Brevet FR2574430A1 — publié le 19860613

La présente invention concerne un matériel d'ana- lyse et un procédé pour détecter la présence et détermi- ner la quantité de substances capablesd'inhiber la sythèse biomoléculaire de novo, comme les toxiques et les antibio- tiques. Les essais biologiques de toxicité classiques utilisant des animaux ou des cellules animales demandent du temps et sont coûteux à réaliser. Parmi les analyses biologiques rapides connues actuellement, les essais bacté- riologiques sont les plus appropriés au criblage de la toxi- cité finis parce qu'ils sont faciles à réaliser, reproduc- tibles et peu coûteux. Les essais microbiologiques exis- tantsmesurent l'inhibition de la croissance, l'absorption d'oxygène, la luminescence, l'aptitude à former des colo- nies, la teneur en ATP et l'activité enzymatique. On a besoin de méthodes d'analyses) pour l'essai sur le terrain qui soient rapides, sensibles et simples, pour déceler les toxiques dans l'eau, les produits chimiques, les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les pro- duits alimentaires et les additifs alimentaires. A titre d'exemple, l'essai sur le terrain est essentiel dans la recherche des antibiotiques dans le lait et dans les sé- rums et dans l'urine. De nombreux systèmes de criblage bactériologique de la toxicité en usage comprennent un essai de biolumines- cence (essai Microtox de Beckman) basé sur le principe de l'atténuation de la lumière par exposition à des toxiques (QURESHI et coll., article intitulé "Evaluation et affina- ge de l'essai Microtox pour l'emploi dans le criblage de la toxicité" dans "Criblage de la toxicité utilisant des procé- dés et des systèmes bactériologiques" publié par Liu et coll., National Water Research Institute, Burlington, Onta- rio, Canada, 1984, pages 1-2); l'essai à Spirillum volutans pour l'emploi dans le criblage de toxicité (GOATCHER et coll., article intitulé "Evaluation et affinage de l'essai à Spirillum Volutans pour l'emploi dans le criblage de toxi- cité" dans "Criblage de toxicité, voir ci-dessus, pages 89- 108, 1984, et le dosage par réduction au tétrazolium (KOOPMAN et coll., article intitulé "Validité des dosages par réduc- tion au tétrazolium pour l'évaluation de l'inhibition des bactéries filamenteuses par les toxiques dans la boue acti- vée" dans "Criblage de toxicité",ci-dessus, page 147-162, 1984. Le premier système est très sensible mais exige des instruments couteux. Les autres méthodes sont compli- quées à mettre en oeuvre ou n'ont pas la sensibilité appro- priée nécessairé pour l'analyse des toxiques dans l'eau et les produits alimentaires. La littérature décrit d'autres techniques dans lesquelles on peut faire des.analyses rela- tivement rapides et sensibles en se basant sur l'observa- tion de l'inhibition de la synthèse des protéines. A titre d'exemple, il a été découvert que la streptomycine inhibe la synthèse des protéines de novo et qu'elle n'inhibe que partiellement la synthèse des protéi- nes en cours (translationnelle) (ZIERBUT et coll., Eur. J. Biochem. 98,577-583, 1979; DAVIS et coll., article intitu- lé: "Interaction complexe des antibiotiques avec les Ribo- somes" dans "Les Ribosomes" publié par NOMURA et coll., Cold Spring Harbor Laboratory, pages 755-762, 1974; CHOI et coll., Biochm. Biophysics Res. Comm., 94, pages 755-762, 1980; ARTMAN et coll., Antimicrob. Agents Chemother. 7, 449-455, 1972) En utilisant l'inhibition de la synthèse des protéines, il est possible de rechercher la présence d'un toxique ou analogue. Cependant, une technique de ce genre n'a été possible qu'avec des toxiques et analogues qui ont une action rapide et qui inhibent rapidement la synthèse des protéines de novo. Lorsqu'un toxique est à action lente, on ne peut pas le détecter en utilisant cette technique par- ce qu'il y a insuffisance de l'inhibition avant que la syn- thèse translationnelle ne commence. Il serait donc souhaitable de pouvoir améliorer ces techniques d'une manière qui permettrait aussi la re- cherche de substances qui-inhibent la synthèse des protéi- nes de novo mais qui agissent plus lentement. Il existe donc une demande pour un matériel rapi- de, utilisable sur le terrain, ayant une sensibilité élevée, dont les modes opératoires soient simples à mettre en oeu- vre et qui donne des résultats visiblement détectables, mê- me avec des substances qui elles-mêmes n'inhibent que rela- tivement lentement la synthèse des protéines de novo. Un but de la présente invention est de fournir une méthode d'analyse qui satisfasse aux différents critères énumérés ci-dessus. La présente invention atteint les buts fixés en fournissant une méthode de dosage simple, rapide (1 à 2,5 heures), par exemple, colorimétrie, qui n'exige pas d'équipement spécial et qui peut être réalisée