Brevet FR2569201A1 — publié le 19860221

La présente invention est relative à une nouvelle souche de microorganisme anaérobie dont la mise en oeuvre sur des substrats appropriés permet la production d'enzymes spécifiques, à savoir de protéases et de collagénases, d'une part, et la production de proline, d'autre part, et dont la mise en oeuvre, en coculture avec un autre microorganisme, donne lieu à une culture inductrice propre à réaliser la méthanisation de résidus protéiques, notamment des déchets protéiques contenus dans les eaux d'égouts. La biomdthanisation devient de plus en plus attrayante en tant qu'alternative à d'autres moyens de destruction des déchets. Les raisons de cet attrait sont, en particulier une faible production de biomasse dans des conditions anaérobies, le fait ne pas devoir avoir recours à de l'énergie que requiert des processus de traitement aérobies, la valeur du méthane en tant que source d'énergie combustible et la conception de nouveaux modèles de digesteurs anaérobies présentant des taux d'épuration améliorés. Les matières protéiques constituent environ 19 à 27 z des boues d'eaux résiduaires. Dans les processus de digestion anaérobie, des substrats complexes (glucides, protéines et lipides) sont hydrolysés et dégradés en méthane et en anhydride carbonique par une population mixte. L'acétate et le couple H2-CO2 sont les principaux précurseurs immédiats des bactéries méthanogènes dans les digesteurs industriels. Les organismes qui produisent ces métabolites intermédiaires à partir de matières organiques complexes constituent une part importante de toute culture inductrice développée pour la biométhanisation. Une condition requise pour le traitement industriel fiable des déchets est de pouvoir contrôler l'activité de la population microbienne mixte. Des populations mixtes de bactéries qui convertissent différents saccharides, y compris la cellulose, en méthane et CO2 , ont été étudiées Z CHEN et WOLIN, 1977 Influence of CH4 production by Methanobacterium ruminantium on the fermentation of glucose and lactate by Selenomonas ruminantium. Appl. Environ. Microbiol. 34 : 756 - 759. KHAN, A.W. 1980. Degradation of cellulose to methane by a co-culture of Acetovibrio cellulotyticus andMethanosarcina barkeri. FEMS Microbiol. Lett. 9 : 233 - 235. V.M. LAUBE et S.M. MARTIN 1981. Conversion of cellulose to methane and carbon dioxide by tri-culture of Acetovibrio cellulotyticus, Desulfovibrio sp. and Methanosarcina barkeri. Appl. Environ. Microbiol. 42 : 413 - 420 ; P.J. WEIMER et J.G. ZEIKUS 1977. Fermentation of cellulose and cellobiose by Clostridium thermocellum in the absence and presence of Methanobacterium thermoautotrophicum. Appl. Environ. Microbiol. 33 : 289 297 ; J.U. WINTER et R.S. WOLFE 1979. Complete degradation of carbohydrate to carbon dioxide and methane by syntrophic cultures of Acetobacterium woodii and Methanosarcina barkeri. Arch. Microbiol. 121 : 97 - 102 ;J.U. WINTER et R.S. WOLFE 1980. Méthane formation from fructose by syntrophic association of Acetobacterium woodii and different strains of methanogens. Arch. Microbiol. 124 : 73 - 79 ; B. SCHINK et J.G. ZEIKUS 1982. Microbial Ecology of pectin decomposition in anoxic lake sediments. J. Gen. Microbiol. 128 393 - 404 ;G.B. PATEL et L.A. ROTH 1978. Acetic acid and hydrogen metabolism during co-culture of an acetic acid producing bacterium with methanogenic bacteria. Can. J. Microbiol. 24 : 1007 - 1010 ; :M.J. McINERNEY et M.P. BRYANT 1981. Anaerobic degradation of lactate by syntrophic associations of Methanosarcina barkeri and Desulfovibrio species and effect on H2 on acetate degradation. Appl. Environ. Microbiol. 41 : 346 - 354 ;W. JACK-JONES, J.P. GUYOT et R.S. WOLFE 1984. Methanogenesis from sucrose by defined immobilized consortia. Appl. Environ. Microbiol. 47 : 1-6 7. Cependant, aucune de ces populations mixtes ne réalise la dégradation complète de protéines complexes en méthane et anhydride carbonique. Les cas dans lesquels une dégradation complète en CH4 et CO2 a été obtenue, qui ont été rapportés dans la littérature qui vient d'être mentionnée plus haut, concernent des substrats sensiblement moins complexes que les protéines : en effet, SCHINK et ZEIKUS ont réalisé la dégradation complète d'une pectine polymérisée, en CH4 et CO2 à l'aide d'une co-culture de Clostridium butyrium et de Methanosarcina barkeri ; KHAN a obtenu la dégradation complète de cellulose à l'aide d'une co-culture d'Acetovi brio cellulotyticus et de M. Barkeri ; JACK-JONES et Al. ne sont'parvenus à réaliser la biométhanisation totale de saccharose qu'au prix de l'intervention de cinq différentes espèces de microorganismes. Or les polysaccharides concernés par les publications énumérées plus haut sont constitués par un motif monomère de sucre qui se répète, alors que les protéines sont constituées d'une pluralité d'aminoacides, dont la dégradation complète en CH4 et CO2 pose des problèmes qui n'avaient pas pu être résolus jusqu'à ce jour. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une co-culture inductrice capable de dégrader facilement et complètement en méthane et anhydride carbonique,des protéines complexes, laquelle co-culture se compose de deux espèces de micro-organismes seulement, dont l'une est une espèce nouvelle de Clostridium qui du fait de son activité de dégradation importante sur les aminoacides des protéines, permet de limiter le nombres d'espèces microbiennes devant intervenir dans la biométhanisation à deux, la co-culture apte à dégrader les protéines en CH4 et CO2 , conforme à la présente invention présentant, en outre, une grande stabilité, qui permet d'envisager son utilisation à l'échelle industrielle, ainsi que des taux de dégradation intéressants du point de vue industriel. La présente invention s'est également donné pour but d'utiliser les propriétés spécifiques intéressantes de la nouvelle souche de micro-organisme pour développer, d' une part, un procédé de production de protéases et de collagé- nases et, d'autre part, un procédé de production de proline La présente invention a pour objet une culture inductrice pour la méthanisation de déchets protéiques, qui est caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par une co-culture de micro-organismes qui comprend une culture d'une nouvelle espèce de Clostridium et une culture de Methanosarcina barkeri souche MS , laquelle co-culture est apte à réaliser la dégradation de protéines complexes en méthane et anhydride carbonique. Selon un mode de réalisation préféré de la culture inductrice conforme à la présente invention, la nouvelle espèce de Clostridium qu'elle comprend est dénommée Clostridium proteolyticumsp.nov. et est déposée dans la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'institut Pasteur, sous le NO I-330 en date du 6 Août 1984. Le- nouveau micro-organisme conforme aux dispositions de la présente invention est un micro-organisme anaérobie qui se distingue essentiellement par les caractéristiques suivantes Caractéristiques cellulaires morphologie : bâtonnets isolés à spores sub-termi nales mobilité : flagelle polaire paroi : gram-positive Caractéristiques de croissance température : 30 - 370C optimum O2 : anaérobie obligatoire gamme de pH : 6 - 8 durée de doublement : 2 heures sur gélatine Caractéristiques métaboliques source d'énergie : gélatine, serum-albumine, collagène, caseine, viandes, diverses protéines produits finaux de: en majorité = acétate fermentation : traces = H2 , étharol isovalérate et isobutyrate nutrition : ne requiert pas de facteurs de croissance Habitat Digesteurs de boues d'eaux résiduaires : 3,5 x 1 n /ml Selon un autre mode de réalisation préféré de la culture inductrice conforme à la présente invention, la culture de M. barkeri souche MS qui constitue l'autre composant de la co-culture, est une culture adaptée par incubation en présence d'acétate comme source de carbone et d'énergie. La présente invention a pour objet un procédé pour l'isolement du nouveau micro-organisme anaérobie dénommé C. proteolyticum, qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape, une boue d'eaux résiduairespu une autre source de déchets protéiques, est soumis à la technique de numération par calcul statistique en cinq tubes connue sous le nom de Méthode de McCrady, utilisée pour dénombrer les bactéries qui utilisent la gélatine, par calcul du "most probable number", ou nombre le plus probable, au bout de 3 à 4 semaines d'incubation, et à une sélection des tubes dont l'absorbance à 660 nm est supérieure à 0,2, considérés comme étant les tubes positifs ; en ce qu'au cours d'une deuxième étape, le contenu desdits tubes positifs est enrichi par culture en milieu minimal approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, qui contient de la gélatine comme seule source de carbone ; en ce que cet enrichissement est suivi de plusieurs transferts, de préférence 5 à 6 environ, après lesquels des dilutions en série sont cultivées sur plaques de gélatine contenant du milieu minimal approprié, gélosé, dans des conditions anaérobies, en ce qu'au cours d'une troisième étape, les colonies individuelles résultant de cette culture sont prélevées et purifiées par culture en stries, puis transférées dans un milieu liquide en vue de la préparation d'une culture-souche. La présente invention a, d'autre part, pour objet un procédé de préparation de la co-culture de M. barkeri et de C. proteolyticum , qui consiste, dans un premier temps, à incuber M. barkeri dans des flacons contenant un milieu approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, tel que, notamment, le milieu PBB (phosphate Buffer Basal Medium) et un mélange de H2-CO2 comme 'source d'énergie et de carbone, de préférence sous agitation et à une température d'environ 37 0C, jusqu'à ce que la culture ait atteint la fin de la phase logarithmique et soit stabilisée par addition d'un agent réducteur, et, dans un deuxième temps, à ajouter à cette culture de M. barkeri , une concentration appropriée d'inoculum de C. proteolyticum et de la gélatine stérilisée, puis à incuber, de préférence sous agitation et à une température de l'ordre de 370C environ, jusqu'à consommation sensiblement totale de la gélatine, pour récolter la co-culture de M. barkeri et de C.proteolyticum. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, le mélange gazeux H2-C02 utilise comme source d'énergie et de carbone pour l'incubation de M. barkeri, est renouvelé quotidiennement jusqu'à ce que la culture ait atteint la fin de la phase logarithmique. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, l'agent réducteur mis en oeuvre pour stabiliser la culture de M. barkeri préalablement à l'introduction de l'inoculum de C. Proteolyticum, est de préférence, un composé de titane -(III) et, de manière encore plus préférée, le nitrilotriacétate de titane-(III). Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, la gélatine ou autre substrat protéique approprié, est présente à une concentration de l'ordre d'au moins 0,5 8 Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, le milieu PBB, ou milieu analogue approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, est réduit, préalablement à l'inoculation, par du sulfure de sodium. La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de méthanisation de protéines complexes, et plus par ticulièrement un procédé de dégradation sensiblement complate de gélatine et d'autres protéines, en méthane et en anhydride carbonique, qui est caractérisé en ce qu'on incube une co-culture stable de M.barkeriet de C. proteolyticum conforme à l'invention,avec des matières protéiques complexes, à une température de 30 - 40"C,pendant une durée appropriée, pour réaliser une dégradation sensiblement quantitative des matières protéiques en méthane. Conformément à l'invention, la méthanisation poussée de substrats protéiques appropriés est donc réalisée à l'aide d'une co-culture du nouveau micro-organisme qu 'est C. proteolyticum avec M. barkeri. Il s'est cependant avéré que si la co-culture de C. proteolyticum associée à M. barkeri est capable de dégrader les substrats protéiques en méthane, C. proteolyticum seul incubé avec des substrats appropriés, produit deux systèmes enzymatiques extracellulaires actif s, à savoir des protéases et des collagénases, qui présentent de nombreuses applications. La présente invention a en conséquence également pour objet un procédé de production de protéaseset de collagénasesqui consiste à cultiver la nouvelle souche de C. proteolyticum isolée conformément à la présente invention, sur de la gélatine, en milieu approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, de préférence en milieu PBB, pendant un temps approprié, pour recueillir au moins une protéase et au moins une collagénase. Selon unmode de mise en oeuvre préféré de ce procédé de production de protéases etde collagénases,ces dernitres sont isolées à partir du surnageant de la culture précitée, obtenu par centrifugation de ladite culture. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé de production d'enzymes conforme à la présente invention, la culture est recueillie pendant sa phase de latence, pour recueillir une quantité majoritaire de protéase. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé de production d'enzymes conforme à la présente invention, la culture est recueillie pendant sa phase stationnaire et de préférence vers la fin de cette phase, pour recueillir une quantité majoritaire de collagénase. L'observation du comportement de C. proteolyticum vis-à-vis de la gélatine pendant un cycle de croissance sur gélatine,a fait apparaître que les principaux amino-acides dont est constituée la gélatine sont métabolisés en acétate et en C02 par C. proteolyticum pendant un cycle de croissance,à l'exception de la proline, ce qui permet d'envisager l'utilisation de C. proteolyticum comme un moyen pour la production de proline à partir de protéines complexes, par voie biologique. La présente invention a, de ce fait, également pour objet un procédé de production de proline à partir d'un substrat protéique complexe en contenant, tel que la gélatine par exemple,à l'aide de C. proteolvticum, par action de ce micro-organisme anaérobie sur un substrat protéique complexe comprenant de la proline, pendant une durée de fermentation qui est sensiblement du même ordre que le cycle de croissance de C. proteolyticum , dans un milieu de culture approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, et notamment dans du milieu PBB. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement les procédés de production d'enzymes spécifiques et de proline à l'aide de la nouvelle souche de micro-organisme définie dans ce qui précède, et les procédé de méthanisation de résidus protéiques à l'aide d'une co-culture de cette souche avec M. barkeri, conformes aux dispositions qui pré cèdent, ainsi que les moyens pour la mise en oeuvre de ces procédés et les produits finaux obtenus en mettant ces procédés en oeuvre, ainsi que les produits intermédiaires utiles pour permettre la mise en oeuvre desdits procédés. L'invention sera décrite dans ce qui va suivre en se référant à des exemples de mise en oeuvre et aux dessins annexés, dans lesquels : La Fig. 1 est un graphique montrant les courbes d'activité de protéase et de collagénase en fonction du temps et de la phase de croissance. La Fig. 2 est un graphique qui représente la dégradation de la gélatine par fermentation par C. proteolyticum, avec les produits finaux résultant de cette dégradation. La Fig. 3 est un graphique qui représente la dégradation de la gélatine par fermentation par une co-culture de M. barkeri et de C. proteolyticum , avec les produits finaux résultant de cette dégradation , et La Fig. 4 représente un graphique qui fait apparat- tre la transformation de la gélatine en CH4 par la co-culture conforme à la l'invention, avec le degré élevé de transféra- bilité et d'activité de la culture inductrice. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre et les dessins correspondants, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I Récupération, isolement et caractérisation du micro-organisme dénommé Clostridium prôteolyticum sp. nov. 1. Récuperat~on et isolement Les bactéries qui hydrolysent la gélatine ont été dénombrées dans une boue d'eaux résiduaires Drovenant d'un digesteur, à l'aide de la méthode de Mac CRADY de calcul du nombre le plus probable de bactéries, avec cinq tubesL Métho- de connue sous le nom de "f ive tube most probable number" (MPN) technique/, en calculant le nombre le plus probable à partir des tables de normes établies par l'American Public Health Association (en 1969), au bout de 3 - 4 semaines d'incubation. Les tubes retenus comme positifs avaient une sbsorbance à 660 nm supérieure à 0,2 et le nombre de bactéries calculé s'est avéré être de 3,5 x 107/ml. On a isolé la bactérie dénommée C. Proteolyticum par enrichissement dans du milieu PBB(phosphate buffered basal rtedium, pH 7,8, 50 et 10 rr.)contenant de la qélatine (à une concentration de 0,5 %) comme seule source de carbone, ledit milieu PBB ayant été réduit avant l'inoculation par du sulfure de sodium 2,6 mM. Après 5 - 6 transferts, des dilutions en série ont été mises en culture sur des plaques de gélatine contenant du milieu PBB gélosé, à l'intérieur d'une botte à gants anaérobie (fournie par COY MANUFACTURING Co, ANN ARBOR, MI). Les plaques ont été incubées dans des conditions anaérobies, en atmosphère d'azote, à 370C. Les colonies individuelles qui se sont développées ont été prélevées, purifiées par culture en stries, puis transférées dans un milieu liquide pour préparer des souches de culture. La pureté a été vérifiée par l'uniformité des colonies sur les plaques de culture en stries et par observation au microscope à contraste de phase, Les procédures d'identification de la bactérie qui ont été utilisées sont celles décrites dans le "VPI ANAEROBE LABORATORY MANUAL "(HOLDEMAN et Al., 1977) 2. Caracterisat on du micro-organisme 2.1. Caractéristiques cellulaires. Le micro-organisme se présente sous forme de bâtonnets gram-positifs. Les cellules apparaissent isolément et forment des spores sub -terminales. La dimension des cellules est de l'ordre de 0,59 - 1,02 x 2,30 - 3,67 zm. Les cellules sont mobiles et présentent un flagelle polaire unique identifié par photomicrographie. Sur plaques de gélose, les cellules développent des colonies circulaires, de couleur blanche, de 1,0 - 3,0 mm de diamètre.Leur teneur en DNA G+C est de 24,22 moles %. te microorsanisme isolé ne requiert ni vitamines, ni facteurs de croissance dans un extrait de levure, et croit dans un milieu minimal (tel que le milieu PBB). 2.2. Caractéristiques de croissance La température de croissance est de l'ordre de 30 370C. La gamme de pH est comprise entre 6 et 8. L'hydrogène n'inhibe pas la croissance de ce microorganisme, même sous une pression d'hydrogène de 3 atmosphères. Toutefois, la cystéine ajoutée en tant qu'agent réducteur inhibe sa croissance. La pénicilline et la streptomycine inhibent sa croissance. Le micro-organisme isolé est un anaérobie essentiel. Il croit sur la gélatine avec un temps de doublement de 2 heures. 