Brevet FR2580174A1 — publié le 19861017

La présente invention est relative à un procédé amélioré pour augmenter l'activité sexuelle d'oiseaux et de mammifères domestiaues utiles et pour préparer les sperma- tozoldes qui conviennent à la reproduction de ces oiseaux et mammifères. Le procédé qui fait l'objet de l'invention permet d'augmenter de façon permanente l'activité sexuelle et la production de sperme (spermatogénèse) d'oiseaux et de mammifères domestiques utiles mâles, en particulier de din- dons, de jars, du bétail et des lapins. L'hormone qui libère l'hormone gonadotrope ( GnRH),isolée-pour la première fois du porc, s'est avérée avoir une structure identique à celle de la GnRH obtenue depuis à partir d'autres espèces (l'homme, le singe, le bétail, le mouton, le cheval, le rat, le hamster etc...). L'hormone GnRH se forme dans l'hypothalamus par stimulation nerveuse et parvient, par la circulation-sanguine, à l'hypo- physe dans laauelle les hormones gonadotropes [l'hormone luteinisante (LH) et l'hormone qui stimule les follicules (FSH)] sont libérées. La reproduction est contrôlée par les gonadotropines soit directement, soit par la libération d'autres hormones telles que la tesbsterone, par exemple. Les analogues structurels de la GnRH de mammifères qui sont des dérivés substitués en positions 6- et 10- ont un effet accru de plus longue durée comparativement à l'hormo- ne naturelle. Les actions endocrines de la GnRH ont été étudiées chez les oiseaux males: sur les coqs LFurr et al.; J. Endo- crinology 59, 495 (1973); Danse et al.: Poultry Science 56, 2016 (1977); Pethes et al.: Acta Physiologica Hung. 56 281 (1980)1; sur les pintades EMathis et al.: Poultry Science 62, 715 (1983)J; sur les canards et les jars domes- tiques Lpeczely et al.: "General Comparative Endocrinology" 57, 293 (1985) ]; aussi bien que sur les bruants jaunes [Wingfield et al.: Biological Reproduction, 21, 801 (1979)j. Des expériences décrites dans la littérature ont montré qu'une libération intense de LH a été provoquée chez des oiseaux males par la GnRH ou ses analogues ayant une action agonistique. Cet effet a atteint un maximum pen- dant les 5ème à 20ème minutes et plus tard pendant les 60ème à 120ème minutes. Le taux de teststérone du plasma sanguin a également été augmenté par la GnRH. On ne dispose, toutefois, d'aucune donnée concernant une augmentation de la production du sperme, qui aurait été rapportée par la littérature. Un grand nombre d'oiseaux et de mammifères domes- tiques utiles (par exemple le bétail, les lapins, les din- dons, les oies) élevés à l'échelle industrielle sont repro- duits artificiellement de telle manière que le sperme drainé chez des animaux màlesest classé selon sa qualité, puis les échantillons utiles sont dilués avec une solution spécifique de dilution du sperme, après quoi les femelles sont insé- minées artificiellement en utilisant le sperme dilué obtenu de la sorte. L'efficacité de cette méthode dépend de façon prédominante de la qualité (motilité, viabilité, aptitude au stockage et analogues) des spermatozoïides. Un nombre relativement faible des males est apte à procurer un sperme de bonne qualité et utile pour l'insémination, alors qu'il est nécessaire de pouvoir disposer sans restriction du maté- riel d'insémination pour n'importe quelle méthode utilisée à grande échelle. La présente invention a pour but de pourvoir à une méthode aui permet d'augmenter l'activité sexuelle et la production de sperme chez des oiseaux males et des mam- mifères domestiques utiles. La présente invention est basée sur le fait que le but mentionné plus haut peut être atteint, c'est-à-dire l'activité sexuelle et la production de sperme d'oiseaux males et de mammifères