Brevet FR2577676A1 — publié le 19860822

! La présente invention concerne un procédé de dosage immunologique des amines présentes dans les milieux biolo- giques, les anticorps monoclonaux spécifiques des produits résultant de la réaction de l'amine sur une quinone. les hybridomes secrétant ces anticorps et les coffrets conte- nant les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de dosage. Le dosage de l'histamine est l'un-des tests les plus significatifs de l'hypersensibilité immédiate..Plusieurs méthodes de dosage de l'histamine sont actuellement dispo- nibles mais ne peuvent être réalisées que dans des labora- toires possédant un appareillage coûteux. La méthode la plus couramment utilisée en clinique est basée sur un dosage fluorimétrique comportant une extraction par le butanol du sérum à étudier, suivie d'un traitement par une solution aqueuse d'acide chlorhydrique contenant de l'heptane; l'histamine prélevée dans la phase chlorhydrique est condensée avec de l'aldéhyde o-phtalique, en milieu alcalin, pour former un composé fluorescent; la fluorescence mesurée est proportionnelle à la quantité d'histamine présente dans le milieu, et qui avait été libérée par les basophiles ou les mastocytes. Cette technique est longue et délicate même lorsqu'elle est automatisée. La méthode radio-enzymatique aussi pratiquée, pose des problèmes de spécificité; ainsi par exemple, la chlor- promazine et la sérotonine inhibent l'activité enzymatique de l'histamine-N-méthyl-transférase. Une autre méthode utilise la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse et implique donc l'utilisation d'appareils complexes et particulièrement coûteux. Il serait ainsi particulièrement avantageux de'pouvoir doser l'histamine par une méthode immunologique, puisqu'on éviterait ces inconvénients. En effet une telle méthode étant spécifique, il ne serait pas nécessaire de procéder à une extraction chimique de l'histamine et par ailleurs la méthode serait sensible puisque l'on sait marquer les anticorps par des substances faciles à doser même en très faible quantité, comme avec des enzymes, des radio-isoto- pes, des fluorochromes. Il est malheureusement apparu particulièrement dif- ficile d'obtenir des anticorps spécifiques de l'histamine et récemment H. Mita et coll. ont indiqué qu'ils n'avaient pas pu obtenir des anticorps dirigés contre l'histamine, ou contre des conjugués histamine/sérum albumine bovine chez le lapin, dans: Agents and Actions 14 p. 574-579 (1984). On a maintenant trouvé qu'en conjuguant l'histamine à un composé de faible masse moléculaire, une quinone, on pouvait obtenir des anticorps spécifiques dudit composé d'addition, utilisables dans un procédé de dosage immunolo- gique de l'histamine. Dans ce qui suit, on se référera à l'histamine, mais il apparaîtra au spécialiste que le procédé d'obtention des anticorps et la mise en oeuvre de ceux-ci, est aussi applicable à d'autres amines présentes dans les milieux biologiques et susceptibles de s'additionner sur une quinone, c'est-à-dire des amines primaires ou secondaires. Parmi celles-ci, on peut citer les neurotransmet- teurs, tels que la dopamine ou la norépinéphrine, les acides aminés, tels que la glycine ou le glutamate, les peptides de faible masse, tels que l'encéphaline, la subs- tance P ou la neurotensine. Le procédé de dosage de l'invention consiste à faire réagir l'amine à doser, présente dans l'échantillon, avec une quinone,immobilisée ou non, pour obtenir un composé d'addition 1,4, puis à mettre le produit obtenu en présence d'un anticorps monoclonal spécifique dudit composé d'addi- tion, et ne complexant ni la quinone seule, ni l'amine considérée et enfin à déterminer la quantité d'anticorps monoclonal complexé par une immunométhode dans laquelle on dosera, soit la forme libre, soit la forme complexée dudit anticorps selon que la quinone était ou non immobili- sée. Parmi les quinones, pouvant convenir, figurent les naphtoquinone, pyrènequinone, pérylènequinone, diphénoqui- none, et les benzoquinones. On préfère tout particulière- ment la p-benzoquinone qui comme les cétones i- éthyléniques peut former des produits d'addition 1,4. Par quinone immobilisée, on entend la quinone qui a réagi sur une polyamine - telle qu'une protéine, un polypeptide, un