Brevet FR2566800A1 — publié le 19860103

2S66800 L'invention se rapporte à un procédé pour la préparation de peptides. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un ester alkyli- que inférieur C1-C4 de L- C-aspartyl-L-phénylalanine par hydrolyse enzymatique d'un dérivé N-acylé convenable. L'invention se rapporte aussi à la préparation d'un agent adoucissant bien connu sous le nom générique d'aspartam, par une hydrolyse enzymatique d'un dérivé N-acylé convenable. L'aspartam, qui est composé d'esters méthyliques de L-O-aspartyl-Lphénylalanine, est très utilisé comme agent adoucissant pour les produits alimentaires et les boissons à basses teneurs en calories et son emploi est décrit et revendiqué dans le brevet belge n 717 373. De nombreux procédés améliorés pour la production, l'extraction et la purification de cette substance ont été décrits et revendi- qués. On connaît, par la littérature, un procédé qui emploie des enzymes pour éliminer les groupes protecteurs de N-amino des aminoacides (par exemple des aminoacides N-acyle substitués) pour la préparation et la séparation des L-amino- acides, comme ta L-méthionine, la L-phénylalanine des mélan- ges des dérivés D,L-(N-acyle) correspondants par l'emploi d'enzymes convenables, comme les L-aminoacidacylases d'origine microbienne ou provenant d'organes d'animaux. Les enzymes sont, en fait, des substances protéi- ques agissant dans les bioréactions comme des catalyseurs très actifs qui, compte tenu de leur spécificité très élevée, sont considérablement supérieurs aux catalyseurs ou aux réactifs habituellement employés dans de nombreuses réactions chimiques. On ne connaît pas beautoup l'emploi des enzymes pour catalyser sélectivement l'hydrolyse des groupes Nprotecteurs liés aux groupes amino terminaux des peptides synthétisés de différentes manières. En fait, des enzymes comme la pepsine, La chymo- trypsine et la protéase ont généralement soit une activité peptidique, c'est-à-dire qu'ils sont capables d'hydrolyser les liaisons peptidiques PNH-CO-P', dans lesquelles P et P' représentent des restes d'aminoacide ou de peptide, soit une activité aminohydrolasique, c'est-à-dire qu'ils sont capables d'hydrolyser la liaison amidique A-C0-NH-P dans laquelle P représente un reste d'aminoacide ou de peptide et A représente un reste d'acide carboxylique aromatique ou aliphatique. Il est connu, par exemple, qu'un enzyme extrait du foie de boeuf, défini comme la "O-N-acylpeptide-hydrolase, a été isolé par Gade et Brown (J. Biol. Chem. 253, 14, 5012- -5018) et on sait qu'il est actif sur l'acyltrialanine et sur d'autres tri- et di-peptides à des vitesses différentes. Une classe très bien connue d'acylases définies comme les pénicillino-acylases est largement utilisée industriellement pour la préparation de l'acide 6-aminopénicillanique (6-APA) par hydrolyse enzymatique de penicillines substituées diffé- remment avec des chaînes latérales aliphatiques ou aroma- tiques sur le groupe amino en position 6: ces enzymes sont classés comme des penicillinacylases agissant sur les pénicillines G-V-X-F etc. en fonction des différentes propriétés des substituants à hydrolyser. Dans le domaine spécifique de la préparation de l'aspartam la synthèse chimique enzymatique de l'ester méthylique de N-acyl-L-C-aspartyl-Lphénylalanine est exécutée à partir de dérivés acyl-L-aspartyle et d'ester méthylique de L-phénylalanine. Le N-acyldipeptide ainsi obtenu est habituellement hydrolysé ensuite chimiquement, par- exemple par hydrolyse chlorhydrique, pour l'obtention du composé final désiré, c'est-à-dire l'ester méthylique de L-OC-aspartyl-L-phényl- alanine. Toutefois, le procédé d'hydrolyse