Brevet FR2597481A1 — publié le 19871023

Procédé pour obtenir des polydésoxyribonucléotides chimiquement définis et reproductibles La présente invention se rapporte à la préparation de polydésoxyribonucléotides sous une forme chimiquement définie et reproductible. Plus particulièrement, la présente invention se 5 rapporte à la préparation de la substance connue sous le nom de "Défibrotide" (DCI, liste 21, Chronique OMS , 5 supp: 4, 1981). La substance nommée Défibrotide est définie comme un sel de sodium de fractions nucléotidiques de 10 faible poids moléculaire, obtenues par extraction d'organes animaux, selon la description des brevets US n' 3.770.720 et 3. 899.481, dont les indications sont incorporées ici à titre de référence. La Défibrotide a fait l'objet d'un certain 15 nombre d'études pharmacologiques et cliniques qui ont permis, d'une part, d'établir sa très faible toxicité (à la fois aiguë et subaiguë, ainsi que chronique), avec les avantages qui vont de soi du point de vue des utilisations thérapeutiques possibles, tandis que, 20 d'autre part, la Défibrotide a révélé des propriétés thérapeutiques remarquables et parfaitement imprévisibles. En fait, selon la description du brevet US 3.892.567, dont les indications sont incorporées ici à titre de référence, la Dêfibrotide est douée d'une 25 activité fibrinolytique qui la rend utilisable comme médicament antithrombique. Par ailleurs, le travail expérimental pharmacologique et clinique (effectué sur des volontaires) a mis en évidence les activités suivantes: a) Thérapie des artériopathies périphériques (Inventeur: O.N. Ulutin; demande de brevet US n 649.055, déposée le 10 septembre 1984); b) Traitement de l'insuffisance rénale aiguë (Inventeur: V. Bonomini; brevet US n 4.649.134, 35 délivré le 10 mars 1987); c) Traitement de l'ischémie aiguë du myocarde (Inventeurs: G. Prino, M. Mantovani, R. Niada; demande de brevet US n 701.695, déposée le 14 février 1985). Les indications du brevet et des demandes de 5 brevet ci-dessus sont incorporées ici à titre de référence pour l'enseignement des compositions pharmaceutiques et de leurs utilisations qui y sont révélées. La variété et l'importance des utilisations 10 thérapeutiques précitées ont, bien entendu, focalisé l'attention sur la Défibrotide et sur sa production industrielle. Ce travail de recherche a été dirigé en particulier, d'une part, vers une production à l'échelle industrielle économiquement avantageuse et 15 techniquement acceptable et, d'autre part, vers la normalisation et le contrôle de la Défibrotide obtenue, en tant que produit industriel. En d'autres termes, les procédés faisant l'objet des brevets US précités sont ceux qui ont été mis au 20 point initialement, aboutissant à l'obtention de la structure nucléotidique à laquelle on a donné le nom de Défibrotide. Lorsque les résultats des études pharmacologiques et cliniques ont révélé les propriétés 25 extrêmement intéressantes et multiformes de la substance initialement isolée, comme c'est naturel et évident, d'une part, on a été confronté au problème de la production à l'échelle industrielle et, d'autre part, les études des propriétés chimiques et physiques 30 de la substance appelée Défibrotide ont été examinées étroitement, du fait qu'elles sont liées strictement à la production et à ses conditions. On a ainsi trouvé, et c'est une première caractéristique de la présente invention, que la 35 Défibrotide satisfait entièrement aux propriétés pharmacologiques et thérapeutiques indiquées précédemment et qu'elle convient donc particulièrement pour les utilisations thérapeutiques précitées, si les fractions nucléotidiques stoechiométriquement à nucléotidique de séquence 3 2597481 qui la forment correspondent la formule polydesoxyriboaléatoire: P1-5, (dAp) 12-24' (dGp)10-20 '(dTp)1326' (dCp) -20 dans laquelle: P = radical phosphorique, dAp = monomère désoxyadénylique, dGp = monomére désoxyguanylique, dTp = monomère désoxythymidylique, dCp = monomère désoxycytidylique 15 La Défibrotide correspondant à cette formule présente, par ailleurs, les propriétés chimicophysiques suivantes: -électrophorèse = mobilité anodique homogène; 1% -coefficient d'extinction E à 260 + 1 nm = 220 + 10 1om -taux d'extinction, E /E 230 260 = 0, 45 + O,04 -rapport d'extinction molaire (rapporté au phosphore), E(P) = 7.750 + 500 20' -pouvoir rotatoire f] D = 53 + 6 -hyperchromicité réversible, indiquée en pourcentage d'ADN d'origine, h 15 +. 