Brevet FR2568883A1 — publié le 19860214

La présente invention concerne l'obtention de variétés d'interféron-r pratiquement pures par génie géné- tique. Les interférons constituent une famille de pro- téines, ou glycoprotéines, produites par des cellules en réponse à des infections virales ou autres agents induc- teurs comme l'ARN à double brin ou des mitogènes. Les in- terférons sont libérés à partir des cellules productrices et réagissent avec d'autres cellules pour leur conférer une vaste résistance antivirale. De plus, ils inhibent la prolifération cellulaire et ajustent la réponse immu- nitaire (W.E. Stewart, 1979, "The Interferon System", Springer). On a constaté que les interférons,produits par des cel- lules différentes, présentent des propriétés physicochimi- ques, sérologiques et fonctionnelles différentes. Les inter- férons humains sont à ce jour regroupés en trois catégories d(,, et y, selon leurs spécificités antigéniques; un classement similaire peut s'appliquer aux interférons mu- rins. Afin de limiter les pertes économiques, provoquées par les maladies virales du bétail, il serait avantageux de pouvoir disposer d'un agent antiviral à large spectre d'ac- tion. Une mortalité élevée est observée dans certaines cir- constances, comme le transport des animaux ou leur regroupe- ment dans un nouvel environnement o ils sont confrontés avec de nouvelles infections virales; L'utilisation prophy- lactique ou thérapeutique d'interférons bovins semblerait idéale dans ces circonstances. Les interférons bovins (BoIFN), à l'opposé de leurs correspondants de sources humaine ou murine, n'ont pas été étudiés de façon poussée. Ils sont probablement de puis- sants agents pour la prévention de maladies du bétail, com- muniquées par des virus comme la fièvre aphteuse, la rhino- trachéite bovine, infectieuse, la pseudorage, la langue bleue et la diarrhée néonatale bovine. Lorsqu'on essaye in vitro des préparations de BoIFN, elles exercent une activité antivirale contre plu- sieurs des virus impliqués dans ces maladies (A. Goossens et coll. Ann. Met. Vet. 127 p.135, 1983). Les d-interférons constituent une famille de protéines voisines, codées par plus d'une douzaine de gènes distincts. Cela est démontré chez les souris et les humains, et maintenant également chez le bétail (D.U. Goeddel et coll., Nature 290 20, 1981; S. Nagata et coll., Nature 287, 401, 1980; Shaw et coll., Nuc. Acid. Res. 11 555, 1983; Wil- son et coll., J. Mol.Biol. 166 457, 1983). Les gènes de IFN o ont une homologie de séquence nette, cependant ils sont conservés d'un bout à l'autre de l'évolution. C'est pourquoi l'on pense qu'il est nécessaire d'avoir une pro- duction in vivo différentielle d'interférons appropriés pour une réponse défensive réussie, chez les humains, aux infections virales spécifiques, interférences immunologi- ques et désordres néoplasiques. L'obstacle majeur, pour une détermination clini- que de combinaison prédéterminée de préparations d' c( -in- terféron, découle des difficultés d'obtention de grandes quantités de protéines purifiées de chacun des types d'in- terféron. Les techniques du génie génétique procurent les instruments d'obtention d'une source fidèle, pour la produc- tion de protéines d'IFN particulières. Ces techniques per- mettent d'isoler l'information génétique de chaque interfé- ron, par manipulation directe du génome ou de ses produits de transcription, ou par synthèse chimique de la séquence complète codant pour IFN dans des cellules procaryotiques ou eucaryotiques. Des ma- nipulations ultérieures de ces séquences de IFN particuliè- res, conjointement avec des signaux d'expression appropriés (signaux de transcription et de traduction), conduisent à des taux élevés de production d'interférons clones. L'objet principal de la présente invention est de procurer une source de production de nouveaux produits dif- férents de la série des protéines de l'interféron bovin, et se rapporte aux espèces très pures d'interféron, ainsi obtenues. L'isolation, le clonage et l'expression des gènes d'interféron-r bovin comprennent les stades suivants. a) Constitution d'une banque génomique bovine, utilisant des vecteurs phages \ 1. Isolation, purification et digestion partielle d'ADN bovin provenant de tissus bovins tel que le foie; Iso- lation de fragments d'ADN 12-20 kb; 2. Préparation de branches de vecteur d'ADN,telles que branches de L47,1>, et fixation de ces branches aug fragments d'ADN bovin fractionnés; 3. Conditionnement et amplification des hybrides > pour former la banque génomique bovine; b) Isolation des gènes de BoIFN- e: 1. Préparation de sondes spécifiques pour les gènes de BoIFN- (. Isolation de séquences de HuIFN d, ADNc cou- vrant la totalité de la région codant pour le gène et marquage radioactif de ces sondes d'ADN; 2. Détermination des conditions de triage pour la banque génomique par utilisation de l'hybridation d'échantillon de HuIFNd avec des macules génomiques bovines; 3. Triage de la banque génomique par hybridation in situ; 4. Purification de plaque des clones positifs et isola- tion de l'ADN du phage hybride \; 5. Analyse du diagramme de restriction des cloneshybri- des) et localisation des régions d'ADN homologues de HuIFN- d. c) Analyse de séquence des gènes de BoIFN- . d) Sousclonage des gènes de BoIFN-1 pour l'expression dans des systèmes hétérologues comcfe bactéries ou cellules eu- caryotiques. 