2.3. Caractéristiques métaboliques Comme sources d'énergie fermentescibles, le micro organisme utilise une grande variété de protéines telles que la gélatine, le collagène, la peptone, la viande cuite, la trypticase -tryptone, ainsi que, mais avec une phase de latence prolongée, la caséine et la sérum-albumine. Le Tableau I qui va suivre fait apparaître différentes sources de protéines fermentées par C. proteolyticum ; les produits de fermentation ont été déterminés après culture dans des tubes scellés aluminium contenant l0 ml de milieu PBB et 0,5 % de substrat (sauf dans le cas de la viande cuite où on a utilisé du milieu DIFCO déshydraté,à raison de 1,25 g/10 ml) incubés à 370C sous agitation. L'inoculum de C. proteolyticum a dté utilisé sur gélatine. TABLEAU I COMPARAISON DE FERMENTATIONS DE DIFFERENTES PROTEINES PAR CLOSTRIDIUM PROTEOLYTICUM produits de fermentation (mM) Propio- Isobu- Buty- Isova- Etha Ssource de Croissance pH H2 Acétate protéines (A660) final ( moles) nate tyrate rate lérate nol Gélatine 0,800 6,96 0,06 19,57 0 0,34 0 0,49 0 Peptone 1,664 7,10 0,87 17,56 0,68 1,08 0,05 0,22 Caséine 0,210 7,21 23,06 7,32 0,53 0,54 0 1,07 0,41 Trypticase Tryptone 0,400 7,23 23,95 3,60 0,63 0,81 1,36 1,67 Serum-Albumine Bovine 0,210 26,10 5,13 0,75 0,83 0 1,98 0,80 Poly-Pep 0,510 6,89 0,08 12,05 0 0,18 0 0,30 0 Viande cuite - 7,12 15,08 53,33 6,90 7,18 21,99 16,10 0 Le micro-organisme isolé, dénommé par l'Inventeur Clostridium proteolyticum sp. nov.,n'utilise pas comme sources d'énergie fermentescibles, les amino-acides isolés ou en mélanges t ni les glucides, la cellulose, l'amidon, la pectine ni méthanol, le glycérol t ni le fumarate ou le pyruvate. 2.4. Produits de fermentation principaux obtenus. Le micro-organisme réalise la dégradation de la gélatine jusqu'au stade de l'acétate et de l'anhydride carbonique, comme le montre la figure 2 annexée, où à la fin de la croissance environ 90 % de la gélatine ont été consommés, pour donner essentiellement de l'acétate, du CO2 et de l'hydrogène, en quantités mMolaires, tandis que l'éthanol, l'isovalérate et l'isobutyrate sont également détectés à l'état de traces (de l'ordre de la mole)./La culture de C. proteolyticum sur gélatine a été réalisée, pour l'établissement des courbes de la figure 2, en phase gazeuse d'azote, dans des bouteilles de sérum scellées qui contenaient 50 ml de milieu PBB, avec 0,5 % de gélatine comme seule source de carbone et d'énergie Le Tableau II ci-après montre l'effet de différentes concentrations de gélatine sur la croissance et sur la formation de produits finaux par C. proteolyticum. La croissance n'est affectée ni par une concentration élevée en gélatine, ni par les produits finaux formés (par exemple par100 mM d'acétate) et le pH est demeuré sensiblement neutre jusqu'à une concentration de 10 % de gélatine. TABLEAU II EFFET DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS EN GELATINE SUR LA CROISSANCE ET SUR LA FORMATION DE PRODUITS FINAUX PAR CLOSTRIAIUM PROTEOLYTICUM Produits finaux formés (mM) Gélatine Croissance pH Acétate Propionate Isobutyrate Isovalérate 16h (A660) (mM) (mM) (mM) (mM) 0,5 1,244 6,96 19,64 0 0,31 0,49 1,0 2,775 6,78 36,67 0,036 0,70 0,99 2,5 2,850 6,64 73,33 0,038 1,70 2,41 5,0 2,930 6,63 80,67 1,25 2,32 3,26 10,0 3,255 6,67 100,00 1,60 3,01 4,35 Le micro-organisme ne se développe pas de fa con autotrophique sur un mélange de H2-CO2 , mais il est capable de consommer de l'hydrogène exogène dans la phase de croissance stationnaire. EXEMPLE II Caractérisation de l'activité enzymatique de C. proteolyticum et de la production d'enzymes par ce micro-organisme En monocultures,C. proteolyticum développe pendant sa croissance, à la fois une activité de protéase et de collagénase. Les activités de protéase et collagénase de C. proteolyticum ont été testées comme suit II.1. Pour déterminer l'activité protéasique,on a incubé pendant 1 heure à 370C, un mélange comprenant 0,7 ml de caséine à 5 %, 1,1 ml de tampon phosphate 0,02M, pH 7,5 auquel a été ajouté 0,2 ml de surnageant de la culture préparée con formément à l'Exemple 1, lequel surnageant a été obtenu par centrifugation de ladite culture à 10000 g pendant 2 minutes. La réaction d'incubation est stoppée par addition de 2 ml de TCA à 5 % qui, après mélange homogène, précipite la caséine non-hydrolysée. Ce mélange est filtré à travers des filtres de 0,45 m d'ouverture de maille. Les échantillons filtrés (1 ml) sont utilisés pour déterminer par la méthode à la ninhydrine ( ROSEN, 1951), les amino-acides libérés de la caséine. A cet effet 0,5 ml de tampon cyanure-acétate et de solution de ninhydrine à 3 % dans de la méthylcellosolve, sont ajoutés à chaque échantillon. On chauffe pendant 15 minutes au bain-marie à 1000C ; on ajoute rapidement 5,0 ml d'agent de dilution constitué par un mélange d'isopropanol et d'eau et on