Brevet FR2593519A1 — publié le 19870731

La présente invention concerne la préparation de vaccins contre le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA), ainsi que les vaccins obtenus et, également, les divers intermédiaires servant à cette obtention. Ainsi, la présente invention concerne des virus qui expriment des peptides et protéines apparentés à des épitopes du virus associé à l'adénopathie /Rymphadenopathy Associated Virus (LAV)7/virus de la leucémie des cellules T humaines /Human T-Cell Leukemia Virus (HTLV-III)/,l'agent étiologique du syndrome d'adénopathie /Lymphadenopathy Syn drome (LAS)7et du syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA); /Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)7.Les virus de la présente invention peuvent servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins à base de virus pour le syndrome d'adénopathie (LAS) ou le SIDA ou dans des formulations de vaccins multivalents.En fait, les virus infectieux de la présente invention, qui peuvent se multiplier dans un hôte sans provoquer de maladie, peuvent servir dans des formula tions de vaccins à base de virus vivants qui procurent une stimulation immunogène prolongée et peuvent donner naissance à une forte immunité. La présente invention vise également des peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAVIHTLV III, pou vant servir d'iiirnunooènes dans des formulations de vaccins à sous-unités pour LAS ou le SIDA, ou dans des formulations de vaccins multivalents, ou comme antigènes dans des dosages immunologiques pour le diagnostic de LAS ou du SIDA. Ces peptides et protéines peuvent être produits en utilisant des techniques mettant en oeuvre de 1'ADN recombinant dans n importe quel système vecteur-hôte, ou bien ils peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques.Donc, l'inven tion vise aussi la construction de nouvelles séquences de ADN et de vecteurs comprenant de 1'ADN de plasmide, et de 1'ADN viral comme des virus infectant les êtres humains, des virus infectant les animaux, des virus infectant les insectes ou des bactériophages pouvant servir pour diriger l'expression de peptides et protéines apparentés à LVA/HTLV dans des cellules d'un hôte approprié à partir desquelles on peut purifier les peptides et protéines. Des méthodes chimiques pour la synthèse de peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III sont également décrites. Dans une forme spécifique de mise en oeuvre de la présente invention, on a utilisé un virus de vaccine recombinant pour produire des protéines apparentées à LAV/HTLVIII. Pour cela, on a inséré des séquences de ADN codant pour les glycoprotéines de LAV/HTLV III dans un vecteur de vaccine capable de diriger l'expression du gène de glycoprotéine de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. On a trouvé que les protéines de LAV/HTLV III produites par le virus de vaccine recombinant sont antigéniques et immunogènes. Ces virus de vaccine recombinants peuvent eux-mêmes servir dans des formulations de vaccins à base de virus. En variante, les protéines apparentées à LAV/HTLV III, produites par les virus recombinants, peuvent être purifiées ou chimiquement synthétisées, et utilisées à titre d'immuno genes dans des formulations de vaccins à sous-unités. Puisque la ou les glycoprotéines apparentées à LAV/HTLV III risquent d'être reconnues comme "étrangères" dans l'hôte animal, une réponse immunitaire à médiation humorale et/ou cellulaire va être déclenchée contre cette protéine. Dans une formulation de vaccin préparée de manière appropriée, cela doit protéger l'hôte contre des infections subséquentes par LAV/ HTLV III. La présente invention prévoit également la production d'antigènes de LAV/HTLV III, qui ont une importance générale en médecine humaine. Cela comprend l'utilisation des peptides et protéines de la présente invention comme réactifs dans des dosages immunologiques comme les essais de dosage immunoenzymatique et ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) et les dosages radioimmunologiques qui sont utiles comme des outils diagnostiques pour la détection de LAV/HTLV dans les échantillons de sang, les fluides corporels, les tissus, etc. En outre, ce réactif sera un outil intéressant pour élucider le mécanisme de la pathogénèse de LAV/HTLV III. Le SIDA (Syndrome Immunodéficitaire Acquis) est une maladie caractérisée par une déficience immunitaire grave due principalement à des troubles de la réponse immunitaire à médiation cellulaire du patient (M. Gottlieb et col., 1981, N. Engl. J. Med. 305:1425 ; J. Masur et col., 1981, N. Engl. J. Med. 305:1431).Deux présentations cliniques de la maladie sont reconnues : (a) une phase de prodrome, appelée syndrome d'adénopathie /Lymphadenopathy Syndrome (LAS)7,caractérisee par une adénopathie chronique, de la leucopénie et une diminution quantitative des cellules auxiliaires du sang périphérique (cellules OKT4), conduisant à une inversion du rapport normal entre les lymphocytes auxiliaires et les lymphocytes T suppresseurs (OKT4:OKT8) qui se déplace de 2 vers 0,1 ou moins à mesure que la maladie progresse ; et (b) un état immunodéficitaire caractérisé par une diminution des cellules OKT4 et l'inversion du rapport normal OKT4:OKT8, la lymphopénie absolue, et des infections répétitives dues principalement à Pneumocystis carnii ; cette dernière phase est finalement associée à la mort dans la majorité des cas.Certains sous-groupes de patients présentent une incidence accrue de lymphome et de sarcome de Kaposi. Les données épidémiologiques ainsi que les renseignements concernant les types de patients qui ont contracté la maladie suggèrent qu'un agent infectieux transmis pat contact intime pourrait être la cause de la maladie. Par la suite, trois groupes de chercheurs ont présenté de fortes preuves indiquant que l'agent provoquant le SIDA est un rétrovirus présentant un tropisme le dirigeant vers les lymphocytes T auxiliaires. Ces groupes sont (a) R.C. Gallo et ses collaborateurs au National Institute of Health ont pu isoler un rétrovirus cytopathe (HTLV III) sur des patients présentant le SIDA et du pré SIDA (R.C. Gallo et col., 1984, Science 224:500 ; M. Popovic et col., 1984, Science 224:497). Ils ont aussi décelé des anticorps contre HTLV III dans le sérum de patients atteints de SIDA. (b) L. Montagnier et ses collaborateurs ont isolé à l'Institut Pasteur un rétrovirus lymphotrope (LAV) sur un patient qui présentait une adénopathie cervicale et présentait aussi un risque de SIDA (Barre-Sinoussi, F. et col., 1983, Science 220:868). Ce groupe a pu aussi montrer l'existence d'anticorps contre LAV dans du sérum provenant de patients atteints de SIDA (V.S. Kalyansraman et col., 1984, Science 225:321). En outre, ils ont pu isoler LAV à partir de lymphocytes d'un patient qui avait développé du SIDA après avoir reçu du sang d'un donneur atteint de SIDA (P.M. Feorino et col., 1984, Science 225:69). (c) J. Levy et ses collaborateurs ont isolé des rétrovirus infectieux (appelés rétrovirus associés au SIDA (AIDS-associated retrovirus, ou ARV)) à partir des cellules mononucléaires périphériques de patients présentant le SIDA (J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840). Ces trois virus ont tous été isolés indépendamment mais ils appartiennent probablement tous au même sous-groupe des rétrovirus (J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840) et ils seront collectivement appelés ici LAV/HTLV III. La structure générale des rétrovirus est celle d'un noyau de ribonucléoprotéines entouré par un enveloppe contenant des lipides que le virus acquiert au cours du bourgeonnement cellulaire. Les glycoprotéines à codage viral sont enfouies au sein de l'enveloppe et font saillie vers l'extérieur. Elles déterminent les virus connus de l'hôte et réagissent avec des récepteurs spécifiques situés à la surface de cellules sensibles. On pense que des anticorps neutralisants se fixent sur les glycoprotéines de l'enveloppe et en bloquent l'interaction avec des récepteurs situés à la surface des cellules (pages 534-535 dans "The Molecular Biology of Tumor Viruses" (biologie moléculaire des virus de tumeur), publié par John Tooze, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory ; pages 226-277 et 236-237 dans "RNA Tumor Viruses" (virus de tumeur à ARN (acide ribonucléique), publié par R. Weiss, N. Teich, H. Varmus et J. Coffin, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory). Dans le cas spécifique de LAV/ HTLV III, il existe des preuves selon lesquelles l'antigène T4, présent dans un sous-groupe de lymphocytes T, est le récepteur ou un composant du récepteur du virus (A.G. Dalgleish et col., 1984, Nature 312:763 ; D. Kltazmann et col., 1984, Nature 312:767). Le génome de ARN de LAVIHTLV III est schématisé sur la figure 1. Trois gènes sont généralement reconnus le gène gag code pour les protéines structurelles internes (protéines de noyau) du virus et définit les antigènes spécifiques du groupe de virus. Le gène pol code pour la transcriptase inverse associée au virion. Le gène env code pour les glycoprotéines virales. D'autres régions, marquées sor et 3'-orf,désignent des zones du génome contenant des cadres à lecture libre ; la fonction de ces régions n'est pas actuellement connue. On utilise actuellement un certain nombre de méthodes pour la prévention et le traitement des infections virales. Elles comprennent des vaccins qui déclenchent une réponse immunitaire active, le traitement par des agents de chimiothérapie et le traitement par l'interféron. Les voies traditionnelles de préparation des vaccins comprennent l'utilisation de virus inactivés ou atténués. L'inactivation des virus les rend inoffensifs comme agents biologiques, mais n'en détruit pas l'immunogénicité. Ltinjec- tion de ces particules de virus "tués" à un hôte va alors déclencher une réponse immunitaire capable de neutraliser une infection future par un virus vivant. Cependant, un souci majeur concernant l'utilisation des vaccins tués (utilisant des virus inactivés) concerne le risque de non-ihactivation de la totalité des particules de virus. Même si l'inactivation est réalisée, puisque les virus tués ne se multiplient pas dans leur hôte, l'immunité obtenue est souvent de courte durée et il faut habituellement des immunisations supplémentaires. Finalement, le processus d'inactivation peut altérer les protéines virales et les rendre moins efficaces comme immunogènes. L'atténuation désigne la production de souches de virus qui ont essentiellement perdu leur aptitude à provoquer des maladies. Une voie pour y parvenir consiste à soumettre le virus à des conditions inhabituelles de croissance et/ou à un passage fréquent en culture cellulaire. On choisit ensuite des mutants de virus qui ont perdu de la virulence mais sont encore capables de déclencher une réponse immunitaire. Les virus atténués constituent généralement de bons immunogènes,car ils se répliquent dans la cellule de l'hôte et déclenchent une immunité de longue durée. Cependant, on rencontre plusieurs problèmes lors de l'utilisation de vaccins vivants, dont le plus gênant est une atténuation insuffisante. Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut utiliser ce que l'on appelle les vaccins de sous-unités, ou sousunités de vaccins. Cela implique une immunisation obtenue seulement à l'aide des protéines contenant le matériau immunologique concerné. Pour de nombreux virus à enveloppe, la glycoprotéine à codage viral contient les épitopes capables de déclencher la production d'anticorps neutralisants ; elles comprennent les glycoprotéines du virus La Crosse (F. Gonzalez Scarano, R.E. Shope, C.E. Calisher et N. Nathanson, 1982, Virology 120:42.), le virus de la diarrhée néonatale du veau (S. Matsuno et S. Inouye, 1983, Infection and Immunity 39:155), le vérus de l'encéphalomyélite équine du Vénézuela (J.H. Mathews et J.T. Roehrig, 1982, J. Imm. 129:2763), le virus de Punta Toro (J.M. Dalrymple, C.J. Peters, J.F. Smith et M.K. Gentry, 1981 dans "Replication of Negative Strand Viruses" (Réplication de virus de Strand négatif), D.H.L. Bishop et R.W. Compans, page 167, Elsevier, New-York), virus de la leucémie de souris (R.A. Steeves, M. Strand et J.T. August, 1974, J. Virol. 14:187) et "Mouse Mammary Tumor Virus" (virus de la tumeur des mamelles de souris) (R.J. Massey et G. Schochetman, 1981, Virology 115:20). Un avantage des vaccins de sous-unités est que le matériau viral non intéressant est exclu Les vaccins sont souvent administrés en association avec divers adjuvants. Les adjuvants aident à atteindre un niveau plus durable et plus élevé d'immunité en utilisant de plus faibles quantités d'antigènes en de plus faibles doses que si l'immunogène était administré seul. Le mécanisme de l'action des adjuvants est complexe et n'est pas entièrement compris. Cependant, il peut impliquer la stimulation de la phagocytose et d'autres activités du système réticuloendothélial aussi bien qu'un retard de libération et de dégradation de l'antigène.Des exemples d'adjuvants comprennent l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet), l'adjuvant 65 (contenant de l'huile d'arachide, du monooléate de mannide et du monostéarate d'aluminium), le polyol "Pluronic L-121", "Avridine", et les gels minéraux comme de l'hydroxyde d'aluminium, du phosphate d'aluminium ou de l'alun. L'adjuvant de Freund n'est plus utilisé dans la formulation des vaccins pour les êtres humains, car il contient de l'huile minérale non métabolisable et il constitue un agent carcinogène potentiel. L'utilisation de la technologie de 1'ADN recombinant pour la production de vaccins de sous-unités implique le clonage moléculaire et l'expression dans un vecteur approprié de l'information génétique virale codant pour les protéines pouvant déclencher une réponse neutralisante dans l'animal hôte. Tous les autres renseignements génétiques du virus sont exclus et seules les protéines nécessaires pour établir une réponse neutralisante sont présentées à l'animal hôte. L'hôte n'est jamais exposé à la totalité du virus et il ne risque pas de devenir infecté. Récemment, une nouvelle approche a été décrite, qui est potentiellement utile pour la production de vaccins de sous-unités (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 7415-7419 ; M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864 ; D. Panicali et E. Paoletti, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 4927-4931). Cette approche implique l'utilisation du virus de la vaccine comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Quand il est introduit dans des hôtes animaux, le virus de vaccine recombinant exprime le gène étranger inséré et déclenche ainsi une réponse immunitaire de l'hôte à de tels gènes. Puisque le virus vivant de vaccine recombinant peut servir de vaccin, une telle approche combine l'avantage des vaccins de sous-unités et des vaccins vivants. Le virus de la vaccine contient un génome de ADN (acide désoxyribonucléique) linéaire à double brin comportant environ 167 paires de kilobases et il se réplique au sein du cytoplasme de cellules infectées. Ces virus contiennent un système complet d'enzymes de transcription (ce qui comprend les enzymes de coiffage, de méthylation et de polyadénylation) au sein du noyau du virus, qui sont nécessaires pour l'infectivité du virus. Les séquences de régulation de transcription du virus de la vaccine (promoteurs) permettent l'amorçage de la transcription par 1'ARN polymérase de vacine, mais non pas par 1'ARN polymérase des cellules de l'hôte. L'expression de l'ADN étranger dans des virus de vaccine recombinants exige la ligature des promoteurs de vaccine sur des séquences de ADN codant pour des protéines du gène étranger. Des vecteurs de plasmide, appelés également vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chimiques dans des virus de vaccine.Un type de vecteur d'insertion est composé : (a) d'un promoteur de virus de vaccine comprenant le site d'initiation de transcription; (b) de plusieurs sites de clonage par endonucléase de restriction unique,situés en aval du site de début de transcription pour l'insertion de fragments de ADN étrangers (c) de ADN non essentiel de virus de vaccine (comme le gène TK) entourant les sites du promoteur et de clonage qui dirigent l'insertion du gène chimérique dans la région homologue non essentielle du génome de virus ; et (d) d'un marqueur d'origine bactérienne de réplication et de résistance à des antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E. coli. Des exemples de tels vecteurs sont décrits par Mackett (M. Mackett, J.