1. Fragmentation de séquences d'ADN hybride X par des enzymes de restriction. Isolation des séquences co- dant pour BoIFN-(. 2. Préparation de véhicules d'expression et d'oligonu- cléotides synthétiques pour la construction d'éléments d'ADN exprimant des niveaux élevés du polypeptide BoIFN- in vivo. e) Production et purification de BoIFN-. et de ses déri- vés. L'ADN total est extrait de cellules bovines com- me des cellules du foie, du placenta et du thymus. L'ADN est extrait de ces cellules par des modes d'extraction uti- lisant des réactifs comme le phénol. Cet ADN est fragmenté au hasard par cisaillement mécanique ou par digestion avec des enzymes de restriction. L'ADN partiellement digéré ou cisaillé, est fractionné par des procédés comme centrifuga- tion dans un gradient de densité de sucrose, ou électro- phorèse sur gel, afin d'obtenir des fragments de la dimen- sion nécessaire. Ces fragments sont insérés dans des véhi- cules de clonage, afin d'édifier la banque génomique. Le choix du vecteur est influencé par plusieurs facteurs, y compris le type d'ADN étranger à insérer, le type d'endonucléase de restriction utilisé, la nécessité ou non d'exprimer l'insert, et la nature de l'hdte. Les vecteurs communément utilisés sont les cosmides, les bac- tériophages ou les plasmides, qui ont un certain nombre de sites intéressants pour l'endonucléase de restriction, et un moyen d'identifier les bactéries qui portent une molé- cule d'ADN recombinée. Les vecteurs viraux ont l'avantage de contaminer les cellules avec une grande efficacité et de se reproduire rapidement. Un autre avantage remarquable des vecteurs phages est que leur ADN est entièrement emballé dans la particule du virus, raison pour laquelle l'ADN é- tranger peut être conservé et amplifié facilement. Cette der- nière propriété est très intéressante lorsqu'il faut manipu- ler une banque de plus d'un million de clones différents. Les génomes de la famille entière des phages lambdoîdes sont organisés de manière à ce que leur tiers central (par- tie silencieuse) contienne les gènes dont on peut se passer pour la croissance lytique. Les extrémités droite et gauche essentielles du phage sont désignées sous les appellations de branches droite et gauche. Les séquences non essentielles peuvent être supprimées au moyen de différentes enzymes de restric- tion. Ces véhicules de clonage permettent l'insertion entre les branches du phage de 15 à 20 kb d'ADN étranger. Dans la pratique, l'ADN du vecteur bactériophage X est d'abord traité avec une enzyme de restriction, puis les branches sont séparées de la partie silencieuse du milieu. Les bran- ches isolées sont alors liées avec l'ADN chromosomique inté- ressant. Selon le vecteur utilisé, on peut utiliser l'une de plusieurs voies de "préparation de branches". La centri- fugation dans le gradient de densité du sucrose prouve que le plus efficace est le procédé choisi dans la présente é- tude. Le clonage des phages hybrides est basé sur le système de conditionnement in vitro (B. Hohn, J.Mol.Biol. 98, 93, 1975). L'ADN conditionné in vitro se propage dans les cellules de E. coli, établissant ainsi la banque de pha- ge recombinant qui représente le génome entier. Plusieurs de ces banques sont amplifiées et utilisées comme source pour isoler des gènes bovins. Pour isoler un seul gène à partir d'une banque d'un ADN eucaryote (3 x 109bp de taille de génome), il faut passer au crible plus de 100000 clones, en supposant une di- mension moyenne de 20 kb pour les inserts eucaryotiques. Un mode de passage au crible, qui permet de manipuler une col- lection aussi vaste de clones, consiste à hybrider in situ, sous réserve qu'une sonde marquée, spécifique de la séquence pour le gène voulu, soit disponible. Comme on n'a pas de connaissance antérieure de la séquence IFN bovine, on a dé- cidé d'utiliser les séquences d'IFN-o humain, que l'on a préalablement clonées (Production d'Interféron, demande de brevet en Israël N 70678, 1984) pour sonder la banque bo- vine quant aux gènes de BoIFN-o. Avant d'utiliser les sé- quences de HuIFN comme sondes pour la banque bovine, on a confirmé que la séquence d'HuIFN pouvait s'hybrider spéci- fiquement avec l'ADN bovin par macules génomiques. Les clones X, qui s'hybrident avec l'échantil- lon de HuIFN-eÀ, sont isolés, se propagent, et leur ADN est analysé par digestion avec une enzyme de restriction et macules australes, pour localiser sur le diagramme les régimes homologues d'ADN de HuIFN- oS. L'analyse poussée par enzyme de restriction de cette région d'ADN permet une ma- nipulation génétique ultérieure du gène de BoIFN- 0. 