Brevet FR2573771A1 — publié le 19860530

La présente invention concerne un procédé de production de peroxydase. Elle a plus particulièrement trait à un procédé de production de peroxydase à partir d'un bouillon de culture obtenu en cultivant un champi- gnon appartenant à la classe des Basidiomycetes. En général, la peroxydase est largement distribuée dans les plantes et est présente en grandes quantités dans le raifort, les figues, le radis japonais, etc. A l'heure actuelle, la peroxydase est produite industriellement à partir du raifort, parce que la teneur en peroxydase de la racine de cette plante est maximale, et elle trouve de nombreuses applications en tant que réactif diagnostique clinique, par exemple pour le dosage quantitatif du glucose, du chlolestérol total, etc., dans le sérum sanguin conjointement avec diverses oxydases, ou comme enzyme marqué dans l'analyse immunologique impliquant un enzyme. Comme peroxydase dérivée de micro- organismes, on mentionne la cytochrome- C- peroxydase, la NADH-peroxydase, etc., produites par des bactéries et des moisissures. Mais ces peroxydases diffèrent par leur action des peroxydases d'origine végétale telles que la peroxydase du raifort, etc., en sorte qu'on ne peut pas les utiliser comme réactif diagnostique clinique. Au cours des dernières années, il a été rapporté que des mirco-organismes appartenant aux genres Alternaria, Cochliobolus, Pellicularia et Curvularia (brevet japonais Kokai N 99192/1982) et au genre Bacillus (ibid., N 179488/1983) produisaient une peroxydase qui pouvait être utilisée comme réactif diagnostique clinique. Mais ces souches ne produisent que des faibles quantités de peroxydase, si bien qu'elles ne sont pas favorables à une production industrielle. Pour ces raisons, la Demanderesse a étudié de nombreuses souches de Basidiomycetes pour la production de peroxydases et il est résulté de cette étude qu'un certain micro-organisme de la classe des Basidomycetes produisait en grandes quantités dans son bouillon de culture une peroxydase ayant d'excellentes propriétés, utilisables comme réactif diagnostique clinique. La Demanderesse a ainsi réalisé la présente invention. Un objectif de la présente invention est donc de trouver un procédé pour la production industrielle à bas prix d'une peroxydase utilisable comme réactif diagnostique clinique, en cultivant la souche appartenant à la classe des Basidiomycetes. En bref, la présente invention propose un procédé de production de peroxydase, qui consiste à cultiver un micro-organisme producteur de peroxydase appartenant au genre Coprinus dans un milieu de culture et à recueillir dans le bouillon de culture résultant la peroxydase ainsi produite. La peroxydase obtenue par le procédé de la présente invention agit en catalysant le développement de couleur de chromogènes donneurs d'hydrogène comme le système 4-aminoantipyrine (appelée ci-après 4-AA)/- phénol, le système 4-AA/diméthylaniline, le système 4-AA/N-éthyl-N-hydroxyéthyl-m-toluidine (appelée ci- après EHMT) et le système 3-méthyl-2-benzothiazolinone- hydrazone (appelée ci-après MBTH), en présence de peroxyde d'hydrogène. Cette peroxydase peut donc être utilisée comme réactif diagnostique clinique. Les micro-organismes appartenant à la classe des Basidiomycetes utilisés dans la présente invention comprennent des souches appartenant au genre Coprinus de la famille des Coprinaceae, par exemple Coprinus macrorhizus K-1330. Cette souche a été isolée du corps fructifère à développement grégaire sur de la bouse de vache dans la ville d' Ootsu, Préfecture de Shiga, Japon, et les caractéristiques physiques du corps fructifère et des spores de cette souche K-1330 sont données ci-après. Chapeau de 2 à 5 cm de largeur, 1,5 à 4,5cm de hauteur, de forme cylindrique à conique au stade immature, puis en forme de cloche. Au début, la surface est grise et recouverte de poils doux d'un blanc pur devenant caducs et la surface devient lisse. Le chapeau est sillonné radialement de l'apex à la marge au niveau de laquelle il est irrégulièrement rugueux. Pendant la croissance, les lamelles s'enroulent vers le haut et