Brevet FR2574081A1 — publié le 19860606

La présente invention concerne un polypeptide possédant une activité de cyclomaltodextrine glucano- transférase. Au cours de la présente invention, les amino acides, peptides et similaires, sont désignés par les abré- viations couramment utilisées par l'homme de l'art, Des exemples en sont donnés ci-après. Lorsqu'il y a possibilité d'existence d'isomères optiques, sauf indication contraire les abréviations des amino acides désignent les isomères L. ADN, est l'abréviation d'acide désoxyribonucléi- que; ARN, de l'acide ribonucléique; A, de l'adénine; T, de la thymine; G, de la guanine; C, de la cytosine; TPdN, du triphosphate de désoxynucléotide; TPddN, du triphosphate de didésoxynucléotide; TPdC, du triphosphate de désoxycytidine; SDS, de sulfate de dodécyle sodique; Ala, d'alanine; Arg, d'arginine; Asn, d'asparagine; Asp, d'acide aspartique,; Cys, de cystéine; Gln, de glu- tamine; Glu, d'acide glutamique; Gly, de glycine; His, d'histidine; Ile, d'isoleucine; Leu, de leucine; Lys, de lysine; Met, de méthiocine; Phe, de phénylalanine; Pro, de Proline; Ser, de sérine; Thr, de thréonine; Trp, de tryptophane; Tyr, de tyrosine; Val, de valine; et CGTase, de cyclomaltodextrine glucanotransférase. La dénomination de "polypeptide" signifie "poly- peptide à activité de CGTase". La CGTase, ou macerans amylase, est connue depuis des années comme étant l'enzyme produite par le Bacillus macerans. Récemment, on a découvert que CGTase était pro- duite par d'autres micro-organismes comme ceux des espèces de Bacillus stéarothermophilus et de Bacillus circulans. L'activité de transfert de saccharide par la CGTase est maintenant utilisée dans de nombreuses industries. Par exemple, on produit des cyclodextrines en soumettant de l'amidon gélifié à l'action de la CGTase, tandis que la production de glycosylsucrose se sert de la réaction de transfert de saccharide de l'amidon au sucrose, qui s'effectue en soumettant une solution mixte d'amidon liquéfié et de sucrose à l'action de la CGTase. La demande en cyclodextrines est en expansion car ces produits servent d'hôte pour former un complexe d'inclusion stable avec une substance organique volatile ou susceptible d'être oxydée; la demande en glycosylsu- crose augmente également car ce produit est un édulcorant faiblement sucré, faiblement cariogène, qui est commer- cialisé par Hayashibara Co., Ltd, sous le nom de marque de "Coupling Sugar". Au regard de l'accroissement de ces demandes, il devient urgent de développer des moyens de production de CGTase. Pour cela, il s'avère nécessaire de déterminer la séquence des amino acides du polypeptide possédant l'ac- tivité CGTase. Toutefois, cette séquence était inconnue à ce jour. La présente invention est basée sur des recher- ches effectuées par la demanderesse afin de déterminer la séquence des amino acides du "polypeptide", d'assurer une large source de ce "polypeptide" par la technique de recom- binant de gène, et d'améliorer la productivité du "poly- peptide". Le "polypeptide" selon l'invention est caractéri- sé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des séquences par- tielles d'amino acides suivantes; (a) Asn-Lys-Ile-Asn-Asp-Gly-Tyr-Leu-Thr, (b) Pro-Val-Phe-Thr-Phe-Gly-Glu-Trp-Phe-Leu, (c) Val-Thr-Phe-Ile-Asp-AsnHis--Asp-Met-Asp-Arg-Phe, (d) Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln-Tyr-Met-Thr-Gly-Asn-Gly- Asp-Pro-Asn-Asn-Arg, et (e) Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly, et plus particulièrement en ce que ces séquences partielles sont situées dans une séquence proche de l'extrémité N- terminale de ce polypeptide. Ce dernier est, en outre, caractérisé en ce qu'il forme de la gyclodextrine à partir d'amidon soluble, en ce qu'il présente un poids moléculaire de 70 000 + 000 daltons par électrophorèse sur SDSpolyacrylamide, et en ce qu'il a une activité spécifique de 200 + 30 uni- tés/mg de protéine. La demanderesse a également découvert que les "polypeptides" provenant de B. stéarothermophilus et de B. macerans, avaient les séquences d'amino acides représen- tées respectivement dans les tableaux 2-1 et 5-1; ces deux séquences sont expliquées ci-après. De plus, la demanderesse a déterminé les séquen- ces des signaux peptidiques qui contrôlent la secrétion du "polypeptide" à partir des micro-organismes producteurs. La présente invention et ses caractéristiques sont expliquées ci-après avec référence aux dessins anne- xés dans lesquels: Figure 1 représente le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pTCH201, en particulier celui du fragment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. stéarothermophilus; Figure 2 représente le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pTCU211, en particulier celui du frag- ment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. stéarothermophilus; Figure 3 représente le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pMAH2, en particulier celui du frag- ment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. macerans; Figure 4 représente le diagramme de restriction de l'ADN recombinant p MAU210, en particulier celui du frag- ment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. macerans. Dans la présente invention, la séquence des aminoacides du "polypeptide" est déterminée par clonage et séquençage du gène du "polypeptide" provenant d'un micro- organisme producteur de CGTase. La séquence des aminoacides renfermant l'extré- mité N-terminale est-déterminée par analyse d'un "polypep- tide" hautement purifié à l'aide d'un séquenceur de protéi- ne en phase gazeuse. Clonage du gène du "polypeptide" Conformément à l'invention, un fragment d'ADN, obtenu par cassure d'ADN provenant d'un micro-organisme donneur, capable de produire ce "polypeptide", et diges- tion de l'ADN par exemple par des ultrasons ou des enzymes de restriction, et un fragment de vecteur, obtenu par clivage de la même manière d'un vecteur, sont liés, par exemple avec une ADN ligase, pour donner un ADN recombi- nant portant le gène du "polypeptide". Le micro-organisme donneur est choisi à partir des bactéries qui produisent ce "polypeptide". Conviennent par exemple des bactéries du genre Bacillus, comme B. ma- cerans, B. megaterium, B. circulans, B. polymyxa, et B. stéarothermophilus, et des bactéries du genre Klebsiella comme K. pneumoniae, ainsi qu'il est décrit dans les bre- vets japonais Kokai N 20 373/72, N 63 189/75 et N 88 290/ 75, et par Hans Bender dans Archieves of Microbiology, Vol. 111, pp. 271-282 (1977). Des microorganismes recombinants, dans lesquels l'aptitude à produire le "polypeptide" a été introduite par la technique de génie génétique, peuvent être utilisés comme microorganismes donneurs. L'ADN du microorganisme donneur peut être préparé par culture de ce microorganisme, par exemple en un milieu de culture liquide pendant environ 1 à 3 jours dans des con- ditions d'agitation-aération, récolte par centrifugation de ces microorganismes à partir de la culture, et lyse de ces derniers. Conviennent comme modes opératoires bactérioly- tiques, le traitement aux ultrasons et cytohydrolyse utili- sant le lysozyme ou la ( -glucanase. Si nécessaire, on peut employer en combinaison une autre enzyme, comme une protéase, et/ou un agent ten- sio-actif comme le sulfate de lauryle sodique. Naturelle- ment, on peut aussi éventuellement effectuer un traitement de congélationdécongélation. Afin d'isoler l'ADN du lysat résultant, on combine,deux ou plus, modes opératoires clas- siques, comme extraction au phénol, élimination de protéi- ne, traitement par la protéase, traitement par la ribonu- cléase, sédimentation par l'alcool et centrifugation. Bien que la ligature de l'ADN puisse être réali- sée par traitement des fragments d'ADN et de vecteur, par exemple par les ultrasons ou les enzymes de restriction, il est souhaitable d'utiliser ces derniers, en particulier les enzymes agissant spécifiquement sur une séquence pres- crite du nucléotide, pour obtenir une ligature régulière. Conviennent de manière spécifique les enzymes de restric- tion de type II, par exemple, EcoRI, HindIII, BamHI, SalI, SlaI, XmaI, MboI, XbaI, SacI, PstI, et similaires. Conviennent comme vecteurs des bactériophages et des plasmides qui prolifèrent de manière autonome dans le micro-organisme hôte. Lorsqu'on utilise comme hôte un microorganisme de l'espèce Escherichia coli, on peut se servir de bacté- riophages comme Xgt.