Brevet FR2581456A1 — publié le 19861107

Villine humaine, en tant aue marqueur de cellules malianes primaires originaires du tube digestif. et moyens en Particulier anticorps dirigés contre la villine humaine. Pour la détection desdites cellules malignes. L'invention est relative à des moyens de diagnostic in vitro de l'existence ou non chez l'homme des proliférations de cellules malignes à partir de cellules tumorales du tube digestif, plus particulièrement du type adénocarcinome. Ces moyens concernent tant des procédés de diagnostic in vitro. que des éléments matériels susceptibles d'être mis en oeuvre dans ces procédés, plus particulièrement des anticorps, de préférence monoclonaux, dirigés contre la villine humaine. L'invention étend encore ses effets aux différentes applications de ces anticorps monoclonaux, par exemple à la purification de la villine humaine à partir d'extraits cellulaires la contenant. A ce titre, l'invention concerne aussi la villine humaine purifiée elle-même. Il a déjà été proposé d'avoir recours à la détection de protéines de structure en tant que marqueurs spécifiques pour l'identification de certains types de cellules d'eucaryotes supérieurs et pour l'étude du suivi des différentes étapes de leur développement, notamment au cours de leur différentiation. A titre d'exemples de marqueurs connus, on mentionnera des protéines de filaments, par exemple la vimentine, des kératines ou des protéines de neurofilaments, qui ont permis l'identification de certains types de cellules, l'étude de leur développement, à partir du stade de l'embryogénése jusqu'au stade ultime de la différentiation cellulaire, ainsi que de leur comportement vis-à-vis du milieu environnant (E. LAZARIDES, Nature, 283. 249 (1980) et R. MOLL et al., Cell 31, 11 (1982). Les kératines sont souvent considérées comme des marqueurs particulièrement efficaces, permettant de distinguer les cellules épithéliales et les cellules non épithéliales. Ceci étant, il a été établi que ce type de distinction ne permettait pas toujours d'établir de fa çon non ambiguë l'origine des cellules en cause. Pourtant la nécessité d'établir de façon certaine l'origine de certains types de cellules revêt une importance particulièrement importante dans un grand nombre de cas, par exemple lorsqu'il s'agit, à l'occasion de l'examen d'un prélèvement biologique témoignant d'une prolifération de cellules tumorales d'identifier les cellules tumorales primaires, se trouvant à l'origine de cette prolifération, ou encore de détecter l'existence de métastases dont l'origine serait un cancer de la région digestive ou encore de vérifier l'efficacité d'un traitement chimiothérapeutique ou autres contre des métastases cancéreuses. On sait bien que l'efficacité d'un traitement anticancéreux peut être liée à l'identification précise des cellules tumorales qui sont la cause première de la maladie. Ces observations s'appliquent avec une force particulière à la détection, de préférence précoce, de proliférations de cellules tumorales d'origine digestive (responsables d'une importante proportion des cancers observés en clinique) ou rénales, ou de cellules dérivées des cellules précédentes, plus particulièrement à l'identification de marqueurs caractéristiques de ces cellules. L'invention s'intéresse donc plus particulièrement à la détection de cellules tumorales qui ont conservé certains des phénotypes essentiels des cellules épithéliales normalement présentes dans les muqueuses de l'appareil digestif, plus particulièrement les muqueuses intestinales, et dont les types différenciés majeurs sont constitués par les cellules absorbantes ou entérocytes.Plus particulièrement encore l'invention se rapporte à des marqueurs spécifiques susceptibles d'être détectés, qu'ils soient ou non portés par ces cellules tumorales. En particulier l'invention vise à permettre la détection de ces marqueurs, même lorsqu'ils sont détachés desdites cellules tumorales, notamment à l'occasion de la nécrose de ces cellules, et libérés, par exemple dans la circulation sanguine. Le marqueur mis en jeu dans le cadre de la présente invention est constitué par tout ou partie de la villine, une protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 95.000 daltons, qui est normalement présente dans les villosités des muqueuses digestives, plus particulièrement intestinales. La villine est capable de se lier à l'actine, en présence