Brevet FR2563434A1 — publié le 19851031

La rage est une maladie très ancienne mais, jusqu'à maintenant, son contr1ôle complet n'a pas pu être réalisé. Bien qu'il existe des vaccins efficaces contre la rage, de tels vaccins sont trop onéreux pour pouvoir être utilisés à titre préventif. En outre, il existe un réservoir très important de virus de la rage dans les animaux sauvages et pour cette raison, seuls deux pays insulaires, la Grande-Bretagne et le Japon, ont pu parvenir à une éradication de ce fléau. L'agent causal de cette maladie est un Rhabdovirus. La transmission de la rage comporte en général la morsure d'un individu récepteur par un animal infecté; le change- ment de comportement associé à l'infection chronique joue un rôle important dans l'étiologie de la maladie. Dans l'homme, l'infection est suivie par une période de dormance pendant laquelle le virus voyage par le système nerveux jusqu'au cerveau. Au début, cette maladie peut être traitée de façon efficace par une vaccination intensive; toutefois, lorsque les symptômes comportementaux apparaissent, la mort est presque inévitable. Le virus comporte 5 protéines virales dont une seule, la glycoprotéine (G, haemmagglutinine), traverse la bicouche lipidique enveloppant le virus. Ainsi, la glycoprotéine est le seul composant viral capable de réagir avec des anticorps neutralisant le virus et également d'induire leur production. Anilionis et al. (1981) ont décrit l'isolement d'une séquence codante correspondant à l'ARN messager de la glycoprotéine de la rage, souche ERA et Lathe et al. (1984) ont décrit l'expression de cette séquence dans une bactérie. Toutefois, une immunisation efficace à l'encontre de la rage utilisant la matière synthétisée par les bac- téries n'a pas encore pu être réalisée. Des résultats similaires ont été rapportés par Yelverton et al. (1983) en utilisant une deuxième souche de rage, CVS. Des résultats préliminaires suggèrent que des modifications posttraductionnelles et/ou une présentation de la glycoprotéine sont des paramètres importants dans l'utilisation de cet antigène pour qu'il confère une protection à l'encontre de la rage. La présente invention décrit l'expression d'une séquence codant pour la glycoprotéine de la rage dans un environnement tel qu'une modification et une présentation correctes des produits de traduction primaire puissent intervenir. Deux groupes ont récemment mis en évidence l'utilisation de recombinants vivants du virus de la vaccine pour exprimer l'antigène de l'Influenza ou de l'Hépatite B pour immuniser contre ces maladies (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983). L'expression d'une séquence codante pour une protéine exogène dans le virus de la vaccine (W) implique nécessairement deux étapes: ) La séquence codante doit être alignée avec un promoteur de WVV et être insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de W cloné dans un plasmide bactérien approprié; 2 ) Les séquences d'ADN de WVV situées de part et d'autre doivent permettre des recombinants homologues in vivo entre le plasmide et le génome viral. Une double recombinaison réciproque conduit à un transfert de l'insert d'ADN du plasmide dans le génome viral dans lequel il est propagé et exprimé (Panicali et Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983). La présente invention concerne un virus de la vaccine caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une glycoprotéine antigénique de la rage, nommée ci-après séquence d'ADN(I). On entend désigner par "glycoprotéine anti- géniqpe de la rage" une glycoprotéine qui, in vitro, mais de préférence in vivo, présente des caractéristiques immunogéniques identiques ou voisines de la glycoprotéine de la rage vraie, c'est-à-dire celle du virus sauvage. Bien que l'on préfère utiliser pour la séquence ADN(I) la séquence d'ADN codant pour la protéine mature complète, il est possible d'utiliser seulement une partie de cette séquence d'ADN ou une telle séquence portant des mutations ponctuelles mais qui conduisent à des produits ayant des activités quasi identiques. Ce virus comportera de préférence l'ensemble des éléments assurant l'expression de ladite glycoprotéine, en