Brevet FR2573427A1 — publié le 19860523

Dérivés de flavolignanes. procédés pour leur préparation et médicaments contenant ces composés. L'invention concerne de nouveaux dérivés de fla- volignanes, des procédés pour leur préparation et des médicaments contenant ces composés. Le chardon de notre-Dame-Silybum marianum(L.) Gaertn.(des jardins) (Carduus marianus L.)-est une plante médicinale connue depuis l'antiquité. Parmi les flavoli- gnanes existant dans les fruits de cette plante, R. Munster a isolé un composant, la silybine; voir Thèse de R. Munster, Munich 1966. La structure chimique de ce composé a été identifiée par A. Pelter et R. HAnsel, voir Tetrahedron Letters, Londres, volume 25, pages 2911-1916 (1968). On sait que la silybine, également appelée au- trefois silymarine I, est un agent thérapeutique de va- leur pour le foie: voir la demande de brevet DE-AS 1 7 67 666. Un procédé industriel de préparation de la si- lybine (silymarine 1) est décrit par exemple dans la DE-AS 1 923 082. Dès 1974, H. Wagner, P. Diesel et M. Seitz, Arzneimittelforschung, volume 24(4), pages 466-471, a- vaient pressenti deux isomères de position de la silybi- ne, à savoir la silybine et l'isosilybine. Cette suposition a été précisée et confirmée expérimentalement par A. Arnone, L. Merlini et A. Zanarotti, Journal Chemical Society Chem. comm; 1979, volume 16, pages 694/97. D'après ces auteurs, la silybine connue consiste en deux composés différents, à savoir les composés ayant les formules de structure A et B ci-après: 0CE3 OH O (A) silibinine oH. O (B) isosilybine 2O Ces formules de structure montrent que ces com- posés sont des isomères de position. Le composé de for- mule (A) a reçu récemment l'appellation INN de silibini- ne. A partir de maintenant, et dans toute la présente demande, c'est ce nom qu'on utilisera pour le composé de formule (A). L'utilisation thérapeutique de la silybine s'est heurtée à une difficulté: la silybine est pratiquement insoluble dans l'eau, de sorte qu'on ne peut pas prépa- rer des solutions pour injections ou des compositions contenant de la silybine pour lesquelles une certaine solubilité dans l'eau est nécessaire. Le brevet DE. 1 963 318 décrit certes des dérivés de la silybine qui ont une certaine solubilité dans l'eau, mais il s'agit là d'un mélange très complexe d'hémiesters de l'acide succinique. Ce mélange est complexe parce que la sylibine porte cinq groupes hydroxy estérifiables, parce que la silybine en outre contient les deux isomères de position décrits ci-dessus et parce que l'acide succinique utilisé pour l'estérification est un diacide capable de former des monoesters comme des diesters. Un produit consistant en un nombre indéterminé de composés les plus variés et mal définis ne peut pas être utilisé dans des applications pharmaceutiques. L'invention vise en conséquence à la mise au point de dérivés hydrosolubles, appropriés aux applica- tions pharmaceutiques, de la silibinine, qui consistent en composés chimiques exactement définis. On a maintenant, trouvé que des dérivés de la silibinine et de certains acides alcane-et alcoylène- dicarboxyliques répondaient à ces exigences. L'invention a en conséquence pour objets des dé- rivés de la silibinine répondant à la formule générale I j CC2- 0-CD(Alki) -COOM -oc3 "-Co> t 3 (tak)M'o(1) os 0 2 ai CD-(Alk2)=CDOOM dans laquelle n et m sont représentent, indépendamment l'un de l'au- tre, O ou 1, Alk1 et Alk2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un radical alcoylène avec 1 à 4 atomes de car- bone ou un radical aicènylène avec 2 à 4 atomes de carbone, et M1 et M représentent chacun, indépendamment l'un de 1 2 l'autre, un atome d'hydrogène ou un atome de métal alca- lin. Parmi les composés de formule (I), on préfère ceux pour lesquels n et m représentent chacun, indépen- damment l'un de l'autre, O ou 1, Alk1 et Alk2 représen- tent chacun un radical alcoylène à deux atomes de carbo- ne et M1 et M2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome