Brevet FR2569983A1 — publié le 19860314

La présente invention se rapporte à une nouvelle substance tumoricide, SPF-140, et à un procédé pour la pré- parer. On a déjà utilisé, dans des compositions carcino- statiques, du Streptococcus pyogenes vivant, atténué. D'au- tre part, sont déjà connus: un procédé qui consiste à broyer les corps de S. pyogenes, pour en extraire un consti- tuant actif à l'aide d'eau ou de solution saline, que l'on additionne ensuite d'un solvant organique, afin de recueil- lir, sous forme de précipité, le constituant tumoricide (Cf la publication du brevet japonais N 1647/1963); un au- tre procédé qui consiste en une bactériolyse de S. pyogenes à l'aide d'une lysokinase telle que lysozyme ou cellulase, ou d'une protéinase, et en fractionnement de la fraction active sous forme de phase aqueuse (Cf brevet anglais N 1163865); et un procédé qui consiste à broyer des cel- lules de S. pyogenes, à recueillir les substances insolu- bles dans l'eau, et à les traiter avec une nucléase et une protéinase (brevet japonais mis à l'inspection N 7014/1980). Ainsi qu'il est indiqué plus haut, il est bien connu que les streptocoques eux-mêmes, ou certains de leurs constituants, présentent une activité tumoricide. Toutefois, les substances habituellement connues sont principalement des cellules bactériennes ou des constituants cellulaires, polymères, solubles ou insolubles. Afin d'isoler un consti- tuant actif d'une bactérie il s'avère nécessaire de réali- ser une bactériolyse ou un broyage mécanique de la bacté- rie, et de fractionner l'ensemble. Ces différents traite- ments peuvent compliquer la purification du produit, de sorte que l'isolement du constituant actif est très diffi- cile. Le seul exemple actuel, d'un constituant actif ayant été isolé, se rapporte à une protéine de poids moléculaire 000 (Cf la publication du brevet japonais N 43841/1973 et le brevet japonais mis à l'inspection N 44617/1976). La demanderesse a antérieurement effectué des études pour isoler un constituant actif tumoricide, produit par des streptocoques, et a réussi à isoler les nouvelles substances physiologiquement actives SPF-1 et SPF- 2, ainsi qu'une nouvelle substance tumoricide SPF-100, par addition de pénicilline, ou de substances dérivées, à un moment ap- proprié au cours de la culture des streptocoques, poursuite de la culture et récupération des substances mentionnées plus haut, présentes dans le milieu, à partir du bouillon de culture filtré, suivie de la purification. Ces substan- ces inhibent la croissance d'un mutant perméable aux macro- molécules d'un bacille MP-2 du colon (FERM-P5432) (Cf Agr. Biol. Chem. 43, 371-378 (1979) qui sera désigné ci-après comme souche de MP-2. La présente invention est basée sur la constata- tion que le bouillon de culture de streptocoques, filtré renferme, en plus de SPF-1, SPF-2 ou SPF-100, une fraction qui n'inhibe pas la croissance de la souche de XMP-2, mais présente un effet tumoricide. La substance de cette frac- tion est appelée SPF-140. La nouvelle substance SPF-140 tumoricide, selon l'invention, obtenue dans le bouillon de culture filtré de streptocoques, traités à un moment approprié par de la pénicilline ou ses dérivés, est caractérisée par un poids moléculaire de 25 000 à 70 000 et par le fait qu'elle n'in- hibe pas la croissance de la souche de MP-2. On ne connatt pas de substances tumoricides dé- rivées de S. pyogenes, secrétées et accumulées dans un milieu, et ayant un poids moléculaire inférieur à des di- zaines de mille. En outre, le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la substance SP-140 selon l'invention, qui semble être de nature peptidique d'après les résultats de l'analyse élémentaire et des réactions colorées, suggère qu'il s'agit d'une nouvelle substance différente des sub- stances tumoricides connues. La présente invention comprend un procédé pour la préparation de cette substance tumoricide SPF-140, qui com- prend la culture d'un streptocoque producteur de SPF-140 et la récupération de la substance tumoricide à partir du milieu. L'invention est décrite plus en détails avec ré- férence aux dessins annexes, dans lesquels: la figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultra- violet d'une solution aqueuse à 0,1% de SPF-140, tandis que la figure 2 