Brevet FR2582671A1 — publié le 19861205

La rhizosphère, ou la terre entourant les racines de plante, est riche en microorganismes qui créent des relations avec des plantes, ayant des effets pouvant aller du bénéfique au nuisible. Le contrôle par génie génétique des relations écologiques entre plantes et microorganismes rhizosphériques pourrait aboutir à des améliorations agronomiques certaines. La composition de cette population de O microorganismes varie selon les sols, l'espèce de la plante, selon l'état physiologique de la plante, etc. et est dirigée en partie, semble-t-il, par les échanges métaboliques entre les parties souterraines des plantes et les organismes habitant la rhizosphère. Certains de ces échanges pourraient impliquer des médiateurs métaboliques spécifiques. Dans cette hypothèse de spécificité méta- bolique, on a découvert que les racines excrètent des composés riches en énergie, qui semblent réfractaires O au catabolisme par la majorité des microorganismes de la rhizosphère, mais procurent une source d'énergie exclusive pour sélectionner les microorganismes possédant l'information nécessaire pour leur catabolisme. La plante semble contrôler l'excrétion de tels médiateurs chimiques et, de cette façon, contrôle les nombres et genres de microorganismes peuplant sa rhizosphère en créant, en quelque sorte, une pression de sélection. En effet, de telles substances libérées par les plantes en quantité suffisante pourraient procurer des sources de nutrition sélectives aux microorganismes possédant l'information génétique nécessaire à leur catabolisme. Ces médiateurs métaboliques riches en énergie et qui sont excrétés et produits abondamment par les racines des plantes dans leur rhizosphère seront appelés ci-après du nom générique de "rhizosphérines". Bien que dans ce qui suit on se soit plus particu- lièrement préoccupé de décrire deux rhizosphérines particulières, à savoir les calystégines 1 et 2 qui ont été observées dans la rhizosphère de Calystegia sepium, il est bien entendu que d'autres types de rhizosphérines pourront être trouvés par des méthodes équivalentes dans la rhizosphère d'autres plantes. On concevra l'importance de cette mise en évidence lorsque l'on saura que la capacité à cataboliser ces médiateurs riches en énergie est, en général, portée par des plasmides qui peuvent, moyennant des techniques mises en oeuvre dans le domaine du génie génétique, être transférés à des microorganismes particuliers et préalablement déterminés. C!est pourquoi la présente invention concerne des vecteurs de transformation de micro- organismes de la rhizosphère, en particulier des microorganismes à action rhizosphérique favorable, caractérisés en ce qu'ils confèrent auxdits micro- organismes transformes la capacité de cataboliser une rhizosphérine particulière. Bien entendu, le gène codant pour le catabolisme d'une rhizosphérine et qui sera inséré ) dans le vecteur de transformation en cause sera prélevé sur une souche catabolisant ladite rhizo- sphérine. De façon générale, il semble que le gène codant pour ce catabolisme provient d'un plasmide de ladite souche. Ainsi, on a pu mettre en évidence, en particulier pour les calystégines qui seront décrites en détail dans les exemples qui suivent, le fait que la capacité à cataboliser ces calystégines était o portée par un plasmide d'une souche de Rhizobium, en particulier la souche de Rhizobium meliloti 41. Ledit plasmide sera appelé ci-après 'plasmide pRme41a". Il est bien entendu que d'autres rhizosphérines pourront être mises en oeuvre, de même que les plasmides ou fragments de gène qui sont responsables de leur catabolisme. Les vecteurs selon la présente invention comporteront, outre le gène codant pour le catabolisme de la rhizosphérine, des éléments permettant la transformation des microorganismes que l'on désire transformer et assurant l'expression dudit gène dans ledit microorganisme. Par exemple, il conviendra d'introduire dans le vecteur tout ou partie d'un marqueur génétique, par exemple tout ou partie d'un transposon, si cela est nécessaire, tel que le transposon Tn5. Il pourra également être nécessaire d'utiliser un vecteur présentant un large spectre d'hôtes de façon à pouvoir l'utiliser pour transformer différents types de microorganismes à activité rhizosphérique favorable. Outre ces vecteurs, la présente invention concerne, bien entendu, les souches transformées par ces vecteurs, quelle que soit la technique de trans- formation mise en oeuvre dans la mesure o celle-ci permet d'insérer et de rendre actif le vecteur dans ladite souche. A titre d'exemple, les microorganismes qui pourront être transformés pourront être choisis dans les genres Azospirillum, Agrobacterium et Rhizobium. En particulier, il pourra s'agir de la transformation de souches de Rhizobium meliloti ou d'Agrobacterium tumefaciens. Les souches de microorganismes rhizosphériques ainsi transformées sont plus particulièrement utilisables à titre d'agent à action rhizosphérique favorable que l'on peut mettre en oeuvre dans le domaine de l'agriculture. En particulier ces souches transformées pourraient permettre, dans certains cas, d'écarter les problèmes de compétition que l'on rencontre avec les souches que l'on tente d'introduire artificiellement dans la rhizosphère de certaines plantes et qui ne sont pas capables d'entrer en compétition avec les souches autochtones. Des souches de microorganismes transformées et capables d'assimiler les rhizosphérines se trouvant au voisinage des racines des plantes en cause devraient pouvoir résister plus facilement et être plus compétitives. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après. L'invention concerne aussi le procédé de transformation des microorganismes, caractérisé en ce qu'il comporte l'utilisation d'un gène catabolisant une rhizosphérine, ainsi que ledit gène en tant que moyen dudit procédé. EXEMPLE 1 A l'origine, on a sélectionné 100 espèces de plantes pour leurs métabolites secondaires énergétiques trouvés dans les racines et les feuilles, à partir d'extraits de plantes bruts que l'on a soumis à une électrophorèse sur papier suivie d'une coloration au nitrate d'argent permettant de visualiser les composés contenant du sucre. Deux substances chargées positivement ont été observées dans les racines et rhizomes de Calystegia sepium (Gloire du matin) et n'ont été trouvées que rarement et à des concentrations faibles dans les feuilles et les tiges. - L'excrétion de ces substances a été observée à partir des racines de plantes ayant poussé dans des conditions aseptiques. Ces deux substances ont été appelées "calystégines 1 et 2" D'autres composés ayant des propriétés similaires ont été trouvés dans les feuilles et les racines de Convolvulus arvensis, Atropa belladonna et Beta vulgaris. La méthode de détection des calystégines ayant été la même que celle utilisée pour l'agropine et la mannopine (substances découvertes initialement dans les tumeurs de plantes induites par Agrobacterium tumefaciens), un extrait de lignée de la tumeur de tabac,utilisé à l'origine pour décrire l'agropine et la mannopine, a servi d'étalon externe pour les estimations de contenu en calystégine. La comparaison entre l'agropine et la calystégine sur la base du poids à l'état frais montre que ces deux substances sont présentes à des concentra- tions similaires. L'agropine dans la lignée tumorale a été estimée représenter environ 7 % du poids sec. On peut conclure que la synthèse de calystégine représente un engagement anabolique majeur de la part de la plante. On crée des cultures d'organes de racines de C. sepium dans le but d'obtenir une source continue, uniforme et abondante de calystégines et de déterminer si elles sont excrétées. Les tentatives de cultures de racines excisées à partir de graines germées in vitro ayant donné des résultats médiocres, on utilise la trans- formation génétique par Agrobacterium rhizogenes, souche 8196, qui consiste à insérer une partie de l'ADN plasmidique de cette souche dans le génome de la plante pour induire la formation de racines adventives sur les tiges de C. sepium. Ces racines contiennent une partie (T-DNA) du plasmide Ri (induisant les racines) qui confère aux racines la possibilité de croître rapidement en culture. On crée ainsi une culture continue de racines de C. sepium qui présente une dominance apicale réduite (ramification fréquente) et une vitesse d'élongation aux extrémités de 1 à 2 cm par jour. Des quantités de l'ordre du kilogramme ont été produites dans un milieu liquide. Comme dans le cas de plantes normales poussant in vitro, une excrétion abondante de calystégines 1 et 2 dans le milieu de culture a été observée en boites de Pétri après trois semaines de culture. il de milieu de culture ont été suffisants pour détecter les calystégines, et sur une base pondérale (état frais) leur concentration dans le milieu était plus basse mais du même ordre de grandeur qu'à l'intérieur des racines de la même culture. Ainsi, une partie majeure des calystégines 1 et 2 produite par les racines est excrétée dans le milieu. Les racines de C. sepium transformé produisent de la mannopine, une substance caractéris- tique des racines contenant Ri-T-DNA. Le catabolisme de la mannopine est spécifique de certaines souches A. tumefaciens et A. rhizogenes. La mannopine a été co-purifiée avec les calystégines 1 et 2 et a servi d'étalon interne dans les tests de catabolisme utilisés pour la recherche aes bactéries du sol capables de cataboliser les calystégines. Préalablement aux tests de catabolisme, des extraits de racines transformées (contenant des calystégines et mannopine) ou des extraits de rhizomes excisés à partir de plantes normales (contenant de la calystégine) ont été partiellement purifiés. Ils contiennent peu ou pas de sucres neutres contaminants. EXEMPLE 2 Des souches des genres Azospirillum, Agrobacterium et Rhizobium ont été choisies dans la recherche des bactéries du sol capables de dégrader les calystégines parce que ces bactéries ont été décrites en détail des points de vue génétique et écologique. Un total de 30 souches a été testé. Le catabolisme de la mannopine a été positif pour les souches A. tumefaciens portant les plasmides Ti de type octopine et pour les souches A. rhizogenes; il a été négatif pour les souches portant les plasmides Ti de type nopaline, confirmant la fiabilité des tests de catabolisme. Le