Brevet FR2566403A1 — publié le 19851227

Imidazolides, procédé d'obtention et application à titre d'intermédiaires de synthèse de conjugués cytotoxiques. La présente invention concerne des nouveaux imidazolides et un procédé pour leur obtention. Les imidazolides selon l'invention conviennent notamment comme agents de couplage de protéines, en particulier pour la synthèse de conjugués cytotoxiques utilisables en thérapeutique. Les composés selon l'invention répondent à la formule dans laquelle - E est une structure d'espacement inerte; - G représente un groupe ou un groupe -S-S-X, dans lequel X est un groupe activateur. Le terme "structure d'espacement inerte" tel qu'utilisé dans la présente description désigne un radical organique bivalent inerte vis-à-vis des réactifs utilisés dans le procédé. de synthèse de conjugués cytotoxiques, tel qu'un groupe alkylène'à chaîne droite ou ramifiée contenant de 1 à 15 atomes de carbone, qui peut contenir une ou plusieurs doubles liaisons ou qui peut être interrompu par des atomes d'oxygène ou qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, tels que des groupes méthoxy, des groupes carboxyles libres ou estérifiés, des groupes dialkylamino, des groupes carbamates. Le même terme désigne également un groupe arylène contenant de 6 à 15 atomes de carbone, qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, comme indiqué ci-dessus pour le groupe alkylène. Le terme "radical activateur tel qu'utilisé ici pour X désigne un groupement lié à un pont -S-S capable de réagir avec un thiol libre pour former un disulfure avec libération de X-SH. Des radicaux activateurs convenables sont les groupes pyridyl-2 et pyridyl-4, non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle; le groupe phényle non substitué ou, de préférence, substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alkoxy, carboxyle ou alkoxycarbonyle; ou un groupe alkoxycarbonyle tel que méthoxycarbonyle. Les termes "alkyle" et "alkoxy" désignent des groupes contenant jusqu a 5 atomes de carbone. Le terme "alkylène" désigne des groupements aliphatiques saturés, à chaine droite ou ramifiée, contenant jusqu'à 10 atomes de carbone, pouvant être substitués par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, tels que les groupes alkoxycarbonyle. Les composés de formule I, dans laquelle E représente un groupe alkylène tel que défini cidessus conviennent particulièrement bien comme agents de couplage de protéines. Les composés de formule I, dans laquelle E représente un groupe -(CH2 - où p est compris entre 2 et 7 ou un groupe de formule -CH-CH2COOH sont préférés. Particulièrement préférés sont les composés de formule I dans laquelle E représente un groupe -(CH2)p-, où p est un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe et G est un groupement de structure -S-S-X, où X est un radical activateur choisi parmi les groupes 2-pyridyle et 4-pyridyle non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle, le groupe phényle non substitué ou substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alkoxy, carboxyle ou alkoxycarbonyle, ou un groupe alkoxycarbonyle. Les nouveaux composés de formule I sont préparés par le procédé qui consiste à faire réagir un composé de formule G-E-COOH II dans laquelle G et E sont tels que définis ci-dessus, avec le carbonyldiimidazole de formule dans un solvant organique, à la température de 10 à 40"C. Les solvants éthérés, tels que le dioxanne et le tétra hydrofuranne sont particulièrement préférés. Les composés de formule I sont particu lièrement utiles comme agents de couplage sur les hydroxyles des tyrosines de protéines, telles que les protéines A et P, définies ci-aprèspour l'obtention des conjugués ou immunotoxines qui font l'objet de la demande de brevet franchais, déposée ce jour au nom de la demanderesse et intitulée "nouveaux conjugués cytotoxiques utilisables en thérapeutique et procédé d'obtention". Ces immunotoxines répondent à la formule statistique suivante P'-W-A' IV dans laquelle P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convenablement modifié, privé d'une ou plusieurs fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, A' représente le radical d'une protéine qui est la sousunité A de la ricine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'au moins une de ses fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont les atomes de soufre sont soit ceux des cystéines de P et A, soit sont liés aux fonctions propres de P etou de A par des structures despa- cement portant un groupe fonctionnel lié auxdites fonctions propres de P et/ou de A; avec la limitation que, dans le cas où W contient un groupe disulfure, lorsqu'un des atomes de soufre dudit disulfure est celui de l'une des cystéines de A, l'autre soufre est lié à la protéine P par une structure d'espacement portant un groupe fonctionnel lié à une fonction de la protéine P autre qu'une fonction aminé. Par liaison thioéther entre deux protéines, on entend une liaison du type dans laquelle Z, Y et E sont tels que définis ci-dessous. Les immunotoxines préférées répondent à la formule statistique-O P' -W' -A' V dans laquelle P' et A' sont tels que définis ci-dessus et W' représente une structure covalente choisie parmi : (a) un groupement de formule (b) un groupement de formule (c) un groupement de formule -Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z' )n- (d) un groupement de formule - (NH-Y'-E' )n-S-E-Y-Z- où - Z et Z' représentent les fonctions propres des protéines A et P, choisies parmi l'atome d'oxygène provenant de l'hydroxyle de l'un des résidus de tyrosine; le groupe carbonyle provenant de l'un des carboxyles terminaux ou des carboxyles libres des acides aspartiques et/ou glutamiques de A et de p; le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glusidiquesde Aetde P par l'acide périodique et le groupe -NH- provenant de l'une des amines terminales de A et de P ou de l'une des amines en position epsilon de l'un des résidus de lysine; - Z" est tel que défini ci-dessus pour Z et Z' mais ne peut pas être -NH-; - Y et Y' représentent des groupes fonctionnels capables de se lier d'une façon covalente avec l'une quelconque des fonctions Z, Z' et Z" des protéines A et P; ; - E et E' reprEsentent des structures