Brevet FR2574311A1 — publié le 19860613

- 1 - "Perfectionnement:; aux procédés et appareils d'élecu trophorèse préparative. L'invention a pour objet des perfectionnements aux procédés et appareils d'électrophorèse préparative, On sait que l'électrophorèse en gel constitue une technique de séparation performantebasée sur les différences de mobilité de composés donnés sous linflu- ence d'un champ éIectrique. Cette technique 'est largement utilisée pour purifier des composés notamment des macrom1lécules telles que les protéines et les acides nucléiques tO Son utilisation à l'échelle préparative est cependant difficile en raison du problème de l'élution des composés pris dans le gel. et ce plus particu- lièrement lorsqu il s'agit de macromolécule. Diverses solutions ont été proposées pour récupérer les composés séparés Il s'agit, par exemple, de couper le gel en tranches et de laisser gonfler les tranches dans un tampon, permettant ainsi une diffusion des macro- molécules dans le tampon extérieur au gel. Cette techni- que présente cependant plusieurs inconvénients liés, notamment à la lenteur de-la diffusion, à la dilution de l'échantillon et au faible rendement. Selon une autre solution, on utilise un réàctif labile (la bisacrylylcystamine par exemple) pour polymériser le gel. Après électrophorèse, le gel est découpé et solubilisé par un deuxième réactif (le 2-mercaptoethanol dans l'exemple cité) pour libérer les produits. Mais. il s'avère souvent nécessair'e de dialyser les produits de solubilisation ce qui entraîne fréquemment une adsorption des pro- duits sur la membrane de dialyse. En outre, le réactif de solubilisation n'est pas toujours neutre vis-à-vis de certains des produits séparén-et peut dornc les altérer. -2- On a également proposé de soumettre le gel ou les tranches du gel à une opération d'électro-élution transversale sur de l'hydroxyapatite puis d'éluer les produits séparés en changeant le tampon. Dans les solutions ci-dessus,l'échantillonsetrmouvecependantdilué eton observe d'une manière générale une perte de résolution. Une autre méthode consiste à continuer l'électro- phorèse jusqu'à ce que les produits émergent en bout du gel. La surface du gel correspondant à cette zone de fin de migration délimite avec une membrane ou un corps poreux une chambre d'élution que traverse un courant de tampon emportant les produits ayant émergé vers un collecteur de fractJo' Ces chambres d'élution souffrent d'un inconvénient majeur, à savoir, la dilution des produits élués. En effet, si le débit du tampon d'élution est faible, les produits migrent vers l'électrode, hors de la chambre d'élution et sont perdus; si le débit du tampon d'élution est suffisant pour éliminer cette perte, l'échantillon est dilué. La concentration sub- séquente nécessaire de l'échantillon amène une perte par adsorption sur la membrane de concentration. Pour limiter la dilution de l'échantillon, on utilisera dans d'autres appareils une membrane semi- perméable pour délimiter la chambre d'élution. Dans ce cas, les produits au lieu d'être perdus vers l'élec- trode, sont collés sur la membrane par le courant élec- trique. D'o la nécessité d'un automatisme qui doit être capable de commander le cycle suivant: a) au bout d'un temps donné (choisi par l'expérimen- tateur) le programme arrête l'électrophorèse. b) dans un deuxième temps (choisi par l'expérimenta- teur également) le programme renverse la polarité de l'électrophorèse pour détacher les produits collés sur la membrane, c) le programme arrête de nouveau l'électrophorèse et met en marche une pompe pour vider la chambre d'élution -3- vers un collecteur de fractions, d) le programme arrête la pompe et ouvre une électro-vanne pour remplir la chambre d'élution et recommencer le cycle. Ce type d'appareil, compte-tenu de la partie électronique, présente le désavantage d'un coût élevé. L'invention a pour but de fournir un procédé d'électrophorèse et un appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé plus satisfaisants au regard des exigences de la technique. EIle vise, en particulier, à fournir un procédé performant permettant l'élution et la récupération des produits recherchés avec des rendements au moins aussi élevés que ceux de l'art antérieur. Elle vise, en outre, à fournir un appareil de construction simple et de prix de revient moindre que ceux connus à ce jour. Selon l'invention, le procédé de purification de produits d'un échantillon donné par électrophorèse sur gel avec élution de ces produits à l'aide d'un premier système tampon est caractérisé en ce qu'il comprend: - le passage d'un deuxième tampon, dans le sens opposé à la migration des produits à séparer, à travers un élément semi-perméable maintenu de manière étanche parallèlement à la surface du gel correspondant à. la zone de fin de migration des produits, à une distance très faible de cette surface, voire nulle, les pores