domestiques utiles peuvent être augmentéesde façon permanente en utilisant les composés de formule générale (I) ci-après: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-Leu-Arg-Pro-X4 (I) dans laquelle: X1 représente un groupe glycyle, un aminoacide ou un dérivé d'aminoacide naturel ou synthétique de confi- guration D, un groupe -Asp-Q de configuration L, dans lequel Q est fixé à la fraction a-carbonyle du groupe aspar- tyle et représente un alkylamide en C1 à C5, un arylamide, un alcoxy enC1 à C4 ou un groupe benzyloxy et, X représente un glycylamide ou un groupe alkylamide en C à C4 Les composés de formule générale (I) peuvent être préparés d'une manière connue en elle-même (Brevet Suisse N 603 559; Brevet Allemand N 2.438. 350; Demande de Brevet Hongrois N 1062/83). La présente invention a également pour objet un procédé pour augmenter l'activité sexuelle d'oiseaux et de mammifères domestiques utiles,aussi bien que pour préparer les spermatozoïdes qui conviennent à la reproduction de ces oiseaux et mammifères. Le procédé conforme à la présente invention est caractérisé en ce qu'il consiste à traiter des oiseaux ou des mammifères domestiques utiles, sexuellement adultes,au moins à deux reprises,et au plus à quatre reprises et de préférence à trois reprises,par 0,1 à 5 pg/kg de poids corporel, et de préférence ar 0,5 à 1,0 pg/kg de poids corpo- rel, des composés de formule générale(I) en observant une pose d'au moins 30 heures et au plus 72 heures, de préféren- ce une pause comprise entre 36 et 42 heures,entre les trai- tements consécutifs. Le procédé qui fait l'objet de l'invention convient au traitement d'oiseaux males et de mammifères domestiques utiles maintenus et élevés dans des conditions de lumière naturelle ou dans des conditions de lumière artificielle prescrites dans la technologie de production. Le composé analogue de la GnRh est injecté par voie intramusculaire, souscutanée ou dans la circulation sanguine. La production de sperme est augmentée et la libido est renforcée de 30 à 120% sous l'action de ce traitement en l'espace de 5 à 20 jours calculésà partir de la première injection. Dans le cas de plusieurs espèces animales, seul le volume du sperme est augmenté sous l'action du traitement alors que sa qualité n'est pas altérée (par exemple dans le cas des dindons); dans le cas d'autres espèces, la qualité du sperme est également améliorée en plus de l'augmentation du volume de sperme (par exemple dans le cas des jars). A la longue, l'augmentation de l'activité sexuell obtenue par le traitement ci-dessus et l'augmentation du volume du sperme disparaissent et il peut même se produire une régression. Dans de tels cas, le traitement peut être répété. Il convient d'observer un intervalle de 30 à 50 jours entre les traitements car il est possible que pendant cette période la production de sperme qui diminue éventuellement, puisse présenter une seconde augmentation au delà de la normale. Dans le cas d'espèces animales dans lesquelles la procédure d'insémination a été élaborée (par exemple chez le dindon, le lapin, le bétail),le produit sexuel peut être collecté en utilisant un massage ou une autre méthode. Dans le cas d'espèces animales dans lesquelles la méthode d'insé- mination ne peut pas être utilisée, l'efficacité du procédé peut être évaluée en fonction de l'apparition d'un plus gran désir d'accouplement (libido plus grande) ou d'une capacité d'insémination plus grande. Le Tableau 1 illustre la relation des doses de composés de formule générale (I) par rapport au taux de testostérone du plasma sanguin d'animaux traités, dans le cas -de cous domestiques. Le Tableau 2 illustre l'influence sur la production du sperme de l'intervalle observé