ARG .................... ARGININE LYS .................... LYSINE TRP .................... TRYPTOPHANNE PRO .................... PROLINE HIS ....................HISTODINE On remorque l'accroissement de fractions de MET (méthionine) par rapport à la séquence de la caséine naturelle puisque le pourcentage de cet acide arriné représente 18 % des acides aminés totaux dans la molécule de synthèse conforme à l'invention, contre 2,5 % seulement dans la molécule d'origine. A chacun de ces acides aminés de la séquence de la molécule conforme à l'invention correspond, par le code génétique, au moins un triplet de base selon la correspondance suivante TYR ................... UAU ALA .................... GCU ASP .................... GAU ASN .................... AAU SER .................... UCU ThR .................... ACU VAL .................... GUU GLU ................... GAA GLN ................... CAA GLY ................... GGU LEU ................... UUA ILE ................... AUU PHE - UUU MET .................... AUG ARG ................... CGU LYS ................... AAA TRP * UGG PRO .................... CCU HIS ...................CAU Les composants des triplets ont la sigification suivante C désigne l'acide sytidylique, G désigne l'acide guanylique, A désigne l'acide adénylique, U désigne l'acide uridylique. Selon le principe de la synthèse génétique, on introduit l'acide désoxyribonucléique (désigné dans ce qui suit par son abréviation habituelle ADN) comportant la séquence du fragment ci-dessus de caséine enrichie de méthionine dans l'ADN du plasmide d'EschGrichia-coli et la multiplication des bactéries recombinées entraîne le clonage (reproduction à partir d'une seule bactérie, par division cellulaire naturelle) de la molécule d'ADN recombiné, c'es$-à-dire contenant à la fois la séquence du fragment de caséine enrichie et la séquence d'Eschérichia- coli. Pour combiner les deux séquences d'ADN, on doit couper par catalyse l'ADN de caséine enrichie au niveau du site de reconnaissance. On sait obtenir une coupure d'ADN par catalyse en utilisant des endonucléases. Selon l'invention, on choisit l'endonucléase éco-R I. Ce choix est avantageux car l'endonucléase éco-R I est facilement disponible et ses réactions sont spécifiques et reprcductibles sans aléas. Afin de réaliser le clonage, il faut que l'ADN recombiné se trouve dans un élément dL matériel génétique qui se réplique. C'est le cas des plasmides qui sont des éléments génétiques en excès du génome normal de la bactérie. Etant ainsi extrachromosomîques, ils sont constitués d'ADN circulaire et ils se répliquent à l'intérieur des cellules bactériennes, lors du processus naturel de division cellulaire, indépendamment du chromosome bactérien. Après injection de l'ADN recombiné, on obtient une population de bactéries portant toutes le plasmide porteur de l'ADN recombiné. Selon l'invention, on choisit comme plasmide, celui ayant la désignation pFC 101, de masse molaire égale à 5,8.10 Daltons, composé de 9.200 paires de nucléotides. L'épissage est une opération connue qui consiste à insérer l'ADN dans un plasmide. Ici, l'épissage est effectué selon la méthode dite des extrémités cohésives bien connue de l'home de métier et qui ne sera donc pas décrite plus en détail ici. L'enzyme éco-R I ouvre le plasmide et coupe les fragments d'ADN de caséine enrichie. Lorsqu'ils sont en solution, les deux types de molécules d'ADN différents s'apparient en présence dans le milieu d'une enzyme de liaison, ici la polynucléotide Ligase. Après épissage, on obtient une molécule d'ADN circulaire de plus grand diamètre que le plastide initial et fermé par des liaisons covalentes qui stabilisent cette structure. Pour obtenir le clonage de l'ADN recombiné, on perméabilise la membrane cellulaire d'Eschérichia-coli en présence de chlorure de calcium, afin de permettre au plasmide recombiné de pénétrer dans la cellule tout en laissant celle-ci intacte, c'est-à-dire sans altérer la viabilité bactérienne. Les bactéries ainsi que les plasmides se répliquent alors indépendamment les uns des autres, sous le contrôle de leurs gènes respectifs. Avant conditionnement et utilisation, on peut contrôler la transformation des bactéries par le plasmide, en vérifiant la présence