Brevet FR2575666A1 — publié le 19860711

PROCEDE ET DISPOSITIF POUR LA SEPARATION CHROMATOGRAPHIQUE DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES. L'invention concerne un procédé et un dispositif permettant de séparer, par adsorption sélec- tive, des macromolécules biologiques, telles que protéines, en- zymes, toxines, anticorps... en vue d'obtenir des solutions en- richies dans une ou des macromolécules recherchées. Les macromolécules biologiques sont caractérisées par des masses moléculaires très élevées et une tendance à se dénaturer, provoquant la perte de leur acti- vité biologique ou de leur capacité fonctionnelle (exemple: dénaturation des protéines en peptides); ces propriétés limi- tent le type de procédés de séparation utilisables à l'échelle industrielle pour les purifier (précipitation, ultrafiltration et chromatographie). Les procédés de chromatographie (chroma- tographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité ou chro- matographie d'exclusion) constituent actuellement les techni- ques préparatives les plus spécifiques et les mieux adaptées pour la production à échelle industrielle de macromolécules de pureté élevée. Ces procédés sont mis en oeuvre par percolation d'une solution contenant les macromolécules biologiques à travers un lit fixe de résines spécifiques aptes à engendrer une adsorption sélective de celles-ci, soit par échanges d'ions, soit par liaisons réversibles avec un ligand, soit encore par un phénomène physique d'exclusion lié à la taille différente des macromolécules à séparer. Dans le cas o la (ou les) macro- molécule recherchée est fixée sur la résine, une élution de cette dernière avec une solution de pH ou de force ionique appropriée permet de la séparer et de l'obtenir purifiée et concentrée. Dans le cas o la macromolécule recherchée reste dans la solution traitée, (les autres macromolécules étant fixées sur la résine) on obtient directement la séparation recherchée. Cette technique de chromatogra- phie en lit fixe et ses performances sont bien connues dans le secteur des biotechnologies et on pourra notamment se reporter- aux documents suivants qui en fournissent des exemples: - "Method of Plasma Protein fractio- nation", by 3.M. CURLING, Académie Press, 1980 p. 149 - 160, - "Protein recovery by ion exchange, by D.T. JONES Bsc, Food Processin Industry, April 1975 p. 21, -23, - "Nouveau procédé de valorisation du lactosérum" par B. MIRABEL, RhÈne-PouIenc Industries, Informa- tions chimie n 175, mars 1978 p. 105 - 109, - Brevets FR 2.321.932 et 2. 359.634 décrivant de nouvelles résines échangeuses d'ions pour la sépa- ration de protéines. Toutefois, ces procédés de sépara- tion chromatographique en lit fixe présentent des défauts dont le plus grave réside dans l'apparition progressive d'un colma- tage du lit; ce colmatage est essentiellement provoqué par les impuretés solides en suspension dans la solution et, souvent, par la précipitation de certains composants de celle-ci. Les conséquences en sont extremement graves sur le plan industriel. Pour conserver un débit de percolation constant au cours du temps, la pression d'entrée de la solution doit augmenter jus- qu'à prendre des valeurs de l'ordre de 3 à 4 fois superieures aux valeurs nominales, ce qui entraine des difficultés techni- ques considérables ou même peut être inacceptable dans certai- nes applications. De plus, le nettoyage cyclique des résines est une opération extrêmement délicate en pratique et conduit généralement à les laver dans des enceintes séparées, ce qui fait obstacle à un fonctionnement continu des installations et impose des manipulations délicates et onereuses. I1 est à noter que certaines résines minérales ont des supports fragiles qui se cassent au cours des nettoyages pour donner des fines suscep- tibles ensuite d'obstruer certaines zones du lit, et que cer- taines résines organiques ne peuvent pas être nettoyées lorsque leurs mailles sont colmatées et doivent être rebutées. Dans certains cas, le colmatage entraîne une prise en masse du lit dans son ensemble et un nettoyage n'est plus possible. Une au- tre consequence extrêmement préjudiciable du colmatage réside dans la dérive de la capacité de fixation du lit de résine après plusieurs nettoyages: quelles que soient les précautions prises, une certaine proportion d'impuretés reste fixée sur la résine et, peu à peu, la capacité de fixation de celle-ci dé- croIt jusqu'à ce qu'il devienne nécessaire de la rebuter. Ces difficultés sont bien connues des spécialistes de la chromatographie biologique et, dans la plupart des cas, elles obligent à réaliser une épuration appro- fondie des solutions avant leur traitement. Cette épuration est un facteur d'augmentation considérable du coût du procédé et limite l'application de celui-ci à l'obtention de produits de valeur élevée (médicament...) écartant son utilisation dans un grand nombre d'applications o les macromolécules produites pré- sentent une plus faible valeur (traitement de certains produits naturels d'origine biologique ou de sous-produits d'industries notamment agro-alimentaire). Un autre défaut des procédés de