Brevet FR2572092A1 — publié le 19860425

La présente invention concerne les anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la protéine kinase humaine, p 72 K, qui est associée à l'action de l'interféron, leur procédé d'obtention et leur application sous forme d'irmun- complexes comme catalyseurs de phosphorylation utilisables pour le dosage de la p 72 K, de ses substrats exogènes et pour la détermination de l'interferon circulant chez lthomme. on a constaté l'auqmentation de l'activité protéine kinase, p 72 K, dans les cellules humaines en culture, comme dans les lv'pho- cytes du sans circulant et les tissus humains en réponse aux interférons endogènes ou exones, activité qui se traduit Par une aug- mentation de la phosPhorylation d'une protéine endogène de masse mcléculaire considérée communément comme étant 72 000 Daltons; dans ce qui suit cette protéine endogène est notée protéine 72000. Ce même phénomène est observé, chez la souris, avec une autre protéine kinase pour la phosphorylation d'une protéine de masse moléculaire 67 000.Aussi, on con çoit que l'étude de cette activité enzymatique puisse servir à déceler la réponse de l'organisme humain, ou animal, à un traitement par l'interféron, comme l'ont souligné Ara G. Hovanessian et coll. dans Analytical Biochemistry 129 349-356 (1983). Toutefois, étant donné les nombreuses pro tétines kinases et phosphatases présentes dansl'orqanisme, la mesure de l'activité enzymatique de la seule p 72 K est difficile; dans l'article précédent, les auteurs décrivent une méthode qui consiste à mesurer l'activité protéine kinase, p 72 d'un échantillon bioloqique après l'avoir soumis à un procédé de purification particulier.Selon cette méthode, on traite l'échantillon par de l'héparine avant de le faire passer sur une colonne d'affinité contenant un gel d'aqarose, le Sépharose (marque déposée par Pharmacia), sur lequel on a couplé des polynucléotides, tels que poly(rI) poly(rC) ou poly (rA).poly(rU), pour y fixer la protéine kinase; on détermine ensuite l'activité kinasique de la colonne sur laquelle ltenzyme a été absorbée; les auteurs siqnalent que le traitement préalable par l'héparine inhibe l'activité de différentes kinases, ainsi que celle de la 2-5 A synthétase, enzyme dont la synthèse est aussi stimulée par l'interféron, sans pour autant modifier l'activité p 72 K kinase et que dans ces conditions, les resultats obtenus sont plus représentatifs de la quantité de la p 72 K présente dans l'échantillon à étudier. Toutefois, la sensibilité d'une telle méthode n'est pas très élevée et, en outre, les résultats peuvent être perturbes par la présence de phosphatases et nucléases spécifiques des ARN bicaténaires utilisés. La présente invention permet d'améliorer la sensibilité du dosage d'un facteur voisin de 100, tout en restant de mise en oeuvre simple. Un premier objet de l'invention est un procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine kinase humaine, p 72 K ; ces anticorps sont secrétés par des hybridomes qui peuvent être préparés de façon clssique, comme par la méthode décrite par Köhler et Milstein dans Nature 256-495-497 (1975).Ces hybridomes résultent de la fusion de cellules de myélome et de cellules de rates, isolées chez des souris qui ont été préalablement immunisées par injection d'une fraction protéique purifiée contenant la kinase, p 72 K. On peut effectuer cette purification par passage des extraits de cellules stimulées par l'interféron, sur une colonne de Sepharose sur laquelle des polynucléotides tels que poly(rA). poly(rU) ou poly(rI).poly(rC) ont été couplés, comme décrit dans l'article de Ara G. Hovanessian et coll., précédemment cité. Dans ces conditions, et si l'on a préalablement ajouté de l'héparine aux extraits cellulaires, on obtiendra une fraction enrichie, jusqu'a 10000 fois, en p 72 K. Les extraits cellulaires peuvent provenir de tous les types de cellules humaines et, par exemple, des cellules Daudi dont la synthèse de p 72 K a été préalablement stimulée par addition d'interféron dans leur milieu de culture. On peut injecter aux animaux directement l'antigène fixé sur le poly(rA).poly(rU)/sépharose, en l'absence d'adjuvant de Freund, ce