Brevet FR2569105A1 — publié le 19860221

L'invention concerne un procédé pour améliorer l'utilisation des gamètes femelles des mammifères herbivores par inovulation. Dans les années 1890, Walter Heape à Cambridge, England, fit des expériences sur le transfert d'oeufs chez les animaux. Ces recherches ont été continuées par de nombreux expérimentateurs. L. E. A. Rowson et ses adjoints à l'unité A.R.C. de physiologie de reproduction et de biochimie, Station de recherches animales à Cambridge, England, ont récemment mis au point des techniques pour la transplantation d'oeufs chez les mammifères, notamment les animaux domestiques. The Veterinary Annual 1969, Bristol, John Wright & Sons Ltd contient un article de L. E. A. Rowson, page 200, intitulé "Reproduction et désordres de la reproduction" qui traite de leurs développements. Des techniques relatives à ces développements sont aussi décrites dans le "Book 5" de la série "Reproduction chez les mammifères", "Artificial Control of Reproduction", par C. R. Austin et R. V. Short, publié à Cambridge aux "University Press" 1972, voir chapitres un à quatre; et on peut aussi se référer aux "Xème Biennial Symposium on Animal Reproduction"', American Society of Animal Science, ainsi qu'à "Sex Ratio at Birth- Prospects for Control", un Symposium publié par la American Society of Animal Science, 1971. Plus généralement, les développements dans ce domaine sont rapportés dans "Science" (U.S.) Nature (U.K.), Journal of Animal Science, Journal of Reproduction and Fertility, et dans la revue, The Biology of Reproduction. Ces techniques actuelles telles qu'elles sont développées et décrites dans les références ci-dessus emploient des gonadotrophines exogènes pour provoquer une superovulation chez la donneuse, quelquefois assistée par la synchronisation de l'oestrus de la receveuse nourrice espérée, suivie d'une insémination artificielle de la donneuse, du prélèvement chirurgical des oocytes après fertilisation, de la culture des embryons pendant une courte période dans un milieu de culture de tissus que l'on peut se procurer dans le commerce, et finalement de la transplantation, dans l'utérus d'une receveuse synchronisée, d'un ou plusieurs embryons pour assurer la maturation du foetus. Les lapins se sont montrés des "réceptacles" provisoires convenables pour l'embryon avant sa transplantation chez la receveuse, dont on préfère actuel- lement qu'elle soit faite chirurgicalement, et l'on a utilisé ces "réceptacles" pour transporter des embryons de brebis d'Angleterre en Afrique du Sud et l'on a obtenu ensuite leur naissance par l'agnelage d'une brebis nourrice. Suivant Austin et Short, pages 30 et suivantes, des fragments d'ovaire de rates traités avec du glycérol ont été congelés à - 79 C, dégelés et transplantés sur des receveuses. Des embryons de souris ont aussi, suivant les rapports, survécu à une congélation à - 196 C; dégelés et transplantés sur des receveuses, ils ont donné naissance à des foetus normaux et vivants à terme exact, ou à des souris nouveau-nées, voir Science (U.S.), Vol. 178, page 411 et suivantes, 27 Octobre 1972. Ces résultats se rapportent aux techniques indiquées aussi bien qu'à d'autres techniques connues séparément que l'on peut utiliser couramment pour arriver aux résultats que l'on a décrits. Par exemple, il est connu que l'on peut pratiquer une vasectomie pour rendre les mâles ardents comme méthode pour détecter l'oestrus, car la monte est une indication sûre, qui peut être confirmée par un procédé de marquage comme le décrit le brevet U.S. 3 076 431 du Février 1963. Les techniques décrites ici sont considérées comme représentant une technique améliorée pour augmenter le potentiel de reproduction des animaux génétiquement supérieurs, aussi bien que d'autres formes d'animaux et de mammifères quand on emploie comme il est indiqué les procédés, dispositifs et compositions décrites. Si l'on emploie les techniques décrites, on peut considérer que la transplantation d'oeufs deviendra une pratique courante, et que, contrairement à l'affirmation de C. Polge dans "Artificial Control of Reproduction" mentionné ci-dessus, le moment n'est pas loin o les techniques mentionnées seront utilisées d'une façon analogue à l'insémination artifi- cielle, afin d'exploiter le potentiel génétique des femelles ainsi que des mâles. Ces techniques permettent aussi d'exploiter la véritable capacité utérine de femelles car les brebis, les bovins, et même les femmes "semblent être plutôt des exceptions du fait que la fréquence de portées importantes à la suite d'un traitement avec des gonadotrophines exogènes indique une capacité utérine phénoménale" (C. Polge, p. 25). Bien que les techniques précédentes aient été utilisées dans des travaux expérimentaux, ceux-ci utilisent des techniques qui ne sont pas facilement reproductibles en grand nombre, et souffrent d'autres insuffisances qui sont surmontées par les perfectionnements décrits ici. Bien que différentes modifications, combi- naisons et réarrangements s'offrent aux personnes compétentes aussi bien aujourd'hui que pour l'avenir sans que l'on sorte de l'esprit des revendications annexées, on devra se rendre compte de ce que les perfectionnements décrits ici font usage de matières que l'on peut se procurer ou de matières qui sont décrites ici. Ainsi, la description présente comprend des procédés qui ont pour objet de rendre-possible l'obtention du matériel génétique désiré. En conséquence, on trouvera ici décrites des techniques améliorées pour la culture d'embryons sur des tissus, des techniques de congélation des oocytes, des procédés pour déterminer au préalable le sexe des embryons que l'on se propose de transplanter, et des techniques de production de clones, de sorte que l'on pourra obtenir de la même donneuse de multiples embryons provenant du même matériel génétique. La synchronisation de la donneuse et de la receveuse est rendue moins critique qu'auparavant, ce qui permet de disposer d'un délai plus important jusqu'au moment de la transplantation. Les nombreux perfectionnements dont on parle seront décrits en détail dans la suite et, en conséquence, ce qui précède ne constitue en aucune façon une limitation des techniques qui seront décrites, ni ne doit être considéré comme une description qui comprenne tous les perfectionnements. Parmi les objectifs de ces perfectionnements, on peut citer des procédés pour la reproduction par clones d'un animal particulier. L'utilisation de spermatozoldesstérilisés et d'une solution de pseudo-fertilisation est destinée à provoquer une réaction dans l'oocyte, et l'oocyte est amené a devenir diplo de en utilisant le corps polaireoriginalement contaminé, transféré, ou par transfert du nucleus On obtient des embryons en forme de clones supplémentaires par séparation cellulaire. En conséquence, on trouvera ci-après une description des modes de réalisation préférés. Le nombre limité d'apparitions de l'oestrus dans un groupe échantillon peut être augmenté par synchroni- sation. La suppression de l'oestrus par les gonadotrophines, en particulier les progestrogènes est utilisable à ces fins. L'acétate de médroxyprogestérone, C-méthyl-17 acétoxyprogestérone (MAP, Upjohn) est une progestérone synthé- tique qui a été utilisée en solution dans l'éthanol pour supprimer l'oestrus. L'acétate de melengestrol (MGA) est vendu par la Tuco Division de la Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan 49 001, comme additif alimentaire que peuvent obtenir les tenants de Medicated Food Applications classiques, et est un progestrogène synthétique que l'on utilise pour supprimer l'oestrus afin d'améliorer le taux de croissance et le méta- bolisme chez des génisses soumises à un régime alimentaire. Ce produit n'est pas approuvé pour obtenir la synchronisation. On peut présumer que la cause en est que le MGA provoque des avortements (Journal of Animal Science, vol. 30, p. 433) et que le taux de fertilisation de l'oeuf est faible car les anomalies ovariennes sont élevées (Abstract 155, Journal of Animal Science, vol. 35). On a introduit du MGA dans un implant de polyuréthane placé dans une veine principale de l'oreille, ou sous-cutané dans l'oreille de génisses. On a obtenu des taux d'absorption de 0,4 mg par jour. MGA peut être pris oralement, chaque jour, ou incorporé dans une ration de grain (jusque 4 mg dans 1,82 kg de grain par jour). On préfère utiliser 0,4 mg à 1 mg dans 1,8 kg par jour. La quantité optimum peut être une dose orale quotidienne voisine de 0,5 mg. Les doses orales de 0, 5 mg par jour se sont montrées efficaces pour supprimer l'oestrus, et pour permettre l'oestrus 2 à 9 jours après leur suppression (Veterinary Medicine/Small Animal Clinician, vol. 65, mai 1970, p. 491). Si l'on utilise l'administration orale dans du grain recommandée, l'oestrus survient 2 à 11 jours après la suppression avec une moyenne de 4,5 jours (1 jour) après celle-ci. Les génisses, et les femelles matures après une naissance, doivent avoir eu un cycle oestrien normal avant la médication. Afin d'améliorer le taux de fertilisation des oeufs et l'oestrus attendu, on administrera, le jour de la suppression, 10 à 20, de préférence 15 à 17 mg du stéroide benzoate d'oestradiol (Arapahoe Chemicals, Inc. Boulder, Colorado), en injection intramusculaire. On pourra faire une seconde injection semblable le 5ème jour. La première dose peut être réduite, avec un dosage de 15 à 17 mg le Sème jour