Brevet FR2583059A1 — publié le 19861212

La présente invention concerne un procédé de production de spores de champignons filamenteux. L'utilisation des champignons filamenteux est très répandue dans des domaines aussi variés que les fermentations alimentaires, l'industrie pharmaceutique et la production d'enzymes ou de molécules biologiques par biosynthèse ou hémisynthèse. Les spores de champignons filamenteux sont la forme de résistance et de reproduction de ces microorganismes. Ces spores constituent le point de départ de toutes ces applications puisqu'elles peuvent servir de forme de conservation et de lancement de l'opération, mais également intervenir de façon massive dans le processus lui-meme soit en tant qutinoculum ou en tant que spores elles-mêmes pour réaliser les transformations de bio-conversion attendues. Différentes techniques sont connues pour la production de ces spores. La plus ancienne, mais la plus artisanale consiste à cultiver l'organisme à la surface d'un milieu gélosé soit en boîte de Pétri au laboratoire, soit en fioles de Roux pour les applications pratiques. Cette technique quoique sûre, puisqu'une aseptie complète peut être réalisée, pose de graves problêmes de récolte des spores et de manipulation d'un nombre important de fioles lorsque la quantité désirée s'élève quelque peu. C'est la raison pour laquelle une telle pratique ne peut rester qu'artisanale et ne trouver d'application que dans des cas particuliers. La technique de production de spores en plateaux fait appel à la culture du champignon sur des substrats végétaux tels que son de blé, paille et divers produits ou résidus amylacés disposés en couche de quelques centimètres d'épaisseur et placées dans des étuves d'incubation. Des dispositifs automatiques complexes de chargement et déchargement des plateaux ont été proposés. Toutefois, il reste que le produit obtenu est constitué non pas de spores pures, mais d'un mélange de spores, de mycelium du champignon et des résidus végétaux. D'autre part, le maintien des conditions aseptiques est très délicat. La récolte des spores, la contamination ambiante et la variabilité de l'organisme sont des inconvénients majeurs. Plus récemment on a montré la possibilité de produire des spores de champignons dans des cultures liquides en utilisant des fermenteurs stérilisables. Il s'agit sans doute d'un progrès réel, mais cela n'est possible que dans des conditions particulières et avec un nombre limité de champignons. D'autre part, la suspension recueillie contient non seulement les spores, mais également une quantité importante de métabolites et tous les débris cellulaires qui peuvent être gênants. Enfin, le maintien des conditions d'aération efficace du milieu liquide pendant de longues périodes d'incubation entraînent des dépenses d'énergie coûteuses. Par ailleurs, parmi les nombreux dispositifs de fermenteur qui ont été proposés pour la culture des microorganismes en milieu liquide, on trouve des fermenteurs à disques rotatifs, dont le principe d'utilisation est basé essentiellement sur la rotation permanente des disques tout au long de l'incubation et qui plongent alternativement dans le milieu nutritif liquide et dans l'atmosphère. La présente invention concerne un procédé de production de spores de champignons filamenteux, caractérisé en ce qu'il implique la mise en oeuvre, dans un fermenteur à disques rotatifs, des opérations successives suivantes a) on ajoute un agent de solidification dans un milieu de culture contenant au moins un substrat de crois sance ainsi que des agents de culture; b) on dispose ce milieu de culture sur les disques rotatifs dans le fermenteur c) on stérilise l'ensemble du fermenteur; d) on refroidit le milieu de culture è une température restant supérieure au point de solidification dudit milieu; e) on inocule ledit milieu de culture avec des spores de champignons filamenteux; f) on homogénéise ledit milieu de culture par rotation lente des disques du fermenteur; g) tout en maintenant une rotation lente des disques du fmBnteur, on soliddie le milieu absorbé sur les disques rotatifs par abaissement brusque de la température du fenrwteur h) après immobilisation des disques rotatifs, on laisse incuber le milieu inoculé en assurant dans le fermenteur une circulation d'air stérile, d'humidité et de teméra- ture contrôlées, pendant le temps nécessaire à la maturation des conidies, et i) après développement uniforme des spores à la sur face des disques du fermenteur, on sépare et on ré colte les spores par balayage des disques animés d'un mouvement de rotation rapide, à l'aide d'un fluide contenant de préférence un agent tensio-actif et/ou des billes calibrées, la biomasse mycélienne restant