entre les traitements consécutifs, dans le cas de dindons males. o cD un (6'o) 't1 (9'o) L' (tZ') 9'C (-'l) I'Z 9 ol ('Il) o'C (9LIc) t'[ (t1'r):.9 ('o) 6L1 i oú ('1) c c I) (,ú(8');(') (o). o (Io) 9' (.F) '.i+ (#'o) 6. ('o) F. or c o (0'o) ocz ("11) /Z (6'1) I t' (,'o) oI z # e-o (#'o) 6'! (') Il' ('") L'- (L'o) ti' oQ cO'0 (9'o) t,/ (o 1) z1 (c'1) 9'1 (L'o) L 01 o10'o0 se;nu-çw OZI 09 0ú 0 sos) xneuiTue sQade uTnfues ueselid np auoa9qso4sa: ap xne,,p a.quwoN esoG sonbTsauiop sboD @p uTnbues vuxsvTd eI suep (lui/6u ua) auoxagso;sal ap xnel al ans fTUfu- 9aqd-a anboleuu,l ap sesop sauaea;gggTp ap saj;;g I TABLEAU 2 Effet de trois injections intramusculaires de l'analogue D-Phe6-GnRH sur la production du sperme chez le dindon, le 20ème jour après la première injection Intervalle entre Nombre d'animaux Dose Volume de sperme en ml deux traitements testés ug/kg au jour 0 le 20ème jour consécutifs (heures) 24 50 1 0,18 (0,05) 0,21 (0,10) 48 '50 1 0,19 (0,07) 0,35 (0,12) 72 50 1 0,16 (0,08) 0,25 (0,11) 144 50 1 0,21 (0,07) 0,24 (0,09) CO co c, Une réponse caractéristique en deux phases dans le taux de LH du plasma sanguin d'oiseaux et de mammifères domestiques utiles est provoquée par l'administration des analogues de GnRH de formule générale (I). La première aug- mentation du taux de LH qui apparaXt après la première in- jection (les moments auxquels les injections ont lieu sont signalés par des flèches verticales) est suivie d'une lente diminution, puis par une nouvelle augmentation au bout de minutes (Figure 1). La concentration en LH du plasma sanguin est maintenue à un taux élevé pendant les trois joui qui suivent le premier traitement (17 Mai) et elle diminue jusqu'à la valeur de départ seulement le 3ème jour (Figure Apres la deuxième injection (20 Mai), la libération de LH s'arrêteau bout de 3 heures et le même phénomène est observe après la troisième injection (23 Mai). Le développement d'un taux de LH élevé de façon permanente à la suite de la première injection de GnRH et ayant pour conséquence une gonadostimulation permanente est un phénomène qui n'a pas été rapporté jusqu'à présent, qui peut constituer l'un des facteurs (essentiels) induisant l'ai mentation de la production de sperme qui apparait au bout de 2 à 3 semaines. Après répétition des injections, ce pla- teau de surproduction de LH ne se développe pas, de façon évidente en conséquence de l'effet de désensibilisation de la GnRH au niveau de l'hypophyse. De façon similaire, un phi nomène caractéristique qui n'a pas été observé jusqu'à présE consiste en ce que le taux de testostérone du plasma sanguin donne une réponse progressivement renforcée aux injections consécutives (cf Figure 3). Dans ce cas une sensibilisation prononcée apparaît au niveau des gonades. L'action de sensi- bilisation des gonades qui augmente la secrétion androgène des traitements répétés peut également être un facteur impo] tant de l'effet permanent de production du sperme. Les importants avantages du procédé qui fait 1' objet de l'invention sont les suivants: a) Ce procédé est efficace pour augmenter de façon perma- nente la spermatogénèse d'animaux ayant une production de sperme normale ou diminuée ou éventuellement une spermatogénèse stoppée pendant une brève durée, b) Le procédé peut être utilisé dans des élevages à grande échelle (par exemple dans des élevages de dindons) dans lesquels l'insémination artificielle est utilisée, mais il peut être utilisé également pour d'autres oiseaux domestiques, pour des gibiers à plumes capturés et pour des oiseaux d'agrément dans les conditions de reproduc- tion naturelle ou d'insémination artificielle. c) Un nombre relativement faible d'animaux mâles doit être maintenu, nourri et soumis