Brevet FR2578424A1 — publié le 19860912

La présente invention concerne des souches mutantes, vaccinantes de bactéries et plus particulièrement de Salmonella, détectables aisément dans des milieux contaminés, ainsi que leurs procédés d'obtention et les préparations vaccinales les contenant. Les Salmonelloses sont des maladies infectieuses, bactériennes, contagieuses, de répartition mondiale, généralement transmissibles entre les animaux et l'homme. Salmonella abortus ovis est pathogène pour les ovins mais pas pour l'homme. Chez les bovins, les deux sérotypes les plus fréquemment isolés actuellement sont Salmonella typhimurium et Salmonella dublin; ils sont pathogènes pour l'homme. On peut citer encore Salmonella cholerae suis, sérotype présentant une adaptation partielle aux porcins. La prévention de ces maladies repose certes sur des mesures d'hygiène; mais celles-ci sont difficiles, coûteuses à mettre en oeuvre et de portée limitée. L'administration préventive, massive et systématique, d'antibiotiques est à déconseiller: cette pratique fait augmenter l'antibiorésistance des souches sauvages. La vaccination est un moyen de prévention complémentaire des mesures d'hygiène; elle offre une alternative à l'antibioprévention; elle a pour but de réduire la mortalité et la morbidité dues aux septicémies, entérites, pneumonies ou avortements salmonelliques, de limiter le nombre des animaux porteurs de salmonelles et donc de diminuer la fréquence et l'intensité de la contamination salmonellique de l'environnement, de la viande et du lait. Différents types de vaccins ont été décrits. On connaît des vaccins inactivés, à base de bactéries tuées et d'adjuvants de l'immunité; mais ceux-ci sont peu immunogéniques, d'où la nécessité d'injections répétées entraînant une certaine proportion de réactions allergiques, parfois mortelles. Les vaccins vivants sont plus efficaces et induisent généralement une protection plus durable. Toutefois, les souches totalement avirulentes ne sont pas nettement plus immunogènes que les bactéries tuées; comme apparemment, toute souche vaccinale plus efficace que les vaccins tués a un certain pouvoir pathogène résiduel pour les espèces sensibles, il est nécessaire de pouvoir suivre les bactéries vaccinales chez les individus et les troupeaux et aussi de pouvoir déceler rapidement, économiquement et avec sensibilité la persistance éventuelle de Salmonella vaccinales dans les denrées alimentaires d'origine animales. Les vaccins vivants décrits à ce jour contiennent des souches qui ne peuvent être décelées et dénombrées simplement au sein d'une population bactérienne nombreuse et complexe, avec un seuil de détection comparable à celui des souches sauvages. Ce dernier point est particulièrement important dans les pays où la législation en vigueur impose, dans l'intérêt des consommateurs, des mesures draconiennes d'hygiène alimentaire vis-à-vis de certaines espèces bactériennes, dont les Salmonella. En effet, les souches vaccinales dont la multiplication est fonction de l'addition de facteurs de croissance donnés dans les milieux de culture usuels présentent, par rapport aux souches sauvages, des exigences culturales supérieures et/ou une réduction de leur vitesse de croissance, ce qui les défavorise nettement lors des opérations d'enrichissement et d'isolement sur milieux sélectifs. En outre, les souches vaccinales qui sont rendues hypovirulentes simultanément à l'acquisition d'un caractère marqueur, qui sera soit la résistance soit la dépendance à une substance donnée, risquent, si elles redeviennent virulentes par mutations, de perdre en même temps leur caractère marqueur, ce qui supprime la possibilité d'identifier l'origine vaccinale des souches virulentes. Parmi ces vaccins, on peut citer le vaccin décrit par Meyer. et col. dans: Archiv für Experimentelle Veterinàrmedizin, 1981, volume 34, p. 99 à 104. Il est à base d'une souche mutante de Salmonella dublin dont la multiplication nécessite la présence de streptomycine. Ce vaccin a été utilisé chez les veaux; de fortes doses