Brevet FR2567521A1 — publié le 19860117

Nouveaux ionophores activés. La présente invention concerne des ionophores activés et leur application à titre d'intermédiaires de synthèse des immunotoxines. Dans sa demande de brevet antérieure, déposée en France sous le numéro 82/02 091, la demanderesse a mentionné la capacité que présentent les ionophores carboxyliques de potentialiser les immunotoxines. Par immunotoxines, on désigne des substances anticancéreuses obtenues par couplage, par liaison covalente, dtune protéine cytotoxique (par exemple la chaine A de la ricine) avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre un antigène posté par une cellule à détruire. De telles immunotoxines ont notamment été décrites par la demanderesse dans le brevet français n0 78/27838 et son addition n" 79/24655 et dans les demandes françaises nO 81/07596 et nO 81/21836. Les propriétés potentialisatrices des ionophores ont pu être utilisées avantageusement dans certains types de situations. En particulier ils donnent des résultats favorables à chaque fois qu une immunotoxine est utilisée en tant qu'agent cytotoxique sélectif in vitro pour détruire les cellules cibles. C'est notamment le cas lorsque l'immunotoxine est utilisée comme agent cytotoxique dans le traitement de la moelle osseuse de patients leucémiques à qui la moelle osseuse ainsi traitée sera ultérieurement transplantée. C'est également le cas lorsque l'immunotoxine est utilisée pour réduire la population de cellules T d'un greffon en vue d'applications de greffe allogénique de moelle osseuse dans le but de prévenir les désordres liés à la réaction du greffon contre l'hôte. Par contre, lorsque l'immunotoxine est utilisée in vivo en tant qu'agent thérapeutique chez l'homme, l'emploi in vivo d'un ionophore afin de bénéficier de l'effet potentialisateur connaît certaines limitations inhérentes - à la toxicité propre des ionophores - à leur faible solubilité dans les solvants appropriés aux administrations parentérales - à leur élimination très rapide du plasma sanguin. Selon la présente invention, il a été trouvé que,d'une façon surprenante, ces limitations pouvaient être éliminées en remplaçant les ionophores carboxyliques par des conjugués associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule, telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide, etc.. Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet, en tant que produits nouveaux, des conjugués (molécules artificielles mixtes) construits par liaison covalente d'un ionophore carboxylique monovalent avec des macromolécules (tels des anticorps, des protéines, des ligands peptidiques). Dans la suite de La présente description, de tels conjugués seront désignés sous le nom de "conjugués ionophores". Les ionophores utilisés sont des molécules connues : ce sont notamment des substances naturelles isolées à partir de souches de champignons Streptomycetes qui comportent un squelette hydrocarboné dans lequel sont inclus des httérocycles oxygénés. A une extrémité de la chaîne il existe toujours une fonction acide carboxylique tandis qu'à l'autre extrémité se trouvent une ou plusieurs fonctions alcool (B.C. Pressman, Annual review of Biochemistry, 45, 501-530, 1976). Ces substances naturelles, ainsi que certains composés hémisynthétiques qui en dérivent, possèdent en commun une activité ion9phore, c'est-à-dire la capacité de permettre le transfert d'ions métalliques (et notamment d'ions monovalents) d'une phase hydrophile à une phase lipophile non miscibles. Les macromolécules utilisées peuvent être des anticorps (ou des fragments d'anticorps), des protéines (telles des hormones peptidiques ou des protéines humaines, par exemple la sérum-albumine humaine), des ligands peptidiques (tels des polypeptides naturels ou synthétiques et en particulier la polylysine). Dans le cas où l'on utilise un anticorps, celui-ci peut être soit de caractère polyclonal s'il résulte d'une immunisation classique conduite chez l'animal, soit de caractère monoclonal s'il est produit par un clone de cellules hybrides obtenues par fusion entre lymphocytes et cellules de myélome. Cet anticorps pourra être utilisé soit sous la forme de molécules entières d'immunoglobuline comportant la capacité à reconnaître l'antigène choisi, soit sous la forme de tout fragment de ces molécules d'immunoglobuline