Brevet FR2584417A1 — publié le 19870109

Des plaques de milieux de culture secs ont été mises au point récemment, un exemple classique étant celle vendue par 3M Company (Medical Products Division, St. Paul, Minnesota 55144, sous la marque commerciale Petrifilm) , caractérisées normalement en ce qu'un milieu de culture bactérienne sec, autonome et prêt à l'emploi, revêtant un support de film est recouvert par exemple d'un film de polyéthylène. Le support porte des substan- ces nutritives classiques et un agent gélifiant hydro- soluble à froid. Le film de couverture est également revêtu de l'agent gélifiant et, en outre, d'un colorant indicateur constitué par le chlorure de 2,3,5-triphényl- tétrazolium, afin de faciliter le comptage. Un quadril- lage (chaque carré mesurant 1 cm x 1 cm) tracé sur le film inférieur facilite également le comptage. La surface globale d'une plaque Petrifilm"' unitaire est de 20 cm2. De telles plaques de milieux de culture secs, comme celles décrites précédemment, présentent souvent des avantages par rapport aux boites de Pétri et aux plaques de gélose plus classiques, couramment utilisées pour l'ensemencement et la croissance bacté- rienne. Par exemple, l'utilisation plus ancienne et plus classique des boîtes de Pétri et des milieux nutri- tifs à base de gélose met en jeu un volume, un poids et une place considérables. Cela rend difficile, au mieux, le transport des échantillons de micro-organismes du terrain jusqu'au laboratoire. D'autre part, le film de milieu de culture sec qui devient le support de la croissance bactérienne simplement par addition d'un échantillon aqueux représente un moyen plus efficace pour permettre les comptages bactériens viables que les procédés classiques actuels. Il est un fait cependant que les films de milieux de culture secs disponibles contiennentseulement un milieu de culture classique revêtant le support du film. D'autre part, le milieu de culture utilisé actuelle- ment est un milieu convenant à la croissance de tous les types de microorganismes et qui n'est pas sélectif pour la croissance d'un type donné. Ainsi, un bactériolo- giste cherchant à faire croútre un micro-organisme parti- culier devait dans le passé abandonner la possibilité d'utiliser les films de milieux de culture très avanta- geux pour revenir à l'utilisation fastidieuse des plaques de gélose classiques, avec des milieux de culture adaptés A des besoins spécifiques, connus pour favoriser la croissance de micro-organismes particuliers recherchés, et inhibant en même temps la croissance des micro- organismes indésirables. Ainsi, comme les bactériolo- gistes et les microbiologistes sont souvent désireux de faire croître seulement un micro-organisme particulier pour ensuite l'isoler, l'étudier, l'analyser et l'utili- ser, les films de milieux de culture secs contenant le milieu classique n'ont pu être utilisés dans de nom- breux cas en raison de la non-sélectivité de leur milieu. -..:En conséquence, la présente invention a principalement pour objet de développer un procédé et des systèmes de préparation d'un film de milieu de cul- ture sec, autonome et prêt à l'emploi, spécifique pour la croissance sélective de certaines bactéries, tout en inhibant en même temps la croissance de certaines autres. En particulier, un objectif de la présente invention est de préparer le film de milieu de culture décrit ci-dessus pour la croissance sélective des bacté- ries lactiques, dans des conditions anaérobies, tout en inhibant en même temps la croissance des autres micro- organismes indésirables. Un autre objectif de la présente invention est le développement d'un procédé, des systèmes et de la technique de préparation d'un film de milieu de