Brevet FR2584498A1 — publié le 19870109

-- i -- DISPOSITIF POUR DETECTER SUR UNE FEUILLE DE NITROCELLU- LOSE LA PRESENCE DE COMPLEXES MACROMOLECULAIRES, TELS QUE ANTIGENES/ANTICORPS, ET PROCEDE DE MISE EN OEUVRE. L'invention concerne un dispositif pour détecter la présence sur une feuille de nitrocellulose de complexes macromoléculaires, tels que par exemple des complexes antigènes/anticorps; elle se rapporte également à un procédé pour la mise en oeuvre de ce dispositif. Bien que dans la suite du texte, l'invention soit plus particulièrement décrite dans sa forme de réalisa- tion à la détection des complexes antigènes/anticorps, elle n'est nullement limitée à ce mode de réalisation, puisque d'autres réactants, notamment d'autres protéines, ARN et ADN peuvent être également utilisés. Pour la détection des complexes antigènes/anti- corps sur une feuille de nitrocellulose, on fait généra- lement appel à une méthode dénommée "ELISA". On connait déjà un dispositif mettant en oeuvre cette méthode cons- titué essentiellement par une plaque en matière plasti- que comportant une pluralité de puits parallèles en for- me de U que l'on remplit individuellement avec chacun des réactants. Bien que cette méthode soit très large- ment répandue, ce dispositif, d'une part nécessite des puits témoins pour effectuer la comparaison, d'autre part ne permet pas d'obtenir une réponse directe et enfin et surtout, nécessite un nombre important de manipulations et une quantité substantielle de matière à analyser, ce qui n'est pas toujours très compatible avec un diagnostic médical. Récemment, on a décrit et même commercialisé des appareils dont la plaque supérieure est constituée de puits sans fond disposés comme dans les plaques "ELISA". Cette plaque est déposée sur une feuille de nitrocellu- lose elle-même posée sur une deuxième plaque percée de trous en correspondance avec les premiers, mais de -2- diamètre moindre et enfin d'appliquer sur le fond une aspiration par le vide, l'ensemble étant maintenu serré pendant toute cette opération. Toutefois, notamment sous l'effet du vide, la feuille de nitrocellulose a souvent la fâcheuse tendance à se déformer, ce qui entraine des réponses aspécifiques, et les composantes du bruit de fond ne sont pas analysables individuellement, d'autant qu'en pratique, on a toujours un bruit de fond. De la sorte, cette méthode reste encore longue à mettre en oeuvre et nécessite un personnel encore assez qualifié. Dans "Analytical Biochemistry" 138. 119-124 (1984), on a décrit un système constitué par: - un socle de fond en aluminium en forme de plaque destiné à recevoir sur le dessus une feuille de caoutchouc silicone et une feuille de nitrocellulose; - une plaque dont l'envers présente une pluralité de canaux ou de rainures parallèles ouvertes seulement à leur extrémité. Ce dispositif d'analyse est applicable seulement à la détection des BLOTS, c'est-à-dire des macromolécu- les biologiques telles que des protéines, ADN ou ARN, transférées sur la feuille de nitrocellulose après une électrophorèse sur gel, et non pas la détection des DOTS cette détection désignant ces mêmes macromolécules dis- posées directement sur la feuille de nitrocellulose. De plus, l'architecture même de ce dispositif entraîne la présence quasi-permanente de bulles d'air dans les ca- naux, ce qui d'une part gêne le remplissage de ces ca- naux et d'autre part et surtout, perturbe les réponse. Elle entraîne également la présence de fuites entre les canaux lorsque le temps d'incubation dépasse quelques heures. L'invention pallie ces inconvénients. Elle vise un -3 - dispositif de détection du type en question qui soit fa- cile et économique à réaliser, commode et rapide à mani- puler, même avec du personnel non qualifié, permette d'utiliser une faible quantité de matière, même non parfaitement purifiée, permette également de réaliser un grand nombre de combinaisons entre les deux réactants et enfin donne des réponses sans ambiguïté et soit donc fiable. Ce dispositif pour détecter sur une feuille de ni- trocellulose la présence de complexes macromoléculaires, comprenant: - un fond destiné à recevoir ladite feuille de ni- trocellulose; - une plaque destinée à reposer sur