de l'élément semi-perméable ayant une dimension appro- ximativement de l'ordre de celle des particules des produits l l'évacuation par le tampon des produits ayant subi l'électrophorèse, et - la récupération de ces produits. On observera que ces dispositions permettent de mettre à profit le phénomène d'électroendosmose qui se produit durant l'électrophorèse. -4- D'une manière avantageuse,-le passage de tampon à travers l'élément semi-perméable permet de le laver con- tinuellement et d'éliminer, tout au moins en grande partie, la perte par adsorption sur l'élément semi-perméable des produits à récupérer. Le volume de la chambre d'élution est inférieur au millimètre et avantageusement de l'ordre de 2 ou 3 dixièmes de millimètres,voire nul, cequi permet de n'uti- liser qu'un faible courant de tampon et présente l'avan- tage de recueillir les produits purifiés dans de petits volumes d'élution. Or, le volume des chambres d'élution dans les appareils connus à ce jour est supérieur au millimètre. De plus, l'utilisation du courant osmotique rend inutile'la mise en oeuvre d'une pompe, facteur de perte du pouvoir séparateur de l'appareil. Selon le processus le plus généralement utilisé, l'échantillon à purifier est déposé au sommet d'une colonne de gel dont la partie supérieure est immergée dans un tampon contenu dans un récipient pourvu d'une électrode, ou tampon d'électrode supérieur, et dont la partie inférieure avec la chambre d'élution délimitée par un élément semi-perméable est en contact avec un tampon contenu dans un récipient pourvu d'une e5 autre électrode, ou tampon d'électrode inférieur. Conformément au procédé de l'invention, l'élément semi-perméable est traversé dans le sens opposé à celui de la migration des produits par le tampon d'électrode inférieur. Les tampons d'électrode inférieurs et supérieurs peuvent être identiques ou différents. De même le gel peut se trouver dans un tampon identique ou différent des tampons d'électrode. Conformément aux techniques classiques, le gel peut comporter plusieurs types de tampons définissant des zones différentes dans le gel, ce qui favorise la séparation des produits. -5 Le choix plus spécialement de l'élément semi-perméable (en particulier de sa nature et de sa porosité), du système tampon (en particulier de la nature du ou des tampons, de leur différence de conductivité), de l'intensité du courant électrique, de la nature du gel est effectué en fonction des produits à purifier et du débit que l'on souhaite imposer pour la récupération de l'éluat et sera aisément déterminé par l'homme de l'art. Le débit peut être notamment de 0.05 à.^. ml/h. A titre d'exemple, l'élément semi-perméable peut être constitué par une couche de matière plastique poreuse telle que l'acétate de cellulose, du poly- chlorure de vinyle ou analogue, éventuellement sur un support, notamment sur du carton. Il peut s'agir également d'une membrane en peau animale ou encore d'une membrane dite millipore. La dimension des pores peut varier largement étant entendu que les pores doivent être. approximativement du même ordre de grandeur que les produits ayant migré et doivent per- mettre la création du'phénnèrle d'électroendosmose avec le tampon comme indiqué ci-dessus. Ainsi les membranes dites "millipores pour dialysel"posedent des diamètres moyens de l'ordre de 200 à 300 A. Dans d'autres membranes ou couches semi-perméables des diamètres peuvent être seulement de l'ordre de ou à 20 A ou même inférieur. Le gel est formé à partir d'un polymère électri- 3 quement chargé. Parmi les polymères utilisés en élec- trophorèse, on citerale polyacrylamide.l'agarose.l'amidon.l'agar ou'la gélose. L'augmentation de la charge électrique du po- lymère accentuera le phénomène d'osmose. - 6 - La configuration du gel peut être variée. La forme cylindrique apparaît la plus simple, mais des formes, par exemple,en tambour ouen. plaque peuvent être utilisées. Le tampon peut être choisi également dans une large gamme de systèmes appropriés comprenant les tampons nitrate, phosphate, borate ou de type tris, c'est-à-dire tris-(hydroxyméthyl) aminométhane. L'invention vise également un appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé d'électrophorèse préparative. Cet appareil est caractérisé en ce qu'il com- porte: - un élément semi-perméable permettant de mettre à profit le phénomène d'électroendosmose qui se crée pendant l'électrophorèse, - des moyens de sortie permettant d'évacuer vers l'extérieur les produits qui émergent du gel à l'aide du tampon traversant l'élément semi-perméable dans le sens opposé à celui de la migration des produits. L'élément semi-perméable répond avantageusement aux dispositions définies ci-dessus. Le ou les conduits de sortie doivent être disposés de manière à évacuer simultanément et en un minimum de temps toutes les molécules d'un type de produit donné qui émergent d-u gel. Ces moyens d'évacuation