Brevet FR2567539A1 — publié le 19860117

I Hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine et procédé pour sa prépa- ration L'invention concerne un hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, qui peut avantageusement être utilisé pour l'i- solement de la lactoferrine à partir du lait dans un état très pur et avec un rendement élevé. La lactoferrine est une protéine fixant le fer que l'on trouve dans les fluides sécrétés par voie ex- terne, tels que le lait et analogues. Elle n'est pas seulement hautement bénéfique pour la nourriture des en- fants d'un point de vue nutritionnel mais présente éga- lement l'effet physiologique d'exercer une action bacté- riostatique sur les bactéries pathogènes qui se trouvent dans les intestins et de nécessiter un degré élevé de fer en raison de sa capacité caractéristique de lier le fer. Plus précisément, on peut dire que la lactoferrine est une protéine du lait importante qui ne sert pas seu- lement de substance nutritive mais présente également une signification pharmacologique en tant qu'agent anti- infectieux, tout comme les immunoglobulines et le lyso- zyme présents dans le lait. De façon classique, en raison des propriétés ca- ractéristiques décrites ci-dessus de la lactoferrine, on a proposé un certain nombre de méthodes pour séparer la lactoferrine à partir du lait et la purifier. Cependant, étant donné que la lactoferrine est une protéine ayant une structure moléculaire hautement réactive et est éga- lement apte à interagir avec d'autres protéines du lait, il a été difficile d'isoler facilement et de façon effi- cace une forme hautement pure de lactoferrine selon les procédés classiques. Par exemple, un procédé classique pour séparer et purifier la lactoferrine comprend l'utilisation de lait écrémé dont la graisse a été séparée, l'élimination de la caséine à partir de celui-ci par précipitation isoélectique à pH 4,6, le relargage de la fraction de petit- lait résultante au moyen de sulfate d'ammonium, la dialyse de la fraction résultante contre de l'eau dé- ionisée, puis le passage du dialysat plusieurs fois à travers une résine échangeuse d'ions [Gordon et coll., Biochim. Biophys. Acta, 60, 410-411, (1962); Merton L. Gloves et coll.: Biochim. Biophys. Acta, 100, 154-162, (1965); Johansson, B.G. et coll.: Acta Chem. Scand. 23, 683,(1969)]. En outre, des modifications du procédé dé- crit ci-dessus comprennent le procédé selon lequel des particules de silice sont utilisées au lieu de la résine échangeuse d'ions (brevet mis à la disposition du public JA 28233/83) et le procédé selon lequel, après que la solution de dialysat ait passé à travers une résine échangeuse d'ions, le ' produit résultant est en outre soumis à une chromatographie d'affinité avec le cuivre (Norihiro Kawakata, Yoshio Yoshino et coll., Abstracts of Lecture at the 1983 Annual Meeting of the Japan Bio- chemical Society, p. 1053). Toutefois, ces procédés sont tous dépourvus d'utilité pratique parce qu'ils nécessi- tent des opérations compliquées et une durée de traite- ment exagérément longue. De plus, étant donné que la lactoferrine présen- te la propriété d'interagir avec d'autres protéines pré- sentes dans le lait, les procédés décrits ci-dessus uti- lisant une résine échangeuse d'ions ne peuvent empêcher la contamination du produit par des immunoglobulines et d'autres protéines présentes dans le lait. En conséquen- ce, il est difficile en pratique d'isoler une forme hau- tement pure de lactoferrine. De plus, ces procédés sont également désavantageux dans la mesure o le traitement répété par relargage et échange d'ions provoque non seu- lement une réduction marquée de la récupération de lac- toferrine, mais également rend pratiquement impossible de récupérer et de réutiliser les autres proteines du lait (autres que la lactoferrine) et les autres com- posants du lait présents dans les résidus obtenus pen- dant le déroulement de la séparation et la purification de la lactoferrine. Les investigations effectuées pour résoudre-les problèmes décrits cidessus rencontrés dans les procédés de l'art antérieur pour isoler une forme hautement pure de lactoferrine à partir du lait ont conduit la demande- resse à trouver qu'un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine peut se combiner de façon spécifique avec la lactoferrine et qu'un tel anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est produit par un hybri- dome qui peut être formé en fusionnant des lymphocytes de rate d'une souris immunisée contre la lactoferrine bovine, avec des cellules de myélome de souris. En conséquence, l'un des objets de la présente invention est de fournir un hybridome capable de produi- re