Brevet FR2578054A1 — publié le 19860829

La présente invention a pour objet des procédés et dispositifs pour la préparation, le conditionnement et l'utilisation de supports de réactifs destinés à l'analyse automatique d'échantillons par mesure de la transmission lumineuse. Elle trouve une application toute particulière dans les systèmes d'analyse faisant appel à des réactions enzymatiques. Dans l'art antérieur existe une quantité de procédés permettant à l'aide de réactifs de définir la teneur en un ou plusieurs composants par mesure colorimétrique, par mesure de la transmission (ou de l'absorption lumineuse) ou autres mesures optiques ou optoélectroniques. On répartit généralement un échantillon liquide entre un certain nombre d'éprouvettes contenant un réactif et on observe l'évolution du contenu en prenant des mesures optiques en début, et/ou pendant et/ou en fin de réaction. La précision de la mesure est liée à celle des dosages absolus et/ou relatifs des composants et aux conditions physico-chimiques d'exécution des réactions, ce qui sous-entend non seulement un bon dosage des échantillons et des réactifs mais également une excellente homogénéité des réactifs lorsque ceux-ci sont à plusieurs composants ce qui est très souvent le cas. Or la tendance actuelle vers l'automatisation des analyses et vers des préldvements d'échantillons de plus en plus restreints impose une méticuleuse précision. Si un réactif composite est sous forme de solution, il ne pose que rarement des problèmes d'hétérogénéité, par contre dans les analyses en petites quantités, on utilise de plus en plus des réactifs à l'état solide ce qui complique les problèmes d'homogénéisation poussée des composants puis de dissolution dans l'échantillon tel quel ou avec un solvant. Il est certain qu' l'heure actuelle, le besoin est de plus en plus impérieux de disposer d'analyseurs automatiques performants, fiables, précis, simples à mettre en oeuvre et portant sur des quantités de plus en plus faibles. La présente invention s'applique à tous les procédés et dispositifs d'analyse par mesures optiques ou optoélectroniques -des caractéristiques d'échantillons en début, et/ou pendant et/ou en fin de réaction. C'est le cas en particulier des appareils de mesure de transmission ou d'absorption lumineuse. L'usage de tels appareils est de plus en plus répandu dans tous les domaines de la chimie, de la biologie, de la biochimie, et donc de la médecine, de la pharmacie, de la bio-industrie, de l'agro-alimentaire, etc... Mais si l'industrie peut disposer d'équipements relativement importants, il est évident que dans des domaines comme celui de l'analyse médicale, on recherche des équipements légers et néanmoins performants. C'est le cas par exemple de l'analyse hématologique qui s'oriente vers le dosage d'un nombre croissant de composants du sang et qui requiert de plus en plus de rapidité et la précision tout en limitant à un minimum la quantité d'échantillon prélevée. Dans ce qui suit et à titre illustratif, on se reportera à cette analyse sanguine étant bien entendu que l'invention s'applique à d'innombrables autres types d'analyse. L'analyse sanguine accumule un nombre assez élevé d'exigences ce qui constitue un terrain d'application de choix pour la présente invention. On abandonne actuellement les prélèvements importants que nécessitait un nombre souvent non négligeable de tubes à essais eux-mêmes de capacité non négligeable mais qui présentaient l'avantage de demander moins de précautions que les analyses en petites quantités. L'usage de réactifs liquides assurait l'homogénéité, la facilité de mélanger avec l'échantillon de sang, mais cela nécessitait une bonne rapidité d'exécution pour éviter des coagulations et autres décantations et dégradations des échantillons en attente d'analyse, inconvénients réduits dans les analyses de sérum. On a donc proposé des supports à plusieurs cellules contenant des réactifs, un échantillon liquide étant amené aux diverses cellules simultanément ou successivement, les cellules transparentes étant soumises simultanément ou successivement aux mesures optiques ou optoélectroniques, généralement à une longueur d'onde ou à plusieurs simultanément ou successivement grâce, en général, à des jeux de filtres monochromatiques. La mesure est faite à l'aide de sources lumineuses et de capteurs ou détecteurs le plus souvent optoélectroniques, entre lesquels on vient intercaler les cellules contenant les mélanges réactionnels d'échantillons et de réactifs et, le cas échéant, des filtres. Dans le cas de certaines mesures