Brevet FR2567892A1 — publié le 19860124

NOUVEAUX OLIGONUCLEOTIDES. LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS COMME MEDIATEURS DANS LE DEVELOPPEMENT DES EFFETS DES INTERFERONS L'invention a pour objet de nouveaux oligonu- cléotides, leur procédé de préparation et leur applica- tion biologique, comme médiateurs dans le développement de l'action des interférons, notamment dans le dévelop- pement d'une partie au moins de l'action antivirale des interférons. On sait que les interférons constituent une fa- mille de protéines caractérisées notamment par leurs propriétés antivirales. On a observé que l'effet antiviral des interfé- rons est médiatisé par la synthèse de protéines parti- culières. Des essais spécifiques ont permis d'identifier la fonction de deux d'entre elles, qui sont toutes les deux des enzymes (BAGLIONI C., 1979, Interferon induced enzymatic activities and their role in the antiviral state, Cell 17, 255-264). L'une d'entre elles est une oligonucléotide polymérase (2-5A synthétase). Cette oligonucléotide po- lymérase catalyse, après activation par les ARN bicaté- naires et à partir d'ATP, la synthèse d'une famille d'oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont des chaînes courtes d'adénosines reliées par des liaisons phosphodiester 2' ' 5' (KERR I. M. et BROWN R. E., 1978, pppA2'- p5'A2'p5'A: An inhibitor of protein synthesis synthe- sized with an enzyme fraction from interferon treated cells. PNAS 75, 256260) dont la formule générale peut être représentée par pppA(2'p5'A)n. Ces oligonucléotides peuvent être désignés par "oligonucléotides 2'-5'", notamment "oligoadénylates 2'-5" ou par (2'-5')tA) n L'un de ces oligoadénylates peut être représenté par la formule suivante: O (-) I (-)o-P=O O H H (-)O-P=O H. H N (-)-= - ooadénine lO I CH2 N H H H ribose OH O N N ! N (')O-P=O H CH N H H H H OH O0 N (-)O-P=o N N 0 H CH2 N H OH OH I1 est composé de chaînes courtes contenant plu- sieurs groupes adénosine (adénine + ribose), liés entre eux par des liaisons phosphodiester, comme représenté. et dans laquelle la position en 5' du noyau d'adénine de l'adénosine terminal est lié à un nombre variable de groupes phosphate (jusqu'à 3 sur l'oligoadénylate 2' ' représenté). Lorsque l'oligoadénylate 2' > 5' est totale- ment déphosphorylé. c'est-à-dire lorsque la position en ' du noyau d'adénine de l'adénosine terminal est libre du susdit nombre variable de groupes phosphate, le com- posé résultant est désigné par "noyau (2' À 5')A3", qui est une abréviation pour "noyau riboadénylyl (2' -- ') riboadénylyl (2') 5') riboadénosine". Les noyaux 2'-5' correspondant aux oligoadény- lates Dans la suite de la description, on désignera également par "oligoadénylate 2'-5' non modifiés" les oligoadénylates 2'5' induits dans les cellules traitées par de l'interféron. Il est convenu que l'expression "oligoadénylate 2' - 5'" mentionnée ci-dessus et utilisée ci-après dé- signera également, - par commodité de langage, le noyau (2'-5')(A) partiellement ou entièrement déphosphorylé. La découverte de ces oligoadénylates 2' -' -5' a révélé une nouvelle classe d'oligonucléotides biologi- quement actifs, que l'on suppose présenter un rôle im- portant comme médiateurs de l'action de l'interféron, notamment dans l'activation de l'endoribonucléase L, qui est présente aussi bien dans les cellules traitées par l'interféron que dans celles non traitées, et dans l'in- hibition de la synthèse des protéines. Mais les'liaisons phosphodiester 2' '- 5' de ces adénylates sont rapide- ment clivées par une enzyme désignée par 2'-phosphodies- térase (cf-. la référence de BAGLIONI mentionnée ci- dessus). L'endoribonucléase L ainsi que la 2'-phospho- diestérase sont présentes à des taux sensiblement égaux dans les cellules traitées ainsi que dans les cellules non traitées par l'interféron. Lorsque la cellule est traitée par l'interféron, la concentration d'oligonucléotide 2'-5' polymérase aug- mente. L'infection par certains virus de cellules ainsi traitées entraine la production au site de réplication virale d'ARN bicaténaires activant l'oligonucléotide 2'-5' polymérase. Il en résulte une augmentation, tran- sitoire et éventuellement localisée au site de réplica- tion du virus, de la concentration en oligoadénylate 2' ' (Nilsen T. W. et Baglioni C., 1984. Interferon 5, 3. Gresser Ed.. Academic Press, New York). Ces oligonu- cléotides activent eux-mémes en s'y liant spécifiquement l'endoribonucléase L qui dégrade les ARN messagers vi- raux. Lorsque l'interféron est enlevé du milieu de culture, l'activité de l'oligonucléotide 2' > 5' poly- mérase décroit et la cellule perd son état antiviral. La synthèse des protéines induites par l'inter- féron est transitoire et, par conséquent, les cellules maintenues dans les cultures de tissu ne maintiennent pas un niveau élevé de ces protéines. Par ailleurs, les oligoadénylates 2': 5' in- duits dans les cellules traitées par l'interféron pré- sentent l'inconvénient d'avoir une stabilité métabolique faible. En effet. les oligoadénylates 2' -'- 5; non mo- difiés sont. d'une part, rapidement hydrolysés par une phosphodiestérase spécifique dégradant la molécule de manière processive à partir de son ribose 2' terminal, d'autre part, sont dégradés sous l'action d'une phos- phatase du côté du premier ribose relié au nombre va- riable de groupes phosphate (Lebleu B. et Content 3., 1982, Interferon 3, 3. Gresser Ed., Academic Press. New York). Des recherches ont été entreprises pour trouver des composés analogues aux oligoadénylates 2' " 5' non modifiés et présentant une activité accrue, en comparai- son avec l'activité d'oligoadénylates 2' 5 induits dans les cellules traitées par l'interféron (BAGLIONI C. et coll., 1981, Analogs of (2'-5') oligo(A). Endonuclease activation and inhibition of protein synthesis in intact cells, The 3ournal of Biological Chemistry, vol. 256. n' 7, p. 3 253-3 257). Différentes recherches ont été effectuées pour synthétiser (par voie enzymatique et/ou chimique) des analogues modifiés des oligoadénylates 2' - 5' induits dans les cellules traitées par l'interféron, qui se- raient résistants aux actions de dégradation, sans per- dre leur activité biologique. Parmi ces recherches, on peut citer la synthèse enzymatique à l'aide de la 2-5A synthétase de "cordycé- pine 2) 5A" à partir de 2'déoxyadénosine triphosphate (DOETSCH et coll., 1981). La cordycépine a été considérée comme inhibant la synthèse des protéines en système acellulaire et le composé déphosphorylé correspondant ("core" ou "noyau") a été considéré comme bloquant la transformation blasti- que de lymphocytes humains. Ces résultats ont cependant été infirmés (CHAPEKAR M. S. et coll., 1983, Biochem. Res. Comm., , 137-143) et il semble que les effets observés aient été provoqués par l'accumulation de produits toxiques de dégradation de la cordycépine. On peut également citer, parmi les recherches effectuées, la synthèse chimique d'un analogue du noyau des oligoadénylates 2' ----+ 5', en série xylose (IMBACH J.3 L. et coll., 1981, Tetrahedron Letters, volt 22, n" 47, p. 4 699-4 702), dénommé "xylo 2'-5'A". Cet analogue s'est révélé présenter une stabilité plus im- portante vis-à-vis des phosphodiestérases que le noyau des oligoadénylates 2'-5' non modifiés, une activité intéressante vis-à-vis de virus à ADN, tel que l'Herpès, mais pas vis-à-vis de virus à ARN, (EPPSTEIN 0., et coll., 1983, Nature, 302, 723-724. On peut aussi mentionner la synthèse chimique et la modification à son extrémité 2' terminale un oligo- adénylate 2'-5'A en un composé appelé "tailed 2'-5'A" dans lequel une chaine d'hexylamine a été associée à un noyau morpholine, lui-même condensé par un groupe phos- phate sur le groupe OH en 2 du ribose terminal. Ce dé- rivé est très stable vis-à-vis des phosphodiestérases et active l'endoribonucléase L en système acellulaire (IMAI 3. et coll.. 1982, 3. Biochem. Chem., 257, 12 739-12 741), mais son activité antivirale n'a pas été établie. Parmi ces recherches, on peut également mention- ner la synthèse chimique de dérivés modifiés d'oligoadé- nylates 2'-5' tels que les dérivés du 2'-5'A triphospha- tés (représenté par la formule pppA2'p5'A2'p5A) dans lesquels les atomes de phosphore en bêta et gamma du groupe triphosphate en 5' sont séparés par un groupe mé- thylène. Une autre modification pour obtenir des oligo- adénylates 2'-5'A modifiés concerne le remplacement d'un groupe hydroxyle en 3' par un groupe OCH3, soit dans l'adénosine terminal, soit dans tous les adénosines (3. A. 3. DEN HARTOG et coll., 1981, 3. Org. Chem., 4&6, 2 242-2 251). Mais il s'est révélé que ces deux derniers groupes de composés étaient faiblement actifs, voire inactifs et ne présentaient pas une stabilité métaboli- que satisfaisante (cf. la référence mentionnée ci-dessus et BAGLIONI et coll., 1981, 3. Biol. Chem.. 256, 2 353- 2 357). D'autres analogues, tels que des 5'S-methylthio- phosphorothioates ont été synthétisés. Certains de ces analogues se sont révélés stables. Mais a priori. les différences apparentes des propriétés de ces analogues ne semblent pas permettre d'envisager leur utilisation sur des cellules humaines à des fins thérapeutiques (HAUGH M. C., CAYLEY P. 3. et coll., 