Brevet FR2573870A1 — publié le 19860530

i La présente invention concerne un procédé d'utilisa- tion d'un instrument du type microscope et plus particulière- ment d'un instrument du type microscope qui comporte une cham- bre d'écoulement permettant l'analyse de particules situées dans un échantillon de fluide traversant la chambre. Les instruments du type microscope permettant d'analy- ser des particules, comme par exemple des particules biologi- ques, sont bien connus dans la technique. De façon typique, on effectue la mise au point de ces instruments du type micros- cope sur les particules qui sont situées sur une lamelle ou sont en suspension dans un échantillon de fluide en circula- tion dans une chambre d'écoulement. Ce dernier cas est bien connu dans la technique. Le brevet US n 3 893 766 et la deman- de de brevet US RF 29 141 ainsi que le brevet US n 4 338 024 décrivent un type de chambre d'écoulement, qui peut être utili- sé avec un instrument du type microscope pour l'analyse des particules la traversant. Dans l'ensemble de ces documents, la chambre d'écoulement est caractérisée en ce qu'elle comporte une admission et une sortie munies-d'un passage s'étendant de- puis l'admission jusqu'à la sortie. Le passage possède une zone de formation d'images, sur laquelle est dirigée l'instrument. La chambre d'écoulement possède une épaisseur qui diminue essen- tiellement sur l'étendue du passage depuis l'admission jusqu'à la zone de formation d'images. Dans le brevet US n 4 338 024, un fluide d'enveloppement est également introduit dans la cham- bre d'écoulement afin de guider l'échantillon de fluide depuis l'admission jusqu'à la sortie. Dans le brevet US n 3 893 766, le fluide d'enveloppement est acheminé par des moyens'd'amenée de l'écoulement d'enveloppement, qui inclut une pluralité de tubes s'étendant dans la direction de l'écoulement du fluide entourant le tube véhiculant l'échantillon. Cependant aucun des documents cités n'indique ou ne sug- gère les paramètres nécessaires pour faire fonctionner les mo- yens d'analyse microscopique en rapport avec les dimensions de la chambre d'écoulement. Conformément à la présente invention, on indique un pro- cédé d'utilisation d'un instrument du type microscope. Ce procédé d'utilisation d'un instrument du type mi- croscope comportant des moyens d'analyse microscopique analy- sant des particules dans un échantillon de fluide circulant de convert avec un fluide d'enveloppement dans une chambre d'écoulement, qui possède une admission et une sortie et un passage s'étendant depuis l'admission jusqu'à le sortie et pos- sédant une zone de formation d'images sur laquelle se trouvent C dirigés lesdits moyens d'analyse microscopique, et des moyens servant à répartir l'échantillon de fluide et le fluide d'en- veloppement depuis l'admission jusqu'àa la zone de formation d'images essentiellement selon un écoulement plan caractéri- sé par une largeur et par une épaisseur, ledit fluide d'enve- loppement et ledit échantillon de fluide étant entraînés de- puis ladite admission jusqu'à la sortie, et lesdits moyens d'a- nalyse microscopique comportant une lentille optique servant à effectuer la mise au point sur ladite zone de formation d'i- mages, est caractérisé en ce qu'il consiste à choisir le débit d'écoulement du fluide d'enveloppement de manière à produire un écoulement laminaire plat au niveau de la zone de formation d'images, diriger lesdits moyens d'analyse microscopique sur ladite zone de formation d'images selon une direction parallè- le à ladite épaisseur, choisir la distance de travail de la- dite lentilleoptique de manière qu'elle soit supérieure à la distance entre le plan image et l'extérieur de ladite chambre au niveau de ladite zone de formation d'images, choisir la profondeur de champ de ladite lentille optique de manière qu'elle soit nettement inférieure à l'épaisseur de ladite chambre au niveau de ladite zone de formation d'images, et maintenir le débit dudit échantillon de fluide et dudit fluide d'envelop- pement de manière que les particules dudit échantillon de flui- de circulent dans l'espace correspondant à la profondeurdechamp de ladite lentille optique au niveau de ladite zone de forma- {ion d'images. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description donnée ci-après pri- se en référence aux dessins annexés, sur lesquels: - la figure 1 est une vue en coupe transversale d'un appareil utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention; - la figure 2 est une vue en coupe transversale, à une échelle nettement agrandie, d'une partie de l'appareil repré- senté sur la figure 1; - la figure 3 est une vueenrlan d'un appareil utilisé pour la mise en oeuvre du procédé conforme àa la présente in- vention; et - la figure 4 est une vue en coupe transversale de l'ap- pareil de la figure 3. En se référant aà la figure 1, on y voit représentée une vue en coupe transversale d'un appareil 10 utilisé pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. L'appareil 10 comporte une chambre d'écoulement 12 possédant une zone de formation d'images 14, sur laquelle se trouvent dirigés des moyens d'analyse microscopique 16. Iesmoyens d'ana- lyse microscopique 16 sont disposés d'un côté de la chambre 12. Une source de lumière 18 fournit l'éclairement des moyens d'analyse microscopique 16 et est située de l'autre côté de la chambre 12. La chambre d'écoulement 12 comporte une admis- sion 20, une sortie 22 et un passage 24 s'étendant depuis l'ad- mission 20 jusqu'à la sortie 22. Le passage 24 inclut la zone de formation d'images 14. L'échantillon de fluide, qui con- tient les particules auxquelles on s'intéresse, comme par exem- ple du sang ou de l'urine, est véhiculé àa travers la chambre d'écoulement 12 en pénétrant dans l'admission 20, et est en- suite entraîné à travers le passage 24 jusqu'à la sortie 22. Des fluides d'enveloppement sont également envoyés à la cham- bre d'écoulement 12 par l'intermédiaire des admissions de flui- de 26 et 28. Les admissions de fluide 26 et 28 sont situées respectivement d'un côté et de l'autre de l'admission 20 et en cmont de cette dernière. La distance entre l'admission 20, o l'échantillon de fluide pénètre dans le passage 24, et la zone de formation d'images 14 est désignée par L. Le passage 24 est caractérisé par une épaisseur et une largeur qui dimi- nuent sensiblement au fur et à mesure qu'on se déplace dans le passage 24 depuis l'admission 20 jusau'à la zone de rétré- cissement 21. a partir de la zone de rétrécissement 21 et jus- qu'à la sortie 22, l'épaisseur de la chambre d'écoulement res- te constante, tandis que la largeur augmente. La surface en coupe transversale de la chambre d'écoulement diminue depuis l'admis- sion 20 jusqu'à la zone de rétrécissement 21. Ensuite la sur- face en coupe transversale augmente. Les moyens d'analyse mi- croscopique incluent une lentille 30 qui est représentée sur la figure 2. En se référant à la figure 2, on y voit représentée, selon une vue en coupe transversale, à une échelle nettement agrandie, une partie de la chambre d'écoulement 12 représentée sur la figure 1. La partie de la chambre d'écoulement 12 repré- sentée sur la figure 2 est la partie qui est proche de la zone de formation d'images 14. La lentille optique 30 est focalisée sur la zone de formation d'images 14. La lentille optique 30 est caractérisée en ce qu'elle possède une distance de-travail WD' En outre la lentille optique 30 possède une profondeur de champ FD L'épaisseur de la chambre d'écoulement 12 au niveau de la zone de formation d'images 14 est désignée par d. Enfin l'é- chantillon de fluide possède une épaisseur t au niveau de la zone de formation d'images 14. Selon le procédé conforme à la présente invention, l'é- chantillon de fluide est introduit dans le courant d'écoule- ment du fluide d'enveloppement. Le fluide (incluant l'échan- tillon de fluide et le fluide d'enveloppement) traverse la zone de rétrécissement 21 qui possède une section en coupe trans- versale de forme rectangulaire dont la largeur est égale à un multiple de son épaisseur. Dans la zone de formation d'images 14, le fluide est maintenudansl'état d'un écoulement plat. De façon typique la largeur est égale à 0,813 mm et l'épaisseur est égale à 0,05 mm. Le débit du fluide est choisi de manière à obtenir un écoulement laminaire. Comme indiqué dans le bre- vet US n 3 893 766, un écoulement laminaire peut être mainte- nu par les moyens fournissant l'écoulement d'enveloppement qui incluent une pluralité de tubes dirigés vers le centre du con- duit suivant la direction de l'écoulement et entourant le tube d'amenée de l'échantillon. Les tubes agissent de manière à em- pêcher toute turbulence de sorte que le fluide pénétrant dans la chambre d'écoulement est "collimaté" et n'est pas turbulent. Lorsque l'échantillon de fluide pénètre dans la chambre d'é- coulement, le fluide prend la forme d'un écoulement de fluide laminaire. L'écoulement laminaire peut être-obtenu sans l'u- tilisation des tubes, si l'on introduit un fluide à faible vi- tesse dans un conduit suffisamment long avant sa pénétration dans la chambre d'écoulement 12. De façon typique la vitesse du fluide d'enveloppement dans la chambre d'écoulement au ni- veau de la zone de formation d'images 14 se situe dans la gam- me comprise entre 0,7 x 103 mm/s et 2,7x 103 mm/s. Une fois que l'écoulement laminaire est établi, l'écoulement du fluide d'enveloppement possède un profil de vitesse. De préférence les moyens d'analyse microscopique 16 sont situés a l'endroit ou au-delà de l'endroit o le fluide d'écoulement a atteint un profil de vitesse essentiellement