Brevet FR2570278A1 — publié le 19860321

COMPOSITIONS ET. PROCEDE POUR PROTEGER LES LYMPHOCYTES T CONTRE L'AGENT ETIOLOGIQUE DES LYMPHADENOPATHIES ET DU SYNDROME D'IMMUNODEPRESSION ACQUISE. L'invention est relative à un procédé et à des compositions pour protéger les lymphocytes T contre l'agent étiologique des lymphadénopathies et du syndrome d'immunodépression acquise. L'agent étiologique des affections susdites a récemment été identifié. I1 s'agit d'un virus qui a été dénommé LAV. Ce virus et divers variants de ce virus ont été complètement identifiés dans la demande de brevet Européen déposée le 14 septembre 1984 au nom de l'Institut Pasteur et sous le titre "Antigènes, moyens et méthode pour le diagnostic de lymphadénopathie et du syndrome d'immunodépression acquise", sous la priorité de la de- mande de brevet britannique 83 24800 déposée le 15\sep- tembre 1983. On sait par ailleurs qu'un virus du même ty- pe a été isolé aux Etats-Unis d'Amérique. Il a été dénommé HTLV-III (SCIENCE, 1984, Vol. 224, 4648, 497). Pour la commodité du langage il sera fait référence dans ce qui suit au virus LAV, étant entendu que cette désigna- tion s'étend en fait à tous les virus doués de propriétés équivalentes. Il avait déjà été reconnu que les lymphocytes T- auxiliaires, plus particulièrement les cellules de spécificité OKT4+ ou "lymphocytes T4+" selon la désigna- tion qui sera utilisée ci-après (cellules 3 Leu) semblaient former la principale cible du virus. Ces lymphocytes ont la particularité d'être reconnaissables par des anticorps monoclonaux commercialisés par la firme ORTHO PHARMACEU- TICAL CORPORATION sous la désignation OKT4. Ces anti- corps monoclonaux ont été décrits plus particulièrement dans la demande de brevet européen 18794 déposée le 25 avril 1980. I1 a également été établi que cet anticorps -2- monoclonal reconnaissait plus particulièrement une protéi- ne de poids moléculaire de l'ordre de 62 000 daltons, révé- lée après immunoprécipitation à partir d'un lysat de thymo- cytes humains marqués au borohydrure de sodium tritié, et ce après une oxydation douce en présence d'une faible con- centration de périodate de sodium (C. TERHORST et coll. SCIENCE (1980),209,520-521. Cette protéine a été dénommée "antigène T4" par les auteurs susdits. Elle sera ci-après encore désignée comme "protéine T4". - L'invention découle de la découverte que cette pro- téine T4 joue apparemment un rôle essentiel au niveau du processus d'infection des lymphocytes T par les susdits virus (ci-après plus généralement dénommés LAV). Plus parti- culièrement le processus d'infection des lymphocytes T paraît tributaire de l'interaction du virus avec la molé- cule T4, celle-ci paraissant jouer un rôle de récepteur pour le virus à la surface de la membrane. La reconnaissance de cette interaction découle de la constatation qui a été faite que l'infection d'une culture de cellules de lympho- cytes T4+ par les virus LAV dans des conditions expérimen- tales qui normalement l'autorisent, ne se produit plus en présence d'anticorps monoclonaux anti-T4, plus particuliè- rement d'anticorps OKT4. Il n'est en particulier plus pos- sible de détecter l'immunofluorescence caractéristique de l'infection dans les conditions de culture décrites par E. L. Reinherz et Coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), Vol. 76, 4061-4065, dès que le milieu de culture contient également des anticorps monoclonaux anti-T4. Au contraire, des anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes autres que la protéine T4 présente sur les lympho- cytes T ne perturbent en aucune façon l'infection dans les mêmes condi- tions des lymphocytes T par les virus LAV. D'une façon générale l'invention concerne un procédé et des compositions dont le but est d'interférer avec le processus infectieux, que ce soit au niveau de la