Brevet FR2560744A1 — publié le 19850913

La présente demande concerne la transformation qénetique de sentences de plantes dicotylédones. Agrobacterium rhizogenes est l'organisme causal de ce qu'on a appelé la "maladie de la racine pileuse" dans un certain nombre d'espèces de plantes supérieures. A. rhizogenes peut être isolé du sol, et est une espèce d'agrobactérie qui a les caractéristiques suivantes: aérobie, en forme de bâtonnet (0,8 x 1,5-30 microns), 1 à 4 flagelles à cils péritriches, gram-négative, et ne formant pas de spores. Les espèces communes sont A. tumefaciens, qui a une action tumorale; A. rhizogenes, qui provoque la maladie de la racine pileuse; et A. radiobacter, qui est non pathogène. La possibilité d'utiliser A. rhizogenes au bénéfice de l'homme a été mentionnée dans un article intitulé "Studies on Infectious Hairy Root of Nursery Apple Trees", Journal of Agricultural Research, Vol. 41, N"7, pp 507-540, A.J. Riker et coll. Les auteurs affirment en p. 537 "Dans des expériences préliminaires, des boutures ou couches de certaines plantes traitées avec l'organisme à racine pileuse se sont enracinées plus rapidement et plus vigoureusement que celles qui n'ont pas été traitées. Ces résultats suqgèrent la possibilité d'utiliser cet organisme pour stimuler la production de racines dans la propagation de certaines plantes. Des travaux plus poussés sont nécessaires avant de pouvoir tirer des conclusions".En dépit de cette invitation, A. rhizogenes n'a pas été activement développé au bénéfice de l'homme, et reste considéré comme un organisme pathogène indésirable. On ne dispose d'aucune information quant à son application pour la transformation des semences. On a maintenant trouvé que l'on peut provoquer effectivement la croissance bénéfique de racines à partir de semences de plantes dicotylédones par transformation génétique de telles semences avec Agrobacterium rhizogenes insensible à l'agrocine. Un contrôle existe dans l'utilisation d'Agrobacterium radiobacter, de préférence A. radiobacter K-84, conjointement à ou après transformation génétique de la semence avec A. rhizogenes. A. radiobacter sert à contenir de façon compétitive tout A. rhizogenes résiduel éventuel vers la région des semences et plantes transformées. Les A. rhizogenes utiles sont les espèces qui sont contenues par A. radiobacter mais qui sont autrement insensibles à l'agrocine qu'elle exprime.Le contact avec une solution aqueuse, une suspension ou un autre milieu, comme la tourbe humide, contenant dé préférence une concentration efficace d'au moins environ 108 cellules par ml, pendant une période raccourcie ou étendue, produit une semence transformée qui, lors de la germination ou ensuite, présente un accroissement de la croissance des racines, de la tolérance à la sécheresse, et du rendement. On préfère actuellement exposer les semences à de la tourbe contenant des organismes A. rhizogenes qui restent fonctionnels, bien que contenus, au moins jusqu'à la germination. A. rhizoqenes peut être simultanément ou ultérieurement être contenu, c'est-à-dire réduit, à des niveaux non infectieux par exposition à A. radiobacter. I1 suffit d'une immersion dans une suspension aqueuse où la concentration d'A. radiobacter est d'environ 107 à environ 109 cellules/ ml. De façon commode, on a trouvé que la transformation peut s'effectuer en combinant A. rhizogenes avec A. radiobacter dans le même milieu traitant, dans un rapport cellulaire d'au moins environ 4 à 1, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1, d'A. rhizogenes à A. radiobacter. Le milieu actuellement préféré contient environ 10 cellules d'A. rhizogenes et environ 2,5 x 108 cellules d'A. radiobacter par ml. En outre, A. rhizogenes comme A. radiobacter, seuls ou en combinaison, résistent à la transformation en pellets par centrifugation et lyophilisation pour donner des cellules sèches viables, et restent fonctionnelles. Dessins La figure 1 compare, dans le mme champ, la