Brevet FR2576791A1 — publié le 19860808

l-1 La présente invention concerne une con.pcsitUon pharm.- ceutique pour le traitement de l'anémie de tumeurs malignes qui comprend une quantité efficace du point de vue thérapeu- tique d'érythropoiétine humaine (désignée ci-après par "EPO humaine") dans un véhicule acceptable par voie parentả.,a Le terme "EPO humaine" tel qu'on l'utilise ci-aî:_s désigne un polypeptide possédant la séquence d'acides *,;.:z inhérente aux êtres humains, avec ou sans chalneîluc oiA. Des exemples de l'EPO humaine comprennent une EPO qJi.ci- vient d'urine humaine (dénommée ci-après "EPO uririairc humaine"), une EPO obtenue par expression dans une cellule hôte du gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine (ce type d'EPO humaine est dénommé ci'après "EPOr humaine"), une EPO obtenue à partir d'une culture de tissu de cellules rénales cancéreuses humaines, et une EP) obtenue par culture d'un hybridome résultant do la fusion cellulaire d'une lignée de cellules humaines ayant la cap- cité de produire de l'EPO humaine. Le terme "érythro- poiétine" (dénomméeci-après "EPO") désigne une substance physiologiquement active à l'état de trace qui agit sur les cellules- souches érythroblastiques présentes non seulement chez l'homme mais également chez d'autres animaux, de manière à accélérer la différentiation de ces cellules- souches en cellules érythrocytaires mûres, et la prollfëra- tion de ces dernières. Bien que de nombreuses études sur l'EPO urinaire humaine aient été rapportées, l'utilisation pharmaceutique de l'EPO humaine reste encore inconnue sous de nombreux aspects. On connaît depuis longtemps l'incidence élevée de l'anémie constituant l'une des complications chez des patients souffrant de cancer (voir par exemple A. Miller et crll., J. Clin. Invest., 35, 1248 (1956)), et l'anémie grave associée -2- aux affections malignes a une importance clinique particullère dans le traitement de la maladie. On a avancé de nombreuses hypothèses pour expliquer le mécanisme responsable du dévelop- pement de l'anémie, et celles-ci comprennent le blocage du fer dans le système réticulo-endothélial dû à un métabolisme du fer anormal, la libération défectueuse du fer, des lésions de la rate, la production défectueuse d'EPO, l'hémolyse et des désordres dans les cellules-souches hémopolétiques. Dans le cas de l'anémie de tumeurs malignes, les causes possibles comprennent l'hémorragie résultant de croissance tumorale anormale, le blocage de la libération de fer réticulo- endothélial, l'infiltration de la moelle osseuse par des cellules tumorales, l'hémolyse due à des vaisseaux de petit calibre endommagés et à des maladies auto-immunes, la destruc- tion de la moelle osseuse à la suite de traitement avec des agents anti-tumoraux ou de radiothérapie, ainsi que l'inflam- mation chronique. Chez des patients souffrant de cancer, les taux d'EPO plasmatique ont été signalés comme étant égaux ou inférieurs aux taux normaux (voir par exemple S. Zucker et coll., J. Clin. Invest., 53, 1132 (1974); S.W. Douglas et coll., Blood, 45, 55 (1975); D. Firat et coll., Cancer Res., 31, 1355, (1971); H.P. Ward et coll., J. Clin. Invest., , 332, (1971) et R.L. Degowin et coll., J. Lab. Clin. Med., 94, 303, (1979)] . Toutefois, en l'absence de toute corrélation entre la diminution des taux d'EPO plasmatique et le degré d'anémie dans les affections malignes, et eu égard au fait que la plupart des patients atteints de cancer souffrent de dysfonctionnement de la moelle osseuse, certains chercheurs suggèrent que la cause principale de l'anémie d'affections malignes n'est pas la production défectueuse d'érythropo3étine mais plus probablement la capacité érythropolétique défectueuse dans la moelle osseuse due à une faculté de réponse à l'EPO insuffisante. En conséquence, eu égard au mécanisme proposé pour le développement de l'anémie dans les affections malignes, on a fort douté que l'administration d'EPO humaine à -3- des patients atteints d'anémie d'affection maligne soit effi- cace aux fins de traitement de la maladie. Comme on l'a déjà mentionné, il existe de nombreux articles qui décrivent les diverses fonctions de l'EPO urinaire humaine, mais per- sonne n'a démontré par expérimentation in vivo avec des sujets