secoue vigoureusement le mélange. Après refroidissement à la température ambiante, on lit l'absorbance à 570 nm. II.2. L'activité collagénase est mesurée en ajoutant des échantillons du filtrat de culture (0,25 ml) à un mélange réactionnel contenant du tampon CaCl-Tris HCl et 5 mg d'Azocoll (suspension d'un colorant azoïque dans du collagène très pur). Le mélange ainsi formé est incubé pendant 30 minutes, puis centrifugé à 10000 g pendant 2 minutes. Le surnageant est dilué de façon appropriée et on utilise 1 ml de diluant pour déterminer par la méthode à la ninhydrine, les amino-acides libérés. Une unité d'activité enzymatique représente la quantité de protéase ou de collagénase qui, dans les conditions décrites dans ce qui précède, produirait l'équivalent d' 1 mg de leucine/minute à partir de caséine ou d'Azocoll. La Figure 1 annexée illustre les activités protéase et collagénase déterminées comme décrit plus haut, avec une culture du micro-organisme en atmosphère d'azote dans des tubes de culture scellés aluminium contenant 10 ml de milieu PBB et 0,5 % de qélatine. La Figure 1 montre la relation entre la production d'exoenzymes et la croissance de C. proteolyticum pendant un cycle de fermentation de gélatine. Des taux variables de protéase extracellulaire sont produits pendant la croissance, les taux les plus élevés étant obtenus pendant la phase de latence et les taux les plus bas pendant la phase stationnaire. La collagénase extracellulaire active est produite à un taux qui croît parallèlement avec la croissance du micro-organisme. La protéase est donc avantageusement recueillie entre la deuxième et la quatrième heures du cycle de fermentation de 16 heures de la gélatine, tandis que la collagénase est avantageusement recueillie à partir de la dixième heure de ce cycle. EXEMPLE III Production de proline par C. proteolyticum C. proteolyticum métabolise tous les amino-acides présents dans la gélatine, sauf la proline, en acétate et anhydride carbonique, comme principaux produits finaux, avec des traces d'hydrogène, d'isovalérate et d'isobutyrate (moins de 1 mM). Le Tableau III qui va suivre montre que la glycine, l'hydroxyproline, l'acide glutamique, l'alanine, l'arginine et l'aspartate sont métabolisés à 60 - 91 % pendant un cycle de fermentation de 16 heures de la gélatine, et que la proline n'est pas dégradée. TABLEAU III ANALYSE DES PRINCIPAUX AMINO-ACIDES PRESENTS DANS LA GELATINE FERMENTEE PAR C.PROTEOLYTICUM Concentration (nmoles/40 ssl) Amino-acide T à T16h % Métabolisés O Aspartate 10,04 4,01 60,06 Acide glutamique 15,18 2,29 84,91 Proline 27,82 36,11 Glycine 70,82 8,01 88,64 Alanine 22,38 6,83 69,48 Arginine 10,19 1,29 87,34 Hydroxyproline 19,227 1,74 90,95 X Seuls les acides aminés dont la concentration initiale est supérieure à 10 nMol/échantillon de 4 l,et qui représentent plus de 60 % des amino-acides totaux, figurent dans ce Tableau. En conséquence, les substrats protéiques contenant de la proline susceptibles d'être biodégradés par C. proteolyticum peuvent constituer une matière première de choix pour la production et l'isolement de proline. EXEMPLE IV Méthanisation de résidus protéiques par une co-culture de C. proteolyticum et de M. barkeri IV.1. Préparation d'une co-culture de M. barkeri et de C. proteolyticum A) Une souche de Methanosarcina barkeri, souche MS, adaptée et maintenue sur de l'acétate 80 mM comme source de car bone et d'énergie, est cultivée dans des bouteilles de sérum contenant 50 ml de milieu PBB et un mélange de H2 CO2 comme source d'énergie et de carbone, à 370C, sous agitation, pendant une semaine. Du mélange de H 2-CO2 (80:20) frais est introduit chaque jour jusqu'à ce que la culture ait atteint la fin de la phaselocarithmique. A ce moment-là, la phase gazeuse des bouteilles de sérum est remplacée par de l'azote, par évacuation et purge, après avoir ajouté 2 - 3 gouttes de nitrilo triacétate de titane-(IIIkomme agent réducteur. B) On ajoute alors de la gélatine stérilisée (0,5 %) et 2,0 % d'inoculum de C. proteolyticum préalablement cul tivé sur gélatine jusqu'en fin de phase exponentielle et on réalise un cycle de fermentation en incubant le tout à 370C, sous agitation. Lorsque la totalité de la gélatine a été consommée, la phase gazeuse est remplacée comme indiqué plus haut, et une nouvelle addition de 0,5 % de substrat est effectuée. C) La co-culture est transférée dans du milieu frais tous les 7 à 10 jours. Cette procédure permet l'établisse ment d'une co-culture stable des deux micro-organismes, apte à continuer à dégrader la gélatine et à produire du CH4 et du CO2 après des transferts répétés. IV.2. Méthanisation de résidus protéiques par ladite coculture. Des protéines complexes, et notamment la gélatine, sont complètement hydrolysées par ladite co-culture et transformées en méthane et