Brevet FR2582672A1 — publié le 19861205

La présente invention concerne un procédé pour obtenir un polysaccharide azoté, procédé consistant en un processus de fermentation, pendant lequel le composé polysaccharide azoté se forme dans un bouillon de culture, et en son isolement ultérieur dudit bouillon sous forme d'un adsorbat, selon la description ci-après dans l'exemple correspondant. La fermentation est réalisée d'une façon originale, en utilisant d'abord comme inoculum du bouillon de culture un microorganisme du type Zymomonas pendant les premiers jours de la fermentation, pour effectuer ensuite un autre ensemencement dans le même bouillon de culture modifié par son action avec le Pediococcus acidilactici, en continuant ainsi le processus jusqu'à l'obtention dans le bouillon de culture du composé recherché, et en le séparant ensuite par formation d'un adsorbat contenant la presque totalité du produit. I1 s'agit, par conséquent, d'une fermentation qui pourrait être dénommée "de cultures associées" que le Dr. J. Risler définit dans son ouvrage "Les complexes antibiotiques d'adaptation" (PACOMHY Editeurs, 7 rue Gustave Nadaud, Paris (16e)), oude culture mixte ("mixed culture fermentation") dénomination due à C.W. Hesseltine (Ann. Rev. Microbiol. 37, 575-601, 1983), article dans lequel il étudie l'obtention de différents aliments par fermentation en utilisant des cultures mixtes. Le procédé de la demanderesse se différencie de la technique que ce dernier auteur appelle "polyculture", en ce que, même si l'on emploie plus d'un microorganisme pour la fermentation et l'obtention du composé final désiré, ces microorganismes sont inconnus, tandis que dans le cas de la demanderesse, on inocule le bouillon avec des cultures pures des micororganismes précédemment cités, avec un décalage dans l'addition desdits microorganismes. Ce mode de procéder est original et il présente divers avantages comme par exemple celui d'obtenir une plus grande vitesse de croissance des deux germes, une association stable de ceux-ci, une résistance très supérieure à l'action des phagocytes et un rendement supérieur en produit désiré, ainsi que la possibilité d'employer des substrats mixtes pour la préparation du milieu de culture. L'exemple suivant illustre suffisamment l'invention. Exemple : Dans un récipient métallique (de préférence en acier inoxydable) on place 90 kg de graines de soja et on les lave deux fois avec de l'eau, en rejetant les eaux de lavage et en ajoutant ensuite de l'eau en quantité suffisante pour que les graines soient totalement recouvertes par l'eau. On ferme le récipient, et on le place dans un bain à une température entre 10 et 150C approximativement (cette température n'est pas critique) pendant environ 18 heures. Une fois écoulé le temps de macération, on procède à une mouture grossière par voie humide des graines qui feront ensuite partie du bouillon de culture. Dans le cas présent, le processus décrit représente une modification importante par rapport aux techniques normales de fermentation avec lesquelles, dans la préparation du bouillon de culture pour fermentation ultérieure, dans le but d'obtenir des composés ayant une action thérapeutique, on utilise toujours les ingrédients finement moulus ("farine"), en procédant une fois le bouillon préparé, à une stérilisation avant d'ensemencer le microorganisme produisant la fermentation.Dans le cas de la demanderesse, une fois terminé le processus de mouture grossière par voie humide, on décante l'eau en récupérant la partie so lide constituée par les graines de soja coupées en morceau que l'on introduit sans les stériliser dans un réacteur de fermentation d'environ 14-15.000 litres de volume utile sous agitation dans lequel on aura introduit préalablement environ 3.000 litres d'eau à la température de 39-400C (cette température n'est pas critique). En main tenant une agitation douce, on ajoute les composes suivants du milieu de culture qui auront été préalablement finement pulvérisés. L'addition s'effectue dans l'ordre suivant : camphre cristallisé 65 kg. Soufre micronisé 65 kg. Colophane : 40 kg. Extrait sec de levure : 75 kg. Bioxyde de manganèse : 2,5 kg et sulfate de manganese : 75 kg. Une fois terminée l'addition