Brevet FR2581655A2 — publié le 19861114

FR 2581655 A2 19861114 FR 8507073 A 19850509 Sondes à papillomayirus et procede de diagnostic in vitro d'infections à papillomavirus L'invention concerne des ADNs de papillomavirus, et plus particullerement des sondes derivees de ces papillo virus. ainsi que des procédés les mettant en oeuvre pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus L expression "papillomavirus" recouvre un g grand nombre de virus ayant en commun d'étre tenus pour rssFon- sables de plusieurs formes d'infections virales s'etageant entre les verrues cutanés ou de muqueuses relativement bénignes et des hyperplasies susceptibles de dégénérer en néoplasies intra-epitheliales et en cancers cutanés. Parmi des infections å papillomavirus. on mentionnera également plus particulierement l'epidermodysplasie verruciforme. qui sera quelquefois ci-apres designée sous L'expression "EV" Un certain nombre de types de papillomavirus a déJa etc decrit. Dans le cadre du brevet principal ont été dé- crits de nombreux types et sous-types nouveaux de papillo- mavirus qui ont ete isoles a partir de verrues ou lesions maculaires disseminées, susceptibles de donner lieu au développement precoce de cancers de la peau chez d'importantes proportions des malades qui en sont affec- tés. Des études récentes ont revele l importance de facteurs immunitaires et le r@le mateur de divers types de virus de papillomes humains (HPV) ces facteurs s'ajoutant au role dejà decrit dans la littérature de facteurs géne- tiques divers et des rayonnements actiniques dans la pathogenese des infections aux papillomavirus. L'invention du brevet principal decoulait des observations qui avaient été faites quant aux comportements relatifs d'un grand nombre de papillomavirus nouvellement isoles. dont les caractéristiques génomiques essentielles ont été définies ci-apres. Un nombre important de types et sous-types de papi Ilomavirus nouveaux ont etc decrits dans le brevet princi- pal. Il en a ete de meme de l'utilisation des ADNs de ces papillomavirus nouveaux, pris isolement ou en association, entre eux et/ou avec des ADNs d'HPV antérieurement connus, dans des techniques de diagnostic in vitro plus affinees. D une facon generale. il a ete remarque dans le brevet principal que le; papillomavirus. bien que tres differents entre eux, avaient des tailles de l'ordre de 7000-8000 paires de bases. En outre, leurs génomes peuvent neanmoins présenter certains degres d homologle, evalues en pourcentages d'homologies entre type; et sous-types de papillomavirus, dans des essais d'hybridation realisés dans des conditions dites non strlngente ou non strictes ou encore dans des conditions d'hybridation stringente ou stricte. Il a ete dit que les papillomavirus qui présentent des pourcentages d'homologie inferieurs à 50 % dans des conditions strictes ou stringentes appartenaient a des types differents. Les virus pour lesquels on observe. dans ces conditions strictes ou stringentes, des pourcentages d'homologie superieurs a 50 % sont consideres comme appar. tenant au même type. Ils peuvent former des sous-types différents au sein de ce même type es essais d'horidation dans les conditions non strictes ou non stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions suivantes decrites par HEILMA.N C.A. et al, 1980. J. Virol., 38, 385-407. et CROISSANT et al. 1382. C.R. Acad. Sc. Paris, 234. 581-585 (molecules heteroduplexes). Les essais d'hybridation dans les conditions strictes ou stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNS provenant de deux isolats de virus dans les conditions decrites par KREMSDORF, D. et al. ((1982). a, Virol. 43:436-447 et 1383, a. Virol. 