d'espacement inertes; et - n représente zéro ou l. Les immunotoxines ci-dessus sont représentées par les formules IV et V en forme simplifiée, mais il est entendu que la structure covalente bivalente -W- ou -W'est liée à au moins une molécule P et d au reins une mol- cule A. Le nombre de liaisons avec les protéines P et A dépend du nombre des fonctions propres desdites protéines intervenant dans l'opération de couplage. Par exemple, si une immunotoxine est formée par couplage de la sous-unité A de la ricine native avec l'anticorps P (par exemple l'anticorps T101) par l'intermédiaire d'une structure covalente bivalente ayant un groupe disulfure dont un soufre est celui de la cystéine 257 de la channe A de la ricine et l'autre est lié aux oxygènes phénoliques des tyrosines de l'anticorps P par un, groupe oxopropylique, elle aura la formule statistique P'(O-CO-CH2-CH2-S-S-A')t dans laquelle t représente le nombre des tyrosines de l'anticorps (par exemple de l'anticorps TiOl) intervenues dans le couplage. L'immunotoxine ainsi obtenue correspond ainsi à un produit de formule V, où: - P' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de l'anticorps T101 privé de t fonctions phénoliques de ses tyrosines; - A' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de la chaine A de la ricine privée de la fonction thiol de sa cysteine 257; - ' est le groupement (c): - Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- OÙ Z" est l'oxygène des hydroxyles phénoliques intervenus dans le couplage, Y est -CC- ; E est la structure d'espacement inerte -CH2-CH2- et n est zéro. Particulièrement préférées sont les immunotoxines formées par une ou- plusieurs structures contenant la sousunité A de la ricine et un seul anticorps P, représentées par la formule statistique P'(W'-A')m VI dans laquelle P', W' et A' sont tels que définis ci-dessus et m représente le nombre de fonctions propres de la protéine P intervenues dans le couplage. Le nombre m varie de 0,3 à 12, de préférence de 0,5 à 10. L'expression "m varie de 0,3 à 12, de préférence de 0,5 à 10" signifie que la valeur de m est statistique car dans la population des molécules d'anticorps le couplage ne se produit pas dune façon homogène. Le nombre m peut donc ne pas être entier. La valeur de m dépend notamment des anticorps utilisés, plus particulièrement de leur poids moléculaire. Ainsi, si comme anticorps P de départ on utilise un fragment Fab ou Fab', la valeur de m pourra varier entre 0,3 et environ 2; si l'on utilise un fragment F(ab')2, m pourra varier entre 0,5 et environ 4; pour un anticorps du type IgG, la valeur de m sera entre 0,5 et 6; enfin, pour un anticorps IgM, la valeur de m pourra varier entre 1 et 12. Il est cependant préférable que le degré de substitution sur l'anticorps P soit tel qu'il.conduiseà une valeur de m non inferieu-reà 0,5 et non supérieure à 10. Plus généralement, les structures IV etV ci-dessus représentent des formules statistiques écrites de façon simplifiée, comme il a été spécifié ci dessus. Dune façon' analogue, les formules VII, VIII et XII cidessous sont également statistiques - lorsque, le cas échéant, n est i - car les réactifs de couplage sont prépares à partir de populations de protéines Pi et P2 qui ont toutes exactement les mêmes propriétés que celles prises en compte ci-dessus pour l'anticorps P, que ces protéines P1 et P2 soient elles-mêmes l'anticorps P ou la chaîne A de la ricine. Les immunotoxines ayant ia structure IV ci-dessus peuvent être obtenues par le procédé qui consiste à faire réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine P1, qui est indifféremment soit la sous-unité A de la ricine éventuellement modifié soit un anticorps ou- fragment d'anticorps porteuse d'au moins un groupe thiol libre attaché à ladite protéine Pi directement ou par l'intermédiaire d0une structure d'espacement, avec une protéine P2, différente de Pi, qui est indifféremment soit la sous-unité A de la ricine soit un anticorps ou- fragment d"anticorps, porteuse d'un groupement capable de couplage avec le thiol libre de la protéine Pi, de façon à former une liaison thioéther ou disulfure; avec la limitation que, dans le cas de la formation de la liaison disulfure, lorsque la protéine Pi est la sous- u-nité A de la ricine, la liaison avec la protéine P2 est effectuée sur une fonction de ladite protéine P2 autre que les fonctions amine Selon un aspect préférentiel, le procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la structure V, dans laquelle P', W' et A' sont tels que définis ci-dessus, consiste à faire réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine de formule P1'-(Z-Y-E)n-SH VII avec une protéine de formule statistique P2'-Z'-YI-E-G VIII où Pl'et P2' représentent les radicaux des protéines Pi et P2 liés aux fonctions propres desdites protéines ou les radicaux des protéines Pi et P2 provenant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide periodique, Z, Z', Y, Y', E et E' sont tels que définis ci-dessus et G représente un groupe ou un groupe -S-SX, où X est un groupe activateur, étant entendu que lorsque G est un groupe -S-S X et Pi' est la sous-unité A de la ricine, n est 1 ou bien n peut être zéro, mais, dans ce cas, Z' est autre que -NH-. Autant p que A sont donc des protéines qui présentent indifféremment (1) la ou- les fonctions thiol qui participent au couplage et (2) un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les fonctions thiol ci-dessus pour former une liaison disulfure ou- thioéther. Dans la présente description, lesdites fonctions thiol et groupements fonctionnels sont ceux des protéines P ou A natives, ou bien ils y sont introduits artificiellement Pour des raisons de clarté on précise cinaprès la signification des symboles utilisés pour désigner les protéines ci-dessus ou leurs radicauP et des expressions utilisées pour désigner les différents symboles. Le symbole P représente une protéine choisie parmi tout anticorps ou fragment d'anticorps, ou toute immunoglobu-line ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule dérivant des précédentes par modification artificielle de lun quelconque de leurs groupements fonctionnels, y compris des structures glucidiques qu'elles portent, sous réserve que la protéine ainsi choisie