et donnera satisfaction dans beaucoup de cas. Le stéroïde peut être administré oralement en mélange, dans une solution dans l'éthanol introduite ensuite dans une capsule saline, ou être ajouté à la ration de grain. Bien que la fécondation puisse se faire pendant le premier oestrus en utilisant la technique ci-dessus, chez les bovins, il sera préférable d'attendre jusqu'à la seconde période si le taux de conception doit être amélioré. On devra inséminer les animaux de préférence le 26 ou 27ème jour et de nouveau le 28ème jour si l'on n'a pas utilisé le contrôle précis de détection de l'oestrus et de l'ovulation que l'on a décrit ici. Après synchronisation, l'oestrus peut facilement être détecté en utilisant des taureaux stérilisés. Comme on l'a dit ci-dessus, cette pratique assure le marquage des femelles au départ de l'oestrus. Comme on l'a mentionné précédemment, beaucoup de mammifères ont une capacité utérine qui permet la maturation d'un nombre de foetus plus grand que ce n'est normal dans l'espèce. Il est par suite spécialement désirable d'obtenir des naissances multiples ou des jumeaux. Toutefois, on a constaté que, si des jumeaux sont désirables, un nombre trop grand d'embryons ne l'est pas. Chez les bovins, le procédé préféré pour provoquer la gémellité est d'administrer une dose de 5 à 15 mg, de préférence 5 à 10 mg de FSH (gonadotrophine pituitaire) dans 3,6 ml de carboxyméthylcellulose sodique àA 1 % (Abbott Laboratories, Chicago, Illinois) en commençant entre le 14 et le 16ème jour du cycle oestrien, en piq re intramusculaire deux fois par jour pendant 5 jours. La suppression de l'oestrus pendant cette période peut être souhaitable et sera obtenue, comme on l'a dit précédemment avec le progestrogène synthétique que l'on peut se procurer chez Upjohn, comme il est dit ci- dessus. Le FSH-P que l'on peut se procurer en fioles de 10 cm3 de 50 mg d'unités FSH peut être obtenu auprès d'Armour-Baldwin Laboratories, Omaha, Nebraska. Le cinquième d'une fiole donne la dose appropriée. Le FSH tend à surmonter la tendance du PMS à produire une super. ovulation indésirable qui pourrait produire un nombre d'oocytes trop grand pour la maturation. On a déjà constaté que la gémellité dans les bovins a des effets secondaires défavorables quand la bête porte des produits de sexe différent, car la présence d'un mâle même unique dans une portée aura habituellement pour effet que toutes les femelles de la portée seront stériles. La gémellité a toutefois comme résultat d'augmenter la production d'animaux, et le côté défavorable qui l'affecte peut être surmonté en utilisant les techniques de contrôle du sexe que l'on décrira plus loin. La superovulation peut être distinguée des techniques de gémellité cidessus du fait qu'habituellement on obtient un plus grand nombre d'oeufs par l'ovulation. On peut réaliser la reproduction d'individus sélectionnés pour utiliser plus complètement les qualités génétiques de femelles voulues. Les techniques de super- ovulation et de transplantation d'oeufs ont été décrites en général. Certains perfectionnements dans ces techniques et des étapes recommandées seront décrits complètement plus loin. La suppression de l'oestrus est désirable chez les mammifères receveuses. On peut se référer à nouveau à la description précédente. La vache ou la génisse qui doit subir le traitement de superovulation doit avoir un cycle synchronisé avec celui des receveuses, mais en raison de problèmes de fertilité, les oeufs ne doivent pas être recueillis jusqu'au second oestrus. L'ovulation multiple ou superovulation peut être provoquée par injection de 1500 à 3000 IU (unités inter- nationales) de PMS mare serum de bête gravide. 2000 IU sont préférées pour les bovins, pendant que la moitié de cette quantité convient pour le porc et le mouton. Le serum PMS (Ayerest Laboratories) peut être injecté le 16ème jour du cycle oestrien, ou entre le 15ème et le 18ème jour. Une seule injection de PAS provoque un développement hyperfolliculaire, même sur des veaux de 4 à 14 semaines deâgeo Il doit être suivi d'une injection intraveineuse de 5 à 10 mg dhormone lutéinisante NIH-LH, cinq jours après l'injection de PiSo La LH peut être obtenue auprès de Diamond Laboratories, Des Moines, Iowa (vétrophine), chaque fiole devant contenir mg de produit actif NIH=FSH-S4 et NIH-LH-Slo Douze à vingt-quatre heures plus tard, les oeufs produits doivent être exposés au semen pour insémination, si celle-ci doit être effectuée sur la bête donneuse. On a déjà mentionné qu'à la place du sérum PMS, on pouvait utiliser les gonadotrophines pituitaires (FSH) pour provoquer la gémellité. Du fait qu'elles se dissipent rapidement, on doit faire, entre le 12ème et le 18ème jour du cycle oestrien, des injections de 6 à 14 mg (le taux le plus bas produira le développement d'une quantité moindre de follicules) deux fois par jour pendant cinq jours, administrées soit comme on l'a précédemment décrit, soit par piqûres intra- musculaires en solution saline physiologique. On a suggéré que le Nilevar (noréthandrolone qui n'est plus fabriqué par Searle) peut être utilisé pour éviter l'oestrus pendant cette période (Journal of Animal Science, vol. 34, 1972, page 77), mais il n'est pas désirable, et on peut utiliser à cet effet une faible dose de MGA (0,3 à 0,5 mg) qui semble augmenter le nombre des follicules. FSH-P (ArmoursBaldwin) est une gonadotrophine pituitaire appropriée, comme on l'a dit précée demment. On peut le remplacer par 10 mg de FSH préparé à partir du porc. On peut utiliser LH, par exemple NIH-LH-S1 pour provoquer le dégagement à la fin de cette période. Après le début de l'oestrus chez les bovins, on doit procéder à un examen toutes les quatre heures jusquA'à la fin de l'oestrus, et les ovaires doivent être palpés par le rectum à quatre heures d'intervalle jusqu'à ce qu'on détecte l'ovulation. Les animaux doivent être inséminés, si on le fait sur la donneuse, par la voie interne, avec la semence, pendant la dernière partie de l'oestrus. Le développement folliculaire auquel on fait allusion ici peut être augmenté, spécialement quand on utilise des gonadotrophines, en donnant une ration alimentaire énergétique importante pendant la période du développement folliculaire, 7 à 14 jours après le dernier oestrus. Cette ration doit doubler le poids de la ration normale de grain, le poids supplémentaire étant fourni par du glucose ou d'autres sources énergétiques importantes comme des graisses (lard) et des mélasses. Au début de cette période, il est aussi désirable de donner du benzoate d'oestradiol à la dose indiquée précédemment dans cette description. Il est très souhaitable que les oeufs soient prélevés sur la femelle qui a subi cette super- ovulation entre 8 et 90 heures après l'ovulation. Si les oeufs ont été inséminés par la voie interne, la meilleure période est alors entre 50 et 80 heures, et de préférence entre 70 et heures, moment o les oeufs sont principalement dans la partie inférieure de l'oviducte, avant la jonction ampoulaire- isthmique (une contraction avant l'utérus) et dans la partie supérieure de la corne utérine. Il s'ensuit une concentration des oocytes dans cette zone bien localisée. Cette période est généralement acceptable pour les sujets qui n'ont pas été inséminés, mais les oeufs se trouveront alors plus haut dans l'oviducte et même près des fimbriae. La meilleure période est ici entre 40 et 80 heures, quand la plupart des oeufs ont atteint un point proche de la jonction ampoulaire-isthmique. Dans d'autres animaux, le porc par exemple, le transport est même plus rapide que la durée mentionnée ci- dessus pour les bovins. Pendant cette période, on peut procéder à une laparotomie latérale. Les sujets doivent être maintenus à la diète 24 heures avant l'intervention chirurgicale, et on fait à chacun une injection intra-musculaire d'environ 0,5 ml de chlorhydrate de propiopromazine (par exemple Travet, Abbott Labs 50/mg.ml), 25 minutes avant l'anesthésie. L'anesthésie peut être donnée par une injection de chlorhydrate de procaine, sur les deux côtés, dorsal et ventral, des première, troisième et cinquième vertèbres lombaires, la dose étant de 100 à 150 ml suivant la grosseur de l'individu. Le champ de l'incision est rasé et lavé avec une solution aseptique. On peut faire une incision entre la dernière côte et l'angle externe de l'ilium, sur une longueur de 15 à 20 cm. On peut la faire avec une lame Bard-Parker N 22 posée sur un manche Bard-Parker N 4. On réalise une ovariecn tomie et une salpingectomie bilatérale en utilisant un écraseur. Quand on a dissecté un oviducte, on clampe l'extrémité cervicale de la corne utérine et cautérise au fer chaud; on ponctionne alors l'endroit cautérisé avec l'aiguilles mousse d'une seringue de 20 à 50 ml contenant du sérum sanguin de boeuf stérile (Difco, Détroit, Michigan), ou de préférence, quand l'oviducte est enlevé, du TCM199, ou mieux encore, le milieu décrit et donné comme exemple ici pour la culture - d'embryons. La corne est lavée avec du sérum (ce qui peut demander 20 à 40 ml de sérum) et ce qui passe est recueilli sur un verre de montre stérile, le flux traversant l'oviducte. L'oviducte est en conséquence abouché avec un tube possédant une chambre de collecte agitée pour recueillir les oocytes mis en liberté. L'aspiration du tubule pourra aider à cette opération. Une variante de l'anesthésie comprend une injection initiale de pentobarbitonate de sodium