par- ticulier un promoteur d'un gène de la vaccine tel que le promoteur du gène de 7,5K noté P7,5K qui assurera la promotion de la séquence d'ADN(I). Cet ensemble promoteur/séquence d'ADN(I) sera inséré dans un gène du virus de la vaccine, par exemple le gène TK, ce qui fournit une possibilité de sélection comme cela sera expliqué ci-après. Le virus hybride ainsi obtenu peut être utilisé tel quel, vivant ou inactivé par traitement chimique ou physique, comme agent vaccinant ou bien être utilisé pour infecter une culture cellulaire de laquelle on pourra extraire la glycoprotéine antigénique par des techniques connues à partir du broyat cellulaire. Il est particulièrement intéressant au niveau industriel de disposer d'un virus recombinant avec lequel les accidents de vaccination soient réduits au maximum. Pour ce faire, on utilisera de préférence les virus recombinants thermosensibles (ts), c'est-à-dire qui sont détruits au-delà d'une température déterminée. En effet, la thermosensibilité est liée en général pour la vaccine avec une diminution de la pathogénicité des souches sauvages et on peut espérer une diminution des risques d'accidents de vaccination dans le cas des virus non-pathogènes recombinants selon l'invention. Voir F. Keller et col., 1978 et F. Keller et R. Drillien, 1980. En effet, cette thermosensibilité conduit à une multi- plication plus lente du virus aux températures du corps humain. En outre, lorsque la température critique de thermosensiblité est voisine de celle de la peau, ceci conduit à une modification du tropisme du virus qui ne peut se développer qu'en surface du corps humain et donc ne peut se généraliser. En outre, toute fièvre anormale, c'est-à-dire dépassant la simple réaction de vaccination pourra conduire à la destruction du virus, ce qui permet d'écarter ainsi les risques de complication qui pourraient surgir lors de la mise en oeuvre des virus recombinants de l'invention. Ce type de mutation ts peut exister sur le vecteur vaccine lui-même ou bien être introduit par mutation dans les virus recombinants selon l'invention. En particulier, on peut introduire dans le virus recom- binant différentes thermosensibilités afin de maintenir le phénotype, même en cas de réversion partielle. En outre, on peut prévoir l'utilisation d'un virus mutant de la vaccine présentant une spécificité d'hôte qui ne pousse pas ou peu sur des cellules humaines et dont la pathogénicité est encore plus faible que celle de la vaccine. La présente invention concerne, en outre, des vaccins destines au traitement ou à la prévention de la rage, caractérisés en ce qu'ils comportent un virus hybride selon l'invention ou une glycoprotéine obtenus par la mise en oeuvre du procédé précédent. L'invention concerne également les anti-sérums obtenus à partir d'animaux immunisés par les vaccins selon l'invention. Pour ces vaccins, les voies d'administration peuvent être variées, en particulier on peut procéder par voie intra-dermique. Ces vaccins peuvent être administrés avec des supports pharmaceutiques connus et comporter, en outre, des adjuvants permettant d'augmenter leur pouvoir vaccinant. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La préparation du virus selon l'invention comporte notamment les étapes suivantes: 1) une restructuration d'une extrémité du cADN de la rage, schématisée à la figure 1, par le procédé schématisé à la figure 2, pour obtenir pTG155; 2) une mutation d'une des séquences de ce cADN afin de rétablir dans la glycoprotéine la proline au 8ème acide aminé, figure 3, pour obtenir ptgl55-pro; 3) La synthèse d'un mini-plasmide ptglH à partir de pBR322 (figure 4); 4) l'insertion dans ce mini-plasmide du fragment Hin-J portant le gène TK de VV; ) l'insertion dans le gène TK du promoteur de la protéine 7,5K (figure 5); - 6) l'insertion sous la promotion de P7,5K du gène de la rage porté par ptgl55-pro (figure 5); 7) le clonage des éléments essentiels de ce dernier plasmide dans le virus de la vaccine (figure 6). Les exemples suivants illustrent les propriétés des différents composants obtenus. Les différents matériels mis en oeuvre sont identifiés dans les exemples. Sauf indication contraire, les enzymes sont