Brevet FR2575834A1 — publié le 19860711

La présente invention est relative à une nouvelle composition antigénique leptospirosique propre à être utilisée dans les tests de diagnostic de leptospirose par des méthodes immunoenzymatiques telles, notamment, que la méthode ELISA et au procédé de préparation d'une telle composition antigénique. Comme on le sait, les infections par leptospires chez l'homme peuvent être diagnostiquées au laboratoire soit par isolement du germe responsable à partir du sang, de l'urine ou du liquide céphalorachidien, soit par la détection d'une augmentation des anticorps spécifiques dans le sérum. Toutefois, bien que les cultures qu'il est nécessaire de réaliser pour isoler le germe responsable, présentent une importance épidémiologique certaine, néanmoins le temps que re quièrent de telles cultures et l'identification de l'organisme infectant, ne permettent de réaliser que des tests dont la réponse est trop tardive pour être utilisée efficacement. Au contraire, les tests de diagnostic immunologique qui détectent les anticorps spécifiques constituent des réactions de dépistage ou de référence propres à affirmer ou confirmer de façon suffisamment précoce le diagnostic d'une infection leptospirosique. Le premier test de détection des anticorps proposé dans l'Art antérieur est la réaction d'agglutination lyse de MARTIN et PETTIT mise au point en 1918, qui utilise les propriétés agglutinantes et lytiques du sérum de malade pour le sérotype spécifique utilisé, ou sa variante plus récente mise au point par KOLOCHINE-ERBER, plus connue sous le nom de "RAL" (réaction d'agglutination et de lyse) ou de "NAT" (microscopic agglutination test), dans laquelle les anticorps apparaissent au 1Oè-12è jour Jf. B. KOLOCHINE-ERBER et M. MAILLOUX : "Physiologie et Métabolisme des leptospires11, Masson Ed., Septembre 1962 ; TURNER "LEPTOSPIROSIS II". Trans Royal Soc. Trop. Med. Hyg., 1968, 62, pages 880-899ç Cependant ce test, qui constitue actuellement le test de ré férence standard pour le diagnostic de la leptospirose, présente un certain nombre d'inconvénients techniques qui en font un test spécialisé, qui n'est pas réalisé dans les laboratoires de diagnostic de routine ; en effet ce test RAL requiert l'utilisation de cultures vivantes de leptospires virulentes et réalise la détermination à l'aide d'un microscope à fond noir que ne possèdent pas tous les laboratoires ; de plus, le test RAL n'est pas capable de distinguer l'une de l'autre les deux classes d'anticorps IgM et IgG et n'est donc pas en mesure de donner, par une seule réaction, des renseignements sur lefait de savoir, dans un cas donné, s'il s'agit d'une infection aigüe ou ancienne. Il est en outre connu d'utiliser l'antigène Leptospira biflexa Patoc, qui est un leptospire aquicole, non pathogène, pour réaliser le sérodiagnostic de leptospirose par la méthode d'agglutination-lyse Ccf. M. MAILLOUX, Annales de l'institut Pasteur, Janvier 1967, Tome 112, pages 121-1257 sans requérir la mise en jeu d'un grand nombre de sérotypes ou antigènes, attendu que Leptospira biflexa Patoc est un "antigène de groupe" qui détecte la présence de leptospires dans des sérums de malades, quel que soit le sérotype auquel appartiennent ces sérums. TERPSTRA et Al. ÈZbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 247, 400-405 (1980L7 ont proposé de remplacer le test RAL compliqué et qui implique l'utilisation d'une batterie de leptospires de structures antigéniques très différentes et, par voie de conséquence, l'entretien de cultures-mères, par un test ELISA (enzyme-linked-immunosorbent assay) utilisant un antigène préparé à partir d'une souche de leptospire, la souche WIJNBERG sérotype ictérohaemorrhagiae, qui, selon ses Auteurs, a permis de mettre en évidence la présence d'anticorps dans le sérum de patients atteints de leptospirose provoquée par des leptospires de 11 sérogroupes différents. Bien que la mise en oeuvre du test ELISA constitue un progrès important par rapport aux méthodes précédemment préconisées, en raison de sa sensibilité et de sa précocité sensiblement plus grandes, néanmoins TERPSTRA et Al. font appel à une souche pathogène, la souche de L. icterohaemorrhagiae Wijnberg, (la souche de L. interrogans Wijnberg, pathogène elle aussi, étant également citée dans cet Article, sans toutefois le support d'une expérimentatLon) et si la souche de L. biflexa Patoc I, qui n'est pas pathogène, est également citée, cette citation n'est pas supportée par une expérimentation, de sorte que l'on n'a aucune indication au sujet.de sa sensibilité. De plus TERPSTRA et Al. n'ont pas établi de distinction entre les anticorps IgM et IgG, distinction qui a été faite par ADLER et Al. /cf.Journal of Clinical Microbiology, Mai 1980, Vol. 11, N" 5, pages 452-457/ qui ont détecté dans les sérums de patients infectés par les sérovars de leptospires hardjo, pomona ou copenhageni, des IgM et des IgG antileptospires spécifiques, par le test ELISA en phase solide, en présence de conjugués d'immunoglobulines M et d'immunoglobulines G, respectivement, et de peroxydase de raifort. Toutefois, les tests ELISA de sérodiagnostic de la leptospirose décrits dans l'Art antérieur, font appel à des souches de leptospires pathogènes dangereuses à manipuler par les personnels chargés des analyses et, d'autre part, ils ne procurent pas une sûreté de diagnostic de 100 %, ce qui constitue un handicap sérieux, s'agissant d'une affection aussi grave que la leptospirose, propre à empecher dans certains cas, la mise en place précoce d'une thérapie efficace. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition antigénique leptospirosique, qui part de souches de leptospires aquicoles, non pathogènes, qui est, par conséquent sans danger pour les manipulateurs, et qui procure une sûreté de diagnostic de l'ordre de 100 8 avec le test ELISA, tout en étant apte à détecter chez l'homme ou l'animal, des anticorps de leptospiroses provoquées par tous les sérotypes de leptospires, quels qu'ils soient. La présente invention a pour objet une composition antigénique obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d1au moins une souche de L. andamana. Selon un mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, la souche de L. biflexa est une souche de L. biflexa Patoc et/ou une souche de L. biflexa Sao Paulo et/ou une souche de L. biflexa C-41. Comme on le sait, la souche C-41 est une nouvelle souche appartenant à l'espèce L. biflexa, qui a été déposée le 29 Mai 1984 sous le n" I-309 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, la souche de L. andamana est une souche de L. andamana CH 11 et/ou une souche de L. andamana Bovedo. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, celle-ci est une composition antigénique thermorésistante (TR) obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d'au moins une souche de L. andamana, dans laquelle la souche de L. bîflexa a été traitée en mettant en oeuvre le procédé décrit dans la Demande de Brevet français déposée au nom de la Demanderesse sous le numéro d'enregistrement 84 09324 en date du 14 Juin 1984, pour obtenir un antigène TR. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la ou les souche(s) de L. biflexa mise(s) en oeuvre pour la préparation de la composition antigénique thermorésistante (TR) est ou sont prise(s) dans le groupe qui comprend non seulement la souche de L. biflexa C 41, comme dans la Demande de Brevet précitée, mais également la souche de L. biflexa Patoc et la souche de L. biflexa Sao Paulo. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, celle-ci est constituée par le mélange des surnageants de culture des quatre souches de leptospires suivantes : L. biflexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L. andamana CH 11, L. andamana Bovedo. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de la composition antigénique conforme à la présente invention qui consiste - à cultiver chacune des souches de L. biflexa et de L. anda mana mises en oeuvre, à une température et pendant une du rée appropriée, dans un milieu approprié, qui peut être le même pour chacune des souches cultivées - à tuer les leptospires des cultures obtenues et - à récupérer les surnageants de ces cultures tuées, résul tant de la centrifugation desdites cultures préalablement chauffées et dont le pH a été ajusté avant de les centrifu ger, pour obtenir un mélange de surnageants qui constitue la composition antigénique conforme à la présente inven tion. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de ladite composition antigénique conforme à l'invention, - chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10 jours, à une température de l'ordre de 28"C, à l'étuve, jusqu'à obtention d'une concentration moyenne de l'ordre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture - après vérification de la non-contamination de chacune des cultures obtenues, les cultures obtenues sont réunies - le mélange desdites cultures est soumis à l'action de for maldéhyde pur, introduit de préférence à raison d'environ 1,5 ml/100 ml de mélange de cultures, et maintenu en con tact avec ledit mélange pendant environ 20 à 40 minutes - le mélange de cultures tuées est ensuite chauffé au bain marie bouillant pendant environ 30 minutes, puis complète ment refroidi jusqu'à la température ambiante - le pH du mélange de cultures tuées refroidi est alors ajus té à pH compris entre 9 et 10 et de préférence à pH 9,6 - le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g pen dant 45 minutes à 1h15 ; puis, - après décantation, le surnageant est recueilli, pour être utilisé en tant que composition antigénique conforme à l'invention. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de ladite composition antigénique conforme à l'invention - chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10 jours à une température de l'ordre de 28"C, à l'étuve, jus qu'à obtention d'une concentration en leptospires de l'or dre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; - chacune des cultures obtenue est traitée, après vérifica tion de sa non-contamination, par du formaldéhyde pur, in troduit dans ladite culture de préférence à raison de 1,5 ml/100 ml de culture et maintenu en contact avec ladite culture pendant environ 20 à 40 minutes, pour tuer les leptospires de ladite culture ;; - chacune des cultures est ensuite chauffée au bain-marie bouillant pendant environ 30 minutes - puis, après complet refroidissement, le pH de chacune des cultures est ajusté à 9-10 et de préférence à 9,6 ; - chacune des cultures est centrifugée séparément à 10000 g pendant environ 45 minutes à lh15, - les surnageants de chacune des cultures, sont mélangés pour former la composition antigénique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, le milieu de culture des leptospires est un milieu 55955 à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamines, Tween, BSA. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, le milieu de culture des leptospires est un milieu sans protéines, à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamine B1, vitamine B121 "Tween" 60 détoxifié, tampon TES (acide tris-méthyl-2-amino-éthane sulfonique), actuellement également désigné sous le n" 55955, tel que décrit et revendiqué dans la Demande de Brevet français n" 84 09324 citée plus haut, de la Demanderesse. Il s'est avéré que la composition antigénique conforme à la présente invention présente une très grande sensibilité et que son application dans un test ELISA permet d'obtenir une sûreté de diagnostic de 100 %, à un stade particulièrement précoce, puisqu'on est en mesure d'obtenir un diagnostic à partir du 4è jour de la maladie, ctest à-dire imme- diatement dès l'apparition des anticorps ; une telle précoce té du test présente une importance considérable pour le diagnostic et l'instauration du traitement thérapeutique appro- prie. En outre la sensibilité du test permet de réaliser un diagnostic rétrospectif d'infections anciennes, susceptible d'orienter le traitement thérapeutique en cas d'atteinte infectieuse nouvelle. De plus, cette grande sensibilité permet de réaliser le contrôle immunologique des sérums utilisés pour la préparation des vaccins antileptospirosiques à l'aide du conjugué d'Ig et de peroxydase de raifort dont il a été question dans le préambule. Enfin, la nouvelle composition antigénique conforme à la présente invention permet de détecter dans les serums de patients, quel que soit le sérovar de leptospire dont ils sont infectés, la présence d'IgM antileptospires spécifiques, en présence du conjugué d'Ig et de peroxydase mentionné plus haut. La présente invention a en conséquence également pour objet un procédé de diagnostic de leptospiroses qui consilt a détecter les anticorps antileptospirosiques présents dans un sérum à contrôler, à l'aide de la composition antigénique conforme à l'invention, qui est telle qu'elle est apte à réagir avec le sérum à contrôler, prélevé chez un malade, quel que soit le sérotype infectant, en mettant en incubation ledit sérum avec ladite composition antigénique, à laquelle se lient les anticorps du groupe Leptospirosa, quels qu'ils soient, si de tels anticorps sont présents dans i 'é- chantillon de sérum à contrôler. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de diagnostic de leptospiroses conforme à la présente invention, les anticorps liés obtenus au cours du mode de mise en oeuvre précédent, qui est alors à considérer comme une première étape du procédé de diagnostic conforme à l'invention, sont additionnés d'une quantité appropriée d'un conjugué (anticorps anti-IgM Chaîne p humains marqués à la peroxydase), provoquant ainsi la fixation des IgM sur lesdits anticorps liés, cette seconde étape du procédé de diagnostic étant suivie d'une troisième étape qui consiste à introduire un substrat constitué par de l'acide 5-aminosalicylique avantageusement additionné, juste avant son introduction dans le milieu réactionnel, d'eau oxygénée, pour provoquer, en présence d'anticorps antileptospirosiques, l'apparition d'une couleur marron/bordeaux plus ou moins intense résultant de la réaction de l'enzyme du conjugué avec le substrat susdit. Selon une modalité avantageuse de mise en oeuvre du procédé de diagnostic conforme à la présente invention, la composition antigénique conforme à l'invention est fixée aux parois des cupules, ou puits, de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA. La présente invention a en outre pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de leptospiroses conforme à la présente invention, qui est caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de la composition antigénique- con forme à l'invention, contenue dans un récipient convenable; - une quantité appropriée de sérum humain positif de contrô le, contenu dans un récipient convenable - une quantité appropriée de conjugué d'anticorps anti-IgM (chaîne p) humains marqués à la peroxydase, dans un réci pient convenable - une quantité appropriée de substrat tel que l'acide amino 5-hydroxy-2-benzoïque dans un récipient convenable - une quantité appropriée d'H202 dans un récipient convena ble ;; - une solution concentrée de tampon phosphate-PBS, dans un récipient convenable, destinée à être diluée au 1/10è lors de son utilisation - une solution de tampon PBS-"TWEEN" à pH 7,2 8 0,1 - une solution de tampon PBS-Tween-Albumine à pH 7,2 i 0,1 - une pluralité de plaques de microtitration utiles dans le test ELISA - éventuellement une pluralité de pipettes automatiques de 50 pl, de 100 pl, de 200 pl, de 1000 pi, etc... à un seul canal ou à canaux multiples. Selon un mode de réalisation simplifié du kit de diagnostic prêt à l'emploi conforme à la présente invention, ledit kit est caractérisé en ce qu'il contient - une pluralité de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA - éventuellement des pipettes automatiques de 50 pl, 100 pl, 200 pl et 1000 pl à un ou plusieurs canaux - les réactifs aptes à se conserver dans des conditions de température ne dépassant pas + 8"C, à savoir une quantité appropriée de la composition antigéni que conforme à l'invention contenue dans un réci pient convenable une quantité appropriée de sérum humain positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable une quantité appropriée de solution concentrée de tampon phosphate-PBS stérilisée. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du kit de diagnostic prêt à l'emploi conforme à la présente invention, les plaques de microtitration sont constituées par des microplaques à fond plat comprenant chacune 12 rangées de chacune 8 cupules, ou puits, de 300 pl de contenance ou par des microplaques à fond plat constituées chacune par une seule rangée de 8 cupules ou puits qui sont caractérisées en ce qu'elles sont revêtues de la composition antigénique conforme à l'invention par adsorption de cette dernière sur la surface intérieure des cupules de chaque microplaque. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, un exemple de mise en oeuvre du test de détection immunoenzymatique des anticorps antileptospirosiques dans un échantillon de sérum à contrôler, et un compte-rendu d'une série de sérodiagnostics de leptospirose humaine effectués à l'aide de la technique ELISA et, à titre comparatif à l'aide des tests RAL, à l'aide d'antigène thermorésistant préparé conformément à la Demande de Brevet mentionnée plus haut et par hémagglutination. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I - Exemples de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention. EXEMPLE 1 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de Leptospira bi flexa Patoc, de L. biflexa Sao Paulo, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 1.a) On cultive une souche de L. biflexa Patoc à l'étuve à 28 C dans un milieu sans protéines, actuellement désigné sous le n 55955 et dont la composition est la suivan te Constituants Quantités par litre de milieu TES 1,2 g NaCl 0,9g Pyruvate de sodium 0,2 g Glycérol à 1.0 g % 1,0 mi CaCl2, 2H20 à 1,5 g % 1,0 ml MgCl2, 6H20 à 1,5 g % 1,0 ml ZnSO4, 7H20 à 0,1 g % 0,5 ml *FeSO4, 7H20 à 0,1 g % 0,5 ml Thiamine HCl (B1) à 0,5 g % 1,0 ml NH4Cl à 25 g % 0,9 ml Vitamine B12 à 0,02 g % 1,0 ml MnSO4, H20 à 0,1 g % 1,0 ml KH2PO4 1,0 g 8 1,0 mi "Tween" 60 1110 g % 13 ml pH 7,2 * à préparer extemporanément. La culture est stoppée, à l'aide de formol par exemple, lorsque sa concentration en leptospires est au moins égale à 1.108 leptospires/ml de culture et est de préférence supérieure à ce nombre et avantageusement de l'ordre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; une telle concentration est atteinte au bout de 8 à 10 jours de culture dans le milieu précité. Avant de stopper la culture on vérifie qu'elle n'est pas contaminée. b) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. biflexa Sao Paulo. c) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. andamana CH 11. d) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. andamana Bovedo. 2. On mélange alors en proportions égales les quatre cultu res obtenues en 1. ci-dessus et on tue le mélange de cultures par adjonction de formaldéhyde pur, à raison de 1,5 ml pour 100 ml du mélange de cultures, et l'on main tient en contact pendant environ 30 minutes. 3. Le mélange de cultures est alors immergé dans un bain marie bouillant, pendant 30 minutes au bout desquelles le mélange est sorti du-bain-marie et est abandonné jus qu'à refroidissement complet à la température ambiante. 4. On ajuste alors le pH du mélange de cultures tuées, dû ment refroidi, à pH 9,6 t 0,1. 5. Le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g pendant une heure, après quoi l'on recueille, après dé cantation, le surnageant qui est la composition anti génique conforme à l'invention. A noter que pour 100 ml de culture en flacons, on obtient un volume d'antigène égal au volume de la culture, soit 100 ml. EXEMPLE 2 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de Leptospira bi flexa Patoc,-de L. biflexa Sao Paulo, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 1.a) On cultive une souche de L. biflexa Patoc à ltétuve à 28 C, dans un milieu de 55955 dont la composition est la suivante : Phosphate disodique Na2 H PO4, 12H20 ....... 1 g Phosphate monopotassique K H2 PO4 .......... 0,3 g Chlorure de sodium NaCl .................... 1 g Chlorure d'ammonium à 25 8 ............... 1 ml Chlorure de calcium à 1 % ................ 1 ml Chlorure de magnésium à 1 % .................. 1 ml Sulfate de fer à 0,5 % ................... 10 ml Sulfate de zinc à 0,4 % ....................... 1 ml Sulfate de cuivre à 0,3 % ................... 0,1 ml Thiamine à 0,5 % ............................. 1 ml Vitamine B12 à 0,02 % .................. 1 ml Tween 80 solution à 10 % ! 12,5 ml Bovine Serum Albumine (Fraction V) ........... 10 g Eau distillée q.s.p. 1.000 ml pour 1 litre de milieu. La culture est stoppée, à l'aide de formol par exemple, lorsque sa concentration en leptospires est au moins égale à 1.108 leptospires/ml de culture et est de préférence supérieure à ce nombre et avantageusement de l'ordre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; une telle concentration est atteinte au bout de 8 à 10 jours de culture dans le milieu précité. Avant de stopper la culture on vérifie qu'elle n'est pas contaminée. b) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. biflexa Sao Paulo. c) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. andamana CH 11. d) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant une culture de L. andamana Bovedo. 2. On mélange alors en proportions égales les quatre cultu res obtenues en 1. ci-dessus et on tue le mélange de cultures par adjonction de formaldéhyde pur, à raison de 1,5 ml pour 100 ml du mélange de cultures, et l'on main tient en contact pendant environ 30 minutes. 3. Le mélange de cultures est alors immergé dans un bain marie bouillant, pendant 30 minutes au bout desquelles le mélange est sorti du bain-marie et est abandonné jus qu'à refroidissement complet à la température ambiante. 4. On ajuste alors le pH du mélange de cultures tuées, dû ment refroidi, à pH 9,6 1 0,1. 5. Le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g pendant une heure, après quoi l'on recueille, après dé cantation, le surnageant qui est la composition anti génique conforme à l'invehtion. A noter que pour 100 ml de culture en flacons, on obtient un volume d'antigène égal au volume de la culture, soit 100 ml. EXEMPLE 3 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de Leptospira bi flexa Patoc, de L. biflexa Sao Paulo, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 1. Les quatre souches de Leptospira sont cultivées séparé ment comme décrit à l'Exemple 1.1 ci-dessus. 