Brevet FR2565598A1 — publié le 19851213

2565S98 La présente invention est relative à un appareil modulaire permettant d'exécuter les phases essentielles de la culture et de l'analyse cellulaire en faisant appel, éventuellement, à des automates. La culture de cellules procaryotes et encaryotes est pratiquée dans les laboratoires et les industries des domaines principaux suivants: - recherche fondamentale et appliquée concernant les méca- nismes cellulaires (croissance, différenciation, interac- tion) dans des disciplines variées (biologie cellulaire, cancérologie, hormonologie, étude et tests de médicaments, etc...); -recherche et industrie de la biotechnologie en vue de la manipulation et de la sélection cellulaire (clonage d'hy- bridomes, par exemple); - analyse toxicologique d'aliments, d'effluents, de colo- rants ou autres, et - diagnostic médical passant par la préparation de cultures humaines (cytogénétique, cancérologie) ou bactériennes. La culture cellulaire fait généralement appel à deux catégories de méthodes, selon la finalité poursuivie: - d'une part, les méthodes manuelles, universellement emplo- yées à des fins préparatoires et analytiques à petite échelle, dans lesquelles on dispose des matériels princi- paux suivants: enceintes thermostatées (à CO2 ou non), hottes à flux laminaire, récipients de culture constitués par des boites de Petri, des boites multitrous ou des flacons, les mises en culture ou les prélèvements de cellules ou de milieu nutritif se faisant manuellement à la pipette Pasteur ou, plus récemment, à l'aide de dispositifs semi- automatisés à cônes plastiques jetables, tandis que l'analyse morphologique se fait généralement manuellement sous microscope inversé, - d'autre part, les méthodes automatisées dans des bioréac- teurs qui permettent la culture en masse de cellules flottantes à des fins de production industrielle et qui ne sont pas directement concernées par la présente invention. Rappelons que les méthodes manuelles comprennent les phases principales suivantes: 1.- prélèvement cellulaire (par dissociation, repiquage); 2.- mise en culture; 3.- entretien de la culture, en vue d'obtenir notamment la croissance et la différenciation, ce qui nécessite: le stockage dans des conditions définies en tempéra- ture, hygrométrie, % CO2 et pH, le renouvellement du milieu nutritif, et 15. le contrôle de non-contamination et de développement du processus; 4.l'interaction avec la culture cellulaire, par exemple par addition d'un produit approprié ou de cellules; 5.- le prélèvement de cellules en vue de repiquage, ou le prélèvement du milieu nutritif en vue de dosages, et 6.l'analyse morphologique, biochimique, physique ou autre de la culture cellulaire. Les phases susdites constituent en réalité une séquence d'opérations dissociées qui, dans tous les cas, conduit à des variations momentanées de conditions dont il est difficile d'apprécier toutes les conséquences. En fait, on fait transiter lesdits récipients de culture entre des appareils différents: - étuve de stockage des récipients de culture, - hotte à flux laminaire pour l'exécution des manipulations, - observation microscopique dans un but de contrôle ou d'analyse, ce qui conduit au minimum à une augmentation des risques de contamination réciproque (homme - cellules en culture) et 2S65598 conduit aussi à un choc thermique qui perturbe le métabo- lisme cellulaire. De plus, le nombre élevé de récipients de culture à entretenir, l'exigence de les manipuler le moins possible et l'absence de moyens adaptés interdisent d'utiliser toutes les informations contenues dans les cultures. En résumé, les problèmes principaux que posent les méthodes manuelles actuellement utilisées consistent dans: - des risques élevés de contamination à l'encontre des cellules cultivées (encaryotes surtout), à l'encontre des personnels si les cellules sont elles-mêmes pathogènes ou si les manipulations mettent en oeuvre des agents dange- reux (cancérogènes, virus, etc...); - des besoins importants en personnels, pour l'exécution d'un travail généralement fastidieux visant à l'entretien régulier des cultures cellulaires, ce qui entraîne des pertes de temps élevées liées à la dispersion des postes de travail et la difficulté d'optimiser les opérations; - des coûts élevés en pièces spécialisées, en produits consommables (récipients de culture, milieux nutritifs, etc...) et en équipements, qu'il faut multiplier pour réduire les risques de contamination et pour tenir compte de la spécialisation des applications; - une exploitation biologique difficile, notamment liée à la variabilité inévitable de la pratique humaine, aux conditions d'environnement non optimales (chocs thermi- ques, mécaniques et chimiques induits par les manipula- tions), l'impossibilité de suivre et de quantifier les processus biologiques qui se déroulent en permanence dans les cultures et a fortiori d'agir rétroactivement sur eux. Toutefois, des améliorations ont été apportées dans certains domaines. C'est ainsi que: - l'étuve de stockage des cultures et la hotte à flux lami- naire ont été juxtaposées par la Société HERAEUS; - il existe des dispositifs nombreux de prélèvement ou de dilution du milieu cellulaire semi-automatisés; - des Constructeurs comme LEITZ proposent des microscopes contenus dans des enceintes simplement thermostatées et à CO2 mais ne réalisant pas la stérilité ni la constance d'un degré hygrométrique élevé, ce qui s'explique pour ce dernier point par l'incompatibilité avec les composants optiques et électromécaniques; - le Déposant a, pour sa part, proposé un dispositif asso- ciant la culture cellulaire à l'analyse d'image automati- que en temps réel et en continu pour suivre les événements d'interaction cellulaire (MIKROSKOPIE, 1980); - d'autres solutions ont été proposées, toujours dans le sens d'une automatisation, comme celles de WALKER et POZNANOVIC (International Biotechnology Laboratory, Décem- bre 