Brevet FR2573091A1 — publié le 19860516

NOUVELLE ENZYME BACTERIOLYTIQUE ET SON PROCEDE DE PREPARATION La présente invention conerne une nouvelle enzyme bactériolytique et un procédé pour la préparer en utili- sant une moisissure de boue cellulaire du genre Polysphon- dylium. Les procédés connus pour rompre les parois cellulaires peuvent être divisés en trois catégories principales: (1) procédés physiques, (2) procédés chimiques et (3) procédés enzymatiques. Les procédés physiques et chimiques posent des problèmes inévitables concernant les systèmes de traitement, et les produits sont susceptibles d'être modifies par un traitement excessif. Les méthodes ou procédés enzyma- tiques ont en conséquence attiré davantage l'attention du public ces dernières années. Les.enzymes pour dissoudre les organismes des germes utilisées à cet effet sont généralement désignées sous le nom d'enzymes bactériolytiques, et la plus connue est le lysozyme préparé à partir du blanc d'oeuf. Cependant, le spectre bactériolytique du lysozyme du blanc d'oeuf ne couvre que certaines bactéries gram-positives, et le lysozyme du blanc d'oeuf présente l'inconvénient de ne pas avoir d'action sur les bactéries lactiques en général telles que celles des genres Lactobacillus et Streptococcus. Le brevet japonais n 8597/1982 décrit un procédé dans lequel une composition d'enzymes (contenant de la cellulase, de la laminarinase, de la xylanase, de la pectinase, de l'amylase, de la protéase, etc...) produite par un micro- organisme du genre des Basidiomycètes Illupec, Coryollus ou Coprynus, est mise à réagir sur une membrane cellulaire (mem- brane de chlorella) pour rompre la membrane. Cependant, ce brevet de la technique antérieure ne cite aucun micro- organisme du genre Polysphondylium. La croissance d'un micro-organisme du genre Polysphon- dylium de lanoisissure de boue cellulaire dans un milieu nutritif simple a été signalée dans Science, Vol. 139, page 338 (1963). Cependant, aucuneenzyme n'a été extraite du milieu --2-- de culture après la culture. Apres une recherche intensive d'une nouvelle enzyme ayant un spectre bactériolytique plus large que celui du lysozyme du blanc d'oeuf, la demanderesse a réussi à séparer une moisissure de boue cellulaire, plus particulièrement un micro-organisme nouveau (une nouvelle espèce de germe) le Polysphondylium, qui présente une action bactériolytique rapide sur les bactéries lactiques qui ne sont pas attaquées par le lysozyme du blanc d'oeuf. La présente invention est basée sur cette découverte. L'enzyme de l'invention est préparée à partir d'une source peu commune en ce sens qu'elle est préparée par culture d'une moisissure de boue cellulaire, comme il a été décrit ci-dessus. En outre, elle présente cette carac- téristique avantageuse que son spectre bactériolytique est plus large que celui du lysozyme du blanc d'oeuf connu. L'enzyme de l'invention est une nouvelle enzyme bactérioly- tique qui est active dans une zone de plus forte acidité dans laquelle les enzymes bactériolytiques connues telles - 20 que celles préparées à partir d'Achromobacter Lunatus et de Bacillus subtilis, ne sont pas actives. Brève description des dessins: La figure 1 est un graphique représentant la courbe de pH optimale de l'enzyme préparée par la présente invention; La figure 2 est un graphique représentant la stabilité del'enzyme préparée par la présente invention; La figure 3 est un graphique montrant la température optimale pour l'enzyme préparée selon la présente invention; La figure 4 est un graphique montrant la stabilité thermique de l'enzyme préparée selon la présente invention; et - La figure 5 est un graphique montrant la capacité de solubilisation de l'enzyme préparée selon la présente invention. -3- La demanderesse a séparé un certain nombre d'espèces de microorganisme des sols de divers lieux, et elle a étudié leurs produits pour vérifier s'ils contenaient une enzyme bactériolytique. A la suite de cette étude, elle a réussi à séparer de nouvelles bactéries qui produisent l'enzyme présentant les caractéristiques indiquées ci- dessus. Les espèces de micro-organismes ainsi séparées sont désignées sous les noms de Polysphondylium Pallidum LE-1 (déposée le 8 Octobre 1984 à l'Institut japonais Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Bikoken FERM BP-633) et Polysphondylium violaceum LE-1 (déposée le 8 Octobre 1984 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Bikoken FERM BP-632). Elles