Brevet FR2563630A1 — publié le 19851031

i Anticorps monoclonaux anticytomégalovirus et procédés pour le diagnostic in vitro des infections par les cy- toméqalovirus humains et d'une protéine-kinase induc- tible par les cytoméqalovirus et susceptible d'être re- connue par les susdits anticorps monoclonaux. L'invention est relative à des anticorps mono- clonaux anticytomégalovirus humains (HCMV) et à un procédé pour le diagnostic in vitro des infections in- duites par les cytomégalovirus humains. Elle concerne plus particulièrement des anticorps de ce type qui sont capables de simultanément détecter les cytomégalovirus (CMV) humains, les cellules humaines infectées par le CMV et un polypeptide, notamment une protéine induite par les HCMV et ayant une activité de protéine-kinase. L'invention concerne encore le susdit polypep- tide ayant la susdite activité de protéine-kinase. Il est connu que le CMV est la cause d'infec- tions cliniques nombreuses s'étageant entre des mani- festations infectieuses bénignes et des manifestations congénitales, par exemple des malformations, particu- lièrement sévères. Le CMV a également été reconnu comme cause de morbidité et mortalité chez les personnes ayant subi des transplantations d'organes, par exemple de rein. Le dépistage du CMV est un problème qui se pose donc de façon particulièrement aiguë. En outre la recon- naissance et l'isolement de polypeptides ou protéines vaccinants ou susceptibles d'être rendus vaccinants à l'égard du CMV ouvrirait des possibilités sérieuses de prévention desdites complications contre lesquelles on ne dispose à l'heure actuelle que de peu de moyens de traitement. Divers auteurs ont déjà porté leur attention sur les techniques de diagnostic qui pourraient être basées sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux à l'égard du cytomégalovirus humain. Les anticorps monoclonaux obte- nus jusqu'à ce jour n'apportaient pas encore la solution attendue pour réaliser un diagnostic à la fois facile et fiable de l'infection aux cytomégalovirus. En effet, il est connu que le CMV (membre de la famille des virus de l'herpès) induit dans les cellules infectées un nombre considérable de polypeptides, à di- vers stades du processus infectieux et à différents ni- veaux des cellules infectées. L.N. PEREIRA et Coll. ("Infection and Immunity", juin 1982, p. 924-932) rap- portent qu'ils ont produit un grand nombre d'hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux capables de recon- naître chez des cellules préalablement infectées et non fixées des polypeptides ou glycoprotéines induites par le CMV dans des cultures de ces cellules. Les diffé- rences observées par PEREIRA et Co1l. au niveau des comportements relatifs des différents anticorps vis-à- vis du virus lui-même, des cellules infectées et des protéines, glycoprotéines ou polypeptides susceptibles d'être isolés à partir d'extraits de ces cellules, les ont conduits à formuler l'hypothèse, que la conformation des glycoprotéines virales reconnues par certains de ces anticorps à la surface membranaire des cellules infec- tées par les CMV, pourrait être différente de la confor- mation de l'enveloppe du virion. L'utilisation de cer- tains des anticorps isolés pour réaliser des opérations de diagnostic du genre sus-indiqué a été évoquée par ces auteurs. Il résulte cependant de ce qui précède et des résultats expérimentaux fournis que les anticorps mono- clonaux jugés les plus intéressants étaient également capables de précipiter à la fois plusieurs polypeptides. L'utilisation de ces anticorps pour reconnaître des déterminants antigéniques ou épitopes spécifiques ne pouvait donc être envisagée en raison du caractère non discriminant de la reconnaissance. L.C. GOLDSTEIN et Coll. ("Infection and Immuni- ty", octobre 1982, p. 273-281) ont également décrit un certain nombre d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître certains polypeptides localisés dans les noyaux ou dans des inclusions cytoplasmiques de cellules infectées par le CIIV. Ces anticorps monoclonaux avaient été sélectionnés par leur capacité à réagir avec des cellules infectées par le CMV, et préalablement fixées au méthanol absolu et séchées à l'air. I1 ne résulte cependant pas de l'article que ces anticorps monoclonaux étaient aptes à reconnaître des cellules infectées en- core intactes. Enfin C. AMADEI et Coll. (Ann. Virol. (Institut Pasteur) 1983, 134 E, 165180) décrivent une batterie de 24 anticorps monoclonaux dirigés contre le cytomégalo- virus humain. Le plus grand nombre d'anticorps monoclo- naux obtenus tient vraisemblablement aux techniques qui ont été utilisées pour les détecter. En particulier, la détection a mis en jeu des techniques immunofluores- centes de détection des anticorps retenus sur des cel- lules préalablement infectées qui avaient été fixées à l'acétone et séchées à l'air. Les mêmes anticorps mono- clonaux se sont révélés pratiquement dépourvus d'acti- vité à l'égard de cellules obtenues