Brevet FR2568587A1 — publié le 19860207

1. La présente invention concerne un procédé de pré- paration d'un facteur de croissance II analogue à l'insu- line humaine (désigné ci-après par FCI-II). Elle concerne plus particulièrement un procédé de préparation de FCI-II humain par culture de cellules hypophysaires humaines. Les somatomédines de composés polypeptidiques sont considérées comme des facteurs importants servant de médiateurs pour les hormones de croissance des mammifères. Le FCI-II humain qui fait l'objet de l'invention, est une de ces somatomédines. On a tout d'abord indiqué que des somatomédines appelées somatomédine-A, somatomédine-C, FCI-I et FCI-II étaient extraites de plasma humain. Il a également été signalé que la somatomédine-A ou le FCI-II tels que dé- crits ci-dessus ou un type de somatomédines nommé activi- té de stimulation de la multiplication cellulaire étaient produits dans un bouillon de culture de cellules ou tissus hépatiques du rat ou de l'homme. Il a été confirmé en outre que les somatomédines apparaissaient dans le bouillon de culture de certaines cellules cancéreuses ou fibroblasts 2. 2568587 humains et de tissu hypophysaire ou de tissu cérébral de rat. [Cf. Biochem. Biophys. Res. Commun., 61, 957-962 (1974); J. Clin. Endocrinol. Metab., 44, 1175-1184 (1977); FEBS Lett., 89, 283-286 (1978); ibid., 124, 178-184 (1981); J. Biol. Chem., 253, 2769-2776 (1978); ibid., 256, 68596865 (1981); Nature, 272, 356-358 (1978); Acta Endocrinol., 93 73-82 (1980); ibid., 93- 83-90 (1980); ibid., 98,24-28 (1981); ibid.,99, 422430 (1982); ibid., 103, 385-390 (1983); Biochemistry; 19, 790-797 (1980); Endocrinology, 106, 2006- 2012 (1980) et J. Clin. Invest., 67, 10-19 (1981)]. Les propriétés physicochimiques et biologiques des somatomédines ont été révélées progressivement par les nom- breuses études ci-dessus grâce auxquelles les somatomédi- nes sont aujourd'hui classées en deux types, à savoir le type FCI-I (comprenant les somadomédines-A et -C) et le type FCI-II (comprenant l'activité de stimulation de la multiplication cellulaire précédemment mentionnée. Comme il a été décrit ci-dessus, les somatomédi- nes ont généralement été préparées par extraction à partir du plasma humain. Cependant, seuls quelques milligrammes de somatomédines ont pu être produits de cette manière à partir de plusieurs tonnes de la matière, ce qui constitue un sérieux obstacle à l'application des somatomédines dans le diagnostic, la prévention et le traitement des ma- ladies humaines. D'autre part, en ce qui concerne la produc- tion classique de somatomédines par culture de tissu ou culture de cellules du foie ou d'autres organes, non seule- ment les propriétés des somatomédines formées n'ont pas né- cessairement été révélées suffisamment, mais dans le cas de la production de somatomédines par culture de tissu du foie ou d'autres organes, on s'est heurté à cet inconvé- nient rédhibitoire que ces tissus n'ont pas pu être sous- cultivés comme c'est le cas ordinairement pour les cultu- res générales de tissus, de sorte que leur utilisation indus- trielle est devenue presque impossible. 3. 2568587 La présente invention fournit un procédé de pré- paration d'un FCI-II humain de haute pureté avec un rende- ment élevé en cultivant des cellules hypophysaires humaines ou des cellules sous-cultivables préparées spécialement à partir de celles-ci (désignées ci-après sous le nom de li- gnées cellulaires). Les lignées cellulaires utilisées dans la présente invention peuvent être obtenues par les procé- dés de routine dans le domaine concerné. En particulier, elles ont été obtenues commodément à partir de cellules hy- pophysaires de malades acromégales. Les lignées cellulaires présentent divers avantages en ce sens qu'elles peuvent être sous-cultivées de manière semi-permanente, qu'elles se multiplient rapidement et qu'elles peuvent se multiplier non seulement avec un milieu contenant du sérum mais encore avec un milieu exempt de sérum. Un procédé pour obtenir ces lignées cellulaires à partir de cellules