Brevet FR2566799A1 — publié le 19860103

1' La présente invention concerne un nouveau gène de la 8-urogastrone, les plasmides recombinents correspondants, les transformants correspondants et leur préparation ainsi que celle de la 13-urogastrone. La B-urogastrone est une hormone polypeptidique synthétisée dans les glandes salivaires de l'homme, etc (cf, p. ex., Heitz et coll., Gut, 19, 408-413 (1978)), elle a une structure primaire constituée de 53 acides aminés dans la séquence suivante (cf H. Gregory et coll., Int. 3. Peptide Protein Res., 9, 107-118 (1977)). Asn Set Asp Set Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp.Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Dans la description, les acides aminés sont représentés par les symboles suivants: Asn: asparagine Set'r. sérine Asp: acide aspartique Glu: acide glutamique Cys: cystéine Pro: proline Leu: leucine His: histidine Gly: glycine Tyr: tyrosine Val: valine Met: méthionine lie: isoleucine Ala: alanine LVs: lysine Gln: glutamine Arg: arginine Trp: tryptophane Ph: phénylalaninn. y La [3-urogastrone a des activités physiologiques comme la suppression de la sécrétion d'acide gastrique et la promotion de la croissance cellulaire (cf Elder et coll., Gut, 16, 887-893 (1975)) et est donc utile pour traiter les - ulcères et les blessures. Comme la 13-urogastrone est excrétée à de faibles quantités dans l'urine humaine, le composé est actuellement préparé à partir de l'urine par extraction, séparation et purification. Cependant, ce procédé pose des problèmes tels qu'on ne peut facilement obtenir de grandes quantités du composé car le composé est un composant mineur de l'urine humaine. D'un autre côté, le demande de brevet européen publiée sous le No 0046039 décrit un essai pour produire la r3-urogastrone par une technique d'ingénierie génétique avec utilisation d'un gène de 13-urogastrone synthétique. Cependant, la publication ci-dessus décrit le gène synthétique ayant une séquence nucléotidique spécifique mais ne dit pas s'il y a d'autres gènes qui sont capables d'exprimer la 13-urogastrone par un procédé analogue, ni ne mentionne un tel gène d'une séquence nucléotidique particulière. Un grand nombre de séquences nucléotidiques peuvent coder pour la séquence d'acides aminés-de la 13-urogastrone. Cependant, il est difficile de savoir lequel de ces gènes est capable d'exprimer la 13- urogastrone par une technique de génie génétique ou quel gène convient le mieux pour l'appli- cation de techniques d'ingénierie génétique. Ainsi, de nombreuses expériences et de nombreux efforts inventifs sont requis pour déterminer la séquence nucléotidique la plus appropriée. Un objet de l'invention est de fournir un nouveau gène de 13-urogastrone qui est entièrement différent du gène décrit dans la publication cidessus dans la séquence nucléotidique et qui est capable d'exprimer la 13urogastrone par des techniques d'ingénierie (ou génie) génétique. Un autre objet de l'invention est de fournir un gène qui est approprié à l'expressionde la [3-urogastrone par des techniques de génie génétique. Un autre objet de l'invention est de fournir de nouveaux plasmides recombinants et transformants correspondant au nouveau gène de 13urogastrone. L'invention a encore comme autre objet de fournir un procédé qui permet la production en quantité de 13-urogastrone avec une pureté élevée avec utilisation du nouveau gène par des techniques de génie génétique. Ces objets de l'invention ainsi que d'autres apparaîtront d'après la description qui suit. On a conduit de nombreuses expériences et trouvé qu'un gène 1 de la séquence nucléotidique suivante répond aux objets de l'invention. GOne 1: - ' A A T A G G CG A-T T C T G A G T G-C C C-A C T G 3' T T A T C G C T A A G A C T C A C G G G T G-A C T C T C A C G A T G G C T A T T G T: C T G C A C A A G G T G C T A C C G AT A A C A G A-C G T G G A C G G T G T T T G C A T G TA C A T C G. A A CTG C C A C AA A C G T A C A T G T A G CTT G C T T T G G A T AAA T A C G C G T G T AAC C G A A A C C T A T T T A-T G C G C A-C A T T G T G T GT A G T G -G GT T A T A T C G G T G A A ACA C A T C A C C C A AT A T A G -CCA- CT T C G C T G T C AA T-A C C GT G A T C T G AA A GCG ACA GTT ATG C A C TA GAG TTT T GG T G G G AA T T G CGT 3' A C C A C C C T T AA C G C A 5' Les lettres représentent les bases purine ou pyrimidine formant la séquence de- nucléotides. Les symboles utilisés ici pour les bases représentent ce qui suit: A l'adénine, G la guanine, C la cytosine et T la thymine. Le gène I est entièrement nouveau et non-évident en lui-même et s'obtient en déterminant la séquence de nucléotidés spécifiée à partir d'un - très grand nombre de séquences-de nucleotides possibles. - - Le gène I a les caractéristiques suivantes.: (1) La 13-urogastrone peut être exprimée très avantageusement par des:techniques de génie génétique. (2) Les codons trinucléotidiques connstituant le gène I sont tous acceptables - pour les cellules hôtes, en particulier Escherichia coli (E.:coli) que l'on peut facilement se procurer, assurant donc un haut degré d'expression. (3) Des sites spécifiques de reconnaissance d'enzyme de restriction peuvent être fournis dans le gène et à ses deux extrémités, et les sites peuvent être manipulés comme on le désire pour faciliter la ligation avec un autre - gène et l'insertion dans le vecteur plasmide.. (4) Pour la préparation du gène 1, les oligonucléotides constituants peuvent être liés en blocs et les blocs peuvent être facilement liés en sous-unités de la manière envisagée, substantiellement sans ligation non désirée. (5) En exprimant la B-urogastrone comme protléine fusionnée, on dispose d'un moyen par lequel on peut facilement enlever une fraction non nécessaire pour obtenir la B-urogastrone désirée. Lorsque la B-urogastrone doit être exprimée effectivement avec utilisation du gène I, des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction peuvent être fournis à l'extrémité avant et/ou l'extrémité arrière du gène en vue de la ligation avec le promoteur, la séquence de Shine-Dalgarno (appelée ci-dessous 'séquence SD"), le vecteur, etc, nécessaire pour l'expression. En outre, si nécessaire, on peut fournir un codon départ et/ou un codon arrêt en amont et en aval du gène, respectivement. Les sites de reconnaissance. le codon départ et le codon arrêt ne sont pas limités en particulier mais peuvent être ceux qui sont désirés. On donne ci-dessous un exemple de gène ayant une séquence agrandie (appelé ci-dessous "gène Il") qui comprend un site de reconnaissanco d'enzyme de restriction et un codon départ disposés en amont du gène I et un codon arrêt et un site de reconnaissance d'enzyme de restriction disposés en aval du:gène l, les sites et les codons étant disposés dans l'ordre mentionné, le gène II incluant en outre d'autres sites de rp.rnnnnaissance d'enzyme de restriction.- Gène II: Codon départ -15 - -1, 1 ' AA T TCG A A G A T C T G C A T GI A -A T A G C 3 | Cl T T C iA C G- T AIC T T A. STC G E Ta Bg(S) Mb -. 20 30 GA T T C T G A G T G C C C ACT T C T C A C C T A G A C T C A C G G G T G A C A G A G T G Hf 50 G A T G G C T A T T G T C T G C A C G A C G G T C T A C C G A T A A C A G A C G T G-C T G CC A C bO Ou uE E" VU E9 Uc,oOUOc.cOUOzU c) ooo op _ ol t1. ó. _ O.Cc.4)HE-4 ó C 1E. F4H cnCCD U Oqvo r-c E- CD 'Livt)ó-'8ó Ek z a-4 C) c. E4O' Lt.'rH H OU ' OD F E-44:óEsPzo ó,_ E-f%DuotQ Pd-I- uacatO - o'o 4 OU ' L'lnvention n'est pas limitée au gène I et au gène II mais comprend également d'autres gênes qui y sont substantiellement identiques dans la séquence de nucléotides et qui sont capables d'exprimer la B-urogastrone. Dans la préparation par synthèse du gène I ou 11, il est avantageux de construire le gêne I ou II comme divisé en la moitié avant et la moitié I arrière. Ainsi, Il est possible de préparer une sous-unité avant la moitié avant de la séquence de nucléotides du gène I ou II et une autre sous-unité ayant la moitié arrière de sa séquence de nucléotides tel qu'il est divisé approximativement à sa moitié et de réunir ces deux sousunités du gène I ou Il ensemble dans le gêne I ou 11. La sous-unité ayant la moitié avant de la séquence de nucléotides du gène II peut en outre avoir un site de reconnaissance d'enzyme de restriction à l'extrémité arrière, et une autre sous-unité ayant la moitié arrière de la séquence de nucléotides du gène II peut avoir un site de reconnaissance d'enzyme de restriction à l'extrémité avant, et ces sous-unités sont réunies ensemble dans le gène II. Autrement dit de façon plus spécifique dans des buts de précision, la première sous-unité peut être une sous-unité A comprenant la moitié avant du gène Il et ayant un site de reconnaissance d'enzyme de restriction (BamHI) fourni à son extrémité arrière, et la dernière sous-unité peut être une sous-unité B comprenant la moitié arrière du gène II qui a un site de reconnaissance d'enzyme de restriction (HindIli) à son extrémité avant. Ces sous-unités sont présentées ci-dessous. Sous-unité A: ' A A T T C G A AG AT C T G C AT G A AT A G C 3' G C TT C T A G A C G T A C TT A T CG G A T T C T G A G T G C C C A C T G T C T C A C CT A AG A CT C ACG G G T G A C A G A GT G GAT G G C T A T T G-T CT G C A C G A C G GT CT A C C G AT A A C A GA C G T G CT G C C A G T TT G C A T G T.A C A T C G A A G C T T C G CAA A C G T A C A T G T A G C T T CG A AG C 3' CTA G 5' 25667=99 7 - Sous-unité B: ' A G C T T T G G A T A A A T'A C G C G T G T 3' A AC C T A T T T AT G C G C A C A A A C T G T G TA G T G G G T T T A TT C GG T T T G A C A C AT C A C CC A A T A -T A:G C C A G AA C G C T GT C AA TA C C G T G AT C T G CT T G C G A CA GT T AT G G C A C T A G A-C A A A T G G T G G A A T TG C-G T T A A- T'A G T T T A C C A CC C T T A A C G C A A --T T A T C TGA AGA T CT G 3' ACT T C T AG A C C T A'G 5' : - i - ' On synthétise les sous-unités A et B, par exemple,-de-la façon suivante. On synthétise des oligonucléotides ayant 11, 13 ou 15 bases (A-i à A-16, et B-1 à B-16, c'est-à-dire 32 oligonucléotides). Ensuite, on assemble 4 à 6 de ces oligonucléotides et on les lie en blocs (bloc 1 à-bloc.7, c'est-à-' dire 7 blocs). Ces oligonucléotides et blocs sont-présentés cidessous.: cc CJ%P E-i-i - C,Or-4 C.) Ln ói- ' -ó D E4f- ri óE(f- -r---- -- I ci ó cIó CKZ Eq Cc óC)Oó ')Q OHD E-4 HE lcI C) siH D óó OHn C0 CDO. I F4-C:>I óO I:OH OqE óóCc)óC>c>cc>co>Oa:l --r-i-- 7-4--7---dr-Et---C Cr-I- -cr-4-- -C.)Eqóó' -CI. C- uH -óóE-4 --C.D n ci w H ciQón ó4 ac CEóC)OhQb-E4^ n O crvoó Eq4 Ici D ó cnó tnC CVLn óEai-cnacqco ^óEq-Eqó -Eq ó d CJ- -C) O- ó Eq- -CD V) Ensuite, on lie ensemble les blocs 1 à 3 en la sous-unité A, et on lie ensemble les blocs 4 à 7 en la sous-unité B. L'invention sera décrite plus en détail avec référence aux dessins et photos joints. La f g. 1 représente schématiquement la synthèse d'un oligonucleotide par le procédé en phase solide; La fig. 2 représente un procédé pour lier les oligonucléotides A- 1 à A-16 en une sous-unité A et introduire la sous-unité dans un plasmide pBR322 dérivé d'E.coli pour obtenir un plasmide recombinant pUGl; La fig. 3 montre un procédé analogue pour préparer un plasmide recombinant pUG2 en introduisant une sous-unité B dans un plasmide pBP322; La fig. 4 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pUG3 à partir de pUG1 et pUG2; La fig. 5 montre le résultat obtenu en analysant la séquence de nucléotides de l'oligonucléotide A-3 par fractionnement bidimensionnel par électrophorèse et homochromatographie; La fig. 6 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pGH37; La fig. 7 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pGH35; La fig. 8 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pEK28; La fig. 9 montre des procédés pour préparer les plasmides recombinants pUG102 à pUG122 et les plasmides recombinants pUG103-E et pUG117-E; La fig. 10 montre des procédés pour préparer les plasmides recombi- nants pBRH02 et pBRH03; La fig. 11 montre la carte de restriction MbolI de pUG3 y compris le fragment H (179 pb) qui contient le présent gène de B-urogastrone; La fig. 12 montre un procédé pour