Brevet FR2569702A1 — publié le 19860307

La présente invention concerne essentiellement une nouvelle 4'- deschlororébéccamycine, une composition pharmaceutique la contenant et un procédé pour sa préparation. Le nouveau composé de la présente invention est proche en structure de l'agent anti-tumeur, rébéccamycine, révélé et revendiqué dans la demande américaine pendante N 461 817 déposée le 28 Janvier 1983, dont la description complète est incorporée ici par référence. La rébéccamycine a la formule suivante: H 0 N '0O 1 J 2 c 2' 3' Ni t5' Xa 3 O OH H ? 6" OH gH OCH3 et est obtenue en cultivant le Nocardia aerocolonigenes. Quelque peu proche en structure au composé de la présente invention est l'agent anti-tumeur, la stauros- porine (également dénommée AM-2282), obtenue par fermentation de Streptomyces staurosporeus. La staurosporine est décrite dans J.C.S. Chem. Comm., 1978, P. 800-801 et dans J. Antibiotics 30(4): 275-282 (1977). Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 19(6): 459-460 (1980) révèle plusieurs pigments indoles obtenus à partir des corps fruiteux de la moisissure de vase Arcyria denudata qui sont proches en structure de la staurosporine. Certains des pigments présentent une activité contre Bacillus brevis et B. subtilis. L'invention concerne un nouvel antibiotique anti- tumeur désigné ici en tant que 4'-deschlororébéccamycine ayant la formule structurelle suivante: a H 1" H OH HO " 3"' H 4"( OH OMe ainsi que le procédé de préparation de celle-ci, son isolation et la purification de la 4'-deschloro- rébéccamycine sous une forme sensiblement pure. L'antibiotique de la présente invention est obtenu par fermentation d'une souche productrice de 4'-deschlororébéccamycine de Nocardia aerocolonigenes, de préférence de la souche de Nocardia aerocolonigenes C38 383-RK2 (ATCC 39243) ou une souche mutante de celle-ci, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité sensible de 4'-deschlororébéccamycine soit produite par ledit microorganisme dans ledit milieu de culture et, éventuelle- ment, la récupération de la 4'-deschlororébéccamycine à partir du milieu de culture sensiblement dépourvu de substances coproduites. Le composé 4'-deschlororébéccamycine présente une activité antimicrobienne et -également une activité contre des systèmes de tumeur animale expérimentaux, par exemple la leucémie P-388 chez la souris. La 4'-deschlororébéccamycine de la présente invention est produite par fermentation d'une souche productrice de 4'-deschlororébéccamycine de Nocardia aerocolonigenes. Comme spécialement préférée la souche productrice de 4'-deschlororébéccamycine est celle révélée dans la demande américaine NO 461 817 déposée le 28 Janvier 1983 comme étant l'organisme produisant la rébéccamycine. La demanderesse a découvert que pendant la culture de ce microorganisme on coproduit également avec la rébécca- mycine le produit 4'-deschlororébéccamycine de la présente invention. Ce microorganisme de production préféré, dénommé la souche C38 383-RK2, est isolé à partir d'un échantillon de sol recueilli à Panama. Des cultures de cette souche ont été déposées à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, et ajoutées à leur collection permanente de microorganismes sous la dénomination ATCC 39243. Les résultats des études taxonomiques réalisées sur la souche C38 383-RK2 indiquent que la souche est classée comme une espèce atypique du gène Nocardia. Sur la base des caractéristiques indiquées ci-dessous, la souche C38 383RK2 est considérée pour appartenirau groupe de l'espèce de Nocardia aerocolonigenes. La souche C38 383-RK2 présente les propriétés suivantes: Morphologie La souche C38 383-RK2 forme des cellules filamenteuses unicellulaires qui se développent en substrats et en micelia aériens. A la fois les micelia sont longs, bien ramifiés et non fragmentés en courts filaments (0,5 micron de diamètre). Des arthrospores sont nés en totalité du mycelium aérien. Ces spores sont disposés avec un intercalage d'hyphes vides, ou formés sous forme d'une chaîne continue. Comme la sporulation de Nocardiopsis dassonvillei, (Intl. J. Syst. Bacteriol. 