différentielles, on prévoit des cellules de référence vides ou contenant notamment le produit à analyser seul ou un réactif seul. On citera par exemple les dispositifs des brevets français suivants : 2 400 700, 2 424 531 et 2 468 909. Dans ces documents sont décrits des supports de réactifs en forme générale de disques présentant un récipient ou cuvette centrale destinés à recevoir l'échantillon liquide qui communique avec une série de cellules périphériques contenant les divers réactifs. Ces supports rotatifs ou rotors présentent l'avantage d'une facilité de répartition de l'échantillon liquide entre cuvette centrale et cellules équidistantes de la cuvette -et équidistantes entre elles grâce à la force centrifuge, ce qui assure la meilleure division statistique. Par ailleurs ils peuvent être de dimensions réduites (quelques centimetres de diamètre, cuvette centrale de l'ordre du centimètre cube, vingt à trente cellules de quelques millimètres cubes), ce qui, en matière plastique transparente, peut être réalisé aisément, tout le problème étant d'assurer la mise en place des compositions réactives, le conditionnement, la conservation, puis l'utilisation de ces supports de réactifs. Comme échantillon on utilise généralement du plasma sanguin dilué de l'ordre de 10 à 100 fois dans l'eau distillée. Or il est évident que l'on doit recourir à des réactifs solides pour éviter des migrations d'une cellule vers la cuvette centrale d'une cellule à l'autre. Mais comme on l'a souligné, un réactif solide composite de petit volume doit être minutieusement dosé c' est-à-dire qu'aussi bien la quantité totale de réactifs que la teneur en ses divers composants doivent être précisément définies dans chaque cellule. Quant à la répartition et au dosage de l'échantillon, la disposition symétrique centrale de ces supports peut l'assurer aisément grâce par exemple à une rotation axiale entraînant par force centrifuge le remplissage de chaque cellule. Dès lors que les volumes de celles-ci sont bien calibrés ce qui peut s'obtenir aisément par moulage de la matière plastique, ce dosage est bien assuré. I1 faut ensuite une bonne solubilité des réactifs dans l'échantillon ou le solvant . L'essentiel repose donc sur la préparation et la mise en place des réactifs, le conditionnement, puis la conservation et l'utilisation des supports équipés de leurs réactifs. Or, les réactifs sont de plus en plus complexes pour nombre de raisons. Pour illustrer cette tendance, on se référera à l'analyse par voie enzymatique qui se répand aujourd'hui dans de très nombreux domaines et en particulier en biochimie. Dans le cas de l'analyse sanguine, elle convient à la mesure de la teneur du nombre de métabolites (urée, glucose ou cholestérol par exemple) et d'enzymes (créatinine-phosphokinase, glutamyltransférase ou amylase, par exemple). Toujours pour illustrer les problèmes posés par les réactifs complexes, on peut, au suet des enzymes utilisés, donner les indications suivantes expliquant la nécessité de ces compositions faisant appel à nombre de composants. Tout d'abord, ces réactifs recourent parfois à l'association de deux enzymes ou plus. Il faut en général prévoir un substrat qui participe à la réaction et souvent un activateur d'enzyme. Par ailleurs il faut, dans de nombreux cas, éviter des réactions secondaires par exemple grâce à un agent complexant les ions gênants ou dégradant une substance pouvant interférer. On doit aussi prévoir des stabilisants et/ou charges et/ou tampons. Il faut également souvent des chromogènes (pour les mesures optiques) et des émulsifiants qui pourront intervenir comme on le verra ci-après aux stades de la lyophilisation et/ou de la remise en solution réactionnelle. Il est donc évident que l'on peut arriver ainsi à des compositions réactives pouvant comprendre jusqu'à une quinzaine de constituants. On comprend aisément les problèmes que pose l'obtention de doses de quelques milligrammes ou centigrammes elles mêmes solides et à compositions précises et stables dans le temps. Pour parvenir à cette stabilité, à cette homogénéité et à cette solubilité dans l'échantillon ou le solvant et ceci pour un corps solide et en quantités minimes, la présente invention utilise des caractéristiques particulières et nouvelles des supports de réactifs permettant le remplissage correctement dosé, l'emprisonnement des réactifs dans les cellules, et la conservation, ce qui est assuré sur le plan des réactifs eux-mêmes par le travail sous atmosphère d'azote ou autre gaz inerte et le passage par une phase de lyophilisation. Ce