4 2597481 L'hyperchromicitâ réversible est une propriété optique particulièrement des polydésoxyribonucléotides et c'est une mesure de la capacité de ces biopolymères de subir un regroupement moléculaire en solution. En fonction de l'état thermodynamique, les molécules d'une substance ont tendance à effectuer un mouvement désordonné et libre et, plus la température de la solution de la substance est élevée, plus ce mouvement est rapide. Dans la plupart des substances 10 solubles simples (sels, sucres, peptides), lorsque la température diminue, même si la vitesse du mouvement diminue, une réorganisation des molécules, par rapport aux conditions initiales, ne se produit pas. Dans le cas des biopolyméres, comme les polydésoxyribonu15 cléotides, les molécules ont tendance à se réorganiser mutuellement. Cette propriété est très évidente dans l'ADN A double hélice, o la capacité de réorganisation par rapport à l'état initial peut être de l'ordre de 100%. On peut effectuer la mesure de cette capacité de 20 façon spécifique pour les polydésoxyribonucléotides par des mesures de variations de la densité optique ou l'on alcalinise et l'on neutralise à pH 5. La mesure de l'hyperchlomicité est donnée par la 25 formule suivante:: h= D.O. (à chaud ou à un pH alcalin) -4 D.O. (à la température ambiante ou à un pH neutre) qui compte tenu des explications précédentes, peut aussi être définie par: h = D.O. (en phase désordonnée) -4. D.O. (en phase ordonnée) Ainsi, l'hyperchromicité h indique la fraction des molécules du polynucléotide susceptible de se réorganiser. 2597481 Comme on l'a deja mentionné dans le cas de l'ADN a double hélice, cette valeur, indiquée en pourcentage, peut être de l'ordre de 100 %, tandis que, dans le cas d'oligodésoxyribonucléotides (poids moléculaire inférieur à 8.000 dalton>, cette valeur est presque nulle. On a trouvé à présent que la valeur optimale de h pour que le polydésoxyribonucléotide appelé Défibrotide soit pharmacologiquement actif et convienne 10 pour les utilisations thérapeutiques précitées, doit correspondre à un pourcentage d'environ 15% et que des valeurs de h inférieures à 10% impliquent une réduction tèrs importante de l'activité pharmacologique, tandis que des valeurs de h supérieures à 20% impliquent des 15 risques d'effets secondaires indésirables. Ces limites d'hyperchromicité caractéristiques indiquent que la Défibrotide polydésoxyribonucléotidique est un filament à un seul brin et cela est confirmé également par les mesures de poids 20 moléculaires effectuées sous lumière diffuse, dans lesquelles on ne note pas de différences de masse moléculaire significatives, en opérant à la fois dans des conditions normales et dans des conditions dénaturantes. En conséquence, la Défibrotide polydésoxyribonucléotidique à la structure d'un biopolymère à un seul filament susceptible de subir une réorganisation intramoléculaire (appariement de bases nucléiques dans la méme molécule> d'environ 15%, indiqué en ADN 30 d'origine. Comme on l'a mentionné précédemment, l'une des caractéristiques principales de la présente invention réside dans le procédé de préparation de Défibrotide présentant les propriétés précitées, en obtenant en 35 même temps une uniformité pratiquement parfaite des caractéristiques du produit d'une série de production à l'autre, l'utilité et la fiabilité parfaites du produit obenu pour la thérapie chez l'Homme et, bien entendu, la viabilité et la commodité du point de vue de la 6 2597481 production industrielle. Comme on l'a déjà indiqué, le procédé décrit dans les brevets US n 3.770.720 et 3.899.481, comprend l'extraction et la dégradation partielle des acides désoxyribonucléiques par dégra5 dation protonique des acides nucléiques. Dans un tel procédé, les rendements en Défibrotide sont relativement faibles et le produit est souvent accompagné de produits de dégradation. En fait, il est connu que la dégradation protonique des polydésoxyribonucléotides 10 peut provoquer, d'une façon plus ou moins remarquable, la dépurinisation, avec le risque de formation de proportions, même modeste, d'acides apuriques, qui peuvent être toxiques. Ainsi, l'invention a principalement pour objet 15 la résolution fondamentale de ces problèmes et la suppression des inconvénients des procédés précités. La présente invention a plus spécifiquement pour objet un procédé d'obtention de Défibrotide présentant les propriété chimiques et chimicophysiques précitées. 20 La présente invention a encore, par ailleurs, pour objet un procédé de production de Défibrotide permettant d'utiliser plusieurs matières premières naturelles, en plus du poumon de bovidés, comme on l'envisage dans les brevets précités. On a trouvé à présent, de façon surprenante, qu'en opérant dans des conditions d'agrégation mieux contrôlées, on peut dépolymériser des acides nucléiques bruts de façon avantageuse, en réduisant ainsi à un minimum la formation de produits de dégradation. Le procédé selon la présente invention est caractérisé par les étapes suivantes: a) broyage et protéolyse à chaud de l'organe animal de départ; b) filtration et concentration du lysat; c) addition au concentré du sel d'un cation susceptible de précipiter les phosphates, et ajustement du pH à des valeurs acides ne dépassant pas pH 4,5. d) filtration sous volume constant de la suspension de précipité, pour séparer la fraction polysadaridique présente en solution; e) addition à la suspension obtenue de sels insolubles d'acides nucléiques d'un sel soluble dans 5 l'eau d'un métal alcalin, pour solubiliser les acides nucléiques, et élimination de la solution de cations insolubilisants déplacés; f) ajustement de la force ionique de la solution d'acides nucléiques à une valeur molaire prédéterminée 