Brevet FR2577236A1 — publié le 19860814

5.' 5"'-PlrP4-diad nosine-tétraphosphate a=,-phosphoryLase et son utilisation pour la préparation de nucléotides isotopiquement marqués. La présente invention concerne une nouvelle enzyme obtenue à partir d'extraits de levures, par exemple de Saccharomyces cerevisiae. Elle a également pour objet l'utilisation de cette enzyme, la diadénosine-tétraphosphate x,3-phosphorylase pour l'obten- tion de nucleotides isotopiquement marqués. On a en effet trouvé que cette nouvelle enzyme dégrade le 5',5"'-P1,P4-diadénosine- tétraphosphate, dénommé ci-après "Ap4A", en le phosphorylant. L'Ap4A est le produit d'une réaction secondaire de l'activation des aminoacides catalysée par la lysyl-tARN-synthétase d'Escherichia coli. On a montré que cette synthétase est également capable de produire une nouvelle familLe de composés de formules générales Ap3N ou Ap4N dans lesquelles N est un nucléoside purique ou pyrimidique. Plus récemment, il a été trouvé que plusieurs amino- acyl-tARN-synthétases de différents organismes, tels que les bactéries, les champignons, les mammifères et les plantes supérieures, sont capables de synthétiser efficacement in vitro l'Ap4A et l'Ap3A (5',5"'-P1,P3diadénosine-triphosphate). On suppose que ces composés sont produits in vivo par ces synthétases. La présence d'AP4A a été démontrée dans un certain nombre de systèmes vivants, tels que Les tissus de mammifères, Les bactéries, les protozoaires, Les invertébrés et les organismes Ph sarum polycephalum et Saccharomyces cerevisiae. L'Ap3A a été récemment identifié à la fois dans Les cellules eucaryotes et les cellules procaryotes. - A côté des composés cites ci-dessus, il existe dans la nature une autre famille de dinucLéosides oligophosphates; il s'agit des composés guanytés Gp4G, Gp3G, Gp2G et Ap3G qui ont été identifiés chez certains crustacés. Dans ces formules, G désigne la guanosine. Les produits Gp4G et Gp3G, qui sont respectivement le diguanosine tétraphosphate et Le diguanosine triphosphate sont synthétisés par La guanylyltransférase chez plusieurs organismes. Récemment, il a été montré qu'une enzyme purifiée obtenue à partir de levure produit in vitro des dinucléosidestri- et tétra-phosphates de type Gp3N et Gp4N, dans lesquels N désigne L'adénosine, la gua- nosine, la cytidine on l'uridine. Le r6le biologique des dinucléosides oligophosphates n'est pas très bien connu. Cependant, on sait que les dinuctéosides oligophosphates Gp4G et Ap4G peuvent réguler le métabolisme des purines. On a trouvé par ailleurs que le Gp4G a un effet positif spécifique sur la GMP-réductase obtenue à partir d'Artemia et d'érythrocytes humains et que l'Ap4A double l'activité de l'AMP-désa- minase obtenue à partir de muscles de rat. Enfin, on pense que l'Ap4A intervient dans la régulation de la réplication de l'ADN. Son taux dans les cellules varie en fonction de l'activité proli- férante des tissus ou avec le cycle des cellules et,en interagis- sant avec l'ADN-polymérase a, il amorcerait.la synthèse de 1'ADN. L'hypothèse que les dinucléosides oligophosphates jouent un rôle important dans le métabolisme cellulaire est renforcée par le fait qu'en plus des enzymes qui peuvent synthétiser ces produits il existe des activités enzymatiques qui les catabolisent. Dans les extraits de cellules eucaryotes, l'Ap4A et ses analogues sont attaqués par une phosphodiestérase qui libère le nucléoside 'monophosphate. De plus, chez certains organismes, on a trouvé deux enzymes distinctes hautement spécifiques qui hydrolysent les dinucléosides oligophosphates. L'une d'entre elles, dénommée Ap4A- hydrolase ou dinucléoside tétraphosphatase (EC 3.6.1.17), trouvée dans de nombreuses espèces, coupe préférentiellement les dinucléosides tétraphosphates etun nucléoside 5'-triphosphate est