humains ou des animaux que 1'EPO urinaire humaine et d'autres types d'EPO humaine sont efficaces en tant qu'agents thérapeutiques pour le traitement de l'anémie dans les affections malignes. Les auteurs de la présente invention ont préparé une forme extrêmement pure d'EPO urinaire humaine et ils ont aussi obtenu de l'EPOr humaine par expression dans une cellule-hôte du gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine. En utilisant ces deux types d'EPO humaine, les auteurs de la présente invention ont étudié leurs effets thérapeutiques sur l'anémie chez des animaux porteurs de cancer. Ils ont eu la grande surprise de constater que ces types d'EPO humaine se sont révélés très efficaces contre l'anémie et par conséquent les auteurs de la présente inven- tion ont conclu qu'ils étaient utilisables en tant qu'agents thérapeutiques pour le traitement de l'anémie dans les affec- tions malignes-. La présente invention a été réalisée sur la base de cette découverte. En conséquence, l'objet principal de la présente inven- tion est de fournir une nouvelle composition pharmaceutique pour le traitement de l'anémie dans les affections malignes qui comprend une quantité efficace du point de vue théra- peutique d'EPO humaine dans un véhicule acceptable par voie parentérale. La figure 1 montre l'effet de l'administration d'EPO humaine sur la numération érythrocytaire périphérique (RBC= Red Blood Cell Count) chez des souris porteuses de carcinome pulmonaire de Lewis; la figure 2 montre l'effet de l'administration d'EPO humaine sur la teneur en hémoglobine périphérique (HGB) chez -4- des souris porteuses de carcinome pulmonaire de Lewis; la figure 3 montre l'effet de l'administration d'EPO humaine sur la numération érythrocytaire périphérique (RBC) chez des souris porteuses de fibro-sarcome C3MC2; la figure 4 montre l'effet de l'administration d'EPO humaine sur la teneur en hémoglobine périphérique (HGB) chez des souris porteuses de fibro-sarcome C3MC2. Sur les figures 1 à 4, O-O correspond au groupe de souris non porteuses de cancer, -a correspond au groupe de souris porteuses de cancer auxquelles seul le solvant a été administré, A-A correspond au groupe de souris porteuses de cancer auxquelles on a administré de l'EPO urinaire humaine et ^-D correspond au groupe de souris porteuses de cancer auxquelles on a administré de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO. Sur chaque figure, les astérisques représentent les seuils de signification des différences avec le groupe de souris porteuses de cancer auxquelles seul le solvant a été administré: *: P Les types d'EPO humaine qui sont incorporés dans la composition de la présente invention en tant-que composant actif peuvent être préparés par divers moyens. Par exemple, de l'EPO urinaire humaine peut être extraite d'urine humaine normale ou de l'urine ou du'plasma (sérum y compris) de patients souffrant d'anémie hypoplastique (T. Miyake et coll., J. B. C., 252, 5558 (1977) et J.P. Lewin et coll., J. Lab. Clin. Med., 66, 987 (1965)]. On peut préparer de l'EPOr humaine par des techniques de génie génétique comprenant l'ob- tention d'un ARN messager (ARNm) correspondant à la séquence d'acides aminés d'EPO humaine, la préparation d'un ADN recombinant en utilisant l'ARNm, et l'expression du gène d'ADN dans une cellule-hôte appropriée telle qu'une bactérie (E. coli par exemple), une levure, ou une lignée cellulaire animale ou végétale (voir par exemple L.H. Sylvia, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 2708 (1984)). Bien que diverses lignées cellulaires animales soient disponibles entant que -5- cellules-hôtes, on préfère les lignées cellulaires cultivées provenant d'êtres humains ou d'autres mammifères, et celles- ci comprennent les cellules COS, les cellules ovariennes d'hamster de Chine (CHO) et les cellules C-127 de souris. On peut également préparer l'EPO humaine par exemple à par- tir de cultures de tissu de cellules rénales cancéreuses humaines (demande de brevet japonais publiée non examinée N 55790/1979), à partir de cellules lymphoblastiques humaines ayant la capacité de produire de l'EPO humaine (demande de brevet japonais publiée non examinée N 40411/ 1982), et à partir d'une culture de l'hybridome obtenu par fusion cellulaire d'une