préparer les plasmides recombinants pUG2301 à pUG2303; La fig. 13 montre un procédé pour préparer les plasmides recombinants pUG2101 à pUG2105; La fig. 14 montre un procédé pour préparer les plasmides recombinants pUG2701 à pUG2703; La fig. 15 montre un procédé pour préparer les Plasmides recombinants pUG1102 et pUG1105; La fig. 16 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pUG1004; La fig. 17 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pUG1201; La fig. 18 montre un procédé pour préparer un plasmide recombinant pUG1301; et Les photos 1 à 5 montrent respectivement les résultats analytiques de séquences de nucléotides de plasmides recombinants obtenus dans l'exemple par le procédé de Maxam-Gilbert. Les procédés eux-mêmes pour construire le gène Il de l'invention sont connus. On peut préparer les oligonucléotides pour construire le gène Il par des procédés connus, p. ex. par le procédé en phase solide qui sera décrit brièvement ci-dessous (cf p. ex. H. Ito et coll., Nucleic Acids Research, , 1755-1769 (1982)). Lorsqu'on a recours au procédé en phase solide, on synthétise l'oligo- nucléotide comme le montre la fig. 1 en couplant successivement des mono- nucléotides ou des dinucléotides avec un nucléoside sur support de résine de polystyrène pour obtenir une séquence prédéterminée de nucléotides. On peut préparer la résine support de nucléoside, par exemple, avec utilisation d'une résine de polystyrène partiellement réticulée en faisant réagir du N-(chlorométhyl)-phtalimide avec la résine, en faisant réagir de l'hydrazine avec le produit pour obtenir une résine de polystyrène amino- méthylée, et en liant à son groupe amino un nucléoside ayant son groupe hydroxyle 5' libre et le groupe amino protégé, enutilisant l'acide succinique comme espaceur. D'un autre côté, on connaît divers procédés pour préparer des mononucléotides ou des dinucléotides (cf p. ex. C. Broka et coil., Nucleic Acids Research, 8, 5461-5471 (1980)). Ainsi, on peut préparer un mononucléotide en faisant réagir du o-chlorophénylphosphorodichloridate, du triazole et un nucléoside ayant son groupe 5' hydroxyle protégé avec un groupe diméthoxy- trityle (DMTr) en présence de triéthylamine, puis en faisant-réagir le mono- triazolide obtenu avec du B13-cyanoéthanol en présence de 1méthylimidazole comme catalyseur, et en éluant le produit de la réaction avec du chloroforme- 1,1 = méthanol par chromatographie sur colonne sur gel de silice, Ce procédé donne un mononucléotide complètement protégé.: On peut préparer un dinucléotide en traitant le mononucléotide complètement protégé obtenu ci-dessus avec de l'acide benzènesulfonique ou un acide analogue pour donner le mononucléotide avec le groupe 5' hydroxyle libre, que l'on fait réagir avec le monotriazolide obtenu ci-dessus, et en àluant le produit de la réaction avec du chloroforme-méthanol par chiromato- graphie sur colonne sur gel de silice. Ce procédé donne un dinucléotide complètement protégé.: La synthèse en phase solide des oligonucléotides est conduite-avanta- geusement en utilisant un synthétiseur d'ADN qui est., p. ex., disponible sous la forme du synthétiseur d'ADN de Bachem Inc., Etats-LUnis. La résine supportant le nucléoside obtenue ci-dessus est mise dans un vase à réaction et lavée avec du dichlorométhane-isopropanol, et on ajoute à la résine une -solution de bromure de zinc dans le dichlorométhaneisopropanol pour enlever le groupe diméthoxytrityle en position 5'. On répète ce procédé plusieurs fois jusqu'à ce que la couleur de la solution disparaisse. On lave la résine avec du dichlorométhane-isopropanol puis avec une solution d'acétate de triéthyl- ammonium dans le diméthylformamide (DMF) pour enlever le Zn 2+ restant, puis on lave avec du tétrahydrofuranne (THF) et on expose à un courant d'azote gazeux pendant plusieurs minutes aux fins de séchage-Séparément, on dissout le dinucléotide ou mononucléotide complètement protégé dans la pyridine puis on ajoute de la triéthylamine, et on agite la-solution obtenue, puis on la laisse reposer à la température ambiante (TA) pendant plusieurs heures puis on fait évaporer à pression réduite. On dissout le sel de triéth/y- triéthylammonium résultant dans la pyridine et on le fait évaporer de façon azéotropique plusieurs fois en utilisant de la pyridine aux fins de séchage. - On dissout le sel de nucléotide dans une solution de mésitylènesulfonyl- -nitrotriazole (MSNT, réactif de condensation) dans la pyridine. On ajoute la solution obtenue à la résine séchée et on laisse reposer à- la TA. On enlève la fraction liquide du mélange réactionnel, et on lave -la: fraction résine avec de la pyridine puis on la fait réagir avec de l'anhydride acétique en -. utilisant de la diméthylaminopyridine comme catalyseur dans le THF-pyridine pour masquer le groupe hydroxyle n'ayant pas réagi. Enfin on lave la résine avec de la pyridine pour compléter un cycle de synthèse en phase solide. i 2 ULin cycle étend la séquence de nucléotides d'une ou deux longueurs de chaîne. On répète le procédé ci-dessus pour coupler des mononucléotides ou des dinucléotides successivement avec la résine à la longueur désirée, grâce à quoi on peut obtenir un oligonucléotide complètement protégé tel que supporté sur la résine. A la résine obtenue on ajoute une solution de tétraméthylguanidine- 2-pyridinealdoximate dans la pyridine-eau, et on laisse le mélange reposer en chauffant. On sépare alors la résine par filtration et on la lave avec de la pyridine et de l'éthanol alternativement. On combine les eaux de lavage - et le filtrat et on concentre à pression réduite. On dissout le concentré dans une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), puis on lave à l'éther. On soumet la solution aqueuse à une chromatographie sur colonne de Sephadex G-50 en utilisant une solution de TEAB comme éluant. On recueille les fractions et on mesure la densité optique de chaque fraction à 260 nm. On concentre une fraction incluant le premier pic d'éluat. On purifie le concentré, par exemple, par chromatographie en phase-liquide à haute vitesse jusqu'à obtention d'un seul pic. L'oligonucléotide ainsi obtenu a toujours son extrémité 5' protégée par un groupe diméthoxytrityle, si bien qu'on traite le produit avec une solution aqueuse d'acide acétique pour enlever le groupe protecteur, suivie à nouveau par une chromatographie en phase liquide à haute vitesse ou un procédé analogue pour la purification jusqu'à obtention d'un seul pic. On prépare les oligonucléotides désirés par le procédé décrit ci- dessus puis on vérifie individuellement la séquence de nucléotides par un procédé de fractionnement bidimensionnel en utilisant une électrophorèse et une homochromatographie et (ou) le procédé de Maxam-Gilbert puis on les utilise pour préparer les blocs et sous-unités. Le procédé de fractionnement bidimensionnel pour vérifier la séquence de nucléotides peut être conduit par le procédé de Wu et coll. (E. Jay, R. A. Bambara, R. Padmanabhan et R. Wu, Nucleic Acids Res. 1, 331 (1974)). Pour pratiquer ce procédé, on dissout l'oligonucléotide tel que lyophilisé dans l'eau distillée à une concentration d'environ 0,1 ig/2l. On traite une fraction de cette solution avec,_32 P-ATP et la T4polynucléotide- kinase pour marquer l'extrémité 5' avec P puis on digère patiellement avec de la phosphodiestérase de venin de serpent. On répartit le produit en gouttes sur une pellicule d'acétate de-cellulose et on le soumet à une électrophorèse pour le premier développement dimensionnel pour séparer le produit selon la différence de bases. On transfère alors les produits développés sur une plaque de diéthylaminoéthyl-cellulose (DEAE cellulose) et. on les soumet au second développement dimensionnel en utilisant une solution d'ARN partiellement hydrolysé appelée un homomélange. (Ce procédé est appelé homochromatographie). De cette manière, on sépare i'oligonu- cléotide selon la longueur de la chaîne. Ensuite, on lit la séquence de nucléotides de l'oligonucléotide par autoradiographie en partant de l'extrémité 5'. S'il est difficile de vérifier la séquence par ce procédé, on a recours au procédé de Maxam-Gilbert si nécessaire. (A.M. Maxam et W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., UJSA, 74, 560 (1977), A.M. Maxam et W. Gilbert, Methods in Enzymol., Vol. 65, p 499, Academic Press 1980). Ce procédé, qui est également appelé un procédé de décomposition chimique, emploie une réaction spécifique à une base particulière pour cliver l'oligonucléotide à la position de la base, et les bandes révélées-par électro- phorèse servent à lire la séquence à partir de l'extrémité 5' ou 3'. Les réactions spécifiques de bases sont les suivantes. La guanine est spécifiquement mé- thylée par le diméthylsulfate. La guanine et l'adénine subissent une réaction de dépurination en présence d'un acide. La thymine et la cytosine réagissent toutes deux avec l'hydrazine à une faible concentration de sel, mais la cytosine ne réagit qu'avec l'hydrazine à une concentration élevée de sel. Après la fin des réactions pour les quatre bases, on fait réagir chaque mélange réac- tionnel avec de la pipéridine pour déplacer la base à noyau ouvert et pour catalyser la 13-élimination des deux phosphates à partir du sucre, et enfin on clive le brin d'ADN à cette base. On soumet les mélanges réactionnels obtenus à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide respectivement pour confirmer la séquence de nucléotides selon celle des réactions qui produit chaque bande. Ensuite, on lie les oligonucléotides en utilisant une T4 ADN ligase comme on le voit dans la figure 2. Pour la ligation correcte, on lie les 16 oligonucléotides A-1 à A-16 correspondant à la sous-unité A divisés en trois ensembles, à savoir le bloc 1 comprenant A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 et A- 16, le bloc 2 comprenantA-4, A-5, A-6, A-11, A-12 et A-13, et le bloc 3 comprenant A-7, A-8, A-9 et A-10 comme on le voit dans la fig. 2. Par électrophorèse on obtient les blocs 1 à 3 ayant les séquences correctes et on les lie plus avant en la sous-unité A. Autrement dit de façon plus spécifique, on marque certaines des extrémités 5' des 16 nucléotides A-1 à A-16 avec 32 p en utilisant e_32 P-ATP et la T4 polynucléotidekinase, et on phosphoryle les groupes hydroxyle des extrémités 5' restantes avec de l'ATP. Pour former chacun des trois blocs, on assemble les oligonucléotides et on les lie en utilisant de la T4 ADN ligase, et on électrophorèse le produit sur gel de polvacrylamide pour isoler le bloc désiré. On lie les trois blocs ainsi obtenus avec utilisation de T4 ADN ligase pour produire la sous-unité A. Bien qu'on puisse produire une structure de dimère dans la réaction de iigation, elle se clive facilement avec les enzymes de restriction EcoRI et BamHI pour obtenir la sous-unité A. Ensuite, comme on le voit dans la fig. 2, on clive un vecteur plasmide connu, pBR322, qui est dérivé d'E. coli et facilement disponible, avec EcoRI et BamHI, et on insère la sous-unité A dans le vecteur pour obtenir un plasmide recombinant pUG 1. On suit également le même procédé que ci-dessus pour la sous- unité B. Comme dans le cas de la sous-unité A, les 16 oligonucléotides B- 1 à B-16 sont liés divisés en 4 ensembles comme on le voit dans la fig. 3, et on lie les blocs ensemble pour produire la sous-unité B. Le dimère, s'il est produit, est clivé avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI pour obtenir la sous-unité B. On clive un vecteur plasmide, pBR322, avec HindIII et BamHI, et on insère la sous-unité B dans le vecteur pour obtenir un plasmide recombinant pULG2 comme on le voit dans la fig. 3. En outre comme on le voit dans la fig. 4, on clive pUG1 avec les enzymes de restriction HindII et SaII, et on insère un fragment enlevé de pUG2 avec utilisation des mêmes enzymes de restriction dans pUG1 pour préparer un plasmide recombinant pUG3 ayant un gène de structure de B-urogastrone (gène II). pUG1, pUG2 et pUG3 sont des plasmides recombinants qui comprennent chacun pBR322 et la sous-unté A qui est la moitié