Brevet FR2570378A1 — publié le 19860321

Nouvel ionophore poI 4rÉer. son procédé de préparation 7 snltilisation La présente invention se rapporte, d'une manière gé-' nérale, à un nouvel ionophore polyéther ainsi qu'à son procédé de préparation. En particulier, l'invention concerne l'ionophore po- lyéther sous forme acide appelé "abiérixine", répondant à la formule: H C H CO H C CH3 CH H3C A 3 Dos10-H2OH I OH &H3 De même, l'invention se rapporte à l'abiérixine sous forme hydratée ou sous forme de sels non toxiques.. Par sels non toxiques, on entend plus particulièrement les sels de métaux alcalins, tels que lithium, sodium ou potassium, les sels de métaux alcalino-terreux, tels que calcium ou magnésium ou les sels d'ammonium, tels que ceux obtenus à partir de l'ammoniac ou d'une amine, telle que méthylamine, éthylamine, diméthylamine, diéthyl- amine, triéthylamine, éthanolamine, diéthanolamine, trométhamol et semblables. On a trouvé que l'abiérixine et ses sels non toxiques sont doués de propriétés anticoccidiennes notamment vis-à-vis d'Eimeria tennella. De même, les composés de l'invention se sont révélés utiles comme facteur de croissance chez les ruminants. Un autre objet de l'invention concerne, par con- séquent, une composition,en particulier une composition vétérinaire alimentaire ou thérapeutique contenant, comme principe actif es- sentiel, au moins un composé de l'invention, en association avec un véhicule, diluant ou excipient approprié. Selon l'invention, on prépare l'abiérixine par cul- ture d'une souche d'Actinomycétales,eS ce, en milieu nutritif con- tenant une source assimilable de carbone, d'azote et de sels minéraux. Caractéristiques de la souche La souche utilisée dans le cadre de l'invention est de l'espèce Streptomyces albus et est déposée auprès de L'INSTITUT PASTEUR (Paris) dans la Collection Nationale de Cultures de Microor- ganismes (C.N.C.M.) sous le N 1-321. Cette souche présente les caractéristiques suivantes I. Caractéristiques culturelles En utilisant les milieux définis ci-après: A:milieu extrait de malt et de levure (ISP 2) B:milieu farine d'avoine (ISP 3) C:milieu de BENNET (S.A. WAKSMANN "The actinomycetes" vol. 2 p. 33) D:milieu d'EMERSON id. p. 331 E:milieu CZAPEK - saccharose id. p. 328 F:milieu CZAPEK - glycérol id. p. 328 G:milieu tyrosine de GORDON et SMITH [Jr. Bact. 69, 147-150 (1955)] on a relevé les caractéristiques culturelles ci-après: Milieu Mycélium Sporulation Pigment primaire soluble A ivoire clair blanc-gris néant B ivoire clair grise* néant C ivoire clair pauvre néant D ivoire clair pauvre néant E incolore blanches néant F incolore blanche* néant G jaune pale blanche néant : très bonne pousse. Sur tous les milieux, le mycélium devient prati- quement noir et humide mais seulement au bout de cinq ou six semaines. Les spores forment des chaînes spiralées en spirales compactes. Leur surface est lisse. II. Caractéristiques physiologiques Croissance sur: - glucose bonne arabinose bonne - xylose bonne - inositol bonne - mannitol - bonne fructose bonne - rhamnose bonne - sucrose bonne - raffinose bonne Réduction des nitrates positive Liquéfaction de la gélatine positive Formation de mélanine négative Réaction à la tyrosine négative Coagulation et peptonisation du lait douteuse Hydrolyse de l'amidon positive Production d'H2S négative Inhibition par la streptomycine positive Les sucres mentionnés ci-dessus sont utilisés dans la classification de NONOMURA, J. Ferment. Technol. 