Brevet FR2578721A1 — publié le 19860919

La présente invention se rapporte à une composition nouvelLe, à base de tryptophane, utiLisable comme additif à L'alimen- tation animale, et concerne également un procédé pour sa préparation. Le tryptophane est L'un des aminoacides essentieLs pour les animaux et peut être préparé par des procédés chimiques ou par des procédés biochimiques. Un procédé biochimique classique de préparation du tryptophane consiste à cultiver un micro-organisme producteur de cet aminoacide dans un milieu contenant des saccharides en tant que sourcesprincipalesde carbone, et de l'ammoniac ou d'autres substances azotées en tant que sourceprincipalesd'azote. Le tryptophane produit dans le bouillon de culture est isolé de ce bouillon, purifié puis utilisé dans l'alimentation animale. On n'a jamais décrit antérieurement l'utiLisation dans l'alimentation animale du tryptophane tel qu'il est contenu dans le bouillon de culture, c'est-àdire non séparé des impuretés de ce bouillon ni soumis à aucune autre purification. D'autre part, Le tryptophane est extrêmement sensible à des modifications chimiques, par exemple à une décomposition. On sait que lorsqu'on concentre et on déshydrate un bouillon de fermentation contenant le tryptophane produit par les procédés couramment décrits dans la littérature technique, le tryptophane contenu dans le bouillon de fermentation se colore et est décomposé dans une mesure importante par hydrolyse. La présente invention vise en premier lieu à la pré- paration, à partir d'un bouillon de culture du tryptophane, d'une composition exempte de substances nocives pour les animaux, stable et non inférieure par sa capacité nutritionnelle au tryptophane isolé, ceci sans faire appel à des quelconques techniques spéciales de purification et par conséquent sans risquer l'hydrolyse du tryptophane. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description ci-après. Ces buts ont été atteints dans un additif pour l'ali- mentation animale qu'on prépare en concentrant une solution aqueuse contenant du tryptophane et des impuretés provenant d'un bouillon de culture d'un micro-organisme producteur de tryptophane en main- tenant le pH de la solution aqueuse dans l'intervalle de 4 à 6 et sa température dans l'intervalle de 20 à 80 C. La figure unique du dessin annexé représente graphi- quement les résultats d'un essai effectué dans l'exemple 2 et met en évidence les effets d'un chauffage sur le tryptophane en fonction du pH. La demanderesse a trouvé qu'une composition obtenue en concentrant une solution aqueuse contenant du tryptophane (à une teneur en tryptophane de 10 à 70 %, de préférence de 20 à 50 % des matières sèches totales contenues au début de l'opération de con- centration) et des impuretés, ces impuretés et ce tryptophane provenant du bouillon de culture d'un micro-organisme producteur de tryptophane, en maintenant le pH de la solution aqueuse dans l'intervalle de 4 à 6, de préférence de 4,5 à 5,5, et sa température dans l'intervalle de 20 à 80 C, de préférence de 40 à 80 C, et si on le désire en séchant le concentré (à une température dans l'inter- valle de 60 à 120 C) possédait la même capacité nutritionnelle que le tryptophane pur. Ce procédé permet d'éviter une hydrolyse ou une formation de matières colorées à partir du tryptophane. Les impuretés provenant du bouillon de culture ne s'opposent nullement à l'utilisation de la composition dans L'alimentation animale lorsque cette composition est préparée comme décrit ci-dessus, et cette composition a une stabilité suffisante pour assurer une longue durée de conservation. L'invention est basée sur cette découverte. On peut utiliser avec efficacité dans l'invention un micro-organisme quelconque à condition qu'il soit capable de produire du tryptophane. Comme exemples