Brevet FR2579891A1 — publié le 19861010

-- 1 -- La présente invention traite des liposomes. Plus particulièrement, la présente invention concerne des lipo- somes dont les membranes contiennent un hydroxyde d'ammo- nium quaternaire, ce qui permet à ces liposomes de fusionner avec des cellules animales et végétales et d'injecter leur contenu à l'échelle microscopique (micro- injection) dans les cellules animales et végétales. D'une façon générale, et ainsi que le terme est employé dans le présent mémoire, les liposomes sont des vésicules constituées de molécules phospholipidiques. Il est maintenant communément reconnu que les liposomes fournissent un moyen pour introduire des médicaments ou autres substances régulatrices dans une cellule animale ou végétale afin de modifier la physiologie cellulaire. Dès lors qu'on s'est rendu compte que les liposomes peuvent jouer un r8le important pour introduire dans une cellule des médicaments ou une matière apte à modifier la physiologie cellulaire, diverses méthodes ont été proposées pour créer ou préparer des liposomes, y compris des liposomes présentant un grand volume aqueux intérieur pour emprisonner un médicament ou autre molécule modifi- catrice à transférer, comme décrit par exemple dans "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse Phase Evaporation" par Szoka et Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., E.U.A. Z5., 1978, pages 4194-4198. D'autres méthodes sont principalement axées sur des techniques perfectionnées pour emprisonner un médicament ou autre dans le liposome, comme décrit par exemple dans "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes" par Kirby et Gregoriodis, Bio/TechnoloQv, novembre 1984, pages 979-984. Le brevet des E.U.A. No 4 235 871 décrit un procédé pour encapsuler de nombreuses matières biologiquement actives dans des vésicules lipidiques oligo-lamellaires synthé- tiques, consistant à préparer un mélange de lipide dans un solvant organique et un mélange aqueux de la matière à - - encapsuler, à émulsionner le mélange obtenu, à chasser le solvant organique, et à mettre en suspension le gel résultant dans l'eau. En outre, diverses applications des liposomes utilisés comme moyen de transfert ont été suggérées dans de nombreux brevets. Ainsi, le brevet NI 4 235 871 précité décrit de nombreux composés et compositions actifs qui sont encapsulés dans des liposomes en vue de leur incorporation dans des cellules. Le brevet des E.U.A. No 4 394 448 est spécifiquement axé sur l'insertion d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou de fragments d'ADN dans une cellule vivante, et enseigne que l'ADN ou le fragment est encapsulé dans une vésicule lipidique et que la vésicule est amenée en contact avec une cellule, moyennant quoi l'insertion a lieu. Les brevets des E.U.A. NI 4 199 565; 4 201 767; 4 261 975; et 4 235 877 décrivent l'incorporation d'un antigène viral ou bactérien dans des liposomes contenant un agent tensio- actif aminé positivement chargé qui peut 4tre un halogé- nure d'ammonium quaternaire. Le brevet des E.U.A. N 4 483 929 décrit un réactif liposome immuno-r6actionnel à utiliser dans le dosage d'un composé chimique capable d'entrer en réaction immunosp6cifique avec un anticorps connu. Dans toutes les applications connues de la demanderesse, bien qu'il ait été démontré que les lipo- somes phospholipidiques sont capables d'introduire leur contenu dans des cellules cultivées ainsi que dans des cellules de tissus spécifiques d'animaux dans leur ensemble, ces liposomes se sont avérés tre des porteurs relativement médiocres. On pense que ces liposomes de l'art antérieur introduisent les substances véhiculées, c'est-à-dire le médicament, dans les cellules par des processus du type de l'endocytose. Par conséquent, seul un faible pourcentage des molécules emprisonnées dans les liposomes atteint le cytoplasme des cellules receveuses.De plus, lorsque des liposomes sont injectés à des animaux, de m me qu'à des humains, il a été établi qu'à moins d'une certaine concentration, les liposomes phospholipidiques sont inertes et non immunogènes. Les liposomes ne sont immunogènes et toxiques qu'à des concentrations relative- ment élevées. Ces liposomes de l'art antérieur, quoique susceptibles d'agglutiner les cellules, ne sont pas fusiogènes et sont inaptes à fusionner avec une membrane cellulaire ou à