Brevet FR2560995A1 — publié le 19850913

256099S Réactifs et nécessaires pour le dosage quantitatif d'un acide nucléique viral dans un milieu bioloqique et procédé de dosage de cet acide nucléique viral. L'invention concerne des réactifs standardisés pour le dosage quantitatif d'un acide nucléique viral (ADN ou ARN) éventuellement contenu dans un milieu biologique, plus particulièrement un milieu naturel, des nécessaires comportant de tels réactifs et un procédé de dosage dudit acide nucléique naturel. Dans l'une de ses applications préférées, l'invention concerne le dosage quantitatif, par exemple dans un sérum humain ou de primate de l'ADN viral du virus de l'hépatite B et, plus généralerent, des virus infectieux ou virions que ce milieu peut contenir. A l'heure actuelle, il n'existe guère de méthode de dosage quantitatif simple et direct des particules infectieuses, notamment du virion de l'hépatite virale B. On commence à utiliser en routine des sondes d'ADN con- tenant une séquence caractéristique du génome du virus recherché. Par exemple, il a déjà été proposé d'utiliser des sondes contenant une séquence de DNA-IHBV ou tout ou partie du gène 5 du virus de l'hépatite virale B. Ces sondes permettent, dans les conditions décrites daqs la littérature technique, des détections qualitatives de la présence ou non du virus ou du virion, dans des échan- tillons biologiques susceptibles de les contenir. Ces sondes ne se prêtent cependant guère, dans les conditions sous lesquelles elles ont été utilisées jusqu'à ce jour, à la réalisation de dosages quantitatifs. Par exemple, lors- que le test d'hybridation est réalisé sur un support, par exemple un support de nitrocellulose, la sonde peut en partie être absorbée ou "traverser" le support en ques- tion. Ce phénomène ne nuit pas au caractère qualitatif des détections. il n'en e-st pas de même, lorsque l'on veut réaliser des dosages quantitatifs. Des dosages quantitatifs de certaines séquences d'ADN ont dans des circonstances particulières été réa- lisés sous microscope électronique. Mais il est clair que de telles techniques ne sauraient être utilisées en rou- tine pour des opérations de détection quantitative de par- ticules virales, notamment en vue du diagnostic. Cette méthode ne peut enfin être mise en oeuvre pour des séries de mesures décalées dans le temps, permettant d'apprécier l'évolution de l'infection. L'invention a pour but de fournir des moyens (réactifs, nécessaires de réactifs et procédés) permettant de tels dosages quantitatifs; en particulier, l'invention a pour but de mettre à la disposition du laboratoire et des cliniciens des moyens leur permettant, non seulement de dépister une éventuelle infection virale, par exemple l'hépatite virale B chez des patients déterminés, mais encore de leur permettre d'apprécier rapidement-l'évolu- tion de l'infection virale et de vérifier et ajuster en conséquence l'efficacité des traitement antiviraux appro- priés. - L'invention a naturellement encore pour but de fournir des moyens de mise en oeuvre aisée et ce en rou- tine. Le réactif standardisé pour le dosage quantitatif d'un ADN viral dans un échantillon de milieu biologique naturel compatible avec le développement du virus corres- pondant est caractérisé en ce qu'il contient, en mélange, une concentration déterminée d'un ADN dans lequel est em- paquetée une séquence d'ADN, de préférence clone, hybri- dable avec le susdit ADN viral, et des protéines. De préférence, l'ADN cloné se présente sous la forme d'un phage cloné contenant une insertion de l'ADN hybridable avec l'ADN viral. De préférence, les protéines sont originaires d'un milieu biologique semblable au susdit milieu biologique naturel.De préférence,ce réactif contient les ingrédients essentiels du même milieu biologique naturel, voire même est constitué par le même milieu biologique naturel, si ce n'est qu'il était initialement exempt de l'ADN viral à do- ser de façon quantitative, ce milieu contenant cependant le susdit phage,à la susdite concentration déterminée. L'association à l'ADN clone, de préférence à un phage contenant la séquence hybridable, de protéines