Brevet FR2561781A1 — publié le 19850927

La présente invention est relative à une nouvelle phase pour la chromatographie d'affinité comprenant un pyridinium, ainsi qu'à des pyridiniums substitués en positions 3 et 4. La chromatographie est une méthode de séparation dite "douce" qui est notamment utilisée pour la purification d'enzymes telles que des déshydrogénases NAD(P)+ dépendantes. Pour cela, il est nécessaire de disposer de phases insolubles qui comportent un support insoluble tel que de l'agarose ou du sépharose, un bras porteur qui est fixé au support et constitué d'une channe aliphatique ayant de n atomes de carbone, le plus souvant de 6 à 8, et d'un ligand fixé à l'extrémité du bras support. Ce ligand doit présenter une affinité spécifique et réversible vis-à-vis du produit à purifier, et posséder des groupes chimiques modifiables lui permettant de se fixer sur le support sans perdre son affinité pour la substance à adsorber. Une fois adsorbée l'enzyme du mélange à analyser et éliminés par lavage les autres constituants, le complexe phase-ensyme est dissocié par percolation au moyen d'un éluant qui renferme un ligand dissous : celui-ci se fixe à l'enzyme à la place du ligand immobilisé sur la colonne. L'enzyme libérée apparaît dans l'élut sous la forme d'un complexe binaire enzyme-ligand d'élution qu'il faut dissocier par une méthode physique (dialyse) ou par une nouvelle chromatographie. D'après ce qui précède, il apparaît que pour séparer une enzyme d'un mélange, il faut préparer une phase particulière à l'aide d'un ligand spécifique de cette enzyme seule : à chaque enzyme il correspond donc une phase. Dans le cas des déshydrogénases, des ligands communs à cette classe d'enzyme utilisés pour préparer des phases pour la chromatographie d'affinité sont leurs co-enzymes à savoir le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP+). Des molécules de NAD+ ou de NADP+ sont ainsi greffées sur un support d'agarose par l'intermédiaire d'un bras porteur comportant n atomes de carbone, le plus généralement de 6 à 8. Les phases ainsi obtenues retiennent toutes les déshydrogénases- dont la séparation requiert donc une- élution à l'aide d'un ligand hautement spécifique. Les deux principaux inconvénients de ces phases connues sont leur prix et leur manque de stabilité. En effet ces co-enzymes sont chers, difficiles à immobiliser et et peu compatibles avec des solvants organiques. De plus, ils sont hydrolysés aux pH basiques et sont sensibles aux réducteurs Aussi un des buts de la présente invention est-il une phase pour chromatographie d'affinité pour séparer des déshydrogénases qui est peu couteuse, stable tout en conservant les qualités de phases connues. Un autre but de l'invention est une telle phase qui peut aisément être rendue spécifique de la déshydrogénase que l'on souhaite isoler. Ces buts ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite sont atteints par une phase qui, selon la présente invention, comporte un support insoluble, un bras porteur à n atomes de carbone fixé à une de ses extrémités sur ce support insoluble et dont l'autre extrémité porte un pyridinium. Avantageusement, le pyridinium est substitué. Selon un mode-de réalisation préféré de l'invention, le pyridinium substitué en position 3 par un groupement Z portant une fonction telle que amide, cétone, acide , oxime, nitrile, ester, thionine, amine, etc..., de formule générale. De préférence, le-pyridinium substitué est un nicotinamide qui peut être substitué en position 4 par une cétone, un aldéhyde ou une oxime. Avantageusement le support insoluble est un polymère insoluble telle que de l'agarose ou du seharose. De préférence, le bras porteur est une chaîne aliphatique ayant de n atomes de carbone, et en particulier de 6 à 8 atomes de carbone. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme du métier de mieux comprendre la présente invention grâce à quelques exemples de réalisation. Les nouvelles phases selon la présente invention comprennent un support insoluble qui est généralement de l'agarose ou du sépharose, sur lequel est fixé par une de ses extrémités un bras porteur, chaîne aliphatique de 6 à 8 atomes de carbone. A l'autre extrémité de ce bras est lié par covalence un pyridinium tel qu'un nicotinamide substitué. La structure générale d'une telle phase est de la forme bras porteur ÂÉ Z support insoluble Les pyridiniums étant des molécules organiques stables, les phases obtenues sont stables, utilisables dans l'eau entre pH 4 et 13, dans l'alcool et le diméthyl-sulfoxide. En fait on peut utiliser tout solvant organique qui n'altère pas les propriétés du support insoluble. Pour qu'une telle phase puisse adsorber des déshydrogénases, il suffit de l'activer, c'est-à-dire la rendre spécifique de la déshydrogénase que l'on souhaite isoler : pour cela il suffit de greffer sur le- pyridinium en position 4 une cétone, un aldéhyde ou une oxime. Lorsque le pyridinium ou ligand est un nicotinamide substitué, celui-ci est par suite de formule générale dans laquelle X représente une cétone, un aldéhyde ou une oxime. EXEMPLE DE PREPARATION D'UN LIGAND Un mélange de 14 g d'acide bromo-acétique et de 12 g de nicotinamide est chauffé à sec dans un ballon pendant 4 heures à une température de 80-90 C-. Après refroidissement, le mélange réactionnel est dissous dans du méthanol. La solution ainsi obtenue, de couleur jaune foncé, est versée dans quatre fois son volume d'éther. Un précipitéblanc de Nl-carboxymEthyl-nicotinamide appairait. Après refroidissement à -200C pendant 15 minutes, ce précipité est essoré, lavé à l'éther et séché sous vide. Le rendement de cette réaction est de 85 %-. EXEMPLE DE COUPLAGE DU LIGAND AU BRAS PORTEUR Comme support- insoluble, on utilise 15 ml d-' > -aminohexyl agarose qui sont lavés avec 2 ou 3 fois leur volume avec une solution de chlorure de sodium (NaCl) 0,5 M, puis rincés à l'eau désionisée. Après décantation et élimination de l'eau surnageante, le gel obtenu est versé dans une solution de 1 millimole de N-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2dihydroquinoline dans 25 ml d'éthanol. Le mélange obtenu est additionné d'une solution concentrée du ligand obtenu précédemment, N1-carboxyméthylnicotinamide. Cette concentration est avantageusement de 1 millimole dans I'éthanol à 50 % aqueux (10 ml). Ce mélange est agité à la température ambiante pendant 8-10 heures. On obtient ainsi un gel qui est ensuite filtré puis lavé abondamment par une solution d'méthanol à 50 % aqueux (200 ml) puis par une solution molaire de chlorure de sodium (200 ml) et enfin par de l'eau désionisée. La phase de nicotinamide N1 N- (6 aminohexyl) acétamide agarose ainsi préparée est conservée en suspension dans de l'eau, sans précaution particulière pendant plusieurs mois. On peut estimer la teneur de la phase en nicotina mide immobilisé en faisant réagir le carboxyméthyl-nicotinamide greffé avec du cyanure de potassium (KCN). Ainsi, 100J2l de la phase mise en suspension dans l'eau sont additionnés à 1 ml d'une solution molaire de cyanure de potassium. La densité optique de cette suspension, lue à 325 nm, est comparée aux densités optiques obtenues dans les mêmes conditions en utilisant une gamme de concentration du N1-carboxyméthyl-nicotinamide allant de 2 à I0rmoles/ml. Alors que 1' b-aminohexyl agarose utilisé contient de 4 à 6 ymoles/ml de fonctions amines primaires, le gel obtenu contient également de 4 à 6 smoles/ml de nicotinamide fixe. Lorsque l'on veut utiliser la phase obtenue préeédem- ment pour isoler une déshydrogénase d'un mélange, il est nécessaire d'activer cette phase au moyen d'un composant X, substrat ou inhibiteur spécifique de la déshydrogénase considérée. Comme composant X on peut citer une cétone, un aldéhyde ou une oxime. EXEMPLE D'ACTIVATION On active la phase obtenue précédemment par deux lavages successifs : le premier à l'aide d'une solution 0,1 M d'un sulfite tel que le sulfite de sodium ; le second à l'aide d'une solution concentrée du composant X à un pH compris entre 9 et 11. La phase ainsi activee peut ensuite être ramenée, par lavage avec un tampon approprié, au pH compatible avec la stabilité de la déshydrogénase à isoler et utilisée selon les techniques habituelles de chromatographie d'affinité. Le mélange d'enzymes à séparer est déposé au sommet de la colonne de chromatographie comportant une phase activée dans le tampon ayant servi equilibrer la colonne. Celle-ci est ensuite percolée par ce tampon