de ces composants, on ajoute dans le réacteur de fermentation, sans cesser l'agitation, de l'eau à une température de 390C + 20C environ jusqu'à atteindre un volume final de 13.000 litres, ce qui met fin à la préparation du bouillon de culture. Le mélange étant préparé et homogénéisé, on versifie sa température qui doit être maintenue, de préférence, à 390C pendant le processus de fermentation. Ensemencement du bouillon dé culture. - On procède ensuite à l'inoculation du bouillon de culture avec une souche de Zymomonas movilis. La quantité d'inoculum utilisée est de 109 cellules par litre de bouillon de culture, quantité avec laquelle commence le processus de fermentation. Au troisième jour, on procède à une nouvelle inoculation dans le bouillon, avec un microorganisme différent du précédent constitué par une souche appelée Pediococcus acidilactici ; dans ce cas, la quantité d'inoculum utilisée est de 109 cellules par litre de bouillon. Le bouillon inoculé est maintenu sans agitation ni aération à une température comprise entre 37 et 409C pendant une durée qui varie entre 5 et 15 jours.Pendant ce temps, le processus de fermentation-extraction des composants se produit, ainsi que les modifications chimiques de ceux-ci, de même qu'une décantation graduelle qui détermine la formation au sein du liquide d'un gradient de solides, particules et microorganismes. Lyse-hydrolyse - Le bouillon ci-dessus est soumis à un processus de lyse-hydrolyse par addition de 120 kg d'acide phosphorique à 85 % en poids, 120 kg d'urée en perles et 3,6 kg de pepsine en poudre à la concentration de 1/3.000. Tous les agents réactionnels sont incorporés sous agitation jusqu'à leur complète dissolution. Au moyen de ce procédé en combinaison avec l'action du processus de fermentation décrit ci-dessus, on atteint les objectifs suivants : lyse complète de tous les microorganismes et solubilisation du polysaccharide azoté, ainsi que sa modification chimique, de manière à obtenir le composé final désiré, composé non toxique et biologiquement actif. Les analyses démontrent qu'à ce point, la seule macromolécule qui reste en tant que telle est le polysaccharide azoté (PN). Précipitation et formation de l'adsorbat - Le bouillon ainsi lysé est filtré sur Hyflo Super-Cel ou un co-adjuvant de filtration ayant des propriétés analogues. A cet effet, on prépare une suspension avec 5 kg d'Hyflo Super-Cel dans 100 litres d'eau, avec laquelle on forme une pré-couche dans un filtre-presse comportant 10 cadres de 40 x 40 cm sur lequel on applique une pression d'entrée de 1 kg/cm2 en laissant la sortie libre. On procède ensuite, et sans interrompre la circulation, à la filtration du lysat, en maintenant la même pression sur le filtre. Ultérieurement, on ajoute à la solution filtrée 300 kg de chlorure de calcium calciné (anhydre), on agite jusqulà obtention de la dissolution complète et on ajoute avec précaution de l'hydroxyde de sodium en solution à raison de 10 % p/p jusqu'à ce que le pH atteigne une valeur d'environ 4,7. L'hydroxyde de sodium est ajouté à un.débit approximatif de 20 litres/minute. A la fin de cette opération, on verse rapidement la totalité du liquide filtré et partiellement neutralisé sur 4.800 litres d'acétone pure. Ce changement de la polarité du solvant détermine la formation d'un adsorbat (sel complexe minéral formé par du sulfate et du phosphate de calcium dont l'analyse ressortira des Tableaux I, II, III et IV qui suivent) qui adsorbe pratiquement de façon sélective la macromolécule constituée par le polysaccharide azoté. I1 se produit également des adsorptions de petites quantités de substances contaminantes (sucres réducteurs, bases azotées, acides aminés) mais ces substances sont éliminées presque totalement au moyen de trois lavages successifs de l'adsorbat avec 900 litres d'acétone à 28 % v/v en eau.On rejette ces "eaux acetoniques" de lavage et la fraction solide en suspension dans celles-ci est séparée par filtration au moyen d'un filtre rotatif et on sèche ensuite dans une étuve à air chaud à 40-600C de température. Le dessin annexé représente le spectre infrarouge de deux échantillons du polysaccharide azoté à l'état pur, obtenus à partir de deux lots différents d'adsorbats. Comme