à des soins hygiéniques vétérinaires pour assurer le même nombre ou un nombre accru de descendants, ce qui a pour résultat d'assurer l'expansion de la production dans des conditions écono- miques; On dispose d'une possibilité plus grande d'obte- nir un grand nombre de descendants en l'espace d'une brève durée, à partir d'un mâle de grande valeur à tous points de vue. Le procédé qui fait l'objet de la présente inven- tion sera décrit de façon plus détaillée dans les Exemples qui vont suivre, qui sont donnés à titre d'illustration de l'invention et n'ont aucun caractère limitatif. L'expression "pg/kg de poids corporel" est abrégée en "Xg/kg". EXEMPLES EXEMPLE 1 Augmentation permanente de la production de sperme de dindons élevés à l'échelle industrielle. On a administré 0,5 pg/kg d'analogue D-Phe6_ -GnRH par voie intramusculaire à des dindons mâles sexuel- lement adultes, tous les 2 jours, en tout 3 fois. Le 20ème jour suivant le traitement, la production de sperme a atteint une augmentation de 44 % et est restée à un taux supérieur comparé au témoin, pendant un mois environ (Figure 4). Un mois et demi après le premier traitement, les mêmes animaux ont été traités de façon analogue par 0,5 pg/kg d'analogue éthylamide de (Asp-cdiéthylamide)6, desGly10-GnRH tous les 2 jours, en tout trois fois. Ce traitement a provoqué une augmentation immédiate de 45 % de la production du sperme et a fourni un taux supérieur de façon significative comparé au témoin pendant 2 mois envi- ron (Figure 4). Il ressort clairement de la Figure 4 que le nombre de spermatozoides par unité de volume est devenu également plus élevé de façon significative. L'augmentation du taux de LH du sang a été suivie d'une augmentation du taux de testostérone (cf Tableau 3 ci-après). TABLEAU 3 Effet d'un traitement dans chaque cas par 0,5 pg/kg d'ana- logue éthylamide de (Asp-a-diéthylamide)6 desGly10-GnRH sur le taux de testostérone du plasma sanguin de dindonspen- dant la totalité de la période de production du sperme (trai- tements: des 2, 4 et 6 Mai, puis 23, 25 et 27 Juin). Date du Testostérone ng/ml test Témoin (n=15) Traités(n=15) 2 Mai 2,65 + 1,05 2,43 + 1,22 23 Mai 2,80 + 1,10 4,06 + 1,62 22 Juin 2,34 + 0,89 3,25 t 1,11 18 Juillet 1,76 + 0,82 3,89 + 1,34 8 Septembre 2,76 + 1,18 2,53 + 1,00 Au cours d'une autre expérience on a traité des dindons adultes sexuellement par 0,5 pg/kg d'analogue éthylamide d' (Asp-a-diéthylamide)6, desGly10-GnRH tous les 3 jours, 3 fois en tout. Ce traitement a également eu pour effet une augmentation de la production du sperme (Tableau 4). TABLEAU 4 Effet d'un traitement par l'analogue éthylamide de (Asp-a-diéthylamide)6, desGly10-GnRH administré tous les 3 jours, 3 fois en tout, sur la production du sperme chez des dindons (traitements:17, 20 et 23 Mai). Date du Sperme ml/animal test Témoin (n=15) Traités(n=15) 17 Mai 0,18 + 0, 07 0,20 + 0,06 Mai 0,20 + 0,09 0,20 + 0,09 23 Mai 0,19 + 0,09 0,21 + 0,05 Mai 0,20 + 0,06 0,25 + 0,07 Juin 0,21 + 0,08 0,31 + 0,07 Au cours d'une autre expérience, la production de sperme chez des dindons a été augmentée en administrant les quatre composés suivants: Composé "A": D- Phe6-GnRH 61 Composé "B": (Asp-a-anilide) 6desGly1-G0RH 6 10 Composé "C": éthylamide D-Phe,desGly -GnRH Composé "D": éthylamide de (Asp-a-diéthylamide)6 desGly 10-GnRH La production de sperme a été augmentée par tous les analogues de GnRH testés.Le composé "D" s'est avéré comme étant le plus actif (Tableau 5). TABLEAU 5 Effet d'analoques de la gonadolibérine sur la production de sperme chez les dindons Composé Production de sperme ml/animal au bout de au comencement 30 jours 60 jours 90 jours 120 jours de l'expérience "A" 0,27 0,34 0t 39 n = 130 +o,04 +0,03 _+o, o4 "B" 0, 18 0,21 02 - -8 n: 150 +O,06 +0,02 +0O03 "C" 0,21 0130 0,32 0 34 o0,30 n 180 +o0 03 +o o, 1 +o2 +_o 05 + o:_ "D " N 0,20 023 O n = 2 7o o _ +o.0o02 +o,0d.0,03 0,0 o Témoin 0,19 OL9 Or 20 0?21 0,20 n = 200 +0o4 +orO5;+o002 +0,03 +0)4 Co Les résultats obtenus au cours des exodriences effectuées sur un grand nombre de différents animaux étayent de façon non ambigie l'observation faite par la Demanderesse du fait que la production de sperme de dindonsest maintenue en utilisant des analogues de LH-RH à un taux élevé pen- dant plusieurs mois à la suite "d'une période latente" qui dure 3 semaines environ. EXEMPLE 2 Modification de l'activité sexuelle et du taux de testostérone du plasma sanguin de jars sous l'effet d'an analoque de GnRH Des jars élevés à l'échelle industrielle et. reproduits de manière naturelle ont été traités par 0,5 6 10 Pg/kg d'analogue éthylamide D-Phe6,desGly -GnRH tous les 2 jours, trois fois en tout. Aussi bien le taux de testostérone du plasma sanguin que la libido des ani- maux ont été augmentés de façon significative par le trai- tement. Ceci s'est manifesté par l'augmentation de l'acti- vité d'accouplement (Tableau 6). Co awauoue.tosTd =, bc ) maintenue à un niveau élevé pendant encore un mois. EXEMPLE 3 Augmentation de la production du sperme chez les jars Des jars "Hongrois" et "Landais" élevés dans des conditions naturelles et divisés en petits groupes ont été traités par 0,5 pg/kg d'analogue éthylamide D-Phe6, desGly10-GnRH, tous les 2 jours, 3 fois en tout. Le trai- tement a eu pour résultat une augmentation de la production du sperme qui a duré pendant environ un mois et demi (cf Tableau 7). Dans le cas des jars "hongrois", le volume du sperme a été augmenté de façon significative et simultanément la qualité du sperme a également été améliorée, c'est-à- dire que le nombre des spermatozoïdes par unité de volume de sperme et leur motilité ont été augmentés tandis que le nombre de spermatozoïdes morts ou déficients a été diminué. i / zl'o 60'0 za'o 60o0 mauaAoauuaxow 61 09 Il Ozlo tzlo auuoq auufL _ 9 Co 6z*_ 9t goo0 9010.6v0 illXo auuoqauuaiow oz L 6w1 611 ell0 oz0 auuoq auuoq;l6 ilsz Wto Salo Bie -0 O0'0 60'0!0'0 iuaoqaUlOlJ Li 61 6'tz-z gI'0 02'0 auuoq auua/oqu 91 6 'l9 3 Z'0 1Z'0: sal,8Z _ _ -...,- CI'0 Z1'0 Zl'0 01'0 4,.Iuaxom auuaxow61 ai 0'Z L't ec0 Lalo auuoq auuoq Zl 9t 6'Z C 'aoZ'0 lal z-o Zl-0 oZ-0 91o- auuoq auuaXom9I zz o-e 6'1;t0o Cz'O auuoq auuaot0 oz zt o' 6'1 9G'o 0o'o OlalAa 1 o'o úLo'o 3I'o 01-0 muaxoU auua.,om6I Ca z'z 6't ac/o oz'o auuoq euua.oui a 91 z' 3'z e Zl?,'o za'0.181.a L 9t'0 01-0 5o0-0 B0-0 auuaXow alqle;úz çz o z 6'1 8'0 ZZ- ?3'alqîuj auuaXowu oz Li zo L- la iAu- er )uuaKow alqleitça Ca 02 61 CI ' l ZO 4l !o'o LO'O 90'0 90'o0 alqxet alqlv.C a tZ 6'1 8'1 61'0 91-0 alqlitBalqîlv 61 91 T'a C'a 61'o 81'o l1lA quam ol Ilo: luWa:l uloW:uailUIOW:iua"l: Ux. om:uea: W ulow:o uawaoq tlo UTOW lUIOW _îull _91 -îe1l L _Bl _a -île-1_,a -Tsla _,a -îilz pla - als _aL-l+ _aqXj 9 sap!ozol -- aD go, sap sap.saqua p s2 9osaOI [so.;p ú Psap ewaads sap -aow salnlIaD -tozoletuiads (iw) autads -lozoluuizads la salzow salnl zo4vwaads (1w) owaadS np ea 9a1lIlowN ap lioddeU ap aaquoN sap Pq.li.oi-lae ap laoddul -.ap aaqwuoN làx.. * (.IOlAga xal qe TaTAuvr qe 8Z: s:quouaq:ve:) sdutaeulzd ne quuldnoooe,s qo selleanquu suoT:Tpuoo sep suep sgaalg sie. sop zaqo auaads op uoTqonpoad el ans HHug0iú{iOsap9alqa-a apTuleV1{q4,iop 4;%oà EXEMPLE 4 Accroissement de l'activité sexuelle de perroquets males. On a injecté 0, 1 pg/kg d'analogue éthylamide de (Asp-a-diéthylamide)6,desGly10-GnRH à des perroquets arara males sexuellement inactifs, élevés dans des conditions naturelles, à raison d'injections tous les 3 jours, 3 fois en tout. Le