particuliers de micro- organismes on citera les types déposés sous les n PERM-P 6258, PERM-P 5236, ATCC-21427, FERM-P 6026 et FERM-P 6027. On trouvera d'autres exemples dans le tableau ci-dessous: Micro-organismes NRRL FERM BP ATCC FERM P revibacterium flavum 21427 revibacterium flavum (NRRL 841211) - Flavobacterium auto- thermophilum - FERM P-4425 Arthrobacter globi- formis FERM P-5296 Microbacterium ammo-.: lniaphilum - FERM P-5298 Escherichia coli - FERM P-5300 revibacterium flavum FERM BP-114 acillus subtilis FERM BP-208 acillus subtilis FERM BP-209 3revibacterium flavum FERM BP-475 Corynebacterium glu- tamicum - FERM BP-478 acillus subtilis FERM BP-202 revibacterium lacto- fermentum FERM P-7126 La culture du micro-organisme producteur de tryptophane peut être effectuée sans difficulté particulière par l'un des pro- cédés classiques tels que décrit dans les demandes de brevets japonais publiéessous n0 58(1983)-107 190, 58 (1983)-138 389 et 57 (1982)-208 994. Le produit de départ de la préparation de la composi- tion selon l'invention peut consister en le bouillon de culture lui-même, non modifié. Si on le désire, on peut soumettre le bouillon de culture à un traitement de raffinage grossier, par exemple la séparation des cellules de micro-organisme usées ou une décoloration du bouillon par le charbon actif ou par une résine échangeuse d'ions (par exemple une résine macroporeuse non polaire vendue sous la marque "DIAION SP 207" par la firme Mitsubishi Chemical Industry). Quelle que soit sa forme, le bouillon de culture peut être utilisé comme produit de départ, la seule condition exigée étant que sa teneur en tryptophane se situe dans l'intervalle de 10 à 70 % des matières sèches totales. On peut utiLiser en tant que source de carbone dans le milieu de culture une source de carbone queLconque assimilable par le micro-organisme producteur de tryptophane. IL est recommandé d'utiliser une matière première à forte teneur en source de carbone assimilable car on diminue ainsi la quantité de résidu après l'opé- ration de fermentation. Par conséquent, les pertes de tryptophane dues à sa réaction avec le résidu diminuent en proportion de l'augmentation de l'assimilabilité de la source de carbone contenue. Comme exemples pratiques de matières premières à forte teneur en sourcesde carbone assimilableson citera le glucose et le saccharose cristallisés et les solutions d'amidon saccharifié. Pour le réglage du pH du bouillon de culture de trypto- phane, on peut utiliser un acide minéral ou organique quelconque courant ne contenant pas de substances nocives pour les animaux. L'acide nitreux et les acides organiques contenant des aldéhydes ne conviennent pas pour ce réglage de pH parce qu'ils réagissent facilement avec le tryptophane. On poursuit la concentration jusqu'à ce que la teneur en matières sèches de la solution se situe dans l'intervalle de 5 à 70 % et de préférence d'environ 60 %, après quoi on peut procéder aux opérations de séchage décrites ci-après. Durant le cours de la concentration et de la déshydra- tation, la solution aqueuse soumise à concentration et le concentré soumis à déshydratation peuvent être maintenus sous vide: on abaisse ainsi Le point d'ébullition de l'eau dans le mélange en traitement. L'addition au bouillon de fermentation d'une substance dépourvue de nocivité pour les animaux et capable de former un mélange azéotropique avec l'eau, et par conséquent d'abaisser le point d'ébullition de l'eau, a des avantages parce qu'on peut ainsi abaisser efficacement la température de la solution en cours de traitement, éviter une hydrolyse et une coloration du tryptophane et en même temps améliorer la fluidité de la solution et utiliser un récipient de réaction à usages multiples jusqu'à une concentration élevée. Ainsi donc, l'addition d'une substance formant