Brevet FR2566663A1 — publié le 19860103

Vermicide à base de mébendazole et procédé pour la préparation de ce vermi- cide L'invention concerne un vermicide, en particulier pour le traite- ment de la maladie hydatique (échinococcose) et de l'alvéococcose ainsi qu'un procédé pour la préparation de ce vermicide, trouvant application en médecine humaine et vétérinaire. On connaft l'utilisation, sous forme de pillules, du mébendazole (méthyl5-benzoyl-2-benzimidazole carbamate) pour le traitement de la maladie hydatique et de l'alvéococcoseo Les inconvénients du mébendazole en tant que vermicide sont faible efficacité pour l'homme ainsi que pour les animaux, même lors d'un traitement quotidien pendant 1 à 5 ans; toxicité envers l'organisme récep- teur; cette préparation provoque des perturbations dans les derniers mois de la grossesse. Les procédés déjà connus pour préparer des liposomes qui contien- nent des substances biologiquement actives comprennent la dissolution des phospholipides dans un solvant organique à concentration déterminée, l'éva- poration, l'addition d'eau ou de tampon et le traitement postérieur par ultrason. Les liposomes ainsi préparés sont surtout à structure monolamel- laire, ce qui les rend de faible efficacité pour inclure des quantités optimales de substances pharmaceutiques hydrophobes telles que le mébendazole. L'objet de l'invention est de mettre au point un vermicide, plus particulièrement pour le traitement de la maladie hydatique et de l'alvéo- coccose, à partir du mébendazole ainsi que de développer un procédé pour la préparation de ce vermicide, permettant une application intraveineuse, et d'atteindre une grande efficacité envers les parasites, de même qu'une faible toxicité envers l'organisme récepteur. Cet objet est atteint par la mise au point d'un vermicide, pré- sentant une forme liposomique qui contient de 0,5 à 2,0g de mébendazole (méthyl-5-benzoyl-2-benzimidazole carbamate), de 0,2 à 0,6 g des lipides totaux du jaune d'oeuf, et de 20 à 80 ml d'une solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium. Les liposomes ainsi préparés sont homogènes en ce qui concerne leur diamètre moyen, lequel est déterminé par microscopie électronique et est en moyenne de 0,4 microns. On observe aussi les liposomes ayant un diamètre de 0,3 et 0,5 microns. Les liposomes sont multilamellaires, c'est- à-dire constitués par plusieures couches bimoléculaires. Le procédé de préparation du vermicide selon l'invention comprend les étapes suivants: On ajoute à la solution chloroforme-méthanolique des lipides totaux de jaune d'oeuf et du méthyl-5-benzoyl-2-benzimidazole car- bamate. On agite le mélange et on évapore à sec à des températures de 20 à 40 C. Ensuite, on ajoute la solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium, à température ambiante, en remuant continuellement afin d'hydrater les lipides jusqu'à la formation finale des liposomes. Ces derniers sont soumis à un cycle de congélation et de décongélation en les faisant passer de 1 à 12 fois à des températures de -196 C et +35 C. Le rapport phase aqueuse: mébendazole: lipide doit être de :0,6:0,1 à 25:0,5;0,2. On obtient ainsi la forme liposome de vermicide, ce qui permet une application intraveineuse. Les avantages du vermicide pour le traitement de la maladie hydati- que et de l'alvéococcose selon l'invention sont sa grande efficacité, la courte durée du traitement, son innocuité. Il en résulte une période d'ac- tion prolongée du vermicide, ce qui permet d'espacer les intervalles d'appli- cation et de diminuer la dose totale. Ce vermicide est biologiquement décom- posable. Les avantages du procédé selon l'invention sont les suivants: il n'exige pas d'équipements spéciaux et de matières premières rares; le procédé est rapide et se réalise facilement; il assure l'obtention de liposomes stables. L'invention est illustrée de façon plus détaillée par les exemples suivants: Exemple 1 Le vermicide selon l'invention a la composition suivante: phase aqueuse (solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium)-40 ml; mébenda- zole(substance)-1 g; phase lipide(lipides totaux du jaune d'oeuf)-0,4 g. La microscopie électrcnique donne la possibilité de caractériser très précisement les liposomes. Les liposomes ainsi obtenus représentent des structures vésiculaires, multilamellaires à doubles couches de membranes lipidiques(fig.1). On remarque clairement la multitude de lamelles à partir desquelles est constitué le liposome. Chaque lamelle représente une couche' -10 bimoléculaire lipidique ayant une épaisseur d'environ 50 À (50.10 m.),ce qui correspond à l'épaisseur des membranes biologiques naturelles. Exemple 2 Le vermicide selon l'invention est préparé de la manière suivante: Dans un flacon à fond sphérique, on verse à la pipette, dans des conditions stériles, 3,3 ml d'une solution des lipides totaux du jaune d'oeuf, dissous dans du chloroforme et du méthanol (1 %). La solution de lipides initiale a une concentration de 129 mg/ml. On ajoute encore 10 ml de chloroforme et on agite fortement (vortex). Ensuite, on ajoute aux lipides 1,0 g de mébendazole, progressivement en agitant continuellement. On évapore dans