Brevet FR2578326A1 — publié le 19860905

Dispositif de captage sur un élément horizontal par voie électrique, de particules déplacées par électro- phorèse. L'invention a pour objet un dispositif de captage sur un élément horizontal, par voie électrique, de particules de matière déplacées par électrophorèse, comportant un récipient étanche aux liquides ayant un fond, un couvercle et des parois latérales s'étendant- entre le fond et le couvercle pour définir une chambre, un ensemble porteur disposé dans cette chambre pour porter la matière devant être captée par voie électri- que, une première électrode disposée au-dessous de l'ensemble porteur et une seconde électrode disposée au-dessus de l'ensemble porteur. D'une façon générale, l'électrophorèse est le phénomène de migration de particules chargées ou ions dans un milieu liquide porteur sous l'influence d'un champ électrique. Ce phénomène peut être utilisé pour séparer de petites particules qui, en raison de proprié- tés chimiques de surface différentes, présentent des concentrations de charge superficielles différentes dans le milieu donné. Sous l'influence du champ électrique, les mobilités par électrophorèse des différentes caté- gories de particules chargées dans le milieu porteur sont différentes. Un échantillon introduit en un point quel- conque dans la feuille de milieu liquide porteur (tampon) diffuse lentement dans une bande étroite en l'absence de gradient de potentiel. Cependant, quand un gradient de potentiel est appliqué à la feuille de milieu tampon, les particules de l'échantillon sont séparées, sous l'influence du champ électrique, en différents groupes de particules ou composants en fonction de la mobilité par électrophorèse des particules respectives, de l'in- tensité du champ et de la durée de la période pendant laquelle les particules demeurent dans le champ. Des particules de mobilité similaire sont concentrées dans des zones distinctes ou bandes à des distances détermi- nées du point d'introduction de l'échantillon (origine). Le captage ou transmission de particules de manière séparées par électrophorèse, par exemple l'ADN, 1'ARN et les protéines, est une opération qui est deve- nue normale quand on doit procéder à une détection sen- sible et spécifique de macromolécules intéressantes au point de vue biologique. Le captage par voie électrique présente des avantages importants sur le captage capillaire en ce que le captage par voie électrique est beaucoup plus rapide. Le captage capillaire et le captage par voie électrique exigent tous les deux que le gel soit placé en contact avec le papier ou autre membrane à laquelle les protéines, les acides nucléiques ou les autres ma- tières doivent être transmis. La différence entre ces procédés réside dans la force de captage qui commande la transmission. Dans le captage capillaire, la force de commande résulte du potentiel d'absorption du papier filtre ou de l'autre matière utilisée. La matière de transmission, par exemple la nitrocellulose ou un po- lyamide, est placée entre le gel et le papier absorbant. Cependant, dans le captage par voie électrique, telle qu'il est couramment pratiqué, le gel et la matière de transmission sont suspendus verticalement dans un ré- cipient de milieu tampon entre deux électrodes. Les protéines ou les acides nucléiques sont ainsi entraînés hors du gel sur la matière de transmission en utilisant le potentiel électrique. A titre d'exemple, un procédé type consiste à placer une membrane en polyamide contre une feuille de gélatine, à immerger l'ensemble gelpolyamide dans une solution tampon, puis à appliquer à l'ensemble un potentiel électrique transversalement en utilisant la solution tampon en tant que milieu conducteur. 25783'26 Cette façon de procéder fait appel, par exemple, à deux électrodes en fil de platine,chacune d'elles étant placée d'un côté de l'ensemble gelpolyamide, ce qui permet d'établir un gradient de potentiel dans la solution tampon. Les électrodes sont disposées à la manière d'une grille et placées à une certaine dis- tance du gel et du polyamide pour obtenir un champ électrique raisonnablement uniforme en utilisant une quantité minimale de platine. Ce procédé de captage présente des avantages importants. En premier lieu, les molécules de la masse d'un gel sont relativement peu accessibles aux corps étrangers tels que les anticorps. Le captage à la surface d'une membrane permet d'effectuer des analyses qu'il est difficile ou impossible d'effectuer dans le gel. En outre, étant donné que les molécules captées sont situées sur la surface de la membrane ou à proxi- mité de celle-ci, le temps d'analyse est notablement réduit. De plus, les membranes sont relativement fortes et faciles à manipuler, contrairement aux gels qui peuvent être aisément déchirés. En outre, les molécu- les captées sont liées à la membrane, de sorte qu'il n'y a pas de perte de résolution, tandis que l'acti- vité biologique est habituellement conservée. Ainsi, il