Brevet FR2591894A1 — publié le 19870626

Immunotoxines à longue durée d'action in vivo comportant la chaîne A de ricine modifiée sur ses motifs polysaccharidiques. La présente invention concerne de nouvelles molécules médicamenteuses comportant au moins une molécule d'anticorps liée de façon covalente à au moins une molécule de chaîne A de ricine dont les motifs polysaccharidiques ont été modifiés. Dans le brevet US 4 340535 et dans les brevets français No.81 07596 et No. 81 21 & 6 (publiés sous les n" 2 504 010 et 2 516794 ) on a décrit la préparation de produits anticancéreux dits "conjugués" obtenus par couplage, par liaison covalente, de la chaîne A de ricine avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre des antigenes portés par les cellules à détruire. Les produits de ce type ont été désignés et sont désignés dans la présente demande sous le nom générique d'immunotoxines. On sait en outre que l'activité cytotoxique de ces immunotoxines peut être potentialisée par diverses substances adjuvantes telles que les sels d'ammonium, diverses amines ou certains ionophores carboxyliques tels que la monensine ou la nigéricine. A cet effet, on peut se référer aux brevets et demandes de brevets FR 81 21836, 82 02081, 82 04119 et 82 04047 (publiés respectivement sous les No. 2 516794, 2 521010, 2 522968, 2 536997) au nom de la demanderesse. Toutefois, les effets thérapeutiques des immuno toques, potentialisées ou non, ne peuvent se manifester pleinement que dans la mesure où l'immunotoxine peut, par sa partie anticorps, se localiser in vivo, sous forme active, sur la cible cellulaire à détruire (condition sine qua non à toute expression d'activité des immunotoxines). La capacité de l'immunotoxine à se localiser sur la cible dépend en tout premier lieu de l'aptitude de l'immunotoxine à demeurer dans la circulation sanguine et les fluides extra-cellulaires sous forme active pendant des temps suffisants pour qu'elle atteigne sa cible cellulaire et à des concentrations suffisamment fortes pour que le taux d'occupation des sites antigéniques correspondants soit éleve. De nombreuses études ont permis d'établir la cinétique d'élimination plasmatique des immunotoxines après injection intra-veineuse dans différents modèles animaux. Il est apparu qu'après l'injection le taux plasmatique d'immunotoxine biologiquement active décroît très rapidement et de façon très importante. Ainsi, typiquement, chez le lapin, dans un modale utilisant une immunotoxine construite en couplant à l'aide d'un bras à pont disulfure la chaîne A de ricine à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T65 des lymphocytes T humains (anticorps T101), il apparaît que 97% de l'immunotoxine présente dans le sang circulant au temps 0 de l'injection disparaissent en 30 minutes et 99,9% en 17 heures.Cette rapide disparition de l'immunotoxine est bien évidemment préjudiciable à l'expression de sa capacité cytotoxique complète, en empêchant que l'immunotoxine ne sature de façon durable une proportion élevée des antigènes cibles portés par les cellules à détruire. En outre, la comparaison des cinétiques d'élimination plasmatique des immunotoxines avec celles des anticorps non conjugués correspondants montre qu'à l'inverse les anticorps - comme cela est bien connu - se maintiennent dans le plasma à un haut niveau pendant des temps relativement longs. Or il existe toujours, même dans les préparations dtimmunotoxinesles plus purifiées, un certain taux résiduel d'anticorps non conjugués.Par le jeu des différences de vitesses d'élimination des immunotoxines et des anticorps, les anticorps non conjugués,initialement très minoritaires, deviennent progressivement majoritaires au bout de quelques heures et donc, progressivement, ces anticorps deviennent par compétition de puissants antagonistes pour la fixation des immunotoxines sur leurs cibles. I1 apparaît donc clairement l'intérêt d'accroître la persistance plasmatique des immunotoxines, sous forme active, afin d'augmenter à la fois la durée et le taux d'occupation des antigènes cibles et par conséquent d'améliorer les effets thérapeutiques des immunotoxines. Par ailleurs, des expériences de localisation in vivo de l'immunotoxine à chaîne A de ricine, radiomarquée puis in jectée chez des animaux sans cible spécifique ont montré que, dans les premières minutes après l'injection, le conjugué se localise préférentiellement dans le foie. I1 en est de même pour la chaîne A de ricine qui présente le même devenir lorsqu'elle est injectée sous forme non couplée. Cela suggère fortement que l'immunotoxine se fixe dans le foie par l'intermédiaire de la sous-unité cytotoxique qu'elle contient. I1 est connu que la chaîne A de ricine est une glycoprotéine dont les groupements polyosidiques comprennent notamment des résidus de mannose et de N-acétylglucosamine, certains résidus de mannose étant en positions terminales (Agri. Biol.Chem., 1978, 42, 501). I1 a été également établi l'existence au niveau du foie de récepteurs capables de reconnaître des glycoprotéines ayant de tels résidus de mannose terminaux. I1 a été aussi montré que les glycoprotéines reconnues par ces récepteurs - présents essentiellement sur les cellules de Kupffer - sont rapidement éliminées de la circulation sanguine par fixation sur ces cellules qui les métabolisent. Ceci est bien documenté notamment dans le cas de la beta-glucuronidase, ainsi que dans le cas de la ribonucléase B (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 188, 418 , Avances in Enzymology, Meister A. Ed., New York, 1974 ; Pediat. Res., 1977, 11, 816). De l'ensemble de ces données, il semble que la rapide élimination des