Brevet FR2572653A1 — publié le 19860509

L'invention concerne un procédé pour augmenter la fécondité chez les truies, en particulier chez les truies immatures, telles que des cochettes. En raison de leur importance économique considé- rable, les études de la biologie de reproduction des ani- maux domestiques ont été dirigées depuis longtemps vers des procédés permettant de modifier la fécondité des animaux de ferme. On a montré que le taux d'ovulation des brebis pouvait être augmenté par immunisation des brebis contre des androgénes stéroYdiens ou des oestrogènes stéroidiens, par exemple en utilisant des conjugats d'andragènes stéroYdiens ou d'oestrogénes stéroidiens avec des protéines immunogènes. Chez les truies matures, le facteur limitant la fécondité (c'est-à-dire l'importance de la portée) est sou- vent la capacité utérine plutôt que le taux d'ovulation, comme c'est le cas avec les brebis. Chez les truies immatu- res telles que des cochettes, c'est-à-dire de jeunes porcs femelles, ayant un taux d'ovulation plus faible que celui des truies matures, ceci n'est pas toujours le cas. C'est ainsi que, par exemple, chez la cochette, le taux d'ovula- tion augmente avec l'âge sexuel (nombre de cycles oestraux) jusque vers la quatrième chaleur post-pubertaire; une truie à son premier rut après la mise bas peut avoir un taux d'ovulation réduit, dû à son état nutritionnel déclinant lors de la première lactation, un effet que ne montre pas la truie mature plus grosse. On a trouvé que dans le cas de truies immatures, la fécondité peut être augmentée en accroissant le taux d'ovulation, et en fait, une augmenta- tion du taux d'ovulation de truies matures peut également s'avérer avantageux. La Demanderesse a trouvé qu'il est possible d'uti- liser plus totalement la capacité utérine en augmentant le taux d'ovulation chez les truies, en particulier chez les truies immatures, et par suite leur fécondité, par immunisa- tion des truies contre un ou plusieurs androgènes stéroT- diens ou oestrogènes stéroTdiens, par exemple en utilisant des conjugats de ces stéroTdes avec des supports immunogé- nes. Selon un de ses aspects, l'invention fournit donc un procédé pour augmenter le taux d'ovulation chez une truie, qui consiste à immuniser la truie contre un ou plu- sieurs androgènes stéroidiens ou oestrogènes stéroTdiens. On notera que le taux d'ovulation inférieur des truies immatures est un phénomène naturel et que l'immuni- sation selon l'invention a pour effet d'augmenter le taux d'ovulation naturel de ces animaux à un degré plus élevé. Le terme "androgène stéroTdien" utilisé ici dési- gne toute substance stéroidienne qui stimule l'expression des caractéristiques sexuelles secondaires du mâle. L'ac- tivité androgéne peut être déterminée en mesurant la régé- nération de la crête involutée d'un coq castré, après une administration d'androgène ou en mesurant la réponse à la croissance des vésicules séminaux chez des rats mâlés cas- trés, après une administration d'androgène. Le terme "oes- trogène stéroîdien" utilisé ici désigne toute substance stéroidienne qui stimule l'expression des caractéristiques sexuelles secondaires chez la femelle. L'activité oestrogè- ne peut être déterminée en mesurant le développement utérin ou la cornification de l'épithélium vaginal après une admi- nistration d'oestrogène à des rats ou des souris femelles châtrés. On peut préparer un conjugat immunogène entre un support immunogène et un dérivé d'androgène stéroîdien ou un dérivé d'oestrogène stéroidien utilisable dans le procé- dé de l'invention, selon un mode opératoire connu dans la technique (voir, par exemple, le brevet GB 2071107 (CSIRO). Comme dérivés d'oestrogènes stéroYdiens appropriés, on ci- tera, par exemple, les dérivés d'androst-4-ène-3,17-dione (androstène-dione) ou detestostérone. Comme dérivés d'oes- trogènes stéroïdiens appropriés, on citera par exemple, les dérivés d'oestrone. Les immunogènes préférés sont donc préparés par conjugaison d'un support immunogène, par exemple une protéi- ne immunogène, avec des dérivés d'androst-4-ène-3,17-dione fonctionnalisée avec un groupe acide en position 1, 7, 11 ou 15 du noyau stéro de, par exemple. Pour