d'ions calcium. La villine est présente plus particulièrement dans les bordures en brosses qui sont observées à la surface des entérocytes, notamment lorsque ceux-ci ont atteint leur stade ultime de différentiation, au niveau des parois de la lumière intestinale. Les micro-villosités sont constituées en organelles assemblées dans le stade final de la différentiation des entérocytes. La villine est plus particulièrement localisée dans les faisceaux de micro-filaments axiaux de ces villosités.Elle contribue à la constitution de leur cytosquelette. Par examen de coupes congelées en immunofluorescence, -il a pu être constaté que la villine était- présente au pôle apical des cellules allongées formant des colonnes affleurant à la paroi interne de l'intestin, et également à proximité des cellules tubulaires proximales du rein. Dans les deux cas il s'agit de régions coincidant avec la bordure en brosse des cellules concernées. Mais la villine n'a pas été détectée au niveau de divers autres types de villosités de divers autres épithéliums, lorsque celles-ci étaient dépourvues d'une bordure en brosse très organisée (A. BRETSCHER et al, Exp. Cell. res., 135, .213 (1981) ou encore article de H. REGGIO et al, publié dans l'ouvrage intitulé "Membranes in Growth and Development" (Membranes en cours de croissance et de développement) de A. LISS, New York ((1982) pp. 89-105). Il a en outre été constaté que la villine était présente dans les entérocytes dans un stade précoce de leur développement, bien avant la mise en place de la bordure en brosse. L'invention résulte d'une double découverte. La villine reste détectable de façon pratiquement systématique au cours de la tumorigénèse des tisus du tube digestif, et plus particulièrement dans les cancers du colon, l'une des formes de cancers parmi les plus répandues et aussi dans certains types de cancers rénaux, alors que la villine n'était jamais détecté dans des cellules tumorales primaires résultant de la cancérisation initiale de tissus localisés dans d'autres organes (foie, ovaires, poumons, etc.). En outre, la villine est détectable in vivo à tous les niveaux du développement des cellules tumorales de la région digestive, tant au stade précoce de la tumorigénèse qu'aux stades les plus tardifs,. quel que soit l'état de différenciation des cellules en cause. Le procédé de diagnostic selon l'invention, qui a essentiellement pour but la détection in vitro de cellules tumorales initialement formées dans la région digestive et/ou dérivées de celles-ci dans un prélèvement biologique suspecté d'avoir un caractère tumoral, est caractérisé par la mise en contact de ce prélèvement biologique avec un réactif présentant une affinité spécifique pour la villine. Le procédé de diagnostic selon l'invention est applicable à tout échantillon biologique susceptible de contenir des cellules tumorales d'origine digestive ou des cellules tumorales éventuellement formées dans d'autres régions de l'organisme, sous l'influence de cellules primaires d'origine digestive ou rénale, ou encore à tout échantillon biologique susceptible de contenir des produits de dégradation de ces diverses cellules tumorales, y inclus le marqueur villine, à l'occasion de la nécrose desdites cellules. Cet échantillon biologique peut consister en toutes formes de prélèvements fragments de tissus ou de tumeurs solides, par exemple obtenus par biopsie, ou encore prélèvement de liquides biologiques, plus particulièrement de sang total ou de sérum sanguin, soupçonné de véhiculer des cellules malignes ou des fragments originaires de celles-ci. De préférence, les techniques mises en oeuvre dans ces procédés de diagnostic font appel à des techniques immunologiques, le réactif présentant une affinité spécifique pour la villine étant alors constitué par des anticorps suseptibles de reconnaître la villine. Ces anticorps sont eux-mêmes marqués de toute façon en soi connue, ou sont reconnaissables à leur tour, lorsqu'ils sont à l'état fixé sur la villine ou les tissus la portant, par des immunoglobulines marquées ou autres protéines marquées (par exemple la protéine A de Stanhvlo- coccus aureus). Des techniques particulièrement appropriées sont celles qui ont été mises en oeuvre dans les essais qui seront décrits plus loin, et qui ont conduit aux constatations qui ont été faites dans ce qui précède. Mais l'invention a aussi pour but de fournir des moyens nouveaux