lignée cellulaire humaine. Tous les types d'EPO humaine qui sont préparés par ces procédés sont utilisables dans la présente invention, dans la mesure ou ils permettent la prolifération de globules rouges mûrs manifestant suffisamment de transport d'oxygène pour être utiles dans le traitement de l'anémie dans les affections malignes. L'EPO humaine présente dans l'urine ou dans le surna- geant de culture obtenu par les procédés précités peut être encore concentrée et purifiée par des techniques courantes d'isolement et de purification telles que, par exemple, précipitation avec un solvant organique (par exemple, acide benzoique, éthanol, acétone ou acide tannique), relargage avec du sulfate d'ammonium, etc, dialyse par exemple par concentration sous vide, des techniques chromatographiques, (par exemple chromatographie par perméation sur gel, chroma- tographie d'échange ionique et chromatographie par affinité) et des techniques d'électrophorèse (par exemple électro- phorèse iso-électrique et électrophorèse sur gel). On peut utiliser ces techniques d'isolement et de purification soit individuellement, soit en combinaison. On peut conserver l'EPO humaine ainsi préparée soit congelée soit sous une forme déshydratée obtenue par lyophili- sation, séchage sous vide ou d'autres méthodes appropriées. -6- Ou encore, on peut mélanger une solution aqueuse contenant l'EPO humaine avec un sel soluble dans l'eau ou un solvant organique hydrophile pour précipiter le composant actif qui est ensuite déshydraté aux fins de stockage. Si on le désire, l'EPO humaine peut être dissoute dans une solution tampon appropriée et filtrée aseptiquement, par exemple à travers un filtre Millipore, pour préparer une solution injectable. La composition pharmaceutique de la présente invention pour le traitement de l'anémie dans les affections malignes peut être mélangée à des agents de traitement de l'anémie traditionnels tels que des composés chalybés, de la vitamine B12 et des androgènes, soit dans une forme pharmaceutique, soit juste avant l'utilisation. Des exemples de composés chalybés comprennent le sulfate de fer séché, le fumarate de fer, le dextraneferrugineux, le gluconate de fer, le glucuronate de fer et l'orotate de fer. On peut déterminer la posologie et la fréquence de l'administration de l'EPO humaine incorporée dans la compo- sition thérapeutique de la présente invention en fonction de l'état du patient sous régime thérapeutique. Dans les cas normaux, on peut administrer à un adulte une préparation contenant 0,1-500 pg, de préférence 5-100 pg d'EPO humaine, en 1-7 doses pendant une semaine, sur la base d'une activité de l'érythropoiétine humaine égale:5à'9 x 104 unités par mg. La composition pharmaceutique de la présente invention pour le traitement de l'anémie dans les affections malignes peut contenir un stabilisant choisi parmi le polyéthylène- glycol, des protéines, des sucres, des acides aminés, des sels minéraux, des sels organiques et des réducteurs sulfurés. On peut utiliser ces stabilisants soit individuellement, soit en combinaison. On les introduit de préférence dans la combinaison de la présente invention en une quantité allant de 0,11 à 10 000 parties en poids par partie en poids d'EPO humaine. Si l'on utilise deux stabilisants ou plus, il suffit que la somme de leurs quantités se trouve dans les limites -7- spécifiées plus haut. On utilise ces stabilisants sous forme d'une solution aqueuse contenant une quantité correspondante d'un stabilisant déterminé pour donner la concentration et le pH appropriés. On ajuste cette solution aqueuse pour obtenir un rapport de pression osmotique allant de 0,1 à 3,0, de préférence de 0,8 à 1,2. On ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur comprise entre 5,0 et 9, 0, de préference entre 6 et 8. On peut préparer la composition de la présente invention sous une forme pharmaceutique en présence d'un agent empêchant l'adsorption. Exemple de référence 1: Préparation d'EPO urinaire humaine Etape (1): Purification partielle à partir d'urine humaine On a traité de l'urine provenant de patients souffrant d'anémie hypoplastique par la technique de T. Miyake et coll. (J. B. C., 52, 5558 (1977]), à savoir par 1) désionisation sur une colonne de Sephadex G-50, 2) adsorption