pénétra- tion des virus LAV dans les lymphocytes T ou de l'inhibition -3- ou de la destruction du virus infectieux à l'intérieur même lymphocytes T infectés. L'élément caractéristique de la composition est naturellement constitué par un anticorps anti-T4, de façon plus générale par toute molécule susceptible de bloquer le récepteur T4, en association avec tout véhicule destiné à faciliter la mise en contact des lymphocytes T in vitro ou in vivo avec ladite composition. Ce procédé est caractérisé par la mise en contact 1l in vitro ou in vivo des lymphocytes T avec un anticorps anti-T4. Cet anticorps anti-T4 est de préférence constitué par des anticorps monoclonaux présentant les caractéristi- ques essentielles de celui qui a été décrit dans la demande de brevet européen 18.794, ou plus particulièrement encore par l'anticorps monoclonal qui est secrété par l'hybridome qui a été déposé par la société ORTHOPHARMACEUTICAL CORPO- RATION auprès de la collection dite "American Type Culture Collection" 12301 Parklawn Drive, ROCKVILLE, M D 20 852, aux Etats-Unis le 28 avril.1979. Cet hybridome est cata- logué sous le N ATCC CRL 8002. Il va de soi que tout anticorps ayant des propriétés analogues peut être substitué à celui qui est secrété par le susdit hybridome. En particulier la composition selon l'invention peut contenir des anticorps polyclonaux formés au préalable contre des lymphocytes T4+, la seule condition étant naturellement que parmi ces anticorps polyclonaux il s'en trouvent certains qui puissent effectivement être fixes plus particulièrement sur la protéine T4. Toute autre substance susceptible de présenter une affinité semblable avec la protéine T4 peut être envisagée. En particulier, une substance adéquate pourrait être constituée par un polypep- tide de plus petite taille que l'anticorps OX T4, ce poly- peptide possédant néanmoins en commun avec l'anticorps OK T4 le site de fixation sur la protéine T4. 257027& -4- Dans l'un de ses premiers modes de réalisation l'inven- tion concerne donc une composition pharmaceutique, de pré- férence injectable, constituée par l'association d'un anti- corps anti-T4, tel qu'il a été défini ci-dessus, ou par une molécule douée de propriétés équivalentes, en association avec un excipient pharmaceutiquerlent acceptable. Il va de soi que la composition doit être dosée de façon à assurer son efficacité au niveau de la prévention ou de l'inhi- bition in vivo de l'infection possible des lymphocytes T4 par le virus LAV. Plus particulièrement on observera que l'inhibition de l'infection supposera la réalisation d'une compétition efficace en faveur de la substance active vis-à- vis des virus, à l'égard desdits récepteurs La composition peut être utilisée soit seule, notam- ment lorsqu'elle est utilisée à titre préventif, soit en association ou en combinaison avec d'autres agents. Par exemple l'invention concerne une composition as- sociant des anticorps T4 (ou des molécules équivalentes) et des lymphocytes T4 provenant de donneurs sains. Les éléments de l'association peuvent être administrés simul- tanément ou d'une façon décalée dans le temps, pour aboutir aux résultats recherchés. Une telle composition sera d'1n intérêt tout particulier dans les modes de traitement de patients se trouvant au dernier stade de la maladie, traitement qui implique des greffes de lymphocytes ou de moelle osseuse provenant d'un donneur sain. L'association a une telle greffe d'anticorps anti-T4 (ou substances ana- logues) par exemple au moment de la greffe peut avoir pour effet de protéger ces lymphocytes sains de l'infection à partir des lymphocytes infectés présents chez le malade. Les administrations peuvent également être décalées;en particulier des injections-supplémentaires du principe ac- tif de la composition selon l'invention après la greffe peuvent contribuer