Brevet FR2566995A1 — publié le 19860110

I La présente invention concerne un procédé pour la production de lignées haploïdes doublées de céréales. Une plante haploïde doublée par définition est une plante qui provient d'une déviation du processus normal de reproduction sexuée. Dans les plantes à fleurs, le cycle végétatif est appelé 2n (diploïde), chaque cellule de l'organisme se divise par mitose. La mitose est un processus par lequel une cellule se divise pour donner 2 cellules filles qui portent chacune la même information génétique que la cellule mère et également le même nombre de chromosomes, unité d'information héréditaire. Pour initier le cycle sexuel, il est nécessaire d'avoir un processus de réduction du nombre des chromosomes (la méiose) pour donner naissance à des cellules gamétiques portant n chromosomes (nombre haploïde). Dans les plantes à fleurs, la reproduction sexuée implique une double fécondation. Une cellule mâle s'unit avec une ovule pour former un zygote qui produit l'embryon, en restaurant le nombre de chromosomes somatiques. Une autre cellule mâle s'unit avec les 2 noyaux polaires, en général fusionnés à un noyau central. La cellule résultante triploide conduit à l'endosperme. Dans certains cas, cette double fécondation ne se produit pas et l'une des deux cellules gamétiques se divise seule pour donner lieu a une plante haploïde. Ces plantes haploïdes sont très intéressantes dans le domaine génétique et dans les procédés de croisement car, après le doublement chromosomique, les informations héréditaires seront identiques sur les deux chromosomes de chaque paire. De cette façon, l'information génétique sera fixée et les haploïdes doublés seront des outils permettant de simplifier et d'accélérer les processus de croisement. Dans le cadre de la présente description, la terminologie "haploïde doublé" désignera une lignée diploïde de blé descendant de la phase haploïde de cette espèce (gamètes mâles ou femelles). Les recherches sur l'haplodiploldisation des plantes supérieures ont été marquées au cours des 15 dernières années par plusieurs découvertes qui ont ouvert des étapes importantes dans ce domaine. Les tra- vaux de Guha et Maheshwari (1964) sur la culture d'anthrères in vitro ont incontestablement provoqué un très grand nombre de recherches sur cette technique d'obtention d'haploïdes à partir des gamètes males. A la même époque les croisements interspécifiques et intergénériques, ainsi que des systèmes génétiques inducteurs, étaient déjà reconnus comme inducteurs d'haploïdes, soit qu'ils provoquaient une parthénogénèse, une semigamie ou une élimination chromosomique (Hougas et Peloquin, 1957; Turcotte et Feaster, 1963; Kasha et Kao, 1970; Chase, 1949). Le cas de l'orge est, à ce titre, tout à fait remarquable puisque le croisement interspécifique de cette espèce avec Hordeum bulbosum a ouvert une voie très efficace d'obtention et d'utilisation des haploides doublés en sélection (Kasha et Reinbergs, 1980). - Puis les travaux de San Noeum (1976) sur l'orge ouvraient une autre étape, celle de la gynogénèse in vitro. Ainsi, ce sont les techniques de culture in vitro appliquées aux gamétophytes, cette "génération oubliée" (Heslop-Harrison, 1980) qui ont permis d'étudier au niveau haploïde et à l'état homozygote qui en découle, le plus grand nombre d'espèces. Elles continuent de marquer profondément les recherches en génétique végétale, non seulement en ce qui concerne les possibilités remarquables qu'elles ouvrent pour la sélection, mais également parce qu'elles sont source d'une nouvelle variabilité génétique (Larkin et Scowcroft, 1981). Cependant, si on analyse les résultats concrets obtenus par l'utilisation de l'haplodiploidisation en amélioration des plantes, on doit reconnaître encore aujourd'hui que cette méthode n'a donné de résultats pratiques que chez très peu d'espèces. On en trouve en effet chez le mais, la pomme de terre, l'orge et le cotonnier, pour les techniques n'utilisant pas l'androgénèse in vitro. Quant aux haploïdes doublés androgénétiques déjà inscrits comme cultivars, on peut en citer quelques uns chez l'asperge, la pomme de terre, le colza, le riz, le blé, l'hévéa et le tabac (Loo Chiwei, 1982). 