chromatographie en lit fixe réside dans la brièveté de la durée de vie des résines qui sont assez rapidement détruites par les contraintes provoquées par leur tassement et les divers traite- ments intermédiaires de lavage et décolmatage qu'elles subissent. Actuellement, les problèmes évoqués ci-dessus demeurent non résolus ou résolus au prix d'une augmen- tation importante des coûts de mise en oeuvre; compte tenu de l'importance économique de ce type de traitements qui touchent aussi bien le secteur alimentaire, que le secteur pharmaceutique, vétérinaire, etc... , de nombreuses études ont été effectuées pour tenter de minimiser les conséquences préjudiciables résu- mées précédemment, afin de pouvoir profiter pleinement des per- formances des procédés chromatographiques. Ainsi certains au- teurs ont préconisé une mise en oeuvre en lit tassé mobile, constitué par un lit qui est déplacé couche par couche par pré- lèvement de la résine à une extrémité avec réinsertion à l'au- tre extrémité après lavage et nettoyage (D.T. 3ones BSc, "Pro- tein recovery by ion exchange"). Toutefois, aucune solution satisfaisante d'application générale, n'a jusqu'à présent été trouvée, certains défauts graves subsistant toujours, tels par exemple que la nécessité de nettoyage, la dérive de la capaci- té de fixation et l'usure des résines. Par ailleurs, dans d'autres sec- teurs techniques et en particulier dans celui des séparations minérales, on réalise depuis longtemps des chromatographies en lit fluidisé, qui évitent le colmatage et réduisent l'usure des résines: - séparation d'ions métalliques: "A continuous ion exchange column, by Turner and Church, Trans. Instn Chem. Engrs, Vol 41, 1963 p. 283 - 288, - extraction d'uranium: "Assessment of Fluidised Bed Ion Exchange Equipment, Michaël 3. Slater, J. Appl. Chem. Biotechnol. 1975, vol. 25 p. 367 - 378. Ces procédés de chromatographie en lit fluidisé sont connus depuis plus de 20 ans pour séparer des molécules minérales de petite taille (ayant une bonne sta- bilité). Toutefois, les biotechniciens n'ont jamais tenté de les utiliser pour la séparation des macromolécules biologiques, car cette technique a toujours paru impossible à adapter à ce type de séparation pour diverses raisons plus ou moins objec- tives. Certaines tiennent, dans l'esprit des spécialites, au type de résines spécifiques des macromolécules biologiques (trop faible granulométrie, densité trop proche de celle de l'eau, nature physique inadaptée), qu'il serait impossible de fluidiser sans entraînement des particules dans le flux. D'autres raisons tiennent à la cinétique de fixation des macro- molécules biologiques, qui, en raison notamment des volumes intersticiels trop importants, subirait une chute d'efficacité en lit fluidisé rendant le procédé inopérant. D'autres raisons tiennent aux vitesses infinétésimales auxquelles il serait nécessaire d'entralner la solution à travers une couche flui- disée (inadaptation à des productions industrielles)... Ainsi, déjà en 1980, le préjugé existant était suffisamment ancré dans l'esprit de l'homme de l'art pour qu'un éminent biotechnicien écrive dans la publi- cation déjà évoquée "Methods of Plasma Protein Frationation, 3.M. Curling, p. 152" (traduction): "Nous avons choisi une colonne en lit fixe plutôt qu'une colonne en lit fluidisé. La fluidisation impose un flux de filtration ascendant et de grosses particules assez denses pour se main- tenir en équilibresous ces forces ascendantes. Mais les gels disponibles pour le fractionnement des protéines sont rarement plus denses que l'eau et donneraient des suspensions extrêmement diluées même à faible vitesse de flux. Au surplus, en rai- son de la lente diffusion des macromolécules, la taille moléculaire des grains et celle des volumes intersticiels doivent être aussi petits que possible dansle but d'augmenter la probabilité de pénétration de l'élément liquide dans le volume interne poreux. Le lit fixe conduit à un volume de colonne minimal et économise la consommation d'eau. Tous ces argu- ments ont des conséquences financières qui ne sont pas à négliger lorsque l'on choisit la méthodologie générale. Avec toutes ces exigences, il est évident que la mise en oeuvre des méthodes chromatographiques dans l'industrie biologique demande des supports spéciaux ayant des qualités mécaniques exception- nelles. Ils doivent être stérilisables quand ils sont utilisés dans une colonne sous la forme la plus compacte et ils doivent permettre des vitesses de flux très élevées quand il y a plusieurs centaines ou milliers de litres de solution à traiter chaque jour". La présente invention se propose d'améliorer la technique actuelle de séparation chromatographi- que des macromolécules biologiques dans le secteur des biotech- nologies. Un objectif essentiel de la présente invention est en particulier de permettre, dans ce secteur, la mise en oeuvre de séparations chromatographiques échappant au défaut le plus grave de ces séparations consistant dans le col- matage des lits. Un autre objectif lié au précédent est de réduire considérablement l'usure des particules de rési- nes constitutives