Brevet FR2572736A1 — publié le 19860509

RETROVIRUS ASSOCIE AUX LYM4PHADENOPATHIES ET ADAPTE A DES LIGNEES CONTINUES DE CELLULES LYMPHOBLASTOIDES B, CAPABLES DE PRODUIRE EN CONTINU LEDIT RETROVIRUS ET PROCEDE POUR LEUR OBTENTION L'invention concerne un rétrovirus associé aux lymphadénopathies, ci-après dénommé rétrovirus LAV (abré- viation de l'expression anglaise "Lymphadenopathy Asso- ciated Virus") ce rétrovirus étant adapté à des lympho- cytes B et capable d'être produit en continu par des lignées continues de cellules lymphablastoides B poussant en suspension. Elle est plus particulièrement relative à des lignées continues de cellules lymphablastoides B capables de répliquer un rétrovirus ayant les caractéris- tiques antigéniques du virus LAV et à un procédé de pro- duction de telles lignées cellulaires. L'invention concerne naturellement encore les extraits susceptibles d'être obtenus à partir de tels virus, plus particulièrement ceux qui sont susceptibles d'être reconnus par les sérums de patients affectés par le syndrome d'immuno-déficience acquise (SIDA) ou par des syndromes mettant en jeu des lymphadénopathies, ou d'au- tres signes précurseurs du SIDA, ci-après désignés par l'abréviation SLA. De ce fait elle concerne toutes les applications possibles de ce virus et de ces extraits, notamment celles destinées à la détection de la présence de ce virus dans des échantillons biologiques, et plus particulièrement au diagnostic in vitro des SLA et du SIDA. Le SIDA est une affection qui s'est récemment dé- veloppée dans plusieurs pays. Il a été constaté que le SIDA était souvent accompagné ou précédé de syndromes lymphadénopathiquesreconnaissables, à l'occasion de l'étude histologique des nodules lymphatiques à des patients qui en sont affectés. Ces lymphadénopathies précèdent ou peut- être constituent une forme moins grave de la maladie, qui,dans son stade final,se manifeste par un effondrement des défenses immunitaires du sujet accompagné par l'apparition d'un sarcome de Kaposi ou des infections opportunistes. L'isolement d'un rétrovirus considéré comme l'a- gent étiologique majeur du SIDA et des SLA a été décrit par S. BARRESINOUSSI et Coll. dans un article intitulé "Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrom (AIDS)", Science 220, 868-70 (1983). Ce rétrovirus a été isolé à partir d'une culture de lymphocytes T obtenue à partir d'un nodule lymphatique d'un homosexuel présentant un SLA. Des isolats de virus ont, depuis, été isolés à partir de nodules lymphatiques obtenus à partir d'autres personnes souffrant du SIDA, parmi lesquelles un hémophile B. On rappellera ci-après les caractéristiques principales de ce rétrovirus: - les cibles préférées de ce rétrovirus sont constituées par des lymphocytes T, plus particulièrement des cellules Leu-3, - il se manifeste par une activité de réverse 2+ transcriptase dépendante de la présence d'ions Mg2+, cette réverse transcriptase possédant une forte affinité pour des poly-(adénylate-oligodéoxy thymidilate) /poly(A)- oligo(dT) 12-11 - il a un diamètre moyen de 139 nanomètres et il possède un noyau ayant un diamètre excentrique moyen de 41 nanomètres, - il induit la production dans les cellules qu'il infecte d'une protéine virale p25, ayant un poids molé-- culaire de l'ordre de 25 000, cette protéine p25 n'étant pas reconnue par des anticorps préalablement formés contre la protéine p24, isolée dans des conditions analo- gues à partir de cellules infectées par un virus du type HTLV [human T cell Leukemia virus décrit dans"Journal of National Cancer Institute", 1982, vol. 69 N 6 par Gallo et Reitz et dans "Cold Spring Harbour Laboratories",1984, Human T cell Leukemia Lymphoma virus, par Gallo, Essex et Gross7 plus particulièrement HTLV1 et HTLV2 - il présente une faible homologie antigénique avec le virus de l'anémie infectieuse du cheval (VAIC), en ce que les anticorps formés contre ce dernier virus immuno-précipitent la susdite protéine p25 du virus LAV, - il présente une densité de l'ordre de 1, 16 dans un gradient de sucrose. Il a également été montré dans l'article mention- né plus haut que le virus pouvait être propagé dans des cultures de lymphocytes T provenant de préférence d'un donneur adulte sain ou d'un cordon ombilical. Les condi- tions dans lesquelles les lymphocytes peuvent être in- fectés ont été décrites dans l'article sus-mentionné. Avantageusement cette infection se fait en présence d'un sérum anti-4 interféron humain. La production de virus, appréciée grace à son activité réverse-transcriptase, débute en général entre le 9ème et le 15ème jour suivant la date de l'infection et se poursuit pendant une durée de 10 à 15 jours. Des échantillons représentatifs des deux rétro- virus LAV ont été déposés à la CNCM le 15 septembre 1983 sous les Nos 1-240 et 1-241 respectivement. Ceci étant, une des difficultés qui n'a pu être surmontée jusqu'à ce jour réside dans la difficulté de répliquer le rétrovirus LAV en quantités importantes dans des lymphocytes T. En effet aucune lignée permanente de cellules productrices en continu du virus LAV n'a été isolée. La production de virus LAV n'est que transitoire et ceux-ci