Brevet FR2564839A1 — publié le 19851129

Conjugués associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule et leur utilisation comme agents potentialisateurs des immunotoxines. La présente invention concerne des nouveaux conjugués associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule. Elle concerne également l'application desdits conjugués à titre de potentialisateurs des immunotoxines. Dans sa demande de brevet français nO 82-02 091, la Demanderesse a mentionné la capacité que présentent les ionophores carboxyliques de potentialiser les immunotoxines. Par immunotoxines, on désigne des substances anticancéreuses obtenues par couplage, par liaison covalente, d'une protéine cytotoxique (par exemple la chaîne A de la ricine) avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre un antigene porté par une cellule à détruire. De telles immunotoxines ont notamment été décrites par la Demanderesse dans le brevet français nO 78/27838 et son addition nO 79/24655 et dans les demandes françaises n" 81/07536 et nO 81/21836. Les propriétés potentialisatrices des ionophores ont pu être utilisées avantageusement dans certains types de situations. En particulier, ils donnent des résultats favorables à chaque fois qu'une immunotoxine est utilisée en tant qu'agent cytotoxique selectif in vitro pour détruire les cellules-cibles. C'est notamment le cas lorsque 1' immunotoxine est utilisée comme agent cytotoxique dans ie traitement de la moelle osseuse de patientos leucémiques à qui la moelle osseuse ainsi traitée sera ultérieurement transplantée.C'est également le cas lorsque 1' immunotoxine est utilisée pour réduire la population de cellules T d'un greffon en vue d'applications de greffe allogénique de moelle osseuse dans le but de prévenir les désordres liés à la réaction du greffon contre lthôte. Par contre, lorsque I' immunotoxine est utilisée in vivo en tant qu'agent thérapeutique chez l'homme, l'emploi in vivo d'un ionophore afin de bénéficier de l'effet potentialisateur connaît certaines limitations inhérentes - à la toxicité propre des ionophores; - à leur faible solubilité dans les solvants appropriés aux administrations parentérales; - à leur élimination très rapide du plasma sanguin. Selon la présente invention, il a été trouvé que, d'une façon surprenante, ces limitations pouvaient être éliminées en remplaçant les ionophores carboxyliques par des conjugués associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule, telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide, etc. Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet, en tant que produits nouveaux, des conjugués (molécules artificielles mixtes) Construits par liaison covalente d'un ionophore carboxylique monovalent avec des macromolécules (tels des anticorps, des protéines, des ligands peptidiques). Dans la suite de cette demande, de tels conjugués seront désignés sous le nom de "conjugués ionophores". Les ionophores utilisés sont des molécules connues : ce sont notamment des substances naturelles iso lées à partir de souches de champignons Streptomycetes qui comportent un squelette hydrocarboné dans lequel sont inclus des hétérocycles oxygénés. A une extrémité de la chaîne, il existe toujours une fonction acide carboxylique tandis qu'à l'autre extrémité se trouvent une ou plusieurs fonctions alcool (B.C. Pressman, Annual Review of Biochemistry, 45, 501-530, 1976). Ces substances naturelles, ainsi que certains composés hémisynthétiques qui en dérivent, possèdent en commun une activite ionophore, c'est-à-dire la capacité de permettre le transfert d'ions métalliques (et notamment d'ions monovalents) d'une phase hydrophile à une phase lipophile non miscibles. Les macromolécules utilisées peuvent être des anticorps (ou des fragments d'anticorps), des protéines (telles des hormones peptidiques ou des protéines humains, par exemple la sérum-albumine humaine), des ligands peptidiques (tels des polypeptides naturels ou synthétiques et en particulier la polylysine). Dans le cas où l'on utilise un anticorps, celui- ci peut être soit de caractère polyclonal s'il résulte d'une immunisation classique conduite chez l'animal, soit de caractère monoclonal s'il est produit par un clone de cellules hybrides obtenues par fusion entre lymphocytes et cellules de myélome. Cet anticorps pourra être utilisé soit sous la forme de molécules entières d'immunoglobuline comportant la capacité à reconnaître l'antigène choisi, soit sous la forme de tout fragment de ces molécules d'immunoglobuline ayant conservé la capacité à rcconnaître l'antigène choisi, et an particulier les fragments connus sous les appellations de F(ab')2, Fab et Fab'. Le couplage chimique entre les macromolécules et l'ionophore peut être réalisé par diverses méthodes sous réserve que la méthode choisie - préserve les activités biologiques respectives des composants du conjugué; - assure une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage; - permette de maîtriser la valeur du rapport ionoph.ore /macromolécule dans le conjugué obtenu; - conduise à un produit stable et soluble dans l'eau. Parmi toutes les méthodes de couplage chimique répondant à ces caractéristiques, on peut choisir çelles qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour l'établissement de la liaison. Dans ce cas, on peut utiliser un groupement thiol artificiellement in troduit. sur l'un des composés à coupler, et introduire sur l'autre composé une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les fonctions thiol, et ceci en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9, à une température ne dépassant pas 30"C, pour fournir une liaison stable, covalente et définie. Par exemple, on peut introduire artificiellement un thiol sur les ionophores par action de l'anhydride S acétyl-mercapto-succinique qui sera capable d'acyler une des fonctions alcool de l'ionophore. On pourra ensuite libérer cette fonction thiol par élimination du radical acétyl protecteur par action de l'hydroxylamine ainsi que cela a déjà été décrit (Archives-of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, 1967). Le couplage sera alors réalisé avec la macromolécule sur laquelle on aua introduit une ou plusieurs fonctions susceptibles d'établir une liaison covalente avec le thiol. Cette liaison covalente pourra être soit une liaison disulfure, soit une liaison thioéther. Cas de la Liaison disuLfure Dans ce cas, la préparation du conjugué peut être représentée par le schéma ISH + P-R-S-S-X --c I-S-S-R-P + XSH dans lequel I représente l'ionophore à coupler, P la macromolécule à modifier, -S-S-X désigne un groupement du sulfure mixte activé dont X est le radical activateur. La macromolécule substituée par un atome de soufre activé est obtenue à partir de la macromolécule elle-même, par substitution à l'aide d'un réactif luimême porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma P + Y-R-S-S-X ~ P-R-S-S-X dans lequel P est la macromolécule à modifier, Y représente une fonction permettant la fixation co- valente du réactif sur la protéine, R désigne un groupement pouvant porter simultanément les substituants Y et -S-S-X, X désigne le radical activateur. Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quel- conque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, les fonctions aminées terminales des radicaux lysyle contenues dans la protéine sont particulièrement indiquées. Dans ce cas, Y pourra notamment représenter - un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonc tions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diéthylb amino-3 propyl)-3-carbodiimides - un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler, - un ester dit "active" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou dinitro-phényle, ou encore un ester de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler, - un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel, par exemple, l'anhydride succinique qui réagit spon tanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides, - un groupement imidoester où R1 est un groupe alkyle réagissant avec les groupes aminés de la macromolécule gelon la réaction Le radical -S-S-X désigne un bisulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En particulier, dans le du sulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle, de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle, tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et S-S-X. Il devra etre choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe -(CH2)n avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe dans lequel R4 désigne l'hydrogene ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone, et R3 désigne un substituant inerte vis- -vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe carbamate ou R5 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé Y-R-S-S-X avec la macromolécule P est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs I'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'à 30% en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à 24 heures. Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire, et en particulier les excès de réactif. Ce procédé permet d'introduire un nombre de substituants par mole de macromolécule habituellement compris entre 1 et 50. En utilisant de tels composés, le couplage de la macromolécule et de l'ionophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés à une température ne dépassant pas 300C pendant un temps variant de quelques minutes à 1 jour. La solution aqueuse obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire. Cas de la liaison thioéther La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir I-SH avec ia protéine P, sur laquelle aura préalablement été introduit un radical maléimide. La réaction est alors représentée par le schéma dans lequel Z représente une structure d'espacement, aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 10 atomes de carbone. La protéine P substituée par le maléimide est obtenue à partir de la protéine P elle-même, par substitution de fonctions aminées de la protéine à l'aide d'un réactif lui-même porteur du groupement maléimide, selon le schéma : dans lequel Y1 représente - soit un groupe carboxylique, la réaction étant alors effectuée après activation de la fonction carboxylique en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbo diimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau, tel que l'éthyl-1 (diéthylamino-3 propyl)-3-carbo diimide, - soit un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou dinitrophényle,ou encore un ester de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler. La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvetica Chimica Acta, 58, 531-541 (1975). D'autres réactifs de la même classe sont commercialement disponibles. La réaction du composé avec l'ionophore est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'à 20% en volume d'un solvant organique miscible à l'eau, tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques heures à 24 heures. Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 50. En utilisant de tels composés, le couplage de la macromolécule avec 1' ionophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés à une température ne dépassant pas 300C pendant un temps variant de quelques heures à un jour. La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. Selon un second aspect, l'invention concerne l'utilisation des conjugués ionophores comme potentialisateurs des immunotoxines. Les études effectuées sur les conjugués ionophores ont montré que - l'effet potentialisateur des ionophores est préservé après couplage avec la macromolécule. La liaison de 1T ionophore à la macromolécule apporte à celui-ci une grande solubilité en milieu aqueux favorable à l'administration in vivo du produit; - la liaison de l'ionophore à la macromolécule allonge considérablement le temps de demi-vie plasmatique de I' ionophore, ce qui est essentiel au maintien de l'effet potentialisateur in vivo; - la toxicité du conjugué est plus faible que celle de 1' ionophore lui-même. Ainsi, pour chaque patient, on dirigera vers les cellules-cibles au moins deux substances effectrices indispensables au résultat - d'une part, une protéine cytotoxique (telle que par exemple la chaîne A de ricine) qui sera l'effecteur cytotoxique inclus dans le conjugué dit immunotoxine; - d'autre part, l'ionophore (tel que par exemple la monensine) qui est le constituant du système poten tialisateur inclus dans le conjugué dit conjugué ionophore. Dans le cas où l'ionophore est couplé à une macromolécule possédant un récepteur à la surface des cellules-cibles (par exemple lorsque la macromolécule sera un anticorps ou un fragment d'anticorps reconnaissant un antigène spécifique de la population cellulaire à détruire différent de celui reconnu par 1' immunotoxine) ou bien si l'ionophore est couplé à une hormone peptidique possédant un récepteur à la surface des cellules à détruire, la probabilité pour que les deux cibles choisies soient présentes ensemble à la surface des cellules non cibles devient très faible et l'on dispose ainsi d'un moyen extrêmement puissant pour augmenter encore le caractère spécifique de la cytotoxicité des immunotoxines. La présente invention concerne donc également l'association médicamenteuse d'au moins une immunotoxine et d'au moins un conjugué ionophore selon l'invention. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre l'anticorps T 29-33 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol. a) Anticorps T 29-33 Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T 200 des leucocytes humains. Cet anticorps est décrit dans J. Exp. Med., 1980, 152, 842. il est commercialement disponible auprès d'Hybritech Inc., San Diego - California - USA. b) Anticorps T 29-33 activé A 2 ml d'une solution d'anticorps T 29-33 à 10 mg/ml (soit 0,133 micromole d'anticorps) est ajoutée une solution aqueuse contenant 3 mg d'acide (pyridyl2-disulfanyl)-3-propionique préalablement dissous dans le butanol tertiaire et 1,8 mg d'ethyl-1-diméthyamino-3- propyl-3-carbodiimide. Le melange est agité 15 minutes à 30"C puis dialysé en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 (40 heures à 500 ml/h). Après dialyse, la solution protéique est centrifugée et l'on obtient 2,5 ml d'une solution à 6,6 mg d'anticorps modifié par ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 7,2 groupements activateurs par mole d'anticorps. c) Monensine activée La monensine utilisée est un produit commercial. Elle a été modifiée comme suit : 693 mg de monensine sont dissous dans le chloroforme puis mis en réaction avec 350 mg d'anhydride S-acétyl mercaptosuccinique (SAlISA) . On laisse la réaction évoluer une demi-heure à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec sous vide puis repris dans l'acétate d'éthyle et lavé extensivement à l'eau. La phase organique est ensuite séchée et tirée à sec sous vide. Le produit est cbtenu cristcllisé après séchage sous vide. Il est identifié par son spectre ROBIN et son spectre de masse. d) Préparation du conjugué ionophore 8 mg (soit 9 micromoles) de monensine activée sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 2,5 ml de la solution d'anticorps activé à 6,6 mglml (soit 0,11 micromole) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7. L'incubation dure 2 heures à 250C puis le milieu réactionnel est purifié par dialyse de L'excès de réactifs contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgG T 29-33 à 5,6 mg/ml portant en moyenne 7 monensines par mole d'anticorps. EXEMPLE 2 Potentialisation de L'imrnunotoxine anti-T65. Le conjugue