Brevet FR2566798A1 — publié le 19860103

i 2566798 La présente invention est relative à une membrane porteuse de la luciférase pour, notamment, le dosage. de l'acide adénosinetriphosphorique, ou ATP, ainsi qu'à un procédé pour sa production. La luciférase est une enzyme généralement extraite de la luciole (Photinus pyralis), Récepment elle est l'objet d'un regain d'intérêt du fait de sa spécificité pour 1A.T.P.: elle permet en effet de doser cet acide ou ses sels dans de nombreux produits alimentaires. Par exemple,en dosant l'A.T.P. présent dans le lait, on peut effectuer le dosage microbien ou celui de la créatinine en analyse diasique. Le dosage de l'A.T.P. est réalisé par photométrie puisque sa réaction avec l'enzyme produit une émission de photons selon les deux équations réactionnelles suivantes: E + LH2 + ATP Mg++ ELH2 -AMP + PP E.LH2 - AMP + 02 > E + P + CO2 + AMP + photons dans lesquelles E représente la luciférase, E.LH2-AMP le complexe luciférine adenylate, Ple produit de la réaction d'oxydation produisant l'oxyluciférine et PP le pyrophosphate. L'intensité de la bioluminescence mesurée est di- rectement proportionnelle à la quantité d'A.T.P. présente dans le produit considéré. Mais la mise en oeuvre de cette méthode a été long- temps freinée par le manque de stabilité de la luciférase. Aussi un certain nombre de méthodes pour cet enzyme a t-il été étudié. Ainsi, on réalisa son piégeage dans un gel d'albumine additionné de glutaraldéhyde, ou dans un gel polyacrylamide, son adsorption sur ce dernier gel ou son immobilisation sur différents supports de polysaccharides tels que: AH-Sepharose 4B ou CH-Sepharose 4Ben utilisant un carbodiimide, ou CH-Sepharose 4B en utilisant le réactif de Woodward, ou encore son immobilisation sur des supports polysaccharidiques activés par un bromure de cyanure (CNBr). -2- Seule cette dernièe méthode a été considéré comme satis- faisante car elle permet de conserver 20% de l-'activité de la luciférase, taux nettement supérieur à tous ceux obtenus par les autres méthodes. De ce fait, la lucifé- rase ainsi immobilisée est produite à un coût relative- ment élevé pouvant être considéré comme prohibitif pour des applications industrielles. Par ailleurs,elle ne pré- sente pas une stabilité réellement satisfaisante. Aussi un des buts de la présente invention est-il de fournir une luciférase immobilisée à un coQt attractif afin d'en permettre une grande utilisation industrielle. Un autre but de l'invention est de fournir une telle luciférase qui est stable à la température et dans le temps. Un but supplémentaire de l'invention est de four- nir un procédé pour la préparation d'une telle luciférase immobilisée qui est simple et peut être réalisé à une échelle industrielle. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par la luciférase immobilisée sur une membrase, laquelle, selon la présente invention, est une membrane constituée par un albuminolde hydrophyle. Avantageusement, cette membrane est constituée par de la gélatine de peau de porc. La présente invention est également relative à un procédé pour fabriquer une telle membrane porteuse de luciférase selon lequel oh dissout un albuminoide hydrophile dans un tampon faiblement acide.afin d'obtenir une membrane homogène, on effectue la réticulation de cette membrane homogène, à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à un pH faiblement acide, et on sature la membrane ainsi ob- tenue par une quantité déterminée de luciférase. De preférence, le tampon faiblement acide est constitué par une solution de phosphate de sodium dont le pH est de 6,8. 3- Avantageusement la solution obtenue par dissolu- tion de l'albuminolde hydrophile dans le tampon comprend 6% en poids de cet a!buminoide. De préférence, on réalise une membrane homogène à partir de cette solution, en l-'étalant, après une in- cubation courte à une température comprise entre 25 C et 500C, sur un support convenable dont elle sera retirée après séchage. Avantageusement, l'incubation est effectuée pen- dant une heure à une température de 37 C. De préférence, le support convenable est constitué par un film de polycarbonate. Avantageusement, la réticulation:de la membrane homogène est effectuée par une solution à-0,5% en.volume de glutaraldéhyde. De préférence, le pH de la solution de glutaral- déhyde est le même que celui du tampon phosphorique.