>C et Xgt. NB, tandis que f11, wl et 105 peuvent être utilisés lorsqu'on utilise comme hôte un microorganisme de l'espèce Bacillus subtilis. En ce qui concerne les plasmides, lorsqu'on uti- lise comme hôte un microorganisme de l'espèce Escherichia coli, on peut se servir de plasmides comme pBR322 et pBR325, tandis que pUB110, pTZ4 (pTP4) et pC194, sont utilisables pour des microorganismes hôtes de l'espèce Bacillus sub- tilis. On peut utiliser comme vecteur des plasmides qui prolifèrent de manière autonome dans 2, ou plus, microorga- nismes hôtes différents,par exemple pHV14, TRp7, YEp7 et pBS7. Ces vecteurs sont coupés avec les mêmes types d'enzy- mes de restriction que ceux qu'on utilise au cours de la digestion de l'ADN pour obtenir un fragment de vecteur. Les fragments d'ADN et de vecteur sont liés au moyen d'un mode opératoire classique,utilisant l'ADN ligase. Par exemple, des fragments d'ADN et-de vecteur sont d'abord recuits, puis soumis in vitro à l'action d'une ADN liaase convena- ble pour obtenir un ADN recombinant. Eventuellement, cet ADN recombinant peut être préparé par introduction des frag- ments recuits dans l'hôte microorganique, afin de les sou- mettre à l'action in vivo d'une ADN ligase. Les microorganismes hôtes, utilisables conformé- ment à l'invention, sont ceux dans lesquels l'ADN recombi- nant prolifère de manière autonome et constante pour expri- mer ses caractéristiques. Plus précisément, les microorga- nismes qui ne sont pas capables de produire 1' o -amylase (EC 3.2.1.1) peuvent être utilisés avantageusement, car l'utilisation de ces microorganismes facilite l'isolation et la purification du "polypeptide" secrété. L'ADN recom- binant peut être introduit dans le microorganisme hôte à l'aide d'un mode opératoire classique. Par exemple, lors- que ce microorganisme appartient à l'espèce Escherichia coli, l'introduction de l'ADN recombinant est réalisée en présence d'ion calcium, alors qu'on utilise, avec un micro- organisme du genre Bacillus, des méthodes de cellules et protoplasmes convenables. Le microorganisme recombinant dans lequel est introduit l'ADN recombinant, est choisi par collecte du clone qui croit sur une culture sur plaque renfermant de l'amidon afin de convertir celui-ci en cyclodextrine. Suivant l'invention l'ADN recombinant, portant le gène du "polypeptide" cloné de cette manière, peut être facilement introduit, après isolation à partir du microor- ganisme recombinant, dans différents microorganismes hôtes. Elle a également constaté qu'un fragment d'ADN portant le gène du "polypeptide", obtenu par digestion d'un ADN recom- binant portant ce gène, avec des enzymes de restriction, peut être aisément lié avec un fragment de vecteur qui a été obtenu de manière identique. En outre, le gène du "polypeptide" dans l'ADN recombinant, obtenu conformément à l'invention, est coupé par l'enzyme de restriction PvuII (de Toyobo Co., Ltd) pour perdre la capacité d'exprimer le gène du "polypeptide', car l'ADN recombinant a un site de coupure du PvuII de res- triction. Séquence du gène de "polypeptide" Le gène du "polypeptide" est séquence par le procédé de rupteur de chaîne, comme décrit dans Gene, Vol. 9, pp.259-268 (1982). Ce procédé comprend le stade d'insertion d'un fragment d'ADN cloné portant le gène du "polypeptide", dans le site d'insertion d'un plasmide convenable comme pUC18, au moyen d'enzymes de restriction. Le plasmide recombinant obtenu est introduit par transformation dans une souche adéquate d'Escherichia coli comme E. coli JM83, puis on sélectionne le micro-organisme recombinant qui renferme le plasmide. Le plasmide recombinant est préparé à partir de microorganismes recombinants ayant proliféré. Il est re- cuit conjointement avec une amorce synthétique, et on laisse alors agir le fragment de Klenow sur le mélange pour développer l'amorce, aussi bien que pour former l'ADN com- plémentaire. Ensuite, ce mélange est soumis séquentiellement à l'électrophorèse sur polyacrylamide et à la radio-auto- graphie, suivies par le séquençage du gène du "polypeptide". Le signal peptidique qui contrôle la secrétion du"polypeptide" à partir de la cellule peut être séquencé de manière identique. Séquence des amino acides du "polypeptide" Cette séquence est déterminée à partir de la sé- quence d'ADN du gène du "polypeptide". La séquence des aminoacides du signal peptidique est déterminée de manière identique. Séquence partielle des aminoacides du "polypeptide"renfer- mant l'extrémité N-terminale On cultive un microorganisme producteur de 'po- lypeptide" du genre Bacillus sur un milieu de culture nu- tritif, pour produire le "polypeptide". La partie surna- geante, obtenue par centrifugation de la culture, est pu- rifiée par fractionnement avec du sulfate d'ammonium, chromatographie par échange d'ions et chromatographie en phase liquide de haute performance, pour obtenir un spé- cimen très pur de "polypeptide". Ce spécimen est alors dé- gradé à l'aide d'un séquenceur à protéine en phase gazeuse, conformément au procédé décrit dans Journal of Biological Chemistry, Vol.256, pp.79907997 (1981), et fixé avec une chromatographie en phase liquide à haute performance, sui- vie de la détermination de la séquence partielle des amino- acides renfermant l'extrémité N-terminale. Préparation du "polypeptide" avec un micro-organisme re- combinant La demanderesse a trouvé qu'une grande quantité du "polypeptide' pouvait être produite par culture d'un microorganisme recombinant avec un milieu de culture nu- tritif. A ce milieu de culture sont incorporés, par exemple, des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et,éventuellement, de petites quantités de produits nutri- tifs organiques comme aminoacides et vitamines. Conviennent comme source de carbone, amidon, hy- drolysat partiel d'amidon, et des saccharides comme glucose, fructose et sucrose; comme source d'azote minéral, ammo- niac gazeux, solution aqueuse d'ammoniac, sels d'ammonium et nitrates; comme source d'azote organique, peptone, extrait de levure, haricot de soja dégraissé, liqueur d'infusion de mais et extrait de viande. Le micro-organisme recombinant est cultivé sur un milieu de culture nutritif pendant environ 1 à 4 jours, sous aération-agitation, afin d'accumuler le "polypeptide", tout en gardant le milieu de culture, par exemple, à pH 4 à 10 et à 25 à 65 C. Bien que ce "polypeptide" puisse être utilisé tel quel dans la culture, en général, avant son utilisation on sépare la culture en solution de "poly- peptide" et en cellules, au moyen de modes opératoires classiques comme filtration et centrifugation. Lorsque le "polypeptide" est présent dansla cellule, celle-ci est d'abord traitée avec des ultrasons, un agent tentioactif et/ou un agent de cytohydrolyse, puis on filtre et centri- fuge pour séparer une solution renfermant le "polypeptide". Cette dernière est purifiée,par exemple, par com- binaison de concentration sous vide, concentration au mo- yen d'une membrane filtrante, relargage avec du sulfate d'ammonium ou de sodium, sédimentation fractionnelle avec méthanol, éthanol ou acétone, afin d'obtenir un "poly- peptide" très pur, avantageusement utilisable dans l'in- dustrie. Afin d'améliorer encore la qualité du "polypep- tide", sa séquence d'aminoacides peut être partiellement substituée, enlevée, ajoutée ou modifiée de manière à ce que ce "polypeptide" ne perde pas son activité CGTase, avant son utilisation. L'unité d'activité CGTase est définie comme la quantité de "polypeptide" qui réduit complètement la colo- ration à l'iode de 15 mg d'amidon soluble à 40 C sur une durée de 10 minutes, dans les conditions de réaction sui- vantes: à 5 ml de solution d'amidon soluble à 0,3%, poids/ poids, renfermant du tampon acétate 0,02 M (pH 5,5) et 2x10 -3M de chlorure de calcium, sont ajoutés 0,2 ml d'une solution diluée d'enzyme, et le mélange est mis à incuber à 40 C pendant 10 minutes. Puis, on échantillonne 0,5 ml de mélange réactionnel et on y ajoute 15 ml de solution aqueu- se d'acide sulfurique 0,02N pour arrêter la réaction enzy- matique. Le mélange réactionnel est alors additionné de 0,2 ml de solution 0,1N de I2-KI, afin d'effectuer la co- loration, et l'on détermine la capacité d'absorption pour une longueur d'onde de 660 nm. Dépôt des microorganismes recombinants Les microorganismes recombinants Escherichia coli TCH201, Escherichia coli MAH2, Bacillus subtilis MAU210 et Bacillus subtilis TCU211 ont été déposés le 2 novembre 1984, respectivement sous les numéros d'admission FERM P-7924, 7925, 7926 et 7927 au Fermentation Research Institute. Plusieurs formes de réalisation, non limitatives, de l'invention sont décrites ci-après. EXEMPLE 1 Clonage du gène du "polypeptiden de B. stéarothermophilus dans E. coli. Exemple 1-(1) Preparation de l'ADN du chromosome portant le gène du "'oly- peptide" résistant à la chaleur de B. stéarothermophilus Cet ADN est préparé conformément au procédé dé- crit par Saito et Miura dans Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 72, pp.619-629 (1963). Une culture de germe de B. stéa- rothermophilus FERM-P N 2225 est réalisée avec un milieu d'infusion coeur-cerveau à 50 C une nuit durant, sous se- couage énergique. Les cellules, recueillies par centrifuga- tion à partir de cette culture, sont mises en suspension dans du tampon TES (pH 8) renfermant du Tris-aminométhane, de l'acide chlorhydrique, de 1'EDTA et du chlorure de sodium; elles sont additionnées de 2 mg/ml de lysozyme, avant qu'on les mette à incuber à 37 C pendant 30 minutes. Le mélange incubé est réfrigéré, abandonné une nuit durant à -20 C, additionné de tampon TSS (pH 9) renfermant du Tris-aminométhane, de l'acide chlorhydrique, du lauryle sulfate de Na et du chlorure de sodium, il est chauffé à C, additionné d'un mélange de tampon TES (pH 7,5) et de phénol, dans la proportion de 1/4 en volume, refroidi dans de l'eau glacée, et centrifugé, pour obtenir la partie sur- nageante. A cette partie surnageante on ajoute 2 volumes d'éthanol froid, afin de recueillir un ADN de chromosome brut, qui est alors dissous dans du tampon SSC (pH 7,1) renfermant du chlorure de sodium et du citrate trisodique, puis le mélange est soumis à la fois-aux actions d'une "RNase A", une ribonucléase commercialisée par Sigma Chemical Co., et d'une "Pronase E", une protéase commer- cialisée par Kaken Pharmaceutical Co.; il est additionné avec une préparation fraîche de mélange phénol et tampon TES, refroidi, centrifugé, et additionné de 2 volumes d'éthanol froid, et l'on recueille un ADN de chromosome purifié. Cet ADN chromosomique est dissous dans uniampon (pH 7,5) renfermant les Tris-aminométhane, acide chlorhy- drique et EDTA,et il est conservé à -20 C. Exemple 1-(2) Préparation du plasmide pBR322 Le plasmide pBR322 (ATCC 37013) est isolé à par- tir d'E. coli conformément au procédé décrit-par J. Meyer et coll. dans Journal of Bacteriology, Vol. 127, pp.1524- 1537 (1976). Exemple 1-(3) PrEparation de l'ADN recombinant portant le qène du L'ADN chromosomique purifié portant le gène du "polypeptide" résistant à la chaleur, préparé dans l'exem- ple 1-(1), est partiellement digéré avec l'enzyme de restriction MboI, fourni par Nippon Gene Co. Ltd, pour donner un fragment d'ADN de 1 à 20 kbp. Séparément, le spécimen de pBR322, préparé dans l'exemple 1-(2) est com- piètement scindé avec l'enzyme de restriction BamHI, fourni par Nippon Gene Co. Ltd, et le produit clivé est soumis à l'action de l'alkali phosphatase-d'E. coli, four- * nie par Takara Shuzo Co. Ltd, afin d'empêcher une auto- ligature du fragment de plasmide, aussi bien que pour dé- phosphoriser l'extrémité 5'-terminale de ce fragment. Les deux fragments sont alors liés par soumission à l'action de l'ADN ligase de T4, fournie par Nippon Gene Co. Ltd., à 4 C une nuit durant, pour obtenir un ADN re- combinant. Exemple 1-(4) Introduction de l'ADN recombinant dans E. coli On utilise comme hôte une souche d'E. coli HB101 (ATCC 33694) incapable de produire de l'amylase. Le microorganisme est cultivé avec du bouillon-L à 37 C pendant 4 heures, et les cellules, recueillies par centrifugation à partir de la culture, sont mises en sus- pension dans du tampon acétate 10 mM (pH 5,6) renfermant du chlorure de manganèse 50 mM, puis sont recueillies à nouveau par centrifugation, remises en suspension dans du tampon acétate 10 mM (pH 5,6) renfermant du chlorure de manganèse 125 mM, additionnées de l'ADN recombinant prépa- ré dans l'exemple 1-(3) et laissées reposer dans un bain d'eau glacée pendant 30 minutes. Le mélange est alors chauf- fé à 37 C, additionné de bouillon-L, étendu sur plaque d'agar au bouillonL renfermant 50 gg/ml d'ampicilline et 2 mg/ml d'amidon, et l'on met à incuber à 37 C pendant 24 heures pour former des colonies. La colonie qui a dégradé l'amidon en cyclodextri- ne est choisie par le procédé de coloration à l'iode. Ain-i si, on a choisi le microorganisme dans lequel a été intro- duit l'ADN recombinant portant le gène du "polypeptide'. On fait alors proliférer ce microorganisme recombinant, et l'on extrait l'ADN recombinant du microorganisme ayant proliféré par le procédé de préparation du plasmide de l'e- xemple 1-(2), on le soumet à l'action d'enzymes de res- triction pour déterminer les sites de coupure de restric- tion, et on le digère complètement avec l'enzyme de res- triction EcoRI, fourni par Nippon Gene Co. Ltd. Le produit digéré est soumis à l'action d'une ADN ligase de T4 comme dans l'exemple 1-(3) pour obtenir un ADN recombinant, sui- vie de la sélection du microorganisme recombinant confor- mément au procédé de l'exemple 1-(4). Ce