à partir de lignées cellulaires identiques préalablement infectées par le même virus, lorsque ces cellules infectées avaient au- paravant été fixées par le méthanol. Peut-être faut-il trouver dans cette observation-la cause du faible nombre d'hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux sélec- tifs contre des cellules infectées au HCMV, qui avaient été isolés par L.C. GOLDSTEIN et Coll.. Parmi ces anticorps monoclonaux certains se sont révélés présenter des propriétés neutralisantes à l'égard de plusieurs souches de virus. Ces anticorps monoclonaux ont d'ailleurs fait l'objet d'une demande de brevet français n 83 05384 déposée le 31 mars 1983. Ces anticorps monoclonaux particuliers ont été retenus pour la réalisation d'essais de diagnostic in vitro d'une infection aux HCMV. Mais la demande de brevet et pas da- vantage l'article susmentionné n'ont pas reconnu parmi les différents hybridomes décrits, celui qui s'est avéré par la suite secréter des anticorps monoclonaux particu- lièrement efficaces pour des opérations de diagnostic et aptes à permettre l'isolement d'un polypeptide inducti- ble par les HCMV et doué de propriétés biologiques per- mettant des opérations de diagnostic particulièrement raffinées. L'invention a pour but de fournir un procédé de diagnostic mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux résultant d'une sélection parmi l'ensemble de ceux qui ont été décrits dans l'état de la technique. L'utilisa- tion de ces anticorps sélectionnés dans des tests de diagnostic in vitro est à la fois aisée et sure. Ils reconnaissent une protéine induite par les HCMV dans des cellules infectées encore intactes dans des essais d'im- munofluorescence. Ces anticorps sont susceptibles de fournir des réponses positives pendant la quasi-totalité du cycle infectieux. Le diagnostic peut être affiné et confirmé dans des essais de dosage de l'activité enzy- matique. Les cellules infectées produisent des poly- peptides, protéines ou glycoprotéinés qui sont induites par les HCMV. Ces polypeptides sont par ailleurs por- teurs d'un épitope ou déterminant antigénique séquentiel continu. Par l'expression "porteur d'un épitope ou dé- terminant antigénique", il faut entendre un déterminant dont la reconnaissance par les anticorps n'est pas liée à la conformation particulière de ce site sur les poly- peptides, protéines ou glycoprotéines naturels du virus ou induits par celui-ci dans les cellules qu'il infecte. - L'invention. résulte de la découverte qu'ont faite les inventeurs que l'hybridome secréteur d'anti- corps monoclonaux antérieurement décrit répondait à l'ensemble de ces conditions. Plus particulièrement, l'invention concerne la mise en oeuvre des anticorps monoclonaux produits par les hybridomes secréteurs concernés pour la détection in vitro d'un déterminant antigénique séquentiel porté par une protéine dont le poids moléculaire avoisine 68.000, isolable sans dégra- dation d'extraits de cellules infectées par une souche CMV, cette protéine possédant en outre des propriétés de protéine-kinase. En d'autres termes, l'anticorps monoclonal anti- cytomégalovirus humain mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention pour le diagnostic in vitro des infec- tions induites par les cytomégalovirus humains et pour la détection d'une protéine-kinase inductible par les cytomégalovirus humains dans des cellules humaines, et notamment dans des lignées cellulaires humaines, peut être défini par la combinaison de ses capacités: - à donner lieu à des réactions détectables par immuno- fluorescence, sur des cellules de cultures d'origine humaine, préalablement infectées avec HCMV et fixées à l'acétone; - à réagir avec essentiellement un seul polypeptide vi- ral induit par les HCMV dans des cellules d'origine hu- maine préalablement infectéees par eux, ce polypeptide présentant un poids moléculaire de l'ordre de 68.000, porteur d'un épitope séquentiel continu, ce polypeptide apparaissant dans les noyaux et diffusant ensuite au moins en partie dans le cytoplasme desdites cellules infectées, à partir duquel il peut être isolé, - de préférence, à se fixer sur la protéine A. L'invention concerne encore plus particulière- ment, dans le cadre des susdites applications, les an- ticorps monoclonaux qui reconnaissent un polypeptide répondant aux caractéristiques suivantes: - il apparaît de manière précoce dans la cellule (il est décelable 3 à 5 heures après l'adsorption du virus sur la cellule; - il est spécifique du CMV humain; - il s'accumule dans les cellules infectées par le CMV; il persiste au moins 4 jours dans les cellules à partir du moment de son apparition (et ce en particulier dans des fibroblastes humains du poumon type MRC5); - il possède l'ensemble des propriétés de polypeptides préférés, dont les caractéristiques sont indiquées plus loin. Les anticorps monoclonaux préférés sont ceux qui ne réagissent pas avec des récepteurs non spécifiques d'IgG, et plus particulièrement encore ceux qui