52, 78-92 (1974). Mode de réalisation de l'invention Suivant un mode de réalisation pour l'obtention de l'abiérixine, on prépare d'abord un inoculum végétatif de S. albus C.N.C.M. - 1-321 en ensemençant une petite quantité du bouillon de culture avec une suspension de spores congelés du micro-organisme. On cultive ensuite ce micro-organisme sous conditions d'aérobiose, à une température comprise entre 25 C et 30 C, de pré- férence à 27 C et sur différents milieux nutritifs contenant des éléments habituellement utilisés à cet effet. - En général, la production maximale d'abiérixine a lieu en 3 à 10 jours après l'inoculation du milieu de culture sous con- ditions d'aérobiose et d'agitation suffisantes. Comme source de carbone, on peut utiliser le glucose, la dextrine, l'amidon, les mélasses. Les sources d'azote peuvent être des extraits de levure, des extraits de viande, des hydrolysats de farine de soya, des hydrolysats de caséine, des peptones de viande, du "corn-steep", etc. L'addition éventuelle d'huile ou d'esters méthyliques, éthyliques, propyliques ou autres d'acides gras dans le milieu de cul- ture a été étudiée. I1 s'est avéré que la présence d'huile, telle que l'huile d'olive, contenant de l'acide palmitique et de l'acide oléique ou la présence d'esters méthyliques de certains acides gras, à raison d'environ 1 à 2 % (V/V), est indispensable pour la production d'une quantité significative d'abiérixine lors de la fermentation. Le palmi- tate de méthyle, l'oléate de méthyle et% dans une moindre mesure, le myristate de méthyle, se sont révélés particulièrement indiqués à cet effet. Avant l'inoculation par le micro-organisme, il est souhaitable d'ajuster le pH du milieu de culture entre environ 6,5 et 7,5 de préférence à 7,2 et, ce, au moyen d'un hydroxyde de métal al- calin, tel que l'hydroxyde de sodium ou de potassium. La fraction abié- rixine produite lors de la fermentation est contenue dans le mycélium. Le meilleur rendement est obtenu à partir d'un mycélium isolé à l'aide d'une centrifugeuse et essoré. On extrait alors l'abiérixine produite, par exemple au moyen d'éthanol, pendant 2 heures environ. On a remarqué que cette durée permet d'obtenir 98 % du poids de composés actifs produits lors de la fermentation constitués notamment d'abiérixine et de nigéricine. On purifie le mélange de polyéthers polycycliques ainsi obtenu, aumoyen de trois chromatographies successives, d'abord par chromatographie sur colonne, de manière à éliminer les acides gras et la majeure partie de la nigéricine, ensuite par chromatographie-éclair (J. Org. Chem. 1978, 14, 2923) de manière à éliminer la totalité de l'élaiophyline et une partie de la nigéricine et finalement par chromatographie liquide haute pression (CLHP). A ce stade, on isole l'abiérixine sous forme de sel de métal alcalin. L'abiérixine elle-même peut être obtenue sous forme monohydratée par acidification de son sel de métal alcalin présent dans les fractions enrichies obtenues après purification par chromatographie sur colonne comme décrit précédemment. Ces fractions enrichies, lorsquelles sont éluées en chromatographieéclair au moyen de solvants contenant un acide, par exemple l'acide acétique, fournissent l'abiérixine monohydratée. Toutefois, on a remarqué que le traitement par l'acide chlorhydrique N/10 d'une solution éthérée du sel de sodium de l'abiérixine ne conduit pas à l'aci-dification totale de l'abiérixine. Le monohydrate ainsi obtenu peut être chauffé modéré- ment pour recouvrer l'abiérixine. Quant aux sels non toxiques d'abiérixine, ceux-ci peuvent être produits de manière connue par réaction de l'abiérixine ou de son hydrate avec une base organique ou inorganique appropriée, telle qu'un hydroxyde de métal alcalin, un oxyde de métal alcalino- terreux, l'ammoniac ou amine. On a déterminé certaines propriétés physico-chi- miques des composés de l'invention, à savoir: A. Caractéristiques physicochimiques de liabiérixine