un azéotrope avec l'eau présente des avantages du point de vue des économies d'énergie. La composition à base de tryptophane obtenue comme décrit ci-dessus possède une valeur nutritionnelle égale à celle du tryptophane raffiné pour les animaux. Le produit selon l'invention peut être préparé à bas prix par un mode opératoire simple à partir d'un bouillon de fermentation contenant du tryptophane: il n'exige pas l'isolement ni la purification du tryptophane et il évite les risques d'hydrolyse du tryptophane ou de formation de matières colorées. Il permet la meilleure exploitation nutritionnelle possible du tryptophane. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indications de parties et de pourcentage s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple 1 On place dans un récipient de fermentation d'un volume intérieur de 20 l et on stérilise 8 l d'un milieu de culture de tryptophane à la composition indiquée dans le tableau ci-après. On cultive sur ce milieu de culture un inoculat du micro-organisme FERM-P 6258 décrit dans la demande de brevet japonais publiéesous n 58 (1983)107 190 avec aération de la solution à 1/2 VVmin, en agitant à 350 tr/min, en maintenant à 31,5 C et en réglant à pH 7,0 par l'ammoniaque. A la moitié de la durée totale de culture, on commence à introduire en continu la solution de glucose. On obtient ainsi 10 l d'un bouillon fermenté contenant 2 g de trypto- phane par dl avec une teneur totale en matière sèche de 6,7 g/dl. Composition du milieu de culture de tryptophane Glucose 13 g/dl NH4Cl 1 g/dl KH2PO4 0,1 g/dl KCL 0,2 g/dl MnSO4,7H20 0,001 g/dl FeSO4,4H20 0,001 g/dl MgSO4,7H20 0,04 g/dl Hydrolysat par HCI de protéine de soya 0,1 g/dl (en azote total) Huile de soya (agent anti- mousse) 0,01 ml/dl. Concentration et déshydratation On règle les 10 litres de bouillon fermenté obtenus comme décrit ci-dessus à pH 4,5 par l'acide sulfurique à 60 % et on concentre sous vide dans un appareil de concentration sous vide Ruhr, à une température maximale de 60 C jusqu'à ce que la teneur en matièressèchesatteigne environ 60% en poids. Le concentré obtenu est séché sur un séchoir continu à tapis sous vide jusqu'à une teneur en humidité inférieure à 1%. Au cours de ce séchage, alors que la teneur en humidité est encore supérieure à 5 %, on règle la pression de vapeur et le vide de manière à empêcher une montée de température de la solution au- dessus de 80 C. La poudre de tryptophane ainsi obtenue a une teneur en tryptophane, par rapport aux matières sèches totales, qui est la même que celle du bouillon fermenté, également par rapport à sa teneur en matières sèches totale. Par rapport au bouillon fermenté, on ne constate pas non plus d'accentuation visible de coloration de la poudre de tryptophane. Cette poudre est très peu hygroscopique: sa teneur en humidité à l'équilibre ne dépasse pas 16 X à 40 C et 70 Z d'humidité relative. La teneur en tryptophane par rapport aux matières sèches totales est également la même que celle du bouillon fermenté, après réglage du pH, par rapport à ses matières sèches totales. On ne constate pas non plus d'accentuation visible de coloration par rapport au bouillon fermenté. Exemple 2 (pH et taux d'hydrolyse du bouillon de tryptophane fermenté) On règle des parties aliquotes du concentré de bouillon fermenté (à une teneur en matières sèches d'environ 60 % en poids) obtenu dans l'exemple I à des pH variés entre 1 et 12 à l'aide d'acide chlorhydrique et d'hydroxyde de sodium puis on dilue à l'eau à une concentration uniforme en tryptophane, de 2g/dl. On place plusieurs échantillonsde chacun des produits obtenus dans des récipients à bouchon fileté d'un volume intérieur de 100 ml qu'on chauffe au bain d'huile à 60 C ou 80 C pendant 6 heures. Après ce chauffage, on refroidit rapidement et on déter- mine par