Brevet FR2585838A1 — publié le 19870206

PROCEDE POUR DETERMINER LA PRESENCE DE IgG SPECIFIQUE DANS DES SERUMS HUMAINS L'invention que l'on décrit traite de la détermination de la concentration d'immunoglobuline G spécifique dans des sérums humains, par un procédé de radioimmunoessai ou d'enzymeimmunoessai en phase solide utilisant des anticorps monoclonaux (AcM). L'obtention de lignées cellulaires capables de produire d'une façon permanente un anticorps spécifique contre un immunogène prédéfini a été décrite pour la première fois en 1975 (coller & Milstein, 1975). Ce procédé se base sur la fusion de cellules myélomateuses et de cellules de rate provenant d'animaux immunisés convenablement. Les hybrides résultants peuvent être sélectionnés de façon que ce soit les seules cellules qui se multiplient activement. Parmi ces hybrides en croissance, on peut sélectionner des clones qui secrètent l'anticorps désiré. De tels anticorps sont par conséquent d'origine monoclonale et peuvent être conservés indéfiniment. Cette méthodologie a été utilisée pour préparer des anticorps contre une grande variété d'antigènes, tels que produits naturels â activité biologique, neuropeptides, hormones peptidiques, enzymes, polysaccharides, glycopro téines, lipopolysaccharides , antigènes dthistocompatibilité, antigènes de différentiation et autres antigènes cellulaires, virus, etc. Ils sont aussi très utiles dans le domaine du diagnostic. La présente invention est caractérisée principalement par le fait que l'on utilise des anticorps monoclonaux dans des techniques immunologiques comme l'enzyme immunoanalyse (E.I.A.) ou la radioimmunoanalyse (RIA). Ainsi, on atteint deux objectifs : fournir un procédé in vitro simple et digne de confiance qui évite des procédés in vivo, et d'autre part améliorer substantiellement les procédés in vitro traditionnels. Dans la présente invention, on détaille le procédé d'estimation de la IgG spécifique. Pour ceci, des antigènes obtenus par des techniques originales sont adsorbés ou liés d'une façon covalente à des plaques de microtitrage ou à une autre surface plastique, à de la nitrocellulose, etc. Ensuite, on ajoute l'échantillon de sérum et après une période d'incubation déterminée, la IgG non spécifique est éliminée par des lavages successifs. La IgG qui reste dans les puits (liée spécifiquement aux allergènes) est détectée en ajoutant l'anticorps monoclonal marqué au préalable avec un isotope radioactif ou une enzyme. Après une période d'incubation, l'excès d'anti-IgG est éliminé et on mesure la radioactivité ou l'activité enzymatique associée aux puits. On emploie par conséquent des anticorps monoclonaux, fabriqués par la Demanderesse, qui reconnaissent spécifiquement la IgG sérique et ne reconnaissent pas d'autres immunoglobulines ou substances présentes dans le sérum ou le plasma sanguin. L'originalité de l'invention réside dans le fait que les anticorps monoclonaux utilisés peuvent être considérés comme uniques, dans ce sens qu'ils n'existaient pas au préalable dans la nature, étant donné qu'ils sont produits par une cellule hybride artificiellement préparée en laboratoire à partir de deux cellules naturelles.Les produits synthétisés par les hybrides, anticorps monoclonaux qui reconnaissent l'IgG humaine, ne survivraient pas dans un milieu naturel et par conséquent, ne peuvent pas être assimilés aux anticorps polyclonaux produits chez les animaux par des techniques standard, bien qu'ils conservent quelquesunes de leurs propriétés. Dans l'évaluation de IgG spécifique in vitro, on utilise généralement des anticorps polyclonaux et la limitation principale de ces procédés est leur faible sensibilité. Un autre problème dans l'utilisation des anticorps poly clonaux est que la fraction spécifique qui reconnaît l'antigène ne représente qu'1 à 10 % de la fraction y-globulinique totale. Cette limitation dans la quantité d'immunoglobuline spécifique n'existe