facile- ment sur le terrain. Suivant un aspect de l'inventionr il est fourni un procédé pour déceler la présence de substances qui inhi- bent la synthèse biomoléculaire de novo, comme des toxiques, -par exemple des antibiotiques, dans un échantillon, en exposant un organisme à un agent inducteur de biomolécu- les, en présence de l'échantillon et en évaluant l'inhibi- tion de la synthèse de cette biomolécule, comme par l'emploi d'un indicateur. Selon un mode de réalisation, la biomolécu- le est de préférence une enzyme et l'organisme d'essai est un micro-organisme, de préférence une bactérie qui a été sou- mise à un stress et qui est en voie de rétablissement. Lors- que la biomolécule est une enzyme, on emploie un substrat homogène, l'importancede la variation de couleur donnant une mesure de l'inhibition de la synthèse de l'enzyme. Pour augmenter la sensibilité de l'analyse, on pré- fère par-dessus tout que l'organisme soit une souche Escheri- cha coli, par exemple ESS, carencée en polysaccharides et soumise à un stress. Cette batérie synthétise la béta-galac- tosidase par suite de l'induction par un inducteur d'enzy- me spécifique, comme le lactose ou l'isopropyl -béta-D-thio- galactopyranoside (IPTG). L'inducteur spécifique est de préférence employé dans un mélange qui contient aussi les facteurs nécessaires au rétablissement des bactéries E. coli après le stress. Par exemple, du chlorure de potassium mélangé avec de la proli- ne ou du glutamate monosodique aide la bactérie à se remet- tre du stress, tandis que le mélange peut contenir en outre une concentration élevée de chlorure de sodium comme agent inducteur de stress. La quantité d'enzyme produite par les bactéries est évaluée par addition d'un substrat chromogène sensible à l'enzyme et mesure de la variation de couleur, par exem- ple par des techniques de colorimétrie ou de mesure de den- sité optique. Plutôt que d'employer spécifiquement un agent inducteur de stress dans le mélange, on peut utiliser pour induire le stress les conditions exernes ou les caraCtéris- tiques physiques des bactéries elles-mêmes. Par exemple, en employant des bactéries lyophilisées qui ont été remises en suspension dans le mélange contenant le toxique, le rétablis- sement à partir de l'état lyophilisé crée la condition de stress. On peut faire incuber le mélange obtenu dans un mi- lieu de croissance pour obtenir une celture d'essai et on évalue la variation de couleur dans la culture après une nouvelle incubation. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, plutôt que de compter sur un inducteur, on infecte par un bactériophage une bactérie lyophilisée qui, lors de la réhy- dratation, est induite à sécréter une enzyme. La sécrétion est moins importante ou est empêchée en'présence de toxiques. Par exemple, le phage Charon 4A (Blattner et coll., 1977, Science, 196, 161) contient le gène de la béta-galactosidase qui est sécrétéedans E. coli lors de l'infection par le pha- ge. Cette sécrétion peut être inhibée par les toxiques. Selon un autre mode de réalisation de l'invention dans lequel la sensibilité du système est augmentée, d'au- tres éléments de codage extrachromosomiques sont introduits dans la cellule. Par exemple, on introduit dans une cellule des plasmides contenant le code des enzymes chromogènes pour produire une enzyme chromogène comme la béta-galactosidase (Casadaban, M.J. et coll., J. Bacteriol., 143, 971-980, 1980). Etant donné qu'une quantité considérable de béta-galactosida- se a alors été produite, on peut employer moins de cellules dans l'essai et ainsi la sensibilité du système est augmen- tée. Des cellules qui sont en train de se rétablir d'un stress (par exemple lyophilisation) employées alors produi- sent encore de la béta-galactosidase. Cette nouvelle produc- tion peut être inhibée par des toxiques. Dans un exemple par- ticulier, le piasmide pMC874, lorsqu'il est introduit dans des cellules bactériennes,produit l'enzyme béta-galactosida - se (Casadaban, M.J. et coll., J. Bacteriol., 143, 971-980, 1980). Lorsque le toxique ou l'antibiotique est une substance qui agit uniquement sur la paroi des cellules, on ajoute au mélange, avec les champignons, un toxique au- xiliaire ou un "messager" dont la toxicité est limitée par son inaptitude à pénétrer dans la paroi de la cellule. Le "messager" est capable d'inhiber la synthèse des protéines de novo dans la mesure o il est capable de pénétrer dans la cellule. Ceci est fonction de la puissance du toxi- que. Un autre aspect de la présente invention concerne un matériel pour l'emploi dans la mise en oeuvre du procédé d'analyse. Ce matériel comprend, dans des conteneurs sépa- rés, a) un micro-organisme d'essai qui a été soumis préala- blement à un stress ou qui doit être stressé,-(b) un agent inducteur de