Brevet FR2586702A1 — publié le 19870306

i Procédé pour la production de L-amino-acides. La présente invention concerne un procédé pour la production de L-aminoacides. Plus particulièrement,-elle concerne un procédé pour la production d'un L-amino-acide à partir d'un DL- et/ou L-amino-amide par action d'une enzyme préparée par un micro-organisme spécifique. Les L-amino-acides sont des composés importants comme additifs pour les aliments de l'homme et des animaux et comme intermédiaires de médicaments et de divers produits chimiques industriels. En général, les L-amino-acides sont produits par fermentation ou par dédoublement optique de DL-amino-acides préparés selon un procédé de synthèse de chimie organique. On a récemment proposé et réalisé en pratique un grand nombre de procédés dits chimico-enzymatiques qui comprennent la conversion de précurseurs pouvant être obtenus à bas prix par synthèse chimique en L-amino-acides par emploi d'enzymes. Des exemples typiques des procédés chimico- enzymatiques pour la production de L-amino-acides comprennent par exemple un procédé comportant l'action de l'acylase produite par un microorganisme sur un dérivé N-acylé d'un DL-amino-acide (brevet japonais publié n 22380/66), un procédé comprenant l'action d'une hydantoinase produite par un micro-organisme sur un dérivé à substitution hydantoi- ne d'un DL-amino-acide (brevet japonais publié n0 2274/79), un procédé comprenant l'action d'une aspartase produite par un micro-organisme sur l'acide fumarique (brevet japonais publié no 18867/82 et demande de brevet japonais mise à l'inspection publique n 14089/84), et un procédé comprenant l'action de la phénylalanine-ammoniac-lyase produite par un micro-organisme sur l'acide cinnamique (Appl. Environ, Microbiol. 42, 773 (1981)). Cependant ces procédés posent des problèmes, par exemple des systèmes réactionnels compliqués, des conditions réactionnelles sévères et des matières de départ coûteuses, et peuvent être améliorés en tant que procédés de production industrielle. On a également récemment proposé des procédés comprenant des réactions pour la production de divers L- amino-acides à partir des DL- ou L-amino-amides correspor.- dants, par emploi d'enzymes produites par des micro- organismes, par exemple un procédé utilisant une enzyme L-amidase produite par des micro-organismes appartenant aux genres Bacillus, Bacteridium, Micrococcus et Brevibacterium (connus par la Gazette Officielle des Brevets Japonais n 500319/81) et un procédé utilisant une L-amidase produite par diverses levures et bactéries (demandes de brevets japonais mis à l'inspection publique n 13000/82, 159789/84 et 36446/85). Cependant tous ces procédés posent un problème de faible activité de la L-amidase et sont des exemples expé- rimentaux dans lesquels les réactions de production d'un L- amino-acide sont effectuées par emploi d'une quantité importante de cellules ou ne sont rien de plus que la découverte que des souches bien connues appartenant à divers genres hydrolysent divers DL- ou L-aminoamides pour former les L-amino-acides correspondants. Par suite de l'emploi de ces micro-organismes, ils ne sont pas suscepti- bles de devenir des procédés avantageux de production économique en ce qui concerne les procédés industriels de production de L-amino-acides à partir de DL-ou de L-amino- amides par action d'enzymes produites par des micro- organismes. Dans ces conditions, pour obtenir un micro- organisme capable de produire une enzyme ayant une forte activité de Lamidase permettant la production efficace de L-amino-acides, en particulier à partir des DL-amino-amides correspondants que l'on peut préparer facilement et à bas prix par synthèse chimique, la demanderesse a effectué une présélection de micro-organismes à partir de sols, de boues et similaires en divers emplacements. La demanderesse a ainsi découvert qu'une enzyme, produite par les micro-organismes Enterobacter cloacae N-7901, Pseudomonas sp. N-7131 et Pseudomonas sp. N-2211, a une très forte activité de L-amidase et est très efficace pour atteindre le but de l'invention, et l'invention en découle. Le fondement de l'invention réside en un procédé de production d'un Lamino-acide qui comprend la production d'un L-amino-acide à partir du DLet/ou du L-amino-amide correspondant représenté par la formule générale: R-CH-CONH2 I NH2 dans laquelle R est un groupe alcoyle substitué ou non substitué ayant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe phényle substitué ou non substitué ou un groupe aralcoyle substitué ou non substitué, par action d'une enzyme ayant une