10 d'au moins 1, pour déclencher leur agrégation stabilisante sous la forme de polydésoxyribonucléotides coupés fortement polymérisés et ajustement du pH de la même solution, Jusqu'à ce que l'analyse spectrophotométrique du mélange réactionnel indique qu'on a 15 obtenu l'hyperchromicité réversible maximale, c'est-àdire l'agrégation maximale possible; g) chauffage de la solution à la température de dépolymérisation du polydésoxyribonucléotide agrégé et contrôle de la dépolymérisation par la mesure de la 20 variation de l'hyperchromicité réversible, jusqu'à ce qu'il obtienne la valeur, indiquée en pourcentage d'ADN natif, de 15 t 5; h) arrêt par refroidissement du processus de dépolymérisation et suppression des liaisons hydrogène 25 dans les fragments à double filament; i) stabilisation des fragments à un seul filament obtenus, dans cet état, en chauffant la solution obtenue par le stade précédent à une température et un pH supérieurs à ceux de l'étape de 30 dépolymérisation, ce qui empêche les liaisons hydrogène de se reformer; j) filtration à chaud et élimination, toujours & chaud, des sels présents en solution, avec concentration éventuelle. En considérant à présent les stades individuels du processus défini cidessus, les organes animaux utilisés comprennent des organes, des tissus et des cellules de mammifères, en particulier les poumons, les 8 2597481 instestins, le foie et les muqueuses de bovins, de moutons, de porcs et de chevaux. On peut également utiliser les liqueurs-mères résiduelles obtenues lors de la production d'héparines, 5 le lysats protéiques et d'extraits d'organes. Une autre matière de départ comprend des cellules telles que, par exemple, des corpuscules blancs ou des résidus de leur culture, des spermatozoïdes, de spermatocytes et des cellules germinales de mammifères. On effectue la protéolyse d'une façon connue en soi avec une enzyme protéolytique, comme, par exemple, la papaïne, la tripsine, etc. Les conditions et la durée de la protéolyse dépendent, bien entendu, du type d'enzyme protéolytique 15 et elles sont bien connus et sont en général, comprises dans l'intervalle de 10 à 90'C pendant 0,5 à 10 heures. Par exemple, avec la papaïne, on effectue, en général, la protéolyse pendant 4 heures à 65'C. En considérant à présent l'étape b) de 20 filtration et l'étape de concentration, on effectue, de préférence, ce dernier sur une membrane à écoulement tangentiel. De cette façon, on peut, en fait choisir un intervalle de poids moléculaires désirés à obtenir. On choisit ainsi la membrane avec une coupure bien 25 déterminée (en général, 50.000 à 100.000). On mélange le concentré obtenu (étape c) avec un cation susceptible de précipiter les phosphates dans le concentré. On peut aJouter au concentré un sel du cation tel que, par exemple, des halogénures, des 30 sulfates, des bicarbonates, des acétates de Ca, Zn, etc. en ajustant le pH à des valeurs acides. On filtre la suspension de précipité par diafiltration à volume constant (étape d) à travers une membrane présentant une dimension de pores de 0, 45 im 35 ou moins, à écoulement tangentiel, avec un appoint d'eau continue pour maintenir le volume constant, Jusqu'à ce que les substances polysaccharidiques disparaissent du filtrat. 9 2597481 Le sel soluble dans l'eau, ajouté (au cours de l'étape e) à la suspension de sels insolubles d'acides nucléiques, est un sel tel qu'un halogénure ou un acétate de métal alcalin, par exemple de sodium ou de potassium. Dans la suspension obtenue, il reste le cation insolubilisant (tel que Ca, Zn, etc.) que l'on élimine, de préférence, par diafiltration à volume constant à travers une membrane d'une coupure de moins de 10.000, 10 avec écoulement tangentiel et appoint continuel de solution saline pour maintenir le volume constant. On poursuit ce traitement, jusqu'à ce que, dans le permeat, le cation insolubilisant ne soit plus présent. En variante, on élimine le cation 15 insolubilisant par échange ionique sur la suspension provenant de l'étape d. On aJuste la solution d'acide nucléique brut, si on le désire, à une force ionique d'une valeur molaire d'au moins 1 et, de préférence, de 3, de préférence par 20 l'addition d'un sel soluble dans l'eau de métal alcalin, et l'on ajuste le pH de la solution, jusqu'à ce qu'on obtienne la valeur de pH qui, selon les mesures exprimentales, correspond à l'hyperchromicité réversible maximale du système. Un tel pH est 25 normalement compris entre 4 et 5. Au cours de cette étape, les acides nucléiques bruts ont subi une agrégation stabilisantes pour former des polydésoxyribonucléotides coupes fortement polymérisés. On peut effectuer de façon appropriée les étapes a) à c) à la température ambiante, bien que la température puisse être comprise entre 10 C et 90 C. Après l'étape d'agrégation stabilisante (étape f), la dépolymérisation des polydésoxyribonucléotides 35 coupés fortement polymérisés a lieu par chauffage à une température d'environ 70 à 75 C, de préférence, bien que la température de dépolymérisation puisse être comprise entre 60 et 90 C, la dépolymérisation étant