Brevet FR2585364A1 — publié le 19870130

La présente invention concerne un dispositif automatique de détection et de comptage de bactéries coliformes en milieu aqueux en vue, notamment, d'un contrôle bactériologique des eaux. Le contrôle bactériologique des eaux est une nécessite pour la protection sanitaire des populations, particulièrement en ce qui concerne - les eaux destinées à la consommation humaine (eaux potables) et animale, - les eaux destinées à des usages alimentaires directs ou indirects (utilisées dans les industries alimentaires), - les eaux des milieux aquatiques utilisées pour la conchyliculture (elevage des coquillages) ou l'aquaculture, - les eaux de piscines, - les eaux du milieu aquatique naturel consacrées aux loisirs, baignades, - les rejets d'eaux uses plus ou moins épurees, notamment dans les zones sensibles à la pollution. Le contrôle est d'autant plus nécessaire que les eaux superficielles (rivières, lacs, etangs) sont de plus en plus utilisées pour la preparation d'eau potable et que ces eaux superficielles sont très vulnérables aux rejets contaminés bactériologiquement (rejets domestiques et urbains, rejets d'abattoirs, ...). Devant la difficulté d'isoler et de dénombrer les bacteries pathogènes, susceptibles de provoquer des maladies humaines ou animales, on recherche classiquement des bactéries dites "germes-tests de contamination fécale" dont la présence permet de suspecter celle de germes pathogènes qui sont de même origine (matières fecales) et les accompagnent généralement. Ces germes-tests ont été choisis egalement en fonction de leur facilité de détermination par les méthodes de la bactériologie classique. Les bactéries- coliformes répondent au critère de définition des germes-tests et sont utilisées classiquement en tant que tels. Par ailleurs, certaines bactéries de ce type, de l'espèce Escherichia coli sont potentiellement pathogènes et leur identification apporte une présomption supplémentaire de non-potabilité. D'autres bactéries sont également utilisables comme germes-tests de contamination fécale (streptocoques fécaux...) Le problème posé par l'application des méthodes classiques de la bactériologie à l'évaluation du degré de contamination bactérienne des eaux est la longueur des déterminations en laboratoire. Cette duree est en effet incompressible du fait que ces methodes comportent des cultures bacteriennes, sur milieux nutritifs appropriés, nécessitant des incubations de longue durée avant lecture du résultat. A titre indicatif, les méthodes classiques de dénombrement des bactéries coliformes ou Escherichia coli necessitent au moins 24 heures (méthode avec concentration sur membrane) dans le cas de l'analyse des eaux peu contaminées (type eaux potables ou eaux traitees) tandis que la méthode utilisée pour les eaux contaminées (type eaux de rivière) nécessite deux incubations successives de 48 heures pour déterminer les bactéries coliformes et Escherichia coli (méthode en milieu liquide, dite du "nombre le plus probable"). Ce temps de réponse élevé constitue un handicap certain lorsque le contrôle de la qualité de l'eau est effectué en vue d'une action préventive ou curative (interdiction de l'usage de l'eau contaminée, modification des conditions de fonctionnement d'une installation de traitement). En effet, une atteinte irréparable a la sante publique peut être cause entre le début de la pollution bacterienne de l'eau et la connaissance du résultat de l'analyse de contrôle. Un autre inconvénient de ces méthodes est d'être purement manuelles et de ne pas pouvoir se prêter à une automatisation complète (réalisation d'analyse en continu ou de façon sequentielle à fréquence rapide sans aucune intervention humaine). Le but recherche lors de la réalisation de l'invention est - de permettre une reduction très importante du temps de réponse des analyses de contrôle bacteriologique des eaux par identification et comptage des bactéries notamment coliformes et/ou Escherichia coli et, si possible, de réduire ce temps de plusieurs jours a une durée de quelques heures ; - de permettre une automatisation complete rendant possible un contrôle pratiquement continu. Au niveau du laboratoire, la seule manière actuellement connue de raccourcir le temps de reponse des méthodes de la bacteriologie classique consiste à réaliser une filtration de l'échantillon liquide sur une membrane dont la taille des pores est inferieure à celle des bacteries (en général, des pores de diamètre 0,4 microns), à concentrer ainsi la totalité des bactéries présentes