anhydride carbonique avec des taux variables d'acétate intermédiaire formés à des temps intermédiaires d'incubation. La Figure 3 montre la relation entre l'alimentation en substrat et la durée du cycle de biométhanisation de la gélatine par une co-culture de C. proteolyticum et de M. barkeri préparée comme décrit ci-dessus. Au jour 5, les flacons sont purgés par de l'azote et on introduit une deuxième alimentation de 0,5 % de gélatine. Après 16 heures du cycle de fermentation par la première charge de gélatine, environ 85 % de la gélatine avaient été hydrolysés, les taux d'acétate intermédiaire étaient à leurs valeurs maximales et H2 avait été détecté en tant que métabolite présent à l'état de trace. La production de méthane s'est cependant poursuivie de façon linéaire pendant les 3 jours suivants en fonction de la consommation d'acétate. La cinétique de la conversion de la gélatine en méthane s'est répétée sur la seconde charge, à l'exception du fait qu'on n'a pas détecté d'H2 Au jour 5 du cycle, un inoculum (10 %) de cette co-culture a été transféré dans du milieu frais contenant 8 mM de méthanol. La Figure 4 montre la relation entre l'aptitude de la co-culture au transfert et la biométhanisation de la gélatine. La co-culture a été transférée (sous la forme des 10 % d'inoculum du jour 5 de la Figure 3) dans une nouvelle bouteille de sérum qui contenait 50 ml de milieu PBB et 0,5 % de gélatine, ainsi que 8 mM de méthanol. L'incubation a eu lieu à 370C, sous agitation. La transformation quantitativement importante de la gélatine en CH4 par la co-culture, montre que la culture inductrice conforme à la présente invention est apte à subir des transferts multiples sans perdre son activité, à quoi s'ajoute que la co-culture qui est stable, ne requiert pas d'addition de facteurs de croissance exogèneset qu'en outre la méthanogénèse est induite rapidement par la co-culture, sans qu'il soit nécessaire de procéder à un contrôle extérieur.du pH. Il résulte de ce qui précède que la co-culture de C. proteolyticum et de M. barkeri présente de nombreuses applications industrielles en tant que culture stable pour le traitement de substrats ; et notamment de résidus protéiques, en raison de sa stabilité, de son aptitude à subir des transferts sans altération de son activité, de son activité élevée, et en raison du fait qu'aucun contrôle de pH, qui demeure naturellement, voisin de la neutralité, n'est nécessaire, même si l'acétate est produit à des taux élevés. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1.- Culture inductrice pour la méthanisation de déchets protéiques, qui est caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par une co-culture de micro-organismes qui comprend une culture d'une nouvelle espèce de Clostridium et une culture de Methanosarcina barkeri souche MS, laquelle co-culture est apte à réaliser la dégradation complète de protéines complexes en méthane et anhydride carbonique. 2.- Culture inductrice selon la revendication 1, caractérisée en ce que la nouvelle espèce de Clostridium qu'elle comprend est dénommée Clostridium proteolyticum sp. nov. et est déposée dans la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur, sous le NO I-330 en date du 6 Août 1984. 3.- Culture inductrice selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la culture de M. barkeri souche MS qui constitue l'autre composant de la co-culture, est une culture adaptée par incubation en présence d'acétate comme source de carbone et d'énergie. 4.- Procédé pour l'isolement du nouveau micro-organisme anaérobie dénommé C. proteolyticum sp.nov. selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape, une boue d'eaux résiduaires ou une autre source de déchets protéiques, est soumis à la technique de numération par calcul statistique en cinq tubes connue sous le nom de Méthode de Mc CRADY utilisée pour dénombrer les bactéries qui utilisent la gélatine, par calcul du most probable number", ou nombre le plus probable, au bout de 3 à 4 semaines d'incubation et à une sélection des tubes dont l'absorbance à 660 nm est supérieure à 0,2, considérés comme étant les tubes positifs ; en ce qu'au cours d'une deuxième étape, le contenu desdits tubes positifs est enrichi par culture en milieu PBB contenant de la gélatine comme seule source de carbone ; en ce que cet enrichissement est suivi de plusieurs transferts, de préférence 5 à 6 environ, après lesquels des dilutions en série sont cultivées sur plaques de gélatine contenant du milieu PBB gélosé, dans des conditions anaérobies, en ce qu'au cours d'une troisième étape les colonies individuelles résultant de cette culture sont prélevées et purifiées par culture en stries, puis transférées dans un milieu liquide en vue de la préparation d'une culture-souche. 5.