toujours l'un des produits de la réaction enzymatique. L'autre enzyme, dénommée Ap3A- hydrolase (EC 3.6.1.29), trouvée dans les tissus de rat et les graines de Lupin, utilise de préférence l'Ap3A comme substrat, mais hydrolyse aussi d'autres dinucléosides oligo- phosphates et unnucléoside 5'-diphosphate est toujours un produit de la réaction. Chez les bactéries et quelques organismes eucaryotes inférieurs, tels que Physarum polycephalum et Euqlena qracilis on a identifié un autre type d'Ap4A-hydrolase. Cette hydrolase coupe la molécule d'Ap4A de façon symétrique pour donner deux molécules d'ADP EL.D. BARNES et C.A CULVER Biochemistry 2,1 6123- 6128 (1982); GURANOWSKI et al. J. Biol. Chem. 258 14784-14789 (1983)]. 257?7236 On a maintenant trouvé que L'Ap4A et certains autres dinucléosides oligophosphates peuvent être dégradés phosphoroly- tiquement par action d'une nouvelle enzyme provenant d'extraits de levures, notamment de la levure Saccharomyces cerevisiae. L'enzyme selon L'invention, dénommée 5',5"'-P1-4 diadénosine tétraphosphate ",O-phosphoryLase ou-Ap4A-",O-phos- phorylase est obtenue à partir d'extraits bruts de Levure en mettant en oeuvre des moyens cLassiques de séparationet de purification. Par exemple, elle peut être obtenue par fractionnement, à L'aide de sulfate d'ammonium, d'un extrait brut de Saccharomyces cerevisiae et purification par filtrationset chromatographies successives sur différents gels. Cette enzyme, qui sera décrite plus en détaiL ci- après, catalyse la coupure phosphorolytique de L'une des liaisons anhydrides entre les résidus phosphates a et f de L'Ap4A ou d'autres dinucléosideoligophosphates. Lephosphate substrat du milieu se retrouve toujours incorporé dans Le nucLéoside 5'-diphosphate correspondant produit. L'enzyme selon L'invention permet notamment L'incor- poration d'isotopes, radioactifs ou non, de L'ion P04 en position du 5'-ADP, du 5'-GDP ou d'un 5'-NDP formés au cours de La dégra- dation enzymatique selon les réactions suivantes: AppppA + p* -4 Appp + p*pA GppppG + p*.- Gppp + p*pG NppppN + p* --- Nppp + p*pN o p* désigne le phosphate à incorporer. L'Ap4A-a,o-phosphorylase catalyse également une réaction d'échange entre le p-phosphate d'un nucléoside diphosphate (NDP) et de l'orthophosphate marqué selon Le schéma réactionnel: Npp + p* - ' Npp* + p Ainsi, la présente invention concerne égaLement L'uti- lisation de la diadénosine tétraphosphate a,f-phosphorylase pour La préparation de nucléotides isotopiquement marqués, soit par dégra- dation phosphorolytique d'Ap4A ou d'autres dinuctéosides oligo- phosphates contenant au moins quatre résidus phosphates Liant Les nueléotides par Leur carbone 5', soit par échange entre le 0=phos- phate d'un nucléoside diphosphate et de L"orthophosphLate rqueo Elle concerne en particuLier l'utilisation de cette enzyme pour L'incorporation de 32p et celle des isotopes de L'oxy- gène 180 et 170. L'utiLisation de kinases connues permet ensuite les conversions ci-après: kinase P*pA (ou G) + p*pA (ou G) kinaseA (ou G) pp*p* + A (ou G) p N + App*p* - Np* + App* Np + App*p* - Npp* + App* L'enzyme selon l'invention, couplée à ces kinases, permet donc l'obtention de différents mono-, di- et tri-nucléotides isotopiquement marqués. L'invention concerne également les nucléotides iso- topiquement marqués ainsi obtenus. On va maintenant décrire en détail L'obtention de l'Ap4A-a,cphosphorylase à partir d'un extrait brut de Saccharomycea cerevisiae sans pour autant limiter l'invention. - - L'extrait de Saccharomyces cerevisiae a été préparé selon le mode opératoire ci-après. 