1983) qui ont réalisé un dispositif multichambres dans lequel les conditions sont programmables et s'applique particulièrement aux cellules en suspension, mais ce dispositif n'est pas approprié à: 20. la culture automatisée d'un nombre élevé d'échantillons, l'usage de récipients existants dans le commerce, l'analyse morphologique, le clonage automatique, et se présente donc comme un dispositif très différent de celui que nous proposons. Le but de l'invention est donc d'éliminer les inconvénients des méthodes antérieures de culture cellulai- re, en particulier en ce qui concerne les risques de conta- mination réciproque, les coûts d'investissement et les coûts de fonctionnement. Un autre but de l'invention est-d'intégrer toutes les phases liées à la culture cellulaire et qui, jusqu'à présent, constituent une séquence d'opérations dissociées, tout en pouvant faire appel à des récipients de culture traditionnels que l'on peut rendre réutilisables, sans pour cela exclure l'emploi de récipients spéciaux. Un autre but de l'invention est de se rapprocher de conditions optimales en supprimant totalement les chocs thermiques, ainsi que mécaniques et chimiques, en réalisant des conditions de culture uniformes indépendamment de l'opé- rateur. Un autre but de l'invention est de permettre d'as- servir par des logiciels les conditions d'environnement des cellules, y compris le milieu nutritif, à des paramètres mesurés fréquemment ou même en continu. La présente invention a pour objet un appareil modulaire de culture cellulaire, caractérisé en ce qu'il comporte, dans une même enceinte étanche et à parois iso- thermes: - au moins un dispositif de stockage de récipients de culture, tels que des boîtes multitrous, des flacons ou analogues, - un dispositif de régulation de température, - un dispositif de stérilisation par flux laminaire filtré, en circuit fermé, - un dispositif d'alimentation et de régulation de gaz, tels que de l'air, du CO2, de la vapeur et/ou autre, et en ce que ladite enceinte contient éventuellement au moins un dispositif supplémentaire permettant d'effectuer une quelconque des opérations classiques de culture cellu- laire, ou tout autre opération spécifique, et définissant un poste de travail modulaire choisi en fonction des besoins, en plus du poste modulaire correspondant audit dispositif de stockage. Selon un mode de réalisation préféré de l'appareil modulaire conforme à l'invention, l'enceinte étanche contient également au moins un bras automatique et program- mable, qui est pourvu d'une pince de manipulation ou analo- gue et qui effectue toutes les opérations correspondant à chacun des postes de travail. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appa- reil conforme à l'invention, le dispositif de stockage comporte une pluralité de modules constituant des rayonnages pourvus de glissières le long desquelles coulissent des compartiments étanches contenant des récipients de culture classiques et obturés par des couvercles,légèrement coniques, équipés d'une poignée et de joints toriques d'étanchéité. Selon une disposition préférée de ce mode de réali- sation, l'alimentation en gaz de chaque compartiment se fait automatiquement à l'aide dudit bras manipulateur, qui aspire le gaz à renouveler, ce qui permet d'analyser la composition, et qui injecte le gaz de renouvellement, notamment à travers un système à deux clapets ménagés dans la poignée du couver- cle d'obturation de chaque compartiment et pourvus de deux conduits communiquant avec un conduit d'injection et un conduit d'aspiration, respectivement, portés par le bras manipulateur et activés lors de la préhension de la poignée du couvercle par la pince du bras. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, chaque compartiment est tenu en place par l'intermédiaire d'une baguette antiretour s'interposant entre la paroi du module de rayonnage et celle du comparti- ment lui-même. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'appareil conforme à l'invention, chaque compartiment est transparent et un espace approprié est ménagé au-dessus et au-dessous de chaque compartiment de manière à introduire, éventuellement à l'aide dudit bras manipulateur, un dispositif optique permettant d'effectuer des mesures de colorimétrie, d'opa- cité ou autre. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la liaison entre modules de rayonnage conti- gus se fait par l'intermédiaire de barres verticales, notam- ment en forme de T, qui sont pourvues de tétons d'accrochage pénétrant dans des logements correspondants ménagés dans des ailettes latérales faisant saillie à partir des côtés verti- caux postérieurs de chaque module de rayonnage. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, le dispositif de stockage comporte une pluralité de modules constituant des étuves à parois isothermes et à compartiments étanches et comprenant trois zones principales, à savoir: - une première zone disposée à la partie avant, rassemblant les récipients de cultures dans lesdits compartiments, - une deuxième zone disposée à la partie médiane, rassem- blant les raccordements entre chaque compartiment et les les différentes alimentations en gaz, et - une troisième zone disposée à la partie arrière, rassem- blant les dispositifs d'alimentation en gaz, les disposi- tifs de régulation et les filtres. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits compartiments sont pourvus d'un rebord sur leur face avant et sont appliqués, par collage ou autre, sur une plaque pourvue d'ouvertures, disposées suivant des rangées verticales et ayant des dimensions variées, et elle aussi fixée par collage notamment sur le pourtour de la face avant de chaque étuve, l'alimentation en gaz de chaque compartiment se faisant automatiquement à l'aide d'ergots à billes permettant l'ouverture des vannes d'alimentation lors de la fermeture des compartiments, tandis que l'ouver- ture de ces derniers désactive les vannes d'alimentation. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, les récipients de cultures, notamment du type multitrous, sont rendus solidaires des couvercles des compartiments et constituent des boîtes spéciales à tiroir destinées à coopé- rer avec lesdits ergots d'activation de l'alimentation en gaz au moment de l'introduction de ces boîtes spéciales dans lesdits compartiments. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits dispositifs d'alimentation en gaz concourent dans une chambre de mélange o l'on règle notam- ment la teneur en air, en CO2 et en vapeur d'eau à l'aide de dispositifs de réglage connus en eux-mêmes, chambre dans laquelle coulisse un piston dirigeant le mélange de gaz vers le ou les compartiments sélectionnés. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appa- reil conforme à l'invention, ledit dispositif supplémentaire est constitué par au moins l'un des dispositifs suivants: - un dispositif d'alimentation en milieu nutritif enrichi et d'évacuation du milieu appauvri, - et/ou un dispositif de rinçage et de stérilisation des récipients, - et/ou un dispositif de distribution de milieux nutritifs, - et/ou un dispositif de distribution de substances, notam- ment pharmacologiques, - et/ou un dispositif de distribution de cellules, - et/ou au moins un dispositif d'observation comprenant des optiques photoniques ou autre, notamment acoustiques, cou- plées ou non à-des platines motorisées, ainsi qu'à un ana- lyseur d'images,-à un appareil photographique ou à un magnétoscope, et/ou des dispositifs d'analyse physico-chimique, -et/ou des dispositifs pour repiquage, -et/ou des dispositifs de stockage variés, - et/ou des dispositifs de préparation de récipients de culture, notamment par pulvérisation de substrats appro- priés, tels que du collagène. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appareil confor- rme à l'invention, ledit dispositif d'évacuation du milieu nutri- tif appauvri consiste en un dispositif d'aspiration compre- nant un micro-moteur pas-à-pas qui actionne, par l'intermé- diaire d'un système mécanique réducteur, un piston dans un cylindre fileté à sa base inférieure, autour de laquelle se visse un cône d'aspiration à extrémité effilée et biseautée, une membrane étant serrée entre ce cône et l'embase dudit cylindre et supportée par un joint torique qui assure en même temps l'étanchéité nécessaire. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le cône est relié à deux conduits permettant l'arrivée de fluides de rinçage et de stérilisation de la partie interne du cône après l'opération d'aspiration et d'évacuation du milieu appauvri. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'évacuation du milieu aspiré se fait dans un puits ménagé dans la table de travail de ladite enceinte, lequel puits sert également de reposoir pour le dispositif d'aspiration et est pourvu d'une série de couronnes de conduits, décalés et inclinés dans le sens de l'évacuation, qui sont destinés au rinçage externe, à la stérilisation et au séchage. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appa- reil conforme à l'invention, ledit dispositif d'aspiration coopère avec un dispositif d'alimentation en liquide pourvu d'un raccord auto-obturant en matière souple, notamment en élastomère, qui est soumis au flux laminaire existant à l'intérieur de l'enceinte et dans lequel est introduit ledit cône d'aspiration, tandis que le réservoir d'alimentation est disposé à l'extérieur de l'enceinte et en ambiance froi- de, l'injection de milieu nutritif liquide neuf ou enrichi se faisant par inversion du sens de rotation dudit moteur pas-à-pas. Selon une variante de ce mode de réalisation, l'injection de milieu nutritif enrichi se fait à l'aide d'un dispositif d'injection qui est indépendant dudit dispo- sitif d'aspiration et qui comprend des flacons contenant les liquides à injecter à l'intérieur d'un bloc réfrigérant, ces liquides étant acheminés par un ou plusieurs tuyaux, notamment en élastomère, réunis en faisceau et enveloppés par une gaine isotherme faisant saillie de la base du bloc réfrigérant, le débit de chaque tuyau d'alimentation étant contrôlé par une vanne stérilisable fonctionnant en tout ou rien. Selon une disposition avantageuse de cette varian- te, la partie terminale du faisceau de tuyaux est pourvue d'une gaine de protection anti-contamination dans laquelle est acheminé un jet d'air permanent et à faible pression qui empêche le reflux des particules de liquide, cette gaine anti-contamination et les extrémités desdits tuyaux d'ali- mentation étant inclinés de façon à diriger le liquide d'injection contre la paroi desdites logettes de culture et à éviter l'impact direct contre les cellules qui adhèrent au fond de chaque logette. Selon encore un mode de réalisation préféré de l'appareil conforme à l'invention, celui-ci comporte en outre un micro-ordinateur de pilotage de toutes les opéra- tions, suivant un protocole d'expériences classiques ou spécialement définies en fonction des besoins, et qui assure également le traitement éventuel des données. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions,qui ressortiront de la description qui va suivre. , L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 est une vue en perspective schématique qui montre un mode de réalisation de l'enceinte de l'appareil modulaire selon l'invention, dans laquelle sont visibles plusieurs dispositifs de stockage des cultures cellulaires conformes à l'invention (pour des raisons de simplifica- tion on n'a pas représenté les dispositifs de régulation thermique, de stérilisation et d'alimentation gazeuse ainsi que les différents dispositifs supplémentaires pou- vant enrichir l'enceinte et constituant autant de postes de travail modulaires connus en eux-mêmes); - la figure 2 est une vue schématique en coupe transversale de l'appareil modulaire selon l'invention qui montre en particulier les dispositifs de régulation thermique et de stérilisation du flux laminaire, notamment vertical, qui ne sont pas représentés à la figure 1, ainsi qu'un bras manipulateur automatique pourvant également équiper l'en- ceinte; - la figure 3 montre une vue en perspective d'un mode de réalisation du dispositif de stockage de récipients de culture conformément à l'invention; - la figure 4 montre une vue en coupe longitudinale d'un compartiment étanche qui peut être glissé dans le dispo- sitif de stockage représenté à la figure 3 et qui contient notamment une boîte de culture et le couvercle assurant l'étanchéité, conformément à l'invention; - la figure 5 montre les détails d'un couvercle associé aux compartiments de figure 4 pouvant coopérer avec la pince d'un bras manipulateur automatique et programmable; - les figures 6 et 7 se réfèrent à un autre mode de réali- sation dudit dispositif de stockage et à une variante des récipients de culture qui peuvent être alimentés en gaz de la partie arrière au lieu de la partie avant; - les figures 8 à 10 montrent le dispositif d'aspiration/ injection du milieu nutritif selon l'invention, et - les figures 11 et 12 montrent le dispositif d'injection du milieu nutritif neuf destiné à coopérer avec le dispo- sitif représenté aux figures 3 et 9 utilisé comme dispo- sitif d'aspiration seulement (à savoir, sans coopérer avec le dispositif d'alimentation en liquide de la figure ) Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les dispositifs de stockage 1, représentés schéma- tiquement à la figure 1 et contenus dans une enceinte 2 dont les parois isothermes 3 sont de préférence en matière métallique ou plastique, notamment transparente en face avant, contiennent des récipients de culture 4 de dimensions variées. L'ensemble des postes de travail modulaires qui, comme précédemment décrit, peuvent éventuellement enrichir l'enceinte 2, en outre desdits dispositifs de stockage 1, au fur et à mesure de l'augmentation des besoins, est soumis à un flux laminaire stérile, en circuit fermé, qui de préfé- rence est descendant (mais il pourrait être également ascen- dant ou horizontal), qui est repris par les perforations 5 de la table de travail 6 et qui est chauffé et régulé par le bloc de résistance 7 (cf. la figure 2). Les déperditions thermiques sont réduites par les parois isothermes 3, y compris la face avant de l'appareil qui est réalisée par exemple en double parois de verre ou de matière plastique. En fonctionnement normal l'enceinte 2 est étanche et l'accès manuel peut se faire par des passages équipés de gants de caoutchouc 8. Pour procéder à des manipulations, on peut également ouvrir le panneau vitré 9 ou utiliser un sas d'in- troduction (non représenté sur la figure 2). Le flux d'air chaud garantit ainsi des conditions thermiques homogènes dans tous les récipients, mais aussi sur le plateau de tra- vail 6. Une turbine centrifuge 11 assure la circulation des gaz. La stérilité est assurée par la boîte à filtre 12. Dans ces conditions, l'ensemble des dispositifs de stockage 1, est baigné par un flux stérile non turbulent qui tend à éliminer, de façon connue, d'éventuels germes de contamination. On peut d'ailleurs inclure dans le circuit de stérilisation par flux laminaire, et très avantageuse- ment dans le circuit ascendant 13, un dispositif de stérili- sation 14 par rayonnement ultraviolet. La figure 2 montre également un bras manipulateur B qui peut éventuellement équiper l'enceinte 2 et qui est de préférence du type antropomorphique, mais qui peut être également du type à mouvement linéaire et à rotation. En fonctionnement normal, lorsqu'un récipient de culture 4 est ouvert, tous les autres sont fermés, ce qui limite considérablement les risques de diffusion d'une contamination. Par ailleurs, une diffusion accidentelle de milieu nutritif liquide (pouvant éventuellement contenir des cellules) sur un poste de travail p, ne peut conduire à la diffusion d'une contamination qui en résulterait, parce qu'un dispositif de recueil des liquides versés accidentellement sur le plateau de travail est associé à chaque poste p: en alternative, on peut utiliser un dispositif unique en forme d'entonnoir (non représenté) placé au- dessous de la table et pourvu d'un orifice latéral de communication avec le circuit 13. La figure 4 rmontre des récipients de culture, constitués en particulier par des boites multitrous 4a, qui sont introduits dans des compartiments 16 constitués très simplement par des boîtes à ouverture frontale réalisées par moulage, par exemple en matière plastique trans- parente telle que celle utilisée pour les récipients eux-mmoes. Ces boîtes 16 sont empilées et collées, ou simple- ment placées, dans un dispositif de stockage constitué par exemple par un simple rayonnage R en métal (ou en matière plastique) qui se présente comme une boîte parallélépipédi- que ouverte sur la face avant et sur la face arrière et comportant des glissières 17 (cf. la figure 3). Ses dimen- sions dépendent de la taille des compartiments 16. Ces derniers (cf. la figure 4) comportent un couvercle équipé de joints toriques d'étanchéité 19. Ce couvercle est légè- rement conique et est pourvu d'une poignée 20 pour facili- ter son introduction à la main ou par ledit bras manipula- teur automatique B. Si le réglage du pH n'est pas nécessaire, par exemple en raison de l'utilisation de milieu tamponné, le couvercle du compartiment est un simple bouchon 18. Dans le cas contraire (qui est actuellement le cas général en culture encaryote) le couvercle est de type spécial (cf. la référence 18a de la figure 6) pour permettre le recyclage du pH qui est obtenu par une injection d'un mélange air + CO2 (à quelques % de CO2). Dans ce cas (cf. la figure 5), la pince 21 du bras manipulateur B a une course de déplace- ment qui lui permet de saisir aussi bien les Récipients de culture 4a que les couvercles 18a,ces derniers étant évidés et présentant des encoches frontales 