Brevet FR2580928A1 — publié le 19861031

_-1 _ La présente invention concerne un agent pour le trai- tement de néphrites qui contient en tant que composant actif de l'acide N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro- anthranilique ou un sel de celui-ci. Il est bien connu que l'acide N-2'-carboxyl-3',6'- diméthylphényl-4chloro-anthranilique est utilisable en tant que médicament qui a le pouvoir d'abaisser le taux de trigly- cérides hépatiques (brevet US 4 092 426) et possède une acti- vité contre l'ulcère gastroduodénal (brevet US 4 447 453). Il existe deux types de néphrites: les glomérulo- néphrites par anticorps anti-membrane basale et les glomérulo- néphrites par dépôts de complexes immuns. Dans ces deux types d'affections, la membrane basale glomérulaire devient très perméable, ce qui provoque une déperdition considérable de protéines du plasma, et parmi les complications de cette maladie figurent une protéinurie élevée, hypoprotéinémie, oedème protéique et hyperlipémie. Le traitement symptomatique est traditionnellement appliqué aux patients souffrant de néphrites et il met en jeu l'utilisation d'anti-inflammatoires stéroldiens, d'anti-inflammatoires non stéroidiens, d'immuno- suppresseurs et d'inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire. Les agents mentionnés ci-dessus, actuellement adminis- trés à des patients souffrant de néphrites, sont utilisés seulement dans le cadre d'un traitement symptomatique, et nombre d'entre eux provoquent des réactions secondaires impor- tantes. Il était par conséquent vivement souhaitable de mettre au point un agent pharmaceutique qui puisse agir réellement contre la cause spécifique des néphrites et qui ait moins d'effets secondaires. Les auteurs de la présente invention ont administré de l'acide N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro- anthranilique à des rats chez lesquels une néphrite avait été provoquée par injection de sérum néphrotoxique (NTS) -2- et ils ont constaté que ce composé avAit le pouvoir d'inhiber l'excrétion de protéines urinaires. Les auteurs de la présente invention ont aussi découvert que ce composé augmentait le débit sanguin rénal et avait une faible toxicité. On peut préparer le composé utilisé en tant que consti- tuant actif de l'agent de traitement de néphrites de la pré- sente invention à partir de l'acide 2,4-dichlorobenzoique et de l'acide 3, 6-diméthylanthranilique par la réaction d'Ullmann. Dans la préparation de formes pharmaceutiques, on peut éventuellement transformer ce composé en un sel de métal alcalin, tel qu'un sel de sodium ou de potassium. Administré à des sujets humains, le composé précité est efficace pour le traitement de troubles rénaux tels que glomérulonéphrite maligne, glomérulonéphrite chronique, néphropathie à IgA et syndrome néphrotique. La figure 1 montre, en fonction de la dose, le pouvoir de l'acide N-2'-carboxyl-3', 6'-diméthylphényl-4-chloro- anthranilique en ce qui concerne l'inhibition de l'apparition de protéinurie 4 jours après injection de NTS; la figure 2 montre, en fonction de la dose, le pouvoir du composé en ce qui concerne la réduction de la quantité totale de protéine excrétée dans l'urine 4 jours après injection de NTS la figure 3 montre la variation en fonction du temps du taux de protéine dans l'urine pendant la période de 2-4 jours après injection de NTS, avec différentes doses du composé; la figure 4 montre la variation en fonction du temps de la quantité totale de protéine excrétée dans l'urine pendant la période de 2-4 jours après injection de NTS, avec des doses différentes du composé; la figure 5 montre le pouvoir du composé en fonction de la dose, en ce qui concerne l'inhibition d'augmentations du taux de cholestérolémie 4 jours après