Brevet FR2583432A1 — publié le 19861219

La présente invention concerne un procédé de préparation de L- eaminoacides, et plus particulièrement, un procédé pour produire par voie enzymatique des L-a aminoacides par réduction enzymatique asymétrique des c-cétoacides correspondants. Il est connu qu'une réaction de préparation enzymatique des L-a aminoacides est représentée par le schéma suivant: H Enzyme A R-C-COOH + NH3 R-C-COOH Il I 0 NH2 ca -cétoacide -a +cétoacie + L-m aminoacide NADH + H NAD+ Produit P Réducteur R Enzyme B L'enzyme A, qui est une L-aminoacide deshydrogénase, catalyse la réduction spécifique de l'0-cétoacide en LOaminoacide correspondant en présence d'un coenzyme qui peut avantageusement être le nicotinamide adénine dinucléotide. Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est, dans cette réaction, oxydé à l'état de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+). Il est très avantageux de le ramener sous forme de NADH dans une oeuxième réaction et donc de le régénérer par un réducteur R qui est oxydé en un produit P, ladite deuxième réaction étant catalysée par l'enzyme B. Le réducteur peut être par exemple le glucose qui est oxydé par une glucose deshydrogénase en gluconolactone qui s'hydrolyse spontanément en acide gluconique. Les enzymes A et B ainsi que le coenzyme sont employes de préférence en quantité catalytique. Le réducteur R est un réactif et peut être présent en quantité substantielle, de préférence en quantité au moins stoechiométrique par rapport à 1b(-cétoacide. Le bilan global de la synthèse de L- régénéré. Le brevet américain n 4304858 décrit un procédé enzymatique continu du type précité selon lequel on synthétise des L-oaminoacides à partir d' cétoacides dans un réacteur à membrane avec le coenzyme nicotinamide adénine dinucléotide sous forme de dérivé à haut poids moléculaire soluble en milieu aqueux et avec deux enzymes purifiées, une deshydrogénase spécifique du substrat(L-aminoacide deshydrogénase) et une formiate deshydrogénase utilisée pour la régénération du coenzyme. Ce procédé comporte plusieurs inconvénients: - On utilise deux enzymes intracellulaires provenant de deux microorganismes différents Candida boidinii ou Pseudomonas oxalaticus pour la formiate deshydrogénase et Bacillus subtilis pour la L-aminoacide deshydrogénase, ce qui implique deux cultures différentes et deux procédures différentes d'extraction des enzymes intracellulaires; - On emploie deux préparations enzymatiques purifiées, ce qui implique des opérations coûteuses de purification. Pour remédier à ces inconvénients, on propose un nouveau procédé de production de L- d'une souche de Bacillus. De préférence, on utilise le produit de culture d'une souche de Bacillus megaterium. On utilise de manière encore plus préférée le produit de culture de la souche de Bacillus megaterium ATCC 39118 en raison des rendements particulièrement élevés obtenus dans la production de L- aminoacide deshydrogénase. Il a déjà été décrit dans le brevet FR 2 526 442 que cette souche Bacillus megaterium ATCC 39118 (IFP 188) a la propriété de posséder une activité glucose deshydrogénase élevée (EC 1.1.1.47). Ce même brevet précise les conditions permettant la préparation d'un extrait brut, stable et actif de glucose deshydrogénase à partir de cette souche, ce qui conduit à la régénération de manière très avantageuse du NADH à partir de NAD+ avec un système o le réducteur R est le glucose et le produit P l'acide gluconique après hydrolyse. Cette souche est un mutant de sporulation de la souche de la collection du laboratoire Bacillus megaterium IFP 180. On a découvert que la culture de Bacillus, de manière préférée la culture de Bacillus megaterium et plus particulièrement de la souche ATCC 39118 conduisent à une composition enzymatique présentant à la fois une activité