Brevet FR2566424A1 — publié le 19851227

La présente invention concerne la transformation de levures Yarrowia, en particulier de Y. lipolytica, , par par des vecteurs de clonage. On connait actuellement des techniques permettant de transformer un certain nombre de levures telles que Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe et Kluyveromyces lactis ; mais, jusqu'à maintenant, il n'a pas été possible d'obtenir la transformation de Yarr.owia par des vecteurs plasmidiques. Or, la levure Yarrowia est utilisée actuellement dans la préparation de différents acides, notamment l'acide citrique, et présente la particularité d'être capable de préparer des protéines exocellulaires, ce qui la différencie de Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces lactis, et présente évidemment, sur le plan industriel, un avantage considérable puisqu'il n'est pas nécessaire d'éclater les cellules afin de récupérer les protéines qui ont pu être synthétisées. Le problème essentiel rencontré lors de la mise au point d'un système de transformation pour Yarrowia lipolytica est le choix d'un marqueur de sélection et d'une souche receveuse. Les souches de Yarrowia sont en général résistantes aux antibiotiques de type gentamycine et en particulier à l'antibiotique G418 couramment utilisé pour sélectionner les levures, et, en particulier, il a été observé que la traduction de messagers par des ribosomes de Y. lipolytica nsest que très peu sensible à cet antibiotique, ce qui exclut de pouvoir sélectionner des transformants en utilisant des vecteurs portant le transposon Tn609 codant pour la résistance à cet antibiotique. De même, les systèmes classiques utilisés dans le cadre de la transformation de S. cerevisiae, à savoir l'utilisation du gène URA3+, ont pu également être utilisés dans la transformation de Schizosaccharomyces pombe et de Kluyveromyces lactis. Toutefois, l'utilisation de plasmides portant ce gène marqueur implique de disposer de mutants usa3 , ce qui est difficilement réalisable dans le cadre de Y. lipolytica car ces mutants sont trop labiles et reversent trop facilement. Dans le cadre de la présente invention, on a pu mettre en évidence des mutants stables, auxotrophes, pour la lysine et mettre en évidence la possibilité de complémenter cette auxotrophie par l'intermédiaire d'un plasmide vecteur portant le gene LYS2+ deS. cerevisiae. Le gène LYS 2+ de S-. cerevisiae a été cloné dans pBR322 (voir Eibel H. et coll. 1983 ). Ce plasmide pBR322 portant le gène LYS2 de S. cerevisiae sera appelé ci-après plasmide YIp333. Ce gène code pour l'a-aminoadipate réductase et doit correspondre au locus complexe LYS2-LYS-3 de Y. lipolytica. C'est pourquoi la présente invention concerne des vecteurs de clonage et d'expression d'une protéine déterminée dans une souche de Yarrowia, en particulier dans Y. lipolytica, caractérisés en ce que ces vecteurs comportent au moins un fragment d'ADN de Yarrowia, en particulier Y. lA lytica, ainsi que le gène LYS2 de S. cerevisiae. De préférence, ce vecteur de clonage et d'expression comportera tout ou partie de 1'ADN plasmidique d'un vecteur bactérien tel que pBR322. En outre, ce vecteur pourra comporter, afin d'exprimer une protéine particulière, outre le gène codant pour ladite protéine, les différents éléments permettant d'en assurer l'expression dans Y. lipolytica, en particulier une séquence assurant la promotion dudit gène à exprimer. Pour la mise en oeuvre de ce vecteur, on transformera une souche de Y lipolytica lys2 et on sélectionnera les transformants devenus lys2+. La présente invention concerne également les souches de Yarrowia transformées-par les vecteurs selon la présente invention ainsi qu'un procédé de preparation d'une protéine déterminée-caractérisé en ce que l'on fait fermenter, sur un milieu de culture approprié, une souche de Yarrowia transformée