micro-organisme renferme un ADN recombinant de taille relativement petite, qui porte le gène du "polypeptide". Cet ADN recombinant et le plasmide pBR322 sont alors complètement digérés par l'enzyme de restriction SalI, fourni par Nippon Gene Co. Ltd, et traités comme dans le cas de EcoRI pour choisir les microorganismes recombinant renfermant un ADN recombinant de taille beaucoup plus pe- tite qui porte le gène du "polypeptide". L'un de ces microorganismes et son ADN recombi- nant sont appelés respectivement "Escherichia coli TCH201" (FERM P-7924) et "pTCH201". Le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pTCH201, en particulier celui du fragment d'ADN dérivé de Bacillus stéarothermophilus, est représenté dans la figure 1. Cette figure montre clairement que cet ADN recombinant est coupé par les enzymes de restriction PvuII (fourni par Toyobo Co. Lrd), KpnI, HindIII (fournis par Nippon Gene Co. Ltd), ou XbaI (fourni par Takara Shuzo Co. Ltd), mais non par EcoRI, BamHI, PstI, BglII ou AccI (tous four- nis par Nippon Gene Co. Ltd). EXEMPLE 2 Clonage du gène du "polypeptide" de B. stéarothermo philus dans B. subtilis Exemple 2-(1) Preparation de l'ADN recombinant pTCH201 Cet ADN est isolé à partid de E. coli TCH201, conformément au procédé de l'exemple 1-(2). Exemple 2-(2) Préparation du plasmide _UBl! Ce plasmide (ATCC 37015) est isolé à partir de B. subtilis conformément au procédé décrit par Gryczan et coll. dans Journal of Bacteriology, Vol. 134, pp.318-329 (1978). Exemple 2-(3) Préparation de l'ADN recombinant portant le gène du L'ADN recombinant pTCH201 portant le gène du "polypeptide" résistant à la chaleur, préparé dans l'exemple 2-(1), est complètement digéré par l'action simultanée des enzymes de restriction EcoRI et XbaI. Séparément, le spécimen de plasmide pUB110, pré- paré dans l'exemple 2-(2),est complètement coupé de manière identique sousl'action des enzymes de restriction EcoRI et XbaI. Les fragments résultants sont soumis, comme dans l'exemple 1-(3), à l'action d'une ADN ligase de T4, pour ob- tenir un ADN recombinant. Exemple 2-(4) Introduction de l'ADN recombinant dans B. subtilis On utilise comme hôte, une souche incapable de produire de l'amylase, le B. subtilis 715A. Le microorga- nisme est cultivé avec un milieu d'infusion coeur-cerveau à 28 C pendant 5 heures, et les cellules, recueillies à partir de la culture par centrifugation, sont ensuite pré- parées en suspension de protoplaste conformément au procé- dé décrit par Schaeffer et coll. dans Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 73, pp.2151- 2155, (1976). A cette suspension on ajoute l'ADN recombi- nant, préparé dans l'exemple 2-(3), et le mélange est alors traité conformément au procédé décrit par Sekiguchi et coll. dans Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 46, pp. 1617-1621 (1982) afin d'effectuer la transformation, est -15 étendu sur du milieu HCP renfermant 250 gg/ml de kanamy- cine et 10 mg/ml d'amidon, et l'on met à incuber à 28 C pendant 72 heures pour former des colonies. - A partir de ces colonies, on choisit par le pro- cédé de l'exemple 1-(4), les micro-organismes recombinant dans les-quels a été introduit l'ADN recombinant portant le gène du "polypeptide" résistant à la chaleur. L'un de ces microorganismes et son ADN recombinant sont respecti- vement appelés "Bacillus subtilis TCU211" (FERM P-7927) et "pTCU211". Le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pTCU211, en particulier celui du fragment d'ADN dérivé du microorganisme B. stéarothermophilus, est représenté dans la figure 2. Cette figure montre clairement que cet ADN recombinant est coupé par l'enzyme de restriction PvuII, KpnI ou HindIII, mais pas par EcoRI, BamHI, PastI, XhoI, BglII, AccI ou XbaI. EXEMPLE 3 Séquence partielle d'amino acides du "polypeptide" de B. stéarothermophilus renfermant l'extrémité N-terminale Exemple 3-(1) Preparation d p B. stéarothermophilus FERM-P N 2225 est-cultivé sur un milieu de culture liquide par le procédé de l'exem- ple 5 pour produire le "polypeptide'. La partie surnageante, obtenue par centrifugation de la culture, est relarguée avec du sulfate d'ammonium pour obtenir une fraction de "polypep- tide" qui est ensuite purifiée par chromatographie sur co- lonne avec "DEAE Toyopearl 650" un échangeur d'anion commer- cialisé par Toyo Soda Manufacturing Co. Ltd., et concentrée par chromatographie avec "Mono P", un produit de Pharmacia Fine Chemicals AB, pour obtenir un spécimen de "polypepti- de" très pur. Lors de l'électrophorèse sur SDS-polyacrylamide, conformément au procédé décrit par K. Weber et M.Osborn dans Journal of Biological Chemistry, Vol. 244, page 4406 (1969), le spécimen du "polypeptide" présente un poids moléculaire de 70000 - 10 000 daltons. L'activité spécifique de ce spécimen est de 200 - 30 unités.mg de protéine. Exemple 3-(2) Séguence partielle des aminoacides du "pol9peptide" renfermant l'extrémité N-terminale Un spécimen du "polypeptide",préparé par le pro- cédé de l'exemple 3-(1), est introduit dans "Model 470A", un séquenceur de protéine en phase gazeuse, produit par Applied Biosystems Inc., puis est analysé par chromato- graphie à haute performance en phase liquide afin de déter- miner la séquence partielle des aminoacides renfermant l'ex- trémité N-terminale. Cette séquence est: Ala-Gly-Asn-Leu-Asn-Lys-Val- Asn-Phe-Thr. EXEMPLE 4 Séquence du gène du polypeptide dérivé de B. stéarothermo- philus et séquence des aminoacides du "polypeptide" Exemple 4-(1) Préparation du plasmide p UCI8 Ce plasmide est préparé conformément au procédé de l'exemple 1-(2), à partir d'E. coli JM83 (ATCC 35607), dans lequel a été introduit ce plasmide. Exemple 4-(2) Préparation de l'ADN recombinant portant le _gne du L'ADN recombinant est préparé selon le procédé de l'exemple 1-(3). Un fragment, obtenu par digestion d'un fragment portant le gène du "polypeptide', préparé par le procédé de l'exemple 2-(3), avec des enzymes de restriction, et un fragment de plasmide, obtenu par coupure d'un spécimen de pUC18, préparé par le procédé de l'exemple 4-(1), sont sou- mis à l'action de l'ADN ligase de T4 pour obtenir un ADN recombinant. Exemple 4-(3) Introduction de l'ADN recombinant dans E. coli Dans cet exemple, on utilise comme hôte E. coli JM83. L'ADN recombinant est introduit dans ce microorga- nisme conformément au procédé de l'exemple 1-(4), pour le transformer. Les microorganismes recombinants sont ense- mencés sur un milieu de culture renfermant du bromo-5 chloro-4 indoyl-3 (galactoside (Xgal) et l'on choisit le microorganisme formant une plaque incolore. Exemple 4-(4) Préparation d'ADN recombinant à partir de microorganisme recombinant. Le microorganisme recombinant est cultivé sur bouillon-L renfermant 50 gg/ml d'ampicilline,et les cellu- les obtenues sont alors traitées par le procédé de mini-pré- paration alcaline pour obtenir un ADN recombinant. Exemple 4-(5) Séquence d'ADN recombinant Cet ADN est séquencé par le procédé de didésoxy rupteur de chaîne. L'ADN recombinant, préparé dans l'exemple 4-(4), et une amorce synthétique composée de 17 bases, sont mélan- gées, recuits à 60 C pendant 20 minutes, additionnés de dNTP, ddNTP, ( l'on met à réagir à 37 C pendant 30 minutes afin de déve- lopper l'amorce à partir du site 5' vers le site 3'. On obtient ainsi l'ADN complémentaire. A cet ADN, on