Brevet FR2569421A1 — publié le 19860228

La présente invention concerne un plasmide contenant un gène pour la résistance à la tétracycline. Plus particulièrement, la présente invention concerne un plasmide comprenant un gène pour la résistance à la tétracycline et un gène pour la réplication qui sont dérivés d'une bactérie corynéforme produisant un acide glutamique. La présente invention concerne également un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et un microorganisme contenant le fragment d'ADN. Dans ce texte, endonucléases de restriction (ci-après mentionnées simplement "enzyme de restriction") représentées par les abréviations suivantes sont des endo- nucléases de restriction respectivement obtenues à partir des microorganismes suivants. Abréviation Microorqanisme EcoRI: Escherichia coli RY13 HindIII: Haemophilus influenza Rd PstI: Providencia stuartii 164 BamHI: Bacillus amyloliquefaciens H XbaI: Xanthomonas badrii BglII: Bacillus qlobiqii SalI: Streptomyces albus G HaeIII: Haemophilus aeqyptius Conventionnellement, il est connu qu'une bactérie corynéforme produisant de l'acide glutamique produit l'acide L-glutamique avec un rendement élevé et qu'un certain mutant ou variant de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique produit d'autres acides aminés tels que L- lysine, et des nucléotides de purine tels qu'un acide inosinique. Une telle bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et un mutant ou variant de celle-ci ont été utilisés de façon industrielle pour l'obtention d'acides aminés et de nucléotides de purine comme mentionné ci-dessus. Pour obtenir la bactérie corynéforme sous une forme telle qu'elle soit susceptible de produire les produits désirés efficacement avec un rendement élevé, on réalise habituellement la'culture de la bactérie corynéforme. Particulièrement dans les années récentes, la culture de bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique par transformation de la bactérie avec un vecteur contenant un codage génétique pour un certain peptide choisi pour l'obtention de l'acide aminé désiré a été entreprise en utilisant la technique de l'ADN recombi- nant. Pour obtenir effectivement la transformation de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique au moyen de la technique de recombinaison d'ADN, il est nécessaire d'utiliser un vecteur convenable pour la trans- formation. Par conséquent, des études variées ont été faites sur un tel vecteur tel qu'un plasmide et un phage. En tant que plasmide, on connaît ceux qui sont obtenus à partir de bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique, tels qu'un plasmide pCG1 (demande de brevet japonais N 57- 134500), un plasmide pCG2 (demande de brevet japonais N 58-35197), un plasmide pCG4 (demande de brevet japonais N 57-183799), des plasmides pAM330 et pAM286 (demande de brevet japonais N 58-67699) et un plasmide pHM1519 (demande de brevet japonais N 58-77895). Cependant, la plupart des plasmides précités n'ont pas de gène utile comme marqueur sélectif. En effectuant la recombinaison génétique, afin de sélectionner une bactérie transformée avecun vecteur recombinant, il est nécessaire que le vecteur recombinant ait un gène utile en tant que marqueur sélectif, tel qu'un gène pour une résistance aux médicaments. Pour cette raison, les plasmides précités ont fait défaut dans l'utilisation pratique. Afin de sur- monter les inconvénients précités, des plasmides variés ayant un gène pour une résistance aux médicaments en tant que marqueur sélectif ont jusqu'à présent été proposés. Par exemple, comme plasmide ayant un gène pour une résis- tance aux médicaments et dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, les plasmides suivants ont été proposés. (1) Plasmide pCGll: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour les résistances à la streptomycine et à la spectinomycine lequel gène est dérivé d'un plasmide pCG4 d'une bactérie appartenant à Corynebacterium (demandesde brevetsjaponais N s 57-183799 et 58-105999). (2) PlasmidespCBlO1 et pEthrl: Les plasmides ont comme marqueur sélectif un gène pour des résistances à la streptomycine et à la spectinomycine lequel gène est dérivé du plasmide pCG4 précité (Demande de brevet japonais N 58-105999). Comme mentionné ci-dessus, tous les plasmides pCGll, pCBlO1 et pEthrl ont communément un gène dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique en tant que marqueur sélectif, c'est-à-dire un gène pour les résistances à la streptomycine et à la spectinomycine. En d'autres termes, en ce qui concerne un marqueur sélectif dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, seul le gène pour les résistances à la strepto- mycine et à la spectinomycine est connu. En général, comme mentionné ci-dessus, afin de sélectionner de façon sûre une bactérie qui a été trans- formée avec un plasmide recombinant, un marqueur sélectif est nécessaire. D'autre part, pour être facilement sûr que le plasmide recombinant qui est contenu dans la bactérie transformée a un codage génétique pour un certain peptide désiré pour la production de l'acide aminé attendu (peptide désiré), il est nécessaire que le plasmide contienne un autre marqueur sélectif. Si un plasmide contenant de tels types de marqueurs sélectifs, c'est-à-dire un gène pour une résistance à un premier médicament et un gène pour une résistance à un second médicament, est utilisé, un transformant destiné peut être sélectionné facilement et séparé. A titre illustratif, un tel plasmide ayant les deux types de marqueurs sélectifs est traité avec une enzyme de restriction spécifique de telle façon que le plasmide soit scindé en une position intermédiaire du gène pour une résistance au premier médicament. Le plasmide scindé ainsi obtenu est mélangé avec un gène pour le peptide désiré et soumis à incubation. Durant l'incubation, certains des plasmides scindés sont forcés à avoir un gène pour le peptide désiré en insertion entre les deux extrémités de la scission du plasmide, et certains des plasmides scindés sont forcés à être religaturés à leurs deux extrémités de la scission du plasmide. Dans le premier cas, le gène pour une résistance au premier médicament est inactivé (inactivation par insertion), de telle sorte que lorsque le plasmide recombinant ayant le O10 gène pour le peptide désiré est utilisé pour transformer une bactérie, la bactérie transformée obtenue qui contient le plasmide recombinant ayant le codage génétique pour le peptide désiré n'est plus résistante au premier médicament, c'est- à-dire, sensible au premier médicament mais résistante au second médicament. Dans le dernier cas, le plasmide résultant présente un gène non scindé pour la résistance au premier médicament et, par conséquent, lorsqu'un tel plasmide est utilisé pour transformer une bactérie, la bactérie transformée obtenue est résistante à la fois au premier et au second médicament. A cet égard, il est notable qu'après l'opération de transforma- tion, le produit résultant comprend, en plus de la bactérie transformée sensible au premier médicament maisz résistant au second médicament et la bactérie résistant à la fois au premier et au deuxième médicament, une bactérie qui n'a pas été transformée avec l'un des deux types de plasmides précités et donc sensible à la fois au premier et au second médicament. En conséquence, des trois types précités de bactéries dans le système de transformation, la bactérie -transformée avec le plasmide recombinant ayant le gène pour le peptide désiré peut être facilement sélectionnée et séparée par les critères de la résistance au premier médicament et de la résistance au second médicament. A cet égard, on doit noter que pour obtenir la sélection et la séparation aisées de la bactérie transformée avec le plasmide recombinant ayant le gène pour le peptide désiré, comme décrit ci-dessus, il est nécessaire d'employer deux types de marqueurs sélectifs. Cependant, en tant que marqueur sélectif dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on ne connaît seulement qu'un gène, c'est-à-dire, le gène pour les résistances à la streptomycine et à la spectinomycine. Avec ce seul marqueur sélectif, la sélection aisée de la bactérie transformée qui contient un plasmide ayant le codage génétique pour le peptide désiré ne peut être obtenue. Dans une telle situation, on a proposé d'utiliser, en tant que second marqueur sélectif ayant une résistance à un médicament autre que la streptomycine et la spectinomycine, un gène dérivé d'une autre bactérie qu'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. En tant que plasmide contenant un tel gène différent, les plasmides suivants ont été mentionnés. (1) Plasmide pCE54: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour la résistance à la tétra- cycline, un gène pour la résistance au chloramphénicol et un gène pour la résistance à la kanamycine lesquels gènes sont tous dérivés de l'Escherichia coli (demandes de brevetsjaponais N0s 58-105999 et 58-126789). (2) Plasmide pCB101: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour la résistance à la kanamycine qui est contenu dans un plasmide pUBllO dérivé d'une bactérie appartenant à Staphylococcus (demande de brevet japonais NO 58-105999). (3) Plasmide pEthrl: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour l'expression de l'opéron de thréonine lequel gène est dérivé de l'Escherichia coli. L'utilisation du plasmide est limitée à la transformation d'une culture thr de bactéries corynéformes (demande de brevet japonais N 58-105999). (4) PLasmide pAJ43: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour la résistance au chloramphénicol lequel gène est dérivé d'un plasmide pBR325 de l'Escherichia coli (demande de brevet japonais N059-120090). 2 69421 (5) Plasmide pAJ655: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour la résistance au chloramphénicol lequel gène est dérivé d'un plasmide pBR325 de l'Escherichia coli (demandes de brevets japonais N s 58-216199 et 59-120090). (6) PLasmides pAJ440 et pAJ3148: Le plasmide a en tant que marqueur sélectif un gène pour la résistance à la kanamycine lequel gène est dérivé d'un plasmide pUBllO d'une bactérie appartenant à Staphylococcus (demande de brevet japonais N 58-216199). Cependant, les seconds marqueurs contenus dans les plasmides précités ont les inconvénients suivants. Les seconds marqueurs sensibles précités sont dérivés de bactéries autres qu'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, c'est-à-dire, les marqueurs sont hétérogènes pour la bactérie corynéforme et, par conséquent, lorsqu'un tel marqueur hétérogène est utilisé en tant que second marqueur pour un système hôte- vecteur utilisant comme hôte une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, le marqueur hétérogène n'agit pas suffisamment et la résistance aux médicaments n'est pas accrue à un degré suffisant. Par exemple, lorsque le gène pour la résistance à la tétracycline du plasmide précité pCE54, lequel est dérivé de E. coli, est utilisé comme marqueur sélectif pour un système hôte-vecteur utilisant, comme hôte, E. coli auquel le gène pour la résistance à la tétracycline du plasmide pCE54 est homogène, la concentra- tion minimum en tétracycline d'un milieu à laquelle la croissance de E. coli est inhibée (concentration minimum en tétracycline d'inhibition de croissance) est accrue à une valeur aussi élevée que 10)>g/mt. Cependant, lorsque le gène précité pour la résistance à la tétracycline qui est dérivé de E. coli est utilisé comme marqueur sélectif pour un système hôte-vecteur utilisant comme hôte une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique relati- vement auquel le gène précité pour la résistance à la tétracycline est hétérogène, la concentration minimum en tétracycline à laquelle la croissance de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est inhibée est seulement accrue de 0,1lj.g/mQ à 3,2p._-g/mQ. Pour une concentration en tétracycline aussi faible que 3,2 y._g/m Q, la sélection de bactéries transformées ne peut être obtenue de façon suffisante et il y a un risque que la bactérie transformée sélectionnée soit contaminée avec une bactérie non transformée. Pour ces raisons, la culture d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique n'est pas effectuée en fait de façon conven- tionnelle. Afin de surmonter le problème précité les présents inventeurs ont réalisé des études étendues et intensives. Comme résultat, les présents inventeurs ont découvert un plasmide contenant un gène pour la résis- tance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et sont parvenus àl'isolation du plasmide et du gène, et le gène isolé est utile en tant que marqueur sélectif pour un système hôte-vecteur utilisant comme hôte une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. La présente invention a été réalisé sur la base de telles nouvelles découvertes. Par conséquent, c'est un objet de la présente invention que de fournir un plasmide contenant un gène pour une résistance spécifique aux médicaments autres qu'un gène pour la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine, qui est utile pour la culture d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par recombinaison génétique. Un autre objet de la présente invention est de fournir un fragment d'ADN contenant le gène précité pour une résistance à un médicament spécifique. Encore un objet de la présente invention est de fournir une bactérie corynéforme contenant le fragment d'ADN précité. