Brevet FR2575833A1 — publié le 19860711

I Cette invention concerne un matériau en bande utilisé dans l'électrophorèse et des techniques similaires, telles que l'immunoélectrophorèse, l'électrophorèse d'affi- nité, et la focalisation iso-électrique. De telles bandes sont appelées ci-après "bandes pour diagnostic", même si elles sont utilisées dans des techniques préparatives. L'agarose, un polysaccharide dérivé de l'agar- agar, lui-même dérivé du goémon, a été utilisé en tant que milieu dans lequel on effectue de telles séparations par électrophorèse. L'agarose forme, comme l'agar-agar, une gelée consistante quand il est dissous dans l'eau et séché. Des trousses pour la préparation de plaques d'agarose sont disponibles depuis quelques années; de telles trousses comprennent de la poudre d'agarose et des assiettes dans lesquelles on forme la gelée d'agarose. De la même manière, des plaques d'agarose répandues sur du verre avec une épais- seur de revêtement d'environ 0,5 mm sont aussi disponibles. Cependant, la préparation d'agarose en assiettes, utilisant une trousse, nécessite à la fois du temps et de l'argent. D'autre part, les plaques d'agarose projeté sur duverre en couches comparativement épaisses sont encore plus chères. L'usage de l'agarose a donc été sévèrement restreint. Cependant, nous avons découvert une méthode de préparation de bandes pour diagnostic, revêtues d'une couche mince d'agarose, qui sont faciles à préparer en grandes quantités que l'on peut ensuite faire sécher pour en faciliter la manipulation, mais qui peuvent ensuite regonfler quand on les trempe dans un tampon ou une solution semblable afin de fournir un milieu pouvant être utilisé dans l'électrophorèse et les techniques similaires. Selon la présente invention, on fournit une méthode de préparation d'une bande pour diagnostic revêtue d'agarose, méthode qui consiste à préparer un rouleau de matériau en bande, de telle façon qu'une émulsion aqueuse de gélatine et d'halogénure d'argent puisse y adhérer sur un côté, mais ne présentant pas de couche de gélatine ou d'une quelconque autre matière protéinée sur le côté préparé, puis à revêtir le côté préparé de la bande, par une méthode de revêtement de bande continue, d'une couche d'une solution aqueuse d'agarose à une température d'au moins 40 C, à sécher la couche d'agarose étalée pour obtenir une couche sèche au toucher, d'épaisseur comprise entre 0,1 et 100 pm, et contenant 10 à 50 % en poids de matières solides, et à couper la bande revêtue en bandes ayant la dimension requise. De préférence, le pourcentage de matières solides dans la couche sèche est compris entre 15 et 30 % en poids, et encore mieux, autour de 20 % en poids. Si le pourcentage de matières solides est supérieur à 50 %, la couche est collante et ne peut être manipulée sans dommage. Si le pourcentage de matières solides est inférieur à 10 %, la couche sèche, quand on la trempe dans l'eau, puis dans un tampon, ce qui est la méthode préférée de reconstitution de la couche avant usage, ne se reconstitue pas correctement, et le matériau ne peut donc être utilisé pour l'une quelconque des techniques indiquées ci-dessus. Le matériau en bande peut être une bande de matériau de papier, qui a été encollée afin de retarder l'absorption de l'eau dans labase,l'agent d'encollage utilisé étant une matière non protéinée, mais étant de nature suffisamment hydrophile pour permettre à la bande d'être revêtue d'une émulsion aqueuse de gélatine et d'halogénure d'argent. Le matériau en bande peut être du papier laminé au polyéthylène, dont on a traité un côté par décharge en couronne de façon à rendre ce côté réceptif à une couche d'émulsion aqueuse de gélatine et d'halogénure d'argent. De préférence, cependant, le matériau en bande est un matériau de film du type utilisé comme base de film dans les films photographiques, mais ne présentant pas de couche sous-jacente de gélatine. Un tel matériau de film peut être du triacétate de cellulose ou de l'acétate-butyrate de cellulose, hydrolysé en surface afin de le rendre réceptif