26: 487-493 (1976) les hyphes aériens de souche C38.383 sont divisés en segments longs qui se subdivisent ultérieurement en spores de dimension irrégulière. Les chaînes de spores intercalés ou continus sont de forme droite ou fléchie. Des chaînes de spores extrêmement longues qui contiennent 50 à 100 spores dans une chaîne sont formées avec des longueurs de chaine courtes ou modérées. Les spores sont de forme cylindrique, de dimension 0,5 à environ 0,7 x 0,7 à environ 5 microns, et présentent une surface lisse. Des sclerotia sont formés sur le mycelium aérien, mais des sporanges, des spores motiles et des verticilles ne sont pas observés. Caractéristiques de culture La souche C38.383 est un actinomycète à obligeance aérobie, et se développe bien dans la plupart des milieux agar. Le mycelium aérien est formé abondamment sur agar sucrose-nitrate de Czapek, milieu ESP N s 2, 4, 5 et 7, agar nutritif et agar de Bennett, mais pauvrement sur glucose-agar asparagine et milieu ISP N s 3 et 6. La couleur du mycelium aérien est blanche, blanche jaunâtre ou jaune pâle. Un pigment jaunâtre est formé dans le mycelium du substrat, qui diffuse légèrement dans le milieu agar. Ce pigment n'est pas un indicateur de pH. Le pigment de mélanoîde n'est pas produit. Les caracté- ristiques de culture sont répertoriées au tableau 1. Caractéristiques physiologiques La température de croissance optimale pour la souche C38.383 est comprise entre 28 C et 37 C, et une croissance modérée est observée à 200C et 41 C. Aucune croissance n'est observée à 7 C et 45 C. La gélatine et l'amidon sont décomposés. La tyrosinase est négative. La croissance est inhibée en présence de NaCú 8%, mais pas par le lysozyme à 0,01%. La souche C38.383 utilise la plupart des sucres pour sa croissance. Les caracté- ristiques physiologiques et l'utilisation de carbohydrates sont répertoriées aux tableaux 2 et 3, respectivement. Composants aminoacides de paroi cellulaire et de suere de la cellule totale La composition en aminoacide dans la paroi cellulaire est examinée selon les procédés décrits par Becker et al. (Appl. Microbial. 13: 236243, 1965) et Yamaguchi (J. Bacteriol. 89: 441-453, 1965), et le composant sucre dans l'hydrolysat de cellule totale est identifié selon les procédures soulignées par Lechevalier et Lechevalier dans Bioloqy of the Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-92, 1976. La paroi cellulaire de la souche 38.383 contient l'acide méso-diaminopimélique et la glycine est absente. L'hydrolysat de cellule totale montre la présence de glucose, galactose, mannose et rhamnose. La composition de paroi cellulaire et les composants de sucre de la cellule totale mentionnés ci- dessus indiquent que la souche C38.383 est une espèce actinomycète de type de paroi cellulaire IIIC. Taxonomie La souche C 38.383 est comparée avec huit genres d'ordre Actinomycetales,incluant Nocardia, Micropolyspora, Microtetraspora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora, Pseudono- cardia, Actinomadura et Streptoalloteichus, dont tous produisent des chaînes de spores sur mycelium aérien et contiennent l'acide mésodiaminopimélique dans la paroi cellulaire. Parmi ces huit gènes, le gène Nocardiopsis est davantage proche de la souche C38.383 dans la chaîne de spores et la morphologie des spores, mais diffère de la cellule C38.383 par l'absence de galactose et de mannose dans l'hydrolysat de cellule totale. Cordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) caractérisent 14 types de nocardiae basés sur les propriétés physiologiques et les compositions chimiques de l'hydrolysat de cellule complète. La souche C38. 383 est davantage similaire à Nocardia aerocoloniqenes dans la composition 2569702- en aminoacide et en sucre dans l'hydrolysat de cellule totale. En conséquence, la souche C38.383 est comparée avec les propriétés physiologiques de diagnostic de N. aerocolonigenes. Comme montré au tableau 4, la souche C38.383 a été découverte pour être reliée de manière proche à N. aerocoloniqenes mais pourrait être différente de manière significative de Nocardia (Nocardiopsis) dassonvillei. Cependant, la totalité des 14 souches de N. aerocolonigenes sont dépourvues ou perdent les capacités à former des spores et du mycelium aérien. Ainsi, la souche C38.383 est considérée pour être une espèce sporogène dans l'espèce de Nocardia aerocolonigenes. La souche C38.383 a également été découverte pour perdre sa capacité à former du mycelium aérien et des spores. Après cinq transferts successifs, 70% d'isolats individuels perdent ces capacités. Une telle propriété de la souche C38.383 semble être similaire à la variation rapportée de Nocardia aerocolonigenes dans la formation - de spores et de mycelium aérien. Tableau 1 Caractéristiques de culture de la souche C38.383 * Bouillon tryptone-extrait de levure (ISP N 1) G: modéré; flocose, granules jaune pâle D: aucun Agar sucrose-nitrate (agar de Czapek) G: abondant R: fortement jaune (84) à jaune vif (82) A: modéré, blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) D jaune grisâtre sombre (91) à brun légèrement olive (94) Agar glucose-asparagine G pauvre R blanc (263) A insuffisance, blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) D:aucun Agar glycérolasparagine (ISP NO 5) G abondant R jaune brillant (83) à jaune fort (84) A:abondant, jaune pâle (89) à légèrement jaune (86) D:gris jaune (93) à jaune grisâtre (90) Agar de sels minéraux- amidon (ISP N 4) G: abondant R: jaune pâle (89) à jaune fort (84) A: abondant, blanc (263) à blanc jaunâtre (92) D: aucun Agar de tyrosine (ISP N 7) G: abondant R: jaune brillant (83) à jaune fort (84) A:modéré, jaune pâle (89) à légèrement jaune (86) D: jaune pâle (89) Agar nutritif G: abondant R blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) A: abondant, blanc (263) D aucun : aucun 2569702- Agar extrait de levure- extrait de malt (ISP NO 2): abondant R: jaune orange brillant (67) à jaune orange fort (68) A: abondant, blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) D: jaune orange sombre (72) à brun jaunâtre modéré (77) Agar de farine d'avoine (ISP N 3): modéré R:légèrement jaune (86) à jaune brillant (83) A:insuffisant, blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) D: aucun Agar de Bennett G: abondant R: jaune brillant (83) à jaune fort (84) A: abondant, blanc jaunâtre (92) à jaune pâle D: jaune vif (82 Agar de peptone-extrait de levure-fer (ISP N 6) G: modéré R: jaune pâle (89) à légèrement jaune (86) A: pauvre, blanc (263) à blanc jaunâtre (92) D: aucun * observé après incubation à 280C pendant 3 semaines ** Abréviation: G = croissance; R= couleur inverse; A = mycelium aérien; D = pigment diffusible 2569702- *** La couleur et le nombre entre parenthèses suivent la couleur standard de Kelly, K.L. et D.B. Judd: tables de nom de couleur ISCC-NBS illustrées avec des couleurs centrées." Département US du Commerce Circulaire 553, Washington, D.C. N , 1975". -2569702- Tableau 2 Caractéristiques physiologiques de la souche N C38.383 Procédé ou Essai Réponse milieu utilisé Domaine de Croissance maximale à Agar de Bennett température 28 C à 370C. Croissance pour la modérée à 20 C et 41 C croissance Aucune croissance à 7 C ET 45 C Liquéfaction Liquéfiée 1 ' d'extrait de de gélatine malt, 0,4%' d'ex- trait de levure, 0,4%, de glucose, % de gélatine Hydrolyse Hydrolysée Plaque agar d'amidon amidon Réactions Non coagulée et complè- Lait écrémé Difco dans du lait tement peptonisée écrémé Formation Négative Agar de tyrosine, de pigment agar de peptone- mélanoide extrait de levure- fer, et bouillon de tryptone- extrait de levure Réaction à Négative Procédé de Arai * la tyrosinase Réduction de Positive Bouillon de su- nitrate crose nitrate de Czapek Positive 0,5% d'extrait de levure, 1%' de glu- cose, 0,5% de KN03, 0,1%' de CaCO3 Tolérance Croissance à pH 5,0 Agar extrait de à l'acide Aucune croissance à levure-extrait pH 4,5 de malt Tolérance Croissance dans NaCU Milieu de base: à NaCe à 7,% ou moins 1,% d'extrait de Aucune croissance levure, 2% d'ami- à NaCt à 8%' don soluble, 0,1% d'agar. Tolérance au Tolérance Bouillon de soja lysozyme Croissance à 0,01% trypticase plus de lysozyme 1,5%0 d'agar. * Arai, T. et Y. Mikami: Chromogénicité de Streptomyces. Appl. Microbiol. 23: 402-406, 1972. 2S69702 Tableau 3 Utilisation de carbohydrate dans la souche N C38.383 Glycérol + D(-)arabinose + L(+)-arabinose + D-xylose + D-ribose + L-rhamnose + D-glucose + D-Galactose + D-fructose + D-mannose + L(-)-sorbose Sucrose + Lactose + Mélibiose + Tréhalose + Raffinose + D(+)-mélézitose Amidon soluble + Cellulose + Dulcitol Inositol + D-mannitol + D-sorbitol Salicine + observé après incubation à 37 C pendant 3 semaines Milieu de base: milieu minéral de Pridham-Gottlieb Abréviation +: utilisation positive, -: utilisation négative Tableau 4 Comparaison des propriétés physiologiques de diagnostic parmi la souche C38.383, Nocardia aerocoloniqenes et Nocardiopsis dassonvillei Nocardia * Nocardiopsis * Souche aerocolonigenes dassonvillei C38.383 (14)** (31)** Décomposition de: Adénine - - + Caséine + + + Hypoxanthine + + + Tyrosine + + + Urée - + - Xanthine - - + Résistance à: Lysozyme + + Rifampine - - Hydrolyse de: Aesculine + + - Hippurate - V + Amidon + + + Acide à partir de: Inositol + + - Lactose + + - Mélibiose + + - Raffinose + V - Utilisation de: Benzoate - - - Citrate + + + Mucate - - - Succinate + + + Tartrate - - - Nitrite à partir de nitrate + V + Survivance à C, 8 h - V + +: positive, -: négative, V: 15 à 84% de souches positives * Données de Gordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) ** N des souches examinées On comprendra que la présente invention n'est pas limitée à l'emploi de la souche préférée particulière C38.383-RK2 décrite ci-dessus ou aux organismes répondant pleinement aux descriptions ci-dessus. L'invention inclut spécialement d'autres souches productrices de 4'deschlororébéccamycine ou d'autres souches mutantes dudit organisme mais qui peuvent être produites par des moyens conventionnels tels que radiation X, radiation ultraviolette, traitement avec des moutardes d'azote, une exposition à des phages, et analogues. Préparation de la 4'-deschlororébéccamycine La 4'-deschlororébéccamycine peut être produite par la culture d'une souche productrice de 4'-deschloro- rébéccamycine de