représente un spectre d'absorption dans l'infra- rouge de la même solution. Au cours du procédé selon l'invention on peut utiliser toute espèce de streptocoque capable de produire la substance tumoricide SPF-140. Conviennent notamment: Streptococcus pyogenes ATCC 21060 Streptococcus sp. ATCC 21597 Streptococcus pyogenes ATCC 21546 Streptococcus pyogenes ATCC 21547 et Streptococcus pyogenes ATCC 21548. On utilise fréquemment des milieux naturels comme milieu d'extrait de viande, milieu d'extrait de levure, et milieu d'infusion coeur-cerveau (milieu BHI),bien que l'on puisse utiliser tout milieu approprié à la croissance des streptocoques. Les streptocoques peuvent être cultivés dans des conditions appropriées, c'est-à-dire à un pH de 5 à 8 (de préférence 6,1 à 7,2) et à une température de 30 à 40 C (de préférence entre 35 et 37 C). En général, on utilise une culture anaérobique et statique, ou sous agitation. Au cours du procédé selon l'invention, l'apport de la pénicilline, ou de substances dérivées, à un moment approprié, joue un grand rôle dans la récupération de la substance tumoricide SPF-140, La pénicilline,ou les substances dérivées, peu- vent être ajoutées 3 à 20 heures, et de préférence 5 à 10 heures, après le début de la phase de croissance logarithmi- que, lorsque la bactérie est cultivée à 37 C. La poursuite de la culture pendant 1 à 20 heures, et de préférence 3 à heures, doit permettre l'accumulation d'une grande quan- tité de substance tumoricide SPF-140 dans le milieu. On peut opérer avec toute substance dérivée de la pénicilline, connue pour avoir un effet similaire, bien qu'on utilise habituellement de la pénicilline G. Celle-ci est ajoutée à raison de 100 à 7000 unités/ml, de préférence 300 à 5000 unités/ml de milieu. Le bouillon de culture ainsi obtenu est centrifugé afin d'éliminer les cellules, et l'on ajoute du sulfate d'am- monium au filtrat. Apres récupération des fractions corres- pondant à des degrés de saturation de 50 à 90%, le produit de relargage obtenu, renfermant la substance tumoricide SPF-140, peut être conservé sous forme congelée. La substance SPF-140 est purifiée à partir du produit de relargage par dissolution de ce dernier dans une solution tampon, suivie de l'adsorption et de l'élution de la solution ainsi formée, de manière continue ou non, avec un échangeur d'ions, puis d'une chromatographie de fil- tration sur gel. Conviennent des échangeurs d'ions comme résine d'échange d'ions, cellulose d'échange d'ions, Sephadex d'échange d'ions (un produit de Pharmacia AB) ou de l'hydroxylapatite, et pour la filtration sur gel, des substances comme Toyo- pearl HW 50F ou HW 50SF (produits de Toyo Soda Mfg. Co., Ltd) ou Sepha4ex (produit de Pharmacia AB). L'adsorption de la substance tumoricide SPF140 par l'échangeur. d'ions, et son élution à partir de cette substance, peuvent s'effec- tuer au moyen d'une solution tampon de valeur de pH et de concentration saline convenables. On peut éventuellement combiner deux ou plusieurs échangeurs d'ions ou de substan- ces de filtration sur gel. La substance tumoricide SPF-140 Sous forme lyo- philisée obtenue dans l'exemple 1 comme décrit ci-après, est une poudre jaune pale ayant les propriétés physico- chimiques suivantes. 1. Analyse élémentaire C: 42,58 à 41,79 % H: 6,15 à 5,92 % N: 12,69 à 12,35 % O: 36,33 à 38,78 % et cendres: 2,25 à 1,16 %. 2. Poids moléculaire; Approximativement 25 000 à 70 000, tel que déter- miné par filtration sur gel. 3, Point de décomposition: Le produit brunit à 170 C et noircit à 245 C, et se décompose, 4. Pouvoir rotatoire spécifique: D20 = -70 à - 80 (C = 1,0). D 5. Spectre d'absorption dans l'ultra-violet: La figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultra-violet d'une solution aqueuse à 0,1% de SPF-140, qui est caractérisé par le maximum d'absorption à 275 nm, 6. Spectre d'absorption dans l'infra-rouge: La figure 2 représente un spectre d'absorption dans l'lnfra-rouge de la même solution. 7. Solubilité dans les solvants; Le produit est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol,et non soluble dans des solvants comprenant éth&nol, n-propanol, n-butanol, isobutanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl isobutyl cétone et oxyde de diéthyle. 8. Acidité: La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1% est de 6,5. 