se ca- ractérisent-par leur capacité à détecter le susdit poly- peptide dans des cellules infectées par tout HCMV, quelle qu'en soit l'origine, par exemple des souches connues sous les désignations Ad-169, Towne et Davis. Un anticorps monoclonal préféré est celui qui est produit par l'hybridome déposé à la Collection Nationale des Cultures de MicroOrganismes (C.N.C.M.) sous le n 1-289 le 27 mars 1984. Les susdits anticorps monoclonaux sont obtenus par un procédé mettant en jeu des hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux neutralisant les virus HCMV, préalablement formés entre des cellules de myélomes et des cellules spléniques d'un animal préalablement im- munisé contre un HCMV, tels que la souche HCMV Ad-169, ce procédé étant plus particulièrement caractérisé en ce que: - l'on fait réagir lesdits anticorps neutralisants avec des cellules humaines en cultures préalablement infec- tées avec un HCMV et préalablement fixées avec de l'acétone, puis séchées, de préférence à l'air; - l'on effectue une première sélection de ceux des clo- nes qui donnent lieu à une réaction de fixation, détec- table par immunofluorescence sur lesdites cellules hu- maines après fixation de ces dernières à l'acétone et - le cas échéant, on effectue une seconde sélection de ceux des anticorps monoclonaux retenus à l'issue de la première sélection, qui réagissent sélectivement avec une protéine virale apparemment induite dans les noyaux desdites cellules infectées et qui diffusent ensuite dans le cytoplasme cellulaire à partir duquel elle peut, le cas échéant, être séparée, cette protéine présentant un poids moléculaire de l'ordre de 68.000, cette pro- téine possédant en outre une activité de protéine-kinase et - l'on récupère l'anticorps sélectionné à partir des produits de réaction obtenus. La récupération de l'anticorps monoclonal peut être réalisée de toute façon en soi connue, par exemple par complexation préalable du produit de réaction formé avec une protéine A, notamment de Staphylococcus aureus, par dissociation du complexe formé dans un tampon ioni- que adéquat. L'isolement au moins partiel du polypeptide de poids moléculaire 68.000 ayant une activité de protéine- kinase peut impliquer une séparation préalable des protéines ou polypeptides ayant des poids moléculaires différents; également contenus dans les extraits cytoplasmiques susceptibles d'être obtenus à partir des 'cellules infectées. En ce qui concerne plus particulièrement les cellules humaines utilisables pour la production du susdit polypeptide, reconnu par les anticorps monoclo- naux produits par les hybridomes dont question plus haut, on peut avoir recours à tout type de cellule susceptible de supporter la réplication du HCMV. Des cellules dont l'utilisation est avantageuse sont constituées par des fibroblastes humains de poumon du type MRC-5. L'invention concerne également les polypeptides inductibles par les HCMV dans des cellules infectées; ayant un poids moléculaire pouvant atteindre une valeur de l'ordre de 68.000, une activité de protéine-kinase et portant un épitope séquentiel, ces polypopeptides pou- vant être obtenus à partir d'une culture de cellules hu- maines, notamment de fibroblastes humains de poumon, préalablement infectés avec une culture de HCMV, notam- ment de la souche Ad-169. Ce polypeptide peut être isolé du cytoplasme des cellules infectées. Mais l'invention concerne aussi tout polypeptide de poids moléculaire plus faible, contenant également l'épitope séquentiel reconnu par les susdits anticorps monoclonaux. Il appa- raîtra clairement au spécialiste qu'à partir de l'ins- tant o l'on dispose de l'anticorps monoclonal selon l'invention, il devient possible d'envisager l'isolement à partir du susdit polypeptide ayant le poids molécu- laire susdit d'environ 68.000, de séquences peptidiques plus petites contenant le même déterminant antigénique, en ayant recours à des techniques en soi connues de dé- coupage du peptide initial intact par des enzymes sus- ceptibles de le couper en des sites spécifiques. A titre d'exemple de telles protéines, on peut mentionner i'en- zyme de Staphylococcus Aureus V8,. l'alpha-chymotrypsine, la "protéase de glande sous-maxillaire de souris" (mouse submaxillary gland protease) commercialisée par la so- ciété BOEHRINGER, la collagénase de Vibrio alqinoluticus chemovar iophaqus qui reconnaît spécifiquement les di- peptides Gly-Pro et Gly-Ala. I1 devient alors possible, à partir des peptides fragmentés de façon contrôlée à l'aide de telles enzymes de détecter ceux qui contiennent le site antigénique par réaction avec l'anticorps monoclonal et qui, le cas échéant, conservent également les susdites activités de protéine-kinase. Des caractéristiques supplémentaires des poly- peptides préférés selon l'invention sont les suivantes: - ils possèdent une activité protéine-kinase de type caséine-kinase II; en particulier ils sont aptes à transférer du phosphore à partir de 1'ATP à la caséine, et