Brevet FR2574090A1 — publié le 19860606

ENSEMBLE POUR DETERMINER LA RESISTANCE INTRINSEQUE D'UNE FAMILLE DE BACTERIES ET METHODE DE DETERMINATION DE CETTE RESISTANCE INTRINSEQUE La présente invention a pour objet, a titre de produit industriel nouveau, un ensemble formé d'un support et d'un antibiotique permettant, par un seul antibiogramme, de déterminer la resistance intrinsèque aux ss-lactamines d'une famille de bactéries, à savoir des staphylocoques. L'invention a egalement pour objet une méthode de détermination de la résistance intrinsèque aux ss-lactamines des staphylocoques. Par "antibiogramme", on entend un examen bactériologique permettant d'apprecier la résistance d'une bactérie vis-a-vis de divers antibiotiques et par "résistance d'une bactérie1,, on entend que cette bactérie est capable de se developper en présence d'un taux d'antibiotiques sensiblement plus élevé que le taux curatif habituel. Par contre, par "résistance intrinsèque", on entend la résistance due a une modification de la cible de l'antibiotique dans les processus de synthese de la paroi; en fait, les bactéries deviennent insensibles du fait de la modification, due a la réaction contre les antibiotiques, des enzymes formant leur paroi. La resistance intrinsèque croissante des bactéries aux antibiotiques avec, pour corollaire, l'échec thérapeutique qu'elle entraine est un souci majeur des bactériologistes. En fait, cette resistance est déterminée dans les laboratoires d'analyse par des techniques in vitro, soit par des méthodes dites de dilution, soit par des méthodes de diffusion. Les méthodes de dilution peuvent être effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. En milieu liquide, elles consistent a distribuer des concentrations croissantes d'un antibiotique défini dans une série de tubes ou de boites de Pétri contenant un milieu de culture convenable et une quantité uniforme du microorganisme à tester, puis a soumettre cette série de tubes a une incubation. En milieu solide, elles consistent à operer en milieu gélosé que l'on inocule en surface. Les méthodes de diffusion font emploi également d'un milieu gélosé sur lequel est disposé un disque formé d'un support et d'un antibiotique, en général méthicilline ou oxacilline, qui diffuse en formant un gradient de concentration inversement proportionnel à la distance du centre du disque qui forme la source de façon qu'une bactérie ensemencée sur cette surface entre au contact de concentrations variables de l'antibiotique. Pour la détermination de la résistance intrinsèque, les méthodes effectuées en milieu solide nécessitent une modification du milieu de culture (par addition d'une solution de chlorure de sodium par exemple), l'établissement d'une température de mise en oeuvre déterminée (en général de l'ordre de 30"C pour les staphylocoques) et une période d'incubation relativement longue (de l'ordre de 24 heures). Les méthodes faisant emploi de systèmes automatisés tels l'appareil connu sous la dénomination d'Autobac (commercialisé par la demanderesse) font emploi de milieu de croissance liquide, ou la densité microbienne est mesurée au photomètre et comparée à celle d'une culture témoin. Ces méthodes permettent une réduction du temps de réponse qui se trouve réduite à un temps compris entre 3 et 5 heures.Les techniques de dilution, pas plus que les techniques de diffusion, ne permettent cependant de déterminer la résistance intrinsèque aux ss-lactamines des staphylocoques, résistance intrinsèque qui correspond à des conditions de resistance hétérogène de la population bactérienne formée, en genéral, de souches homogenes (cf. MATTHEWS et col., l'article résistance heterogenety in methycillin resistant staphylococcus aureus", FEMS Micorb. Letters, 1984, 22, 161,166; Reynaud et col. l'article "Expression de la résistance des staphylocoques à l'oxacilline et à la céfalotine", Path. Bio. 1982, 30, 489-494; Sabath, l'article "Mechanisms of resistance to beta-lactams antibiotics in strains of staphylococcus aureus", Ann. Intern. Med. 1982, 97, 339-334); Aldridge K. et col., l'article "Interlaboratory variation of antibiograms of methicillin-resistant and methicillin- susceptible Staphylococcus aureus strains with conventional and commercial testing systems. J. Clin. Microbiol., 1983, 18, 1226-1236. Dans ce dernier article le non fonctionnement à cette fin des techniques automatisées est décrit. Jusqu'à présent, on determine la résistance intrinsèque par une série de tests sur la méthicilline ou sur l'oxacilline, ces tests étant effectués dans des conditions différentes -fonctions du procédé opératoire (procédé de dilution ou procédé de diffusion). De plus, l'exacti- tude des resultats obtenus quant à la généralisation de la resistance intrinséque est loin d'être