Brevet FR2580150A1 — publié le 19861017

La présente invention concerne un procédé pour produire des polysaccharides permettant notamment de préparer une boisson sucrée fermentée ou kéfir sucré qui peut être aromatisée selon le goût des consommateurs. A l'origine le kéfir est une boisson lactée fermentée à partir du lait de jument, comme cela est encore le cas chez les nomades de l'Asie centrale, mais actuellement est fabriqué à partir du lait de vache ou de chèvre. Mais en Occident on désigne également par ce terme "kéfir" une boisson sucrée aromatisée généralement appelée kéfir sucré ou kéfir aux fruits. La fermentation, qu'il s'agisse de celle du lait ou d'une eau sucrée, est provoquée par une "gelée" ou matricepolysaccharidique, englobant des bactéries et des levures ou grains de kéfir. Un grand nombre d'auteurs a étudié la flore de kéfir ; celle-ci comprend trois groupes principaux de micro-organismes a) les Streptococcacae, avec les genres Streptococcus et Leuconostoc b) les Lactobacillacae avec le genre Lactobacillus dont certains représentants sont susceptibles de produire des polysaccharides de type dextranes c) les levures surtout représentées par le genre Saccharomyces, et fréquemment lactose &commat; Chacun de ces groupes comprend un grand nombre de représentants comme cela est mentionné dans un article du Demandeur, paru dans la revue Techniciens du lait (avril 1984). De plus, d'autres microorganismes ou contaminants tels que des moisissures, des bactéries acétiques, ont également été mis en évidence dans les grains de kéfir. Ces contaminants présents dans les grains de kéfir ménager présentent néanmoins de nombreux inconvénients - ils peuvent perturber la croissance des microorganismes utiles et par conséquent freiner la croissance du grain entier - ils peuvent apporter des flaveurs désagréables lorsque ces grains seront utilisés pour produire une boisson - ils peuvent même rendre la boisson obtenue impropre à la consommation en fonction des normes d'hygiène bactériologique. L'industrie agro-alimentaire utilise pour la production de kéfir , des levains constitués de bactéries et de levures. Mais ces levains, tel que celui mis au point par Y. VAYSSIER (Revue lait FR nO 362, 1978, 131-134), ont des populations de micro-organismes qui varient au cours des repiquages successifs : ainsi les levures ont tendance à se multiplier plus rapidement que les bactéries lactiques et au sein des bactéries, certaines souches se multiplient plus vite que d'autres. De plus ces levains ne sont pas récupérables. Aussi la présente invention a-t-elle pour but de fournir un procédé pour préparer une boisson sucrée fermentée ou kéfir sucré, à partir de microorganismes exempts de tout contaminant. Un autre but de l'invention est un procédé de ce type qui permet de n'utiliser que peu de souches de microorganismes par rapport au nombre présent dans le kéfir menager. Un but supplémentaire de l'invention est de fournir un tel procédé qui permet de récupérer les microorganismes. Ces buts ainsi que d'autres qui apparaitront par la suite sont atteints par un procédé pour produire des polysaccharides permettant notamment de préparer une boisson sucrée ferme tée ou kéfir sucré qui peut être aromatisée selon le goût des consommateurs, lequel procédé comprend, selon la présente invention, les étapes suivantes a) on ensemence un milieu liquide hypersaccharosé pour la culture de microorganismes producteurs de polysaccharides, avec des quantités égales de-Lactobacillus brevis et Leuconostoc mesenteroides, isolées à partir d'un kéfir sucré ménager b) on élimine le surnageant pour le remplacer par un volume équivalent de ce milieu hypersaccharosé, jusqu'à l'obtention d'un gel ferme c) on ajoute à ce gel, le surnageant ayant été éliminé, au moins deux souches de levures résistantes à l'actidione et on recouvre d'un liquide comprenant en parties égales ce milieu hypersaccharosé et un jus naturel sucre d) périodiquement, on maintient le niveau du surnageant au-dessus des grains de kéfir en formation en ajoutant ce liquide dont la proportion en jus naturel sucré augmente progressivement e) quand le surnageant n'est plus visqueux, on ensemence un milieu aqueux