700 g de poids humide de cellules fraîches de levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae ont été mis en suspension dans 700 ml de phosphate de-potassium 100 mM (pH 7,8) contenant I mM de dithioérythritol et I mM de fluorure de phénylméthyLsulfonyle. Les cettllules ont ensuite été rompues par trois passages de la suspension ainsi obtenue dans une presse Menton-Gaulin réfrigérée (600 kg/cm2). L'extrait résultant a été dilué dans du glycérol % V/V final et centrifuge pendant 60 min à 20 000 g. Le surnageant obtenu, qui constitue l'extrait brut, a été soumis à un fraction- nement avec du sulfate d'ammonium (50-70 % de saturation). Le précipité obtenu a été dissous dans un tampon phosphate contenant 20 mM de phosphate de potassium (pH 6,8),5 mM de 2-mercaptoéthanoi et 10 X de glycérol, dénommé ci-après tampon B, et dialysé contre ce tampon B. Après centrifugation, le surnageant (380 ml) a été mélangé avec du DEAESéphacel (600 ml de gel compact) et la suspension obtenue a été versée dans une colonne. Après tassement du gel, La colonne (5 x 30 cm) a été lavée avec 3 L du tampon B et ensuite un gradient Linéaire 0-0,5 M de KCL dans Le même tampon B a été appLiqué (au total 5,8 l). L'activité phosphorylase, déterminée selon le mode opératoire défini ciaprès, contenue dans Les fractions 200-300 mM KCL, a été concentrée par précipitation à L'aide de sulfate d'am- monium (70 % de saturation). Le précipité a été récolté par centri- fugation, dissous dans du tampon contenant 50 mM de phosphate de potassium (pH 6,8), 5 mM de 2-mercaptoéthanoL et 10 % de glycérol, dénommé ci-après "tampon C" et chromatographié sur une colonne de "Sephadex G-100" (4,4 x 72 cm). Les fractions actives, qui sont apparues à Ve/Vo: 1,75 (Ve = Volume d'éLution et Vo = Volume mort) ont été rassemblées et L'enzyme a été-précipitée par du sulfate d'ammonium. Après resolubiLisation et dialyse contre du tampon contenant 10 mM de phosphate de potassium (pH.6,8), 5 mM de 2-mer- captoéthanot et 10 % de glycérot, dénommé ci-après "tampon A", l'Ap4AphosphoryLase a été passée sur une coLonne de Bio-Gel HTP de Bio-RAD (hydroxyapatite; 1 x 12 cm). Apres lavage avec 30 ml du tampon A, on a appliqué un gradient linéaire: 10-150 mM de phosphate de potassium (pH 6,8) contenant 5 mM de 2-mercapto- éthanol et 10 % de glycérot (au total un volume de 120 mL). L'enzyme a été éLuée entre 50 et 80 mM de phosphate de potassium. Elle a été concentrée avec du sulfate d'ammonium, dissoute dans un petit volume (1 ml) de tampon C et chromatogra- phiée sur une colonne de Sephadex G-75 superfine (1,14 x 114 cm) équilibrée avec le tampon C. On a recueilli des fractions de 1 ml. L'activité AP4A- phosphorylase était dans les fractions 46 à 48, correspondant au plus grand pic de densité optique à 280 nm. - L'activité de l'Ap4A-phosphorylase a été déterminée à 370C. Le mélange d'incubation standard contenaitdans un volume final de 25 ou 50 pl, du tampon 50 mM acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazine éthane sulfonique (Hepes)/KOH (pH 8,2), 1 mM 2-mercapto- éthanol, 2 % de glycérol, 500 pM MnCl2, 10 mM KlP04 50.M de E3H]Ap4A (1 pmoL = 20 cpm), de la sérum-albumine bovine (0,4 mg/ml) et une solution d'enzyme diluée de façon appropriée en présence de 2 mg/ml de sérumalbumine bovine. Dans certains cas, l'activité a été suivie à l'aide de [32P]K2HPO4. Pour mesurer les vitesses initiales, de phosphorolyse, on a déposé des prélèvements de 2.l sur des couches minces de poly- éthylèneimine-cellulose contenant un indicateur fluorescent (four- nies par MERCK) après 2, 4, 8 et 16 min de réaction. Des standards d'Ap4A et d'ADP ont été ajoutés et les chromatogrammes ont été développés tout d'abord pendant 15 min dans le méthanol à 75 %, puis pendant I h dans du chlorure de lithium 0,85 M. Les valeurs Rf des composés standards étaient res- pectivement de 0,15 (Ap4A) et 0,25 (ADP), la valeur Rf du phosphate était de 0,55. Les taches d'ADP visualisées sous lumière ultra- violette ont été découpées et immergées dans 5 ml de mélange de scintillation et la radioactivité a été mesurée. Au cours des dif- férentes étapes de purification, l'enzyme a été testée en l'absence de radioactivité; les fractions actives ont été alors directement identifiées sur les chromatogrammes sous lumière ultraviolette. Les protéines ont été repérées par mesure de l'absorp- tion à 280 nm. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode turbidimétrique au tannin selon la méthode de MEJBAUlM- KATZENELENBOGEN, W (1955) Acta Biochim. Polon. 2, 279-290. Les caractéristiques des différentes fractions obtenues au cours du procédé d'obtention de l'enzyme Ap4A-phosphorylase sont indiquées dans le tableau I ci-après. Dans l'extrait brut et dans la fraction contenant l'Ap4A-phosphorylase après précipitation au sulfate d'ammonium, on a observé une autre activité qui provoquait la dégradation de l'Ap4A en présence ou en absence de phosphate. Il s'agit probablement d'une phosphodiestérase non spécifique. En conséquence, le taux de purification indiqué dans le tableau I est sous-estimé. Par ailleurs, l'augmentation de l'activité totale observée après la précipitation au sulfate d'ammonium suggère la présence d'inhibiteurs de l'Ap4A- phosphorylase dans l'extrait brut. Après l'étape de purification sur gel de DEAE-Sephacel, l'Ap4A-phosphorylase était dépourvue d'activité phosphodiestérase. Cette étape élimine aussi des activités du type ATPase et apyrase qui ne sont pas adsorbées sur le geL et l'activité adénytate kinase qui est retardée sur la colonne et éLiminée par l'étape de lavage. La séparation sur cotonne de Sephadex G-100 permet d'éliminer les traces de queLques autres ATPases non identifiées. Apres ta chromatographie sur hydroxyapatite, l'enzyme présente une pureté d'environ 40 %. La chromatographie de la fraction ainsi obtenue sur des cotonnes de phosphocellulose, de DEAE-Sephacel ou d'hydroxy- apatite à des pH plus élevés que ceux utiLisés précédemment, à savoir 7?8, ne permet pas d'éliminer les protéines êontaminantes. Par contre La filtration sur gel de Sephadex G?75 superfine est très efficace et la pureté de l'enzyme obtenue apres cette dernière étape de purification est supérieure à 95 %o Le poids moléculaire de la phosphorylase native a été estimé par filtration sur colonne de gel de Sephadex 6-75 superfine (1 x 53 cm) selon la méthode de ANDREWS P. (1964) Biochen. J.. 91 222233. Cette détermination% été faite par comparaison avec les volumes d'étution des protéines standards suivantes: - cytochrome c de coeur de cheval 14 500 - anhydrase carbonique 30 000 - ovalbumine 45 000 - sérum-albumine bovine 6X 000 On a trouvé par cette méthode que le poids mole& culaire de l'enzyme native était de 40 000. Par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrytamide selon la méthode de LAEMMLI U.K. (1970) Nature (Londres) 227. 680-685, on a trouvé que l'Ap4A-phosphorylase dénaturée présentait une seule bande de poids moléculaire 40 000. Ces résultats indiquent que l'Ap4A phosphorylase est constituée d'une seule chaine polypepti que. 2577-236 La figjre I annexée est a photgrahie. du gel d'êlectrophaèser -r laquelle Les bandes A, A1, A2 et A3 correspondent aux fractions d'Ap4Aphosphorylase obtenues sur gel d'hydroxyapatite, respectivement Les fractions combinées (A), la fraction de tête (A1), la fraction médiane (A2) et la fraction de queue (A3) du pic de l'activité enzymatique. La bande B correspond aux protéines standards qui sont respectivement de haut en bas: méthionyl-tARN-synthétase de E. coli (76 000) méthionyl-tARNsynthétase de E. coli après digestion par la trypsine (64 000) ovalbumine (45 000) anhydrase carbonique (30 000) La bande C correspond à L'Ap4Aphosphorylase obtenue après filtration sur Sephadex G-75 superfine. La dégradation enzymatique de l'AD4A par l'enzyme selon