reste capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigène et notamment des cellules cancéreuses. Le symbole A représente une protéine qu-i est la sousunité dite chaine A de la toxine végétale ricine telle qu'elle peut étre directement obtenue à partir de la ricine naturelle ou toute molécule dérivant de cette chaine A par modification artificielle de tout groupement fonctionnel porté par cette protéine, y compris la structure glucidique quelle porte naturellement, sous réserve que la protéine ainsi choisie présente encore la propriété d'inhiber la synthèse protéique ribosomale des cellules eucaryotes telle que l'on peut la mettre en évidence dans un modèle d'étude acellulaire. Le symbole P' représente un radical dérivé de la protéine P ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole A: représente un radical dérivé de la protéine A ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole Pi représente une des protéines A et P telles que définies ci-dessus qui porte des fonctions thiol libres, attachées à ladite protéine directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement. Le symbole P2, différent de Pi, représente une des protéines A et P telles que définies ci-dessus, qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols libres. Le symbole PfP représente le radical de-la protéine Pl lié aux fonctions propres de la protéine Pi notamment les fonctions SH (de la cystéine), NH2 (terminal de la protéine ou- dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques) ou le radical de la proteinexPl, provenant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide périodique. Le symbole P2' représente le radical de la protéine P2 lié aux groupes fonctionnels caractéristiques NH2 (terminal de la protéine ou dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques). Par exemple, P1'-SH représente la protéine P1 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la sous-unité A de la ricine) dans laquelle les groupes SH des cystéines sont libres et les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. De la même façon, P1'-CO- représente la protéine P1, dans laquelle son groupe carboxylique terminal ou les groupes carboxyliques de ses acides glutamiques et aspartiques sont couplés avec un groupement qui apporte un groupe SH introduit artificiellement. Encore, P2'-NH- représente la protéine P2 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la sous-unité A de la ricine) dans laquelle son groupe amino terminal ou les groupes amino de ses lysines sont attachés à .un groupement susceptible de couplage avec le thiol de la protéine P1. L'expression "groupe fonctionnel capable de se lier d'une façon covalente" telle qu'utilisée ici pour Y et Y' désigne tous les-groupes susceptibles de réagir avec les fonctions propres des protéines P1 et P2 pour donner une liaison covalente. Ainsi, les groupes -CO- et -(C=NH)- sont des groupes fonctionnels convenables susceptibles de se lier aux amines libres, aux thiols et aux hydroxyles phénoliques des protéines. De même, le groupe -NH- est un groupe fonctionnel convenable susceptible de se lier aux groupes carboxyliques libres des protéines Le groupe N- est un groupe fonctionnel convenable susceptible de se lier aux dieux atomes de carbone des structures glucidiques des protéines P1 et P2 après oxydation avec les ions periodate. L'expression "fonction propre des protéines telle qu'utilisée ici pour Z, Z' et-Z" désigne les radicaux provenant des groupes caractéristiques des acides aminés formant les protéines P1 et P2, telles que l'atome d'oxygène provenant des hydroxyles des acides aminés tyrosine et éventuellement sérine, le groupe carbonyle provenant du carboxyle terminal ou des carboxyles libres des acides aspartique et glutamique, le groupe -NH- provenant de l'amine terminale des protéines ou des lysines, l'atome de soufre provenant du thiol de la cystéine La même expression désigne également le groupe provenant de la structure dialdéhydique' obtenue après oxydation d'une des structures glucidiques des protéines Pi et P2 par traitement avec les ions periodate. L'obtention de la chaîne A de ricine pure, nécessaire à la réalisation des immunotoxines définies cidessus, a été décrite dans le brevet US 4 340 535. La préparation dsanticorps monoclonaux dirigés contre des cellules cancéreuses humaines a été largement mentionnée dans la littérature scientifique et beaucoup de ces anticorps sont maintenant disponibles commercialement. Le couplage chimique entre la chaîne A de ricine et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) peut être réalisé selon des modes opératoires qui - préservent les activités biologiques respectives des deux composants du conjugué n 1 B anticorps et la chaîne A de ricine, - assurent au procédé une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage, - permettent de maîtriser la valeur du rapport chaîne A de ricine/anticorps dans le conjugué obtenu, - conduisent à un produit stable et soluble dans l'eau. Parmi les modes opératoires répondant à ces caractéristiques, il faut privilégier ceux qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour ltéta- blissement de la liaison entre les deux protéines. En effet, ces fonctions thiols se prêtent particulièrement bien à l'établissement soit de liaisons disulfure, soit de liaisons thioéther qui satisfont les unes comme les autres aux conditions générales ci-dessus. D'une façon générale, pour la bonne conduite des réactions de couplage entre protéines et en vue d'éliminer notamment les rE > ticu-lations anarchiques, il importe que l'une des protéines a coupler et elle seule porte la ou les fonctions thiol à mettre en oeuvre, alors que l'autre protéine et elle seule porte une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les thiols en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9 et à une température ne dépassant pas 300 C, pour fournir une liaison covalente stable et définie. Les caractéristiques des protéines Pi et P2 utilisées comme produits de départ sont illustrées en détail ciaprès. La structure d'espacement E peut être remplacée par les structures préférentielles R à R8 qui ne sont données qu'à titre d'exemple. I - CAS DE LA PROTEINE Pi Cette protéine étant dans tous les cas celle