Brevet FR2566426A1 — publié le 19851227

La présente invention concerne un fragment d'ADN de Spiroplasma citri, codant pour un polypeptide qui contient notamment la séquence d'aminoacides correspondant à la spiraline, les plasmides recombinants contenant ce fragment, et les microorganismes dans lesquels ce fragment s'exprime. Les mollicutes-, primitivement décrits sous le nom de mycoplasmes,sont des germes de plus en plusincriminés en pathologie humaine, vétérinaire et en phytopathologie. Parmi eux les spiroplasmes ont été découverts vers 1970 et font actllement l'objet de diverses recherches. Spiroplasma ce est le premier de ces mollicutes qui a été cultivé et caractérisé comme le décrit SAGLIO et coll. dans Int. J. Syst. Bacteriol. 23 191-204; il estnotamment à l'origine d'une maladie des agrumes connue sous le nom de "stubborn disease". La spiraline est la plus abondante des protéines de la membrane de S.citri, de masse moléculaire comprise entre 26 et 28 kDa, c'est le principal antigène de ce microorganisme, spécifique de l'espèce S.ctt L'obtention de quantités importantes de spiraline, antigène de microorganismes pathologiques est donc utile, notamment pour la préparation des réactifs de diagnostic et c'est un des avantages de l'invention de permettre la préparation microbiologique d'un polypeptide contenant les aminoacides de la spiraline. D'autres avantages de l'invention seront mentionnés dans ce qui suit. Un premier objet de l'invention est le procédé d'isolement d'une souche d'Escherichia coli transformée et sécrétant un polypeptide présentant les caractères immunogéniques d'un antigène de S.cetoe, la spiraline. Ce procédé consiste à 1 ) - traiter le plasmide pBR 328, isolé et. dé- crit par SOBERON X., COVARRUBIUS L. et BOLIVAR F., dans Gene 9 p. 287-305 (1980), par une endonucléase de restriction comme Eco R@,Hind III et analogues; on préfère tout particulièrement Hind III. 20) - à isoler 1'ADN de Spiroplasma cette et à le fragmenter par l'endonucléase de restriction utilisée à l'étape 1 ) 30) - à lier les différents fragments d'ADN obtenus selon 20) sur le vecteur plasmidique linéarisé, par action d'une ligase, 40) - à introduire les plasmides recombinants obtenus dans des bactéries de type E.eote par transformation, 50) à cultiver les bactéries de façon à sélectionner celles ayant incorporé un plasmide recombinant en tenant compte des marqueurs apportés par le plasmide pBR 328 puis parmi celles-ci à isoler celles qui sécrètent un polypeptide donnant une réaction immunologique avec les anticorps dirigés contre les cellules de S. ce et la spiraline Les bactéries transformées obtenues par ce procédé sont un autre objet de l'invention. Les plasmides recombinants comportant l'information génétique, codant pour ce polypeptide donnant une réaction immunologique définie ci-dessus sont extraits des bactéries ainsi sélectionnées par des moyens classiques; ils sont un objet de l'invention ainsi que le fragment d'ADN contenu dans ces plasmides, qui provient du Spiroplasma ce et codant pour ce polypeptide antigénique,et qui est fixé au vecteur dérivé du pBR 328. L'invention concerne aussi l'utilisation de fragments d'ADN et/ou plasmides selon l'invention à la préparation par clonage de nouveaux microorganismes modifiés et plasmides recombinants contenant ces fragments d'ADN; les fragments d'ADN isolés, les plasmides recombinants préparés avec ceux-ci et les microorganismes contenant au moins un plasmide recombinant ou ayant intégré un fragment d'ADN entrent aussi dans le cadre de l'invention. On préfère tout particulièrement les plasmides dérivés du pBR 328 et un microorganisme de type Escherichia coli; mais on peut aussi envisager d'autres vecteurs comme les phages, les autres plasmides connus, les cosmides.Il n'est pas nécessaire que que ces vecteurs soient pourvus d'un promoteur qui favorise l'expression des génes de 1'ADN cloné puisque l'on a montré que le fragment d'ADN selon l'invention porte un promoteur, actif non seulement chez SpewopEazma ce mais aussi chez E. Cote et donc chez des spiroplasmes comme des bactéries. Un autre microorganisme modifiab.le selon l'invention pourrait être Bacillus subtilis ou saccharomyces cervisiae. L'invention