Brevet FR2589063A1 — publié le 19870430

Procédé de culture de Babesia canis, application à la prépara- tion d'antigènes et de vaccins, et antigènes et vaccins contre la piro- plasmose. La présente invention a trait à un procédé de culture de parasites de l'espèce Babesia canis. Elle a également trait à l'application de ce procédé à la préparation d'antigènes et de vaccins contre les Babesioses canines, ainsi qu'aux antigènes et aux vaccins obtenus. La préparation de vaccins contre les Babesioses a longtemps posé des problèmes pratiquement insurmontables. Ces difficultés étaient liées à l'impossibilité d'obtenir une multiplication industrielle des parasites in vitro ainsi qu'aux difficultés de détecter et d'isoler des antigènes utiles, et notamment des antigènes protecteurs. Un procédé de multiplication de Babesia a été proposé dans Erp, et al. Am. Jour Trop. Med. Hva., 27 (5): pp. 1061-1064 (1978). Ce procédé consistait en une propagation des parasites dans une culture d'érythrocytes sous agitation mécanique et avec une teneur accrue de gaz carbonique. Ce procédé n'a cependant pas permis d'atteindre une production de masse. Les tentatives qui ont été faites, d'autre part, pour produire les parasites de la Babesiose selon des techniques proches de la cultu- re de Plasmodium, décrites dans Trager, et al., Science, 193: pp. 673-675 (1976) ou Speer, et al., Z. Parasitenk, 50: pp. 237-244 (1976), n'ont pas abouti. Plus récemment un procédé a été proposé par Miodrag Ristic et Michael G. Levy, dans le brevet européen nO 18580, pour une production à grande échelle de ces parasites. Ce procédé est basé sur 2 2589063 l'incubation dans des cellules érythrocytaires, dans un milieu de cultu- re convenable pour les érythrocytes, auquel est adjoint de 30 à 50 % de sérum, cette incubation s'effectuant de façon statique en présence d'une atmosphère contrôlée contenant de 3 à 6 % de gaz carbonique et dans des conditions permettant de maintenir l'hémoglobine des érythro- cytes à l'état désoxydé, à une température de l'ordre de 35 à 38 C. Ce procédé s'est avéré efficace pour la production à grande échelle de Babesia bovis, mais non pas de Babesia canis. Il est apparu intéressant de pouvoir produire, à grande échelle, Babesia canis dans des conditions pratiques et économiques afin de pouvoir fabriquer un vaccin contre la piroplasmose canine. L'invention se propose donc de fournir un tel procédé qui permette de façon simple et peu coûteuse de produire à grande échelle le parasite Babesia canis. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé permettant de préparer des antigènes ou vaccins à partir des.surna- geants de culture. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé d'application du procédé de culture selon l'invention à la préparation d'antigènes ou de vaccins. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir des antigènes, purifiés ou non, et des vaccins, purifiés ou non, à partir des surnageants de culture. L'invention a pour objet un procédé de culture de parasites de l'espèce Babesia canis, dans lequel on incube des érythrocytes infectés par le parasite dans un milieu de culture convenable pour les érythrocytes, en présence de sérum homologue, à l'état sensiblement statique, caractérisé en ce que l'on met la culture à incuber en atmos- phère normale. Par atmosphère normale dans le sens de la présente invention, on entend une atmosphère composée essentiellement d'oxygène et d'azo- te et dépourvue de teneur importante en gaz carbonique. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux de l'invention, la culture est mise à incuber d'abord à température élevée, notamment entre 34 et 38 C, puis à basse température, notam- ment entre 0 et 10 C. 3 2589063 De préférence, l'incubation à température élevée est de l'ordre de 8 heures et la durée de culture à basse température de l'ordre de 16 heures. On peut cependant augmenter le temps d'incubation à température élevée et réduire la durée pendant laquelle la culture se trouve à basse température, cette dernière durée n'étant cependant, de préférence, pas inférieure à 6 ou 8 heures. A la fin de la période d'incubation à basse température, on décante et recueille le milieu surnageant et on remplace celui-ci par du milieu neuf, après quoi on remet la culture à incuber à température élevée, puis à température abaissée et l'on ajuste, de temps en temps, i 'hématocrite. - De façon avantageuse, la concentration en érythrocyte, c'est- à-dire l'hématocrite, est de l'ordre de 8 à 12 %, et de préférence de %. Egalement de façon avantageuse, le milieu de culture comporte entre 20 % et 3 %, et de préférence de l'ordre de 5 % de sérum de chien. Le milieu de culture préféré est