spécifiques, en particulier des anticorps monoclonaux, pour la détection de la villine au niveau des micro-villosités des entérocytes ou cellules analogues (étant entendu que l'utilisation de ces moyens nouveaux n'est pas nécessairement limitée à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic conforme à l'invention). Avant d'aborder la définition des anticorps monoclonaux selon l'invention, il peut être utile de faire un retour en arrière sur les propriétés connues des villines, du moins lorsque celles-ci peuvent, à l'aide des techniques de purification connues, être obtenues à l'état pratiquement purifié. C'est le cas pour les villines de poulet ou de porc. Ce n'est pas le cas de la villine humaine. L'une des villines les mieux connues est celle du poulet. Elle est formée d'une séquence de 854 acides aminés. Elle peut être coupée par protéolyse ménagée avec la trypsine et la protéase V-8 en des points déterminés, pour produire des fragments 44 Kd, 51 Kd et 10 Kd dont les positions relatives apparaissent dans la carte, de la villine, d'après Paul MADSUDAIRA, MRC, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, U.K. et John GLENNEY et al, J.B.C., 1981, 256, 8156-8161, qui s'établit comme suit Site de liaison à 1 'actinie, indépendante de la présence de calcium V8 10 Kd (HP) site de liaison à 1 'actinie, dépendant de la présence de calcium Ti : rupture trypsique V8 : rupture avec la protéine V8. région connue quant à la séquence en acides aminés La séquence en acides aminés de la partie Cterminale (779-854) ou "partie de tête" (head piece ou "peptide HP") est la suivante 1 10 11 Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Thr-Thr-Leu-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Glu- 20 Thr-Phe-Pro-Leu-Asp-Val -Leu-Val -Asn-Thr-Ala-Ala-Glu-Asp- 30 31 40 41 Leu-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-Pro-Ser-Arg-Lys-Glu-Asn-His-Leu- 50 51 Ser-Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Ala-Val-Phe-Gly-Met-Thr-Arg-Ser- 60 61 70 71 Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Trp-Lys-Gln-Gln-Asn-Leu-Lys-Lys-Glu Glu-Lys-Gly-Leu-Phe Le perfectionnement supplémentaire de l'invention s'appuie sur le fait que les villines, originaires de différentes espèces, possèdent des épitopes communs, accessibles à des anticorps monoclonaux reconnaissant de façon spécifique non seulement la villine particulière ayant servi à l'immunisation de l'animal, dont les cellules spléniques avaient été fusionnées avec les cellules de myélome appropriées à la production des hybridomes secréteurs desdits anticorps monoclonaux, mais reconnaissant de façon aussi spécifique des villines originaires d'autres espèces, y inclus l'espèce humaine. Un anticorps monoclonal préféré selon l'invention est donc caractérisé par les propriétés suivantes - Il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blotting). - Il reconnait la villine de poulet (Western Blotting). - il reconnaît la villine d'extrait cellulaire de la lignée dérivé d'un adénocarcinome de colon humain : HT29 (Western Blotting). - Il reconnaît la villine de rat en immunocytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées au formaldéhyde). Un anticorps monoclonal préféré parmi ceux qui répondent à la définition précédente reconnait également un épitope contenu dans le "peptide HP" de la villine de poulet, la reconnaissance étant possible tant à l'égard du peptide HP préalablement isolé qu'à l'égard du peptide S1Kd contenant encore le peptide HP ; cet anticorps ne reconnaît ni le peptide 44Kd ni le peptide 44Kd de la villine de poulet. L'anticorps préféré de l'invention reconnaît d'ailleurs la protéine HP, aussi bien à l'état dénaturé, notamment après traitement par le dodécylsulfate de sodium (SDS) que sur les cellules épithéliales porteuses de la villine), ce résultat démontrant par conséquent que l'épitope porté par le peptide HP n'est pas masqué par d'autres protéines dans le milieu cellulaire. L'invention concerne naturellement également les hybridomes secréteurs de ces anticorps monoclonaux. Une technique avantageuse pour produire ces hybridomes, notamment par fusion de cellules spléniques de souris immunisées contre la villine purifiée de porc, d'une part, et de cellules d'un myélome approprié, sera décrit plus loin. L'hybridome préféré ainsi obtenu (souche BD-D 2C3) a été déposé à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'institut