avant du gène de structure de B-urogastrone, la sous-unité B qui est la moitié arrière du gène, ou le gène de structure entier. On peut faire proliférer ces plasmides recombinants en grandes quantités en les introduisant dans un hôte, comme la souche HB101 d'E. coli qui est connue et facilement disponible selon le procédé -2566799 du calcium comme procédé de transformation (E. Lederberg et S. Cohen, 3. Bacteriol., 119, 1072 (1974)).: On peut vérifier si pUG1, pUG2 et pUG3 sont présents dans l'hôte comme la souche HB101 d'E. coli par les procédés suivants. Après avoir recueilli les plasmides par le procédé d'extraction alcaline, on vérifie dans pUG1 et pUG2 la présence du site de reconnaissance de BglI qui n'est pas présent sur le vecteur pBR322. De même, on vérifie si pUG2 et pUG3 peuvent être clivés avec MluI qui n'est pas présent sur pBR 32-2. Selon le procédé d'extraction alcaline on fait incuber E. col abritant le plasmide, on recueille alors les cellules,.et on y fait agir le lysozyme pour dissoudre la paroi cellulaire. On utilise un mélange d'hydroxyde de sodium et de Iaurylsulfate de sodium pour rompre la cellule puis dénaturer l'ADN, qu'on neutralise alors avec un tampon d'acétate de sodium. A ce moment, l'ADN chromosomique reste dénaturé, mais le plasmide, qui est un ADN extra- chromosomique, rétablit la forme à deux brins initiale. On recueille les plasmides en utilisant ces caractéristiques. On soumet ensuite les plasmides à une ultracentrifugation à gradient de-densité avec du chlorure de-césium et - du bromure d'éthidium aux fins de purification puis on les fait passer àtravers une colonne de Biogel A 50m pour enlever l'ARN. On peut ainsi obtenir des plasmides avec une-pureté élevée en grande quantité. De cette manière, on peut obtenir le gène de B-urogastrone de l'invention (gène II). - Ensuite,- on décrira le procédé d'introduction du gène-de la 13-uro- gastrone dans les-cellules hôtes. -: Les cellules hôtes à utiliser dans l'invention ne sont pas limitées particulièrement eton peut utiliser n'importe lesquelles de celles qui sont connues, p. ex. celles d'E. coli, Bacillus, Pseudomonas, les levures, etc,- parmi lesquelles on préfère les cellules d'E. coli.: Les modes d'expression du gène de la 13-urogastrone avec utilisation d'E. coli comprennent un système pour exprimer directement la 13-urogastrone, et un système o elle est exprimée sous forme de protéine fusionnée avec la B-lactamase ou une autre protéine différente. Pour l'expression directe du gène de la 13-urogastrone, il est nécessaire d'introduire dans le piasmde;;nt e; mnt du èn de la R-.ir-qast.rnnp. un promoteur et une séquence SD. Tandis que le promoteur n'est pas limité particulièrement, les promoteurs souhaitables sont ceux qui assurent un haut degré d'expression, comme AP qui est le promoteur de la partie gauche L du phage ?, lac UV5 qui est présent en amont du gène de la Bgalactosidase d'E. coli, etc. Lorsqu'on utilise. P comme promoteur, la séquence SD n'est pas limitée particulièrement, mais il est souhaitable d'utiliser la séquence -à 4 bases de AGGA. En out re lorsqu'on utilise lac UV5 comme promoteur, il est souhaitable d'utiliser la séquence SD qui se trouve en aval du promoteur lac UV5 ou celle qui est synthétisée chimiquement. Le système pour exprimer directement le gène de la B-urogastrone sera décrit avec référence au cas o l'on utilise le gène àPL -séquence SD-13urogastrone. -10 Bien que ÀPL soit un puissant promoteur -(J. Hedgpeth et coll., L Molecular and General Genetics, 163, 197-203 (1978)), le promoteur PL pleinement activé produit des effets léthaux sur la cellule hôte d'E.. coli, si bien qu'il faut faire proliférer la cellule dans des conditions dépourvues de toute action léthale puis faire fonctionner le 3L. D'un autr.e côté, C1857 qui L est un gène dans le phage X est un des gènes mutés 'de répresseur CI qui agit sur l'opérateur pour PL. A basse température (jusqu'à environ 30 C), L le répresseur CI857 se lie à l'opérateur pour inhiber complètement l'activité de P comme promoteur, par conséquent permettant la prolifération d'E. L coli. On laisse donc les cellules hôtes proliférer dans cet état puis on les amène à une température élevée (non inférieure à 37 C), grâce à quoi le XPL peut fonctionner. En outre, les vecteurs plasmides, comme pSC101 qui est connu et facilement disponible, ayant un mécanisme de réplication strict, et ceux comme pBR322 qui ont un mécanisme de réplication relâché ne sont pas incompatibles les uns avec les autres mais peuvent coexister dans'la même cellule d'E. coli. Il est donc approprié de construire un plasmide recombinant pGH37 o l'onincorpore un gène CI857 dans un vecteur plasmide résistant à la tétra- cycline pSC101 (avec le promoteur lac UV5 fourni en son amont pour l'expression efficace de CI857) comme on le voit dans la fig. 6 et pour introduire le plasmide recombinant dans E. coli (souche H8101) afin d'obtenir un transformant (souche ECI-2) pour application comme hôte pour le vecteur pour exprimer la B-uro- * gastrone. sous le contrôle du promoteur à PL Selon l'invention, on introduit le gène PL-séquence SD-B-urogastrone, p. ex;, dans pBR322 pour obtenir un vecteur exprimant la B-urogastrone; qu35 i est utilisé pour transformer l souche ECI-2, grâce quoi il estfourni qu'i est utilisé pour transf-ormner la souche ECI-2, grâce à quoi il est.fourni ce qu'on appelle un système à deux plasmides o deux plasmides utiles coexistent dans une cellule d'E. coli. Dans ce système, le répresseur C1857 encodé par pGH37 se lie à l'opérateur pour le promoteur)PL sur le second plasmide lorsque la cellule est cultivée p. ex. à 30 C, permettant la prolifération de la cellule. Lorsque la cellule a pleinement proliféré dans cet état, on élève la température p; ex. à 40 C, après quoi on dissocie le répresseur CI857 de l'opérateur, permettant l'activité du promoteur; P pour l'expression de la Burogastrone. L Bien qu'un concept analogue soit appliqué à l'expression de l'interféron de fibroblaste, l'antigène SV-40 Small t, etc, dans ces cas on utilise un lysogène comme hôte dans lequel on introduit l'ADN du phage j portant un gène CI857 dans le chromosome hôte (R. Derynck et coll., Nature, 287, 193-197 (1980), C. Derom et coll., Gene, 17, 45-54 (1982), K. K pper et coll., Nature, 289, 555- 559 (1981). Cependant, avec le système de l'invention, le gène Cl857 est introduit- dans un plasmide différent qui est résistant à la tétracycline. Les avantages du présent système sont donc qu'il n'est pas vraisemblable que le phage Xintroduit dans le chromosome hôte soit induit à proliférer et que la souche peut être contrôlée facilement. Naturellement, le système à deux plasmides est utilisé pour la première fois pour les systèmes pour exprimer la 1urogastrone. Selon un autre système, une fraction de n'importe quel autre gène de protéine comme le gène de -la B-lactamase est liée au gène de la Burogastrone pour exprimer le gène de la 3-urogastrone sous la forme d'une protéine fusionnée. L'avantage de ce procédé est que la protéine fusionnée est moins exposée à la décomposition par la protéase dans l'E. coli pour fournir par conséquent une protection pour la 8-urogastrone. Un autre avantage est que la protéine fusionnée migre vers le cytoplasme de la cellule d'E. coli ets'y accumule (S.J. Chan et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., USAS, 78, 5401- 5405 (1981)), est localement présente et est donc facile à séparer et à purifier. Autrement dit de façon plus spécifique, un gène codant pour deux acides aminés basiques qui peuvent fournir un site de clivage pour enlever la Burogastrone de la protéine fusionnée par clivage avec une enzyme est inséré dans le gène de la B-lactamase à un site approprié de clivage d'enzyme de restriction, et un gène de 13-urogastrone est lié au gène de la Blactamase. De préférence la séquence de deux acides aminés basiques est -Lys-Arg- ou -Arg-Lys-. Comme exemples d'enzymes pour reconnaître la séquence d'acides aminés pour cliver la B-urogastrone d'avec la protéine fusionnée on peut citer la kallicréine, la trypsine, etc. Comme exemples d'enzymes de restriction pour cliver le gène de la B-lactamase on peut citer XmnI, HincI], ScaI, PvuI, Pstl, Bgl1, BanI, etc. Le plasmide recombinant 13lactamase-B-urogastrone ainsi préparé peut exprimer une protéine fusionnée dans E. coli pour une production en quantité. On traite la protéine fusionnée résultante avec la kallicréine ou une substance analogue, grâce à quoi on peut obtenir la B-urogastrone. On peut vérifier le système d'expression en analysant directement la séquence de nucléotides du gène par le procédé de MAxam-Gilbert, en confirmant l'insertion du gène et sa direction par le procédé de la mini- préparation ou d'établissement d'une carte (H.C. Birnboim et coll., Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)), ou par radioimmunodosage pour la B- urogastrone. Le transformant de l'invention ainsi obtenu est cultivé par le procédé habituel, grâce à quoi on peut recueillir la B-urogastrone avec une pureté élevée en grande quantité. L'invention sera décrite ci-dessous plus en détail avec référence à l'exemple suivant auquel l'invention ne se limite en aucune manière. EXEMPLE 1) Préparation d'une résine supportant un nucléoside. On prépare diverses résines supportant des nucléosides par le procédé suivant. On mélange une certaine quantité de résine de polystyrène réticulée "S-XI" à 1% en poids (produit de BIO-RAD Laboratories, USA, 0, 074 à 0,043 mm d'ouverture de maille) avec 2,41 g de N-(chlorométhyl)phtalimide, 0,22 ml d'acide trifluuorométhanesulfonique et 50 ml de dichlorométhane en agitant à la TA pendant 2 h. Après la fin de la réaction, on filtre la résine, on la lave successivement avec du dichiorométhane, de l'éthanol eL du mei,id,'ui, on sèche à pression réduite puis on fait refluer avec 50 ml de solution à % en poids d'hydrazine dans l'éthanol pendant la nuit en chauffant. On filtre la résine et on la lave avec de l'éthanol, du dichlorométhane et du méthanol successivement puis on sèche à pression réduite. On laisse reposer 2:566799 pendant la nuit à la TA le mélange de résine, polystyrène aminméthylée (2, 5 g) obtenu par le procédé ci-dessus, 0,75 mM d'ester de l'acide mônosuccinique du 5'-o-diméthoxytritylnucl1oside, 1,23 mM de dicyclohexylcarbodiimide et 1 mM de diméthylaminopyridine avec addition de 30 ml de dichlorométhane. On filtre la résine, on la lave avec du dichlorométhane, du méthanol et. de- la pyridine successivement, puis on la plonge dans la pvridine-anhydride ' acétique (90:10 en rapport volumique) et on laisse reposer à la-TA pendant minutes. On filtre la résine supportant un nucléoside obtenue, on la lave avec de la pyridine et du dichlorométhane et on sèche à pression réduite pour application dans une réaction de synthèse en phase solide. 