Brevet FR2565825A1 — publié le 19851220

Vaccin contre les maladies dues à des microorqanismes tels que des mycoplasmes, sa préparation et membranes de microorqanismes en tant que principe actif. L'invention a oour objet un vaccin contre les maladies animales provoquées oar des microorqanismes ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, et plus Dar- ticulièrement contre les maladies provoquées par les mycoplasmes, ainsi qu'un procédé pour sa préparation. Les maladies provoquées par les- microorcianismes ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, tels que les bactéries qram néqatives et les mycoplasmes sont très réDandues, en particulier dans les élevages d'animaux domestiques oU elles sont resDonsables d'un manque à gagner important. I1 en est particulièrement ainsi dans les élevaqes intensifs de porcins où la pneumonie enzootique du porc, provoquée par MycoDlasma hyopneumoniae est très fréquente. Dans un article récent consacré à l'élevage moderne du porc, W. POND [Pour la Science, 66, D. 60-68 (1983)J décrit la place tenue actuellement dans le monde par ce ty De d'élevaqe. Le porc fournit notamment environ 25 % de l'énergie et 9 % des protéines d'oriqine animale. En élevaqe, le rendement des porcins est suDérieur à celui des bovins, des ovins et des volailles. De plus, la viande de porc possède d'excellentes qualités nutritives et est aDpréciée des consommateurs. I1 n'est donc pas surprenant que l'relevage de porcins occupe une place non n- qligeable dans l'économie de nombreux pays d'Amérique (Nord et Sud), d'EuroDe, d'Asie et d'Océanie. Ceci concerne-aussi bien des pays fortement industrialisés que des pays qui le sont beaucoup moins. En France, notamment en Bretagne, l'é levasse des porcins constitue une composante essentielle de l'économie agricole. Les techniques d'élevage des porcs ont beaucoup pro qressé tant au niveau des rendements obtenus, qu'au niveau des conditions d'élevage, les conditions d'hyqiène en particulier. Ces Droqrès ne permettent pas, néanmoins, de mettre les élevages à l'abri d'un certain nombre de maladies dont les mycoplasmoses. Parmi les maladies qui affectent l'appareil resDiratoire du porc, la pneumonie est très commune, en particulier dans le contexte de l'élevage intensif. Une enauête épidémiologique de trois ans, menée en Bretaqne, a permis de détecter MycoDlasma hyopneumoniae dans 15 à 42 % des lésions pulmonaires chez des porcelets âgés de 8 à 12 semaines. D'autre Dart, des anticorps anti M.hyoDneumoniae ont été détectés Dar hémaqglutination indirecte dans 80 % des troupeaux. [M. Kobisch et Coll., Journées de Recherche Porcine en France (1977) p. 161-164, M. Kobisch et Coll., Rec. Méd. Vét., 154, (1978) p. 847-852 et J.P. Tillon, Journées de Recherche Porcine en France, (1980), p. 361-3801. Le rôle étioloqique primaire de M. hyopneumoniae dans la pneumonie enzootique du porc a été démontré par R.F.W. Goodwin et Coll., British . Vet. 77 (1973), p. 456464 et revu par W.P. Switzer et Coll. dans Disease of Swine, (1975), 4e éd., Dunne and Leman Eds., Iowa University Press. Les maladies respiratoires sont resDonsables de la baisse siqnificative du rendement de nombreux élevages porcins. S'il est possible de lutter contres les bactériens au moyen d'antibiotiques, les mycoplasmes posent un probleme spécifiaue, lié à leur simDlicité structurale. Dépourvus de paroi, ces microorganismes sont totalement insensibles à tout antibiotique dont la cible est Précisément la paroi, tels que par exemple pénicilline, céphalosporine, et bacitracine. D'autre part, la membrane plasmiaue des mycoplasmes serait imperméable à un certain nombre d'antibiotiques dont la cible est intracellulaire [S. Razin, Microbiol. Rev. (1978), p. 414-470], I1 résulte de ceci que la vaccination Dourrait constituer un mode efficace et rentable de lutte contre les mycoplasmes. Il n'existe pas actuellement sur le marché de vaccin contre les maladies provoquées par les mvcoplasmes. Certes, on a déjà proposé des vaccins contre ces maladies, tels que des vaccins vivants utilisant des souches atténuées (brevet US 3 534 136), ou des vaccins renfermant des cellules complètes de mycoplasmes tuées par la chaleur, un agent tel que le formol, le salicytate d'éthylmercure sodium ou la Q-pro- piolactone, ou par sonication demande de