constant, qui présente la forme d'une parabole. Ainsi la distance L est de façon ty- pique égale à 12,7 mm. Une fois que la distance entre l'admission et la zo- ne de formation d'images est déterminée, l'épaisseur extérieu- re D au niveau de la zone de formation d'images 14 de la cham- bre d'écoulement 12 est déterminée. La distance de travail WD de la lentille 30 doit alors être choisie supérieure à la dis- tance entre le plan image et l'extérieur de la chambre d'écou- lement 12 au niveau de la zone de formation d'images 14. La distance de travail W de la lentille 30 et la dis- tance extérieure D au niveau de la zone de formation d'images tance extérieure D au niveau de la zone de formation d'images étant définies, la profondeur de champ FD de la lentille 30 est choisie de manière à être nettement inférieure à l'épaisseur extérieure D. L'épaisseur T de l'échantillon de fluide au niveau de la zone de formation d'images 14 doit être comparable ou in- férieure à la profondeur dechamP FDde la lentille 30. L'épais- seur T de l'échantillon de fluide au niveau de la zone de for- mation d'images 14 est déterminée par les vitesses d'écoule- ment de l'échantillon de fluide et du fluide d'enveloppement. Les débits de l'échantillon de fluide et du fluide d'envelop- pement peuvent être réglés par modification de l'épaisseur T de l'échantillon du fluide au niveau de la zone de formation d'images 14. Naturellement, comme indiqué précédemment, le dé- bit du fluide d'enveloppement est limité, afin d'obtenir un écoulement laminaire. Dans le cas o l'épaisseur T de l'échantillon de flui- de au niveau de la zone de formation d'images 14 est supérieu- re à la profondeur de champ FD de la lentille 30, le procédé con- forme à la présente invention peut être encore mis en oeuvre en modifiant le débit de l'écbantillon de fluide et du fluide d'enveloppement de manière que les particules, auxquelles on s'intéresse dans l'écoulement de l'échantillon de fluide, cir- culent au centre du courant de l'échantillon de fluide, o elles sont situées à l'intérieur de la profondeur de champ de la lentille optique 30. Finalement, pour observer les particules dans l'échan- tillon de fluide, on choisit comme source de lumière 18 une lumière d'échantillonnage stroboscopique. La durée de l'im- pulsion de la source de lumière 18 doit être suffisamment bré- ve pour "geler" l'image de l'échantillon de fluide. Naturelle- ment la durée de l'impulsion de la source de lumière permet- tant de "geler" l'image est déterminée par le débit de l'échan- tillon de fluide. Cependant, une fois que le débit de l'échan- tillon de fluide est réglé, comme indiqué ci-dessus, la durée minimum de l'impulsion est alors également déterminée. On va maintenant décrire une forme de réalisation spé- cifique. Une chambre d'écoulement 12 a pour dimensions 0,4 cen- timètre (largeur) et 0,005 centimètre (profondeur, dimension intérieure) au niveau de la zone de formation d'images. La lon- gueur est de 3,81 centimètres. La distance L entre l'admission et la zone de formation d'images 14 est choisie supérieure à cinq fois l'épaisseur intérieure (d) de la chambre au niveau de la zone de formation d'images 14. De préférence la distance L est égale à 1,27 centimètre. Au niveau de la zone de forma- tion d'images 14, l'épaisseur extérieure D de la chambre d'é- coulement 12 est égale à 0,7 centimètre ou moins. De préféren- ce l'épaisseur D est de l'ordre de 0,157 centimètre. L'instru- ment de type microscope est dirigé suivant une direction paral- lèle à l'épaisseur D au niveau de la zone de formation d'ima- ges 14. La distance de travail WD de la lentille optique 30 est choisie égale à 0,137 centimètre, qui est une valeur supé- rieure àa la moitié de l'épaisseur D au niveau de la zone de formation d'images 14. La profondeur de chanpde la lentille op- tique FD est choisie à une valeur comprise entre 0,6 et 4,5 microns, ce qui est nettement inférieur àa l'épaisseur D de la chambre 12 au niveau de la zone de formation d'images 14. De façon typique une telle lentille optique 30 est d'un type tel que fabriqué par la société dite American Optical Manufactu- ring Corporation et possède une profondeur de champde + 1,1 micron. Enfin les débits du fluide d'enveloppement et de l'é- chantillon de fluide sont réglés de manière que l'épaisseur T de l'échantillon de fluide au niveau de la zone de formation d'images 14 soit inférieure ou comparable à la profondeur de champ F de la lentille optique 30. Les débits typiques de l'échan- D tillon de fluide et du fluide d'enveloppement se situent dans la gamme comprise entre 1/2 et 1/50. De préférence les dé- bits sont égaux respectivement 0,0036 ml/s et à 0,05 ml/s, pour un débit total de fluide de 0,054 ml/s. L'impulsion de la source de lumière 18 possède une durée de 2 microsecondes, et