Brevet FR2572528A2 — publié le 19860502

FR 2572528 A2 19860502 FR 8416781 A 19841031 La présent Certificat d'Addition concerne des précisions apportées à la mise en oeuvre du procédé décrit au Brevet Principal, ce procédé ayant pour objet l'identification, le tri et le comptage entièrement automatiques de particules de très petites dimensions et notamment mais non exclusivement des micro-organismes d'origine animale ou végétale, ainsi que l'exploitation des résultats obtenus dans des domaines aussi variés que les analyses biologiobtenus dans des domaines aussi variés que les analyses biologiques telles que celles du lait ou du sang, les contrôles automatiques de pollution bactérienne, par exemple dans le pilotage automatique des stations d'épuration d'effluents industriels ou d'eau potable, ce procédé se caractérisant par sa précision, sa rapidité et son bon marché. Ainsi qu'il a été indiqué au Brevet Principal, divers procédés visant à atteindre des résultats semblables sont connus. Par exemple, dans le cas de l'analyse du sang humain, le processus usuel consiste dans un premier temps à préparer manuellement chaque échantillon par divers traitements mécaniques et/ou chimiques, puis à l'examiner au microscope de manière à analyser et compter les divers éléments cellulaires recherchés. Cette technique est longue et laborieuse et comporte cependant un taux d'erreur admis entre 20 et 30 %. De même, pour analyser et compter les bactéries présentes dans un liquide, l'opérateur doit prélever des échantillons du liquide, puis procéder sur chacun à des cultures permettant de faire apparaître les bactéries, ce qui provoque des délais de plusieurs heures, et enfin analyser et compter ces bactéries par référence à des formes connues, avec les mêmes limitations et inconvénients que ci-dessus. Plus généralement, il n'existe pas de procédé automatique et répétitif permettant d'obtenir les résultats cherchés de manière rapide et continue, tout en évitant l'erreur humaine. L'invention permet d'atteindre ce résultat par la mise en oeuvre d'une succession d'opérations dont le principe est individuellement connu pour d'autres applications, mais qui sont ici combinées et adaptées l'une à l'autre en vue de ce nouveau résultat, ces opérations étant énumérées au Brevet Principal La premiere opération consiste à préparer et à déposer de manière automatique et continue une succession d'échantillons sur un support continu, en les répartissant sur un trajet d'explo ration d'un système d'enregistrement de tous les échantillons successifs par une caméra vidéo. La seconde opération consiste dans ledit enregistrement par la caméra vidéo de l'image donnée par un microscope, comportant des éléments optiques particuliers. La troisième opération consiste dans la décomposition de l'image de chaque échantillon suivant un découpage quadrillé comportant un certain nombre de lignes et colonnes, définissant pour chaque échantillon un certain nombre de zones bien identifiées ou 1,pixels", en vue de l'analyse de chaque échantillon conformément à des techniques classiques en elles-mêmes. La quatrieme opération consiste dans ladite analyse d'image en fonction du niveau d'éclairement de chaque pixel, au moyen d'un ordinateur, dont les résultats d'analyse sur tous les échantillons sont traités statistiquement puis digitalisés sur imprimante, ce qui permet, non seulement de connaître à tout moment le résultat de l'analyse, mais au surplus de suivre avec le temps l'évolution de ce résultat. La mise en oeuvre de ces diverses opérations appelle toutefois un certain nombre de commentaires, qui font l'objet de cet Additif Commentaires sur la première opération Chaque échantillon subit une préparation physicochimique, en amont de la phase de dépôt sur le support. Cette préparation est comparable aux traitements usuels pour le produit considéré, mais moyennant certaines modifications. Ainsi dans les techniques antérieures, par exemple la phase de "coloration" n'avait pour but que de rendre visibles toute une catégorie de cellules telles que les bactéries, sans préjuger de leur état de développement ou de mort. Selon la présente invention, la coloration a pour but d'indiquer l'état viable de certaines cellules et de les visualiser