chimique a plusieurs inconvénients consistant spécialement en son manque :: -2566800 -3 * 0 0 avec formation d'acide aspartique et de dérivés de phényL- alanine, soit à des réactions estérasiques avec formation d'aspartam déméthylé, soit finaLement à des réactions de cyclisation avec formation de dicétopipérazines différemment substituées.: . La présence de tous ces sous-produits, outre qu'elle abaisse le rendement de la production,- rend diffici-- les les phases d'extraction en vue de l'obtention du compose' désiré au degré désiré de-pureté et nécessite des procédés supplémentaires chimiques et biochimiques en vue de la récu- pération des sous-produits importants de la réaction de manière à parvenir à une optimisation d.u procédé fau point de 15. vue économique.. .: L'objet de la présente invention -est un procédé d'hydrolyse enzymatique de N-acyl-aspartam caractérisé par l'emploi d'enzymes hydroiasiques. En particulier, le- procédé décrit et revendiqué ici permet d'obtenir, dans des conditions remarquablement plus simples que celles employées pour L'hydrolyse chimique, un produit final, l'aspartam, avec des rendements très élevés et.avec une-réduction drastique de la quantité des sous-produits indésirables. - Des enzymes hydrolasiques qui conviennent pour le présent procédé sont, par exempLe, les protéases acides. ou neutres qui, dans des conditions appropriées,:hydrolysent' La liaison amidique d'un N-acyl-peptide avecformation du peptide désiré.: -- En particulier, les enzymes hydrolasiques préférés pour le procédé d'hydrolyse enzymatique de N-acyl-aspartam sont des enzymes dedésacylation obtenus à partir. de souches microbiennes du genre Escherichia, Noca'rd.ia:, Proteus,. Penicillium ou Streptomyces, communément clas.sés comme acylases ou plus spécifiquement comme Pénicillinacylases. Le procédé- hydrolytique peut être effectué soit par usage direct de cellules microbiennes libres ou immobili- sées, soit par l'isolement des enzymes spécifiques qui peuvent être utilisés à l'état libre ou immobilisés selon les techniques connues à l'aide de résines, de verre, -de cellu- l ose ou de substances similaires par des liaisons ioniques ou covalentes ou par greffage sur -des fibres perméables au substrat. L'emploi des enzymes isolés et purifiés au degré désiré est préféré plutôt que celui d'extrait cellulaire brut étant donné que le processus d'extraction ou de purification permet normalement de réduire ou d'éliminer la présence des enzymes contaminés qui sont la cause d'une diminution des rendements du procédé enzymatique et de la formation de sous- -produits indésirables. Par conséquent, conformément à- l'invention, la désacylation du peptide N-substitué est exécutée de préféren- ce par traitement de ce composé dans un milieu aqueux à l'aide d'une préparation enzymatique à activité acylasique De façon pLus préférable encore, le processus de l'invention consiste en une désacylation d'un dérivé N-subs- titué de l'ester méthylique de L-OC-aspartyl-L-phénylalanine à l'aide d'un enzyme isolé et purifié ayant une activité acylasique. Comme on l'a déjà mentionné ci-dessus, les enzymes hydrolasiques préférés utilisés conformément à l'invention, soit à l'état soluble, soit à l'état immobilisé sur -un substrat inerte convenable ou insolubilisés par un processus de réticulation sont ceux qui sont classés comme acylases et qui sont notamment connus jusqu'à présent comme pénicil- linacylases. Comme exemples de ces enzymes on peut citer: les acylas-es d'origine fongique produits par la fermentation de diverses espèces d'actinomycètes, de champignons filamenteux et de levures, comme par exemple: Alternatia Mucor Aspergillus Penicillium