sur la surface de la membrane et à realiser sur celle-ci, par apport de milieu nutritif adéquat, une culture qui, après incubation rapide, permettra d'identifier la presence et de denombrer les bacteries spécifiquement recherchées. Cette technique présente trois graves inconvenients - le diamètre des pores de la membrane nécessaire à la rétention des bactéries est si petit que ces pores peuvent se trouver rapidement colmatés par des particules solides de petite taille, de nature non bacterienne (particules colloîdales d'argile, limons, matières humiques, débris végétaux ou animaux, etc...), ce colmatage empêchant la filtration de se poursuivre et rendant donc la méthode inoperable ; - le nombre de bactéries séparées par filtration et retenues par unité de surface de la membrane peut être trop élevé, rendant impossible l'identification séparée des colonies bacteriennes se developpant lors de l'incubation et, par consequent, la numération de ces bacteries ;; - la prêconcentration des bactéries sur membrane étant irreversible, cette dernière ne peut retrouver son état initial et être réutilisées. On pourrait concevoir des systèmes à renouvellement automatisé de la membrane, par-exemple deroulement d'une bande de matériau filtrant, mais au prix d'une grande complexité sur le plan mecanique et avec un risque important de contamination de la membrane neuve par celle qui a déjà été utilise. La méthode décrite ci-avant, de par ses inconvénients, ne peut donc être automatisée commodement. Dans le but de résoudre le problème, des méthodes nouvelles reposant sur des principes tout à fait différents ont été mises au point. I1 s'agit essentiellement de méthodes instrumentales et notamment la méthode électrochimique de detection des bactéries coliformes et Escherichia coli mise au point par Wilkins et colla borateurs("Microbial detection method based on sensing molecular hydrogen". Applied Microbiology, vol. 27, n" 5, mai 1974, pages 949952. J.R. Wilkins, G.E. Stoner, E.H. Boykin - "Electrochemical method for early detection and monitoring of coliformes in water". J.A.W.W.A., mai 1976, pages 257-263, J.R. Wilkins and E. Boykin "Use of platinum electrodes for the electrochemical detection of bacteria". Applied and environmental microbiology, 1978, vol. 38, pages 683-687, Wilkins JR) qui nombre ces bactéries en mesurant le temps de latence au bout duquel une culture réalisée par mélange de l'échantillon étudié avec un milieu nutritif convenable produit de l'hydrogène moléculaire détectable à l'aide d'une electrode de platine dont le potentiel est comparé en permanence à celui d'une électrode de référence (par exemple au calomel ou au chlorure d'argent).On peut calculer, à partir de la connaissance du temps de latence, la population initiale de bacteries (numération bacterienne) contenue dans l'échantillon d'eau étudie en faisant l'hypothèse d'une croissance exponentielle de la population, croissance dont les caractéristiques (coefficient de la loi) sont vérifiées et mesurées par étalonnage avec une suspension bactérienne de numération connue. Le problème que s'est posé la Demanderesse est la mise au point d'un dispositif entièrement automatique permettant la mise en oeuvre de la methode electro-chimique de detection et de comptage de bactéries coliformes et Escherichia coli contenues dans un echantillon d'eau, decrite ci-avant. A cet effet, l'invention a pour objet un dispositif automatique de détection et de comptage de bactéries coliformes en milieu aqueux dans lequel on detecte la presence de ces bactéries dans un échantillon d'eau, auquel est ajouté un milieu nutritif adequat, par la presence d'hydrogene moleculaire généré par ces bactéries et detecte au moyen d'une électrode de platine dont le potentiel est compare en permanence à celui d'une electrode de référence, ce dispositif comprenant au moins une cuve d'incubation munie d'une résistance chauffante extérieure, fermée par un couvercle, à l'intérieur de laquelle sont disposés, portés par le couvercle, une électrode combinée de mesure de potentiel, trois tubulures d'injection, une thermistance de contrôle et de régulation de chauffage de la cuve et un détecteur de niveau. L'invention est exposée ci-après en détail à l'aide des dessins annexés representant un mode de réalisation, donné à titre d'exemple non limitatif, dessins sur lesquels - la Fig. 1 est une vue schématique du dispositif automatique objet de l'invention - la Fig. 2 est un schéma de principe du circuit électronique du dispositif automatique objet de -l'invention. Le