Brevet FR2566425A1 — publié le 19851227

La présente invention concerne un procédé pour la production de 2-(phényl substitué) acide propionique et de façon plus détaillée un procédé pour la production microbiologique de 2-(phényl substitué) acide propionique à partir de 1-(phényl substitué) 1-phényléthane. 2-(phényl substitué) acide propionique a une activité anti-phlogistique et une activité analgésique pour l'être humain et les animaux, et en particulier 2-(4- isobutylphényl) acide propionique a été généralement utilisé comme excellent agent anti-inflammatoire. Pour sa production, on ne connait que le procédé de synthèse chimique. Comme procédé synthétique chimique, ceux révélés par exemple dans les publications de brevets japonais N 40-7491 (1965) et n 47-18105 (1972), demande de brevet japonais soumise n 504040 (1975) etc... sont connus, cependant le procédé connu comprend généralement de nombreuses étapes et les opérations en sont complexes et incommodes, c'est-à-dire que les procédés traditionnels ne sont pas nécessairement satisfaisants. Par exemple, le procédé révélé dans la demande soumise de brevet japonais no 504040'(1975) comprend les étapes suivantes: i socuty]nzene + soBu Q CH-C[4 2CRCOOH of O c q-'301,C CHg3 pendant 3 heures Cu(OCOC).33 2 in c so 6--H-=c Pb(OCOCH) 2C C.3 i. KM nO Cf4 (2-(4-isobutylphényl) acide propionique -2. _ L'objet de la présente invention est de fournir un procédé pour produire 2-(phényl substitué) acide propionique qui ne soit pas basé sur une méthode synthétique chimique afin d'éliminer la complexité mentionnée ci-dessus et les problèmes des procédés synthétiques chimiques traditionnels. Après avoir étudié un procédé pour produire 2-(phényl substitué) acide propionique en utilisant une espèce spécifiée de bactéries, les inventeurs de la présente invention ont constaté qu'une espèce bactérienne spécifiée récemment isolée d'un - sol à IWAKI City F U K USHIMA-Prefecture, Japon oxyde 1-(phényl substitué)-1-phényléthane en 2- (phényl substitué) acide propionique, et en se basant 1D sur la transformation microbiologique, les présents inventeurs ont mis au point. la nouvelle méthode de production de 2-(phényl substitué) acide propionique comprenant moins d'étapes que le procédé synthétique chimique traditionnel. Dans un aspect de la présente invention, il est prévu la production de 2(phényl substitué) acide propionique, comprenant les étapes de l'inoculation d'un micro-organisme appartenant au genre des Pseudomonas et ayant une activité de conversion de 1-(phényl substitué)-l- phényléthane en 2-(phényl substitué) acide propionique dans un milieu de culture contenant 1(phényl substitué)- 1-phényléthane. la culture du micro-organisme dans ce milieu, faisant ainsi produire au micro- organisme 2-(phényl substitué) acide propionique, et la récupération du 2(phényl substitué) acide propionique ainsi produit à partir de cette matière de culture. La présente invention concerne un procédé pour la production de 2-(phényl substitué)acide propionique, comprenant les étapes d'inoculation d'une bactérie appartenant au genre des Pseudomonas et ayant une activité de transformation de 1-(phényl substitué)-1-phényléthane en 2-(phényl substitué) acide propionique o le substituant est le même que le substituant dans le 1-(phényl substitué)-l-phényléthane, dans un milieu de culture contenant 1-(phényl substitué)-l-phényléthane, la culture de la bactérie ainsi inoculée dans ce milieu, oxydant ainsi le 1-(phényl substitué)-1- phényléthane en 2-(phényl substitué)-acide propionique et la récupération du 2-(phényl substitué) acide propionique ainsi formé. 3- La bactérie nouvellement isolée par les présents inventeurs et utilisée dans la présente invention pour transformer 1-(phényl substitué)1-Phënyléthane en 2-(phényl substitué) acide propionique appartient, ceci a été constaté, au genre des Pseudomonas par suite de l'examen des propriétés bactériologiques de celle-ci, en se référant au Manuel de Bactériologie déterminative de Bergy 8ème édition, et les Prokaryotes, et après avoir constaté que la présente bactérie diffère des espèces connues des Pseudomonas en vue de l'utilisation de 1-(phényl substitué)-1phényléthane, les présents inventeurs ont décidé que l'espèce de bactérie nouvellement isolée est une nouveauté, et ont dénommé la nouvelle espèce: Pseudomonas cepacia. Un type de Pseudomonas. cepacia a été déposé à Fermentation Research