activité hydrolytique vis-à-vis des L-amino-amides qui est produite par un micro-organisme, Enterobacter cloacae N-7901 (FERM BP n 873), Pseudomonas sp. N-7131 (FERM BP n 874) ou Pseudomonas sp. N-2211 (FERM BP n 875). L'inrvention va maintenant être décrite de facon détaillée. Les micro-organismes utilisés dans l'invention sont ceux nouvellement isolés et dénommés par la demanderesse comme décrit ci-dessus qui ont été déposés au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Bikoken), Ministry of International Trade and Industry respectivement sous les désignations FERM BP n 873 (Enterobacter cloacae N-7901), FERM BP n 874 (Pseudomonas sp. N-7131) et FERM BP n 875 (Pseudomonas sp. N-2211) selon le Traité de Budapest. Les propriétés mycologiques de ces micro-organismes sont les suivantes: souche N-7901 (1) Propriétés morphologiques Bacille 0,8, 1,2 x 1,0 1,5 pm Flagelle mono ou multitriche Mobilité + Coloration de Gram négative (2) Propriétés physiologiques Réduction des nitrates + Dénitrification Test au rouge de méthyle - Test de Vages-Proskauer + Production d'indole Production de sulfure d'hydrogène - Utilisation des citrates + Production de pigment - Uréase Oxydase Catalase + Gammesde culture pH 4 - 10 Température optimale 35 - 37 C Ccmportement vis-à-vis de l'oxygène anaerabic facultatif Test OF F Production d'acide et Production Production de gaz à partir des sucres d'acide de gaz Adonitol - - Arabinose + + Xylose + + Glucose + + - Mannose + + Fructose + + Galactose + + Maltose Saccharose Lactose Raffinose Rhamnose Glycérol Sorbitol Mannitol IDositol Dulcitol (3) Autres propriétés Décomposition de l'amidon Décomposition de la gélatine Décomposition de l'urée Utilisation du malonate Décarboxylation de la lysine Décarboxylation de l'ornithine Désamination de la phénylalanine Arginine-dihydrolase i -galactosidase Résistance au cyanure de potassium Souche N-7131 (1) Propriétés morphologiques Bacille Flagelle Mobilité Endospore Coloration de Gram (2) Propriétés physiologiques Dénitrification Production d'indole Production de sulfure d'hydrogène Utilisation des citrates polaire mono- ou multitriche + néant négative + + + + + + + + + + + + + + + faible + + + + + 2 5 3 0 + Production de pigment pigment soluble dans l'eau pigment fluorescent Uréase Oxydase Catalase Culture à 40 C Test O-F Production d'acide et de gaz à partir des sucres Xylose Glucose Mannose - Galactose + + + O Production d'acide + + + + Production de gaz Lactose Mannitol Utilisation Glucose Fructose L- Arabinose Saccharose Malonate Ethanol Tréhalose Méso-inositol -alanine DL- arginine (3) Autres propriétés Décomposition de l'amidon Décomposition de la gélatine Décomposition de l'urée Accumulation de poly-6- hydroxybutyrate Anginine-dihydrolase Aminopeptidase + + + + + + + + + Culture en présence de 6,5 % de NaCl Souche N-2211 (1) Propriétés morphologiques Bacille Flagelle polaire monotriche Mobilité + Endospore néan' Coloration de Gram néga (2) Propriétés physiologiques Dénitrification faib. Production d'indole Production de sulfure d'hydrogène Utilisation de citrates + Production de pigment pigment soluble dans l'eau 1 pigment fluorescent Uréase + Oxydase + Catalase + Culture à 40'C - Test 0-F O Production d'acide et Production de gaz à partir des d'acide des sucres Xylose + Glucose + Mannose + Galactose + Lactose Mannitol faible Utilisation Glucose + Fructose + t tive le 6ger Production de gaz L-arabinose + Saccharose Malonate Ethanol Tréhalose Méso-inositol faible alanine faible DL-arginine (3) Autres propriétés Décomposition de l'amidon Décomposition de la gélatine Décomposition de l'urée + Accumulation de poly-A- hydroxybutyrate faible Arginine-dihydrolase Amiropeptidase + Culture en présence de 6,5% de NaCl - Les propriétés mycologiques décrites ci-dessus ont permis, par référence au Bergey's Manual of Determina- tive Bacteriology, 8ème édition, d'identifier la souche N-7901 comme Enterobacter cloacae et les souches N-7131 et N-2211 comme des bactéries appartenant à Pseudomonas. La souche N-7131 accumule du poly- b-hydroxybutyrate dans les cellules, ne pousse pas en bouillon à 40 C, ne produit pas d'arginine-dihydrolase et provoque une dénitrification. Bien que cette souche ait des propriétés atypiques en ce qui concerne l'utilisation des sucres et similaires; elle semble appartenir à Pseudomonas solanacearum ou être une souche qui lui est très apparentée. Il est évident pour le spécialiste de l'art que des mutants des souches mentionnées ci-dessus peuvent également être utilisés. Ces mutants peuvent facilement être obtenus par traitement avec un