9. Forme: Poudre jaune pale. 10. Réactions colorées Réaction à la ninhydrine; positive Réaction du biuret: positive Réaction de Lowry: positive Réaction de Molisch: négative Réaction de Dische: négative Réaction à l'anthrone; négative, et Réaction au sulfate de cystéine: négative. 11. Stabilité: I ne nécessite pas de stabilisant. Dans la présente invention l'activité antlbac- térienne est déterminée par l'effet d'inhibition de la croissance de la souche MP-2. De plus, l'unité d'activité d'une substance physiologiquement active est déterminée par le procédé d'Udaka (Cf. J. Antibiotics, 35, 1319 à 1325 (1982)) avec indication de l'activité antibactérienne contre MP-2, C'est-à-dire qu'un milieu (milieu M3) comprenant 1,75% de "Bact Antibiotic medium 3" (un produit de Difco) et 1, 3% d'agar, est stérilisé par chauffage à 120 C pendant minutes. Puis des portions de 20 ml de ce milieu sont versées dans des bottes de Pétri, et on laisse refroidir pour préparer les milieux de plaque. D'autre part, on stérilise par chauffage à 120 C pendant 15 minutes, un milieu qui comprend 0,5% de peptone, 0,5% d'extrait de viande, 0,3% de NaCI et 0,8 % d'agar. Puis on le met dans un thermostat à 420C. Lorsque la tempé- rature de ce milieu atteint 420C, on y ajoute MP-2 préala- blement cultivé à 370C pendant 17 heures, à raison de 104 cellules/ml. 2 ml de ce milieu sont recueillis à l'aide d'une pipette et déposés à la surface du milieu M3 qui a été antérieurement préparé. Puis le milieu additionné est immédiatement étalé de manière homogène, et est solidifié. Une solution d'essai est diluée de manière convenable. Une rondelle de papier (diamètre 8 mm; un produit de Toyo Roshi Co. LTD.) est imprégnée avec cette solution, et est ensuite placée sur la plaque préparée plus haut, et la culture est menée pendant 17 heures à 37 C afin de déter- miner le diamètre de la zone d'inhibition résultant de la substance d'essai. Puis l'on définit comme correspondant à une unité ( 1 u) la concentration de la substance d'es- sai pour laquelle le diamètre de la zone d'inhibition est de 10 mm. La présente invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 ml d'un milieu BHI sont ensemencés avec Streptococcus pyogenes ATCC 21060 et on soumet à une culture statique à 37 C pendant 8 heures pour obtenir un fluide de culture de germe. Puis on ensemence avec ce fluide 1 litre de mi- lieu 1, ayant la composition indiquée dans le tableau 1 ci-après, et on soumet à une préculture anaérobique dans des conditions identiques à celles que l'on a observé pour la culture du germe. TABLEAU 1: Milieu A Extrait de viande 1% Polypeptone 1% Maltose 0,5% Extrait de levure 0,25% Phosphate monopotassique 0,1% Sulfate de magnésium 0,05% (pH = 6,8) Puis 8 litre de milieu A sont introduits dans une fiole à fermentation (10 litres), sont stérilisés à 120 C pendant 10 minutes, et on laisse refroidir à 37 C avant d'y ensemen- cer 1 litre du fluide précultivé; et l'on cultive en anaé- robie à 37 C et pH 6,5 pendant 15 heures 30 à la vitesse de 300 tours/minute. On introduit alors 5000 unités/ml de pé- nicilline G dans ce milieu et l'on poursuit la culture pen- dant 5 heures supplémentaires. Le bouillon de culture obte- nu est centrifugé pour enlever les cellules. On ajoute du sulfate d'ammonium au bouillon de culture fil- tré et l'on récupère une fraction correspondant à un degré de saturation de 50 à 90%, pour obtenir un précipité. Ce précipité renferme 381 x 104u d'une substance physiologi- quement active, qui inhibe la croissance de MP-2. On le dissout dans 300 ml d'une solution tampon phosphate (1 x 10 -2M; pH = 7; KH2PO4-Na2HPO4) et la.solution obtenue est introduite dans une colonne de DEAE-cellu- lose ( 5 x 70 cm) afin qu'y soit adsorbée la substance physiologiquement active. Puis on élue graduellement avec la solution tampon phosphate, précédemment mentionnée, ren- fermant 0,3 M de chlorure de sodium pour obtenir une frac- tion ayant une activité physiologique de 283,4 x 104 u. Cette fraction est adsorbée sur une colonne de DEAE Sepha- dex A-25 (2,6 x 70 cm), et l'on élue ensuite tout en aug- mentant linéairement la concentration du chlorure de sodium dans la solution tampon phosphate mentionnée plus haut, pour recueillir une fraction ayant une activité