utilisées dans les conditions préconisées par le fabricant et les techniques mises en oeuvre sont connues de l'homme de métier. Les séquences d'acides aminéset les séquences de nucléotides représentées sur les figures ne sont pas reprises dans le corps de la description pour ne pas l'alourdir mais elles en constituent une partie intégrante. Restructuration du cADN de la glycoprotéine de la rage La séquence codant pour la glycoprotéine de la rage isolée par Anilionis et al. et représentée à la figure 1, comporte des éléments qui peuvent gêner sa traduction et son expression comme antigène. Tout d'abord, 1'ATG correspondant au codon d'initiation pour le message mature se trouve immédiate- ment adjacent à une séquence polyG introduite par la procédure de clonage du cADN. Cette séquence est susceptible de provoquer une instabilité lors de la recombinaison in vivo entre les éléments G/C à chacune des extrimétés du cADN et peut de plus gêner la traduction du message. Ensuite, les séquences du cADN de la glyco- protéine ne correspondent pas parfaitement à la séquence codant pour le peptide N-terminal de la glycoprotéine mature. C'est pourquoi il a été décidé d'éliminer ces deux obstacles avant d'effectuer le clonage de la séquence codante correspondant. 1/ Kozak (1981, 1983) a montré que les codons d'initiation de la traduction dans les eucaryotes se trouvent normalement dans une séquence qui peut être représentée de la façon suivante: A X X ATG (A ou G) et des altérations de cette séquence peuvent conduire à des diminutions de la traduction. Bien que l'importance de ces nucleotides d'extrémité ne soit pas parfaitement établie, il semble préférable d'éliminer la séquence G/C adjacente et de conserver l'essence de la séquence consensus mentionnée précédemment. En outre, il est nécessaire de prévoir une séquence de reconnaissance BglII en amont de façon à faciliter la manipulation Subséquente. 2563434' En restructurant l'extrémité 5' du cADN, comme cela est représenté à la figure 2, on a profité de l'existence d'un site unique MstII qui recouvre les codons codant pour les amino-acides 2, 3 et 4 du produit de traduction primaire. Dans le plasmide pTG150, le cADN de la glyco- protéine de la rage d'Anilionis a été inséré, en utilisant des oligonucléotides adaptateurs PstI/BglII (Lathe et al. 1982) dans un site unique BgiII inséré dans le site HindIII du plasmide pBR327. Ce plasmide, représenté en A de la figure 2, a été mis en digestion partielle avec glII et en digestion complète avec MstII et les fragments linéaires appropriés ont été isolés par électrophorèse sur un gel d'agarose à basse température de gélification. Les oligonucléotides (5'dGAT TAATATGGTTCC-3') et (5'-dTGAGGAACCATATTA-3') ont été synthétisés selon une technique précédemment décrite (Kohli et al., 1982). Les oligonucléotides sont hybridés pour donner un duplex partiel (B de la figure 2) et ligaturés entre les extrémités BglII et MstII du plasmide linéaire purifié, ce qui permet la recircularisa- tion et génère le plasmide ptglS5 (C de la figure 2). 2/ Le 8ème amino-acide de la glycoprotéine mature (ne présentant pas la séquence signal) des souches de virus ERA et CVS de la rage est la proline, tandis-que le cADN isolé par Anilionis et al. correspond à un triplet codant pour la leucine. Dans pTG155 représenté à la figure 3, le site mutant est flanqué par un site en amont EcoRI dans le vecteur et par un site HindIII sur les séquences corres- pondant aux amino-acides 10 et 11 de la séquence codant pour la glycoprotéine mature. Ce petit fragment EcoRI/HindII est cloné dans le bactériophage M13tgl31 (Kieny et al., 1983) en orientation reverse. Une mutagénèse localisée dirigée par un oligonucldotide est effectuée selon la technique de Zoller et Smith (1983) en utilisant l'oligo- nucléotide (5'-dATCACGATCCCAGACAAGC-3') synthétisé comme cela a été indiqué précédemment. Le codon pour l'amino-acide 8 dans la séquence de cADN est changé pour remplacer CTA en CCA. L'oligonucléotide (19-mer) contient deux modifications par rapport A la séquence originale: un T en place de C, ce qui corrige le triplet de la leucine CTA en proline CCA, et un A en place de C qui correspond à