L-aminoacide deshydrogénase et une activité glucose deshydrogénase élevées. Dans le procédé de l'invention, on utilise de préférence une composition enzymatique présentant les deux activités précitées, en proportion de 0,1: 1 à 10: 1. La composition peut être utilisée sous la forme d'un extrait brut ou très peu purifié. A fortiori, elle peut être employée sous la forme d'un extrait purifié. De manière préférée, la composition enzymatique présente des activités Laminoacide deshydrogénase et glucose deshydrogénase sensiblement égales. Des conditions préférées pour la conduite de la culture de Bacillus, de Bacillus megaterium et de la souche ATCC 39118 sont les suivantes:- La présence dans le milieu, de glucose à une concentration d'au moins 1 g/1l et de manière préférée, de 1 à 40 g/litre s'est avérée utile pour l'obtention d'activités glucose deshydrogénase et L-aminoacide deshydrogénase élevées. L'addition d'une source d'azote minéral (sous forme d'ions ammonium) et de manière préférée d'une quantité de 0,1 à i % d'azote organique sous forme d'aminoacides telle que notamment la peptone de soja, des hydrolysats de caséine, la liqueur de macération du mais, et des extraits de viande permettent d'obtenir en milieu aérobie une bonne croissance et des activités enzymatiques élevées. Les conditions de milieu de culture sont les suivantes: température: 20 à 40 C, pH = 5,5 à 8,0. Un excellent niveau d'activité a été obtenu à une température comprise entre 27 et 32 C et dans un intervalle de pH de 6,5 à 7,5. A partir des cultures de Bacillus, ou de Bacillus megaterium et en particulier de la souche ATCC 39118, on récolte, par exemple, par centrifugation, les bactéries qui sont ensuite cassées en utilisant des techniques telles que le broyage avec des billes de verre, le traitement aux ultra-sons, etc. Après centrifugation des broyats bactériens pour éliminer les débris des parois cellulaires, on obtient l'extrait enzymatique brut, présentant les activités glucose deshydrogénase et Laminoacide deshydrogénase, utilisé pour la synthèse de L-:aminoacides à partir des c-cétoacides correspondants. On mesure la double activité de cet extrait dans les conditions suivantes: T : 30 C, pH d'activité maximum pour chaque enzyme et concentration de substrat saturante. Le coenzyme sous forme réduite (NADH) ou oxydée (NAD+) peut être utilisé à une concentration de 0,1 à 10 mmoles par litre et de manière préférée de 0,3 à 3 mmoles par litre. Il peut notamment être mis en oeuvre sous une forme polymérique à haut poids moléculaire (500 - 50 000). On a obtenu de très bons résultats de production de L-aaminoacides lorsque le réducteur du coenzyme était le glucose. La synthèse proprement dite des L-c aminoacides s'effectue dans un réacteur maintenu à une température de 10 à 60 C, de préférence de 20 à 45 C. Le pH du milieu est maintenu à une valeur choisie entre 6 et 10. On le maintient de préférence sensiblement constant par addition d'une base, de préférence l'ammoniaque. L'addition d'ammoniaque dans le réacteur est doublement nécessaire, à la fois comme agent de régulation mais aussi comme réactif puisqu'il intervient dans la première réaction enzymatique, à savoir l'amination réductrice de l':-cétoacide. On a obtenu de bons résultats en injectant de 1 à 3 moles exprimées en ammoniaque, de la source d'ion ammonium pour 1 mole d'-cétoacide. Un pH situé entre 6,5 et 8,5 est particulièrement favorable pour la stabilité des enzymes utilisées et du nicotinamide adénine dinucléotide. Le choix du pH est en effet important pour ce dernier composé dont la forme réduite est instable en milieu acide et la forme oxydée instable en milieu alcalin. La présence dans le milieu d'un tampon, par exemple un sel soluble de l'acide phosphorique tel qu'un phosphate d'ammonium, peut être utile pour maintenir le pH