monohydratée Aspect: solide P.F. 83-85 C. Solubilité: se dissout dans les solvants organiques usuels, tels que les alcools inférieurs par exemple méthanol, éthanol, les esters inférieurs par exemple l'acétate d'éthyle ou encore dans l'éther éthylique, le chloroforme etc. Dans l'eau, la solubilité est de 40 % environ. a: + 45 (c = 0,03 n, méthanol) J Masse moléculaire: 742 déterminée par la méthode FAB (Fast Atom Bombardment) [Org. Mass Spectrum, 16, 256 (1981)]. L'ion (M-H)m/z: 723 apparaît dans le spectre FAB négatif et confirme la masse moléculaire m/z = 724 de l'abiérixine. Formule brute: C H O H20 ----------- 40 68 11 2 Analyse élémentaire C H O Calculé pour C40H70012 64,66 % 9,49 % 25,84 % Trouvé 64,41 % 9,46 % 25,60 % Spectre I.R. (pastille de KBr) En infrarouge, le spectre de l'abiérixine, repré- senté à la figure 1, présente les bandes caractéristiques suivantes: 3360 (F), 2980 (F), 2940 (F), 2880 (F), 2640 (t.f.), 1730 (f), 1640 (f), 1460 (m), 1370 (m), 1360 (e), 1355 (e), 1310 (e), XlY fv 1300 (e), 1290 (f), 1260 (t.f.), 1240 (t.f.), 1205 (t.f.), 1185 (t.f.1 1115 (m), 1080 (F), 1070 (F), 1040 (F), 1030 (F), 1020 (F), 990 (f), 980 (f), 960 (m), 930 (t. f.), 910 (t.f.), 880 (t.f.), 870 (t.f.), 845, (t.f.), 810 (t.f.), 730 (t. f.), 715 (t.f.), 690 (t.f.), 640 (t.ú), 620 (t.f.), 610 (t.f.), 590 (t.f.) , 535 (t.f.), 500 (t.f.), 460 (t.f.), 455 (t.f.), 415 (t.f.), 395 (t.f.) cm = épaulement, t.f. = très faible, f = faible, m = moyen, F = forte. De ces données, on peut tirer les informations suivantes: -1 - entre 3 700 et 3 150 cm, une bande intense qui se prolonge jusqu'à -i 2 500 cm1 implique la présence d'un ou plusieurs groupements hy- droxylés dont un pourrait être un OH d'acide. - trois bandes très intenses avec des maximums à 2 970, 2 940,et 2 880 cm correspondent aux vibrations d'élongation des liaisons CH de la molécule. -i - une bande intense à 1 715 - 1 690 cm 1 que l'on peut attribuer aux vibrations de valence d'une liaison C=O d'acide conjugué du type C=C-X2l 1 - une bande intense à 1 460 cm attribuable aux vibrations des défor- mations des liaisons C-H -enfin, une bande large représentant plusieurs maximums entre 1 115 et -1 1 020 cm qui se rapporte à des vibrations de valence C-O-C. Spectre U.V. (cyclohexanne) En ultraviolet, le spectre de l'abiérixine, représente à la figure 2, présente une bande intense (A max = 217 nm, e = 10 400), caractéris- tique d'un groupement acide a,1-insaturé, et une bande faible (X max = 275 nm, = 2 800). Spectre R.M.N. (CDCl3) La figure 3 représente à 200 MHz le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton de l'abiérixine (substance de référence: tétra- méthylsilane) et les figures 4 et 5 représentent à 50,3 MHz le spectre de résonance magnétique nucléaire du 13C de ce composé (substance de référence: tétraméthylsilane). B. Caractéristiques physico-chimiques du sel de sodium de l'abiérixine Aspect: mousse blanche solide. P.F.: 120 - 123 C. Solubilité: se dissout dans les solvants organiques usuels, tels que les alcools inférieurs par exemple méthanol, éthanol, les esters inférieurs par exemple l'acétate d'éthyle ou encore dans l'éther éthylique, le chloroforme etc. Par contre, il est insoluble dans l'eau. Spectre I.R. (KBr) Le spectre infrarouge du sel de sodium de l'abiérixine se distingue de celui de l'abiérixine même par le fait que la bande intense à 1 715 - 1 690 cm- due à la liaison C=O de l'acide est remplacée par une bande intense à i 540 cm-1 due à l'ion carboxylate. On a décrit ci-dessus la préparation, selon l'inven- tion, de l'abiérixine a partir de la souche de S. albus indiquée cidessus. Il est entendu que l'invention ne se limite pas à la production d'abiérixine a partir de ce