biomolécules et (c) un constituant permettant le rétablissement du micro-organisme après le stress. Le micro-organisme peut être de préférence une sou- che de E. coli carencée en polysaccharides et lyophilisée et on peut aussi prévoir un milieu de croissance. Lorsque le micro-organisme n'a pas été préalable- ment stressé on prévoit aussi un agent pour stresser le mi- cro-organisme, par exemple du chlorure de sodium à con- centration élevée. Le constituant qui permet le rétablissement de la biomolécule après le stress peut être par exemple du chloru- re de potassium ou de la proline ou du glutamate monosodique. On préfère en particulier un inducteur de béta-ga- lactosidase, par exemple ' isopropyl- béta-D-thiogalactopy- ranoside ou le lactose. Ou bien on peut employer ou ajouter en plus un inducteur de béta-galactosidase. Le matériel d'analyse peut comprendre en outre un indicateur pour in- diquer la toxicité en fonction de l'inhibition. Le matériel peut comprendre aussi une solution d'arrêt et une plaque de microtitrage normalisée. L'analyse est basée sur la propriété de certaines substances comme les toxiques ou les antibiotiques d'inhiber la synthèse de novo (par opposition à la synthèse en cours) de biomolécules dans les microorganismes. C'est avec ces substances que la technique selon l'invention trouve une application particulière. Par opposition aux techniques antérieures, la tech- nique de la présente invention permet de déceler la présence d'inhibiteurs,même à action lente, de la synthèse des protéi- nes de novo. Ceci est réalisé par mise en contact de l'échan- tillon avec un micro-organisme, comme une bactérie,qui a été stressé et que l'on a laissé se rétablir. C'est pendant la période de rétablissement que la synthèse des protéines de novo est retardée à un point suffisant pour permettre aux toxiques ou analogues d'agir et d'inhiber la synthèse de pro- téines de novo. Une technique de stress des micro-organismes pour obtenir l'effet désiré est de le lyophiliser. SINSKY et SILVERMAN, J. Bacteriol. 101, 429-437, 1970, ont montré qu'après la lyophilisation de cellules d'Escherichia coli, une période de rétablissement (incubation dans un milieu nu- tritif) d'environ 30 minutes est nécessaire avant que la capacité à synthétiser la béta-galactosidase soit rétablie. Ils sont aussi montré qu'immédiatement après la réhydrata- tion, la perméabilité de ces cellules aux antibiotiques augmente d'une façon spectaculaire. On peut aussi produire le stress en employant la plasmolyse ou en ajoutant aux autres causes la plasmolyse (CHARLANG et HOROWITZ, J. Bacteriol, 117, 261-264, 1974; MUNRO et coll., J. Biol. Chem. 247, 1272-1280, 1972; BAT- TERSTON et VAN BAALEN, Arch. Mikrobiol.Z., 76, 151-165, 1971, RUBENSTEIN et coll., J. Bacteriol, 104, 443-452, 1970, ou bien on peut employer le choc thermique (HURST, Can. J. Microbiol. 23, 935-944, 1977). Le processus de rétablissement après lyophilisa- tion ou après plasmolysenécessite de l'énergie et un trans- fert actif (MEASURES, Nature 257, 398-400, 1975; EPSTEIN et LAIMINS, TIBS, 1980; HAROLD et ALTENDORF, Current Topics in Membranes and Transport, vol 5, 1 à 50, 1974, SEDGWICK et MACLEOD, Can. J. Biochem. 58, 1206-1214, 1980; RHOADS et EPSTEIN, J. Biol.. Chem., 252, 1294-1401, 1977). Pour cette raison, la présente invention envisage de préférence la présence d'un milieu de croissance et d'un sel. agent de transport comme le chlorure de potassium en mélange avec le micro-organisme soumis à l'essai. A titre d'illustration, la technique de l'inven- tion peut être appliquée à des toxiques comme le cyanure (SEDGWIK et MACLEOD, Can. J. Biochem., Ibid) et le phénol (KROLL et ANAGNOSTOPOULOS, J. Appl. Bacteriol, 51, 313-323, 1981), qui inhibetcomplètement le rétablissement et par con- séquent empêchent la synthèse des protéines de novo. Lorsque le micro-organisme soumis à l'essai est un mutant brut (un mutant possédant une membrane externe déficiente, par exemple une souche carencee en polysaccha- rides),la sensibilité de l'essai est augmentée du fait de l'augmentation de la perméabilité de la paroi cellulaire de la bactérie. Par exemple, un mutant brut d'E. coli désigné par E. coli ESS, qui a été mis au point par KOHSKA et DEMAIN, 1976, Biochem. Biophys. Res. Comm. 70, 465 à 473, qui est extrêmement sensible - à un spectre étendu de substances toxiques comme les pesticides, les microtoxines et les mé- taux lourds, est employé de préférence selon l'invention du fait de sa sensibilité accrue. Comme on l'a noté ci-dessus, l'analyse est réali- sée dans des conditions de stress, dans une réaction en une étape, dans un mélange contenant tous les éléments nécessai- res. Les conditions de stress peuvent comprendre mais ne sont pas limitées à: un différentiel de pression osmotique à travers la