Brevet FR2569722A1 — publié le 19860307

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de lysozyme ou muramidase (E.C.3.2.1.17) à partir d'une matière première à base de blanc d'oeuf, utilisant la technique de microfiltration. Le lysozyme est présent dans la plupart des liquides physiologiques (salive, larmes, lait de femme). La prin- cipale source industrielle de lysozyme est le blanc d'oeuf de poule qui en contient 3 à 6 g/kg. Les propriétés enzyma- tiques de cette protéine lui confèrent une action bactéri- cide essentiellement sur les bactéries Gram+. Ses propriétés antibactériennes sont utilisées pour des applications préventives telles que la supplémentation des laits mater- nisés et des applications curatives sous forme de médica- ments contre la toux, certaines affections buccales et autres. Depuis une dizaine d'années, le champ d'action du lysozyme s'est considérablement élargi du fait de son utili- sation en industrie fromagère. Le lysozyme est en effet employé pour prévenir le développement de la flore butyrique des laits destinés à la fabrication d'Emmental. Au sens de la présente invention, l'expression "matière première à base de blanc d'oeuf" couvre le blanc d'oeuf lui-même et/ou l'entier d'oeuf aussi bien que les mélanges de ces produits avec divers additifs, ainsi qu'il sera décrit ci-après plus en détails. L'entier d'oeuf est un mélange de blanc et de jaune d'oeuf en proportion variable (40 à 80 % du blanc). La compo- sition typique du jaune d'oeuf industriel est la suivante: eau protéines lipides glucides minéraux 44-50 % 15,7-16,6 31,8-35,5 0,2-1 1,1 Le blanc d'oeuf industriel ou coule fraîche est obtenu par la casse des oeufs qui permet de libérer le con- tenu de l'oeuf et de séparer le blanc d'oeuf du jaune d'oeuf. La composition moyenne en poids du blanc d'oeuf industriel est la suivante: eau protéines lipides glucides minéraux 88,5 % 10,5 traces 0,5 0,5 Les protéines représentent la fraction majeure de la matière sèche: le rapport matières azotées totales sur extrait sec est généralement supérieur à 90 %. Le pH du blanc d'oeuf frais, immédiatement après la casse, se situe entre 9 et 9,5. Le blanc d'oeuf industriel est essentiellement utilisé en industrie biscuitière pour ses propriétés foisonnantes. Une douzaine de protéines ont été identifiées dans le blanc d'oeuf. Leurs teneurs et caractéristiques respectives ont également été précisées. Le lysozyme est une des protéines du blanc d'oeuf et se différencie des autres protéines par deux caractéristiques essentielles: son très faible poids moléculaire (14 600 dalton) qui en fait la plus petite des protéines du blanc d'oeuf; - sa forte charge électropositive au pH du blanc d'oeuf (son pH isoélectrique est, en effet, 10,7). C'est précisément sur l'une ou l'autre de ces pro- priétés que reposent les procédés actuels d'extraction du lysozyme du blanc d'oeuf. Ilexiste trois techniques principales dont deux sont utilisées industriellement. Les techniques chromatographiques échangeuses d'ions utilisent les caractéristiques électriques du lyso- zyme. Le principe de ce type de procédé consiste à fixer le lysozyme sur des résines échangeuses de cations, puis à désorber le lysozyme à l'aide d'une solution d'élution. La nature de la résine peut être variable. Un tel procédé permet d'obtenir un rendement d'extraction du lysozyme voisin de 70 %, mais sa mise en oeuvre est complexe et demande une haute technicité du personnel. De plus, il conduit à la production d'une quan- tité d'effluents polluants au moins égale à la quantité de blanc d'oeuf traitée. La seconde technique industrielle consiste à précipiter le lysozyme par salage du blanc d'oeuf au voi- sinage de son pH isoélectrique (pH 9,5). Le rendement d'extraction est de l'ordre de 60 %; le procédé est simple, mais il présente les inconvénients majeurs d'immo- biliser le blanc d'oeuf 72 h, et de fournir un sous-produit, le blanc d'oeuf salé, dont les propriétés fonctionnelles (aptitude au foisonnement, en particulier) sont altérées et l'utilisation limitée (aux industries de la viande, surtout). Enfin, la dernière technique consiste à effectuer un tamisage moléculaire des protéines du blanc d'oeuf sur des