ajoute une quantité en excès de dNTP, et l'on fait réagir le mé- lange à 37 C pendant 30 minutes avant d'ajouter, pour sus- pendre la réaction, une solution d'un mélange de colo- rants dans la formamide. Le mélange réactionnel est porté à ébullition pendant 3 minutes, et l'on pratique une élec- trophorèse sur gel de polyacrylamide à 6% à environ 25 mA (environ 2 000 volts) afin de séparer l'ADN complémentaire développé. Après achèvement de l'électrophorèse, le gel est fixé et déshydraté. Ce gel déshydraté est alors enre- gistré, et le gène du "polypeptide" est déterminé par ana- lyse des bandes de base sur le radio-enregistreur. Les résultats sont reportés sur le tableau 1-1. Le gène du signal peptidique situé en amont de l'extrémité 5'-terminale du gène du "polypeptide",est sé- quencé de manière identique. Les résultats sont reportés dans le tableau 1-2. Exemple 4-(6) Séqgguence des aminoacides du"PolyReltide" Cette séquence est déterminée avec référence à la séquence comme représentée dans le tableau 1-1, et les ré- sultats sont reportés dans le tableau 2l1. La séquence des aminoacides du signal peptidique est déterminée de manière identique, et les résultats sont reportés dans le tableau 2-2. Ces indications confirment que le "polypeptide" dérivé de B. stéarothermophilus a la séquence d'aminoaci- des reportée dans le tableau 2-1. EXEMPLE 5 Préparation du "polypeptide" avec des microorganismes recombinants On prépare des "polypeptides" au moyen des micro- organismes recombinants E. coli. TCH201 (FERM P-7924) et B. subtilis TCU211 (FERM P-7927), dans lesquels a été in- troduit l'ADN recombinant portant le gène du "polypeptide" résistant à la chaleur dérivé de B. stéarothermophilus. Les productivités du "polypeptide" de ces micro- organismes recombinants sont comparées à celles du micro- organisme hôte et du microorganisme donneur, B. stéarother- mophilus, en relation avec leur activité CGTase. Un milieu de culture liquide comprenant en poids/ volume 1% de liqueur d'infusion de mais 0,1% de sulfate Co tn c% 33.kúVgLúV DVú93V193ú V VXV23úl3 39LVú9L9Vú ú Vú9EVVY V3YLVD93úú lV93939399 91>VVúVúE>V 1V) 31V39E) DVV33 939VV ' 991VDLOiVVV V9ú9ú3VV1L Oflo' tZ Oz o9z 09Z1 OGZ VI9ZVx34V 19V.33 Va33 iúúL .ú3Vú.LJV 9 VV.991VL VV V3.LVlVDi z oI 01 0oz OIZ OO9. O0l ZJJD.VsJJt9 L.LEaVai sDvt3 VllV"O.LD Y3V.99L1fX.J. E3fVVVD 3FJVVVVV3.L úVO93VVúúV DAVVIVV3V 31.Vl39V399p1g91993V 391úV9V V 9 3VúúúVV3Vl n00 UOZ OlZ OU. 09oz oc LV9EJ3VúLVV VVlVVJJV3ú VV VVH).ú. 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Dans chaque cas, le microorganisme est cultivé à 37 C pendant 48 heures, sous agitation énergique. Séparément, B. subtilis TCU211 est ensemencé dans le milieu de culture liquide renfermant en plus 5 gg/ ml de kanamycine, tandis que B. subtilis 715A est ensemen- cé dans le milieu sans addition d'antibiotique. Dans cha- que cas, le microorganisme est cultivé à 28 C pendant 72 heures. B. stéarothermophilus FERM P N 2225 est cultivé avec ce milieu à 50 C pendant 48 heures sans addition d'an- tibiotique. Après séparation par centrifugation, de chaque culture, en partie surnageante et cellules, on dose l'ac- - tivité CGTase de la partie surnageante en l'état, tandis que les cellules sont brisées par les ultrasons avant que leur activité CGTase soit déterminée pour chaque culture. Les résultats sont reportés dans le tableau 3. Ces indications montrent clairement que les micro- organismes recombinants peuvent être avantageusement utili- sés pour la production à l'échelle industrielle du "poly- peptide" en raison de leur productivité améliorée de ce produit. Les parties surnageantes sont relarguées avec du sulfate d'ammonium à un degré de saturation de 0,6, afin d'obtenir des spécimens bruts du "polypeptide". Après étu- de de ces spécimens de "polypeptide" quant à leurs proprié- tés enzymatiques, comme transfert de saccharide de l'amidon au sucrose, production de cyclodextrine à partir d'amidon, proportions des &-, ?- et y -cyclodextrines, tempéra- ture optimale, pH optimal, intervalles de température et de Tableau 3 Activité de CGTase (unités/ml) Microorganism- Partie Partie Toa surnageante cellule Total Escherichia coli TCH201 (FERM P-7924) 0.8 13.5 14.3 Presenteinvention Bacillus subtilis TCU211 (FERM P-7927) 46.7 20.5 67.2 Presenteinvention Escherichia coli HB101 0 0 0 Témoin Bacillus subtilis 715A Témoin Bacillus stearothermophilus FERM-P No.2225 8.5 0.3 8.8 Témoin l'J À- C, o o0 pH stables, on.constate que les propriétés du "polypepti- de" produit par les microorganismes recombinants concor- dent parfaitement avec celles du microorganisme donneur, B. stéarothermophilus. EXEMPLE 6 Clonaqe du qène du "polypeptide" de B. macerans dans E.coli Exemple 6-(1) Preparation d'ADN chromosomique _ ortant le _gène dui "oly- peEtide de B. macerans Le gène du "polypeptide" est préparé conformé- ment au procédé de l'exemple 1-(1), à cela près que B. macerans est cultivé à 28 C. Exemple 6-(2) Preparation d'ADN recombinant.portant lgèe ne du "poly- p tide" L'ADN chromosomique dérivé de B. macerans, por- tant le gène du "polypeptide", préparé dans l'exemple 6-(1), est partiellement digéré comme dans l'exemple 1-(3) avec l'enzyme de restriction HindIII. D'autre part, un spécimen de plasmide pBR322, préparé par/e procédé de l'exemple 1-(2), est complètement coupé par l'enzyme de restriction HindIII, et l'extrémité '-terminale du produit coupé est déphosphorisée par le procédé de l'exemple 1-(3). Les fragments ainsi obtenus sont liés selon le procédé de l'exemple 1-(3) pour obtenir un ADN recombinant. Exemple 6-(3) Introduction de l'ADN recombinant dans E. coli Le micro-organisme dans lequel l'ADN recombinant a été introduit, est cloné selon le procédé de l'exemple 1-(4) au moyen d'E. coli HB101 (ATCC 33694) comme hôte, une souche incapable de produire de l'amylase. Puis on isole l'ADN recombinant du microorganisme, on le soumet à l'ac- tion d'enzymes de restriction afin de déterminer les sites de coupure de restriction, et on le digère partiellement avec l'enzyme de restriction Sau3AI, commercialisé par Nippon Gene Co. Ltd. D'autre part, un spécimen de plasmide pBR322, ob- tenu par le procédé de l'exemple 1-(2), est complètement coupé par l'enzyme de restriction BamHI, et l'extrémité '-terminale du produit résultant est déphosphorisée comme dans l'exemple 1-(3). Les fragments obtenus sont liés par une ADN ligase de T4 pour obtenir un ADN recombinant, puis on choisit les microorganismes recombinants, conformément au procédé de l'exemple 1-(4). Ces microorganismes renfer- ment un ADN recombinant de taille relativement petite, qui porte le gène du "polypeptide". L'un de ces microorganismes recombinants et son ADN recombinant sont nommés respectivement "Escherichia coli MAH2" (FERM P-7925) et "pMAH2". Le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pMAH2, en particulier celui du fragment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. macerans, est reporté dans la figure 3. Cette figure montre que cet ADN recombi- nant est coupé par l'enzyme de restriction PvuII, SaII, AvaI (commercialisé par Nippon Gene Co. Ltd) ou PstI, mais pas par EcoRI, HindIII, KpnI, BamHI, XbaI, XhoI ou SmaI. EXEMPLE 7 Clonage du gène du "polypeptide" de B. macerans dans B. subtilis Exemple 7-(1) Preparation de l'ADN recombinant PMAH2 Cet ADN pMAH2 est isolé à partir