induire une fusion entre cellules. Il a également été établi que les enveloppes de certains virus d'animaux, telles que celles obtenues à partir du virus Sendai, sont fusiogènes et elles se sont montrées aptes à servir de porteurs efficaces pour l'introduction de molécules dans des cellules cultivées, comme décrit dans "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes", par Vainstein et coll., Biochimica et Biophysica Acta, 277 (1984), pages 181-188. On pense que l'activité fusiogène de ces virus est due à la présence de certains glycoprotéines virales spécifiques dans les enveloppes des virus. Il se trouve cependant que la présence d'une protéine dans les enve- loppes virales fusiogènes rendent ces vésicules immuno- gènes et, par conséquent, inutilisables pour un emploi in vivo. L'injection d'enveloppes virales à des animaux suscite la formation d'anticorps antiviraux, un fait qui limite leur emploi en tant que porteurs biologiques in vivo. La littérature mentionnée déclare en conséquence que, bien que les vésicules phospholipidiques aient été reconnues comme un outil potentiellement important pour introduire des médicaments et autres substances modifica- trices dans des cellules, cette technique n'a connu qu'un succès restreint en raison des limitations des liposomes de l'art antérieur. En conséquence, un but majeur de la présente invention est de fournir des liposomes qui sont fusiogènes et qui sont aptes à fusionner avec une membrane cellulaire et à induire une fusion entre cellules. - 4 Un autre but majeur de la présente invention est de fournir un procédé pour produire des liposomes qui sont aptes à fusionner avec une membrane cellulaire et à induire une fusion entre cellules. On parvient aux buts de la présente invention en incorporant un hydroxyde d'ammonium quaternaire dans la membrane d'un liposome, soit pendant la préparation du liposome, soit après qu'il a été préparé. Il s'est avéré que la présence d'hydroxyde d'ammonium quaternaire dans la membrane de la vésicule phospholipidique permet à celle-ci de fusionner avec une membrane cellulaire et d'induire une fusion entre cellules. Si la vésicule est chargée d'un médicament ou autre substance modificatrice de cellule, le contenu de la vésicule sera micro-injectée dans la cellule animale ou végétale. La faculté de l'hydroxyde d'ammonium quaternaire à faire passer les vésicules phospholipidiques d'un état non fusiogène à un état fusiogène est particuliè- rement surprenante eu égard au fait que les sels d'ammo- nium quaternaires autres que les sels d'hydroxydes donnent des vésicules non fusiogènes. Ainsi, on a constaté que des vésicules phospholipidiques contenant des halogénures dtammonium quaternaire, des acétates d'ammonium quater- naire ou autres, ne fusionnent pas avec une cellule et, par conséquent, n'injectent pas leur contenu dans la cellule. Ces vésicules réagissent de la m3me façon que les vésicules non fusiogènes connues et incorporent manifes- tement leur contenu dans les cellules par un processus du type de l'endocytose. Les caractéristiques fusiogènes des liposomes de la présente invention font qu'ils constituent par ailleurs un moyen commode pour incorporer directement en des quantités importantes dans une cellule animale ou végétale n'importe quelle substance modificatrice de cellule susceptible d'gtre emprisonnée dans une vésicule phospholipidique. L'hydroxyde d'ammonium quaternaire à incorporer dans la paroi ou membrane de la vésicule phospholipidique répond à la formule: -5 - R2 [ + R1 - N _ RD ' OH R4 dans laquelle R1 est un groupe alkyle supérieur ou une combinaison d'un radical alkyle et d'un radical aryle, apte à conférer des caractéristiques tensio-actives à l'hydroxyde, et R2, R3 et R4 sont des radicaux alkyle a chaine ramifiée ayant 1 à 20 atomes de carbone, ou un radical aryle, ou bien R2 et R3 peuvent constituer ensemble un radical hétérocyclique pentaou hexagonal comme, par exemple, de pyrrole ou de pyridine. Des composés que l'on préfère en particulier sont les agents tensio-actifs suivants: hydroxyde de cétyl benzyldi- méthyl ammonium, hydroxyde d'hexadécyltriméthyl ammonium, hydroxyde de cétyltriméthyl ammonium, hydroxyde de diisobutyl crésoxy éthoxy éthyl diméthylbenzyl ammonium, hydroxyde de diisobutyl phénoxy éthoxy éthyl diméthyl- benzyl ammonium, hydroxyde de méthyl dodécylbenzyl tri- méthyl