contrôlée par des mesures de variation d'hyperchromicité réversible. On effectue la suppression des liaisons hydrogène restantes dans les fragments à double 5 filament obtenus, une fois que la dépolymérisation est arrêtée par refroidissement à une température inférieure, de préférence de 15 à 30 C, par alcalinisation de la masse reactionnelle à un pH supérieur à 7, de préférence à un pH de 8 ou plus. Enfin, on obtient la stabilisation des fragments à un seul filament par chauffage de la solution obtenue au stade h à une température supérieure d'au moins 5 C à la température de dépolymérisation, et en général à une température de 65 à 100 C. Le dessin représente, schématiquement et avec la représentation classique, les modifications à différents stades des acides nucléiques bruts, extraits d'organes et soumis à la digestion protéolytique. Comme on peut l'observer clairement, lorsque la 20 matière de départ, que l'on peut imaginer comme étant un ensemble polynucléotidique plus ou moins désapparié, déspiralisé et partiellement dégradé avec formation de courts segments dépurinisés, désignés par l'abréviation SM, est dissoute dans une solution saline de force 25 ionique élevée et suffisamment protonée, d'une valeur molaire de 3, de préférence, d'un sel soluble dans l'eau d'un métal alcalin, les molécules formant la matière de départ tendent à s'agréger, comme on le sait selon la règle de Chargaff de l'appariement des bases, 30 en raison des liaisons hydrogène pouvant être fournies par le milieu solvant. Du fait que les chaînes polynucléotidiques sont partiellement incomplètes, un appariement occasionnel a lieu, aboutissant à la formation de polynucléotides à double filament 35 fortement polymérisés, filaments qui sont occasionnellement interrompus par des discontinuités dans les séquences ("coupures") présentes le long des frontières hydrophiles de la structure représentées par l'abréviation AS (système agrégé) sur le dessin. Sur le dessin, les zones hydrophobes (IR) et les zones hydrophiles (IF) comportant des charges négatives sont représentées. A ce moment, l'apport d'énergie thermique 5 ajustée de façon appropriée provoque une fracture, de façon prédominante au niveau des discontinuités des doubles filaments seulement, de sorte que des fragments à double filament ayant une certaine régularité (indiqués par DSF sur la figure) sont produits. On contrôle le degré de fragmentation par le réglage de plusieurs paramètres chimicophysiques, le principal étant l'indice d'hyperchromicité réversible du système (telle que déjà définie). L'élimination des ions hydrogène, effectuée au 15 moment o l'hyperchromicité réversible a atteint la valeur caractérisant la Défibrotide, (15 + 5), provoque l'élimination des liaisons hydrogène, par lesquelles les bases nucléiques sont appariées, ce qui aboutit à des monofilaments polydésoxyribonucléo20 tidiques présentant la structure caractéristique désirée. On a également trouvé que l'état de liberté des filaments individuels est stabilisé dans la structure, les filaments individuels ayant environ 15% d'hyper25 chromicité réversible caractérisant la Défibrotide, lorsque l'on chauffe encore la solution à pH 8 + 0,2, & un niveau de température supérieur à la température utilisée dans la dépolymérisation dans des conditions d'agrégation qui a eu lieu précédemment. L'énergie cinétique induite dans le système empêche les réagrégations qui pourraient survenir au cours des phases subséquentes du procédé mettant en jeu l'isolement des fractions polydésoxyribonucléotidiques intéressantes, d'avoir lieu. Seuls les filaments polydésoxyribonucléotidiques ainsi stabilisés (indiqués par SSD sur la figure) maintiennent toutes les propriétés chimiques qui caractérisent la structure de Defibrotide désirée. En opérant ainsi, on réduit le degre de depurinisation a un minimum et le rapport entre les bases puriques et les bases pyrimidiques est rarement inférieur a 0,95%. Il y a lieu de souligner, enfin, qu'avec le procédé selon la présente invention, on peut obtenir des polydésoxyribonucléotides normalisés présentant les propriétés chimiques et pharmacologiques de la Défibrotide. Au cours de ce travail de recherche, on a 10 trouvé, comme on l'a déjà mentionné, qu'il était possible d'obtenir des polydésoxyribonucléDtides présentant les propriétés désirées, également à partir d'autres sources que le poumon de bovidés. On a trouvé à présent, de façon surprenante, qu'en opérant selon 15 les critères précités, il est possible d'obtenir des polydésoxyribonucléotides présentant les caractéristiques de la Défibrotide, également à partir d'autres sources telles que le poumon et l'intestin de porc, le foie et le thymus, à la fois de bovins et de porcs. 