du milieu et la stabilité des enzymes. On peut encore ajouter des agents de stabilisation des enzymes parmi lesquels les composés comportant un groupement thiol, tels que le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol, etc..., sont particulièrement efficaces. Un mode opératoire-préféré est décrit ci-après: on introduit dans le réacteur les éléments choisis, notamment le tampon, le NAD+ (ou le NADH) et l'extrait enzymatique préparé à partir d'une culture de Bacillus, du Bacillus megaterium ou de la souche ATCC 39118. Une partie seulement du réducteur, par exemple le glucose, nécessaire à la réaction est introduite en début de réaction. En effet, on préfère éviter la présence dans le réacteur de concentrations trop fortes en glucose qui peuvent avoir une action inhibitrice sur l'activité enzymatique L-aminoacide deshydrogénase. De la même façon, on préfère éviter la présence dans le réacteur de concentrations élevées en bC-cétoacides qui peuvent avoir une action inhibitrice sur l'activité enzymatique L-aminoacide deshydrogénase. C'est pourquoi, il est souvent avantageux d'injecter en continu dans le réacteur ces deux composés sous forme d'une solution aqueuse dont la quantité de réducteur (glucose par exemple) est de 1 à 2 moles pour 1 mole de V son introduction. Le LD-aminoacide formé au cours de la réaction peut être dosé par des techniques connues de l'homme de l'art par exemple enzymatiquement au moyen de la L-aminoacide oxydase ou au moyen d'un analyseur automatique d'aminoacides. En fin de réaction, on peut extraire le L-"aminoacide formé par exemple par passage sur une résine échangeuse de cations et ensuite évaporer l'éluat sous vide. A titre d'exemple, on peut réaliser les synthèses suivantes: - la Lalanine à partir d'acide pyruvique ou de l'un de ses sels, - la L-leucine à partir de l'acide cétoisocaproique ou de l'un de ses sels, - la Lvaline à partir de l'acide 3-méthyl-2-oxobutyrique ou de l'un de ses sels, - la L-isoleucine à partir de l'acide 3-méthyl-2-oxovalérique ou de l'un de ses sels, et - la L-phenylalanine à partir de l'acide phénylpyruvique ou de l'un de ses sels. Les exemples suivants qui illustrent l'invention sont donnés à titre non limitatif. Exemple 1: Préparation de la L-leucine La souche de Bacillus megaterium ATCC 39118 est cultivée en fioles de Fernbach dans un milieu dont la composition est la suivante: - hydrolysat trypsique de caséine 17 g peptone papainique de soja 3 g - chlorure de sodium 5 g - phosphate bipotassique 2,5 g -glucose 2,5 g - Eau distillée 1 litre Ce milieu est stérilisé, avant ensemencement, 30 minutes à 115 C. La culture est réalisée à 30 C, pH = 7,0, pendant 24 heures. Ensuite les cellules sont récoltées par centrifugation, mises en suspension dans un tampon phosphate de potassium 100 mM, pH = 7,5, et cassées au cours d'un traitement aux ultra-sons pendant 2 mn en réfrigérant en permanence la suspension cellulaire de façon que sa température n'excède jamais 10 C. On élimine par centrifugation les débris cellulaires et on récupère l'extrait enzymatique sur lequel on détermine l'activité enzymatique de la glucose deshydrogénase et de la leucine deshydrogénase. L'activité enzymatique de la glucose deshydrogénase est trouvée égale à 0,23 unité par mg de protéines de l'extrait, celle de la leucine deshydrogénase est de 0,13 unité par mg de protéines de l'extrait. Une unité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme permettant la transformation d'une micromole de substrat (le glucose dans le cas de la glucose deshydrogénase, l'acide o(.cétoisocaproîque ou un de ses sels dans le cas de la leucine deshydrogénase) par minute dans les conditions de l'essai. Une partie aliquote de cet extrait enzymatique a été concentrée environ 5 fois par ultrafiltration à + 4 C, et l'extrait enzymatique concentré obtenu