est déclenchée 60 fois par seconde. Dans la description précédente de la présente inven- tion, on a décrit un procédé permettant de déterminer les pa- ramètres optiques optimum pour les moyens d'analyse microsco- piques, dont la mise au point est réalisée dans la zone de for- mation d'images d'une chambre d'écoulement traversée par un échantillon de fluide. REVENDICATIONS 1. Procédé d'utilisation d'un instrument du type mi- croscope (10) comportant des moyens d'analyse microscopique (16) analysant des particules dans un échantillon de fluide circulant de concert avec un fluide d'enveloppement dans une chambre d'écoulement (12), qui possède une admission (20) et une sortie (22) et un passage (24) s'étendant depuis l'admis- sion jusqu'à la sortie et possédant une zone de formation d'i- mages (14) sur laquelle se trouvent dirigés lesdits moyens d'a- I'C nalyse microscopique (16), et des moyens (26, 28) servant à répartir l'échantillon de fluide et le fluide d'enveloppement depuis l'admission jusqu'à la zone de formation d'images (14) essentiellement selon un écoulement plan caractérisé par une largeur et par une épaisseur, ledit fluide d'enveloppement et ledit échantillon de fluide étant entraînés depuis ladite ad- mission (20) jusqu'à la sortie (22), et lesdits moyens d'ana- lyse microscopique (16) comportant une lentille optique (30) servant à effectuer la mise au point sur ladite zone de for- mation d'images (14), caractérisé en ce qu'il consiste à - choisir le débit d'écoulement du fluide d'enveloppe- ment de manière a produire un écoulement laminaire plat au ni- veau de la zone de formation d'images (14), - diriger lesdits moyens d'analyse microscopique (16) sur ladite zone de formation d'images selon une direction pa- rallèle à ladite épaisseur, - choisir la distance de travail de laditelentille op- tique de manière qu'elle soit supérieure à la distance entre le plan image et l'extérieur de ladite chambre (12) au niveau de ladite zone de formation d'images (14), - choisir la profondeur de champ de ladite lentille opti- que (30) de manière qu'elle soit nettement inférieure à l'épais- seur de ladite chambre (12) au niveau de ladite zone de forma- tion d'images (14), et - maintenir le débit dudit échantillon de fluide et du- dit fluide d'enveloppement de manière que les particules dudit échantil] on fluide circulent dans l'espace correspondant à la profondeur dechampde ladite lentille optique (30) au niveau de ladite zone de formation d'images (14). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il inclut en outre les phases opératoires consistant &: - admettre ledit échantillon de fluide dans le courant d'écoulement dudit fluide d'enveloppement, et faire passer ledit fluide d'enveloppement ainsi que ledit échantillon de fluide à travers un dispositif d'étran- glement (21) possédant une forme en coupe transversale rectan- gulaire et dont la largeur est nettement supérieure àa l'épais- seur. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens d'analyse microscopique (16) sont disposés à une distance à laquelle ou au-delà de laquelle le fluide d'en- veloppement prend un profil de vitesse essentiellement cons- tant. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit profil possède la forme d'une parabole. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé enc ce que l'épaisseur dudit échantillon de fluide, au niveau de ladite zone de formation d'images (14],est comparable ou infé- rieure à laprofondeurdechanp de ladite lentille optique (30). 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'épaisseur extérieure de ladite chambre (12) au niveau de ladite zone de formation d'images (14) est égale à 0,7 cen- timètre ou moins. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lentille optique (30) possède une profondeurdechampccm- prise entre 0,6 et 4,5 um. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la distance entre la zone de formation d'images (14) et ladite admission (20) est supérieure à cinq fois l'épaisseur intérieure de ladite chambre (12). 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce l1 que le rapport du débit dudit échantillon de fluide au débit dudit fluide d'enveloppement se situe dans la gamme comprise entre 1/2 et 1/50. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il inclut en outre la phase opératoire d'échantillonnage de l'échantillon de fluide au niveau de la zone de formation d'images (14) pendant une durée apte à geler l'image de l'é- chantillon de fluide. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le débit dudit échantillon de fluide est égal à environ 0,0036 ml/s. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'échantillonnage s'effectue à l'aide d'impulsions d'une durée de deux microsecondes apparaissant a une cadence égale à environ 60 fois par seconde.