Botrytis Phoma Cephalosporium Streptomyces Cryptococcus Trichoderma Emericellopsis Trichophyton Epicoccum Trichosporon Epidermophyton Actinoplanes Fasarium Nocardia ou les acylases d'origine bactérienne produits par la fermen- tation de diverses espèces bactériennes, comme par exemple: Aerobacter Flavobacterium Alcaligenes Micrococcus Bordetella Proteus Cellulomonas Pseudomonas Corynebacterium Salmonella Erwinia Sarcina Escherichia Xanthomonas B. megaterium B. subtilis Achromobacter Les préparations enzymatiques obtenues par extrac- tion à partir d'organes d'animaux comme les acylases du rein de porc sont aussi capables de provoquer l'hydrolyse de la liaison amidique entre le groupe carbonyle d'un acide organi- que et le groupe aminique de l'ester méthylique de L-aspartyl- -L-phénylalanine. L'aspartam, c'est-à-dire l'ester méthylique de L-OCaspartyl-L-phénylalanine, a été préparé jusqu'à présent par condensation chimique de l'ester méthylique de L-phényl- alanine avec une forme active de l'acide L-aspartique N-subs- titué à l'aide d'un résidu d'un acide organique comme l'acide formique, l'acide acétique ou d'autres (brevet français n 2 040 473); on connaît aussi une synthèse enzymatique entre l'ester méthylique de Lphénylalanine et un dérivé d'acide L-aspartique N-substitué (brevet belge n 882 603), comme le benzyloxycarbonyle, le butyloxycarbonyle, etc., effectuée dans un milieu non aqueux à l'aide d'un enzyme appellé métalprotéinase. Le procédé intermédiaire obtenu soit par le procédé chimique, soit par la synthèse enzymatique, c'est-à-dire l'ester méthylique de L-oc-aspartyl-lphénylalanine N-substitué, peut être isolé du milieu en réaction soit par concentration jusqu'à cristallisation soit par extraction soit par d'autres processus; le composé est hydrolysé ensuite pour l'élimina- tion du groupe protégeant N pour l'obtention de l'ester méthylique L-taspartyl-L-phénylalanine ayant des propriétés édulcorantes 200 fois plus élevées que celles du saccharose. Les procédés connus utilisés pour éliminer les groupes protégeant N consistent principalement en une hydro- lyse chimique acide ou basique. Par exemple, la suppression de la protection de N est effectuée soit en présence d'un acide fort (brevet américain n 4 071 511) soit en présence de bases, comme l'hydroxylamine ou l'acétylhydrazine (brevet américain n 4 021 418 et brevet britannique n 2 098 220). Comme mentionné précédemment, ces processus chimi- ques de désacylation ont de nombreux inconvénients au point de vue industriel, par exemple de faibles rendements, des réactifs coûteux en plus du fait que le produit obtenu doit être purifié de manière répétée en vue de l'élimination des divers sous-produits provoquée par l'estérification du groupe carboxy libre ou par l'hydrolyse de l'ester ou de la liaison peptidique. Les inconvénients et les limites de l'hydrolyse chimique du groupe protégeant N des alkylesters de dipeptide, comme l'ester méthylique de Lcc-aspartyl-L-phénylalanine, sont surmontés par l'hydrolyse enzymatique selon le procédé de l'invention. Les enzymes préférés ayant une action de désacyla- tion sont produits par des microorganismes comme les suivants: Penicillium, Streptomyces, Aspergillus, Escherichia Coli, Nocardia, Proteus, purifiés à l'aide de méthodes particu- lières pour en éliminer les activités enzimatiques indésira- bles, par exemple L'activité estérasique qui s'exercerait sur le produit à hydrolyser, c'est-à-dire sur l'ester méthylique L-C-aspartyl-L-phénylalanine N-substitué, en vue de parvenir - à l'aspartam déméthylé. Les enzymes ci-dessus sont immobilisés par des méthodes convenables sur des résines ou d'autres substrats appropriés