des lits. Un autre objectif est d'autoriser une mise en oeuvre en continu des séparations. Un autre objectif est de rendre la séparation chromatographique des macromolécules biologiques économiquement applicable à l'échelle industrielle à un très grand nombre de corps, notamment en vue d'assurer la valori- sation de sous-produits protéiques d'industries agro-alimen- taires. A cet effet, le procédé visé par l'invention pour effectuer une séparation chromatographique de macromolécules biologiques contenues dans une solution est du type consistant à amener la solution au contact d'un lit de résines spécifiques des macromolécules à séparer en vue de réa- liser une fixation sélective; selon la présente invention, le procédé se caractérise en ce que: - l'on utilise une résine ayant une granulométrie moyenne G et une masse volumique M dont les va- mi v leurs sont situées dans la zone z (non hachurée)du diagramme de la figure 1, - l'on dispose ladite résine dans une colonne comprenant au moins un étage pourvu à sa base d'un système perforé de distribution présentant les caractéristiques suivantes: pourcentage de sections ouvertes approximativement compris entre 1 % et 10 %, diamètre moyen des sections ouvertes supérieur à environ 300 microns, diamètre moyen des sections ouvertes approximativement compris entre 2 Gm et 20 Gm, - et l'on alimente chaque étage de la colonne à travers son système de distribution au moyen de la solution de manière à fluidiser le lit de résine, en ajustant le débit de la solution de façon à obtenir dans la colonne une vitesse linéaire du liquide (ramenée à la section droite totale) approximativement comprise entre 1,5 Vmf et 12 Vmf, o Vmf est la vitesse minimale de fluidisation de la résine. La "granulométrie moyenne" de la résine est définie de façon usuelle comme le diamètre moyen des particules (50 % en poids des particules ont des dimensions supérieures à ce diamètre moyen et 50 % ont des dimensions inférieures). Ainsi, de façon. inattendue par rapport aux enseignements de l'art antérieur, on a pu consta- ter qu' il était possible de réaliser une séparation chromato- graphique de macromolécules biologiques, par fixation sélective en lit fluidisé, en combinant les conditions sus-évoquées relatives à la résine et à la distribution de la solution (structure des distributeurs, débit d'alimentation). Comme les exemples fournis plus loin le montreront, de façon surprenante, la mise en oeuvre en lit fluidisé ne réduit pas les capacités d'échange de la résine et les transferts de matières par affi- nité ou échange d'ion ou exclusion demeurent globalement sensi- blement similaires à ceux obtenus en lit fixe. De préférence, on choisira une ré- sine de granulométrie moyenne Gm comprise entre 75 et 300 microns correspondant sur le diagramme de la figure 1 à la bande hori- zontale comprise entre la courbe limite C et les deux droites D et D2. Il s'est avéré qu'il y avait intérêt à ce que la- dis- persion de la taille des grains ne soit pas trop grande et un tamisage préalable desdites résines sera préférentiellement effectué pour limiter la dispersion à environ 50 % autour de la valeur moyenne Gm. Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre préféré, la résine est disposée dans une colonne sen- siblement verticale comprenant entre 2 et 5 étages superposés, parcourus successivement par la solution, le soutirage de la- dite solution étant effectué par surverse en partie haute de l'étage supérieur, chaque étage (à l'exception de ce dernier) étant délimité par deux systèmes perforés de distribution, l'un distribuant la solution à la base de l'étage considéré, l'autre distribuant la solution vers l'étage situé immédiate- ment au-dessus. On a pu constater que, pour une quantité globale de résine donnée, le fractionnement en lit fluidisé à plusieurs étages améliore considérablement les per- formances de séparation dans un temps donné et permet de se rapprocher des performances obtenues en lit fixe. Ce phénomène peut s'expliquer par le fait que l'on tend ainsi à recréer un gradient de concentration (favorisant la séparation) qui existe naturellement en lit fixe mais non en lit fluidisé à un seul étage. De la sorte, le procédé de l'inven- tion permet à la fois d'atteindre sensiblement les performances des procédés en lit fixe, tout en étant affranchi des graves défauts de ce type de lit: colmatage et nécessité de nettoyage, détérioration des résines provoqué par le tassement et les net- toyages. En effet, le lit fluidisé autorise le libre passage des impuretés de la solution sans risque de colmatage; aucun nettoyage n'est nécessaire de sorte que la durée de vie des résines est considérablement accrue. De plus, le procédé peut être mis en oeuvre en continu en raison de l'absence des contraintes créées par les nettoyages: la résine peut être amenée à circu- ler en continu de haut en bas dans la colonne, avec une alimen- tation continue en résine en partie haute et un soutirage con- tinu en partie basse, la séparation en lit fluidisée étant effectuée en continu dans la colonne, avec exécution concomi- tante d'opérations de lavage, élution et