Brevet FR2571372A1 — publié le 19860411

La présente invention concerne un procédé industriel de dédoublement d'un mélange de zéaralanols en ses diastéréoisomères par une technique chromatographique. Le terme zéaralanol est conforme à l'ancienne nomenclature : 6-(6,10-dihydroxy undecyl)-ss-résorcylic acide-u-lactone. Lorsqu'on transforme la zéaralénone répondant à la formule en zéaralanol répondant à la formule par réduction de la liaison oléfinique et du groupe cétone, il se forme un nélange de diastéréoisomères du zéaralanol, dont l'un présente un point de fusion plus élevé que l'autre Cette réduction est décrite dans le brevet U.S. 3.239.345 publié le 8/3/1966. La nouvelle nomenclature chemical abstract donne le nom chimique -7,14,16-trihydroxy-3 méthyl-decahydro-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12-1H-2-benzoxacy clotetradecine -1- one : avec la configuration [3S-(3R*,7S*)1 pour le zearalanol a de point de fusion le plus élevé et la configuration [3S-(3R*, 7R*)] pour la zéaralanol ss de point de fusion moins élevé. Ces stéréoisomères, non énantiomorphes sont désignés sous le nom de diastéréoisomères. Les diastéréoisomères présentent habituellement des différences entre leurs propriétés physico-chimiques, telles que pouvoir rotatoire, point de fusion, solubilité , spectrométrie en phase solide. Les deux diastéréoisomères du zéaralanol sont utiles en tant que substances anaboliques et oestrogènes destinées à l'administration aux animaux. Cependant, selon l'utilisation pour laquelle il est destiné, il peut être préférable d'utiliser uniquement l'un ou l'autre de ces diastéréoisomères. Il-devient alors nécessaire de séparer les diastéréoisomères en zéaralanol de point de fusion élevé (pF = 182/1840C) et zéaralanol de point de fusion inférieur (pF = 1550C). La réduction de la zéaralénone selon la technique générale décrite dans le brevet US 3.239.345 aboutit à un mélange sensiblement 50:50 des deux diastéréoisomères. Selon ce même brevet, on peut séparer, à l'état pur, l'isomère de haut point de fusion par cristallisations répétées dans le mélange isopropanol/ eau. On obtient ainsi 0,18 g d'isomère à haut point de fusion à partir de 1 g de mélange (exemple 6). La séparation par ce procédé n'est Cependant pas tout à fait complète et le zéaralanol qui reste contient encore une quantité notable de chaque diastéréoisomère. Le procédé de séparation peut être amélioré, c'est ainsi que le brevet U.S. 3.687.982 revendique un procédé de séparation d'un mélange de diastéréoisomères du zéaralanol, comportant les stades ci-après 1 - Dissolution du mélange de diastéréoisomères dans l'acide acétique. 2 - Maintien de la solution obtenue à une température suffisante pour effectuer l'estérification et obtenir les dérivés 6'-acétates des diastéréoisomères du zéaralanol. 3 - Séparation des esters 6' acétates des diastéréoisomères du zéaralanol par cristallisation fractionnée. 4 - Desestérification des groupes acétates aboutissant aux diastéréoisomères séparés du zéaralanol. Ce nouveau procédé apporte des améliorations sensibles par rapport à la technique originale de cristallisation directe permettant ainsi d'obtenir selon l'exemple 1,38 g d'isomère de point de fusion élevé à partir d'un mélange contenant sensiblement 55 % d'isomère à haut point de fusion et 45 % d'isomère à bas point de fusion. Cependant, cette technique présente des inconvénients ; ainsi, quatre stades sont nécessaires comprenant de nombreuses manipulations et utilisant divers réactifs dont la récupération peut être coûteuse. D'autre part, le rendement de chaque stade n'est pas quantitatif, ainsi l'acétylation ne permet de récupérer que 81 à 84 % par rapport à la théorie. La présente invention concerne un procédé industriel de séparation des diastéréoisomères par chromatographie sur un système de colonnes chromatographiques à hautes performances (HPLC) utilisant une phase inverse avec comme éluant une solution aqueuse de méthanol ou d'acétonitrile. La présente invention permet d'obtenir 100 % de chaque diastéréoisomère à l'état pur Les gels de silice sont actuellement fabriqués et commercialisés avec un diamètre de particules uniforme. La sphéricité parfaite des grains de silice assure de meilleures performances chromatographiques, le resserrement de la tolérance granulométrique augmente également ces performances. Ces gels de silice sont traités par un alkyl trichlorosilane pour obtenir des gels de silice greffée. Les chaines