une transversion dans la séquence GATA. Ceci génère une séquence GATC de dam méthylation ce qui favorise l'incorporation de la séquence d'oligonucléotide par correction des faux appariments sélectifs in vivo. Il faut remarquer que le fragment EcoRI/HindIII qui a été cloné en orientation réverse a celle qui est_ présentée ici de façon que le brin inférieur, complémen- taire de l'oligonucléotide, soit présent dans le bactério- phage recombinant M13 mono-brin. Des plages de phages sont examinées pour l'hybridation dans des conditions appropriées avec l'oligo- nucléotide marqué à son extrémité 5' par32P. Un certain nombre de plages positives sont prélevées et les inserts correspondants sont séquencés. L'insert de l'un des clones correctement modifié est recloné dans pTG155 en échangeant les fragments EcoRI/HindiII pour générer finalement le plasmide restructuré pTG155-pro. L'analyse des clones apparaissant pendant cette étape est facilitée par l'existence d'un nouveau site pour l'enzyme de restriction Sau3A qui coincide avec la séquence de méthylation dam introduite pendant la mutagénèse dirigée par oligonucléotide Dans le plasmide pTG155-pro, le cADN de la glycoprotéine de la rage restructuré est flanqué à chacune de ses extrémités par des sites BglII. A l'extrémité aval le site BglII provient de l'utilisation de l'oligo- nucléotide adaptateur BglII/PstI octamer utilisé pour cloner le fragment de cADN PstI/PstI dans le site BglII et le site en amont résulte de l'utilisation d'un petit oligonucléotide double brin destiné à éliminer l'extrémité G/C. Construction des plasmides hybrides Les tailles combinées des différents éléments nécessaires pour le transfert de la séquence codant pour la glycoprotéine de la rage dans le génome de VV et son expression subséquente sont de l'ordre de plusieurs kb. Il a donc été jugé nécessaire de minimiser la taille du plasmide de réplication dans E. coli utilisé pour le travail de construction de façon à faciliter les mani- pulations nécessaires. Le fragment HindIII (Hin-J) du génome de VV contient le gène complet de la thymidine kinase (TK) qui a déjà été utilisé précédemment pour permettre l'échange et la recombinaison de l'ADN inséré dans le génome de VV (Mackett et al., 1982). Il est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TK dans le génome de VV crée un virus TK déficient qui peut être reconnu de façon très simple en utilisant une simple sélection. Il a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant un site unique HindIII utili- sable pour l'intégration du fragment Hin-J VV. En outre, il était nécessaire d'éliminer les séquences de restriction non nécessaire du plasmide de façon à permettre les manipulations suivantes. i] 3/ La construction a été amorcée à partir du plasmide pML2 (Lusky et Botchan, 1981) qui est un vecteur dérivé du plasmide pBR322 par délétion spontanée dans lequel le segment entre le nucléotide 1089 et 2491 a été perdu (figure 4). D'abord la séquence de PstI a été éliminée par insertion du fragment AhaIII-AhaIII de pUC8 (Vieira et Messing, 1982) entre deux sites AhaIII de pML2 en éliminant 19 paires de bases. On a utilisé la méthode de "linker-tailing" (Lathe et al., 1984) pour insérer un linker HindIII entre les sites NruI et EcoRI traité par S1 de ce plasmide, en éliminant le site BamHI. Ceci conduit à un plasmide de 2049 paires de bases portant le gène P-lactamase fonctionnel (conférant la résistante à l'ampicilline et comportant en outre une origine de réplication active dans E. coli et un site de restriction unique HindIII. Cette construction a été appelée pTGlH. 