Brevet FR2583984A1 — publié le 19870102

La présente invention concerne l'activateur tis- sulaire du plasminogène et en particulier des formulations pharmaceutiques contenant un activateur tissulaire du plas- minogène, leur préparation et leur emploi en médecine humaine et vétérinaire. Il est admis qu'il existe un équilibre dynamique entre le système enzymatique capable de former des caillots sanguins - le système coagulateur - et le système enzyma- tique capable de dissoudre les caillots sanguins - le sys- tème fibrinolytique - qui maintient un lit vasculaire entiè- rement dégagé. Pour limiter la perte de sang par une bles- sure, des caillots sanguins sont formés dans les vaisseaux lésés. Après la réparation naturelle de la blessure, les caillots sanguins superflus sont dissous par l'action du système fibrinolytique. Des caillots de sang peuvent occa- sionnellement se former sans blessure traumatique et peu- vent se loger dans des vaisseaux sanguins majeurs en provo- quant une obstruction partielle ou même totale du courant sanguin. Lorsque cela se produit dans le coeur, le poumon ou le cerveau, il peut s'ensuivre un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire ou un ictus cérébral. L'ensemble de ces cas constitue la cause principale de morbidité et de mortalité dans les nations industrialisées. Les caillots sanguins sont constitués d'un réseau fibreux qui est susceptible d'être dissous par une enzyme protéolytique, la plasmine. Cette enzyme est dérivée d'une pro- enzymeinactive, leplasminogène, uncomposant duplasma sanguin, par l'action d'un activateur de plasminogène. Il existe chez les mammifères deux activateurs de plasminogène immu- nologiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plas- minogène, également connu en tant qu'urokinase, est une enzyme produite par le rein qui peutêtre isolée de l'urine. On peut également la préparer à partir d'un certain nombre de cultures tissulaires comme sources. L'activateur extrin- sèque du plasminogène, également connu en tant qu'activateur vasculaire du plasminogène et qu'activateur tissulaire du plasminogene (AP-t), peut être isolé de nombreux homogénats tissulaires (notamment d'utérus humain), de la paroi des cellules vasculaires et de certaines cultures cellulaires. En plus de ces deux types d'activateurs du plasminogène, il existe également un produit bactérien, la streptokinase, qui est préparé à partir de streptocoques bêta-hémolytiques. Un inconvénient majeur de l'urokinase et de la streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non juste à l'emplacement du caillot sanguin. Elles peuvent, par exemple, détruire d'autres protéines du sang, telles que le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, en réduisant ainsi le pouvoir de coagulation du sang et en augmentant de ce fait le risque d'hémorragie. Par contre, l'activité biologique de AP-t dépend de la pré- sence de fibrine à laquelle il se lie et o il est active. L'activité maximale se développe ainsi au seul emplacement d'un caillot sanguin, c'est-à-dire en présence du réseau fibrineux à dissoudre, et ceci écarte largement le risque d'hémorragie. Le mode principal d'administration de AP-t est la perfusion intravasculaire, ce qui nécessite de formuler AP-t en une solution à usage parentéral. Dans le cas d'une protéine, il est préférable de présenter le médica- ment au médecin ou au vétérinaire sous forme d'une formu- lation pharmaceutique lyophilisée en raison des importants avantages de conservation et de transport qu'elle présente par rapport à une formulation liquide. I1 importe cependant que toute formulation lyophilisée de ce type puisse être facilement transformée en la solution désirée à usage parentéral sans inconvénient ni difficulté exagérés, et que le médecin ou le vétérinaire soit à même d'obtenir la concentration requise en médicament dans toute situation donnée par simple reconstitution de la formulation dans la quantité appropriée de solvant. Il est par exemple à décon- seiller d'administrer un grand volume de solution à un ma- lade atteint de troubles cardiaques ou rénaux car cela imposerait au coeur ou aux reins des efforts encore plus grands. I1 faut donc maintenir le volume à un minimum dans ces circonstances. Ainsi, il est souhaitable de pouvoir obtenir une solution