le milieu Ham's F10 ou F12 contenant un peu de glucose et convenablement tamponné. Ainsi le milieu peut par exemple comprendre du glucose à lg/Il, un tampon Hepes et du bicarbonate à environ 1,2 % final. Cependant d'autres milieux usuels peuvent être utilisés, tels que par exemple, 199 avec sels de Hanlg-. ou RPMI 1640. Les milieux de culture doivent être compatibles avec la survie des érythrocytes et contenir les éléments permettant la multiplication des parasites. Ceci peut être obtenu en partant de milieux de culture riches et en faisant des essais convenables. Dans le cas o le procédé de culture est destiné à produire des substances destinées à être administrées à l'animal, par exemple un vaccin, la culture s'effectue avantageusement en présence d'un antibio- tique tel que par exemple la gentamycine. La culture est effectuée à un pH convenable pour le dévelop- pement des parasites, ce pH étant de l'ordre de 7,3 à 7,5, et de préférence de l'ordre de 7,4. Conformément à l'invention, le surnageant de culture est re- cueilli à la fin de la période d'incubation à basse température. Ce 4 2589063 surnageant peut être utilisé soit directement, soit après des étapes de purification, pour former des antigènes et/ou un vaccin contre la piroplasmose canine. De préférence, on recueille le surnageant lorsque la concentration en parasites atteint au moins 108 parasites/mil. De façon avantageuse. le surnageant est soumis à une centrifu- gation de façon à éliminer les cellules, les parasites et les débris cellulaires et débris de parasites, après quoi on procède à une filtra- tion stérilisante. Le surnageant peut ensuite être avantageusement concentré, par exemple par ultrafiltration. Pour la préparation d'un vaccin, on peut ensuite avantageuse- ment inactiver les contaminants éventuels du surnageant par exemple au formol ou la bétapropiolactone ou éthyl-éthylénimine. Le vaccin se présente de préférence sous forme lyophilisée. Le vaccin peut être administré par voie sous-cutanée. Un vaccin contre la piroplasmose, selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comporte des antigènes solubles et concentrés de Babesia canis en provenance d'un surnageant de culture de Babesia canis sur érythxocytes. De préférence, la dose contient au maximum 0,120 mg de formol ou 20 %Ode bétapropiolactone ou d'éthyl-éthylénimine. Le solvant du vaccin lyophilisé comporte de préférence un adjuvant et se présente, par exemple, sous forme d'une solution de saponine, par exemple à 0,5 mg/ml. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparai- tront àecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1: culture du parasite. On recueille le sang d'un chien splénectomisé infecté expéri- mentalement, par voie intraveineuse, à l'aide d'une souche de Babesia canis congelée en azote liquide. Le sang parasité est récolté par ponction intracardiaque, sur héparine, à la concentration finale de U/ml. Le plasma et les leucocytes sont éliminés par une première centrifugation à 400 g pendant 10 minutes. Le culot de globules rouges est ensuite lavé deux fois en tampon PBS 0,15 M, pH 7,2 à 400 g pendant 10 minutes. On réalise alors une suspension du culot de globules rouges à la concentration de 10 % dans un milieu de culture constitué de 5 % de sérum de chien et de 95 % de milieu Ham's F10 contenant du gluco- se à 1 g/I, un tampon Hépes à 25 mM, du bicarbonate à 1,2 % et de la gentamycine à 100 mg/I. Le pH de la suspension de globules rouges parasités est ajusté à 7,4 avec de la soude 1M. La suspension est ensuite répartie dans des flacons de culture cellulaires à raison de 100 ml pour 150 cm2. Les flacons sont ensuite mis à incuber dans une étuve en atmosphère normale humide à une température de + 37 C pendant une durée de 8 heures. Ensuite les flacons sont amenés à une température de + 4 C pendant 16 heures. A la fin de cette incubation à + 4 C> le milieu surnageant des flacons est décanté et recueilli. Ce milieu est remplacé dans les fla- cons par du milieu neuf et les cultures sont remises ensuite à incuber pendant 8 heures à 37 C. Le cycle de culture se poursuit et, toutes les 72 heures, des érythrocytes sains sont ajoutés à la culture de façon à rajuster l'hé- matocrite à 10 % par rapport au milieu. Le surnageant recueilli, dépourvu de globules rouges et de parasites, contient les antigènes recherchés. Exemple 2: préparation d'un vaccin contre la piroplasmose Les surnageants recueillis à la fin de plusieurs incubations successives sont mélangés. Le mélange de surnageants ainsi obtenu est soumis à une centrifugation à 700 g destinée à éliminer les globules rouges et les éventuels parasites ainsi que leurs débris. La durée de la centrifugation est