per- met une fixation de l'ADN sur un support du type membrane ou filtre, dans des conditions sensiblement reproductibles pour des conditions relatives déterminées. Ces constata- tions s'étendent de la même façon à la fixation d'échan- tillons à tester sur les mêmes supports. Le procédé de dosage quantitatif de la teneur en un acide nucléique viral déterminé, éventuellement contenu dans un milieu biologique naturel, est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact appropriée de ce milieu contenant éventuellement cet acide nucléique viral et pré- alablement amené dans des conditions autorisant une telle hybridation avec une sonde d'ADN, et la comparaison du rapport mesuré du résultat relatif à la quantité de sonde hybridée avec l'acide nucléique viral recherché au bruit de fond mesuré dans les mêmes conditions avec un témoin négatif, avec au moins un rapport de référence correspon- dant au résultat obtenu dans des conditions semblables,si- non identiques, par hybridation de la même sonde avec un réactif tel qu'indiqué ci-dessus et contenant un ADN cloné correspondant à l'ADN viral recherché, au bruit de fond correspondant. Le rapport de référence sus-indiqué peut également résulter d'abaques pré-établies à partir des rapports des mesures des quantités de sonde fixées avec des proportions déterminées, respectivement distinctes entre elles de l'ADN cloné, aux bruits de fond correspondants. Il va de soi que dans ce qui précède le témoin négatif a une composition semblable ou identique à celle du réactif, excepté l'absence de l'ADN clone. Les quantités de sondes hybridées peuvent être corrélées à tout système mesurable. Par exemple, l'un des partenaires de l'hybridation est porteur d'un marqueur radioactif enzymatique, fluorescent, etc., donnant lieu à la production d'un signal dont l'intensité peut être me- surée. La quantification possible de l'acide nucléique mis en jeu dans la réaction d'hybridation résulte de la stabilité observée des mesures du susdit rapport, lorsque l'opération d'hybridation entre une sonde appropriée et une quantité prédéterminée du réactif selon l'invention est répétée. Il en va de même pour ce qui est des rapports mesurables dans les mêmes conditions sur un échantillon naturel contenant une dose également toujours semblables (par exemple les parties aliquotes) d'un même échantillon biologique. Ces rapports sont cependant variables en fonction des quantités d'ADN cloné que peut contenir le réactif utilisé, de sorte qu'il est possible de construire des ahaq,,;; rprésentatives de la variation du susdit rapport en fonction des concentrations en ADN cloné, notamment en particules (de phage. Les variations du même rapport ré- sultant des mesures semblables effectuées sur des échan- tillons biologiques testés, sont alors corrélables aux susdites abaques, de sorte que la teneur en particules virales initialement inconnue pour un échantillon biolo- gique déterminé pourra découler d'une simple comparaison des mesures effectuées avec la courbe d'une abaque cor- respondante. Il résulte de ce qui précède que, lorsque l'échan- tillon biologique naturel contenant la particule virale à déposer est constituée par un sérum sanguin, il sera avan- tageux d'utiliser un réactif standardisé conforme à l'in- vention, dans lequel l'ADN cloné sera associé aux consti- tuants essentiels d'un sérum sanguin. Si l'échantillon à tester est formé à partir d'un extrait cellulaire, les réactifs mis en oeuvre seront avantageusement constitués par un mélange d'un extrait cellulaire équivalent et d'une proportion prédéterminée de l'ADN cloné. En ce qui concerne l'ADN cloné lui-même, il se présente sous la forme du phage dont le patrimoione g6- nétique a été modifié par insertion de la séquence- sonde, par exemple tout ou partie de DNA-IIBV. Cette sé- quence est donc "empaquetée" dans un phage distinct, dont de nombreux exemples ont été décrits dans la littérature. Il s'agit par exemple du phage lambda ou du phage M-13, ou de dérivés ou analogues de ces phages. Le phage utilisé sera quelquefois choisi en fonction de la séquence d'ADN- sonde correspondante en particules