Brevet FR2571498A1 — publié le 19860411

La présente invention a pour objet un procédé destiné à la séparation de cellules ou de virus à partir de milieux biologiques. Elle consiste en l'immobilisation de macromolécules biologiques et plus précisément d'anti- corps à la surface de particules "flottantes", c'est-à- dire de particules ayant une densité inférieure au milieu dans lequel elles sdnt utilisées. On entend par cellules dans la présente descrip- tion les bactéries, les cellules, animales ou végétales, les cellules obtenues par recombinaison génétique. La pré- sente invention s'applique aussi aux autres microorganismes et aux virus. Les supports insolubles jusqu'ici utilisés dans les processus d'immunopurification sont généralement de-s particules de Nylon, des billes de verres, de polystyrène, des gels de silice ou des gels à base de dérivés de cellu- lose, d'agarose, d'acrylamide, de dextrane, etc. Ces supports, lorsqu'ils se présentent sous forme de billes ont l'inconvénient cependant de sédimenter en même temps que les cellules à séparer. Récemment et pour pallier ces difficultés on a vu apparaitre des gels magnétiques, c'est-à-dire des gels de nature identique aux précédents mais renfermant en leur sein une charge magnétique. Néanmoins, ces particules ont une densité élevée se déposant rapidement et pouvant parfois détruire en par- tie les substances séparées comme par exemple les cellules dans les processus d'épuration cellulaire (cassure par fric- tions mécaniques). Ces gels nécessitent de plus l'emploi d'appareillages (aimants) afin de faciliter la séparation à l'aide d'un champ magnétique. La présente invention consiste d'une part à uti- liser un support de faible densité, et d'autre part, à fi- xer sur ce support, des anticorps ou des lectines dirigés contre la ou les substances 2S71I98 que l'on désire séparer. Les particules utilisées peuvent être de différentes formes (billes, bâtonnets, ailettes, etc.) de diamètre variable (de 0 à 500 y) et de nature di- verse (polyéthylène, polypropylène, silicone). Elles sont revêtues d'un film macromoléculaire par exemple selon le procédé déjà décrit dans la demande de brevet français N 83.05618. - La fixation de l'anticorps dirigé contre la ou les substances que l'on désire séparer (que l'on nommera anticorps spécifique) est assuré par l'intermédiaire d'un "réseau-relais" (bras) destiné à assurer une orientation privilégiée de l'anticorps spécifique par rapport à celle de l'antigène porté par la cellule. Parmi ces réseaux-relais, l'invention prévoit: - un système avidinecomposé biotiné en plusieurs couches alternées: Le composé biotiné se fixant sur la phase solide est une macromolécule {du type albumine, hémoglobine, etc.) sur laquelle sont fixées plusieurs molécules de biotine. Chacun des résidus biotine peut à son tour fixer une molécule d'avidine, laquelle avidine ayant quatre sites de fixation pour la biotine est encore capable de lier une deuxième couche de composé biotiné, etc, la dernière couche d'avidine servant de site de fixation à l'anticorps spécifique lui- même biotiné. Suivant une variante, ladite orientation peut être obtenue avec un système anticorps anti-immunoglobulines: Dans ce cas précis, un premier anticorps est fixé au support solide; cet anticorps reconnaît les anticorps d'une autre espèce animale (rat anti-souris); le second anticorps spécifique des cellules à purifier est ensuite fixé sur le premier. Une variante avantageuse consiste à utiliser une chaîne de trois anticorps. Les anticorps anti- anticorps sont avantageusement dirigés contre les chaînes légères Kappa ou Lambda. 2571 498 Suivant encore une autre variante, l'invention prévoit le système anticorps anti-haptènes: Dans ce dernier cas, l'anticorps immobilisé sur la phase solide est un anticorps anti-haptène, c'est-à- dire un anticorps dirigé contre une molécule de petit poids moléculaire. Le même haptène est par ailleurs lié de façon covalente à l'anticorps spécifique destiné à la purifica- tion, par un couplage chimique lui permettant d'être encore reconnu par l'anticorps anti-haptène. Ce système permet la purification des complexes antigènes-anticorps par déplacement à l'aide d'un excès d'haptène libre. Les exemples suivants sont donnés à titre illus- tratif et nullement limitatif de la présente invention: Exemple 1: Immobilisation sur des billes flot- tantes avidinées d'un anticorps monoclonal biotine dirigé contre un antigène de surface cellulaire. a) Pour la préparation des