cul- ture Petrifilm"' 3M spécifique pour la croissance des micro-organismes appartenant aux Lactobacillaceae, ou en d'autres termes des bactéries lactiques. Un autre objectif spécifique de la présente invention est la mise au point d'une solution diluante destinée à préparer des échantillons pour l'ensemencement des films de milieux de culture autonomes et prêts à l'emploi, qui rende le film spécifique pour les bactéries lactiques, tout en inhibant en même temps la croissance des bactéries, levures et moisissures indésirables. Le procédé et les systèmes nécessaires à la réalisation de chacun des objectifs ci-dessus, parmi d'autres, seront mis en évidence dans la descriptiuon détaillée de la présente invention. Des films de milieux de culture bactérienne secs, autonomes et prêts àl'emploi, sont rendus spécifi- ques pour la croissance sélective des bactéries lactiques, dans des conditions anaérobies. Cela est réalisé avec une solution diluante à base d'eau, ou diluant, qui contient un inhibiteur de micro-organismes Gramnégatifs, associé à un agent antifongique hydrosoluble et un nitrite hydrosoluble. Le nitrite de sodium est le sel préféré. La solution a un pH compris dans l'intervalle d'environ 6,5 à environ 7,5, de préférence un pH neutre. La solu- tion, lorsqu'elle est utilisée comme diluant ou support pour l'ensemencement avec des bactéries, agit en rendant le milieu de culture, par ailleurs classique, revêtant le film de support, spécifique pour les Lactobacillaceae. Le film de milieu de culture sec contenant le milieu de culture classique devient le support de la croissance bactérienne simplement par addition d'un échantillon aqueux. Conformément à la présente invention, il a été découvert que si l'échantillon aqueux est uti- lisé pour ensemencer le film de milieu de culture grâce à une solution spécifique, décrite ci-après, alors, et seulement dans ce cas, le film devient spécifique pour les micro-organismes appartenant aux Lactobacillaceae. Il existe de nombreuses raisons pour les- quelles les bactériologistes et les microbiologistes peuvent vouloir faire croftre un micro-organisme parti- culier, à l'exclusion des autres. La solution de support, ou solution diluante, mise au point conformément à la présente invention, est destinée notamment à l'utilisa- tion avec des films de milieux de culture afin de les rendre spécifiques pour les Lactobacillaceae. Cela permet ainsi l'utilisation convenable des avantages des films de milieux de culture, comme la récolte sur le terrain, le transport et l'étude, même quand on cultive seulement de manière spécifique les micro-organismes appartenant aux Lactobacillaceae. Les micro-organismes lactiques classiques que l'on peut faire croître de manière sélective sur les films de milieux de culture décrits précédemment, lorsqu'on utilise le diluant de la présente invention, sont les streptocoques, les pédiocoques, les lactobacil- les et les leuconostocs. Le diluant destiné à l'utilisation dans la présente invention est un système à trois composants, à base d'eau. La solution contient un inhibiteur de micro-organismes Gram-négatifs associé à un agent anti- fongique et à un nitrite hydrosoluble. La solution doit également avoir un pH compris dans l'intervalle d'environ 6,5 à environ 7,5, et être dé préférence neutre. Lorsque ces conditions sont réunies, cela permet d'obtenir un diluant qui, placé sur un film de milieu de culture sec, rend le film spécifique pour les Lactobacillaceae. L'inhibiteur de micro-organismes Gram-négatifs peut être un antibiotique du type de la Polymyxine et doit avoir une concentration comprise dans l'intervalle de 24 unités/ml de solution diluante à environ 40 unités/ ml de solution diluante, 24 unités/ml étant une concen- tration fonctionnellement très satisfaisante pour le sulfate de Polymyxine B. L'antibiotique préféré est la Polymyxine, la Polymyxine préférée étant le sulfate de Polymyxine B. mnun La solution d'ensemencement contient égale- ment un agent antifongique hydrosoluble, à une concentra- tion comprise dans l'intervalle de 10 pg/ml à environ:. 