est habituellement possible de stocker la membrane avant son utilisation. Comme mentionné ci-dessus, dans le captage par voie électrique tel qu'il est couramment pratiqué, le gel et la matière de transmission sont suspendus verticalement dans un réservoir de liquide tampon entre deux électrodes. Un certain nombre d'inconvé- nients sont associés à la transmission par voie élec- trique. Par exemple, les réservoirs du type en bac de batterie limitent les dimensions de la zone de gel que l'on peut transmettre tandis que les réservoirs de captage destinés au captage de gels d'électrophorèse de grandes dimensions nécessitent des quantités exagé- rées de liquide tampon et sont de construction très onéreuse. De plus, les supports pour les installations de captage sur un élément vertical doivent être très robustes pour maintenir le gel et la membrane de trans- mission à proximité immédiate. Cela exige le recours à des organes de support très grands qui tendent à bloquer la charge électrique, ce qui conduit à des zones de captage qui ne sont pas nettes.-Les dimensions du système de support limitent également les dimensions de la zone de gel qui peut être captée. Enfin, les gels d'agarose mous, tels que ceux qui sont nécessaires pour l'identification des génomesne peuvent pas subir l'opération de captage dans une installation de captage sur un élément vertical par voie électrique en raison du décalage, du glissement et de l'effondrement du gel dans le support. Les essais effectués pour le captage sur un élément horizontal, qui résoudrait certains des pro- blèmes mentionnés ci-dessus pour les dispositifs de captage sur un élément vertical, ont conduit dans une large mesure à des échecs. Pendant le captage par voie électrique dans les installations de captage sur un élément horizontal, des bulles d'oxygène et d'hydrogène sont respectivement produites sur la cathode et sur l'anode pendant l'électrolyse. Les bulles libérées sur l'électrode au-dessous de la membrane de gel dis- posée horizontalement s'accumulent sur la surface inférieure de cette membrane, ce qui bloque partielle- ment les charges électriques. Il en résulte un captage non uniforme. I1 est évident qu'il serait hautement sou- haitable de créer une installation de captage sur un élément horizontal par voie électrique convenant pour l'utilisation avec des gels d'agorose mous et des gels similaires pour lesquels les bulles qui sont produites sur l'électrode pendant- l'électrolyse se- raient dispersées de manière à éviter l'accumulation de bulles sur la surface inférieure de la membrane de gel disposée horizontalement. En conséquence, le but principal de l'inven- tion est de créer un dispositif de captage sur un élé- ment horizontal, par voie électrique, de particules de matière déplacées par électrophorèse. Un autre but de l'invention est de créer un dispositif tel que ci-dessus et qui convienne par- ticulièrement pour l'usage avec des gels mous tels que les gels d'agorose et similaires. Un but particulier de l'invention est de créer un dispositif tel que ci-dessus qui évite l'ac- cumulation de bulles sur la surface inférieure de la membrane de gel disposée horizontalement. La présente invention a encore pour but de créer un dispositif tel que cidessus qui soit de construction simple, de fabrication économique et facile à utiliser pour le captage par voie électrique. A cet effet, l'invention concerne un dispo- sitif du type ci-dessus caractérisé en ce que des mo- yens sont disposés dans la chambre pour dé- vier les bulles produites par la première électrode de manière h empêcher l'accumulation de ces bulles sur l'ensemble porteur pendant le captage par voie électrique de la matière transportée par électrophorèse. Les électrodes sont par exemple en platine. On pourrait cependant utiliser des électrodes réalisées en carbone ou en une autre matière conduc- trice. Le moyen ou barrage de déviation des bulles est disposé entre la première électrode et l'ensemble porteur. Ce barrage dévie les bulles produites par la première électrode de manière à empêcher l'accu- mulation des bulles sur la surface inférieure de l'ensemble porteur, ce qui porvoquerait une trans- mission non uniforme. L'ensemble porteur comporte une première surface porteuse et une seconde surface porteuse qui sont assemblées par serrage pour bloquer ensemble le gel et la membrane réceptrice absorbante. En raison de la disposition horizontale des surfaces porteuses une faible compression suffit pour mainte- nir en contact le gel et la membrane, ce qui permet l'utilisation de gels mous très dilués. Le dispositif suivant la présente invention présente des avantages importants sur les procédés utilisés jusqu'à maintenant. En premier lieu, les systèmes de transmission par voie électrique du type à disposition horizontale sont, par nature, plus fa- ciles à utiliser qu'un système à disposition verticale. Il est à noter que le dispositif suivant la présente invention permet l'utilisation de gels mous et dilués sans la gêne due au glissement qui se pro- duit dans les systèmes de captage sur un élément ver- tical par voie électrique. Enfin, le dispositif suivant la présente in- vention garantit un captage uniforme en éliminant l'accumulation des bulles sur la surface inférieure de l'ensemble porteur du gel pendant le processus de captage par voie électrique. On peut ainsi voir aisément que le disposi- tif suivant la présente invention présente des avan- tages importants qui, jusqu'à maintenant, n'ont pas été obtenus avec les dispositifs suivant la technique antérieure. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention résulteront de la description ci-après et des dessins annexés représentant un exemple de réalisation de l'invention, dessins dans lesquels: - - la Fig 1 est une vue en perspective, en partie éclatée d'un dispositif de captage conforme à la présente invention; - la Fig. 2 est une vue en plan de dessus du dispositif conforme à la présente invention, - la Fig.3 est une élévation frontale du dispositif représenté sur la Fig.2; - la Fig.4 est une vue en élévation du coté droit de la fig.2; - la Figs5 est une vue en élévation partiel- le du côté droit de la Fig.2; - la Fig.6 est une vue en perspective écla- tée de la surface porteuse inférieure de l'ensemble porteur utilisé dans le dispositif suivant la pré- sente invention. En se référant aux dessins dans le détail, on voit que le dispositif 10 de captage sur un élé- ment horizontal par voie électrique comporte un ré- cipient étanche aux liquides muni d'un couvercle 12, de parois latérales désignées respectivement par 14,16,18,20 et d'un fond 22 qui définissent une chambre 24. Le fond 22 est muni d'une électrode 26 qui s'étend dans la paroi latérale 20 o elle est reliée à un connecteur électrique 28. La paroi laté- rale 16 est munie de deux montants 30 qui reçoivent une tige 32 logée dans des oreilles 34 en forme de U disposées sur la face inférieure du couvercle 12. La paroi latérale 18 est munie d'un levier 36 monté à pivot et qui, dans une position, est agencé pour s'engager dans un renfoncement 38 prévu dans le cou- vercle 12. On peut ainsi maintenir ce couvercle en position d'ouverture, comme représenté sur la Fig.5. Un ensemble porteur, désigné d'une façon générale par la référence numérique 40 sur la Fig.5, est suspendu au couvercle 12 et s'engage dans la chambre 24 quand ce couvercle 12 est en position de fermeture, comme représenté sur la Fig.3 et la Fig.4. L'ensemble porteur comporte un premier ensemble 42 à surface porteuse supérieure et un second ensemble 44 à surface porteuse inférieure. Ces ensembles sont maintenus assemblés par des crampons 46 prévus sur l'ensemble 44 à surface porteuse inférieure. Comme on le voit le mieux sur la Fig.6, chacun des ensembles à surface porteuse 42 et 44 comporte un châssis 48 muni d'une garniture 50 montée dans le chassis et maintenue en place par une plaque d'appui 52 au moyen de vis 54. Comme indiqué précédemment, l'ensemble à surface porteuse inférieure est muni de crampons 46 qui sont montés sur le châssis 48 par des vis et des écrous appropriés 56. Conformément à la présente in- vention, la garniture 50 comporte une matière poreuse telle que la matière vendue sous la-dénomination com- merciale SCOTCH-BRITE par la Société 3M. Une matière appropriée est celle qui correcxed à la couche Scotch Brite pour applications générales, numéro 7447. La plaque d'appui 52 est de préférence une plaque à claire- voie permettant le passage à travers elle de la solution tampon qui peut ainsi pénétrer dans la garniture 50. La plaque d'appui doit avoir une rigi- dité suffisante pour assurer une compression uniforme de la garniture à l'intérieur du châssis 48. L'ensemble porteur 40 est suspendu au cou- vercle 12 au moyen de montants 58 qui reçoivent dans des taraudages des tiges filetées 60. Les tiges file- tées 60 sont collées sur une plaque de barrage ther- mique 62 qui est à son tour maintenue à distance du couvercle 12 au moyen d'entretoises 64. Une plaque en nids d'abeilles 66, présentant des perçages 68, est disposée entre la plaque de barrage thermique 62 et l'ensemble porteur 40. Les tiges filetées 60 passent à travers les perçages 68 et sont fixées aux montants 58 pour maintenir en place la plaque en nids d'abeilles 66. Une seconde électrode 70 est disposée sur la pla- que en nids d'abeilles 66 et se dirige vers le haut dans une virole 72 disposée sur la face supérieure du couvercle 12 o elle vient en contact avec un contact électrique qui est agence pour constituer une liaison électrique avec un connecteur 74 quand le couvercle est en position de fermeture. Conformément à la présente invention, un écran en polyamide 76 est disposé dans la cham- bre entre la première électrode 26 du fond 22 et l'ensemble porteur 40 suspendu au couvercle 12. Cet écran est destiné à dévier les bulles produites dans la solution tampon près de la première électrode 26 vers les côtés de la