22 (cf. la figure 6). Dans la figure 5 les couvercles 18a sont pourvus d'un système à deux clapets 30 dont les orifices externes 23 sont coniques, les orifices internes 24 étant orientés de manière à réaliser un balayage efficace de gaz dans le compartiment, après introduction de l'injecteur et de l'as- pirateur 27a, 27b, solidaires de la pince 21, dans les orifices externes 23. En bout de course les clapets 30 sont ouverts. Suivant le programme et le résultat de la mesure, le CO2 est ajouté seul ou avec tout autre gaz nécessaire (vapeur d'eau, azote, etc...) à partir d'un dispositif d'alimentation filtré en gaz (l'injection et l'aspiration étant commandées par un micro-ordinateur qui pilote d'ailleurs éralement toutes les opérations suivant le protocole d'expériences classiques prédéfinies). Ainsi, sans ouvrir les couvercles, il est possible de contrôler et réguler autant de fois que nécessaire chacune des boites, le cycle complet qui comprend la connexion, l'aspiration,la mesure et l'injection, prenant seulement quelques secondes. Par ailleurs, le volume du compartiment constitue une réserve gazeuse suffisante, vis- à-vis de la consommation cellulaire, pour limiter les besoins à quelques cycles par jour pour chacun des comparti- ments. Lorsque le récipient de culture 4a doit être extrait du compartiment 16, par exemple en vue d'un-changement de milieu, la pince 21 est amenée par le bras manipulateur B selon une position X-Y-Z définie par le programme. La pince 21 est engagée dans le couvercle 18a, puis serrée sur les faces latérales desdites encoches frontales 22. Par un mouvement de retrait de la pince 21 le couvercle 18a est retiré, puis placé dans un logement vide du dispositif de stockage spécialement réservé à cet usage. La pince 21 revient en position et pénètre dans le compartiment 16, saisit la boîte multitrous 4a (qui, rappelons-le, n'a ni couvercle ni bou- chon et qui peut être remplacée, soit par une bouteille, soit par des bottes de Petri), exerce un mouvement de retrait et place le récipient 4a sur le poste de travail correspon- dant. Apres l'exécution de l'opération, le cycle se déroule à l'inverse et se termine par une injection de gaz parti- culier destiné à chasser le gaz de l'enceinte qui s'est introduit par suite de l'ouverture du compartiment. Les compartiments 16 sont fixes rigidement par une baguette anti- retour 25, qui s'interpose entre la paroi du dispositif de stockage R et la paroi de chaque compartiment 16 en coulis- sant dans des rainures ménagées dans ces parois (cf. toujours la figure 6). Lesdits rayonnages R s'accrochent sur des barres verticales 26 (cf. la figure 4) qui sont pourvues de tétons 27 pénétrant dans des logements correspondants 28 ménagés dans des ailettes latérales 29 faisant saillie des côtés verticaux postérieurs de chaque rayonnage. La fixation se fait à l'aide d'un système d'accrochage rapide classique, type Zeus par exemple. Lorsque le dispositif de stockage 1 est réalisé par collage des compartiments 16 entre eux, une plaque perforée est collée sur la face arrière de la boîte ouverte R. Pour obtenir une bonne assise des dispositifs de stockage R, ceux-ci disposent de pattes inférieures (non représentées) et éventuellement de pattes supérieures si leur taille le justifie. Précisons en passant que, étant donné que les récipients contenant les cellules peuvent être constitués non seulement par des boites multitrous 4a ou des bouteilles, mais également par des boîtes de Petri, il va de soi que dans ce dernier cas un support spécial doit être employé: de toutes façons, dans chaque cas l'évaporation est très faible dans le compartiment étanche 16. Une forme modifiée de dispositif de stockage est constituée par une étuve étanche E à compartiments 16a schématisée sur la figure 3 et comprenant trois zones prin- cipales: - une zone A en face avant, qui rassemble les récipients de culture et qui peut être avantageusement modulaire pour tenir compte de formats variés de récipients de culture; - une zone intermédiaire B rassemblant les raccordements des compartiments 16a aux différentes alimentations, et - une zone C, disposée à la partie arrière, comprenant le géné- rateur de gaz, les dispositifs de régulation et les fil- tres. Dans cette zone C, à l'intérieur des parois iso- thermes 31 et thermostatées, on distingue un ensemble de filtres 32, une pompe destinée à forcer la circulation par l'intermédiaire d'un piston 33 coulissant dans une chambre de mélange o l'on règle la teneur en air, en CO2 et en eau à l'aide de dispositifs classiques,schématiquement représentés, 34, 35, 36-. Les compartiments 16a sont connectés à deux groupes de tuyaux destinés à l'alimentation et à l'évacua- tion, respectivement. Les compartiments 16a, représentés sur la figure 7, sont en métal ou-en matière plastique mou- lée et sont fixés par collage sur le panneau avant isotherme 37 qui a été évidé par matriçages 38 selon des dimensions adaptées aux récipients de culture. Le panneau avant 37 est lui-même collé de façon étanche sur le pourtour de la face avant défini par coopération des parois de l'étuve E. Les compartiments 16a présentent, par rapport aux compartiments 16 décrits précédemment et représentés sur la figure 5,un rebord sur le pourtour antérieur pour être eux aussi collés, notamment sur le panneau 37, et peuvent conte- nir des bottes multitrous classiques: dans ce cas les couvercles sont également identiques à ceux décrits plus haut. On peut avantageusement utiliser des boîtes spéciales telles que représentées-sur la figure 7 qui combinent un couvercle étanche et isotherme et qui se présente sous forme de bottes à tiroirs 40. Chaque botte spéciale 40 est alors introduite à la main, ou par le bras manipulateur, dans le compartiment 16a et l'étanchéité est assurée également par un joint torique. L'alimentation en gaz peut se faire par la face avant et avec l'utilisation du bras manipulateur, comme décrit