suivie de minutes avec un circuit fermé de Fluothane et oxygène. L'incision peut être faite immédiatement en avant du pelvis sur la ligne médiane, et permet de retirer l'utérus et les ovaires en clampant la corne. On fait à la moitié de l'oviducte une incision par o on insère la tubulure. On introduit une seringue de 40 ml en avant du clamp, et lave l1oviducte de la manière indiquée ci-dessus. L'utérus est ensuite rentré dans l'abdomen et la blessure est suturée en utilisant du catgut N 3 puis en faisant des points de suture sur la peau que l'on recouvre d'une bande. Les oeufs fertilisés peuvent être transférés dans une mère nourrice receveuse, dont l'oestrus est synchronisé avec une variation possible de + 2 jours. La transplantation utilise la même technique que précédemment si ce n'est que l'ovaire contenant le corps jaune est identifié par palpation rectale, et les oeufs sont transférés dans la corne utérine adjacente en utilisant une pipette de Pasteur raccordée à une seringue d'un ml. Si le corps jaune est présent dans les deux ovaires, on peut transplanter des oeufs dans les deux cornes. Toutefois, hors cette présence, la gémellité n'est pas aussi souhaitable. Pourvu que les oeufs (blastomères) soient sexués, il est désirable de transplanter deux oeufs pour augmenter la proba- bilité d'une naissance, mais il faut le faire sans avoir à craindre l'apparition de jumeaux de sexe différent, car une naissance pour deux oocytes est la plus probable. Si les oeufs sont fertilisés, on peut les conserver pendant une courte durée (10 heures), dans une chambre à dyalyse, ou dans une unité d'incubation, comme on la décrira plus loin, pendant une durée plus longue, ou on peut les transférer dans la jonction utéro-tubale d'un oviducte de lapin qu'on ligature de façon que les oeufs ne passent pas dans l'utérus. Cela en facilite la récupération quand on lave l'oviducte pour recueillir les oeufs. Dans ces conditions, les oeufs se diviseront normalement plus de sept jours, comme dans un incubateur. On doit prendre soin de s'assurer que la receveuse est synchronisée à + 2 jours près, de préférence exactement. Il se passe habituellement quatre jours après la fertilisation avant que les oeufs pénètrent dans l'utérus o on peut les recueillir à partir de l'entrée du cervix, la façon de faire devant être exposée plus loin. Il y a lieu de rappeler que l'on utilise à peu près le même temps, que les oeufs soient prélevés chirurgicalement dans l'oviducte et dans l'utérus. Les receveuses doivent recevoir les oeufs avant la régression du corps jaune, et de préférence dans la période qui se termine le 6ème ou le 7ème jour. Si l'on utilise une pipette et des techniques analogues à celles que l'on utilise pour l'insémi- nation artificielle, on peut implanter les oeufs par le cervix chez les bovins et les équidés (mais non chez les porcins), mais on doit prendre des mesures d'asepsie pour éviter une endométrite purulente. Il est préférable, si l'on opère le transfert par une voie non chirurgicale, de distendre l'utérus avec de l'acide carbonique. L'introduction non chirurgicale des oeufs chez les receveuses, 2 ou 3 oeufs à six cellules au stade précoce de morula, s'opère en commençant par aspirer les oeufs, en même temps que 0,5 ml de milieu ou de sérum dans une pipette ordinaire d'insémination qui est courbée à une extrémité, le tout dans des conditions aseptiques. La pipette est introduite, à travers un spéculum stérile, dans le canal il cervical de la receveuse, puis poussée en avant le long de la corne utérine dont on a détecté préalablement le corps jaune par palpation rectale. On introduit du CO2 par la même pipette jusqu'à ce que l'utérus soit complètement distendu. L'équi-. pement comprend deux flacons, dont l'un, qui contient des morceaux de glace sèche qui sont couverts d'éthanol, est relié au second flacon endessous du niveau de l'eau (le second flacon est à demi rempli d'eau distillée). L'espace supérieur du second flacon est raccordé à un raccord en T dont un côté conduit à la pipette et l'autre coté est raccordé à un ballon en caoutchouc qui se distend quand la pression dans l'utérus augmente. Immédiatement après l'envoi du gaz, on retire la pipette et l'utérus pourra rester distendu pendant quatre à six heures. -La transplantation par ces techniques non chirurgicales prévoit l'utilisation d'une canule flexible, de préférence en Silastic (TM de Dow Chemical), tubulaire, dans une pipette. On introduit la pipette dans la corne utérine et passe la canule (à travers la pipette), de façon à envoyer le transplant dans la corne utérine, ou si les transplants sont de petite dimension, dans l'oviducte en passant par la jonction isthmique. Avant le transfert des oeufs. fertilisés chez la receveuse, il est désirable de déterminer le sexe de l'embryon que l'on transfère. On peut le faire par différentes voies. Evidemment, la fertilisation des oocytes avec des spermatozoïdes ordinaires donne 50 % de chaque sexe. Mais, comme il est possible de conserver l'embryon in vitro pendant une certaine durée, comme on l'a dit, il est aussi possible de déterminer au microscope électronique si ceest le chromosome X ou Y qui est présent dans les cellules de l]embryon. On excise de l'embryon les cellules du stade morula ou blastocyste. Avec le blastocyste que l'on doit préférer en raison du risque plus faible d'endommagement, on maintient la zone pellucide sous aspiration avec une pipette, et on fait pénétrer, dans le trophoblaste, une aiguille suffis samment grande pour exciser une ou deux cellules. Afin d'examiner la teneur en chromosomes des cellules, on mélange 0,075 I suspension les cellules dans ce liquide surnageant restant. On fixe avec trois parties d'alcool absolu pour une partie -dacide acétique cristallisé, en ajoutant d'abord 0,5 mi puis encore 3,5 ml de solution fixative. Les cellules doivent rester dans la solution fixative pendant 15 minutes. Rejeter à nouveau le tout à part 0,25 ml de la solution fixative et répéter l'opération de fixation. Après avoir répété l'opération de fixation, on ne conserve à nouveau que 0,5 nml de solution fixative et remet en suspension les cellules. On pose deux gouttes, avec les cellules, sur une plaquette de verre trempé propre et humide, et souffle pour sécher. On dilue avec deux gouttes de Acétoorsin (Gibco # 537, 538, 539). Puis on examine les cellules sous un microscope électronique et note les caracté- ristiques des chromosomes. Les animaux abattus peuvent être une source d'oocytes que l'on peut transférer à des receveuses vivantes pour maturation. On traite les animaux avant l'abattage comme si l'on devait pratiquer les procédés normaux, chirurgical ou non. Le moment de l'abattage doit correspondre à ce qu'on a exposé pour les techniques chirurgicales. L'animal doit être abattu après fertilisation ou avant insémination comme dans les techniques de récupération chirurgicales. L'abattage est effectué en assommant la bête et la saignant. Quand la saignée est achevée, on fait une incision ventrale et l'on peut prélever les ovaires, oviductes et cornes utérines intactes. Les cornes utérines sont immédia- tement clampées et cautérisées. Les organes sont places dans un incubateur de transfert pour les maintenir à 30 à 38 C, de préférence 31 à 33 C, puis transférés à l'endroit o l'on recueillera les oeufs. Le prélèvement est accompli en coupant l'oviducte et en faisant soitir par lavage les oeufs de l'oviducte en introduisant une seiingue par la corneutérine et en injectant 20 à 40 ml de s4rum ou de préférence de milieu convenant à la culture des tissus (TCM199 ou Hames F10 ou F12, Gibco). On dépose les oeufs sur un verre de montre et couvre avec de l'huile de paraffine. On les examine sous 50X et les recueille et transfère sur le milieu de culture de tissus recommandé décrit ici puis chez la receveuse. Les oocytes non fertilisés peuvent aussi être recueillis à partir de l'ovaire par aspiration du corps jaune de l'animal abattu. On peut alors les fertiliser comme on l'a décrit plus haut. Entre le prélèvement et le transfert chez une receveuse, il est bon de cultiver l'embryon sur un milieu de culture de tissus tel que TCM199 ou Ham's F10 et de préfé- rence tel que les formules décrites à titre d'exemple ici. La culture est maintenue dans un incubateur du commerce destiné aux cultures de tissus, à des températures se situant entre 31 et 37 C, avec 5 % d'acide carbonique et 95 % d'air ou d'oxygène. On préfère cependant les températures plus basses, de l'ordre de 31 à 33 C. On peut obtenir des résultats satisfaisants à la température normale de culture de 37 Co Les chambres de culture peuvent être des tubes de verre (30 x 100 mm ou 25 x 75 mm) avec des bouchons de caoutchouc de silicone. La surface intérieure du tube doit être enduite de silicone pour éviter la fixation de l'oeuf en croissance sur la paroi de verre. On remplit la moitié du tube avec le milieu de culture tamponné avec le tampon HEPES et 20 % de sérum de bovidé et l'autre moitié avec le mélange de gaz que l'on renouvelle toutes les huit heures. Les tubes doivent être maintenus horizontaux sur des rouleaux et tourner continuellement à raison de 30 à 40 tours par minute pendant 1 incubation. Quand les oeufs sont recueillis, les liquides de lavage sont rassemblés dans les tubes. On enlève environ 3 ml de fluide au fond de chaque tubes au bout de vingt minutes de séjour à la température d'incubation, et les transfère sur un verre de montre ou une plaquette de verre, et l'on cherche les oeufs sous un microscope de dissection sous 50 X ou 187,5 X, et les examine sous 450 X ou 1875 Xo On peut transférer les oeufs chez les receveuses de la façon décrite, ou pour une culture de plus longue durée dans des tubes, ou chez des lapines. Le milieu de culture préféré tel quail est illustré dans les exemples suivants comprend de la vitamine B 12, de l'acide lipo5que, du pyruvate de sodium et de la L-Glutamine. Il est tamponné avec le tampon HERES et NaHCO3 a un pH de 7,3 à 7s4. Exempleide milieu de culture recommandé mg/l NaCl 6800 Kcl 400 MgS04-7H20 200 Na2HP04 2H20 60 KH2PO4 60 Glucose 1800 Rouge de phénol 10 CaCl (anhyd.) 