Brevet FR2566667A1 — publié le 19860103

PROCEDE DE T2AITEXENT ANTITHROMBOGENE DE CATHETERS ET CATHETERS AINSI OBTENUS. La présente invention concerne un procédé de traitement antithrombogène de cathéters, et les cathéters ainsi obtenus. L'invention se rapporte plus particulièrement à un procédé de traitement de cathéters en élastomère de silicone et aux cathéters à utilisation prolongée obtenus par la mise en oeuvre du procédé, et destinés à un usage en médecine humaine et vétérinaire, ainsi que comme matériel de laboratoire. Il est bien connu que le domine d'utilisation des cathéters s'étend à l'expérimentation animale et aux applications en clinique humaine. En expérimentation animale, les cathéters à usage prolongé permettent la mesure de la pression artérielle en continu, les mesures directes des pressions partielles sanguines de l'oxygène et du gaz carbonique, des prélèvements réguliers de sang ,ce qui autorise leur utilisation pour des études de toxicité chronique et de pharmacocinétique, par exemple. Les applications en clinique humaine concernent entre autres, la dialyse, les traitements à long terme du diabète et des cancers. Si l'on rappelle les qualités recherchées pour un cathéter à utilisation prolongée, les points suivants doivent être mentionnés, sans préjuger de l'ordre de leur importance - la stérilité, - l'inertie tissulaire, - les propriétés physiques comparables à celles des vaisseaux sanguins, la stabilité et la résistance, - la facilité d'insertion et de maintenance, - le prix de revient acceptable pour l'utilisateur. Il existe actuellement sur le marché cinq catégories de cathéters, selon la nature du polymère entrant dans leur composition. Il s'agit - des cathéters en chlorure de polyvinyle - des cathéters en polyéthylène, - des cathéters en polypropylène, - des cathéters à base d'organofluorés, tels que le polytétrafluoroéthylène (P.T.F.E.), - et des cathéters en élastomère de silicone. Ces différents cathéters présentent entre eux des différences relatives aux caractéristiques mécaniques et aux résistances thermique et chimique, qui ne seront pas consirées dans le présent mémoire, et seule sera considérée leur thrombogénéicité comparée, c'est-à-dire leur comportement par rapport à la formation du caillot de fibrine lors de la coagulation sanguine. Il sera ensuite décrit les tenta tives. effectuées- à ce jour pour améliorer leur propriété antithrombogénique. Mis à part les risques liés à l'intervention chirurgicale et le rôle possible de la nature des liquides perfusés, et plus précisément le risque, d'ailleurs controversé, de thrombophlébite par administration périphérique de solutés hypertoniques,ecndes,, il est logique de rattacher l'observa- tion de thrombus après implantation d'un cathéter à la création d'un interface artificiel entre la matière plastique du cathéter et le sang. La matière plastique jouerait le rôle des structures sous-endothéliales (microfibrilles, membrane basale et collagène) qui, lors d'une blessure vasculaire, permettent l'adhésion plaquettaire.Cette adhésion est la première étape conduisant à la coagulation et dont on sait seulement qu'outre les structures sousendothéliales, elle met en jeu la glycoprotéine I plaquettaire et le facteur WILLEBRAND plasmatique (F VIII W). La fixation de plaquettes sur les cathéters et l'activation du processus de coagulation ont été démontrées il y a une quinzaine d'années, mais ces phénomènes varient selon la nature du polymère utilisé pour réaliser les cathéters. A propos des cathéters en chlorure de polyvinyle (PVC), la rapide coagulation intravasculaire a été imputée à une certaine solubilisation de la matière plastique, qui serait liée davantage aux stabilisateurs qu'aux plastifiants utilisés. En tout cas, il n'a pas été possible. de montrer un effet quelconque des phtalates sur la fonction plaquettaire. En ce qui concerne les cathéters en polyéthylène, ce polymère est souvent pris comme référence pour comparer la thrombogénéicité des cathéters. Il se révèle thrombogène de la même manière que son homologue supérieur, le polypropylène, mais moins que le chlorure de polyvinyle. Les cathéters à base d'organofluorés sont considérés