- Avantageusement, la saturation par la luciférase:- de la membrane est effectuée en présence de dithlothrêitol: (D.T.T.). La description qui va suivre et qui ne présente. aucun caractère limitatif permettra à l'homme du métier de mieux comprendre la présente invention ainsi que de mettre en évidence les avantages de celle-ci. La luciférase est préparée, selon une méthode connue, à partir d'abdomensdesséchés de lucioles (Photinus pyralis par exemple) dans un tampon à 0,1 m d'arsénate dont le pH est de 7,4, comme cela est décrit par S. RAJGOPAL et al. dans J. of Chromatography 1982, n 243, pages 164- 167. L'extrait ainsi obtenu est dialysé pendant.24 heures dans du trisacétate à 0,02 M (pH = 7,8) en présence de 1 mbM d'acide éthylène-diaminotétracétique-(EDTA) iet avec trois changements du tampon. Parmi les produits albuminoides hydrophile, la Deman- deresse a choisi d'utiliser la gélatine de peau de porc pour réaliser une membrane sur laquelle sera immobilisée la luciférase. Dans un premier tems, on dissout la gélatine de peau de porc dans un tampon de phosphate de sodium -5 à 0,02 M (pH = 6,8) de façon à obtenir une solution dans laquelle la concentration en gélatine est de 6% en poids. ette solution est ensuite incubée pendant une heure à 37 C. Dans un second temps on étend la solution obtenue sur un film de polycarbonate, matériau convenant du fait de sa non-adhérence: par exemple sur une surface de 15 cm2 d'un tel film, on dispersel5 ml de cette solu- tion. Puis on laisse sécher pendant environ une dizaine - d'heures. Une membrane homogène se forme ainsi sur ce film de polycarbonatedont elle se détache aisément. La réticulation de cette membrane homogène est réalisée en trempant des bandes ou des carrés de celle-ci pendant un court laps de, temps, de l'ordre de cinq minutes, dans un tampon identique au précédent qui comprend en outre O,5%en volume de glutaraldéhyde.La membrane ainsi réticulée est lavee plusieurs fois avec ce même tampon afin d'éliminer l'excès de glutaraldéhyde. L'immobilisation de la luciférase sur la membrane réticulée est effectuée par saturation par une quantité déterminée de luciférase de preférence enprésence de dithiothréitol(D.T.T.). Après une heure à température am- biante, on lave cette membrane réticulée sur laquelle est immobilisée de la luciférase, avec le tampon déjà décrit ci-dessus. Les essais suivants ont permis de déterminer les différents paramètres du procédé pour obtenir de la lu- ciférase immobilisée sur une membrane protéinique. 1) Effet du glutaraldéhyde Différentes membranes homogènes ont été réticulées avec des tampons de phosphate de sodium à 0,02 M (pH 6,8) comprenant des concentrations de glutaraldéhyde variant -S - entre 0,5 et 5,0%. Les membranes réticulées ainsi obtenues -en fait des disques de celles-ci- ont été plongées dans aune solution de luciférase en présence de DTT pendant une heure à une température de +4 C. Sur chaque centimètre carré ont été immobilisés 500 V1 d'enzyme en presence de 100 U1 de DTT (9,5 mg de UIT dans 10 ml de morpholino-propane-sulfonate ou MOPS). Il a été ainsi montré que l'activité maximum de la luciférase est obtenue avec une concentration du glu- taraldéhyde de 0,5%. Cette activité diminue alors que la concentration en glutaraldéhyde augmente jusqu'à 1% puis devient supérieure à 2%. Entre une concentration comprise entre 1% et 2%, l'activité enzymatique de la luciférase croit linéairement. _ Il y a lieu de rappeler que la luciférase en so- lution est totalement inactivée.par le glutaraldéhyde en une heure de temps et que le dithiothréitoI n'a aumne influence sur cette vitesse d'inactivation. 2) Effet du temps de contact de la luciférase avec des membranes réticulées. On laisse des disques de membranes réticulées en présence de 0,5% de glutaraldéhyde en contact avec de la luciférase pendant différentes durées. Le temps de contact maximum ainsi mis en évidence est de une heure. Pour des durées différentes, on a pu constater des pertes d'activité significatives. Dans le cas de la luciférase en solution, on constate qu'au bout d'une heure, cette solution présente une activité enzymatique résiduelle de 10% par rapport à celle de la solution fraîchement préparée. Si cette solu- tion comporte du DTT, cette activité résiduelle est de %. 3) Effet du pH lors de la réticulation Des disques de membrane homogène ont été placés dans une solution à 5% de glutaraldéhyde dans un tampon de 0,02 M de phosphate de sodium pendant une heure à +4 C. -6- On a constaté que l'activité enzymatique de la luciférase immobilisée ultérieurement sur de telles membranes est maximum lorsque le pH du tampon est de 6,8. Certes il est connu que la réticulation en présence de glutaraldéhyde est favorisée par un pH acide: elle est en particulier maximum à pH 5. Par contre, l'ac- tivité maximum de la luciférase en solution est à pH 7,8. L'expérience a montré que le dosage de l'activité de la luciférase immobilisée sur une membrane réticulée à pH 5 est pratiquement impossible. 4) Effet de la température lors de l'immobilisation La température optimum d'immobilisation corres- pond à l'activité enzymatique maximum, a été déterminée en faisant varier la température lors de la mise en contact de disques de membranes réticulées. Cette tem- pérature est de 18 - 20 C c'est-à-dire la température ambiante. Les caractéristiques de la luciférase immobilisée selon le procédé de la présente invention ont été mises en évidences par les expériences suivantes. 