Brevet FR2581313A1 — publié le 19861107

La présente invention concerne des composés dont l'administration à un individu suscite la formation d'anti- corps dirigés contre l'antigène ou l'haptène dont ils déri- vent, ainsi que les- compositions qui contiennent de tels composés, qui sont utilisables comme immunogènes et immuno- protecteurs. On considérait jusqu'à présent qu'un haptène de- vait être couplé à une molécule-support hétérologue pour que son administration à un organisme humain ou animal déclenche la formation d'anticorps dirigés contre cet haptène; le cou- plage à une molécule provenant d'un individu de même espèce était considéré comme ne pouvant pas induire la formation d'anticorps dirigés contre l'haptène. On a aussi constaté que des substances antigéni- ques en elles-mêmes, que ce soit des antigènes figures tels que virus, champignons, bacilles et autres bactéries ou des antigènes solubles tels que les anatoxines diphtériques ou tétaniques, des polysaccharides ou des protéines hétérolo- gues, ont souvent des effets secondaires non négligeables si on doit les administrer seules en une quantité suffisante pour déclencher une réaction immunitaire d'utilité pratique. Ainsi dans le cas des vaccinations non seulement les injec- tions sont repétées, mais encore des immunostimulants sont souvent administrés simultanément au réactif antigènique dé- clenchant, pour diminuer la dose vaccinante et les réactions secondaires; on peut citer parmi les immunostimulants les dérivés de l'alumine, le glycérol, ou le muramyldipeptide et ses analogues actuellement à l'étude. Ou encore, dans le cas o l'on veut, chez l'animal, stimuler la formation des lym- phocytes B secréteurs d'anticorps dirigés contre une subs- tance antigénique particulière, par exemple pour préparer et cloner des hybridomes, on administre simultanément à la sub- stance, de l'adjuvant de Freund complet ou incomplet. Par ailleurs, on sait que la plupart des vaccins actuels, à base d'antigènes figurés détoxifiés ou d'anti- gènes synthétiques conjugués, lorsqu'ils sont administrés à des nouveaux-nés ne protègent pas ceux-ci contre les infec- tions ultérieures; chez l'homme, seul la vaccination par le BCG est pratiquée efficacement dans les premiers mois de la vie. La présente invention a donc un caractère inatten- du. Elle a en effet pour objet des composés qui déclenchent la formation d'anticorps dirigés contre leur élément anti- génique lorsqu'ils sont administrés au nouveau-né, et qui injectés par la suite au même individu devenu adulte, donne- ront une réponse immunitaire supérieure, en intensité et spécificité, à celle qui pourrait apparaître lors de l'administration d'un antigène de type connu. Les composés selon l'invention, utiles pour indui- re la sécrétion d'anticorps chez un individu, sont consti- tuées d'un agent antigénique fixé ou lié à une molécule support d'un type particulier, c'est-v-dire une molécule ne pouvant déclencher une réaction immunitaire lorsqu'elle est administrée seule à l'individu adulte à traiter. Un autre objet de l'invention est constitué des compositions dans lesquelles les composés sont associés à un véhicule inerte convenant à leur administration à l'orga- nisme o on désire stimuler la formation d'anticorps dirigés contre l'agent antigénique, que se soit pour traiter ou protéger ledit organisme, pour isoler des'anticorps ou les cellules productrices de ces anticorps. Dans la mesure o la première administration doit être effectuée chez le nouveau-né, la dose unitaire sera adaptée. Par agent antigénique, on entend ici d'une part les composés susceptibles de déclencher à eux seuls la for- mation d'anticorps, c'est-à-dire les antigènes figurés, tels bactéries, virus, champignons et autres microorganismes, les antigènes solubles, tels anatoxines, allergènes, protéines hétérologues, polysaccharides, glycolipides et glycopro- tdines et d'autre part les haptènes, c'est-à-dire des déter- minants antigéniques (ou épitopes), peptides, hormones et autres petites molécules naturelles et synthétiques, tels que les médicaments. Un tel agent antigénique peut être couplé chimi- quement à la molécule-support, soit directement lorsqu'il comporte des fonctions réactives, soit par l'intermédiaire d'un agent connu de couplage des macromolécules, tel que le glutaraldéhyde, la benzoquinone, les carbodiimides, le pe- riodate, les dimaleimides et dérivés; le couplage est réa- lisé d'une manière connue en soi, de telle sorte que les épitopes de l'agent antigénique ne soient pas modifiés. On peut fixer un ou plusieurs agents antigéniques, de même type ou de type différents, sur la moléculesupport. La fixation de l'agent antigénique sur la molécule-support peut aussi être effectuée par des liaisons non-covalentes. La molecule-support