qui est l'une des caractéristiques de l'invention. La même technique d'immunisation est avantageusement applicable pour les autres protéines qui s'attachent à des ARN bicaténaires, lorsque ceux-ci sont couplés sur un support solide tel que le Sépharose. Selon le procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux de la présente invention, on sélectionne les hybridomes en étudiant les surnageants des cultures par mesure de l'activité enzymatique des immunprécipités -sur la phosphorylation de la protéine endogène 72 000, et de protéines exogènes basiques, telles que les histones et le facteur d'initiation de la synthèse protéique eIF2 (décrit par A.G. Hovanessian dans Differentiation 15, 139-151 (1979)). D'autres essais peuvent être effectués simultanément à celui-ci pour compléter la sélection des hybridomes. On peut ainsi étudier les surnageants des cultures - par immunoprécipitation avec la protéine kinase, p 72 K, marquée : ce marquage peut être réalisé par exemple métaboliquement par un élément radioactif, notamment par la 35 S-méthionine, ou encore à l'aide d'un marqueur enzymatique ou par un agent fluorescent, et - par immunoempreinteavecla protéine 72 000, technique connue sous le nom de "Western Blot et décrite notamment par W.N. Burnette dans Analytical Biochemistry 112, p. 195-203 (1981). Par clonage et sous-clonage, on isole ainsi des hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux spécifiques de la p 72 K. L'injection péritonéale rades souris d'un clone sélectionné d'hybridomes, selon une technique classique, permet d'isoler des quantités importantes d'immunoglobulines anti-p 72 Et à partir des liquides d'ascite. Il faut noter que c'est la mise en évidence par les inventeurs de la présence de l'activité enzymatique phosphorylante des immuncomplexes formés entre la protéine kinase, p 72 K, et ses anticorps polyclonaux qui est à l'origine de la mise au point d'un procédé d'obtention d'hybridomes secréteurs d'anticorps monoclonaux, particulièrement spécifiques. Les anticorps monoclonaux obtenues par ce procédé et les immuncomplexes correspondants sont un autre objet de l'invention. On préfère tout particulièrement les anticorps ayant les caractéristiques de ceux secrétés par la lignée d'hybridomes dont des échantillons ont été déposés le 19 octobre 1984 à la Collection Nationale de Hicroorga nismes(CNCM) de l'institut Pasteur (France) sous le nO I - 353 . Ces anticorps sont des immunoglobulines de type IgG1. Un autre objet de l'invention est constitue par les anticorps monoclonaux fixés sur un support insoluble dans les milieux biologiques, c'est-à-dire les milieux utilisés pour la solubilisation ou la mise en suspension des produits d'origine biologique. Le support est avantageusement constitué par un gel d'agarose activé ; on peut utiliser par exemple du Sépharose activé au bromure de cyanogène, qui agira comme agent de fixation des anticorps, ou activé par tout autre agent de couplage bifonctionnel. Les immuncomplexes fixés sont obtenus par mise en contact des anticorps monoclonaux immobilisés sur un support, avec de la protéine kinasep72 K ; ils ont l'activité enzymatique de ladite protéine kinase, ce qui est un autre avantage de l'invention, puisqu'ils peuvent être notamment utilisés pour catalyser les réactions de phosphorylation des substrats de l'enzyme, p 72 K. Parmi ces substrats, on trouve la protéine humaine 72 000 qui est constituée de plusieurs espèces moléculaires dont les points isoélectriques se situent entre 7,2 et 8,2 et qui, sous l'action de la protéase V8 de Staphylococcus aureus, donne plusieurs polypeptides de masse comprise entre 56000 et 23000.D'autres substrats exogènes ont aussi été mis en évidence, dont des protéines basiques exogènes, telles que les histones, et la sous-unité { du facteur d'initiation de la synthèse protéique eIF2. Un autre objet de l'invention concerne l'application des anticorps monoclonaux anti-p 72 K kinase à un procédé de dosage de cette protéine kinase, ou de ses substrats exogénes, dans les milieux biologiques et à un procédé de détermination de la quantité d'interféron circulant chez l'homme. Le procédé de dosage de la p 72 K selon l'invention consiste