à usage parentéral non seulement à une concentration relativement basse mais également à une concentration relativement élevée en médicament. Un certain nombre de formulations pharmaceutiques lyophilisées de AP-t ont été décrites dans l'art antérieur, par exemple dans les documents EP-A-113 319 et EP-A-123 304. Ces formulations sont préparées à partir de solutions aqueuses salines de AP-t, dont le pH est à peu près neutre, et pré- sentent l'inconvénient que la solubilité de AP-t dans ces solutions est faible en l'absence d'une augmentation de la concentration ionique. En conséquence, les solutions à usage parentéral obtenues à partir de ces formulations lyophilisées doivent soit avoir de faibles concentrations en AP-t, ce qui nécessite dans certains cas d'administrer des volumes inop- portunément grands de solution à un malade, soit être hyper- toniques, ce qui peut être préjudiciable aux hématies au moment de l'administration. On a maintenant découvert que la solubilité de AP-t en solution aqueuse peut être améliorée si le pH de la solution se situe dans une plage acide, qu'une formula- tion pharmaceutique lyophilisée peut être préparée à partir d'une solution acide de AP-t, et que cette formulation est capable de fournir une solution à usage parentéral qui ne suscite aucun inconvénient physiologique notable en étant administrée. Par conséquent, la présente invention propose un procédé pour préparer une formulation pharmaceutique lyophilisée de AP-t, qui consiste à dessécher sous vide une solution aqueuse congelée de AP-t, dont le pH est de 2 à 5. I1 résulte de la meilleure solubilité de AP-t que l'on peut préparer conformément à la présente invention une formulation pharmaceutique lyophilisée qui est capable de fournir une solution à-usage parentéral ayant une concen- centration élevée en AP-t sans aucun risque sensible que AP-t précipite de la solution. La formulation lyophilisée peut donc être présentée aux médecins ou aux vétérinaires qui peuvent la dissoudre au moment voulu et de la manière requise pour obtenir la concentration désirée en utilisant par exemple de l'eau à pH neutre ou acide. La présente invention propose donc une formulation pharmaceutique lyo- philisée stable qui dispose d'une meilleure souplesse d'em- ploi et de maniement par les médecins et vétérinaires, tout en assurant un moyen plus commode de transport et d'entre- posage. Le AP-t à utiliser dans la présente invention peut être n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement au AP-t des mammifères, et en particulier des êtres humains, et il englobe les formes avec et sans glycosylation. Il peut s'agir de AP-t à une ou deux chaînes, ou d'un mélange de ceux-ci, comme décrit dans le document EP-A112-122, et, dans le cas de AP-t humain totalement glycosylé, son poids moléculaire apparent sur gel de polyacrylamide est d'environ 70 000 et son point isoélectrique est compris entre 7,5 et 8,0. De préférence l'activité spécifique du AP-t est d'environ 500000 UI/mg (Unités Internationales/mg, l'Unité Internationale étant une unité d'activité définie par WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Londres, NW3 6RB, Royaume-Uni). La séquence d'amino-acides de AP-t correspond de préférence sensiblement à celle qui est exposée sur la figure 1 des dessins annexés. Il s'agit donc d'une séquence identique à celle de la figure 1 ou comportant une ou plu- sieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélique ou autre, la séquence résultante ayant au moins 80 %, et de préférence %, d'homologie avec la séquence de la figure 1 et con- servant essentiellement les mêmes propriétés biologiques et immunologiques que cette protéine. En particulier, la séquence de AP-t est identique à celle de la figure 1 ou bien est la même à la différence que l'amino-acide de la 245ème position à partir de la sérine N-terminale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement totalement dépourvue des trois pre- miers amino-acides ou contenant éventuellement une présé- quence N-terminale polypeptidique additionnelle consistant en Gly-Ala-Arg. La séquence d'amino-acides représentée sur la figure 1 contient trentecinq résidus de cystéine et a donc la capacité de former dix-sept ponts disulfure. Sur la base de l'analogie faite avec d'autres protéines dont