Pasteur de Paris, le 29 Avril 1985, sous le n 1-440. il va cependant de soi que tout autre agent immunogène contenant le même épitope peut être utilisé par par exemple, le peptide HP lui-même, le cas échéant greffé au préalable sur une molécule porteuse, telle que la sérumalbumine bovine, en vue d'accroître ses propriétés immunogenes. il apparaîtra clairement à l'homme du métierqu'ayant en mains l'anticorps monoclonal préféré selon l'invention, il est à même de définir la région épitopique caractéristique du peptide HP. Pour l'identifier de façon plus précise, il pourrait notamment avoir recours à un procédé comprenant les étapes suivantes - synthèse d'une séquence polynucléotidique codant pour le peptide HP (ou pour la partie de peptide HP dont il est raisonnable de présumer qu'elle contient l'épitope recherché), - insertion de la séquence polypeptidique dans un plasmide et clonage de ce plasmide, - linéarisation dudit plasmide au niveau d'un site de restriction extérieur à ladite séquence plus petite, - émondage de façon contrôlée du plasmide linéarisé avec une enzyme exonucléolytique, telle que l'enzyme Bal 31, - recircularisation du plasmide au moyen d'une ADN-ligase, - transformation d'un microorganisme approprié, lui-même transformable par le plasmide correspondant et capable d'exprimer l'insérant contenu dans celui-ci, - remise en contact des produits d'expression de ce microorganisme avec l'anticorps considéré, le cycle d'opérations qui vient d'être défini étant répété jusqu'à la disparition de la détection dudit peptide immunogène parmi les produits d'expression dudit microorganisme transformé par le dernier plasmide recircularisé. Il est possible, au terme de chacun des cycles du procédé sus-défini, notamment séquençage des parties d'extrémité du plasmide avant et après la dernière opération d'émondage, ayant conduit à la perte de capacité de reconnaissance du plasmide recircularisé intermédiaire, de situer l'épitope au niveau du peptide codé par la séquence nucléotidique éliminée au cours de cette dernière opération d'émondage. C'est dire que le fait pour l'homme du métier de disposer de l'anticorps monoclonal sus-indiqué est équivalent à la mise à sa disposition de la séquence peptidique définie chimiquement et contenant cet épitope. L'invention concerne également la villine humaine pratiquement pure biologiquement, réagissant avec l'anticorps monoclonal préféré susdit et ne donnant essentiellement qu'une seule bande dans des essais de migration en électrophorèse sur gel de polyacrylamide, notamment SDS-PAGE. En effet, la villine humaine peut être extraite d'un lysat d'entérocytes humains, notamment obtenu par traitement de ces derniers avec une solution aqueuse contenant un détergent approprié, et purifiée à l'aide du susdit anticorps monoclonal. Un procédé de purification de ce type met en jeu l'anticorps monoclonal avantageusement immobilisé sur un support solide, de préférence adapté à des opérations de chromatographie d'affi nité. Par exemple, l'anticorps monoclonal est fixé sur un réseau d'agarose à réticulation tri-dimensionnelle, commercialisé sous la marque SEPHAROSE par la société suédoise PHARMACIA A.G., par exemple par la méthode au bromure de cyanogène. L'invention concerne donc plus particulièrement un procédé de séparation de la villine humaine caractérisé par les opérations consistant à faire passer une solution la contenant au contact d'une colonne d'affinité portant le susdit anticorps monoclonal, pour fixer sélectivement la villine humaine, puis à récupérer celle-ci par dissociation du complexe antigène-anticorps soit par tampon acide à pH 2-4 à base de glycine, soit par un tampon basique à base de méthylamine, pH 11, puis à dialyser contre un tampon d'acétate d'ammonium. Il va de soi que l'invention concerne également des polypeptides de poids moléculaires plus faibles consistant en des fragments de villine humaine. Il apparaîtra clairement au spécialiste que les fragments pourront être obtenus par découpage de la villine humaine par des enzymes de coupure de polypeptides en des sites spécifiques. A titre d'exemple de telles protéines, on mentionnera en premier lieu la trypsine ou la protéase de Stanhvlococcus aureus V8, l'alpha-chymotrypsine, la "protéase de glande sous-maxillaires de souris" (mouse submaxillary gland protease) commercialisée par la Société BOEHRINGER, la collagénase de Vibrio alginolyticus