un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovi- ne, lequel peut être avantageusement utilisé pour l'iso- lement de la lactoferrine bovine à partir du lait dans un état. hautement pur et avec un rendement élevé. D'autres objets de la présente invention appa- raîtront à la lecture de la description qui suit. Ces objets et d'autres objets encore de la pré- sente invention sont obtenus par un hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, lequel peut se combiner de façon spécifique avec la lactoferrine bovine, l'hybridome étant obtenu en fu- sionnant des lymphocytes de rate provenant d'une souris immunisée contre la lactoferrine bovine, avec des cellu- les de myélome de souris, ainsi qu'un procédé pour for- mer l'hybridome. L'invention a pour objet un hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, lequel est obtenu par fusion de lymphocytes de rate provenant d'une souris immunisée contre la lacto- ferrine bovine avec des cellules de myélome de souris, et un procédé pour former l'hybridome. Le procédé pour la formation d'hybridomes pro- duisant des anticorps monoclonaux par fusion de lympho- cytes de rate provenant d'une souris immunisée avec des cellules de myélome de souris a été publié pour la pre- mière fois par G. Kâhler et C. Milptein (Nature, 256, 495-497 (1975)7. Depuis lors, on a effectué de nombreux compte rendus de la formation d'hybridomes par fusion de cellules ainsi que des recherches scientifiques relati- ves aux anticorps produits par ces hybridomes et leur utilisation. Toutefois, lorsque l'on applique ce procédé gé- néral pour la formation d'hybridomes à la formation d'un nouvel hybridome capable de produire un anticorps mono- clonal particulier, on se heurte à différentes difficul- tés d'un point de vue opérationnel. De façon spécifique, selon le type de la protéine utilisée comme antigène dans la formation d'un hybridome, des mesures particu- lières peuvent être nécessaires dans les processus sub- séquents pour l'immunisation et la fusion de cellules, et des influences peuvent être exercées sur la technique de criblage (screening) pour l'isolement de l'hybridome désiré. L'hybridome capable de produire un anticorps mo- noclonal contre la lactoferrine bovine selon la présente invention peut être formé en recueillant des lymphocytes de rate provenant de la rate excisée à partir d'une sou- ris immunisée avec la lactoferrine et en fusionnant ces lymphocytes de rate avec des cellules de myélome de sou- ris de la manière classique. Le procédé pour former l'hybridome décrit ci-dessus sera maintenant décrit ci- après. Formation d'un hybridome capable de Produire un anti- corps monoclonal contre la lactoferrine bovine Une préparation de lactoferrine humaine ayant une pureté de 98% est commercialisée par Sigma Co., mais la lactoferrine bovine n'est pas disponible dans le com- merce. La caséine est donc extraite du colostrum bovin par précipitation isoélectrique et la fraction de petit -lait résultante est traitée selon une méthode classique [par exemple Johansson, B.G. et Coll.: Acta Chem. Scand., 23, 683, (1969)j pour obtenir une fraction de lactofer- rine bovine ayant une pureté d'environ 60%. Puis on prépare une solution de lactoferrine bo- vine (habituellement en utilisant une solution saline de tampon phosphate (PBS), pH 7,2, contenant du chlorure de sodium 0,15 M) et on la mélange avec une quantité égale d'adjuvant de Freund pour former une émulsion. On immu- nise trois fois, à des intervalles de deux semaines, une souris (habituellement âgée de 6 à 8 semaines) en injec- tant cette émulsion dans la cavité abdominale. Pour ce faire, on doit utiliser une forme hautement pure de lac- toferrine bovine. A cette fin, il est souhaitable d'augmenter la pureté de la lactoferrine bovine en utilisant un anti- sérum contre les immunoglobulines bovines pour enlever les immunoglobulines qui sont les principales impuretés présentes dans la fraction de lactoferrine bovine. Si la pureté de la lactoferrine bovine est fai- ble, il est difficile d'obtenir l'hybridome désiré. La raison pour cela est qu'une souris est plus facilement immunisée par des immunoglobulines bovines que par de la lactoferrine bovine et par conséquent le titre en anti- corps contre la lactoferrine bovine n'est pas porté à un niveau complet. Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne le type de souris utilisée selon la présen- te invention. Toutefois, il est habituellement souhaita- ble d'utiliser une souris de souche BALB/c. Selon l'art antérieur, les lymphocytes de rate pour l'utilisation dans la formation d'un hybridome ca- pable de produire un anticorps monoclonal sont habituel- lement recueillis à partir d'une rate de souris excisée 3 ou 4 jours après l'immunisation finale par un antigène spécifique. Dans le cas de la lactoferrine bovine qui est concernée par la présente invention, le titre de l'anticorps observé chez la souris n'atteint pas un ma- ximum 3 ou 4 jours après l'immunisation finale, et les cellules produisant l'anticorps parmi les lymphocytes de rate ne sont pas suffisamment activées à ce moment. En conséquence, le taux de formation d'un hybridome désiré, capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, est d'une faiblesse non satisfai- sante. La demanderesse a trouvé que le taux de forma- tion du susdit hybridome peut être largement augmenté en utilisant des lymphocytes de rate recueillis à partir de la rate excisée à partir d'une souris 6 ou 7 jours après l'immunisation finale par la lactoferrine. Les lymphocytes de rate (appelés ci-après cellu- les de rate) recueillis à partir de la rate de souris de la manière décrite ci-dessus, sont ensuite fusionnés avec des cellules de myélome de souris(appelées ci-après cellules de myélome). Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne le type de cellules de myélome utilisées dans la présente invention. Toutefois, lorsque l'on dé- sire les fusionner avec des cellules de rate obtenues à partir d'une souris de souche BALB/c, il est préférable d'utiliser des cellules SP2/0Ag14 qui ne sécrètent pas la chaîne K de l'IgG. La fusion peut être effectuée se- lon tout mode opératoire classique. Toutefois, lorsque l'on utilise des cellules SP2/O-Ag14 en tant que cellu- les de myélome, il est essentiel que la durée de fusion, y compris l'addition d'un promoteur de fusion (inducteur de fusion), le mélange et la dilution)soit dans la gamme de 5 à 15 minutes et de préférence de 9 à 11 minutes. Si la durée de fusion est inférieure à 5 minu- tes, la fusion sera incomplète tandis que si elle est supérieure à 15 minutes, les cellules mourront par em- poisonnement par le polyéthylèneglycol utilisé comme promoteur de fusion. A ce propos, si la durée de fusion est dans la gamme de 9 à 11 minutes, le taux de forma- tion de colonies approchera 100%. Lorsque l'on fusionne des cellules de rate provenant d'un souris de souche BALB/c immunisée par de la lactoferrine bovine avec des cellules SP2/O-Agl4, le taux de formation de colonies (le taux de fusion) peut être fortement augmenté en uti- lisant du polyéthylèneglycol de qualité "chromatographie gazeuse" (poids moléculaire 4000; Merck & Co., Inc.) en tant que promoteur de fusion de 50%. Lorsque la fusion est complète, les cellules fu- sionnées peuvent être traitées de manière classique. Plus précisément, les cellules fusionnées sont disper- sées dans du milieu HT (milieu MEM Dulbecco-modifié con- tenant de l'hypoxanthine, de la thymidine et 10% de sé- rum de veau foetal), pulvérisées au dessus d'une plaque microtitrée à 96 trous et cultivées à une température de 37'C sous une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone. A partir du jour suivant, on effectue la sélection des hy- bridomes dans du milieu HAT (milieu MEM Dulbecco-modifié contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine, de la thymidine et 10% de sérum de veau foetal). Dès que les colonies ont atteint une taille suf- fisante, les hybridomes sont criblés ("screenés") selon la méthode en phase solide. Puis les hybridomes présen- tant une réaction positive sont clones selon la méthode de dilution limite. Selon un mode de réalisation, la méthode en pha- se solide est mise en oeuvre en provoquant l'adsorption d'un antigène soluble sur un micropuit souple à 96 trous, en traitant les puits par de la sérumalbumine bo- vine (BSA) pour bloquer les portions sur lesquelles l'antigène n'est pas adsorbé et en plaçant les surna- geants des milieux de cultures susindiqués dans les puits pour effectuer la réaction avec l'antigène. Lors- que la réaction est terminée, les puits sont lavés com- plètement et des anticorps contre des anticorps de sou- ris biotinylés y sont ajoutés en tant qu'anticorps se- condaires. A la suite de quoi, les puits sont traités par l'avidine et la biotine marquée à la fluorescéine pour détecter l'anticorps désiré par la production d'une fluorescence. L'antigène soluble utilisé dans ce but doit être de la lactoferrine Bovine ayant une pureté aussi élevée que possible. La raison pour cela est que si la pureté de la lactoferrine bovine est faible, les hybridomes pour les antigènes d'impuretés présentent également une réaction positive et ceci rend difficile de trouver un hybridome désiré produisant un anticorps monoclonal con- tre la lactoferrine bovine. Selon un mode de réalisation, le procédé de di- lution limite est mis en oeuvre comme suit: une disper- sion de 108 cellules de