Brevet FR2564860A1 — publié le 19851129

La présente invention se rapporte à un nouveau procédé simple pour concentrer les virus à partir de flui- des, plus particulièrement à partir de fluides biologiques et d'-eaux vannes. La concentration de virus à partir de fluides s'effectue généralement à partir de grands volumes de flui- des, le but étant d'obtenir de petits volumes de ces flui- des permettant un comptage facile de ces virus par une technique usuelle qui utilise le nombre possible de plaques de culture de tissus. On a suggéré plusieurs procédés de concentration de différents virus à partir de l'eau. Parmi les procédés de concentration connus, on peut citer les suivants: filtration sur membrane d'alginate, précipita- tion par la protamine, hydroextraction, séparation en deux phases, ultrafiltration, adsorption sur hydroxyde d'alumi- nium, adsorption sur polyélectrolyte, et filtration par le procédé d'adsorption-élution suivi de floculation organique. Ce dernier procédé est le plus fréquemment utilisé; son stade d'élution implique l'utilisation de solutions protéi- niques basiques, par exemple tampon glycine, bouillon phos- phate tryptose, bouillon soja trypticase, serum foetal de veau et extrait de boeuf. Ce dernier éluant est le plus souvent utilisé au cours du travail de laboratoire utili- sant le manuel USEPA de Virologie (Berg et Safferman, 1983). Le procédé avec extrait de boeufconsiste à utili- Ser de l'extrait de boeuf à 3% au cours d'un procédé de flo- culation organique, après le procédé d'adsorption-élution. Cependant, on a constaté que des extraits de boeuf diffé- rents, du commerce, aboutissaient à des rendements diffé- rents de reconcentrations de virus, en raison de leur pro- priété de former des flocons organiques à pH 3,5. Les pro- duits du commerce de ce type sont soumis à un traitement spécifique, apparemment nécessaire lors du procédé de fabri- cation, qui les rend impropres à la floculation organique. La concentration sur une petite échelle de virus, utilisant des cellules erythrocyte, a été également rappor- tée: elle est basée sur une interaction d'hémoagglutina- tion ou sur une hémoagglutination passive. L'hémoaggluti- nation a été largement utilisée pour la détection des myxo- virus, pour essayer les fluides provenant d'oeufs embryon- nés, ensemencés. Les propriétés hémoagglutinantes des virus se sont également révélées intéressantes dans la délimita- tion des groupes et sous-groupes de virus. Comme certains virus hIémoagglutinants éluent à partir des érythrocytes dans des conditions qui ne sont pas optimales pour l'adsorp- tion, on a suggéré de purifier et de concentrer des suspen- sions de virus par des techniques relativement simples. De nombreux virus sont adsorbés par des érythrocytes entiers à 4 C, et sont élués à 37 C, et vice-versa. Toutefois, ce procédé ne peut être utilisé que lorsque les quantités de liquide à manipuler sont très faibles. De plus, des dif- férences dans la qualité de l'eau, au point de vue de la pression osmotique, vont à l'encontre de l'utilisation des cellules d'érythrocyte entier, en raison de l'hémolyse et de la perte des propriétés-d'hémoagglutination. Le dosage par hémoagglutination passive a d'abord été utilisé pour déceler les anticorps viraux, et plus tard il a été étendu une variété d'antigènes viraux et d'anti- corps contre eux. Les antigènes d'essai sont généralement des préparations brutes de virus, telles que homogénats de culture de tissus et fluide allantolque contaminé. Des es- sais pour mesurer la relation quantitative entre les fins d'hémoagglutination et les nombres absolus de particules de virus, n'ont pas permis de conclure. Aussi, en raison de l'hMmolyse de l'érythrocyte entier, ce procédé ne peut être généralement utilisé pour la concentration de virus sur gran- de échelle. En