par un vecteur selon la présente invention. L'étude de llADN transformant montre qu'aucun plasmide libre n'est détecté, ni par hybridation de 1'ADN total non restreint ni par retransformation d'E. coli. L'ADN transformant est intégré dans le génome à raison d'une à au moins 10 copies par génome suivant les trans formants. La structure de ces insertions multiples n'est pas modifiée après 30 générations en milieu sélectif. Après restriction par l'enzyme PstI et religation de 1tADN des souches transformées, on peut réisoler dans E. coli des fragments de YIp333 associés à des séquences uniques de Y. lipolytica. En outre, le gène de résistance à la tEtra- cycline dlE. coli est maintenu sans modification dans la levure et s'exprime normalement dans E. coli après réextraction de Y. lipolytica. Enfin, les souches ainsi transformées sont hyperproductrices de lysine; en particulier lorsque plusieurs copies du gène LYS 2+ ont été intégrées dans leur génome. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après. EXEMPLE 1 Mise en évidence de la complémentation de l'auxotrophie lys2 par le gène LYS2 Afin de mettre en évidence que le gène LYS 2+ pouvait complémenter une mutation lys2 de Y. lipolytica, on a effedtuX les fusions de protoplastes suivants - la fusion lys2+ S. cerevisiae x lys2 Y. lipolytica - la fusion lys2 S. cerevisiae x lys2 Y. lipolytica - la fusion lys2+/B6-61 S. cerevisiae x lys2 Y. lipolytica. La première fusion est lys2+ alors que ia seconde fusion est lys2-, ceci démontre que la- complémentation est possible. La troisième fusion correspond à une souche de S. cerevisiae lys2 transformée par le plasmide B6-61 qui est un dérivé de YIp333 portant un fragment EcoRI de Y. lipolytica qui permet sa réplication dans S. cerevisiae. Le fait que la fusion soit lys+ a montré qu'il était envisageable de transformer Y. lipolytica directement avec un plasmide analogue à B6-61. EXEMPLE 2 Construction -de plasmides vecteurs pour Y. lipolytica Le plasmide de base utilisé pour la réalisation des plasmides selon la présente invention est le plasmide YIp333 décrit dans l'article de Eibel H. et coll., 1983, et qui comporte essentiellement le gène LYS2 de S. cerevisiae cloné dans le plasmide bactérien pBR322. Les expériences conduites par Philippsen ont mis en évidence que ce plasmide était capable de complémenter la mutation lys2 dans S.- cerevisiae. Ce plasmide YIp333 digéré par EcoRI est ligué avec un "shotgun" d'ADN total de Y. lipolytica traité par EcoRI (banque B6, 18 000 hybrides, taille moyenne de l'insert : 6,2 kb). On obtient de cette façon un grand nombre de plasmides selon la présente invention, c'est-a-dire comportant le gène LYS2 et des séquences aléatoires prélevées sur Y. lipolytica EXEMPLE 3 Transformation de Y. lipolytica On utilise pour cette transformation une souche de Y. lipolytica 8601-1 (LYSi-5 lys2, adel). LYS 1-5 supprime le rEtro-contrôle par la lysine du premier enzyme de la voie de biosynthese de ladite lysine. La transformation de la souche de Y. lipolytica par les vecteurs plasmidiques construits précédemment est effectuée selon la technique décrite pour S. cerevisiae dans l'ouvrage Methods in Yeast Genetic, 1981. - Les - protoplastes ont été mis à régénérer sur un milieu minimum supplémenté en adénine. Après 4 jours dnincubation, on a observé, à saturation d'ADN (5 Vg/ml) environ 1 colonie LYS+ pour 5,105 protoplastes régénérés, sur un fond de microcolonies abortives (environ 1 % des protoplastes viables ont été transformés mais ne maintiennent pas l'ADN transformant). Toutes les colonies LYS s'hybrident à une sonde YIp333, alors que les colonies lys n'hybrident plus. Ceci permet de les distinguer d'éventuels revertants. La stabilité des transformants a été étudiée et mesurée après 10 générationsen milieu sélectif Les résultats observés sont rappelés dans le tableau