Brevet FR2570276A1 — publié le 19860321

1. La présente invention concerne l'obtention du complexe FVIII/vWF à usage thérapeutique possédant à la fois l'activité anti- hémophilique A et l'activité Willebrand, ainsi qu'un haut degré de pureté. Plusieurs procédés de purification du facteur anti- hémophilique A en vue d'une utilisation thérapeutique de ce facteur ont déjà été décrits: ils font appel à des méthodes diverses telles que cryoprécipitation, précipitation sélective, adsorption et élution fractionnée et chromatographie d'échanges d'ions. On sait que l'activité antihémophilique A est portée par le facteur VIII (désigné par FVIII ou VIII:C) qui, à l'état physiologique, est associé au facteur Willebrand (désigné par vWF ou VIIIR:Ag) sous forme de ccaplexe FVIII/vWF. Les principales formes de facteur antihémophilique A à usage thérapeutique qui sont les plus généralement connues et commer- cialisées comprennent: - soit le cryoprécipité qui est obtenu par décongé- lation du plasma sanguin frais à 4 C; - soit le concentré qui est obtenu à partir du cryoprécipité après deux étapes de précipitation au polyéthylèneglycol. Au sujet de ces deux formes, on notera que la concen- tration du cryoprécipité (lequel est très contaminé en fibrinogène) est de 5 à 10 unités internationales (U.I.) par ml, tandis que l'on peut obtenir, pour le concentré, un taux de 25 U.I. par ml. On remarquera cependant, en ce qui concerne le concentré, qu'au cours de sa préparation, une grande partie du facteur Willebrand a été perdue, si bien que le concentré ne peut pas être efficacement utilisé pour suppléer la déficience des sujets atteints de maladie de Willebrand. En outre, bien qu'il se présente sous une forme plus pure que le cryoprécipité, le concentré possède l'inconvénient d'être encore fortement contaminé: le complexe constitue moins de 10 % de 1 'ensemble des protéines dudit concentré. 2. Des solutions originales permettant d'obtenir un facteur VIII de haute pureté ont déjà été proposées. Ces solutions sont, en général, fondées sur le principe qui consiste à fixer le complexe FVIII/vWF (contenu dans le cryoprécipité) sur un support solide, à laver les molécules contaminantes, puis à dissocier le complexe, de manière à recueillir le facteur VIII coagulant (FVIII:C) sous forme isolée. Le ccmplexe est habituellement fixé sur ledit support solide, soit à l'aide d'anticorps polyclonaux (E.G.D. Tuddenham et al. Journal of Laboratory Clinical Medicine (1979) vol. 93, page 10), soit à l'aide d'anticorps monoclonaux (T.S. Zimnermann et C.A. Fulcher, United State Patent (1982) n 4.361.509) couplés à des billes de gel de "Sépharose", soit à 1 'aide d'une résine échangeuse d'ions appropriée comme 1 'aminohexyl-Sépharose (D.E.G. Austen, Bristish Journal of Haematology (1979) vol. 43 p. 669).- On fera cependant observer que le produit obtenu par ces différents procédés consiste en facteur VIII coagulant (FVIII:C) isolé ne contenant donc pas le facteur Willebrand (vWF ou VIIIR:Ag), facteur qui est nécessaire aux malades Willebrand et qu'en outre, ce facteur VIII ainsi isolé n'est pas, sous sa forme physiologique (qui est normalement le complexe FVIII/vWF) o le facteur Willebrand sert à la fois de transporteur et de protecteur dudit facteur VIII. - tLa présente invention se propose par conséquent: - de fournir un produit à usage thérapeutique ayant non seulement l'activité antihéncphilique A mais encore l'activité Willebrand, contrairement au FVIII:C isolé qui ne possède pas cette dernière activité et au concentré dont l'activité Willebrand est insuffisante; - de founir donc un tel complexe FVIII/vWF à usage thérapeutique ayant les activités ci-dessus mais présentant de plus une pureté beaucoup plus élevée que celle du cryoprécipité et du concentré; - de fournir au surplus un tel complexe FVIII/vWF à usage thérapeutique de haute pureté présentant une concentration en facteur VIII plus élevée que celle du cryoprécipité et du concentré; - de fournir ainsi une molécule physiologique dans laquelle, contrairaement au FVIII:C isolé, le facteur VIII est associé au facteur Willebrand qui lui sert de transporteur et de protecteur; - de founir aussi un procédé d'obtention du ccmplexe FVIII/vWF ayant les caractéristiques définies ci-dessus avec un rendement 3. plus élevé que celui du concentré, ce procédé étant en outre directement applicable au plasma humain. Selon l 'invention, le procédé en question est fondé sur le principe bien connu de l'immunopurification (Immunoadsorbents in protein purification E. Ruoslahti Ed.,Sc. J. Immunol. 