sans colorer les artefacts-. De même, après la coloration, l'application d'un traitement d'épifluorescence (en général en rayonnement UV par dessus), dont la ré-émission est filtrée permet la mise en évidence de toutes les cellules contenant un noyau, tandis qu'un traitement d'immunofluorescence permet de les extraire de façon spécifique. Enfin, chaque échantillon est déposé automatiquement par pulvérisation,ou parsoufflage sur le support continu, sous forme de gouttes calibrées d'épaisseur et de diametre constants. Ces gouttes sont réparties de façon régulière et homogène sur le support, pour être vues suceessivement par la caméra. Dans une première réalisation, le support est un disque horizontal tournant autour de son axe, et les gouttes sont déposées en cercles concentriques, de manière à être explorées soit suivant lesdists cercles successifs, soit par une exploration alternativement radiale et circulaire. Selon une seconde réalisation, le support est une bande continue se déroulant depuis un rouleau d'alimentation et s'enroulant sur un rouleau récepteur, le tout étant logé dans une cassette jetable. Cela élimine la nécessité de laver le support comme dans le cas du disque. En général, 1 mm3 représente le nombre de gouttes dont le résultat statistique est pris comme valeur pour un échantillon, et ainsi de suite pour les suivantes. Bien entendu, après chaque mesure, le support subit un lavage, contrôlé automatiquement. Commentaires sur la seconde opération Le système utilisé comprend la combinaison d'un microscope équipé d'une optique spéci-ale, et d'une caméravidéo, dont la photo est transmise à un mini-ordinateur en vue de la troisième opération. Ce microscope transmettant des informations en continu, il était donc nécessaire d'en assurer une mise au point correcte en permanence. A cet effet, il est prévu entre l'objectif et le support d'échantillons une vis micrométrique garantissant une focalisation mécanique constante. Ce microscope est de préférence éclairé en UV directs, puisque l'observation est photographiée par la caméra, qui peut recevoir davantage de lumière que l'oeil humain. Commentaires sur la troisième opération: La photographie de l'échantillon par la caméra est transmise à l'ordinateur qui va procéder à son analyse conformément à des techniques complexes mais bien connues. De ce fait il n'est pas nécessaire de développer la description de ces techniques. On se bornera donc à rappeler que l'image étant envoyée en mémoire dans l'ordinateur (''acquisition'l), on détermine d'abord la valeur minimum de l'éclairement d'un pixel correspondant à une particule à prendre en considération ("seuillage"), puis, ce seuil étant fixé pour un échantillon, on détermine le contour de chaque particule. On notera toutefois que c'est en particulier par l'exploitation de cette technique que le procédé de l'invention se différencie fondamentalement des techniques manuelles classiques, qui se bornaient à une comparaison visuelle avec une série de formes données. Cette différence se traduit à la fois par la précision et la rapidité des opérations, par opposition à la simple commparaison visuelle, lente, imprécise et source d'erreurs. La phase suivante de cette opération est le tri entre les particules ainsi définies par leurs dimensions et leurs formes. Ce tri s'effectuant-pour chaque goutte, les résultats de toutes les gouttes sont ensuite traités statistiquement, ce qui assure la précision des informations recueillies,aussi bien en un moment déterminé que dans leur évolution dans le temps. Bien-entendu, la technique générale de l'analyse d image ou de forme ("pattern recognition") étant devenue classique, toutes les opérations auxiliaires également connues dans cette technique sont utilisables, telle que le prétraitement de l'image en vue de l'élimination des "bruits de fond", pour bénéficier d'une image plus nette, le filtrage, la dilatation, l'érosion ou la squelettisation de l'image, ces techniques pouvant intervenir dans des cas spécifiques. On va maintenant illustrer l'invention en se référant à deux exemples d'applications pratiques de ce procédé. Exemple 1. Dans cet exemple, le -procédé selon l'invention est appliqué à la recherche des bactéries dans le lait. Dans