qu-i porte la ou les fonctions thiol qui participeront au couplage1 la situation se présente de façon diverse selon la nature de cette protéine Pi. A) La protéine Pi porte naturellement un ou plusieurs radicaux thiol utilisables pou permettre le couplage à la protéine P2 : c'est notamment le cas si la protéine Pi est le fragment d'anticorps connu sous la dénomination de F(ab) ', tel qu-'il est classiquement obtenu- par protéolyse limitée de l'anticorps en présence de pepsine, suivie d'une réduction du (ou- des ) ponts disulfure entre chaînes lourdes. C'est également le cas si la protéine Pi est la chaîne A de la ricine, ou un dérivé de cette chaîne A où l'un aumoins des groupements thiol portés par les résidus de cystéine 171 et 257 de la chaîne A de ricine native est libre et accessible au couplage chimique. Dans tous ces cas, la protéine Pi porteuse de son (ou ses) groupementX thiol naturels peut être utilisée dans cet état pou-r l'étape de couplage. B) La protéine Pi ne porte pas naturellement de radicaux thiol utilisables pour permettre le couplage a la protéine P2 - c'est notamment le cas si la protéine Pi est une immunoglobuline native, un anticorps entier ou un fragment d'anticorps et notamment l'un des fragments couramment dénommés F(ab)'2 ou F(ab), un autre cas ou la protéine Pi ne porte pas naturellement de fonction thiol utilisable pour le couplage est celui où cette protéine Pi est la chaîne A de ricine où chacun des deux résidus de cystéine est soit bloqué par alkylation, soit inaccessible a la modification chimique. Dans tous les cas, il conviendra alors d'introduire artificiellement sur de telles molEcu-les une ou plusieurs fonctions thiol aptes à permettre le couplage. Trois types de réaction peuvent être utilisés de préférence pou-r l'introduction de fonctions thiol: 1 - Le premier type de réaction est l'action de l'anhydride S-acétylmercapto succinique qui est capable d'acyler des fonctions aminées de la protéine. On pourra ensuite libérer les fonctions thiol par élimination duradical acétyl protecteur, par action de l'hydroxylamine, ainsi que cela a été décrit (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 4l-49, 1967).On pourra même, dans le cas où la (ou- les) fonction(s) thiol ainsi introduites sous forme prptégée doivent réagir ultérieurement avec un radical disulfure mixte activé, se dispenser de la déprotection préalable par l'hydroxylamine ; en effet, la réaction de formation de la liaison disulfure utilisant les réactifs objet de la présente invention se produit aussi bien avec le radical S-acétyl qu'avec le thiol libre. D'autres méthodes décrites dans la littérature scientifique peuvent aussi être utilisées pou l'introduction de fonctions thiol sur la protéine a modifier. 2 - Le deuxième type de réaction consiste à faire réagir la protéine par ses groupements carboxyliques avec une molécule diamine symétrique 'présentant un pont disulfu-re, de formule: H2N-R1-S-S-R1-NH2 dans laquelle Rl est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone La réaction se fait de préférence avec la cystamine [R1 = -(CH2)2-] en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'ethyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre, de l'un des dérivés suivants ou- du- mélange des deu-x:: P1'-CO-NH-R1-S-S-SR1-NH2 IVa P1'CO-NH-R1-S-S-R1-NH-CO-P1 IVb Un tel produit de réaction peut être alors utilisé de deux manières: a) Si dans les formules la -ou lb, la protéine P1 est la chaîne A de ricine ou l'un de ses dérivés le milieu réactionnel obtenu est soumis sans fractionnement à l'action d'un réducteur tel que le mercapto-2-éthanol,, ce qui conduit à l'obtention d'un dérivé protéique unique de formule générale:: pi '-CONH- Ri- SH Le produit ainsi obtenu- est alors purifié par dialyse ou filtration sur gel b) Si dans les formules IVaet IVb le radical P1' est le radical de la protéine P1 constituée par un anticorps ou l'un de ses fragments, le milieu réactionnel obtenu sera utilisé tel quel pour le couplage en utilisant alors une méthode d'échange thiol/disulfere par exemple celle décrite par Gilliland et Collier (Cancer Research, 40, 3564, 1980). 3 - Le troisième type de réaction consiste à utiliser des motifs glucidiques naturellement présents soit sur la chaîne A de ,ricine, soit sur les anticorps pour fixer le radical porteur du thiol que loon se propose d'introduire La protéine est alors soumise, à une oxydation par les ions periodate afin de faire apparaître des fonctions aldéhyde sur les motifs glucidiques Après arrêt de la réaction par addition d'un excès d'éthylène glycol et élimination des sou-s produ-its et- excès de réactifs par dialyse, le produit obtenu est traité par une molécule du aminée symétrique présentant un pont disulfure, de formule générale H2N-Rl- S- SRl-NH2 dans laquelle Rl est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. Les produits d 9 addition formés sont alors réduits en amines secondaires ou tertiaires par action d'un hydrure métallique convenable, notamment le borohydrure de sodium.La réaction se fait de préférence avec la cystamine tRl = -(CH2)2-j et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre de l'un des dérivés su-ivants ou du mélange des deux: Selon que, dans les formules Va ou Vb, le radical P1' est le radical de la protéine P1 constituée par la chaîne A de la ricine éventuellement modifiée ou un anticorps ou fragment d'anticorps, le milieu réactionnel obtenu pourra alors être traité exactement comme indiqué ci-dessus pour les produits caractérisés par les structures IVa ou IVb. Dans les deux derniers types de réaction d'introduction artificielle de groupements thiols décrits ci-dessus (ceux utilisant un réactif disulfure aminé symétrique) il est préférable que la proteine PI mise en oeuvre ne possède ni groupes SH libres, ni groupes amines libres. Dans le cas de la chaîne A et de ses derives cela peut toujours être réalisé par alkylation du ou des 5H naturels obtenue par réaction avec un réactif usuel des thiols tel que le N-ethylmaléìimide ou l'acide iodacétique ou l'un de ses dérives et par methylation des NH2 naturels selon le procédé de méthylation réductive décrit par WiEANS et FEENEY (Siochemistry 7, 2192 (1968)). On peut introduire ainsi dans la chaîne A de ricine native