Brevet FR2580176A1 — publié le 19861017

Vaccin antirabique avirulent. La présente invention concerne un nouveau vaccin antirabique. Le virus rabique est un rhabdovirus constitué de cinq protéines, dont une protéine externe, la glycoprotéine, qui déclenche les réactions immunitaires chez les animaux inoculés. L'injection de la glycoprotéine purifiée protège l'animal contre une surinfection. Les souches du virus rabique les plus utilisées et notamment la souche CVS sont décrites dans "Rabies Viruses" par H.F. Clark et T.J. Wiktor - Strains of Human Viruses édité par Majer et Plotkin /Karger, Bâle, 1972, p. 177-1827. Les vaccins antirabiques actuellement utilisés sont soit des vaccins fabriqués à partir de virus inactivés, soit des vaccins constitués de souches virales dont la virulence a été atténuée. L'inactivation des virus peut être réalisée par différents procédés, notamment par des procédés chimiques,tels que le traitement au formol ou à la A -propiolactone. L'inconvénient majeur de ce procédé de fabrication de vaccins est la manipulation de souches virulentes qui nécessite des conditions de mise en oeuvre très strictes et présente des risques de contamination du personnel de fabrication. L'atténuation de la virulence des souches virales est une technique bien connue; elle peut 8tre réalisée par exemple par passages successifs des souches virales sur des embryons de poulet. On obtient ainsi des souches moins virulentes mais qui sont également moins protectrices car elles diffèrent trop des souches de virus" des rues". On a déjà montré que la plupart des mutants de la souche CVS du virus rabique qui sont résistants aux anticorps monoclonaux anti-glycoprotéine G n 194-2 et 248-8 du WISTAR INSTITUTE présentent une pathogénéité considérablement réduite. A cet effet on peut se référer notamment à l'article de P. COULON et al. dans J. Gen. Virol. (1983), 64, 693-696. Tous les mutants 2 2 5 8 0176 avirulents étudiés jusqu'à présent sont de simples mutants thermostables. Les mutants thermosensibles qui ont déjà été isolés sont soit toujours virulents, soit atténués, ces derniers n'ayant pas un pouvoir protecteur suffisant. Le problème de la réversion d'une souche mutante avirulente vers l'état initial virulent se pose pour l'utilisation de cette souche comme vaccins vivants ou inactivés. On a maintenant trouvé un double mutant avirulent et thermosensible de la souche CVS du virus rabique, qui peut être utilisé pour la vaccination contre la rage. Ce double mutant avirulent thermosensible, dénommé ci-après TAG1 a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.U.C.M.) INSTITUT PASTEUR-France le 12 Avril 1985 sous le n" 1-433. Le mutant TAG1 porte deux mutations sur la glycopro- téine, qui entraînent chacune la perte de la virulence pour les animaux adultes. Ces mutations sont: I - une mutation thermosensible. Cette mutation entratne une perte complète du pouvoir pathogène par injection intramusculaire. En effet la souche portant cette première mutation est avirulente par voie intramuscu- laire chez la souris adulte comme le montrent les courbes de mortalité de la figure 1 annexée en fonction des doses administrées (unités formant plage). Sur cette figure, la courbe A est relative à la souche mutante et la courbe B est relative à la souche CVS d'origine. Les souris inoculées avec cette souche mutante sont protégées contre une surinfection par 107 UFP de CVS par voie intramusculaire comme le montre la courbe de la figure 2 annexée qui est représentative du pouvoir protecteur de cette souche dans ces conditions II - une seconde mutation caractérisée par le remplacement de l'arginine 333 par une glutamine. Cette mutation a été sélectionnée à partir de la souche portant la première mutation thermosensible à l'aide des anticorps monoclonaux 248-8 et 21B4 selon le mode opératoire décrit 3 2 5 8 0 1 7 6 par I.SEIF et al. dans J. of Virology, Mars 1985, vol. 53, p. 926-934. On sait que cette substitution d'acide aminé entraîne la perte complète de virulence pour les animaux adultes. Il a aussi été montré que les souches avirulentes portant cette mutation confèrent aux animaux vaccines une excellente protection contre le virus sauvage injecté par voie intramusculaire / A. FLAMAND et al. "Modern Approaches to Vaccines" Cold Spring Harbor Laboratory 1984, 189-1947. Cependant,ces souches avirulentes présentent l'inconvénient de ne pas être stables, c'est-à-dire de réverser vers l'état virulent initial. Le double mutant selon l'invention présente la caractéristique spécifique des mutants avirulents et à pouvoir protecteur, Il convient donc bien pour la vaccination des animaux contre la rage. De plus c'est un mutant stable. Il a en effet 6té vérifié par passages successifs en cerveau de souriceaux nouveaux-nés que la conjugaison de ces deux mutations augmentait la stabilité de la souche. En outre ce mutant TAG1 permet lamanipulation de grandes quantités de virus sans danger pour le personnel de fabrication. Le mutant selon l'invention peut être multiplié sur cellules de rein de hamster nouveaux-nés BHK 21, en présence de milieu GEM (milieu essentiel minimum modification Glasgow commercialisé par FLOW) et de 2% de sérum de veau à 33 C et en atmosphère humide avec 5% de C02. On le titre selon les méthodes habituelles, par exemple par détermination de la dose létale 50 (DL50) chez les souriceaux, par immunofluorescence ou détermination des plages formant lyse sous agar. Il peut être conserve à -70QC. Comme tous les mutants avirulents, on notera que le double mutant TAG1 est résistant aux anticorps monoclonaux 248-8 et 194-2 du WISTAR INSTITUTE, par contre il est sensible à l'anticorps monoclonal anti- glycoprotéine' 21B4 du Laboratoire de 4 2 5 8 80176 Génétique des Virus de Gif-sur-Yvette décrit dans Journal of Virology, Mars 1985, vol. 53, p. 926-934. Pour la vaccination, la dose de mutant à utiliser varie en fonction de l'animal à traiter. A titre indicatif, on précisera que des doses de 104 UFP à 107 UFP/souris assurent une bonne protection en vaccin vivant. En vaccin inactive, le pouvoir vaccinant de TAG1 est comparable à celui de la souche CVS chez la souris. Par le test de Pharmacopée Européenne, on a en effet déterminé que le pouvoir vaccinant de TAG1 est de 1,39 unités internationales par ml (UI/ml) alors que le pouvoir vaccinant de CVS est de 0,95 UI/ml. Le mutant selon l'invention peut être administré à titre de vaccin vivant par tous les modes d'administration habituellement utilisés pour la vaccination et notamment par voie intramusculaire. Le mutant est dilué dans un véhicule inerte pharmaceutiquement acceptable, tel que le sérum physiologique. 2 5 8 0176 REVENDICATIONS 1. Double mutant avirulent et thermosensible de la souche CVS du virus rabique déposé à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C. N.C.M.) INSTITUT PASTEUR-France le 12 Avril 1985 sous le n' 1-433. 2. Vaccin antirabique, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par le double mutant avirulent et thermosensible de la souche CVS du virus de la rage tel que défini à la revendication 1.