ont été identifiées comme des moisissures de boues cellulaires du genre Polysphondylium par le procédé décrit par Lindsay S. Olive dans "The Mycetozoans" (1975). - - Les caractéristiques microbiologiques des moisissures sont les suivantes: (1) Sorocarpes à tige tubulaire large, remplie d'un réseau de cellules vides, ceci étant la caractéristique des Dicryosteliacées. (2) Sorocarpes avec un sorus terminal de grande dimension et des spires régulières de sori stipités le long de la tige principale, ceci étant la caractéristique du Polysphondylium. (3-i) Sorocarpes avec un sorus terminal de grande dimension et des spires régulières de sori stipités plus petits le long de la tige principale, et colorés en pourpre rougeâtre, ceci étant la caractéristique du polysphondylium violaceum. (3-ii) Sorocarpes avec un sorus terminal de grande dimension et des spires régulières de sori stipités plus petits le long de la tige principale et colorés en blanc, ceci étant la caractéristique du Polysphondylium Pallidum. Le procédé de l'invention consiste a inoculer et à cultiver une moisissure qui appartient au genre Poly- sphondylium et produit une enzyme bactériolytique dans un milieu de culture. On peut utiliser à cet effet n'importe quel milieu solide ou liquide. Il est généralement commode d'utiliser un milieu de culture liquide, et d'effectuer la culture en atmosphère aérobie, par exemple en cultivant sous agitation ou en cultivant sous aération et agitation. On peut utiliser comme composition de culture un milieu de culture ordinaire. Des saccharides, tels que le glucose et le lactose, peuvent être utilisés comme source de carbone, et des composés azotés organiques et minéraux tels que la peptone, les extraits enzymatiques, les organismes bactériens séchés, le lait écrémé, les sels d'ammonium et les nitrates, peuvent être utilisés comme source d'azote. Des phosphates ou des sulfates d'éléments métalliques, tels que le potassium et le magnésium peuvent être ajoutés comme sel minéral. Les conditions de culture peuvent être choisies ou ajustées de telle sorte qu'il s'accumule la quantité maximalede l'enzyme bactériolytique produite. La deman- deresse a trouvé que l'on pouvait obtenir un résultat satisfaisant en réglant le pH du milieu de culture à 4,0-8,0, de préférence à 5,5-7,0 et en cultivant à une température de 15 à 40 C, de préférence de 20 à 30 C, pendant 2 à 4 jours. L'enzyme bactériolytique désirée s'accumule ainsi dans la solution de culture et dans l'organisme de la moisissure cultivé. Dans la présente invention l'enzyme désirée peut être extraite par des moyens de séparation et de purifi- cation ordinaires. On peut préparer des produits enzyma- tiques ayant n'importe quelle pureté désirée. Plus précisément, l'enzyme peut être séparée de la manière suivante. Initialement, l'organisme des moisissures cultivées est séparé de la solution de culture par séparation centri- fuge ou filtration. Il est broyé par des ondes ultra- sonores ou par d'autres moyens, et le résidu de cellules est éliminé par séparation centrifuge pour obtenir une solution surnageante. Cette solution surnageante peut être utilisée directement sans autre traitement. On peut également traiter la solution surnageante de la même manière que la solution de culture pour obtenir le produit désiré, comme il sera décrit en détail ci-après. La solution de culture est directement soumise à un relargage par addition d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou par addition d'un solvant organique hydrophile, tel que l'alcool et l'acétone, pour fractionner et précipiter le produit désiré. Le degré de purification peut être encore augmenté par un procédé dans lequel le produit est absorbé par une résine échangeuse d'ions puis séparé, ou par un procédé de filtration sur gel dans lequel on utilise du Sephacryl (Marque déposée, fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals) ou du Toyopearl (Marque déposée,fabriqué et vendu par Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd). Ces procédés peuvent être utilisés isolément ou en combinaison. L'enzyme de l'invention est active dans un large intervalle de pH d'environ 2 à 7. Elle a une activité particulièrement élevée dans l'intervalle des pH acides de 3 à 6. (A cet égard, on se référera à la figure 1. Dans l'expérience, la valeur du pH est ajustée en utilisant une solution tampon de McIlvaine ayant une force ionique de 0,06). L'enzyme est relativement stable dans