paroi de la cellule, c'est-à-dire une pression osmotique externe plus élevée ou plus basse, un choc, de température (chaleur ou froid), un pH défavorable, un rayon- nement, une concentration ionique différentielle, la pré- sence d'autres bactéries ou de moisissures, la présence de certains composés chimiques,etc. Ainsi, tel qu'il est employé dans toute la descrip- tion et les revendications, le mot "stress" désigne un stimu- lus qui, lorsqu'il est appliqué à la cellule du micro-orga- nisme, provoque une modification du métabolisme de la cellu- le et de l'intégrité de la cellule. Si les conditions de stress sont améliorées, la cellule se rétablit pendant une période de rétablissement au cours de laquelle la vitesse de métabolisme augmente, pour permettre la réparation et la restauration de la cellule. Pendant cette période de métabo- lisme cellulaire plus élevé, la cellule est particulière- ment sensible à l'intoxication qui interfère avec les activités métaboliques intervenant dans le processus de ré- tablissement de la cellule. 9 2574430 L'invention concerne également le mélange d'analyse en une seule étape qui contient le toxique ou l'antibiotique, les bactéries, du chlorure de sodium à concentration élevée, de l'ordre de 15 à 25% en poids, pour créer des conditions de stress, des facteurs essen- tiels pour le rétablissement de la bactérie (chlorure de potassium et proline ou glutamate)et un inducteur spécifi- que de bêta-galactosidase, par exemple l'isopropyl-bêta -D thiogalactopyranoside (IPTG) ou le lactose. Dans ces analyses en une seule étape, il se produit des évènements successifs. Premièrement, la bactérie subit une plasmolyse qui est connue pour augmenter la perméabi- lité de la paroi des cellules et provoquer une diminution rapide de toutes les activités métaboliques (SCHEIE, J.Bacteriol.98:335-340, 1969; SCHEIE et REHBERG, J. Bacteriol. 109, 229-235, 1972). Cette étape est suivie d'une déplasmolyse progressive qui exige, en particulier, un transport rapide à travers la membrane, la respiration et le métabolisme énergétique (DHAVISES et ANAGNOSTOPOULOS, Microbios Letters, 7,149-159,1978). En stressant le microorganisme soumis à l'essai par le procédé d'analyse de l'invention, on obtient quatre avantages principaux: l.pendant la plasmolyse, augmentation de la per- méabilité qui augmente la sensibilité du système vis-à-vis de toxiques qui autrement seraient non-pénétrants. 2.augmentation du nombre de fonctions physiologi- ques essentielles à l'induction des enzymes. Toutes ces fonctions ou n'importe laquelle de ces fonctions peut être sensible à l'inhibition par les toxiques ou les antibioti- ques, élargissant ainsi le spectre du toxique ou les cibles de l'antibiotique. 3.Séparation de la période d'activité du toxique à partir de la vitesse maximum d'induction de la bêta- galactosidase (qui a lieu à la fin de la déplasmolyse)per- mettant un effet toxique maximum avant l'induction dans un procédé en une seule étape 4.Le procédé d'induction de la synthèse des pro- téines de novo est sensible aux toxiques et aux antibioti- ques parceque l'énergie ainsi que la synthèse de l'ARN et des protéines interviennent. Pour augmenter la sensibilité de l'analyse et pour permettre l'analyse de toxiques et d'antibiotiques qui n'agissent que sur la membrane externe (paroi cellulaire), on peut employer une stratégie modifiée. Selon cette approche,le mélange pour analyse contient des quantités seuils d'un toxique auxiliaire ou "messager",par exemple du violet de gentiane ou de l'actinomycine D, dont la toxicité est limitée par son incapacité à pénétrer dans la paroi cellulaire. Toute augmentation de la perméabilité de la paroi cellulaire se produisant par suite de l'influence de la substance analysée sur la perméabilité de la paroi cel- lulaire permet aux toxiques "messagers" de pénétrer et d'empêcher l'induction d'enzyme. Ainsi, selon l'invention,on peut employer un toxique messager à la fois pour augmenter la sensibilité aux toxiques d'une façon gé- nérale et pour permettre l'analyse de substances qui n'a- gissent que sur la perméabilité de la paroi cellulaire En résumé,le principe de l'invention est basé sur l'exposition d'une bactérie stressée en voie de réta- blissement à des conditions telles que la perméabilité de la cellule et sa sensibilité vis-à-vis d'un spectre étendu de toxiques et d'antibiotiques sont augmentées. Ainsi, la cellule est forcée de fonctionner à l'effort métabolique maximal pour se rétablir du stress et l'action de la toxine est séparée de l'induction par un mécanisme de retard bio- logique (plasmolyse-déplasmolyse). Dans l'essai, on mélange des dilutions en sé- rie de l'échantillon avec les bactéries stressées et avec un mélange contenant l'inducteur spécifique de l'enzyme 2,574430 Il chromogène et les facteurs essentiels nécessaires pour que les bactéries se rétablissent de leur stress.La capacité des cellules à synthétiser des enzymes dans ces conditions dépend de leur capacité de se rétablir du stress(SINSKY et SILVERMAN, J. Bacteriol. 