est une molécule qui adminis- trée dans l'organisme de l'individu adulte considéré ne dé- clencherait pas de réaction immunitaire; c'est donc une molécule qui doit provenir de l'organisme considéré lui-même ou d'un individu de la même espèce animale, lorsque ladite molécule a des caractéristiques antigéniques conservées dans l'espèce. Comme support, on peut utiliser des macromolécules autologues mais on préfère les protéines, et plus spéciale- ment l'albumine du sérum, abondante et facile à obtenir. Les composés, selon l'invention, associés à un vé- hicule convenable, sont administrés à l'individu nouveau-né chez lequel on veut déclencher la formation d'anticorps di- rigés contre l'agent antigénique qui en est un élément. La réponse immunitaire est nette et les anticorps formés parti- culièrement spécifiques. On peut utiliser ces composés dans des composi- tions pharmaceutiques pour protéger beaucoup plus précoce- ment un nouveau-né contre des infections diverses et tout particulièrement contre des maladies infantiles comme les infections à méningicoques B, ou hémophilus B. Une restimulation du même individu est possible ultérieurement, même à l'âge adulte, par de nouvelles injec- tions de la composition et ceci est particulièrement surpre- nant, alors qu'on sait qu'un individu n'ayant reçu aucune injection d'un composé conforme à l'invention dans la pério- de néonatale ne produit pas d'anticorps contre l'agent anti- génique, élément du composé, si ce dernier lui est adminis- tré à l'âge adulte. L'utilisation des composés selon l'invention pour stimuler les défenses immunitaires contre un agent infec- tieux-ou vacciner un individu est d'autant plus avantageuse que la molécule-support n'induit aucune réaction immunitaire nocive dirigée contre elle, ce qui diminue sensiblement les réactions secondaires de l'individu. On peut utiliser les composés de l'invention comme réactif d'immunisation d'animaux de laboratoire pour prépa- rer de façon connue en soi de grandes quantités d'anticorps soit directement à partir du sérum des animaux traités avec ce réactif soit par culture des hybridomes obtenus à partir des lymphocytes B prélevés sur des animaux traités. De tels anticorps pourraient servir, notamment comme réactifs dans des dosages immunoenzymatiques ou radioimmunologiques dont le principe est bien connu. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de réalisation de l'invention. L'haptêne choisi à titre d'exemple est le groupe- trinitrophényl ou TNP, classiquement utilisé en recherche imiunologique, et considéré comme un excellent modèle d'haptène, tout comme la fluoresceine ou l'acide p- aminophénylarsonique. on peut à ce sujet se référer à l'ouvrage "Methods in immunology and immuno-chemistryn Vol. 1 et 2 (1967) Acad. Press, de Curtis A. Williams et Merril W. Chase. L'haptène a été couplé à la protéine-support sans agent de couplage intermédiaire, étant donné la présence de fonctions réactives sur la molécule hapténique; on a utilisé la méthode de fixation décrite par J.R. Little et H.N. Eisen dans Biochemistry 5 p3385 (1966). Les essais ont été effectués avec des souris de souche Balb/c et la protéine-support selon l'invention était de la sérum albumine de souris (SSA), de cette même souche. A titre de comparaison, on a aussi préparé dans les mêmes conditions des dérivés dans lesquels le TNP était fixé à de la sérum albumine bovine (BSA). Les conjugués TNP/albumines ont été injectés aux animaux par voie intrapéritonéale, dans du sérum physio- logique; les animaux témoins ont reçu des injections du mê- me volume de sérum physiologique (PBS). Le protocole d'ad- ministration a été celui indiqué dans le Tableau 1. TABLEAU 1 Protocole d'administration Injection Nombre de Volume de Poids de conjugué No jours diluant TNP/albumine après la ( 1) naissance 1 0 50 20 2 2 50 20 3 4 50 20 4 6 50 20 8 50 50 6 10 50 50 7 12 100 100 8 14 100 100 9 16 100 100 18 100 100 11 20 100 100 12 22 100 100 13 67 100 100 14 90 100 100 t__ ____________I Des prélèvements sanguins ont été effectués les ème, 60ème, 85ème et 98ème jours après la naissance. La souris est adulte au 60ème jour. Le dosage des anticorps anti-TNP présents dans les sérums prélevés a été effectué par une méthode immunoenzyma- tique, connue sous le nom d'ELISA et décrite notamment dans l'article de B. GUILBERT, G. DIGHIERO et S. AVRAMEAS dans The Journal of immunology 128 (6) p 2779 (1982). On a opéré comme suit: des plaques de polystyrène à micropuits ont été revêtues avec différents composés anti- géniques en faisant incuber lh à 37 C et une nuit à 4 C une solution de 1 ig du composé dans 1 ml de tampon carbonate/ bicarbonate (O,lM; pH = 9,5) avant d'éliminer l'excès des des réactifs par des lavages au tampon phosphate salin. Quatre