Brevet FR2569276A1 — publié le 19860221

Procédé de dosage de produits de dégradation du fibrinogène L'invention concerne un nouveau procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation du fibrinogène et de la fibrine (en abrégé PDF) au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps anti-PDF. On sait que les fibrinolyses peuvent avoir des conséquences très graves. En effet les fibrinolyses, qu'elles soient primaires, cas extrêmement rares ou consécutives à une coagulation intra-vasculaire disséminée, cas assez fréquents en chirurgie, obstatrique, services de réanimation, cancérologie ou autres induisent des troubles pathologiques sévères. I1 se trouve que certains facteurs de la coagulation sont soit détruits par protéolyse (fibrinogène, facteurs V, VIII, et...), soit consommés (AT III, Protéine C, Plasminogène, Facteurs V, VIII, etc...). I1 en résulte un tableau coagulolytique totalement déséquilibré, induisant des troubles hémorragiques pouvant être très graves. Les produits de dégradation du fibrinogène ou de la fibrine (PDF) sont des marqueurs de cet état fibrinolytique. Ils sont produits par l'action de la plasmine formée sur le fibrinogène ou la fibrine. Cliniquement, il est donc important de pouvoir évaluer le taux des PDF. Toutefois, ce marqueur obéissant à la réponse du tout ou rien, une approche semi-quantitative est suffisante. On sait par ailleurs que pour doser les PDF on a utilisé dans le passé des méthodes de dosage sur le sérum, le sérum étant obtenu à partir du plasma par coagulation puis centrifugation pour recueillir le surnageant. Le plasma étant lui obtenu par centrifugation du sang et recueil du surnageant. Parmi les techniques antérieures on connait celles qui font appel à l'agglutination de staphylocoques dorés inactivés, l'agglutination d'un support sensibilisé par des anticorps polyclonaux spécifiques ou encore la méthode de Merskey qui est un test d'inhibition. Les techniques anciennes de dosage présentent un certain nombre d'inconvénients. En particulier elles ne permettent pas de distinguer le fibrinogène plasmatique des PDF et impliquent donc au,préalable un traitement du plasma pour oter spécifiquement le fibrinogène naiif ; cela peut s'effectuer par coagulation dans des conditions adéquates (en présence d'agents antifibrinolytiques). Les PDF sont ensuite recherchés sur le sérum obtenu. Ces opérations successives entrainent - un allongement de la durée du dosage, - la coagulation de certains PDF précoces (notamment le fragment X également désigné PDF-X), ce qui entraine l'éliminatiôn desdits PDF avec le caillot. - une proportion non négligeable des PDF formés est susceptible d'être adsorbée sur le caillot de fibrine, - le cas échéant, une mauvaise coagulation, laissant du fibrinogène résiduel, qui conduit à des erreurs de dosage. Selon l'invention on se propose de doser les PDF non pas sur le sérum mais de préférence sur le plasma en utilisant des anticorps monoclonaux anti-PDF, les techniques et matériel utilisés étant simples et non onéreux. I1 serait possible d'envisager d'utiliser des articorps monoclonaux spécifiques anti-PDF selon une technique de détermination radioimmunologique ou en utilisant un autre marqueur (marqueur fluorescent,enzymatique etc..) différent du marqueur radioactif. Toutefois l'utilisation du matériel radioimmunologique n' est pas adapté à la routine des hôpitaux et des laboratoires d'analyses, eu égard aux éléments suivants - la grande sensibilité d'un dosage radioimmunologique est inutile pour ce genre de test, - le matériel radioimmunologique est lourd et coûteux, - la durée du dosage radioimmunologique est trop importante. Le procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation du fibrinogène et de la fibrine (PDF), selon l'invention, au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps anti-PDF, est caractérisé en ce que l'on met en contact un anticorps monoclonal anti-PDF avec un milieu liquide aqueux susceptible de contenir au moins un PDF, ledit anticorps monoclonal anti PDF qui est purifié, ne réagit pas avec le fibrinogène et est fixé sur un