Brevet FR2574428A1 — publié le 19860613

La présente invention concerne des facteurs d'attachement des Bacteroides, en particulier des Bacteroldes du groupe fragilis, ainsi que l'application de certains récepteurs immobilisés pour la préparation de ces facteurs et leur mise en évidence ou leur dosage. Plus particulièrement, il s'agit de la mise en évidence et de la caractérisation de facteurs d'attachement chez les bactéries anaérobies du genre Bacteroldes pour différentes espèces du groupe fragilis et notamment Bactero i des fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroldes ovatus, Bacteroides distasonis, Bacteroldes vulgatus. Ces facteurs d'attachement de Bacteroldes du type lectine ont pu être mis en évidence grâce à leur propriété d'adhésion à des récepteurs immobilisés sucrés, en particulier des récepteurs de type glucosamine ou galactosamine, 1' a-D-glucosamine ou la D-galactosamine. La fixation des sucres précédents sur des supports immobilisants tels que l'agarose permet de purifier les facteurs d'attachement. Ces facteurs d'attachement, en raison de leur propriété antigénique, peuvent être utilisés dans des compositions pharmaceutiques, eux-mêmes ou les anticorps correspondants soit à titre curatif, soit à titre préventif, tant en médecine humaine qu'en médecine vétérinaire, pour le traitement ou la prévention des infections à germes anaérobies et en particulier des infections mixtes à anaérobies entre eux ou avec d'autres bactéries qui se rencontrent assez fréquemment. Ces facteurs d'attachement sont particulièrement intéressants car les Bacteroldes du groupe fragilis sont les germes dominants dans la constitution de la flore normale de l'organisme, notamment au niveau de la flore intestinale. La présente invention concerne également un procédé de préparation de ces facteurs d'attachement de Bacteroldes, caractérisé en ce que a) on prépare, à partir d'une souche de Bacteroldes, un extrait antigénique soluble de Bacteroides, b) on met cet extrait en présence dlun récepteur sucré immobilisé, c) puis on sépare les facteurs d'attachement ainsi fixés du récepteur. Parmi les récepteurs sucrés immobilisés utilisables dans le cadre de ce procédé, il faut citer plus particulièrement les récepteurs sucrés immobilisés de type glucosamine ou galactosamine, c'est-à-dire essentiellement ceux dans lesquels le sucre est choisi parmi l'a-D-glucosamine ou la D-galactosamine fixée sur un support tel que l'agarose par exemple. Les récepteurs -immobilisés peuvent se présenter sous une forme quelconque, en particulier ils peuvent être utilisés sous forme de colonne ou bien mis en oeuvre par "batch". Enfin, les propriétés de fixation de ces facteurs d'attachement et leur spécificité permettent d'envisager des procédés de dosage ou de mise en évidence des Bacteroldes. Ces procédées de mise en évidence des BacteroIdes comporteront au moins une étape de fixation des facteurs d'attachement des Bacteroldes sur un sucre récepteur de type glucosamine ou galactosamine, ce sucre récepteur étant, de préférence, immobilisé sur un support tel qu'un support d'agarose Les facteurs d'attachement présentant des propriétés antigéniques, il est possible de les mettre en évidence et/ou de les doser par des procédés immunologiques, en particulier par des procédées d'immunoélectrophorbse. Dans le cadre d'un dosage de type immunologique, on pourra doser ou mettre en évidence la présence de Bacteroides dans un liquide physiologique en mettant en évidence la disparition du précipité caractéristique antigène/anticorps dans le liquide soumis; préalablement, à l'action d'un sucre récepteur fixant lesdits facteurs d ' attachement Il est également possible de mettre en évidence les précipités spécifiques antigène/anticorps correspondant aux facteurs d'attachement à partir d'un liquide ayant été traité par des récepteurs sucrés immobilisés, lesdits récepteurs sucrés immobilisés étant séparés puis remis en solution pour libérer les éventuels facteurs d'attachement. Bien entendu, la présence ou au contraire l'absence de ces facteurs d'attachement par des méthodes immunologiques mettant en oeuvre les précipités antigène/anticorps peuvent etre de type très varié, en particulier il peut s'agir dlimmunodlectrophorbse telle que l'immunodlectrophorbse bidimensionnelle àu bien l'immunoélectrophorèse de type "Rocket-line" ou touteautre méthode immunologique