1983, Europ. J. Biochem., 132, 77-84). Des recherches ont également porté sur l'inci- dence de la modification du ou des groupes phosphate portés par le carbone en 5' des oligoadénylates 2'-5' vis-à-vis de l'activité antimitogénique (cf. TORRENCE et coll. 1983, J. Medicinal Chemistry 26, n 12,1674-1678). Les composés préparés dans le cadre de ces recherches se sont révélés présenter une activité antimitogénique, mais on a trouvé que certains d'entre eux n'activent pas l'endoribonucléase L dans un système cellulaire in vi- tro, ce qui empêche d'établir une corrélation entre l'activité antimitogénique et l'action antivirale. D'autres oligonucléotides analogues des (2'-5')(A) ont été synthétisés par voie enzymatique en n remplaçant l adénosine, notamment par la 8azaadénosine, la toyocamycine, la sangivamycine. la formycine, la 8bromoadénosine, la tubercidine et la guanosine. Il s'est révélé que la plupart de ces composés étaient dé- gradés dans des extraits cellulaires. Seuls des tests d'inhibition de la synthèse des protéines et de la pro- lifération cellulaire ont été effectués dans des cellu- les intactes, mais l'activité antivirale n'a pas été établie (B. G. HUGUES et R. K. ROBINS, 1983, Biochemistry, 22, n' 9, 2 127-2135). Aucun des analogues des (2'-5')(A)n synthétisés à ce jour n'a présenté des propriétés de stabilité -tant vis-à-vis des phosphodiestérases quedes phosphatases-, et d'activité biologique suffisantes pour qu'on puisse envisager de les utiliser dans le traitement thérapeuti- que des affections virales. La Société Demanderesse a trouvé de nouveaux oligonucléotides ayant une structure différente de celle des oligoadénylates 2'-5'A non modifiés et de ses analo- gues connus, présentant une activité antivirale sembla- ble à celle de l'interféron, qui sont résistants vis-à- vis de la dégradation par la 2'-phosphodiestérase et par les phosphatases permettant d'envisager leur utilisation dans le traitement d'affections virales. L'un des aspects de l'invention est de proposer de nouveaux oligonucléotides qui peuvent être reconnus par l'endoribonucléase L, c'est-à-dire qui peuvent for- mer avec l'endoribonucléase L un complexe actif. Un autre aspect de l'invention est de proposer de nouveaux oligonucléotides qui ont une résistance ac- crue vis-à-vis de la dégradation par la 2'-phospho- diestérase. Un autre aspect de l'invention est de fournir de nouveaux oligonucléotides qui ont une résistance accrue vis-à-vis des phosphatases. Un autre aspect de l'invention est de fournir de nouveaux oligonucléotides biologiquement actifs, qui présentent notamment une activité antivirale efficace. Ces différents aspects sont obtenus par de nou- veaux oligonucléotides comprenant une chaine contenant n unités nucléosidiques, identiques ou différentes, n étant égal ou supérieur à 2, ces unités nucléosidiques étant reliées par des liaisons 2'-5', qui comprennent un groupe de liaisons contenant au moins un atome de phos- phore et dans lesquels: - la "première unité" nucléosidique de la susdi- te chaine est reliée par l'intermédiaire de son carbone en 5' à un nombre variable de groupes phosphate, et l'un des atomes d'oxygène d'au moins l'un des groupes phos- phate, lequel atome d'oxygène relié uniquement au phos- phore des groupes phosphate et n'intervenant pas dans la liaison entre deux groupes phosphate, est remplacé par un atome de soufre, de sélénium ou un groupe NH, et/ou l'une au moins des liaisons entre deux groupes phosphate adjacents comporte un groupe NH ou un atome de soufre; et/ou - la "dernière unité" nucléosidique de la susdi- te chaine est reliée, par l'intermédiaire de son atome de carbone en 2': soit à un groupe phosphoglycéryl, soit à un groupe phosphate, lequel est relié au carbone en 5' d'un "groupe nucléosidique modifié", dans lequel la liaison directe entre le carbone en 2' et 3' a été supprimée et les carbones en 2' et 3' sont res- pectivement porteurs de groupes aldéhyde ou de groupes alcool, éventuellement estérifiés. Ces différents aspects de l'invention sont de préférence obtenus par de nouveaux oligonucléotides com- prenant une chaîne contenant n unités nucléosidiques, identiques ou différentes, n étant supérieur ou égal à 2, ces unités nucléosidiques étant reliées par des liai- sons 2' - 5', qui comprennent un groupe de liaisons contenant au moins un atome de phosphore, et dans les- quels: - la première unité nucléosidique de la susdite chaîne est reliée, par l'intermédiaire de son carbone en S'. à des groupes phosphate, et l'un des atomes d'oxygè- ne d'au moins l'un des groupes phosphate, lequel atome d'oxygène relié uniquement au phosphore des groupes phosphate et n'intervenant pas dans la liaison entre deux groupes phosphate, est remplacé par un atome de soufre, un atome de sélénium ou un groupe NH, et/ou l'une au moins des liaisons entre deux groupes phosphate adjacents comporte un groupe NH ou un atome de soufre; - et éventuellement la "dernière unité" nucléo- sidique de la susdite chaîne est reliée, par l'intermé- diaire de son atome de carbone en 2': soit à un groupe phosphoglycéryl soit à un groupe phosphate, lequel groupe phosphate est relié au carbone en 5' d'un "groupe nu- cléosidique modifié", dans lequel la liaison directe entre le carbone en 2' et 3' a été supprimée, et les atomes de carbone en 2' et 3' sont porteurs de groupes aldéhyde, ou de groupes alcool, éventuellement estéri- fiés. Une unité nucléosidique désigne un composé cons- titué par un pentose lié à une base purique ou pyrimidi- que, dans laquelle le pentose peut être sous la forme pyrane ou furane. Dans la suite de la description, les formules représenteront les pentoses généralement sous la forme furane. Les unités nucléosidiques sont selon l'invention avantageusement constituées par des adénosines, l'adéno- sine désigne le composé constitué par du ribose lié à de l'adénine et peut être représenté par la formule: A 4, 1 t -- OH OH dans laquelle le ribose est sous la forme furane, mais peut être également sous la forme pyrane et dans laquel- le A représente l'adénine. Dans le cadre de l'invention, l'adénine désigne la molécule représentée par la formule suivante: NH2 1' 3 H Les unités nucléosidiques selon l'invention peu- vent également être constituées par des dérivés d'adéno- sines, les dérivés d'adénosine désignant le composé constitué par du ribose, lié à un dérivé de l'adénine. Parmi ces dérivés de l'adénine, on peut citer ceux de formule suivante: ll NH2 NH2. vH2 S N" o c=.o ( N9\ X NH2 NMI2 N2 I Les dérivés d'adénosine correspondants seront respectivement désignés par 8-azaadénosine, sangivamy- cine, toyocamycine, formycine, tubercidine, 8-bromo- adénosine. Le nombre d'unités nucléosidiques constituant les oligonucléotides de '1 invention n'est pas limité dans les valeurs supérieures, sous réserve que les oli- gonucléotides obtenus puissent être associés à un véhi- cule physiologiquement acceptable. Ce nombre peut rapidement être limité dans la mesure o l'augmentation de ce nombre et la synthèse correspondante plus difficiles ne seraient pas suppor- tées par une augmentation suffisante de l'activité. Le nombre d'unités nucléosidiques devrait être choisi de façon à ce que le poids moléculaire soit de préférence compris de 1 500 à 5 000 daltons. Dans une classe préférée d'oligonucléotides selon l'invention, la valeur de n n'est pas supérieure à , et est de préférence de 7 ou 8. Les oligonucléotides dans lesquels la valeur de n est 3 ou 4 sont particulièrement préférés. Dans une classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention, la première unité nucléosidique est liée à un ou plusieurs groupes phosphate. De préférence, le nombre de ces groupes phos- phate est de 1 à 3. Dans une classe préférée de composés de l'in- vention, la première unité nucléosidique est liée aux groupes phosphate suivants: O O 'O Il il 11 - O - P -OH - O - P - - P - OH I I I *OR' OR' OR" 0 0 000 Il I1 1l Ii Il - O - - O0 - P - 0 - P - POH, -- P - CH2 1 O OR"' OR' UUN OR R" dans lesquelles R', R", R"' représentent, indépendamment les uns des autres: - un atome d'hydrogène, - un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un méthyle, - un radical éthyle substitué en bêta par un groupe cyano, aryle ou arylsulfonyle, - un radical trihalogénoéthyle. Dans une classe préférée de composés selon l'in- vention, la liaison 2' 5' reliant deux unités nu- cléosidiques et comprenant au moins un atome de phos- phore est une liaison phosphodiester, une liaison phos- photriester, une liaison alcoylphosphonate. La liaison 2' -i 5' phosphodiester qui relie deux unités nucléosidiques adjacents dans les oligonu- cléotides selon l'invention peut être représentée comme suit: base 0 il OH La liaison 2---- 5' phosphotriester qui relie deux unités nucléosidiques adjacents dans les oligonu- cléotides de l'invention peut être représentée comme suit: base o-P-o o OR1 dans laquelle R1 représente un radical alcoyle ayant de 1 a 4 atomes de carbone; - un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, enparticulier un méthyle, - un radical éthyle substitué en bêta par un groupe cyano, aryle ou arylsulfonyle, - un radical trihalogénoéthyle. La liaison 2' -- 5' phosphonate qui relie deux unités nucléosidiques adjacentes