à l'inhibition stable de l'infection des lymphocytes greffés. -5- Dans ce qui précède il n'a été évoqué que le cas o les principes actifs mis en oeuvre dans la composition selon l'invention étaient constitués par des anticorps anti-T4 ana- logues ou modifiés. L'invention concerne également encore des compositions dans lesquelles ces anticorps, et plus particu- lièrement les anticorps monoclonaux du type OK T4 sont conju- gués par l'intermédiaire de liaisons covalentes à une struc- ture permettant de faire pénétrer par endocytose cellulaire un agent distinct, susceptible d'agir directement sur le vi- rus. Cet agent distinct peut être constitué par un anticorps distinct dirigé contre le virus, l'enveloppe du virus ou certaines des protéines qul peuvent être isolées à l'occasion de la ly- se du virus. En particulier on pourra avoir recours à des an- ticorps distincts anti-LAV tels que ceux décrits dans LANCET, juin 1984 1, 1253-1256. Cet agent peut aussi être constitué par une substance antivirale inhibant, voire détruisant le virus. On citera à titre d'exemples de substances antivirales utilisables, les composés d'hétéropolyanions décrits dans le brevet françals 73 27536/2245374, la ribavérine ou la linco- mycîne (commercialisée sous la marque LYNCOCYNE) ou la clin- damycine décrite dans "Molecular Basis of Antibiotic Action" par Gale et Coll. (1972) p. 678, 2e édition Wiley and Sons. L'invention concerne donc plus particulièrement les immunotoxines qui peuvent être réalisées par couplage covalent entre l'anticorps monoclonal anti-T4 et l'agent distinct, que ce soit directement ou indirectement. Dans tous les cas le rôle de l'anticorps anti-T4 se trouvera également être celui de faciliter l'endocytose de l'agent qui lui est associé à' l'intérieur des lymphocytes T infectés, l'agent internalisé étant alors rendu apte à agir directement sur le développe- ment du virus infectieux à l'intérieur desdits lymphocytes T. L'anticorps et l'agent antiviral peuvent être associés par tout moyen compatible avec leurs propriétés respectives, notamment leurs caractéristiques chimiques; par exemple -6 - l'anticorps et l'agent antiviral ou l'anticorps distinct sont associés par couplage par l'intermédiaire d'au moins une liaison covalente directe ou d'un groupe de pontage (thérapeutiquement acceptable). La conjugaison peut être réalisable en mettant en oeuvre une réaction de condensation entre des fonctions ré- actives complémentaires portées par l'anticorps monoclonal anti-T4, d'une part, et l'agent anti-viral ou l'autre anti- corps, d'autre part, en présence d'un agent de condensation choisi selon les natures chimiques respectives de ces fonc- tions réactives. Par exemple, les agents de condensation peuvent être constitués par des carbodiimides lorsque les fonctions com- plémentaires sont respectivement constituées par des groupes carboxyle et amine, ou vice versa, par exemple le p-toluène- sulfonate de N-cyclohexyl-N'-$-(N-méthyl-morpholino-éthyl)- carbodiimide et le chlorhydrate de (3-méthyl)-aminopropyl- carbodiimide ou le dicyclohexyl-carbodiimide. La réaction est alors conduite dans des conditions usuelles dans la chi- mie des protéines. Les agents de condensation peuvent encore être consti- tués par un 6-maléimido-caproique-acyl-N-hydroxy-succinimide- ester ou le N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)-propionate (SPDP), lorsque les fonctions complémentaires sont respecti- vement, au départ, un groupe sulfhydryle et un groupe amine ou vice versa. Des conditions-de réaction appropriées sont encore celles décrites dans les articles suivants: J. CARLSSON et coll., Biochem. J. (1978) 173, 727737 ou P.E. THORPE et coll. dans Europ. J. Biochem. (1981), 116, 447-454. Pour ce qui est des couplages entre anticorps dis- tincts, on peut encore avoir recours aux techniques décrites dans "Immunoenzymatic Technics" édité par Avrameas et Coll. (1983) Elsevier Science Publishers, page 1997 et dans l'ar- ticle de Guesdon, Jouane et Avrameas publié dans les Annales d'Immunologie de l'INSTITUT PASTEUR (1983) tome 134C, p. 265-274. -7- On peut également avoir recours aux techniques décrites dans la demande de brevet EP 0 063 988. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps monoclonal et i 'agent antiviral selon l'anti- corps distinct sont associés par l'intermédiaire d'un liposome. Plus précisément, l'autre substance est alors "encapsulée" dans des liposomes qui sont eux-mêmes asso- ciés, notamment au moyen d'un couplage par liaison(s) covalente(s) par exemple par l'intermédiaire du SPDP, avec 1ol01'anticorps monoclonal anti T4 (voir notamment J. BIOL. Chem. 255, 2015-8018 (1980); Nature, vol 293, n 5829, page 226-8, 1981); et Journal of Supramolecular Structure and Cellular Biochemistry, 16, p. 243-258 (1981). Il va de soi que les doses d'anticorps anti-T4 ou analo- gues, qu'il s'agisse de l'anticorps libre ou de l'anticorps couplé à des moyens permettant l'introduction d'un agent anti- viral à l'intérieur des lymphocytes seront réglées par le cli- nicien en tenant compte de l'état du patient. On disposera d'un degré de liberté plus important, dans le cas o le patient doit ultérieurement recevoir une greffe de lymphocytes ou de moelle osseuse provenant d'un individu sain. L'invention peut également être mise en oeuvre in vitro. par exemple sur des prélèvements de lymphocytes infectés ob- tenus à partir du patient, ces Iymphocytes infectés étant alors mis en contact avec les compositions selon l'invention pendant le temps nécessaire à la destruction du virus, à tout le moins à l'inhibition de sa prolifération, avant d'être re- greffés au patient. L'invention concerne encore des anticorps monoclonaux du type susindiqué libres ou combinés à un autre agent, ces anticorps étant cependant fixés sur une résine appropriée à la réalisation de chromatographies affines, le produit obtenu pouvant alors être utilisé, par exemple pour purifier le sang d'unlm patient, pour le débarrasser des virus circulants, cette opération pou- -8- vant alors être réalisée dans le cadre d'une circulation extra-corporelle du sang. Ces protéines peuvent encore être obtenues par ma- nipulation génétique selon des techniques connues de l'hom- me du métier. L'invention concerne également un procédé d'élimina- tion du virus LAV contenu dans le plasma d'un patient affecté des susdites maladies, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait passer ce plasma sur une colonne d'affi- nités portant des molécules T4 et en ce que l'on recueille le plasma ainsi débarrassé de sa teneur en virus LAV. La colonne porteuse de molécules T4 peut servir également à piéger les anticorps anti-T4 résultant d'un mécanisme auto- immunitaire quelquefois impliquésdans la maladie. Les anticorps anti-T4 ainsi piégés sont en général constitués par des auto anticorps présents dans le plasma. Cette opération peut être réalisée par incorporation de la colonne d'affinité dans un circuit extra-corporel, le sang à purifier étant prélevé sur le malade puis, après pu- rification, réinjecté dans le malade. On peut à l'inverse éliminer les lymphocytes infec- tés par passage du plasma du malade sur une colonne d'affi- nités portant des anticorps anti-T4. L'invention concerne encore des compositions médi- camenteuses constituées par la protéine T4 elle-même ou des fragments peptidiques obtenus à partir de cette protéine T4, dans la mesure o ceuxci comportent le site de fixation du virus. Ces protéines peuvent être isolées à partir. de cultures de lymphocytes T4, par exemple dans les conditions décrites par C. TERHORST et coll. ou E.L.REINHERZ. et coll. (documents déjà cités). -9- Ces protéines ou