Brevet FR2571061A1 — publié le 19860404

La présente invention concerne l'industrie microbiologique et, plus précisément, un procédé de préparation de la L-lysine, trouvant une application dans les industries alimentaire et pharmaceutique, et égalenent en élevage pour l'équilibrage et l'enrichissement de la composition du fourrage. On connaît un procédé de synthèse microbiologique de la L-lysine, dans lequel on effectue la culture immergée dans des conditions aérobies d'un producteur du genre de Brevibacterium sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, les sels minéraux et les stimulateurs de la croissance. En qualité de producteurs, on utilise des mutants auxotrophiques des bactéries du genre de Brevibacterium. par exemple la souche de Brevibacterium flavum RC-115 ou la souche de Brevibacterium sp.E-531. En qualité de source de carbone, on uti-- lise des carbohydrates. le plus souvent la mélasse, le sucre ainsi que l'acide acétique, l'éthanol, les hydrocarbures. Une quantité nécessaire d'azote, de phosphore, de potassium est ajoutée dans le milieu sous forme de sels inorganiques.Des stimulateurs de la croissance indispensables sont introduits dans le milieu sous forme d'extrait de mals, soit sous forme d'hydrolysats de protéines. On conduit la culture sous aération et agitation du milieu. Le processus de fermentation peut être réalisé avec une alimentation supplémentaire d'une partie des substances nutritives pendant la fermentation. Lors de la mise en oeuvre du processus de fermentation dans un milieu contenant des substances réductrices à raison de 11 à l3% (sans alimentation supplémentaire en substances nutritives) on accumule 26-39 g/l de L-lysine après 72-90 heures, à un taux de conversion du sucre de 0,2-0,3. La vitesse d'accumulation de la L-lysine est de 0,2 à 0.5 g/l en heure (certificat d'auteur de 1'URSS N671384, 1976 , certificat d'auteur de 1'URSS N679980, 1977). Les procédés de préparation connus de la L-lysine sont caractérisés par une technologie compliquée et un bas rendement en L-lysine, dû à la phase initiale prolongée qui dans les conditions industrielles constitue 12-15 heures. Le rendement en produit isé augmente dans un certain degré après l'introduction de la quantité supplémentaire en substances nutritives pendant la fermentation, cependant ce processus exige un appareillage assez compliqué pour l'amenée et le contrôle de la concentration en substances. On s'est donc proposé par introduction d'une nouvelle opération technologique afin de simplifier la technologie du processus. d'augmenter le rendement en produit visé et de réduire la durée du processus de culture. La solution consiste en ce que, dans le procédé de préparation de la L-lysine par culture immergée dans des conditions aérobies de son producteur du genre de Brevibacterium, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, les sels minéraux et des stimulateurs de la croissance, et avec isolement subséquent du produit préparé suivant l'invention, le producteur de la L-lysine avant culture est irradié par rayonnement ionisant à raison de 0,5-4,0 krad/min jusqu'à une dose intégrale ne dépassant pas 50 krad. En cas d'utilisation en qualité de producteur de la L-lysine de la source de Brevibacterium flavum RC-115 dans le processus, pour augmenter son activité, il est préférable de la soumettre avec rayonnement ionisant jusqu'à une dose intégrale comprise dans des limites de 10 et 30 krad. Pour augmenter l'activité de la souche de Brevibacterium sp.E-531, lors de son utilisation en qualité de producteur, il est avantageux de la soumettre au rayonnement ionisant jusqu'à une dose intégrale comprise dans les limites de 0,5 et 1,0 krad. Diverses souches productrices de la L-lysine du genre de Brevibacterium ont une sensibilité au rayonnement considérablement différente qui dépend non seulement des propriétés de la souche, mais également des conditions environnantes d'irradiation. Après l'irradiation, on observe l'accélération des processus de la vitalité des cellules. Dès le début du processus de culture, les substances nutritives sont consommées d'une manière intense et la L-lysine s'accumule avec une vitesse élevée. ta concentration en L-lysine après 48 heures de culture est de 118 à 160 % plus supérieure comparativement à celle de culture non irradiée. De plus, en cas de dérogation aux conditions optimales