finissent par tuer l'hôte cellulaire, de sorte que la production de nouvelles doses de virus est chaque fois tributaire de cultures fraîches de lymphoctyes T. Enfin la réplication efficace in vitro du virus implique la présence dans le milieu de culture d'un facteur de croissance coûteux, connu sous la désignation TCGF (abré- viation de l'expression anglaise "T cell growth factor") ou également appelé interleukine II. L'invention a pour but de remédier à ces dif- cultés, en particulier de fournir des lignées cellulaires à la fois permanentes directement infectables par un rétro- virus possèdant les caractéristiques immunologiques es- sentielles du virus LAV et possédant en outre la capa- cité d'infecter directement lesdites lignées cellulaires et,par conséquent,de permettre la production importante de ce nouveau rétrovirus, en vue d'études scientifiques et médicales complémentaires et, en particulier, de la mise au point de nécessaires ou "kits" de diagnostics in vitro dans des conditions économiques acceptables. L'invention découle des découvertes que le rétro- virus LAV n'a pas d'effet cytopathogène notable à l'égard des lymphocytes B et que les lymphocytes B peuvent être transformés en lignées cellulaires permanentes suscepti- bles d'être infectées par un virus ci-après dénommé B-LAV, et de produire ce virus qui présente les caractéristiques antigéniques essentielles-du virus LAV, dans des cultures en suspension, et ce en l'absence du facteur de croissance TCGF. L'invention concerne plus particulièrement des lignées continues de cellules lymphoblastoides B carac- térisées par leur capacité à être infectées par le virus ou par un isolat de ce rétrovirus et à répliquer ce rétro- virus de façon continue. Plus particulièrement encore elles sont directement infectables par un virus ou isolat de virus ayant les caractéristiques antigéniques essen- tielles du rétrovirus LAV, ce rétrovirus ayant au préa- lable été adapté à des lymphocytes B,éventuellement en présence de lymphocytes T. Plus particulièrement, l'inven- tion concerne des lignées permanentes de cellules lympho- blastoldes B,cont le patrimoine génétique comprend au moins une partie de celui du virus d'gpstein-Barr (EBV). Mais l'invention n'est pas limitée à ce type de lignée de cellules lymphoblastoîdes B. D'autres lignées peuvent être utilisées, par exemple des lignées de cellules déri- vées du lymphome de Burkitt, lesquelles peuvent être rendues capables de répliquer le susdit rétrovirus. L'invention concerne également un procédé de production desdites lignées continues de cellules lymphoblas- toides B aptes à produire en continu le susdit rétrovirus, ce procédé étant caractérisé par le fait aue ces lignées continues sont infectées avec un rétrovirus LAV préalable- ment adapté à la fois à des lymphocytes T et à des lympho- cytes B. Des lignées continues de cellules lymphoblastoï- des B particulièrement préférées sont celles oui ont été obtenues par la culture de lymphocytes B, éventuellement en présence de lymphocytes T, en présence d'un agent de transformation blastique et d'une souche de rétrovirus LAV, infectante pour des lymphocytes T. Avantageusement l'agent de transformation blastique est constitué par le virus d'Epstein-Barr (EBV). On obtient ainsi des lignées conti- nues de cellules lymphoblasto!des B, rendues capables de répliquer un rétrovirus ayant les caractéristiques anti- géniques essentielles du virus LAV. De surcroît ces lignées se sont révélées non-tumorigènes, notamment à l'occasion de leur inoculation à des souris NUDE. Dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour produire des lignées continues de cellules de lymphoblastoides B, on réalise une co-culture de lympho- cytes B et de lymphocytes T, d'un même donneur, en présence du virus EBV dans des conditions autorisant l'infection des lymphocytes B par le virus EBV, de préférence en présence encore d'un activateur favorisant la transformation blasti- que des lymphocytes B, et en présence de virus LAV dans des conditions autorisant normalement l'infection des lympho- cytes T. Un activateur préféré est constitué par la pro- téine A de Staphylococcus Aureus. Naturellement tout autre type d'activateur conduisant aux mêmes résultats peut être utilisé. La protéine A peut être remplacée par d'autres mitogènes, par exemple des lectines, l'agent mitogène tel que celui connu sous l'expression "Pook-weed mitogen". Bien entendu l'invention n'est pas limitée à l'utilisation de EBV pour induire la transformation des lymphocytes B en lignées lymphablastoïdes B "immortelles", en tous les cas capables de se reproduire à travers un grand nombre de générations (au moins 60 générations) dans un milieu de culture approprié. L' EBV peut être remplacé par d'autres ADNs transformants oncogènes, tels que les ènes connus sous les désignations "Myc" "Erb", etc.. De préférence l'infection des lymphocytes B par l'agent blastique approprié, en présence des lymphocytes T, pour transformer les premiers en une lignée de cellules lymphoblastoides, précède la réalisation d'au moins une opération d'infection du mélange avec une souche de virus LAV. Les lymphocytes B mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être constitués par tout type de cellules lymphoïdes B originaires du sang ou de tissus lympho!des contenant des lymphocytes B, par exemple ceux obtenus à partir de moelle osseuse, de la rate, des gan- clions lymphatiques, etc. Dans ce qui précède il a également été indiqué que les lymphocytes B doivent de préférence provenir du même donneur que les lymphocytes T ayant servi à propager le virus. L'adaptation du virus LAV au lymphocyte B est réalisée par propagation en plusieurs passages, de préfé- rence de 8 à 10 passages du virus LAV dans des cultures successives de lymphocytes sains B et Ten mélange, obtenus à partir du même individu sain. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit de réalisations particulières de lignées de cellules lymphoblastoides B productrices d'un rétrovirus ayant les propriétés antigéniques du rétrovirus LAV, même s'il dif- fère de ce dernier par un certain nombre de propriétés nouvellement acquises et dont il sera question plus loin. L'invention concerne enfin les ratrovirus adaptés B-LAV qui peuvent être obtenus par le procédé selon l'invention, ces rétrovirus possédant, outre les propriétés antigèniques caractéristiques du rétrovirus LAV, la capa- cité d'infecter des lignées continues de cellules lympho- blastoides B résultant notamment de la transformation blas- tique dans les conditions telles que décrites plus haut, de lymphocytes B préalablement adaptés des lymphocytes T, en présence d'un agent de transformation blastique tel que le virus EBV ou encore des lignées continues de cellules d'autres lymphomes B, tels que le lymphome de Burkitt. Des suches virales répondant à ces caractéristiques ont été déposées à la collection nationale des cultures de micro- organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris sous les mêmes numéros et aux dates qui seront indiquées plus loin. Certaines souches virales préférées de l'invention se caractérisent également par une densité un peu plus élevée que celle des souches de Virus LAV décrites par F. BARRE SINOUSSI et Coll, notamment de l'ordre de 1,18 dans un gradient de sucrose. L'intérêt de disposer de telles souches est mani- feste.Il permet l'infection directe de lignées continues de lymphoblastoldes B en vue de la production de quantités. importantes de virus. Ceci constitue-la matière première pour la production d'extraits de rétrovirus reconnaissa- bles par des sérums de patients affectés par le SIDA ou le SLA, notamment en vue du diagnostic in vitro de ces affections, par exemple dans les conditions qui seront indiquées plus loin à titre d'exemple. A ce titre l'inven- tion concerne plus particulièrement les extraits de ces rétrovirus qui contiennent la protéine p25, directement reconnaissable par les sérums des susdits patients. L'in- vention s'étend naturellement également aux nécessaires ou "kits" pour le diagnostic in vitro des susdites affections, comprenant à titre de constituant principal des extraits de rétrovirus B-LAV. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la discussion qui suit des techniques qui peuvent être mises en oeuvre pour accéder aussi bien à des lignées de cellules lymphoblastoides B qui peuvent être rendues capables de produire en continu un virus ayant les caractéristiques antigèniques du rétrovirus LAV ainsi que les souches virales en question. Le virus isolé à partir de lymphocytes T d'un patient atteint de lymphadénopathie fut d'abord propagé dans des lymphocytes de cordon ombilical, puis dans des lymphocytes de plusieurs donneurs adultes. Il avait au préalable été vérifié que les sérums de ces donneurs ne contenaient pas d'anticorps actifs contre le virus LAV et que leurs lymphocytes n'étaient pas aptes à libérer spon- tanément du virus LAV après activation, dans les conditions qui ont été décrites par BARRE-SINOUSSI et Coll. Les lymphocytes d'un donneur particulier désigné par les initiales FR sont choisis en raison de leur capa- cité à produire après infection des quantités élevées et régulières de virus LAV. Mais comme indiqué plus haut la production de virus LAV était dans tous les cas temporaire, puisque suivie par une réduction, puis une interruption de la production de virus et finalement de la mort des cultures cellulaires. La production de lignées de cellules lymphoblas- todes B susceptibles de produire le virus de façon conti- nue dans des cultures en suspension, a été effectuée dans les conditions suivantes. Il est entendu que les conditions de culture, puis d'infection, correspondent à celles qui ont été indiquées dans l'article de S. BARRE SINOUSSI et Coll. mentionné plus haut. Les lymphocytes complets (lymphocytes B et T en mélange) ont été d'abord stimulés pendant 24 heures avec de la protéine A, puis infectés avec une souche de virus EBV, dérivée d'un carcinome nasopharyngé (souche M 81 décrit dans B.J.A.B B 95-8 Int J. Cancer 1976 vol.17 p.161). Cinq jours plus tard, la moitié de la culture a été infec- tée avec le virus LAV dans les conditions décrites par BARRE SINOUSSI et Coll. puis divisée en deux sous-cultures C1 et C2. La culture des cellules provenant de la sous- culture C1 fut