thymus de souris et de 50 cel- lules d'hybridome dans 10 ml de milieu HT est pulvérisée au-dessus d'une plaque microtitrée à 96 trous, de sorte qu'une cellule d'hybridome ou moins soit présente dans chaque trou et par conséquent, que des colonies uniques de l'hybridome se forment. Les cellules de thymus de souris sont ajoutées comme cellules de charge, étant donné que les cellules d'hybridomes ne peuvent croître à de faibles densités de cellules. Le processus de clonage décrit ci-dessus est ré- pété trois fois ou plus pour obtenir un hybridome mono- clone. Puis l'hybridome résultant capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine peut être mis à croître de la manière habituelle. Plus précisément, l'hybridome est injecté dans la cavité ab- dominale de souris et leur liquide ascitique est récu- péré. En variante, l'hybridome est cultivé dans un mi- lieu convenable et son surnageant est récupéré. Le li- quide ascitique ou le surnageant récupéré est alors pu- rifié par précipitation au sulfate d'ammonium et chro- matographie d'échange d'ions pour obtenir l'anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine. Selon un mode de réalisation, l'anticorps mono- clonal contre la lactoferrine bovine peut être préparé comme suit: des cellules de l'hybridome susindiqué sont dispersées dans une solution saline de tampon phosphate (PBS) et injectées dans la cavité abdominale de souris de souche BALB/c auxquelles du pristane (2,6,10,14-té- traméthylpentadécane) a été administré au préalable. Après 7 à 10 jours, leur liquide ascitique est recueil- li, clarifié par centrifugation, dilué avec du PBS pour donner une concentration en protéines de l'ordre de 10 à 12 mg/ml puis relargué avec du sulfate d'ammonium à 45% de saturation. Une solution de la fraction de précipité résultante est dialysée puis purifiée par chromatogra- phie d'échange d'ions. Puis, l'anticorps monoclonal contre la lacto- ferrine bovine ainsi obtenu peut être utilisé dans la séparation et la purification de la lactoferrine bovine. Ceci peut être effectué en préparant une colonne de chromatographie d'affinité de l'anticorps selon le mode opératoire décrit ci-dessous et en faisant passer une solution de lactoferrine bovine brute séparée à partir du lait à travers la colonne de chromatographie d'affi- nité. Préparation d'une colonne de chromatoqraphie d'affinité L'anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine préparé de la manière décrite ci-dessus est mé- langé avec une quantité égale d'un support insoluble pour l'utilisation en chromatographie d'affinité (par exemple Affigel-10; Bio-Rad Co.) et ce mélange est agi- té à basse température pour lier et fixer l'anticorps au support. Après lavage, les groupes fonctionnels sur le support auxquels le susdit anticorps n'est pas attaché, sont inactivés et le support est alors lavé. Le gel d'affinité résultant est entassé dans une colonne de taille convenable pour former une colonne de chromato- graphie d'affinité. De la lactoferrine bovine brute ob- tenue à partir du lait est dissoute dans une solution saline de tampon phosphate (PBS) et on fait passer la solution résultante à travers la susdite colonne. Puis le gel d'affinité à l'intérieur de la colonne est lavé avec du PBS pour éliminer la fraction non adsorbée, on fait suivre par un lavage complet avec du PBS contenant du chlorure de sodium 0,5 M puis une solution 0,15 M de chlorure de sodium. A la suite de quoi, la lactoferrine bovine adsorbée est éluée avec une solution de tampon acétate, pH 2,7, contenant du chlorure de sodium 0,15M. La fraction éluée contenant la lactoferrine bovine est ajustée à pH 7, dialysée contre de l'eau déionisée puis lyophilisée pour obtenir de la lactoferrine bovine ayant une pureté de 98% ou plus. La présente invention est illustrée plus en détail par l'exemple suivant. Exemple En utilisant une résine échangeuse d'ions, une fraction de lactoferrine bovine est séparée du colostrum bovin selon la méthode classique rJohansson, B.G. et coll.: Acta Chem. Scand.,23, 683, (1969)7. Cette frac- tion de lactoferrine bovine a une pureté de 60%. A la fraction de lactoferrine bovine ci-dessus, on ajoute un antisérum contre les immunoglobulines bo- vines. Ainsi, les immunoglobulines bovines constituant les principales impuretés sont éliminées pour augmenter la pureté de la lactoferrine bovine jusqu'à environ 90%. La lactoferrine bovine ainsi obtenue est dissou- te dans une solution saline de tampon phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 0,15 M de chlorure de sodium pour donner une concentration de 0,3 %.Cette solution est mélangée avec une quantité égale d'adjuvant complet de Freund (Difco) pour former une émulsion. Une