Brevet FR2576107A1 — publié le 19860718

Procédé de recherche d'anticorps et équipement ou kit pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention est relative à un procédé d'analyse pour la recherche d'anticorps de rétrovirus, ainsi qu'à de nouveaux isolats viraux utilisables dans ce procédé, et plus spéci- fiquement à l'isolation d'un virus lié au virus T-lympho- trope humain et à ses utilisations ainsi qu'à l'utili- sation d'autres rétrovirus dans l'analyse de sérums pour déterminer la présence d'anticorps de rétrovirus, en parti- culier de ceux associés au syndrome immuno-déficitaire acquis (SIDA). Il apparaît vraisemblable depuis quelques années que le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA) est provoqué par un agent infectieux. Les symptômes de cette maladie sont limités à certains groupes à risque bien définis selon un schéma qui suggère fortement un agent transmis- sible par contact sexuel ou sanguin. Bien que la maladie ait été détectée initialement aux Etats-Unis d'Amérique, elle se manifeste de façon croissante dans d'autres ré- gions, y compris en Europe. On pense que l'un des moyens par lesquels la maladie se répand est la transfusion de sang donné par des donneurs qui sont eux-mêmes contaminés par le virus du SIDA. La mise en commun de sang donné implique que si du sang fourni par un donneur porteur du virus du SIDA est mis en commun avec des échantillons de sang provenant d'autres donneurs, la totalité du sang et des autres produits dérivés de ce fond commun peut être contaminée, quelle que soit la taille de l'échantillon. Beaucoup de donneurs de sang porteurs du virus du SIDA sont dans l'ignorance de leur contamination, en particulier dans les phases initiales de celle-ci, et d'autres donneurs contaminés, même s'ils sont conscients de cet état de fait, peuvent ne pas être disposés à révéler soit qu'ils sont atteints par la mala- die, soit qu'ils appartiennent à un groupe à haut risque. Une demande croissante existe donc pour des tests relati- vement simples mais entièrement fiables permettant d'effec- tuer sur des échantillons de sang donné aux fins de trans- fusion une recherche de routine de la présence de virus du SIDA ou d'anticorps du virus du SIDA. Les dons de sang qui donnent un résultat-positif au test peuvent être reje- tés pour la transfusion et la contamination d'autres échan- tillons de sang par mise en commun avec l'échantillon contaminé peut être évitée. Des recherches sont conduites activement depuis quelque deux ans en vue d'identifier et d'isoler l'agent respon- sable du SIDA, mais un désaccord subsiste entre divers chercheurs dans ce domaine quant-à l'identité et à la nomenclature précises de celui-ci. Ce qui a été appelé un isolat de virus SIDA a d'abord fait l'objet d'un rap- port en 1983 par Montagnier et ses collaborateurs en France qui l'ont appelé "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-l) (Virus Associé à la Lymphadénopathie Un). Presqu'un an plus tard, Gallo et ses collaborateurs aux Etats-Unis ont publié des précisions sur l'isolement d'un autre virus appelé virus du SIDA qu'ils ont désigné par "Human T- Lymphotropic Virus Type III", (HTLV-III), (Virus T-Lympho- trope Humain Type III). Nous avons maintenant pu isoler, à partir d'une tumeur du ganglion lymphatique, un rétrovirus T-lymphotrope humain apparenté au HTLV-III et au LAV que nous avons appelé CBL-l. Notre CBL-l est un isolat stable qui peut être cultivé dans une lignée cellulaire hôte et peut être uti- lisé dans une analyse pour la détection d'anticorps de virus du SIDA dans des échantillons de sérum. En conséquence, l'invention fournit un rétrovirus T-lym- photrope humain CBL-l lié étiologiquement au SIDA. Nous avons constaté que le CBL-l peut être maintenu pen- dant des périodes de temps prolongées dans une lignée cellulaire leucémique T appelée CCRF-CEM et décrite par Foley et al, Cancer 18, 522529 (1965) et un autre aspect de l'invention prévoit des cellules CCRFCEM hébergeant notre virus CBL-l. Aux fins de confirmation, nous avons déposé des échan- tillons de cellules CCRF-CEM hébergeant notre virus CBL-l auprès de la National (maintenant European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) au Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG Angleterre. La NCACC (ECACC) a été désignée comme Autorité Interna- tionale de Dépôt selon le traité de Budapest de 1977. Notre dépôt a été effectué le 11 janvier 1985 et a reçu le numéro de dépôt 85 01 1101. Notre produit CBL-l a été isolé à partir de lymphocytes cultivés en provenance d'une biopsie d'une tumeur du gan- glion lymphatique d'un patient britannique subissant un traitement pour un lymphome immunoblastique associé au SIDA. On a maintenu des fragments de la biopsie dans un milieu de culture auquel ont été ajoutées des cellules T et, après deux jours environ, les cellules CCRF-CEM ont été ajoutées à la culture qui a été maintenue dans des conditions telles que les lymphocytes primaires dis- paraissent sur une période d'environ un mois tandis que les cellules CCRFCEM prolifèrent et sont infectées de façon chronique par le virus CBL-l. On a montré que le virus CBL-1 est apparenté aux isolats de HTLV-III précédemment décrits (a) par une activité de transcriptase inverse avec une préférence pour les cations Mg++; (b) par la morphologie des particules de virus visualisées par microscopie électronique; (c) par immunofluorescence indirecte spécifique pour les antigènes viraux dans des cellules CCRF-CEM infectées par CBL-l avec des sérums préparés en provenance de pa- tients atteints du SIDA; (d) par comparaison avec HTLV-III et LAV-l en analyse radioimmunologique (radioimmunoassay - RIA) en phase solide. et est ainsi compris dans le groupe taxonomique des Retro- viridae contenant les virus lymphotropes de cellules T humaines. Une analyse préliminaire de séquence de DNA indique que la séquence du virus CBL-1, bien qu'étroitement apparentée à celles des autres rétrovirus Tlymphotropes humains décrits jusqu'ici, n'est pas identique à celles des produits décrits précédemment mais présente un certain écart de séquence en divers endroits. On a montré que les cellules infectées que nous avons déposées auprès de la ECACC continuent de synthétiser