plus de ces différents inconvénients de cha- cun des procédés spécifiques énumérés plus haut, intervient la découverte, de temps en temps, de nouvelles substances adsorbantes possédant une affinité supérieure pour les dif- férents virus à concentrer, et dont l'utilisation est sug- gérée. L'un des inconvénients principaux de tous les procé- dés connus réside dans l'efficacité variable de la concen- tration du virus. La présente invention permet d'éviter les incon- vénients de l'art antérieur, et d'obtenir,grâce à un procé- dé simple et très efficace, la concentration d'un large spectre de virus. Le nouveau procédé selon l'invention de concen- tration de virus,à partir de fluides biologiques et d'eaux vannes, est caractérisé en ce qu'on met en contact les fluides renfermant les virus avec une matrice adsorbante comprenant des cellules animales parasites d'érythrocyte, puis on acidifie le mélange ainsi obtenu ce qui entraîne la séparation du précipité de virus adsorbés sur les cel- lules animales parasites d'érythrocyte, et enfin on élue le précipité dans une solution présentant un pH supérieur à celui qui existe au stade précédent, afin d'obtenir un concentré de virus. La matrice adsorbante peut être sous forme de par- ticules solides ou de pellicule continue.Dans le cas de par- ticules solides, la matrice adsorbante peut se présenter sous forme de couche dans une colonne, ou sous forme de cartouche. On peut également envisager d'utiliser l'adsor- bant sous forme d'un revêtement sur un support adéquat tel que du verre ou des perles de matières plastique. La dimen- sion des particules d'adsorbant peut se situer dans un large intervalle, en général on préfère un intervalle allant de 1 à 20 microns. L'utilisation particulièrement préférée de cellules de parasites d'érythrocyte animal est sous forme d'une pellicule continue telle qu'une membrane. Selon une forme de réalisation préférée de la pré- sente invention, l'élution de virus précipités, adsorbés sur des cellules de parasite d'érythrocyte animal, s'effectue grace à une solution tampon de pH supérieur à 6,5. De cette manière, l'efficacité de la concentration des virus est por- tée au maximum. Le tampon préféré est PBS (solution de tam- pon phosphate, saline) avec un pH de l'ordre de 7,5. Parmi les avantages de la nouvelle matrice ad- sorbante, on peut noter les suivants: - On réalise des rendements élevés en concentrés de virus. - Les cellules parasites d'érythrocyte sont très sta- bles, et pour cette raison résistent à de nombreux cycles d'adsorption-élution sans subir d'altération. - La matrice adsorbante peut être utilisée pour con- centrer un large spectre de virus. Contrairement aux essais de l'art antérieur, le procédé selon l'invention n'implique pas de risque d'hémo- lyse. Les cellules parasites d'érythrocyte sont facilement préparées, un procédé simple pour leur préparation est dé- crit par Kabat (Experimental Immunochemistry, Thomas Pub. Second Edition, 1961, page 110). Ce procédé consiste à re- cueillir les cellules parasites d'érythrocyte à partir de grands volumes d'eau distillée, saturée en CO2 à 4 C, après hémolyse. La masse est ensuite centrifugée (de préférence par un système centrifuge-d'écoulement continu de Sorvall KSB-E), rincée avec des solutions froides de chlorure de sodium (0,2% en poids) et mise en suspension dans une solu- tion saline renfermant 1/10 000 d'éthylmercurithiosalicy- late de sodium, que l'on garde dans le réfrigérateur. La fixation de la cellule parasite est produite avec 3% de formaldéhyde, et PBS (0,01 M), les proportions étant de 1/5/5 (1 litre de cellules parasites d'érythrocyte + 5 li- tres de formaldéhyde + 5 litres de PBS). Ce mélange est abandonné une nuit durant, à 37 C, sous agitation cons- tante. Après fixation, les cellules parasites sont à nou- veau