48:340-351) et DAVIS R.W. et al., 1971, Methods Enzymol., 21, 413-428 (molécules hétéroduplexes) Partant de ces considérations, plusieurs virus nouveaux ont fait l'obJet d'une description dans le brevet principal. De même ont été décrits des recombinants génétiques comprenant tout ou partie des génomes (dénommés ADN-HPVs) de ces virus.L'invention du brevet principal concernait par conséquent chacun des ADN-HPVs choisis parmi l'ensemble des ADNs qui présentent des tailles qui s'etagent entre 7000 et 8000 paires de bases et sont caractérisés par les cartes de restriction qui apparaissent dans les dessins également reproduits dans cette demande, en ce qui concerne plus particuliérement les ADN-HPVs obtenus a partir des papillomavirus et qui répondent aux désignations HPV-2d, HPV-10b, HPV-14a, HPV-14b, HPV-15, HPV-17a, HPV-17b, HPV-19, HPV-20, HPV-21 HPV-22, HPV-23, HPV-24, HPV-28, HPV-29, HPV-31 et HPV-32. L'invention du brevet principal concernait également des mélanges ou "cocktails" d'ADN-HPVs isolés a partir des papillomavirus nouveaux ou antérieurement connus. 9 la date de depot du brevet principal, ou des sondes d' hybridation les contenant susceptibles d'ètre mis en oeuvre plus efficacement pour le diagnostic de diverses catégories d'infections, voire des niveaux de risques qu'accompagnent la decouverte chez un patient de papillo- mavirus déterminés.Le nombre des sondes a papillomavirus décrites dans le brevet principal, auxquelles s'ajoutaient celles constituées a partir des ADNs génomiques de papillomavirus dé7a isoles précedemment et leurs associations dans des mélanges détermines, permet donc la réalisation de diagnostics affinés, notamment une grande discrimination des diverses catégories d'infections imputables aux divers types de papillomavirus ou susceptibles de se développer sous l'effet de ces derniers types et, au sein d'une catégorie d'infections déterminées, de mieux pronostiquer le degré de risque que ces derniéres se transforment en des maladies plus redoutables.En particulier. l'invention du brevet principal fournissait des moyens permettant, dans le cas des infections se manifestant par des épidermodysplasies verruciformes, de mieux apprécier le degré de risque que ces derniéres évoluent vers des cancers cutanés. A ce titre, 1' invention du brevet principal concer nait plus particulierement des compositions de diagnostic; un groupe de compositions préférées était défini comme contenant 1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV10b, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV17, 24, 4) au moins l'un des ADNS de HPV14, 15, 17, 19, 20. 21, 22 et 23, 5) au moins l'un des ADNs de HPV15 et 17, 6) l'ADN de HPV24, 7) l'ADN de HPV14, 32, 8) l'ADN de HPV31, 9) l'ADN de HPV32, étant entendu que les ADNs des neuf groupes étaient choisis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres. Dans les figures t a 9 des dessins ci-annexés, sont représentées les cartes physiques de restriction des ADN-HPVs concernes. Les cartes physiques donnent la position de sites de coupure par diverses endonucléases de restriction. L'origine des cartes est genéralement constituée par un site unique de coupure. Les distances a l'origine sont exprimées en pourcentage de longueur de génome. La présente invention concerne des papillomavirus nouvellement isolés, les ADNs génomiques qui peuvent en être extraits ou des fragments de ces ADNs génomiques, ainsi que de nouvelles sondes d'hybridation qui peuvent etre formées a partir de ces ADN-HPVs ou fragments d'ADN-HPVs. L' invention concerne encore des "cocktails" nouveaux de sondes les contenant ou leur utilisation dans des "CLCKtails" de sondes déjà decrits dans le brevet princi. pal, cependant complétés avec l'un ou l'autre des ADN-HPVs faisant l'obJet de la présente demande et. par consequent, des trousses ou "kits" de diagnostie encnre davantage perfectionnes. L ADN-HPVs selon la presente invention sont caracterises par les cartes de restrictions faisant les omets de la figure 10 et respectivement dénommés HPV-IP2 et HPV-IP4. Une sonde d'hydridation construite a partir du gé- nome d HPV-IP2 est particulièrement utile pour le diag- nos tic et/ou le depistage in vitro, dans les conditions qui ont éte décrites dans le brevet principal et qui seront encore décrites plus loin, des types de papillomavi- rus