également à d'autres substrats, tels que la phosvi- tine, la glycogène-synthétase, des histones et des alpha-phosphorylases. l'activité de protéine-kinase est inhibée par la quercitine; - ce polypeptide est capable de- s'autophosphoryler in vitro; - il est thermosensible (perte d'activité à -700C et à C). L'invention concerne encore plus particulière- ment un procédé de diagnostic in vitro mettant en oeuvre les susdits anticorps monoclonaux, ce procédé comportant la mise en contact desdits anticorps monoclonaux avec les cellules dont est recherché le caractère infecté ou non et la détection, de préférence par immunofluores- cence sur les cellules traitées, sans destruction de celles-ci, du susdit polypeptide. Des conditions préfé- rées dans lesquelles le test peut être mis en oeuvre se- ront indiquées plus loin. La mise en oeuvre de ces anticorps monoclonaux particuliers dans des essais de diagnostic est particu- lièrement avantageuse en ce qu'elle peut être réalisée très rapidement, dès après l'infection. Il a en effet été vu que la protéine induite apparaissait de 3 à 5 heures après l'infection et persistait pendant toute la durée du cycle infectieux. Cette propriété distingue tout particulièrement cet anticorps monoclonal des autres anticorps monoclonaux. Il est particulièrement utile dans des essais de diagnostic, tant il est vrai que dans la pratique l'instant du déclenchement de l'infection est en général ignoré, surtout lorsque les essais sont réalisés sur des cellules obtenues à partir de biopsies tissulaires ou autres prélèvements cellulaires sur des patients soupçonnés d'être porteurs d'une infection aux cytomégalovirus. Les anticorps monoclonaux mis en oeuvre dans le cadre de l'invention peuvent également être à la base de ce qui peut être considéré comme un procédé de purifica- tion d'un polypeptide protéine ou glycoprotéine, ou en- core d'un fragment de ces derniers, contenant un déter- minant antigénique séquentiel du HCMV et/ou possédant des activités de protéine-kinase semblable, à partir d'extraits ou de lysats de cultures cellulaires humai- nes, préalablement infectées par HCMV. Dans une forme préférée de ce procédé, on aura recours à un anticorps monoclonal du type de ceux qui ont été définis plus haut, fixé au préalable, par exemple au bromure de cyanogène sur un support solide, tel que le réseau d'agarose à réticulation tri-dimensionnelle, commercia- lisé sous la marque 5EPHAROSE par la société suédoise PHARMACIA AG. Le caractère séquentiel continu du déterminant antigénique des polypeptides selon l'invention se déduit de ce que le polypeptide le portant peut toujours être isolé à partir de l'extrait cytoplasmique de cellules infectées, même lorsque l'opération de séparation est effectuée en présence de détergents puissants comme le dodécylsulfate de sodium (SDS), le déoxycholate de so- dium, ou du détergent commercialisé sous la marque TRI- TON X-O100, avec ou sans bêta-mercapto-éthanol. Les agents susmentionnés sont en effet connus pour leur ca- pacité à "défaire" ou à "déplier" une protéine. Tout déterminant antigénique "conformationnel" cesserait alors d'être reconnu par l'anticorps monoclonal, et ce surtout dans l'hypothèse o le "site conformationnel" mettait en jeu des séquences d'acides aminés dont le voisinage dans la protéine naturelle ne résultait que du rapporchement de séquences non directement liées entre elles, du fait de la conformation initiale de ladite protéine. Il résulte de ce qui précède que cette Il protéine ou polypeptide porteur dudit site antigénique est vraisemblablement également immunogène et par conséquent apte à induire la production in vivo d'anticorps neutralisant le virus lui-même. Si les anticorps selon l'invention permettent de détecter spécifiquement la protéine de poids moléculaire d'environ 68.000 au sein d'un extrait cellulaire, le cas échéant protégé contre les dégradations enzymatiques, à l'exclusion de tout autre polypeptide ou protéine ayant des poids moléculaires distincts, il en résulte que ce polypeptide ou protéine pourra lui-même également être utilisé pour réaliser la sélection et l'isolement d'anticorps monoclonaux susceptibles d'être produits par des hybridomes obtenus par des fusions cellulaires mettant en jeu initialement d'autres types de myélomes, d'une part, et d'autres HCMV pour l'immunisation des cellules spléniques destinées à être fusionnées avec lesdites cellules de myélome, d'autre part. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples de production d'hybridomes et d'isole- ment de ceux d'entre eux qui sont aptes à produire des anticorps conformes à l'invention. Les techniques qui ont été mises en jeu dans la réalisation de ces exemples ont été réalisées selon les modes opératoires suivants: 1) Préparation des hybridomes Des souris sont immunisées par injection intrapéritonéale d'une suspension de cellules MRC-5 humaines infectées et décongelées. Des cellules avaient été congelées 5 jours après leur infection avec une souche de HCMV Ad-169. Une injection de rappel est administrée à ces souris 3 ou 4 semaines plus tard. Les souris sont sacrifiées et les rates récupérées en vue de leur fusion cellulaire 3 jours après l'injection de rappel. Les cellules spléniques sont fusionnées avec des cellules de myélome SP2/OAg 14 (souche de SCHULMANN et Coll., "Nature", 1978, 276, 269/270) et- les hybridomes formés sont sélectionnés dans un milieu.RPMI contenant de l'hypoxanthine (5 mM) et de l'azasérine (1 mM) selon la technique décrite par R. CRAINIC et Coll., "Develop. Biol. Standard.", 1982, 50, 229-234, en rapport avec la production d'hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux contre le virus de la poliomyélite. 2) Sélection des hybridomes positifs Les surnageants des cultures d'hybridomes ainsi retenus ont été sélectionnés pour leur; capacité à se- créter des anticorps spécifiques contre HCMV par immunofluorescence indirecte, à l'aide de préparations d'antigènes tardifs. Une série d'hybridomes positifs est clonée par la méthode des dilutions limites et les surnageants de ces clones sont ensuite testés de la même façon par fluorescence indirecte, selon la méthode décrite dans l'article susmentionné de C. AMADEI et Coll. On sélectionne alors ceux des hybridomes qui secrètent des anticorps monoclonaux ayant des caractéristiques semblables à celles des anticorps monoclonaux F6b de C. AMADEI et Coll. c'est l'une de ces - souches qui a été déposée à la C.N.C.M. sous le n I-289. 3) Marquaqe des anticorps monoclonaux Les clones (2 x 106 cellules) sont marqués soit avec le 35S-méthionine, soit avec la 3H-méthionine, également selon la technique décrite par C. AMADEI et Coll. 4) Détection de la fixation sur la protéine A Elle est là encore réalisée selon la méthode décrite dans l'article d'AMADEI et Col.. Les essais mentionnés sous les paragraphes 3) et 4) sont plus particulièrement destinés à la reconnais- sance des anticorps monoclonaux de produire une-réaction décelable par immunofluorescence avec des cellules hu- maines en cultures préalablement infectées avec HCMV, sont en outre susceptibles d'être précipités par la protéine A. S'agissant de détecter parmi ces anticorps mono- clonaux ceux qui sont en outre capables de ne réagir qu'avec un seul polypeptide de poids moléculaire de l'ordre de 68.000, on aura recours de préférence au mar- quage radioactif ou analogue préalable des cellules hu- maines préalablement infectées et dont seront ultérieu- rement récupérées les extraits cellulaires. Ce sont ces extraits cellulaires que l'on fera réagir ensuite avec les anticorps monoclonaux non marqués à sélectionner. ) Extraction de l'antigène Des cellules infectées ou non infectées sont la- vées deux fois in situ avec une solution saline tampon- née au phosphate (PBS) contenant des ions calcium et ma- gnésium (PBS complet), puis récupérées par raclage dans du PBS complet contenant du fluorure de phényl-méthyl- sulfonyle 10-4 M (PMSF) et du diisopropylfluoro- phosphate 10-4 (DFP), les cellules étant enfin soumises à extraction dans une solution ayant une teneur élevée en sel et à pH élevé contenant 0,5 y du détergent com- mercialisé sous la désignation NP-40, selon la technique de MICHELSON et Coll. (1979) J. Virol. 32, 259-267. Dans certains cas, les noyaux ont été séparés du cytoplasme après gonflage des cellules dans un tampon hypotonique, addition de NP-40 (concentration finale 0,5 %) et sou- mission de la suspension de cellules à l'action d'un piston plongeur pour casser les cellules (selon la tech- nique de MICHELSON et Coll.). La suspension est ensuite centrifugée à 800 g pendant 5 minutes à 4 C. Les noyaux sont alors retenus dans le culot formé et le surnageant constituant la fraction cytoplasmique est alors récupé- ré. Les noyaux ont été soumis au même traitement d'ex- traction que mentionné plus haut. Tous les extraits ont été centrifugés à 15.000 g pendant 15-30 minutes à 4 C et congelés à -70 C, jusqu'au moment de l'utilisation. Pour les essais de mesure de l'activité phosphotransférase, on procède à l'immunoprécipitation immédiate de l'antigène recherché dans les conditions indiquées ci-après. L'antigène peut être conservé à l'état lié à Staphylococcus aureus. 6) Immunoprécipitation La précipitation est réalisée en mettant en oeuvre 5 microlitres de fluide d'ascite par 200 micro- grammes de protéine extraite. L'antigène et les anti- corps monoclonaux (F6b) sont incubés sous agitation pendant 1,5 heure à température ambiante. On ajoute la protéine A sous la forme d'une suspension à 10 t d'une souche de S. aureus sérotype I de Cowan inactivée à la chaleur et fixée par le formaldéhyde (50 microlitres/ 5 microlitres de fluide d'ascite). Les complexes anti- gène-anticorps sont lavés trois fois dans le milieu de NETS (KESSLER S.W. (1975) 3. Immunol. 