Brevet FR2565994A1 — publié le 19851220

La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de l'antigène TR (thermorésistant) pour le diagnostic sérologique macroscopique des leptospiroses. Les nombreuses leptospires actuellement dénombrées ne peuvent être différenciées uniquement sur la base de leurs critères morphologiques et culturaux ou de leur pouvoir pathogène. Seuls, les critères immunologiques permettent de distinguer les divers sérovars. Toutefois, cette étroite spécificité sérologique complique le diagnostic de dépistage des leptospiroses et de nombreux Chercheurs, et notamment les Inventeurs de la présente invention, ont tendu vers l'obtention d'antigènes du groupe, stables, sensibles et d'utilisation pratique. Ainsi, J. MAZZONELLI, G. DORTA de MAZZONELLI et M. MAILLOUX ont réussi à sélectionner un antigène TR à partir de la souche L. biflexa Semaranga, Patoc. Cet antigène absorbe l'immunsérum correspondant à des taux supérieurs à 99 % (cf. notamment Ann. Microbiol., 1974, 125 A, 125-126 et Tropenmed. Parasit., 26, 1975, 35-42). Cet antigène TR existe également chez divers sérotypes pathogènes de leptospires. Il résiste à une température de 80"C pendant 10 minutes. Il constitue une fraction commune à toutes les leptospires et réagit avec les différents immunsérums quelle que soit la souche d'origine. Il absorbe les anticorps des immunsérums homologues, et, en réaction crol- sée, les anticorps des autres sérums anti-leptospires pathogènes étudiés. Les Inventeurs ont ainsi démontré que les antigènes TR des sérovars icterohaemorrhagiae Wijnberg, australis Ballico, pyrogenes Salinem ne peuvent absorber les agglutinines des sérums anti-Patoc I, au contraire de TR/Hebdomadis et TR/Pomona qui peuvent en absorber jusqu'à 20 %. Par contre, TR/Hond Utrecht IV et TR/Patoc I (en absorbant en réaction croisée leurs immunsérums) se comportent comme des souches homologues, avec un taux d'absorption de 99 %. La puissance d'absorption des TR variait selon la composition des milieux de culture. En poursuivant leurs investigations, les Inventeurs ont mis au point un nouveau procédé de préparation de l'antigène TR permettant un dépistage des leptospiroses bien plus précoce et ayant un comportement vis-à-vis des sérums de différentes espèces (humains et animaux) bien plus général. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de l'antigène TR (thermorésistant) de leptospire, caractérisé en ce qu'il est basé sur l'utilisation d'une nouvelle souche C 41 appartenant à l'espèce L. biflexa ayant une bonne croissance dans tous milieux de culture, la température de croissance se situant entre 28 et 35"C et de préférence entre 28 et 300C et la durée de croissance entre 5 et 8 jours. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé objet de la présente invention, le milieu de culture est le milieu sans protéines du type proposé par BEY et JOHNSON, mais modifié. BEY et JOHNSON (Infection and Immunity, Fevr. 1978, p 562-569) ont proposé un nouveau milieu sans protéines pour la culture des leptospires. Ce milieu se caractérise principalement par sa teneur en "Tweens" détoxifiés (nom générique d'agents mouillants obtenus par condensation d'esters d'acides gras et de sorbitol avec l'oxyde d'éthylène). Ce milieu BEY-JOHNSON comprend, outre les vitamines B 12 et B 1, les sels inorganiques et le tampon TES zi'aci- de N-Tris (hydroxyméthyl )-méthyl-2-amino-éthane sulfonique (HOCH2) 3 CNHCH2 CH2 SO3H) à pH 7,6, trois "Tweens" 40-6080. La détoxification a lieu à l'aide du charbon actif (qualité "NORIT") : 40 g de charbon pour 20 g de "Tween" dans 200 ml-d'eau distillée. Le traitement a lieu pendant-18 heures à température ambiante. Après la décantation (18 heures à 4"C), la séparation du charbon actif s'effectue par 1) la centrifugation (10 000 G, une heure), et 2) l'ultrafiltration (membrane XM 100 Amicon). Les modifications proposées portent surtout sur la méthode de séparation du charbon actif et la concentration finale des composants. Conformément à la présente invention, le milieu de culture BEY-JOHNSON modifié se caractérise en ce que a) il ne comprend qu'un seul "Tween" : Tween 60, b) quantité de charbon utilisé : 40 à 50 g pour 20 g de Tween dans 180 ml d'eau distillée, c) la séparation du charbon s'effectue par filtration sur double papier filtre suivie de filtration sur plaques (plaque SELTZ" Supra EKS), d) le tampon TES utilisé est ajusté à pH 7,30 - 7,5, e) la stérilisation du milieu s'effectue par autoclavage (15 minutes à 119"C) sauf la vitamine B 12 stérilisée par fil tration. Selon une autre variante particulièrement intéresante, la détoxification du "Tween 60" a lieu à l'aide de polyvinylpyrrolidone de poids moléculaire environ 25 000 (méthode de Schonberg) : 10 g de polyvinylpyrrolidone pour 20 g