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaltront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs de l'invention et dans -lesquels: - la figure 1 illustre la carte de restriction par scission par l'endonucléase d'un plasmide pAGl de la présente invention; la figure 2 illustre la carte de scission d'endonueléase de restriction d'un plasmide pAG3 utilisé dans la présente invention; - la figure 3 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG12 de la présente invention; - la figure 4 illustre la carte de scission. d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG14 de la présente invention; - la figure 5 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG31 de la présente invention; - la figure 6 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG32 de la présente invention; et - la figure 7 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG50 de la- présente invention. Dans les figures 1 à 7, les positions dans la carte dessites de restriction variés sont données en coordonnées kilobases (référencés ciaprès "kb") relatives au site de restriction de XbaI à 0,0/20,4 kb sur la figure 1, site de restriction de HindIII en 0,0/4,8 kb sur la figure 2, site de restriction de XbaI en 0,0/10,7 kb sur la figure 3, site de restriction de XbaI en 0,0/10,7-kb sur la figure 4, site de restriction de BamHI en 0,0/8,4 kb sur. la figure 5, site de restriction de BamHI en 0,0/7,3 kb sur la figure 6 et site de restriction de BamHI en 0,0/8,0 kb sur la figure 7. Sur la figure 7, (A) est un fragment d'ADN obtenu par scission de BamHI du plasmide pAG3, et (B) est un fragment d'ADN obtenu par scission de BamHI et BglII du plasmide pAG14. De façon essentielle, selon la présente invention on a prévu un plasmide contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Le gène pour la résistance à la tétracycline représente un codage génétique pour une information généti- que telle que lorsque le gène est exprimé dans la cellule d'un microorganisme, la résistance à la tétracycline qui est un antibiotique est conférée sur le microorganisme. La bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est une bactérie Gram-positive, non mobile et aérobie qui ne forme pas une spore et nécessite la biotine pour sa croissance, et qui produit l'acide Lglutamique avec un rendement élevé dans un milieu contenant de la biotine en quantité limitée, ou dans un milieu additionné de tensio-actif contenant de la biotine en quantité élevée. Comme telle bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner les bactéries appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium ou Microbacterium. En tant que plasmide de la présente invention, on peut mentionner, par exemple, un plasmide pAG1. Le plasmide pAG1 peut être obtenu à partir du microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 qui est déposé à l'Institut de Recherche sur la Fermentation (ci-après "FRI") sous le numéro d'entrée FERM BP-560. Le plasmide pAG1 a une longueur moléculaire d'environ 20,4 kb et les sensi- bilités du plasmide pAG1 à des enzymes de restriction variés sont les suivantes: Enzyme de restriction Nombre de sites de scission EcoRI 8 HindilI 5 PstI 5 BamHI 2 XbaI 1 2S569421 Les sites de scission d'endonucléase de restriction (souvent référencés ci-après simplement "sites de restric- tion") du plasmide pAG1 sont déterminés comme suit. Premièrement, le plasmide pAG1 est complètement digéré en présence d'un excès d'une enzyme de restriction. Ensuite, les produits de digestion obtenus sont soumis à électrophorèse sur gel d'agarose 1% (p/v) et ensuite sur gel de polyacrylamide à 4% (p/v). Le nombre de sites de restriction est déterminé à partir du nombre de fragments résolvables dans le gel d'agarose et dans le gel de polyacrylamide. La longueur moléculaire de chacun des fragments scindés est déterminée comme suit. Dans le cas d'une électrophorène sur gel d'agarose, les fragments dont la longueur moléculaire est connue et qui sont obtenus par digestion d'ADN de phage de E. coli avec HindIII sont soumis à électrophorèse sur le même gel d'agarose pour former des diagrammes de migration standards des fragments obtenus par digestion d'ADN de phage X_ de E. coli, les longueurs moléculaires des fragments étant 23130 bp, 9419 bp, 6557 bp, 4371 bp, 2322 bp, 2028 bp, 564 bp et 125 bp dans l'ordre décroissant de longueur moléculaire. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion de plasmide pAG1 est déterminée relativement aux schémas de migration standards. Dans le cas d'un gel de polyacrylamide, les fragments dont la longueur moléculaire est connue et qui sont obtenus par digestion d'ADN de phage pX174 de E. coli avec HaeIII sont soumis à électrophorèse sur le même gel de poly- acrylamide, pour former ainsi des schémas de migration standards des fragments obtenus par digestion d'ADN de phage 0X174 de E. coli, les longueurs moléculaires des fragments étant 1353 bp, 1078 bp, 872 bp, 603 bp, 310 bp, 281 bp, 271 bp, 234 bp, 194 bp, 118 bp et 72 bp dans l'ordre des longueurs moléculaires. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du plasmide pAG1 est déterminée relativement aux schémas de migration standards. La longueur moléculaire du plasmide pAGl est déterminée en ajoutant les longueurs moléculaires des fragments obtenus par scission par enzyme de restriction. Les sites de restriction du plasmide pAGl peuvent être déterminés par digestion totale du plasmide pAG1 avec des catégories variées d'enzymes de restriction, en faisant l'électrophorèse des fragments d'ADN résultant sur un gel d'agarose et ensuite sur un gel de poiy- acrylamide et en analysant les résultats obtenus. Ainsi, on obtient une carte de scission par endonucléase de restriction du plasmide pAGl comme représenté sur la figure 1. Comme mentionné ci-dessus, le plasmide pAG1 est disponible à partir du microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. La Corynebacterium melassecola 22243 est une nouvelle souche isolée à partir du sol. Les propriétés microbiologiques de la souche et les caractéristiques pour déterminer le biotype de la structure sont les suivantes. (1) Caractéristiques microscopiques: Habituellement, la souche est un bacille ayant une taille de 0,5 à 1,0 lm x 0,8 à 2,0y.-m. Les cellules de la culture sont multipliées par une division brusque et montrent des agencements angulaires et en palissade (palis) et un pléomorphisme. La culture est Gram-positive et non mobile. Aucune sporulation n'est observée. (2) Couleur et caractéristiques de la culture: Des colonies formées sur de la gélose en plaque sont circulaires avec un bord distinct, opaques et lustrées. La couleur est blanc lait irisé de jaune. Sur une gélose inclinée de culture, la souche croît bien le long d'une ligne inoculée et ne donne pas d'odeur nau- séabonde. On n'observe aucune coloration sur le milieu de gélose. Dans le cas d'une culture piquée d'agar, la souche croit bien à la partie supérieure du milieu d'agar. Dans un milieu de culture liquide, le milieu devient trouble de façon homogène et un anneau est formée sur la surface du milieu. (3) Caractéristiques physiologiques: a. Température: La croissance est observée à une température de 25 0C à 37 C. b. Valeur de pH: La souche peut croître à un pH de 6 à 9. c. Résistance à la chaleur: résistant à environ 55 C pendant environ 15 minutes dans un milieu contenant 10% de lait écrémé. d. Bactérie aérobie. e. Liquéfaction de gélatine: négatif. f. Couleur du lait de tournesol: inchangée. g. Production d'indole: négatif. h. Test de Voges-Proskauer: négatif. i. Test du rouge de méthyle: positif. j. Production de sulfure d'hydrogène:négatif. k. Réduction de nitrate: positif. 1. Utilisation d'acide citrique: négatif. m. Liquéfaction d'amidon: négatif. n. Production d'uréase: positif. o. Production de catalase: positif. p. Production d'acide à partir de carbonates variés: positif pour le glucose, fructose, sucrose, maltose et mannose. Négatif pour mannitol, xylose, arabinose, raffinose et lactose. q. La biotine est nécessaire pour la croissance. r. Une quantité notable d'acide L-glutamique est produite dans un milieu contenant une quantité limitée de biotine ou dans un milieu additionné de tensio-actif contenant une quantité élevée de biotine. En ce qui concerne la souche 22243 ayant les propriétés microbiologiques précitées, son placement taxologique a été déterminé en référence à "Bergey's Manual od Determinative Bacteriology", Huitième édition, et le brevet japonais N 576690 et en faisant une comparaison avec Corynebacterium melassecola ATCC 17965 2S69421 en tant que culture type. Comme résultat, on a découvert que les caractéristiques de la souche 22243 sont prati- quement identiques à celles de Corynebaeterium melassecola. Par conséquent, la souche 22243 est identifiée comme Corynebacterium melassecola et sa terminologie est Corynebacterium melassecola 22243. Comme mentionné ci- dessus, les caractéristiques microbiologiques de Corynebacterium melassecola 22243 sont en accord avec celles de Corynebacterium melassecola. Cependant, la Corynebacterium melassecola 22243 est caractérisée par la présence du plasmide pAGl contenant un gène pour la résistance à la tétracycline. On a confirmé par les exemples de référence 1 et 2 mentionnés ci-après qu'un gène pour la résistance à la tétracycline est contenu dans le plasmide pAGl. Le plasmide pAGl peut être isolé facilement et purifié par un procédé qui comprend la soumission de la souche précitée à un traitement avec la lysozyme-SDS pour obtenir une solution de cellules lysées, la soumission de la solution de cellules lysées obtenue à un traitement avec du phénolchloroforme, la soumission de la solution ainsi obtenue à une précipitation par l'éthanol et la soumission des précipités obtenus à une centrifugation densité-gradient au chlorure de césium dans laquelle on utilise du bromure d'éthidium (voir T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sanbrook: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. 