115, 1617-1624), puis conservés dans ce tampon sous la forme d'une sus- pension à 10 % à 4 C. Le complexe peut aussi être disso- cié dans un tampon d'électrophorèse par chauffage pen- dant 5 minutes à 100 C. L'immunoprécipitat a été analysé sur le gel d'électrophorèse sodium-dodécyl-sulfate- polyacrylamide (SDS-PAGE à 10 %). La résolution des protéines a été réalisée par migration différentielle sous une intensité de 30-35 mA. Le cas échéant, la fluo- rographie a été réalisée selon la méthode de BONNAR et Coll. (1974) Eur. 3. Biochem. 46, 83-88, avec la modifi- cation consistant en l'utilisation d'un seul bain à base de diméthylsulfoxide (DMSO) pendant 15 minutes à 37 C et d'un seul bain de DMSO + 20 % de 2,5-diphényloxazole (PPO) pendant 30 minutes à 37 C. 7) Marquaqe radioactif des cellules Des cellules infectées sont sélectionnées 1 heure postérieurement à l'infection et privées -de mé- thionine pendant 15 minutes. L'absorption avec le virus est ensuite conduite dans un milieu contenant 10 micro- curies/millilitre de 35Sméthionine. Pour les autres * échantillons de cellules infectées, le virus a été ab- sorbé pendant 1 heure et le milieu pour la croissance a été ajouté. Toutes les cellules ont été privées de mé- thionine pendant 15 minutes avant d'être marquées pen- dant 2 heures avleur prélèvement à des instants respectifs de 3, 9, 24, 48, 72 et 96 heures après l'in- fection. Les cellules non infectées ont été marquées de la même façon. Le milieu de marquage consistait en un milieu essentiel minimum de Eagle dépourvu de méthionine contenant 10 microeuries/millitre de 35Sméthionine (AMERSHAM, activité spécifique de 1300 curies/mMole). Le marquage des phosphoprotéines a été réalisé pendant 3 heures dans un milieu modifié de DULBECC0 dépourvu de phosphate contenant 100 microcuries/millilitre de 32P-orthophosphate. 8) Mise en évidence de l'activité de protéine-kinase Sauf lorsque spécifié autrement, l'essai pour l'activité de protéine-kinase est réalisé en utilisant 50 microlitres d'enzyme liée à des bactéries dans un milieu (volume final de 100 microlitres) contenant du tampon au phosphate de magnésium 22 mM à pH 6,8 KPi), du sulfate de magnésium MgSO4 5 mM, de 1'EDTA 0,15 mM, de l'ATP 0,1 mM, 3 microcuries de 32P-ATP et 1 milligramme par millilitre de caséine. La caséine n'est pas présente dans les essais d'analyse des immunoprécipitats dans le gel SDS-PAGE. Les immunoprécipitats sont alors lavés comme indiqué plus haut, remis en suspension dans le mé- lange de réaction, et incubés pendant 30 minutes à 300C. La réaction est stoppée avec 10 microlitres de solution d'EDTA 0,3 M. Les immunoprécipitats sont séparés par centrifugation à 5000 g pendant 4 minutes à 4 C. Les surnageants sont précipités avec une solution d'acide trichloracétique à 5 % (TCA). Les précipitats sont dissous dans une solution de soude i M, puis reprécipi- tés par le TCA, lavés par filtration sur des filtres - 2563630 commercialisés sous la désignation WHATMAN G.F./C. Après lavage supplémentaire dans l'éthanol, les filtres sont séchés et les impulsions comptées dans un liquide scin- tillateur PACKARD. Les immunoprécipitats destinés à l'analyse sur gel sont lavés trois fois dans le tampon KPi, remis en suspension dans le tampon de l'électro- phorèse et analysés dans le gel SDS/PAGE à 10 % dans les conditions sus-indiquées. 9) Estimation du coefficient de sédimentation L'antigène marqué à la 355-méthionine a été pré- paré et extrait comme indiqué plus haut à partir de cellules infectées pendant 120 heures. L'antigène est ensuite déposé à la partie supérieure d'un gradient de sucrose 5-25 % formé dans du PBS et soumis à centri- fugation dans un rotor BECKMAN SW-41 à 35.000 révolu- tions par minute pendant 17,25 heures à 4 C. Des frac- tions ont été collectées. Chaque fraction a été immunoprécipitée avec l'anticorps monoclonal F6b, puis analysée sur-SDS-PAGE. 10) Electrophorèse des aminoacides marqués au _2p Après la réaction de protéine-kinase mettant en oeuvre des immunoprécipitats obtenus en l'absence de ca- séine, le produit marqué au 32p est détaché avec une solution de NH4HCO3 à 0,1 % contenant 0,1.% de SDS. L'échantillon est séché sous vide, remis en suspension dans HC1 6M et hydrolysé pendant la nuit à 110O C. Après évaporation de HC1, les préparations sont remises en suspension dans le tampon d'électrophorèse. Les phos- phoaminoacides sont séparés à pH 3,5 (dans un milieu formé à partir de 50 millilitres d'acide acétique et de millilitres de pyridine par litre) pendant 45 minutes sous 1000 V sur des plaques minces revêtues de cellulose (commercialisées par la société MACHEREY-NACEL & Co). Des étalons ont été colorés avec-le réactif-cadmium- ninhydrine (décrits par DRICKAMER et Coll., 3. Biol. Chem. (1982) 257, 15156-15161) et les plaques ont été exposées à une pellicule Kodak X-Omat pendant une se- maine. Le polypeptide immunoprécipité par l'anticorps monoclonal F6b présente une masse moléculaire d'environ 68.000 (p68). Il est immunoprécipitable à partir des noyaux des cellules infectées dès la troisième heure après l'infection. Il peut être immunoprécipité éga- lement à partir des