a été employé ci-après pour la synthèse de la L-leucine. La synthèse de la L-leucine est effectuée dans un réacteur de 150 ml, thermostaté à 30 C, avec un volume liquide initial de 50 ml, agité par l'intermédiaire d'un barreau magnétique. Le milieu liquide initial renferme les composants suivants: - tampon phosphate d'ammonium pH = 8?2 1 mole/l - NAD+ 1 mmole/l - glucose 50 mmoles/l - extrait enzymatique concentré tel qu'obtenu ci-dessus = 12,5 ml soit 290 unités de glucose deshydrogénase et 122 unités de leucine deshydrogénase On injecte en continu une solution à pH = 7,0, contenant 200 mmoles par litre db ccétoisocaproate de sodium et 220 mmoles par litre de glucose, à un débit de 1,5 ml/h. Le pH est maintenu à 8,2 par addition d'ammoniaque 2N. Apres 24 heures, le volume liquide dans le réacteur est de 86 ml, et la concentration en L-leucine formée, mesurée par le dosage enzymatique à la L-aminoacide oxydase, est de 65 mmoles par litre. La production en Lleucine est égale à 5,6 mmoles avec un rendement molaire de 78 % par rapport à l'(cétoisocaproate de sodium injecté. La consommation d'ammoniaque 2N est de 5,7 millilitres. La purification des L-ocaminoacides décrits dans les exemples s'effectue de la manière suivante: Le milieu réactionnel est versé en haut d'une colonne de résine échangeuse de cations Amberlite ER 151 préalablement mise sous forme H+ par lavage avec de l'acide chlorhydrique 1N suivi d'un lavage à l'eau. Après introduction de l'échantillon, la colonne est à nouveau lavée par de l'eau puis éluée avec de l'ammoniaque 2N. Après -le passage d'un volume de la solution d'élution correspondant au volume "mort" de la colonne, on commence à récupérer les fractions éluées jusqu'à ce que leur volume total représente 1,5 fois le volume mort de la colonne. L'éluat est ensuite évaporé sous vide, redissous dans l'eau et à nouveau évaporé. Le rendement de la purification est de 98 %. Exemple 2: Préparation de L-valine La préparation de l'extrait enzymatique est effectuée dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1, sauf que la culture de Bacillus megaterium ATCC 39118 dure 30 heures et que l'extrait enzymatique est utilisé à l'état brut. L'activité enzymatique de la glucose deshydrogénase et de la L-valine deshydrogénase sont trouvées chacune égales à 0,3 unité par mg de protéines de l'extrait. La synthèse de la L-valine est réalisée dans un réacteur de 150 ml, agité, et thermostaté à 30 C. Les composants du milieu dont le volume initial est de 50 ml, sont les suivants - tampon phosphate d'ammonium pH = 8,2 1 mole/1 - NAD+ 1 mmole/l - glucose 50 mmoles/1 - extrait enzymatique = 8,5 ml soit 50 unités de glucose deshydrogénase et 50 unités de L-valine deshydrogénase On injecte en continu une solution à pH = 7,0, contenant 200 mmoles par litre de 3-méthyl-2-oxobutyrate de sodium et 220 mmoles par litre de glucose, à un débit de 1,5 ml/h. Le pH est maintenu constant à 8,2 par addition d'ammoniaque 2N. La réaction de synthèse est arrétée après 24 heures. Le volume liquide dans le réacteur est alors de 90 ml et la concentration en L-valine formée, mesurée par le dosage enzymatique à la L-aminoacide oxydase, est égale à 80 mmoles par litre. Le rendement molaire de la synthèse de Lvaline est de 100 % par rapport au 3-méthyl-2-oxobutyrate de sodium introduit dans le réacteur, et la production en L-valine égale à 7,2 mmoles. La consommation en ammoniaque 2N est de 7,4 millilitres. Exemple 3: Préparation de L-isoleucine On emploie le même extrait enzymatique que celui décrit dans l'exemple 2. L'activité enzymatique de la glucose deshydrogénase est égale à 0,30 unité par mg de protéines de l'extrait, celle de la L-isoleucine deshydrogénase 0,25 unité par mg de protéines de l'extrait. On réalise la synthèse de la L-isoleucine dans l'appareillage déjà décrit dans