ayant conservé la capacité à reconnaître l'antigène choisi, et en particulier les fragments connus sous les appellations de F(ab')2, Fab et Fab'. Le couplage chimique entre les macromolécules et l'ionophore peut être réalisé par diverses méthodes sous réserve que la méthode choisie - préserve les activités biologiques respectives deS composants du conjugué - assure une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage ; - permette de maîtriser la valeur du rapport ionophore/ macromolécule dans le conjugué obtenu - conduise à un produit stable et soluble dans l'eau. Parmi toutes les méthodes de couplage chimique répondant à ces caractéristiques, on peut choisir celles qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour l'établissement de la liaison. Dans ce cas, on peut utiliser un groupement thiol artifíciellement introduit sur l'un des composés à coupler, et introduire sur l'autre composé une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les fonctionsthiol, et ceci en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9, à une température ne dépassant pas 300C, pour fournir une liaison stable, covalente et définie. Par exemple, on peut introduire artificiellement un thiol sur les ionophores par action de l'anhydride S-acétyl-mercapto- succinique qui sera capable d'acyler une des fonctions alcool de l'ionophore. On pourra ensuite libérer cette fonction thiol par élimination du radical acétyle protecteur par action de l'hydroxyl- amine ainsi que cela a déjà été décrit (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, 1967). Des ionophores convenables sont la monensine, la nigéricine, la grisonixine et le lasalocide ; la monensine et la nigé ricine, ayant les formules ifOH3 ICH HÇ/-F-t--CH20H CH,O Ln. jLH v fl 1 n cr---n3VC CH(CH3)CoeH monensine 3 H H > HO CCOH nigéricine sont particulièrement préférées. L'introduction du thiol artificiel est effectuée par réaction de l'ionophore avec l'anhydride S-acétyl-mercaptosuccinique de formule O )Lo S-CO-CH3 dans un solvant organique inerte à environ la température ambiante. Par cette réaction, on établit une liaison ester entre un des hydroxyles de l'ionophore, l'hydroxyde primaire dans le cas de la monensine et de la nigéricine, et l'acide acétylmercaptosuccinique et l'obtention d'un composé de formule où I" représente le résidu du ionophore privé d'un de ses hydroxyles, l'hydroxyle primaire dans le cas de la monensine et de la nigéricine. Le groupe thiol du composé ci-dessus peut être libéré par action de l'hydroxylamine et le produit ainsi obtenu, de formule où IO est tel que défini ci-dessus, peut être utilisé in situ pour l'opération de couplage. Lesdits ionophores activés, qui sont représentés par la formule dans laquelle W est l'hydrogène ou un groupe acétyle, sont nouveaux et reprsentent un autre aspect de la présente invention. Le groupe est indiqué ci-après I et désigné "ionophore à coupler". Le couplage sur la macromolécule peut être effectué avec l'un ou l'autre des composés I et II, mais ledit couplage est plus rapide avec le composé II qui est donc utilisé de préférence. Le couplage sera alors réalisé avec la macromolécule sur laquelle on aura introduit une ou plusieurs fonctions susceptibles d'établir une liaison covalente avec le thiol. Cette liaison covalente pourra être soit une liaison disulfure, soit une liaison thioéther. Cas de la liaison disulfure Dans ce cas, la préparation du conjugué peut être représentée par le schéma ISH + P-R-S-S-X > I-S-S-R-P + XSH dans lequel I représente l'ionophore à coupler, P la macromolécule à modifier, -S-S-X désigne un groupement disulfure mixte activé dont X est le radical activateur. La macromolécule substituée par un atome de soufre activé est obtenue à partir de la macromolécule elle-même, par substitution à l'aide d'un réactif lui-meme porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma P + Y-R-S-S-X > P-R-S-S-X dans lequel P est la macromolécule à modifier, Y représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine, R désigne un groupement pouvant porter simultanément les substituants Y et -S-S-X, X désigne le radical activateur. Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine E substituer. Parmi celles-ci, les fonction aminées terminales des radicaux lysyle contenus dans la protéine sont particulièremenr indiquées.Dans ce cas, Y pourra notamment représenter - un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans 1'eau comme 1 'éthyl-1 (diéthylamino-3 propyl)-3-carbodiimide, - un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler, - un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou dinitro-phényle, ou encore un ester de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler, - un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel, par exemple, l'anhydride succinique qui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides, - un groupement imidoester où R1 est un groupe alkyle réagissant avec les groupes aminés de la macromolécule selon la réaction Le radical -S-S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En particulier, dans le disulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle, tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et -S-S-X. I1 devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe .(CH2)n avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe dans lequel R4 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone, et R3 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe carbamate -NH-C-OR5 où R5 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié.ayant de o 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé Y-R-S-S-X avec la macromolécule P est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqutà 30 % en volume d'un solvant organique miscible à l'eau, tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à 24 h. Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire, et en particulier les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de substituants par mole de macromolécule habituellement compris entre 1 et 50. En utilisant de tels composés, la couplage de la macromolécule et de l'ionophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés à une température ne dépassant pas 3O0C pendant un temps variant de quelques minutes à 1 i. La solution aqueuse obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire. Cas de la liaison thioéther La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir I-SH avec la protéine P, sur laquelle aura préalablement été introduit un radical maléimide. La réaction est alors représentée par le schéma dans lequel : Z représente une structure d'espacement, aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 10 atomes de carbone. La protéine P substituée par le maléimide est obtenue à partir de la protéine P elle-meme, par substitution de fonctions aminées de la protéine à l'aide d'un réactif lui-même porteur du groupement maléimide, selon le schéma dans lequel Y1 représente - soit un groupe carboxylique, la réaction étant alors effectuée après activation de la fonction carboxylique en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau, tel que l'éthyl-1 (diéthylamino-3 propyl)-3carbodiimide, - soit un ester dit "activé" tel qu'un ester d'orthoou para-, nitro- ou dinitrophényle, ou encore un ester de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler. La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvetica Chimica Acta, 58, 531-541 (1975). D'autres réactifs de la même classe sont commercialement disponibles. La réaction du composé avec l'ionophore est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'à 20 % en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques h à 24 h. Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mol de protéine habituellement compris entre 1 et 50. En utilisant de tels composés, le couplage de la macromolécule avec l'îonophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés à une température ne dépassant pas 300C pendant un temps variant de quelques h à 1 j. La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. Selon un second aspect, l'invention concerne l'utilisation des conjugués ionophores comme potentialisateurs des immunotoxines. Les études effectuées sur les conjugués ionophores ont montré que - l'effet potentialisateur des ionophores est préservé après couplage avec la macromolécule. La liaison de l'ionophore à la macromolécule apporte à celui-ci une grande solubilité en milieu aqueux favorable à l'administration in vivo du produit. - la liaison de l'ionophore à la macromolécule allonge considérablement le temps de demi-vie plasmatique de l'ionophore, ce qui est essentiel au maintien de l'effet potentialisateur in vivo - la toxicité du conjugué est plus faible que celle de i 'ionophore lui-même. Ainsi, pour chaque patient, on dirigera vers les cellules-cibles au moins deux substances effectrices indispensables au résultat - d'une part, une protéine cytotoxique (telle que par exemple la chaîne A de ricine) qui sera lteffecteur cytotoxique inclus dans le conjugué dit immunotoxine - d'autre part, l'ionophore (tel que par exemple la monensine) qui est le constituant du système potentialisateur inclus dans le conjugué dit "conjugué ionophore". Dans le cas où l'ionophore est couplé à une macromolécule possédant un récepteur à la surface des cellules-cibles (par exemple lorsque la macromolécule sera un anticorps ou un fragment d'anticorps reconnaissant un antigène spécifique de la population cellulaire à détruire différent de celui reconnu par l'immunotoxine) ou bien si l'ionophore est couplé à une hormone peptidique possédant un récepteur à la surface des cellules à détruire, la probabilité pour que les deux cibles choisies soient présentes ensemble à la surface des cellules non cibles devient très faible et l'on dispose ainsi d'un moyen extrêmement puissant pour augmenter encore le caractère spécifique de la cytotoxicité des immunotoxines. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter ia portée. Exemple 1 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre l'anti- corps T 29-33 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol. a) Anticorps T 29-33 Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T 200 des leucocytes humains. Cet anticorps est décrit dans J. Exp. Med., 1980, 152, 842. I1 est commercialement disponible auprès d'Hybritech Inc., San Diego - California - USA. b) Anticorps T 29-33 activé A 2 ml d'une solution d'anticorps T 29-33 à 10 mg/ml (soit 0,133 pmol d'anticorps) est ajoutée une solution aqueuse contenant 3 mg d'acide (pyridyl-2-disulfanyl)-3-propionique préalablement dissous dans le butanol tertiaire et 1,8 mg d'éthyl-l-diméthylamino-3-propyl-3-carbodiimide. Le mélange est agité 15 min à 300C puis dialysé en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 (40 h à 500 ml/h). Après dialyse, la solution protéique est centrifugée et l'on obtient 2,5 ml d'une solution à 6,6 mg d'anticorps modifié par ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de-la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2-éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 7,2 groupements activateurs par mol d'anticorps. c) Monensine activée La monensine utilisée est un produit commercial. Elle a été modifiée comme suit : 693 mg de monensine sont dissous dans le chloroforme puis mis en réaction avec 350 mg d'anhydride S-acétylmercaptosuccinique (SAMSA). On laisse- la réaction évoluer une 1/2 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec sous vide puis repris dans l'acétate d'éthyle et lavé extensivement à l'eau. La phase organique est ensuite séchée et tirée à sec sous vide. Le produit est obtenu cristallisé après séchage sous vide. I1 est identifié par son spectre RMN et son spectre de masse. Le produit ainsi obtenu (monensine activée S-acétyl) a la formule III ci-dessus, dans laquelle 10 est le résidu de la monensine privée de son hydroxyle primaire et W est un groupe acétyle. Le radical acétyle peut être libéré par action de l'hydroxylamine à une concentration de 50 mS finale et le produit ainsi obtenu, répondant à la formule III ci-dessus où IO est le résidu de monensine privé de son hydroxyde primaire et W est l'hydrogène, peut être directement utilisé pour le couplage. Toutefois, pour l'étape suivante il est préférable de libérer le groupe thiol in situ en présence de la monensine activée S-acétyl et de l'anticorps activé. d) Préparation du conjugué ionophore 8 mg (soit 9 ;mol) de monensine activée S-acétyl sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 2,5 ml de la solution d'anticorps activé à 6,6 mg/ml (soit 0,11 umol) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7. On ajoute 125 ul d'une solution d'hydroxylamine 1N. L'incubation dure 2 h à 250C puis le milieu réactionnel est purifié par dialyse de l'excès de réactifs contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgG T 29-33 à 5,6 mg/ml portant en moyenne 7 monensines par mol d'anticorps. Exemple 2 Potentialisation de l'immunotoxine anti-T65 Le conjugué selon