Brevet FR2568682A1 — publié le 19860207

La présente invention concerne un procédé de dia- gnostic des infections à papillomavirus humainr mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux permettant de distinguer les papillomavirus bénins des papillomavirus potentielle- ment oncogènes. Les méthodes classiques de réaction immunologique antigène/anticorps ne peuvent être systématiquement utili- sées pour détecter la présence de certains types de papillo- mavirus humainsen raison de la trop faible quantité dispo- nible de papillomavirus potentiellement oncogènes,pour l'immunisation d'animaux en vue de la préparation d'immun- sérums polyclonaux.-Il est donc apparu nécessaire de mettre au point un procédé d'identification différentielle per- mettant de distinguer les papillomavirus humainsbénins (HPV), le type 1 par exemple, des papillomavirus de type 16 ou 18 dont on connalt le potentiel oncogène (se référer à l'article de Lionel Crawford, Nature, 1984,volume 310 p.l6). Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, des anticorps monoclonaux sont préparés, à partir de lignées d'hybridomes spécifiques de chaque type de papillo- mavirus humain. A titre d'exemple de mise en oeuvre de l'invention, des anticorps monoclonauxdirigés contre le papillomavirus humain de type 1 et des lignées de cellules hybrides qui secrètent ces anticorps,ont été préparés. La présente invention concerne un procédé de diagnostic des papillomavirus humain (HPV) mettant en oeu- vre des anticorps monoclonaux dirigés contre un type de papillomavirus humain, des lignées de cellules hybrides qui secrètent ces anticorps et l'application de ces anticorps à l'identification spécifique, le dosage et la purification des papillomavirus. Les papillomavirus, de la famille des papovavirus provoquent, chez l'homme, des tumeurs épithéliales bénignes de la peau et des muqueuses, les verrues et condylomes,qui peuvent parfois dégénérer en tumeurs malignes. On a, jusqu'à présent, dénombré vingt-huit types de papillomavirus humains,en tenant compte des taux d'hybridation croisée des DNA inférieurs à 50%; récemment l'apparition de can- cers génitaux et cutanés a été associée à la présence de certains types de ces virus, le type 1 entre autres, étant, considéré comme parfaitement bénin. Si l'on a pu montrer l'existence d'antigènes spé- cifiques des différents types, et d'antigènes du groupe des papillomavirus, des anticorps polyclonaux spécifiques de la plupart de ces types de virus n'ont jamais été préparés en raison de la très faible quantité de matériel antigéni- que disponible. Il est pourtant particulièrement souhaitable d'avoir des anticorps qui soient spécifiques,c'est-à-dire ne reconnaissant qu'un type de papillomavirus,pour préparer des réactifs d'identification,de différentiation, de dosage et de purification de ces virus, dans la mesure o certains seulement sont associés à des phénomènes de cancérogénèse. En outre, ces anticorps permettraient l'étude de la struc- ture antigénique de ces virus. Ainsi, la mise au point d'un réactif permettant de différencier un virus bénin,tel celui de type 1, des virus potentiellement oncogènes, comme ceux de type 16 ou 18, était particulièrement souhaitable, et c'est l'un des avantages fondamentaux de l'invention de permettre cette différentiation. Actuellement, il n'existe pas de moyen de détec- tion des types de papillomavirus, basé sur la réaction antigène/anticorps,dont on connalt pourtant les avantages. On sait, depuis le travail de Kohler et Milstein publié en 1975 dans Nature 256 p.495, fabriquer des hybri- domes, lignées cellulaires immortelles, par fusion de cellules de myélome de souris et de cellules de rate de souris. Ces dernières ayant été préalablement immunisées contre un antigène donné, les hybridomes secréteront des anticorps dirigés contre cet antigène et ces anticorps seront monoclonaux du fait de la technique de sélection et culture utilisée. Si cette méthode a été largement appliquée depuis cette date, il n'est pas pour autant évident de sélectionner la lignée de cellules qui secrètera des anticorps spécifiques contre un type donné de papillo- mavirus, c'est-à-dire ne donnera pas ou.peu de réaction croisée avec les autres types. Les hybridomes, objets de l'invention, sont des secréteurs des anticorps spécifiques d'un type particulier de papillomavirus humain et ces anticorps monoclonaux sont un autre objet de l'invention. Le papillomavirus