immunotoxines à chaîne A de ricine peut s'expliquer par la reconnaissance des résidus osidiques de la chaîne A de ricine par les cellules hépatiques et en particulier les cellules de Kupffer. I1 est connu que par oxydation par les ions periodate des structures osidiques, y compris celles qui sont contenues dans les glycoprotéines, on provoque la rupture de la chaîne carbonée chaque fois que deux atomes de carbone adjacents portent des hydroxyles primaires ou secondaires. Si les deux hydroxyles contigus sont secondaires, comme cela est le cas dans les oses cycliques présents dans la chaîne A de ricine, l'oxydation conduit à deux fonctions aldéhyde portées par les carbones entre lesquels la rupture a eu lieu. D'autre part, on sait que les fonctions aldéhyde sont tres réactives vis-à-vis des groupements amines primaires par formation d'imines également connues sous le nom de bases de Schiff. Ainsi, les groupes aldéhyde formés lors de la réaction d'oxydation peuvent réagir avec des amines primaires portées par la chaîne peptidique de la glycoprotéine, et former des liaisons covalentes intra- et/ou intermoléculaires indésirables, conduisant à l'insta bilité du produit d'oxydation et fréquemment à la formation de polymères insolubles. On a maintenant trouvé, de façon absolument inattendue que lorsqu'on modifie les motifs glucidiques de la chaîne A de ricine par le procédé original décrit ci-apres, on obtient une nouvelle molécule de chaîne A ayant la double propriété de conserver ses activités biologiques et d'être éliminée très lentement de la circulation sanguine après injection chez les animaux supérieurs ou l'homme. Cette nouvelle chaîne A modifiée qui conserve la pro priété d'inactiver les ribosomes et qui a acquis, du fait de la modification, une longue durée d'action in vivo est désignée dans la présente demande par le symbole A-La. Ce procédé original consiste à modifier les motifs osidiques de la chaîne A de ricine par réaction avec des ions periodate en présence d'un excès d'un réactif auxiliaire comportant un groupement amine primaire et qui, par le reste de sa structure, n'est pas susceptible de réagir avec les ions periodate dans les conditions opératoires utilisées. De la sorte, les groupements aldéhyde engendrés par l'oxydation periodique sont bloqués au fur et à mesure de leur apparition par formation de base de Schiff avec le réactif amine exogène en excès, évitant ainsi les réactions indésirables avec d'autres groupes aminés de la chaîne A et permettant d'obtenir un produit stable. et bien soluble. On a également trouvé que, lorsque cette nouvelle molécule de chaîne A à longue durée d'action est couplée à des anticorps ou fragments d'anticorps, les conjugués obtenus conservent les propriétés biologiques connues des immunotoxines et présentent une cinétique d'élimination plasmatique lente. La présente invention a donc pour objet, à titre de produit nouveau, une chaîne A de ricine modifiée dans sa structure, dont les motifs glucidiques ont été modifiés par l'action des ions periodate en présence d'un excès de réactif auxiliaire présentant un groupe amine primaire et capable de bloquer les groupements aldéhyde engendrés par l'oxydation periodique, au fur et à mesure de leur apparition. La présente invention a aussi pour objet le procédé d'obtention de la chaine A de ricine modifiée telle que caractérisée ci-dessus. La présente invention a également pour objet des produits appartenant à la classe des immunotoxines, obtenus par couplage conalent entre, d'une part, un anticorps ou fragment d'anticorps utilisé sous forme naturelle ou correctement modifié et, d'autre part, une molécule de chaîne A dont les motifs glucidiques ont été modifiés par le procédé original ci-dessus. On précise ci-apràs la signification des différents produits utilisés dans la mise en oeuvre de l'invention Le terme "periodate" désigne l'ion I04 présent dans les solutions aqueuses des sels de l'acide periodique et notamment les sels dérivant des métaux alcalins. Ces sels sont également mentionnés dans la littérature sous le nom de métaperiodates. Le terme "réactif auxiliaire présentant un groupe amine primaire" désigne toute molécule organique porteuse d'un unique groupe amine primaire qui n'est pas susceptible de réagir avec les ions periodate dans les conditions opératoires utilisées. En particulier ce réactif peut être toute alkylamine, non réactive avec le periodate et soluble dans l'eau, à la concentration nécessaire, sous forme de base ou de sel, à pH compris entre 5 et 7 et à température comprise entre O et 150C. Ce réactif peut être aussi tout acide ou ou 3 aminé répondant aux conditions ci-dessus, qu'il soit optiquement actif ou racémique, et notamment l'un des acides aminés aliphatiques suivants : glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, arginine, acide aspartique,acide glutamique.Ce réactif peut être aussi tout peptide répondant aux conditions ci-dessus fixées. Le terme "anticorps" représente une protéine choisie parmi tout anticorps ou fragment d'anticorps, ou toute immunoglobuline ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule, dérivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels, y compris des structures osidiques qu'elles portent, sous réserve que la protéine ainsi choisie reste capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigene et notamment des cellules cibles. L'anticorps de départ peut être polyclonal ou monoclonal. La protéine de départ peut être d'origine naturelle ou biosynthétique provenant d'une cellule dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but. La préparation d'anticorps monoclonaux dirigés notamment contre