Nocardia aerocoloniqenes, de préférence une souche ayant les caractéristiques de la souche de Nocardia aerocolonigenes C38.383-RK2 (ATCC 39253) ou une souche mutante de celle-ci, dans des conditions aérobies submergées dans un milieu nutritif aqueux. L'organisme pousse dans un milieu nutritif contenant une source de carbone assimilable, par exemple, sucrose, lactose, glucose, rhamnose, fructose, mannose, mélibiose, glycérol ou amidon soluble. Le milieu nutritif devrait également contenir une source d'azote assimilable telle que de la farine de poisson, la peptone, de la farine de soja, de la farine de noisette, de la farine de graine de coton, ou de la liqueur macérée de mais. Des sels minéraux nutritifs peuvent également être incorporés dans le milieu. De tels sels peuvent comprendre n'importe lequel des sels habituels capables de fournir du sodium, du potassium, de l'ammonium, du calcium, du phosphate, du sulfate, du chlorure, du bromure, du nitrate, du carbonate ou des ions analogues. La production de 4'-deschlororébéccamycine peut être effectuée à toute température capable de donner une croissance satisfaisante de l'organisme, par exemple -41 C, et est réalisée de manière convenable à une température d'environ 27 C. La fermentation peut être réalisée en flacons ou dans des fermenteurs de laboratoire ou industriels de diverses capacités. Lorsque la fermentation en réservoir est utilisée, il est souhaitable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif en inoculant un faible volume du milieu de culture avec une culture inclinée ou de sol ou une culture lyophilisée de l'organisme. Après l'obtention d'un inoculum actif de cette manière, celui-ci est transféré aseptiquement au milieu du réservoir de fermentation pour une production à grande échelle de 4'deschlororébéccamycine. Le milieu dans lequel l'inoculum végétatif est produit peut être le même que,ou être différent de, celui utilisé dans le réservoir pour autant qu'il est tel qu'une bonne croissance de l'organisme producteur soit obtenue. En général, la production optimum de 4'-deschlororébéccamycine est obtenue après des périodes d'incubation d'environ 7 jours. La 4'-deschlororébéccamycine est un produit mineur de la fermentation et elle peut être récupérée à partir du milieu de culture et isolée sous une forme sensiblement pure selon la procédure multi-étape décrite à l'exemple 1 ci-dessous. Ainsi, on trouve la 4'-deschlororébéccamycine désirée principalement dans le mycelium et sa récupération à partir du mycelium peut être effectuée par extraction avec un solvant oragnique tel que le tétrahydrofuranne. Après la réduction du volume extrait on peut obtenir un solide brut contenant la 4'-deschlororébéccamycine désirée. Ce solide brut peut ensuite être soumis au schéma de purification multiétape illustré dans le diagramme de procédure suivant: Solide brut (1) mise en suspension dans chloroforme: méthanol (2:1) (2) ajouter de la terre de diatomée (3) diluer avec du Skellysolve B (4) concentrer jusqu'à obtenir une poudre in vacuo (5) mettre en bouillie dans le Skellysolve B et soumettre à une chromatographie flash Skellysolve B Toluène CH 2C2 Acétate T4F méthanol d'éthyle (1) évaporer à sec (résidu A) (2) chromatographie sur colonne (3) élution à gradient linéaire- CHC43 jusqu'à CH30H 5% dans CHCú3: ] fois des fractions de 200 me Fractions 13-16 (1) évaporer à sec (résidu B) (2) extraire avec DMSO (3) chromatographie sur colonne- élution avec CH3CN:CH30H: NH40Ac 0,lM (3:2:4):21 et poursuivre ensuite avec 40 fois des fractions de 65 m- Fractions 9-32 (1) extraire avec CHCZ3 CHCQt3 aqueux O_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ (1) concentrer (2) précipiter avec Skellysolve B Filtrat, monochlororébéccamycine mettre de côté solide à droite Propriétés physicochimiques de la 4'-deschlororébéccamycine Les propriétés physicochimiques de la 4'-deschlororébéccamycine sont les suivantes: La 4'deschlororébéccamycine est un solide amorphe jaune ayant une formule moléculaire C27H2207N3Ct et un poids moléculaire égal à 535,8397. Elle est composée des éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et chlore. Les données d'analyse élémentaire sont les suivantes: Calc. pour C27H2207N3CZ.H20: C, 58,54; H, 4,37; N, 7,58 Trouvé: C, 58,43; H, 4,29; N, 7,29. Le spectre de masse à haute résolution de la 4'-deschlororébéccamycine a été déterminé avec un spectro- mètre Kratos MS-50 et une ionisation FAB. La masse observée est la suivante: Caleulé pour l'ion (M+H)+: 536,1224 Trouvé pour l'ion (M+H)+: 536,1188 La 4'-deschlororébéccamycine est insoluble dans l'eau et soluble dans le diméthylsulfoxyde. Le spectre d'absorption infrarouge de la 4'-deschlororébéccamycine lorsqu'elle est comprimée dans KBr présente des bandes caractéristiques aux fréquences suivantes exprimées en centimètres