ammonium, méthyl dodécyl xylène bis(hydroxyde de triméthyl ammonium), hydroxyde de N-(alkyles en C12, C14, C16)diméthylbenzyl ammonium, et hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium. Il est capital que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire possède des caracté- ristiques tensio-actives et contienne le radical hydro- xyle pour conférer des caractéristiques fusiogènes à la vésicule phospholipidique. La quantité d'hydroxyde d'ammonium quaternaire contenue dans les vésicules va normalement d'environ 5 à 750 ug/mg de phospholipide et elle est de préférence d'environ 50 à 250 ug d'hydroxyde d'ammonium quaternaire par milligramme de phospholipide. Les liposomes qui sont utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent %tre n'importe lesquels des liposomes de l'art antérieur. Des liposomes représentatifs comprennent un lipide phosphocholiné - 6 comportant une cha!ne d'acide gras de 12 à 20 atomes de carbone et une chalne d'acide gras d'au moins 8 atomes de carbone, dont des exemples sont la dimyristoylphosphati- dylcholine, la dioléoylphosphatidylcholine, la dipalmi- toylphosphatidylcholine, la distéaroylphosphatidylcholine, la phosphatidylcholine et la sphingomyéline; ainsi que le cholestérol et autres. Les liposomes peuvent être préparés par l'un quelconque des procédés publiés connus tels que le traitement par ondes sonores de suspensions de phospho- lipides, l'évaporation avec inversion de phases ou la - réhydratation de couches séchées de molécules phospholipi- diques. Des techniques appropriées sont celles décrites dans "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", par Szoka et coll., cité ci-dessus; "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes", par Kirby et Gregoriadis, cité ci-dessus, ainsi que d'autres techniques connues, comme l'emploi de détergents (voir Szoka et Papahadjopoulos, AMnnu. Rev. Biohkvs. Bioen., 92 (1980), pages 467-480) . En outre, la substance modificatrice de cellule qui peut être emprisonnée dans le liposome et *tre injectée dans des cellules animales ou végétales par fusion avec les liposomes de la présente invention peut être n'importe laquelle des substances antérieurement suggérées. On a constaté que les substances qui peuvent tre encapsulées dans un liposome et injectées dans une cellule conformément à la présente invention comprennent l'ADN et les fragments d'ADN; des composés à action pharmaceutique et des compositions de tels composés, par exemple des hydrates de carbone, nucléotides et poly- nucléotides, tant naturels que synthétiques; des vaccins et antigènes grippaux; ainsi que d'autres substances qui peuvent influencer la physiologie de cellules animales et végétales. - 7- Les deux exemples non limitatifs suivants illustrent des modes de préparation actuellement préférés des liposomes fusiogènes de la présente invention. Exemple 1 - Incorporation d'hydroxyde d'ammonium auaternaire dans des membranes de liposomes Pendat la r éaration des liposomes On fait sécher à partir de leur solution chloro- formique 2 mg d'un phospholipide non chargé, la phospho- tidylcholine (PC), et 1 mg de cholestérol. On solubilise avec 1 ml d'éther de diéthyle la couche sèche obtenue à partir de PC et du cholestérol, et on ajoute la solution obtenue à une suspension contenant 2 mg d'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium (sel- Q) dans du tampon acétate, à un pH de 7,0. On fait ensuite énergiquement tourbillonner la suspension obtenue et la traite rapidement aux ultrasons dans un appareil de traitement aux ultrasons à bain. On prépare ensuite de grands liposomes monolamellaires, ayant subi une évapora- tion avec inversion de phases, suivant le procédé décrit dans "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", par Szoka et coll., cité ci-dessus. On élimine l'excès de sel-Q non incorporé par addition de Bio-perles SM-2 en appliquant la technique décrite dans "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes", par Vainstein et coll., cité ci-dessus. Ainsi, on fait incuber 50-80 mg de Bio- perles SM-2 avec les phospholipides et le sel-Q décrits ci-dessus pendant 40-60 minutes à la température ambiante, en secouant doucement, dans un volume final de 1 ml de tampon acétate. Une estimation quantitative montre qu'environ 30-40 % du sel-Q ajouté est incorporé dans la bi-couche phospholipidique (300-400,g