qui conxtitjent un risque pour la developpement de néoplasmes genitales et. en particulier, de cancers du col de l'utérus. Une sonde d hybridation construite a partir de HPV-IP4 est particulierement utile pour le diagnostic et/ou le dépistage in vitro des types de papillomsvirus constituant un risque pour le développement de leaions précancéreuses ou cancéreuses de la peau, Cas sonde d' hybridation seront avantageusement incorporées aux mélanges de diagnostic des affections du mème type sur lesquels il sera revenu plus loin. L'invention concerne également des fragments des ADN HPVs précédents ou capables de s'hybrider avec ceux- ci. notamment dans des conditions strictes. De même, elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou partie de chacun des ADN-HPVs sus-indiqués. et plus particulièrement des ADNs recombinants contenant des fragments correspondant aux gênes El, E6-E7, L1 et L2 respectivement ou encore des fragments contenant des séquences correspondant aux régions intergéniques desdits ADN-MPvs. Elle concerne enf;n les sondes qui peuvent être constituées a partir de ces ADN-HPVs respectifs ou a partir des fragments correspondants et les procédés de diagnostic in vltro mettant en Jeu lesdites sonde s Les préparstions d ADN viral or:: ete extraites selon les techniques qui seront decrites ci-apresdans les exemples 1 et 2. Dans ce qui suit seront decrites de facon plus precise les condition; dans lesquelles les virus ont ete isoles. puis les condition-, dans lesqaelles ont eté obtenus les ADN-HPVs a partir de ces virus Clonage moléculaire et caractérisation d'@@ nouveau type d'HPV associé a des neoplasies et a des cancers oenitaux (HPV IP2). Un nouveau type d'HPV a ete mis en évidence dans l'ADN extrait d'un cancer du col de 1 uteras. par hy@ri- dation. dans des conditions non strietes avec une sonde radioactive specifique du HPV type 16. Aucune hybridation croisée n'etart détectable lorsque l'hyoridation etait effectuez dans des conditions strictes d'hybridation. ce etude de la sensibilite de l'ADN de cet HPV à plusieurs enzymes de restrrction a montre que l'enzyme Bglll coupait une fois l'ADN viral. Après digestion de l'ADN extrait de la tumeur par l'endonucléase Bglll. la fraction renfermant des molecuîes d'ADN de 8kb (taille d'un génome de papillo- mavirus) ont éte purifies par centrifugation dans un gradient de saccharose.Les molécules de Skb ont éte insé- rées, par le site Bgill. dans un vecteur constitue du plasmide PL15.5 (renfermant un site unique de coupure par BglII et par BamHI) inséré par son site BamHI. dans l'ADN du bactériophage lambda L47.1. Après encapsidation de l'ADN recombinant et infection de bactéries hôtes (Escherichia coli, souche LA101), les plages de lyse correspondant à des phages recombinants ont été détectées par hybridation de répliques des cultures bactériennes infectees, avec un ADN de HPV16 radioactif, dans des conditions non strictes.Plusieurs bactériophages recombinants, contenant la totalité des séquences virales. ont été isolés la coupure de l'ADN phagique par l'enzyme d'insertion BglII engendre un fragment de Ekb hybridant avec la sonde HPV16 dans des conditions non strictes ; la coupure de l'ADN des phages recombinants et de l'ADN de la tumeur d'origine par melange des enzymes BglII et PstI engendre les mêmes 5 fragments dans la somme des poids moléculaires est égale à la taille d'un génome des papillomavirus. L'ADN du nouvel HPV a été excisé de l'ADN des bactériophages recombinants, purifié par électroélution, et recloné dans le plasmide PL15.5. Une carte de restriction de l'ADN viral a été établie à partir de la sensibilité de cet ADN à 18 endonucléases de restriction, ce qui a permis de localiser 21 sites de coupure (figure 9). La carte ainsl établie est differente de la carte des génomes des HPV identifiés à ce Jour. L'homologie de séquence entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiés à ce Bour a été analyse par des expériences d'hybridation moleculaire sur réplique