inverses: 3400, 3330, 2930, 1745, 1703,1575, 1490, 1470, 1458,1435, 1398, 1380, 1330, 1273, 1238,1140, 1105, 1083, 1050,1015, 947, 910, 800, 798, 755, 738, 670, 665, 633 Le spectre d'absorption ultraviolet de la 4'-deschlororébéccamycine a été déterminé dans le méthanol (0,03462 g/t) dans des conditions neutres. Les maximum d'absorption observés et d'absorptivités sont les suivants: 400 nm (8,6), 315 nm (96,5), 290 nm (107,7), 257 nm (sh), 235 nm (76,3) Un spectre de résonance magnétique aux protons de la 4'-deschlororébéccamycine dissoute dans le diméthyl- sulfoxyde a été déterminé avec un spectromètre Bruker WM-360 opérant à 360 MHz et utilisant le tétraméthylsilane comme standard interne. Les déplacements chimiques observés (valeurs), les constantes de couplage (valeurs J en Hz) et les descriptions de modèle sont les suivantes: 11,81 (s, 1H, N8-H), 11,24 (s, 1H, N5'-H), 9,26 (d, J=7,9, 1H, Ce-H ou C '-H), 9,10 (d, J=7,9, 1H, C -H ou Ck'-H), 7,77 (d, J=7,9, 1H, C4'-H), 7, 63 (m, 2H, C3-H et C3'-H), 7,42 (m, 2H, C2-H et C2'-H), 6,91 (d, J=9,4, 1H, C,"-H), 6,30 (bs, 1H, C6"-0H), 5,25 (d, J=5,7, 1H, C3"-OH), 4,91 (d, J=5,7, 1H, C2"-OH), 4,01 (bs, 2H, C6"-H), 3,90 (d, 1H, C5"-H), 3,67 (t, 1H, C4"-H), 3,62 (s, 3H, C4"-0CH3), 3,53 (m, 1H, C2"-H se chevauche avec H20). Un spectre de résonance magnétique au carbone 13 de la 4'deschlororébéccamycine dissoute dans le diméthylsulfoxyde a été déterminé avec un spectromètre Bruker WM-360 opérant à 22,5 MHz en utilisant le tétraméthylsilane commestandard interne. Les déplacements chimiques observés (valeurs ppm) et les attributions sont les suivantes: Déplacement chimique (ppm) Attribution 170,7 C7 ,6 C7' ,7 C4a 138,1 C4a' ,4 C5a 129,9 C5a' 129,4 C3' 127,3 C3 ,6 C5c 124,6 ci, 123,9 Cî 122,8 C5c' 122,3 C2 121,1 C6 ,6 C2' 119,4 C6' 119,1 C5b' 117,4 C5b 116,4 C4 112,1 C4' 83,9 Ct" 77,6 C3" 77,0 C4" 76,6 C5" 72,1 C2" ,0 OCH3 58,7 C6" Activité biologique de la 4'-deschloro- rébéccamycine L'activité antibactérienne de la 4'-deschloro- rébéccamycine a été déterminée contre un grand nombre d'organismes grampositif et gram-négatif par la méthode de double dilution agar en série. Les résultats sont répertoriés au tableau 5 ci-dessous en comparaison avec l'activité de la rébéccamycine. Tableau 5 Activité antibactérienne de la 4'-deschlororébéccamycine Concentration inhibitrice minimum (MIC) (p/me.) Organisme Rébéccamycine 4'-deschloro- rébéccamycine S. pneumoniae A9585 > 125 32 S. pyogenes A9604 >125 32 S. faecalis A20688 8 16 S. aureus A9537 0,5 2 M. luteus A9547 0,5 1 S. aureus (Pen-Res) A9606 >250 >250 S. coli A15119 >250;250 S. coli A20341-1 >250 >250 K. pneumoniae A9664 ?250 >250 K. pneumoniae A20468 2 250 7250 E. cloacae A9659 ?250 -250 E. cloacae A9656 >250 >250 P. mirabilis A9900 > 250 >250 P. vulgaris A21559 >250 i250 M. morganii A15153 >250 >250 P. rettgeri A22424 '250 >250 S. marescens A20019 7250 >250 P. aeruqinosa A98'43A >250 >250 P. aeruqinosa A21213 -250 >250 List. mono- cytogenes A15121 32 32 3 0 List. mono- cytogenes A20025 32 63 La 4'-deschlororébéccamycine a été également testée contre la leucémie P-388 de la souris transplantée et les résultats sont répertoriés ci-dessous au tableau 6. La méthodologie utilisée suivait généralement le protocole du National Cancer Institute C Cancer Chemotherapy Rep., Part 3, 3, 1-103 (1972)]. Les détails expérimentaux essentiels sont donnés en bas du tableau 6. Tableau 6 Effet de la 4'-deschlororébéccamycine sur la leucémie P-388 Poids moyen Dose, IP MST MST changement,g Survivants Matériau mg/kg/inj. jours %T/C jour 5 jour 10 Rébéccamycine 512 17,0 155 -1,4 6/6 256 15,0 136 -0,3 6/6 128 14,5 132 0,2 6/6 64 15,0 136 0,3 6/6 32 13,0 118 -0,6 6/6 16 15,0 136 -0,8 6/6 4'-deschloro- 512 15,5 141 -1,0 4/4 rébéccamycine 256 15,0 136 -1,5 4/4 128 17,5 159 -0,6 4/4 64 15,0 136 -0,8 4/4 32 15,5 141 -0,8 4/4 16 18,0 164 -0,9 3/4 Contrôle 0,5 mt 11,0 100 0,6 10/10 inoculum de la tumeur: 106 cellules ascites, ip Hôte: souris CDF1F Traitement: injection unique le jour 1 donnéei.p. Evaluation: MST = durée de survivance moyenne Effet: pourcentage de T/C= (MST traité/ MST contrôle x 100 Critères: Pourcentage T/C supérieur à 125 considéré comme une inhibition de la tumeur significative Contrôle: salin (0,5 m t) donné une fois journellement i.p. pendant 5 jours Comme indiqué par les données antimicrobiennes et de tumeur de la sourismentionnées cidessus, la 4'-deschlororébéccamycine est utile comme antibiotique et également comme agent anti-tumeur pour une inhibition des tumeurs malignes des mammifères telles que la leucémie P-388. L'invention inclut dans sa portée des compositions pharmaceutiques contenant une quantité antimicrobienne ou inhibitrice de tumeur efficace de la 4'deschlororébéccamycine en combinaison avec un support ou diluant inerte pharmaceuti- quement