250 pg/ml, l'intervalle d'environ 10 ig/ml à environ pg/ml étant préféré. L'agent antifongique préféré est le cycloheximide. Cependant, outre le cycloheximide, on peut utiliser d'autres agents antifongiques et conser- vateurs comme le sorbate de potassium, le butylhydroxy- anisole (BHA) et le butylhydroxytoluène (BHT). Le troisième composant de la solution de support, ou du diluant, est un nitrite hydrosoluble, sel qui est présent à une concentration comprise dans l'intervalle de 600 pg/ml à environ 1800 pg/ml. Le nitri- te peut être n'importe quel nitrite métallique hydro- soluble, mais est avantageusement un nitrite d'un métal du Groupe I, et est de préférence le nitrite de sodium ou le nitrite de potassium. Le nitrite de potassium est le sel préféré. Un nitrite, utilisé dans cet inter- valle de concentrations, s'est révélé inhiber la crois- sance des micro-organismes autres que les bactéries lactiques. La solution de support doit avoir un pH compris dans l'intervalle de 6,5 à environ 7,5, de préfé- rence d'environ 6,5 à environ 7,0. La solution diluante idéale est neutre. Il s'est révélé déterminant dans la préparation du film de milieu de culture spécifique des Lactobacillaceae que le pH reste en général proche de la neutralité, c'est-à-dire dans l'intervalle d'envi- ron 6,5 à environ 7,5. Cela est dg au fait que les films disponibles dans le commerce, comme le Petrifilm"' vendu par 3M Company, contiennent un colorant du type tétrazo- ltum pour colorer en rouge les bactéries mises en culture, afin de faciliter le comptage. Cependant, le colorant du type tétrazolium devient toxique pour tous les micro- organismes en croissance si le pH devient plus acide, comme par exemple vers un pH de 5,5. Ainsi, la solution de support de la présente invention doit avoir un pH compris dans l'intervalle mentionné, ce qui évite la réaction défavorable avec le colorant du type tétrazo- lium. Afin de maximiser l'effet inhibiteur de croissance sur les autres organismes, il est également essentiel pour la présente invention que le film ense- mencé soit mis a incuber dans des conditions anaérobies. D'autre part, la solution diluante est spécifique pour les Lactobacillaceae seulement dans des conditions anaéro- bies. Cet environnement anaérobie peut être induit par de nombreux procédés classiques, comme par l'utilisation de générateurs anaérobies Gas Pack"', fabriqués par BBL Microbiology Systems of Cokeysville, Maryland. La description précédente a été donnée à propos de l'utilisation des antibiotiques du type Poly- myxine comme inhibiteurs des micro-organismes Gram- négatifs. Une autre formulation a été mise au point qui convient à de nombreuses applications, et dans cer- tains cas se comporte mieux que la formulation décrite auparavant. Elle est basée sur l'utilisation du 2- phényléthanol comme inhibiteur des micro-organismes Gram-négatifs. Lorsque du 2-phényléthanol est utilisé, une composition préférée est celle décrite ci-après. La concentration.du 2-phényléthanol doit être comprise entre environ 1 mg/ml et environ 4 mg/ml. La concentra- tion de l'agent antifongique doit être comprise entre environ 10 lig/ml et environ 250 ug/ml et la concentration du nitrite hydrosoluble doit être comprise entre environ 600 pg/ml et environ 800 ug/ml. Le pH est donc compris dans l'intervalle d'environ 6,5 à environ 7,5, de