Brevet FR2562088A1 — publié le 19851004

La présente invention concerne des vecteurs de clonage et d'expression de la séquence d'ADN codant pour une hirudine ou des analogues de l'hirudine, des microorganismes transformés par ces vecteurs et des procédés permettant d'obtenir par fermentation une hirudine ainsi que l'hirudine obtenue. L'activité anti-coagulante qui se trouve dans les glandes salivaires des sangsues médicinales, Hirudo medicinalis, provient d'un petit polypeptide que l'on appelle l'hirudine. Cet inhibiteur très spécifique et très efficace de la thrombine a été largement étudié ces derniers temps car il représente potentiellement un agent thérapeutique très intéressant. Toutefois, la difficulté extrème et le coGt de son isolation et de sa purification ont empêché qu'il soit utilisé plus largement, ou même qu'il puisse être étudié sur le plan clinique ; le coût de la matière est de l'ordre de 1 300 a 1 600 francs (1983) pour 2 000 U. La présente invention concerne un moyen pour la production de l'hirudine par le clonage des gènes et leur expression grâce à la technique des ADN recombinants dans une cellule hôte hétérologue afin d'obtenir une grande quantité de polypeptide ayant les propriétés biologiques de l'hirudine. Le polypeptide avec une activité antithrombinique obtenu à partir des glandes salivaires de sangsues a été isolé pour la première fois au milieu de 1950 (1, 2). Cette protéine appelée hirudine a été purifiée à partir des tètes de sangsues environ 650 fois pour obtenir une activité spécifique de 8 500 unités par milligramme. Le poids moléculaire de la protéine était alors estimé à environ 16 000, cette protéine était stable à la dénaturation par la chaleur et présentait un point isoélectrique de 4,8. Lors d'une électrophorèse sur papier, le produit purifié migre sous forme d'une bande unique et l'analyse d'amino-acide indique que la matière est très riche en amino-acide acide, l'acide aspartique et l'acide glutamique. Des étapes de purification complémentaires (3) augmentent l'activité spécifique jusqu'd 10 400 U/mg et l'isoleucine a été identifiée comme étant l'amino-acide N-terminal (3, 4). On a pu démontrer que l'activité de l'hirudine résistait à la digestion avec des enzymes protéolytiques plasmine, chymotrypsine A et trypsine, mais était sensible à la digestion par la papaine, la pepsine et la subtilopeptidase A (3). Le poids moléculaire estimé est maintenant quelque peu inférieur à ce qu'il était dans les documents initiaux, on considère que ce poids moléculaire est de l'ordre de 10 000 daltons et la première estimation de la constante de dissociation du complexe thrombine-hirudine 1:1 (0,8 x 10 10) indique une association extrèmement forte entre ces molécules (5). Pour des raisons pratiques, le complexe non-covalent entre ces deux molécules peut etre considéré comme non-dissociable in vivo Le mécanisme d'action de l'hirudine comme anti-coagulant commence seulement à etre compris (5). Le substrat pour la fixation de l'hirudine est la thrombine, qui est une enzyme protéolytique, qui, par activation (par lefacteur X activé) à partir de sa forme zymogène, la prothrombine, coupe le fibrinogène dans le flux circulatoire pour le transformer en fibrine qui est nécessaire pour la formation du caillot de sang. L'hirudine est un inhibiteur très spécifique de la thrombine et réagit plus rapidement avec la thrombine que le fibrinogène. En outre, il n'est pas nécessaire d'avoir d'autres facteurs de coagulation ou d'autres constituants du plasma. L'interaction entre les deux molécules est au moins en partie due à leur interaction ionique car l'acétylation des groupes amino libres de la thrombine produit une perte de la fixation d'hirudine. En outre, l'hirudine se fixe dans les mêmes sites que ceux qui sont occupés par la fibrinopeptide et non pas sur les sites actifs de la thrombine car la thrombine acétylée conserve son activité estérase qui n'est pas inhibée par l'hirudine et car la thrombine traitée avec DFP (diisopropyl fluorophosphate) qui phosphoryle les centres actifs de la sérine dans la thrombine continue à fixer l'hirudine. Le développement suivant dans l'étude de l'hirudine a été la mise au point d'un procédé pour extraire l'hirudine à partir de la sangsue entière (16) au lieu du procédé très délicat consistant a disséquer la titre de l'animal. Le produit final obtenu par ce procédé a une activité biologique similaire à celle de l'hirudine obtenue a partir des têtes mais présente une activité spécifique de 6 500 unités anti-thrombine par milligramme. La taille estimée de ce composé déterminée par sédimentation à l'équilibre est de 12 000, mais la différence importante entre cette préparation et les préparations précédentes est que l'on a identifié la valine comme l'amino-acide N-terminal au lieu de l'isoleucine qui avait été trouvée a l'origine. La cause de cette différence avait été apparemment expliquée lorsque l'on a mis en évidence que le second élément de l'extrémité N-terminale se trouvait étre de la valine, comme le dansyl dipeptide val-val est résistant à l'hydrolyse acide, on a tout d'abord pensé (7) que l'extrémité N-terminale initiale avec un dipeptide val-val avait été confondue'avec le dérivé isoleucine, car ces composants ne sont pas bien résolus par la séparation chromatographique utilisée. Une préparation d'hirudine à partir de l'animal entier a été utilisée pour déterminer la séquence d'aminoacide de la protéine (8, 9) qui est représentée à la figure 1. I1 apparait qu'il n'y a pas d'hydrate de carbone attaché à l'hirudine, mais qu1à la position 63 le résidu tyrosine est modifié par un groupe ester Sulfate. La fonction de cette modification n'est pas connue mais il est significatif qu'une modification similaire figure également dans le fibrinopeptide B d'un grand nombre d'espèces animales (9). Une étude récente (10) a démontré que lorsque l'on fait complètement disparaître l'ester sulfate, on réduit l'activité à seulement 55 % de l'activité de 1 'hirudine initiale. Le problème de la nature de l'extrémité N de l'hirudine s'est posé à nouveau dans les études (12, 13) qui semblent indiquer que deux formes différentes d'hirudine existent. Une forme à activité faible appelée pseudohirudine, dont on pense qu'elle a été extraite des corps de sangsues, avec la séquence val-val à l'extrémité N-terminale; une forme prédominante dans les têtes qui serait très active et qui présenterait un radical isoleucine a son extrémité N-terminale. L'activité anti-thrombinique spécifique et très importante de l'hirudine indique immédiatement une application clinique, c'est-à-dire celle d'un anti-coagulant. L'hirudine a été étudiée de façon très importante chez l'animal pour ses propriétés anti-coagulantes. L'étude la plus détaillée (14) décrit l'activité de l'hirudine dans la prévention des thromboses veineuses, des occlusions vasculaires et des coagulations intra-vasculaires disséminées (DIC) dans le rat. L'hirudine est bien tolérée par les rats, les chiens, les lapins et les souris lorsqu'elle est sous forme très purifiée et injectée par voie intraveineuse. La DL50 dans les souris est supérieure,500 000 U/kg de poids corporel (c'est-à-dire 60 mg/kg). Une autre étude (15) indique que les souris tolèrent des doses allant jusqu 'à 1 g par kg et que les lapins tolèrent à la fois par voie intraveineuse et par voie subcutanée jusqu'à 10 mg/kg. Dans les souris, des injections répétées pendant une période de deux semaines ne conduisent pas à des réactions de sensibilisation. Deux autres études indépendantes, l'une utilisant les chiens (16) et l'autre (17) démontrant l'activité de l'hirudine dans la prévention des DIC dans les rats, tombent en accord avec les résultats positifs de Markwardt et de ses collaborateurs. On a aussi pu démontrer que l'hirudine prévient les endotoxines induits par les DIC dans les cochons et ainsi constitue une solution potentielle aux problèmes très sérieux poses par les endotoxinémies qui conduisent a une mortalité élevée chez les cochons. En outre, l'hirudine chez l'animal expérimental est rapidement éliminé (demi-vie de l'ordre de 1 heure) encore sous forme biologiquement active par l'intermédiaire des reins. Cette étude suggere que l'hirudine peut constituer un agent clinique intéressant comme anti-coagulant. En outre, la pré-phase de coagulation du sang n'est pas affectée