à une couche d'émulsion aqueuse de gélatine et d'halogénure d'argent. Mieux encore, le matériau en bande est un maté- riau en film polyester orienté biaxialement, qui a été préparé par un procédé dans lequel le polyester non orienté en forme de bande est orienté dans une direction dans un élargisseur, un copolymère de latex est ensuite étalé sur une surface au moins du polyester, et l'orientation du polyester dans l'autre direction est effectuée conjointement avec un procédé de fixation à chaud. Dans quelques cas, un traitement par décharge en couronne de la surface du polymère revêtu est ensuite effectué. Puis la solution d'agarose est étalée sur la surface de copolymère du film de polyester orienté biaxialement. De préférence, le copolymère utilisé comprend jusqu'à 10 %, et encore mieux de 0,5 à 9 %, en poids d'acide itaconique. Des copolymères convenables pour l'emploi dans cette méthode sont décrits dans les spécifications des brevets anglais n 1 540 067, 1 583 343 et 1 589 926. Dans les méthodes décrites dans ces spécifications, un traitement par décharge en couronne du polyester orienté biaxialement est nécessaire pour obtenir la meilleure adhésion à la solution aqueuse de revêtement. Un autre copolymère convenable est décrit dans les spécifications du brevet anglais n 1 571 583, mais dans ce cas, aucun traitement par décharge en couronne de la couche de copolymère n'est nécessaire pour rendre la surface réceptive à une couche de solution aqueuse de revêtement. Le mieux est que le copolymère soit un copoly- mère à base de styrène. Par cette méthode, on peut aussi préparer des revêtements ayant une épaisseur à sec supérieure à 100 um, mais de tels revêtements sont sans nécessité dispendieux en agarose, parce que l'on a trouvé que des revêtements aussi minces que 1 à 10 pm fonctionnent très bien comme bandes de diagnostic. On peut ajouter divers adjuvants à la solution d'agarose avant qu'elle ne soit étalée. De tels adjuvants comprennent des agents mouillants, ainsi que des agents d'étalement. On peut aussi utiliser des humectants, par exemple le glycérol, qui aide la plastifisation de la couche étalée, et des adjuvants, par exemple le sorbitol et le galactomannane, qui aident à améliorer la solubilité de l'agarose dans l'eau. Avant usage, afin de faire gonfler la couche d'agarose, on traite les bandes préparées par la méthode de la présente invention dans un liquide. Ce liquide est habituellement de l'eau, que l'on fait suivre d'un tampon aqueux. Pour aider le gonflement de la couche d'agarose, on peut ajouter à la solution d'agarose destinée à être étalée, des adjuvants, par exemple de l'urée. L'urée affecte la résistance de gel du revêtement d'agarose, et donc, si ceci n'est pas considéré comme désirable,on peut ajouter des adjuvants de gonflement au liquide qui provoque le gonflement de l'agarose. Quand les bandes revêtues d'agarose doivent être utilisées pour la focalisation iso-électrique, on peut ajouter à la solution d'agarose des ampholytes, par exemple des mélanges de composés qui contiennent des groupes amides et acides carboxyliques. Cependant, de tels ampholytes peuvent être alternativement ajoutés au liquide de gonfle- ment. Les machines à revêtement continu de tissu que l'on peut utiliser pour étaler la solution d'agarose sur le tissu comprennent n'importe laquelle des machines de revê- tement utilisées pour étaler des solutions de colle sur du tissu de papier, et n'importe laquelle des machines utilisées pour étaler des solutions de gélatine sur des matériaux de basesphotographiques. De telles machines de revêtement comprennent des machines de revêtement à bac et fente, avec ou sans dispositif à lame d'air ou à barre docteur, contrôlant l'épaisseur de la couche. On peut aussi employer des machines à revêtement à nappe et cascade, aussi bien que des machines à revêtement à gravure et à gravure inverse. On peut préparer la solution aqueuse d'agarose en additionnant la quantité requise de poudre d'agarose à de l'eau, et en laissant le mélange reposer pendant une heure. On