Etude de l' DN Transformant Aucun plasmide libre nea été détecté, ni par hybridation de 1'ADN total non restreint ni par retransformation d'E. coli.Après restriction de l'ADN total de ces transformants par différents enzymes de restriction, on peut conclure que - les transformants dénommés 621 et 622 ne portent qu'une copie (remaniée) du vecteur ; - les transformants 641, 642 et 643 portent 2 à 3 copies du vecteur1 celui-ci n'est pas remanié (après restriction par EcoRI on sépare le fragment YIp333 de 1'ADN total, une restriction par PstI donne 2 bandes par copie intégrée); - les transformants 644 et 651 portent 10 copies ou plus du vecteur non remanié. EXEMPLE 4 Effet du nombre de copies LYS2 sur le pool en lysine libre La souche 8601-1 est dérégulée pour le premier enzyme de la voie de biosynthèse de la lysine. On sait que dans une souche sauvage portant cette mutation le flux des intermédiaires est ralenti au niveau de l'aminoadipate réductase (locus LYS2) et qu'on ne déréprime pas cette activité dans les mutants affectés dans le contrôle général, on pouvait donc penser qu'une augmentation du pool de lysine libre devait résulter d'une augmentation du nombre de copies du gène LYS2+. Cette hypothèse a été testée avec le gène clonE tYS2 de S. cerevisiae présent sur YIp333. On a pu constater - que le"poot observé après insertion d'une seule copie de LYS2 est supérieur à celui d'une souche témoin de Y. lipolytica LYS2 - que l'augmentation du nombre de copies de LYS2 conduit à une augmentation du pool de lysine libre. Les résultats mesurés sont rappelés dans le tableau ci-après - TABLEAU NOMBRE DE COPIES nMoles lys/mg SOUCHE STABILITE LYS2 LYS2 poids sec (%) Y.lipo. S.cerev. Réf. 1 0 100 621 99,9 0 1 219 622 99,9 0 9 214 641 33,- 0 2-3 565 642 77,- 0 2-3 483 643 26,- 0 2-3 567 644 19 O 10 880 651 91 0 10 800 (Toutes les cultures sont faites en milieu minimum + ade) (La stabilité est estimée après 10 générations sur milieu complet) Ces expériences mettent en évidence la possibilité d'une amplification génique correspondant dans ce cas particulier à une étape limitante de la biosynthèse de la lysine. Les souches ainsi obtenues sont devenues hyperproductrices de lysine. REFERENCES EIBEL H. et P. PHILIPPSEN (1983) Molec. Gen. Genet. 191, 66-73. Methods in Yest Genetics, p. 91-92, Cold Spring Harbor Laboratory (ed), Cold Spring Harbor N.Y. (1981) REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage et d'expression d'une protéine déterminée dans une souche de Yarrowia, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un fragment d'ADN de Yarrowia, ainsi que le gène LYS2 de S. cerevisiae. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre , un fragment de plasmide bactérien. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le plasmide bactérien est pBR322. 4) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment d'ADN de Yarrowia est un fragment EcoRI. 5) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporter en outre, le gène codant pour ladite protéine et les éléments assurant son expression dans une levure. 6) Souche de Yarrowia transformée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 5. 7) Souche selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Y. lipolytica. 8) Souche selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle comporte plusieurs copies du gène LYS2 intégrées dans son génome. 9) Procédé de préparation de la lysine, caractérisé en ce qu'on fait fermenter sur un milieu de culture approprié une souche selon l'une des revendications 6 à 8. 10) Procédé de préparation d'une protéine déterminée, caractérisé en ce qu'on fait fermenter sur un milieu de culture approprié une souche selon l'une des revendications 6 à 8 transformée parun vecteur comportant un gène codant pour une protéine déterminée et les éléments assurant son expression dans ladite souche.