compte tenu de la haute spécificité de l'action de l'hirudine, l'activité anti-thrombinique est dépendante de la dose et l'effet de l'hirudine est rapidement reversible compte tenu de son élimination rénale rapide. On a pu mettre en évidence que l'hirudine est très supérieur à l'héparine pour le traitement des DIC (14, 17) comme cela pouvait être attendu compte tenu du fait que la DIC est accompagnée par une décroissance de l'anti-thrombine III (un co-facteur nécessaire pour l'action de l'héparine) et un relarguage du facteur de plaquette 4 qui est un agent très efficace anti-héparine. L'une des études a mis en évidence la possibilité que l'hirudine puisse être absorbée par la peau des êtres humains (19) bien que les résultats obtenus restent quelque peu difficiles à interpréter. Des préparations commerciales d'extraits de sangsues bruts sont disponibles (Hirucrème, Exhirud-Blutgel), mais des tests complémentaires avec des doses plus importantes d'une matière hautement purifiée sont nécessaires pour établir s'il s'agit là d'une voie d'administration intéressante. De façon générale, les voies d'administration préférées sont les voies intra-veineuses, intra-musculaires et la voie percutanée. D'autres voies d'administration ont été rapportées pour l'hirudine, notamment la voie orale (BSM 3 792 M). Ce produit peut également, en combinaison avec d'autres composants, être utilisé dans le traitement du Psoriasis et d'autres désordres cutanés du même type comme cela est décrit dans le DOS 2 101 393. L'hirudine peut être en outre utilisée à titre d'anti-coagulant dans les tests cliniques en laboratoires et comme outils de recherche. Là, la haute spécificité pour une étape unique dans la coagulation du sang peut présenter un avantage considérable par rapport aux anticoagulants utilisés le plus généralement avec une action qui est beaucoup moins spécifique. En outre, l'hirudine peut être très utile comme agent anti-coagulant dans les circuits extra-corporels et dans les systèmes de dialyses où élle.peut présenter des avantages considérables par rapport aux autres anticoagulants, en particulier s'il peut être immobilisé sous forme active sur la surface de ces systèmes circulatoires artificiels. Finalement, l'utilisation de l'hirudine marquée peut constituer une méthode simple et efficace pour mesurer les taux de thrombine et de prothrombine. En résumé, l'hirudine présente un grand nombre d'applications possibles 10) comme anti-coagulant dans des conditions thrombotiques critiques pour la prophylaxie et la prévention de l'extension des thromboses existentes 20) comme anti-coagulant pour réduire les hématomes et les enflures après les micro-chirurgies, car il est fait une utilisation importante de sangsues vivantes 3 ) comme anti-coagulant dans des systèmes de circulation extra-corporelles et comme agent anti-coagulant pour revêtir des biomatériaux synthétique ;; 40) comme anti-coagulant dans les tests cliniques des échantillons de sang dans les essais de laboratoires 50) comme anti-coagulant dans la recherche clinique sur la coagulation et comme outil expérimental 60) comme agent topique possible pour l'application cutanée dans le traitement des hémorroides, des varices et des oedèmes ; 70) comme composant dans le traitement des psoriasis et autres désordres apparentés. Enfin, l'hirudine-peut être utilisée pour fixer la thrombine dans des milieux où celle-ci est génante (dosage, expérience ou sang traité par exemple). En particulier, l'hirudine permet de limiter les coagulations dans les circuits extra-corporels. En dépit de ces nombreux avantages comme anticoagulant, l'hirudine n'a, jusqu'à maintenant, pas été utilisée largement même dans la recherche clinique. Ceci tient au fait que la matière naturelle est très difficile à obtenir sous forme pure et par dessus tout qu'elle est particulièrement chère, même pour commencer des essais cliniques afin de mettre en évidence une utilité potentielle. Bien que les procédés de purification adéquats existent (20, 21) pour obtenir des échantillons très purs, la difficulté d'obtention de la matière de base (des sangsues) en quantité suffisante demeure l'obstacle majeur. Bien que l'hirudine soit commercialement vendue par différentes compagnies (Sigma, Plantorgan, Pentopharm), de telles préparations présentent une activité qui peut varier énormément et des puretés très variables. C'est pourquoi la production d'hirudine par technologie de 1'ADN recombinant est une solution parti culièrement attrayante pour obtenir cette matiere en grande quantité à des courts raisonnables afin de permettre de tester et d'utiliser ce type de produit. Dans ce qui va suivre, on utilisera la plupart du temps la terminologie "l'hirudine'l. Compte tenu de ce qui vient d'être dit et d'autres éléments qui sont apparus lors de la présente étude, il est clair qu'il existe plusieurs formes d'hirudine et donc que la terminologie "une hirudine" serait plus correcte. C'est pourquoi, dans ce qui suit on entendra par "hirudine" l'une quelconque des formes de l'hirudine naturelle ou synthétique, c'est-à-dire un produit ayant la même activité in vivo que l'hirudine qui sera parfois nommé "analogue de l'hirudine". I1 convient d'ailleurs de remarquer que les produits dénommés "analogues de l'hirudine" obtenus à partir des bactéries seront dépourvus de la fonction ester O-sulfate, mais par contre que "l'hirudine bactérienne pourra comporter à l'extrémité N-terminale un aminoacide méthionine qui ne figure pas dans l'hirudine native. Mais il est bien entendu que par "analogue de l'hirudine" on entend également protégé des produits d'origine biologique ayant été modifiés après leur production notamment par réaction chimique ou réaction enzymatique. La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans une cellule hôte de l'hirudine ou d'un analogue de l'hirudine, caractérisés en ce qu'ils comportent le gène codant pour l'hirudine ou un analogue de l'hirudine et les éléments d'expression de ce gène dans ladite cellule haute. La nature des éléments d'expression peut varier selon la nature de la cellule hôte. Ainsi, dans les cellules bactériennes, les éléments d'expression comporteront au moins un promoteur bactérien et un site de fixation des ribosomes (qui constitue ce qui sera parfois nommé région codant pour l'initiation de la traduction). De façon générale, les vecteurs selon la présente invention comporteront, outre le gène codant pour l'hirudine - l'origine de réplication d'un plasmide bactérien, - un promoteur, en particulier tout ou partie d'un promoteur du bactériophage : PL, PR ou P'R - une région codant pour l'initiation de la traduction incor porant 1'ATG soit de l'extrémité 5' du gène de l'hirudine, soit de l'extrémité 5' du gène de l'hirudine fusionné en 5' avec une autre protéine ; la raison de cette fusion est de permettre l'expression d'une protéine de haut poids moléculaire qui se dégrade moins dans E. coli. La présence d'une origine de réplication pour un plasmide est essentielle pour permettre la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes, en particulier dans le cas de E. coli on utilisera, de préférence,.l'origine de réplication du plasmide pBR322. Le plasmide pBR322 présente, en effet, l'avantage de donner un grand nombre de copies et ainsi d'augmenter la quantité de plasmides produisant la protéine désirée. Parmi les promoteurs du bactériophage A, on utilisera, de préférence, le promoteur principal de gauche noté APL. est un promoteur puissant responsable de la transcription précoce de A. Il est également possible d'utiliser d'autres promoteurs du bactériophage A, notamment le promoteur de droite, PR ou le second promoteur de droite, Bien qu'il soit possible d'utiliser des séquences d'initiation de la traduction très variées, on préfereutiliser tout ou partie du site de fixation des ribosomes de la protéine cII du bactériophage A qui sera nommée ci-après # cIIrbs. Comme cela sera démontré il est également possible d'utiliser de telles séquences synthétiques en particulier tout ou partie de la séquence ATAACACAGGAACAGATCTATG. Le vecteur en cause comporte, en outre, de préférence une fonction d'antiterminaison de transcription codée par ex. par le gêne N de A note AN. En présence du produit de transcription du gène N la transcription à partir de PL se poursuit au-delà de la plupart des signaux stop. Ceci