afin de rendre plus économique le procédé en utilisant le même enzyme immobilisé pour de nombreux cycles de préparation. Les mêmes résultats décrits ci-dessus peuvent être obtenus évidemment à l'aide d'un enzyme non immobilisé. Les enzymes ainsi préparés et choisi.s sont ajoutés à une solution aqueuse ou modérément tamponnée à différents pH selon l'enzyme utilisé, c'est-à-dire dans une gamme de 2 à 9, de préférence de 5 à 7, et en présence d'un dérivé N-acyle d'aspartam à la concentration de 0,2 à 260 g/l, ayant la formule (I) suivante: COOR1 I. R-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH2-C6H5 2 6 5 CH2-COOH (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkényle ou phénylalkyle libre ou substitué ayant de 1 à 11 atomes de carbone, choisi dans le groupe composé de: -CH3, -(CH2)nCH o n est un nombre de 1 à 10, -C6H5, -CH2-C6H5, -CH2-C6H4-OH, -CH2 -C6H4-N02, -C6 H3(OCH 3)2 -CH -C H(OH) -CH -CH=CH-CH CH -CH CH-CH -CHl=CH 2 6 3()2' 2 2 3 H2 2 2'- -CH2-0-R' o R' est choisi dans le groupe composé de: -C6H5, -CH3, C (CH2)m-CH o m = 1:5, -C6H4-CH3, -CH 6H4-OH; et R1 est un alkyle inférieur C1-C4. La réaction est effectuée à une température de.10 à 60 C, de préférence de à 40 C, pendant une durée de 1 à 48 heures, en charge individuelle ou en colonne selon la-quantité d'enzyme présent dans le méLange en réaction et le rapport entre la quantité d'enzyme en solution ou sous forme immobilisée et la quantité de dipeptide N-substitué présent dans le mélange en réaction. Les rendements des réactions effectuées dans les conditions optimales atteignent des valeurs supérieures à 80% rendant superflus des processus compliqués et coûteux de récupération des composés qui n'ont pas réagi ou des sous- -produits indésirables, ce qui est couramment nécessaire quand la réaction d'hydrolyse du groupe protégeant N de l'aspartam est effectuée par un procédé chimique. L'aspartam ainsi obtenu est extrait selon les processus techniques connus. Les exemples qui suivent et les modes de prépara- tions qui sont donnés illustrent l'invention sans intention limitative de sa portée. Les N-acyl-dérivés dont la préparation n'est pas spécifiquement indiquée ont été obtenus à des rendements élevés par des opérations telles que décrites dans les prépa- rations A, B, C et D qui suivent et par l'emploi comme matière de départ d'un dérivé convenable pour l'acylation. Preé2ration A ester me ylge. de N-ehényla cétX l-L- X artXl-L-2hénXl-_ alanine On a mis en-suspension 66,6 g d'acide L-aspartique dans 100 ml de H20. On a ajouté NaOH à 10% (200 ml) et on a refroidi le mélange à 15 17 C; on a laissé tomber goutte à goutte pendant 1 heure en même temps une solution de NaOH à % (100 ml) et du chlorure de phénylacétyle (70 ml). Le mélange a été conservé pendant 3 heures à 20 C et puis-on y a ajouté de l'acide chlorhydrique à 37% jusqu'au pH 2. Après refroidissement à 0 - 5 C et filtration le mélange en réaction a été séché pour l'obtention d'acide N-phényl-acétylaspartique (120 g), titre 99,77%. On a mis en suspension 78 g de N-phénylacétyl- -aspartique dans 80 ml d'anhydride acétique. Le mélange a été chauffé à 80 pendant 2 heures. On a obtenu 70 g d'anhydride de N-phénylacétyl-aspartique après refroidissement et insolu- bilisation à l'aide d'un solvant. A 52 g d'anhydride de N-phénylacétylaspartique en suspension dans 52 ml d'acide acétique glacial et 100 ml de dichloro-éthane refroidis à C on a ajouté 200 ml de dichloroéthane contenant 40,2 g d'ester méthylique de phénylalanine. Après extractions avec une base en ajustant le pH à une valeur acide et par filtration on a obtenu 85 g du composé indiqué en titre. úé2rat ion B ester méthzligue