l'invention, obtenu comme indiqué précedemment, a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques et plus spécialement sa capacité à potentialiser l'activité de l'immunotoxine anti-T65 dans un modèle cellulaire approprié. Ce modèle est constitué par des cellules de la lignée lymphoblastolde humaine CEM qui portent naturellement les antigènes T65 et T200. L'antigène T65 contre lequel est dirigée l'immuno- toxine utilisée constitue le premier antigène-cible du modèle. Cette immunotoxine est celle qui a été décrite dans une précédente demande de brevet de la demanderesse déposée en France sous le n" 81/21836. L'antigène T200 contre lequel est dirigé le conjugué ionophore sera le deuxième antigène-cible du modèle. La propriété fondamentale des immunotoxines étant d'inhiber la synthèse protéique des cellules-cibles, le test utilisé consiste à mesurer l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de celle décrite dans Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562, utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A -partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisses la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnéesl'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI 50). Les différents essais ont été conduits comme suit les résultats expérimentaux correspondants sont présentés sur la figure n" I. a) Des cellules CEM sont incubées 18 h en présence de concentrations connues d'immunotoxine anti-T65 utilisée à titre de référence, puis les cellules sont soumises à l'étape d'incorporation -11 du traceur radioactif. La CI 50 obtenue est de 2,8.10 11 M (courbe 1), ce qui montre que les cellules sont normalement sensibles à l'effet de l'immunotoxine. b) Les cellules CEM sont incubées 18 h à 370C en présence d'un mélange de concentrations connues anti-T65 et respectivement 1 - soit de monensine libre à la concentration de 50 nM (courbe 2) 2 - soit de conjugué ionophore anti-T200 préalablement décrit, à la concentration de 10 M (soit 70 nM en monensine) (courbe 3). Il a été préalablement vérifié que la monensine et le conjugué ionophore ne sont pas cytotoxiques pour les cellules employées aux concentrations indiquées. Les CI 50 obtenues sont respectivement -14 2,4.10 14 M pour la monensine 50 nM -14 1,4.10 M pour le conjugué ionophore 10 M Ces résultats montrent des effets potentialisateurs remarquables, d'un facteur de 1000 fois pour la monensine 50 nM et de 2000 fois pour le conjugué ionophore à la concentration de 10*-8 M (soit 70 riM en monensine). Exemple 3 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre l'anticorps 3E10 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol. a) Anticorps 3E10 Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène membranaire humain. Il a été obtenu lors d'une fusion lympllocyraire anti-celiules de r:eano-.e h'r.aines SK MEL 28. L'hybri corne a été cloné et multiplié ; l'anticorps a été produit en ascite puis purifié sur protéine A Sepharose. b) Anticorps anti-3E10 activé Cet anticorps est obtenu à partir de l'anticorps ci-dessus selon une technique décrite à l'exemple i. On a ainsi obtenu 195 mg d'anticorps 3E10 possédant 8 groupements activateurs par mol d'anticorps. c) Monensine activée La monensine est activée selon la méthode décrite à l'exemple 1. d) Préparation du conjugué ionophore 91 mg de monensine activée S-acétyl (soit 104 pmol) sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 50 ml de la solution d'anticorps activé à 3,9 mg/ml (soit 1,3 umol) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7. On ajoute 2,5 ml d'une solution d'hydroxylamine 1 N. L'incubation dure 2 h à 250C, puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactifs par dialyse contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM, pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgC à 3,7 mg/ml portant en moyenne 8 monensines par IgC. Exemple 4 Toxicité du conjugué 3E10-monensine Le conjugué 3E10-monensine a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques in vivo. Plus spécialement, sa toxicité et sa pharmacocinétique ont été comparées à celles de la monensine libre. La toxicité de la monensine libre a été déterminée chez la souris. La dose létale 50 % après injection I.V. est de 4 mg/kg, soit 80 ug/souris. a a toxicité du conjugué a été testée sur souris en administration unique également