introduite dans un milieu dépourvu d'un facteur de croissance spécifique des lymphocytes T, en par- ticulier du facteur TCGF. Au contraire les cellules de la sous-culture C2 furent cultivées dans un milieu contenant le facteur TCGF. Les cultures furent maintenues par addition de milieu tous les trois jours et changement complet de milieu chaque semaine. Comme prévu, les cultures stimulées par le facteur de croissance TCGF produisirent du virus LAV détecté grâce à l'apparition d'une activité de transcriptase réverse dans le milieu entre le 12ème jour (c'est à dire le 6ème jour après le début de l'infection par le virus LAV) et le 21ème jour. Au contraire aucune activité de transcriptase réverse ne fut obervée dans les cultures des cellules pro- venant de la sous-culture C1 en l'absence du facteur TCGF. Il était ainsi clairement établi qu'à ce stade le virus LAV n'avait été produit en quantité détectable que par les lymphocytes T activés et en présence du facteur de crois- sance TCGF, et ce en l'absence de production détectable de virus par les lymphocytes B. Le 19ème jour, au moment de l'apparition d'un déclin de la production du virus LAV, une partie C'2 de la culture provenant de la sous-culture C2, fut mise en contact avec des lymphocytes T d'une culture fraîche de lymphocytes T qui avait été obtenue à partir du même donneur et qui avait été activée au préalable pendant trois jours &vec de la phyto- hémaglutinine,et ce dans le but de fournir des cibles nou- velles pour le virus et relancer l'infection virale. Huit jours plus tard (25ème jour) on observe effectivement l'ap- parition d'un nouveau type de transcriptase réverse. Cepen- dant contrairement aux observations faites au cours de la première infection, la production ne s'arrêta plus. Après certaines variations quantitatives de la production au cours du temps on observa un accroissement et une stabili- sation de l'activité transcriptase réverse (supérieure à 000 coups par minute/ml surnageant). Le virus produit fut ensuite extrait à partir des cultures cellulaires dans les conditions décrites dans l'article de BARRE SINOUSSI et Coll. mentionné plus haut. On notera qu'au moment de la relance de l'infection par le virus LAV, l'apparition de cellules transformées par EBV et de plus grandes dimensions avait été observée tant dans les cultures issues des sous-cultures C1 que dans cel- les issues des sous-cultures C2. Cette observation témoi- gnait de ce que "l'immortalisation" des cellules B sous l'action de EBV s'était déjà produite. Il restait à déter- miner si la production continue de rétrovirus LAV (ou d'un rétrovirus en possédant les caractéristiques-antigéniques essentielles) pouvait être attribuée à une survie prolongée des cellules infectées T en présence de la lignée de cel- lules lymphoblastoldes obtenues par transformation des lymphocytes B par EBV, ou au contraire à ces dernières. C'est pour faire la discrimination nécessaire entre ces deux possi- bilités que la culture témoin des cellules de la sous-culture C1 fut à son tour infectée par le virus obtenu à partir de la culture C'2 (en fait à partir du surnageant congelé au jour 25 de la culture C'2) et maintenue en l'absence de TCGF. Dans un tel milieu les population de cellules T éventuellement pré- sentes ne pouvaient que décliner rapidement, ce qui fut d'ailleurs vérifié par l'absence de réaction avec des anti- corps monoclonaux commercialisés sous la marque OKT4 par la société ORTHO, cette absence de réaction témoignant donc de l'absence d'un phénotype caractérisque des lymphocytes T. En conséquence la sous-culture productrice du virus était essentiellement constituée de cellules lymphoblastoldes B. Il peut raisonnablement être inféré des observations pré- cédentes que la nouvelle propriété acquise par les virus produits par la sous-culture C'2 a résulté de l'adaptation du virus aix lymphocytes B contenus dans le mélange de lymphocytes qui avait été obtenu à partir du donneur FR, avant la réalisation des essais de co-infection.En effet il a été observé que des souches de virus LAV obtenues après les tout premiers passages dans les lymphocytes de FR n'étaient pas aptes à infecter la lignée de lymphoblastoide B issue de la sous-culture C. Au contraire la culture virale LAV obtenue après 10 passages sur le mélange de lymphocytes de FR est apte à réaliser la susdite infection. D'autres lignées cel- lulaires de cellules lymphoblastoides B ont pu étre infectées dans des conditions semblables Il est vrai que l'infection n'a pu être réalisée dans toutes les lignées de cellules lymphoblastoides B testées. Le tableau I qui suit témoigne cependant de ce que sur 14 lignées testées, 5 se sont révélées productrices. Il en découle pour l'homme du métier la conclusion,naturelle dans ce domaine,aue -l'obtention d'une production continue de virus à partir d'au moins une lignée de cellules lymphoblastoidesB, soit naturelle, soit induite partir de lymphocytes B dans les conditions qui ont été indiquées plus haut, n'impliquera des essais d'infection que sur un nombre limité de lignées de cellules lymphoblastoides B, soit induites à partir de lymphocytes B, soit "naturelles". La