1982). Comme résultat, le plasmide pAGl est obtenu sous une forme essentiellement pure. -Le plasmide pAGi ainsi obtenu a un gène pour la réplication dans la cellule d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique en plus d'un gène pour la résistance à la tétracycline. Le gène pour la réplication signifie un gène qui est nécessaire pour qu'un plasmide soit répliqué dans une cellule pour la multiplication. Par conséquent, lorsqu'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est transformée avec le plasmide pAG1, le plasmide pAG1 est multiplié dans la cellule de la bactérie et confère la résistance à la tétracycline sur la bactérie. Le plasmide pAG1 peut être modifié du moment que le gène pour la résistance à la tétracycline et le gène pour la réplication ne soient pas abîmés. Par exemple, une partie du plasmide pAGl peut être abandonnée tandis que l'on retient le gène pour la résistance à la tétracycline et le gène pour la réplication dans le plasmide pour obtenir un dérivé d'abandon du plasmide pAG1. L'abandon partiel du plasmide peut être effectué par digestion du plasmide pAGl avec une ou plusieurs enzymes de restriction et par recuit des produits de digestion résultants. Comme exemples spécifiques de tels dérivés d'abandon, on peut mentionner les plasmides pAG12, pAG14, pAG31 et pAG32. Les plasmides pAG12, pAG14, pAG31 et pAG32 ont des longueurs moléculaires d'environ 10,7 kb, 10,7 kb, 8,4 kb et 7,3 kb, respectivement. Les cartes de scission d' endonucléase de restriction des plasmides pAG12, pGA14, pAG31 et pAG32 sont représentées dans les figures 3,4, 5 et 6, respectivement. Ci-après, des explications détaillées vont être données relativement à la préparation de chacun des plasmides précités de la présente invention. Plasmides pAG!2 et pAG14 Les plasmides pAG12 et pAG14 peuvent être préparés à partir du plasmide pAGl.Comme mentionné ci-dessus, le plasmide pAGl peut être isolé et purifié facilement par un procédé qui comprend la soumission d'une culture de microorganismes Corynebacterium melassecola 22243 à un traitement avec la lysozyme-SDS, soumission de la solution de cellules lysées obtenue à un traitement avec du phénol- chloroforme, soumission de la solution obtenue à un traitement avec précipitation par éthanol et soumission finale des précipités obtenus à centrifugation densité- gradient avec un chlorure de césium contenant du bromure d'éthidium. A partir du plasmide pAG1 ainsi obtenu qui présente huit sites EcoRI, les plasmides pAG12 et pAG14 peuvent être préparés par abandon d'une partie du plasmide pAG1 en utilisant EcoRI tout en retenant un gène pour larésistance à la tétracycline et un gène pour la réplication dans le plasmide comme suit. Premièrement, le plasmide pAG1 est digéré complètement avec une enzyme de restriction EcoRI pour obtenir un fragment d'ADN linéaire, et ensuite le fragment d'ADN linéaire ainsi obtenu est traité avec une ligased'ADN phage T4 pour former un ADN circulaire. Avec l'ADN circulaire (plasmide), des cellules de bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique sont transformées, et les cellules transformées qui ont un plasmide contenant un gène pour la résistance à la tétracycline sont choisies par le critère de la résistance à la tétracycline. Ensuite, les plasmides contenus dans les cellules sélectionnées sont analysés pour confirmer la présence du gène souhaité pour la résistance à la tétracycline et du gène pour la réplication. La trans- formation des cellules avec l'ADN circulaire précité peut être obtenue selon le procédé de transformation habituel pour Bacillus subtilis, etc., dans lequel un protoplaste est employé comme cellule hôte. Le plasmide contenu dans la souche transformée ainsi obtenue peut être isolé de la culture de la souche et purifié selon le procédé mentionné cidessus. La structure du plasmide peut être déterminée par analyse des fragments d'ADN formés par digestion du plasmide avec des enzymes de restriction variées et par soumission des produit de digestion résultants à une électrophorèse sur gel d'agarose et, ensuite, une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide. Comme résultat, on a découvert que deux types de plasmides sont obtenus. Les plasmides isolés à partir des cultures transformées sont désignés par pAG12 et pAG14, respectivement. Les figures 3 et 4 illustrent les cartes de scission d' endonucléase de restriction des plasmides pAG12 et pAG14, respectivement. Le plasmide pAG12 est un ADN recombinant consistant en deux fragments EcoRI dérivés du plasmide pAG1 qui sont ligaturés l'un à l'autre de telle façon que l'orientation du premier fragment EcoRI soit opposée à la direction du second fragment, et le plasmide pAG14 est un ADN recombinant consistant en deux fragments EcoRI dérivés du plasmide pAGl1 qui sont ligaturés l'un à l'autre de telle façon que l'orientation du premier fragment EcoRI soit la même que l'orientation du second. Les deux plasmides ont un site XbaI. Les deux plasmides contiennent le gène pour la résistance à la tétracycline, et par conséquent, lorsque tout plasmide est utilisé pour la transformation d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, les cellules transformées peuvent être facilement choisies par le critère de la résistance à la tétracycline. Plasmides pAG31 et pAG32 Les plasmides pAG31 et pAG32 peuvent être préparés par abandon d'une partie du plasmide pAG12 tout en mainte- nant un gène pour la résistance à la tétracycline et un gène pour la réplication qui sont dérivés d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique en accord avec le procédé suivant. Le plasmide pAG12 qui a été obtenu essentiellement de la même façon que décrite ci-dessus est digéré partiellement avec une enzyme de restriction EcoRI (T.I. TIKCHONENKO, E.V. KARAMOV, B.A. ZAVIZON et B.S. NARODITSKY: Gene, 4, 195-212 (1978)) pour obtenir un fragment d'ADN linéaire. Ensuite, le fragment d'ADN linéaire ainsi obtenu est traité avec une ligase d'ADN phage T4 pour obtenir un plasmide circulaire. Avec le plasmide ainsi obtenu, une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est transformée, et les cellules transformées qui ont un plasmide contenant un gène pour la résistance à la tétracycline sont sélectionnées par le critère de la résistance à la tétracycline. Ensuite, le plasmide contenu dans les cellules choisies est analysé pour confirmer que les plasmides contiennent le gène souhaité pour la résistance à la tétracycline et le gène nécessaire à la réplication. Le plasmide ainsi obtenu contenu dans les cellules transformées peut être isolé de la culture des cellules substantiellement de la même façon que celle décrite en référence aux plasmides pAG12 et pAG14. La structure du plasmide peut être déterminée par analyse des fragments d'ADN formés par digestion avec des enzymes de restriction variées et soumission des produits de digestion résultants à une électrophorèse sur gel d'agarose et, ensuite, à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Comme résultat, on a découvert que deux catégories de plasmides sont obtenues. Les plasmides isolés à partir des cellules trans- formées sont désignés pAG31 et pAG32, respectivement. Les figures 5 et 6 illustrent les cartes de scission d'endonucléase de restriction des plasmides pAG31 et pAG32, respectivement. Le plasmide pAG31 est un plasmide recombi- nant consistant en deux fragments EcoRI d'abandon partiel dérivés du plasmide pAG12 qui sont ligaturés l'un à l'autre de telle façon que l'orientation du premier fragment EcoRI d'abandon partiel soit la même que l'orientation du second fragment. le plasmide pAG32 est un plasmide recombinant consistant en deux fragments EcoRI d'abandon partiel dérivés du plasmide pAG12 qui sont ligaturés l'un à l'autre de telle façon que l'orientation du premier fragment EcoRI soit opposée à l'orientation du second fragment. Le plasmide pAG31 a un site BamHI et un site EcoRI. Le plasmide pAG32 a un site BamHI, un site EcoRI et un site HindIII. Puisque les deux plasmides, nommément pAG31 et pAG32, ont un site de restriction à scinder par EcoRI largement employé dans l'art, l'insertion de fragments d'ADN contenant un codage génétique pour un peptide souhaité pour la production d'un acide aminé désiré dans le plasmide pAG31 ou pAG32 est effectuée facilement en utili- sant le site EcoRI comme site d'insertion. De plus, puisque le gène pour la résistance à la tétracycline peut être utilisé comme marqueur dans les deux plasmides, le clonage du fragment d'ADN contenant le gène pour le peptide désiré précité peut être effectué avec une efficacité élevée en utilisant un système hôte-vecteur comprenant une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et l'un quelconque des plasmides. Tous les plasmides précités sont dérivés de Corynebacterium melassecola 22243 et, par conséquent, tous les plasmides sont convenables naturellement pour la transformation des souches précitées. Ces plasmides peuvent également être utilisés pour la transformation de bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique de catégorie autre que Corynebacterium melassecola 22243. Cependant, du point de vue de la stabilité et de l'aptitude à la réplication dans la cellule, en ce qui concerne les bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique du type autre que Corynebacterium melassecola 22243, ces plasmides dérivés respectivement des bactéries peuvent, bien entendu, être plus convenablement utilisés comme vecteurs pour la transformation des bactéries respectives. Dans ce cas également, un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique peut être avantageusement inséré dans les plasmides dérivés des bactéries des catégories autres que Corynebacterium melassecola 22243 de façon que le gène pour la résistance à la tétracycline puisse être utilisé comme marqueur. De plus, en ce qui concerne les bactéries corynéformes produi- sant l'acide glutamique d'un type autre que Corynebactérium melassecola 22243, tout plasmide compatible avec chacune des bactéries peut être également utilisé de façon convenable comme vecteur pour la transformation de chacune des bactéries. Dans ce cas également, un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique peut être avantageusement inséré dans le plasmide compatible avec chacune des bactéries d'un type autre que Corynebacterium melassecola 22243 si bien que le gène pour la résistance à la tétracycline peut être utilisé comme marqueur. Ainsi, selon la présente invention, on a prévu un plasmide comprenant un premier fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement ligaturé audit second fragment d'ADN. Comme premier fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline, on peut mentionner, par exemple, le fragment d'ADN dérivé du plasmide pAGlI et les dérivés d'abandon de ceux-ci mentionnés ci-dessus. Des exemples spécifiques de tels fragments d'ADN sont les suivants. (1) Un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb et ayant une extrémité collante ou adhérante forméE par la scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par la scission BglII, et qui a les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb, 2,2 kb et 2,8 kb à partir de cette extrémité collante formée par la scission de BamHI; (2) Un fragment d'ADN ayant une longueur molécu- laire d'environ 2,8 kb et ayant une extrémité collante formée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission EcoRI et qui a les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI et un second site PstI qui sont situés respectivement à environ 0,7 kb, 1,3 kb et 2,2 kb à partir de l'extrémité collante formée par la scission BamHI; (3) Un fragment d'ADN ayant une longueur molécu- laire d'environ 2,5 kb et ayant une extrémité collante formée par scission de BglII et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et qui a les sites de restriction suivants: un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont situés respectivement à environ 0,6 kb, 1,5 kb et 2,1 kb à partir de l'extrémité collante formée par scission SalI; et (4) Un fragment d'ADN ayant une longueur molécu- laire d'environ 2,1 kb et ayant une extrémité collante formée par scission EcoRI et l'autre extrémité collante formée par-scission SalI, et qui a les sites de restriction suivants: un premier site PstI et un second site PstI qui sont situés respectivement à environ 0,6 kb et 1,5 kb de l'extrémité collante formée par scission SalI. En tant que second fragment d'ADN, on peut employer tout fragment d'ADN dérivé d'un plasmide d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Comme tel fragment d'ADN, on peut mentionner, par exemple, un fragment d'ADN dérivé d'un plasmide pAG3. Le plasmide pAG3 peut être obtenu à partir de Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accès FERM BP-559, et a une longueur moléculaire d'environ 4, 8 kb et une carte de scission d' endonucléase de restriction repré- sentée à la figure 2. Le microorganisme Corynebacterium melassecola 22220 est une souche nouvelle isolée de la terre. Les propriétés microbiologiques de la souche et les caractéristiques pour déterminer le biotype de la souche sont les suivantes. (1) Caractéristiques microscopiques: Habituellement, la souche est un bacille ayant une taille de 0,5 à um x 0,8 à 2,0"-m. Les cellules de la souche sont multipliées par division brusque et montrent des agencements angulaires et en palissade (palis) et un pléomorphisme. La souche est Gram-positive et non mobile. Aucune sporulation n'est observée. (2) Couleur et caractéristiques de la culture: Des colonies formées sur de la gélose en plaque comme milieu sont circulaires avec un bord distinct, opaques et légèrement lustrées. La couleur est jaune. Sur une gélose inclinée, la souche croît bien le long d'une ligne inoculée et ne donne aucune odeur offensive. Aucune coloration du milieu de gélose n'est observée. Dans le cas d'une culture piquée de gélose, la souche croit bien à la partie supérieure du milieu de gélose. Dans le cas d'un milieu liquide de culture, le milieu devient trouble de façon homogène et un anneau est formé sur la surface du milieu. (3) Caractéristiques physiologiques: a. Température: La croissance est observée à une température de 25 0C à 37 C. b. Valeur de pH: La culture peut croître à un pH de 6 à 9. c. Résistance à la chaleur: résistant à environ C pendant environ 15 minutes dans un milieu contenant 10% de lait écrémé. d. B.actérie aérobie. e. Liquéfaction de gélatine: négatif. f. Couleur du lait de tournesol: inchangée. g. Production d'indole: négatif. h. Test de Voges-Proskauer: négatif. i. Production de sulfure d'hydrogène: négatif. j. Test du rouge de méthyle: positif. k. Réduction de nitrate: positif. 