procédé consiste essentiellement en la préparation de la composition de chaque mélange réactionnel, suivi de la mise en place dans les cellules du support ouvert, de la fermeture partielle de celui-ci, de la mise du support sous azote ou autre gaz inerte, de sa fermeture et de sa mise sous conditionnement, les compositions étant soumises à lyophilisation soit avant la mise en place des produits solides lyophilisés dans les cellules, soit après la mise en -place des produits à l'état liquide dans les cellules, la lyophilisation étant alors conduite sur les supports partiellement clos. Les supports doivent dans tous les cas permettre, lors du remplissage, l'accès aux cellules pour mise en place de solides ou de liquides, la fermeture partielle par fixation du couvercle, purgeant ainsi l'air qui est inclus dans le support, -et la fermeture du joint entre couvercle et base présentant cellules et cuvette centrale, et de l'ouverture de cette cuvette permettant l'introduction postérieure des échantillons. Par ailleurs on peut prévoir une segmentation du support permettant d'éviter certaines interférences entre les divers mélanges réactionnels surtout si l'on travaille avec des solvants différents et/ou à concentrations différentes, ce qui nécessite autant d'ouvertures d'accès aux divers segments. En ce qui concerne le remplissage, doit être résolu le problème de placer le mélange réactionnel adéquat dans une cellule bien repérée. d'un support bien défini. Pour ce faire, ces supports sont munis de dispositifs permettant le repérage d'une cellule dite NO 0 et de dispositifs de signalisation du type de support, c'est à dire de la ou des recherches analytiques correspondant au support.Ce problème de repérage de la cellule NO 0 et du type de support se retrouvera dans les mêmes conditions lors de l'utilisation. Pour mieux faire comprendre les caractéristiques techniques et les avantages de la présente invention, on va en décrire des exemples de réalisation étant bien entendu que ceux-ci ne sont pas limitatifs quant à leur mode de mise en oeuvre et aux applications qu'on peut en faire. On se référera à la figure unique qui représente en perspective cavalière partiellement arrachée un support de réactifs permettant la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. Le support présente la forme générale d'un disque pouvant pivoter autour de son axe, ensemble que l'on appellera ci-après le rotor. Il comprend une base 1 et un couvercle 2 pouvant être constitués en matière plastique transparente moulée. La base 1 présente une cuvette centrale 3 et une série de cellules périphériques 4 reliées à la cuvette 3 par des canaux 5 sensiblement radiaux. Chaque ensemble constitué par un canal 5 ou équivalent et la cellule qui lui est associée peut être isolée de ses voisins par des nervures 6 sensiblement radiales et de l'extérieur parue nervure circulaire 7. Ces nervures 6 et 7 peuvent servir au soudage ou au collage du couvercle 2 sur la base 1, fixation pouvant être ponctuelle ou linéaire (le long- de ces nervures). Ces nervures peuvent lors du soudage ou du collage être en tout ou partie écrasées. Il est évident d'ailleurs comme l'expérience l'a montré que les canaux 5 peuvent être inutiles si le jeu laissé entre soudures ou collages permet la communication entre cuvette 3 et cellules 4 et le passage de l'azote puis des échantillons à analyser. On peut également isoler totalement une cellule 4 et la rendre inaccessible à l'échantillon, par exemple en la privant de son canal 5, ce qui permet d'en faire la cellule NO 0 qui restera vide ou -contiendra au départ solvant ou autre substance, en vue de mesures différentielles par exemple. Dans ce cas les dispositifs optiques peuvent d'eux-mêmes repérer cette cellule NO 0. Le couvercle 2 présente une cheminée centrale 8 au centre d'une surface généralement plate. Au-dessus des cellules 4, le couvercle 2 ainsi que le fond des cellules 4 doivent être des lames transparentes à faces de préférence parallèles pour faciliter les mesures optiques. Le couvercle 2 et la base 1 présentent respectivement des rebords 9 et 10 entre lesquels on pourra placer un joint par exemple posé par voie thermique. Ce joint 11 repose entre les rebords 9 et 10 sur la périphérie 12 du couvercle 2. Deux nervures 13 de la base 1 et 14 du couvercle 2 peuvent créer une chicane améliorant la fixation du couvercle 2 sur la base 1 et formant chicane d'étanchéité. Sous la cuvette 3 une douille cylindrique 15 qui présente par exemple un crantage 16 permettant le reprage de la cellule N 0 et l'entraînement en