billes flottantes avi- dinées, on se réfèrera au procédé déjà cité dans le brevet N 83.05618. On rappelle que le matériau utilisé peut être du polypropylène, ou polyéthylène de densité inférieure à celle des milieux aqueux et biologiques. Le diamètre des billes est de l'or- dre de 50 à 300 y. La capacité de fixation de la biotine sur les billes avidinées est estimée par l'incubation de biotine radiomarquée à 1 nmole/gr de billes. b) Le nombre de molécules de biotine fixées par molécule d'anticorps est estimé par une augmentation de la densité optique à 233 nm, selon la méthode de Green mise au point pour le complexe avidine-biotine. On prend un anticorps monoclonal de souris (B9- 11) dirigé contre l'antigène de surface T8 spécifique d'une sous-population lymphocytaire. Cet anticorps (1 mg/ml) por- tant 2 molécules de biotine est fixé sur les billes avidi- nées par incubation à 4 C pendant 5 heures en solution sa- line tamponnée par du phosphate à pH 7,4. La préparation est ensuite lavée exhaustivement avec la même solution saline. Toute perte de billes durant les lavages et aspirations est évitée par l'emploi d'un filtre de Nylon, "Nyltex". Suit un séchage à 37 C permettant la conserva- tion des billes. Exemple 2: Immobilisation sur des billes flot- tantes avidinées d'un anticorps monoclonal de souris dirigé contre un antigène de surface cellulaire par l'intermédiaire d'un bras anticorps monoclonal biotine de rat anti-immuno- globulines de souris, chatne K. (RAMK). On opère comme décrit dans l'exemple 1 pour fixer sur les billes l'anticorps monoclonal RAMK portant 2 molé- cules de biotine par molécule. La capacité de liaison des billes RAMK pour l'anticorps B9-11 est estimé par incuba- tion de B9-11 radiomarqué à 100 gg/g de billes. Après lavage et séchage des billes portant le RAMK, on accroche un anticorps monoclonal de souris à une concentration de 1 mg/ml par incubation en milieu salin tamponné par du phosphate, pH 7,4 pendant 16 heures à 4 C. De la même façon que décrit dans l'exemple 1, les billes sont lavées et séchées pour conservation. Exemple 3: Immobilisation sur des billes flot- tantes avidinées d'un anticorps monoclonal de souris dirigé contre un antigène de surface cellulaire par l'intermédiaire d'un bras anticorps monoclonal biotiné de souris anti- immunoglobulines de rat, chaîne K (MARK) plus l'anticorps monoclonal de rat anti-immunoglobulines de souris, chatne K (RAMK). a) On opère comme décrit dans l'exemple 1 pour accrocher sur les billes une molécule d'anticorps MARK portant 2 molécules de biotine. Ces billes MARK ont la capacité de fixer 100 gg d'anticorps de rat par g; cette capacité est estimée par incubation d'un anticorps mono- clonal de rat radiomarqué. Les billes MARK sont incubées avec l'anticorps RAMK à une concentration de 1 mg/ml en milieu salin tam- ponné par du phosphate, pH 7,4, pendant 16 heures à 4 C. La capacité de liaison des billes MARK-RAMK pour l'anti- corps monoclonal de souris B9-11 radiomarqué est estimé à 2 mg/g de billes. Après lavage, dans les mêmes conditions, les billes MARK-RAMK sont incubées avec un anticorps monoclonal de souris à une concentration de 1 mg/ml et ensuite à nou- veau lavées et séchées pour conservation. b) Pour fixer un anticorps monoclonal de rat, on procède de la même façon mais en prenant soin d'interver- tir l'ordre de fixation des anticorps sur les billes avidi- nées. TESTS IN VITRO A: Fixation des cellules lymphoblastoi- des T de la lignée HPBALL avec les différents systèmes de billes ci-dessus présentés. Une petite quantité de billes (environ 1 mg) est incubée avec 100 gl d'une suspension cellulaire HPBALL, à 5 X 106 cellules/ml de RPMI. 10 % FCS, pendant 20 minutes à température ambiante en agitation intermittente. Les billes sont lavées avec une solution saline tamponnée par du phosphate pH 7,4 et sont ensuite observées au microscope optique. On compte le nombre de cellules vi- sibles accrochées par bille. a) Fixation des cellules par des billes portant B9-11 (exemple 1) b) Fixation des cellules par des billes RAMK por- tant B9-11 (exemple 2) c) Fixation des cellules par des billes MARK-RAMK portant B9-11 (exemple 3). Pour les trois types de billes a), b) et c), des billes-témoins ne portant pas l'anticorps spécifique ne montrent aucune fixation cellulaire non spécifique. Dans le cas a), on observe 2 à 3 cellules par bille. -35 Dans le cas b), on observe entre 10 et 20 cellu- les par bille, et dans le cas c), on observe plus de 20 cel- lules par bille. 