Brevet FR2578847A1 — publié le 19860919

La présente invention concerne une sonde d'ADN utile dans le diagnostic anté-natal de certaines maladies génétiques liées au chromosome X. Plus particulièrement, l'invention concerne une sonde d'ADN caractérisée en ce qu'elle reconnaît le locus polymorphique de la région q28 du chromosome X présentant au moins 8 allèles différents dans la population définie comme suit par digestion avec l'enzyme TaqI 6,6 kb 5,3 kb 4,8 kb 4,5 kb 4,1 kb 4,0 kb 3,9 kb 3,4 kb. On a, en effet, pu mettre en évidence qu'une telle sonde était capable de reconnaître un locus chromosomique lié à des gènes responsables des anomalies suivantes Hémophilie A (HemA) Déficit en G6DPH Adrénoleucodystrophie (ALD) Débilité mentale lide au site fragile de l'X. Il s'agit là de maladies dont certaines sont fortement incapacitantes et leur diagnostic doit tendre à se généraliser dans les familles à risque. Pour comprendre le processus du diagnostic, il convient de rappeler certaines notions sur l'hérédité. Les chromosomes X et Y sont dits chromosomes sexuels car c'est eux qui déterminent le sexe d'un embryon. La femme possède une paire de chromosomes XX alors que l'homme possède une paire de chromosomes XY. Dans le cas d'une hérédité récessive liée au chromosome X, un caractère anormal porté par l'un des chromosomes X chez la femme ne s'exprimera pas, empêché par le gène correspondant situé sur l'autre X. Par contre, chez l'homme, un caractère anormal porté par le chromosome X s'exprimera toujours car il n'y a pas de gène homologue sur le chromosome Y. Le schéma ci-après représente les différentes possibilités dans le cas de l'union d'une femme conductrice (c'est-d-dire pouvue d'un chromosome X' portant une anomalie, l'autre chromosome X étant normal) et d'un homme sain. Femme conductrice Homme sain filles garçons saine conductrice sain malade D'autres cas de figure sont envisageables, en particulier lorsque l'homme est malade. Le diagnostic s'effectuede la façon suivante mère conductrice fils malade père sain foetus mâle On détecte, grâce à la sonde, chez la mère conductrice au moins deux allèles qui montrent qu'elle est hétérozygote ; on détecte chez le fils malade l'un des allèles, ce qui signifie que cet allèle est lié à l'anomalie chromosomique. Dans ces conditions, un diagnostic anténatal pour le foetus mâle permet, en mettant en évidence l'un ou l'autre des allèles précédents, de savoir si le nouveau-né sera ou non porteur de l'anomalie chromosomique. Dans certains cas, il est possible, en changeant d'enzyme de restriction, en particulier en utilisant à la place de TaqI l'enzyme MspI, de mettre en évidence un caractère hétérozygote lorsque celui-ci n'apparat pas avec TaqI. En tout état de cause, les résultats d'un tel diagnostic doivent être pondérés en fonction des pourcentages de recombinaison entre la sonde et la maladie concernée, et dans certains cas il peut être nécessaire d'avoir recours à une autre sonde pour limiter les risques d'erreurs. Le procédé de détection consiste essentiellement à hybrider la sonde selon l'invention avec le produit de digestion des chromosomes avec une enzyme, par exemple TaqI ou MspI, puis à mettre en évidence la sonde et à évaluer la dimension du fragment hybridé. Les conditions d'hybridation et de lavage sont, de préférence, de 420C, 40 % formamide, 0,9 M NaCl pour l'hybridation et 600C, 1 x SSC pour le lavage, ce qui permet une détection des séquences divergeant de 30 % avec la sonde utilisée. Dans certains cas, il est possible de modifier les conditions d'hybridation et de lavage. Afin d'être mise en évidence, la sonde ADN selon l'invention doit être marquée, par l'un des procédés connus pour le marquage des sondes ADN. Ainsi, il peut s'agir d'un marquage radioactif, par exemple 32 avec P, ou bien dans le cas d'une "sonde froide" d'un marquage non radioactif, par exemple enzymatique, comme cela est également connu, par exemple par le brevet français 2 422 956. Dans certains cas, la sonde n'est pas marquée lors de son utilisation mais modifiée chimiquement pour pouvoir être "repérée" après l'hybridation. La sonde selon l'invention présente de nombreux avantages qui ont pu être mis en évidence grâce à des études comparatives avec d'autres sondes. 