Brevet FR2579617A2 — publié le 19861003

FR 2579617 A2 19861003 FR 8504990 A 19850402 Le brevet principal décrit un procédé permettant d'intégrer dans le génome de Yarrowia lipolytica des fragments d'ADN à l'aide de vecteurs de clonage et d'expression plasmidiques. Le brevet principal montre que certaines des souches transformées ont intégré le gène marqueur LYS2 dans un de leurs chromosomes, sous forme de multicopies stables. Les recherches récentes suggèrent que ces intégrations multiples résultent de la pénétration de plusieurs plasmides dans certaines cellules (cotransformation). Selon toute vraisemblance, ces plasmides se recombinent entre leurs régions homologues (LYS2+ ou pBR322) en formant des cointégrats. Ces molécules polymériques s'intègrent ensuite dans le chromosome par échange entre régions homologues (ADN de Y. lipolytica du polymère et ADN du chromosome). Les copies multiples de LYS2 sont localisées côte à côte dans un chromosome déterminé qui varie selon le transformant, comme cela est explicité dans la figure 1. Sur la figure 1, la banque d'ADN de Y. lipolytica est intégrde dans un plasmide pBR322 portant LYS2 (schématisé en A). Après transformation, ces plasmides se recombinent entre eux par 1'intermédiaire de leurs régions homologues pour former des cointégrats (polymère) représentés en B. Ce polymère s'intègre alors dans un chromosome grâce aux séquences homologues, ce qui conduit à des copies multiples de LYS2 intégrées. On a montré récemment que ce système de transformation permet l'intégration simultanée de plusieurs plasmides distincts indépendants, si les cellules à transformer sont mises en présence d'un mélange. D'une façon plus précise, ce mécanisme permet l'intégration efficace de n'importe quel ADN circulaire présentant une homologie avec le plasmide qui porte le marqueur sélectionné (on a utilisé LYS2 , mais on pourrait en prendre un autre). La présente addition a donc pour objet un perfectionnement à ce procédé et aux vecteurs de clonage et d'expression plasmidiques qui peuvent être mis en oeuvre. Plus particulièrement, la présente addition concerne donc une combinaison de vecteurs destinée à l'intégration d'une séquence d'ADN dans le génome de Y. lipolytica qui comprend a) un plasmide 1 comportant au moins ladite séquence d'ADN à intégrer et une région homologue du plasmide 2 b) un plasmide 2, dit "d'intégration", comportant au moins une région homologue du génome de Y. lipolytica. Ce plasmide 2 comportera également, de préférence, un gène marqueur s'exprimant dans Y. lipolytica, par exemple le gène LYS2 Afin de faciliter la mise en oeuvre, la séquence homologue entre le plasmide 1 et le plasmide 2 sera une séquence de pBR322 couramment utilisée pour le clonage de gènes hétérologues. Ce plasmide 2 d'intégration ainsi conçu peut être utilisé pour intégrer n'importe quel gène,ou séquence d'ADN, clone dans pBR322 qui constituera le plasmide 1. De façon générale, le plasmide d'intégration sera incapable de se répliquer de façon autonome dans y. lipolytica. A titre d'exemple, on peut intégrer dans le génome de Y. lipolytica les gènes suivants clonés sur un plasmide 1 SUC2 codant pour l'invertase de S. cerevisiae, PH05 codant pour la phosphatase alcaline de S. cerevisiae, lacZ codant pour la ss-galactosidase de E. coli, le gène codant pour une a-amylase thermostable de B. licheniformis. La présente addition concerne également un procédé d'intégration d'une séquence d'ADN déterminée dans Y. lipolytica, caractérisé en ce qu'on effectue la cotransformation d'une souche de Y. lipolytica par au moins une combinaison de vecteurs telle que décrite précédemment. La souche transformée sera, de préférence, une souche auxotrophe, le plasmide portant un gène marqueur complémentant cette auxotrophie, par exemple le gène LEU2 qui complémentera une souche leu D'autres caractéristiques et avantages de la présente addition apparaItront dans l'exemple ci-après décrit en se référant aux dessins annexés sur lesquels la figure 1 représente un schéma de l'intégration du gène LYS2 sous forme de copies multiples, la figure 2 représente la structure de pRB58, la figure 3 représente le schéma de la recombinaison entre pRB58 et B6, la figure 4 montre l'hybridation de l'ADN extrait d'un clone de Y. lipolytica transformé par B6 et pRB58. EXEMPLE Les techniques mises en oeuvre sont les mêmes que celles décrites dans le brevet principal. Le plasmide pRB58 représenté sur la figure 2 est un plasmide dérivé de-pBR322 portant au site EcoRI de pBR322 une insertion de 2,2 kb comprenant un fragment du plasmide 2am de S. cerevisiae (forme B) portant l'origine de réplication du plasmide 2Fm ; une insertion de 1,1 kb au site HindIII de pBR322 comprenant un fragment