préfé- rence d'environ 6,5 à environ 7,0. L'utilisation du film revêtu de milieu sec avec les solutions de support de la présente invention est une technique classique bien connue des microbiolo- gistes et bactériologistes. Son utilisation met essen- tiellement en jeu la technique suivante. Le film est placé sur une surface horizontale et le film transparent supérieur est soulevé afin qu'un échantillon de 1 ml du diluant portant le micro-organisme puisse être placé sur le film inférieur. Le film supérieur est ensuite ajusté soigneusement sur le film inférieur. Un étendeur d'échantillons en plastique est ensuite pressé légèrement sur le film supérieur pour faire pénétrer la solution de support à travers le film inférieur contenant le milieu. Après cela, le film est laissé au repos pendant environ une minute pour permettre la gélification. Le film est alors mis à incuber en position horizontale avec le côté transparent du film vers le haut, à 32 C pendant 48 heures. Les micro-organismes réduisent le colorant indicateur du type tétrazolium dans le film inférieur, faisant apparaître les colonies de micro- organismes sur le film sous forme de taches rouges, qui peuvent être dénombrées. Les exemples suivants sont proposés pour illustrer plus en détail et non pour limiter le procédé, la technique et la composition du produit de la présente invention. Exemples Dans chacun des exemples présentés ci-après, le fim de milieu de culture sec était la plaque de Petrifilm"' mise au point par 3M Company (Medical Products Division, St. Paul, Minnesota 55144). Ce Petrifilm"' était consti- tué par un milieu de culture bactérienne sec, autonome et prêt à l'emploi, revêtant un support de film et étant recouvert d'un film de polyéthylene. Le support portait des substances nutritives de référence et un agent géli- fiant hydrosoluble à froid. Le film de couverture, qui a été également revêtu d'un agent gélifiant, contenait également du chlorure de 2,3,5triphényltétrazolium comme colorant indicateur afin de faciliter le comptage du micro-organisme. Un quadrillage avec des carrés de 1 cm x 1 cm a été dessiné sur le film inférieur pour faciliter également le comptage. La surface globale de la plaque de Petrifilus" était de 20 cm2. Le procédé de base a consisté en la prépara- tion de solutions-mères du diluant, l'ensemencement des Petrifilms"', puis l'incubation à 32 C pendant 48 heures dans des conditions anaérobies, et ensuite le comptage des micro-organismes (ufc/ml). Un échantillon de sol provenant d'une serre a été utilisé comme culture d'essai et un autre échantillon, désigné S/80, connu pour être une culture de Lactobacillus a été utilisé comme témoin. L'échantillon de sol était connu pour contenir de nombreux micro-organismes autres que Lactobacillus. Les solutionsmères diluantes ont été préparées avec les teneurs suivantes en nitrite de sodium, en pourcentage en poids/volume: 1% en poids/ volume; 6 % en poids/volume, 12 % en poids/volume et 18 % en poids/volume. Le cycloheximide a été utilisé à des teneurs, exprimées en pourcentages en poids/volume, de: 0,1 %, 0,5 %, 1 % et 2,5 %. De la Polymyxine B, dans la première série d'exemples, puisqu'ils étaient destinés à l'étude des variations de concentration du nitrite de sodium et du cycloheximide, a été utilisée à la teneur constante de 0,03 % en poids/volume. Les solutions -mères ont été stérilisées par filtration et le diluant final a été préparé en utilisant 97 ml d'eau distillée stérile et en ajoutant 1 ml pour 100 ml d'eau de chacun des trois composants, à savoir le nitrite de sodium, le cycloheximide et la Polymyxine B, chacun dans les intervalles de concentra- tion mentionnés auparavant. Les mélanges stériles ont