support inerte, permettant de déceler la présence de PDF par agglutination macroscopique, l'absence d'agglutination dénotant l'absence de PDF. Le PDF qui intervient pour la fabrication de l'anticorps anti PDF peut être un PDF quelconque en particulier un des PDF décrits par BUDZYNSKI et al. Biochim. Biophys. Acta, 147, 313-323 (1967)" et MARDER et BUDZYNSKI "The Structure of the Fibrinogen Degradation Products" dans "Progress in Hemostasis and Thrombosis, Vol. II, pages 141-174 (1974)". Conviennent par exemple les fragments X, Y, D, E ainsi que leurs dimères en particulier le dimère du fragment D dénommé D-D. Comme les fragments de PDF comportent sensiblement un certain nombre d'épitopes communs (un épitope étant caractérisé par un groupe de 4 -à 6 amino-acides) jouant le râle de déterminants antigéniques, un anticorps monoclonal anti-PDF-D peut être utilisé pour reconnat- tre la présence d'un quelconque PDF par exemple un PDF-X ou Y ou D, etc. La préparation de l'anticorps monoclonal anti-PDF qui intervient dans le mécanisme antigene-anticorps selon le procédé de dosage de l'invention comprend 10) la dégradation de fibrinogène par de la plasmine pendant 24 h à 37"C, 20) la purification d'au moins un PDF ainsi obtenu, 3 ) l'innoculation dudit PDF à une souris, 40) le prélèvement de la rate de l'animal immunisé, 50) l'extraction des lymphocytes de la rate et la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome, 60) la sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les PDF mais pas avec le fibrinogène, 70) le développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés, 80) la récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction, 90) la purification des anticorps, 100) la fixation des anticorps monoclonaux purifiés sur un support inerte Le support inerte qui intervient pour la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF, est choisi notamment parmi l'ensemble constitué par les billes de verre, les particules de latex. (notam- ment les latex de polystyrène, polyncrylate, polymétacrylate, etc.), les globules rouges, les argiles telles que la bentonite, le noir de carbone et l'agarose. Bien entendu on peut faire appel à un support inerte quelconque différent de ceux visés ci-dessus De façon avantageuse on fera appel à un support inerte constitué par des particules de latex dè polystyrène ayant un diamètre moyen inférieur ou égal à 5 fim et de préférence de l'ordre de 0,1 à 1 pm, notamment de 0,3 pu. La fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF sur le support inerte peut être réalisée par des moyens connus. De préférence l'on fera appel à l'une des techniques suivantes - fixation directe sur le support inerte, notamment les billes de polystyrène, - fixation par liaison convalente après activation chimique du support ou par activation de l'anticorps, - fixation par l'intermédiaire d'un bras espaceur, luimême activé, ou après activation de l'anticorps, - fixation sur couche intermédiaire (protéique, chimique ou autre...) enrobant la particule ou recouvrant le support, par simple adsorption, par activation chimique ou physique de la couche ou par activation de l'anticorps. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'objet de l'invention consiste à utiliser un anticorps monoclonal anti-PDF obtenu à partir d'un des PDF facilement isolable ctest-a-dire un PDF-D ou un PDF-E. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEMPLE I. Pré~ration des réactifs 4. PREPARATION DES PDF On procède à une dégradation prolongée du fibrinogène humain (1 g dans 50 ml de tampon citrate 50 mg/ml, NaCl 0,15 M à pH 7,00) par de la plasmine humaine / 50 CU (Unités Caséine pendant 24 heures à 370C. On procède ensuite à la purification des PDF-D et/ou PDF-E-- par électrophorèse préparative sur gel d'amidon ("PEVICON") selon MARDER et al. "The purification of fibrinogen degradation products by Pevicon Block Electrophoresis". Thromb .Diath.Haemorrh. ,22, 234-239 (1969) ; ou par chromatographie d'échange d'ions selon NILEHN, Thromb. Diath.Haemorrh., 18, 89-100, (1967). B. DEVELOPPEMENT DES ANTICORPS MONOCLONAUX Les PDF-D