Brevet FR2564731A1 — publié le 19851129

La présente invention concerne de nouvelles fractions exo-antigeniques, leur procede de préparation et leur application à la recherche de l'immunité toxoplasmique chez l'homme par tests cutanés. La toxoplasmose est une maladie parasitaire pro vouée par un sporozoaire intracellulaire Toxoplasma gondii. Cette maladie qui se transmet par la mère au foetus est particulièrement grave pour ce dernier, et se traduit peu de temps après la naissance par l'hydroce- phalie, des convulsions, de la fièvre et une choriore- tinine atrophique et pigmentaire. Elle peut aboutir à l'issue fatale et laisser des séquelles nerveuses et oculaires. Le diagnostic dc la toxoplasmose s'effectue le plus souvent sur la base d'éléments biologiques apportés par des épreuves biologiques, telles que 1/ l'immuno-fluorescence indirecte, 2/ le test de lyse de SABIN et FELDMAN, 3/ la réaction d'hemagglutination indirecte, 4/ le test d'agglutination des toxoplasmes, et 5/ diverses anti-reactions sérologiques. Ces méthodes diagnostiques sont toutefois d'une mise en oeuvre longue et sont coûteuses. Aussi a-t-on très vite mesure l'intérêt qu'il y aurait à pouvoir disposer d'antigenes toxoplasmiques qui permettraient la recherche de l'immunité toxoplasmique par tests cutanés. Des études ont été réalisées dans ce sens par DESGEORGES, et colt. Lyon Médical, 1980, 243 : 737-740 qui a préparé des exo-antignes in vitro par culture de Toxoplasma gondii sur des cellules VERO (cellules de reins de singes) en présence de sérum de veau. Les antigènes préparés par DESGEORGES n'ont pu toutefois être utilisés en clinique humaine par suite de la présence de divers contaminants apportés par la culture cellulaire. Plus récemment, AMBROISE-THOMAS et Coll.Lyon Médical, 1982, 248 : 79-83, ont montré que les exoantigènes toxoplasmiques produits sur des cellules diploïdes humaines MRC 5 pouvaient être utilisés in vivo, comme moyen de détection de l'immunité toxoplasmique en clinique humaine. Dans le prolongement des travaux entrepris par AMBROISE-THOMAS et Coll., le déposant a cherché à identifier et à isoler les fractions exo-antigéniques présentant une activité antigénique et une spécificité élevées1 et aptes à êtreXutilisées dans les tests cutanés pour le contrôle chez l'homme de l'immunité acquise anti-toxoplasmique. La présente invention concerne donc de nouvelles fractions exo-antigéniques obtenues par culture de Toxoplasma gondii sur des cellules diploïdes humaines et leur utilisation pour la recherche de l'immunité anti-toxoplasmique chez l'homme par tests intra-dermiques. La présente invention a également pour objet le procédé de préparation de telles fractions. Elle a encore pour objet l'application de ces fractions exo-antigéniques à la détection de l'immunité toxoplasmique chez l'homme par tests cutanés. Elle a enfin pour objet une nouvelle substance de test pour la détection chez l'homme de l'immunité toxoplasmique. Le procédé de préparation des fractions exo-an tigéniques conforme à l'insrention qui consiste successivement - à cultiver Toxoplasma gondii sur des cellules diploïdes humaines, notamment sur des cellules connues sous la désignation MRC 5. Cette lignee correspond à des cel lules embryonnaires pulmonaires d'origine humaine ; elle est disponible auprès de FLOW Lab., 99 Rue de la République, 92800 Puteaux. - à recueillir le surnageant, - à extraire les exo-antigènes du surnageant, - à concentrer les exo-antigènes, est caractérisé en ce qu'après avoir concentré les exoantigènes - on dialyse lesdits exo-antigènes contre une solution tampon appropriée, à un pH voisin de 9, - on soumet lesdits exo-antigènes à un fractionnement, - on repère les fractions séparées pour leur activité antigénique, - on réunit les fractions riches en exo antigènes. Les surnageants de culture sont recueillis au 6eme jour, soumis à une filtration stérilisante (0,22ss) puis traités par le formol à 5 % pendant 24 heures. Ils sont alors concentrés 200 fois et subissent 10 cycles de dialyse sur les colonnes de filtration à fibres creuses (AMICON) avec coupure à 10.000 Daltons. L'antigène concentré est à nouveau filtré sur filtre stérilisant 0,22ss. Le fractionnement est effectué par chromatographie sur Gel G 200 (PHARMACIA) à un PH de 8,8 en tampon