Brevet FR2570189A1 — publié le 19860314

Les méthodes de dosage dites immunoenzymologiques représentent actuellement un des domaines les plus prometteurs de l'analyse biologique et du diagnostic. Elles consistent, brièvement, à combiner les avantages de la réaction antigène-anticorps, très spécifique, et de la mesure des activités enzymatiques, très sensible et qui dispense du recours aux isotopes radioactifs. Ces méthodes relèvent de l'un ou l'autre des deux types suivants: 1. La compétition - L'antigène à doser (Ag) est fixé à l'anticorps (Ac) et forme le complexe (C). I1 est mis en compétition avec un conjugué antigène-enzyme (Ag-E). Après incubation, on procède à la séparation du conjugué libre et fixé à l'anticorps et l'on mesure l'activité enzymatique de l'une ou l'autre fraction.La quantité d'enzyme associé à l'anticorps (CE) est donc une fonction décroissante de la quantité d'antigène à doser Une bonne méthode de séparation du conjugué libre de celui lié à l'anticorps consiste à fixer l'anticorps à l'avance sur un support solide. - Une variante de ce procédé consiste à disposer d'un antigène fixé à un support solide (Agf) et d'un conjugué anticorps-enzyme (AcE). L'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène fixé pour la liaison à l'anticorps marqué. On mesure l'activité enzymatique associée à la phase solide (CfE) à la fin de l'incubation. A nouveau, cette activité est une fonction décroissante de la quantité d'antigène 2. Les techniques "sandwich" On dispose de 2 anticorps (au moins), l'un d'entre eux est fixé à un support solide Ac1f, l'autre est conjugué à l'enzyme Ac2E.L'antigène réagit avec l'un et l'autre. anticorps, réalisant un pont entre eux ; le complexe ternaire est appelé sandwich On mesure l'activité enzymatique associée au support solide CfE qui se présente alors comme fonction croissante de la quantité d'antigène à doser. Ces procédés sont bien connus et ont donné lieu à de nombreuses réalisations commerciales. L'état de la question est bien résumé par de nombreux ouvrages tels que "Enzyme-Immunoassay, Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Inc. USA" et "Enzyme-Immunoassay, Eiji Ishikawa, M.D., Ph.D., Tadashi Kawai, M.D., Ph.D., Kiyoshi Miyai, M.D. Ph.D., 1981, Igaku-Shoin, Tokyo-New-York". Ces procédés, et notamment ceux qui ont donné lieu à une réalisation commerciale, sont caractérisés par le fait que l'un des partenaires de la réaction (soit antigène, soit anticorps) est fixé sur une phase solide, et qu'à la fin de l'incubation, une partie de l'activité enzymatique se trouve associée à la phase solide sur laquelle elle est mesurée. Les enzymes les plus utilisées sont - la phosphatase alcaline - la ss -galactosidase - la peroxydase - l'acetylcholinestérase. Les phases solides les plus utilisées sont - poudres - billes - tubes - plaques. Dans une réaction immunoenzymatique, la révélation de l'activité enzymatique est généralement une réaction colorée qui se développe au contact de la phase solide. Cette situation est restée jusqu'ici difficilement compatible avec la mesure de la densité optique. Les solutions adaptées à ce problème sont - ou bien, la séparation de la phase solide du milieu d'incubation par décantation, centrifugation ou transfert par aspiration - ou bien, pour les phases solides non divisées (parois de tubes ou d'alvéoles), on a développé des spectrophoto mètres spéciaux. La mesure de densité optique dans les alvéoles des plaques de culture est imprécise, même si les cuves sont à fond plat, à cause de la courbure du ménisque. Elle l'est également dans les tubes de forme ronde En effet, il résulte de la loi de BEER LAMBERT que la densité optique n'est plus proportionnelle à la concentration dès lors que le chemin optique n'est plus uniforme, comme le montrent les relations suivantes chemin uniforme :: DO = Log I = lC I où DO = densité optique 10 = intensité de lumière incidente I = intensité de lumière transmise = = coefficient d'extinction caractéristique de la substance 1 = chemin optique chemin variable où x = paramètre arbitraire Io(x) = intensité de lumière incidente l(x) = chemin optique L'invention résulte de l'abord du problème par une voie inverse : partant d'un spectrophotomètre du commerce, fonctionnant avec cuves optiquement travaillées, donc capables de donner une mesure de densité optique précise, on fait subir un traitement biochimique de surface approprié qui la rende apte à subir la réaction immunoenzymatique.Celle-ci se déroule alors dans le support même qui servira à la mesure de densité optique. De plus, en adoptant les cuves à deux faces parallèles, on rend le résultat linéaire vis-b-vis de la concentration en produit formé. Parmi les cuves de spectrophotomètres utilisables selon l'invention, on citera les cuves à usage unique du commerce en matière plastique telles que celles que l'on trouve sur le marché par exemple sous les appellations - "Ratiolab", réf. 45/104 P - "C M L", réf. SMCU 1 - "OSI", réf. 12.100.5. Ces cuves présentent en général un chemin optique de 1 cm. Les cuves sont recouvertes d'anticorps (ou d'antigène) par tout procédé connu tel que par exemple selon le procédé décrit dans la demande de brevet nO 8305618. L'exemple nullement limitatif suivant est donné à titre illustratif de l'invention - Dosage de la ss2 microglobuline a) Préparation des réactifs - Cuves revêtues par un premier anticorps monoclonal antip2 microglobuline (procédé selon demande de brevet rappeléeci-dessus) - Conjugué : deuxième anticorps monoclonal anti 2 microglobuline lié à laB galactosidase selon Ishikawa (référence rappelée plus haut). b) Mode opératoire 50 til de solution standard de ss 2 microglobuline + 1 ml de conjugué (deuxième anticorps monoclonal antip2-microglobuline lié à la ss galactosidase) dilué en tampon phosphate 10 2 molaire, NaCl 0,15 M (pH 7,2)-albumine (1 g/l)-Tween (1 g/l). Incubation 4 h. à température ambiante. 3 lavages en tampon phosphate 10 2 molaire, NaCl 0,15 M (pH 7,2)-albumine (1 g/l)-Tween (1 g/l). Incubation du substrat de lag galactosidase orthonitrophenyl-8 -D-galactoside pour la révélation de la- réaction = 1 ml par cuve, pendant 1 h à 200C. Lecture de la D.O. à 410 nm. On établit la courbe correspondante. Celle-ci figure au dessin annexé. On se sert de cette courbe dite courbe standard pour évaluer le titre de toute solution de titre inconnu enp 2-microglobuline suivant la valeur de la densité optique obtenue en se servant d'une cuve selon l'invention. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toutes modifications utiles pourront y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunoenzymologique, caractérisé par le fait que l'on fait subir à une cuve de spectrophotomètre,déjà optiquement travaillée et capable de donner une mesure de densité optique précise, un traitement biochimique de surface approprié la rendant apte à subir une réaction immunoenzymatique et à servir ainsi de support au déroulement de celle-ci, puis à procéder directement sur la cuve ainsi traitée à une mesure de densité optique. 2. A titre de produit industriel nouveau, une cuve de spectrophotomètre convenant pour des mesures biochimiques, caractérisée par le fait que ses parois sont recouvertes d'anticorps capable de fixer son antigène dans une réaction immunoenzymatique ou vice-versa et convenant dans le procédé selon la revendication 1. 3. Cuve selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'elle comporte au moins deux faces parallèles. 4. Cuve selon la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle présente un chemin optique de 1 cm.