des cellules cibles humaines définies a été largement mentionnée dans la littérature scientifique et beaucoup de ces anticorps sont maintenant disponibles dans le commerce. Le terme chaîne A de ricine" (ou simplement chaîne A) représente la sous-unité cytotoxique de nature glycoprotéique inactivant les ribosomes, obtenue à partir de la toxine ricine tel que cela est décrit dans le brevet US 4 340535. La même substance, produitepar voie biosynthétique par des cellules dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but, est également un composé convenable. Des fragments de chaîne A, à condition que de tels fragments retiennent tout ou partie de la propriété d'inactivation des ribosomes qui caractérise la chaîne A dont ils sont issus,peuvent également être utilisés comme produits de départ. On préfère toutefois la chaîne native. Le terme "chaîne A-La" représente la chaîne A de ricine modifiée selon l'invention, c'est-à-dire une molécule ayant la propriété d'inactiver les ribosomes comme la chaîne A mais ayant une durée d'action in vivo supérieure à celle de la chaîne A et qui résulte du traitement en milieu aqueux de la chaîne A par un agent oxydant, comme un periodate, en présence d'un excès d'amine primaire pour transformer les groupes aldéhyde formés en groupes imine (ou base de Schiff). On opère en général à une température comprise entre O et 15"C, dans une solution aqueuse de pH compris entre 5 et 7, et de préférence à l'abri de la lumière; dans ces conditions la réaction dure de 0,2 à 24 heures. Eventuellement, au moins un des groupes thiol des cystéines 171 et 257 de la chaîne A de la ricine est protégé pendant le traitement ci-dessus et déprotégé après celui-ci. La chaîne A de ricine native, dont au moins l'un des groupementsthiol est éventuellement protégé, est un composé de départ préféré pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. La protection des groupes thiol de la chaîne A de départ n'est nécessaire que lorsque lesdits groupes thiol sont ceux qui seront utilisés pour le couplage avec l'anticorps. Si pour le couplage on utilise d'autres groupes fonctionnels, la protection n'est pas indispensable. Cette protection est effectuée de préférence par réaction avec un agent susceptible de substituer les fonctions SH à l'aide d'un radical qui peut être ensuite éliminé par réduction ou échange thiol/disulfure, par exemple l'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzoique (DTNB) ou bien l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique. En l'absence d'un tel traitement les thipls libres de la chaîne A peuvent disparaître pendant la réaction d'oxydation et dans ce cas peuvent ne pas être totalement régénérés par l'action d'un agent réducteur, tel que le mercapto-2 ethanol. L'excès de l'agent bloquant est éliminé par dialyse ou par toute technique équivalente. La chaîne A dont les thiols sont bloques est alors soumise à la réaction d'oxydation par les ions periodate et à la formation simultanée de base de Schiff avec une amine primaire. La réaction d'oxydation periodique et la réaction de blocage par formation de base de Schiff peuvent être effectuées à un pH modérément acide, compris entre 5 et 7, de préférence entre 6 et 6,5. La chaîne A de ricine est mélangée à l'amine primaire avant l'addition du periodate. Le periodate est utilisé en excès; plus particulièrement, la concentration en periodate alcalin est toujours supérieure à la concentration des diols vicinaux susceptibles d'être oxydés : des concentrations de 10 à 50 mM en periodate de sodium pour des concentrations de 1 à 10 mg/ml de sous-unité cytotoxique sont convenables.L'amine primaire (telle que la Leucine, ou la L-alanine ou la L-arginine ou l'acide L-glutamique) est également utilisée à une concentration supérieure à la concentration des diols vicinaux susceptibles d'être oxydés : des concentrations de 50 à 500 mM en amine primaire pour des concentrations de 1 à 10 mg/ ml de sous-unité cytotoxique sont convenables. ta durée du traitement, réalisé à une température comprise entre O et 15 C et de préférence entre 1 et 50C et à l'obscurité, est comprise entre 0,2 et 24 heures. Lorsque la réaction est terminée, f'excès de periodate est éliminé par addition d'un réactif qui le consomme, par exemple un excès d'éthylgne-glycol et les sous-produits sont éliminés par dialyse. Le produit obtenu à la fin de la réaction est isolé selon les techniques classiques. Lorsque les groupes thiol du produit de départ ont été bloqués, le déblocage est effectué selon les méthodes connues, par exemple par action d'un agent réducteur apte à libérer la fonction thiol préalablement bloquée, tel que le mercapto-2 éthanol,ce qui conduit à l'obtention de la nouvelle glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action prête à être utilisée pour le couplage avec un anticorps pour obtenir une immunotoxine. La nouvelle molécule de la chaîne A de ricine ainsi obtenue (A-La) possede les propriétés principales suivantes - un poids moléculaire non significativement différent de celui de la chaîne A native. Par électrophorèse en gradient de polyacrylamide du produit final, on constate que le procédé de modification ne fournit des polymeres de la protéine qu'en quantité nulle ou très faible et ne fournit aucun produit de dégradation. - un taux de groupements thiol libres supérieur à 0,7 par mole, - une immunoréactivité envers des anticorps de lapin anti-chaîne A de ricine que l'on ne peut distinguer de celle de la chaîne A native, - une activité inhibitrice de la synthese protéique dans un mode le acellulaire supérieure à 50% de celle provoquée par une égale quantité de chaîne A