jusou'à 6 radicaux méthyle par mole. La protéine ainsi modifiée conserve l'intégralité de ses propriétés biologiques et notamment sa capacité à inhiber la synthèse protéique ribosomale dans les cellules eucaryotes. Dans les cas des anticorps ou fragments d'anticorps et plus généralement de toutes les substan.ces du premier groupe tel que défini précédemment qui ne possèdent pas de groupements SH naturellement libres, il conviendra de procéder à une méthylation réductive, par exemple selon la méthode de MEANS et FEENEY : on peut ainsi habituellement introduire plusieurs dizaines de radicaux m(thyle par mole d'anticorps sans modifier sa capacité à reconnaître sélectivement un antigène à la surface des cellules porteuses de cet antigène. II - CAS DE LA PROTEINE P2 Cette protéine est dans tous les cas celle qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols de la protéine P1 pour former une liaison soit disulfure, soit thiodther. Ces groupements fonctionnels, toujours artificiellement introduits sur la protéine P2 différent selon que l'on cherche à obtenir un couplage par liaison disulfure ou par liaison thioéther et sont choisis comme indiqué ci-après. 1) Cas de la liaison disulfure La préparation du conjugué peut alors être représenté par le schéma P1'-(Z-Y-E)n-SH + P2'-Z'-Y'-E'-S-S-X Pl'-(Z-Y-E)n-S-S-E'-Y'-Z'-P2' + X-SH La protéine P2 substituée par un atomes ce soufre activé est obtenue à partir de la protéine P2 ellemême ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution à l'aide d'un réactif lui-même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma P2 + L-Y'-R-S-S-X P2'-Z-Y'-R-S-S-X dans lequel P2 désigne la protéine à substituer .L-Y' représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine. Le groupement fonctionnel L-Y' est une fonction capable de se lier de fanon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, on citera notamment les fonctions phénols des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cas L-Y' pourra notamment représenter un groupement imidazolyl-l-carbonyl, réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction où le l-imidazolyle est L, le groupe CO est Y' et R4 est le groupe -R-S-S-X. Le composé de formule Ia est un imidazolide selon l'invention. Le radical -S-S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre.En parti culer, dans ce du sulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou- pyridyl 4, (ventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène ou carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle de pr-éférence substitué par un ou des groupes nitre ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne la structure d'espacement (indiquée comme E dans la formule générale Il ci-dessus) capable de porter simu-ltanément les substituants Y' et S - S - X. Il devra etre choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés.En particulier, le- groupe R peut être un groupe - (CH2)n- avec n compris entre l et 10, OU encore un groupe dans lequel R6 désigne l'hydrogène ou- un groupe alkyle ayant de i à 8 atomes de carbone et R5 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement tel quQun groupe carbamate où R7 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de i à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du- composé L-Y'-R-S-S-X avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteinre 20 % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou 10 8 en volume lorsqu'il s'agit dudiméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Apres quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse molécu-laire et, en particu-lier, les excès de réactif s. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre Z et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en-solu-tion aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 300 C, pendant un tempos variant de 1 heure à 24 heures. La solution aqueuse obtenue est éventuellement dialysée pou éliminer les produits de faible masse molécu-laire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. 2) Cas de la liaison thioéther La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir Pl'-(Z-Y-E)n-SH avec la protéine P2 sur laquelle aura préalablement été introduit un ou plusieurs radicau-x maleìimide. La réaction est alors représentée par le schéma suivant.cité comme exemple: dans lequel: -. R8 représente une structure d'espacement aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 15 atomes de carbone, inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement Z Z représente des groupes variables selon le type de groupement fonctionnel de la protéine P2 intervenant dans le couplage. Ainsi, Z = oxygène dans le cas d'un ester sur le phénol d'un résidu tyrosyle Z = NH dans le cas du couplage d'un groupement carboxylique activé sur un groupement aminé de la protéine Z = NH-CH2 dans le cas de la réaction d'une chlorométhylcétone sur un groupement aminé de la protéine. La protéine P2 substituée par le ou les groupes maléiimide est obtenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution de fonctions convenables de la protéine à l'aide dgun réactif lui-même porteur du groupement maleimideo Parmi ces fonctions convenables, on retiendra particulièrement les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine.Dans ce cas, le réactif porteur du radical mal'timide pourra être un réactif de formule générale lb c'est-d-dire un imidazolide selon l'invention, rdagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction La réaction des réactifs porteurs de malaimide avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteindre 20 % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire, tel que le butanoltertiaire ou 10 % en volume lorsqu'il s'agit du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine Pi est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30"C, pendant un temps variant de 1 heure à 24 heures. La solution obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faibles masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. Ainsi, les imidazolides selon l'invention conviennent comme agent de couplage des protéines Pl et P2. Ils permettent l'obtention des--nouveaux produits ayant la formule statistique P2:'.