et PDF-E purifiés sont utilisés pour des immunisations de souris (BALP-C) selon des techniques usuelles, voir à cet effet "Methods in Immunology".WA.Benjamin Inc. Publishers, 159-182, (1970). Après immunisations on sacrifie ies-souris et on prélève stérilement les rates (2 souris par fusion). On extrait les lymphocites de la rate puis on procède à la fusion des lymphocytes avec des cel- lules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de10 lymphocytes par cellule de myélome, selon notamment des protocoles classiques d'hybridation lymphocytaire (voir HURRELL J.G.R. : "Mono- clonal Hybridoma Antibodies :;Techniques and Applications". CRCp're'ss Inc. Edit., 1981"). On procède ensuite à la sélection des hybridomes sécréteurs et autres screening des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant avec les PDF (D ou E) mais pas avec le fibrinogène (par techniques immunoenzymatiques). C. PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Les clones sélectionnés sont mis en culture, puis utilisés pour développer des tumeurs ascitiques chez la souris BALB-C. Les liquides d'ascite sont riches en anticorps monoclonaux et sont obtenus par ponction. Les anticorps sont ensuite purifiés par précipitation au sulfate d'ammonium à 50 % de saturation, dialyse contre le tampon Tris 0,025 MNaCl 0,035 M pH 8,80, puis chromatographie d'échange d'ions sur gel de DEAE-Trisacryl équilibré dans le même tempon. Ces anticorps purifiés sont ensuite utilisés pour fixation sur particules de latex ou toute autre particule solide par simple adsorption ou par liaison covalente. EXEMPLE 2. Fixation par simple adsorption sur latex On prend 5 ml de suspension de latex de polystyrène de 0,3 m de diamètre moyen et ajoute 12,5 mg d'immunoglobulines dans 1 ml de tampon glycine 0,1 M - NaCi 0,15'M à pH 8,35. On incube 4 heures à 370C, puis une nuite à température ambiante (15-250C). On cenBrifuge l hà 7000 tours/min., puis reprend le culot obtenu par 50 ml de tampon-Glycocolle 0,1 m, NaCl 0,15 M, Albumine Bovine 5 mg/ml à pH-8,-35. On remet en suspension et le réactif est ainsi prêt à ltemplói.- " EXEMPLE 3. Fixation par liaison covalente On prend 5 ml de latex hydroxylé (ayant des fonctions OH li- bres) et active par le métapériodate 0,1 M à'raison de 5 ml. On incube 30 minutes à température ambiante. (15-25 C) puis dialyse contre 3 fois 1000 volumes de tampon acétate O,OO1-M à pH 4,20. On prend le dialysat et y ajoute 10'ml de solution d'éthylene- diamine 1 M à pH 9,5. On incube une heure à températureambiante et dialyse contre 4 fois 200 volumes de tampon phosphate 0,20 M, NaCl 0,15 M à pH 7,6. On prend le dialysat résultant et y ajoute 10 ml de glutaraldéhyde à 25 %, puis incube une nuit à température ambiante. On dialyse ensuite contre 5 fois 200 volumes de tampon carbonate OsO5 M contenant 0,25 M de NaCl à pH 8,3. On prend le dialysat ainsi obtenu et y ajoute 12,5 mg d 'immu- noglobulines (dans 1 ml de tampon carbonate 0,05 M, NaCl 0,25 M à pH 8,3). On incube une nuit à température ambiante, puis centrifuge pendant 1 heure à 7000 tours/min. On reprend le culot dans 50 ml de tampon glycine 0,1 M, NaCl 0,15 M, Albumine Bovine à 5 mg/ml à pH 8,35. EXEMPLE 4. Fixation par liaison covalente On prend 5 ml de latex (ayant des fonctions COOH libres) et y couple un bras éthylène-diamine à l'aide du carbodiimide soluble. Pour celui on ajoute 5 mg de EDAC / 3-Ethyl-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide~7. On incube une heure en maintenant le pH à 5,5 puis ajoute 5 ml d'é'thylène-diamine 0,1 M à pH 5,59 On incube encore une haure à température ambiante, en maintenant le pH à 5,5 puis on laisse une nuit à température ambiante. On dialyse contre 3 fois 500 volumes de-tampon phosphate 0,20 M NaCl 0,15 M à pH 7,6. On prend le dialysat et y ajoute 10 mi de glutaraldéhyde a' 25 %, puis incube une nuit à température du laboratoire. On dialyse ensuite contre 5 fois 200 volumes de tampon carbonate 0,05 M contenant 0,25 M de NaCl à pH 8,3. On prend le dialysat et y ajoute 12,5 mg d'immunoglobulines (dans 1 mi de tampon carbonate 0,OS M, 0,25 M de Ni1 à pH 