Brevet FR2581653A1 — publié le 19861114

La présente invention se rapporte à un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase (souvent appelée ci-après "PEPC"). Plus particulièrement, la présente invention concerne un fragment d'ADN qui contient un gène codant pour PEPC et qui est dérivé d'une bactérie productrice de l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium. La présente invention concerne également un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN et un micro-organisme contenant l'ADN recombinant. Dans la présente description, les endonucléases de restriction (que l'on appelera souvent ci-après simplement "enzyme de restriction") représentées par les abréviations suivantes sont celles obtenues à partir des micro-organismes suivants, respectivement. Abréviation Micro-organisme EcoRI : Escherichia coli RY13 Hindili : Haemophilus influenza Rd PstI : Providencia stuartii 164 BamHI : Bacillus amyloliquefaciens H XbaI : Xanthomonas badrii BglII : Bacillus globigii SalI : Streptomyces albus G HaeIII : Haemophilus aegyptius SacI : Streptomyces achromogenes XhoI : Xanthomones holcicola On sait qu'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium produit l'acide L-glutamique à un haut rendement et qu'un certain mutant ou variant de la bactérie produisant l'acide glutamique produit d'autres acides aminés comme la L-lysine et les purine nucléotides comme l'acide inosinique.Une telle bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium et son mutant ou variant ont été industriellement utilisés pour la production des acides aminés et des purine nucléotides comme on l'a mentionné ci-dessus. Pour obtenir une bactérie appartenant au genre Corynebacterium sous une forme capable de produire les produits souhaités de manière efficace et à un haut rendement, on effectue usuellement une reproduction de la bactérie. En particulier ces dernières années, on a tenté de reproduire une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium par technique d'ADN recombinant.Jusqu'à maintenant, dans la mise en pratique de la reproduction d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium par technique d'ADN recombinant, les gènes suivants ont été clones (1) un gène pour la résistance à la S-(2-aminoéthyl)cystéine dérivé de Corynebacterium glutamicum (ATCC 21543) et un gène codant pour l'anthranilate synthétase dérivé de Brevibacterium flavum (ATCC 14067) atsumata et autres, description de la demande de brevet au Japon No. 58-126789/19833 (2) un gène codant pour l'ATP-phosphoribosyltransférase dérivé de Corynebacterium glutamicum UMizugami et autres, abrégés des conférences données à la rencontre annuelle de Agricultural Chemical Society of Japan P. 249 (1984)0 etc... La plupart des acides aminés, acides nucléiques, etc, sont directement ou indirectement produits à partir d'intermédiaires formés dans le cycle de l'acide tricarboxylique (que l'on appelera ci-après "cycle TCA") Le cycle TCA est une séquence de réactions enzymatiques se produisant dans les cellules. L'oxalacétate, l'un des intermédiaires du cycle TCA, est donné par la réaction de PEPC. Par conséquent, si l'activité de PEPC peut être accrue dans les cellules de la bactérie produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée appartenant au genre Corynebacterium, des acides aminés, des acides nucléiques, etc..., peuvent être produits à un haut rendement par fermentation en utilisant la bactérie. En général, afin d'augmenter l'activité d'une enzyme voulue dans les cellules d'un micro-organisme, on a proposé le clonage du gène codant pour l'enzyme voulue et la transformation des cellules de micro-organisme par le gène cloné. Pour le gène codant pour PEPC, on a cloné un gène codant pour PEPC dérivé de Brevibacterium lactofermentum lItoh et autres, abrégés des conférences données à la rencontre annuelle de Agricultural Chemical Society of Japan, page 431 (1984)3 . Par ailleurs, on a proposé que le gène cloné codant pour PEPC dérivé de la bactérie Brevibacterium lactofermentum soit transformé dans les cellules de la bactérie Brevibacterium lactofermentum pour augmenter l'activité de PEPC de la bactérie (description de la demande de brevet au Japon No. 60-87788).Afin d'obtenir une bactérie appartenant au genre Corynebacterium capable de produire des acides aminés, des acides nucléiques, etc..., à un haut rendement, on a tenté de transformer le gène de PEPC cloné ci-dessus mentionné dérivé de Brevibacterium lactofermentum dans les cellules d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, laquelle bactérie est industriellement utilisée pour la production des acides aminés, des acides nucléiques, etc.... Cependant, des résultats satisfaisants n'ont pas été obtenus par rapport à la production des acides aminés. En effet-, l'on a pas obtenu une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium capable de produire des acides aminés, des acides nucléiques, etc... à un haut rendement. Afin de surmonter le problème ci-dessus mentionné, les présents inventeurs ont effectué des études extensives et intensives. Par suite, ils ont réussi à isoler un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique, appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase et clonant le fragment d'ADN. Ils ont également trouvé que lorsqu'un tel fragment d'ADN est inséré dans un vecteur pour obtenir un ADN recombinant et qu'une cellule d'un micro-organisme appartenant au genre Corynebacterium est transformée par le recombinant obtenu, l'activité de PEPC dans la cellule du micro-organisme transformé peut être accrue. Ainsi, a été accomplie la présente invention. Par conséquent, la présente invention a pour objet de produire un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase, utile pour la production d'acides aminés, d'acides nucléiques, etc..., à un haut rendement par technique d'ADN recombinant. La présente invention a pour autre objet un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN ci-dessus mentionné. La présente invention a pour autre objet la production d'un micro-organisme contenant l'ADN recombinant ci-dessus mentionné. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques détails et avantage-s de celle-ci apparattront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation et dans lesquels - la figure 1 illustre carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG203 de la présente invention - la figure 2 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG211 de la présente invention - la figure 3 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG103 utilisé dans la présente invention - la figure 4 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG204 de la présente invention - la figure 5 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG221 de la présente invention - la figure 6 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG1 utilisé dans la présente invention - la figure 7 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG3 utilisé dans la présente invention - la figure 8 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG14 utilisé dans la présente invention - la figure 9 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG50 utilisé dans la présente invention - la figure 10 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG2001 de la présente invention ; et - la figure Il illustre la carte de scission par eridonucléase de restriction d'un plasmide pAG2002 de la présente invention . Sur les figures 1 à 11, les positions sur la carte des divers sites de restriction sont données en coordonnées de kilobases (que l'on appellera ci-après "kb") relativement au site de restriction de PstI à 0,0/11,5 kb sur la figure 1, au site de restriction de SalI à 0,0/9,3 kb sur la figure 2, au site de restriction de EcoRI à 0,0/11,4 kb sur la figure 3, au site de restriction de XbaIII à 00/22,9 kb sur la figure 4, au site de restriction de XbaI à 0,0/17,5 kb sur la figure 5 > site de restriction de XbaI à 0,0120,4 kb sur la figure 6, au site de restriction de Hind III à 0,0/4,5 kb sur la figure 7, au site de restriction de XbaI à 0,0/10,6 kb sur la figure 8, au site de restriction de BarsHI à 0,0/7 > 6 kb sur la figure 9, au site de restriction de SalI à 0,0/10,9 kb sur la figure 10- et au site de restriction de xbai à 0,0/19,1 kb sur la figure Il Sur la figure 1, ADN-A est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb et pBR 325-(A) est un fragment d'ADN obtenu par scission par PstI du plasmide pBR325. Sur la figure 2, ADN-(B) est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et pBR325-(B) est un fragment d'ADN obtenu par scission par SalI du plasmide pBR325.Sur la figure 3, ADN-(C) est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb et pBR325-(C) est un fragment d'ADN obtenu par scission par EcoRI du plasmide pBR325. sur la figure 4, ADN-(D) est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pAG103-(A) est un fragment d'ADN obtenu par scission par XbaI du plasmide pAG103. Sur la figure 5, pBR325-(D) est un fragment d'ADN obtenu par scission par XbaI du plasmide dérivé du plasmide pBR325. Sur la figure 9, ADN-(E) est un fragment d'ADN obtenu par scission par BamHI et scission par BglII du plasmide pAG14. Sur la figure 10, pAG50-(A) est un fragment d'ADN obtenu par scission par SalI du plasmide pAG50 et ADN-(B) est identique à celui de la figure 2. Sur la figure 11, ADN-(D) est identique à celui de la figure 4 et pAG50-(B) est un fragment d'ADN obtenu par scission par Xbai du plasmide pAG50. Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase. Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un ADN recombinant comprenant un premier fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement lié audit second fragment d'ADN. Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un micro-organisme qui comprend une bactérie et l'ADN recombinant ci-dessus mentionné, ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie. La bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium est une bactérie non mobile et aérobie, à Gram positif, qui ne forme pas de spore et nécessite de la biotine pour sa croissance, et qui produit l'acide L-glutamique à un haut rendement dans un milieu contenant de la biotine en une quantité limitée ou dans un milieu additionné d'un surfactant contenant de la biotine en une forte quantité. Le fragment d'ADN de la présente invention est dérivé de la bactérie ci-dessus mentionnée produisant l'acide glutamique qui appartient au genre Corynebacterium. Le fragment d'ADN de la présente invention contient un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase. Lorsque le gène est exprimé dans une cellule d'un micro-organisme, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) est produite dans la cellule. La phosphoénolpyruvate carboxylase est une enzyme et catalyse la conversion entre l'acide phosphoénolpyruvique et l'acide oxaloacétique. Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC peut être isolé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique en utilisant un système hôte-vecteur habituel. Pour l'hôte, on peut employer, par exemple, Escherichia coli (souvent appelé ci-après "E. Coli"). Pour E. coli, on peut employer la souche K12 de E. coli et ses variantes. Comme vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur, où l'on utilise E. coli ou sa variante comme hôte, on peut mentionner les plasmides habituellement employés pour transformer E. coli et ses variantes. On peut également employer un système hôte-vecteur où l'on utilise une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme hôte et un plasmide habituel compatible avec la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisé comme vecteur. Comme bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner les bactéries appartenant à Corynebacterium, Brevibacterium ou Microbacterium. Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC peut être isolé de la bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium par la méthode suivante. (1) la totalité de 1'ADN est extraite d'une cellule d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium et est partiellement scindée par diverses enzymes de restriction pour obtenir des fragments d'ADN. L'extraction de l'ADN de la bactérie peut être accomplie par une méthode habituelle où l'on effectue le traitement au lysozyme-SDS et le traitement au phénol-chloroforme. Comme enzymes de restriction à employer pour scinder la totalité de l'ADN de la bactérie ci-dessus mentionnée, on peut employer toute enzyme de restriction tant qu'elle peut scinder non seulement l'ADN de la bactérie ci-dessus mentionnée mais également 1'ADN du vecteur ci-dessous mentionné d'un système hôte-vecteur à utiliser pour cloner le fragment d'ADN de la présente invention. Les fragments d'ADN ainsi obtenus contiennent un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC. (2) un ADN du vecteur est complètement scindé par au moins l'une des enzymes de restriction appropriées ci-dessus mentionnées pour obtenir un ADN du vecteur scindé. Pour le vecteur, on doit utiliser ceux qui sont compatibles avec un hôte à transformer ainsi. Il est nécessaire de confirmer, à l'avance, que le vecteur n'est pas digéré par la bactérie qui est destinée à etre utilisée comme hôte. (3) les fragments respectifs d'ADN obtenus à l'étape (1) ci-dessus sont séparément insérés dans le site de scission de 1'ADN du vecteur scindé obtenu à l'étape (2) ci-dessus selon toute méthode habituelle, par exemple la méthode de Maniatis et autres (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J Sambrook : molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982). Ainsi, on obtient des ADN recombinants circulaires qui contiennent un ADN recombinant ayant un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC. (4) les ADN recombinants respectifs sont séparément transférés dans une cellule de E. coli pour former des transformants. La transformation peut litre effectuée par une méthode habituelle, par exemple la méthode de Nandel et autresVMandel, M., Higa, A., J. Nol. Biol. t 53, 159-162 (1970g Comme E. coli à utiliser pour la transformation, on emploit une souche mutante déficiente en PEPC de E. coli. La raison en est la suivante. Afin que la souche mutante croisse, il faut, dans le milieu, de l'acide glutamique ou un acide organique devant être formé comme intermédiaire dans le cycle TAC, et par conséquent, la souche mutante ne peut crotte dans un milieu ne contenant pas l'acide glutamique ou pas d'acide organique devant litre formé dans le cycle TAC.Cependant, lorsque la souche mutante est transformée par un ADN recombinant contenant un gène codant pour PEPC, la souche mutante ne nécessite plus d'acide glutamique ou d'acide organique pour sa croissance et peut croître même dans le milieu ne contenant ni acide glutamique ni cet acide organique. Par ailleurs, même si la souche mutante est transformée par un ADN recombinant, si l'ADN recombinant ne contient pas de gène codant pour PEPC, la souche nécessite toujours l'acide glutamique ou l'acide organique pour sa croissance et ne peut crotte dans le milieu ne contenant ni acide glutamique ni cet acide organique.Par conséquent, lorsque les transformants ci-dessus obtenus sont mis en culture dans un milieu ne contenant ni acide glutamique ni cet acide organique, seul le transformant qui retient un ADN recombinant contenant un gène codant pour PEPC croît dans le milieu. En conséquence, le transformant voulu peut être efficacement et facilement choisi et isolé en utilisant une souche mutante de E. coli déficiente en PEPC. Une telle souche mutante de E. coli peut entre obtenue par les méthodes habituelles. Par exemple, une telle souche mutante peut être obtenue comme suit. D'abord, des cellules de E. coli sont mutées en utilisant la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine pour obtenir des cellules mutantes. Des cellules mutantes, les cellules mutantes auxotrophes qui nécessitent l'acide glutamique sont choisies et isolées. Les cellules mutantes ainsi isolées sont soumises à des déterminations concernant l'activité de PEPC, et une cellule mutante ne présentant pas d'activité de PEPC est choisie. La cellule ainsi choisie est mise en culture pour obtenir une souche mutante de E. coli déficiente en PEPC. La mutation de E. coli peut également être effectuée par des techniques habituelles, par exemple irradiation aux ultraviolets, irradiation aux rayons X, traitement par divers mutagènes, traitement avec des transposons, etc... Alternativement, la souche connue déficiente en PEPC peut être obtenue de dépôts publics ayant une telle souche. (5) des transformants obtenus à l'étape (4) ci-dessus, le transformant qui retient un ADN recombinant contenant un gène codant pour PEPC est choisi et isolé par le critère de l'auxotrophie de l'acide glutamique. A titre d'exemple, les transformants sont mis en culture dans un milieu de synthèse ne contenant pas d'acide glutamique à 20 à 370C selon une méthode habituelle. Les cellules croissant dans le milieu de synthèse ne contenant pas d'acide glutamique sont isolées. Les cellules ainsi isolées sont mises en culture séparément dans le milieu pour obtenir des souches. Les cellules des souches respectives sont recueillies, avec ensuite extraction pour obtenir des extraits de cellules. Les extraits respectifs de cellules sont soumis à une mesure de l'activité de PEPC selon une méthode habituelle pour choisir une souche