200 NaHCO3 (suivant le pH) 400 L-Arginine HC1 70,0 L-Histidine HC1 20,0 Monohydrochlorure de LLysine 70,0 DL-Tryptophan 20,0 DL-Phénylalanine 50 O DL-Méthionine 30,0 DL-Sérine 50,0 DL-Thréonine 60,0 DL-Leucine 120,0 DL-Isoleucine 40,0 DLValine 50,0 Acide DL-Glutamique monohydraté 150,0 Acide DL-Aspartique 60, 0 DL-Alpha-Alanine 50,0 L-Proline 40,0 L-Hydroxyproline 10O,0 Glycine 50, 0 L-Glutamine 100,0O Acétate de sodium 50,0 L-Cystine 20,0 L-Tyrosine 40, 0 L-Cystéine HC1 0,1 Sulfate d'adénine 10,0 Guanine HC1 O3 Xanthine 0.3 Hypoxanthine OQ3 Uracil 093 S Thymine 0,3 Phosphate dValpha tocopherol disodique 0,01 Thiamine HCl 0901 Pyridoxine HCl 09025 Riboflavine 09010 Pyridoxal HCl 09025 Niacine 09 025 Pantothénate de Ca 09010 i-Inositol O0O50 Acide ascorbique O050 Acide folique 09010 Acide para-aminobenzoique 0050 Nitrate de fer Fe(N03)3 0100 d-Biotine 09 010 Ménadione 0,010 Glutathione 0O050 Vitamine A 0O100 Calciférol 09200 Tween 80 (marque de fabrique Atlas Powder) 2090 Acide adénylique 09200 Triphosphate d'adénosine 1,0 Désoxyribose 095 Ribose 09 5 Choline Cl Oe$ Vitamine B12 1,3 Acide lipo que 0C2 Pyruvate de sodium 110,0 L=Glutamine 2009 O0 Plus 20 % de sérum foetal de veau, inactivé par la chaleur, par litre de la composition ci-dessuso Exemple 2 La composition est la méme si ce n'est que l'on remplace les sels du premier exemple par des sels d9Earle (Gibco), le Glucose restant encore à 1800 mg/l. La compeosition est la me qu lexeple 23 La composition est la memne quVà l exemple 2 en doublant le poids de vitamines et d'aminoacides. Exemple 4 Même composition que l'exemple 1 avec le double du poids de vitamines et d'aminoacides, la quantité de glucose étant ramenée à 1000 mg/l. On peut retirer les oocytes du corps jaune et les faire mûrir in vitro. On fixe une aiguille N 20 sur une seringue de 100 ml que l'on garnit avec 20 ml de milieu de culture. Le corps jaune est identifié par la paroscopie que l'on effectue 32 à 36 heures après l'injection de gonadotrophine pour provoquer le développement folliculaire, ou dans les premières vingtquatre de la chaleur ou de l'oestrus chez les bovins, de préférence avant qu'il ne se soit écoulé 14 heures après la détection. On fait une incision de 15 à 20 cm comme il est décrit pour la collecte chirurgicale des oeufs, ou mi- ventrale au-dessus du pis chez les bovins. On distend la cavité abdominale avec C02, et on introduit un labroscope pour localiser les ovaires et le corps jaune. On fait pénétrer l'aiguille dans le corps jaune et aspire l'oocyte sous un vide régulier. On transfère l'oocyte sur un verre de montre sur lequel on a déposé d'abord 5 ml de milieu nutritif couvert de paraffine ou d'huile minérale. On élimine les cellules du cumulus entourant l'oocyte par exposition à l'hyaluronidase pendant trois à cinq minutes. L'oocyte est retiré du milieu avec une pipette et 0,1 ml de milieu, et on le lave deux fois avec 2 ml de milieu. Il faut prendre soin de s'assurer que les oocytes sont toujours couverts avec le milieu ou du milieu PBS (solution de Dulbecco de sel tamponné au phosphate) pour éviter la déshydratation. Les oocytes aspirés à partir des follicules devront mûrir in vitro si le développement folliculaire a été amorcé par des injections de gonadotrophine comme on le fait pour provoquer la superovulation, et on retire les oocytes des parois des follicules amincis (développés). Les oocytes mûrissent quand ils sont recouverts par le corps jaune de follicules matures en environ quatre heures quand les cellules du cumulus sont séparées. Il n'est habituellement pas nécessaire de séparer le cumulus oophorus. Les oocytes peuvent être prélevés par abattage de la bête 6 à 14 heures après la détection de l'oestrus. Les oviductes sont séparés en 1 à 8 sections et le corps jaune qui n'est pas ouvert doit être aspiré en même temps. On pose les sections et le corps jaune aspiré avec les oocytes dans le milieu couvert avec de l'huile de paraffine ou de l'huile minérale. Toutes les fois que les oocytes sont recouverts, ils doivent être maintenus chauds dans un incubateur ou sur la platine chaude d'un microscope à dissection. L'huile de paraffine doit être équilibrée avec 5 o de CO2 dans l'air du milieu de culture. Si nécessaire, on doit enlever les grumeaux de cumulus. On doit prendre soin de conserver une certaine quantité de fluide folliculaire frais, de façon à introduire 0,1 ml de ce fluide avec 0,4 ml de sperme à la concentration de un à deux millions par ml. Dans les deux à quatre heures, les cellules du cumulus qui entourent les oocytes se séparent et forment une couche sur la surface. Avec cinq à sept heures de concentration, la fertilisation est complète et les oeufs peuvent être mis en culture, pour leur maturation, au stade morula, ou être transférés sur une receveuse. La fertilisation in vitro utilise les exemples de formulation de milieu de culture, tamponnés à pH 7,3 à 7,5 avec du bicarbonate de sodium et de l1HC1 dilué. Le pyruvate ou oxaloacétate de sodium peuvent rentrer dans la composition de ce milieu de fertilisation, et l'on peut utiliser l'albumen bovin à 30 % en volume. Le milieu destiné à la fertilisation et à la culture doit contenir 50 milligrammes de sulfate de streptomycine/ml, et l'on doit aussi ajouter mg de pénicilline G (sel de potassium)/ml. On doit toutefois le faire quand on utilise la séparation du sperme par sexes. La synchronisation de la donneuse et de la receveuse pour le moment de l'ovulation peut être surmontée par des techniques perfectionnées. On peut s'assurer un certain délai en cultivant les corps cellulaires transplantés pendant une certaine durée. On peut à cet effet utiliser les techniques de congélation décrites ici, ou en retardant le développement de la cellule de la donneuse en séparant cette cellule de façon que le nombre total de cellules différenciées, qui sont trans- plantées, se trouve au stade qu'elles auraient atteint si on leur avait permis une progression normale. Ainsi, on préférera transplanter les corps cellulaires chez les receveuses à un moment correspondant à un petit nombre de jours à partir du moment de la division de la première cellule, ou des corps cellulaires, et du moment de la fertilisation normale de la receveuse. L'objectif est de fournir la cellule de la donneuse à la receveuse à un moment qui correspond approximativement à celui qui permet l'implan- tation au stade blastocyste du développement. Il faut compter de préférence 12 jours de synchronisation du stade blastocyste ou morula attendu pour l'embryon et la date o la receveuse doit attendre son propre stade blastocyste ou morula. La possibilité de disposer de ce délai permet un plus grand usage de la transplantation non chirur- gicale, ainsi que les transplants chirurgicaux aux moments plus tardifs, et ces transplantations doivent être faites avant le 10ème jour après l'ovulation de la receveuse, et de préférence avant le 7ème jour après l'ovulation. Les techniques de séparation des cellules et les techniques de congélation que l'on doit utiliser pour arriver au résultat sont décrites ci-après. La détermination du sexe est importante pour beaucoup de raisons et peut être effectuée en déterminant le sexe d'un embryon après la fertilisation ou par d'autres moyens tels que ceux décrits ici. On peut obtenir des spermatozoïdes d'un sexe déterminé en séparant les sperma- tozordes portant les chromosomes X et ceux qui portent les chromosomes Y et utiliser la fraction voulue pour fertiliser les oocytes matures. Un procédé pour réaliser cette séparation consiste à centrifuger des pipettes fermées contenant le semen à 750 tours par minute pendant une durée prolongée. Le sperme "femelle" est légèrement plus lourd et tend à se concentrer dans la partie inférieure du tube. Les spermatozoïdes doivent être en suspension claire, tamponnées pendant la centrifugation. On a aussi utilisé liélectrophorèse pour séparer les sperma- tozoldes. Ni l'une ni l'autre de ces techniques n'est parti- culièrement satisfaisante dans l'état courant de la technique. Toutefois, on peut employer une technique améliorée utilisant des matières échangeuses d'ions comme on le décrit ci-après. On a reconnu que les spermatozoïdes ont une charge nette négative, mais il semble quVil s'agisse d'une localisation de la charge soit sur la tête9 soit sur la queue du spermatozoïde. Il semble que de meilleurs résultats soient possibles pour donner les spermatozoïdes femelles désirés en utilisant des matières échangeuses d'ions, seules ou en - combinaison avec la centrifugation On utilise des cations pour assurer la capture du sperme "mâle" et des anions pour capturer les spermatozoides "femelles". On doit à cet effet induire une floculation du sperme indésirable