25714 98 B: Fixation des cellules lymphoblas- toldes T de la lignée HPBALL avec des billes MARK-RAMK portant différents anticorps monoclonaux de souris anti- lymphocytes T. On opère comme décrit sous A. On établit l'échelle des valeurs suivantes: - moins d'une cellule fixée par bille + entre 1 et 4 cellules par bille ++ entre 4 et 10 cellules par bille +++ entre 10 et 20 cellules par bille ++++ plus de 20 cellules par bille. Liste des anticorps monoclonaux testés: Anticorps Spécificité Echelle de fixation 8H8,1 GP41 + 13B8,2 T4 + 6F103 il + 25.3 LFA-1 ++ B9.11 8 BL4 T ++ 16G5 3 ++ SPL14 12 ++ Leu I T1 ++++ BLla T1 C: Fixation des cellules lymphoblastol- des T de la lignée HPBALL incubées au préalable avec l'anti- corps monoclonal de souris spécifique puis mises en contact avec les billes MARK-RAMK. il d'une suspension cellulaire HPBALL, à 5 X 106 cellules/ml sont incubées directement avec 20 g d'anticorps monoclonal de souris anti- lymphocyte T. Deux lavages sont effectués avec la même solution saline afin d'éliminer l'excès d'anticorps et les cellules sont remises en suspension en milieu RPMI 10 % FCS. Dans une deuxième étape d'incubation, on met en présence la suspension cellulaire à une concentration de X 106 cellules par ml avec 1 mg de billes MARK-RAMK. 257t 498 Au microscope optique, on observe une légère aug- mentation de la fixation cellulaire spécialement dans le cas du BL1 négatif lors de l'incubation en une seule étape. Exemple 4: Elimination d'une sous-population cel- lulaire à partir d'une préparation lymphocytaire du sang périphérique et d'une préparation lymphocytaire de la moelle osseuse observée par analyse au fluorographe. La séparation des lymphocytes à partir du sang périphérique et de la moelle osseuse est effectuée par la technique de densité sur Ficoll déjà décrite par B6yum. A (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 2 (Suppl 97): 77, 1968). La viabilité des cellules est contrôlée par ex- clusion au bleu Trypan et estimée supérieure à 95 %. 4 X 106 cellules dans 1 ml de RPMI. 10 % FCS sont incubées avec 20 mg de billes MARK-RAMK B9-11 sèches pendant 2 heures à température ambiante et sous agitation rotative (5 r.p.m.). On procède à une incubation identique avec des billes-témoins. A la fin de l'incubation, les cellules n'ayant pas réagi sont récupérées par décantation et aspiration en utilisant un filtre "Nyltex"- Les cellules récupérées sont comptées; on observe une baisse de la numération cellu- laire entre 30 et 50 % dans le cas du traitement avec B9-11 par rapport aux billes-témoins. Les lymphocytes récupérés sont incubés en milieu phosphate salin contenant 0,2 % d'albumine bovine avec gg de B9-11 pendant 1 heure- 4 C. Après lavage, les cellules sont incubées avec une sonde fluorescente chèvre anti-souris marquée au fluoroisothiocyanate et préparées pour analyse au fluorographe. Le sang périphérique contient 30 % de cellules positives avec l'anticorps B9-11. Traité par les billes- témoins, il les conserve intégralement; traité par-les billes portant l'anticorps B9-11, il perd la totalité des cellules positives pour cet anticorps. 2571 98 Les lymphocytes de la moelle osseuse, traités avec les billes-témoins, ayant une positivité de 5 à 10 % avec l'anticorps B9-11, sont devenus négatifs avec B9-11 à la suite du traitement avec les billes portant le B9-11. Un anticorps contre l'antigène de leucémie aiguë (CALLA), ALB2 ayant une positivité de 15 % sur cette mne population lymphocytaire de moelle est positif à 17 % après le traitement avec les billes B9-11. Exemple 5: Mise en oeuvre du procédé de l'inven- tion pour traiter les échantillons de moelle en vue d'une greffe. Il s'agit d'une application particulièrement-im- portante du procédé décrit. De 10 à 30 g de billes traitées comme dans les exemples 2 et 3, portant un anticorps anti- cellule T sont séchées et introduites dans une poche de transfert de sang de 450 ml. L'ensemble est stérilisé par exposition aux rayons selon les protocoles usuels. Au mo- ment de l'emploi les billes sont réhumidifiées par une so- lution tampon puis l'échantillon de moelle, préalablement centrifugé et semi-purifié sur barrière de Ficoll est alors introduit, mis en présence des billes pendant 2 heures avec rotation lente assurant le contact entre les billes et les cellules. Après décantation, les cellules non fixées aux billes sont injectées au patient en vue de la reconstitution de sa moelle. D'une façon générale, le procédé selon l'invention