micro-organisme mais englobe également des modes de réalisation équivalents à partir notamment de mutants de la souche S. albus en question sans pour autant sortir du' cadre de l'invention. De tels mutants peuvent être obtenus par des technique connues, par exemple en soumettant le micro-organisme producteur d'abiérixine à une irradiation aux rayons X ou ultraviolets ou à l'action d'agents chimiques. La coccidiose est une maladie commune et répandue chez la volaille, le porc, le lapin, le chat, le chien, chez certains ruminants etc. maladie causée par une ou plusieurs espèces parasites du type protozoaires de souche Eiméria tels que E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti, E. mivati, E. adenoides et E. maleagrimitis. E. tenella et E. acervulina sont les agents respon- sables d'une infection importante et souvent fatale des poulets, infection qui se manifeste par une hémorragie sévère et importante, une accumulation de sang dans le caecum et par passage de sang dans les matières fécales. E. necatrix attaque l'intestin grêle du poulet causant, une coccidiose intestinale tandis que E. maleagrimitis et E. adenoides sont responsables de la coccidiose chez le dindon. Laissées sans traitement, les infections graves dues à la coccidiose conduisent à un gain de poids inférieur à la normale, à une efficacité réduite de la nourriture et à une mortalité élevée chez les oiseaux. Par conséquent, la morbidité et la mortalité occa- sionnées par les infections de coccidiose créent une perte écono- mique importante lorsque les infections sont laissées sans traitement ou sans surveillance. L'élimination ou le.contrôle de cette maladie est, par conséquent, de première importance notamment pour l'élevage de la volaille. On a trouvé, dans le cadre de la présente invention, que l'abiérixine ainsi que ses sels non toxiques présentent de très intéressantes propriétésanticoccidiennes susceptibles d'être utilisées pour la destruction de parasites chez les oiseaux et certains ruminants (ovins). Des tests ont été effectués de manière à montrer l'efficacité de l'abiérixine comme agent anticoccidien dans lesquels on a relevé les résultats zootechniques (poids, indice de consommation) et les symptômes chimiques de coccidiose (morbidité, mortalité, aspect des matières fécales, excrétion ookystale, lésions). On a utilisé à cet effet le protocole expérimental suivant: Animaux Coquelets de souche génétique Warren Sex Sal Link - Age le jour de l'inoculation (J 0): 17 jours - Age le jour de l'abattage (J + 8): 25 jours Inoculum Dose: 300 000 oocystes sporulés d'Eimeria tenella Alimentation 9 - Aliment utilisé: aliment type poulet de chair, ler age Anticoccidien utilisé: l'abiérixine à la dose de ou 50 ppm/jour depuis J 2 jusqu'à J + 8 Lots -Nombre d'animaux par lot: 4 - Répartition des lots: NCNT: animaux non contaminés, non traités CTNT: animaux contaminés, non traités CTT1: animaux contaminés, traités avec 40 ppm d'abiérixine CTT2: animaux contaminés, traités. avec 50 ppm d'abiérixine Les critères - Les gains de poids (GP) de J - 2 à J + 8 - L'excrétion ookystale (EO) journalière de J + 4 à J + 8 - La morbidité (M) notée de O à 4 - L'aspect des fécès noté de 0: fécès normales à 4: fécès diarrhéiques ou hémorragiques - La mortalité (MI%) exprimée en pourcentage - Les lésions (L) notées selon la notation de REID -Les indices de consommation (IC) T A B L E A U Traitements Critères NCNT CTNT CTT1 CTT2 Poids moyen de départ P GP P GP P GP P GP à J - 2: 127 g 286 g 159 g 199 g 72 g 219 g 93 g 190 g 63 g EO x 103 Total 0 5628 4165 2324 % - - 74,0 41,3 M J + 5 O 4 3 3 o J + 6 O 2 0 0 J + 7 0 1 0 0 MF J + 5 O 4 4 3 J + 6 O 2 1 1 J + 7 O 2 0 O M% 0 0 0 0 Lésion individuelle