centrifugées et rincées avec une solution saline (0,85% en poids), afin d'éliminer l'excès de formaldéhyde. Pour empêcher l'altération microbienne, un réactif stabili- sant tel que azoture de sodium, est ajouté à la cellule parasite. Immédiatement avant utilisation,les cellules para- sites d'érythrocyte sont à nouveau rincées avec une solu- tion saline. Le procédé selon la présente invention peut être réalisé dans un large intervalle de température, de préfé- rence entre 4 et 37 C. Cette constatation va à l'encontre des indications de l'art antérieur, selon lesquelles un accroissement de la température augmente l'adsorption (C.A. Zittle, 1953, Advances in Enzymology, 44:319) car le dé- ploiement des protéines sur la surface adsorbante est une réaction endothermique. La concentration des cellules parasites des érythrocytes peut se choisir dans un large intervalle, de préférence entre 4 et 30% en volume. Audessous de 4%, il semble qu'il se produise une légère baisse d'efficacité, tandis qu'au-dessus de 30% on n'obtient pas d'amélioration de l'efficacité. Le procédé selon la présente invention est très simple à réaliser sans qu'il y ait nécessité d'avoir une nouvelle installation spécifique. Le cycle adsorption- élution, utilisant le procédé des cellules animales parasi- tes des érythrocytes selon l'invention, implique les stades suivants: Stade 1 Des tubes à essai,renfermant des cellules anima- les parasites d'érythrocyte à une concentration donnée, sont ensemencés avec une quantité connue de virus/bactério- phages. Le pH de la solution se situe entre 6 et 7,5. Stade 2 Le pH de l'échantillon est abaissé à 3,5 au moyen d'une solution de HCl 0,1M, et l'on agite le mélange pendant minutes. On obtient un complexe de virus adsorbé sur les cellules animales parasites d'érythrocyte, sous forme d'un précipité, après centrifugation de ce mélange pendant envi- ron 10 minutes. La phase surnageante est échantillonnée tan- dis que le résidu peut être rejeté. Stade 3 Le précipité obtenu au stade 2, renfermant les cellules animales parasites d'6rythrocyte conjointement avec les virus adsorbés, est remis en suspension homogène avec PBS a un pH de l'ordre de 7,5, sous agitation. L'invention est illustrée ci-après, à titre d'exemple, avec utilisation de bactériophages Ox-174, MS-2 et f2, comme modèles, mais il est bien entendu que l'invention n'est pas limitée uniquement à ces phages. Ainsi qu'il est connu, ces phages sont souvent utilisés en tant que modèles pour l'étude des entérovirus dans l'eau, car ils sont peu coûteux et résistent bien aux conditions défavorables de l'environnement, leurs multiplications s'effectuant rapidement. Ils sont également considérés comme des indicateurs de la pollution virale. Il est bien évident pour l'homme de l'art que l'invention n'est pas limitée aux détails figurant dans les exemples suivants, et qu'elle peut être mise sous d'autres formes spécifiques sans sortir de son cadre. Partie expérimentale Les phages sont doses aux trois stades concernant le cycle adsorption-élution: a) Immadiatement après que l'échantillon renfermant les cellules animales parasites d'érythrocyte, aient été ensemencées avec les virus/phages. b) Dès que prélevés dans la phase surnageante (stade 2) à pH 3,5, après centrifugation. c) Dès que prélevés dans le stade 3, à pH voisin de 7,5, après addition de la solution PBS au précipité et mise en dispersion homogène. En même temps et parallèlement, une expérimenta- tion témoin est menée avec ces phages en solution saline, hors la présence des cellules animales parasites d'érythro- cyte. Toutes les expérimentations ont lieu en solution sa- line afin de protéger les bactériophages du choc osmotique qu'ils subiraient en solutionshypotoniques. Les résultats donnés dans les tableaux sont exprimés en pourcentages