souris de souche BALB/c, âgée de 6 à 8 semaines, est immunisée par injection de l'émulsion dans sa cavité abdominale. Cette immunisation est répétée trois fois à des intervalles de 2 semaines. Sept jours après l'immunisation finale, la rate est excisée à partir de la souris et les cellules de rate sont recueillies à partir de celle-ci. Ces cel- lules de rate sont dispersées dans du milieu DMEM (mi- lieu essentiel minimum Dulbecco-modifié) et mélangées avec des cellules de myélome de souris SP2/0-Ag14 en une proportion de 2:1. A ce mélange, on ajoute une solution à 50% de polyéthylèneglycol (qualité chromatographique gazeuse, poids moléculaire 4000; Mêrck & Co., Inc.) comme promoteur de fusion. Ainsi la fusion des cellules est terminée en 10 minutes. Les cellules fusionnées ré- sultantes sont séparées du polyéthylèneglycol par cen- trifugation, dispersées dans du milieu HT pour donner une densité de cellules de 1 x 107 cellules/ml ou moins, pulvérisées au-dessus de plaques microtitrées à 96 trous puis cultivées à 37C sous une atmosphère de 5% de dio- xyde de carbone. A partir du jour après le commencement de la culture, (c'est-à-dire le premier jour), la moitié du milieu est continuellement échangée contre du milieu HAT. Le 17e jour, les hybridomes sont criblés selon la méthode en phase solide. On constate que 100% des hybri- domes forment une colonie et 8,3% des hybridomes présen- tent une réaction positive pour la lactoferrine bovine. Puis les hybridomes présentant une réaction po- sitive sont transférés sur des plaques microtitrées à 24 trous et clones dès que leur croissance a atteint une densité de cellules de I x 105 cellules/ml. A la suite de quoi, on les cultive dans du milieu HT pendant 2 se- maines et les hybridomes formant une colonie unique dans le puit sont soumis à un clonage secondaire. Ce processus de clonage et de criblage est répé- * té trois fois. Ainsi, on obtient des monoclones d'un hy- bridome capable de produire un anticorps contre la lac- toferrine bovine. Une culture de l'hybridome résultant capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine est maintenue à l'American Type Culture Collec- tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852- 1776 (E.U.A.) sous le numéro de dépôt ATCC HB 8852. Revendications 1. Hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, lequel peut se combiner spécifiquement avec la lactoferrine bovine, ca- ractérisé en ce que l'hybridome est obtenu en fusionnant des lymphocytes de rate provenant d'une souris immunisée contre la lactoferrine bovine, avec des cellules de myé- lome de souris. 2. Hybridome selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les lymphocytes de rate sont recueillis à partir d'une rate de souris excisée 6 ou 7 jours après l'immunisation finale. 3. Hybridome selon la revendication 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que les cellules de myélome de souris sont des cellules SP2/O-Ag14. 4. Procédé pour former un hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes con- sistant à utiliser une solution de lactoferrine bovine séparée de la fraction de petit-lait du lait; à immuni- ser une souris au moyen d'une émulsion formée en mélan- geant des quantités égales de la solution de lactofer- rine et d'adjuvant complet de Freund; à recueillir des lymphocytes de rate à partir de la rate de la souris; à fusionner les lymphocytes de rate avec des cellules de myélome de souris et à cultiver les cellules fusionnées résultantes; à sélectionner les hybridomes formés dans du milieu HAT; à cribler les hybridomes sélectionnés selon la méthode en phase solide pour obtenir un hybridome présentant une réaction positive; et à sou- mettre l'hybridome à un processus de clonage pour obte- nir un monoclone de l'hybridome. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la solution de lactoferrine bovine est prépa- rée en séparant la lactoferrine bovine de la fraction de petit-lait du colostrum bovin, en ajoutant un antisérum contre les immunoglobulines bovines à la lactoferrine bovine pour fixer et éliminer les immunoglobulines bovi- nes et autres impuretés qui y sont présentes, et à dis- soudre la lactoferrine bovine purifiée résultante dans une solution saline de tampon phosphate (PBS). 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, carac- térisé en ce que des lymphocytes de rate recueillis à partir d'une rate de souris excisée 6 ou 7 jours après l'immunisation finale par de la lactoferrine bovine sont utilisés en tant que lymphocytes de rate, des cellules SP2/O-Ag14 sont utilisées en tant que cellules de myélo- me de souris,et ces cellules sont fusionnées pendant une période de 5 à 15 minutes et de préférence de 9 à 11 minutes.