la préparation d'immunogènes contre la tes- tostérone, on peut utiliser des dérivés de testostérone fonctionnalisés avec un groupe acide en position 3 ou 17. Le dérivé d'androgène stéroidien peut donc être la testostérone-3-carboxyméthyloxime ou de préférence le ll:-hydroxy-androst-4-ène-3,17-dipneTillahémisuccinate ou la 7a-(2-carboxyéthylthio)androst-4-ène-3,17-dione. Les dé- rives d'oestrone préférés sont ceux qui, après conjugaison avec une protéine et administration à un animal, produisent un anticorps spécifique de l'oestrone. Des exemples non-li- mitatifs de tels dérivés d'oestrone déjà connus dans la technique comprennent l'oestrone-3-hémisuccinate, l'oestro- ne-3-carboxyméthyléther, l'oestrone-6-carboxy-méthyloxime et la 15-carboxy-méthyloestrone. Le dérivê d'oestrogène sté- roidien préféré est l'oestrone-3-carboxyméthyléther. Le support immunogène est généralement une pro- téine ayant une masse moléculaire supérieure, qui est anti- génique vis-à-vis de l'animal. Certaines protéines antigé- niques naturelles présentent un intérêt particulier, par exemple des albumines sériques homologues et hétérologues et des thyroglobulines. De manière générale, on préfère l'al- bumine sérique humaine. En général, les compositions immunogènes peuvent contenir en outre un adjuvant, en particulier, le diéthyl- aminoéthyl dextrane, mais on peut utiliser tout adjuvant approprié, connu dans la technique. Un des aspects de l'invention concerne un procédé pour augmenter le taux d'ovulation --chez les truies, en par- ticulier chez les truies immatures, lequel procédé consiste à administrer aux truies une composition immunogène compre- nant au moins un conjugat immunogène entre un support immu- nogène et un dérivé d'androgène stéroYdien ou un dérivé d'oestrogne stéroidien. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour augmenter le taux d'ovulation d'un troupeau de truies, qui consiste à immuniser des truies dans le troupeau, en particulier des truies immatures, contre un ou plusieurs androgènes stéroidiens ou oestrogènes stéroY- diens. Selon encore un autre aspect de l'invention, cet- te dernière fournit un procédé pour augmenter la fécondité des truies, en particulier des truies immatures, qui con- 1O 0 siste à immuniser les truies contre un ou plusieurs andro- gènes stéroYdiens ou estrogènes stéroYdieis, avant le début de la période d'accouplement grâce à qUoi des anticorps fi- xant le stéroïde sont présents dans les animaux pendant la période d'accouplement à un titre suffisamment élevé pour produire une augmentation significative du taux d'ovulation, mais suffisamment faible pour garantir que pratiquement la totalité des animaux entrent en rut avant la fin de cette période. C'est ainsi, par exemple, qu'on augmente l'immu- nité de manière désirable, en particulier chez les truies immatures telles que des cochettes, par immunisation contre un ou plusieurs androgènes stéroYdiens ou oestrogènes sté- roTdiens, de manière à produire un titre moyen d'anticorps fixant un stéroide, de 1 dans 10 à 1 dans 5 000, de préfé- rence de 1 dans 30 à 1 dans 5 000, au début de la période d'accouplement et à maintenir le titre de manière qu'il soit compris entre 1 dans 10 et 1 dans 10 000, de préférence entre 1 dans 30 et 1 dans 10 000, à la fin de la période d'accouplement. Dans le cas d'une immunisation avec un conjugat entre un support immunogéne et de l'androsténedione par exemple, les titres en anticorps stéroidiens peuvent être mesurés en utilisant un mode de dosage radioimmunologique sur charbon de bois enduit de dextrane. On prépare des dilu- tions en série de plasma dans un tampon et on incube un échantillon de 300 pl pendant une nuit avec 100 pl de (1,2, 6,7-3H) androstènedione (15 000 désintégrations par minute: à 25 picogrammes) à 4 C. Apres incubation, on sépare les fractions fixées et libres en utilisant une suspension de charbon de bois enduit de dextrane (500 pl) et on mesure la radioactivité dans la fraction fixée demeurant dans le produit surnageant, par comptage dans un compteur à scintil- lation liquide. Le titre en anticorps d'androsténedione dans l'échantillon est exprimé par la dilution de plasma qui fixe 40 % de