humain de type 1 (ou HPVl)convient particulièrement bien à l'étu- de des virus infectant l'homme. On trouve des quantités importantes de ces particules virales dans les verrues plantaires profondes. Des anticorps monoclonaux dirigés contre le virus de type 1 et les hybridomes qui les secrètent, illustrent la présente invention. On prépare, selon l'invention,les hybridomes par fusion de cellules de myélome de souris convenablement choisies et de cellules extraites de la rate de souris préalablement immunisées contre le papillomavirus du type choisi. Dans le cas du papillomavirus de type 1, les particules virales sont extraites des verrues plantaires profondes humaines, purifiées en vue de leur injection à des souris. On peut s'assurer que cette préparation virale ne comprend que des virus-de type 1 en Isolant l'ADN présent dans un échantillon et vérifiant que cet ADN donne les fragments connus pour être ceux du virus HPVI, par action - d'endonucléasesy par exemple Hind II et Hind III. La préparation virale est utilisée pour immuniser des souris par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale. On fera plusieurs injections successives, à intervalle de plusieurs semaines. Lorsque les souris sont immunisées, elles sont tuées, et leurs rates prélevées; les cellules de ces rates sont utilisées pour la fusion. On peut faire appel à différentes lignées de cellules de myélome murin pour effectuer la fusion;elles doivent permettre la sélection ultérieure des hybridomes formés par des méthodes connues en soi,on préfère des cellules ne sécrétant pas d'immunoglobulines et la souche SP2/O, résistante à la 8-azaguanine convient parfaitement pour permettre la séparation des hybridomes des cellules non-fusionnées. La fusion est réalisée par mise en contact des deux sortes de cellules en présence d'un agent de fusion qui peut être le polyéthylène glycol ou encore le virus de Sendai. Après la fusion,l'ensemble des cellulesaprès dilution, est mis en culture dans un milieu sélectif, o seuls les hybridomes pourront se développer; dans le cas des souches de myélome SP 2/0, la présence dans le milieu de culture d'azasérine entrainera la disparition des cellules de rate n' ayant pas fusionné. On ne met en culture que quelques cellules par puits d'une plaque classique et après quelques jours, de 5 à 15, lorsque le développement des cellules est devenu apparent, on recherche la présence, dans le surnageant des différents puits,d'anticorps anti- HPVI, par une méthode classique (immunofluorescence, immu- nodiffusion ou par méthode immunoenzymatique).On peut,par exemple, mettre en évidence les anticorps formés par leur réaction avec les antigènes de HPVI présents dans des coupes de verrues plantaires congelées, réaction révélée par immunofluorescence ou par une technique immunoenzymatique; par cette méthode, on détectera les anticorps spécifiques d'un type ou du groupe des papillomavirus. Par immunodiffu- sion, en utilisant les particules virales entières comme antigèneson mettra uniquement en évidence les antigènes spécifiques d'un type de virus. On peut également détecter les anticorps monoclonaux par la méthode "Elisa" en utilisant les particules virales intactes comme anti - gènes. Les cellules secrétant des anticorps intéressants, ainsi mises en évidence,sont alors clonées par la technique de la dilution limite pour obtenir.-des cultures monoclonales. Les anticorps monoclonaux secrétés par ces clones de cellules peuvent être isolés dans les surnageants de leurs cultures,ou dans les liquides des ascites qui se forment après injection intrapéritonéale,à des souris, des hybridomes. L'identification de la classe à laquelle appartien- nent les immunoglobulines sécrétées par les hybridomes peut être effectuée par immunodiffusion selon une méthode a nt - connue,en utilisant des/anticorps de souris dirigés contre des immunoglobulines de souris (anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-IgG2b, anti-IgG3). Deux lignées d'hybridomes sont objet de l'inven- tion. Elles ont été déposées dans la Collection de micro- organismes de l'Institut Pasteur (France) le 30 Juillet 1984, sous les numéros 1-324 et 1-325. Le clone n 1-324 porte la référence 334 B6,alors que le clone n I-325 porte la référence 405 DS. Ces hybridomes qui résultent de la fusion de cellules de myélome SP 2/0 et de cellules de souris Bal b/c, ont secrété depuis plus d'un an des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre le virus HPV1; en effet, ces anticorps dilués au 1/400 (v/v),permettent de déceler la présence d'antigè- nes de HPV 1 dans des coupes de verrues plantaires congelées, alors que,dilués au 1/10 (v/v),ils ne donnent aucune réac- tion décelable par immunofluorescence ou méthode immuno- enzymatique (révélation de l'activité peroxydasique)dans des coupes congelées de verrues dues aux papillomavirus de type 2, 3, 4, 5, 6 et 7. Les anticorps monoclonaux sont secrétés par les cellules en culture en quantité importantel:ies titres des culturesqui sont l'inverse de la plus grande dilution de surnageant révélant les noyaux infectés dans des coupes de verrues congelées ou donnant une ligne de précipitation avec des particules virales,sont compris entre 10 et 100 dans le cas de l'immunofluorescence ou de la technique dimmu.Orxydaseeentre 1 et 16 pour la technique d' immunodiffusion. O Les liquides d'ascites résultant de l'inJection intrapéritonéale aux souris Bal b/c de 2 x 10io6 hybridomes ont un titre, 12 jours après l'injection,allant de 200 à 400 (détermination par immunofluorescence) ou de 200 à 400 (détermination par technique d'immunoperoxydase) ou de 50 à 200 (détermination par immunodiffusion). Les classes auxquelles ces anticorps appartiennent, ont été déterminées par immunodiffusion; ce sont la sous-classe IgGl(souche 334 86) et la sous-classe IgG2a(souche 405 D5). Dans le cas des papillomavirus humainsdes autres types, dans la mesure o ceux-ci ne sont disponibles qu'en faible quantité, par exemple parce qu'on ne sait pas les cultiver, on pourra préparer des anticorps spécifiques en quantité suffisante en utilisant des techniques d'hyperimmuni- sation des animauxcomme par exemple celle décrite par LANGE et Coll. dans 3. of Immunological Methods (1983) vol. 63 p.123-131 et qui consiste à coupler l'antigène viral à un lipopolysaccharide. Les anticorps monoclonaux selon l'invention,spéci- fiques d'un type de virus, sont avantageusement utilisés pour préparer des réactif-s immunologiques de détection, d'identification, de dosage et de purification du type de virus correspondant par des méthodes dont le principe est monoelonaux- connu en soi. L'application de ces anticorps/a úaprepara- tion de ces réactifs immunologiquesest un autre objet de l'invention. Les réactifs d'identification de l'HPVl contenant les anticorps monoclonaux spécifiques de l'HPVl seront utiles à la détermination de la gravité des infections à papillomavirus. Un autre objet de l'invention est un pro- cédé de détermination de la présence ou non dans une lésion de papillomavirus potentiellement oncogènes. I1 consiste à faire un essai immunologique,dont le principe est connu, entre des particules virales ou des antigènes viraux de la lésion avec les anticorps monoclonaux selon l'invention spécifiques du type HPV1 ou de tout autre type de papillo- mavirus humain. Dans ce qui suit, on illustre les procédés mis en oeuvre pour préparer les hybridomes et les anticorps mono- clonaux, selon l'invention. EXEMPLE a) Immunisation des animaux. Les particules virales HPV1 ont été isolées et purifiées selon la méthode décrite dans 3. Virol 24 108-120(1977). On a injecté par voie sous-cutanée, à trois souris de souche Bal b/c, une suspension de ces particules dans un tampon phosphate salin,mélangée à un volume égal d'adjuvant complet de Freund; chaque injection correspon- dait à 50 pg de protéines virales. L'injection a été répé- tée après 2 semaines; puis un mois après la première injection,la même quantité de particules virales a été vole injectéePff/intrapéritonéalee aux animaux, sans adjuvant; les souris ont été tuées trois jours après cette dernière injection et leurs rates prélevées. b)Fusion Les cellules des rates, environ 2 x 108 cellules par animalaprès isolement et lavage avec du milieu RPMI 1640 supplémenté par 20% de sérum de veau foetalont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris de type SO 2/O,résistant à la 8-azaguanine. On a mis pour cela en contact environ une cellule de myélome par 10 cellules de rate,en présence de 1 ml de polyéthylène glycol à 50% pen- dant 1 minute 30 à 370C. Les hybridomes ont ensuite été séparés des cellules non fusionnées par culture sur un milieu classique composé de RPMI 1640,supplémenté par 20% de sérum de veau foetal,par de l'hypoxanthine(10 5M) et de l'azasérine ( 5 x 105M). Le milieu RPMI couramment utilisé pour les cultures de cellules