Brevet FR2570192A1 — publié le 19860314

i 2570192 La présente invention concerne un appareil et un procédé pour la détection de particules dans un échantil- lon, et elle concerne plus particulièrement un appareil et un procédé de cytométrie à écoulement destinés à la dé- tection et à la classification de particules biologiques intéressantes dans une population hétérogène de particules biologiques. Les appareils de cytométrie à écoulement repo- sent sur l'écoulement de cellules ou d'autres particules dans un courant de liquide pour déterminer une ou plusieurs caractéristiques des cellules étudiées. En outre, un appa- reil de cytométrie à écoulement est utile pour identifier la présence de certaines cellules ou particules intéressan- tes, pour déterminer le nombre de ces cellules ou particu- les et, dans certains cas, pour procurer une possibilité de tri, de façon à permettre de collecter les cellules ou particules intéressantes. Dans un appareil de cytométrie à écoulement de type caractéristique, on fait passer à tra- vers l'appareil un échantillon de fluide contenant des cellules, dans un courant de liquide en mouvement rapide, de façon que toutes les cellules traversent successivement une région de détection, pratiquement une cellule à la fois. On peut déterminer le volume de la cellule par des varia- tions d'impédance électrique au moment o chaque cellule traverse la région de détection. De façon similaire, si on dirige vers la région de détection un faisceau de lumière incident, les cellules qui passent diffusent cette lumière au moment de leur passage à travers la région de détection. Cette lumière diffusée est fonction de la forme et de la taille de la cellule, de son indice de réfraction, de son opacité, de sa rugosité, etc. On peut en outre détecter, pour l'identification de cellules ayant des propriétés de fluorescence, la fluorescence émise par des cellules mar- quées, ou par des cellules auto-fluorescentes, qui ont été excitées du fait de leur passage à travers l'énergie d'exci- 2 2570192 tation du faisceau lumineux incident. Après ana- lyse des cellules par l'appareil de cytométrie à écoulement, on peut trier les cellules qui ont été identifiées comme ayant les propriétés désirées, si une telle possibilité a été incorporée au moment de la conception de l'appareil. On trouve des descriptions d'appareils de cyto- métrie à écoulement de types représentatifs dans les bre- vets des E.U.A. n 3 826 364 et 4 284 412, ainsi que dans l'article de Herzenberg et col. intitulé "Fluorescence- activated Cell Sorting," Sci. Am. 234 (3): 108, 1976. L'analyse quantitative rapide de cellules bio- logiques s'avère très utile en recherche biomédicale et en médecine clinique. De nouveaux appareils de cytométrie à écoulement permettent d'effectuer une analyse quantita- tive multi-paramètre de propriétés cellulaires à des ca- dences de plusieurs milliers de cellules par seconde. Ces instruments offrent la possibilité de discriminer entre différents types de cellules, en mesurant des différences entre eux. La discrimination est basée sur les caractéris- tiques de fluorescence, qu'on peut utiliser pour détecter des différences fonctionnelles des cellules, et sur la dif- fusion de la lumière, qui est fonction de la morphologie des cellules. Bien que les progrès des techniques de cytométrie à écoulement aient amélioré l'analyse cellulaire, le maté- riel dont on dispose actuellement présente encore certains défauts. A titre d'exemple, on peut utiliser des techniques de cytométrie à écoulement pour détecter la présence de bac- téries dans le sang humain, c'est-à-dire une condition con- nue sous le nom de bactérièmie. Les procédés de diagnostic admis à l'heure actuelle dont on dispose pour détecter une bactérièmie sont basés sur la détection visuelle du dévelop- pement de bactéries dans des milieux liquides auxquels on a inoculé des échantillons de sang. La détection d'une bacté- rièmie par les procédés de développement est lente et né- cessite habituellement de deux à quatorze jours. On a étu- dié des techniques de cytométrie à écoulement utilisant un marquage spécifique des bactéries avec des colorants fluo- rescents et des procédures de préparation d'échantillons, qui permettent la discrimination de cellules sanguines ré- siduelles. A l'heure actuelle, une fois qu'une culture sanguine positive a été identifiée, les laboratoires d'ana- lyses ont recours à des matières et des travaux supplémen- taires, qui prennent du temps, pour obtenir une information de classification bactérienne et de sensibilité aux antibio- tiques. Bien que ces procédures soient efficaces, elles sont coûteuses et reposent pratiquement toutes sur le dévelop- pement bactérien. Les résultats ne sont pas disponibles avant plusieurs heures et la plupart des cas exigent une incubation pendant une nuit complète ou pendant plusieurs jours. Il existe donc un besoin clairement perçu portant sur la nécessité d'augmenter la vitesse de ce test complémentai- re. On pourrait parvenir à une telle augmentation de vitesse en appliquant des techniques de cytométrie à écoulement à la classification de bactéries ne faisant pas intervenir un développement de celles-ci. Les progrès dans l'application des techniques de cytométrie à écoulement ont également été limités par l'ab- sence de procédés d'analyse perfectionnés pour traiter des données portant sur des caractéristiques multiples, de fa- çon à obtenir des résultats fiables. Les données obtenues au moyen d'appareils de cytométrie à écoulement sont pres- que toujours présentées sous la forme de distributions de fréquence unidimensionnelles (histogramme) et bidimension- nelles (diagramme de contour, diagramme de dispersion) de variables mesurées. La séparation de fichiers de données portant sur des paramètres multiples fait intervenir l'uti- lisation consécutive de programmes graphiques interactifs unidimensionnels ou bidimensionnels. Cette procédure est 4 2 2570192 malcommode et, en outre, elle fait également perdre les avantages -du traitement des données dans un espace multi- dimensionnel, et peut masquer une sous-population impor- tante de cellules. A titre d'exemple, les appareils de cytométrie à écoulement dont on dispose à l'heure actuelle sont capa- bles de mesurer quatre caractéristiques pour chaque cellu- le, sur des milliers de cellules par seconde. Le traite- ment des données pour la classification des cellules doit transformer de tels grands ensembles de données d'entrée -à paramètres multiples en mesures expérimentales signifi- catives, et il s'agit là d'une tâche extrêmement complexe. Le procédé de traitement de données qui est de loin le plus utilisé consiste dans l'utilisation successive de fe- nêtres rectangulaires en deux dimensions, pour réaliser une analyse multidimensionnelle. L'analyse quantitative de données de cytométrie à écoulement à paramètres multiples pour la détection ra- pide de cellules comprend deux stades: la caractérisation des classes de cellules et le traitement des échantillons. De façon générale, le processus de caractérisation des classes de cellules sépare l'espace des caractéristiques des cellules en régions disjointes correspondant à des cel- lules intéressantes et à des cellules inintéressantes. Ensuite, dans le traitement des échantillons, chaque cellu- -le est classée dans l'une des deux catégories, en fonction de la région dans laquelle elle tombe. Une analyse soigneu- se de la classe des cellules étudiées est très importante du fait qu'on ne peut espérer obtenir de bonnes performances de détection que si on obtient une région appropriée pour la représentation des cellules intéressantes. Ainsi, la sélec- tion d'une région spécifique pour une population de cellules est l'opération fondamentale de l'analyse de données de dé- tection cellulaire. Cependant, pour des données à paramètres multiples, le problème de l'isolation d'une région intéressan- 2 5 2570192 te par examen visuel dans un espace quadridimensionnel est une tâche irréalisable en pratique. Une solution pos- sible à ce problème consiste à sélectionner deux fenê- tres bidimensionnelles à la fois. Aussi bien avec des fenêtres rectangulaires à quatre paramètres qu'avec des fenêtres à cinq paramètres, la plupart des amas de cellules présentent une forme ellip- tique ou ovoïde dans l'espace des coordonnées qui est re- présenté par la détection de fluorescence à-deux couleurs. Les axes principaux de ces amas ne sont souvent pas paral- lèles aux axes de coordonnées. La frontière idéale pour définir une telle région est donc une figure ellipsoidale ou ovoîde dans l'espace multidimensionnel. Les fenêtres rectangulaires utilisées pour isoler de tels amas englobent habituellement un espace libre considérable, ce qui revient à considérer comme des cellules intéressantes des particu- les de fond non désirées, et introduit donc une erreur de classification. Il apparaît ainsi un besoin portant sur des al- gorithmes plus perfectionnés pour améliorer les possibili- tés analytiques des appareils de cytométrie à écoulement. On ne connaît pas de travaux visant à classer des "événe- ments" mesurés par un équipement de cytométrie à écoule- ment, par l'utilisation des techniques de reconnaissance des formes. La reconnaissance des formes est un domaine qui porte sur la reconnaissance par une machine de régularités significatives dans des environnements bruyants ou comple- xes. Elle comprend la détection et la reconnaissance de propriétés invariantes parmi les ensembles de mesures dé- crivant des objets ou des événements. Le but de la recon- naissance des formes est en général de ranger dans une classe un échantillon de données observées. Il est tout d'abord nécessaire d'extraire un ensemble de mesures et de relations caractéristiques, pour la représentation de la 6 2570192 classe, après quoi on peut effectuer une classification des données sur la base de la représentation.Ona appliqué cette technique à des problèmes issus de nombreux domai- nes divers, parmi lesquels figurent certaines études dans le domaine de la cytologie. Un chercheur a appliqué des procédés de recon- naissance des formes à des images de leucocytes obtenues par examen microscopique de frottis sanguins colorés spé- cialement (Prewitt, J.M.S., "Parametric and Nonparametric Recognition by Computer: An Application to Leukocyte Image Processing," Adv. Computers 12:25-414, 1972). Dans la publication de Prewitt, on distingue cinq types de globules blancs présents dans le sang humain périphérique normal, sur la base d'un traitement par ordinateur de micro-images numérisées. Une étude similaire de Bartels décrit des tentatives visant à caractériser de façon statis- tique des "profils" cytologiques pour des populations de cellules normales et anormales. Plusieurs méthodes d'ana- lyse à plusieurs variables sont utilisées pour déterminer les différences entre les profils qui sont significatives au point de vue statistique. On peut alors classer les cellules dans ces deux catégories avec une précision éle- vée. (Bartels, T.H., "Numerical Evaluation of Cytologic Data, I-VIII, Anal. Quant. Cytol. 1, 2, 3, (1979, 1980, 1981). En ce qui concerne le traitement de données de cytométrie par écoulement, peu de travaux ont été effectués pour l'application de la reconnaissance des formes. Dans une tentative visant à adapter des formes de fenêtres à des con- tours d'amas dans l'espace bidimensionnel, un chercheur a essayé d'utiliser une équation quadratique ou quadratique par morceaux pour former une fenêtre elliptique (Sharpless, T., "Cytometric Data Processing, " dans Flow Cytometry and Sorting, Melamed M.R., Mullaney, P.F. Mendelsohn, M.L., John Wiley and Sons, New York, 1979, pa- ges 359-379). On peut ajuster la fenêtre pour l'adapter à l'amas de cellules. Du fait que le pouvoir de discrimina- tion est accru lorsqu'on analyse des données dans un espace ayant un nombre de dimensions élevé, d'autres chercheurs ont décrit des matériels et des logiciels destinés à une analyse graphique tridimensionnelle, dans laquelle des amas ellipsoidaux sont séparés par des plans (Stohr, M., et Futterman, G., "Visualization of Multidimensional Spectra in Flow Cytometry," J. Histochem. Cytochem. 27:560, 1978). Il est cependant beaucoup plus difficile de visualiser un espace d'analyse ayant plus de trois dimen- sions alors que les données de cytométrie à écoulement comprennent de façon caractéristique quatre paramètres pour chaque cellule. Dans l'analyse de particules biologiques, la dé- tection des particules seule n'est habituellement pas suf- fisante. Pour que l'analyse ait une utilité clinique, elle doit également fournir une certaine indication concernant la nature des particules présentes, comme des bactéries, de façon que le clinicien puisse prendre des décisions con- cernant le site d'infection probable et le traitement anti- microbien approprié. A l'heure actuelle, dans les labora- toires d'analyses, on accomplit habituellement la classifi- cation des bactéries en-observant ou en mesurant les résul- tats de réactions biochimiques entre des réactifs spécifi- ques et des bactéries et/ou leurs produits métaboliques. Ce processus exige l'isolation d'éléments bactériens purs, peut prendre de quatre à six heures, ou plus, et exige des cultu- res comportant plus de 107 éléments de formation de colo- nie par centimètre cube. Dans les conditions habituelles, on ne peut pas obtenir l'information de classification avant que les organismes se soient développés en nombres suffi- sants pour former des cultures appropriées pour la procédure usuelle. De ce fait, des décisions basées sur des organismes réellement prélevés sur le patient ne sont possibles que dans 8 2570192 un délai de deux à quatorze jours. L'attente de ces résul- tats peut entraîner un risque élevé de morbidité ou de mortalité du patient. Dans la pratique récente, les déci- sions prises de façon précoce sont habituellement empi- riques et basées sur les symptômes du patient. Il demeure donc un besoin portant sur des décisions plus précoces concernant un traitement antimicrobien, basées sur une in- formation appropriée. Pour permettre de prendre des dé- cisions plus précoces basées sur une information appro- priée, on a besoin de procédés qui permettent d'effec- tuer une classification avec de plus faibles concentra- tions de particules biologiques, et qui puissent donc être mis en oeuvre plus rapidement. L'invention porte donc sur des techniques de reconnaissance de formes visant à améliorer