13 clones s'hybridant spécifiquement avec un échantillon d' HuIFN- d, ont été identifiés jusqu'ici. Ils représentent au moins 5 membres séparés de la famille de gène de BoIFN- dont 4 ont été en outre analysés et leur séquence com- plète d'ADN a été déterminée (Tableaux 1 à 4). Pour déterminer l'activité biologique de BoIFN-o, on peut utiliser un véhicule d'expression efficace pour la production de BoIFN- o, de polypeptide ou de polypeptide de met-IFN mûr. Pour l'expression efficace dans les bactéries de gènes de BoIFN- o, des plasmides sont établis, qui com- prennent des promoteurs de transcription efficaces comme lac, trp, PL ou X PR, conjointement avec des signaux d'initiation de traduction, naturels ou synthétiques, effi- caces sur les bactéries, et les séquences codantes appro- priées qui conduisent éventuellement à la production de poly- peptide de met-IFN. Les gènes de BoIFN- o( peuvent être égale- ment manipulés pour l'expression efficace dans les cellules eucaryotiques, o ils sont clonés avec les séquences natu- relles codant pour le signal peptide, ce qui est effectué in vivo et produit ainsi l'authentique polypeptide naturel IFN-d. En outre, les séquences de BoIFN- e peuvent être manipulées de telle manière qu'il y a production dans la cellule bactérienne ou eucaryotique, d'un polypeptide fu- sionné, et ce polypeptide fusionné est ultérieurement trai- té par les cellules, ou in vitro, pour produire le poly- peptide naturel authentique IFN- N. BoIFN-d peut être produit dans un support euca- ryotique ou procaryotique fondé sur le système de régula- tion d'expression spécifique qui est établi. Par exemple, l'expression dans les procaryotes utilisant le promoteur de transcription trp peut être induite par régulation de la concentration de tryptophane dans le milieu de crois- sance, ou bien la production peut être effectuée soit par introduction d'une souche défectueuse dans du represseur trp, ou par une construction utilisant un mutant de consti- tution d'opérateur à trp. La croissance dans les conditions convenables décrites plus haut conduit à l'accumulation du polypeptide BoIFN-e produit par génie génétiqueo Le stade d'extraction de IFN dépend de ce que le produit est extra- ou intra-cel- lulaire. Dans le dernier cas, on utilise des modes opéra- toires impliquant la rupture de la membrane cellulaire par des enzymes, détergents ou forces mécaniques. Le mode de pu- rification est basé sur les propriétés physico-chimiques, immunologiques et biologiques de BoIFN-d, par exemple fai- ble pH et stabilité vis-à-vis des détergents; poids molécu- laire de 18 000 daltons, liaison avec des anticorps homolo- gues poly- ou mono-clonaux ou récepters d'IFN- d 0 et sur l'activité antivirale. En utilisant une combinaison des procédés d7ex- bacLioL, de précipitation différentielle, de chromatogra- phie par dimension et par affinité, on a purifié le BoIFN-a bactérien pour obtenir une activité spécifique élevée. Les préparations purifiées déIFN-i présentent une activité antivirale sur un large spectre de différentes cellules eu- caryotiques allant de l'homme aux mammifères inférieurs. BoIFN-o a une activité spécialement élevée dans les cel- lules d'origine bovine. EXEMPLE Stade 1. Isolation d'ADN de poids moléculaire élevé à partir de foie de veau. La source d'ADN pour la banque génomique est le foie d'une vache Holstein Frisonne fraîchement abattue. L'ADN est préparé pratiquement selon le mode opératoire de Blin & Stafford (Nucleic Acid Res. 3, 9, 1976), 50 g de tissu congelé sont broyés en une fine poudre dans un broyeur de Waring, en présence d'azote liquide. Cette poudre est ajoutée en petites quantités à une solution de 400 ml de phénol et 400 ml de tampon d'extraction (20 mM de tris-HCl pH 7, 6, 0,5% SDS, 1 M NaCl, 1 mM EDTA). Ce mélange est agité par un agitateur magnétique pendant 30 minutes, puis l'on centrifuge à 4000 tours/minutes pendant 10 minutes dans un rotor Sorvall GSA. La phase aqueuse est réextraite avec du phénol, puis avec de l'éther, dans un entonnoir à décantation. La préparation d'ADN est placée dans un sac à dialyse et on ajoute de la RNase (exempte de DNase) de manière à avoir une concentration finale de 50 gg/ml. La dialyse est effec- tuée une nuit durant à température ambiante, contre 10 li- tres de 20 mM de Tris-HCl pH 7,6, 10 mM NaCl et 1 mM d'EDTA. EDTA (concentration finale 50 mM), SDS (0,5% en final) et protéinase K (en final 100 gg/ml), sont ajoutés à la solu- tion d'ADN que l'on met à incuber pendant 3 heures à 37 C. l'ADN est extrait à deux reprises avec du phénol, est préci- pité avec de l'éthanol et remis en suspension dans 10 mM de Tris-HCl pH 7,6, 1mM d'EDTA (tampon TE). Stade 2. Préparation de fragments d'ADN 16 kb à partir d'ADN de foie de veau partiellement digéré Des fragments d'ADN bovin 16 kb sont obtenus par digestion partielle d'ADN de poids moléculaire élevé avec l'enzyme de restriction Sau 3A. Cette enzyme recon- naît la séquence GATC 4 bp et engendre une extrémité de cohésion 4 b. Cette extrémité de GATC est homologue d'une extrémité engendrée par l'enzyme de restriction BamH 1. BamH 1 sera utilisée plus tard pour obtenir les branches gauche et droite du vecteur > L47,1, qui doivent être liées à l'ADN bovin. 