est commercialisé par GIBCO - P.O.Box 35 - Paisley - Scotland. On a déposé en- viron 5 x 105 cellules par puits de culture. c)Recherche des hybridomes secréteurs Les cellules fusionnées avaient été réparties dans des puits et 12 jours après le début de la culture, on a déterminé si les surnageants de chacun de ces puits contenaient des anticorps anti-HPVl,par les méthodes précédemment citées dans J. Virology(1977) 24 p.108-120 et Virology (1978) 91 p. 243-255. On a trouvé deux puits dans lesquels les surna- geants donnaient un résultat positif par la méthode d'immu- nofluorescence ou à l'immunoperoxydase (sur coupes conge- lées de verrues)et par la méthode par immunodiffusion (contre des particules virales entières). Ces deux puits contenaient donc des anticorps spécifiques d'HPVl. d)Clonage Les cultures correspondantes dénommées 86 et D5 ont été clonées par dilution limiteselon un principe con- nu,de telle sorte que les cultures dans chaque puits ne dérivent plus que d'une cellule. Les surnageants de ces puits ont été étudiés, lorsque la croissance y était suffisanter, pour ne conserver que les puits o les anti- corps monoclonaux étaient présents. On a ainsi isolé deux clones, 334 B6 et 405 DS. e)Identification des polypeptides viraux portant les déterminants antigéniques reconnus par les anticorps mono- clonaux secrétés par les clones 334 B6 et 405 D5. On sait que les particules virales sont disso- ciées à 100 C par action d'un détergent tel que le SDS (sodium dodécylsulfate)(conc.3%),en présence d'urée 4M et de mercapto-2 éthanol (concentration finale 5%),en trois sortes de polypeptides séparables par électrophorèse en gel de polyacrylamide: l'un en grande quantité,de masse moléculaire apparente 54 000 daltons, un second,en plus faible quantité, de masse 76 000 daltons et d'autres de masses comprises entre 12 500 et 16 500 daltons,comme décrit dans les deux articles précédemment cités. Les anticorps monoclonaux secrétés par les cellules de lignée 334 B6 et 405 D5 réagissent avec les polypeptides de masse 76 000 daltons et de masse 54 000 daltonsqui sont donc tous deux porteurs de déterminants antigéniques du virus.Ceci a été mis en évidence par la technique d'immunoréplique (Western Blot). 9 y c o2568682o REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de la présence de papillomavirus humains, caractérisé en ce que l'on fait une recherche d'immunoréaction entre les particules virales ou les antigènes viraux présents dans une coupe de biopsie ou extraits d'une lésion,et des anticorps monoclonaux spécifiques des papillomavirus. 2.Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre un type de papillomavirus. 3. Anticorps monoclonal selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre le papillomavirus humain de type 1. 4. Anticorps monoclonal selon l'une des revendica- tions 2 ou 3,caractérisé en ce qu'il est secrété par un hybridome résultant de la fusion de cellules de myélome murin et de cellules de rates de souris immunisées contre un type de papillomavirus humain. 5. Anticorps monoclonal selon la revendication 3, - caractérisé en ce qu'il est secrété par la lignée de cellu- les hybrides déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes à l'Institut Pasteur (France) sous le n 1-324. 6.Anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est secrété par la lignée de cellules hybrides déposée à la Collection Nationale de Cul- tures de microorganismes à l'Institut Pasteur (France) sous le n 1-325. 7.Lignée de cellules hybrides secrétant des anti- corps contre le papillomavirus humain de type l,déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes à l'Institut Pasteur (France) sous le nO 1-324. 8.Lignée de cellules hybrides secrétant des anticorps contre le papillomavirus humain de type 1,déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes à l'Institut Pasteur (France) sous le n 1-325. 9.Application d'un anticorps monoclonal spécifi- que selon l'une quelconque des revendications 2. à 6,à la 2568682 différenciation, la détection, au dosage ou à la purifi- cation des particules virales ou des antigènes spécifi- ques des différents types de papillomavirus humains. Application d'un anticorps monoclonal spéci- fique du papillomavirus de type lselon l'une des revendi- cations 3 à 6 à la différenciation, la détection, au dosa- ge ou la purification de particules virales ou des anti- gènes spécifiques des différent,*apillomavirus humains