de sel-Q/mg de PC). Pour préparer des liposomes chargés avec un composant intéressant quelconque, on ajoute les composants désirés, tels que médicaments, enzymes, ARN ou ADN, au tampon dans lequel les phospholipides sont mis en suspension, comme - 8 - décrit dans "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse- Phase Evaporation", par Szoka et coll., cité ci-dessus. Le procédé de préparation de liposomes fusiogè- nes qui est exposé à l'Exemple 1 n'est pas recommandé lorsque des molécules électriquement chargées sont emprisonnées dans les liposomes. Dans certaines conditions et à un certain pH, tout composant négativement chargé formera un complexe avec l'hydroxyde dtammonium quater- naire et précipitera avec celui-ci. Etant donné que l'hydroxyde d' ammonium quaternaire est chargé positivement, il entrera en interaction avec toute molécule chargée négativement, comme par exemple les acides nucléiques dont l'ADN et l'ARN sont des exemples et qui sont fortement chargés négativement à pH neutre. La formation de tels complexes entre l'hydroxyde d'ammonium quaternaire positivement chargé et les molécules négativement chargées réduit l'efficacité d'emprisonnement (nombre de molécules emprisonnées dans chaque liposome) et l'activité fusiogène des liposomes. Par conséquent, dans l'Exemple 2 est expo- sée une seconde technique de préparation de liposomes fusiogènes selon laquelle le contact direct entre l'hydro- xyde d'ammonium quaternaire et les molécules emprisonnées est évité. Exemple 2 - Introduction de sel-Q dans des liposomes charmés déjà Prépares On prépare des liposomes chargés comme décrit à l'Exemple 1 ou suivant les procédés antérieurement publiés décrits ci-dessus. Cependant, au contraire du procédé décrit à l'Exemple 1, on n'ajoute pas de sel-Q pendant la préparation des liposomes mais on l'ajoute après la prépa- ration des liposomes chargés à une suspension contenant les liposomes chargés refermés. L'incubation du sel-Q avec une suspension de liposomes refermés entraIne l'incor- poration de la partie hydrophobe de la molécule de sel-Q dans la bi-couche phospholipidique des liposomes. 9 9 _ On exécute ce mode opératoire comme suit: on introduit une suspension contenant des vésicules phospho- lipidiques (liposomes) préparés à partir de 2 mg de PC et 1 mg de cholestérol, en suspension dans 400 ul de tampon acétate, dans un tube contenant 3 mg de sel-Q dans 20jul de tampon acétate. On fait énergiquement tourbillonner le mélange obtenu, après quoi on le fait incuber pendant -15 minutes à 37 C en secouant doucement. On élimine l'excès de sel-Q libre non incorporé par adsorption sur des Bio-perles SM2, comme précédemment décrit. Une estimation quantitative montre de nouveau qu'environ 30 % du sel-Q ajouté est incorporé à la bi-couche phospho- lipidique. Pour certaines préparations, le procédé de l'Exemple 2 présente un avantage par rapport à celui de l'Exemple 1 du fait que les molécules enfermées dans les liposomes sont emprisonnées à l'intérieur du liposome avant l'addition du sel-Q, et aucune interaction n'a donc- lieu entre la substance enfermée et l'agent tensio-actif ajout6. De plus, les propriétés fusiogènes de liposomes portant le sel-Q préparés par le procédé de l'Exemple 2 sont supérieures à celles des Iiposomes préparés par la technique de l'Exemple 1. On a étudié l'aptitude de liposomes composée de phosphatidylcholine et de cholestérol (liposomes PC/ cholestérol) comme décrits dans l'Exemple 2 à induire une fusion entre cellules, par incubation avec des érythrocytes humains et des cellules cultivées de tissu dthépatome (CTH), comparativement à des témoins. On a incorporé à des liposomes déjà formés, comme décrit à l'Exemple 2, un sel-Q qui est l'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium, un sel-C qui est le chlorure d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium, et un sel-B qui est le bromure de benzyldiméthyl hexadécyl ammonium. Dans ces expériences, on a fait incuber soit le sel-Q libre (5-10ug), soit le sel-C libre (5-10 ug) , soit le sel-B libre (5-10 pg), soit des liposomes portant ces molécules d'ammonium quaternaire (20jug de PC) avec une - 10- suspension de cellules (106 cellules) pendant 15 minutes à 37 C. On suivait l'agglutination des cellules et la fusion entre cellules par observation au microscope à contraste de phase. Les résultats