lavage à l'extérieur de la colonne. I1 convient de ne pas confondre les opérations classiques de lavage qui consistent en un simple rin- çage à l'eau distillée ou d'élution qui consistent en un passage d'une solution de régénération, avec les opérations de nettoya- ge ou décolmatage qui requierent dans les procédés connus un traitement mécanique énergique des résines et sont à l'origine de leur détérioration et des difficultés de mise en oeuvre en continu. La circulation de la résine entre deux étages superposés, peut-être assurée par un tube de passa- ge, agencé de façon à permettre à la résine de circuler par surverse dans ledit tube de l'étage du dessus à l'étage du des- sous. De plus, une ou des chicanes sont préférentiellement disposées à chaque étage en vue d' assurer un renouvellement complet de la résine de l'étage,sans appari- tion de zones mortes. Bien entendu, le procédé de l'in- vention peut, le cas échéant, être mis en oeuvre en discontinu: la résine est alors enfermée à chaque étage de la colonne en l'absence de circulation d'un étage à l'autre, la séparation en lit fluidisée étant effectuée par cycles de fixation sélec- tive, lavage, élution.et lavage dans la colonne. Ce mode de mise en oeuvre reste avantageux par rapport aux séparations en lit fixe pour les raisons déjà évoquées: en particulier, il n'est pas nécessaire de démonter la colonne pour des décolma- tages. -Dans les deux cas de mise en oeuvre (continu, discontinu) la colonne est avantageusement alimentée de sorte que le débit de solution à l'intérieur de celle-ci soit sensiblement constant au moins pendant les phases de fixa- tion sélective, la variation de ce débit par rapport à sa va- leur nominale étant inférieure à + 5 %. Cette disposition garantit une flui- disation stable de la résine sans risque d'entraînement acci- dentel de grains. Le procédé de l'invention est appli- cable de façon générale pour la séparation de toute macromolé- cule biologique; l'homme du métier est apte, dans chaque appli- cation, à choisir une résine appropriée (conditions de masse volumique et granulométrie fournies par le diagramme de la figure 1) et à réaliser un système perforé de distribution con- venant à la granulométrie de ladite résine (conditions déjà évoquées de diamètres des sections ouvertes). En particulier, le procédé de l'in- vention peut être appliqué à la séparation chromatographique des protéines d'un lactosérum; la résine utilisée peut notam- ment être une résine du type "résine Spherosil" vendue sous ce nom par la Société "Rhône Poulenc" et décrite dans le brevet français n0 2.321.932; cette résine répond aux spécifications fournies par le diagramme de la figure 1. La description qui suit fournit, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention, réalisés, d'une part dans une installation dis- continue (exemples let 2), d'autre part dans une installation continue (exemple 3); les figures de dessins annexés repré- sentent ces installations: - la figure 1 déjà évoquée est un diagramme donnant les spécifications des résines appropriées, - la figure 2 est une vue schéma- tique d'une installation discontinue pour la mise en oeuvre du procédé, - la figure 3 est une coupe verti- cale de détail de la colonne de ladite installation, - la figure 4 est une vue schémati- que d'une installation continue, - la figure 5 est une coupe verti- cale de détail de la colonne de ladite installation, - la figure 6 en est une coupe trans- versale par un plan horizontal AA', - les figures 7, 8 et 9 sont des diagrammes donnant, en fonction du temps, l'évolution des con- centrations de sortie de la solution, respectivement pour cha- cun des exemples 1 à 3. L'installation représentée à titre d'exemple aux figures 2 et 3, est destinée à assurer une sépa- ration chromatographique de macromolécules biologiques selon un processus de fonctionnement eyclique, alternant une phase de fixation, une phase de lavage, une phase d'élution et une nou- velle phase de lavage. Au cours de ces différentes phases, la résine spécifique est enfermée dans une colonne verticale 1 à plusieurs étages, tels que 3 ou 4. Trois ou quatre étages pourront être prévus en pratique. La colonne 1 comprend une embase 2 qui permet de distribuer les solutions vers l'étage inférieur 3, à travers un système perforé de distribution. Ce système est identique pour tous les étages et a été représenté en 5 à échelle dilatée à la figure 3. I1 comprend deux plaques cylindri- ques perforées 6 et 7 (oule cas échéant un nombre supérieur de plaques) qui sont disposées l'une au-dessus de l'autre, avec un espace entre plaques préservé par des cales 8. Les plaques 6 et 7 sont dotées de perforations 6a et 7a et sont positionnées de sorte que ces perforations soient décalées d'une plaque par rapport à la plaque voisine. La densité de répartition des pla- ques est telle que le pourcentage de sections ouvertes soit compris entre 1 % et 10 % et, en particulier égale à 5 % dans les exemples décrits plus loin. Par pourcentage de sections ouvertes, on entend,selon l'habitude le rapport dans une section droite de la somme des surfaces ouvertes à la