1. Utilisation d'acide citrique: négatif. m. Liquéfaction d'amidon: négatif. n. Production d'uréase: positif. o. Production de catalase: positif. p. Production d'acide à partir de carbohydrates variés: positif pour glucose, fructose, sucrose, maltose et mannose. Négatif pour mannitol, xylose, *arabinose, raffinose et lactose. q. La biotine est nécessaire pour la croissance. r. Une quantité remarquable d'acide L-glutamique est produite dans un milieu contenant une quantité limitée de biotine ou dans un milieu additionné d'agent tensio- actif contenant une grande quantité de biotine. En ce qui concerne la souche 22220 ayant les propriétés microbiologiques précitées, son placement taxologique a été déterminé en référence à "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", Huitième édition et au brevet japonais N 576690 et en effectuant une comparaison avec Corynebacterium melassecola ATCC 17965 comme culture type. Comme résultat, on a découvert que les caractéristi- ques de la souche 22220 sont pratiquement identiques à celles de Corynebacterium melassecola. Par conséquent, la culture 22220 est identifiée comme Corynebacterium melassecola et appelée Corynebacterium melassecola 22220. Les sites de restriction du plasmide pAG3 peuvent être déterminés substantiellement de la même façon que décrit en référence à la détermination des sites de restriction du plasmide pAGI. La carte de scission d'endonucléase de restriction ainsi obtenue du plasmide pAG3 est représentée à la figure 2. Le premier fragment d'ADN peut être directement ligaturé au second fragment d'ADN. Alternativement, le premier fragment d'ADN peut être indirectement ligaturé au second fragment d'ADN au moyen d'un autre type de fragment d'ADN. Comme plasmide comprenant un premier fragment d'ADN et un second fragment d'ADN on peut mentionner, par exemple, un plasmide pAG50. Le plasmide pAG50 comprend comme premier fragment d'ADN le fragment d'ADN (1) men- tionné ci-dessus et comme second fragment d'ADN un fragment scindé BamHI du plasmide pAG3. Dans le plasmide pAG50, le premier fragment d'ADN est directement ligaturé au second fragment d'ADN. Le plasmide pAG50 a une longueur moléculaire d'environ 8,0 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction telle que représentée à la figure 7. Le plasmide pAG50 peut être préparé par insertion d'un fragment BamHI-BglII du plasmide pAG14 mentionné ci-dessus contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dans le seul site BamHI du plasmide pAG3 par le procédé suivant. Premièrement, des fragments BamHI du plasmide pAG3 réagissent avec des fragments BamHI-BglII du plasmide pAG14 contenant un gène pour la résistance à la tétracycline en présence d'une ligase d'ADN phage T4 pour obtenir un ADN circulaire (plasmide). Avec le plasmide ainsi transformé, une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est transformée et une bactérie transformée est choisie par le critère de la résistance à la tétracycline. Ensuite, les plasmides contenus dans la bactérie transformée ainsi obtenue sont isolés pour obtenir le plasmide pAG50. Le plasmide pAGC50 est analysé substantiellement de la même façon que mentionné ci-dessus pour déterminer ses sites de restriction. Les plasmides précités de la présente invention peuvent être modifiés en changeant la séquence de base d'au moins un site de restriction du plasmide de façon que l'enzyme de restriction efficace pour la scission du site de restriction soit changée-en un type différent d'enzyme de restriction, tandis qu'on maintient le gène pour la résistance à la tétracycline et le gène pour la réplication. De plus, selon la présente invention, on a prévu un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Un tel fragment d'ADN peut, comme mentionné ci-dessus, être utilisé comme premier fragment d'ADN du plasmide précité comprenant un premier fragment d'ADN et un second fragment d'ADN. Le fragment d'ADN de la présente invention peut être obtenu à partir des plasmides contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivés d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par un procédé qui comprend la scission du plasmide utilisant des enzymes de restriction pour obtenir des fragments d'ADN et l'isolation d'un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétra- cycline à partir des fragments d'ADN. Le fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme mentionné ci-dessus peut être modifié facilement en changeant la séquence de base d'au moins un site de restriction du fragment d'ADN de façon que l'enzyme de restriction efficace pour la scission du site de restriction soit changée en une catégorie différente d'enzyme de restriction, tout en maintenant le gène pour la résistance à la tétracycline. Le fragment d'ADN peut également être changé au moins à une de ses extrémités relativement à la séquence de base de façon que l'extrémité du fragment d'ADN puisse être adaptée à la séquence de base d'une partie scindée d'un vecteur, laquelle partie scindée doit être ligaturée à l'extrémité du fragment d'ADN. De plus, selon la présente invention, on a prévu un microorganisme qui comprend une bactérie corynéforme et un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dériv é-d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, ledit fragment d'ADN étant contenu dans ladite bactérie corynéforme. Des exemples de bactérie corynéforme comme hâte comprennent les bactéries appartenant au genre Coryne- bacterium, Brevibacterium et Microbacterium. Parmi ceux-ci, les bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique sont préférées. Comme bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner une souche curée de plasmide de Corynebacterium melassecola 22243, Corynebacterium melassecola 801 déposée au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558, etc. Comme fragment d'ADN contenu dans les bactéries corynéformes, on peut employer les fragments d'ADN mentionnés ci-dessus. Comme microorganisme de la présente invention, on peut mentionner, par exemple, un microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 mentionné ci-dessus. Le Corynebacterium melassecola 22243 est, comme mentionné ci-dessus, déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560, et la culture du microorganisme est disponible auprès du FRI sous forme biologiquement pure. Comme microorganisme de la présente invention, on peut également mentionner, par exemple un microorganisme qui comprend un microorganisme Corynebacterium melassecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558 comme bactérie corynéforme et le fragment d'ADN (1) mentionné ci-dessus comme fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline, ledit fragment d'ADN (1) étant dans une forme telle qu'il soit ligaturé au plasmide pAG3 pour former le plasmide pAG50. Le micro- organisme est obtenu en transformant la Corynebacterium melassecola 801 avec le plasmide pAG50. La Corynebacterium melassecola 801 est isolée du sol et ne contient aucun plasmide. Les caractéristiques microbiologiques de la souche et les caractéristiques pour déterminer le biotype de la souche sont les suivantes. (1) Caractéristiques microscopiques: Habituellement, la souche est un bacille ayant une taille de 0,5 à 1,0Ojm x 0,8 à 2,0",m et différent en taille. Les cellules de la souche sont multipliées par division brusque et montrent des agencements angulaires et en palissade (palis) et un pleomorphisme. La souche est Gram-positive et non mobile. Aucune sporulation n'est observée. (2) Couleur et caractéristiques de la culture: Des colonies formées sur une gélose en plaque sont circulaires avec un bord distinct, opaques et lustrées. La couleur est jaune. Sur une gélose inclinée de culture, la culture croît bien le long d'une ligne inoculée et ne donne aucune odeur offensive. Aucune coloration de la gélose de culture n'est observée. Dans le cas d'une culture piquée de gélose, la souche croît bien à la partie supérieure du milieu de gélose. Dans le cas d'un milieu liquide de culture, le milieu devient trouble de façon homogène et un anneau est formé sur la surface du milieu. (3) Caractéristiques physiologiques: a. Température: La croissance est observée à une température de 25 C à 37 C. b. Valeur de pH: La souche peut croître à un pH de 6 à 9. c. Résistance à la chaleur: résistant à environ 55 C pendant environ 15 minutes dans un milieu contenant 10% de lait écrémé. d. Bactérie aérobie. e. Liquéfaction de gélatine: négatif. f. Couleur du lait de tournesol: inchangée. g. Production d'indole: négatif. h. Test de Voges-Proskauer: négatif. i. Production de sulfure d'hydrogène: négatif. j. Test du rouge de méthyle: positif. k. Réduction de nitrate: négatif. 1. Utilisation d'acide citrique: négatif. m.- Liquéfaction d'amidon: négatif. n. Production d'uréase: positif. o. Production de catalase: positif. p. Production d'acide à partir de carbohydrates variés: Positif pour glucose, fructose, sucrose, maltose et mannose. Négatif pour mannitol, xylose, arabinose, raffinose et lactose. q. La biotine est nécessaire pour la croissance. r. Une quantité remarquable d'acide L-glutamique est produite dans un milieu contenant une quantité limitée de biotine ou dans un milieu additionné d'un tensio-actif contenant une quantité élevée de biotine. En ce qui concerne la souche 801 ayant les propriétés microbiologiques précitées, son placement taxologique a été déterminé en référence à "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", huitième édition, et au brevet japonais No 576690 et en effectuant la comparaison avec la Corynebacterium melassecola ATCC 17965 comme culture type. Comme résultat, on a découvert que les caractéristiques de la souche 801 sont pratiquement identiques à celles de la Corynebacterium melassecola. Par conséquent, la souche 801 est identifiée comme Corynebacterium melassecola et appelée Corynebacterium melassecola 801. La Corynebacterium melassecola 801 est déposée au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558 et est disponible au FRI. Le plasmide et le fragment d'ADN de-la présente invention présentent les avantages suivants. Lorsqu'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, dont la croissance est inhibée dans un milieu contenant de la tétracycline même à une concen- tration aussi faible qu'environ l>g/mQ, est transformée avec le plasmide de la présente invention, la bactérie devient résistante à la tétracycline, c'est-à-dire, que la bactérie transformée peut croitre dans un milieu contenant de la tétracycline à une concentration aussi élevée que 10_y.g/mQ. Par conséquent, une bactérie transformée est facilement et efficacement sélectionnée et séparée à partir d'une bactérie non transformée par addition de tétracycline au milieu de culture pour avoir une concentration en tétracycline de lOy>g/mt. De plus, lorsqu'un marqueur sélectif connu conventionnellement dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, c'est-à-dire, un gène pour la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine est inséré dans le présent plasmide contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et le produit résuitant