20 Cette possibilité est très importante, du fait que, compte tenu de la consommation thérapeutique du produit appelé Défibrotide prévue, il semble nécessaire d'élargir les sources de départ. Il est particulièrement avantageux de pouvoir utiliser les 25 liqueurs-mères de la production d'héparine, des extraits et des hydrolysats protéiques comme matières de départ, du fait que ces matières sont très abondantes et actuellement rarement utilisées, leur évacuation étant également une cause sérieuse de 30 pollution. Un autre avantage de la présente invention consiste non seulement en la possibilité d'élargir les sources d'extraction de Défibrotide, mais également dans la possibilité de récupérer de la Défibrotide de 35 produits secondaires, ce qui augmente le rendement économique d'autres procédés, tels que des procédés de production d'héparine et de lysats protéiques, et réduit, par ailleurs, les causes de pollution, telles que celles résultant de résidus riches en phosphates de ces autres procédés, résidus qui sont, en fait d'origine nucléique. Les exemples non limitatifs qui suivent servent à illustrer la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. On broie 100 kg de poumon de bovidés congele et 10 on les disperse dans 50 litres d'eau potable contenant g de papaïne brute, activée par des sulfites. On ajuste le pH de la dispersion à 5,8 avec de l'acide chlorhydrique dilué, en chauffant alors la masse à 65 C pour effectuer la protéolyse. Au bout de 4 heures, on arrête la protéolyse en chauffant la masse à l'ébullition pendant 15 minutes. Après filtration à travers un filtre-presse, dans lequel les matières solides de la dispersion sont éliminées, on concentre la solution filtrée de protéo20 lysat à un volume de 25 litres par filtration avec écoulement tangentiel sur une membrane tubulaire Romicon d'une coupure de 50.000. On pourrait utiliser le perméat, ayant une activité héparinique d'environ 8 UI/ml, pour la 25 récupération d'héparine et d'acides aminés. On traite le concentré avec 150 g de chlorure de calcium anhydre, et l'on ajuste la solution à pH 3 en provoquant la précipitaiton de la portion nucléique, tandis que la portion polysaccharidique restante 30 demeure en solution. On diafiltre la suspension par écoulement tangentiel à travers une membrane tubulaire Romicon de dimension de pores de 0,45 micron, en maintenant le volume concentre constant par des additions d'une 35 solution de chlorure de calcium à 0,01. On poursuit la diafiltration, jusqu'à ce que le concentré ne produise plus de réaction des polysaccharides sur le chlorure de cétylpyridinium. On utilise le perméat de diafiltration pour la récupération de polysaccharides, en produisant environ 50 g d'un mélange comprenant des sulfates de condroitine et de l'héparine. On mélange la suspension de concentré de diafiltration, contenant les sels de calcium insolubles d'acides nucléiques, avec 25 litres de chlorure de sodium 3M. On diafiltre le mélange avec écoulement tangentiel à travers une membrane Romicon d'une coupure 10 de 10.000, en maintenant le volume de concentré constant par des additions de solution 3 fois molaire de chlorure de sodium, jusqu'à ce que le perméat liquide ne produise plus la réaction du calcium sur l'oxalate d'ammonium; ainsi, l'échange entre les ions 15 calcium et sodium a lieu en faisant passer tous les acides nucléiques sous la forme sodique. On concentre alors encore le concentre par filtration avec écoulement tangentiel sur la même membrane, jusqu'à ce qu'on obtienne un volume de 7, 5 20 litres. Ce concentré contient environ 3% (évaluation spectrophotométrique) de sels de sodium des acides nucléiques bruts, correspondant à 0,22% du poids d'organe initial, dans une solution saline trois fois molaire. On ajuste cette solution au point d'hyperchromicité maximale en ajoutant des portions d'acide chlorhydrique 3M, jusqu'à ce que les mesures spectrophométriques d'hyperchromicité par réalcalinisation des échantillons de solution ne présentent pas 30 un delta d'absorption maximum; ce dernier s'avère égal à 38% d'ADN d'origine, lorsque le pH atteint 4,25, ce qui correspond au point d'hyperchromicité maximale du système et, par conséquent, à l'état maximum d'agrégation et d'appariement des bases des acides 35 polydésoxyribonucléotidiques en solution. Lorsque ces conditions sont établies, on chauffe la solution à 75'C pour déclencher la dépolymérisation. A des intervalles de 15 minutes, on effectue des mesures d'hyperchromicité sur des échantillons de la solution, pour contrôler la progression de la dépolymérisation. Apres six mesures, les données portées en ordonnées dans un système cartésien permettent l'extrapolation sur l'axe des abscisses 5 d'une durée de 4 heures pour obtenir des polydésoxyribonucléotides présentant une hyperchromicite de 19% en ADN d'origine. En conséquence, au bout de 4 heures, on arrête la dépolymérisation dans des conditions d'agrégation en 10 refroidissant la masse dépolymérisée à une température de 30'C et en l'alcalinisant (pH 8) avec une solution d'hydroxyde de sodium 3 fois molaire. On élève la température à 85 C pendant 30 minutes, pour stabiliser la structure des 15 polynucléotides, puis l'on filtre la solution à chaud et on lui fait subir une dialyse et une concentration avec écoulement tangentiel, comme précédement, jusqu'à un volume de 6.500 ml. On précipite le produit obtenu avec de l'acool à 20 partir de la solution concentrée. Après déshydratation