Brevet FR2563100A1 — publié le 19851025

C0 La présente invention concerne un procédé pour la détection de facteurs pathologiques ou/et toxiques, dans un liquide corporel humain ou animal. Elle se rapporte no- tamment à la détection du facteur cancéreux. La détection des modifications spécifiques dans le sang des malades cancéreux est considérée aujourd'hui comme ayant une grande importance pratique. En dehors de l'intérêt théorique qu'elle suscite, elle représente aussi un espoir pour trouver un test paraclinique d'utilité pra- tique pour la détection précoce du cancer. Pendant les der- nières décennies, un certain nombre de découvertes, dans différentes branches de la médecine, ont proposé des indica- teurs d'affection néoplasique. Ces données sont en rapport avec des changements enzymatiques, qualitatifs et quantita- tifs, se produisant dans le sang des malades cancéreux, tels que les variations des taux d'histaminase, de déhydrogénase lactique, ou d'aldolase sérique. D'autres découvertes por- taient sur des facteurs tumoraux d'organes spécifiques, tels que la phosphatase acide, la phosphatase alcaline ou les produits carcinomateux de la thyroïde. Toutes ces données ont en commun la postulation d'une différence fondamentale entre le métabolisme du tissu normal et le métabolisme du tissu cancéreux, différence dans l'expression enzymatique décelable. D'autres recherches biologiques ont abouti à la découverte, dans le sang des malades cancéreux, des protéi- nes pathologiques, telles que 41 et 2 et aussi d'autres protéines. Récemment, les progrès en immunologie et le raf- finement des techniques immuno-diagnostiques ont mené à la découverte de toute une série de marqueurs cancéreux, les plus connus parmi eux sont les antigènes oncofétaux et aus- si une série d'antigènes placentaux, d'hormones ectopiques, découverts récemment, tout comme les virus oncogéniques. Toutefois, la valeur pratique de ces marqueurs, pour le diagnostique, est limitée par un grand nombre de résultats faux-positifs et faux-négatifs, qui peuvent apparaître au cours de l'examen des malades cancéreux du groupe de con- trôle. En dépit du grand nombre de marqueurs, aucun d'en- tre eux n'a pu constituer par lui-même un test efficace pour diagnostiquer le cancer et c'est uniquement par le recours concomitant à différents tests biochimiques que l'on a pu obtenir certaines informations diagnostiques. Pour nombreux et varies qu'ils soient, les fac- teurs pathologiques, trouvés dans le sang des cancéreux, peuvent être identifiés uniquement par des méthodes bio- chimiques et immunochimiques, aucune méthode n'indiquant la valeur fonctionnelle, biologique, des produits patho- logiques. En fait, bien que les effets cliniques de l'into- xication cancéreuse soient bien connus, (syndrome paranéo- plasique), aucun test de laboratoire spécifique n'a encore ététrouvé qui puisse dépister les changements humoraux dis au cancer et leurs effets fonctionnels à distance, produits sur d'autres tissus vivants. La présente invention comble cette lacune elle apporte un procédé pratique d'application facile, permet- tant de détecter rapidement l'éventuelle présence de facteur cancéreux dans une substance comprenant un liquide corporel ou/et des cellules, prélevée sur le sujet à examiner. Ce nouveau procédé consiste à introduire, dans un organisme animal, ladite substance prélevée sur le sujet à examiner, et à observer certains effets biologiques, qui en résultent chez l'animal; le procédé est caractérisé en ce que l'on provoque une stimulation des motoneurones de l'ani- mal avant et après l'introduction de la substance, on déter- mine le potentiel d'unité motrice de l'animal, et l'on com- pare les valeurs de ce potentiel trouvées après l'introduc- tion de ladite substance, avec celles que l'on obtient avant cette introduction. Bien que divers liquides corporels et/ou différen- tes cellules du patient, soupçonné d'une affection cancéreu- se, puissent être utilisés, la substance particulièrement appropriée est le sérum du sujet à examiner. En ce qui concerne les animaux d'expérimentation préférés de beaucoup, ce sont des amphibies et, en parti- culier, des batraciens. Ils présentent de nombreux avanta- ges pour la réalisation de l'invention. Les caractéristi- ques de leur système nerveux central sont communes à tout le