acceptable. De telles compositions peuvent également contenir d'autres agents antimicrobiens ou anti-tumeurs actifs et peuvent être réalisées sous une forme pharmaceu- tique appropriée pour la route d'administration désirée. Des exemples de telles compositions incluent des compositions solides pour l'administration orale telles que des comprimés, des capsules, des pillules, des poudres et des granules, des compositions liquides pour l'administration orale telles que des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs et des préparations pour l'administration parenté- rale telles que des solutions stériles, de suspension ou des émulsions. Elles peuvent également être fabriquées sous la forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile, un milieu salin physiologique ou un autre milieu injectable stérile immé- diatement avant l'emploi. Pour l'emploi comme agent antimicrobien, la 4'-deschlororébéccamycine ou une composition pharmaceutique de celle-ci estadministrée de sorte que la concentration en ingrédient actif soit supérieure à la concentration inhibi- trice minimum pour l'organisme particulier à traiter. Pour emploi comme agent anti-tumeur, les dosages et les régimes optimum de la 4'deschlororébéccamycine pour un hôte mammifère donné peuvent être aisément déterminés par les spécialistes de l'art. On appréciera naturellement que la dose actuelle de la 4'-deschlororébéccamycine utilisée variera selon la composition particulière formulée, le mode d'application et le site particulier, l'hôte et la maladie à traiter. De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament seront pris en compte incluant l'âge, le poids, le sexe, la diète, la durée d'adminis- tration, la route d'administration, la vitesse d'excrétion, la condition du patient, les combinaisons de médicaments, les sensibilités réactionnelles et la sévérité de la maladie. L'exemple suivant est fourni à titre d'illustra- tion seulement et non pour limiter la portée de l'invention. * Le Skellysolve B est un solvant de pétrole commercialement disponible (Skelly Oil Co.) comprenant des hexanes isomères et ayant un point d'ébullition de 60-69 C. La dicalite est de la terre de diatomée fabriquée par Grefco, Inc. Sauf indication contraire, toutes les températures données ci-dessous sont en degrés centigrades. EXEMPLE 1 Préparation de la 4'-deschlororébéccamycine A. Fermentation Une souche de Nocardia aerocoloniqenes C38.383-RK2 (ATCC 39243) est maintenue et transférée dans des tubes d'essai sur des récipients inclinés d'agar d'agar levure- extrait de malt. Ce milieu consiste de 4,0 g de glucose, 4,0 g d'extrait de levure, 10 g d'extrait de malt et 20 g d'agar ajustés à 1 litre avec de l'eau distillée. Avec chaque transfert on incube le récipient incliné d'agar pendant 7 jours à 27 C. Pour préparer un inoculum pour la phase de production, la croissance de surface à partir de la culture inclinée est transférée à un flacon Erlenmeyer de 500 m t contenant 100 mR de milieu stérile et consistant de 30 g de glucose, 10 g de farine de soja, g de farine embryonnaire de grainesde coton et 3 g de CaCO3 ajustés à 1 litre avec de l'eau distillée. Cette culture végétative est incubée à 27 C pendant 48 heures sur un agitateur giratoire Gyrotory tier (modèle G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) réglé à 210 révolutions par minute décrivant un cercle avec un diamètre de 5,1 cm. Quatre mi de culture végétative sont transférés dans un 25697C2 ballon Erlenmeyer de 500 mú contenant 100 m-L d'un milieu de production stérile consistant de 60 g d'amidon de blé ou de mais, 10 g de glucose, 15 g de farine de graines de lin, 5,0 g de levure autolysée, 1,0 g de FeS04. 7H20, 1,0 g de NH4H2PO4, 1,0 g de (NH4)2S04 et 10 g de CaCO3 ajustés à I litre avec de l'eau distillée. La culture de production est incubée à 27 C sur un agitateur tel qu'utilisé pour la culture végétative. Le taux d'agitation est réglé à 250 révolutions par minute. La fermentation est terminée au bout de 168 heures. B. Fermentation Le bouillon de fermentation obtenu selon l'exemple A est filtré en utilisant un auxiliaire de filtre de terre de diatomée(l'auxiliaire de filtre est mélangé avec le bouillon et également utilisé pour former un mat). Le filtrat est mis de côté et le mat extrait avec du tétrahydrofuranne (THF) pendant 30-60 minu- tes en utilisant 0,1-0,2 volumes basés sur le volume d'origine (le THF contient de préférence 0,025 ' d'hydroxy- toluène butylé comme agent de conservation). L'extrait de THF est filtré et les insolubles sont mis de côté. Le filtrat est concentré in vaeuo jusqu'à ce que presque la totalité du THF soit enlevée. L'auxiliaire de filtre inerte est ensuite mélangé avec le concentrat et le mélange résultant est filtré sur un mat d'auxiliaire de filtre inerte. L'air est aspiré au travers