polyéthylèneimine préalablement fixée sur un support insoluble - tel qu'une plaque de microtitra- tion, les parois de tubes ou billes en polystyrène, poly- propylène, chlorure de polyvinyle, polyacrylamide et analo- gues, les gels de polyacrylamide, d'agarose ou de polyacrylamide/ agarose. Dans le schéma de la p-benzoquinone, le schéma réactionnel est le suivant: - NH2 + o0 4 -) HO- H dans lequel Z représente la polyamine primaire dont une seule fonction amine est mise en évidence - fixée sur un support. Lorsque l'amine à doser réagit sur la quinone, on obtient un composé d'addition 1,4; dans le cas de la p-benzoquinone libre et d'une amine primaire, représentée par RNH2, le schéma réactionnel est le suivant: RNH2 0== = - HO- -OH NHR tandis que lorsque RNH réagit sur la p-benzoquinone immo- bilisée, le produit d'addition est représenté par la for- mule II NHR Ht >OH -NH II Lorsque la premiere étape du procédé selon l'inven- tion consiste à faire réagir l'amine à doser sur la quinone libre, on bloque la fonction réactive du composé d'addition obtenu, avant sa mise en contact avec l'anticorps monoclo- nal spécifique, en le faisant réagir avec une amine primaire en excès, telle que la glycine, la lysine, l'éthanolamine, le trishydroxyméthylaminométhane, dit TRIS, ou analogues. Par anticorps monoclonal spécifique du composé d'addition, on entend un anticorps qui complexe ce produit, sous sa forme libre ou immobilisée, sans complexer l'amine primaire seule, ni la quinone libre ou immobilisée et ne se fixe pas sur la poly- amine ou le support, mentionnés ci-dessus. Il est particulièrement surprenant de pouvoir obte- nir de tels anticorps monoclonaux qui reconnaissent le produit résultant de la réaction de la quinone sur une amine, sans reconnaître chacune de ces structures séparées. Ces anticorps monoclonaux sont sécrétés par des hybridomes, préparés selon la technique connue décrite pour-la première fois par Kôhler et Milstein dans Nature, 2561 495-97 (1975). Pour obtenir les cellules qui seront fusionnées avec des cellules de myélome murin, on injecte à des souris un conjugué protéine/amine à étudier, préparé en faisant réagir la quinone considérée sur une protéine, puis l'amine primaire sur la protéine "sensibilisée" ainsi obtenue. Le couplage de différents composés de forte masse moléculaire aux protéines par l'intermédiaire d'une quinone est décrit dans différents articles de S.AVRAMEAS et T. TERNYNCK, dont notamment Immunochemistry vol. 14 p. 767 (1977); la même méthode est appliquée dans ce cas.- La protéine utilisée pour préparer le conjugué immu- nogène peut être par exemple l'albumine bovine, l'ovalbu- mine, une enzyme telle que la glucose-oxydase, la ribonu- cléase, ou encore l'hémocyanine de lamproie. Les hybridomes obtenus par fusion des cellules de myélome murin, telles que SP-2/0 ou Ag 8 x 63 - 653, et les cellules de rate des souris immunisées, sont sélec- tionnés par clonage et sous-clonage de telle sorte qu'on isole les lignées d'hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux ayant une forte affinité pour le composé d'addition 1,4 du type de ceux de formule I ou II précédem- ment représentées, et une affinité négligeable pour l'amine libre, la quinone libre ou immobilisée, ainsi que pour la polyamine utilisée pour le couplage de la quinone au support insoluble. L'immunoréactivité des surnageants de culture est contrôlée par une technique enzymo-immunologique directe. Tout d'abord, chaque surnageant est testé simultanément vis-à-vis du conjugué histamine-quinone-polyamine et du conjugué histidine-quinone-polyamine. La présence d'anti- corps liés à ces deux conjugués est révélée par des anticorps anti-IgG de souris marqués par une enzyme. Les hybridomes qui secrètent des anticorps qui se combinent uniquement avec le premier conjugué sont seuls conservés. La spécifi- cité fine de ces anticorps est ensuite analysée par une technique d'inhibition en utilisant comme inhibiteur la quinone, le composé histamine-quinone, le composé histidine- quinone, le composé glycine-quinone, la polyamine, l'histi- dine, l'histamine, les conjugués histamine-quinone-polyamine, histidine-quinone-polyamine et glycine-quinone-polyamine. Les hybridomes sélectionnés sont ceux qui secrètent des anticorps reconnaissant