4/ Le fragment Hin-J de l'ADN de WVV portant le gène TK a préalablement été cloné dans un vecteur pro- venant de pBR327 (Drillien et Spehner, 1983). Ce fragment de 4,6 kb a été recloné dans le site HindIII de pTG1H. Un clone a été sélectionné dans lequel le gène TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Cette construction pTG1H-TK a été utilisée comme porteur dans l'expérience suivante. / L'étape suivante a été d'isoler un promoteur de W utilisable pour commander l'expression de la séquence codant pour la glycoprotéine de la rage insérée. Le promoteur d'un gène précoce codant pour une protéine de 7 500 daltons (7,5K) a déjà été utilisé avec succès dans un but identique (Smith et al., 1983) et on a donc procédé l'isolement de ce segment. Le gène 7,5K est situé sur l'un des plus petits fragments SalI (fragment Sal-S) du génome de WVV type WR (Venkatasan et al., 1981). Comme les petits fragments sont clones de façon préférentielle, une grande proportion des clones obtenus par clonage direct de l'ADN de WVV type WR coupé par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal-S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (voir Kieny et al., 1983), par digestion SalI-et religation, en conduisant ainsi au phage M13tgSal-S. Dans ce clone, un site ScaI se trouve immédiate- ment à proximité de 1'ATG d'initiation du gène 7,5K. En aval du gène 7,5K se trouvent situés des sites uniques BamHI et EcoRI provenant du vecteur. Les sites BamHI et ScaI sont fusionnés par l'intermédiaire d'un linker BglII 5'-CAGATCTG-3' par la technique des "linker" après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment Klenow de la polymérase. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et déplace le site unique EcoRI en aval. En même temps, le site SalI devient donc unique. Cette construction est appelée M13tg7,5K. A l'intérieur du fragment Hind-J de l'ADN de WVV se trouvent situés des sites ClaI et EcoRI qui sont séparés par environ 30 paires de bases (Weir et Moss, 1983). Le fragment promoteur de 7,5K présent dans M13tg7,5K est excisé par AccI et EcoRI et clone entre les sites ClaI et EcoRI de pTG1HTK pour générer pTG1H-TK-P7,5K dont la synthèse est schématisée figure 5. Cette construction conduit au transfert du site BamHI unique du vecteur M13 immédiatement en aval de la séquence du promoteur 7,5K. Ce site unique BamHI est utilisé dans les constructions suivantes. 6/ pTG1H-TK-P7,5K est mis en digestion avec BamHI et ligué avec pTG155-pro digéré par BglII. (figure 5). Apres transformation de E_ ol, l'un des plasmides recombinants isolé par cette procédure, pVVgRAB, est sélectionné car il porte le cADN de la glycoprotéine de la rage dans l'orientation correcte pour l'expression à partir du promoteur de 7,5K. pVVgRAB sera parfois noté pTG1H-TK-P7,5K-gRAB. Clonage dans le virus de la vaccine (figure 6) 7/ La stratégie décrite par Smith et al. (1983) repose sur l'échange in vivo entre un plasmide portant un insert dans le gène VV TK et le génome viral de type sauvage de façon à inactiver le gène TK porté par le virus. Les virus TK peuvent être sélectionnés par étalement sur une lignée cellulaire TK-négative en présence de 5-bromo- déoxyuridine (5BUDR) (Mackett et al., 1982). La thymidine ki- nase phosphoryle le5BUDR en 5'-monophosphate, qui est ensuite converti en triphosphate. Ce composé est un analogue de dTTP et son incorporation dans l'ADN bloque le développement correct du virus. Un virus TK- peut néanmoins répliquer son ADN normalement et il conduit à des plaques virales visibles dans une couche cellulaire également TK-. Le virus de la vaccine se propage dans le cytoplasme des cellules infectées plut6t que dans leur noyau. C'est pourquoi il n'est pas possible de tirer avantage de la machinerie de réplication et de transcrip- tion de l'ADN de l'hôte et il est nécessaire que le virion possède les composants pour l'expression du gène viral. L'ADN de VV purifié est non-infectif. Afin de générer les recombinants, il est nécessaire d'effectuer simultanément l'infection cellulaire avec un WVV et une transfection avec le segment d'ADN cloné qui présente de l'intêrét. Toutefois, la génération des recombinants est limitée à une petite proportion des cellules compétentes pour la transfection à l'ADN. C'est pour cette raison qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre une stratégie de "congruence" indirecte pour réduire le bruit de fond des virus parentaux non-recombinants. Ceci a été effectué en utilisant comme virus infectieux vivant un mutant thermosensible (ts) de la vaccine qui n'est pas capable de se propager à une température non per- missiblede 39,5 C (Drillien et Spehner, 1983). Lorsque les cellules sont infectées avec un mutant ts dans des condi- tions non permissibles et transfectées