été ensuite placés de manière aseptique dans des tubes à essai à raison de 9 ml/tube. Les mélanges suivants ont été préparés: Concentration finale des ingré- dients Témoin Tampon de Butterfield* plus 0,1% de Tween 80 Variation 1 Variation 2 Variation 3 Variation 4 Variation 5 pg/ml ug/ml 24 unités/ ml 600 Pg/ml Pg/ml 24 unités/ ml 1200 pg/ml Pg/ml 24 unités/ ml 1800 Pg/ml mg/ml 24 unités/ ml 600 pg/ml pg/ml 24 unités/ ml nitrite cycloheximide Polymyxine B nitrite cycloheximide Polymyxine B nitrite cycloheximide Polymyxine B nitrite cycloheximide Polymyxine B nitrite cycloheximide Polymyxine B * Le tampon de Butterfield est une solution tampon au phosphate de po- tassium classique utilisée en microbiologie alimentaire. Variation 6 600 pg/ml nitrite pg/ml cycloheximide 24 unités/ ml Polymyxine B Variation 7 600 pg/ml nitrite 250 ug/ml cycloheximide 24 unités/ ml Polymyxine B Les procédés classiques de dilution du Pe- trifilm"' ont été suivis pour l'ens1renoent du témoin S/80, en particulier 1 ml d'une culture développée durant une nuit a été dilué en série au moyen de la solution d'essai et des volumes de 1 ml ont été placés sur la plaque. Un échantillon de 11 g de sol provenant d'une serre a été initialement dilué dans 100 ml de tampon de Butterfield. Cette préparation a ensuite été diluée en série au moyen de la solution d'essai. Des volumes de 1,0 ml de dilutions 106, 10 et 108 de S/80 ont été placés sur le milieud'ensrenomoent Petrifilm"'. Des volumes de 1,0 ml de dilutions 10- 4, -5 -6 et 106 de sol ont été placés sur le milieu d'étale- ment Petrifilm"'. Les écantillons sur plaques ont ét-m is A incuber dans des conditions anaérobies dans des réci- pients contenant des générateurs Gas Pack (BBL). Ils ont été mis A incuber à 32 C pendant 48 heures. Le tableau I ci-dessous donne les résultats du comptage des microorganismes, au moyen de la solution diluante mentionnée dans le présent mémoire. TABLEAU I Echantillon Unités formant des colonies (ufc/ml) Sol: Témoin 5 x 10 Variation 1 3,3 x 10 Variation 2 2,3 x 104 Variation 3 5 x 104 Variation 4 0 x 106 Variation 5 7,0 x 107 Variation 6 7,1 x 107 Variation 7 4,0 x 10 Echantillon Unités formant des colonies (ufc/ml) S/80 Témoin 2,4 x 108 Variation 1 7,5 x 109 Variation 2 1,3 x 109 Variation 3 1,3 x 10 Variation 4 -1,3 x 10 Variation 5 9,6 x 10 Variation 6 1,2 x 109 Variation 7 1,0 x 109 Comme on peut le constater, il y a une augmen- tation significative de l'effet inhibiteur du diluant sur les microorganismes du sol lorsque la concentration du nitrite est augmentée de 600 à 1200 gg/ml. Le témoin S/80 n'a pas été affecté par la variation de la concentration du nitrite ou du cycloheximide, respec- tivement, dans les intervalles de 100 pg/ml à 1800 pg/ml et 10 pg/ml à 250 pg/ml. On peut constater également que le diluant a permis au film de milieu de culture d'être spécifique pour les micro-organismes du genre Lactobacillus, et a inhibé la croissance des autres micro-organismes. Des expériences similaires à celles présentées dans les variations 1 à 7 ont été effectuées en faisant varier la concentration de Polymyxine B, ce qui s'est révélé sans aucun effet sur le micro- organisme S/80 dans un intervalle de 24 à 40 unités/ml. Pour les micro-organismes du sol, des teneurs inférieures à 24 unités/ml de Polymyxine B ont entraîné une diminu- tion de l'effet inhibiteur. Exemples montrant l'effet du remplacement du sulfate de Polymyxine B par le 2-phényléthanol Du 2-phényléthanol (PEA) provenant de Sigma Scientific, sous forme liquide (1 ml = 1,02 g) a été utilisé comme diluant. Le PEA est ajouté afin d'obtenir les concentrations mentionnées ci-dessous, pour un volume donné d'eau distillée, et est passé à l'autoclave. Des