selon l'invention, obtenu comme indiqué précédemment, a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques et plus spécialement sa capacité à potentialiser l'activité de l'immunotoxine anti-T65 dans un modèle cellulaire approprié. Ce modèle est constitué par des cellules de la lignée lymphoblastoide humaine CEM qui portent naturellament les antigènes T65 et T200. L'antigene T65 contre lequel est -dirigée l'immunotoxine utilisée constitue le premier antigène-cible du modèle. Cette immunotoxine est celle qui a été decrite dans une précédente demande de brevet de la Demanderesse déposée en France sous le numéro 81121836. L'dntigène T200 contre lequel est dirigé le conjugué ionophore sera ledeuxieme antigènecible du modèle. La propriété fondamentale des immunotoxines étant d'inhiber la synthèse protéique des cellulescibles, le test utilisé consiste à mesurer l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de celle décrite dans Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562, utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces determinations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisses la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnées I'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI 50). Les différents essais ont été conduits comme suit; les résultats expérimentaux correspondants sont présentés sur la figure n" I. a) Des cellules CEM sont incubées 18 heures en présence de concentrations connues d'immunotoxine anti-T65 utilisée à titre de référence, puis les cellules sont soumises à l'étape d'incorporation du traceur radioactif. La CI 50 obtenue est de 2,8.10-11 M (courbe 1), ce qui montre que les cellules sont normalement sensibles à l'effet de l'immunotoxine. b) Les cellules CEM sont incubées 18 heures à 370C en presence d'un mélange de concentrations connues d 'immunotoxine anti-T65 et respectivement 1. soit de monensine libre à la concentration de 50 nM (courbe 2); 2. soit de conjugué ionopnore anti-T200 préalablement decrit, à la concentration de 10 8 M (soit 70 nM en monensine) (courbe 3). Il a été préalablement vérifié que la monensine et le conjugué ionophore ne sont pas cytotoxiques pour les cellules employées aux concentrations indiquées. Les CI 50 obtenues sont respectivement 2,4.10-14 M pour la monensine SO nM 1,4-10-14 M pour le conjugué ionophore 10 8 M. Ces résultats montrent des effets potentialisateurs remarquables, d'un facteur de 1000 fois pour la monensine 50 nM et de 2000 fois pour le conjugué ionophore à la concentration de 10 M (soit 70 nM en monensine). EXEMPLE 3 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre L'anticorps 3E10 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur Laquelle on a introduit un thiol. a) Anticorps 3E10 Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène membranaire humain. Il a été obtenu lors d'une fusion lymphocytaire anti-cellules de mélanome humaines SK MEL 28. L'hybridome a été cloné et multiplié; l'anticorps a été produit en ascite puis purifié sur pro téine A Sepharose. b) Anticorps anti-3E10 activé Cet anticorps est obtenu à partir de l'anticorps ci-dessus selon une technique décrite à l'exemple 1. On a ainsi obtenu i95 mg d'anticorps 3E10 possédant 8 groupements activateurs par mole d'anticorps. c) Monensine activée La monensine est activée selon la méthode décrite à l'exemple 1. d) Préparation du conjugué ionophore 91 mg de monensine activée (soit 104 micromoles) sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 50 ml de la solution d'anticorps activé à 3,9 mg/ml (soit 1,3 mlcromole) dans le tampon phosphate 125 mM ph 7. L'incubation dure 2 heures à 25 C, puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactif par dialyse contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 m, pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgG à 3,7 mg/ml portant en moyenne 8 monensines par IgG. EXEMPLE 4 Toxicité du conjugué 3E10-monensine. Le conjugue 3E10-monensine a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques in vivo. Plus spcialement, sa toxicité et sa pharmacocinétique ont été comparées à celles de la monensine libre. La toxicité de la monensine libre a été déterminée chez la souris. La dose letale 50 % après injection I.V. est de 4 mg/kg, soit 80 microgrammes/souris. La toxicité du conjugué a été testée sur souris en administration unique également par voie I.V. Pour les souris de chaque lot, le produit a été injecté par voie intraveineuse aux doses suivantes : 3,7 mg, 1,85 mg, 0,952 mg, 0,496 mg de conjugué, soit respectivement i'équivalent de 163 ug, 81,5 pg, 40,75 us, 20,4 us de monensine. Aucune mortalité n'a été observée dans aucun des lots de souris. EXEMPLE 5 Pharmacûcinétique du conjugue -3e10-monensine. La pharmacocinétique a été étudiée chez la souris nude femelle à l'aide du conjugué ionophore décrit à ltexemple 3. On injecte aux souris - soit 1 ml de conjugué ionophore à 3,7 mg/ml (soit 163 us de monensine couplée), - soit 163 us de monensine libre (lot témoin). Pour chaque temps, les plasmas de deux souris sont prélevés. La monenainc active est dosée dans les plasmas par dilution de ceux-ci et comparaison avec une courbe-étalon de monensine libre dans le test d'inhibition de la synthèse protéique décrit à l'exemple 1. Le dosage est effectué sur des cellules CEM en présence de l'immunotoxine anti-T65. Les résultats sont présentés à la figure 2 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en heures et en ordonnées la concentration en monensine en pg/ml. Ces résultats montrent 1) que la monensine libre ne peut pas etre mise en évi dence dans les plasmas (sauf au temps zéro ou l'on retrouve une concentration plasmatique de 5.10 7 M, soit environ 0,5 pg/ml, soit dans la masse sanguine totàle de la souris une quantité égale à 0,007 Z de la dose injectée). 