brevet FR 2 201 878). Toutefois, aucun de ces vaccins ne s'est, pour diverses raisons, révélé satisfaisant et n'est utilise couramment. Selon l'invention, on a établi que la membrane plasmique d'un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, en particulier d 'un mycoplasme, peut constituer, lorsqu'elle est séparée du reste de la cellule, le principe actif particulièrement efficace d'un vaccin contre les maladies provoquées par le microorganisme concerne. L'invention a donc pour objet un vaccin destiné à protéger contre les maladies provoquées par un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane , en particulier un mycoplasme, caractérisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, des membranes plasmiques du microorganisme concerné, débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants dudit microorganisme. Les mlcroorganismes concernés par l'invention sont notamment les bactéries gram négatives et surtout les my- coplasmes. Parmi ces derniers on peut citer - en pathologie aviaire : Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae et Mycoplasma meleagridis; - en patholoqie bovine : Mycoplasma mycoïdes, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovirhinis et Mycoplasma boviqenitalium - en patholoqie ovine et caprine : Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma capricolum, et Mycoplasma mycoïdes subspecies cauri - en patholoqie du cheval :Mycoplasma equigenitalium, MycoDlasma equirhinis, Acholeplasma heppikon et Acholesplasma equiletale , et - en Dathologie porcine : MycoDlasma hyopneumoniae et Mycoplasma hyorhinis. Selon un mode préféré de réalisation, le vaccin selon l'invention se présente sous forme d'une suspension de membranes dans une solution saline dite physioloqique, c'està-dire une solution de NaCl à 8,5 g/l, en présence d'un adjuvant qui assure un relarqaqe progressif de l'immunogène. Selon un mode tout particulièrement préféré de realisation, l'adjuvant est constitué par de l'hydroxyde d'aluminium, de l'agarose ou des anticorps anti-membrane du microorqanisme concerné. D'autres adjuvants, en particulier huileux, peuvent être utilisés; il ne sont toutefois pas préférés. La concentration en protéines provenant des membranes dans le vaccin est de préférence située dans la gamme de 2 à 3 g/l , elle est avantageusement de 2,5 g/l. La concentration en hydroxyde d'aluminium est de préférence dans la gamme de 12 à 13 g/l, selon la concentration en protéines; elles est avantaqeusement de 12,5 q/l, pour une concentration en protéines de 2,5 ,g/l. L'aqarose est en qénéral utilisé sous forme de sel très dilué, de préférence à une concentration comprise dans la gamme de 1,5 à 2 g/l selon la concentration en protéines; elle est avantaqeusement de 1,7 q/l pour une concentration en protéines de 2,5 g/1. Selon un mode tout particulièrement préféré de réalisation, l'invention a pour objet un vaccin destiné à pro- téger les porcins contre la pneumonie enzootique, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de Mycoplasma hyopneumoniae débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme, correspondant à un poids de protéines de 2 à 3 g/l, dans une solutionaqueuse de NaCl à 8,5 g/l en présence de 12 à 13 g/l d'hydroxyde d'aluminium en tant qu'adjuvant. Selon un autre mode tout particulièrement préféré de réalisation, l'invention a pour objet un vaccin destiné à Drotéqer les porcins contre la pneumonie enzootique, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de Mycoplasma hyopneumoniae débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme, correspondant à un poids de protéines de 2 à 3 g/l, dans une solution aqueuse deNaCl à 8,5g/len présence de 1,5 à 2 q/l d'agarose en tant qu'adjuvant. L'invention a en outre pour objet un procédé pour la préDaration du vaccin décrit plus haut, caractérisé en ce qu'il comDrend essentiellement les étapes consistant à a) cultiver le microorqanisme contre leauel on désire préparer un vaccin jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance b) récolter les cellules par centrifugation c) lyser les cellules récoltées par les ultrasons, à 20 à 28 kHz, en plusieurs étases,pendant 2 à 5 minutes au total; d) sédimenter les membranes par centrifugation, et e) les introduire dans une forme utilisable pour la vaccination. La culture