avec l'ADN d'un virus de type sauvage, la multiplication virale inter- viendra seulement dans les cellules qui sont compétentes pour la transfection et dans lesquelles une recombinaison entre 1'ADN viral sauvage et le génome du virus ts aura eu lieu; aucun résultat ne sera obtenu dans les autres cellules, en dépit du fait qu'elles ont été infectées. Si un plasmide recombinant contenant un fragment de l'ADN de vaccine tel que pVVgRAB est inclus dans le mélange de transfection à la concentration appropriée avec l'ADN du type sauvage, il est également possible d'obtenir qu'il participe à la recombinaison homologue avec l'ADN de la vaccine dans les cellules compétentes. Des monocouches de cellules primaires de fibro- blastes d'embryons de poulets (CEF) sont infectées à 33 C avec VVcopenhague ts 26 (0,1 pfu/cellule) et transfectées avec un coprécipité au phosphate de calcium de l'ADN de type sauvage VV-Copenhague (0,5 pg/106 cellules) et le plasmide recombinant pTG1H-TK-P7,5-gRAB (3,0 pg/106 cellules). Il faut remarquer que les concentrations plus faibles (0,1 pg/106 cellules) ont dans les expériences suivantes donné des rendements sensiblement améliorés en recombinants. Après incubation pendant 2 heures à une tem- pérature qui ne permet pas le développement du virus ts (39,5 C), les cellules sont rincées et incubées pendant 48 heures à 39,5 C. Des dilutions de virus ts sont utilisées pour réinfecter une monocouche de cellules de souris L-TK & 37 C et incubées en présence de 5BUdR (100 pg/ml). Différentes plaques TK sont obtenues à partir de ces cellules qui ont reçu le plasmide recombinant, tandis que les cultures de contrôle sans plasmide ne montrent pas de plaques visibles. Une double recombinaison réciproque correcte entre le plasmide hybride rage/vaccine et le génome de VV échange le gène viral TK pour le gène T porté par l'insert présent dans le plasmide. Dans le génome de VV le gêne TK est présent sur un fragment unique HindIII:Hin-J. Les recombinants ayant transféré le bloc d'expression de la glycoprotéine de la rage sont sensés avoir intégré un site interne HindIII dérivant du cADN de la glycoprotéine. C'est pourquoi les ADN purifiés à partir de virus TK sont digérés avec HindII et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. Comme cela était prévisible, le fragment Hin-J de 4,6 kb est absent, par contre deux nouveaux fragments de 1,1 et 5,5 kb révèlent la présence d'un insert contenant un site interne HindIII. Apres sous clonage des virus TK l'un des recombinants VVgRAB-26D3 est conserve. Expression de la glycoprotéine de la rage à partir des virus de vaccine recombinants Des mono-couches de cellules L-TK- semi- confluentes sont infectées avec VVgRAB-26D3 (50 pfu/ cellule)pendant 1 heure à la température ambiante puis un milieu de culture exempt de méthionine est ajouté, et après 30 mn chaque boite de culture est complémentée avec de la L-méthionine 35S1 (1265 Ci/mmole) et l'incubation est poursuivie à 37 C pendant 4 heures. Les cellules sont récol- tées, resuspendues dans un tampon d'immunoprécipitation con- tenant des inhibiteurs de protéase et après éclatement aux ultra-sons et clarification, les protéines fixées par l'anti-sérum anti-rage sont récupérées-par chromatographie d'affinité sur une résine protéine A - sépharose et char- gées sur un gel d'électrophorèse et fluorographiées par une technique décrite par Lathe et al., (1980). Un anti-sérum polyclonal 3554-R215 dressé contre la glycoprotéine purifiée au Wistar Institute a été utilisé dans les expériences A (a) et B; des résultats identiques sont obtenus (b, c) avec deux anticorps mono-clonaux neu- tralisant les virus (509-6 et 101-1: du Wistar) qui iden- tifient différents épitopes sur la glycoprotéine de la rage. En (A) la mono-couche cellulaire est infectée avec: 1) le recombinant VVgRAB-26D3, 2) le virus de la vaccine du type sauvage, 3) aucun virus. En (B) une mono-couche cellulaire est infectée avec VVgRAB-26D3 et marquee en présence (1) ou absence (2) du tunicamycine (2pg/ml. Dans (A) et (B) les poids moléculaires standards sont donnés en kilodaIDns. Comme cela apparaît dans la figure 7A, un anti-sérum rabique polyclonal de même que deux