bien connue de l'homme de métier. Enfin, il est possible de dresser des anticorps contre ces antigènes de facteurs d'attachement par des procédés connus, lesdits anticorps étant également utiles à titre de composants thérapeutiques Les exemples suivants sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE 1 Cet exemple a pour objet la mise en évidence des facteurs d'attachement décrits précédemment. Les 7 sucres suivants ont été testés - a-D-glucosamine - B-D-N-acétyl glucosamine - D-galactosamine - 8-D-galactosylamine - B-D-thiogalactoside - ss-L-fucosylamine - a-D-mannopyranoside. Ces sucres ont été fixés sur des billes d'agarose par des techniques qui sont connues de l'homme de métier. Pour la mise en oeuvre de l'exemple proprement dit, une suspension bactérienne de 0,5 ml a été mise en contact avec 0,5 mi de sucre immobilisé sur des billes. Après incubation, les billes ont été lavées puis observées au microscope. Suivant les sucres, deux cas se sont présentés. Pour les billes recouvertes d'a-D-glucosamine ou de D-galactosamine, on a observe que les Bacteroldes fragilis adhéraient sur ces billes. Par contre, pour les autres sucres, et en particulier pour le mannopyranoside, on n'observe aucune adhésion des BacteroIdes fragilis. Afin de mettre en évidence la spécificité de ces fixations, on a étudié la possibilit.é d'inhiber la fixation des Bacteroldes fragilis en faisant incuber préalablement la suspension de Bacteroides fragilis avec un sucre libre correspondant-au sucre fixé mis en oeuvre dans l'étape suivante. Les résultats observés sont rassemblés autableau 1 Billes agarose Billes agarose glucosamine galactosainine Bacterotdes fragilis seul + + Bacteroldes fragilis + glucosamine libre (25 mg/ml) Bacteroides fragilis + galactosamine libre (25 mg/ml) Bacteroiaes fragilis + xylose libre (25 mg/ml) + + Bacteroiäes ovatus.seul + + Bacteroiaes ovatus + glucosamine libre (25 mg/ml) - NT Bacterotdes ovatus + galactosamine libre (25 mg/ml) NT Bacterotäes ovatus + xylose libre (25 mg/ml) + + +: adhésion -: absence d'adhésion NT : non testé Il ressort clairement de ce tableau que la fixation est inhibée uniquement si l'on ajoute au mélange d'incubation le sucre libre correspondant à une concentration suffisante. L'inhibition n'est réalisée avec aucun autre sucre. Donc il existe à la surface des Bacterordes des facteurs d'attachement qui permettent l'adhésion des facteurs immobilisés. Ceux-ci possèdént entre autres des résidus glucosamine et galactosamine. Ceci-permet, bien entendu, la purification de ces facteurs par chromatographie d'affinité sur des récepteurs sucrés immobilisés. EXEMPLE 2 Caractérisation de ces facteurs d'attachement Un extrait antigénique soluble de Bacteroldes est soumis à une électrophorèse. Les antigènes ainsi séparés migrent ensuite dans un gel contenant l'antisérum polyvalent correspondant préparé préalablement. Les gels antigènes et anticorps sont séparés, soit par un gel vierge témoin, soit par un gel contenant les sucres immobilisés sur des billes. La figure 1 schématise l'int,erprétation des résultats observés. Le schéma a) représente l'immunoélectrophorèse dans la première dimension. Le schéma b) représente l'immunoélectrophorèse simple dans la seconde dimension à partir d'un antigène et dans un gel contenant l'anticorps. On note l'apparition de 3 pics distincts notés 1, 2 et 3. Dans le schéma c) l'antigène, avant de migrer dans le gel contenant l'anticorps, passe par un gel intermédiaire contenant des billes recouvertes de glucosamine. Il ressort très clairement de ce schéma c) que le pic 1 a disparu et que le pic 3 a nettement diminué de surface ; la disparition de ces pics correspond à la fixation des facteurs d'attachement par le gel intermédiaire. Cette interprétation schématise à L'extrême les résultats observés, ces lames montrent un grand nombre de pics ainsi que le caractère antigénique de ces facteurs d'attachement. Des essais équivalents réalisés avec BacteroIdes distasonis donnent le mdme type de profil, c'est-b-dire que des billes d'agarose glucosamine et d'agarose galactosamine utilisées en gel intermédiaire modifient les profils obtenus par fixation des facteurs d'attachement. Outre la mise en évidence de la nature antigénique de ces facteurs d'attachement, on peut mettre en évidence la disparition d'un pic correspondant à la phosphatase qui est nettement diminué en