Brevet FR2563532A1 — publié le 19851031

La présente invention concerne un procédé d'extraction de fractions mitogènes de sérums d'animaux immunises ou non contre des antigènes définis, les compositions mitogènes ainsi obtenues ainsi que leur application notamment comme constituants de milieux de culture de cellules. On sait que de nombreux facteurs sériques con trôlent l'initiation de la synthèse de 1'ADN ainsi que la division cellulaire,et on a mis en évidence que dans les milieux de culture contenant peu de sérum,la croissance de la culture s'arrête rapidement, alors les cellules se trouvent en phase G zéro (Go) du cycle de réplication cellulaire. D'autre part on sait que la synthèse de l'ADN reprend quand on ajoute au milieu carencé une quantité faible de sérum de veau foetal, insuffisante par elle-même pour assurer la multiplication cellulaire, de facteur de croissance épi- théliale (EGF)ou de facteur de croissance fibro-blastique (FGF). Toutefois, ces deux derniers facteurs ne suffisent pas pour que des divisions cellulaires aient lieu; il est nécessaire que soient ajoutées aussi au milieu de petites quantités de sérum ainsi que de l'insuline et de la transférine. Des milieux sans sérum ont été élaborés par divers auteurs. Ils sont fort complexes et.restreints aux types cellulaires pour lesquels ils ont été définis. Ils doivent, en particulier, comporter des facteurs d'attachement et antitryptiques lorsque les cellules ne peuvent se multiplier qu'attachées à une surface. (Voir la revue de D.BARNES et G. SATO Analytical Biochemistry,1980, 102, p.255-270). On a par ailleurs montré que les anticorps dirigés contre les récepteurs membranaires de certains de ces facteurs stimulants présentent au moins partiellement,des activités biologiques de même type. Ainsi,dans Science 200 p. 1283-1284 du 16 Juin 1978), Steven JACOBS et coll. rapportent que des anticorps dirigés contre les récepteurs de l'insuline ont certaines des activités biologiques de l'insuline et notamment qu'ils augmentent la dégradation oxydative du glucose et indigent la lipolyse due à l'épi- néphrine dans les adipocytes de rat; toutefois,ces auteurs précisent qutil reste à étudier si de tels anticorps ont aussi les activités indirectes de l'insuline, à savoir celles de stimulation de la synthèse de 1'ADN et des protéines. Dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (12) p.7535-7539 (Décembre 1981), Alain B. SCHREIBER et coll. rapportent que des anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs du facteur de croissance épithéliale (EGF) d'une cellule de carcinome humain ont les mêmes activités biologiques directes ou indirectes que 1'EGF et stimulent la synthèse de 1'ADN ainsi que les divisions cellulaires d'une population de fibroblastes, mais le milieu de culture qu'ils utilisent contient 0,5 % de sérum de veau foetal. Dans les milieux de culture cellulaire du sérum de veau foetal est généralement utilisé en raison de son très large spectre d'activité et de sa supériorité par rapport aux milieux dits définis; mais même dans ces derniers, on introduit assez fréquemment du sérum de veau foetal à de très faibles concentrations,non mitogènes en elles-memes. Toutefois, ce sérum est très variable d'un lot à l'autre, ses propriétés totalement incontrôlables du fait de sa complexité et de son mode de préparation ainsi que des inconnues quant à ses principes actifs. Il était donc souhaitable de trouver une composition qui ait les propriétés- du sérum,que celles-ci soient reproductibles et que ladite composition puisse être préparée facilement en grandes quantités. L'un des objets de l'invention est un procédé d'obtention d'une composition à base d'une préparation d'immunoglobulines qui présente le même type d'activité stimulante que le sérum de veau foetal, c'est-à-dire qu'elle stimule la synthèse de l'ADN et la réplication cellulaire. Le procédé selon l'invention consiste à extraire du sérum d'un animal immunisé ou non contre u n antigène approprie, une fraction protéique à activité mitogène, en soumettant le sérum à une chromatographie d'affinitré sur un absorbant sur lequel a été fixé par pontage chimique l'antigène ou un haptène,tel que le sérum de veau foetal l'ovalbumine ou la glycine et en éluant par une méthode classique ladite fraction; on utilise par exemple une solution aqueuse,de force ionique appropriée,telle qu'une solution d'acide acétique M., de MgC12 4M ou d'urée 12 M. L'éluat, qui contient la fraction préalablement retenue par l'absorbant sera séparé des composants de la solution éluante