doivent etre administrées par voie orale quotidiennement pendant 10 jours pour obtenir une protection satisfaisante. Un autre vaccin a été décrit par Hoiseth et Stocker dans Nature, 1981, volume 291, p. 238. La souche vaccinale ne se multiplie qu'en présence de certaines molécules aromatiques et d'histidine. La dépendance visà-vis des molécules aromatiques est liée à l'obtention de l'hypoviru].ence. Ces deux marqueurs ne permettent pas l'isolement direct et sensible en même temps que le dénombrement de la souche vaccinale à partir de prélèvements naturellement contaminés. Une autre souche vaccinale a été partiellement décrite par Meyer et col. dans Monatshefte für Veterinärmedizin, 1980, volume 35, p. 405 à 410. Les deux caractères de dépendance vis-à-vis e métabolites sont aussi des marqueurs obtenus au cours de l'obtention de l'hypovirulence, et qui ne permettent pas l'isolement direct de la souche vaccinale. Enfin, des souches mutantes de Salmonella abortus ovis ont été décrites dans FR-A-2.464.300. Ces souches sont des souches réverses de souches dépendant de la présence de streptomycine, porteuses de deux mutations. La première, la souche dépendante, est obtenue par culture d'une souche sauvage sur un milieu contenant de la streptomycine; la seconde, la souche réverse, est obtenue par ensemencement et culture de la souche dépendante sur un milieu sans streptomycine. La souche vaccinale ainsi obtenue ne porte pas de marqueur permettant son isolement aisé à partir d'une population bactérienne complexe. La présente invention n'a pas les inconvénients mentionnés précédemment. D'une part, bien qu'étant de virulence atténuée, les souches bactériennes mutantes vaccinantes, selon l'invention, ont un pouvoir immunogène tel qu'elles permettent un protocole vaccinal simple. De plus, grâce à un marquage particulier de ces souches vaccinantes, qui leur confère des caractères spécifiques permettant leur sélection, appelés caractères marqueurs/sélecteurs, leur seuil de détection par ensemencement direct sur milieu de culture sélectif est faible, quelque soit l'échantillon étudié, même riche en contaminants divers et/ou en souches sauvages du même type que celui dont sont issues les souches vaccinantes.En effet, même si la multiplication des bactéries vaccinales est moins rapide que celle des bactéries sauvages, leur isolement sélectif permettant en même temps leur identification et leur numération peut être obtenu sans enrichissement préalable, par ensemencement direct et culture sur un milieu suffisamment sélectif, choisi en tenant compte du marquage des souches vaccinantes caractéristiques de l'invention, et éventuellement des propriétés de la souche dont sont issues ces souches vaccinantes. Enfin, comme cet isolement sélectif des souches vaccinantes ne repose pas sur des marqueurs liés au mode d'obtention de l'hypovirulence, on pourra surveiller efficacement l'absence ou l'éventuelle survenue d'une réversion vers la virulence. Dans ce qui suit, on se réfère uniquement aux Salmonella, mais le procédé d'obtention de souches bactériennes vaccinantes, c'est-à-dire utiles pour vacciner les animaux contre ces bactéries et donc immunogènes et hypovirulentes, porteuses en outre d'au moins un marqueur chromosomique différent de ceux obtenus lors de l'introduction de l'hypovirulence, et permettant l'identification des bactéries après isolement et aussi leur détection sensible et quantitative par culture directe sur milieu sélectif approprié, peut s'appliquer avantageusement à l'obtention d'autres souches vaccinantes bactériennes et les souches mutantes alors obtenues, ainsi que les vaccins qui les contiennent, sont un autre objet de l'invention.Parmi ces bactéries, on peut citer: Escherichia, Pasteurella, Listeria, Corynebacterium et Mvcobacterium. Les bactéries de l'invention sont immunogènes et hypovirulentes, ce qui signifie qu'elles peuvent être utilisés comme souches vaccinantes; leur administration entraîne une bonne protection des animaux contre les infections par des souches virulentes, sans effets