les performan- ces de la détection et de la classification de particules par l'utilisation de données de cytométrie à écoulement à paramètres multiples. L'appareil de l'inventiondestiné à la détection de particules dans un échantillon,comprend des moyens des- tinés à déplacer des particules, pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide. On dirige de préférence un faisceau d'éclairage incident vers les particules pré- sentes dans le courant. Des moyens de détection de lumiè- re sont incorporés dans le but de détecter des données liées à la lumière qui sont associées à chaque particule en mouvement, lorsque celle-ci traverse le faisceau d'éclairage. Il existe des moyens destinés à établir une classe de particules ayant des caractéristiques communes, conformément à une configuration de données liées à la lumière qui sont détectées à partir d'une telle classe de particules. Il existe en outre des moyens destinés à déter- miner le fait que des particules d'échantillon provenant d'une classe inconnue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la reconnaissance de la configuration au moyen de données liées à la lumière, qui sont détectées à partir des particules de l'échantillon. On peut également employer des données collectées par détection électrique ou acoustique, pour les techniques de reconnaissance de formes qui sont décrites ici. Dans un autre mode de réalisation de cet aspect de l'invention, un appareil de cytométrie à écoulement détecte et classe des particules biologiques intéressantes provenant d'une population hétérogène de particules biolo- giques. En plus des éléments de l'appareil décrit ci- dessus, ce mode de réalisation comprend des moyens desti- nés à diviser la classe établie en un ensemble de sous- classes, et les données liées à la lumière sont enregis- trées séparément pour chaque sous-classe. Les moyens de comparaison comparent de telles données enregistrées avec des données liées à la lumière qui sont détectées à partir de particules d'échantillon d'une classe inconnue. Des moyens déterminent ensuite le fait que des particules de la classe inconnue appartiennent à la classe établie, du fait de la correspondance des données respectives liées à la lumière, et ils identifient les sous-classes aux- quelles les particules inconnues appartiennent. Selon un autre aspect de l'invention, un procédé détecte des particules dans un échantillon. Le procédé com- prend l'établissement d'une classe de particules ayant des caractéristiques communes connues, conformément à une confi- guration des données détectées à partir d'une telle classe de particules connues. On peut détecter des données liées aux particules en utilisant diverses techniques, comprenant la détection électrique ou acoustique, ainsi que l'utilisa- tion des caractéristiques lumineuses des particules. Le pro- cédé détermine ensuite le fait que des particules d'échan- tillon provenant d'une classe inconnue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la reconnaissance de la con- figuration au moyen des données détectées à partir des parti- 2570192 cules d'échantillon. Dans un autre mode de réalisation de cet aspect de l'invention, un procédé détecte et classe des particu- les biologiques intéressantes provenant d'une population hétérogène de particules biologiques. Ce procédé comprend le déplacement de particules, pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide. On utilise de préférence un faisceau d'éclairage incident qui est dirigé vers les par- ticules dans le courant. On détecte des données liées à la lumière qui sont associées à chaque particule en mou- vement, lorsque cette dernière traverse le faisceau d'éclairage. On établit une classe de particules, et ces particules ont des caractéristiques communes basées sur les données relatives à la lumière qui sont détectées dans une telle classe de particules. On enregistre ensuite ces données liées à la lumière. Le procédé comprend en outre la division de la classe en un ensemble de sous- classes, avec l'enregistrement séparé des données liées à la lumière concernant chacune des sous-classes. On compare de telles données enregistrées à des données relatives à la lumière qui sont détectées dans des particules d'échantil- lon d'une classe inconnue. Enfin, le procédé considéré déter- mine que des particules issues de la classe inconnue appar- tiennent à la classe établie, du fait de la correspondance -entre les données respectives liées à la lumière, et il iden- tifie les sous-classes auxquelles appartiennent les particu- les inconnues. Conformément aux principes de l'invention, on recourt aux techniques de reconnaissance de formes pour amé- liorer les performances de la classification de particules * en utilisant des données de cytométrie à écoulement à para- mètres multiples. Les techniques décrites ici introduisent dans le système des "aides intelligentes" pour la détection et la classification automatiquesde particules biologiques. La technique de reconnaissance de formes génère une il description effective et efficace des particules, elle détermine les distinctions entre les caractéristiques de divers types de cellules et elle classe les cellules in- connues sur la base des caractéristiques extraites. Des algorithmes de reconnaissance des formes capables de trai- ter l'information plus rapidement et de façon plus préci- se que d'autres procédés, présentent donc une utilité considérable. Ces caractéristiques avantageuses facili- tent le développement de techniques rapides, ne faisant pas appel à la croissance de micro-organismes, pour la dé- tection et la classification de particules biologiques. Un principe qui est à la base de l'invention consis- tedamlutilisation d'une méthode déterministe de recon- naissance des formes pour la détection de particules bio- logiques, par des techniques de cytométrie à écoulement. On a développé un nouvel algorithme qui définit des ré- gions de détection dans un espace multidimensionnel, en utilisant des caractéristiques couramment mesurées par les appareils de cytométrie à écoulement. Pour la détec- tion d'un certain type de particules, comme des bactéries, on collecte des données provenant d'un spécimen pur, qui constituent un ensemble d'apprentissage. On applique à l'ensemble de données d'apprentissage une transformation des composantes principales, pour obtenir les nouvelles caractéristiques non corrélées. On applique ensuite une transformation de groupage, pour comprimer les données sous une forme plus compacte. Enfin, on définit une ré- gion de détection, de préférence sous la forme d'une hypersphère ayant un rayon égal à deux écarts-types, de façon à contenir l'amas repéré. On peut ensuite utiliser la région pour différencier des particules intéressantes vis-à-vis de particules de fond dans des échantillons in- connus. En termes de rapport signal/bruit, l'invention pré- sente une amélioration considérable par rapport à ce qu'on obtient par le procédé classique d'application de fenêtres 12 2570192 rectangulaires -. On a également appliqué la méthode des composantes principales à l'étude de la classification de particules biologiques. Outre la technique des composantes principa- les, d'autres techniques de classification de particules entrent dans le cadre de l'invention. Pour améliorer la vitesse, on a développé une technique basée sur la règle de Bayes. Pour traiter des événements ayant une apparte- nance multiple, on a développé une technique basée sur les caractéristiques des amas. Pour une méthode non para- métrique, on a développé une technique basée sur la règle des k voisins les plus proches. Chacune de ces techniques de classification de particules biologiques assistée par ordinateur présente des avantages et des caractéristiques propres. On pense que l'utilisation d'algorithmes de recon- naissance des formes pour détecter, analyser et classer de façon intelligente des données concernant des particu- les biologiques, obtenues par cytométrie à écoulement, doit simplifier et accélérer l'analyse de particules bio- logiques. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre de modes de réalisation, et en se référant aux dessins annexés sur lesquels: La figure 1 est une représentation schématique d'éléments optiques et de faisceaux lumineux d'un appareil préféré de cytométrie à écoulement, destiné à la détection et à la classification de particules biologiques intéres- santes, conformément aux principes de l'invention; La figure 2 est un diagramme à deux paramètres (fluorescence rouge logarithmique et fluorescence verte logarithmique) du fichier d'étalonnage de E. coli et P. mirabilis, dans lequel la fenêtre représente la région de détection déterminée par le procédé d'application de fe- nêtre rectangulaire; La figure 3 est un diagramme à deux paramètres 13 2570192 (fluorescence rouge logarithmique et fluorescence verte logarithmique) du fichier d'étalonnage pour E. coli et P. mirabilis, dans lequel la frontière de forme ovale re- présente la région de détection déterminée par la métho- de des composantes principales. Les figures 4A et 4B montrent respectivement des comparaisons entre les procédés des composantes principa- les linéaire et logarithmique, d'une part, et le procédé d'application de fenêtre rectangulaire, d'autre part, dans la détection de S. aureus dans le sang, et sur ces figures les régions de forme ovale et irrégulière ont été générées par analyse par la méthode des composantes principales, en utilisant la diffusion vers l'avant et la fluorescence verte, tandis que le rectangle résulte du traitement d'application de fenêtre; La figure 5 est une représentation schématique d'un organigramme relatif à la classification de cellu- les et de spécimens; La figure 6 est un diagramme de dispersion de cinq types de bactéries dans l'espace des deux vecteurs propres dominants du développement de Karhunen-Loeve; La figure 7 est une représentation graphique de frontières d'amas qui ont été déterminées par la méthode des composantes principales (MCP) pour les cinq types de bactéries dans l'espace des deux vecteurs propres domi- nants du développement de Karhunen-Loeve; La figure 8 est une représentation graphique des frontières de classification de sept types de bactéries dans l'espace des deux vecteurs propres dominants du déve- loppement de Karhunen-Loeve, dans laquelle les frontières ont été déterminées par la méthode des composantes princi- pales (MCP), en employant des données projetées sur cet espace propre bidimensionnel, à partir de l'espace quadri- dimensionnel des caractéristiques; La figure 9 est une représentation graphique de 14 2570192 trois classes de particules et de leurs régions de classi- fication correspondantes, déterminées par les frontières de décision bayésiennes; et Les figures 10A et 10B sont des représentations graphiques de la détermination d'amas par application de seuils, dans lesquels on a appliqué l'algorithme de re- cherche d'amas pour extraire la partie principale d'un amas à partir de données contaminées par du bruit, et la figure 10A représente le contourdes données d'origine, tandis que la figure 0lB représente l'amas résultant après l'application de l'algorithme de recherche d'amas. Bien que l'invention puisse faire l'objet de nombreux modes de réalisation différents, les dessins et la description détaillée qui suit portent sur un mode de réalisation préféré qui ne doit être considéré que comme un exemple non limitatif des principes de l'invention. Le cadre de l'invention sera défini par les revendications annexées et leurs équivalents. En considérant les dessins, et en particulier la figure 1, on voit les éléments optiques et d'écoulement de particules d'un appareil de cytométrie à écoulement 11 d'un type caractéristique. Les éléments optiques et d'écou- lement de la figure 1 représentent les principaux compo- sants d'un appareil de cytométrie à écoulement préféré des- tiné à déplacer des particules, telles que des cellules ou des particules analogues, dans un courant de fluide, prati- quement une à la fois, afin de déterminer des caractéristi- ques spécifiques de ces particules. A titre d'exemple, les éléments du dispositif de la figure 1 peuvent être incorporés dans un appareil de tri de cellules activées par fluorescence de la marque FACS, fabriqué et commercialisé par la firme Becton, Dickinson and Company, FACS Systems Division, Sunnyvale, Californie. L'appareil de tri de cellules FACS analyse et trie des populations de cellulessur la base de la diffusion de la lumière et de la fluorescence dans une 2S70192 grande variété d'applications dans les laboratoires de recherche. En plus des éléments optiques et d'écoulement qu'on décrira ci-après de façon plus détaillée, et qui peuvent être incorporés dans un instrument-tel que l'appa- reil de tri de cellules FACS, d'autres détails d'un-appa- reil de tri de cellules utile en relation avec l'invention sont décrits dans le brevet des E.U.A.