de métal alcalin. De préférence, n et m, Alk et Alk2, ainsi que M1 et M2 sont identiques. Al1 l2, M1 Le composé particulièrement préféré- est le C-2', 3-dihydrogénosuccinate de silibinine, sel disodique. Dans les composés selon l'invention, les groupes OH de la silibinine qui ne sont pas fixés sur un noyau benzènique sont estérifiés en totalité ou en partie, par exemple par l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide adipique, l'acide maléique ou l'aci- de fumarique. De préférence, les deux groupes OH de la silibinine non fixés sur un noyau aromatique sont à l'é- tat de monoeters des acides carboxyliques en question. Le procédé selon l'invention pour la préparation des dérivés revendiqués de la silibinine se caractérise en ce que l'on dissout environ 1 partie en poids de si- libinine de formule (A): C2 (A) silibinine dans 1 à 2 parties en poids de pyridine, et on fait réa- gir sous agitation avec 1 à 3 parties en poids d'un anhydre d'acide dicarboxylique de formule O. C - Alk - C a o dans laquelle "Alk" a la signification de l'un des sym- boles Alk1 et Alk2 définis ci-dessus, on ajoute ensuite de l'éthanol jusqu'à obtention d'un mélange homogène, puis on ajoute lentement de l'eau, sous agitation éner- gique, ce qui provoque l'hydrolyse des esters des grou- pes OH à liaisons aromatiques, dès que cette hydrolyse est complète, on dilue par de l'acétate d'éthyle, on lave avec de l'eau acidulée saturée d'acétate d'éthyle, on concentre la phase acétate d'éthyle, on reprend dans l'éthanol et on convertit à l'aide d'une solution alcoo- lique d'un hydroxyde alcalin en le sel du groupe acide carboxylique libre non estérifié. De préférence, la réaction avec l'anhydre d'aci- de dicarboxylique est effectuée à une température de 40 à 50'C. De préférence, le pH de l'eau de lavage acidulée et saturée d'acétate d'éthyle est maintenu aux environs de 1,5 à 2,4. On a constaté avec surprise que ces composés, en particulier le composé C2',3-dihydrogénosuccinate de silibinine, sel disodique, avaient une activité pharma- cologique marquée dans le traitement des lésions par brûlures. En outre, malgré la conversion décrite en dé- rivés, ils ont conservé l'activité pharmacologique tota- le de la silybine connue en tant qgi agent thérapeutique pour le foie. Ils conviennent particulièrement bien pour le traitement de la cirrhose du foie et des atteintes toxiques-métaboliques du foie. On a constaté avec surprise que les composés se- lon l'invention avaient une extraordinaire efficacité dans le traitement des empoisonnements par champignons, en particulier des empoisonnements très graves par les amanites (Amanita phalloides). Et on a également consta- té avec surprise que ces composés permettaient de trai- ter avec de bons résultats des empoisonnements par des solvants organiques halogénés comme le tétrachlorure de carbone, le trichloréthylène, le chloroforme, etc. En application préventive, les composés selon l'invention évitent les troubles décrits ci-dessus. L'invention a donc également pour objets des médicaments contenant ces composés. Ces médicaments sont dans la plupart des cas utilisés en administration sys- témique, par exemple sous la forme de pilules, de cap- sules, de solutions, dans des véhicules usuels et le cas échéant avec des adjuvants usuels. La posologie quoti- dienne pour un humain adulte est d'environ 50 à 500 mg selon l'état du patient et la sévérité des symptômes de la maladie. Essais avec le C-2'.3-dihvdrogénosuccinate de silibinine, sel disodique (en abrégé ci-après Sili-suc- na). Les symptômes apparaissant dans les cas de brû- lures sont provoqués en particulier par une intoxication due à des produits de la nécrose thermique des tissus. La preuve que des processus d'auto-intoxication après des brûlures sévères de la peau sont responsables de cet état a été apportée par de nombreuses voies. Des trans- plantations croisées de peau brûlée et non brûlée à des animaux récepteurs sains ou respectivement brûlés à des animaux