secondaires importants. Elles comportent au moins un caractère marqueur, qui permettra leur sélection. Ces caractères marqueurs/sélecteurs peuvent être une résistance à des agents inhibiteurs de la croissance des bactéries, comme certains antibactériens, antibiotiques ou substances toxiques, vis-à-vis desquels peuvent être sélectionnées des résistances chromosomiques sans effets finalement incompatibles avec l'immunogénicité et l'hypovirulence de la souche. On préfère une résistance chromosomique, car une résistance plasmidique est relativement instable et pourrait être transmise à d'autres bactéries. On évite les résistances chromosomiques vis-à-vis d'antibactériens éventuellement utilisables dans le traitement ou la prévention des bactéries du type parental, ou vis-à-vis de substances appartenant aux familles des désinfectants et/ou antiseptiques. On choisira, en particulier, les résistances que l'on rencontre rarement chez les bactéries sauvages.Par ailleurs, l'homme du métier choisira parmi les antibactériens disponibles ceux qui,pour la bactérie en cause,donneront une diminution de la virulence sans perte importante des propriétés immunogéniques. Parmi les antibiotiques susceptibles de convenir on peut citer les béta-lactamines, par, exemple pénicilline , ampicilline, céfalotine; les céphalosporines; les aminosides, par exemple streptomycine, gentamicine; les tétracyclines; les macrolides comme l'érythromycine; les rifamycines, comme la rifampicine; les quinolones, comme l'acide nalidixique ou la fluméquine; les isoniazides; l'acide fusidique; le chloramphénicol; la fosfomycine; la tétracalne; le crital violet ou l'azoture de sodium.Pour les Salmonella, on préfère tout particulièrement l'acide nalidixique ou l'azoture de sodium. Bien qu'un facteur de sélection soit dans la plupart des cas, suffisant pour distinguer les bactéries selon l'invention dans un prélèvement peu contaminé, on préfère disposer d'au moins deux marqueurs/sélecteurs afin d'assurer en une seule étape la détection, l'identification et la numération des bactéries vaccinales de l'invention, à partir de prélèvements contenant de nombreuses bactéries de diverses espèces. On choisit ces marqueurs/sélecteurs pour que le seuil de détection de la souche vaccinale par ensemencement direct sur milieu solide contenant les concentrations appropriées des facteurs de sélection soit très faible. Un enrichissement dans un milieu liquide contenant les concentrations appropriées des sélecteurs, effectué avant ensemencement sur milieu sélectif solide, n'est pas indispensable mais reste une modalité réalisable parallèlement avec l'ensemencement direct.Parmi les couples de marqueurssélecteurs, on préfère celui constitué de l'acide nalidixique et de l'azoture de sôdiumpour les Salmonella. On préfère ajouter les caractères marqueurs héréditaires à des bactéries rendues préalablement hypovirulentes et qui sont toujours de bons agents immunogènes. Ces dernières peuvent être obtenues par un procédé connu dit de réversion de la dépendance à un antibactérien. Ce procédé a déjà été appliqué à la préparation de souches vaccinales et notamment à des Salmonella abortus ovis, comme il est décrit dans FR-A2.464.300 en utilisant la streptomycine.Mais, les conditions opératoires de ce procédé de reversion ne sont pas générales; elles doivent être adaptées par le spécialiste à l'espèce bactérienne considérée, et en outre, on obtient une popul.ation de souches réverses qui sont hétérogènes en ce qui concerne à la fois leur hypovirulence, leur immunogénicité et leur sensibilité à la streptomycine et aux autres aminosides; aussi la sélection de la souche mutante convenable est importante. Ainsi, dans le cas d'une recherche de souches réverses convenables à partir d'un clone dépendant de Salmonella dublin, près de la moitié des souches réverses isolées avaient une virulence encore trop élevée pour être des souches vaccinantes acceptables. Comme antibactériens dans ce procédé de réversion, on peut utiliser les antibiotiques et autres substances toxiques des