Brevet FR2571146A1 — publié le 19860404

La présente invention concerne des antigènes carcino-foetaux spécifiques du cancer du pancréas, leur purification, un antisérum spécifique, sa préparation ainsi que les compositions à usage diagnostique les comportant. La mise en évidence de la présence, dans des extraits de pancréas foetal, d'antigènes analogues à ceux des cellules pancréatiques tumoralesest connue. Des antigènes pancréatiques oncofoetaux humains ont été identifiés, ayant pour poids moléculaire 40 KD (Banwo 0., Versey J. et Hobbs J.R., New Oncofetal antigen for human pancreas. Lancet, I: 643-645, 1974; Hobbs J.R. , Knapp, M.L. et Branfoot A.G. Pancreatic oncofetal antigen (POA): its frequency and localisation in humans. Oncod. Biol. and Medicine, 1: 37-48, 1980), 800 et 900 KD (Gelder F.B., Resse C. J., Moossa A.R., Hall T. et Hunter R. Purification partial characterization and clinical evaluation of a pancreatic oncofetal antigen. Cancer Res. 38: 313-324, 1978) et 1 000 KD (Shimano T., Loor R.M. Papsidero L.D. et al. Isolation, characterization and clinical evaluation of a pancreas cancer associated antigen. Cancer., Supplement, 47: 1602-1614, 1981). Cependant, aucun de ces antigènes n'est spécifique du cancer du pancréas car ils se retrouvent dans des tissus différents des tumeurs cancéreuses pancréatiques. La présente invention concerne des antigènes carcino-foetaux du pancréas humain de masse moléculaire apparente moyenne choisie parmi 120 KD, 95 KD, 75 KD et 58 KD, en particulier les antigènes majeurs de masse moléculaire apparente moyenne 75 KD et 58 KD. 1I1 s'agit de glycoprotéines manosidées. La présente invention concerne un procédé de préparation d'antigène, caractérisé en ce qu'on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble et que l'on isole une fraction constituée par des glycoprotéines manosidées. Le procédé de préparation de ces antigènes comporte les étapes suivantes: a) on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble, b) on traite l'homogénat par chromatographie sur colonne d'affinité sur concanavaline A couplée à un gel et on fixe la fraction glycosylée comportant du manoside. c) on élue la fraction fixée, d) on purifie la fraction fixée éluée par dialyse et on la lyophilise, e) on sépare les antigènes par électrophorèse préparative et on recueille les deux fractions de gel chargées en antigènes majeurs, f) on extrait les antigènes des fractions de gel par électroélution des fractions contre un tampon, g) on dialyse contre de l'eau et on lyophilise. La préparation de l'homogénat est décrite à l'exemple 1. On utilise des foetus jeunes (moins de 5 mois de gestation), parce que les antigènes selon l'invention n'apparaissent pas dans le pancréas adulte et que des lapins injectés avec du pancréas de foetus âgés de plus de 6 mois n'ont pas produit d'anticorps décelables. Dans un mode particulier de réalisation, on a utilisé comme gel couplé à la concanavaline A du Sépharose 4B commçrcialisd par Pharmacia. La fraction non fixée est éliminée, la fraction fixée est éluée à l'aide de méthyl-manoside 0,2 M. On purifie alors la fraction fixée élude par une technique classique de dialyse contre de l'eau distillée et on la lyophilise. On sépare les antigènes par électrophorèse préparative. On a préalablement repéré les pics correspondant aux deux antigènes majeurs par électrophorèse qualitative. Les deux fractions de gel d'acrylamide chargées en antigènes majeurs sont alors prélevées, et les antigènes majeurs en sont extraits par électroélution dans un boyau de dialyse contre un tampon au phosphate P.B. S. (solution saline 0,15 M NaCl tamponnée à pH 7 avec tampon phosphate de potassium 0,01 M final). On dialyse contre de l'eau distillée et on lyophilise. La présente invention concerne également un antisérum contre les antigènes selon l'invention. Par la technique de "blotting" (après électro- phorèse en gel d'acrylamide - PAGE -, on transfert électrophorétiquement les protéines ayant migré dans le gel à une feuille de nitrocellulose; cette feuille est ensuite traitée comme