-n 3 826 364 et dans l'article de Scientific American précité. Il faut noter que l'invention est utile dans de nombreux types différents de cytométrie à écoulement ou d'appareils fluo- rométriques à écoulement, pour la mesure-de la diffusion de la lumière, du volume de particuies, de la fluorescence, de combinaisons des paramètres précédents ou d'autres para- mètres optiques, électriques ou acoustiques, pour l'identi- fication, la quantification ou la classification de cellu- les ou d'éléments analogues dans un échantillon de fluide. Comme le montre la figure 1, l'énergie lumineuse pour - l'appareil de cytométrie à écoulement est fournie par une source lumineuse 12 telle qu'un laser qui produit un fais- ceau de lumière collimaté à une seule longueur d'onde, ou une lampe à arc, telle qu'une lampe à arc au mercure ou au xénon, qui produit un faisceau de lumière non cohérent ou non collimaté, comprenant un spectre étendu de iongueurs d'onde. Dans l'appareil de cytométrie à écoulement 11, l'énergie d'excitation est fournie par un faisceau de lumiè- re 14 produit par la source lumineuse 12. De façon caracté- ristique, le faisceau d'éclairage traverse une lentille de focalisation 15 qui focalise le faisceau lumineux dans le courant de liquide 16 contenant les particules ou cellules 17 qui sont étudiées. Une buse 18, incorporée dans l'appareil de cytomé- trie à écoulement de l'invention, facilite le passage de particules ou de cellules 17 à l'intérieur du courant de fluide 16. L'utilisation d'une buse de ce type est bien 16 2570192 connue et est d4crite par exemple dans le brevet des E.U.A. n0 3 826 364. On utilise normalement une gaine de liquide 19 pour engainer le courant de particules 16, afin de pro- duire un système d'écoulement de fluide focalisé de façon hydrodynamique. Lorsque chaque cellule ou particule traver- se la région de lumière focalisée 20, dans laquelle le faisceau lumineux 14 rencontre le courant de liquide 16, un photodétecteur approprié 21 peut détecter la lumière dif- fusée par la particule. Dans le mode de réalisation qui est décrit, le photodétecteur 21 détecte la lumière diffusée vers l'avant, de façon caractéristique dans un angle com- pris entre 0,5 et 10 par rapport à l'axe du faisceau lu- mineux. Simultanément, un photodétecteur approprié 22 dé- tecte la lumière diffusée dans une direction orthogonale par des cellules 17 qui traversent le faisceau lumineux. De façon similaire, on peut également détecter la fluorescence si des particules excitées par l'éclairage de la source lumineuse émettent de la lumière de fluores- cence. La lumière de fluorescence émise par des particules auto-fluorescentes ou par des particules marquées de fa- çon fluorescente dans le courant de fluide 16 est détectée le long d'un axe de fluorescence 23 qui est de façon carac- téristique perpendiculaire à l'axe du faisceau lumineux 14. La lumière de fluorescence émise par les particules en écou- lement peut traverser un filtre approprié 24 avant de se propager vers un miroir dichroique 25. Ce miroir dichrol- que, bien connu de l'homme de l'art, transmet certaines lon- gueurs d'onde de lumière et réfléchitd'autres longueurs d'onde. Dans ces conditions, on peut détecter dans des dé- tecteurs de fluorescence 26 et 27 la lumière de fluorescen- ce émise par les particules à différentes longueurs d'onde. Les photodétecteurs 21 et 22 et les détecteurs de fluorescence 26 et 27 peuvent être des tubes photomultipli- cateurs bien connus ou des dispositifs similaires qui con- vertissent des signaux lumineux en impulsions électriques, 17 2570192 de façon que la lumière ainsi détectée puisse être asso- ciée aux cellules marquées de façon fluorescente et à des cellules d'une taille spécifique traversant l'appa- reil. Les signaux électriques provenant des photodétec- teurs et des détecteurs de fluorescence sont appliqués de façon caractéristique aux circuits électroniques 28 de l'appareil, pour la visualisation, l'enregistrement ou un traitement ultérieur, de façon à pouvoir déterminer une ou plusieurs caractéristiques des cellules analysées. Dans la configuration qui est décrite, on peut détecter simultanément la lumière diffusée et la lumière de fluorescence pour chaque particule traversant la ré- gion de lumière focalisée 20. On peut collecter dans un récipient approprié 29 les particules 17 contenues dans le courant de liquide, ou bien on peut trier ces particu- les et les collecter dans différents récipients si l'ap- pareil de cytométrie à écoulement comporte une possibi- lité de tri. Maintenant qu'on a décrit les principaux élé- ments d'un appareil de cytométrie à écoulement, on pourra apprécier de façon plus complète les techniques de recon- naissance des formes de l'invention. On comprend que les algorithmes de l'invention qui appliquent les techniques de reconnaissance des formes pour la classification de par- -ticules biologiques sont mis en oeuvre dans les circuits électroniques 28 de l'appareil considéré. Pour les besoins de la description qui suit, on présentera des exemples de techniques de reconnaissance des formes en considérant la détection et la classification de bactéries. A titre d'exem- ple,-on a testé les caractéristiques de détection de l'invention sur des bactéries présentes dans du sang hu- main périphérique. D'autre part, on a également étudié en relation avec l'invention la classification de bactéries dans des échantillons d'urine humaine. Les principes de l'invention sont cependant applicables de façon très large 18 2-5 à la détectien et à la classification de particules biolo- giques telles que des micro-organismes présents dans di- vers fluides biologiques, et à l'analyse cellulaire telle que l'identification et la numération de diverses sous- classes de leucocytes. Dans l'analyse de données pour la détection de bactéries, on détermine que des particules sont des mem- bres d'une espèce bactérienne spécifique à laquelle elles appartiennent. Les méthodes de reconnaissance des formes sont particulièrement bien adaptées à ce type d'étude. Lorsqu'on procède par reconnaissance des formes, une fois qu'on a sélectionné un procédé de conception spécifique, on doit apprendre au classificateur de cellules à recon- naître des particules appartenant à la classe considérée. Ceci constitue ce qu'on appelle la technique d'apprentis- sage supervisé. On "apprend" au classificateur à détecter des cellules par la procédure d'enseignement des caracté- ristiques communes, à partir d'un ensemble de particules représentatives appartenant à la classe. Cet ensemble de configurations d'apprentissage de classification connue constitue un élément important pour cette méthode. On ob- tient de façon caractéristique les ensembles d'apprentis- sage pour l'analyse en préparant des échantillons avec une concentration élevée (habituellement 106 ou 107 parti- - cules par centimètre cube) d'un type connu de bactérie.On appelle fichiers d'étalonnage des fichiers de données col- lectées dans l'appareil de cytométrie à écoulement à par- tir des échantillons. Dans le processus d'apprentissage, des classificateurs de cellules extraient du fichier d'étalonnage un ensemble de descripteurs pour chaque type de bactérie et ils l'appliquent aux échantillons inconnus pour la détection de bactéries. Du fait qu'on peut décrire des particules par une caractérisation numérique de leui propriétés,on utili- se dans le cadre de l'invention pour la logique de classi- 19 2570192 fication, une technique basée sur une représentation vec- torielle et sur la théorie de la décision. Une particule ayant des valeurs mesurées xl, x2...xn pour n caractéris- tiques est représentée par le vecteur x = (Xl1x2..xn) dans un espace à n dimensions, dans lequel chaque axe de coordonnée est associé à une caractéristique spécifique. Du fait que les valeurs de coordonnées sont des mesures, x est un vecteur aléatoire d'observations. L'espace vecto- riel couvert par tous les vecteurs aléatoires possibles constitue l'espace des caractéristiques ou espace des para- mètres pour le problème de la classification. En outre, pour chacune des classes de particules, on forme une ré- gion correspondante dans cet espace. On considère que ces classes couvrent collectivement toutes les éventualités de classification et excluent la région correspondant aux par- ticules de fond qui ne sont pas contenues dans ces classes. Un point fondamental dans la classification de particules consiste dans l'élaboration de fonctions de décision pour diviser l'espace des paramètres en régions qui contiennent les points d'échantillon de chaque classe. On a élaboré dans ce but un algorithme qu'on appelle ici la méthode des composantes principales (MCP). La MCP fait intervenir une transformation de groupage qu'on accomplit dans l'espace de mesure dans le but de grouper en amas les points représentant des éléments de la classe. Une telle transformation minimise la distance, à l'intérieur d'un ensemble, entre des points de configuration appartenant à la même classe. Une autre étape importante dans l'élabo- ration de fonctions de décision consiste dans l'extraction de caractéristiques, c'est-à-dire la procédure consistant à sélectionner les caractéristiques les plus efficaces dans un but de discrimination. De bonnes caractéristiques renfor- cent la similitude des configurations à l'intérieur d'une même classe et la discordance entre classes. L'extraction des caractéristiques consiste à extraire un certain nombre 2570192 de caractéristiques, chacune d'elles étant une combinai- son linéaire de toutes les mesures initiales. On peut considérer cette façon de procéder comme une transforma- tion de l'espace de mesure d'origine en un autre espace de représentation, et une recherche du sous-espace qui, pour la classe considérée, préserve le mieux l'informa- tion disponible dans l'espace d'origine. On utilise la transformation de groupage en amas pour augmenter la similitude de configurations dans la même classe, en minimisant une relation métrique entre les points définissant la classe. On mesure la relation métrique entre deux points par la distance euclidienne. Plus les configurations de classes différentes sont dis- tantes les unes des autres, plus la probabilité de la re- connaissance correcte de l'appartenance à une classe est grande. On évalue la proximité physique sur la base de la distanceentre deux points de configurations. Ainsi, les mesures de distance constituent le principe fondamental dans le traitement de l'information de configuration. On peut alors exprimer la distance quadratique moyenne à l'intérieur d'un ensemble pour une classe, dési- gnée par D, en termes de variances associées aux compo- santes des vecteurs de configurations dans l'ensemble. On utilise cette mesure de distance dans l'étude de la trans- formation de groupage en amas, et elle s'exprime par la re- lation suivante: n D= 2 ICr- Z k k=l dans laquelle 0-k est la variance d'échantillons sans biais pour les composantes dans la direction Xk. On représente des mesures d'une configuration par différents axes de coordonnées, Xk, dans l'espace à n dimen- sions. Ces paramètres ne sont pas tous également importants dans la définition de la région à laquelle ces configurations 21 2570192 appartiennent. Pour comparer deux configurations caracté- ristique par caractéristique, on doit affecter de plus faiblespoids aux mesures ayant une moindre importance. On doit pondérer fortement des mesures qui contiennent une information de discrimination fiable. On peut accomplir le processus de pondération des caractéristiques par une transformation linéaire qui groupe en amas les points de configuration dans le nouvel espace. Cette transformation minimise la distance à l'intérieur d'un ensemble pour une certaine classe particulière, dans l'espoir de condenser cette classe et de rendre ainsi plus aisée la tâche de classification. On considérera deux vecteurs a' et b' dans l'es- pace S' qui sont transformés à partir de vecteurs a et b dans l'espace S, par une matrice de transformation W. On peut les écrire sous la forme: a' = W a et avec: Wil w12........ wln w21 w22....... W2n Wnl Wn2....... Wnn w..ij désignant les coefficients de pondération. West la matrice qui représente une transformation linéaire généra- le. Le processus de pondération auquel on s'intéresse ne fait intervenir que les paramètres situés sur les axes prin- * cipaux. Lorsqu'on accomplit la transformation linéaire avec seulement des changements de facteur d'échelle des coordon- nées, W peut être une matrice diagonale dans laquelle seuls les éléments situés sur la diagonale principale sont diffé- rents de zéro. Du fait que chaque élément du vecteur trans- formé est une combinaison linéaire des éléments du vec- teur d'origine, on peut écrire les nouvelles composantes sous la forme: a'k kk k et b'k = Wkk bk Par conséquent, la distance euclidienne entre a et b dans le nouvel espace est représentée par la distance de points de configuration à l'intérieur de l'ensemble, conformément à la relation suivante: D2 = 2 (wkk d. k=1 kk k Dans cette équation, Wkk est la seule inconnue, et pour éviter des solutions triviales, on doit appliquer une contrainte supplémentaire à la matrice W. La contrain- te considérée est la suivante: n T- Wkk = k=1 La relation ci-dessus implique une pondération à volume constant et est liée à la norme de l'espace des paramè- tres. En utilisant la méthode de Lagrange, la minimisa- tion de D2 avec la restriction précédente, conduit à la relation suivante: n r 1/n Wkk = ||ki j=l qui montre que wkk est inversement proportionnel à l'écart-type des mesures. Les coordonnées qui ont de gran- des variances n'apportent que peu de choses en commun avec les configurations de la classe; leurs facteurs de pondération sont donc faibles. Inversement, si la varian- ce est faible, la contribution au groupage en amas est grande et la pondération est forte. 23 2570192 Du fait que les coefficients de pondération des caractéristiques, w, déterminent la matrice de transfor- mation W, compte tenu de la contrainte spécifiée ci- dessus, et si les facteurs de configuration sont trans- formés de l'espace S vers l'espace S' par la transforma- tion: x' =W x la distance à l'intérieur d'un ensemble entre des points dans l'espace S' est minimisée. Ceci constitue ce qu'on appelle la transformation de groupage en amas pour les points de données d'une classe. L'extraction de caractéristiques à partir de configurations d'apprentissage est une fonction qui con- siste à déterminer certains attributs relativement inva- riants de la classe de configurations. Avant de détermi- ner quelles sont les composantes des données qui ont des variances faibles ou élevées, on pré-traite les données pour construire de nouvelles caractéristiques qui ne sont pas corrélées, du fait que certaines des caractéris- tiques choisies peuvent être corrélées (c'est-à-dire qu'un paramètre mesuré peut dépendre de certaines des autres variables ou de la totalité de celles-ci). Une certaine technique est nécessaire pour extraire les ca- ractéristiques non corrélées lorsque les mesures sont -corrélées par nature. La forme mathématique de la fonc- tion qui mesure la corrélation entre les variables est la matrice de covariance, et elle satisfait la relation suivante: 0-ll Ci2 Crin C = 21 '22. . . 