rotation de l'ensemble, et/ou des saillies ou mesures de guidage dû rotor sur l'arbre d'entraînement en rotation de la machine de remplissage puis de la machine de mesure optique. Le couvercle 2 peut également présenter des signaux d'identification optique par exemple un anneau 18 à signalisation digitale telle que des zones claires et des zones sombres qui peuvent être lues et identifient le type de rotor. On peut d'ailleurs concevoir que si la base I et le couvercle 2 présentent par exemple une reprise de positionnement relatif angulaire (encoche et saillie par exemple), les signaux 18 peuvent servir également à identifier la cellule N 0. La cheminée 8 peut être fermée par un bouchon 19 de forme générale cylindrique à tête élargie pour empêcher son enfoncement trop profond dans la cheminée 8. Ce bouchon 19 présente des concavités 20 ouvertes vers la cuvette et closes vers le haut de façon à permettre, lorsque le bouchon n'est pas totalement enfoncé comme sur la figure, la communication entre cuvette 3 et l'extérieur. Le type de rotor ci-dessus décrit est particulièrement adapté à la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention dont on donnera. Exemple 1 : Lyophilisation in situ On prépare les compositions réactives destinées à chacune des cellules (y compris la substance ou composition réactive ou non destinée éventuellement à la cellule NO 0. Ces compositions sont bien homogénéisées puis dosées dans chaque cellule 4. Le couvercle 2 est placé sur la base 1 et fixé par tout moyen adéquat (collage, soudage etc...) en prenant soin de ne pas détériorer thermiquement les réactifs. On peut également mettre en place le joint 11. Le bouchon 19 est placé dans la cheminée 8 à mi-hauteur pour assurer la communication avec l'extérieur. On peut placer un certain nombre de rotors sur un ou plusieurs plateaux et l'on entre en lyophilisation. Le cycle de lyophilisation sera de tout type classique convenant aux diverses compositions réactives. On notera en passant que des réactifs différents devront être lyophilisés dans les mêmes conditions, il faudra jouer sur les divers additifs et composants pour assurer cette lyophilisation commune. On va purger les rotors en éliminant l'air. par exemple par un courant d'azote ou autre gaz inerte qui pénètre dans les rotors par les concavités 20 du bouchon 19. Une fois terminé le cycle de lyophilisation, on enfonce l'ensemble des bouchons 19 pour maintenir l'azote ou gaz inerte dans les rotors et on les extrait du lyophilisateur. On les conditionne alors sous emballage plastique ou équivalent de préférence scellé et éventuellement rempli d'azote ou de gaz-inerte. Il est évident que comme pour toute opération de lyophilisation, on travaille sous atmosphère contrôlée. En ce qui concerne le remplissage, la machine doit comprendre un support repérant la cellule NO 0 grâce à l'un des systèmes prévus plus haut et dans les autres cellules qui sont remplies par autant de doseuses, simultanément ou successivement, rotor fixe ou tournant pas à pas. Exemple 2 : Lyophilisation préalable On prépare les diverses compositions réactives et on les lyophilise ce qui permet de travailler dans des conditions adaptées à chaque composition. On dose les quantités adéquates que l'on place dans chaque cellule. Cette opération peut être simplifiée par la préparation de comprimés correspondant à chaque dose, que l'on place dans les diverses cellules. On effectue le remplissage par des moyens mécaniques correspondant à ceux de remplissage liquide quant au repérage des différentes cellules. On place le couvercle 2 sur la base 1, on la fixe, on place le joint 11. On met le bouchon 19 à mi-hauteur, on purge à l'azote ou à un gaz inerte on bouche puis on conditionne en emballage de préférence étanche et éventuellement rempli d'azote ou de gaz inerte. Toutes ces opérations doivent être effectuées sous atmosphère à humidité contrôlée. Ce procédé présente l'avantage d'adopter les conditions de lyophilisation à chaque composition et non chaque composition à des conditions communes comme c'était le cas à l'exemple 1. I1 faut par contre prévoir des liants pour constituer les comprimés ou équivalents, mais cela constitue une bonne garantie contre les transits de réactifs entre cellules ou entre cellules et cuvette centrale. Qui plus est, cela évite les précautions à prendre lors des manutentions de rotors contenant les réactifs liquides non encore lyophilisés. Lors de l'utilisation, quel que soit le procédé utilisé pour la fabrication, on sort le rotor de son emballage, on débouche et on place l'échantillon