croissance de graines de soja traitées selon l'invention (10) à celle de graines de soja non traitées (12), environ13-14 jours après la levée. La figure 2 compare la croissance, dans le même champ et au même endroit que dans la fig. 1, sauf que la date est 14 jours plus tard. La figure 3 montre l'étendue du développement-des- racines dans les graines de soja traitées selon l'invention (10) et dans les graines non traitées (12), 39-à 40 jours après la levée. La figure 4 montre l'étandue du développement des racines dans les graines de coton traitées selon l'invention (14) par opposition aux graines de coton non traitées (16). Toutes les photos se réfèrent aux exemples et aux témoins ici décrits. On traite les semences, et on cultive les plantes, selon le protocole ici décrit. Selon l'invention, A. rhizogenes, de préférence A. rhizogenes TR-105 ou A. rhizogenes ATCC 39207, qui est isolé à partir d'A. rhizogenes TR 105, est utilisé seul ou en combinaison avec d'autres A. rhizogenes inducteurs de racines pour la modification génétique de semences réceptives de plantes dicotylédones pour accroître le développemen-t des racines des plantes qui lèvent à partir d'elles, le contrôle de 1'A. rhizogenes étant disponible par l'utilisation d'A. radiobacter, de préférence A. radiobacter K-84. A. rhizogenes ATCC 39207 est déposé à l'American Type Culture Collection, conformément au traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt des microorganismes pour les procédures de prise de brevets. Telle qu'utilisée ici, l'expression "A. rhizogenes insensible à ltagrocinell désigne l'espèce du genre A. rhizogenes qui est substantiellement non sensible à l'activité toxique de l'agrocine mais est contenue à la région locale d'une-semence ou plante transformee par l'activité compétitive d'A. radiobacter. Une semence traitée avec A. rhizogenes peut être ultérieurement traitée avec A. radiobacter ou, dans le mode de réalisation préféré, les deux combinés. Quoi qu'il en soit, on évite un résidu infectant d'A. rhizogenes dans le sol. Si l'on combine les deux on peut, et de préférence, les combiner dans un rapport cellulaire d'environ 4 à 1 ou plus d'A. rhizogenes à A. radiobacter, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1. A. radiobacter sert dans le système à empêcher substantiellement 1'A. rhizogenes de contaminer le sol sans'gêneur la transformation des semences. Transformer une semence avec A. rhizogenes nécessite l'exposition de-la semence pendant une durée suffisante pour qu'une transformation génétique se produise. Ceci semble se produire par simple liaison de l'organisme avec de l'eau ou -un milieu équivalent à la semence, au moins à la plantation. La concentration d'A. rhizogenes dans un milieu traitant, normalement un milieu aqueux, un milieu de tourbe humide, deshuiles, etc, est normalement 8 au moins une quantité équivalant à environ 10 cellules/ml. de préférence au moins environ 109 cellulels/ml. Des conclentrations inférieures sont également utiles mais peuvent nécessiter uen exposition plus longue. Les avantages de l'application d'A. rhizogenes selon l'invention sont nombreux. Elle favorise les racines latérales, aboutissant à un plus grand développement des feuilles, tant en taille qu'en nombre; elle diminue le rabougrissement; elle accroît la possibilité de développement des fruits; et, de manière significative, elle accroit l'aptitude de la plante à survivre à la sécheresse. En dépit des bienfaits potentiels de l'invention, A. rhizogenes peut rester considéré comme un agent pathogène du sol. L'effet peut donc être éliminé ou réduit à des niveaux non infectants par l'utilisation d'A. radiobacter. On préfère actuellement A. radiobacter K-84. A. radiobacter K-84 est cultivé et vendu par AgBioChem Inc., 3 Fleetwood Court, Orinda, Californie 94563. On préfère employer A. radiobacter, de préférence présent dans un milieu utile à une concentration dépassant environ 107 cellules/ml, pour mettre fin à l'activité