comme étant moins thrombogènes que les cathéters en polyéthylène, eux-mêmes supérieurs aux cathéters en chlorure de polyvinyle. Parmi les organofluorés, le FEP serait préférable au ETFE. Les cathéters en polymères acryliques sont considérés par certains comme étant supérieurs à tous les cathéters en polymère déjà cités. Quelques tests ont été réalisés pour tenter de démontrer la résistance à la thrombogénèse, mais sans résultat probant. Les cathéters en élastomère de silicone ont déjà été expérimentés en clinique. Ils ont donné lieu à plusieurs cas de phlébite, mais ces cathéters présentent néanmoins les meilleurs qualités antithrombogènes. En conclusion de ces considérations relatives à la composition chimique des cathéters, au rapport entre celle - ci et la thrombogénèse, il faut convenir qu'il n'existe pas de matériel, utilisé seul, qui puisse donner satisfaction pour une implantation à long terme. Les réussites au-delà de un mois demeurent isolées, et il semble qu'aucun cathéter n'évite la formation.de manchon de fibrine, au site d'insertion, ni la formation de microemboles. C'est pourquoi, très souvent, la cathétérisation s'accompagne d'une héparinothérapie, tolérable en médecine humaine, en milieu hospitalier, mais qui oblige à une surveillance constante et perturbe les données hématologiques, ce qui la rend peu compatible avec l'expérimentation animale. Afin de remédier à l'inconvénient que représente la nécessité de recourir à une héparinothérapie, il a déjà été proposé de réaliser des traitements de surface des cathéters, afin d'en améliorer la thromborésistance. Ceci a été tenté par différents procédés mis au point à partir des années 60. De façon pragmatique, et pour faciliter la compréhension, deux classes de procédés de greffage d'héparine sur.cathéters seront distinguées, suivant le nombre d'intermédiaires nécessaires : les traitements ternaires, et les traitements binaires. En ce qui concerne les traitements ternaires, le premier revêtement mis au point était constitué d'une première couche de graphite colloïdal, recouverte d'une seconde couche de chlorure de benzalkonium sur lequel était fixée, en, dernier lieu, l'héparine. Des études microscopiques ont montré l'aptitude du graphite colloldal à combler les imperfections de la surface lisse d'une matière plastique. Le graphite colloldal a d'autre part une action directe dans la prévention de la thrombose par son inertie, sa nonmouillabilité, son potentiel Zéta négatif. On rappelle que le potentiel Zéta est une notion couramment utilisée dans l'étude des interfaces. De chaque côté de toute interface, il existe en général une différence de potentiel électrique. Plusieurs modèles de répartition des charges en doubles couches ont été proposés. Selon la théorie de STERN, on distingue - une première couche, de potentiel Vo, adhérant directement à la surface d'une particule (cas d'un interface solide-liquide) et comprenant les ions déterminants - une deuxième couche de contre-ions, de potentiels Vs (potenties de STEM) ; - une couche de solvant de potentiels (potentiel Zéta) - une couche de contre-ons, ou couche diffuse. La thromborésistance était améliorée par le passage d'une solution d'héparine. Mais, la fixation trop labile de l'héparine ne permettait qu'une utilisation de quelques heures. De plus, ce traitement s'avérait inapplicable aux cathéters en polyéthylènes, à base d'organofluorés et en silicone. D'autres approches se basaient sur le greffage par irradiation d'un hydrogel sur le polymère. Des irradiations ionisantes de haute énergie , telles que les rayons gamma, sont capables d'ioniser et d'exciter des molécules. Cet état transitoire de la molécule conduit rapidement à des radicaux libres susceptibles d'initier des greffages en chaîne, lorsque des monomères de type vinylique sont introduits dans le milieu, en même temps que les polymères à haut poids moléculaire. De cette façon il a été réalisé la fixation d'hydroxy-éthyl-méthacrylate (HEMA) sur un élastomère de silicone. L'activité de l'héparine, fixée dans un stade ultérieur, s'avère très faible, ce qui prouve que l'héparine n'est plus accessible à l'antithrombine III, et que le complexe actif