par la cheminée dans la cuvette centrale. De préférence on rebouche par exemple à mi-hauteur et on place sur l'appareil analyseur ; la cellule NO 0 est repérée soit par les dispositifs mécaniques de la douille soit optiquement sur l'anneau 18 ou directement sur la cellule si celle-ci est vide ou contient une substance ou composition d'étalonnage. La machine peut -être du type faisant l'objet de la demande de brevet français NO déposée ce jour. En ce qui concerne l'échantillon lorsqu'on veut analyser du sérum sanguin, on le-prépare généralement par centrifugation, puis on peut le diluer dans 10 à 100 fois son volume de solvant et en particulier dans 15 à 60 fois son volume d'eau distillée. On a décrit ici des dispositifs et des procédés en se référant à l'analyse par voie enzymatique et à l'analyse sanguine. Il est évident que l'on peut les appliquer à d'autres types d'analyses et à tout type de support de réactifs solides dans lesquels on introduit un échantillon liquide ou dissous dans un solvant que l'on amène simultanément ou successivement aux diverses cellules contenant les réactifs. Ces supports doivent être transparents au moins dans la zone permettant des mesures optiques sur les cellules et leur contenu. Comme on l'a noté, il est possible de sectoriser des supports pour permettre de disposer de plusieurs cuvettes connectées chacune à une ou plusieurs cellules. Ceci permet d'éliminer les risques de transit entre cellules et/ou cuvettes mais surtout de travailler avec des solvants différents et/ou à des concentrations différentes. Sur des rotors tels ceux de la figure, cette sectorisation peut être réalisée par des séparations radiales, en prévoyant de préférence plusieurs accès aux cheminées bien repérés pour y déposer les divers échantillons. On notera que si l'on a parlé d'analyse du sérum, on peut analyser le sang et toutes autres substances biologiques (urine, lait, extraits végétaux) ou non (compositions chimiques). Il faut bien entendu choisir alors le matériau de réalisation du support inerte aux échantillons, aux solvants et aux réactifs. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de supports de réactifs comprenant au moins un récipient 3 pour échantillon liquide ou dissous dans un solvant communiquant avec une ou plusieurs cellules 4 contenant chacune un ou plusieurs réactifs solides, caractérisé par le fait que lesdites cellules desdits supports sont garnies de leurs réactifs, que les supports sont partiellement clos, purgés de leur air par un gaz inerte puis clos, les réactifs subissant avant clôture du support une lyophilisation. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que la lyophilisation a lieu sur les réactifs avant mise en place dans les cellules 4. 3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé par le fait que les réactifs lyophilisés sont mis sous forme de comprimés avant mise en place dans les cellules 4. 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que les réactifs sont lyophilisés dans les supports chargés en réactifs liquides. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé par le fait que les supports~ sont mis sous conditionnement scellé. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé par le fait que le conditionnement contient un gaz inerte. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé par le fait que le gaz inerte est l'azote. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que les réactifs sont enzymatiques. 9 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé par le fait que chaque support est composé d'au moins un récipient ou cuvette 3 destinée à recevoir au moins un échantillon liquide ou dissous, communiquant chacune avec au moins une cellule 4 destinée à recevoir au moins un réactif, -l'ensemble des récipients/cuvettes et des cellules étant disposés dans une base 1 que que l'on ferme avec un couvercle 2 fixé sur la base en ménageant les communications 5 entre récipients/cuvettes et cellules et en emprisonnant les réactifs, l'ensemble étant clos pour emprisonner un gaz inerte. 10 - Dispositif selon la revendication 9 caractérisé par le fait que les supports sont circulaires et rota tifs, les cellules 4 étant disposées périphériquement pour assurer la circulation des échantillons par voie centrifuge. 11 - Dispositif selon l'une des revendications 9 ou 10 caractérisé par le fait que les supports présentent des moyens de détection 16, 17, 18 d'une cellule de référence. 12 - Dispositif selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé par le fait que les supports sont sec torisés.