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857864). Des virus de vaccine recombinants sont produits par transfection de plasmides d'insertion de bactéries recombinantes,contenant le gène étranger des cellules précédemment infectées par le virus de la vaccine. Une recombinaison homologue se produit au sein des cellules infectées et produit l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Les cellules infectées peuvent être dépistées à l'aide de techniques immunologiques, d'hybridation sur plaque de ADN, ou de choix génétique de virus recombinants que l'on peut isoler par la suite. Ces recombinants de vaccine conservent leurs fonctions essentielles et leur infectivité et ils peuvent être construits de manière à comporter environ 35 kilobases de ADN étranger. L'expression de gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunologiques (par exemple par immunoprécipitation, dosage radioimmunologique ou immunocoagulation). Les glycoprotéines naturelles de membrane produites par des cellules infectées par de la vaccine recombinante sont glycosylées et peuvent être transportées vers la surface des cellules. On peut obtenir des taux élevés d'expression en utilisant des promoteurs forts ou en obtenant par clonage des copies multiples d'un seul gène. On va décrire des virus qui dirigent l'expression de peptides ou protéines apparentés à des épitopes de LAV/ HTLV III. Ces virus peuvent être formulés sous forme de vaccins de virus pour protéger les êtres humains contre une infection par LAV/HTLV III. Dans une forme particulière de mise en oeuvre de la présente invention, on peut préparer des formulations de vaccins de virus vivants, en utilisant des virus infectieux qui expriment des épitopes apparentés à LAV/HTLV III dans un hôte infecté, mais ne provoquent pas une telle maladie chez cet hôte. L'invention vise également des peptides ou protéines apparentés aux épitopes de LAV/HTLV III. On peut les formuler en des vaccins de sous-unités pour protéger les êtres humains contre une infection par LAV/HTLV III ou bien on peut les formuler dans des vaccins multivalents. Les peptides ou protéines de la présente invention peuvent être produits dans, et isolés à partir de, n'importe quel système de vecteur d'expression dans des cellules hôtes ; cela comprend, par exemple, des cultures de cellules d'animaux ou d'insectes infectées par du virus recombinant approprié ; des microorganismes comme des bactéries transfectées par des plasmides recombinants, des cosmides ou des phages ; et de la levure transformée à l'aide de plasmides recombinants.La présente invention propose également des méthodes, des modes opératoires et des constructions de ADN servant à l'expression de l'information génétique codant pour les épitopes de LAV/HTLV III. En variante, on peut effectuer la synthèse chimique des peptides et protéines de la présente invention. Dans une forme spécifique de mise en oeuvre de la présente invention, le gêne codant pour les glycoprotéines d'enveloppes de LAV/HTLV III (gène env de LAV/HTLV III) est inséré dans un plasmide de manière qu'un promoteur de virus de vaccine antérieur soit placé en 5' par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) du gène env LAV/HTLV III, ce qui donne un gène chimérique qui est à son tour flanqué ou entouré par des séquences de thymidine kinase (TK) de ADN de vaccine. Ce plasmide est ensuite transfecté (introduit) dans des cellules qui ont été au préalables infectées par du virus de vaccine de type sauvage,ce qui permet aux gènes chimériques env LAV/HTLV III, entourés par les séquences de TK, de se recombiner dans le gène TK du virus de vaccine. On laisse les cellules se lyser et l'on cultive le virus résultant sur des plaques de cellules de TK-. On choisit le virus recombinant d'après son aptitude à se fixer sur des cultures de ces cellules en plaques en présence de 5-bromo-désoxyuridine ainsi que par hybridation ADN-ADN sur une sonde radiomarquée d'enveloppe LAV/HTLV III. On purifie des plaques positives à l'hybridation, on en provoque la croissance et l'on soumet le virus recombinant résultant à des essais d'aptitude à la production des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III. On utilise des stocks de virus, ou virus de réserve, produisant ces protéines pour infecter les animaux d'essai. Le sérum obtenu sur ces animaux peut être soumis à des dosages d'anticorps contre de la glycoprotéine LAV/HTLV III, pour déterminer l'aptitude de ce sérum à empêcher une virémie provoquée par LAV/HTLV III, et enfin pour en déceler l'aptitude à conférer une protection contre le SIDA. On va maintenant brièvement décrire les figures annexées. La figure 1 représente la structure du génome proviral intégré de LAV/HTLV III. Les zones hachurées indiquent des régions de cadres à lecture ouverte. Les régions codant pour l'antigène spécifique du groupe, la transcriptase inverse et les protéines d'enveloppe sont désignées respectivement par gag (groupe-spécifique antigène), pol et env. Les cadres à lecture ouverte qui se chevauchent sont représentés par des zones à hachurage croisé. Les nombres désignent les nombres de paires de base en aval du site de coiffage (site de "cap"), ou démarre la transcription virale. Les sites de restriction sont marqués comme suit : Bg, BglII ; Ec, EcoRI ; Hn, HindIII ; kp, kpnI ; Ss, SstI. La figure 2 représente la séquence des nucléotides de la région spécifique de LAV (EcoRI à SstI) présentes dans le plasmide pRS-3 ADN ; la totalité du gène d'enveloppe de LAV (nucléotide 5766 à 8349) est contenue dans l'insertion LAV. Les sites de restriction utilisés dans la construction de pv-envî, pv-env2 et pv-env5 sont indiqués. La totalité de la séquence des amino acides du gène de l'enveloppe, telle que déduite des données des séquences de nucléotides, est également indiquée. La figure 3 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant une portion de la séquence codant pour des protéines d'enveloppe LAV, séquence insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. La séquence codant pour l'enveloppe de LAV est représentée par la barre libre et le promoteur de vaccine par la barre ombrée ou hachurée. La séquence des nucléotides à la jonction de la région de promoteur de vaccine et de la séquence codant pour l'enveloppe LAV est indiquée à la partie inférieure de la figure. Les sequences soulignées indiquent les codons présumés d'amorçage et le cadre de lecture pour le gène chimérique. On notera que les troisième et quatrième aminoacides de la séquence translatée (Pro-Val) du pv-env2 recombinant correspondent aux aminoacides numéro 43 et 44 de la séquence de codage d'enveloppe de LAV. La figure 4 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la totalité de la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le promoteur de- virus de vaccine est représenté par la barre hachurée ou ombrée. Le plasmide pv-env5 contenant la totalité de la region de codage d'enveloppe de LAV a été construit en deux étapes. Les portions 5' et 3' de la région de codage ont été tout d'abord clonées séparément dans pGS20 pour former pv-envl qui contient l'extrémité amino de codage du gène de l'enveloppe de LAV et pv-env2 qui contient l'extrémité carboxyle de codage du gène de l'enveloppe de LAV.Ces deux portions sont regroupées au site StuI comme représenté, La figure 5 représente la construction et le choix du virus de vaccine recombinant. Les barres pleines représentent le gène de thymidine kinase (TK) du virus de la vaccine. Ce gène TK est aussi présent dans le plasmide pv-env5 ADN, mais dans le plasmide le gène TK est interrompu par le gène chimérique consistant en le promoteur à 7,5K de la vaccine (barre hachurée) et par la région de codage d'enveloppe de LAU (barre ouverte). Après infection des cellules par la vaccine, le plasmide recombinant contenant le gène TK interrompu par le gène d'enveloppe de LAV est introduit dans les cellules infectées.Les recombinaisons qui se produisent dans les séquencest TK entourant le gène chimique introduisent la séquence de gène d'enveloppe de LAV dans le génome de virus de la vaccine. Le virus recombinant résultant, contenant le gène d'enveloppe de LAU, est TK La figure 6A représente une analyse par immunocoagulation de Western des protéines produites par les recombinants de env-LAV de vaccine. Les protéines provenant des sources suivantes ont été résolues sur un gel de polyacrylamide à gradient de 7 à 15 % de SDS et électrotransférees sur du papier nitrocellulosique : protéines de virion de LAV (LAV) ; cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage ("WTvv");("wild-type vaccinia virus"); cellules non infectées ("mock"); cellules infectées par des virus recombinants v-env2 (v-env2) ou v-env5 (v-env5).Des protéines immunoréactives à l'égard du sérum d'un patient atteint de SIDA ont été décélées par l'action d'une peroxydase conjuguée à des anticorps de IgG anti-humaines. Les gènes LAV/ env produits sont indiqués par gp150, gpllO et gp41. Les étalons de poids moléculaire sont exprimés en kilodaltons (kd). La figure 6B représente une analyse d'un immunocoagulat de Western de protéines produites par des recombinants de vaccine LAV-env dans deux types de cellules. Les protéines provenant de cellules BSC-40 ou de cellules HeLa ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et électrotransférées sur du papier nitra- cellulosique puis mises en réaction avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV-III les pistes 1 et 5 représentent les cellules"mock"non-infectées ; les pistes 2 et 6 représentent des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage ; les pistes 3 et 7 représentent des cellules infectées par v-env5 ; et les pistes 4 et 8 représentent des cellules infectées par v-env2. On a décelé des protéines immunoréactives en utilisant de la protéine A marquée par 1251. Les produits de type gène de LAV-env sont indiqués par gap150, gpllO et gp41. La figure 7A représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines synthétisées dans des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage ("WTvv") ou par du virus de vaccine recombinant (v-env2 et v-env5). Les protéines ont été marquées par de la 35S-méthionine de 10 à 12 heures après l'infection. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (N) ou avec du sérum de patient atteint de SIDA (I) et l'on a provoqué la précipitation des immun complexes par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 15 % de SDS et détectées par fluorographie. Les poids moléculaires sont indiqués en kilodaltons (kd). La figure 7B représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation de protéines marquées par 3Hglucosamine produites par les recombinants de vaccine-LAV de l'invention. Les cellules Hela ont été soit infectées par des cellules non infectieuses (mock"i non-infection) (pistes 1 et 5) soit infectées par des virus de vaccine de type sauvage (pistes 2 et 6), v-env5 (pistes 3 et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8) et marquées par de la 3H-glucosamine. Les lysats de cellules ont été immunoprécipités avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/ HTVL III (pistes 5-8) et de la protéine A. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide. La figure 7C représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des protéines d'enveloppe LAV produites par les recombinants de vaccine LAV. On a infecté des cellules HeLa avec dues virus de vaccine de type sauvage, v-env5 ou v-env2 comme indiqué, marqué par 35S-méthionine, et on a lavé avec un milieu de chasse. Aux intervalles suivants de temps, on a lavé les cellules, on les a lysées et immunoprécipitées avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III et l'on a résolu par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide) : O heure (pistes 1, 7, 13) une demi-heure (pistes 2, 8, 14) ; 1 heure (pistes 3, 9, 15) ; 2 heures (pistes 4, 10, 16) ; 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18). La figure 7D représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe LAV que l'on trouve dans les cellules et dans des milieux provenant de cellules infectées par les virus de vaccine-LAV recombinants de l'invention. Des cellules HeLa ont été soit'infectées par des virus non infectés (c'est-à-dire non-infectées ; piste 1 "mock"), soit infectés par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2) v-env5 (piste 3) ou v-env2 (piste 4) et marquéeas par 35S-méthionine. Les cellules ont été separées du milieu et lysées. Les lysats de cellules (culot) et le milieu (supe) (rieur) ont été chacun immunoprécipités à l'aide de sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électropho- rèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). La figure 8 représente une analyse par immunocoa gulation de Western d'échantillons de sérum provenant de souris immunisées par des virus recombinants de vaccine LAV. Les souris avaient été immunisés avec du virus de vaccine recombinant v-env5 ou v-env2. Au bout de 8 semaines, on a fait réagir les échantillons de sérum avec des proté ines de virion LAV qui avaient été résolues par électropho rèse sur SDS-PAGE (gel de polyacrylamide) et électrotrans férées sur du papier nitrocellulosique. On a utilisé une immunoglobuline anti-souris de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline pour déceler les protéines LAV qui ont été reconnues par les sérums de souris.Les pistes a à e représentent les échantillons de sérum de 5 souris indivi duelles auxquelles on a inoculé v-env5, et les pistes 9 k représentent des échantillons de sérum provenant de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-env2. Les sérums groupés provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III (SIDA) et de souris non immunisées C57B16J (NMS) ont servi de témoins positif et négatif, respective ment. Les positions des glycoprotéines d'enveloppe LAV gp150, gel 10 et gp43 sont indiquées. La figure 9 représente une analyse par immunocoa gulation de Western d'échantillons de sérum provenant de macaques immunisés par du virus recombinant de vaccine LAV. On a inoculé à quatre singes macaques (numéros 168, 175, 180, 182) 2 x 108 unités de formation de plaques de recombinants vaccine-herpès simplex gD (v-HSgD1). On a collecté des échantillons de sérum avant l'inoculation (pistes p) et au bout de 3, 4 et 6 semaines après inoculation (pistes 3, 4 et 6, respectivement). On a dilué 50 fois des parties aliquotes de sérum que l'on a fait réagir avec de la protéine de virion LAV qui a été résolue par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immobilisée par électrotransfert sur des filtres en nitrocellulose. Les protéines de LAV reconnues par ces sérums ont été décelées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline. Les sérums groupés provenant de personnes à réponse positive à LAV/HTLV III (SIDA) ont servi de témoin positif. On va maintenant présenter une description plus détaillée de l'invention. La présente invention vise l'obtention de virus qui produisent les peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III. L'invention vise également des peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III, que l'on peut produire en utilisant des méthodes faisant appel à de 1'ADN recombinant ou par synthèse chimique. Les virus ou peptides et protéines de la présente invention peuvent servir d'immunogènes dans diverses formulations de vaccins, ce qui comprend des formulations de vaccins multivalents pour protéger contre une infection par LAV/HTLV III, qui est l'agent responsable de LAS (syndrome d'adénopathie) et du SIDA Selon une forme de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise des techniques faisant appel à de 1'ADN recombinant pour insérer des séquences de nucléotides codant des épitopes de LAV/HTLV III dans des vecteurs d'expression qui vont diriger l'expression de séquences de LAV/HTLV III dans des cellules d'hôtes appropriés.Ces systèmes vecteurs d'expression-cellules d'hôtes peuvent servir à produire in vitro des peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III et, dans ce cas, les gènes produits peuvent être purifiés à partir des cellules en culture et servir d'immunogène dans des formulations de vaccins de sous-unités. En variante, les séquences d'aminoacides de ces peptides et protéines peuvent être déduites des séquences des nucléotides de LAV/HTLV III contenues dans des recombinants qui expriment des peptides et protéines immunogènes apparentés à LAV/HTLV III. Ces peptides et protéines peuvent ensuite faire l'objet de synthèses chimiques et servir dans des formulations de vaccins à sous-unités synthétiques. Quand le vecteur d'expression est un virus, le virus lui-même peut être formulé à titre de vaccin. Des virus