Brevet FR2561662A2 — publié le 19850927

FR 2561662 A2 19850927 FR 8404453 A 19840322 La présente invention concerne un perfectionnement aux blocs d'expression de la catéchol-2,3-oxygénase décrits au brevet principal. Les souches de levures utilisées dans les exemples du brevet principal sont des souches de laboratoire aisément transformables grâce à leur auxotrophie pour la leucine. Les souches industrielles, en particulier les souches de levures de boulangerie ou de brasserie, sont par contre très difficile à travailler car elles ne possèdent aucun caractère d'auxotrophîe. Notamment, le caractère principal d'auxotrophie pour la leucine nécessaire à l'utilisation du plasmide pJDB207-XylE étant absent, il est impossible de se baser sur cette méthode pour les transformer. Un système a été décrit par Jimenez et colle (1980) qui utilise le couple antibiotique G418/résistance au G418 pour sélctionner avec des levures sans auxotrophie des évenements de transformation.La méthode est cependant limitée par le fait que des levures non transformées par les plasmides peuvent devenir naturellement résistantes à l1antibiotique. Une analyse longue et peu réalisable sur de grandes séries doit suivre chaque expérience de transformation pour différencier ces deux types de colonies. Le couplage du bloc d'expression de XylE avec le gène de résistance au G418 permet de résoudre ce problème immédiate ment. En effet, les souches transformées deviennent jaunes au contact du catéchol, alors que les résistants spontanés restent blancs. C'est pourquoi la présente invention concerne un bloc d'expression de la catéchol-2,3-oxygénase dans une levure selon l'une des revendications 1 à 4 du brevet principal, caractérisé en ce qu'il comporte comme marqueur de sélection le gène de résistance à un composé chimique. Parmi les gènes de résistance à des composés chimiques, il faut citer plus particulièrement les gènes de résistance aux antibiotiques et en particulier la résistance à G418, c'est-a-dire le gène Néo. Ce gène de résistance à un composé chimique est, de préférence, sous la promotion d'un promoteur de levure tel que le promoteur du gène PGK (phosphoglycerokinase) de levure et terminé par un segment de terminaison du même gène PGK. Le bloc d'expression peut être incorporé dans un chromosome de la levure ou bien être autonome, c'està-dire porté par un plasmide comportant une origine de réplication dans les levures, par exemple l'origine de réplication du plasmide 2p. Ces blocs d'expression et plasmides peuvent en outre comporter d'autres éléments qui sont déjà décrits dans le brevet principal. La présente invention concerne également les souches de levures transformées par ces plasmides ou un bloc d'expression, en particulier les souches de levures de boulangerie, de brasserie et de vinification Ce perfectionnement doit permettre de marquer des souches de levures industrielles et ainsi de pouvoir suivre et contrôler lesdites fermentations. Les exemples suivants sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Sur les dessins ci-annexés la figure 1 représente le schéma de préparation de pTG840, la figure 2 représente le schéma de préparation de pTG861. EXEMPLE 1 Construction de pTG840 La construction du plasmide pTG840 est rappelée dans la figure 1. Le plasmide de départ est le plasmide pTG902 obtenu à partir de pBR322 par délétion des sites PstI et NdeI. Par digestion de pTG902 et du plasmide portant le gène ura3 (ne possédant pas de site PstI) avec BindIII et ligation du produit de digestion, on obtient le plasmide pTG803. Le plasmide 2 de levure est mis en digestion avec Aval I et Hindi Il et les extrémités sont rendues franches par traitement avec la polymérase de Klenow. Ce fragment de 2 AvaII/HindIII est ligé avec pTG803 digéré par SmaI pour fournir le plasmide pTG807. Le gene ura3 et 1'origine de réplication du 2 sont libérés sous forme d'un fragment unique par digestion de pTG807 avec MindIII. Ce fragment est traité par la polymérase de Klenow et cloné dans le site EcoRI de pBR322 traité de façon similaire pour donner pTG831. Le gène de levure phosphoglycerate kinase (PGK) est muté de façon que le site unique BglII soit introduit a 1'ATG d'initiation de la traduction de la protéine PGK. Le fragment HindIII/SalI (2,15 kb), comprenant le promoteur et le début de la région codante du gène correspondant à la phosphoglycérate kinase de levure, a été clone dans les mimes sites du vecteur M13mp8. La création d'un site BglII au niveau de 1'ATG initiateur de la phosphoglveeratekinase a été effectuée suivant les techniques classiques de mutagenèse in-vitro (Gillam and Smith, 1979 gene 8, 99-106). Pour ce faire, un oligonucléotide synthétique, de séquence 5' ATATAAAACAAGATCTTTATC 3', a été utilisé afin de modifier la séquence originale 5' ATATAAAACAATGTCTTTATC 3' a 1'ATG initiateur est ainsi rendu non fonctionnel du fait de son remplacement par la séquence AGA. Ce gène ainsi modifié est cloné dans le plasmide pTG831 pour donner le plasmide pTG832. Le terminateur de PGK situez dans le fragment EcoRI/HindIII est clone dans le site PvuII de pTG832 après traitement de ses extrémités & la polymérase de Klenow. Le plasmide résultant1 pTG833, est mis en digestion avec BglII et recircularisé pour donner le vecteur d'expression final pTG834. Comme cela est indiqué précédemment, le site unique BglII dans ce vecteur est utilisable pour l'expression de gène hétérologue dans la levure. C'est dans ce site BglII