précédemment. En alimentation continue de gaz, l'ouverture et la fermeture des circuits de gaz est déclenchée par l'enfoncement de la botte 40 et inversement, par exemple selon un disposi- tif à bille qui assure également la fermeture mécanique. L'un des buts principaux de l'invention étant d'au- tomatiser les opérations de prélèvement et d'injection de milieux liquides ou encore de cellules, il existe des dispo- sitifs commerciaux qui peuvent être valablement utilisés, en particulier ceux qui font appel à des cônes jetables. Le choix entre un dispositif réutilisable ou un autre faisant appel à des composants consommables dépend directement du débit du système. Avec un nombre de récipients de culture élevé, par exemple de l'ordre de 120 boîtes à 96 trous ou logettes chacune,on peut consommer plusieurs milliers de cônes par jour. Le dispositif réutilisable peut traiter sans diffi- culté cet ensemble des plus de 10 000 logettes dans la jour- née à raison d'un cycle moyen de 6 secondes comprenant l'aspiration du milieu appauvri, la vidange, le rinçage, la stérilisation et le remplissage en milieu neuf. Cepen- dant, si la cadence l'exige, il est possible de disposer en parallèle plusieurs dispositifs d'aspiration. Le dispositif d'aspiration proposé et représenté aux figures 8 et 9, se rapproche d'un système à piston. Il comprend un micro- moteur pas-à-pas 41 actionnant, par l'intermédiaire d'un système mécanique réducteur, un piston 42 dans un cylindre 43. Un cône d'aspiration 44 en métal, acier inoxydable, aluminium, en verre ou même en plastique (Téflon), se visse sur le cylindre 43. Une membrane 45 est serrée entre le cône 44 et l'embase du cylindre 43. Un joint torique en métal ou matière plastique 46 facilite le montage de la membrane 45, tout en assurant l'étanchéité nécessaire. * L'extrémité du cône 44 est effilée et en biseau, son diamètre extrême est, par exemple, de l'ordre de 2 mm. Deux conduits 47 permettent l'arrivée de fluides de rinçage (eau stérile) et de stérilisation (vapeur d'eau à haute tem- pérature, formaline, alcool, etc...). L'évacuation se fait dans un puits 48, ménagé dans la table de travail de l'en- ceinte, qui sert également de reposoir pour le dispositif mais aussi permet le rinçage externe, la stérilisation et le séchage par des couronnes de trous inclinés dans le sens de l'évacuation. En fonctionnement le bras manipulateur dépose préalablement le récipient de culture sur le poste de travail. Dans le cas le plus simple, ce dernier n'est équipé que de simples butées (non représentées) de calage du réci- pient destinées à placer tous les récipients dans la même position au millimètre près. Dans ce cas, le bras manipula- teur assure à la fois le placement de la boîte, les déplace- ments du dispositif d'aspiration et du dispositif d'injec- tion, si ceux-ci sont séparés. Notons à ce sujet que le dis- positif d'aspiration peut également servir à l'injection comme cela est représenté sur la figure 10. Le dispositif permet de raccorder le cône 44 à une alimentation en liquide par l'intermédiaire d'un raccord 49 autoobturant en matière souple, notamment en élastomère. Le cône 44, en pénétrant dans ce raccord auto-obturant, écarte les parois internes initialement accolées du-matériau souple et l'extrémité du cône entre en contact avec le liquide à aspirer. Le disposi- tif de figure 10 comprend également un bouchon isotherme qui est raccordé au réservoir 50 placé en ambiance froide 4 C et se trouve placé à l'extérieur de l'enceinte représentée à la figure 1, tandis que le raccord 49 est soumis au flux laminaire stérile existant à l'intérieur de cette enceinte, en sorte que la contamination ne peut se produire sur-les traces résiduelles du milieu nutritif. Le cycle complet d'un changement de milieu est le suivant. Le récipient déposé et centré n'a pas de couvercle (dans le cas d'une organisation très simple de l'enceinte à rayonnage susdite, le couvercle peut exister et doit alors être enlevé par le bras manipulateur). Le bras manipulateur B saisit le dispositif d'injection préalablement rincé (et, si possible, séché par injection d'air ou vapeur sèche) et le place dans la logette du récipient correspondant au programme de l'ordinateur, le moteur 41 exécute et actionne le piston 43 vers le haut; la mnembrane 45 est déprimée dans le même sens et transmet l'aspiration au cône 44. Le volume aspiré, de l'ordre du millilitre n'entre jamais en contact avec le piston 43. Le cône 44 est soulevé et replacé dans le puits 48, le piston 43 est actionné vers le bas et chasse le liquide. Une injection d'eau par l'intermédiaire du conduit 47 rince l'intérieur du cône. Un jet d'air ou de vapeur sèche, toujours introduit par l'intermédiaire du conduit 4, stérilise l'intérieur de ce -cne 44 dont la partie extérieure est également soumise simultanément au mnme traitement par l'intermédiaire des orifices du puits 48. Comme déjà dit, l'injection de milieu neuf peut se faire par le même dispositif d'aspiration et d'injection des figures 8 et 9 en se connectant sur le dispositif d'alimen- tation représenté sur la figure 10. On comprend aisément que de cette manière on peut injecter différents liquides, ce qui rend ce système très modulaire. Dans d'autres cas, il est plus intéressant de dissocier la fonction d'aspiration et d'injection,en par- ticulier pour gagner du temps et réduire les risques de- dissémination de contamination qui pourraient être créés par l'emploi d'un dispositif unique. A cet effet, les figures 11 et 12 représentent un dispositif d'injection comprenant une arrivée de liquides acheminés par un ou plusieurs tuyaux métalliques t, par exemple six, gainés par un conduit isotherme 51. En 52 on représente une gaine de protection anticontamination qui achemine un jet d'air j permanent et à faible pression qui empêche le reflux de particules apportées au contact des tuyaux par des remous éventuels. L'inclinaison donnée aux tuyaux t