2 566995 Les causes de cette lenteur du transfert de l'haplo- méthode au niveau de l'application sont à rechercher, en partie, dans les limites actuelles des techniques de cultures in vitro qui sont: a) la grande spécificité génotypique de réponse à la culture in vitrQ; b) les faibles pourcentages de microspores ou de cellules du sac embryonnaire se dédifféren- ciant pour donner naissance à des-embryons et c) la perte importante de ces embryons quand on veut les conduire vers une organogénèse complète. Le blé tendre fait donc partie de ces espèces o l'effort déployé est très important, étant donné l'enjeu, pour surmonter ces problèmes. Dans ce contexte les premiers résultats obtenus dans le cadre de la présente invention ouvrent une nouvelle voie d'obtention d'haploides doublés in vivo chez le blé grâce à l'utilisation d'un agent chimique d'hybridation (A.C.H.>. Ce nouveau procédé se caractérise, en effet, par une haploîdie induite in vivo à une fréquence suffisamment élevée pour en envisager l'application, cas qui jusqu'à présent ne s'était pas présenté (Lacadena, 1974). La présente invention concerne un procédé d'obtention d'haploides doublés de céréales, dans lequel on traite les plantes par un agent chimique d'hybridation;après la période de pollinisation on prélève les caryopses anormaux et on régénère les plantes à partir des embryons de caryopses anormaux et on réalise l'auto-fécondation de chacune des plantes régénérées pour obtenir des semences correspondant à des plantes homozygotes, dans les générations suivantes si cela est nécessaire. Parmi les céréales qui doivent être traitées, il faut citer notamment: le blé dur, le blé ordinaire, l'orge, le tritical, l'avoine, le sarrasin, le mals, le riz, le sorgho et le seigle. Les agents chimiques d'hybridation (ci-après A.C.H.) utilisables dans le cadre de là présente invention sont plus particulièrement choisis parmi les composés décrits dans les brevets français n 78 06494 et 78 21842. Il s'agit plus particulièrement du composé de l'acide 1-(4-chlorophényle)-4-oxo-6-méthylpyridazinone- 3-carboxylique et ses sels, en particulier le sel de potassium. L'époque de traitement ainsi que le dosage des A.C.H. pourront varier suivant la nature de 1'A.C.H. et de la céréale traitée,ainsi pour le blé le traitement sera effectué de préférence à un stade de croissance compris entre 5 et 9 avec une dose de l'ordre de 0,04 à 10 kg/ha de principe actif, et de préférence à une dose de 0,1 à 1 kg/ha. Une caractéristique importante du procédé est le fait que les plantes traitées doivent présenter dans leur voisinage des plantes non traitées afin que le procédé puisse être mis en oeuvre. Les caryopses anormaux sont nettement visibles, en particulier sur le blé car il présente un aspect plat et fripé; ces caryopses anormaux présentent, en général, un albumen réduit et possèdent un embryon, dont le point de départ est une cellule haplolde. De préférence, les plantes sont régénérées par culture in vitro de l'embryon prélevé des caryopses anormaux sur un milieu de régénération R9. Les plantes obtenues sont autofécondées par des procédés connus tels que l'ensachage des épis afin d'obtenir des semences correspondant à des plantes homozygotes. Les lignées pures fixées ainsi obtenues sont utiles comme outil de recherche, mais également comme parents d'hybrides. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages du procédé selon la présente invention. EXEMPLE 1 Le matériel était constitué de 240 lignées F'3 de blé tendre d'hiver installées au champ obtenues après deux années de sélection dans un programme de sélection récurrente multilocale. La variabilité génétique intra-lignées et inter-lignées de ces F'3 était très importante car la population servant de matériel de base provenait d'un croisement pyramidal à 16 parents. Ces lignées devant être intercroisées entre elles, ce qui constitue une opérationi normale de la fin d'un cycle de sélection récurrente, il a semblé intéressant de traiter une partie de ces lignées avec le produit A. C.H. n 1 afin de rendre mâle-stérile une partie des plantes de chaque lignée ce qui devait rendre de grands services pour faciliter le croisement. C'est donc la moitié de chaque ligne de 11 plantes qui a été traitée en avril 1981, toutes les lignes ayant été traitées le même jour à un stade repéré comme étant en moyenne proche du stade optimum tel que cela est notamment décrit dans le brevet français ROHM & HAAS no 2 383 605. Dans le cas présent, les plantes ont été traitées avec 300 g/ha d'une formulation de 1-(4-chlorophényl)- 4-oxo-6-méthylpyridazinone-carboxylate de potassium. Au