des cellules est avantaqeusement effectuée à 37"C sur un milieu liquide tel que le milieu de FRIIS [N.F. Friis, Nord. Vet. Med., 27, (1975), p. 337-339] Les cellules centrifuqées (à environ 10 000 g) sont lavées avec un tampon présentant un DH légèrement ba siqué , par exemple du tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,5 ; contenant du NaCl à 8,5 g/1. - Les cellules sont ensuite dispersées, par exemple au moyen d'un cylindre de Potter, de maniére à obtenir une suspension dense dans du tampon légèrement basique, par exemple du tamoon Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.La lyse par les ultrasons se fait en plusieurs étapes, avantageusement à des fréquences croissantes, dans la gamme indiquée plus haut, au voisinaqe de 0 C. Après centrifugation poussée (à environ 40 000 q, pendant environ 1 h) du lysat, les membranes sédimentées sont lavées soiqneusement (plusieurs fois avec du tampon, Dar exemple du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0) et dispersées puis centrifuqées de nouveau plusieurs fois. Les membranes ainsi recueillies sont prêtes à être utilisées pour préparer le vaccin. Elles peuvent être conservées à -70 C sous forme d'une suspension concentrée dans une solution aqueuse de NaCl à 8,5 g/l, par exemple à 20 mg de protéines/ml, ou sous forme lyophilisée. L'invention a donc en outre pour objet en tant que produits industriels nouveaux - une suspension concentrée dans une solution aqueuse de NaCl à 8 , 5 g/l de membranes d'un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, en particulier d'un mycoplasme, débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme, pour l'utilisation en tant que principe actif d'unvaccin;et - des membranes d'un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane en particulier d'un mycoplasme, débarrassées, au moins dans une large mesure,des autres- constituants du microorganisme, sous forme lyophiliséepour l'utilisation en tant que principe actif d'un vaccin. Le vaccin selon l'invention qui ne contient pas de cellules vivantes est dépourvu de toxicité et ne présente donc pas, pour l'animal traité, les risques des vaccins vivants utilisant des souches atténuées, tout en étant Dlus efficace et d'un emDloi plus aisé que les vaccins utilisant des cellules simplement tuées, sans séparation de la membrane plasmique, tels que ceux décrits dans la demande de brevet FR 2 201 878. Ainsi, contrairement à ce qu'on pouvait attendre, les vaccins obtenus selons l'invention sont actifs même lorsqu'ils sont administrés par voie sous-cutanée ou intramusculaire, alors que les vaccins décrits dans la demande de brevet FR 2 201 878 n'exercent un effet préventif sur l'animal traité que lorsqu'vils sont inoculés dans la trachée par injection ou pulvérisation. De plus, les vaccins obtenus selon l'invention, lorsau'ils sont inoculés à une femelle gestante, Drotèqent également de façon efficace la Dortée à naître, ce qui représente un avantaqe très imDortant Dour la salubrité des élevages industriels. Ainsi, il est Dossible de protéger efficacement une portée de porcelets contre les maladies provoquées par Mycoplasma hyopneumoniae en injectant à la truie gestante, par voie sous-cutanée ou intramusculaire, un inoculum tel que défini ci-dessous, 7 à 8 semaines avant la mise-bas, puis de nouveau 2 semaines avant celle-ci. Sélon un mode tout particulièrement préféré de réalisation, l'invention a oour objet un tel inoculum, ou dose unitaire, qui est caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de Mycoplasma hyopneumoniae dsbarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme, et correspondant à un poids-de protéines de 4 à 6 mg, de préférence de 5 mq, dans 2 ml d'une solution aqueuse de NaCl à 0,85 %, en présence de 1,20 à 1,30 %, de préférence 1,25 %, d'hydroxyde d'aluminium ou de 0,15 à 0,20 %, de préférence 0,17 %,d'aqarose, ou encore d'une quantité saturante pour les membranes d'anticorps de porc antimembrane de Mycoplasma hyopneumoniae. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description donnée ci-dessous, à titre purement illustratif, d'un exemple de mise en oeuvre de l'invention et des ré- sultats qu'elle permet d'obtenir. I - Obtention de vaccins anti-Mycoplasma hyopneumoniae 1) Culture du microorganisme. Mycoplasma hyopneumoniae souche BQ 14:M. Kobisch et coll,Rec. Méd. Vét. 152 (1976),p.817-827] est cultivée à 37 C sur le milieu liquide décrit par FRIIS. Les cellules sont récoltées en fin de phase exponentielle de croissance par centrifugation (10,000 x q, 15 min, à 4 C) et lavées deux foix avec du tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,5 contenant du NaCl à 8,5 q/l. 2) Isolement des membranes Les cellules sont disDersées au moyen d'un cylindre de Potter de manière à obtenir une suspension dense dans du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. Elles sont ensuite lysées par les ultrasons : 2 fois 1 minute à 20kHz et lfois une minute te à28kHa, L'opération est réalisée à 0 C en laissant reposer le matériel une minute entre deux cycles consécutifs. Le lysat cellulaire est centrifuqé pendant 1 heure à 40,000 x g, à 4"C, de maniere à sédimenter les membranes. Celles-ci sont lavées quatre fois avec du tampon Tris-HCl 0,1 M,pH 8,0 par dispersions et centrifugations successives. Le matériel obtenu est stocké à -70 C, soit sous forme d'une suspension concentrée (20 m de protéines/ml), soit sous forme lyophilisée. 3) Préparation des vaccins Les vaccins sont constitués par des membranes de M. hyooneumoniaeobtenues comme décrit ci-dessus,en suspension dans une solution de NaCl à 8,5 g/l. La concentration en protéines est de 2,5 mg/ml. Les adjuvants utilisés sont : hydroxyde d'aluminium à 1,25 % (vaccin I), agarose à 0,17 % vaccin II) et anticorps de porc antimembrane de M. hyooneumoniae qui précipitent les membranes (vaccin III). Il - Utilisation des vaccins Les vaccins dont la Préparation est décrite cidessus ont été utilisés pour vacciner des truies gestantes nullipares provenant de la porcherie protéqée de la Station de Pathologie Porcine de Ploufragan (Cotes du Nord, France). Le trouDeau de cette porcherie est constitué d'animaux obtenus par hystérectomie et maintenus à l'abri des contaminants. Les truies soumises aux essais ont été Dlacées dans des animaleries protéqées, dix semaines avant la date présumée de mise-bas. Les truies ont été inoculées 7 ou 8 semaines avant la mise-bas, par voie sous-cutanée ; un rappel a été effectué 2 semaines avant la mise-bas, par voie intramusculaire. Chaque inoculum contenait 2 ml de suspension membranaire, soit 5 mq de protéines. Deux séries d'essais ont été réalisés 1ère série d'essais - une truie (10043) a reçu le vaccin I, - une truie ( 10044) a reçu le vaccin II, - deux truies (témoins 071 et 1010) n'ont pas été vacci nées. 2ème série d'essais - deux truies (20008 et 20012) ont reçu le vaccin II, - une truie (20013) a reçu le vaccin III, - deux truies (témoins 20005 et 20007) n'ont pas été vaccinées. Ces truies ont donné naissance aux nombres respectifs de porcelets indiqués dans le tableau suivant Référence de la truie Nombre de porcelets 10043 9 10044 - 6- X 071 11 1010 - 6 20008 - 11 20012 4 20013 10 20005 9 20007 9 Tous les porcelets ont reçu à 2, 3 , 4 et 5 jours d'âge, à raison de 0,5 ml par narine, une suspension de M. hyopneumoniae titrant 108 UFC/ml (UFC = Unités formant colonies). La souche utilisée était la même que celle ayant servi à la préparation du vaccin. Les porcelets ont été examinés chaque jour. La température rectale a été relevée, les signes cliniques ont été notés quotidiennement et des ponctions sanguines effectuées chaque semaine chez tous les porcelets. Ils ont été pesés et leurs consommation alimentaire a été évaluée chaque semaine. Les Dorcelets ont été sacrifiés de façon échelonnée dans chaque groupe, de 5 à 10 semaines après l'infection. Après l'observation macros-conique des poumons, des contrôles bactérioloqiques et mycoplasmiques ainsi que des examens histoloqiques ont été entrepris. Les anticorps se- riques ont été détectés par hémagglutination passive [M.Kobisch et Coll.,Rec. Méd.Vét,154 (1978), p. 847-852] III - Résultats 1) Etat des porcelets issus des truies non trai tées Les résultats de la première série d'essais ont confirmé des observations précédentes : l'infection expérimentale par M. hyopneumoniae s'est traduite sur le plan clinique par de l'hyperthermie et de la toux apparaissant dans les jours qui ont suivi l'infection et se Doursuivant durant la triode d'induction des lésions pulmonaires. M. hyopneumonîae a exercé un effet dépressif sur la croissance des