d'E. coli MAH2 * (FERM P-7925) selon le procédé de l'exemple 1-(2). Exemple 7-(2) PréEaration de l'ADN recombinant portant le gène du L'ADN recombinant pMAH2,portant le gène du "poly- peptide", préparé dans l'exemple 7-(1), est complètement digéré sous l'action simultanée des enzymes de restriction EcoRI et BamHI. D'autre part, un spécimen de plasmide pUB110, préparé par le procédé de l'exemple 2-(2), est complètement coupé sous l'action simultanée des enzymes de restriction EcoRI et BamHI. Les fragments ainsi obtenus sont soumis à l'ac- tion d'une ADN ligase de T4, comme dans l'exemple 1-(3), pour obtenir un ADN recombinant. Exemple 7-(3) Introduction de l'ADN recombinant dans B. subtilis Des microorganismes recombinants, dans lesquels a été introduit l'ADN recombinant portant le gène du "polypeptide" dérivé de B. macerans, sont clonés conformé- ment au procédé de l'exemple 2-(4) au moyen de B. subti- lis 715A, une souche incapable de produire l'amylase. L'un des microorganismes recombinants et son ADN recombinant sont respectivement nommés "Bacillus subtilis MAU210" (FERM P-7926) et "pMAU210". Le diagramme de restriction de l'ADN recombinant pMAU210, en particulier celui du fragment d'ADN qui porte le gène du "polypeptide" dérivé de B. macérans, est représenté dans la figure 4. Cet- te figure montre que l'ADN recombinant est coupé par l'en- zyme de restriction PvuII, AslI, AvaI et PstI, mais pas par EcoRI, HindIII, KpnI, BamHI, WbaI, XhoI ou SmaI. EXEMPLE 8 Séquence des aminoacides du "polypeptide" dérivé de B. macerans renfermant l'extrémité N-terminale Exemple 8-(1) Préparation du "poly2eptide" Ce "polypeptide" est produit par culture de B. subtilis MAU210 avec un milieu de culture liquide semblable à celui de l'exemple 10, et on le purifie conformément au procédé de l'exemple 4-(1) pour obtenir un spécimen de "polypeptide" très pur. Lors de l'électrophorèse sur SDS- polyacrylamide, ce spécimen de "polypeptide" montre un poids moléculaire de 70 000 - 10 000 daltons et une activi- té spécifique de 200 30 unités/mg de protéine. Exemple 8-(2) Séguence partielle des aminoacides renfermant l'extrémité N-terminale Cette séquence est déterminée avec le spécimen de "polypeptide" préparé dans l'exemple 8-(1), conformé- ment au procédé de l'exemple 3-(2). Cette séquence partielle est: Ser-Pro-Asp-Thr- Ser-Val-Asn-Asn-Lys-Leu. EXEMPLE 9 Séquence du gène du "polypeptide" dérivé de B. macerans et séquence des aminoacides du "polypeptide" Exemple 9-(1) Preparation de l'ADN recombinant portant le gène du :p22!YP2 tide" L'ADN recombinant est préparé conformément au procédé de l'exemple 4-(3). Plus particulièrement, un fragment d'ADN, obte- nu par digestion d'un fragment d'ADN portant le gène du "polypeptide", préparé par le procédé de l'exemple 7-(2), avec des enzymes de restriction, et un fragment de plasmide, obtenu par coupure d'un spécimen de plasmide pUC18, préparé par le procédé de l'exemple 4-(2), de manière identique, sont liés avec uneADN ligase de T4 pour obtenir un ADN recombinant. Exemple 9-(2) Introduction d'ADN recombinant dans E. coli L'ADN recombinant est introduit dans l'hôte E. coli JM83, conformément au procédé de l'exemple 4-(3) pour obtenir un microorganisme recombinant. Exemple 9-(3) Préparation d'ADN recombinant à partir de microorganisme recombinant l'ADN recombinant est préparé conformément au procédé de l'exemple 4-(4). 257408.1 Exemple 9-(4) Séuence de 1'ADN recombinant Le gène du "polypeptide" est séquencé conformé- ment au procédé de l'exemple 4-(5). Les résultats sont reportés dans le tableau 4-1. Le signal peptidique situé en amont du site 5' du gène du "polypeptide" est séquencé de manière identi- que. Les résultats sont reportés dans le tableau 4-2. Exemple 9-(5) Séquence des aminoacides du "olyep2tide" Cette séquence est déterminée avec référence à celle du gène du "polypeptide". Les résultats sont reportés dans le tableau 5-1. La séquence des aminoacides du signal peptidique est déterminée de manière identique.Les résultats sont re- portés dans le tableau 5-2. Ces indications confirment que le "polypeptide" dérivé de B. macerans a la séquence d'aminoacides repré- sentée dans le tableau 5-1. Les indications données dans les tableaux 2-1-et -2 montrent que chaque "polypeptide" a d'habitude la sé- quence d'aminoacides de: (a) Asn-LysIle-Asn-Asp-Gly-Tyr-Leu-Thr, (b) Pro-Val-Phe-Thr-Phe-Gly-Glu-Trp-Phe-Leu, (c) Val-Thr-Phe-Ile-Asp-Asn-His-Asp-Met-Asp-Arg-Phe, (d) Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln-Tyr-Met-Thr-Gly-Asn- Gly-Asp-Pro-Asn-Asn-Arg, et (e) Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly, et que ces séquences partielles sont situées dans la sé- quence à proximité de l'extrémité N-terminale du "polypep- tide". --- 393995VV3 V33 D3úú9ú 339933933 V93vV39Vú' ú9 V3993ú 39ú393 V99 apsnsS azg a l osnos G D 3V p$3 DDel399V J 9 gD9DV 93úDDDVV3V J,993úú3 g3 3VV 3 vD V3V3 D3vúv99& úVc9x 3E D 3VD 3Vú 939o 93393 9úx ozl,1 oot nul06e Dzu aVúO3V33 V ú3V3iv$ VaV ú939v9 D.i1vúuvv3 úVú E9333 VV3'VVgV9 zsasVaS avssa aapaaaZ asssz avzúzza alSvo popEIn LVDEV z O UVLZ1LVY3y vvvovsa, anezDUZ azz ooaa Qsa nul CZl.Ol Osl opI Del DBVD44p3DV DDVDDD3v DVDDt3 Ost93V99X9 3"3t I 011001 R O Oil. 0Ol of. oZ.oz zsvav, svv93 oszzv azsvovo Vsssva,w-aa ozol 0o01 00 0 3V3ú 3x V4JúV Vú39OE V33úE3993 39Wn33ú3v ú993úV 9ú 3V93VE 096 0$iQ DU 0C6 OZG UfO D3V)V9939 3VV9393 ú 9ú9VV9193 D3úVVV99V V9.3D 39ú úV3V99ú)9 OaV,99LaIDDD oV u V Vl ooDa V3oozVD &3úú9úVV993ú3 O.9t9ú9D11933úV 39139 9AV3 Vúé3úV93ú9 393Vú399 00Z azz aa 091 o 1'1 o cL 9VV9V399ú3 999V3ú33D9 V3V1aVVú953 393V93úú3 199393JVa3 93úv91V O?1 OIL 001 069 009 L9 1VV9J.39ú lagvaazw.VVVV3 úvsvl vzsaza3VD IvYWavavJV vavvDvaJLV 09o.099 01'9 01 OZ9 019 o3úVV9939339 úúV 19ú33. 1VV9VVaV 3úVú999VV Vg9úa9.iVgV ú3úV92LJ non 069 009 o 9 09 09nu (T) o Ins T-P oFOGTq'eO co Cli r- VDXJ93 39 3u 339Y3viYvJ.EI9a1J Lv:j.YYVv vYDV9v;vJ V19LD95 Ozu | n}oau|OS'I. os Z DO3v9tYSDAV9tO;v33YDYP5933 SYV91 9V D 933999D DOvD9llbVp on"I 0 s01 01o0s 1 0z I 0L l v93V933V3 PIv9vv93V,3 YV3V3Y9ú 3 9ú3V9 3V1993ú 93 9DV3. 9L V ID.VVDDVD 1993v199iD DDVVY.La3Lv LjVVDI.L VV 91Vi L91 DD99n.35LD Ln ^ ll42E)::V4.)v VJ.EEWV3iV3:5 VVX):).Li )!.V13fd.L3E339E 9!)9.LVLEJ^9:)LV. 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L 0111,0011i ozli 01,1,1,oI10 (Z) 9;TUS Tablea4-1 suite (3) 10630 16f40 1650 1'660 1670 i680 ATCGTGAGCT GGGAAGATAC CGAAATCAAG GTCAAAGTTC CGAACGTGGC CGCCGGCAAC 1090 1700, 1710 1720 1730 1740 ACGGCCGTTA CGGTAACGAA CGCCGCCGGC ACTACCAGCG CAGCGTTCAA CAACTTTAAC 1750 1760 1770 1780 17O0 1600 GTACTGACTG CCGATCAGGT CACTGTCCGC TTCAAAGTCA ACAATGCCAC CACGGCCCTG lino 1820 1830 1840 1850 1I60 GGACAAAACG TCTACCTGAC CGGTAACGTC GCCGAGCTTG GCAACTGGAC AGCCGCCAAC 1870 1880 1800 1900 1910 1920 w GCAATC6GTC CGATGTACAA CCAGGTAGAA GCCAECTATC CGACTTGGTA CTTCGACGTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 AGCGTTCCGQ CCAACACGGC GCTGCAATTC AAGTTCATCA AAGTGAACGG CTCGACAGTG 1990 2000 2010 2020 ' 2030 2040 ACTTGGGAA6 GCGGCAACAA CCACACCTTC ACCTCGCCTT CGAGCGGCGT TGCGACCGTA 2050 20ó0 ACGGTCGATT GGCAGAAC rO> o -r-. e" un it as.1J Us al! lel I 1 atla el y.1q.L a)11 uV r1 It. AUT 4aS atI (D2. ci-il. naql m lV,qj4 'll, 19 ':t-DllaH,9 dq.1.. nal d,1 A,19 cG'V u'v 1a1 4d us'.V. tas RA.I4. AID AI l ueV IeA.1 4. a1. lal ugy AID uly EXEMPLE 10 Préparation du "polypeptide avec un microorganisme recombinant