l'intervalle de pH d'environ 2 à 8. (A cet égard, on se référera à la figure 2 montrant la stabilité de l'enzyme lorsque le pH varie. Le graphique de la figure a été obtenu en portant les activités de l'enzyme résiduelle après que l'enzyme préparée par le procédé de l'invention a été maintenue aux valeurs de pH portées en abscisses à 30 C pendant 16 heures. Les solutions tampons utilisées pour l'ajuste- ment du pH sont les suivantes: pH 2 à 6 (désigné par O): Solution tampon glycine/ acide chlorhydrique (0,01M) pH 4 à 6 (désigné par O): Solution tampon acide acétique (0,01 M) pH 5 à 8 (désigné part): Solution tampon acide phosphorique (0,01 M) pH 8 à 10 (désigné par à): Solution tampon ammonium (0,01 M) La température optimale pour la réaction enzymatique est d'environ 45 à 55 C. (Voir figure 3). L'enzyme a une stabilité thermique suffisante en ce qu'elle est stable même après avoir été chauffée à 60 C pendant 15 minutes. (A cet égard, on se référera à la figure 4, montrant les résultats d'une expérience pour la confirmation de la stabilité thermique. Dans cette expé- rience, l'enzyme a été ajoutée respectivement à une solu- tion tampon acide acétique 0,01 M ayant un pH de 4,0 et à une solution tampon acide phosphorique 0,01 M ayant un pH de 7,0, puis chauffée aux températures portées en abscisses et l'activité résiduelle de l'enzyme a été mesurée). L'action de dissolution de l'enzyme a été mesurée ou calculée de la manière suivante. Sauf indication contraire, le substrat utilisé était un corps bactérien séché (fabriqué par Sigma Chemical Company) de -Microccus Lysodeikticus. Le substrat a été ajouté à une solution tampon de McIlvaine (pH 3,5, force ionique 0,06) pour préparer une suspension. On a ajouté 0,1 ml de la solution d'enzyme à 3,0 ml de la suspension ayant une densité optique (désignée ci-après simplement par D.O.) à 570 mg de 0,7 et la suspension a été maintenue à 37 C. L'activité bactériolytique a été identifiée par la diminution de la turbidité à la longueur d'onde ci- dessus. La quantité de l'enzyme nécessaire pour abaisser la D.O. à 570 m. de 0,001 par minute a été définie comme une unité d'activité bactériolytique. Une suspension dans laquelle de l'eau a été ajoutée à la place de la solution enzymatique a été utilisée comme témoin. La nouvelle composition d'enzyme bactériolytique de l'invention a été soumise à une chromatographie par échange d'ions, qui a révélé qu'elle contenait au moins trois constituants actifs pour la dissolution du Micro- ccus Lysodeikticus. Ce résultat montre que la composi- tion est un mélange de plusieurs enzymes. Dans l'extrac- tion et la purification de la composition d'enzymes, les enzymes individuelles peuvent être purifiées et isolées complètement, ou bien un mélange partiellement purifié contenant trois enzymes ou davantage présentant la pureté désirée peut être extrait pour l'utilisation. Comme le montre la figure 5, au fur et à mesure que la dissolution s'effectue, l'hexosamine est solubilisée. L'hexosamine est colorée par la réaction de Morgan-Elson. Les courbes de la figure 5 ont été obtenues de la manière suivante. A 7,5 ml de la solution enzymatique dissous dans une solution tampon acide acétique 0,01 M, on a ajouté 15 mg de peptidoglycane de B. Megaterium pour les faire réagir à 37 C. La diminution de turbidité a été représentée par la modification de la D.O. à 570 mi. Le N-acétylamino sucre a été analysé quantitativement conformément à la méthode de Ghysen et coll. (Elizabeth F. Neufeld et coll., Methods in Enzymology "Complex Carbohydrates", vol. VIII, p. 691-692, 1966). La composition enzymatique bactêriolytique préparée selon la présente invention présente un spectre bactério- lytique qui est considérablement plus large que celui du lysozyme de blanc d'oeuf. En d'autres termes, elle présente une action bactériolytique sur presque toutes les bactéries gram-positives, y compris les bactéries lactiques. Une caractéristique particulièrement remarquable est qu'elle est active dans un intervalle très acide, dans lequel les enzymes bactériolytiques connues ont des activités rela- tivement mauvaises. La composition enzymatique selon l'invention peut être utilisée comme antibiotique dans-les domaines médi- caux et pharmaceutiques. Elle peut également être utilisée comme un antiseptique naturel ne produisant que peu de réaction défavorable dans le domaine de la production des aliments. On peut s'attendre à ce que la composition enzymatique selon