catabolisme des calystégines 1 et 2 a été positif pour seulement une des souches examinées, Rhizobium meliloti 41. On désigne ce phénotype catabolique par Cac+ (= Calystégine catabolisme). Dans R. meliloti souche 41, trois plasmides ont été détectés: un plasmide cryptique de 215 kb nommé pRme41a, et deux megaplasmides de plus de 700 kb. Un de ceux-ci, pSym, porte les gènes impliqués dans la nodulation des légumineuses et la fixation de l'azote. Après marquage du plasmide cryptique pRme41a en utilisant le transposon Tn5, on observe son auto-transfert à d'autres souches R. meliloti avec une basse fréquence (10-6) mais pas à Agrobacterium. Afin de permettre une étude complète dans dif- férents hôtes, on doit utiliser un autre plasmide mobilisateu] à large spectre d'hôtes. Pour ce faire, on utilise un plas- mide dérivé du plasmide RP4: le plasmide pGMI4142. La souche hôte utilisée est A. tumefaciens C58C1 (débarrassée de son plasmide Ti). Alors que cette souche C58C1 est Cac, les transconjuguants de C58C1 (pRme41a::Tn5) (pGMI4142) catabolisent la calystégine 1 et 2, montrant que les gènes responsables du catabolisme de la calystégine (cac) sont localisés sur ce plasmide. EXEMPLE 3 Les essais suivants ont eu pour but d'objectiver l'activité du vecteur construit à l'exemple 2. Puisque la souche C58C1 de contrôle (pGMI4142) était Cac, les souches C58C1 (pRme41a::Tn5) (pGMI4142) transconjuguées ont catabolisé les calystégines 1 et 2, montrant que les gènes responsables du catabolisme de la calystégine (cac) sont localisés sur ce plasmide. Le plasmide pRme41a étant incompatible avec pAtC58, un plasmide cryptique de 410 kb de C58C1, les transconjugués des souches C58C1 (pRme41a::Tn5) sont de cette façon débarrassés du plasmide pAtC58. Ce n'est pas l'enlèvement du pAtC58 qui rend la souche C58C1 (pRme41a::Tn5) Cac+, puisque C58C1 débarrasséde pAtC58 est Cac. De plus, la souche 41 débarrassée du pRme41a est Cac, ce qui confirme que pRme41a porte les gènes cac et indique que les copies fonctionnelles de ces gènes ne sont pas présentes ailleurs. EXEMPLE 4 Les bactéries Cac et Cac+ ont été testées pour leur capacité à pousser dans un milieu pauvre en nutriments, contenant les calystégines 1 et 2, extraites comme décrit ci-dessus,puis purifiées par gel-filtration et électrophorèse préparative sur papier. Apres 3 jours dans la culture, la croissance a été stimulée plus de 3 fois chez les bactéries Cac+ par rapport aux bactéries de contrôle Cac. Bien que le Demandeur ne souhaite pas être limité par une explication scientifique, on pense que la faible croissance observée chez les contrôles est due à des impuretés dans l'extrait de calystégine ou à une lente auto-dégradation de la calystégine. On sait que la croissance des Rhizobia est stimulée dans les rhizosphères des légumineuses et non-légumineuses. A côté de la stimulation de la croissance chez les bactéries Cac+ observée,plusieurs voies évidentes suggèrent que pRme41a pourrait être impliqué dans les associations plutôt saprophytes que symbiotiques avec les plantes. 12 2582671 REVENDICATIONS 1) Vecteur de transformation de micro- organismes de la rhizosphère, caractérisé en ce qu'il confère auxdits microorganismes transformes la capacité de cataboliser une rhizosphérine. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte un gène codant pour le catabolisme d'une rhizosphérine prélevé sur une souche catabolisant ladite rhizosphérine. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène codant pour ce catabo- lisme provient d'un plasmide de ladite souche. 4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène codant provient d'un plasmide d'une souche de Rhizobium catabolisant ladite rhizosphérine. ) Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche de Rhizobium est une souche de R. meliloti. 6) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que le plasmide est le plasmide pRme41a et la rhizosphérine est choisie parmi les calystégines 1 et 2. 7) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte, outre le gène codant pour le catabolisme d'une rhizosphérine, tout ou partie d'un marqueur génétique, par exemple tout ou partie d'un transposon. 8) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le transposon est le transposon Tn5. 9) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le gène est inséré dans le vecteur RP4 ou ses dérivés. ) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que le gène est inséré dans le vecteur pGMI4142. 11) Souches de bactéries transformées par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 10. 12) Souche selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi les genres Azospirillum, Agrobacterium et Rhizobium. 13) Souche selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi Rhizobium meliloti et Agrobacterium tumefaciens. 14) Application des souches selon l'une des revendications 11 à 13 à titre d'agent à action rhizosphérique favorable dans l'agriculture. ) Procédé de transformation des micro- organismes de la rhizosphère, caractérisé en ce qu'il comporte l'utilisation d'un gène catabolisant une rhizosphérine. 16) Gènes catabolisant une rhizosphérine, en tant que moyen du procédé selon la revendication 15.