avec de l'alcool et séchage sous vide à 60'C, on obtient 126 g de produit présentant les propriétés analytiques suivantes: P = 8,40 % G = 8,60 % d = 34,10 % C = 6,15 % A = 8,90 % T = 9,20 % Proportion molaire P/(A+G+C+T) = 1,07 30 Proportion molaire purines pirymidines = 0,96 Extinction molaire rapportée a P e (P) = 7,800 Coefficient d'extinction E1% 230 lcm Pouvoir rotatoire aJ D = +57 Hyperchromicité (en ADN d'origine) h = 18 % Les données précitées aboutissent stoechiométriquement à la formule nucléotidique suivante: P3' (dAP)12, (dGp)10, (dCp)10 (dTp)3 13 On traite 1.000 kg de poumon de porc de la façon 15 décrite dans l'exemple 1, pour produire 700 g de Défibrotide présentant les propriétés suivantes: P = 8,50 % d = 36,20 % 20 A = 9,30 % G = 8,90 % C = 6,80 % T = 10,20 % Proportion molaire P/(A+G+C+T) = 1,02 Proportion molaire purines pyrimidines = 0,90 'C D = +53' h= 16 % E(P) = 7,750 Les données précitées aboutissent stoechiométriquement à la formule nucléotidique suivante: P, (dAp)12, (dGp)10, (dCp) 10, (dTp)4 Rxe-Tnl i 3 On concentre 1.000 litres de liqueurs-mères provenant de la productiond'héparine à partir de 5 muqeuse intestinale de bovidés à 55 litres au moyen d'une membrane à écoulement tangentiel. On précipite les acides nucléiques avec du chlorure de zinc, selon la description du brevet US n 3.770.720. Après décantation et lavage pour séparer les 10 polysaccharides, on met le précipité en suspension dans de l'eau et on le transforme en le sel de sodium par traitement avec une résine échangeuse d'ions IR 120 sous forme Na'. On agrège les sels sodiques des acides 15 nucléiques contenus dans l'éluat en ajoutant un volume égal d'une solution 5M de tampon d'acétate (pH 3,9), en obtenant ainsi un mélange final présentant un pH 4,1, que l'on utilise pour la mesure de l'hyperchromicité réversible maximale du système. On chauffe le mélange à 70 C, et on le maintient à cette température, en contrôlant l'indice d'hyperchromicité réversible toutes les 15 minutes. Au bout de 4 heures, l'indice ateint une valeur h = 18 %. On refroidit la solution à 25 C, puis on l'ajuste à pH 25 7,8 avec de l'hydroxyde de sodium 5N, puis on la chauffe à 85'C pendant 30 minutes. Après filtration, on précipite 1,0 volume du produit en ajoutant 1,5 volume d'éthanol. On lave ensuite le précipite et on le déshydrate avec de l'ethanol, puis on le sèche sous 30 vide & 60'C. On obtient 630 g de produit présentant les propriétés chimiques suivantes: P = 8,73 % G = 8,5 % d = 36,40 % C = 6,9 % A = 9,60 % T = 9,7 % Proportion molaire P/(A+G+C+T) = 0,4 Proportion molaire purines pyrimidines = 0,92 e(P)= 7,580] =51 h = 15 % D auxquelles correspond la formule nucléotidique suivante: O P2' (dAp)13, (dGp)10 Exemple 4 On dissout 30 kg de sels de sodium d'acides nucléiques obtenus à partir de poumon de bovidés selon ce qui est indiqué dans le brevet US 3.770.720 dans 500 litres de tampon d'acétate 3M à pH 4, 5 pour former une solution ayant l'hyperchromicité réversible maximale du 20 système. On filtre la solution ainsi obtenue, puis on la chauffe à 75'C. On prélève, à des intervalles de 15 minutes, les échantillons pour déterminer l'indice d'hyperchromicité réversible, et l'on porte les données 25 d'hyperchromicité en ordonnées dans un système cartésien dans lequel on porte en abscisses les instants auxquels on prélève les échantillons. Sur la base des données trouvées pour 3 ou 4 mesures, on extrapole le temps nécessaire pour que 30 l'hyperchromicité h du système prenne une valeur de %, indiqué en ADN d'origine, et l'on poursuit le chauffage pendant ce temps. On aJuste la masse obtenue à pH 8 avec de l'hydroxyde de sodium 5N et on la chauffe à 80 C 35 pendant 60 minutes pour stabiliser la structure polydésoxyribonucléotidique, qui est caractéristique de la Défibrotide. Enfin, on filtre la solution et on la sèche, comme indiqué dans l'exemple 3. On obtient environ 15 kg de produit. Les propriétés du produit, préparé selon la description de cet exemple, sont les suivantes: P = 8,83 % G = 8,40 % d = 37,80 % C = 7,00 % A = 9,90 % T = 9,85 % Proportion molaire P/(A+G+C+T) = 1,06 10 Proportion molaire purines pyrimidines = 0,95 E(P) = 7,750 a] = +54 h = 17 % D La formule nucléotidique obtenue est: P, (dAp)13, (dGp)11, (dTp)14, (dCp) 2 13 il14' 12 Exemple Une variante de l'exemple 4 implique d'éliminer 25 du système pendant le stade de dépolymérisation, le produit dépolymériser, par perméation sur une membrane & écoulement tangentiel d'une coupure moléculaire de 100.000. On effectue cette élimination pour éviter une dégradation ultérieure pour les structures polydésoxy30 ribonucléotidiques qui pourraient déjà avoir la structure de la Défibrotide, ce qui améliore les rendements. En fait, en opérant dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4, mais avec cette variante, à 35 partir de 30 kg de sels de sodium d'acides nucléiques, on obtient 16,5 kg de produit de propriétés correspondant & celles de l'exemple 4. Revendications 1. Procédé de production de Défibrotide du polydésoxyribonucléotides a partir d'une solution 5 d'acides nucléiques