l'invention soit utilisée dans une large gamme d'applications, parmi lesquelles la fusion cellu- laire, qui est devenue ces dernières années-un sujet d'actualité en biotechnologie. Exemple 1 Dans un récipient de culture d'un volume de 50 litres, on introduit 15 litres d'un milieu de culture liquide contenant 0,5 % de peptone, 0,05 % d'un extrait de levure, 0,5 % de glucose, 0,225 % de phosphate de potassium, 0,067 % d'hydrogénophosphate dipotassique et 0,05 % de - sulfate de magnésium (heptahydrate)-, et on stérilise le contenu du récipient en le chauffant à 121 C pendant minutes. Apres inoculation avec Klebsiella aerogenes, on poursuit la culture pendant 48 heures à 35 C et en agitant à 150 tours/minute sous un débit d'aération de litres/minute. On évite les bulles produites par le développement du germe par addition d'un agent anti- mousse. Lorsque la culture est terminée, on stérilise la solution de culture à 1210C pendant 5 minutes,-et on ajoute une amibe Polysphondylium Pallidum LE-1 qui a été cultivée dans un ballon vibrant pendant 2 jours à la solution de culture stérilisée, après quoi on cultive à 25 C et en agitant à 150 tours/minute avec un débit d'aération de 20 litres/minute. Lorsque la culture est terminée, on soumet la solution de culture à une sépara- tion centrifuge pour séparer les cellules d'amibes (97 g de poids humide) que l'on rince à l'eau désionisée et auxquelles l'on ajoute de l'eau à raison de 50 % en poids des cellules. On place le mélange dans un oscillateur ultrasonique pour briser ou écraser les cellules sous kHz pendant 20 minutes. Le résidu de cellules est éliminé par séparation centrifuge, et l'on obtient 110 ml d'une solution surnageante. L'activité enzymatique de la solution surnageante est de 180 unités/l ml. Exemple 2 On ajoute 684 g de sulfate d'ammonium (heptahydrate) à 1000 ml de la solution surnageante cultivée de la même manière que dans l'exemple 1, et dépourvue de cellules d'amibes et on laisse le mélange reposer à 4 C pendant une nuit pour relarguer le précipité qui est recueilli par séparation centrifuge. Le précipité recueilli est dialysé avec une quantité d'eau suffisante que l'on concentre pour obtenir 50 ml de liquide de dialyse. L'activité enzymatique du liquide de dialyse ainsi concentré est de 55 unités/l ml. Exemple 3 On utilise la solution surnageante préparée dans l'exemple 1 comme source d'enzyme pour effectuer des expériences de dissolution afin de déterminer son activité de dissolution sur divers corps de micro-organismes. Les germes indiqués dans le tableau 1 sont cultivés dans des liquides, après quoi on recueille les corps des germes par séparation centrifuge, et on les met en suspension dans une solution tampon de McIlvaine (pH 3,5, force ionique: 0,06). On détermine les activités bactérioly- tiques sur les germes respectifs par la méthode de déter- mination précédemment décrite. Les résultats sont donnés dans le tableau 1. Dans la détermination des activités bactériolytiques du lisozyme, une solution tampon acide phosphorique (pH 7,0, force ionique: 0,06) a été utilisée à la place de la solution tampon de McIlvaine, et une solution de lisozyme (concentration: 15 pg/mg) a été utilisée à la place de la composition enzymatique de l'invention, les autres opérations étant les mêmes. Comme il ressort du tableau 1, les enzymes selon l'invention agissent sur une plus grande diversité de germes en milieu acide à pH 3,5 que celles attaquées par le lisozyme du blanc d'oeuf. i l TABLEAU 1 Lysozyme de Enzyme de Espèce de germe 'albumen l'inven- (témoin) tion Lactobacillus arabinosus - +++++ Lactobacillus bulgaricus + +++++ Lactobacillus casei + ++ Streptococcus faecalis (+) +++ Streptococcus thermophilis ++++ Streptococcus lactis - +++++ Bacillus subtilis +++ + ++ Bacillus megaterium ++ ++++ Bacillus licheniformis + ++ Bacillus polymyxa - ++++ Bacillus cereus Microccus lysodeikticus +++++ +++ ++ Staphylococcus epidermidis - Arthrococcus simplex (+) ++ Brevibacterium ammoniagenes (+) Corynebacterium fascians Escherichia Coli Alcaligenes faecalis (+ Enterobacter aerogenes Note: La diminution de la D.O. à 570 mP (%) est cotée comme suit: 0 à moins de 8: - 8 moins de 10 (+) à moins de 20:+ 20 à moins de 40: ++ à moins de 60: +++ 60 à moins de 80: ++++ Pas moins de 80: ++++ Exemple 4 Dans dix ballons de Sakaguchi de 500 ml, on introduit ml d'un milieu de culture liquide contenant 0,5 % de peptone, 0,05 % d'un extrait de levure, 0,5 % de glucose, 