mutagène tel que la moutarde à l'azote et similaires. Pour cultiver les micro-organismes mentionnés ci-dessus afin qu'ils produisent l'enzyme de l'invention, il suffit de cultiver ces microorganismes en aérobiose en utilisant un milieu classique contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels minéraux et une substance nutritive organique. Comme sources de carbone, on peut utiliser de façon appropriée des sucres tels que le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose et similaires, des acides organi- ques tels que l'acide acétique, l'acide citrique et similai- res, etc. La quantité utilisée est généralement de 0,1 à % (en poids et il en est de même ci-après) par rapport au poids du milieu. Comme sources d'azote, on peut utiliser des sources d'azote naturelles ordinaires telles que la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, l'infusion de maïs, les hydrolysats de protéines, les amino-acides ou similaires et des sels d'ammonium de divers acides organiques et minéraux, etc. Comme sels minéraux, on peut au besoin utiliser de façon aporopriée KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, NaCl, CaC12, MgSO4.7H20 et des ions de métaux lourds tels que Fe, Mn, Zn, Co et similaires. Dans ce cas, l'addition d'une petite quantité d'un amide aliphatique ayant 2 à 5 atomes de carbone (par exemple l'acétamide, le propionamide, le butyramide ou le succinamide) est efficace pour induire une forte activité enzymatique et la quantité ajoutée est généralement de préférence de 0,01 % ou plus et mieux d'environ 0,1 à environ 0,5 % par rapport au poids du milieu. La culture est effectuée en aérobiose à un pH de 5 à 10, à une température de 20 à 40 C pendant 1 à 5 jours. L'invention utilise l'action d'une enzyme produite par un micro-organisme et l'action enzymatique peut être obtenue par incubation d'un mélange de DL- et/ou de L-amino-amide et d'un bouillon de culture quelconque d'un micro-organisme cbtenu par culture, comme décrit ci-dessus, de cellules viables séparées, de fractions dérivées de micro-organismes (par exemple des cellules traitées par les ultrasons et un extrait cellulaire) et de cellules ou de leurs extraits immobilisés obtenus par immobilisation des cellules ou d'une fraction dérivée des micro-organismes sur du polyacrylamide, du caragéénane ou similaires, selon un procédé classique. Toutes ces formes d'utilisation conviennent dans l'invention. L'hydrolyse (l'incubation avec ledit amide) est généralement effectuée dans les conditions suivantes: La concentration du DL- et/ou du L-aminoamide de formule générale ci-dessus est de 0,5 à 50 % (la solution servant de substrat à la réaction peut être une suspension); la quantité du micro-organisme ou similaires est de 0,01 à 10% (en cellules sèches) par rapport au poids de la solution réactionnelle; la température de réaction est de 20 à 60 C; le pH est de 6 à 11; et la durée de réaction est de 5 minu- tes à 100 heures. Le L-amino-acide ainsi produit et accumulé dans la solution réactionnelle peut être séparé et purifié par une combinaison de procédés bien connus tels qu'un échange d'ions et similaires. Le DL- et/ou le L-amino-amide utilisés dans l'invention sont un composé représenté par la formule générale ci-dessus dans laquelle R est un groupe alcoyle substitué ou non substitué ayant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe phényle substitué ou non substitué ou un groupe aralcoyle substitué ou non substitué. Les substituants comprennent un groupe mercapto, un groupe hydroxyle, un groupe amino, un groupe carboxyle, un groupe phényle, un groupe indolyle, un groupe pyridyle, un groupe imidazolyle, etc. Le L-amino-acide produit selon l'invention comprend par exemple la L-phénylalanine, le L-tryptophane, la L-leucine, la L- méthionine, la L-sérine, etc. L'invention est expliquée concrètement par les exemples ci-dessous qui sont purement illustratifs et nullement limitatifs. Dans chaque exemple, l'identification et la détermination quantitative du L-amino-acide sont effectuées par chromatographie en couche mince puis examen des positions après coloration à la ninhydrine, et chroma- tographie liquide haute performance. Exemple 1 On effectue une culture agitée de la souche N-7901 à 300C pendant 48 heures en utilisant un milieu ayant la composition suivante: Saccharose 1% Extrait de viande 0.5% MgSO4.7H20 0,01% FeSO4.7H20 0j001% Sels minéraux MnSO4.4H20 0y001% CaC12.2H20 0,001% ZnSO4-7H20 0,0001% Propionamide 01.5% pH 5 On centrifuge 100 ml du bouillon de culture et on met les cellules viables ainsi obtenues en suspension dans 50 