400 gg d'ADN de foie de veau de poids moléculaire élevé, sont digérés avec 100 unités de Sau 3A. Après-incubation à 37 C pendant 1 heure, on arrête la ré- action par addition de phénol.L'ADN est extrait à deux re- prises avec un mélange phénol-chloroforme, est précipité dans de l'éthanol et dissous dans du tampon TE. Pour fractionner l'ADN, on chauffe la préparation pendant minutes à 68 C, on refroidit à 20 C et on dépose en cou- che sur un gradient de 38 ml de sucrose à 10-40% dans 1M NaCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8 et 5 mM d'EDTA. On effectue une centrifugation à 26 000 tours/minute dans un rotor de Beckman SW 27 pendant 24 heures à 20 C. On recueille des fractions de 0,5 ml, des prélèvements de 10 il sont ana- lysés par électrophorèse au travers d'un gel d'agarose à 0,8%. Suite à cette électrophorèse on rassemble des frac- tions de gradient renfermant de l'ADN dans l'intervalle de 12 à 18 kb. A ce stade, on constate qu'il n'est pas possible de préci- piter l'ADN. Il apparaît qu'à la fois un stade de dialyse et un stade de concentration sont nécessaires avant la précipitation. La dialyse est réalisée contre 4 litres de TE, une nuit durant. La concentration s'effectue par chro- matographie sur cellulose DEAE. Les fractions dialysées (8 ml) sont chargées sur une colonne de 0,3 ml de DE-52 prééquilibré avec 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,6.Cet- te colonne est ensuite rincée avec plusieurs fois son vo- lume de tampon d'équilibrage. L'ADN lié est ensuite élué avec de l'urée 6, 5 M, NaCL 1 M et Tri-HCl 10 mM pH 7,6. On recueille des fractions de 0,5 ml et celles qui renferment ADN sont rassemblées, précipitées et séchées sous vide. Les comprimés d'ADN de poids moléculaire élevé, amenés à sec par évaporation, sont difficiles à dissoudre. La remise en suspension complète dans TE à une concentration de 1 Fg/ il est réalisée par 4 heures d'incubation à température ambiante. 400 gg d'ADN chromosomique de foie donnent 60 jg de fragments d'ADN purifiés de 12 à 18 kb. Stade 3: Préparation de l'ADN du bactériophage A L47,1 Le bactériophage X L47, décrit par Leonen et Brammar (Gene 10 p.249, 1980), est utilisé comme vecteur de clonage pourla constitution de la banque génomique. L'ADN est préparé à partir d'une suspension du phage ren- fermant 1013 particules de CsCl purifié. CsCl est enlevé par dialyse de la suspension à deux reprises contre 1000 fois son volume de 50 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM NaCl et mM MgCl2. Au bout de 2 Heures, les phages sont enlevés du sac de dialyse, on y ajoute EDTA (concentration finale 20 mM), SDS (concentration finale 0,5%) et 50 gg/ml de protéinase K, et la préparation est mise à incuber pendant 1 heure A C. Ensuite on extrait consécutivement avec du phénol,un mélange phénol-chloroforme et du chloroforme. Stade 4: Préparation des branches, Il s'avère nécessaire d'enlever le "stuffer seg- ment" médian des vecteurs bactériophages \ de leur génome afin qu'ils s'accommodent des 15 à 20 kb de l'ADN étranger. Ce procédé est généralement désigné sous l'appellation de "préparation des branches". Dans le cas de X L47, cela est réalisé par digestion de l'ADN du phage avec l'enzyme de restriction BamH 1, suivie par centrifugation dans le gra- dient de densité du sucrose. Ce traitement engendre 3 frag- 1 1 ments: un fragment à 2305 kb représentant la branche gau- che, un fragment à 10,5 kb représentant la branche droite, et un fragment "stuffer" à 6,6]kb. La séparation quantitative des branches et du fragment si- lencieux est obtenue par recuit des branches droite et gau- che du vecteur par leurs extrémités de cohésion (dans les conditions o ces extrémités créées par digestion restric- tive ne sont pas recuites) pour former un fragment à 34 kb, avant la séparation dans le gradient de densité du sucrose. De plus, le fragment silencieux a sa dimension encore ré- duite par des enzymes qui clivent exclusivement ce fragment. Dans le cas de L47,I, les enzymes utilisées pour produire des fragments inférieurs à 4,3 kb sont Xho I et Sal I. Mode opératoire: 150 gg d'ADN de bactériophage sont digérés avec un excès égal au triple de BamH I. Lorsque la digestion par BamH I est terminée, l'ADN est traité avec Sal I et Xho I. L'ADN digéré est extrait à deux reprises avec un mélange phénolchloroforme, précipité par de l'éthanol et remis en suspension à une concentration de 150 gg/ml. Pour re- cuire les branches gauche et droite, on ajoute MgCl2 à une * concentration de 10 mM et l'on fait incuber cette prépara- tion à 42 C pendant 1 heure. L'ADN digéré et recuit, est chargé sur des gradients