virales à doser, eu égard à la taille de l'ADN d'insertion qu'il est capable d'empaqueter. L'avantage d'utiliser un ADN cloné dans un phage réside dans la similitude entre l'élément cloné et la par- ticule naturelle, de sorte qu'à concentrations voisines en particules virales, on observe des comportements sembla- bles tant du réactif que de l'échantillon dosé vis-à-vis d'une sonde ADN déterminée, lorsque les opérations d'hy- bridation sont conduites dans des conditions semblables. Ceci étant, il convient de noter que dans certains cas l'ADN cloné pourra être constitué par un plasmide conte- nant la séquence hybridable avec une partie du génome de la particule virale à doser. En ce qui concerne la sonde elle-même qui va être hybridée, aussi bien avec l'ADN cloné qu'avec l'acide nucléique viral de l'échantillon à tester, on peut avoir recours à toute sonde connue pour sa capacité à s'hybrider avec l'ADN cloné et le génome de la particule virale re- cherchée. Dans le cas préféré o les particules virales à doser sont constituées par des virus de l'hépatite B, la 2560995' sonde pourra être constituée par toute séquence patielle ou entière de DNA-HBV.' Il va de soi que la sonde peut d'ailleurs égale- ment être constituée de la même façon que les susdits ré- actifs, dès lors que leur mise en contact mutuelle peut conduire à une hybridation détectable et mesurable, dans les conditions qui ont été indiquées. C'est en général la sonde qui sera marquée, soit par un marqueur radioactif, soit par toute autre forme de to marqueur, fluorescent ou enzymatique. Dans le cas du mar- queur enzymatique, la quantité d'ADN marqués mise en jeu dans l'hybridation, peut être appréciée par le niveau d'action de l'enzyme sur le substrat correspondant, lors- que la modification de ce dernier peut être appréciée quantitativement de toute façon appropriée, notamment par colorimétrie ou spectrophotométrie. Bien entendu, on peut avoir recours à toute tech- nique classique, pour réaliser la liaison entre la sonde hybride et le marqueur utilisés. Le marqueur peut être préincorporé à la sonde: cela peut être le cas lorsque le marquage est effectué par l'intermédiaire d'un radio- élément. Cette liaison peut être directe ou indirecte dans le cas des marqueurs non radioactifs. En particulier, la sonde peut avoir été modifiée pour porter un site antigé- nique susceptible d'être reconnu par de premiers anti- corps, lesquels sont à leur tour reconnus par de seconds anticorps qui portent l'enzyme ou le marqueur fluorescent mis en jeu dans le dosage sus-indiqué. Un se -reportera à cet égard avec avantage aux techniques décrites, par exemple,dans le brevet français n0 78 10975, le brevet américain n 4.358. 535 et le brevet européen nu 00063879. La réaction d'hybridation proprement dite peut être réalisée dans toutes conditions connues appropriées. On peut opérer sur une composition biologique éventuelle- ment pré-enrichie en ADN et obtenus à partir de l'échan- tillon à étudier. Dans une telle hypothèse, il sera. avan- tageux d'utiliser des 'réactifs standardisés du type sus- défini, lesquels auront alors avantageusement subi les mêmes types de préenrichissement. Cette prépurification ne sera en général pas nécessaire. Le traitement préalable de l'échantillon peut être limité à l'obtention des résultats que constituent la solubilisation des particules virales à détecter et à doser et la dénaturation de l'ADN ou de l'ARN viral. La réaction d'hybridation peut être réalisée en phase liquide ou et de préférence sur un support solide. Il est avantageux de réaliser le dépôt, d'une part, de l'échantillon à doser et, d'autre part, le ré- actif contenant l'ADN cloné sur des supports appropriés aux opérations d'hybridation ultérieures, par exemple sur un filtre de nitrocellulose ou un support de polyamide connu sous la marque NYLON. Ce dépôt est réalisé dans des conditions également connues pour que les séquences d'ADN que contiennent tant l'échantillon que le réactif soient pratiquement fixées sur le support. Par fixation, il faut entendretout mode de retenue correspondant à une véritable fixation, par exemple par l'intermédiaire