sur de la DEAE-cellulose dans un système discontinu, 3) précipitation avec de l'éthanol et 4) chromatographie sur une colonne de DEAE-agarose. On a obtenu par cette technique une,forme par- tiellement purifiée d'EPO urinaire humaine. Etape (2): Chromatoqraphie en phase inversée On a dissous l'EPO urinaire humaine partiellement purifiée dans une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1% (Aldrich Chemical Co, Inc.,) contenant 24% de propanol (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) et on a soumis la solu- tion à une purification par HPLC sur une colonne Hitachi type 638-50. On a utilisé comme indicateur l'absorption dans l'ultraviolet à 280 nm et 220 nm. On a appliqué l'échantillon ainsi préparé sur une colonne YMC-C8 (6 mm x 30 cm, fournie par Yamamura Chemical Co Ltd.) équilibrée avec une solution d'acide trifluoro-acétique à 0,1% contenant 24% de n-propanol, puis on a élué.la colonne avec la même solution d'équilibrage. Une fois éluées les fractions non adsorbées, on a fait passer la concentration du n-propanol à 26% pour éluer les fractions actives. On - 8 - 2576791 a recueilli les fractions contenant l'activité EPO et on les a concentrées à un volume de 0,1-0,2 ml par ultrafiltration en utilisant Centricon-100 (nom commercial d'Amicon). Etape (3): Chromatographie sur tamis moléculaire à haute performance On a appliqué l'échantillon concentré sur une colonne TSK-G300 SW (7,8 mm x 60 cm, fournie par Toyo Soda Manufactu- ring Co Ltd.) équilibrée avec une solution de TFA à 0,1% contenant 26% de n-propanol, et on a élue la colonne avec 13 la même solution d'équilibrage. On a obtenu des pics pour les fractions à activité EPO à des positions correspondant aux poids moléculaires allant de 25 000 à 30 000. On a recueilli ces fractions actives et on les a lyophilisées. Les fractions avaient une activité spécifique d'environ 9 x 104 unités/mg. Les activités spécifiques des échantillons préparés dans les étapes respectives 1 à 3 sont indiquées dans le tableau I. Tableau I Etape Activité spécifique (U/mg) (1) Purification partielle 600 (2) Chromatographie en phase inversée 10 000 (3) Chromatographie sur tamis moléculaire à haute performance 90 000 Méthode d'évaluation: selon la méthode de N.N. Iscove et coll., J. Cell Physiology, 83, 309 (1974). Exemple de référence 2: Préparation d'EPOr humaine provenant de cellules CHO Un plasmide contenant le gène codant pour la séquence d'acides aminés pour l'EPO humaine a été exprimé dans des cellules ovariennes d'hamster de Chine (cellules CHO) pour la production d'EPOr humaine. Les techniques utilisées sont décrites spécifiquement dans la demande de brevet japonais N 281862/1984 (date de dépot: 27 décembre 1984), intitulée "Vector haboring accessory DNA for the transformation of eucaryotic cells" (Vecteur hébergeant de l'ADN complémentaire pour la transformation de cellules eucaryotes). On donne ci-dessous un résumé des modes opératoires. _9-- On a fait digérer avec EcoRI l'ADN provenant d'un clone lambda HEPOFL 13 contenant le gène codant pour la séquence d'acides aminés d'EPO humaine provenant de cellules hépatiques de foetus humain, et le court fragment EcoRI recueilli héber- geant le gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine a été inséré dans le site EcoRI du plasmide RKI-4. Le plasmide a été ensuite incorporé dans des cellules CHO déficientes en DHFR de manière à les transformer. On a cultivé les cellules CHO transformées dans un milieu l alpha carencé en acides nucléiques. On a sélectionné les cellules hébergeant au moins un gène DHFR et on les a utili- sées dans la production d'EPOr humaine en augmentant progres- sivement la concentration de mèthotrexate dans le milieu. L'EPOr humaine dans le surnageant de la culture finalement obtenue avait une activité de 20 unités/ml. On a cultivé les cellules CHO pendant 3 jours dans un milieu de culture liquide exempt de sérum et on a isolé de l'EPOr humaine pure par les techniques utilisées dans la préparation d'EPO urinaire humaine pure. L'EPOr humaine ainsi obtenue s'est révélée posséder une activité de 6600 unités/ml, telle que déterminée par la méthode de Krystal et coll. (J. Lab. Clin. Med., 97, 144 C1981]). L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide a montré que cette EPOr humaine était constituée d'une seule bande protéique. On a mélangé l'EPOr humaine avec 0,1% d'ASB (albumine de sérum bovin) et on l'a dialysée contre une solution saline physiologique pour préparer des échantillons à utiliser dans des expériences ultérieures. -lO- Expériences: Effets thérapeutiques de l'EPO humaine pour le traitement d'anémie dans des affections malignes 1. Préparation de souris porteuses de cancer On a transplanté sous la peau des flancs de souris mâles âgées de 6 semaines de petits morceaux carrés (1-2 mm de côté) des lignées de cellules tumorales de souris indiquées ci-dessous. 