jusqu'à l'élimination compléte des impuretés. L'enzyme dont le substrat ou l'inhibiteur a servi à activer la phase, reste adsorbée à la phase. Elle est éluée par un gradient de concentration de sel tel que du chlorure de sodium ou par un tampon au pH convenable. L'enzyme est donc obtenue pure en fin de chromatographie. A partir de la phase proposée, il est donc possible de préparer des phases activées spécifiques par exemple des déshydrogénases 1, 2, et 3 présentes dans un mélange telle que si ces trois enzymes reconnaissent respectivement les composants X1, X2 et X3 - la phase activée par X1 retiendra l'enzyme I et non les enzymes 2 et 3 qui seront éliminées avec les autres impuretés - la phase activée par X2 retiendra l'enzyme 2 et non les enzymes 1 et 3 qui seront éliminées avec les autres impuretés - la phase activée par X3 retiendra l'enzyme 3 et non les enzymes 1 et 2 qui seront éliminées avec les autres impuretés. Une fois activée, la phase ne peut pas être régénérée, mais elle peut être conservée sous sa forme activée pendant un mois environ, si elle est mise en suspension a l'abri de l'air dans une solution 0,1 M de sulfite tel que du sulfite de sodium. Avant utilisation, ce sulfite pourra être élimine par lavage de la phase. On donnera ci-après un exemple d'utilisation d'une phase selon la présente invention pour séparer l'alcool déshydrogénase de foie de cheval (LADH, EC 1.1.1.1.) et la lactate déshydrogénase de coeur de porc (LDH, EC 1.1.1.27). EXEMPLE Le substrat de la lactate déshydrogénase, mais-non de l'alcool déshydrogénase, étant le pyruvate de sodium, la phase obtenue comme précédemment est activée avec ce composant. Une colonne contenant 25 ml de nicotinamide N1 N-(6-aminohexyl) acétamide~7 agarose équilibrée a pH 7,6 dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M à 5"C est percolée par environ 75 ml d'une solution 0,1 M de sulfite de sodium, puis par une solution U,1 M de pyruvate de sodium a pH 10,5. La phase est ensuite ramenée a pH neutre par lavage par un tampon phosphate de sodium 0,05 M. Au sommet de la colonne sont ensuite déposés 100 pl du mélange enzymatique contenant 0,3 mg d'alcool déshydrogénase et 0,1 mg de lactate déshydrogénase. On -constate que l'alcool déshydrogénase, non reteiueapparalt dans l'effluent, tandis que la lactate déshydrogénase est retenue et n'est éluée que par un gradient 0-0,5 M de NaCl. Le rendement est d'environ 90 % pour la lactate déshydrogénase. On a pu noter que les phases selon la présente invention peuvent être conservées pendant un temps plus long que les phases connues comprenant du NARD+ ou du NAD(P) et sont d'un emploi simple. La présente invention concerne également des pyridiniums substitués en positions 3 et 4 qui peuvent être activés sous forme de ligands spécifiques pour les déshy drogenases à purifier. De tels pyridiniums permettent de réaliser les phases pour chromatographie telles que défi; nies ci-dessus. REVENDICATIONS 1.- Phase pour chromatographie d'affinité comprenant un support insoluble, un bras porteur à n atomes de carbone fixé à une de ses extrémités sur ce support insoluble, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un pyridinium fixé à l'autre extrémité dudit bras porteur. 2.- Phase selon la revendication 1, caractérisée.en ce que ledit pyridinium est substitué en position 3 par un groupement Z qui est choisi dans le groupe c3slstitué par les amides, cétones, -esters, acides, oximes, nitriles, thionines, amides. 3.- Phase selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit pyridinium est un nicotinamide. 4.- Phase selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit pyridinium substitué est un nicotinamide substitué de formule générale dans laquelle X est une cétone, un aldéhyde ou une oxime et Z un amide. 5.- Phase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée'en ce que ledit support insoluble est de l'agarose ou du sépharose. 6.- Phase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit bras porteur est une chaîne aliphatique ayant de 6 à 8 atomes de carbone. 7.- Pyridinium substitué en positions 3 et 4 activable sous forme d'un ligand spécifique pour la liaison d'une déshydrogénase à purifier selon l'une quelconque des -revendications 1 à 6.