l'invention, c'est-a-dire l'Ap4A-phosphorylase, a été caractérisée par identification des produits de ladite réaction de dégradation par co-migration avec des composés standards authen- tiques sur des couches minces de polyéthyLèneimine-cellulose. Cette identification a été confirmée sur une colonne de Lichrosorb RP-18 (MERCK) en utilisant un système HPLC (chromatographie Liquide haute performance) avec une élution isocratique par du phosphate de potassium 25 mM, pH 5,3 selon la méthode de BREVET et al. décrite dans J. Biol. Chem. (1982), 25,7 14613-14615. La colonne de chro- matographie a été utilisée avec une pompe modèle 112, un injecteur modèle 210 et un détecteur d'absorbance modèle 160 (matériel BECKMAN), en opérant à 254 nm avec une sensibilité de 0,002 unité d'absorbance pleine échelle. En présence de phosphate, on a constaté que l'Ap4A est converti par l'Ap4A-phosphorylase en ATP plus ADP. Par contre, aucune conversion n'a été observée en l'absence de phosphate ou lorsque le phosphate était remplacé par mM de pyrophosphate ou de sulfate,que ce soit en présence de 500 pM de MnCl2 ou en présence de 5 mM de MgCl2. Cependant, en présence d'arséniate, l'Ap4A subit. également une dégradation avec 10 mM d'arséniate, la vitesse ini- tiaLe de dégradation de l'Ap4A est seulement inférieure de 20 % à celle mesurée en présence de 10 mM de phosphate. On a constaté que l'arsénolyse de L'Ap4A catalysée par l'Ap4A-phosphorylase fournissait de l'ATP et de l'AMP. La pro- duction d'AMP à la place d'ADP suggère que l'adényl-arséniate formé est immédiatement décomposé en AMP et arséniate. Le résultat de cette décomposition arsénolytique de l'Ap4A indique que l'arséniate attaque l'une des liaisons anhydridesentre les résidus phosphate a et g de l'Ap4A. Pour confirmer le mode de coupure phosphorolytique de l'Ap4A catalysée par l'enzyme selon l'invention,l'Ap4A a été incubé en présence de E32 p] orthophosphate. Parmi les deux produits formés (ATP et ADP), seulement l'ADP était marqué. Ces résultats excluent le fait que la phosphorolyse puisse avoir lieu au niveau de la liaison 6,5-phosphate de l'Ap4A. Parmi les composés testés, le diadénosine 5"5"'-p1,p4_ tétraphosphate (Ap4A) est le substrat préféré de l'enzyme selon l'invention. On a recherché parmi tes composés structurellement apparentés à l'Ap4A les substrats potentiels de l'enzyme selon l'in- vention. Les composés ci-après ont été testés: - Adénosine diphosphate (ADP) - Adénosine triphosphate (ATP) - Adénosine tétraphosphate (p4A) Acide polyadénylique (poly A) - Adénosine monophosphate 3,5l-cyclique (3', 5' c AMP) - Ester p-nitrophénylique de thymidine 5'-monophosphate Diadénosine diphosphate (Ap2A) - Diadénosine triphosphate (Ap3A) Dadnriosine peintaphosphate (Ap5A) 3$ - Diguanosine tetraphosphate (Gp4G) 25772-36 Parmi ces composés, seulement l'Ap5A et le Gp4G se sont comportés comme substrats de l'Ap4A-phosphorylase et les pro- duits résultant de La dégradation étaient respectivement p4A et ADP d'une part et GTP et GDP d'autre part. En présence de E 32p] orthophosphate, le phosphore marqué a été retrouvé seulement dans les nucléosides diphosphates. Les vitesses de phosphorolyse de l'Ap5A et du Gp4G, mesurés dans un milieu d'incubation standard contenant 500 pJM de substrat, correspondaient respectivement à 50 et 40 % du taux observé pour l'Ap4A. Finalement, on a noté que l'arsénolyse de l'AP5A et du Gp4G fournissait p4A + AMP d'une part et GTP + GMP d'autre part. Les produits formés au cours de l'arsénolyse ou de la phosphorolyse de Ap5A et Gp4G confirment le mécanisme de réaction indiqué précédemment, c'est-à-dire l'attaque enzymatique de l'une des liaisons anhydrides entre les deux résidus phosphates o et 0 du substrat et l'incorporation du phosphate dans le nucléoside 5'-di- phosphate. Le fait que le