pas dans les anticorps monoclonaux, étant donné que la presque totalité de la protéine est spécifique contre l'antigène. Par conséquent, si on utilise des anticorps polyclonaux, il y a beaucoup dX possibilités de réactions croisées avec des substances non spécifiques. D'autres avantages des anticorps monoclonaux par rapport aux polyclonaux sont la facilité de leur purification et le fait de pouvoir disposer de quantites illimitées de réactifs standardisés. On peut affirmer qu'une fois qu une lignée cellulaire hybride (hybridome) a été établie, on peut préparer des quantités illimitées de l'anticorps monoclonal. Ainsi, on assure la disponibilité de réactifs ayant des propriétés permanentes (homogénéité, spécificité et affinité) et on garantit l'obtention de résultats reproductibles, et par conséquent comparables entre différents laboratoires. Quand on la compare aux procédés in vitro connus, la nouvelle invention possède l'avantage supplémentaire qu'il n'est pas nécessaire d'isoler et de purifier la IgG sérique (Galfre & Milstein), au moins dans les quantités ou proportions requises dans ceux-là. On a besoin de beaucoup Soins de temps pour obtenir des résultats fiables, et il n'est pas nécessaire de centrifuger les échantillons pendant les différentes phases de l'analyse. Pour doser la IgG spécifique dans le sérum, il est nécessaire d'utiliser des extraits bien caractérisés biologiquement et/ou immunochimiquement (Carreira J. et sol., Clin Allergy, 14, 503, 1984; Corbi et Carreira, Int. Archs. Allergy appln. Inmun. 76, 156, 1985). Les extraits utilisés dans cette invention, bien que commercialement accessibles, sont soumis dans tous les cas à un processus préalable de purification pour augmenter l'efficacité de la liaison, la reproductibilité du procédé et la corrélation avec les essais in vivo. Pour ces extraits, on mesure l'activité biologique in vivo, la puissance allergénique in vitro, et l'on identifie les différents composants de l'extrait et évalue leur activité relative (Standardization of allergen extracts, Alergia e Inmunologia Abello,S.A.). Bien que le mécanisme par lequel se produit une liaison non covalente entre une protéine en solution aqueuse et le plastique auquel elle est exposée soit peu connu (Parsons, Méthods of Enzymology, 73, 224, 1981) la liaison est extrêmement forte, et ce qui est le plus important, l'activité biologique de l'échantillon est maintenue. La plupart des auteurs sont d'accord sur le fait que la liaison des protéines aux surfaces plastiques se produit par interactions hydrophobes non spécifiques. Il semble que le seul réactif nécessaire pour la préparation de plastiques recouverts de protéine soit le plastique lui-même. Plusieurs auteurs (Catt et Coll, Science 158, 1570, 1967; Crosignani et Col., J.Clin Endocrinal Metabl. 30, 153, 1970) ont examiné l'effet de divers paramètres sur la liaison d'anticorps à un plastique, et sont arrivés à la conclusion que ni la température, ni le pH, ni la force ionique, ntont une influence. Selon l'expérience de la Demanderesse, le polystyrène, le polyéthylène, le polypropylène ou un polyvinylique peuvent être utilisés presque indifféremment. On peut utiliser des tubes de plastique, des plaques de titrage ou des récipients individuels de différentes formes et formats. De même, les forces qui maintiennent les protéines liées à la nitrocellulose sont peu connues, mais il est très probable que les interactions hydrophobes jouent un rôle très important. Cependant, malgré ce qui vient d'être dit, la protéine adsorbée peut être libérée du plastique pendant les procédés d'incubation et de lavage. Pour éviter ceci, les atlgènes peuvent être liés d'une façon covalente à la phase solide plastique, moyennant une modification chimique de celle-ci. La séparation entre ce qui est lié au plastique et ce qui reste libre en solution peut être réalisée par simple aspiration ou décantation. La reproductibilité