Brevet FR2587495A1 — publié le 19870320

La présente invention concerne un milieu et une méthode de séparation des cellules mononucléées du sang et de la moëlle osseuse. Actuellement, cette séparation s'effectue sur un milieu à base de sucrose sur lequel la suspension cellulaire est déposée. La nature du milieu favorise la formation en rouleaux des globules rouges. Mais cette méthode est d'une part assez longue dans sa préparation et demande le plus grand soin pour ne pas perturber l'interface entre les deux liquides. D'autre part, elle ne peut s'appliquer à un récipient à parois souple qu'au prix d'un montage compliqué ou d'un machine onéreuse.Enfin, les rendements de récupération des cellules mononucléées ne se situent qu'entre 70 % et 80 % et la pureté de ces cellules varie entre 85 % et 95 %. La présente invention vise à supprimer ces inconvénients Le produit employé permet en effet - de travailler en mélangeant la suspension cellulaire et le nouveau milieu de séparation. - de consommer un minimum de temps et de soin à l'élaboration de ce mélange. - d'améliorer le rendement et la pureté des cellules mononucléées. Une technique de séparation permettant le mélange des constituants, interdit un milieu favorisant la formation en rouleaux des globules rouges. La présente invention répond à cet impératif. La méthode par mélange est très utilisée pour les suspensions de protéines, mais pas du tout pour les suspensions cellulaires non déplétées en globules rouges. Mode de réalisation pour un volume V de sang total dans un tube à parois rigides - Au volume V de sang total, on ajoute le volume V du milieu de séparation. - On mélange l'ensemble en inversant trois ou quatre fois le tube. - On centrifuge à 3000 G pendant 30' (les conditions de centrifugation sont à établir suivant la hauteur du tube). - On récupère 90 % du surnageant riche en cellules mononucléées. - Le surnageant est dilué au 1/3 avec un milieu de lavage et centrifugé 800 G pendant 15'. - Les cellules mononucléées sont suspendues dans un milieu habituel. On a considéré dans cette méthode que l'hématocrite initial du sang pouvait se situer entre 30% et 60 %. (Hématocrite = volume des globules rouges : volume total du sang (GR + Plasma)). Ces limites recouvrent la quasi totalité des valeurs du sang de sujets normaux. Dans des conditions. physiologiques, ces écarts d'hématocrite entraineraient des écarts de la densité du mélange (plasma plus milieu de séparation) trop importants. Le milieu de séparation a été conçu pour amener le mélange final à une osmolarité de 400 mOsm. Cette valeur a été choisie arbitrairement, dans la mesure où elle ne met en danger aucune des cellules du sang et de la moëlle osseuse. Deux effets se combinent pour éviter de trop grands écarts de densité par rapport à la valeur optimale choisie pour mettre au point cette technique correspondant à un hématocrite initial de 40 %. - La densité d'une cellule croit quand l'osmolarité augmente. Si le sang de départ a un hématocrite faible la proportion plus importante (par rapport à 40 gg) abaisse la densité du mélange mais en abaisse également l'osmolarité. Le couple de valeur densité-osmolarité, véritablement important pour l'efficacité d'une séparation, se trouve moins perturbé par rapport aux valeurs optimales (densité et osmolarité pour hématocrite 40 %). Si les conditions étaient physiologiques cet effet ne pourrait avoir lieu. Si l'hématocrite est plus fort que 40 %, l'effet inverse se produit. (Fig. 2) - Les globules rouges sont très sensibles aux variations osmotiques. On a pu établir qu'à 400 mOsm,1 mi de globules rouges relachait 0,2 mi d'eau. il en a été tenu compte pour déterminer les conditions de séparation pour un hématocrite de 40 %. Si l'hématocrite est plus faible la dilution par l'eau