101,429-437,1970). Les substances toxiques interfèrent avec et/ou inhibent le processus de rétablissement et avec celui-ci la synthèse de la bêta- galactosidase. La quantité d'enzyme synthétisée de novo peut être déterminée par une réaction colorimétrique très nette. Il est particulièrement avantageux de surveiller la synthèse d'une enzyme de novo en employant un substrat chromogène, grâce à la facilité de détection d'une biomo- lécule de ce genre. Le mode opératoire analytique de la pré- sente invention se prête à la conteneurisation dans un cof- fret qui est destiné à l'usage sur le terrain et facile à manier. A titre d'exemple, l'ensemble peut contenir une bactérie sous une forme lyophilisée et tous les réactifs sont stabilisés, de sorte que l'ensemble peut être stocké sous réfrigération normale pendant une période prolongée. MODE OPERATOIRE ANALYTIQUE. Le mode opératoire analytique est direct et facile à suivre. Initialement, la substance à analyser, (le toxique soupçonné)est dissous dans un solvant approprié et dilué en série soit dans une série de tubes à essais * soit dans les cupules d'une plaque de microtitrage. Des bactéries lyophilisées, qui ont été remises en suspension dans un milieu contenant un nutriant de croissance et un agent d'induction de la synthèse de la bêta-galactosidase, sont ajoutées aux solutions d'échan-- tillons à analyser et incubées pendant 30 à 60 minu- tes. Pendant cette période d'incubation, les bactéries sont soumises à un stress, libérées de ce stress et stimu- lées pour produire l'enzyme bêta-galactosidase. L'utili- sateur naturellement ne se rend pas compte de toutes ces opérations qui se font automatiquement et en série. Lorsque la période d'incubation est termi- née, on met fin à l'essai par addition de -la solution chromogène. A ces concentrations de substances (s), qui sont toxiques pour les bactéries, il n'y a pas ou il n'y a que peu de développement de couleur. Un fort développement de couleur, égal à celui est qui observé dans le cas des bactéries non traitées, indique qu'il y a peu ou qu'il n'y a pas d'activité toxique. Les milieux et les tampons qui peuvent être employés dans la pratique de la présente invention et les méthodes pour les employer sont décrits dans les exem- ples suivants: EXEMPLE 1: Milieux et tampons Milieu de lyophilisation Tréhalose 0,6 M Chlorure de magnésium 0,004 M Chlorure de sodium 0,7% HOPS(acide 3-[N-morpholino]propanesulfonique) 0,02 M Milieu L Bacto tryptone 1% Extrait de bacto levure 0,5% Chlorure de sodium 1% Milieu G Chlorure de sodium 2% Chlorure de potassium 0,05M Sel monosodique de l'acide L-glutamique 0,03% IPTG 0,0005 M Tampon au phosphate de sodium 0,02 M Milieu - Dodécylsulfate de sodium 0,1% MgSO4.7H20 0,025% Bêta-mercaptoéthanol 0, 27% O-nitro-phényl-bêta-D-galactoside bêta-D-galactoside 1,2% Tris HCI pH 9,0 0,2 M EXEMPLE 2: Lyophilisation des bactéries Des cellules de E.Coli ESS (Kohska et al, Biochem, Biophys. Res. Comm., Ibid) sont cultivées dans des milieux L à 37 C jusqu'à ce que la turbidité de la suspen- sion de culture atteigne une densité optique ( D.O.) de 0,4 à 600 nm. On centrifuge la culture (4 C, 10.000 g,O1 mn) on la remet en suspension dans le milieu de Iyophilisation jusqu'à une D.O. de 2,4 à 600 (nm). On introduit 2 ml de la suspension dans des flacons à sérum en verre de 12 ml (24 mm x 45 mm) et on les congèle dans l'azote liquide. La lyophilisation est réalisée dans un Freeze Dryer (séchoir à congélation)8 Labconco et elle est terminée en 24 heures. Les milieux décrits dans l'exemple I et la culture bactérienne lyophilisée produite comme dans l'exemple 2, peuvent être emballés sous forme d'un ensemble d'analyse, par exemple dans des récipients séparés. EXEMPLE 3: Système de plasmolyse (système P) A. Dilution du toxique. L'essai est réalisé dans des plaques de microtitrage jetables, chacune compor- tant 96 cupules (12 cupules dans chacune des huit rangées) d'environ 0,3 ml de volume de cupules total. Ces plaques sont disponibles dans le commerce chez diffé- rents fabricants et fournisseurs d'équipements médical et scientifique (par exemple DYNATECH, FLOW, AMERICAN SCIENTIFIC PRODUCTS, THOMAS SCIENTIFIC, FISHER, etc.). On ajoute dans chaque cupule 100 microlitres de milieu G, sauf pour la première cupule de chaque rangée à laquelle on ajoute 200 microlitres. Le toxique soupçonné est ajouté en un volume ne dépassant pas 20 microlitres dans la pre- mière cupule de la rangée qui contient les 200 microlitres de diluant. On prélève 100 microlitres dans la première cupule