de liaisons co- valentes, ou encore une simple complexation, voire même adsorption, conduisant cependant au résultat global équi- valent à celui d'une fixation. On réalise alors la mise en contact, dans des conditions en elles-mêmes connues, de l'échantillon et du réactif respectivement avec une 'tonde commune. Le dosage est effectué ultérieurement après lavage adéquat du support pour éliminer toute sonde apportée et excédentaire. On peut également utiliser des techniques mettant en oeuvre des réctions de compétition. De telles techni- ques mettent en jeu la compétition à l'égard d'un substrat approprié en quantité déterminée d'un premier constituant apte à réagir avec le substrat, mais en quantité inconnue, et un second constituant, en quantité connue, en général identique ou analogue au premier. La concentration ini- tiale du premier constituant découle alors de la quantité ou de la concentration du second constituant engagé dans la réaction avec le substrat. Dans le cadre de l'invention, le substrat sera notamment constitué par la sonde, le premier constituant par l'échantillon à doser et le second constituant par un réactif conforme à l'invention. Il va de soi que l'on aura également dans cette technique établi des abaques permettant la détermination par comparaison des teneurs en la particule virale re- cherchée de l'échantillon biologique soumis au test. Pour réaliser des dosages quantitatifs aussi pré- cis que possible, il sera souvent avantageux de disposer d'un nécessaire ou "'kit" comportant une pluralité de ces réactifs, ceux-ci se distinguant cependant entre eux par des concentrations en ADN clones respectivement distinc- tes. En effet, il peut être avantageux de disposer de suffisamment de réactifs, dans un même nécessaire, pour être toujours à même de mettre en présence avec l'échan- tillon à doser au moins un réactif dont la, teneur en ADN cloné n'est pas trop éloignée de la quantité inconnue à doser pour que les résultats soient les plus significatifs possibles. L'invention concerne encore des nécessaires ou "kits", caractérisés en ce qu'ils comprennent: - au moins un réactif tel que décrit ci-dessus et - un réactif de même composition, si ce n'est qu'il est dépourvu de l'ADN cloné. Il comprend avantageusement en outre au moins une abaque représentative des variations observables du rap- port des intensités mesurées d'un signal fourni par un marqueur, après hybridation aveec la sonde de différentes concentrations du réactif selon l'invention, au bruit de fond mesurée dans des conditions semblables par contact du réac- tif témoin avec la meme sonde et dans des conditions d'hybrida- È560995 tion identiques, en fonction des proportions de réactifs mises en jeu dans ces essais d'hybridation, étant entendu que le marqueur est porté par l'un ou l'autre des parte- naires mis en jeu dans l'hybridation, et de préférence par la sonde. Le nécessaire comprend de préférence en outre un ou plusieurs supports appropriés au dépôt et à la Fixation sur un support des différents ingrédients des réactifs se- lon l'invention, du réactif témoin et de l'échantillon à tester, dans des conditions permettant leur hybridation ultérieure éventuelle avec une sonde d'ADN contenant éga- lement une séquence hybridable. D'autres caractéristiques de l'invention apparai- tront encore au cours de la description qui suit de modes de préparation préférés des réactifs standardisés ainsi que de leur mise en oeuvre, de l'établissement d'une abaque pouvant être utilisée comme référence pour des dosages quantitatifs ultérieurs et d'un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. 