du mat pendant 4 heures ou davantage pour sécher le mat autant que possible. Le mat obtenu tel que décrit ci-dessus est ensuite extrait pendant environ 30 minutes avecassez de THF pour donner une bonne bouillie. L'extrait est filtré et le mat est mis de côté. Le filtrat est concentré par mise à l'ébullition à une atmosphère. Du méthanol chaud est simultanément ajouté lorsque le volume devient faible. Après que la cristallisation de solides jaunes débute, le mélange est mis à bouillir gentiment jusqu'à ce que le bouillonnement devienne un problème. Le mélange réactionnel est ensuite laissé refroidir et est trempé à 5-8 C. Le produit solide est filtré, rincé avec du méthanol froid et séché. Ce matériau contenant la 4'-deschloro- rébéccamycine désirée est utilisé dans la procédure de séparation suivante. C. Séparation et purification Des solides bruts de l'exemple 1B (336,3 g) sont mis en suspension et partiellement dissous dans 2,5 t de 2 parties de chloroforme: 1 partie de méthanol et trans- férés dans un flacon à fond rond de 6 litres. Approxima- tivement 1 kg d'auxiliaire de filtre (Dicalite) est mélangé dans la suspension. Le mélange est dilué avec approximativement 1,5. de Skellysolve B. La bouillie résultante est concentrée en une poudre in vacuo dans un évaporateur rotatoire. Cette poudre est transformée en bouillie dans 6 t de Skellysolve B et emballée dans une colonne de chromatographie flash de 12 cm de diamètre externe x 90 cm. Un lit est formé avec un écoulement sous pression (N2- - 39,5 kPa). La colonne emballée est éluée avec un écoulement sous pression avec les séries élutropes suivantes: 9 litres de Skellysolve B (3 litres frais + 6 litres de solvant d'emballage); 13 litres de toluène; 12 litres de chlorure de méthylène; 12 litres d'acétate d'éthyle; 18 litres de tétrahydrofuranne; et 7 litres de méthanol. L'éluant de toluène est évaporé à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire pour obtenir 5,15 g de solide désigné comme résidu A. Une colonne du type Glenco 3500 Universal LC (2,67 cm de diamètre interne x 75 cm) est emballée avec 80 g de gel de silice Woelm (0,063-0,200 mm) dans du chloroforme. Le résidu A est dissous dans 40 mMt de chloroforme et pompé directement sur la colonne. L'élution commence avec un rinçage isocratique initial de 500 m de chloroforme. L'élution est poursuivie avec un gradient linéaire de 4 Q de chloroforme jusqu'à 5 parties de méthanol à 95 parties de chloroforme en recueillant fractions de 100 t. Les fractions 13 à 16 sont jugées 2,69702 comme étant approximativement homogènes. Elles sont rassemblées et évaporées à sec pour obtenir 663 mg de résidu B. La colonne Glenco (2,67 cm de diamètre interne x 75 cm) est emballée avec un gel de silice d'octadécyle à phase liée Baker (C-18) dans le méthanol. La colonne est équilibrée avec approximativement 2,5 volumes de lit diluant: 3 parties d'acétonitrile, 3 parties de méthanol et 4 parties d'acétate d'ammonium à O,lM. Le résidu B dans 3 m t de diméthylsulfoxyde est soutiré dans la boucle d'échantillon et pompé sur la colonne avec l'éluant. L'élution commence tout en contrôlant l'éluant à 280 nm. Après un précurseur de 2 litres initial, 40 fractions de mf sont recueillies. Sur la base du chromatogramme UV, les fractions 9 à 32 sont rassemblées. Le composite est extrait avec 2 litres de chloroforme. La phase inférieure est séparée et concentrée à sec in vacuo dans un évapo- rateur rotatoire. Le résidu est partiellement dissous dans 50 mi de chloroforme avec une sonication. La suspension est ajoutée à 1 litre de Skellysolve B sous une agitation rapide. Le précipité résultant est recueilli par filtration pour obtenir 606 mg de 4'-deschloro- rébéccamycine. Des détails supplémentaires de la procédure d'isolation cidessus sont répertoriés ci-dessous: HPLC analytique: Les composants suivants sont utilisés pour cons- truire un système HPLC analytique: pompe de système de distribution de solvant modèle Waters Associates 6000A; varichrome variant modèle VUV-10 uv/vis de détection réglée à 254 nm 0,1 D.O.; enregistreur de la série 5000 des enregistreurs Fisher; injecteur Waters Associates modèle U6K; colonne Altex Spherisorb ODS (10 microns) (4,6 mm de diamètre interne x 25 cm). Les composants sont reliés avec un tubage en acier inoxydable 316 (1,6 mm de diamètre externe - 0,23 mm de diamètre interne). L'éluant de 4 parties d'acétonitrile, 3 parties de méthanol et 3 parties d'acétate d'ammonium à O,lMest pompé à 2 mQ/mn pour toute l'analyse. Occasionnellement, un système de détection HPLC Hewlett Packard 1040A est substitué au détecteur varichrome variant VUV-10. Chromatographie sur couche mince (CCM): La CCM est réalisée sur des plaques GHLF de gel de silice pré-enrobées Analtech (2,5 cm x 10 cm couches de 0,25 mm d'épaisseur). Les plaques sont développées