p4A et l'Ap3A ne soient pas des substrats de l'enzyme selon L'invention indique clairement que le site catalytique de l'enzyme nécessite d'une part la présence de deux résidus nucleotides dans le substrat et d'autre part une chaîne d'au moins quatre résidus phosphate liant les nueléosides par leurs carboneq 5'. L'effet du pH sur les vitesses initiales de phos- phorolyse d'Ap4A a été déterminé. Ces vitesses ont été mesurées à différents pH en présence de 500 pM de 3H]Ap4A; 500 pM de MnCl2; mM de K2HPO4 (pH 8,0); 2 X de glycérol et I mM de 2-mercapto- éthanol. La gamme de pH de 5,6 à 8,8 a été obtenue en utilisant les tampons ci-après: mM Mes/KOH; 50 mM Hepes/KOH; 50 mM Tricine/KOH On a trouvé que le pH optimum pour l'activité phos- phorolytique de l'enzyme était de 8,0 + 0,2. On a par ailleurs noté qu'à pH 6,5 et 9,0 l'activité enzymatique correspondait à - la moitié de l'activité maximale. 1-1 L'intégrité des cystéines de l'enzyme est essentielle à L'activité. En présence d'Ap4A saturant, la vitesse de-la réaction de phosphorolyse est de 36 s-1. La constante de MichaeLis Km de l'Ap4A est de 60 piM (37oC, 50 mM Hepes/KOH pH = 8,2, 500 pM MnCl2, 10 mM K2HP04, 1 mM 2mercaptoéthanol et 2 % de glycérol). Le Km du phosphate est de 1 mM; La phosphoroLyse de l'Ap4A par t'Ap4A-phosphorytase n'a lieu qu'en présence de certains ions métaLLiques divalents.- Les vitesses initiales de la phosphoroLyse de L'ApA io ont été mesurées dans un milieu contenant 50 mM Hepes/KOH (pH G,2); 1 mM de 2-mercaptoéthanol; 2 % de glycêrol et 0,4 mg/mL de sérum- albumine bovine, 5 mM K2HP04; 500 pM [3H] Ap4A et différentes con- centrations de chlorures de manganèse, de magnésium, de caLcium, de cobalt ou de cadmium. Les résultats obtenus sont indiqués sur te graphe de la figure 2 annexée sur lequel on a porté en ordonnées Les vitesses initiales de phosphorolyse de L'Ap4A exprimées en pourcentages de la vitesse observée avec-500 pM MnCL2 (36 s1) et en-abscisses la concentration en ions métallttiques exprimée en mM. Les différentes courbes correspondent respectivement aux chlorures ciaprès: courbe A ()-0) = MnCl2 courbe B ( --) = MgCI2 courbe C (U-Ul) = CaCL2 courbe D Mg sont les plus actifs. L'enzyme selon l'invention peut également être utilisée pour preéparer des nucléotides isotopiquement marqués à partir de dinucléosides diphosphates par réaction d'échange avec le phosphate. Les dinucLéosides diphosphates qui peuvent être utilisés sont aussi bien Les ribonucléosides diphosphates puriques ou pyrimidiques que les analogues de ces nucleotides modifiés, soit au niveau de l'agLycone ou du sucre, soit au niveau de la Liaison anhydride en position À. On a estimé les constantes de Michaelis Km et Les vitesses d'échange pour différents NDP au pH optimum, Lequel varie en fonction des substrats. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-après ainsi que Les conditions expérimentales. On notera que, contrairement à La réaction de dégra- dation phosphorolytique, la réaction d'échange NDP-P* ne requiert pas la présence d'ions métalliques divalents.'En fait ces ions inhibent la réaction d'échange. L'enzyme selon.l'invention présente une spécificité pour l'adénosine 5'phosphosulfate CAMPS) plus élevée que pour les autres NDP testés. Le rapport V/km est environ 5 fois plus élevé pour L'AMPS que pour l'ADP. En présence d'orthophosphate L'AMPS est irréversiblement transformé en ADP. Ainsi l'Ap4A-phosphorylase de l'invention présente unepropriété qui est analogue à celle de l'ADP-sulfurylase de levure CEC 2.7.7.5.) [GRUNBERGMANAGO et al. Biochem. Biophys. Acta (1966) 123, 1-16; NICHOLLS R.G. Biochem. J. (1977) 16,5 149-155]. TabLeau I Purification de La diadénosine tétraphosphate at,-phosphoryLase de Saccharomyces cerevisiae à partir de 700 g de poids humide de ceLLuLes de Levure