1976 Supplement N 3, pages 1 à 86 Characterisation of a monoclonal antibody to human interferon and its use in affinity chromatography, Stenman et al. J. et Immol. Meth. (1981) 46 p. 337-345). Lorsque 1 'on applique ce principe dans le cas particulier du facteur VIII, on se rend compte que ce dernier se comporte d'une façon qui lui est propre, à savoir qu'il perd, de façon irréversible, son activité dans les solutions d'élution qui sont habituellement utilisées en imunopurification, telles que par exemple chlorhydrate de glycine, solution tampon acétate à pH acide, KSCN et analogues. Or, la présente invention se propose de respecter ce facteur VIII et vise par conséquent un procédé essentiellement caractérisé par le fait qu'il consiste à fixer le complexe FVIII/vWF en milieu physiologique sur un anticorps monoclonal particulier et à libérer ledit complexe au moyen d'un milieu d'élution approprié n'ayant pas d'effet sur la nature et les fonctions du complexe FVIII/vWF, mais capable de dissocier les liaisons entre l'anticorps monoclonal sélectionné et le complexe FVIII/vWF, puis à recueillir ainsi ce dernier sous une forme hautement purifiée. Suivant d'autres caractéristiques: - l'anticorps est lié à un support solide; - l'anticorps monoclonal est choisi parmi ceux capables tout d'abord de fixer le complexe FVIII/VWF en milieu physiolo- gique et de libérer ensuite ce complexe dans le milieu d'élution, 1 'anticorps n'étant pas lui-même dénaturé et retrouvant sa capacité à fixer le complexe FVIII/vWF après retour en milieu physiologique, permettant ainsi des cycles répétés de purification; - de façon avantageuse, l'anticorps répondant à la définition ci-dessus est un anticorps monoclonal provenant d'un hybridome sélectionné après une série d'hybridations de cellules de myélome de 4. souris X63 et de splénocytes de souris BALB/C immunisées avec du complexe FVIII/vWF; - le milieu d'élution est choisi parmi les solutions alcalines présentant un pH compris entre 8,7 et 10,4; - la solution alcaline d'élution est choisie parmi les bases suivantes: NaOH, NH40H, éthanolamine, diéthanolamine, triéthanolamine et analogues. Suivant un mode de réalisation particulier, la sélection est effectuée en trois étapes: 1. Les anticorps anti-VIIIR:Ag sont identifiés à l'aide de facteur Willebrand (VIIIR:Ag) fixé sur plaque de titration et d'anticorps (marqué à l'iode 125) de chèvre anti-immunoglobulines de souris. 2. Les anticorps anti-VIIIR:Ag identifiés comme indiqué ci-dessus sont couplés à des particules solides du type gel et ils sont ensuite testés pour leur capacité à fixer le complexe FVIII/vWF à partir de plasma, se traduisant par la chute des activités anti- hémophilique A et Willebrand testées in vitro. 3. Les anticorps anti-VIIIR:Ag couplés aux particules solides et capables de fixer efficacement le complexe FVIII/vWF sont testés pour leur aptitude à relâcher le complexe FVIII/vWF en milieu alcalin (pH 8,7 à 10; 4); les activités antihémophilique A et Willebrand éluées sont testées in vitro par les procédés connus. Suivant d'autres caractéristiques, le complexe FVIII/vWF recueilli peut être concentré par un procédé connu du type ultrafiltration ou passage sur aminohexyl-Sépharose;le procédé peut être complété par une étape de gel-filtration et/ou une étape de lyophilisation. L'exemple suivant est donné à titre illustratif et nullement limitatif de la présente invention: Des cellules de splénocytes de souris BALB/C hyper immunisées avec du conplexe FVIII/vWF sont fusionnées à l'aide de polyéthylèneglycol avec des cellules de myélome de souris (souche X63). Les hybridomes produisant des anticorps anti-VIIIR:Ag sont sélectionnés et les anticorps produits sont couplés à des particules solides du type gel de Sépharose 4B et testés: - pour leur capacité à fixer le complexe FVIII/vWF; 5. - pour ceux qui ont donné un résultat positif quant à cette capacité de fixer ce complexe, pour leur aptitude à relâcher le complexe FVIII/vWF en milieu alcalin (pH 8,7 à 10,4), les activités antihémophilique A et Willebrand fixées dans le premier test ci-dessus et éluées à la suite du second, étant testées in vitro par les procédés connus. L'anticorps monoclonal produit par l'hybridome sélectionné comme cidessus est alors placé en milieu protéique approprié et couplé à du gel de Sépharose 4B(polymère de dextrane).Une colonne de 1 litre est ensuite remplie de gel couplé à l'anticorps. La colonne équilibrée en chlorure de sodium 0,1 M est chargée par 10 litres de plasma passés avec un débit de 0,5litre par heure. La colonne est ensuite lavée par 2 litres de chlorure de sodium 