membranes d'ultrafiltration. Ces membranes sont uti- lisées classiquement dans les industries agro-alimentaires pour concentrer et purifier les produits liquides avant séchage, en éliminant une partie de l'eau et des substances dissoutes qu'ils contiennent. Le faible rendement de la méthode (voisin de 25 %l du lysozyme du blanc d'oeuf) empê- che son extension industrielle. La présente invention a pour objet un procédé qui remédie aux inconvénients de la technique antérieure. Elle concerne en particulier un procédé d'extraction du lysozyme à partir du blanc d'oeuf ou/et d'entier d'oeuf, procédé qui est avantageux à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle, et fournit notamment un haut rendement d'extraction tout en permettant d'obtenir à la fois un lysozyme de grande pureté et un entier d'oeuf ou/et un blanc d'oeuf appauvri en lysozyme, mais conservant toutes les propriétés du produit naturel. L'invention a-donc pour objet un procédé pour l'obtention de lysozyme à partir d'une matière première à base de blanc d'oeuf, caractérisé en ce qu'on soumet une matière première fluide à base de blanc d'oeuf, telle que définie dans la présente description, à au moins une microfiltration, par mise en contact de ladite matière sous pression et en flux tangentiel avec une membrane capable de séparer les particules ayant une taille comprise entre 0,02 micron et 10 microns environ, ce qui fournit d'une part un microfiltrat passant à travers la membrane et contenant au moins une fraction du lysozyme de la matière première et, d'autre part, un produit retenu par la membrane, qui conserve les propriétés fonctionnelles de la matière première à base de blanc d'oeuf, mais est appauvri en lysozyme. Ainsi, la présente invention consiste à appliquer la technique industrielle de microfiltration à l'extraction du lysozyme du blanc d'oeuf et/ou d'entier d'oeuf. La microfiltration est une technique connue de séparation ou d'élimination de particules: voir par exemple l'ouvrage de H.W. Ballew intitulé "Basics of filtration and separa- tion", (1978). Selon cette technique, la matière de départ est mise en contact avec une membrane ayant certaines caractéristiques de porosité. Cette mise en contact se fait sous pression, en flux tangentiel, pour forcer une fraction du produit dénommé microfiltrat, à passer à travers la membrane. Ainsi que l'indique l'ouvrage de H.W. Ballew précité, la différence fondamentale qui existe entre l'ultrafiltration et la microfiltration est que l'ultra- filtration permet de séparer des molécules alors que la microfiltration a pour but la séparation de particules. Les deux techniques diffèrent donc essentiellement par la nature des membranes mises en oeuvre. Dans le cas de la microfiltration, les membranes ont un diamètre de pore au moins cent fois supérieur à celui des membranes d'ultra- filtration. Contrairement à ces dernières, qui ne laissent passer théoriquement que l'eau et les substances dissoutes non protéiques, les membranes de microfiltration ne retiennent que les microorganismes, les substances colloi- dales ou micellaires. Les applications des membranes d'ultrafiltration sont les concentrations sélectives des matières protéiques des liquides agroalimentaires. Les principales applications de la microfiltration sont: l'épuration bactérienne à basse température et la clarification des liquides agro- alimentaires. La présente invention met à profit la technique générale de microfiltration pour extraire le lysozyme du blanc d'oeuf ou/et d'entier d'oeuf. Les résultats obtenus par le procédé sont particulièrement intéressants et sur- prenants. En premier lieu, l'extraction est parfaitement sélective, car le microfiltrat passant à travers la mem- brane contient au moins une partie du lysozyme de la matière première à base de blanc d'oeuf ou d'entier d'oeuf, à l'exclusion des autres protéines de celui-ci. Le produit retenu par la membrane est un blanc d'oeuf ou un entier d'oeuf ou un rétentat (produit d'oeuf enrichi en protéines et éventuellement en lipides) exempt d'une partie de son lysozyme mais conservant toutes les propriétés du produit naturel (pH, propriétés foisonnantes, composition relative en protéines autres