de N-hénoxhL-: -as2partXl-L-hénhla lanine En opérant comme décrit à la préparation A, mais en partant de 77,2 g de chlorure de phénoxy-acétyle au lieu de chlorure de phényl-acétyle, on a obtenu 110 g du composé indiqué en titre. E!paration C est--er méh ig ue de N- -h droxy hénylacét Xl:L-OC t-as art 1- En opérant comme décrit à la préparation A, mais en partant de 60,4 g de chlorure de p-hydroxyphénylacétyle, on a obtenu 70,7 g du composé indiqué en titre. Préparation D ester méthy kdeyNiZi:_aaúz:lalaniedene En opérant comme décrit à la préparation A mais en partant de 41,8 g de chlorure de propionyle au lieu de chlorure de phénylacétyle, on a obtenu 33,8 g du composé indiqué en titre. Les composés d'enzymes acylases ont été obte- nus par fermentation à l'aide des microorganismes mentionnés ci-dessus dans des bouillons de culture spécifiques. Púéparation E EnzXmeaclaseprovenant de E. Coli ATCC 11105 Le microorganisme a été mis en fermentation dans un bouillon de culture composé d'extrait de levure, de glutamate de sodium, d'acide phénylacétique, de sels d'ammoniac,_ tamponnée pour garantir un pHinitial de 6,8-6,9. La croissance optimale a été obtenue en 10-12 heures avec un poids de cellules séchées de 300-400 mg/100 ml de bouillon. Quand la fermentation a été terminée, les cellules ont été séparées par centrifugation, lavées et soumises à un traitement de lyse avec de l'acétate de n-butyle. Le lysat a été soumis à floculation, clarifié et soumis à ultrafiltration. Le concentré obtenu par ultrafiltration sélective a été salé à l'aide de (NH4)2SO4. Le composé salé consistait en une acylase stable ayant une activité de 600-900 U/ml. EXEMPLE 1 On a fait dissoudre 2 -g d'ester méthylique de N-phénylacétyl-L-aspartylL-phénylalanine (obtenu selon la préparation A) dans 100 ml d'eau avec des additions progres- sives de NaOH 10%, en maintenant le mélange en agitation à 37 C et à un pH inférieur à 7,5. Quand la dissolution a été terminée, on a ajouté NaOH 1N ou HCl 1N pour stabiliser le pH à la valeur 6,5-6 et on a ajouté au mélange 0,5 g de l'enzyme ayant une activité acylasique de 50 U/g, obtenu par immobili- sation du composé de la préparation E sur un substrat solide, par adsorption sélective et réticulation à l'aide de glu- taraldéhyde, en présence d'albumine. On a laissé le mélange réagir pendant 23 heures, chauffé à 37 C, avec agitation, et on a maintenu le pH à 6 0,5 par addition de NaOH 1N; à la fin de la réaction l'en- zyme immobilisé a été séparé par filtration, sous vide, à 1 1 travers un filtre en verre et Lavé à L'aide de 100 mL d'eau. Le filtrat et les liqueurs de Lavage ont été combinés et La solution a été analysée par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) indiquant un rendement d'hydrolyse de l'ester phénylique de phénylacétylL-ac-aspar- tyl-L-phénylalanine de 90% de la valeur théorique, avec seulement 5% de composé n'ayant pas réagi et 5% de produits indésirables. L'aspartam obtenu a été extrait ensuite et cristallisé conformément à des procédés de préparation convenables à partir de solutions aqueuses à faible teneur en sel, et l'acide phénylacétique Libre a été récupéré par extraction à l'aide de solvants ou adsorption sur des résines et utilisé à nouveau pour des préparations supplémentaires. EXEMPLE 2 On a fait dissoudre 2 g de l'ester méthylique de N-phénoxyacétyl-Laspartyl-L-phénylalanine obtenu selon la préparation B dans 100 ml d'eau chauffée à 35 C avec addition de NaOH 10% et maintien du pH à une valeur non supérieure à 7,5. Après solubilisation le pH a été ajusté à 6 et on a ajouté 0,5 g de l'acylase Novozym 217 à 60 U/g, l'enzyme étant immobilisé sur un substrat insoluble