la struc- ture a été déterminée plus en détail, la figure 2 montre la structure proposée pour la séquence (résultant de la formation de ponts disulfure) située entre l'amino-acide de la 90ème position et la proline C-terminale. On est moins sûr de la structure de la région N-terminale bien que quel- ques propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; et Proc. Natl. Adad. Sci., 1984, 81, 5355-5359). Les caractéristiques les plus importantes de la structure de AP-t sont les deux régions en anneau (situées entre les 92ème et 173ème amino-acides et entre les 180ème et 261ème amino-acides) qui sont cause de la liaison de la protéine à la fibrine, et la région des sérine-protéases qui constitue la majeure partie la chaîne-B et qui est cause de l'activation du plasminogène. Les amino-acides particu- lièrement importants des sérine-protéases sont la triade catalytique His/Asp/Ser. Dans AP-t, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 37lème et 463ème positions. Le pont disulfure reliant les résidus de cystéine aux 264ème et 395ème posi- tions est également important en ce sens qu'il maintient ensemble les chaînes A et B dans la forme bicaténaire de AP-t. Sur les figure 1 et 2, les codes conventionnels à une et trois lettres ont été employés pour désigner les résidus d'amino-acides comme suit: Asp D Acide aspartique Ile I Isoleucine Thr T Thréonlne Leu L Leucine Ser S Sérine Tyr Y Tyrosine Glu E Acide glutamique Phe F Phénylalanine Pro P Proline His H Histidine Gly G Glycine Lys K Lysine Ala A Alanine Arg R Arginine Cys C Cystéine Trp W Tryptophanne Val V Valine Gln Q Glutamine Met M Méthionine Asn N Asparagine On peut obtenir le AP-t par l'une quelconque des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur. Par exemple, on peut l'obtenir à partir d'une lignée cellulaire normale ou néoplasique du genre décrit dans Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41 766 ou EP-A- 113 319. On préfère cependant que AP-t soit préparé à par- tir d'une lignée cellulaire cultivée transformée ou trans- fectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recom- binant comme décrit par exemple dans les documents EP-A- 93 619; EP-A-117 059 ou EP-A-117 060. On préfère en parti- culier l'utilisation de cellules d'ovaire de hamster chi- nois (OHC) pour la production de AP-t, et que ces cellules soient dérivées de la manière décrite dans Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759. Selon cette méthode, le gène cloné est transfecté conjointement au gène codant la dihydrofolate-réductase (dhfr) dans des cellules dhfr de OHC. Les transformants exprimant dhfr sont sélectionnés sur des milieux manquant de nucléosides et sont exposés à des concentrations croissantes de méthotrexate. Les gènes de dhfr et AP-t sont ainsi amplifiés conjointement en con- duisant à une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des taux élevés de AP-t. De préférence, on purifie le AP-t en utilisant n'importe laquelle des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur, par exemple les techniques décrites dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid., 1981, 256(13), 7035- 7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 ou GB-A-2 122 219. I1 apparaît n'y avoir aucunelimite supérieure à la solubilité de AP-t dans la solution aqueuseà utiliser dans le procédé de la présente invention. Aux concentrations très élevées, comme de plus de 150 000 000 UI/ml (Unités Inter- nationales/ml), la solution devient simplement visqueuse sans aucune précipitation sensible de AP-t. On peut faire varier dans de larges limites la concentration de AP-t dans la solution aqueuse, par exemple de 50 000 à 50 000 000 UI/ml. Afin de tirer le meilleur parti de la présente invention, on préfère que la concentration de AP-t soit supérieure à 000 UI/ml, plus particulièrement supérieure à 500000 UI/ml, et mieux encore supérieure à 1 000 000 UI/ml. On pré- fère au mieux que la concentration de AP-t soit supérieure à 5 000 000 UI/ml. La limite supérieure du pH de la solution aqueuse est, de préférence, de 4,5. En fait, le pH se situe de pré- férence de 2,5 à 4,0, mieux encore de 2,8 à 3,5, et au mieux à environ 3, 0. On obtient commodément le pH désiré de la solution aqueuse en utilisant un acide minéral ou organique physiologiquement