recombinants infectieux, qui ne déclenchent pas une maladie dans l'hôte, peuvent servir dans des préparations de vaccins à virus vivant pour conférer une immunité importante. En variante, on peut préparer des vaccins contenant des virus inactivés, quand on utilise des virus "tues". En outre, on peut préparer des vaccins multivalents contenant des épitopes de LAV/HTLV III ainsi que ceux d'autres agents provoquant des maladies. Pour une description claire, le procédé de l'invention peut être divisé en les étapes suivantes : (a) isolement d'un gène, ou fragment de gène, codant des protéines de virus LAV/HTLV III ; (b) insertion du gène, ou du fragment de gène,dans des vecteurs d'expression ; (c) identification et croissance du vecteur d'expression recombinant dans un système hôte qui est capable d'assurer la réplication et l'expression du gène ; (d) identification et purification du produit obtenu à l'aide du gène ; (e) détermination du pouvoir immunitaire du produit, et (f) formulation d'un vaccin. Dans une forme spécifique de mise en oeuvre de l'invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants contenant le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immunologiquement liées aux protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules en culture tissulaire infectées par les virus recombinants. Cependant, les compositions et procédés que l'on décrit ici ne se limitent pas à la construction des virus de vaccine recombinants exprimant des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTVL III, et ils peuvent servir à reconstruire des recombinants dans n'importe quel système de vecteur d'expression pour la production de polypeptides apparentés à des antigènes de n'importe quel agent étiologique du SIDA. Pour la clarté de l'exposé, la totalité du procédé sera étudiée en termes de gènes de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Cependant, la même technique peut être appliquée de façon analogue pour construire des vecteurs d'expression recombinants et pour produire des polypeptides apparentés à n'importe laquelle des protéines de LAV/HTLV III ainsi que pour celles de virus apparentés. ISOLEMENT DE GENES, OU DE FRAGMENTS DE GENE, CODANT DES PROTEINES VIRALES LAV/HTLV III L'isolement du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III implique tout d'abord l'isolement de fragments de ADN contenant les séquences de gènes d'enveloppe. Comme précédemment expliqué, LAV/HTLV III possède un génome de ARN et, donc, on peut obtenir 1'ADN correspondant qui code le gène LAV/HTLV III (a) en clonant par ADNc 1'ARN isolé de virion purifié de LAV/HTLV III, ou (b) en clonant par ADNc de l'ARN contenant du polyA que l'on obtient à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III, ou (c) en clonant de 1'ADN de génome purifié à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III. Ci-après, on appelera 1'ADN codant les gènes de LAV/ HTLV III de 1'ADN de LAV/HTVL III. Afin d'engendrer des fragments de ADN de LAV/HTVL III, on peut cliver 1'ADN de i;AV/HTLV III en des sites spécifiques, en utilisant diverses enzymes de restriction. En variante, on peut utiliser de 1'ADN ase en présence de manganèse pour fragmenter 1'ADN, ou bien l'on peut cisailler physiquement 1'ADN, par exemple par traitement aux ultrasons. On peut ensuite séparer les fragments linéaires de ADN, selon leurs dimensions, par des techniques classiques, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, une électrophorêse sur gélose et gel de polyacrylamide et une chromatographie sur colonne. On peut utiliser n'importe quelle enzyme de restriction ou n'importe quelle combinaison d'enzymes de restriction pour engendrer un ou des fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant la séquence d'enveloppe, à la condition que les enzymes ne détruisent pas le pouvoir immunitaire du produit protéinique de gène d'enveloppe. Par exemple, le site antigénique d'une protéine peut consister en environ 7 à environ 14 aminoacides. Ainsi, une protéine de la dimension du peptide précurseur d'enveloppe (environ 97 000 daltons) peut comporter de nombreux sites antigéniques séparés, peut-être des milliers en considérant les séquences en recouvement, des considérations de structures secondaires et tertiaires et des possibilités de traitement comme l'acétylatioa, la glycosylation ou la phosphorylation.Donc, de nombreuses séquences de gènes polypeptidiques d'enveloppes risquent de coder pour un site antigénique. Par conséquent, on peut utiliser de nombreuses combinaisons d'enzymes de restriction pour engendrer des fragments de ADN qui, quand ils sont insérés dans un vecteur approprié, sont capables de diriger la production de séquences d'aminoacides spécifiques d'enveloppe comprenant différents déterminants antigéniques. Une fois les fragments d'ADN engendrés, on peut réaliser d'un certain nombre de façons une identification du fragment spécifique d'ADN contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III. En premier lieu, il est possible de séquencer les fragments d'ADN correspondant à la totalité du génome de LAV/HTLV III puis 6' identifier les fragments contenant la séquence de gènes protéiniques d'enveloppe en se fondant sur une comparaison de la séquence des aminoacides prédite et de la séquence des aminoacides de la protéine d'enveloppe. En second lieu, une fois déterminée la totalité de la séquence de génome, on peut ordonner de 5' à 3' les grands cadres à lecture ouverte Comme l'organisation de génome de tous les rétrovirus examinés jusqu'à présent est 5'-gagpol-env-3', le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 3' risque très probablement de coder pour le gène d'enveloppe. En variante, le fragment contenant le gène protéinique d'enveloppe peut être identifié par sélection de ARNm. Dans ce mode opératoire, on utilise les fragments de ADN LAV/HTLV III pour isoler, par hybridation, les ARNm complémentaires. Une analyse par immunoprécipitation des produits de translation in vitro des ARNm isolés identifie l'ARNm et donc, les fragments d'ADN LAV/HTLV III complémentaire qui contiennent Ies sequences des protéines d'enveloppe.Enfin, on peut choisir des ARNm spécifiques de protéines d'enveloppe par adsorption de polysomes isolés à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III surtdes anticorps immobilisés dirigés contre la protéine d'enveloppe. On peut synthétiser une ADN d'enveloppe radiomarquée, ADNc (ADN complémentaire) en utilisant comme gabarit l'ARNm choisi (provenant des polysomes adsorbés). L'ARNm radiomarqué ou l'ADNc radiomarqué peuvent alors servir de sonde pour identifier les fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant des séquences de gènes de protéines d'enveloppe. Au lieu d'isoler le gène d'enveloppe on peut, sans que cette liste soit limitative, effectuer la synthèse chimique de la séquence de gène elle-même (à la condition que la séquence soit connue) ou transformer ADNc en ARNm qui code le gène d'enveloppe. Une fois identifié et isolé, le fragment d'ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences intéressantes peut être tout d'abord inséré dans un vecteur de clonage, tel un vecteur de clonage de plasmide,qui sert à transformer des cellules hôtes appropriées afin de provoquer la réplication de 1'ADN de manière à engendrer de nombreuses copies des sequences intéressantes de LAV/HTLV III. On peut y parvenir en provoquant la ligation du fragment de ADN de LAV/HTLV III dans un vecteur de clonage comportant des terminaisons cohésives complémentaires. Cependant, si les sites de restriction complémentaires servant à fragmenter 1'ADN de LAV/ HTLV III ne sont pas présents dans le vecteur de clonage, les extrémités des molécules de ADN risquent d'être modifiées.De telles modifications comprennent la production d'extrémités émoussées par digestion des terminaisons de ADN à simple brin ou par garnissage des terminaisons à simple brin de manière que les extrémités puissent subir une ligation d'extrémité émoussée. En variante, on peut produire n importe quel site voulu en fixant par ligation des séquences de nucléotides (agents de liaison) sur les terminaisons d'ADN ; ces agents de liaison ligaturés peuvent comprendre des oligonucléotides spécifiques, synthétisés par voie chimique, et codant des séquences de reconnaissance de sites de restriction. Selon d'autres procédés, on peut modifier, par terminaison homopolymère, le vecteur clivé et le fragment de ADN de L-AV/HTLV III. La transformation de cellules hôtes par des molécules de ADN recombinants qui incorporent le gène isolé, par ADNc ou une séquence de ADN obtenue par synthèse, permet d'engendrer de multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut être obtenu en grandes quantités par la croissance de transformants, l'isolement des molécules de ADN recombinant à partir des transformants et, quand cela est nécessaire, la récupération du gène inséré, à partir de 1'ADN recombinant isolé. Si le but ultime consiste à insérer le gène dans des vecteurs d'expression de virus comme le virus de la vaccine ou l'adénovirus, la molécule de ADN recombinant qui incorpore le gène LAV/HTLV III peut être modifiée de manière que le gène soit entouré par des séquences de virus permettant la recombinaison génétique dans des cellules infectées par le virus, de sorte que le gène puisse être inséré dans le génome viral. La totalité du génome de LAV/HTLV III a été clonée et séquencée par Wain-Hobson et col. (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9). Un clone, appelé lambda J19, a contenu un fragment de ADN de 9,2 kilopaires de bases d'une séquence de génome de LAV insérée dans le site Hind III de lambda L 47.1. Un sous-clone particulièrement utile de lambda J19, contenant le gène d'enveloppe LAU, est pRS-3 qui consiste en un fragment à !840 paires de base EcoRI vers SstI de la séquence de nucléotides de LAV insérée dans le site EcoRi et SstI de pUC18. L'ADN spécifique de LAV contenu dans pRS-3 se situe entre le site EcoRI placé au nucléotide 5289 et le site SstI placé au nucléotide 9129 sur le génome LAV (s. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9) ; voir la figure 2 qui montre la séquence de nucléotides de LAV contenue dans pRS-3.Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences codant pour les nucléotides, on peut utiliser dans la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent pratiquement la même séquence des aminoacides que celle présentée sur la figure 2. Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides d'enveloppe représentée sur la figure 2, qui sont modifiées par remplacement de différents codons qui codent le même reste aminoacide ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence (par exemple un aminoacide de même polarité), en produisant un changement silencieux. INSERTION DES SEQUENCES DE CODAGE DE PROTEINES DE LAV/HTLV III DANS DES VECTEURS D'EXPRESSION On insère la séquence des nucléotides codant pour la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou une partie de cette séquence, dans un vecteur d'expression approprié, c'est-g- dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage de protéines insérées. On peut utiliser divers systèmes hôtesvecteurs pour exprimer la séquence de codage des protéines. Cela comprend, sans que ce soit limitatif, des systèmes de cellules de mammifères infectées par des virus (par exemple le virus de la vaccine, de l'adénovirus, etc.) ; des systèmes de cellules d'insectes infectées par des virus (par exemple du baculovirus) ; des micro-organismes comme de la levure contenant des vecteurs ou bactéries de levure transformés par de 1'ADN de bactériophage, de 1'ADN de plasmide ou de 1'ADN de cosmide. Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en force et spécificité. Selon le système hôte-vecteur que l'on utilise, on peut utiliser n'importe lequel d'un certain nombre d'éléments convenables de transcription et de translation.Par exemple, quand on effectue un clonage dans des systèmes de cellules de mammifèrés, on peut utiliser des promoteurs isolés à partir du génome des cellules de mammifères (par exemple un promoteur de type métallothionene de souris) ou isolés à partir de virus dont la croissance s'effectue dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5 K de virus de vaccine). On peut aussi utiliser des promoteurs produits par de l'ADN recombinant ou par des techniques synthétiques, pour assurer la transcription desséquences insérées. Il faut aussi des signaux spécifiques d'amorçage pour une translation efficace des séquences insérées de codage de protéines. Ces signaux comprennent le codon d'amorçage ATG et les séquences adjacentes. Quand on insère dans les vecteurs d'expression appropriés la totalité du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III,y compris son propre codon d'amorçage et les séquences adjacentes, des signaux témoins supplémentaires pour la translation peuvent ne pas être nécessaires. Cependant, quand on insere une partie seulement de la séquence de codage d'enveloppe, il faut fournir des signaux exogènes de commande de translation, ce qui comprend le codon d'amor çage ou initiation de traduction ATG. Le codon d'amorçage ou initiation doit en outre être en phase avec le cadre de lecture des séquences de codage de protéines d'enveloppe pour garantir la translation de la totalité de la séquence insérée. Ces signaux exogènes de commande de translation et ces codons d'initiation ou amorçage de traduction peuvent avoir diverses origines, aussi bien naturelles que synthétiques. On peut utiliser n'importe laquelle des méthodes anté- rieurement décrites pour l'insertion de fragments de ADN dans un vecteur pour construire des vecteurs d'expression contenant un gène chimérique consistant en des signaux appropriés de commande de transcription/translation et les séquences de codage de protéines. Ces procédés peuvent comprendre des techniques utilisant de 1'ADN recombinant in vitro et des techniques synthétiques et une recombinaison in vivo (recombinaison génétique). Dans la forme particulière de réalisation décrite en détail dans les exemples de la présente invention, le virus de la vaccine a été choisi comme vecteur d'expression. Cependant, l'invention ne se limite pas à l'utilisation du virus de la vaccine. Comme précédemment expliqué, les vecteurs d'expression utilisables comprennent, sans qu'on doive se limiter aux vecteurs suivants ou à leurs dérivés : des virus infectant les êtres humains ou les animaux comme le virus de la vaccine ou les adénovirus ; les virus infectant les insectes comme des baculovirus ; des vecteurs de type levure; des vecteurs de type bactériophage, et des vecteurs de type ADN de plasmide et cosmide pour n'en citer que quelques-uns. Quand on utilise un adénovirus comme vecteur d'expression, le gène d'enveloppe de LAV/HTLV II est fixé par ligation sur un complexe de commande de transcription/translation d'adénovirus, par exemple la dernière séquence de promoteur et les séquences tripartites de tête. Ce gène chimérique est ensuite inséré dans le génome de l'adénovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome de virus (par exemple la région El ou E3) va donner un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer, dans les hôtes infectés, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III. Actuellement, il existe deux souches d'adénovirus (type 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire.Elles constituent les premiers candidats à utiliser comme vecteurs pour exprimer des gènes d'enveloppe de LAV/HTLV III. Un autre système d'expression que l'on pourrait utiliser pour exprimer la glycoprotéine de LAV/HTLV III est un système dérivant d insectes. Dans un tel système, on utilise le virus de polyédrose nucléaire Autagrapha californica (AcNPV) comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus croit dans les cellules de Spodoptera frugiperda. Le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III peut être cloné dans des régions non essentielles (par exemple le gène de polyédrine) du virus et cela est placé sous la commande d'un promoteur de AcNPV (par exemple le promoteur de polyédrine) . Le succès de l'insertion du gène de LAV/HTLV III va aboutir à l'inactivation du gène de polyédrine et à la production d'un virus recombinant non enfermé (c'est-a-dire un virus auquel manque le revêtement protéinique codé pour le gène de polyédrine). On utilise ensuite ces virus recombinants pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène inséré est exprimé. En outre, on peut choisir une souche de cellules hôtes qui module l'expression des séquences insérées ou modifie et traite le produit de gène chimérique de