anticorps monoclonaux neutralisent le virus, précipitent une protéine qui migre sous forme d'une bande diffuse avec un poids moléculaire apparent d'environ 66 000 daltons. Ce poids moléculaire correspond précisément au poids, 67 000 daltons, d'une glycoprotéine rabique authentique. Comme le poids moléculaire de la glycoprotéine naturelle et du recombinant correspondent, on a vérifié que la glycoprotéine recombinante était qlycosylée in vivo. Une mono-couche cellulaire a été infectée avec VVgRAB-2603 comme précédemment, et on a ajouté au milieu avant le marquage un inhibiteur puissant de la glycosylation, la tunicamycine (2Ug/ml). Les extraits de cellules infectées sont immunoprécipités en utilisant un anticorps polyclonal et le produit est chargé sur un gel d'électrophorèse comme précédemment. Comme le montre la figure 7B, l'addition de tunicamycine au milieu conduit à une réduction du poids moléculaire de la glycoprotéine recombinante de 66 000 daltons, ceci correspond à l'élimination des groupements glycosylés de la protéine. On peut donc en conclure que la glyco- protéine rabique recombinante est glycosylée dans les cellules infectées par VVgRAB. Différentes bandes addition- nelles dans la ligne (1) sont présumées être des produits de dégradation de l'antigène de la rage non glycosylé. Dans une autre expérience, une mono-couche de cellules L-TK est infectée avec VVgRAB-26D3 (105 pfu par plaque contenant 106 cellules) et incubée pendant 8 heures à 37 C. Les cellules sont fixées, traitées avec des anticorps monoclonaux et polyclonaux et après un lavage très complet, l'anticorps fixé est détecté en utilisant un deuxième anticorps (chèvre anti- souris) marqué par fluoresceine. La plupart des cellules infectées par le recombinant VVgRAB-26D3 (A) montrent une fluorescence significative tandis que les cellules non infectées (C) et les cellules infectées avec les virus non-recombinants (B) ne montrent pas de fluores- cence. Comme cela ressort de la figure 8, la fluorescence est'associée en priorité avec la membrane cytoplasmique comme cela pouvait être attendu d'une protéine transmembranaire. Propriété limunologique in vivo du virus hybride vaccine/rage Des lapins sont immunisés par intra-dermo avec 3 x 107 pfu de VVgRAB-26D3 et des échantillons de sérum sont prélevés au bout de O, 11 et 14 jours. Une enflure reconnaissable est observée au site d'infection qui diminue après 8 à 9 jours. Une souche de virus rabique ERA inactivée avec de la Apropiolactone et marquée avec I125 selon le protocole standard et testée pour sa réaction avec le sérum des animaux immunisés. Les protéines fixées sont placées sur gel d'électrophorèse et autoradiographiées. Les sérums de 11 et 14 jours, mais pas le sérum du jour de contrôle O, se sont trouvés reconnaitre et fixer efficacement la glycoprotéine virale radiomarquee. Le sérum des animaux de contrôle immunisés avec le virus de la vaccine non-recombinant de type Copenhague ne donne pas de telles réactions. Le sérum des animaux immunisés décrit précédemment, est ensuite testé pour l'inactivation du virus rabique in vitro. Les dilutions de la souche ERA rabique sont préincubées pendant 1 heure avec différentes quantités de l'anti-sérum de lapin et étalés sur des cellules de reins de hamsters nouveau-nés (BHK) sur des plaques à microtitration (103 cellules/puit). Après incubation à 37 C pendant 22 heures, les cellules infectées produc- trices sont colorées en utilisant une technique d'immuno- fluorescence directe. Le tableau I indique que même pour les dilutions les plus élevées de l'anti-sérum de 11 et 14 jours une inactivation complète du virus est obtenue. Les sérums préimmunes et non recombinants ne donnent pas de neutra- lisation détectable. Les titres sont donnés comme la plus forte dilution à laquelle on observe l'inhibition de l'infection. TABLEAU I Nbre de jours Vaccine après VVgRAB26D3 Type la vaccination Sauvage Lapin I Lapin II Lapin III Lapin IV 0 0 O O 0 O il 10000 10000 10000 10000 O 14 >30000 >30000 >30000 >30000 0 Ces résultats démontrent que le recombinant VVgRAB-26D3 n'induit pas seulement la production d'anti- corps réagissant avec le virus rabique, mais également que