2. Toutefois, au lieu de les mélanger une fois la concen tration en leptospires voulue atteinte, on poursuit leur traitement séparément, ce qui signifie que a) chacune des cultures est tuée par adjonction de for maldéhyde pur à raison de 1,5 ml/100 ml de culture et maintien en contact pendant 30 minutes ; b) chacune des cultures tuées est chauffée au bain-marie bouillant pendant 30 minutes, au bout desquelles elle est refroidie et son pH est ajusté à pH 9,6 ss 0,1 c) chacune des cultures est alors centrifugée pendant une heure à 10000 g. d) On recueille, après décantation, le surnageant des quatre cultures et on mélange les quatre surnageants obtenus : le mélange forme la composition antigénique conforme à l'invention. EXEMPLE 4 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de Leptospira bi flexa Patoc, de L. biflexa C 41 TR, de L. an damana CH 11 et de L. andamana Bovedo. On procède comme décrit à l'Exemple 1 ou à l'Exemple 2, en remplaçant toutefois la culture de L. biflexa Sao Paulo par une culture de L. biflexa C 41. EXEMPLE 5 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de L. biflexa Patoc, de L. biflexa C 41, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 1. On cultive séparément comme décrit en 1.a), 1.c) et 1.d) de l'Exemple 1 des souches de L. biflexa Patoc, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 2. D'autre part on cultive une souche de L. biflexa C 41 comme décrit dans la Demande de Brevet français numéro 84 09324 du 14 Juin 1984, déjà mentionnée plus haut et l'on centrifuge la culture decL. biflexa C 41 ainsi ob tenue, à 10000 g pendant une heure, pour recueillir un surnageant de culture. 3. Ce surnageant de culture thermorésistant (TR) est mélan gé aux surnageants des trois autres cultures, obtenus en mettant en oeuvre l'Exemple 1 ou l'Exemple 2 ci-dessus EXEMPLE 6 - Préparation d'une composition antigénique contenant des leptospires de L. biflexa Patoc I TR, de L. biflexa Sao Paulo, de L andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. 1. On cultive des souches de L. biflexa Sao Paulo, de L. andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo en procédant comme décrit à l'Exemple 1.1. ci-dessus. 2. On cultive une souche de L. biflexa Patoc I, serogroupe semaranga pendant 10 jours en milieu de Reiter-Ramme tamponné et additionné de peptone puis traité corme dé crit dans "TROPENMEDIZIN UND PARASITOLOGIE" (Band 26, Heft 1, 1975, pages 35-42, "Recherches sur les antigènes des leptospires", J. MAZZONELLI, G. DORTA de MAZZONELLI et M. MAILLOUX). 3. Le surnageant recueilli, contenant un antigène thermo résistant pour L. biflexa Patoc I, est mélange aux sur- nageants des trois autres cultures que ceux-ci aient été obtenus, comme décrit aux Exemples 1 et 2, ou comme dé crit à l'Exemple 3, la composition antigénique conforme à l'invention résultante étant thermorésistante. II - DETECTION IMMUNOENZYMATIQUE D'ANTICORPS ANTI-LEPTO SPIROSIQUES PAR LA TECHNIQUE ELISA. Le test de diagnostic de leptospirose qui fait l'objet de la présente invention est un test simple et sensible qui permet de détecter les anticorps anti-leptospirosiques à l'aide d'une composition antigénique leptospirosique nouvelle, qui fait éga lement l'objet de la présente invention, qui réagit avec le sérum de malade quel que soit le sérotype infectant. A. Ce test de diagnostic repose sur les principes suivants Le sérum à contrôler est mis en incubation dans les cupules d'une plaque de microtitration en matière plastique (PVC ou polystyrène notamment) prévue pour la technique ELISA, qu'il s'agisse d'une plaque de microtitration à 96 cupules à fond plat ou d'une plaque comprenant une seule rangée de 8 cupules à fond plat, lesquelles cupules sont sensibilisées par adsorption sur leur paroi de la composition antigénique conforme à l'invention. Si des anticorps de groupe sont présents dans i 'é- chantillon, ils se lient aux antigènes reliés à la phase solide. Ce qui n'est pas fixé est éliminé par lavages. Le conjugué (anticorps anti-IgM - chaîne p - humaines marqués à la peroxydase) est ajouté dans un deuxième temps. Les IgM se fixent sur les fragments des anticorps retenus sur les cupules. Ceux qui ne sont pas fixés sont à nouveau éliminés par lavages. L'addition du substrat de l'enzyme peroxydase dans un dernier stade est suivie de l'apparition d'une couleur marron/bordeaux plus ou moins intense, résultant de la réaction enzymatique si l'échantillon contient des anticorps anti-leptospirosiques. Au contraire, si l'échantillon testé ne contient pas d'anticorps anti-leptospirosiques, le conjugué n est pas retenu et aucune coloration ne se développe. En cas de réaction positive, voire douteuse, il est absolument nécessaire d'adresser le sérum examiné au Centre National des Leptospires pour confirmation et détermination du sérotype en cause. REACTIFS 1. Composition antigénique conforme à l'invention prête à l'emploi. 2. Sérum humain de contrôle, positif. Conservation : + 2 C à + 8 C jusqu'à la date indiquée sur le conditionnement. 3. Conjugué IgM - Anticorps ANTI-IgM (chaîne p) HUMAINES mar qués à la peroxydase (chèvre ou mouton). 4. Substrat - Acide amino 5 - hydroxy 2 -benzoïque. 5. Peroxyde d'hydrogène H202 PM 34,01 (solution aqueuse). 6. Tampons 6.1. Tampon phosphate - PBS (solution mère 10 fois concen trée) NaCl ....................................... 80 g KCl ..................................... 2 g Na2HPO412H2O ............................ 11,33 g KH2PO4 .................................. 2 g H20 distillée q.s.p. .................... 1000 ml Conservation : peut être stérilisé par autoclavage - stable à + 4 C sous forme concentrée. 6.2. Tampon PBS - TWEEN pH 7,2 * 0,1 PBS (10 fois concentré) .............. 100 ml Tween 20 ............................... 0,5 ml H20 distillée q.s.p. ...................... 1000 ml Conservation : 24 heures à + 4 C. Utilisation : Lavages. 6.3. Tampon PBS - TWEEN - ALBUMINE à pH 7,2 i 0,1 PBS (10 fois concentré) .............. 10 ml Tween 20 ................................ 0,05 ml Albumine bovine (fraction V) v ou 0,5 g H20 distillée q.s.p. O eoo 100 ml Conservation : 24 heures à + 4C. Utilisation : Dilution des sérums et dilution du conjugué IgM peroxydase. REMARQUES concernant 6. ci-dessus Seul le tampon phosphate-PBS (6.1. ci-dessus) peut être préparé à l'avance et est donc susceptible d'être inclus dans un kit de diagnostic de leptospirose prêt à l'emploi. Les tampons PBS-Tween pH 7,2 1 0,1 (6.2... ci-dessus) et PBS Tween-Albumine pH 7,2 + 0,1 (6.3.