polypeptides, qui peuvent alors entrer en compétition avec les lymphocytes T4 dans la fixation du vi- rus, peuvent contribuer à prévenir l'infection virale ou même à l'interrompre, lorsque celle-ci se trouve déjà à un état avancé. Il va de soi que, de préférence, les protéines T4 mises en oeuvre (ou les polypeptides qui portent le même site de fixation du virus) seront de préférence conformes à ceux qui appartiennent aux lymphocytes humains. On remarque- ra que des polypeptides portant ce site de fixation peuvent être obtenus par fragmentation de la protéine T4, notamment avec des enzymes susceptibles de reconnaître des liaisons particulières (par exemple l'achromase, la trypsine, l'alpha- chymotrysine, etc..) et sélection des fragments obtenus par interaction avec des anticorps monoclonaux anti-T4. L'invention concerne enfin les différentes composi- tions évoquées ci-dessus, en tant que réactifs pour l'étude in vitro, pour l'étude du comportement du virus LAV par rapport à des lymphocytes T4 dans des conditions détermi- nées. -10 - Revendications 1. Composition contenant un anticorps anti-T4, ou une composition analogue, caractérisée par une affinité semblable à l'égard de la protéine T4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, cette com- position contenant une dose efficace du principe actif pour maîtriser in vivo l'infection des lymphocytes T par les virus LAV. 2. Composition selon la revendication 1, dans la-. quelle l'anticorps monoclonal anti-T4 ou l'agent analogue sont couplés de façon covalente à des moyens permettant, par endocytose cellulaire, de libérer une substance anti- virale à l'intérieur des lymphocytes susceptibles d'être envahis par les virus LAV. 3. Composition selon la revendication 2, dans la- quelle l'agent distinct couplé aux anticorps anti-T4 sont eux-mêmes constitués par des anticorps dirigés contre les virus LAV, plus particulièrement contre les enveloppes de ceux-ci. 4. Composition selon la revendication 2, caracté- risée en ce que les moyens aptes à délivrer une substance antivirale sont constitués par des liposomes conjugués par covalence à l'anticorps anti-T4. 5. Procédé de traitement in vitro de lymphocytes T4 susceptibles d'être infectés par des virus LAV> carac- térisé par la mise en contact de ces lymphocytes avec des anticorps antiT4 ou analogues, eux-mêmes à l'état libre ou conjuguésavec des moyens du type de ceux envisagés dans les revendications 2 à 4. 6. Conjugué entre d'une part des anticorps anti-T4, et,d'autre part,des moyens susceptibles de délivrer des anticorps anti-LAV ou une substance antivirale à l'inté- rieur de lymphocytes T4, après internalisation dans ceux- ci et lorsque ces lymphocytes ont été mis en contact avec le susdit conjugué. - 1l - 7. Conjugué selon la revendication 6, caractérisé en ce que les moyens couplés à l'anticorps anti-T4 sont constitués par des anticorps anti-LAV. 8. Conjugué selon la revendication 6, caractérisé en ce que les moyens couplés à l'anticorps anti-T4 sont constitués par des liposomes contenant une substance anti- virale. 9. Composition destinée à un usage pharmaceutique, caractérisée par l'association de la protéine T4 et d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Procédé d'élimination du virus LAV, et le cas échéant d'anticorps-anti-T4 résultant d'un mécanisme auto- immunitaire, contenus dans le plasma d'un patient atteint de lymphadénopathie ou du syndrome d'immunodépresslon acquise, caractérisé en ce que l'on fait passer ce plasma sur une colonne d'affinité portant des molécules T4, et en ce que l'on recueille le plasma ainsi débarrassé de sa teneur en virus LAV et, le cas échéant, en anticorps anti- T4. 11. Anticorps anti-T4 fixés sur une résine appropriée à la réalisation de chromatographie affine. 12. Molécules T4 fixées sur un support de chromato- graphie d'affinité.