ladite feuille de nitrocellulose appliquée sur le fond, comportant une pluralité de rainures parallèles, caractérisé en ce que lesdites rainures parallèles tra- versent ladite plaque sur toute son épaisseur et sur toute la longueur desdites rainures. En d'autres termes, l'invention consiste à ne plus utiliser des rainures parallèles ouvertes seulement à leur extrémité, mais des rainures parallèles ouvertes sur toute leur longueur et sur toute l'épaisseur de la plaque. Ainsi, après croisement de ces plaques, on peut étudier aussi bien des DOTS que des BLOTS et par voie de conséquence, on peut ainsi multiplier le nombre des com- binaisons, ce que l'on ne savait pas faire économique- ment jusqu'alors de manière rapide fiable. Ainsi, grâce à cette simple disposition, on peut étendre considéra- blement le champ d'application et l'intérêt de ce dispo- sitif. Avantageusement, en pratique: - le fond a la forme d'un boitier dans lequel est emboitée la plaque rainurée dont le dessus est recouvert à son tour par un couvercle, l'ensemble: boitier, - 4 - plaque, couvercle étant serré par des organes de ferme- ture appropriés; ces organes de fermeture,tels que par exemple des pinces ou des vis, doivent permettre de ré- partir la pression de manière uniforme sur toute la surface de la plaque rainurée, être pratique, simple à manipuler et ne pas être encombrante; on dispose au moins une feuille de papier humidifiée entre la feuille de nitrocellulose et le bas de la plaque rai- nurée; dans une première forme de réalisation, cette feuille de papier est constituée par un papier fortement absorbant humidifié; dans une seconde forme de réalisation avantageuse, la feuille de papier humidi- fiée est disposée sur un empilement de feuilles de papier élémentaires sèches, ce qui permet l'adsorption rapide du premier réactant sur la feuille de nitrocellulose; - dans une autre configation, le fond du boitier comporte un compartiment pouvant être relié à une source à vide dans laquelle vient s'emboiter une autre plaque formant fond percée d'orifices traversants, disposés en regard des rainures traversantes de la première plaque, une feuille de papier étant interposée entre cette deuxième plaque de fond et la feuille de nitrocellulose est toujours au contact de la première plaque rainurée; en pratique, les orifices traversants de la deuxième plaque sont constitués par des trous ou des rainures de petites dimensions; - le fond, la plaque et le couvercle sont en matiè- re plastique, notamment en polymethacrylate de méthyle, usiné ou moulé; - l'ensemble comprend deux plaques rainurées ouver- tes parallèles distinctes, la direction des rainures de la deuxième plaque étant orthogonale à celle de la pre- mière plaque; - les rainures parallèles ouvertes ont une largeur -5- comprise entre 1,5 et trois millimètres; si cette lar- geur est inférieure à 1,5 mm, on risque de voir appara - tre des phénomènes de capillarité sur les parois; en revanche, si cette largeur est supérieure à trois milli- mètres, pour la même surface, on diminue inutilement le nombre de combinaisons réalisables et on assure en outre un serrage moins efficace; si la hauteur des rainures, donc de la plaque qu'elle comporte n'est ni significa- tive ni critique, en revanche, il importe que la longueur de ces rainures soit adaptée au matériel d'analyse (électrophorèse), notamment pour éviter des fuites. Utilement, la longueur de ces rainures correspond à celle du gel d'électrophorèse grâce auquel sont préparés les BLOTS, tels que par exemple un gel de polyacrylamide; enfin, la distance entre deux rainures parallèles successives doit tenir compte des - données de fabrication et d'utilisation pour éviter des ruptures intempestives; économiquement, la plaque rainurée est moulée avec des dépouilles appropriées de l'ordre de 1 à 3 par exemple. L'invention concerne également un procédé pour la mise en oeuvre de ce dispositif. Ce procédé pour détecter sur une feuille de nitro- cellulose la présence de macromolécules, biologiques notamment, se caractérise en ce qu'il consiste: - à déposer une feuille de nitrocellulose sur au moins une feuille de papier disposée sur la première plaque de fond; - à recouvrir cette feuille