dans les oligonucléo- tides selon l'invention peut être représentée comme suit: base Il O R2 dans laquelle R2 peut représenter un alcoyle ayant de 1 4 atomes de carbone, en particulier le méthyle. Par convention, dans un oligonucléotide selon l'invention contenant n unités nucléosidiques, on désignera, ci-après, l'unité nucléosidique de rang n, lorsque le dernier élément de la chaine est un groupe phosphoglycéryle, par l'expression "dernière unité nu- cléosidique". Dans ce cas, l'oligonucléotide selon l'invention pourra être désigné par (2'-5')(A)nPGro. Lorsque le dernier élément de l'oligonucléotide selon l'invention est: soit un groupe nucléosidique de formule: A OH OH A ayant les significations ci-dessus indiquées; - soit un "groupe nucléosidique modifié' comme défini ci-après; on désignera, par convention dans les définitions l'uni- té nucléosidique de rang n - 1 par l'expression "dernie- re unité nucléosidique". Par "groupe nucléosidique modifié", on définit un groupe nucléosidique dans lequel: - la liaison directe entre le carbone 2' et le carbone 3' reliant directement la liaison a été suppri- mée et peut être représenté par la formule suivante: A ' / 4 3' 2' dans laquelle le pentose est sous la forme furane, mais peut également être sous la forme pyrane et dans laquel- le A représente l'adénine ou un dérivé de l'adénine com- me défini ci-dessus; - les carbones en 2' et 3' sont porteurs de fonctions aldéhyde ou de fonctions alcool, éventuelle- ment estérifiées; dans le cas o les carbones en 2' et 3 portent des fonctions alcool, on pourra désigner les oligonucléotides selon l'invention par (2'-5')(A) nOx Red. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être représentés par la formule (I) suivante: y IlIl -0P -Z _CH2 A HO O- PW - W CH O- X 1 0 dans laquelle: - Y et T, identiques ou différents, représentent indé- pendamment l'un de l'autre, O, S. Se ou NH; - Z et W, identiques ou différents, représentent indé- pendamment l'un de l'autre, O, S ou NH - X représente: A A O OH OH O_ A O H 'H 2a... CH2OH CH2OH - A représente l'adénine ou l'un de ses dérivés comme définis ci-dessus; t est un nombre entier égal à: - n lorsque X représente -CHOHCH20H;OH - n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH2OH; n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2; - m est un nombre entier égal à 0 et de préférence supé- rieur ou égal à 1; sous réserve que: - ou bien l'un au moins des deux éléments Y ou Z est différent de l'oxygène; - ou bien X représente: 0 A^A -CHOHCI OH C0 2 O 1 H CH OH CH2OH O H H 2 2 - ou bien l'un au moins des deux éléments Y ou Z est différent de l'oxygène et X représente: A 0 O \ X C---O v -CHOHCH20H a;I I CH2OH CH2OH O H H Une classe d'oligonucléotides préférés selon l'invention est constituée par ceux répondant à la for- mule (I) suivante: (I) 2 P { Z {CHI A - T - ({) 2s II HO 0- P -W - CH2 O0 X dans laquelle: - Y et T sont identiques ou différents et représentent 0, S, Se, NH; - Z et W sont identiques ou différents et représentent O, S. NH; - l'un au moins des éléments Y et Z étant différent de l'oxygène; - X est choisi dans le groupe constitué par: A A O S lC-O OH OH J' O H H A Ni0 -,-CHOHCH20H CH20H CH20H les fonctions alcools de ces radicaux étant éventuelle- ment estérifiées par des acides carboxyliques R3COOH, R3 représentant un radical alcoyle de 1 à 5 atomes de car- bone, ou un radical phényle - est un nombre entier égal à: n lorsque X représente -CHOHCH2OH, n - i lorsque X représente: A O O 1 OH OH A A 0 _ O_ I I CH20H CH20H O H H n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2; - m est un nombre entier supérieur ou égal à 1; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 N142 N8N2 tH H2Nz 3 I I NM2 NM2NH I Dans une classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention, le nombre m varie de préférence de 1 à 3. Parmi les groupes reliés à la première unité nu- cléosidique, et de formule: Y I P - z l'un au moins est tel que Y représente Se, S ou NH et/ou Z représente S ou NH, et les autres groupes; Y II -P - Z- I_- o représentant des 'groupes phosphate. Dans une classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention, Y représente S, et Z représente O. Une classe préférée d'oligonucléotides selon l'invention est celle dans laquelle X est soit un groupe nucléosidique modifié pouvant être représenté par: A A C 0 O 1 I CH20H CH20H 0 H H 3.5 soit le groupe -CHOHCH20 H. Les fonctions alcool des radicau: A -CHOHCH OH CH20H CH2OH 2 sont éventuellement estérifiées par un acide carboxyli- que R3COOH, dans lequel R3 représepte un radical alcoyle de 1 à 5 atomes de carbone ou un radical phényle. Une classe préférée d'oligonucléotides selon l'invention est constituée par ceux de formule (I) suivante: l y2 y3 il il il 0O - - P - Z- -20CH2 A i - i 2I I (II) O O O O T II OH -P - CH2 2 0 _ dans laquelle: - Y1. Y2. Y3, T sont identiques ou différents et repré- sentent O, S. Se, NH; - Z1 et Z2 sont identiques ou différents et représentent O, S. NH; l'un au moins des éléments Y Y2, y3 Z étant dif- 1' 2 3* 1. Z2 étant dif- férent de l'oxygène; - X est choisi dans- le groupe constitué par: A A OH OH À ' 0 H H A __/0 -CHOHCH2OH CH2OH CH 20H les fonctions alcools de ces radicaux étant éventuelle- ment estérifiées par des acides carboxyliques R3COOH, R3 représentant un radical alcoyle de 1 à 5 atomes de car- bone ou un radical phényle; - T représente un nombre entier égal à n. lorsque X re- présente -CHOHCH2OH. et 5 représente un nombre entier égal à n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH2OH0, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NN4 NH2 NH2 CONH 2 I '8 If N142 Nl PN2 ! i Le phosphore du groupe: y z P - 0- 2 1 o sera appelé phosphore alpha. Le phosphore du groupe: y z1- - z2 o, sera appelé phosphore bêta. Le phosphore du groupe: 0 - P - Z1 - Il o sera appelé phosphore gamma. A l'intérieur de la classe d'oligonucléotides de formule (II), une classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention est constituée par les oligonucléotides de formule (III): O 0 11- ilIl lI 0 P - Z --- P - 0 - CH A 1_ 1 o_ o_ 1 2 0 0 0 0 O OH 0 - P - 0 - CH2 0 X dans laquelle: - Y1 représente S, Se ou NH; - Z1 représente O. NH ou S; -S. X et A ayant les significations indiquées ci-dessus. A l'intérieur de cette classe d'oligonucléoti- des, une classe préférée d'oligonucléotides est consti- tuée par ceux dans-lesquels: - X représente: soit: A 0 Y CH2OH CH20H A représentant l'adénine; soit: -CHOHCH20H. Une autre classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention est constituée par ceux de formule (IV) suivante: 0 0 y 1l l 1 O _ pO-P-_O - P- O- CiS A O- O- O- SO1 OH - P. CH2 0 0 dans laquelle - Y3 représente S. Se ou NH, -ú, X et A ayant les significations ci-dessus indiquées. A l'intérieur de cette classe d'oligonucléoti- des, une classe préférée d'oligonucléotides selon l'in- vention est constituée par ceux dans lesquels: - X représente: - soit: A CH20H CH20H A représentant l'adénine; - soit: -CHOHCH20H. Une autre classe d'oligonucléotides préférée se- lon l'invention est constituée par celle de formule (V) suivante: O O Il 1 I Il 0 -P-O-P-O P 0 CH A O- O- OI (V) H0 - P -0 C H2 O- X dans laquelle: - Y représente Se. S ou NH; - Z, X et A ayant les significations indiquées ci- dessus. A l'intérieur de cette classe, une classe préfé- rée d'oligonucléotides selon l'invention est constituée par ceux dans lesquels: - X représente: - soit: A CH OH CH2 OH 2 2 A représentant l'adénine - soit: -CHOHCH2OH. Une autre classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention est constituée par ceux de formule-(VI) suivante: 0 0 0 O O O Il 11 11 - P Zl P - P - 0 CH2 0 0 0- 0 (VI) HO 0 P 0 - CH2 dans laquelle: - Z1 représente S ou NH; -ú, X et A ayant les significations ci-dessus indiquées. A l'intérieur de cette classe, une classe préfé- rée d'oligonucléotides est constituée par ceux dans les- quels: - X représente: - soit: 2S67892 O A CH20H CH20H A représentant l'adénine; - soit: -CHOHCH 20H. Une autre classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention-est constituée par ceux de formule (VII) suivante: y y0 il Il P - Z2 P - 0 - CH2 A "1 O O yi$IT (Vil) HO 0 - P -O CH 1- - 2 X L.o dans laquelle: - y2, Y3. T sont identiques ou différents et représen- tent O, S. Se, NH; - Z2 représente O0, S. NH: l'un au moins des éléments Y2 Y3 Z2 étant différent de l'oxygène; - X est choisi dans le groupe constitué par: A A OH OH- I 0 H H A >3 -CHOHCH2OH CH20H CH20H - Z est un nombre entier égal à n. lorsque X représente -CHOHCH2OH et est un nombre entier égal à n - 1, lorsque X est différent de -CHOHCHzOH, n étant un nombre entier variant de 2 à 10; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 NH2 Iti2 tWfaXN X X iH2 1 0 NH2 NNI2 NH2 N A l'intérieur de cette classe de nucléotides, une classe préférée est constituée par ceux dans les- quels T représente l'oxygène. Une autre classe préférée d'oligonucléotides se- lon l'invention est constituée par ceux de formule (VIII) suivante: Y O - P - O - CH2 O- O O T Il (VIII) *HO OP HO - P - 0 -CH2 O- X dans laquelle: - Y3 représente S, Se, NH; - T représente O, S. Se, NH - X est choisi dans le groupe constitué par: A A O O OH OH ' I 0O H H A v" O -CHOHCH2OH CH2OH CH2OH - S représente un nombre entier égal à n, lorsque X représente -CHOHCH 2OH et un nombre entier égal à n - 1 lorsque X est différent de - CHOHCH2OH, n étant un nombre entier variant de 2 à 10; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 NTMX NH2 H lNH NM2 NM2 I! A l'intérieur de cette classe de nucléotides, une classe préférée est constituée par ceux dans les- quels T représente l'oxygène. Des oligonucléotides particulièrement préférés selon l'invention ont pour formule: NH, - N IIo NH1 IlII, -0- P-O-P-O-P-OCI12 I IIo N' - 0- 0 N Il Nil 3Nit, 0H O-P-OCP-OCH, -È I. o - HO O-P-OCCH M H - C j-H Q 0O NH, N P-O- _oP-O-P- 0C i l (X O-0 0 l ililNlHl HO P-O-P-g0OCA0o 2 HO 0-PO--PO I0OH 0 HO. -P-OCHO PO HC CH20H Nil, NU1 1 lili l | Nil, O-P-o-P-O- P-O-P-OC i HO O-P-C HO O-P-OCH 1 -1 1Ne o0 o- o- ( O O, Il Nil Il 0 C I-O C'. O. NU, HOCC "N | NH, (XII) HO O-P-OCCH 1I HO 0- -OCHU dûPOCli Il 6l O 1O 0 CifO11 NH1 >-' Il Nil, (XII) HO O-P-OCH: N "0 Il NH2 HO! O-P-OC H z -0 H-C C--H 0 0 Nil, HOCH: N O N N (XIII) HO O- -OCN NH il NH | NH: iloCil N l V 0i HlO O-P-OC' H I o -O0 HCI2OH Il O-P- HCiH1 -0 CJIOH Nil, N > 0 0 il J NHN -0-- - 0- 0 1. 