chauffe ensuite le mélange rapidement, sous agitation efficace, à une température supérieure à 95 C, et on le maintient à cette température élevée pendant 15 minutes, ou bien jusqu'à ce que toute la poudre soit dissoute. Ceci est indiqué par une réduction considérable de la turbidité de la solution. On abaisse ensuite la température, sous agitation constante, à une température supérieure de 5 C à la tempé- rature de revêtement désirée (qui est habituellement d'envi- ron 55 C), et on place la solution dans un récipient de stockage thermostaté jusqu'à ce qu'on l'étale. La tempéra- ture effective de revêtement, supérieure à 40 C, dépend du type d'agarose utilisé, et de l'emploi des bandes de diagnostic. L'agarose est un galactane linéaire purifié, solide hydrocolloidal que l'on isole de l'agar-agar ou que l'on récupère directement des algues marines contenant de l'agar-agar. Les différentes préparations d'agarose varient de façon significative quant à leurs propriétés physiques et chimiques. Les propriétés physiques et chimiques sont influencées par l'origine des algues marines, y compris leur lieu d'origine et l'étape de leur cycle de croissance, le procédé de récolte, et par le procédé utilisé pour isoler l'agarose. Des propriétés telles que la température de gélification, la résistance du gel, la porosité, et l'élec- troendosmose, peuvent être ajustées par mélange de deux ou plusieurs lots. Les températures de gélification et de fusion dépendent de la teneur de l'agarose en méthoxyle, et les propriétés de l'agarose peuvent être influencées par incor- poration de groupes hydroxyléthyles; par exemple, l'agarose "Miles Seaplaque". Les gels d'agarose ne sont pas absolument limpides, à cause de domaines de microcristallinité. De faibles concentrations d'urée et de polyéthylèneglycol réduisent la turbidité, mais la résistance du gel est réduite. Bien que neutre de façon prédominante, la matrice d'agarose contient quelques résidus anioniques, par exemple des ions sulfate et pyruvate. Sont associés à ces résidus des contre- ions hydratés. Quand un courant électrique est appliqué, les contre-ions migrent vers la cathode, entraînant avec eux l'eau d'hydratation et n'importe quelle molécule d'écbantil- ion neutre; ceci est connu sous le nom d'électroendosmose. Ceci est avantageux dans les techniques de diagnostic par contre-électrophorèse, mais pas dans la focalisation iso- électrique. La focalisation iso-électrique tire parti du fait que chaque protéine est caractérisée par un pH diffé- rent auquel elle est électriquement neutre; ce que l'on appelle son point iso-électrique (pI). Les protéines s6nt séparées selon leur pI par électrophorèse sur un gel dans lequel on a engendré un gradient stable de pH par incorpora- tion d'ampholytes. Ces ampholytes peuvent être des mélanges de groupes amides et acides carboxyliques, qui viennent au repos selon leur rang de pI quand ils sont soumis à un champ électrique, chacun d'eux maintenant un pH local corres- pondant à son pI en vertu d'un fort pouvoir tampon. Ces ampholytes peuvent être incorporés durant la formulation ou au cours du gonflement de la couche d'agarose séchée avec obtention d'un faible effet de degré de séparation. - On peut employer beaucoup d'autres techniques d'électrophorèse et d'immunologie, de culture cellulaire et de clonage, avec. des couches d'agarose possédant diverses propriétés physiques et chimiques, par exemple l'électro- phorèse des protéines du sérum, l'électrophorèse d'acides nucléiques,la séparation selon les poids moléculaires, l'électrophorèse 2D, l'électrophorèse de celluleset de virus, la diffusion sur gel d'Ouchterlony, l'immunodiffusion radiale, l'immunoélectrophorèse, l'immunoélectrophorèse croisée et l'immunoélectrophorèse par fuséesde Laurell, la contre-électrophorèse, et le recouvrement antigène-anticorps. On peut facilement faire gonfler les couches d'agarose séchées en les trempant dans un solvant convenable. Le degré de gonflement dépend du type et de la quantité de l'agarose étalé, de la température du gonflement, du