porcelets (Dar rapport aux animaux issus de truies vaccinées). Les lésions pulmonaires se sont montrées très étendues au moment. des premiers sacrifices (5 semaines après l'infection1 et jusqu'à la fin de l'expérience (10 semaines après l'infection). Contrairement à ce qui a été observé dans des expériences précédentes, il n'a Das été noté de sillons cicatriciels correspondant à des zones d'atélectasie indiquant l'évolution vers la cicatrisation. Ainsi, dans cette expérience, l'apparition des anticorps sériques décelés par hémaqqlutination pas- sive a Drécédé la régression des lésions. Au plan anatomo-patholoqique, l'existence d'une pneumonie caractérisée par des infiltrats lymphoïdes a confirmé les observations macroscopiaues . Les résultats de la 2ème série d'essais ont été moins tranchés. Le pouvoir pathoqène de M. hyopneumoniae s'est exprimé moins nettement, en particulier chez les porcelets de la truie 20007, qui a eu des problèmes de santé au moment de 1-a mise-bas et a reçu des antibiotiques aux jours J3 à J6 après la mise-bas. M. hyopneumoniae a induit de la toux chez les animaux infectés, mais a eu peu d'effet sur la croissance et la température corporelle. Les lésions pulmonaires ont tété inconstantes chez les porcelets de la truie 20007. I1 ne semble pas que M. hyopneumoniae se soit multiplié dans les poumons des Dorce lets de cette portée avant 60 jours alors qu'il était présent au niveau de la trachée dès les premiers sacrifices. M. hyopneumoniae a été retrouvé dans les poumons de 66 % des porcelets de la truie 20005 (dans le mucus trachéal de 88%) et dans les polluons de 55 % des porcelets de la truie 20007 (dans le mucus trachéal de 100 %). Ces résultats montrent que les recherches microbiologiques de M. hyopneumoniae doivent être conduites à partar des poumons mais aussi du mucus trachéal qui se-révèle être un bon témoin de la présence du mycoplasme. Le taux des anticorps sériques décelés chez les porcelets n'a pas atteint le seuil de signification à la fin de l'expérience. Dans le cas des porcelets de la truie 20005, il faut noter que des anticorps colostraux ont été- transmis, ce qui vraisemblablement a eu une incidence sur la synthèse des anticorps actifs faisant habituellement suite à l'infection. La multiplication réduite de M. hyopneumoniae dans les premiers stades de l'exDérience explique le faible taux des anticorps chez les porcelets de la truie 20007. 2) Evaluation du potentiel vaccinant des membranes Dans le modèle expérimental utilisé, l'effet protecteur du vaccin I (membrane + hydroxyde d'alumine) sur les porcelets a été de 100 %. Dans le cas du vaccin II (membranes + agarose), il a été de 100 % dans la première série d'essais et de 87 % dans le deuxieme série d'essais. L'efficacité du vaccin III (membranes précipitées par des anticorps) n'a été que de 70 % (en écartant la pleurésie qui ne correspond pas aux lésions décrites lors d'une infection par M. hyopneumoniae). On notera que les vaccins utilisés induisent des anticorps sériques chez les truies. Les porcelets issus de ces truies possedent, après la prise colostrale, des anticorps d'origine maternelle dont le taux diminue rapidement en fonction du temps et atteint une valeur moyenne se situ ans au dessous du seuil de signification dans les semaines qui suivent la naissance. Six semaines après l'infection des porcelets, les truies présentent une remontée du taux des anticorps circulants. Enfin, M. hyopneumoniae est peu retrouvé chez les porcelets issus de truies vaccinées (13 à 26 %). 3) Conclusion Les expériences réalisées montrent que les membranes de M. hyopneumoniae, injectées par voies sous-cutanée et intra-musculaire à des truies gestantes, ont un effet protecteur significatif à l'égard des porcelets (absence de pneumonie et de retard de croissance). Ceci est particulièrement vrai dans le cas où de l'hydroxyde d'aluminium ou de l'agarose est utilisé comme adjuvant. Ces résultats montrent que le vaccin selon l'invention permet, avec un coût très réduit en raison de la simplicité de sa préparation, de lutter efficacement contre les maladies provoquées par les microorganismes ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, notamment les mycoplasmes, et en particulier contre les maladies respiratoires qui affectent bon nombre d'élevages de porcins