phylum des vertébrés, y compris les vertébrés supérieurs; leur organisation neuromusculaire est basée principalement sur l'innervation multiple du muscle; enfin, la différence entre les vertébrés à sang chaud et les poikilothermes mul- tiplie les possibilités de saisir les changements biologi- ques survenus chez les homéothermes. La neurostimulation de l'animal d'essai peut être effectuée par tous moyens connus, notamment selon la méthode électrique. Quant à la détermination du potentiel d'unité mo- trice elle est avantageusement réalisée à l'aide des élec- tromyographes, notamment à canaux multiples, qui permettent d'obtenir, sur un écran, des électromyogrammes enregistra- bles. Le procédé de l'invention procure ce résultat re- marquable que l'amplitude des potentiels est diminuée, lors- que la substance, introduite dans l'organisme de l'animal, contient un facteur cancéreux. Ainsi, par l'observation du diagramme, fourni par l'électromyographe, peut-on très ra- pidement savoir si le sujet examiné est cancéreux ou non. Dans les exemples, donnés plus loin et illustrés par les figures 1 à 13, on a opéré comme suit. Les sérums de sujets à examiner étaient prélevés chez des malades affectés par des cancers de formes, origines et localisations diffé- rentes, afin de vérifier si l'intoxication cancéreuse, carac- téristique des étapes avancées, accompagne tous les cas de malignité et non seulement ceux qui sont définis morphologi- quement comme la pseudo-myathénie du syndrome d'Eaton Lam- bert. D'autre part, pour comparaison, du sérum était préle- vé sur des sujets sains et sur des malades atteints de ma- ladies infectieuses, mais non cancéreuses. L'animal d'essai était la grenouille ou le crapaud. La méthode neurophysiologique employée utilise le fait que les jonctions neuromusculaires, ramifiées, de la grenouille sont formées par un grand nombre d'unités synaptiques à po- tentiels fonctionnels inégaux. Par une stimulation prolon- gée, appropriée, il est possible de rendre inactive une partie de ces unités synaptiques, et de diminuer la marge de sécurité fonctionnelle des autres. La sensibilité du mo- dèle neuromusculaire à l'égard d'un agent toxique, d'ail- leurs inefficace, est sensiblement augmentée par ce procé- dé, et les effets provoqués peuvent être détectés par sti- mulation électromyographique (EMG) appropriée.La détection des effets toxiques du sérum cancéreux est effectuée sur des amphibies adultes, immobilisés sur une table en liège, à la température ambiante. Des électrodes de stimulation sont placés sur les formations nerveuses supérieures de l'animal, afin de provoquer une stimulation physiologique des motoneurones, ultérieurement transmise au muscle par des fibres larges à conduction rapide. Les potentiels d'ac- tion motrice musculaire de l'animal, ainsi induits in vivo et in situ, sont détectés par des électrodes co-axiales et apparaissent sur l'écran d'un électromyographe à canaux multiples. Dans ces opérations les stimuli sont délivrés par un neurostimulateur et sont adaptés à une intensité supra- liminaire, en un temps de stimulation aussi bref que pos- sible, habituellement de l'ordre de 0,05 msec. Les trains de stimulation sont de préférence de 100 à 1000 msec, ou mieux de 300 à 800 msec, sous une tension de 1000 à 10000 hV. La fréquence de la stimulation est généralement de 1 c/s à 30 c/s; après approximativement 10 minutes de sti- mulation à cette fréquence, on injecte lentement dans le sac lymphatique dorsal de l'amphibie 0,5 à 1 ml de sérum du sujet à examiner. On continue lentement l'injection pen- dant cinq minutes, en maintenant une stimulation constante. Après l'accomplissement de l'injection du sérum, on recherche la présence et l'effet du Facteur Humoral Can- céreux (F.H.C.) en évoquant l'action EMG au moyen de trains de stimuli de fréquence et durée variables. La stimulation des modèles neuromusculaires de l'amphibie sain, non traité, par le procédé de l'invention produit des trains de Potentiels d'Unités Motrices (P.U.M.) de forme et de grandeur égales, constantes pendant de lon- gues périodes de stimulation. Les dessins annexés montrent des électromyogram- mes (EMG) obtenus dans différents cas. Fig. 1 correspond au diagramme de la grenouille nor- male, à laquelle aucune injection n'a été faite. A et A' sont les EMG respectivement