surface utile de la plaque. En outre, les perforations de chaque plaque sont prévues de façon que chacune d'elles ait un diamè- tre supérieur à 300 microns. Au-dessus de ce seuil le diamètre des perforations est adapté à la granulométrie moyenne Gm de la résine utilisée: une valeur de l'ordre de 4 G à 6 G parait m m donner les meilleurs résultats. Par exemple, pour les résines "Sphérosil" visées aux exemples, on a utilisé des plaques ayant des perforations de diamètre égal à 1 mm. Les plaques 6 et 7 sont maintenues en bordure par des brides annulaires boulonnées 9 Les éléments cylindriques 3 ou 4 ou embase 2 sont collés à leur périphérie sur les surfaces internes annulaires de ces brides. De plus, des joints annulaires tels que 10 assurent l'étanchéité péri- phérique, d'une part entre plaques, d'autre part entre brides et plaques. La solution (solution à traiter au cours de la phase de fixation, solution d'eau distillée au cours des lavages ou solution de régénération au cours de la phase d'élution) pénètre dans l'embase 2 par un conduit 11. Pour assurer un débit rigoureusement constant, ces solutions sont disposées dans des réservoirs 12 (solution à traiter ou solution de régénération) et 13 (solution d'eau distillée) qui sont disposées à une hauteur-appropriée au-dessus de la colonne 1 pour délivrer le débit désiré. Un débitmètre 14 et un dia- phragme 15 permettent de réaliser un réglage fin de ce débit. La solution à traiter est stockée dans un bac 16 o elle est agitée et maintenue à température régulée. La solution de régénération est stockée dans les mêmes conditions dans un bac 17. L'eau distillée est stockée dans un bac 18. La. solution en sortie de colonne peut être sto- ckée dans un bac 19. Une pompe 20 et un système de conduits et vannes permet d'alimenter à chaque phase les réservoirs 12 ou 13, en solutions appropriées à partir des bacs 16-18, de sorte que le niveau des réservoirs soit sensiblement constant. Le système ci-dessus décrit assure une alimentation de la colonne 1 avec un débit dont les va- riations sont en pratique inférieures à + 5 %. En sortie de la colonne 1, le liqui- de est recueilli par surverse en partie haute de l'étage supé- rieur pour être éventuellement stocké dans le bac 19. Par ailleurs, la figure 4 schéma- tise une installation modifiée par rapport à la précédente pour autoriser un fonctionnement en continu. La colonne, ses systè- * mes perforés de distribution et les moyens d'alimentation en liquide à débit constant sont similaires. Toutefois, dans cette installation, la résine est amenée à circuler en continu d'un étage à l'étage inférieur et les phases de lavage et d'élution sont effectuées à l'extérieur de la colonne, cette dernière réalisant la fixa- tion chromatographique en continu. Les aménagements effectués sur l'installation sont les suivants. Comme le représente la figure 5, entre deux étages superposés de la colonne, est disposé un tube 21 de passage de résine qui traverse le système perforé de dis- tribution. Ce tube s'étend entre la partie haute 21a du lit de l'étage du dessus et la partie basse 21 b du lit de l'étage du- dessous. Ainsi la résine peut circuler par surverse dans les divers tubes 21, successivement d'un étage à celui du dessous. Pour autoriser cette surverse, cha- que tube de passage 21 dépasse, à chaque étage, d'une hauteur HB inférieure à la hauteur H$ de la portion non occupée de l'étage considéré. Ainsi, le lit de résine fluidisé qui se for- me à l'intérieur de chaque tube 21 ne déborde pas du tube à l'étage du dessus, ce qui constitue la condition de circula- tion par gravité de la résine d'un étage à l'étage inférieur. De plus, à chaque étage, une chicane 22 est disposée entre les deux orifices des deux tubes 21 qui débouchent à l'étage considéré (orifice inférieur 21'b du tube communiquant avec l'étage du dessus et orifice supérieur 21a du tube communiquant avec l'étage du dessous). Chaque chicane 22 peut être constitué par un manchon tubulaire entourant le tube 21; ce manchon se prolonge en partie haute au-dessus du niveau de l'orifice 21 a et preserve en partie basse, un passage 22a pour la résine. La résine provenant de l'étage du dessus et débouchant par l'orifice 21'b est moins chargée et donc généralement plus légère et a tendance à monter dans le lit; la chicane 22 évite que se crée un court-circuit de rési- ne entre les orifices 21'b et 21a: elle supprime les zones mortes du lit o la résine ne serait pas renouvelée et assure ainsi un renouvellement complet de celle-ci (il est à noter que, pour certaines résines et certaines macromolécules à fixer, la masse volumique de la résine ne change pas au cours de l'échan- ge: dans ce cas, la chicane est moins essentielle mais amélio- re l'uniformité globale de fixation). Par ailleurs, en partie basse de la colonne, le tube de passage inférieur 23 traverse l'embase d'a- limentation et est associé à des moyens hydrauliques d'entrai- nement de la résine 24, en l'exemple vers un bac de récupéra- tion 25. La résine de ce bac est régénéré dans une colonne externe qui peut également fonctionner en lit fluidisé; l'en- trainement vers cette