de 38 ml de sucrose à 10-40% ren- fermant 20 mM de Tris-HCl pH 7,6, 1 M NaCl et 5 m4 d'EDTA. On n'applique pas plus de 60 Fg d'ADN par gradient. La cen- trifugation s'effectue dans un rotor SW 27 à 26 000 tours/ minute pendant 24 heures à 15 C. On recueille des fractions de 0,5 ml, et on analyse par électrophorèse sur gel des pré- lèvements de 20 il de chaque fraction. Les fractions renfer- mant des quantités équimolaires des branches droite et gau- che sont rassemblées, dialysées et concentrées comme décrit pour l'ADN fragmenté de foie de veau. Trois gradients chargés de 50 Fg d'ADN digérér donnent 45 g de branches purifiées. Stade 5: Ligature, conditionnement et amplification gg de branches sont liés à 2,5 gg d'insert, dans un volume total de 100 Al, en présence de 60 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 15 mM DTT et 1000 unités de ligase T4 (N.E. iolabs). La réaction s'effectue en deux étapes. D'abord, les branches sont mélangées avec le tampon Tris et MgCl2, et l'on met à incuber pendant 1 heure à 42 C pour que s'effectue le recuit des extrémité de cohésion >, puis on ajoute ATP, DTT, ADN bovin et ligase, et l'on porte à 14 C pendant 16 heures. On utilise un mélange de conditionnement > préparé pratique- ment selon le procédé de B. Hohn (Methods in Enzymology 68 p. 299, 1979). 1 gg d'ADN lié donne 7 x 105 pfu. Pour pré- parer une banque complète, on utilise 4 gg d'ADN lié donnant une banque primaire de 2,8 x 106 phages. La banque génomique est amplifiée par propagation des bacté- riophages dans E.coli LE 392 sur plaques NZCYM (1% d'amine NZ, 0,5% d'extrait de levure, 0,1% d'acide casamino, 0,2% de MgSO4 et 1% d'agar). Des prélèvements du mélange de con- ditionnement,renfermant des bactériophages recombinants, sont mélangés avec des bactéries et mis à incuber à 37 C pen- dant 20 minutes. On ajoute de l'agar fondu (NZCYM + 0,5% d'agar) et la suspension est étendue sur des plaques de 150 mm de NZCYM agar. Chaque plaque est recouverte avec 7 ml d'agar renfermant 17 000 bactériophages recombinants et 0,2 ml de bactéries hôtes. On prépare des groupesde 30 pla- ques à la fois. Un total de 150 plaques est utilisé pour amplifier la banque. Les plaques sont mises à incuber à 37 C pendant 9 heures. Afin de recueillir les bactériophages, les agars sont ras- semblés dans un bécher stérile. On y ajoute du chloroforme à une concentration finale de 5% et les lysats sont mis à incuber pendant 15 minutes à température ambiante avec agi- tation sporadique. La suspension est ensuite abandonnée une nuit durant à 4 C afin de permettre l'élution des bactério- phages. Les débris cellulaires et l'agar sont alors enle- vés par centrifugation à 4 C pendant 15 minutes. Le nombre total des bactériophages dans la banque amplifiée est de l'ordre de 8 x 10 12pfu. Cela indique une amplifica- tion de 2,5 x 106 par rapport à la banque primaire. Stade 6: Détermination des conditions d'hybridation entre le gène HuIFN- a et les séquences bovines Afin de déterminer si les séquences de HuIFN- i pouvaient être utilisées pour essayer la banque bovine gé- nomique, on prépare des macules génomiques d'ADN bovin et différents fragments marqués du gène de HuIFN-d J1 (A. Shafferman et coll. demande de brevet N 70678). Le gène de HuIFN- a est découpé par Sau 3A en 4 fragments de 177, 207, 270 et 515 bp, et les fragments isolés sont marqués par translation d'entaille avec 32p dATP et hybridés sous dif- férentes conditions d'hybridation en macules génomiques bo- vines. Lors de l'utilisation du fragment Sau 3A 177 (ce fragment couvre la région du N terminal du block codant> il y a révé- lation de plusieurs bandes séparées. Ce fragment est choisi comme échantillon pour passer la banque au crible. Stade 7: Triage de la banque génomique pour séquences d'interféron La banque génomique est déposée sur des boites de Pétri de 150 mm à une concentration de 30 000 particules de bactériophage par plaque. On utilise 30 plaques, chaque plaque est préparée selon le mode opératoire suivant: 50g1 de suspension de bactériophage sont mélangés avec 02 ml d'une culture d'une nuit de E. coli LE 392, et on met à in- cuber pendant 20 minutes à 37 C, puis ony ajoute 7 ml d'agarose (0,7% d'agarose dans du milieu NZCYM) et on verse ce mélange sur une plaque sèche renfermant NZCYM + 1,5% d'agar. Ces plaques sont mises à incuber à 37 C jusqu'à ce que les taches atteignent un diamètre de 1 mm (environ 7 heures) et l'on refroidit à 4 C pendant 1 heure pour permettre le dur- cissement de l'agarose. Les taches sont transférées à des cercles de nitrocellulose en plaçant les filtres sur le dessus de l'agar molle pendant 10 minutes. Les filtres sont alors enlevés et mis à flotter sur le dessus d'une so- lution dénaturante faite de 1,5 M de NaCl et 0,5 M de NaOH, pendant 30 secondes. Les filtres sont ensuite plongés dans la solution pendant 30 secondes supplémentaires et transférés vers une solution neutralisante (1, 5 M NaCl, 0,5 M Tris HCl pH 