effectuees dans des conditions strictes. L'homologie détectée toujours été inférieure à 5 7., la plus grande homologie étant détectée avec le génome du HPV16. Le nouveau virus caractérisé à partir d'un cancer du col de l'utérus constitue donc un nouveau type d'HPV, provisoirement dénommé HPVIP2. L'analyse, au microscope électronique. de molécules héréroduplexes formees, dans différentes conditions, entre l'ADN de HPVIP2 et l'ADN du HPVI a permis d'aligner les cartes physiques de ces 2 genomes et de définir la position théorique des différents gènes portés par l'ADN de l'HPVIP2. LOCALISATION PUTATIVE DES PRINCIPAUX GENES ET DE LA REGION INTRAGENIQUE DU HPV-IP2 SUR LA CARTE DE CE GENOME Coordonnées des extrémités 5' 3' E6-E7 62 71,5 El 71 95 E2 95.5 11.5 L2 11 30.5 L1 31,5 52 Région intergénique 52 63,5 L'utilisation de sondes radioactlves préparées à partir de l'ADN de l HPVIP2 purifié a permis de determiner le pouvoir pathogène de ces virus. L ADN du HPVIP2 a été mis en évidence dans un cas de papules bowenoïdes des organes génitaux externes sur les 14 étudiés. dans 2 cancers invasifs du col de l'utérus sur les 51 etudiés et dans 1 cas de néoplasie intraépithéliale du col de l'utérus sur les 28 étudiés.HPVIP2 constitue donc un type d'HPV à tropisme génital présentant un potentiel oncogène. dont la fréquence est un peu inférieure à celle du HPV'a, et nettement inférieure å celle du HPV16. Il est nécessaire de l incorporer à tout mélange d'ADN d'HPV destine a la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant un risque pour le développement de néoplasies génitales et. en particulier, de cancers du col de l'utérus, Clonaae moléculaire et caractérisation d'un nouveau tvoe d'HPV associé à des lésions Drécancéreuses de la peau (HPV IP4). Un nouveau type d'HPV a été mis en évidence dans lADN extrait d'une biopsie de kératose actinique. une lésion précancéreuse cutanée, par hybridation moléculaire. dans des conditions strictes, avec un mélange avec des sondes radioactives spécifiques des HPV type 5, 8 et 14. Aucune hybridation croisée n'a été détectée lorsque l'hybridation a été effectuée des sondes specifiques des types 1,2,3,7,10,13,16,18,28, IP1 (précédemment denommé HPV31 IP2, et IP3 (précédemment dénommé HPV32). Une etude de la sensibilité de l'ADN de cet HPV a plusieurs enzymes de restriction a montré que l'enzyme EcoRI coupe une fois l'ADN viral. Apres digestion de l'ADN extrait de la biopsie par l'endonuclease EeoRI. la friction renfermant des molécules d'ADN de skb (taille d'an génome de pap;llomavirus) a eté purifies par centrifags un dans un gradient de saccharose. Les mosecules 8kb ont carte insérees. par le site EcoRI, dans l'ADN du bacteriophage ss gt wes. B.Après encapsidation de l'ADN recombi- nant et infection de bactéries hotes (Escherichia col, souche LA101), les plages de lyse correspondant à des phages recombinants ont été detectées par hybridation de répliques des cultures bacteriennes infe mélange radioactif des ADN de HPVs, 8. et 14. dans des conditions non strictes.Plusieurs bacteriophages recombinants. contenant la totalite des sequences virales ont été isolés : la coupure de l'ADN phagique par l'enzyme dinsertion EcoR 1 engendre un fragment de 9kb hybridant avec la sonde spécifique des HPV5,S et 14 dans des conditions non strictes : la coupure de 1 ADN de phages recom- binants et de l'ADN de la lesion d'origine par le mélange des enzymes EcoRI et PstI engendre les mêmes 6 fragments dont la somme des polds moléculaires est égale a la taille d'un génome des paplliomavlrus. L'ADN du nouvel HPV a été excisé de l'ADN d'un bactériophage recombinant, purifié par électroélution. et recloné dans le plasmide P@P65. Une carte- de restriction de l'ADN viral a eté établie à partir de la sensibilité de cet ADN à 15 endonotléases de res- triction, ce qui a permis de localiser 23 sites de coupure (figure 10). La carte ainsi établié est différente de la carte des gnomes des HPV identifiés a' ce jour. L'homologie de séquence entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiés à ce Jour a été analysée par de expériences d'hybridation moléculaire sur réplique effectuées dans des conditions strictes. Une homologie, inférieure à 50 Z. a eté détectée entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN de certains types d'HPV precedemment identifiés dans des lesions d'epidermodysplasie verruciforme @@PV5.8.12.14. - 19.20,21 et 25), mais aucune homologie n'a été détectée avec les autres types d'HPV Le nouveau virus caractérisé a partir d'une kératose actinique constitue donc n nou- veau type d'HPV provisoirement denommé HPVIP4. L utilisation d'une sonde radioactive preparée a partir de l'ADN de l'HPVIP4 purifie a permis de mettre en evidence HPVIP4 cnez 42 % des 17 patients atteints d'épidermodysplasie verruciforme etudies et dans x sur y des biopsies de kératose actinique analysées. Du fait de sa grande frequence chez les malades atteints d épidermodys- plasie verruciforme. une maladie caractérisee par le dé veloppement fréquent de cancers cutanes, et de son asso- ciation a une fraction des lès ions de keratose actinique considerees comme précurseurs de cancers spinocelluiarres de la peau, HPVIP4 constitue un type d'HPV a tropisome cutane présentant un potentiel oncogene.Il est nécessaire de l'incorporer a tout melange d ADN d'HPV destiné a la preparation de sondes moleculaires en vue du diagnostic ou du depistage des types d'HPV constituant an risque pour le développement de lésions precancereuses ou cancéreuses de la peau. Etant donné la grande diversité des HPVs suscepti- bles d'étre isolés à partir des différentes formes de ver r@es ou autres lésions cutanées ou de muqueuses. il est cependant préféré d'utiliser, pour le diagnostic de chaque type d'affection mentionne dans le tableau, des me anges comportant plus d'un ou deux ADN-HPVs, des lors que d'au- tres ADN-HPVs ont et reconnus cumme pouvant également ln- tervenir dans le développement du même type d'affection. Le diagnostic de la nature de l'infection et de son evolution possible sera d'autant plus efficace que le nombre de sondes utilisées sera plus élevé. En outre, des essais d'hybridation réalisés avec des mélanges différents de sondes permettra des diagnostics différentiels présentant un degré de probabilité également plus important de la nature du mal dont souffre le patient. L'invention concerne donc plus particuliérement encore des mélanges ou cocktails de différents ADNs-HPVs (ou sondes contenant ces ADNs-HPVs ou de séquences de ces dernlers), susceptibles d'etre utilisés en combina son pour réaliser des diagnostics globaux des différentes formes d'infections a papillomavirus éventuellement aux fins de pronostiquer l'évolution possible de l'infection. Des mélanges preférés conformes à 1' invention sont identifiés dans le tableau ci-après TASLEAU CARACTERISTIQUES DES MELANGES D'ADN D'HPV UTILISABLES POUR LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE D'INFECTIONS A PAPILLOMAVIRUS Désifgnation Constitution ) Maladies à diagnostiquer des mélanges 1 1,2d*,4 Verrues cutanées ou mugueueses (en particulier, verrues vulgaires et plantaires). Diagnostic différentiel de l'épidermodysplasie verruciforme. 2 3,10a,10b*,28*,29* Verrues planes ou intermédiaires cutanées ou mu queuses. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. Diagnostic différentiel de l'épidermodys plasie verruciforme. 3 5,17a*, 24* Epidermodysplasie verruciforme. Néoplasies intra épithéliales et cancers cutanés. 4 5,8,12,14a*,14b*,19*,20*,21*,22*,IP4 Epidermodysplasie verruciforme. 5 9,15*,17a*,17b Epidermodysplasie verruciforme. 6 24* Epidermodysplasie verruciforme. 7 5,8,14b*,32* ,IP4 Cancers cutanés de l'épidermodysplasie verruciforme. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 8 13,31* Hyperplasie épithéliale focale orale ; Diagnostic différentiel des néoplasies intraépithéliales orales. 