est utilisé comme vecteur d'expression pour un codage génétique pour un peptide souhaité pour la production d'un acide aminé désiré d'une telle façon que le codage génétique pour le peptide désiré soit inséré dans le gène pour la résistance à la tétracycline, le plasmide contenant le codage génétique pour le peptide souhaité peut être sélectionné facilement et efficacement en utilisant l'inactivation du marqueur sélectif due à l'insertion du codage génétique pour le peptide désiré dans le marqueur sélectif comme expliqué ci-après. Lorsque le fragment d'ADN de la présente invention contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est inséré dans un plasmide dérivé de ou compatible avec une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on obtient un plasmide qui a comme marqueur sélectif un gène pour la résistance à la tétra- cycline et qui peut être utilisé avantageusement comme vecteur dans la cellule d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme un hâte avec un nombre de copies et une stabilité accrus. De plus, le microorganisme de la présente invention contenant un gène pour la résistance à la tétracycline peut être utilisé avantageusement comme un système stable, efficace hôte-vecteur pour la recombinaison génétique d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Comme il apparaît de ce qui précède, par l'utili- sation du plasmide, de fragment d'ADN ou microorganisme de la présente invention, la culture d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique peut être effectuée facilement et efficacement par la technique de l'AD.N 'recombinant. La présente invention sera illustrée plus en détail en référence aux exemples de référence et aux exemples, illustrant de façon non limitative la portée de la présente invention. Dans l'exemple 1, l'existence d'un gène pour la résistance à la tétracycline dans le plasmide pAG1 de la présente invention résulte du fait que la souche obtenue à partir de la Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) en curant le plasmide pAGl y étant contenu est sensible à la tétracycline, et à partir du fait que la souche devient résistante à la tétracycline lorsque le plasmide pAGl est incorporé dans la souche de plasmide curé. Ces faits seront illustrés ci- après au moyen des exemples de référence 1 et 2. En ce qui concerne les plasmides de la présente invention autres que le plasmide pAG1 également, l'existence d'un gène pour la résistance à la tétracycline dans chacun des plasmides estconfirmée par l'expérience dans laquelle substantiellement les mêmes processus que ceux des exemples de référence 1 et 2 sont répétés à l'exception que chacun des plasmides est utilisé au lieu du plasmide pAGl. De plus, en ce qui concerne le fragment d'ADN de la présente invention, l'existence d'un gène pour la résistance à la tétracycline dans le fragment d'ADN est confirmée par l'expérience dans laquelle substantiellement les mêmes processus que ceux des exemples de référence 1 et 2 sont répétés à l'exception que le fragment d'ADN est inséré dans un plasmide ne contenant aucun gène pour la résistance à la tétracycline et que le plasmide résultant est utilisé au lieu du plasmide pAGl. EXEMPLE DE REFERENCE 1: Curage du plasmide pAG1 dans la Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) Une boucle de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) a été inoculée dans 5 mQ- de milieu LG obtenu en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl et 2 g de glucose dans de l'eau distillée bipermutée pour réaliser une solution de 1 litre et en ajustant la concentration en ion hydrogène de la solution à pH 7,2, et mise en culture avec agitation à 37 C pendant une nuit. La culture de cellules a été diluée avec de l'eau stérilisée, étendue sur un milieu d'agar LG obtenu en ajoutant 1,5% d'agar au milieu LG précité, et incubée à 32 C pendant 2 jours. 100 colonies ont été prélevées des colonies résultantes, et inoculées dans un milieu d'agar LG contenant 10}/mQ de tétracycline par réplique-placage. La culture de cellules a été incubée à 32 C pendant 2 jours, et ensuite deux colonies présentant une sensibilité à la tétracycline ont été isolées. A partir des colonies les plasmides y étant contenus étaient séparés substantiellement de la même façon que celle décrite dans l'exemple 1 qui sera donné ci-après pour vérifier l'existence du plasmide pAG1. Comme résultat, on a découvert que les deux colonies présentant une sensibilité à la tétracycline ne contenaient pas le plasmide pAGl. EXEMPLE DE REFERENCE 2: Transformation d'une souche de plasmide curé de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) avec le plasmide pAG1. La souche de plasmide curé de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) obtenue dans l'exemple de référence 1 a été mise en culture avec agitation dans un milieu semi-synthétique (qui est du même type que dans l'exemple 1 qui sera.donné ci-après) à 32 C pendant 12 heures. A partir de la culture de cellules 0,5 m t ont été prélevés, inoculés dans 50 mL du même milieu semi-synthétique que ci-dessus, et incubés avec agitation à 32 C. Lorsque l'absorbance à 660 nm de la culture de cellules mesurée au moyen d'un spectro- photomètre modèle 228 fabriqué et vendu par Hitachi Ltd est devenue 0,2, de la pénicilline G a été ajoutée à la culture de cellules jusqu'à une concentration finale de 0,3 unité/mL. Ensuite, l'incubation de la culture de cellules a été continuée à 32 C pendant 1,5 heures. A partir de la culture de cellules résultante les cellules ont été récoltées, et suspendues dans 5 m - de milieu R -2569421 obtenu en dissolvant 5 g de glucose, 10 g d'acide Casamino, 10 g d'extrait de levure, 0,35 g de K2HPO4, 0,15 g de KH2PO4, 137 g de sucrose, 5,73 g d'acide N-tris-(hydroxyméthyl)méthyl-2-aminoéthanesulfonique (référencé ci-après TES), 0,95 g de MgC12 et 1,11 g de CaC12 dans de l'eau distillée pour obtenir une solution de 1 litre et en ajustant la concentration en ion hydrogène de la solution à un pH de 7,2 en utilisant NaOH. Le nombre de cellules normales de la suspension à soumettre à un traitement par une lysozyme a été trouvé égal à 7,6 x 1D08 m9--1 en (1) prenant une partie aliquote de la suspension, (2) en diluant la partie aliquote dans un milieu R, et (3) en étendant le mélange sur un milieu d'agar LG, suivi par l'incubation à 32 C pendant 2 jours. A 4,5 mû de la suspension de cellules précitée ont été ajoutés 0,5 mP de milieu R préstérilisé avec un filtre millipore qui contenait de la lysozyme en une concentration de 3 mg/m.-, et incubé en étant maintenu encore à 35 C pendant 5 heures. Les cellules protoplastes résultantes étaient récoltées par centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à 5 C pendant 7 minutes, et suspendues dans 5 ml de milieu R. Les mêmes opérations étaient répétées pour obtenir une suspension de cellules protoplastes. Le rapport du nombre de cellules formant une colonie sous condition hypotonique qui étaient présente dans la suspension de cellules protoplastes au nombre précité de cellules normales soumises au traitement par la lysozyme était déterminé en (1) prenant une quantité aliquote de la suspension de cellules protoplastes, (2) en diluant la partie aliquote avec de l'eau stérilisée, (3) en étendant le mélange sur un milieu d'agar LG (condition hypotonique), (4) en incubant la culture de cellules à 32eC pendant 2 jours, et (5) en comptant le nombre de colonies formées, suivi par le calcul du rapport précité. Même si l'incubation de l'étape (4) ci-dessus était continuée pendant plus de 2 jours, le nombre de colonies formées ne s'accroissait pas. Le rapport ci-dessus était déterminé comme étant de 1,3 x 10- 5. D'autre part, le rapport du nombre de cellules formant une colonie sous une condition hyper- tonique qui était présente dans la suspension de cellules protoplastes au nombre précité de cellules normales sou- mises au traitement par la lysozyme était déterminé en (1) extrayant une autre quantité aliquote de la suspension de cellules protoplastes, (2) en diluant la quantité aliquote dans un milieu R, (3) en inoculant le mélange dans un milieu régénérant (condition hypertonique) C le milieu régénérant était un milieu d'agar à double couche comprenant une couche de milieu d'agar inférieure obtenue en ajoutant de la polyvinyl pyrrolidone (ci-après PVP) et de l'agar en concentrations respectives de 40 g/X et 15 g/Q au milieu R et, superposée sur la couche infé- rieure, une couche supérieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et de l'agar en concentrations respectives de 40 g/-t et 6 g/e au milieu R; et l'inoculation du mélange précité était effectuée en le mélangeant avec 3 mQ de la couche supérieure du milieu d'agar avant de former la double couche 3, (4) en incubant la culture de cellules à 32 C pendant 4 jours, et (5) en comptant le nombre de colonies formées, suivi par le calcul du rapport précité. Même si l'incubation à l'étape (4) ci-dessus est continuée pendant plus de 4 jours, le nombre de colonies formées n'augmente pas. Le rapport précité a été déterminé égal à 2,4 x 10- 1 La transformation était effectuée en utilisant la suspensionde cellules protoplastes précitée comme suit. 50 d'une solution de plasmide pAG1 contenant 1,25.Lg d'ADN a été mélangé avec 50,yt d'une solution de 2 x TSMC contenant 50 mM de TES, 0,8 M de sucrose, 20mM de MgC12 et 60 mM de CaCl2 laquelle solution était ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH, et ensuite avec 0,5 mt de la solution de cellules protoplastes précitée. Au mélange résultant était ajouté 1,5 mâ d'une solution PEG préparée en dissolvant un polyéthylène glycol ayant 69421 un poids moléculaire de 6.000 dans une solution de TSMC contenant 25 mM de TES, 0,4 M de sucrose, 10 mM de MgC12 et 30 M de CaC12, laquelle solution était ajustée à pH 7,2 au moyen de NaOH, jusqu'à une concentration finale de 40% (poids/volume). La suspension était mélangée doucement, et maintenue sans agitation pendant 2 minutes. Ensuite, à la suspension était ajouté 5 ml d'une solution de R-PVP préparée en dissolvant PVP dans un milieu R jusqu'à une concentration finale de 40 g/L, et centrifugée à 4.000 t/mn (1.800 g) pendant 10 minutes, suivi par l'élimination du surnageant. Ces opérations d'addition de la solution de R-PVP et centrifugation ont été répétées pour obtenir une boulette de protoplastes. La boulette de protoplastes était suspendue doucement dans 0,5 m- d'une solution de R-PVP, incubée à 30 C pendant 3 heures, et diluée avec une solution de R-PVP. Une partie aliquote était prélevée de la suspension et inoculée dans un milieu préparé en ajoutant de la tétracycline au milieu régénérant précité jusqu'à une concentration finale de lO0jg/mL afin de trouver le nombre de transformants résistants à la tétracycline. Concurremment, une autre partie aliquote était prélevée de la suspension et inoculée dans le milieu régénérant précité afin de trouver le nombre de cellules formant colonies. Les cultures de cellules étaient incubées à 320C pendant 4 jours, et ensuite le nombre de colonies formées était compté. Egalement, un essai de contrôle était effectué substantiellement de la même façon que décrite ci-dessus à l'exception que le plasmide pAGl n'était pas employé. Comme résultat, on a découvert que le rapport du nombre de cellules formant colonies après exécution des opérations de transformation décrites ci- dessus au nombre de cellules normales soumises au traitement par la lysozyme était de 1,8 x 10 2, et que le rapport du nombre de transformants résistants à la tétracycline au nombrede cellules normales soumises au traitement par -4 la lysozyme était de 3,2 x 10- On a également trouvé que 105 colonies résistant à la tétracycline étaient formées par --g d'ADN de plasmide ajouté. D'autre part, la formation de toute colonie résistant à la tétracycline n'était pas reconnue dans l'essai de contrôle dans lequel le plasmide pAGl n'était pas employé. De plus, on a découvert que les 12 souches choisies au hasard à partir des transformants résistantsà la tétracycline obtenus contenaient le plasmide pAGl comme résultat d'une isolation et analyse des plasmides qui a été effectuée substantiel- lement de la même façon que celle décrite dans l'exemple 1 décrit ci-dessous. EXEMPLE 1: Isolation d'un plasmide pAG1 à partir de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560) Le microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 était mis en culture dans un milieu semi-synthétique un milieu préparé en dissolvant 10 g de (NH4)2S04, 3 g d'urée, 1 g de K 2HPO4, 50 mg de NaCl, 400 mg de MgS04.7H20, 2 mg de MnSO 4.4-6H20, 2 mg de FeSO4.4-6H20, g de glucose, 50,-g de biotine, 200.y-g d'hydrochlorure de thiamine et 1 g d'extrait de levure dans de l'eau distillée et bipermutée de telle sorte que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH 7,2 1 à 32 C pendant une nuit sous agitation. 