extraits cytoplasmiques 24 heures après l'infection. La teneur en ce polypeptide vis-à-vis de l'ensemble des protéines extraites,96 heures après l'infection, peut atteindre 0,5 % (estimation sur la base du pourcentage de radioactivité contenu dans l'immunoprécipitat récupéré). Ce polypeptide présente un coefficient de sédimentation dans l'eau à 200 de 6,9 (par comparaison à des marqueurs consistant en catalase et en sérum albumine bovine). Le poids moléculaire de p68 a été apprécié par rapport aux distances demigration dans un même système électrophorétique, des quatre substances de poids molé- culaires connus qui suivent: - phospharylase A (94.000); - sérumalbumine bovine (68.000); - fumarase (49.000); - aldolase (40.000). Ce polypeptide témoigne des capacités de phos- phorylation in vitro qui ont été indiquées plus haut. La réaction de protéine-kinase avec la caséine utilisée en tant qu'accepteur se fait de façon optimale à pH 6-6,5. Elle décline rapidement dans des milieux à pH plus acides ou plus alcalins. La réaction est dépendante de la présence d'ions Mg2+. Ces réactions ne sont pas cAMP-dépendantes. La réaction de transfert de phosphate ne s'opère pas en présence de manganèse à pH élevé. Ce polypeptide (ou cette enzyme) est stable. Il peut être conservé à l'état conjugué avec S. aureus, sans perte d'activité après conservation pendant 6 semaines à 4 C. La complexation avec les anticorps monoclonaux F6b n'entraîne pas la perte d'activité. Cette enzyme est capable de s'autophosphoryler, celle-ci intervenant au niveau de résidus aminoacyles constitués par la thréonine et la sérine. Des polypeptides ayant des poids moléculaires de l'ordre de 68.000 et présentant les mêmes caractéris- tiques que celles qui ont été indiquées plus haut sont induits dans des cellules humaines infectées, notamment des fibroblastes de poumon, par d'autres souches de cytomégalovirus, particulièrement les souches humaines TOWNE et DAVIS. Par contre des souches de cytomégalo- virus spécifiques du singe (souche COLBURN et souche SGC) n'induisent pas la production d'une protéine de poids moléculaire 68.000 reconnaissable par les anti- corps monoclonaux secrétés par la souche F6b. L'invention concerne donc plus particulièrement la sélection des souches productrices d'anticorps mono- clonaux ayant les caractéristiques des anticorps mono- clonaux F6b. La mise en oeuvre de cet anticorps monoclonal permet en effet des diagnostics sûrs in vitro d'une infection virale aux HCMV. Il a déjà été indiqué que cette détection pouvait se faire pratiquement à tout moment du.cycle infectieux, notamment par des réactions d'immunofluorescence. Cet anticorps monoclonal présente encore le grand avantage que le diagnostic réalisé par immunofluorescence peut être confirmé, par la capacité du même anticorps à former des complexes avec une protéine induite par les cytomégalovirus humains, pro- téine dont la présence peut ensuite être décelée par des activités de protéine-kinase. Celles-ci peuvent être détectées avec un niveau de précision élevé. Enfin l'utilisation d'anticorps monoclonaux du type sus-ind- qué peut être mis en oeuvre dans des essais de dosage quantitatif du niveau d'infection des cellules humaines atteintes. L'invention concerne également le polypeptide lui-même, en tant que réactif biologique de grande valeur, par exemple dans des essais d'identification de virus, dès lors que leur classification au sein des cytomégalovirus n'apparaît pas certaine a priori. A l'inverse, il peut être uitilisé pour la sélection des anticorps monoclonaux les plus efficaces pour la cons- titution de "kits" de diagnostic. L'invention concerne encore des-nécessaires ou "kits" pour réaliser des diagnostics-in vitro comme décrits plus haut. Un tel nécessaire pourra notamment comprendre: - au moins une micro-plaque, - une préparation contenant des anticorps monoclonaux appropriés au diagnostic, - des extraits cellulaires témoins (obtenus à partir de cellules humaines, notamment du type MRC-5 humaines, ces cellules ayant ou non été préalablement infectées avec un HCMV), - des anticorps marqués (marqueur radioactif, enzymatique, fluorescent ou autre) dirigéscontre les immunoglobulines du sang humain, - les tampons appropriés à la réalisation des différen- tes opérations et à l'examen final des produits ayant réagi, au microscope à fluorescence. Un tel nécessaire sera par exemple mis en oeuvre de la façon suivante: - un extrait cellulaire provenant d'une biopsie cellu- laire à examiner est déposé dans une ou plusieurs cu- pules de la plaque de titration et adsorbé à leur sur- face; - on introduit dans les cupules ou puits de la micro- plaque des doses de la préparation d'anticorps monocl- nal - la plaque est mise à incuber à la température appro- priée; - la microplaque est ensuite efficacement lavée; - on introduit ensuite dans les puits de la microplaque des anticorps marqués dirigés contre des immunoglobu- lines sanguines, donc contre les anticorps