par tout moyen classique connu de l'homme du métier. L'utilisation dans la colonne de purification des substances actives de ligands sans spécificités connues, tel que les acides aminés et par exemple la glycine, permet de moduler la composition et les propriétés des préparations actives isolées. Les compositions obtenues par ce procédé d'extraction sont un autre objet de l'invention;elles sont principalement composées d'immunoglobulines, et ont une réactivité d'anticorps contre des antigènes, tels que le sérum de veau foetal ou l'ovalbumine selon le sérum de départ. La présente invention concerne en outre l'application de ces compositions en tant qu'agents mitogènes, utilisables par exemple pour la culture des cellules et, notamment en tant que substitut du sérum de veau foetal dans les milieux de culture habituels ou comme l'un des composants d'un nouveau milieu de culture, à côté des produits nutritifs et le cas échéant de facteur-s stimulants l'adhérence cellulaire. Les sérums, d'où sont extraits, selon l'invention, les facteurs mitogènes peuvent être des sérums provenant d'animaux tels les rongeurs (rat, souris, lapin), les ovins, les bovins, les porcins, les chevaux et même de l'homme pour certains cas particuliers. On utilise de préférence les sérums d'animaux préalablement immunisés contre les antigènes appropriés;maix ceux d'animaux non immunisés, ou des sérums humains peuvent convenir. L'invention sera maintenant illustrée par les exemples de réalisation qui suivent : I.Préparation d'une fraction mitogène a)conditionnement de la colonne de chromatographie. Une colonne de chromatographie (commercialisée par Pharmacia)d'une hauteur de 250 mm et d'un diamètre de 16 mm, est remplie aux deux. tiers de sa hauteur avec un gel de sépharose Pus activé au bromure de cyanogène,sur lequel on a préalablement fixé 150 mg de sérum de veau foetal ou d'ovalbumine au bromure de cyanogène puis qu'on a saturé par une quantité suffisante de glycine,selon un procédé connu. Avant chaque utilisation la colonne est lavée avec une solution aqueuse d'un mélange de borate de sodium (M/SO)et chlorure de sodium(MtlO),puis avec de l'acide acétique en solution aqueuse0Jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent soit celle de la solution d'acide acétique introduit; enfin on neutralise cette colonne avec une solution de borate de sodium de concentration. b)Préparation de la fraction mitogène. On fait passer dans la colonne entre 5 ml et 100 ml de sérum d'animal immunisé ou non contre le ligand. On élue ensuite la fraction de sérum retenue par environ 100 ml de solution aqueuse M d'acide acétique. L'éluat,qui se trouve à pH åcide,est dialysé contre la solution de borate mentionnée ci-dessus,concentré par évaporation puis dialyse de nouveau contre une solution physiologique de NaCl(NaCl en solution tampon pH = 7,4 ), concentration 9po). c)L'analyse de ces fractions par électrophorèse en gel de polyacrylamide et révélation par coloration au bleu de coomassie ,ou 4'-anilino-8-hydroxy-1,1'-azonaphtalène-3,6, 5'-trisulfonate trisodique et à l'argent montre qu'elles sont composées principalementde protéines de masse moléculaire proche de 150000,associées parfois à des protéines de masse inférieure. D'autre part, on a constaté que ces protéines de masse voisine de 150.000 peuvent être dissociées par réduction au A -mercaptoéthanol en éléments analogueS à ceux que l'on observe en réduisant de la meme manière des immunoglobulines provenant de sérums d'animaux immunisés, ELles donnent en immunodiffusion les mêmes bandes que les anticorps dirigés contre le sérum de veau foetal ou l'ovalbumine. II. Etude de l'activité biologique des compositions a) étude de l'activité blastogénique (initiation de la synthèse de 1'ADN) Des fibroblastes de la lignée BALB/c 3T3 entretenus sur du milieu de culture RPMI1640 commercialisé par GIBCO LTD,Paisley - Scotland (voir In Vitro 9,6, 1974) en présence de 10% de sérum de veau foetal sont ensemencés 2 4 dans des puits de 2 cm à raison de 104 cellules par puits avec addition d'un volume de 1 ml du même milieu.Après six Jours d'incubation pour obtenir l'arret de la croissance en phase Go du cycle de réplication par inhibition de contact, o le milieu est remplacé, après lavage, par du milieu RPMI sans sérum de veau foetal, et les cellules sont maintenues 48 heures dans ce milieu de carence. On introduit alors dans chaque puits les fractions à tester, et on laisse incuber de 18 à 20 heures. Puis on détermine le taux de la synthèse de 1'ADN par un marquage des cellules