2n nl n2 Crnn Pour des variables non corrélées, la matrice 24 2570192 de covariance est une matrice diagonale, c'est-à-dire que les éléments qui ne sont pas situés sur la diagonale sont égaux à zéro. On sait que dans une transformation de similitude (c'est-à-dire C' = ACA 1), la matrice C est diagonalisée par la matrice A si on choisit pour A la ma- trice modale de C. Pour une matrice modale, les colonnes de A sont les vecteurs propres de C, ou, en d'autres termes, les lignes de A sont les vecteurs propres de -C. Par conséquent, une matrice modale A transforme les mesures d'origine en les faisant passer dans un espace dans lequel la matrice de covariance est diagonale et les nouvelles coordonnées ne sont pas corrélées. A l'espace de mesure établi par la transforma- tion de groupage en amas (x' = Wx) est associée une matri- ce de covariance C', qu'on peut former par la transforma- tion C' CWT, à partir de la matrice de covariance d'origine C. L'indice supérieur T qui est adjoint au vec- teur signifie que ce vecteur est le vecteur transposé de W. On peut alors découpler la covariance des composantes dans l'espace S', en déterminant A, c'est-à-dire la trans- formation qui maintient la distance minimale à l'intérieur de l'ensemble et qui diagonalise la matrice de covariance. Ceci conduit à un nouvel espace, S", dans lequel la contri- bution des diverses composantes non corrélées au groupage en amas est évidente. Pour récapituler, on peut dire que la méthode des composantes principales est basée sur l'obtention de l'en- semble de caractéristiques optimal qui décrit le mieux la structure de l'ensemble de données. En l'appliquant à l'échantillon représentatif (fichier d'étalonnage), on peut sélectionner les descripteurs de l'amas multidimen- sionnel de bactéries qui contiennent le plus d'information, et on peut donc faciliter la tâche de détection et de clas- sification. Lorsqu'on applique la technique indiquée ci-dessus 2570192 à la détection de bactéries, on utilise des spécimens bac- tériens purs en tant qu'ensembles d'apprentissage pour les fichiers d'étalonnage, comme décrit ci-dessus. Pour de telles données, la moyenne de l'échantillon et la ma- trice de covariance de l'échantillon constituent une des- cription condensée. La moyenne de l'échantillon localise le centre de gravité de l'amas et la matrice de covariance de l'échantillon indique dans quelle mesure la moyenne de l'échantillon décrit correctement les données, au moyen de la valeur de dispersion qui existe dans diverses direc- tions. On peut obtenir une transformation d'extraction de caractéristiques par diagonalisation de la matrice de co- variance des données d'origine. Les vecteurs propres ré- sultants sont les lignes de la matrice de transformation désirée, et les valeurs propres correspondantes sont les variances desnouvelles caractéristiques, qui sont des com- binaisons linéaires des composantes d'origine. Comme décrit ci-dessus, on considère que les ca- ractéristiques ayant de faibles variances doivent avoir plus d'importance dans la discrimination entre des bacté- ries et des particules autres que des bactéries, et doi- vent être pondérées plus fortement pour parvenir à des dé- cisions de détection et de classification. On met en oeu- vre ce processus de pondération de caractéristiques par la transformation de groupage en amas, qui minimise la distance des données à l'intérieur d'un ensemble, c'est-à- dire la distance quadratique moyenne entre des points de données. Avec cette transformation, les données sont compri- mées sous une forme plus condensée. Avec l'hypothèse selon laquelle les points dans l'ensemble d'apprentissage (fi- chier d'étalonnage) proviennent d'une seule distribution normale à plusieurs variables, on peut obtenir la région de classification en définissant une hypersphère (c'est-à- dire une "sphère" dans quatre dimensions ou plus), avec un rayon égal à deux écarts-types, de façon qu'elle contienne 26 2570192 cet amas resserré. Ensuite, dans le nouvel espace, on peut reconnaître qu'une particule inconnue est une bacté- rie si sa distance par rapport au centre de l'amas est inférieure au rayon de l'hypersphère. Au contraire, une particule inconnue ne sera pas considérée comme une bac- térie si sa distance au centre de l'amas est supérieure au rayon de l'hypersphère. On va maintenant considérer l'application de la méthode des composantes principales à la détection de par- ticules biologiques. La détection ou la classification de particules en cytométrie à écoulement est basée sur des mesures de lumière de fluorescence et de diffusion de la lumière, ou sur des rapports de ces mesures. Ces paramè- tres forment un outil analytique permettant d'identifier une cellule en tant que membre d'un type spécifique de cellules. Dans la détection ou la classification de bac- téries, les cellules sont de façon caractéristique diver- ses espèces de bactéries. Il n'y a que deux moyens prati- ques pour enregistrer ces données: sous la forme de listes de nombres et par l'utilisation d'une représentation graphique. Cependant, pour séparer des bactéries par rap- port à des particules de fond, ou pour identifier des ty- pes de bactéries, on ne peut parvenir à la discrimination maximale que si on utilise tous les paramètres dans l'ana- lyse par données à paramètres multiples. Il est nécessaire d'enregistrer les mesures et de les traiter ensuite au mo- yen d'algorithmes perfectionnés. Les données enregistrées de façon numérique sous la forme de listes de paramètres pour chaque particule mesurée par le système constituent ce qu'on appelle des données en mode de liste et sont utili- sées essentiellement pour le traitement des données en mode différé. Une fois qu'on a collecté des données en mode de liste, on peut les visualiser sous la forme d'histogrammes unidimensionnels ou bidimensionnels, de diagrammes de disper- sion, de diagrammes de contour, etc, avec la résolution 27 2570192 maximale. On peut également analyser ces données événe- ment par événement, en utilisant divers algorithmes. La figure 2 montre un exemple de deux types de bactéries qu'on trouve dans l'urine, E. coli et P. mirabilis, qui présentent un intérêt. La détection de bactéries dans l'urine constitue un problème complexe dans lequel on sait seulement qu'on a de fortes chances de rencontrer un type de bactérie parmi deux ou trois. Pour un échantillon d'urine d'un sujet, il est important de savoir si l'un de ces types de bactéries est présent, et en quelle quantité. On a abordé de façon caractéristi- que ce problème en utilisant une fenêtre rectangulaire "universelle" pour discriminer entre les bactéries et les particules de fond. Sur la figure 2, le rectangle repré- sente la fenêtre universelle bidimensionnelle qu'on utili- se pour établir la région de détection déterminée par le procédé classique d'application de fenêtre rectangulaire. On donne de façon caractéristique de grandes dimensions à la fenêtre de façon qu'elle englobe les deux ensembles d'apprentissage (fichiers d'étalonnage) pour les deux es- pèces de bactéries. On peut voir que la surface excessive occupée par l'espace vide dans la fenêtre contribue à des erreurs dans la détection des signaux. Conformément à l'invention, la méthode des compo- santes principales affine cette discrimination de particu- les. La figure 3 montre le diagramme à deux paramètres du fichier d'étalonnage pour E. coli et P. mirabilis, et la frontière bidimensionnelle calculée par l'algorithme de la méthode des composantes principales (MCP). La frontière de forme ovale représente la région de détection déterminée par la méthode des composantes principales. On voit claire- ment que la région qui est ainsi déterminée est plus étroi- tement adaptée aux données que la fenêtre universelle repré- sentée sur la figure 2, ce qui réduit les erreurs de détec- tion. On peut mettre en oeuvre la méthode MCP dans un espace 28 2570192 logarithmique à quatre dimensions, avec en tant qu'axes de paramètres la diffusion vers l'avant, la fluorescence verte, la fluorescence rouge et la diffusion à 90 . On a trouvé que la technique MCP procure une augmentation considérable du rapport signal/bruit, ce qui indique que cette technique est très utile même lorsqu'on ne connaît pas a priori le type de particules à détecter. L'analyse quantitative de la méthode des compo- santes principales est basée sur l'information contenue dans l'ensemble d'apprentissage (fichier d'étalonnage). Cette information calculée de façon numérique compre les éléments statistiques de position, de taille, de for- me et de distribution des cellules contenues dans l'échan- tillon. Les paramètres de la MCP qui construisent une sur- face mieux adaptée pour l'amas de cellules isolé dans l'espace multidimensionnel sont directement déduits de la moyenne et de la covariance de la distribution d'échan- tillons à plusieurs variables. Dans cette façon de procé- der, le fait que la MCP utilise simultanément tous les paramètres pour obtenir des solutions aux problèmes struc- turaux complexes procure une technique effective et effi- cace pour la discrimination. On peut employer une méthode des composantes principales modifiée pour obtenir une description plus effective des bactéries et une région de classification plus efficace pour la discrimination par rapport aux par- ticules de fond. Cette technique modifiée exige de retrai- ter les données pour faire disparaître le biais dans les mesures. On extrait ensuite les caractéristiques et les relations entre les mesures, pour la représentation des cellules intéressantes. La modification de la MCP est basée sur une transformation logarithmique accomplie avant la transformation de groupage en amas et la transformation d'extraction des caractéristiques, de façon à redistribuer approximativement les données en une distribution gaussienne. 29 2570192 La figure 4A montre la frontière de la MCP (de forme ova- le) superposée sur la fenêtre rectangulaire générée par la procédure d'application de fenêtre. La frontière ova- le résulte de l'utilisation de l'analyse par MCP linéaire. La figure 4B illustre la méthode des composan- tes principales modifiée de façon logarithmique, comparée à la méthode de la fenêtre rectangulaire universelle. Les points de données sur la figure 4B représentent la détec- tion de S. aureus dans le sang. On a généré la région de forme irrégulière à partir d'une analyse par MCP de la dif- fusion vers l'avant et de la fluorescence verte, en utili- sant une transformation logarithmique. Le rectangle résul- te de la technique d'application d'une fenêtre universelle. On peut voir que la région de la MCP modifiée englobe la majorité des événements dans l'échantillon positif, beau- coup mieux que la fenêtre rectangulaire et que la région de la MCP linéaire, représentées sur la figure 4A. La classification de particules biologiques est une technique plus affinée qu'on met en oeuvre après avoir détecté des particules intéressantes. La description pré- cédente de l'invention portait de façon générale sur la détection des particules seule. La figure 5 représente un modèle en cascade de classification de cellules et d'échan- tillons. Dans le stade de classification de cellules, K est le nombre de cellules classées comme étant des bacté- ries. Cependant, en pratique, la valeur de K est enta- chée d'erreur du fait de la présence d'un certain nombre de particules de fond (bruit) qui satisfont également les cri- tères présélectionnés pour les bactéries. Le degré d'erreur dépend de la qualité du fonctionnement du classificateur de cellules. Si le classificateur de cellules éliminait la contamination de façon parfaite, toute valeur de K différen- te de zéro suffirait à indiquer l'existence de bactéries. Il est donc nécessaire de sélectionner un seuil de détecteur dif- férent de zéro dans le classificateur d'échantillons, pour 2570192 déterminer si l'hypothèse selon laquelle l'échantillon est positif au point de vue des bactéries, est vérifié. On dit qu'un échantillon est positif si on détecte dans celui-ci un nombre de bactéries supérieur au seuil, et on dit qu'il est négatif si le nombre de bactéries détec- tées dans l'échantillon est inférieur au seuil. La fixa- tion de la valeur de seuil permet d'effectuer un compromis entre les taux d'erreur correspondant à des échantillons reconnus faussement positifs et à des échantillons recon- nus faussement négatifs. Cependant, ces taux d'erreur dépendent eux-mêmes de la précision sur les valeurs K. Le fait de diminuer l'erreur de détection dans le classifi- cateur de cellules améliore la précision sur la valeur K, ce qui réduit les deux taux d'erreur du classificateur d'échantillons. Avec une estimation fiable de K, et en rè- glant le seuil pour réaliser un compromis entre les échan- tillons reconnus faussement positifs et ceux reconnus faussement négatifs, on peut atteindre les performances de classification optimales. On a développé conformément à l'invention des techniques de reconnaissance des formes destinées à la classification de particules biologiques. On a élaboré des algorithmes capables d'effectuer une classification correcte de particules biologiques. On entend par classi- fication correcte le fait que les algorithmes sont capa- bles de garantir la concordance entre l'analyse par ordi- nateur et les procédures de test classiques utilisées en microbiologie, avec lesquelles on a établi les fichiers de classification pour les particules spécifiques. On a en particulier développé des algorithmes pour classer sept types de bactéries qu'on rencontre couramment en pra- tique: Proteus mirabilis, Streptococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, et Lactobacil- lus. Il faut cependant noter qu'on peut également générer des algorithmes destinés à la détection et à la classifica- 31 2570192 tion d'autres particules biologiques telles que des sous- classes de lymphocytes, et ces algorithmes entrent dans le cadre de l'invention. On peut classer des particules biologiques par un certain nombre de techniques différentes de reconnais- sance des formes comprenant, de façon non limitative: (1) la méthode des composantes principales, (2) la règle de Bayes, (3) l'exploitation des caractéristiques statis- tiques des amas et (4) la règle des k voisins les plus proches. Comme indiqué brièvement ci-dessus, une repré- sentation vectorielle de particules biologiques projette les particules pour donner des points, et les classes de particules pour donner des ensembles, dans un espace ayant un nombre de dimensions limité. Pour chaque classe de particulesgon forme une région de particulescorrespon- dante dans l'espace vectoriel. On suppose que les régions de particules et la région qui correspond aux particules de fond sont exhaustives et mutuellement exclusives. Par caractérisation quantitative d'amas de données de parti-. cules, on définit une mesure de la séparation des amas,de façon à- pouvoir établir des régions de classification. Les mesures fondamentales sur lesquelles on se base pour la quantification correspondent à la position, à la taille et à la séparation des amas de données. Ces propriétés facili- tent la sélection de caractéristiques d'analyse telles que des