moyenne O 3,5 2,5 3,5 n ICcd J - 2 à J + 8 1,88 3,02 2,8 3,35 P = poids moyen 3 + 8.n GP = gain de poids moyen de J - 2 à J + 8 Les résultats montrent qu'aux doses de 40 ou 50 ppm/ jour l'abiérixine augmente la croissance pondérale de coquelet âgés de 14 jours et contaminés par E. tenella quand ce produit est distri- bué pendant 10 jours. On a également trouvé, dans le cadre de l'invention, que l'abiérixine et ses sels non toxiques peuvent être utiles comme facteur de croissance en particulier chez les ruminants et à ce titre peuvent être employés en élevage comme additif alimentaire. Dans ce contexte, on a remarqué que "in vitro" l'abiérixine présente un intérêt tout particulier par le fait qu'elle permet, à la flore ruménale, d'utiliser l'azote des rations alimen- taires animales de manière différente de celle de la nigéricine ou de la monensine, deux antibiotiques ionophores connus. L'addition d'abiérixine au milieu fermentaire diminue notablement la fermentescibilité des sources protéiques étudiées (graine de lupin doux, tourteau d'arachide, tourteau de soya) tout comme la monensine ou la nigéricine. L'emploi "in vivo" d'abiérixine pourrait donc limiter la dégradation des protéines dans le rumen et ainsi accroître l'apport d'acides aminés d'origine alimentaire dans l'intestin grêle du ru- minant. Par contre, la présence d'abiérixine ne diminue pas significativement la quantié d'azote ammoniacal fixée par les bac- téries. Ce composé n'a donc pas l'effet inhibiteur de la monensine ou de la nigéricine sur la synthèse microbienne, effet qui a été décrit avec différents ionophores ou antibiotiques. En outre, l'efficacité de la synthèse microbienne mesurée en l'absence d'azote protéique, afin de connaître avec exac- titude la quantité d'azote fixée par les bactéries n'a diminué que de 10 % en présence d'abiérixine, mais de plus de 30 % avec la monen- sine ou la nigéricine, ce qui confirme la différence de comportement du composé de l'invention et des composés connus. L'addition des effets à la fois sur la fourniture d'acides aminés provenant de protéines alimentaires et sur la quantité de protéines microbiennes synthétisées dans le rumen ne pourrait qu'avoir des répercutions positives sur la nutrition azotée du ruminant Il s'est avéré également possible d'envisager l'emploi d'abiérixine dans des rations alimentaires contenant de l'azote non protéique utilisable par les bactéries alors qu'une utili- sation des antibiotiques ou ionophores connus à ce jour n'est pas très recommandable dans de telles conditions. L'absence d'effets négatifs de l'abièrixine sur l'activité microbienne ou sur la production de gaz à partir d'azote protéique a également pu être mise en évidence alors que dé tels effets négatifs ont été enregistrés en particulier avec la nigéricine. L'abiérixine, en tant que facteur de croissance pour ruminants, présente, par conséquent, des avantages indéniables sur la négéricine ou la monensine puisque le composé de l'invention améliore l'utilisation de l'azote des rations du ruminant en limitant la dégra- dation des protéines dans le rumen sans réduire l'activité fermentaire des microbes. En outre, on mentionnera que l'abiérixine est capable, en association avec certains antibiotiques en particulier les antibio- tiques aminoglycosides, de potentialiser l'action des ces composés. A ce titre, l'abiérixine et ses sels non toxiques, en association avec certains antibiotiques, pourraient être utilisés en médecine humaine. Finalement, l'abiérixine et ses sels non toxiques ont montré une toxicité relativement faible et compatible avec leur utili- sation comme médicament à usage humain ou vétérinaire. L'abiérixine et ses sels non toxiques peuvent