injection de NTS; la figure 6 montre le pouvoir du composé en fonction de la dose, en ce qui concerne l'inhibition d'augmentations du taux d'albumine dans le sang; et -3- la figure 7 montre le pouvoir du composé en fonction de la dose, en ce qui concerne l'augmentation du débit rénal. Le présent composé peut être présenté sous des formes pharmaceutiques telles que comprimé, comprimé dragéifié, qélule, poudre, granules, suspensionet solution injectable, après avoir été mélangé par des techniques classiques avec des adjuvants et des véhicules pharmaceutiquement acceptables. Les véhicules préférés à utiliser dans la préparation de comprimés, de comprimés dragéifiés, de capsules, de poudres, de granules et de suspensions comprennent le lactose, l'amidon, la dextrine, le sucrose, la cellulose cristalline, le kaolin, le carbonate de calcium, le talc, le stéarate de magnésium, des esters de sucrose et d'acides aliphatiques, le glycérol, l'hydroxypropylméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose calcique, la carboxyméthylcellulose sodique et l'hydroxy- propylcellulose. On prépare de préférence les solutions injec- tables par dissolution du composé dans de l'eau distillée ou dans des solutions de sels tels que le chlorure de sodium et le chlorure de potassium. Le composé peut être administré en une quantité suffi- sante pour provoquer la stimulation et la normalisation des fonctions rénales. Pour l'administration orale à des sujets humains, la dose quotidienne ira de 5 à 100 mg, de préférence de 10 à 30 mg; pour l'injection intraveineuse, la dose quoti- dienne ira de 1 à 20 mg, de préférence de 2 à 6 mg. L'acide N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro- anthranilique ou ses sels utilisés dans la présente invention ont le pouvoir d'inhiber l'excrétion de protéines urinaires et possèdent d'autres activités. Les expériences et l'exemple qui suivent sont donnés pour illustrer la présente invention plus en détail mais ne doivent pas être considérés comme limitatifs. Expérience N I Pour l'induction de néphrite due au sérum néphrotoxique, on a administré par injection intraveineuse au niveau de -4- la queue 1 ml de NTS (antisérum de lapin contre l'homogénat du cortex rénal de rat) à des rats SD mâles âgés de 5 semaines (5 animaux par groupe). En commençant la veille de l'injection de NTS, on a administré par voie orale de l'acide N-2'- carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro-anthranilique aux doses choisies jusqu'au troisième jour après l'injection de NTS, à raison d'une dose par jour. On a administré seule- ment de l'eau au groupe témoin. On a placé les animaux dans des cages individuelles, et on a prélevé des échantillons d'urines de 24 heures 2 et 4 jours après l'injection de NTS. On a mesuré la quantité de protéines urinaires dans ces échantillons par la méthode suivante: on a centrifugé l'échan- tillon (3 000 tours/minute, 10 minutes); on a dilué le sur- nageant avec de l'eau distillée; on a ajouté 4 ml d'acide sulfosalicylique à 3% à 1 ml du surnageant dilué et, en utilisant comme référence une solution d'albumine de sérum bovin, on a déterminé la quantité de protéine en mesurant la turbidité du mélange. 4 jours après l'injection de NTS, on a anesthésié les rats avec de l'éther et on a prélevé des échantillons du sang entier à partir de l'artère inférieure. Les taux de cholestérol et d'albumine dans le sang ont été mesurés, respectivement, à l'aide de l'UNIKIT -Cholestérol-E et de l'UNIKIT -Albumine-S (fournis l'un et l'autre parChugai Seiyaku Kabushiki Kaisha). Les doses d'acide N-2'-carboxyl-3',6'- diméthylphényl-4-chloro-anthranilique étaient de 10mg/kg, mg/kg et 100 mg/kg. Les résultats sont indiqués sur les figures 1 à 6. Les trois activités du composé, à savoir, diminution de l'excrétion de protéines urinaires, réduction du taux de cholestérolémie et augmentation du taux d'albumine dans le sang, se sont révélées dépendre de la dose et augmen- ter de façon progressive, pour 10, 50 et 100 mg/kg. Expérience N 2 On a fait jeûner pendant 19 heures des rats SD mâles (Agés de 7 semaines, 5 animaux par groupe) et on leur a -5- administré par voie intraveineuse 4,8 mg de phénolsulfone- phtaléine (PSP). 