Brevet FR2568094A1 — publié le 19860131

La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir en condition axénique in vitro, des champignons à partir de mycorhizes à vésicules et arbuscules. L'invention concerne également les produits fertilisants faisant application des champignons obtenus selon ce procédé ou procédé similaire. I1 convient, avant d'aborder les dispositions principales de l'invention, de rappeler les difficultés rencontrées à l'occasion des tentatives de mise en culture pure de tels champignons. Les travaux scientifiques effectués dans un domaine proche ont déjà permis de produire des inoculum in vitro. Tous les inoculum de champignons mycorhiziens à vésicules et arbuscules produits actuellement in vitro ont été obtenus à partir de spores de ces champignons. Les mycelium des champignons mycorhiziens à vésicules et arbuscules, issus de spores germées en conditions stériles, ne se cultivent actuellement qu'en présence d'une plante-hôte ou d'une partie de celle-ci. La culture in vitro de ces mycelium sur un milieu minéral et organique, sans plante-hôte, n'a pas été réalisée. Les procédés de culture en présence d'une plante-hôte réalisés in vitro sont difficiles à mettre en oeuvre. En effet, il faut cultiver dans un même milieu nutritif deux organismes ayant des besoins différents pour avoir un développement optimal. Il existe aussi plusieurs procédés de production d'inoculum de champignons endomycorhiziens à vésicules et arbuscules à partir de spores ou de racines mycorhizées en condi- tions non stériles. Tous ces procédés non axéniques présentent l'inconvénient de constituer une source d'introduction de microorganismes pathogènes. La présente invention a, en conséquence, pour but de fournir tout d'abord un procédé de culture permettant d'obtenir in vitro, en milieu stérile, des champignons formant des mycorhizes à vésicules et arbus- cules aux fins de favoriser la nutrition minérale des plantes d'intérêt agronomique telles que blé, mals, pois, pomme de terre, soja, oignon, fraisier, asperge. Des espèces d'intérêt horticole sont aussi concernées (tulipe, rosier) ainsi que des essences forestières précieuses (frêne, merisier, tulipier). Un autre but de l'invention est de fournir des champignons endomycorhiziens à vésicules et arbus- cules n'ayant pas de spécificité d'hôte et permettant de mycorhizer un très grand nombre d'espèces végétales qui ne se limitent donc pas à celles rapportées ci-dessus à titre d'exemple. L'invention concerne à cet effet un procédé de culture in vitro, en condition axénique, de champignons Endogonacées, notamment du genre Glomus, procédé carac- térisé en ce qu'il consiste à prélever des mycorhizes à vésicules et arbuscules, à les nettoyer, notamment par ultrasons, et à les stériliser, par exemple par immersion dans des solutions désinfectantes, puis à les placer sur un milieu nutritif stérile pourvu d'éléments minéraux, de vitamines,notamment du groupe B, et de sucre; ce grace à quoi on constate d'une manière surprenante, notamment à partir des extrémités de la mycorhize, la croissance du mycelium. Bien que le nettoyage des mycorhizes à vésicules et arbuscules soit, de préférence, effectué par ultrasons, il est possible d'utiliser d'autres techniques de nettoyage. De même, la stérilisation peut mettre en oeuvre des solutions désinfectantes telles que des - antibiotiques ou l'hypochlorite de calcium, seuls ou successivement, mais d'autres types de stérilisation sont également utilisables. Le procédé permet d'obtenir des mycelium en conditions stériles, ce qui autorise leur exportation sans problème sanitaire. Enfin, les vitamines du groupe B qui peuvent être mises en oeuvre peuvent être notamment: le pantho- thénate de calcium, la biotine, l'acide nicotinique, la pyridoxine (B6), la thiamine (B1). Suivant une caractéristique de ce procédé, on produit un inoculum utilisable pour la mycorhization de plants en milieu de culture stérile ou non. D'autres caractéristiques et avantages du présent procédé ressortiront encore de la description détaillée ci-après d'un mode de réalisation du présent procédé et des dessins illustrant à titre d'exemple une racine mère ayant produit le mycelium en milieu stérile. EXEMPLE 1 Suivant l'invention, des racines de fraisiers sont prélevées sur des plantes-hôtes issues de conditions naturelles ou mycorhizées en pots. La mycorhization est vérifiée par les techniques de coloration classiques. Les mycorhizes sont vibrées aux ultrasons durant 15 minutes environ puis fragmentées en segments de 0,3 à 1 cm. Ces segments sont ensuite désinfectés par passage dans une solution d'alcool à 95 pendant 2 à minutes et rincés à l'eau distillée stérile. Sous hôte stérile, les échantillons sont désinfectés par passage dans une solution d'hypochlorite de calcium à 6 % durant 1 à 10 minutes puis rincés trois fois à l'eau distillée stérile. La désinfection est enfin réalisée par passage dans une solution antibiotique (200 ppm streptomycine + 2 % chloramine T) durant 5 à 20 minutes puis rinçage à l'eau distillée stérile. Les fragments de racines sont mis en culture à l'obscurité à 25 C, notamment dans des boîtes de Pétri contenant le milieu suivant: - Eléments minéraux Macroéléments mg.1 -1 KNO3: 303 * Ca (N03)2, 4H20: 2 040 * MgSO4, 7H20: 368 KH2PO4: 44 FeNaEDTA: 65 Oligoéléments mg.1 -1 * MnSO4, 4H20 2,23 * CuS04, 5H20: 0,24 * ZnSO4, 7H20: 0,29 H3B03: 1,86 (NH4)6Mo7024, 4H20 0,035 - Vitamines du groupe B mg.1- Panthothénate de Ca: 1 Biotine: 0,01 Acide nicotinique: 1 Pyridoxine (B6) : 1 Thiamine (B1):1 - Saccharose 15 g.11 - Gélose 7 g.1l - pH avant autoclavage 5,7 Au bout de quelques semaines, on observe la croissance d'hyphes mycéliennes à partir de sections racinaires. Parfois, des hyphes sortent aussi des racines en franchissant l'épiderme. L'aspect des eultures est présenté dans les figures 1 et 2. Les filaments forment un réseau lâche peu ramifié d'hyphes grèles. EXEMPLE 2 On observe des résultats équivalents en suivant le processus de l'exemple 1 mais en partant de racines de tulipiers. REVENDICATIONS 1) Procédé de culture in vitro en condition axénique de champignons Endogonacées, notamment du genre Glomus, caractérisé en ce qu'il consiste à prélever des mycorhizes à vésicules et arbuscules, à les nettoyer et à les stériliser puis à placer en culture les mycorhizes sur un milieu nutritif gélosé stérile pourvu d'éléments minéraux, de vitamines, en particulier du groupe B, et de sucre. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la stérilisation est effectuée par immersion des mycorhizes dans au moins une solution désinfectante. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution désinfectante comporte un antibiotique. 4) Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que la solution désinfectante est une solution d'hypochlorite de calcium. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le nettoyage est effectué par un traitement ultrasonore. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les vitamines du groupe B présentes dans le milieu nutritif sont choisies parmi le panthothénate de calcium, la biotine, l'acide nicotinique, la pyridoxine et la thiamine. 7) Application des mycelium obtenus à la mycorhization de plants.