écarteles problèmes posés par un arrêt prématuré de la transcription qui peuvent se produire lorsque les gènes étrangers clones présentent de tels signaux stop. En outre, il a été démontré que l'expression à partir de PL est améliorée dans un environnement N Afin d'écarter les problèmes de toxicité et d'instabilité du système hôte-vacteur en cas de production en continu de grandes quantités d'une protéine étrangère. il est nécessaire de prévoir le contrôle de l'activité du promoteur en lui adjoignant tout ou partie d'un système d'expression inductible, en particulier thermo lnductible. De préférence, le contrôle par la température de la synthèse de la protéine étrangère est effectué au niveau de la transcription au moyen d'un répresseur thermosensible codé dans la bactérie hôte, par exemple cI857, qui réprime l'activité de PL à 28 C mais qui est inactivé è 420C. Le répresseur agit sur l'opérateur OL qui est adjacent au promoteur PL.Bien que dans le cas précédent une partie du système d'expression thermoinductible soit partie intégrante de la bactérie hôte, il est possible de prévoir que ce système fasse partie du vecteur lui-meme Le vecteur en cause peut également comporter un gène de résistance à un antibiotique, par exemple l'ampicilline dans le cas de pBR322, mais d'autres genes de résistance peuvent etre utilisés, résistance à la tétracycline (Tetr) ou au chloramphénicol L'incorporation d'un tel marqueur est nécessaire pour la sélection des bactéries contenant les transformants porteurs du plasmide selon l'invention pendant les expériences de clonage. L'incorporation d'un gene de résistance permet d'augmenter la stabilité du plasmide en imposant une pression de sélection lors de la fermentation, et en outre facilite l'isolement des transformants. Pour le clonage il est intéressant de disposer d'un système permettant de détecter l'insertion dans un plasmide d'un ADN oranger A titre d'exemple, il est possible de prévoir dans la sone de clonage le fragment N-terminal de la B-galactosldase de E. coli (lac@') en le fusionnant avec la région d'initiation de traduction dérivée de AcII, ce qui met la traduction du fragment a sous le contrôle des séquences de cII. Le fragment &alpha; est complémenté par l'expression du fragment o C-terminal codé dans l'hôte, ceci conduit à une activité ss-galactosidase dans les cellules. Cette activité B-galactosidase produit des colonies bleues en présence d'un substrat chromophorique, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactosidase. A 28 C, le promoteur PL est inactivé, le fragment Q n'est pas synthétisé et les colonies demeurent blanches. Lorsque la température est amenée à 420C, le promoteur PL est activé, le fragment a est synthétisé et les colonies virent au bleu. L'insertion d'ADN étrangers dans les sites de clonage situés dans ce système de détection empêche la synthèse de la ss-galactosidase et conduit donc à des colonies blanches aussi bien à 28 C qu'à 42 C. I1 est également possible de remplacer le gène lacZ'par d'autres gènes permettant une détection. La présente invention concerne les cellules,en particulier les bactéries, notamment les souches de E.coli transfor indes par les vecteurs selon 14 invention par des techniques connues et dont certaines seront rappelées dans les exemples. Enfin, l'invention concerne un procédé de préparation de l'hirudine ou de ses analogues dans lequel on cultive sur un milieu de culture des bactéries transformées comme décrit précédemment et dans lequel on récupère ensuite l'hirudine ou l'analogue formés. Les milieux de culture mis en oeuvre sont connus de l'homme de métier et devront être adaptés à chaque souche cultivée. La culture sera, de préférence, effectuée en présence de l'antibiotique à l'encontre duquel la souche transformée est devenue résistante. L'hirudine ou ses analogues peuvent être purifiés ou pré-purifiés à partir du mélange de fermentation par chauffage à pH acide, notamment à 50-800C à pH compris entre 1 et 3, en particulier à 700C à pH 2,8, et récupération du surnageant dans lequel se trouve l'hirudine. Il est également possible de mettre a profit l'affinité de l'hirudine pour la thrombine en utilisant une résine sur laquelle est fixée la thrombine, par passage du mélange contenant l'hirudine sur une telle résine on fixe l'hirudine qui peut être ensuite éluée par une solution contenant un agent compétiteur de l'hirudine. La présente invention concerne enfin l'hirudine ou ses analogues obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, c'est-a-dire l'hirudine ou ses analogues d'origine bactérienne mais également les hirudines ou analogues obtenus a partir de produits bactériens par réaction chimique ou enzymatique, par exemple par clivage chimique ou enzymatique ou bien par réaction chimique ou enzymatique destinée a fixer le radical -S03H. En particulier, l'invention concerne les peptides comportant tout ou partie de la formule suivante : ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCG GGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA @GC AAT GTT TGC GGT Ile Thr Tyr Thr Asp Cy@ Thr Gl@ Ser Gly Gl@ As@ Les Cys Les Cys Gl@ Gly Ser As@ Val Cys Gly AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAG GGC AAC CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAC CCT GAA AGC CAT AAT AAC Lys Gly As@ Lys Cy@ Ile Leu Gly Ser As@ Gly Lys Gly As@ Gl@ Cy@ Val Thr Gly Gl@ Gly Thr Pre As@ Pro Glu Ser @is As@ A@@ @GC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAA GAA TAT TTA CAA Gly Asp Phe Gl@ Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ce peptide est représenté avec la séquence codante correspondante qui ne fait pas partie du peptide. L'invention concerne, enfin, des compositions pharmaceutiques contenant l'hirudine ou ses analogues à titre de principe actif. Ces compositions peuvent être applicables par voie intra-péritonéale, intra-veineuse, intra-musculaire ou sous-cutanEe, par voie orale ou par voie cutanée topique. Ces compositions contiennent les excipients connus en la matière et éventuellement d'autres principes actifs. La présente invention comporte, bien entendu, d'autres aspects, notamment certains plasmides qui seront décrits dans les exemples ainsi que leurs mutants et dérivés et de façon générale les procédés de fermentation des bactéries transformées ainsi que les produits ainsi obtenus. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris å la lecture des exemples ci-après et des dessins annexés sur lesquels la figure 1 représente la séquence d'amio-acide de l'hirudine extraite de la sangsue totale, la figure 2 représente la sonde oligonucléotide 48 mer conçue pour le criblage, la figure 3 représente la séquence de l'hirudine du clone pTG717, la figure 4 représente une autoradiographie du mélange d'hybridation entre la sonde marquée et diverses restrictions de pTG717, la figure 5 représente la carte de restriction de l'insert dans pTG717, . la figure 6 représente le détail de la construction des deux vecteurs d'expression de l'hirudine pTG718 dérivé de pTG927 et pTG719 dérivé de pTG951, . la figure 7 représente le graphique de l1évolution de l'activité en hirudine des extraits de E. coli en fonction du temps pour les deux vecteurs, . la figure 8 représente l'analyse des extraits de E. coli marqués contenant l'activité hirudine, la figure 9 représente l'analyse des mêmes extraits qu'à la figure 8 mais auprès traitement par la chaleur à pH acide. Il convient de remarquer que les différentes séquences de nucléotides figurant dans les dessins doivent être considérées comme faisant explicitement partie de la présente description, ces séquences n'ont pas été reproduites dans le corps du texte afin de ne pas l'alourdir inutilement. La plupart des techniques mises en oeuvre dans les exemples suivants sont connues de l'homme de métier et certaines sont décrites dans les références ci-annexées. Seules les techniques particulières seront donc décrites dans le cours de la description. On donnera uniquement à titre de renseignements généraux les caractéristiques des souches mises en oeuvre a) Souches bactériennes Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes : . TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : su- F- his ilv bio (#cI857#Bam#HI) N6437, souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : F- his ilv gal+ #8proC+ : tn10 lac#m15 (AcI857dBamAHI). . Jm103 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : #(lac-pro) supE thi endA sbcB15 sttA rX nK+ / F1 traD36 proAB+ lacia lacZEm15. Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres souches dans la mesure où elles présentent certaines caractéristiques essentielles qui sont rappelées dans le cours de la description détaillée. Les exemples ci-après comportent essentiellement étapes suivantes 10) la préparation des mARN et la constitution d'une banque de cADN 20) la réalisation d'une sonde 30) la sélection de la banque grâce à cette sonde et l'identification d'un plasmide portant la séquence codant pour l'hirudine 40) la réalisation d'un vecteur d'expression du gène codant pour l'hirudine 50) L'étude des résultats obtenus. Préparation de l'ARN Des sangsues vivantes de l'espèce Hirudo médicinalis sont prélevées dans la région de Bordeaux en France. On les fait jeuner pendant un minimum de 4 semaines puis elles sont décapitées et les têtes sont immédiatement congelées dans l'azote liquide. L'ARN de têtes totales est extrait par broyage des têtes sous forme d'une poudre fine dans l'azote liquide. A 1 g de cette poudre on ajoute 5 ml d'un tampon NETS (10 mM Tris HC1, pH 7,5, 100 mM NaCl, lmM EDTA, 0,5 % SDS) et 5 ml de phénol redistillé tous les deux préchauffés à 950C. La solution est alors mélangée par vortex, centrifugée à 30 000 g, la phase aqueuse est réextraite avec 1 ml de tampon NETS, et les phases aqueuses rassemblées sont réextraites avec 5 ml de phénol frais. L'ARN est précipité par addition de deux volumes méthanol et rassemblé par centrifugation après avoir été abandonné à -200C pendant plus de 4 heures. Le culot brun foncé est dissout dans 2,5 ml d'eau distillée, 2,5 ml de Licol 5 M sont ajoutés, et après mélange la solution est abandonnée pendant une nuit à 40C. La solution est ensuite réhaussée avec 5 ml de LiCl 3 M, et centrifugée à 20 000 g pendant 10 minutes à 40C. Le surnageant est éliminé et le culot d'ARN clair est repris dans 1 ml de H20. On le reprend dans NaCl 0,25 M et 1'ARN est précipité avec 2 volumes d'éthanol. Le culot d'ARN final est récupére par centrifugation puis est dissout et stocké à -800C dans l'eau distillée. La concentration de 1'ARN est mesurée par son absor tion à 260 nm. L'ARN messager polyadénylé est préparé en utilisant une cellulose oligo dT et une procédure standard (22). Le rendement en mARN représente environ 2 à 5 % de 1'ARN total de départ. Préparation de 1'ADN complémentaire et Construction de la banque de cDNA dans le plasmide vecteur pBR 322. Le processus mis en oeuvre est exactement le même que celui qui a conduit a la construction de la banque de mARN de foie humain décrite dans la référence 23. Les mARN de têtes de sangsues sont copiées sous forme d'ADN en utilisant un "Primer" oligo dT et l'enzy- me reverse transcriptase. Un second brin d'ADN est synthétisé en utilisant 1'ADN polymérase, l'épingle à cheveux est ouverte avec la nucléase S1 et le cADN double brin est purifié sur un gradient de sucrose.Des cADN de taille déterminée sont terminés à l'extrémité 3' avec des petites extensions de dC en utilisant lXenzyme terminale déoxytransférase puis sont rassemblés avec un vecteur pBR322 à extrémité polyG coupé par Pstl. Les plasmides obtenus sont utilisés pour transformer des souches de E. coli (souche 1106) et les transformants tétracycline résistants (obtenus avec une efficacité comprise entre 500 et 1 000 par ng de cDNA double brin) sont mis en croissance sur des plaques de L-agar contenant 15 pg/ml de tétracycline.La banque de clone de cDNA représentant 43 000 transformants individuels est établie, les cellules sont récupérées par grattage à partir des colonieset remises en suspension dans un bouillon-L contenant la tétracycline. La suspension est effèctuée dans le glycérol à 50 % et stockée à 20 C. Réalisation de la sonde d'ADN pour le criblage de la banque Compte-tenu du fait que la séquence d'aminoacide publiée pour l'hirudine (figure 1) ne présente pas de méthionine ou de tryptophane, c'est-à-dire les aminoacides qui sont codés par un codon unique, la séquence de protéine ne présente pas de régions particulièrement pro pices pour la réalisation de sondes d'oligonucléotide par ticulierement court qui constitue en règle générale la stratégie mise en oeuvre pour l'identificatlon des séquences d'ADN cloné (24). C'est pourquoi il a été décidé d'adopter la technique différente d'une sonde d'oligonucléotide assez grande mais unique, ce qui a permis en particulier d'isoler le clone de cDNA pour le facteur IX de coagulation humain (23).Dans cette stratégie, on sélectionne la région de séquence d'amino-acide pour lequel la redondance des codons est limitée au choix de la 3ème base (ctest-à-dire que l'on écarte l'arginine, la leucine et la sérine), et on sélectionne la 3ème base. Les paramètres considérés pour choisir la 3ème base de ce codon, sont connus, il s'agit de maximiser la possibilité d'interaction G/T et d'écarter les épingles à cheveux et les palindromes dans la séquence de la sonde et bien entendu de tenir compte des séquences de genes connues pour les sangsues. Comme aucune séquence de gène n'a été publiée pour les sangsues on a du faire usage des connaissances sur les êtres les plus proches des sangsues au plan de l'évolution et sur lesquels il existe de nombreuses séquences d'ADN publiées, à savoir les insectes. Toutes les séquences codantes pour des ADN d'insectes ont été analysées et une table des codons que l'on retrouve le plus fréquemment a été établie. Ceci avec d'autres paramètres a été utilisé pour concevoir un oligonucléotide de 48 bases de longueur, correspondant à 16 amino-acides, de la position 34 à la position 49 dans la séquence de l'hirudine. Cette région de séquence présente une redondance seulement dans la troisième position de chaque codon. Cet oligonucléotide représenté à la figure 2 a été synthétisé chimiquement par la méthode au phosphodiester, sur un support solide inorganique (25), qui a déjà été décrit pour un 52 mer en reférence (23). Criblage de la banque de cDNA avec l'oligonucléotide 48 mer. La banque de cDNA tenue à partir des mARN de têtes de sangsues a été étalée sur des plaques d'agar L contenant 15 vg/ml de tétracycline avec une densité de colonie d'environ 4 000 colonies par plaque de 13 cm et les colonies sont mises en croissance jusqu'S une taille de 1 à 2 mm de diamètre à 370C. Les colonies sont alors prélevées sur filtres de nitrocellulose. Les colonies des plaques maintenues sont mises en croissance puis les plaques sont stockées à 40C. Les filtres sont placés sur les plaques de L-agar contenant 170 pg/ml de chloramphénicol et sont incubés une nuit à 370C pour amplifier les plasmides dans les colonies bactériennes. Les filtres sont ensuite traités par la procédure standard pour lyser les colonies bactériennes et fixer 1'ADN sur la nitrocellulose. Les filtres sont ensuite lavés très complètement puis préhybridés dans un volume de 100 ml de 6 x SSC (1 x SSC = 0,15 % NaCl, 0,015 M de citrate trisodique), 5 x Denhardts (1 x Denhardts solution = 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinyl pyrollidone, 0,02 % d'albumine de sérum bovin) 100 Ug/ml d'ARN de transfert de levure et 0,05 % de pyrophosphate de sodium. Un aliquote (30 pmole) de l'oligonucléotide 48 mer est marqué avec [ p] à son extrémité 5' par incubation avec y [ p] ATP en présence de 15 unités de polynucléotides kinase. La sonde marquée est purifiée du y [ p] ATP libre par passage sur cellulose DEAE. La sonde marquée est hybridée sur le filtre à la dose de 20 ml de 6 x SSC, 1 x Denhardts, 100 pg/ml de tRNA de levure, 0,05 % de pytophosphate de sodium à 420C sous agitation légère pendant 16 heures. Les filtres sont alors lavés dans 6 x SSC, 0,1 t de dodécyl sulfate de sodium (SDS) à la température de 37 0C, 420C, 500C puis soumis à un lavage final avec 2 x SSC, 0,1 % SDS à 50 C pendant 10 minutes. Les filtres sont alors séchés et exposés sur des films rayons X. Les colonies donnant des résultats positifs sont repérées à partir des plaques marquées en comparant les spots positifs sur le film X avec les plaques maitresses. L'un de ces clones dont le plasmide sera nommé pTG700 est confir mé comme étant positif par une seconde hybridation avec la sonde marquée est cultivé en quantité et 1'ADN plasmidique est purifié par des procédures