le virus et les antigènes viraux sur une période d'au moins six mois. Bien que nous ayons constaté que les cellules CCRF-CEM sont un hôte idéal pour notre virus CBL-l, nous avons constaté que les cellules peuvent aussi être utilisées pour héberger un virus similaire que nous avons isolé à partir du sang périphérique du même patient sur qui la biopsie de tumeur du ganglion lymphatique a été pré- levée et des virus similaires isolés à partir d'autres patients contaminés par des virus liés au SIDA. Nous avons ainsi montré que cette lignée cellulaire peut fournir un hôte utile pour la culture in vitro non seulement de notre produit CBL-l mais d'autres produits apparentés. Selon un autre aspect de la présente invention, nous pro- posons un procédé d'analyse d'un échantillon biologique pour la recherche d'un anticorps de rétrovirus, caracté- risé en ce qu'on met l'échantillon biologique en contact avec (1) un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et (2) une immunoglobuline qui contient un anticorps spéci- fique des antigènes rétroviraux et qui est-marquée par un traceur révélateur non radioactif, et qu'on sépare la phase liquide de la phase solide et détermine la quan- tité de traceur révélateur associée à l'une ou l'autre de ces phases. Selon encore un autre aspect de l'invention, on fournit un équipement d'essai ou kit d'essai comprenant (1) un premier composant qui est un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et (2) un second composant qui est une immunoglobuline conte- nant un anticorps spécifique des antigènes rétroviraux et marquée par un révélateur non radioactif. Comme indiqué plus haut, CBL-l trouve une utilisation principale comme composant d'un système d'essai pour le contrôle de routine de sang destiné à la transfusion pour déterminer s'il provient d'un sujet contaminé par le virus du SIDA. Nous avons développé un système basé sur une analyse compétitive simultanée utilisant des antigènes CBL-1 immobilisés ou d'autres antigènes rétroviraux comme phase solide, et le sérum à tester comme phase liquide. Plus précisément, notre analyse compétitive simultanée est basée sur l'immobilisation de l'antigène CBL-1 ou autre antigène rétroviral par sa liaison à une phase solide, au moyen d'un ligand, par exemple une globuline ou un autre anticorps, et permettant aux sites de liaison de cet antigène immobilisé de faire l'objet d'une compéti- tion de la part d'un mélange d'un anticorps du sérum à tester et d'un anticorps connu pour le virus du SIDA qui peut être identifié par l'agent révélateur. Nous avons constaté que les résultats les plus satisfaisants sont obtenus quand l'agent révélateur est un traceur enzyme. L'utilisation d'un traceur enzyme plutôt que d'un traceur radioactif présente l'avantage de supprimer le risque biologique de la radiation et une conséquence inattendue est qu'elle permet de réduire l'incubation immune de l'es- sai à une heure ou moins. Une autre possibilité est d'utiliser l'immunofluorescence pour révéler la présence de l'anticorps connu lié à l'anti- gène immobilisé. Comme indiqué plus haut, nous avons constaté que les meil- leurs résultats sont obtenus quand l'antigène est attaché à la phase solide par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps. Une technique est d'utiliser un sérum humain de titre élevé prélevé sur quelqu'un qui est conta- miné de façon asymptomatique par le virus du SIDA. Le sérum idéal possède un titre élevé d'anticorps au virus du SIDA mais provient d'un patient dont les niveaux d'immu- noglobulines se situent dans la gamme normale.-Une autre approche est d'utiliser un anticorps monoclonal dirigé contre le rétrovirus. Si celuici est cultivé de façon classique en utilisant des souris, certains avantages peuvent en être tirés comme il sera décrit plus en détail ciaprès. Le matériau de phase solide est de façon convenable le polystyrène qui peut être utilisé sous forme de tubes, perles ou de préférence plaques présentant une-multipli- cité-de puits de surface ou d'autres cavités de surface. La gamma-globuline préparée à partir du sérum choisi, ou autre anticorps, est alors étendue sur le polystyrène, puis l'antigène est lié au polystyrène revêtu de globu- line pour former le premier composant du test. Ce compo- sant peut être conservé à l'état humide ou sec pendant plusieurs mois. Le second composant du test comprend la fraction IgG iso- lée à partir du sérum à tester et, quand il est prévu de révéler au moyen d'un traceur enzyme, cette fraction IgG peut être conjuguée avec par exemple la peroxydase du raifort (HRPO) selon des techniques connues. On peut utiliser l'équipement de test selon l'invention en mélangeant le composant IgG marqué avec le sérum à tester et en mettant ensuite le mélange d'IgG et de sérum à tester en contact avec l'antigène insolubilisé, en sépa- rant l'une de l'autre les phases solide et liquide et en déterminant à quel degré -l'IgG s'est liée à l'antigène. Conformément aux analyses compétitives simultanées, plus le composant IgG de la phase liquide est lié à la phase solide, plus faible est la quantité d'anticorps ou d'anti- gènes dans le sérum à tester. En choisissant des valeurs de contrôle appropriées, il est ainsi possible d'avoir un test de routine dans lequel, si la HRPO est utilisée comme agent révélateur, le sérum à tester peut être consi- déré comme exempt d'anticorps ou d'antigènes du SIDA dès lors que la densité optique (OD) de l'échantillon à tester atteint un niveau minimum prédéterminé. Tout échantillon 8 - de sérum à tester qui donne lieu à l'enregistrement d'une valeur d'OD inférieure au niveau prédéterminé peut par conséquent être rejeté, évitant ainsi une contamination possible d'un don de sang à transfuser par un virus ou un anticorps du SIDA. Il est possible d'utiliser d'autres rétrovirus à titre d'alternative au CBL-l comme antigènes rétroviraux dans la méthode d'analyse et dans l'équipement d'essai de diag- nostic de l'invention. Il peut s'agir d'autres rétro- virus humains étiologiquement liés au SIDA tels que le rétrovirus T-lymphotrope humain HTLV-III ou d'autres rétro- virus humains tels que le virus leucémique T HTLV-II ou HTLV-I, ou de rétrovirus animaux tels que le virus du maedi-visna ou celui de