1 ) Préparation des échantillons Des échantillons de sérums sanguins présumés être infectés par le virus de l'hépatite B sont fixés sur une membrane du polyamide nylon (Biodine A, Pall Co) ou sur tout autre support de nylon ou de nitrocellulose approprié pour des essais d'hybridation. Les dépôts sont effectués en taches "Dot-blots". Ces dépôts peuvent être réalisés soit par dépôts directs des échantillons concentrés, soit par filtration des échantillons préalablement dilués à travers des zones localisées du support et par aspiration à travers ces zones. Les échantillons sont ensuite traités avec une solution de soude 0,15 M et de NaCl 1 M (concen- trations finales) pour solubiliser sur place les particu- les virales et dénaturer les ADN et les rendre accessibles à une sonde susceptible de s'hybrider au génome du virus HBV. Z560.995 On neutralise ensuite avec un tampon Tris:NaCl. La phase solide est ensuite portée è 80 C et la cuisson est maintenue pour une durée de 1 à 2 heures, selon la nature du support utilisé, cuisson dont l'effet est alors d'assu- rer la fixation des ADN de l'échantillon sur le support. Les échantillons sont alors prêts pour la réalisa- tion des opérations ultérieures d'hybridation avec des réactifs standardisés conformes à l'invention. ) Préparation des réactifs standardisés Les ADN clones mis en oeuvre dans ces réactifs sont constitués par des phages tels que les phages lambda ou M-13, dont les génomes ont été modifies dans une région non essentielle pour la réplication de ces phages par une insertion d'un ADN ayant une séquence commune avee le génome des particules virales à détecter, par exemple une séquence partielle ou complète de DNA-HBV, séquence alors empaquetée dans les phages en question. Un ou plusieurs réactifs conformes à l'invention sont préparés par mélange de ces phages modifiés en con- centrations déterminées (concentrations déterminées par exemple par des mesures de densités optiques ou par des plaques de lyse de cultures cellulaires en tapis) avec du sérum sanguin sain. I1 est avantageux de réaliser des ré- actifs de ce type permettant la mise en oeuvre de doses unitaires de particules s'étageant de 102 à a010 parti- cules de phages. Ces réactifs sont alors déposés également. sur filtre et traités dans les mêmes conditions que les échan- tillons à doser. Les membranes comprenant finalement des dépôts d'ADNs en quantités connues (taches formées par les réactifs) et en quantités inconnues (taches obtenues à partir des échantillons à doser) sont prêtes pour la réa- lisation de l'hybridation dans des conditions classiques, par exemple avec une sonde DNA-HBV marquée par un élément radioactif, par exemple 32p. il On a recours aux techniques d'hybridation clas- siques, à la suite de quoi les supports sont lavés pour éliminer la sonde non fixée. Les dosages sont ensuite faits directement sur le filtre (autoradiogrammes)-ou, par exemple, par scintillographie en milieu, après découpe des taches et introduction de celles-ci dans des cuves de mesures contenant un liquide scintillateur approprié. 3a) Préparation d'une abaque caractéristique Une membrane-filtre de nitrocellulose est posée à la surface d'une plaque comportant une pluralité de trous, elle-même posée sur une cuve reliée à une pompe aspirante permettant la réalisation d'une dépression légère s'exer- çant sur la membrane au niveau des trous (diamètre 12 mm) de la plaque. La membrane est humidifiée avec un tampon SSC et dans les puits de profondeur limitée que forment alors les parties de la membrane au-dessus des trous de la plaque, on dépose, dans les conditions qui ont été indi- quées plus haut, des doses croissantes du réactif de l'in- vention contenant des particules, par exemple de DNA-HBV empaquetées dans un phage lambda, en suspension dans du sérum sanguin, pour obtenir une série de dépôts comportant respectivement des quantités de particules s'étageant entre 102 et 1010 particules virales par puits. On réalise le contact dans des conditions permettant l'hybridation avec une sonde marquée, par exemple au 32p, comme il a été indiqué. Après les étapes de préhybridation et d'hybrida- tion réalisées dans des conditions classiques, on mesure, pour chaque puits, le niveau de radioactivité retenu et on établit le rapport de la radioaotive mesurée au bruit de fond (é'tabli avec un échantillon témoin traité dans les mêmes conditions, mais exempt de particules virales sou- mises aux mêmes opérations de dosage) et l'on trace la courbe correspondant à la variation des rapports radioac- tivité mesurée/bruit de fond, en fonction des nombres de particules virales contenus dans les réactifs