acceptable. Des exemples de tels acides sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide nitrique, ainsi que l'acide citrique, l'acide tartrique et l'acide benzènesulfonique. Parmi ceux-ci, on préfère l'acide chlorhydrique. Bien qu'une certaine quantité d'un cosolvant phy- siologiquement acceptable puisse éventuellement être présente en addition à l'eau, on préfère que le milieu de formation de la solution aqueuse soit totalement ou presque totale- ment aqueux. La solution à usage parentéral préparée à partir de la formulation pharmaceutique lyophilisée peut être hypertonique, hypotonique ou isotonique vis-à-vis du sérum sanguin du malade. Pour éviter des effets secondaires indé- sirables, il est cependant préférable que la solution à usage parentéral soit isotonique, bien que des écarts mi- neurs n'aient pas une grande incidence physiologique. Une solution à usage parentéral sensiblement isotonique peut être préparée grâce à. l'incorporation d'un agent physiolo- giquement acceptable qui est capable d'élever la pression osmotique de la solution jusqu'au niveau requis. L'agent peut être incorporé dans la solution aqueuse à lyophiliser de sorte qu'il se trouve déjà dans la formulation pharma- ceutique lyophilisée, ou bien il peut être incorporé dans l'eau de pH neutre ou acide qui est utilisée pour dissoudre la formulation pour préparer la solution à usage parentéral désirée. Des exemples de tels agents sont bien connus en pratique et comprennent le dextrose (sous forme anhydre ou monohydratée) et le chlorure de sodium, et leurs mélanges. La concentration de l'agent dans la solution aqueuse ou dans l'eau servant à la dissolution sera évidemment diffé- rente d'un agent à l'autre. Dans le cas du chlorure de sodium, cette concentration est de préférence de 7 à 10 mg/ml, et mieux encore d'environ 8,5 mg/ml, concentration qui est celle de ce que l'on nomme une solution physiologique saline. Dans le cas du dextrose anhydre, la concentration est de préférence de 30 à 70 mg/ml, et mieux encore d'environ 50 mg/ml. La solution aqueuse peut éventuellement contenir des additifs couramment associés aux formulations pharma- ceutiques lyophilisées de ce type. Des exemples en sont la sérum-albumine humaine, ainsi que des liants et des charges comme le mannitol, le lactose et le glucose. AP-t a en outre tendance à être adsorbé sur les surfaces de verre et de matières plastiques et il peut donc être souhaitable d'incorporer un surfactif à la solution aqueuse pour empêcher ou minimiser cette adsorption. Des exemples de surfactifs sont les déri- vés polyoxyéthyléniques d'esters partiels d'acides gras for- més avec des anhydrides de sorbitol, tels que ceux vendus sous la marque commerciale "Tween 80". L'un des avantages surprenantsde la présente in- vention, hormis la forte augmentation de solubilité de AP-t, est que l'emploi d'une solution acide à usage parentéral obtenue par reconstitution de la formulation pharmaceutique lyophilisée apparaît n' exercer aucun effet physiologique défavorable par administration au malade. Il semblerait que le courant sanguin soit capable d'une façon générale d'éle- ver le pH de la solution jusqu'à neutralité presque aussi- tôt que le contact est réalisé, le AP-t étant rapidement distribué dans le courant sanguin. On préfère cependant que ce processus ne soit sensiblement freiné d'aucune façon et que la solution à usage parentéral, et donc la solution aqueuse à lyophiliser et l'eau de reconstitution, ne con- tiennent pas d'agent tampon fort. Un agent tampon faible qui n'inhibe pas notablement ce processus peut toutefois être incorporé et en fait AP-t lui-même agit à pH acide comme son propre agent tampon faible. En outre, la sérum-albumine humaine est capable d'agir comme agent tampon faible. En raison de la solubilité fortement accrue de AP-t dans une solution aqueuse dont le pH est de 2 à 5, il est inutile d'incorporer dans la solution à usage paren- téral, obtenue par reconstitution de la formulation lyo- philisée, une matière additionnelle, telle que la lysine ou l'ornithine ou un de leurs sels, pour accroître la solu- bilité de AP-t. La solution aqueuse de AP-t peut être préparée en formant une solution de AP-t purifié et en échangeant le milieu pour un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, ou