ce cas, la première opération comporte la coloration de l'échantillon au moyen d'acridine orange à pH 6. Dans la goutte vont alors apparaître : les globules de graisses, non colorés, les leucocytes vivants, de forme semblables aux globules de graisse,mais qui en sont différenciés par leur coloration, les bacilles, en forme de batonnets, et les coques en forme de ronds, apparaissant avec ou sans acide ribonucléique (ARN) en cours de "mort" et acide desoxyribonucléique (ADN) revivifiables. On connait donc ainsi des lors le nombre de germes totaux et le nombre de leucocytes, que l'on identifie par epifluorescence, par éclairage par dessus à Ut(400 p, avec réémission d'un spectre vers 600 nano p que l'on peut filtrer. On peut alors, dans les bacilles, rechercher le clostridium butyricum et le pseudomonas fluorescens. Pour les extraire on utilise l'immunofluorescence avec un serum correspon dant au germe cherché et un colorant spécifique. On procede alors aux opérations suivantes sur 1 'échan- tillon, toujours à basse température a On obtient les germes totaux en ajoutant à l'échan- tillon 1 % de cyanure et 10 % d'acridine orange,et en soumettant des gouttes du produit de réaction aux opérations 2 et 3. h On obtient le pseudomonas seul en recommencant l'essai a, mais sans colorant. c On obtient le clostridium seul en recommencant a, mais en ajoutant à la fois l'acridine orange et le serum spécifique coloré. Quel que soit le processus a, b ou c choisi, on photographie alors l'image donnée par le microscope par une caméra, la photo étant transmise en mémoire d'ordinateur sous forme d'un rectangle découpé par 512 lignes et 512 colonnes, soit 262144 points ou pixels. la profondeur de chaque point c'est-à-dire la quantité de lumiere reçue, est représentée par un chiffre ou "bit". Dans le cas présent, on utilise six bits, soit 64 niveaux, le zéro correspondant au noir et le 63 au blanc. Les images, étant des objets éclairés, se détachent sur fond noir (aux parasites pres). Au départ d'une opération d'analyse, on fixe la valeur minimum d'éclairement (seuil) à partir de laquelle un point va être décompté comme élément d'objet.Ce "seuillage" étant fixé, on passe à la phase "contour", c' est-à- dire la détermination du périmetre de chaque objet, et on répertorie tous les objets dans un tableau, dans lequel, selon les coordonnées de chaque périmetre, on en détermine un certain nombre de paramètres, tels que la "plus grande longueur", ainsi qu' un "facteur de forme", qui, à partir du cercle, pris arbitrairement pour = 1, conduit à séparer les objets "longs" des objets "ronds". On trie alors dans le tableau les seuls objets intéressant en fonction des parametres choisis, et les résultats sont enfin traités statistiquement, pour chaque goutte et pour l'ensemble des gouttes. Dans le cas présent, l'analyse d'une goutte représente une seconde et demi, avec un pourcentage admis d'erreur de 5 %.Ces valeurs sont à rapprocher des durées, et de la marge d'erreur admises jusqu'à présent, et elles résultent de l'automatisation complète: des opérations. Exemple 2 : Analyse du sang. L'application du procédé de 1 invention permet dans ce cas non seulement d'évaluer avec rapidité et précision les cellules proprement dites, c 'est-à-dire les globules rouges et les globules blancs, mais également -de déceler et de compter automatiquement les parasites qu'ils contiennent, et qui avaient jamais pu faire l'objet d'une telle opération antérieurement en raison de leur tres petite taille. Ainsi par exemple, grâce à 1 invention, il est maintenant possible de procéder à la recherche et au comptage automatique des parasites du paludisme dont la dimension est de l'ordre de 2 microns. Plus précisément, l'analyse du sang par le procédé selon l'invention est réalisée en suivant le processus suivant En premier lieu, le dépôt sur le support est effectué de maniere continue et automatique par pulvérisation ou soufflage. Cela représente un progres par rapport aux techniques antérieures où chaque goutte de sang était écrasée entre un support et une plaquette de verre, ce qui détruisaitou altérait les cellules. La phase de coloration à l'acridine orange à pH 6 a pour résultat une différenciation entre les globules rouges