uniquement le composé histamine- quinone. Par composé histamine-quinone (ou histidine, ou glycine), on entend le composé résultant de la réaction de l'histamine sur la quinone (ou de l'histidine, ou de la glycine). Par conjugué histamine-quinonepolyamine, on entend le résultat de la réaction de la quinone avec le polyamine suivie de la réaction du produit obtenu avec de l'histamine. - Dans le cas de la recherche d'anticorps monoclonaux diri- gés contre une autre amine que l'histamine, on pourra uti- liser pour la sélection d'autres amines que l'histidine ou la glycine, c'est-à-dire d'autres analogues structuraux de l'amine considérée. Les hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux ayant les caractéristiques d'affinité précédemment définies ainsi que ces anticorps monoclonaux sont un autre objet de l'invention. Des échantillons de l'hybridome préféré préparé à ce jour, ont été déposés à la Collection Nationale de Microor- ganismes à l'Institut Pasteur, Paris, le 4 février 1985, sous le n I 421. Les principes des immunométhodes de dosage de l'anti- corps monoclonal restant libre, après sa mise en présence avec le composé formé par réaction entre la quinone et l'amine à doser, ou de l'anticorps monoclonal complexé à l'amine à doser sont classiques. Lorsque la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion implique la réaction de la quinone immobilisée sur l'amine, on dose, après avoir isolé le support du milieu réactionnel, l'anticorps monoclonal qui s'est fixé sur le support en se complexant au composant résultant de la réac- tion de l'amine à doser sur la quinone préalablement fixée au support. Une technique, particulièrement sensible, consiste à faire réagir sur l'anticorps complexé Ac1, un anticorps Ac2 dirigé contre lui par exemple un anticorps anti-immunoglobulines - et marqué de façon connue en soi, de telle sorte que la quantité d'Ac fixée à Ac1 soit facile à mesurer avec précision. Parmi les agents de marquage connus des anticorps, on peut citer les éléments radioactifs, les éléments fluo- rescents, les enzymes, les globules rouges. On préfère les enzymes, telles que la galactosidase, la peroxydase, la glucose-oxydase, la phosphatase alcaline. Lorsque la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion implique la réaction de la quinone libre sur l'amine présente dans l'échantillon, la détermination de la quanti- té d'anticorps monoclonal s'étant complexé peut être faite par une méthode dite de "compétition". Pour cela, on intro- duit dans le milieu réactionnel, après l'étape de complexa- tion de l'anticorps monoclonal Acl, une quantité connue du composé résultant de la réaction de la quinone immobili- sée et de l'amine considérées, ainsi qu'un anticorps Ac2, dirigé contre Acl, et marqué comme précédemment. Le marqua- ge permet la mesure de la quantité d'Ac1 qui n'avait pas réagi avec le composé d'addition formé à partir de l'amine contenue dans l'échantillon à doser et qui s'est fixée sur le support portant le composé quinone-amine. Les échantillons dans lesquels on dosera par le procédé de l'invention les amines peuvent être préparés à partir des tissus et liquides biologiques de façon connue en soi et dilués si nécessaire de telle sorte que la con- centration des amines soit en général comprise entre 10 pg/ml et 20 ng/ml; cette concentration est fonction du pH du milieu rêactiontel, de l'affinité des agents immuno- géniques en présence, de la quantité de quinone fixée au support et de la nature du marquage de l'anticorps utilisé pour la révélation. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de mise en oeuvre de l'invention: EXEMPLE 1: obtention d'hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux spécifiques du composé d'addition 1,4 formé par action de la para-benzoquinone sur l'histamine. 1) Préparation de l'immunogène: On dissout 10 mg d'albumine bovine dans 2 ml de tampon phosphate (0,1 M; pH.