-0-CO-E-G XII dans laquelle : P 2 représente le radical d'une protéine choisie parmi (a) tout anticorps ou fragment d'anticorps ou toute immunoglobuline ou fragment d'immunoglobu-line ou toute molécule drivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels; et (b) la sous-u-nité A de la ricine ou toute molécule dérivant de ladite sous unité A par modification artificielle de lBun quelconque de leu-rs groupements fonctionnels; ledit radical étant privé dlun ou plusieurs groupes hydroxyles phénoliques des tyrosines l'atome d'oxygène est celui des groupes hydroxyles phénoliques manquant dans le radical P2"; - E et G sont tels que definis ci-dessus. Particulièrement préférés sont les composés de formule IX dans laquelle E représente un groupe -(CH2)p-, où p, est un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe et G est un groupement de structure -S-S-X, OÙ X est un radical activateur choisi parmi les groupes 2-pyridyle et 4-pyridyle, non substitués ou substitues par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle, le groupe phényle non substitué ou substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alkoxy, carboxyle ou- alkoxycar.boxyle, ou un groupe alkoxycarbonyle. Les produits de formule IX sont prépares en faisant réagir un produit de formule P2"-OH dans laquelle P2" est tel que défini ci-dessus et le groupe hydroxyle est l'hydroxyle phénolique manquant dans les tyrosines du radical P2", avec un compose de formule VI ci-dessus à une température de 10 à 400C dans un solvant aqueux contenant éventuellement un solvant organi que miscible à l'eau, tel que par exemple un solvant éthéré comme le dioxanne ou le tétrahydrofuranne. Les exemples qu suivent permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter la portée. Dans tous ces exemples, la préparation des conjugues sera décrite à partir de la chaîne A de ricine sous sa forme native, telle qu'elle est obtenue par le procédé décrit dans le brevet US 4 340 535. Les anticorps utilisés dans ces exemples sont soit l'anticorps monoclonal TiOl dirigé contre l'antigène T65 présent su les lymphocytes T humains et de nombreuses lignées de cellules de leucémies T humaines. Cet anticorps est celui décrit dans Journal of Immunology 125 (2), 725-7 (1980) Il est commercialement disponible auprès de HYBRITECH Inc. SAN DIEGO, California, USA - soit l'anticorps monoclonal ATTISE, dirigé contre l'antigène Thy 1.2 des lymphocytes murins. Cet anticorps est celui décrit dans Journal of Immu.nology 122, 2491-8 (1979) et a été obtenu à partir de lahybridome décrit dans Hybridoma l (l) 13-17 (1981) - soit un anticorps monoclonal anti-DNP. EXEMPLE 1 Pl = anticorps T101 sur lequel on a introduit un 5H par l'intermédiaire des amines. P2 = Chaîne A de ricine sur laquelle on a introduit un groupement disulfure activé par l'intermédiaire de l'hydroxyle des tyrosines. A) Préparation du réactif de couplage: Il, s'agit de l'imidazolide dérivé de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique (APDP). Cet imidazolide s'obtient en une seule étape à partir de l'APDP et du carbonyl diimidazole (CDI). 430 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique sont dissous dans 2 ml de THF. A cette solution sont ajoutés 405 mg de CDI. Le mélange est agité 1/4 h à 250C. On observe un dégagement gazeux de C02. Le milieu réactionnel est utilisé directement et immédiatement sans purification. B) Préparation de la chaîne A de ricine correctement fonctionnalisée 1) Blocage du thiol naturel par le N-éthylmaSé'iimide 15 ml de solution aqueuse de chaîne A de ricine à 8 mg/ml (soit 4,1 micromoles de chalne A) sont additionnés d'une solution aqueuse de mercapto-2-éthanolEde telle sorte que la concentration finale de ce dernier soit de 1%. La solution est laissée au repos une heure, puis dialysée en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 renouvelé pendant 40 heures à raison de 300 ml/h. Selon la méthode d'ELLMAN (Methods in Enzymology 25, 457, 1972), on a dosé 0,9 équivalent SH par mole de chaîne A de ricine. On procède au blocage de cette fonction SH par le N-éth maZiimide selon la méthode décrite dans Methods in Enzymology 11, 541 (1967). Pour cela, la chaîne A de ricine obtenue à l'étape précédente est incubée pendant 2 heures à 300C en présence de 20 équivalents de N-éthyl maléDmide par mole de chaîne A. On élimine l'excès de réactif par dialyse en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 renouvelé pendant 20 heures à raison de 500 ml/h. On obtient ainsi 13 ml d'une solution de chaîne A de ricine à 7 mg/ml, ne présentant plus de groupements thiol dosables par le réactif d'ELLMAN. Le produit ainsi obtenu est désigné ultérieurement sous l'appellation chaîne A (NEM). 2) Modification des tyrosines: A 18 mg de chaîne A (NEM) dans 10 ml de tampon phosphate 125 mM pH 7 (soit 0,6 micromoles) sont ajoutés goutte à goutte 300 microlitres de la solution de réactif de couplage dans le THF obtenue précédemment. Le milieu réactionnel est agité 15 min. à 250 C puis la solution est purifiée de l'excès de réactif par dialyse contre dutampon phosphate l25 SI pH 7. On obtient ainsi 9,5 ml d'une solution de chaîne A (NEM) modifiée à 1,55 mg/ml de protéine. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercaptoo2 éthanol, on constate que l'on a obtenu une chaîne A (NEM) modifiée portant 1,6 groupements activateurs par mole de chaîne A (NEM) C) Préparation de l'anticorps modifié:: A 45 mg d'une solution dlanticorps TlOl à 9 mg/ml, soit 0,3 micromoles, sont ajoutés 25 microlitres dune solution d'anhydride 5-acétyl mercapto succinique (SAMBA) à 170 mg/ml dans le dimé'thylformamide. Le milieu- réactionnel est agité pendant 2 heurtes à 4 C puis purifié par dialyse des réactifs contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 pendant 24 heures à un débit de 400 ml/heure. On obtient ainsi 4,1 mi d'une solution d'anticorps modifié à 8,6 mg/mlO A cette solution d'anticorps sont ajoutés 0,46 ml d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine 0,5 M. Après une incubation de l h à 300 C, le milieu réactionnel est purifié par dialyse des réactifs contre le tampon phosphate 125 mM pH 7. Par dosage spectrophotométrique des groupements -SH ainsi libérés par la méthode d'ELLMAN, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 5 groupements