2) Synthèse de dinucléotide. A titre d'exemple, on décrira la synthèse d'un dinucléotide complète-. ment protégé ayant la séquence de bases de TA. On dissout dans le dioxanne anhydre l'adénosine (13,14 g) ayant son groupe hydroxyle en 5' protégé par pehdoye'n pog.pa un groupe diméthoxytrityle (DMTr) et le groupe- amine avec un groupe benzoyle et 6,34 g de triazole. En refroidissant avec de la glace, on ajoute 8,35 ml de triéthylamine à la solution, puis on ajoute goute à goutte au mélange 6,86 g de o- chlorophénylphosphorodichloridate pendant une période de 10 minutes, et on agite le mélange obtenu à la TA pendant 2 h 1/2. On sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé, on concentre le filtrat à environ 2/3 de son volume, et on mélange 3,6 g de 13-cyanoéthanol et 4,8 g de 1-méthylimidazole avec le doncentré en agitant à la TA pendant 3 h. On concentre le mélange réactionnel à pression réduite. On dissout le résidu dans I'acétate d'éthyle (AE), on lave avec une solution aqueuse 0,1 M de phosphate de sodium, dibasique 3 fois et avec de l'eau 2 fois puis on concentre à pression réduite donnant 19,96-g de produit brut. On purifie le produit par chromatographie sur colonne sur gel de silice en: utilisant du chloroforme-méthanol (98:2 en rapport volumique) comme éluant. On répète le procédé de purification pour obtenir 15,12 g d'adénosine mono- nucléotide compiLtinmerit proL.:é. On ajoute l'adénosine mononucléotide (7,81 g) ainsi obtenu à'une solution à 2% en poids d'acide benzènesulfonique dans le chloroforme-méthanol (70:30 en rapport volumique), et on agite le mrélange en refroidissant avec de la glace pendant 20 minutes puis on neutralise avec une solution aqueuse de carbonate acide de sodium. On lave à l'eau la couche de chloroforme séparée et on concentre à pression réduite, donnant 7,11 g d'un produit brut. On soumet le produit à une chromatographie sur colonne de gel de silice et on élue avec du chloroforme-méthanol (97:3 en rapport volumique) pour obtenir 4,31 9 d'adénosine mononucléotide avant un groupe hydroxyle en 5' brut. On dissout de la thymidine (1,64 g) ayant son groupe hydroxy en ' protégé avec un groupe diméthoxytrityle-et 0,95 g de triazole dans 21 ml de dioxanne anhydre, on ajoute à la solution 1,25 ml de triéthylamine, et on ajoute goutte à goutte 0,69 ml de o-chlorophénylphosphorodichloridate au mélange pendant une période de 5 minutes tout en agitant et en refroidissant avec de la glace. On agite ensuite le mélange à la TA pendant 1 h. On sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine résultant de la réaction, et on agite le filtrat pendant 10 minutes avec 1,1 ml d'une solution aqueuse de pyridine (1M). A la solution on ajoute une solution dans le dioxanne (10 ml) de 1,17 g de l'adénosine mononucléotide ayant le groupe hydroxyle en 5' libre et on prépare comme ci-dessus et avec 0,72 ml de 1-méthylimidazole, et on agite le mélange à la TA pendant 3 h. On concentre à pression réduite le mélange réactionnel obtenu, on dissouut le résidu dans l'AE, et on lave la solution avec une solution aqueuse de phosphate de sodium, dibasique (0,1 M) puis avec de l'eau et on concentre à pression réduite, donnant 2,39 g de produit brut. On soumet le produit à une chromatographie sur- colonne sur gel de silice (CCGS) et on élue avec du chloroforme-méthanol (98:2 en rapport volumique) pour obtenir 2,39 g de dinucléotide TA complètement protégé. De la même manière que ci-dessus on prépare divers nucléotides. 3) Synthèse d'oligonucléotide. On décrit la synthèse en phase solide de lVoligonucléotide A-i, c'est-à-dire l'undécanucléotide AATTCGAAGAT. On met dans un vase à réaction une résine (40 mg) supportant le nucléoside T et préparée selon le procédé 1) ci-dessus, on lave avec du dichlorométhane-isopropanol (85:15 en rapport volumique) 3 fois, puis on traite avec une solution de bromure de zinc (1M) dans le dichlorométhane- isopropanol pour enlever le groupe diméthoxytrityle en position 5'. On répète ce procédé plusieurs fois jusqu'à ce que la couleur de la solution disparaisse.' On lave la résine avec du dichlorométhane, puis on lave avec une solution d'acétate de triéthylammonium (0,5 M) dans le DMF pour enlever le Zn2+ restant, on lave encore avec du THF et on sèche en faisant passer de l'azote gazeux dans le vase à réaction pendant plusieurs minutes. On dissout dans 1 ml de pyridine le dinucléotide GA (50 mg), complète- ment protégé et préparé comme dans le procédé 2) ci-dessus, on agite avec 1 ml de triéthylamine puis on laisse reposer à la TA pendant plusieurs heures. On fait alors évaporer la solution à pression réduite. On fait évaporer de façon azéotropique lerésidu plusieurs fois avec de la pyridine pour transformer le nucléotide en un sel de triéthylammonium. On dissout le sel dans 0,3 ml de solution de mésitylène-sulfonyl-5-nnitrotriazole (0,3 M) dans la pyridine. On ajoute la solution à la résine séchée, puis on fait réagir à la TA pendant minutes. On sépare par filtration la fraction liquide du mélange réactionnel, et on lave la fraction solide avec de la pyridine puis on la laisse reposer pendant 5 minutes dans un mélange de 0,2 mrl d'anhydride acétique et 0,8 ml d'une solution de diméthylaminopyridine (0,1 M) dans le THF-pyridine pour masquer le groupe hydroxyle n'ayant pas réagi. Enfin, on lave la résine avec de la pyridine, grâce à quoi on achève un cycle de procédé de synthèse en phase solide. Un cycle étend la chaîne de nucléotides de longueurs de base. On répète le même procédé que ci-dessus pour coupler successivement les dinucléotides AA, CG, TT et AA avec le nucléotide résultant par condensation, grâce à quoi on prépare l'undécanucléotide complètement protégé AATTCGAAGAT supporté sur la résine. On laisse reposer la résine (20 mg) obtenue à 40 C pendant 1 h avec 0,6 ml d'une solution de tétraméthylguanidine-2-pyr-idinealdoximate (0,5 M) dansla pyridine-eau (90:10 en rapport volumique). On fait alors passer la résine à travers une pipette de Pasteur bouchée avec du coton et ainsi on sépare par filtration. On lave la résine avec de la pyridine et de l'éthanol alternativement. On combine les eaux de lavage et le filtrat et on concentre à 40 C à pression réduite. On dissout le résidu dans.2 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 10 mM). On lave la solution 3 fois avec de l'éther. On applique la phase aqueuse dans une colonne de Sephadex G-50 (2 x 100 cm) et on élue avec une solution de TEAB 10 mM. On vérifie l'absorption des fractions à 260 nm. On concentre la fraction incluant le premier pic d'éluat. On soumet le résidu à une chromatographie en phase liquide à haute vitesse (pompe: Modèle 6000A, détecteur: Modèle 440, produits de Waters Associates, EtatsUnis) pour obtenir une fraction purifiée ayant un seul pic. Pour la chromatographie en phase liquide à haute vitesse, la colonne employée est [-Bondapak C18 (produit de Waters Associates, Etats- Uni), et l'on emploie une solution aqueuse d'acétonitrile d'acétate de triéthyl- ammonium (0,1 M) comme éluant pour l'élution avec gradient ( 5 - 40% vol.) . L'undécanucléotide anisi purifié a toujours son extrémité 5' protégée avec un groupe diméthoxytrityle, si bien qu'on traite le composé avec une solution aqueuse à 80% vol. d'acide acétique pendant 15 minutes pour enlever le groupe diméthoxytrityle puis on purifie à nouveau par chromatographie en phase liquide à haute vitesse jusqu'à obtention d'un seul pic. On utilise dans ce but la même colonne que ci-dessus, et l'on emploie pour l'élution par gradient une solution acétonitrile-aqueuse d'acétate de triéthylammonium (0,1 M) (5 -> 25% vol.). De la même manière que ci-dessus, on synthétise les oligonucléotides A-2 à A-16, etB-1 à B-16. Le tableau 1 montre le rendement de chaque oligonucléotide déterminé avec utilisation de 20 mg de la résine résultant de la synthèse en phase solide, en séparant l'oligonucléotide de la résine, puis en enlevant le groupe protecteur et en purifiant. On calcule le rendement à partir de la mesure de l'absorption du produit purifié final à 260 nm et de la somme des valeurs d'absorption pour les bases des nucléotides. TABLEAU 1 A-1, 80g A-2, 120g A-3, 90og A-4, 50g A-5, 140g A-6, 70lg A-7, 80g A-8, 90g A-9, lOO1g A-10, 90g A-11-, llOg A-12, 40gg A-13, 50ug A-14, 40g A-15, 60g A-16, 150g B-l, 60 gg B-2, l00gg B-3, 50gg B-4, 90g B-5, 100g B-6, 90g B-7, 130g B-8, 0l0g B-9, O110g B-10, lOO0g B-l llO0g B-12, llOig B-13, 130gg B-14, 60g B-15, 70g B-16, 50g 4) Vérification de la séquence de bases d'oligonucléotides. On vérifie la séquence selon le-fractionnement bidimensionnel par électrophorèse et homochromatographie de Wu et coll.-mentionné ci-dessus. On trouve que chacun des oligonucléotides A-1-à -A-16 et B-1 à B-16 a la séquence de nucléotides envisagée. La fig. 5 montre le résultat obtenu en analysant l'oligonucléotide A-3, o l'on trouve que- A-3 a la séquence GATTCTGAGTG lue à partir de l'extrémité 5'. On vérifie également la séquence de nucléotides- de chaque oligonu- cléotide par le procédé de Maxam-Gilbert exposé ci-dessus. - -Il se confirme que les oligonucléotides A-i à A-16 et B-1 à B-16 ont chacun la séquence de nucléotides envisagée. ) Construction de blocs et sous-unités d'oligonucléotides. On prépare les blocs et sous-unités par le procédé montré dans la fig. 2. comme il est dit en détail ci-dessous. Tout d'abord, on dissout environ 5 'g de chacun des:oligonucléotides A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 et A-16 dans l'eau distillée (50 VI) pour obtenir - une solution ayant une concentration d'environ 0,1 pg/ll. On met les 6 types de solution aqueuse, chacun en unequantité de 10 l (1 ig calculé en ADN), dans 6 autres tubes d'Eppendorf individuellement, On met dans chaque tube une solution de mélange (6 Ll) contenant du tris-HC1 250 mM (pH 7,6), du chlorure de magnésium 50 mM, de la spermine 10 mM et du DTT 50 mM, puis on ajoute 0,5 pJl de solution aqueuse de _-3P-ATP (produit d'Amersham International Ltd, Royaume-Uni), 0,5 Vl de polynucléotidekinase T4 (produit de Takara Shuzo Co.., Ltd, Japon) et 13 el d'eau distillée, pour obtenir-30.1. de mélange. On fait réagir le mélange pendant 30 minutes à 37?C,:et on le fait encore réagir. pendant 30 minutes avec addition de 1 Iel de solution aqueuse d'ATP 30 mM. On termine la réaction en chauffant à 100 C pendant 2 minutes. On refroidit rapidement le mélange réactionnel avec de la glace. On met les oligonucléotides, A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 et A--i6 ayant ainsi l'extrémité 5'. phosphorylée, chacun en une quantité de 10 11l, dans unautre tuk-d'Eppendorf simple de 1,5 ml. Dans le tube on met 40 Vl de solution aqueuse de tris-HCl 250 mM (pH 7,6), 40 l de chlorure de magnésium 50 mM et 35 I1 d'eau distillée pour obtenir une quantité totale de 175 ul. On chauffe le mélange à 90 C pendarit 2 minutes, puis on refroidit graduellement à la TA. Avec addition de 10 1el de solution aqueuse de DTT 200 mM, 10 el de solution aqueuse d'ATP 20 mM et 5 el (100 unités) d'ADN ligase T4 (produit de Nippon Gene Co., Ltd., Japon), on fait réagir le mélange pendant la nuit à 4 C, donnant le bloc 1 d'oligonucléo- tides liés A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 et A-16. On forme de même le bloc 2 et le bloc 3 par la ligation de A-4, A- 5, A-6, A-11, A-12 et A-13 et par la ligation de A-7, A-8, A-9 et A-10. On ajoute de l'éthanol au mélange réactionnel des blocs ainsi préparés à 2 fois leur volume, et on laisse reposer le mélange à -80 C pendant 30 minutes pour précipiter l'ADN, puis on effectue une électrophorèse sur un gel de polyacrrylamide à 12,5% en poids et une autoradiographie. Ceci donne des bandes dans les positions de 72 pb (paires de bases) et 36 pb pour le bloc 2 et des bandes aux positions de 48 pb et 24 pb pour le bloc 3. Ensuite, on décbupe chaque bande et on y ajoute un mélange de tris-HCl 10 mM (pH 7,6)et d'une solution aqueuse d'EDTA 10 mM (tris-EDTA) On laisse alors reposer le mélange-pendant la nuit à laTA aux fins d'extraction. On centrifuge le mélange obtenu, on sépare le surnageant, et on agite pleinement le surnageant avec du phénol saturé avec tris-EDTA puis on centrifuge pour jeter la couche inférieure. On rêpère 2 fois le même procédé avec du phénol saturé avec tris-EDTA. Enfin, on fait passer la couche supérieure à travers une colonne de 1 cm de diamètre et 20 cm de longueur remplie de Sephadex G-50 pour enlever le phénol et l'acrylamide. On concentre alors l'éluat à 200 El puis on laisse reposer à -80 C pendant 30 minutes avec de l'éthanol dans 2 fois le volume du concentré pour précipiter l'ADN. On combine les 3 blocs Obtenus. Au mélange on ajoute du tris-HCl mM (pH 7, 6), du chlorure de magnésium 10 mM, du DTT 20 mM, de l'ATP 1 mM et 5 el d'ADN ligase T4. On laisse reposer le mélange obtenu pendant la nuit à 40C aux fins de ligation. Au mélange on ajoute de l'éthanol à 2 fois son volume, et on laisse reposer le mélange à -80 C pendant 30 minutes pour précipiter l'ADN, puis on effectue une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide à 8% en poids et une autoradiographie, qui révèle des bandes à 96 pb et 192 pb. On décce chaque bande, et on y ajoute du tris-EDTA, et on laisse le mélange reposer pendant la nuit à la TA aux fins d'extraction. On