de Tween dans 180 ml d'eau distillée. Conformément à l'invention, la souche C 41 est cultivée sous agitation par passages successifs en milieu sans protéines modifié, l'ensemencement s'effectuant sous un volume de 3 à 5 % du volume du milieu, le lavage et la concentration s'effectuant à travers une membrane (du type PTHK de "Millipore") à flux tangentiel. Le système de lavage est celui à volume constant et la relation volume de milieu/volume de lavage est de 1:1. Ainsi, par exemple, pour 5 litres de culture, on utilise pour le lavage 5 litres de solution physiologique 0,15 M tamponnée par TES à pH final 7,35 et formolée à 2 à 3 EO. Cette méthode de préparation permet un rendement d'environ 100 à 120 ml d'antigène par litre du.milieu de cul ture. Conformément à la présente invention, l'antigène est chauffé à 100in pendant environ 10 minutes, puis stabilisé par le maintien pendant 8 jours à une température comprise entre + 4 et + 6 C. Après cette phase de stabilisation, l'antigène standardisé à une concentration équivalant à 26 % de transmittance (néphélomètre Coleman) avec filtre 430 nm. Pour ajuster le O, la solution physiologique tamponnée par le TES est formolée. La dilution finale est effectuée à l'aide de la même solution physiologique. Pour tester la sensibilité de l'antigène, on effectue le contrôle à l'aide d'un sérum humain sérologiquement positif par microagglutination, provenant d'un patient malade de moins de 20 jours d'évolution. Un sérum provenant d'un malade ayant une leptospirose depuis 4 mois et positif en réaction d'agglutinationlyse (R.A.L.) doit agir négativement. Quand l'antigène est utilisé en diagnostic vétérinaire (par exemple chiens ou porcs), les tests doivent être effectués, pour contrôle, sur des sérums des espèces étudiées. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui va suivre qui se réfère à un exemple de préparation de l'antigène TR, à un exemple de dépistage des leptospires et à un exemple de conservation d'antigène TR, et notamment dans les pays tropicaux. Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 5 - PREPARATION DE L'ANTIGENE Préparation-type : 1. Dans un flacon de 5 1., avec barreau aimanté incorporé, préparer 3 1. de milieu de culture sans protéines. 2. Stériliser le milieu à l'autoclave, 15 minutes à 119"C. 3. Laisser refroidir. 4. Ajouter 2 ml de vitamine B12, à partir d'une solution stock, préparée au 0,02 % en eau distillée. La stérilisa tion de cette solution stock se fait par filtration à tra vers membranes de 0,22 pm (généralement par filtre Stéri vex GS ou Millex HA de Millipore). 5. Contrôle de stérilité du milieu de culture à 37"C pendant 48 heures. 6. L'ensemencement se fait à partir d'une culture de 7 jours de la souche C 41, conservée dans le même milieu sans pro téines. Le volume ensemencé est de 100 ml. 7. Incubation de la culture à 28-30"C, en agitation pendant une semaine. Vitesse d'agitation : 300-500 tours p.m. 8. Contrôle microscopique de la culture. 9. Si la croissance des leptospires est convenable, formoler la culture au 0,2-0,3 %. 10. Incubation à 37"C pendant 2 heures. 11. Lavage et concentration de l'antigène. Matériels employés a. Eau physiologique au 9 $o, tamponnée, formolée. Fractionner par quantités de 3 litres par flacon. b. Filtre à air Millipore, réf. SLFG 050.25, de 50 mm de dia mètre. c. Pompe péristaltique Millipore à vitesse variable (réf. XX80.002.30) avec une tête de 1.680 ml/min. (réf. XX80. 000.05). d. Tuyauterie en "Téflon", de 9,5 mm de diamètre. e. Cellule d'ultrafiltration, système à cassette Pellicon Millipore (réf. XX42 ASY 60), avec une cassette (réf. PTHK 000.05). f. Tampons en caoutchouc. q. Robinets. Technique L'appareillage utilisé pour la production de l'an- tigène TR est représenté à titre d'exemple non limitatif à la figure unique annexée, dans laquelle - les références 1 et 10 désignent des filtres d'air. - les références 2 et 3 désignent des robinets. - la référence 4 désigne une pompe péristaltique. - la référence 5 désigne un système Pellicon Millipore. - la référence 6 désigne un récipient contenant la culture formolée de la souche C-41. - la référence 7 désigne un récipient contenant l'eau physio logique de lavage. - la référence 8 désigne une cassette Pellicon PTHK, et - la référence 9 désigne un récipient contenant le filtrat. I. Lavage - Robinet 3 : ouvert. - Robinet 2 : fermé. Le lavage est terminé une fois que toute l'eau physiologique de lavage a passé. II. Concentration - Robinet 3 : fermé. - Robinet 2 : ouvert. arrêter la concentration quand le volume de liquide concen tré est d'environ 12-15 % du volume original. Chauffer l'antigène à 100CC, 10 minutes au bain-marie. Transvaser l'antigène dans un flacon plus petit et le sto cker à 4-6"C, une semaine, pour le stabiliser. Prendre