Institute, Agence de la Science et Technologie Industrielles, Japon, sous le nO de dépôt FERM-BP 534, date de dépôt le 25 mai 1984. Les propriétés bactériologiques des Pseudomonas cepacia sont les suivantes (1) Propriétés morphologiques Forme d'une cellule: en bâtonnets dimension d'une cellule: 1,0 à 1,5 um de large et 1,5 à 2,5 um de long Pléomorphisme d'une cellule: néant Mobilité: positive. Nombre de flagelles: plus d'un Formation de spore: néant Coloration Gram: négative Résistance à l'acide: négative (2) Etat de développement (couleur, éclat, aspect, etC ooo) Essai (conditions de culture) Résultats des essais Culture bouillon-plaque de gélose (1) productivité de pigment: (+) pigment jaune pâle (2) éclat: -(+) les surfaces des colonies étaient lisses. Culture bouillon-gélose inclinée (1) productivité de pigment: (+) pigment jaune pâle (2) éclat (+) les surfaces des colonies étaient lisses. Culture bouillon-liquide (1) ne siest pas développé. Culture bouillon-gélatine (1) ne se développe que sur la surface du milieu (2) liquéfaction de la gélatine: (-] Culture tournesol-lait (1) l'aspect du milieu n'a pas changé, coagulation: (-) - liquéfaction: (-) (3) Effet de la température sur le développement: Température (OC) Dévroppi__ 4 (-) (-) (+] 37 (+) -5 - (4) Effet du pH sur le développement: Ph Développement 4,0 (-) ,0 (-) 6,0 (+) 8,0 (+) 9,0 C-) ,0 (-) (5) Production d'acide et/ou gaz à partir d'hydrate de carbone. 1l Hydrate de carbone Production d'acide Production de gaz L-arabinose (+) (-) D-xylose (+) (-) D-glucose (+) (-) D-mannose (+) (-) D-fructose (+) C-) D-galactose (+) --) Maltose (+) (-) Sucrose '+] (-) Lactose (+) _ C-) Tréhalose (+) D-sorbitol - (-) D-mannitol (+} -) Inositol (+) -) Glycérol -) (-) -25 Amidon -) C-) -6 (6) Autres natures: Test Résultat d'essai Développement dans des conditions aérobies (+) Développement dans des conditions anaérobies (-) Hydrolyse de l'amidon (-) Réduction d'un nitrate (-H Dénitrification (-H Essai MR () Essai VP (-) Formation d'indole (-) Formation d'acide sulfhydrique (-) Utilisation d'acide citrique dans le milieu de culture de Koser (-) dans le milieu de culture de Christensen -)- Utilisation d'un nitrate (-) Utilisation d'un sel d'ammonium (+) Formation d'un pigment (+) pigment jaune Formation d'uréase (-. Formation d'oxydase (+) Formation de catalase (+) Essai O/F (méthode d'Hugh-Leifson) - oxydant En tant qu'espèce de bactérie à utiliser pour la présente invention les Pseudomonas cepacia peuvent être citées comme exemple approprié, cependant toute espèce mutante artificielle ou naturelle de celle-ci et tous autres micro-organismes appartenant au genre des Pseudomonas et produisant 2-(phényl substitué) acide propionique à partir de 1-(phényl substitué)-1-phényléthane peuvent être utilisés dans la présente invention. Dans la culture des bactéries dans la présente invention, toute source de carbone qui est habituellement utilisée comme élément de substances nutritives peut être utilisée, cependant, afein que la bactérie produise 2-(phényl substitué) acide propionique à un rendement élevé, 1-(phényl substitué)-1-phényléthane est utilisé comme seule source de carbone ou un élément de la source de carbone. Dans de tels cas, le 1-(phényl substitué) -l-phényléthane est choisi selon le 2-(phényl substitué) acide propionique souhaité. C'est-à-dire que le substituant (groupe) dans le 1- (phényl substitué)-1-phényléthane est le même que le substituant (groupe) dans le 2-(phényl substitué) acide propionique objectif. La concentration de 1-(phényl substitué)-l-phényléthane comme source de carbone à ajouter est 0,01 à 0,5 en-poids, et le montant total de la source de carbone peut être ajouté à la fois ou peut être ajouté en plusieurs fois après avoir divisé en parties. Comme 1-(phényl substitué)1l-phényléthane, -e ---cmpose. r-epresenté par la formule (1) peut être mentionné: Ras C_- Q utilisés sans restriction. En outre, comme sources de phosphore et potassium inorganiques utilisées dans le milieu de culture, du phosphate d'hydrogène disodique, du potassium dihydrogène phosphate, dipotassium hydrogène phosphate, et autres sont utilisés. Le sulfate de magnésium, chlorure de calcium, chlorure ferrique et autres sont utilisés comme éléments métalliques nutritifs mineurs pour les bactéries. Les autres additifs pour le milieu de culture, extrait de levure, liqueur de maTs macéré, extrait de viande et autres sont utilisés pour le