types différents de particules biologiques apparaissent différents, et elles permettent d'identifier la méthode de préparation qui est la plus efficace pour la discrimination. Dans la projection vectorielle de particules, on a élaboré une technique dans laquelle des données quadridi- mensionnelles peuvent être présentées en deux dimensions, en utilisant un nouvel espace des caractéristiques à deux dimensions. Les deux nouvelles composantes de l'espace des caractéristiques sont déduites des paramètres mesurés et 32 2570192 prennent en compte la majeure partie de la variation dans les données d'origine, pour toutes les données con- sidérées, ce qui fait qu'on peut réduire à deux les dimen- sions effectives des données. L'invention utilise la théorie du développement de Karhunen-Loeve (K-L), qui facilite la mise en oeuvre de la technique de sélection des caractéristiques. La pro- cédure de sélection des caractéristiques est liée au fonc- tionnement de systèmes de reconnaissance des formes. Elle a pour fonction d'extraire des données disponibles les caractéristiques qui apparaissent les plus significatives en ce qui concerne la classification. Le développement de K-L est bien connu dans la théorie de la communication et il a été décrit par Fukunaga dans "Introduction to Statistical Pattern Recognition," Academic Press, New York, 1972. Ce développement de K-L est basé sur une ana- lyse des vecteurs propres de la matrice de covariance d'échantillon qui est associée aux données d'entrée. On utilise les résultats de cette analyse pour effectuer une transformation linéaire des vecteurs de représenta- tion des points dans tous les amas, afin de les projeter dans un nouveau système de coordonnées dans lequel les va- * riables correspondant aux coordonnées ne sont mutuellement pas corrélées, et dans lequel l'information provenant de la distribution de données d'origine est concentrée dans les quelques premiers axes du nouveau système de coordon- nées. De cette manière, il est possible d'approcher le vecteur de représentation, en considérant l'erreur au sens des moindres carrés, avec un nouveau vecteur de caractéris- tiques de dimension réduite. C'est cette combinaison de sélection de caractéristiques et de réduction qui fait du développement de K-L une technique générale et puissante dans les problèmes de reconnaissance des formes. Une technique pour la visualisation de données quadridimensionnelles dans un espace bidimensionnel, confor- 2 5 7 0 192 mément à un algorithme de développement de K-L, est mise en oeuvre de la manière suivante - 1) on enchaîne les fichiers de données des ensem- bles d'apprentissage pour toutes les classes de bactéries intéressantes, pour former un seul fi- chier d'étalonnage; 2) on calcule la moyenne et la matrice de cova- riance de ce fichier d'étalonnage, conformément aux procédures ci-dessus; 3) on calcule les vecteurs propres et les valeurs propres pour la matrice de covariance; 4) on choisit les deux vecteurs propres qui cor- respondent aux deux valeurs propres les plus éle- vées de la matrice de covariance, qui formeront la base du nouvel espace; ) on forme une matrice de transformation de deux par quatre, W,en utilisant pour les lignes de la matrice W les vecteurs propres choisis à l'étape 4; et 6) on calcule le nouveau vecteur de données, x', en utilisant la relation x'= Wx et on visualise les nouveaux événements dans le nouvel espace. Les vecteurs x' sont maintenant la représentation bidimensionnelle qui minimise l'erreur d'approximation. On a donc effectivement réduit le nombre de caractéristiques nécessaires pour décrire les données. En fait, si on sélec- tionnait l'ensemble des quatre nouvelles caractéristiques, il n'y aurait pas de diminution résultante des caractéris- tiques et les nouveaux points de données représenteraient les anciens points après une rotation de coordonnées. On notera qu'en ce qui concerne la description faite ici, les données quadridimensionnelles pour chaque particule intéressante concernent la diffusion vers l'avant, la diffusion à 90 , la fluorescence verte et la fluorescence rouge, détectées par l'appareil de cytométrie à écoulement. 34 2570192 La figure 6 montre les résultats de l'analyse de cinq types de bactéries dans l'urine: S. faecalis, P. mirabilis, S. saprophyticus, P. aeruginosa et K. pneumoniae. On a extrait les vecteurs propres de l'en- semble de données qui contenait l'ensemble des cinq types de bactéries, et on les a ordonnés du plus élevé au plus faible, sur la base de leurs valeurs propres. Le pourcen- tage de variance préservé dans les deux premières compo- santes est de 93,5%. Du fait que ces variables sont des combinaisons linéaires des variables d'origine, on pense que ce diagramme devrait contenir davantage d'informations concernant la structure des données qu'un simple diagramme quelconque à deux variables, bien qu'il puisse être diffi- cile de donner une signification scientifique aux combi- naisons linéaires. Bien que des membres de différentes classes soient représentés sur la figure 6 par différents types de symboles, il demeure très difficile de visualiser l'espace réel pour chaque classe individuelle et l'impQr- tance de l'espace commun à plusieurs classes. Un diagramme ne représentant que les frontières (ou les régions de clas- sification) des classes serait suffisant pour montrer o sont les classes et l'importance de l'espace occupé par chacune d'elles. Parmi les quatre stratégies de classifi- cation différentes énumérées ci-dessus, la méthode des com- posantes principales est la plus appropriée pour définir la frontière des classes individuelles. Dans cette application au problème de la détection de bactéries, la méthode des composantes principales permet de distinguer avec succès les bactéries par rapport aux par- ticules de fond. La MCP utilise de façon explicite la struc- ture des particules pour délimiter une frontière entre le si- gnal et le bruit, comme décrit ci-dessus. On peut coder un amas déterminé expérimentalement, au moyen d'un ensemble de nombres qui comprennent deux transformations, à savoir l'ex- traction des caractéristiques et le groupage, et un centre et 2570192 un rayon dans l'espace transformé.On peut considérer ces nombre comme des éléments d'un ensemble de caractéristiques spé- cifiques de l'amas. Si on utilise une telle forme numéri- que pour caractériser une classe de bactéries, c ensembles de nombres seront suffisants pour définir les c classes qui sont considérées.Ces ensembles de caractéristiques dé- limitent fondamentalement c régions de classification dans l'espace de mesure. Cependant, il existe dans ce cas un espace inoccupé à l'extérieur de l'union des c régions de classification, et cet espace inoccupé est spécialement prévu pour des particules de fond. La méthode MCP exige différents ensembles d'ap- prentissage (fichiers d'étalonnage) pour différents grou- pes de bactéries devant être classées. Lorsqu'on a traité tous les ensembles d'apprentissage pour obtenir l'ensemble de caractéristiques,on divise l'espace des paramètres mul- tidimensionnel en régions correspondant à différentes clas- ses bactériennes. Ces régions correspondent collectivement aux bactéries prises en considération et excluent les par- ticules de fond. On peut réaliser le classificateur en dé- terminant si une particule d'entrée entre dans l'une quel- conque des c régions de classification, et en l'affectant à la classe dans laquelle se trouve le vecteur de données, ou bien en considérant qu'il s'agit d'une particule de fond si elle n'appartient à aucune des c classes. Sur la base de cette technique, il est souhaita- ble que les régions des classes bactériennes correspondent à des amas condensés et bien séparés. Cependant, les ré- gions générées par différents types de bactéries se chevau- chent à divers degrés. On doit résoudre le problème de la classification d'événements qui tombent dans les régions de chevauchement. Il est nécessaire d'incorporer dans le clas- sificateur certains processus supplémentaires de prise de décision, pour faire face à de telles situations. Une solution intuitive consiste à adopter le prin- cipe utilisé en reconnaissance de formes qu'on appelle règle du voisin le plus proche, selon lequel on affecte une configuration de classification inconnue à la classe de son voisin le plus proche. L'événement doit être incor- poré dans la classe dont le centre est le plus proche. Pour définir le concept de "proximité", il est nécessaire de définir tout d'abord une mesure de similitude qui éta- blira une règle pour affecter des configurations au do- maine d'un centre d'amas particulier. Dans la technique du voisin le plus proche, on considère généralement la distance euclidienne. Cependant, si on désire déterminer à quelle distance du vecteur moyen se trouve une particu- le individuelle, on ne doit pas-simplement calculer la distance euclidienne. Ceci vient du fait que les valeurs pour les différentes composantes peuvent ne pas être mu- tuellement indépendantes, mais peuvent présenter une cova- riance. On doit considérer la corrélation mutuelle entre les variables qui forment l'amas. Une mesure appelée dis- tance de Mahalanobis accomplit ceci. La distance de Mahalanobis est une mesure de probabilité qui représente la séparation effective entre deux points, après ajustement tenant compte de la cova- riance interne des paramètres, et elle est définie par la relation:-T -1 DM = t C - -T dans laquelle T est un vecteur ligne de différences entre un centred'amas et une particule individuelle; Lest le vecteur colonne correspondant; et O -1 est l'inverse de la matrice de variance-covariance. Du point de vue du princi- pe, ceci revient à chercher à quel type de cellule l'ensem- ble de caractéristiques de l'événement ressemble le plus. Plus la distance entre l'événement et un centre d'amas est courte, plus la probabilité que la cellule inconnue appar- tienne à cette classe est grande; et plus la distance est grande, plus la probabilité que la cellule inconnue appar- tienne à cette classe est faible. La figure 7 illustre l'application de la techni- que de classification par la MCP. Les frontières des amas qui ont été déterminées par la MCP sont tracées pour les cinq types de bactéries, dans l'espace des deux vecteurs propres prédominants du développement de K-L. Les classes P. aeruginosa, S. faecalis et S. saprophyticus, qui sont presque indiscernables sur la figure 6, sont clairement présentées sur la figure 7.Bien qu'on puisse toujours observer le chevauchement entre S. faecalis et S. saprophyticus, la séparation entre P. mirabilis et K. pneumoniae est notablement augmentée. De façon similaire, la figure 8 montre les régions de classification bidimensionnelles calculées pour sept ty- pes de bactéries: P. mirabilis, S. faecalis, S. saprophyticus, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa et Lactobacillus. Le diagramme de la figure 8 représente l'espace des deux vecteurs propres prédominants du déve- loppement de Karhunen-Loeve. On a déterminé les frontiè- res par la méthode des composantes principales, en emplo- yant des données projetées dans cet espace propre bidimen- sionnel à partir de l'espace des caractéristiques quadridi- mensionnel. On voit clairement que la classe 1(P. mirabilis et la classe 5 (E. coli) présentent un chevauchement consi- dérable. Il y a un certain chevauchement entre S. faecalis et lactobacillus, ainsi qu'une interaction avec S. saprophyticus. Bien que l'étendue du chevauchement soit réduite dans l'espace quadridimensionnel, il n'est pas surpre- nant de voir que le classificateur utilisant la MCP a rangé dans la classe E. coli certaines des particules faisant partie du spécimen P. mirabilis, comme le montre le ta- bleau suivant: 38 2570192 N de Nom de Nombre Niveau de la la d'événements confiance classe classe (%) 1 P.mirabilis 822 85,71 2 S.faecalis 23 2,40 3 S.saprophyticus 0 0,00 4 K.pneumoniae 14 1,46 E.coli 100 10,43 6 P.aeruginosa O 0,00 7 Lactobacillus O O,00 Fond 41/1000 L'échantillon a cependant été classé correctement du fait qu'il contenait beaucoup plus de cellules rangées dans la catégorie P. mirabilis. En supposant l'existance de caractéristiques statistiques normales pour les données, on peut réaliser la classification de particules biologiques, telles que des bactéries, en appliquant la règle de Bayes. Selon la technique de la règle de Bayes, on effectue la classifica- tion en se basant sur la théorie statistique de la décision. Cette technique divise l'espace des caractéristiques en c régions mutuellement exclusives et exhaustives (R1, R2,.... Rc), correspondant à c types bactériens. La classifica- tion consiste alors à affecter une cellule à la classe de rang i si ses paramètres donnent la plus grande probabili- té dans la région associée, Ri. L'utilisation de principes probabilistes est motivée par plusieurs considérations. Premièrement, ils procurent un outil pour exprimer les con- séquences de la variabilité des mesures, qui est inévitable dans la collecte de données. Secondement, ils permettent d'effectuer des mesures quantitatives de corrélations entre des caractéristiques. Enfin, le point de vue statistique re- connaît l'existence d'une ambiguité inhérente (c'est-à-dire 39 2570192 des appartenances multiples) qui est liée au processus de discrimination, ce qui fait qu'il est impossible de par- venir à une classification exempte d'erreur.La stratégie de décision bayésienne qu'on utilise ici constitue une technique statistique appropriée, du fait que, par son principe même, elle minimise les pénalités qui résultent des erreurs commises. Le classificateur de Bayes favorise l'affecta- tion d'un événement, x, à la source la plus probable, et maximise le taux de succès moyen sur les c classes. Sa stratégie est équivalente à une séquence de c(c-l)/2 com- paraisons par paires, chacune d'elles conduisant à l'éli- mination de la classe qui correspond à la plus faible probabilité. A chaque étape, l'espace des caractéristiques est divisé en deux régions en fonction du signe de dij = Di(x)-Dj(x), avec i, j = 1, 2....c, et Di et D. étant les fonctions de décision respectives de la classe i et de la classe j. La région de signe positif est associée à la classe i et la région de signe négatif est associée à la classe j. Ces régions sont séparées par une frontière de décision sur laquelle dij s'annule. La classification cor- respondant à la classe i est simplement la partie commune de toutes les régions positives