de culture pendant la fermentation, la population irradiée est plus rapidement adaptée et son rendement en L-lysine est de 200 à 300 % plus grand que celui de la population non irradiée.La valeur du taux de conversion du sucre est maintenue à la limite supérieure de 0,3 à 0,4, mais elle ne chanqe pas d'une manière sensible, ce qui témoigne de ce que la voie du métabolisme des cellules irradiées reste invariable, et on parvient de cette manière, dans le régime de rayonnement proposé à une stimulation de l'activité des producteurs de la L-lysine sans modifications génétiques. Le procédé proposé est mis en oeuvre de la manière suivante. On réensemence la culture du genre de Brevibacterium sur une pente gélosée d'agar-agar de viande peptonée fraîche, on cultive au thermostat saune température de 28-30"C pendant 24 heures. On soumet ensuite cette pente gélosée à une irradiation par le rayonnement ionisant avec des rayons X à une puissance de la dose de 0,5-4,0 krad/min jusqu'à la dose intégrale ne dépassant pas 50 krad. Les conditions d'irradiation pour chaque souche productrice concrète de la L-lysine du genre de Brevibacterium sont différentes, elles sont sélectionnées expérimentalement, suivant la sensibilité de la souche donnée. Sous l'effet de llirra- diation, le métabolisme des cellules du microorganisme s'accélère. La vitesse de la croissance et du développement des cellules, l'assimilation des ingrédients nutritifs et la biosynthèse de la L-lysine augmentent de 2 fois. On n'observe pas cet effet après l'irradiation des microorganismes à une dose inférieure à 0,5 krad. Le mé- tabolisme des cellules reste invariable. A des doses intégrales d'irradiation dépassant 50 krad, la croissance des cellules diminue par suite de l'apparition d'anomalies dans le processus de division des cellules, ce qui indique que les ADN et ARN ont été atteints. Après l'irradiation, on utilise la pente gélosée avec la culture pour cultiver la semence.On utilise pour la culture de la semence un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, les sels minéraux et les stimulateurs de la croissance, par exemple de composition suivante (g/l d'eau de robinet) mélasse à teneur en sucres 50 % : 200,0 (ce qui corres pond à une te neur en subs tances réduc trices de 10 + 0,5 %) hydrolysat de levure (concentré de protéine-vitamine) ou l'extrait de vitamine 40,0 sulfate d'ammonium 20,0 phosphate de potassium monosubstitué 5,0 phosphate de potassium disubstitué 5,0 craie 10,0 pH = 7,0-7,2 On réalise ensuite la fermentation.En qualité de milieu nutritif de fermentation, on peut utiliser un milieu de composition suivante (g/l) mélasse à teneur en sucre 50 % : 250,0 (ce qui corres pond à une te neur en subs tances réduc trices de 5 + 0,5%) extrait de mais ou hydrolysat de levure (concentré de protéine-vitamine) 40,0 sulfate d'ammonium 25,0 phosphate de potassium monosubstitué 5,0 phosphate de potassium disubstitué 5,0 antimousse synthétique 0,5-1,0 pH = 7,0-7,2 On ensemence le milieu de fermentation avec la semence à raison de 0,1 à 8 % vol. On effectue la fermentation à une température de 30 à 33"C, pH - 7,0-7,8, P02 = 20 % de la saturation entière. La croissance de la culture commence dès le moment d'ensemencement, la phase initiale de la croissance de la culture étant absente. On continue le processus jusqu'à la diminution des substances réductrices dans le milieu jusqu'à 0,5 %. Le processus de la fermentation de base dure 48-55 heures. A la fin de la fermentation, il s'accumule dans le milieu jusqu'à 53 g/l de L-lysine (calculé sur le monochlorhydrate de L-lysine). Le taux de conversion des sucres atteint alors 0,42 et la vitesse de la synthèse de la L-lysine constitue 0,96 g/l par heure. La teneur en biomasse du milieu est de 15-20 g/l. Puis on isole le produit visé dans le liquide de culture obtenu suivant la méthode connue, sous forme de concentré fourrager liquide ou sec de la L-lysine ou sous forme de L-lysine cristalline pure. Le procédé proposé présente les avantages suivants comparativement au procédé connu - la vitesse de la croissance du producteur dès le moment d'ensemencement augmente étant donné l'absence de phase initiale dans le processus, - la vitesse de la synthèse de la L-lysine se voit accrue de 2 fois, la synthèse commençant dès le début du processus de fermentation, - le cycle de fermentation est réduit de 25 %, ce qui simplifie la technologie du processus et son équipement. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description, qui va être suivie d'exemples de réalisation du procédé de préparation de la L-lysine. Exemple 1. En qualité de souche productrice de la L-lysine, on utilise la souche de Brevibacterium flavum RC-115. La culture fraîche réensemencée sur pente gélosée de viande peptonée est irradiée avec la dose de puissance de 1 krad/ min jusqu'à la dose intégrale de 10 krad. On utilise en suite la pente gélosée comme semence au cours de la biosynthèse de la L-lysine dans les fioles d'une secoueuse. On verse 10 ml d'eau de robinet stérile dans chaque fiole à pente gélosée, et on secoue. La suspension obtenue est utilisée comme semence à raison de 2 ml (8 %), dans le milieu de fermentation. La composition du milieu de fermentation est la suivante (en g/l d'eau de robinet) mélasse à une teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 12,5 %) 250,0 extrait de maïs (à une teneur en substances sèches de 50 %) 40,0 NH4S04 25,0 KH2P04 5,0 K2HP04 5,0 craie 10,0 5 On stérilise le milieu sous 1,0 atm. eff. (1osa) pendant 20 minutes. Après la stérilisation du milieu nutritif, on porte le pH jusqu'à un niveau de 7,0-7,2 par addition de l'eau ammoniacale à 25 %.On réalise la culture dans des fioles de 750 ml de capacité contenant 25 ml de milieu sur une secoueuse à 230 t/min à une température de 30-33 C. On continue la fermentation durant 50 heures, pendant ce temps, la concentration en sucres diminue jusqu 0,5 % et 40,7 g/l de L-lysine sont accumulés (calculés sur le monochlorhydrate de L-lysine), le taux de conversion des sucres étant de 0,33.La vitesse moyenne de la biosynthèse de la L-lysine pendant toute la période de la fermentation est de 0,81 g/l par heure. Exemple 2. On utilise en qualité de souche productrice de la L-lysine la souche de Brevibacterium flavum RC-115. La culture fraîche réensemencée sur la pente gélosée de viande peptonée est irradiée à une dose de puissance de 3 krad/min jusqu'à la dose intégrale de 20 krad. On réa- lise la culture comme dans l'exemple 1. La concentration en sucres diminue après 48 heures de la fermentation de 0,5 % et il s'accumule alors 43,-4 g/l de L-lysine (calculés sur le monochlorhydrate de L-lysine). Le taux de conversion du sucre constitue 0,35. La vitesse moyenne de la biosynthèse de la L-lysine pendant toute la période de fermentation est de 0,90 g/l par heure. Exemple 3. On utilise en qualité de souche productrice de L-lysine la souche de Brevibacterium flavum RC-115. On irradie la culture fraîche réensemencée à une dose de puissance de 4 krad/min jusqu'à une dose intégrale de 30 krad. On cultive la semence pour la fermentation pendant 20 heures dans des fioles de 750 ml de capacité contenant 25 ml de milieu nutritif d'ensemencement de composition suivant (g/l d'eau de robinet) mélasse à une teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 10 %) 200,0 extrait de mals (teneur en substances sèches 50 %) 40,0 (NH4)2S04 20,0 KH2PO4 5,0 K2HP04 5,0 craie 10,0 Après 20 heures de la croissance, on transfère stérilement la semence dans un fermenteur de 30 1 de capacité, à raison de 165 ml (1 %) du volume du milieu (le fermenteur contient 18 1 de milieu nutritif). La concentration de départ en biomasse du milieu de fermen tation constitue alors 0,3 g/l. Le fermenteur est muni d'un agitateur, d'appareils pour la mesure et la régulation de la température et de pH.La composition du milieu de fermentation est la suivante (g/l) mélasse à une teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en-substances réductrices de 12,5 %) 250,0 extrait de mais (teneur en substances sèches de 50 %) 40,0 (NH4)2S04 25,0 KH2P04 5,0 K2HP04 5,0 On réalise la culture de la souche productrice à une température de 30 à 33"C et pH = 7,0-7,8, pO2 = 20 % de la saturation entière. On continue le processus jusqu'à une réduction de la concentration en sucres du liquide de culture de 0,5 %. I1 s'accumule pendant 55 heures 44,8 g/l de L-lysine dans le milieu de fermentation (calculés sur le monochlorhydrate de L-lysine). Le taux de conversion du sucre constitue 0.36, la vitesse moyenne de la synthèse de la L-lysine est de 0,81 g/l par heure. Exemple 4. On utilise en qualité de souche productrice de la L-lysine la souche de Brevibacterium sp.E-531. On irradie la culture fraîche