bactéries, cités précédemment comme utilisable à l'introduction d'un caractère marqueur/sélecteur, selon l'invention. Il est bien entendu que l'antibactérien qui sera choisi pour l'obtention de souches mutantes hypovirulentes et immunogènes par le procédé de "réversion" doit être nettement différent de celui qui sera utilisé pour introduire tout caractère marqueur/sélecteur dans la souche bactérienne selon l'invention. Dans le cas des Salmonella, les aminosides et particulièrement la streptomycine permettent d'obtenir lors des mutations du procédé de "réversion" un spectre de virulence convenant particulièrement bien. Ilest possible d'utiliser les clones bactériens ayant subi une faible réduction de leur virulence, et de chercher au cours d'étapes ultérieures à réduire encore leur virulence avec adjonction ou non de marqueurs permettant, après isolement, de distinguer les souches obtenues des souches sauvages. L'autre possibilité, préférée, est de s' assurer d'emblée de l'acceptabilité sur le plan vaccinal de certaines souches et ensuite de les marquer en modifiant le moins possible leur virulence et leur immunogénicité, en choisissant comme marqueurs/s-électeurs, ceux facilitant à la fois l'isolement, l'identification et la numération des souches vaccinales. Un autre objet de l'invention est un procédé d'obtention de souches de bactéries hypovirulentes et immunogènes, vaccinantes et porteuses d'au moins un marqueur héréditaire pouvant servir de sélecteur. Ce procédé consiste notamment à obtenir des souches de bactéries résistantes à un antibactérien par culture de souches hypovirulentes et immunogènes, et non résistantes sur un milieu comportant cet antibactérien à une concentration telle que puissent être isolées des colonies de bactéries mutantes ,résistantes à cet antibactérien. Après clonage, sont retenues les souches ayant le niveau de virulence et d'immunogénicité le moins modifié. Selon un aspect de l'invention, les souches hypovirulentes et immunogènes sont des souches mutantes, préalablement obtenues par un procédé de "réversion", mais toute autre souche bactériennes suffisamment immunogénique et peu virulente pourrait être utilisée, quelque soit son procédé d'obtention. Dans le cas où on choisit d'introduire aussi un second marqueur sélecteur pour faciliter l'isolement quantitatif direct des bactéries vaccinales à partir de divers milieux contaminés, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire, à savoir la culture des clones précédemment choisis sur un milieu comportant un autre antibactérien, de structure et de mécanisme d'action suffisamment différents de ceudqutiigseseSdans les étapes précédentes, et en quantité suffisante pour que puissent être isolées des bactéries mutantes résistantes à cet autre antibactérien. Après clonage, sont retenues les souches ayant conservé le premier caractère marqueur et de même niveau de virulence et d'immunogénicité. On a constaté dans certains cas que l'ordre d'utilisation des antibactériens utilisés pour modifier la virulence ou marquer les souches est à prendre en considération en même temps que la nature de ces antibactériens afin d'aboutir à des souches convenables comme agents vaccinaux et il est préférable d'effectuer des expériences préliminaires pour déterminer quel est l'ordre le meilleur pour un couple donné. Comme souche parentale, on utilise de préférence des souches sensibles aux antibiotiques habituell.ement utilisés contre les bactéries de la même espèce, en particulier celles ne comportant pas d'antibiorésistance à support plasmidique, pour éviter une éventuelle dissémination de ce caractère par l'administration du vaccin. Parmi les souches sauvages, on préfère les souches fortement immunogéniques et virulentes, et spécialement celles portant en outre une particularité présente sur une minorité de souches sauvages. Parmi les Salmonella, on peut utiliser notamment les Salmonella tvphimurium, Salmonella dublin, particulièrement utiles pour préparer un vaccin bovin, ou les Salmonella abortus ovis pour préparer un vaccin pour