colonne externe peut être assuré en continu. La résine régénérée est disposée dans un réservoir de stockage 26, soit par un transfert continu depuis la colonne de régénération, soit par alimentation manu- elle. Ce réservoir hermétiquement fermé est rempli d'eau distil- lée et peut être alimenté en eau distillée par un conduit 27 comprenant une vanne et un débitmètre. La résine peut être hydrauliquement transportée à travers un tube 28 vers un tapis roulant 29 qui est associé à une pompe à vide en vue d'éliminer l'eau entou- rant les grains de résine. Le tapis 29 déverse la résine régé- nérée, à un débit ajustable, dans un tube de passage supérieur 21", muni d'un entonnoir supérieur. Les exemples.l et 2 ont été mis en oeuvre sur une installation du type de celle représentée à la figure 2 et l'exemple 3 dans une installation du type de celle représentée aux figures 4 et 5. Exemple 1 La colonne de l'installation com- porte trois étages dans cet exemple; la hauteur de chaque éta- ge est de 50 cm, le diamètre de la colonne étant de 5 cm. Cet exemple vise à extraire les al- bumines Plactoglobuline et (lactalbumine d'un lactosérum doux, résidu des fabrications de fromage, fourni par les "Fromageries Bel". La résine utilisée est une résine "Sphérosil QMA" fabriquée par "Rhône Poulenc". La distribution granulométrique initiale est de 100 à 300 ym. On procède à un tamisage à sec pour retenir la plage de grains compris entre 200 et 250 pm, soit une granulométrie moyenne de Gm = 225 ym. La masse volumique de la résine "Sphérosil QMA" est M v= 1 400 Kg/m3. Le couple de valeurs (Gm, Mv) caractérisant ladite résine est représenté au point R sur le diagramme de la figure 1. Cette résine est une résine échan- geuse d'anions constituée de grains sphériques de silice, de diamètres compris entre 100 et 200 pm, possédant une surface spécifique de 25 m2/g, un diamètre poreux moyen de 1 250 A et un volume poreux de 1 cm3/g, revêtus d'un polymère réticulé styrène vinyl triethoxysilane, portant les groupements fonc- tionnels: CH -e@ - CH - N - CH3 Ci0 CH3 La vitesse minimale de fluidisation d'une telle résine est Vmf = 1,4.10-4 m/s. mf =,.0 ms Le diamètre moyen des sections ou- vertes du distributeur de chaque étage de la colonne correspond dans ces conditions à environ: 4 G- m La quantité de résine déposée à chaque étage est de 130 cm La colonne est alimentée à sa base par le lactosérum, avec un débit de solution égal à 9 1/h ne variant pas de plus de 5 % par rapport à cette valeur nominale grâce à la nature des moyens d'alimentation prévus (bacs en charge à hauteur déterminée). Ce débit, dans une colonne de sec- tion 1,96.10- 3 m2 correspond à une vitesse de liquide égale à 1,3.10-3 m/s/soit 9 Vmf. I mf, Lorsque le débit est établi, on constate que le lit dans chaque étage subit une expansion de 64 % et présente une hauteur de 20 cm. On constate visuellement une bonne fluidisation stable. A son entrée le lactosérum présente les concentrations suivantes: 3,0 g/1 en plactoglobuline et 1,2 g/1 en clactalbumine. Le procédé est mis en oeuvre pendant deux heures. La figure 7 représente les courbes donnant, en fonction du temps, le rapport des concentrations à la sortie de chaque étage C à la concentration initiale Co; les courbesc1, 2 et o3 représentent la variation de C pour 1' rlactalbumine, respectivement à la sortie de l'étage inférieur, intermédiaire et supérieur. Les courbes P1' P2 et P3 représentent la varia- C tion de Co pour la jlactoglobuline respectivement à la sortie de l'étage inférieur, intermédiaire et supérieur. Les mesures ont été faites sur des prélèvements effectués toutes les 3 minutes, par électrophorèse de zone sur membrane-en acétate de cellulose. On constate que pendant3O minutes la plactoglobuline et l'clactalbumine sont totalement fixées sur la résine (palier initial des courbes v3 et P3) puisque seule la Plactoglobuline continue d' être adsorbée pendant une quinzaine de minutes alors que 1' dlactalbumine se trouve dans le courant de sortie de la colonne. Lorsque l'opération de fixation est terminée (C/Co= 1), on procède à un lavage à l'eau distillée pendant 20 minutes environ. La résine est alors éluée à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N pendant 2 heures. On procède alors à un nouveau lavage à l'eau distillée pendant 1 heure environ et la colonne est prête pour un nouveau cycle. Pendant toutes ces opérations (lavage, élution), la résine de la-colonne est fluidisée de façon analogue. La quantité de protéines issue de la phase d'élution est,pour la plactoglobuline,10,5 g ce qui représente une fixation de 102 mg par gramme de résine sèche et,pour l'clactalbumine,l,7 g ce qui représente 16, 5 mg par gramme de résine sèche. L'éluat contient donc 86,1 % de Plactoglobuline et 13,9 % d'dlactalbumine. Or, les proportions relatives de ces protéines dans le produit de départ (lactosé- rum) étaient de 71 % en Plactoglobuline et 29 % en 4lactalbu- mine. Il y a donc un enrichissement en Plactoglobuline. Le produit d'élution contenant ces protéines est débarrassé du lactose, fines de caséine et sels minéraux initialement contenus dans le