Fraction Protéine Activité spécifiquea Purification Rendement mg pmol Ap4A/min/mg (taux de) % extrait brut surnageant 20 000 x g 25 200 0, 033b 1 100 précipité au sulfate d'ammonium 14 250 0,115b 3,5 197 daLysé (50-70 %) DEAE-Sephacel 1 046 0,464 14 58 Sephadex G-100 38 5,93 180 27 Hydroxyapatite 7,8 18,1 548 17 Sephadex G-75 superfine 2,4 55 1 666 16 a. l'activité a été mesurée dans un milieu contenant un tampon 50 mM Hepes/KOH (pH 8,2), 500 Pm MnCL2, 500 pM E3H]Ap4A, 10 mM K2HP04, 2 % glycérol et 1 mM 2-mercaptoéthanol. L'incubation a été effectuée à 37 C. bo Etant donné les activités dégradant L'ADP dans l'extrait brut et dans le précipité au sulfate d'ammonium dialysé, la disparition de l'Ap4A a été mesurée plutôt que l'apparition d'ADP. P40 Tableau Il Caractéristiques cinétiques de L'ADP et de ses analogues dans la réaction d'échange NDP-P* catalysée par L'AP4 A-hosDhorylase (a) (b) KmmM Substrat pH optimum Vitesse à (a) 1 Vitesse a b) Km (mM) (tampon) 2 mM de NDP(s) saturation de NDP (s-1) ADP 7,0 (Hepes) 36 96 0,74 analogues de l'ADP modifiés sur l'aglycone GDP 8,0 (Hepes) 27 64 0,7 IDP 6,75 (Hepes) 16 XDP 6,75 (Hepes) 0,1 CDP 7,0 (Hepes) 14 61 2,8 UDP 6,5 (Mes) 7 27 3,7 analogues de l'ADP modifiés sur le sucre d-ADP 6,75 (Hepes) 16 2'-0méthyl ADP 7,0 (Hepes) NDP saturant et la quantité d'enzyme limitant 'la vitesse d'échange. L'incubation a eu lieu à 37 C. Co REVENDICATIONS . 5',5"' -P1,P4-diadenosine-tétraphosphate.,14-phospho- rylase isolée à partir d'extraits bruts de levures. 2. 5',5"'-PlP4-diadénosine-tétraphosphate ct,f-phos- phorylase*de Saccharomyces cerevisiae ayant un poids moLéculaire de 40 000 obtenue par fractionnement au sulfate d'ammonium d'un extrait brut de Saccharomyces cerevisiae et chromatographies suc- cessives sur DEAE-Sephacel, Sephadex G-100, hydroxyapatite et Sephadex G-75 superfine. 3. Utilisation de 5',5"'P1,P4-diadénosine-tétraphos- phate a,O-phosphorylase isolée à partir d'extraits bruts de levures pour la préparation de nucléotides isotopiquement marqués. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la 5',5"'-P1,P4-diadénosine-tétraphosphate a,P-phos- U5 phorylase est obtenue à partir d'extraits bruts de SaccharomZces cerevisiae et en ce qu'elle aun poids moléculaire de 40 000. 5. Utilisation selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que les nucléosidea diphosphates iàotopiquement marqués sont obtenus par dégradation phosphorolytique desubstrats cons- -titués de nucléosides oligophosphates contenant deux nuclèosides reliés entre eux par leurs carbones 5' par l'intermédiaire d'une chaîne comprenant au moins 4 résidus phosphates. 6. Utilisation selon la revenfdication 5, caractériséeen ce qu'on opère à pH 8 environ. 7 Utilisation selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que l'on opère en présence d'ions métalliques divalents. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les ions métalliques divalents sont les ions Mn2 ou 2+ Mg 9. Utilisation selon la revendication 3, caractériséeen ce que les nucléosides diphosphates. iotopiquement marques sont obtenus par réaction d'échange entre le 0-phosphate d'un nucléoside diphos- phate et de l'orthophosphate isotopiquement marqué. 10. Nucléosides diphosphates isotopiquement marqués obtenus par dégradation phosphorolytique de substrats constitués de nucléosides oligophosphates contenant deux nucléosides reliés entre eux par leurs carbones 5' par l'intermédiaire d'une chaîne comprenant au moins 4 résidus phosphates à l'aide de la ',5".-P1,P4-diadénosine-tétraphosphate a,g-phosphorylase. 1. Nucléosides diphosphates isotopiquement marqués obtenus par réaction d'échange entre le a-phosphate d'un nucléoside diphosphate et de l'orthophosphate isotopiquement marqué à l'aide de la 5',5"'-P1,P4-diadénosine-tétraphosphate c,O-phosphorylase.