12-16 jours après la transplantation, on a prélevé une partie du sang à partir des veines métatarsiennes posté- rieures pour la détermination de la numération érythrocytaire l0 (RBC), de la teneur en hémoglobine (HGB) et de la numération leucocytaire (WBC) avec un compteur Coulter (Toa Medical Electronics Co Ltd.). Les résultats sont récapitulés dans le tableau II. Lignées de cellules tumorales Souris Ca 755 (adénocarcinome C57BL/6N (fournies par Japan mammaire) Charles River Co Ltd.) Carcinome pulmonaire de Lewis C57BL/6N (fournies par Japan (cancer du poumon) Charles River Co Ltd.) C3MC2 (fibro-sarcome) C3H/HeN (fournies par Japan Charles River Co Ltd.). Tableau II Lignée cellulaire RBC HGB WBC transplantée (xi04/mm3) (E/T%) (g/dl)(E/T%) (x104/mm3)(E/T%) non porteuse de cancer 929 18,4 153 (témoin) Ca 755 521 (56) 12,2 (66) 59 (39) Carcinome pulmonaire de Lewis 803** (86) 17,5 (95) 172* (112) non porteuse de cancer (témoin) 873 18,6 81 C3MC2 748* (86) 14,6**(78) 161* (199) *: P 0,05 **: P 0,01; E: essai, T: témoin. -11- Comme le montre le tableau II, toutes les souris porteuses de cancer étaient dans une condition anémique. 2. Effets thérapeutiques de l'EPO humaine pour le traitement de l'anémie a. Modèle de souris à carcinome pulmonaire de Lewis transplante On a transplanté le carcinome pulmonaire de Lewis chez des souris BDF1 mâles agées de 6 semaines (fournies par Japan Charles River Co Ltd.) comme en 1. 8 jours après la transplantation, les souris porteuses de tumeur pour les- quelles la réussite de la greffe avait été confirmée ont été réparties en trois groupes constitués chacun de 7 animaux portant des tumeurs de même taille. 9 jours après la trans- plantation, on a injecté par voie sous-cutanée aux trois groupes de souris de l'EPO urinaire humaine (10 unités/souris/ jour), de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO (10 unités/ souris/jour) et un solvant (0,5 ml/souris/jour d'un dialysat de milieu RPMI 1640 contenant 0,1% de solution d'ASB) et on a effectué 7 injections à un jour d'intervalle entre les injections. 16 jours après la transplantation, on a administré par voie intrapéritonéale du chlorure de fer (1 mg/souris exprimé en tant que Fe) aux groupes de souris porteuses de cancer afin de fournir un apport de fer. Le groupe témoin consistait en 7 souris BDF1 non porteuses de cancer. Les courbes de numération érythrocytaire (RBC) et d'hémoglobine (HGB) en fonction du nombre de jours écoulés après la transplantation de la tumeur sont données, respecti- vement, sur les figures 1 et 2. b. Modèle de souris à fibro-sarcome C3MC2 transplant' On a transplanté le fibro-sarcome C3MC2 chez des souris C3H/HeN mâles âgées de 6 semaines (fournies par Japan Charles River Co Ltd.) comme en 1. 28 jours après la transplantation, les souris porteuses de tumeur, chez lesquelles le succès de la greffe avait ét6 confirmé, ont été réparties en trois groupes constitués chacun de 7 animaux portant des tumeurs -l- de même taille. 29 jours après la transplantation, on a injecté par voie sous- cutanée aux trois groupes de souris de l'EPO urinaire humaine (10 unités/souris/jour), de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO (10 unités/souris/jour) et un solvant (0,5 ml/souris/jour d'un dialysat de milieu RPMI 1640 contenant 0,1% de solution d'ASB) et on a effectué 7 injec- tions à un jour d'intervalle entre les injections. 