pon- déraux, et sont calculés comme suit: Le comptage de phages dans le Stade 1, marqué "a", représente 0% d'adsorption et est donnné par la formule: 100 bx100 a tandis que l'élution est donnée par la formule: cx100 a dans lesquelles b = comptage de phages dans la phase surnageante du Stade 2, et c = comptage de phages dans la suspension du Stade 3. Les résultats figurant dans les tableaux des exem- ples,présentés ci-dessous, sont calculés en conformité avec ces formules. EXEMPLE 1 Deux mélanges à 15% de cellules de porc parasites d'érythrocyte sous forme de membrane, l'un dans 5 ml d'eau distillée et l'autre dans 5 ml de solution saline (0,85%), sont utilisés pour le cycle d'adsorption-élution de trois bactériophages: Ox-174, MS-2 et f2' présents dans l'eau contaminée. Les résultats sont présentés dans le Tableau i à la page 12, conjointement avec ceux qui proviennent de l'utilisation d'un extrait de boeuf à 3% en poids, et d'une solution saline, en tant que témoins. On peut tirer les conclusions suivantes des ré- sultats présentés dans le Tableau 1. -1) L'efficacité de l'adsorption et de l'élution est pratiquement de 100% pour tous les phages ci-dessus, en so- lution saline ou dans l'eau distillée, ce qui n'est pas le cas avec l'extrait de boeuf à 3%. -2) L'efficacité de l'adsorption et de l'élution n'est pas influencée par le pH (dans l'intervalle de 3,5 à 7) con- trairement à ce qui se passe avec l'extrait de boeuf à 3%. -3) L'efficacité de l'adsorption et de l'élution, ob- tenue avec de l'extrait de boeuf à 3%, dépend fortement de la source de cet extrait, ce qui n'est pas le cas avec le 25648O60 procédé utilisant des cellules animales parasites d'érythro- cyte selon l'invention. EXEMPLE 2 Un mélange à 13% en volume de cellules de porc parasites d'érythrocyte, sous forme de membrane, dans 5 ml de solution saline (0,85%), est utilisé pour l'adsorption- élution de la souche de poliovirus LSC-1.Les résultats sont résumés dans le Tableau 2 à la page 14, et sont compares avec ceux qui proviennent de la mise en oeuvre d'une solu- tion d'extrait de boeuf à 3%, obtenue de sources diverses, ainsi qu'avec ceux qui proviennent de la mise en oeuvre d'une solution saline, utilisée comme témoin. - Des résultats du Tableau 2, on peut tirer les mêmes conclusions que de ceux du Tableau 1; l'adsorption et l'élutlion dépendent beaucoup de la source de l'extrait de boeuf à 3%, tandis qu'elles sont pratiquement constantes pour différents phages en utilisant le procédé selon l'in- vention. EXEMPLE 3 On réalise plusieurs expérimentations avec le cy- cle adsorption-élution, en utilisant 3 bactério-phages avec le procédé selon l'invention, à trois températures: 40C, 24"C et 37 C.Les résultats sont résumés dans le Tableau 3 à la page 16. Il ressort clairement des résultats de ce tableau que, dans l'intervalle de température entre 40 et 37"C, les résultats d'adsorption-élution par le procédé selon l'in- vention sont pratiquement constants, ce qui n'est pas le cas pour les solutions salines. EXEMPLE 4 On effectue une expérimentation avec différentes concentrations de cellules animales parasites d'érythrocyte. Les cycles adsorption-élution sont réalisés avec trois bac- tériophages: Xx-174, MS-2 et-f2, en utilisant des cellules animales parasites d'érythrocyte à une concentration donnée, en solutions a 0,35% en volume de solution saline, a pH constant (3,5). Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau 4 à la page 18 Les résultats montrent que, pour des concentrations dans l'intervalle de 4 à 32% en volume, l'efficacité de l'adsorption est comprise entre 78,8 et 100%. EXEMPLE 5 Quelques expérimentations utilisant le procédé suivant l'invention sont effectuées, pour le cycle adsorp- tion-élution, sur un fluide biologique: l'urine. On dose les souches de virus suivantes: Poliovirus LSC-I; Echo- virus 6; Echovirus 7 et Coxsackievirus B5. On fait pas- ser sur une membrane à 15% en volume de cellules de porc parasites d'érythrocyte (Exp. A) une quantité de 5 ml d'u- rine, préparée comme décrit dans la norme. Des essais com- paratifs sont réalisés avec la mime quantité d'urine, mais sans les cellules de porc parasites d'érythrocyte (expéri- mentation B), préparée dans les mêmes conditions que pour l'expérimentation A. Les résultats du cycle adsorption- élution sont représentés dans le Tableau 5 à la page 20. Les résultats de ce tableau montrent nettement l'effet bénéfique obtenu lors de l'utilisation de la mem- brane de cellules de porc parasites d'érythrocyte, l'ef- ficacité du cycle adsorption-élution des virus, à partir de l'urine, étant pratiquement de 100%. EXEMPLE 6 On opère avec un autre fluide biologique: le fluide cérébrospinal (CSF). Au cours des expérimentations, on utilise 5 ml de CSF, avec une membrane à 15% en volume de cellules de porc parasites d'érythrocyte (Exp. A), pré- parée comme décrit dans la norme. On réalise une série d'essais comparatifs sans membrane (Exp. B), prépares dans les mêmes conditions. Les résultats du cycle adsorption- élution sont représentés dans le Tableau 6 à la page 20. EXEMPLE 7 Dans le Tableau 7 à la page 21 sont représentés les résultats d'une adsorption-élution réalisée en utili- sant une membrane à 15% en volume de cellules de porc pa- rasites d'érythrocyte, et en dosant les virus suivants pré- sents dans une solution saline: Echovirus 7; coxsackie- virus B-5; Echovirus 6 et Rotavirus (5A-11). EXEMPLE 8 On réalise une expérimentation avec une colonne de 10 cm de haut, renfermant de l'agarose avec des groupe- ments hexyl amine (liés à du bromure de cyanogène), et des cellules parasites d'érythrocyte. Le virus dosé est ox174. Les résultats obtenus sont résumés dans le Ta- bleau 8 à la page 22. Il ressort de ce tableau que dans l'expérimenta- tion 3 (témoin, sans cellules parasites d'érythrocyte), il ne se produit qu'une très faible adsorption, alors que, conformément à l'invention, on obtient une adsorption- élution pratiquement complète. La présnte invention peut être également utilisée avec succès, conjointement avec des "kits" connus, utilisés pour le dosage des virus, le but étant d'augmenter la sen- sibilité du "kit". On connaît bien le "Rotavirus Elisa kit" (produit par Dakopatts, au Danemark), grâce auquel on peut doser l'antigène de Rotavirus à des concentrations supé- rieures à 106 PFU (Unité de formation de plaque) par ml. Pour des concentrations inférieures à ce nombre, la sensibi- lité du dosage est très faible. Lors de l'utilisation de la concentration du virus, conformément à l'invention, avant celle de l'-"Elisa kit", des concentrations qui étaient à l'origine inférieures à 105 et même 104 PFU/ml, peuvent être décelées avec une précision élevée. Dans le Tableau 9 à la page 22, sont résumés les résultats obtenus au cours du dosage de Rotavirus SA-11 (provenant du singe) avec "Elisa kit". L'échantillon avait une concentration inférieu- re à 106 PFU/ml; une dilution à 10-4 PFU/ml est réalisée; le dosage est effectué à 2 valeurs de pH: 3,5 et 7,2 (Numé- ros d'ordre dans la série, 1 et 2 avec concentration, et 3 et 4 sans concentration). Il resssort de ce tableau que lors des expérimen- tations avec concentration selon l'invention, on obtient des dosages positifs avec "Elisa kit" à pH 7,2, alors que, * sans concentration, on ne peut obtenir de dosage. TABLEAU 1 Adsorption et élution de phages, avec utilisation d'extrait de boeufs à 3% de différentes sources, comparées à ces opérations avec membranes d'érythrocyte. Phage PFU/ml 0X-174 MS-2 pubst ance %% % % Substance absorbant 7,0 3,5 7,0 Ads. Elu. 7,0 3,5 7,0 Ads. lu. OXOID W PROD. 3,3x102 0,4x10 3,4x102 98,81031,4x103 