native, - enfin, apres administration intraveineuse unique chez le lapin à une dose voisine de 0,4 mg/kg de poids corporel, le taux plasmatique de la chaîne A à longue durée d'action (A-La) présent dans le sang circulant au temps 23 heures après l'injection est de 10 à 100 fois supérieur au taux plasmatique de la chaîne A native mesuré dans les mêmes conditions. Disposant d'une chaîne A-La possédant les propriétés résumées ci-dessus il est possible de l'utiliser pour créer des conjugués ou immunotoxines selon les procédés déjà connus. Le couplage chimique entre la chaîne A-La et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) peut être réalisé par tout mode opératoire qui - préserve les activités biologiques respectives des deux composants du conjugué : Anticorps et la chaîne A, - assure au procédé une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage, - permet de maîtriser la valeur du rapport chaîne A-La/anticorps dans le conjugué obtenu, - conduit à un produit stable et soluble dans l'eau. N'importe quel procédé convenablement choisi dans la gamme de ceux qui sont décrits dans le brevet US 4 350535 et la demande de brevet FR 84 09703 (publiée sous le No. 2 566271) peut être utilisé pour la préparation des conjugués ou immunotoxines à partir de la chaîne A-La de ricine de l'invention. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet des produits, appartenant à la classe des immunotoxines (ciaprès symbolysées IT), obtenus par couplage covalent entre, d'une part, un anticorps ou fragment d'anticorps, utilisé sous sa forme naturelle ou correctement modifié, possédant la capacité de reconnaître sélectivement un antigène porté par les cellules cibles visées et, d'autre part, la chaîne A de ricine à longue durée d'action dite chaîne A-La, obtenue par traitement, après protection des groupes thiol, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin en présence d'une amine primaire en excès, puis déprotection éventuelle des groupes thiol. Avantageusement on opère pendant une période de temps de 0,2 à 24 heures à la température de O à 150C à pH compris entre 5 et 7, et à l'abri de la lumière. Le couplage entre les 2 protéines est de préférence réalisé par l'intermédiaire d'une liaison disulfure. Le couplage entre les 2 protéines réalisé par l'intermédiaire d'une liaison disulfure a les caractéristiques suivantes - la liaison covalente entre la chaîne A-La et l'anticorps contient un radical disulfure, - l'un des atomes de soufre constituant la liaison disulfure est toujours l'atome de soufre appartenant au résidu de cystéine en position 257 de la chaîne A-La de ricine, - le bras de liaison réunissant la chaîne A-La de ricine et l'anticorps est fixe sur ce dernier au niveau de groupements NH2 latéraux ou terminaux d'une chaîne peptidique, - ce couplage d'un anticorps avec la chaîne A-La de la ricine est réalisé selon le procédé décrit en détail dans le brevet US 4 340535. Le réactif de couplage utilisé de préférence est un réactif hétérobifonctionnel du type N-succinimidyl 3-(2-pyridyl-dithio)propionate ou du type acide (pyridyl-2-disulfanyl)-3 propionique activé par 1'éthyl-l(diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide tel que cela est décrit dans le brevet US 4 340535. Les immunotoxines selon 1 invention peuvent être représentées par la formule statistique suivante : P'-(W'-A')m dans laquelle P' représente l'anticorps ou le fragment d'anticorps, W' une structure covalente appropriée, par exemple une structure à pont disulfure, A' la chaîne A-La et m le nombre de fonctions de l'anticorps ou du fragment d'anticorps intervenues dans le couplage. m peut être un entier ou non car dans la population des molécules d'anticorps le couplage ne se produit pas toujours d'une façon homogène. Le taux de couplage moyen exprimé en nombre de moles de chaîne A-La par mole d'anticorps est généralement compris entre 0,5 et 5 et en particulier entre 1 et 3. Les immunotoxines à chaîne A-La ainsi obtenues ont les propriétés suivantes : - la séparation électrophoréique en gel de polyacrylamide de 1'IT (A-La) conduit à une répartition du produit en une série de bandes correspondant à des produits dont les poids moléculaires diffèrent de celui de l'anticorps par incréments successifs de 30 000 daltons, - les etudes effectuées par cytofluorométrie permettent de montrer que l'anticorps n'a subi aucune altération importante au cours des réactions d'activation et de couplage auxquelles il a été soumis et qu'il reste capable au sein même du conjugué de reconnaître l'antigène contre lequel il est dirigé, - l'activité inhibitrice de la synthèse protéique de la chaîne A-La, modifiée et couplée à un anticorps, déterminée dans un modèle acellulaire en présence de mercapto-2-éthanol est totalement conservee. L'activité cytotoxique des immunotoxines à chaîne A-La mesurée dans un test de synthèse protéique en modèle cellulaire sur des cellules présentant l'antigène cible est plus de 100 fois supérieure à celle mesurée dans les mêmes conditions pour des cellules ne présentant pas l'antigène cible. Par exemple, l'immunotoxine (désignée IT (A-La) AT1SE) construite en couplant à l'aide d'un bras à pont disulfure la chaîne A-La à un anticorps monoclonal (désigné anticorps AT1SE) dirigé contre l'antigène Thy 1.2 présent à la surface de certaines cellules leucémiques de souris est environ 1000 fois plus toxique vis-à-vis des cellules Thy 1.2 positives que des cellules Thy 1.2 négatives, - enfin, après administration intraveineuse de 1'IT (A-La) chez le lapin à une dose voisine de 0,4 mg/kg de poids corporel exprimé en chaîne A, le taux plasmatique de 1'IT (A-la) présent dans le sang