Brevet FR2585839A1 — publié le 19870206

PROCEDE POUR L'EVALUATION DE LA CONCENTRATION D'IMMUNOGL013ULINE E DANS LES SERUMS HUAIS L'invention que l'on décrit traite de la détermination de la concentration d'immunoglobuline E (IgE) dans des sérums humains par un procédé de radioimmunoessai ou enzymeimmunoessai en phase solide utilisant deux anticorps monoclonaux (AcM) qui reconnaissent deux épitopes différents spécifiques de la IgE humaine. On a décrit plusieurs procédés d'évaluation de IgE humaine dans des sérums, qui utilisent des antisérums polyclonaux spécifiques obtenus chez le lapin, la brebis ou la chèvre : (Rao et coll, 1983, J. Immunol. 57, 71 ; Weltam et coll, 1978, J. Allergy Clin. Immunol. 58, 426; Goldsmith, 1981, Anal. Biochem. 117, 53; Cheung et coll, 1981, Ann Allergy, 46, 132; Reid et coll, 1981, J. Allergy Clin. Immunol. 67, 263; Yman et coll, 1975, Devlop. Biol. Standard. 29, 151; Gleich et coll, 1980, J. Allergy Clin. Immunol. 65, 20). Dans ces procédés, on utilise des antisérums spécifiques de IgE, purifiés et marqués radioactivement (RIA) ou conjugués à une enzyme (EIA). Cependant, ces systèmes souffrent de plusieurs limitations: a) la nécessité de purifier la fraction d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement des déterminants dans la chaîne Epsilon et qui ne donnent pas de réaction croisée avec les chaînes lourdes ou légères des autres classes d'immunoglobulines ; b) l'ob- tention de ces antisérums dépend d'animaux immunisés dont le degré d'immunisation et le titre d'anticorps varient au cours du temps, ce qui rend considérablement difficile la standardisation commerciale et l'utilisation de ces réactifs biologiques. Ces inconvénients sont évités par l'emploi du procédé que l'on décrit, dans lequel on utilise des AcM spécifiques pour IgE. Ceux-ci ont été obtenus suivant les techniques d'hybridation cellulaire décrites antérieurement (Galfré et Milstein, 1981, Methods Enzymol. 73; Springer et coll, 1982, Hybridoma, 1, 257; Sanchez Madrid et coll, 1982, Cell. Immunol. 73, 1). On a obtenu des AcM qui reconnaissent deux déterminants antigéniques différents spécifiques de IgE. Dans la présente invention, on détaille le procédé par lequel on estime quantitativement la concentration de IgE dans les sérums humains, moyennant l'emploi de deux AcM purifiés spécifiques de IgE. L'un d'eux est adsorbé ou lié de façon covalente aux puits d'une plaque en plastique, pour sélectionner et fixer sélectivement la IgE en solutions de concentration connue, contenue dans des sérums 125 à doser. Un deuxième AcM purifié et marqué avec I ou une enzyme, qui reconnaît un épitope différent dans la IgE, est utilisé pour déterminer la quantité d'IgE fixée au premier AcM. Le procédé objet de cette invention se compose des deux étapes suivantes Première étape: préparation purification marquage et caractérisation des AcM spécifiques de IgE. Les lignées cellulaires d'hybridomes de souris HE2/1 et HE3/2, secrétrices de AcM spécifiques pour IgE humaine, ont été obtenues par fusion de splénocytes de rate d'une souris Balb/c immunisée avec les cellules de la lignée de myélome de souris P3X63Ag8.6.5.3. Après des clonages et sous-clonages successifs sur agar-agar semisolide, les lignées stabilisées se multiplient dans 500 ml de milieu DMEM complété avec 10 t de sérum fétal de veau. A partir de ce matériel initial, on purifie les AcM par fractionnement sur sulfate d'ammonium et passage ultérieur au travers d'une colonne dtimmunoabsorbant de protéine A de Staphylococcus aureus couplé à du Sépharose, en suivant la méthode décrite précédemment par Ey. et coll., 1978, Immunochemestry 15, 429. La pureté des AcM purifiés est contrôlée par résolution par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide en présence de SOS et coloré avec du bleu de Coomassie. On observe seulement la présence de la chaîne lourde y1 et de la chaîne légère kappa teintes dans le gel. Les AcM purifiés sont marqués avec 1 mCi de 125I selon la méthode décrite précédemment par Fraker et Speck, 1978, Biochem., Biophys. Res. Commun. 80, 849, ou avec une enzyme (O'Sulliven et Marks, Methods of Enzymol. 