des muscles gastro-crémiens droit et gauche, soumis à des trains de stimulations de 500 msec avec une fréquence de 20 c/s, la durée du stimulus étant de 0,05 msec (sous 10000 gV). B est un EMG similaire,mais enregistré à grande vitesse: 1 mm/lmsec0C avec 1 mm/2,5 msec. Fig. 2 donne en A et A' respectivement les EMG ob- tenus dans les mêmes conditions que les A et A' de la figu- re 1, mais sur les muscles g.cremius du crapaud auquel on a injecté - par la technique décrite plus haut - du sérum d'un sujet de 60 ans atteint d'un cancer gastrique. B est un EMG similaire, obtenu avec des trains de stimulations de 700 msec. Fig. 3 représente trois EMG, dont les deux supé- rieurs ont été obtenus dans les mêmes conditions que A et A' de la figure 1, mais avec une grenouille à laquelle on a injecté du sérum d'un malade atteint de T.W. leucémie lym- phatique aigae. La fréquence était de 30 c/s. L'EMG inférieur a été enregistré de la même manière, sauf la stimulation de 400 msec sous 2000 gV. Fig. 4.EMG du muscle g.cremius de la grenouille; respectivement trains de stimulation de 700 msec et 500 msec de 0,05 msec de durée, avec une fréquence de 26 c/s, sous 2000 gV. La grenouille avait reçu l'injection du sérum d'un patient de 45 ans porteur d'un ostéosarcome. Fig. 5. Deux EMG du muscle gastro-crémien gauche de la grenouille, l'un avec des trains de stimulation de 700 msec, l'autre avec 500 msec sous 2000 gV; durées 0,05 msec. Le sérum,injecté à la grenouille, provenait d'un ma- lade ayant le cancer de la prostate avec métastases. Fig. 6. Dans les mêmes conditions que le second EMG de la fig. 5 on a déterminé un EMG avec du sérum pro- venant d'un cancer gastrique. Fig.7. Les conditions générales étant celles de la fig. 4, cependant l'EMG I est fait avec des trains de stimulation de 700 msec, et EMG II 1000 msec; on a injecté à la grenouille le sérum d'un patient atteint d'un cancer squameux du poumon. Fig.8. Les vues A.B.C.D. composant cette figure, montrent schématiquement l'innervation multiple du muscle d'un batracien. Ces dessins sont à l'échelle 140:1 (10 mm correspondent à 71,4 microns). Le nerf est désigné par 1,sa partie terminale par 2. Les quatre vues illustrent différentes manières possibles d'injection d'une substance dans le muscle. Fig. 9. Les EMG sont enregistrés par multiélectro- de, dans la longueur du muscle'g.cremius de crapaud, auquel on a injecté du sérum d'un enfant de 12 ans souffrant de leucémie myclolde a-igCe. Les trains de stimulation sont de 700 msec, de 0,05 msec par stimulus, sous 1000.V. Fig. 10. Enregistrement monopolaire par multiélec- trode opéré sur muscle gastrique crémien de la grenouille, excité par des trains de stimulation de 500 msec, à 0,05 msec par stimulus, avec une fréquence de 18 c/s. Fig. 11. EMG similaire à celui de la fig.10 mais obtenu par enregistrement bipolaire. Fig. 12. Enregistrement bipolaire, comme Fig.10, mais 24 c/s et injection de sérum de cancer gastrique à la grenouille. Fig. 13. EMG obtenu par exploration bipolaire, avec multiélectrode, du muscle g.crémius du crapaud, auquel on a injecté du sérum d'un sujet présentant un mélanome ma- lin. Mêmes conditions de stimulation que pour fig. 12. La figure 1 montre l'enregistrement du diagramme physiologique évoqué par des trains de stimuli que séparent des intervalles de repos de même durée. Ce même diagramme physiologique apparaît aussi quand on a injecté à la gre- nouille ou au crapaud du sérum de contrôle prélevé sur des sujets normaux ou des sujets présentant des affections non- cancéreuses, notamment des maladies infectieuses, par exem- ple grippe ou staphylococcie. On a des trains de potentiels d'action d'amplitudes égales. Le diagramme électromyographique évoqué change dans le cas de l'injection d'un sérum cancéreux: à la pla- ce de potentiels de grandeur égale apparaft graduellement un EMG de type nouveau qui n'a jamais été décrit jusqu'à présent, et qui est quasi pathognomonique; ce diagramme signale la présence d'un facteur cancéreux spécifique. Le mécanisme de sa production est exposé ci-dessous. Sa prin- cipale caractéristique réside en l'apparition d'un premier potentiel d'unité motrice de grande amplitude du train, sui- vi de potentiels d'action à amplitudes décroissantes (Fig.2). Ce diagramme peut être sujet à un certain nombre de variations dues à son