-ci-dessus) doivent être des tampons frais. concernant 3. ci-dessus Quant au conjugué IgM, il est mis en solution dans le tampon PBS-Tween-albumine extemporanément, juste avant le test ; toutefois, il peut être-conservé quelques heures à l'abri de la lumière et à + 4 C. Les propositions pour une microplaque de 96 cupules sont les suivantes Tampon PBS-Tween-albumine ................ 15 ml Conjugué IgM ............................. 0,03 ml concernant 4. ci-dessus La solution de substrat se prépare extemporanément, juste avant de procéder au test. Il est en outre recommandé de protéger la solution de la lumière en entourant le bécher qui la contient de papier d'aluminium. Les proportions pour une microplaque de 96 cupules sont les suivantes acide amino-5-hydroxy-2-benzoïque ..... 12 mg H2O bidistillée ...................... 15 ml le pH étant ajusté à 6 par addition de NaOH N et N/10 puis au moment de la répartition dans les cupules, on ajoute H2O2 à 10 volumes ........................ 0,150 ml (on dilue 11 fois i'H2O2 à 110 volumes dans de l'eau distillée pour obtenir de l'H2O2 à 10 volumes). B. La technique mise en oeuvre est décrite ci-après a) L'adsorption de l'antigène sur les microplaques (ou ran gées de 8 cupules) se fait - soit par évaporation à 37"C environ, - soit à la température ambiante (par évaporation égale- ment), - soit à 37"C pendant 16 à 18 heures, la plaque étant re couverte d'un papier aluminium pour éviter l'évapora- tion. Il est préférable de scotcher les cupules destinées à recevoir la dilution témoin des sérums à tester, pour éviter qu'elles reçoivent des projections d'antigène lors de sa répartition dans les puits. b) Dilution des échantillons dans le tampon PBS-Tween-Albumine 1/50 1/100 1/200 etc PBS-Tween-Albumine 980 pl 350 pl 350 p (préparé comme décrit en A.6.3. ci-dessus) Sérum à tester 20 pl O 0 de la- dilution au 1/50 0 350 pl 0 de la dilution au 1/100 0 O 350 pi (N.B. On peut pousser les dilutions aussi loin qu'on le désire). c. Réalisation du titrage. c. 1. Après avoir retiré le scotch obturant les cupules des tinées à recevoir les dilutions des témoins sérums, on effectue le lavage de la microplaque. A l'aide d'une pissette contenant du tampon PBS-TWEEN, on remplit cha que cupule ; on laisse en contact 1 à 2 minutes et on vidange par retournement de la microplaque (ou aspira tion, si on dispose d'un dispositif de vidange des mi crocuves pas aspiration). On répète 4 ou 5 fois cette opération. c. 2. Après le dernier lavage, on secoue bien la plaque pour éliminer le tampon de lavage et on la pose retournée sur du papier absorbant pour qu'elle finisse de s'é- goutter. c. 3. On distribue 150 pl de la dilution du sérum à tester Témoin sérum Dilutions au 1 1 1 au 1 50 100 200 50 Sérum à tester 150 pl 150 pl 150 pl 150 pi Sérum témoin + 150 pl 150 pl 150 pl 150 pi c. 4. On incube une heure à 37-C. c. 5. On vide les cupules par retournement ou aspiration et on lave 4 fois comme décrit en c.1. ; c. 6. On distribue 150 pl de la solution du conjugué anti-IgM préparée comme décrit sous A "REMARQUES", "concernant 3. ci-dessus" ; c. 7. On incube une heure à 37-C. c. 8. On vide les cupules par retournement ou aspiration et on lave 4 fois comme décrit en c.1. c. 9. On distribue 150 pl de la solution de substrat préparée comme décrit sous A "REMARQUES" "concernant 4. ci dessus" et on laisse la coloration se développer à la température ambiante, à l'abri de la lumière. c.10. On effectue la lecture par appréciation visuelle, après 30 minutes à une heure. La lecture par appréciation visuelle est rapide et souvent suffisante. On considère comme positif, c'est-à-dire contenant des anticorps anti-leptospirosiques, tout sérum ayant conduit à l'observation d'une couleur marron - bordeaux plus intense que celle du témoin sérum à tester (cupule n'ayant pas reçu d'antigène). III - COMPTE-RENDU DE SERODIAGNOSTICS DE LEPTOSPIROSE REALI SES A L'AIDE DES TESTS ELISA, RAL ET A L'AIDE D'ANTI GENE TR , AINSI QUE PAR HEMAGGLUTINATION. Les sérodiagnostics dont il est rendu compte ciaprès ont été réalisés au cours de la période comprise entre fin Août 1983 et fin Août 1984. Ils concernent 400 patients. Le sérum prélevé chez les patients examinés, a été fractionné pour être soumis aux techniques de sérodiagnostic suivantes 1. Test ELISA avec la composition antigénique conforme à l'Exemple 1. 2. Test RAL. 3. Test avec l'antigène thermorésistant TR selon la Demande de Brevet français précitée, avec examen macroscopique sur lame (TR). 4. Test par hémagglutination(HA). TABLEAU I Etude comparative des résultats des sérodiagnostics de leptospiroses, effectués par 4 techniques différentes sur des sérums de malades suspectés cliniquement de cette affection et prélevés entre le jour J 1 et le jour J 60. Nombre de P O S I T I F S Par rapport au nombre de sérums TEST sérums Nombre de Dilutions DOUTEUX NEGATIFS traités traités sérums POSITIFS DOUTEUX NEGATIFS % % % 1. E 400 374 1/50 32 12 14 93,50 % 3,00 % 3,50 % L 1/100 65 I 1/200 80 S 1/400 68 A 1/800 57 1/1600 31 1/3200 et > 41 2. R 400 181 1/10 et 20 39 2 217 45,25 % 0,50 % 54,25 % A 1/50 et 80 32 L 1/100 et 200 33 1/500 et 800 22 1/1000 à 8000 37 1/10000 à 20000 18 3. TR 350 63 3 284 18,00 % 0,86 % 81,14 % 4. H 216 38 1/10 7 4 174 17,59 % 1,85 % 80,56 % A 1/20 7 1/40 6 1/80 9 1/160 8 1/320 1 N.B. au Tableau I 1") Les résultats qui figurent dans le Tableau I ci-dessus concernent 400 malades.Sur les 400 sérums traités, 374 ont donné lieu à des résultats positifs qui se répartis sent comme suit PRELEVEMENT NOMBRE DE POSITIFS du ler au 11ème jour 88 du 12ème au 21ème jour 52 du 22ème au 44ème jour 39 du 45eme au 60ème jour 3 182 Date du début de la maladie inconnue + 192 374 2") Les 3 % de douteux et les 3,50 % de négatifs obtenus avec le test ELISA correspondent à des prélèvements effectués très précocement, à savoir entre le jour J 1 et le jour J 4 du début de la maladie. 