concerne aussi l'application des microorganismes m-odifiés,comportant un fragment d'ADN de la présente invention : a) pour l'obtention de polypeptides qui contiennent la séquence d'aminoacides correspondant à la spiraline par culture de ces microorganismes dans des conditions connues, ainsi que b) l'utilisation des fragments d'ADN comme sonde d'hybridation aux ADN d'autres spiroplasmes et mollicutes utilisable pour, notamment, la détection de ces microorganismes, y compris dans les hâtes, ou c) comme source d'un promoteur de mollicute. C'est en effet un autre avantage surprenant de l'invention, que le fragment d'ADN isolé de S. citri s'hybride aux ADN d'autres spiro- plasmes et de mollicutes qui ne comportent pourtant pas une protéine sérologiquement reliée à la spiraline de Sp to- plasma citri. I1 est aussi inattendu et particulièrement utile que le fragment d'ADN selon l'invention comporte un promoteur d'expression des gènes qui ne soit pas actif uniquement chez S.ce ou même chez les spiroplasmes ou mollicutes mais aussi~ chez une bactérie. L'isolement de ce promoteur, par des méthodes connues, après sous-clonage du fragment d'ADN pourra servir à -la préparation d'un vecteur navette entre un mollicute et une bactérie ou d'autres micr-oorga- nismes. Dans les exemples qui suivent, on décrit une mise en oeuvre des procédés selon l'invention et certains des produits obtenus selon l'invention. Parmi les objets de l'invention, une souche de E.coQt transformée, dénommée E.C.pES1,contenant un plasmide de dénommé p ES1 constitué par un fragment d'ADN selon l'invention inséré dans le vecteur plasmidique pBR 328 a fait l'objet d'un dépôt le 19 Juin 1984, dans la Collection Nationale de cultures de Microorganismes de l'INSTITUT PASTEUR (CNCM) à Paris sous le NO I-311. EXEMPLE 1 PREPARATION D'UNE BACTERIE TRANSFORMEE 1) Isolation de 1'ADN de Spiroplasma citri La souche de S. ce R8A2 déposée à 1'ATCC sous le numéro 27556 a été cultivée à 32 C en milieu aérobie. A lafin de la période de croissance exponentielle 50 ml de milieu de culture ont été centrifugés à 150000 tours par minute, à 4 C, pendant 20 minutes Le culot d'organismes a été remis en suspension dans une solution aqueuse 100 mM chlorhydrate de tris-hydroxyméthylaminométhane (TRIS HCl) à pH@9, 150 mM de NaCl, 35 mM de dodécylsulfate de sodium, 10 mM de sel disodique de l'acide éthylènediami- ne tétraacétique (EDTA) et 50 mM de ss -mercaptoéthanol;; après addition de 0,1 ml d'une solution de protéine K à 10 mg/ml, la suspension a été doucement agitée pendant 20 minutes avant d'en extraire les acides nucléiques, par un traitement au phénol puis par un mélange chloroforme al- coo-l isoamylique ( 24/1 V/V), et enfin par précipitation à lréthanol. Remis en solution dans 10 mi d'une solution 30 mM TRIS HC1/500 mM NaCl/5 mM d'ETDA, ils ont été incubés pendant 30 minutes à 20 C en présence de 0,5 mg de ribonuclé- ase L'ADN a été finalement déprotéinisé et isolé par des extractions au phénol et chloroforme suivies d'une prXei- pitation à l'éthanol. 2) Préparation des fragments d'ADN 4 g d'ADN purifiés comme décrit ci-dessus ont été traités par 400 unités de l'endonucléase de restriction Hind III dans 0,3 ml d'une solution tamponnée de TRIS HCl pH 7,5 (100 mM)/NaCl (50 mM)/MgC12 (10 mM) pendant 2 heures à 370C. Les fragments obtenus ont été purifiés par des extractions au phénol et le mélange chloroforme/alcool isoamylique (24/1-V/V) suivies d'une précipitation par ltéthanol. 3) - Préparation du vecteur plasmidigue 5 ss 9 du plasmide pBR 328 ont été linéarisés par Hind III puis traités par la phosphatase alcaline selon le protocole décrit par MANIATIS et coll. dans Molecular cloning" (1982) p.75-85 édité par Cold Spring Harbor NY. 4) - Préparation des plasmides recombinants et transformation de bactéries E.cote 5 g de vecteur plasmidique et 4 ssg de fragments d'ADN préparés selon 2 ont été incubés pendant 14 heures à 140C en présence de 20 unités de ligase pour ADN du phage T4 dans 0,1 ml d'une solution de 50 mM de TRIS HC1 (pH 7,4) 10 mM de MgCl2, 20 mM de dithiothréitol, 1 mM d'adénosine trisphosphate (ATP) . Les produits obtenus ont été utilisés pour transformer la souche de E. cote HB 101. selon une