hypophysaires et leurs propriétés elles-mêmes ont déjà été décrits par la demande- resse (voir Endocrinology, 104, 1765-1773 (1979). Les opérations de culture de cellules hypophy- saires humaines ou des lignées cellulaires de celles-ci et de purification du FCI-II humain à partir du bouillon de culture peuvent être effectuées d'une manière bien connue. Par exemple,des lignées cellulaires de cellules hypophysai- res humaines sont inoculées dans un milieu de culture de cellules du commerce et cultivées par un procédé tel que la culture en surface dans un ballon, la culture tournante avec un flacon tournant ou une culture agitée avec un micro- support.Le liquide surnageant de la culture peut alors être décanté et remplacé par un milieu frais pour poursuivre ainsi la culture. Le liquide surnageant de la culture ainsi obtenu est centrifugé pour donner une solution clarifiée,à partir de laquelle le FCI-II humain peut être purifié en utilisant des techniques appropriées choisies parmi le relargage,l'ultrafiltration, la dialyse, la filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie 4 2568587 d'affinité en utilisant un anti-corps monoclonal contre le FCI-II humain, la chromatographie du type à haute per- formance, le fractionnement isoélectrique et la lyophili- sation. Pour illustrer encore le procédé de préparation du FCI-II conforme à la présente invention et les proprié- tés physicochimiques et biologiques du FCI-II humain obte- nues, en détail et à titre non limitatif, on donnera les exemples suivants. A. Obtention de lignées cellulaires à partir de cellules hypophysaires humaines. Les cellules épithéliales humaines obtenues à par- tir d'un adénome hypophysaire d'un malade acromégale ont été classées morphologiquement en plusieurs classes et de nombreuses cellules ont été choisies dans les classes respec- tives.Chacune de ces cellules a été soumise à un essai de sous-culture sur un grand nombre de passages, par exemple en le cultivant avec un milieu GIB (marque commerciale, fabri- quée par la société dite Grand Island Biological Co.) conte- nant 12,5 % de sérum de cheval et 2,5 % de sérum de foetus de veau et avec un milieu CF-12 exempt de sérum (marque com- merciale, fabriquée par la société dite K C Biological Co.), respectivement. Le terme "sous-culture" désigne ici une technique consistant à répéterles opérations des cultures des cellules avec le milieu pendant approximativement une semai- ne,à centrifuger le liquide surnageant de la culture pour sé- parer les cellules et à cultiver les cellules obtenues à nou- veau avec un milieu frais. La plupart des celluies essayées sont mortes au cours de l'essai de sousculture ci-dessus. Cependant, on a trouvé que certaines cellules soumises à l'essai seraient acceptables pour une sous-culture semi-permanente. Il a été confirmé que ces cellules sous-cultivables, c'est-à-dire les lignées cellulaires,étaient biologiquement identiques aux ma- tières de départ de ces cellules hypophysaires humaines du 2568587 point de vue de la production de l'hormone prolactine. B. Culture de lignées cellulaires de cellules hypophysai- res humaines (1) Culture tournante avec un flacon tournant: 6 x 10 lignées cellulaires telles qu'obtenues au paragraphe A ci-dessus sont inoculées dans 500 ml d'un milieu CF-12 exempt de sérum maintenu dans un flacon tour- nant pour la culture de cellules d'une capacité de 2 000 ml (1llcm x 57 cm) et sont cultivées à 0,5 tour/minute à 37 C pendant une semaine. On décante le liquide surnageant de la culture et on cultive à nouveau les cellules en cultu- re tournante avec un milieu CF-12 exempt de sérum frais pen- dant une semaine supplémentaire. En répétant les opérations ci-dessus,on recueille 2,5 à 3 litres du liquide surnageant par flacon. Il est confirmé que le liquide surnageant recueil- li contient 0,5 unité/ml d'activité du FCI-II humain dans un essai par radio-récepteur qui sera décrit ci-après. On effectue les mêmes opérations que ci-dessus sauf qu'on cultive les lignées cellulaires avec un milieu CF-12 contenant 3 % de sérum de veau à la place du milieu CF-12 exempt de sérum. On décante le liquide surnageant et après lavage avec 125 ml de solution saline isotonique avec du tampon phosphate (pH 7,4) on cultive les cellules obtenues en culture tournante pendant une nuit avec 250 ml d'un mi- lieu CF-12 exempt de sérum frais. On décante le liquide surnageant obtenu et on cultive à nouveau les cellules avec 500 ml d'un milieu exempt de sérum frais pendant une semaine. Le liquide surnageant ainsi obtenu contient 0,6 unité/ml d'activité du FCI-II humain. (2) Culture agitée avec micro-support: On ajoute 0,3 g de micro-support de culture de cellule (marque commerciale: Cytodex 3; fabriqué par la société dite Pharmacia Fine Chemical Co.) à 40 ml d'un mi- lieu CF-12 exempt de sérum, dans lequel on inocule ensuite 1 x 107 lignées cellulaires telles que décrites ci-dessus 6. 2568587 que l'on cultive à 37 C pendant cinq heures tout en répé- tant 2 minutes d'agitation (20 tours/minute) et 30 minutes de non agitation. Au bouillon de culture obtenu, on ajou- te un supplément de 60 ml d'un milieu CF-12 exempt de sé- rum frais et on cultive à nouveau les lignées cellulaires à 25 tours/minute pendant trois jours. Apres avoir décan- té le liquide surnageant, on ajoute du milieu CF-12 frais supplémentaire et on répète la culture des cellules. On poursuit la culture agitée de cette manière pendant trois mois ou davantage. Le liquide surnageant présente environ 1,0 unité/ml d'activité de FCI-II humain. C. Purification de FCI-II provenant du liquide surnageant de la culture (1) Purification par chromatographie sur colonne: On centrifuge 40 litres du liquide surnageant de culture obtenu de la même manière que dans la première colonne du sous-paragraphe (1) de B ci-dessus pour éliminer les cellules brisées et autres matières insolubles, et on chauffe la solution clarifiée obtenue à 95 C pendant cinq minutes pour inactiver les protéases qu'elle contient.On ajuste le pH de la solution obtenue à 5,0 avec de l'acide acétique 1N et on fait écouler la solution à travers une colonne (capacité du lit: 2 000 ml) remplie d'une résine Dowex type Na 50 x 8 (marque commerciale; fabriquée par la société dite Dow Chemical Co.) qui a été mise en équilibre avec une solution de tampon acétate 0,02 M (pH ,0) contenant du chlorure de sodium 0,1 M. Apres avoir la- vé la colonne avec la même solution tampon que ci-dessus, on fait écouler à travers celle-ci de l'ammoniaque 0,1 N. On ajuste le pH de l'effluent à 5,0 avec de l'acide acéti- que 1 N, et on concentre la solution sous pression réduite à un volume d'environ 100 ml. On fait écouler le concentré à travers une colonne (capacité de lit: 2 000 ml) remplie de Séphadex G-75 (marque commerciale; fabriquée par la société dite Pharmacia Fine Chemical Co.) qui a été mise en 7 2568587 équilibre avec de l'acide acétique 1 N. On réunit les frac- tions d'effluent ayant des masses moléculaires de 12 000 à 3 000, on les lyophilise et on obtient environ 30 mg du FCI-II humain brut. On dissout le FCI-II humain brut dans 100 ml d'une solution tampon chlorhydrate de tris 0,02 M (pH 8,0) et on élimine par centrifugation les quelques matiè- res insolubles qui s'y sont formées. On fait écouler la solu- tion clarifiée obtenue à travers une colonne (capacité de lit ml) remplie de DEAE- ellulose (marque commerciale, fabriquée par la société dite Whatman Ltd.) qui a été mise en équilibre avec la même solution tampon que ci-dessus. Apres avoir lavé la colonne avec la même solution tampon on fait écouler à travers celle-ci la même solution tampon mais contenant du chlorure de sodium 0,05 M. On réunit les fractions d'effluent actives, on les dialyse contre de l'acide acétique 1N et on lyophilise la solution interne ob- tenue. On dissout le produit lyophilisé ainsi obtenu dans 1 ml d'acide acétique et on fait écouler la solution à tra- vers une colonne (capacité de lit: 150 ml), remplie de Séphadex G-50 (marque commerciale; fabriquée par la société dite Pharmacia Fine Chemical Co.). On réunit les fractions actives