commencent à se liquéfier. Lamelles denses. Pied de 3 à 10 cm de hauteur, blanc. Le substratum est gonflé et se prolonge finement en un pseudorhize (3-5 cm de longueur). Spores ellipsoïdes, lisses, 11-15 x 6,8 gm. Dépôt des spores formant une empreinte noire. Se développent sur le tas de fumier et la bouse des bovidés. Cette souche a été déposée sous le numéro de dépôt FERM BP-648 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology;, Japon. D'autres particularités de la présente inven- tion ressortent de la description détaillée suivante, faiteen regard du dessin annexé sur lequel: La figure 1 est un graphique représentant la relation activité-pH du peroxyde obtenu par la présente invention. La figure 2 montre la relation activité- pH de cet enzyme après traitement à 37 C pendant 60 minutes et à des pH différents. La figure 3 montre la relation activité-température de cet enzyme. La fi- gure 4 montre la - relation activité- température de cet enzyme après traitement à pH 7,0 pendant 10 minutes et à des températures différentes. La figure 5 montre le spectre d'absorption visible de cet enzvy- me (concentration de l'enzyme, 0,057%; pH 7,0). Sur les figures 1 à 4, l'axe des ordonnées indique l'activité relative (%) et l'axe des abscisses indique le pH (figures 1 et 2) et la température en OC (figures 3 et 4). Sur la figure 5, l'axe des abscisses porte la longueur d'onde en nanomètres et l'axe des ordonnées indique l'absorbance. En ce qui concerne, d'une manière plus détail- lée, le procédé de la présente invention, toute source nutritive bien connue peut être ajoutée au milieu de culture, si -la souche utilisée peut l'exploiter pour produire de. la peroxydase. Gomme source de carbone, on peut utiliser par exemple le glucose, l'amidon, le saccharose, le maltose, le lactose, le glycérol, la dextrine, des huiles et des graisses, etc. Comme source d'azote, on peut utiliser de l'extrait de levure, de la peptone, du soja dégraissé,de l'extrait soluble de mais, un extrait de viande, etc. De même, on peut utiliser des substances inorganiques et des sels métalliques comme des phosphates, des sels de potassium, des sels de magnésium, etc. En particulier, l'addition d'un sel de fer (par exemple sulfate de fer, chlorure de fer, nitrate de fer, etc.) est souhaitable attendu que la production de peroxydase en est grandement favorisée. La quantité de ce sel de fer est en général de 0,01 à 0,50% (en poids/volume, de préférence de 0,08 à 0,20% (en poids/volume). Lors de la culture de la souche appartenant au genre Coprinus, la production de peroxydase varie grandement selon les conditions de culture. En général, la température de la culture est de préférence de 20 à 35 C, le pH du milieu de culture est de préférence de 4 à 8 et la production de la peroxydase atteint un maximum par culture avec aération et sous agitation pendant 4 à 12 jours. Dans ce cas, il est naturel que la condition de culture soit déterminée de manière à obtenir une production maximale de peroxydase conformément à la souche particulière et à la composition particulière du milieu que l'on utilise. La peroxydase élaborée par les organismes de la présente invention est présente principalement dans le filtrat du bouillon de culture, et elle est séparée sous forme de précipité par l'addi- tion de 20 à 80% en poids/volume d'un agent précipitant (par exemple du sulfate d'ammonium) ou de 50 à 80% en poids/volume d'un solvant organique (par exemple alcool, acétone) au filtrat du bouillon de culture. Le précipité obtenu est débarrassé des sels par ultrafiltration, dialyse ou traitement sur "Sephadex" pour obtenir une solution d'enzyme brut. Pour purifier la solution d'enzy- me brut ainsi obtenue, on traite la solution comme suit: on fait adsorber la solution sur une colonne de "DEAE- Sepharose CL-6B" préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0, 01M (pH 7,0) et on lave la matière adsorbée avec un tampon au phosphate 0, 02M (pH 7,0) et on l'élue avec un tampon au phosphate 0,1M (pH 7,0) pour recueillir une fraction active. Cette fraction active est ensuite concentrée et débarrassée des sels par