du procédé augmente si on ajoute au liquide de lavage une protéine non en rapport, par exemple l'albumine sérique, et un détergent quelconque (Triton, Tween, etc). Le marquage des anticorps monoclonaux avec des isotopes radioactifs ou avec des enzymes est réalisé par des procédés conventionnels ; on choisit par exemple 125I (Fraker and Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun 80, 849), ou la S-galactosidase (O'Sullivan et Marks. Methods Enzymol, 74, 147, 1978). Les procédés de dosage de la radioactivité ou de l'enzyme liée sont aussi réalisés par des procédés conventionnels ; on utilise dans le premier cas des compteurs de radiations y ; dans le deuxième, il faut procéder à une incubation avec différents substrats enzymatiques en fonction du moyen de détection dont on dispose. L'invention est illustrée au moyen des exemples suivants, qui doivent être considérés comme explicatifs et non limitatifs de cette dernière. Dans ces exemples, il est fait référence à la figure unique du dessin annexé, qui est un graphique de détermination de IgG spécifique au moyen d'anticorps monoclonaux anti-IgG dans des récipients de polystyrène, et sur lequel l'échelle d'ordonnées de gauche représente la liaison spécifique d'un AcM marqué enzymatiquement à une IgG sérique anti-Lolium perenne, l'échelle d'ordonnées de droite représente la liaison spécifique du même AcM quand il est marqué radioactivement avec 125î, la ligne discontinue représente la liaison non spécifique, et l'échelle d'abcisses représente différentes dilutions du sérum en échelle logarithmique. Exemple 1 Détermination de la IgG spécifique contre des antigènes présents dans des pollens de plantes (L. Perenne). A) Préparation des anticorps monoclonaux On injecte à des souris par voie intrapéritonéale 100 ijg de IgG purifiée en adjuvant complet de Freund, aux jours -45 et -30. Le jour -3, on leur injecte la même quantité de IgG et 200 pl de tampon phosphate salin (PBS) par voie intraveineuse. Au jour zéro, des cellules de myelome de souris sont fusionnées avec des lymphocytes de rate des animaux immunisés, en utilisant du polyéthylèneglycol à 50t. On partage les cellules en fractions aliquotes sur six plaques à puits, on les cultive dans un milieu sélectif HAT. B) Sélection Après deux semaines, on recueille les surnageants des cultures et on analyse la possible spécificité contre IgG. Pour éviter la sélection d'hybridomes qui secréteraient des anticorps avec spécificité contre les chaînes légères ou contre des déterminants idiotypiques, on utilise une autre IgG de myélome différente. Dans les clones positifs, on analyse la possible réactivité croisée avec IgE, IgM ou IgA. Les hybridomes qui reconnaissent IgG sont clonés et sousclonés sur agar-agar semi-solide. Ceux qui reconnaissent différents épitopes dans la IgG sont cultivés à grande échelle pour purification et marquage. C) Marquage Une fois les anticorps monoclonaux purifiés par 125 des procédés standard, ils sont marqués avec I conformé- ment au procédé décrit par Fraker et Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res.Commun. 80, 849. Dans d'autres cas, on les marque enzymatiquement avec la S-galactosidase par le procédé O'Sullivan et Marks, 1978, Methods in Enzymol., 74, 147. D) Détermination de IgG spécifique Les analyses sont effectuées indifféremment sur des plaques de microtitrage de différents formats et matières plastiques, dans des tubes de plastique, ou sur des disques de nitrocellulose. 1) Les plaques de polystyrène sont nitrées et ensuite réduites afin d'obtenir des plaques stables de polyaminostyrène. On remplit les puits d'une plaque modifiée avec 200 pl de l'antigène à 0,01 % (p/v) en présence de EDC à 0,1 %(p/v) dans un tampon de MES 0,25 M, pH 6,0. 2) On élimine la protéine non liée en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant ceux-ci avec une solution saline qui contient de l'albumine sérique bovine à 1 % (PBS-BSA). 