1, N (XV) o- o- o-i/ '? HOO - P-OC',l I- N, N - Il NH,N HOO OH NH2z -o II SOOI-P-OH II 0 | N1,(XI y,>- O OP!0 OH| --XHH N O O -0-P-O-P-0-P-OC0 I I I o N- - -N o- o- o;.J-, i{ 0O- P-OCII, o Z2567892 NH2 s o o I.. oNN N 0-1'l-OC tlHO O-P O 1-10O O- -O C NI/ .02HC CH20H N!{2 O-P-O -P-O-P-OCHt].H -È ' '-?O Nx Ho1 o--cl I 1 ', _, N; O HOH-OC}l O o C'!I:1OH PO H CH0H L'invention concerne également les sels qui peu- vent être obtenus par réaction des susdits oligonucléo- tides avec les bases appropriées, en particulier les sels d'ammoniums quaternaire, tels que le sel de trié- thylammonium, et les sels minéraux, tels que le sel de sodium. L'invention concerne également un procédé de préparation des oligonucléotides. Pour préparer les oligonucléotides selon l'in- vention, on peut avoir recours soit à une synthése chi- mique totale, soit à une synthèse enzymatique suivie de modifications chimiques. En ce qui concerne la synthèse chimique, on peut se reporter au protocole décrit dans Methods of Enzymology, 79, 1981, 233-234. En ce qui concerne la synthèse enzymatique des oligonucléotides de formule (I) selon l'invention. elle comprend: - la polymérisation de composés de formule (XIX} suivante:y II{ XIX) | o OH O - dans laquelle: - Y représente O. S. Se ou NH - Z représente O, S ou NH; l'un au moins des éléments Y et Z étant de préférence différent de l'oxygène; - m est sUpérieur ou égal à 3 - A a les significations indiquées ci-dessus; pour obtenir un composé de formule (Ibis) suivante: 256789Z -0 -P Z CH2 A È- (mJT 1{Ibis) T il HO 0- P - W - CH^ A OH OH dans laquelle: - Y et T, identiques ou différents, représentent O. S. Se, NH - Z et W. identiques ou différents, représentent 0, S, NH; l'un au moins des éléments Y et Z étant de préférence différent de l'oxygène; - E est un nombre entier égal à n - 1, n étant supérieur ou égal à 2; - m est un nombre entier supérieur ou égal à; - A a les significations indiquées ci-dessus; - et si nécessaire les étapes chimiques suivan- tes à savoir: 25. l'oxydation éventuelle du groupe glycol pour introduire des fonctions aldéhyde sur les carbones en 2' et 3' de la dernière unité nucléosidique et obtenir le composé de formule (Iter): 30. il H2 A LO. _ t|| ( Iter) H 0 W - C HO O- P -W -CH 0 A 0- la réduction éventuelle des deux fonctions al- déhyde en fonctions alcool pour obtenir le composé de formule (Iquater): {.}C2 A (Iquater) HO O- P - A I o : O--O L j Z l'hydrolyse éventuelle, dans des conditions évitant la bêtaélimination, pour obtenir le composé de formule (Iquinquiès) suivante: * l O,- PZ -CH2 A [: O -mW T (Iquinquiés) 2 'HO 0- P - W CH2 t O HOH CH2OH Un mode de réalisation préféré d'oligonucléo- tides selon l'invention de formule (XX) suivante: OH OH dans laquelle: - Y et T. identiques ou différents, représentent 0, S. Se. NH; - Z et W. identiques ou différents, représentent 0, S. NH: - Y et Z ne représentent pas simultanément-l'oxygéne - X est un nombre entier variant de 1 à 9; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 N NH2 C 1 1 N NNM2 NRI2 N N-1 comprend: 1' la polymérisation d'un composé de formule (XIXbis) suivante: 0- P -Z - CH2 A 0- 2 0 3 X A (XIXbis) dans laquelle: - Y représente O, S. Se ou NH; - Z représente 0. S ou NH; - Y et Z ne représentent pas simultanément l'oxygène; - A a les significations indiquées ci-dessus; 2 l'oxydation éventuelle du groupe glycol ter- minal. notamment par l'ion periodate pour transformer le glycol en deux fonctions aldéhyde et obtenir un composé de formule (XXI) suivante: [P Z CH A Tt W Il l (XXI) T I OH O-P- W -CH O- 0 C C= 0 O I H H dans laquelle Y, Z. T, W. ú et A ont les significations indiquées cidessus; 3' la réduction éventuelle des fonctions aldé- hyde, notamment par le borohydrure de sodium pour trans- former les deux susdites fonctions aldéhyde en fonctions alcool et obtenir le composé de formule (XXII) suivan- te: j - ZCH A O-3 T (XXII) II OH 0 - P W - CH2 A 0 -lm 0 CH20H CH20H 4 l'hydrolyse éventuelle, notamment l'hydrolyse acide ménagée, pour éliminer le noyau de ribose et obte- nir le composé de formule (XXIII) suivante: O4 -P -Z] - CH2 A 3 1 (XXIII) T Il LOH O - P W- CH - CHOH -CH2 -OH Parmi les composés de formule (XIX) sont dispo- nibles dans le commerce, ceux de formule (XIXbis) sui- vante: y O- P - Z- CH2 A O,- O-I (XIXbis) H H dans lesquels Y représente le soufre et Z représente l'oxygène, ainsi que ceux dans lesquels Y représente l'oxygène et Z représente le groupe NH, A représentant l'adénine ou un de ses dérivés comme définis ci-dessus. L'oxydation du groupe glycol de la dernière uni- té nucléosidique pour supprimer la liaison directe entre le carbone en 2 et le carbone en 3 et introduire deux fonctions aldéhyde peut être effectuée par l'acide pé- riodique dans des conditions de pH rigoureusement con- trôlées pour éviter une bêta élimination. L'expression "conditions de pH rigoureusement contrôlées" signifie le maintien du milieu réactionnel à pH 4,0, à 0-4'C et à l'obscurité. La réduction des fonctions aldéhyde en fonctions alcool peut être effectuée par le borohydrure de sodium. L'hydrolyse pour transformer: A O N CH OH CH OH 2 2 en groupe -CHOHCH 2OH est de préférence une hydrolyse acide ménagée, effectuée selon des méthodes classiques. Un procédé d'obtention selon l'invention des oligonucléotides de formule (V) suivante: y O O Il i -O Il O -P-O-P- P - O - CH A I I I O- O- 0- O (V) OH O- P - CH O- X dans laquelle: - Y1 représente NH, Se, S; - X représente: A A OH OH 0 0 H H A /O O \ -CHOHCH2OH CH OH CH20H - 5 est un nombre entier égal à n. lorsque X représente -CHOHCH20H, n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH20H, n variant de 2 à 10; est caractérisé en ce que l'on polymérise le composé de formule (XXIV) suivante: y O 0 Il Il 0 - P - 0PO - P- 0 - 0 - CH2 A 0 O O- (XXIV) OH OH et que l'on effectue les étapes 2', 3' et 4' comme in- diqué ci-dessus. A l'intérieur de la classe de procédés qui vient d'être définie, un procédé d'obtention selon l'invention des oligonucléotides de formule (Vbis) suivante: S O O II II ii O -P - - P - O- P - O-CH A J IO 2 (Vbis) HO O - P -O- CH2 3- 0 S X -2567892 dans laquelle: - Y, X ont les significations précédemment indiquées - A a la signification précédemment indiquée, et de préférence représente l'adénine; est caractérisé en ce que l'on polymérise un composé de formule (XXIVbis) suivante: S 0 0 11 1i I1 O - P - P -O -P - O- CH2 I O L (XXIVbis) O O- O OH OH et que l'on effectue les étapes 2',-3 et 4 comme indi- qué ci-dessus. Un procédé d'obtention selon l'invention des oligonucléotides de formule (VI) suivante: 0 0 0 O O O - 0 (vIl IlII O -P-Z1 -P-O-P-O-CH2 O. O O IV) 2 5 [HO 0 - P - 0 - CH2 O- X L dans laquelle: - Z1 représente NH ou S - X est choisi dans le groupe constitué par: A A 0 0 A __ OH OH 1 CH2 OH CH20H O H H - est un nombre entier égal à 1, lorsque X représente -CHOHCH2OH et égal à n - 1 lorsque X est différent de CHOHCH20H, n variant de 2 à 10; est caractérisé en ce qu'on polymérise le composé de formule (XXV) suivante: 0 0 0 O P Z _- -PP - 0 - CH A O - O- O- xv 1 1 1i_ 0 (XXV) OH OH dans laquelle Z1 représente S ou NH et A a la signifi- cation indiquée ci-dessus; et que l'on effectue les étapes 2', 3' et 4 comme in- diqué ci-dessus. Un procédé d'obtention d'oligonucléotides selon l'invention de formule (IV) suivante: 0 O Y3 Il I 1 0 - P - o- P _ 0 - P - o - CH2 A *0-P-O-P-O-P- -H O È È (IV) 113 OH 0 - P - 0 CH2 0 X dans laquelle: - Y3 représente NH, S ou Se; -, X et A ont les significations indiquées ci-dessus; est caractérisé en ce qu'on polymérise le composé de formule (XXVI) suivante: O O Y3 1. L O O -P-O -P-O - CIIHASiXV 0 0 OH O dans laquelle: - Y3 représente S. Se, NH; - A a les significations indiquées ci-dessus; et que l'on effectue les étapes 2', 3 et 4*, comme in- diqué ci-dessus. EXEMPLE 1 cet exemple concerne la préparation d'oligonu- cléotides (2'-5')(A) synthétisés par voie enzymatique n et modifiés chimiquement. Ces composés peuvent étre représentés par les formules suivantes: NH2 ! N N N N NH2 0 0 0 il Il I ' O- -P - 0 - P -H0 - C OCH O -P-O(XXVII) ! 