hydro -carbonées les plus communément utilisées sont les groupes en C18. Nous utilisons dans notre procédé ce type de silice R.P, 18 contenant environ 20 8 de carbone et commercialement disponible. Le procédé consiste à utiliser une colonne chromatographique de grande capacité contenant une phase inverse, par exemple une silice greffée C18 de moyenne granulométrie permettant une vitesse nominale élevée de l'éluant et assurant la séparation d'au moins 80 % du mélange des diastéreisomères. Cette colonne de grande capacité est couplée avec une colonne de moyenne capacité contenant une phase inverse silice greffée C18 de faible granulométrie assurant la séparation du mélange restant des diastéréoisomères. L'éluant est constitué par une solution aqueuse d'acétonitrile ou de méthanol permettant de travailler dans de larges conditions de température. Le mélange des diastéréoisomères du zéranol contenant sensiblement 50 % de chaque diastéréoisomère est mis en solution à -raison de 5 à 10 % dans un mélange de solvants sensiblement identique à celui utilisé pour ltélution. La solution à injecter peut être maintenue à une température suffisante pour éviter la recristallisation du mélange des diastéréoisomères. Cette solution est injectée sur la colonne de HPLC de grande capacitécontenant le gel de silice greffée RP 18 de granulométrie moyenne par exemple 15 à 25 microns. Puis ltélution est réalisée parun éluant qui peut être un système méchanol:eau comprenant de 60'p de méthanol et 40 p eau à 80 p de méthanol et 20 p d'eau, de préférence 70 p de méthanol et 30 p d'eau, ou bien un système acétonitrile:eau comprenant de 65 p d'acétonitrile et 35 p d'eau à 40 p d'acétonitrile et 60 p d'eau de préférence 50 p d'acétonitrile et 50 p d'eau. Les fractions sont collectées ou recyclées automatiquement en fonction de la réponse du détecteur d'indice de réfraction. Les fractions isolées du premier pic chromatographique (volume de rétention le plus faible) contiennent exclusivement l'isomère de bas point de fusion (A) et sont collectées. La fraction intermédiaire, contenant environ 10 % d'isomères non résolus (C), est dérivée vers la colonne HPLC suivante et enfin les fractions restantes contenant le deuxième diastéréoisomère pur (B)(isomère de point de fusion élevé) sont collectées à nouveau. A partir d'une injection contenant 50 p d'isomère à bas point de fusion et 50 p d'isomère à haut point de fusion, on isole ainsi 45 p de chaque isomère à l'état pur en sortie de la première colonne. La fraction de collecte intermédiaire (C) contenant sensiblement 5 p de chaque diastéréoisomère est immédiatement injectée dans une colonne de plus faible capacité contenant une silice greffée RP 18 de fine granulométrie par exemple 10 microns et éluée avec le même éluant que précédemment. On obtient ainsi la résolution totale du mélange à savoir 5 p de chaque diastéréoisomère. L'invention est illustrée par les exemples suivants donnés à titre non limitatif. EXEMPLE 1 Description du système chromatographique 1 Colonne verre 300 mm x 500 mm Remplissage 5 kg gel de silice RP 18 - 15725 microns Lichroprep (Merck) Solvant acétonitrile 50/eau 50 Injection 100 g de mélange d'isomères 50/50 dans 2,4 litres de solvant d'élution Débit 300 ml/mn Pression Détecteur réfractive indice - Jobin-Yvon ; Iota Collecteur de fraction 2 Colonne Inox 80 mm x 1000 mm (prépamatic Jobin-Yvon) Remplissage 1 kg gel de silice sphérique 10 microns RP 18 Nucléosil (Macherey Nagel) Solvant acétonitrile 50/eau 50 Injection 10 g de mélange d'isomères à environ 50/50 en solution dans le solvant éluant Débit 65 ml/mn Pression 12/15 bar Détecteur réfractive indice Jobin Yvon ;Iota Col lecteur de fraction On injecte sur la première colonne (1) (figure I) la solution contenant les 100 g de mélange d'isomères (C) de composition relative d'environ 50/50, puis démarre la pompe d'élution ; l'éluant est recyclé automatiquement jusqu'à apparition du premier isomère détecté par le changement d'indice de réfraction. La collecte du premier pic (A) (isomère de bas point de fusion) est démarrée et maintenue jusqu a ce que l'indice de réfraction redescende à une valeur comprise entre 10 et 15 % de la valeur maximum du premier pic (figure II). Cette valeur maximum est atteinte après environ 100 minutes. Le collecteur envoie ensuite la fraction intermédiaire (C) partiellement mélangée vers la réserve échantillon de la deuxième colonne. Quand le deuxième pic chromatographique apparait et que