36 jours après la transplantation, on a administré par voie intra- péritonéale du chlorure de fer (1 mg/souris exprimé en tant que fer) aux groupes de souris porteuses de cancer afin de fournir un apport de fer. Le groupe témoin consistait en 7 souris C3H/HeN non porteuses de cancer. Les courbes de numération érythrocytaire (RBC) et d'hémoglobine (HGB) en fonction du nombre de jours écoulés après la transplantation de tumeur sont représentées, respec- tivement, sur les figures 3 et 4. Comme l'indiquent les figures 1 à 4, le degré d'anémie dans les groupes de souris auxquelles seul le solvant avait été administré a augmenté avec le temps écoulé après la trans- plantation de tumeur, mais on a observé une nette atténuation de l'anémie dans les groupes de souris porteuses de cancer auxquelles on avait administré l'EPO humaine. Les deux types d'EPO humaine n'avaient pas de toxicité dans les conditions expérimentales utilisées. On illustre la présente invention plus en détail à l'aide des exemples ci-après qui ne sont pas limitatifs. -13- Exemple 1 On a préparé aseptiquement une solution à partir de la formulation indiquée ci-dessous. Composants Quantités (parties en poids) EPOr humaine provenant de cellules CHO 1 Albumine de sérum humain 100 Eau distillée pour injections jusqu'à 100 000 On a réparti la solution dans de petits flacons et on l'a lyophilisée, puis on a scellé les flacons. Exemple 2 On a obtenu des préparations lyophilisées comme dans l'exemple 1, mis à part que l'on a remplacé l'albumine de sérum humain par 100 parties en poids de dextrane40. Exemple 3 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse contenant, pour 100 ml, du mannitol (5 g), de l'EPO urinaire humaine (1 mg), de l'albumine de sérum humain (100 g), de l'acétyl- tryptophane sodique (2,154 mg) et du caprylate de sodium (1,33 mg). On a mis de petites portions (1 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées, puis on a scellé les flacons. Exemple 4 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant de l'EPO urinaire humaine (1 mg), du polyéthylèneglycol 4000 (500 mg) , un copolymère oxyde d'éthylène/oxyde de propylène (30 mg) et du chlorure de sodium (800 mg) dans 100 ml d'une solution de tampon phosphate 0,05M (pH 7,0). On a placé de petites portions (1 ml) de la solution dans des ampoules, qui ont été ensuite scellées par fusion. Exemple 5 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse contenant de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO (0,5 mg), de la glycine (1 g) et du sorbitol (1 g) dans 50 ml de solution de tampon phosphate 0,05M (pH 7,0). On a mis de petites portions (0,5 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées -14- puis on a scellé les flacons. On a aussi préparé aseptiquement une solution aqueuse de méthylcellulose à 0,1% et on a mis des portions de 1 ml de la solution dans des ampoules pour la préparation de milieux de solubilisation. Exemple 6 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant, pour 100 ml, de l'EPO urinaire humaine (1 mg), de l'albumine de sérum humain (50 mg) et du mannitol (500 mg). On a mis de petites portions (1 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées, puis on a scellé les flacons. On a aussi préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant du gluconate ferrique (3 g) et du chlorure de sodium (2,7 g) dans 300 ml, et on a mis des portions de 3 ml de cette solution dans des ampoules qui ont été ensuite scellées par fusion. On a transféré le contenu d'un flacon dans une ampoule et on a obtenu une solution complète par mélange intime. On a injecté lentement (2-3 minutes) la solution par voie intraveineuse. -15- REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour le traitement de l'anémie de tumeurs malignes comprenant une quantité effi- cace du point de vue thérapeutique d'érythropoétine humaine dans un véhicule acceptable par voie parentérale. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'érythropolétine humaine provient d'urine humaine. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'érythropoiétine humaine est obtenue par expression dans une cellule-hôte du gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'érythropolétine humaine. 4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule d'E. coli, une cellule de levure, une lignée de cellules végétales, ou une lignée de cellules animales. 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule ovarienne d'hamster de Chine. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule COS.