la leucose bovine. Comme il sera décrit plus en détail ci-après, la liaison indirecte d'antigènes rétroviraux humains à la phase solide par l'intermédiaire de globuline procure une certaine amplification des résultats et la formule du test permet une détermination simple, rapide et précise de la présence ou de l'absence de contamination dans des échantillons de sang par des techniciens relativement peu qualifiés et inexpérimentés. L'invention sera mieux comprise grâce aux exemples de réalisation décrits ci-après à titre illustratif, et des dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 représente une micrographie électronique au grandissement de 81 000 montrant des particules de CBL-l qui se détachent de cellules hôtes CCRF-CEM et si- tuées à la limite de celles-ci; - la figure 2 montre l'efficacité-de l'ELISA (essai connu sous le nom d'"Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay", Analyse par immunoabsorption avec liaison d'enzyme) en phase solide pour les anti-HTLV III. La figure présente les densités optiques obtenues en testant un certain nombre de sérums cliniques, les uns réactifs et les autres non réactifs pour les anti-HTLV III, résultats connus à l'avance par analyse radioimmunologique; - la figure 3 montre des données semblables à celles de la figure 2, mais cette fois pour des anti-HTLV I, déter- minées par un ELISA compétitif simultané en une étape semblable au précédent. EXEMPLE 1. ISOLATION ET CARACTERISATION DE CBL-1. Le virus CBL-1 a été isolé à partir de lymphocytes culti- vés en provenance d'une biopsie de tumeur du ganglion lymphatique d'un patient britannique subissant un traite- ient pour un lymphome immunoblastique associé au syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA). On a découpé la biopsie du ganglion lymphatique en petits fragments et on les a placés dans un milieu de culture composé du milieu de base RPMI-1640 complété par 10% de sérum de veau foetal et 10 pg/ml de phytohémagglutinine. Après 24 heures, on a ajouté un milieu conditionné contenant un facteur de croissance de cellules T récolté à partir de cultures mixtes de lymphocytes d'amygdales, et on a retiré la phyto- hémagglutinine. 48 heures après le commencement de la culture, on a ajouté de l'antisérum d'interféron alpha. On a aussi ajouté à 48 heures des cellules CCRF-CEM (appe- lées ci-après cellules CEM). Les cellules CEM sont une lignée cellulaire leucémique T en croissance permanente décrite par Foley et al (1965) Cancer 18; 522-9. Dans ces conditions de culture en commun les lymphocytes primaires ont disparu en quatre semaines de culture tandis que les cellules CEM ont proliféré exponentiellement. Le virus CBL-1 produit par les lymphocytes primaires a infecté les cellules CEM et après huit semaines en culture les cellules CEM étaient infectées de façon chronique par le virus CBL-l. Le maintien des cellules CEM infectées par CBL-l n'a pas nécessité de facteur de croissance de cellules T ni d'anti-interféron alpha. Ces cellules CEM infectées par CBL-l ont été déposées comme indiqué plus haut auprès de la NCACC sous le numéro de dépôt 85 01 1101. On a montré que le virus CBL-l est apparenté aux isolats de HTLV-III/LAV décrits antérieurement (a) par une acti- vité de transcriptase inverse avec une préférence pour les cations Mg++, par la morphologie des particules de virus visualisées par microscopie électronique (voir fi- gure 1) et (b) par immunofluorescence indirecte spécifi- que pour les antigènes viraux dans des cellules CEM infec- tées par CBL-l avec des sérums préparés en provenance de patients atteints du SIDA et par comparaison avec un autre isolat- de virus du SIDA en RIA en phase solide. Les cellules CEM/CBL-l ont continué de synthétiser le virus et les antigènes viraux sur une période de six mois. EXEMPLE 2 1. Préparation de l'antigène. On a préparé un lysat brut de cellules gelées-dégelées de la façon suivante. On a laissé des cellules HT-H9 infec- tées par HTLV-IIIB se développer à la densité maximale en culture en suspension. On a refroidi les cultures à 4 C et on a ajouté 0,25 % v/v de f-propiolactone pendant deux heures. On a alors séparé du fluide de culture et aggloméré les cellules par centrifugation à basse vitesse. On a remis le culot de cellules en suspension dans l'eau distillée et lui a fait subir trois cycles gel/dégel. A chaque cycle, on remettait soigneusement en suspension le résidu du culot de cellules. Après le troisième cycle, on a porté l'extrait à 0,25% vol/vol avec la -propiolac- tone et on l'a conservé à 4 C pendant deux heures; on l'a ensuite réchauffé à 37 C pendant une demi-heure. Pen- dant ce temps, le pH était maintenu dans la région de 7,4. Le lysat brut a été clarifié et conservé à -20 C. Avant utilisation, on l'a dilué dans le tampon TRIS (2- amino-2-hydroxyméthyl-l,3 propanediol) additionné de 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et de détergent. Le choix du détergent et sa concentration ont été importants et on a observé un optimum par l'utilisation de Tween 20 à 0,1% de concentration, amplifiant l'activité de la pré- paration d'antigènes d'un facteur trois ou parfois même plus. Après dilution dans TRIS BSA/Tween 20, l'antigène a été incubé pendant 30 minutes à 37 C. C'est à ce stade que se produit l'accroissement de l'activité des antigènes. De cette façon, la préparation d'antigène peut être uti- lisée pour surveiller l'expression de l'antigène HTLV-III dans des conditions de culture définies diverses. L'anti- génicité peut être quantifiée par RIA en phase solide en utilisant de l'anti-HTLV-III en phase solide et un second réactif, comprenant de l'anti-HTLV-III marqué par I. Dans l'analyse finale, l'antigène a été utilisé àune dilution qui permet un rapport P:N de 10:1 avec 1 à 2% de liaison au traceur en présence de sérums néga- tifs (voir ci-après méthode d'analyse). On a observé une perte variable d'antigènes viraux dans le fluide surnageant sur les cellules mais en termes relatifs la masse d'antigène détectable est restée dans le culot de cellules. Ceci est vrai pour le CBL-1 et pour d'autres isolats de HTLV- III portés dans des cellules CEM ou des cellules HT/H9. Il n'y a pas de contraintes sur la pureté de l'antigène (voir ci-après) et il convient de porter au maximum l'ex- pression de l'antigène dans des cellules. La préparation d'antigène utilisée ici est facile à fabriquer, probable- ment d'un rendement plus élevé par volume de culture cellu- laire que l'antigène préparé à partir du fluide surnageant et apparaït stable à -200C. Elle peut facilement être inactivée par la'n-propiolactOne. On peut également s'at- tendre à ce que l'utilisation du Tween 20 réduise forte- ment le titre d'un virus infectieux quelconque. 