que le fragment BamHI/BglII du gène pNeo est inséré par-Iigation. EXEMPLE 2 Construction du plasmide pTG861 On prélève dans le plasmide pTG821 décrit à l'exemple 1 du brévet principal un fragment HindIII/HindIII qui regroupe toutes les fonctions d'expression du gène xylE dans la levure et on l'introduit par digestion et ligation dans le site unique Hindili de pTG840. On obtient ainsi le plasmide définitif pTG861. Les différents éléments de ce plasmide sont rappelés dans le tableau ci-après. RELATIONS ENTRE LES STRUCTURES ET LES FONCTIONS DU PLASMIDE pTG861 - ORIGINES Structures Origines Fonctions ORI : origine de réplication pBR322 Réplication dans E. coli (Bolivar & al. 1977) AmpR : gène de résistance à PBR322 Maintien dans E. coli l'Ampicilline URA3 : gène de l'OMP décarboxylase génome de Maintien dans les levures levure de laboratoire 2 : fragment contenant une plasmide 2 Réplication en multicopie origine de réplication de la levure dans toutes les levures PGK : promoteur et terminateur génome de Permet l'expression du du gène de la phospho- levure gène G418R glycéro kinase G418R : gène de résistance à la plasmide pNeo Maintien dans toutes les Néomycine et au G418 (PL Biochemicals levures y compris les souches cat. n 4924 industrielles (Beck. & al. 1982) xylE : bloc d'expression du gène plasmide Tol Coloration jaune en présence de la catéchol oxygénase (exemple 1) de catéchol EXEMPLE 3 On utilise deux souches cultivées industriellement qui ne portent pas d'auxotrophie.L'une est utilisée en brasserie, l'autre en boulangerie. Ces souches ont été transformées par le plasmide pTG861 selon la méthode décrite par Hinnen et colt. (1978) avec quelques modifications : après le processus tel qu'il est décrit par ces auteurs, les protoplastes sont incubés 5 heures à 30 C dans le milieu complet contenant du sorbitol (1M). Après ce temps d'expression, ils sont mélangés à 10 ml de milieu complet à 450C contenant du sorbitol (1M), 3 % d'agar. 10 ml du même milieu contenant 600 ug/ml de G418 pour la levure de brasserie et 2 mg/ml de G418 pour la levure de boulangerie sont coulés sur la première couche après une incubation de 6 à 15 heures à 3O0C. Cette manipulation est faite en parallèle avec ou sans ADN pTG861. On obtient ainsi des clones de levure résistant au G418, essentiellement sur les boites correspondant à la série avec ADN. Les fréquences sont cependant très faibles (de 1 à 100 clones par boite). Les colonies obtenues sont repiquées sur du milieu frais avec antibiotique et sans sorbitol, puis mises au contact du catéchol selon la technique décrite dans l'exemple 4 du brevet principal. On trouve alors qu'une fraction importante des clones issus de la série avec ADN deviennent jaunes alors que tous les clones de la série sans ADN restent blancs. La présence ou l'absence de pTG861 dans les clones respectivement jaunes et blancs ont été vérifiées par la présence de P-lactamase dans les souches (Chevallier et coîl. 1979). Un autre avantage de la méthode est lié à l'instabilité du plasmide (voir exemple 4). Les clones obtenus avec les souches de brasserie et de boulangerie sont cultivés sans antibiotique puis subclonés. Les populations de subclones sont analysées selon la même méthode rapide au catéchol. On peut voir alors très aisément l'apparition de clones dépourvus de plasmide. Cette application de l'invention peut être très utile, d'une part pour analyser des fermentations industrielles conduites avec de telles souches, d'autre part pour rechercher facilement des souches dépourvues de plasmide dans des manipulations de cotransformation (Rothstein, 1983) BIBLIOGRAPHIE BECK E., LUDWIG G., AUERSWALD E. ., REIM B. et SCHALLER H. (1982) Gene 19, 327-336. BOLIVAR F., RODRIGEZ R.L., GREENE P.J., BETLACH M.C., HEYNECHER H.L. et BOYER H.W. (1977) Gene 2, 95-113. CHEVALLIER M.R. et AIGLE M. (1979) FEBS Letter 108, 179-180. JIMENEZ A. et DAVIES J. (1980) Nature 287, 869-871. ROTHSTEIN R.J. (1983) dans Methods in enzymology, vol. 101. Wu, Grossman et Moldave Editeurs, Academic Press (N.Y.) 202-211. REVENDICATIONS 1) Bloc d'expression de la catéchol-2,3-oxygénase dans une levure selon l'une des revendications 1 à 4 du brevet principal, caractérisé en ce qu'il comporte comme marqueur de sélection le gène de résistance à un composé chimique. 2) Bloc d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de résistance à un composé chimique est un gène de résistance à un antibiotique. 3) Bloc d'expression selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène de résistance à un antibiotique est le gène de résistance à G418. 4) Bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gene est sous la promotion d'un promoteur de levure et est terminé par un terminateur de levure. 5) Bloc d'expression selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur de levure proviennent du gène PGK. 6) Plasmide caractérisé en ce qu'il comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 5 et une origine de réplication dans les levures. 7) Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'origine de réplication est l'origine de réplica- tion du plasmide 2u. 8) Souche de levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 6 et 7. 9) Souche de levure caractérisée en ce qu'elle comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 5 incorporé sur son chromosome. 10) Souche selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'il 'agit d'une levure de boulangerie ou d'une levure de brasserie.