8 mQ de la culture ainsi obtenue était inoculé dans 200 mPQ du même milieu semi- synthétique, suivi par la mise en culture à 32 C pendant heures sous agitation pour obtenir une culture du microorganisme. A partir de la culture, des cellules du micro- organisme ont été collectées et suspendues dans 10 mR d'une solution de lysozyme contenant 50 mM de glucose, mM d'EDTA, 25 mM de Tris(hydroxylméthyl)aminométhane (ci-après "Tris") et 10 mg/mQ de lysozyme (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, USA), suivi par incubation à 42 C pendant 1 heure. A la suspension était ajouté 20 md'une solution d'alcali-SDS contenant 0,2 N de NaOH et 1% (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium (ci-après "SDS"). Le mélange était agité et, ensuite laissé dans de la glace pendant 5 minutes. Ensuite, au mélange était ajouté 15 mQ- d'une solution d'acétate de potassium refroidi à la glace (un mélange de 60 mi d'acétate de potassium 5M, 11,5 mk d'acide acétique et 28,5mP- d'eau bipermutée et distillée). Le mélange était agité et laissé dans la glace pendant minutes pour obtenir un lysat. Le lysat entier était transféré dans un tube à centrifuger et soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (13.000 g), 4 C pendant 5 minutes, pour obtenir un surnageant. Le surnageant était soumis à extraction avec un équivolume de phénol-chloroforme (1:1) et une phase aqueuse était récupérée. A la couche aqueuse était ajouté.un demi-volume d'éthanol, et le mélange résultant était agité et maintenu à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, le mélange était soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g), 20 C pendant 10 minutes, pour obtenir ainsi des précipités. Les précipités étaient lavés avec de l'éthanol à 70% (volume/volume), séchés sous pression réduite et dissous dans 20 mt d'un tampon TE contenant 10 mM de Tris et 1 mM d'EDTA (pH 7,5) dans un tube à centrifuger. A la solution résultante, 1,2 mt d'une solution aqueuse de bromure d'éthidium à 10 mg/mb et 23,6 g de chlorure de césium étaient ajoutés doucement et dissous, suivi par une centrifugation à 4.000 t/mn (100o.000 g), 15 C pendant 48 heures. Après achèvement de la centrifugation, deux bandes étaient visualisées sous lumière UV. La bande inférieure était extraite du tube à centrifuger à travers le côté du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction de plasmide. La fraction ainsi obtenue était soumise à extraction avec un équivolume d'alcool isopropylique quatre fois pour obtenir un produit d'extraction. A partir du produit d'extraction, le bromure d'éthidium était éliminé et la solution résultante était dialysée sur le tampon TE pour obtenir 1 mi de dialysat contenant un plasmide à une concentration de 501/g/m-. Le dialysat était digéré avec des enzymes de restriction variées, c'est-àdire, EcoRI, HindIII, PstI, BamHI (chacun fabriqué et vendu par Nippon Gene Co, Ltd, Japon) et XbaI (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) dans une condition convenable pour chacune des enzymes de restriction. Les produits de digestion ainsi obtenus étaient soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1I% (poids/volume) ou à électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume) selon une méthode habituelle. L'électrophorèse est effectuée de façon continue à 5 V par cm de longueur de gel pendant 4 heures. Après parachèvement de l'électrophorèse, le gel était versé dans une solution de bromure d'éthidium contenant 1)xg/mî de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teindre le gel. Ensuite, le gel était irradié avec une lumière à UV pour déterminer le nombre de bandes qui correspond au nombre de fragments d'ADN obtenus. La longueur moléculaire de chacun des fragments d'ADN était déterminée par comparaison de la distance de migration de chacun des fragments avec celle de chacun des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire connue qui sont soumis à électrophorèse simultanément avec les fragments d'ADN obtenus ci-dessus. Comme tel fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire connue, les fragments d'ADN obtenus par digestion HindIII d'ADN de phage X (fabri- qué et vendu par Nippon Gene Co, Ltd, Japon) ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel d'agarose et des fragments d'ADN obtenus par digestion par HaeIII d'ADN de phage eX174 (produit et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le résultat est montré dans le tableau 1. Par l'analyse des fragments d'ADN obtenus par digestion du plasmide avec des enzymes de restriction variées, la carte de scission d' endonueléase de restric- tion du plasmide a été déterminée et représentée sur la figure 1. Le plasmide était désigné pAGl. Tableau 1 Enzyme de restriction EcoRI PstI HindIII Nombre de sites de 8 5 5 restriction Longueur moléculaire des 5,4 9,5 11,5 fragments d'ADN obtenus (kb) 5,3 4,9 3,9 4,3 3,7 2,6 2,0 1,4 1,9 1,7 0,9 0,5 0,7 0,7 0,3 Total (kb) (longueur moléculaire du plasmide) 20,4 20,4 20,4 EXEMPLE 2: Préparation des plasmides pAG12 et pAGl4 Etape 1. Recombinaison in vitro de plasmide pAG1 A 0,5 ywg de l'ADN du plasmide pAG1 préparé dans l'exemple 1 ont été ajoutées 10 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. Le mélange résultant a réagi dans >>t d'un tampon contenant 50 mM de TrisHCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl à 37 C pendant 2 heures. Ensuite, la température a été élevée à 70 C, et le mélange a été chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. 20 Y2 du mélange de réaction ainsi obtenu ont réagi avec 3 unités de ligase d'ADN de phage T4 (produit et vendu par Nippon Gene Co, Ltd, Japon) dans 50 - d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HC1 (pH 7,4), 10 mM de MgC12, mM de dithiothreitol, 1 mM de spermidine, lmM d'ATP et 1 mg/m-e de BSA (alumine de sérum bovin) (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) à 15 C pendant une nuit. Etape 2. Isolation des plasmides pAG12 et pAG14 En utilisant l'ADN recombinant préparé à partir du plasmide pAG1 dans l'exemple 2 étape 1, la souche de plasmide curé de Corynebaeterium melassecola 22243 (déposée au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560) a été transformée pour obtenir une souche résistant à la tétracycline. A partir de la souche résistant à la tétracycline, des plasmides ont été isolés substantielle- ment de la même façon qu'à l'exemple 1 et analysés. Comme résultat, lesplasmidespAG12 et pAG14 ont été obtenus. Le procédé est décrit ci-après en détail. (Curage du plasmide) Un enroulement de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560) a été inoculé dans 5 m- d'un milieu LG (un milieu préparé en dissolvant 10 g de trypton, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl et 2 g de glucose dans de l'eau bipermutée et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH 7,2) et cultivé à 37 C pendant une nuit sous agitation. La culture ainsi obtenue a été diluée dans de l'eau stérilisée. La culture diluée était ensuite étendue sur un milieu d'agar LG (un milieu préparé en ajoutant de l'agar au milieu LB de façon que la concentration en agar du milieu résultant soit de 1,5% en poids) suivi par la mise en culture à 32 C pendant 2 jours pour former des colonies. 100 colonies formées ainsi étaient transférées par réplique- placage sur une plaque d'agar LG contenant l0y.g/mL de tétracycline, suivi par la mise en culture à 32 C pendant 2 jours. Ensuite, deux souches sensibles à la tétracycline étaient choisies. En ce qui concerne les deux souches ainsi choisies, l'existence du plasmide pAGl dans les souches a été déterminée par le procédé d'isolation de plasmide décrit dans l'exemple 1. Comme résultat, on a trouvé que les deux souches ne contenaient aucun plasmide, c'est-à-dire, les souches étaient une souche curée de plasmide. Une des souches étaient utilisée comme hôte dans l'étape suivante. (Transformation) La souche de plasmide curéepréparée dans l'étape cidessus a été cultivée dans un milieu semi-synthétique mentionné ci-avant à 32 C pendant 12 heures sous agitation. 0,5 m Q de la culture ainsi obtenue était inoculé dans îo 50 m. du même milieu semi-synthétique et cultivé à 32 C sous agitation. La densité optique (OD) de la culture à 660 nm était mesurée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd, Japon). A l'instant o la OD devenait 0,2, de la pénicilline G était ajoutée à la culture de façon que la concentration en pénicilline soit de 0,3 unité/mL. La culture résultante était incubée à 32 C pendant 1,5 heures. A partir de la culture ainsi obtenue, des cellules étaient collectées et mises en suspension dans 5 me- de milieu R pour obtenir une suspension de cellules. A 4,5 m- de la suspension de cellules était ajouté 0,5 mL du milieu R contenant 3 mg/mL de lysozyme (stérilisée sur filtre Millipore), suivi par l'incubation à 35 C pendant heures, pour former ainsi des protoplastes. La culture résultante était soumise à centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g), 5 C pendant 7 minutes pour obtenir les proto- plastes. Les protoplastes ainsi obtenus étaient mis en suspension dans 5 mPt de milieu R. La suspension de protoplastes était soumise à centrifugation dans les mêmes conditions que décrites ci-dessus pour obtenir des protoplastes. Les protoplastes étaient mis en suspension dans 5 me de milieu R pour obtenir une suspension de protoplastes. A 0,5 m t de suspension de protoplastes était ajouté un mélange de 50 C du mélange obtenu dans l'exemple 2 étape 1 et 50yut de solution 2 x TSMC (une solution aqueuse contenant 50 mM de TES, 0,8 M de sucrose, mM de MgC12 et 60 mM de CaCi2 et ajusté à pH 7,2 2 2 ajséàp7, en utilisant NaOH). Ensuite, on a ajouté au mélange résultant une solution de PEG, et laissé le tout à température ambiante pendant 2 minutes. Ensuite, au mélange ont été ajoutés 5 mL d'une solution de R-PVP suivi par centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) pendant minutes pour former un surnageant et des précipités. Le surnageant était éliminé. Aux précipités étaient ajoutés 5 mL de la solution de R-PVP, suivi par une centrifugation dans les mêmes conditions que mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes comme précipités. Les. protoplastes ainsi obtenus étaient mis' en suspension délicatement dans 0,5 mJ- de solution de R-PVP. La suspension était incubée à 30 C pendant 3 heures et diluée avec une solution de R-PVP pour obtenir un ' suspension diluée. La suspension diluée était mélangée avec 3 ml de milieu d'agar fondu ayant la même composi- tion que celle de la couche de milieu d'agar supérieure du milieu régénérant contenant 10,}>g/m Q de tétracycline dans l'exemple 1, et le mélange résultant était appliqué sur la couche inférieure de milieu d'agar. Le milieu résultant régénérant était incubé à 32 C pendant 4 jours pour former des souches résistant à la tétracycline. A partir des souches résistant à la tétracycline ainsi formées, 10 souches étaient choisies optionnellement et ont crû sous forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10)_g/mQ de tétracycline. A partir de chacune des souches, un plasmide était isolé..substan- tiellement de la même façon qu'à l1exemple 1. 