on peut le voir, les spectres obtenus sont les mêmes. Les positions des bandes les plus importantes (en cm 1) sont les suivantes : 3400, 2940, 1660, 1135, 1060, 980 et 815. TABLEAU 1 COMPOSITION CHIMIQUE DU POLYSACCHARIDE AZOTE ET DE SON SUPPORT MINERAL MANNO-GLUCANE PARTIE ORGANIQUE ACTIVE (2% en poids) POLYSACCHARDIDE 85,6 # 3,2 % PROTEINES 14,4 # 3,2 % SUPPORT MINERAL (98 % en poids) : SEL COMPLEXE DE PHOSPHATE DE CALCIUM CONTENANT DU SOUFRE, SOUS FORME DE SULFATE Caractéristiques de l'adsorbat - Poudre blanche inodore et insipide (goût de craie) insoluble dans l'eau et soluble dans les acides minéraux dilués, nitrique, chlorhydrique, etc. et dans les acides organiques forts comme par exemple l'acide acétique. Sa solution nitrique donne à chaud avec le molybdate d'ammonium (solution réactionnelle) un précipité jaune de phosphomolybdate d'ammonium qui indique la présence de phosphates, Sa solution dans de l'acide chlorhydrique dilué (double liaison normale) donne avec la solution de chlorure de baryum (réactif) un précipité blanc qui indique la présence de sulfates. La suspension aqueuse de l'adsorbat traité avec une solution de sel de sodium de l'acide tétra-acétique éthylènediamine donne un liquide transparent et incolore par formation d'un complexe avec ledit sel. La solution de l'adsorbat dans l'acide acétique dilué donne avec de l'oxalate d'ammonium un précipité blanc d'oxalate de calcium indiquant la présence de calcium dans l'adsorbat. TABLEAU II COMPOSITION CHIMIQUE DU POLYSACCHARIDE AZOTE FRACTION DE POLYSACCHARIDE COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES GLUCOSE 23 # 4 % MANNOSE 74 # 5 % DIVERS 5 # 3 % (#) STRUCTURE AU MOYEN DE LA DEGRADATION DE SMITH-UNION 1-6 PRINCIPALEMENT (#) Principalement du ribose qui provient probablement d'une légère contamination des acides nucléiques. TABLEAU III COMPOSITION CHIMIQUE DU POLYSACCHARIDE AZOTE : FRACTION DE POLYSACCHARIDE DERIVES ACETYLES (par GLC) (%) DE GLYCEROL 90,5 MANNITOL 4,1 SORBITOL 2,9 DIVERS 2,5 TABLEAU IV COMPOSITION EN ACIDES AMINES % en poids PHOSPHOSERINE 0,73 + 0,16 ACIDE ASPARTIQUE 10,6 ~ 0,28 THREONINE 9,2 + 0,83 SERINE 8,01 + 0,32 ACIDE GLUTAMIQUE 17,6 + 1,22 PROLINE 6,1 + 1,4 GLYCINE 1,8 + 0,05 ALANINE 3,9 + 0,2 ACIDE AMINOBUTYRIQUE 3,5 + 0,25 VALINE 2,5 + 0,16 CISTEINE 3,2 + 0,23 METHIONINE 0,62 + 0,31 ISOLEUCINE 3,05 + 0,13 LEUCINE 5,4 + 0,17 THYROSINE 2,8 + 0,16 PHENYL-ALANINE 1,87 + 0,1 ORNITHINE 0,17 + 0,02 LYSINE 9,2 + 0,52 HISTIDINE 2,15 + 0,38 ARGININE 6,65 + 0,36 REVENDICATIONS 1. Procédé pour obtenir un polysaccharide azoté isolé sous forme d'adsorbat, caractérisé en ce que la fermentation du bouillon de culture se produit au moyen de l'inoculation de deux classes différentes de bactéries, et en ce que les bactéries inoculées au bouillon de culture appartiennent aux genres Zymomonas et Pediococcus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'espèce inoculée du genre Zymomonas est le Zymomonas movilis et celle appartenant au genre Pediococcus est définie comme Pediococcus acidilactici. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les souches citées ne sont pas inoculéesen même temps au milieu de culture, Pediococcus acidilactici étant inoculé au troisième jour après inoculation au bouillon de culture de la souche de Zymomonas movilis. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le bouillon de culture n'est pas stérilisé par la chaleur et est maintenu sans agitation ni aération à une température de 37 -à 400C pendant 5 à 15 jours. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'une fois la fermentation terminée, le bouillon de culture est soumis à un processus de lyse-hydrolyse par addition à celui-ci d'acide phosphorique, d'urée et de pepsine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le bouillon étant lysé et filtré, en utilisant un coadjuvant de filtration, on lui ajoute du chlorure de calcium anhydre et, après dissolution, on ajoute une solution d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH atteigne une valeur d'environ 4,7, la solution obtenue étant versée sur de l'acétone en grand excès, ce qui donne un précipité complexe dans lequel le polysaccharide azoté recherché se trouve retenu sous forme d'adsorbat.