présentant une activité de PEPC.La souche présentant une haute activité de PEPC a un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC. La souche est mise en culture pour cloner le fragment d'ADN. Le fragment d'ADN est isolé des cellulesde la souche selon une méthode habituelle. L'un des exemples spécifiques du fragment d'ADN de la présente invention est obtenu du micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation Research Institute (appelé ci-après "FR1") sous le numéro d'accession FERM BP-558, et a les caractéristiques suivantes (1) le fragment d'ADN a une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. (2) le fragment d'ADN a ses deux bouts collants formés par scission par XbaI. (3) le fragment d'ADN a les sites de scission par endonucléase de restriction qui suivent un premier site PstI, un second site PstI, un premier site EcoRi, un troisième site PstI, un premier site HindlII, un premier site BamHI, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un second site Hindili, un troisième site Hindili, un premier site SalI, un second site EcoRi, un quatrième site HindIII, un troisième site EcoRi, un sixième site PstI, un septième site PstI, un cinquième site HindIII, un huitième site PstI, un second site BamHI, un second site SalI, un neuvième site PstI et un troisième site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site EcoRi, ledit troisième site PstI, ledit premier site Hindili, ledit premier site BamHI, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit second site HindIII, ledit troisième site HindIII, ledit premier site SalI, ledit second site EeoRI, ledit quatrième site Hindili, ledit troisième site EcoRI, ledit sixième site PstI, ledit septième site PstI, ledit cinquième site Hindili, ledit huitième site PstI, ledit second site BamHI, ledit second site SalI, ledit neuvième site PstI et ledit troisième site BamHI étant respectivement placés à environ 1,0 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ 3,5 kb, environ 3,7 kby environ 4,0 kb, environ 4,3 kb, environ 4,4 kb, environ 5,0 kb, environ 6,3 kb, environ 6,5 kb, environ 6,7 kb, environ 6,9 kb, environ 7,0 kb, environ 7,0 kb, environ 7,4 kb, environ 7,4 kb, environ 8,3 kb, environ 9,5 kb et 10,3 kb dudit premier site de PstI. Les sites de scission par endonucléase de restriction (souvent appelés simplement ci-après situes. de restriction") du fragment d'ADN sont déterminés comme suit. D'abord, l'ADN recombinant contenant le fragment d'ADN est obtenu des cellules de la souche ci-dessus mentionnée par une méthode habituelle. Alors, le fragment d'ADN est obtenu de l'ADN recombinant en utilisant les enzymes de restriction. Le fragment d'ADN ainsi obtenu est complètement digéré en présence d'un excès d'une enzyme de restriction. Alors, les produits digérés obtenus subissent une électrophorèse sur un gel agarose a 1% (poids/volume) puis sur un gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume). Le nombre de sites de restriction est déterminé à partir du nombre de fragments résolvables dans le gel agarose et dans le gel de polyacrylamide. La longueur moléculaire de chacun des fragments scindés est déterminée comme suit.Dans le cas d'une électrophorèse sur gel agarose, des fragments qui sont obtenus par digestion de l'ADN A phagique de E. coli par Hindili et dont les longueurs moléculaires sont respectivement de 23130 bp, 9419 bp, 6557 bp, 4371 bp, 2322 bp, 2028 bp, 564 bp et 125 bp (paire de bases) dans l'ordre de grande longueur moléculaire subissent une électrophorèse sur le meme gel agarose pour former des motifs standards de migration des fragments. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée relativement aux motifs standards de migration.Dans le cas d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les fragments qui sont obtenus par digestion de 1'ADN du Fox174 phage de E. coli par HaeIII et dont les longueur moléculaires sont respectivement de 1353 bp, 1078 bp, 872 bp, 603 bp, 310 bp, 281 bp, 271 bp, 234 bp, 194 bp, 118 bp et 72 bp > dans l'ordre de grande longueur moléculaire, subissent une électrophorèse sur le même gel de polyacrylamide, pour ainsi former des motifs standards de migration des fragments. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée relativement aux motifs standards de migration. La longueur moléculaire du fragment d'ADN est obtenue en additionnant les longueurs moléculaires des fragments obtenus par une scission par enzyme de restriction. Les sites de restriction du fragment d'ADN peuvent être déterminés en digérant complètement le fragment d1ADN par diverses sortes d'enzymes de restriction, en effectuant une électrophorèse des fragments résultants sur un gel agarose puis sur un gel de polyacrylamide et en analysant les résultats obtenus. Le fragment d'ADN peut être modifié tant que cela ne nuit pas au gène codant pour PEPC. Par exemple, une partie du fragment d'ADN peut être laissée tout en retenant le gel codant pour PEPC dans le fragment d'ADN pour obtenir un dérivé par délétion du fragment d'ADN. La délétion partielle du fragment d'ADN peut être effectuée par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction. Comme exemples spécifiques d'un tel dérivé par délétion, on peut mentionner les fragments d'ADN suivants: (I) un fragment d'ADN ayant (1) une longueur moléculaire d'environ 8,3 kb (2) un bout collant formé par SalI et l'autre bout collant formé par XbaI ; et (3) les sites de restriction qui suivent un premier site PstI, un second site PstI, un premier site EcoRi, un troisième site PstI, un premier site Hindili, un premier site BamHI, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un second site HindIII, un troisième site HindIII, un site SalI, un second site EcoRi, un quatrième site HindIII, un troisième site EcoRi, un sixième site PstI, un septième site PstI, un cinquième site Hindili, un huitième site PstI, et un second site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site EcoRi, ledit troisième site PstI, ledit premier site HindIII, ledit premier site BamHI, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit second site HindIII, ledit troisième site HindIII, ledit site SalI, ledit second site EcoRi, ledit quatrième site HindIII, ledit troisième site EcoRi, ledit sixième site PstI, ledit septième site PstI, ledit cinquième site HindIII, ledit huitième site PstI et ledit second site BamHI étant respectivement placés à environ 1,0 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ 3,5 kb, environ 3,7 kb, environ 4,0 kb, environ 4,3 kb, environ 4,4 kb, environ 5,0 kb, environ 6,3 kb, environ 6,5 kb, environ 6,7 kb, environ 6,9 kb, environ 7,0 kb, environ 7,0 kb, environ 7,4 kb, et environ 7,4 kb dudit premier site PstI. (II) un fragment d'ADN ayant (1) un poids moléculaire d'environ 6,4 kb (2) un bout collant formé par scission avec EcoRI et l'autre bout collant formé par scission avec SalI ; et (3) des sites de restriction comme suit un premier site PstI, un premier site Hindili, un premier site BamHI, un second site PstI, un troisième site PstI, un second site Hindili, un troisième site Hindili, un site SalI, un premier site EcoRi, un quatrième site Hindili, un second site EcoRi, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un cinquième site Hindili, un sixième site PstI et un second site BamHI, ledit premier site HindIII, ledit premier site BamHI, ledit second site PstI, ledit troisième site PstI, ledit second site HindIII, ledit troisième site HindIII, ledit site SalI, ledit premier site EcoRI, ledit quatrième site HindIII, ledit second site EcoRi, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit cinquième site HindIII, ledit sixième site PstI et ledit second site BamHI étant respectivement placés à environ 0,1 kb, environ 1,0 kb, environ 1,2 kob, environ 1,5 kb, environ 1,8 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 3,8 kb, environ 4,0 kb, environ 4,2 kb, environ 4,4 kb, environ 4,5 kb, environ 4,5 kb, environ 4,9 kb et environ 4,9 kb dudit premier site PstI. (III) un fragment d'ADN ayant (1) un poids moléculaire d'environ 5,5 kb (2) les deux bouts collants formés par scission avec PstI ; et (3) des sites de restriction comme suit un premier site HindIII, un second site Hindili, un premier site SalI, un premier site EcoRi, un troisième site HindIII, un second site EcoRI, un premier site PstI, un second site PstI, un quatrième site Hindili, un troisième site PstI, un site BamHI et un second site SalI, ledit second site Hindili, ledit premier site SalI, ledit premier site EcoRi, ledit troisième site HindIII, ledit second site EcoRi, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, ledit quatrième site HindIII, ledit troisième site PstI, ledit site BamHI et ledit second site SalI étant respectivement placés à environ, 0,1 kb, environ 0,7 kb, environ 2,0 kb, environ 2,2 kb, environ 2,4 kb, environ 2,6 kb, environ 2,7 kb, environ 2,7 kb, environ 3,1 kb, environ 3,1 kb et environ 4,0 kb dudit premier site Hindiii. (IV) un fragment d'ADN ayant (1) un poids moléculaire d'environ 4,8 kb ; (2) un bout collant formé par scission avec BamHI et l'autre bout collant formé par scission avec Sali ; et (3) des sites de restriction comme suit un premier site PstI, un second site PstI, un premier site HindIII, un second site HindIII, un site SalI, un premier site EcoRi, un troisième site HindIII, un second site EcoRi, un troisième site PstI, un quatrième site PstI, un quatrième site HindIII, un cinquième site PstI et un site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site HindIII, ledit second site HindIII, ledit site SalI, ledit premier site EcoRi, ledit troisième site HindIII, ledit second site EcoRi, ledit troisième site PstI, ledit quatrième site PstI, ledit quatrième site Hindili, ledit cinquième site PstI et ledit site BamHI étant respectivement placés à environ 0,3 kb, environ 0,6 kb, environ 0,7 kb, environ 1,3 kb, environ 2,6 kb, environ 2,8 kb, environ 3,0 kb, environ 3,2 kb, environ 3,3 kb, environ 3,3 kb, environ 3,7 kb et environ 3,7 kb dudit premier site PstI. (V) un fragment d'ADN ayant (1) un poids moléculaire d'environ 3,9 kb (2) un bout collant formé par scission avec Hindili et l'autre bout collant formé par scission avec SalI ; et (3) des sites de restriction comme suit un site SalI, un premier site EcoRi > un premier site HindIII, un second site EcoRi > un premier site PstI, un second site PstI, un second site HindIII, un troisième site PstI, et un site BamHI, ledit premier site EcoRi, ledit premier site HindIII, ledit second site EcoRi, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, ledit second site HindIII, ledit troisième site PstI et ledit site BamHI étant respectivement placés à environ 1,3 kb, environ 1,5 kb, environ 1,7 kb, environ 1,9 kb, environ 2,0 kb, environ 2,0 kb, environ 2,4 kb, et environ 2,4 kb dudit site SalI. (VI) un fragment d'ADN ayant (1) un poids moléculaire d'environ 3,3 kb (2) les deux bouts collants formés par scission avec SalI ; et (3) des sites de restriction comme suit un premier site EcoRi, un premier site HindIII, un second site EcoRi, un premier site PstI, un second site PstI, un second site HindIII, un troisième site PstI et un site BamHi, ledit premier site Hindili, ledit second site EcoRi, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, un second site HindIII, un troisième site PstI et un site BamhI étant respectivement placés à environ 0,2 kb, environ 0,4 kb, environ 0,6 kb, environ 0,7 kb, environ 0,7 kb, environ 1,1 kb et environ 1,1 kb dudit premier site EcoRi. Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC mentionné ci-dessus peut également être facilement modifié en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction du fragment d'ADN de façon que l'enzyme de restriction efficace pour scinder le site de restriction soit changée en une sorte différente d'enzyme de restriction, tout en maintenant le gène intact pour PEPC. Le fragment d'ADN peut également être changé au moins à sa première extrémité par rapport à la séquence des bases de façon que l'extrémité du fragment d'ADN puisse être adaptée à la séquence des bases d'une partie scindée d'un vecteur, laquelle partie scindée doit être liée à l'extrémité du fragment d'ADN. Comme on l'a décrit ci-dessus, la souche ci-dessus mentionnée déficiente en PEPC de E. coli ne croit pas sans acide glutamique ou un acide organique à former dans le cycle TAC et ne produit pas PEPC. Cependant, lorsqu'un ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC est incorporé dans la souche ci-dessus mentionnée, la souche ci-dessus mentionnée est forcée à produire PEPC sans nécessiter d'acide glutamique ou d'acide organique à former dans le cycle TAC. Par conséquent, la présence d'un gène codant pour PEPC dans le fragment d'ADN de la présente invention peut être confirmée par le fait que lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour former un ADN recombinant puis que l'ADN recombinant est transféré à des cellules de la souche ci-dessus mentionnée, les cellules croissent dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique ni d'acide organique comme on l'a mentionné ci-dessus et produisent PEPC dans les cellules. L'ADN recombinant de la présente invention comprend un premier fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie. Le premier fragment d'ADN est lié directement ou indirectement au second fragment d'ADN. Pour le premier fragment d'ADN, on utilise un fragment d'ADN de la présente invention. Pour le second fragment d'ADN, on peut mentionner tout fragment d'ADN dérivé d'un vecteur d'un système hote-vecteur qui est habituellement employé dans la technique d'ADN recombinant. Pour ce fragment d'ADN on peut mentionner, par exemple, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Escherichia coli est utilisé comme hôte, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Bacillus subtilis est utilisé comme hôte, et analogues.Pour la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée, on peut mentionner une bactérie appartenant au genre Corynebacterium, une bactérie appartenant au genre Brevibacterium et une bactérie appartenant au genre Microbacterium. Pour le fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte, on peut mentionner, par exemple, des fragments d'ADN dérivés de pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 et pAG103. Le plasmide pAG1 peut être obtenu du micro-organisme Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 peut être obtenu de Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559.Le plasmide pAG14 est un dérivé par délétion du plasmide pAG1. Le plasmide pAG50 comprend une partie du plasmide pAG14 et une partie du plasmidepAG3. Le plasmide pAG103 comprend un plasmide pBR325 scindé par EcoRI et un fragment d'ADN, dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558), contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb. Les méthodes d'obtention de ces plasmides seront décrites dans les exemples ci-dessous. Les cartes de scission par endonucléase de restriction des plasmides pAG103, pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 sont montrées aux figures 3, 6, 7, 8 et 9 respectivement.Comme fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur ou Escherichia coli est utilisé comme hôte, on peut mentionner par exemple, des fragments d'ADN dérivés du plasmide pBR325. Comme fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Bacillus subtilis est utilisé comme hôte, on peut mentionner par exemple des fragments d'ADN dérivés du plasmide pUB110. L'ADN recombinant-de la présente invention peut être préparé par ligature du premier fragment d'ADN directement au second fragment d'ADN. Alternativement, 1'ADN recombinant de la présente invention peut être préparé par ligature du premier fragment d'ADN indirectement au second fragment d'ADN par un autre type de fragment d'ADN. Pour préparer 1'ADN recombinant, on peut employer un système habituel hSte-vecteur. Comme système hôte-vecteur, on peut mentionner, par exemple, un sytème hôte-vecteur utilisant E. coli comme hôte, un système hôte-vecteur utilisant Bacillus subtilis comme hôte, un système hôte-vecteur utilisant une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme hôte, etc... Pour l'ADN recombinant comprenant le premier fragment d'ADN et le second fragment d1ADN, on peut mentionner, par exemple, les plasmides pAG203, pAG211, pAG204, pAG22î, pAG2001, pAG2002, etc... . Le plasmide pAG203 comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN (III) ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pBR325 scindé par PstI. Le plasmide pAG211 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN (IV) ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide scindé par SalI.Le plasmide pAG204 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pAG103 scindé par XbaI. Le plasmide pAG221 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide scindé par XbaI dérivé du plasmide pBR325. Le plasmide pAG2001 comprend, pour le premier fragment drADN, le fragment d'ADN (VI) ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et pour le second fragment dlADN, un plasmide pAG50 scindé par SalI.Le plasmide pAG2002 comprend, pour le premier fragment d'ADN1 le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pAG50 scindé par XbaI. L'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention peut être modifié en changeant-la séquence des bases d'au moins un site de restriction de l'ADN recombinant de façon que l'enzyme de restriction efficace pour scinder le site de restriction soit changé en un type différent d'enzyme de restriction, tout en retenant le gène intact codant pour PEPC et le gène pour la réplication. Le micro-organisme de la présente invention comprend une bactérie et un ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et un fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication. L'ADN recombinant est contenu dans la bactérie. Comme ADN recombinant, on utilise l'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention. Pour la bactérie, on peut mentionner, par exemple, les souches connues de Escherichia coli et les bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnées. Le micro-organisme de la présente invention est préparé en transformant la bactérie par 1'ADN recombinant au moyen d'une technique habituelle d'ADN recombinant. Comme micro-organisme de la présente invention, on peut mentionner, par exemple, la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG211), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG221), Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001), Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002), etc... . La souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG211), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204) et la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG221) sont préparées en transformant des cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 par les plasmides ci-dessus mentionnés pAG203, pAG211, pAG204 et pAG221, respectivement.La souche 342-167 de E. coli K12 peut être publiquement disponible au E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Université de Yale, Ecole de médecine, E.U.A. Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001) et Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002) sont préparés par transformation de cellules de Corynebacterium melassecola 801 par les plasmides pAG2001 et pAG2002 ci-dessus mentionnés, respectivement. Corynebacterium melassecola 801 est, comme on l'a mentionné ci-dessus, déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558 et est disponible au Fermentation Research Institute. Le fragment d'ADN de la présente invention a les avantages suivants. Lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie appartenant au genre Corynebacterium est utilisée comme hôte pour former un ADN recombinant, et que 1'ADN recombinant ainsi formé est transféré dans une bactérie appartenant au genre Corynebacterium, la capacité de production de PEPC de la bactérie peut être améliorée et la bactérie peut y produire PEPC à un haut rendement. Comme on l'a précédemment mentionné, les réactions dans le cycle TAC sont favorisées par l'action de PEPC pour former des acides organiques comme intermédiaires. A partir des intermédiaires ainsi formés, divers acides aminés, acides nucléiques souhaités et autres sont produits.Par conséquent, par mise en culture de la bactérie ayant une capacité améliorée de production de PEPC, de tels acides aminés, acides nucléiques et autres, peuvent être produits à haut rendement. En effet, le fragment d'ADN de la présente invention est utile pour obtenir une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, laquelle bactérie est capable de produire des acides aminés, des acides nucléiques, etc, à un haut rendement. L'ADN recombinant de la présente invention présente les avantages suivants. Lorsque le second fragment d'ADN de l'ADN recombinant est un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie appartenant au genre Corynebacterium est utilisée comme hôte, 1'ADN recombinant de la présente invention peut être avantageusement employé pour transformer une bactérie appartenant au genre Corynebacterium pour obtenir la bactérie ci-dessus mentionnée appartenant au genre Corynebacterium ayant une excellente capacité de production placides aminés, d'acides nucléiques, etc... Par ailleurs, lorsque le second fragment d'ADN de l'ADN recombinant est un ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où l'on utilise, comme h8te, une bactérie autre que celle appartenant au genre Corynebacterium, comme une bactérie appartenant aux genres Escherichia, Bacillus, Brevibacterium, Microbacterium, etc..., l'ADN recombinant de la présente invention peut être avantageusement employé pour la multiplication du fragment d'ADN de la présente invention. Le micro-organisme de la présente invention a les avantages suivants. Dans le cas où le micro-organisme contenant l'ADN recombinant de la présente invention est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium, le micro-organisme de la présente invention est utile pour la production de divers acides aminés, divers acides nucléiques, etc..., à un haut rendement. Dans le cas où le micro-organisme est une bactérie autre que celle ci-dessus mentionnée, le micro-organisme de la présente invention peut être directement utilisé pour la multiplication du fragment d'ADN de la présente invention. La présente invention sera illustrée en plus de détail en se réfèrant aux exemples suivants, qui ne doivent pas être considérées comme limitant le cadre de la présente invention. Exemple 1. Dans ce exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) comme -donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour PEPC (Corynebacterium melassecola 801 est déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558). Le gène codant pour PEPC a été cloné en utilisant le système hôte-vecteur où l'on a utilisé la souche 342-167 de Escherichia coli K12 comme hôte et le plasmide pBR325 a été utilisé comme vecteur. La souche 342-167 de Escherichia coli K12 a été obtenue du Docteur Barbara J. Bachmann de E. coli Genetic Stock Center, Département des Génétique Humaine, Université de Yale, Ecole de médecine, 333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven, Connecticut 06510 E.U.A. . La souche 342-167 de Escherichia coli K12 est publiquement disponible au E. coli Genetic Stock Center. Le plasmide pBR325 a été acheté au Bethesda Research Laboratories, E.U.A. Etape 1. Èxtraction de l'ADN de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) et sa scission3. Le micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) a été inoculé dans 100 ml d'un milieu de mélasse (préparé en dissolvant 80 g de mélasse de ligule noire de la betterave, 0,5 g de MgS04.7H20, 8 g d'urée et 1,5 g d'acide phosphorique dans l'eau de façon que le volume total soit de 1 litre et en ajustant le pH à 6,2), avec ensuite stérilisation à 1200C pendant 15 minutes et mise en culture à 320C pendant une nuit tout en agitant, pour ainsi obtenir une culture du micro-organisme. De la culture, des cellules du micro-organisme ont été recueillies, lavées puis mises en suspension dans 8 ml d'un tampon contenant tris-HCl 10 mM (pH8,0) et EDTA 1 mM. A cette suspension, on a ajouté un lysozyme en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en lysozyme de 5 mg/ml. On a laissé le mélange résultant reposer à 370C pendant 4 heures. Alors, au mélange on a ajouté Pronase E (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, E.U.A.) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en Pronase E de 200 ,ug/ml. On a laissé le mélange résultant reposer à la température ambiante pendant 15 minutes. Alors, au mélange, on a ajouté du dodécylsulfate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait la concentration en dodécylsulfate de sodium de 1% (poids/volume).On a laissé le mélange reposer à 370C pendant 1 heure. Ensuite, on a ajouté, au mélange ci-dessus obtenu, un volume égal de phénol saturé d'une solution tampon de TNE (contenant tris-HCl 50 mM, EDTA 5mM, NaCl 100 mM et pH8,0). Alors, on a soumis le mélange résultant à une centrifugation à 10000 t/mn (11000 g) pendant 10 minutes et l'on a recueilli une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol-chloroforme (1:1, volume/volume), avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10000 t/mn (11000 g) pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a encore ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 10000 t/mn (11000 g) pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de la ribonucléase A (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, E.U.A.) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en ribonucléase A de 40 ,ug/ml. On a laissé le mélange reposer à 370C pendant une heure.Ensuite, on a ajouté, au mélange, 1/5 volume d'une solution aqueuse contenant NaCl 5M et 1/4 volume d'une solution aqueuse contenant 50% (poids/volume) de polyéthylène glycol 6000, avec ensuite mélange. On a laissé le mélange résultant reposer à 40C pendant 4 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 5000 t/mn (2700 g) pendant 20 minutes pour obtenir des précipités et un produit surnageant. Les précipités ont été recueillis et dissous dans 4 ml d'un tampon TE contenant tris-HCl 10 mM et EDTA lmM, pH7,5. A la solution ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en acétate de sodium de 300 millimoles. Subséquemment, on a ajouté, au mélange, deux fois son volume d'éthanol.Le mélange ainsi obtenu a été soumis à agitation, on l'a laissé reposer à -300C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 10000 t/mn (11000g) pendant 20 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis, séchés sous pression réduite et dissous dans 2 ml d'un tampon TE, pour ainsi obtenir une solution d'ADN contenant 0,85 mg/ml d'ADN. L'ADN dans la solution d'ADN a été scindé comme suit. 16 unités de l'enzyme de restriction PstI (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) ont été ajoutées à 145 pg de 1'ADN, et on a mélangé le mélange résultant à 200 jil d'un tampon contenant Tris-HCl (pH7,4) 10 mM, NaCl 50 mM et du dithiothréitol 1 mM et on laissé reposer à 300C pendant 2 heures de façon que la réaction se passe. Alors, le mélange réactionnel a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Etape 2. (Préparation du plasmide pBR325 et sa scission) La souche 342-167 de Escherichia coli K12 a été inoculée dans 50 ml d'un bouillon L (contenant 10 g/l de polypeptone, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl et pH7,2) et mise en culture à 370C jusqu'à ce que la concentration en cellules atteigne 5x108 cellules/ml. Les cellules ont été recueillies de la culture par centrifugation à 20C. Les cellules ont été mises en suspension dans 50 ml de MgCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 25 ml de CaCl2 dans 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer la glace pendant 30 minutes.De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 5 ml de CaCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 1 heure pour obtenir une suspension de cellules compétentes. A 200 jil de la suspension, on a ajouté 0,1 pg d'ADN de pBR325 (fabriqué et vendu par (Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) et on laissé le mélange résultant reposer dans la glace pendant 1 heure. Subséquemment, on a laissé le mélange reposer à 420C pendant 2 minutes puis l'on a ajouté, au mélange, 5ml d'un bouillon L. Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 370C pendant 900 minutes. Alors, le mélange a été dilué avec de l'eau stérile et étendu sur un milieu d'agar L (milieu obtenu en ajoutant 15 g d'agar à un bouillon L de façon que le volume total soit de 1 litre) contenant 20 pg/ml de chloramphénicol, avec ensuite incubation pendant une nuit à 370C pour obtenir Escherichia coli transformé par le plasmide pBR325. La souche 342-167 de Escherichia coli K12 transformée par le plasmide pBR325 a été inoculée dans 100 ml d'un bouillon L contenant 20 pg/ml de chloramphénicol et mise en culture pendant une nuit à 370C. Du mélange, des cellules ont été recueillies par centrifugation et lavées avec un tampon TE. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 ml d'une solution aqueuse consistant en 15% (poids/volume) de saccharose, Tris-HCl 50 mM (pH8,5), EDTA 50 mM et 2 mg/ml de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A) et on laissé reposer à la température ambiante pendant 30 minutes. A la suspension résultante, on a ajouté 2 ml d'une solution de Triton (poids/volume) de Triton X-100 (fabriqué par Rohm & Haas Co., E.U.A. et vendu par Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japon), Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) et EDTA 50 mMet on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes. La solution ainsi obtenue a été soumise à centrifugation à 30000 t/mn (64000 g) à 50C pendant 1 heure pour obtenir un produit surnageant.Au produit surnageant, on a ajouté un tampon TE en une quantité telle que le mélange résultant ait un volume de 18 ml. On a doucement dissous 1,2 ml d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de césium, dans le mélange ci-dessus obtenu, avec ensuite centrifugation à 40000 t/mn (100000 g) à 150C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous une lumière ultraviolette. La bande inférieure a été prélevée du tube de centrifugeuse à travers le c8té du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction du plasmide pBR325. La fraction ainsi obtenue a été soumise quatre fois à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique pour obtenir un extrait.De l'extrait, le bromure d'éthidium a été retiré et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 ml d'un dialysat contenant le plasmide pBR325 qui avait une concentration en ADN de 150 wug/ml. A une aliquote du dialysat contenant 15 ug de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu, on a ajouté 45 unités de l'enzyme de restriction PstI. Le mélange résultant a été ajouté à 150nul d'une solution tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH7,4), MgSO4 10 mM, NaCl 50 mM et du dithiothréitol 1 mM, avec ensuite incubation à 300C pendant 2 heures pour avancer une réaction. Ensuite, on a chauffé le mélange à 700C pendant 10 minutes pour arreter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 millimoles. Au mélange on a ajouté deux fois son volume d'éthanol et on a laissé le mélange obtenu reposer à -300C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite. Les précipités ainsi obtenus ont été dissous dans 200 pl d'un tampon de BAPT (Tris-HCl 50 mM, pH8,4).A la solution ainsi obtenue on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne à la solution, avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Ensuite, un volume égal de phénol saturé du tampon TNE a été ajouté à la solution avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 mn et l'on a récupéré une phase aqueuse.Alors, on a ajouté un volume égal d'un mélange de phénol-chloroforme (1:1 > volume/volume), à la phase aqueuse, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, un volume égal de chloroforme a été ajouté à la phase aqueuse tout en agitant, et soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour récupérer une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 millimoles et deux fois le volume d'éthanol tout en agitant. On a laissé reposer le mélange résultant à -300C pendant 3 heures. Subséquemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont été séchés sous pression réduite et dissous dans 30 pu d'une solution de tampon TE. Etape 3. (Recombinaison de l'ADN) on a ajouté 2,9 ug de l'ADN obtenu à l'étape 1 de l'exemple 1, et 1,5 > ig de 1'ADN obtenu à l'étape 2 de l'exemple 1 et 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) à 100,pu d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgC12 10 mM, du dithiothréitol 10 mM, de la spermidine lmM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.). On a laissé le mélange résultant reposer pour faire avancer une réaction à 150C pendant une nuit.Le mélange réactionnel ainsi obtenu a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrenter la réaction. Etape 4. (Transfert du plasmide recombinant dans Escherichia coli) Une suspension de cellules compétentes de Escherichia coli K12 souche 342-167 a été préparée sensiblement de la même manière qu'à ltétape 2 de l'exemple 1. On a mélangé 400 > il de la suspension de cellules compétentes et 40 p1 du mélange réactionnel obtenu à l'étape 3 de l'exemple 1, et on laissé reposer dans la glace pendant 1 heure. Ensuite, le mélange a étb chauffé à 420C pendant 2 minutes et ensuite l'on a ajouté 5 ml du bouillon L, au mélange. Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 370C pendant 90 minutes. Alors, du mélange, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans de l'eau stérile pour obtenir une suspension de cellules.La suspension de cellules ainsi obtenue a été appliquée à un milieu d'agar de synthèse (contenant 6 g/l de Na2HP04, 3 g/l de KH2P04, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4C1, MgS04 1 mM, CaCl2 0,1 mM, 2 gil de glucose, 15 g/l d'agar, de la L-thréonine 0,3 mM, de la L-leucine 0,3 mM, de la L-histine 0,1 mM, de la L-arginine 0,6 mM et de la thiamine 0,05 mM) et on a incubé. Etape 5. t(Sélection et isolement de E. coli ayant un gène codant pour PEPC dérivé d'un micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558 Les cellules obtenues à l'étape 4 de l'exemple 1 ont été mises en culture séparément sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de l'ampicilline (30 Eug/ml) et de la tétracycline (10 > ig/ml) et sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de la tétracycline (10 jig/ml) seule. Les cellules qui ne croissaient pas sur le milieu d'agar de synthèse contenant l'ampicilline et la tétracycline mais qui croissaient sur le milieu d'agar de synthèse contenant la tétracycline ont été choisies et isolées. Les cellules ainsi isolées étaient sensibles à l'ampicilline mais résistantes à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique dans le milieu. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG203) qui avait le gène souhaité codant pour PEPC. E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gène codant pour PEPC. L'activité de PEPC de E. coli isolé a été déterminée par la méthode suivante pour confirmer que le gène cloné était un gène codant pour PEPC. La souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG203) a été inoculée dans 100 ml d'un milieu liquide de synthèse (contenant 13,6 gXl de KH2P04, 2,61 g/l de K2SO4,-0,2 g/l de MsSO4. 7H20, 10 mg/l de CaCl2, 0,5 mg/l de FeS04.7H20, 4 gjl de glucose, 3 gXl de NH4Cl, 0,3 mx de L-thréonine, 0,3 mx de L-leucine, 0,1 mM de L-histidine, 0,6 mM de L-arginine et 0,05 mx de thiamine, pH7,2) et mise en culture à 37 C pendant un jour.De la culture ainsi obtenue, les cellules de E. coli ont été recueillies et mises en suspension dans 2 ml d'un tampon MES Eacide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) 50 mM, MgS04 10 mM, EDTA 10 mM, pH7,02 pour obtenir une suspension. La suspension a été soumise à une ultrasonication puis à une centrifugation à 14000 t/mn (20000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellule (solution d'enzyme brute). Par ailleurs, la souche 342-167 de Escherichia coli K12 et la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans le milieu liquide de synthèse ci-dessus mentionné contenant du glutamate de sodium 10 mM.L'activité de PEPC a été déterminée en mesurant une augmentation de l'absorbance à 412 nm de 2,5 ml d'une solution réactionnelle de l'enzyme contenant MES 10 mM, du phosphoénolpyruvate 2 mM, NaHC03 10 mM, de l'acétal CoA 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.) MnSO4 3,3 mM, du 5,5'-dithiobis(acide 2-nitrobenzolque) 0,05 mM (souvent appelé ci-après DTNB), 5 unités/ml de citrate synthase du coeur du cochon (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, E.U.A.) et 10 à 100 fil de l'extrait de cellules, pH7,4 en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon).Par ailleurs, la concentration de la protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée par la méthode de Lowry et autres.l0.H. Lowry, N.J. Rowebrough, R.J. Randall, J. Biol. Chem. 193, 265 (î9Sî)j . Pour mesurer la concentration en protéine, l'on a utilisé de l'albumine de sérum bovin (fabriquée et vendue par Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japon) en tant que protéine standard pour la détermination ci-dessus mentionnée. Les résultats sont montrés au tableau 1 donné à l'étape 7 que l'on mentionnera ci-après. Comme cela est apparent par les résultats montrés au tableau 1, la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG203) avait une activité spécifique de PEPC extrêmement élevée. Etape 6. (Isolement d'un plasmide hybride pAG203 et son analyse) un ADN du plasmide pAG203 a été isolé de la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203) et purifié sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 2 de l'exemple 1, à l'exception que l'on a utilisé la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203) au lieu de la souche 342-167 de E. coli K12 transformée par pBR325.Ainsi, on a obtenu 170 ug de 1'ADN du plasmide pAG203. 0,3jug de l'ADN ainsi isolé a été digéré avec un excès de chacune des diverses enzymes de restriction, c'est-à-dire EcoRi, BamHI, HindIII, SalI et PstI (chacune fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) dans des conditions appropriées à chacune des enzymes de restriction. Les produits digérés ainsi obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur 1% (poids/volume) de gel agarose et une électrophorèse sur 4% (poids/volume) de gel polyacrylamide selon une méthode habituelle. L'électrophorèse a été effectuée constamment à 5 V par cm de longueur du gel pendant 4 heures. Après accomplissement de l'électrophorèse, le gel a été plongé dans une solution de bromure d'éthidium contenant l)ug/ml de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teinter le gel. Alors, le gel a été irradié de lumière ultraviolette pour déterminer le nombre de bandes correspondant au nombre de fragments d'ADN obtenus. Les longueurs moléculaires respectives des fragments d'ADN ont été déterminées par la comparaison des distances respectives de migration des fragments dans l'électrophorèse avec celles des fragments d'ADN ayant respectivement des longueurs moléculaires connues.Pour un tel fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire connue, des fragments d'ADN obtenus par digestion par Hindili de 1'ADN X phasique (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel agarose et des fragments d'ADN obtenus par digestion par HaeIII de l'ADNfX174 phage (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Par ailleurs, par l'analyse des fragments d'ADN obtenus par la digestion du plasmide avec diverses enzymes de restriction, on a déterminé les sites de restriction du plasmide. Par suite, on a trouvé que le plasmide pAG203 avait la structure illustrée dans la carte de scission ou de coupure par endonucléase de restriction montrée sur la figure 1 et se composait du vecteur pBR325 et, inséré au site coupé ou scindé par l'enzyme de restriction PstI, un fragment de PstI étranger ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb. Le fragment de PstI est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558). Des cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 ont été transformées par 1'ADN du plasmide pAG2O3 ci-dessus obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple 1, à l'exception que l'ADN du plasmide pAG203 a été utilisé au ieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés par rapport à la résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à la tétracycline mais sensibles à l'ampicilline, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est rélévée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus. Etape 7. (Délétion partielle d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb) A 3 Sug de 1'ADN du plasmide pBR325 obtenu à l'étape 2 de l'exemple 1, on a ajouté 20 unités d'une enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 jil d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM, et NaCl 100 mM à 370C pendant 2 heures. Alors, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme dans le mélange et on agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et l'on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures, et soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 mn pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon I d'ADN. A 3,4 pg de 1'ADN du plasmide pAG203 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1, on a ajouté 20 unités d'une enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 p1 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et un NaCl 100 mM à 37OC pendant 2 heures. Au mélange réactionnel résultant on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme. Le mélange a été soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium Jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures, et soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir un échantillon d'ADN II. On a fait réagir la totalité des échantillons d'ADN I et II ci-dessus obtenus avec 3 unités d'ADN ligase T4 phage dans 50 pl d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine lmM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA à 150C pendant une nuit. Ensuite, on a chauffé le mélange réactionnel résultant à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. En utilisant le mélange réactionnel de ligase ci-dessus obtenu, la transformation des cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 a été effectuée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'exemple 1. Par suite, on a obtenu des transformants qui étaient résistants à l'ampicilline et au chloramphénicol mais sensibles à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Le plasmide retenu dans chaque souche a été séparé sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG211. Pour les souches retenant le plasmide pAG211, l'activité de PEPC a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'exemple 1 à l'exception que le milieu liquide de synthèse contenait 20 ug/ml de chloramphénicol. Par suite, on a trouvé que les souches retenant le plasmide pAG211 avaient une activité spécifique de PEPC extrêmement élevée comme le montre le tableau 1. Tableau 1. Souche PEPC Activité spécifique de PEPC *1) 342-167 *2) - 0,003 342-167(pBR325) - 0,002 342-167(pAG203) + 0,081 342-167(pAG211) + 0,26 Notes : *1) exprimée en termes de la quantité (micromoles) de l'acide oxaloacétique forcé à être formé par 1 mg de la protéine dans la solution réactionnelle d'enzyme pendant 1 minute. La détermination de la quantité de l'acide oxaloacétique formé est effectuée comme suite. On fait réagir l'acide oxaloacétique formé avec des excès de citrate synthase et d'acétyl CoA pour former l'acide citrique et la coenzyme A.La coenzyme A ainsi formée est mesurée en utilisant un réactif pour l'analyse quantitative des groupes SH pour déterminer la quantité de coenzyme A formée. La quantité de l'acide oxaloacétique est calculée en se basant sur la quantité de coenzyme A formée. *2) une variante de la souche K12 de Escherichia coli obtenue du Docteur Barbara J. Bachmann de E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Université de Yale, Ecole de médecine, 333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven, Connecticut 06510 E.U.A. . Cette souche est une souche déficiente en PEPC. Le plasmide pAG211 avait la structure montrée sur la figure 2 et était un ADN recombinant composé d'un fragment de SalI du plasmide pBR325 et d'un fragment de SalI étranger ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb. Le fragment de SalI étranger était un fragment d'ADN dérivé de Corynebacterium melassecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558, contenant un gène codant pour PEPC. Les cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 ont été transformées par 1'ADN du plasmide pAG211, ci-dessus obtenu, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé 1'ADN du plasmide pAG211 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés par rapport à la résistance aux médicaments et à l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants au chloramphénicol et à l'ampicilline mais sensibles à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le-transformant s'est révélée être la même que celle du.plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus. Etape 8.(Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb). A 30 pg de 1'ADN du plasmide pAG203 obtenu à l'étape 7 de l'exemple 1, on a ajouté 100 unités de chaque enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 p1 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 370C pendant 2 heures. Le plasmide ainsi digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel à 1% d'agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé un gel à 1% d'agarose préparé par LMP Agarose (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.), et que l'électrophorèse a été effectuée à 40C.Le gel agarose a été teinté avec du bromure d'éthidium et exposé à une irradiation aux rayons ultraviolets, de façon à observer visuellement les fragments d 'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3kb. Une partie du gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Au gel découpé, on a ajouté un tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation > avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse1 on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide puis dissoute dans 20 il d'un tampon TE.Ainsi, on a obtenu une solution contenant environ 3pg d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb. Etape 9. (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb). A 50 pg de 1'ADN du plasmide pAG203 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1, on a ajouté 150 unités de chacune des enzymes de restriction BamHI et SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 p1 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 370C pendant 3 heures pour digérer le plasmide. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de l'exemple 1. Par suite, on a observé un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,8 kb et un fragment d'ADN ayant environ 4,1 kb. Une partie du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été découpée.Au gel découpé, on a ajouté un tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'uhe phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10000 t/mn (9000g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide puis dissoute dans 50 pl d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et du dithiothréitol 1 mM. A la solution résultante, on a ajouté 50 unités de PstI, avec ensuite incubation à 300C pendant 3 heures pour digérer la boulette d'ADN. La boulette digérée a été soumise à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de l'exemple 1. Par suite, on a observé un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1,0 kb et un fragment d'ADN ayant environ 1,2 kb. Une partie du gel ou l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Au gel découpé, on a ajouté du tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN.La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir environ 2 pg de la boulette d'ADN contenant un fragment PstI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 1,2 kb et un fragment PstI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 1,0 kb qui sont des parties du fragment d'ADN contenant le gène de PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb. La boulette d'ADN a été dissoute dans 20 > 11 d'un tampon TE. On a ainsi obtenu trois fragments d'ADN ayant des longueurs moléculaires d'environ 1,0 kb, environ 1,2 kb et environ 3,3 kb, respectivement, qui étaient les constituants du fragment d'ADN contenant le gène de PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5kb. Le fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb était le même que celui obtenu à l'étape 8 de l'exemple 1. Exemple 2. Dans cet exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) comme donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour PEPC (Corynebacterium melassecola 801 est déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558). Le gène codant pour PEPC a été cloné en utilisant un système hôte-vecteur où l'on a utilisé la souche 342-167 de Escherichia coli K12 comme hôte et un plasmide hybride pAG103 a été utilisé comme vecteur. La souche 342-167 de Escherichia coli K12 a été obtenue du Docteur Barbara J. Bachmann de E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Université de Yale, Ecole de Médecine, 333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven, Conneeticut 06510 E.U.A..La souche 342-167 de Escherichia coli K12 est publiquement disponible au E. coli Genetic Stock Center. Le plasmide pAG103 a la structure illustrée sur la carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 3. Comme cela est apparent sur la figure 3, le plasmide pAG103 comprend le plasmide pBR325 et, inséré à son site de EcoRI, un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase (que l'on appelera souvent ci-après "GDH") et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb, lequel fragment d'ADN est dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558). Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH contenait un site XbaI. Le plasmide pAG103 a été préparé comme suit. Etape 1. (Préparation du plasmide pAG103) (1) Extraction de 1'ADN de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) et sa scission3 On a répété sensiblement les mimes processus qu'à l'étape 1 de exemple 1 pour obtenir une solution d'ADN contenant 1'ADN de Corynebacterium melassecola 801. L'ADN dans la solution d'ADN a été scindé comme suit. On a aJouté 160 unités de l'enzyme de restriction EcoRI (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) à 34 g de l'ADN, et l'on a mélangé le mélange résultant avec 67 l d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM et l'on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes de façon que la réaction se passe. Alors, le mélange réactionnel a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arreter la réaction. (2) (Préparation du plasmide pBR325 et sa scission). La souche PA340 de Escherichia coli K12 qui est une souche déficiente en GDH et glutamate synthase et nécessite de l'acide glutamique pour sa croissance a été inoculée dans 50 ml d'un bouillon L (contenant 10 g/l de polypetone, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl et ayant un pH de 7,2) et mise en culture à 370C jusqu'à ce que la concentration en cellules atteigne 5 x 108 cellules/ml. Les cellules ont été recueillies de la culture par centrifugation à 20C. Les cellules ont été mises en suspension dans 50 ml de MgCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 25 ml de CaCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 30 minutes.De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 5 ml de CaCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 1 heure. A 200 pl de la suspension, on a ajouté O,lzg d'ADN de pBR325 (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) et on a laissé le mélange résultant reposer dans la glace pendant 1 heure. Subséquemment, on a laissé le mélange reposer à 420C pendant 2 minutes puis on y a ajouté 5 ml d'un bouillon L. Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 370C pendant 90 minutes. Alors, le mélange a été dilué avec de l'eau stérile et étendu sur un milieu d'agar L (milieu obtenu en ajoutant 15 g d'agar à un bouillon L de façon que le volume total soit de 1 litre) contenant 10 ug/ml de tétracycline, avec ensuite incubation pendant une nuit à 370C pour obtenir Escherichia coli transformé par le plasmide pBR325. Escherichia coli K12 PA340 transformé par le plasmide pBR325 a été inoculé dans 100 ml d'un bouillon L contenant 10 wug/ml de tétracycline et on a mis en culture pendant une nuit à 37 C. Du mélange, des cellules ont été recueillies par centrifugation et lavées avec un tampon TE. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 ml d'une solution aqueuse consistant en 15% (poids/volume) de saccharose, Tris-HCl 50 mM (pH8,5) EDTA 50 mM et 2 mg/ml de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.) et on laissé reposer à température ambiante pendant 30 minutes. A la suspension résultante, on a ajouté 2 ml d'une solution de Triton t0,1% (poids/volume) de Triton X-100 fabriqué par Rohm & Haas Co., E.U.A. et vendu par Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japon), Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) et EDTA 50 mMet on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes. La solution ainsi obtenue a été soumise à centrifugation à 30000 t/mn (64000 g) à 50C pendant 1 heure pour obtenir un produit surnageant.Au produit surnageant on a ajouté un tampon TE en une quantité telle que le mélange résultant ait un volume de 18 ml. On a doucement dissous 1,2 ml d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de césium, dans le mélange obtenu ci-dessus, avec ensuite centrifugation à 40000 t/mn (100000 g) à 150C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous lumière ultraviolette. La bande inférieure a été prélevée du tube de centrifugeuse à travers le côté du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction du plasmide pBR325. La fraction ainsi obtenue a été soumise quatre fois à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique pour obtenir un extrait.De l'extrait, le bromure d'éthidium a été retiré et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 ml d'un dialysat contenant le plasmide pBR325 qui avait une concentration en ADN de 130 pg/ml. A une aliquote de dialysat contenant 17 pg de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu, on a ajouté 40 unités de l'enzyme de restriction EcoRI. Le résultat a été ajouté à 150 p1 d'une solution tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM, avec ensuite incubation à 370C pendant 2 heures pour avancer une réaction. Ensuite, le mélange a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arreter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 millimoles. Au mélange on a ajouté un volume double d'éthanol et on a laissé le mélange obtenu reposer à -300C pendant 3 heures. Alors, le mélange a eté soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes-pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite. Les précipités ainsi obtenus ont été dissous dans 200 pl drun tampon BAPT (Tris-HCl 50 mM, pH8,4).A la solution ainsi obtenue on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne à la solution, avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Ensuite, on a ajouté à la solution un volume égal de phénol saturé de tampon TNE, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté un volume égal de phénol saturé de tampon TNE, avec ensuite mélange.Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, on a ajouté un volume égal d'un mélange de phénol-chloroforme (1:1, volume/volume) à la phase aqueuse, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, un volume égal de chloroforme a été ajouté à la phase aqueuse tout en agitant, et on a soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour récupérer une phase aqueuse.A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium une concentration de 300 millimoles et deux fois le volume d'éthanol tout en agitant. On a laissé le mélange résultant reposer à -300C pendant 3 heures. Subsequemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont été séchés sous pression réduite et dissous dans 23 pl d'une solution de tampon TE. (3) (Recombinaison de l'ADN) 2,4 pg de l'ADN obtenu à l'étape 1-(1) de l'exemple 2 et 1,4 > ig de l'ADN obtenu à l'étape 1-(2) de l'exemple 2 et 3 unités d'ADN ligase T4 phage (fabriquée et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) ont été ajoutés à 100 jil dtun tampon contenant 50 mx de Tris-HCl (pH7,4), 10 mx de MgC12, 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine, 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.). On a laissé le mélange résultant reposer pour avancer une réaction à 150C pendant une nuit. Le mélange réactionnel ainsi obtenu a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. (4) (Transfert du plasmide recombinant dans Escherichia coli) Une suspension de cellules compétentes de la souche PA340 de Escherichia coli K12 a été préparée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2. On a mélangé 400 pl de la suspension de cellules compétentes et 40 y1 du mélange réactionnel obtenu à l'étape 1-(3) de l'exemple 2 et on a laissé reposer dans la glace pendant 1 heure. Ensuite, le mélange a été chauffé à 420C pendant 2 minutes puis on a ajouté, au mélange, 5 ml du bouillon L. Le mélange résultant a été incubé de manière stationnaire à 370C pendant 90 minutes. Alors, du mélange, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans l'eau stérile pour obtenir une suspension de cellules. La suspension ainsi obtenue de cellules a été appliquée à un milieu d'agar de synthèse (contenant 6 g/l de Na2HP04, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4C1, 1 mM de MgS04, 0,1 mM de CaC12, 2 g/l de glucose, 15 g/l d'agar, 0,3 mM de L-thréonine, 0,3 mM de L-leucine, 0,1 mM de L-histidine, 0,6 mM de L-arginine et 0,05 mM de thiamine, et on a incubé. (5) [Sélection et isolement de E. coli ayant un gène codant pour GDH dérivé du micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558)j Les cellules obtenues à l'étape 1-(4) de l'exemple 2 ont été mises en culture séparément sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant du chloramphénicol (20 pg/ml) et de la tétracycline (10 pg/ml) et sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant la tétracycline seule (10 yg/ml). Les cellules qui ne croissaient pas sur le milieu d'agar de synthèse contenant le chloramphénicol et la tétracycline mais qui croissaient sur le milieu d'agar de synthèse contenant la tétracycline ont été choisies et isolées. Les cellules ainsi isolées étaient sensibles au chloramphénicol mais résistantes à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique dans le milieu. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAG103), qui avait le gène souhaité codant pour GDH. E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gène codant pour GDH. L'activité de GDH de E. coli isolé a été déterminée par la méthode suivante pour confirmer que le gène cloné était le gène codant pour GDH. La souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAG103) a été inoculée dans 100 ml d'un milieu liquide de synthèse (contenant 13,6 g/l de KH2P04, 2,61 g/l de K2S04, 0,2 g/l de MgS04.7H20, 10 mg/l de CaCl2, 0,5 mg/l de FeS04.7H20, 4 g/l de glucose, 3 g/l de NH4Cl, 0,3 mM de L-thréonine, 0,3 mM de L-leucine, 0,1 mM de L-histidine, 0,6 mM de L-arginine et 0,05 mM de thiamine, pH7,2) et mise en culture à 370C pendant 1 jour. De la culture ainsi obtenue, on a recueilli des cellules de E. coli et on les a mises en suspension dans 2 ml d'un tampon TM (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de 2-mercaptoéthanol, pH7,6) pour obtenir une suspension.La suspension a été soumise à une ultrasonication et puis à une centrifugation à 14000 t/mn (20000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzyme brute). Par ailleurs, la souche PA340 de Escherichia coli et la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans le milieu liquide de synthèse ci-dessus mentionné contenant 10 millimoles de glutamate de sodium. L'activité de GDH a été déterminée en mesurant une diminution de l'absorbance à 340 nm de 2,5 ml d'une solution réactionnelle d'enzyme (contenant 50 mM de Tris-HCl, 40 mM de NH4Cl, 0,25 Mm de NADPH, 5 mx d'acide 3( -cétoglutarique et 10 à 100 il de l'extrait de cellules, pH7,6) en utilisant un spectrophotomètre Modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon). Par ailleurs, la concentration de la protéine dans extrait de cellules a été mesurée par la méthode de Lowry et autres WO.H. Lowry, N.J. Rowebrough, R.J. Randall, J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)2.Pour mesurer la concentration en protéine, on a utilisé de l'albumine de sérum bovin (fabriquée et vendue par Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japon) comme protéine standard pour la détermination ci-dessus mentionnée. Les résultats sont montrés au tableau 2. e TABLEAU 2. Souche GDH Activité spécifique de GDH *1) PA340 - 0,009 PA340(pBR325) i 0,003 PA340(pAGlQ3) + 20,8 PA340(pAGîî2) + 28,9 Note : *1) exprimée en termes de la quantité (micromoles) de NADPH (-nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme réduite) forcée à être oxydée par 1 mg de la protéine-dans la solution réactionnelle pendant 1 minute. Comme cela est apparent par les résultats montrés au tableau 2, la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAG103) avait une activité spécifique de GDH extrêmement élevée. (6) (Isolement d'un plasmide hybride pAG103 et son analyse). Un ADN du plasmide pAG103 a été isolé de la souche PA340 de E. coli K12 (pAG103) et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2 à l'exception que l'on a utilisé la souche PA340 de E. coli K12 (pAG103) au lieu de la souche PA340 de E. coli K12 transformée par pBR325.Ainsi, on obtenu 150 ug de l'ADN du plasmide pAG103. 0,3 pg de l'ADN ainsi isolé a été digéré avec un excès de chacune des diverses enzymes de restriction, c'est-à-dire EcoRi, BamHI, BglII, Hindîli, SalI et XbaI (chacune fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon), PstI (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.), et SacI et XhoI (chacune fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) dans les conditions appropriées à chacune des enzymes de restriction. Les produits digérés ainsi obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur 1% de gel agarose (poids/volume) et une électrophorèse sur 4% de gel de polyacrylamide (poids/volume) selon une méthode habituelle.L'électrophorèse a été effectuée constamment à 5 V par cm de longueur du gel pendant 4 heures. Après accomplissement de l'électrophorèse, le gel a été plongé dans une solution de bromure d'éthidium contenant 1 pg/ml de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teinter le gel. Alors, le gel a été irradié d'une lumière ultraviolette pour déterminer le nombre de bandes correspondant au nombre de fragments d'ADN obtenus. Les longueurs moléculaires respectives des fragments d'ADN ont été déterminées par la comparaison des distances respectives de migration des fragments dans l'électrophorèse avec celles des fragments d'ADN ayant respectivement des longueurs moléculaires connues. Pour ce fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire connue, on a utilisé des fragments d'ADN obtenus par digestion avec HindîlI d'un ADN A phage (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) dans le cas de l'électrophorèse sur gel agarose, et des fragments d'ADN obtenus par digestion par HaeIII de l'ADN Fox174 phage (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) dans le cas de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Par ailleurs, par l'analyse des fragments d'ADN obtenus par digestion du plasmide avec diverses enzymes de restriction, on a détermné les sites de restriction du plasmide. Par suite, on a trouvé que le plasmide pAG103 avait une structure illustrée par la carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 3 et se composait du vecteur pBR325 et, inséré au site scindé ou coupé par l'enzyme de restriction EcoRi, un fragment de EcoRI étranger ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb. Le fragment de EcoRI est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558). Les cellules de la souche PA340 de E. coli K12 ont été transformées avec 1'ADN du plasmide pAG103 ci-dessus mentionné sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2, à l'exception que l'on a utilisé l'ADN du plasmide pAG103 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et leur auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés résister à la tétracycline et à l'ampicilline mais être sensibles au chloramphénicol, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus. A 15 pg de l'ADN du plasmide pAG103 obtenu ci-dessus, on a ajouté 100 unités de l'enzyme de restriction XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 150 p1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCI à 3700C pendant 2 heures. Alors, le mélange a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. On a ainsi obtenu l'échantillon III d'ADN. Etape 2. (Scission de l'ADN obtenu de Corynebacterium melassecola 801) On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 1 de l'exemple 1 pour obtenir 1'ADN de Corynebacterium melasssecola 801. On a ajouté 50 pg de l'ADN ainsi obtenu à 150 pl d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCI (pH7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCl. Au mélange on a ajoute 50 unités de XbaI, avec ensuite incubation à 370C pendant 2 heures pour avancer une réaction. Alors, le mélange a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrenter la réaction. On a ainsi obtenu l'échantillon IV d'ADN. Etape 3. (Recombinaison de l'AD. 1,8 pg de l'échantillon III d'ADN obtenu à l'étape 1 de l'exemple 2 et 1,5 pg de 1'ADN obtenu à l'étape 2 de l'exemple 2 et 3 unités d'ADN ligase T4 phage (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) ont été ajoutés à 100 P1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine, 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA (albumine de sérum de bovin) (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.). On a laissé le mélange résultant reposer pour avancer une réaction à 150C pendant une nuit. Le mélange réactionnel ainsi obtenu a été chauffé à 70DC pendant 10minutes pour arrenter la réaction. Etape 4. (Transfert du plasmide recombinant dans Escherichia coli). Une suspension de cellules compétentes de la souche 342-167 de Escherichia coli K12 a été préparée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple 1. On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 4 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé, comme milieu de culture, un milieu d'agar de synthèse contenant 10 pg/ml de tétracycline. Etape 5. Sélection et isolement de E. coli ayant un gène codant pour PEPC dérivé d'un micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558,1 Les cellules obtenues à l'étape 4 de l'exemple 2 ont été mises en culture séparément sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de l'ampicilline (30 pg/ml) et de la tétracycline (10 pg/ml) et sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de la tétracycline (10 pg/ml) seule. Les cellules qui ne croissaient pas sur le milieu d'agar de synthèse contenant l'ampicilline et la tétracycline mais croissaient sur le milieu d'agar de synthèse contenant la tétracycline ont été choisies et isolées.Les cellules ainsi isolées étaient sensibles à l'ampicilline mais résistantes à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique dans le milieu. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG204) qui avait le gène souhaité codant pour PEPC. E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gène codant pour PEPC. L'activité de PEPC de E. coli isolé a été déterminée de la même manière qu'à l'étape 5 de l'exemple 1 pour confirmer que le gène cloné était un gène codant pour PEPC. Les résultats sont montrés au tableau 3 donné ci-dessous. Comme cela est apparent par les résultats montrés au tableau 3, la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG204) avait une activité spécifique de PEPC extrêmement élevée. TABLEAU 3. Souche PEPC Activité spécifique de PEPC *1) 342-167 *2) - 0,003 342-167(pBR325) - 0,002 342-167(pAG204) + 0,036 Notes : *1) et *2) sont identiques aux notes du tableau 1. Etape 6. (Isolement d'un plasmide hybride pAG204 et son analyse). Un ADN du plasmide pAG204 a été isolé de la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204) et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2, à l'exception que l'on utilisé à la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204) au lieu de la souche 342-167 de E. coli K12 transformée par pBR325. Ainsi, on a obtenu 165 pg de 1'ADN du plasmide pAG204. L'ADN a été analysé sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1 pour préparer la carte de scission par endonucléase de restriction qui est montrée sur la figure 4.Le plasmide pAG204 comprend le plasmide pAG103 et, inséré à son site XbaI, un fragment de XbaI ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb, lequel fragment est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC dérivé de Corynebacterium melassecola 801. Les cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 ont été transformées par 1'ADN du plasmide pAG204 ci-dessus mentionné sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2 à l'exception que l'on a utilisé 1'ADN du plasmide pAG204 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés par rapport à la résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés résister à la tétracycline et à l'ampicilline mais être sensibles au chloramphénicol, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est rélévée etre la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus. Etape 7. (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb, du plasmide pAG204). I1 a été impossible d'isoler un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb du plasmide pAG204 par une électrophorèse sur gel agarose parce que le fragment d'ADN restant du plasmide pAG204, lequel fragment d'ADN restant était un plasmide pAG103 scindé par XbaI, avait presque la meme longueur moléculaire que celle du fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC. Par conséquent, le fragment d'ADN restant, c'est-à-dire un plasmide pAG103 scindé par XbaI a été changé pour l'autre fragment d'ADN contenant un vecteur, avec ensuite isolement du fragment d'ADN contenant un gène codant pour PFPC au moyen d'une électrophorèse sur gel agarose.Pour l'autre fragment d'ADN, on a utilisé un plasmide scindé obtenu en scindant le plasmide pBR325 par EcoRI et en ligaturant des linkers XbaI (fabriqués et vendus par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) aux deux extrémités du pBR325 scindé. Ci-dessous, la méthode sera expliquée en détail. (1) Préparation d'un plasmide scindé qui comprend un plasmide scindé par EcoRI et, lié à ses deux extrémités, des linkers XbaI. A 5 pg de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu à l'étape 2 de l'exemple 1, on a ajouté 20 unités d'une enzyme de restriction EcoRi. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 p1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 2 heures. Alors, on a chauffé le mélange réactionnel à 709C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange résultant on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité.Alors, le mélange a été maintenu- au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d1ADN a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon V d'ADN. A l'échantillon V d'ADN ainsi obtenu, on a ajouté 3 unités d'ADN polymérase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon). On a laissé le mélange résultant réagir dans 44 pl d'une solution contenant 33 mM de Tris-CH3COOH (pH7,9), 66 mx de CH3COOK, 10 mM de (CH3C00)2Mg, 0,5 mM de dithiothréitol, 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 mM de 2'-désoxyadénosine 5'-triphosphate (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.), 0,1 mM de 2'-désoxycytidine 5'-triphosphate (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.), 0,1 mM de 2'-désoxyguanosine 5'-triphosphate (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.) et 0,1 mM de thymidine 5'-triphosphate (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.). La réaction a été avancée à 300C pendant 20 minutes. Alors, au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon VI d'ADN. A 1,5 ug d'un linker de XbaI (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) on a ajouté 2,5 unités de polynucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon). On a laissé le mélange résultant réagir à 370C pendant 1 heure dans 100 ul d'une solution contenant 66 mM de Tris-HCl (pH7,6), 1 mM de ATP, 10 mM de MgCl2, 1 mM de spermidine, 15 mM de dithiothréitol, 0,2 mg/ml de BSA. On a ainsi obtenu l'échantillon VII d'ADN. Un quart de la quantité de l'échantillon VI d'ADN, la totalité de la quantité de l'échantillon VII d'ADN et 6 unités de 1'ADN ligase T4 phage ont été ajoutés à 22 ul d'une solution contenant 66 mM de Tris-HCl (pH7,6), 1 mM de ATP, 10 mM de MgCl2, 1 mM de spermidine, 15 mM de dithiothréitol et 0,2 mg/ml de BSA. Le mélange résultant a été incubé à 220C pendant 4 heures. Alors, au mélange réactionnel, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on agité > avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon VIII d'ADN. A toute la quantité de l'échantillon VIII d'ADN on a ajouté 15 unités de XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir à 370C pendant 2 heures dans 50 l d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl, pour ainsi obtenir un ADN digéré. L'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé de l'agarose LMP (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) en tant qu'agarose et que l'électrophorèse a été effectuée à 40C. Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement ultraviolet de façon à observer visuellement des fragments d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 6,0 kb. Une partie du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été découpée. Au gel découpé on a ajouté un tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir un échantillon IX d'ADN. (2) Scission du plasmide pAG204 par l'enzyme de restriction XbaI. A 5 yg de l'ADN du plasmide pAG2G3 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 2, on a ajouté 15 unités d'une enzyme de restriction XbaI. On a laissé le melange résultant réagir dans 100 yl d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange réactionnel résultant on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN.La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon X d'ADN. (3) Recombinaison de l'ADN. La totalité de la quantité de l'échantillon IX d'ADN, la totalité de la quantité de l'échantillon X d'ADN et trois unité d'ADN ligase T4 phage ont été ajoutées à 100 jil dlune solution contenant 50 mM de Tris-HCl (pH7,4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine, 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA. Le mélange a été incubé à 150C pendant une nuit. Alors, on a chauffé le mélange à 700C pendant 10 minutes pour arreter la réaction. (4) Transformation de E. coli par l'ADN recombinant. On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 4 de l'exemple 2 à l'exception que l'on a utilisé 40 pl du mélange réactionnel obtenu à l'étape 7-(4) de l'exemple 2 au lieu de 40 pl du mélange réactionnel obtenu à l'étape 3 de l'exemple 2 pour obtenir des transformants. (5) Sélection de E. coli ayant un gène codant pour PEPC dérivé d'un micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) et isolement d'un plasmide hybride du micro-organisme. On a répété sensiblement les mimes processus qu'à l'étape V de l'exemple 1 pour isoler, des transformants obtenus à l'étape 7-(4) de l'exemple 2, un transformant qui est résistant à l'ampicilline et à la tétracycline mais sensible au chloramphénicol. Du transformant ainsi isolé, on a isolé un plasmide contenu dans le transformant et on l'a purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1-(2) de l'exemple 2. Le plasmide ainsi obtenu a été analysé de la même manière qu'à l'étape 1-(6) de l'exemple 2.Le plasmide a été désigné par plasmide pAG22î. pAG221 a une structure illustrée par la carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 5, et composée du plasmide pBR325 ayant un linker XbaI à son site EcoRI et, inséré à son site scindé par XbaI, un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. Le fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb était le mme que celui contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. (6) Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb du plasmide pAG221. A 20 yg du plasmide pAG221 obtenu à l'étape 7-(5) de l'exemple 2, on a ajouté 60 unités de XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir à 370C pendant 2 heures dans 100 P1 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM, pour ainsi obtenir un plasmide digéré. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé de l'agarose LMP (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) en tant qusagarose et que l'électrophorèse a été effectuée à 40C.Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement ultraviolet, de façon à observer visuellement les fragments d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. Une partie du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été découpée. Au gel découpé on a ajouté un tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide puis dissoute dans 20 rl d'un tampon TE. On a ainsi obtenu une solution contenant environ 5 jig d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. Etape 8. (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 8,3 kb). A 5 yg du fragment d'ADN XbaI-XbaI obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2, on a ajouté 20 unités d'une enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 rl d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mx et NaCl 100 mM à 370C pendant 3 heures pour digérer le fragment d'ADN. Le fragment d'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Par suite, on a observé un fragment d'ADN XbaI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb et un fragment d'ADN SalI-SalI ayant environ 3,3 kb. Une partie de gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Du gel découpé, on a obtenu environ 1 pg d'un fragment d'ADN XbaI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb et environ 0,5 Xug d'un fragment d'ADN SalI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Les fragments d'ADN ont été analysés pour leur motif de restriction. Par suite, on a trouvé que le fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb était le même que celui ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb obtenu à l'étape 8 de l'exemple 1. Ainsi, on a obtenu un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 8,3 kb sous la forme d'un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb et d'un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb. Etape 9.(Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 6,4 kb). A 2 pg du fragment d'ADN XbaI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de l'exemple 2, on a ajouté 10 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 pi d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgSO4 10 mM et NaCi 100 mM à 370C pendant 2 heures pour digérer le fragment d'ADN. Le fragment digéré d'ADN a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Par suite, on a observé un fragment d'ADN EcoRI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb. Une partie du gel où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée.Du gel découpé, on a obtenu environ 0,5 jig d'un fragment d'ADN EcoRI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Ainsi, un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 6,4 kb a été obtenu sous la forme de deux fragments constituants d'ADN, c'est-à-dire un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb et un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb obtenu à l'étape 8 de l'exemple 2. Etape 10. (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,8 kb). A 4 jig du fragment d'ADN XbaI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de l'exemple 2, on a ajouté 20 unités d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 pl d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH7,4), MgS04 10 mx, NaCl 50 mM et du dithiothréitol 1 mM à 370C pendant 2 heures pour digérer le fragment d'ADN. Le fragment digéré d'ADN a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Par suite, on a observé un fragment d'ADN BamHI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 1,5 kb. On a découpé une partie du gel où l'on a trouvé ce fragment.Du gel découpé, on a obtenu environ 0,5 pl d'un fragment d'ADN BamHI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 1,5 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Ainsi, on a obtenu un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,8 kb, sous la forme de deux fragments d'ADN constituants, c'est-à-dire un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1,5 kb et un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb obtenu à l'étape 8 de l'exemple 2. Etape 11. (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,9 kb). A 4 pg du fragment d'ADN XbaI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 5,0 kb obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de l'exemple 2, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction Hindîli. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50jus d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pu7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol i mM à 370C pendant 2 heures pour digérer le fragment d'ADN. Le fragment digéré d'ADN a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2. Par suite, on a observé un fragment d'ADN HindIII-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 0,6 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée. Du gel découpé, on a obtenu environ 0,2 rg d'un fragment dtADN HindIII-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 0,6 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7-(5) de l'exemple 2.Ainsi, un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,9 kb a été obtenu sous la forme de deux fragments d'ADN constituants, c'est-à-dire un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 0,6 kb et un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb obtenu à l'étape 8 de l'exemple 2. Exemple 3. Dans cet exemple, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour PEPC, a été inséré dans un vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme productrice de l'acide glutamique pour préparer un ADN recombinant pour la production de PEPC. Un transformant capable de former PEPC à un haut rendement a alors été préparé en utilisant l'ADN recombinant. Le fragment SalI obtenu à l'étape 8 de l'exemple 1, c'est-à-dire un fragment SalI contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et le fragment XbaI obtenu à l'étape 7-(6) de l'exemple 2, c'est-à-dire un fragment XbaI contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,1 kb, ont été utilisés comme fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour PEPC. Un plasmide pAG50 a été utilisé comme vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme productrice de l'acide glutamique.Le plasmide pAG50 est un plasmide qui a été préparé à partir des plasmides pAGi et pAG3 dérivés d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par la méthode qui sera mentionnée ci-dessous. Le plasmide pAGi est un plasmide résistant à la tétracycline qui a été isolé de Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 est un plasmide cryptique isolé de Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559. Etape 1. CPréparation du plasmide pAG50 et son isolement de Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O)3 (1) Isolement d'un plasmide pAGi de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560). Le micro-organisme Corynebacterium melassecola 22243 a été mis en culture dans un milieu semi-synthétique Milieu préparé en dissolvant 10 g de (NH4)2S04, 3 g d'urée, 1 g de K2HPO4, 50 mg de Nazi, 400 mg de MgS04.7H2, 2 mg de MnS04.4-6H20, 2 mg de FeS04.4-6H20, 20 g de glucose, 50 jig de biotine, 200 de chlorhydrate de thiamine et 1 g d'extrait de levure dans de l'eau échangée en ions et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre et en ajustant à pH 7 à 320C pendant une nuit, tout en agitant.On a inoculé 8 ml de la culture ainsi obtenue dans 200 ml du même milieu semi-synthétique, avec ensuite mise en culture à 320C pendant 5 heures tout en agitant pour obtenir une culture du micro-organisme. De la culture, des cellules du micro-organisme ont été recueillies et mises en suspension dans 10 ml d'une solution de lysozyme (pH8,0) contenant 50 mM de glucose, 10 mM de EDTA, 25 mM de Tris(hydroxylméthyl)- aminométhane (appelé souvent ci-après "Tris") et 10 mg/ml de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, E.U.A.) avec ensuite incubation à 420C pendant 1 heure. A la suspension, on a ajouté 20 ml d'unesolution alcali-SDS contenant NaOH à 0,2 N et 1% (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium (que l'on appellera souvent ci-après "SDS"). Le mélange a été soumis à agitation et ensuite on l'a laissé reposer dans la glace pendant 5 minutes.Alors, au mélange, on a ajouté 15 ml d'une solution d'acétate de potassium refroidie à la glace (un mélange de 60 mi d'acétate de potassium 5 M, de 11,5 ml d'acide acétique et de 28,5 ml d'eau distillée et échangée en ions). Le mélange a été soumis à agitation et on l'a laissé reposer dans la glace pendant 10 minutes pour obtenir un lysat. La totalité du lysat a été transférée à un tube de centrifugeuse et soumise à une centrifugation à 12000 t/mn (13000 g) à 40C pendant 5 minutes pour ainsi obtenir un produit surnageant. Le produit surnageant a été soumis à une extraction avec un volume égal de phénol-chloroforme (1:1) et une phase aqueuse a été recueillie.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume double d'éthanol et le mélange résultant a été soumis à agitation et on l'a laissé reposer à la température ambiante pendant 5 minutes. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 10000 t/mn (11000 g) à 200C pendant 10 minutes pour ainsi obtenir les précipités. Les précipités ont été lavés avec 70% (volume/volume) d'éthanol, séchés sous pression réduite et dissous dans 20 ml d'un tampon TE (pH7,5) contenant 10 mM de Tris et 1 mM de EDTA dans un tube de centrifugeuse. A la solution résultante, on a doucement ajouté 1,2 ml d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de bromure d'éthidium et 23,6 g de chlorure de césium et on a dissous avec ensuite centrifugation à 40000 t/mn (100000 g) à 150C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées a la lumière ultraviolette.La bande inférieure a été retirée du tube de centrifugeuse à travers la paroi latérale du tube en utilisant une seringue pour obtenir un plasmide pAGi. La fraction plasmidique ainsi obtenue a été soumise à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique, quatre fois, pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromure d'éthidium a été retiré et la solution résultante dialysée avec un tampon TE pour obtenir 1 ml d'un dialysat contenant un plasmide pAG1 à une concentration de 50 pg/ml. (2) Recombinaison in vitro du plasmide pAGI. A 0,5 pg de l'ADN du plasmide pAGI préparé à l'étape 1-(1) de l'exemple 3 ci-dessus, on a ajouté 10 unités de l'enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 40 pi d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mx (pH7,4), MgS04 10 mM et Naci 100 mM à 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 700C et maintenue à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction.On a fait réagir 20 pl du mélange réactionnel ainsi obtenu avec 3 unités d'ADN ligase T4 phage (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) dans 50 > 11 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgCl2 10 mM, du dithiothréitol 10 mM, de la spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) à 150C pendant une nuit. (3) Isolement du plasmide pAG14. (Curage du plasmide). Une boucle de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560) a été inoculée dans 5 ml d'un milieu LG (milieu préparé en dissolvant 10 g de Trypton, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl et de 2 g de glucose dans de l'eau échangée en ions et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre et en ajustant à pH7,2) et mise en culture à 370C pendant une nuit tout en agitant. La culture ainsi obtenue a été diluée avec une eau stérilisée.La culture diluée a alors été étendue sur un milieu d'agar LG (milieu préparé en ajoutant de l'agar au milieu LG de façon que la concentration en agar du milieu résultant soit de 1,5% en volume), avec ensuite mise en culture à 320C pendant 2 jours pour former des colonies. 100 colonies ainsi formées ont été transférées par réplique-placage sur une plaque d'agar LG contenant 10 pg/ml de tétracycline avec ensuite mise en culture à 320C pendant 2 jours. Alors, on a choisi deux cellules sensibles à la tétracycline. Pour les deux cellules ainsi choisies, l'existence du plasmide pAGi dans les cellules a été déterminée par la méthode d'isolement du plasmide décrite précédemment. Par suite, on a trouvé que les deux cellules ne contenaient pas de plasmide, c'est-à-dire que les cellules étaient une souche curée du plasmide.L'une des cellules a été utilisée comme hôte à l'étape suivante. (Transformation). La cellule curée du plasmide préparée à l'étape ci-dessus a été mise en culture dans le milieu semi-synthétique mentionné précédemment à 320C pendant 12 heures tout en agitant. On a inoculé 0,5 ml de la culture ainsi obtenue dans 50 ml du même milieu semi-synthétique et on a mis en culture à 320C tout en agitant. La densité optique (OD) de la culture à 660 nm a été surveillée en utilisant un spectrophotomètre Modèle 228 fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon. Au point dans le temps où la valeur de OD est devenue de 0,2, de la penicilline G a été ajoutée à la culture de façon que la concentration en penicilline soit de 0,3 unité/ml. La culture résultante a été incubée à 320C pendant 1,5 heures. De la culture ainsi obtenue, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 5 ml d'un milieu R (milieu préparé en dissolvant 5 g de glucose, 10 g d'acide Casamino, 10 g d'extrait de levure, 0,35 g de K2HP04, 0,15 g de KH2PO4, 1,37g de saccharose, 5,73 g d'acide N-tris-(hydroxyméthyl )méthyl-2-aminoéthane- sulfonique (appelé ci-après TES), 0,95 g de MgCl2 et 1,11 g de CaCl2 dans de l'eau distillée et échangée en ions de façon que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH7,2) pour obtenir une suspension de cellules. A 4,5 ml de la suspension de cellules, on a ajouté 0,5 ml du milieu R contenant 3 mg/ml de lysozyme (stérilisé en utilisant un filtre Millipore) avec ensuite incubation à 350C pendant 5 heures pour ainsi former des protoplastes. La culture résultante a été soumise à une centrifugation à 7000 t/mn (4500 g) à 50C pendant 7 minutes pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ainsi obtenus ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R. La suspension des protoplastes a été soumise à une centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension des protoplastes. A 0,5 ml de la suspension des protoplastes, on a ajouté un mélange de 50 Fm du mélange réactionnel de ligase obtenu à l'étape 1-(2) de l'exemple 3 et 50 rl de 2 x solution de TSMC (solution aqueuse contenant TES 50 mM, saccharose 0,8 M, MgC12 20 mM et CaC12 60 mM et ajustée à pH7,2 en utilisant NaOH).Alors, au mélange résultant on a doucement ajouté une solution de PEG solution préparée en dissolvant un polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire de 6000 dans une solution de TSMC contenant TES 25 mM, saccharose 0,4 M, MEC12 10 mM et CaCl2 30 mM, laquelle solution a été ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH, jusqu'à une concentration finale de 40% (poids/volume)3 et on a laissé reposer à température ambiante pendant 2 minutes. Alors, au mélange, on a ajouté 5 millimoles d'une solution R-PVP solution préparée en dissolvant de la polyvinyl pyrrolidone (appelée ci-après "PVP") dans le milieu R à une concentration de 40 gel , avec ensuite centrifugation à 4000 t/mn (1800 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et des précipités.Le produit surnageant a été retiré. Aux précipités, on a ajouté 5 ml de la solution R-PVP, avec ensuite centrifugation dans les memes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes comme précipités. Les protoplastes ainsi obtenus ont été doucement mis en suspension dans 0,5 ml d'une solution R-PVP. La suspension a été incubée à 300C pendant 3 heures et diluée avec une solution R-PVP pour obtenir une suspension diluée. La suspension diluée a été inoculée dans un milieu régénérant contenant 10 pg/ml de tétracycline.Le milieu régénérant étant un milieu d'agar à deux couches comprenant une couche inférieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et de l'agar aux concentrations respectives de 40 g/l et 15 g/l au milieu R et, sur la couche inférieure, une couche supérieure du milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et l'agar à des concentrations respectives de 40 g/l et 6 g/l, au milieu R ; et l'inoculation de la suspension diluée ci-dessus mentionnée a été effectuée par mélange avec 3 ml de la couche supérieure du milieu d'agar fondu avant de former la couche double. Le milieu régénérant résultant a été incubé à 320C pendant 4 jours pour former des souches résistant à la tétracycline. Des souches résistant à la tétracycline ainsi formées, 10 souches ont été choisies au hasard et on les a fait croître sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 rg/ml de tétracycline. De chacune des souches, un plasmide a été isolé sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 1-(1) de l'exemple 3. Les sites de restriction du plasmide ainsi isolé ont été déterminés en utilisant 0,5 jig du plasmide sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1, pour ainsi obtenir un plasmide pAG14. En utilisant l'ADN du plasmide ainsi obtenu, des cellules de la souche avec du plasmide de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-560) ont été transformées sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. Du transformant ainsi obtenu, on a séparé un plasmide, avec ensuite analyse sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus. Par suite, on a trouvé que le plasmide séparé avait la mEme carte de scission par endonucléase de restriction que le plasmide pAG14. (4) Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline du plasmide pAG14. A 20 oug de l'ADN du plasmide pAG14 obtenu à l'étape 1-(3) de l'exemple 3, on a ajouté 100 unités de chacune des enzymes de restriction BamHI et BglII. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ul d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 370C pendant 2 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse à 40C en utilisant un gel agarose à 1% préparé à partir d'Agarose LMP (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1.Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à une irradiation de lumière ultraviolette de façon à observer visuellement des fragments d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb. Une partie du gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Au gel découpé, on a ajouté un tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour effectuer une dissolution complète du gel agarose. A la solution résultante, on ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à l:l(volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10000 t/mn (9000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide. (5) Préparation du plasmide pAG3 et son traitement avec l'enzyme de restriction BamHI. On a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction BamHI à 4pg de l'ADN du plasmide pAG3 obtenu de Corynebacterium melassecola 22220 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-559) et on a purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1 de l'exemple 3. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ul d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH7,4), MgSO4 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 370C pendant 2 heures. Alors, on a ajouté, au mélange, un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide. (6) Isolement du plasmide pAG5O. On a fait réagir la totalité de chacun des ADN obtenus aux sous-étapes (4) et (5) de l'étape 1 de l'exemple 3 avec trois unités d'ADN ligase T4 phage dans sOjal d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgCl2 10 mM dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA à une température de 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. En utilisant 50 pi du mélange réactionnel de ligase, on a obtenu un transformant résistant à la tétracycline de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d' accession FERM BP-558), selon la même technique de transformation qu'employée à l'étape 1-(3) de l'exemple 3, à l'exception que l'incubation dans le milieu régénérant a été entreprise pendant 7 jours. On a ainsi obtenu un transformant résistant à la tétracycline. Un plasmide retenu dans le transformant résistant à la tétracycline ci-dessus obtenu a été séparé sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 1-(1) de l'exemple 3. Alors, le plasmide ainsi obtenu a été soumis à une analyse sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG5O. Sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus, des cellules de la souche de Corynebacterium melassecola 801 (déposée au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558) ont été transformées en utilisant le plasmide ci-dessus obtenu pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. La carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus. Etape 2. (Insertion d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb dans le plasmide pAG5O). A 5 pg de l'ADN du plasmide pAG50 préparé à l'étape 1-(6) de l'exemple 3, on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60 pl d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.Au mélange, on a ajouté de 1'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté deux fois le volume d'6thanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -300C pendant 3 heures puis on l'a soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ansi obtenue a été séchée sous pression réduite. Alors, la boulette a été dissoute dans 200 y1 d'un tampon BAPT contenant Tris-HCl 50 mM (pH8,4). A la solution résultante on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon). On a laissé le mélange résultant réagir à 650C pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté de plus, au mélange réactionnel, une unité de phosphatase alcaline bactérienne. On a laissé le mélange résultant réagir à 650C pendant 3 heures. Au mélange réactionnel ainsi obtenu, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Le mélange a été soumis à une centrifugation dans les mêmes conditions que.ceiles I mentionnées ci-dessus pour obtenir une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, on a agité et soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) pendant 10 minutes, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, on a soumis à agitation et à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a agité. Alors, on a laissé le mélange reposer à -300C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenu a été séchée sous vide. On a fait réagir la totalité de la quantité de l'ADN ainsi obtenu et 1 pg de 1'ADN préparé à l'étape 8 de l'exemple 1 avec 3 unités d'ADN ligase T4 phage (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) dans 50 ul d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4) MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) à une température de 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction. Etape 3.(Isolement d'un plasmide hybride pAG2001 contenant un gène codant pour PEPC) On a mis Corynebacterium melassecola 801 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558) en culture dans le milieu semi-synthétique mentionné précédemment à 320C pendant 12 heures tout en secouant. 0,5 ml de la culture ainsi obtenue a été inoculé dans 50 ml du même milieu semi-synthétique et mis en culture à 320C tout en secouant. La densité optique (OD) de la culture à 660 nm a été surveillée en utilisant un spectrophotomètre Modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon). Au point où la valeur de OD est devenu de 0,2, on a ajouté de la pénicilline G à la culture de façon que la concentration en pénicilline soit de 0,3 unité/ml.La culture résultante a été incubée à 320C pendant 1,5 heures. Des cellules ont été recueillies de la culture ainsi obtenue. Les cellules recueillies ont été mises en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension de cellules. A 4,5 ml de la suspension de cellules, on a ajouté 0,5 ml du milieu R contenant 3 mg/ml de lysozyme (stérilisé en utilisant un filtre Millipore) avec ensuite incubation à 350C pendant 5 heures pour ainsi former des protoplastes. La culture résultante a été soumise à centrifugation à 7000 t/mn (4500 g) à 50C pendant 7 minutes pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ainsi obtenus ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R. La suspension de protoplastes a été soumise à centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes.Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension de protoplastes. A 0,5 ml de la suspension de protoplastes on a ajouté un mélange de 50 pl du mélange obtenu à l'étape 2 de l'exemple 3 et 50 ri d'une solution de 2 x TSMC (solution aqueuse contenant TES 50 mM, saccharose 0,8 M, MgC12 20 mM et CaC12 60 mM et ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH). Alors, au mélange résultant on a ajouté 1,5 ml de la solution PEG, on a doucement soumis à agitation et on a laissé reposer à température ambiante pendant 2 minutes. Alors, au mélange on a ajouté 5 ml de la solution R-PVP, avec ensuite centrifugation à 4000 t/mn (1800 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et des précipités. Le produit surnageant a été retiré.Aux précipités on a ajouté 5 ml de la solution R-PVP avec ensuite centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes en tant que précipités. Les protoplastes ainsi obtenus ont été doucement mis en suspension dans 0,5 ml de la solution R-PVP. La suspension a été incubée à 300C pendant 3 heures et diluee avec la solution R-PVP pour obtenir une suspension diluée. La suspension diluée a été mélangée à 3 ml du milieu d'agar fondu ayant la meme composition que celle de la couche supérieure du milieu d'agar du milieu régénérant contenant 10 jig/ml de tétracycline à l'étape 1-(3) de l'exemple 3 et le mélange résultant a été appliqué sur la couche inférieure de milieu d'agar.Le milieu régénérant résultant a été incubé à 320C pendant 7 jours pour former des cellules résistant à la tétracycline. On a fait croître sous forme biologiquement pure les cellules ainsi formées résistant à la tétracycline sur le milieu d'agar LG contenant 10 pg/ml de tétracycline. De chacune des cellules, un plasmide a été isolé sensiblement de la meme manière qutà l'étape 1 de l'exemple 3 avec ensuite analyse sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG2001. La carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide pAG2001 est montrée sur la figure 10.Comme cela est apparent sur la figure 10, le plasmide pAG2001 est un plasmide hybride contenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction SalI, un fragment d'ADN dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique, appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb. Etape 4. (Mesure de l'activité de PEPC d'un transformant retenant le plasmide pAG2001). La cellule de Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001) retenant le plasmide pAG2001 a été mis en culture à 320C pendant une nuit dans 50 ml d'un milieu de mélasse du type employé à l'étape 1 de l'exemple 1 contenant 10 yg/ml de tétracycline. De la culture ainsi obtenue, les cellules ont été recueillies, lavées deux fois avec 20 ml d'une solution aqueuse à 0,8% de NaCl et mises en suspension dans 10 ml d'un tampon MES (pH7,0) contenant de l'acide 2-(N-morphoiino) éthanesulfonique 50 mM (appelé ci-après MES), MnS04 10 mM et EDTA 10 mx. La suspension a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules (Homogénéiseur de cellules MSK modèle 85321 fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) avec ensuite centrifugation à 14000 t/mn (20000 g) à température ambiante pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzyme brute). L'activité de PEPC et la concentration en protéine de extrait de cellules ont été déterminées sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 5 de l'exemple 1. Les résultats sont montrés au tableau 4 donné à l'étape 5 qui sera mentionnée ci-après. Etape 5. (Insertion d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb dans le plasmide pAG50). On a fait réagir 5 pg de 1'ADN du plasmide pAG50 préparé à l'étape 1-(6) de l'exemple 3 avec 15 unités d'une enzyme de restriction XbaI dans 60 ul d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à une température de 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles et un volume double d'éthanol et on laissé reposer à -300C pendant 3 heures. Ensuite, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide. L'ADN séché a été dissous dans 200 pi d'un tampon BAPT contenant Tris-HCl 50 mM (pH8,4). A la solution résultante on a ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Alors, au mélange résultant on a encore ajouté une unité de phosphatase alcaline bactérienne avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Au mélange réactionnel ainsi obtenu on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Le mélange a été soumis à centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, on a agité et soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, on a soumis à agitation et à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 millimoles puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on soumis à agitation. Alors, on a laissé le mélange reposer à -300C pendant 3 heures et l'on a soumis à centrifugation à 12000 t/mn (8900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide. On a fait réagir toute la quantité de l'ADN ainsi obtenu et 1 pg de l'ADN préparé à l'étape 7 de 1'exemple 2 avec 3 unités d'ADN ligase T4 phage (fabriqué et vendu par Nippon Gened Co., Ltd., Japon) dans 50nul d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH7,4) MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/ml de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, E.U.A.) à une température de 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction. On a ainsi obtenu un mélange réactionnel de ligase. Etape 6.(Isolement d'un plasmide hybride pAG2002 contenant un gène codant pour PEPC). En utilisant le mélange réactionnel de ligase obtenu à l'étape 5 de l'exemple 3, des cellules de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au Fermentation Resarch Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558) ont été transformées sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'exemple 3 pour obtenir des transformants résistant à la tétracycline. On a fait croître les transformants résistant à la tétracycline ainsi obtenus sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 ,ug/ml de tétracycline. Un plasmide a été isolé de chacun des transformants sensiblement de la même manière qu'à l'étape 1 de l'exemple 2 avec ensuite analyse sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1. On a ainsi obtenu un plasmide. Le plasmide obtenu a été désigné par pAG2002. La carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide pAG2002 est montrée sur la figure 11. Comme cela est apparent sur la figure 11, le plasmide pAG2Q02 est un plasmide hybride contenant le plasmide pAG5O, et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction XbaI, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium , contenant un gène codant pour PEPC et ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb. Etape 7.(Mesure de l'activité de PEPC d'un transformant retenant pAG2002). Les cellules de Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002) retenant le plasmide pAG2002 ont été mises en culture et l'on a obtenu un extrait de cellules (solution d'enzyme brute) des cellules mises en culture sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'exemple 3. En utilisant l'extrait de cellules ainsi obtenu, on a déterminé l'activité de PEPC de Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'exemple 1. Le résultat est également montré au tableau 4 donné ci-dessous ainsi que les données obtenues à l'étape 4 de l'exemple 3, en comparaison avec les données se rapportant aux cellules retenant le plasmide pAG50 et les cellules ne retenant pas de plasmide. Comme cela est apparent sur le tableau 4, les cellules retenant le plasmide pAG2001 et les cellules retenant le plasmide pAG2002 avaient une activité spécifique de PEPC élevée en comparaison aux cellules retenant le plasmide pAG50 et aux cellules ne retenant pas de plasmide. Par ailleurs, l'incubation de la cellule de Corynebacterium melassecola 801, ne retenant pas de plasmide, a été effectuée en l'absence de tétracycline. TABLEAU 4. Souche Activité spécifique de PEPC *1) 801 *2) 0,06 801 (pAG50) 0,06 1 801 (pAG2001) 0,22 801 (pAG2002 0,79 Notes :*1) comme au tableau 1 *2) Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558. REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il est dérivé d'une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, contenant un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase. 2. Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie précitée produisant 1 t acide glutamique est le micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558. 3. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il-a les sites de restriction suivants un premier site PstI, un second site PstI, un premier site EcoRI, un troisième site PstI, un premier site HindîlI, un premier site BamHI, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un second site Hindili, un troisième site Hindîli, un premier site SalI, un second site EcoRI, un quatrième site HindîlI, un troisième site EcoRI, un sixième site PstI, un septième site PstI, un cinquième site HindîlI, un huitième site PstI, un second site BamHI, un second site SalI, un neuvième site PstI et un troisième site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site EcoRI, ledit troisième site PstI, ledit premier site HindîlI, ledit premier site BamHI, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit second site HindîlI, ledit troisième site HindIII, ledit premier site SalI, ledit second site EcoRI, ledit quatrième site HindîlI, ledit troisième site EcoRI, ledit sixième site PstI, ledit septième site PstI, ledit cinquième site HindîlI, ledit huitième site PstI, ledit second site BamHI, ledit second site SalI, ledit neuvième site PstI et ledit troisième site BamHI étant respectivement placés à environ 1,0 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ 3,5 kb, environ 3,7 kb, environ 4,0 kb, environ 4,3 kb, environ 4,4 kb, environ 5,0 kb, environ 6,3 kb, environ 6,5 kb, environ 6,7 kb, environ 6,9 kb, environ 7,0 kb, environ 7,0 kb, environ 7,4 kb, environ 7,4 kb, environ 8,3 kb, environ 9,5 kb et 10,3 kb dudit premier site PstI. 4. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent un premier site PstI, un second site PstI, un premier site EcoRI, un troisième site PstI, un premier site Hindîli, un premier site BamHI, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un second site HindIII, un troisième site HindlII, un site SalI, un second site EcoRi, un quatrième site HindîlI, un troisième site EcoRI, un sixième site PstI, un septième site PstI, un cinquième site HindILI, un huitième site PstI, et un second site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site EcoRI, ledit troisième site PstI, ledit premier site HindIII, ledit premier site BamHI, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit second site HindîlI, ledit troisième site HindîlI, ledit site SalI, ledit second site EcoRi, ledit quatrième site HindIII, ledit troisième site EcoRi, ledit sixième site PstI, ledit septième site PstI, ledit cinquième site HindIII, ledit huitième site PstI et ledit second site BamHI étant respectivement placés à environ 1,0 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ 3,5 kb, environ 3,7 kb, environ 4,0 kb, environ 4,3 kb, environ 4,4 kb, environ 5,0-.kb, environ 6,3 kb, environ 6,5 kb, environ 6,7 kb, environ 6,9 kb, environ 7,0 kb, environ 7,0 kb, environ 7,4 kb et environ 7,4 kb dudit premier site PstI. 5. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction suivants un premier site PstI, un premier site HindIII, un premier site BamHI, un second site PstI, un troisième site PstI, un second site HindîlI, un troisième site HindIII, un site SalI, un premier site EcoRI, un quatrième site HindîlI, un second site EcoRI, un quatrième site PstI, un cinquième site PstI, un cinquième site HindIII, un sixième site PstI, et un second site BamHI, ledit premier site HindîlI, ledit premier site BamHI, ledit second site PstI, ledit troisième site PstI, ledit second site HindîlI, ledit troisième site Hindili, ledit site SalI, ledit premier site EcoRI, ledit quatrième site HindIII, ledit second site EcoRi, ledit quatrième site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit cinquième site HindIII, ledit sixième site PstI et ledit second site BamHI étant respectivement placés à environ 0,1 kb, environ 1,0 kb, environ 1,2 kb, environ 1,5 kb, environ 1,8 kb, environ 1,9 kb, environ 2,5 kb, environ 3,8 kb, environ 4,0 kb, environ 4,2 kb, environ 4,4 kb, environ 4,5 kb, environ 4,5 kb, environ 4,9 kb et environ 4,9 kb dudit premier site PstI. 6. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent un premier site HindîlI, un second site HindIII, un premier site SalI, un premier site EcoRi, un troisième site HindîlI, un second site EcoRi, un premier site PstI, un second site PstI, un quatrième site HindîlI, un troisième site PstI, un site BamHI et un second site SalI, ledit second site HindIII, ledit premier site SalI, ledit premier site EcoRI, ledit troisième site HindîlI, un second site EcoRI, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, ledit quatrième site Hindîli, ledit troisième site PstI, ledit site BamHI et ledit second site SalI étant respectivement placés à environ 0,1 kb, environ 0,7 kb, environ 2,0 kb, environ 2,2 kb, environ 2,4 kb, environ 2,6 kb, environ 2,7 kb, environ 2,7 kb, environ 3,1 kb, environ 3,1 kb et environ 4,0 kb dudit premier site HindîlI. 7. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent un premier site PstI, un second site PstI, un premier site HindîlI, un second site HinaIII, un site SalI, un premier site EcoRI, un troisième site HindIII, un second site EcoRI, un troisième site PstI, un quatrième site PstI, un quatrième site Hindîli, un cinquième site PstI, et un site BamHI, ledit second site PstI, ledit premier site HindIII, ledit second site HindîlI, ledit site SalI, ledit premier site EcoRI, ledit troisième site HindîlI, ledit second site EcoRI, ledit troisième site PstI, ledit quatrième site PstI, ledit quatrième site HindIII, ledit cinquième site PstI, et ledit site BamHI étant respectivement placés à environ 0,3 kb, environ 0,6 kb, environ 0,7 kb, environ 1,3 kb, environ 2,6 kb, environ 2,8 kb, environ 3,0 kb, environ 3,2 kb, environ 3,3 kb, environ 3,3 kb, environ 3,7 kb, et environ 3,7 kb dudit premier site PstI. 8. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent un site SalI, un premier site EcoRi, un premier site HindîlI, un second site EcoRI, un premier site PstI, un second site PstI, un second site HindîlI, un troisième site PstI et un site BamHI, ledit premier site EcoRI, ledit premier site HindîlI, ledit second site EcoRI, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, ledit second site HindîlI, ledit troisième site PstI, et ledit site BamHI étant respectivement placés à environ 1,3 kb, environ 1,5 kb, environ 1,7 kb, environ 1,9 kb, environ 2,0 kb, environ 2,0 kb, environ 2,4 kb et environ 2,4 kb dudit site SalI. 9. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent un premier site EcoRi, un premier site Hindîli, un second site EcoRI, un premier site PstI, un second site PstI, un second site HindIII, un troisième site PstI, et un site BamHI, ledit premier site HindîlI, ledit second site EcoRI, ledit premier site PstI, ledit second site PstI, un second site HindîlI, un troisième site PstI et un site BamHI étant respectivement placés à environ 0,2 kb, environ 0,4 kb, environ 0,6 kb, environ 0,7 kb, environ 0,7 kb, environ 1,1 kb et environ 1,1 kb dudit premier site EcoRI. 10. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un premier fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 et un second fragment d'ADN contenant un gène pour une réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement lié audit second fragment d'ADN. 11. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité est le fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 3 à 9. 12. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hote-vecteur où Escherichia coli est utilisé comme hôte. 13. ADN recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce que le vecteur precité est un élément choisi dans le groupe consistant en un plasmide pBR325 et ses dérivés. 14. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur'où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte. 15. ADN recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pAGi, plasmide pAG3, plasmide pAG50 et leurs dérivés. 16. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 1 et est appelé pAG203. 17. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 9,3 kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 2 et est appelé pAG211. 18. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 22,9 kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 4 et est appelé pAG204. 19. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 17,5 kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 5 et est appelé pAG221. 20. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 10,9kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure 10 et est appelé pAG2001. 21. ADN recombinant selon la revendication 1Q, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 19,1 kb et une carte de scission par endonucléase de restriction montrée sur la figure Il et est appelé pAG2Q02. 22. Micro-organisme caractérisé en ce qu'il contient une bactérie et 1'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 10 à 21, qui est contenu dans ladite bactérie. 23. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie appartenant au genre Escherichia. 24. Micro-organisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Escherichia est Escherichia coli. 25. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. 26. Micro-organisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium. 27. Micro-organisme selon la revendication 26, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Corynebacterium est Corynebacterium melassecola. 28. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Escherichia coli K12 souche 342-167 et 1'ADN recombinant recombinaprécité est le plasmide pAG203 selon la revendication 16 et que l'on appelle la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG203). 29. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Escherichia coli K12 souche 342-167 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG211 de la revendication 17 que l'on appelle la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG211). 30. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Escherichia coli K12 souche 342-167 et 1'ADN recombinant précité est le plasmide pAG204 de la revendication 18 que l'on appellera la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG204). 31. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Escherichia coli K12 souche 342-167 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG221 de la revendication 19, que l'on appellera la souche 342-167 de Escherichia coli K12 (pAG221). 32. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Corynebacterium melassecola 801 et 1'ADN recombinant précité est le plasmide pAG2001 de la revendication 20, que l'on appellera Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001). 33. Micro-organisme selon la revendication 22, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Corynebacterium melassecola 801 et 1'ADN recombinant précité est le plasmide pAG2002 selon la revendication 21, que l'on appellera Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002).