Tris-glycine 0,05 M, 0,01 % NaN3, à une température de 40C et avec un débit de 0,75 ml cm-2 x h-1 pour une colonne de 1,6 x 60 cm contenant 98,5 de gel. La caractérisation des fractions exo-antigéniques a été effectuée en utilisant différentes techniques biochimiques et immunologiques. Pour l'identification des fractions exo-antige- niques et la détermination de leur poids moléculaire, on a fait appel aux techniques immuno-enzymatiques communément dénommées tests ELISA et GEDELISA, abréviations des expressions anglaises "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assai" et "Gel Electrophoresis Derivated of Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay". Ces techniques sont connues de l'homme de l'art qui pourra se reporter si nécessaire à AMBROISE-THOMAS et Coll. Bulletin de 1'OMS, 1978, 56 609-613 et DESGEORGES et Coll., Annales de biologie clinique 1980, 38 : 361-363 pour en connaître les détails d' exécution. Le déposant a pu ainsi déceler la présence de six fractions exo-antigéniques ayant des poids moléculaires allant de 15 000 à plus de 660 0000 daltons. La fraction exo-antigénique préférée est celle ayant un poids moléculaire de l'ordre de 325 000 daltons, laquelle présente de très intéressantes propriétés pharmacologiques qui la rendent particulièrement apte à être utilisée pour la recherche de l'immunité toxoplasmique dans les tests cutanés. Cette fraction se caractérise par le fait qu'elle donne face à un immunsérum produit chez un animal à partir de cette fraction une densité optique (D.O.) de 5,7 mesurée en ELISA à 490 nm et un arc de précipité caractéristique en contre-electrophorèse et en immunoélectrophorèse bi-dimensionnelle. Les fractions exo-antigéniques conformes à l'invention ont une nature essentiellement protéique, comme le montre le fait qu'elles se trouvent être pratiquement inactivées lorsqu'on les laisse incuber avec des enzymes du groupe des protéases telle que la trypsine. Elles présentent une bonne résistance à la désoxyribonucléase et à la ribonucléase. Les fractions exo-antigéniques conformes à l'invention se caractérisent également par une bonne stabilité à la chaleur. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui suit, se référant à un exemple de préparation de fractions exo-antigéniques et de caractérisation desdites fractions. I1 va de soi qu'il doit être naturellement entendu que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'invention et qu'il n'a aucun caractère limitatif. EXEMPLE Préparation des fractions exo-antigéniques toxoplasmiques Toxoplasma gondii souche R H de SABIN a été entretenue sur souris blanches OF1, par injections intrapéritonéales. Les cultures in vitro ont été réalisées sur cellules MRC 5 en présence de milieu EAGLE BME à raison de 1,5 x 108 parasites pour 3,5 litres de culture. Les surnageants ont été recueillis après 6 jours et les antigènes ont été extraits et concentrés suivant la technique décrite par AMBROISE-THOtGS et Coll. Lyon Médical, 1982, 248 : 79-83. La solution antigénique obtenue contenait 0,108 mg d'azote protéique par ml. Préparation témoin Elle a été obtenue dans les mêmes conditions que pour les antigènes toxoplasmiques, mais à partir de cultures de cellules MRC 5 non inoculées par Toxoplasma gondii. Préparation des sérums témoins On a utilisé, comme sérums témoins positifs, un pool de sérums humains très fortement positifs en immunofluorescence indirecte (IF Réalisée avec une contre-coloration par le bleu d'Evans) et en contre-Electrophorèse. Quant aux sérums témoins négatifs, ils provenaient d'un ensemble de sujets non immuns et dont la sérologie en immuno-fluorescence indirecte et en contre-électrophorèse était également négative. On a utilise par ailleurs des sérums expérimentaux de lapins que l'on a immunisés par injection sous-cutané (8 points d'injection) d'l ml d'exo-antigènes additionnés à 1 ml d'adjuvant complet de FREUND. 