Brevet FR2579616A1 — publié le 19861003

La présente invention concerne la préparation d'une enzyme, la superoxyde dismutase (ci-après SOD). La superoxyde dismutase catalyse la réaction de dismutation o + et est 2H + 2 O2-+O2-2H+ - O2 + H2O2 + H202 et est obtenue par purification à partir d'étythrocytes bovins. La SOD a été proposée dans le traitement d'affections diverses. En particulier la SOD a été proposée, par exemple,pour empêcher l'hyper-perméabilité capillaire au niveau de la microcirculation, dans le traitement de la maladie de Crohn, dans la prévention des accidents de radiothérapie. La SOD peut être préparée par le procédé décrit par Joe M. McCord et Fridovich I., J. Biol. Chem., 224, 6049-6055 (1969). Ce procédé comprend essentiellement les étapes suivantes a) l'obtention d'un lysat d'érythrocytes, en particulier d'érythrocytes bovins b) la précipitation du lysat obtenu afin d'éliminer, par exemple par centrifugation, les débris cellulaires et recueillir un surnageant contenant la SOD ; et c) la purification de la SOD contenue dans le surnageant. La préparation du lysat peut être effectuée comme cela est décrit dans l'article de Fridovich, à partir de sang de boeuf traité par un anticoagulant tel que le citrate de sodium, puis centrifugé pour séparer les érythrocytes. Les érythrocytes obtenus sont alors lysés par addition d'eau désionisée, de préférence volume à volume. Ce lysat est alors précipité par un mélange éthanol/chloroforme 5/3 (v/v) environ qui laisse un surnageant contenant la SOD. Le procédé décrit par Fridovich utilise un rapport volume de lysat traité/volume de mélange de précipitation de 2,5. La demanderesse a pu mettre en évidence le fait que l'utilisation d'un tel rapport ne permettait pas de se débarrasser de l'hémoglobine qui reste présente dans la suite des opérations. C'est pourquoi la présente invention concerne un perfectionnement du procédé de Fridovich dans lequel le rapport en volume lysat d'érythrocyte/volume du mélange éthanol + chloroforme est compris entre 1,5 et 1,6 et est, de préférence, de 1,56. Le surnageant de cette purification, qui ne contient pratiquement plus d'hémoglobine et de membrane est prélevé puis précipité comme cela est décrit par Fridovich à l'aide de K2HPO4 à 300 g/l. La phase supérieure éthanolique est prélevée et contient sensiblement toute l'activité SOD. Après une éventuelle centrifugation de nettoyage, la phase surnageante est précipitée à 40C par de l'acétone à 0,75 volume, c'est-à-dire environ 45 1 pour 60 1 de surnageant. L'opération est, de préférence, effectuée dans une colonne de ddcantation avec recyclage de ce qui arrive à la partie basse dans la partie haute. On laisse décanter une nuit et on recueille, après une éventuelle centrifugation, le précipité blanc qui contient pratiquement toute l'activité SOD. Le dépôt est repris pour être purifié. Selon la présente invention, la purification est effectuée, de préférence, de la façon suivante Le précipité repris par de l'eau est désalé, placé sur une colonne SAEG (Pharmacia) ou équivalente et relargué à partir de cette colonne ; à la différence du procédé de Fridovich qui utilise une colonne SAE et un gradient de phosphate de potassium. Après relargage de la SOD, les queues obtenues moins pures sont repassées sur la colonne et on obtient globalement un rendement de 70 % environ, ce qui est supérieur au rendement des procédés connus. Le produit ainsi obtenu est sous une forme très pure. Il peut être conditionné par exemple en ampoule pour injection, par exemple de 2 mg de protéine et 6 000 unités. Les études de tolérance et de conservation ont montré que la SOD préparée par ce procédé était très bien tolérée et pouvait être conservée sans dénaturation dans des conditions normales. EXEMPLE On prélève 400 1 de sang de boeuf en bidon de 20 1 sur citrate de sodium, 10 l de sang/bidon. On centrifuge le sang prélevé, en présence d'anticoagulant, dans une centrifugeuse de transfusion à une vitesse suffisante pour sédimenter les érythrocytes du plasma. Les étythrocytes sédimentés sont remis en suspension dans le sérum physiologique et centrifugés à nouveau pour les laver. Les érythrocytes sédimentés sont lysés dans une quantité équivalente d'eau légèrement adoucie (eau de Château-Landon passée sur résine). Le lysat obtenu est précipité avec un mélange éthanol 10 1 - - = = 1,66 chloroforme 6 1 en utilisant 64 1 de mélange pour 100 1 de lysat. La précipitation est effectuée à froid. On obtient alors un gâteau solide et après repos d'une nuit un surnageant qui contient la SOD. Ce surnageant est recueilli et mis dans une colonne de précipitation, puis précipité avec 300 g/l de K2HP04. Il se forme deux phases, la phase inférieure contient du sel, la phase supérieure contient la SOD. Cette phase supérieure est placée dans une autre colonne de précipitation et précipitée par de l'acétone préalablement refroidie. La quantité est de 0,75 volume, soit 45 1 pour 60 1 de phase supérieure. Pour obtenir un bon mélange on recueille audessous ce qui arrive et on le replace sur le haut de la colonne. On laisse reposer une nuit. Il se forme un dépôt blanc qui est recueilli et centrifugé. Ce dépôt blanc contient la SOD. Il est repris avec de l'eau distillée et désalée au travers d'un filtre millipore préalablement traité par du sulfate de cuivre. La solution ainsi obtenue est placée sur une colonne contenant du gel Pharmacia SAEG au lieu de SAE. Cette purification ne se peut pas par un gradient de potassium, mais par relargage. Les queues qui sont moins pures sont repassées sur la colonne et un rendement de 70 % est ainsi obtenu, soit dans le cas présent environ 17 g de SOD. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de superoxyde dismutase (SOD) à partir d'un lysat d'érythrocyte par précipitation du lysat avec un mélange éthanol/chloroforme dans un rapport d'environ 5/3, le surnageant contenant la SOD étant prélevé et la SOD purifiée à partir de ce surnageant, caractérisé en ce que le rapport en volume du lysat d'érythrocyte /volume du mélange éthanol/ chloroforme est de l'ordre de 1,5 à 1,6. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SOD est purifiée à partir du surnageant par précipitation avec K2HP04 et récupération du nouveau surnageant et précipitation par l'acétone à froid et récupération du précipité. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la SOD est purifiée à partir d'une solution aqueuse par relargage sur une colonne SAEG. 4) Superoxyde dismutase obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 3.