= 6,0) et on ajoute 30 mg de p-benzoquinone dissous dans 0,6 ml d'éthanol. Après une- heure sous agitation à température ambiante, la solution est chromatographiée sur une colonne de Trisacryl GF05, commercialisée par IBF - Pharmindustrie, qui est à base de copolymères acryliques; la colonne contenant environ ml de gel avait été préalablement équilibrée avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M. On recueille en éluant avec la même solution de chlorure de sodium la fraction de tête jusqu'à un volume correspondant au volume mort de la colonne. On ajoute à cette fraction la quantité suffisante de solution aqueuse de bicarbonate de sodium 1M pour obtenir une concentration finale en bicarbonate de 0,1 M, puis on introduit 10 mg d'histamine. Après 24 heures à 18 C, la solution est chromatographiée sur une colonne constituée d'environ 50 ml de Trisacryl GF05, équi- librée avec une solution de chlorure de sodium 0,15 M, tamponnée à pH 7,4 avec du phosphate de potassium 0,01 M ; l'élution est réalisée avec cette même solution. L'immu- nogène ainsi obtenu contient en moyenne 2,6 molécules d'histamine par molécule d'albumine. 2) Immunisation des souris On pratique 4 injections, y comrpis l'injection de rappel, de l'immunogène aux animaux à raison de 100 ?g d'antigène dans 200 u1 d'adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée, pour les deux premières injections à 14 jours d'intervalle et de 5f"gd'antigène dans 200 ul de sérum physiologique par voie intraveineuse pour les deux 257-7676 suivantes pratiquées le même jour et 4 jours après la seconde. Le sacrifice et l'isolement des cellules spléniques a lieu 3 jours après la dernière injection. 3) fusion La fusion avec des cellules d'hybridome adaptées SP 2/0, est réalisée en présence de polyéthylène glycol 1000, commercialisé par la Société MERCK. 4) Sélection des hybridomes La culture des clones et sous-clones est effectuée sur le milieu RPMI 1640, complémenté par du sérum de cheval à 10 %; la composition de ce milieu classique est mention- née dans In Vitro 9, p. 6 (1974). On sélectionne les clones en étudiant le contenu des surnageants des puits de culture par la méthode dite ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), c'est-à-dire "essai utilisant une enzyme fixée à un immunoadsorbant". 4) Sélection A partir de cultures primaires, en utilisant la technique d'analyse des surnageants précédemment décrite, on a ainsi isolé 2 clones dont l'affinité pour le conjugué histamine/p-benzoquinone/albumine est nettement supérieure à celle pour l'histamine libre. Pour le clone de référence D2-12, déposé à la CNCM sous le n I-421, les affinités relatives de l'anticorps monoclonal secrété figurent dans le tableau 1. TABLEAU 1 Nature de l'antigène affinité relative Conjugué histamine/ pbenzoquinone/albumine 1 histamine libre 0,5 x 10- 5 conjugué p-benzoquinone/albumine _ - albumine seule _ o EXEMPLE 2: Dosage de l'histamine de type "direct". 3) Préparation de la p-benzoquinone immobilisée. On introduit 100 1 d'une solution d'albumine bovine à pg/ml dans un tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,02 % (p/V) d'azoture de sodium, dans chaque puits d'une microplaque de titration en polystyrène. La plaque est cou- verte puis incubée pendant 2 heures à 60 C et au moins une nuit à 4 C. Le liquide est éliminé des puits qui sont ensuite lavés par une solution de phosphate de sodium (O,1M; pH = 4,5). On introduit ensuite dans chacun des puits ainsi traités 100 pl d'une solution de para-benzoquinone à 3 mg/ml dans un mélange à 10 % (V/V) d'éthanol et de phosphate de potassium (0,1 M; pH,= 4,5). La plaque couverte, est main- tenue 1 heure à 4 C, à l'obscurité. Le liquide est décanté et les puits sont lavés avec du tampon phosphate (0,1 M; pH:= 4,5) pour éliminer l'excès de benzoquinone. 2) Fixation de l'histamine à doser L'échantillon (témoin ou à étudier) est dilué avec un tampon bicarbonate de sodium (0,1 M) pour obtenir un pH:= 8,5, de telle sorte que l'on ait une concentration en histamine comprise entre 0,1 et 20 ng/ml. On introduit alors 100 ul de cette dilution dans les puits de la plaque précédemment obtenus et l'on maintient 4 heures à 37 C, la plaque couverte. On élimine alors le liquide des puits et les lave par une solution dénommée TBS constituée d'une solution aqueuse, de TRIS (0,01 M; pH:= 7,4) et de NaCl (0,15 M) dans laquelle on a introduit un agent tensio-actif classique le TWEEN 20 à raison de 0,1%. 