par voie I.V.. Pour les souris de chaque lot, le produit a été injecté par voie intraveineuse aux doses suivantes 3,7 mg, 1,85 mg, 0,952 mg, 0,496 mg de conjugué, soit respectivement l'équivalent de 163 ug, 81,5 ug, 40,75 ug, 20,4 pg de monensine. Aucune mortalité n'a été observée dans aucun des lots de souris. Exemple 5 Pharmacocinétique du conjugué 3E10-monensine. La pharmacocinétique a été étudiée chez la souris nude femelle à l'aide du conjugué ionophore décrit à l'exemple 3. On injecte aux souris - soit l ml de conjugué ionophore à 3,7 mg/ml (soit 163 ug de monensine couplée), - soit 163 ug de monensine libre (lot témoin). Pour chaque temps, les plasmas de deux souris sont prélevés. La monensine active est dosée dans les plasmas par dilution de ceux-ci et comparaison avec une courbe-étalon de monensine libre dans le test d'inhibition de la synthèse protéique décrit à l'exemple 1. Le dosage est effectué sur des cellules CEM en présence de l'immunotoxime anti-T65. Les résultats sont présentés à la figure 2 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en heures et en ordonnées la concentration en monensine en ug/ml. Ces résultats montrent 1) que la monensine libre ne peut pas être mise en évidence dans les plasmas (sauf au temps zéro où l'on retrouve une concentration plasmatique de 5.10*-7 M soit environ 0,5 ug/ml, soit dans la masse sanguine totale de la souris une quantité égale à 0,007 z de la dose injectée). 2) Dans le cas du conjugué, on observe que le conjugué peut être mis en évidence pendant au moins 8 h à une concentration de l'ordre de 10 pg/ml,soit environ 1.10*-5 M. Au bout de 24 h, la concentration retrouvée n'est plus que voisine de 1,5 pg/ml. Cette concentration est cependant 100 fois supérieure à celle nécessaire à l'activation maximale dans les conditions des essais in vitro. Exemple 6 Conjugué ionophore obtenu par réaction entre la sérumalbumine-humaine (SA) substituée par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol a) Sérum-albumine humaine activée La SA a été obtenue à partir de la SA ci-dessus selon une technique analogue à celle décrite pour les anticorps dans les exemples précédents. On a ainsi obtenu 220 mg de SA possédant 16 groupements activateurs par mol d'albumine. b) Monensine activée La monensine est activée selon la méthode décrite à l?exernple 1. c) Préparation du conjugué ionophore 228 mg de monensine activéeS-acétyl, soit 268 umol, sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 23 ml de la solution de SA activée à 9,4 mg/ml (soit 52,7 umol) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7. On ajoute 1,15 ml d'une solution d'hydroxylamine I N. L'incubation dure 1 h à 250C, puis le milieu réactionnel est dialysé contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM, pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 28 nil d'une solution de SA modifiée à 8,7 mg/ml portant en moyenne 16 monensines par mol d'albumine. Exemple 7 Pharmacocinétique du conjugué SA-monensine La pharmacocinétique a été étudiée chez la souris nude m le à L'aide du conjugué ionophore décrit à 11 exemple 6. Le protocole experimental utilisé est le même que celui décrit à l'exemple 5. Les résultats sont préséntés à la figure 3 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en h et en ordonnées la concentration en monensine en pg/ml. Ils montrent que 1) Comme dans le cas de l'exemple 5, la monensine libre ne peut pas être mise en évidence dans les plasmas. 2) On observe que le conjugué peut être mis en évidence pendant au moins 4 h à une concentration de l'ordre de 30 Clgjml. Au bout de 8 h, la concentration retrouvée n'est plus que de l'ordre de 6 ug/ml. Cette concentration est cependant 400 fois supérieure à celle nécessaire à l'activation maximale dans les conditions des essais in vitro. REVENDICATIONS 1. Composé de formule I -O-CO-CH-S-W CH2COOH dans laquelle IO représente le résidu d'un ionophore privé d'un de ses hydroxyles et W représente l'hydrogène ou un groupe acétyle. 2. Composé selon la revendication 1, ayant la formule I -O-CO-CH-S-W CH2COOH dans laquelle IO représente le résidu de la monensine privée de son hydroxyle primaire et W est tel que défini dans la revendication 1. 3. Composé selon la revendication 2, ayant la formule I -O-CO-CH-S-CO-CH3 CH2COOH dans laquelle IO est tel que défini dans la revendication 2.