d'A. rhizogenes. On a cependant observé qu'en dépit de la fin de l'activité, la transformation de la semence est toujours réalisée. De façon commode, on combine les deux dans un milieu transformant commun. On emploie un rapport cellulaire d'A. rhizogenes à A. radiobacter d'au moins environ 4 à 1, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1. Dans ce cas, comme dans le cas de l'application d'A. rhizogenes seul, la transformation nécessite l'exposition de la semence à l'organisme transformant. Cependant, 1'A. radiobacter ne semble pas gêner le processus de transformation, en dépit du fait qu'il entre en compétition avec, et contient, A. rhizogenes. On a trouvé que la tourbe est un excellent hôte pour les organismes. On a trouvé que les organismes prospèrent dans la tourbe essentiellement neutre à alcaline (pH) , qui sert de support commode et de milieu traitant efficace. On peut également employer la lyophilisation. Si l'on emploie la tourbe, on maintient 1'A. rhizogenes séparé de 1'A. radiobacter et on combine les unités de tourbe qui les portent au moment de l'utilisation. On peut utiliser de l'eau, de l'huile et d'autres milieux pour lier les organismes, en tant que tels ou la tourbe qui les contient, à la semence au moment de la plantation. Une simple humidification de la tourbe convient pour favoriser la liaison. Sans limitation, l'invention est précisée ci-dessous. EXEMPLES ET TEINS A. soja Le soja employé est celui connu sous le nom de Williams 79. Pour le témoin, on met en contact la semence avec Rhizobium japonicum (bactéries fixant l'azote) dans la tourbe à une concentration de 3,42 g/kg de semence + 4,4 ml d'H2O/kg de semence comme liant. Pour mettre en évidence l'invention, on traite la semence avec R. japonicum dans la tourbe à 3,42 g/kg de semence et 2 g d'un rapport de 4:1 p/p d'une tourbe contenant A. rhizogenes MT-232 (A. rhizogenes ATCC 39207) et A. radiobacter avec 4,4 ml d'eau/kg de semence comme liant. On effectue le revêtement des semences en mélangeant le contenu dans un sac de matière plastique. On observe une bonne adhérence de la tourbe. On transfère les semences revêtues dans une boite à insectes et on les transporte au champ.Une partie du revêtement tomhe des semences mais est déposée avec les semences à la plantation. On plante les semences dans du limon boueux (26,8X de sable, 50,8% de boue, 22,4% d'argile et 3,5% de matière organique). Le pH du sol est de 5,8; la CECC est de 11,5. On plante 10 semences par parcelle, à 25,4 mm de profondeur, à une densité de 97,55 kg/ha. La levée est de 36 à 72 h. Le tableau r montre les observations 42 jours plus tard, "parcelle témoin" désignant les semences traitées avec R. japonicum seul, et "parcelle exemple" désignant les semences traitées selon l'invention. TABLE AU I Nb de Nb de ra- Longueur périphérique Diamètre Nb de cosses nodules(1) cines maximale (2) des (3) (+ de 5 mm de long) de racines latérales Racines latérales (cm) tiges (mm) Parcelle témoin 1 2 120 37 302 63 Parcelle témoin 4 30 51 38 233 72 Parcelle témoin 5 12 17 32 283 70 Parcelle témoin 8 5 7 25 264 70 Total/40 plantes 49 195 132 1082 275 Moyenne par plante 1,23 4.88 3,3 27,1 6,88 Parcelle exemple 2 24 104 56 273 82 Parcelle exempel 3 25 10 51 270 97 Parcelle exemple 6 39 10 51 302 75 Parcelle exemple 7 17 5 47 322 90 Total/40 plantes 105 129 205 1167 344 Moyenne par plante 2,63 3,23 5,13 29,18 8,6 (1) Se réfère aux nodulels fixateurs d'azote de Rhizobium (2) Longueur hors tout de la plus longue paire de racines latérales étendues. (3) Diamètre de la tige à la région de la cîme au point où la couieur de la tige passe du vert au bianc. B. Graine de coton On cultive- A. rhizogenes TR-105(1) dans un milieu de culture à la concentration de croissance maximale et on concentre dans une centrifugeuse. On jette le milieu nutritif et on le remplace par de l'eau pour fournir un milieu contenant A. rhizogenes à une concentration d'environ 108 cellules par millilitre. On