0,5y._g du plasmide ainsi isolé était digéré avec une quantité en excès d'enzymes de restriction variées sous les conditions convenables pour chacune des enzymes de restriction afin d'obtenir des produits de digestion. Les produits de digestion étaient soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% (poids/volume) ou à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume) selon un procédé habituel. L'électrophorèse était effectuée de façon continue à 5 V par cm de longueur de gel pendant 4 heures. Après parachèvement de l'électrophorèse, le gel était versé dans une solution de bromure d'éthidium ayant une concentration en bromure d'éthidium de lg/m pendant 30 minutes pour teindre le gel. Le gel teint était irradié par lumière UV pour déterminer le nombre de bandes formées sur le gel qui correspond au nombre de fragments d'ADN formés par digestion. La longueur moléculaire de chacun des fragments d'ADN était déterminée substantiellement de la même façon qu'à l'exemple 1. Basé sur le nombre et la longueur moléculaire des fragments d'ADN, la longueur moléculaire et les sites de restriction des plasmides étaient déterminés. Comme résultat, on a trouvé que deux catégories de plasmides étaient obtenues. Les deux plasmides étaient désignés pAG12 et pAG14, respectivement. Les cartes de scission d'endonucléase de restriction des plasmides pAG12 et pAG14 sont représentées aux figures 3 et 4, respec- tivement. Substantiellement de la même façon que mentionnée ci-dessus, la souche de plasmide curée de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) était transformée en utilisant ces plasmides pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. La carte de scission d'endonucléase de restriction de chacun des plasmides retenus dans le transformant était la même que celle de chacun des plasmides incor- poré dans la transformation précitée. EXEMPLE 3: Préparation des plasmides pAG31 et pAG32 Etape 1. Recombinaison in vitro de plasmide pAG12 A 2 d'ADN de plasmide pAG12 préparé dans l'exemple 2 étape 2 étaient ajoutées 10 unités d'enzyme de restriction EcoRI. Le mélange résultant était mis en réaction dans 80 A d'un tampon contenant 25 mM de Tris-HC1 (pH 8,6), 3 mM de MgSO4 et du glycérol à 40% (poids/poids) à une température de 37 C pendant une période de 90 minutes. Ensuite, la température était élevée à 70 C, et le mélange était chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour achever la réaction. De l'acétate de sodium était ajouté jusqu'à une concentration finale de 300 mM, suivi d'une addition d'un demi-volume d'éthanol. Le mélange était agité pendant un temps, et laissé encore à -300C' pendant 3 heures. Ensuite, le mélange était soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. L'ADN ainsi obtenu était séché sous vide, et mis en réaction avec 3 unités de ligase d'ADN de phage T4 dans 50"-- d'un tampon contenant mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgC12, 10 mM de dithiothreitol, 1 mM de spermidine, 1 mM d'ATP et 0,1 mg/mL- de BSA (albumine de sérum bovin) à une température de 15 C pendant une nuit. La température était élevée à 70 C et le mélange était chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour achever la réaction. Etape 2. Isolation des plasmides pAG31 et pAG32 En utilisant 50).'. de mélange de réaction de ligase préparé dans l'exemple 3 étape 1, la souche de plasmide curé de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) était transformée substantiellement de la même façon que dans l'exemple 2 pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. A partir du transformant ainsi obtenu on séparait les plasmides, suivi d'une analyse substantiellement de la même façon qu'à l'exemple 2 étape 2. Comme résultat, deux catégories de plasmides ont été trouvées et désignées pAG31 et pAG32. Les cartes de scision d'endonucléase de restriction de ces plasmides sont représentées aux figures 5 et 6. Substantiellement de la même façon que mentionnée ci-dessus, la souche de plasmide curé de Corynebacterium melassecola 22243 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-560) était transformée en utilisant chaque plasmide pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. La carte de scission par endonucléase de restriction de chaque plasmide retenu dans le transformant était la même que celle de chaque plasmide incorporé dans la transforma- tion précitée. EXEMPLE 4: Préparation du plasmide pAG50 îO L'ADN de plasmide pAG14 était scindé en utilisant des enzymes de restriction BamHI et BglII pour obtenir un mélange de fragments d'ADN. Le mélange était soumis à électrophorèse en utilisant un gel d'agarose pour isoler un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb. Ensuite, une ligase d'ADN de phage T4 était ajoutée à unmélange du fragment d'ADN précité et le fragment obtenu par scission du plasmide pAG3 avec l'enzyme de restriction BamHI. En utilisant le mélange de réaction de ligase résultant, la Corynebacterium melassecola 801 déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-558 était transformée pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. A partir du transformant ainsi obtenu le plasmide pAG50 était séparé selon les procédés décrits ci-après. Etape i. Isolation du fragment d'ADN contenant le gène pour la résistance à la tétracycline A 20 jg d'ADN de plasmide pAGl4 obtenu dans l'exemple 2 étape 2 étaient ajoutées lO0 unités chacune d'enzyme de restriction BamHI et BglII. Le mélange résultant était mis en réaction dans l00 d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl (ph 7,4), O10 mM de MgSO4, mM de NaCl et 1 mM de dithiothreitol à une température de 370C pendant une période de 2 heures. Le plasmmide digéré était soumis à électrophorèse à 40C en utilisant un gel d'agarose à 1l% préparé à partir de l'agarose LMP (marque déposée pour un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) substantiellement de la même façon qu'à l'exemple 2 étape-2. Le gel d'agarose était teint avec du bromure d'éthidium et exposé aux irradiations de lumière ultraviolette, de façon que soient observés visuellement des fragments d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb. La partie du gel dans laquelle de tels fragments d'ADN ont été trouvés, a été prélevée.A ce gel prélevé était ajouté un tampon TE en une quantité égale à trois fois l.e poids du gel, et on a chauffé à 65 C pendant 10 minutes pour réaliser la dissolution complète du gel d'agarose. A la solution résul- tante était ajouté un équivolume de phénol sous agitation, suivi par la récupération d'une phase. aqueuse. A la phase aqueuse était additionné un équivolume d'un mélange 1:1 de phénol et chloroforme avec agitation, suivi par la récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse était ajouté un équivolume de chloroforme avec agitation, suivi de la récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse était ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM et ensuite était ajouté un demi-volume d'éthanol, avec agitation. Ensuite, le mélange était maintenu encore à -30 C pendant 3 heures, et soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue était séchée sous vide. Etape 2 Préparation de plasmide pAG3 et son traitement par une enzyme de restriction BamHI 20 unités d'enzyme de restriction BamHI étaient ajoutées à 4 p.g d'ADN de plasmide pAG3 séparé à partir de Corynebacterium melassecola 22220 (déposée à l'Institut de la Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-559) et purifiées substantiel- lement de la même façon qu'à l'exemple 1. Le mélange résultant était mis en réaction dans 100 0 -L d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) , 10 mM de MgSO4, mM de NaCl et 1 mM de dithiothreitol à une température de 37 C pendant une période de 2 heures. Ensuite, un équivolume d'un mélange 1:1 de phénol et chloroforme était ajouté au mélange avec agitation, suivi par la récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse était ajouté un équivolume de chloroforme avec agitation, suivi par la récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse était ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM et ensuite était ajouté un demi-volume d'éthanol, avec agitation. Ensuite, le mélange était laissé encore à -30 C pendant 3 heures, et soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue était séchée sous vide. Etape 3. Isolation de plasmide pAG50 La quantité entière d'ADN obtenu dans l'exemple 4 aux étapes 1 et 2 était mise en réaction avec 3 unités de ligase d'ADN de phage T4 dans 50,,.- de tampon contenant 50 mM de TrisHCL (pH 7,4), 10 mM de MgC12, 10 mM de dithiothreitol, 1 mM de spermidine, 1 mM d'ATP et 0,1 mg/mk de BSA à une température de 15 C pendant la nuit. La température était élevée à 70 C et le mélange était chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. En utilisant 50 >x-e du mélange de réaction de ligase, un transformant résistant à la tétracycline de Corynebacterium melassecola 801 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-558) était obtenu selon la même technique de transformation qu'à l'exemple 2 étape 2. L'incubation dans le milieu régénérant était effectuée pendant une période de 7 jours. A partir du transformant résistant à la tétracycline obtenu les plasmides étaient séparés, suivi d'une analyse substantiellement de la même façon qu'à l'exemple 2 étape 2. Comme résultat, on a trouvé que seule une catégorie de plasmide était obtenue. Le plasmide ainsi obtenu était désigné pAG50. L'enzyme de restriction SalI employée dans cette étape est l'une des enzymes vendues par Nippon Gene Co, Ltd, Japon. La carte de scission d'endonucléase de restriction de ce plasmide est illustrée à la figure 7. Substantiellement de la même façon que décrite ci-dessus, la souche de plasmide curé de Corynebacterium melassecola 801 (déposée à l'Institut de Recherche sur la Fermentation sous le numéro d'accession FERM BP-558) était transformée en utilisant ce plasmide pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. La carte de scission d'endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant était la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation précitée. EXEMPLE 5: Préparation de fragments d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline Etape 1. Préparation d'un fragment BamHI-EcoRI ayant une longueur moléculaire d'environ 2,8 kb. /u._g du plasmide pAG50 préparé dans l'exemple 4 étape 3 était digéré par 100 unités de BamHI et 100 unités de EcoRI dans 100 j d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl à 37 C pendant 2 heures pour obtenir des produits de digestion. Les produits de digestion étaient soumis à électrophorèse sur gel d'agarose à 1% (poids/volume) substantiellement de la même façon que dans l'exemple 2 étape 2 à l'exception que l'agarose LMP (produit et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) était utilisé et que l'électrophorèse était effectuée à 4 C. Ensuite, le gel d'agarose était coloré avec le bromure d'éthidium et soumis aux radiations ultraviolettes pour détecter de façon visuelle la position du fragment d'ADN digéré. Le fragment d'ADN était trouvé à la position correspondant à la longueur moléculaire d'environ 2,8 kb. Le gel d'agarose autour de la position d'environ 2,8 kb était prélevé. Au gel d'agarose ainsi obtenu était ajouté un tiers en poids d'un tampon TE et incubé à 65 C pendant minutes pour dissoudre complètement le gel dans le tampon. Ensuite, la solution ainsi obtenue était additionnée d'un équivolume de phénol. Le mélange était agité et une phase aqueuse était récupérée.Ala phase aqueuse était ajouté un équivolume de phénol-chloroforme (1:1) en solution, suivi d'une agitation. Une phase aqueuse était récupérée, et à la phase aqueuse était additionné d'un équi- volume de chloroforme, avec agitation subséquente. Une phase aqueuse était récupérée. A la phase aqueuse était ajouté de l'acétate de sodium de façon que la concentration finale en acétate de sodium était de 300 mM, et ensuite était ajouté un demi-volume d'éthanol. Le mélange résultant était laissé à -30 C pendant 3 heures. Ensuite, le mélange était soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) pendant 10 minutes pour obtenir des précipités. Les précipités ainsi obtenus étaient séchés sous pression * réduite pour obtenir environ 3 J?