l'anti-sérum d'animaux immunisés est capable d'in- activer le virus rabique in vitro. Comme est indiqué dans la conclusion, l'induction d'anticorps neutralisant n'est pas toujours en corrélation avec une possible protection contre le développement de la maladie. C'est pourquoi il a été effectué une étude directe d'un test de protection en utilisant le virus recombinant. Des souris sont immunisées par injection dans la patte ou grattage sur la queue avec 107 pfu de VVgRAB-26D3. Ces animaux sont ensuite confrontés avec une dose léthale (1 000 unités, DL50) d'un virus rabique sauvage introduit par injection intra-cérébrale. Apres 10 jours, le groupe des animaux de contrôle immunisés avec la vaccine non recombinante présente une infection rabique terminale, au contraire, 15 des 15 animaux immunisés avec VVgRAB-25D3 ne montrent aucune trace de maladie. On peut donc conclure que l'immunisation avec le recombinant de virus de la vaccine/rage conduit à une protection contre la rage. Bien que ce plasmide ne présente de l'intérêt que pour le gène codant pour la glycoprotéine de la rage le plasmide pTG150 peut être obtenu de la façon suivante: Le plasmide pBR327 (Soberon et coll 1980) est mis en digestion avec HindIII, les extrémités cohésives sont complémentées par traitement avec 1'ADN polymérase Klenow, et le plasmide est lié avec un "linkeré BglII #, * octamère 5' dCAGATCTG-3'. Apres réhybridation des extrémi- tés de "linker" et transformation dans E. coli, on met en évidence les plasmides corrects par restriction avec BglII, on obtient ainsi pTG149. Le plasmide pTG147(provient du plasmide pRG décrit par Anilionis (1981) et dont la construction est décrite dans le brevet français n 83 15716,) ou encore le plasmide pTG171 et le plasmide pTG149 sont digérés complètement avec BglII, mélangés en quantité équimolaire, liés, et le mélange de ligation est utilisé pour transformer E. coli. Le plasmide pTG150 est identifié comme le plasmide comportant le cDNA complet de la glycoprotéine de la rage inséré dans le site BglII de pTG149. Le plasmide pTG171 portant le gène codant pour la glycoprotéine de la rage sur un fragment BglII/BglII a été déposé dans une souche de E. coli 1106 le 30 Septembre 1983 dans la Collection Nationale de Culture de Micro- organisme de l'Institut Pasteur: E. coli i106/pTG171 n I 248. REFERENCES Anilionis, A., Wunner, W.H. & Curtis, p.J. (1981) Nature 294, 275-278. Drillien, R. & Spehner, D. (1983) VIrology 131, 385-393. Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. (1983) Gene 26, 91-99. 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REVENDICATIONS 1. - Virus de la vaccine caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'une séquence ADN(I) co- dant pour une glycoprotéine antigénique de la rage. 2. - Virus selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la séquence ADN codant pour une glyco- protéine antigénique de la rage est la séquence l'ADN codant pour la glycoprotéine mature complète. 3. - Virus selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la séquence d'ADN(I) est sous la promotion du promoteur du gène de la protéine 7,5K de la vaccine. 4. - Virus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence ADN(I) est clonée dans le gène TK de la vaccine. 5. - Virus selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est thermosensible. 6. - Cellule de mammifère infectée par un virus selon l'une des revendications 1 à 5. 7. - Procédé de préparation d'une glycoprotéine antigénique de la rage caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon la revendication 6 et que l'on récupère la glycoprotéine formée. 8. - Glycoprotéine antigénique de la rage obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 7. 9. - A titre de vaccin pour le traitement et la présention de la rage, un virus selon l'une des revendica- tions 1 à 5, vivant ou inactive. 10. - A titre de vaccin pour le traitement et la prévention de la rage, une composition contenant à titre de principe actif au moins une glycoprotéine selon la revendication 8. 11. - Antisérum contenant des anticorps dressés contre la glycoprotéine selon la revendication 8 ou contre le virus selon l'une des revendications 1 à 4.