antérieu- rement introduits dans les puits. On obtient alors la courbe représentative des variations de ce rapport (S/B: abréviation de "signal/ bruit") en fonction des concentrations particulaires initialement mises en oeuvre. Une telle abaque résulte, par exemple, de la figure unique jointe. Elle illustre la variation observée du rapport S/B (sur l'axe des ordon- nées) en fonction des proportions initiales déterminées de particules du phage déposées dans chaque puits (en nombre N de particules par puits sur l'axe des abscisses). Les mesures ont été faites directement sur le filtre par auto- radiogramme. S'agissant maintenant de déterminer la teneur en particules virales d'un échantillon à étudier, on mesure et on détermine, dans les mêmes conditions que précédem- ment indiqué, le rapport S/B. La détermination de la te- neur inconnue en particules vitales découle alors de la comparaison du rapport S/B obtenu et de l'abaque, en te- nant compte s'il y a lieu d'un facteur de correction, éga- lement prédéterminé, éventuellement dû à l'éventuelle dif- férence de composition entre les réactifs mis en oeuvre et les échantillons à tester. On peut tracer des abaques du même type pour tous autres types de réactifs contenant des concentrations en ADN clonés empaquetés distincts. Pour des mesures quantitatives, il y aura lieu de retenir comme crédibles les valeurs des mesures correspon- dant à des rapports S/B supérieurs à 2. IJne méthode quantitative de dosage qui peut être utilisée en variante vise des séquences d'HBV-DNA marqués radioactivement et d'activité spécifique connue, immobi- lisés sur un support solide. Ces réactifs standards immo- bilisés sont alors traités comme indiqué ci-dessus. On réalise une hybridation entre ces séquences immobilisées et un jeu de réactifs radioactivement marqués de concen- trations connues en particules de phages, d'une part, et un second jeu de doses déterminées d'un échantillon à doser dont le contenu en particules virales naturelles est inconnu. La quantité d'ADN finale retenue sur le support solide peut alors être calculé et l'on peut déterminer aussi bien l'efficacité d'hybridation que le dosage quan- titatif des particules hybridées provenant des échantil- lons à doser. D'une façon générale, la méthode dont un exemple de mise en oeuvre vient d'être donné peut être adaptée à tous autres types de particules virales et à toutes sondes correspondantes mettant en jeu des marqueurs différents, par exemple des marqueurs enzymatiques ou fluorescents. La méthode peut être utilisée pour la détermination de con- centrations relatives de tout ADN ou ARN particulier d'origine virale dans des fluides biologiques, tissus ou cellules. Les réactifs selon l'invention sont également applicables à la production d'étalons internationaux, tant en ce qui concerne les réactifs que des échantillons con- tenant les particules virales naturelles correspondantes. Le procédé selon l'invention fournit par consé- quent une méthode de dosage quantitatif direct de parti- cules, par exemple de particules d'HBV, dont la mise en oeuvre est particulièrement simple. Elle est particuliè- rement utile lorsqu'il s'agit de déterminer le niveau d'infection dont souffre un patient, pour l'appréciation de l'évolution de l'infection et de l'évaluatioh de l'efficacité d'un traitement antiviral. * Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Réactif standardisé pour le dosage quantitatif d'un ADN viral dans un milieu biologique naturel compati- ble avec le développement du virus correspondant, caracté- risé en ce qu'il contient, en mélange, une concentration déterminée d'un ADN, de préférence clone, contenant une séquence d'ADN hybridable avec le susdit ADN viral, et des protéines permettant la fixation de 1'ADN cloné sur un support du type membrane ou filtre. 2 - Réactif selon la revendication 1, dans lequel l'ADN cloné est constitué par un phage cloné dans lequel est insérée la susdite séquence d'ADN hybridable avec le susdit ADN viral. 