les ovins; on préfère les Salmonella dublin pour les bovins; les vaccins vivant s mixte s contenant des souches provenant de plusieurs sérotypes sontjun autre objet de l'invention. Les milieux de culture utilisés dans les différentes étapes du procédé de l'invention sont ceux connus pour convenir au développement des colonies bactériennes de l'espèce considérée, auxquels on ajoute selon les étapes les agents antibiotiques ou antibactériens appropriés. Dans le cas des Salmonella, on utilise notamment un milieu gélose-trypticase-soja, commercialisé par BioMérieux, (Lyon, France). Pour l'obtention de l'hypovirulence, on préfère utiliser un antibiotique du groupe des aminosides, particulièrement la streptomycine. La streptomycine est introduite dans le milieu de culture en quantité supérieure à la concentration minimale inhibitrice des souches sauvages porteuses de plasmides de résistance et à une concentration comprise entre 5 et 2000 pg/ml, de préférence à raison de 500 ,ug/ml de streptomycine. Pour l'obtention de marqueurs utiles à titre de sélecteurs, les antibactériens choisis sont introduits dans les milieux de culture à une concentration au moins égale à la concentration minimale inhibitrice pour les souches sauvages de l'espèce considérée. Pour les Salmonella, on préfère l'acide nalidixique auquel peu de Salmonella sauvages sont résistantes, et l'azoture de sodium auquel aucune Salmonella sauvage n'est résistante; le premier est introduit dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 5 et 1000 pg/ml, le second entre 50 et 1500 pg/ml. A chacune des étapes du procédé, on sélectionnera et classera les bactéries qui ont acquis les caractéristiques recherchées, qui se multiplient rapidement sur le milieu de culture et conservent les caractères acquis. L'étude de la virulence résiduelle, tant des Salmonella dites réverses que des Salmonella réverses et marquées, peut être effectuée à l'aide de souris, préalablement inoculées avec les souches de Salmonella à étudier; on utilise de préférence l'inoculation sous cutanée plantaire d'environ 106 bactéries viables par animal.. On compare la virulence des souches mutantes et de la souche parentale, en étudiant le poids de la rate des souris et le nombre de Salmonella viables par rate, 6 jours après l'injection d'épreuve. L'étude de 1 'immunogénicité peut être aussi effectuée chez la souris. On vaccine les animaux par une injection à chaque animal de 106 bactéries de la souche à étudier en solution dans 0,2 ml de sérum physiologique, par voie sous-cutanée dorsale. Sur un lot de souris vaccinées, on étudie au bout d'un mois la persistance des bactéries vaccinales dans la rate et le foie. Un autre lot reçoit une injection d'épreuve d'une souche virulente de Salmonella par voie sous-cutanée plantaire et 6 jours après, on détermine le nombre de Salmonella présentes dans la rate de chaque animal. Un autre objet de l'invention est constitué par les vaccins comportant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, des bactéries hypovirulentes, immunogènes et porteuses d'au moins un caractère marqueur/sél.ecteur selon l'invention. Ces vaccins sont administrables à titre prophylactique aux animaux susceptibles de souffrir d'une infection par les bactéries virulentes de l'espèce correspondante. Ces vaccins peuvent être administrés aux animaux par voie orale, intra-musculaire, sous-cutanée, conjonctivale ou nasale.On préfère la voie conjonctivale, car elle assure le meilleur compromis entre la facilité et la sécurité d'emploi, la contamination minimale du matériel d'élevage et la stimulation du système immunitaire par une voie proche de la voie de contamination la plus probable. Les doses unitaires de vaccin sont en généra). conservées sous forme lyophilisée, diluables au moment de l'emploi, dans lesquelles se trouvent les bactéries vaccinantes associées ou non aux agents de conservation habituels. L'innocuité des vaccins a été étudiée chez les races animales susceptibles d'être vaccinées. On a administré aux animaux une dose correspondant au moins