d'ADN chromosomique de S. cerevisiae correspondant au gène URA3 ; une insertion de 8,5 kb dlADN chromosomique de S. cerevisiae au site BamHI de pBR322, ce dernier fragment porte le gène SUC2 codant pour l'invertase (Carlson et Botstein (1983) Cell 28, p. 145-154). Il existe donc une homologie de séquence entre les parties pBR322 de B6 décrit au brevet principal et de pRB58 permettant la formation éventuelle de concatémères portant 4 types de séquences recombinéess Comme cela est représenté sur la figure 3, les plasmides pRB58 et B6 peuvent se recombiner par leurs séquences homologues de pBR322 pour donner un plasmide intermddiaire A. Ce dernier plasmide A peut se recombiner avec pRB58 pour donner le plasmide B qui peut lui-même se recombiner avec le plasmide B6 pour donner le plasmide C (bien entendu, ces recombinaisons ne sont données qu'à titre d'exemple). Ce plasmide C peut s'intégrer dans le chromosome par la séquence homologue notée b. Ceci conduit à une structure chromosomique linéaire qui est schématisée en bas de la figure 4.Une restriction EcoRI et une hybridation avec pBR322 doit conduire à des fragments notés de I à IV. Après transformation de la souche de Y. lipolytica 8601.1 décrite au brevet principal par un mélange de B6 et de pRB58, 12 clones LYS+ ont été isolés et leur ADN a été extrait. Cet ADN a été digéré par l'enzyme EcoRI et les fragments ont été séparés sur gel d'agarose puis transférés sur un filtre de nitrocellulose. Celui-ci a été hybridé avec une sonde pBR322 (bande 2) et, dans une seconde expérience, avec une sonde spécifique de SUC2 (bande 3) (fragment HindILI de 3 kb de l'insertion de 8,5 kb). (La bande 1 correspond à pRB58 coupé par EcoRI hybridé avec pBR322 et la bande 4 à YIp333 coupé par EcoRI hybridé avec pBR322). Comme le montre la figure 4, on observe, dans des clones analysés, l'ADN SUC2 intégré sous forme de copies multiples. Le meme profil de restriction a été observé dans les 12 clones cotransformés, l'intensité relative des différentes bandes I, II, III, IV étant variable et reflétant le nombre de copies de pRB58 et de YIp333 qui ont participé à la formation du polymère. La même expérience a été reprise en cotransformant B6 avec différents plasmides dérivés de pBR322 portant des gènes d'origine diverse : PH05 (phosphatase de S. cerevisiae), amy (a-amylase de B. licheniformis), lacZ (B-galactosidase d'E. coli). Dans tous les cas, les transformants LYS+ isolés contenaient également l'ADN cotransformé. REVENDICATIONS 1) Combinaison de vecteurs destinée à l'intégration d'une séquence d'ADN déterminée dans le génome de Yarrowia lipolytica qui comprend a) un plasmide 1 comportant au moins ladite séquence d'ADN déterminée à intégrer et une région homologue du plasmide 2, et b) un plasmide 2 dit d'intégration comportant au moins une région homologue du génome de Y. lipolytica. 2) Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que le plasmide d'intégration comporte un gène marqueur s'exprimant dans Y. lipolytica. 3) Combinaison selon la revendication 2, caractérisée en ce que le gène marqeur est LYS2 4) Combinaison selon l'une des revendications i à 3, caractérisée en ce que le plasmide d'intégration est incapable de se répliquer chez Y. lipolytica. 5) Combinaison selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la région homologue du plasmide d'intégration est une région de pBR322. 6) Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le plasmide 1 est un plasmide pBR322 portant le gène SUC2 codant pour l'invertase de S. cerevisiae. 7) Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le plasmide 1 est un plasmide pBR322 portant le gène PH05 codant pour la phosphatase alcaline de S. cerevisiae. 8) Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le plasmide 1 est un plasmide pBR322 portant le gène lacZ codant pour la ss-galactosidase de E. coli. 9) Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le plasmide 1 est un plasmide pBR322 portant le gène codant pour une a-amylase thermostable de B. licheniformis. 10) Procédé d'intégration d'une séquence d'ADN déterminée dans Y. lipolytica, caractérisé en ce qu'on effectue la cotransformation d'une souche de Y. lipolytica par au moins une combinaison de vecteurs selon l'une des revendications 1 à 9. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la souche de Y. lipolytica transformée est auxotrophe et que le plasmide 2 porte un gène marqueur complémentant cette auxtrophie. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la souche de Y. lipolytica est leu et que le gène marqueur du plasmide 2 est LEU2 . 13) Levure Y. lipolytica ayant une séquence d'ADN déterminée intégrée dans son génome obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 10 à 12.