74, 147, 1978). Les deux AcM HE2/1 et HE3/2 reconnaissent spécifiquement les immunoglobulines de classe E, sans montrer aucune fixation avec d'autres classes d'immunoglobulines. Dans des expériences de fixation comparative à IgE des AcM purifiés et marqués, il n'existe pas d'interférence. Ces deux AcM reconnaissent donc des déterminants antigéniques qui ne sont pas en relation dans la molécule de IgE. Deuxième étape : estimation quantitative de IgE dans des sérums humains. L'estimation quantitative de IgE dans des sérums humains est réalisée au moyen des AcM spécifiques de IgE purifiés. Parallèlement, on effectue une expérience avec une IgE humaine purifiée et de concentration connue, afin d'obtenir une courbe d'étalonnage. Le procédé employé est basé sur la propriété des deux AcM de reconnaître deux épitopes différents dans la molécule de IgE. En premier lieu, on adsorbe et on lie d'une façon covalente aux puits de plaques de plastique, comportant 96 puits, l'AcM HE3/2 purifié à une concentration de 10 pg/ml. On emploie un volume de 50 ul/puits, et on incube pendant une heure à 37 C, ou bien toute la nuit à 40C. La protéine non liée est éliminée par aspiration sous vide et les puits sont lavés avec une solution de phosphate salin (PBS) qui contient 1 t d'albumine sérique bovine (SAB) et on laisse pendant 5 à 10 minutes, pour saturer les sites de fixation du puits et ainsi éviter des fixations non spécifiques. On répète deux fois le lavage. Ensuite, on ajoute 50 ul d'une solution de IgE humaine purifiée diluée dans du PBS, qui contient des concentrations de IgE décroissantes par puissances de 10, de 10 ug/ml à 1 ng/ml. Parallèlement, dans d'autres puits, on ajoute en même temps des dilutions successives de sérums humains.On les laisse incuber pendant 1 h à température ambiante, et ensuite on réalise quatre lavages successifs avec la solution PBS avec 0,25 t de SAB pour éliminer la IgE non fixée. Finalement, pour détecter la IgE fixée, on emploie un deuxième AcM (HE2/1) purifié et marqué avec 125I ou avec une enzyme, qui est spécifique d'un épitope différent dans la molécule de IgE humaine. On ajoute 50 ul et on incube pendant 1 h à température ambiante. Après, on lave les puits 4 fois avec PBS à 0,25 % de SAB. Les puits sont partagés et la radioactivité fixée est mesurée à l'aide d'un compteur de radiations gamma, ou bien on mesure l'activité enzymatique après incubation avec un substrat approprié. Dans ces conditions, on établit en premier lieu une courbe d'étalonnage avec une IgE de concentration connue, courbe représentée sur le dessin annexé. Ce procédé permet d'évaluer la concentration d'IgE en établissant un rapport entre la radioactivité de AcM fixé ou l'activité enzymatique et la concentration de IgE, avec une limite de détection de 5 à 10 ng/ml. De cette façon, on a déterminé la concentration de IgE dans plusieurs sérums humains de patients allergiques : dans le tableau les valeurs obtenues sont comparées aux concentrations de IgE évaluées dans le sérum d'un individu non allergique. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION DE LA IgE DANS LES SERUMS HUMAINS Sérum humain IgE (ng/ml) déterminé par RIA EIA - p. judaïque #1 310 340 - p. " # 2 120 160 - " # 3 500 500 - D. pteronyssinus # 1 800 760 - " 2 850 700 - " 3 2125 1700 - L. perenne 750 608 - O. européenne 500 550 - Pool sérums non allergiques 50 20 La concentration de IgE est évaluée par RIA ou EIA en utilisant les courbes d'étalonnage du graphique 1. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'évaluation de la concentration d'immunoglobuline E dans des sérums humains, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) Obtention de lignées cellulaires d'hybridomes de HE2/1 et HE3/2 secrétrices de AcM spécifiques pour IgE humaine, obtenues par hybridation cellulaire, moyennant l'utilisa tion de polyéthylèneglycol comme agent de fusion b) Purification des AcM par fractionnement sur sulfate d'ammonium et passage ultérieur au travers d'une colonne de protéine A de Staphylococcus aùreus couplée à du Sépharose c) Marquage des AcM anti-IgE avec 1251 ou avec une enzyme d) Fixation de l'AcM non marqué à un support solide e) Incubation avec des échantillons de sérum dans lesquels on détermine la concentration de IgE en utilisant comme référence des solutions de concentrations connues de IgE de myélomes humains, servant à établir une courbe d'éta lonnage f) Détection et mesure de la IgE fixée au premier AcM, par incubation des échantillons avec l'autre AcM purifié et 125 marqué avec 125I ou avec une enzyme et reconnaissant un autre épitope différent dans la molécule de IgE. 2. Procédé pour l'évaluation de la concentration d'immunoglobuline E dans des sérums humains, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fixation de l'AcM au support solide peut être effectuée par adsorption ou par liaison covalente. 3. Procédé pour l'évaluation de la concentration d'immunoglobuline E dans des sérums humains, selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le support solide est le récipient même dans lequel on effectue l'essai.