comprenant un jus naturel sucré avec les grains de kéfir ainsiobtenus, et on recueille les néo-grains formés. De préférence, on place les néo-grains de kéfir issus de l'étape e) dans un milieu tamponné, le pH étant voisin de la neutralité, pour les fai-r-e--croitre Avantageusement, le milieu liquide hypersaccharosé pour la culture de microorganisme producteurs de polysaccharides est le milieu de Mayeux, Sandrine et Elliker (ou milieu M.S.E.) ou le milieu Saccharose - Extraits Citrates - Sels (ou milieu S.E.C.S.). De préférence, Lactobacillus brevis et Leuconostoc Mesenteroides étant respectivement cultivés en milieu de Man, Rogosa, et Sharpe additionné de saccharose (ou milieu MRS-saccharose) d'une part, et en milieu M.S.E. ou milieu S.E.C.S. d'autres part, on ensemence avec une solution de ceux-ci dont la densité optique est superieure a' 0,3, la longueur d'onde pour la mesure étant de 540 nm. Avantageusement, on ajoute à ce milieu liquide hypersaccharosé au moins 0,2 % en volume de chaque solution de Lactobacillus brevis et de Leuconostoc mesenteroldes. De préférence, on ajoute entre 0,25 et 1 % en volume de chacune de ces solutions. Avantageusement, l'étape b) est réalisée à température ambiante pendant au moins trois semaine. De préférence, cette étape b) est réalisée à une température de l'ordre de 250C. A l'étape c) les levures résistantes à l'actidione sont choisies dans le groupe constitué par Saccharomyces florentinus et Kloeckera apiculata. On peut également ajouter à ces deux levures Candida lambica et Candida valida. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures étant cultivées dans le milieu liquide de Sabouraud, on ajoute au moins 0,2 % en volume de ce milieu liquide au gel issu de l'étape b). Avantageusement, le jus naturel sucré est une solution aqueuse de sucre de canne non raffiné comprenant un extrait de levure. De préférence à l'étape e), le milieu aqueux ensemencé est composé d'une solution de 60 g de sucre de canne non raffiné par litre d'eau potable. Selon un mode de réalisation préféré, le sucre de canne non raffiné et l'eau potable ont été pasteurrisés. A l'étape b) on peut également ajouter Lactobacillus casei de préférence en solution dans le milieu MRS saccharose : la quantité de solution contenant Lactobacillus casei est du même ordre que celle de Lactobacillus brevis. Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte une étape f), au cours de laquelle on élimine le surnageant qui constitue la boisson aromatisable et con sommable. La description qui va suivre et qui ne pré sente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme du métier de réaliser la présente invention et d'en mieux comprendre les avantages. On réalise des cultures pures de Lactobacillus brevis, d'une part, et de Leuconostoc mesenteroides d'autre part,à partir d'un kéfir ménager. Les milieux liquides uti lisés sont le milieu de Man, Rogosa et Sharpe (ou milieu MRS) enrichi en saccharose pour Lactobacillus brevis, et le milieu de Mayeux, Sandrine et Elliker (ou milieu MSE) ou le milieu saccharose - extraits - citrates - sels (ou milieu S.E.C.S.) pour Leuconostoc mesenteroides. Une composition type de chacun de ces milieux est donnée dans les trois tableaux ci-dessous Milieu M.R.S. - saccharose Peptone trypsique 10 g Extrait de levure 5g Polyoxyéthylène sorbitan mono-Géate 1 ml Phosphate bi-potassique 2g Acétate de sodium (CH3-COONa, 3H20) 5 g Citrate d'ammonium 2g Sulfate de magnésium (MgS04, 7H20) 0,57 g Sulfate de manganèse (MnS04, 4H20) 0,14 g Eau distillée 1000 ml Extrait de viande . 