Brevet FR2562671A1 — publié le 19851011

1. On entend, d'une manière restrictive, par monoamine les amines résultant de la décarboxylation des amino-acides, accompagnée ou non de l'oxydation du résidu. On les rencontre dans le système nerveux o elles jouent le rôle de neuro- médiateurs. On connaît ainsi: - dérivés du tryptophane: les indolamines tryptamine, hydroxytryptamine (sérotonine), 5 methoxytryptamine - dérivés de la tyrosine: la tyramine, et les catécholamines: adrénaline, nor adrénaline, dopamine, etc; - dérivé de l'histidine: histamine; - dérivé de l'acide glutamique: l'acide gamma aminobutyrique (GABA). Du point de vue chimique, le terme monoamine englobe encore bien d'autres molécules, de formule générale R-NH2, o R est un radical hydrocarboné plus ou moins substitué incluant les amino-acides naturels, sans référence particu- lière au système nerveux. D'une manière générale, les monoamines sont dosées après chromatographie par une réaction colorée basée sur la fonction amine, telle que la réaction à la ninhydrine, une réaction de fluorescence telle que le couplage avec un résidu dansyl. Plus rarement, on fait appel à une réaction impliquant aussi le radical, comme par exemple la réaction à l'orthophtal- aldéhyde par laquelle on dose l'histamine, ou les méthodes polarographiques par lesquelles on dose les indolamines ou les catecholamines (voir "Methods in Enzymology vol XVII, H. Tabor and C. Tabor Eds, Academic Press N.Y. 1971" et "Mefford I.N. and Barchas J.D. (1980) J. Chromatogr. 181, 187-193"). La caractéristique commune de ces méthodes est le fait qu'elles impliquent au minimum une extraction et une chromatographie qui assure la spécificité. Leur sensibilité (rarement moins de 10 ng) en limite l'emploi, surtout lorsqu'il s'agit d'analyses biologiques sur des prélèvements nécessairement restreints. 2. Il faut signaler enfin que, pour les laboratoires de recherches capables de préparer des enzymes, on peut utiliser des méthodes radioenzymatiques, basées sur la méthy- lation des résidus par une méthyl-transférase, par exemple pour l'histamine (C. Bruce, W.H. Taylor and A. Westwood (1979) Annals of Clinical Biochemistry 16-259-264). Ces méthodes n'ont pas de valeur industrielle. La présente invention concerne un procédé général de dosage des monoamines, dans le sens chimique du terme, faisant intervenir un anticorps reconnaissant la monoamine chimiquement modifiée pour en accroître l'immunoréactivité. De ce fait, et contrairement aux méthodes immunologiques classiques, la présente méthode est applicable aux très petites monoamines, de masse moléculaire inférieure à 200 telle que l'histamine. Le principe général sur lequel est fondée la présente invention est celui des immunodosages dans lesquels le composé à doser est mis en compétition avec un analogue radioactif, ou porteur d'un autre type de traceur, pour la fixation à un anticorps capable de les reconnaître l'un et l'autre. Les molécules de faible masse, comme l'histamine ou les autres monoamines, se prêtent mal à cette approche car elle ne contractent pas d'interactions suffisamment fortes avec les anticorps. La présente invention remédie à cet inconvénient par le moyen d'une transformation chimique qui augmente la taille de la molécule et accroît ainsi son affinité pour l'anticorps. Bien entendu: - l'analogue radioactif doit porter la même modification; l'anticorps doit être produit contre la molécule modifiée, et non contre la molécule native. Dans ces conditions, l'immunodosage des monoamines peut atteindre le même niveau de sensibilité que celui des molécules de masse moléculaire plus élevée. 