figurent sur le Tableau I. TABLEAU I Caractérisation de Liposomes Portant des Sels d'Ammonium Quaternaire Fusiogènes et Non Fusiofènes Fusion entre ARRlutination cellules Erythrocytes Humains Incubés avec: Liposomes PC/cholestérol - - Sel-Q libre (sel OH) + + Liposomes PC/cholestérol portant du sel-Q (sel 0 7) + +++ Sel-C libre (sel C1) + - Liposomes PC/cholestérol portant du sel-C (sel Cl-) + - Sel-B libre + - Liposomes PC/cholestérol portant du sel-B + CTH incubées avec: Liposomes PC/cholestérol - - Sel-Q libre (sel OH) + + Liposomes PC/cholestérol portant du sel-Q (sel OH-) + +++ Sel-C libre (sel C1) + - Liposomes PC/cholestérol portant du sel-C (sel C1) + - Sel-B libre + - Liposomes PC/cholestérol portant du sel-B + - Les résultats récapitulés sur le Tableau I démontrent que: (1) Les liposomes composés de PC/cholestérol mais ne portant aucune des molécules d'ammonium quaternai- re n'exercent aucun effet sur l'agglutination ou la fusion entre cellules des érythrocytes humains ou des cellules CTH. - 11 - (2) Toutes les molécules d'ammonium quaternaire utilisées (sel-Q, sel-C et sel-B), qu'elles soient sous forme libre ou incorporées aux liposomes, sont capables d'induire une agglutination entre cellules. On pense que cela est dû à la fixation des molécules d'ammonium quaternaire chargées positivement sur les membranes cellulaires chargées négativement. (3) Seul le sel-Q, c'est-à-dire l'hydroxyde, qu'il soit sous forme libre ou incorporé aux liposomes, est capable d'induire une fusion entre cellules. L'induc- tion de la fusion entre cellules est beaucoup plus forte par les liposomes portant le sel-Q que par le sel-Q libre. Le chlorure et le bromure d'ammonium quaternaire n'in- duisent pas de fusion entre cellules malgré le fait qu'ils sont capables de se fixer aux membranes cellulaires, ce que l'on peut déduire de leur aptitude à induire une agglutination entre cellules. La fusion de liposomes portant un hydroxyde d'ammonium quaternaire avec des cellules est également démontrée par leur faculté d'injecter leur contenu dans le cytoplasme de cellules animales et végétales. On a utilisé trois systèmes pour s'assurer de la fusion de liposomes portant le sel-Q avec des cellules vivantes et de la micro-injection de leur contenu dans ces cellules, à savoir les suivants: (1) On a enfermé une toxine, la chalne A de la ricine, dans les liposomes, et on a fait incuber ces liposomes chargés avec des cellules en culture telles que CTH. La ricine A inhibe la synthèse protéique cellulaire et ne tue par conséquent les cellules que lorsqu'elle se trouve à l'intérieur de celles- ci. Contrairement à la molécule entière de la ricine (ricine contenant à la fois les sous-motifs A et B), la chalne A de la ricine ne peut, par elle-même, pénétrer dans les cellules. Ainsi, lorsqu'elle se trouve audehors d'une cellule, elle n'a pas d'effet léthal. 2579891 ' -12 - (2) On a enfermé de l'ADN-SV40, c'est-à-dire l'ADN extrait du virus SV40, dans les liposomes. On a fait incuber les liposomes chargés d'ADNSV40 avec des cellules CTH cultivées. On a observé la micro-injection de l'ADN- SV40 dansles cellules CTH par l'apparition d'une protéine spécifique, l'antigène-T-SV40. La synthèse de l'antigène- T-SV40 ne se déclenche que lorsque l'ADN-SV40 est intro- duit dans le cytoplasme cellulaire à partir duquel il est transféré au noyau de la cellule. Il est également à remarquer que (a) l'appari- tion de l'antigène-T-SV40 n'a lieu que dans des cellules vivantes, car elle nécessite une synthèse protéique acti- ve; et (b) les molécules d'ADN-SV40 libres, étant en incubation avec des cellules vivantes, sont incapables de pénétrer dans les cellules et, par conséquent, ces molécules libres ne déclenchent pas la synthèse de l'anti- gène-T. (3) On a enfermé dans les liposomes des molé- cules protéiniques à marquage fluorescent, à savoir de l'albumine de sérum de bovins (ASB) à marquage fluores- cent. On a ensuite fait incuber les liposomes chargés, soit avec des protoplastes de végétaux, soit avec une suspension de cellules végétales. On a observé l'injection par voie de fusion en guettant l'apparition de fluores- cence intracellulaire. (a) Micro-injiection Par voie de fusion de la chatne A de ricine Par des livosomes fusioènes Les résultats récapitulés sur le Tableau II montrent que seuls les liposomes chargés de la chalne A de ricine et portant