convenable. Le méLange a été laissé en réaction pendant 24 heures à 35 C, avec agitation et maintien du pH à 6 0,5 par addition de NaOH 1N; l'enzyme immobilisé a été récupéré ensuite par filtration à travers un filtre en verre et lavé à l'aide de 10 ml d'eau. Le filtrat et les liqueurs de lavage ont été- combinés et la solution a été soumise à chromatographie (HPLC) avec un rendement de 93% de la valeur théorique. EXEMPLE 3 La réaction a été exécutée comme décrit à l'exem- ple 1, sauf que l'enzyme était adsorbé sur une résine échangeuse d'ions et insolubilisé par réticulation eh présence de gluteraldéhyde et d'une diamine selon des méthodes connues (Haynes R.; Biochem. Biophys. Res. Commun 36, 235 (1969)). Le- composé ayant une activité de 16 U/g a été utilisé à la quantité de 2 g pour 1QO mL d'une solution à 2% d'ester méthylique de N-phénylacétyl-Laspartyl-L-phénylalanine. Les rendements de la réaction ont été de 80% après 22 heures de réaction. EXEMPLE 4 La réaction a été exécutée comme décrite à l'exem- ple 1, sauf que l'enzyme a été insolubilisé par greffage sur des fibres d'acétate de cellulose selon des méthodes connues (Dinelli D., Process Biochem 718,9, 1972). Le composé avait une activité de 10.000 U/g et on a utilisé 1 g de fibre pour obtenir 90% de transformation dans les conditions mentionnées à l'exemple 1. EXEMPLE 4 Bis La réaction a été exécutée comme décrit à l'exem- ple 1, sauf que l'enzyme a été insolubilisé sur des particu- les de verre poreux avec des fonctions aminiques primaires par activation avec du gluteraldéhyde et une liaison covalente de l'enzyme sur'un intermédiaire carbonylique. Le composé avait une activité de 25 U/g et on a utilisé 2 g de l'enzyme immobilisé pour obtenir 75% de trans- formation aux conditions décrites.à l'exemple 1. EXEMP LE 5 La réaction a été exécutée comme déec-rite à l'exem- ple 1, sauf que l'enzyme de.préparation E a été utilisé sous forme soluble. A 100 ml d'une solution à 2% d'ester méthyli- que de N-phénylacétyl-L-aspartyl-L-phénylalanine on a ajouté U d'enzyme extrait de bouillons de culture de E. Coli. Le mélange a été maintenu en réaction pendant 8 heures à 37 C - et au pH 6-6,5 en procurant à ces conditions un rendement en produit désiré de.87% par rapport à la valeur théorique. EXEMPLE 6 - On.-a fait dissoudre 3 g de l'ester -méthylique de N-phydroxyphénylacétyl-L-aspartyl--L-phénylaLanine (obtenu seLon la préparation C) dans 100 ml d'eau, on a ajusté le pH à 6 et on a chauffé la solution à 40 C puis on a ajouté 1 g d'acylase (pénicillinacylase) de E. Coli adsorbée sur une résine échangeuse d'ion et ayant une activité de 40 U/g. Le mélange en réaction a été maintenu en agitation à 40 C au pH 5,5-6,5, pendant 20 heures: l'enzyme immobilisé a été séparé ensuite par filtration, le mélange en réaction a été soumis à analyse chromatographique (HPLC) et a montré une quantité d'aspartam produit par l'hydrolyse enzymatique de 82% de la valeur théorique. EXEMPLE 7 Comme décrit à l'exemple 6, sauf que l'enzyme utilisé a été obtenu par extraction du bouillon de culture de Nocardia et utilisé sous forme soluble. En exécutant la réaction aux conditions décrites, l'ester méthylique de N-p-hydroxyphénylacétyl-L-aspartyl-L- -phénylalanine a été transformé en aspartam avec un rendement de 50% de la valeur théorique. EXEMPLE 8 Comme décrit à l'exemple 1, sauf que l'enzyme immobilisé utilisé a été obtenu par extraction à partir d'un bouillon de culture de Proteus, ayant une activité de 25 U/g, et a été utilisé en quantité de 1 g/100 ml du mélange en réaction. Le rendement en aspartam obtenu dans ces conditions a été de 48% de la valeur théorique. EXEMPLE 9 On a fait dissoudre 