sur un verre de montre ayant une surface importante par rapport au volume; la méthode recommandée étant décrite ci-dessous. O20 Bien qu'il soit connu que les terres vertes et les zéolithes puissent être utilisées comme matières échan- geuses d'ions, les plus satisfaisantes de ces matières sont les résines échangeuses d'ions finement divisées. On a trouvé satisfaisantes les résines cationiques faites de copolymères divinyl benzène carboxyliques ou les produits de la copolymé- risation de l'acide méthacrylique avec le divinylbenzène et ceux de l'anhydride maléique avec le styrène et le divinyl= benzène. On ne doit pas utiliser la streptomycine dans le milieu support avec les résines carboxyliques en raison de ses échanges d'ions avec celles-ci. Ces résines cationiques donneront des spermatozoïdes capables de produire une progéniture femelle. On peut produire des échangeurs anioniques par nitration et réduction subséquente de copolymères de styrène et de divinylbenzène. Ces échangeurs donneront des sperma- tozoldes capables de fournir des mâles. Les résines obtenues ont les structures suivantes: Résine échangeuse anionique basique - CH CH2 CH CH2 CH- C H2N(CH3)2 NlCH2N)2 J4 92 *CH - CH2 * Résine 6changeuse cationique acide CH CH3 1 31 - C CH C CH2 2 2CH i COOH COOH - CH -CH2 Les résines à utiliser peuvent être à base de résines Dowex (marque de fabrique de Dow Chemical Company, Midland, Michigan). On peut utiliser les résines anioniques lesplus fortement basiques du type styrènedivinylbenzène, Dowex 1, 2, 21K, mais on pourra mieux utiliser la polystyrène- polyamine Dowex 3, qui est faiblement basique, dans un milieu dont le pH se situe de 7,1 à 7,3. On choisira de préférence une grosseur passant au tamis de 100 mailles ou plus grosse (100 à 300). On peut citer comme résines convenables les B342-AG3, B343-AG3 (toutes deux polystyrènepolyamines) et B143-AG1, B144-AG1 (Polystyrène-ammonium quaternaire) comme résines anioniques, et comme résines cationiques, B544AG50, B545-AG50 (basées sur Dowex 50) que l'on pourra obtenir auprès de Bio-Rad Laboratories, Richmond, California. Les résines des types anionique et cationique peuvent être du type cellulosique, le type cationique étant préférable. Un échangeur passant au tamis de 100 à 200 mailles du type 20 CM-cellulose (carboxyméthylcellulose) de Brown Company, 555 Fifth-Avenue, New York, New York, pourra convenir. Pour obtenir l'échantillon, on lave le semen deux fois et le dépose dans une solution tampon dont le pH est de 7,3 à 7,5. La résine est introduite dans un tube à essais avec un entonnoir à extrémité basse et à lèvre élargie, ce tube à essai étant à son tour posé sur un support de tubes à essais. On verse le sperme sur la résine et on l'amène à s'infiltrer dans la résines de préférence par centrifugation à 750 tpm pendant une minute ou pluso La base du tube collecteur extérieur contient une solution support tampon supplémentaire pour recueillir le sperme séparé. On fait ensuite sédimenter le sperme et retire les spermatozoïdes voulus pour les utiliser pour l'insémination ou les congeler. Une autre technique que l'on peut envisager d'utiliser seule ou en combinaison avec les matières échangeuses d'ions mentionnées ci-dessus pour la séparation de fractions de sperme consiste à combiner une centrifugation et des différences de pression. Cette technique est particulièrement efficace avec les bovidés en raison de la grande différence de dimensions qui sépare les spermatozoïdes X et Y. On utilise une chambre de séparation tubulaire conique d'une centrifugeuse à contre-courant. On obtient la fraction femelle désirée en plaçant le semen lavé et dilué dans la centrifugeuse seul ou en combinaison avec l'échangeur d'ions approprié, et on centrifuge la solution diluée à 750 tpm, de toute façon à une vitesse inférieure à 1000 tpmo. On applique ici une seconde ou troisième force, savoir l'application d'une pression différant de 15 à 30 cm de celle à laquelle on a obtenu le sperme. Pour la sélection des mâles, on utilise les techniques ci-dessus et l'on augmente la vitesse de façon qu'elle soit supérieure à 1000 tpm et inférieure à 1200 tpm. On applique un vide de l'ordre de 15 à 30 cm comme pression différentielle comparée à la pression de prélèvement du sperme. Les fractions sont ainsi obtenues et extraites du diluant puis concentrées. Elles peuvent alors être utilisées pour l'insémination ou congelées pour un usage ultérieur. Le mode de réalisation recommandé utilise une centrifugation à contre-courant en combinaison avec un échangeur d'ionso Bien que l'application d'une différence de pression semble améliorer les résultats, on peut obtenir des fractions satisfaisantes par les autres procédés décrits. Ces fractions sont utilisées pour fertiliser les oeufs prélevés. Le sexe peut être déterminé par examen de cellules prises sur un embryon. Au stade blastocyste, l'embryon est placé dans une chambre sur la platine chauffée d'un microscope de dissection du type- à contraste de phase. La zone pellucide est maintenue avec une micro-pipette sous un léger vide. Les cellules sont prélevées en plaçant une seconde micropipette contre la zone pellucide avec une légère pression dans la région du trophoblaste, et en introduisant une aiguille capillaire dans les cellules pour en retirer quelques-unes du trophoblaste. On peut examiner ces dernières avec un microscope électronique pour déterminer le sexe. Quand le sexe a été déterminé, on peut transférer le blastocyste sur une receveuse et le laisser poursuivre sa maturation. Les cellules d'embryons peuvent subir de nombreuses opérations différentes qui aident à la reproduction d'animaux génétiquement supérieurs et permettent que les receveuses portent des sexes semblables. Cela permet d'utiliser plus complètement la capacité utérine des bovidés en évitant les jumeaux de sexe différent et est applicable à d'autres espèces. Les oeufs fertilisés et les petits embryons, dont la dimension n'est de préférence pas supérieure à celle du stade morula, peuvent être congelés à - 196 C. A cet effet, on lave les embryons dans 2 ml de milieu, tel que celui décrit ici par exemple, ou avec de la solution PBS. Les oeufs repris du corps jaune doivent avoir été débarrassés des cellules étrangères du cumulus des follicules de De Graaf par exposition à de l'hyaluronidase (150 unités de la pharmacopée U.S. par millilitre) dans le milieu pendant 3 à 5 minutes. Les oeufs sont transférés, dans une très petite goutte (environ 0,01 ml), dans des pipettes contenant 0,1 ml de milieu. Le refroidissement s'opère dans un bain à une vitesse inférieure à 2 C par minute, la vitesse optimum étant entre 0,3 et 0,4 C par minute. A O C, on ajoute, comme tampon, 0,1 ml de diméthylsulfoxyde 2 M. Au bout de quinze minutes ou plus, les échantillons sont transférés dans un bain à environ - 4 C, et on ensemence deux minutes plus tard avec un petit cristal de glace. Les échantillons sont ensuite refroidis à la même vitesse à - 70 C et ensuite à 110 C (bain d'éthanol 256 9 1 0 5 et de glace sèche), puis transférés directement dans l'azote liquide (196 C). On peut utiliser l'hélium pour assurer le gradient de température et la vitesse de refroidissement. La décongélation s'opère en plaçant la pipette dans un tube de 40 x 200 mm dans 1'éthanol à - 110 C, et en réchauffant par contact avec l'air à la température ambiante à raison de 4 C par minutes mesurée en partant de 65 Co A O C, on ajoute alors 0,2 puis encore 0,2 et enfin 0,4 ml de milieu de culture. Les embryons sont ensuite transférés dans un millilitre de milieu de culture puis rincés deux fois avec la même quantité. On les examine sous un grossissement de 50X pour déterminer le taux de remise en état et transfère en culture par exemple sur un verre de montre sous huile minérale à 30 à 38 C (de préférence à 31 à 33 C) sous atmosphère deoxygène ou d'air avec 5 % de Co2, Les corps cellulaires qui sont ainsi congelés doivent l'être dans le milieu recommandé ici, contenant du pyruvate de sodium ou de l'oxaloacétate de sodium en quantités égales. On peut aussi utiliser la solution PBS contenant ces substances, et il est bon d'ajouter du glucose. Il y a avantage, pour augmenter l'utilisation des oeufs recueillis, de congeler dans le même conteneur des embryons du même sexe. A cette fin, il est bon de séparer les cellules individuelles d-un oeuf avec une lysine comme on l'a décrit ici, et de placer les cellules de même type dans le même conteneur. Les cellules séparées à la lysine sont - complètement aptes à la différentiation après décongélation, et l'on obtient des résultats améliorés dans l2opération de congélation. La zone pellucide du stade morula ou du corps cellulaire embryonnaire inférieur, y compris ceux qui ont été séparés par traitement avec une lysine, sera de préférence éliminée avant la congélationo Après décongélation, les corps cellulaires doivent être protégés par transfert dans la zone pellucide d'une seconde cellule. Ces procédés sont décrits plus en détail icio On peut congeler les oosphères de la manière ci-dessus et les décongeler à 0 C, puis mélanger des gouttes successives de sperme de pr6férence avec du liquide folliculaire comme on le décrit plus loin, avec le milieu support jusqu'à ce que la quantité de milieu support fluide soit approximativement de 098 ml à 1 ml, et on laisse le milieu se réchauffer par exposition'A la température de l'air pendant 3 heures. Four une description