chemovar iohagus, qui reconnaît spécifiquement lesdits peptides Gly-Pro et Gly-Ala, etc. Il va sans dire que font alors également partie de l'invention - les hybridomes et anticorps monoclonaux spécifiques d'espèce ou non qui peuvent être fabriqués à partir de la villine humaine ou de ses fragments, - les ADNs ou ARNs codant pour la villine humaine, dès lors qu'ils peuvent être localisés en mettant en oeuvre des études de structure facilitées par la connaissance qui peut être acquise de tout ou partie de la structure polypeptidique de la villine, ou des ADNs synthétiques, ou semi-synthétiques, par exemple des cADNs obtenus à partir des mARNs correspondant, par transcription reverse de ces derniers selon des techniques bie connues de l'homme de métier. Il va de soi que l'inventin est également relative aux ADNs recombinants constitués par des vecteurs, notamment plasmides, contenant des insérats formés de tout ou partie de ceux dits ADN ou cADNs. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaitront encore à la lumière de la description qui suit des conditions particulières indiquées seulement à titre d'exemples, dans lesquelles la villine humaine peut être détectée in vivo, des hybridomes conformes à l'invention peuvent être produits et les anticorps monoclonaux ainsi obtenus, être-mis en oeuvre dans des essais de détection de la villine, notamment pour des épreuves de diagnostic in vitro. L'expression de la villine peut être étudiée in vivo à différents stades de la prolifération de cellules tumorales ou non originaires des régions digestives ou rénales d'une part, et d'autres régions de l'organisme d'autre part. Partant des tissus concernés, ceux-ci ont été congelés, fixés et préparés dans des conditions à permettre la réalisation de coupes (cryocoupes) selon la technique décrite par BROWN et FARQUHAR, Cell. 36, 295 (1984). Des coupes ayant des épaisseurs de 5 pm ont été obtenues à -25iC et déposées sur des lames de verre recouvertes de polylysine. Après trempage dans une solution d'un tampon constitué d'une solution saline de phosphate et contenant 0,2 % de gélatine (PBS-gélatine), les coupes ont été traitées pour détecter la villine à l'aide d'une solution contenant 50 pl d'antisérum de lapin antivilline dilué au 1/800- dans la PBS-gélatine, puis incubées pendant 25 minutes à la température ambiante dans une chambre humide. Les coupes ont ensuite été lavées trois fois pendant 10 minutes dans la PBS-gélatine. Des anti-IgG de lapin marqués par la rhodamine (produit par la Société néerlandaise Nordic Immunological Laboratories) ont ensuite été ajoutés et les coupes incubées en présence de ces anti-IgG à la température ambiante pendant 25 minutes. Les coupes ont ensuite été lavées de façon complète dans la PBS-gélatine, puis montées pour examen sous microscope à fluorescence (Photomicroscope ZEISS) équipé de lentille à immersion dans une huile Plan Néofluar et d'un jeu de filtres appropriés. Les tissus témoins ou les tissus tumoraux d'autres origines ont été traités de la même manière. Les observations suivantes ont pu être faites: Lorsque les tissus provenaient d'adénocarcinomes du colon, 11 observations sur 12 se sont révélées positives pour ce qui est de l'expression de la villine. Des tumeurs humaines d'autres origines telles que des lymphomes, notamment lymphomes de nodules mésentériques et des types variés de carcinomes d'autres origines résultant des métastases ou non au niveau du pancréas, de l'oesophage, n'ont pas exprimé la protéine. D'une façon générale, les observations ont montré une corrélation étroite entre l'origine intestinale primaire de tumeurs traitées et l'expression de la villine. Les nombreux essais réalisés sur des tueurs manifestement d'origine distincte se sont pratiquement dans tous les cas révélés négatifs au niveau de l'expression de la protéine. Il est à remarquer que dans les tissus d'origine intestinale, la villine a toujours été observée, quel que soit le degré de prolifération desdites cellules Les essais qui précèdent ont été réalisés avec des anticorps polyclonaux. Des résultats beaucoup plus nets peuvent être obtenus avec l'anticorps monoclonal préféré qui a fait l'objet d'un dépôt à la CNCM. Les conditions dans lesquelles les hybridomes secréteurs de ces anticorps monoclonaux ont été isolés seront décrites ci-après à titre d'exemples. Il sera également indiqué un mode de mise en oeuvre préféré des conditions dans lesquelles le diagnostic de la présence ou non de villine peut etre détecté dans des essais immunologiques du type ELISA. A) PROGRAMME D'IMMUNISATION - Souris Balb/C go 6 à 8 semaines. - Antigène : villine de porc purifiée (10 mg/ml) (bande homogène après électrophorèse de la protéine sur gel de polyacrylamide (10 %) en présence de SDS de poids moléculaire 95Kd) 10 mM Imidazole 75 mM HCl 1 mM EGTA . 