Brevet FR2569111A1 — publié le 19860221

l 2569111 La présente invention concerne des médicaments nouveaux actifs comme immunostimulants contenant comme principe actif au moins un tripeptide constitué des aminoacides glycine, leucine et phényl- alanine ou tyrosine. Dans le brevet européen EP 0049666 ont été décrites des subs- tances biologiquement actives obtenues par fractionnement d'hydro- lisats enzymatiques de la caséine humaine et les compositions qui les contiennent. Plus particulièrement, le fractionnement, sur une colonne de Sephadex G50 de la fraction hydrosoluble provenant du traitement de la caséine humaine, délipidée et solubilisée, par la trypsine pendant 24 heures à 37 C fournit trois fractions biologiquement actives désignées par "substances IV, V et VI", parmi lesquelles la "substance V", par purification sur une colonne DEAE - Sephadex A-25,fournit la substance neutre appelée "MJH 24", en éluant par une solution tampon à pH voisin de 8, puis les substances à caractère acide, appelées "MJH 63" et "MJH 65" en éluant par une solution tampon à pH voisin de 3,5. Il a maintenant été trouvé que la purification de la substance "MJH 65" par filtration sur Sephadex G-15 puis par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), après désalification, permet d'isoler un tripeptide dont la structure correspond à l'enchaînement: Gly - Leu - Phe (I) La structure du tripeptide de formule (I) a été déterminée: - par hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6N à 110 C pendant 18 heures - par dansylation pour déterminer la nature de l'aminoacide N-terminal - par action de la carboxypeptidase A - par dégradation automatique avec un séquenceur BECKMANN, modèle 890 C. 2 2569111 Le tripeptide de formule (I) et les tripeptides analogues correspondant à la combinaison des trois aminoacides glycine, leucine, phénylalanine ou glycine, leucine, tyrosine, dont la synthèse peut être aisément réalisée par application des méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique présentent des propriétés immunostimulantes remarquables. Plus particulièrement, le tripeptide de formule (I) et les tripeptides analogues se sont montrés actifs à des concentrations comprises entre 105 et 10-7 M dans le test d'augmentation du nombre de macrophages plagocytaires selon la technique de J. Michl et Coll., J. exp. Med., 144, 1465 (1976). La présente invention concerne les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un tripeptide selon l'invention en asso- ciation avec un ou plusieurs diluants ou excipients compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions peuvent être utilisées pour favoriser et augmenter l'élimination des agents infectieux. En tant qu'immunostimulants non spécifiques de l'immu- nité anti-infectieuse, les tripeptides selon l'inventior -nt administrés à des doses comprises entre 0,1 et 100 mg/kg par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), intra- nasale, buccale ou rectale. Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granu- lés. Dans ces compositions, le produit actif est mélangé à un ou plusieurs diluants tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant, tel que le stearate de magnésium. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solu- tions, des suspensions, des sirops ou des élixirs contenant des diluants inertes, tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. 3 2569111 Les compositions pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme véhicule, on peut employer le polyéthylèneglycol, un-polypropy- lèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent contenir également des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la compo- sition des agents stérilisants ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides, rendues stériles par exemple par irradiation, qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile ou dispersées dans tout autre milieu stérile injectable, éventuellement au moment de l'emploi. Les compositions pour administration intra-nasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions qui peuvent être éventuellement associées à un agent propulseur