type et du pH des solvants employés. Les revêtements d'agarose pour les techniques d'électrophorèse sont habituellement trempés dans une forme plus concentrée du tampon à utiliser dans la séparation des protéines. Une importante caractéristique des bandes préparées selon la méthode de la présente invention consiste en ce qu'aucune couche sous-jacente de gélatine n'est présente entre la base de polyester et la couche d'agarose. La gélatine étant à base de protéine, elle interfère grande- ment avec les techniques de séparation des protéines, puisqu'elle colore de façon désavantageuse les protéines séparées, et empêche leur identification. Dans la méthode préférée de la présente invention, le copolymère de latex séché à base de styrène, appliqué lors de l'étape de tirage intermédiaire, fournit une couche hydrophile sur laquelle les solutions de revêtement d'agarose peuvent être appli- quées, et à laquelle elles peuvent adhérer. De préférence, la base de film, après orientation complète et thermofixage, est traitée par décharge en couronne. Ceci augmente l'adhé- rence de la solution d'agarose à la base. Cependant, ce n'est pas toujours nécessaire. L'exemple suivant sert d'illustration à l'inven- tion. Exemple On a employé un support basai de film de poly- ester en téréphtalate de polyéthylène, préparé selon la description donnée dans l'exemple 11 des spécifications du brevet anglais n 1540067, excepté que l'on n'a étalé1 aucune émulsion d'halogénure d'argent sur la surface du film traité par décharge en couronne. On a préparé une solution aqueuse d'agarose comme suit: Agarose (Serva Zero EEBO(R)) 20 g Agent mouillant (Olin lOG(R)) 2,0 g Eau, q.s.p. 1 litre. L'agarose est trempé dans l'eau pendant 60 minutes en présence de l'agent mouillant. Le mélange est ensuite chauffé fortement, sous agitation vigoureuse, jusqu'à ce qu'il entre en ébullition à 96 C. La température est abaissée à 92 C, et on maintient cette température jusqu'à ce que la solution, d'apparence opaque, s'éclaircisse. On diminue la température de la solution à 60 C tout en agitant constamment, puis on transfère la solution dans un récipient de revêtement thermostats. On étale ensuite la solution à travers une fente sur la base de film de polyester, comme on va le décrire. On fait passer la base de film à travers la fente d'étalement à la vitesse de 4,56 m/min, et le volume par unité de surface de solution étalée sur la base de film est de 1,6 cm3.dm 2. La température de la solution de revêtement est de 55 C au cours de l'étalement. On réfrigère ensuite le revêtement afin de fixer l'agarose, et on le sèche,par projection d'air,à 20 % en poids de solides. L'épaisseur de la couche d'agarose séché étalée est de 10 pm, et la couche n'est pas collante. La base de film revêtue avec la couche d'agarose séché est ensuite découpée en bandes de 6 x 18 cm de long, ce qui est une taille convenable pour des bandes de diag- nostic. On effectue, comme cela est décrit dans le brevet anglais n 1540067, à la fois des tests d'adhésion à sec et à l'humidité, et on a trouvé que dans les deux tests, la couche d'agarose adhère très bien à la base de film. On utilise l'une de ces bandes dans un test d'électrophorèse pour indiquer quelles sont les protéines présentes dans un échantillon de sérum humain. On utilise une chambre d'électrophorèse Shandon 600. On poinçonne une bande juste préparée afin de pratiquer des trous de retenue de bande. La bande est ensuite trempée dans l'eau pendant minutes, et ensuite placée dans un bain de tampon aqueux (pH 8,6, 0,05 M) pendant 10 minutes afin que la couche d'agarose gonfle. L'excès de tampon est éliminé, et la bande est placée dans la chambre d'électrophorèse, chaque extrémité de la bande plongeant dans un bain de tampon à 0,025 M. Un petit volume de sérum est amené à l'une des extrémités de la bande, au moyen d'un papier filtre. De petits échantillons contenant des protéines de sérum connues sont placés en ligne le long de la même extrémité de la bande. On applique pendant 5 minutes un courant constant de 3 