la façon spécifique voulue. On peut augmenter l'expression de certains promoteurs en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc et cadmium pour des promoteurs de métallothionéine). Donc, on peut régler l'expression de la protéine de LAV/HTLV III-env obtenue par génie génétique. Cela est important si le produit protéinique du gène étranger cloné est mortel pour les cellules hôtes. En outre, des modifications (par exemple une glycosylation) et un traitement (par exemple un clivage) des produits protéiniques sont importants pour le fonctionnement de la protéine.Des cellules hôtes différentes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques de traitement post-translation et de modification des protéines. On peut choisir des lignées de cellules appropriées ou des systèmes d'hôtes appropriés pour garantir la modification et le traitement corrects de la protéine étrangère exprimée. Dans la forme particulière de réalisation décrite en détail dans les exemples de la présente invention, on a ligaturé les séquences codant l'enveloppe LAV (séquence de env de LAV), aussi bien dans leur forme complète que dans leurs portions, sur le promoteur à 7,5K du virus de vaccine pour former des gènes chimériques dans divers plasmides. On a entouré les gènes chimériques de ces plasmides par des séquences supplémentaires du virus de la vaccine homologues du gène TK de virus de la vaccine. La construction du gène chimérique a impliqué l'utilisation de nucléotides, aussi bien naturels que synthétiques, codant des signaux de commande pour la transcription et la translation des séquences d'enveloppe de LAV.On a ensuite introduite le gène chimé- rique dans les vecteurs d'expression de virus de vaccine par recombinaison in vivo entre la région TK homologue présente sur le vecteur de plasmide et le génome de virus de vaccine. On a utilisé ces virus recombinants, contenant le gène chimérique, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe LAV. IDENTIFICATION DE VECTEURS D'EXPRESSION RECOMBINANTS CAPABLES DE REPLICATION ET D'EXPRESSION DU GENE INSERE On peut identifier par trois approches générales les vecteurs d'expression contenant des séquences insérées de gènes étrangers : (a) hybridation ADN-ADN ; (b) présence ou absence de fonctions de gène "marqueur" , et (c) expression de séquences insérées. Dans la première approche, on peut déceler la présence d'un gène étranger inséré dans un vecteur d'expression par hybridation ADN-ADN en utilisant des sondes comprenant des séquences qui sont homologues du gène étranger inséré.Dans la seconde approche, on peut identifier et choisir le système vecteur recombinant/hôte en se fondant sur la présence ou l'absence de certaines fonctions de gènes "marqueurs" (par exemple de l'activité de thymide kinase, la résistance à des antibiotiques, un phénotype de transformation, etc.) dûs à l'insertion des gènes étrangers dans le vecteur. Par exemple, si l'on insère le gène LAV/HTLV III au sein de la séquence des gènes marqueurs du vecteur, on peut identifier les recombinants contenant la séquence insérée de LAV/HTLV III par l'absence de la fonction de gène marqueur.Dans la troisième approche, on peut identifier des vecteurs d'expression recombinants en recherchant et/ou dosant le produit du gène étranger exprimé par le recombinant. De telles recherches ou dosages peuvent se fonder sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du produit du gène. Une fois une molécule particulière de ADN recombinant identifiée et isolée, on peut utiliser plusieurs procédés pour en provoquer la propagation, selon qu'un tel recombinant constitue ou non une unité à autoréplication (un réplicon). Une unité à autoréplication, par exemple des plasmides, des virus, des cellules, etc., peut se multiplier dans l'environnement cellulaire approprie et dans des conditions appropriées de croissance. Des recombinants manquant d'une unité d'autoréplication devront être intégrés à une molécule comportant une telle unité pour que la propagation puisse avoir lieu. Par exemple, certains vecteurs d'expression de plasmide doivent, lors de leur introduction dans une cellule hôte, être intégrés au chromosome cellulaire pour garantir la propagation et une expression stable du gène recombinant. Une fois établis un système d'hôtes convenables et des conditions convenables de croissance, on peut provoquer la propagation des vecteurs d'expression recombinants et les préparer en quantité. Dans la forme particulière de mise en oeuvre de l'invention décrite en détail dans les exemples9 on a inséré le gène chimérique contenant la région codant l'enveloppe de LAV dans le gène TK du génome de virus de la vaccine, en transformant ainsi le virus en TK, c'est-à-dire en détruisant l'aptitude du virus à fabriquer de la thymidine kinase. On a choisi de tels recombinants d'après leur aptitude à croitre dans des milieux contenant de la 5-bromo-désoxy- uridine, qui est un nucléoside analogue à celui mortel pour les cellules TK mais non pas pour les cellules TK . On a en outre identifié des recombinants par hybridation ADN-ADN, en utilisant des sondes spécifi-ques de l'enveloppe de LAV. On a isolé le virus recombinant TK par purification sur plaque et l'on a préparé des stocks de réserve à partir de cellules de cultures tissulaires infectées. IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DU GENE EXPRIME Une fois identifié un recombinant qui exprime le gène LAV/HTLV III, il convient d'analyser le produit du gène. On peut y parvenir par des analyses et dosages se fondant sur les proprietés physiques, immunologiques ou fonction nelles du produit. Une analyse immunologique est particulièrement importante puisque le but final consiste à utiliser les produits de gènes ou virus recombinants qui expriment de tels produits dans des formulations de vaccins et/ou à titre d'antigènes dans des dosages immunologiques pour diagnostiques. Divers antisérums sont disponibles pour analyser l'immunoréactivité du produit, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, du sérum provenant de patients atteints de LAS (syndrome d'adénopathie) ou de SIDA et des sérums polyvalents dirigés contre le virus LAV/HTLV, la protéine d'enveloppe virale et ses analogues produits dans un système bactérien, ou les peptides synthétiques contenant des déterminants antigéniques de l'enveloppe de LAV/HTLV III. L'identification des peptides et protéines décrits dans la présente invention se fonde sur deux exigences. En premier lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être produite seulement dans des cellules infectées par du virus recombinant.En second lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être capable d'une réaction immunitaire avec le sérum de patients atteints de SIDA ou avec divers anticorps dirigés contre la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III ourses analogues et dérivés. La protéine doit être immunoréactive, qu'elle résulte de l'expression de la totalité de la séquence de gènes, d'une partie de séquence de gènes ou de deux ou plusieurs séquences de gènes qui sont liées par ligation pour diriger la production de protéines de fusion. Cette réactivité peut être mise en évidence par des techniques immunologiques classiques, comme une radio-immunoprécipitation, une compétition radioimmunitaire, ou des immunocaillots. Une fois identifiée la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III, on peut isoler et purifier cette protéine par des méthodes classiques comprenant la chromatographie (par exemple la chromatographie par échange d'ions, par affinités et dans une colonne de classement par dimensions), par centrifugation, par différence de solubilité, ou par n'importe quelle autre technique classique pour la purification de protéines. En variante, une fois identifiée une protéine immunoréactive apparentée à LAV/HTLV III et produite par un recombinant, on peut déduire la séquence des aminoacides de la protéine immunoréactive d'après la séquence des nucléotides du gène chimérique contenu dans le recombinant. Par suite, la protéine peut être synthétisée par des méthodes chimiques classiques connues en pratique (voir, par exemple, M. Hunkapiller et col., 1984, Nature 310:105-111). Dans une forme particulière de réalisation de la présente invention, de tels peptides, qu'ils soient produits par des techniques utilisant de 1'ADN recombinant ou par des méthodes de synthèse chimique, comprennent, sans que cette liste soit limitative, la totalité ou une partie de la séquence des aminoacides essentiellement comme représenté sur la figure 2, ce qui comprend des séquences altérées dans lesquelles des restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui crée une variation silencieuse. Par exemple, un ou plusieurs restes d'aminoacides de la séquence peuvent être remplacés par un autre aminoacide de polarité semblable, qui joue le rôle d'un équivalent fonctionnel, en donnant une altération silencieuse.On peut choisir, parmi d'autres membres de la classe à laquelle l'aminoacide appartient, des éléments pour remplacer un aminoacide au sein de la séquence. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine. Les aminoacides neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides (basiques) à charge positive comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les aminoacides (acides) à charge négative comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. DETERMINATION DU POUVOIR IMMUNITAIRE DU PRODUIT RECOMBINANT On peut déterminer le pouvoir immunitaire du produit apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III en surveillant la réponse immunitaire d'aminaux d'essai après immunisation par injection de la protéine purifiée ou du peptide ou protéine de synthèse purifiée. Quand la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III est exprimée par un virus recombinant infectieux, on peut utiliser le virus recombinant lui-même pour immuniser les animaux d'essai. Les animaux d'essai peuvent comprendre des souris, des lapins, des chimpanzés, et l'on peut éventuellement aussi faire appel à des êtres humains.Des méthodes d'introduction de l'immunogène peuvent comprendre la voie intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée, intranasale ou n'importe quelle autre voie classique d'immunisation. La réponse immunitaire des sujets d'essai peut être analysée par trois approches : (a) la réactivité de l'immun sérum résultant à l'égard d'antigènes viraux authentiques de LAV/ HTLV III, selon des dosages ou essais effectués par des techniques connues, par exemple le dosage par immunosorption avec enzyme liée (ELISA), les immunocoagulats, des radioimmunoprécipitations, etc., (b) l'aptitude de l'immun-sérum à neutraliser in vitro"l'infectivité de LAV/HTLV III (M. Robert-Guroff, 1985, Nature 316:72-74), et (c) une protection contre l'infection par LAV/HTLV III et/ou une atténuation des symptômes infectieux chez des animaux immunisés (D.P. Francis, 1984, Lancet 2:1276-1277 ; D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1:55-56). FORMULATION D'UN VACCIN Le but de cette forme de réalisation de l'invention est de formuler un vaccin dans lequel l'immunogène est apparenté à un épitope de LAV/HTLV III ou est un virus recombinant qui exprime un tel immunogène qui protège contre les infections à virus de LAV/HTLV III pour la prévention de l'adénopathie (LAS) ou du SIDA. En outre, on peut préparer des formulations de vaccins multivalents dans lesquels on utilise le produit de gène de LAV/HTLV III ou un virus recombinant exprimant le produit de gène chimérique, en combinaison avec d'autres immunogènes, pour la prévention du syndrome d'adénopathie (LAS) ou du SIDA et d'autres maladies. Des exemples de diverses formulations sont présentés ci-après. FORMULATIONS DE VACCINS A VIRUS On peut formuler un vaccin à virus recombinant vivant ou un vaccin à virus recombinant inactivé. Le choix dépend de la nature du virus recombinant que l'on utilise pour exprimer les épitopes apparentées à LAV/HTLV III. Quand le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser mais ne suscite pas de maladie, un vaccin vivant est préférable parce qu'une multiplication chez l'hôte conduit à une stimulation prolongée d'un genre et d'une amplitude semblables à ce qui se produit dans des infections subcliniques naturelles et, donc, cela confère une forte immunité de longue durée.Lors de son introduction dans un animal hôte, le virus recombinant infectieux peut exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/STLV III à partir de son gène chimérique et stimuler ainsi une réponse immunitaire contre des antigènes de LAV/HTLV III. Quand une telle réponse immunitaire constitue une protection à l'encontre d'une attaque ultérieure par LAV/HTLV III, le virus recombinant vivant peut servir lui-même de vaccin préventif contre une infection par le virus du SIDA. La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces formulations peut impliquer des systèmes aussi bien' in vitro'(par exemple des cellules de culture tissulaires) qu"'in vivo" (par exemple un animal hôte naturel comme une vache).On peut adapter des méthodes classiques pour la préparation et la formulation de vaccins contre la variole à la formulation d'un vaccin à virus recombinant. On peut préparer des vaccins multivalents à virus vivant à partir d'un seul ou d'un petit nombre de virus recombinants infectieux qui expriment des épitopes d'organismes provoquant d'autres maladies en plus des épitopes de LAV/HTLV III. Par exemple, on peut traiter par génie génétique un virus de vaccine (qui peut recevoir environ 35 kilobase de ADN étranger) de manière qu'il contienne des séquences de codage d'autres épitopes en plus de ceux codant pour LAV/HTLV III ; un tel virus recombinant luimême peut servir d'immunogène dans un vaccin multivalent. En variante, on peut formuler, dans un vaccin multivalent, un mélange de virus de vaccine ou d'autres virus, capables de chacun de diriger l'expression d'un gène différent codant pour différents épitopes de LAV/HTLV III et/ou d'autres organismes capables de provoquer une maladie. Que le virus recombinant soit ou non infectieux pour l'hôte à immuniser, on peut préparer une formulation de vaccin inactivé. Les vaccins inactivés sont "morts" en ce sens que leur infectivité a été détruite, habituellement par traitement par du formaldéhyde. En principe, l'infectivité du virus est détruite sans affecter la capside ou enveloppe des protéines qui porte le caractère immunogène du virus. Afin de préparer des vaccins inactivés, il faut faire croître en culture de grandes quantités du virus recombinant pour fournir la quantité nécessaire d'antigènes apparentés. On peut utiliser un mélange de virus inactivés qui exprime différents épitopes pour formuler des vaccins "multivalents". Dans certains cas, cela peut être préférable à des formulations de vaccins vivants, en raison de difficultés potentielles dues à une interférence mutuelle de virus vivants administrés ensemble. Dans l'un ou l'autre cas, il convient de formuler le virus recombinant inactivé,ou le mélange de tels virus, avec un adjuvant convenable afin d'amplifier la réponse immunologique à leurs antigènes. Des adjuvants convenables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple de l'hydroxyde d'aluminium; des substances tensioactives comme de la lysolécithine, des polyols "Pluronic" ; des polyanions ; des peptides ; et des émulsions dans de l'huile. On peut utiliser de nombreuses méthodes pour introduire les formulations de vaccins décrites ci-dessus; elles comprennent, sans que ce soit limitatif, les voies intrader mique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée et intranasale. Quand on utilise une formulation de vaccins à virus recombinants vivants, ce vaccin peut être introduit par la voie naturelle d'infection du virus de type sauvage apparenté que l'on a utilisé pour obtenir le virus recombinant dans la formulation du vaccin. FORMULATION DE VACCINS A SOUS-UNITE Au lieu de vaccins à base de virus, on peut utiliser la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III ellemême comme immunogène dans des formulations de vaccins à sous-unité. Comme précédemment expliqué, des vaccins à sousunité comprennent seulement le matériel immunogène en cause nécessaire pour immuniser un hôte.Donc, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III peut être purifiée à partir de recombinants qui expriment les épitopes de LAV/ HTLV III.De tels recombinants comprennent n'importe lesquelles des cellules cultivées infectées par le virus, des transformants bactériens, ou des transformants de levure qui expriment les épitopes de LAV/HTLV III (on peut se reporter