associées à la classe i. Sa frontière est constituée par tous les points situés à l'intérieur des frontières de décisions par paires qui ne sont pas dans des régions négatives. La réalisation d'un classificateur de Bayes pour des particules biologiques, basé sur des fonctions de déci- sion statistiques,comprend les opérations suivantes: pre- mièrement, on évalue les c valeurs de fonctions pour un vec- teur d'entrée, x; secondement, on sélectionne la plus gran- de; et finalement, on affecte la particule d'entrée inconnue à la classe correspondante. La figure 9 montre une illustra- tion de la technique utilisant la règle de Bayes. Trois classes de cellules ont été séparées dans l'espace à deux 2570192 paramètres de La figure 9. La région correspondant à la classe 1 est constituée par- la zone déterminée par le côté négatif de la courbe d12 = O, et par le côté positif de la courbe d31 = O. Cette zone est indiquée sur la figu- re par la mention "région de classification I". On voit que, bien que la classe I occupe une étendue relativement faible, la région de classification réelle dans laquelle une particule serait affectée à cette classe présente une très grande étendue. Des commentaires similaires s'appli- quent aux deux autres classes. Le classificateur de Bayes classera par erreur en tant que particules de la classe I les trois points désignés par A, B et C, qui sont claire- ment représentés sur la figure comme étant des particules de fond. Ceci constitue un inconvénient du classificateur de Bayes, du fait qu'il n'est pas capable de faire face à des situations ambiguës (par exemple lorsque la probabi- lité qu'un événement soit dans une classe quelconque est extrêmement faible), dans le processus de prise de déci- sion. Une solution à ce problème consiste à pré-traiter les caractéristiques d'un événement pour éliminer tous les événements qui appartiennent manifestement au fond. Une autre façon de procéder pour classer des par- ticules biologiques par des techniques de reconnaissance des formes, consiste à employer la technique des caracté- ristiques d'amas. Les techniques de classification décri- tes précédemment portent essentiellement sur une analyse événement par événement. Cependant, des mesures portant sur le groupe d'événements considéré comme un tout peuvent con- tenir suffisamment d'information consistant en données numé- riques pour déterminer si la particulebioogique est présente. Lorsque la clé du diagnostic réside dans la matérialisation de différences entre deux populations de cellules, il n'est habituellement pas nécessaire de classer correctement cha- que cellule individuelle; il suffit simplement de montrer le caractère significatif d'une différence entre deux classes. 41 2570192 Si la distinction est suffisamment bonne pour classer des amas sans erreur, on peut éliminer la difficulté consis- tant dans l'existence de régions en chevauchement, et on peut négliger le problème de particules ayant une appar- tenance multiple. L'aspect fondamental de la classification des amas consiste en ce qu'on suppose que le groupe de parti- cules considéré comme un amas provient d'une seule popu- lation bactérienne. Ceci signifie qu'on considère que les données sont représentatives d'une seule classe de bacté- ries. Par conséquent, l'étape initiale dans l'analyse d'amas, commune à toutes les techniques de traitement de données bactériennes, consiste à obtenir un fichier de classification net. Les méthodes d'application de fenêtres rectangulaires ne sont pas suffisamment bonnes, du fait que les caractéristiques structurales sont très sensibles à des particules situées à l'extérieur de l'amas. Par consé- quent, on a élaboré conformément à l'invention un algorith- me de recherche d'amas dont le but est de conserver le grou- pement "naturel" dans les données et d'éliminer effective- ment les événements qui se trouvent à l'extérieur. On a élaboré conformément à l'invention une tech- nique efficace en ce qui concerne le temps exigé, qui est basée sur le fait qu'il existe toujours un amas dans des 'données de cytométrie à écoulement concernant des particules biologiques. Cette observation est suggérée par le fait que des données bactériennes présentent habituellement une struc- ture unimodale. Bien que les bactéries contenues dans l'amas puissent être pathogènes ou non pathogènes, chacune d'elles forme un amas dans l'espace des paramètres. S'il n'y a pas suffisamment d'événements dans l'amas, onconsidère que l'échantillon de fluide ne présente pas un intérêt clinique. Sur la base de ces hypothèses, il devient utile d'utiliser un histogramme pour la représentation des données. L'histo- gramme représente les points dans l'amas sous une nouvelle 42 2570192 forme, caractérisée par des nombres élevés sur l'axe de fréquence, et les points restants, avec de faibles va- leurs de fréquence, dans la zone environnante. Du fait de ces différences de valeurs distinctes dans le nouveau format, on peut identifier plus aisément l'amas. L'idée principale est ici de rechercher un pic central entouré par une vallée dans le nouvel espace à (d+l) dimensions. Les événements formant le pic sont des constituants de l'amas dans l'espace d'origine et on considère que les autres événements correspondent à du bruit. Le procédé d'extraction d'un amas comprend l'application d'un seuil à l'histogramme des données. Ceci comprend le choix d'un niveau, T, tel que toutes les fréquences supérieures à T soient projetées dans l'amas, tandis que les autres fréquences sont projetées dans le fond. Du fait que la génération d'histogrammes multidi- mensionnels n'est pas pratique, la technique la plus effi- cace et qui procure le plus d'information consiste à for- mer un histogramme à deux paramètres. Celui-ci est similai- re à une image bidimensionnelle, et les valeurs de fré- quence sont équivalentes aux niveaux de gris. L'algorithme qui est établi ci-après calcule l'histogramme pour deux paramètres sélectionnés, détecte un pic, calcule un seuil, identifie la partie de l'histogramme dans laquelle se trou- ve un amas, et extrait des données d'origine les événements qui constituent l'amas. L'algorithme préféré comprend la construction d'un histogramme bidimensionnel pour deux des quatre paramètres de mesure, qui a une résolution inférieure à la résolution maximale possible qui existe dans les mesures d'origine. Le choix d'une résolution inférieure préserve les caractéristi- ques importantes de l'amas d'origine, mais réduit les exigen- ces de calcul et de mémoire qui sont imposées aux étapes sui- vantes. Avec des résolutions plus faibles, de petits amas situés à proximité d'un grand peuvent être indétectables. 43 2570192 En utilisant un détecteur de crête sur l'histogramme bidi- mensionnel, on peut découvrir la région intéressante et il suffit de conserver cette région pour une analyse ul- térieure. La tâche principale est ici de trouver la par- * tie de "l'image" qui diffère du fond de façon significa- tive. En d'autres termes, il est nécessaire de définir la frontière autour du pic qui délimite l'amas. Une fois qu'on a déterminé le seuil, on peut définir le contour d'un amas en marquant des régions qui contiennent des franchissements du seuil. L'étape consistant à trouver le contour de la région est importante pour l'identifica- tion de particules dans l'amas à partir de l'ensemble de données d'origine. Avec la possibilité de prélever, dans les données d'origine, les événements qui forment l'amas, l'algorithme peut parvenir à une sensibilité maximale dans la caractérisation d'un amas, en utilisant les deux paramètres restants. La figure 10B montre les amas résultants après l'application de l'algorithme de recherche d'amas aux en- sembles de données d'origine, représentés sur la figure A. On voit clairement que plusieurs amas de fond non si- gnificatifs sont éliminés et que seuls les amas prédomi- nants sont conservés. Dans l'analyse d'amas pour la classification bactérienne, il est souhaitable de prouver qu'une différen- ce entre deux classes est significative. Ceci est basé sur l'utilisation de tests statistiques qui ont une sensibilité élevée en ce qui concerne la détermination du caractère si- gnificatif de différences observées. On peut employer di- vers tests statistiques couramment utilisés en analyse à plusieurs variables, pour déterminer le caractère significa- tif de ces différences. A titre d'exemple, on peut employer une analyse à plusieurs variables pour déterminer le carac- tère significatif d'une différence entre les vecteurs mo- yens de deux distributions à plusieurs variables. On peut 44 2570192 en outre employer un autre test pour détecter de petites différences dans la structure de variance-covariance de deux échantillons. Dans les paragraphes précédents, on a traité l'apprentissage supervisé dans l'hypothèse selon laquelle les fonctions de densité sous-jacentes étaient approxima- tivement normales. Bien que cette hypothèse semble raison- nable du fait de l'intense agglutination unimodale des données bactériennes et des résultats satisfaisants, les formes paramétriques courantes sont rarement exactement adaptées aux densités. Par conséquent, des méthodes non paramétriques de reconnaissance des formes entrent égale- ment dans le cadre de l'invention. Une telle technique non paramétrique de reconnaissance des formes correspond à la règle des voisins les plus proches, qui saute l'es- timation de probabilité et passe directement aux fonctions de décision. Grossièrement, les règles des voisins les plus proches échangent la nécessité de connaître les distribu- tions sous-jacentes contre celle de connaître un grand nombre de configurations. Les idées fondamentales qu'on trouve derrière cette technique sont que des points qui tombent près les uns des autres dans l'espace des carac- téristiques ont de fortes chances d'appartenir à la même classe ou d'avoir approximativement les mêmes probabili- tés d'appartenir à leurs classes respectives. La première de ces idées conduit à la formulation de la règle du voi- sin unique le plus proche, tandis que la seconde conduit à la formulation de la règle des k voisins les plus pro- ches. La mise en oeuvre dans un classificateur de la règle des k voisins les plus proches n'est pas aussi com- pliquée que les techniques décrites précédemment. Pour cha- que événement inconnu, la règle des voisins les plus proches calcule les distances entre toutes les paires de points et trie les valeurs en ordre croissant. On détermine ensuite les k points les plus proches et leurs appartenances. Parmi ces k points, on sélectionne pour la particule in- connue la classe qui contient la majorité d'événements. Cependant, si le nombre total d'événements dans la classe sélectionnée ne dépasse pas une valeur de seuil, L, on classe les particules inconnues dans la catégorie des particules de fond. La valeur de seuil protège le classi- ficateur contre une erreur de classification excessive, en recourant à une telle option de rejet. En tant qu'algorithme de classification non paramétrique, la règle des k voisins les plus proches re- pose sur la similitude ou la proximité dans l'espace des caractéristiques, plutôt que sur la vraissemblance maxi- male, en tant que base pour la détermination de l'appar- tenance à une classe.FUleaffecte la particule inconnue à la classe en examinant une mesure de similitude définie pour toutes les paires d'objets dans toutes les classes. La mesure de similitude qui est utilisée est de préféren- ce la distance euclidienne. La justification théorique de la procédure de la règle des k voisins les plus proches est basée sur une taille d'échantillon infinie, ce qui est une condition qu'on rencontre rarement en pratique. On ne doit donc uti- liser la règle des k voisins les plus proches que lors- qu'on dispose d'un très grand ensemble d'apprentissage (fi- chier d'étalonnage). L'invention procure donc un procédé et un appareil de cytométrie à écoulement pour la détection et la classi- fication de particules biologiques. Conformément aux princi- pes de l'invention, on a élaboré des techniques de recon- naissance des formes qui améliorent notablement les perfor- mances de la détection et de la classification de particules biologiques. On a démontré ici que la classification de par- ticules par cytométrie à écoulement est améliorée qualitati- 46 2570192 vement par une analyse qui utilise simultanément toutes les caractéristiques mesurées des particules étudiées. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées au dispositif et au procédé dé- crits et représentés, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Appareil de cytométrie à écoulement (11) destiné à la détection de particules biologiques intéres- santes dans un échantillon de particules biologiques in- connues (17), caractérisé en ce qu'il comprend: des mo- yens (18, 19) destinés à faire passer des particules (17) dans un courant de fluide (16) , pratiquement une à la fois; des moyens (12, 15) destinés à produire un fais- ceau d'éclairage incident dirigé vers les particules (17) dans le courant (16); des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter des données liées à la lumière qui sont associées à chaque particule en mouvement (17) , lorsqu'elle traverse le faisceau d'éclairage (14); des moyens (28) destinés à établir une classe de particules ayant des caractéristiques communes, sur la base des don- nées liées à-la lumière qui sont détectées pour une telle classe de particules, et à enregistrer de telles données liées à la lumière; des moyens (28) destinés à comparer ces données enregistrées avec des données liées à la lu- mière qui sont détectées à partir de particules d'échan- tillon d'une classe inconnue; et des moyens (28) destinés à déterminer que des particules provenant de la classe in- connue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la concordance des données respectives liées à la lumière. 2. Appareil selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que les moyens destinés à détecter des données liées à la lumière comprennent des moyens (21, 22, 24, , 26, 27) destinés à détecter plusieurs signaux lumineux différents. 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens de détection comprennent des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter de la lumière diffusée par les particules et de la lumière de fluores- cence émise par les particules qui traversent le faisceau d'éclairage (14). 