que le lysozyme). Selon le procédé de l'invention, le rendement d'extraction du lysozyme du blanc d'oeuf ou de l'oeuf entier est de 50 à 80 % ou davantage. Contrairement à la technique connue de précipita- tion, l'invention permet de n'immobiliser le blanc d'oeuf ou l'oeuf entier traité que pendant une durée très courte, inférieure à 6 heures. Enfin, le procédé se prête parfai- tement à une mise en oeuvre industrielle en raison de l'extrême simplicité des conditions opératoires et du faible coût d'extraction qu'il procure. Les conditions de mise en oeuvre de la microfil- tration n'ont pas de caractère critique. Les paramètres opératoires, tels que la température, la pression et la vitesse de circulation du produit dépendent uniquement du type de membranes utilisé. Celles-ci sont du type usuel en microfiltration et sont capables de séparer des parti- cules ayant une taille comprise entre 0,02 micron et 10 microns environ. Ainsi qu'il est classique, les montages de membranes sont organisés sous forme de dispositifs dénommés modules. Il est en général avantageux de travail- ler à des températures supérieures à la température ordi- naire afin de faciliter la mise en contact du produit fluide avec la membrane. Comme le montrent les exemples qui suivent, des températures de l'ordre de 40 à 45 C se sont avérées convenables. Le procédé implique le passage de la matière première fluide sur la membrane avec une pression positive. Il est, cependant, avantageux de limi- ter par des moyens hydrodynamiques connus la croissance 2S69722 en épaisseur et la densité de texture de la couche de polarisation, par exemple en faisant circuler le liquide à base de blanc d'oeuf à une vitesse égale ou supérieure à 5 m/s et en limitant, autant que la conception du module le permet, la pression d'entrée. Comme l'illustrent les exemples suivants, des pressions inférieures à 5 bars et notamment de l'ordre de 2 à 3 bars se sont avérées appro- priées. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, 1o on peut utiliser directement le blanc d'oeuf, mais on préfère le diluer au préalable avec de l'eau contenant un sel soluble, tel que le chlorure de sodium, ou encore un sucre soluble tel que le glucose ou le saccharose, de manière à obtenir à la fois une matière première fluide convenant à la microfiltration et un rendement plus élevé d'extraction du lysozyme. On peut également utiliser direc- tement de l'entier d'oeuf, mais on préfère le diluer au préalable avec de l'eau contenant un sel soluble, tel que le chlorure de sodium ou un sucre soluble, tel que le glucose ou le saccharose. Selon la présente invention, une substance anti- oxydante, autorisée par la réglementation en vigueur, telle que l'acide ascorbique, peut être ajoutée préalablement à l'oeuf entier pour éviter tout endommagement des lipides du produit au cours du traitement par microfiltration. Ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, tous les mélanges ainsi mis en oeuvre entrent dans le cadre de la présente invention et constituent la matière première à base de blanc d'oeuf, objet du procédé. On notera également que, ainsi qu'il est usuel dans la technique de microfiltration, il est avantageux dans certains cas, bien que cela ne soit absolument pas nécessaire, de travailler par diafiltration du blanc d'oeuf ou d'entier d'oeuf, natures ou dilués, en ajoutant ainsi à la matière première une quantité d'eau égale à la quan- tité de microfiltrat sortant. Les exemples 1, 2, 4 et 5 ci-après sont illustratifs de cette technique. L'invention a également pour objet les produits obtenus par le procédé cidessus décrit. Le blanc d'oeuf ou l'entier d'oeuf, ou les rétentats respectifs, délysozy- més sont utilisables en l'état, sous forme liquide ou congelée, ou encore concentrés par évaporation, éventuel- lement supplémentés en additifs (sels, sucres, acide ascorbique) ou séchés. Le lysozyme contenu dans le micro- filtrat peut être, selon un procédé connu, concentré et purifié par ultrafiltration sur membrane de porosité com- prise entre 2 000 et 10 000 daltons, puis déshydraté par lyophilisation ou séchage par atomisation. L'invention concerne un produit à base de blanc d'oeuf ou/et d'entier