méthode connue en elle-même, décrite notamment par VILLA-KOMAROFF L. et coll. dans Proc. Natl. Acad Sci. USA 75 3727-3731 (1978); elle consiste essentiellement à traiter les bactéries par du chlorure de calcium à pH 5,8, puis à les incuber avec les produits de la ligation, à 40C pendant 1 heure. On fait ensuite subir un choc thermique à 42oC de 2 minutes au mélange, et on l'étale sur un milieu de culture solide contenant-du chlor-amphénicol. Le plasmide pBR 328 comporte en particulier un gène codant pour la résistance au chloroamphénicol et un gène codant pour la résistance à la tétracycline; ces propriétés sont connues comme s'exprimant dans E.coti. Le site Hind III est loca-lisé dans le promoteur du gène codant pour la résistance à la tétracycline; dès lors l'introduction d'un fragment d'ADN exogène dans le site inactive généralement ce gène. 5) - Sélection des bactéries selon l'invention Les bactéries transformées, présentant une résistance au chloramphénicol, ont été isolées sur milieu solide, contenant par litre 37g d'infusion de coeur et cer veau , commercialisé par Bio-Mérieux, 10 g de 8acto-agar des Laboratoires DIFCO (Détroit - USA) et 25 ,gg/ml de chloramphénicol. On a ainsi isolé 920 colonies pour lesquelles on á recherché la sensibilité à la tétracycline sur le même milieu solide mais contenant cette fois 15 ss g/ml de tétracycline au lieu de chloramphénicol on a isolé ainsi 565 clones résistants au chlonamphéni- col et sensibles à la tétracycline. Parmi ces clones, on a recherché ceux qui sécrétaient des antigènes de S.cetoe par une méthode de type ELISA, c'est-à-dire par fixation sur antigène immobilisé et révélation par un conjugué immunoenzymatique, comme décrit par SAILLARD et cois. dans C.R. Acad. Sci. Paris, 286 1245-1248. Les anticorps de lapin utilisés étaient dirigés contre les cellules entières de S. citri. Pour cela des bactéries transformées E.tote issues de chaque clone ont été introduites dans des puits d'une plaque de microtritration contenant un bouillon de culture constitué par 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 5 g de NaCl par litre d'eau, ainsi que du chloramphénicol à la concentration de 25 9 par mi. Les piaques ont été incubées à 37 C pendant une nuit puis 0,02 ml de solution de lysozyme (5 mg par ml d'une solution 25 mM de TRIS HCl à pH 8) ont été ajoutés dans chaque puits, avant de les laisser incuber 30 minutes à température ambiante puis de les soumettre à 3 cycles de congélation ( - 800C)/décongélation, suivis d'une incubation 10 minutes à 37 C. Les bactéries lysées alors obtenues ont été transférées dans de nouvelles plaques de microtitration revêtues d'immoglobulines de lapin dirigées contre la souche R8A2 de S.cetoe. Les immunoglobulines, purifiées comme décrit par SAILLARD et coll. dans C.R. Acad. Sc. Paris 286 1245-48 (1978), ont été déposées àpartir d'une solution tamponnée à la concentration de 12 > 9 par ml; ces IgG réagissent fortement avec la spiraline et d'autres protéines de membrane de S.citri . Après incubation des plaques pendant une nuit à 4 C, les complexes anticorpsantigènes spécifiques ont été décelés après addition d'un conjugué d'immunoglobulines de lapin anti-S.cette et de phosphatase alcaline, par révélation au p-nitrophényl phosphate, substrat de l'enzyme; les mesures de l'absorption ont été effectuées à 405 nm après 30 minutes à température ambiante. Un seul clone a donné une réaction nettement positive à ce test; l'absorption obtenue en traitant 0,2 mi de culture de ce clone était supérieure à 2 unités,résul- tat obtenu avec environ Os3pg de protéines de S.citri. 