Brevet FR2561256A1 — publié le 19850920

Procédé de purification de particules biologiques de type antigène HBs, par ultracentrifugacion de flottation sur gradient de densité. L'invention concerne un procédé de purification, par ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité, de particules constituées de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B ou antigène HBs ou de toutes autres particules biologiques ayant des propriétés physiques (taille et densité) analogues, obtenues à partir de sérums ou de plasmas sanguins. La préparation de vaccins contre le virus de l'hépatite B à partir de l'antigène HBs, obtenu à partir de sérums ou de plasmas sanguins humains, nécessite une purification d'un très haut degré. En effet, ce haut niveau de pureté est recommandé par l'0rganisation Mondiale de la Santé. Cette recommandation est justifiée par le fait que l'étape d'inactivation de virus potentiellement contaminants doit être effectuée sur un matériel de très haute pureté pour qu'elle soit pleinement efficace. Un procédé pour obtenir un haut degré de purification des particules d'antigène HBs,préalablement concentrées et prépurifiées (par précipitation des immuncomplexes et par fractionnement de vélocité), c1est-à-dire une séparation efficace de ces particules et des impuretés constituées desprotéines sériques les accompagnant, consiste à soumettre la solution ou la suspension de ces particules (désignée ci-après "échantillon à purifier") à une ultracentrifugation isopycnique (c'est-à-dire à une ultracentrifugation de densité). L'ultracentrifugation isopycnique consiste à déposer l'échantillon à purifier sur un gradient de densité préformé ou autoformé et à faire migrer sous l'effet de la force centrifuge les particules et les impuretés jusqu'à leurs zones isodenses respectives ; après centrifugation, le fractionnement du gradient par un moyen classique permet de recueillir séparément les particules et les impuretés. Généralement, l'échantillon à purifier, préparé de façon que sa densité soit inférieure à celle de la couche la moins dense du gradient, est introduit au-dessus des couches légères du gradient ; les particules et les impuretés migrent dans le sens de la force centrifuge. Un inconvénient majeur de l'ultracentrifugation isopycnique est que les particules et les impuretés (telles que notamment les protéines sériques) migrent dans le meme sens vers les couches les plus denses ; les particules d'antigène HBs s'arrêtent les premières (dans la zone de densité 1,20 en gradient de chlorure de césium) et les impuretés (protéines sériques de densité 1 1,30 en gradient de chlorure de césium) traversent la zone isodense des particules pour rejoindre leur propre zone isodense.Comme ces impuretés ont une constante de sédimentation (pour les protéines seriques : S20 wu 20 S) plus faible que celle des particules (pour l'antigène HBs : S20,w = 40 à 50 S), elles migrent plus lentement dans le gradient et il en résulte un phénomène de traînes de ces impuretés qui contaminent la zone isodense des particules. L'ultracentrifugation isopycnique ne permet donc pas d'obtenir une séparation suffisamment satisfaisante de ces particules. On a maintenant trouvé un nouveau procédé de purification des particules biologiques, telles que les particules d'antigène HBs. Ce procédé consiste à soumettre lesdites particules, préalablement concentrées et prépurifiées, à une ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité. L'ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité consiste à augmenter, par addition d'un sel approprié, la densite apparente de l'échantillon à purifier jusqu'à une valeur sensiblement égale à celle des impuretés- à séparer, puis à l'introduire dans les couches denses du gradient ; sous l'effet des forces centrifuges, les particules (dont la densité est inférieure à celle de l'échantillon proprement dit) migrent dans le sens opposé des forces centrifuges. L'ultracentrifugation selon l'invention est réalisée avec un gradient de densité à faible viscosité et une force centrifuge d'au moins 20 000 g pendant un temps suffisant pour que les particules à séparer rejoignent leur zone isodense. Pour l'antigène HBs, on utilise avantageusement un gradient de densité de chlorure de césium qui permet l'obtention de gradients de faible viscosité appropriés à la migration des particules d'antigène HBs ; les particules d'antigène HBs ont alors une densité d'environ 1,20 alors que les impuretés (protéines sériques) ont une densité d'environ 1,30. L'ultracentrifugation est avantageusement réalisée dans une ultracentrifugeuse de petite taille (par exemple de type MSE) équipée d'un rotor zonal (par exemple du type BXV). Un avantage essentiel de l'ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité est que les particules (notamment celles de l'antigène HBs) migrent vers les couches légères du gradient, tandis que la très grandè majorité des impuretés (protéines sériques) stationnent à leur position de départ ; il en résulte qu'après