d'oeuf, appauvri en lysozyme, mais conservant par ailleurs toutes les autres propriétés et caractéristiques du produit naturel ainsi que le lysozyme de pureté élevée extrait par le procédé de l'invention. L'invention sera maintenant illustrée sans être aucunement limitée par les exemples qui suivent: Exemple 1 7 kg de blanc d'oeuf d'une teneur de 4,5 g/kg en lysozyme sont préalablement déchalazés et homogénéisés. Ils sont ensuite dilués dans 14 kg d'eau salée à 5 g/kg de chlorure de sodium. Le mélange est microfiltré à l'aide d'un dispositif de microfiltration comprenant un module de microfiltration SFEC équipé de membranes M 6-4 d'une surface égale à 0,113 m2. Les conditions opératoires sont les suivantes: température de microfiltration de 40 C, pression d'entrée dans le module de microfiltration de 2 bars, vitesse de circulation dans le module de microfil- tration de 1 à 8 m/s, préférablement 4 à 6 m/s. On réalise, dès le début de la microfiltration, une diafiltration du blanc d'oeuf dilué (ajout en continu d'une quantité d'eau égale à la quantité du microfiltrat sortant). La diafiltration dure 4 h puis on effectue la concentration du mélange pour obtenir les 7 kg de blanc d'oeuf initiaux. On recueille d'autre part 45 kg de micro- filtrat contenant 0,46 g/kg de lysozyme. Le rendement d'extraction en lysozyme est de 65,7 %. Cette solution est ensuite ultrafiltrée de manière connue afin de concen- trer le lysozyme. Le concentré obtenu est séché ou lyophi- lisé. Exemple 2 ,28 kg de blanc d'oeuf contenant 4,08 g/kg de lysozyme sont déchalazés et homogénéisés. Ils sont ensuite dilués dans 15,84 kg d'eau salée à 5 g/kg de chlorure de sodium. Le mélange est microfiltré sur un dispositif de microfiltration, comprenant un module de microfiltration SFEC M6-1000 d'une surface de membrane égale à 0,113 m2 à une température de 42 C et une pression d'entrée de 2 bars, à une vitesse de circulation dans le module de micro- filtration de 6 m/s. On réalise une diafiltration du mélange pendant 4 heures et on concentre le mélange jusqu'à l'obtention des 5,28 kg de blanc d'oeuf initiaux. On recueille d'autre part 51,3 kg de microfiltrat contenant 0,32 g/kg de lysozyme. Le rendement d'extraction est de 76 %. Le microfiltrat est ensuite concentré par ultrafil- tration, de manière connue, puis séché ou lyophilisé. Exemple 3 6,9 kg de blanc d'oeuf déchalazés et homogénéi- sés sont additionnés de 13,3 kg d'eau salée à 5 g/kg et portés à 40 C. Le mélange est microfiltré sur un dispositif de microfiltration comprenant un module Norton équipé de 0,0248 m2 de membranes céramiques ayant une porosité de 0,5 p. La pression d'entrée est de 2,5 bars et la pression de sortie de 0,5 bar. La vitesse de recirculation est de 8 m/s. Le volume de liquide dans la cuve de recirculation est maintenu constant par recyclage du perméat. L'expéri- mentation dure 1 h 45. Le débit de microfiltration varie -1 -2 - 3.1 -2 de 27 1.h.m2 à 23 1.h l.m2. La teneur en lysozyme du liquide retenu par les membranes de microfiltrat est de 2,14 g/kg. La teneur en lysozyme du microfiltrat est de 1 g/kg. La performance d'extraction du lysozyme dans les conditions utilisées varie donc de 23 à 27 g/h/m2. La pureté en lysozyme dans le microfiltrat de fin d'expéri- mentation est voisine de 99 %. Exemple 4 4 kg d'entier d'oeuf contenant 3,27 g/kg de lyso- zyme sont déchalazés et homogénéisés. Ils sont ensuite dilués dans 16 kg d'eau salée à 5 g/kg de chlorure de sodium. Le mélange est microfiltré sur un dispositif de microfiltration SFEC M6-4 d'une surface de membrane égale à 0,113 m2, à une température de 44 C et une pression d'entrée de 2 bars, à une vitesse de circulation dans le module de microfiltration de 6 m/s. On réalise une diafil- tration du mélange pendant 4 heures et on concentre le mélange jusqu'à l'obtention des 4 kg d'entier d'oeuf ini- tiaux. On recueille d'autre part 50,7 kg de microfiltrat contenant 0,13 g/kg de lysozyme. La pureté du lysozyme dans le microfiltrat est supérieure à 94 %. Le rendement d'extraction en lysozyme est de 50 %. EXEMPLE 5 880 kg de blanc d'oeuf contenant 4,5 g/kg de lyso- zyme sont déchalazés et homogénéisés. Ils sont ensuite dilués dans 1 750 kg d'eau