Des "polypeptides" sont préparés avec E.coliMAH2 et B. subtilis MAU210, dans lesquels on a introduit l'ADN recombinant, portant le gène du "polypeptide", dérivé de B. macerans. Les productivités en "polypeptide" de ces mi- croorganismes recombinants, du microorganisme hôte et du microorganisme donneur, B. macerans, sont comparées en relation avec leurs activités CGTase. Le milieu de culture liquide utilisé est préparé par le procédé de l'exemple 5. E. coli MAH2 est ensemencé sur ce milieu renfer- mant en outre 50 gg/ml d'ampicilline, tandis que E. coli HB101 est ensemencé sur ce milieu sans addition d'antibioti- que. Dans chaque cas on cultive à 35 C pendant 24 heures sous secouage énergique. B. subtilis MAU210 est ensemencé sur ce milieu additionné de 5 gg/ml de kanamycine, tandis que B. subtilis 715A est ensemencé sur le même milieu sans addition d'antibiotique. Dans chaque cas le micro- organisme est cultivé à 28 C pendant 72 heures. B. mace- rans 17A est cultivé sur ce milieu de culture à 28 C pen- dant 72 heures, sans addition d'antibiotique. Chaque culture est traitée comme dans l'exemple , et son activité CGTase est alors déterminée. Les résul- tats sont reportés dans le tableau 6. Ces indications montrent clairement que les micro- organismes recombinants peuvent être avantageusement utili- sés pour la production à l'échelle industrielle du "poly- peptide", car ils ont une-productivité améliorée en "poly- peptide". Tableau 6 Activité CGTase (unités/ml) Microorganism Partie Parti e surnageante Cellule Total Escherichia coli MAH2 (FERM P-7925) 0.6 11.8 12.4 Presentdinvention Bacillus subtilis MAU210 (FERM P-7926) 54.6 0.3 54.9 Presentinvention Escherichia coli HB101 0 0 0 Témoin Bacillus subtilis 715A 0 0 0 TémOin Bacillus macerans 17A 7.5 0.4 7.9Témin LJn -a La partie surnageante est relarguée avec du sul- fate d'ammonium à un degré de saturation de 0,6 pour ob- tenir des spécimens du "polypeptide" brut. Lorsqu'on étudie ces spécimens bruts pour leurs propriétés enzymatiques, comme dans l'exemple 5, on cons- tate que les propriétés enzymatiques du "polypeptide" produit par les microorganismes recombinants concordent avec celles du "polypeptide" provenant du donneur B. mace- rans. Les utilisations principales du "polypeptide" sont décrites ci-après. Le "polypeptide" réalise la réaction de transfert de saccharide, intra- ou inter-moléculaire, entre un don- neur saccharide et un accepteur saccharide. Conformément à une forme de réalisation de l'invention, on peut produire différents produits à saccharide transféré en profitant de ces réactions de transfert de saccharide. Par exemple, un hydrolysat partiel d'amidon renfermant des i , P - et y - cyclodextrines, est préparé en soumettant un substrat amylacé comme amidon, amidon liquéfié avec un ED inférieur à 10, ou amylose, à l'action du "polypeptide", utilisant ainsi la réaction de transfert de saccharide intra-molé- culaire. Si nécessaire, chaque cyclodextrine peut être isolée à partir de l'hydrolysat partiel d'amidon. Un édulcorant saccharide c -glycosylé, par exemple a -glucosyl-, o-maltosyl-, et o-maltotriosyl- saccharide, peut être préparé en soumettant un mélange d'un donneur de saccharide, comme substance amylacée telle qu'amidon, amidon liquéfié, dextrine, cyclodextrine ou amylose, et d'un accepteur, par exemple un monosaccharide comme xylose, sorbose ou fructose, ou un disaccharide comme sucrose, maltulose ou isomaltulose, à l'action du "polypeptide", utilisant ainsi la réaction de transfert de saccharide intermoléculaire. Cet édulcorant saccharide "-glycosylé peut être avantageusement utilisé dans les aliments et les boissons, car il est beaucoup plus doux au goût, plus soluble dans l'eau, et il cristallise moins, comparé à l'édulcorant saccharide nono(-glycosylé. Lors de la réaction de transfert de saccharide inter-moléculaire, l'utilisation comme saccharide accep- teur d'un glycoside, par exemple steviol glycoside comme stévioside ou rebaudioside, glycyrrhizine, saponine de soja, saponine de thé, rutine ou esculine, conduit à la formation de glycosides i -glycosylés comme o-glucosyl-, '-maltosyl-, et o- maltotriosyl-glycosides. Le glycoside o -glycosylé est dénué de saveurs déplaisantes comme amer- tume et astringence, qui sont inhérentes au glycoside in- tact, et est plus facilement soluble dans l'eau que lui. Cela favorisera beaucoup le développement de l'utilisation de ces glycosides. Plus spécialement, le glycoside stéviol o(-glycosylé et la glycyrrhizine a -glycosylée, peuvent être avantageusement utilisés dans des aliments, boissons et produits pharmaceutiques à administration perorale, car l'amélioration de saveur dans ces glycosides o(-glycosylés est remarquablement élevée, et leur pouvoir sucrant est comparable à celui du sucrose. Plusieurs formes de réalisation sont décrites ci-après. EXEMPLE 11 Sirop de mais renfermant de la cyclo-dextrine Une suspension à 10% poids/poids d'amidon de pomme de terre est additionnée de 2 unités/gramme d'amidon d'un spécimen de "polypeptide" préparé avec B. subtilis TCU211 conformément au procédé de l'exemple 5; elle est liquéfiée par chauffage à 85 C à pH 6,5, est refroidie à C et additionnée de la même quantité du spécimen de "po- lypeptide", avant d'être laissée à réagir pendant 40heures. Ce mélange réactionnel est purifié par décoloration avec du charbon activé, et est désionisé au moyen d'une résine échangeuse d'ions, puis est concentré afin d'obtenir un si- rop de mais renfermant de la cyclodextrine avec un rendement de 92% rapporté au produit sec. Ce sirop de mais peut être avantageusement incorporé dans des parfums et cosmétiques pour lesquels l'odeur agréable ou l'arôme constitue l'un des facteurs importants, car ce sirop a d'excellentes pro- priétés de fixation du parfum. Les -, - et -cyclodextrines de ce sirop peuvent être séparées par traitement par un mode opératoire utilisant des précipitants organiques comme toluène ou trichlorométhane,-ou une chromatographie sur colonne, classique. EXEMPLE 12 À -glycosylsucrose Une suspension d'amidon de mais à 35% poids/poids est additionnée d'acide oxalique à 0,2% poids/poids, pas- sée à l'autoclave à 120 C pour obtenir un ED de 20, puis neutralisée avec du carbonate de calcium et filtrée, pour obtenir une solution de dextrine. Cette solution est en- suite additionnée de la moitié de sa quantité de sucrose, calculée en solide sec, et le mélange réactionnel est additionné de 15 unités/gramme d'amidon d'un spécimen du "polypeptide" préparé avec B. subtilis MAU210 conformément au procédé de l'exemple 10, et on laisse réagir à pH 6 et 55 C pendant 40 heures. Le mélange réactionnel est pu- rifié par décoloration avec du charbon activé et désioni- sation au moyen d'une résine échangeuse d'ions, avant d'être concentré pour obtenir un sirop de mais incolore et transparent avec un rendement de 94% rapporté au solide sec. Ce sirop renfermant une grande quantité d' o-glyco- sylsucrose peut être avantageusement utilisé en confiserie, car il est modérément sucré et amorphe. EXEMPLE 13 d-glycosyl stevioside On dissout 200 g de stevioside et 600 g de dex- trine (ED = 8) dans 3 litres d'eau, par chauffage, et on refroidit la solution résultante à 70 C avant de l'addi- tionner de 5 unités/gramme de dextrine d'un spécimen du "polypeptide" préparé avec B. subtilis TCU211 conformément