Brevet FR2570615A1 — publié le 19860328

La présente invention est relative à un nouveau- complexe d'élution particulièrement adapté à la chromato- graphie d'affinité. La chromatographie d'affinité est une technique actuellement très utilisée pour isoler des enzymes et les purifier de façon à obtenir l'enzyme recherchée avec un grand degré de pureté. Une des phases délicates de cette technique est l'élution: il faut exclusivement entraîner l'enzyme souhaitée ou parfois un ensemble d'enzymes. En effet plusieurs types d'enzymes ont pu être retenus sur la colonne de chromatographie. Afin d'être assuré que seule l'enzyme recherchée est éluée, on utilise une solution contenant le complexe constituant le substrat de cette enzyme. Ainsi, par exemple, les hexokinases qui ont pour substrat le nicotinamide-adénine-dinucléotide phosphate (NADP), sont éluées au moyen d'une solution renfermant ce complexe; de même, la luciférase qui a pour substrat spécifique l'adénosine-triphosphate (ATP), est éluée au moyen d'une solution contenant cet acide. Mais les substrats, en particulier ceux énoncés ci-dessus, sont parfois co teux,car d'obtention difficile. De plus, une fois l'enzyme extraite de la solution d'élution, on ne peut réutiliser la solution restante, cette impos- sibilité de recyclage augmente encore le prix de revient de l'enzyme. Aussi,un des buts de la présente invention est-il de fournir un complexe d'élution notamment pour chromato- graphie d'affinité aussi performant que le substrat spéci- fique de l'enzyme fixée sur la colonne de chromatographie. Un objet de l'invention est un tel complexe d'élution dont la production est facile et peu coûteuse, permettant ainsi une production d'enzyme à un prix de revient aussi bas que possible. Ce but et cet objet, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un complexe d'élution, notamment pour chromatographie d'affinité qui, selon la présente invention, comprend un sel de magnésium et de l'acide éthylène-diamino-tétracétique (EDTA) et a un pH légèrement basique. Avantageusement le sel de magnésium dont la concentration est comprise entre 1 mM et 30 mM, est du sulfate de magnésium (MgSO4). De préférence, la concentration en acide éthylène- diamino-tétracétique est comprise entre 30 mM et 50 mM. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le complexe d'élution comprend également du ribose ou du mannose. Avantageusement, la concentration en ribose ou en mannose dans le complexe est de 5 mM. De préférence, ce complexe comprend également du dithiothréitol à une concentration de l'ordre de 1 mM. Ainsi qu'il l'a été dit précédemment, la présente invention est relative à un complexe d'élution pour la chromatographie., d'affinité qui permet d'éluer une enzyme sans utiliser le substrat de cette enzyme. La Demanderesse a été conduite à étudier un complexe simple, pouvant être produit industriellement, de bonne conservation et peu coûteux. Ce complexe comprend notamment du magnésium sous forme de sel et de l'acide 6thylène-diamino-tétracétique (EDTA), auquel on peut ajouter un sucre tel que du ribose ou du mannose, ainsi que du dithiothréitol (DTT). Le pH de ce complexe doit être légère- ment basique: en général il est de l'ordre de 7,4. Plus précisément ce complexe comprend de 1 mM à 20 mM d'ions magnésium et de 30 à 50 mM d'acide éthylène- diamino-tôtracétique, avec éventuellement environ 5 mM de sucre et environ 1 mM de dithiothréitol. Les exemples suivants de réalisation de la présente invention, qui n'ont aucun caractère limitatif, permettent à l'homme du métier de mieux comprendre la présente invention, ainsi que ses avantages. EXEMPLE 1: récupération de la luciférase. La luciférase est une enzyme dont le substrat spécifique est l'adénosine-triphosphate ou A.T.P. Cette enzyme est isolée par chromatographie d'affinité sur une colonne contenant du Blue-Sépharose. L'élution permettant de récupérer la luciférase pure a été réalisée avec plusieurs êluants dont la composition est indiquée dans le tableau I ciaprès: TABLEAU I Euant - 2 3 4 5 (1)M0PS 0,01 mM - - - ATP 0,5 mM.. EDTA - 30 mM 40 mM 40 mM 40 mM (2)Mg++ 20 mM 20 mM 20 mM 20 mM 20 mM Ribose - _ _ 5 mM - Mannose -. 