ml de tampon Tris-HCl (pH 9). Ensuite, à des portions de 1 ml de la suspension obtenue, on ajoute 4 ml d'une solution aqueuse à 0,5 % (préparée par emploi de tampon Tris-HCl (pH 9)) de chacun des divers amides indiqués dans le tableau 1 et on incube chacune des solutions mélan- gées obtenues à 30 C pendant 10-15 minutes. Après élimina- tion des cellules fongiques, on mesure la quantité de L-amino-acides produite et la quantité d'amino-acides totaux produite pour obtenir les résultats qui figurent dans le tableau 1. Tableau 1 Amino-amide Amino-acide Durée Rendement L-amino- de départ produit réactio l acieamino- réactior la forme acd acide (mn) DL intro- produit poduite duite' (%) () DL-.leucinamide L-l1eucine 10 50 100 DL-mkthionina- L-Réthionine 15 13 100 mide DL-.sérinamide L-serine 15 3 100 DL- phényl- L-phé nyl- 15 50 100 alani n a mide alanine DL-tryptophan- L-tryptophane 15 34 100 amide DL-phényl- L-phényl- 15 48 100 glycinamide glycine I DL tryptophan__________________________________ _________ry____________opha_______________ 15_________________ 34 1 00_______________________ Exemple 2 On effectue la culture agitée de la souche N-2211 à C pendant 48 heures en utilisant un milieu ayant la composition suivante: Glycérol 1% Extrait de levure 0,001% 0,001% 01001% 0,0001% Ensuite, cn reprend le mode opératoire de l'exemple 1, si ce n'est que la durée de réaction est de 1 à 3 heures, pour obtenir les résultats qui figurent dans le tableau 2. Tableau 2 Amino-amide Amino.acide Durée Rendement L-amino- de départ produit de la (relatif à acide/ réaction la forme DL aminoacide introduite) produit (h) M M DL-leucinamide L-leucine 1 50 100 DLméthioni.- L-nèthionine 3 19 100 numide DL-S,érinamide L-sérine 3 6 100 DL-2 hényl- L-.phenyla- 3 24 100 alaninamide lanine DL-t-ryptopha-, Ltryptophane 3 50 100 namide DL-p hnyL- L-phényl- 3 20 100 glydinamide glycine Exemple 3 On effectue la culture agitée de la souche N-7131 à 30 C pendant 48 heures en utilisant un milieu ayant la composition suivante: Glycérol 1% Extrait de viande 0/5% MgSO4 7H20 0>01% FeSO4.7H20 01001% Sels minéraux MnSO4 4H20 0,001% CaC12 2H20 0,001% ZnSO4. 7H20 070001% Isobutylamide 05% pH 7 On reprend ensuite le mode opératoire de l'exemple 2 pour obtenir les résultats qui Tableau 3 figurent dans le tableau 3. Amino-acide Durée Rendement L-amino - Amrino-amide de la (relatif à acid/ de départ produit réac- la forme amino-acide tion DL intro- -produit (h) duite)(%) (%) DL-leucinamid Lleucine 1 50 100 ! DL-mnethionina- L-methionine 3 31 100 mide DL-s:. erinamideL-serine 3 0;3 100 DL-phenyla- L-phenyIlani 3 50 100 laninamide ne. DL-tryptopha- L-t-ryptophare 3 48 100 amide ! DL-p henyl- L-phenyL - 3 48 100 glycinamide glycine Exemple 4 Lorsqu'on ajoute 1 mi d'une suspension de la souche N-1901 obtenue de la même façon que dans l'exemple 1 à 4 ml d'une solution à 1,25 % de Lphénylalaninamide et que l'on fait réagir le mélange obtenu à 40 C pendant 15 minutes, le rendement de la phénylalanine est de 75 % et la phénylalanine produite est uniquement sous la forme L. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'un L-amino-acide qui comprend la production d'un L-amino-acide à partir du DL- et/ou L-amino-amide correspondant représenté par la formule générale: R-CH-CONH2 NH2 dans laquelle R est un groupe alcoyle substitué ou non substitué ayant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe phényle substitué ou non substitué ou un groupe aralcoyle substitué ou non substitué, par action d'une enzyme ayant une activité hydrolytique vis-à-vis des L-amino-amides qui est produite par un micro-organisme choisi dans le groupe constitué par Enterobacter cloacae N-7901 (FERM BP n 873), Pseudomonas spa N-7131 (FERM BP n 874), Pseudomonas sp. N-2211 (FERM BP nô 875) et leurs souches mutantes. 2. Procédé pour la production d'un L-amino-acide selon la revendication 1 dans lequel ledit micro-organisme est cultivé en présence d'un amide aliphatique ayant 2 à atomes de carbone. 3. Procédé pour la production d'un L-amino-acide selon la revendication 1 dans lequel ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par le bouillon de culture, les cellules viables séparées, les cellules traitées par les ultrasons, les extraits cellulaires, les cellules immobilisées et les extraits cellulaires immobilisés. 4. Procédé pour la production d'un L-amino-acide selon la revendication 1 dans lequel les cellules dudit micro-organisme sont incubées avec l'amide pour produire le L-amino-acide dans un milieu dont le pH est de 6 à 11 à une température de 20 C à 60 C pendant 5 minutes à heures.