48 2570192 4. Appareil selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les moyens de détection (21, 22, 24, 25, 26, 27) détectent simultanément les signaux de lumière diffusée et de fluorescence. 5. Appareil selon la revendication 3,caracté- risé en ce que les moyens de détection comprennent des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter la lumière diffusée dans au moins deux directions différen- tes, et à détecter la lumière de fluorescence émise par des particules (17) à un minimum de deux longueurs d'on- de différentes. - 6. Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les moyens (28) destinés à établir et à enregistrer une classe de particules comprennent un cir- cuit électrique avec une mémoire, et ce circuit comprend des moyens destinés à convertir des signaux lumineux en signaux électriques. 7. Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les moyens destinés à comparer les don- nées (28) comprennent des moyens mettant en oeuvre une fonction de décision qui divisent l'espace pour la mesure des données lumineuses en une région qui contient les points de données de particules d'échantillon appartenant à la classe établie. 8. Appareil selon la revendication 7, caracté- risé en ce que les moyens mettant en oeuvre une fonction de décision (28) comprennent des moyens destinés à trans- former les données de l'espace de mesure dans le but de grouper les points de données représentant des éléments de ladite classe. 9. Appareil selon la revendication 8, caracté- risé en ce que les moyens de transformation de groupage (28) sont capables de transformer des vecteurs concernant des données de configuration de l'espace de mesure en vec- teurs d'un nouvel espace, conformément à la relation: x' =W x et dans cette relation x est le vecteur d'origine de l'espace de mesure, x' est le vecteur trans- formé, et W est la matrice de transformation, formée par des coefficients de pondération variables, wij. h. 10. Appareil selon la revendication 9, caracté- risé en ce que les moyens de transformation de groupage (28) sont capables de minimiser la distance, à l'intérieur d'un ensemble, entre des points de données de la classe établie. 11. Appareil selon la revendication 10, carac- térisé en ce que les moyens de transformation (28) sont capables d'utiliser la relation suivante pour minimiser la distance à l'intérieur d'un ensemble, pour des points de données dans l'espace transformé: n D = 25 (Wkk k) k=l avec les notations suivantes: D est la distance quadra- tique moyenne à l'intérieur de l'ensemble entre deux points dans un espace multidimensionnel, C est la variance d'échantillons sans biais des composantes dans la direc- tion x, Wkk est le facteur de pondération variable, et, pour minimiser D, n wkk 1 T 1 ()l/n kk j=l 12. Appareil selon la revendication 7, caracté- risé en ce que les moyens mettant en oeuvre une fonction de décision (28) comprennent en outre des moyens destinés à extraire des caractéristiques à partir des données enre- gistrées, pour la discrimination de données liées aux par- ticules inconnues (17). 13. Appareil selon la revendication 12, caracté- 2 570192 risé en ce que les moyens d'extraction (28) sont capa- bles d'extraire plusieurs caractéristiques des données enregistrées, chaque caractéristique étant une combinai- son linéaire de toutes les mesures concernant les don- nées enregistrées d'origine. 14. Appareil selon la revendication 13, carac- térisé en ce que les moyens d'extraction (28) sont capa- bles d'extraire des caractéristiques non corrélées des données enregistrées, lorsque les mesures de ces caracté- ristiques sont corrélées par nature, ce qui fait que la forme mathématique de la fonction qui mesure la corréla- tion entre les caractéristiques est une matrice de cova- riance. 15. Appareil selon la revendication 14, carac- térisé en ce que les moyens d'extraction (28) sont capa- bles de transformer les données enregistrées de l'espace de mesure d'origine en un autre espace de représentation, et de déterminer le sous-espace pour la classe qui préser- ve pratiquement les données disponibles dans l'espace de mesure d'origine, conformément à la relation mathématique suivante: C' = WWT, dans laquelle C' est la matrice de covariance transformée, C est la matrice de covariance d'origine, W est la matrice de transformation formée par -T des coefficients de pondération variables, wij, et WT est la forme transposée de la matrice de transformation, W. 16. Appareil selon la revendication 15, caracté- risé en ce que les moyens d'extraction (28) sont capables de découpler la covariance des caractéristiques des compo- santes en se basant sur une matrice modale qui transforme l'espace de mesure d'origine en un nouvel espace dans lequel la matrice de covariance est diagonale, et les coor- données du nouvel espace ne sont pas corrélées. 17. Appareil selon la revendication 16, caracté- risé en ce que les moyens de détermination (28) comprennent des moyens destinés à définir une région pour ladite classe établie, sous la forme d'une hypersphère avec un rayon spécifié dans le nouvel espace, et ces moyens de déter- mination sont en outre capables de déterminer qu'une particule inconnue (17) appartient à la classe établie si sa distance par rapport au centre de l'amas est infé- rieure au rayon de l'hypersphère. 18. Appareil (11) destiné à la détection de particules (17) dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend: une zone de détection (20) pour la dé- tection de caractéristiques de particules (17); des mo- yens (18, 19) destinés à faire passer des particules, pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16) traversant la zone de détection (20); des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter des données associées aux caractéristiques de chaque particule en mou- vement, lorsqu'elle traverse la zone de détection (20); des moyens (28) destinés à établir une classe de particu- les ayant des caractéristiques communes, conformément à une configuration de données détectée à partir d'une telle classe de particules; et des moyens (28) destinés à déter- miner que des particules d'échantillon d'une classe incon- nue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la reconnaissance de ladite configuration dans des données détectées à partir de particules d'échantillon. 19. Appareil de cytométrie à écoulement (11) des- tiné à la détection de particules biologiques intéressantes dans une population hétérogène de particules biologiques (17), caractérisé en ce qu'il comprend: des moyens (18, 19) destinés à faire passer des particules (17), pratique- ment une à la fois, dans un courant de liquide (16); des moyens (12, 15) destinés à produire un faisceau d'éclaira- ge incident (14) dirigé vers les particules (17) dans le courant (16); des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter simultanément la lumière diffusée par chaque par- ticule en mouvement et la lumière de fluorescence émise par chaque particule en mouvement, lorsqu'elle traverse le faisceau d'éclairage (14); des moyens (28) destinés à établir une classe de particules ayant des caractéristi- ques communes basées sur des données liées à la lumière diffusée et à la lumière de fluorescence, qui sont détec- tées à partir d'une telle classe de particules, et à en- registrer de telles données; des moyens (28) destinés à transformer des données liées à la lumière, détectées à partir de particules d'échantillon (17) d'une classe in- connue, afin de grouper les points de données ainsi trans- formés; des moyens (28) destinés à extraire des caracté- ristiques à partir des données enregistrées, pour la dis- crimination de données liées aux particules inconnues; et des moyens (28) associés aux moyens de transformation et d'extraction dans le but de déterminer que des parti- cules provenant de la classe inconnue appartiennent à la classe établie, du fait de la concordance de données res- pectives liées à la lumière. 20.Appareil de cytométrie à écoulement (11) des- tiné à la détection et à la classification de particules biologiques intéressantes dans un échantillon de particu- les biologiques inconnues (17), caractérisé en ce qu'il comprend: des moyens (18) destinés à faire passer des par- ticules (17), pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16); des moyens (12, 15) destinés à produire un faisceau d'éclairage incident dirigé vers les particu- les (17) dans le courant (16); des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter des données liées à la lumière et associées à chacune des particules en mouvement (17), lorsqu'elle traverse le faisceau d'éclairage (14); des mo- yens (28) destinés à établir une classe de particules ayant des caractéristiques communes, sur la base de la lu- mière détectée à partir de cette classe de particules, et à enregistrer ces données liées à la lumière; des moyens (28) destinés à séparer cette classe en plusieurs sous- classes, les données liées à la lumière étant enregis- trées séparément pour chaque sous-classe; des moyens (28) destinés à comparer ces données enregistrées à des données relatives à la lumière qui sont détectées à par- tir de particules d'échantillon (17) d'une classe incon- nue; et des moyens (28) destinés à déterminer que des particules provenant de la classe inconnue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la concordance de données respectives liées à la lumière, et à identifier les sous-classes auxquelles appartiennent les particules inconnues. 21. Appareil selon la revendication 20, carac- térisé en ce que les moyens de détection (28) sont capa- bles de caractériser de façon numérique les sous-classes, par représentation vectorielle dans un espace. 22. Appareil selon la revendication 21, carac- térisé en ce que les moyens de détermination (28) sont capables de projeter des particules pour les faire cor- respondre à des points et de projeter des sous-classes de particules pour les faire correspondre à des amas, dans un espace ayant un nombre de dimensions limité. 23. Appareil selon la revendication 22, caracté- risé en ce que les moyens de détermination (28) accomplis- sent cette projection en établissant une présentation bi- dimensionnelle de données quadridimensionnelles. 24. Appareil selon la revendication 23, caracté- risé en ce que les moyens de détermination (28) sont capa- bles d'extraire des données quadridimensionnelles enregis- trées les caractéristiques qui sont les plus importantes dans un but de classification, et de transformer de façon linéaire les vecteurs de représentation des amas d'origine en un nouveau système de coordonnées dans lequel les varia- bles de coordonnées ne sont mutuellement pas corrélées et les données provenant des amas d'origine sont concentrées sur les quelques premiers axes du nouveau système de coordonnées. 25. Appareil selon la revendication 24, carac- térisé en ce que les moyens de détermination (28) ex- traient lesdites caractéristiques en effectuant une ana- lyse par vecteurs propres d'une matrice de covariance qui est associée à des données des amas d'origine, et en utilisant les deux plus grandes valeurs propres de la matrice de covariance en tant que base pour le nouvel ensemble bidimensionnel. 26. Appareil selon la revendication 20, carac- térisé en ce que les moyens de détermination (28) sont capables d'identifier des sous-classes par l'utilisation de moyens de décision statistiques. 27. Appareil selon la revendication 26, carac- térisé en ce que les moyens de décision statistiques (28) sont capables de diviser la région d'enregistrement des données d'origine en plusieurs sous-régions mutuellement exclusives et exhaustives, correspondant au nombre de sous-classes, et d'affecter une particule à l'une des sousclasses si ses données liées à la lumière donnent la probabilité la plus élevée dans la sous-région associée. 28. Appareil selon la revendication 20, carac- térisé en ce que les moyens de détermination (28) sont capables d'identifier des sous-classes en distinguant des particules intéressantes par rapport à des particules de fond, sur la base des données représentant la structure des particules, pour délimiter la frontière entre le si- gnal et le bruit. 29. Appareil selon la revendication 28, caracté- risé en ce qu'il comprend des moyens (28) destinés à grou- per des données représentant des sous-classes de particules, en codant pour chaque sous-classe de particules un ensemble de nombres produits par deux transformations mathématiques, chacun de ces ensembles étant en outre représenté fonc- tionnellement par un centre et un rayon dans l'espace trans- formé, et en ce qu'une particule inconnue est identifiée comme appartenant à une sous-classe si son vecteur de données tombe dans l'ensemble de nombres codé spécifique. 30. Appareil selon la revendication 20, carac- térisé en ce que les moyens de détermination (28) sont capables d'identifier des sous-classes en distinguant des amas de particules intéressantes par rapport à d'autres amas ou à des particules de fond, en se basant sur les données représentant la structure des particules pour dé- limiter la frontière entre des amas. 31. Appareil selon la revendication 30, caracté- risé en ce qu'il comprend des moyens (28) destinés à dis- tinguer des amas en utilisant un histogramme pour la repré- sentation des données, et en ce que les points de données dans l'histogramme sont projetés sous une nouvelle forme qui se caractérise par des nombres élevés de ces points sur l'axe de fréquence correspondant, les points restants étant affectés à la zone environnante avec de faibles va- leurs de fréquence. 32. Appareil selon la revendication 31,caracté- risé en ce que l'histogramme est capable d'identifier un amas intéressant sous l'effet de l'application d'un seuil de fréquence aux données d'histogramme, de telle façon que toutes les fréquences supérieures au seuil soient proje- tées dans l'amas et que toutes les autres fréquences soient projetées dans la région de fond. 33. Appareil selon la revendication 20, caracté- risé en ce que les moyens de détermination (28) sont capa- bles d'identifier des sous-classes en examinant une mesure de similitude définie pour toutes les paires de points dans toutes les sous-classes. 34. Appareil selon la revendication 30, caracté- risé en ce que la mesure de similitude est la distance euclidienne entre toutes les paires de points. 