réensemencée à une dose de puissance de 0,5 krad/min jusqu'à la dose intégrale de 0,5 krad. On réalise la culture dans les fioles secoueuses, comme dans l'exemple 1, sur un milieu de composition suivante (g/l) mélasse à une teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 12,5 %) 250,0 hydrolysat de levure fourragère (concentré de protéine-vitamine à teneur en substances sèches de 20 %) 40,0 (NH4)2S04 25,0 KH2P04 5,0 K2HP04 5,0 craie 10,0 La concentration en sucres après 55 heures de fermentation se voit diminuée jusqu'à 0,5 % et il s'accumule 48 g/l de L-lysine (calculés sur le monochlorhydrate de L-lysine).Le taux de conversion du sucre constitue 0,38, la vitesse moyenne de la synthèse de la L-lysine est de 0,87 g/l par heure. Exemple 5. On utilise en qualité de souche productrice de la L-lysine la souche de Brevibacterium sp.E 531. On irradie la culture fraîche réensemencée avec une dose de puissance de 1,0 krad/min jusqu'à la dose intégrale de 1,0 krad/min. On cultive la semence en deux stades. Au premier stade, on réalise la culture dans des fioles de secoueuse comme dans l'exemple 3, sur un milieu nutritif de composition suivante (g/l) mélasse à teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 10 %) 200,0 hydrolysat de levure fourragère (concentré de protéine-vitamine à teneur en substances sèches de 20 Z) 40,0 (NH4)2S04 20,0 KH2P04 5,0 K2HP04 5,0 craie 10,0 Au deuxième stade, on cultive la semence dans un fermenteur d'ensemencement de 5000 1 de capacité, contenant 3000 1 de milieu nutritif de composition suivante (g/l) : mélasse à teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 10 %) 200,0 hydrolysat de levure fourragère (concentré de protéine-vitamine à teneur en substances sèches de- 20 %) 40,0 (NH4)2S04 40,0 KH2PO4 5,0 K2HP04 5,0 Le milieu nutritif pour le matériau semence stétilisé sous 1,2 atm. eff. (120 kPa) pendant 60 minutes est refroidi, le pH du milieu étant porté jusqu'à 7,07,2 par addition de l'eau ammoniacale à 25 %. On ensemence la semence à partir des fioles de secoueuse à raison de 2-3 1 (0,1 %). On cultive la semence pendant 20-24 heures à une température de 30 à 33"C, à pH = 7,0-7,8 et pO2 = 20 % de la saturation complète. On réalise ensuite la fermentation dans un fermenteur de 50 000 1 de capacité (contenant 35 000-1 de milieu nutritif).La composition du milieu de fermentation est la suivante (g/l) mélasse à teneur en sucre de 50 % (ce qui correspond à une teneur en substances réductrices de 12,5 %) 250,0 hydrolysat de levure fourragère (concentré de protéine-vitamine à teneur en substances sèches de 20 %) 40,0 sulfate d'ammonium 25,0 KH2P04 5,0 K2HPO4 5,0 silicone 1,0 On stérilise le milieu nutritif dans une installation continue sous une pression de 1,2 atm. eff. (120 kPa), on refroidit jusqu'à 30-33"C, on porte le pH à 7,0-7,2 par addition d'eau ammoniacale à 25 % et on ensemence avec la semence à raison de 2800 1 (8%). On maintient la température à 30-33"C pendant la fermentation, le pH du milieu étant de 7,0-7,8 et p02 = 20 % de la saturation complète. Après 55 heures de fermentation, il s'accumule dans le milieu de -fermentation 52,7 g/l de L-lysine (calculés sur L-lysine monochlorhydrate). Le taux de conversion du sucre constitue 0,42, la vitesse moyenne de la synthèse de la L-lysine est de 0,96 g/l par heure. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de la L-lysine par culture immergée dans des conditions aérobies'de son producteur du genre de Brevibacterium, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, les sels minéraux et les stimulateurs de la croissance, et avec isolement subséquent du produit préparé, caractérisé en ce qu'on soumet le producteur de la L-lysine, avant la culture, à l'action du rayonnement ionisant avec une dose de puissance de 0,5-4,0 krad/min jusqu'à une dose intégrale ne dépassant pas 50 krad. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de producteur de la L-lysine, on utilise la souche de Brevibacterium flàvum RC-115, qu'on soumet, avant la culture, à l'action du rayonnement ionisant jusqu'à une dose intégrale comprise dans les limites entre 10 et 30 krad. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de producteur de la L-lysine, on utilise la souche de Brevibacterium sp.E-531, qu'on soumet, avant la culture, à l'action du rayonnement ionisant jusqu'à une dose intégrale de 0,5 à 1,0 krad.