relachée par les globules rouges est moindre. Si l'hématocrite est fort l'eau relachée est plus importante.Bien que secondaire, ce point Ylent~s'8outer au premier pour moduler les variations de la densité du mélange en fonction de }'hématocrite initial (voir Fig. 1)? L'ensemble de cinq manipulations a donné les résultats suivants 50% 1 60%j 30 % 40 %# 92%jb (94%t1 I 95%r, ss%+3 31 ( rendement en#CMN : 0,2# f0,2 0,7%- -' 3% a I I%#-# Ycléai res o- -I e ia densité par rapport à 40% : -2,5%-+ 0.3 Téinoin +4%- 0,3 +7%± 100 mi de la solut#ion de séparation sorat constitués de 14, 2 g de Métrizamide en poudre (Nyegaard, Oslo) 35,25 g de Métrizoate de sodium (Nyegaard, Oslo) 63, 95 g d'eau distillée Le pH est ajusté à 7,1 La densité finale est de 1,134 L'osmolarité finale est de 482 mOsm.-+ 20 Une démarche analogue peut être suivie pour séparer les cellules mononucléées de grands volumes de sang ou de moelle osseuse et utilisant des poches transfusionnelles en plastique souple. Il est conseillé pour le cas de la moëlle osseuse d'ajuster l'hématocrite à 40 % avec du plasma isogroupe ou si l'on veut réduire le volume du milieu de séparation, ajouter ce milieu dans des proportions de 60 % pour 40 % de plasma restant après la séparation destinée à augmenter l'hématocrite. En effet, ces manipulations requérant le plus grand nombre de cellules mononucléées en vue de transfusion, il vaut mieux se mettre dans les conditions optimales de la séparation. Le mélange moëlle osseuse et milieu de séparation étant fait directement dans une poche transfusionnelle, celle-ci est centrifugée pendant 45 mn à 3000 G. Le surnageant riche en cellules mononucléées (CMN) est recueilli par pression sur une presse utilisée en transfusion. Les résultats préliminaires et l'expérience passée de la séparation en gradient discontinu avec un milieu de séparation courant (Ficoll 40d) Pharmacia Fine Chimicals) laissent entrevoir une légère baisse du rendement et une pureté en cellules mononucléées de tordre de 95 %. Cette méthode permet en outre de gagner de 30 à 60 mn sur le temps de séparation, par rapport aux autres méthodes. REVENDICATIONS 1) Méthode de séparation caractérisée par mélange volume à volume du milieu de séparation avec le sang total ou la moelle osseuse totale. 2) Méthode de s & aration caractérisée selon la revendication 1, en ce que l'hyperosmolarité du mélage obtenu régule la variation de la densité liée aux différences physiologiques d'hématocrites de sangs de sujets normaux. 3} Méthode de séparation caractérisée selon la revendication 1, en ce qu'une dilution du milieu par les globules rouges est fonction de l'hématocrite et que les écarts du couple de valeurs densité-osmolarité sont moindres. 4) Milieu de séparation caractérisé par une association de Métrizamide, de Métrizoate de Sodium et d'eau distillée, en ce que ces composants ont été établis pour obtenir une densité et une osmolarité conciliables avec une bonne séparation des cellules mononucléées. 5) Milieu de séparation -caractérisé selon la revendication 4 , en ce #;u###ti lis#tiondkj-fl -sel - dense (Métrizoate de Sodium) permet une tonicité physiologique. 6) Milieu de séparation caractérisé selon la revendication 4, en ce que ce milieu ne favorise pas la formation en rouleaux des globules rouges ce qui rendrait le procédé inutilisable. 7) Milieu de séparation caractérisé selon la revendication 4, en ce qu'il utilise#du métrizamide, mais qui pourait être préparé avec d'autres molécules voisines, telles que le Maxidens, Nycodenz (Nyegaard and Co. OSLO - NORVEGE) dans la mesure où cette molécule ne favorise pas la formation en rouleaux des globules rouges et qu'elle permet la préparation d'un milieu dont les conditions de densité et d'osmolarité soient conciliables avec une bonne séparation.