centrifuge le mélange pour séparer le surnageant, on agite pleinement le surnageant avec du phénol saturé avec tris-EDTA, et on jette la couche inférieure. En ajoutant encore du phénol saturé avec tris-EDTA, on répète 2 fois ce procédé. On fait passer la couche supérieure à travers une colonne '66799 de Sephadex G-5, on concentre l'éluat, et on ajoute au concentré de l'éthanol à 2 fois le volume du concentré, puis on laisse reposer à -80 C pendant 30 minutes pour précipiter l'ADN. On clive le produit obtenu avec EcoRI et BamHl pour obtenir la sous-unité A. On répète le même procédé que ci-dessus comme on le voit dans la fig. 3 pour lier les oligonucléotides B-1, 8-2, B-15 et 8-16 en le bloc 4, pour lier les oligonucléotides B-3, B-4, B-13 et B-14 en le bloc 5, pour lier les oligonucléotides B-5, B-6, B-11 et B-12 en le bloc 6, et pour lier les oligonu- cléotides B-7, B-8, B-9 et B-10 en le bloc 7. On recueille les blocs correspondant à 26 pb et 52 pb, et on les lie de même pour donner des produits de 104 pb et 208 pb, que l'on clive avec HindlII et BamHI. Ainsi, on obtient la sous- unité B. 6) Clonage de sous-unités et analyse de plasmides recombinants. Avec référence à la fig. 2, on clive pBR322 avec EcoRI et BamHI, et on enlève les groupes phosphate des extrémités 5' avec la phosphatase alcaline (produit de Takara Shuzo Co., Ltd, Japon) de manière à ne pas rétablir l'état d'origine. Ensuite on laisse reposer pendant la nuit à 4 C pBR322 ainsi clivé et déphosphorylé et la sous-unité A dans un mélange de tris-HCl 50 mM (pH 7,6), chlorure de magnésium 10 mM, DTT 20 mM et ATP lmM avec addition de 5 ul d'ADN ligase T4, grâce à quoi ils sont liés. Au mélange réactionnel on ajoute de l'éthanol à 2 fois son volume, et on laisse reposer le mélange à -80 C pendant 30 minutes aux fins de précipitation. On centrifuge alors le mélange, on sèche le précipité et on le dissout dans 100 el d'eau distillée, grâce à quoi on obtient un plasmide pUG1 o la sous-unité A est incorporée dans pBR322. On transforme E. col! souche HB101 avec le plasmide pUG1 par le procédé du calcium. On cultive la souche HB101 servant d'hôte à 37 C dans 50 ml de milieu de culture LB (1% en poids de bactotrypton, 0,5% en poids d'extrait de levure et 0,5% en poids de chlorure de sodium). Lorsque l'absorption à 610 nm atteint 0,25, on transfère une fraction de 40 ml du bouillon de culture dans un tube de centrifugation et on centrifuge à 6000 tpm pendant 10 minutes à 4 C. on jette le surnageant, on met le précipité en suspension dans 20 ml de chlorure de magnésium 0,1 M refroidi avec de la Glac-, n centrifuge la suspension à nouveau dans les mêmes conditions, et on jette le surnageant. Z6 On met le précipité en suspension dans 20 ml de solution glacée de chlorure de calcium 0,1 M et de chlorure de magnésium 0,05 M et on refroidit avec de la glace pendant 1 h. On centrifuge la suspension, on jette le surnageant, et on met le précipité en suspension dans 2 ml de solution glacée de chlorure de calcium 0,1 M et de chlorure de magnésium 0,05 M. A une fraction de 200 LA de la suspension on ajoute 10 yl de solution aqueuse de pUG1, et on refroidit le mélange avec de la glace pendant 1 h puis on chauffe dans un bain d'eau à 43,5 C pendant 30 s. On ajoute ensuite au mélange 2,8 ml de milieu de culture LB, puis on fait incuber à 37 C pendant 1 h. On étend alors la culture sur une plaque LB contenant 50 Lg/ml d'ampicilline, en une quantité de 200 Pl/plat et on fait incuber pendant la nuit à 37 C. On vérifie les colonies en croissance en transplantant encore vers une plaque LB contenant 50 Lig/ml d'ampicilline et également vers une pllaque LB contenant 20 Lg/ml de tétracycline et on fait incuber pendant la nuit à 37 C. On sépare les colonies résistant à l'ampicilline seule pour obtenir une cellule transformée. On recueille des plasmides à pakir de la cellule à petite échelle par le procédé d'extraction alcaline et on vérifie la présence d'un site de clivage BgII. On cultive l'une des cellules contenant le plasmide ayant le site de clivage BGilI à grande échelle pour obtenir le plasmide pUG1 purifié de même par le procédé d'extraction alcaline. On analyse sur les 2 brins la séquence de nucléotides de la sous- unité A incorporée dans le pUG1 résultant par le procédé de Maxam-Gilbert exposé ci-dessus. Les photos 1 et 2 montrent les résultats de l'analyse. Les chemine I à 4sont le résultat de l'électrophorèse pour le fragment EcoRI-Sa1I, et les chemins 5 à 8 le sont pour le fragment BamHI-PstI. Les chemins 1 et 5 montrent les produits de réaction pour la. guanine, les chemins 2 et 6 les produits de réaction pour guanine + adénine, les chemins 3 et 7 montrent les produits de réaction pour thvmine + cvtosine, et les chemins 4 et 8 montrent les produits de réaction pour la cytosine. La photo 2 montre les résultats obtenus par les mêmes spécimens que ci-dessus, o une région du côté à plus haut poids moléculaire (correspondant à la partie supérieure de la photo 1) est élargie. De cette manière, la séquence de nucléotides de la sous- unité A est confirmée. -2566799 Si l'on se réfère à la fig. 3, on clive le plasmide pBR322 avec Hindill et BamHI, et on isole le plus grand fragment par électrophorèse-et on l, lie à la sous-unité B. Ainsi, on obtient un plasmide pUG2-o la sous- unité B est introduite dans pBR322 comme dans le cas de pUG1. En utilisant le:plasmide pUG2 résultant, on transforme la souche HB101_, et on sélectionne les colonies résistant à l'ampicilline seule. On recueille les plasmides à partir des colonies puis on vérifie la présence d'un site de clivage BglII et d'un -site de clivage MluI. On sélectionne les cellules contenant-les plasmides ayant les deux sites. On cultive l'une des cellules sélectionnées à grande échelle pour obtenir - le plasmide pUG2 purifié. On analyse la séquence de nucléotides de la sous- unité B dans pUG2 sur les deux brins par le procédé de Maxam-Gilbert. La photo 3 montre les résultats dde l'analyse. Les chemins i à 4 montrent le résultat obtenu par le fragment HindIII-SalI. Les chemins 5 à 8 montrent le résultat obtenu par le même spécimen, o une région du côté à plus haut poids moléculaire (correspondant à la partie supérieure des chemins 1 à 4) est montrée à une échelle agrandie. Chaque chemin montre le même produit réactionnel correspondant que dans la photo 1. Ainsi, la séquence de nucléotides de la sous-unité B est confirmée., Si l'on se réfère ensuite à la fig. 4, on clive pUG1 avec HindIII et Sali, et on sépare un plus grand fragment à travers une colonne de Biogel de 1,5 m. On clive pUG2 avec HindIII et Sali, puis on fait une électrophorèse pour obtenir un fragment plus petit. On Combine les deux fragments et on les traite avec l'ADN ligase T4 pour la ligation, grâce à quoi on obtient le plasmide pUG3 o les sous-unités A plus B, c'est-à-dire le gène de la 13B- urogastrone, sont incorporées dans pBR322. On transforme E. coli, souche HB101, en utilisant le plasmide pUG3. Le transformant a été déposé selon les termes du traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt avec le N0 de dépôt FERM BP-543 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministère du. commerce interna- tional et de l'industrie, Japon, le 22 juin 1984. Dans le cas ci-dessus également, on sélectionne les cellules abritant le plasmide pUG3 qui est résistant à l'ampicilline seule et a un site de clivage MluI. L'une des-cellules sélectionnées est cultivées à grande échelle pour obtenir le plasmide pUG3 purifié. On analyse la séquence de nucléotides du gène de la B3-urogastrone dans pUG3 sur les deux brins par le procédé Maxam-Gilbert. La photo 4 montre le résultat de l'analyse. Les chemins 1 à 4 montrent le résultat obtenu avec le fragment BamHI-Pstl. Les chemins 5 à 8 montrent le résultat obtenu avec le même spécimen, ou une région du coté à plus haut poids moléculaire (correspondant à la partie supérieure des chemins 1 à 4) est montrés à une échelle agrandie. Les produits réactionnels des chemins (ou voies) sont les mêmes que ceux qui correspondent dans la- photo 1. L'analyse confirme la séquence de nucléotides du gène de la Burogastrone. 7) Vecteur d'expression incorporant le promoteur AP L Le promoteur PL, promoteur de la partie gauche du phage, L est utilisé pour exprimer la Burogastrone comme il sera décrit en détail ci-dessous. On décrira tout d'abord la préparation d'une souche ECI-2 dérivée de la souche d'E. coli HB101. ECI-2 sert d'hôte pour les plasmides d'expression i5 P-. On décrit ensuite le clonage d'un-.fragment d'ADN contenant le promoteur P à partir de l'ADN de 'ACI857S7 qui est un mutant du phage., et la construction de plasmides d'expression à partir de l'ADN, clone. On décrit en outre l'expression du gène de la B-urogastrone dans la souche ECI- 2 hôte par le promoteur P 7-1) Construction de la souche ECI-2. La souche ECI-2 est E.coli HB101 abritant un plasmide pGH37 pour l'expression du gène CI857. On prépare pGH37 par le procédé montré dans la fig. 6. Tout d'abord, on clive l'ADN de ICI857S7 avec BglII. On digère ensuite les extrémités cohésives au site de clivage en utilisant la S1 nucléase. On fait réagir 1 1 tg d'ADN de;C6I857S7 clivé avec BglI avec 200 unités de'SI nucléase à C pendant 30 minutes dans 100 el d'une solution aqueuse (pH 4,5) comprenant du chlorure de sodium 200 mM, 'de l'acétate de sodium 30 mM et du sulfate de zinc 5 mM. On soumet les fragments d'ADN à extrémité émoussée ainsi obtenus à une électrophorèse-sur gel d'agarose à 1,0% en poids pour en isoler un fragment avec 2385 pb ayant tout le gène de structure CI857. On insère le fragment dans le site de clivage PvuII des plasmides pGL101 pour construire un plasmide pGH36 qui exprime le gène C1857 sous le contrôle d'un promoteur, lac UV5. Ensuite, on clive pGH36 avec deux enzymes de restriction, EcoRI et PstI, pour obtenir un fragment ayant 1193 pb, que l'on insère dans un plasmide pSC101 entre les sites de clivage EcoRI et Pstl pour préparer un plasmide pGH37. Ensuite, on transforme la souche HB101 d'E. coli avec pGH37 par le procédé du calcium mentionné ci-dessus,- L'une des souches obtenues est nommée ECI-2. La souche ECI-2 est déposée sous le traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt avec le N de dépôt FERM-BP- 542 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministère du commerce international et de l'industrie, Japon, le 22 juin 1984. Cette souche est résistante à la tétracycline, exprime le gène CI857 et permet la présence conjointe, par transformation, d'autres plasmides dérivés, p. ex., de pBR322. On utilise donc ensuite la souche ECI- 2 comme hôte pour les plasmides d'expression A P L 7-2) Clonage du promoteur 1 P et préparation de plasmides d'expression. L Comme on le voit dans la fig. 7, pGH35 est construit en premier. On clive l'ADN de ACI857S7 avec EcoRI et SalI pour obtenir un fragment de 5925 pb qui comprend le promoteur P et le gène CI857 ainsi que le L promoteur)> P. On insère le fragment dans le plasmide pBR322 entre les R sites de clivage EcoRI et Sa1I pour construire un plasmide pGH25. On clive ensuite pGH25 avec BamHI et on lie à pBR322 clivé de même avec BamHI pour obtenir pGH34. Ensuite, on clive pGH34 avec AvaI et Bg1II puis on traite avec la S1 nucléase pour donner un fragment à extrémité émoussée d'environ 4500 pb. On circularise le fragment avec l'ADN ligase T4 pour construire un plasmide pGH35. On construit ensuite pEK28 comme on le voit dans la fig. 8. On lie les oligonucléotides de synthèse C-1-1 et C-1-2 comme adaptateur, qui comprend une séquence SD, et qui ont la séquence de nucléotides montrée ci-dessous, au fragment que l'on obtient en clivant pGH35 avec HpaI. On lie encore l'assem- blage au plasmide pMC1403 clivé avec BamHI pour obtenir le plasmide pEG2. Le pEG2 a deux gènes résistant à l'ampicilline, et exprime le gène de la B-galactosidase dérivé de pMC1403 sous le contrôle du promoteur.PL en utilisant un codon départ ainsi que la séquence SD incluse dans l'adaptateur. Les fragments C-1-1 et C-1-2 ont la séquence de nucléotides suivante: Séquence SD codon départ C-1-1: 5' A G G A A C A G A T C T A T G 3' C-1-2: 3' T C C T T G T C T A G A T A C C T A G 5' BglII On emploie le procédé de Miller pour confirmer l'expression de la Bgalactosidase chez l'hôte ECI-2 abritant le plasmide pEG2 (Miller, 3. (1972) "Experiments in Molecular Genetics" New York, Cold Spring Harbor Laboratory pp 352-355). Ce procédé est fondé sur la réaction de la Bgalactosidase avec un substrat synthétique ONPG (o-nitrophénylgalactoside) pour libérer un composé jaune o-nitrophénol. Le procédé de Miller sera décrit plus en détail. On mélange une quantité de 0,1 ml de culture d'une espèce de bactérie, dont on a mesuré l'absorption à 610 nm, avec 1,9 ml de tampon de dosage (phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0, 1 mM de sulfate de magnésium et Bmercaptoéthanol 0,1 M) et on agite vigoureusement pendant 15 s avec 0,1 ml de toluène pour accroître la perméabilité de l'espèce de bactérie. On enlève ensuite le toluène par évaporation au moyen d'un aspirateur. Avec addition de 0,2 ml de solution - d'ONPG (solution de 400 mg d'ONPG dans 100 ml de tampon de dosage), on fait incuber le mélange à 30 C jusqu'à ce qu'une couleur jaune apparaisse, après quoi on ajoute 0,5 ml de carbonate de sodium 1 M pour arrêter la réaction enzymatique. On mesure l'absorption du mélange réactionnel à 42-. im et 550 nm. L'activité de la B-galactosidase par les unités dans 1 ml de la culture liquide selon l'équation suivante, o l'absorption à 610 nm est calculée comme 1,0. Activité de - DO 420 - 1,75 x DO550 -uié 1 x 1000 galactosidaseD)4050X10 (unités t x v x DO610 (unité.9 t: temps d'incubation (minutes) v: quantité de spécimen ajoutée au système réactionnel (0,1 ml) DD610 absorption à 610 nm du spécimen. Le procédé ci-dessus, une fojs pratiqué, révèle le résultat suivant. Lorsqu'on fait-incuber la souche ECI-2 abritant pÉG2 à 30.C, l'activité de. 13-galactosidase est de 98 unités. Cependant, lorsqu'on fait encore incuber la culture à 42ZC pendant 1 h. on active le promoteur= PL pour aboutir à une activité de B-galactosidase de 9637 unités. Ceci donne des preuves comme quoi la séquence du promoteur i'PL à la 13-galactosidase est dans l'ordre envisagé. Bien que pEG2 ait deux sites de clivage BglIL, seul le site BgllI présent immédiatement après la séquence SD de la B-galactosidase est nécessaire, tandis que l'autre site est indésirable. On clive donc le plasmide avec BamHl et on le lie à nouveau pour enlever un fragment ayant environ 770 Pb. On complète la construction de pEK28, qui est un plasmide d'expression, en utilisant un promoteur; P L 7-3) Expression du gène fusionné de la moitié avant de la 13-urogastrone et de la 13-galactosidase. La fig. 9 montre schématiquement la série de procédés à décrire cidessous. On construit un plasmide pUG101 ayant un gène fusionné de la moitié avant de la S-urogastrone et d'une 13-galactosidase de la façon suivante. De façon plus spécifique, on clive pUGt, qui a la moitié avant du gène-de la 13-urogastrone, et pMC1403 ayant un gène de' 13-galactosidase avec BamHI puis on lie pour former pUG101. Avec ce plasmide, on lie la moitié avant du gène de la B3-urogastrone et le gène de la B3-galactosidase dans le même cadre. Le plasmide exprime donc les séquences d'acides aminés des deux: sous la forme d'une protéine fusionnée.; Pour'l'expression avec ce plasmide sous le contrôle du promoteur PL pUG101 et pEK28 sont chacun clivés avec Bg1II. Le clivage avec Bg1II produit un fragment d'ADN ayant des extrémités ' extrudantes sous la forme de (::. A G) \.TCTAG). Cependant, lorsqu'on fait réagir le fragment- d'ADN avec un grand fragment d'ADN polymérase I d'E. coli (fragment de Klenow), en présence des 4 types de désoxyribonucléotide triphosphates dGTP, dATP, dTTP et dCTP,- on obtient une extrémité émoussée en complétant avec les nucléotides correspondants donnant une extrémité.. A AGATC: À TCTAGff Si l'on ajoute dGTP seulement comme composant de nucléotide, nn pbtient l'extrémité de f.AG È... TCTAG) étant donné la fin de la réaction. Ensuite, lorsqu'on utilise la Si1 nucléase pour digérer le brin unique restant, on obtient une extrémité "émoussée" sous la forme de / AG De même si l'on ajoute dGTP et dATP dans la réaction de Klenow, puis si l'on procède à une digestion avec la S1 nucléase, on obtient. AGA' TCT) Lorsque la réaction de Klenow est conduite par addition de dGTP. dATP et dTTP, puis par digestion avec la S1 nucléase, on obtient AGAT\ È...TCTA) En outre, si l'on conduit seulement la digestion avec la S1 nucléase sans effectuer la réaction de Klenow, on obtient A Ainsi, lorsqu'on soumet le fragment d'ADN avec l'extrémité de ( TCTA) TCTAGJ à la réaction de Klenow avec utilisation de différents nucléotides et/ou à la réaction de la S1 nucléase, on obtient cinq sortes d'extrémités émoussées qui diffèrent l'une de l'autre d'une longueur d'une paire de bases. La réaction de Klenow et la réaction de la S1 nucléase sont conduites dans les conditions suivantes: Réaction de Klenow: On fait réagir 1 Vg d'ADN comme substrat avec 1 mM de chaque désoxyribonucIlotide triphosphate à-12 C pendant 30 minutes en présence d'une unité de l'enzyme (fragment de Klenow) et de 1 mM d'ATP dans 50 el d'un milieu réactionnel comprenant 40 mM de tampon au phosphate de potassium (pH 7,4), 1 mM de B-mercapto-éthanol et 10 mM de chlorure de magnésium. * Réaction de la S1 nucléase- On fait réagir 1 Pg d'ADN comme substrat et 200 unités de l'enzyme à 20 C pendant 30 minutes dans 100 Ul d'un milieu réactionnel comprenant mM de chlorure de sodium, 30 mM d'abétate de sodium et 5 mM de sulfate de zinc (pH 4,5). pEK28 et pUG101 sont l'un et l'autre clivés avec BglII puis soumis à diverses combinaisons de la réaction de Klenow et de la réaction de la S1 nucléase, ddnant des fragments ayant 5 types d'extrémités émoussées. Les deux types de ces fragments, lorsqu'on les combine, fournissent 21 combinaisons qui diffèrent les unes des autres dans le nombre et la séquence de nucléotides entre la séquence SD et le codon départ de la protéine fusionnée, comme cela est énuméré au tableau 2. En fait, on clive les fragments d'ADN ainsi obtenus avec Sall pour isoler des fragments qui contiennent le gène encodant la protéine fusionnée de la moitié avant de la B-urogastrone et la 13-galactosidase à partir de pUG101, et les fragments contenant le promoteur ?P à partir de pEK28. L Ces fragments sont liés par l'ADN ligase T4 dans les combinaisons montrées au tableau 2. Par conséquent, on obtient les plasmides recombinants au tableau 3. On mesure l'activité de B-galactosidase des protéines fusionnées exprimées par le procédé de Miller. Le tableau 3 montre que tous les plasmides expriment un niveau relativement élevé d'activité de B-galactosidase. En particulier pUG103, pUG104 et pUG117 obtiennent des résultats remarquables. Tableau 2 Séquence de nucléotides en amont du codon départ (ATG) ATCTGC- GATCTGC- -ACA -ACAATCTGC- -ACAGATCTGC- p1.(pUG105) (UG106) -ACAG -ACAGGATCTGC- Séquence de nucleéotides '. en aval de la séquence SD -ACAGA -ACAGAATCTGC- -ACAGAGATCTGC- (,(pUGl13) (pUG114) -ACAGAT -ACAGATATCTGC- -ACAGATGATCTGC- _______;(pUG117) (pUGll8) -ACAGATC -ACAGATCATCTGC- -ACAGATCGATCTGC- ___ ___,. ___ ___-_ _....(pUG121) (pUG122) Nt o o Tableau 2 (suite) ....,..DTD: Séquence de nucléotides en amont du codon départ (ATG) TGC- CTGC- TCTGC- -ACA -ACATGC- -ACACTGC- -ACATCTGC- (pUG102 pUG3) (pUG104) -ACAG -ACAGTGC- -ACAGCTGC- -ACAGTCTGC- Séquence de nucléotides en (pUG107) (pUG108) (pUG109) ', aval de la séquence SD . -ACAGA' -ACAGATGC- -ACAGACTGC-: (AGGA) Z ' i: (pUGll1) (pUG112) ' -ACAGAT -ACAGATTGC- -ACAGATTCTGC- (pUG115)_,.: (pUGl16) :-ACAGATC - -ACAGATCCTGC- -ACAGATCTCTGC- ', _;,. : ' ' '' ', :' P.''' ,'' i____ ____ ____ ____,___ __....,_i (pUG1 9); (pUGl2) *: ,, ',. . .. ' , ' \: ,,,,,,,, s lu i, ',''o, " ' ' ' 'Z Tableau 3 Nombre de nucleotides entre la séquence SD et le codon Plasmide - eGalactosidase départ recombinant (unitDs) 6 pUG102 1674 7 pUG103 2533 7 pUG107 2260 8 pUG104 2802 8 pUG108 1835 9 pUG105 1018 9 pUG109 1942 pUG106 973 11 pUGl1lO 1764 11 pUGl13 1950 11 * pUGl-19 1862 12 pUG114 946 12 pUGI17 2332 12 pUG120 1374 13 pUG118 2041 13 pUG121 1678 14 pUGl22 1814 Ensuite, on prépare un vecteur pour l'expression de la 13- urogastrone à partir de pUG103 ou pUG117. Dn clive le plasmide (pUG103 ou pUG117) avec HindII et PvuI] pour obtenir un fragment de 1,2 kb contenant la région allant du promoteur À P L à la moitié avant du gène de la 2- urogastrone. Ensuite on clive pUG2 avec EcoRI, on complète avec le fragment de Klenow, et on clive avec Hindill pour obtenir un fragment de 4,1 kb. On lie les deux fragments avec l'ADN ligase T4, et on transforme la souche ECI-2 d'E. coli par le procédé du calcium exposé ci-dessus pour obtenir un recombinant contenant le plasmide pUG103-E ou pUG117-E pour l'expression de la combinaison de la moitié avant et de la moitié arrière du gène de la B-urogastrone, c'est-à-dire tout le gène de la B- urogastrone, sous le contrô1e du promoteur A P 8) Vecteur pour l'expression de la protéine fusionnée. On lie un gène de B-lactamase sur le plasmide pBR322-et un gène de B3urogastrone pour exprimer la S-urogastrone sous la forme d'une protéine fusionnée comme il sera décrit ci-dessous. 8-1) Donneur de gène de B-lactamase. On obtient pBRH02 en clivant pBR322 avec Aval et PvuII, puis en effectuant la réaction de Klenow et la ligation par l'ADN ligase T4. Ce plasmide a des gènes pour la résistance à l'ampicilline (ApR) et la résistance à la tétracycline (TcR) comme marqueurs. On obtient pBRHO3 en clivant pBR325 avec Aval et HindIII, puis eneffectuant la réaction de Klenow et la ligation et il a Ap R et la résistance au chloramphénicol (CmR) comme marqueurs. La fig. 10 montre ces plasmides. 8-2) Donneur de gène de 3-urogastrone. On clive pUG3 préparé comme il a déjà été décrit avec MboII pour obtenir 13 types de fragments d'ADN, que l'on dénomme A à M dans l'ordre de taille comme il est montré dans la fig. 11. Sur ces fragments d'ADN, on trouve que le fragment H est composé de 179 pb en partant d'un nucléotide codant pour l'asparagine à l'extrémité N de la 13-urogastrone et se terminant avec 16 bases en aval db codon arrêt, le fragment ayant tout le gène de structure de ia ià-urogastrone. -ioui- isUii l ramet. rn..numet les fragments à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 6% en poids, et on purifie le fragment. 8-3) Adaptateur. Pour les adaptateurs, on prépare les oligonucléotides énumérés au tableau 4 par le même procédé que celui déjà exposé. Ces adaptateurs sont conçus pour coder pour la paire d'acides aminés basique de Lys-Arg ou Arg-Lys pour cliver enzymatiquement la B-urogastrone à partir de la protéine fusionnée exprimée. 2S66799 Tableau 4 Adaptateur Extrémité 5'. Extrémité 3' D-l-3 CCGTAAG - D-l-4 TTACGG: - D-2-1 CGTAAG D-2-2 TTACG D-3-2 TTACGGAT D-4-2 TTACGTGCA: E-1 CGCTAAACGG E-2 CGTTTAGCG E-3 GACAAACGG E-4 ' CGTTTGTC E-5 CGTTTAGCGAT E-6 CGTTTGTCTGCA E-7 CGGCTAAACGG E-8 CGTTTAGCCG: E-9 CAAACGG... E-10 CGTTTG:: - 8-4) Système pour l'expression de laprotéine fusionnée de 13-lactamase et de 8-urogastrone liées par Lys-Arg. On prépare un vecteur pour l'expression de la protéine fusionnée Blactamase-B-urogastrone de manière qu'une séquence de reconnaissance d'enzyme de restriction soit générée dans la région contenant un adaptateur. 8-4-a).Construction de pUG2301 à pUG2303. On pratique le procédé montré dans la fig. 12. On clive complètement le piasmide pBRH02 avec XmnI à 37 C sur une période de 3 h. On lie ensuite 3 ig du vecteur, environ 0,1 Ig du fragment B-urogastrone de 179 pb et environ 1 1g de chacun de E-1 et E-2 (avec l'extré- mité 5' non-phosphorylée) servant d'adaptateur en une seule étape à 12 C pendant une période de 15 h pour obtenir des plasmides sous forme de vecteur- d'expression. On transforme la souche HB101 avec utilisation des plasmides- par le procédé du calcium. Sur les 499 colonies TcR, 168 colonies (33,7%) sont ApS. Dans ces colonies on vérifie par mini-préparation la taille de l'ADN du plasmide. Treize plasmides sont plus grands d'environ 200 pb que le vecteur et considérés comme ayant un gène de B-urogastrone qui y est inséré. Tous, qui ont un site MluI, sont clivés avec HinfI et vérifiés quant à l'orientation de l'insertion du gène de 13-urogastrone par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% en poids. Trois d'entre ceux quisont vérifiés donnent des fragments d'environ 1050 pb et environ 800 pb. Ceci indique que le gène de B-urogastrone est inséré dans la même orientation que ia B- lactamase. Ces trois plasmides sont dénommés pUG2301 à pUG2303. 