standards. Identification de pTG700 comme contenant la séquence codant pour l'hirudine. L'insert de cADN de pTG700 représente environ 235 paires de bases. Ce fragment d'ADN est isolé et transféré dans le phage vecteur m13 mp8 et la séquence d'ADN de l'insert est déterminée par terminaison de channe (26). Une partie de cette séquence code pour une séquence protéinique qui est très similaire à celle de l'hirudine. Cette région de la séquence correspond à la zone de la sonde qui est représentée à la figure 2. Sur cette figure 2 : (a) correspond à la séquence de l'hirudine figurant dans la référence 2 de glu 49 à gly 34, (b) correspond a la séquence de la sonde 48 mer synthétisée et utilisée pour l'hybridation, (c) correspond à la séquence du clone pTG700 dans cette région, les points indiquant les homologies, (d) correspond à la séquence d'amino-acide codée dans cette région de pTG700. I1 faut remarquer que la séquence de cADN dans pTG700 est incomplète, elle code seulement 28 des aminoacides C-terminaux de l'hirudine en plus des 101 base de la séquence non traduite 3' précédée par un codon stop en phase. L'une des différences par rapport à la séquence de protéine publiée pour l'hirudine est observée dans ce clone car l'acide glutamique remplace la glutamine à la position 49. Isolement de clones de cADN d'hirad-ihe plus grand. Comme la séquence d'ADN confirme que l'insert de pTG700 code pour l'hirudine, cet insert est rendu radioactif par [ ] par la procédure de "nick-translation" connue et est utilisée pour un nouveau test de la banque de cDNA. Plusieurs autres colonies positives sont trou vées et l'une d'entre elle comporte un plasmide désigné par pTG717 qui contient un insert d'une longueur d'environ 450 paires de bases. L'analyse de restriction de cet insert indique que la présence d'un site de restriction Taql placé au voisinage du centre. C'est pourquoi le fragment purifié est mis en digestion avec Taql et les fragments résultant 5' et 3' sont liés dans le vecteur de séquensage ml3 clivé par PstI/AccI. La construction du m13 contient chacun des fragments qui peuvent etre identifiés et soumis l'analyse séquentielle. Le résultat de cette analyse est indiqué à la figure 3. La séquence d'ADN de l'insert de pTG717 moins les extrémités polyG/C introduites à l'extrémité pendant le clonage de la procédure est long de 379 bases, dont 219 codent un peptide dont la séquence est très similaire à celle de la séquence de l'hirudine publiée. Différents points doivent être notés dans cette séquence. 1) la séquence d'amico acide codée par le fragment n'est pas identique à celle de la séquence de la protéine publiée pour l'hirudine native. I1 y a 9 amino-acides de différence entre la séquence de l'hirudine isola partir de pTG717 et la séquence de l'hirudine publiée. On note les modifications suivantes : Val 1 - ile val 2 - thr ; gln 24 - lys ; asp 33 - asn glu 35 - lys ; lys 36 - gly ; lys 47 - asn gln 49 - glu et asp 53 - asn. Ceci constitue un changement majeur dans la séquence car 7 de ces modifications impliquent un changement de charge.L'homologie entre la séquence codante clonée et la séquence de la protéine publiée est ainsi de 46/65, c'est-à-dire d'environ 70 %. I1 existe deux raisons possibles pour les différences observées entre les deux séquences d'amino-acidés. 10 - On peut voir des espèces, sous-espèces et mêmes des variations animales individuelles entre la séquence exacte de la molécule d1hirudine. I1 n'est pas possible de vérifier si les sangsues utilisées dans cette étude sont exacte ment de la même espèce ou sous-espèce que celles qui ont été utilisées pour publier la séquence d'amino-acide. En outre, il est possible qu'il existe dans les sangsues non seulement une mais différentes formes d'hirudine avec une activité biologique similaire mais avec des variations dans les séquences d'amino-acides de base. Dans ce contexte, il est significatif de mentionner les différences des résultats dans la littérature concer nant les amino-acides N-terminaux de l'hirudine (à l'ori gine in avait été trouvé dans la matière des têtes, puis val avait été trouvé dans l'ensemble de l'animal, tandis que plus récemment on a de nouveau indiqué ile pour la matière provenant des têtes. L'isoleucine se trouve dans la séquence de pTG717 à la position corres pondant à l'extrémité N-terminal de-la protéine mature. Le concept de différentes formes d'hirudine est supporté par les études préliminaires au niveau de 1'ADN. Lorsque 1'ADN total des sangsues est extrait à partir de sangsues congelées broyées par des procédés standards, digérées par divers enzymes de restriction traité par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés sur nitrocellulose et hybridés avec l'insert pTG717 comme sonde, on observe une grande quantité de fragments qui s'hybrident. Ainsi les résultats de la figure 4 sont obtenus de la façon suivante - 10 ug de 1'ADN total de sangsues sont mis en digestion avec des enzymes de restriction et pressés en électro phorèse sur un gel d'agarose à 1 %, transférés sur des filtres de nitrocellulose et hybridés avec un insert PstI marqué au E 32p7 de pTG717. Les filtres sont alors lavés fortement (0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 650C) et les bandes hybridées sont visualisées par autoradiographie. Ligne 1 - ADN digéré avec EcoRI Ligne 2 - ADN digéré avec HindIII Ligne 3 - ADN digéré avec BamHI Ligne 4 - ADN digéré avec BglII La dimension des fragments EcoRI en kb est indiquée à droite. Avec les fragments de digestion Eco R1, 6 fragments totalisant 40 kb peuvent se voir dans des conditions de lavage très dures. Même s'il est théoriquement possible que ce schéma représente un gène mosaïque très large, il est peu probable qu'une seule petite séquence codant pour moins de 400 bases soit distribuée sur 40 kb de génome. En outre, des expériences préliminaires avec des sondes comportant des fragments à insert partiel suggèrent que cela n'est pas le cas. I1 a également été observe qu'il existait une différence dans les séquences dans différents clones d'hirudine, isolés à partir de la même banque de cADN. Par exemple dans pTG700 un lys se trouve en position 47 (figure 2) comme dans la séquence d'amino-acides publiée, tandis que dans pTG717 il existe un asn à cette position. C'est pourquoi toutes ces informations sont consistantes avec le concept de gènes d'hirudine de structure différente et présentant des formes multiples au niveau de la protéine. Un point finalement important est que la séquence entière du mXRN d'hirudine n'est certainement pas contenue dans pTG 717. En effet, la lecture ouverte continue jusqu'd l'extrémité 5' du clone et il n'y a pas de méthionine dans cette région. Comme l'hirudine est une protéine qui est sécrétée à partir des cellules des glandes salivaires, on peut penser qu'elle a à son extrémité N-terminal une séquence "leader" (nécessaire pour la sécrétion) et probablement aussi une pro-séquence. La molécule active finale serait alors produite comme cela est le cas pour de nombreuses zymogènes et précurseurs par des étapes de clivage protéolytiques. La taille du mARN de l'hirudine a été déterminée et confirme que le clone pTG717 n'en n'est pas une copie complète. L'ARN des têtes total d'hirudîne a été passé sur électrophorèse sur un gel d'agarose formaldéhyde dénaturé (27) transféré sur nitrocellulose et hybridé avec un insert de pTG717. Une espèce d'ARN hybride unique de 640 paires de bases est observée. Comme on pense que le pTG717 contient la séquence de mARN 3' entière (une portion polyA est observée) de même que deux sites d'addition de polyA qui se recouvrent, environ 20 base à partir du polyA, on v-oit une région non traduite 3' de 160 bp (figure 3).Ce clone de cDNA manque de 160 paires de base à l'extrémité 5'. il comprend le reste de l'extrémité N-terminal de la protéine, la méthionine de l'initiateur, et une région non traduite 5' du mARN. I1 n'est pas exclu que l'hirudine soit coupée-à partir de l'extrémité C sous forme d'un précurseur plus important, qui peut coder pour d'autres peptides actifs biologiquement, bien que la taille maximum de ce précurseur hypothétique serait au moins de 110 a 120 aminoacides, (c'est-a-dire environ le double de la taille de l'hirudine mature). I1 n'a pas été possible de générer les clones de cADN d'une longueur supérieure à celle de pTG717 et on pense qu'une