2. Antisérums. Le réactif pour l'analyse a été préparé à partir de sérums humains de titre élevé prélevés sur des personnes conta- minées de façon asymptomatique par le rétrovirus du SIDA. La sélection des sérums pour la préparation du réactif est importante. Le sérum avait un titre élevé d'anti-HTLV-III par RIA mais provenait d'un patient dont les niveaux d'immu- noglobulines étaient dans la gamme normale. En pratique, il est habituellement nécessaire de préparer des réactifs à partir d'un petit nombre de sérums satisfaisant aux critères ci-dessus et de tester l'efficacité des réactifs à l'analyse. De façon à rendre ces réactifs non infectieux, les sérums de départ ont été traités par chauffage à 56 C pendant 30 minutes. (a) Préparation de globuline anti-HTLV-IIIB. Ce produit a été utilisé pour purifier l'antigène HTLV-IIIB in situ sur une phase solide. Cette stratégie entraîne des avan- tages considérables. La globuline provenant du sérum traité a été précipitée deux fois par le sulfate d'ammonium à % de la saturation. Il s'agit du réactif le plus simple pour le recouvrement par la globuline bien qu'il soit possible d'utiliser soit un sérum entier soit une IgG purifiée. On a utilisé la globuline à une dilution opti- male qu'il a fallu déterminer par titration individuelle du réactif. Le matériau de phase solide était le polysty- rène sous forme de puits; on l'a recouvert de globuline et on a ensuite neutralisé les sites de liaison en excès par une protéine inerte - dans le cas présent l'albumine de sérum bovin (BSA) à 0,1%. La phase solide recouverte et neutralisée a été conservée à l'état humide à 4 C pen- dant des mois; le séchage donne un produit plus stable. Pour le recouvrement de la phase solide, on a dilué le lysat HT-H9/HTLVIIIB décrit ci-dessus dans le tampon TRIS/BSA/Tween à une dilution qui, lors de tests subsé- quents, permettait la liaison de 1 à 2% du traceur avec un sérum négatif. Le recouvrement a été réalisé de la façon la plus efficace par une incubation de deux jours d'antigène à température ambiante dans la phase solide suivie d'une conservation à l'état humide à 4 C jusqu'à utilisation. Les expériences préliminaires ont montré que la phase solide était stable sous cette forme pendant plusieurs mois. Néanmoins, elle peut aussi être séchée sans perte sensible d'activité et rester stable pendant plusieurs mois. (b) Marquage de la globuline. On a conjugué l'IgG décrite ci-dessus en 2(a) avec la HRPO en utilisant des dérivés hétérobifonctionnels de la façon usuelle pour fournir un rapport de substitution molaire de 1:3. Ce produit a été utilisé en association avec la phase solide décrite en 2(a) ci-dessus dans une analyse immunologique avec enzyme pour la détection d'anti- corps de rétrovirus du SIDA dans des échantillons de fluide corporel. Aux fins de comparaison, un autre échantillon de l'IgG a été marqué par 125I à une activité spécifique de 15 i/Ci par pg de protéine. EXEMPLE 3. ELISA compétitif en une étape pour anti-CEM/CBL 1. Réactifs de sérum. On a utilisé un sérum humain contenant un titre élevé d'anti-HTLV-III pour la préparation de globuline de recou- vrement comme décrit précédemment dans l'exemple 2.2. On a recouvert des puits de polystyrène présentant une configuration à fond rond avec une dilution optimale de globuline, puis on les a neutralisés par une protéine inerte, dans le cas présent la BSA à 0,1%. Le même sérum a été utilisé comme source d'immunoglobuline, qui a été purifiée par chromatographie à écnange d'ions sur DE 52 comme décrit précédemment. L'IgG a été-couplée avec la peroxydase du raifort à un degré de substitution approxi- matif de trois molécules de peroxydase du raifort pour une molécule d'IgG. L'efficacité du conjugué a été déterminée par incubation par rapport à des puits préalablement recouverts, par l'intermédiaire d'un anticorps indirect, par des anti- gènes viraux provenant de cellules infectées par HTLV-III et par des cellules non infectées par des antigènes. On a considéré comme dilution optimale du conjugué celle qui donnait la liaison colorée maximale avec l'antigène des cellules infectées et la production de couleur maxi- male avec les cellules non infectées. Antigène CEM/CBL 1. Des cellules infectées de façon persistante par le virus CEM/CBL 1 ont été cultivées jusqu'à la densité maximale dans des cultures sous agitation non adhérentes. Les cul- tures sous agitation ont été refroidies à 4 C puis portés à 0,25% en volume avec la P-propiolactone. Après deux heures d'incubation à 4 C, le culot de cellules a été récolté et soumis à des cycles gel/dégel, puis clarifié comme précédemment par centrifugation. L'extrait de culture tissulaire a ensuite été traité pour une nouvelle incuba- tion de deux heures à 4 C par 0,25% de '-propiolactone puis hydrolysé comme précédemment. Dans le cas présent, le diluant pour l'éclatement des cellules et le cyclage gel/dégel était le sérum physiologique tamponné au phos- phate, additionné de 0,1% de Tween 20. On a ensuite titré les préparations d'antigène sur une phase solide recou- verte de globuline anti-HTLV-III de titre élevé, et on a utilisé comme dilution de travail pour les essais subsé- quents la dilution donnant une OD à 450 nm comprise entre * 1,0 et 1,2 dans les conditions définies ci-après. Optimisation et formule d'essai. On a incubé des puits recouverts de globuline à titre élevé, et ensuite neutralisés, avec 100 y1 de la dilution optimale d'antigène CEM/CBL 1. Après une nuit d'incuba- tion à température ambiante, on a éliminé l'extrait d'anti- gène par lavage des puits et séché ceux-ci dans des condi- tions qu'on a trouvées propres à promouvoir la stabilité des antigènes viraux CEM/CBL 1 immobilisés. Pour l'essai, on a placé 25 pl de sérums positifs pour