centrifugation les particules sont massées dans leur zone isodense sans que celle-ci soit contaminée par les impuretés qui n'ont pu å aucun moment traverser les couches du gradient. La séparation obtenue est alors très satisfaisante. L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans les exemples ci-après en référence aux dessins annexés sur lesquels Fig. 1 représente schématiquement le rotor de l'ultracentrifugeuse et la disposition de la gamme des composants (solutions de chlorure de césium et échantillon) en fin de chargement du rotor. Fig. 2 représente les positionnements respectifs des impuretés et des particules d'antigène HBs dans le rotor après 44 h à- 31 000 tr/min. Fig. 3 représente l'enregistrement des densités optiques des fractions recueillies après centrifugation. Exemple 1 Une suspension d'antigène HBs concentrée, issue d'un processus de centrifugations zonales de vélocité, est soumise à une ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité de chlorure de césium. Un rotor 1 de type BgV muni d'un noyau 2, adapté sur une ultracentrifugeuse MSE, est mis en rotation jusqu'à 2000 tr/min. Les solutions de chlorure de césium ainsi que l'échantillon à purifier sont introduits à l'aide de la pompe 3 dans le rotor par sa périphérie par la canalisation 4, à raison de 35 ml/min par ordre croissant de densité (voir figure 1). Sur cette figure 1, on a représenté schématiquement les zones I à VI occupées par les solutions de sel et l'échantillon à purifier après leur introduction dans le rotor. Le tableau ci-après indique l'ordre d'introduction, les densités apparentes et les volumes. Ordre Solutions de sel ou Densité Volume d'introduction échantillon à purifier apparente (ml) I chlorure de césium 1,15 300 II " n 1,20 300 III n n 1,26 300 IV n " 1,29 300 V échantillon à purifier 1,33 400 VI chlorure de césium 1,36 50 Le chargement étant effectué, le rotor est accéléré à 31 000 tr/min, ce qui crée une force centrifuge d'environ 90 000 g ; cette force est appliquée pendant environ 44 h de façon à permettre aux particules de HBs de rejoindre, tout en traversant le gradient linéaire de densité obtenu, leur zone isodense. La densité apparente des impuretés étant sensiblement de 1,30, celle des particules d'antigène RBs étant de 1,2, seules les particules d'antigène HBs migrent vers leur zone d'équilibre 5 (voir figure 2). La récupération des particules s'opère de manière classique après retour du rotor à une vitesse de 2000 tr/min. L'enregistrement en continu de la densité optique à 280 an de fractions recueillies est représenté sur la figure 3 (en abscisses : n0 des fractions - ordonnées : densité optique -à 280 nm). I1 permet de constater une très bonne séparation des particules d'antigène HBs et des impuretés. Exemple 2 L'essai ci-après met en évidence le haut degré de purification obtenu selon le procédé de l'invention. A une préparation de protéines sériques, on a ajouté une quantité minime d'antigène HBs pour servir de marqueur sans affecter sensiblement la concentration des protéines sériques. Cette préparation a été séparée en deux fractions égales - une fraction a été soumise à une ultracentrifugation isopycnique (fraction A), - l'autre fraction a été soumise à une ultracentrifugation sur flottation de densité selon l'invention (fraction B). Après centrifugation, les fractions présentant une activité HBs ont été rassemblées et analysées (mesure de la densité optique à 280 nm et mesure de l'activité HBs exprimée en unités hémagglutinantes - U.H.A - par un test d'hémagglutination passive sur hématies enrobées d'anticorps anti-HBs). On a obtenu les résultats suivants d'activité spécifique (U.H.A./DO à 280 nm) pool de fractions HBs issues de la fraction A : 530 pool de fractions HBs issues de la fraction B : 8600 Ces r ésultats indiquent que le degré de pureté de l'antigène HBs obtenu par ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité est 16 fois plus élevé que celui de l'antigène HBs obtenu par ultra centrifugation isopycnique. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de particules biologiques de type antigène HBs, obtenues à partir de sérums ou de plasmas sanguins, caractérisé en ce qu'il consiste à augmenter la densité de l'échantillon à purifier jusqu'à une valeur sensiblement égale à la densité des impuretés à séparer, à soumettre ledit é-chantillon à une ultracentrifugation de flottation sur gradient de densité en déposant ledit échantillon dans les couches denses d'un gradient de densité à faible viscosité et en appliquant une force centrifuge d'au moins 20 000 g pendant untemps suffisant pour que les particules d'antigène HBs migrent vers leur zone isodense caractéristique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules biologiques sont des particules d'antigène KBs et en ce que le gradient de densité est obtenu à partir de solutions de chlorure de césium. 3. Procédé selon l'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que l'ultracentrifugation est effectuée à 90 000 g pendant 44 heures.