lactoserum, les proté- ines étant pures et dans leur état natif (non dénaturées). Les capacités de fixation de la résine "Sphérosil QMA" en couche fluidisée de trois étages sont sensiblement identiques à celles obtenues à l'aide d'une cou- che fixe lors de travaux antérieurs, voir les publications sui- vantes: - SKUDDER P.3. "Recovery and Fractionation of Proteins from Cheese whey using a Porous Silica - Based Ion Exchange Medium" Chemitry and Industry, 21, 810 - 814 (1983), - BOURGEOIS C.M. et LEROUX P. "Protéines Animales (extraits concentrés et isolats en ali- mentation humaine), chap. 3, Collection Sciences Techniques agro alimentaires, Lavoisier (DR). Les essais ci-dessus décrits ont été renouvelés des dizaines de fois, sans que l'on constate un col- matage quelconque, que ce soit au niveau de la couche ou à celui des distributeurs; il-est à noter que le lactosérum utilisé était à l'état brut et contenait des impuretés solides en suspension. De plus, aucune diminution d'effica- cité de la résine n'a pu être observée, ni aucune usure de celle-ci. Exemple 2 Cet exemple est mis en oeuvre dans les mêmes conditions que l'exemple 1, à l'exception de la quan- tité de résine déposée sur chaque étage qui est de 110 cm3. Lorsque le débit est établi, on constate que le lit dans chaque étage subit une-expansion de 69 % et présente une hauteur de 18 cm. On constate visuelle- ment une bonne fluidisation stable. - A son entrée, le lactosérum pré- sente les mêmes concentrations que dans l'exemple 1 (3,0 g/1 en Blactoglobuline et 1,2 g/1 en clactalbumine). Le procédé est mis en oeuvre pendant 2 heures. La figure 8 présente les courbes donnant, en fonction du temps, le rapport des concentrations à la sortie de chaque étage C à la concentration initiale Co. On constate que la quantité de résine sur chaque étage étant moins importante que dans l'exem- ple 1, les durées pendant lesquelles la totalité des deux pro- téines d'une part, puis la Plactoglobuline seule d'autre part, sont adsorbées, sont plus courtes que dans l'exemple 1 (d'une quinzaine de minutes chacune). On procède à la succession de lavage, élution, lavage de la même façon que dans l'exemple 1. La quantité de protéines obtene par élution correspond à une fixation de 110 mg par gramme de résine sèche pour la)lactoglobuline et 19,5 mg par g de résine sèche pour 1' dlactalbumine. L'éluat contient donc 84,9 % de Plactoglobuline et 15,1 % d' dlactalbumine. Aux erreurs expé- rimentales et analytiques près, ces proportions sont analogues à celles observées pour l'exemple 1. Exemple 3 Cet exemple a été mis en oeuvre dans l'installation décrite précédemment et représentée aux figures 4 et 5, la colonne comportant trois étages de 60,5 cm de hau- teur chacun. Cet exemple vise à extraire les al- bumines plactoglobuline et clactalbumine d'un lactosérum doux, résidu des fabrications de fromages, fourni par les "Fromage- ries Bel". La résine utilisée ("Sphérosil QMA") présente les memes caractéristiques que dans l'exemple 1. Le diamètre moyen des sections ou- vertes du distributeur de chaque étage de la colonne est 4 Gm m' Les tubes de jonction servant à véhiculer la résine de haut en bas de la colonne ont un dia- mètre intérieur de 1,4 cm et dépassent à chaque étage d'une hau- teur HB = 25 cm. Le débit de résine introduit dans la colonne est maintenu à 0,14 1/h. Le système d'évacuation de la résine à la base de la colonne comprend trois vannes électromagnéti- ques contrôlées par un temporisateur. Les particules de solide traversent la vanne supérieure ouverte et s'accumulent dans un tube en plastique souple. Toutes les 20 secondes, la vanne su- périeure est fermée, alors que la vanne latérale qui s'ouvre en même temps que la vanne inférieure injecte de l'eau distillée qui entraîne les particules vers le bas. La colonne est alimentée à sa base par le lactosérum, avec un débit de solution égal à 9 1/h, ce débit étant contrôlé de la même façon que dans l'exemple 1. Lorsque le débit est établi, on constate que le lit dans chaque étage présente une hauteur de cm correspondant à la hauteur du dépassement HB du tube de jonction sur l'étage considéré. Chaque étage a une hauteur de 60,5 cm de telle sorte que la hauteur de la couche fluidisée retenue dans le tube de jonction de l'étage possède un niveau inférieur à celui de la couche fluidisée de l'étage immédiatement supé- rieur, empêchant ainsi le débordement de la résine dans l'étage du dessus. On constate visuellement une bonne fluidisation stable et une bonne circulation des deux phases solide et liquide. A son entrée, le lactosérum présente les concentrations suivantes: 3,0 g/l en Plactoglobuline et 1,2 g/1 en olactalbumine. Le procédé fonctionne en continu mais, pour l'exemple considéré, il est mis en oeuvre pendant 3 heures. La figure 9 représente les courbes donnant en fonc- tion du temps, le rapport des concentrations à la sortie de chaque étage C à la concentration initiale Co. On constate que l'opération comporte une phase transitoire avant d'atteindre le régime stationnaire de fonctionnement. On note que 1' Qlactalbumine ( ' 2' c3) est retenue en moins grande quantité sur la résine que la Jlactoglobuline (p1' P2Z' P3) A la sortie de la colonne (troisième étage) le liquide contient environ 50 % d' lactalbumine ini- tiale alors qu'il ne contient plus que 25 % de la Plactoglobu- line, le reste étant fixé sur la résine. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de séparation chromato- graphique de macromolécules biologiques contenues dans une so- lution, du type consistant à amener la-solution au contact d'un lit de résines spécifiques des macromolécules à séparer en vue de réaliser une fixation sélective, ledit procédé étant carac- térisé en ce que: - l'on utilise une résine ayant une granulométrie moyenne Gm et une masse volumique Mv dont les va- leurs sont situées dans la zone Z (non hachurée) du diagramme de la figure 1, - l'on dispose ladite résine dans une colonne comprenant au moins un étage pourvu à sa base d'un système perforé de distribution présentant les caractéristi- ques suivantes: pourcentage de sections ouvertes approximativement compris entre 1 % et 10 %, diamètre moyen des sections ouvertes supérieur à environ 300 microns, -. diamètre moyen des sections ouvertes approximativement compris entre Z Gm et 20 Gm, - et l'on alimente chaque étage de la colonne à travers son système de distribution au moyen de la solution de manière à fluidiser le lit de résine, en ajus- tant le débit de la solution de façon à obtenir dans la colonne une vitesse linéaire du liquide (ramenée à la section droite totale) approximativement comprise entre 1,5 Vmf et 12 Vmf, o Vf est la vitesse minimale de fluidisation de la résine. 2/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel la résine est disposée dans une colonne sensi- blement verticale comprenant entre 2 et 5 étages superposés, parcourus successivement par la solution, le soutirage de la- dite solution étant effectué par surverse en partie haute de l'étage supérieur, chaque étage (à l'exception de ce dernier) étant délimité par deux systèmes perforés de distribution, l'un distribuant la solution à la base de l'étage considéré, l'autre distribuant la solution vers -l'étage situé immédiate- ment au-dessus. 3/ - Procédé selon l'une des revendi- cations 1 ou 2, caractérisé en ce que la colonne est alimentée de sorte que le débit de solution à l'intérieur de celle-ci soit sensiblement constant au moins pendant les phases de fixation sélective, la variation de ce débit par rapport à sa valeur nominale étant inférieure à + 5 %. 4/ - Procédé selon l'une des revendica- tions 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on réalise chaque système perforé de distribution au moyen d'au moins deux pla- ques perforées, superposées avec un espace entre plaques, les- dites plaques étant dotées de perforations et étant position- nées de façon à décaler les perforations d'une plaque par rap- port à celles de la ou des plaques voisines. / - Procédé selon l'une des revendica- tions 1, 2, 3 ou 4, dans lequel la résine est enfermée à cha- que étage de la colonne en l'absence de circulation d'un éta- ge à l'autre, la séparation en lit fluidisée étant effectuée par cycles de fixation sélective, lavage, élution et lavage dans la colonne. 6/ - Procédé selon l'une des revendica- tions 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que la résine est ame- née a circuler en continu de haut en bas dans la colonne, avec une alimentation continue en résine en partie haute et un sou- tirage continu en partie basse, la séparation en lit fluidisée étant effectuée en continu dans la colonne, avec exécution concomitante d'opérations de lavage, élution et lavage à l'ex- térieur de la colonne. 7/ - Procédé selon les revendications 2 et 6 prises ensemble, caractérisé en ce que l'on dispose entre deux étages superposés de la colonne, un tube de passage de résine, traversant le système de distribution et s'étendant entre la partie haute du lit de l'étage du dessus et la par- tie basse du lit de l'étage du dessous, la résine circulant par surverse dans ledit tube, de l'étage du dessus vers l'éta- ge du dessous. 8/ - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, à chaque étage, l'on dispose dans le lit de résine au moins une chicane disposée entre l'orifice du tube communiquant avec l'étage du dessus et l'orifice du tube communiquant avec l'étage du dessous, de façon à assurer un renouvellement complet de la résine de l'étage. 9/ - Procédé selon l'une des revendica- tions 7 ou 8, caractérisé en ce que les tubes de passage sont disposés dansla colonne de sorte que le lit de résine fluidi- sé formé dans un tube à un étage donné ne déborde pas du tube à l'étage du dessus. / - Procédé selon l'une des revendi- cations 1 à 9, pour la séparation chromatographique des'protéi- nes d'un lactoserum. 11/ - Procédé selon la revendication pour l'extraction des albumines A lactoglobulines, g -lactalbumines d'un lactosérum, dans lequel on utilise une résine du type "Sphérosil" de granulométrie moyenne Gm compri- se entre 75 et 300 microns, ladite résine étant préalablement tamisée de sorte que la dispersion des tailles de grains au- tour de cette valeur moyenne soit au plus égale à 50 %.