ne peut donc plus se former. Ces études semblent montrer qu'interposer entre le support de l'héparine et le polymère du cathéter à traiter un intermédiaire supplémentaire accroit l'instabilité et diminue l'efficacité. En ce qui concerne les traitements -binaires, ce type de traitement a été réalisé sur des cathéters en polyéthylène, et exploite la propriété des molécules de surfactif de s'orienter à l'interface huile-eau, de façon à ce que la partie apolaire du surfactif soit en contact avec la phase huileuse et l'extrémité polaire avec la phase aqueuse. Sur cette extrémité polaire est fixée l'héparine. Les expérimentations réalisées avec des cathéters ainsi traités, en shunt artérioveineux, montrent une efficacité pendant une période d'une douzaine d'heures environ. Quelques modifications dnt été proposées par divers utilisateurs, sans amélioration sensible. Bien au contraire, des travaux récents laissent apparaître des contradictions notables, bien peu favorables à une solution'satisfaisante pour le problème du cathétérisme chronique. Par la présente invention, on se propose de remédier aux inconvénients liés aux traitements de cathéters présentés ci-dessus, et l'invention 2 pour objet un procédé original de traitement de surface de cathéters, permettant à cette surface d'être immédiatement thromborésistante. L'idée a la base de l'invention est de réaliser directement un " bras " qui s'adapte, d'un côté, à l'héparine, et de l'autre, au polymère dans lequel est réalisé le cathéter. Un autre objet de l'invention est de réaliser un cathéter présentant une antithrombogènéicité totale, qui rend inutile l'introduction d'héparine en solution pendant la durée de son utilisation. Comme un domaine d'application plus particulièrement concerné par l'invention est le cathétérisme chronique, l'exigence d'efficacité prolongée que doivent satisfaire les cathéters traités conformément à l'invention impose de partir d'un matériel de base qui soit le plus thromborésistant possible, et donc d'utiliser des cathéters en elastomère de silicone. Selon l'invention, le procédé de traitement antithrombogène d'un cathéter en élastomère de silicone se caractérise en ce qu'il consiste - à nettoyer au moins la paroi externe du cathéter, - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec une solution chaude d'un surfactif, qui est-une résine fluorée comportant un ammonium primaire, afin de greffer du surfactif sur la paroi nettoyée du cathéter - à rincer le cathéter - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec une solution chaude d'héparine, afin de greffer de l'héparine sur le surfactif déjà greffé sur le cathéter - à mettre au moins la.paroi externe du cathéter en contact avec une solution tiède ou légèrement chaude de glutaraldéhyde, afin de réaliser des pontages de l'héparine greffée;; - à rincer le cathéter - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec du plasma sanguin déplaquetté, afin de réaliser, par fixation sélective de l'antithrombine III par l'héparine, un complexe actif héparine-antithrombine III, permettant à la paroi du cathéter d'être immédiatement thromborésistante, et enfin - à rincer le cathéter. Avantageusement, le procédé consiste à traiter simultanément les parois externe et interne du cathéter, et, à cet effet, le procédé consiste de préférence à appliquer le traitement à un cathéter préalablement introduit dans une canalisation de même nature que le cathéter à traiter, et de longueur et de diamètre en rapport avec la taille du cathéter à traiter, de sorte que les diverses solutions et divers fluides utilisés puissent passer dans le cathéter et entre ce dernier et la canalisation. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, le procédé consiste, parmi les différentes résines fluorées comportant un ammonium primaire, à utiliser comme surfactif le produit de formule : C6F13C2H4S0 NHC,H N+(CH )3I , qui présente une bonne affinité pour les élastomères de silicone et se lie bien à l'héparine. De plus, le procédé consiste à préparer la solution de surfactif sous la forme d'une solution millimolaire de ce produit dans de l'eau distillée. En ce qui concerne la solution d'héparine, le procédé consiste à utiliser une solution à 10 000 UI par dmf dans du sérum physiologique à 9/1 000 de Na Cl, le pH étant ajusté à 3,6. Enfin, le glutaraldéhyäe est utilisé sous la forme d'une solution à 1 %. Dans le but de prévenir la formation d'un manchon de fibrine, qui pourrait être obtenu à la suite d'un simple trempage du cathéter dans les solutions de greffage, ie procédé selon l'invention se caractérise en ce qu'il consiste à mettre le cathéter en contact successivement avec les solutions de surfactif, d'héparine et de glutaraldéhyde ainsi qu'avec le plasma déplaquetté en faisant circuler ces solutions et ce plasma déplaquetté contre le cathéter, la circulation des solutions et du plasma déplaquetté s'effectuant de préférence en circuit fermé, les solutions étant soumises à une agitation continue. De plus, le procédé consiste avantageusement à faire circuler le plasma déplaquetté au débit maximum permis par la viscosité du milieu. Avantageusement, la solution de surfactif est à une température comprise entre 80 et 950 C, et de préférence voisine de 900C, et cette solution circule contre le cathéter pendant une durée comprise entre 1 et 4 heures, et de préférence voisine de 2 heures. De même, la solution d'héparine est à une température comprise entre 600 C et 850 C, et de préférence voisine de 750 C, et cette solution circule contre le cathéter pendant une durée comprise entre 2 et 8 heures, et de préférence voisine de 4 heures. Enfin, la solution de glutaraldéhyde est à une température comprise entre 45 et 600 C, et de préférence voisine de 500 C, et elle circule contre le cathéter pendant une durée comprise entre 1/4 d'heure et 1 heure, et de préférence voisine d'une demi-heure. De plus, après les mises en contact du cathéter respectivement avec les solutions de surfactif et de glutaraldéhyde et avec le plasma déplaquetté, le procédé consiste à rincer le cathéter respectivement à l'eau distillée tiède, à l'eau distillée froide et au sérum physiologique. Enfin, en ce qui concerne le nettoyage préalable du cathéter, le procédé consiste à nettoyer la paroi du cathéter en effectuant successivement - un lavage du cathéter avec une solution alcoolique et en soumettant le cathéter à un faisceau d'ultra-sons pendant une durée comprise entre 1/2 heure et 2 heures, et de préférence voisine d'une heure, - un rinçage du cathéter avec du cycohexane pendant une durée comprise entre 1/4 d'heure et 1 heure, et de préférence voisine d'une 1/2 heure, et - un sèchage à l'air comprimé sec et filtré. Le cathéter en élastomère de silicone propre à l'invention se caractérise en ce que sa paroi externe au moins est recouverte d'un complexe actif héparineantithrombine III obtenu par la mise en oeuvre du procédé présenté ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à l'aide d'un exemple particulier de procédé, décrit ci-après à titre non limitatif, en référence aux dessins annexés, sur lesquels les figures 1 à 5 schématisent les différentes étapes principales de traitement. Le matériel utilisé pour la réalisation du traitement comprend un agitateur magnétique, une pompe péristaltique, un bain-marie thermostaté, à bac à ultra-sons, un circuit réfrigérant, une source de vide et une source d'air comprimé, sec et filtré, à 0,5 MPa environ. Le cathéter à traiter étant un cathéter en élastomère de silicone commercialisé sous le nom de marque SILASTIC " par la société CORNING GLASS, le matériel utir lisé pour la réalisation du traitement comprend également des canalisations en élastomère de silicone de même nature, dont une au moins présente une longueur et un diamètre en rapport avec la taille du cathéter à traiter, c'est-à-dire que le diamètre interne et la longueur de cette canalisation sont supérieurs respectivement au diamètre externe et à la longueur du cathéter. Le cathéter est tout d'abord introduit dans cette canalisation, et l'ensemble obtenu est disposé dans le bac à ultra-sons, rempli d'une solution alcoolique à 70 % V/V, afin d'y subir un lavage en étant soumis à l'action d'un faisceau d'ultra-sons, pendant une heure environ. Puis, on procède à un rinçage, pendant 30 minutes environ, avec du cyclohexane commercialisé par les