d'une seconde plaque comportant une pluralité de rainures parallèles traver- sant cette plaque sur toute son épaisseur et sur toute la longueur de ces rainures; - après avoir serré lesdites plaques, à remplir ces rainures ouvertes avec un premier réactant; - à laisser incuber ce premier réactant sur ladite - 6 - feuille de nitrocellulose puis à vidanger et rincer le contenu des rainures parallèles ouvertes; - après avoir retiré la deuxième plaque, à laisser incuber la feuille de nitrocellulose pour saturer les sites,aspécifiques; - à recouvrir à nouveau la feuille de nitrocellulo- se ainsi incubée d'une troisième plaque comportant éga- lement une pluralité de rainures parallèles traversant cette plaque sur toute son épaisseur et sur toute la largeur de ces rainures, mais dont la direction des rainures est orthogonale à la direction des rainures de la deuxième plaque; - puis, après avoir à nouveau serré lesdites pla- ques, à remplir ces rainures ouvertes d'un deuxième réactant; - à laisser incuber, vidanger et rincer puis reti- rer cette troisième plaque; - et enfin, à incuber si nécessaire la feuille de nitrocellulose ainsi imprégnée du deuxième réactant pour saturer les sites aspécifiques avant de l'incuber avec des solutions de sondes de révélateurs. Ce procédé est particulièrement adapté à la détec- tion avec les systèmes CROSS-DOTS. Avantageusement, en pratique: - les réactants sont formés par des solutions con- tenant un ou plusieurs réactants; - l'incubation s'effectue à la température désirée, notamment de 4 à 37'C, le temps d'incubation variant de quelques minutes à quelques heures; - la vidange s'effectue simplement en retournant l'ensemble fermé serré. Si la seconde et la troisième plaques ont les mê- mes dimensions extérieures, après démontage, après la première incubation, cette plaque est replacée après décalage de 90- d'angle sur la feuille de - 7 - nitrocellulose incubée, afin d'obtenir le croisement sur cette feuille de nitrocellulose des interactions provoquées par les rainures. Si la seconde et de la troisième plaques rainurées sont rectangulaires, les rainures de la deuxième plaque sont disposées à angle droit par rapport à celle de la troisième plaque afin d'obtenir lesdits croisements. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif à l'appui des figures anne- xees. La figure 1 est une vue en perspective sommaire é- clatée d'un dispositif conforme à l'invention. Les figures 2 et 3 montrent une représentation de la plaque rainurée caractéristique de l'invention res- pectivement vu de dessus (figure 2) et vu en coupe (fi- gure 3). La figure 4 est une vue en coupe d'un dispositif conforme à l'invention dans lequel tous les éléments ont été montrés écartés,alors qu'en figure 5 ces mêmes élé- ments sont mis en place. La figure 6 est une représentation sommaire desti- née à expliquer le fonctionnement du dispositif selon l'invention. Comme déjà dit, bien que l'utilisation décrite con- cerne la détection des complexes antigènes/anticorps, son mode de réalisation est simplement préféré. Le dispositif selon l'invention comprend essentiel- lement trois pièces principales en polyméthacrylate de méthyle moulé, à savoir respectivement: - un boitier (1) dans lequel est ménagé un compar- timent (2) sur le fond (3) duquel va reposer les feuilles de papier (13) et de nitrocellulose (4); - une première plaque (5) dans laquelle sont ména- - 8 - gées une pluralité de rainures parallèles ouvertes tra- versantes (6,7), ouvertes sur toute la hauteur H1 de cette plaque (5) et sur toute la longueur de ces rainures (voir figures 2 et 3); la hauteur MI de cette deuxième plaque est variable dans le schéma, typiquement équivalente à la hauteur H2 du compartiment (2) du boitier, alors que la longueur et la largeur de cette même deuxième plaque sont légèrement inférieures à celles du compartiment (2) et ce, afin de pouvoir être facilement retirées de ce compartiment (2); - un couvercle (8) plein qui recouvre au moins la surface rainurée de la plaque (5), comportant deux oreilles latérales (9) et (10) qui facilitent la préhen- sion et sur la face envers desquelles sont montés des axes (11) destinés à venir s'emmancher dans des orifices (12) prévus