8-4-b) Construction de pUG2101 à pUG2105. On pratique le procédé montré dans la fig. 13. On utilise le plasmide pBR322 comme vecteur de plasmide qui a un site PvuI unique dans le gène de la B-lactamase. Selonn le procédé décrit e!-4- Ja), cn ccnstr"t ur v!c t- cu'. e:; En ea- -5 j, adaptateur. Lorsqu'on vérifie dans les 1626 colonies TcR obtenues la sensibilité Ap, 31 colonies (1,9%) sont Ap S. On effectue. une mini-préparation pour 22 colonies Tc R et ApS, et on vérifie dans les plasmides l'insertion du gène de la B-urogastrone par clivage avec MluI. On trouve que Z0 plasmides ont un site Mlu. On vérifie l'orientation en clivant avec Hinf ou BamHI. On trouve un site Mlul. On vérifie l'orientation en -clivant avec HinfI ou BarnilL On trouve que les plasmides pUG2101 à pUG2105 ont un gène de B-urogastrone qui y est inséré dans la même orientation que le gène de la B-lactamase. 8-4-c) Construction de pUG2701 à pUG2703 On construit les plasmides d'expression par le même procédé que dans 8-4-a) en utilisant pBR322 comme vecteur et E-7 et E-8 comme adaptateur, comme on le voit dans la fig. 14. Sur les 217 colonies TcR, 106 colonies (48,8%) sont ApS. On effectue une mini-préparation pour 25 de ces colonies. Huit des plasmides sont d'environ pb plus grandes que le vecteur et semblent avoir un gène de Burogastrone inséré, si bien qu'on clive ces 8 plasmides et qu'on y vérifie l'orientation du gène. Par conséquent, on trouve que 3 plasmides ont le gène de la B- urogastrone inséré dans la même orientation que la B-lactamase et sont dénommés pUG2701 à 2703. Le plasmide pUG2301 obtenu par le procédé 8-4-a) ci-dessus produit une protéine fusionnée d'une fraction de B-lactamase et de B-urogastrone. La séquence d'acides aminés prédite et la séquence de nucléotides corres- pondante sont présentées ci-dessous. Met Ser I le Gin His Phe Arg Val ATG AGT ATT OAA CAT TTC CGT GTC Ala Leu I le Pro Phe Phe Ala Ala GCC CTT ATT CCC TTT TTT GOG GCA Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His TTT TGC CTT OCT GTT TTT GCT CAO Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA Asp.Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA Arg Val GIy Tyr [ le Glu Leu Asp CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT Leu Asn Ser Gly Lys I le Leu Glu CTC AAC AGC GGT AAG ATC' CTT GAG Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Ala AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGC GOT Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC Pro Leu Ser His Asp Giy Tyr Cys CCA CTG TCT CAC-GAT GGC TAT TGT Leu His ASP Gly Val Cys Met Tyr CTG. CAC GAC G GG T GTT TGC ATG TAC I leGlu Ala Leu Asp LYs Tyr Ala: ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG CYs Asn Cys Val Val GIY Tyr:I le TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC-O GYI Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GA-T Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (arrêt) CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA; TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCGTTTTCCA ATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA-TGTGGC GCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCQGGGCAAGAG - CAACTCGGTCGCCGCATAC De même, le plasmide pUG2101 obtenu par le procédé 8-4-b) produit une protéine fusionnée ayant la structure primaire: suivante: - Met Ser lle Gln His Phe Arg, Val ATG AGT ATT CAA CAT-TTC CGT =GTC : ' -: -i Ala Leu I le Pro Phe Phe a Aa:Ala GCC CTT ATT CCC -TTT TTT GCG GCA Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His TTT- TGC CT COT GTT TTT GCT CAC Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA Asp Ala Glu Asp- Gin Leu Gly Ala GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA Arg Val Gly Tyr I leGlu Leu Asp CGA G-TG GGT TAC ATC-GAA CTG GAT Leu Asn Ser Gly Lys lie Leu Glu CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG Ser.Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser CTG CTA TGT- GGC GCG GTA TTA TCC Arg Val ASP Ala GIy Gin Glu Gin CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA Leu Gly Arg Arg I leHis Tyr, Ser CTC GGT CGC CG-C ATA CAC TAT TCT Gin Asn Asp I le Val Glu Tyr Ser CAG AAT GAC TTG GTT GAG TAC TCA Pro Val Thr Glu LYS His Leu Thr CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT ACG Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu GAT GGC ATG ACA GTA AGA GAA TTA Cys Ser Ala Ala I le Thr Met Ser TGC AGT GCT GCC ATA ACC ATG AGT Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu GAT AAC ACT GCG GCC AAC TTA CTT Leu Thr Thr I leAla Lys Arg Asn CTG ACA ACG ATC GCT AAA CGG AAT Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser AGC GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT His Asp Gly Tyr Cys Leu His ASP CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC Gly Val Cys Met Tyr I leGlu Ala GGT GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys TTG GAT AAA TAC GCG-TGT AAC TGT Val Val Gly Tyr le Gly Glu Arg GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp TGT OAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG Trp Glu Leu Arg (arrêt) TGG GAA TTG CGT TAA TAGTGAAGATC TGGATCCGTTTAGCGATCGGAGGACCGAAGG AGCTAACCGCTTTTTTGCACA De même, le plasmide pUG2701 obtenu par le procédé 8-4-c) produit une protéine fusionnée ayant la structure primaire suivante: Met Ser I le Gin His Phe Arg Val ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTI Ala Leu I le Pro Phe Phe Ala Ala GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA Phe CYS Leu Pro Val- Phe Ala His TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA Asp Ala Glu ASP GIn Leu GIY Ala GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA Arg Val Giy Tyr I le Glu -Leu Asp CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT Leu Asn Ser Gly Lys I le Leu- Glu CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG Ser Phe Arg Pro.Glu Glu Arg Phe AGT TTT CGC C0CC GAA GAA CGT TTT Pro Met Met Ser Thr Phe LLYS Val CCA ATG ATG AGOC ACT TTT AAA GTT Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCCO- Arg Val Asp Ala Gly Gin Glu - Gin- -- CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG -CAA Leu Gly Arg Arg le F HisTyr- Ser, CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT Gin Asn AsP Iie Val Glu Ser- Ala CAG AAT GAC TTG GTT GAG TCG GOT Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu -Cys AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC Pro Leu Ser His Asp Gly: Tyr Cys CCA CTG TCT CGAC GAT GGC TAT TGTLeu His Asp Gly -Vai Cys Met -TYr- CTG CAC GAC GG T GTT:TGC ATG TAC I leGlu Ala Leu Asp Lys -Tyr Ala ATO GAA GCT TTG GAT- AAA TAC GCG Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr I le TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC Gly Glu-Arg Cys Gin Tyr Arg ASPv, GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GATI Leu Lys Trp Trp Glu - Leu Arg (arr4t) CTG AAA TGG TGG GAA TTG. CGT TAA TAGTGAAGATCTGGATOCCGTTTAGCCGACTCAC CAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGAT On analyse les séquences de nucléotides codant pour les protéines fusionnées dans les pismides pUG2101, pUG2301 et pUG2701 par le procédé de Maxam-Gilbert. La photo 5 montre les résultats de l'analyse. - Si l'on seréfère à la photo 5, les chemins 1 à 4 montrent le résultat obtenu avec le fragment MluI-PstI (224 pb) de pUG2101, les chemins 5 à 8 montrent le résultat avec le fragment MluI-EcoRI (721 pb) de pUG2101, les chemins 9 à 12 montrent le résultat avec le fragment MluI-BamHI (452 pb) de pUG2301, les chemins 13 à 16 le résultat avec le fragment MluI-Pstl (335 pb) de pUG2701, et les chemins 17 à 20 montrent le résultat avec le fragment Mlul-EcoRI (610 pb) de pUG2701. Les chemins 1, 5, 9, 13 et 17 montrent les produits réactionnels pour la guanine, les chemins 2, 6, 10, 14 et 18 montrent les produits réactionnels pour la guanine plus l'adénine, les chemins 3, 7, 11, 15 et 19 montrent les produits réactionnels pour la thymine plus la cytosine, et les chemins 4, 8, 12, 16 et 20 montrent les produits réactionnels pour la cytosine. La fraction marquée avec "3' est un adaptateur. 8-5) Système pour l'expression de la protéine fusionnée de B-lactamase et 3-urogastrone liée par Arg-Lys. 8-5-a) Préparation de pUG1102 et pUG1105. On insère le gène de la 13-urogastrone dans le gène de 13-lactamase de PBR322 à son sit. de rpstriction PvuI unique pour obtenir les vecteurs pour l'expression de la protéine fusionnée de B-lactamase et de Burogastrone montrés dans la fig. 15. On clive le plasmide pBR322 avec PvuI à 37 C sur une période de 3 h. On vérifie certains des plasmides par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% en poids pour confirmer qu'ils ont été complètement clivés. On lie les adaptateurs D-1-3 et D-3-2 au fragment à 12 pendant une période de h, puis on soumet le produit lié à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% en poids pour isoler un fragment d'ADN. Ensuite, on mélange le fragment de B13-urogastrone et le vecteur dans un rapport molaire d'environ 5:1 et on lie à 12 C pendant une période de 15 h. Après la ligation, on transforme la souche HB101 avec le plasmide résultant, et on sélectionne les colonies en se référant à Tc. On obtient 71 colonies transformées par TcL et on en vérifie la sensibilité Ap. On prépare l'ADN du plasmide à partir de 20 colonies Ap S (28,2%) puis on vérifie la présence du site de restriction MluI pour confirmer l'insertion du gène de la B-urogastrone. On trouve que 5 plasmides sur 20 ont le site MluI du gène de la 13-urogastrone. On clive l'ADN avec HinfI puis on le soumet à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% en poids pour vérifier l'orientation de l'insertion. On trouve que deux des plasmides, à savoir pUG1102 et pUG1105, ont le gène dans l'orientation correcte. 8-5-b) Préparation de pUG1004, pUG1201 et pUG1301. On répète le procédé 8-5-a) en utilisant PstI, HincII et XmnI à la place de PvuI pour obtenir pUG1004, pUG1201 et pUG1301 comme on le voit dans les fig. 16, 17 et 18, respectivement. 9) Confirmation de l'expression de la 8-urogastrone. On utilise les plasmides d'expression ainsi construits pour transformer E. coli, HB101 ou ECI-2, et on cultive les cellules par le procédé suivant, suivi par une extraction et un radioimmunodosage pour confirmer l'expression. 9-1) Culture de microorganismes recombinants avec le gène de la Burogastrone et extraction de protéines. 9-1-a) Système d'expression utilisant le promoteur PL On cultive la souche ÈCI-2 abritant le plasmide d'expression pUG103- E et la même souche abbritant le plasmide d'expression pUG117-E à 25 C dans deux flacons contenant chacun 1 litre de milieu de culture LB. Lorsque la culture dans un des flacons présente une absorption de 0,3 à 600 nm, on soumet la culture à une induction de chaleur à 42 C pendant 1 h. On fait incuber de façon continue la culture de l'autre flacon à 25 C jusqu'à ce que l'absorption devienne 0,4. On recueille les cellules de chaque flacon, on les lave avec un tampon STP (chlorure de sodium 137 mM, chlorure de potassium 2,7 mM, phosphate de sodium dibasique 8,1 mM et phosphate de 2566?99 sodium monobasique 1,5 mM (pH 7,0), puis on remet en suspension dans un tampon STP dans 3% vol. de la quantité de culture d'origine et on détruit (à 100 W pendant 30 s, 3 fois) par un appareil à ultra-sons (Modèle 5202, produit de Ohtake Works Co., Ltd, 3apon) en refroidissant avec de la glace. On dialyse le surnageant séparé du déris cellulaire par ultracentrifugation (à 40000 g pendant 1 h) contre une solution aqueuse 0, 01 N d'acide acétique, et on lyophilise le dialysat puis on le soumet à un radioimmunodosage (appelé ci-dessous "RIA"). 