9 32*, IP4 Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 1) Les nouveaux types d'HPV entrant dans la constitution des mélanges de sondes sont indigués par un astérisoue Le tableau susdit indique également les natures des affections susceptibles d'être plus particulièrement diagnostiquées par l'utilisation des mélanges figurant dans la partie gauche du tableau. Il est rappele que les cartes de restriction des autres ADN-HPVs identifies dans le tableau qui précede sont contenues dans les figures 1 à 9. Il est a remarquer que le HPV-IP2 peut etre consi- déré comme particuliérement representatif de sondes utilisables pour la detection des risqoes de développement de neoplasies genitales et en particul@er. de cancers du col de l'uterus. L'invention concerne donc plas particuliérement encore des trousses ou "kits" de diegnostic comprenant au moins 10 groupes figurant dans les groupes numerote-s de t à 10 dans le tableau sous la rubrique "Designation des mélanges" Dans ce qui precéde. on a surtout envisage- l'utili- sation, à titre de sondes. des ADN MPVs entiers clones. Ceux-ci peuvent cependant être ubstitues par de fragments clonés de ces differents ADNs. notamment par les gènes El ou L1 et par les gènes E6-E7. Le principe de base des detectlons in v-ltro d'ADN- HPV mettra naturellement en Jeu des nybridations opérees dans des conditions strictes ou moins strictes. On peut opérer par exemple comme suit. cnt @aturellement entendu que les essaIs de diagnostic décrits ne sauraient etre considérés $comme limitatifs des conditions d'emploi des sondes ou mélanges de sonde. selon l'invention. L'objet des examens mettant en Jea des sondes preparees a partir de mélanges d'ADNs Je YPVs clonés est de mettre en évidence un HPV et d'identifier le type d'HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies fixes par le mélange de Carnoy (éthanol. chloroforme, acide acétique 6:3:1) et incluses dans la paraffine.L'examen nécessite l'extraction préalable de l'ADN des prelevements selon des méthodes dont le principe est connu et met en Jeu l'analy- se de cet ADN par des expêrlences d'hybridation molecu- laire, effectuées dans des conditions strictes ou moins strictes, a l'aide de sondes rauioactives (marquees au 32p ou au 35S) préparees à partir de melanges d'ADN HPVs. Chaque examen requiert. en general. l'otilisation de plusieurs melanges de sondes. Plusieurs methodes d'hybridation beuvent étre utilisées. On peut. par exemple. -,ettre -en oeuvre s méthode d'hybridation sur tache. Cette méthode comporte. apre dénaturation de l'ADN. le depêt d'une quantité aliquote d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou GenescreenpIus). l'hybridation de chaque membrane. dans les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la detectian des hybrides radioactifs par expasition des membranes au contact d un film radiographique.On peut aussi utiliser une methode d'hybridation sur réplique, Cette methode comprend la separation electrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN engenores aprés traitement de l'ADN par des enzymes de restriction transfert des fragments, apres dénaturation alcaline. sur des membranes (nitrocellulose, Genesoreenplus) et leur hybridation, dans les conditions usuelles, avec differents mélanges de sondes, La formation d'hybrIdes radioactifs est detectée aprés exposition des membranes au contact d'un film radiographique. On peut aussi avoir recours à une méthode d'hybri- dation in situ. par exemple sur des coupes de tissus fixés par le mélange de Carnoy et incluses dans la paraffine. Les sondes radioactives sont constituées soit par des ADNs d'HPVs marqués par la méthode de "nick-translation". soit par d*s ARNs préparés par transcription d'ADNs viraux insérés dans un vecteur, par exemple de type SPE. L'utilisation de sondes radioactives présente l'avantage d'une grande sensibilité. mais ceci n'exclut pas l'utilisation de sondes non radioactives par exemple biotinylées et susceptibles d'être reconnues par des anticorps soit marqués eux-memes, soit eux-memes reconnus par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluorescent, etc. L'invention concerne donc encore des nécessaires ou "kits" contenant une pluralité des sondes sus-indiquées, et comprennent - HPV-IP2 et HPV-IP4 respectivement pris de façons isoliées, - soit les sondes précédentes, en mélange avec d'autres. notamment celles définies plus haut, ces "kits" étant destiné à des études de diagnostic in vitro par hybridation entre des préparations virales obtenues a partir de patients et les divers groupes ou mélanges. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs délà de ce qui précéde, l'invention ne se limite nuilement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qu; ont été plus specialement envisages ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes ; notamment la référence dans les revendications à une désignation ADN-HPV suivie d'un nombre determiné, et à laquelle correspond un ADN-HPV dont la carte de restriction a été fournie dans les dessins, s'entend comme signifiant que ces revendications couvrent tous les ADN -HPVs qui ont en commun avec cet ADN-HPV particulier de pouvoir être classés dans le meme type, selon la définition qui en a été donnée plus haut, et a fortiori aux ADN-HPV appartenant au meme sous-type. On notera que les ADNs recombinants désignés ci-après ont été déposés le 3 Mai 1985 a la C.N.C.M. (Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris), sous les numéros apparaissant ci-après PLI55/IP2................ n I-450 pSP65/IP4 n I-449 REVENDICATIONS 1 - ADN-HPV ayant une taille comprise entre environ 7000 et environ 8000 paires de bases ou un fragment de cet ADN-HPV, cet ADN-HPV consistant en une variante des ADN-HPVs définis dans le brevet principal, cet ADN-HPV étant obtenu a partir d'un des papillomavirus repondant aux designations HPV-IP2 et HPV-IP4. 2 - Fragment d'ADN selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'il correspond aux génes E1. E6-E7. L1 ou L2 ou qu il correspond encore å un fragment correspondant à une région lntergénique dudit ADN-HPV. 3 - ADN recombinant contenant un ADN-HPV selon la revendication 1 ou un fragment selon la revendication 2. 4 - ADN, fragment ou ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3 pour l'utilisation en tant que sonde de détection d ADN-HPVs, 5 - Composition utilisable pour la détection de papillomavirus dans un milieu biologique le contenant, caractérisée en ce qu'elle contient un ADN-HPV conforme à la revendication 1 associé a un ou plusieurs ADN-HPVs dis- tincts. 5 - Nécessaire ou kit comportant une pluralité de sondes ou mélange de sondes distinctes, caractérise par 9 groupes de sondes ; chacune desquelles comporte 1) au moins l'ADN de l'HPV2d. 2) au moins l'un des ADNs de HPV 1Ob, 28 et 29. 3) au moins l'un des ADNs de HPV 17, 24. 4) au moins l'un des ADNs de HPV 14, 15, 17, 19, 20. 21, 22, 23 et IP4. 5) au moins l'un des ADNs de HPV 15 et 17, 6) l'ADN de HPV 24, 7) l'ADN de l'un des ADNs de HPV 14, 32 et IP4. 8) l'ADN de HPV 31, 9) l'ADN de HPV 32, IO)au moins l'un des ADNs de HPV 16. 18 et IP2. étant entendu que les ADNs des neuf groupes sont choisis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres dans la mesure où chacun des neuf groupes serait réduit à un seul des ADNs qui le composent. 7 - Procédé de détection et d'identification de papillomavirus contenus dans un échantillon biologique comprenant la realisation d'essais d'hybridation avec uo ou plusieurs -ADN-HPVs, fragments d'ADN-HPVs ou ADNs recombinants conformes à l'une quelconque des revendication' 1 a 3 ou encore plusieurs compositions distinctes conformes à la revendication 4, et la détection de ceux des ADN-HPVs, fragments ou ADNs recomb;nants ou encore compositions qui donnent lieu a hybridation préfèrent elle avec les ADN-HPVs préalablement soutenus à partir desdits echan- tillons biologiques. 8 - Papillomavirus purifiés biologiquement purs. caracterisés en ce qu ils appartiennent a-u meme type que l'un de ces papillomavirus identifies dans la revendica tion 1. 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