activateurs par mole d'anticorps. D) Préparation de l'immunotoxine: A 2,1 ml de la solution d'anticorps précédemment obtenue (soit O,11 micromole), on ajoute 5,2 ml de la solution de chaîne A modifiée (0,,27 micromoles) On laisse le mélange incuber 5 heu-res à 300 'C. Le milieu réactionnel est purifié sur colonne de Sephadex G100 avec mesure de la densité optique de l'effluent à 280 nm. On obtient 17 mi d'une solution d'immunotoxine à 1,1 mg/ml (soit 18,7 mg). Cette solution contientX 0,32 mg/ml en chaîne A (NEM) modifiée. Le tau-x de couplage moyen de cette préparation est de 2 chaînes A (NEM) par mole d'anticorps On obtient ainsi une immunotoxine de formule V ci-dessus; - Al est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes SH sont bloques par le N-éthylmaléimide - PB est le radical de 12 anticorps TlOl - W' est un groupement de formule (NH-Y'-E')n-S-S-E-Y-Z- dans laquelle Y' est -CO- . E' est -CH2CH2- E E est .Y est -COS e Z est -O- . n est I E) Test d'activité des immunotoxines La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique.dans les cellules eucaryotes par altération de la sous-unité ribosomale 60S. Les tests réalisés sont donc des tests deinhibition de la synthèse protéique, soit sur un modèle acellulaire (test n 1) soit sur un modèle cellulaire (test n 2) l) Le modèle acellulaire (test ne l) Le protocole in vitro utilise des fractions subcellulaires de foie de rat convenablement complémentées et capables d'incorporer la 14C-phénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel : l'acide polyuridyliqueO Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14C phÇnylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans Biochemica Biophysica Acta 312, 608-615 (1973), mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépato,cytes de rat L'échantillon contenant la channe A est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon Tris HCl 50 mM, pH 7,6 contenant du mercapto-2 méthanol à 0,2 % et de la sérum-albumine bovine à 15 microgrammes/ml. A partir des données de comptage, on calcule par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur le pourcentage d'inhibition d'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines pour chaque milieu- réactionnel contenant de la chaine A de ricine. L'ensemble de ces valeurs permet de déterminer la concentration de chaîne A de ricine (ou CI50) qui inhibe 50 % d'incorporation de la î4C- phénylalanine d.ans les conditions de l'essai 2) Le modèle cellu-laire (test n 2) Ce test mesure l'effet des substances étudiées sur 11 incorporation de l4C-leucine dans des cellules cancereuses en cultu-re Les cellules utilisées dépendent de la spécificité de l'anticorps choisi pou-r la fabrication de 1 'immunotoxine. Dans cet exemple, il s'agit de cellules de la lignée lymphoblastoïde humaine CEM portant naturellement l'antigène T65. Ces cellu-les sont incubées en présence de préparations des substances à étudier pus soumises en fin d'incubation à une mesure de leur tau-x d'incorporation de 14C-leucine. Cette mesure est effectuee selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 249 (il), 3557-3562 (1974) utilisant le trac-eu-r 14Cleucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorpore est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14Cleucine exprimée en pourcentage de l'incorporation par des cellules témoins en l'absence de la substance à étudier. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhi-be de 50 pour cent l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules ou concentration inhibitrice 50" (CISO). On a vérifié que la mesure d'incorporation de la 14C-leucine dans les cellules entières conduit à la détermination de CISO identiques a celles obtenues par la méthode classique de mesure de la synthèse protéique. Résultats a - Test n l (modèle acellulaire) L'activité inhibitrice de la chaîne A (NEM) modifiée a été déterminée. La CISO est égale à 3,6.10**-lO mole/litre. La CISO de la chaîne A témoin de l'expérience est de 1,2.10**-10 mole/l. Il n'y a donc pas de perte d'activité significative de la chaîne A modifiée. b)Test n 2 modèle cellulaire): Dans les conditions expérimentales définies ci-dessus, la CI50 en présence d'activateur (monensine 50 nM) est de 1,2.10**-12 mole/l, ce qui représente une activité 5.10** 4 fois supérieure à celle de la chaîne A (CI50 = 6.10**-8 mole/l). EXEMPLE 2: Pi = anticorps T101 sur lequel on a introduit un groupement SH par l'intermédiaire des amines. P2 = chaîne A de ricine sur laquelle on a introduit un groupement maléimide par l'intermédiaire de l'hydroxyle des tyrosines. ) Préparation de l'agent de couplage: Il s'agit de l'imidazolide dérive de l'acide maléimidocaproiique. Cet imidazolide s'obtient en 1 seu-le étape à partir de l'acide maleiiniidocaproïque et du ce.rbonyldiimidazole (CDI) 422 mg d'acide maléimidocaproiique sont dissous dans 2 ml de THF. A cette solution sont ajoutés 405 mg de CDI Le mélange est agité 1/4 h à température ambiante. On observe un dégagement gazeux de CO2. Le milieu réactionnel est utilisé directement sans purification. B) Préparation de la channe A de ricine correctement fonctionnalisée: l) Blocage au- N-éthyl-maléii:1iGe . identique à celui décrit dans l'exemple l. 2) Modification des tyrosines: A l8 mg de chaîne A (NEM) dans 10 ml de tampon phosphate 125 mM pH 7 (soit 0,6 micromoles) sont ajoutés goutte à goutte 300 microlitres de la solution de réactif de couplage dans le THF obtenue précédemment. Le milieu réactionnel est agité 15 minutes à 250C puis la solution est purifiée de l'excès de réactif par dialyse contre dutampon phosphate 125 mM pH 7. On obtient ainsi 20 ml d'une solution de chaîne A (NEM) modifiée à 1,45 mg/ml.Par dosage des groupements maléiimide à l'aide de 14C cystéine, on constate que l'on a obtenu une chaîne A portant en moyenne i groupement activateur par mole de chaîne A (NEM) C) Préparation de l'anticorps modifié: identique à celle' décrite dans l'exemple 1. D) Préparation de l'immu.notoxine: A 2,1 ml de la solution d'anticorps précédemment obtenue (soit O,11 micromoles), on ajoute 5,8 ml de la solution de chaine A modifiée (0,28 micromoles). On laisse le mélange incuber 1 h à 300 C. Les groupements maléimide résiduels sont bloqués par 5 micromoles de