Brevet FR2567133A1 — publié le 19860110

Procédé de fixation de molécules, notamment biologiques, sur un support et filtres obtenus. L'invention a pour objet un procédé de fixation irréversible de molécules, notamment d 'acides nucléiques ou de protéines, sur des supports pour faciliter la mise en oeuvre de procédés d'analyse biologique, ou de purification auxquels ces molécules sont destinées à participer, et les filtres résultant de cette fixation en tant que réactifs. L'hybridation "in situ" sur des acides nucléiques fixés à des supports solides est une technique largement utilisée en génétique moléculaire, notamment pour identifier des séquences particulières dans un mélange complexe de fragments d'acides nucléiques. Elle consiste à mettre en présence des acides nucléiques "cibles" fixés à des supports solides, le plus souvent des filtres de nitrocellulose ou en résine synthétique de la classe des polyamides connue sous la dénomination de nylon ou encore des papiers de cellulose activée connus sous la dénomination de papiers DBM, et des acides nucléiques "sondes"0 en milieu liquide, dans des conditions permettant le réappariement de ces molécules.La "sonde" est marquée, notamment à l'aide d'un isotope radioactif, et la position de la "cible" correspondante est déterminée par l'intermédiaire du marquage de la sonde, par exemple par autoradiographie, dans le cas du marquage par un isotope radioactif. I1 est souvent intéressant de pouvoir réutiliser plusieurs fois le filtre portant la cible avec des sondes différentes, en déshybridant après chaque utilisation. Par ailleurs, il est important, lorsqu'on cherche à détecter des séquences présentes en de faibles quantités, d'avoir la plus grande quantité possible d'acides nucléiques cibles sur les filtres. Il convient donc, notamment pour des utilisations sur une grande échelle, de disposer d'un mode de fixation simple et aussi irréversible que possible des acides nucléiques, et aussi d'autres molécules destinées à participer à des procédés d'analyse biologique ou de purification, sur un support. L'invention a donc pour but de mettre au point un mode de fixation irréversible de molécules sur un support, selon un procédé ne demandant pas une mise en oeuvre compliquée. Ce but a été atteint selon l'invention qui fournit un procédé de fixation irréversible de molécules, notamment d'acides nucléiques ou de protéines, destinées à participer à des procédés d'analyse biologique ou de purification, sur un support, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1) adsorber lesdites molécules sur un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées et présentant des groupements libres0 notamment -OH0 -COOH et/ou -NH2;; et 2) fixer irréversiblement lesdites molécules sur le support au moyen de pontages entre des groupements libres, notamment -OH,COOH et/ou -NH2, desdites molécules, d'une part et des groupements libres notamment -OH0 -COOH et/ou -NH2 du support, d'autre part et/-ou entre au moins deux groupements libres du support, au moyen d'un agent de pontage présentant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes, capables de réagir, dans des conditions non dégradantes pour le support et les molécules fixées, avec les groupements libres du support et des molécules ou du support seulement pour former des ponts stables dans les conditions d'utilisation ultérieures du produit obtenu ou filtre. Les "molécules" qui peuvent être fixées sur un support par le procédé selon l'invention sont de différents types. A titre indicatif, il peut s'agir des constituants d'un mélange complexe de fragments d 'acides nucléiques notamment dénaturés, provenant par exemple d'un échantillon biologique à analyser, notamment en vue d'identifier un ou plusieurs gènes particuliers au moyen de sondes spécifiques. I1 peut également s'agir de séquences nucléiques caractéristiques d'organismes à rechercher ou étudier (voire extraire) dans un mélange complexe à analyser, par exemple de séquences caractéristiques de génomes viraux ou bactériens, pour la détection des virus ou bactéries correspondants. I1 peut encore s'agir de molécules d'acides nucléiques permettant de purifier des molécules biologiques, par exemple des protéines, présentant une affinité pour elles. I1 peut encore s'agir de composés de nature protéique tels que des enzymes réagissant de façon spécifique avec des composés, par exemple leurs substrats, que l'on souhaite retenir sélectivement sur le filtre pour les purifier ou extraire à partir d'un mélange. En tant que support on peut avantageusement utiliser du nylon, par exemple celui commercialisé par la so- ciété PALL sous la dénomination.-de Biodyne A ou de la cellulose, par exemple celle commercialisée par la société WHATMAN sous la référence 541. Les molécules sont adsorbées sur le support choisi selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple pour le nylon selon la technique de E.M. Southern tJ.Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)] ou la technique dite de'horthern" (P.S. Thomas, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 5201-5205(1980)], et pour la cellulose selon la technique de F.C. Kasatos et coll. CNucleic Acids Research, vol. 7, (1979) p. 1541-15523 ou celle de M. Grunstein et D.S. Hogness troc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 72, p. 3961-3965 (1975)). En tout état de cause, le choix du support dépend dans une large mesure des fonctions libres qu'il présente et de leur réactivité mais aussi de ses caractéristiques physiques, en particulier de son adsorption spontanée. Selon l'invention, on a constaté que les molécules destinées à participer à des procédés d'analyse biologique ou de purification, notamment les fragments d'acides nucléiques dénaturés,pouvaient être fixées de façon irréversible sur un filtre de nylon au moyen de pontages utilisant des fonctions libres des molécules, telles que -OH, -COOH et -NH2, en particulier -OH et/ou -NH2,dans le cas des fragments d'acides nucléiques,et les fonctions libres du support, notamment -COOH et/ou -NH2 dans le cas du nylon, et -OH dans le cas de la cellulose,ou seulement les fonctions libres du support.Dans ce dernier cas, il ne se forme pas de ponts reliant les molécules adsorbées et le support ; il semble que la fixation ait lieu par l'intermédiaire de "ponts" formés par l'agent de pontage au-dessus des molécules à fixer et reliés au support par réaction avec au moins deux fonctions libres de ce dernier, plus ou moins éloignées l'une de l'autre. Les fonctions réactives de l'agent de pontage doivent être suffisamment réactives vis-à-vis des groupements -OH, -NH2 et/ou -COOH pour que la réaction de pontage s'effectue dans des conditions douces, de préférence à la température ambiante, et en l'absence d'agents agressifs afin que le support et les molécules fixées ne soient pas détériorés. Par ailleurs, les ponts formés doivent pouvoir résister aux différents traitements que devra subir ultérieurement le filtre obtenu. En particulier dans le cas où des acides nucléiques, ou des fragments d 'acides nucléiques, seraient fixés, ils doivent pouvoir résister à des hybridations et déshybridations successives. Avantageusement l'agent de pontage est constitué par une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents, réagissant spontanément avec des groupes libres, notamment -OH, -NH2 et/ou -COOH. Des groupements de ce type sont par exemple les groupes carbodiimide, halogène et isocyanate. L'agent de pontage est avantageusement l'hexaméthylène-diisocyanate ou 1,6 -diisocyanato-hexane. Quel que soit son mode de réalisation, le procédé selon l'invention permet de fixer de façon irréversible des molécules destinées à participer à des procédés d'analyse biologique ou de purification, notamment des fragments d'acides nucléiques, sur dessupports pour obtenir des systèmes réutilisables un très grand nombre de fois et donnant, dans le cas des analyses, des intensités de signaux élevées. L'invention a en outre pour objet un filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement cons titué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel sont fixés des fragments d'acides nucléiques, au moyen de ponts résultant chacun de la réaction d'un agent de pontage avec le support, d'une part et les fragments d'acides nucléiques, d'autre part, ou le support seul. L'invention a encore pour objet un filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel est fixé un composé de nature protéique, notamment une enzyme, au moyen de ponts résultant chacun de la réaction d'un agent de pontage avec le support, d'une part et le composé de nature protéique, d'autre part, ou le support seul. Selon un mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées. sur lequel sont fixés des fragments d'acides nucléiques au moyen de ponts résultant de la réaction avec le support et les fragments d'acides nucléiques, ou le support seul, d'une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents. Selon un autre mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagéesosur lequel est fixé un composé de nature protéique, notamment une enzyme. au moyen de ponts résultant de la réaction avec le support et le composé de nature protéique ou le support seul, d'une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents. L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples détaillés qui suivent, donnés à titre purement illustratif. Les essais ont été faits avec de 1'ADN de phageX et de 1'ADN de plasmide p BR 322. La fixation a été effectuée comme suit. L'acide nucléique choisi, dénaturé selon une technique usuelle, ou non dénaturé, a été adsorbé sur un support de nylon (Biodyne A de la société PALL), selon une technique courante, par exemple la méthode de Southern ou la méthode dite "northern". Le support a été rincé dans du tampon citrate de sodium lOmM, pH7. Le filtre a ensuite été mis à incuber dans une solution d'hexaméthylène diisocyanate ou l,6-diisocyanato-hexane (OCN(CH 2)6NCO) à 0,07 %, contenant 0,3 % de diméthylformamide, dans du tampon citrate de sodium 19 mM, pH7 avec agitation douce pendant 2 heures à la température ambiante pour obtenir un filtre selon l'invention. ler exemple L'efficacité de la fixation a été évaluée en utilisant, dans la première expérience, de 