présence de glucosamine et a complètement disparu en présence de galactosamine. EXEMPLE 3 On utilise maintenant un autre type d'immuno électrophorèse, à savoir 1 immunoé l'immunoélectrophorèse "Rocket-line". Le mélange antigénique est incorporé à une bande d'agarose, il migre dans le gel contenant l'antisérum polyvalent correspondant et quand un antigène rencontre son anticorps spécifique à la concentration appropriée, cela se traduit par une ligne de précipitation. La figure 2 schématise l'interprétation des résultats observés. Dans cette immunoélectrophorèse, l'antigène est constitué par un extrait soluble de Bacteroides fragilis, l'anticorps correspond à l'antisérum correspondant. Les puits correspondent aux extraits suivants - puits 1 : extrait soluble de BacteroIdes fragilis souche - puits 2 : extrait soluble de BacteroIdes thetaiotaomicron - puits 3 : extrait soluble de Bacterodes ovatus - puits 4 : extrait soluble de BacteroIdes vulgatus - puits 5 : extrait soluble de BacteroIdes distasonis. L'antigène R donne avec l'immunosérum correspondant 3 lignes de précipitation. L'identité d'un constituant des antigènes des puits 1 et -2 avec le constituant de l'antigène R formant la ligne inférieure entraîne la formation de rocket en regard du puits correspondant. L'échantillon -4 possède également un constituant en présence de Ag R mais différent du premier puisqu'il correspond à la seconde ligne de précipitation. La ligne supérieure n'est pas modifiée et aucun des échantillons ne contenait de constituant correspondant. Cette interprétation schématise à l'extrême les résultats observés, les lames montrant un plus grand nombre de précipités. Des essais complémentaires ont permis de mettre en évidence,tout d'abord,qu'il existait une interaction des antigènes de Bacteroides entre eux et, ensuite, que les facteurs d'attachement responsables de ces interactions pouvaient être en quantités variables suivant les espèces. Ces facteurs permettent de proposer : - des explications concernant la constitution de la flore normale de l'organisme, notamment la flore intestinale où les Bacteroldes du groupe fragilis sont les germes dominants t en conséquence, il est possible, en intervenant au niveau de ces facteurs, de modifier l'écosystème considéré ; - des explications concernant les infections à anaérobies et en particulier les infections mixtes à anaérobies entre eux ou avec d'autres bactéries, qui sont très frdquentes - des thérapeutiques curatives et préventives en raison des propriétés antigéniques de ces facteurs d'attachement. REVENDICATIONS 1) Facteurs d1attachement de BacteroIdes du groupe fragilis. 2) Facteurs d'attachement de Bacteroldes selon la revendication 1, qui sont fixés par des récepteurs de type glucosamine ou galactosamine. 3) Anticorps dressés contre les facteurs d'attachement selon l'une des revendications 1 et 2. 4) Procédé de préparation de facteurs d'attachement selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que a) on prépare, à partir d'une souche de Bacteroldes, un extrait antigénique soluble de Bacteroides, b) on met cet extrait en présence d'un récepteur sucré immobilisé, c) puis on sépare les facteurs d'attachement fixés sur ledit récepteur. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le récepteur sucré immobilisé comporte au moins un sucre sélectionné parmi la glucosamine et la galactosamine fixée sur un support. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le sucre est choisi parmi l'a-D-glucosamine et la D-galactosamine. 7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le support immobilisant le sucre est l'agarose. 8) Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif au moins un facteur d'attachement ou un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3. 9) Procédé de mise en évidence et/ou de dosage des Bacterodes dans un milieu, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de fixation des facteurs d'attachement des Bacterodes sur un sucre. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le sucre est fixé sur un support. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support est un support d'agarose. 12) Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le procédé mis, en oeuvre est un procédd de dosage immunologique. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le procédé mis en oeuvre comporte une étape d'immunoélectrophorèse.