nécessité de répéter les essais d'infection sur des li- gnées différentes en nombre limité relève de la routine pour le spécialiste du domaine technique concerné. C'est ce dont témoignent les résultats apparais- sant dans le tableau et obtenus par des essais d'infection in vitro avec LAV B, de différentes lignées cellulaires de lymphoblastoides B produites à partir de lymphocytes obtenus à partir d'adultes ou de cordons ombilicaux préalablement infectés avec des souches de EBV NPC (M 81) ou (B 95/8). Les résultats témoignent de ce que des productions;de virus LAV ont été obtenues à partir de cellules lymphoblastoides B obtenues à partir d'une culture de lymphocytes de cordon ombilical (LCo),à partir de lymphocytes d'un autre donneur BAR (c'est à dire à partir de cultures de lymphocytes issus de deux donneurs sur quatre). Il est à remarquer que le virus B-LAV dérivé de la lignée cellulaire lymphoblasto[de B du donneur FR est apparu plus rapidement et sous un titre plus élevé, ce résultat suggérant que la souche virale B-LAV avait bien subi une adaptation secondaire aux cellules B, après son passage dans le mélange initial de lymphocytes de FR. D'autres lignées cellulaires obtenues à partir de cellules lymphoblastoides B (naturelles), notamment de lignées cancéreuses présentant certains des phénotypes des lymphocytes B, ont également été testées pour leur suscep- tibilité à l'infection par les virus LAV et B-LAV. Seule la souche BJAB (non infectée au préalable par EBV) a été infec- tée par B-LAV après une période prolongée de 30 jours. Au contraire la même souche n'a pas pu être infectée dans les mêmes conditions par la souche LAV initiale. Cependant,la transformation in vitro préalable de la même lignée cellu- laire avec la souche B 95/8 de EBV a permis une potentia- lisation de la production ultérieure par la même lignée de virus LAV-B. En effet on a constaté un rendement de production de virus B-LAV de 2 à 3 fois plus élevée que dans le cas de la lignée BJAB décrite dans Biomedicine 1975, vol. 2 22, p. 276, non préalablement transformée par EBV. Certes le tableau fait apparaître que d'autres lignées cellulaires "naturelles" n'ont pu être affectées. Mais il est tout à fait remarquable que celles des lignées cellulaires qui se sont révélées produire le virus B-LAV le faisaient en l'absence de tout facteur de croissance, qu'il soit spécifique des lymphocytes T ou des lymphocytes B. Les résultats sont résumés dans le tableau qui suit: T A B L E A U Lignées de Origine Présence Retro- Croissance CNCM cellules du génome virus de B-LAV EBV LAV FR 8 lymphocytes B oui ++ ++ 1-303 d'un donneur adulte BAR " " oui + ++ BRA " " oui - - DIER " " oui - - LCo lymphocyte B oui + ++ 1-302 de cordon ombilical LC1 " " oui - - Daudi lymphome de oui - - Burkitt Namalwa " " oui - - Raji " " oui - - Chev " " oui - - BJAB " " non - + 1-300 BJAB/B95/8 " " oui - ++ 1-301 MOLT/4 T-lymphome non - - HL60 Leucémie non - - myéloide Les lignées cellulaires suivantes ont fait l'objet de dépôts à la CNCM, le 9 mai 1984 sous les Nos sus-indiqués. Le virus B-LAV lui- nmame a été déposé à la CNCM à la même date sous le N 1-299. Les souches de virus B-LAV peuvent être isolées à partir des surnageants des cultures cellulaires qui l'ont re- produit et peuvent ensuite être à nouveau propagées dans d'au- tres lignées cellulaires de cellules lymphoblastoides B, dès lors que leur capacité à produire le virus aura été reconnue. Bien que le B-LAV ne montre pas d'effets cytopathogènes sur les lignées du type B, il est préférable d'ajouter périodique- r:ent environ 50% de nouvelles cellules non infectées quand la production virale commence à décliner (environ tous les deux mois). 2S72736 L'analyse des caractéristiques morphologiques et immunologiques des souches B-LAV a conduit à la conclu- sion qu'elles possèdent toutes les caractéristiques des souches LAV initialement mises en oeuvre et qui ont été définies dans l'article de S. BARRE SINOUSSI et Coll. Elles présentent en outre la caractéristique de pouvoir infecter les susdites lionees de cellules lymphoblastoides B. Certaines de ces souches, en particulier celles obtenues à partir du donneur FR 8 se sont révélées présenter une densité un peu plus élevée que la souche initiale (1,18 au lieu de 1, 17 dans un gradient de glucose). L'examen plus détaillé des lignées productrices de cellules lymphoblastoides B confirme l'appartenance aux lignées B. Ces cellules présentent les marqueurs carac- téristiques des lymphocytes B (immunoglobulines specifiaues présentes à la surface). Les cellules obtenues à partir de lymphocytes B infectés avec EBV se sont toutes révélées posséder l'antigène EBNA (abréviation de l'expression anglaise "Epstein-Barr nuclear antigen"). Une expression de l'antigène précoce (EA) a pu être observée dans 0,1% des cellules de la lignée LCo et dans 3,5% des lignées FR 8. Aucune des cellules de la lignée NCo n'a produit de réponse positive dans le test de détection de l'antigène de capside virale. Cet antigène était cependant présent dans 1,5% des cellules de la lignée FR 8. En ce qui concerne enfin les différentes prépa- rations de virus B-LAV, il a été constaté