à cet effet sur le dessus de la plaque (5); - l'ensemble est maintenu serré par des organes de fermeture connus, tels que des pinces (14) (voir figure ). Dans une version non représentée, particulière- ment adaptée au diagnostic par des non-professionnels tels que des agriculteurs pouvant diagnostiquer des maladies sur des plantes), le boitier est fermé sur l'ensemble de la première plaque et du couvercle par un second couvercle formé en deux parties verrouillables, ce qui assure ainsi l'action de fermeture et le serrage automatique de l'ensemble. Dans une autre version, également non représentée, plus particulièrement destiné à des professionnels, le fond du boitier est tout d'abord revêtu d'un empilement de feuilles de papier (13), puis est relié à une source de vide. La mise en oeuvre de ce dispositif dans son appli- cation à la détection des complexes antigènes/anticorps s'effectue selon le procédé défini ci-dessus en prenant - 9 - soin avantageusement de recouvrir le fond (3) du compar- timent (2) d4une feuille de papier fortement absorbante humidifiée (13) sur laquelle va donc reposer la feuille de nitrocellulose (4). Ainsi, grâce au croisement des plaques rainurées caractéristiques (voir figure 6) et grâce à la grande capacité de combinaison, et de la possibilité d'analyser de manière comparative l'origine du bruit de fond, ce dispositif permet d'effectuer une analyse quan- titative et qualitative de ces nombreux paramètres in- fluençant la formation et l'analyse du complexe anti- gène/anticorps. D'après les résultats obtenus (voir fi- gure 6), on peut ainsi définir quatre régions sur la feuille de nitrocellulose (4). Ces quatre régions sont schématisées par les références A, B, C et D et contribuent de manière complémentaire à estimer les différentes composantes du bruit de fond, donc à analyser sans ambiguité la réponse antigène/anticorps. La région A correspond au bruit de fond que l'on rencontre en l'abscence d'antigènes et d'anticorps puisque cette zone n'a nullement été affectée. La région B permet d'estimer le bruit de fond du à l'antigène alors que la région C permet d'estimer le bruit de fond du à l'anticorps. En l'absence de toute réaction spécifique antigènes/anticorps, l'intensité maximum due à l'aspécificité est donc la somme des intensités des régions B et C. Par compa- raison, l'intensité de la réponse de la région D donne la spécificité de celle-ci. Le dispositif et le procédé selon l'invention com- portent de nombreux avantages par rapport à ceux connus à ce jour. On peut citer: - en ce qui concerne l'appareil: un coût réduit, 35. le fait que le boitier peut-recevoir des - 10 - plaques différentes, ce qui augmente ainsi les possibilités de combinaison, l'absence de fuites, donc absence de conta- mination; - en ce qui concerne le procédé: le fait d'être rapide et facile à manipuler avec un nombre d'opérations réduit et ce, même sans faire appel à du personnel quali- fié, 10. la possibilité d'utiliser les réactants dans n'importe quel ordre, une excellente reproductibilité puisque tous les carreaux résultant du même croisement ont la même intensité, 15. l'élimination directe des faux positifs, la possibilité d'obtenir une analyse directe de la réponse et ainsi de comparer des affi- nités, une économie de la quantité de réactants (de 20 à 30 fois selon le nombre de rainures croisées, enfin, par rapport aux deux procédés cités dans le préambule: * d'une part, le nombre de combinaisons premier et deuxième réactants en une seule expérienceest très supérieur à celui des systèmes existants, puis- qu'il est plus que doublé, voire même décuplé selon l'utilisation; * en outre et surtout, la possibilité de réaliser comme déjà dit une analyse directe de la contribution de chacun des bruits de fond et du signal spéci- fique de l'interaction des réactants, bref la possibilité d'estimer immédia- - 11 - tement et directement sans expérience - supplémentaire si le deuxième réactant est spécifique, ce qui permet ainsi de porter un diagnostic. On obtient ainsi un dispositif aux multiples possi- bilités pour la détection de réactants macromoléculaires très complexes, notamment des macromolécules biologi- ques, tels que des protéines (complexes