2 INX 1 1 111 OH 0 -P OCR2 H-C C-H 0 0 % NH2 N - N N N NH2 o -o o l '(XXVIII) O - P - 0 - P - 0 - P -IO CH2 i I N L1 Nl 101 O N O- O- O- 0-1 OH - P -OCH HO2HC CH2OH NH2 NN N 0 0 0 I2 Il il r O -P - O - P - 0 -P -OCH2 XXX O- O O- 0O O LOH O -P- OCH o- / CHOH CH2OH et de leurs dérivés déphosphorylés correspondants. Matériaux et méthodes Matériaux Les milieux proviennent d'Eurobio (Paris) et les sérums des Laboratoires Flow. On utilise par exemple de l'interféron de leuco- cytes humains (Hu IFN ") purifié à une activité spéci- fique de 2 x 10 UI/mg de protéines. Le polyacide riboinosinique-polyacide ribocyti- dylique Cci-après désigné par l'abréviation poly(rI).poly(rC)7 est obtenu par exemple de PL Biochemicals. La phosphatase alcaline bactérienne de ty- pe III-R provient de Sigma et est conservée à 4'C. Le [T 2p_3 ATP (activité spécifique 2 000 Ci/mM) et le (2'-5')(A) -pCp 3P J (activité spécifique n 3 000 Ci/mM) proviennent d'Amersham. Le boror H jhydrure de sodium (activité spéci- fique 30 Ci/mol) est fourni par le Commissariat à l Energie Atomique. Le diéthylaminoéthyl-trisacryl (ci-après désigné par DEAE trisacryl) provient de l'Industrie Biologique Française. Cellules et virus On maintient des cellules HeLa en monocouches dans un milieu commercialisé sous la désignation RPMI 1640, notamment par les Laboratoires Eurobio, Paris, complété par du sérum de veau foetal à 10 Z (v/v), UI/ml de pénicilline et 50 yg/ml de streptomycine. On fait croître des cellules L929 dans un milieu minimal essentiel additionné de 5 Z (v/v) de sérum de cheval donneur, de 3 g/l de bouillon de phosphate bacto- tryptose, 3,4 g/l de glucose et d'antibiotiques comme mentionné ci-dessus. On utilise la souche Indiana du virus de stomatite vésiculaire- (VSV) et on la fait pousser dans des cellules L929. Svnthèse enzymatique d'oligoadénvlates (2'-5')(A) n Les oligoadénylates (2'-5')(A) sont synthétisés n par voie enzymatique selon la méthode décrite par MINKS et coll. (J. Biol. Chem., 1979, 254, 5 058-5 064). On peut résumer la préparation des composés (2'-5')(A)n comme suit. Des extraits cytoplasmiques sont préparés à par- tir de cellules HeLa traitées avec 200 unités par ml d'interféron de leucocytes humains pendant 48 heures. L'extrait est incubé avec 5 mM d'ATP et 20 >g/ml de poly(rI).poly(rC) pendant 2 heures, porté à ébullition pendant 3 mn à 100'C et centrifugé à 10 000 x g pendant mn. Des oligoméres r- 32p 7 (2'-5')(A) sont synthé- n tisés en incubant des extraits cellulaires avec du r- 32P J ATP dans les même conditions. Fractionnement des oliqoadénvlates (2'-5')(A) n On synthétise approximativement 4 000 unités de densité optique à 260 nm de (2'-5')(A) n, c'est-à-dire - 100 rmoles, n allant de 2 à 15 (qui seront fractionnées par la suite) dans des extraits de cellules HeLa trai- tées par l'interféron à 37C pendant 2 heures comme dé- crit ci-dessus. Les protéines sont précipitées par in- cubation du mélange à 100 C pendant 5 mn et centrifuga- tion à 15 000 x g pendant 10 mn. Le surnageant est dilué 3 fois avec de l'eau et ajusté à pH 8,5 avec du KOH 0,1 M avant d'être chargé sur une colonne (2,5 x 64 cm) de DEAE trisacryl M, équilibré avec un tampon à pH 8,5 de bicarbonate de triéthylammonium 0,25 M. On lave la colonne avec 1 500 ml de ce tampon et les oligoadényla- tes (2'-5')(A)n sont élués avec un gradient linéaire (1 n 500 ml/1 500 ml) de tampon à pH 8,5 de bicarbonate de triéthylammonium 0,125-0,45 M.- Les oligomères en pics individuels sont identifiés par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Les fractions sont concentrées sous vide sous pression réduite et coévaporées avec de l'eau plusieurs fois, afin d'éliminer le tampon de bi- carbonate de triéthylammonium. Des quantités en mg de chacun des oligomères peuvent être obtenues sous forme purifiée et contrôlées par HPLC. Svnthèse et purification des noyaux ou 'cores" de (2'-5'){A) n Les oligoadénylates déphosphorylés que l'on dé- signe également par cores" ou noyaux (400 unités de A260) obtenus par digestion enzymatique de (2'-5')(A) de phosphatase alcaline sont fractionnés par chromato- graphie à échange d'ions sur une colonne (1,5 x 25 cm) de DEAE-trisacryl M. Chaque oligoadénylate déphosphorylé est obtenu sous forme pure par une élution de la colonne avec un gradient linéaire (300 ml/300 ml) de tampon à pH 8,5 de bicarbonate de triéthylammonium (0-100 mM). Modification chimique d'oliaoadénvlates (2'-5')(A) n On effectue l'oxydation, à l'aide de periodate, du (2'-5')(A) pendant 15 heures dans des conditions ménagées, afin d'éviter la bêta-élimination. De façon classique. on ajoute 100 Pl de métapériodate de sodium 16 mM dans du tampon d'acétate de sodium 0,2 M à pH 4,0 à 100,l de (2'-5')(A)n 1 mM dans l'eau distillée à 4'C. n On agite le mélange à 4'C dans l'obscurité pendant 15 heures. L'excès de périodate est détruit immédiatement après la phase d'oxydation avec 10 pl d'éthylène glycol et le dérivé dialdéhyde en 2',3', conforme à l'inven- tion, correspondant au (2'-5')(A) est réduit à 4*C pen- n dant 5 heures par 100 pl de borohydrure de sodium 0,1 M dans un tampon de borate 0,1 M à pH 9,0. Dans certains cas, le dialdéhyde en 2',3' est réduit aved du boro/3HI- hydrure de sodium. On acidifie ensuite le mélange avec de l'acide acétique 0.1'M et on dessale sur une colonne de Séphadex G-15. Le dérivé O-phosphoglycérylé conforme à l'invention de (2'-5')(A) est obtenu par une hydro- n lyse acide ménagée de la liaison ribose-oxygène avec de l'acide sulfurique 0,005 M à 80'C pendant 30 minutes. On désignera ci-après par (2'-5')(A) PGro, les 2'-5' oligo- n adénylates selon l'invention qui comportent un groupe terminal O-phosphoglycéryle. Le diagramme ci-après résume, à titre d'exemple, les principales modifications chimiques effectuées à partir de l'oligoadénylate (2'-5')(A) 4 non modifié pour obtenir les oligoadénylates (2'-5')(A)4 selon l'inven- tion. Composé de départ: oligoadénylate (2'-5')tA)4 Nit, Ne N> Ilil? NIl oloIl liPOC; NH, HO 0-P-OC HO O-P-OCHI Traitant - NrO N1 X k 5 % oH % O-P-P- H110 O-P-OC l, -O- Y-? OH - NH, o- o- o-F- /'o ilil il H I I I Om- i0O-o-POC'Ho:ii- I 0 -P-OCI (lx) Ho 0 HO O-P -o ' H!H oo- L'oxydation, par exemple par l'ion periodate, du groupe alpha-glycol de la molécule (2'-5')(A)4 introduit deux fonctions aldéhyde en 2 et 3', ce qui conduit au composé (IX). Composé de formule (IX): Traitement par BH4Na NH,2 Il Il Il NH, -O-P-O-P-O-P-OCI! N, o- o- o- N e o X 1l NNHt O- P-0C1i; 2J HO - P-OCH I O 2HO O -PlO C - HO2HC CH2OH Les deux fonctions aldéhyde sont réduites par exemple par du borohydrure de sodium en deux fonctions alcool, ce qui conduit au composé (X). Composé de formule (X) Hydrolyse acide ménagée O O O il Il Il N i1, O-P-O - P-O-?-OCl! J QNl HO O-P-OC O l -0-P-0-P1o0 O-PP-cC I 1. -1!C OII HO 0O-P-OCH - - L'hydrolyse acide ménagée avec par exemple de l'acide sulfurique dilué donne un (2'-5') oligoadénylate comportant un groupe terminal 2'-Ophosphoglycéryle. Les noyaux déphosphorylés correspondant aux composés de for- mules (IX), (X), (XI) s'obtiennent par traitement de ceux-ci, par la phosphatase alcaline bactérienne. On obtient ainsi respectivement les composés de formules suivantes: HOM.) 0- I 1 Se i0.)O-d-O OH (AIX)....- 0 jo -li- À ' HO 'J113,7011 N""-'"0- -O 0'1I O- O5 Zl o-'9 N H)-d-O oit O I 0/ dlix) N Nr N /I-N o0-0 OH OH kw, IN l O' I I.,O 0=)N)0 Z H (ZZTX)0 OHII0 0 - -d-OH oit 0I! I (lix) OH30d O H0H - 0 I ' 'H30-a-O Oils.":" HOH 269L9SZ Analvse par chromatoqraphie liquide hautes performances des (2'-5')(A) phosphorviés et non phosphoryviés et de n leurs dérivés O-phosphoqlvcérvlé Les oligoadénylates (2'-5')(A)n, les (2'-5')- (A) -PGro (dérivé 2'-O-phosphoglycéryle de (2'-5')(A)n) n n et les oligoadénylates déphosphorylés correspondants (noyaux) sont isolés et caractérisés sur une colonne commercialisée sous le nom pondapak C18 dans un tampon phosphate d'aluminium (Brown R. E. et coll., 1981, Methods Enzymol. 