35. Appareil selon la revendication 34, caractérisé en ce que les moyens de détermination (28) calculent la distance entre toutes les paires de points de données et trient les valeurs calculées en ordre croissant, pour dé- terminer les voisins les plus proches de tous les points, et les particules inconnues sont affectées à la sous- classe dans laquelle se trouve la majorité des points voi- sins. 36. Appareil selon la revendication 35, caracté- risé en ce qu'un nombre de points de seuil doit être dé- passé avant que les particules inconnues soient affectées à une sousclasse, et dans le cas contraire les particules sont classées comme étant des particules de fond. 37. Appareil de détection et de classification de particules (17) dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend: une zone de détection (20) destinée à dé- tecter des caractéristiques de particules (17); des moyens (18, 19) destinés à faire passer des particules (17), pra- tiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16) traversant la zone de détection (20); des moyens (21, 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter des données associées aux caractéristiques de chaque particule mobile (17), lors- qu'elle traverse la zone de détection (20); des moyens (28) destinés à établir plusieurs sous-classes de particules, ayant chacune des caractéristiques communes, conformément à une configuration de données détectées à partir de cha- cune de ces sous-classes de particules; et des moyens (28) destinés à déterminer que des particules d'échantillon pro- venant d'une classe inconnue appartiennent aux sous-classes établies, sous l'effet de la reconnaissance desdites confi- gurations dans des données détectées à partir de particu- les d'échantillon. 38. Procédé de détection de particules biologiques intéressantes dans un échantillon de particules biologiques inconnues, caractérisé en ce que: on fait passer des parti- cules (17), pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16); on établit un faisceau d'éclairage incident (14) dirigé vers les particules, dans le courant (16); on détecte des données liées à la lumière qui sont associées à chaque particule en mouvement (17), lorsqu'elle traver- se le faisceau d'éclairage (14); on établit une classe de particules ayant des caractéristiques communes, sur la base des données liées à la lumière qui sont détectées à partir d'une telle classe de particules, et on enregistre ces données liées à la lumière; on compare de telles don- nées enregistrées avec des données liées à la lumière qui sont détectées à partir de particules d'échantillon d'une classe inconnue; et on détermine que des particules pro- venant de la classe inconnue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la concordance de données respec- tives liées à la lumière. 39. Procédé selon la revendication 38, caracté- risé en ce que l'opération de détection comprend la détec- tion de plusieurs signaux lumineux différents. 40. Procédé selon la revendication 39, caractéri- sé en ce que l'opération de détection comprend la détection simultanée de signaux de lumière diffusée et de lumière de fluorescence. * 41. Procédé selon la revendication 40, caractéri- sé en ce que l'opération de détection comprend la détection de la lumière diffusée dans au moins deux directions diffé- rentes et la détection de la lumière de fluorescence émise par des particules à au moins deux longueurs d'onde diffé- rentes. 42. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que l'opération de comparaison comprend l'opération qui consiste à diviser l'espace pour mesurer les données liées à la lumière, en une région qui contient les points de données de particules d'échantillon appartenant à la classe établie. 43. Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que l'opération de division comprend en outre la transformation des données de l'espace de mesure, dans le but de grouper les points de données représentant des éléments de ladite classe. 44. Procédé selon la revendication 43, caracté- risé en ce que l'opération de transformation transforme des vecteurs relatifs à des données de configuration de l'espace de mesure en vecteurs d'un nouvel espace, con- formément à la relation suivante: x' = Wx, dans laquelle x est le vecteur d'origine de l'espace de mesure, x' est le vecteur transformé, et W est la matrice de transforma- tion, formée par des coefficients de pondération varia- bles, wij. 45. Procédé selon la revendication 44, caractéri- sé en ce que l'opération de transformation comprend l'opé- ration consistant à minimiser la distance, à l'intérieur d'un ensemble, entre des points de données de la classe établie. 46. Procédé selon la revendication 42, caractéri- sé en ce que l'opération de division comprend l'extraction de caractéristiques à partir des données enregistrées, pour la discrimination de données liées aux particules inconnues (17). 47. Procédé selon la revendication 46, caractéri- sé en ce que l'opération d'extraction comprend l'extraction de plusieurs caractéristiques des données enregistrées, cha- que caractéristique étant une combinaison linéaire de toutes les mesures portant sur les données enregistrées d'origine. 48. Procédé selon la revendication 47, caractéri- sé en ce que l'opération d'extraction comprend l'extraction de caractéristiques non corrélées des données enregistrées, lorsque les mesures de ces caractéristiques sont corrélées par nature, ce qui fait que la forme mathématique de la fonc- tion qui mesure la corrélation entre les caractéristiques est une matrice de covariance. 49. Procédé selon la revendication 48, caracté- risé en ce que l'opération d'extraction comprend la trans- formation des données enregistrées de la mesure d'origine en un autre espace de représentation, et la détermination du sous-espace pour la classe qui préserve pratiquement les données disponibles dans l'espace de mesure d'origine, conformément à la relation mathématique suivante: _---T C' = dans laquelle C' est la matrice de covariance transformée, C est la matrice de covariance d'origine, W est la matrice de transformation formée par des coeffi- -T cients de pondération variables, wij, et W est la forme transposée de la matrice de transformation, W. 50. Procédé de détection de particules dans un échantillon, caractérisé en ce que: on fait passer des particules (17), pratiquement une à la fois, dans un cou- rant de fluide (16) traversant une zone de détection (20); on détecte des données associées à des caractéristiques de chaque particule en mouvement (17), lorsqu'elle traver- se la zone de détection (20); on établit une classe de par- ticules ayant des caractéristiques communes, conformément à une configuration de données détectées à partir d'une telle classe de particules; et on détermine que des parti- cules d'échantillon provenant d'une classe inconnue appar- tiennent à la classe établie, sous l'effet de la recon- naissance de ladite configuration dans des données détec- tées à partir des particules d'échantillon. 51. Procédé de détection de particules dans un échantillon, caractérisé en ce que: on établit une classe de particules (17) ayant des caractéristiques communes con- nues, conformément à une configuration de données détectées à partir d'une telle classe de particules connues; et on dé- termine que des particules d'échantillon provenant d'une classe inconnue appartiennent à la classe établie, sous l'effet de la reconnaissance de ladite configuration dans des données détectées à partir des particules d'échantillon. 52. Procédé de détection et de classification de particules biologiques intéressantes à partir d'un échantillon de particules biologiques inconnues, carac- térisé en ce que: on fait passer des particules (17), pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16); on établit un faisceau d'éclairage incident (14) dirigé vers les particules (17) dans le courant (16); on détecte des données liées à la lumière qui sont associées à cha- que particule en mouvement (17), lorsqu'elle traverse le faisceau d'éclairage (14); on établit une classe de parti- cules ayant des caractéristiques communes, sur la base des données liées à la lumière qui sont détectées à partir d'une telle classe de particules, et on enregistre de telles données liées à la lumière; on sépare cette classe en plusieurs sous-classes, en enregistrant séparément les données liées à la lumière pour chaque sous-classe; on compare les données enregistrées à des données liées à la lumière qui sont détectées à partir de particules d'échantillon d'une classe inconnue; et on détermine que des particules provenant de la classe inconnue appartien- nent à la classe établie, sous l'effet de la concordance de données respectives liées à la lumière, et on identifie les sous-classes auxquelles appartiennent les particules inconnues. 53. Procédé selon la revendication 52, caracté- risé en ce que l'opération de détermination comprend la ca- ractérisation numérique des sous-classes par une représen- tation vectorielle dans un espace. 54. Procédé selon la revendication 53, caracté- risé en ce que l'opération de détermination comprend la pro- jection de particules de façon à donner des points et la projection de sous-classes de particules de façon à donner des amas, dans un espace ayant un nombre de dimensions li- mité. 55. Procédé selon la revendication 54, caracté- risé en ce qu'on effectue la projection en établissant une présentation bidimensionnelle de données quadridimension- nelles. 56. Procédé selon la revendication 55, caracté- risé en ce que l'opération de détermination comprend l'extraction, dans les données quadridimensionnelles enre- gistrées, des caractéristiques qui sont les plus impor- tantes dans un but de classification, et la transformation des vecteurs de représentation des amas d'origine en vec- teurs d'un nouveau système de coordonnées, dans lequel les variables de coordonnées ne sont mutuellement pas corré- lées, et les données provenant des amas d'origine sont concentrées dans les quelques premiers axes du nouveau sys- tème de coordonnées. 57. Procédé selon la revendication 52, caractéri- sé en ce que l'opération de détermination identifie des sous-classes par une opération de décision statistique qui comprend la division de la région d'enregistrement des données d'origine en plusieurs sous-régions mutuellement exclusives et exhaustives, correspondant au nombre de sous- classes, et l'affectation d'une particule à l'une de ces sous-classes si ses données liées à la lumière donnent la plus grande probabilité dans la sous-région associée. 58. Procédé selon la revendication 57, caracté- risé en ce que l'opération de division comprend le groupage de données représentant des sous-classes de particules, par codage d'un ensemble de nombres pour chaque sous-classe de particules résultant de deux transformations mathématiques, chacun de ces ensembles étant en outre représenté fonction- nellement par un centre et un rayon dans l'espace transformé, et en ce qu'une particule inconnue est identifiée comme ap- partenant à une sous-classe si son vecteur de données tombe dans l'ensemble de nombres codé spécifique. 59. Procédé selon la revendication 52, caractérisé en ce que l'opération de détermination pour l'identification de sous-classes comprend la distinction d'amas de particules intéressantes Dar rapport à d'autres amas ou à des particu- les de fond, sur la base des données representant la struc- ture des particules, pour délimiter la frontière entre des amas. 60. Procédé selon la revendication 52, caracté- risé en ce que l'opération de détermination pour l'identi- fication de sous-classes comprend l'examen d'une mesure de similitude qui est définie pour toutes les paires de points dans toutes les sous-classes. 61. Procédé selon la revendication 60, caracté- risé en ce que l'opération d'examen comprend le calcul de la distance entre toutes les paires de points de données et le tri en ordre croissant des valeurs calculées, pour déterminer les voisins les plus proches de tous les points, des particules inconnues étant affectées à la sous-classe dans laquelle on trouve la majorité de points voisins. 62. Procédé selon la revendication 52, caracté- risé en ce que les particules à détecter et à classer sont des cellules. 63. Procédé selon la revendication 52, caractéri- sé en ce que les particules à détecter et à classer consis- tent en plusieurs sous-classes de bactéries. 64. Procédé selon la revendication 63, caracté- risé en ce que les bactéries à détecter et à classer pro- viennent d'un échantillon de fluide biologique. 65. Procédé selon la revendication 64, caractérisé en ce que le fluide biologique est de l'urine. 66. Procédé selon la revendication 52, caractérisé en ce que les particules à détecter et à classer consistent en différentes sous-classes de leucocytes. 67. Procédé selon la revendication 52, caracté- risé en ce que l'opération d'établissement comprend la pré- paration d'un échantillon de liquide avec une concentration élevée d'un type connu de particules (17) ayant des carac- téristiques communes, et la détection de données liées à la 63 2570192 lumière à partir d'une telle classe connue de particules, pour établir une région ayant une configuration reconnais- sable de points de données. 68. Procédé de détection et de classification de particules dans un échantillon, caractérisé en ce que: on fait passer des particules (17), pratiquement une à la fois, dans un courant de fluide (16) traversant une zone de détection (20), on détecte des données associées à des caractéristiques de chaque particule en mouvement (17) lorsqu'elle traverse la zone de détection (20); on éta- blit plusieurs sous-classes de particules, ayant chacune des caractéristiques communes connues, conformément à des configurations de données associées à de telles sous- classes de particules; et on détermine que des particules d'échantillon provenant d'une classe inconnue appartiennent aux sous-classes établies, sous l'effet de la reconnaissan- ce desdites configurations dans des données associées aux particules d'échantillon. 69. Procédé de détection et de classification de particules dans un échantillon, caractérisé en ce que: on établit plusieurs sous-classes de particules ayant chacune des caractéristiques communes connues, conformément à des configurations de données associées à de telles sous-classes de particules; et on détermine que des parti- cules d'échantillon provenant d'une classe inconnue-appar- tiennent aux sous-classes établies, sous l'effet de la re- connaissance desdites configurations dans des données associées aux particules d'échantillon.