donc être administrés en tant que principe actif médicamenteux sous forme de compositions unitaires convenant à l'administration en thérapie humaine ou vétérinaire ou en tant qu'additif alimentaire à usage vétérinaire. Sous son aspect le plus général et en tenant compte de l'utilisation finale choisie, les compositions en question sont préparées en associant le principe actif selon l'invention, avec un véhicule, diluant ou excipient approprié. A titre d'exemple, une composition thérapeutique anti- coccidienne peut être obtenue par addition d'abiérixine ou d'un de ses sels non toxiques, à la ration alimentaire de base en quantité de l'ordre de 0,02 % en poids du mélange final. Pour ce qui concerne l'unité d'administration celle- ci peut prendre la forme, par exemple, d'un comprimé, d'une dragée, d'une capsule, d'une gélule, d'une poudre, d'une suspension oud'uin sirop pour l'administration orale, d'un suppositoire pour l'administration rectale, d'une solution stérile ou suspension pour l'administration parentale. A usage vétérinaire, l'unité d'administration peut en outre, prendre la forme d'un prémélange contenant le principe actif dispersé sur le véhicule ou diluant ou encore la forme d'un supplément de nourriture contenant le principe actif mélangé au véhicule ou diluant. Dans ces deux derniers cas, un tel véhicule est de préférence un composant alimentaire pour animaux, par exemple avoine, graine de soya,luzerne, froment, résidus de fermentation, coquilles d'huître broyées, mélasses, substances végétales comestibles, farine de soya, kaolin, talc, calcaire broyé, etc. Sous forme de prémélange, des compositions de l'invention destinées à lutter contre la coccidiose peuvent contenir de 10 à 80 % en poids d'abiérixine ou d'un de ses sels non toxiques et de 90 à 20 % de véhicule ou diluant en poids de la composition. Ces prémélanges peuvent être dilués avec un supplément alimentaire pour animaux ou peuvent être ajoutés directement à une ration alimentaire animale de manière à fournir une alimentation thérapeutique qui peut être ingérée par la volaille. Alternativement, l'abiérixine et ses sels non toxiques peuvent être administrés sous forme d'une solution ou-supension con- tenant une quantité thérapeutiquement efficace de ce principe actif dans l'eau de boisson de la volaille. Une telle quantité thérapeutiquement active peut varier de 0,005 à 0,004 % en poids de la quantité de nourriture journalière chez le poulet. Les exemples, non limitatifs suivants, illustrent l'invention: EXEMPLE 1 Préparation de l'abiérixine et de son sel sodique I. Sel sodique de l'abiérixine lère préculture: On stérilise en erlenmeyer de 500ml pendant 20 min à 118 C. On y place alors 100 ml de milieu I (30 g de farine de soya, 20 g de glucose, 2,5 g de corn-steep, 1,0 g de K2HP04, 1 000 ml d'eau, le pH étant ajusté à 7,2 avec HaOH 1ON). On introduit alors un tube de spores congelé de S.albus C.N.M.C.-I-321 et on agite l'ensemble dans une secoueuse animée d'un mouvement rotatif pendant 3 jours à 27 C (vitesse: 200 tr/min). 2epréculture: Sous conditions stériles, on transfère la lère préculture dans un fermenteur de 20 1 contenant 1 1 de milieu I puis on agite pendant 24 h. A. Production: On stérilise un fermenteur de 20 1 contenant 15 1 de milieu II (extrait de levure: 1 g, extrait de viande: 1 g, "casami- noacids " (caséine hydrolysée par un acide) 4 g, glucose: 15 g, oléate de méthyle: 20 g, eau: 1 000 ml, le pH étant ajusté à 7,2 avec NaOH 1ON) pendant 45 min à 118 C..On y transfère alors la 2e préculture et on maintient le milieu ainsi formé en culture durant 7 jours à la température de 27 C sous agitation (vitesse 650 tr/min) et sous aération de 0,75 1 d'air/min/l de