récepteurs sont particulièrement convaincantes à cet égard: on constate que les récepteurs non brûlés de peau brûlée sont atteints alors que les récepteurs brû- lés de peau saine ne subissent aucun préjudice: voir KM Schmidt et collaborateurs, Neuere Aspekte zur Autointo- xikation nach schweren Verbrennungen; Die Verbrennungs- krankheit (F.W. Ahnefeld et collaborateurs, éditeur L. Springer, Berlin 1982, pages 45-52). Dans les cas de brûlures de la peau, il y a li- bération ou formation d'un grand nombre de composés chi- miques. Malgré ce grand nombre, on a réussi à identifier la structure de quelques uns de ces composés. On a pu montrer entre autres que les composés formés dans les cas de brûlures de la peau présentaient une analogie avec les composés formés dans-une peroxyda- tion des lipides. Il y a également des analogies dans les effets toxiques de ces susbstances. Un détail parti- culièrement impressionnant réside dans la formation d'aldéhydes saturés et insaturés toxiques à longueurs de chaîne variées en conséquence de la peroxydation des lipides (Benedetti et collaborateurs, Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim. Biophys. Acta 620, 281-296 (1980) et de la dégradation thermique des tissus (K.H. Schmidt et collaborateurs, Studies on the structure and biological effects of pyro- toxins purified from burned skin, World J. Surg. 3, 361- 365 (1979). On admet donc que les brûlures conduisent à une dégradation par oxydation des structures cellulai- res. En conséquence, on a étudié les modifications par autoxydation des lipides des membranes en conséquen- ce d'une auto-intoxication après des brûlures sévères. On a étudié en particulier les variations dans la compo- siton des acides gras des lipides des membranes. On a en outre vérifié dans quelle mesure les dérivés de silibi- nine selon l'invention avaient une influence sur les va- riations dans la composition des acides gras des lipides des membranes. Variations dans la composition des acides aras des lipides des membranes après brûlures sévères. On a réparti des rats Wistar mâles d'un poids moyen de 360 g par groupes de trois avec libre accès à l'eau et à la nourriture sèche. Jusqu'au début des es- sais, la température ambiante était de 22 'C et après le début des essais, les animaux ont été maintenus à 30'C. Les brûlures de la peau ont été provoquées à l'aide d'un timbre de cuivre d'une surface de 20 cm2 sous pression constante et à une température de 250 C. Pour exclure toute atteinte thermique des organes plus profonds, on a étiré la peau sur une spatule creuse re- froidie à l'air. Ce modèle d'expérimentation animale permet de provoquer des traumas par brûlures très exacts, donnant des durées de survie constantes. Avant le début des essais, les animaux sont nar- cotisés par 50 mg/kg de Nembutal. Après la brûlure, on a injecté par voie i.p. ml de solution de Ringer-lactate pour la prophylaxie du choc. Onxforme cinq groupes d'expérience: a) groupe normal: animaux totalement indemnes b) groupe témoin I: uniquement traitement par la silibinine pendant 6 jours par 75,5 mg de Sili-suc- na c) groupe témoin II: animaux soumis à opération simulée d) groupe avec animaux brûlés: 25 %, 250'C, s, 0,5 atmosphère (environ 5.104 Pa). e) groupe expérimental: animaux auxquels on a administré 75,5 mg de Silisuc-na, i.p., pendant 6 jours en commençant 1 jour avant la brûlure. Pour l'isolement des microsomes, on a saigné les animaux sous narcose après la fin de la période d'essai. On a prélevé ensuite les foies, on les a pesés et on les a transfèrés immédiatement dans un milieu d'isolement refroidi à la glace (saccharose 0,25 mM, EDTA lmM, 10 mmoles de Tris. HC1, pH 7,2); On a haché les foies et on les a homogénéisés dans le milieu. Par centrifugation différentielle, on a mis la fraction de microsomes & l'état de granulés. On remet les microsomes en suspen- sion et on les a centrifugé à nouveau. On a préparé en- suite une suspension dont 1 ml correspondait à 1 g de tissu hépatique. On a analysé les lipides par la méthode de J. Folch (A simple method for the isolation and purifica- tion of total lipids from animais tissues, J. Biol. Chem. 226, 497-508 (1957)), modification de Bligh et Dyer (A rapid method of total lipid extraction and puri- fication, Can. J. Biochem. Pysio. 