emprisonnée dans le milieu de culture soli difié qui reste fixé sur les disques du fermenteur. La présente invention concerne aussi le dispositif nécessaire à la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus; il s'agit d'un fermenteur à disques rotatifs, pourvu de systèmes de régulation de la température et de l'humidité, et d'un moteur permettant la mise en rotation de l'axe supportant l'empilement des disques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la des cription détaillée faite ci-après, notamment en regard de la figure annexée qui illustre un mode de réalisation particulier du dispositif nécessaire a' la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Ce nouveau procédé pour la production de spores de champignons filamenteux allie l'avantage de la culture de surface sur un milieu solidifié, qui reste la technique la plus sûre et la plus générale de sporulation, avec l'utilisation d'un fermenteur a' disques rotatifs particulier dont le principe d'utilisation a été fondamentalement modifié de façon è obtenir une grande surface de sporulation et permettant en particulier de récolter aisément uniquement les spores par simple la vage des surfaces, la biomasse mycéliennerestant emprisonnée dans le milieu solidifié. Toutes les opérations peuvent être réalisées dans le même appareil -stérili- sable, assurant une grande simplicité et une aseptie stricte. Le principe de ce procédé est basé sur le fait que le milieu de culture. nutritif contenant le ou les substrats de croissance et les agents de cultures est additionné d'un agent de solidification, par exemple de la gélose. Après stérilisation, le milieu est refroidi et sa température est maintenue au-dessus du point de solidification, par exemple 500C. L'inoculum de spores est alors ajouté et une rotation lente des disques permet d'homogénéiser le milieu. Tout en maintenant une lente rotation des disques, l'atmosphère est brutalement refroidie de façon à permettre la solidification du milieu à la surface des disques. Lorsque le milieu de culture est réparti sur les disques, la rotation est stoppée et la tempewature du dispositif est amenée à la température d'incubation. Un flux d'air stérile,d'humidité et de température contrôlés est maintenu pendant toute la période d'incubation de façon à maintenir les conditions favorables de développement du champignon. Notons que pendant cette.incu- bation aucune agitation mécanique n'est nécessaire. L'organisme se développe ainsi uniformément dans toute la masse du milieu solidifié. Après 1 à 2 jours les surfaces libres sont recouvertes d'un tapis homogène de filaments aériens. Suivant l'organisme utilisé la sporulation se produit après 2 à 3 jours d'une façon très régulière et synchrone sur toutes les surfaces disponibles. Les spores contenues dans les têtes conidiennes aériennes se trouvent ainsi à l'extérieur des disques (5), alors que le mycelium végétatif reste emprisonné dans le milieu solidifié (6). L'incubation peut être poursuivie jusqu'à 7 à 10 jours pour permettre la maturation des têtes conidiennes. La récolte des spores peut alors être faite de façon particulièrement aisée en introduisant dans le fermenteur un volume d'eau stérile additionné d'un agent tensio-actif, par exemple du TWEEN 80 et en maintenant une rotation rapide des disques pendant 10 minutes environ. Ceci permet un lavage très efficace des surfaces des disques provoquant la mise en suspension des spores à l'exclusion de la biomasse mycélienne et de la majorité des métabolites qui sont fortement fixées à l'intérieur du milieu gélosé. Plusieurs lavages successifs peuvent être pratiqués. Les spores peuvent alors être centrifugées ou décantées, lavées, et séchées par évaporation sous vide, lyophilisation ou atomisation. Selon un autre mode de récolte possible, on peut introduire des billes calibrées d'un diamètre inférieur à la distance interface des disques pour favoriser la dispersion des spores dans l'atmosphère. Les spores sont alors récoltées à sec grâce à la rotation des disques couplée à un balayage d'air stérile suffisamment élevé pour créer des turbulences et entratner les spores qui sont alors récoltées grâce à un dispositif de filtration de l'air à la sortie du fermenteur. Lorsque les spores ont été récoltées, le lavage du fermenteur est réalisé en introduisant un liquide détergent à chaud qui,couplé à une agitation rapide, provoque la fusion du milieu, la stérilisation de la biomasse résiduelle et le nettoyage du dispositif. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé, le réacteur décrit sur la figure 1 est de forme cylindrique et réalisé en matériaux pouvant supporter la stérilisation. Le fermenteur est constitué d'une cuve cylindrique 1 munie à une extrémité d'une platine 2, munie d'un axe rotatif 3 supportant un empilement de disques rigides 4 d'un diamètre légèrement inférieur au diamètre interne de la cuve. La matière, l'épaisseur et la surface des disques peuvent être quelconques, pourvu qu'ils permettent une bonne rétention et une répartition homogène du milieu au cours de la rotation et de la phase de solidification. Ces disques 4 peuvent être constitués simplement par une ou deux grilles d'acier de quelques mm d'épaisseur et de maille de 2 à 5 mm. L'espacement et la disposition de ces grilles peuvent être variables. Dans la figure 1 décrivant un exemple de mise en oeuvre de ce dispositif, les disques sont constitués de deux grilles d'acier de 2 mm d'épaisseur espacées de 2 mm de telle sorte qu'après répartition et solidification du milieu, on obtienne un disque de 6 mm d'épaisseur. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'espacement entre les disques gélosés est de 10 mm. Un balayage forcé du réacteur par un flux d'air stérile humidifié par barbotage doit être prévu par une entrée haute (7) et une sortie basse (8) qui permettent également le remplissage et la vidange du réacteur. Des dispositifs de contrôle et de régulation de la température, de l'humidité relative et de la composition de l'atmosphère du réacteur peuvent se révéler utiles. Le réacteur tel qu'il vient d'être décrit a été utilisé pour la mise en oeuvre de l'invention sous forme d'un réacteur de 1500 cm3 muni de 10 plateaux de 5 mm représentant une surface libre de 1 270 cm2. Les essais ont porté sur la production de spores de champignons appartenant aux genres Aspergil- lus, Trichoderma, Penicillium. En l'occurrence une souche d'Aspergillus hennebergii du groupe A. niger et une souche de Penicillium isolée au laboratoire ont été choisies pour représenter les genres Aspergillus et Penicillium. Deux souches de collection internationale, Trichoderma harzianum CCN-F-470 et Penicillium camembertii CCM-F-378 ont été choisies pour représenter les genres Trichoderma et Penicillium. Dans un exemple de mise en oeuvre préféré du procédé, le milieu de culture est composé pour un litre d'eau de 100 g de farine de manioc, de 4 g de EH P 4, de 8 g de (NH4)2S04, de 2 g d'urée et de 20 g d'Agar. 300 ml de ce milieu sont introduits dans le réacteur qui est alors stérilisé à 1200C pendant 30 minutes. Le dispositif est alors refroidi et lorsque la température du milieu est de 500C l'inoculum de spores est introduit stérilement. Le milieu est alors homogénéisé par une rotation des disques à raison de 60 t/mn pendant quelques minutes. Après homogénéisation, un courant d'air stérile et froid à raison de 200 l/h permet la solidification du milieu de culture sur les grilles et la constitution des disques de milieu. Après 30 minutes, la rotation est stoppée et le fermenteur est aéré par un débit de 10 litres/h d'air stérile saturé d'eau à la température d'incubation, qui peut hêtre de 300C, mais varie avec l'organisme cultivé. Après 7 jours, la récolte des spores est réalisée en introduisant dans le fermenteur 500 ml d'eau stérile contenant quelques gouttes de TWEEN 80. L'aération est stoppée et la rotation des disques à 100 200 t/mn est maintenue pendant 10 minutes. La suspension de spores est alors recueillie, et le nombre de spores est calculé par un comptage microscopique direct sur une cellule de Malassez après une dilution adéquate. Deux lavages supplémentaires utilisant 250 ml d'eau sont réalisés. La suspension de spores est alors décantée et,après élimination du surnageant,une poudre sèche de spores est obtenue par évaporation sous vide de la suspension concentrée. Cette poudre de spores permet une remise en suspension aisée des spores pour leur utilisation, sans phénomènes tensio-actifs gênants. Le tableau I indique les résultats obtenus pour quatre souches de champignons. On constate que le premier lavage permet de récolter 75 à 90 % des spores contenues dans le dispositif et d'obtenir des suspensions de spores concentrées contenant au moins 1,1 x 1O8 à 4,2 x 108 spores par mi. La quantité de spores formée par cm2 varie de 3 x 107 à 2,2 x 108 spores/cm2. Le rendement pondéral en spores rapporté à la quantité de substrat introduite dans le fermenteur varie de 5 à 14 eX, ce qui représente un taux de conversion en spores important. Compte tenu de ce qui précède, la présente invention permet de produire des spores de champignons en conditions aseptiques et selon une technique relativement simple, d'une mise en oeuvre aisée ne nécessitant pas de manipulations longues et coûteuses. Elle permet également d'éviter tous risques de contamination de l'environnement. D'autre part, la présente invention est