de l'effluent, on les lyophilise à nouveau et on obtient 0,5 mg de FCI-II humain purifié. Le FCI-II humain purifié ainsi obtenu donne une bande unique par électrophorèse sur gel de SDS-polyacryla- mide et indique un pic par électrophorèse sur disque de gel. Elle présente une activité de 1 480 unités/mg de FCI-II hu- main dans le dosage au radio-récepteur. (2) Purification par chromatographie d'affinité en utili- sant un anticorps monoclonal contre le FCI-II humain: On prépare un anticorps monoclonal contre le FCI-II humain conformément à un procédé bien connu, et on l'emploie en chromatographie d'affinité pour purifier ainsi le FCI-II humain désiré [Voir Nature, 256, 495-497 (1975) et J. Biol. Chem., 256, 9750-9754 (1981)]. C'est-à-dire que l'on conjugue 8. 2568587 le FCI-II humain purifié tel que préparé dans le sous- paragraphe (1) de C ci-dessus avec de l'ovalbumine en utilisant du glutaraldéhyde et on administre la matière conjuguée obtenue par voie sous-cutanée 10 fois à des inter- valles de deux semaines à des souris mâles Balb/C âgées de six semaines à la dose de 150 pg chacune. On administre en outre par voie intrapéritonéale la matière conjuguée aux mêmes animaux à la même dose que ci-dessus.Trois jours après l'administration finale, on excise les rates des ani- maux. 8 x 10 cellules des rates excisées sont condensées avec 4 x 10 des cellules de myélome de souris résistant à la 8-azaguanine du commerce (marque commerciale: P3-NS-1/1-AG4-1; fabriquée par la société dite Flow Labo- ratories) en utilisant du polyéthylèneglycol 1450 à 50 % (marque commerciale, fabriquée par la société dite Bethesda Research Laboratories Inc.). Les cellules condensées ainsi obtenues sont cultivées avec 200 pl d'un milieu RPMI-1640 du commerce (marque commerciale; fabriquée par la société dite Flow Laboratories) qui a été supplémenté avec 10 % de sérum de foetus de veau, de l'hypoxanthine 0,1 mM, de l'ami- noptérine 0,4 pM et de la thymidine 16 pM. On mélange 40 pl du liquide surnageant obtenu avec 1 ng (environ 5 000 cpm) de FCI-II humain marqué à l'iode 125 du commerce et on fait incuber le mélange. On ajoute au mélange réactionnel obtenu 0,3 ml de sérum de veau à 10 % et 1 ml de polyéthylèneglycol 6 000 à 21 % (marque commerciale; fabriquée par la société dite Nakarai Chemicals, Ltd.) et on centrifuge le mélange à 1 870 x g pendant 30 minutes. La radioactivité du précipi- té résultant de la conjugaison de ce FCI-II humain marqué à l'iode 125 avec l'anticorps monoclonal formé est déterminée avec un compteur à rayons y pour compter les cellules pouvant produire un anticorps qui sont ensuite soumises à la méthode de dilution limite pour effectuer le clonage. Les cellules pouvant produire de l'anticorps ainsi obtenues sont adminis- trées par voie intrapéritonéale à des souris et à la dose de 9. 2568587 i x 107 cellules chacune. Au bout de 10 à 14 jours, on re- cueille le fluide ascitique des animaux, qui est ensuite soumis à une précipitation avec du sulfate d'ammonium satu- ri à 50 % et à une chromatographie avec une colonne remplie de DEAEcellulose, et l'on obtient 210 mg d'un anticorps nonoclonal contre le FCI-II humain. Cn fait réagir 150 ml de l'anticorps monoclonal obtenu ci-dessus avec 10 ml d'Affigel 10 du commerce (mar- que commerciale, fabriquée par la société Bio-Rad Laborato- ! ries) pour préparer un produit insolubilisé de l'anticorps. On introduit dans une colonne 4 ml du produit insolubili- sé, à travers lesquels on fait écouler une solution saline isotonique avec du tampon phosphate (pH 7,4) pour équili- brer la matière introduite. A travers la colonne ci-dessus, on fait écouler une solution aqueuse de 10,3 mg de produit lyophilisé,qui a été préparée à partir des fractions d'ef- fluent ayant des masses moléculaires de 12 000 à 3 000 dans le sousparagraphe (1) de B ci-dessus. On lave ensuite la colonne avec la même solution tampon que ci-dessus et une solution de tampon phosphate 5 mM (pH 7,4) successivement, on fait passer à travers de l'acide acétique 0,5 M. On lyophi- lise