15 minutes après, on a anesthésié les animaux avec de l'éther et on a prélevé des échantillons de sang à partir de l'artère inférieure pour une détermination quan- titative du taux de PSP dans chaque échantillon. Une heure avant l'injection de PSP, on avait administré par voie orale une quantité préétablie du composé d'essai. A l'aide de la formule ci-dessous, on a calculé l'accélération en pourcentage de l'excrétion de PSP pour chacune des doses utilisées. Les résultats sont donnés dans le tableau 1. On a administré seulement de l'eau au groupe témoin. A B A - B Accélération de l'excrétion de PSP = x 100 (%) A o A: concentration de PSP dans les échantillons de sang provenant du groupe témoin; et B: concentration de PSP dans les échantillons de sang provenant du groupe traité. Tableau 1 Doses Taux de PSP dans le sang Accélération de (mg/kg (Fg/ml) l'excrétion de PSP (%) Témoin 50,4 2,6 0 12,5 42,6 1,3* 15,5* 32,1 3,3** 36,3** 50 25,5 1,5** 49,4** 21,0 0,7** 58,3** (* P Expérience N 3 On a administré par voie orale, comme dans l'expérience N 2, le composé d'essai de la présente invention en une quan- tité de 100 mg/kg, et on a examiné la concentration de PSP dans le sang en fonction du temps écoulé après l'administration. On a calculé comme dans l'expérience N 2 l'accélération en pourcentage de l'excrétion de PSP, et les résultats sont -6-- indiqués dans le tableau 2. On a administré seulement de l'eau au groupe témoin. Tableau 2 Temps Taux de PSP dans le sang Accélération de (h) ( 0,5 21,2 1,2** 51,6** 1 21,8 1,9** 50,2** 2 19,8 2,5** 54,8** t4 19,8 1,9** 54,8** (**P Expérience N 4 Pour provoquer chez ies animaux une insuffisance rénale, on a administré par injection intrapéritonéale 100 mg/kg de bromhydrate de bromo-éthylamine (BEA) à des rats SD mâles (âgés de 7 semaines, 5 animaux par groupe). 3 jours après l'injection, on a administré par voie orale le composé d'essai da la présente invention à des doses choisies. Une heure après l'administration, on a injecté aux rats, par voie intraveineuse, du PSP à une dose de 4,8 mg par animal. 15 minutes, 30 minutes ou 60 minutes après l'injection intraveineuse, on a anesthésié les rats avec de l'éther, et on a prélevé des échantillons de sang à partir de l'artère inférieure, puis on a déterminé quantitativement les taux de PSP comme dans l'expérience N 2. A l'aide de la formule ci- dessous, on a calculé l'accélération en pourcentage de l'excrétion de PSP pour chacune des doses utilisées, et les résultats sont indiqués dans le tableau 3. Accélération de l'excrétion de PSP = x 100 (%) A o A: concentration de PSP dans les échantillons de sang provenant du groupe témoin; et B: concentration de PSP dans les échantillons de sang provenant du groupe traité. T A B L E AU 3 minutes 30 minutes 60 minutes TRAITEMENT Taux de PSP Accdlération Taux de PSP Accélération Taux de PSP Accélération dans le sgel'crétion de l'excrétion le sang de l'excrétion ld P % dans le sang de PSd de PSP (Pg/ml) (% g/ml) (%) (Pg/ml) (%) AUCUN 42,7 + 1,6 - 20,4 + 1,3 - 6,9 0,5 - EA seult54t2 + 2,8 0 34,6 + 26 0 19,2 + 21 0 ( témoin) BEA+ composé d'essai30,0 + 37* 44,6* 182 + 3,1* 474* 9t4 + 2,8* 51,0* (50 mg/kg) BEA + composé d'essai27,2 + 2,4* 49,8* 15,0 + 1,9* 56,6* 7X0 + 11* 63, 5* (100 mg/kg) (*P W Ln co Co Expérience N 5 Comme dans l'expérience N 4, on a provoqué une insuf- fisance rénale chez des rats SD mâles (âgés de 7 semaines, animaux par groupe), mis à part que l'on a utilisé comme inducteur la kanamycine à la place d'EBA. On a effectué un essai d'excrétion de PSP 15 minutes après l'injection intraveineuse de PSP. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Tableau 4 Traitement Taux de PSP dans Accélération de le sang ({g/ml) l'excrétion de PSP (%) aucun - 59,7 3,8 - kanamycine seule (témoin) 71,2 3,6 0 kanamycine + composé d'essai 2 (50 mg/kg) 28,4 1,3** 60,0** (** P Expérience N 6 On a dégagé l'artère rénale gauche de rats Wister- Imamichi mâles (âgés de 15 semaines, 7 animaux par groupe) anesthésiés au pentobarbital, et on l'a connectée à un senseur tout en injectant par voie intraveineuse le composé d'essai de la présente invention à des doses de 10 mg/kg et de 30 mg/kg On a mesuré le débit sanguin rénal à l'aide d'un hémodromomètre Doppler pulsé. On a calculé pour chaque animal l'augmentation en pourcentage du débit sanguin rénal, et les résultats sont indiqués sur la figure 7. Expérience N 7 - Toxicité aigue: Un sel de potassium du composé d'essai de la présente invention administré par voie orale à des rats SD mâles (âgés de 5 semaines, 5 animaux par groupe) a donné des valeurs -9- de la LD50 allant de 1600 à 4096 mg/kg. Expérience N08 Le composé d'essai de la présente invention, soit sous forme libre, soit sous forme de sel de sodium, a été administré par voie orale à des rats Sprague-Dawley mâles (âgés de 5 semaines, 5 animaux par groupe) pendant 14 jours consécutifs, à raison d'une dose par jour. Les résultats sont indiqués dans le tableau 5. Tableau 5 Composé d'essai Dose (mg/kg) Mortalité Forme libre 220 0/5 440 0/5 _______- 880 0/5 Sel de sodium 250 0/5 500 0/5 1000 0/5 20. Comme on peut le constater d'après les données ci- dessus, le composé de la présente invention a une faible toxicité et manifeste les activités suivantes chez des rats dans lesquels une néphrite provoquée par le sérum néphro- toxique a été induite: diminution de l'excrétion de protéines urinaires, inhibition d'augmentations du taux de cholestérolémie, inhibition de diminutions du taux d'albumine dans le sang, accélération de l'excrétion de PSP et augmentation du débit sanguin rénal. En vertu de ces avantages, le composé de la présente invention peut être utilisé en tant qu'agent de traitement de néphrites. Exemple (préparations) a) Comprimé g de N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro- anthranilate disodique, que l'on avait fait passer au travers -10- d'un tamis de 0,30 mm d'ouverture de mailles (N 50 US) ont été mélangés intimement avec 50 g de lactose, 30 g de cellulose cristalline, 9 g d'amidon de mals et 1 g de stéarate de magnésium. On a mis le mélange dans un pilulier pour confec- tionner des comprimés ayant un diamètre de 7 mm, pesant chacun 100 mg. b) Comprimé dragéifié Les comprimés préparés en a) ont été enrobés avec une solution aqueuse à 10% contenant de l'hydroxypropylméthyl- cellulose, du talc et du glycérol en une proportion de 1:1:0,2. c) gélule On a mélangé intimement 50 g d'acide N-2'-carboxyl- 3',6'-diméthylphényl-4-chloro-anthranilique avec 148 g de lactose et 2 g de stéarate de magnésium. On a mis le mélange sous forme de gélules contenant chacune 200 mg du mélange. d) Poudre On a ajouté 600 g de lactose et 360 g d'amidon de mais à 40 g d'acide N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4- chloro-anthranilique broyé, et on a introduit le mélange dans un granulateur à lit fluidisé, o une poudre a été préparée par pulvérisation par voie humide. e) Granule On a ajouté 450 g de lactose et 40 g de carboxyméthyl- cellulose calcique à 10 g d'acide N-2'-carboxyl-3',6'- diméthylphényl-4-chloro-anthranilique