l'anticorps et négatifs pour l'anticorps dans des puits séparés, et ajouté aux puits 75 p1 de conjugué ELISA dans de l'eau distillée additionnée de détergent. On a incubé le mélange de sérum à tester et de conjugué (incubation immune) dans les puits pendant des temps variables dans différentes conditions. On a ensuite lavé les puits trois fois au Tween salin (solution de chlorure de sodium à 0,8% additionnée de 0,1% de Tween 20). Après trois lavages, on a rempli les puits de Tween salin et on les a laissés tremper deux minutes à température ambiante, après quoi la procédure de lavage a été répétée avec trois cycles de lavage. En- suite, on a ajouté 100 ivl de substrat chromogène, dans le cas présent la 3,3',5,5'tétraméthylbenzidine (TMB). Après vingt minutes d'incubation à température ambiante, on a interrompula réaction chromogène par addition de il d'acide sulfurique quatre fois normal. On a mesuré la formation de couleur par spectrophotométrie à 450 nm. On a considéré comme dilution de travail pour chaque anti- gène CEM/CBL 1 particulier celle qui donnait de façon fiable une densité optique comprise entre 1 et 1,2 avec un sérum négatif lors de l'utilisation dans l'ELISA dans les conditions optimales, définies comme étant une incuba- tion immune d'une heure à 450C. Résultats. La comparaison entre les résultats obtenus dans un RIA classique utilisant la phase solide et une IgG marquée par 1251 décrit dans l'exemple 2 et les résultats ELISA obtenus dans le présent exemple a démontré deux avantages inattendus en faveur de l'ELISA. En premier lieu, des préparations d'antigènes sous-optimales qui donnaient des résultats médiocres en RIA ont été capables de pro- duire, au même titre, des bons résultats en ELISA. En second lieu, comme illustré dans le tableau 1, il n'a pas été possible avec le RIA de réduire les temps d'incuba- tion au-dessous de trois heures. Un besoin existe d'une recherche rapide, une à deux heures au total, dans les préparatifs de transfusion, et ceci n'a été possible qu'avec l'ELISA. TABLEAU 1 Expériences à temps et température variables en RIA avec IgG marquée par 125I. Sérums témoins Temps en heures Température_ S r m _ _on Négatif Coupure Positif 18) 1.13 0.28 0.08 3)TA 0.37 0.19 0.1 2) 0.30 0.18 0.09 1) 0.34 0.15 0.1 3) 0.43 0.15 0.11 2)37 C 0.43 0.19 0.09 1) 0.28 0.18 0.12 3) 0.45 0.14 0.06 2)450C 0.40 0.14 0.07 1) 0.27 0.13 0.05 * % de liaison du niveau d'entrée. La figure 2 montre les résultats d'essais par ELISA de 56 sérums cliniques, provenant dans le cas présent d'hémo- philes traités par des concentrés commerciaux et non com- merciaux de Facteur VIII et d'homosexuels. On peut voir dans la figure qu'une séparation claire s'est faite entre les sérums réactifs pour l'anti-CEM/CBL 1 et les sérums non réactifs. Dans cet exemple particulier, la densité optique moyenne de 16 sérums réactifs pour l'anticorps du CEM/CBL 1 était 0,085 (0,037 à 0,327) et la densité optique moyenne de 40 sérums non réactifs pour cet anti- corps était 1,16 (0,736 à 1,352). Le sérum a provenait d'un patient atteint du SIDAcondamné et était faiblement réactif aux essais par immunofluorescence et par liaison directe. Les sérums b et c étaient non réactifs lors d'un nouveau test. La même formule exactement a été utilisée dans une étude sur des sérums de Transfusion Sanguine au Royaume-Uni. Jusqu'à présent plus de 12 000 sérums de donneurs ont été testés. Trois sérums ont donné des réactions aux essais de dépistage. Toutefois, lors d'un nouvel essai, un don- neur unique seulement a été trouvé réactif. Le sérum était réactif de façon répétée, était titrable et manifestait une forte réactivité en immunofluorescence à l'égard de cellules infectées mais non de cellules non infectées. La réactivité aléatoire de sérums non liée à l'infection par CEM/CBL 1 était par conséquent extrêmement faible. Des expériences ultérieures de titrage de sérums réactifs pour l'antiHTLV-III ont démontré que les titres étaient en gros les mêmes lors des essais par i'ELISA CEM/CBL 1 et les analyses directes. Ceci a été confirmé par l'exa- men ultérieur de sérums prélevés sur des patients subis- sant une séroconversion aigu& à la suite d'une infection primaire par HTVL-III. Encore une fois il n'y avait en gros aucune différence dans le niveau ou le temps de réac- tivité initial entre l'analyse par liaison directe et i'ELISA compétitif. En utilisant la même méthode d'essai, des sérums de patients contenant des anticorps anti-lympho- cytes oligo et pan-réactifs, et des sérums de patients atteints d'une maladie auto-immunitaire, ont été non réac- tifs dans l'ELISA compétitif. Considérées ensemble ces données indiquent une spécificité et une sensibilité éle- vées de cet ELISA compétitif pour l'anticorps du rétro- virus lié au SIDA. EXEMPLE 4. ELISA compétitif en une étape pour l'anti-HTLV-I On a sélectionné et préparé des sérums et des réactifs de la même façon que pour l'analyse immunologique du CEM/ CBL i de l'Exemple 3, à ceci près qu'on a utilisé des cellules infectées par HTLV-I pour la préparation de l'anti- gène et des sérums de patients contaminés par HTLV-I comme source de réactifs. La figure 3 montre la densité optique fournie par 32 sérums cliniques, y compris trois témoins connus faiblement posi- tifs. Une différenciation claire s'est manifestée entre les sérums réactifs et non réactifs, la densité optique moyenne de cinq sérums réactifs pour cet anticorps étant 0,099 (0,060 à 0,129) et la densité optique moyenne de 24 sérums non réactifs pour cet anticorps étant 1,64 (1,48 à 1,83). L'essai est robuste et on peut faire varier les conditions mais en pratique on a décidé d'adopter comme optimum une incubation immune d'une heure à 45 C. Ceci correspond aux conditions adoptées pour la détection des anticorps de CEM/CBL 1. La même formule d'essai a été utilisée pour dépister plus de 1000 donneurs de sang britanniques tout-venant et aucun sérum réactif n'a été identifié. En revanche, un dépis- tage sélectif de quelques 75 donneurs d'origines afri- caine et antillaise a permis d'identifier un seul donneur séropositif donnant pour la première fois. La procédure décrite ci-dessus a été répétée mais en uti- lisant des sérums de patients infectés par HTLV-II comme source de globuline de recouvrement et comme source d'IgG. On a utilisé des cellules infectées par HTLV-II comme source d'antigène. Ces réactifs ont été choisis et pré- parés de la même façon que précédemment décrit dans l'exem- ple 2 pour le RIA de l'anti-HTLV-III. EXEMPLE 5 Production et utilisation de l'équipement d'essai. 