trouve des domaines d'applications très étendus. On citera, de façon nullement exhaustive, les applications dans le cas du tri cellulaire, qu'il soit du type préparatif, comme pour: - l'élimination des cellules T dans les moelles greffées; l'élimination des cellules fibroblastiques dans les cultures cellulaires; - la préparation de sang déleucocyté en utilisant un anticorps anti-HLA ou un anti P-microglobuline; 2571 498 ou la séparation positive, telle que pour: - la préparation de cellules pancréatiques B (produisant l'insuline dans les ilôts de Langherhans); - la récupération de cellules ou de microorga- nismes dans des cultures contaminées, ou du type analytique comme pour: les opérations soustractives dans le cas des lymphocytes T et B; - des sous-populations lymphocytaires T4+ et T8+; - des cellules leucémiques (Calla+) etc... ou pour la détection positive (marquage des bil- les après réaction avec les cellules, utilisant un antigène cellulaire); ou la quantification de sous-populations rares, etc. On citera également la possibilité d'appliquer le procédé de l'invention à la concentration, la détection, l'identification de virus à partir d'échantillons de grand volume (contrôle des eaux potables par exemple), la purifi- cation de milieux biologiques. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement illustratif et nullement limi- tatif et que toute modification, notamment au niveau des équivalences, pourra y -être apportée par l'homme de l'art sans sortir de son cadre. C'est ainsi en particulier que dans le procédé de l'invention certains anticorps peuvent être remplacés par des lectines. 257 1498 REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation applicable à des cellules caractérisé par le fait qu'il consiste à partir d'un support finement divisé de densité inférieure à celle du milieu d'o les cellules doivent être extraites et à le couvrir de macro- molécules capables de se fixer spécifiquement aux cellules à extraire et auxquelles on a conféré une orientation pri- vilégiée permettant la fixation de ces cellules. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les macromolécules sont des anticorps mono- clonaux ou polyclonaux. 3. Procédé selon la revendication 1 ou. 2, carac- térisé par le fait que les macromolécules sont des lectines. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé par le fait que ie recoivrement au support est assuré par un système avidine-composé biotiné en plusieurs couches alternées. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé par le fait que les couches succes- sives en partant du support sont albumine biotinée-avidine- anticorps 1 biotiné- anticorps 2- anticorps 3- etc. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 5, caractérisé par le fait que l'anticorps 3 est l'anticorps spécifique de la cellule à purifier, l'anti- corps 2. est dirigé contre la chaîne légère de l'anti corps 3, l'anticorps 1 est dirigé contre la chaîne lé- gère de l'anticorps 2. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, caractérisé par le fait que l'anticorps 2 est un anticorps monoclonal de rat dirigé contre la chaîne Kappa des anticorps de souris, l'anticorps 1 est un anti- corps monoclonal de souris dirigé contre la chaîne Kappa des anticorps de rat. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé par le fait que le recouvrement est assuré par un système anticorps-immunoglobuline. 1 1 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé par le fait que le recouvrement comporte un système anticorps-anti-haptène. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 9, caractérisé par le fait que le support divisé est constitué de billes comprises entre 10 et 500 A d'un matériau de densité-inférieure à l'unité tel que polyéthy- lène, polypropylène, silicone. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 10, caractérisé par le fait que l'anticorps 3 est dirigé contre les cellules lymphocytes humaines de type T. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 11, caractérisé par le fait que le support di- visé portant l'anticorps dirigé contre les cellules T est présenté en poche prête à l'emploi en quantité suffisante pour permettre l'épuration d'un prélèvement de moelle des- tiné à être greffé. 13. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 aux domaines des tris cellulaires, du type préparatif ou analytique, de la concentration, de la détection et de l'identification des virus, de la puri- fication de milieux biologiques et analogues.