que l'on avait passer au travers d'un tamis de 0,56 mm d'ouverture de mailles (N 32 US et on a préparé un mélange intime en utilisant 100 g d'une solution aqueuse d'hydroxypropylcellulose à 10%. On a intro- duit le mélange dans un granulateur de type extrudeuse. On a fait sécher les granules résultants et on les à fait passer à travers un tamis de 1,4 mm d'ouverture de mailles (N 14 US). f) Suspension On a dissous 200 g de sucrose dans de l'eau pour obte- nir un volume total de 400 ml. On a ajouté à la solution -11- g de cellulose cristalline et 0,75 g de carboxyméthyl- cellulose sodique, et on a préparé une suspension homogène. Dans un broyeur à boulets, on a broyé 5 g d'acide N-2'- carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro-anthranilique conjoin- tement avec 0,5 g d'un ester de sucrose et d'acide aliphatique et 20 ml d'eau. On a combiné le mélange broyé avec la sus- pension préparée au préalable, pour obtenir un volume total de 500 ml. On a agité le mélange résultant jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. g) Solution injectable On a dissous une poudre purifiée (10 g) de N-2'-carboxyl- 3',6'-diméthylphényl-4-chloro-anthranilate disodique et 18 g de chlorure de sodium dans de l'eau distillée pour injection, pour obtenir un volume total de 2000 ml. La solution a été filtrée à travers un filtre à membrane (0,22)am), puis placée dans des ampoules incolores ayant chacune une capacité de 2 ml. Les ampoules ont été scellées et stérilisées par chauf- fage à 100 C pendant 30 minutes pour donner des préparations injectables. Exemple de référence (Synthèse) On a introduit dans un ballon à fond rond de 300 ml à trois tubulures 150 ml d'alcool iso-amylique, 8,72 g (0,0457 mole) d'acide 2,4-dichlorobenzoique, 7,56 g (0,0458 mole) d'acide 3,6diméthylanthranilique, 15 g de carbonate de potassium anhydre, 200 mg de poudre de cuivre et une trace de iodure, et on a chauffé le mélange au reflux pendant 5 heures sous agitation. On a refroidi le mélange réactionnel à la température ambiante, on l'a versé dans 500 ml d'eau, et on l'a filtré. On a concentré sous vide la liqueur-mère pour éliminer l'alcool iso-amylique, puis on a acidifié le résidu avec de l'acide chlorhydrique 6N. On a dissous les cristaux résultants dans du tétrahydrofuranne (THF) et on a traité la solution sur du charbon actif. On a éliminé le THF par concentration sous vide de la solution, et les cristaux résultants ont été mis en suspension dans -12- du méthanol. On a chauffé au reflux la suspension pendant 3-4 heures, puis on l'a refroidie à la température ambiante. Les cristaux résultants ont été recueillis par filtration; ils ont été identifiés comme étant constitués d'acide N-2'- carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4-chloro-anthranilique ayant un point de fusion de 283 C (avec décomposition). Rendement: 7 g. Analyse élémentaire: Formule brute: C H CNO 16 14 1NO4 C H N Cl Calculé (%): 60,10 4,41 4,38 11,09 Trouvé (%): 59,88 4,42 4,21 10,93 -13- REVENDICATIONS 1. Agent de traitement de néphrites caractérisé en ce qu'il contient en tant que composant actif l'acide N-2'-carboxyl-3',6'-diméthylphényl-4chloro-anthranilique ou un sel de celui-ci. 2. Agent de traitement de néphrites selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que la néphrite est la glomérulonéphrite maligne. 3. Agent de traitement de néphrites selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que la néphrite est la glomérulonéphrite chronique. 4. Agent de traitement de néphrites selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que la néphrite est la néphropathie à IgA. 5. Agent de traitement de néphrites selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que la néphrite est le syndrome néphritique.