laboratoires S{ERCK SHARP & BR DOHME. Ces deux opérations sont exécutées avec des débits de 15 cm3/ mn au travers de la canalisation. On effectue ensuite un sèchage par passage d'air comprimé provenant de la source d'air sec et filtré, sous une pression de 0,5 MPa. La suite des opérations, sauf les rinçages, est assurée en circuit fermé, constitué à l'aide de la pompe et du bain-marie, et en faisant intervenir le circuit réfrigérant, et les trois solutions utilisées et présentées cidessous sont soumises à une agitation continue par l'utilisation de l'agitateur magnétique. L'étape suivante consiste à faire passer dans la canalisation, pendant 2 heures environ et avec un débit de 1 dm3 à l'heure, une solution de surfactif à une température voisine de 900 C. Cette solution est une solution millimolaire préparée en réalisant une dissolution de 0,653 g du produit de synthèse de formule C6F13C2H4SO2NHC3H6N+(CH3)3I, commercialisé par la société PECHINEY UGINE KULHMANN, dans un minimun d'alcool, puis par ajustage à 1 dm avec de l'eau distillée. A partir d'un cathéter 1, dont la surface de paroi externe et interne a été nettoyée et parait lisse, comme cela est schématisé sur la figure 1, on réalise ainsi -un greffage de surfactif 2 sur la paroi du cathéter 1, comme cela est représenté sur la figure 2. On effectue ensuite un rinçage avec un .dom3 d'eau tiède. L'étape suivante consiste à greffer l'héparine 3 sur le surfactif 2 déjà greffé, comme cela est schématisé sur la figure 3. Pour cela, on fait passer-dans la canalisation, pendant 4 heures environ et avec un débit de 20 cm3/mn, une solution d'héparine à une température voisine de 750 C. Cette solution d'héparine est préparée en prélevant à la seringue 2 cm3 d'hép.arine dans une ampoule à injection intra-veineuse de 5 cl3 (25 000 UI) commercialisée par les laboratoires CHOAY, et en introduisant ces 2 cm3 dans une fiole jaugée de 1 dm3, puis en ajustant le volume avec du sérum physiologique (solution de Na C1 à 90/00), le pH étant ajusté à 3,6. On obtient ainsi une solution d'héparine à 10 000 UI par dm3. L'étape suivante consiste à réaliser des pontages de l'héparine 3 , comme schématisé sur la figure 4, à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 4 à une température voisine de 500 C, que l'on fait passer dans la canalisation pendant environ 30 minutes. Cette solution de glutaraldéhyde à 1 % est obtenue par dilution d'une solution commerciale à 25 %. Cette opération est suivie d'un rinçage à froid, à l'eau distillée. L'étape suivante consiste à faire circuler dans la canalisation du plasma sanguin déplaquetté, avec le débit maximum permis par la viscosité du milieu, puis à effectuer un rinçage immédiat au sérum physiologique. Ce passage de plasma déplaquetté permet d'obtenir une fixation sélective de l'antithrombine III 5 par l'héparine 3, comme cela est schématisé sur la figure 5, de sorte qu'un revêtement thromborésistant est immédiatement formé'aussi bien sur la paroi externe que sur la paroi interne du cathéter. Le cathéter ainsi préparé, et dont la surface est recouverte d'un complexe actif héparine-antithrombine III, est conservé, jusqu'à son utilisation, à l'abri des ultraviolets et de toute contamination bactérienne. Il présente une antithrombogénéicité totale, qui rend inutile l'introduction d'héparine en solution pendant la durée de son utilisation, et constitue un cathéter à utilisation prolongée, destiné à un usage en médecine humaine ou vétérinaire, -et otmme matériel de laboratoire. REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement antithrombogène d'un cathéter (1) en élastomère de silicone, caractérisé en ce qu'il consiste - à nettoyer au moins la paroi externe du cathéter, - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec une solution chaude d'un surfactif (2), qui est une résine fluorée comportant unammonium primaire, - à rincer le cathéter, - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec une solution chaude d'héparine (3), - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec une solution tiède ou légèrement chaude de glutaraldéhyde (4), - à rincer le cathéter, - à mettre au moins la paroi externe du cathéter en contact avec du plasma sanguin déplaquetté, afin de réaliser, par fixation sélective de l'antithrombine III (5) par l'héparine (3), un complexe actif héparine(3)-antithrombine III (5) permettant à la paroi du cathéter (1) d'être immédiatement thromborésistante,et, - à rincer le cathéter. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter simultanément les parois -externe et interne du cathéter (1). 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu il consiste à appliquer le traitement à un cathéter (1) préalablement introduit dans une canalisation de même nature que le cathéter à traiter, et de longueur et de diamètre en rapport avec la taille du cathéter à traiter, de sorte que les diverses solutions et divers fluides utilisés puissent passer dans le cathéter (1) et entre ce dernier et la canalisation. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser comme surfactif le produit de formuleC6F13C2H4S02NHC3H6N+(CH3)3I. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer la solution de surfactif sous la forme d'une solution millimolaire de ce produit dans de l'eau distillée. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser une solution d'héparine à 10 000 UI / dm3 , dans du sérum physiologique à 90/00 de Na Cl, le pH étant ajusté à 3,6. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser une solution de glutaraldéhyde à 1 %. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre le cathéter en contact successivement avec les solutions de surfactif (2) d'héparine (3) et de glutaraldéhyde (4), ainsi qu'avec le plasma déplaquetté, en faisant circuler ces solutions et ce plasma déplaquetté contre le cathéter (1); 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la circulation des solutions et du plasma déplaquetté s'effectue en circuit fermé, les solutions étant soumises à une agitation continue. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 et -S, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler le plasma déplaquetté au débit maximum permis par la viscosité du milieu. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler la solution de surfactif (2) à une température comprise entre 80 et 950 C, et de préférence voisine de 900 C, contre le cathéter (1) pendant une durée comprise entre 1 et 4 heures, et de préférence voisine de 2 heures. 12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler la solution d'héparine (3) à une température comprise entre 60 et 850 C, et de préférence voisine de 750 C, contre le cathéter (1) pendant une durée comprise entre 2 et 8 heures, et de préférence voisine de 4 heures. 13. Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler la solution de glutaraldéhyde à une température comprise entre 45 et 600 C, et de préférence voisine de 500 C, contre le cathéter (1) pendant une durée comprise entre 1/4 d'heure et 1 heure, et de préférence voisine d'une demi-heure. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce. qu'il consiste, après les mises en contact du cathéter (1) respectivement avec les solutions de surfactif (2) et de glutaraldéhyde (4), et avec le plasma déplaquetté, à rincer le cathéter (1) respectivement à l'eau distillée tiède, à l'eau distillée froide, et au sérum physiologique. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il consiste à nettoyer la paroi du cathéter (1) en effectuant successivement : - un lavage du cathéter avec une solution alcoolique et en soumettant le cathéter un faisceau d'ultrasons, - un rinçage du cathéter avec du cyclohexane, et - un sèchage à l'air comprimé sec et filtré. 16. Procédé selon la revendications 15, caractérisé en ce qu'il consiste - à laver le cathéter (1) avec la solution alcoolique en le soumettant au: faisceau. d'ultra-sons pendant une durée comprise entre 1/2 heure et 2 heures, et de préférence voisine de 1 heure, et - à rincer le cathéter (1) -avec du cyclohexane pendant une durée comprise entre 1/4 d'heure et 1 heure, et de préférence voisine d'une demi-heure. 17. Cathéter en élastomère de silicone, caractérisé en ce que sa paroi externe au moins est recouverte d'un complexe actif héparine (3)-antithrombine III (5), obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 16.