Brevet FR2563010A1 — publié le 19851018

Lame pour immunofluorescence et son procédé de fabrication La présente demande de brevet concerne le domaine de 1' immunofluorescence. On rappellera brièvement que l'immunofluorescence est une technique basée sur une méthode de marquage des réactifs immunologiques par un colorant fluorescent. Ce marquage est appliqué, dans la grande majorité des cas, aux anticorps mais quelquefois également aux antigènes. Comparée aux autres moyens de marquage des antigènes et des anticorps (éléments radioactifs, ferritine, enzymes), l'immunofluorescence est une méthode simple et rapide. La préparation des sérums fluorescents est facile et, comme appareillage, cette méthode demande seulement un équipement microscopique, à la portée de tous les laboratoires. Les substances fluorescentes ont la propriété, lorsqu'on les éclaire avec certaines radiations lumineuses, notamment avec des radiations UV, d'émettre de nouvelles radiations lumineuses différentes des préce- dentes. En immunofluorescence, c1 est donc une nouvelle lumière émise que l'on observe au microscope. Le colorant fluorescent le plus utilisé en immunologie est la fluorescéine, qui émet une lumière vert-jaune. On utilise généralement un sel de fluorescéine qui est l'isothiocyanate. Peuvent également être utilisés des rhodamines telles que la tétraméthylrhodamine, des lissamine rhodamines qui émettent une lumière rouge. Plus rarement, on emploie l'acide diméthylaminonaphtalène sulfonique qui émet une lumière jaune. Les colorants utilisés sont fixés sur la globuline anticorps, par une liaison chimique stable, ne risquant pas d'être rompue au cours de la réaction immunologique. En résumé, cette technique permet, soit dtiden- tifier un antigène à l'aide d'un immunsérum connu, soit de rechercher et de titrer un anticorps à l'aide d'un antigène connu. Toutes les études ou analyses faites par immunofluorescence, s'effectuant au microscope, il est nécessaire de disposer de lames de verre, sur lesquelles sont fixés, de façon connue, l'antigène ou les cellules étudiés. Ce support, que constitue la lame de verre, revêt, on le comprendra, une importance primordiale pour aboutir à des résultats exploitables. Ces lames doivent définir des sites parfaitement propres, exempts de toute pollution. En règle générale, ces sites sont définis par une encre qui est déposée par sérigraphie sur la lame. Ces encres doivent répondre à un certain nombre de critères bien définis, parmi lesquels on citera - la résistance aux solvants de différentes natures, et plus particulièrement à l'acétone, au méthanol, aux différents alcools et à l'eau, qui eonstituent les solvants les plus utilisés dans ce domaine, - la résistance à la chaleur, puisque les lames, qui sont conservées, en général, à très basse température avant usage (de l'ordre de moins 300 C) peuvent être mises ultérieurement dans des étuves, - la bonne adhérence au support puisque, si encre à tendance à s'écailler, il pourra y avoir là encore, pollution du milieu réactionnel, - non interaction de l'encre avec le rayonnement UV ultérieur, toute réémission de radiations par l'encre, sous l'action du rayonnement UV, étant susceptible de faire naître des erreurs au cours de la manipulation, voire de rendre celle-ci impossible, - bonne constance des teintes choisies pour les différentes encres. Jusqu'à ce jour, il a été difficile de concilier tous ces impératifs. La meilleure solution qui a été proposée consistait à utiliser des encres polymérisables sous l'action de la chaleur. Ces encres, notamment du type époxy, sont en général à deux constituants, et elles polymérisent par chauffage à une température de l'ordre de 100 à 1600 C pendant une période de temps qui peut varier entre 1 h et i h. Les utilisateurs des lames ainsi réalisées ne se sont montrés que moyennement satisfaits ; ils ont déploré en particulier, soit le manque de propreté des sites ou puits laissés libres d'encre, soit le mauvais état général des parties encrées. Ce mauvais état, qui se révélait par la présence de poussière ou de bulles, était probablement