mode d'obtention, notamment mono ou diphasique (Fig. 3 et 4); le rapport entre le premier accident cancéreux (P.A.C.) et le reste du train peut être plus ou moins ample. On voit sur le tracé supérieur de la fig. 4 un AEC biphasique et des trains de potentiels d'ac- tion de grande amplitude; par contre, le tracé inférieur est en opposition de phase monophasique; le surchargement (trains prolongés) produit une activation EMG notable. Le PAC peut être dans la même phase que le reste du train ou en opposition de phase à divers degrés (Fig.5, 6 et 7). La fig. 5 montre la production d'un EMG en dents de scie; la décroissance de l'amplitude est proportionnelle pour les deux composants du diagramme. La production de l'expression électromyographique évoquée du cancer (EEEC) ,suivant l'invention, est fondée sur la spécificité de l'innervation du muscle de l'amphibie, dont la jonction neuromusculaire - comme mentionné ci-des- sus - est formée de nombreuses unités synaptiques à valeurs fonctionnelles inégales. La stimulation prolongée à fré- quence de 1 c/s des formations nerveuses supraspinales consomme une partie de la réserve du neurotransmetteur et cause la diminution de la marge de sécurité de fonctionne- ment du modèle. Pendant cette étape, quand les unités synaptiques, fonctionnant à la limite de l'épuisement, sont affectées par un facteur toxique, notamment le facteur humoral can- céreux, si l'inactivation agit de manière sélective sur une partie seulement des unités synaptiques, alors il se crée un état o le potentiel de l'unité motrice, dérivant d'unités synaptiques à longue durée de rechargement, un P.A.C. de grande amplitude est produit; par contre les unités synaptiques à rechargement rapide engendre des po- tentiels d'action de basse amplitude, répétés, caractéris- tiques du reste du train. Le prototype d'innervation multiple du muscle de l'amphibie a été décrit, dans ses lignes générales, par différents auteurs. Les résultats électromyographiques de la présente invention démontrent que le diagramme réel d'innervation est plus vaste qu'il n'a été décrit; il peut correspondre à une des formes ou dispositions illustrées sur la Fig. 8. Le mécanisme de la formation de l'expression élec- tromyographique évoquée du cancer (EEEC), proposé ci- dessus, est confirmé par l'exploration au moyen de multi- électrodes, effectuée le long de l'axe du muscle. L'enre- gistrement selon Fig. 9 montre qu'au cours du processus de stimulation, et sous l'effet de l'intoxication par le sérum du malade cancéreux, la jonction neuromusculaire de la grenouille présente deux ou plusieurs foyers électrogé- niques se déclenchant indépendamment, qui ont des expres- sions morphologiques différentes. L'exploration, enregistré avec des dérivations bipolaires, aussi bien que monopolaires, montre des résul- tats similaires, alors que les différences d'amplitude et de morphologie sont dues aux différences entre les métho- des d'enregistrement (Fig. 10 et 11). On constate notamment, sur la figure 10, un foyer électrogénique fusiforme se dé- ployant avec décrément entre les dérivations 6 et 10, alors que la transition des dérivations 1 à 5 est abrupte. La fig. 11 montre un foyer électrogénique avec amplitude maxi- male dans la dérivation 2-6. En définitive, chaque fois que le batracien n'a re- çu aucune injection, ou une injection de sérum d'un sujet sain ou porteur d'une affection non cancéreuse (fig.1, 10, 11), l'amplitude des potentiels d'action reste constante; par contre, lorsque du sérum d'un sujet cancéreux est injec- té, on constate une nette décroissance progressive de l'am- plitude (fig. 2 à 7, 9, 12 et 13). De tout ce qui précède résulte implicitement une méthodologie appropriée, pour indiquer et identifier diver- ses formes de choline acétyle transférase (ChAT) ou des isomères de celleci. L'existence des différentes formes de la ChAT et des isomères de ChAT est un fait accepté, bien que leur identification biochimique soit très diffici- le dans le système nerveux central et impossible dans le synapse neuromusculaire. Il s'est avéré que les différences 1 0 entre les valeurs fonctionnelles des unités synaptiques sont dues à leur contenu différent de transmetteur ner- veux. La synthèse de l'acétyle choline (Ach) est réglée par la transférase impliquée dans le métabolisme de l'Ach. Les