3 ) Les figures 1 et 2 annexées illustrent - en ce qui concerne la figure 1, la répartition des ré sultats en fonction des dilutions, le graphique repré senté à la figure 1 portant en abscisse les dilutions et en ordonnée le nombre de sérums analysés ; - en ce qui concerne la figure 2, la répartition des ré sultats négatifs, douteux et positifs en fonction de la technique des tests (ELISA, RAL, TR ou HA) mise en oeu vre. TABLEAU @@ Etude comparative des résultats des sérodiagnostics de leptospiroses, effectués par 4 techniques différentes, sur des sérums de malades, suspectés cliniquement de cette affection et prélevés entre le jour J 1 et le jour J 11 du début de la maladie. Nombre de P O S I T I F S Par rapport au nombre de sérums TEST sérums Nombre de Dilutions DOUTEUX NEGATIFS traités traités sérums POSITIFS DOUTEUX NEGATIFS % % % 1. E 88 76 1/50 9 6 6 86,36 % 6,82 % 6,82 % L 1/100 29 I 1/200 12 S 1/400 12 A 1/800 9 1/1600 4 1/3200 et > 1 2. R 88 2 1/10 2 0 86 2,27 % 0 % 97,73 % A L 3. TR 76 2 1 73 2,63 % 1,32 % 96,05 % 4. H 42 2 1/20 1 0 40 4,76 % 0 % 95,24 % A 1/160 2 N.B. au Tableau Il Les 6,82 % de négatifs et de douteux obtenus avec le test ELISA correspondent à des prélèvements effectués très précocement, à savoir entre le jour J 1 et le jour J 3 du début de la maladie. Les figures 3 et 4 annexées illustrent graphiquement les résultats réunis dans le Tableau II ci-dessus et en particulier - a figure 3 représente la répartition des résultats néga tifs, douteux et positifs obtenus par les quatre techniques différentes mises en oeuvre (tests ELISA, RAL, TR et HA) sur des sérums prélevés du jour J 1 au jour J 11 du debut de la maladie, les leptospiroses ayant été confirmées par la suite dans tous les cas, ce qui met très nettement en évidence la détection précoce des anticorps en mettant en oeuvre le test ELISA conformément à la présente invention. - la figure 4 fait apparaître la répartition des résultats obtenus avec les 88 sérums analysés dans le Tableau II, en fonction des dilutions. La figure 5 représente la superposition de la représentation graphique des résultats telle qu'elle figure respectivement dans le Tableau I et dans le Tableau II, cette superposition montrant la fiabilité et l'absence de dispertion des résultats obtenus à l'aide du test ELISA réalisé conformément à la présente invention. Il résulte des tableaux I et II qui précèdent que l'on obtient avec la composition antigénique conforme à l'invention appliquée au test ELISA des résultats positifs dès le premier prélèvement, dans des cas de leptospiroses, alors que les résultats sont négatifs dans les autres réactions mises en oeuvre conformément à l'Art antérieur, dans lesquels les résultats deviennent positifs ultérieurement, lors de prélèvements plus tardifs. Ceci montre l'importance du diagnostic précoce pour le traitement thérapeutique du malade. REVENDICATIONS 1") Composition antigénique caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d'au moins une souche de L. andamana. 2") Composition antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la souche de L. biflexa est une souche de L. biflexa Patoc et/ou une souche de L. biflexa Sao Paulo et/ou une souche de L. biflexa C 41. 3 ) Composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la souche de L. andamana est une souche de L. andamana CH 11 et/ou une souche de L. andamana Bovedo. 4 ) Composition antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une composition antigénique thermorésistante (TR) obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d'au moins une souche de L. andamana, dans laquelle la souche de L. biflexa a été traitée pour obtenir un antigène TR. 5 ) Composition antigénique selon la revendication 4, caractérisée en ce que la ou les souches de L. biflexa mise(s) en oeuvre pour la préparation de la composition antigénique thermorésistante (TR) est ou sont prise(s) dans le groupe qui comprend la souche de L. biflexa C 41, la souche de L. biflexa Patoc et la souche de L. biflexa Sao Paulo. 6 ) Composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par le mélange des surnageants de culture des quatre souches de leptospires suivantes : L. biflexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L. andamana CH 11, L. andamana Bovedo. 7 ) Procédé de préparation de la composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste - à cultiver chacune des souches de L. biflexa et de L. anda mana mises en oeuvre, à une température et pendant une du rée appropriée, dans un milieu approprié, qui peut être le même pour chacune des souches cultivées ; à à tuer les leptospires des cultures obtenues et à à récupérer les surnageants de ces cultures tuées, résul tant de la centrifugation desdites cultures ptéalablement chauffées et dont le pH a été ajusté avant de les centrifu ger, pour obtenir un mélange de surnageants qui constitue la composition antigénique selon l'une quelconque des re vendications 1 à 6. 8 ) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que - chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10 jours, à une température de l'ordre de 28"C, à l'étuve, jusqu'à obtention d'une concentration moyenne de l'ordure de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; après vérification de la non-contamination de chacune des cultures obtenues, les cultures obtenues sont réunies - le mélange desdites cultures est soumis à l'action de for maldéhyde pur, introduit de préférence à raison d'environ 1,5 ml/100 ml de mélange de cultures, et maintenu en con tact avec ledit mélange pendant environ 20 à 40 minutes ;; - le mélange de cultures tuées est ensuite chauffé au bain marie bouillant pendant environ 30 minutes, puis complète ment refroidi jusqu'à la température ambiante ; - le pH du mélange de cultures tuées refroidi est alors ajus té à pH compris entre 9 et 10 et de