mA, ce qui correspond à 1/2 mA par cm de largeur de la bande. La bande d'agarose est ensuite enlevée de la chambre et placée dans une solution à 10 % de rouge Ponceau (C.I. n 27195) afin que les protéines soient teintes. La teinture accessoire est ensuite éliminée par trempage dans l'acide acétique dilué pendant dix minutes, ce qui ne laissent teintes que les protéines séparées. La bande est trempée dans une solution de 10 % d'acide acétique dilué dans 90 % de méthanol, et séchée. La bande séchée indique les diverses protéines présentes dans l'échantillon de sérum, séparées le long de la bande. Leur identité est établie par comparaison avec les protéines connues qui ont également été séparées le long de la bande. Ce test montre que les bandes préparées selon la présente invention, même si la couche d'agarose étalée est très mince, sont utilisables dans les techniques de séparation de protéine par électrophorèse. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une bande de diagnostic revêtue d'agarose, caractérisé ence qu'il consiste à préparer un rouleau de matériau en bande de telle façon qu'une émulsion aqueuse d'halogénure d'argent puisse y adhérer sur un côté, mais ne présentant pas de couche de gélatine ou d'une autre matière protéinique sur le côté préparé, puis à revêtir le côté préparé de la bande,par une méthode de revêtement de bande en continu,d'une couche d'une solution aqueuse d'agarose à une température d'au moins 40 C, à sécher la couche d'agarose étalée de façon à obtenir une couche, sèche au toucher et présentant une épaisseur de 0,1 à 100 pm et de 10 à 50 % en poids de matières solides, et à couper la bande revêtue en bandes de la dimension requise. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pourcentage de matières solides dans la couche séchée est compris entre 15 et 30 % en poids. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pourcentage de matières solides dans la couche séchée est d'environ 20 % en poids. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'épaisseur du revêtement sec est comprise entre 1 et 10 pm. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le matériau en bande est une bande de papier laminé au polyéthylène, dont le côté à revêtir a été traité par décharge en couronne. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le matériau en bande est un polyester orienté biaxialement, qui a été préparé selon un procédé dans lequel on oriente dans une direction une bande de polyester non orientée, on revêt une surface du polyester d'un latex de copolymère, on achève l'orientation et on fixe à chaud le polyester revêtu. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le copolymère comprend jusqu'à 10 % en poids d'acide itaconique. 8. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que le copolymère est un copolymère à base de styrène. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la bande de polyester, après orientation biaxiale, est traitée par décharge en couronne du côté revêtu avec le copolymère. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 7, caractérisé en ce que l'on étale la solution aqueuse d'agarose sur la bande en utilisant une machine à revêtement à fente, à cuve, à cascade, ou à nappe. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on ajoute un agent mouillant à la solution aqueuse de revêtement d'agarose. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 11, caractérisé en ce que l'on ajoute un agent de gon- flement à la solution aqueuse d'agarose. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 10, caractérisé en ce que l'on ajoute un ampholyte à la solution aqueuse d'agarose. 14. Une bande de diagnostic revêtue d'agarose, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé reven- diqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Emploi d'une bande de diagnostic telle que reven- diquée dans la revendication 14, caractérisé en ce que l'on fait d'abord gonfler la bande dans l'eau, puis dans un bain tampon, dans une technique d'électrophorèse ou de focalisa- tion iso-électrique.