3) Pour saturer les sites de liaison encore libres, les puits sont incubés avec PBS-BSA pendant 1 h à température ambiante. 4) Ensuite, on lave les puits trois fois avec PBS en présence de Tween à 0,1 % (PBS-Tween), en décantant soigneusement chaque fois le liquide des puits. 5) On ajoute dans chaque puits 50-200 p1 de sérum humain en dilutions successives. 6) Dans d'autres puits, on ajoute des volumes similaires de sérum étalon dont on a auparavant déterminé la teneur en IgG spécifique. 7) Le contenu de ces récipients est incubé pendant 1-2 h à température ambiante. 8) On lave les puits trois fois avec PBS-Tween et ensuite, on incube avec 50-200 ul des anticorps monoclonaux marqués de la façon indiquée en C. 9) Le contenu des puits est incubé comme on l'indique dans le point 7. 10) Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 est marqué avec 125I,dans ce point, on partage les puits pour mesurer la radioactivité avec un compteur de radiations gamma. Si l'anticorps monoclonal est marqué enzymatiquement, dans ce point, on ajoute le substrat enzymatique ONPG (3mM ortho-nitrophényl-ss-D-galactopyranoside) dans du PBS contenant 10 mM de MgCl2 et 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol. Ensuite, on incube le contenu des puits à 370C pendant 2 h. A ce moment-là, on arrête la réaction en ajoutant 100 pl de 1 Na2C03 et on mesure l'absorbance à 410 nm. 11) Le nombre de coups par minute (cpm) ou l'absorbance, pour les puits étalons, est représentée sur un diagramme sur lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 nm,et les abscisses, le logarithme de l'inverse de la dilution employée. A l'aide de ce diagramme, on classe chaque échantillon en comparant son cpm ou Abs 410 avec les valeurs obtenues pour les sérums étalons. Exemple 2 Détermination de la IgG spécifigue contre les antigènes présents dans des pollens de plantes XL.Perennel. A) Préparation des anticorps monoclonaux On injecte intrapéritonalement 100 pg de IgG purifiée à des souris en adjuvant complet de Freund les jours -45 et -30. Le jour -3, on leur injecte la meme quantité de IgG (s,K) en 200 ul de tampon phosphate salin (PBS) par voie intraveineuse. Le jour zéro, des cellules de myélome de souris sont fusionnées avec les lymphocytes de rate des animaux immunisés en utilisant du polyéthylèneglycol à 50 %. Les cellules sont partagées en fractions aliquotes sur six plaques à puits et sont cultivées dans un milieu sélectif HAT. B) Sélection Après deux semaines, on recueille les surnageants des cultures et on analyse la possible spécificité contre IgG. Pour éviter la sélection d'hybridomes qui secréteraient des anticorps avec spécificité contre les chaines légères ou contre des déterminants idiotypiques, on utilise une autre IgG de myélone différent (e,N). Dans les clones positifs, on analyse la possible réactivité croisée avec IgE, IgM ou IgA. Les hybridomes qui reconnaissent IgG sont clonés et sousclonés sur agar-agar semi-solide. Ceux qui reconnaissent différents épitopes dans la IgG sont cultivés à grande échelle pour purification et marquage. C) Marquage Après avoir purifié les anticorps monoclonaux par 125 des méthodes standard, on les marque avec I conformément à la méthode décrite par Fraker et Speck, 1978, Biochem Biophys.Res. Commun. 80, 849. Dans d'autres cas, on les marque enzymatiquement avec la S-galactosidase par la méthode de O'Sullivan et Marks, 1978, Methods in Enzymol, 74, 147. D) Détermination de IgG spécifique Les analyse sont effectuées indifféremment sur des plaques de microtitrage de différents formats et matériel plastique, dans des tubes de plastique, ou sur des disques de nitrocellulose. 1) A chacun des puits, tubes ou disques, on ajoute un volume (50 à 200 pl) d'une solution d'extraits protéiques préparés selon des méthodes décrites au préalable et on laisse incuber toute la nuit à 40C. 2) On élimine la protéine non adsorbée en aspirant ou en décantant le contenu des puits et en lavant ceux-ci avec une solution saline qui contient de l'albumine sérique bovine à 1 t (PBS-BSA). 