que leurs acides nucléiques respectifs ne conduisaient à aucune hybridation avec des sondes d'ADN contenant le fragment G codant pour l'antigène précoce EA (abréviation de l'expression anglaise "early antigen") dans les essais réalisés sur filtre de cel- lulose. Il en résulte que les préparations obtenues de rétrovirus ne témoignaient pas d'une contamination détectable par le génome du virus EBV-. L'invention concerne enfin un Drocédé de diagnostic in vitro de SLA ou de SIDA, ce procédé comprenant la mise en contact d'un sérum ou autre milieu biologique provenant d'un patient présumé pouvoir être affecté et la détection de la réaction immunologique éventuellement produite. Des modes de mise en oeuvre préférés de ce procédé * mettent en jeu des essais immunoenzymatiques ou immuno- fluorescents, notamment selon la technique ELISA.. En consé- quen.ce l'invention est également relative à des extraits viraux pourvus d'un marqueur, par exemple un marqueur enzy- matique, fluorescent, radioactif, etc. Les essais de diagnostic pourront comprendre les opérations suivantes: - dépôts de quantités déterminées d'un extrait conforme à l'invention dans les godets d'une microplaque pour titration; - introduction dans ces godets de dilutions crois- santes du sérum soumis au diagnostic; - incubation de la microplaque; lavagE poussés de la microplaque; - introduction dans les godets de la microplaque d'anticorps marqués et dirigés contre des immunoglobulines de sang, le marquage étant de préférence réalisé par une enzyme susceptible d'hydrolyser un.substrat, l'hydrolyse mettant en jeu une modification de l'absorption par ledit substrat de certaines bandes de longueur d'ondes déterminées et - détection, de préférence par.comparaison avec des témoins, de la quantité de substrat hydrolysé, la mesure obtenue conduisant à une appréciation du risque auquel est exposé le patient ou de la-présence effective de la maladie. En conséquence l'invention concerne également des nécessaires ou "kits" pour réaliser le susdit diagnostic in vitro, ces nécessaires comprenant: un extrait ou une fraction davantage-purifiée du virus B-LAV, cet extrait et cette fraction étant marqués, par exemple par un marqueur radioactif, enzymatique, ou immunofluorescent; - des anti- immunoglobulines humaines ou de la protéine A (avantageusement fixéessur un support insoluble dans l'eau, par exemple des billes d'agarose); - un extrait lymohocytaire obtenu à partir d'un donneur sain; - des tampons et si nécessaire des substrats pour permettre la visualisation du marqueur. On décrira encore ci-après à titre d'exemple seu- lement, des constitutions préférées des réactifs pouvant être utilisés pour le diagnostic in vitro et les conditions de leur mise en oeuvre. Principe de la méthode Ce test ELISA est mis en route pour la détection et le titrage des anticorps sériques anti-rétrovirus type LAV. Il est réalisé par un test de compétition entre un antigène viral (cultivé sur cellules lymphoblastoides B) et un antigène témoin constitué par un lysat des mêmes cellules non infectées. La fixation des anticorps sur les deux antigènes est révélée par l'utilisation d' une antiglobuline humaine marquée par une enzyme, ellemême révélée par l'addition d'un substrat correspondant. Préparation d' antigène viral Les cultures cellulaires utilisées sont des cellules lymphoblastoldes B d'origine humaine, infectées avec B-LAV dans les conditions sus-indiquées. On utilise le surnageant des cellules infectées par le virus. Il est concentré par précipitation au PEG 10%, puri- fié successivement sur gradients de saccharose (20 à 60 ) par ultra- centrifugation à l'équilibre. Les fractions virales sont récoltées et concentrées par centrifugation = 50.000 RPM pendant 60 minutes. Le culot des virus est repris dans un volume minimum de tampon NTE pH = 7,4 (Tris 0,015 M-NaCl 0,1M - EDTA 1 milli- Molaire). La concentration protéique est déterminée par la méthode de Lowry. Le virus est ensuite lysé par un tampon RIPA + SDS (0,5% final) pendant 15 minutes à 37 C. Le tampon RIPA est décrit dans Sciences 1983, vol. 220, page 868 - 871. On peut utiliser pour la lyse du virus la variante suivante: solution de 1% de TRITON x 100 et de 0,1% de dësoxycholate de sodium en tampon RIPA, préparée sans SDS. la méthode de Lowry. Le virus est ensuite lysé par un tampon RIPA + SDS (0,5% final) pendant 15 minutes à 37 C. Préparation de l'antigène témoin - Les cellules lymphoblastoides B en culture, mais non infectées, selon les conditions précédentes depuis 5 à 10 jours, sont centrifugées à faible vitesse et lysées dans le tampon RIPA en présence de 5 % du composé commercialisé sous la marque ZYMOFREN (Spécial) soit 500 U/ml. Après un séjour de 15 minutes à 4 C avec fréquentes agitations dans le dis- positif d'agitation violente connu sous la désignation VORTEX, le lysat est centrifugé à 10.000 tours/minute. Le surnageant constitue l'antigène témoin. On mesure sa concentration en protéines par la méthode de Lowry. Réactifs 1 - Plaques = NUNC - sp ciales ELISA contrôlées 2 - Tampon PBS: pH = 7,5 3 - Agent mouillant commercialisé sous la marque TWEEN 20 03NA2 = 0,2 M 4 - Tampon carbonate: pH = 9,6 CO3HN = 0,2 M L3 a - Sérum de veau non foetal: conservé congelé (Biopro) 6 - Sérum d'albumine bovine (BSA) SIGMA (fraction V) 7 - Anti IgG humaines (H + L) marquees à la peroxydase de l'Institut Pasteur = flacons de 1 ml - conservation à +4 C 8 - Tampon de lavage = tampon PBS pH 7,5 + 0,05% TWEEN 20 Dilution du conjugué = à la dilution indiquée en tampon PBS + TWEEN 20 (0,05%) + Albumine bovine 0,5 g pour 100 ml. 9 - Tampon dilution des sérums = tampon PBS + 0,05% TWEEN 20 - Substrat = EPO citrate trisodique (C6H5Na403, 2H20) (Merk) -I 0,05 M * tampon citrate pH = 5,6 acide citrique (C6H807,1H20) (Merk) 0,05 M eau oxygénée = à 30% (110 volumes) - utilisée à 0,03% au moment de l'emploi en tampon citrate. * ortho-phénylène-diamine: SIGMA. mg pour 25 ml tampon - A diluer en tampon citrate extenroranément. Préparation des plaques On utilise des plaques 96 godets à fond U (NUNC = ELISA). Elles comprennent 12 colonnes, respectivement de 8 godets, numérotées de 1 à 12. La répartition des antigènes est faite dans les conditions suivantes: 100 el de l'antigène viral dilué en tampon carbonate pH = 9,6 sont déposés dans chaque godet des colonnes: i - 2 - 5 - 6 - 9 - 10 Les godets de ces colonnes sont ci-après désignés sous sous l'expression "godets +". - - De même 100 1ul de l'antigène témoin dilué en tamNon carbo- nate pH = 9, 6 sont déposés dans les godets des colonnes: 3 - 4 - 7 - 8 - 11 - 12 Les godets de ces dernières colonnes sont ci-après désignés par l'expression "godets -". La dilution de l'antigène viral est titrée à chaque production virale. Plusieurs dilutions d'antigène viral sont testées en fonction de témoins positifs et négatifs connus (à plusieurs dilutions) et en fonction de l'anti-IgG hu- maines, marquees à la peroxydase, testées aussi à plusieurs dilutions. En règle générale, la concentration protéique de la préparation est de 5 à 2,5 ug/ml. La même concentration protéique est utilisée pour l'antigène témoin. Les plaques sont fermées à l'aide d'un couvercle de plastique et sont incubées une nuit à +4 C. Elles sont ensuite mises une fois en eau distil- lée puis bien essorées. Les godets sont alors remplis de 300 p1 de sérum de veau foetal à 20% en tampon PBS. L'incubation dure 2 heures à 37 C (plaques couvertes). Les plaques sont lavées 3 fois en tampon PBS + TWEEN 20, 0,05% = PBS-tw. ler lavage 300 l l 2ème et 3ème lavages 200 pl/godet. Les plaques essorées, puis scellées avec film de plastique adhésif peuvent être conservées à -80 C. Réaction ELISA = Recherche en titrage d'anticorps Après décongélation,les. plaques sont lavées 3 fois en PBS- tw. Elles sont essorées et séchées. Les sérums témoins positifs, négatifs, ainsi que les sérums testés sont dilués en tubes au préalable, en PBS-tW 0,05% Albumine bovine à 0,5%. La dilution choisie est le 1/40. - 100 p1 de chaque sérum sont déposés en double sur l'antigène viral et en double sur l'antigène témoin. - de même pour les sérums positifs et négatifs dilués. - 100 al de PBS + TWEEN + albumine bovine sont déposés de même dans 2 "godets + " et 2"godets - "pour constituer le témoin conjugué. Les plaques munies de leur couvercle sont incubées lh30 à 37 C. Elles sont lavées 4 fois en PBS = TWEEN 0,05% - 100 p1 d'anti-IgG humaines (marquées à la péro- xydase) à la dilution choisie, sont déposées dans chaque godet et incubés à 37 C. Les plaques sont à nouveau lavées 5 fois au PBS + TWEEN. Elles sont essorées et séchées. La révélation de la réaction enzymatique sera ef- fectuée à l'aide d'un substrat ortho-phénylène-diamine (0,05% en tampon citrate pH 5,6 contenant 0,03% H202). ul de substrat sont répartis dans chaque godet. Les plaques sont mises au noir 20 minutes à la température du laboratoire. Lecture au spectrophotomètre (pour microplaques à 492 nm. Sont considérés comme des sérums possédant des anticorps contre ce virus ceux auxauels correspondent des différences de densité optique (entre la densité optique de l'antigène viral et la densité optique de l'antigène témoin) supérieures ou égales à 0,30%. Cette technique permet un dosage qualitatif, mais aussi quantitatif. Pour cela, on peut, soit effectuer des dilutions du sérum à tester, soit comparer une dilution du sérum à une gamme de témoins testés, dans les mêmes conditions. ) RÉPUBLIQUE FRAN AISE 2 572 737 INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE PARIS Ce numéro n'a donné lieu a aucune publication ILn N u. REVENDICATIONS 1 Lignées continues de cellules lymphoblastoides B caractérisées par leur capacité à produire en continu un rétrovirus ayant les caractéristiques antigéniques essentiel- les du virus LAV, lorsqu'elles ont au préalable été infectées avec le virus ou avec un isolat de ce rétrovirus. 2 - Lignées de cellules lymphoblastoides B continues, caractérisées en ce qu'elles sont directement infectables par un virus ou isolat de virus ayant les caractéristiques antigéniques essentielles du rétrovirus LAV, ce rétrovirus ayant au préalable été adapté à des lymphocytes B en pré- sence de lymphocytes T. 3 - Lignées selon la revendication 1 ou la revendi- cation 2, caractérisées par leur absence de tumorigénicité dans des souris NUDE. 4 - Lignées selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisées par le fait qu'elles comportent au moins une partie du patrimoine génétique du virus d'Epstein Barr. - Lignées selon la revendication ou la revendi- cation 2, caractérisées par le fait qu'elles sont dérivées d'un lymphome de Burkitt. 