1,0 % d'un corps bactérien lyophilisé de Klebsiella aerogenes, 0,225 % de dihydrogénophosphate de potassium, 0,067 % d'hydrogénophosphate dipotassique et 0,05 % de sulfate de magnésium (heptahydrate), et on stérilise à 121 C pendant 15 minutes. Puis, on inocule l'amibe de Polysphondylium Pallidum LE-1 dans chaque flacon, après quoi on effectue une culture vibrante à 22 C pendant 3 jours. Lorsque la culture est terminée, les cellules de l'amibe sont brisées et la solution surnageante est séparée par séparation centrifuge. L'activité enzymatique de la solution surnageante est mesurée et l'on trouve que l'activité pour 1 ml de la solution est de 170 unités. La solution surnageante est soumise à un relargage par du sulfate d'ammonium, suivi d'une dialyse, et l'activité enzymatique de la solution dialysée est mesurée et elle est de 46 unités. Exemple 5 Dans dix ballons de Sakaguchi de 500 ml, on introduit ml d'un milieu de culture liquide contenant 0,08 % de lécithine du soja, 2 % de lait écrémé, 1 % de peptone de protéose et 0,68 % de dihydrogénophosphate de potassium, et on le stérilise à 121 C pendant 15 minutes. Puis, on inocule dans chaque flacon l'amibe de Polysphondylium Pallidun LE-1, après quoi on effectue une culture avec vibration à 22 C pendant 3 jours. Lorsque la culture est terminée, on sépare les cellules de l'amibe de la solution de milieu de culture par séparation centrifuge. On mesure l'activité enzymatique de la solution surnageante séparée des cellules d'amibe brisées de la même manière que dans l'exemple 2; et on trouve qu'elle est de 72 unités pour 1 ml de la solution. La solution de liquide surnageant du milieu cultivé est soumise à un relargage avec du sulfate d'ammonium, suivi d'une dialyse, de la même manière que dans l'exemple 2, et l'activité enzymatique de 50 ml de la solution dialysée est mesurée. On trouve qu'elle est de 60 unités/1 ml. Exemple 6 On cultive l'amibe de Polysphondylium violaceum LE-1 avec vibration pendant 3 jours dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4. Lorsque la culture est terminée, on recueille les cellules d'amibe par sépara- tion centrifuge, et on brise les cellules par des ondes ultrasonores de la même manière que dans l'exemple 1. L'activité enzymatique de la solution surnageante séparée par séparation centrifuge est de 170 unités/1 ml, et l'enzyme est efficace sur les divers micro-organismes indiqués dans l'exemple 3, montrant leurs actions bacté- riolytiques. A 100 ml de la solution surnageante du milieu de culture séparé des cellules d'amibe, on ajoute du sulfate d'ammonium pour le relargage, et on dissout le précipité dans une faible quantité d'eau, puis on le soumet à une dialyse pour obtenir 50 ml d'une solution d'enzyme concentrée. L'activité enzymatique de la solution ainsi concentrée est de 42 unités/1 ml. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une enzyme bactérioly- tique comprenant les étapes consistant à cultiver une bactérie du genre Polysphondylium dans un milieu de culture contenant une source de carbone, une source d'azote, un sel minéral et d'autres ingrédients nutritifs, puis à extraire ladite enzyme bactériolytique du produit cultivé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite bactérie du genre Polysphondylium est Polysphondylium Pallidum LE-1 (Bikoken FERM BP-633). 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite bactérie du genre Polysphondylium est Polysphondylium violaceum LE-1 (Bikoken FERM BP-632). 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite source de carbone est le glucose ou le lactose. 5. Procédé selon-la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite source d'azote est au moins une source choisie dans le groupe constitué des corps des germes séchés et du lait écrémé. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit sel minéral est un phosphate ou un sulfate de potassium ou de magnésium. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la culture est effectuée à un pH de 4,0 à 8,0 et à une température de 15 à 40 C pendant 2 à 4 jours. 8. Enzyme bactériolytique ayant une activité élevée dans un intervalle acide de pH de 3 à 6, stable dans un intervalle de pH de 2 à 8, ayant un optimum d'activité à une température de 45 à 55 C, pouvant résister à un chauffage à 60 C pendant 15 minutes, ayant une activité bactériolytique sur Microccus Lysodeikticus et ayant un spectre bactériolytique plus large que celui du lysozyme de blanc d'oeuf.