1'ADN (ADN de phageX ou ADN de plasmide pBR 322) radioactif. Après adsorption et fixation sur le support comme indiqué plus haut, le filtre obtenu a été incubé pendant 5 heures dans une solution de déshybridation (Tris,HCl 10 mM, EDTA 2mM, pH8 ; 65"C), ce qui correspond à environ 20 déshybridations successives. Deux filtres témoins n'ayant pas subi de traitement de fixation ont été utilisés dans chaque essai -l'un a été soumis au bain de déshybridation avec le filtre traité, -l'autre n'a pas été déshybridé. Les quantités d'ADN restant sur chaque filtre ont été comparées en utilisant comme critère l'intensité du signal obtenu après autoradiographie - le filtre non déshybridé a donné le signal le plus intense - le filtre traité et déshybridé a donné un signal légèrement moins intense - le filtre non traité et déshybridé a donné un signal beaucoup plus faible. Ainsi le traitement a fixé 1'ADN au support. 2e exemple Dans cet exemple, il a été vérifié que ce traitement n'avait pas modifié la capacité de 1'ADN fixé à se réhybrider avec une sonde homologue. Pour cela, de 1'ADN de phage X coupé par l'enzyme de restriction Hind III a été utilisé. Les fragments de restriction obtenus (de 23 130 à 564 paires de bases) ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose puis transférés à un support de nylon selon la technique de S o u t h e r n. Deux groupes de cinq puits, contenant au départ 1000 pg à 100 pg ont été faits, et le filtre obtenu a été divisé en deux. Une moitié a été traitée et l'autre conservée comme témoin. Les deux moitiés ont été mises à hybrider avec de 1'ADN de phage X radioactif, selon les étapes habituelles : séchage du filtre, cuisson à 800C, préhybridation (saturation du filtre) et hybridation. Après rinçage et autoradiographie, on a constaté que la moitié traitée donnait un signal plus intense que la moitié non traitée, probablement parce que le rinçage enlève une partie de 1'ADN cible du filtre non traité. Ceci est vrai en particulier pour les fragments de restriction de petite taille (564 paires de bases). Ainsi le traitement ne modifie pas les propriétés de 1'ADN fixé au support, et améliore même le signal obtenu. Revendications 1. Procédé de fixation irréversible de molécules, notamment d'acides nucléiques ou de protéines, destinées à participer à des procédés d'analyse biologique ou de purification, sur un support, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1) adsorber lesdites molécules sur un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées et présentant des groupements libres, notamment -OH, -COOH et/ou -NH2 ; et 2) fixer irréversiblement lesdites molécules sur le support au moyen de pontages entre des groupements libres, notamment -OH, -COOH et/ou -NH2, desdites molécules0 d'une part0 et des groupements libres notamment -OH, -COOH et/ou -NH2 du support, d'autre part et/ou entre au moins deux groupements libres du support, au moyen d'un agent de pontage présentant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes, capables de réagir, dans des conditions non dégradantes pour le support et les molécules fixées, avec les groupements libres du support et des molécules ou du support seulement pour former des ponts stables dans les conditions d'utilisation ultérieures du produit obtenu ou filtre. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de pontage est constitué par une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents, réagissant spontanément avec des groupes libres, notamment -OH, -NH2 et/ou -COOH. 3. Procédé selon la revendication 2,caractérisé en ce que l'agent de pontage est l'hexaméthylène-diisocyanate. 4. Filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il ést essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel sont fixés des frag ments d'acides nucléiques, au moyen de ponts résultant chacun de la réaction d'un agent de pontage avec le support, d'une part et les fragments d'acides nucléiques, d'autre part, ou le support seul. 5. Filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel est fixé un composé de nature protéique, notamment une enzyme, au moyen de ponts résultant chacun de la réaction d'un agent de pontage avec le support, d'une part et le composé de nature protéique d'autre part, ou le support seul. 6. Filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel sont fixés des fragments d'acides nucléiques. au moyen de ponts résultant de la réaction avec le support et les fragments d'acides nucléiques, ou le support seul, d'une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents. 7. Filtre destiné à l'analyse ou la purification de substances biologiques, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'un support présentant des caractéristiques physiques et chimiques compatibles avec les applications envisagées, sur lequel est fixé un composé de nature protéique, notamment une enzyme, au moyen de ponts résultant de la réaction avec le support et le. composé de nature protéique, ou le support seul, d'une molécule linéaire présentant de 4 à 12 maillons, dont la partie alcoyle est saturée et terminée par deux groupements réactifs, identiques ou différents.