et diminuent leur rendement de façon importante. I1 est rappelé que le milieu de FRIIS a pour composition ( solution saline de HANKS 500 ml ( eau distillée 750 ml ( "Bacto brain heart infusion" (Difco) 8,2 g ( "Bacto PPLO broth" (Difco) 8,7 g ( extrait de levure 60 ml ( rouge de phénol à 1 % 4 ml B- ( bacitracine 500 mg (50000 ( acétate de thallium à 5 % (MERCK) 3 ml unités) ( sérum de cheval 320 ml et que la solution saline de HANKS a pour composition ( NaCl 80 g ( K cl 4 g solu- ( Mg So4, 7 H2O 1 g tion A ( Mg Cl2, 6 H2O 1 g ( dissolution dans 400 ml d'eau distillée ( Ca C12 anhydre 1,4 g eau distillée qsp 500 ml ( Na2 HP04, 12H20 1,5 g (dissolution dans 400 ml d'eau distillée tion B ( KH2 PO4 0,6 g (eau distillée qsp 500 ml R E V E N D I C A T I O N S 1. Vaccin destiné à protéger contre les maladies pro voquées par un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane,en particulier un mycoplasme, caractérisé en ce au'il contient en tant que principe actif, des membranes plasmiques du microorganisme concerné, débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants dudit microorganisme. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce au'il représente sous forme d'une suspension desdites mem branes dans une solution de NaCl à 8,5 q/l, en présence d'un adjuvant qui assure le relarqaqe progressif de l'immuno gene. 3. Vaccin selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'adjuvant est constitué Dar de l'hydroxyde d'alumi nium, de l'aqarose ou des anticorps anti-membrane du micro organisme concerne. 4. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 3, carac térisé en ce que la concentration en protéines est située dans la gamme de 2 à 3 mg/ml. 5. Vaccin destiné à protéqer les porcins contre la pneumonie enzootique, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de Mycoplasma Hyopneu- montae ciébarrassées aw moins dans une laros mesure, des autres cotistitu- snts du microorqanisme, correspondant à un poids de protéines de 2 à 3g/1, dans une solution aqueuse de NaCl à 8,5 g/l en présence de 12 à 13 g/l d'hydroxyde d'aluminium en tant qu'adjuvant. 6. Vaccin destiné à protéger les porcins conte la pneumonie enzootique, caractérisé en qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de Mycoplasma hyopneumoniae debarrassées,au moins dans une larae mesure, des autres constituants du microorganisme, correspondant à un poids de proteinesde 2 à 3 g/l dans une solution aqueuse de NaCl à 8,5 g/l, en pré sence de 1,5 à 2 g/l d'agarose en tant qu'adjuvant. 7. Procédé pour la préparation du vaccin selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à a) cultiver le microorganisme contre lequel on désire pré parer un vaccin jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance b) récolter les cellules par centrifugation c) lyser les cellules récoltées par les ultrasons à 20 à 28 kHz, en plusieurs étapes, pendant 2 à 5 minutes au total d) sédimenter les membranes par centrifugation; et d) les introduire dans une forme utilisable pour la vaccination. 8. Suspension concentrée dans une solution aqueuse de NaCl à 8,5 g/l de membranes d'un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane, en particulier d'un mycpplasme, débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme pour l'utilisation en tant que principe actif d'un vaccin. 9. Membranes d'un microorganisme ayant pour enveloppe la plus externe une membrane en particulier d'un mycoplasme débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme, sous forme lyophilisée pour l'utilisation en tant que principe actif d'un vaccin. 10. Dose unitaire de vaccin ou inoculum destiné à protéger les porcins et les portées des truies gestantes contre les maladies provoquées par Mycoplasma hyopneumoniae, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une suspension de membranes de mycoplasma hyopneumoniae débarrassées, au moins dans une large mesure, des autres constituants du microorganisme et correspondant à un poids de protéines de 4 à 6 mg, de préférence 5 mg, dans 2 ml d'une solution aqueuse de NaCl à 0,85%, en présence de 1,20 à 1,30%,de préférence 1,25 %, d'hydroxyde d'aluminium ou de 0,15 à 0,20 ,de préférence 0,17 %, d'agarose, ou encore d'une quantité saturante pour les membranes d'anticorps de porc anti-membrane de Mycoplasma hyopneumoniae.