78B, 208-216 et Knight M. et coll., 1980, Nature, 288, 189-192). On équilibre la colonne avec un tampon de phosphate d'ammonium 50 mM à pH 7,0 pour la séparation des (2'-5')(A) phosphorylés ou avec n un tampon phosphate d'ammonium 4 mM à pH 6,5 pour la séparation des noyaux déphosphorylés et on élue pendant minutes avec 25 ml d'un gradient linéaire 0-50 Z de méthanol/eau (1: 1 v/v). Toutes les séparations sont effectuées avec un chromatographe HPLC commercialisé sous le nom Varian 5 000. Analyse par électrophorèse haut voltage d'oliqoadénv- lates (2'-5')(A) et leurs produits de dégradation n Les oligoadénylates individuels (2'-5')(A) et n leurs produits de dégradation tels que des phosphates inorganiques (Pi), ATP et AMP sont séparés par électro- phorèse sur papier commercialisé sous le nom Whatman DE81 dans de l'acide formique à 8.7 Z (v/v) à pH 1.8 pendant 0,5 à 6 heures à 60 V/cm dans un appareil d'é- lectrophorése haut voltage commercialisé sous le nom Gilson. On repère les composants radio-actifs et on les quantifie par une autoradiographie avec une pellicule commercialisée sous le nom Kodak X-Omat AR. Activité de la ohosphodiestérase dans les extraits cel- lulaires HeLa La stabilité des (2'-5')(A) et des noyaux ana- n logues conformes à l'invention est déterminée dans les extraits cellulaires HeLa en mesurant la disparition des oligonucléotides. Le (2'5')(A)5 (5 ul)est incubé à la concentration finale de 0,02 mM avec 5 pl d'extraits cellulaires HeLa (22 mg de protéines par ml) en présence d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfoni- que (Hepes) 20 mM à pH 7,6 d'acétate de magnésium 2,5 mH, de chlorure d'ammonium 33 mM, de dithiothreitol et de fluorure de phénylméthylsulfonyl 1 mM (tampon 1). La réaction est arrêtée par chauffage à 100'C pendant 2 minutes et on centrifuge à 10 000 Xg pendant 10 minutes. Le (2'-5')(A)3 (1 nM) est additionné au surnageant comme référence interne et les produits résiduels sont quanti- fiés par HPLC comme décrit ci-dessus. Activité de la phosphatase dans les extraits cellulaires HeLa Les oligoadénylates (2'-5')(A)n et leurs analo- gues conformes à l'invention sont incubés dans des ex- traits cellulaires HeLa (5 pl) pendant des durées de temps différentes dans des essais de 20 i, dans le tam- pon 1 défini ci-dessus (cf. l'essai à la phosphodiesté- rase) ou dans le même tampon complété avec de l'ATP 1 mm, du GTP (guanosine triphosphate) 0,1 mM, du CTP (cytosine triphosphate) 0.6 mM, de la phosphate créatine mM, de la phosphokinase créatine à raison de de pg/ml et tous les 20 aminoacides à raison de 500 pM chacun (tampon 2). On arrête la réaction en chauffant à C pendant 20 minutes, les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation à 10 000 Xg pendant 10 mi- nutes. L'activité de la phosphatase est déterminée en mesurant la disparition de rr-32PJ(2'-5')(A) et l'ap- 32 n parition concomitante de Pi, libérée apres électropho- rése haut voltage, ou en mesurant l'accumulation de noyaux d'oligoadénylates, par chromatographie liquide hautes performances. Micro-injection cellulaire Des cellules d'HeLa sont cultivées sur des pe- tits morceaux de verre (2 mm2) a des densités qui per- mettent à environ 200 cellules de s'attacher à chacun des fragments de verre comme décrit dans Huez G. et coll., 1981, Proc. Natl Acad. Sci., 78, 908-911. On effectue des micro-injections selon la méthode origi- nellement décrite par Graessmann (1983, Methods Enzymol., 101, 482-492). Un volume moyen de 0,5 nl (approximativement 1/1Oème du volume cellulaire) est injecté dans le cytoplasme de chacune des cellules avec des micropipettes en verre de diamètre 0,5-1 pm. Les injections sont contr6ôlées sous un microscope à con- traste de phase commercialisé par Leitz-Diavert avec un grossissement de 320. Essai de l'activité antivirale Les cellules sont infectées à des temps indi- qués, généralement une heure après la micro-injection, avec du virus de stomatite vésiculaire (VSV) à une mul- tiplicité de 10 pendant une heure à 37C dans un milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau foetal 5 Z (v/v). Les virus non adsorbés sont soigneusement éliminés par trois lavages avec du RPMI contenant du sérum de veau foetal à 10 Z (v/v). On détermine le titre de virus produit 18 heures plus tard selon les méthodes connues (Stewart W. E., 1970, J. Virol., 6. 795-799). Pour résumer 106 cellules L929 sont mises dans des boites de Petri destinées à la culture de tissus (2 cm de diamètre). 24 heures après l'incubation. on étend 0,05 ml des suspensions de virus diluée (facteur de dilution 50) soigneusement sur la monocouche des cellules. Une heure plus tard, la sus- pension virale est éliminée par succion et on étend 2 ml d'agarose fondu à 1,6 Z (v/v) dans un milieu es- sentiel minimum complété par du sérum de veau foetal à 2 Z (v/v) sur la monocouche des cellules. Les plaques sont incubées pendant 18 heures dans un incubateur à CoG 2Les plaques sont ensuite révélées par une solution à 1 Z (v/v) de rouge neutre dans une solution saline tamponnée isotonique de phosphate. RESULTATS Synthèse et modification chimique de (2'-5')(A) n Des quantités en mg de (2'-5')(A) sont syn- n thétisées enzymatiquement dans des extraits de cellules HeLa traités par l'interféron et fractionnés en une éta- pe par une chromatographie à échange d'ions sur du DEAE trisacryl comme décrit précédemment. On effectue ensuite les modifications chimiques comme indiqué ci-dessus, pour obtenir les (2'-5')(A) modifiés, conformes à l'in- n vention. Stabilité du (2'-5')(A) et de ses analogues Afin de tester la stabilité des composés selon l'invention vis-à-vis de la 2phosphodiestérase, on a incubé les noyaux de (2'-5 ')(A) et leurs dérivés O-phosphoglycéryl, pendant 8 heures dans des extraits préparés soit à partir de cellules HeLa non traitées, soit à partir de cellules traitées par l'interféron, et leur disparition est suivie d'une chromatographie liqui- de haute performance. Pour les extraits cellulaires HeLa traités par l'interféron et selon les résultats publiés (Minks M. A., 1979, 3. Biol. Chem., 254, 5 058-5 064; Williams B. R. G. et coll., 1978, Eur. J. Biochem., 92, 455-462; Schmidt A. et coll., 1979, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76, 4 788-4 792; Verhaegen-Lewalle M., 1982, Eur. J3. Biochem., 126, 639-643), les noyaux non modifiés sont rapidement dégradés. Au contraire, le noyau (2'-5')(A) -PGro ou le noyau du dérivé (2'-5')(A)n por- n n teur des deux fonctions alcool selon l'invention sont stables dans les mêmes conditions. Des résultats sem- blables ont été obtenus dans des extraits préparés à partir de cellules non traitées avec l'interféron. La figure 1 est relative à la stabilité du noyau de (2'-5')(A)5 non modifié comparée à celle du noyau (2'-5')(A) 4PGro. En abscisses, on a représenté le temps, exprimé en heures, et en ordonnées le pourcentage de noyaux dégradés. Les noyaux déphosphorylés de (2'-5')(A)5 (repré- sentés par des triangles sur la figure 1) et leurs dé- rivés 2'-O-phosphoglycéryle correspondants (noyau (2'-5')(A)4PGro) (représentés par des cercles sur la fi- -gure 1) sont incubés avec des extraits cellulaires HeLa complétés (droite en trait plein) ou non (droite en trait pointillé) par de l'ATP 1 mM et un système régéné- rateur d'ATP. Les noyaux sont introduits à une concentration initiale de 0,02 mM. On arrête les incubations aux temps indiqués par ébullition et les protéines dénaturées sont éliminées par centrifugation. Les noyaux résiduels du surnageant sont analysés par HPLC comme indiqué ci- dessus. Activité antivirale des oliaoadénvlates (2'-5')(A)n et n de leurs dérivés phosphoqlvcérvyle Pour tester l'activité biologique des composés chargés tels que les (2'-5')(A) et de leurs analogues n conformes à l'invention dans les cellules intactes, on a recours à la micro-injection avec des micropipettes, étant donné qu'elle permet d'introduire des quantités déterminées de composés dans le cytoplasme, et sans perturber, de façon significative. le métabolisme cel- lulaire (Graessmann M. 1983, Methods Enzymol., 101, *482-492). Le tableau 1 ci-après est relatif à l'activité antivirale de (2'-5')(A) non modifié et de ses dérivés y s ln5 2'-O-phosphoglycéryle selon l'invention. TABLEAU 1 ACTIVITE ANTIVIRALE DES DERIVES 2'-O-PHOSPHOGLYCERYLE DES (2'-5')(A) DE L'INVENTION [(2'-5')(A) -PGro] COMPAREE A L'ACTIVITE DES OLIGO- n ADENYLATES (2'-5')(A) NON MODIFIES n po::: Titre en : tComposé:Concentration: virus: % de Essai n teste (pm) : (pfu/: témoin :::200cellules) :::: ---------------: - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - : - - 1,6 x 103 100,0 : (2'-5')(A) 10: 1,5 x 10 93,7 5. (2'-5')(A)4 FGro 10 2,5 x 101 1,5 2 1,6 x 104: 100,0 (2-5')(A)4* 10: 1,7 x 102 1,1 :: 4 :(2'-5')(A)4PFGro: 0,1: 2,1 x 10: 131 ::: Les essais dont les résultats ont été rassemblés dans le tableau 1 ont été effectués comme suit. Des cellules Hela qui croissent sur des morceaux de verre sont microinjectées avec 0,5 nl à chacun des (2'-5')(A) ou des produits relatifs aux concentrations indiquées. Une heure après, les cellules sont infestées avec du virus de stomative vésiculaire (multiplicité de l'infection = 10) et le rendement du virus est déterminé 18 heures après, par essai de plaques dans des cellules L929. Etant donné que 0,5 nl représente approximative- ment 1/10ème du volume cellulaire, on peut estimer que les concentrations intracytoplasmiques finales des oli- gomères soit environ un dixième des valeurs dans le ta- bleau 1.. Comme le montre le tableau 1, le (2'-5')(A)5 non modifié n'affecte pas la production de virus de stomati- ve vésiculaire lorsqu'il est microinjecté dans les cel- lules HeLa à une concentration intracytoplasmique d'en- viron 1 PH. Au contraire, le (2'-5')(A) PGro réduit la croissance du virus d'environ 100 fois à la même concen- tration et est toujours actif à une concentration finale de 100 nM. Conclusion Les modifications chimiques apportées sur les oligoadénylates 2'-5', conformément à l'invention, ont conduit à des dérivés qui sont toujours actifs vis-à-vis de l'endoribonucléase et qui sont stables vis-àvis de la dégradation de la phosphodiestérase dans les extraits acellulaires, et présentent une activité biologique an- tivirale accrue dans les cellules. EXEMPLE 2 Synthèse du fS-(2'-5'A)n( Ox Red On rappelle que l'on désigne par rS-(2'-5')- (A) Ox Red les composés qui peuvent être représentés par n la formule suivante: NH2 -e N N N NH2 S N $ il 0 Il (XXX) o - P - o - P - O - P- OCH2 I I I N O- O O-0- Il OH O -P-OC og% HO 2HC CH20H dans laquelle ú est un nombre entier égal ou supérieur à 1. Le produit de départ est l'adénosine 5'-O-(3- thiotriphosphate) (ci-après nommé Y S ATP) de formule (XXXI) NH2 N 4 N (XXXI) S 0 0 Il il ll o - P - OCH OC2 O O' O- 3O 0 OH OH que l'on polymérise par exemple par voie enzymatique à l'aide d'une préparation partiellement purifiée de 2-5A synthétase, pour obtenir le composé de formule (XXXII), ci-aprés désignés par NH 60 %SN/ N NH Nil S O O (XXXII) O - P -0 - P - 0 - P -O CH2 Il Il Il ii 2 o o oj o 10._OH OC| ]. -P OCH -OH OH dans laquelle ú est un nombre entier égal ou supérieur à 1. On purifie ensuite, par exemple, par chromato- graphie d'échange d'ions sur DEAE-trisacryl. On effectue une oxydation, par exemple par l'ion periodate, du gly- col terminal, pour obtenir le composé de formule (XXXIII): qH N 2 N 4N NHN N2 N NH2 S o o (XXXIII) 0 - p - -OC O- O- O--t|o OH 0 -P OCH2 O O=C C=O I I H H. dans laquelle ú est un nombre entier égal ou supérieur h 1. Puis on réduit les groupes aldéhyde, par exem- ple, par le borohydrure de sodium pour obtenir le rS-(2'-5')(A) Ox Red. n On purifie ensuite, par exemple, par filtration moléculaire et on analyse sur chromatographie HPLC. Stabilité métabolique Les oligoadénylates rS(2'-5')(A) conformes à n l'invention et comportant un atome de soufre sur le phosphore en gamma du groupe triphospate relié au car- bone en 2' à la première unité oligonucléosidique et qui peuvent être obtenus comme indiqué ci-dessus et en par- ticulier le S(2'-5')(A) Ox Red ont une stabilité méta- n bolique en système acellulaire supérieure à celle des dérivés protégés uniquement à leurs extrémités 3'OH. Les figures 2 et 3 ci-après représentent les pourcentages de dégradation dans un extrait de cellules HeLa, respectivement du (2'-5')(A)4 non modifié, du S-(2'-5')(A)4Ox Red selon l'invention et du (2'-5')- (A)4Ox Red selon l'invention. La figure 2 est relative à un milieu contenant de l'ATP (1 mM) (très proches des conditions in vivo). La figure 3 est relative à un milieu sans ATP. On a représenté sur chacune des figures 2 et 3 en abscisses le temps (en heures) et en ordonnées le pourcentage de produits non dégradés. Dans les figures 2 et 3, la courbe repérée par des triangles est relative au YS(2'-5')(A)40x Red, la courbe repérée par des points est relative au composé (2'-5')(A)4Ox Red et la courbe repérée par des carrés est relative au composé (2'-5')(A) non modifié. Activité bioloqique a) Liaison à l'endoribonucléase Les différents analogues selon l'invention se lient à l'endoribonucléase avec une affinité quasi iden- tique à celle classiquement utilisée dans ce domaine de "radiobinding" initialement décrit par Knight et coll., 1980. b) Activité antivirale Les différents composés ont été micro-injectés à l'aide de micropipettes dans le cytoplasme de cellules HeLa. Comme le montrent les résultats indiqués dans le tableau 2 ci-après, le S-(2'-5 ')(A) Ox Red présente une n activité antivirale nettement supérieure à celle du com- posé (2'-5')(A) non modifié. n TABLEAU 2 ACTIVITE ANTIVIRALE D'ANALOGUES DU (2'-5')(A)n Dérivé: Concentration: Titre en virus :à: :S - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 -:-: 14,0 x 105 (2'-5')(A)n 10 pM 192 x 10 (N.S.) 2-,_; 3,3 x 105 (2'5')(A) Ox.Red 100 nM 2,6 x 103 id.: 10 nm: 5,2 x 10 : 5 3-: -: 3,8 x 105 rS(2'-5')(A): 10 pM: 3,3 x 105 (N.S.) id. n 1 pM: 2,4 x 105 (N.S.) : 4 4 - -: 2,3 x 104 S ATP 10 iM: 1,3 x 10 (N.S.) : S -: -: 3,8 x 10 YS(P'-5')(A) Ox.Red: 1 pM Q.RM (?1: 10 PM: 6,2 x 10 N. S. Diffrence par rapport au témoin non significative Les essais, pour déterminer l'activité antivira- le, sont effectués comme suit. Des cellules HeLa (200 par point expérimental environ) attachées à un support de verre sont micro- injectées chacune par 5 x 1010 ml de (2'-5')(A) ou n d'un analogue de (2'-5')(A)n aux concentrations indi- n quées. Les cellules sont infectées une heure plus tard par le virus de la stomatite vésiculaire (multiplicité d'infection = 10) et la multiplication virale est déter- minée 18 heures plus tard par un essai en plages de lyse -10 sur des fibroblastes de souris L929. Comme 5 x 10 ml représentent environ 1/10ème du volume cellulaire, les concentrations intracellulaires finales en 2-5 A sont' environ 1/10Ome des valeurs indiquées dans ce tableau. L'invention concerne également les sels que les oligonucléotides cidessus peuvent former avec les bases en particulier les bases minérales ou organiques. Parmi les sels de base minérale, on préfère les sels de sodium et de potassium. Parmi les sels organiques, on préfère les sels d'amine, d'alcoylamine et d'arylamine, en par- ticulier ceux d'amines secondaires, tels que la diéthyl- amine, la pipérazine, ou d'amines tertiaires, tels que la méthylamine. la pyridine, la méthylpipérazine etc. Parmi tous ceux-ci, les sels physiologiquement accep- tables sont préférés. Les sels peuvent être lyophilisés, Les composés selon l'invention ont des propriétés biologiquement intéressantes, en particulier des propriétés du type de l'interféron, et plus particuliè- rement une activité antivirale. Les composés selon l'invention sont capables d'inhiber la synthèse de l'ADN, en particulier la repli- cation dans les cellules et/ou de dégrader l'ARN viral, en empêchant ainsi la synthèse des protéines, plus par- ticulièrement des protéines virales dans les cellules infectées par le virus à des concentrations nanomolai- res. Les composés selon l'invention sont stables et résistent à la dégradation par les phosphodiestérases et le temps de résistance vis-àvis des phosphatases est accru. Une classe préférée de composés selon l'inven- tion résistent à la dégradation par les phosphatases. Les oligonucléotides selon l'invention sont donc des substituts appropriés de l'interféron et de ses ap- plications connues. Ils peuvent être préparés reproduc- tiblement sous forme hautement purifiée, comme réactifs biologiques, en particulier comme référence de comparai- son dans les essais qualitatifs et quantitatifs, dans les cultures cellulaires, des composés de l'interféron ou d'autres substances semblables à l'interféron. L'invention concerne également les sels pharma- ceutiquement acceptables des oligonucléotides définis ci-dessus en particulier ceux appropriés pour l'adminis- tration in vivo. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques associant les susdits oligonucléotides, de préférence sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables, avec un véhicule pharmaceutique. L'invention fournit ainsi des compositions pharmaceutiques ayant une activité semblable à celle de l'interféron en utilisant un composé chimique.déterminé sous forme de haute pureté, ne présentant pas de toxici- té, étant stable et facile à manipuler. La composition selon l'invention peut être sous forme de préparations administrables par voie orale ou rectale, en utilisant des solides ou des liquides ap- propriés pour un tel type d'administration ou sous forme de préparations injectables stériles contenant au moins l'un quelconque des nucléotides en association avec des véhicules liquides appropriés stériles, de préférence isotoniques. D'autres formes appropriées de préparations con- sistant en pommades dans lesquelles les oligonucléotides de l'invention sont associés avec des véhicules en pom- made. L'une quelconque des techniques de préparation classiquement utilisées pour associer i'interféron avec les supports pharmaceutiques peut être utilisée pour préparer les compositions pharmaceutiques selon l'in- vention. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être associés à d'autres vecteurs appropriés, tels que les liposomes. Les compositions de l'invention ont des proprié- tés antivirales et sont en particulier susceptibles d'inhiber les maladies virales susceptibles d'être sui- vies de troubles tumoraux, par exemple les maladies in- duites par les virus de l'hépatite B ou les différentes formes de virus de l'herpés. Plus généralement, les compositions de l'inven- tion sont utiles pour le traitement et la prévention de maladies virales, et pour les traitements antitumoraux vis-à-vis des tumeurs susceptibles d'être également dé- limitées par les traitements à l'interféron. On notera que les doses auxquelles les composi- tions sont utilisées sont déterminées selon la nature de la maladie qui afflige le patient et les conditions par- ticulières de santé. Les dosages appropriés sont déterminés par le médecin, comme la pratique l'exige dans ces domaines d'application. REVENDICATIONS 1. Oligonucléotides de formule générale (Il): _l 0 - P - Z -CH A T (1) _1 eHO O- P -W - CH2 0 X L HO O dans laquelle: - Y et T sont identiques ou différents et représentent O, S. Se, NH; - Z et W sont identiques ou différents et représentent O, S. NH; - l'un au moins des éléments Y et Z étant différent de l'oxygène; - X est choisi dans le groupe constitué par: A A A O O OH OH O H H v O -CHOHCH2OH CH2ÈH CH20H les fonctions alcools de ces radicaux étant éventuelle- ment estérifiées par des acides carboxyliques R3COOH, R3 représentant un radical alcoyle de 1 à 5 atomes de car- bone ou un groupe phényle; - [ est un nombre entier égal à: 68 - n lorsque