Brevet FR2569420A2 — publié le 19860228

FR 2569420 A2 19860228 FR 8413250 A 19840827 La présente addition concerne la préparation de l'hirudine. Le brevet principal décrit des vecteurs permettant l'expression de l'hirudine dans différentes cellules, notamment les bactéries. La présente invention concerne l'expression de l'hirudine ayant la structure naturelle, c'est-àdire dont l'extrémité N terminale a la structure ile - thr, avec éventuellement un résidu met correspondant au codon de départ ATG. Les vecteurs selon la présente addition se caractérisent essentiellement par la structure des codons de départ qui codent pour ile : l'isoleucine, et thr : la thréonine. De préférence, le gène codant pour l'hirudine selon l'invention présente la structure suivante ATG ATT ACG TAC TAA TGC De façon encore préférable, la structure est la suivante ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT L'invention concerne, en particulier, le vecteur pTG720 qui présente une structure voisine de celle de pTG718 décrit au brevet principal. L'invention concerne également des cellules transformées par un vecteur exprimant l'hirudine dont l'extrémité N terminale est soit met - ile - thr, soit ile - thr. Parmi les cellules qui peuvent être transformées il faut citer, en particulier, les bactéries et notamment Escherichia coli, comportant éventuellement les éléments assurant l'expression à partir d'un promoteur thermo-inductible, comme cela est décrit dans le brevet principal, par exemple la souche E. coli TG900. L'invention concerne également un procédé de préparation de l'hirudine caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu de croissance des cellules transformées ,telles que mentionnées précédemment, dans des conditions assurant la synthèse de l'hirudine. En particulier, lorsque le promoteur est thermoinductible, la température de la culture sera supérieure à la température d'induction. Les conditions de culture dépendront, en général, de la souche utilisée mais sont connues de l'homme de métier. L'hirudine obtenue pourra être récupérée par l'un des procédés décrits dans le brevet principal. L'invention concerne enfin l'hirudine obtenue par ce procédé et, de façon générale, l'hirudine obtenue par culture de cellules et notamment d'origine bactérienne dont l'extrémité N terminale est met - ile - thr ou ile - thr, ainsi que son application à titre de médicament dont les propriétés sont voisines de celles de l'hirudine décrite au brevet principal. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Sur les figures ci-annexées, - la figure 1 represente une courbe de l'activité hirudine induite dans une culture de E. coli TG900 contenant pTG720 - la figure 2 représente un spectre d'analyse des protéines marquées au 35S des extraits de E. coli TG9OO contenant pTG720. EXEMPLE 1 La construction du plasmide pTG720 exprimant l'hirudine selon l'invention est obtenue selon le même processus que le plasmide pTG718 décrit au brevet principal en partant de pTG717 et de pTG927. On assemble le fragment NdeI/PvuII de pTG927 avec le fragment HinfI/AhaIII de pTG717 par l'intermédiaire d'oligonucleotides adaptateurs,decrits ci-après,afin de reconstituer à l'extrémité N terminale de l'hirudine la séquence ile - thr. 11 mer 15 mer Hinfl AhaIII PvuI PL N CIIrbs TATGATTACGTATACAGACTGCACAG # # # pTG927 # ACTAATGCATATGTCTGACGTGTCTTA pTG717 pTG927 NdeI 27 mer metilethrtyrthraspcysthrglu Le mélange de ligation est utilisé pour transformer E. coli TG900 et les transformants contenant des plasmides sont sélectionnés sur plaque de L agar contenant 100 pg/ml d'ampicilline. Les constructions qui contiennent la séquence de l'hirudine sont identifiées par hybridation des colonies en utilisant un insert marqué de pTG717 comme sonde. La séquence d'ADN du plasmide final a été contrlée par séquençage direct de 1'ADN dans le plasmide d'expression. EXEMPLE 2 Expression de l'activité hirudine par pTG720 Des cellules de E. coli TG900 contenant le plasmide pTG720 sont mises en croissance sur milieu LB plus 50 pg/ml d'ampicilline à 300C jusqu'à une densité optique 600 de 0,3. Les cultures cellulaires sont alors transférées à 370C pour induire la transcription à partir du promoteur PL. On prélève heure par heure 1 ml d'une aliquote et la densité à 600 nm est mesurée, puis les cellules sont collectées par centrifugation. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans 200 p1 de TGE (25 mM Tris HC1, pH 8,0, 50 mM glucose, 10 mM EDA) et les cellules sont lysées par sonication. Après clarification, le surnageant est collecté et l'activité antithrombine est mesurée, soit par l'essai de coagulation ou par dosage colorimétrique de l'inhibition de la coupure du substrat, tosyl-glycil-prolyl-arginine-4 nitroanilide acétate (Chromozym TH, Boehringer Mannheim GmbH) par une solution de thrombine standard. La réaction est conduite dans un volume réactionnel de 1 ml en utilisant 13 VM de substrat dans un tampon composé de 100 mM Tris HC1, pH 8,0, 0,15 M KC1, 0,1 z de polyéthylène glycol 6000. La réaction avec 0,25 U de thrombine est suivie pendant 2 minutes grâce à un spectrophotomètre à 405 nm et'la vitesse de réaction est mesurée à partir de la pente d'accroissement de densité optique. De l'hirudine standard ou des extraits inconnus sont ajoutés à ce mélange réactionnel de thrombine pour déterminer la quantité dtinhibition ou l'activité antithrombinique. La figure 1 ci-annexée montre l'effet de l'induction de l'activité antithrombinique d'une culture de cellules contenant pTG720 exprimé en unité antithrombine pour une densité optique de 600 par litre de culture et ceci sur une période de 6 heures. La ligne pointillée indique la courbe de croissancezdes cellules de E. coli mesurée à une densité optique de 600 pendant la même période. On observe une activité de type hirudine présentant un niveau significatif grâce à l'induction. Des lysats de contrôle des cultures contenant le plasmide sans la séquence hirudine ne présentent aucune activité. Lorsque ces-lysats bactériens sont chauffés à 700C pendant 15 minutes après acidification à pH 2,8 avec HC1, une quantité considérable de protéines est dénaturée et précipitée. Lorsque celle-ci est éliminée par centrifugation de l'extrait refroidi et le surnageant neutralisé par addition d'un tampon Tris HC1 (concentration finale 100 mM, pH 8,0) au moins 100 % et souvent plus de l'activité de départ se retrouve dans le surnageant. Dans une expérience typique, 130 % de l'activité de départ se retrouve dans le surnageant. Aucune activité résiduelle n'est trouvée dans le matériel précipité dans le culot. Lorsqu'un extrait bactérien, chauffé et acidifié après refroidissement, centrifugation et neutralisation (200 p1 contenant 5 ATUs d'hirudine) est incubé pendant 15 minutes à 370C avec 100 p1 d'une bouillie à 50 % de thrombine couplée de façon covalente à une résine Sepharose (préparée par des procédures standards) et lorsque la Sepharose thrombine est éliminée par centrifugation, aucune activité de type hirudine ne peut se trouver dans le surnageant. Ainsi, l'hirudine produite par pTG720 a les mêmes propriétés générales que la molécule native et que celle qui est obtenue par pTG717 et pTG718. Les polypeptides spécifiquement induits dans la culture de pTG720, après marquage avec la méthionine S35, resolution par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et visualisation par fluorographie, sont représentés à la figure 2. Une série de polypeptides de petit poids moléculaire (5 a 10 000 daltons) sont plus particulièrement induits. Sur la figure 2, la ligne 1 représente les cellules non induites, la ligne 2 l'induction à O heure, la ligne 3, 1 heure d'induction, la ligne 4, 2 heures d'induction, . la ligne 5 : marqueurs de poids moléculaire, . La ligne 6, 3 heures d'induction, la ligne 7, 4 heures d'induction, . la ligne 8, 5 heures d'induction, la ligne 9, 6 heures d'induction, la ligne 10, 7 heures d'induction. REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage et d'expression selon l'une des revendications 1 a 7 du brevet principal, caractérisé en ce que le gène codant pour l'hirudine débute, après la séquence de départ, par un codon ile et un codon thr. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu5l comporte la séquence au départ du gène de l'hirudine ATG ATT ACG TAC TAA TGC 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence suivante au départ du gène de l'hirudine ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT. 4) Vecteur pTG720. 5) Cellules transformées par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 4. 6) Cellules selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules bactériennes. 7) Cellules selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli. 8) Procédé de préparation de l'hirudine, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu de culture des cellules selon l'une des revendications 5 à 7 dans des conditions assurant la croissance desdites cellules. 9) Hirudine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8. 10) Hirudine dont l'extrémité N terminale est met - ile - thr ou ile - thr. 11) Hirudine selon la revendication 10 d'origine bactérienne.