plus détaillée de la fertilisation in vitro, on pourra se référer à l'exemple donné ici sans référence à la congélation. Les opérations sur les cellules, morula et blastocystes sont effectuées avec l1aide d'un microscope de dissection à contraste de phase. Le support des cellules utilisé est un verre de montre en forme de petite coupe que l'on a couvert et qui présente des ouvertures d'accès de petites dimensions sur les côtés pour permettre d'introduire les outils nécessaires. Ces orifices et la plaquette formant couvercle sont rendus étanches par une pellicule d'huile de silicone, et les outils doivent être tenus au moyen de micros manipulateurs et introduits à travers le film d'huile. La platine du microscope doit être chauffée. On peut faire les micro-aiguilles avec du verre Pyrex (marque de fabrique de Corning Glass) ou de verre boro-silicique, en tige de 1 mm que l'on étire pour former une mince tige (environ 0,3 mm) de 50 mm de long. On fait une courbure verticale pour réaliser un dégagement entre le porte- outil et la platine du microscope. La tige mince est munie d'un crochet pour porter un poids et ensuite le crochet est chargé d'un poids de 1 g et tiré sur un angle de 45O. On façonne la pointe en un grain que l'on efface ensuite, et pour une aiguille à crochet, on refroidit légèrement le bout et ensuite courbe sur un angle d'environ 120 de façon à former une aiguille à crochet incluant un angle d-environ 600. Les micropipettes se font de la même manière que les aiguilles, en partant d-un capillaire de verre de 1 mm. Entre les opérations détirage la pipette est façonnée en crochet et finalement elle est aussi tirée en une partie très mince avec une charge de 250 mg sur un angle de 45 0 On façonne la surface de lorifice pour avoir une pointe biaise mousse. Les micromanipulateurs du commerce (Leitz) peuvent être utilisés comme porteoutils dans les opérations que l'on peut exécuter sur les cellules avec les outils ainsi préparés et qui seront alors portés par ces micromanipulateurso Au stade bi-cellulaire avant la division, on doit observer attentivement les cellules pour veiller à la division au stade à quatre celluleso Au stade des quatre cellules, les quadrants supérieur et inférieur du même hémisphère des quatre cellules peuvent être séparés par microchirurgie en faisant passer mécaniquement une micro-aiguille de verre au travers de la zone pellucide (si celle-ci n'a pas été éliminée préalablement avec des lysines) et en séparant ensuite les deux hémisphères par une pression continue légère. Ce procédé peut être utilisé pour produire des jumeaux identiques. Il est possible de séparer en clones les oeufs fertiliséso La technique que l'on devra utiliser ici consiste à éliminer la zone pellucide au stade morula du développement ou au stade de 8 ou 16 cellules par trypsinisation. Les cellules sont mises en suspension dans du bouillon et exposées à la solution de trypsine, puis on agite mécaniquement pendant 15 minutes avec une micro-aiguille de verre pour séparer les cellules individuelles. Les cellules sont alors lavées rapidement avec le milieu phosphatique tamponné. D'un autre côté, il est bon de disposer d'oeufs supplémentaires de la donataire dont la zone pellucide soit intacte. On retire, avec une aiguille stérile sous le microscope, le noyau des cellules individuelles de la donneuse ou les détruit. Les cellules de la donneuse sont aspirées dans une aiguille fixée à une seringue, et l'on injecte la cellule dans la zone du noyau des cellules de la donataire, et ensuite on transfère les cellules de la donataire en culture ou chez la receveuse pour maturation. Normalement, on conserve en observation les cellules pendant la première division après l'injection avant le transfert0 La zone pellucide peut être éliminée avec de la trypsine et les cellules être dissociées par trypsini- sation ou avec une autre lysineo On peut mettre les cellules en suspension dans le milieu recommandé ou dans le milieu basique diEagle, tous deux modifiés de façon à avoir une teneur double de la teneur courante en amino-acides et vitamines (80 parties en volume), en bouillon à la typtose phosphaté (10 parties en volume) et en sérum de bovin albuminé (10 parties en volume), dans une boîte de Petri plate de 112 ml contenant 20 ml de milieu sous huile de paraffine ou minérale. On ajoute ensuite au milieu une solution à 0,5 % d:édétate de sodium dans une solution à 1 5 de trypsine. Les cellules doivent incuber pendant 15 à 30 minutes jusqu'à ce que la zone pellucide soit éliminée. On peut effectuer la dissociation des cellules après avoir éliminé la zone pellucide au moyen de O,1 % de trypsine une fois cristallisée (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) dans une solution PBS (solution de sels de phosphate tamponnés avec des sels de Eagle), et en pipetant doucement au bout de 15 à 30 minutes. On peut utiliser 0,01 ml de solution de PBS avec 0,005 de trypsine en solution. On peut aider au détachement en agitant, ou par une autre assistance mécanique, telle que l'introduction d'une fine aiguille dans la masse cellulaire avec agitation. Après le détachement avec la trypsine ou une autre lysine, on remplit une seringue d'environ 0Q1 ml de milieu et retire les cellules que l'on lave deux fois avec une solution propre r'ui eliminer la trypsine. On peut déterminer le sexe d'une ou de plusieurs cellules à l'aide du microscope électronique. Si l'on désire courir le risque de répéter le type cidessus de formation de clones, on doit laisser les cellules se développer en culture, à nouveau, au stade morula, les cellules étant placées dans le milieu de culture, à raison de 2 à 4 ml, dans une boîte de Petri pour la culture des tissus, de 32 mm, en plastique, et placées dans une boîte plus grande contenant 1 ml de solution PBS, enfermées hermétiquement dans les boîtes en plastique pour qu'elles se développent à une dimension plus grande. Toutefois, on doit bien comprendre que chaque répétition de l!opération augmente fortement la proba- bilité de développement d'embryons incomplets. Il est possible d'obtenir le développement de cellules séparées sans zone pellucide, mais cette zone pellucide agit comme protection naturelle dans l'organe 4C receveur et lVon obtient ainsi plus facilement que les cellules survivent à la maturation. Comme on l'a dit précédemment, on peut à cet effet procéder par transfert de la cellule donneuse dans une cellule donataire. Pour cela, on aspire la cellule et linjecte dans une cellule donataire dont la zone pellucide est intacte mais dont on a détruit le noyau. Cette dernière opération peut se faire de différentes manières que l'on décrit ci-après. On maintient un-oocyte avec une pipette sous un microscope de dissection, La zone pellucide traversée par une aiguille à crochet, on chasse le noyau de la cellule ou le détruit par agitation. On implante ensuite dans cette région la cellule de la donneuse. Le noyau peut aussi être détruit en provoquant l'extrusion des chromosomes de la cellule si celle-=ci est capable de se diviser. Au cours de la métaphase, on place une petite goutte d'huile de silicone adjacente à la cellule, et cette dernière extrudera les chromosomes dans lV'huile o on peut les éliminer. Toutefois, l'élimination mécanique du noyau protoplasmique est préférable, et l'on peut utiliser des cellules qui se divisent dans l'interphase, ou les oocytes. Il est aussi possible de retirer le noyau par aspiration avec une aiguille capillaire. En utilisant des aiguilles fines, on évite les déformations de la cellule causées par des aiguilles plus grosses. Une autre technique pour le transfert de corps cellulaires d'un embryon consiste à retirer la cellule de la zone pellucide par application de lysine ou chirurgi- calemento Ensuite, on transplante la ou les cellules dans une nouvelle zone pellucide et la ou les laisse s'y développer. Le noyau de la cellule originale peut être détruit par énu- cléation, destruction du noyau. comme il est recommandé, ou par excision. Ces techniques ou combinaisons peuvent être utilisées pour retarder le moment de la transplantation néces- saire et pour obtenir plus de corps pouvant former des clones. On peut transplanter les cellules choisies dans leur intégrité, ou on peut transplanter seulement le noyau et le cytoplasme qui l'entoure sur le nouveau corps cellulaire, Si on utilise cette dernière technique. il est nécessaire d'énucléer la cellule receveuse et de transférer le noyau et le cytoplasme qui l'entoure dans le cytoplasme de la cellule nourrice. Bien que la technique décrite ci-dessus soit simple et efficace, on peut aussi envisager d'employer des variantes techniques. On peut laisser intacte la zone pellucide de la cellule de la donneuse, et retirer les cellules du blastomère ou de la morula et les transférer de la façon précédente dans une cellule donataire. On peut extraire les cellules sous la forme de cellules complètes et obtenir de bons résultats. Toutefois, il est aussi possible d'extraire le noyau lui-même et de le transférer dans une cellule donataire. Le minutage de cette dernière technique est plus critique, car le noyau aussi bien que la cellule donataire ont, quand ils sont isolés, tendance à se désintégrer, et le transfert doit être accompli en conduisant les deux opérations parallèlement ou dans une durée très brève. Ces techniques produisent des "jumeaux" identiques, qui n'ont pas le même matériel génétique