15 autres clones ont donné une légère absorption correspondant à 0,25 unités, alors que la plupart donnaient des absorptions inférieures à 0,1 unité, valeur obtenue avec les bactéries témoins, ne contenant que le plasmide pBR 328, non recombiné. EXEMPLE 2 ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU PLASMIDE pESl Les bactéries du clone sélectionné selon le procédé décrit dans irexempie i contiennent un plasmide recombinant, appelé pESl. Celui-ci a été isolé et purifié comme décrit par MANIATIS et colt. dans l'ouvrage précédemment cité. Ce plasmide est composé d'environ 11,4 kpaires de bases nucléotidiques,et son traitement par des endonucléases de restriction a montré qu'un fragment d'ADN provenant du spiroplasme et composé d'environ- 6,5 kpaires de bases avait été inséré dans le site Hind III du vecteur de départ pBR 328. Une carte de restriction sommaire est représentée Fig. 1, sur laquelle le fragment d'ADN du spiroplasme figure en clair. EXEMPLE 3 ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU FRAGMENT D'ADN DE Spiroplasma citri PRESENT DANS LE PLASMIDE pESl. Le fragment d'ADN de spiroplasme est obtenu par action d'endonucléase Hind III sur le plasmide pESl à raison d'environ 2 unités d'endonucléase par ,g de plasmide,comme il est habituel. On a montré par des techniques classiques que le fragment d'ADN de Spiroplasma citri compris dans le plasmide recombinant pESl contient environ 6,5 paires de bases, Il n'a pas de site Bam H1 ou Hind III interne. Il contient beaucoup plus de bases que le fragment de 0,8 kpaire de bases, nécessaire pour coder la spiraline. Il contient,au moins,outre le gène de la spiraline, un promoteur d'expression des gènes de spiroplasme, actif également chez une bactérie comme E.coli. La présence du promoteur a été montrée de maniè- re indirecte en préparant un plasmide recombinant pES2, contenant le fragment d'ADN, inséré dans le sens inverse à celui dans lequel il se trouvait dans le pESls le fait que le gène codant pour la séquence d'amino-acides correspondant à la spiraline s'exprime dans la -bactérie transformée par ce nouveau plasmide recombinant pES2 démontre que le fragment comporte un promoteur à partir duquel le gène de la spiraline est exprimé chez E. cote. EXEMPLE 4 UTILISATION DU FRAGMENT D'ADN de S.citri COMME SONDE Une sonde marquée au P32 a été préparée par réparation de coupure du pESI par i'ADN polymérise de S.- cote en présence d'uridine triphosphate radioactive. La sonde a été hybridée avec des fragments d'ADN digérés par Hind III, séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés par buvardage (Southern blot) à des feuilles de nitrate de cellulose Par ces expériences d'hybridation, on a mis en évidence la présence de séquences,correspondant au fragment d'ADN de S.citri présent dans le pESi, dans les ADN d'autres souches de spiroplasmes et mollicutes. En effet, on a constaté que la sonde s'hybridait avec les fragments d'ADN chromosomique obtenus par action de Hind III sur les ADN de trois souches différentes de S.citri, bien qu'on ait montré par ailleurs que la spiraline de S.citri est un antigène spécifique des souches de spiro plasme de cette espèce. On a constaté aussi que la sonde s'hy bridait avec un ou plusieurs fragments d'ADN provenant de l'action de Hind III sur les ADN chromosomiques d'autres espèces de spiroplasmes et mollicutes tels que S.flori- cola, S. mirum, Mycoplasma mycoïdes (souche PC50) et Acholeplasma laidlawii. Donc,malgré l'absence du même antigène chez les autres espèces de spiroplasmes et de mollicutes que S.citri le fragment d'ADN de 3 ce inséré dans pESl peut être utilisé comme sonde pour la mise en évidence d'autres spiroplasmes. EXEMPLE 5 OBTENTION ET CARACTERISATION DU POLYPEPTIDE RESULTANT DE L'EXPRESSION DANS E.cote DU FRAGMENT D'ADN de S.citri CONTENU DANS pESl On a cultivé des bactéries E.cote transformées, contenant le plasmide pESl et des bactéries comportant le plasmide pBR 328. Les polypeptides de ces deux transformants et de la souche de S.Citri R8A2 ont été séparés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate de Na, puis transférés par buvardage sur deux feuilles de nitrate de cellulose disposées de part et d'autre du gel. L'une des feuilles a été incubée avec des anticorps de lapin dirigés contre les cellules de S. cette entières, tandis que l'autre a été testée avec un antisérum de lapin spécifique dirigé contre la spiraline purifiée.Les complexes antigènes/anticorps formés ont été mis en évidence par un conjugué immunoenzymatique constitué par des anticorps de mouton antiwimmunoglobuline de lapin couplés à de la peroxyda-se en utilisant comme substrat le 4-chloro-l-naphtol.On a montré ainsi que les immunoglobulines de lapin dirigées contre les cellules de S.citri reconnaissent plusieurs polypeptides provenant de ces cellules, y