solutions stérilisées par filtration de nitrite de sodium à 6 % en poids/volume et de cycloheximide à 0,1 % en poid/volume ont été utilisées pour compléter les mélanges énumérés ci-dessous en ajoutant 1 ml pour 100 ml de diluant préparé. TABLEAU II Mélanges préparés % en poids/volume 8 600!Jg/ml nitrite ug/ml cycloheximide 0,05 % PEA 9 600 pg/ml nitrite pg/ml cycloheximide 0,10 % PEA 600 ug/ml nitrite ig/ml cycloheximide 0,20 % PEA 1i 600 9g/ml nitrite 10 gg/ml cycloheximide 0,4 % PEA L'inoculation et la technique ont été celles décrites dans les exemples précédents. Une solution de S/80 et de sol ont constitué les échantillons essayés. Le S/80 a été dilué en série en partant d'une culture développée pendant une nuit grâce aux mélanges de diluants, -7 et ensemaencé sur du Petrifilm"' à des dilutions de 10 et -8 10. Le sol a été initialement dilué dans le rapport 1:10 avec 99 ml de tampon de Butterfield modifié et ensuite dilué en série dans un diluant donné. Les dilu- - 4 -5- -6 tions 10, 10 et 106 de sol ont été placées sur du Petrifilm"'. Les films ont été mis à incuber dans des conditions anaérobies en utilisant des Gas Packs% BBL pendant 48 heures à 32 C. Les résultats sont présentés dans le tableau III. 2?584417 TABLEAU III Résultats Solutions d'ense- mencement, No. Variation 8 Variation 9 Variation 10 Variation l1 uf c/ml) 6,2 x 105 x 103 0x 103 0x 103 S/80: Variation 11 9,4 x 108 Comme on peut le constater, le remplacement de l'antibiotique du type Polymyxine B par l'alcool phényléthylique dans la formulation se révèle très effi- cace dans l'inhibition des micro-organismes du sol. Les exemples suivants montrent diverses modifications des formulations en utilisant de l'alcool phényléthylique (PEA) comme inhibiteur des micro- organismes Gram-négatifs. Mélanges préparés TABLEAU IV Formulations Concentration de Concentration Concentration nitrate de sodium de cyclohex- d'alcool imide phényléthyli- que Témoin 16* 17* (Tampon de But- terfield) 800 pg/ml 800 ug/ml 600 pg/ml 600 pg/ml 800 pg/ml 600 pg/ml Des échantillons de S/80 et de sol ont consti- tué les échantillons d'essai. Des dilutions à 10-7 et 10-8 de S/80 ont été ensemencées. Le sol a été dilué initialement dans 99 ml (1:10) de tampon de Butterfield modifiéetense- mencé à une dilution de 10 ou jusqu'à 10. Les Petri- * Contient de la Polynyxine B au taux de 24 unités/ml. Sol pg/ml pg/ml ug/ml pg/ml iug/ml ug/ml 0,1 % 0,2 % 0,1 % 0,2 % 0,1 % 0, 1 % films ont été mis à incuber dans des conditions anaéro- bies au moyen de Gas Packs"' BBL à 32 C pendant 48 heures, d'une manière similaire à celle décrite dans les exemples précédents. Les résultats sont indiqués ci-dessous. TABLEAU V Résultats Echantillon Mélange ufc/ml Témoin: Témoin 9,8 x o108 S/80: 12 8, 7 x 108 13 8,5 x 108 14 8,7 x 108 1,0 x 10 16 7,4 x 108 17 1,1 x 109 Témoin 2,7 x 107 Sol: 12 1,8 x 104 13 3,0 x 102 14 3,4 x 106 3,3 x 104 16 4,2 x 104 17 9,0 x 104 Comme on peut le constater, la solution N 13 a donné les meilleurs résultats d'inhibition avec le sol, sans affecter la croissance du S/80. On peut constater dans chacun des exemples ci-dessus, comme le montrent les différents tableaux, que des compositions efficaces de diluant peuvent rendre les films de milieux spécifiques pour les bactéries lactiques, et donc atteindre effectivement leur but envisagé. REVENDICATIONS 1. Solution aqueuse diluante pour la préparation de films de culture bactérienne, normalement secs, auto- nomes et prêts à l'emploi, spécifiques pour la crois- sance sélective des bactéries lactiques dans des condi- tions anaérobies, caractérisée en ce qu'elle possède: (a) un inhibiteur de microorganisme Gram-négatif qui peut être un antibiotique de type Polymyxine à une con- centration de 24 à 40 unités/ml de solution diluante ou du 2-phényléthanol à une concentration d'environ 1,0 mg/ml à environ 4,0 mg/ml de diluant; (b) environ 10 pg/ml à environ 250- pg/ml d'un agent antifongique hydrosoluble; et (c) environ 600 ig/ml à environ 1800 pg/ml d'un nitrite hydrosoluble; (d) un pH compris dans l'intervalle d'environ 6,5 à environ 7,5. 