1,2x103 1,3x103 14,3 93 PRD. cd 0 INOLEX 2102 3 3 -'J PROD. 3,4x10 3,4x i3,2x102 66941,4x101, 3X1031,4x1037,2 100 GX) C>'dDIFCO 2 2 3 3 3 PROD. 3,2X102 4,4x10 2,7x1020 84 1,5x10 1,4x103 1,3x103 6,7 86,6 dans sol. e saline à 0,85%3,9x102 0,6x104,10298,5102 1,35x103 0 1,3x103100 96, O dans l'eau L distillée 4,2x102 0,6x10 5,3x102 98,6126 1,37x1030 1, 35x10100 98, Solution 4,9x102 4,7x1024,9x102 4,5100 1,32x101,3x101,3x1031, 5 98, saline Un CK Co ul o TABLEAU 1 (suite) phage PFU/ml f-2 % % Substance absorbante 7,9 3,5 7,0 Ads. Elu. 4tOXOID = PROD. lx104 4,5x103 5,7x103 55 57 ctO -' NOLEX rN PROD.EX 1,2x104 1,2x104 9,5x103 0 79 DIFCO 4 3 3 PROD. 1,5x104 6x103 9,2x103 60 61 dans sol. i saline à 0,85% 1,2x104 0 1,1x104 100 92 -. S zdans l'eau distillée 1, 2x104 0 1,3x104 100 108 Solution saline 1,2x104 1,2x104 1,1x104 0 92 oi 0% o, 0% TABLEAU 2 Adsorption-élution de Poliovirus utilisant des membranes d'érythrocyte à 13% et de l'extrait de boeuf à 3% provenant de trois sources. TYPE DE VIRUS POLIOVIRUS LSC-1 (PFU/ml)a Matrice adsorbante Membranes Extrait de boeuf à 3% Solution saline pH d'érythrocyte (source) témoin INOLEX DIFCO OXOID 7,0 2,1x10O4b 1,9x104 2,0x104 2,1x104 4,1x103 3,5 0 0,6x104 1,8x104 0, 8x103 3,7x103 7,0 1,9x104 1,6x104 0,2x104 1,6x104 5,5x10 Adsorption % 100 97 12 96 9,8 Elution % 90 82 10 76 134 Note: Membranes d'érythrocyte à 13% dans solution saline a- PFU: unités formant des plaques b- Les résultats constituent une moyenne de deux expérimentations. ro oC 0o TABLEAU 3 Adsorption et élution de phages avec des membranes d'érythrocyte à différentes températures PhagessX - 174 PFU/ml Substance Membranes d'érythrocyte Solution saline adsorbante b ep b 4 C 24 C 37 C 4 C 24 C 37 C pH 7,0 5,8x104 6,2x104 6x104 5,7x104 6,6x104 7,5x104 3,5 0 0 0 5, 1x104 6,1x104 6,1x104 7,0 5,8x104 5,3x104 3,4x104 6,4x104 6,3x104 1,9x104 Adsorp. 100 100 100 10,6 7,6 18,7 %._ Elution 100 85 56 89 97 84 Note:La concentration des membranes d'érythrocyte est de 13% (en solution saline) à 24 C. Chaque expérimentation est faite 2 fois et c'est la moyenne qui est présen- te ici. o / o TABLEAU 3 (suite) Phages PFU/ml MS - 2 Substance adsorbante Membranes d'érythrocyte Solution saline b Tempb 4 C. 24 C 37 C 4 C 24 C 37 C pH__ _ _ _ 4 4 4 4 4 4 7,0 3,7X104 5,2X104 5,2x104 3,8x104 5,9x10 5,3x104 3,5 7,6x103 3,6X103 2x103 3,8x104 5,2X104 5,6x104 44444 4 7,0 3,9x104 3,3x104 4,9x104 3,3x104. 4,9X104 4,6X104 Adsorp. 79,5 93 96 0 12 0 -, __..DTD: Elution 51 77 75 87 83 87 _......_, ..........., Co TABLEAU 3 (Suite) Phages f2 PFU/ml Substance Substance Membranes d'érythrocyte Solution saline adsorbante Tempb 40C 24 C 37 C 4 C 24 C 370C 7,0 8,6x104 7,5x104 8,5x104 8,1x104 7,2x104 8,2x104 3,5 4x103 1x103 2x103 4,5x104 6,2x104 4,4x104 7,0 6,2x104 6,3x104 6,7x104 6,5x104 7,1x104 6,5x104 Adsorp. 95 98,7 97,7 44,5 14 47 Elution 72 84 79 80 98,6 79 co% Co TABLEAU 4 Adsorption des phages à différentes concentrations de membrane d'érythrocyte, à pH 3,5 Phlage 0X-174 MS-2 PFU/ml Membrane Titre en pha- Titre en pha- Adsc Membrane Titre en pha- Titre en pha- Ads. Conc. ge dans le ge dans la % Conc. ge dans le ge dans la % % sup.a solb % sup. sol. 32 4,6x106 1,2x108 96 26 2,5x106 4,7x107 95 26 3x108 5,2x109 94 18 2, 6x106 4,7x107 94 23 7,2x106 1,2x108 94 12 3,1x106 4,5x107 93 11 1,2x107 1, 2x108 90 4 1x107 4,7x107 78,8 o 7,2x108 5,2x109 86 1 3,8x107 4,4x107 14 3 8x108 5,2x109 84,6 2 2,5x107 1,2x108 79 b- Titre en phage dans la solution saline, sans membranes d'érythrocyte (stade 2, pH 3,5). o 0% oo TABLEAU 4 (suite) f2 Membrane Titre en phage Titre en phage Ads % Conc. dans le Sup. dans la Sol. 26 0 1,2x104 100 2 4A- 12 6x102 1,2x104 95 4 1,3x103 1x104 87 2 4,6x103 1,2x104 62 0,9 6,6x103 1, 4x104 53 Ln os c7o os o TABLEAU 5 Adsorption et élution de virus provenant de l'urine, avec utilisation de membrane de cellules de porc parasites d'érythrocyte (Exp. A), et sans utilisation de membrane (Exp. B) Poliovirus Echovirus 6 Echovirus 7 Coxsackie- virus B5 % Ads,% Elu % Ads. % Elu % Ads.