moment de l'application, les plantes se trouvaient à des stades de croissance compris entre 5 et 9 (échelle de Feekes), le stade de développement étant en moyenne de 6 à 7. On a utilisé à titre d'agent tensio-actif du triton X-100 à 0,03 % et le composant actif a été utilisé dans un volume porteur de 500 1/ha. Il est cependant important de remarquer que compte tenu de la variabilité génétique des lignées traitées, il est évident qu'une partie des plantes ont été traitées à un stade plus ou moins éloigné du stade optimum d'application pour obtenir des mâles-stériles. Les fleurs des épis des plantes traitées ont été observées in situ pendant les semaines qui ont suivi la période de pollinisation. On a pu observer après 2 à 4 semaines suivant cette période un grand nombre d'épis portant des caryopses anormaux. La principale caractéristiques de ces caryopses était qu'ils étaient dépourvus d'albumen et apparaissaient donc comme des caryopses plats. Leur aspect était assez semblable à des caryopses plats que l'on obtient lorsque l'on croise, par exemple, Hordeum vulgare par Hordeum bu]bosum. Ces caryopses pouvaient présenter presque la longueur du grain normal résultant de la double fécondation. La fréquence de ce phénomène a été notée et s'est montrée très différente d'une plante à l'autre comme cela est indiqué dans le tableau 1. Ainsi, sur 15 plantes différentes, un total de 234 caryopses anormaux a été dénombré pour 93 épis observés avec de 4 à 9 épis comptés par plante. Le nombre moyen de caryopses anormaux variait de 0,8 à 8,50 par épi et par plante. On a ensuite pratiqué la dissection de ces caryopses anormaux prélevés quelques semaines après la fécondation. Cette dissection a montré que ces caryopses étaient réellement dépourvus d'albumen normal, celui-ci n'apparaissant que sous la forme d'un liquide plus ou moins blanc, mais par contre ces caryopses possédaient un embryon visible à sa place normale. Ces embryons paraissaient plus petits que les embryons issus de grains normaux avec une diversité dans l'aspect morphologique de leur scutellum. Sur certains des caryopses il n'a pas été trouvé d'embryon, soit parce qu'ils étaient absents, soit parce que trop petits ils ont été perdus dans l'albumen liquide. Afin d'effectuer une culture in vitro des plantes à partir de ces embryons, on a procédé de la façon suivante: Les caryopses ont d'abord été désinfectés suivant le procédé habituel: lavage pendant 1 minute dans une solution de teepol S 2 %, 5. désinfection dans une solution d'hypochlorite de calcium à 4 % pendant 3 minutes, rinçage à l'eau stérile deux fois. Les embryons, une fois disséqués et sortis de l'cnveloppe des grains, ont été transportés sur un milieu de régénération R9 ayant la composition suivante: Macro-éléments et micro-éléments de Miller Vitamines de Fuji Fer EDTA 104 M A.I.A. 106 Saccharose 2 % -Agar 0,8 % pH 5,9. Il s'agit là d'un milieu couramment employé pour régénérer les plantes haploides à partir des embryons androgénétiques obtenus en culture d'anthères in vitro. Après 3 semaines, 74 des 88 embryons mis en culture ont donné naissance à des plantules chlorophyliennes complètes et qui ressemblaient de façon très frappante à des plantes haploides. Leur croissance était vigoureuse et leur enracinement in vitro était normal. Afin de connaître le niveau de ploidie des plantules, on a prélevé des pointes de racines suivant le procédé habituel (préfixation dans une solution d'alpha-monobromonaphtalène à 2 %, fixation dans l'alcool à 70 , coloration au carmin acétique). 2 à 3 pointes de racine par plante ont été comptées pour plantes. Ce comptage a permis de découvrir que le niveau de ploidie à l'intérieur d'une même racine, et ceci pour toutes les plantes, variait de l'état haplolde à l'état diploïde. D'une plaque métaphasique à l'autre dans une même racine, on a constaté que le nombre des chromosomes variait de l'état haploîde n = 21 à l'état diploide n = 42 avec des niveaux intermédiaires: 21 - 27, 28, 29 -33, 35, 36 - 41, 42. Ce résultat pourrait signifier que la cellule initiale de l'embryon était haploïde et qu'au cours des divisions cellulaires de ces embryons le niveau de ploidie est devenu instable, peut-être du fait de l'absence d'albumen bien constitué. Le plus extraordinaire est que le phénomène d'endoreduplication se passait comme si le doublement avait lieu génome par génome: A B D A A B D > A B B D > A A B