types de revêtements ont été utilisés: 1) Conjugué TNP/sérum albumine de souris (SSA) 2) Conjugué TNP/sérum albumine bovine (BSA) 3) Conjugué TNP/ -galactosidase; 4) Conjugué TNP/ovalbumine. Les conjugués 1 et 2 sont identiques à ceux admi- nistrés aux souris pour étudier la secrétion des anticorps dirigés contre le TNP, selon le protocole du tableau 1. Ils peuvent être préparés comme suit: a) Conjugués TNP/albumines On dissout d'une part 20 mg d'albumine dans 1 ml de tampon carbonate/bicarbonate( O,1M; pH = 9,5) et d'autre part 2 mg d'acide 2,4,6trinitrobenzène sulfonique (TNBS) dans 1 ml du même tampon. On mélange ensuite 1 ml de chacune de ces solutions et après les avoir laissé reposer 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière, on dialyse la solution pendant 48 heures, à 4 C, contre une solution de NaCl (0O,15M; pH = 7,4) en changeant 2 fois de dialyse. On obtient dans ces conditions dans le cas de la sérum albumine murine de 28 à 35 groupements trinitrophényl fixds par molécule d'albumine; dans le cas de la sérum albu- mine bovine de 24 à 28 groupements fixés et dans le cas de l'ovalbumine environ 12 groupements TNP fixés par molé- le. b) Conjugué TNP/p -galactosidase On dialyse durant 24 heures à 4 C contre une solu- tion de NaCl( 0,15 M), une solution commerciale de -galac- tosidase, puis durant 24 heures contre une solution tamponnée au borate (0,1 M; pH = 9,2) . 4mg de solution de P -galactosidase, ainsi dialysée, dans 1 ml du tampon au bora- te sont mélangés avec 2 mg de TNBS préalablement dissous dans 1 ml du même tampon; la solution est abandonnée 30 mi- nutes à la température du laboratoire puis dialysée pendant 48 heures à 4 C, contre une solution de NaCl ou de PBS (0,15 M; pH = 7,4). Dans ces conditions, on obtient un conjugué qui comporte environ 100 groupements de TNP par molécule de /-galactosidase. On introduit alors dans chacun des puits ainsi re- vêtus 100 P1 de différentes dilution du sérum à étudier (au 1/100, 1/300, 1/900 et 1/2700) dans du tampon phosphate sa- lin contenant 0,5% de gélatine et 0,1% de Tween 20 et lais- se incuber 1 heure à 37 C, avant de laver et d'introduire dans les micropuits 0,1 pg d'anticorps de mouton, dirigés contre les immunoglobulines de souris, et marqués de façon connue avec de la e galactosidase (ou de la peroxydase si la plaque a été revêtue du conjugué TNP/ /-galactosidase). Après une heure d'incubation à 37 C, on lave les plaques abondamment pour éliminer les anticorps de mouton marqués, non fixés et on introduit le substrat de l'enzyme habituellement utilisé pour ce type de révélation puis on mesure la densité optique de la solution qui est fonction de la quantité d'enzyme fixée, qui dépend elle-même de la quantité d'anticorps anti-TNP présente dans le sérum à étu- dier. Les résultats des mesures effectuées en utilisant une plaque revêtue du conjugué TNP/ P -galactosidase sont l'objet de la Figure 1, sur laquelle on a porté dans les 4 quadrants A, B, C, D en abscisse les dilutions de sérum et en ordonnée la densité optique. Dans le quadrant A figurent les résultats obtenus lors du premier prélèvement, à 30 jours; dans le B, les ré- sultats du 2ème prélèvement, dans le C, ceux du 3àme et en D ceux du dernier prélèvement; la courbe TNP/SSA est celle ob- tenue pour les animaux auxquels on a injecté le conjugué TNP/SSA suivant le protocole mentionné précédemment, alors que la courbe TNP/BSA correspond à l'administration du conjugué TNP/BSA et la courbe PBS aux témoins; les courbes en pointillé correspondent à des animaux n'ayant reçu que les injections de l'âge adulte (après le 60ème jour). On déduit de cette figure: - que les animaux jeunes auquels on a injecté le conjugué TNP/SSA de l'invention présentent quelques jours après la dernière injection un taux sanguin d'anticorps circulants anti-TNP non négligeable, alors que le taux chez les animaux qui ont reçu le conjugué connu TNP/BSA est très comparable à celui des animaux témoins qui n'ont reçu que le solvant de dilution - que le taux des anticorps circulants diminue avec le temps (quadrant B par rapport à A) mais peut être sensiblement réaugmenté par des injections de rappel pratiquées à l'âge adulte (quadrants C et D) alors que les animaux contrôle, recevant leur première injection à l'âge adulte de conjugué TNP/BSA ou TNP/SSA (courbes en pointillé), ont des taux d'anti- corps anti-TNP beaucoup plus faibles. Sur la Figure 2 ont été représentés les résultats obtenus en effectuant le dosage sur une microplaque revêtue d'un conjugué TNP/ovalbumine; le fait que les figures 1 et 2 aient des aspects tout à fait comparables confirme que les anticorps qui se fixent sur les plaques sont essentiellement dirigés contre le TNP et non contre les protéines supports, que ce soit