3) Pour saturer les sites de liaison encore libres, les puits sont incubés avec PBS/BSA pendant 1 -h à température ambiante. 4) Ensuite, on lave les puits trois fois avec PBS en présence de Tween à 0,1 % (PBS-Tween), en décantant soigneusement le liquide des puits à chaque passage. 5) On ajoute dans chaque puits 50-200 pl du sérum humain en dilutions successives. 6) Dans d'autres puits, on ajoute des volumes similaires de sérums étalons dont on a déterminé au préalable la teneur en IgG spécifique. 7) Le contenu de ces puits est incubé pendant 1-2 h à température ambiante. 8) On lave les puits trois fois avec PBS-Tween et ensuite, on incube avec 50-200 ul d'un des anticorps monoclonaux marqués comme il est indiqué en C. 9) Le contenu des puits est incubé comme on l'indique au point 7. 10) Si l'anticorps monoclonal ajouté au point 8 est marqué avec 125I, dans ce point, on partage les puits pour mesurer la radioactivité avec un compteur de radiations gamma. Si l'anticorps monoclonal est marqué enzymatiquement, dans ce point, on ajoute le substrat enzymatique ONPG (3 mM ortho-nitrophényl-B-D-galactopyranoside) dans du PBS contenant 10 mM de MgCl2 et 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol. Après, on incube le contenu des puits à 370C pendant 2 h. A ce moment, on arrête la réaction en ajoutant 100 pl de 1 M Nazi03 et on mesure l'absorbance à 410 nm. 11) Le nombre de coups par minute (cpm) ou l'absorbance obtenu pour les puits étalons est représenté sur un diagramme (voir graphique 1) sur lequel les ordonnées représentent cpm ou Abs 410 nm, et les abcisses, le logarithme de l'inverse de la dilution employee. A l'aide de ce diagramme, on classe chaque échantillon en comparant son cpm ou Abs 410 aux valeurs obtenues avec les sérums étalons. REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : fixation d'extraits protéiques complexes, purifiés au préalable, à un support solide, suivie de l'incubation de l'échantillon de sérum avec lesdits extraits protéiques fixés : lavage des protéines non spécifiques ; incubation avec l'anticorps monoclonal anti-IgG marqué avec 125I ou avec une enzyme ; lavage postérieur du support solide avec les produits fixés, et détermination de la radioactivité ou de l'activité enzymatique, incorporée ail support solide. 2. Procédé pour déterminer la presence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal a été marqué avec une enzyme (par exemple : B-galactosidase). 3. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on fixe un sucre à un plastique comme support solide. 4. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon n'importe laquelle des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que l'on lie au support solide une glycoprotéine. 5. Procédé pour déterminer la présence de IgGspécifique dans des sérums humains, selon les revendications 1, 2, 3 et 4, caractérisé en ce que l'on lie, à de la nitrocellulose comme support solide, une glycoprotéine, un sucre ou une protéine. 6. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon n'importe laquelle des revendications précédentes, caractérisé en ce que les valeurs obtenues sont comparées semi-quantitativement avec un sérum étalon. 7. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon n'importe laquelle des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison de l'extrait protéique au support solide est covalente. 8. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon n'importe laquelle des revendications 1-6, caractérisé en ce que la liaison de l'extrait protéique au support solide n'est pas covalente. 9. Procédé pour déterminer la présence de IgG spécifique dans des sérums humains, selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que le support solide est le récipient même dans lequel on effectue l'essai.