effective du plasmide à l'intérieur des bactéries, en soumettant celles ci à l'action d'un antibiotique porté par les gènes spécifiques au plasmide et en constatant la résistance de ces bactéries à cet antibiotique. En présence des acides aminés en excès dans le milieu de culture, les bactéries synthétisent la nouvelle protéine de caséine enrichie. Comme déjà indiqué plus haut, la molécule de caséine enrichie de méthionine selon l'invention présente 18 pour cent de méthionine au lieu de 2,5 pour la caséine naturelle. On obtient donc un agent actif puissant et bien assimilé par l'organisme puisqu'il est entièrement de nature biologique et non chimique. Il est conditionné avantageusement après lyophilisation, en doses que l'on incorpore à la nourriture des animaux. Le prix de revient du produit conforme à l'invention est destiné à être bas car le procédé selon l'invention étant de type biologique, on parvient, après des investissements de départ si l'on ne dispose pas déjà des installations voulues, à une production naturelle, ne nécessitant pas l'apport d'énergie chère. Sans compter l'installation de lyophilisation, on a, au début des opérations un prix de revient du produit équivalent à ce qu'il serait avec un procédé chimique industriel classique mais avec le procédé biologique, ce prix tend à diminuer considérablement, ce qui n'est pas le cas des procédés chimiques faisant appel à d'importants apports d'énergies extérieures. Les effets sur l'animal sont excellents, sans contre-indications. Le produit est surtout important pour les animaux monogastriques appelés à subir des épreuves pénibles : chevaux de courses oc de trait, chiens de traîneaux etc. ou soumis à un environnement microbien dangereux, pouvant provoquer des infections : épizooties, blessures en pays tropicaux, etc. Mais il apporte aussi des avantages pour l'alimentation d'animaux d'élevage tels que les volailles car le segment de caséine intact possède tous les acides aminés nécessaire à une alimentation équilibrée des animaux et le supplément de méthionine contribue à parfaire l'équilibre et à rendre inutile l'ajout d'acides aminés individuels de complément parfois très coûteux. De ce fait, les animaux consomment moins de nourriture et ont néanmcins une croissance plus rapide, on améliore donc le rendement de l'élevage. Actuellement, on doit fournir environ 2,2 à 2,5 kilos d'aliments à un poussin de volaille pour l'amener a environ 1 kilo. En utilisant le produit conforme à l'invention, on peut améliorer ce rendement de sept à dix pour cent et, pour obtenir ce résultat, on ajoute aux alimentes, du produit conforme à l'invention à raison de 2 a 4 % en poids de produit fini. REVENDICATIONS 1- Molécule de synthèse caractérisée en ce qu'elle est de nature caséinique et qu'elle est enrichie de méthionine. 2- Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés suivante ALA-LEU-PRO-MET-MET-PHE-TRP-SER-THR-PRO-LEU-TYR-LN-ASP-GLN-GLN- GLU-MET-MET- VAL-LEU-LYS-ARG-H IS-SER-MET-MET-VAL-LEU-PHE-AFN-GLN-ALA-GLN- ARG-MET-LEU- I LE-VAL-SER-THR-GLU-GLU-MET-MET-TYR-ARG-LEU-GLU -MET-SER-ALA- LEU-PRO. 3- Procédé d'obtention de molécules conformes aux revendications 1 et 2 ci-dessus, caractérisé en ce que l'on insère par voie biologique dans la chaîne de l'acide désoxyribonucléique contenant la séquence d'un fragment de caséine, des codons de méthionine, que l'on combine la chaîne obtenue à la chaîne de l'acide désoxyribonucléique du plasmide de bactéries d'Eschérichia-Coli, bacille Gram négatif afin de recombiner le patrimoine génétique de ces bactéries, puis qu'on place celles-ci dans des conditions de milieu favorables à leur multiplication pour obtenir le clonage de la molécule d'acide désoxyribonucléique recombinée, puis qu'après lyophilisation on conditionne des doses destinées à être incorporées à des aliments pour animaux. 4- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'affin de couper l'acide désoxyribonucléique contenant la séquence de la caséine et les fractions insérées de méthionine, par catalyse d'endcnucléases dans un plasmide, ainsi que cela est connu en soi, on utilise l'endonucléase éco-R I. 5- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le plasmide utilisé est celui connu sous la désignation de pFC 101.