de l'éluat qui sont plus spécialement constitués par des moyens du type tube, dépend notamment de la dimension du gel. Pour les gels de petit diamètre, cae-smoyens d'évacuation peuvent être cependant disposés sur le côté du gel, et pour les gels de grande dimension au milieu de la surface du gel. Ces dispositions permettent d'augmeinter le pouvoir séparateur de l'appareil, en évitant le remélange des produits qui a lieu lorsque l'évacuation des molécules d'un même type de produit ne sont pas évacuées simultanéweri 25743 1 1 -7- Selon une autre disposition, l'appareil d'électro- phorèse de l'invention comprend un circuit de réfrigé- ration. Dans le cas, par exemple, des appareils compre- nant comme indiqué ci-dessus un récipient renfermant le tampon inférieur d'électrode, ce récipient est surélevé jusqu'à la base du récipient du tampon supérieur d'électrode et un serpentin disposé à l'intérieur du récipient inférieur ou inclus dans la masse du récipient amène le liquide réfrigérant qui refroidit, par l'in- termédiaire du tampon inférieur, la colonne d'électro- phorèse. L'utilisation de moyens d'agitation, par exemple, d'un barreau aimanté permet d'améliorer l'échange calorifique. L'invention sera illustrée plus en détail ci-après à l'aide des figures 1 et 2 qui représentent respecti- vement des r.odes de réalisation d'appareils d'électropho- rèse selon l'invention. Sur la figure 1, on a représenté un appareil d'électrophorèse comprenant une enceinte formée d'un tube cylindrique 1 en verre renfermant le gel 2 sur lequel est déposé l'échantillon 3 contenant le produit a récupérer. Ainsi, la partie supérieure du tube 1 est engagée dans la partie inférieure d'un bac 4 de forme entonnoir, e-t est immergée dans un tampon supérieur d'électrode 5 contenu dans le bac. L'extrémité inférieure du tube 1 est fermée par une membrane semiperméable 6, fermement maintenue sur le pourtour du gel par un collier à vis en polyéthylène 7, délimitant une chambre d'élution de très faible -8volume 8 (représentée,avec une épaisseur exagérée sur la figure). La partie inférieure du tube plonge dans un tampon inférieur d'électrode 9 contenu dans le bac inférieur 10. Une cathode 11 et une anode 12 sont fixées avec leurs bornes respectives 13 et 14 sur les parois internes respectivement du bac 4 et du bac 10. Un tube 15 en polyéthylène est maintenu par le collier à vis 7 contre le tube I de sorte qu'une extrémité soit appuyée contre la membrane semiperméable 6, l'autre extrémité débouchant à l'extérieur du bac vers un collecteur de fractions 16. Le tube en verre 1 est bouché en bas et le gel 2 est polymérisé de la façon habituelle. On d,épose en haut du gel un échantillon 3 renfermant les pro- duits à séparer. Ceux-ci migrant vers la chambre d'élu- t-ion 8, le tampon d'électrode 9 entre dans la chambre Id'élution en. traversant la membrane semi-perméable 6 et ressort par le tube 15 en emportant vers le collec- teur de fraction 16 les produits qui émergent du gel. Sur la figure 2; on a représenté un autre mode de réalisation d'une chambre d'élution. Les référenc esde la figure 1 sont utilisées pour désigner les mêmes éléments. La chambre d'élution est formée par l'extrémité du gel 2 et la membrane 6 qui est maintenue de manière étanche ét parallèle au gel à l'aide du collier vissant 7 appliquant une bague d'étan- O30 chéité en matériau souple 18 tel que le caoutchouc. L'éluat est évacué par le conduit 15. A titre d'exemple, on rapporte ci-après la réalisation du procédé selon l'invention à l'aide de l'appareil décrit ci-dessus. Cet exemple s'applique -9 - à l'étape finale de la purification d'une kinase qui représente moins de I: 10 000 d'un mélange comportant plusieurs centaines de protéines. Les différentes étapes de la purification sont les suivantes: a) précipitation acide b) précipitation par le sulfate d'ammonium c) chromatographie sur DEAE-cellulose d) chromatographie sur phosphocellulose e) chromatographie sur hydroxylapatite f) ultracentrifugation sur gradient de glycérol g) électrophorlse su. gel de polyacrylamide On observera que les contaminants de l'échantillon utilisé. pour l'étape g possèdent des charges et des masses très voisines de celles de l'enzyme et que, par conséquent, les contaminants et l'enzyme migrent dans le gel les uns à côté des autres (de l'ordre du mm). Néanmoins, certaines fractions de l'éluat--contiennent uniquement l'enzyme recherché. On utilise un gel de polyacrylamide de 2cm _ de section. Les tampons d'électrode sont formés de tris-glycine pH 8,3 ou de tris/Bicine (dérivé de glycine) pH 9,3. Leur conductivité est de 7 mmhos Le tampon de gel est formé de tris/HCl, pH 9,8 de con- ductivité - égale à 0,7 mmhos. Comme élément semi-perméable, on utilise une membrane millipores pour dialyse, de diamètre moyen de pores de l'ordre de 250A Le volume d'élution pour chaque protéine est de 0,05ml à 0,5ml environ dépendant