37, 911-917 (1959)). Les lipides des microsomes, extraits, ont été saponifiés par la lessive de soude. On a estérifié les acides gras libres par addition de BF3méthanol. Après évaporation du méthanol et élimination des produits d'accompagnement hydrophiles, on a dosé quantitativement les esters'd'acides gras. Dans les groupes d'animaux non brûlés, on n'a pu constater aucune modification notable de la composition des acides gras. Ainsi donc, la narcose et la légère at- taque par opération ne provoquent pas de modification des lipides des microsomes. Par conséquent, pour la sui- te des comparaisons, on a rassemblé le groupe normal et le groupe témoin en un seul goupe témoin. Une comparaison des animaux non brûlés et des animaux brûlés en matière de composition des acides gras des microsomes t fait apparaître des déplacements impor- tants des acides gras insaturés vers les acides gras sa- turés. La figure 1 des dessins annexés représente la répartition des acides gras dans les lipides des micro- somes du foie et les variations causées par les lésions thermiques de la peau. Après brûlure, la proportion d'acide palmitique (en C 16) passe de 25,1 à 34,4 % des acides gras totaux. Pour l'acide stéarique (en C 18) la proportion de 46,3 % chez les animaux brûlés est supérieure de 13,2 % à celle trouvée chez les animaux témoins. Pour le cas de l'acide oléique (C 18:1) on constate une légère diminution non signifiante. La pro- portion d'acide linoléique (C 18:2) recule après brûlure au 1/3 environ de la valeur initiale. Finalement, pour l'acide arachidonique (C 20:4), on ne retrouve, après brûlure, que 31 % de la teneur initiale. Les résultats rapportés dans le tableau I ci- après font apparaître l'influence du Sili-suc-na sur les teneurs en les divers acides gras chez les animaux brû- lés et chez les animaux non brûlés. Tableau I Répartition des acides qras des lipides des microsomes de foies de rats après thérapie Par Sili-suc-na chez des animaux brûlés et non brûlés. C16 C18 C1B:1 C18:2 CZD:4 Non brûlés 29,8: 37r2 W 8 9: 9t6 V 16,2 Non brûlsd89 16?s (groupe témoin I)6,2 t12 3 f1i1 -3,3 It9 Bral 25,4: 37r5: 78: 11 4 18rD: Brûlés -36,o -8 i -53 -971 On peut constater que le traitement selon l'in- vention par un dérivé de silibinine ne provoque aucune modification importante chez les animaux témoins non brûlés, comparativement aux animaux non traités. Chez les animaux brûlés, la thérapie provoque une suppression totale de la perte des acides gras insaturés. Pour résumer, on peut donc conclure: les brûlu- res conduisent à des variations dans la composition en acides gras des lipides des microsomes. On peut admettre que cette modification est due à une dégradation par o- xydation des membranes. Celà ressort en particulier de la forte diminution de la teneur en acides gras polyin- saturés. Les dérivés de silibinine utilisés conformément à l'invention sont donc capables d'inhiber les dégrada- tions cellulaires par oxydation. Ils sont donc parti- culièrement aptes à interrompre les mécanismes de dégra- dation par oxydation après brûlures sévères. Comme on l'a déjà montré, on admet que les réac- tions auto-toxiques après brûlures sévères conduisent en particulier à des dégradations cellulaires par oxyda- tion. On a donc recherché quel était l'effet d'un trauma thermique normalisé sur la blastogénèse induite par PHA (phyte_hémagglutinine) des lymphocytes T de la rate et du sang périphérique des rats. On a en outre recherché l'influence des dérivés de la silibinine utilisables conformément à l'invention sur ces troubles des fonc- tions lymphocytaires après brûlures sévères. Action d'un trauma thermique normalisé sur la blastoqénèse induite par PHA des lymphocvtes