2. Solution diluante suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent antifongique est choisi entre le cycloheximide, le sorbate de potassium, le butylhydroxytoluène (BHT) et le butylhydroxyanisole (BHA). 3. Solution diluante suivant la revendication 2, caractérisée en ce que l'agent antifongique est le cycloheximide. 4. Solution diluante suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le pH est compris entre environ 6,5 et environ 7,0. 5. Solution diluante suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le nitrite est le nitrite d'un métal du groupe I. 6. Solution diluante suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le nitrite est le nitrite de sodium. 7. Association d'un film de milieu de culture bactérienne, normalement sec, autonome et prêt à l'emploi, avec une solution aqueuse diluante selon la revendication 1 pour rendre ledit film de milieu de culture prêt à l'emploi spécifique pour la croissance sélective des bactéries lactiques dans des conditions anaérobies. 8. Association suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le film de culture bactérienne, normalement sec, autonome et prêt à l'emploi, est carac- térisé en ce que: (a) un milieu de culture bactérienne revêt un support de film et est recouvert d'un film transpa- rent; (b) ledit support de film porte des substances nutritives pour méthodes classiques, et un agent gélifiant hydrosoluble à froid; (c) ladite couverture est revêtue d'un agent gélifiant et d'un colorant indicateur constitué par le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium afin de faci- liter le comptage du micro-organisme. 9. Association suivant la revendication 7, caractérisée en ce que ladite solution diluante est une solution aqueuse contenant environ 24 unités/ml de diluant à environ 40 unités/ml de diluant d'un antibio- tique du type Polymyxine, environ 10 pg/ml de diluant à environ 250 Ig/ml de diluant d'un agent antifongique hydrosoluble, et environ 600 ug/ml à environ 1800 pg/ml de diluant d'un nitrite, ladite solution ayant un pH d'environ 6,5 à environ 7,0. 10. Association suivant la revendication 7, caractérisée en ce que la solution de milieu de cul- ture est une solution comprenant environ 1.0 mg/ml à environ 4,0 mg/ml de 2-phényléthanol, environ 10 pg/ml à environ 250 pg/ml de cycloheximide et environ 600 pg/ml à environ 800 pg/ml de nitrite de sodium. 11. Procédé de culture anaérobie de bactéries lactiques, qui possèdent une durée de conservation allant jusqu'à un an, caractérisé par: l'obtention d'une plaque de film biologique contenant un milieu de culture pour méthodes classiques; la préparation d'une solution diluante aqueuse contenant en association 24 unités/ml de solution diluante à environ 40 unités/ml de solution diluante d'un inhi- biteur de micro- organismes Gram-négatifs, environ pg/ml à environ 250 ig/ml de solution d'un agent antifongique hydrosoluble, environ 600 ig/ml à environ 1800 pg/ml d'un nitrite hydrosoluble, ladite solution ayant un pH compris entre environ 6,5 et environ 7,5; et l'application d'une quantité faible mais efficace de ladite solution à ladite plaque de film conjointement avec un échantillon contenant des micro- organismes lactiques; et la mise en incubation dudit film dans des conditions anaérobies afin d'obtenir une culture de conservation stable.