6 - Procédé de production de lignées continues de cellules lymphoblastoldes B, aptes à produire en continu un rétrovirus ayant les caractéristiques antigéniques es- sentielles du rétrovirus LAV, caractérisé par le fait que ces lignées continues sont infectées avec un rétrovirus B-LAV préalablement adapté à la fois à des lymphocytes T et à des lymphocytes B. 7 -Procédé selon la revendication 8 caractérisé par le fait que les lignées continues de cellules lymphoblas- toïdes B mises en oeuvre ont été obtenues par la culture de lymphocytes B préalablement adaptés à des lymphocytes T, en présence d'un agent de transformation blastique des lymphoctyes B et d'une souche de rétrovirus LAV infectante pour les lymphocytes T. 8 - Procédé selon la revendication 6 ou selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'agent de transforma- tion blastique est constitué par le virus d'Epstein-Barr. 9 - Procédé selon la revendication 7 ou la reven- dication 8 caractérisé en ce que l'infection des lymphocytes B par l'agent blastique a précédé l'infection des lymphocytes T par le virus LAV. - Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la lignée continue de cellules lymphoblastoides B est constituée par une lignée de cellules d'un lymphome de Burkitt, le cas échéant lui-même transformé par le génome du virus de Epstein-Barr. 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 6 à 10, caractérisé en ce que les lignées continues de cellules de lymphoblastoides B ont été obtenues par co- culture de lymphocytes B adaptés aux lymphocytes T, d'une part, et de lymphocytes T, d'autre part, et en presence du virus de Epstein-Barr dans des conditions autorisant l'infection des lymphocytes B et en présence encore d'un activateur favori- sant la transformation blastique des lymphocytes B. 12 - Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la susdite co-culture est réalisée en présence d'un activateur, tel qu'une protéine A de Staphylococcus aureus. 13 - Rétrovirus ou isolat de ce rétrovirus, qui ont les propriétés antigéniques essentielles d'un rétrovirus T-lymphotropique, isolable à partir de sérums de patients affectés par le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) ou par un syndrome mettant en jeu des lymphadénopathies (SLA), ce rétrovirus possédant l'ensemble des propriétés biolo- giques suivantes: - les cibles préférées de ce rétrovirus sont cons- tituées par des lymphocytes T, notamment des cellules Leu-3, - il se manifeste par une activité de réverse trans- 2+ criptase dépendante de la présence d'ions Mg, cette réser- ve transcriptase possédant une forte affinité pour des poly- (adénylate-oligodéoxy-thymidylate) fipoly(A)-oligo(dT)2î 12-18/ -23 _ il a un diamètre excentrique de 139 nanomètres et il possède un noyau ayant un diamètre moyen de 41 nanomètres, - il induit la production dans les cellules qu'il infecte d'une protéine virale p25, ayant un poids molécu- laire de l'ordre de 25 000, cette protéine p25 n'étant pas reconnue par des anticorps préalablement formés contre la protéine p24, isolée dans des conditions analogues à partir de cellules infectées par un virus du type HTLV, - il présente une faible homologie antigénique avec le virus de l'anémie infectieuse du cheval (VAIC), en ce que les anticorps formés contre ce dernier virus immuno-pré- cipite la susdite protéine p25 du virus LAV, ce rétrovirus étant plus particulièrement carac- térisé par son adpatation aux lymphocytes B et par sa capa- cité à infecter des lignées continues de cellules lymphoblas- toEdes B, telles que celles résultant de la transformation Plastique des lymphocytes B, préalablement adaptés à des lymphocytes T, en présence d'un agent de transformation blastique tel que le virus d'Epstein-Barr, ou des lignées continues de cellules d'un lymphome de Burkitt. 14 - Rétrovirus selon la revendication 13, carac- térisé par sa capacité à infecter des lignées continues de lymphoblastoides B, du type de celles qui ont été déposées à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris, sous les Nos 1-300, 1-301; 1-302 et 1-303. - Rétrovirus selon la revendication 13 ou la revendication 14 caractérisé en ce qu'il présente une densité de l'ordre de 1,18 dans un gradient de saccharose 16 - Application du rétrovirus obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou du rétrovirus selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, à la production d'extraits de rétrovirus reconnais- sables par des sérums de patients affectés par le SIDA ou les SLA., notamment en vue du diagnostic in-vitro de ces affections. 17 - Extraits du rétrovirus obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, cet 24- extrait contenant la susdite protéine p25. 18 - Nécessaire ou "kit" pour le diagnostic in vitro du SIDA ou de LAS comprenant à titre de constituant principal un extrait conforme à la revendication 17.