la/3-galactosidase ou l'ovalbumine, puisque celles-ci ont des caractéristiques tout à fait différen- tes. Sur la Figure 3 ont été représentés les résultats obtenus en effectuant le dosage avec une microplaque revêtue d'un conjugué TNP/SSA et sur la Figure 4 d'un conjugué TNP/BSA. Dans le cas de la Figure 3, les anticorps cir- culants fixés sont ceux dirigés contre le TNP, et le conju- gués TNP/SSA; dans le cas de la Figure 4, ils sont dirigés contre le TNP, la BSA et leur conjugué. L'étude de ces figu- res permet de conclure: - que les anticorps anti-TNP apparaissent chez l'individu jeune en quantité plus faible lorsqu'ils ont une protéine hétérologue (BSA) au lieu d'une autologue (SSA) comme protéine-support. (Figures 3 et 4, quadrant A) - que les anticorps circulants n'ont pas disparu lorsque l'animal atteint l'âge adulte (quadrants B) - qu'une injection de rappel à l'âge adulte déclenche une nouvelle production d'anticorps même si l'haptène est fixé sur une protéine autologue (comparaison des courbes TNP/SSA en traits pleins et en pointillés des quadrants D) - que deux injections à l'âge adulte, sans injec- tion préalable au nouveau-né, d'un conjugué avec une protéine autologue (TNP/SSA) ne déclenche pas de for- mation d'anticorps anti-TNP (courbes TNP/SSA en pointillés, quadrants D), alors que le conjugué TNP/BSA la déclenche, comme il est connu. On opère de manière analogue avec d'autres haptènes; lorsque ceux-ci ne portent pas initialement de fonction susceptible de réagir sur la protéine, on effectue- ra le couplage chimique à l'aide d'une molécule réactive adaptée, par une méthode connue de l'homme de métier. Lorsque les composés seront utilisés pour des vac- cinations, on effectuera de préférence plusieurs injections à l'individu à vacciner, la première injection de composé se situant toujours dans la période néo-natale. Lorsque les composés seront utilisés pour permettre la préparation d'anticorps particulièrement spécifiques chez l'animal, on répétera de préférence les injections pour obtenir un taux suffisant d'anticorps circulants, la première injection étant obligatoirement effectuée dans la période proche de la naissance des animaux. il REVENDICATIONS 1. Composés pour induire chez un individu la for- mation d'anticorps, dirigés contre un agent antigénique, ces composés résultant de la fixation de cet agent antigénique à une molécule-support et étant caractérisés en ce que ladite molécule, administrée seule, ne déclenche pas de réaction immunitaire chez l'individu adulte auquel seront administrés les composés. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que la moléculesupport provient d'un individu de la même espèce animale ou de l'homme dans le cas de l'induction chez l'homme. 3. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que la molécule-support est une protéine. 4. Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que la molécule-support est la sérum albumine. 5. Composés selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes caractérisés en ce que l'agent antigénique est un haptène choisi parmi les peptides, les polysacchari- des, les hormones et autres. 6. Composâs selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que l'agent antigénique est un antigène figuré, tel que microorganismes, bactéries ou virus, ou un antigène soluble, tel que polysaccharides, glycolipides, glycoprotéines et protéines. 7. Composés selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes dans lesquels la molécule-support est cou- plée à l'agent antigénique par l'intermédiaire d'une mold- cule réactive. 8. Composition pharmaceutique pour induire une ré- sistance à uneinfection chez un individu caractérisée en ce qu'elle comporte, associée à un véhicule inerte, un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'agent antigénique comporte au moins un épitope de RE 1i'anent > il oricine de 1l' infection. 9. Composition pharmaceutique selon la revendi- tion 8, caractérisée en ce que la dose unitaire convient à l'immunisation d'un nouveau-né. 10. Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 8, caractérisée en ce que la dose unitaire convient pour effectuer une restimulation chez l'adulte. 11. Composition pour induire la formation d'an- ticorps de spécificité donnée chez un animal caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité convenable d'un composé se- lon l'une quelconque des revendications 1 à 7, associée à un véhicule inerte. 12.Procédé pour la préparation d'anticorps in-vivo ou ex-vivo, caractérisé en ce qu'on administre au moins une fois, une composition selon la revendication 11, à des ani- maux nouveaux-nés, pour prélever le sérum ou les cellules immuno-compétentes après achèvement de la stimulation immu- nitaire chez l'animal, éventuellement adulte.