satisfaisante.On recherche, bien entendu, depuis longtemps une méthode qui permette la détermination de la résistance intrinsèque d'une famille de bactéries vis- -vis d'une famille d'antibiotique et qui puisse être mise en oeuvre dans des conditions identiques et rapidement, aussi bien dans les procedés de dilution que dans lesprocedes de diffusion, et conduise à des résultats parfaitement généralisables et cela avec une grande exactitude. La présente invention permet de pallier les inconvénients des procédés connus et consiste en untest prototype de la résistance d'une famille complète de bacteries vis- -vis d'une famille d'antibiotiques, ce test conduisant à des résultats meilleurs que ceux auxquels on parvient par les méthodes employées jusqu'à présent. La présente invention a pour objet un ensemble formé d'un support et d'un antibiotique permettant par un seul antibiogramme de déterminer la résistance intrinsèque aux 8-lactamines d'une famille bactéries, cet antibiotique consistant en céphamandole, employé à raison de 0,1 à 7,5 ug, associé audit support consistant en tout excipient véhicule ou base, solides ou liquides. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit support est solide et consiste en tout support convenable tel que coton hydrophile, bois, papier, matériau plastique, silice ou autre matière sous forme de granules ou de perles, à la surface duquel le céphamandole adhère ou auquel le céphamandole est mélangé, ce support étant inerte vis-à-vis du céphamandole. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le support est solide et le céphamandole est employé à raison de 0,5 à 7,5 jjg. De préférence, cette quantité est de l'ordre de 1 à 5 pg. Selon encore un autre mode de realisation de l'invention, le support est liquide et consiste en tout support convenable tel que solution saline, eaudistiliée, serum et autre support liquide inerte vis-à-vis du cèphamandole, dans lequel celui-ci est en solution ou en suspension. Selon un autre mode encore de realisation de l'invention, ce support est liquide et le céphamandole est employé à raison de 0,10 à 1,5 ug De préférence, cette quantité est de l'ordre de 0,10 à 1 pg. L'invention a également pour objet une méthode de détermination de la résistance intrinsèque aux ss-lactamines des staphylocoques faisant emploi du produit industriel nouveau que constitue l'ensemble précite formé d'un support, liquide ou solide, associé à un antibiotique consistant en céphamandole employé à raison de 0,1 à 7,5 p9. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre illustratif et nullement limitatif. EXEMPLE 1 Des essais sont effectues sur 109 souches de staphylococcus aureus présentant une résistance hétérogène à la methicilline, ces souches ayant diverses origines géographiques: TABLEAU I Origine des souches résistantes à la méthicilline Nombre de souches Serotype 18 U.S.A. 80 7 . AUSTRALIE 10 0 . FRANCE 19 6 Nombre TOTAL 109 13 On remarquera que treize de ces souches comportent un antigene de surface 18. Des essais sont également effectués sur 58 souches, d'origine française, sensibles à la méthicilline; huit de ces couches qui ne produisent pas de ss-lactamases étant formées de souches Cowan et ATCC 25923. Le tableau II contient les résultats de tests effectués selon des méthodes classiques sur l'appareil appelé AUTOBACe avec de l'oxacilline, d'une part, et, d'autre part, conformément à l'invention, c'est-à-dire avec du céphamandole, ces deux~ séries de tests étant effectués dans des conditions identiques ( 37 C et avec emploi du milieu liquide appelé EUGONICs commercialise par la demanderesse) sur des staphylocoques S-Aureus résistant à la méthicilline (MRSA) et des staphylocoques S-Aureus sensibles à la méthicilline (MSSA). Les résultats consignés dans ce tableau II montrent que l'emploi de céphamandole conduit à des resultats supérieurs à ceux que l'on obtient avec l'oxacilline, le produit généralement utilisé pour determi- ner la résistance de bactéries aux ss-lactamines. Dans les exemples 2 à 20 qui suivent, les souches choisies pour les traitements indiques sont intrinsèquement résistantes à toutes les ss-lactamines, c.à.d. que la résistance intrinsèque atteint toutes les ss-lactamines à l'exception du céphamandole. TABLEAU II METHODE: A MSSA OXACILLINE MRSA 5 g NOMBRE DE SOUCHES: PENICILLINASE PENICILLINASE 39 positive negative 50 8 S 24 50 8 I 8 O O R 7 O O METHODE: B MSSA CEPHAMANDOLE MRSA 0,5 g OMBRE DE SOUCHES: PENICILLINASE PENICILLINASE 109 positive négative 50 8 S 2 48 8 I 0 1 0 R 107 1 0 S : sensible MSSA : staphylocoques S-aureus I : intermédiaire sensibles à la methicilline R : résistant MRSA : staphylocoques S-aureus A : classique resistants à la méthicilline B : selon l'invention EXEMPLES 2 à 12 Des antibiogrammes sont effectués sur les appareils automatiques appelés AUTOBAC. On emploie des disques de papier imprégnés de diverses quantités de céphamandole (Exemples 2 à 11) et imprégnés de 5,0 i'g d'oxacilline à titre de témoin (Exemple 12). Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau III. TABLEAU III Technique classique utilisée pour 1'AUTOBACs Charge/disque Nombre de % de concordance entra Exemples g souches technique à l'AUTOBAC et classification des souches céphamandol e 2 0,125 41 42,3 3 0,25 65 67 4 0,5 94 96,9 5 1 88 90,7 6 2 69 71,1 7 4 63 64,9 8 6 60 61,9 '9 8 59 60,8 10 9 57 58,8 11 10 56 58,8 oxacilline 12 5 97 57 TABLEAU IV Technique classique par diffusion (technique manuelle) Charge/disque diamètre Nombre de % de concordance Exemples 9 critique souches entre technique de l'inhi- par diffusion et bition max. classification (mm) des souches céphamandole 13 0,125 6 65 83,3 14 0,250 6 70 89,7 15 0,5 6 75 96,2 16 1 14 77 98,7 17 5 20 74 94,9 18 10 25 40 51,12 oxacilline 19 1 15 69 88,5 20 5 20 64 82,1 EXEMPLES 13 à 20 Des antibiogrammes sont effectues par des techniques de diffusion (technique manuelle) dans des boites de Petri selon la méthode décrite ci-dessus. On emploie des disques de papier imprégnés de diverses quantités de céphamandole (Exemples 13 à 18) et de diverses quantités d'oxacilline (Exemples 19 et 20). La comparaison des résultats contenus dans ces tableaux III et IV montre, aussi bien pour les techniques automatiques que pour les techniques manuelles,-que le céphamandole conduit à des resultats plus exacts. Il est surprenant que le céphamandole qui est le moins touché par le phenoméne de résistance intrinséque donne lieu à une réponse generalisable à tous les autres antibiotiques du même groupe. Il est également surprenant, comme il est apparu à la lecture du tableau II, que le céphamandole conduise à des résultats meilleurs que ne le permet l'oxacilline. En fait, les tests effectués sur une très large population de souches resistantes ayant une origine geographique très diversifiée, montrent le comportement qui de façon surprenante est treks constante du céphamandole vis- -vis du staphylocoque S-aureus. Il faut remarquer que les essais effectués, aussi bien par les méthodes automatiques que par les methodes manuelles classiques, conduisent aux mêmes résultats plus fiables sans qu'aucune modification des conditions opératoires (telles que modification de latempérature, du milieu ou dumode d'interprétation) n'ait à intervenir. REVENDICATIONS 1.- A titre de produit industriel nouveau, un ensemble formé d'un support et d'un antibiotique permettant par un seul antibiogramme de déterminer la résistance intrinseque aux 8-lactamines d'une famille de bactéries, cet ensemble etant caractérisé en ce que l'antibiotique est formé de céphamandole, employé à raison de 0,1 à 7,5 p9, associé audit support qui consiste en tout excipient, véhicule ou base solides ou liquides. 2.- Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support est solide et consiste en tout support convenable, tel que coton hydrophile, bois, papier, matériau plastique, silice ou autre matiere sous forme de granules ou de perles, à la surface duquel le cephamandole adhere ou auquel le céphamandole est mélangé, ce support étant inerte vis- -vis du céphamandole. 3.- Ensemble selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit support est solide et en ce que le céphamandole est employé à raison de 0,5 à 7,5 ug. 4.- Ensemble selon la revendication 3, caractérisé en ce que cette quantite est de l'ordre de 1 à 5 iig. 5.- Ensemble selon la revendication 1-ou 2, caractérisé en ce que ledit support est liquide et consiste en tout support convenable tel que solution saline, eau distillée, sérum et autre support liquide inerte vis-à-vis du céphamandole, dans lequel celui-ci est en solution ou en suspension. 6.- Ensemble selon une quelconque des revendications 1, 2 ou 5, caractérisé en ce que ledit support est liquide et en ce que le céphamandole est employé à raison de 0,10 à 1,5 'jg. 7.- Ensemble selon la revendication 6, caractérisé en ce que cette quantité est de l'ordre de 0,10 à 1 ug. 8.- Methode de détermination de la résistance intrinsèque aux ss-lactamines des staphylocoques, caracterisee en ce que l'on emploie le produit industriel nouveau selon une quelconque des revendications 1 à 7 précitées 9.- Méthode selon la revendication 8, caracterisEe en ce qu'elle est mise en oeuvre dans une installation automatisee et en ce que le céphamandole est employé à raison de 0,10 à 1,5 ug par test, et de préférence, de 0,10 à 1,00 'jg-par test. 10.- Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre manuellement et en ce que le cephamandole est employe à raison de 0,5 à 7,5 ug par test et, de préférence, de 1,00 à 5 ug par test.