dû au phénomène d'évaporation en cours du cuisson, ou à une pollution par le four ou étuve utilisés. Ce mauvais état provoquait souvent la rupture des lamelles déposées sur les lames ultérieurement pour l'observation au microscope.De façon plus générale, on a pu conclure que le mode de cuisson de l'encre, exerçait une influence certaine, à la fois sur la mouillabilité des lames et la tenue de l'encre à l'acétone, et qu'un équilibre restait à trouver entre ces deux paramètres, apparemment contradictoires, puisqu'une cuisson forte donne une bonne résistance à l'acétone, au méthanol et à l'eau, mais détruit la mouillabilité des lames ; en revanche, une faible cuisson préserve cette mouillabilité, mais confère à l'encre une résistance insuffisante à l'acétone. La présente invention vise à apporter une solution aux problèmes précédemment évoqués. Elle a pour objet un nouveau procédé pour la fabrication de lames pour immunofluorescence consistant à déposer, par sérigraphie, de façon connue en soi et de manière sélective, une encre sur une lame de verre, puis à polymériser cette encre, ce procédé étant caractérisé en ce que l'étape de polymérisation de l'encre est effectuée sous l'action d'un rayonnement UV. Bien entendu, on connait déjà la technique de polymérisation sous l'action d'ultraviolets, que cette technique soit appliquée à des polymères en général, ou à des encres en particulier. On sait également utiliser de telles encres polymérisables sous l'action du rayonnement UV dans le cadre de la sérigraphie. En revanche, il n'avait jamais été envisagé jusqu'à ce jour, d'utiliser de telles encres pour la fabrication de lames pour immunofluorescence, tant le risque d'interaction des encres; avec les réactions immunologiques étudiées, semblait évident. En effet, l'étude de la fluorescence se fait sous l'action de rayonnements UV, et il était communément estimé que l'utilisation d'encres polymérisables sous l'action de rayonnements UV apporterait un trouble rédhibitoire s'opposant, de façon absolue, à l'application desdites encres dans ce cadre. Or, la Demanderesse a trouvé qu'il n'en était rien et qu'il était possible de mettre en oeuvre, dans le cadre de la sérigraphie, des encres polymérisables sous rayonnement UV, sans que les études ultérieures en immunologie soient perturbées. D'autre part, l'étude minutieuse des lames pour immunofluorescence obtenues par le procédé de l'invention a révélé que celles-ci résistaient parfaitement aux solvants couramment utilisés dans ce domaine, à savoir, l'acétone, l'eau, le méthanol, les alcools, et que la résistance à la chaleur était convenable dans la gamme d'utilisation habituelle en immunologie. D'autre part, le fait d'éviter une étape de chauffage à des températures de 100 à 1500 C permet d'éviter toute projection nuisible de l'encre et de ce fait, aboutit à la formation de lames dont les sites réactionnels ont un état de propreté proche de la perfection. L'état de surface de l'encre elle-même est également excellent et il est possible en phase de manipulation, de poser des lamelles sur la glycérine et sur la lame sans risque de briser lesdites lamelles, puisque les particules formant des excroissances, sont rares ou totalement absentes. Bien entendu l'invention concerne également les lames pour immunofluorescence comprenant une lame de verre et une encre déposée de façon sélective sur ladite lame par sérigraphie, ces lames étant caractérisées en ce que ladite encre a été polymérisée sous rayonnement UV. On ne décrira pas ici en détail la technique de sérigraphie, qui est bien connue de l'homme de l'art. De même, pour ce qui est des encres susceptibles d'etre mises en oeuvre, l'homme de l'art pourra choisir les encres connues dans ce domaine, pouvant être polymérisées sous l'action des rayons UV et appliquées par sérigraphie sur le verre. Le choix de la longueur d'onde UV sera bien entendu fonction de la nature de l'encre utilisée. On citera néanmoins une encre qui a été considérée comme particulièrement appropriée, et a donné des résultats excellents. Il s'agit de l'encre choisie