compris la spiraline de 28 kDa et que dans polypeptides synthétisés par E.cote transformée par pESl, une protéine de 30,5 kDa fixe les immunoglobulines anti S. ce et anti-spiralines; celle-ci est absente des milieux ob ont été cultivées les E.coli contenant le seul plasmide pBR328. La souche de E.coli transformée selon l'invention,synthétise donc une protéine, sérologiquement identique à la spiraline (fixation des anticorps spécifiques anti-spiraline) mais qui est de masse légèrement supérieure. Elle contient ainsi l'ensemble des amino acides de la spiraline, à côté d'autres amino-acides. REVENDICATIONS 1. Folypepti-de préparé par microbiologie caractérisé en ce qu'il contient la séquence d'aminoacides correspondant à la spiraline, antigène de Spiroplasma ce 2. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu-'il code pour le polypeptide selon la revendication 1. 3. Fragment d'ADN selon la revendication 2-, caractérisé en ce qu'il comporte en outre la séquence d'un promoteur de spiroplasmg fonctionnel chez les bactéries. 4. Fragment d'ADN selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il s'hybride aux ADN des spiroplasmes et autres mollicutes. 5. Fragment -d'ADN selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est obtenu par action de S'endonucléase de restriction Hind III sur 1'ADN de Spiroplasma citri. 6. Plasmide recombinant caractérisé en ce qu'il comporte un fragment d'ADN de spiroplasme selon l'une quelconque des revendications 2 à 5. 7. Plasmide recombinant caractérisé en ce qutil est obtenu à partir du vecteur plasmidique pBR 328 et du fragment d'ADN selon l'-une des revendications 2 à 5 par action de l'endonucléase de restriction Hind III. 8. Microorganisme, en particulier E. cote caractérisé en ce qu'il contient l'information génétique pour la biosynthèse du polypeptide selon la revendication i. 9. Bactérie selon la revendication 8, ca ractérisée en ce qu'un plasmide selon l'une des revendications 6 ou 7 y a été introduit. 10. Microorganisine selon la revendica tion.8, caractérisé en ce que le fragment d'ADN selon l'une des revendications 2 à 5 y a Xtd introduit par transforma- tion avec un plasmide selon la revendication 6 ou parunautre vecteur. 11. Souche d' Escherichia coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganis- mes de l'Institut Pasteur sous le N 1-311. 12. Plasmide selon la revendication 6,dénommée pES caractérisé en ce qu'il figure dans la souche d' richia coli selon la revendication 11. 13. Fragment d'ADN selon l'une des revendilations 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est indu au site Hind III dans le plasmide recombinant selon la revendication 12. 14. Sonde pour. la détection de spiroplasmes et autres mollicutes caractérisée en ce qu'elle contient un fragment d'ADN selon l'une quelconque-des revendications 2 à 5 ou 13. 15. Procédé de préparation d'une bacté rie- selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste à- - 10) traiter le plasmide pBR328 par 1' endonucléase de restriction Hind III, - 20) isoler l'ADN de Spiroplasma Ce et le traiter par ladite endonuclé ase, - 30) lier les différents fragments d'ADN formés-au plasmide linéarisé pour obtenir des plasmides recombinants, - 40) introduire par transformation ces plasmides recombinants dans E.coli - 50) cultiver les bactéries et sélec tionner celles ayant incorporé le plasmide recombinant et présentant les caractères immunogéniques de la spiraline. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la-mise en évidence des bactéries contenant le fragment d'ADN codant pour la spiraline selon l'une des revendications 2 à 5 est réalisée par fixation sur antigène immobilisé et révélation par un conjugué immunoenzymatique. 17. Procédé de préparation du fragment d ADN selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu;un plasmide selon l'une des revendications 6 et 7 et 11 est traité par l endonucléase de restriction Hind III et le fragment polynucléotidique isolé par une méthode connue. 18. Procédé d'obtention d'un polypeptide selon la revendication 1,caractérisé en ce qu'on cultive de manière connue les microorganismes selon l'une queiconque des revendications 8 à li pour en isoler ledit polypeptide.