90 % des femmes proposantes sont hétérozygotes pour la sonde St14 qui est une sonde selon l'invention avec laquelle ont été effectuées les expériences. Hémophilie A (Hem A > Le risque d'erreur de diagnostic est donné par le pourcentage de recombinaison entre St14 et la maladie concernée (= distance génétique en centi Morgan (cM)). Le rapport des chances de liaison entre St14 et l'hémophilie A par rapport à une non liaison est de 4,4 x 109 en faveur d'une liaison à O % de recombinaison. Ceci donne une distance génétique inférieure à 5 cM (ou 6,5 cM) pour un intervalle de confiance de 90 % (ou 95 8 respectivement). Déficit en G6PDH Le risque d'erreur de diagnostic est évalué indirectement à partir des distances génétiques entre St14 et Hem A d'une part et Hem A et G6PDH d'autre part. Les évaluations donnent une distance génétique inférieure b 10 cM. Adrenoleucodystrophie (ALD) Le risque d'erreur est évalué de la même manière que pour G6DPH mais considérant en plus la distance génétique entre G6DPH et ALD. Les évaluations donnent une distance génétique entre G6DPH ou ALD et St14 inférieure à 10 cM Débilité mentale liée au site fragile de l'X (X fra) Pourcentage de recombinaison entre St14 et X fra environ 11 %. Si l'on utilise en association la sonde F IX (PI) pour laquelle 40 % des femmes sont hétérozygotes, le pourcentage de recombinaison avec X fra est de 11 %, on peut donc réduire le risque d'erreur de diagnostic à moins de 2 % dans les cas où la femme est hétérozygote pour les deux sondes en même temps (36 % des cas). Pour ces maladies, on dispose donc, grâce aux sondes selon l'invention, de la possibilité d'effectuer un diagnostic anténatal avec un prélèvement de liquide amniotique à la 16ème semaine ou un prélèvement de villosités trophoblastiques à la 12ème semaine. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. EXEMPLE 1 Préparation de la inonde Stl4 Cette sonde est obtenue par sous clonage des inserts de la banque A de DAVIES X.E. et coll. (1981), enrichie en fragments spéclfiques du chromosome X humain (50 t), dans pBR329. On détecte ensuite les clones ne contenant pas de séquences très répétitives, c'est-b-dire les clones négatifs, après hybridation avec un ADN génomique total. Parmi ces clones, on recherche ceux localisés sur le chromosome X par"southern blot"et présentant un polymorphisme de longueur de fragments de restriction. On obtient ainsi un clone portant un fragment EcoRI de 9,3 kb qui sera appelé sonde St14. EXEMPLE 2 Préparation de la sonde St141 Cette sonde est obtenue par criblage à l'aide de la sonde St14 d'une librairie génomique partielle établie dans le vecteur d'insertion B1149 à partir d'un digest total par EcoRI de l'ADN d'un placenta féminin et après enrichissement en séquences St141 par chromatographie en phase réverse. St141 est un fragment EcoRI de 3 kb. Bien entendu, en utilisant cette méthode, il est possible de préparer d'autres sondes. EXEMPLE 3 La taille et la fréquence des fragments TaqI alléliques mis en évidence par la sonde St14 ont été mises en évidence dans une population essentiellement caucasienne sur 200 chromosomes X et sont les suivantes TABLEAU I Allèle Taille Fréquence (kb) (%) 1 6,6 0,5 2 5,4 2A 5,2 t 4,5 3 4,8 12 4 4,5 36 5 4,1 6 4,0 20,5 7 3,9 10,5 7A 3,6 0,5 8 3,4 15,5 Ces allèles sont numérotés par ordre de taille décroissante. Les allèles 2 et 2A et les allèles 5 et 6 sont parfois difficiles à différencier. EXEMPLE 4 Comme cela a été indiqué précédemment, il peut être nécessaire, dans certains cas, d'utiliser une enzyme de restriction autre que TaqI. Des déterminations du même type que dans l'exemple 3 ont permis d'obtenir les résultats suivants qui concernent la fréquence des allèles et haplotypes détectés par la sonde St14 dans l'ADN humain digéré par MspI (tableau Il) TABLEAU II Allèle Taille Fréquence Nombre de ou haotype (kob) (%) analyses 1 4,4 45,6 68 2 3,6 54,4 3 2,0 69,9 73 4 1,6 30,1 5 1,0 36,8 38 13 - 35,1 14 - 10,5 57 23 - 35,1 24 - 19,3 EXEMPLE 5 La figure 1 reprdsente la filiation d'une famille présentant une ALD. Cette famille a, à l'origine, été considérée comme difficile pour le polymorphisme TaqI car les deux soeurs (II 2 et Il 3) étaient homozygotes pour l'allèle 4. On a donc utilisé l'enzyme MspI. L'ADN de divers membres de la famille et du foetus à risque (III 4) ont été digérés avec MspI et hybridés avec St14. II 2 et II 3 sont hétérozygotes pour deux allèles polymorphiques (fragments M 1 et M 2). Elles ont hérité de l'allèle 2 de leur mère I 1. Les deux sujets mâles malades III 1 et III 3 présentent également l'allèle 2, de même que le foetus mâle III 4. Ces résultats montrent une absence de recombinaison sur 4 meloses (2 phases inconnues dans la génération II et 2 phases connues dans la génération III) et suggèrent que le foetus a de très fortes chances d'être atteint (# 90 %). Ceci sera confirmé par des analyses biochimiques. BIBLIOGRAPHIE DAVIES K.E., YOUNG B.D., ELLES R.G., HILL M.E. et WILLIAMSON R. (1981) Nature 293, 374-376. REVENDICATIONS 1) Sonde ADN caractérisée en ce qu'elle reconnaît le locus polymorphique de la région q28 du chromosome X prdsentant au moins 8 allèles différents dans la population définie comme suit par digestion avec l'enzyme TaqI 6,6 kb 5,3 kb 4,8 kb 4,5 kb 4,1 kb 4,0 kb 3,9 kb 3,4 kb. 2) Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est radioactive. 3) Sonde selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est marquée au 32p. 4) Sonde selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est pourvue d'un système de marquage non radioactif. 5) Sonde selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est marquée par une enzyme.