dans des cylindres en verre (diamètre 6,4 cm par 15 cm de hauteur) commercialisés par Whatman, Inc. Les réser- voirs sont chargés avec 10 mR de 5 parties de méthanol- parties de chloroforme et laissées s'équilibrer avant l'introduction de la plaque. Les plaques séchées à l'air développées sont visualisées avec une lumière ultraviolette de 254 nm et 366 nm soit en utilisant une boîte à lumière Chromato-VUE modèle C-20 (Ultra-Violet Products Inc.) soit une lampe de lumière minérale maintenue à la main modèle UVSL-58 (Ultra-Violet Products Inc.). HPLC préparative: Les composants suivants sont utilisés pour construire un système de chromatographie liquide sous moyenne pression: pompe Fluid Metering, Inc. modèle RP-SY 2CSC FMI Lab; humidificateur à pulsion Fluid Metering Inc. modèle PD-60-LF FMI; une boucle d'échantillon de 15 m t construite en tubage de poly- propylène (3,0 mm de diamètre externe x 1,5 mm de diamètre interne) emballée autour d'un tube en carton (8,65 cm de diamètre externe); une colonne Glenco de la série 3500 Universal LC (2,67 cm de diamètre interne x 75 cm); un contrôle d'absorbance/fluorescence Instrumentation Specialties Co. modèle UA-5 avec une unité optique type 6; valeur d'interruption d'écoulement Instrumentation Specialties Co. modèle 590; et un collecteur de fractions Instrumentation Specialties Co. modèle 328. Les composants sont -connectés au tubage de polypropylène Teflon (3,0 mm de diamètre externe x 1,5 mm de diamètre interne) et des connecteurs multi-adaptables Glenco et des vannes multi-adaptables Glenco dans l'ordre répertorié. La colonne Glenco du type 3500 Universal LC est emballée en bouillie avec l'absorbant défini dans le solvant désigné en utilisant des techniques standards. Le vide entre le lit précipité et le sommet du tube est rempli avec du sable d'Ottawa standard. L'éluant est pompé à un taux maximum qui n'excéderait pas une pression arrière de ' 413,7 kPa (approximativement 20 mt/mn). Elution à gradient: Un appareil d'élution à gradient Glenco consistant de deux chambres de diamètre, hauteur et volume égaux connectées en tandem avec une vanne en Teflon est utilisé pour des élutions à gradient. Une chambre sert comme chambre de mélange et l'autre comme réservoir statique. Le solvant le moins polaire, le chloroforme, est initia- lement maintenu dans la chambre de mélange. Le solvant le plus polaire, 5 parties de méthanol dans 95 parties de chloroforme, est maintenu dans la chambre statique. Des barres d'agitation magnétiques revêtues de Teflon (1,0 x 3,7 cm) sont placées dans les deux chambres et entraînées par des agitateurs magnématiques Thomas modèle 15. L'éluant est pompé à partir de la chambre de mélange au système HPLC à pression moyenne par le tubage en polypropylène (0,5 mm de diamètre interne x 3,0 mm de diamètre externe). Comme l'éluant est enlevé de la chambre de mélange, le solvant dans le réservoir statique est laissé le remplacer librement, en créant ainsi un gradient linéaire d'éluant. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. L'invention comprend donc tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs diverses combinaisons. R E V E N D I C A T I 0 N S ___________________________ 1.- Nouveau composé, caractérisé en ce qu'il présente la formule suivante: H 6 5_6',1' 0NW HO. " î OMe 2 2.- Procédé de production de la 4'-deschloro- rébéccamycine ayant la formule suivante: 3 NII N58, a 2 HO. 6 OMe 2.- Procédé de production de la 4'-deschloro- rébéccamycine ayant la formule suivante H 6 6' 2 5s()b5 2' 4 'N CL OH HO L' 3" 4"1 OH OMe caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une souche productrice de 4'-deschlororébéccamycine de Nocardia aerocolonigenes dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité sensible de 4'-deschlororébéccamycine soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture et ensuite la récupération de ladite 4'deschlororébéccamycine du milieu de culture sensiblement dépourvu de substances coproduites. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche productrice de 4'-deschlororébéccamycine est Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243 ou une souche mutante de celle-ci. 4.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend unequantité antibactérienne efficace de 4'-deschlororébéccamycine ayant la formule suivante: N 2t 2, 3 3 =,..,Na if HO X X 4" OH OMe en combinaison avec un support ou diluant inerte pharmaceutiquement acceptable. 5.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité d'inhibition de tumeur efficace de 4'-deschlororébéccamycine ayant la formule suivante: H H N 6 6' 1' io //A 4"ifOH OMe en combinaison avec un support ou diluant inerte pharmaceutiquement acceptable. H c p. 1 0 H El/ H HO e 4" O OMe en combinaison avec un support ou diluant inerte pharmaceutiquemnent acceptable.