structure secondaire dans l'extrémité 5' du mARN empêche la transcription inverse du mARN au delà de ce point. L'analyse de la séquence génomique de l'hirudine devrait fournir des informations sur l'extrémité 5' de ce gène. La séquence d'amino-acides de l'hirudine codée par le clone pTG717 a été adaptée pour s'exprimer dans les cellules de E. coli de la façon qui sera décrite ciaprès. Expression de l'hirudine dans E. Coli A partir de l'analyse de restriction de pTG7i7 (figure 5) il est clair que l'ensemble de la séquence codant de l'amino-acide est contenu sous forme d'un fragment de 225 bp HinfI/AhaIII. Ce fragment est isolé par restriction et inséré dans les vecteurs d'expression plasmidique pTG951 et pTG927 en utilisant des molécules d'adaptateurs d'oligonucléotide synthétique. Les adaptateurs constituent les 7 amino-acides qui ont été éliminés de l'extrémité N-terminal par la restriction Hindi et on ajoute le fragment méthionine initiateur et le site pour les endonucléases de restriction NdeIou BglII qui sont nécessaires pour l'insertion dans les vecteurs d'expression. Les deux amino-acides après l'initiateur met sont remplacés, c'est-à-dire que le fragment ile-thr qui figure dans le clone de cDNA pTG717 est remplacé par val-val de la séquence de protéine d'hirudine publiée. Bien que le clone de cADN pTG717 comporte la séquence ile-thr au lieu de la séquence val-val de la séquence publiée pour l'hirudine, il a été décidé initialement d'exprimer la molécule avec une séquence val-val à l'extrémité N-terminal. I1 y a deux raisons à ce choix - le clone de cADN est certainement incomplet, avec pro bablement une structure secondaire dans le mARN qui empeche la transcription. Ceci rend possible que l1extré- mité 5' de la séquencè de cADN soittcorrecte compte-tenu de la transcription et du clonage "d'artefacts", - en général on admet que l'extrémité N-terminal de la molécule d'hirudine active extraite de l'animal complet commence avec val-val (8, 11). Le vecteur d'expression pTG951 est un vecteur d'expression plasmidique destiné à exprimer le gène de l'interféron y dont la synthèse est rappelée à la fin de la présente description. Pratiquement, il contient essentiellement le promoteur gauche du bactériophage PL contrôlé par un répresseur codé par l'hôte thermosensible C1857, suivi par le gène N de h , intact ou tronqué. Ensuite on trouve un site de fixation des ribosomes synthétiques qui a été conçu pour donner une fixation des ribosomes optimale. Un site de restriction unique BglII se trouve situé entre le site de fixation des ribosomes et 1'ATG de la séquence codant pour l'interféron y. Ce vecteur est mis en digestion sur le site BglII et au site unique PvuI en aval de la séquence codant pour l'interféron y puis est récupéré par électrophorèse sur gel d'agarose. Ce fragment de vécteur est combiné avec un ensemble d'oligonucléotide d'adaptateurs et la séquence d'hirudine contenant le fragment HinfI/AhaIII tel que cela est décrit dans la figure 6. Le vecteur d'expression pTG927 est étroitement relié au vecteur d'expression pTG908 décrit à la fin de la présente description. Il diffère seulement en ce qu'il contient un fragment additionnel SalI-PvuII provenant du gène de la tétracycline de pBR322. Le vecteur d'expression pTG927 contient le promoteur PL, un gène N intact et le site de fixation des ribosomes de la protéine CII de X puis 1'ATG et une séquence codant pour le fragment lacZ de la 8-galactosidase. Sur 1'ATG de cette séquence codante on trouve un site NdeI. Ce vecteur est mis en digestion avec NdeI et PvuII et le fragment de vecteur est purifié. I1 est utilisé ensemble avec un autre jeu d'adaptateur d'oligonucléotide et le fragment HinfI/AhaIII de l'hirudine pour construire le second vecteur d'expression de l'hirudine qui figure à la figure 6. Les deux vecteurs d'expression sont destinés à exprimer la molécule d'hirudine native (avec une séquence val-val à l'extrémité N-terminal immédiatement après 1 'ini- tiateur ATG). Dans l'oligonucléotide adaptateur le codon de la 3ème base est choisi pour favoriser un haut degré de traduction et pour éviter la formation de structures secondaires dans les mARN au niveau de cette région. Les deux vecteurs sont assemblés de la façon suivante : les oligonucléotides sont phosphorylés à l'extrémité 5' par la polynucléotide kinase, puis traités en mélange équimolaire (après 10 minutes de chauffage à 650C pour 15 heures à 150C). Le vecteur et le fragment d'hirudine sont ajouter en quantité destinés à donner des rapports molaires du vecteur /les fragments d'hirudine/fragment d'adaptateur de 1:20:50 et le mélange est lié avec la ligaseADNT4. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer la souche E. coli Tu990 et les transformants portant les plasmides sont sélectionnés sur la plaque d'agar contenant de l'ampicilline (100 pg/ml) et ceux qui comportent la séquence codant pour l'hirudine sont identifiés par hybridation des colonies en utilisant un insert marqué de pTG717 comme sonde.A partir d'un grand nombre de clones positifs, 6 de chaque, en même temps que 1 négatif (souche parente) sont sélectionnés et mis en croissance dans un milieu liquide de bouillon-t à 300C jusqu'à une densité optique de 0,3 à 650 nm. L'expression à partir du promoteur PL est ensuite induite par une augmentation de la température à 370C et une incubation qui est maintenue pendant 6 heures. Les cellules sont alors récoltées par centrifugation, suspendues 1/5 du volume de TGE (25 mM Tris HC1, pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA) puis broyées par sonification. Après clarification des extraits par centrifugation, un aliquote du surnageant est testé pour son activité antithrombinique. Des niveaux significatifs d'activité antithrombinique apparaissent dans 5 des 6 constructions avec pTG 927 et dans 4 des constructions sur 6 avec pTG 951 qui indiquent également une activité bien qu'elle soit plus faible. Les contrôles n'indiquent aucune activité significative. L'analyse de la séquence d'ADN des clones donnant des résultats positifs par séquençage direct des plasmides montrent que la sequence attendue se trouve dans toutes les constructions qui présentent une activité. Deux clones présentant une expression positive, le clone pTG719 dérivant de pTG951 et leclone pTG718 dérivant de pTG917 sont analysés pendant 6 heures d'induction. Après croissance de la culture à 300 jusqu'à une densité optique de 0,3, l'expression est induite par une augmen tation de la température à 370C et un aliquote est prélevé toutes les heures pendant 6 heures des extraits tels que préparés précédemment et l'activité en hirudine est mesurée (29). Les résultats (figure 7) montrent que le clone pTG719 . présente une croissance initiale suivie par un plateau de l'activité après 3 à 4 heures qui est au niveau de 370 U/1 à une densité optique de 650. Au contraire, le clone pTG718 présente une activité supérieure qui continue à croître pendant toute cette période d'induction. Le niveau d'activité obtenu après 6 heures est environ 5 fois supérieur à celui du clone pTG7i9 et représente une activité totale de 7300 p/1 de culture. Si ce recombinant d'hirudine présente une activité spécifique similaire à celle du produit naturel val-val le produit obtenu dans les extraits les plus actifs correspondraient à environ 1 mg/l de culture. Propriété de l'hirudine obtenue. Afin de caractériser l'hirudine obtenue à partir de E. coli on a analysé directement des échantillons de culture après induction, qui ont été chauffés à 700C pendant 15 mn ou chauffés à 700C après réduction du pH 2,8 avec HC1. Dans ce dernier cas le pu de extrait à été ramené à la neutralité avant d'être dosé. L'hirudine native traitée de la même façon ne présente pas de perte d'activité, comme cela pouvait être attendu compte-tenu des propriétés publiées de la molécule (20). Dans le cas de l'extrait, aucune perte d'activité n'apparat après ce traitement, en fait, après le traitement on observe une augmentation de l'activité d'environ 2 fois.Ceci peut refléter soit la dégradation, soit l'inactivation des constituants de l'extrait qui inhibaient l'action de l'hirudine, ou peut être le pH assez bas et l'étape de chauffage peuvent dans certains cas assurer une reformation plus complète des ponts disulfure qui sont nécessaires pour que l'hirudine présente une activité maximum. Les