que la mère ou le père, qui contiennent des gènes des deux, car les carac- téristiques génétiques sont déterminées par la fertilisation avant séparation des cellules de l'embryon. Il peut être désirable d'obtenir une progéniture femelle ayant le même matériel génétique que l'animal mère. On a déjà créé de nouveaux individus chez les animaux-inférieurs sans fertilisation par des spermato- zoOdes. On a "fertilisé" des oeufs de dinde avec des virus pour produire des dindons mâles. On envisage l'utilisation du contenu chromosomique de la femelle seule suivant les deux techniques décrites ci-dessous. On utilise deux oocytes. Chaque oocyte est un oocyte secondaire qui a éliminé un seul corps polaire et qui a atteint la métaphase mitotique de la seconde division de la maturation comme c2est le cas au moment de l'ovulation. Le corps polaire et le pronucleus sont tous deux haploïdes. Les deux oocytes sont placés dans une chambre de dissection fermée, sur la platine chauffée d'un microscope de dissection à contraste de phase. On surveille soigneusement la pression dans la chambre. Le milieu support doit être renforcé avec du glucose dans la proportion pondérale qui est décrite dans l'exemple Io Le milieu support peut être le même que l'on utilise pour la trypsinisation, avec addition d'une quantité égale de trypsine de l'hyaluronidaseo On ponctionne la cellule donataire et observe attentivement la membrane vitelline pour détecter la formation de granules corticales. Dans les 5 à 10 minutes, le pronucleus du second oocyte trypsinisé a atteint le développement nécessaire et est retiré et injecté dans le premier oocyte donataire. On ajoute ensuite, au milieu support, des quantités égales d'Androgamome III, un acide gras, de dodécylsulfate de sodium et de venin d'abeille. On obtient dans une certaine mesure, à partir de ce pourcentage égal, pondéral, de trypsine, duhyaluronidase et d'Androgamome III de dodécylsulfate de sodium et de venin d'abeille, une pseudo-fertilisation de la cellule donataire. Comme substitut, on peut préparer, dans une solution de trypsine, une suspension lavée, dense, de spermatozoïdes que l'on centrifuge à grande vitesse. Ce qui surnage contient un extrait que l'on substitue dans la même quantité pondérale aux acides gras et détergents au même point du déroulement des opérations. Dans un second mode de réalisation, on peut remplacer le pronucleus du second oocyte par le corps polaire. Quand on observe la métaphase, on constate que les deux corps haploïdes ont fusionné pour former le zygote diploïde et que le sexe de lembryon est déterminé par les chromosomes obtenus du seul animal-mère. Quand on a observé que la cellule a eu la réaction violente caractéristique de la fertilisation, le zygote diploïde est repris, lavé et transféré en milieu de culture. On surveille ensuite la cellule pour déter- miner si la division normale se produit, puis on peut la traiter comme si elle était le résultat d'une fertilisation normale. Les spermatozoïdes vivants stériles sont capables d'amorcer la pseudo-fertilisation. Ces spermatozoides sont obtenus en soumettant des spermatozoides normaux à la lumière ultra-violette. L'importance de l'exposition est variable et dépend de l'espèce, de la proximité de la source lumineuse et de la durée. Une trop forte exposition tue les spermatozoïdes. La durée recommandée d'exposition se situe dans un éventail assez large, et on pourra obtenir des résultats satisfaisants de 30 secondes à 3 minutes. Ces spermatozoïdes irradiés à l'ultra- violet, stériles (ou stérilisés d'une autre manière, comme par exposition à des radiations comme on le fait dans des programmes de contrôle de la multiplication des mouches), peuvent provoquer l'amorçage de la télophase. L'expulsion du corps polaire aura norma- lement pour résultat la formation d'un corps haploide dont les divisions progresseront, mais dont la maturation ne s'opérera pas. Outre les procédés mentionnés ci-dessus pour suppléer un corps haploïde supplémentaire, on peut utiliser des voies différentes pour produire le diploïde désiré. Alors que la température de développement normal des oocytes chez les bovidés se situe entre 37,8 et 39,1 C, on peut recueillir les oocytes et les maintenir à une température inférieure. Les bovidés, les porcs et les équidés donnent des oeufs qui peuvent être cultivés à 37 C ou, comme on l'a mentionné précédemment, les résultats voulus peuvent être obtenus à des températures même aussi basses que 30 à 34 C, et de préférence entre 31 et 33 Co On peut obtenir la pseudofertilisation par les procédés décrits ci-dessus. On peut opérer sous un microscope afin de pouvoir observer le développement des oeufs "fertilisés". Quand on remarque que le second corps polaire progresse vers l'expulsion à travers la membrane vitelline, mais sans l'avoir encore atteinte, on peut soumettre les oeufs à un choc thermique d'approximativement 10 C, en plaçant la plaquette de culture dans un bain d'eau à température plus élevée. Ceci fait monter la température audessus de la température normale en restant en-dessous de la température à laquelle les cellules mourraient. Bien que le rendement soit très bas, on a observé que l'on peut obtenir des corps diploides. Ceux-ci se divisent normalement et peuvent être transplantés pour poursuivre leur développement. On peut cultiver les cellules et l'on peut obtenir des corps supplémentaires sous forme de clones constituant des copies par séparation cellulaire de l'embryon comme on l'a dit plus haut. Le rendement peut être augmenté en implantant le noyau obtenu d-un autre oeuf du même animal comme mentionné précédemment. On peut utiliser un choc thermique en conjonction avec ce traitement. Cette technique peut être combinée avec l'utilisation de sperme stérile pour produire des clones de corps cellulaires On peut utiliser, pour la fertilisation d'un oocyte, un autre exemple de sperme sélectionné; ce procédé emploie la technique mentionnée ci-dessus de séparations de préférence au moyen d9une résine échangeuse de cations et avec un milieu contenant 20 à 40 % d'albumine, de préférence d'albumine bovine (Grand Island Biological Cy)o On peut utiliser ici les résines échangeuses de cations mentionnées précédemment. Le sperme résultant comprendra un plus grand pourcentage de sperme produisant des femelles. En pratique, quand on essaie de provoquer la formation de duplications en clones du génotype de la donneuse, l'utilisation de sperme dont on a déterminé le sexe, mais stérilisé, peut assurer un plus grand rendement en corps transplantables, car les mêmes spermatozoïdes non stériles seraient efficaces pour causer la fertilisation vraie, et le résultat, bien qu'il ne serait pas un génotype de la donneuse pourrait être utilisé comme corps transplantable. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples ci-dessus décrits, à partir desquels on pourra prévoir d'autres formes et d'autres modes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. REVENDI C A T IONS 1 ) Procédé dans lequel on transplante des embryons afin d'augmenter en nombre la progéniture de donneuses femelles de mammifères ongulés omnivores et herbivores, caractérisé en ce qu'il comprend la conservation, pendant une certaine durée, d'oeufs prélevés sur une donneuses dans un milieu de culture de tissus sous la forme de cellules indivi- duelles, d'un oeuf ou de corps cellulaires, la préparation d'une ou plusieurs receveuses envisagées pour la transplantation, et la détermination du moment de l'ovulation chez une receveuse sélectionnée, la sélection d'un oeuf ou d'un corps cellulaire conservé à partir du milieu de culture de tissu, puis la transplantation de l'oeuf ou du corps celiulaire sélectionné, provenant de la donneuse, sur une receveuse choisie, à un moment correspondant à la synchronisation de l'oeuf ou du corps cellulaire individuel transplanté et du moment normal de fertilisation de la receveuse, de façon que le transplant soit synchronisé au stade blastocyste chez la receveuse avec le moment o cette dernière devrait normalement implanter un blastocyste qui lui serait propre si elle avait été fertilisée. ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les oeufs sont congelés dans un milieu de culture de tissus avant la transplantation. 3 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on sépare, dans les oeufs prélevés sur la donneuse, des cellules d'un oeuf individuel sous forme de corps embryonnaires cellulaires, et retarde ainsi le dévelop- pement au stade blastocyste de chaque corps cellulaire ainsi séparé, et transplante ultérieurement un ou plusieurs de ces corps cellulaires sur une receveuse sélectionnée. 4 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la transplantation est opérée après que les oeufs ont été conservés pendant une durée de plusieurs jours, pouvant même dépasser la durée nécessaire pour que les oeufs passent, chez la donneuse, dans l'oviducte et dans la corne utérine, la transplantation étant faite dans la corne utérine ou dans l'oviducte de la receyeuse et dans ce dernier cas, en passant dans la corne utérine et au moyen d'une canule intro- duite par la jonction isthmique. 5 ) Procédé suivant la revendication 1, 2569-105 caractérisé en ce qu'on provoque la division de l'oeuf en une pluralité de corps cellulaires qui n'ont pas dépassé le stade blastocyste de développement, et que l'on examine,9 avec un microscope, une ou plusieurs cellules différenciées d'un corps cellulaire qu'on se propose de transplanter ou d'un corps cellulaire dérivé de celui qu'on désire transplanter, afin de déterminer le sexe du transplant. 