l'effluent obtenu et l'on obtient 843 pg de FCI-II hu- main brut. On dissout 500 pg de FCI-II humain brut ci-dessus 2!5 dans de l'acide trifluoracétique à 0,2 % et on fait passer la solution dans un appareil de chromatographie du type à hau- te performance (fabriqué par la société dite Waters Associa- tes; Type 510) dans lequel une colonne remplie d'octadécyl- silane (marque commerciale: TSK ODS 120 T; fabriqué par la société dite Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.; 6 4,6 mm x 25 cm) a été placée. Puis, on fait passer un gradient linéaire de 20 à 40 % d'acétonitrile à travers la colonne. La fraction d'effluent à environ 30 % d'acétonitrile est lyophilisée et l'on obtient 64 pg de FCI-II humain purifié. Le FCI-II humain purifié ci-dessus donne une bande unique 10. 2568587 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et un pic unique par électrophorèse sur disque de gel à sépara- tion isoélectrique. Elle présente une activité de FCI-II humain de 1 540 unités/mg au dosage au radiorécepteur. D. Propriétés physicochimiques du FCI-II humain préparé par le procédé de l'invention: (1) Masse moléculaire: La valeur déterminée par électrophorèse sur gel de SES polyacrylamide est d'environ 7 000. (2) Point isoélectrique: La valeur déterminée par électrophorèse sur disque de gel à séparation isoélectrique est de 6,8. (3) Stabilité à la chaleur et vis-à-vis du pH: Le produit est stable au chauffage à 95eC pendant cinq minutes en milieu acide ou neutre. (4) Inhibiteurs: Les propriétés biologiques du produit sont inhi- bées par des thiols comme le dithiothréitol ou le 2-mercap- toéthanol. O (5) Détermination de l'activité par dosage au radiorécep- teur: On ajoute 15 000 cpm de somatomédine-A marquée à l'iode 125 du commerce, 100 pg d'un récepteur de membrane préparées à partir de placenta humain et 1 ml d'un échantil- lon d'essai à 200 pl d'une solution tampon chlorhydrate de tris à 50 mM (pH 7,4) contenant 1 % de sérum albumine humaine et on fait incuber le mélange à 4 C pendant 16 heu- res. On ajoute à la liqueur obtenue 0,8 ml de la même solu- tion tampon que ci-dessus et on centrifuge le mélange à 6 000 g pendant 10 minutes. On lave le précipité résultant de la-conjugaison de la somatomédine-A marquee à l'iode 125 avec un récepteur à membrane avec 1 ml de la même solution tampon que ci-dessus, on la centrifuge à nouveau et on dé- termine sa radioactivité au moyen d'un compteur de rayons y. La valeur déterminée en utilisant du sérum humain étalon l. 2568587 du commerce comme échantillon d'essai est définie comme 1 unité d'activité de FCI-II humain. 2. Propriétés biologiques du FCI-II humain préparé par le procédé de l'invention: (1) Activité de stimulation de la synthèse du protéoglycane (activité de l'ion sulfate): On cultive des cellules de culture primaire de cliondrocyte costal de lapin qui ont été mises à multiplier ns un micropuits (O 16 mm) avec un milieu MEM du commerce (marque commerciale, fabriquée par la société dite Flow T.aboratories) contenant 0,3% de sérum de foetus de veau pendant 24 heures. On ajoute au bouillon de culture 0,5 pCi de SO4 So42- et un échantillon d'essai et on fait incuber le mé- lange obtenu pendant 18 heures. On ajoute à la liqueur obtenue 5 % d'acide trichloracétique contenant du sulfate de magnésium 1 mM, et on recueille les cellules qui s'y for- mrent avec des "policemen" de caoutchouc. On lave les cellu- les recueillies cinq fois avec de l'acide trichloracétique à 5 % et on les met en suspension dans un milieu liquide de solution tampon chlorhydrate tris 0,2 M (pH 8,0). On ajoute à la suspension 1 mg de Pronase E (marque commerciale, fa- briquée par la société dite Kaken Chemical Co., Ltd.), et on fait incuber le mélange à 55 C pendant 10 heures. On ajoute successivement à la liqueur ainsi obtenue 3 mg de sulfate de chondroitine et 1 ml de chlorure de cétylpyridi- nium à 1 %. On centrifuge le précipité résultant de la 2- conjugaison du sulfate de chondroitine avec ce 35SO42, on le lave avec du chlorure de cétylpyridinium à 1 % et on dé- termine sa radioactivité à l'aide d'un compteur à scintil- lation liquide. Lorsqu'on utilise 0,1 pg du FCI-II humain préparé par le procédé de la présente invention coeme échan- tillon d'essai,la quantité de 35SO42- est de 6 270 - 296 4 + dpm/puits, alors qu'elle est de 4 208 - 276 dpm/puits lors- qu'on utilise comme témoin une solution saline physiologi- que. 12. 