développement favorable des bactéries. Comme méthode de culture des bactéries, on peut citer la culture avec secousses, la culture avec agitation ou la culture avec aération submergée et une méthode combinant les techniques ci-dessus, par exemple, culture avec aération submergée sous agitation et autres peut être utilisée. La culture s'effectue de façon adéquate à une température de 25 à 35 C et à un pH de 6 à 8 pendant 3 à 35 jours. Après avoir fini la culture, en soumettant la matière cultivée à une filtration ou centrifugation afin d'éliminer les corps de bactéries, on obtient l'élément surnageant contenant 2-(phényl substitué) acide propionique. L'acide épuré peut être obtenu en soumettant l'élément surnageant au procédé comprenant les étapes d'extraction de solvant, déshydratation, décoloration, fractionnement, chromatographie à colonne et par un seul procédé ou la combinaison de ceux-ci. -9 - Par exemple, après avoir fini la culture, la matière cultivée est soumise à la centrifugation pour obtenir la fraction surnageante, et après acidification de la fraction en ajoutant un acide, si besoin est, la substance objet du brevet est extraite avec un solvant organique comme du dichlorométhane et autres. Après avoir soumis I'extrait à la déshydratation et condensation, le condensat est soumis à la chromatographie au gel de silice, pour l'élution et le fractionnement du condensat en utilisant un mélange de 7/1 de benzène et d'acétate d'éthyle comme éluant. La fraction ainsi obtenue contenant la substance objet du brevet est condensée ce qui permet d'obtenir le produit objet du brevet sous forme de cristaux bruts, qui sont purifiés suivant les besoins par recristallisation, etc.. La présente invention sera expliquée plus en détail en se référant aux exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1.: Dans un ballon conique de 300 ml, 100 mi d'un milieu de culture liquide aqueux (pH 7,2) d'une composition comprenant 0,065 g de K2HPO4, 0,026 g de KH2PO4, 0,134 g de Na2HPO4.12H20, 0,005 g de NH4CI, 0,068 g de MgSO4. 7H20, 0,083 g de CaCI2, 0,0008 g de FeCI3o6H20, 0,2 g de polypeptone, 0,3 g d'extrait de levure et un litre d'eau distillée et 0,05 g de 1- 4-(3,3, 3-trifluoropropyl)phény! -1-phényléthane de synthèse suivant la demande de brevet japonais soumise n 58-29725 (1983) ont été introduits, et après stérilisation du ballon pendant 15 mn à 121 C sous pression, des Pseudomonas cepacia (espèce n KTB-03, déposée à Fermentation Research Institute, Agence pour la Science et la Technologie Industrielles, Japon sous dépôt n FERM- BP 534) ont été inoculées dans le milieu de culture ainsi préparé et cultivées pendant 28 jours à 30 C en tournant et secouant le ballon. Après avoir éliminé- les corps de bactérie provenant du milieu ainsi cultivé par centrifugation, le pH de l'élément surnageant a été réglé à moins de 2 en ajoutant de l'acide chlorhydrique aqueux 6N et à partir de l'élément surnageant ainsi traité la substance objet du brevet a été extraite avec 100 ml de chloroforme. Après avoir dissous l'extrait dans une solution d'hydrate de sodium 1N, la solution aqueuse a été acidifiée en ajoutant encore de l'acide chlorhydrique et la solution a été soumise à nouveau à l'extraction au chloroforme. En condensant la couche de chloroforme sous une pression réduite pour éliminer complètement le solvant, on a obtenu un liquide légèrement visqueux rouge-marron. - 1 0- Le liquide ainsi obtenu a été soumis à la chromatographie au gel de silice en utilisant le mélange de benzène et d'acétate d'éthyle comme éluant, en épurant ainsi le liquide, et la fraction ainsi obtenue a été recristallisée à partir de n-hexane pour obtenir 27 mg de cristaux blancs avec un rendement de 61 % par rapport à la matière de départ, 1-[4-(3,3,3, -trifl uoropropyl)phény 1-l-phényléthane. Le point de fusion des cristaux ainsi obtenus a été de 75 à 76,5 C et les cristaux ainsi obtenus ont été identifiés comme 2- 4-(3,3,3-trifluoropropyl)phény!J acide propionique par suite de l'examen de NMR, spectre d'absorption à infrarouge, et spectre de mass avec ceux d'éprouvette autentique (voir demande de brevet japonais soumise n 58-65237 (1983)). La transformation de la matière de départ à la substance objet du brevet est représentée comme suit CF CH 2CHCH_ CF CH ci QCHH-COOH 3C2CH2 Q >;- 3 2 2 ie CH3 CH5 EXEMPLE 2: En cultivant les bactéries de la même façon qu'à l'exemple 1 si ce n'est l'utilisation