et on les transfère dans la seconde cupule (contenant 100 microlitres de diluant). Ainsi, on obtient une dilution de 1/2. Après mélange, on prend 100 microli- - tres de substance diluée et on les transfère dans la cupule suivante de la rangée, ce qui constitue une nouvelle dilu- tion de 1/1. On poursuit l'opération jusqu'à une cupule avant la fin de la rangée de cupules,et on obtient des di- lutions de moitié (jusqu'à 1/2 048)de la solution de la première cupule. La dernière cupule est celle de l'essai témoin, sans toxique. Dans chaque plaque de microtitrage on peut faire des essais sur huit substances différentes et sur leurs dilutions de moitié. B.Préparation bactérienne. Les bactéries lyophilisées sont réhydratrées par 10 ml de milieu L froid et incubées pendant 2 heures à 37 C. On ajoute 10 microlitres de cel- lules incubées dans chaque cupule de la plaque de microti- trage contenant la (les) substance(s)suspecte(s)et leurs dilutions. La plaque est incubée, sans secouage, à 37 C pendant 45 minutes C. Dévelopement de la couleur. Dans chaque cupule, on ajoute 100O microlitres de milieu HL (exemple 1) et on dé- termine le développement de la couleur par un lecteur de plaque de microtitrage (photomètre)10 minutes après.Le mi- lieu HM donne une couleur jaune après développement.Ou bien on peut employer de l'O-nitrophényl-bêta-D-galactoside, qui développe une couleur jaune et du bromo-chloro-indo- xyl-bêta-D-galactoside (X-Gal), qui développe une couleur bleu foncé. Des solutions des deux derniers chromogènes sont disponibles dans le commerce chez Organics Ltd., P.O.Box 360, Yavne 70650, ISRAEL, sous le nom de consti- tuants E et F du"SOS CHROMOTEST kit".La sélection du subs- trat chromogène est basée naturellement sur l'enzyme induite EXEMPLE 4Système de lyophilisation. (Système L) La lyophilisation est réalisée comme avec le système P avec les modifications suivantes: A. La dilutiondu toxique se fait dans du milieu L contenant 0,5 millimole de IPTG. B. Les bactéries réhydratées sont employées immédiate- ment apres la réhydratation, sans pré-incubation,et in- cubées pendant deux heures dans le mélange. EXEMPLE 5- Evaluation de la toxicité de l'azoture de sodium On prépare une solution d'azoture de sodium à 10% dans l'eau. On ajoute 20 microlitres de solution d'azoture de sodium dans la première cupule d'une plaque de microti- trage contenant 200 microlitres de milieu L avec 5 millimo- les de IPTG. On fait des dilutions en série pour obtenir des concentrations finales allant de 10 mg par millilitre à 0,0095 mg/ml. On ajoute 15 microlitres de suspension bac- térienne dans chaque cupule et on fait incuber la plaque pendant 2 heures comme il est décrit dans l'exemple 4.Pour comparer l'efficacité du FM et celle de la solution de chromogène jaune Orgenics pour déterminer l'activité de l'enzyme, on divise le contenu de chaque cupule (100 mi- crolitres)en portions égales. A chacune, on ajoute des portions en double de 50 microlitres de l'une des deux so- lutions chromogènes. Il se développe une couleur jaune que l'on évalue au bout de 10 minutes. Densité optique dans mg/ml d'azoture HM Orgenics 0,03 0,02 0,04 0,03 2,5 0,1 0,09 1,25 0,80 0,75 0,625 0,165 0,157 0,312 0,262 0,251 0,155 0,408 0,388 0,077 0,520 0,472 0,0385 0,752 0,642 0,019 1,00 0,90 0,0098 1,200 1,15 0 1,2 1,1 EXEMPLE 6- Essais sur toxiques et antibiotiques dans les systèmes L ou P de la manière d6crite dans les exemples 3 et 4. Toxiques Solvant. Concentration Système inhibitrice minimum (mg/ml) Patuline eau.0,5 P Mycotoxine T-2 éthanol 0,2 P Mycotoxine O.A.S. éthanol 0,6. P Arsenite de sodium eau 0,08 P,L Malathion eau 25 P,L Simbush éthanol 10 P,L Fluoroacétate de sodium éthanol 50 P,L Endosulfane eau 12 P Endosulfane eau 6.8 P,L NaN3 eau 19 P,L Simazine eau 19 P,L Acide cacodylique eau 750 P,L -alowax _ tha _1. PL- Antibiotiques; Penicilline G méthanol 5 P Néomycine éthanol 5 P Ampicilline eau 0,5 P Chloramphénicol. éthanol 0,2- P Erythromycine eau 0, 1- P Rifampycine eau 0,4 P Comme- on le voit ci-dessus, l'essai de toxicité selon la présente invention permet la détermina- tion nette et rapide de la concentration inhibitrice mi- nimum pour une grande variété de toxiques dans les conditions de terrain. La description se réfère sans cesse à des "toxiques" et des "antibiotiques" comme étant les substances analy- sées selon l'invention. Cependant, on comprendra que ces termes sont employés uniquement dans un but de commodité et ne sont pas censés être limitatifs. Ainsi, ces termes ont été employés comme désignation rapide de toutes les substances que l'on désire analyser, qui sont capables d'être décélées sur la base du principe de l'inhibition de la synthèse biomoléculaire de novo De même, bien que l'invention ait été décrite en ré- férence à un microorganisme