dans la technique du NIF.), cet antisérum reconnaît, dans les extraits de pancréas foetal, 4 constituants de masse moléculaire apparente moyenne , 94, 75 et 58 KD (à 10 % près), dont 2 majeurs: 75 et 58 KD. Z571146 La présente invention concerne également un procédé de préparation de cet antisérum comportant les étapes suivantes: a) on injecte à un animal un extrait de pancréas foetal humain de moins de 5 mois, b) on saigne l'animal et on récupère un antisérum, c) on décomplémente cet antisérum, d) on absorbe l'antisérum décomplémenté, e) on centrifuge l'antis6rum décomplémenté absorbé, et f) on récupère l'antisérum spécifique. On prépare cet antisérum selon le protocole décrit à l'exemple 2 contre des extraits pancréatiques bruts préparés comme le décrit l'exemple 1. Dans le mode particulier de réalisation décrit à l'exemple 1, seules les saignées n 4 et 5 sont positives dans un test de présence d'anticorps. Dans un mode de réalisation de l'invention, on a injecté l'extrait à un lapin. Les souris et les poules, par exemple, peuvent également produire un antisérum contre ces extraits. Pour décomplémenter l'antisérum, on chauffe au bain-marie à environ 56 C pendant 1/2 heure, selon une technique classique. On rend ensuite l'antisérum spécifique du pancréas foetal par absorption de différents extraits, par exemple des extraits de pancréas adulte normal, du sérum normal, des globules rouges A, O, B. Pour ceci, on ajoute 2 ml de sérum normal par ml d'antisérum et 250 mg d'extraits de pancréas adulte normal lyophilisé par ml d'antisérum. Pour faire l'extrait de pancréas adulte normal, on procède comme à l'exemple 1, Z5 71146 le pancréas provient de donneur jeunes morts accidentelle- ment. On purifie l'antisérum décomplémenté absorbé par une technique classique de centrifugation. On a testé l'antisérum absorbé purifié pour sa faculté à déceler les antigènes par deux techniques: A) Immunofixation sur membranes de nitrocellulose (technique NIF) - Cette technique est décrite à l'exemple 3. Elle permet de déceler de très faibles quantités d'un ou plusieurs antigènes dans 'les mélanges complexes, par exemple des extraits bruts d'organes, des sérums patholo- giques. Cette technique permet de déceler approximative- ment jusqu'à 0,1 mg d'antigènes par ml dans les extraits bruts d'organes ou les liquides biologiques. La sensibilité varie avec le système antigène- anticorps et peut aller jusqu'à 0,01 gg d'antigène par ml, soit 0,0005 % lorsque, comme pour les tests rassemblés dans le tableau 1, les extraits sont analysés à partir de 20 mg/ml. Par cette technique, l'antisérum s'est révélé positif pour les extraits de pancréas foetal, les tumeurs de pancréas et des métastases hépatiques d'un cancer primitif du pancréas. Par contre, ont été révélés négatifs, d'autres extraits d'organes adultes ou foetaux détaillés dans le tableau I. 2571146" TABLEAU I EXTRAITS D'ORGANES NORMAUX ET SERUM NORMAL Organes Foetal adulte Pancréas + - Foie - - Estomac - - Poumon. - - Intestin - - Rein - - Rate - - Serum normal N.T - Les extraits sont des "pools" d'organes utilisés à concentration décroissante à partir de 20 mg/ml. N.T. = Non Testé Par cette même technique, 100 % des sérums de malades atteints de cancers du pancréas ont été positifs alors que le sérum de patients ayant d'autres tumeurs était négatif (voir tableau II) TABLEAU II SERUMS PATHOLOGIQUES SerumSpathologilques Nombre testés Nombre positifs Cancer pancreas 17 17 estomac 2 0 " colon 2 0 " poumon 2 Q " rein 2 0 10. Les sérums sont utilisés à des dilutions lg2 à partir de la concentration normale. B) Immunohistologie sur coupes fixées à l'éthanol ou au liquide de Bouin La méthode utilisée est décrite à l'exemple 4. En utilisant soit la technique d'immunofluorescence, soit l'immunopéroxydase indirecte, l'antisérum marque les cellules acineuses foetales jusqu'à environ le 6ème mois de la gestation et est négatif pour d'autres organes foetaux ou adultes. Il a marqué tous les cancers du pancréas analysés et a été négatif pour une large variété d'autres types de cancer. Les résultats de