3 g de l'ester méthylique de N-propionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine obtenu selon la prépa- ration D dans 100 ml d'eau, la solution a été chauffée à 37 C et le pH ajusté à 6,5. Au mélange en réaction on a ajouté 300 U/g du composé enzymatique qui avait été obtenu par extraction et purification selon les méthodes connues à partir du bouillon de culture de E. Coli. Le mélange en réaction a été maintenu en agitation pendant 24 heures à la température indiquée, maintenue au pH 6,5 0,5: Le rendement final en aspartam a été meilleur que % de la valeur théorique. EXEMPLE 10 En opérant comme décrit à l'exemple 9, sauf qu'en remplacement de l'ester méthylique de N-propionyl-L-aspartyl- -L-phénylalanine la préparation enzymatique ayant une activité acylasique a été mise à réagir au pH 6 1 sur une solution contenant 0,5 g/l de N-undécylcarbonyl-L-aspartam; le rende- ment de l'hydrolyse a été de 30% de la valeur théorique. EXEMPLE 11 On a fait dissoudre dans 100 ml d'eau chauffée à 37 C 2 g d'ester méthylique de N-formyl-L-aspartyl-L-phényl- alanine. Quand la dissolution a été terminée, on a ajusté le pH à 6,5-7 à l'aide de NaOH 10%, on a ajouté 250 U d'un composé enzymatique ayant une activité acylasique obtenu d'une culture de Pseudomonas. On a laissé réagir pendant 36 heures à 37 C. On a ajusté le pH à 4-4,5 et on a séparé le composé par concentration. Le rendement en ester méthylique de L-OCaspartyl-L-phénylalanine a été de 20% de la valeur théorique. EXEMPLE 12 On a opéré comme à l'exemple 2, sauf qu'on a utilisé un enzyme ayant une activité de 18.000 U/g obtenu d'un bouillon de culture d'Aspergillus, à une concentration de 2% de celle de N-phénoxyméthyl-L-aspartam, avec un rende- ment d'hydrolyse de 20% de ta valeur théorique. EXEMPLE 13 On a opéré comme décrit à l'exemple 1, sauf que l'enzyme n'a pas été isolé mais les cellules ont été immobi- lisées globalement: on a mis en suspension dans 5 ml d'un tampon phosphaté 50 mM, pH 7,5, 1 g de cellules humides obtenues à partir d'une culture de E. Coli. On a ajouté à la solution 0,5% d'albumine de boeuf et 1% de glutaraldéhyde. Après 2 heures à la température de la pièce les granulés obtenus ont été séparé.s par filtration et lavés à l'aide d'un tampon phosphaté 50 mM. Le composé utilisé avait une activité de 14 U/g et a été employé en quantité de 2 g pour 100 ml d'une solution à 2% d'ester méthylique de N-phénylacétyl-L-aspartyl-L-phényl- alanine. Les rendements de la transformation apr'ès 8 heures d'incubation à 37 C ont été de 65% de la valeur théorique. *EXEMPLE 14 On a opéré comme décrit à l'exemple 2, sauf que l'enzyme n'a pas été isolé et que la masse du mycélium obtenu à partir d'une culture de Streptomyces a été immobilisée. Le processus de liaison a été analogue à celui décrit à l'exemple 13. La masse de mycélium réticulé a été séparée par filtration, lavée à l'aide d'eau et liophylisée. Le composé liophylisé a été trituré grossièrement et utilisé pour sélective l'hydrolyse t di v'ester méthylique de N-phénoxyacétyl-L- -aspartyl-L-phénylalanine. 2 g du composé ayant une activité de 12 U/g ont été utilisés pour 100 ml d'une sol.ution à 2% du produit à hydrolyser. Les rendements de la transformatiîonhaprès 8 heures -25 d'incubation à 37 C ont été de 60% de la valeur théorique. EXEMPLE 15 On a ajouté à 100 ml d'eau chauffée à 37 C 1 g d'ester méthylique de N-propoxy-acétyl-L-aspartyl-L-phényl- alanine. Le produit -a été mis en solution avec réglage du pH à 6 à l'aide de NaOH 10%. Au mélange en réaction on a ajouté 250 U du composé enzymatique ayant une activité acylasique obtenu d'une culture deCephalosporium. On a laissé le mélange réagir pendant 20 heures à 37 C.' A. la fin de la réaction enzymatique le rendement a été de 45% de la valeur théorique. EXEMPLE 16 On a fait dissoudre 1 g d'ester méthylique de N-tolyloxyacétyl-L-aspartylL-phénylalanine dans 100 ml de H20 et on a ajouté progressivement NaOH 10% jusqu'au pH 6-7. On a ajouté au méLange 250 U d'un composé enzymatique ayant une activité acylasique obtenu de cultures d'Actinoplanes Utahensis. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 24 heures. Le rendement de l'hydrolyse du dérivé N-toLyloxy- méthyle a été de 40% de La valeur théorique. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un ester alkyli- que inférieur C1-C4 de L-O-aspartyl-L-phénylalanine, caracté- risé en ce qu'un dérivé N-acyLé de formule I: COOR1 I R-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH -C H5 I 2 65 CH2-COOH (I) dans laquelle R représente un groupe alkyle, alkényle ou phénylalkyle libre ou substitué ayant de 1 à 11 atomes de carbone et R1 représente un alkyle inférieur C1-C4, est hydrolysé de manière enzymatique après quoi l'ester inférieur de L-C-aspartyl-L-phénylalanine-est extrait et isolé. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ester alkylique inférieur de L-O-aspartyl-L-phényl- alanine est l'ester méthylique ayant la formule: COOCH3 H2N-CH-CO-N-H-CH-CH2-C6H5 CH2-COOH 3. Procédé selon les revendications 1 et 2 carac- térisé en ce que R est choisi dans le groupe composé de: H, -CH3, -(CH2) nCH3 o n est un nombre de 1 à 10, -C6H5, -CH2-C6H5, -CH2-C6H4-OH, -CH2-C6H4-N02, -C6H3(OCH3)2, -CH2-C6H3(OH)2 -CH2-CH=CH-CH -CH -CH -S-CH -CH=CH2 -CH 2-R' o R' est choisi dans le groupe composé de: -C6H5, -CH3, 6 5'- 3' -(CH2)m-CH3 o m = 1: 5, -C6H4-H C H 4-OH 4. Procédé selon les revendications 1 à 3 caracté- risé en ce que l'hydrolyse enzymatique est effectuée avec des enzymes hydrolasiques. 18 - 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les enzymes hydrolasiques sont préparés à partir de microorganismes. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe des actinomycètes, champignons et bactéries. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les actinomycètes utilisés sont du genre Nocardia, Actinoplanes et Streptomyces. 8. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les champignons utilisés sont du genre: Alternatia, Aspergillus, Botrytis, Cephalosporium, Cryptococcus, Emericellopsis, Epicoccum, Epidermophyton, Fusarium, Mucor, Penicillium, Phoma, Trictoderma, Trichophyton, Trichosporon. 9. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les bactéries utilisées sont du genre: Aerobacter, Alcaligenes, Bordetella, Cellulomonas, Corynebacterium, Erwinia, Escherichia Achromobacter, Flavobacterium, Micro- coccus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Xanthomo- nas, B. subtilis. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique est effectuée soit en présence de cellules microbiennes produisant l'enzyme désiré, soit par préparation séparée de l'enzyme et par son utilisation ultérieure sur le composé de formule (I). 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'enzyme préparé séparément est isolé et purifié. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 10-11 caractérisé en ce que Les cellules microbiennes ou les enzymes préparés séparément sont soit immobilisés sur un substrat inerte soit insolubilisés par un procédé de réticulation. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique du dérivé Nacylé ayant la formule (I) est effectuée en général : 19 en solution aqueuse à La concentration de 0,2 à 260 g/l, tamponnée au pH de 2 à 9, de préférence de 5 à. 7, et à la température de 10 à 60 C, de pr,éfrence de 15 à 40 C.