1. Réactifs On a recouvert au moins la surface interne des puits d'une plaque de polystyrène multipuits contenant 96 puits d'un anticorps humain du CBL-1 purifié. L'anticorps provenait d'un sérum traité par la chaleur prélevé sur un humain contaminé par le rétrovirus du SIDA. Après recouvrement du polystyrène par l'anticorps, on a neutralisé les sites de liaison résiduels par une protéine inerte, dans le cas présent l'albumine de sérum bovin. L'antigène utilisé pour l'insolubilisation sur les plaques, de polystyrène était le CBL-1. On a d'abord traité celui-ci par la F propiolactone viricide et une suspension du CBL-1 inactivé dans le tampon TRIS/BSA/Tween a été incubée avec le poly- styrène traité pendant deux jours environ à température ambiante. De cette façon, le CBL-1 a été solubilisé par liaison indirecte au support de polystyrène par l'inter- médiaire de l'anticorps. Ce composant est le premier compo- sant de l'équipement d'essai. On a préparé le second composant de l'équipement d'essai en marquant le même anticorps humain qui a été utilisé pour recouvrir le polystyrène comme décrit ci-dessus. On a marqué l'anticorps par conjugaison avec la peroxydase de raifort (HRPO) en utilisant des techniques de conjugai- son classiques. On a conservé cet anticorps marqué par HRPO à l'état lyophilisé et l'a reconstitué immédiatement avant l'utilisation en utilisant une suspension dans un diluant aqueux. En plus des deux composants mentionnés ci-dessus, il est souhaitable d'inclure dans l'équipement d'essai des réac- tifs auxiliaires de façon à mettre à disposition tous les réactifs de révélation et de contrôle nécessaires. Pour l'équipement utilisant la HRPO comme traceur, il est commode d'utiliser la 3,3',5,5 '-tétraméthylbenzidine 257610? (TMB) comme substrat pour l'enzyme;.la TMB a été mise en oeuvre sous forme de comprimés, chaque comprimé procu- rant un substrat suffisant pour 96 puits. Immédiatement avant utilisation, on a dissous les comprimés de TMB dans une solution aqueuse contenant du citrate trisodique et du peroxyde d'hydrogène. Il est également souhaitable de prévoir des sérums témoins positif et négatif. Le sérum témoin négatif était du sérum humain normal non réactif pour l'anticorps du CLB-1 dans ce test. Le sérum témoin positif était un sérum humain traité par la chaleur, réac- tif pour l'anticorps du CBL-1 dans la procédure d'essai. De plus, il est souhaitable de prévoir, comme sérum témoin de coupure, un sérum humain traité par la chaleur réactif (au niveau de coupure dans l'essai) pour l'anticorps du CBL-1 et également un fluide de lavage comprenant du sérum physiologique et du Tween 20. 2. Utilisation de l'équipement d'essai. L'anticorps marqué à la HRPO a été reconstitué immédiate- ment avant utilisation. L'essai a été effectué en utili- sant 25 microlitres d'échantillon de sérum par puits. Deux puits ont reçu un sérum témoin négatif et un un sérum témoin positif, trois un sérum témoin de coupure et les échantillons à tester ont été introduits dans les puits restants. On a introduit des portions de 75 microlitres de l'anticorps marqué à la HRPO reconstitué dans chaque puits, puis on a couvert la plaque à puits et on l'a incu- bée sur un bloc chauffant à 45 pendant une heure, ou alternativement à 20 à 25 C pendant une nuit pour une incubation d'au moins 16 heures. A la fin de la période d'incubation, on a lavé la plaque et ajouté à chaque puits des portions de 100 microlitres de solution de substrat. La plaque a ensuite été incubée pendant 20 minutes entre 18 et 25 C, après quoi une couleur bleue s'est développée dans les puits contenant les échantillons négatifs. Des portions de 50 microlitres d'acide sulfurique 2M ont alors été ajoutées à chaque puits, la couleur bleue devenant 2576T107 alors jaune. On a ensuite lu l'absorbance de chaque puits à 450 nm, dans les 30 minutes suivant l'addition de l'acide sulfurique, en utilisant un lecteur de plaque à micro- puits. 3. Résultats Les résultats ont été évalués de la façon suivante: on a calculé l'absorbance moyenne des trois sérums témoins de coupure. On a alors considéré comme négatif pour l'anti- corps du rétrovirus du SIDA, dans les limites du système d'essai, tout échantillon présentant une absorbance égale ou supérieure à la valeur moyenne du témoin de coupure. Tout échantillon présentant une absorbance inférieure à la moyenne du témoin de coupure ou jusqu'à 10% au-dessus de celle-ci a été de nouveau testé. Tout sérum apparaissant positif de façon répétée dans cet essai a été testé de nouveau aux fins de confirmation en utilisant l'immunofluorescençe ou la méthode de sépa- ration par électrophorèse et transfert connue sous la désignation "Western Blot". La procédure décrite ci-dessus a été-testée avec 1600 échantillons de routine de donneurs de banques du sang avec des résultats négatifs. Cependant, quand on a testé d'autres spécimens cliniques provenant de patients présen- tant un diagnostic clinique de SIDA, de para-SIDA (Aids- relatex complex) ou d'autres maladies, on a détecté des résultats positifs qui, pratiquement dans tous les cas, ont été confirmés au test par immunofluorescence et par un autre essai immunologique avec enzyme. On a obtenu les résultats indiqués dans le tableau 2. 