T de la ra- te et du sanq périphérique de rats. En opérant comme décrit plus haut, on a brlé la peau du dos de rats Wistar par un timbre de cuivre. On a utilisé en tant que groupe témoin des animaux soumis à un simulacre de brûlure, sur lesquels on a effectué tou- tes les manipulations opératoires mais sans brûlure. Au bout de 2, 4, 7 et 9 jours, on a prélevé sur les animaux brûlés et sur les animaux témoins, sous narcose par l'é- ther, du sang et la rate. Pour l'isolement des lymphocytes, on a appliqué le sang héparinisé en revêtement sur une solution Fi- coll-Hypaque (densité 1,077). On a ensuite centrifugé et on a vérifié la vitalité des lymphocytes obtenus à l'ai- de de Bleu Trypan. Pour l'isolement des lymphocytes de la rate, on a broyé l'organe, on a passé au travers d'un tamis et on a éliminé les érythrocytes présents à l'aide la solution lytique de Gay. On a soumis ensuite le mélange des cellules à incubation de 30 mn dans un récipient en présence de 5 % de sérum foetal de veau inactivé à la chaleur afin de diminuer la proportion des cellules mononucléaires dans la suspension par adhérence à la paroi du récipient (5 %). Pour la culture, on a introduit les cellules dans des plaques de microtitrage à "fond plat". On a ensuite ajouté 20 % de sérum foetal de veau. De cette manière, on a déterminé la blastogénèse spontanée par mesure de l'incorporation de la H-thymidine (2Ci/mM) dans l'ADN des cellules. Dans des essais préalables, on avait vérifié qu'il y avait une stimulation mitogène optimale à une concentration en PHA (Phythémagglutinine mitogène) de 5 microgrammes/ml. Dans ces expériences pour l'optimisa- tion du système expérimenal cellulaire, on a en outre constaté que la stimulation maximale de la nouvelle -synthèse de l'ADN se produisait au bout de 72 heures. D'autre part, on a constaté que la concentration optimale en sérum foetal de veau était de 20 % pour une stimulation maximale. On a donc suivi comme décrit ci-dessus la blas- togénèse spontanée par mesure de l'incorporation de la 3H-thymidine dans 1'ADN des cellules. Les cellules ont été récoltées 18 heures après l'addition de la 3-H-thy- midine, le point zéro pour les 18 heures coincidant avec le moment de la stimulation maximale. Pour l'étude de l'activité des dérivés de la si- libinine utilisables conformément à l'invention, on a traité un groupe de rats par un dérivé de la silibinine. A cet effet, on a administré par injection intrapérito- néale 75,5 mg de Sili-suc-na une fois par jour. Cette thérapie a été poursuivie du jour de la brûlure jusqu'au jour du prélèvement d'organe (au maximum jusqu'au 9ème jour). Pour l'évaluation des résultats obtenus avec les animaux témoins et les animaux non brûlés et les animaux traités par Sili-suc-na, on a calculé l'indice de stimu- lation. Cette valeur numérique est le quotient de la va- leur moyenne de l'échantillon stimulé et de la valeur moyenne de l'échantillon témoin. A partir de l'indice de * stimulation ainsi obtenu pour chaque animal d'expérien- ce, on a calculé un indice de stimulation moyen par groupe d'animaux. Les résultats obtenus sont exprimés par cet indice SI. La figure 2 des dessins annexés montre l'influ- ence du Sili-suc-na utilisé sur la blastogénèse des lymphocytes. Chez les animaux brûlés, la stimulabilité réduite des cellules a été nettement accrue par la sili- binine. Au deuxième jour déjà, chez les animaux traités par Sili-suc-na, on a constaté une réponse environ 10 fois plus forte des lymphocytes du sang à la PHA. Au quatrième jour après le trauma, la valeur de l'indice de stimulation des lymphocytes du sang était de 8 pour les animaux traités, alors que la valeur correspondante était de 1,5 pour les animaux non traités. Pour les cellules de la rate, les indices de stimulation des animaux brûlés, non traités, sont tous nettement inférieurs à 1. L'administration de la silibi- nine conduit à une amélioration significative tous les jours d'examen, avec un maximum le septième jour après le trauma. On