physiologique de 249,6 X 104u. L'éluat est à nouveau concentré et est intro- duit dans une colonne (2,6 x 100 cm) de substance pour fil- tration sur gel Toyopearl HW 50F, afin de recueillir une fraction non bactéricide qui après lyophilisation donne 640 mg de la substance tumoricide SPF-140. Cette substance ainsi obtenue est utilisée au cours des exemples d'essai 1 et 2 décrits plus loin, pour examiner son action tumoricide. EXEMPLE 2 On cultive, de la manière décrite dans l'exemple 1, et dans un milieu B dont la composition est indiquée dans le tableau 2, du Streptococcus pyogenes ATCC 21060. On y ajoute de la pénicilline G à une concentration de 1000 unités/ml de mi- lieu. Le bouillon de culture filtré est purifié comme dé- crit dans l'exemple 1, et donne 767 mg de la substance tumo- ricide SPF-140. TABLEAU 2; Milieu B Extrait de viande 0,5 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25% Chlorure de sodium 0,1 % (pH = 6,7) EXEMPLE 3 Streptococcus pyogenes ATCC 21060 est cultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, dans un milieu C dont la composi- tion figure dans le tableau 3. Le bouillon de culture filtré est purifié de la manière décrite dans l'exemple 1, et donne 527 mg de la substance tumoricide SPF-140. TABLEAU 3: Milieu C Extrait de viande 1% Polypeptone 1% Maltose 0,5% Extrait de levure 0,25% Phosphate monopotassique 0,1% Sulfate de magnésium 0,05% Chlorure de sodium 0,5% (pR r 6,5) EXEMPLE 4 On cultive de la manière décrite dans l'exemple 1, dans un milieu D dont la composition figure dans le tableau 4, du Streptococcus pyogenes ATCC 21060. On ajoute de la pdnicil- line G jusqu'à obtention d'une concentration de 1000 unités/ ml de milieu. Le bouillon de culture filtré est purifié comme dans l'exemple 1, et donne 830 mg de substance tumo- ricide SPF-140. TABLEAU 4: Milieu D Maltose 0,8% Polypeptone 0,1% Extrait de levure 0,1% Phosphate monopotassique 1,43% Sulfate de magnésium 0,585% Nitrate de potassium - 1% (pH = 6,5) EXEMPLE 5 Streptococcus pyogenes ATCC 21060 est cultivé de la maniêre décrite dans l'exemple 1, dans un milieu E dont la composi- tion figure dans le tableau 5. On ajoute de la pénicilline G pour avoir une concentration de 1000 unités/ml de milieu. Le bouillon de culture filtré est purifié comme décrit dans l'exemple 1, et donne 570 mg de substance tumoricide SPF- 140. TABLEAU 5: Milieu E Maltose 0,3% Acides casamino 0,5% Extrait de levure 1% Phosphate monopotassique 0,5% Sulfate de magnésium 0,1% Chlorure de sodium 0,1% Nitrate de potas!ium 0,5% (pH 6,5) EXEMPLE D'ESSAI 1 L'activité tumoricile de l'agent d'essai in vitro est déterminée conformément à la détermination du degré d'inhi- bition cellulaire. L-5178Y (Leucémie), utilisée comme cellules tumorales, est mise en suspension dans du milieu RPMX 1640 renfermant 10% de FCS et 5 mg/litre de kanamyclne. On injecte 0,45 ml de ce milieu dans un tube de Falcon 2058 de manière à avoir une concentration de 1 x 105 cellules/tube. Ensuite, une certaine quantité de l'agent d'essai, qui est préparée par dissolution de la substance tumoricide SPF-140 dans 0,05 ml de milieu, est injectée dans le milieu, et on cultivre à 37 C en présence de 5% de C02. 48 heures après l'addi- tion de l'agent d'essai, on effectue une coloration vitale avec du bleu de trypan, et le degré d'inhibition cellulaire est détermlné par l'équation suivante 1 1 Nombre de cellules dans chaque groupe d'essai (A) Degré d'inhibition = x 100 cellulaire (%1 Nombre de cellules dans le groupe témoin (A') Le tableau 6 montre le résultat obtenu lors de l'utilisa- tion de la substance SPF-140 comme agent d'essai. TABLEAU 6: Degré d'inhibition cellulaire (%) SPF-140 (mg/ml) L-5178Y 2,0 15,3% 1,0 11,3% EXEMPLE D'ESSAI 2 L'activité tumoricide de l'agent d'essai in vivo est déterminée par utilisation de souris femelles CRJ-CD-1 ICR, âgées de 5 semaines. Des cellules cancéreuses, qui sont des cellules d'ascites Sarcoma-180, sont mises en suspension dans du sérum phy- siologique. Chaque souris reçoit par vgie intrapérito- néale 0,2 ml de suspension comprenant 1 x 106 cellules can- céreuses. Après cette inoculation, on administre par voie intrapéri- tonéale une quantité déterminée de l'agent d'essai, à cha- que souris, une fois par jour pendant 7 jours, afin d'ob- server le nombre