25761t07 TABLEAU 2 Réactivité de sérums de donneurs de sang et de patients ayant le SIDA, des états associés au SIDA et d'autres maladies. Positif pour Positif pour Nombre l'anticorps l'anticorps Groupe clinique d'échantillons avec l'équiconfirméa pement d'essai Donneurs de sang 1600 0 - SIDA 4 4 4 para-SIDA 39 39 39 Groupes à haut risque 7 7 7 Autres maladiesb Mononucléose infectieuse 48 0 - Hépatite B 25 3c 2 Syphilis 117 2 2 Rhumatisme articu- laire 9 O Autres infectionsd 37 O aLes tests de confirmation comprennent l'immunofluores- cence et un essai immunologique alternatif avec enzyme. bEchantillons positifs seuls confirmés. CUn échantillon positif à deux réalisations de l'essai sur quatre, négatif à la confirmation. dInclut rubéole (18 cas), parvovirus (9), cytomégalovirus (5), toxoplasmose (5). Le principe de l'utilisation d'un antisérum humain pour lier un antigène viral à la phase solide donne une phase solide qui reflète elle-même le modèle d'antigènes viraux le mieux reconnus par les humains. Ceci peut être avanta- geux car il y aura alors une bonne adaptation entre le mélange d'antigènes capturés et le profil des anticorps humains. De plus, les conditions douces utilisées pour la préparation d'antigènes peut permettre la préservation d'épitopes conformationnels délicats non représentés dans les préparations purifiées par gradient et éclatées uti- lisées dans les autres essais en phase solide. Il est maintenant possible d'ajuster le mélange d'antigènes de phase solide en recouvrant la phase solide d'un anticorps monoclonal murin de spécificité définie de façon que les antigènes immobilisés aient une spécificité prédéter- minée. Les données fournies ici démontrent la supériorité du test quand un anticorps monoclonal sélectionné réagis- sant avec p25 (une protéine 25 K Dalton) est utilisé sur la phase solide. Les avantages portent sur la quantité plus faible d'antigène nécessaire pour une recherche conve- nable (Tableau A) et sur la sensibilité accrue de l'essai résultant, voir le Tableau B, qui montre que les dilutions au point final de sérums individuels donnent une inhibition supérieure (c'est-à-dire une lecture d'OD inférieure) dans l'essai monoclonal que dans l'essai polyclonal. L'aug- mentation de sensibilité a rendu l'essai plus efficace dans la détection de la production précoce d'anticorps par comparaison avec de nombreux autres essais. De plus, l'utilisation d'un anticorps murin sur la phase solide évite le problème potentiel de la réticulation par des facteurs du type rhumatorde entre l'IgG humaine de la phase solide et le conjugué d'IgG humaine dans les essais homologues. Pratiquement, on a identifié un petit nombre de sérums qui manifestent de façon régulière un degré d'inhibition supérieur dans l'essai à base monoclonale par rapport à l'essai à base polyclonale. Ce phénomène est apparemment dû à la réactivité de niveau faible et de titre faible qui lie le conjugué à la phase solide d'une manière non spécifique dans les essais homologues seulement. Ce phénomène ou un phénomène similaire peut aussi expliquer une autre constatation inattendue, à savoir que la distribution de réactivité en densité optique de sérums normaux est beaucoup plus étroite dans l'essai à base monoclonale que dans un essai polyclonal réalisé simultanément. Etant donné la simplicité constatée de l'utilisation d'un anticorps monoclonal pour un produit de gène rétroviral gag, fournissant essentiellement un essai compétitif pour la réponse humaine anti-HTLV-III contre le nucléolde, il est probable que l'utilisation d'anticorps pour des produits env définis permettra le développement d'essais analogues pour des anticorps contre des antigènes d'enve- loppes sélectionnés. Ceci permettra une étude beaucoup plus précise de la réponse humaine à différents antigènes viraux qui peuvent avoir de l'importance en termes clini- ques, prognostiques et de lutte contre l'infection. TABLEAU A Titration de l'antigène CEM/CBL 1 sur des phases solides polyclonales et monoclonales. Dilution Revêtement de la phase solide de l'antigène de l'antigène Polyclonal Monoclonal * Neg.Cou- Positif Neg C pou-rePositif pure pure 1.34** 0.69 0.05 NT NT NT 1.14 0.45 0.03 1.85 0.86 0.11 0.82 0.45 0.03 NT NT NT NT NT NT 1.50 0.37 0.09 NT NT NT 1.36 0.38 0.08 NT NT NT 1.23 0.28 0.07 100 NT NT NT 1.18***0.27 0.07 * Coupure - témoin faiblement positif ** OD à 450 nm dans les conditions standards de test pour l'anti-CEM-CBL-1 *** Titre "de travail" de la préparation d'antigène NT = Non testé TABLEAU B OD à 450 nm de dilutions de 19 sérums titrés à 50% du point final d'inhibition, testées sur des phases solides polyclo- nales et monoclonales. Revêtement de la phase solide Sérum Polyclonal Monoclonal Témoin positif 0.08 0.09 Coupure 0.76 0.55 Négatif 1.39 1.42 Hémophile -1 1.08 0.86 2 0.95 0.77 3 1.01 0.77 4 1.04 0.74 Sida 1 0.63 0.48 2 0.93 0.71 3 0.85 0.52 4 0.70 0.56 PGL 1 0.84 0.62 (lymphadénopathie 2 0.84 0.58 générale 3 0.73 0.56 persistante) 4 0.60 0. 48 Drogué 1 0.50 0.44 2 0.66 0.50 3 0.95 0.73 4 0.85 0.63 Sain 1 0.50 0.41 2 0.56 0.42 3 0.69 0.49 Dans les exemples ci-dessus, l'essai est conduit par une détermination de traceur associé à la phase solide. Cepen- dant, le niveau de traceur associé au sérum de départ étant ou pouvant être déterminé, il est aussi possible de surveil- ler la réduction de comptage radioactif ou de niveau d'enzyme associé à la phase liquide après que les sérums marqués connus et les sérums testés ont été mis en contact avec l'antigène en phase solide, et la réduction de niveau de traceur de la phase liquide utilisée comme mesure de la teneur en anti- corps des sérums testés. Les avantages de l'essai compétitif simultané peuvent être résumés sous les titres suivants. Préparation de l'antigène. Bien que l'exemple 2 décrive l'utilisation de virus HTLV-III purifiés, la fixation accrue résultant de l'utilisation d'un anticorps immobilisé permet d'utiliser pour le recouvrement une préparation de lysat de cellules brutes quand un tel antigène n'est pas susceptible par lui-même de se lier direc- tement de façon utile à une phase solide. Cette mesure sup- prime la contrainte constituée par la nécessité d'un anti- gène hautement purifié pour la production de tests de diag- nostic et rend leur fabrication plus facile. Cet avantage n'est pas applicable aux recherches directes dans lesquelles un revêtement de globuline humaine entière donnerait un signal inévitable avec le traceur de globuline anti-humaine final. Formule d'essai. L'utilisation d'un volume de sérum non dilué offre un avan- tage considérable aux centres de transfusion sanguine o la nécessité de procéder à une dilution initiale accroîtrait la charge de travail. Le rapport entre les volumes de sérum et de traceur enzyme peut varier de 1:1 à 1:10 avec une faible altération seulement de l'efficacité du test. L'optimum est 1:3 avec 25 /1l de sérum et 75 /1 de traceur