dispositif objet de l'invention est alimenté en eau à contrôler par une tubulure (non représentée) reliée soit à une canalisation de transport de cette eau, soit à un milieu aquatique. I1 comporte à son entrée un régulateur de pression 1 delivrant l'eau à contrôler à une pression déterminée. Le dispositif comprend deux cuves d'incubation 2 (voir Fig. 1) identiques munies chacune d'un couvercle 3. A l'intérieur de chacune des cuves 2, supportés par les couvercles 3 qu'ils traversent par des passages étanches, sont disposés - une électrode combinée 4 Platine/Electrode de référence (électrode de référence au calomel ou au chlorure d'argent) munie d'un réser voir d'electrolyte 5 placé en charge à l'extérieur des cuves 2 ; - trois tubulures d'injection 6, 7 et 8 ; - une thermistance 9 de contrôle et de regulation de chauffage des cuves 2 ; - un détecteur de niveau 10. La moitie inférieure de chacune des cuves 2 est entouree par une résistance électrique 71 de chauffage et la partie la plus basse de chacune des cuves 2 est munie d'une tubulure 12 de vidange. Les tubulures d'injection 6, 7, 8 ainsi que la tubulure 12 de vidange sont munies d'électrovannes du type à pincement de tuyau, respectivement 13, 14, 15, 16 permettant l'écoulement ou l'arrêt de l'écoulement de liquide dans les tubulures correspondantes. La tubulure d'injection 6 sert à l'alimentation des cuves 2 en eau à contrôler et est reliée au régulateur de pression 1, lui-même relié à la source d'eau à contrôler ; la tubulure d'injection 7 est reliée à un réservoir 17 contenant un agent stérilisant tel qu'une solution concentrée d'eau de Javel (48 degres chlorométriques) ; la tubulure d'injection 8 est reliée à un reservoir 18 contenant une solution aqueuse d'un milieu de culture contenant de la peptone, du lactose, de l'extrait de viande et des sels minéraux. Les reser- voirs 17 et 18 sont placés en charge à l'extérieur des cuves 2. Enfin, les couvercles 3 des cuves 2 sont équipés d'une tubulure 19 d'évacuation de trop plein. Toutes les tubulures de liaison sont réalisées en matériau souple empêchant l'accrochage des bactéries et les électrovannes sont du type à pincement de tuyau pour éviter toute contamination bacterienne d'origine extérieure. Chacune des électrodes combinées 4 est reliée (voir Fig. 2) par l'intermédiaire d'un adaptateur d'impédance 20 à l'entrée d'un multiplexeur 21 tandis que chacune des thermistances de contrôle et de régulation de chauffage 9 et chacun des détecteurs de niveau 10 est relié directement à l'entrée de ce même multiplexeur 21. La sortie du multiplexeur 21 est reliée à l'entrée d'un convertisseur analogique/digital 22 dont la sortie est reliee à l'entrée d'une carte microprocesseur 23 sur laquelle sont branchées une horloge 24 et des roues codeuses 27. La carte microprocesseur 23 comnande l'ouverture et la fermeture des électrovannes 13, 14, 15, 16 ainsi que la mise en route et l'arrêt de la résistance de chauffage 11 des cuves d'incubation 2. Elle est de plus reliée à une imprimante 25, qui inscrit les résultats de la numeration bactérienne, et à une alarme 26 munie de voyants et d'optocompteurs, alarme programmee pour se déclencher lorsque le résultat de la numération est supérieur à une valeur fixée. En outre, la carte microprocesseur 23 commande les differentes sequences en mode de fonctionnement automatique. Le dispositif peut aussi être piloté manuellement en utilisant les roues codeuses 27. Le fonctionnement du dispositif automatique objet de l'invention est décrit ci-apres. Le dispositif est relié à la source d'eau dont on veut contrôler la qualité. On suppose qu'une séquence de mesure vient de se terminer. Les cuves 2 d'incubation sont propres mais non steriles et remplies d'eau contenant une faible quantité d'eau de Javel pour empêcher tout développement bacterien. Les électrodes combinées 4 sont immergées pour éviter leur détérioration. Lorsque debute un nouveau cycle de mesure, l'une des deux cuves 2 est vidée de son contenu puis rincée à l'eau. Elle est ensuite stérilisée. Pour ce faire, la cuve 2 est remplie totalement d'eau par la tubulure 6 et de l'eau de Javel à 48 degrés chlorométriques est injectée par la tubulure 7, les électrovannes, respectivement 13 et 14, étant ouvertes.La quantité d'eau de Javel injectée est réglable par le temps d'ouverture programmable de I'électrovanne 14. Le temps de contact pour assurer une stérilisation correcte de la cuve 2 est de l'ordre de 20 minutes. La cuve 2 est ensuite vidée, l'electrovanne 16 étant ouverte, puis rincée