les exemples précédents. Les composants du milieu, dont le volume initial est 50 ml, sont les suivants: - tampon phosphate d'ammonium pH = 8,2 1 mole/l - NAD+ 1 mmole/l1 - glucose 50 mmoles/l - extrait enzymatique = 9 ml soit 53 unités de glucose deshydrogénase et 44 unités de L-isoleucine deshydrogénase. On injecte en continu une solution à pH = 7,0, contenant 200 mmoles par litre de 3-méthyl-2-oxovalérate de sodium et 220 mmoles par litre de glucose, à un débit de 1,5 ml/h. Le pH est maintenu à 8,2 par addition d'ammoniaque 2N. Après 24 heures de réaction, le volume liquide dans le réacteur est de 89 ml et la concentration en L-isoleucine formée, mesurée par le dosage enzymatique à la L-aminoacide oxydase, est égale à 78 mmoles par litre. Le rendement molaire de synthèse de la L-isoleucine par rapport au 3-méthyl-2-oxovalérate de sodium injecté est de 97 %. ÀExemple 4: Préparation de la L-alanine La préparation de l'extrait enzymatique est effectuée comme dans l'exemple 2. On détermine une activité enzymatique L-alanine deshydrogénase dans l'extrait brut de 0,04 unité par mg de protéines pour une activité glucose deshydrogénase de 0, 30 unité par mg de protéines. Après concentration, par exemple, par ultrafiltration de l'extrait enzymatique, on réalise à partir du pyruvate de sodium la préparation de la L-alanine selon l'exemple 1 et on obtient après purification un rendement de 52 %. Exemple 5: Préparation de la L-phénylalanine L'extrait enzymatique est préparé comme dans l'exemple 2 et on détermine une activité enzymatique Lphénylalanine deshydrogénase de 0,03 unité par mg de protéines et une activité glucose deshydrogénase de 0,30 unité par mg de protéines. Apres concentration de l'extrait, on réalise la préparation de la Lphénylalanine à partir du phénylpyruvate de sodium, selon l'exemple i et on obtient un rendement après purification de 38 %. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de L- o(aminoacide, dans lequel on soumet un mélange d'au moins un 0-cétoacide ou d'au moins l'un de ses sels, d'un réducteur, d'une source d'ions ammonium et de nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite ou oxydée à l'action d'une composition enzymatique, caractérisée en ce que ladite composition est le produit de culture d'une souche de Bacillus. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la souche est celle de Bacillus megaterium. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la souche est celle de Bacillus megaterium ATCC 39118. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit produit de culture a été obtenu en présence de glucose à la concentration de 1 à 40 g/litre. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le produit de culture a été obtenu par culture de Bacillus à une température de 20 à 40 C et à un pH de 5,5 à 8 dans un milieu de culture renfermant au moins une source d'aminoacide. 25.6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ladite production de L- c aminoacide est mise en oeuvre à une température de 10 à 60 C et à un pH de 6 à 10. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le réducteur est le glucose. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel, dans une opération continue, pour 1 mole d'océtoacide, on met en oeuvre de 1 à 2 moles de réducteur et de 1 à 3 moles, exprimées en ammoniaque, de la source d'ions ammonium. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on met en oeuvre le procédé avec une composition enzymatique présentant une activité L-ocaminoacide deshydrogénase et une activité glucose deshydrogénase en proportions de 0,1: 1 à 10: 1. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l'o-cétoacide est l'aciae pyruvique, l'acide C-cétoi- socaproîque, l'acide 3-méthyl-2-oxobutyrique, l'acide 3-mé- thyl-2-oxovalérique, l'acide phénylpyruvique ou l'un de leurs sels.