en dissolvant AP-t purifié dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5. La purification de AP-t peut comporter comme stade final l'élution de la protéine d'une colonne de chro- matographie sous forme d'une solution contenant un agent tampon fort. Comme mentionné précédemment, on préfère que la solution à usage parentéral, et donc la formulation phar- maceutique lyophilisée et la solution aqueuse, ne contien- nent pas d'agent tampon fort et, par conséquent, un moyen commode pour procéder à son élimination tout en échangeant le milieu est d'effectuer une dialyse. On peut s'y prendre en utilisant un tube de dialyse ou un rein artificiel dans lesquels la solution purifiée est dialysée contre un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5. Il peut être souhaitable, notamment si la concentration de AP-t dans la solution puri- fiée est élevée, d'ajuster tout d'abord le pH de la solu- tion de.sorte qu'il soit de 2 à 5. Un autre moyen pour pro- céder à l'élimination d'un agent tampon fort tout en échan- geant le milieu consiste à soumettre la solution purifiée à une filtration sur gel et développer la colonne avec un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5. On peut de préférence recueillir AP-t sous forme d'un solide précipité à partir d'une solution purifiée en ajustant le pH à environ 5,5, en refroidissant la solution juste au-dessus de son point de congélation, et en séparant la protéine, par exemple par centrifugation. On peut ensuite dissoudre le solide précipité dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, d'une manière classique. On préfère que la solution aqueuse résultante soit stérilisée de façon classique, par exemple par stéri- lisation par filtration, et qu'elle soit ensuite répartie dans des récipients stériles en verre ou matière plastique, par exemple des ampoules ou des flacons, en des volumes de 0,5 à 20 ml par exemple. La solution aqueuse de AP-t est congelée, de pré- férence à une température de -10 à -40 C. La solution aqueuse congelée est ensuite de préférence maintenue à cette tempé- rature jusqu'à ce que la dessiccation sous vide soit commencée. La dessiccationsous vide de la solution aqueuse congelée peut être effectuée de facon classique et cette opération comprend unedessiccationsous un vide partiel ou complet, par exemple à une pression de 1,33 à 13,3 Pa, pen- dant une durée suffisante pour effectuer l'élimination de pratiquement tout le liquide congelé. l1 La température à laquelle est conduite la dessic- cation sous vide est habituellement de -30 à -40 C au début de l'opération afin de maintenir la solution aqueuse sous une forme sensiblement ou totalement congelée. A mesure que l'opération avance et que l'eau est éliminée, la température peut être progressivement élevée jusqu'à atteindre la tempé- rature ambiante. On préfère, à la fin de l'opération, effec- tuer ladessiccation sous vide à la température ambiante ou juste audessus sous un vide poussé d'environ 1,33 Pa afin de chasser autant que possible les dernières traces d'eau. La teneur en humidité de la formulation pharmaceutique lyo- philisée résultante est de préférence inférieure à 2,5 %. Dès que la dessiccationsous vide est achevée, on scelle alors de façon commode le récipient stérile en verre ou matière plastique contenant la formulation pharmaceutique lyophilisée. Durant ladessiccation sous vide de la solution aqueuse congelée, l'eau est chassée en laissant le AP-t sous forme d'un sel physiologiquement acceptable. En con- séquence, la présente invention propose également un sel physiologiquement acceptable, en particulier un sel d'addi- tion d'acide physiologiquement acceptable, tel que le chlor- hydrate, de AP-t. La mise en oeuvre de la présente invention permet pour la première fois d'obtenir une formulation pharmaceu- tique lyophilisée qui est capable de fournir une solution à usage parentéral ayant une concentration élevée en AP-t. En conséquence, la présente invention propose également une formulation pharmaceutique lyophilisée de AP-t qui,par dis- solution dans l'eau, est capable de fournir une concentra- tion de AP-t supérieure à 100 000 UI/ml, plus particulière- ment supérieure à 500000 UI/ml, et tout particulièrement supérieure à 1 000 000 UI/ml. Pour préparer une solution de