15 jours après (J 15), les injections ont été répétées dans les mêmes conditions, mais en utilisant un mélange d'exo-antigènes, et d'adjuvant incomplet de FREUND. Aux jours J 21, J 28 et J 35, les animaux ont reçu une injection intra-musculaire d'l ml d'exo-antigènes sans adjuvant.Au jour J 43, on a sacrifié les animaux et on a contrôlé individuellement leurs sérums en immuno-fluorescence indirecte et en doublc diffusion, selon la technique d'Ouchterlony, avant d'être mélangés. Mise en évidence des fractions exo-antigéniques toxoplasmique s Les fractions exo-antigéniques ont été mises en évidence par le test ELISA. Ce test a été réalisé sur des plaques de microtitration, suivant ia méthode décrite par AMBROISE-THOMAS et coll. dans Bulletin de 1'OMS 1978, 56 : 609-613, en employant comme chromogène de l'ortho-phénylène diamine (OPD) 2 HC1 (3 mg/ml) et comme substrat de l'eau oxygénée à 30 Vol. (à 3 ttl/ml dans du tampon phosphate-citrate pH 5,15 0,075 M). La réaction a été arrêtée après 10 min. à l'obscurité par addition, dans chaque cupule, de 200 1 d'acide sulfurique 2 N. La lecture a été effectuée à 492 nm à l'aide d'un spectro-photomètre. Les fractions exo-antigéniques toxoplasmiqus ont été décelées jusqu'à la dilution de 1/1 600, ce qui correspond à environ 67,5 ng d'azote protéique/ml. A cette dilution, les témoins positifs (extraits de cultures parasitées) ont des densités optique de 0,46 face au pool de sérums positifs et de 0,01, dans les mêmes conditions expérimentales, face aux sérums négatifs. L'extrait de culture non parasité, rapporté à la même dilution que les exo-antigènes, ne donnait face au pool de sérums positifs aucune D.O. décelable. La mise en évidence des fractions exo-antigéniques a également été réalisée par contre-Electrophorèse. Celle-ci a été réalisée suivant la méthode décrite par PINON et Coll. dans American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1978, 28 : 318-324 sur des bandes d'acétate de cellulose (Cellogel) (2,5 cm x 17 cm x 190 ssm) placées sur des portoirs et dans des cuves spéciaux (SEBA). Le tampon utilisé était du Tris-glycine pH 8,8 de force ionique 0,05 M. La migration a été réalisée pendant 2 heures sous 110 Volts, après quoi on a coloré par le bleu de Coomassie à 0,2 %, l'excès de colorant étant enlevé par une solution de mdthanol (500 moi), d'acide acétique (100 ml) et d'eau distillée (400 ml). On a pu ainsi mettre en évidence 6 bandes de précipitation face au sérum de référence. Une coloration sélective a démontré que ces bandes taient de nature protéique. Détermination des poids moléculaires des fractions exo-antigéniques Le fractionnement des exo-antigènes et la détermination de leur poids moléculaire ont été réalisés par filtration sur gel dans les conditions qui suivent. On a utilisé une colonne chromatographique (1,6 x 60 cm) chargée de gel Sephadex G 200 de qualité superfine (PHARMACIA), du tampon Tris-glycine 0,05 M pH 8,8, 0,01 % de NaN3, hauteur du lit de gel : 49 cm. Volume total : 98,5 ml. On a étalonné la colonne avec les substances suivantes : ribonucléase, ovalbumine, aldolase, ferritine, chymotrypsinogène, albumine, catalase, thyroglobuline et bleu de dextrane 2 000. 2 ml d'exo-antigènes préalablement dialysés contre le tampon de chromatographie ont été déposés en haut de la colonne. On a élué sous un débit de 0,75 ml/heure et recueilli 160 fractions d'l ml à 40C. Ces fractions ont été contrôlées à 280 nm et en ELISA. Le diagramme d'dilution obtenu a été illustré sur la Fig. 1 qui montre les teneurs des volumes éludes (en ml) telles que mesurées par spectrophotométrie UV (absorption à 492 nm). On a porté en haut du graphique sur une droite parallèle à l'axe des abscisses les poids moléculaires de substances connues servant d'étalons. On a isolé 6 pics antigéniques correspondant à des poids moléculaires de l'ordre de 15 000, 60 000, 175 000, 240 000, 340 000 et plus de 600 000 daltons. La séparation entre les pics à 175 000, 240 000 et 340 000 daltons n'était toutefois pas très bonne avec cette technique. On a utilisé une autre méthode pour déterminer les poids moléculaires des fractions exo-antigéniques, la technique GEDELISA. A cet effet, on a suivi le mode opératoire décrit par DESGEORGES & COLL. dans Annales de biologie clinique, 1980, 38 : 361-363, en utilisant un gel de polyacrylamide PAA 4/30 (PHARtECIA). On a utilisé, comme protéines étalons, les protéines suivantes : thyroglobuline, serritine, catalase, lactate, déhydrogénase et albumine. Après électrophorese, une moitié du gel a été colorée par le bleu de Coomassie tandis que l'autre moitié a été congelée et découpée en tranches transversales de 2,5 mm d'épaisseur qui ont