}g d'un fragment d'ADN. Substantiellement de la même façon que dans les exemples de référence 1 et 2 mentionnés ci-dessus, on a confirmé que le fragment d'ADN ainsi obtenu contenait un gène pour la résistance à la tétracycline. Etape 2. Isolation d'un fragment BglII-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 2,5 kb. Substantiellement les mêmes procédés que ceux décrits dans l'exemple 3 étape 2 étaient répétés pour obtenir environ 3 j&g de fragment BamHIBglII ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb à partir du plasmide pAG14. Le fragment d'ADN ainsi obtenu était digéré avec 15 unités de SalI dans 30. d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et mM de NaCl à 37 C pendant 2 heures pour obtenir des produits de digestion. Les produits de digestion étaient soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1%' (poids/volume) substantiellement de la même façon que dans l'exemple 2 étape 2 à l'exception que l'agarose LMP (produit et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) était utilisé et que l'électrophorèse était effectuée à 4 C. Ensuite, le gel d'agarose était coloré par le bromure d'éthidium et soumis aux radiations ultraviolettes pour déterminer la position du fragment d'ADN digéré. L'ADN était découvert à la position correspondant à la longueur moléculaire d'environ 2,5 kb. Le gel d'agarose autour de la position d'environ 2,5 kb était prélevé. On ajoutait au gel d'agarose ainsi obtenu un tiers en poids d'un tampon TE et on effectuait l'incubation à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement ie gel dans le tampon. Ensuite, la solution ainsi obtenue était ajoutée à un équivolume de phénol. Le mélange était agité et une phase aqueuse était récupérée. A la phase aqueuse était ajouté un équivolume d'une solution de phénol-chloroforme (1:1) avec agitation subséquente. Une phase aqueuse était récupérée, et à la phase aqueuse était ajouté un équivolume de chloroforme, avec agitation subséquente. Une phase aqueuse était récupérée. A la phase aqueuse était ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à ce que la concentration finale en acétate de sodium soit de 300 mM, et ensuite on ajoutait un demi-volume d'éthanol. Le mélange résultant était laissé à -30 C pendant 3 heures. Ensuite, le mélange était soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) pendant 10 minutes pour obtenir des précipités. Les précipités ainsi obtenus étaient séchés sous pression réduite pour obtenir environ 1 p-g d'un fragment d'ADN. Substantiellement de la même façon que dans les exemples de référence 1 et 2 précités, on a confirmé que le fragment d'ADN ainsi obtenu contenait un gène pour la résistance à la tétracycline. Etape 3. Préparation d'un fragment EcoRI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 2,1 kb. 1ug du plasmide pAG50 préparé dans l'exemple 4 étape 3 était digéré avec 100 unités de EcoRI et 100 unités de SalI dans 100 - d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCl à 37 C pendant 2 heures pour obtenir des produits de digestion. Les produits de digestion étaient soumis à électrophorèse sur gel d'agarose à 1,% (poids/volume) substantiellement de la même façon que dans l'exemple 2 étape 3 à l'excep- tion que l'agarose LMP (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, USA) était utilisé et que l'électrophorèse était effectuée à 4 C. Ensuite, le gel d'agarose était teint par le bromure d'éthidium et soumis aux radiations ultraviolettes pour détecter de façon visuelle la position du fragment d'ADN digéré. Le fragment d'ADN était découvert à la position corres- pondant à la longueur moléculaire d'environ 2,1 kb. Le gel d'agarose autour de la position d'environ 2,1 kb était prélevé. Au gel d'agarose ainsi obtenu on ajoutait un tiers en poids d'un tampon TE et on soumettait à incubation à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel dans le tampon. Ensuite, on a ajouté à la solution ainsi obtenue un équivolume de phénol. Le mélange était agité et une phase aqueuse était récupérée. A la phase aqueuse était ajouté un équivolume d'une solution de phénolchloroforme (1:1) avec une agitation subséquente. Une phase aqueuse était récupérée et, à la phase aqueuse était ajouté un équivolume de chloroforme, avec agitation subséquente. Une phase aqueuse était récupérée. A la phase aqueuse était ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à ce que la concentration finale de l'acétate de sodium soit de 300 mM, et ensuite un demi- volume d'éthanol était ajouté. Le mélange résultant était maintenu à 30 C pendant 3 heures. Ensuite, le mélange était soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) pendant 10 minutes pour obtenir des précipités. Les précipités ainsi obtenus étaient séchés sous pression réduite pour obtenir environ 2k;,g d'un fragment d'ADN. Substantiellement de la même façon que dans les exemples de référence 1 et 2 précités, on a confirmé que le fragment d'ADN ainsi obtenu contenait un gène pour la résistance à la tétracycline. R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- PLasmide caractérisé en ce qu'il contient un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. 2.- PLasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène précité pour la résistance à la tétra- cycline est dérivé du microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 déposée au "Fermentation Research Institut " (FRI) sous le numéro d'accès FERM BP-560, et qui présente une longueur moléculaire d'environ 20,4 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction telle que représentée sur la figure 1, et qui est substan- tiellement pur et référencé pAGl. 3.- Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est dérivé du plasmide pAG1 selon la revendication 2. 4.- Plasmide selon la revendication 3, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 10,7 kb; 10,7 kb; 8,4 kb; 7,3 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction représentée respectivement aux figures 3, 4, ,6, et respectivement référencé pAG12, pAG14, pAG31 et pAG32. 5.- PLasmide caractérisé en ce qu'il comprend un premier fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement ligaturé audit second fragment d'ADN. 6.- Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN dérivé du plasmide pAGl. 7.- PLasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb et a une extrémité collante formée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission BglI, et présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb, 2,2 kb et 2,8 kb de ladite extrémité collante forméepar scission BamHI. 8.- Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,8 kb et a une extrémité collante formée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission EcoRI, et présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI et un second site PstI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb et 2,2 kb de ladite extré- mité libre formée par scission BmHI. 9.- Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,5 kb et a une extrémité collante formée par scission BglII et l'autre extrémité collante formée par scission Sali, et présente les sites de restriction suivants: un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,6 kb, 1,5 kb et 2,1 kb de cette extrémité collante formée par scission SalI. lO.- PLasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,1 kb et a une première extrémité collante formée par scission EcoRI et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et présente les sites de restriction suivants: un premier site PstI et un second site PastI qui sont situés respectivement à environ 0,6 kb et 1,5 kb de ladite extrémité collante forméepar scission SalI. 11.-- Plasmide selon l'une des revendications et 6, caractérisé en:ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN dérivé d'un plasmide pAG3, ledit plasmide pAG3 étant défini comme plasmide obtenu à partir du microorganisme Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559, et qui présente une longueur moléculaire d'environ 4,8 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction telle que représentée à la figure 2. 12.- PLasmide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN dérivé du plasmide pAG3 précité, et qui a une longueur moléculaire d'environ 8,0 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction telle que représentée à la figure 7, et qui est référencé pAG50. 13.- Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il comprend un gbne pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. 14.- Fragment d'ADN selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est dérivé du plasmide pAGl. 15.- Fragment d'ADN selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb et a une extrémité collante formée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission BgliT et présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb, 2,2 kb et 2,8 kb à partir de ladite extrémitécollante formée par scission BamHI. 16.- Fragment d'ADN selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 2,8 kb et a une extrémité collante formée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission EcoRI, et présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI et un second site PstI, qui sont situés respectivement à environ 0,7 kb, 1,3 kb et 2,2 kb de ladite extrémité collante forméepar scission BamHI. 17.- Fragment d'ADN selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 2,5 kb et a une extrémité collante formée par scission BglII et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et présente les sites de restriction suivants: un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,6 kb, 1,5 kb et 2,1 kb de ladite extrémité collante formée par scission SalI. 18.- Fragment d'ADN selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 2,1 kb et a une extrémité collante formée par scission EcoRI et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et présente les sites de restriction suivants: - un premier site PstI et un second site PstI qui sont respectivement situés à environ 0,6 kb et 1,5 kb de ladite extrémité collante formée par scission SalI. 19.- Culture biologiquement pure de microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560 caractérisée en ce qu'elle comprend le plasmide pAGl selon la revendication 2. 20.- Microorganisme caractérisé en ce qu'il comprend une bactérie corynéforme et un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, ledit fragment d'ADN étant contenu dans ladite bactérie coryneforme. 21.- Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée est une bactérie appartenant au genre choisi parmi le groupe consistant en Corynebacterium, Brevibacterium et Microbacterium. 22.- Microorganisme selon la revendication 21, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée est une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. 23.- Microorganisme selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité contenant un gène pour la résistance à la tétracycline est un fragment d'ADN dérivé du plasmide pAG1 selon la revendication 2. 24.- Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb et a une extrémité colilanteformée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission BglII et présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb, 2,2 kb et 2,8 kb de ladite extrémité libre formée par scission BamHI. 25.- Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,8 kb et a une extrémité collanteformée par scission BamHI et l'autre extrémité collante formée par scission EcoRI, et qui présente les sites de restriction suivants: un site SalI, un premier site PstI et un second site PstI qui sont respectivement situés à environ 0,7 kb, 1,3 kb et 2,2 kb de cette extrémité collante formée par scission BamHI. 26.- Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,5 kb et a une extrémité collante formée parscission BglII et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et présente les sites de restriction suivants: un premier site PstI, un second site PstI et un site EcoRI qui sont respectivement situés à environ 0,6 kb, 1,5 kb et 2,1 kb de ladite extrémité formée par scission SalI. 27.- Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité a une longueur moléculaire d'environ 2,1 kb et a une extrémité collante formée par scission EcoRI et l'autre extrémité collante formée par scission SalI, et qui présente les sites de restriction suivants: un premier site PstI et un second site PstI qui sont respectivement situés à environ 0,6 kb et 1,5 kb de ladite extrémité collante formée par scission SalI. 28.- Microorganisme selon la revendication 24, caractérisé en ce que le fragment d'ADN précité est ligaturé au plasmide pAG3 tel que défini dans la revendication 14 pour former le plasmide pAG50 de la revendication 15 et en ce que ladite bactérie corynéforme est un microorganisme Corynebacterium melassecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558.