X-représente -CHOHCH2OH, n - 1 lorsque X représente: A A OH OH A H H A CH20H CH20H n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2; - m est un nombre entier supérieur ou égal à 1 - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 N142 MMI ftM2C f- I NH42 HN142 NM2 >1 V NtifI> 2. Oligonucléotides selon la revendication 1 ré- pondant à la formule générale (II): y y2 y3 O- P Z P Z2 - P - 0 -CH A 2 2 T OO O i T (II) OH 0 -P- - CH2 O J X E dans laquelle: - YV Y2' Y3I T sont identiques ou différents et repré- sentent 0. S, Se, NH; - Z1 et Z2 sont identiques ou différents et représentent O, S, NH; l'un au moins des éléments YI, Y2' Y3 ZI. Z2 étant dif- férent de l'oxygène; - X est choisi dans le groupe constitué par: A v\ CHOHCH2OH CH20H CH2OH A A OH OH 1I O H H les fonctions alcools de ces radicaux étant éventuelle- ment estérifiées par des acides carboxyliques R3COOH, R3 représentant un radical alcoyle de 1 à 5 atomes de car- bone ou un groupe phényle; - ú représente un nombre entier égal à n. lorsque X re- présente -CHOHCH 0H, et ú représente un nombre entier égal à n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH2OH, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 NMH2 - NM2 =N c-O w;; X NH2 MNH2 N4H2 N ! I 3. Oligonucléotides selon la revendication 1 de formule (VII): y2 y3 O - P - Z - P - O - CH A O O T (VII) Il HO 0 - P - CH2 dans laquelle: - Y2. Y3- T sont identiques ou différents et représen- tent O, S. Se, NH; - Z2 représente O, S, NH; l'un au moins des éléments Y2. Y3. Z2 étant différent de l'oxygène; - X est choisi dans le groupe constitué par: A A O O C 00 O H I---I OH OH O H O H H A O ) v -CHOHCH2OH CH2OH CH2OH - E est un nombre entier égal à n. lorsque X représente -CHOHCH2OH et est un nombre entier égal à n - 1, lorsque X est différent de -CHOHCH 2OH, n étant un nombre entier variant de 2 à 10; - A est une base choisie parmi l'adénine-ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 NH2 tHH c H1ç_ NH2 NH2 NM2 jXN S9 I 4. Oligonucléotides selon la revendication 1 de formule (VIII) y3 O - P - O - CH 1 1 2 O T il (VIII) HO0 - - PCH2 I 12 x L _ Z. dans laquelle: - Y3 représente S. Se, NH; - T représente O, S. Se, NH; - X est choisi dans le groupe constitué par: A A |0 0 = 4I I OH OH O 0 H H A -CHOHCH2OH CH20H CH20H - représente un nombre entier égal à n, lorsque X représente -CHOHCH20H et un nombre entier égal à n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH2OH. n étant un nombre entier variant de 2 à 10; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 N NH2 ç- NH2 NH2 NH2 N 5. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lesquels T représente l'oxygène. 6. Oligonucléotides selon la revendication 1, de formules: NiI, * N' -l -Q0 | H -o-P-o-P-O-FP-oc'!. H - NH -C, I I N o- OH Nit, Ho O-P-OCi (xV) 1 O. N )-" Il Nit, HO O-P-OCH[ O -C- -OCIIC / o O OH NH, 0 0{ Ilil Il Kil ;I {I NH -O-P-O-P-O-P-OCIi; { H o- o- o- X ? -O N o0 o-P-oc,,II. (xvI) o il Nil, HO O-P-OCH, 1 5 HO O-|-Cé H -C -H Il là 0 0 NH, N s o o il il il N.H, -0-P-0-P-O-P-OCIl, O- I- I O N- U O O il K'il, I o (XVII) -O HO 0-p-ocNil, - 3HO P O- CH2H 3 5 HO2HC CH2OH Nil, u O' Nll, Il Nil. O-PO-P--IPOC2 | NHci, HO O-P-OC H )11 M, IClOH 7. Procédé de préparation d'oligonucléotides de formule {I) selon la revendication 1 o { Z I A T 2 HO O-- P -W CH O! X dans laquelle - Y et T sont identiques ou différents et représentent 0, S, Se ou NH; - Z et W sont identiques ou différents et représentent 0. S ou NH; l'un au moins des éléments Y ou Z étant différent de l'oxygène; - m est supérieur ou égal à 3 - A a les significations indiquées à la revendication 1. caractérisé en ce qu'il comprend: - la polymérisation de composés de formule (XIX) suivante: O -I P- Z CH2 [ 1- p W ^ (XIX) OH OH pour obtenir un composé de formule (Ibis) suivante: CH2 A m LHO O- P - W- CH A 0- Z OH OH dans laquelle: - Y et T, identiques ou différents, représentent O, S, Se ou NH; - Z et W, identiques ou différents, représentent O, S ou NH; l'un au moins des éléments Y et Z étant de préférence différent de l'oxygène est un nombre entier égal à n - 1, n étant supérieur ou égal à 2; - m est un nombre entier supérieur ou égal à I; - A a les significations indiquées ci-dessus; - et si nécessaire les étapes chimiques suivan- tes à savoir: l'oxydation éventuelle du groupe glycol pour introduire des fonctions aldéhyde sur les carbones en 2' et 3' de la dernière unité nucléosidique et obtenir le composé de formule (Iter): O.- P - Z CH2 A (Iter) T HO O- P - V - C A 0- HE la réduction éventuelle des deux fonctions al- déhyde en fonctions alcool pour obtenir le composé de formule (Iquater): O.-1 - - Z CA(Iquater) |HO O- P - CH A 2 0 t î20 ?\ /o J2 0- l'hydrolyse éventuelle, dans des conditions évitant la bêta-élimination. pour obtenir le composé de formule (Iquinquiès) suivante: -0.- P- Z CH2 A U2],0 - ( AIquinquiès) T HO O-P-W -12 1HOH I I CH2OH 8. Procédé selon la revendication 7 de prépara- tion d'oligonucléotides de formule (XX): P- zl -CH A Ldan laqu e3[ OH (XX) Il OH 0- P - - CH A OH OH dans laquelle: - Y et T, identiques ou différents, représentent O, S., Se, NH; - Z et W, identiques ou différents, représentent O, S, NH; - Y et Z ne représentent pas simultanément l'oxygène; - ú est un nombre entier variant de 1 à 9; - A est une base choisie parmi l'adénine ou ses dérivés, notamment ceux de formule: NH2 MM2 vH - cwNMI2 isM allX I NH2 NM2 NH2 !! caractérisé en ce qu'il comprend: 1' la polymérisation d'un composé de formule (XIXbis) suivante: fP - Z CH2 A O- 0 (XIXbis) dans laquelle: - Y représente O, S. Se ou NH; - Z représente O, S ou NH; - Y et Z ne représentent pas simultanément l'oxygène; - A a les significations indiquées à la revendica- tion 1; 2 l'oxydation éventuelle du groupe glycol ter- minai, notamment par l'ion periodate pour transformer le glycol en deux fonctions aldéhyde et obtenir un composé de formule (XXI) suivante: O -LP- Z- CH2 A OH-0 T il -OH O- P -W - C I C C=O 0.11 1 H H dans laquelle Y. Z. T. W. ú et A ont les significations indiquées cidessus; 3- la réduction éventuelle des fonctions aldé- hyde, notamment par le borohydrure de sodium pour trans- former les deux susdites fonctions aldéhyde en fonctions alcool et obtenir le composé de formule (XXII) suivan- te y -L P z_ CH2 A O 3 0 j OH_ A (XXII) OH 0 - P - W - CH A 0 M 0 CH20H CH20H 4 l'hydrolyse éventuelle, notamment l'hydrolyse acide ménagée, pour éliminer le noyau de ribose et obte- nir le composé de formule (XXIII) suivante: [ -CH2 A O- (1 XXIII) 4 T Il OH O - P - W CH2 -CHOH - CH2 -OH 9. Procédé selon la revendication 7 de prépara- tion d'oligonucléotides de formule (V): Y1 0 O Il I i O-P-O-P-O- P - O - CH A O- O - H- ô I _ 1' W 1l 1 V) OH 0- P - 0 - CH2 I O X dans laquelle:. - Y représente NH, Se, S; - X représente: A A OH OH 1I 0 H H A O \ 10. CH20H CH20H - X est un nombre entier égal à n. lorsque X représente -CHOHCH20H, n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH20H, n variant de 2 à 10; est caractérisé en ce que l'on polymérise le composé de formule (XXIV) suivante: y 0 0 O- O-I8 O- - O - 0 -P- 0 - P - 0 - CH2 A 1 0 0 XXV 0P-O- O- (XXIV) OH OH et que l'on effectue les étapes 2', 3* et 4' comme in- diqué à la revendication 7-. 10. Procédé selon la revendication 7 de prépara- tion d'oligonucléotides de formule (VI): 0 0 0 !! I I P IIP H O.O O 3 1 Iil tVI) l HO 0 -.P - 0 - CH2 I Il 2 CH O- X L dans laquelle: - Z1 représente S ou NH - X est choisi dans le groupe constitué par: *A A O OH OH O 0 H H A O -CHOHCH20H CH20H CH20H - v est un nombre entier égal à 1, lorsque X représente -CHOHCH20H et égal à n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH20H, n variant de 2 à 10; caractérisé en ce qu'on polymérise le composé de formule (XXV) suivante: O O 0 Il 11 il 0-- - P - O - P- O- CH A I I l I | g o (xxv) 1 1 1 0 (-XXV) O - O- O OH OH dans laquelle Z1 représente S ou NH et A a la signifi- cation indiquée à la revendication 1; et que l'on effectue les étapes 2', 3' et 4' comme indi- qué à la revendication 7. 11. Procédé selon la revendication 7 de prépara- tion d'oligonucléotides de formule (IV) O - P - O- P - OY P CH O-P-O-P-O-P-O-CH2 A O OO-OO- (IV) OH O P -_0 - CH2 O X dans laquelle: - Y3 représente NH, S ou Se; -, X et A ont les significations indiquées ci-dessus; est caractérisé en ce qu'on polymérise le composé de formule (XXVI) suivante: O O Y O - P- - P - O- P -O-CH A _ _ _ (XXVI) OH dans laquelle: - Y3 représente S, Se, NH - A a les significations indiquées ci-dessus; et que l'on effectue les étapes 2, 3' et 4', comme in- diqué à la revendication 7. 12. Procédé selon la revendication 7 de prépara- tion d'oligonucléotides de formule (Vbis) suivante: S 0 0 0--p?-P-0- P -0CH- SQ n Il Il IH2 O ----- O-C O (Vbis) 0il OH P -0 - CCH2 O- X dans laquelle: - X représente A A o OH OH O H H A CH OH CH2 OH - ú est un nombre entier égal à n lorsque X représente -CHOHCH2OH, n - 1 lorsque X est différent de -CHOHCH2 OH, - A a les significations indiquées à la revendication 1, de préférence l'adénine; caractérisé en ce qu'on polymére le composé de formule (XXIVbis) suivante: S O 0 O 11 1 1 11 -I. Il Il - PO -P - P- O- CH A 0. O (XXIVbis) OH OH et que l'on effectue les étapes 2', 3' et 4' comme'indi- qué à la revendication 7.