qui, étant sans noyau, ne contiennent ni ARN ni ADN et demeurent donc non colorés, tandis que, au contraire, les globules blancs, étant vivants, contiennent un noyau et diverses inclusions, qui prendront des colorations différentes (ADN pour le noyau, ARN pour les inclusions). Par contre, dans le cas de la présence de parasites sanguins à l'intérieur d'un globule rouge, ces parasites seront mis en évidence par coloration car ils contiennent de 1'ADN et de l'ARN. On procede à l'analyse d'image conformément aux techniques générales évoquées précédemment, mais en prenant en compte la complexité des "objets". En effet, si les globules blancs, colorés, sont bien connus et faciles à identifier et à compter, à partir de leur contour, on trouve, à l'intérieur de ce contour extérieur un ou plusieurs contours intérieurs, constituant des noyaux, à l'intérieu desquels, on peut déceler encore d'autres constituants. Il devient alors possible, en fonction du nombre d'objets ainsi décelé, d'identifier et compter différents types de constituants polynucléaires. Il en est de meme pour les parasites des globules rouges, ce qui représente une grande originalité du présent procédé. Ainsi par exemple, le parasite du paludisme se présente sous forme d'un anneau ouvert (ARN) portant à ses deux extrémités des excroissances ou chatons (ADN), ce qui, malgré leur très petites dimensions (2 microns) permet pour la première fois leur comptage automatique et continu dans le sang soumis à l'analyse. Les applications de ce nouveau procédé, qui ont éte évoquées au début, sont en fait -pratiquement illimitées, et notamment depassent le simple comptage de particules dans un liquide. Ainsi on peut en envisager l'application au tri et au comptage de défauts de surfaces dans des matériaux solides. L'adaptation de ce procédé à de telles applications ainsi qu'à d'autres fera l'objet de futurs additifs au présent brevet. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'identification, le tri et le comptage continus et automatiques de particules de petites dimensions, selon la revendication 1 du Brevet Principal, caractérisé en ce qu'il consiste, dans une premiere opération à préparer et déposer de manière continue une succession d'échantillons sur un support en déplacement continu, en les répartissant sur le trajet d'exploration d'un système d'enregistrement par une caméra vidéo des images de ces échantillons données par un microscope, dans une seconde opération, à procéder audit enregistrement, dans une troisième opération à décomposer l'image de chaque échantillon suivant un découpage quadrillé en vue, dans une quatrième opération de l'analyse de ladite image conformément aux techniques dites de "pattern recognition", et enfin à traiter statistiquement les résultats de cette analyse, à les digitaliser et à les délivrer matériellement à l'opérateur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation intervenant dans la première opération consiste en une coloration spécifique, suivie d'une observation par epifluorescence. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dépôt de l'échantillon sur le support est effectué par pulvérisation ou soufflage continu. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit support continu est un disque de verre tournant autour de son axe vertical, et subissant un lavage continu. 5. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit support est une bande continue se déroulant d'un premier rouleau et enroulé sur un second rouleau après un seul usage, cette bande étant enfermée dans une cassette jetable. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le microscope est équipé de moyens assurant sa mise au point automatique permanente sur l'échantillon. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le microscope est éclairé en UV. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le colorant utilisé dans la première opération est l'acridine orange et/ou un serum spécifique coloré. 9. Application du procédé selon les revendications 1 à 8, à la recherche des bactéries dans le lait. 10. Application du procédé selon les revend-ications 1 à 8 à l'analyse du sang et plus spécialement à la recherche, dans le sang, des parasites tels que le parasite du paludisme.