permet de diri- ger le flux contre les parois des logettes et évite l'impact direct contre les cellules adhérentes du fond de chaque logette. Des fibres optiques 53 et 54, dirigées vers la surface, permettent de repérer la montée du niveau par un procédé sans contact. La mise en rapport des logettes préalablement vidées et de ce dispositif d'injection peut se faire, soit par le bras manipulateur B,qui transporte le dispositif d'injection rendu mobile, soit par déplacement de la boite sous ce dispositif rendu fixe. Il est également aisé de - coupler le dispositif d'aspiration des figures 8 et 9 au dispositif d'injection des figures 11 et 12. Les flacons 55 contenant les produits à injecter peuvent être reliés à des systèmes de vannes stérilisables 56 fonctionnant en tout ou rien, par exemple par écrasement des tuyaux d'alimentation en élastomère. Une arrivée 57 d'air stérile à basse pression met, de façon connue en soi, les flacons 55 en pression à l'intérieur de l'enceinte réfrigérée 58. En fonctionnement, le récipient de culture déplacé par le bras manipulateur B met une logette déterminée sous le dispositif d'injection, le clapet ou les clapets 56 correspondants au programme s'ouvrent, la logette se remplit et,dès que le niveau fixé est atteint, le clapet ou les clapets 56 sont refermés. - Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de réali- sation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à 1 'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 2565598. REVENDICATIONS 1.- Appareil modulaire de culture cellulaire, caractérisé en ce qu'il comporte, dans une même enceinte étanche (2) et à parois isothermes (3): au moins un dispositif de stockage (1, R, E) de récipients de culture, tels que des boîtes multitrous, des flacons ou analogues, - un dispositif de régulation de température (7), - un dispositif de stérilisation (11, 12, 13, 14) par flux laminaire filtré, en circuit fermé, - un dispositif d'alimentation et de régulation de gaz, tels que de l'air, du CO2, de la vapeur et/ou autre, et en ce que ladite enceinte contient éventuellement au moins un dispositif supplémentaire permettant d'effectuer une quelconque des opérations classiques de culture cellu- laire, ou toute autre opération spécifique, et définissant un poste de travail modulaire choisi en fonction des besoins, en plus du poste modulaire correspondant audit dispositif de stockage (1, R, E). 2.- Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que, l'enceinte étanche contient également au moins un bras automatique(B)et programmable, qui est pourvu d'une pince de manipulation (21) ou analogue et qui effectue toutes les opérations correspondant à chacun des postes de travail. 3.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que, le dispositif de stockage comporte une pluralité de modules constituant des rayonnages (R) pourvus de glissières (17) le long desquelles coulissent des compartiments (16) étanches contenant des récipients de culture classiques (4a) et obturés par des couvercles,légèrement coniques (18, 18a) équipés d'une poi- gnée (20) et de joints toriques d'étanchéité. 4.- Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'alimentation en gaz de chaque compartiment se fait automatiquenent à l'aide dudit bras manipulateur (B), qui aspire le gaz à renouveler, ce qui permet d'en analyser la composi- tion, et qui injecte le gaz de renouvellement, notamment à travers un système à deux clapets (30) ménagés dans la poignée (20) du couvercle d'obturation (18a) de chaque compartiment (16) et pourvus de deux conduits communiquant avec un conduit d'injection (27a) et un conduit d'aspiration (27b), respectivement, portés par le bras manipulateur (B) et activés lors de la préhension de la poignée (20) du cou- vercle (16) par la pince (21) du bras (B). 5.- Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que, chaque compartiment (16) est tenu en place par l'intermédiaire d'une baguette anti-retour (25) s'interpo- sant entre la paroi du module de rayonnage (R) et celle du compartiment (16) lui-même. 6.- Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que, chaque compartiment (16) est transparent et un espace approprié est ménagé au-dessus et au-dessous de cha- que compartiment de manière à introduire, éventuellement à l'aide dudit bras manipulateur (B), un dispositif optique permettant d'effectuer des mesures de colorimétrie, d'opa- cité ou autre. 7.- Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que, la liaison entre modules de rayonnage (R) contigus se fait par l'intermédiaire de barres verticales (26), notamment en forme de T, qui sont pourvues de tétons d'accrochage (27) pénétrant dans des logements correspon- dants (28) ménagés dans des ailettes latérales (29) faisant saillie à partir des côtés verticaux postérieurs de chaque module de rayonnage (R). 8.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que, le dispositif de stockage comporte une pluralité de modules constituant des étuves (E) à parois isothermes et à compartiments étanches (16a) et comprenant trois zones principales (A, B, C), à savoir; - une première zone (A),disposée à la partie ayant, rassemblant les récipients de cultures dans lesdits compartiments (16a), une deuxième zone (B),disposée à la partie médiane, ras- semblant les raccordements entre chaque compartiment (16a) et les différentes alimentations en gaz, et - une troisième zone (C), disposée à la partie arrière, rassemblant les dispositifs d'alimentation en gaz, les dispositifs de régulation et les filtres. 9.- Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que, lesdits compartiments (16a) sont pourvus d'un rebord sur leur face avant et sont appliqués, par collage ou autre, sur une plaque (37) pourvue d'ouverture (38) disposées suivant des rangées verticales et ayant des dimen- sions variées, et elle aussi fixée par collage notamment sur le pourtour de la face avant de chaque étuve (E), l'ali- mentation en gaz de chaque compartiment (16a) se faisant automatiquement à l'aide d'ergots à billes permettant l'ou- verture des vannes d'alimentation lors de la fermeture des compartiments (16a), tandis que l'ouverture de ces derniers désactive les vannes d'alimentation. 