à la dose considérée comme vaccinale et étudié la réaction sérologique aux antigènes bactériens, la persistance et l'excrétion des bactéries vaccinales et noté toute élévation de température ou signe clinique éventuel qui pouvait être la traduction d'une certaine activité pathogène des bactéries injectées. Dans le cas des bactéries de type Salmonella dublin, objets de l'invention, dont un échantillon de référence a été déposé à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Paris, France, le 31 janvier 1985 sous le nOI-419, la dose vaccinale pour administration conjonctivale à des bovins contiendra de 107 à 1010 bactéries; pour une administration par voie sous-cutanée ou intramusculaire, les doses seront de 106 à 109 et par voie orale ou nasale de 107 à 101 bactéries viables par animal. Un tel vaccin augmente la résistance des animaux aux infections dues à plusieurs sérotypes de Salmonella et notamment celles à Salmonella dublin et Salmonella typhymurium, ce qui est un autre avantage de l'invention. Dans ce qui suit, on décrit un exemple de réalisation de l'invention Exemple: Obtention de souches vaccinales de Salmonella dublin Les bactéries parentales sont des bactéries de type Salmonella dublin, sauvages, porteuses de l'antigène Vi, tel que défini dans un essai d'agglutination sur lame avec un anti-sérum spécifique, commercialisé par l'institut Pasteur. La souche parentale est la souche de Salmonella dublin, de référence 136-69 (Institut Pasteur). a) les bactéries ont été mises en culture sur 20 boites de milieu trypticase-soja, commercialisé par Bio-Mérieux (France) sous la référence nO 5146, complémenté par 500 ,ug/ml de streptomycine. Les bactéries ont été ensemencées à raison de 1,5 x 109 par boite de Petri de 90 mm de diamètre. Après 7 jours d'incubation à T = 370C, on a prélevé les 60 colonies apparues; après clonage un seul des 60 clones s'est révélé être totalement streptomycino-dépendant. Ce clone a été retenu. b) la souche a ensuite été mise en culture sur un milieu sans streptomycine. On a retenu parmi les clones redevenus capables de se multiplier en l'absence de streptomycine, 26 clones sensibles à la streptomycine, donnant naissance à des colonies morphologiquement analogues à celles de la souche parentale et ayant gardé l'antigène Vi, et ayant au moins 1 mm de diamètre au bout de 36 heures. Leur virulence a été contrôlée sur souris. La moitié d'entre elles ayant une virulence trop proche de la souche sauvage a été rejetée. Les 5 souches les plus virulentes parmi le groupe des souches atténuées, ont été retenues, et la persistance d'un pouvoir immunogénique et de l'antigène Vi a été vérifié. c) des bactéries issues de chaque clone ont ensuite été ensemencées à raison de 2,5 x 109 bactéries par boîte de Petri de 90 mm de diamètre contenant du milieu trypticase-soja, complémenté avec 100 ,ug/ml d'acide nalidixique. Après incubation pendant 3 jours à T = 370C, on a cloné des bactéries mutantes apparues et conservé les clones ayant toujours l'antigène Vi et une hypovirulence et une immunogénicité comparables à celles des clones réverses parentaux; d) les 5 clones ainsi retenus ont été ensemencés, à raison de 2,5 x 109 bactéries par ml, sur un milieu trypticase-soja, complémenté par 100 Xug/ml d'azoture de sodium. Après incubation pendant 3 jours à T = 370C, on a étudié les propriétés des colonies bactériennes mutantes apparues pour sélectionner celles pouvant entrer dans une composition vaccinale. L'étude a concerné la virulence, l'immunogénicité et la stabilité dans le temps des caractères marqueurs acquis. Parmi les 26 clones réverses étudiés, la moitié présentait une virulence très proche de celle de la souche parentale. En effet, alors qu'après injection souscutanée plantaire de 106 bactéries de la souche parentale, les rates des souris OF1 contenaient un nombre de bactéries v-iables de 5,53 (en log décimal), après injection dans les mêmes conditions de bactéries de 12 autres souches, les rates contenaient de 4,9 à 4,0 (en log) bactéries, alors que l'autre groupe de