2568587 (2) Activité de stimulation de la synthèse de l'acide désoxyribonucléique On inocule 1 x 10 fibroblasts obtenus à partir de peau humaine dans un milieu DME du commerce (marque com- merciale; fabriquée par la société dite Flow Laboratories) contenant 3,0 % de sérum de veau qui a été maintenu dans un micropuits (O 16 mm) et on les cultive à 37 C pendant six heures. On décante le liquide surnageant de la culture et on cultive encore les cellules avec un milieu DME frais mais contenant 0,2 % de sérum de veau à 37 C pendant 48 heu- res. On ajoute un échantillon d'essai au bouillon de cultu- re obtenu et on poursuit la culture pendant 16 heures sup- plémentaires. On ajoute au bouillon de culture obtenu 0,5 pCi de (3H)thymidine et on fait incuber le mélange pendant trois heures. Apres avoir décanté le liquide sur- nageant, on lave les cellules qui se sont multipliées avec une solution saline isotonique avec du tampon phosphate (pH 7,4) et de l'acide trichloracétique à 10 % successive- ment. On extrait la (3H)-thymidine incorporée avec de l'aci- de désoxyribonucléique dans ces cellules avec de l'hydroxy- de de sodium 0,5N,et on détermine sa radioactivité au moyen d'un compteur à scintillation liquide. Lorsqu'on utilise 0,1 g du FCI-II humain préparé par le procédé de l'invention comme échantillon d'essai, la 3+ quantité de ( H)-thymidine incorporée est de 15 762 + 334 dpm/puits,tandis qu'elle est de 1 629 - 50 dpm/puits lors- qu'on utilise comme témoin une solution saline isotonique avec du tampon phosphate (pH 7,4). Comme il a été décrit ci-dessus, les propriétés physicochimiques et biologiques du FCI-II humain préparé par le procédé de l'invention sont identiques à celles du FCI-II provenant de plasma humain comme cela est décrit dans la littérature antérieure. On peut s'attendre à ce que le FCIII humain préparé par le procédé de l'invention soit utilisé dans le diagnostic, la prévention et le traitement 13. 2568587 de maladies humaines telles que l'acromégalie, l'hypopi- tuitarisme, le nanisme hypophysaire, les fractures et les traumatismes. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de varian- tes qui apparaîtront à l'homme de l'art. 14. 2568587 REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation d'un facteur de crois- sance II analogue à l'insuline humaine (désigné ci-après par FCI-II) qui consiste à cultiver des cellules hypophy- saires humaines avec un milieu de culture de cellules et à purifier le FCI-II humain du liquide surnageant du bouil- lon de culture obtenu. 2 - Procédé selon la revendication 1, dans le- quel les cellules hypophysaires humaines utilisées sont des cellules souscultivables (désignées ci-après sous le nom de lignées cellulaires) provenant en particulier de cellules hypophysaires humaines. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 ou 2, dans lequel les cellules hypophysaires humai- nes sont obtenues chez un malade acromégale. 4 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le milieu de culture de cellules est un milieu GIB ou CF-12 du commerce. - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 ou 2,dans lequel des cellules hypophysaires hu- maines ou les lignées cellulaires en provenant sont culti- vées par les procédés de culture tournante avec un flacon tournant ou de culture agitée avec un microsupport. 6 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le FCI-II est purifié du liquide surnageant du bouillon de culture par le procédé de chromatographie sur colonne ou de chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal contre le FCI-II humain. 7 - Procédé selon la revendication 4,dans lequel le milieu GIB- ou CF-12 est exempt de sérum.