5 mM Glucose | 5 mM - DTT | I 1 mM |1 mM lmM I (1) MOPS: acide 3N-morpholino-propane sulfonique (2) Sous forme de sulfate de magnésium MgSO4 Dans le tableau II cidessous sont regroupés les résultats des élutions réalisées avec les éluants mentionnés dans le tableau I. TABLEAU II Eluant pH % d'activité % de proté- multiplica- de luciférase ine récupé- tion de puri- rée fication 1 7,4 180 63 3,0 2 7,4 20 70 - 3 7,4 Nul Négligeable - 4 7,4 120 58 2,0 7,4 67 37 1,8 Il apparaît donc qu'un complexe pouvant remplacer 1'ATP pour éluer la luciférase doit comprendre un sel de magnésium et de l'acide éthylènediamino-tétracétique (EDTP), et éventuellement un sucre qui ne peut être du glucose, mais du ribose ou du mannose, ainsi que du dithiothréitol. Ainsi, les éluants 2, 4 ou 5 sont satisfaisants, l'éluant 4 étant le plus performant. EXEMPLE 2: récupération de l'hexokinase. L'hexokinase est une enzyme dont le substrat spécifique est le nicotinamide-adénine-dinucléotide phosphate ou NADP. Cette enzyme est isolée par chromatographie d'affi- nité sur une colonne de Sépharose 4B liée à du Procion Blue HB. L'élution permettant de récupérer l'hexokinase pure retenue sur une telle colonne est usuellement une solution de NADP. Selon l'invention, la Demanderesse a mis en évidence qu'un complexe comprenant 5 mM de sel de magnésium tel que du sulfate de magnésium (MgSO4), et 40 mM d'EDTA, auquel on a ajouté 5 mM de ribose, convient parfaitement pour récupérer toute l'hexokinase retenue par une telle colonne. Le pH de ce complexe est de l'ordre de 7,4. EXEMPLE 3: récupération de la lactate déshydrogénase à partir du muscle du lapin La lactate déshydrogénase est une enzyme dont un des substrats spécifique esle NAD+ (nicotinamide-adénine- dinucléotide). Cette enzyme est isolée par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose 4B couplée à du Procion Blue HB. L'élution permettant de récupérer la lactate déshydrogénase pure retenue sur une telle colonne est usuelle- ment une solution de NAD+ et de pyruvate. Selon l'invention, la Demanderesse a mis en évidence qu'un complexe comprenant mM de sel de magnésium tel que du sulfate de magnésium (MgSO4) et 40 mM d'EDTA auquel on ajoute 5 mM de ribose, avec ou sans addition de pyruvate, convient parfaitement pour récupérer toute la lactate déshydrogénase retenue par une telle colonne. Le pH de ce complexe est de l'ordre de 7,5. REVENDICATIONS 1.- Complexe d'élution notamment pour chromatographie d'affinité, caractérisé en ce qu'il comprend un sel de magné- sium et de l'acide éthylène-diamino-tétracétique (EDTA) et a un pH légèrement basique. 2.- Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en sel de magnésium est compris entre 1 mM et 30 mM. 3.- Complexe selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sel de magnésium est du sulfate de magnésium (MgS04). 4.- Complexe selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que la concentration en acide éthylènediamino-tétracétique est comprise entre mM et 50 mM. 5.- Complexe selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend également du ribose ou du mannose. 6.- Complexe selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration en ribose ou en mannose est de l'ordre de 5 mM. 7.- Complexe selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend également du dithiothréitol. 8.- Complexe selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration en dithiothréitol est de l'ordre de 1 mM. 9.- Complexe selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend 20 mM de sulfate de magnésium, 40 mM d'EDTA, 5 mM de ribose et 1 mM de dithiothréitol. 10.- Complexe selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend 5 mM de sulfate de magnésium,40 mM d'EDTA et 5 mM de ribose.