ultrafiltration, réadsorbée sur une colonne de "DEAE-Sepharose CL-6B" tamponnée avec un tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0), et la matière adsorbée est lavée avec un tampon au phos- phate 0,02M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate 0,05M (pH 7,0) pour recueillir une fraction active. Cette fraction active est ensuite dialysée vis-à-vis d'eau distillée et elle est lyophilisée en vue d'obtenir l'enzyme purifié en poudre. Cet enzyme purifié en poudre présente une seule bande dans l'électrophorèse sur disque de gel de polyacrylamide. Les propriétés enzymologiques et physicochimi- ques de la peroxydase- -de la présente invention sont les suivantes: (1) Action: Cet enzyme agit très spécifiquement sur le peroxyde d'hydrogène en catalysant l'oxydation de divers composés qui peuvent devenir des donneurs d'hydro- gène en présence de peroxyde d'hydrogène. Le mécanisme de la réaction est le suivant: H202 + AH2 -) 2H20 + A o AH2 représente un donneur d'hydrogène et A représente un donneur d'hydrogène oxydé. (2) Spécificité envers des donneurs d'hydrogène: La spécificité de cet enzyme envers des donneurs d'hydrogène préparés en associant le 4-AA avec divers composés a été examinée (Tableau I). TABLEAU I Longueur d'onde Activité (nm) utilisée relative Composé dans la mesure (%) Phénol 500 100 Résorcinol " 10 Pyrocatéchol " 58 Hydroquinone " 10 "Naphtol " 18 2,4-Dibromophénol 520 47 2,4-Dichlorophénol " 115 2,6Dichlorophénol " 154 2,4,6-Trichlorophénol " 96 Diméthylaniline 550 21 Diéthylaniline " 49 EHMT " 62 De même, on a examiné (tableau II) la spécifi- cité de cet enzyme envers des donneurs d'hydrogène prépa- res par association de MBTH avec la diméthylaniline, la diéthylaniline ou l'EHMT. Dans ce test, on a pris pour valeur 100 la valeur d'activité du système 4-AA/phé- 7 =- nol, donneur d'hydrogène utilisé comme témoin. TABLEAU II Longueur d'onde Activité (nm) utilisée relative Composé dans la mesure (%) Diméthylaniline 590 50 Diéthylaniline " 49 EHMT " 41 4-AA/phénol 500 100 (3) pH optimal et stabilité au pH: Cet enzyme a une grande activité au voisinage d'un pH égal à 7,0 comme le montre le graphique de la figure 1. Une solution tampon à l'acétate a été utilisée pour un pH de 3 à 3,5, une solution tampon au phosphate pour un pH de 6 à 8,5 et une solution tampon au borate pour un pH de 9 à 9,5. La stabilité au pH de cet enzyme lorsqu'il a été traité -à 37 C pendant 60 minutes et à des pH différents, est reproduite sur la figure 2. Comme le fait apparaître la figure 2, cet enzyme est stable entre pH 6,0 et pH 7,5. (4) Température optimale et thermostabilité: Cet enzyme a -une température optimale au voisinage de 35 à 40 C comme le montre le graphique de la figure 3. La thermostabilité de cet enzyme lorsqu'il a été traité pendant 10 minutes à un pH de 7,0 et à des températures différentes, est reproduite sur la figure 4. Cet enzyme est stable jusqu'à 45 C. (5) Poids moléculaire: Le poids moléculaire de cet enzyme est d'envi- ron 37 000, déterminé par la méthode de filtration sur gel de "Sephacryl S-200" (produit de la firme Pharmacia) et d'environ 41 000 par la méthode électrophorétique sur gel de SDS-polyacrylamide. (6) Homogénéité: Une électrophorèse sur disque a été effectuée en utilisant un gel à 7,5% de polyacrvlam.ide (pH 9,4) et la protéine a été colorée. On observe une seule bande colorée de protéine. Une seule bande s'observe également dans l'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide. (7) Point iso-électrique: Le point iso-électrique de cet enzyme mesuré par la méthode de convergence iso-électrique utilisant le "Pharmalyte" (pH 3-10; produit de la firme Pharmacia) a une valeur de 3,4 à 3,5. (8) Effets d'inhibiteurs, d'ions métalliques et d'agents chélateurs métalliques: Cet enzyme est inhibé par les ions HG 2+, le cya- nure de potassium, l'azoture de sodium, la thio-urée, etc. (Tableau III). TABLEAU III Additif Activité Activité (1 mM) relative Additif relative (%) (1 mM) (%) Aucune addition 100 Acide iod- 100 acétique L-cystéine 105 EDTA 97 Dithiothréitol 95 CuSO4 105 Thio-urée 57 MnCl2 86 Cyanure de potas- sium 