Brevet FR2571383A2 — publié le 19860411

FR 2571383 A2 19860411 FR 8415294 A 19841005 La présente invention concerne un perfectionnement au procédé décrit dans le brevet principal pour la prepara- tion du facteur IX (ci-après FIX) à partir de culture de cellules de mammifères. Le brevet principal décrit un procédé de préparation du facteur IX utilisant comme vecteur d'expression de cette protéine le virus de la vaccine. Ce vecteur est utilisé pour infecter des cultures-de cellules de mammifères, en particulier des cellules de foie HepG2. La présente invention a permis de mettre en évidence l'importance de la vitamine K dans le milieu de culture cellulaire sur l'activité du facteur IX obtenu. En outre, les expériences effectuées confirment que dans ce procédé d'autres cultures de cellules pouvaient être utilisées, en particulier des cellules de reir: telles que les cellules Vero ou les cellules BHK21. C'est pourquoi la présente addition concerne un procédé de préparation du facteur IX actif, caractérisé en ce qu'on cultive une lignée cellulaire de mammifères infectée avec un virus recombinant dénommé vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 4 du brevet principal, la lignée cellulaire infectée étant cultivée sur un milieu comportant de la vitamine K. La quantité de vitamine mise en oeuvre peut varier en fonction des cultures cellulaires mais sera, de préférence, en quantité assurant la saturation du milieu, par exemple entre 20 et 80 g/ml de milieu de culture et, en général, sera de l'ordre de 50 g/ml. Un excès de vitamine K ne semble pas nuisible et cette vitamine est consommée durant la croissance. Les milieux de culture en eux-mêmes sont connus. Ainsi lorsque les cellules utilisées sont des cellules dérivant de reins telles que les cellules Vero, le milieu utilisé peut être le milieu Dulbecco; pour les cellules BHK21 le milieu est MEM-Galsgow; pour les cultures dérivant de foies telles que Chang on utilisera un milieu MEM. Ces milieux sont, de préférence, additionnés de 10 % de sérum de veau foetal. L'invention concerne enfin le facteur IX obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer la présente invention mais ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1 Les procédés expérimentaux sont similaires à ceux déjà décrits dans le brevet principal. Ainsi, des tapis de cellules confluentes ont été infectés soit avec le virus sauvage soit avec le virus recombinant (1 à 5 pfu/cellule) dans les conditions décrites dans le brevet principal. L'infection de cellules (c'est-à-dire la multiplication du virus dans les cellules) a été accomplie 22 heures dans les milieux de culture MEM (Chang), Dulbecco (Vero), MEM-Galsgow (BHK2î) supplémentés avec 10 % de sérum de veau-foetal. Ces milieux sont en outre additionnés de vitamine K (n V3501, catalogue Sigma) à raison de 50 g/ml. Après l'infection, les milieux de culture ont été fractionnés comme décrit dans le brevet principal. Le tableau A ddcrit les résultats obtenus. Ils sont exprimés en unité et non en pourcent comme décrit pour les cellules HepG2. Une unité représente la quantité de facteur IX dans 1 ml de plasma humain normal. Tableau A Etude du facteur IX produit dans plusieurs lignées infectées par W RTG2 Lignée BHK21 Vero Chang Virus WT : CII WT : CII WT : CII Volume initial milieu 53 55 40 40 30 30 de culture Volume fraction non adsorbée sur Barium 5 5 3,6 3,8 7 5 (FI) (mol) Volume fraction absor- bée sur Barium (FII) 0,6 0,5 0,65 0,40 0,45 0,26 (ml) Quantité antigène dans 0,05 1,45 4 0,02 0,15 s 0,07 0,10 FI (U) Quantité antigène dans 0,02 3,65 # 0,02 1,09 # 0,02 0,58 Fil (U) Quantité activité dans 0,01 4,55 # 0,02 1,07 0,16 0,73 FII (U) Les résultats montrent que les trois lignées cellulaires infectées par le virus recombinant peuvent produire du facteur IX actif. EXEMPLE 2 Cas des cellules HepG2 Les cellules HepG2 ont été cultivées pendant 12 à 15 générations (4 passages) dans du milieu MEM supplémenté avec 1 % de sérum synthétique Ultroser G, commercialisé par IBF (nO catalogue 50902), ce milieu était supplémenté ou pas avec la vitamine K. Les cellules ont ensuite été infectées avec les virus. Les résultats obtenus sont rassemblés au tableau B. Tableau B Effet de la vitamine K sur la synthèse du facteur IX dans les cellules HepG2 infectées par VVRTG2 Virus VVRTG2 WT VVRTG2 Sérum Ultroser G Ultroser G SVF Vitamine K + - + - + Volume milieu culture 10 10 10 10 10 10 (ml) Quantité Ag fraction non adsorbée sur 0,02 0,26 40,01 40,01 0,08 0,92- barium (U) Quantité Ag fraction adsorbée sur barium (U) 1,54 0,98 40,02 40,02 1,8 1,6 Activité fraction adsorbée sur barium (U) 0,36 0,04 0,04 ~ ~ Ce tableau B montre que les cellules cultivées et infectées en présence de vitamine K produisent du facteur IX actif y carboxyle. En revanche, les cellules cultivées et infectées sans supplément de vitamine K produisent un facteur IX moins y carboxylé : la fraction non absorbée sur barium contient une quantité importante d'antigène facteur IX. De plus l'activité coagulante dans la fraction absorbée sur le barium est très inférieure au niveau attendu compte tenu de la quantité d'antigène. Un effet similaire est noté lorsque les cellules sont cultivées dans le milieu normal : si la vitamine K est omise au cours de l'infection la fraction non adsorbée sur le barium contient notablement plus d'antigène facteur EXEMPLE 3 Effet sur les cellules Vero Les cellules Vero cultivées dans le milieu Dulbecco, additionné de sérum de veau foetal (10 %) ont été infectées avec le virus VVRTG2 ou sauvage. La multiplication des virus a été accomplie dans ce même milieu, éventuellement supplémenté en vitamine K. Les résultats obtenus sont rassemblés au tableau C. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation du facteur IX actif, caractérisé en ce qu'on cultive une lignée cellulaire de mammifère infectée avec un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 4 du brevet principal, la lignée cellulaire infectée étant cultivée sur un milieu comportant de la vitamine R. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lignée cellulaire est choisie parmi les cellules de rein ou les cellules de foie. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la lignée cellulaire est choisie parmi les cellules Vero, BHK21 ou Chang. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la quantité de vitamine K ajoutée est telle qu'elle assure la saturation du milieu de culture. Tableau C Effet de la vitamine K sur la synthèse du facteur IX dans les cellules Vero infectées avec le virus WRTG2 Virus WRTGL WT W RTG2 Temps d'infection 12 22 38 22 22 Vitamine K (supplément) - - - + + Volume'milieu de 20 20 10 40 40 culture (ral) Quantité Ag fraction non 0,86 1,06 0,73 0,04 0,30 adsorbée sur barium (U) Quantité Ag fraction adsorbée sur barium (U) 0,18 0,20 0,22 40,01 1,09 Activité fraction absorbée 0,21 0,08 0,08 40,02 1,07 sur barium (U) Le tableau C montre que l'addition de vitamine K dans le milieu de culture est très importante pour l'activité du facteur IX produit. On peut noter que l'importance de ce supplément de vitamine est d'autant plus important que le temps d'infection est long. L'ensemble de ces résultats montre l'importance du supplément de vitamine K dans les milieux de culture des cellules infectées.