longuement à l'eau, durant 30 minutes environ, pour enlever toute trace d'agent stérilisant et éviter une interférence sur la mesure. Après rinçage, une certaine quantité de solution d'un milieu de culture est injectée dans la cuve 2 par le tube d'injection 8, la quantité à injecter etant ajustee par un temps d'ouverture programmable de l'électrovanne 15. Enfin, 100 millilitres de l'eau à contrôler sont injectés dans la cuve 2 par la tubulure d'injection 6, l'électrovanne 13 étant ouverte.La quantité d'eau injectee est déterminee par la sonde de niveau placée dans la cuve 2. La phase d'incubation commence alors par un chauffage progressif du contenu de la cuve 2, afin d'éviter un choc thermique néfaste à la croissance bactérienne, jusqu'à ce que la temperature atteigne 44 C. Lorsque cette température est atteinte, le dispositif procède à une mesure périodique (plusieurs fois par seconde) du potentiel fourni par l'électrode combinée 4. Les valeurs du potentiel, après amplification et calcul d'une moyenne flottante, sont comparées à des valeurs seuils programmée. Si, au cours du cycle de mesure, le potentiel détecté par la sonde combinée 4 est supérieur à une valeur seuil programmée, la carte microprocesseur 23 déclenche l'alarme 26, calcule le nombre de bactéries coliformes présentes dans l'échantillon par référence à un étalonnage antérieur et affiche le résultat avec la date et l'heure sur l'imprimante 25. Le seuil d'alarme est réglable au moyen des roues codeuses 27. De plus, un cycle similaire de mesure est alors automatiquement déclenche, pour confirmation, dans la seconde cuve 2 qui etait en attente. Le seuil de potentiel provoquant la séquence de calcul du nombre de bactéries coliformes présentes dans l'échantillon prélevé est reglable. Une valeur faible, quelques dizaines de millivolts, permet de gagner du temps sur le temps de reponse mais augmente le risque d'erreur car certains phénomènes, biologiques, dus à la présence d'autres bactéries, et éventuellement physico-chimiques, sont susceptibles de faire dériver le potentiel mesuré. Pour qu'une telle dérive ne soit pas assimilée à la conséquence de la production d'hydrogène, il est préférable de régler le seuil de potentiel à une valeur nettement plus élevée : de l'ordre de 200 millivolts par exemple. A la fin de chaque cycle de mesure et pour eviter de contaminer le réseau aval d'évacuation, on procède à une decontamination de l'échantillon par injection d'eau de Javel. Puis on vidange les cuves, on les rince et on les remplit d'eau légèrement additionnée d'agent sterilisant. Les cuves sont alors prêtes pour un nouveau cycle de mesure. Le dispositif automatique de mesure objet de l'invention présente les avantages suivants - il permet le prélèvement direct d'échantillons sur une canalisation d'eau ; - il permet la realisation de prises d'échantillons et d'analyses periodiques à une fréquence déterminée à la fois par la qualité de l'eau contrôlée (frequence élevée en cas d'eau fortement conta minee) et par le nombre de cuves d'incubation mises en jeu, le dispositif comportant au moins une cuve mais pouvant comporter plusieurs cuves analogues, par exemple au nombre de deux suivant le mode de réalisation préférentiel ;; - possibilité de suivre automatiquement la qualité microbiologique des eaux sans autre intervention humaine que la maintenance pério dique consistant à recharger les réservoirs d'électrolyte de la sonde combinée, d'agent stérilisant, de solution de milieu nutritif ; - possibilité de faire varier. la durée d'un cycle de mesure par programmation de la carte microprocesseur, la durée d'un cycle pouvant varier de 5 à 24 heures ; - mise en route automatique d'un cycle de mesure de confirmation dans une deuxième cuve lorsqu'une contamination bactérienne est detectée au cours d'une mesure dans la première cuve ; - autonomie de fonctionnement de deux mois, les réservoirs d'élec trolyte d'eau de Javel et de solution de milieu nutritif ayant un volume suffisant pour couvrir cette période sans être rechargés ;; - declenchement d'alarmes en cas de dépassement de seuils predéfinis et programmés de contamination, ces alarmes pouvant soit provoquer une intervention humaine, soit déclencher automatiquement des actions curatives immédiates comme, par exemple, l'augmentation de l'agent chlorant utilisé - une grande sécurité d'emploi, la carte microprocesseur declenchant une alarme en cas de défaut d'arrivée d'eau, température des cuves hors de la plage de réglage, défaut d'injection du milieu nutritif, défaut