antigènes/ anticorps, ADN, ARN..) en toute combinaison. Ainsi, ce dispositif et cette méthode sont particulièrement adaptés au diagnostic médical, agricole, vétérinaire, biochimique par des professionnels qualifiés ou même par des utilisateurs non spécialisés. - 12 - REVENDICATIONS 1/ Dispositif pour détecter la présence, sur une feuille de nitrocellulose (4) des complexes macromolécu- laires, comprenant: - un fond (1) destiné à recevoir ladite feuille de nitrocellulose (4); - une plaque (5) destinée à reposer sur ladite feuille de nitrocellulose (4), appliquée sur le fond (1) comportant une pluralité de rainures (6,7) parallèles, caractérisé en ce que lesdites rainures parallèles (6,7) traversent ladite plaque (5) sur toute son épaisseur H1 et sur toute la longueur desdites rainures (6,7). 2/ Dispositif selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que le fond (1) a la forme d'un boitier (1) dans lequel est emboitée la plaque rainurée (5) dont le dessus est recouvert à son tour d'un couvercle (8), l'ensemble boitier (1)/plaque (5)/couvercle (8) étant serré par des organes de fermeture (14). 3/ Dispositif selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une feuille de papier humidifié (13) disposée entre le fond (1) et la feuille de nitrocellulose (4). 4/ Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fond (2) du boitier (1) compor- te un compartiment (3) destiné à être relié à une source à vide, et dans lequel vient s'emboiter une seconde plaque formant fond proprement dit, percé d'ori- fices traversants disposés en regard des rainures paral- lèles ouvertes (6,7) de la première plaque (5), une feuille de papier humidifié (13) étant interposée entre la deuxième plaque de fond et la feuille de nitrocellulose (4) qui est au contact de la première plaque (5) rainurée. / Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fond (1), la plaque rainurée - 13 - (5) et le couvercle (8) sont enpolyméthacrylate de mé- thyle. 6/ Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'ensemble comprend deux plaques rainurées (5) dont la direction des rainures (6,7) est orthogonale d'une plaque par rapport à l'autre. 7/ Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les rainures parallèles (6,7) ouvertes ont une largeur d'au moins 1,5 millimètre. 8/ Procédé pour la détection sur une feuille de ni- trocellulose (4) de la présence de macromolécules, bio- logiques notamment, caractérisé en ce qu'il consiste: - à déposer une feuille de nitrocellulose (4) sur au moins une feuille de papier humidifiée (13) disposée sur une première plaque (1) de fond, - à recouvrir cette feuille (4) d'une seconde pla- que (5) comportant une pluralité de rainures parallèles (6,7) traversant cette deuxième plaque (5) sur toute son épaisseur H et sur toute la longueur de ces rainures, - après avoir serré (14) lesdites plaques (1,5), à remplir ces rainures (6,7) ouvertes avec un premier réactant, - à laisser incuber ce premier réactant sur ladi- te feuille de nitrocellulose (4), - à vidanger et à rincer le contenu des rainures parallèles ouvertes (6,7), - après avoir retiré la deuxième plaque (5), à laisser incuber la feuille de nitrocellulose (4) pour saturer les sites aspécifiques, - à recouvrir à nouveau ladite feuille de nitro- cellulose (4) incubée d'une autre plaque (5') comportant également une pluralité de rainures parallèles traver- sant cette plaque (5') sur toute son épaisseur et sur toute la longueur de ces rainures, mais dont la direc- tion des rainures (6,7) est orthogonale à la direction - 14 - des rainures (6,7) de la deuxième plaque (5), - puis, après avoir à nouveau serré (14) lesdites plaques (1,5'), à remplir ces rainures ouvertes d'un deuxième réactant, - à laisser incuber, vidanger et rincer puis retirer cette troisième plaque (5'), - et enfin, à incuber la feuille de nitrocellulose (4) ainsi imprégnée. 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la feuille de nitrocellulose (4) est déposée sur une feuille de papier absorbante humidifiée (13) placée sur le fond (1). / Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que sous la feuille de papier humidifiée (13), est disposé sur un empilement de feuilles de papier sèches.