pénis des animaux a été augmenté de façon signi- ficative sous l'effet de ce traitement. Les animaux ont présenté une modification éthologiaue caractéristique (ils ont recherché une femelle) et l'augmentation de leur acti- vité sexuelle s'est manifestée également par des copula- tions répétées. EXEMPLE 5 Accroissement de la production du sperme de lapins males en utilisant un analogue de GnRH Dans cette expérience on a utilisé des lapins angora males présentant une faible libido, à partir desquels on n'avait pas pu obtenir de sperme. La motilité des cel- lules de leur sperme était inférieure à 75 %; de ce fait ces animaux ne pouvaient pas être utilisés pour la reproduc- tion. On a traité 234 de ces animaux par 3 pg d'analogue 6 10 éthylamide D-Phe6,desGly10-GnRH tous les 2 jours, 3 fois en tout. Alors que l'activité sexuelle des animaux témoins n'a pas été modifiée de façon substantielle, les observations sui- vantes ont été faites sur les animaux traités,pendant une période de 4 semaines après le traitement: la libido des animaux a été augmentée de façon significative; leur produc- tion de sperme a atteint 80 % (pesée en ml) du poids moyen de sperme obtenu à partir de mâles bons reproducteurs utili- sés pour la reproduction; de plus, la motilité caractéris- tique de l'aptitude à l'insémination des spermatozoïdes était supérieure en moyenne de 10 % à la valeur moyenne (76 %) du sperme obtenu à partir de males'ons reproducteurs. Ces effets ont pu être observés pendant plusieurs semaines; ainsi la quantité de sperme utilisable pour l'insémination artificielle a été augmentée de 2,5 fois. EXEMPLE 6 Accroissement de l'activité sexuelle d'un taureau Un taureau de 2 ans, pesant 1010 kgs, en état de reproduire et présentant de façon correspondante un bon système musculaire, une bonne construction des pattes et un caractère sexuel mâle bien défini,a été choisi pour la reproduction en 1985. Les 16 et 23 Octobre ainsi que le ler Novembre 1985 des tests visant à lui faire couvrir des vaches femelles en rut et un taureau mannequin ont été effectués. L'animal n'a fait aucune saillie dans aucun des cas et n'a montré d'intérêt ni pour les femelles ni pour le mAle. Le diagnostic établi par le vétérinaire a été: impotentia coeundi. Le taureau a été traité le 29 Novembre ainsi que les2 et 4 Décembre 1985, en tout 3 fois,par 300 pg chaque fois d'analogue D-Phe6-GnRH. Le 6 Décembre 1985 le taureau a couvert deux fois une vache en rut et a répété cette action le 7 Janvier 1986. Le 21 Janvier 1986 le taureau a sailli une vache qui n'était plus en rut. La puissance sexuelle de l'animal était irréprochable même au bout de semaines après le traitement. REVENDICATION Composé utile pour l'augmentation de l'acti- vité sexuelle d'oiseaux et de mammifères domestiques utiles mles et pour préparer des spermatozoïdes convenant à la reproduc- tion de ces oiseaux et de ces mammifères, lequel composé est caractérisé en ce qu'il présente la formule générale (I) ci-après, Glp-His-Trp-SerTyr-X1-Leu-Arg-Pro-X4 (I) dans laquelle, X1 représente un groupe glycyle, un aminoacide ou un dérivé d'aminoacide naturel ou synthétique de configuration D, un groupe -Asp-Q de configuration L, dans lequel, Q est fixé à la fraction a-carbonyle du groupe aspartyle et représente un groupe alkylamide en C1 à C5, un groupe arylamide, un groupe alcoxy en C1 à C4 ou un groupe benzyloxy; et X4 représente un groupe glycylamide-ou un groupe alkylamide en C à C4 lequel composé est apte à être administré à des oiseaux ou à des mammifères domestiques utiles, sexuellement adultes, mâles, à au moins 2 et au plus 4 reprises, à raison de doses de 0,1 à 5 Pg/kg de poids corporel, à des intervalles de temps de 30 heures à 72 heures.