circulant au temps 24 h après l'injection est de 10 à 200 fois supérieur au taux plasmatique de 1'IT classique mesuré dans les mêmes conditions. Ainsi typiquement chez le lapin, il apparaît que le taux plasmatique de 1'IT (A-La) AT1SE dans le sang circulant au temps 24 h après l'injection est de 10% du produit présent au temps zéro contre 0,08W pour 1'IT AT1SE classique correspondante à chaîne A non modifiée, au même temps, soit un accroissement d'un facteur 120 environ. On obtient ainsi des immunotoxines modifiées qui ont acquis un caractère nouveau quant à leurs propriétés pharmacocinétiques. Plus particulièrement, par modification appropriée de la sous-unité cytotoxique on a pu ajouter aux propriétés de cytotoxicité spécifique des immunotoxines, sans qu'il leur soit porté atteinte, une nouvelle propriété tout aussi intrinsèque : la capacité à manifester une lente cinétique d'élimination plasmatique après injection chez les animaux supérieurs ou chez l'homme. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques anticancéreuses contenant, à titre de principe actif, une immunotoxine modifiée selon l'invention, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'administration par voie injectable en particulier par voie intraveineuse. Les exemples suivants permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, l'élimination lente de-la chaîne A de ricine modifiée par réaction d'oxydation par le periodate de sodium réalisée en présence d'un excès de L-leucine. Modification de la chaîne A de ricine par action simultanée du periodate de sodium et de la L-leucine. 1) Blocage du SH naturel de la chaîne A par le DTNB. La chaîne A de ricine a été préparée et purifiée selon le mode opératoire décrit dans le brevet US 4 340535. A 23 ml d'une solution de chaîne A de ricine comportant 0,84 groupement thiol par mole de chaîne A à 7,2 mg/ml dans le tampon PBS (tampon phosphate 20mM, NaCl 150mM, pH 7), on ajoute 20 équivalents d'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzolque (DTNB) sous la forme de 1 ml de solution de DTNB dans un tampon phosphate 125mM, cette solution étant amenée à pH7 à l'aide d'hydroxyde de sodium. On dialyse ensuite la solution contre du PBS à 40C et on obtient ainsi 162 mg de chaîne A bloquée sur la fonction thiol, en solution à 6,9 mg/ml. 2) Oxydation periodique et formation de base de Schiff avec la L-leucine sur la chaîne A bloquée sur la fonction thiol A 79,4 mg de chaîne A bloquée sur la fonction thiol contenus dans 11,5 ml de solution amenée à pH 6,5 à l'aide d'acide acétique, on ajoute 12 ml d'une solution de L-leucine à 52 mg/ ml dans un tampon phosphate 30mM pH 6,5 puis 0,5 ml d'une solution de periodate de sodium 0,5M dans l'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 17 heures à 40C dans l'obscurité. La réaction est arrêtée par addition de 2,8 ml d'une solution aqueuse d'éthylèneglycol 1M. Après 15 minutes d'incubation à 200C, le milieu réactionnel est dialysé à 4 0C contre du tampon PBS pendant 48 h.Après centrifugation à 10 000 xg pendant 30 minutes, on obtient 28 ml (à 1,9 mg/ml) de chaîne A bloquée sur la fonction thiol et modifiée sur ses résidus osidiques par oxydation et formation de base de Schiff. 3) Déblocage des groupements thiol 25 ml de solution à 1,9 mg/ml de chaîne A bloquée et modifiée sur ses résidus osidiques sont ramenés à 10,5 ml par concentration, puis on ajoute 0,214 ml de mercapto-2-éthanol à 50%. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 1 h à 200C. On dialyse ensuite la solution contre le tampon PBS à 40C. On obtient ainsi 26,5 mg de chaîne A modifiée à une concentration de 2,65 mg/ml. En utilisant la technique au DTNB (Methods in Enzymology, 1972, 25, 457 (Academic Press)),on détermine que la chaîne A modifiée obtenue présente 0,89 groupement thiol libre par mole. Le poids moléculaire de la chaîne A modifiée est de 30 000 3 000, détermine par électrophorèse en gradient de polyacrylamide en présence de dodécyl-sulfate de sodium. La préparation de chaîne A dont les motifs osidiques ont été modifiés, obtenue précédemment, a été étudiée en ce qui concerne ses activités enzymatiques d'inhibition de la synthèse protéique et ses propriétés pharmacocinétiques. Il - Activité enzymatique de la chaîne A-La à longue durée d'action, mesurée sur un modèle acellulaire. La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60S. Le protocole in vitro utilisé comporte l'emploi de fractions subcellulaires de foie de rat convenablement complé mentées et capables d'incorporer la 14C-phénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel, l'acide polyuridylique. Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14Cphénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans Biochemica Biophysica Acta, 1973, 312, 608-615, mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. L'échantillon contenant la chaîne A est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon Tris HC1 50 mM, pH 7,6, contenant du mercapto-2 ethanol à 0,2% et de la sérumalbumine bovine à 15 microgrammes/ml. A partir des données de comptage, on calcule par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines pour chaque milieu réactionnel contenant de la chaîne A de ricine. Les courbes obtenues permettent de calculer la CI50 ou concentration de chaîne A (native ou modifiée) qui inhibe de 50% l'incorporation du précurseur radiomarqué dans les protéines. On observe ainsi une CI50 égale à 3.10-10 mole/1 pour la chaîne A-La oxydée et bloquée. La CI50 de la chaîne A témoin de l'expérience est de lO mole/l : compte tenu de la précision des mesures, la modification n' entraîne donc pas de perte significative d'activité de la chaîne A. III - Propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A à longue durée d'action modifiée sur ses motifs osidiques (chaîne A-La) La chaîne A (native ou modifiée) est administrée chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité de chaîne A injectée correspond à 0,415 mg/kg. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique ci-après désigné par l'abréviation IRM-1. Cette technique a l'avantage de doser la chaîne A sans modification de celle-ci. Ce dosage est réalisé dans des plaques à microtitrations (par exemple . "NUNC-TSP screening system" Poly Labo Block France) dont le couvercle est muni de pointes hyperabsorbantes qui plongent dans les puits du socle. Ces pointes constituent les phases solides. Des anticorps de brebis anti-chaîne A de ricine (ci-après désignés sous l'abréviation Acl), purifiés par chromatographie d'affinité, sont absorbés sur les phases solides. Pour cela 200 microlitresd'une solution d'Acl à 10 microgrammes/ml dans le tampon phosphate PBS sont distribués dans les puits. Les pointes sont mises en contact d'abord avec la solution d'Acl pendant 24 h à 4"C puis avec du sérum de veau foetal pendant 3 h à 200C pour saturer tous les sites de fixation. L'immunoabsorbant saturé est alors mis en contact pendant 3 h à 200C avec les échantillons plasmatiques à doser à différentes dilutions ou avec des solutions de chaîne A de concentrations connues pour l'établissement de la courbe d'étalonnage.Un lavage est effectué par un tampon PBS, puis l'immunoabsorbant est mis en contact pendant 2 h à 200C avec les anticorps de brebis anti-chaîne A de ricine purifiés par chromatographie d'affinité et radiomarqués (ci-après désignés par l'abréviation Ac2). Le radiomarquage de l'Ac2 est réalisé avec l'iode 125 en présence de chloramine T selon la méthode de Greenwood et Hunter (Biochem. J., 1963, 89, 114) ; l'activité spécifique des Ac2 radiomarqués est de 5 à 10 microcuries/microgramme. 106 coups par minute (cpm) d'Ac2 radiomarques sont introduits sous 200 microlitres dans le tampon PBS, contenant q, 1% de sérum-albumine bovine. Après lavage dans le tampon PBS, les pointes sont détachées et la quantite d'Ac2 lié est mesurée par comptage de la radioactivité. La mesure de la concentration en chaîne A dans les échantillons à doser se fait par référence à la courbe d'étalonnage réalisée avec la chaîne A introduite à différentes concentrations connues. Lorsque de la chaîne A-La à longue durée d'action est injecté chez l'animal, cette même chaîne A-La est utilisée pour l'etablisse- ment de la courbe d'étalonnage correspondante. Les valeurs de concentration en chaîne A (native ou modifiée) dans le plasma sanguin mesurées par cette technique sont reproductibles et fiables. Le seuil de détection est de 1 nanogranm4/rm. L'étude de la reproductibilité intra- et interessais donne des coefficients de variation inférieurs à 10% pour les valeurs de concentrations comprises dans la gamme de 1 à 200 nanogrammes/ml. Les resultats de ces expériences sont représentés sous la forme de courbes présentant en abscisse le temps, exprimé en heures,et en ordonnée, sur échelle logarithmique, la concentration plasmatique du produit testé, rapportée en pour-cent de la concentration plasmatique théorique au temps zéro. Cette valeur appelée "concentration plasmatique relative" (CPR) est calculée à l'aide de l'expression suivante: Concentration mesurée au temps t CPR = ------------------------------------- x 100 quantité injectée/volume plasmatique Le volume plasmatique est considéré égal à 36 ml/kg de poids corporel de l'animal. La figure 1 montre les courbes d'élimination plasmatique, en fonction du temps après injection intraveineuse, de la chaîne A de ricine native et de la chaîne A-La modifiée. Pour la chaîne A native (courbe 1) il apparaît deux phases : dans la première phase, le produit disparaît très rapidement de la circulation, puisque trois heures après l'injection il ne reste plus dans le plasma que 0,1% de la dose administrée. Dans la deuxième phase, la décroissance est plus lente. Lorsque la chaîne A a été modifiée sur ses motifs osidiques (chaîne A-La, courbe 2), le profil d'élimination est profondément modifié : la première phase d'élimination, responsable de la disparition de la plus grande partie du produit, est pratiquement abolie, ce qui conduit à un accroissement considérable des taux plasmatiques de sous-unité cytotoxique active. Vingt heures après l'injection, la concentration de la chaîne A-La modifiée est 460 fois supérieure à la concentration de la chaîne A non modifiée (courbe 2). Ainsi, ces résultats prouvent que les réactions d'oxydation par le periodate de sodium et de blocage par formation de base de Schiff par la L-leucine ont modifié les sucres impliqués dans le processus de reconnaissance responsable de l'élimination de la chaîne A au point d'empêcher cette reconnaissance sans que l'activité biologique caractéristique de la chaîne A soit altérée. EXEMPLE 2 Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, l'élimination lente de la chaîne A de ricine modifiée par réaction d'oxydation par le periodate de sodium et par formation de base de Schiff en présence de Alanine, ou d'acide L-glutamique ou de L-arginine. I) Mode opératoire. La chaîne A est modifiée selon le procédé décrit dans l'exemple 1 excepté que la réaction de Schiff est réalisée en présence soit d'acide glutamique, soit d'arginine, soit d'alanine, à la place de la leucine. Les quantités de chacun de ces acides aminés introduites sont 103, 5.103, et 10 fois supérieures aux quantités molaires de chaîne A mises en oeuvre, pour l'acide glutamique, l'arginine, et