3. La mise en oeuvre du procédé nécessite la prépa- ration préalable de trois réactifs: 1/ Un réactif d'acylation (I), qui réagira avec la fonction amine primaire, la transformant en fonction amide substituée: X - NH2 + R - CO - R' X - NH - CO - R + R' - H monoamine I monoamine modifiée IV o X est le support de la monoamine comme par exemple: X l2-C2- pour l'histamine HN N HO- CH2-CH2- X= pour la dopamine HO Il en serait de même pour les autres amines: la séro- tonine ou autre indolamine, lescatecholamines(adrénaline, noradrénaline) ou un amino-acide tel l'acide gamma amino- butyrique, le glutamate et analogues. (I) est un réactif d'acylation dans lequel: R représente un radical hydrocarboné, de faible poids moléculaire, ne portant pas de fonction acylable. R' représente un groupement libérable tel que: CO - CH2 - O-N/ (N hydroxysuccinimide) CO- CH2 ou -Cl ou -O-CO-R' (R' radical hydrocarboné) 4. A titre d'exemple: CH2-CO - I est l'anhydride succinique 2 /O CH2 CO (dans ce cas R et R' sont confondus) et le produit formé est une amide hémisuccinate. - I est un ester activé et le produit formé IV est une amide. - I est un chlorocarbonate, comme le chlorocarbonate d'éthyle: Cl-CO-O-Et, ou un anhydride de carbonate acide. Le produit IV est alors un carbamate. 2/ Un traceur radioactif (II), de formule générale: XNHCO - NH - CO - R 125I R1 est un radical aussi proche que possible de R, radical apporté à l'amine par le réactif d'acylation. 3/ Un anticorps (III) capable de reconnaître la monoamine modifiée (IV), et le traceur. Un tel anticorps doit être produit contre un conjugué (V ou VI) o le motif (IV) est couplé à une protéine immunogène: (V) X - NH - CO - R2 - CO - NH - Albumine (R2 est un radical aussi proche que possible de R). ou bien: (VI) R - CO - NH - X - CO - NH - Albumine Une fois en possession des trois réactifs ((I), réactif de conversion; (II), traceur; (III), anticorps), on procède au dosage de la manière suivante: 1. L'échantillon à doser (quelques centaines de microlitres) est additionné du réactif de conversion, et d'un tampon convenable (neutre ou légèrement alcalin) de sorte que l'ensemble des fonctions amines soit quantitativement transformées en (IV). 5. 2. L'échantillon ainsi transformé est mis en présence du traceur (II) et de l'anticorps en quantités calibrées (III). 3. Après incubation, on procède à la séparation des complexes moléculesanticorps et l'on compte la radioactivité liée à l'anticorps. Celle-ci sera d'autant plus faible que les molécules X - NH - CO - R (IV) seront plus nombreuses et feront compétition au traceur. La quantité de monoamine X - NH2 présente au départ se déduit par comparaison avec une courbe d'étalonnage. Les exemples suivants dont donnés à titre purement explicatif et nullement limitatif de l'invention. Exemple A - Histamine transformée par la NOH succinimide ester succinyl glycinamide 1. Le réactif d'acylation (I) CO - CH2 NH2COCH2 - N CO - CH2 - NH - CO - CH2 - CH2 - COO - N- "-CO-CH2 (I) = NOH succinimide ester succinyl glycinamide transforme l'histamine par réaction directe en milieu légèrement alcalin en: -C2 CH2 - NH - CO - CH2 - CH2 - CO - NH - CH2 - CO NH2 HN N (IV) = histamine succinyl glycinamide 2. Le traceur radiomarqué est obtenu par fixation du succinyl sur la fonction amine puis couplage à la glycyltyrosine qui sera iodée pour donner (II): ! CH2- CH2- NH - CO- CH2- CH2- CO- NH -CH2-CO - NH - CH -CO- HN N CH2 125 I OH 6. Une variante consiste à accrocher la succinylhistamine à une enzyme à la place de la glycyltyrosine. 3. Les anticorps (III) correspondants sont obtenus par injection chez l'animal du dérivé immunogénique (V) préparé de la façon suivante: Après fixation du maillon succinyl sur la fonction amine de l'histamine, la succinylhistamine est couplée à la glycylalbumine (de préférence, une protéine non modifiée peut convenir). --CH2-CH2-NH - CO - CH2-CH2- CO - NH - CH2-CO - NH -(CH2)4-Alb HN N Exemple B - Histamine transformée par le BOC2O (anhydride d'acide tertiobutyloxycarbonique) 1. Le réactif d'acylation (I) CH3 CH3 i t CH3 - C- O - 0-C O- 0 O - C- CH3 I I CH3 CH3 transforme l'histamine en milieu alcalin en (IV): CH3 I -__ CH2 - CH2 - NH - CO - O -C - CH3 HN N CH3 2. Le traceur radiomarqué est obtenu par couplage de la BOC histidine activée sous forme d'hydrazide à la glycyltyrosine qui sera iodée: 7. CH3 ----- CH2 - CH -NH- CO -'- C- CH3 HN N0- CH NH I CH2 J CO NH I CH - COOH I CH2 K / OH 3. Les anticorps (III) correspondants, sont obtenus par injection chez l'animal du dérivé immunogénique (V) préparé de façon semblable à l'exemple A par couplage de la BOC histidine activée sur la glycylalbumine (une autre protéine peut convenir): CH3 CH2- CH - NH - CO - O - C - CH3 HN N CH3 cH NH I CH2 NHl N CH2 (Albunine) 8. De ce qui précède, l'homme de l'art se rend immédiatement compte qu'il dispose de moyens de dosage simple immunologique des monoamines ce qui permet de constituer des trousses de dosage renfermant des réactifs prêts à l'emploi mettant en oeuvre le procédé de l'invention. Il va du reste de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toutes modifications utiles pourront y être apportées sans sortir de son cadre. 9. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunologique des amines (molécules présentant une fonction amine primaire ou secon- daire), caractérisé par le fait que l'on procède à la trans- formation chimique quantitative de ces amines en dérivés de plus haut poids moléculaire et qu'on met ces derniers dérivés en compétition avec des analogues radioactifs ou porteurs d'un traceur pour la fixation à un anticorps capable de les reconnaître les uns et les autres. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on transforme les fonctions amine en fonctions amide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou-2, carac- térisé par le fait que les analogues radioactifs ou porteurs d'un traceur comportent dans leur molécule au moins la même fonction que celle résultant de ladite transformation chimique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé par le fait que les dérivés amides sont reconnus par des anticorps dirigés contre ces mêmes dérivés, couplés à des supports macromoléculaires (conjugués immunogènes). 5. Réactifs pour le dosage immunologique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés par le fait que: a) le réactif de transformation chimique des amines en dérivés de plus haut poids moléculaire consiste en un réactif d'acylation (I) de formule générale: R-CO-R' dans laquelle R représente un radical hydrocarboné de faible poids moléculaire ne comportant pas de fonction acylable et R' représente un groupement hydrocarboné libérable, R et R' pouvant être confondus; b) le traceur est,soit un traceur radioactif de formule générale: X-NH-CO-R1125I I (II) o R1 est un radical aussi proche que possible de R et X est le reste de la molécule portant la fonction amine, 10. soit un traceur enzymatique, l'iode 125 étant remplacé par une enzyme; c) l'anticorps (III) est capable de reconnaître l'amine modifiée et le traceur; il doit être produit contre l'amine modifiée couplée à des supports macromoléculaires (conjugués immunogènes). 6. Réactifs selon la revendication 5, caracté- risés par le fait que le réactif d'acylation est l'anhydride succinique. 7. Réactifs selon la revendication 5, caracté- risés par le fait que le réactif d'acylation est le composé de formule: CH2-CO | \ N-O-CO-CH2-CH2 -CO-NH-CH2 -CO-NH2 CH2-CO 8. Réactif selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le traceur radioactif est obtenu par réaction de l'amine avec le réactif: CH 2-cO | \>N-O-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CO-NH-H-COO CH2 CH2 I OH 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le motif tyrosine porte une fonction amide ou ester. *11. 10. Procédé de dosage immunologique et réactifs pour sa mise en oeuvre selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 9, caractérisés par le fait que l'amine à doser est l'histamine, la sérotonine ou autre indolamine, les catecholamines (adrénaline, noradrénaline, dopamine), ou un amino-acide tel l'acide gamma aminobutyrique, le glutamate et analogues. 11. Procédé de dosage immunologique de l'histamine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que l'histamine est dosée après conversion par le réactif selon la revendication 7 en dérivé amide: F- i__-CH2-CH2-NH-oC-CH2-2-C-CH2-CN O-H2 1 = 22 2 2E H 2 HIN N 12. Procédé de dosage immunologique de l'histamine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que le traceur radioactif est le composé: CH2-CH2-]F-CO-CH2CH2-CO-NH-cH2-cO-CH-CH h N CH2 1251O OH 13. Troussesde dosage de l'histamine utilisant les réactifs prêts à l'emploi (I) Réactif d'acylation selon la revendication 7 (II) Traceur radioactif selon la revendication 12 (III) L'anticorps capable de reconnaître l'amine modifiée et le traceur.