l'hydroxyde d'ammonium quaternaire (sel-Q) ont provoqué une forte inhibition de la synthèse protéique et un haut degré de mortalité de CTH. On n'a observé aucune mortalité avec les liposomes non chargés ni avec la chaCne A de ricine libre. Comme on peut le voir, une mortalité très légèrement supérieure à celle des témoins a été provoquée par les liposomes portant le chlorure d'ammonium quaternaire (sel-C), ce qui indique - 13- une absence complète ou presque complète de fusion liposomecellule. TABLEAU I.I de de Liiosomes Fusiogènes char4gs de Ricine A à inhiber la Synthèse Protéigue et à tuer CTH Inhibition de la CTH tuées CTH incubées avec: Synthèse Protéique (%) Liposomes PC/cholestérol O O Chalne A de ricine libre 5 4 Liposomes PC/cholestérol chargés de ricine A 6 7 Liposomes PC/cholestérol portant du sel-Q (sel OH-) 5 8 Liposomes PC/cholestérol chargés de ricine A et portant du sel-Q (sel OH-) 90 95 Liposomes PC/cholestérol chargés de ricine A et portant du sel-C (sel Ci-) 17 14 On a tout d'abord emprisonné la cha!ne A de ricine dans des liposomes PC/cholestérol en utilisant la technique décrite dans "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", par Szoka et coll., cité ci-dessus, après quoi on a incorporé le sel d'ammo- nium quaternaire (soit le sel OHr, soit le sel C1-) dans la bi-couche des liposomes, comme décrit ci-dessus. Dans les expériences, on faisait incuber 10-20jug de liposomes avec 106 cellules pendant 30 minutes à 37 C, période durant laquelle les liposomes entraient en interaction avec les cellules. A la fin des périodes d'incubation, on lavait les cellules et les mettait encore à incuber dans un milieu de croissance pendant douze heures de plus, à la suite de quoi on évaluait la synthèse protéique (par incorporation de 3H-leucine) et la viabilité des cellules (par coloration avec du bleu Trypan). -14 - (b) Micro-injection d'ADN-SV40 par voie de fusion Les résultats du Tableau II démontrent que les liposomes fusiogènes peuvent ttre utilisés pour la micro- injection de gènes actifs (molécules dtADN) dans ces cellules en culture telles que CTH. Toutes les conditions expérimentales et l'incubation avec CTH étaient comme décrit à propos de la ricine A dans le Tableau II. On a emprisonné l'ADN-SV40 dans des liposomes de la façon décrite dans "Procedure for Preparation of Liposomes vith Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse- Phase Evaporation", par Szoka et coll., cité ci-dessus. On a évalué l'apparition de l'antigène-T-SV40 comme décrit ci-dessus en utilisant un anticorps spécifique anti-anti- gène-T-SV40 à marquage fluorescent. TABLEAU III Aptitude de liposomes fusiozènes charmés (liposomes portant du sel-Q) à micro-injecter de ltADN-SV0o Cellules positives à la CTH incubées avec des recherche dtantigène- liposomes chargés d'ADN-SV40 T-SV4o (% du total) Liposomes PC/cholestérol O Liposomes PC/cholestérol portant du sel-Q (sel OH) 10 - 15 Liposomes PC/cholestérol portant du sel-C (sel C1-) O L'antigène-T spécifique est apparu dans le noyau de 10-15 % des cellules incubées avec les liposomes chargés d'ADN-SV40 et portant du sel-Q (sel OH-). Il n'est pas apparu d'antigène-T dans les cellules incubées avec les liposomes PC/cholestérol chargés d'ADN-SV40 mais portant le sel-C (sel Cl-). - 15 - (c) Injection par voie de fusion de ASB fluorescente dans des Drotoplastes vézétaux et des cellules végétales en suspDension de Petunia Hybrida On a préparé des protoplastes de cellules issues de petunia hybrida par des méthodes classiques telles que décrites dans la littérature. On a enfermé lt'ASB fluores- cente dans des liposomes comme décrit pour la chalne A de ricine, puis on a incorporé du sel-Q à la membrane des liposomes chargés, comme décrit ci-dessus. Dans l'expé- rience, on a fait incuber 10-20>ug de liposomes chargés avec 5 x 105 protoplastes ou cellules végétales. Après -60 minutes d'incubation à 28 C, on a guetté l'appari- tion de fluorescence intracellulaire en opérant par microscopie en fluorescence. TABLEAU IV Injection par Voie de Fusion d'Albumine de Sérum de Bovins dans des Protoolastes Végétaux et des Cellules Vézétales en Suspension de Petunia Hybrida Apparition de Fluorescence Intracellulaire (% des cellules totales) Protoplastes de Petunia incubés avec des liposomes chargés de ASB fluorescente PC/cholestérol O PC/cholestérol portant du sel-Q (selO0H) 80 Cellules de Petunia en suspension incubées avec des liposomes chargés de ASBfluorescente. PC/cholestérol O PC/cholestérol portant du sel-Q (sel OH-) 60 - 16 - Il ressort des résultats du Tableau IV que les liposomes portant du sel-Q (sel OH-) peuvent également micro-injecter leur contenu dans des protoplastes de végétaux. L'apparition de fluorescence ne peut résulter que de la.fusion des liposomes chargés avec les proto- plastes de végétaux. Tout autre processus conduirait à une autre forme d'apparition de la fluorescence. Les résultats du Tableau IV montrent que les liposomes chargés sont non seulement capables de fusion (ou de micro- injection) avec des protoplastes de végétaux, mais peuvent aussi fusionner avec des cellules végétales entourées d'une paroi cellu- laire et micro-injecter leur contenu dans celles-ci. En raison de la présence du sel-Q à forte charge électrique, les liposomes se montrent capables de traverser la paroi cellulaire et de fusionner avec la membrane cellulaire. Application des LiopQsomes portant un Hydroxvde d'Ammonium Quaternaire Après avoir illustré la préparation de liposomes contenant des hydroxydes d'ammonium quaternaire et avoir démontré l'aptitude qu'ont les liposomes dont les membranes vésiculaires contiennent de l'hydroxyde d'ammo- nium quaternaire à fusionner avec des cellules et à induire une fusion entre cellules, en micro-injectant le contenu des vésicules dans la cellule, on expose diverses applications des liposomes décrits dans la présente invention. (1) Utilisation du sel-Q (OH) libre ou de liposomes portant du sel-Q (1OH). comme réactif pour induire une fusion entre cellules La fusion entre cellules animales, telle que démontrée pour les liposomes présentement décrits, est d'une importance considérable pour les études d'expressi- vité des gènes. En outre, la fusion de protoplastes de végétaux est source de nombreuses applications industriel- les qui peuvent conduire au développement de nouvelles espèces de plantes aux propriétés améliorées. -17- (2) Utilisation de liposomes fusioènes pour la micro- injection de divers combosants dans des cellules animales et vigétales développées en culture Des liposomes fusiogènes chargés peuvent être utilisés pour la micro-injection d'ADN, d'ARN, de protéines (enzymes, hormones) et de médicaments dans des cellules en culture. De plus, ils peuvent servir à la micro- injection d'organites ou de tous autres composants ou molécules susceptibles d'âtre enfermés dans les liposomes. La micro-injection d'ADN, d'ARN ou d'organites à des cellules, notamment à des cellules ou protoplastes de végétaux, est source d'applications industrielles impor- tantes comme c'est le cas du domaine entier de la manipu- lation génétique des cellules animales ou végétales. En outre, sur la base d'expériences effectuées avec des cellules animales et végétales, les liposomes portant un hydroxyde d'ammonium quaternaire se montreront capables de fusionner avec n'importe quelles cellules avec lesquelles ils peuvent tre mis à incuber et de micro-injecter leur contenu à ces cellules. Ainsi, ces liposomes se montreront capables de fusionner avec des protoplastes de bactéries, de levures et d'algues. (3) Utilisation de liposomes fusioxènes pour l'aooort in vivo de divers comoosants à des cellules. nommment à des tissus ou cellules d'animaux dans leur ensemble Des liposomes fusiogènes peuvent 9tre utilisés, après injection à des animaux de laboratoire ou à des 9tres humains, comme véhicule pour l'apport de médicaments, hormones ou protéines telles que des enzymes ou de l'ADN. Des liposomes non fusiogènes chargés sont couramment utilisés actuellement comme véhicules de médicaments à des fins thérapeutiques. Cependant, les liposomes fusiogènes peuvent 8tre beaucoup plus efficaces que les liposomes non fusiogènes en tant que porteurs biologiques, vu qu'ils injectent leur contenu directement dans le cytoplasme cellulaire. 