extraits de contrôle ne présentent aucune activité avant ou après le traitement. Lorsque les extraits bactériens sont pré incubés avec de la thrombine fixée sur une résine sépharose et que la thrombine-sépharose est éliminée par centrifugation, pratiquement toute l'activité hirudineliitiale se trouve éliminée de l'extrait. L'hirudine obtenue selon la pré- sente invention semble se lier de façon très efficace à la résine thrombine-sépharose ce qui permet d'envisager une . possibilité pour la purification de cette hirudine bactérienne. Des cultures bactériennes de cellules contenant le vecteur d'expression pTG7i8 sont mises en culture jusqu'à une densité optique de 0,3 à 30 C puis induites à 370C et des aliquotes sont prélevés toutes les heures et marqués, sur milieu minima avec de la méthionine 35S 100 pCi/ml. Les bactéries sont rassemblées par centrifugation et l'ensemble des protéines bactériennes marquées sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS, suivies par une fluorographie. Aumoins deux polypeptides induits en quantité significative par la construction du vecteur peuvent être obser vés à environ 6 a 8 000 Daltons (figure 8 - lignes 5 à 10). Lorsque les matériaux marqués à partir de cultures non induites de pTG718 et à partir de cultures de 3 et 5 heures après induction sont traités à 700C à pH 2,8 pendant 15 mn, centrifugés pour éliminer les protéines dénaturées et analysées sur un gel de polyacrylamide SDS, il est clair que l'essentiel des protéines de E. coli marquées sont éliminées de l'échantillon (figure 9 - lignes 1 et 2). Cette procédure donne une purification très satisfaisante des 2 bandes de poids moléculaire faible qui sont induites dans les vecteurs d'expression de l'hirudine. L'ensemble de l'activité hirudine se retrouve dans le surnageant. Expression d'une protéine d'hirudine fusionnée. Comme les polypeptides étrangères de bas poids moléculaire exprimées dans E. coli sont souvent instables, on peut envisager facilement d'exprimer une hirudine sous forme fusionnée dans le vecteur pTG927 en insérant un segment NdeI contenant l'essentiel du gène de la B-galacto- sidase dans le site de restriction unique NdeI de pTG718. Cette construction nommé pTG720 peut exprimer une fusion ss-lac-hirudine dans laquelle la séquence complète de l'hirudine peut être séparée de la séquence de la ss-galactosidase au niveau de l'amino-acide méthionine par clivage de ce produit avec du bromure de cyanogène qui fournit la molécule d'hirudine sans méthionine résiduelle à l'extrémité N-terminal. Préparation des plasmides vecteurs pTG951 et pTG927. Ces plasmides vecteurs ont été utilisés pour cloner l'interféron Y ou dérivés de plasmides entrant dans la préparation de tels vecteurs. C'est cette synthèse qui sera rappelée brièvement ci-après en regard des figures ci-annexées sur lesquelles - la figure 10 représente la préparation de pTG907 - la figure 11 représente la préparation de M13 TG910 - la figure 12 représente la préparation de pTG908 - la figure 13 représente la préparation de pTG909 - la figure la représente la préparation de pTG941 - la figure 15 représente la préparation de pTG951. La préparation de ces plasmides vecteurs comporte essentiellement : a - la préparation de pTG908 vecteur qui comporte PLION et CII rbs b - la préparation de pTG951 vecteur qui comporte un site de fixation des ribosomes synthétiques. Préparation de pTG907 (figure 10). Le plasmide de base utilisé est le plasmide pBR322 ; toutefois, celui-ci présente l'inconvénient d'avoir à l'intérieur du gène ampR un site de restriction PstI, car un site de même nature sera utilisé par la suite dans la zone de clonage comme site unique de restriction. I1 convient donc de faire disparaltre ce site de restriction PstI en utilisant un mutant du plasmide pBR322, le le plasmide pUC8, dans lequel le gene de résistance à l'ampicilline ne présente pas de site de restriction PstI (ce site a été éliminé par mutation in vitro). pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laboratories et pUC8 est décrit dans l'article référencé 30. Pour ce faire, on échange le fragment PvuI/PvuII de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue PvuI/PvuII du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plasmides pBR322 et pUC8 sont traités successivement par PvuI, PvuII, puis circularisés par action d'une ligase. On obtient ainsi le plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction PstI et qui a également perdu le site de restriction NdeI présent à l'origine sur pBR322 (non représenté sur la figure). En outre, le plasmide pTG902 porte un fragment de 50 kb correspondant à- la séquence laci' dans lequel se trouve le site PvuII. Le promoteur PL et le gène AN (qui provient du phage A, le gène kN code pour une fonction d'antiterminaison de transcription) sont isolés du plasmide pKC30 pour être inserés dans pTG902 comme celà est indiqué sur la figure 10 ci-annexee par traitement EcoRI, Sl, BamHI pour pTG902 et par traitement PvuI, S1, BamHI pour pKC3O avec ligation. L'un des plasmides obtenus après transformation de la souche TGE900, pTG906, est traité de façon à éliminer le segment PvuII-SalI. Pour ce faire, pTG906 est traité successivement avec SalI, la nucléase SI, PvuII et la ligase. On obtient ainsi pTG907. Préparation de M13 TG910 (figure 11). On insère ensuite la "région de fixation des ribosomes" AcIIrbs (provenant elle aussi du phage A) sous forme d'un fragment AvaI/TaqI dans le début du gène LacZ' (fragment a de la ss-galactosidase) lequel a été cloné dans le phage M13 nommé M13tgl10. Cette stratégie permet un test fonctionnel simple pour rbs, à savoir la production de la protéine lacZ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal ; ceci permet gale- ment un séquençage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxy. On obtient ainsi après sélection dans les bactéries compétentes un clone résultant M13tg910 dont la structure globale est représentée à la partie inférieure de la figure. Préparation de pTG908 (figure 12). Le fragment cIIrbs/lacZ' du phage M13tg910 est transféré sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédem- ment. Pour ce faire, on élimine les sites EcoRI, BamHI et AvaI en amont de cIIrbs puis on insère un site BglII. Dans ces conditions, cIIrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site BamHI en aval du promoteur PL et du gène AN de pTG907. Le phage M13tg910 est digéré avec EcoRI puis traité avec Bal31 puis ensuite par la polymérase de Klenow. Les fragments obtenus sont alors soumis à l'action de la ligase en présence d'adaptateur BglII non phosphorylés. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM103. On sélectionne alors les plages bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin de vérifier qu'ils contiennent le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI ou BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg 912 dont la structure est représentée. Le traitement par Bal31 a produit une délétion de 101 bp éliminant les sites EcoRI, BamHI et Aval ; ainsi que les séquences de lac ATG et lac Shine/Dalgarno. Le site BglII introduit se trouve placé environ 100 bp en amont de 1'ATG de cII et 10 bp en aval de Plac. Le fragment BamHI/SphI de pTG907, le fragment BglII/HpaI portant cIIrbs et lacZ' et l'adaptateur phosphorylé ont été préhybridés dans un rapport molaire de 1:2:1 puis traités avec la ligase T4. Des aliquots sont utilisés pour transformer les cellules compétentes de la souche 6150 à 30C. Les cellules intéressantes sont identifiées ensélectionnant les transformants avec un fragment cIIrbs/ lacZ' marqué au P32 et la construction obtenue est confirmée par une étude de restriction enzymatique. Afin d'avoir une première indication montrant que les différents éléments du système d'expression se conduisent comme cela est désiré, le plasmide obtenu, pTG908, est transféré dans une souche hôte N6437 qui possède à la fois c1857 et le fragment X de la ss-galactosidase complémentant le fragment a qui est codé par le plasmide. Les transformants obtenus placés sur une boite contenant IPTG + Xgal sont blancs à 280C puis virent au bleu environ 30 minutes après lorsqu'on les transfère à 420C. Ce vecteur avant d'être utilisé pour cloner l'hirudine a été adapté pour cloner l'interféron y humain IFN-y, en fait pour le clonage de l'hirudine la nature de la protéine