analyse la concentration en tryptophane. Les résultats obtenus sont rapportés sur le graphique de la figure unique du dessin annexé. On notera que l'hydrolyse du tryptophane est pratiquement négligeable lorsque l'échantillon est réglé à un pH de 4 à 6 au cours de la concentration. Exemple 3 (essai d'alimentation) On prépare une alimentation de base à une teneur en protéines brutes de 12 % en combinant un mélange de 87,0 % de mais des Indes et 9,5 % de soya déshuilé, un mélange de matières minérales telles que du phosphate de calcium et du chlorure de sodium avec des vitamines, des aminoacides à savoir 0,3 % de chlorhydrate de L- lysine, 0,1 % de DL-méthionine et 0,1 % de L-thréonine. On accorde cet aliment de base accompagné d'une quantité équivalant à 0,04 % de L- tryptophane à des porcs adultes en vue de mettre en évidence la valeur nutritionnelle de l'additif. Les résultats de ces essais sont rapportés ci-après |Groupe d'animaux 1 2 3 I.- - Produit selon Additif sans L-tryptophane l'invention tryptophane pur (correspondant à 0,04 % de L-tryptophane) Augmentation de poids par jour, (g) 480 620 621 Quantité d'aliment consommé par jour 1,35 1,50 1,50 Rapport de demande de l'aliment 2,76 2,42 2,42 Mode opératoire d'essai: Chaque groupe d'animaux consiste en 4 mâles castrés et 4 femelles adultes, recevant l'aliment de base plus l'additif indiqué pandant 28 jours (avec des poids corporels allant de 18 à kg); on détermine ainsi les variations de poids moyen. Les résultats obtenus dans les essais ci-dessus montrent que le produit selon l'invention provoque une augmentation de poids quotidienne identique à celle obtenue avec le tryptophane pur et suscite, comme lui, un rapport de demande de l'aliment plus élevé. ExempLe 4 Le producteur de L-tryptophane utiLisé dans cet exemple est un mutant dérivé de Corynebacterium glutamicum (FERM P-7374). Ce mutant a été décrit dans la demande de brevet japonais publiéesous n 60 (1985)-137 298. Ce mutant identifié par le n FERM P ci-dessus a été déposé le 19 décembre 1983 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciences and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken 305, Japon qui a accordé le n FERM-P en question. Le mutant déposé a ensuite été converti en dépôt dans le cadre du traité de Budapest du 2 février 1984, et on lui a donné le n correspondant FERM BP-478. On procède à une fermentation avec un volume utile de 10 litres; à cet effet, on dissout Les composants du milieu indiqués dans Le tableau cidessous dans 8 litres d'eau de ville dans un récipient de fermentation de 20 litres. On stérilise le milieu à 120 C pendant 20 minutes par introduction de vapeur à haute pression. Composition du milieu de culture du tryptophane Mélasses 100 g/l (exprimé en glucose) KH2PO4 0,5 g/l K2HPO4 0,25 g/l MgSO4.7H20 0,25 g/l (NH4)2S04 20 g/l Liqueur de macération de mais 10 g/l L-phénylalanine 200 mg/IL Ltyrosine 175 mg/l pH 7,2 On inocule le milieu de fermentation à un rapport de 5 % par la culture d'ensemencement obtenue en cultivant les cellules dans un milieu liquide. La fermentation est effectuée à 31,5 C. Le pH du milieu est maintenu à 6,5 par l'ammoniac gazeux, à la vitesse d'agitation de 350 tr/min et à un débit d'air de 1/2 VVmin. Dans le coursde la fermentation, du glucose est introduit en continu dans Le récipient de fermentation. Le glucose est consommé presque complètement et il s'accumule dans le bouillon de culture de 10 litres 1,8 g/dl de L-tryptophane, à une teneur totale en matières sèches de 6,0 g/dl. Le bouillon fermenté au volume de 10 I obtenu comme décrit ci-dessus est réglé à pH 4,5 par l'acide sulfurique à 60 % et concentré sur un appareil sous vide Ruhr, à une température ne dépassant pas 60 C (température de la matière) jusqu'à ce que la teneur en matières sèches atteigne environ 60 % en