à la thymidine tritiée, la mesure étant effectuée par la méthode classique de précipitation à l'acide trichloracétique et comptage dans une solution scintillante. b) étude de l'effet mitogène (multiplication cellulaire) On ensemence des puits et cultive les cellules comme en a). Après 24 heures d'incubation ce qui permet l'adhérence des cellules en milieu RPMI complet, le milieu de culture est retiré et les cellules lavées avec 1 puis 2 ml de milieu RPMI; on introduit alors 1 ml de milieu RPMI, contenant les fractions mitogènes à étudier. Toutes les 24 heures on détache par la trypsine (o,l ml) la totalité des cellules présentes dans un certain nombre des puits et on les dénombre à l'hématimètre, après avoir inactivé la trypisne par addition de 0,25 ml de RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal. EXEMPLE -l On a extrait par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle a été fixé du sérum de veau foetal comme précédemment décrit, une fraction active à partir de 100 ml du sérum d'un cheval, l'animal ntayant pas été immunisé préalablement contre un antigène particulier. L'éluat contient la fraction active, dont les activités blastogéniques et mitogéniques ont été mesurées par les méthodes décrites ci-dessus. Les résultats figurent dans le tableau 1 (action mitogénique) et sur la figure 1 (action blastogénique). Sur cette figure sont représentées les activités, en fonction de la quantité de protéines introduite dans chaque puits en prenant pour valeur de base (MP) celle des témoins. La courbe -(A) représente les résultats obtenus avec la fraction active isolée, la courbe B ceux du sérum de cheval initial, d'où a été extraite la fraction active. On voit que les préparations obtenues sont très actives, près de 20 fois plus actives que le sérum d'origine à poids de protéines égal. EXEMPLE 2 Des sérums de lapin immunisés contre le SVF ou l'ovalbumine (5 à 20 ml) ont été passés dans des colonnes de chromatographie d'affinité dont le ligand est l'antigène ne correspondant. On a étudié l'action blastogénique des anticorps de lapin isolés à partir des colonnes.Les résultats sont sur la figure 2. Les courbes représentent l'incorporation de la Thymidine tritiée dans des cellules en fonction du poids de la fraction active ajoutée. La droite notée SVF a été tracée à titre de comparaison en introduisant dans le milieu de cultures témoins du sérum de veau foetal. On constate que l'efficacité des fractions "actives" varie d'un lapin immunisé à un autre, mais elle est de 10 à 50 fois supérieure à celle du sérum de veau foetal ou du sérum d'origine. TABLEAU I Action mitogène de la fraction active préparée selon l'exemple 1 Agent nitogène NOMBRE DE CELLULES 2ème jour 3ème jour 6ème jour sérum de veau foetal (300 g) * 4900 14.700 38.500 témoins sérum de cheval pur (270 g) * 5200 12.600 20.000 fraction active essais 150 g* 1750 1750 13.300 100 g* 1750 2100 11.900 50 g* 2800 4900 6.300 sans mitogène 2100 4200 1.400 *introduits sous un volume de 0,1 ml par puits nota: avec 100 g de SVF ou de sérum de cheval/ml de RPMI, les cellules ne se multiplient pas. REVENDICATIONS 1.Procédé de préparation de compositions mitogènes,caractérisé en ce qu'une fraction protéique possèdant une activité mitogène est extraite de sérums d'animaux,immunisés ou non, contre un antigène ou un haptène approprié,en soumettant le sérum à une chromatographie d'affinité dont l'absorbant porte ledit antigène,ou haptène avec élution par une solution aqueuse d'un composté de force ionique definie. 2.Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que l'antigène fixé sur l'absorbant est du sérum de veau foetal. 3.Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que l'antigène fixé sur l'absorbant est de l'ovalbumine. 4.Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que l'haptène fixé sur l'absorbant est un aminoacide biologique dont la glycine. 5.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 , caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur une colonne d'absorbant sur lequel l'antigène est lié chimiquement. 6.Procédé selon la revendication 5,caractérisé en ce que la liaison est covalente. 7.Procédé selon la revendication 6,caractérisé en ce que l'absorbant a été activé par le bromure de cyanogène ou le glutaraldéhyde pour assurer la liaison. 8.Composition mitogène extraite de sérum,caractérisée en ce qu'elle est préparée selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9.Milieu de culture cellulaire,caractérisé en ce qu'il contient une composition selon la revendication 7.