de 15 mn. Le surnageant ainsi centrifugé est ensuite soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 p. Le surnageant est ensuite soumis à une concentration par ultra-filtration sur une membrane 20 000 Daltons. Le concentrat est traité au formol à une teneur de 0,12 mg/ml pendant une nuit à une température de + 4 C. Il est ensuite lyophilisé et réparti en doses correspondant chacune à au moins 108 parasites/ml. Pour l'administration aux chiens, le vaccin lyophilisé est 6 2589063 dissous dans une solution de saponine à 0,5 mg/ml dans de l'eau stérile apyrogène. Le vaccin est.administré par voie sous-cutanée, de préférence dans la région sous-scapulaire, à raison d'une dose. La primo-vacci- nation comporte deux injections à trois-quatre semaines d'intervalle. On effectue des rappels annuels ou semestriels. La quantité de solvant à la saponine est adaptée au poids du chien à vacciner, les chiens d'un poids supérieur à 7 kilos recevant la dose dissoute dans 1 ml de solvant et les chiens d'un poids inférieur à 1 kilo recevant la dose dissoute dans 0,5 ml de solvant. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'on peut lui apporter diverses modifications de détails sans pour cela s'éloigner ni de son cadre ni de son esprit. REVEND ICATIONS 1) Procédé de culture de parasites de l'espèce Babesia canis dans lequel on incube des érythrocytes infectés par le parasite dans un milieu de culture convenable pour- la survie des érythrocytes et la multiplication des parasites, en présence de sérum homologue, à l'état sensiblement statique, caractérisé en ce que l'on met la culture à incuber en atmosphère normale. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met la culture à incuber d'abord à température élevée, notamment entre 34 et 38 C, puis à basse température, notamment entre 0 et 10 C. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'incubation à température élevée est de l'ordre de 8 heures et l'incu- bation à basse température est de l'ordre de 16 heures. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'en fin de culture à basse température, on décante et recueille le milieu surnageant et on le remplace par du milieu neuf, après quoi on remet la culture à incuber à température élevée, puis à température abaissée et on ajuste, si nécessaire, l'hématocrite. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'hématocrite est de l'ordre de 8 à 12 % et no- tamment 10 %. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu de culture comporte entre 20 % et 3 %, et notamment de l'ordre de 5 %, de sérum de chien. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de culture est à base de milieu Ham's F10 ou F12, ou 199 avec sels de Hanks ou RPMI 1640, contenant un peu de glucose et convenablement tamponné. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu comprend du glucose à 1 g/I, un tampon Hépes et du bicarbona- te à environ 1,2 %. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que la culture est effectuée à un' pH de I'ordre de 7,3 à 7,5 et notamment de l'ordre de 7,4. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, 258 90 63 caractérisé en ce que l'on effectue la culture en présence d'un anti- biotique et notamment la gentamycine. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on recueille l'inoculum de parasites sur héparine. 12) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 à la préparation d'antigènes et de vaccins, caractérisée en ce que l'on utilise le surnageant de culture pour pré- parer l'antigène ou vaccin. 13) Application selon la revendication 12, caractériséeeen ce que l'on soumet le surnageant à une centrifugation puis/ une filtration stérilisante. 14) Application selon la revendication 13, caractériseen ce que l'on concentre le surnageant. 15) Application selon l'une des revendications 12 à 14 à la préparation d'un vaccin, caractérisée en ce que l'on inactive les contaminants éventuels du surnageant et qu'on le iyophilise. 16) Antigènes et vaccins obtenus selon l'une quelconque des revendications 12 à 15. 17) Vaccin contre la piroplasmose du chien, caractérisé en ce qu'il comporte les antigènes solubles traités et concentrés de Babesia canis en provenance d'un surnageant -de culture de Babesia canis sur érythrocytes. 18) Vaccin lyophilisé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le solvant comporte un adjuvant, notamment la saponine. 19) Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que le solvant comporte une solution de saponine à 0,5 mg/ml. ) Vaccin selon. l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il correspond au surnageant d'une culture contenant au minimum 108 parasites/m d'une culture contenant au minimum 10 parasites/ml.