intermédiaire clonée n'a pas d'importance, mais les vecteurs ont été réalisés selon le schéma ci-après. L'analyse de la séquence des nucléotides de IFN-y pour les sites de restriction révèle un site EcoRII à 8 bp en aval du départ de la protéine mature et un site Sau3A à 285 bp en aval du codon stop, ce qui permet d'isoler pratiquement toute la séquence codant pour la protéine mature sur un fragment EcoRII/Sau3A. Le clone de IFN-y obtenu à partir d'une banque est nommé pTGll. Construction de pTG909 (figure 13). On utilise tout d'abord une molécule d'adaptation synthétique qui permet a) d'effectuer la jonction entre les extrémités EcoRII et NdeI, b) d'introduire les 8 bp manquantes par rapport à la séquence codant pour IFN-y mature et, c) de reconstituer le codon de départ ATG de cIIrbs de façon que la séquence codant pour la protéine IFN-y mature soit traduite sans amino-acides fusionnés à l'exception de l'initiateur F-met. Cet adaptateur est synthétisé chimiquement et sa constitution est représentée sur la figure. pTGll est mis en digestion avec EcoRII et Sau3A et pTG908 avec NdeI et BamHI. Les fragments appropriés sont purifiés sur gel, mélangés avec une quantité équimolaire de l'adaptateur, préhybridés et ligés. Le mélange est utilisé pour transformer des cellules compétentes TGE900 et les transformants sont sélectionnés en hybridant un insert PstI de pTGll "nick-traduitW et marqué au P32 avec les transformants. 13 clones sont sélectionnés et contrôlés par cartographie et l'un d'eux pTG909 est vérifié par séquen çage. Construction du vecteur pTG941 (figure 14). pTG909 contient 2 sites NdeI, l'un au codon de départ de IFN-y et l'autre 22 bp eb aval de la séquence IFN-y. La région entre ces sites qui est la région codant pour les 7 premiers amino-acides de IFN-y a été éliminée par traitement avec -NdeI et remplacée par un oligonucléotide synthétique qui est représenté sur la figure. Cette réaction détruit le site NdeI aval et recons titue le site NdeI amont tout en introduisant un site BamHI qui est unique. On obtient ainsi le vecteur pTG941. Construction de TG951 (figure 15). La figure 15 schématise la construction de pTG951 qui est dérivé de pTG941 dans lequel le fragment contenant le cIIrbs a été remplacé par une séquence synthétique sur la base de la séquence de la région d'initiation de la traduction de l'opéron E. coli lac noté E. coli lac opéron rbs. Cet oligonucléotide synthétique a été inséré au niveau du site HgaI entre le site unique NdeI du codon de départ de la séquence codant pour IFN-y et le site ClaI qui a été inséré dans le gène N. De ce fait par traitement avec NdeI et Clal le plasmide pTG951 ne contient plus qu'un gène N tronqué (un codon stop en phase avec la traduction du gène N est place immédiatement en amont d nouveau site rbs) et est depourvu -des terminateurs de transcription tLl et tRl présents dans pTG909 et pTG941. Les principaux résultats sont rappelés dans le tableau ci-après NOM PROMOTEUR RBS SEQUENCE DE RBS ET JONCTION AVEC LA SEQUENCE fmet cys tyr cys gln asp pro pTG909 PL cII TAAGGAAGTACTTACATATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA fmet cys tyr cys gln asp pro pTG941 PL cII TAAGGAAGTACTTACATATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC - fmet cys tyr cys gln asp pro pTG951 PL SYNTH CACAGGAACAGAGATCTATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC (lac) BglII REFERENCES 1. Markwardt, F. (1955) Naturwissenschaften 42, 587. 2. Markwardt, F. (1957) Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 308, 147@156. 3. Markwardt, F. and Walsmann, P. (1967) Hoppe@Seylers Z. Physiol. Chem. 348, 1381@1386. 4. de la Llosa, Tertrin, C. and Jutisz, M. (1963) Bull. Soc. Chioe. Biol. 45, 63@74. 5. Markwardt, F. (1970) in Methods in Enzymology, eds. Perlman, G.E. and Lorand, L., Academic Press., vol. 19, pp. 924-932. 6. Bagdy, D., Barabas, E. and Graf, L. (1973) Thrombosis Research 2, 229- 238. 7. Graf, L., Patthy, A., Barabas, E.B., and Bagdy, D. (1973) Biochim. Biophys. 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REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage et d'expression dans une cellule hôte de l'hirudine ou d'un analogue de l'hirudine, caractérisé en ce qu'il comporte le gène codant pour l'hirudine ou un analogue de l'hirudine et les éléments d'expression de ce gène dans ladite cellule haute. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gdne codant est sous la promotion d'un promoteur bactérien et que ledit promoteur bactérien est précédé d'une région codant pour l'initiation de la traduction. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérise en ce qu'il comporte l'origine de réplication d'un plasmide bactérien, un promoteur, en particulier tout ou partie d'un pro moteur du bactériophage A : PL, PR ou P'R ; une région codant pour l'initiation de la traduction incorporant 1'ATG soit de l'extrémité 5' du gène de l'hirudine, soit de l'extrémité 5' du gène de l'hirudine fusionné en 5' avec une autre protéine. 4) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'origine de réplication est l'origine de réplication de pBR322. 5) Vecteur selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la région d'initiation de la traduction comporte tout ou partie de la séquence d'initiation de la traduction de la protéine cII du bactériophage A nommé cIIrbs. 6) Vecteur selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la région d'initiation de la traduction comporte tout ou partie de la séquence ATAACACAGGAACAGATCTATG 7) Vecteur selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, tout ou partie du gène N du bactériophage A 8) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène codant pour l'hirudine débute par 5' - GTA GTT - 3' CAT CAA 9) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un gène conférant la résistance à un antibiotique. 10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte le gène AmpR. 11) Vecteur selon la revendication 1O, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pTG718 ou pTG719. 12) Vecteur selon l'une des revendications 1 à iii caractérisé en ce que entre le codon ATG d'initiation et le premier codon codant pour l'hirudine ou un analogue de l'hirudine se trouve une séquence codant pour une autre protéine. 13) Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 12. 14) Cellule selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie. 15) Cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli. 16) Procédé de préparation d'hirudine ou d'un analogue d'hirudine, caractérisé en ce qu'on cultive une cellule transformée selon l'une des revendications 13 à 15 et que l'on récupère l'hirudine ou l'analogue d'hirudine formés. 17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'hirudine est récupérée à partir du produit de culture par chauffage à pH acide suivi d'une décantation, l'hirudine ou son analogue étant récupéré dans le surnageant. 18) Procédé selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que l'hirudine est récupérée par fixation sur une résine portant de la thrombine, puis élution de la résine après fixation avec un compétiteur de l'hirudine. 19) Hirudine ou analogue de l'hirudine obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des reven dications 16 à 18. 20) Hirudine ou analogue de l'hirudine selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'ils ont été modifiés par une réaction chimique ou enzymatique. 21) Hirudine comportant tout ou partie-du peptide suivant ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCG GGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA A@C AAT GTT T@C @GT Ile Thr Tyr Thr Asp Cy@ Thr Gl@ Ser Gly Gla As@ Leu Cys Le@ Cys Gl@ Gly Ser As@ Val Cys Gly AA@ GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAG GGC A@C CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAC CCT GAA AGC CAT AAT A@C Lys G@@ As@ Lys Cys Ile Les Gly Ser As@ Gly Lys Gly Asa Gla Cyr Val Thr Gly Gl@ Gly Thr Pre As@ Pro Gl@ Ser @is As@ As@ GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAA GAA TAT TTA CAA Gly Asp @@@ Glu Glu Ile Pro Glu Gl@ Tyr Leu Gla 22) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte comme principe actif une hirudine ou analogue de l'hirudine selon l'une des revendications 19 à 21. 23) Application de l'hirudine ou d'un analogue de l'hirudine selon l'une des revendications 19 à 21 à la séparation de la thrombine.