10.- Appareil selon la revendication 9, caractérisé en ce que, les récipients de cultures, notamment du type multitrous, sont rendus solidaires des couvercles des compartimnEts (16a) qui constituent ainsi des boîtes spéciales à tiroir (40) destinées à coopérer avec lesdits ergots d'activation de l'alimentation en gaz au moment de l'introduction de ces boîtes spéciales (40) dans lesdits compartiments (16a). 11.- Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que, lesdits dispositifs d'alimentation en gaz concourent dans une chambre de mélange o l'on règle notam- ment la teneur en air, en CO2 et en vapeur d'eau à l'aide des dispositifs de réglage (34, 35, 36) connus en eux-mêmes chambre dans laquelle coulisse un piston (33) dirigeant le mélange de gaz vers le ou les compartiments (16a) sélec- tionnés. 12.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que, ledit dispositif sup- plémentaire est constitué par au moins l'un des dispositifs suivants: - un dispositif d'alimentation en milieu nutritif enrichi et d'évacuation du milieu appauvri, - et/ou un dispositif de rinçage et de stérilisation des récipients, - et/ou un dispositif de distribution de milieux nutritifs, - et/ou un dispositif de distribution de substances, notam- ment pharmacologiques, - et/ou un dispositif de distribution de cellules, - et/ou au moins un dispositif d'observation comprenant des optiques photoniques ou autre, notamment acoustiques, couplées ou non à des platines motorisées, ainsi qu'à un analyseur d'images, à un appareil photographique ou à un magnétoscope, - et/ou des dispositifs d'analyse physico-chimique, - et/ou des dispositif pour repiquage, - et/ou des dispositifs de stockage variés, - et/ou des dispositifs de préparation de récipients de culture, notamment par pulvérisation, de substrats appro- priés, tels que du collagène. 13.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 12, caractérisé en ce que, ledit dispositif d'évacuation du milieu nutritif appauvri consiste en un dispositif d'aspiration comprenant un micro-moteur pas-à-pas (41) qui actionne, par l'intermédiaire d'un système mécani- que réducteur, un piston (42) dans un cylindre (43) fileté à sa base inférieure, autour de laquelle se visse un cène d'aspiration (44) à extrémité effilée et biseautée,une membrane (45) étant serrée entre ce cône (44) et l'embase dudit cylindre (43) et supportée par un joint torique (46) qui assure en même temps l'étanchéité nécessaire. 14.- Appareil selon la revendication 13, caractérisé en ce que, le cône (44) est relié à deux conduits (47) per- mettant l'arrivée de fluides de rinçage et de stérilisation de la partie interne du cône (44) après l'opération d'aspi- ration et d'évacuation du milieu appauvri. 15.- Appareil selon la revendication 14, caractérisé en ce que, l'évacuation du milieu aspiré se fait dans un puits (48) ménagé dans la table de travail ( 6) de ladite enceinte, lequel puits (48) sert également de reposoir pour le dispositif d'aspiration et est pourvu d'une série de couronnes de conduits (39), décalés et inclinés dans le sens de l'évacuation, qui sont destinés au rinçage externe, à la stérilisation et au séchage. 16.- Appareil selon la revendication 13, caractérisé en ce que, ledit dispositif d'aspiration coopère avec un dispositif d'alimentation en liquide pourvu d'un raccord auto-obturant (49) en matière souple, notamment en élasto- mère, qui est soumis au flux laminaire existant à l'inté- rieur de l'enceinte et dans lequel est introduit ledit cône d'aspiration (44), tandis que le réservoir d'alimentation (50) est disposé à l'extérieur de l'enceinte et en ambiance froide, l'injection de milieu nutritif liquide neuf ou enri- chi se faisant par inversion du sens de rotation dudit moteur pas-à-pas (41). 17.- Appareil selon la revendication 13, caractérisé en ce que, l'injection de milieu nutritif enrichi se fait à l'aide d'un dispositif d'injection qui est indépendant dudit dispositif d'aspiration et qui comprend des flacons (55) contenant les liquides à injecter à l'intérieur d'un bloc réfrigérant (58), ces liquides étant acheminés par un ou plusieurs tuyaux (t), notamment en élastomère, réunis en faisceaux et enveloppés par une gaine isotherme (51) faisant saillie de la base du bloc réfrigérant (58), le débit de chaque tuyau (t) d'alimentation étant contrôlé par une vanne stérilisable (56) fonctionnant en tout ou rien. 18.- Appareil selon la reyendication 17, caractérisé en ce que, la partie terminale du faisceau de tuyaux (t) est pourvue d'une gaine de protection anti-contamination (52) dans laquelle est acheminé un jet d'air (j) permanent etd à faible pression qui empêche le reflux des particules de liquide, cette gaine anti-contamination (52) et les extré- mités desdits tuyaux d'alimentation (t) étant inclinés de façon à diriger le liquide d'injection contre la paroi des- dites logettes de culture et à éviter l'impact direct contre les cellules qui adhèrent au fond de chaque logette. 19.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte également un dispositif de recueil des liquides versés accidentellement sur un poste de travail, qui est constitué de préférence par un entonnoir unique placé au-dessous de la table de travail et qui est pourvu d'un orifice latéral de communication avec le circuit de stérilisation par flux laminaire. - 2D.- Appareil selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 19, caractérisé en ce que celui-ci comporte en outre un micro-ordinateur de pilotage de toutes les opéra- tions, suivant un protocole d'expériences classiques ou spécialement définies en fonction des besoins, et qui assure également le traitement éventuel des données.