un échantillon afin d'établir la dilution à effec tuer avec l'eau physiologique tamponnée, formolée, et glycé rinée s'il y a lieu. . Contrôles de sensibilité avec des sérums positifs et néga tifs. Distribution finale de l'antigène. Observations accessoires - En ce qui concerne une possible contamination de l'antigène, aucune précaution d'emploi n'est nécessaire. - Si l'antigène est destiné aux pays de climat tempéré, l'eau physiologique sera tamponnée avec des phosphates et formo lée au 0,2-0,3 %, pH 7,3. - Si l'antigène est destiné aux pays tropicaux, l'eau physio logique sera formolée à la même concentration et tamponnée avec tampon TES à pH 7,4-7,5 (1,2 g/litre) et glycérinée au 12-15 % du volume final de l'antigène. EXEMPLE 2 - DEPISTAGE DES LEPTOSPIRES La réaction de dépistage est macroscopique et elle s'effectue sur lame ou sur fiche bristol, de la manière suivante : On dépose sur une lame propre une goutte de. sérum à examiner recueillie stérilement. On ajoute ensuite une goutte de l'antigène TR bien homogénéisé avant emploi. On mélange le tout à l'aide d'une baguette de bois (par exemple une allumette) par des mouvements rotatifs. La lecture est faite à l'oeil nu ou, éventuellement, à l'aide d'une loupe à faible grossissement. La réaction doit être lue avant 5 minutes. Une réaction positive se traduit par des amas plus ou moins gros et denses et un liséré périphérique plus ou moins épais. Un témoin antigène (une goutte d'eau physiologique plus une goutte d'antigène) est nécessaire. Ce témoin est négatif et doit toujours être comparé aux réactions. EXEMPLE 3 - CONSERVATION DE L'ANTIGENE TR EN PAYS TROPICAUX L'addition du glycérol, à 12-15 % du volume total du TR, facilite la conservation et empêche une évaporation rapide de l'antigène. Des essais expérimentaux, effectués en pays tropicaux, ont montré que l'antigène TR glycériné, conservé à température ambiante, avait conservé toute son activité antigénique au moins trois mois de plus que le TR non glycériné. L'addition de glycérol acidifie l'antigène TR. Pour y obvier, il suffit de préparer une eau physiologique à 9 tO de NaCl, formolée à 0,2-0,3 % et tamponnée avec TES. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1") Nouveau procédé de préparation de l'antigène TR (thermorésistant) de leptospire, caractérisé en ce qu'il est basé sur l'utilisation d'une nouvelle souche C 41 appartenant à l'espèce L. biflexa ayant une bonne croissance dans tous milieux de culture, la température de croissance se situant entre 28 et 350C et de préférence entre 28 et 30"C et la durée de croissance entre 5 et 8 jours. 2') Procédé selon la revendication 1, comportant le milieu de culture sans protéines du type BEY et JOHNSON, caractérisé en ce qu'il est modifié de la manière suivante a) il ne comprend qu'un seul "Tween" (nom générique d'agents mouillants obtenus par condensation d'esters d'acides gras et de sorbitol avec l'oxyde d'éthylène) : Tween 60, b) quantité de charbon utilisé : 40 à 50 g pour 20 g de Tween dans 180 ml d'eau distillée, c) la séparation du charbon s'effectue par filtration sur double papier filtre suivie de filtration sur plaques (plaque "SElTZ" Supra EKS), d) le tampon TES utilisé est à pH 7,30 - 7,5, e) la stérilisation du milieu s'effectue par autoclavage (15 minutes à 119"C) sauf la vitamine B 12 stérilisée par fil tration. 3 ) Procédé comportant le milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que la détoxification du "Tween 60" a lieu à l'aide de polyvinylpyrrolidone de poids moléculaire environ 25 000 (méthode de Schonberg) : 10 g de polyvinylpyrrolidone pour 20 g de Tween dans 180 ml d'eau distillée. 4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la souche C 41 est cultivée sous agitation par passages successifs en milieu sans protéines modifié, l'ensemencement s'effectuant sous un volume de 3 à 5 % du volume du milieu, le lavage et la concentration s'effectuant à travers une membrane (du type PTHK de "Millipore") à flux tangentiel. 5 ) Antigène TR obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6") Antigène selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est chauffé à 100"C pendant environ 10 minutes, puis stabilisé par le maintien pendant 8 jours à une température comprise entre + 4 et + 6"C. 7 ) Procédé de conservation de l'antigène TR, caractérisé en ce que l'on ajoute 12 à 15 % du volume total de glycérol à une solution de l'antigène TR dans l'eau physiologique à 9 %o de NaCl, formolée à 0,2-0,3 % et tamponnée avec TES. 8 ) Utilisation de l'antigène TR pour le dépistage des leptospires. 9 ) Nouvelle souche appartenant à l'espèce L. biflexa, caractérisée en ce qu'elle est dénommée souche C 41 et a été déposée le 29 Mai 1984 sous le n" I-309 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.