- Nouveau micro-organisme anaérobie dénommé Clostridium proteolyticum sp. nov., caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon la revendication 4. 6.-Procédé de préparation de la culture de M. barkeri et de C. proteolyticum selon la revendication 1, qui consiste, dans un premier temps, à incuber M. barkeri dans des flacons contenant un milieu approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, tel que, notamment, le milieu PBB (phosphate Buffer Basal Medium) et un mélange de H2-CO2 cati::'e source d'énergie et de carbone, de préférence sous agitation et à une température d'environ 370C, jusqu'à ce que la culture ait atteint la fin de la phase logarithmique et soit stabilisée par addition d'un agent réducteur, et, dans un deuxième temps, à ajouter à cette culture de M. barkeri, une concentration appropriée d'inoculum de C. proteolyticum et de la gélatine stérilisée, puis à incuber, de préférence sous agitation et à une température de l'ordre de 370C environ jusqu'à consommation sensiblement totale de la gélatine, pour recolter la co-culture de M. barkeri et de C. proteolyticum. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le mélange gazeux H2-CO2 utilisé comme source d'énergie et de carbone pour l'incubation de M. barkeri est renouvelé quotidiennement jusqu'à ce que la culture ait atteint la fin de la phase loqarithmique. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que l'agent réducteur mis en oeuvre pour stabiliser la culture de M. barkeri préala lablement à l'introduction de l'inoculum de C. proteolyticum est, de préférence, un composé de titane-IIII) et, de manière encore plus préférée, le nitrilotriacétate de titane (III). 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la gélatine ou autre substrat protéique approprié, est présente à une concentration de l'ordre d'au moins 0,5 %. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le milieu PBB, ou milieu analogue approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, est réduit préalablement à l'inoculation, par du sulfure de sodium. 11.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lorsque la gélatine ou substrat analogue approprié a été consommée en totalité, une nouvelle addition de substrat dans le milieu de culture est effectuée. 12.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lorsque la culture a atteint la fin de la phaselo garithmique, le mélange gazeux H2-C02 est évacué et remplacé par une atmosphère neutre, telle qu'une atmosphère d'azote notamment. 13.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la co-culture résultant de cette seconde addition de substrat, est transférée dans du milieu de culture frais, contenant éventuellement du méthanol, pour donner lieu à une culture aisément transférable. 14.- Procédé de méthanisation de protéines complexes, et plus particulièrement procédé de dégradation sensiblement complète de gélatine et d'autres proteines, en méthane et en anhydride carbonique, caractérisé en ce qu'on incube une co-culture stable de M. barkeri et de C. proteolyticum selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, avec des matières protéiques complexes, à une tempera ture de 30 - 400C, pendant une durée appropriée, pour réa liser une dégradation sensiblement quantitative des matières protéiques en méthane. 15.- Procédé de production de protéaseset de colla génases caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la nouvelle souche de C. proteolyticum selon la revendication 2 ou la revendication 5, isolée conformément à la revendication 4, sur de la gélatine, en milieu approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, de préférence en milieu PBB, pendant un temps approprié, pour recueillir au moins une protéase et au moins une collagénase. 16.- Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesditesenzymes sont isolées à partir du surnageant de la culture précitée, obtenue par centrifugation de ladite culture. 17.- Procédé selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que la culture est recueillie pendant sa phase de latence, pour recueillir une quantité majoritaire de protéase. 18.- Procédé selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que la culture est recueillie pendant sa phase stationnaire et de préférence vers la fin de cette phase, pour recueillir une quantité majoritaire de collagénase. 19.- Un procédé de production de proline à partir d'un substrat protéique complexe en contenant, tel que la gélatine par exemple à l'aide de C. proteolyticum, par action de ce micro-organisme anaérobie sur un substrat protéique complexe comprenant de la proline, pendant une durée de fermentation qui est sensiblement du même ordre que le cycle de croissance de C. proteolyticum, dans un milieu de culture approprié pour la culture de micro-organismes anaérobies stringents, et notamment dans du PBB.