d'essai particulier et à des inducteurs d'enzymes spécifiques, on comprendra que l'invention ne se limite à aucun microorganisme d'essai particulier et qu'elle est bien évidemment appropriée à n'importe quel microorganisme d'essai capable de répon- se au stress, de rétablissement après stress et d'induction de la manière décrite ci-dessus. Finalement, bien que l'invention ait été décrite spécifiquement avec référence à des moyens et modes de réalisation particuliers, on comprendra qu'elle n'est pas limitée aux indications particulières décrites et qu'elle s'étend à tous les équivalents dans le cadre des revendi- cations REVENDICATIONS 1.Procédé de mise en évidence de la présence d'une substance capable d'inhiber la synthèse biomoléculaire de novo dans un échantillon qui comprend:l'exposition d'un or- ganisme d'essai à cet échantillon et la détermination du degré d'inhibition de la synthèse de la biomolécule 2.Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'organisme est un microorganisme stressé en voie de rétablissement. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance capable d'inhiber la synthèse biomolé- culaire de novo est choisie parmi les toxiques et les anti- biotiques 4. Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que l'organisme d'essai est une bactérie. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette bactérie est une souche carencée en polysac- charides de E.coli et que cette biomolécule est une enzyme 6.Procédé selon la revendication caractérisé en ce que cette bactérie est E.coli ESS. 7.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que cet organisme est une bactérie et en ce que la syn- thèse biomoléculaire de novo est inhibée par la sécrétion d'un phage inhibiteur dans le microorganisme d'essai in- fecté par un bactériophage. 8.Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ce bactériophage est Charon 4, contenant le gène de la bêta-galactosidase 9.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est induit à synthétiser la biomolé- cule par un agent inducteur de--biomolécule. lO.Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la biomolécule est une enzyme. ll.Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'agent inducteur de la synthèse de la biomolécule est choisi parmi le lactose et l'isopropyl-bêta-D-thioga- lactopyranoside. 12. Procédé selon la revendication I, comprenant en outre la détermination du degré d'inhibition par addition,à un organisme d'essai exposé puis rétabli, d'un indicateur pour indiquer le degré auquel ladite substance inhibe la synthèse biomoléculaire de novo. 13.Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'indicateur est, un substrat chromogène sensible à une enzyme et en ce que le procédé comprend en outre l'évaluation du changement de couleur obtenu. 14.Procédé selon la revendication l,comprenant en outre l'exposition dudit échantillon audit organisme en présence d'un milieu de croissance pour ledit organisme. 15.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est un microorganisme stressé par lyophilisation. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on fait se rétablir ledit microorganisme en le réhydratant 17.Procédé selon la revendication!, caractérisé en ce que l'organisme est stressé par chauffage. 18.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme est stressé par une pression osmotique élevée. 19.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme est un microorganisme et en ce que la substance capable d'inhiber la synthèse biomoléculaire de novo agit uniquement sur la membrane cellulaire de cet or- ganisme et en ce que le procédé comprend en outre l'addition d'un toxique messager dont la toxicité est lifmi- tée par son incapacité à pénétrer-dans la paroi de la cel- lule jusqu'à l'échantillon d'essai. 20.Procédé selon la revendication 10,comprenant en outre l'addition d'un toxique messager au microorganisme stressé en voie de rétablissement. 21.Procédé de mise en évidence de la présence de toxiques ou d'antibiotiques dans un échantillon qui com- prend le mélange de l'échantillon avec une souche d'Escherichia col! carencée en polysaccharides qui a été stressée et qui est en voie de rétablissement et avec un mélange comprenant un inducteur spécifique d'une enzyme chromogène;l'incubation des bactéries dans le mélange; l'addition à ce mélange d'un substrat chromogène sensible à l'enzyme chromogène;et la détermination du chan- gement de couleur. 22.Procédé selon la revendication 21,caractérisé en ce que l'enzyme chromogène est la bêta-galactosidase et en ce que l'inducteur spécifique est un inducteur spécifique de la bêta-galactosidase. 23.Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'inducteur spécifique de la bêta-galactosidase est choisi parmi l'isopropylbêta-Dthiogalactopyranoside et le lactose., 24.Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que E.coli est stressée part-expos-itionà du chlorure de sodium à une concentration de l à 2$X Dans l.ditmélange. 25.Procédé selon la revendication 24,caraCtér-isé en--' ce que ce niélange contient!au moins un facteur qui- active le rétablissement de E.coli après le stress. 26.Procédé-selon la revendication -25,cajractérisé en ce qu'au moins un facteur comprend du chlorure de potassium et un composé choisi parmi I- proline et le glutamate mono- sodique 27.Procédé- selon la revendication.21,caractérisé- en ce que le mélange comprend de l'isopropyl-bêta-D-thiogalac- topyranoside comme inducteur spécifique de la bêta- galactosidase et qu'il comprend en outre (a) du chlorure de sodium à une concentration suffisante pour stresser la souche; et (b) du chlorure de potassium et du glutamate monosodique en.quantités suffisantes pour permettre à E.coli stressée de se rétablir du stress. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le mélange comprend en outre un milieu de croissance. 29. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'inducteur spécifique est un bactériophage. 30. Procédé selon la revendication 21, comprenant en outre l'addition d'un toxique messager au mélange. 31. Ensemble analytique destiné à l'emploi dans la mise en évidence de la présence d'une substance capable d'inhiber la synthèse biomoléculaire de novo dans un échan- tillon qui comprend: (a) un microQrganisme d'essai stressé; (b) au moins une substance permettant le rétablisse- ment du microorganisme d'essai stressé; et (c) un indicateur pour indiquer que la synthèse bio- moléculaire de novo s'est produite. 32. Ensemble selon la revendication 31, caractérisé en ce que le microorganisme stressé est une souche de E.coli carencée en polysaccharide lyophilisée. 33. Ensemble selon la revendication 32, caractérisé en ce que E.coli est E.coli ESS. 34. Ensemble selon la revendication 32, comprenant en outre un milieu de croissance pour le microorganisme. 35. Ensemble selon la revendication 31, comprenant: du chlorure de sodium à une concentration suffisante pour stresser le microorganisme d'essai et un inducteur spécifi- que de la bêta-galactosidase.- 36. Ensemble selon la revendication 35, caractérisé en ce que la substance qui permet le rétablissement après stress comprend du chlorure de potassium et une substance choisie parmi la proline et le glutamate monosodique; et en ce que l'inducteur spécifique de la bêta-galactosidase est une substance choisie parmi l'isopropyl-bêta-D-thiogalac- topyranoside et le lactose. 37. Ensemble pour mettre en évidence la présence d'une substance capable d'inhiber lma synthèse des pro- téines de novo dans un échantillon qui comprend: (a) une souche de E.coli carencée en polysaccharides lyophilisée; (b) un mélange contenant un milieu de croissance et un inducteur spécifique de la bêta-galactosidase; et (c) une solution de chromogène. 38. Ensemble selon la revendication 37, caractérisé en ce que l'inducteur spécifique de la bêta-galactosidase est choisi parmi l'isopropyl-bêta-Dthiogalactopyranoside et le lactose. 39. Mélange comprenant une souche de E.coli carencée en polysaccharides qui a été stressée et qui est en voie de rétablissement et un inducteur spécifique d'une enzyme chromogène. 40. Mélange selon la revendication 39 comprenant en outre au moins un facteur activant le rétablissement de E.coli après stress. 41. Mélange selon la revendication 40 comprenant en outre un agent inducteur de stress. 42. Mélange selon la revendication 41 caractérisé en ce que l'agent inducteur de stress est du chlorure de so- dium à une concentration de 15 à 25% et en ce que E.coli stressée est lyophilisée. 43. Mélange selon la revendication 40, caractérisé en ce que l'inducteur spécifique de l'enzyme chromogène est choisi parmi l'isopropyl-Dthiogalactopyranoside et le lactose; et en ce qu'au moins un des facteurs activant le rétablissement de E.coli après le stress est le chlorure de potassium ou une substance choisie la proline et le gluta- mate monosodique. 44. Mélange selon la revendication 39 comprenant en outre un échantillon dans lequel on recherche la présence d'une substance capable d'inhiber la synthèse biomoléculai- re de novo. 45. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme est stressé à une pression osmotique basse. 46. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que- l'organisme est un organisme stressé en voie de rétablissement. 47.- Procédé selon la revendication l,, caractérisé en ce que l'organisme contient un élément chromosomique sup- plémentaire codant la syntèse moléculaire de-novo. 48. Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que l'élément chromosomique supplémentaire est un plasmide.