dans la série PSGL, fabriquée par la société NAZ-DAR. On précisera ici que par l'expression "de façon sélective", on entend que le dépôt de l'encre s'effectue aux endroits choisis par l'utilisateur sous la lame de verre, en ménageant des sites intacts de forme et de dimensions quelconques. Ces sites sont toutefois généralement circulaires et d'un diamètre variant de 2 ou moins à 16 mm ou plus. L'exemple suivant est destiné à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLE On réalise des lames pour immunofluorescence à partir de lames de verre à bords rodés dont les dimensions étaient de 26 mm x 76 mm. Ces plaques de verre provenaient de la société M.M.G (République Fédérale d'Allemagne). Ces lames de verre sont nettoyées soigneusement par ultrasons, puis on procède à l'impression sérigraphique proprement dite. L'encre utilisée appartient à la série PSGL de la société NAD-DAR. Il s'agit d'une encre 100 % solide, polymérisable sous UV, mono composant, contenant le photoinitiateur. Plusieurs tissus sont utilisés du type 165, 140 et 150 calandré (ouverture de maille) ; l'écran est constitué p-ar une émulsion diazo. Il aurait également été possible d'utiliser un film direct ou indirect de faible épaisseur. La raclette est en polyméthane 70 ou 80 shores rectifié. Après dépôt de l'encre dans le procédé sérigraphique connu, on effectue la polymérisation dans un tunnel à lampes UV de type classique pendant une durée de 10 secondes. La série de lames pour immunofluorescence ainsi conçues, est utilisée pour réaliser des recherches ou analyses. En particulier, on utilise ces lames pour la recherche de E. Coli pathogène dans les selles, la recherche de Tréponèmes sur un frottis, la recherche de Gonocoques dans un pus, et la recherche de B. Pertussis dans un mucus nasal. Ces recherches sont effectuées par immunofluorescence directe. On procède d'autre part à des expériences par immunofluorescence indirecte pour des sérodiagnostics de la toxoplasmose, de la syphilis et de la brucellose. Au cours de ces expérimentations, les lames sont soumises à l'action de différents solvants, notamment de l'acétone, du méthanol et de l'eau, ainsi que de divers alcools tels que méthanol. Après examen attentif des plaques après usage, il se confirme que la résistance à ces divers solvants est bonne à très bonne. Les utilisateurs confirment, en outre, que les puits ménagés au cours de la sérigraphie ne présentent pas de pollution, et en particulier, ne comportent pas, en règle générale, de traces d'encre dues-à des projections. Enfin, la surface de l'encre est suffisamment régulière pour ne pas provoquer de bris de lamelles. Ces lames pour immunofluorescence marquent donc un progrès tout à fait surprenant et remarquable par rapport aux lames utilisées antérieurement. Il est également confirmé par les expérimentateurs que, au cours de 11 examen par microscope sur de telles lames et sous UV, il ne se produit aucune interaction défavorable avec les encres utilisées, et ceci bien que lesdites encres aient été également polymérisées sous l'action de rayons ultraviolets. Naturellement, l'invention n'est en rien limitée par les particularités qui ont été spécifiées dans ce qui précède ou par les détails du mode de réalisation particulier choisi pour illustrer l'invention. Toutes sortes de variantes peuvent être apportées à la réalisation particulière qui a été décrite à titre d'exemple et à ses éléments constitutifs sans sortir pour autant du cadre de l'invention. Cette dernière englobe ainsi tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la fabrication de lames pour immunofluorescence consistant à déposer par sérigraphie, de façon connue en soi, et de manière sélective, une encre sur une lame de verre, puis à polymériser ladite encre, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est effectuée sous l'action d'un rayonnement UV. 2. Lame pour immunofluorescence comprenant une lame de verre et une encre déposée de façon sélective sur ladite lame de verre, par sérigraphie, caractérisée en ce que ladite encre a été polymérisée sous rayonnement UV.