souches n'infectait la rate qu'à hauteur de 2,7 à 1,8 (en log) bactéries viables. On a étudié l'activité immunogénique de ces dernières, par la méthode précédemment décrite. La souche vaccinale étudiée V, injectée à la dose de 106 bactéries viables à des souris OF1, non vaccinées, selon le test de virulence précédemment décrit, infecte la rate à hauteur moyenne de 2,96 (en log), contre 5,59 (en log) (une souris morte chez les 6 souris ayant reçu la souche sauvage parentale dans les mêmes conditions. Les souris vaccinées avec 106 bactéries viables de la souche V et éprouvées avec la souche parentale, sont infectées à hauteur moyenne de 2,28 (en log) de la souche d'épreuve par rate, contre 4,86 (en log) dans la rate des souris contrôlées, éprouvées, mais non vaccinées. Un échantillon de la souche V, lyophilisée, a été déposé à la CNCM sous le nO I-419 après vérification de la conservation de ses caractéristiques d'hypovirulence et d'immunogénicité après lyophilisation. On a aussi étudié d'autres caractéristiques importantes de la souche V et notamment: 1) sa stabilité: pas dè modification significative de sa virulence et de son immunogénicité après 10 passages in vitro ou sur souris; la résistance aux deux antibactériens est conservée après ces passages. 2) son développement sur un milieu sélectif, comme le milieu Salmonella-Shiqella, commercialisé par l'institut Pasteur, auquel ont été ajoutés 100,ug/ml d'acide nalidixique et 100 jig/ml d'azoture de sodium. Après ensemencement d'aliquotes d'une même suspension bactérienne, le nombre de colonies exprimé en log décimal est sensiblement le même après culture sur milieu normal (log q = 2,19 et log q = 2,40) "ou sur milieu complémenté (log q = 2,29 et 2,53 respectivement) alors que la souche sauvage parentale ne donne pas de colonies sur ce milieu complémenté; 3) la durée de la persistance de bactéries vaccinales dans les rates de souris auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée plantaire 106 bactéries de souche V. Dans la rate des souris qui ont été immunisées, on ne décèle la présence de bactéries vaccinales viables que chez une des sept souris tuées huit semaines après vaccination.Chez les souris vaccinées puis éprouvées huit semaines après vaccination, la résistance à l'infection d'épreuve était comparable à celle de souris éprouvées plus précocement après vaccination, et qui hébergeaient alors plus fréquemment des bactéries vaccinales. 4) la spécificité de l'immunité conférée chez la souris. Il n'y a aucune protection contre une infection par des Listeria, mais une protection contre les infections à Salmonella dublin et à Salmonella typhymurium, toutefois légèrement inférieure contre les bactéries du second type, que les bactéries vaccinales de souche V soient ou non lyophylisées. 5) l'innocuité de la souche vaccinale V visà-vis des vaches adultes et des veaux, après administration par voie conjonctivale à la dose de 1010 bactéries par animal, en 2 gouttes de 33 l de solution salée isotonique. Une élévation fréquente et durable de la température rectale des animaux n'a pas été observée après vaccination, ni aucune réaction oculaire, ni aucune crise importante de diahrrée, malgré la présence transitoire, mais à faible concentration, de bactéries vaccinales dans les fécès. L'augmentation des titres en anticorps antisalmonelle dans le sang a été surtout nette chez les adultes. REVENDICATIONS 1. Bactéries mutantes, vaccinantes, caractérisées en ce qu'elles sont porteuses d'au moins un caractère marqueur/sélecteur héréditaire apparu indépendamment de toute mutation ayant conduit à l'hypovirulence et à 1 'immunogénicité. 2. Bactéries selon la revendication 1, caractérisées en ce que hypovirulence et immunogénicité sont obtenues par réversion d'un phénotype dépendant d'un antibactérien. 3. Bactéries selon l'une des revendications 1 ou 2, qui présentent à titre de caractère marqueur/sélecteur une résistance accrue à un antibactér ien. 4. Bactéries selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que les antibactériens sont choisis parmi les antibiotiques, tels que béta-lactamines, aminosides, tétracyclines, céphalosporines, macrolides, rifamycines, quinolones, isoniazides, chloramphénicol, acide fusidique, fosfamycine ettétracalne, cristal violet ou azoture de sodium. 