monoclonaux et on incube à nouveau; - on détecte le marqueur (par exemple par action sur le substrat approprié, lorsque le marqueur est constitué par une enzyme), l'ensemble de ces opérations étant également réalisé à l'égard d'extraits cellulaires témoins, et ce à des fins comparatives. - Avantageusement, on peut également réaliser des essais de détection et de dosage quantitatifs, par exemple par passage d'un extrait cellulaire obtenu dans des conditions par exemple du genre de celles qui ont été envisagées plus haut, sur une colonne de chromato- graphie d'affinité comportant les anticorps monoclonaux fixés sur gel d'agarose, par exemple comme il a été in- diqué plus haut, la dissociation du complexe éventuel- lement formé entre les anticorps monoclonaux utilisés et le polypeptide spécifiquement reconnu par les derniers, et le dosage quantitatif du polypeptide,. en mettant en oeuvre ses propriétés de protéine-kinase. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé de détection de la présence d'une infection, notamment de diagnostic in vitro, par les cytomégalovirus humains dans des cellules d'origine humaine, caractérisé par la mise en contact de ces cel- lules à l'état intact ou avec des extraits cellulaires obtenus à partir de ces cellules, avec un anticorps monoclonal défini par la combinaison de propriétés suivantes: - il donne lieu h des réactions détectables par immuno- fluorescence, sur des cellules de cultures d'origine humaine, préalablement infectées avec HCMV et fixées à l'acétone; - il réagit essentiellement avec un seul polypeptide viral induit par les HiVMV dans des cellules d'origine humaine préalablement infectées par eux, ce polypeptide présentant un poids moléculaire de l'ordre de 68.000, porteur d'un épitope séquentiel continu, ce polypeptide apparaissant dans les noyaux et diffusant ensuite au moins en partie dans le cytoplasme desdites cellules infectées, à partir duquel il peut être isolé, - de préférence, il réagit avec la protéine A. 2 - Procédé selon la revendication 1, caracté-- risé en ce que l'on met en oeuvre un anticorps mono- clonal réagissant avec un polypeptide de poids molécu- laire 68.000: - qui possède une activité de;protéine-kinase II; - qui apparalt de manière précoce dans la cellule (il est décelable 3 à 5 heures après l'adsorption du virus sur la cellule); - qui s'accumule dans les cellules infectées par le CMV et qui persiste au moins pendant 4 jours dans les cellules à partir du moment de son apparition. 3 - Procédé de détection dans un extrait de cellules d'un polypeptide induit dans ces cellules par un cytomégalovirus humain, caractérisé en ce qu'on fait réagir un extrait de ces cellules avec un anticorps monoclonal du type défini dans les revendications précédentes eten ce que l'on détecte le complexe formé entre l'anticorps monoclonal et le polypeptide par me- sure de l'activité de protéine-kinase dudit polypeptide. 4 - Polypeptide inductible dans des cellules d'origine humaine par un cytomégalovirus humain et pré- sentant les caractéristiques suivantes: - il possède un poids moléculaire d'environ 68.000; - il possède une activité protéine-kinase de type caséine-kinase II; - il est apte à transférer du phosphore à partir de I'ATP à la caséine, et également à d'autres substrats, tels que la phosvitine, la glycogène-synthétase, des histones et des alphaphosphorylases; - son activité de protéine-kinase est inhibée par la quercitine; - il est capable de s'autophosphoryler in vitro; - il est thermosensible (perte d'activité à -70 C et à 1000C). - Polypeptide selon la revendication 4, ca- ractérisé en ce qu'il est complexé par l'anticorps mo- noclonal déposé à la C.N.C.M. sous le no 1-289. 6 - Polypeptide selon la revendication 5, dont l'activité de protéinekinase est dépendante de la présence d'ions Mg2+, mais qui n'est dépendante ni de la présence d'ions manganèse, ni de la présence de cAMP. 7 - Polypeptide selon l'une quelconque des re- vendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il est conjugué à de la protéine A de Staphylococcus aureus. 8 - Polypeptide selon l'une quelconque des re- vendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il est à l'état de complexe avec un anticorps monoclonal tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 9 - Nécessaire de diagnostic d'une infection cellulaire par des cytomégalovirus humains caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une micro-plaque, - une préparation contenant des anticorps monoclonaux appropriés au diagnostic, - des extraits cellulaires (témoins obtenus à partir de cellules humaines, notamment du type MRC-5 humaines, ces cellules ayant ou non été préalablement infectées avec un HCMV), - des anticorps marqués (marqueur radioactif, enzymati- que, fluorescent ou autre) dirigés contre les immuno- globulines du sang humain, - les tampons appropriés à la réalisation des diffé- rentes opérations et à l'examen final des produits ayant réagi, au microscope à fluorescence.