0,1 M DTT 50 % Glycérol. - Proaramme - Jour O : Injection en IP de 50 tjg de villine pure dans une émulsion 50/50 (PBS-Adjuvant de Freund Complet). Jour 14 : Rappel en IP 50 g de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet). Jour 21 : Rappel en IP 50 ijg de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet). . Jour 28 : Injection en IM de 20 g de villine pure en solution dans du PBS. Jour 29 : Injection IV de 10 pg-de villine pure en solution dans du PBS. Jour 32 : Fusion. B) FUSION I) Cellules Parentales a) Cellules de myélome . Lignée Sp2/0-Ag14 (8 Azaguanine résistant). Culture stérile en milieu DMEM 10 % FCS. b) Cellules sPléniaues : Origine : rate de souris # Balb/C hyperimmunisée contre la villine de porc. II) Procédé de fusion cellulaire selon Kùhler G. et Milstein C. (Continuous culture of fused-cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 1975, 256, 495). - Fusion en milieu DMEM sans sérum dans des conditions stériles, en présence d'une solution de polyéthylèneglycol (PEG 1000-Merck 9729) à 50 % dans un milieu DMEM sans sérum. Après dénombrement des deux types de cellules parentales, la suspension de cellules- de myélome en culture est mélangée à la suspension de cellules spléniques dans la proportion de 1 pour 5. - Contact 2'30". - Arrêt de l'action du PEG par dilution en milieu DMEM complet. - Dilution finale de la suspension cellulaire (2x105 cellules/ml) dans du milieu sélectif DMEM-HAT. - Distribution dans puits boite COSTAR-24 trous 1 ml/puits (COSTAL Tissue Culture Cluster 24, Cat. N 3524, COSTAR 205 Groadway, Cambridge, Ma. USA). III) Sélection des clones Les clones sont identifiés pour leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre la villine purifiée de porc. C) METHODE DE SELECTION I) Test ELISA : Ce test permet la mise en évidence d'anticorps monoclonaux anti-villine dans les surnageants de culture après fusion. - Fixation de l'antigène sur support (plaque ELISA) Concentration : 5 pg/ml dans un tampon phosphate de potassium 50 mM pH 8, 1 nuit à 4 C. - Saturation avec PBS-Tween 20-BSA. - Incubation I avec surnageant d'hybridome non dilué, 3 heures à 4 C. - Incubation II avec des anti-IgG de souris marquées à la bêta-galactosidase, 2 heures à 4"C. Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du PBS-Tween 20 0,1 %. - Substrat O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (Sigma N11-27) dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,0. 10 3 M MgSO4. 2x1O3 M MnS04. 2x10 3 M magnésium Tritriplex déshydraté (merci 8409). Lecture : DO 414 nm. Les clones sélectionnés sont ceux pour lesquels les surnageants d'hybridome donnent une DO supérieure à 10 fois la DO du bruit de fond. II) Western Blottis selon Burnette. Anal. Biochem. 1981, 112, 195-203. Ce test permet de sélectionner les clones sécrétant des anticorps monoclonaux anti-villine de porc, reconnaissant également la villine humaine et la villine de poulet, parmi les clones positifs pour le test ELISA. Différentes étaPes du test a) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide d'un extrait cellulaire de la muqueuse intestinale de poulet et d'un extrait cellulaire de la lignée HT29 (adénocarcinome de colon humain) exprimant la villine. b) Electrotransfert des protéines séparées sur gel de polyacrylamide sur papier de nitrocellulose. c) Incubation dû papier de nitrocellulose sur lequel les protéines cellulaires ont été transférées avec les surnageants d'hybridomes préalablement sélectionnés en ELISA 1 nuit à 4 C. d) Incubation 1 heure à température ambiante avec des anti-IgG de souris marquées à la peroxydase. e) substrat - 10 mg tétrahydrochlorure de diaminobenzidine. - 20 ml 0,1 M Tris HCl pH 7,6. - 0,2 ml H202 à 1 %. Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du sérum de veau nouveau-né-PBS-Triton X100. f) réaction positive : apparition rapide d'une bande marron (poids moléculaire 95Kd) si la réaction antigène-anticorps monoclonal a eu lieu. D) CLONAGE DES HYBRIDES SELECTIONNES - Méthode des dilutions limitées Dilution en milieu sélectif des clones posi- tifs de façon à ne distribuer qu'une cellule par puits (plaques 96 trous) sur des macrophages (origine souris Balb/C, 4 semaines) attachées au fond des puits. Addition de milieu sélectif conditionné. - Sélection des clones positifs selon les méthodes précédemment énoncées. - Reclonaae si nécessaire. E) PREPARATION D'ASCITES - Les clones sélectionnés sont injectés à des souris (qui ont subi une injection de "PRISTANE" (Aldrich, 2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) 4 à 5 jours avant). - 1 à 2x106 cellules injectées/souris. - Récupération au bout de 10 à 15 jours du liquide d'ascite contenant les cellules du clone qui ont proliféré. Le liquide d'ascite a un taux d'anticorps monoclonal anti-villine supérieur à 1 mg/ml. = Congélation des clones sélectionnés en milieu DMEM 10% FCS-5% DMSO. Conservation dans azote liquide à -176vC. = AdsorPtion des IaG purifiées à partir de l'ascite BD-D2C3 en concentration constante sur des plaques ELISA. L'anticorps a été purifié par chromatographie d'échange d'ions (DEAE-Tris acryl) et sur colonne d'hydroxyapatite. . Concentration à établir. Incubation 2 heures à 37in, puis 1 nuit à 4 C. Lavage dans PBS/Tween 20 0,1 %. = Saturation des Plaques Incubation 30 minutes eK présence de PBS/Tween 20 0,1 s/BSA 0,4%. = Addition de l'antigène Gamme de concentration décroissante de la villine purifiée de 5 g/ml à 1 ou 0,1 ng/ml en présence de BSA 0,4 . Incubation 3 heures à 4 C. . Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 %. = Addition des IqG purifiées à partir d'un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la villine et couplées à la bêta-galactosidase. . Incubation 2 heures à 4 C. Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 %. = Détection de la bêta-qalactosidase Addition de 20 mg de p-nitrophényl-bêta-D-galactopyrannoside à partir d'une solution à 4 mg/ml, dans 20 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7, MgSO4 10 3 M, MnSO4 2x10 M, EDTA (Merck 8409) 2x10 3 M. . Incubation x heures à 37'C. Lecture densité optique à 414 nm. REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic pour la détection in vitro de cellules tumorales initialement formées dans la région digestive et/ou dérivées de celles-ci dans un prélèvement biologique suspecté d'avoir un caractère tumoral, caractérisé par la mise en contact de ce prélèvement biologique avec un réactif présentant une affinité spécifique pour la villine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif présentant une affinité spécifique pour la villine est constitué par des anticorps antivilline, ces anticorps reconnaissant la villine humaine. 3. Anticorps monoclonaux dirigés contre la villine caractérisés par les propriétés suivantes - Il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blottinq) - Il reconnaît la villine de poulet (Western Blotting). - Il reconnaît la villine d'extrait cellulaire de la lignée dérivé d'un adénocarcinome de colon humain : HT29 (Western Blotting). - Il reconnaît la villine de rat en immunocytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées à la formaldéhyde). 4. Anticorps monoclonaux selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un site antigénique contenu- dans la séquence C-terminale (779-854) ou "partie de tête" de la villine de poulet de formule 1 10 11 Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Thr-Thr-Leu-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Glu 20 Thr-Phe-Pro-Leu-Asp-Val-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Ala-Glu-Asp- 30 31 40 41 Leu-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-Pro-Ser-Arg-Lys-Glu-Asn-His-Leu- 50 51 Ser-Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Ala-Val-Phe-Gly-Met-Thr-Arg-Ser- 60 61 70 71 Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Trp-Lys-Gln-Gln-Asn-Leu-Lys-Lys-Glu Glu-Lys-Gly-Leu-Phe lesdits anticorps monoclonaux étant capables de reconnaître ladite "partie de tête", que celle-ci soit isolée ou à l'intérieur du peptide 51Kd contenu dans la villine du poulet. 5. Hybridome producteur des anticorps monoclonaux selon la revendication 3 ou 4, notamment tel que celui déposé à la CNCM sous le N I-440 le 29 Avril 1985. 6. Villine humaine biologiquement pure ne donnant essentiellement qu'une seule bande de poids moléculaire dans les essais de migration en électroporèse sur gel de polyacrylamide.