l'alanine, respectivement. II) Résultats. Le tableau I montre les propriétés de ces différentes chaînes A-La modifiées. Les résultats obtenus avec la chaîne A native et avec la chaîne A-La modifiée par le periodate de sodium et la L-leucine tel que cela est décrit dans l'exemple 1 sont rappelés à titre comparatif. Tableau I Amines primaires utilisées pour la formation des bases de Schiff Chaîne A L-leucine acide glu- L-arginine L-1 alanine native tamique inhibition de synthèse protéique 10-10M 3.10-10M 3,4.10-10M 2.10-10M 3,3.10-10M en modèle acellulaire (CI50) thiol libre par chaîne A 0,9 0,89 0,87 0,8 0,85 poids moléculaire 30 000 30 000 30 000 30 000 30 000 +/-3 000 +/- 3 000 +/- 3 000 +/- 3 000 +/- 3 000 concentration plasmatique 0,01 7 7 8,5 10 relative (%) 24 h après injection Ainsi, ces résultats prouvent que les réactions d'oxydation par le periodate de sodium accompagnées par le glocage simultané des groupes aldéhyde sous forme de bases de Schiff par la L-alanine, la t-arginine ou l'acide L-glutamique ont modifié les sucres impliqués dans le processus de reconnaissance responsable de l'élimination biologique de la chaîne A in vivo au point d'empêcher ltessentiel de cette reconnaissance, sans que la propriété d'inactivation des ribosomes de la chaîne Assoit significativement altérée et sans perte des groupements thiol utilisables pour les couplages ultérieurs. EXEMPLE 3 Immunotoxine (abrégé IT) obtenue par réaction entre un anticorps anti-cellules T de souris (anticorps dirige contre l'antigène Thy 1.2) substitué par des groupements disulfure active et la chaîne A-La de ricine, a) anticorps anti-cellules T de souris ou anticorps AT15E : cet anticorps a été obtenu selon la méthode décrite dans Jour nal of Immunology (1979) 122, 2491-2498, b) chaine A-La de ricine : la chaîne A-La de ricine utilisée a été préparée ainsi qu'il a été indiqué dans l'exemple 1, c) anticorps activé anti-cellules T de souris. A 43,7 ml d'une solution à 7 mg/ml d'anticorps dans un tampon phosphate 125mM, pH 7, on ajoute 3,62 mg de N-succinimidyl-3 (2-pyridyl-dithio)propionate dans I'éthanol à 95% sous un volume de 0,326 ml. Le mélange est agité 30 minutes à 20 C. Après dialyse contre du tampon phosphate 125mM,pH 7, la solution protéique est centrifugée à 10 000 xg pendant 30 minutes à 40C, et l'on obtient ainsi 96,8 mg d'anticorps activé à une concentration de 2,42 mg/ ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de pyridinethione-2 libérée par echange avec le mercapto-éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 6,7 groupements disulfure mixte activé par mole d'anticorps. d) Préparation de l'immunotoxine à chaîne A-La de ricine à longue durée d'action. A 14,8 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (concentration 2,42 mg/ml soit 35,8 mg d'anticorps activés) on ajoute 10 ml de chaîne A-La à 2,65 mg/ml obtenue comme indiqué à l'exemple 1 et on incube 20 heures à 250C. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur gel (gel AcA 44) avec mesure de la densité optique de l'effluent à 280 nm. Le regroupement des fractions contenant à la fois l'anticorps et la chaîne A modifiée conduit à 52 ml de solution d'immunotoxine à 0,315 mg/ml soit 18,25 mg. Cette solution contient 0,076 mg de chaîne A-La modifiée couplée à l'anticorps par ml. Le taux de couplage moyen de cette préparation est donc de 1,6 mole de chaîne A-La par mole d'anticorps. t'immunotoxine à chaîne A-La de ricine obtenue comme indiqué ci-dessus a été étudiée en ce qui concerne ses propriétés pharmacocinétiques et ses propriétés de cytotoxicité spécifique vis-à-vis des cellules cibles. EXEMPLE 4 : Cet exemple démontre 11 acquisition de la propriété de lente élimination plasmatique des immunotoxines à chaîne A de ricine à longue durée d'action désignées en abrégé IT (A-La3. I - Mode opératoire Le conjugué préparé selon le procédé décrit dans l'exemple 3 est administré chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité injectée correspond à 0,415 mg/kg exprimé en chaîne A. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique à deux sites ci-apres désigné par l'abréviation IRM-3. Cet essai est realisé selon la même technique que pour le test IRM-1 (décrit dans l'exemple 1) excepté que la solution Ac2 est ici une solution d'anticorps de chèvres anti-IgG de souris purifiés par chromatographie d'affinité et radiomarqués comme décrit pour la technique IRM-1 (décrit dans l'exemple 1). La mesure de la concentration en immunotoxine modifiée dans les échantillons à doser se fait par référence à une courbe d'étalonnage réalisée avec I'immunotoxine modifiée introduite à différentes concentrations connues. L'essai IRM-3 répond aux mêmes caractéristiques de fiabilité et de reproductibilité que celles décrites pour la technique IRM-1. Pour comparaison, une étude contrôle est réalisée dans les mêmes conditions avec le conjugué appelé IT-AT1SE obtenu par réaction entre le même anticorps AT1SE substitué par des groupements disulfure activé et la chaîne A native de ricine. La préparation est réalisée selon la même procédure que celle décrite dans l'exemple 3 de ce conjugué. Les résultats de ces expériences de pharmacocinétique sont représentés de la même façon que pour la chaîne A de ricine non couplée dans l'exemple 1. II - Résultats La figure 2 montre les courbes d'élimination plasmatique en fonction du temps de 1'IT AT1SE (courbe 1) et de 1'IT (A-La) AT1SE (courbe 2) injectées par voie intraveineuse. Vingtquatre heures après l'injection, la concentration d'immunotoxine active est 120 fois supérieure pour 1'IT (A-La) AT1SE que pour 1'IT ATl5E.classique. Ce fait montre que les nouvelles propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A-La oxydée et bloquée sont conservées après couplage à un anticorps. EXEMPLE 5 Cet exemple démontre le maintien des propriétés de cytotoxicité spécifique de 1'IT (A-La) AT1SE vis-à-vis des cellules cibles Thy 1.2 positives. La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60S. La technique utilisée met en oeuvre un modèle cellulaire dans lequel on mesure l'effet des substances étudiees sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire T2 issue d'une leucémie T qui porte l'antigène Thy 1.2. Les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier puis, en fin d'incubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de 14C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 1974, 249 (11), 3557-3562 utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la-concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut aussi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50% de l'incorporation de 14Cleucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI50). Le tableau II ci-après représente les valeurs de CI50 obtenues dans la même expérience avec l'IT-(A-La)-AT15E et IT AT1SE d'une part, la chaîne A native et la chaîne A-La non couplée, d'autre part. On peut constater que l'IT (A-La) ATTISE a une très forte activité cytotoxique, indentique à celle obtenue avec l'immunotoxine à chaîne A native correspondante et qui est environ 1 000 fois supérieure à celle de la chaîne A-La modifiée non couplée, mesurée dans les mêmes conditions. Tableau II Produit testé Concentration inhibitrice 50. IT (A-La) ATl5E 2.10-10M IT AT15E 2.10-10M Chaîne A native 3.lo7M Chaîne A-La 2.10-7M Ces immunotoxines modifiées peuvent être utilisées pour le traitement des affections cancéreuses ou non dont les cellules cibles seraient reconnues par l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Les modalités optimales d'administration ainsi que la durée du traitement devront être déterminées dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les nouveaux médicaments selon l'invention sont condi tionnés pour être utilisés par voie injectable et de préférence par voie intraveineuse. REVENDICATIONS 1. Chaîne A de ricine modifiée, ayant la cytotoxicité de la chalne A native et une durée d'action in vivo prolongée par rapport à celle de la chaîne A, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement de la chaîne A de ricine par des ions periodate en présence d'une amine primaire en excès. 2. Chaîne A modifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins l'un des groupes thiol de la chaîne A cst protégé pendant le traitement par les ions periodate. 3. Chaîne A modifiée selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le traitement par les ions periodate a lieu dans une solution aqueuse de pH 5 à 7, à une température de O à 150C, à l'obscurité et pendant une période de 0,2 à 24 heures. 4. Chaîne A modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution réactionnelle contient de 1 à 10 mg/ml de chaîne A réactive, 10 à 50 mM de periodate alcalin et 50 à 500 mM d'amine primaire. 5. Chaîne A modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'amine primaire est une amine aliphatique choisie parmi les alkylamines, les aminoacides et les peptides hydrosolubles. 6. Chaîne A modifiée selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'aminoacide est choisi parmi les racémiques ou les énantiomères de glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, arginine, acide aspartique, acide glutamique. 7. Procédé de préparation d'une chaîne A modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on fait réagir sur la chaîne A de ricine en solution aqueuse un excès de periodate alcalin et d'une amine primaire. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le traitement par les ions periodate a lieu dans une solution aqueuse de pH 5 à 7, à une température de O à 150C, à l'obscurité et pendant une période de 0,2 à 24 heures. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la solution réactionnelle contient de 1 à 10 mg/ml de chaîne A réactive, 10 à 50 mM de periodate alcalin et 50 à 500 mM d'amine primaire. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'en outre avant la réaction d'oxydation on traite la chaîne A de ricine par un réactif classique de protection des groupes SH, et que l'on libère les groupes SH après le traitement par les ions I04 et l'amine primaire. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif de protection des groupes SH est choisi parmi l'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzolque et l'acide (pyridyl2 disulfanyl)-3 propionique et en ce que la déprotection des groupes SH est effectuée par action du mercapto-2 éthanol. 12. Immunotoxine à durée d'action prolongée in vivo, caractérisée en ce qu'elle résulte du couplage d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps à de la chaîne A de ricine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 13. Immunotoxine selon la revendication 12, caractérisée en ce que le couplage entre l'anticorps ou le fragment d'anticorps et la chaîne A modifiée a lieu par l'intermédiaire d'un pont disulfure. 14. Immunotoxine selon la revendication 13, caractérisée en ce que le couplage est effectue avec un réactif héterobi- fonctionnel choisi parmi le N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio) propionate ou l'acide (pyridyl-2-disulfanyl)-3 propionique activé par l'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide. 15. Composition pharmaceutique anticancéreuse caractérisée en ce qu'elle contient,à titre de principe actif, une immunotoxine selon l'une quelconque des revendications 11 à 14.