257989f - 18- (4) Utilisation de liQosomes fusiozènes pour l'élaboration d'un nouveau système sensible non isototiaue de dosaze à des fins diaenostiaues Des liposomes portant des hydroxydes d'ammonium quaternaire peuvent fusionner avec d'autres liposomes. La fusion entre liposomes entraîne la fuite de leur contenu. Cette fuite est spécifiquement due à l'interaction et à la fusion entre liposomes. En raison de la présence des molécules d'hydroxyde d' ammonium quaternaire positivement chargées, les liposomes qui portent ces molécules d'ammo- nium quaternaire ne réagissent pas entre eux et se repoussent l'un l'autre. Comme indiqué ci-dessus, ils ne peuvent réagir mutuellement et fusionner qu'avec des liposomes perdant l'hydroxyde d'ammonium quaternaire. Cependant, deux molécules quelconques capables de réagir entre elles avec une forte affinité forceront les lipo- somes portant l'hydroxyde dtammonium quaternaire à fusionner entre eux en surmontant les forces répulsives de la charge positive. Ainsi, si un antigène spécifique est incorporé dans des membranes de liposomes portant l'hydroxyde d'ammonium quaternaire, un anticorps préparé contre cet antigène forcera les liposomes A réagir entre eux. L'interaction entre liposomes portant l'hydroxyde d'ammonium quaternaire entrainera une fusion et la libé- duco tenu ration/des liposomes. Une détermination quantitative quelconque du processus de libération (par libération d'un colorant fluorescent ou de tout autre réactif) constituera une mesure de l'interaction antigèneanticorps. Ainsi, la fusion entre liposomes portant un hydroxyde d'ammonium quaternaire peut être mise à profit pour déterminer quantitativement l'interaction entre un anticorps et son antigène ou une hormone et son récepteur. Ce système peut donc 9tre utilisé pour doser de petites quantités quel- conques diune hormone ou d'un antigène présent dans un fluide biologique quelconque. - 19 - I1 va de soi que la présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et qu'on peut y apporter diverses variantes et modifications sans pour autant sortir de son cadre. -20- REVENDICATIONS 1. Vésicule phospholipidique caractérisée par le fait que sa membrane contient un hydroxyde d'ammonium quaternaire, cet hydroxyde étant présent en une quantité suffisante pour rendre fusiogène ladite vésicule. 2. Vésicule phospholipidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est choisi parmi l'hydroxyde de cétyl benzyldiméthyl ammonium, l'hydroxyde d'hexadécyl- triméthyl ammonium, l'hydroxyde de cétyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de diisobutyl crésoxy éthoxy éthyl diméthyl- benzyl ammonium, l'hydroxyde de diisobutyl phénoxy éthoxy éthyl diméthylbenzyl ammonium, l'hydroxyde de méthyl dodé- cylbenzyl triméthyl ammonium, le méthyl dodécyl xylène bis(hydroxyde de triméthyl ammonium), et l'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium. 3. Vésicule phospholipidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est l'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium. 4. Vésicule phospholipidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le phospho- lipide est choisi parmi la phosphatidylcholine, la dimy- ristoylphosphatidylcholine, la dioléoylphosphatidyl- choline, la dipalmitoylphosphatidylcholine, la distéaroyl- phosphatidylcholine, la sphingomyéline, le cholestérol, et leurs mélanges. 5. Vésicule phospholipidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que de l'ADN ou un fragment d'ADN y est encapsulé. 6. Vésicule phospholipidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'un composé ou une composition à activité pharmacologique y est encapsulé. 7. Procédé pour rendre fusiogène une vésicule phospholipidique, caractérisé par le fait qu'il consiste à incorporer un hydroxyde d'ammonium quaternaire dans la membrane de ladite vésicule. - 21 - 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est choisi parmi l'hydroxyde de cétyl benzyl- diméthyl ammonium, l'hydroxyde d' hexadécyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de cétyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de diisobutyl crésoxy éthoxy éthyl diméthyl- benzyl ammonium, l'hydroxyde de diisobutyl phénoxy éthoxy éthyl diméthylbenzyl ammonium, l'hydroxyde de méthyl dodécylbenzyl triméthyl ammonium, le méthyl dodécyl xylène bis(hydroxyde de triméthyl ammonium) et l'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxy éthyl diméthyl benzyl ammonium. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est l'hydroxyde d'octylcrésoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est incorporé pendant la formation du phospholipide. 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydroxyde d'ammonium quaternaire est incorporé dans ladite membrane de vésicule après la formation du phospholipide.