8) pendant 5 minutes. Les filtres sont rincés à 2 reprises dans SSC, séchés à température ambiante et cuits à 80 C sous vide pendant 2 heures. Les filtres sont d'abord soigneusement humectés dans 6 x SSC, puis transférés dans une cuvette renfermant 300 ml de solution de rinçage (50 mM de Tris-HC1, pH 8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% de SDS), et mis à incuber à 42 C sous agi- tation constante. Au bout de 2 heures les filtres sont en- levés et transférés dans un récipient renfermant 100 ml de solution de préhybridation (50% de formamide désionisée, x solution de Denhardt, 6 x SSC, 0,5% SDS et 100 gg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé). On effectue la préhybridation pendant 4 heures, puis on ajoute directement à la solution de préhybridation, l'échan- tillon d'ADN dénaturé par la chaleur, marqué 32p (fragment Sau 31 177). Après 48 heures d'hybridation à 42 C les fil- tres sont rincés dans 2 x SSC, 0,1% SDS. Ce mode de rinçage consiste en 3 rinçages de 15 minutes à température ambiante, suivis par 2 rinçages de 1 heure et demie à 42QC. Les filtres sont séchés et exposés à une pellicule pour rayons-X. 13 taches d'hybridation sont identifiées. Les phages de chaque tache sont déposés et réhybridés avec l'échantillon 177 bp, et à ce stade on constate que les clo- nes 105, 116 et 120 s'hybrident dans une moindre mesure que les clones 103, 107, 108, 111, 115, 118, alors que les clo- nes restants ne se r6hybrident pas avec l'échantillon. Les clones qui ont été réhybridés sont ensuite purifés. L'ADNX est isolé et soumis à une digestion avec BamHI, Hind III et EcoR I, séché avec du filtre à la nitrocellulose et hybridé à nouveau avec l'échantillon de HuIFN- i 177 bp, aussi bien qu'avec les échantillons d'HuIFN-c 270 et 515 bp. Tout clone s'hybridant avec chacun des 3 échantillons est un bon candidat pour supporter une séquence de BoIFN- o. Parmi les 9 clones essayes, 6 s'hybrident avec chacun des 3 échantillons. Les clones qui ne s'hybrident pas avec le 270 bp ou le 515 bp sont les mêmes qui ne s'hybrident que faiblement avec l'échantillon 177 bp dans le mode de triage initial. En conclusion, les clones 103, 107, 108, 111, 115 et 118 sont candidats pour supporter une partie substantiel- le des séquences de BoIFN-o. Stade 8: Emplacement des séquences d'interféron sur l'ADN hybride Les diagrammes de restriction par Hind III, BamH 1, AcoR I et Sal I, des clones 103, 107, 108, 111, 115 et 118 sont déterminés par de multiples digestions enzymati-- ques. On constate d'après ces diagrammes que les clones et 118 représentent des régions recouvrant le chromosome bovin. Afin de situer les séquences de BoIFN, les macules de cha- cun des clones digérés avec les enzymes de restriction mentionnées plus haut, sont mises a incuber séparément avec chacun des 3 échantillons Sau 3A de HuIFN- d {177 bp, 270 bp et 515 bp). - Dans l'ensemble, on peut conclure des études de restriction et d'hybridation, qu'au moins 5 gènes distincts d'IFN-A sont présents dans le génome bovin. Les clones 103, 107, 108 et 115 sont ensuite caractérisés. Des fragments d'ADN, portant la totalité du bloc hybridant pour chacun de ces clones, sont isolés et sous-clonés dans le site Hind III du plasmide pBR322, puis séquences par le procédé de Maxam et Gilbert (Pro. Nat.Sci. 74, P.560, 1977). Des plasmides portant les inserts génomiques inté- ressants sont soumis au clivage avec des enzymes de restric- tion appropriées. Des fragments d'ADN sont marqués avec des désoxynucléotides ( d _32p) en utilisant le large fragment d'ADN Polymérase I de E. coli. Les gènes portés sur les clones 103, 108, 115 et 107, sont désignés respectivement par BoIFN-v A, BoIFN- i B, NoIFN-oa C et BoIFN- o(D. La séquence du gène BoIFN- i A est représen- tée dans la figure 1. Celle du gène BoIFN- i B est repré- sentée dans la figure 2, celle du gène BoIFN-" C dans le ta- bleau3 et celle du gène BoIFN- i D dans le tableau 4. Ces quatre séquences renferment un cadre à lecture ouverte de 570 bp codant pour 189 amino acides. Les 23 premiers amino acides du polypeptide supposé constituent le signal pepti- dique caractéristique des molécules d'IFN-. Les protéines mûres supposées sont très proches (figure 5), leur séquence d'amino acide est bien conservée avec une homologie moyenne de 93%. Il est à remarquer que les quatre polypeptides res- semblent tous à IFN-c humain. L'homologie entre la séquence supposée d'amino acide de BoIFN et celle du consensus de l'IFN-i humain (D.U. Goeddel et coll. Nature 290, p.20, 1981) est de l'ordre de 65%. Stade 9: Préparation du véhicule d'expression Pour montrer que les gènes de BoIFN- i ont une activité biologique, il est nécessaire de produire cette protéine, et ainsi sont destinés à la production du poly- peptide IFN-d des véhicules d'expression efficaces. On dé- crit ici l'utilisation d'un tel véhicule, pSE2-, dans lequel les séquences trp d'E. coli servent d'élément d'expression. Ce plasmide promoteur