compatible. Les compositions pour administration rectale sont des supposi- toires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao ou un glycéride semi-synthétique. Les exemples suivants illustrent l'isolement du tripeptide de formule I et les compositions qui le contiennent. EXEMPLE 1 La substance "MJH 65" dont l'isolement est décrit dans l'exem- ple 2 du brevet européen EP 00 49666 est purifiée par filtration sur une colonne de Sephadex G-15. On utilise une colonne de 120 cm de hauteur et de 1,2 cm de diamètre. On élue avec de l'acide acétique à % en recueillant des fractions de 0,6 cm3 avec un débit de 9 cm3/heure. Le diagramme d'élution est représenté par la figure 1 dans laquelle sont portés, en abscisses, le numéro des fractions et, en ordonnées, l'absorption à 280 nm. 4 256911 On recueille ainsi la fraction "MJH 210", éluée entre 81,6 et 88,8 cm3 (fractions 136 à 148) et la fraction "MJH 211", éluée entre 88,9 et 114 cm3 (fractions 149 à 190). La fraction "MJH 210" est désalifiée sur une colonne de Dowex -50X4 de hauteur 14 cm et de diamètre 1,4 cm. L'élution est effectuée en recueillant des fractions de 4,3 cm3 avec un débit de 24 cm3/heure en utilisant comme éluants 100 cm3 d'acide chlorhydrique 0,05N, 100 cm3 d'eau puis de l'ammoniaque 2M. On recueille ainsi une fraction "'3" éluée entre 34,4 et 81,7 cm3 avec l'ammoniaque 2M. Cette fraction "3" est purifiée par HPLC en phase "reverse" sur une colonne semi-préparative (colonne C18 -p Bondapack, Waters) dont la longueur est de 30 cm et dont le diamètre est de 7,8 mm. On recueille des fractions de 0,5 cm3, la vitesse d'élution étant de 1 cm3/minute. Au départ, la colonne est tamponnée par de'l'acide trifluoro- acétique à 0,1% (éluant A). On prépare un éluant contenant de l'acide trifluoroacétique (0,1% en volume) et de l'acétonitrile (70% en volumes) dans l'eau (éluant B). L'élution est effectuée en utilisant un gradient linéaire d'élution et en opérant selon le tableau suivant: Temps Eluant A Eluant B (minutes) 0 100 0 100 0 50 50 0 100 L'élution est suivie par lecture à 280 nm et par la fluores- cence après réaction à la fluorescamine à 490 nm. Le diagramme d'élution est représenté par la figure 2. La fraction n 15, éluée entre 83 et 85 minutes contient le tripeptide de formule (I) pur. 2569111 La structure du tripeptide de formule (I) est déterminée: - par l'hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6N à 110 C pendant 18 heures qui montre la présence de glycine (Gly) = 1, de leucine (Leu) = 1 et de phénylalanine (Phe) = 1. - par dansylation afin de déterminer la nature de l'aminoacide N-terminal, qui est la glycine. - par analyse par le séquenceur Beckmann, modèle 890C, pro- gramme Quadrol 0,1M avec détermination des différentes étapes grâce à la caractérisation des phénylthiohydantoine-acides aminés (déter- mination par HPLC et révélation sur plaques). EXEMPLE 2 Par applications des méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique, les tripeptides suivants sont préparés: - Gly - Phe - Leu -Leu - Gly - Phe - Phe - Leu - Gly - Leu - Phe - Gly - Phe - Gly - Leu - Gly - Tyr - Leu -Leu - Gly - Tyr - Tyr - Leu - Gly - Leu - Tyr - Gly - Tyr - Gly - Leu Gly - Leu - Tyr EXEMPLE 3 On prépare selon la technique habituelle une composition liquide administrable par voie intraveineuse ayant la composition suivante: tripeptide de formule (I)............... 50 mg - soluté injectable..................... 5 cm3. 6 2569111 R E V E N D ICATIONS 1 - Médicament nouveau caractérisé en ce qu'il est constitué par un tripeptide constitué des aminoacides glycine, leucine et phényl- alanine ou tyrosine. 2 - Médicament nouveau caractérisé en ce que le tripeptide est Gly - Leu - Phe. 3 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moins un médicament selon la revendication 1 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharma- ceutiquement acceptables. 4 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient le tripeptide Gly - Leu - Phe en association avec un ou plusieurs diluants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. - A titre de produit nouveau le tripeptide Gly - Leu - Phe.