la radioactivité totale ajoutée. Les animaux à immuniser sont, de manière désirable, dans une condition d'âgede modérée à bonne au moment de l'ac- couplement. De manière générale, la dose initiale de conjugat d'hormone pour l'immunisation est comprise entre 0,3 et 5 mg par animal. C'est ainsi que,par exemple, des cochettes pe- sant 100 kgs peuvent recevoir initialement entre 1,2 et 3,6 mg du conjugat, de préférence 2,4 mg du conjugat, il peut être souhaitable d'administrer une ou plusieurs doses de renforcement à intervalles appropriés, par exemple entre 14 et 35 jours, de préférence 21 jours, pour obtenir les titres en anticorps fixant le stéroîde indiqués ci-dessus. La dose efficace globale du conjugat d'hormone peut donc, par exemple, être comprise entre 0,6 et 8,r0mg. L'administra- tion de la composition a lieu, de manière tout à fait clas- sique, par voie parentérale, par exemple intradermique, souscutanée ou intramusculaire. De manière générale, le volume de la composition administrée chaque fois est compris entre 1 et 6 ml, il est de préférence de 4 ml. La concentration en conjugat d'hor- mone dans la composition est généralement comprise entre 0,2 et 5 mg/ml. Toutes les méthodes d'immunisation de la techni- que antérieure peuvent être utilisées pour obtenir les ti- tres en anticorps antistéroTdiens désirés. l'exemple non- limitatif suivant iillustre l'invention. (a) Préparation d'une composition immunogéne de stéroïde- protéine On refroidit une solution de 79 mg de 7a-(2-car- boxyéthylthio)-androst-4-ène-3,17-dione dans 5 ml de dio- xane à 10 C, on agite et on traite avec 38 mg de tri-n- butyl:àmine, puis avec une solution de 28 mg de chlorofor- miate d'isobutyle dans 2,5 ml de dioxane. On garde cette solution à 10 C environ pendant 40 minutes en secouant de temps;à autre. On ajoute alors en 2 à 3 minutes à une so- lution agitée de 275 mg d'albumine de sérum humain (HSA) dans 210 ml d'un tampon de phosphate 0,1 M, ayant un pH de 7,8. 24 heures plus tard, on dialyse la solution légé- rement trouble contre 300 ml d'eau distillée (changée 11 fois) pendant 192 heures à 5 C. On lyophilise la substance retenue pour obtenir le conjugat de stéroYde-proteine sous forme d'une mousse blanche (194 mg). Son absorption ultra- violette à 246 nm correspond à une incorporation de stéroT- de de 26 moles par mole. (b) Préparation d'une composition immunogène de stéroTde- protéine et d'adjuvant. On prépare une pâte avec 12 mg du conjugat de stéroYde-protéine dans 0,2 ml d'une solution saline stérile à 0,9 %. On dilue lentement la pâte avec une autre quantité de solution saline stérile à 0,9 %, en agitant doucement, jusqu'à un volume total de 10 ml. En même temps, on prépare une solution de réserve de DEAE dextrane en dissolvant 15 g dans 100 ml d'eau distillée, en ajustant le pH à 7,5 - 7,7 par lente addition de tris(hydroxyméthyl)-méthylamine,. puis en diluant à 150 ml avec de l'eau distillée. On obtient la composition d'immunogène et d'adjuvant en ajoutant 10 ml de la solution de réserve de DEAE-dextrane à 10 ml de solution du conjugat dans une solution saline. (c) Etude d'immunisation et d'accouplement Pour le traitement, on choisit des cochettes agées de 150 à 170 jours et on injecte à 14 jours d'intervalle des doses de 2 ml de la composition immunogène de stéroTde-pro- têine et d'adjuvant (équivalant à 1,2 mg d'androstènedipne- albumine de sérum humain dans 2 ml de DEAE-dextrane comme adjuvant). On prélève des échantillons de sang à intervalles donnés pour déterminer s'il y a formation d'anticorps contre l'androstènedione par les cochons. Les résultats indiquent une formation d'anticorps satisfaisante chez 100 % des ani- maux traités et le.titre en anticorps produits est de 1 dans à 1 dans 5500. Des animaux témoins sont laissés sans traitement. L'âge moyen + (SEM) au moment du premier rut dé- tecté est de 243 + 7 jours pour les cochettes traitées par rapport à 233 + 5 jours pour les animaux témoins. Chaque cochette traitée reçoit donc de 5 à 7 in- jections avant l'accouplement naturel. Le moyenne arithmétique + (SEM) des titres en anti- corps contre l'androstènedione pendant le cours de la pé- riode d'accouplement est de 1 dans 626 + 194 du jour 230 au jour 239 à 1 dans 554 -+ 413 du jour 250 au jour:259. (d) Importance des portées Les données relatives à l'importance des portées indiquent que les cochettes immunisées produisent des por- tées plus importantes d'une manière significative (p (9,1 + 0,5, n = 8 portées). R E V E N D I C A T I 0 N S 1 - Procédé pour augmenter le taux d'ovulation chez une truie, caractérisé en ce qu'on immunise la truie contre un ou plusieurs androgènes stéro diens ou oestro- gènes stéroTdiens. 