salée à 5 g/kg de chlorure de sodium. Le mélange est microfiltré sur une installation industrielle de microfiltration comprenant un module SFEC de type M6-4ayant une surface membranaire égale à 5- 7 m2. Les conditions opératoires sont les suivantes: - température de microfiltration: 40 C - pression d'entrée dans lemodule de microfiltra- tion: 2 à 3 bars - vitesse de circulation dans le module de micro- filtration: 4 m/s. On réalise, dès le début de la microfiltration, une dia- filtration du blanc d'oeuf dilué. L'expérimentation dure heures. La teneur en lysozyme du microfiltrat moyen est de 0,8 g/kg. La performance d'extraction moyenne du lysozy- me est de 24 g/h/m2. La pureté du lysozyme dans le micro- filtrat moyen est de 80 %. EXEMPLE 6 310 kg de blanc d'oeuf contenant 4.21 g/kg de lysozyme sont préalablement déchalazés et homogénéisés. Ils sont ensuite dilués dans 750 kg d'eau salée à 5 g/kg de chlorure de sodium. Le mélange est microfiltré sur une installation industrielle de microfiltration comprenant un module SFEC de type - M6-4 ayant une surface mem- branaire égale à 5,7 M2. Les conditions opératoires sont les suivantes: - température de microfiltration: 42 C - pression d'entrée dans le module de micro- filtration: 2 à 3 bars - vitesse de circulation dans le module de mi- crofiltration: 5M/S. On concentre le blanc d'oeuf dilué jusqu'à l'ob- tention de 124 kg de blanc d'oeuf concentré d'une teneur en extrait sec de 26%. La teneur en lysozyme du micro- filtrat est de 0,56 g/kg. Le rendement en extraction dulysozyme dans le microfiltrat moyen est de 40O%. il REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention de lysozyme à partir d'une matière première à base de blanc d'oeuf, caractérisé en ce qu'on soumet une matière première fluide à base de blanc d'oeuf à au moins une microfiltration, par mise en contact de ladite matière sous pression et sous flux tan- gentiel avec une membrane capable de séparer les particules ayant une taille comprise entre 0,02 micron et 10 microns environ, ce qui fournit d'une part un microfiltrat passant à travers la membrane et contenant au moins une fraction du lysozyme de la matière première et d'autre part un produit retenu par la membrane, qui conserve les propriétés naturelles de la matière première à base de blanc d'oeuf mais est appauvri en lysozyme. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière première à base de blanc d'oeuf est le blanc d'oeuf lui-même et/ou l'entier d'oeuf. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la matière première à base de blanc d'oeuf est diluée au préalable avec de l'eau conte- nant des sels ou sucres solubles, tels que, respectivement le chlorure de sodium et le glucose ou le saccharose. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que la matière première à base de blanc d'oeuf est additionnée d'une substance antioxydante, telle que l'acide ascorbique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que, lors de la mise en oeuvre de la microfiltration, on réalise une diafiltration de la matière à base de blanc d'oeuf en lui ajoutant en continu une quantité d'eau égale à la quantité de microfil- trat sortant. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce que le microfiltrat con- tenant le lysozyme est concentré et purifié par ultrafil- tration de manière connue puis déshydraté par lyophili- sation ou séchage par atomisation. 7. Lysozyme obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, notamment sous forme de poudre. 8. Produit retenu par la membrane de microfil- tration mise en oeuvre dans le procédé selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, et consistant en une matière à base de blanc d'oeuf appauvrie en lysozyme mais conservant toutes les propriétés et caractéristiques du produit naturel. 9. Produit selon la revendication 8, consistant en un blanc d'oeuf ou un entier d'oeuf ou en un rétentat de microfiltration, en l'état ou sous forme liquide, congelée, concentrée par évaporation, ou séchée. 10. Produit selon la revendication 9, contenant divers additifs, tels que des sels ou sucres, par exemple chlorure de sodium, glucose, saccharose, ou un antioxydant, par exemple l'acide ascorbique.