à ce qui a été dit ci-dessus à propos de l'insertion des séquences de codage de protéines, de l'identification des vecteurs recombinants d'expression, et à propos de l'identification de la purification du produit de gène exprimé). Dans une autre forme de mise en oeuvre de la présente invention, les peptides ou protéines apparentés à LAV/HTLV III peuvent être obtenus par synthèse chimique. Pour cela, on peut déduire la séquence des aminoacides d'un tel peptide ou d'une telle protéine à partir de la séquence des nucléotides du gène chimérique qui en dirige l'expression (voir, par exemple, ce qui a été indique ci-dessus à propos de l'identification et de la purification du produit de gène exprimé). Que les immunogènes soient purifiés à partir de recombinants ou obtenus par synthèse chimique, le produit final peut être ajusté à une concentration appropriée et formulé avec n'importe quel adjuvant convenable pour vaccin, puis emballé en vue de son utilisation. Des adjuvants conve nables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, les substances tensioactives comme la lysolécithine, des polyols Pluronic ; des polyanions ; des peptides ; et des émulsions dans de l'huile. L'immunogène peut également être incorporé à des lyposomes, ou conjugué à des polysaccharides et/ou à d'autres polymères pour servir dans une formulation de vaccin. Quand le peptide ou la protéine apparenté à LAV/ HTLV III est un haptène, c'est-à-dire une molécule qui est antigénique du fait qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps reconnus, mais qui n' est pas antigénique du fait qu'elle ne peut déclencher une réponse immunitaire, l'haptène peut être lié par covalence à un support ou une molécule immunogène ; par exemple, une grosse protéine comme de la sérum albumine protéinique va conférer un caractère immunogène à l'haptène qui lui est couplé. On peut formuler l'ensemble haptène-support pour l'utiliser à titre de vaccin. IMMUNITE PASSIVE ET ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES Au lieu d'une immunisation active à l'aide de vaccins à virus ou à sous-unité, il est possible de conférer une protection à court terme à un hôte en lui administrant de l'anticorps préformé dirigé contre un épitope de LAV/HTLV III. Donc, on peut utiliser les formulations de vaccins décrites ci-dessus pour produire des anticorps destinés à servir à une immunothérapie passive. On préfère en médecine humaine de l'immunoglobuline humaine,car de l'immunoglobuline hétéro- logue risque de provoquer une réponse immunitaire à ses composants immunogènes étrangers. Une telle immunisation passive pourrait servir en cas d'urgence pour une protection immédiate de personnes non immunisées et exposées à des risques speciaux, par exemple les personnes exposées à un contact avec des patients atteints de SIDA, par exemple, dans des hôpitaux et autres installations de soins.En variante, on peut utiliser ces anticorps pour produire de l'anticorps antiidiotypique, que l'on peut utiliser à son tour à titre d'antigène pour stimuler une réponse immunitaire contre des épitopes de LAV/HTLV III. DOSAGES IMMUNOLOGIQUES Dans un autre aspect de la présente invention, on peut utiliser les peptides et protéines de la présente invention, apparentés à LAV/HTLV III, comme antigènes dans des dosages immunologiques pour la détection d'anticorps de LAV/HTLV III dans divers tissus et fluides corporels de patients ainsi que dans le sang de banques de sang et dans des hôpitaux. Les antigènes de la présente invention peuvent servir dans n'importe quel système de dosage immunologique connu en pratique,ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, les dosages radioimmunologiques, les dosages dits "ELISA", les dosages en "sandwich", les réactions de précipitation, les réactions de précipitation par diffusion sur gel, les dosages d'immunodiffusion, les dosages par agglutination, les dosages par fixation de compléments , les dosages immunoradiométriques, les dosages par immunofluorescence, les dosages immunologiques de protéines A et les dosages par immunoélectrophorèse, pour n'en nommer que quelques-uns. EXEMPLES Dans les exemples suivants, on a construit divers vecteurs de plasmides contenant des gènes chimériques comprenant des séquences de codage de l'enveloppe de LAV logées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription du virus de la vaccine. On a inséré dans le génome du virus de la vaccine, par recombinaison in vivo, ces gènes chimériques, contenant le promoteur de vaccine et la séquence de codage de l'enveloppe de LAV. De tels virus recombinants ont été identifiés et purifiés, et des stocks de réserve du virus ont été préparés à partir de cellules de culture tissulaire infectées I1 a été montré que des protéines immunoréactives, apparentées à l'enveloppe de LAV,sont.produites par ces virus recombinants de la vaccine in vitro. On a soumis ces recombinants à des essais dans des animaux d'expérience pour en déterminer l'aptitude à déclencher des réponses immunitaires de neutralisation ou de protection et pour étudier leur utilisation à titre de vaccins contre le SIDA.Une description détaillée de chaque étape de cette forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après. Voici quelques détails sur les modes opératoires généraux. CELLULES ET VIRUS On a obtenu de R. Condit (Professeur associé, Département de Biochimie, Université de l'Etat de New-York, Buffalo, New-York, Etats-Unis d'Amérique) des cellules de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée continue de cellules de singe vert d'Afrique provenant de cellules BSC-1, n" ATCC CCL26), et on en a provoqué la propagation dans du milieu de Eagle modifié selon Dulbecco (MEMD, Gibco, Grand Island, New-York) additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et de 100 unités de pénicilline et 100 unités de streptomycine par millilitre. On a obtenu de M.Botchan (Professeur, Département de biologie moléculaire, Université de Californie, Berkley, Californie, Etats-Unis d'Amérique) des cellules humaines 143 TK t3 S. Rhim et col. , 1975, Intl J. Cancer 15:23-29) et on en a provoqué la propagation dans le milieu ci-dessus, avec l'addition de 5-bromo-désoxyuridine (BUdR) à 25 pg/ml. On a obtenu de R. Condit des virus de la vaccine (souche WR, n" ATCC VR-119) que l'on a cultives dans des cellules BSC-40 dans MEMD + 5 % de sérum de veau sans gamma globuline + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine. On a choisi des recombinants TK parmi des cellules 143 TK dans le même milieu contenant 25 pg/ml de BUdR et on les a purifiées sur plaque sur la même lignée de cellules dans MEMD contenant 1 % de gelose Noble (DIFCO, Détroit, Michigan, Etats-Unis d'Amérique), 5 % de sérum de veau sans gamma globuline, 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine ainsi que 25 > ig/ml de BUDR. On a effectué des dilutions des stocks de virus dans une solution saline tamponnée par des phosphates et contenant par litre 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,5 g de NaH2PO4, 0,2 g de K2HP04, avec addition de 1 mM de MgC12 et de 0,01 X de sérum albumine de bovin. PREPARATION, RESTRICTION ET MODIFICATION DE L'ADN Sauf spécification contraire, toutes les méthodes utilisées pour les modes opératoires suivants sont telles que décrites dans les pages indiquées de Maniatis et col., 1982, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory: préparation d'ADN de plasmide (pages 86-96), digestion de restriction de 1'ADN (pages 98-106) et purification de fragments de restriction à partir de gels de gélose à faible température de fusion (pages 157-161 et page 170), conditions de réaction pour 1 enzyme ADN polymérase de E. coli du fragment de Klenow (pages 107-114), réactioP de phosphatase alcaline de l'intestin de veau (pages 133-134) et réaction des ligases (page 146), préparation de sondes bien translatées (pages 109-112) et modes opératoires pour l'hybridation ADN-ADN (pages 324-325). CONSTRUCTION DE VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT LE VIRUS DE VACCINE, PROMOTEUR, LIE PAR LIGATION AUX SEQUENCES DE CODAGE DU GENE DE L'ENVELOPPE DE LAV On décrit ci-après la construction de divers vecteurs de plasmides contenant des séquences de codage du gene de l'enveloppe de LAV (adénopathie) précédées par des séquences de commande de transcription du virus de la vaccine; ces fréquences chimériques sont entourées par de 1'ADN TK. Ces vecteurs de plasmides recombinants ont servi par la suite à insérer, par recombinaisonwin vivo", les séquences de codage d'enveloppe de LAV dans le génome du virus de la vaccine. On a purifié la séquence de codage de l'enveloppe de LAV à partir de pRS-3, qui est un sous-clone de lambda J19 (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9) et on l'a insérée dans le plasmide pGS20 (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864) en aval par rapport au promoteur 7,5 K de vaccine contenu dans pGS20, afin de construire pv-envî, pv-env2 et pv-env5. Dans chacune de ces constructions, le gène chimérique (c'est-à-dire le promoteur de vaccine 7,5 K relié par ligation à la séquence des nucléotides spécifiques de LAV) est entouré par les séquences de gène TK de la vaccine. Comme précédemment expliqué, PRS-3 consiste en un fragment de 3840 paires de bases, de EcoRI à SstI, de la séquence d'ADN de LAV contenue par insertion dans lambda J19 cloné dans le site EcoRI et SstI de pUCi8. Cela a été obtenu par clonage du fragment de restriction SstI de J19 introduit dans le site SstI de pUC18 pour créer pBT-1 > qui a été ensuite soumis à digestion avec EcoRI et soumis à nouvelle ligation. On a utilisé cet ADN pour transformer E.coli et l'on a isolé le plasmide pRS-3. L'ADN spécifique de LAV, contenu dans pRS-3, va du site EcoRI, logé au nucléotide 5289, au site SstI situé au nucléotide 9129 sur le génome de LAV (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9) ; voir figure 2). CONSTRUCTION DE VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU VIRUS DE VACCINE PROMOTEUR RELIE PAR LIGATION A LA SEQUENCE CODANT EN 3' DU GENE DE L'ENVELOPPE DE LAV On a soumis cinq microgrammes d'ADN de plasmide de pRS-3 à digestion,jusqu'à achèvement, avec l'enzyme de restriction KpnI, et l'on a résolu les fragments résultants sur un gel de gélose à 1 % à faible température de fusion. On a isolé et purifié un fragment de 2,68 pKb ( kilopaires de bases). Ce fragment a contenu de 1'ADN spécifique de LAV allant du nucléotide numéro 5889 au numéro 8572 et comprenant des séquences (5889-8349) qui codent la portion carbonée terminale de la protéine d'enveloppe de LAV. On a mélangé 1 pg de ce fragment avec 0,5 ug d'ADN de pGS 20 qui a été au préalable linéarisé à l'aide de l'enzyme de restriction BamHI. On a laissé une ligation de ces deux fragments se poursuivre durant 24 heures à 4"C en présence d'agents de liaison de type oligodésoxynucléotide consistant en 0,6 )ug de 5'-GATCCACCATGGTAC-3'-OH et 0,3 pg de 5'-CATGGTG-3'-OH.Ces agents de liaison ont servi (a) à transformer les extrémités cohésives de KpnI du fragment à 2,68 pKb provenant de 1'ADN de plasmide de pRS-3 en des extrémités cohésives de BamHI qui sont complémentaires des extrémités cohésives de BamHI de 1'ADN de pGS 20 clivé et (b) à fournir une séquence d'initiation de translation (ATG) dans le cadre correct de lecture de la séquence de gène d'enveloppe de LAV ainsi que des séquences de nucléotides nécessaires pour une translation efficace de l'ARNm transcrit.On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche de E. coli MC1000. On a soumis de 1'ADN de plasmide provenant de transformants résistant à l'ampicilline à des essais de détermination de l'orientation de la séquence insérée et de régénération des sites BamHI, NcOI et KpnI aux jonctions de ligation. La structure confirmée du plasmide voulu, pv-env2, est montrée sur la figure 3 dans laquelle la partie carboxylique de codage du gène d'enveloppe de LAV, correspondant aux numéros de nucléotides 58898672 (comme représenté sur la figure 2) est située en aval par rapport au promoteur de vaccine à 7,5 K. La séquence d'enveloppe de LAV est placée dans le cadre correct de lecture par rapport à 1'ATG d'initiation fourni par 1'ADN de liaison. CONSTRUCTION DES VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU PROMOTEUR DE VIRUS DE VACCINE RELIE PAR LIGATION A LA SEQUENCE CODANT EN 5' DU GENE D'ENVELOPPE DE LAV On a soumis 5 microgrammes d'ADN de plasmide de pRS-3 à digesti.on,jusqutå achèvement, avec l'enzyme de restriction Avaîl et l'on a résolu les fragments résultants sur un gel de gelose à 1 % a faible température de fusion. On a isolé et purifié un fragment de 0,82 pKb. Ce fragment a contenu des séquences spécifiques de LAV entre les numéros de nucléotides 5671 et 6490 (comme représenté sur la figure 2). Cela comprend des séquences (numéros de nucléotide 57666490) codant la partie terminale azotée de la protéine d'enveloppe et 95 paires de bases de séquences non translatées de LAV voisines de 5'. On a traité ce fragment avec 1'ADN polymérase de fragment de Klenow de E. coli en présence d'un excès de triphosphate de désoxyribonucléotide. Le fragment résultant à extrémité émoussée a été soumis à fixa tion par ligation sur 0,5 pg d'ADN de pGS 20 qui a été au préalable linéarisé avec SmaI et traité par de la phosphatase alcaline d'intestins de veau ( calf-intestine alcaline phosphatase ; CIAP).On a laissé la ligation se poursuivre durant 16 heures à 12"C. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MClGOO de E.coli. On a soumis de 1'ADN de plasmide provenant de transformants résistants à l'ampicilline à des essais de détermination de l'orientation des séquences correspondant à LAV insérées, par rapport aux séquences de commande de transcription du virus de la vaccine. La structure confirmée pour le plasmide voulu, pv-envî, est présentée sur la figure 4, dans laquelle la partie amino de codage du gène de l'enveloppe de LAV,conte- nant sa propre séquence d'initiation ATG, correspondant aux nucléotides numéros 6671 à 6490 (comme représenté sur la figure 2),est située en aval par rapport au promoteur de vaccine 7,5 K. CONSTRUCTION DES VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU VIRUS DE VACCINE PROMOTEUR RELIE PAR LIGATION A LA TOTALITE DES SEQUENCES DE CODAGE DU GENE D'ENVELOPPE DE LAV On a soumis 2 microgrammes d'ADN de plasmide pv-envl à digestion,jusqu'à achèvement, par l'enzyme de restriction StuI, PvuI et XhoI. On a résolu les fragments résultants sur un gel de gélose à 1 x à faible température de fusion. On a isolé et purifié le fragment à 4 pKb, contenant l'élé- ment de commande de transcription du virus de la vaccine et la partie 5' des séquences de codage d'enveloppe LAV. On a relié par ligation ce fragment à un fragment de 6,5 pKb engendré par des digestions de pv-env2 à l'aide des enzymes de restriction StuI et PvuI. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche Mi 1000 de E. coli. On a choisi des transformants pouvant résister 9 l'ampicilline. On a soumis de 1'ADN de plasmide provenant de transformants individuels à des essais de détermination de la régénération des sites de restriction StuI et PvuI et de la présence des fragments apparentés à 4 paires de kilobases (4 pKb) et 6,5 pKb. Le plasmide voulu, pv-env5, décrit sur la figure 4, contient la totalité du gène d'enveloppe de LAV correspondant aux nucléotides n" 5766 à 8349 (comme représenté sur la figure 2), relié par ligation en aval des éléments de commande de transcription du virus de la vaccine. CONSTRUCTION DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CHIMERIQUE CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV L'insertion des séquences de gènes chimériques correspondant à l'enveloppe de LAV (LAV-env) dans le génome du virus de la vaccine est obtenue par recombinaison" in vivo" rendue possible par le fait que les gènes chimériques sont entourés dans les plasmides pv-env2 et pv-env5 par des séquences du virus de la vaccine codant pour le gène de thymidine kinase (TK). L'introduction de ces plasmides dans des cellules infectées par le virus de la vaccine a permis une recombinaison entre la séquence TK du plasmide et la séquence homologue du génome de virus de la vaccine. L'insertion du gène chimérique se produit par suite d'une double recombinaison dans les séquences d'entourage latéral.De tels recombinants comporteront le gène chimérique inséré dans le gène TK de la vaccine et, donc, leur phénotype correspondra à TK-. On peut choisir ces recombinants TK pour les faire croître dans un milieu auquel on a ajouté BUdR, qui est mortel pour les cellules TK+ mais non pas pour les cellules TK-. Le principe général de ce mode opératoire a été décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864). On a infecté une boite de 100 ml de diamètre comportant 80 % de cellules confluentes de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40) avec du virus de la vaccine (souche WR) à une multiplicité d'infections de 0,05. Après 2 à 4 heures d'incubation à 370C, on a recouvert les cellules infectées par des coprécipités, à l'aide de phosphate de calcium, de 1'ADN de plasmide pv-env2 ou pv-env5.On a préparé les précipités en ajoutant goutte 0,5 ml d'une solution de 2XADN-CaCl2 à 0,5 ml de solutions 2XHeBS (la solution de 2XADN-CaC12 contient 20 pg de ADN de plasmide dans 0,5 ml de CaCl2 0,25M ; 2XHeBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 0,74 mg de KC1, 0,25 mg de Na2HPO4 2H20, 2 mg de dextrose, et 10 mg de HEPES, à un pH de 7,08. On a laissé se former à la température ambiante durant 30 minutes les coprécipités obtenus à l'aide de ADN-phosphate de calcium).Quatre heures après les avoir recouvertes de précipité, on a lavé les cellules une fois avec 1XHeBs, on a fait incuber à 37 C durant 3 minutes en présence de 2 ml de glycérol à 15 % dans 1XHeBs, puis on a lavé une fois encore avec 10 ml de milieu de croissance (MEMD + 10 % de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine). Deux jours plus tard, on a récolté les cellules infectées et on les a collectées par centrifugation (4 C, 10 minutes à 2000 x g). On a préparé des stocks de virus en mettant ces cellules à nouveau en suspension dans 1 ml d'une solution saline tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin, puis l'on a effectué deux cycles de congélation et décongélation et trois traitements durant 15 secondes par des ultrasons. On a choisi des recombinants en plaçant 0,1 ml de dilution à 10 3 des stocks de virus provenant des opérations ci-dessus sur des plaques circulaires dans des boites de 60 ml de cellules humaines confluentes 143 TK, surmontées de 5 ml/boite de gélose Nobel à 1 % (Difco, Détroit, Michigan) avec 5 % de sérum de veau, 25 pg/ml de BUdR dans MEMD. Deux jours plus tard, on a coloré les cellules en plaçant 2 ml/ boite de milieu de gélose contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus, plus 0,01 % de rouge neutre. On a prélevé les plaques individuelles un jour après coloration, on les a mises à nouveau en suspension dans 0,5 ml d'une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin (PBSAM), et l'on a utilisé des parties aliquotes (0,25 ml) des suspensions de virus pour infecter des cellules confluentes 143 TK placées dans des creux de 16 mm de diamètre sous un milieu sélectif (MEMD + 10 % de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de streptomycine + 100 unités/ml de pénicilline + 25 g/ml de BUdR). On a collecté par centrifugation les cellules infectées et on les a remises en suspension dans 100 ml de solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) contenant 0,5 mg/ml de trypsine et 0,2 mg/ml de EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique).On a lysé les cellules par incubation à 37"C durant 30 minutes, ce qui a été suivi de 3 cycles de 20 secondes chacun de traitement aux ultrasons. On a collecté sur des filtres de nitrocellulose les lysats de cellules, en utilisant un manifold ou collecteur de filtration à plusieurs creux (Schleicher et Schuell, Arlington, MA). On a déterminé par hybridation ADN-ADN, comme décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 7415-7419) la présence des séquences de ADN spécifiques de l'enveloppe de LAV dans ces échantillons. On a utilisé comme sonde d'hybridation de-l'ADN~ de plasmide pRS-3-.marqué par 32p, préparé par translation appropriée. On a encore purifié deux fois sur plaque des recombinants qui avaient donné une hybridation positive pour cette sonde, sur des cellules 143 TK dans des conditions sélectives (milieu contenant BUdR) et une fois sur des cellules BSC-40 dans des conditions non sélectives. Après confirmation finale par hybridation ADN-ADN, on a préparé des stocks de virus à partir des plaques trois fois purifiées sur des cellules de BSC-40 et on les a utilisés pour la caractérisation subséquente. Une représentation schématique de la construction des virus recombinants est montrée sur la figure 5, sur laquelle la séquence de gène correspondant à l'enveloppe de LAV (env) située en aval du promoteur de vaccine 7,5K (Par) est entourée au sein du génome de la vaccine par des séquences de ADN TK. Les stocks de virus provenant de la recombinaison entre le génome de virus de la vaccine et le plasmide pv-env5 ont été appelés v-env5,et ils contiennent la totalité du gene de l'enveloppe de LAV. Dans la forme particulière de mise en oeuvre décrite dans les exemples ici, v-env5 contient la totalité du gène d'enveloppe aussi bien que 96 paires de bases des séquences non translatées proches de 5' et 223 paires de bases des séquences non translatées proches de 3'.Les stocks de virus provenant de pvenv2 ont été appelés v-env2 et ils contiennent la plupart du gène de l'enveloppe de LAV (c'est-à-dire le fragment KpnI), mais ils ne comportent pas la partie de la séquence codant pour les 42 premiers aminoacides de la protéine de l'enveloppe de LAV. Puisque la séquence de signal supposée de la protéine d'enveloppe de LAV est située au sein des 49 premiers aminoacides de la protéine, v-env2 devrait produire une protéine ne comportant pas la séquence de signal; donc, on devrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV produite par ce virus recombinant ne soit pas transportée vers la membrane. Au contraire, v-env5, qui contient la totalité de la séquence d'enveloppe de LAV,doit produire une protéine qui est transportée vers la membrane. EXPRESSION DES PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV DANS DES CELLULES DE CULTURE TISSULAIRE INFECTEES PAR DES VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANTS On a montré que les virus de vaccine recombinants, portant les gènes chimériques d'enveloppe de LAV, sont capables d'exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV lors d'une infection de cellules dans une culture tissulaire. On a également trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA. -IDENTIFICATION, A l'AIDE DE TECHNIQUES D'IMMUNO- COAGULATION, DE PROTEINES APPARENTEES A LJENVELOPPE DE LAV EXPRIMEE DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT. On a infecté une plaque de boite circulaire de 100 ml de cellules confluentes BSC40, à un taux ou multiplicité d'infection de 10, par du virus de vaccine de type sauvage ou avec ses dérivés recombinants, v-env5 ou v-env2. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté des cellules, on les a lavées une fois avec une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) et collectées par centrifugation. Les culots de cellules infectées ont été remis en suspension dans 1 ml de tampon d'échantillon de Laemmli (Laemmli, U.K., 1970, Nature 227:680) et on a effectué une lyse par 4 minutes d'ébullition. On a résolu par électrophorèse, sur un gel de SDS-polyacrylamide à un gradient de 7 à 15 %, la proteine cellulaire totale dans une partie aliquote (75 1) de lysat de cellules. On a inclus comme témoin un échantillon de virion de LAV purifié et une partie aliquote de lysat de cellules "infecté" par un virus non pathogène (c'est-à-dire non infecté). On a fait passer par électrotransfert le contenu du gel sur une feuille de filtre nitrocellulosique. On a fait incuber le filtre tout d'abord dans 5 ml de PBS (solution saline physiologique tamponnée par des phosphates) plus 5 % de poudre de lait dégraissé, durant 20 minutes à la température ambiante puis durant 2 heures à la température ambiante dans PBS + 5 % de poudre de lait dégraissé + du sérum humain provenant de patients atteints de SIDA (dilution à 1:100 du sérum inactivé par chauffage). On a ensuite lavé le filtre cinq fois avec PBS + 0,05 % de "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane) et une fois avec PBS seul. On a fait incuber durant 2 heures à la température ambiante le filtrat ainsi lavé avec 5 ml de PBS contenant 1 % de sérum normal de chèvre (inactivé par chauffage) plus une dilution à 1/3000 de conjugué IgG (immunoglobuline G) anti-humaine de chèvre/peroxydase de raifort. On a lavé à nouveau le même filtre 5 fois avec PBS + 0,05 % de "Tween 20", et une fois avec TBS (NaCl 0,5 M + 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5). On a décelé le conjugué de peroxydase de raifort fixé sur le filtre en faisant réagir des réactifs de coloration, de type chloronaphtol, avec le filtre durant 10 minutes à la température ambiante à l'obscurité (le réactif de coloration de type chloronaphtol a été préparé en mélangeant des solutions A et B juste avant utilisation. Solution A : 20 m 1 de méthanol à 30 % froid + 60 mg de 4-chloro1-naphtol ; solution B : 60 fil de peroxyde d'hydrogène à 30 % froid + 100 ml de TBS). Les protéines fixées sur le filtre et qui ont réagi avec des anticorps du sérum de patient atteint de SIDA peuvent décelés par le réactif de coloration, par la fixation sur les conjugués IgG anti-humaine de chèvre/ peroxydase de raifort. Les résultats de cette analyse, tels que repré sentés sur la figure 6A, ont indiqué que v-env5 de virus recombinant de vaccine a produit une famille de trois protéines qui ont été capables de présenter une réactivité immunitaire spécifique avec du sérum provenant d'un patient atteint de SIDA. Ces protéines avaient des mobilités en électrophorèse semblables à celles des glycoprotéines gap150, gpllO et gp41 du virus authentique LAV/HTLV III, que l'on pense codé par le gène d'enveloppe (W. Robey et col., 1985, Science 228:593-595). Ces protéines n'ont pas été produites dans des cellules infectées par du virus non infectieux ou dans des cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage.V-env recombinant, qui ne comporte pas les séquences voisines de 5' codant pour la méthionine supposée d'initiation et les 42 premiers aminoacides des protéines d'enveloppe de LAV, a produit une protéine de dimensions restreintes, mais encore immunoréactive à l'égard d'un sérum de patient atteint de SIDA. On suppose que la translation de la séquence env dans v-env2 recombinant part du codon AUG transcrit à partir de la séquence correspondant à l'agent de liaison utilisé dans la construction de ce recombinant (voir ci-dessus la construction des vecteurs de plasmide contenant du virus de vaccine lié par ligation aux séquences du gène d'enveloppe de LAV codant en 3'). Dans une seconde expérience, on a infecté par v-env5 et v-env2 deux lignées de cellules (BSC-40 et HeLa). On a soumis les protéines spécifiques de LAV, dans les lysats de cellules infectées, à des essais de dosage par immunocoagulation selon Western, comme décrit ci-après. On a infecté des monocouches confluentes de cellules BSC-40 ou HeLa avec v-env5 ou v-env2 de virus recombinant à une multiplicité ou taux d'infection de 50 unités de formation de plaques par cellule. Douze heures après l'infection, on a lavé deux fois les cellules dans une solution saline tamponnée par des phosphates, on les a remises en suspension dans du tampon pour échantillon de Laemmli et l'on a fait bouillir durant 5 minutes. On a résolu, par électrophorèse sur gel de polyacryamide comportant du dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) les protéines provenant de cellules infectées, on les a soumises à électrotransfert vers une membrane nitrocellulosique et on les a fait réagir avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif dans la recherche de LAV/HTLV-III.On a décelé à l'aide de la protéine A, qui a été marquée par 125 I par la méthode à la chloramine T, les protéines immunoréactives. Sur la figure 6B, les pistes 1 et 5 contiennent des protéines provenant de cellules infectées par des virus non infectieux ; les pistes 2 et 6 contiennent des protéines provenant de cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage ; les pistes 3 et 7 des protéines provenant de cellules infectées par v-env-5 ; et les pistes 4 et 8 proviennent de cellules infectées par v-env2. On a utilisé comme témoin (LAV) des protéines de virion de LAV purifiées à l'aide d'un gradient de saccharose, et les positions des protéines d'enveloppe gp150, gel 10 et gp41 étaient comme indiqué sur la figure. Les poids moléculaires ont été exprimés en kilodaltons (kd). On a décelé dans les cellules infectées par v-env (figure 6B, pistes 3 et 7) trois protéines majeures capables d'une réaction immunitaire avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum donnant une réponse positive. On a estimé que les poids moléculaires de ces protéines étaient de 150 kd, 120 kd et 41 kd, semblables à ceux des glycoprotéines d'enveloppe de LAV gap150, gpllO et gp41. V-env2 de virus recombinant ne comportait pas la séquence supposée émettre un signal pour l'enveloppe de LAV, mais pouvant produire au moins trois polypeptides immunoréactifs ayant pour poids moléculaires 99 kd, 68 kd et 40 kd (figure 6B, pistes 4 et 8). IDENTIFICATION, PAR DES TECHNIQUES D'IMMUNOPRECIPITATION, DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV ET EXPRIMEES DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT Le dosage par immunoprécipitation, décrit ci-après, a montré que des cellules infectées par des virus de vaccine recombinants de la présente invention synthétisent des protéines capables d'une réaction immunitaire spécifique avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA. On a infecté par du virus de vaccine de type sauvage, ou par ses recombinants v-env5 ou v-env2, à un taux ou multiplicité d'infection de 10, une boite de 100 ml comportant des cellules confluentes BSC-40. Après l'écoulement d'un intervalle de temps de 9,5 heures après l'infection, on a remplacé le milieu de croissance par MEMD sans méthionine et sans complément de sérum. A 10 heures après l'infection, on a remplacé le milieu par 2 ml de MEMD sans méthionine contenant 100 ,uCi/ml de (35S)méthionine et on a laissé le marquage se poursuivre durant 2 heures à 37"C. A la fin de la periode de marquage, on a lavé les cellules une fois avec de la solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) et on les a collectées par centrifugation. On a remis en suspension les culots de cellules dans 1 ml de tampon de lyse:1 % de NP 40 (polyoxyéthylène (9) p-tertoctylphénol), 0,5 % de désoxycholate de sodium, NaCl 0,1 M, tris-HCl 0,01M, pH 7,4, EDTA lmM, et on a séparé le lysat par centrifugation durant 1 minute dans une microcentrifugeuse Eppendorf. On a effectué une immunoprécipitation en ajoutant 5 microlitres de sérum humain inactivé par chauffage, provenant d'une population témoin ou de patients atteints de SIDA, à 100 ml de lysat de cellules. Après 1 heure d'incubation à 4"C, on a ajouté 60 ml de cellules de Staphylococcus aureus activées (cellules "Pansorbin", Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, CA) et on a laissé l'incubation se poursuivre durant 1 heure supplémentaire à 4"C. On a collecté par centrifugation durant 30 secondes, dans une microcentrifugeuse Eppendorf à 4 C. les complexes d'immunoprécipitation et on les a lavés une fois dans NaCl 1M + 0,1 % de NP 40 + Tris-HCl 0,01M, à pH 7,4, et deux fois du tampon RIPA (Tris-HCl îOmM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, 1 % de désoxycholate de sodium, 1 % de "Triton-X 100" (polyoxyéthylène (9-10) p-tert-octylphénol), 0,1 % de laurylsulfate de sodium). On a remis en suspension les immunoprécipités, lavés, dans 50 ml d'un tampon pour échantillon de Laemmli, on a fait bouillir durant 1 minute et centrifugé durant 1 minute dans une microcentrifugeuse Eppendorf. On a analysé par électrophorèse sur des gels de polyacryamide à 15 S de SDS les protéines immunoprécipitées présentes dans le liquide surnageant.Après l'électrophorèse, on a coloré les gels avec du colorant bleu de Coomassie, on les a traités par du salicylate de sodium (30 minutes à température ambiante dans du salicylate de sodium îM) et on les a séchés pour fluorographie. Les résultats de cette analyse, tels que représentés sur la figure 7A, ont indiqué que v-env5 recombinant a synthétisé une famille de protéines présentant une immunoréaction spécifique avec du sérum de patient atteint de SIDA. Ces proteines présentaient des poids moléculaires apparents de 160, 140, 120, 42 et 40 kilodaltons (kd), correspondant approximativement aux poids moléculaires apparents des glycoprotéines apparentées à l'enveloppe citées pour LAV/HTLV III (W.G. Robey et col., 1985, Science 228:593-595). Ces protéines n'étaient pas présentes dans des cellules "infectées' par des virus non infect-ieux ou dans des cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage et elles ne subissaient pas non plus d'immunoprécipitation par du sérum humain témoin. Dans des cellules infectées par v-env2, une protéine tronquée, d'un poids moléculaire apparent de 95 d, a été produite et reconnue par du sérum de patient atteint de SIDA. Cette forme tronquée de protéine apparentée à l'enveloppe de LAV part très probablement du codon AUG codé par la séquence d'agents de liaison située en 5' près de la séquence insérée, correspondant à LAV, dans ce recombinant. MARQUAGE PAR 3H-GLUCOSAMINE DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV PRODUITES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE CORRESPONDANT A LAV Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ciaprès a indiqué que les virus recombinants de vaccine, correspondant à LAV, de la présente invention ont produit des protéines d'enveloppe glycosylées. On a soumis des cellules HeLa à une infection par des virus non infectieux (voir figure 7B, pistes 1 et 5) ou à une infection séparément par du virus de vaccine de type sauvage (pistes 1 et 6), du v-env5 recombinant (pistes 3 et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8), le tout à un taux d'infection de 50 unités de formation de plaques par cellule. On a ajouté au milieu de cultureientre 4 et 16 heures après l'infection,de la glucosamine marquée par 3H (0,25 ,uCi à 23 mCi/mg, Amersham).On a lavé les cellules deux fois avec une solution saline physiologique tamponnée par du phosphate et on les a lysées dans du tampon contenant NaCl O,lM, tris HC1 O,OlM à pH 7,4, EDTA lmM, 1% de NP-40 (polyoxySthylène (9) p-tert-octylphénol) et 0,5 % de désoxycholate de sodium. On a mélangé des parties aliquotes de lysat de cellules avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV III (pistes 5-8). Les protéines immunoréactives ont été précipitées par des cellules fixées de Staphylococcus aureus portant de la protéine A, puis on a effectué une résolution par SDS-PAGE et une détection par fluorographie. Les résultats du marquage par de la glucosamine comportant un radioisotope, tels que représentés sur la figure 7B, piste 7, indiquent que les protéines obtenues à l'aide du recombinant v-env5, comme les protéines d'enveloppe de LAV, ont également été glycosylées. Des différences de configurations de glycosylation peuvent expliquer les légères variations observées dans les mobilités par électrophorèse de protéines fabriquées à l'aide de recombinants, en comparaison des glycoprotéines dues au virion de LAV. Comme on pourrait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptides émetteurs de signaux, on n'a pas observé de glycosylation liée à l'azote, avec 3H-glucosamine, dans des cellules infectées par v-env2 (figure 7B, piste 8). ANALYSE PAR IMMUNOPRECIPITATION, AVEC PULSION DE CHASSE, DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV PRODUITES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE LIEES A LAV I1 a été suggéré que gap150 de LAV constituait le précurseur dont proviennent une protéine extérieure gel 10 et une protéine de transmembrane gp4î. L'essai d'immunoprécipitation par "impulsions de chasse" décrit ci-après, indique que les protéines à 150 kd, 120 kd et 41 kd obtenues à l'aide du virus de vaccine recombinant correspondant à LAV, ont une relation entre précurseur et produit semblable à celle suggérée pour gap150, gpllO et gp41 pour LAV/HTV III authentique. On a infecté des monocouches confluentes de cellules HeLa avec du virus de vaccine de type sauvage (voir figure 7C, pistes 1-6), v-env recombinant (pistes 7-12) ou v-env2 (pistes 13-18), le tout à une multiplicité d'infection de 50 unités de formation de plaques/cellule. Au bout de 10 heures et demie après infection, on a marqué les cellules avec 35S-méthionine (plus de 800 Ci/mmoles, Amersham) à 100 pCi/ml durant 15 minutes.A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules une fois avec 2 ml de milieu de chasse préchauffé milieu de Eagle modifié selon Dulbecco, MEMD, + 3 mg/ml de L-méthionine + 5 % de sérum de veau t 100 unités/ml de pénicilline + 100 sg/ml de streptomycine) puis on a fourni à nouveau aux cellules 1 ml du même milieu avant de les faire revenir dans l'incubateur. A divers moments par la suite, on a lavé les cellules et on les a lysées comme décrit précédemment ci-dessus (marquage par H-glycosamine) et l'on a soumis les protéines provenant de lysats de cellules à immunoprécipitation avec du sérum groupé provenant de personnes dont le sérum présentait une réponse positive pour LAV/HTLV-III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur SDS-PAGE et décelées par fluorographie. La durée de chaque chasse a été comme suit : O heure (pistes 1, 7, 13) ; 1 demiheure (pistes 3, 8, 14) ; 1 heure (pistes 3, 9, 15) ; 2 heures (pistes 4, 10, 16) ; 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18). Les résultats présentés sur la figure 7C, pistes 7-12, indiquent pour les protéines à 150 kd, 120 kd et 41 kd obtenues à l'aide du recombinant, la même relation précurseur-produit que pour gp150, gpllO et gp41 de LAV/HTLV III authentique. Le traitement de la protéine à 150 kd a semblé lent et inefficace dans les cellules HeLa, puisqu'au bout de 6 heures apurés le marquage par impulsions, moins de 50 % de la radioactivite de la protéine à 150 kd étaient passés dans les protéines à 120 kd et 41 kd. Des résultats préliminaires indiquent que ce traitement est plus efficace dans certains types de globules de sang périphérique humain infecté par les mêmes virus recombinants.Ces expériences ont également indiqué que la séquence env dans v-en2, qui ne comportait pas la séquence supposée émettre un signal pour déceler l'enveloppe de LAV, a été exprimée sous forme d'un précurseur à 87 kd non modifié (780 aminoacides), qui a donné par traitement un intermédiaire à 99 kd et a été clivé en les polypeptides à 68 kd et 40 kd (figure 7C, pistes 13-18). PRESENCE D'UNE PROTEINE APPARENTEE A L'ENVELOPPE DE LAV DANS LE MILIEU DE CROISSANCE DE CELLULES INFECTEES PAR DES VIRUS DE VACCINE RECOMBINANTS LAV Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ciaprès a montré que les protéines immunoréactives produites par le virus de vaccine recombinant de l'invention peuvent être exprimées et traitées de façon semblable à la glycoprotéine d'enveloppe de LAV authentique. On a soumis des monocouches confluentes de cellules de HeLa a infection par du virus non infectieux (voir figure 7D, piste 1) ou séparément à infection par du virus de vaccine de type sauvage (piste 2), par v-env5 recombinant (piste 3) ou v-env2 recombinant (piste 4), le tout à une multiplicité ou taux d'infection de 20 unités de formation de plaque par cellule. On a marqué les cellules avec 35 Sméthionine (plus de 800 Ci/mmole, Amersham) à 100 pCi/ml 10 à 12 heures après l'infection. A la fin de la période de marquage, on a retiré le milieu et on l'a clarifié par centrifugation durant 2 minutes à 12 000 g avant de l'utiliser pour une immunoprécipitation par du sérum groupé prove-nant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III.Les protéines provenant de cellules infectées ayant subi une immunoprécipitation par le même sérum sont présentées dans la partie marquée "culot" et les protéines provenant du milieu de croissance ou culture sont présentées dans la partie marquée "Supe" (milieu supérieur surnageant). Comme on pouvait s'y attendre pour gpîîO de LAV, la protéine à 120 kd obtenue à l'aide du recombinant a également été décelée dans le milieu infecté (figure 7D, piste 3). Ces résultats ont montré quev-env5 de virus recombinant était capable d'exprimer le gène correspondant à l'enveloppe de LAV et de produire des protéines immunoréactives qui ont été traitées de façon semblable à des glycoprotéines d'enveloppe de LAV authentique. Comme on pouvait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptides de signal, on n'a pas décelé de polypeptides liés à l'enveloppe de LAV dans le milieu de croissance de cellules infectées par v-env2 (figure 7D, piste 4). POUVOIR IMMUNITAIRE DU VIRUS RECOMBINANT CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV I1 a été montré que les virus recombinants, portant le gène chimérique correspondant à l'enveloppe de LAV, sont capables de déclencher une réponse par anticorps à LAV dans deux souches de souris et une espèce de primate sub-humain. IMMUNOGENICITE DES RECOMBINANTS DE VACCINE PORTANT LE GENE D'ENVELOPPE DE LAV CHEZ LES SOURIS On a examiné le caractère immunogène de protéines exprimées par v-env5 et v-env2 de virus de la vaccine recombinants. Les expériences décrites ci-après indiquent l'aptitude de ces virus recombinants à déclencher une réponse immunitaire pour toutes les glycoprotéines majeures de LAV. A deux lignées de souris, l'une consanguine (C57B16J) et l'autre non consanguine (ICR), on a inoculé v-env2 ou v-env5 de virus recombinants. Tous les animaux étaient âgés de 5 à 7 semaines au moment de l'inoculation. On a utilisé quatre voies d'inoculation : coussinet, de patte-, scarification de queue, voies intranasale et intrapéritonéale. On a réalisé l'inoculation dans le coussinet de patte en injectant 25 l (5 x 106 unités de formation de plaque) de virus recombinant dans chacunqdes coussinets des pattes arrière. On a effectué la scarification de queue en grattant, à l'aide d'une aiguile à deux branches, la peau à la base de la queue et en appliquant sur la surface scarifiée 10 ul (2 x unités de formation de plaque) de virus recombinant.On a réalisé une inoculation intranasale en plaçant 10 pl (2 x 107 unités de formation de plaque) de virus recombinant sur le nez des souris et en laissant la souris aspirer l'inoculum. On a effectué les injections intrapéritonéales en 7 injectant 10 > il (2 x 10 unités de formation de plaque) de virus recombinants dans la cavité péritonéale des souris. On a effectué la préparation des stocks et diluation de virus en opérant comme décrit ci-dessus à propos de cellules et virus. On a collecté à des intervalles de 2 semaines après l'inoculation d'échantillons de sérum sur des souris individuelles et l'on a analysé ces échantillons à la fois par un dosage d'immunosorption avec liaison d'enzyme (ELISA'I enzyme linked immunosorbant assay) et par analyse de coagulat de Western comme decrit ci-après. CONVERSION DU SERUM (SEROCONVERSION), MONTREE PAR LE DOSAGE OU ESSAI ELISA, DE SOURIS IMMUNISEES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE A GENE CHIMERIQUE D'ENVELOPPE DE LAV Les résultats des essais ELISA sur des échantillons de sérum de 6 semaines sont résumés au Tableau 1. Les séquences v-env2 et v-env5 de virus recombinants ont converti (transformé) à 100 % et à 95 % le sérum des souris C57B16J, respectivement. Pour les souris ICR, le taux de conversion de sérum a été de 44 % pour v-env2 et de 100 % pour v-env5. On a obtenu une conversion totale de sérum ainsi que le titre moyen le plus élevé, à l'essai ELISA, chez des souris immunisées par scarification de la queue. TABLEAU I Séroconversion de souris inoculées avec des virus recombinants portant le gène chimérique de l'enveloppe de LAV Virus recombinant Voie d'inoculation Séroconversion de souris inoculées* ICR C57B16J v-env2 coussinet de patte 1/3 4/5 Scarification de queue 3/3 4/5 Voie intranasale 0/3 4/5 Voie intrapéritonéale non effectuée 3/5 v-env5 Coussinet de patte 4/4 5/5 Scarification de queue 3/3 5/5 Voie intranasale 3/3 4/5 Voie intrapéritonéale non effectuée 5/5 * La séroconversion, déterminée par l'essai ELISA comme décrit, est exprimée par le nombre de souris présentant de la séroconversion par rapport au nombre total de souris ayant subi une inoculation, pour chaque groupe. On a obtenu comme suit les résultats des dosages ou essais ELISA : on a dilue des virions de LAV, inactivés et purifiés, dans du tampon de carbonate (50 nM de carbonate de sodium, pH 9,6) et l'on a placé ces dilutions dans des plaques pour microtitrage comportant 96 creux ou puits (100 Al/creux, contenant 0,2 pg de LAV inactivé). On a laissé la liaison s'effectuer à 4"C durant la nuit On a aspiré la protéine non fixée et on a lavé avec 200 ml (par creux) de solution saline physiologique à tampon de phosphate + 5 % de poudre de lait dégraissé puis avec 300 ul (par creux) à 4 % de saccharose. Après aspiration de l'excès de la solution de saccharose, on a laissé les plaques sécher a la température ambiante (1 heure). Puis on a ajouté dans chaque creux 50 pl de solution saline physiologique à tampon de phosphate contenant 2,5 ,ul d'échantillon de sérum de souris, et on a laissé réagir à 37"C durant 1 heure. A la fin de la période d'incubation, on a lavé cinq fois les creux avec de la solution saline physiologique comportant du tampon de phosphate (PBS) + 0,05 % de "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitanne). On a ajouté dans chaque puits 50 p1 de conjugués immunoglobuline G anti-souris de chèvre/ peroxydase de raifort (dilution à 1:5000 dans PBS (solution saline physiologique à tampon de phosphate) + 0,05 % de "Tween-20", et on a laissé reagir à 37"C durant 45 minutes. Après 5 lavages par PBS + 0,05 % de "Tween 20", on a ajouté 100 1ut d'un substrat citrate-O-phénylènediamne-peroxyde. On a préparé le substrat comme suit : on a dissous 0,294 g de citrate de sodium dihydraté + 0,537 g de cristal de phosphate de sodium dibasique dans 10 ml de H20 et l'on a ajusté à pH 5,0 avec HC1 ; on a ajouté juste avant emploi 2 pl de H202 à 30 % et 4 mg d'O-phénylène-diamine. On a fait incuber les plaques 30 minutes à l'obscurité à la température ambiante. On a arrêté la réaction en ajoutant 100 > il d'acide sulfurique 1,3N dans chaque creux et l'on a mesuré le coefficient d'absorption optique du mélange réactionnel à 490 nm. Les résultats présentés au tableau I sont exprimés sous forme des rapports du nombre total de souris séropositives au nombre total de souris ayant subi une inoculation. Les échantillons de sérum ont été collectés 6 semaines après inoculation et analysés par l'essai de dosage ELISA. On a utilisé comme témoin des échantillons de sérum provenant de 5 souris n'ayant pas subi d'inoculation. Les titres ELISA moyens pour le groupe témoin ont été de 0,021 + 0,005 et de 0,017 + 0,010 pour les souris ICR et C57B15J, respectivement. On a considéré comme positifs des échantillons de sérum provenant de souris ayant subi une inoculation d'immunisation qui ont présenté des titres ELISA supérieurs de plus de trois écarts-types aux titres du groupe témoin. Pour montrer que des souris ayant reçu une inoculation de virus recombinants (souris "séroconverties")ont produit des anticorps contre des glycoprotéines authentiques d'enveloppe de LAV, on a analysé des échantillons de sérum provenant de souris ayant subi cette inoculation ("souris immunisées") par une technique d'immunocoagulation de Western comme suit : on a "immunisé" des souris mâles âgées de 5 à 7 semaines, consanguines (C57B16J, Jackson Laboratory) par scarification de la queue, ce qui a consisté à appliquer un inoculum de 10 1 contenant 2 x 107 unités de formation de plaque de virus de vaccine recombinant à des abrasions engendrées par grattage à l'aide d'une aiguille à deux branches à la base de la queue.On a saigné les animaux à partir du sinus rétro-orbital 8 semaines après l'inoculation et l'on a conservé le sérum sous congélation jusqu'à utilisation. On a fait réagir les parties aliquotes d'échantillons de sérum, diluées 50 fois dans une solution saline tamponnée par des phosphates + 0,2 z de "NP-40" et 3 % de poudre de lait non gras avec des protéines de virion de LAV qui ont été résolues par électrophorèse sur polyacrylamide SDS et immobilisées par électrotransfert sur des filtres de nitrocellulose. On a décelé par de l'immunoglobuline antisouris de chèvre conjuguée à des phosphatases alcalines les protéines de LAV reconnues par ces sérums. Les résultats obtenus sur des échantillons de sérum de 8 semaines provenant de souris C57B16J ayant subi une inoculation, par scarification de queue, de virus recombinants sont présentés sur la figure 8. Tous les animaux ayant subi une inoculation par des virus recombinants ont produit des anticorps qui ont réagi avec la glycoprotéine gp41 de l'enveloppe de LAV. Le sérum de certains des animaux ayant subi une inoculation de v-env5 (figure 8, piste a) a également reconnu gp50 et gpllO, ce qui indique l'aptitude de ce virus recombinant à déclencher une réponse immunitaire à l'égard de toutes les glycoprotéines majeures de LAV/HTLV III. CARACTERE IMMUNOGENE DE V-ENV5 RECOMBINANT DE VIRUS DE VACCINE CHEZ DES PRIMATES SUB-HUMAINS On a utilisé cinq macaques à longue queue (Macaca Fascicularis) , allant de la jeunesse à