la valeur de l'indice de réfraction atteint 10 % du maximum atteint sur le premier pic, le collecteur de fraction (3) receuille l'éluat contenant le deuxième isomère pur (diastéréoisomère à point de fusion élevé) (B) (figure II). Après évaporation, chaque collecte contient 45 g de chacun des deux * isomères purs. La fraction intermédiaire (C) est à son tour injectée sur la deuxième colonne et éluée par le meme mélange éluant. Le solvant est recyclé automatiquement par le deuxième collecteur (4) jusqu a apparition du premier isomère détecté par le changement d'indice de réfraction (figure III), la collecte du premier pic (A) isomère de bas point de fusion est alors démarrée et maintenue jusqu'à ce que l'indice de réfraction reprenne sa valeur initiale la séparation étant quantitative sur cette deuxième colonne. Le solvant est recyclé ensuite jusqu a apparition d'un deuxième pic chromatographique représentant le passage du deuxième isomère (B) qui est collecté. Après évaporation des fractions A et B, on récupère sensiblement 50 g d'isomère à haut point de fusion du zéranol et 50 g d'isomère à bas point de fusion du zéranol. la pureté de chaque isomère est déterminée par HPLC analytique et est supérieure à 99 %. EXEMPLE 2 On utilise l'ensemble de la technique décrite à l'exemple 1 à la seule différence près que l'on utilise un solvant d'élution constitué par un mélange méthanol 70/eau 30. L'ordre d'élution des deux isomères est identique mais les temps d'élution sont légérement augmentés ; on récupère de la même façon la tota lité de chacun des deux diastéréoisomères avec une pureté > 99 %. REVENDICATIONS i - Procédé de séparation chromatographique industrielle des diastéréoisomères du zéaralanol de formule 2 - Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que l'on effectue la majeure partie de la séparation sur une colonne de grand débit et en ce que l'on dérive la partie non totalement séparée sur une colonne à haut pouvoir de résolution. 3 - Procédé suivant les revendications 1 et 2 où l'on utilise comme phase stationnaire une silice greffée de type R.Po 18 de granulométrie moyenne sur la colonne à grand débit et une silice sphérique grerfée de type R.P. 18 ayant une taille de particule d'environ 10 microns dans la deuxième colonne. 4 - Procédé suivant les revendications 1 à 3 où l'éluant est un mélange d'acétonitrile/eau dont le rapport est compris entre 65/35 et 40/60. 5 - Procédé suivant les revendications 1 à 3 où l'éluant est un mélange de méthanol/eau dont le rapport est compris entre 60/40 et 80/20. 6 - Appareil pour la séparation chromatographique selon la revendication 1 permettant de coupler une colonne de grande capacité fonctionnant'à faible pression et garnie d'un gel de silice greffée de type R.P 18 ae granulo- métrie moyenne à une colonne de moyenne capacité fonctionnant à moyenne pression et garnie d'un gel de silice greffée de type R.P. 18 de fine granulométrie et assurant en un seul cycle la séparation totale des diastéréoisomères. REVENDICATIONS 1 - Procédé de séparation chromatographique industrielle des diastéréoisomères du zéaralanol de formule caractérisé en ce que l'on effectue la séparation chromatographique à l'aide d'une phase solide constituée d'une silice greffée C18 avec un solvant polaire aqueux, le système comportant une colonne de grand diamètre pour une séparation grossière accouplée avec une colonne de plus faible diamètre ayant un haut pouvoir de résolution. 2 - Procédé suivant la revendication 1 où l'on utilise comme phase stationnaire une silice greffée de type RP 18 de granulométrie moyenne sur la colonne à grand débit et une silice sphérique greffée de type RP 18 ayant une taille de particule d'environ 10 microns dans la deuxième colonne. 3 - Procédé suivant les revendications 1 et 2 où l'éluant est un mélange dlacétonitrile/eau dont le rapport est compris entre 65/35 et 40/60. 4 - Procédé suivant les revendications 1 et 2 où l'éluant est un mélange de méthanol/eau dont le rapport est compris entre 60/40 et 80/20. 5 - Appareil pour la séparation chromatographique selon la revendication 1 permettant de coupler une colonne de grande capacité fonctionnant à faible pression et garnie d'un gel de silice greffée de type RP 18 de granulométrie moyenne à une colonne de moyenne capacité fonctionnant à moyenne pression et garnie d'un gel de silice greffée de type RP 18 de fine granulométrie et assurant en un seul cycle la séparation totale des diastéréoisomères.