cystéine. L'incubation dure l heure à 30 C. Le milieu réactionnel est purifié sur Sephadex G100 selon la méthode précédemment décrite. On obtient 19,5 ml d'une solution d'immunotoxine à 1,05 mg/ml (soit 20,5 mg). Cette solution contient 0,31 mg/ml de chaîne A (NEM) modifiée Le taux de couplage moyen de cette préparation est de 2 chaînes A (NEM) par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule II ci-dessus, où : - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes SH sont bloqués par le N-éthylmaléimide - P' est le radical de l'anticorps Thiol - W' est un groupement de formule O - (Z to E ' ) n- Se E-Y Z dans laquelle . Z' est -NH- . Y' est -CO- . E' est -CH CH2COOH . E est -CH 2-CH 2- . Y est -CO-- . Z est -O- . n est I E) Tests d'activité: a) Test n 1 (modèle acellu-laire L'activité inhibitrice de la chaîne A modifiée a été déterminée.La CISO est égale à 10.10**-10 mole/1. La CI50 de la chaîne A témoin de l'expérience est de 1,1.10**-10 mole/l. Malgré une perte d'activité notable, la chaîne A modifiée conserve encore un important pouvoir d'inhibition de la synthèse protéiqueO- b) Test n 2 (modèle cellulaire Dans des conditions expérimentales identique a celle de l'exemple lp la CISO en présence d'activateur (Monensine 50 nM) est de 3.10**-11 mole/l, ce qui représente une activité 3.10**3 fois supérieure à celle de la chaîne A 4 = 6.10**-8 mole/l)O EXEMPLE 3 Pl = chaîne A de ricine a l'état natif. P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit un groupement disulfure activé par l'intermediaire de l'hydroxyle des tyrosines. A) Préparation du- réactif de couplage: identique à celle décrite.à l'exemple 1. B) Préparation de l'anticorps modifié A 12,8 mg d'anticorps T101 dans 2,8 ml de tampon phosphate 125 mM pH 7, sont ajoutés goutte à goutte 34 microlitres de la solution de THF diluée au 1/2 décrite précédemment (200 équivalents/mole d'IgG). Le milieu réactionnel est agité 1/4 h à température ambiante puis purifié par dialyse On obtient ainsi 2,6 ml d'une solution d'anticorps modifié à 4,55 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par 'échange avec le mercapto-2 éthanol, on constate que l'on a obtenue un anticorps portant 2,2 groupements activateurs par mole d'anticorps C) Préparation de l'immunotoxine A 750 microlitres d'une solution de chaîne A de ricine à 7,1 mg/ml (soit 0,177 micromoles) sont ajoutés 2,5 ml d'une solution d'anticorps activé à 4,55 mg/ml (soit 0,075 micromoles d'anticorps). On laisse le mélange incuber 18 h à 250 C. Le milieu réactionnel est purifié sur colonne de Sephadex C100 comme décrit à l'exemple 1. On obtient 13 ml d'une solution d'immunotoxine à 0,8 mg/ml (soit 10,4 mg). Cette solution contient 0,2 mg/ml de chaîne A. Le taux de couplage moyen de cette préparation est de 1,5 chaîne A par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formu-le VI cidessus, où : - A' est le radical de la sous-unité A de. la ricine - P' est le radical de l'anticorps Thiol - W' est un groupement de formule - Z"-Y-E-S-S- (E'-Y'-Z')n- dans laquelle . Z" est -O- . Y est -CO- . E est -CH2-CH2- n n est zéro - m est 1,5 D) Tests d'activité: Test n0 2 (modèle cellulaire). Dans des conditions expérimentales identiques à celles de l'exemple l, la CISO en présence d'activateur (Monensine 50 nM) est de 3,5.10**-13 mole/l ce qui représente une activité cytotoxique 1,5.10**5 fois supérieure à celle de la chaîne A dans la meme expérience (CI50 = 0,6.10**-8 mole/l). EXEMPLE 4 P1 = chaîne A de ricine à l'état natif. P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit un groupement maléiimide par l'intermédiaire de l'hydroxyle des tyrosines. A) Préparation du- réactif de couplage: identique à celle de l'exemple 2. B) Préparation de l'anticorps modifié: A 12,8 mg d'anticorps TlOl dans 2,8 ml de tampon phosphate 125 mM. pli 7 sont ajoutés goutte à goutte 34 microlitres de la solution de THF diluée au l/2 décrite précédemment (200 équivalents/mole d'IgC). Le milieu réactionnel est agité 1/4 heure à température ambiante puis purifié par dialyse. On obtient ainsi 2,6 ml d'une solution d'anticorps modifié à 4,5 mg/ml. Par dosage des groupements maMiinide à l'aide de 14C cystéine, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 4,0 groupements activateurs par mole d'anticorps. C) Préparation de l'immunotoxine A 850 microlitres d'une solution de chaîne A de ricine à 7,1 mg/ml (soit 0,20 micromole) on ajoute 2,5 ml d'une solution d'anticorps activé à 4,5 mg/ml (soit 0,075 micromole d2IgG). On laisse le mélange incuber 1 h à 250 C. Les groupements maléiimide résiduels sont bloqués par 6 micromoles de cystéine. L'incubation dure l h à 300 C. Le milieu- réactionnel est purifié sur colonne de Sephadex G100 comme décrit à l'exemple 1 et on obtient ll ml d'une solution d'immunotoxine à 0,76 mg/ml (soit 8,36 mg). Cette solution contient 0,29 mg/ml de chaîne A. Le taux de couplage moyen de cette préparation est de 3 chaînes A par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule VI cidessus, où - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine - P' est le radical de l'anticorps TlOl - W' est un groupement de formule dans laquelle . Z est -O . Y est -CO- E E est -(CH2)5- . n est zéro - m est 3 D) Tests d'activité: Test n 2 (modèle cellulaire} Dans les conditions expérimentales identiques à celle de l'exemple 1, la CISO de l'immunotoxine en présence d'activateur (Monensine 50 nM) est de 1,7.10**-12, mole/l, ce qui représente une activité 3.10**3 fois supérieure à celle de la chaîne A dans la même expérience. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Imidazolides de formule dans laquelle - E représente une structure d'espacement inerte; et - G représente un groupe ou un groupe -S-S-X où X est un groupe activateur. 2 - Un composé selon la revendication 1 ayant Ia formule dans laquelle E représente un groupe -(CH2)p- où p est un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe et G est un groupement de structure -S-S-X, où X est un radical activateur choisi parmi les groupes 2-pyridyle et 4-pyridyle non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle, le groupe phényle non substitué ou substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alkoxy, carboxyle ou alcoxycarbonyle, ou un groupe alkoxycarbonyle.