enzyme, ce qui fournit une bonne différenciation entre les sérums posi- tifs et négatifs. Les durées d'essai peuvent être réduites à une heure ou moins en utilisant une technique ELISA. Sensibilité Une mesure de la sensibilité d'un essai quelconque pour la recherche d'anticorps du SIDA est donnée par la proportion de sérums prélevés sur des malades du SIDA condamnés qui demeurent positifs. Avec les essais directs, il semble qu'un nombre variable de patients perdent la réactivité pour l'anti- corps. Ceci ne se produit pas avec l'essai compétitif, ce qui suggère que la sensibilité de l'essai compétitif est aussi bonne ou meilleure que celle des autres essais couram- ment utilisés. Spécificité Il n'y a pas lieu de s'attendre à ce qu'un essai compétitif présente le problème majeur de réactivité faussement positi- ve. L'inclusion d'antigènes de membranes de lymphocytes dans l'enveloppe de virions HTLV conduit certainement à une fausse réactivité, de même que la présence d'aggrégats d'IgG adhé- rant de façon non spécifique à la phase solide. Un tel phéno- mène ne donne pas lieu à une réactivité dans l'essai compé- titif. Des effets non spécifiques d'une concentration en protéine variable peuvent être minimisés par le choix d'un rapport sérum/traceur approprié (1:3, voir ci-dessus) et par l'utilisation d'une valeur de coupure supérieure à 50% de l'inhibition. Les sérums qui produisent une inhibition de la liaison au traceur égale ou supérieure à celle fournie par un sérum témoin interne sont considérés comme positifs à l'essai de dépistage mais l'essai doit être répété. Compte tenu du faible niveau de fausse réactivité, prévu à moins d'l pour 5 000, il est peu probable que les réactions faus- sement positives dans l'ELISA compétitif créeront un problème numériquement aussi grand qu'elles semblent le faire dans les essais directs. Il en est particulièrement ainsi quand les essais directs sont exécutés sans antigène témoin. On s'attend à ce que ce soit le cas dans les centres de trans- fusion du fait que l'utilisation d'un antigène témoin double- rait les quantités de réactif nécessaires dans les essais directs. En résumé, la combinaison d'une formule simple, d'une sensi- bilité élevée et d'une spécificité élevée rend l'essai com- pétitif idéal pour le dépistage des dons de sang et l'usage diagnostique. De plus, quand les centres utilisent un essai direct pour la recherche d'anti-HTLV-III, il peut se révéler préférable de confirmer la réactivité du sérum par un nouveau test à l'essai compétitif plutôt qu'en soumettant les sérums au "Western Blot", plus laborieux et moins sensible, qui peut être recommandé par la Food and Drug Administration aux Etats-Unis. -2576107 Revendications. 1. Procédé d'analyse d'un échantillon biologique pour la recherche d'un anticorps de rétrovirus-, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon biologique en contact avec (1) un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés A une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et (2) une immunoglobuline qui contient un anticorps spéci- fique des antigènes rétroviraux et qui est marquée par un traceur révélateur non radioactif, et qu'on sépare la phase liquide de la phase solide et détermine la quan- tité de traceur révélateur associée à l'une ou l'autre de ces phases. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce e que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope hu- main CBL-l. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope hu- main HTLV-III, le rétrovirus T-leucémique humain HTLV-II ou le rétrovirus T-leucémique humain HTLV-I. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un sérum ou un plasma de sang humain. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope hu- main CBL-l ou le rétrovirus T-lymphotrope humain HTLV-III, et en ce que l'immunoglobuline marquée par l'agent révéla- teur est une immunoglobuline provenant d'un patient humain contaminé asymptomatiquement par le virus du SIDA mais ayant un niveau d'immunoglobuline normal. 6. Procédé selon l'une des evendications précédentes, caractérisé en ce que le traceur révélateur est un traceur enzyme. 7; Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la globuline liée au support est un anticorps monoclonal--propre à-fixer--un-antigène -rétro- viral. 8. Equipement ou kit d'essai comprenant (1) un premier composant qui est un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et (2) un second composant qui est une immunoglobuline conte- nant un anticorps spécifique des antigènes rétroviraux et marquée par un révélateur non radioactif. 9. Equipement selon la revendication 8, caractérisé en ce que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope humain CBL-l. 10. Equipement selon la revendication 8, caractérisé en ce que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope humain HTLV-III, le rétrovirus T-leucémique humain HTLV-II ou le rétrovirus T-leucémique humain HTLV-I. 11. Equipement selon la revendication 8, caractérisé en ce que le rétrovirus est le rétrovirus T-lymphotrope humain CBL-l ou le rétrovirus T-lymphotrope humain HTLV-III et en ce que l'immunoglobuline provient d'un patient humain contaminé asymptomatiquement par le rétrovirus du SIDA mais ayant un niveau d'immunoglobuline normal. 12. Equipement selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que le traceur révélateur est un traceur enzyme. 13. Equipement selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la globuline liée au support est un anticorps monoclonal propre à fixer un antigène rétro- viral. 14. Rétrovirus T-lymphotrope humain CBL-1 relié étio- logiquement au SIDA. 15. Cellules T-leucémiques CCRF-CEM hébergeant des rétro- virus T-lymphotropes humains CBL-1. 16. Antigènes rétroviraux T-lymphotropes humains CBL-1 insolubilisés liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte. 17. Antigènes insolubilisés selon la revendication 16, caractérisés en ce que la globuline provient d'un patient humain contaminé asymptomatiquement par le rétrovirus du SIDA mais ayant un niveau d'immunoglobuline normal. 18. Antigènes insolubilisés selon la revendication 16, caractérisé en ce que la globuline est un anticorps mono- clonal propre à fixer un antigène rétroviral.