10 g Saccharose 60 g Glucose 1 g pH 6,8 Milieu M.S.E. Pastone 10 g Extrait de levures 5 g Saccharose 100 g Citrate de sodium 1 g Glucose 5g Eau distillée 1000 ml pH 6,8 Milieu S.E.C.S. Saccharose 60 g Extrait de viande 10 g Extrait de levure 5g Citrate de sodium 1 g Sulfate de-magnésium (Mg S04, 7H2O) 0,2 g Hydrogéna phosphate bipotassique 2 g Sulfate de manganèse (Mn S04, 4H20) 0,01 g Sulfate de fer (Fe S04, 7H20) 0,01 g Carbonate de calcium 20 g Eau distillée 1000 ml pH 6,8 Quand la densité optique de chacune de ces cultures est supérieure à 0,3 environ, et de préférence égale à 0,5,cette densité étant mesurée à une longueur d'onde de 540 nm, on ajoute au milieu liquide hyper saccharosé, situé dans un réacteur, au moins 0,2 % en volume de chaque solution de ces cultures. En général, on ajoute entre 0,25 et 1 %- en volume de chaque solution au milieu M.S.E.Ceci constitue l'étape a) du procédé selon l'invention. On observe au bout de quelque temps la for mation d'un gel mou et d'un surnageant visqueux, du fait de la présence de polysaccharides solubles. Au cours de cette étape b) de croissance du gel, on élimine le surnageant et on le remplace par un volume égal de milieu M.S.E. Ceci peut être réalisé soit de façon continue, soit de façon discontinue par exemple tous les sept jours, jusqu'à ce que l'on obtienne un gel ferme dans le réacteur maintenu à température ambiante. Celui-ci peut éventuellement être chauffé à 250C. Puis on ajoute au gel ferme ainsi obtenu au moins deux levures résistantes à l'actidione (étape.c)). De telles levures sont choisies dans le groupe constitué par Saccharomyces florentinus et Kloeckera apiculata. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on choisit Saccharomyces florentinus et Koecklera apiculata cultivées en milieu liquide de Sabouraui : on ajoute au moins 0,2 % en volume de ce milieu liquide dont la densité optique est d'environ 0,5 mesurée comme précédemment au gel issu de l'étape b). On recouvre d'un liquide comprenant en parties égales le milieu M.S.E. et un jus naturel sucré tel qutune solution aqueuse de sucre de canne non raffiné comprenant 2,5 % en poids d'extrait de levure : la concentration en sucre est de 60 g/l environ, selon cet exemple de réalisation. Périodiquement, on maintient (étape d)) le niveau du surnageant au-dessus du gel constitué par des grains de kéfir en formation ou néo-grains, en ajoutant le même liquide qu'a' l'étape c) mais en augmentant progressivement la proportion de la solution aqueuse de sucre de canne non raffiné. Ainsi à l'issue de'l'étape d) on n'ajoute uniquement que de la solution aqueuse de sucre de canne non raffiné. Par exemple le maintien du niveau du surnageant est réalisé tous les cinq jours : au début la proportion MSE :- solut-ion-de-sucre de canne est de 1 : 1, puis 1 : 3 puis O : 1 et ce jusqu'à l'obtention d'un surnageant non visqueux. A ce moment, on peut ensemencer un milieu aqueux comprenant un jus naturel sucré (étape e)) tel qu'une solution de sucre de canne non raffiné dans de l'eau potable, avec les grains de kéfir issus de l'étape d) à raison de 1 kgde grains pour 10 1 de solution. La concentration de cette solution en sucre de canne est par exemple d'environ 60 g/l. L'étape e) peut être réalisée en milieu non stérile si le milieu aqueux utilisé a été préalablement stérilisé. Les néo-grains à l'issue de l'étape e) peuvent être placés dans un milieu tamponné ( par exemple phosphate monopotassique - soude) 0,05 M à pH 7 ou dans un milieu normal, le pH étant régulé par de la soude 0,5 N afin d'en obtenir un accroissement. On peut ainsi obtenir en quelques semaines plusieurs kilogrammes de néo-grains. Avec régulation du pH, on a pu observer des rendements en poids de néo-grains par rapport au poids de sucre introduit qui sont de l'ordre de 75 %. Lorsque les néo-grains sont destinés à produire des fermentations, on ajoute environ 0,5 % en volume d'une culture de Lactobacillus caser en milieu MRS saccharose dans le réacteur au cours de l'étape b), en fait la même quantité que de Lactobacillus revis. Et le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire f), au cours de laquelle le surnageant qui apparait lors de l'éta- pe e) est éliminé au fur et à mesure de sa formation, ou de façon discontinue : il constitue la boisson aromatisable consommable. Ainsi en utilisant au maximum cinq-souches des microorganismes présentes dans le kéfir ménager, on peut obtenir une boisson à partir d'eau sucrée aromatisée. Par ailleurs, la production de néo-grains de kéfir issue de étape e), selon la présente invention, peut conduire à la production de produits épaississants ou gélifiants du fait de leur richesse en polysaccharides (dextranes) : ceux-ci étant produits par Lactobacillus brevis et Leuconostoc menseteroldes. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour préparer une boisson sucrée fermentée ou kéfir sucré, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on ensemence un milieu liquide hypersaccharosé pour la culture de micro-organismes producteurs de polysaccharides, avec des quantités égales de Lactobacillus brevis et Leuconostoc mesenteroides isolés à partir d'un kéfir ménager b) on élimine le surnageant pour le remplacer par un volume équivalent dudit -milieu hypersaccharosé, jusqu'à l'obtention d'un gel ferme c) on ajoute à ce gel, le surnageant ayant été éliminé, au moins deux souches de levures résistantes à l'actidione, et on recouvre d'un liquide comprenant en parties égales 1- dit milieu hypersaccharosé et un jus naturel sucré d) périodiquement, on maintient le niveau du surnageant au dessus des grains de kéfir en formation en ajoutant ledit liquide dont la proportion en jus naturel sucré augmente progressivement e) quand le surnageant n'est plus visqueux, on ensemence un milieu aqueux comprenant un jus naturel sucré avec les grains de kéfir ainsi obtenus, et on recueille les néo-grains formés. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits néo-grains de kéfir issus de ladite étape e) dans dans un milieu tamponné dont le pH est voisin de la neutralité, afin de les faire croltre. 3 .- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu liquide hypersaccharosé pour la culture de micro-organismes producteurs de polysaccharides est le milieu de Mayeux, Sandrine et Elliker (ou milieu M.S.E) ou le milieu Saccharose-Extraits-Citrates-Sels (ou milieu S.E.C.S.). 4.- Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisé en ce que Lactobacillus brevis et Leuconostoc mesenteroides étant respectivement cultivés en milieu de Man, Rogosa et Sharpe addita.anné de saccharose (ou milieu MRS-sacharose) d'une part, et en milieu M.S.E. ou milieu S.E.C.S. d'autre part, on ensemence avec une solution de ceux-ci dont la densité optique est supérieure à 0,3, la longueur d'onde pour la mesure étant de 540 nm. 5 .- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on ajoute audit milieu liquide hypersaccharosé au moins 0,2 % en volume de chaque solution de Lactobacillus brevis et de Leuconostoc mesen teroides. 6 .- Procédé selon la revendication 5, carac térisé en ce qu'on ajoute entre 0,25 et 1,0 % en volume de chacune de ces solutions. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite étape b) est réalisée à température ambiante pendant au moins trois semaines. 8.- Procédé selon la revendication 7, carac térisé en ce que ladite étape b) est réalisée à une température de l'ordre de 250C. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à ladite étape c) les levures résistantes à l'actidione sont choisies dans le groupe constitué par Saccharomyces florentinus et Kloeckera apiculata. 10.- Procédé selon la revendication 9 r carac terse en ce qu 'on ajoute également Candida lambica et Candida valida. 11.- Procédé selon la revendication 9 ou la revendication iO,caractérisé en ce que lesdites levures étant cultivées dans le milieu liquide de Sabouraud, on ajoute au moins 0,2 % en volume de ce milieu liquide au gel issu de l'étape b). 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que ledit jus naturel sucré de ladite étape d) est une solution aqueuse de sucre de canne non raffiné comprenant un extrait de levure. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 , caractérisé en ce qu'à ladite étape e) le milieu aqueux ensemencé est composé d'une solution de 60 g de sucre de canne non raffiné par litre d'eau potable. 14.- Procédé selon la revendication 13, carac térisé en ce que ledit sucre de canne non raffiné et ladite eau potable ont été pasteurisés. 15.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'à ladite étape b) on ajoute Lactobacillus casei en même quantité que Lactobacillus brevis. 16.- Procédé selon la revendication 15, carac térisé en ce qu'on ajoute Lactobacillus casei en milieu MRSsaccharose. 17.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 16, caractérisé encre qu'il comporte une étape f) au cours de laquelle on élimine le surnageant produit lors de ladite étape e), qui constitue une boisson aromatisable consommable.