3 - Réactif selon la revendication 1 ou la reven- dication 2, caractérisé en ce que les protéines sont ori- ginaires d'un milieu biologique semblable au susdit milieu biologique naturel contenant les particules virales à do- ser. 4 - Réactif selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ADN cloné est associé avec les ingrédients es- sentiels du même milieu biologique naturel, voire le même milieu biologique naturel que celui contenant l'ADN viral à doser, si ce n'est que ce milieu était initialement exempt de l'ADN viral à doser de façon quantitative, ce milieu contenant cependant le susdit phage à la susdite concentration déterminée. - Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que l'ADN cloné comporte un marqueur. 6 - Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est fixé sur un sup- port dans des conditions autorisant l'hybridation ulté- rieure de son ADN cloné avec ladite sonde. 7 - Nécessaire ou "kit" pour le dosage quantitatif d'un ADN viral dans un milieu biologique naturel comprenant un réactif conforme à l'une quelconque des revendications I à 6, et un réactif témoin, de même composition, si ce n'est qu'il est dépourvu de l'ADN cloné, et une sonde commune à l'ADN cloné et à l'ADN viral à doser. 8 - Nécessaire selon la revendication 7, caracté- risé en ce qu'il comprend plusieurs réactifs, lesquels se différencient entre eux essentiellement par leurs concen- trations déterminées respectives en le susdit ADN cloné. 9 - Nécessaire selon la revendication 7 ou la re- vendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend à la fois au moins un des susdits réactifs fixés sur un support et au moins un des susdits réactifs non fixés sur un support, le réactif fixé ne comportant pas de marqueur et le réac- tif non fixé portant un marqueur. - Nécessaire selon l'une quelconque des reven- dications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une abaque représentative des variations du rap- port des intensités mesurées d'un signal fourni par un marqueur, après hybridation avec la sonde de différentes concentrations du réactif selon l'invention, au bruit de fond mesuré dans des conditions semblables par contact du réactif témoin avec la même sonde et dans des conditions d'hybridation identiques, en fonction des proportions de réactifs mises en jeu dans ces essais d'hybridation, étant entendu que le marqueur est porté par l'un ou l'autre des partenaires mis en jeu dans l'hybridation, et de préférence par la sonde. 11 - Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6 ou nécessaire de réactifs selon l'une quelcon- que des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'ADN cloné contient un ADN hybridable avec le génome de l'hépa- tite virale B, notamment DNA-HBV. 12 - Procédé de dosage quantitatif de la teneur en un acide nucléique viral déterminé, éventuellement contenu dans un milieu biologique naturel, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ce milieu contenant éven- tuellement cet acide nucléique viral et préalablement amené dans des conditions autorisant une telle hybrida- tion, avec une sonde d'ADN, et la comparaison du rapport mesuré du résultat relatif à la quantité de sonde hybridée avec l'acide nucléique viral recherché au bruit de fond mesuré dans les mêmes conditions avec un témoin négatif, avec au moins un rapport de référence correspondant au résultat obtenu dans des conditions semblables, sinon identiques, par hybridation de la même sonde avec un réac- tif conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 6 et contenant un ADN cloné correspondant à l'ADN viral re- cherché, au bruit de fond correspondant. 13 - Procédé selon la revendication 13, caractéri- sé en ce que le rapport mesuré est comparé à des rapports de référence résultant d'une abaque pré-établie. 14 - Procédé selon la revendication 12 ou la re- vendication 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique viral déterminé à doser est constitué par le génome du virus de l'hépatite B et en ce que l'ADN cloné du réactif est constitué par un phage cloné contenant, inséré dans une partie non essentielle de son propre génome, une sé- quence d'ADN hybridable avec le génome du virus de l'hépa- tite B, tel que DNA-HBV ou le gène S du génome du virus de l'hépatite 8.