8,3). On incube une nuit à température ambiante, puis centrifuge pendant une heure à 7000 tours/min. - On reprend le culot dans 50 mi de tampon glycine 0,1 M, NaCl 0,15 M, albumine bovine à 5 mg/ml, pH 8,35. Le réactif est prêt à l'emploi. EXEMPLE 5. Pour réaliser le dosage selon le procédé de l'invention on procède comme suit. On prélève le sang (9 volumes) et on y ajoute un anticoagulant (1 volume), l'anticoágulant étant un mélange aqueux de citrate (0,108 M) et d'aprotinine en excès. On recueille le plasma par centrifugation puis on dose les PDF qu'il est suceptible de contenir par mise en contact du plasma (1 goutte) ou de ses dilutions avec le réactif (1 goutte) selon l'invention. La présence dtune agglutination macroscopique (visible à l'oeil nu) indique que des PDF sont présents, l'absence de PDF se traduisant par l'absence d'agglutination. Selon l'invention on préconise des ensembles ou kits de dosage comprenant les réactifs[c'est-à-dire essentiellement un anticorps anti-PDF-D (ou E) âdsorbé-sur un support inerte, notamment un latex ayant des particules d'un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 m ; et des diluants 7. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation du fibrinogène et de la fibrine (PDF) au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps anti PDF, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact un anticorps monoclonal anti-PDF avec un milieu liquide aqueux susceptible de contenir au moins un PDF, ledit anticorps monoclonal anti PDF qui est purifié, ne réagit pas avec le fibrinogène et est fixé sur un support inerte, permettant de déceler la présence de PDF par agglutination macroscopique, l'absence d'agglutination dénotant l'absence de PDF. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé enc e que-le moyen anti-PDF qui intervient dans le mécanisme réactionnel antigèneanticorps est préparé par 10) dégradation de fibrinogène par de la plasmine pendant 24 h à 37"C. 20) purification d'au moins un PDF ainsi obtenu, 30) innoculation de souris, 40) prélèvement de la rate de l'animal immunisé, 50) extraction des lymphocytes de la rate et fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome, 6 ) sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les PDF mais pas avec le fibrinogène. 70) développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés, 80) récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction, 90) purification des anticorps, 100) fixation des anticorps monoclonaux purifiés sur un supportinerte. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support inerte intervenant pour la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF est choisi parmi l'ensemble constitué par les billes de verre, les particules de latex, les globules rouges, les argiles, le noir de carbone et l'agarose. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support inerte est constitué par des particules de latex ayant un diamètre moyen inférieur ou égal à 5 pu. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4 caractérisé en ce que le support inerte est constitué par des particules de latex choisi parmi les latex de polystyrène, polyacrylate, polymétacrylate. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support inerte est constitué par des particules de latex de polystyrène ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 pm. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu liquide aqueux susceptible de contenir au moins un PDF est le plasma. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en contact le plasma décanté obtenu par prélèvement de sang sur anticoagulant puis centrifugation. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le plasma décanté a été obtenu par prélèvement de 9 volumes de sang additionnés de 1 volume d'anticoagulant constitué par du citrate (0,108 M) et d'aprotinine en excès, puis centrifugation. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF sur le support inerte est obtenue par un moyen choisi parmi l'ensemble constitué par, la simple adsorption, les liaisons covalentes, un bras espaceur et une couche intermédiaire.