chambre, de manière à empêcher l'accumulation des bulles sur la surface inférieure de l'ensemble porteur 40 pendant la transmission de la matière déplacée par électrophorèse. Conformément à la présente invention, l'écran en polyamide 76 (ou un écran constitué en une autre matière appropriée) doit avoir des dimensions et une forme qui soient, au moins approximativement, les mêmes, que celles de l'ensemble porteur 40, de manière à garantir la déviation des bulles vers les côtés de la chambre pour empêcher leur aocumulation sur l'ensemble porteur 40. L'écran 76 est monté sur deux tiges 78 en forme de V, de manière que l'écran 76 fasse un léger angle par rapport au fond 22 du récipient pour contribuer à gui- der les bulles vers l'extérieur et les côtés du réci- pient. On a constaté qu'un angle correspondant à 6,4 mm en direction verticale pour 10 cm d'extension hori- zontale est idéal pour la conduite et l'évacuation des bulles. L'écran 76 est maintenu en place à l'intérieur de la chambre en montant les tiges 78 dans des per- çages borgnes 80 pratiqués dans les parois 16 et 20 du récipient. Le dispositif de captage sur un élément ho- rizontal par voie électrique suivant la présente in- vention fonctionne comme indiqué ci-après: Le couvercle 12 de l'unité horizontale con- tenant l'ensemble porteur 40 et l'électrode 70 montée sur la plaque en nids d'abeilles 66 est retiré du dispositif et posé en position renversée sur l'aire de travail. L'ensemble à surface porteuse 44 est reti- ré en faisant fléchir les crampons 46. Le gel à uti- liser est disposé sur la garniture 50 de l'ensemble à surface porteuse 42. L'ensemble à surface porteuse 44 est ensuite bloqué en place pour prendre en sand- wich le gel entre les ensembles à surface porteuse 42 et 44. Le couvercle est ensuite monté à articulation sur la barre 32 et il est fermé de manière à immerger l'ensemble porteur 40 dans la solution tampon dispo- sée dans la chambre 44. Le contact électrique est réalisé entre les électrodes 26 et 70 par les connec- teurs électriques 28 et 74. Un courant continu sous une tension de 50 à 150 volts environ est ensuite appliqué pendant une période de 3 à 5 heures. A la fin de l'opération, l'ensemble sandwich est ouvert et la membrane de transmission en polyamide est reti- rée. REVENDICATIKS 1 . Dispositif de captage sur un élément horizontal, par voie électrique, de particules de ma- tière déplacées par électrophorèse, comportant un récipient étanche aux liquides ayant un fond (22), un couvercle (12) et des parois latérales (14,16,18, ) s'étendant entre le fond (22) et le couvercle (12) pour définir une chambre (24), un ensemble porteur (40) disposé dans cette chambre pour porter la matière devant être captée par voie électrique, une première électrode (26) disposée au-dessous de l'ensemble por- teur et une seconde électrode (70) disposée au-dessus de l'ensemble porteur, caractérisé en ce que des mo- yens {76) sont disposés dans la chambre (24) pour dé- vier les bulles produites par la première électrode (26), de manière à empêcher l'accumulation de ces bul- les sur l'ensemble porteur (40) pendant le captage par voie électrique de la matière transportée par électrophorèse. 2 . Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens {76) de déviation des bulles ont une forme et une surface sensiblement identiques à la forme et à la surface de l'ensemble porteur. 3 . Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ensemble porteur (40) est monté sur le couvercle (12). 4 . Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une plaque de barrage (62) est disposée entre la seconde électrode (70) et le cou- vercle (12) pour dissiper la chaleur produite par la seconde électrode. 50. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la première électrode (26) est disposée dans le fond. 6 . Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens de déviation des bul- les comportent une membrane (76) disposée dans la cham- bre (24) en faisant un angle avec le fond (22). 7 . Dispositif selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que les moyens (76) de déviation des bulles sont conducteurs de l'électricité. 8 . Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la seconde électrode (70) est montée sur un support poreux. 9 .- Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ensemble porteur (40) pré- sente un premier ensemble à surface porteuse supé- rieure (42) et un second ensemble à surface porteuse inférieure (44) ainsi que des moyens pour bloquer la première surface porteuse contre la seconde surface porteuse. . Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le premier ensemble à surface porteuse supérieure- (42) et le second ensemble à surface porteuse inférieure (44) comportant chacun un châssis (48), une garniture (50) disposée dans le châssis et une plaque d'appui (52) pour soutenir la garniture dans le châssis. 11 . Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la garniture (50) est poreuse.