22 FeCl3 107 Azoture de sodium 52 BaCl2 96 PCMB* 98 CoCl2 98 PMSF** 98 ZnCl2 85 Fluorure de sodium 103 SnCl2 92 Sulfure de sodium 82 NiSO4 92 c,a'-Dipyridyle 103 HgCl2 6 o-Phénanthroline 88 * Acide pchloromercuribenzoïque ** Fluorure de phénylméthylsulfonyle (9) Spectre d'absorption visible: Ce spectre est représenté sur la figure 5. (10) Mesure de l'activité enzymatique: L'activité en peroxydase a été mesurée sur le système 4-AA/phénol utilisé dans le diagnostic clinique comme donneur d'hydrogène. En fait, la réaction a été conduite à 37 C pendant 60 secondes en utilisant 3,0 ml d'une solution réactionnelle comprenant 0, 1 ml de solution de peroxyde d'hydrogène 5 mM, 1,0 ml de - tampon au phosphate 0,3M (pH 7,0), 0,1 ml de solution de 4-AA 24,6 mM, 0,1 ml de solution de phénol 0,42 M, 1,6 ml d'eau et 0,1 ml de la solution d'enzyme convenable- ment diluée, et l'absorbance à 500 nm a été mesurée (DO échantillon). On a ajouté séparément pomme témoin 0,1 ml d'eau à la place de la solution de peroxyde d'hy- drogène, on a mesuré l'absorbance de la même manière que ci-dessus (DOblanc) et on a fait la différence DO500 entre Dchantillon et DO blanc L'activité en per- oxydase est calculée d'après l'équation suivante: àADO500(DO chantillon DOblanc)xVtxdf Unités/ml= 6,17xtxVs =ADO500x4,86xdf Vt: Volume de la solution réactionnelle (3,0ml) Vs: Volume de la solution d'enzyme (0,1 ml) 6,17: Coefficient d'extinction moléculaire par millimole d'un colorant du type quinone- imine à 500 nm (cm2/micromole) t: Temps de réaction (1 minute) df: Vitesse de dilution Exemple expérimental - Effet de sels de fer sur la produc- tion de peroxydase On a introduit 100 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2P04 et 0,1% de MgSO4.7H20 dans chacune de plu- sieurs fioles d'Erlenmeyer de 500 ml et on a ajouté aux fioles du FeS04. 7H20 de manière que ses concentrations respectives soient de 0%, 0,04%, 0, 08%, 0,12%, 0,16%, 0,20%, 0,24% et 0,32%. Après stérilisation à 120 C pendant minutes, on a refroidi les fioles, on les a inoculées avec Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) et on a conduit la culture à 26 C pendant 5 à 10 jours en agitant à une vitesse de 100 tr/min et en prélevant périodiquement des échantillons. Les bouillons de culture ainsi obtenus ont été filtrés pour éliminer les mycélium, et l'activité en peroxydase (activité maximale) de chaque filtrat obtenu a été mesurée. Le résultat est indiqué sur le tableau IV. 1 1 TABLEAU IV Quantité ajoutée de Activité en peroxydase FeS04.7H20 (%) (activité maximale, unités/ml) Aucune addition 19,4 0,04 28,0 0,08 46,4 0,12 75,5 0,16 80,2 0,20 66,2 0,24 36,8 0,32 17,0 Comme le fait apparaître le tableau IV, la production de la peroxydase a été remarquablement améliorée par l'addition du sel de fer au milieu. D'après ce tableau, la concentration optimale en FeSO4.7H20 est de 0,12 à 0,20%. Un procédé de production de peroxydase conformé- ment à la présente invention est illustré par les exemples ci-après, mais la présente invention n'est pas limitée à ces exemples. Exemple 1 Un milieu incliné contenant 2% de glucose, 0,5% de "Ebios" et 1,5% de gélose (milieu "Ebios") a été inoculé avec Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP- 648) et la culture a été effectuée en maintenant le milieu au repos à 25'C pendant une semaine pour obtenir une culture d'ensemencement. On a chargé, séparément, dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml, 100 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2P04 et 0,1% de MgS04.7H20 et après stérilisation à 120'C pendant 20 minutes, on a refroidi les fioles et on les a inoculées avec la culture d'ensemence- ment ci-dessus. Ensuite, on a conduit la cultU-re à 27 C pendant 10 jours en agitant à une vitesse de 100 tr/min. Une fois la culture terminée, on a enlevé le mycélium par filtration pour obtenir un filtrat. L'activité en peroxydase de ce filtrat a été de 20,0 unités/ml. Exemple 2 100 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2P04 et 0,1% de MgS04.7H20, chargés comme ci-dessus dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml et stérilisés à 120 C pendant 20 minutes, ont été inoculés avec Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) cultivé dans le milieu "Ebios" de l'exemple 1 et la culture a été conduite à 26"C pendant 7 jours pour obtenir un bouillon de culture d'ensemencement. On a chargé séparément dans un appareil de fermentation à récipient de 30 litres, 20 litres d'un milieu contenant 2% de glucose, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2P04, 0,1% de MgSO4. 