trp appartient à une famille de véhi- cules d'expression trp décrite antérieurement (Rose Shaffer- man PNAS 78 p.6670, 1981; Shafferman et coll. J. Mol.Biol. 161 p. 57; Grosfeld et coll. M.G.G. 195 p.358, 1984; In- terféron production, demande de brevet n 70678, 1984). pSE2 a un site remarquable pour EcoR I situé dans le si- xième codin du trp L. pSE2 est digéré par EcoR I et les extrémités de cohésion sont remplies par un large fragment d'ADN polymérase I. Cet ADN est lié au fragment PvuII- Sma I du clone 115 renfermant la totalité du bloc codant de BoIFN-o -C mûr, ainsi que 24 bp codant pour la partie des plasmides du peptidesignal contenant le fragment de BoIFN-ok-C ADN dans l'orientation appropriée; ils ont été isolés et analysés pour vérifier la fusion correcte des séquences trp L avec des séquences IFN bovines. Ce plasmi- de est désigné par pBC-1. Différents véhicules d'expression trp, tel que pHG5 (Gros- feld et coll. M.G.G. 195, p.358, 1984), sont utilisés pour produire un polypeptide met-IFN- d mûr, profitant de l'u- nique site ClaI dans pHG5 et du site Fnu4HI en position 154 de la séquence BoIFN- C. Les plasmides supportant les différents dérivés de BoIFN, y compris ceux qui codent pour met-BoIFN mar, comme pBC-3, sont utilisés pour transformer différentes souches de F. coli. Stade 10: Production et purification d'un dérivé de polypeptide BoIFN-d C Il s'agit ici de la production et de la purifi- cation de polypeptides dérivés de BoIFN- o -C codés par pBC-1 ou pBC-3. Les cellules de E.coli LE392 abritant pBC-1 ou pBC-3 sont cultivées jusqu'à une densité de 8x108 cellules/ml dans du milieu L additionné de 0,5% de K2HPO4 et 0,2% de KH2PO4. L'extrait bactérien renfermant BoIFN-, C est soumis à 60 minutes de centrifugation à 28 000 tours/minute dans un rotor de Beckman R-30, et l'on recueille la partie surna- geante. Les protéines sont précipitées par TCA à 7,5%. Le précipité est remis en suspension dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 8, et les protéines non solubles sont enlevées par centrifugation. La partie limpide surnageante est appliquée directement sur une colonne monoclonale par affinité. Une colonne disponible dans le commerce (Serono Diagnostic =23-4), renfermant des anticorps monoclonaux contre HuIFN- i (34) convient pour la purification de BoIFN -d C. Après l'application, la colonne est rincée avec plu- sieurs volumes de NaCl 0,3 M dans du tampon phosphate de K 0,1 M pH 8, et l'IFN est élué avec NaCl 0,3 M dans du tampon acétate 0,1 M pH 2,4. La capacité de la colonne est de 5 x 106 unités de BoIFN par ml de colonne de substance. Une purification à 200 fois est réalisée avec une récupé- ration de 50%; l'activité spécifique de la préparation ainsi obtenue est de l'ordre de 2 x 108 unités/mg de proté- ine. La préparation de BoIFN- ' C semble être homogène d'a- près SDS-PAGE. Stade 11: Caractérisation des produits de BoIFN- a obtenus par génie génétique Les dérivés polypeptidiques purifiés de BoIFN-o> sont essayés quant à leur activité biologique antivirale, par le procédé CPE utilisant comme challenge VSV. Les essais sont réalisés sur les cellules suivantes: Humaines: Hela et FS11 De singe: Vero Bovine: MDBK et EBtr De rongeurs: L929 et BHK On observe une activité antivirale prononcée sur les li- gnées bovines. Propriétés immunologiques: L'activité antivirale de l'IFN-ç bactérien est neutralisée par IFN-d anti-humain ou par IFN- ( anti-humain. Cependant, des expériences sur de l'interféron anti-humain, immobilisé, ont montré que BoIFN- d C partage des déterminants antigéni- ques avec HuIFNo s. Propriétés physico-chimicues a. Il est stable à pH 2, 37 C pendant 2 heures. b. Il est stable vis-à-vis de SDS à 0,1% avec une durée de demie vie ne dépassant pas 5 heures. c. Le polypeptide IFN-c migre, sur des gels de SDS-poly- acrylamide, à une position équivalent à un poids molé- culaire de l'ordre de 18 000. Les figures annexées définissent les séquences d'ADN codant pour les produits selon la présente invention, et aussi la composition des interférons de type bovin selon i.'invention. Les tableaux suivants illustrent Tableau 1 La séquence nucléotidique du gène de BoIFN- d A et la séquen- ce d'amino acides correspondante de: pré-BoIFN-v BoIFN-À A mûr; dans Met-BoIFN-,>& A mûir, un codon de mêthio- nine (à la position indiquée par le triangle noir) précède le codon de Cys. Tableau 2 La séquence nucléotidique du gène de BoIFN- e B et la sé- quence aminoacide correspondante de: pré-BoIFN-d. e et de BoIFN- B mgr; dans Met-BoIFN-ço. B mûr, un codon de méthio- nine (à la position indiquée par le triangle noir) précède le codon de Cys. Tableau 3 La séquence nucléotidique du gène de BoIFN- - ce d'aminoacides correspondante de: pré-Bo!FiN- i C et de BoIFN- C mar; dans Met-BoIFN- d C mfir, un codon de méthio- nine (à la position indiquée par le triangle noir) précède le codon de Cys. Tableau 4 La séquence nucléotidique du gène de BoIFN- 4 D et la sé- quence d'aminoacides