9-1-b) Système pour l'expression de la protéine fusionnée. On fait pré-incuber la souche d'E. coli HB101 abritant les plasmides pUG1004, 1301, 2101, 2303 ou 2703 à 370C dans un milieu de culture contenant Eg/ml de tétracycline, puis on dilue au rapport volumique de 1:100 avec le même milieu et on cultive jusqu'à ce que l'absorption à 660 nm devienne 0,4. On recueille les cellules, on lave avec un tampon STP, puis on remet en suspension dans un tampon STP dans 3% en volume de la quantité de culture d'origine et on traite aux ultra-sons ( à 100 W pendant 30 s, 3 fois) par le même appareil à ultra-sons que ci-dessus en refroidissant avec de la glace. On dialyse le surnageant séparé du débris cellulaire par ultracentrifugation (40000 g pendant 1 h) contre une solution aqueuse 0, 01 N d'acide acétique, on lyophilise puis on soumet à RIA. Pour confirmer l'accumulation de protéine fusionnée dans le cytoplasme, on prépare la fraction cytoplasmique selon S.J. Chan et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5401-5405 (1981)). On dilue une fraction de la culture à un rapport volumique de 1:100 avec un milieu de culture E frais (1 litre de solution aqueuse de 10 g de phosphate de potassium dibasique, 3,5 g de phosphate acide de sodium-ammonium, 0,2 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 2 g d'acide citrique, 2 g de glucose, 0,23 g de L- proline, 39,5 mg de L-leucine, 16,85 mg de thiamine et 20 mg de chlorhydrate de tétracycline) puis on cultive à 370C jusqu'à ce que l'absorption à 660 nm devienne 0,4. On recueille les cellules (6000 tpm, 10 minutes) et on lave 2 fois avec un mélange de tris- HCl 10 mM (pH 8,0) et de chlorure de sodium 30 mM. On remet à nouveau en suspension les cellules (1 g) dans 80 ml de saccharose à 20% en poidstris HC1 30 mM (pH 8,0), après quoi on ajoute de l'EDTA à la suspension jusqu'à une concentration de 1 mM. On agite le mélange avec un agitateur rotatif à 180 tpm pendant 10 minutes (Z4-L) puis on rontrifuge (13000 g, 10 minutes) pour recueillir les cellules, que l'on remet en suspension dans 80 ml d'eau distillée. On laisse reposer la suspension- dans de la glace pendant environ minutes en agitant ocasionnellement puis on centrifuge (13000 g, 10 minutes). On recueille le surnageant sous la forme d'une fraction cytoplasmique (O- Sup). On-met le pellet en suspension dans un mélange de tris-HCl 10 mM: (pH 8,0) et de chlorure de sodium 30 mM et on traite par le même'appareil à ultra-sons que ci-dessus pour obtenir une fraction cytoplasmique.(O-Ppt) . On soumet ces échantillons à RIA. 9-2) Radioimmunodosage. 9-2-a) Etablissement du système RIA. On immunise des lapins avec de la B-urogastrone humaine purifiée comme antigène pour obtenir l'antisérum. On dissout la 13-orogastrone (300 ug) dans-0,2 ml d'eau distillée, on ajoute à la solution 1,5 ml de solution. de polyvinylpyrrolidone à 50%, et on agite le mélange pendant 2 h à la TA. On ajoute au mélange l'adjuvant complet de Freund (2,0 ml) pour obtenir une émulsion, que l'on injecte par voie sous-cutanée dans la cage thoracique de trois lapins. Après avoir répété l'immunisation 4 fois toutes les 2 semaines, on injecte encore par voie intraveineuse 50 tg de l'antigène, on recueille le sang entier 3 jours plus tard, et on sépare le sérum. On détermine ensuite les conditions RIA suivantes en vue de la courbe de titrage pour déterminer le degré de dilution de l'antisérum pour le dosage, la durée d'incubation pour optimiser les conditions dedosage, le procédé de séparation de l'antigène radio-marqué lié (lié) d'avec l'antigène radio-marqué libre (libre), etc. La solution diluante utilisée est un tampon phosphaté (10 mM, pH 7,4) contenant 0,5% en poids de sérumalbumine de boeuf (SAB), 140 mM de chlorure de sodium et 25 mM d'EDTA disodique. On mélange la solution diluante (400 il), 100 jIl de l'échantillon ou B-urogastrone humaine standard et 100 Il de sérum de 13urogastrone antihumain. Après avoir fait incuber: le mélange pendant 24 h à 4 C, on ajoute au mélange 100 el de solution de 13-urogastrone humaine marquée avec 125I (environ 5000 cpm). Apres avoir encore fait incuber le mélange pendant 48 h à 4 C, on ajoute au mélange * obtenu 100 pl de second anticorps (sérum de chèvre à (-giobuline anti- lapin)(dilution au 20e avec un tampon STP), 100 el de sérum de lapin normal (dilution au 200e avec un tampon STP) et 900 Vl de tampon STReontenant èneglycol à 5% en poids, puis on fait encore incuberpendant du polyéth.vlèneglycol à 5% en poids, pUis on fait encore incuber pendant 3 h à 40C. On centrifuge la culture pendant 30 minutes à 3000 tpmn, on sépare le surnageant, et on compte le précipité. On détermine le contenu de le substance lmmunoréactive sous forme de S-urogastrone humaine dans l'échantillon à partir de la courbe standard obtenue avec utilisation de B-urogastrone humaine standard. 9-2-b) Confirmation de laproductivité de B-urogastrone du microorganisme recombinant. Le tableau 5 montre le résultat de la RIA conduite pour le système d'expression avec utilisation du promoteur P L' TABLEAU 5 Plasmide Induction de Quantité de - - d'expression chaleur urogastrone produite (ng/fl de culture) pUG103-E oui 450,2 pUG103-E Non 3,2 pUG117-E Oui 388,4 pUG117-E Non 3,2 Témoin - Non. Non détectable (pBR322) . Le tableau 6 montre le résultat de la RIA conduite pour les systèmes d'expression de protéines fusionnées. TABLEAU 6 Plasmide Quantité de - d'expression urogastrone produite (MS/1 de culture) pUG1004 729,6 pUG1301 650,7 pUG2101 31,3 pUG2301 125,2 pUG2701 119,2 Le tableau 7 montre la localisation de la protéine fusionnée exprimée. TABLEAU 7 Quantité-de --urogastrone produite Plasmide (vg/1 de culture) d'expressiqn Fraction periplasmique Fraction cytoplasmique (O-Sup) (O-Ppt) pUG1004 326,0 4,0 pUG1301 347,4 2,8 pUG2101 79,9 10,2 pUG2301 118,8 '4,1 pUG2701 65,7 3,6. Les tableaux 5 et 6 révèlent que le système promoteur P pour L pu l'expression directe de la B-urogastrone et le système pour l'expression du composé sous forme de prot6ine fusionnée expriment tous deux l'immuno- réactivité de la B-urogastrone dans E. coli. Le tableau 7 révèle que dans le cas de la protéine fusionnée, l'lmmunoréactivité de la B-urogastrone exprimée est presque entièrement localisée dans le cytoplasme. REVENDICATIONS :L 1. Nouveau gène de 13-urogastrone ayant la séquence de nucléotides suivante: ' A A T- A G C G A T T C T G;A G T G- C C C A C-T G 3' T TA T C G C T A A G A C T C A C G G G T G A C T CT C A C G A T- G G C T A TG T G:T C T G C A C A G A G T G C T A C C G A T A A C A G AA A G C- G T G G AC G G T G T T T G C A T G TAC A T C G AA C TG C C A C A A A C G T A C A:T G_ T A G C T T G C T T T GG A T A A A T A C GC G-T G T A A C C GA A A C C T A T T T A T G C G:C A:C AT T GC T T G T G T AG T G G G T T AT A T C G G T G AA A CA C A T C A C C C A A T A TACG CCA CTT C GC T G T C A A T A C.C G:T G A T C T G A A A G C G AC A G T T A T G-G C A- C T- A G A C T T T T G G T G G G A A T T G C G T 3':: A C C A C C C T T A A C G C A 5' 2. Sous-unité du gène défini dans la- revendication 1, la sous-unité ayant la moitié avant de la séquence de nucléotides de la revendication 1 et divisée approximativement à sa moitié. 3. Sous-unité du gène défini dans la revendication 1, la sous-unité ayant la moitié arrière de la séquence de nucléotides de la revendication 1 et divisée approximativement à sa moitié.: 4. Gène tel que défini dans la revendication i qui a un site de reconnaissance d'enzyme de restriction attaché à chacune des extrémités avant et/ou arrière du gène. 5. Gène tel que défini dans la revendication 4 qui a un site de reconnaissance d'enzyme de restriction et un codon départ fourni en amont du gène et/ou un codon arrêt et un site de reconnaissance d'enzyme de restriction fourni- o'. cn 4à a( %n O -' c I- o. a). E-4 E-' 'ó C) n G @ (0 (3 0( E-' d 'ó - n oc E"ó UtD Qo o"CEui,4 C!)E4E1- O V) ciC. " ci -,4 (30 E-i c ci'E Oó, :. a cc-' ó30 E E-4 '-'" -- *E- c e. n uo uo 4.E-o a u 300-' tD 'c g,. -. 0 (! C) CD ciD aé ó E4)OA) 4ó.F E4 óg tD3 0 0óE-'E- ó E- - c- 0 C ' (30 0 3 _3 _.E a Ec' E-4' oaio. E-'E-4'*H CI)w' CD IDL 7. Sous-unité du gène défini dans le revendicetion 6, la sous-unité ayant la moitié avant de la séquence de nucléotides définie dans la revendication 6 et divisée approximativement à sa moitié, la sous-unité ayant en outre un site de reconnaissance d'enzyme de restriction & son extrémité arrière. 8. Sous-unité telle que définie dans la revendication 7 ayant la séquence de nucléotides suivante: ' A A T T CG A A G AT C T G C ATG A A T AGC 3' G C TT C T A G A C G TA C TT A T CG G A T T C T G A G T G C C C A C TG T C T C AC CT A A G A CT C A C G G G T GAC AG A GTG GAT GGC T AT T GT C T G C AC GA C GGT CTA CC G A T A A C A G AC GTG CTG C CA GTT T G C A T G T A C A T C GAA G CT T CG C AA A C G T A C A T G TAG CTT C G A -A GC 3' CTA G 5' 9. Sous-unité du gène défini dans la revendication 6, la sous-unité ayant la moitié arrière de la séquence de nucléotides'définie dans la revendication 6 et divisée approximativement à sa moitié, la sous-unité ayant en outre un site de reconnaissance d'enzyme de restriction à son extrémité avant. 10. Sous-unité telle que définie dans la revendication 9 ayant la séquence de nicléotides suivante: ' A G CT T T G G A T A A A T A C G C G T GT A A C C T A T T T A T G C G C A C A AAC T G T G TA GT G G G T T A T AT C G GT T G A C A C A T C AC CC A AT A T A G C CA GAA C G C T G T C A A T A C C G T G A T CTG CT TG C G AC A G T T AT G G C A C T A G A C A AA T G G T GG G AA TT G -CGT T A A TAG TTT A C C AC C C T T AA CG CA A T T AT C T G A A G A T C T G 3' ACT T C T A G A C C T AG 5' 11. Plasmide recombinant ayant le gène défini dans la revendication 6. 12. Procédé pour préparer le plasmide recombinant tel que défini dans la revendication 11 dans lequel on insère la sous-unité' définie dans la revendication 8 et la sous-unité définie dans la revendication 10 dans un site d'insertion approprié d'un vecteur plasmide approprié. 13. Plasmide recombinant comprenant un vecteur plasmide o est inséré le gène de la Burogastrone défini dans la revendication 6, avec en outre insertion dans le vecteur plasmide en amont du gène de la B-urogastrone un promoteur pour contrôler l'expression du gène et une séquence SD jointe au promoteur. 14. Plasmide recombinant comprenant un vecteur plasmide ayant la séquence de laquatrième paire de bases, et des suivantes, du gène de la Burogastrone défini dans la revendication 6, le vecteur plasmide ayant la combinaison d'un promoteur, une séquence SD et d'un autre gène qui y est inséré en amont du gène de la B-urogastrone. 15. Plasmide recombinant tel que défini dans la revendication 14 o ledit autre gène est un gène de B-lactamase. 16. Plasmide recombinant tel que défini dans les revendications 13 et 14 o le promoteur est FPL ou lac UV5. 17. Plasmide recombinant tel que défini dans les revendications 13 et 14 o le vecteur plasmide est pBR322. 18. Transformant comprenant une cellule hôte ayant un plasmide recombinant capable de l'expression du gène de la B-urogastrone défini dans la revendication 1. 19. Transformant tel que défini dans la revendication 18 o le plasmide recom- binant est le plasmide défini dans la revendication 13. 59 2566799 20. Transformant tel que défini dans la revendication -18 o le plasmide recom- binant est. celui qui est défini dans la revendication 1 4. 21. Transformant tel que défini dans la revendication 18 o-a cellule hôte est E. coli. 22. Transformant tel que défini dans la revendication 18 o la cellule hôte est transformée avec un plasmide recombinant ayant un gêne TR et un gène CI857. 23. Procédé pour produire un transformant en transformant ne cellule hôte avec un plasmide recombinant capable d'exprimer le gène de la 13urogastr. one défini dans la revendication 1. 24. Procédé pour produire la B-urogastrone caractérisé en ce qu'on cultive le transformant défini dans la revendication 18 et en ce -qu'on recueille la B-urogastrone exprimée. -