5. Salmonella mutantes, vaccinantes ayant les caractéristiques mentionnées dans l'une quelconque des revendications précédentes. 6. Salmonella, selon la revendication 5, reverses d'un phénotype dépendant d'un antibiotique et résistantes à l'acide nalidixique. 7. Salmonella selon la revendication 6, résistantes en outre à l'azoture de sodium. 8. Salmonella selon l'une quelconque des revendications précédentes, réverses d'un phénotype dépendant de la streptomycine. 9. Salmonella selon la revendication 8 de type dublin. 10. Salmonella dublin, selon la revendication 9, porteuse de l'antigène Vi. 11. Salmonella dublin selon la revendication 10, ayant les caractéristiques de la souche dont un échantillon a été déposé à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) sous le nO I-419. 12. Salmonella dublin selon l'une des revendications 9 à 11, sous forme lyophilisée. 13. Procédé d'obtention de bactéries hypovirulentes immunogènes, marquées avec un caractère non lié à l'obtention de l'hypovirulence, caractérisé en ce qu'il consiste: 1) à cultiver des bactéries immunogènes sur un milieu contenant un antibiotique en quantité telle que puissent être isolées des bactéries mutantes résistantes à cet antibiotique; 2) à sélectionner parmi les bactéries résistantes celles qui sont dépendantes de cet antibiotique; 3) à ensemencer ces bactéries résistantes et dépendantes sur un milieu dépourvu de cet antibiotique et à isoler les bactéries réverses et hypovirulentes qui se sont multipliées sur ce milieu; 4) à cultiver ces bactéries réverses, hypovirulentes sur un milieu contenant un autre antibactérien en quantité telle que puissent être isolées des bactéries mutantes résistantes à l'antibactérien et hypovirulentes. 14. Procédé d'obtention de bactéries vaccinantes, marquées, caractérisé en ce que les bactéries obtenues par le procédé selon la revendication 13 sont ensuite cultivées sur un milieu contenant un autre antibactérien en quantité telle que puissent être isolées des bactéries mutantes résistantes à ce dernier et hypovirulentes. 15. Procédé d'obtention selon la revendication 13 de Salmonella hypovirulentes, immunogéniques, marquées, caractérisé en ce que l'antibiotique est choisi parmi les aminosides et l'antibactérien parmi les quinolones. 16. Procédé selon la revendication 14, d'obtention de Salmonella, caractérisé en ce que le second antibactérien est l'azoture de sodium. 17. Procédé selon la revendication 16, d'obtention de Salmonella dublin, caractérisé en ce que la première culture est effectuée en présence de streptomycine à une concentration dans le milieu de culture comprise entre 5 et 2000 pg/ml, que la culture des bactéries reverses est effectuée en présence d'acide nalidixique à une concentration comprise entre 5 et 1000 lug/ml et que la dernière culture est effectuée en présence d'azoture de sodium à une concentration comprise entre 50 et 1500 fg/ml. 18. Procédé selon" la revendication 17, caractérisé en ce que la streptomycine est introduite à raison de 500 ug/ml, l'acide nalidixique à raison de 100 ug/ml et l'azoture de sodium à raison de 100 fig/ml. 19. Vaccin vivant atténué comportant des bactéries hypovirulentes, immunogéniques et porteuses d'au moins un caractère marqueur/sél.ecteur selon l'une des revendications 1 à 12, associées à un excipient pharmaceutiquement acceptable. 20. Vaccin selon la revendication 19 pour la protection contre les infections à Salmonella, caractérisé en ce que l'agent immunogénique est constitué par des Salmonella dublin mutantes selon les revendications 9 à 12. 21. Vaccin sel.onla revendication 20 pour la protection des bovins, caractérisé en ce que la dose unitaire par animal pour l'administration par voie conjonctivale, comporte de 106 à 1010 Salmonella dublin selon la revendication 11, sous forme lyophilisée.