1) Rendement de l'immobilisation Environ 30 à 40% de l'activité de la luciférase mise au contact d'une membrane réticulée comme décrite cidessus est retenue. Une activité spécifique de 100 à 200 unités par milligramme de membrane a été mesurée. De plus la même membrane peut être utilisée plusieurs fois. Les disques de membrane après utilisation peuvent être lavés et conservés dans un tampon de 0,02 M de phos- phate de sodium (pH 6,8) en présence de dithiothréitol afin de préserver leur activité. L'enzyme immobilisée sur de tels disques et con- servée dans ces conditions est stable pendant au moins 16 jours. Le fait que la membrane préparée selon la présente -7- invention soit utilisable pendant un tel laps de temps, représente un avantage important sur le plan industriel. 2) Stabilité dans le temps. De l'étude précédente ont été déduites les condi- tions optimales pour chaque paramètre étudié. La luciférase mise au contact d'une membrane qui a été réticulée en présence de 0,5% de glutaraldéhyde à pH 6,8, pendant une heure à la température ambiante en présence de DTT, présente une activité enzymatique stable:deux heures après la fin dé la mise en contact, l'activité enzymatique est de 95% et se maintient à O cette valeur. - Dans le cas de la luciférase en solution, ce taux d'activité n'est que de 54%. 3) Stabilité à la température - En chauffant des disques de membrane réticulée comportant de la luciférase, on remarque une stabilïté de l'activité enzymatique jusqu'à environ 20-25 C, puis une décroissance relativement lente. La tenue mécanique des disques n'est nullement affectuée par la température. Lorsque la luciférase est en solution, son activité enzymatique maximum est à:4 C puis:décroît très rapidement pour être nulle avant 40 C. Obtenir une membrane utilisable à la température ambiante représente un grand avantage dans la mesure o - aucune précaution particulière d'emploi n'est nécessaire. On peut inclure un détecteur d'ATP utilisant une telle membrane sans devoir fondamentalement modifier une chaîne de contrôle dans l'industrie. De plus, on mesure l'acti- -30 vité d'organismes vivants. 4) Stabilité au pH. Tant pour l'enzyme immobilisée que pour celle en solution, le pH optimum est de 7,4. ) Concentration de la luciférase et de l'ATP. Vis-a-vis de ces deux produits, on a pu remarquer -8- que le support (gélatine.de peau de porc) n'a aucune influence sur l'affinité-du substrat (luciférine ou ATP) pour la luciférase. Il n' y a donc aucun problème de diffusion de l'enzyme immobilisée à la surface de la ' me brane et ces produits. L'immobilisation de la luciférase sur une membrane d'un albuminoide hydrophile tel-que la gélatine de peau de porc permet donc d'obtenir une membrane facilement uti- lisable, d'une durée de vie acceptable et présentant une grande spécificité pour l'acide adénosine-triphos- phorique (ATP). En effet,on a pu observer une réponse linéaire du pic d'intensité lumineuse avec des concen- trations d'ATP variant entre 10 et 106 picogrammes d'ATP par millilitre de solution. -9- REVENDICATIONS 1. Membrane porteuse de luciférase pour notamment le dosage de l'acide adénosine-triphosphorique caractérisée par le fait que ladite membrane est constituée par un albuminolde hydrophile. 2. Membrane selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par de la gélatine de peau de porc. 3. Procédé pour fabriquer une membrane selon la renvendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on dissout un albuminoide hydrophile dans un tampon faiblement acide afin d'ob- tenir une membrane homogène, que l'on effectue ensuite la réticulation de ladite membrane homogène à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à un pH faiblement acide, et on sature la membrane obtenue par une quantité de lucifé- rase. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le tampon faiblement acide est une solution de phosphate de sodium dont le pH est 6,8. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, carac- térisé en ce que la solution obtenue par dissolution dudit albuminoide hydrophile dans ledit tampon comprend 6% en poids dudit albuminolde. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, / caractérisé en ce que, après la dissolution dudit albuminolde hydrophile, on étale la solution obtenue, après une courte incubation à une température comprise entre 25. et 50 C., sur un support convenable dont elle sera retirée après séchage. 7. Procédé selon 6, caractérisé en ce que ladite incibBtion est effectuée pendant une heure à 37 C. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le support convenable est constitué- par un film de polycarbonate. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica- -10- tions3 à 8, caractérisé en ce que la réticulation de ladite membrane homogène est effectuée par une solution à 0,5% en volume de glutaraldéhyde. 10. Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que le pH de ladite solution de glutaral- déhyde est le même que celui dudit tampon. 11. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 3 à 10, caractérisé en ce que la saturation par la luciférase de ladite membrane réticulée est effectuée en présence de dithithréitol. 12. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 3 à 11, caractérisé en ce que ledit albuminolde hydrophile est de la gélatine de peau de porc.