de souris vivantes. Le tableau 7 montre les résultats d'un essai au cours du- quel on a utilisé comme substance d'essai la substance tumo- ricide SPF-140. TABLEAU 7: Activité tumoricide de SPF-140 (Nombre de souris vivantes) Dose (mg) Nombre de jours 0 10 15 20 25 30 Témoin 5/5 2/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0,3 5/5 5/5 5/5 4/5 4/5 3/5 Le taux de prolongation de vie (durée moyenne de survie en jours du groupe témoin/durée moyenne de survie en jours du groupe d'essaix 10)de l'agent d'essai est de 270%. Revendications 1. Substance tumoricide, appelée SPF-140, caractéri- sée par les propriétés physicochimiques suivantes: (1) Analyse élémentaire C: 42,58 à 41,79 % H: 6,15-à 5,92 % N: 12,69 à 12,35 % O: 36,33 à 38,78 % et Cendres: 2,25 à 1,16 %. (2) Poids moléculaire Environ 25 000 à 70 000, d'apres la détermination par filtration sur gel. (3) Point de décomposition La substance brO.nit à 170 C et noircit à 245 C et se décompose. (4) Pouvoir rotatoire spécifique [y20= -70O à -80 (C = 1) (5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet La figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1%, qui est caractérisé par un maximum d'absorption à 275 nm. (6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge La figure 2 représente un spectre d'absorption dans l'infrarouge de la même solution. (7) Solubilité dans les solvants La substance est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol, et difficilement, ou pas soluble du tout dans des solvants comprenant étha- nol, n-propanol, n-butanol, isobutanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl isobutyl cétone et éther éthylique. (8) Acidité La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1% est de 6,5. (9) Présentation Poudre jaune pâle. (10) Réactions colorées Réaction à la ninhydrine; positive Réaction du biuret: positive Réaction de Lowry: positive Réaction de Molisch: négative Réaction de Dische; négative Réaction à l'anthrone: négative Réaction au sulfate de cyst4ine; négative. (11) Stabilité La substance ne nécessite pas de stabilisants. 2. Procédé de production de SPF-140, selon la revendi- cation 1, à partir d'une culture de Streptocoques, caracté- risé en ce qu'on provoque la libération de la substance dans le bouillon de culture par addition de pénicilline, ou de produits dérivés, à un moment approprié au cours de la culture. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme streptocoque, $treptococcus pyogenes ATCC 21060, Streptococcus pp, ATCC 21597, Streptococcus pyogenes ATCC 21546, Streptococcus pyogenes ATCC 21547 ou Streptococcus pyogenes ATCC 21548. 4. Procédé selon une des revendications 2 ou 3, ca- ractérisé en ce qu'on utilise pour la culture des milieux naturels comme milieu d'extrait de viande, d'extrait de le- vure, ou d'infusion coeur-cerveau (milieu BsI). 5. Procédé selon une des revendications 2 à 4, carac- térisé en ce que l'on opère à un pH de 5 à 8, de préférence 6,1 à 7,2 et à une température allant de 30 à 40 C, de préférence entre 35 et 37 C. 6. Procédé selon une des revendications 2 a 5, carac- térisé en ce que l'on opère en culture anaérobique, stati- que ou sous agitation. 7. Procédé selon une des revendications 2 à 6, carac- térisé en ce qu'on ajoute de la pénicilline G a raison de à 7000 unités/ml de milieu, de préférence à raison de 300 à 5000 u/ml. 8. Procédé selon une des revendications 2 à 7, carac- térisé en ce que la pénicilline, ou un de ses dérivés, est ajoutée, lors d'une culture à 37 C, 3 à 20 heures, et de préférence 5 à 10 heures, après le début de la phase de croissance logarithmique, et en ce que, après cette addi- tion, on poursuit la culture pendant 1 à 20 heures, et de préférence pendant 3 à 15 heures. 9. Procédé selon une des revendications 2 à 8, carac- térisé en ce que le bouillon de culture, apres traitement par la pénicilline, est centrifugé pour éliminer les bac- téries, avant d'être additionné de sulfate d'ammonium. 10.Procédé selon la revendication 9, caractériseé en ce que les précipités obtens, correspondant à des degrés de saturation de 50 à 90% en Culfate d'ammonium, sont re- dissous dans une solution tampon afin de subir un traite- ment par échange d'ions et une chromatographie de filtra- tion sur gel, afin d'obtenir la substance SPF-140 puri- fiée.