été chacune placées dans une cupule d'une plaque de microtitration, dilacérées et mises à incuber une nuit à + 40C, sous agitation mécanique en présence de 1 ml de tampon carbonate-bicarbonate pH 9,6. La présence de protéines antigéniques a été détectée par le test ELISA avec les différents sérums témoins. On a sur la Fig. 2 représenté la courbe d'absorption à 492 nm, en portant en abscisses le numéro des fractions, en ordonnées les D.O. et en haut du gra phique, sur une droite parallèle à l'axe des abscisses les poids moléculaires des protéines étalons. Par cette technique, les poids moléculaires des fractions décelées sont de l'ordre de 64 000,- 83 000, 126 000, 322 500 et plus de-l 400-000 daltons. On relève l'existence d'un pic non spécifique à 570 000 daltons. Avec cette technique, on obtient une meilleure résolution et certains des pics décelés correspondent à ceux mis en évidence par chromatographie : 64 500 et 60 000, 322 500 et 340 000. Quant aux autres valeurs, on observe que les fractions antigéniques décelées par GEDELISA sont les monombres de celles qui ont t isolées en gel-filtration comme le montre la concordance des chiffres 2 x 83 000 = 166 000 (au lieu de 175 000 en gel filtration), 2 x 126 000 + 252 000 (au lieu de 240 000 en gelfiltration). Les légères differences constatées s'expliquent par le fait que, pendant l'électrophorèse constituant le premier temps de GEDELISA, il y a une migration par différence de potentiel, ce qui n'existe pas en gelfiltration.On note que la fraction de 15 000 daltons décelée en filtration sur gel nc pouvait par être retrouvée en GEDELISA puisque la limite inférieure de cette technique est de 50 000 daltons. Nature biochimique des exo-antigènes L'étude de la nature biochimique des exo-antigènes a Été réalisée par attaque enzymatique et chimique avec la trypsine, la désoxyribonucléase, la ribonucléase A, la lipase et le périodate de sodium. La trypsine et la ribonucléase A ont été utilisées aux concentrations de 2,5, 0,25, 0,025, 0,0025 et 0,00025 mg/ml. Dans le cas de la dsoxyribonucléase, on a employé les concentrations de 1,0, 0,1, 0,01, 0,001 et 0,0001 mg/ml et pour la lipase 25, 2,5, 0,25, 0,025 et 0,0025 mg/ml. Le périodate a été employé à des concentrations de 10, 1, 0,1, 0,01 et 0,001 mg/ml. Les tampons utilisés sont ceux qui sont mentionnés par BERGMEYER dans Methods of enzymatic analysis, vol. 2, 2nd Edition, Academic Press Ed. 1974/ additionnés de 0,05 % de Tween 20, sauf pour le tampon de la lipase. Le périodate de sodium a été dissous dans la glycine 0,05 ll. Chaque réactif (100 1 par cupule) a été déposé dans une plaque de microtitration en polystyrêne préalablement sensibilisé avec les exo-antigènes toxoplasmiques ou les préparations témoins.Après une incubation d'une heure à 370C, un test ELISA a été pratiqué face au sérum de référence. On a pu ainsi mettre en évidence la nature essentiellement protéique des exo-anti gènes toxoplasmiques. En effet, après le traitement par la trypsine effectué dans les conditions décrites ci-dessus, on ne retrouve plus que 7 % d'antigénicité résiduelle. Le traitement par le périodate laisse persister 67 % d'antigénicité, ce qui montre que les exo-antigènes ont un caractère glucidique faible. Il en va de même du caractère lipidique avec 73 % d'antigénicité résiduelle après action de la lipase. La ribonucléase A et la désoxyribonucléase n'ont pratiquement pas d'action sur les exo-antigènes (98 % et 96 % d'activité antigénique résiduelle, respectivement). Stabilité à la chaleur La thermostabilité a été étudiée à 600C et 800C, pendant des temps de 5, 10, 15, 20, 30, 40 et 50 min. Auparavant, les solutions d'exo-antigènes ont été diluées au 1/200 dans du tampon carbonate-bicarbonate pH 3,6 0,05 M. L'antigénicité résiduelle a été détectée par ELISA face aux sérums témoins. Les exo-antigènes toxoplasmiques sont partiellement thermolabiles avec une antigénicité résiduelle de 45 % et de 15 %, respectivement après 50 min. de chauffage à 600C et à 80 C. Entre 20 et 50 min. à 800C, l'activité antigénique résiduelle reste pratiquement la même. Elle continue par contre à varier à 600C dans ce même intervalle de temps. Chromato-focalisation On a utilisé la technique de PHARMACIA Chromatofocusing with Polybuffer and PBE, Rahms & Lund, Ed, 