a encore effectué des essais comparatifs qui ont montré que le Silisuc-na seul, chez des animaux sains, ne provoquait aucune modification appréciable de la stimulabilité dans le cas de la blastogénèse induite par PHA des lymphocytes T de la rate et du sang périphé- rique. Ainsi donc, la silibinine utilisée conformément à l'invention stimule la blastogénèse des lymphocytes des animaux brûlés dans une mesure significative. On a en outre constaté que chez les animaux traités par des dérivés de la silibinine, la catabolie générale était plus faible car les animaux reprefin aient rapidement du poids après le trauma thermique. Empoisonnement Par des champignons: Les empoisonnements par les amanites comptent parmi les plus graves rencontrés dans le domaine médi- cal. Bien que 10 à 30 % seulement de tous les empoison- nements par champignons soient causés par l'amanite ver- te, l'empoisonnement par ce champignon, en raison de son danger, a soulevé de tous temps le plus grand intérêt médical. Dans les publications anciennes, on indique une létalité de 30 à 50 %. Grâce à la médecine intensive moderne, selon une étude faite par Floersheim et colla- borateurs sur 205 patients, ce nombre a été ramené en moyenne à 22,4 %. Le poison de l'amanite, l'amanitine, peut déjà être mortel à la dose de 7 mg pour un adulte. Cette quantité de substance toxique se trouve dans environ g de champignons frais. Après une série d'expériences prometteuses sur des animaux, on a utilisé la substance active Sili-suc- na dans la thérapie de l'empoisonnement par amanites. On a traité vingt-huit patients souffrant d'em- poisonnement par des amanites par du Sili-suc-na, con- jointement avec les mesures thérapeutiques habituelles. Un seul de ces vingt-huit patients est mort: il avait absorbé de grandes quantités du champignon vénéneux dans des buts de suicide. Ces'résultats prouvent un progrès thérapeutique énorme dans ce domaine. Préparation de la silibinine exempte d'isosilv- bine. On chauffe sous agitation à l'ébullition pendant minutes une suspension de 500 g du produit décrit dans la demande de brevet DE-AS 1 923 082, colonne 8, lignes 14 à 19, à une teneur en silymarine d'environ 70 % et avec des proportions relatives d'environ 3: 1: 1 : entre les isomères silybine/silidianine/silicristine, la silybine contenant environ 1/3 d'isosilybine et 2 kg de méthanol (environ 2,53 1). A la fin de cette période, un peu de silibinine peut déjà précipiter de la solution ainsi obtenue. On élimine ensuite sous vide de 0,75 à 1,25 kg (environ 0,96 à 1,58 1) de méthanol et on aban- donne le résidu au repos pendant 10 à 28 jours à tempé- rature ambiante. On filtre la silibinine qui a précité et on la lave à deux reprises avec 50 ml à chaque fois de méthanol froid. Après séchage à 40C sous vide, on soumet la silibinine brute isolée à purification de la manière suivante: On dissout à chaud 60 g de silibinine brute dans 3 1 d'acétate d'éthyle technique; on ajoute ensuite g de charbon actif et on agite pendant encore 2 h sous reflux. On clarifie ensuite par filtration et on concentre la solution sous pression réduite à 50C à volume final d'environ 250 ml, on agite le concentré pendant 15 minutes à l'aide d'un appareil de type Ultra- Turrax et on ajoute sous agitation 25 ml de méthanol. On abandonne ensuite le mélange au repos pendant une nuit à température ambiante. Avant d'essorer la silybine qui a précipité, on agite pendant encore 5 minuteségalement à l'aide d'un appareil Ultra-Turrax. On lave le précipité essoré à deux reprises avec 50 ml d'acétate d'éthyle et on sèche à l'étuve à vide en une nuit à 40'C. On broie ensuite le produit et on termine le séchage dans les mêmes conditions pendant 48 h. EXEMPLE 1 Préparation du C-2',3-dihydroQénosuccinate de silibinine - - c+2 _O-CO C C14 COO tib 15. Q ci," - 2 C-2 H-Cool+ On dissout 50 g de silibinine à 45'C dans 70 ml de pyridine, on ajoute 50 g d'anhydride succinique, on agite le mélange pendant 8 h environ à 45C, on ajoute 30 ml