l'immunohistologie sont détaillés dans le tableau III. 7 1 146 TABLEAU III lmmunohistologie (peroxydase) Réaction de l'antisérum anti-pancréas foetal Cancer Nombre testés Positifs Négatifs Pancréas 12 12 0 Foie il 0 il Estomac 8 0 8 Colon 10 0 10 Glandes salivaires 4 0 4 Poumon 4 0 4 Vessie 6 0 6 Vésicule biliaire 6 0 6 Sein 3 0 3 Prostate 7 0 7 Tissus normaux Pancréas foetal 20 - 18 2 () 6 mois et moins Pancréas foetal 16 8 8 plus de 6 mois Pancréas adulte 6 0 6 Duodénum 4 0 4 Estomac 2 0 2 Vésicule biliaire 5 5 0 (canaux) Glandes salivaires 3 0 3 Pancréatite 7 2 5 chronique Les pancréatites chroniques constituent un cas à part car elles sont en général négatives, dans certains cas on observe un marquage similaire à celui trouvé dans les zones péritumorales. L'antisérum selon l'invention permet donc de déceler des taux sériques et tissulaires trop faibles pour être dosés par précipitation dont le seuil de sensibilité se situe autour de 10 gg/ml. Les antigènes selon l'invention peuvent être appliques à l'élaboration d'anticorps spécifiques. Une observation intéressante concerne la présence de ces antigènes dans les zones péritumorales. Ces antigènes pourraient avoir valeur de marqueurs prétumoraux. La présente invention concerne donc également des compositions à usage diagnostique contenant à titre d'élément actif au moins un antigène ou un anticorps selon les revendications 1, 2, 3 ou 5 et un substrat acceptable, sous forme de kits d'immunodiagnostic selon un mécanisme basé sur des réactions anticorps-antigène. EXEMPLE 1 Préparation d'extraits de pancréas foetal On prélève sur des foetus en bon état, après avortement thérapeutique, à 3 à 4 mois de gestation, le pancréas qui est rapidement-plongé dans une solution d'antiprotéase contenant de l'acide aminocaprolque (0,4 %) et de l'aprotinine (40 unités de Kallikreine / ml), par exemple l'aprotinine Trasylol commercialisée par Sigma. Le pancréas, à raison de 100 mg/ml de solution d'antiprotéase, est broyé le plus tôt possible après le prélèvement avec un broyeur Ultraturax pendant quelques minutes à froid. L'extrait est centrifugé à 20 000 tours/minute pendant 1/2 heure, le surnageant est aliquoté et conservé à - 80 C. Ces extraits contiennent entre 5 et 8 mg de protéines par ml. EXEMPLE 2 Préparation de l'antisérum L'extrait de pancréas ci-dessus décrit est injecté à un lapin selon le protocole suivant: Jour 1: 1 ml d'extrait + 1 ml d'adjuvant complet de Freund en injections intradermiques sur plusieurs points au dos. 25. Jour 24: Même opération que Jour 1. Jour 44: Saignée d'essai n 1. Jour 54: Re-immunisationcomme Jours 1 et 24. Jour 78: Saignée d'essai n0 2. Jour 98: Nouvelle injection comme précédemment. 30. Jour 110: Saignée d'essai n0 3. Jour 150: Injection intraveineuse sans adjuvant (solution bien claire centrifugée). Z5 71146 Jour 156: Saignée d'essai n 4. Jour 186: Nouvelle injection intraveineuse. Jour 192: Saignée n0 5. Le sérum est alors d6complémenté, en le portant au bain-marie à 56 C pendant 30 minutes environ, puis absorbé par des extraits de pancréas adulte normal, du sérum normal et des globules rouges A, 0, B. EXEMPLE 3 Technique de NIF 10. Découper une pièce de nitrocellulose de dimensions appropriées (membranes de nitrocellulose BA85, Schleicher et Schell - Dassel, R.D.A.). Déposer la solution dans laquelle l'antigène est recherché en microgouttes de 1 à 5 pl. La concentration est choisie en fonction de la sensibilité désirée. Les dilutions des antisérums sont faites dans une solution à 2 % d'ovalbumine de blanc d'oeuf, dans l'eau distillée, commercialisée par Sigma. Laisser sécher. Rincer avec du P.B.S. 20. Incuber 1 heure à 4 C dans une solution de protéine saturante (solution à 2 % d'ovalbumine de bland d'oeuf, dans l'eau distillée, commercialisée par Sigma) pour bloquer les sites de fixation de la membrane non occupée par l'antigène. 25. Rincer avec du P.B.S. Incuber avec l'antisérum. Dans ce cas, pour le sérum anti-pancréas foetal absorbé, on l'utilise dilué 1/1000 pendant une nuit à 4 C. Laver abondamment le filtre pour éliminer complètement l'antisérum. 