préférence à pH 9,6 t - le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g pen dant 45 minutes à 1h15 ; puis, - après décantation, le surnageant recueilli est la composi tion antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 9 ) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10 jours à une température de l'ordre de 28'C, à l'étuve, jus qu'à obtention d'une concentration- en leptospires de l'or dre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; - chacune des cultures obtenue est traitée, après vérifica tion de sa non-contamination, par du formaldéhyde pur, in troduit dans ladite culture de préférence à raison de 1,5 ml/100 ml de culture et maintenu en contact avec ladite culture pendant environ 20 à 40 minutes, pour tuer les lep tospires de ladite culture ;; - chacune des cultures est ensuite chauffée au bain-marie bouillant pendant environ 30 minutes - puis, après complet refroidissement, le pH de chacune des cultures est ajusté à 9-10 et de préférence à 9,6 ; - chacune des cultures est centrifugée séparément à 10000 g pendant environ 45 minutes à 1h15, - les surnageants de chacune des cultures, sont mélangés pour former la composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 10-) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture des leptospires est un milieu 55955 à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamines, Tween, BSA. 110) Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture des leptospires est un milieu sans protéines, à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamine B1, vitamine B12, "Tween" 60 détoxifié, tampon TES (acide tris-méthyl-2-amino-éthane sul fonique)., actuellement également désigné sous le n" 55955. 12-) Procédé de diagnostic de leptospiroses qui consiste à détecter les anticorps antileptospirosiques présents dans un sérum à contrôler à l'aide d'un antigène leptospirosique, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont détectés à l'aide de la composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui est apte à réagir avec le sérum à contrôler prélevé chez un malade, quel que soit le sérotype infectant, en mettant en incubation ledit sérum avec ladite composition antigénique, à laquelle se lient les anticorps du groupe Leptospirosa, quels qu'ils soient, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon de sérum à contrôler. 13 ) Procédé de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que les anticorps liés obtenus selon la revendication 12, qui constitue alors la première étape du procédé de diagnostic selon la présente revendication, sont additionnés d'une quantité appropriée d'un conjugué (anticorps anti-IgM Achaine p7 humains marqués à la peroxydase), provoquant ainsi la fixation des IgM sur lesdits anticorps liés, cette seconde étape du procédé de diagnostic étant suivie d'une troisième étape qui consiste à introduire un substrat constitué par de l'acide 5-aminosalicylique avantageusement additionné, juste avant son introduction dans le milieu réactionnel, d'eau oxygénée, pour provoquer, en présence d'anticorps antileptospirosiques, l'apparition d'une couleur marron/bordeaux plus ou moins intense résultant de la réaction de l'enzyme du conjugué avec le substrat susdit. 14") Procédé de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que la composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 est fixée aux parois des cupules, ou puits, de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA. 15 ) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de leptospiroses selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de la composition antigénique con forme à l'invention, contenue dans un récipient convenable; - une quantité appropriée de sérum humain positif de contrô le, contenu dans un récipient convenable - une quantité appropriée de conjugué d'anticorps anti-IgM (chaîne p) humains marqués à la peroxydase; dans un reci- pient convenable ; - une quantité appropriée de substrat tel que l'acide amino 5-hydroxy-2-benzoïque dans un récipient convenable ;; - une quantité appropriée d'H202 dans un récipient convena ble - une solution concentrée de tampon phosphate-PBS pH 7,2 t 0,1, dans un récipient convenable, destinée à être diluée au 1/10è lors de son utilisation ; - une solution de tampon PBS-TWEEN à pH 7,2 ' 0,1 - une solution de tampon PBS-Tween-Albumine - une pluralité de plaques de microtitration utiles dans le test ELISA ; - éventuellement une pluralité de pipettes automatiques de 50 pl, de 100 pl, de 200 pl, de 1000 pl, etc... à un seul canal ou à canaux multiples. 16 ) Kit de diagnostic selon la revendication 15, caractérisé en ce que selon un mode de réalisation simplifié, il comprend : - une pluralité de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA ; - éventuellement des pipettes automatiques de 50 pl, 100 pl, 200 pi et 1000 pl à un ou plusieurs canaux - les réactifs aptes à se conserver dans des conditions de température ne dépassant pas + 8"C, à savoir une quantité appropriée de la cpmposition antigéni que selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, contenue dans un récipient convenable une quantité appropriée de sérum humain positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable ; ; une quantité appropriée de solution concentrée de tampon phosphate-PBS stérilisée. 17 ) Kit de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que les plaques de microtitration qu'il comprend sont constituées par des microplaques à fond plat comprenant chacune 12 rangées de chacune 8 cupules, ou puits, de 300 pl de contenance ou par des mi croplaques à fond plat constituées chacune par une seule rangée de 8 cupules ou puits qui sont revêtues de la composition antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, par adsorption de cette dernière sur la surface intérieure des cupules de chaque microplaque.