milieu. B. Purification de l'abiérixine a) Centrifugation et extraction En fin de culture en fermenteur, on sépare le mycélium du jus de fermentation par centrifugation à 40 000 g. On place, dans 500 ml d'éthanol, le mycélium récolté dans le cylindre de la centri- fugeuse et on le broie très finement afin de permettre une meilleure action du solvant d'extraction. Après broyage, on ajoute 4 1 d'éthanol (300 ml d'éthanol/l de milieu centrifugé) et on laisse agir le solvant pendant 2 h. On sépare alors le mycélium sur filtre en verre fritté et on concentre l'extrait éthanolique à l'aide d'un évaporateur cyclone. On poursuit ensuite la concentration au moyen d'un évaporateur rotatif jusqu'à obtention d'une huile rouge foncé. On ajoute ensuite 500 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N, ce qui permet une meilleure extraction à l'éther éthylique (3 à 4 fois, 250 ml d'éther). On séche sur sulfate de sodium anhydre et on concentre à l'évaporateur rotatif. On analyse alors l'extrait éthéré par chromatographie sur couche mince de gel de silice, ce qui permet de différencier l'abiérixine d'autres polyéthers polycycliques formés au cours de la fermentation (nigéricine). Valeur des Rfs Couleur révélée 3 la vanilline Eluant Acide gras Bleu 0,70 Nigéricine Rouge foncé 0,47 Abiérixine Marron rougeâtre 0,29 : chloroforme/méthanol 90/10 b) Purification On réalise 3 chromatographies successives de l'extrait éthéré à savoir: 1) sur colonne de gel de silice (diamètre des par- ticules: 60 à 200 pm) L'on utilise à cet effet deux éluants cyclohexane/acétate d'éthyle 7/3 puis on fait varier régulièrement le pourcentage d'acétate d'éthyle jusqu'à 100 % - chloroforme/méthanol 9/1 puis on fait varier le pourcentage de méthanol jusqu'à 100 % Cette première colonne permet d'éliminer les acides gras et une grande partie de la nigéricine. 2) Chromatographie éclair On traite alors les fractions enrichies en abiérixine par chromatographie-éclair qui utilise des caractères propres à la chromatographie sous pression. Il s'agit d'une technique rapide et économique permettant en 10 à 15 min la séparation d'échantillons dont les poids sont compris entre 0,04 et 2,5 g. On choisit à cet effet un solvant qui fasse migrer l'élément désirer à un Rf de 0,35 en chroma- tographie sur couche mince. On remplit une colonne de diamètre approprié jusqu'à une hauteur de 15 cm avec du gel de silice (0,040 - 0,063 mm), on ajoute l'éluant et on règle la pression pour avoir un débit de K3 cm3/min (Tr: rayon de la colonne en cm). En fonction du diamètre de la colonne et du volume d'éluant on a donné dans le tableau ci-dessous les quantités d'abié- rixine et de nigéricine dans les fractions collectées ainsi que les Rf respectifs. Diamètre Volume Echantillon charge Volume des de la colonne d'éluant (mi1) typique (mg) fractions (mm) c eollectées (ml) (mm) Rf: 0,2 Rf: 0,1 160 100 40 5 20 200 400 160 10 400 900 360 20 600 1 600 600 30 1 000 2 500 1 000 50 On utilise 3 éluants successifs à savoir - chloroforme pur 500 ml chloroforme/méthanol 9,8/0,2 300 ml - chloroforme/méthanol 9,6/0,4 500 ml Les volumes d'éluants donnés ci-dessus permettent d'éliminer la totalité de l'élaiophyline et une partie de la nigéricine formées au cours de la fermentation. 3) Chromatographie liquide haute pression préparative On effectue la dernière chromatographie en CLHP en utilisant deux colonnes de gel-de silice branchées en série. On emploi à cet effet des colonnes de 40 cm de longueur et 6 cm de diamètre et on effectue la détection à l'aide d'un réfractomètre différentiel intégré au chromatographe. On utilise deux éluants et deux valeurs de débit: ler éluant: 3 1 de chloroforme/méthanol 95/5 (v/v). Le débit est de ml/min jusqu'à l'élution des pics antérieurs à l'abiérixine. 