7H20, 0,005% de GuSO4.5H20 et 0,02% d'un agent anti-mous- sant (CB-442; produit de la firme Nippon Yushi Co-) et la stérilisation a été conduite à 120 C pendant 20 minutes. Après refroidissement, le milieu a été inoculé avec 100 ml du bouillon de culture d'ensemencement ci- dessus et il a été cultivé à 26 C pendant 6 jours dans des conditions choisies de manière que la vitesse d'aéra- tion soit de 13 litres par minute et que la vitesse d'agitation soit de 270 tr/min. Une fois la culture terminée, le mycélium a été enlevé par filtration pour obtenir un filtrat. L'activité en peroxydase de ce filtrat était de 41,5 unités/ml. Le sulfate d'ammonium a ensuite été ajouté à 17 litres de ce filtrat pour atteindre la saturation à 80%, et après repos pendant un jour entier et une nuit, le précipité résultant a été dissous dans environ 500 ml de tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0). La solution d'enzyme brut ainsi obtenue a été concentrée et débarrassée des sels par ultrafiltration et adsorbée sur une colonne [5,0 cm (diamètre) x 4 cm (longueur)] de "DEAE-Sepharose CL-6B" préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,01 M (pH 7,0). La colonne a été lavée avec un tampon au phosphate 0,02M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate O,1YM (pH 7,0) afin de recueillir une fraction active. Cette fraction active a ensuite été concentrée et débarrassée des sels par ultrafiltration, et réadsorbée sur une colonne [(2,5 cm (diamètre) x 4 cm (longueur)] de "DEAE- Sepharose CL-6B" tamponnée avec un tampon au phosphate 0,01 M (pH 7,0). La colonne a été lavée avec un tampon au phosphate 0,02 M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate 0,05M (pH 7,0) pour recueillir une fraction active. La fraction active ainsi obtenue a été dialysée contre de l'eau distillée et lyophilisée pour obtenir 494 mg d'une poudre d'enzyme purifié. L'activité spécifi- que de cette poudre était de 1180 unités/mg. Cette poudre d'enzyme a présenté une seule bande dans l'électrophorèse sur disque de gel de polyacrylamide. Les étapes de purifi- cation décrites ci-dessus sont reproduites sur le tableau IV. TABLEAU IV Teneur totale Activité Activité Rende- en protéine totale spécifique ment (mg) (unités) (unités/mg) (%) Filtrat de la culture 237 500 707 000 2,98 100 Relargage au sulfate d'am- monium 41 200 724 000 17,6 102 Ultrafiltration 17 000 703 000 41,4 99,4 Premier traitement sur "DEAE-Sepha- rose CL-6B" 1440 699 000 485 98,9 Second traitement sur "DEAE-Sepha- rose CL-6B" 494 583 000 1180 82,5 Exemple 3 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KHP4 0,1% de MgS04.7H20 et 0,16% de FeSO4.7H20, tels que char- gés précédemment dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml et stérilisés à 120 C pendant 20 minutes, ont été inoculés avec Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP- 648) qui avait été cultivé dans le milieu "Ebios" de l'exemple 1, et la nouvelle culture a été cultivée à 26 C pendant 10 jours sous agitation à une vitesse de tr/min. Une fois la culture terminée, le mycélium a été enlevé par filtration pour obtenir un filtrat. L'activité en peroxydase de ce filtrat était de 79,4 unités/ml. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de peroxydase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro- organisme producteur de peroxydase appartenant au genre Coprinus dans un milieu de culture -et à recueillir la peroxydase produite dans le bouillon de culture résultant. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que la culture est conduite dans un milieu de culture contenant un sel-de fer. - 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM-BP-648);