AP-t en vue de son administration par voie parentérale, la formulation pharma- ceutique obtenue conformément au procédé de la présente invention est reconstituée dans de l'eau ayant un pH neutre ou acide. Si la solution aqueuse à partir de laquelle est obtenue la formulation pharmaceutique lyophilisée est sen- siblement isotonique, on préfère alors que l'eau de recons- titution soit également sensiblement isotonique. L'activité biologique qu'exerce AP-t en dissol- vant le réseau fibrineux des caillots sanguins est à l'ori- gine de son utilité dans le traitement de troubles thrombo- tiques (The Lancet, 7 novembre 1981, 1018-1020; ibid., 13 avril 1985, 842847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; et ibid., 1985, 312(14), 932-936). La présente invention propose par conséquent une méthode pour le traitement d'un trouble thrombotique chez un mammi- fère, qui consiste à administrer au mammifère une solution à usage parentéral de AP-t préparée à partir d'une formula- tion pharmaceutique lyophilisée telle que définie ici. Dans l'alternative, il est également proposé une formulation pharmaceutique lyophilisée de AP-t, telle que définie ici, destinée à être employée en médecine humaine ou vétérinaire, notamment dans le traitement d'un trouble thrombotique. Des exemples particuliers de troubles thromboti- ques sont connus en pratique et comprennent l'infarctus du myocarde, la thrombose des veines profondes, l'embolie pul- monaire et l'ictus cérébral. Le principal mode d'administration de AP-t est la perfusion intravasculaire, notamment intraveineuse, bien qu'il soit concevable d'employer d'autres,Iodes d'adminis- tration, tels que l'administration intramusculaire. Les perfusions intravasculaires sont normalement effectuées en utilisant la solution à usage parentéral contenue dans un sachet ou un flacon ou encore dans une seringue à perfusion actionnée électriquement. La solution peut être délivrée au malade à partir du sachet ou du flacon sous l'effet d'un écoulement par gravité ou en utilisant une pompe de perfu- sion. L'utilisation de systèmes de perfusion à écoulement par gravité ne donne pas suffisamment d'emprise sur la vitesse d'administration de la solution à usage parentéral et on préfère donc l'utilisation d'une pompe de perfusion, notamment avec des solutions dont la concentration en AP-t est relativement élevée. On préfère cependant encore plus l'utilisation d'une seringue à perfusion actionnée électri- quement qui donne une emprise encore meilleure sur la vi- tesse d'administration. La quantité de AP-t qui est efficace pour traiter un mammifère atteint d'un trouble thrombotique est évidem- ment fonction d'un certain nombre de facteurs comprenant, par exemple, l'âge et le poids du mammifère, le cas précis qui nécessite le traitement et sa gravité, le mode d'admi- nistration, et cette quantité sera en fin de compte laissée à l'appréciation du médecin ou vétérinaire traitant. On peut cependant s'attendre à ce qu'une quantité efficace pour dissoudre un thrombus d'artère coronaire, par exemple, se situe en général de 150 000 à 450 000 UI/kg de poids corpo- rel du malade et par heure. Ainsi, pour un être humain adulte de 70 kg, une quantité efficace par heure sera en général de 10 000 000 à 30 000 000 UI, notamment d'environ 000000 UI, et cette quantité peut être administrée avec ou sans dose d'amorçage. On peut également s'attendre à ce que la posologie soit moindre pour certaines affections thrombotiques, telles que la thrombose de veine profonde et l'ictus cérébral aigu, ou pour maintenir simplement le dégagement d'une artère coronaire qui est déjà sous une nouvelle perfusion. Dans ces circonstances, une quantité efficace est en général de 7000 à 36 000 UI/kg de poids corporel du malade et par heure. Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention. Exemple 1 On purifie par voie chromatographique une récolte clarifiée de AP-t, tirée d'une lignée de cellules de OCH transformée et cultivée ayant été dérivée selon la techni- que de Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, et on recueille le AP-t sous forme d'une solution aqueuse à pH 5,5 contenant du citrate de sodium 0,17M et 0,01 % en poids par volume de Tween 80. On ajuste le pH de la solu- tion à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique et concentre la solution résultante par ultrafiltration en utilisant une cartouche H-10 (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, Angleterre). On purifie davantage la solu- tion aqueuse concentrée en l'appliquant à une colonne de filtration surgel (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Suède) et en éluant avec une solution saline à 0,85 % à pH 3,0 contenant 0,01 % en poids par volume de Tween 80. On obtient ainsi une solution aqueuse hautement purifiée de AP-t que l'on concentre une fois de plus en utilisant un rein artificiel à usage unique. On fait précipiter AP-t de la solution en portant le pH à 5,5 avec de l'hydroxyde de sodium et en maintenant la suspension à 4 C pendant 2 heures. On sépare le AP-t par centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4 C. On redissout le culot de AP-t dans une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85 % en poids par volume contenant 0,01 % de Tween 80 en poids par volume et dont le pH est ajusté à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique. Le volume de la solution saline utilisée est celui qui convient pour obtenir une concentration de AP-t comprise entre 7 500 000 UI/ml et 10 000 000 UI/ml. On dilue cette solution de AP-t avec davantage de solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85 % en poids par volume conte- * nant 0,01 % de Tween 80 en poids par volume dont le pH est ajusté à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique, et également avec une quantité suffisante d'une solution de mannitol à 10 % en poids par volume dans la même solution saline acide pour obtenir des concentrations finales de 5 000 000 UI/ml de AP-t et de 25 mg/ml de mannitol. On stérilise la solu- tion résultante par filtration et la distribue en volumes de 1 ml dans des flacons de verre que l'on fait congeler à -35 C. On applique un vide de 6,66 Pa. Au bout de 24 heu- res, on élève progressivement la température jusqu'à 5 C et on maintient à cette température pendant 16 heures. On élève ensuite de nouveau la température jusqu'à 25 C et porte le vide à 2,66 Pa pendant 24 heures supplémentaires, après quoi on obture les flacons sous un vide partiel de 80 kPa en atmosphère d'azote anhydre. Exemple 2 L'efficacité thrombolytique d'une solution à usage parentéral préparée à partir de la formulation lyo- philisée de AP-t de l'Exemple 1 a été évaluée dans un modèle in vivo de thrombose de veine jugulaire. (a) Mode opératoire: Le mode opératoire expérimental était essentiel- lement conforme à celui décrit pour la première fois par Collen et coll. (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376). La formulation lyophilisée de l'Exemple 1 a été rapidement et complètement dissoute dans une solution saline isotonique stérile ajustée à pH 3,0 contenant 0,01 % de Tween 80. On a ainsi obtenu une solution à usage parentéral convenant à uneperfusion en 2 heures de 500 000 UI/kg de AP-t. La perfusion était faite par une canule dans la veine fémo- rale droite. On s'est servi dans cette étude de quatre la- pins blancs de Nouvelle-Zélande. Après la perfusion, on a estimé le degré de thrombolyse. (b) Résultats: Le pourcentage de thrombolyse était de 28,9 4,1, ce qui démontre l'effet thrombolytique de la solution à usage parentéral préparée à partir de la formulation lyo- philisée de l'Exemple 1. De plus, on n'a observé aucune réaction défavorable avec cette solution. 16b REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer une formulation pharma- ceutique lyophilisée d'activateur tissulaire du plasmino- gène, caractérisé en ce qu'il consiste à dessécher sous vide une solution aqueuse congelée d'activateur tissulaire du plasminogène, dont le pH est de 2 à 5. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activateur tissulaire du plasminogène est soit sous forme monocaténaire, soit sous forme bicaténaire. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'activateur tissulaire du plasminogène présente la séquence d'amino-acides suivante: SerTyr Gin Val lie Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met lie Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin Cys His Ser Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu lie Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly lie Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala lie Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met lie Leu lie Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Met Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile.Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp lie Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala le Phe A.ia Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val lie Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu GIn Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr lle Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Giln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lle Arg Asp Asn Met Arg Pro ou présente la même séquence d'amino-acides mais o l'amino- acide de la 245ème position à partir de la sérine N-terminale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement totalement dépourvue des trois premiers amino-acides ou comportant éventuellement une pré- séquence polypeptidique N-terminale additionnelle de Gly- Ala-Arg. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'activateur tis- sulaire du plasminogène est tiré d'une lignée cellulaire cultivée transformée ou transfectée ayant été dérivée par une technique d'ADN recombinant. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la concentration de la solution aqueuse en activateur tissulaire du plasmi- nogène est supérieure à 100 000 UI/ml. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration en activateur tissulaire du plas- minogène est supérieure à 500 000 UI/ml. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration en activateur tissulaire du plas- minogène est supérieure à 1 000 000 UI/ml. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration en activateur tissulaire du plas- minogène est d'environ 5 000 000 UI/ml. 9. Procédé selon l'une quelconque tions précédentes, caractérisé en ce que le tion aqueuse est de 2 à 4,5. 10. Procédé selon la revendication en ce que le pH est de 2,5 à 4,0. 11. Procédé selon la revendication en ce que le pH est de 2,8 à 3,5. 12. Procédé selon la revendication en ce que le pH est d'environ 3,0. 13. Procédé selon l'une quelconque tions précédentes, caractérisé en ce que le des revendica- pH de la solu- 9, caractérisé , caractérisé 11, caractérisé des revendica- milieu de forma- tion de la solution aqueuse est totalement ou presque tota- lement aqueux. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le milieu de forma- tion de la solution aqueuse comprend un agent physiologique- ment acceptable qui rend la solution sensiblement isotonique vis-à-vis du sérum sanguin humain. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le chlo- rure de sodium. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le dex- trose. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse comprend un agent tensio-actif. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est sensiblement non tamponnée. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est sensiblement exempte de lysine, d'ornithine ou de sel de celles-ci. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est stérilisée. 21. Formulation pharmaceutique lyophilisée obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes. 22. Formulation pharmaceutique lyophilisée d'ac- tivateur tissulaire du plasminogène, caractérisée en ce qu'elle est capable de fournir, par dissolution dans l'eau, une concentration d'activateur tissulaire du plasminogène supérieure à 100000 UI/ml. 23. Formulation pharmaceutique lyophilisée selon la revendication 22, caractérisée en ce que la concentra- tion est supérieure à 500 000 UI/ml. 24. Formulation pharmaceutique lyophilisée selon la revendication 23, caractérisée en ce que la concentra- tion est supérieure à 1000 000 UI/ml. 25. Récipient obturé contenant la formulation pharmaceutique lyophilisée de l'une quelconque des reven- dications 21 à 24. 26. Sel physiologiquement acceptable d'activateur tissulaire du plasminogène. 27. Sel d'addition d'acide physiologiquement accep- table d'activateur tissulaire du plasminogène. 28. Chlorhydrate d'activateur tissulaire du plas- minogène. 29. Formulation pharmaceutique lyophilisée selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être employée en médecine hu- maine ou vétérinaire, notamment dans le traitement d'un trouble thrombotique.