2) Dans le cas du conjugué, on observe que le conjugué peut être mis en évidence pendant au moins 8 heures à une concentration de l'ordre de 10 yg/ml soit en viron 1 x 10 5 M. Au bout de 24 heures, la concen tration retrouvée n' est plus que voisine de 1,5 ug/ml. Cette concentration est cependant 100 fois supérieure à celle nécessaire à l'activation maximale dans les conditions des essais in vitro. EXEMPLE 6 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre la sérumalbumine humaine (SA)- substituée par un groupement du sulfure activé et la monensine sur Laquelle on a introduit un thioL. a) Sérum-albumine humaine activée La SA a été obtenue à partir de la SA ci-dessus selon une technique analogue à celle décrite pour les anticorps dans les exemples précédents. On a ainsi obtenu 220 mg de SA possédant 16 groupements activateurs par mole d'albumine. b) Monensine activée La monensine est activée selon la méthode décrite à l'exemple 1. c) Préparation du conjugué ionophore 228 mg de monensine activée, soit 268 micromoles, sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 23 ml de la solution de SA activée à 9,4 mg/ml (soit 52,7 micromoles) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7. L'incubation dure 1 heure à 250C, puis le milieu réactionnel est dialyse contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM, pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 28 ml d'une solution de SA modifiée à 8,7 mg/ml portant en moyenne 16 monensines par mole d'albumine. EXEMPLE 7 Pharmacocinétique du conjugué SA-Monensine. La pharmacocinétique a été étudiée chez la souris nude mâle à l'aide du conjugué ionophore décrit à l'exemple 6. Le protocole expérimental utilisé est le même que celui décrit à l'exemple 5. Les résultats sont présentes à la figure 3 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en heures et en ordonnées la concentration en monensine en pg/ml. Ils montrent que 1) Comme dans le cas de l'exemple 5, la monensine libre ne peut pas être mise en évidence dans les plasmas. 2) Le conjugué peut être mis en évidence pendant au moins 4 heures à une concentration de l'ordre de 30 g/mT. Au bout de 8 heures, la concentration retrouvée n'est plus que de l'ordre de 6 pg/ml. Cette concentration est cependant 400 fois supérieure à celle nécessaire à l'activation maximale dans les conditions des essais in vitro. REVENDICATIONS 1. A titre de produits nouveaux, les conjugugués obtenus par couplage par liaison covalente d'un ionophore carboxylique monovalent et d'une macromolécule. 2. Conjugués selon la revendication 1, carac térisés en ce que la macromolécule est choisie parmi les anticorps, les fragments d'anticorps, les protéines, telles que les hormones peptidiques ou les protéines humaines et les ligands peptidiques. 3. Conjugué selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la macromolécule est un anticorps monoclonal. 4. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le couplage par liaison covalente est obtenu par une liaison disulfure ou une liaison thioéther. 5. Conjugué selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que la macromolécule est choisie parmi l'anticorps T 29-33, l'anticorps 3E10 et la serum-albumine humaine et le ionophore est la monens ine. 6. Procédé pour l'obtention des conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à introduire un groupement thiol sur l'un des composés à coupler; 2) à introduire -sur l'autre composé une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec lesdites fonctions thiol; 3) à faire réagir les deux composés ainsi obtenus en milieu aqueux, à pH compris entre 5 et 9 à une température inférieure à 300C. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'ionophore portant un groupement thiol avec une macromolécule sur laquelle on a introduit un groupement susceptible de réagir avec la fonction thiol, ce groupement étant de formule -S-S-X où X représente un radical activateur. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'ionophore portant un groupement thiol avec une macromolécule sur laquelle on a introduit un groupement susceptible de réagir avec la fonction thiol, ce groupement étant de formule dans laquelle Z est une structure d'espacement aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 10 atomes de- carbone. 9. Application des conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à titre d'agents potentialisateurs des immunotoxines. 10. Association médicamenteuse, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une immunotoxine et au moins un conjugué salon l'une quelconque des revendications 1 à 5.