des conditions d'électrophorèse et de la quantité et des propriétés de migration de chaque protéine. (on notera que les - 10 - volumes d'élution correspondants des appareils existant actuellement sur le marché est de I à plusieurs ml). On récupère l'enzyme avec un rendement de 50 à %. en activité enzymatique. On notera que la kincqse présente la particularité d'être retenue partiellement dans le gel ce qui diminue le rendement. En marquant l'enzyme à l'aide d'un traceur radio-actif, on vérifie que seuls quelques pour cent de radioactivité sont absorbés sur la membrane et que la perte majeure se produit dans le gel. Pour d'autres protéines, le rendement est au moins égal à ceux obtenus avec les appareils actuellement disponibles et dépasse par exemple 90% avec l'hémoglobine. L'invention fournit donc des moyens simples et efficaces pour purifier par électrophorèse préparative des compositions chimiques ou biologiques grâce à l'ap- plication du phénomène d'électroendosmose à l'élution des produits. Leur utilisation pour p-urifier des - protéines et des acides nucléiques revêt un intérêt par- - ticulièrement important. - il - REVENDICATIONS 1.- Procédé de purification de produits d'un échantillon donné par électrophorèse sur gel avec élution de ces produits à l'aide d'un premier système tampon, caractérisé en ce qu'il comprend: - le passage d'un deuxième tampon, dans le sens opposé à la migration des produits à séparer, à travers un élément semi-perméable maintenu de manière étanche parallèlement à la surface du gel correspondant à. la zone de fin de migration des produits, à une distance très faible de cette surface, voire nulle, les pores de l'élément semi-perméable ayant une dimension appro- ximativement de l'ordre de celle des particules des produits élués l'évacuation par le tampon des produits ayant subi l'électrophorèse, et - la récupération de ces produits. 2.- Procédé selon la rcvendication 1, caractérisé en ce que le volume de la chambre d'élution est in- férieur au mm, avantageusement de l'ordre de 2 ou 3 dixièmes de mm, voire nul. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'échantillon à purifier est déposé au sommet d'une colonne de gel dont la partie supérieure est immergée dans un tampon contenu dans un récipient pourvu d'une électrode, ou tampon d'électrode supérieur, et dont la partie inférieure avec la chambre d'élution délimitée par un élément semi-perméable est en contact avec un tampon contenu dans un récipient pourvu d'une autre électrode, ou tampon d'électrode inférieur, l'élé- ment semi-perméable étant traversé dans le sens opposé à celui de la migration des produits par le tampon d'électrode inférieur. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que le gel présente une forme cylindre, en tambour ou en plaques. 5.- Appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé d'électrophorèse préparative, caractérisé en ce qu'il comprend - un élément semi-perméable permettant de mettre à profit le phénomène d'électroendosmose qui se crée pendant l'électrophorèse, - des moyens de sortie permettant d'évacuer vers l'extérieur les produits qui émergent du gel à l'aide du tampon traversant l'élément semi-perméable dans le sens opposé à celui de la migration des produits. 6.- Appareil selon la revendication 5, caractérisé en ce que le ou les conduits de sortie sont disposés de manière à évacuer simultanément et en un minimum de temps toutes les molécules d'un type donné qui émergent du gel. 7.- Appareil selon la revendication 5 ou 6, caracté- risé en ce qu'il comprend, en outre, un circuit de réfrigération. 8.- Appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé d'électrophorèse préparative, caractérisé en ce qu'il comprend: - une enceinte formée d'un tube cylindrique 1 en verre renfermant un gel 2 sur lequel est déposé un échantillon 3 contenant le produit à récupérer, - la partie supérieure du tabe 1 étant immergée dans un tampon supérieur d'électrode 5 contenu dans le bas 4, - une membrane semi-perméable 6 fermement maintenue à l'extrémité inférieure du tube 1 sur le - 13 - pourtour du gel par un collier à vis 7 délimitant une chambre d'élution de très faible volume 8, - un bac inférieur 10 contenant un tampon inférieur d'électrode 9, dans lequel plonge la partie inférieure du tube 1; - une cathode 11 et une anode 12 fixées sur les parois internes respectivement du bac 4 et du bac 10, - un tube 15 maintenu par le collier à vis 7 contre le tube 1 de sorte qu'une extrémité soit appuyée contre la membrane semi-perméable 6, l'autre extrémité débouchant à l'extérieur du bac vers-un collecteur de fractions 16. 9.- Application d'un appareil selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, et du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 à la purification de composition chimique ou biologi- -que, en particulier, de protéines, notamment, des enzymes et d'acide nucléique.