B D D Il n'est pour l'instant pas possible de se prononcer sur l'origine de cette cellule haploide; il pourrait s'agir d'une parthénogénèse induite ou bien d'une androgénèse in situ. Cependant, l'origine étant certainement haploide et une endoreduplication se manifestant dans ces plantes, celles-ci devaient à ce moment là donner lieu à une descendance haploide, doublée, homozygote. C'est ce qui a été démontré dans l'exemple ci-après. EXEMPLE 2 Les plantules obtenues par culture d'embryons ont tout d'abord été clonées in vitro, puis vernalisées 8 semaines en tube afin de leur permettre une floraison normale à la sortie en serre. Seule une partie des plantes a pu être repiquée avec succès en serre et finalement 18 plantes ont pu fleurir normalement. Comme on pouvait s'y attendre, suivant que le doublement spontané était plus ou moins efficace, les territoires cellulaires des épis étaient mixoploides. Ainsi la fertilité variait de 2 à 4 grains par épi jusqu'à une fertilité normale. 2 épis par plante avaient été ensachés pour vérifier ce point. Afin de vérifier que les grains récoltés sur chaque plante avaient bien tous la même constitution génétique, résultat attendu si les plantes issues des caryopses anormaux étaient bien des homozygotes, on s'est intéressés à l'étude des gliadines et des glutènines de 14 grains issus du même épi pour chaque plante. 6 descendances ont ainsi été analysées par électro- phorégramme en comparaison avec des descendances F'4 des mêmes lignées F'3 d'origine. obtenues par autofécondation. Pour 4 descendances des caryopses anormaux, les 14 électrophorégrammes de gliadines se sont montrés rigoureusement identiques entre eux. Pour une descendance, seul un grain différait seulement par une bande des 13 autres identiques entre eux. Pour le dernier cas, 7 grains présentaient un spectre identique, les 7 grains présentaient un spectre identique au premier avec 2 bandes en moins. Par contre, pour les glutènines, la stabilité était parfaite. En comparaison, les descendances F'4 présentaient pour la plupart de nombreuses différences dans leur bande-de gliadines. Il ressort des exemples précédents que les plantes obtenues à partir des caryopses anormaux sont des plantes haploldes doublées à caractère mixoplolde pouvant alors donner lieu à une descendance homozygote. Ceci ouvre une nouvelle voie totalement originale d'haplodiploidisation du blé tendre sur des plantes ayant subi un traitement par un A.C.H. Un simple calcul permet de dire que par rapport à la culture d'anthère, la fréquence d'obtention des lignées haploïdes doublées sera environ 25 fois plus importante avec cette technique qu'avec la culture d'anthère in vitro. TABLEAU 1 N de la Nombre d'épis Nombre de Nombre moyen plante observés caryopses par épi anormaux 1 4 29 7,25 2 4 34 8,50 3 6 6 1 4 6 19 3,17 5 5 1 6 4 5 1,25 7 6 13 2,17 8 6 22 3,67 9 7 18 2,57 6 5 0,83 11 6 10 1,67 12 6 15 2,50 13 9 23 2,56 14 9 17 1,89 9 13 1,44 Totaux 93 234 2,52 REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'haplo!des doubles de céréales, dans lequel on traite les plantes par un agent chimique d'hybridation, après la période de pollinisation on prélève les caryopses anormaux et on régénère les plantes à partir de l'embryon de caryopses anormaux et on réalise l'autofécondation de chacune des plantes régénérées pour obtenir des semences correspondant à des plantes homozygotes dans les générations suivantes. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la céréale traitée est choisie parmi le blé dur, le blé commun, l'orge, le tritical, l'avoine, le sarrasin, le mais, le riz, le sorgho et le seigle. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'agent chimique d'hybridationutilisé est l'acide 1-(4-chlorophényl)-4-oxo-6-méthylpyridazinone- 3-carboxylique et ses sels, en particulier le sel de potassium. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les plantes sont traitées à des doses d'A.C.H. de 0,04 à 10 kg/ha. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les caryopses anormaux prélevés présentent un albumen réduit et possèdent un embryon, dont le point de départ est une cellule haploïde. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les plantes à traiter ont dans leur environnement des plantes non traitées. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les plantes sont régénérées par culture in vitro de l'embryon prélevé à partir du caryopse.