3) Complexation. Pour obtenir de grandes quantités d'anticorps mono- clonal, on a appliqué une méthode connue: formation d'asci- tes chez des souris auxquelles on injecte par voie intra- péritonéale les anticorps monoclonaux secrétés par l'hybri- dome préféré isolé dans l'exemple 1 et isolement du liquide d'ascite.L es anticorps sont dilués dans du TBS contenant 1 % d'albumine bovine et 0,1 % de TWEEN 20 pour obtenir des solutions de concentration voisine de u pg/ml On introduit dans chacun des puits précédemment trai- tés 100 pl de dilution d'anticorps monoclonal et laisse la plaque 1 nuit environ à la température ambiante. On élimine alors le liquide des puits et les lave avec une solution de TBS contenant 0,1 % de TWEEN 20. 4) Révélation a) Des anticorps anti-IgG de souris, marqués à la -galactosidase sont dilués dans une solution de TBS conte- nant 0,02 % (p/V) d'azoture de sodium pour obtenir des concen- trations en anticorps comprises entre 1 à 5 ug/ml. On en introduit pl dans chaque puits et abandonne la plaque couverte, 2 heures à température ambiante avant d'éliminer le liquide des puits et de les laver avec du TBS contenant 0,1 % de TWEEN 20. b) On introduit ensuite dans chacun des puits 200 pl d'une solution aqueuse tamponnée d'un substrat spécifique de la -galactosidase, l'ortho-nitrophényl galactopyrano- side, de concentration 0,8 mg/ml. Après 2 à 4 heures à 3i C, on arrête la réaction enzymatique par addition de 50 pl de solution aqueuse de Na2CO3 (2M) et on détermine par lecture de la densité optique de la solution contenue dans les micro- puits, la quantité de substrat transformée. Sur la figure 1 est représenté en coordonnées semi-logarithmiques la densité optique lue, à 414 nm, en fonction de la concentra- tion après dilution, en histamine de l'échantillon de départ, exprimé en ng d'histamine par ml. On constate que dans ces conditions le seuil de détec- tion de l'histamine est voisin de 20 pg/100 pl. EXEMPLE 3: Dosage de l'histamine par la méthode dite de compétition" 1) Réaction de l'amine sur la p-benzoquinone. On mélange dans des petits tubes (volume à volume) l'échantillon à doser ou l'échantillon témoin, contenant l'histamine avec une solution de pbenzoquinone à 6 mg/ml dans un tampon phosphate (0,1 M; pH = 4,5) contenant 20 % (V/V) d'éthanol pour obtenir une solution ayant un volume final de 0,5 ml environ. Le mélange est abandonné à tempé- rature ambiante 1 heure à l'obscurité. 2) Blocage des fonctions réactives. On introduit ensuite dans chacun des tubes 50,1 d'une solution aqueuse de glycine (2M) et carbonate de sodium (2M), pour obtenir un pH final compris entre 7,5 et 8,5 et aban- donne le mélange à température ambiante 1 heure à l'obscurité. 3) Complexation. On introduit alors 90 pl d'une solution d'anticorps monoclonal, précédemment obtenu, dans une solution aqueuse de phosphate monopotassique (0,5 M) contenant 10 % (p/V) de sérum albumine bovine et 0, 1 % de TWEEN 20, de telle sorte que la concentration en anticorps soit voisine de 100 ng/ml. Les tubes sont abandonnés à température ambiante pour 20 heures. 4) Révélation Les solutions contenues dans les tubes sont alors introduites dans les micropuits d'une plaque sur les parois desquels ont été fixés de l'histamine par l'intermédiaire de la sérum albumine bovine comme décrit à l'exemple 2-1 et 2-2,à raison de 1 yg d'histamine par puits. Dans chacun des puits ainsi remplis, on ajoute ensuite une solution d'anticorps marqués anti-IgG de souris dans les conditions décrites à l'exemple 1 (4-a) et on révèle comme à l'exemple 1 (4-b). L'activité enzymatique mesurée est pratiquement inversement proportionnelle à la concentration de l'échantil- lon de départ en histamine, comme on peut le constater sur la figure 2 sur laquelle est portée la densité optiqueLue en fonction de la concentration d'histamine dans la solution. Le s-euil de détection avec les anticorps monoclonaux secrétés par les hybridomes de référence D22-12 dans ces conditions est donc de 5 ng/ml. EXEMPLE 4: Comparaison des résultats obtenus avec une méthode selon l'invention et une méthode fluorimétrique connue. On a dosé successivement par les deux méthodes, 22 échantillons de solutions contenant de l'histamine à diverses concentrations. Sur la figure 3, on a porté en abscisse les résultats obtenus avec la méthode selon l'invention de type direct (E) et en ordonnée avec la méthode flMorimétrique (F); on constate sur cette figure qu'il y a corrélation entre les résultats obtenus par les deux méthodes. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunologique des amines dans les milieux biologiques, caractérisé en ce que: a) on fait réagir l'amine présente dans l'échantillon à étudier avec une quinone libre ou immobilisée; b) on introduit ensuite dans le milieu un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement7composé ainsi formé; c) on dose par une immunométhode l'une des formes de l'anticorps monoclonal présent, c'est-à-dire l'immuno- complexe ou l'anticorps libre. 2. Procédé selon la revendication 1 de type direct, caractérisé en ce que la quinone a été préalablement fixée sur un support insoluble par l'intermédiaire d'un polymère à fonctions amines et en ce que la forme complexée de l'anti- corps monoclonal est dosée. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que a) on fait réagir l'amine de l'échantillon sur la quinone immobilisé; b) on bloque le reste des fonctions réactives de la quinone; c) on introduit dans le milieu un anticorps monoclonal spécifique du composé résultant de l'addition de l'amine sur la quinone; d) après séparation de la phase solide, on détermine la quantité d'anticorps monoclonal qui y est fixée par une immunométhode. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'immunométhode de détermination de la quantité d'anticorps monoclonal fixé consiste à introduire dans le milieu un anticorps, dirigé contre l'anticorps monoclonaL,et marqué par un élément dosable. 5. Procédé selon la revendication 1 de type par compé- tition, caractérisé en ce que a) on fait réagir l'amine à doser avec la quinone libre b) on bloque les fonctions réactives restantes de la quinone, c) on introduit l'anticorps monoclonal spécifique du composé d'addition dans le milieu; d) on dose l'anticorps monoclonal non complexé. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on dose l'anticorps monoclonal non complexé en intro- duisant dans le milieu une quantité donnée d'histamine fixée sur un support insoluble par l'intermédiaire d'un polymère à fonctions amines et de la quinone, et un anticorps, dirigé contre l'anticorps monoclonal, et marqué par un élément dosable, et qu'après réaction, on détermine la quantité d'agent marqué présent sur la phase solide. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour le dosage des amines primaires dans les milieux biologiques. 8. Procédé selon la revendication 7 mettant en oeuvre la p-benzoquinone à titre de quinone. 9. Procédé selon l'une des revendications X ou 8, pour le dosage de l'histamine. 10. Anticorps monoclonaux spécifiques du produit résultant de la réaction d'une quinone avec une amine primaire ou secondaire. 11. Anticorps monoclonaux selon la revendication 10 spécifiques du produit -résultant de la réaction d'une amine primaire sur la p-benzoquinone. 12. Anticorps mol.oclonaux selon l'une des revendi- cations 10 ou 11 spécifiques du composé résultant de la réac- tion de la p-benzoquinone et de l'histamine. 13. Anticorps monoclonaux selon la revendication 12, ayant les caractéristiques de ceux secrétés par la lignée d'hybridome dont des échantillons ont été déposés à la CNCM sous le n 1-421. 14. Hybridomes secréteurs d'un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 10 à 12. 15. Hybridomes ayant les caractéristiques de ceux appartenant à la lignée cellulaire dont des échantillons ont été déposés à la CNCM sous le n 1-421. 16. Ensemble de réactifs pour l'application du procédé. selon l'une des revendications 2 à 4 et 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte: - un support insoluble sur lequel a été fixé une quinone par l'intermédiaire d'une polyamine; - un anticorps monoclonal spécifique du produit résul- tant de la réaction d'une quinone avec l'amine à doser; - un système pour le dosage immunologique de l'anti- corps monoclonal. 17. Ensemble de réactifs pour l'application du procédé selon l'une des revendications 5 ou 6 et 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte: - une quinone - un composé susceptible de bloquer les fonctions réactives de la quinone - un anticorps monoclonal spécifique du produit résultant de la réaction de la quinone avec l'amine à doser - un système pour le dosage immunologique de l'anti- corps monoclonal.