d'injection d'agent stérilisant ; - fonctionnement possible avec seulement une cuve d'incubation en service, des opérations d'entretien pouvant alors être effectuées sur les autres cuves ; ; - un f-aible coût de réalisation rendant le dispositif automatique accessible aux collectivités locales - une grande simplicité de mise en oeuvre grâce aux fonctions d'automatisme. Le dispositif selon l'invention trouve des applications diverses telles que - contrôle des systèmes de captage, traitement, stockage, distri bution des eaux potables ainsi que des chaines de production et conditionnement de liquides alimentaires ; - contrôle sanitaire des eaux à usage thérapeutique - contrôle des piscines et installations de loisir utilisant l'eau ; - contrôle de la qualite sanitaire des eaux de baignade (eaux douces et marines) - contrôle et protection des zones de pisciculture, conchyliculture, aquaculture et toutes zones sensibles à la contamination microbiologique - contrôle continu d'eaux industrielles. REVENDICATIONS 1.- Dispositif automatique de détection et de comptage de bacteries coliformes en milieu aqueux dans lequel on détecte la présence de ces bactéries dans un échantillon d'eau, auquel est ajouté un milieu nutritif adéquat, par la presence d'hydrogène moléculaire généré par ces bacteries et détecté au moyen d'une électrode de platine dont le potentiel est comparé en permanence à celui d'une electrode de réference, dispositif caracterise en ce qu'il comprend au moins une cuve d'incubation (2) munie d'une resistance chauffante (11) extérieure, fermee par un couvercle (3), à l'intérieur de laquelle sont disposés, portés par le couvercle (3), une électrode combinée (4) de mesure de potentiel, trois tubulures d'injection (6, 7, 8), une thermistance (9) de contrôle et de régulation du chauffage de la cuve (2) et un détecteur de niveau (10). 2.- Dispositif suivant la revendication 1 caractérise en ce que chaque cuve d'incubation (2) est munie à sa partie la plus basse d'une tubulure (12) de vidange. 3.- Dispositif suivant les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que le couvercle (3) de chaque cuve d'incubation (2) est muni d'une tubulure (19) d'évacuation de trop plein. 4.- Dispositif suivant l'une des revendications 1 à 3 caracterisé en ce que la tubulure d'injection (6) de l'eau à contrôler de chaque cuve est reliée à un régulateur de pression (1) lui-meme relié par une tubulure à la source d'eau à contrôler. 5.- Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'électrode combinée (4) de chaque cuve (2) est munie d'un reservoir (5) d'électrolyte et les tubulures d'injection (7) et (8) de chaque cuve (2) sont reliées respectivement à un réservoir (17) contenant un agent sterilisant et à un réservoir (18) contenant une solution d'un milieu de culture des bacteries, les réservoirs (5), (17), (18) etant placés en charge à l'extérieur de la cuve (2) d'incubation. 6.- Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérise en ce que les tubulures d'injection (6), (7) et (8) de chaque cuve (2) sont munies d'electrovannes, respectivement (13), (14) et (15) permettant l'injection dans la cuve (2) d'incubation de l'eau à contrôler, de l'agent sterilisant et de la solution d'un milieu de culture convenable. 7.- Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6 caracterise en ce que l'électrode combinée (4) de chaque cuve est reliée, par l'intermédiaire d'un adaptateur d'impédance (20), à un multiplexeur (21), tandis que la thermistance (9) et le détecteur de niveau (10) de chaque cuve sont reliés directement à ce même multiplexeur (21), la sortie dudit multiplexeur (21) etant reliée à l'entrée d'un convertisseur analogique/digital (22) dont la sortie est reliée à l'entrée d'une carte microprocesseur (23) sur laquelle sont branchees une horloge (24) et des roues codeuses (27). 8.- Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en que la sortie de la carte microprocesseur (23) est reliée à une imprimante (25), à une alarme (26), aux électro- vannes (13), (14), (15), (16) de chaque cuve dont elle commande l'ouverture et la fermeture et à la résistance de chauffage (11) dont elle commande la mise en route et l'arrêt. 9.- Dispositif suivant l'une des revendications 7 ou 8 caractérisé en ce que la carte microprocesseur (23) commande le déclenchement d'un cycle de mesure de chaque cuve. 10.- Dispositif suivant l'une des revendications 7 à 9 caractérise en ce que la duree d'un cycle de mesure sur chaque cuve est programmee et commande par la carte microprocesseur (-23).