correspondante de: pré=BoIFN-z D et de BoIFN-=D mûr; dans Met-Bo!FN-d.D mû1r, un codon de mé- thionine (à la position indiquée par le triangle noir) précède le codon de Cys. Tableau 5 Une comparaison des séquences d'amino-acides de BoIFN- "A, -,ZB, - SC et d D; la séquence de BoIFN mûr débute à l'amino-acide 1 (CyS) alors que le pré-BoIFN renferme en plus le signal peptidique de 23 aminoacides (les nombres des amino-acides de signal sont précédés de la lettre S). Seules les différences de BoIFN- C sont indiquées dans les figures annexées. Figure 1: Elle illustre la constitution d'un plasmide recombinant, exprimant un polypeptide fusionné de BoIFN-Z C: A. Les stades impliqués dans l'insertion des séquences d'IFN-o C bovin dansle véhicule d'expression trp pSE2:la barre ouverte représente le fragment promoteur d'E.coli trp 360 bp, renfermant les premiers 6 codons de trp L. La barre hachurée représente 525 bp des séquences codant pour BoIFN-o C. L'insertion du fragment d'ADN bovin Pvu II-Sma I dans le site EcoRI rempli de pSE2 régénère le site EcoRI. B. Les séquences N-terminales du polypeptide fusionné de trpL-BoIFN-d C (f-BoIFN-z C). Figure 2: Constitution de pBC-3 pour l'expression de met-BoIFN-O C mar Les surfaces hachurées marquent les régions codant pour BoIFN-W C mGr. Les surfaces noires marquent les séquences de signal peptidique. onv so9qV VVo 1991 o Co Ln !t SaN3dssfin66jVEiJ;HdgsntgutgnlusVJ4"Su.SJ dst n:, csfiDfilone-J.Jessno': lWte6nh9ly6JynleAnlOuld-lntsfioJedusn! HVsfà,nfuln1dfi 91V319VVo839ú389vO191i99V9393OúO13. 39VV38133VgiO3139VV31Vl nn]ll46unVs!H3disi;vbln3Jsvn]n]uSs]dsdl nllodsfinnannlnuN_ 3iVi1339V9VD3V Y3V 939V39ú919:39J339193131OVDJ9V. 3úJ9DD ulvl9oVnn]lOSlSnig]eglgVnlSn]Hnlqdsvuevu9asdsvnaululgsn V39ú19Vo339999J995ú8591O13555931331úVV9391313VgiVVVV39lV9 31 9i3o3D13933o313o9Vy399Vg13E3JV9V3o9 D9193V333ú9e9V9Vevz39 H Jn SS!dnHHlS!HOdJ4s!Hs!4U J l OS! g nS lIelussin 013935131393313133013V3933Vú9019V3ú31391931331V3381331399VV ff V91V3V919ll9V93EOV1113V91VVV1 3 O 9v3V99O3 I-sf!HIL. OidflJsoJJ1S 1 H nlugugn35;3 ISnethfUS6VSIvDJSnS1 v 01ú913331Vú38ú331iO3310330 V333O9i3L33339VVD3D3D39V338 DD.LLEP9J3D O i CJ fliafl.i6iS f DDD 9DDL1O ZJDD J. O DOVO V DJ. ID I fl*7flelV% f V Di. 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Interféron bovin du type IFN- a, pratiquement pur, produit par génie génétique, caractérisé en ce qu'il est constitué par pre-IFN- oA, pre-IFN- c B, pre-IFN-o C, pre- IFN-o D, m-IFN-, A, m-IFN- oB, m-IFN- &C, m-IFN- cD, Met- m-IFN- A, Met-m-IFN- (B, Met-m-IFN- oC ou Met-m-IFN-o D, o m signifie "mûr" et Met désigne la méthionine. 2. Interféron suivant la revendication 1, qui présente les caractéristiques suivantes: - assure la protection de cellules bovines contre des infections virales; - se lie aux anticorps anti-HuIFN immobilisés; - est stable à pH2 pendant au moins 2 heures; - est stable vis-à-vis du SDS à 0,1% avec une demi-vie de plus de 5 heures; - migre dans des gels de polyacrylamide SDS à une posi- tion équivalente au poids moléculaire d'environ 18 000 daltons. 3. Interféron suivant la revendication 1 ou 2, carac- térisé par les séquences d'amino-acides précisées dans les tableaux 1 à 5 de la description. 4. Interféron suivant une des revendications précéden- tes, caractérisé en ce qu'il est sous la forme d'une molé- cule ADN à double brin, codant pour cet interféron. 5. Interféron suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'ADN se trouve dans un véhicule de clonage, dans un plasmide qui n'existe pas tel que dans la nature, ou dans une cellule qui normalement ne contient pas cet ADN. 6. Interféron suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ladite cellule est procaryote ou eucaryote. 7. Interféron suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit plasmide recombinant comporte un ADN complé- mentaire de l'ARN messager de l'IFN-. bovin, inséré dans un vecteur ADN, en particulier un ADN codant pour un des poly- mW u 0sv nv y" m w w; o;w dm v2 t u 23g 311 "a 1viv nie 31v Vws m 1Vo 3î1 île t 330 lut 133 w mv1 wv W cwâ v3 v1 111 113 1V 3I là vu)31 it 1Wi v v MW 1m Ln 5i 311 8. -....... s b Aw giv Diâ â" îiv 1 m) 5mm I on 11 vil 010-101 s vvo 013 s IlW OÀ3 wo o. À DW MV911 Xi 1t 3V M M vvv ya13 21â 321 Sv m0i in in 131 vi1 3IwîV0 v31 MW 311 313 . À 1AI 3wi 013 31V 211 u2 113 31 lu 2 1131 x 3 ln 121 0o 10 311 o13 It 320 11 111 t0 22 2 211 >31 311 'i U 10 1wu 13 M0 >9W D 11 Dil 331 311 1i" 131 3t1 r01 193 0 wn V13 013 313 OPPTqútq sauoID sol e;TnsuG:etosT xnod 'luvuîqu.Doer:ne4oe un suLp no 'e.oÀaeones GinihoD sun sump 'uTAoq NaV,T DeAta uT2uyni _vú -r-tq '[ ep pnbyvtLr quau6eu. un#P puoyupT:2q q, I en; Dej3eï uo,1 enb ez ua e?'O-Ndl up,&oqj uo.rxe -Ur[ sap e G s ouasbes el sp uoy3 TT Uep ip 9Ppooxd 06 Ob eTIqu;9 4ue4p NcIV ap uoTsse.cdxaI 8 elqexoe suoçT puoo sep "NUV la; un uausIeu-z'ou sud;ueyquoo eu;e e;oX;oo: no e;oKnone;q eIn//so I '(I G-N.IoEl no -No El ? -N. 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