% Elu % Ads.% Elu. A 98,6 111 96,4 101 93,5 79,7 78 84 B 59 97 2,7 97,4 8 102 5,6 97,2 TABLEAU 6 Adsorption et élution de virus provenant de CSF: Exp.A: avec membrane de cellules de porc parasites d'érythrocyte. Exp.B; sans membrane. Polyovirus LSC-1 Echovirus 6 ox174 (Bacterio- phage) % Ads. % Elu. % Ads. % Elu % Ads. % Elu. A 91,7 100 98,2 114 98,9 102 B 7 104 0 118 0 111 TABLEAU 7 Adsorption-élution de 5 virus "entering" sur des cellules parasites d'érythrocyte % virus Pliovirus LSC-1 Echovirus 7 Coxsackievirus B5 Echovirus 6 Rotavirus(SA-11) Exp. Adsorbé Elué Adsorbé Elué Adsorbé Elué Adsorbé Elué Adsorbé Elué 1 100 100 100 160 100 100 94 91 88 92 2 99 91 100 105 100 104 100 104 96 92 3 100 104 100 120 100 108 100 114 95 108 4(témoin) 17,5 109 13,4 86,6 8,2 71 18,2 82 8 116 I Note: Le volume essayé est de 5 ml de solution saline renfermant 13% de cellules parasites d'érythrocyte (Exp. 1 à 3), et de 5 ml de solution saline seule (Exp.4). Le titre en virus est de 1,6x104 à 3,1x104 PFU/ml. L'élution est faite comme décrit dans "Materials and Methods". n o' co o TABLEAU 8 Dosage de ox174 sur une colonne renfermant de l'agarose avec des groupements hexyl amine, et des cellules parasites d'érythrocyte Exp. N % adsorption % Elution 1 75 94 2 82 90 3 (témoin 18 98 sans cell. parasites d'érythro- cyte) TABLEAU 9 Dosage de Rotavirus SA-11 avec "Elisa Xit" conjointement avec concentration par cellules parasites d'érythrocyte N d'ordre dans pH Experiment. N0 Témoin Ne la série 1 2 3 4 1 3,5 - - 2 7,2 + + - - 3 3,5 4 7,2 Revendications 1. Procédé pour concentrer des virus à partir de fluides biologiques liquides et d'eaux vannes, caractéri- sé en ce qu'on met en contact le fluide renfermant les vi- rus avec une matrice adsorbante comprenant. des cellules animales parasites d'érythrocyte, puis on acidifie la ma- trice ainsi traitée, ce qui entraîne la séparation du pré- cipité de virus adsorbé par les cellules animales parasi- tes d'érythrocyte, et on élue ensuite le précipité obtenu à l'aide d'une solution dont le pH est supérieur à celui de l'étape précédente, ce qui permet d'obtenir un concentré de virus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élution est réalisée à un pH supérieur à 6,5. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que la matrice adsorbante se présente sous forme d'une pellicule continue, de préférence sous forme de membrane. 4. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que la matrice adsorbante se présente sous forme de particules solides, de préférence d'une dimension comprise entre 1 et 20 microns. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que la concentration en cellules animales pa- rasites d'érythrocyte, dans la matrice adsorbante, est com- prise entre 4 et 30% en volume. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce qu'on opère à une température comprise entre 4 et 37 C. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce que les cellules animales parasites d'érythro- cyte sont déposées sur un support, de préférence des perles de verre ou de matière plastique. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, carac- térisé en ce que l'on empoche l'altération microbienne des cellules parasites par traitement avec un réactlif stabi- lisant, de préférence l'azoture de sodium. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que le fluide biologique est l'urine. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que le fluide biologique est le fluide cérébro- spinal. 11. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on l'applique conjointement avec des "kits" utilisés pour le dosage de virus.