traite des graines de coton désouatées avc du ciorox #, de l'éthanol et de liteau stérile pour enlever les bactéries et les champignons. On met 7 graines en contact avec la solution d'A. rhizogenes pendant 10 minutes, puis on les plante dans du terreau stérile. On plante également 7 autres graines, après rin çage à l'eau stérile, dans le terreau stérile comme témoin. L'arrosage est identique dans tous les cas. Le tableau Il montre le poids des racines fraîches à 3 mois de croissance. Les graines traitées donnent, en moyenne, deux fois la masse de racines que donnent les graines non traitées. {1) Disponible auprès du Dr. Nester, Département de Microbiologie et d'Immunologie, Université de Washington, Seattle, Washington 98165. TABLE AU II Poids des racines Traitées avec Non Traitées avec Semences &num; A. rhizogenes A. rhizogenes 1 1,6 g 0,85g 2 1,3 g 0,75g 3 0,95g 0,9 g 4 1,25g 0,7 g 5 1,35g 0,5 g 6 0,7 g 0,1 g 7 2,2 g 0,55g Total 9,35g 4,35g Moyenne 1,34g 0,62g REVENDICATIONS 1. Procédé pour transformer génétiquement les semences de plantes dicotylédones pour accroître la croissance des racines à la germination, procédé dans lequel on expose les semences, avant la plantation, à l'action transformante d'A. rhizogenes insensible à l'agrocine inducteur de racines pendant une durée suffisante pour transformer les semences pour accroitre la croissance des racines, en combinaison avec l'application d'A. radiobacter en une quantité suffisante pour contenir tout A. rhizogeaes résiduel vers la région des semences transformées. 2. Procédé selon la revendication l où 1'A. rhizogenes comprend A. rhizogenes TR 105. 3. Procédé selon la revendication 1 où 1'A. rhizogenes comprend A. rhizogenes ATCC 39207. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où l'A. radiobacter comprend A. radiobacter K-84. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où L'on fait adhérer 1'A. rhizogenes aux semences. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où l'A. rhizogenes est contenu dans la tourbe. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où l'on fait adhérer A. rhizogenes et A. radiobacter aux semences dans la tourbe. 8. Procédé selon l'une-quelconque d revendications précédentes où A. rhizogenes inducteur de racines est présent à une concentration équivalant à une suspension aqueuse d'au moins 108 cellules/ml pour transformer génétiquement de telles semences pour accroitre la croissance des racines. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où A. radiobacter est fourni à une concentration équivalant à un rapport cellulaire d'A. rhizogenes à A. radiobacter d'au moins environ 4 à 1. 10. Procédé pour transformer génétiquement les semences, dans lequel on expose des semences dicotylédones à un mélange d'A. rhizogenes inducteur de racines et d'A. radiobacter contenu dans un milieu à partir duquel 1'A. rhizogenes peut transformer les semences après exposition, 1'A. rhizogenes étant présent dans le milieu en une quantité équivalant à une concentration de suspension d'au moins 108 cellules/ml d'eau et où le rapport cellulaire d'A. rhizogenes à A. radiobacter est d'au moins 4 à-i. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où 1'A. rhizogenes et 1'A. radiobacter-sont présents dans un rapport cellulaire d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1. 22. Procédé pour transformer génétiquement les semences, dans lequel on expose les semences à l'action transformante d'A. rhizogenes choisi entre A. rhizogenes TR-105, A. rhizogenes ATCC 39207, et leurs mélanges, dans un milieu à partir duquel 1'A. rhizogenes peut transformer les semences. 13. Procédé selon la revendication 12 où le milieu est la tourbe. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où les semences sont du soja ou du coton. 15. Semences transformées lorsqu'elles sont produites par le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes. 16. Plantes cultivées à partir de semences transformées de la revendication 15.