l'âge adulte, pour étudier le caractère immunogène de v-env5 recombinant de virus de vaccine. On a soumis tous les animaux à des essais de dépistage préliminaire pour constater l'absence d'anti corps à des virus de vaccine et à LAV et l'absence de virus T-lymphotropes de singe ou de virus de SIDA de singe ou d'anticorps de ces virus. A quatre des singes, on a inoculé 2 x 108 unités de formation de plaque de v-env5 et à un singe on a inoculé 2 x 107 unités de formation de plaque d'un virus de vaccine recombinant témoin (v-HSgD1 de virus recombinant de vaccine à herpès simplex gD1), le tout par scarification de la peau.On a collecté des échantillons de sérum et de sang entier avant l'inoculation et au bout de 3, 4 et 6 semaines après inoculation. Tous les animaux ont présenté une autocicatrisation des lésions de peau typiques des infections par le virus de la vaccine et des résultats physiologiques normaux pendant tout le cours de ltexpé- rimentation. On a analysé les réponses immunitaires humorales et à médiation cellulaire, par un dosage d'immunocoagulat de Western et par des essais de prolifération, respectivement. REPONSE IMMUNITAIRE HUMORALE, MONTREE PAR UN ESSAI D'IMMUNOCOAGULAT DE WESTERN, CHEZ DES MACAQUES On a collecté des échantillons de sérum avant inoculation et au bout de 3,4 et 6 semaines après inoculation. On a dilué 50 fois des parties aliquotes de sérum que l'on a fait réagir avec de la protéine de virion de LAV ayant subi une résolution par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et immobilisée par électrotransfert sur des filtres de nitrocellulose. On a décelé par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre, conjuguée à des phosphatases alcalines, les protéines de LAV reconnues par ces sérums. On a utilisé comme témoin positif des sérums groupés provenant d'individus à résultat séropositif pour LAV/HTLV III (SIDA). Les résultats de l'analyse par coagulat de Western sur des échantillons de sérum de macaque sont présentés sur la figure 9. Sur les quatre singes, trois (singes n" 168, 175 et 180) ont produit, à partir de la troisième semaine après inoculation, des anticorps à la glycoprotéine gp41 d'enveloppe de LAV. Le singe 182, qui n'a pas présenté de niveau décelable de réponse à LAV, avait également un titre inférieur de neutralisation de sérum contre le virus de la vaccine, en comparaison du reste du groupe. SENSIBILISATION IN VIVO DE CELLULES T (LYMPHOCYTES) CHEZ DES MACAQUES VACCINES AVEC LE VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT A GENE CHIMERIQUE D'ENVELOPPE On a isolé par centrifugation de Picole, des lymphocytes de sang périphérique de macaque, 6 semaines après vaccination, et on les a mis en suspension à raison de 1 x 106 lymphocytes/ml dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum humain normal inactivé par la chaleur.Puis on a cultivé 0,1 ml de lymphocytes de sang périphérique sensible, dans des creux de plaque à 96 creux, avec absence totale d'antigène, avec du recombinant de virus de vaccine, à gène chimérique d'enveloppe, inactivé par l'ultraviolet (UV) ou avec de la vaccine de départ inactivée à l'ultraviolet (1 x 106 unités de formation de plaque par ml avant inactivation à l'ultraviolet), puis on a déterminé 7-jours plus tard la prolifération des lymphocytes T en déterminant la H3-thymidine incorporée au cours des 6 dernières heures d'une culture de 7 jours. Les résultats présentés au tableau II indiquent que les lymphocytes T de sang périphérique de macaque présentent 6 semaines après vaccination, des réponses de prolifération importantes après stimulation in vitro par du virus de vaccine de départ ou par du virus recombinant à gène chimérique v-env5. En outre, la réponse a été semblable en amplitude à celle des lymphocytes du macaque 173, qui a été. vacciné à l'aide d'un virus recombinant v-HSgDl de vaccine à herpès simplex gD. Ces résultats indiquent que l'expression du gène d'enveloppe de LAV par le virus recombinant chez les macaques n'a pas supprimé in vitro ou in vivo les réponses immunitaires à médiation par des lymphocytes T. TABLEAU II Sensibilisation " in vivo" de lymphocytes T chez des macaques vaccinés par le virus de vaccine recombinant à gène d'enveloppe ("vaccine-env"0 Incorporation de H-thymidine (coups par minute) Macaque Vaccination à des cellules de lymphocytes Taprès 7 jours de culture n Pas d'antigène Vaccine de départ vaccine-env 168 vaccine-env 520 36 755 36 942 175 vaccine-env 7 640 36 405 35 142 180 vaccine-env 3 962 32 960 30 237 182 vaccine-env 929 11 077 12 692 173 vaccine-herpes simplex gD 1 757 35 837 31 860 208 Néant 6 102 4 867 9 420 233 Néant 4 100 4 755 5 530 Dans l'ensemble, les résultats présentés aux figures 6-9 et aux tableaux I et II indiquent que les virus de vaccine recombinants que l'on décrit ici ont été capables (a) d'exprimer le gène d'enveloppe LAV inséré (b) de modifier ou traiter des produits de gène pour se rapprocher de protéines de LAV authentiques apparentées à de l'enveloppe virale, (c) de produire des protéines immunogènes à immunoréactivité spécifique avec du sérum de patient atteint de SIDA, (d) de déclencher des réponses spécifiques à LAV (adénopathie) chez des souris et des primates sub-humains ; et (e) le virus recombinant n'a pas supprimé les réponses immunitaires, à médiation par les lymphocytes Tin vitro'ou in vivo" DEPOT DE MICRO-ORGANISMES Les souches suivantes de E. coli, portant les plasmides énumérés, ont été déposées à l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (Etats-Unis d'Amérique) et ont reçu les numéros suivants d'inscription:: E. coli Souche Plasmide Numéro d'inscription K 12 Mi 1000 pv-envl NRRL B-18003 K 12, MC1000 pv-env2 NRRL B-18004 K 12, Mi 1000 pv-env5 NRRL B-18005 Les virus recombinants suivant s ont été déposés à l'American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, Etats-Unis d'Amérique, et on reçu les numéros suivants de dépôt virus recombinant numéro de dépôt v-env2 ATCC VR 2114 v-env5 ATCC VR 2113 On ne doit pas considérer que le cadre de la présente invention se limite seulement aux micro-organismes et virus déposés, puisque ce qui est déposé constitue une simple illustration d'un aspect de l'invention et que tous les micro-organismes ou virus fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de la présente invention. I1 va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux virus recombinants, à leurs génomes chimériques et protéines ou peptides et aux formulations de vaccins, décrits et représentés. I1 va également de soi que toutes les dimensions données pour les paires de bases des nucléotides constituent des renseignements approximatifs fournis à titre surtout descriptif REVENDICATIONS 1. Virus recombinant caractérisé en ce que son génome comprend une séquence de nucléotides codant pour un épitope de virus associé à l'adénopathie (LAV)/virus de leucémie de cellules ou lymphocytes T-humains (HTLV-III), ou d'une portion antigénique de cette séquence qui est sous la commande d'une seconde séquence de nucléotides qui régule l'expression du gène de manière qu'un peptide, ou une protéine apparenté(e) à l'épitope de LAV/HTLV III soit exprimé dans un hôte infecté par le virus. 2. Virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence des nucléotides codant pour l'épitope de LAV/HTLV III comprend la séquence du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III ou n'importe quelle partie de ce gène codant pour un peptide ou protéine antigénique. 3. Virus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence des nucléotides de gène d'enveloppe comprend la séquence des nucléotides telle que représentée sur la figure 2, à partir du nucléotide numéro 6767 au numéro 8549, ou n importe quelle partie de cette séquence codant pour un peptide antigénique ou une protéine antigénique. 4. Virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine exprimé(e) dans l'hôte infecté est lié(e) à un épitope d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou n'importe quelle partie antigénique de ce virus ou du peptide ou protéine d'expression. 5. Virus recombinant selon la revendication 4, carac térisé en ce que l'épitope d'enveloppe comprend un peptide ou une protéine ayant une séquence d'aminoacides essentiellement comme représentée sur la figure 2 depuis le reste aminoacide numéro 1 au reste numéro 361, ou n importe quelle partie antigénique de cette séquence. 6. Virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un virus comportant une enveloppe. 7. Virus recombinant selon la revendication 6, carac térisé en ce qu'il est ou comprend un virus de vaccine. 8. Séquence v-env5 de virus de vaccine tel que déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et qui a reçu le numéro d'entrée VR 2113, ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de ce virus obtenu par génie génétique. 9. Séquence v-env2 de virus de vaccine, tel que ce virus est déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et a reçu le numéro d'entrée VR 2114 ou un mutant, recombinant ou dérivé de ce virus obtenu par génie génétique. 10. Virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un virus nu. 11. Virus recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un adénovirus. 12. Virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un virus de polyédrose nucléaire. 13. Virus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un baculovirus. 14. Virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un bactériophage. 15. Peptide ou protéine antigénique essentiellement pur(e), caractérisé en ce qu'il ou elle est apparenté(e) à un épitope de LAV/HTLV III. 16. Peptide ou protéine selon la revendication 15, caractérisé(e) en ce que l'épitope comprend une glycoprotéine d'enveloppe de LAV/HTLV III. 17. Peptide ou protéine selon la revendication 15, caractérisé(e) en ce qu'il ou elle comprend une séquence d'amioacides comprenant la séquence des aminoacides telle que décrite sur la figure 2,du reste aminoacide numéro 1 au reste 861, ou n'importe quelle partie antigénique de cette séquence. 18. Peptide ou protéine selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé(e) en ce que ce peptide ou cette protéine a été purifié(e) à partir d'une cellule cultivée contenant une séquence de nucléotides codant pour le peptide ou la protéine qui est sous la commande d'une seconde séquence de nucléotides régulant l'expression des gènes, de sorte que le peptide ou la protéine est exprimé(e) par la cellule cultivée. 19. Peptide ou protéine selon la revendication 18, caractérisé(e) en ce que la cellule cultivée est ou comprend un microorganisme. 20. Peptide ou protéine selon la revendication 19, caractérisé(e) en ce que le micro-organisme est ou comprend une bactérie. 21. Peptide ou protéine selon la revendication 19, caractérisé(e) en ce que le micro-organisme est ou comprend une levure. 22. Peptide ou protéine selon la revendication 18, caractérisé(e) en ce que la cellule cultivée est ou comprend une lignée de cellules animales. 23. Peptide ou protéine selon la revendication 18, caractérié(e) en ce que la cellule cultivée est ou comprend une lignée de cellules d'insectes. 24. Peptide ou protéine selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé(e) en ce que le peptide ou la protéine a été obtenu(e) par synthèse chimique. 25. Formulation de vaccin à virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend un virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ce virus étant infectieux sans provoquer de maladie pour l'hôte à vacciner. 26. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 25, caractérisée en ce que le virus est ou comprend un virus à enveloppe. 27. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 20, caractérisée en ce que le virus à enveloppe est ou comprend un virus de vaccine. 28. Formulation de vaccin à virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de la séquence de gène v-env5 du virus de vaccine selon la revendication 8. 29. Formulation de vaccin à virus vivant caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de la séquence de gène v-env2 de virus de vaccine de la revendication 9. 30. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 25, caractérisée en ce que le virus est ou comprend un virus nu. 31. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 30, caractérisée en ce que le virus nu est ou comprend un adénovirus. 32. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 33. Formulation de vaccin à virus inactivé caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant à enveloppe selon la revendication 6, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 34. Formulation de vaccin à virus inactivé caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de la vaccine de la revendication 7, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 35. Formulation de vaccin à virus inactivé caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de la séquence v-env5 de virus de vaccine selon la revendication 8, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 36. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de la séquence v-env2 du virus de vaccine selon la revendication 9 à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 37. Formulation de vaccin à virus inactivé, caracté risee en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus nu selon la revendication 10 , à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 38. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de l'adénovirus de la revendication 11, à un état non infectieux, e n mélange avec un excipient pharmaceutique. 39. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de polyédrose nucléaire selon la revendication 12, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 40. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du baculovirus selon la revendication 13, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 41. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du bactériophage de la revendication 14 à un état non infectieux,en mélange avec un excipient pharmaceutique. 42. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de l'une quelconque des revendications 15, 16 ou 17, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 43. Formulation de vaccin à sous-unité caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 18, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 44. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 199 en mélange avec un excipient pharmaceutique. 45. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 20,en mélange avec un excipient pharmaceutique. 46. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 21, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 47. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 22, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 48. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogene comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 23, en mélange avec un excipient pharmaceutique. 49. Formulation de vaccin à sous-unité, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine de la revendication 24 en mélange avec un excipient pharmaceutique. 50. Vecteur de ADN (acide désoxyribonucléique) recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend pv-envl. 51. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant de la revendication 50. 52. Bactérie caractérisée en ce qu'elle comprend le vecteur de ADN recombinant de la revendication 50. 53. Bactérie selon la revendication 52, caractérisée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRLL et qui a reçu le numéro d'entrée B18003 ou est un mutant, recombinant ou dérivé de cette bactérie obtenu par génie génétique. 54. Vecteur de ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend pv-env2. 55. Organisme unicellulaire caractérisé en ce qu'il contient le vecteur de ADN recombinant de la revendication 54. 56. Bactérie contenant le vecteur de ADN recombinant de la revendication 54. 57. Bactérie selon la revendication 56, caractérisée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRLL et qui a reçu le numéro d'entrée B18004, ou un mutant, recombinant ou dérivé obtenu par génie génétique. 58. Vecteur de ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend pv-env5. 59. Organisme unicellulaire caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant de la revendication 58. 60. Bactérie caractérisée en ce qu'elle comprend le vecteur de ADN recombinant de la revendication 58. 61. Bactérie de la revendication 60, caractérisée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRLL et qui a reçu le numéro d'entrée B--18005 ou un mutant, recombinant ou dérivé de cette bactérie obtenu par génie génétique