un évaporateur rotatif durant 5 à 6 min,à la température ambiante. On ajoute encore 5 ml de chloroforme et on évapore pendant 1,5 h dans l'évaporateur rotatif à une temperature de 35 20C (bain marie). Les traces éventuelles de chloroforme sont éliminées par insufflation d'azote durant 5 min. A la substance ainsi séchée, on ajoute 40 ml de sérum physiologique stérile (solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium). Après une insufflation complémentaire d'azote durant 5 min, on incube pendant une période d'une heure à la température ambiante, en agitant continuellement (vortex) afin d'hydrater le lipide. Maintenant, on effectue la congélation à l'azote liquide durant 2 à 3 minutes, puis une décongélation dans un bain marie à 500C durant 2 à 3 min, en agitant continuellement et fortement, de telle sorte que la température du mélange ne dépasse pas 400C. Exemple 3 Le vermicide proposé a été testé sur des animaux contaminés ex- périmentalement par la maladie hydatique. Le traitement des animaux (moutons A et B) commence 20 mois après leur contamination. Afin de suivre l'effet du traitement on a prélevé un échantillon de sang avant chaque piqûre, de façon à étudier la dynamique des anticorps selon la méthode de la réaction passive de l'hémoagglutinationlfig.2Y. On a évalué l'état général des animaux au cours du traitement, l'image macroscopique, les changements pathohistologiques dans le parasite et les organes internes de l'oganisme récepteur ainsi que les modifications ultrastructurales dans le parasite et les organes affectés. Juste après la préparation des liposomes à mébendazole inclus, qui se présentent sous la forme d'une suspension blanche comparable au lait ayant un goût salé et une odeur spécifique, on les injecte en une dose de 20 ml contenant 10 mg/kg de mébendazole, une fois par semaine intraveineusement(veine ugularis). La vitesse d'injection de 4 à 5 min. jusqu'à 5-6 sec.n'a eu aucune influence sur la façon de supporter la préparation. On n'a pas observé d'effets secondairesau-cours de toute la période de traitement. Le cours de traite- ment comprend six piqûres. Les animaux traités furent tués trois semaines après la dernière piqûre; toutefois une heure avant leur mort, les animaux subirent une piqûre supplémentaire afin de suivre à l'aide de la micros- copie électronique la localisation des liposomes dans les organes. Un groupe d'animaux témoins, contaminés avec le même parasite mais qui n'ont pas été soignés subirent des examens histologiques et par microscope électronique. A la fin de l'expérience, les animaux traités par le vermicide étaient dans un état général très bon et avaient pris du poids. Le titre en anti- corps (fig.2) commença à diminuer progressivement après la deuxième piqûre jusqu'à la sixième pour se stabiliser ensuite et rester constant jusqu'à la fin de la période étudiée (9 semaines). Chez les animaux du groupe té- moin examinés au microscope, on a établi des kystes du parasite de 10 à mm, ayant une image macroscopique caractéristique et une ultrastructure spécifique. Chez les animaux traités, les kystes avaient de 1 à 5 mm et pathohistologiquement on pouvait observer une destruction complète de la couche germinative ainsi que des changements considérables dans la membrane cuticulaire (fig.3). Dans la paroi périkysteuse et parfois dans la vésicule hydatique, on a pû établirla présence de dép8ts de calcium. Les organes internes des animaux traités ne s'écartent pas de la norme. Sur le plan de l'ultrastructure, on a constaté un parenchyme bien conservé. On a observé une multitude de liposomes secondaires à caractéristiques d'autophagosomes et de corpuscules résiduelles. Dans certains cas, on a idendifié des rési- dus de liposomes soumis à la destruction et à la phagocytose. La membrane germinative démontre une destruction complète et on constate des résidus sous forme de vésicules, formations membraneuses, granules osmiophiles etc. (fig.4). Dans les zones de nécrose, on identifie des inclusions à carac- téristique de liposomes soumis à décomposition. REVENDICATIONS 1. Vermicide, plus particulièrement pour le traitement de la maladie hydatique et de l'alvéococcose, à base de méthyl-5-benzoyl-2- benzimidazole carbamate, caractérisé en ce qu'il présente une forme lipo- somique contenant des lipides totaux du jaune d'oeuf et une solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium dans les proportions quantitatives suivantes: Méthyl-5-benzoyl-2-benzimidazole carbamate de 0,5 à 2,0 g Lipides totaux du jaune d'oeuf de 0,2 à 0,6 g Solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium de 20 à 80 ml, 2. Procédé de préparation du vermicide selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans une solution des lipides totaux du jaured'oeuf dans du chloroforme-méthanol, on inclut le méthyl-5-benzoyl-2-benzimidazole carbamate, on évapore à sec à une température allant de 20 C à 40 C, on ajoute au résidu sec la solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium en agitant continuellement jusqu'à formation des liposomes, après quoi on effectue un cycle de congélation et de décongélation comprenant de 1 à 12 passages de -196 C à +35 C.