au procédé de l'exemple 5, et de laisser réagir à pH 6 et C pendant 35 heures. Le mélange réactionnel est alors chauffé à 95 C pendant 15 minutes, est purifié par filtra- tion, concentré et pulvérisé, ce qui donne un édulcorant pulvérulent renfermant de 1' c -glycosyl stevioside avec un rendement de 92% rapporté au solide sec. Cet édulcorant dénué de la saveur déplaisante, inhérente au stevioside intact, est comparable au sucrose pour la qualité de la saveur, et son pouvoir sucrant est environ 100 fois supérieur à celui du sucrose. Il peut être avantageusement utilisé comme édulcorant de régime ou pour assaisonner aliments et boissons, en raison de ses proprié- tés faiblement calorifliques--et faiblement cariogènes. EXEMPLE 14 oc-glycosyl ginsenoside g d'un extrait de ginseng et 180 g de (-cyclo- dextrine sont dissous dans 500 ml d'eau par chauffage, et le mélange résultant est refroidi à 70 C et ajusté à pH 6, avant d'être additionné de 3 unités/gramme de f-cyclodextri- ne d'un spécimen du "polypeptide" préparé avec E. coli TCH201 conformément au procédé de l'exemple 5, puis on re- froidit à 65 C et laisse réagir à pH 6 pendant 40 heures. Ce mélange réactionnel est chauffé pendant 15 minutes pour inactiver le "polypeptide", puis l'on filtre. Le filtrat est admis sur une colonne chargée de 3 litres d'"Amberlite XAD-7", un adsorbant synthétique, commercialisé par Rohm & Haas Co., puis on rince la colonne avec suffisamment d'eau pour éliminer les saccharides libres. On introduit alors dans la colonne 10 litres d'éthanol à 50% volume/ volume, et l'éluat est concentré et déshydraté pour don- ner 21 g d'un produit pulvérulent qui renferme de 1' o- glycosyl ginsenoside. Comme ce produit est dépourvu des saveurs déplaisantes comme amertume, astringence et âpreté, 2574081U inhérentes au ginsenoside intact, il peut être administré par voie orale tel quel, ou, si nécessaire, avant son uti- lisation, assaisonné d'édulcorant ou de produit acide. De plus, on peut l'utiliser avantageusement dans les aliments de santé et les médicaments à administration interne, car il possède les effets tonique, peptique, régulateur de l'in- testin, hématique, anti-inflammatoire et expectorant du gingenoside intact. Ainsi qu'il est décrit ci-dessus, la demanderesse a déterminé les séquences des amino acides du gène du "polypeptide" et de son signal peptidique, tout en prépa- rant l'ADN recombinant ayant un site de restriction PuvII, à partir d'un microorganisme donneur, in vitro, par une technique de génie génétique. De plus, elle a préparé des microorganismes recombinants dans lequel est introduit l'ADN recombinant, tout en confirmant que ces microorga- nismes prolifèrent de manière autonome et notable dans un milieu de culture nutritif. Au point de vue de la fournitu- re adéquate de "polypeptide", la présente invention est significative à l'échelle industrielle, car elle assure une large source de ce produit et améliore aisément la productivité en "polypeptide" du micro-organisme donneur. Il est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers indiquant des formes de réa- lisation préférées de l'invention, ne sont données qu'à titre d'illustration; différents changements et modifi- cations possibles apparaîtront à l'homme de l'art en par- tant de cette description détaillée, sans sortir du domaine de l'invention. 25740 81 Revendications 1. Nouveau polypeptide présentant l'activité de cyclo- maltodextrine glucanotransférase (CGTase), caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des séquences: (a) Asn-Lys-Ile-Asn-Asp-Gly-TyrLeu-Thr, (b) Pro-Val-Phe-Thr-Phe-Gly-Glu-Trp-Phe-Leu, (c) Val-Thr-Phe-Ile-Asp-Asn-His-Asp-Met-Asp- Arg-Phe, (d) Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln-Tyr-Met-Thr-Gly- Asn-Gly-Asp-Pro-Asn-Asn-Arg, et (e) Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly. 2. Polypeptide suivant la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'une ou plusieurs séquences partielles d'amino- acide selon (a) à (e) se trouvent près de l'atome d'azote terminal de ce polypeptide. 3. Polypeptide suivant la revendication 1 ou 2, carac- térisé par une masse moléculaire de 70 000 10 000 dal- tons, déterminée par électrophorèse sur du SDS-polyacryla- mide. 4. Polypeptide suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que sa séquence partielle d'aminor-acide, renfermant le N terminal, est Ala-Gly-Asn-Leu-Asn-Lys- Val-Asn-Phe-Thr. 5. Polypeptide suivant une des revendications-précé- dentes, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'a- minoacides indiquées au tableau 2-1 (pages 25-26). 6. Polypeptide suivant la revendication 4, caracté- risé en ce que son peptide signal, ayant une séquence d'a- minoacide Met-Azg-Arg-Trp-Leu-Ser-Leu-Val-Leu-Ser-Met-Ser- Phe-Val-Phe-Ser-Ala-Ile-Phe-Ile-Val-Ser-Asp-Thr-Gln-Lys- Val-Thr-Val-Glu-Ala est située en amont du côté de l'azote terminal du polypeptide. 7.Polypeptide suivant la revendication 4, caractérisé en ce que sa séquence partielle d'amino-acide, contenant l'extrémité de N terminal, est Ser-Pro-Asp-Thr-Ser-Val- Asn-Asn-Lys-Leu. 8. Polypeptide suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il présente la séquence indiquée au tableau 5-1 (pages 38 et 39). 9. Polypeptide suivant la revendication 8, caracté- risé en ce qu'il comprend un peptide messager de séquence Met-Lys-Lys-Gln-Val-Lys-Trp-Leu-Thr-Ser-Val-Ser-Met-Ser- Val-Gly-Ile-Ala-Leu-Gly-Ala-Ala-Leu-Pro-Val-Trp-Ala, si- tué en amont du côté de N terminal. 10. Polypeptide suivant une des revendications précé- dentes qui provient d'un microorganisme capable de produire de la CGTase, en particulier du Bacille stearothermophilus, Bacille macerans ou d'un microorganisme dans lequel a été introduit un ADN recombinant, porteur d'un gène de CGTase. 11. Un Adn recombinant, présentant un site de cli- vage de restriction Pvull apportant un gène de CGTase, ca- ractérisé en ce qu'il comprend: un fragment d'ADN obtenu par la digestion de l'ADN d'un microorganisme donneur, ca- pable de produire "in vitro" de la CGTase avec une enzyme de restriction, et un fragment vecteur, obtenu par clivage d'un vecteur à l'aide d'une enzyme de restriction, ces fragments étant liés. 12. Adn recombinant suivant la revendication 11, ca- ractérisé en ce que le microorganisme donneur est un ba- cille, en particulier stéarothermophilus ou macerans. 13. Une culture d'un microorganisme dans lequel a été introduit un ADN recombinant suivant la revendication 11 ou 12, le microorganisme pouvant notamment être un Escherichia coli ou un Bacille subtilis. 14. Procédé de production de cyclomaltodextrine gluca- notransférase (CGTase) caractérisé en ce qu'il comprend: la culture d'un microorganisme recombinant, dans laquelle on a introduit un ADN recombinant possédant un site Pvull de clivage de restriction et portant un gène de CGTase, pré- paré par ligature d'un fragment d'ADN obtenu par la diges- tion de l'ADN d'un microorganisme donneur, capable de pro- duire la CGTase, avec une enzyme de restriction, avec un fragment vecteur obtenu par clivage d'un vecteur à l'aide d'une enzyme de restriction, le microorganisme pouvant ê- tre en particulier Escherichia coli ou Bacille subtilis. 15. Application du polypeptide suivant une des reven- dications 1 à 10 au transfert d'un saccharide,par l'action du polypeptide sur une matière amylacée.