0,1 M puis éluée par 2 litres de triéthanolamine 100 M4 (pH 9,9). La totalité du produit actif est recueillie dans un litre d'éluant et contient environ 5000 U.I. de facteur VIII et de facteur Willebrand, soit un rendement de 50 % et une concentration de 5 U.I. par ml. Ce produit contient 100 fois moins de contaminants que le cryoprécipité et 10 fois moins que son concentré. La teneur protéique étant très faible (100 fois moins que dans le cryoprécipité), le produit peut être concentré jusqu'à 25 fois (125 U.I. par ml) soit par ultrafiltration, soit sur colonne d'aminohexyl-Sépharose. Il peut également être ultérieurement lyophilisé. La colonne rééquilibrée en chlorure de sodium 0,1 M a pu être réutilisée coamme décrit ci-dessus avec les mêmes résultats. Lorsqu'on a utilisé dans les opérations décrites ci-dessus du Sephacryl (polymère de dextrane et d'acrylamide) à la place du Sepharose, des concentrations de 16 U.I. par ml ont été obtenues. On peut de la même façon utiliser d'autres gels analogues comme le Trisacryl (polymère de tris et d'acrylamide). Le produit résultant de la mise en oeuvre du procédé convient particulièrement pour restaurer les activités déficientes chez les hémophiles A et les malades Willebrand par injection intra- veineuse sous faible volume (de l'ordre de 4 ml pour 500 U.I.). 6. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée, au niveau des équiva- lences, sans sortir de son cadre. 7. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention du complexe FVIII/vWF à usage thérapeutique possédant à la fois l'activité hémophilique A et l'activité Willebrand, ainsi qu'un haut degré de pureté, procédé essentiellement caractérisé par le fait qu'il consiste à fixer le complexe FVIII/vWF en milieu physiologique sur un anticorps monoclonal particulier et à libérer ledit complexe au moyen d'un milieu d'élution approprié n'ayant pas d'effet sur les fonctions du complexe FVIII/vWF, mais capable de dissocier les liaisons entre l'anticorps monoclonal sélectionné et le complexe FVIII/vWF, puis à recueillir ce dernier sous une forme hautement purifiée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'anticorps est lié à un support solide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'anticorps monoclonal est choisi parmi ceux capables tout d'abord de fixer le complexe FVIII/vWF en milieu physiologique et de libérer ensuite ce complexe dans le milieu d'élution. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le même anticorps monoclonal est utilisé dans plusieurs cycles. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'anticorps monoclonal provient d'un hybridome sélectionné après une série d'hybridations de cellules de myélome de souris X63 et de splénocytes de souris BALB/C immunisées avec le complexe FVIII/vWF. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que 1 'hybridome est sélectionné pour sa capacité à fixer le complexe FVIII/vWF et pour son aptitude à se dissocier de ce complexe. entre pH 8,7 et 10,4. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le milieu d'élution est choisi parmi les solutions alcalines présentant un pH compris entre 8,7 et 10,4, à base de NaOH, NH40H, éthanolamine, diéthanolamine, triéthanolamine ou analogues. 8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'après avoir recueilli le complexe FVIII/vWF hautement purifié, celui-ci est soumis à une opération de lyophilisation. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre une étape de concentration par ultra-filtration ou sur aminohexyl-Sépharose. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre une étape de gel-filtration. 11. A titre de produit industriel nouveau convenant pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, un anticorps monoclonal anti-VIIIR:Ag fixé sur un support solide, cet anticorps monoclonal provenant d'un hybridome sélectionné après une série d'hybridations de cellules de myélcme de souris X63 et de splénocytes de souris BALB/C immunisées avec le complexe FVIII/vWF. 12. Anticorps monoclonal anti-VIIIR:Ag selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ledit corps solide est un gel. 13. Anticorps monoclonal anti-VIIIR:Ag selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'il- est mis en présence d'un milieu protéique approprié. 14. Produit à usage thérapeutique ayant non seglement l'activité antihémophilique A mais encore l'activité Willebrand, carac- térisé par le fait qu'il consiste en un complexe FVIII/vWF de haute pureté et présentant une concentration en facteur VIII élevée obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.