1980. avec comme gel, le PBEC TM 94, dans une colonne (10 x 20 cm) pour un volume total de 15 ml. On a fait varier la zone d'étude de pH de 7 à 4, en utilisant comme tampon d'élution de Poly tampon 74 HCl (1/8) pH 4,0 de PHARMACIA. On a collecté 250 fractions d'l ml. A partir de la fraction 200, on a Flué la colonne avec Na C1 1M. La chromatographie a été réalisée à +40C avec un débit de 20 ml/h. On a mesuré le plf de chaque fraction, son absorption à 280 nm et sa réaction vis-A-vis du test ELISA. Pour ce dernier test, on a préalablement ajouté à chaque fraction 100 Rl de tampon carbonate-bicarbonate pH 2,6 0,35 M. La plupart de l'activité antigénique se trouve dans l'intervalle de pli 4 h 5 et inférieur à 5, comme le montre la Fig. 3 où l'on a représenté la courbe de variation de la D.O. à 492 nm et la courbe de variation du pH en fonction des volumes élus. Etudes pharmacologiques La fraction exo-antigénique de poids moléculaire de l'ordre de 325 000 daltons a été soumise à des contrôles d'înnocuite' chez des souris, des cultures cellulaires et des cultures bactériologiques (contrôles de sté milité). Utilisation pour le dépistage de l'immunité toxoplasmique La fraction exo-antigénique peut être utilisée - en injection intra-dermique ; pour cela on réaliseune solution contenant 1 unité biologique (telle qu'elle est définie chez le cobaye, AMBROISE-THOMAS et Coll., Lyon Médical, 1982, 248 : 78-83), qui est injectée dans un volume de 0,2 ml. La lecture du résultat est effectuée après 72 heures ou plus par mesure de l'induration obte nue. - en tests épicutanés à l'aide de bagues de multipunctures. La fraction antigénique préalablement titrée est mélangée dans une proportion de 70 % à une solution de glycérol. Ce mélange est déposé sur des bagues de multipunctures dont le chaton est garni de 9 pointes, telles qu'elles ont été décrites pour plusieurs autres applications et notamment dans le dépistage de l'immunité anti-tuberculinique (KRAVITZ et coll. Pediatrics, 1968, 42 : 465-470). Les résultats sont lus après 72 heures ou plus par mesure de l'induration. REVENDICATIONS 1. Nouvelle fraction exo-antigénique toxoplasmique obtenue par culture de Toxoplasma gondii sur des cellules diploïdes humaines, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de l'ordre de 325 000 daltons. 2. Nouvelle fraction exo-antigénique toxoplasmique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente une absorption de 5,7 unitésde D.O. à 492 nm et en ce qu'elle donne, face à un immunsérum produit chez un animal à partir de ladite fraction, une bande de précipitation caractéristique en immuno-électrophorèse bi-dimensionnelle. 3. Nouvelle fraction exo-antigénique toxoplasmique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente une activité antigénique maximale à un pH inférieur à 5. 4. Nouvelle fraction exo-antigenique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle présente une activité résiduelle de l'ordre de 45 % lorsque ladite fraction est chauffée à 600C pendant 50 minutes. 5. Procédé de préparation des fractions exo-antigéniques selon les revendications 1 à 4, consistant successivement - à cultiver Toxoplasma gondii sur des cellules diploides humaines, notamment sur des cellules connues sous la désignation MRC 5, - à recueillir le surnageant, - à extraire les exo-antigènes des surnageants, - à concentrer les exo-antigènes, caractérisé en ce que, après concentration des exo-anti gènes, - on dialyse les exo-antigènes contre une solution tampon appropriée, à un pH voisin de 9, - on soumet lesdits exo-antigènes à un fractionnement, - on repère les fractions séparées pour leur activité antigénique, - on réduit les fractions riches en exo-antigènes. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le fractionnement est réalisé par filtration sur gel G 200 (PHARMACIA) à un pll 8,8, et à une température comprise entre 3 et 40 C. 7. Application de la fraction exo-antigénique définie dans les revendications 1 à 4 à la recherche de l'immunit toxoplasmique chez l'homme par tests cutanés. 8. Nouvelle substance de test pour la détection de l'immunité toxoplasmique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la fraction exo-antigénique telle que défi- nie dans les revendications 1 à 4, associée à un véhicule, notamment au glycérol.