de 1- [4-(2-trifluorométhyl-propyl)phényl -1-phényléthane de synthèse suivant demande de brevet japonais soumise n 58-29725 (1983) au lieu de 1-[4-(3,3,3-trifluoropropyl) phényq -1-phényléthane dans l'exemple 1 comme matière de départ, 12 mg de cristaux blancs purifiés ont été obtenus avec un rendement de 27 % par rapport à la matière de départ, 1- [4-(2-trifl uorométhyilpropyl)phényI -1 -phényléthane. La transformation de la matière de départ en la substance objet du brevet est représentée comme suit CHB CH CFli3 / li3, H CHC142 CH-COOH CF3 CH3 CF3 CH3 EXEMPLE 3: En cultivant les bactéries de la même façon qu'à l'exemple 1 si ce n'est l'utilisation de 0,1 g de 1-(4-isobutylphényl)-1-phényléthane au lieu de 0,05 g de li-(3,3,3-trifluoropropyl)phényl]-1-phényléthane à l'exemple 1, 61 mg de cristaux - 11- blancs épurés ont été obtenus avec un rendement de 70,5 9% par rapport à la matière de départ, 1-(4-isobutylphényl)-1-phényléthane.. Le point de fusion du cristai ainsi obtenu a été de 75 à 77 C, et le spectre NMR, le spectre d'absorption à infrarouge et le spectre de masse ont été les mêmes que ceux de l'éprouvette authentique de 2-(4isobutylphényl) acide propionique. La transformation de la matière de départ en substance objet du brevet est représentée comme suit CH3 CH3 /C 2 CHCH1 Q CH-COOH 2c ci CH 3 éH - 3cs l3 EXEMPLE 4: Exemple de culture en période courte, Après introduction de 50 ml du même milieu de culture qu'à l'exemple 1 et 0,01 g de 1-(4-isobutylphényl)-1phényléthane dans un ballon conique de 300 ml, et après avoir soumis le milieu à une stérilisation sous forte pression pendant 15 mn à 121 C, le même type de Pseudomonas cepacia qu'à l'exemple 1 a été inoculée dans le milieu de culture ainsi stérilisé, et la matière à inoculer a été cultivée pendant 3 jours b 30 C en tournant et secouant le ballon. Après avoir soumis la matière ainsi cultivée à la. centrifugation, en éliminant ainsi les corps de bactéries, l'élément surnageant a été acidifié à un pH inférieur à 2 en ajoutant un acide chlorhydrique 6N et par la suite à partir de l'élément surnageant, la substance objet du brevet a été extraite avec 50 ml de chloroforme. Après condensation de la couche de chloroforme sous pression réduite, 10 ml de --- condensat mesurés avec précision ont été soumis à une analyse chromatographique liquide à grande vitesse, par laquelle il a été. constaté que 4 mg de 2-(4-isobutylphényl) acide propionique étaient formés avec un rendement de 46 % par rapport à la matière de départ -1-(4-isobutylphényl)-l -phényléthane. EXEMPLE 5: De la même façon qu'à I'exemple 1, 0,2 g de 1-(4-isopropylphényl)-1phényléthane, a été utilisé dans la culture du même type de Pseudomonas cepacia qu'à l'exemple 1 et transformé en 2-(4-isopropylphényl) acide -12- propionique. La quantité de produit a été de 49 mg correspondant à un rendement de 28,6 % par rapport à la matière de départ, 1-(4-isopropylphényl)-lphényléthane. La transformation de la matière de départ en substance objet du brevet est représentée comme suit-: ____ C.3 /. X _C- CHf 5.. 0CH-. CH-COO3 C43 C3 3 C 3I. - 13- REVENDICATIONS. 1. Un procédé pour la production de 2-(phényl substitué) acide propionique, comprenant les étapes de l'inoculation d'un micro-organisme appartenant au genre des Pseudomonas et ayant une activité de transformation de 1-(phényl substitué)-1-phényléthane en 2-(phényl substitué) acide propionique dans un milieu de culture contenant 1-(phényl substitué)-1 -phényléthane. la culture du micro-organisme dans celui-ci, faisant ainsi produire au micro- organisme 2-(phényl substitué) acide propionique, et la récupération du 2(phényl substitué)-acide propionique ainsi produit à partir de la matière ainsi cultivée. 2. Un procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que ce 1- (phényl substitué)l-phényléthane est un composé représenté par la formule (1): c"3 o R indique un élément choisi à partir du groupe comprenant des groupes alcoydes à chaînes rectilignes de 1 à 4 atomes de carbone, des groupes alcoydes à chaînes ramifiées de 3 et 4 atomes de carbone, CF -CH12CHl- et CF3-CHCH2-. CH3 3. Un procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la culture du micro-organisme est effectuée à une température de 25 à 35 C et à un pH de 6 à 8. 4. Un procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de ce 1-(phényi substitué)-1-phényléthane dans ce milieu de culture est 0,01 à 0,5 % en poids.