fluctuations de la valeur fonctionnelle de l'unité sy- naptique et du contenu de la vésicule de l'Ach peuvent ê- tre affectées par une altération dans la synthèse de l'Ach, à la suite d'une action inhibitrice précédemment exercée par le facteur humoral cancéreux sur la transférase. La méthode électromyographique, suivant l'inven- tion, pour l'estimation de la jonction neuromusculaire de l'amphibie offre, par conséquent, la possibilité d'iden- tifier un ou plusieurs produits cancéreux d'accompagnement grâce à l'action spécifique de ces mêmes produits sur les isomères de la ChAT. Les variations de ces paramètres sont susceptibles de causer des modifications dans la EEEC carac- téristique de l'inhibition et/ou de l'activation de certains isomères de la ChAT par le sérum cancéreux spécifique (Fig. 12 et 13). Le déplacement distal de l'électrode commune (5), sur la figure 12, amène une proéminente opposition de phase sur le deuxième canal et une réduction notable de l'activi- té électrique de la première dérivation (tracé inférieur). Sur la figure 13, le passage de l'électrode de référence, entre les dérivations 1 et 8 produit successivement la dé- flexion de l'AEC en haut, en bas et en biphasicité. Le stan- dard de référence est placé au commencement du tracé. La jonction neuromusculaire de la grenouille s'est révélée un instrument sensible, qui réagit aux modifica- tions biochimiques, pathologiques, du sang à examiner, par des changements fonctionnels, susceptibles d'être enregis- trés par des moyens neurophysiologiques.L'estimation des effets fonctionnels des produits cancéreux d'accompagnement apporte un nouvel élément dans la recherche du cancer. Ain- si le procédé de l'invention permet-il d'établir un rapport 6 3 1 0 0 1 1 qualitatif et quantitatif entre le taux et l'activité du facteur humoral cancéreux, d'une part, et l'expression élec- tromyographique évoquée du cancer (EEEC), d'autre part, ba- sé sur des comparaisons entre l'état clinique du malade et les divers diagrammes EMG obtenus. Le critère suivant l'in- vention,qui présente par lui-même une importance diagnosti- que, peut également avoir une importance considérable en immunologie. L'identification et l'isolement des produits cancéreux d'accompagnement, possédant une activité fonc- tionnelle tissulaire, offre la possibilité de leur utilisa- tion comme déterminants antigéniques et ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques en immunologie. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'un facteur cancéreux dans une substance, comprenant un liquide corporel ou/et des cellules, prélevée sur un sujet à examiner, caractérisé en ce que l'on provoque une stimulation de motoneurones d'un animal, avant et après l'introduction de ladite substance dans un muscle de l'animal, on détermine le potentiel d'u- nité motrice de l'animal, et l'on compare les valeurs de ce potentiel trouvées après l'introduction de la substance avec celles que l'on a obtenues avant cette introduction. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'animal d'essai est un amphibie, en particulier un batracien. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que la stimulation est électrique et porte sur des formations nerveuses, centrales, de l'animal. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le potentiel d'unité motrice est dé- terminé et enregistré au moyen d'un électromyographe. 5. Procédé suivant la revendication 3 ou 4, caractéri- sé en ce que la stimulation est effectuée par des trains de à 1000 msec, et de préférence 300 à 800 msec, de stimuli dont l'ordre de grandeur de durée est de 0,05 msec. 6. Procédé suivant une des revendication 3 à 5, carac- térisé en ce que les stimulations sont produites sous 1000 à 10000 AV. 7. Procédé suivant une des revendications 3 à 6, carac- térisé en ce que la fréquence des stimuli est de 1 à 30 c/s. 8. Procédé suivant une des revendications précédentes, dans lequel la substance injectée est le sérum du sujet à examiner. 9. Application du procédé suivant une des revendica- tions précédentes à l'inhibition ou/et activation sélective de différents isomères de la choline acétyle transférase (ChAT). 10. Application du procédé suivant une des revendica- tions 1 à 8 à l'établissement d'un critère permettant la séparation des protéines et/ou polypeptides d'un sérum.