bruts, ladite solution étant, au moins pratiquement, dépourvue de polysaccharides et de protéines, ledit procédé étant caractérisé en ce que: (1) on forme des polydésoxyribonucléotides coupés fortement polymérisés sur agrégation 10 stabilisante des acides nucléiques bruts en ajustant, si nécessaire, la solution à une force ionique prédéterminée d'une valeur molaire d'au moins 1, et en ajustant le pH de la solution, jusqu'à obtention de l'hyperchromicité réversible maximale, (2) on dépolymérise des polydésoxyribonucléotides, jusqu'à ce que l'hyperchromicité de la solution ait une valeur de h = 15 + 5, mesurée en pourcentage d'ADN d'origine, en chauffant la solution obtenue à une température de dépolymérisation pour 20 ledit polydésoxyribonucléotide, et en maintenant la solution à une température de dépolymérisation, Jusqu'à obtention de ladite valeur d'hyperchromicité réversible, (3) on arrête ensuite la réaction de 25 dépolymérisation, et l'on supprime les liaisons hydrogène dans tout fragment à double filament dans la solution dépolymérisée pour former des fragments de polydésoxyribonucléotides à un seul filament, et (4) on stabilise ensuite les fragments à un seul 30 filament de polydésoxyribonucléotides obtenus en chauffant la solution obtenue à une température et un pH supérieurs à ceux de la réaction de dépolymérisation, pour empêcher les liaisons hydrogène de se reformer. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient ladite solution d'acides nucléiques bruts à partir de tissus d'organes et des cellules de mammifères. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on effectue l'étape (1) en ajoutant un sel soluble dans l'eau d'un métal alcalin à une suspension de sels insolubles desdits acides nucléiques bruts pour 5 solubiliser les acides nucléiques, en éliminant de la suspension obtenue le cation insolubilisant, et en poursuivant l'addition du sel soluble dans l'eau, jusqu'à obtention d'une solution saline au moins une fois molaire d'acides nucléiques bruts. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on poursuit l'addition de sels solubles dans l'eau jusqu'à ce que ladite solution saline d'acides nucléiques bruts soit au moins 3 fois molaire. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé 15 en ce qu'on choisit le sel soluble dans l'eau de métal alcalin dans le groupe comprenant les halogénures et les acétates. 6. Procédé selon la revendication 5,caractérisé en ce que ledit sel est le chlorure de sodium. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit sel est une solution de chlorure de sodium trois fois molaire. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'élimination du cation 25 insolubilisant par diafiltration à volume constant à travers une membrane à écoulement tangentiel, avec appoint continuel de solution saline. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite membrane a une coupure ne dépassant 30 pas 100.000. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'ajustement de pH de l'étape (1) avec un acide correspondant a l'anion du sel solubilisant utilisé pour obtenir la solution 35 saline de force ionique prédéterminée. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit acide est l'acide chlorhydrique. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on ajoute l'acide chlorhydrique, jusqu'à ce que la solution ait une concentration en ions hydrogène correspondant à un pH de 3 à 5. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction de dépolymérisation de l'étape (2) par chauffage à une température d'environ 70 à environ 75 C. 14. Procédé selon la revendication 13, 10 caractérisé en ce qu'on contrôle la dépolymérisation en mesurant la valeur d'hyperchromicité réversible jusqu'à ce que cette valeur, indiquée sous la forme d'un pourcentage d'ADN d'origine soit de 15 + 5. 15. Procédé selon la revendication 1, 15 caractérisé en ce qu'on arrête la dépolymérisation à l'étape (3) par refroidsement de la solution. 16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'élimination des liaisons hydrogène dans les fragments à double filament 20 du stade (3) en ajustant le pH de la solution à une valeur supérieure à (7). 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on amène la solution à un pH supérieur à (8). 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH par addition d'un hydroxyde de métal alcalin. 19. Procédé selon- la revendication 18, caractérisé en ce que l'hydroxyde de métal alcalin est 30 l'hydroxyde de sodium. 20. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on chauffe la solution obtenue à partir de l'étape (3> à une température qui est supérieure d'au moins 5 C à la température de la 35 réaction de dépolymérisation, pour stabiliser des fragments à un seul filament. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'on effectue l'étape de chauffage pendant au moins 30 minutes. 22. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on filtre a chaud la solution obtenue à partir de l'étape de chauffage stabilisant 4, puis l'on élimine les sels éventuellement présents dans la solution, tant qu'elle est encore à l'état chaud. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'on concentre la solution, après élimination desdits sels. 24. Procédé selon la revendication 22, 10 caractérisé en ce qu'on fait subir au filtrat provenant de l'étape de filtration à chaud une dialyse à travers une membrane à écoulement tangentiel. 25. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'étape (1) avec un 15 tampon d'acétate présentant une molarité permettant d'obtenir le pH final désiré correspondant à l'hyperchromicité réversible maximale du système. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'on filtre la solution obtenue, 20 provenant du chauffage stabilisant des fragments à un seul filament, et l'on précipite le produit final par l'addition d'un solvant alcoolique. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit solvant est l'éthanol. 28. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare ladite solution saline d'acides nucléiques bruts par broyage, digestion protéolytique à chaud, filtration et concentration de lysat, puis addition du sel d'un cation susceptilbe de 30 précipiter des phosphates, et filtration à volume constant de la suspension de précipité. 29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'on effectue la filtration du lysat protéolytique sur une membrane à écoulement tangentiel. 35 30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'on choisit ladite membrane de façon qu'elle présente une coupure de 50.000 à 100.000. 31. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'on effectue la filtration à volume constant avec une membrane à ecoulement tangentiel et en ajoutant continuellement de l'eau d'appoint. 32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que ladite membrane a une dimension de pores ne dépassant pas 0,45 gm. 33. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'on choisit la matière dans le groupe comprenant les poumons, les intestins, le foie et les muqueuses de mouton, de porc, de cheval et de 10 bovins. 34. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'on choisit la matière de départ dans le groupe comprenant des corpuscules blancs ou des résidus de leurs cultures, des spermatozoïdes, des 15 spermatocytes ou des cellules germinales de mammifères. 35. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la matière de départ est une liqueur-mère provenant du traitement d'organes ou de tissus animaux au cours d'un procédé pour obtenir des 20 héparines, des lysats protéiques ou des extraits d'organes. 36. Polydésoxyribonucléotide connue sous le nom de Défibrotide, correspondant à la formule suivante de séquence aléatoire: P.,(dAp), (dGp), (dTp), (dCp) 1-15(dA) 12-24 (dp)1020 13-26' (dCp)10-20 dans laquelle P = radical phosphorique, dAp = monomère désoxyadénylique, dGp = monomére désoxyguanylique, dTp = monomère désoxythymidylique, dCp = monomère désoxycytidylique, et présentant, en outre les propriétés chimicophysiques suivantes: - électrophorèse = mobilité anodique homogène 1% - coefficent d'extinction E a 260 + 1 nm = 220 t i0 1cm - rapport d'extinction, E /E = 0,45 + 0,04; 230 260 -coefficient d'extinction molaire (rapportée au phosphore): E(P) = 7.750 + 500 20 - pouvoir rotatoir =]D53 + 6 -hyperchromicité réversible, indiquée sous forme de % d'ADN d'origine, h = 15 + 5 37. Procédé de production de Defibrotide à partir d'une solution d'acide nucléique brut qui est, 15 au moins pratiquement, dépourvue de polysaccharides et de protéines, ledit procédé étant caractérisé en ce que: coupés fortement polymérisés par l'agrégation 20 stabilisant d'acides nucléiques bruts, en ajustant, si nécessaire, la solution d'acides nucléiques bruts à une force ionique prédéterminée d'une valeur molaire d'au moins (1), et en ajustant le pH de ladite solution, jusqu'à obtentionde l'hyperchromicité réversible 25 maximale, (2) on dépolymérise ensuite les polydésoxyribonucléotides, jusqu'à ce que l'hyperchromicité réversible de la solution ait une valeur h = 15 + 5, mesurée sous la forme d'un 30 pourcentage d'ADN d'origine, en chauffant la solution obtenue à une température de dépolymérisation pour ledit polydésoxyribonucléeotide, ladite température de depolymérisation étant d'environ 60 à environ 90 C, et en maintenant la solution a une température de 35 dépolymérisation, jusqu'à obtention de ladite valeur d'hyperchromicité réversible, (3) puis l'on arrête la réaction de dépolymerisation par refroidissement de la solution a une température de 15 a 30'C, et l'on supprime les liaisons hydrogène dans tout fragment à double filament dans la solution dépolymérisée, pour former des fragments de polydesoxyribonucléotides a un seul filament, en ajustant le pH de la solution a une valeur supérieure à 7, et (4) on stabilise ensuite les fragments de filament de polydésoxyribonucléotides obtenus en chauffant le résultat obtenue à une température supérieure d'au moins 5 C à la température de la 10 réaction de dépolymérisation, à un pH qui est supérieur d'au moins 0,2 au pH de la réaction de dépolynmérisation, ce qui empêche les liaisons hydrogène de se reformer.