poids. Le concentré obtenu est séché dans un séchoir-atomiseur alimenté en air à 115 C à une température de matière qui ne dépasse pas 100 C. La matière séchée ainsi obtenue est à 2,0 % d'humidité. La poudre de tryptophane ainsi obtenue a la même teneur en tryptophane, par rapport aux matières sèches totales, que le bouillon fermenté, également par rapport à ces matières sèches totales. De même, par rapport au bouillon fermenté, on ne constate pas d'accentuation visible de la coloration. Exemple 5 On place 8 litre d'un milieu de culture de tryptophane à la composition indiquée dans le tableau ci-après dans un récipient de fermentation d'un volume intérieur de 20 litres, on stérilise, et on cultive dans ce milieu un inoculat du micro-organisme de FERM P-5907 décrit dans la demande de brevet japonais publiéesous n 57 (1982)-174 096, déposée sous le nom et le n Brevibacterium Flavum FERM BP-114 dans le cadre du traité de Budapest, avec aération de la solution à 1/2 VVmin, agitation à 350 tr/min, température main- tenue à 31,5 C et réglage du pH à 7,0 par l'ammoniaque. A la moitié de la durée totale de culture, on commence à introduire la solution de glucose. On obtient ainsi 10 litres d'un bouillon fermenté conte- nant 1,4 g/dl de tryptophane avec une teneur en matières sèches totale de 5,6 g/dl. Composition du milieu de culture de tryptophane Glucose 130 g/l (NH4)2S04 25 g/I KH2P04 1 g/l Acide fumarique 12 g/I Acide acétique 3 ml/L MnSO4, 7H20 8 mg/l d-biotine 50 pg/l Chlorhydrate de vitamine B1 2000 pglt Ltyrosine 650 mg/l DL-méthionine 400 mg/l Solution d'hydrolysat à l'acide de protéine de soya 50 ml/l MgSO4,7H20 1 g/t pH 6,5 Le bouillon fermenté au volume de 10 litres obtenu comme décrit ci-dessus est réglé à pH 4,5 par l'acide sulfurique à % et concentré dans un appareil sous vide Ruhr à une température ne dépassant pas 60 C dans la matière jusqu'à une teneur en matières sèches totale d'environ 60 % en poids. Le concentré obtenu est séché dans un séchoir atomiseur avec de l'air à 115 C à une température ne dépassant pas 100 C dans la matière. La teneur en humidité de la matière séchée est de 2,0 %. La poudre de tryptophane obtenue dans ces conditions a la même teneur en tryptophane, par rapport aux matières sèches totales, que le bouillon fermenté, égaement par rapport à ses matières totales. Dans la poudre de tryptophane, on n'observe aucune accentuation visible de coloration par rapport au bouillon fermenté. Il est clair que l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titred'exemples et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un additif alimentaire, caractérisé en ce que l'on concentre une solution aqueuse contenant du tryptophane et des impuretés, ce tryptophane et ses impuretés provenant d'un bouillon de culture d'un micro-organisme producteur de tryptophane, en maintenant le pH de ladite solution aqueuse dans l'intervalle de 4 à 6 et sa température dans l'intervalle de 20 à 80 C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en tryptophane de la solution aqueuse se situe dans l'intervalle de 10 à 70 % par rapport aux matières sèches totales de ladite solution. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la teneur en tryptophane se situe dans l'intervalle de 20 à % des matières sèches totales. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse au cours de sa concentration se situe dans l'intervalle de 4,5 à 5,5. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température de la solution aqueuse au cours de sa concen- tration se situe dans l'intervalle de 40 à 80'C. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le concentré obtenu est ensuite séché à une température dans l'intervalle de 60 à 120 C. 7. Additif alimentaire caractérisé en ce qu'il a été obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.