2e éluant: 4 à 5 1 de chloroforme/méthanol 90/10. On règle le débit à 100 ml/min et on recycle une fois la fraction contenant le composé désiré. On collecte des fractions de 100 ml puis on évapore le solvant De cette manière, on obtient le sel sodique de l'abié- rixine sous forme d'une mousse blanche solide. P.F.: 120 - 123 C. II,. Abiérixine On peut obtenir l'abiérixine monohydratée à partir de son sel de sodium en modifiant les éluants au niveau de la chromato- * graphie-éclair (paragraphe 2) en leur ajoutant 5 % d'acide acétique, à savoir: - méthanol/acide acétique 99,5/0,5 500 ml chloroforme/méthanol/acide acétique 97,75/1,75/0,5 500 ml chloroforme/méthanol/acide acétique 95,75/3,75/0,5 500 ml De cette manière, on obtient l'abiérixine monohy- dratée. P.F.:83 - 85 C. EXEMPLE 2 On a préparé un prémélange alimentaire pour animaux _ mélangeant intimement les ingrédients suivants: Ingrédients Parties en poids i1 Aoiérixine 50 Granulés de luzerne 50 2) Abiérixine 40 Mélasses solubles 60 , 3) Abiérixine 30 Grains séchés de mals 70 4) Sel de sodium d'abiérixine 40 Farine de mais 30 Grains séchés de mats 30 5) Sel de sodium d'abiérixine 60 Graines moulues de soya 40 6) Sel de sodium d'abiérixine 20 Grains séchés de mais 60 Son de froment 20 7) Abiérixine 80 Son de froment 20 8) Abiérixine 25 Graines de soya 75 REVENDICATIONS 1. Ionophore polyéther répondant à la formule: CH3 HC HH3CO H3C CH H 3C CH3 CHCH \| ç A-N;; \ \ - S S t t - CH201O OH HOOC-C OH CH3 sous forme anhydre ou hydratée-ainsi que les sels non toxiques dudit ionophore polyéther. 2. Ionophore polyéther selon la revendication 1, sous la forme de son monohydrate présentant les caractéristiques suivantes: - un point de fusion de 83 - 85 C. - une masse moléculaire de 742 - un a j de + 45 (c = 0,03 n, méthanol) une solubilité dans les alcools inférieurs, les esters inférieurs, l'éther éthylique, le chloroforme et à 40 % dans l'eau; - un spectre infra-rouge dans le KBr avec les bandes caractéristiques suivantes: 3360, 2980, 2940, 2880, 2640, 1730, 1640, 1460, 1370, 1360, 1355, 1310, 1300, 1290, 1260, 1240, 1205, 1185, 1115, 1080, 1070, 1040, 1030, 1020, 990, 980, 960, 930, 910, 880, 870, 845, 810, 730, 715, 690, 640, 620, 610, 590, 535, 500, 460, 455, 415, 395 cm-1 - un spectre ultra-violet dans le cyclohexane avec une bande intense (X max = 217 nm,: 10 400) et une bande faible (X max = 27 nm,E = 2 800). 3. Ionophore polyéther selon la revendication 1, sous la forme de son sel de sodium présentant un point de fusion de 120 - 123 C. 4. Procédé de préparation de l'ionophore polyéther - selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive Strepto- myces-albus C.N.C.M. - 1-321 en milieu nutritif contenant une source assimilable de carbone, d'azote et de sels minéraux puis l'on fait éventuellement réagir le composé obtenu sous forme acide avec une base organique ou inorganique appropriée pour former un sel non toxique de ce composé. 5. Composition caractérisée en ce qu'elle contient comme principe actif essentiel au moins un des composés définis à la revendication 1, en association avec un véhicule, diluant ou excipient approprié. 6. Composition vétérinaire ayant une activité anti- coccidienne, caractérisée en ce qu'elle contient comme principe actif essentiel au moins un des composés définis à la revendication 1, en association avec un véhicule, diluant ou excipient approprié. 7. Composition vétérinaire alimentaire utile comme facteur de croissance, caractérisée en ce qu'elle contient comme prin- cipe actif essentiel au moins un des composés définis à la revendi- cation 1, en association avec un véhicule, diluant ou excipient approprié.