d'éthanol et on agite jusqu'à formation d'un mé- lange homogène. On ajoute ensuite sous agitation énergi- que, en 30 mn environ, 60 ml d'eau afin de saponifier les esters phényliques. Après environ 1 h d'agitation à 'C, les esters phényliques sont hydrolysés quantitati- vement. On vérifie que l'hydrolyse est complète par chromatographie liquide sous haute pression(HPLC). On ar- rête l'hydrolyse en ajoutant rapidement au mélange de réaction obtenu 1,7 1 d'acétate d'éthyle. Pour séparer l'acide succinique en excès et la pyridine, on extrait à contre-courant la solution de réaction diluée par l'acétate d'éthyle à deux reprises par 5 1 à chaque fois d'eau saturée d'acétate d'éthyle et réglée à pH 1,85 (par l'acide chlorhydrique aqueux dilué). A cet effet, on pompe l'eau de lavage acidifiée et saturée d'acétate d'éthyle en circuit contre la solu- tion de réaction diluée et on maintient ensuite le pH, par addition d'acide chlorhydrique dilué, à 1,85 jusqu'à ce que ce pH reste constant après le passage de l'acéta- te d'éthyle. On extrait ensuite la phase acétate d'éthyle à deux reprises à contrecourant par 3,4 1 à chaque fois d'eau saturée d'acétate d'éthyle afin d'éliminer l'acide chlorhydrique en excès. Dès que le pH de l'eau de lavage est supérieur à 4,5, on sépare la phase organique quan- titativement, on la concentre à 40-50'C sous vide au 1/12 du volume initial (environ 0,2 1) et on la dilue par 125 ml d'éthanol. On obtient le composé du titre par précipitation dans un mélange éthanol/eau et séchage à 50C sous vide pendant 15h. Pour la préparation d'un échantillon analytique, on reprécipite le composédu titre à trois reprises dans un mélange éthanol/eau et on sèche ensuite 15 h à 50'C sous vide. Dans le spectre de masse FD le pic moléculaire apparaît à la masse moléculaire attendue de 682. Le spectre IR présente dans la région de la fré- quence de valence de CO deux bandes qui se chevauchent, dont l'une, existant également dans le cas de la silibi- nine, doit être attribuée à la fonction carbonyle du cy- -1 cle pyrone à la longueur d'onde de 1 635 cm 1 La seconde bande est à 1 730 cm 1 et est due aux deux fonctions carbonyle d'esters. Le spectre de RMN- H confirme qu'il y a eu dou- ble estérification. Ainsi, le rapport entre les protons aromatiques et les protons de méthylène des restes d'a- cide succinique, déterminé par intégration, est de 8: 8 (région de 5,9 à 7,1 ppm). Le rapport entre ces protons de méthylène (2,6 ppm) et les protons de méthyle du groupe méthoxy (3,8 ppm) est de 8: 3, ce qui concorde bien. De même les déplacements chimiques dans les étu- des au 1 C montrent que l'estérification se produit sur les deux groupes OH alcooliques car les déplacements chimiques varient le plus fortement pour C11 et les ato- mes de carbone voisins C12-C14, ainsi que pour C2-C4. Analyse élémentaire pour C33H30016 (682,60): C H O calc.: 58,07 4,43 37,50 trouvé: 58,05 4,57 37,31 EXEMPLE 2 Préparation du C-2',3-dihvdroaénosuccinate de silibinine. sel disodigue. y À C2O -- Ci2o -CB--c C2CON HO 't,X O DR cO CD2 - 8 Co-Na A la solution éthanolique obtenue dans l'exemple 1, on ajoute goutte à goutte sous agitation et en re- froidissant de l'extérieur à une température de -5 à 9'C, de la lessive de soude éthanolique à 6 % en quan- tité calculée d'après une détermination de la teneur en substance solide de cette solution, on agite la suspension pendant encore 1 h à température ambiante, on essore la substance solide de couleur beige qui a précité, on la remet en suspension à deux reprises pendant 5 à 10 minutes à chaque fois, à l'aide d'un ap- pareil Turrax, dans 150 ml d'éthanol et on essore à nou- veau. Pour l'élimination des résidus d'acétate d'éthyle, on met ensuite le produit en suspension pendant 14 h à température ambiante dans 280 ml d'éthanol, on essore à nouveau, on lave avec 70 ml d'éthanol et on sèche en h à l'étuve à vide à 40-45'C. Ensuite on broie le produit préséché, tamise à une taille de grains infé- rieurm à 0,2 mm et sèche encore 48 heures à 40-45'C sous vide. On obtient ainsi 52 g du composé recherché (rende- ment 69 %). Le composé du titre n'a pas de point de fusion net. Il commence à fritter à environ 80' et fond avec formation de bulles à 100'C environ. Spectre UV dans le méthanol: A max = 288 nm, E = 1,73. 