30. Incuber avec l'anticorps anti IgG de lapin conjuguée à la péroxydase (Institut Pasteur Production), dilué 1/2000 pendant 2 heures à 4 C. Laver & nouveau abondamment avec du P.B.S. Révéler la réaction enzymatique par incubation dans le substrat de la péroxydase: H202 0,01 % et le chromogène (D.A.B., chloronaphtol de Merck, diaminobenzidine, Sigma). Celui-ci peut être soit le chloronaphtol: coloration bleue, soit le 3,3'-diaminobenzidine (DAB): coloration marron. Le premier est dissous à 3 mg/ml dans le méthanol puis dilué 5 fois dans le P.B.S. Le deuxième est dissous directement dans le P.B.S. (0,5 mg/ml). Dans les deux cas, ajouter du péroxyde d'hydrogène à concentration finale de 0,01 % comme indiqué plus haut. Lorsque la réaction est développée (stabilisa- tion de la couleur), laver à l'eau distillée et pour le D.A.B., fixer la couleur-par lavage au HCl 10 2 M. EXEMPLE 4 Immunohistologie Les coupes d'organes, fixées soit à l'éthanol, soit au formol, soit encore au liquide de Bouin, sont incluses dans la paraffine. Déparaffiner, hydrater et inhiber la péroxydase endogène. 1) Incuber avec de la sérumalbumine bovine (B.S.A.) à 2 % dans de l'eau distillée, 1 heure à 4"C. 2) Incuber avec de l'antisérum anti-pancréas foetal dilué 1/25 dans B.S.A. 1 %, 4 heures, à 4"C. 3) Laver 3 fois 10 minutes dans P.B.S. 4) Incuber avec les anticorps anti IgG de lapin conjugués à la péroxydase (Institut Pasteur Production) dilués 1/100 dans du P.B.S. ) Laver 3 fois 10 minutes dans P.B.S. 6) Révéler la réaction enzymatique dans un bain de H202 0,01 % et amino-éthylcarbazole. REVENDICATIONS 1) Antigènes carcino-foetaux du pancréas humain de masse moléculaire apparente moyenne choisie parmi: KD, 94 KD, 75 KD et 58 KD, caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines manosidées. 5. 2) Antigènes selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines manosidées. 3) Antigène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par sa masse moléculaire apparente moyenne 75 KD. 4) Antigène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par sa masse moléculaire apparente moyenne 58 KD. ) Procédé de préparation d'antigène selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble et que l'on isole une fraction constituée par des glycoprotéines manosidées. 6) Procédé de préparation d'antigène à partir d'extraits pancréatiques foetaux humains selon la reven- dication 5, comportant les étapes suivantes: a) on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble, b) on traite l'homogénat par chromatographie sur colonne d'affinité sur concanavaline A couplée à un gel et on fixe la fraction glycosylée comportant du manoside, c) on élue la fraction fixée, d) on purifie la fraction fixée éluée par dialyse et on la lyophilise, e) on sépare les antigènes par électrophorèse préparative et on recueille les deux fractions de gel chargées en antigènes majeurs, f) on extrait les antigènes des fractions de gel par électroélution des fractions contre un tampon, g) et on dialyse contre de l'eau et on lyphilise. 7) Antisérum contre les antigènes selon l'une des revendications 1,2,3 et 4,caractérisé en ce qu'il est spécifique du cancer pancréatique. 8) Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 7, comportant les étapes suivantes: a) on injecte à un animal un extrait de pancréas foetal humain de moins de 5 mois, b) on saigne l'animal et on récupère un antisérum, c) on décomplémente cet antisérum, d) on absorbe l'antisérum décomplémenté, e) on centrifuge l'antisérum décomplémenté absorbé, et f) on récupère l'antisérum spécifique. 9) Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on injecte un extrait de pancréas foetal humain d'on foetus âgé de 6 mois au plus. ) Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on adsorbe l'antisérum, en particulier sur globules rouges A, 0, B, le sérum normal et/ou du pancréas normal. 11) Composition à usage diagnostique contenant à titre d'élément actif au moins un antigène ou un anticorps selon l'une des revendications 1,2,3,4 ou 7 et un substrat acceptable.