6 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de conservation de l'oeuf prélevé est supérieure à deux jours, la température de conser- vation du milieu de culture du tissu se situant entre 30 et 38 C, et la composition de ce milieu de culture comprenant une solution saline, du glucose, des acides aminés et des vitamines, et du pyruvate de sodium et correspondant aux indications données dans les exemples recommandés dans la description. ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la transplantation sans opération chirurgicale. 8 ) Procédé suivant la revendication 1s caractérisé en ce que l'oeuf individuel ou les corps cellulaires sont un génotype formé par un clone, tous les chromosomes de chaque cellule embryonnaire étant dérivés du même individu. 9 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que tous les chromosomes de l'oeuf ou du corps cellulaire transplanté proviennent de la donneuse, du fait que l'on provoque le développement d'un oocyte prélevé sur la donneuse tel qu'il soit formé d'un noyau diploïde dérivé de deux génomes de la donneuse. 10 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, pour fertiliser les oeufs avec une fraction de spermatozoides dont le plus grand nombre produira des zygotes du sexe que l'on désire, on produit une fraction de spermatozoïdes en lavant le sperme recueilli d'un mâle donneur et en transférant les spermatozoïdes dans une solution support fluide diluée, en filtrant les spermatozoïdes sur une matière échangeuse d"ions, puis en concentrant le produit et en transférant le produit concentré dans une solution tamponnée, la matière échangeuse d'ions étant une résine échangeuse de cationso 11 ) Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'on obtient la fraction de spermatozoïdes en lavant et diluant les spermatozoïdes recueillis sur le mile donneur, en plaçant la solution diluée contenant les sperma- tozoides dans une centrifugeuse à contre-courant, et en centrifugeant pendant une durée dépassant vingt minutes, et enfin en arrêtant la centrifugation et en retirant la fraction désirée du diluant, les spermatozoïdes étant soumis pendant la centrifugation à une pression différente de celle à laquelle ils ont été recueillis sur le mâle donneur, cette différence de pression étant un vide de 15 à 30 cm. 12 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on conserve un oeuf individuel ou des corps cellulaires destinés à une transplantation pendant une certaine durée en transférant l'oeuf, ou le corps cellulaire provenant de l'oeuf prélevé, dont le développement ne dépasse pas le stade morula de différenciation qui se trouve dans une petite quantité de fluide dans un milieu support vivant et un conteneur, en refroidissant le conteneur dans un bain de fluide à une vitesse inférieure à 2 C par minute, en ajoutant, environ 0 C une même quantité de solution tampon dans le conteneur, en continuant le refroidissement du conteneur à la même vitesse jusqu'à ce que l'on ait atteint une température stable de stockage à l'état congelé de l'oeuf ou du corps cellulaire, le conteneur étant soumis, vers -4 C, à la conti- nuation du refroidissement après ensemencement du bain fluide avec un cristal congelé pour amorcer la poursuite du refroidissement. 13 ) Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on enlève la zone pellucide du corps cellulaire avant de le transférer dans le conteneuro 14 ) Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que les oeufs congelés comprennent une oosphère qui est ensuite décongelée à environ 0 C, et que l'on mélange des gouttes successives de fluide contenant du sperme avec le milieu de culture jusqu'à ce que la quantité de milieu soit d'environ 098 à 1 mm, et qu'on laisse le milieu s'échauffer par exposition de son conteneuz à l'air à la température ambiante pendant plus de trois heures. 15 ) Procédé pour augmenter en nombre la progéniture d'un mammnifère femelles ongulées omnivore et herbivore, qui sera la donneuse, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection d'un oeuf unique que l-on a prélevé sur une donneuse pour la transplantation, la séparation d'une ou plusieurs cellules des autres cellules de cet oeuf pour obtenir une pluralité de corps cellulaires semblables mais séparés, embryonnaires, qui sont séparés et libérés des autres cellules de cet oeuf unique, la sélection des corps cellulaires individuels qui ont été ainsi séparés et sont capables de différenciation individuelle pour la transplantation, et la transplantation d'un ou plusieurs des corps cellulaires individuels séparés, qui sont capables de poursuivre leur différenciation et qui sont dérivés de l'oeuf unique, sur une receveuse femelle pour continuer leur maturation, l'oeuf choisi ayant été fertilisé avec une fraction de spermatozoïdes dont la majorité produira des zygotes d'un sexe voulu, et le sexe des corps cellulaires ayant été déterminé avant la transplantation sur la receveuse. 16 ) Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que les cellules embryonnaires individuelles sont séparées et libérées des autres cellules d'un oeuf unique à l'aide d'une solution de lysineo 17 ) Procédé dans lequel on transplante des embryons afin d'augmenter en nombre la progéniture de donneuses femelles mammifères, ongulées, omnivores et herbivores, caractérisé en ce qu'il comprend le prélèvement d'un oeuf sur la donneuse, la séparation d'une ou plusieurs cellules de cet oeuf, après qu'il s'est divisée mais ne s'est pas différencié au-delà du stade morula de développement, à l'aide d'une solu- tion de lysine dans laquelle on a placé cet oeuf et séparé des cellules individuelles des autres cellules de cet oeuf, libérant ainsi des corps embryonnaires individuels qui sont capables de différenciation séparée, l'injection des cellules individuelles qui ont été ainsi séparées dans un corps cellulaire correspondant en attente de façon que ce corps en attente protège la cellule individuelle de la destruction et lui permette de se développer et de se différencier sous la forme d'une cellule embryonnaire séparée dont le développement a été retardé si on compare avec le stade de.développement qu'aurait atteint l'oeuf original si les cellules individuelles n:en avaient pas té séparées, et ensuite la transplantation d'une ou plusieurs des cellules provenant de 1-oeuf unique obtenu de la donneuse sur une receveuse à un moment tel que la receveuse est synchronisée de façon à recevoir les cellules transplantées en accord avec leur stade de différenciation. 18 ) Procédé dans lequel on transplante des embryons afin d'augmenter en nombre la progéniture de donneuses mammifères ongulées, omnivores et herbivores, caractérisé en ce qu'il comprend la provocation d'une superovulation chez une donneuse choisie, la détection de l'oestrus chez cette donneuse, l'insémination de cette donneuse, le prélèvement des oeufs fertilisés de cette donneuse en chassant les oeufs de l'oviducte ou de l'utérus par lavage,9 en recueillant les oeufs entraînés et en les plaçant dans un milieu support vivant, le retardement du développement des oeufs de la donneuse obtenus au cours de la différenciation des oeufs par un procédé de retardement, celui-ci comprenant un stade'o l'on congèle un ou plusieurs des oeufs embryonnaires obtenus avec une petite quantité de milieu support vivant que l'on a déposé dans un conteneur, le refroidissement du conteneur dans un bain fluide à une vitesse inférieure à 2 C par minute et l'addition dans ce conteneur, a environ O C, d'une petite quantité de solution tampon égale à celle de milieu support, et la continuation du refroidissement du conteneur à une température inférieure à 0 C qui soit une température de conservation stable, la détection de l'oestrus chez une receveuse envisagée, la sélection d'un oeuf parmi ceux que l'on-a conservés et la décongélation de cet oeuf, et enfin la transplantation de l'oeuf choisi sur la receveuse envisagée à un moment correspondant à la synchroni- sation de l'oeuf choisi avec le moment de la fertilisation de la receveuse de façon que le transplant soit synchronisé au stade blastocyste chez la receveuse avec le moment o cette dernière implanterait normalement un blastocyste qui lui serait propre si elle avait été fertilisée. 19 ) Procédé dans lequel on transplante des embryons sur des mammifères ongulés omnivores et herbivores, caractérisé en ce qu-il comprend la préparation d'un ou plusieurs corps cellulaires destinés à la transplantation de façon à produire un génotype spécifique voulu par les étapes consistant à obtenir un oocyte non fertilisé qui s'est développé en atteignant la métaphase mitotique à partir d'une donneuse d'oocytes sélectionnées provoquer l'apparition d'une réaction de fertilisation dans l'oocyte sans pénétration d'un génome dérivé d'un spermatozoïde dans l'oocyte, et provoquer le développement d'un noyau diploide complet dans l'oocyte, ce nucleus étant constitué d'un jeu de chromosomes dérivé des cellules sexuées femelles de la donneuse de chromosomes, et transférer cet oocyte dans un milieu support vivant pour sa différenciation et sa maturation après transplantation. 0 20 ) Corps cellulaire différencié caractérisé en ce qu'il est issu du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 19.