2 - Procédé pour augmenter le taux d'ovulation d'un troupeau de truies, caractérisé en ce qu'on immunise des truies dans le troupeau contre un ou plusieurs androgènes stéroYdiens ou oestrogènes stéroidiens. 3 - Procédé pour augmenter la fécondité de truies, caractérisé en ce qu'on immunise les truies contre un ou plusieurs androgènes stéroYdiens ou oestrogènes stéroYdiens avant le début de la période d'accouplement grâce à quoi des anticorps fixant le stéroîde sont présents dans les ani- maux pendant la période d'accouplement à un taux suffisamment élevé pour produire une augmentation significative du taux- d'ovulation, mais suffisamment faible pour garantir que la totalité des animaux entre en rut avant la fin de ladite pé- riode. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le titre moyen en anticorps-fixant le stéroYde est compris entre 1 dans 10 et 1 dans 5 000 au début de la période d'accouplement et entre 1 dans 10 ml et 1 dans 000 à la fin de la période d'accouplement. 5 - Procédé pour augmenter le taux d'ovulation chez des truies, caractérisé en ce qu'on administre aux truies une composition immunogéne comprenant au moins un conjugat immunogène entre un support immunogène et un déri- vé de stéroïde androgène ou un dérivé de stéroîde oestro- gène. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue l'immunisa- tion d'une truie ou de truies immature(s). 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce qu'on ef1ectue une immuni- sation contre l'androst-4-ène-3,17-dione et/ou la testosté- rone ou l'oestrone. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, caractérisé en ce qu'on effectue une immunisa- tion en administrant un conjugat immunogène entre un support immunogène et un dérivé d'androst-4-éne-3,17-dione fonction- nalisé avec un groupe acide en position 1, 7, Il ou 15 du noyau stéroïde. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le dérivé d'androst-4-ène-3,17-dione est le ll - hydroxy-androst-4-ène-3,17-dione ou la 7a-(2-carboxyéthyl- thio)-androst-4-ène-3,17-dione. - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, caractérisé en ce qu'on effectue une immunisa- tion en administrant un conjugat immunogène entre un support immunogène et un dérivé de testostérone fonctionnalisé avec un groupe acide en position 3 ou 17. I1l - Procédé selon la revendication 10, caracté- risé en ce que le dérivé de testostérone est la testostéro- ne-3-carboxyméthyl-oxime. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, caractérisé en ce qu'on effectue l'immunisation en administrant un conjugat immunogéne entre un support im- munogène et un dérivé d'oestrone fonctionnalisé en position 3. 13 - Procédé selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le dérivé d'oestrone est l'oestrone-3-carboxy- méthyléther. 14 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 13, caractérisé en ce que le support immunogéne est une albumine de sérum humain. 15 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise une com- position immunogène contenant un adjuvant. 16 - Procédé selon la revendication 15, caracté- risé en ce que l'adjuvant est le diéthylaminoéthyl dextrane. - 17 - Composition immunogéne utilisable dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou , caractérisée en ce qu'elle comprend un conjugat immuno- gène entre un support immunogène et un dérivé d'androgène stéroTdien ou un dérivé d'oestrogène stéroTdien.. 18 - Utilisation d'un conjugat immunogène entre un support immunogène et un dérivé d'androgène stéroNdien ou un dérivé d'oestrogène stéroYdien, pour la préparation d'une composition immunogène utilisable dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 5.