10. Le poids moléculaire du composé du titre est de 726,56. Le composé est une poudre microcristalline de couleur légèrement beige, sans odeur particulière et avec un goût salé. Il est bien soluble dans l'eau, peu soluble dans l'éthanol et pratiquement insoluble dans l'acétone, l'éther et le chloroforme. Exemple d'application Préparation de lyophilisats Pour l'administra- tion i.v. C-2',3-dihydrogénosuccinate de silibinine, sel disodique 75,0 mg mannitol 10,0 mg eau pour injection complément à 1,5 ml On introduit 1,5 ml de solution dans des ampou- les à pointe de 5 ml de capacité puis on lyophilise se- lon la technique habituelle. L'ampoule contenant le lyd- philisat fini est soudée de la manière habituelle pour la conservation. Pour l'utilisation, le lyophilisat est dissous dans 5 ml de sérum physiologique stérile; on obtient ainsi une solution limpide. REVENDICATIONS 1. Dérivés de la silibinine répondant à la for- mule générale I o 0 2-OCE COD- (A1k1)-COOM ,sO^': 2 -o-ó- - (AllnC0I) OC CI O O C:--( Alk2)m-CDoM2 dans laquelle n et m représentent chacun, indépendamment l'un de l'au- tre, O ou 1, Alk et Alk2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un radical alcoylène avec 1 à 4 atomes de car- bone ou un radical alcènylène avec 2 à 4 atomes de carbone, et M1 et M2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un atome de métal alca- lin. 2. Dérivés de la silibinine selon la revendica- tion 1, caractérisés en ce que n et m représentent chacun, indépendamment l'un de l'au- tre, à O ou 1, Alk1 et Alk2 représentent chacun un radical alcoylène à deux atomes de carbone et M1 et M2 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome de métal alcalin. 3. Dérivés de la silibinine selon la revendica- tion 1, caractérisés en ce que n et m, Alk1 et Alk2 ainsi que M1 et M2 sont identiques. 4. C-2',3-dihydrogénosuccinate de silibinine, sel disodique, de formule on 0 sCD - CH2 - CS2 - CD-N-. 1' if oR o 5. Procédé de préparation des dérivés de la si- libinine selon l'une des revendications 1 à 4, caracté- risé en ce que l'on dissout une partie en poids de la silibinie de formule (A) C " 2 0ci OH O" OHcH (A) silibinine dans 1 à 2 parties en poids de pyridine et on fait réa- gir sous agitation avec 1 à 3 parties en poids d'un anhydre d'acide dicarboxylique de formule O C - Alk - C = O on dans laquelle "Alk" représente un-radical Alk1 ou Alk2 selon la revendication 1, on ajoute ensuite de l'éthanol jusqu'à formation d'un mélange homogène, puis on ajoute lentement, sous agita- tion énergique, de l'eau, ce qui provoque l'hydrolyse des esters présents des groupes OH à liaisons aromati- ques, dès que cette hydrolyse est complète, on dilue par de l'acétate de d'éthyle, on lave avec de l'eau acidi- fiée, saturée en acétate d'éthyle, on concentre la phase acétate d'éthyle, on reprend par l'éthanol et on conver- tit en le sel du radical acide carboxylique libre à l'aide d'une solution alcoolique d'hydroxyde alcalin. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la réaction avec l'anhydre d'acide dicarboxy- lique est effectuée à une température d'environ 40 à 'C. 7. Procédé selon la -revendication 5 ou 6, carac- térisé en ce que l'on maintient l'eau de lavage acide, saturée d'acétate d'éthyle, à un pH d'environ 1,5 à 2,4. 8. Compositions pharmaceutiques contenant au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 4, éventuellement dans un excipient et/ou adjuvant pharmaceutique. 9. Utilisation des composés selon l'une des revendications 1 à 4 pour la fabrication de médicaments pour le traitement des lésions provoquées par brûlures, des cirrhoses du foie, des troubles toxiques-métaboli- ques du foie et des empoisonnements par les champignons.