caractérisée par le fait que l'on obtient des spores pures sans contamination par d'autres microorganismes ni par des métabolites ou résidus mycéliens qui sont retenus essentiellement dans le dispositif lors de la récolte. Les rendements obtenus sont supérieurs ou comparables à ce que l'on peut obtenir par les autres techniques habituelles d'une mise en oeuvre délicate.Enfin cette invention est caractérisée par le faible encombrement des matériels en fonction des quan- tités de spores obtenues. TABLEAU I Aspergillus Trichoderma Penicillium Penicillium niger harzianum sp camembertii (henebergii) 1er lavage, 500 ml 75 % 76 % 87 % 92 % 2ème lavage, 250 ml 15 % 24 % 11 % 6 % 3ème lavage, 250 ml 10 % 5 % 2 % 2 % Nombre de spores 7,3 x 1010 2,8 x 1011 1,5 x 1011 3,8 x 1010 récoltées dans 1 l 1è 1,1 x 108 4,2 x 108 2,6 x 108 6,9 x 107 Concentration 2è 4,3 x 107 2,6 x 108 6,6 x 107 9,1 x 106 en spores/ml 3è 3,0 x 107 5,6 x 107 1,2 x 104 3,0 x 106 Nombre de spores 5,75x 107 2,2 x 108 1,2 x 108 3,0 x 107 formées par cm2 Nombre des spores 2,5 x 109 9,3 x 109 5,0 x 109 1,25x 109 par g de substrat Poids de 1 spore (g) 6,0 x 10-11 1,3 x 10-11 1,1 x 10-11 4,0 x 10-11 Rendement pondéral global rapporté au 14,6 % 12,1 % 5,75 % 5 % substrat carboné, poids spores/g - HEVENDICATh0NS 1 - Procédé de production de spores de cham- pignons filamenteux, caractérisé en ce qu'il implique la mise en oeuvre, dans un fermenteur à disques rotatifs, des opérations successives suivantes a) on ajoute un agent de solidification dans un milieu de culture contenant au moins un substrat de crois sance ainsi que des agents de culture; b) on dispose ce milieu de culture sur les disques ro tatifs dans le fermenteur c) on stérilise l'ensemble du fermenteur; d) on refroidit le milieu de culture à une température restant supérieure au point de solidification dudit milieu; e) on inocule ledit milieu de culture avec des spores de champignons filamenteux; f) on homogénéise ledit milieu de culture par rotation lente des disques du fermenteur; g) tout en maintenant une rotation lente des disques du fermenteur, on solidifie le milieu par abaissnent brusque de la terrprérature du fermenteur, ce qui a pour effet de répartir le milieu sur les disques; h) après immobilisation des disques rotatifs, on laisse incuber le milieu inoculé en assurant dans le fermen teur une circulation d'air,d'humidité et de tempéra ture contrôlées, pendant le temps nécessaire à la maturation des conidies, et i) après développement uniforme des spores à la surface des disques du fermenteur, on sépare et on récolte les spores par balayage des disques animés d'un mou vement de rotation rapide, à l'aide d'un fluide con tenant de préférence un agent tensio-actif et/ou des billes calibrées, la biomasse mycélienne restant emprisonnée dans le milieu de culture solidifié qui reste fixé sur les disques du fermenteur. 2 - Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'il est appliqué à la production de spores de champignons dont la forme de reproduction est consti tuée par des conidies. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la pro duction de spores de champignons appartent aux genres Aspergil- lus, tel que Aspergillus niger, Trichoderma, tel que Trichoderma harzianum ou Penicillium, tel que Penicil lium camembertii. 4 - Procédé selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que les agents de culture sont constitués d'une source de carbone, telle que l'amidon, d'une source d'azote, telle qu'un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée, d'une source de phosphore et d'au tres composés minéraux ou organiques. 5 - Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'agent de'solidification ajouté au cours de l'étape a) est de la gélose. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le fluide de lavage utili sé au cours de l'étape i) est de l'eau stérile, addi tionnée d'un agent tensio-actif tel que du TWEEN 80. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les billes calibrées uti lisées au cours de l'étape i) ont un diamètre inférieur à la distance interface des disques. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la suspension des spores récoltées est concertrée par centrifugation ou decanta- tion,lavée puis séchée par évaporation sous vide, lyo philisation ou atomisation. 9 - Dispositif pour la mise er oeuvre du pro cédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un fermenteur à disques rotatifs, pourvu de systèmes de régulation de la température et de l'humidité, et d'un moteur permettant la mise en rotation de l'axe supportant l'empilement des disques, disques dont au moins une surface est constituée par une grille ayant une ouverture de maille de 2 à 5 mm.