à mettre en contact l'extrait biologique dans lequel se trouve la p 72 K à doser, avec une phase solide constituée d'anticorps monoclonaux couplés à un support insoluble dans les'milieux biologiques, et après le lavage de la phase solide'ainsi obtenue pour éliminer les protéines fixées non spécifiquement, à déterminer l'activité enzymatique de la phase solide par mesure de la phosphorylation de la protéine 72 000 en présence d'ATP. La fixation de la p 72 K sur le support où ont été couplés les anticorps monoclonaux (anti-p 72 K/Sépharose) est effectuée, de préférence, par passage de l'extrait de p 72 K sur une colonne de chromatographie remplie du support anti p-72 K/Sépharose dans les conditions classiques d'une chromatographie d'affinité. On peut aussi opérer dans des tubes de polystyrène ce qui permet, lors des opérations de lavage, d'éliminer simplement les surnageants par décantation après centrifugation. L'activité enzymatique peut être mesurée en faisant incuber l'ensemble, en présence d'ATP marqué au 32p ( -32P-ATP)' le milieu d'incubation est alors, après addition d'albumine, soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; la protéine 72000, marquée au 32P04 migre juste au-dessus de l'albumine ; on la localise avec un réactif de coloration des protéines et la zone du gel correspondante est prélevée puis comptée par scintillation liquide ; la concentratson en protéine 72000 est trop faible pour être décelée par une simple coloration au nitrate d'argent. Dans le cas du dosage de substrats exogènes de la p 72 K, ceux-ci sont introduits dans le milieu avant l'incubation avec 1'ATP marqué. La détermination de la quantité de p 72 K kinase dans les lymphocytes du sang périphérique permet d'étudier la quantité d'interféron circulant chez l'homme, étude très difficile à effectuer jusqu'à présent. En effet, comme la durée de vie de l'interféron circulant est très courte (période : 15 à 20 minutes), il est à peu près impossible de le doser directement ou même de le déceler quand il n'est produit quten très faible quantité. Par contre, la p 72 K kinase a une durée de -vie beaucoup plus longue (période 15 à 20 heures) et il est, avec le procédé de l'invention, possible de doser même de faibles activités enzymatiques des lymphocytes, activités qui sont liées au taux d'interféron. Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont aussi utilisables pour détecter la protéine 72 000 par des techniques d'immunocytochimie. Ces techniques sont diverses et classiques et on pourra se référer à l'ouvrage "Immunochemistry in Practice" de A. Johnstone et R. Thorpe publié par Blackwell Scientific Publications en 1982, ou encore à l'article de D.L. Taylor et Y.L. Wang dans Nature 284 405-410 (1980). Les coffrets comprenant les différents réactifs pour la mise en oeuvre des présents procédés de dosage sont un autre objet de l'invention. Un coffret pour le dosage de la p 72.K comprend - des anticorps monoclonaux immobilisés sur un support, - de 1'ATP marqué une préparation étalon de p 72 K - des tampons pour la fixation et le lavage Dans ce qui suit, on décrit un exemple de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1) Obtention de fractions protéiques purifiées contenant la p 72 K kinase. Des cellules Daudi humaines ont été cultivées en suspension dans un milieu RPMI-1640, contenant du mercapto2-éthanol (C = 10 5M) et du sérum de veau foetal (10 %). Le milieu RPMI est décrit dans In Vitro 9,6 (1974) et commercialisé par Grand Island Biological Cy-.USA. Les cellules en culture ont été traitées pendant 18 à 22 heures par 500 à 1000 unités NIH (Nationalinstituteof Health) par ml d'interféron K préalablement purifié (108 unités/mg de protéine). Pour préparer les extraits cellulaires, les cellules Daudi stimulées par l'interféron, ont été lavées par un tampon phosphate salin avant l'addition d'un tampon lysant. Les extraits ont été centrifugés à 12 000 g et les surnageants séparés et conservés, lorsqu'vil y avait lieu, à - 80"C. L'extrait cellulaire, contenant la p 72 K kinase induite par l'interféron, a été purifié par passage)en présence d'héparine (100 unités/ml)1 sur une colonne de Sépharose activée au BrCN sur laquelle avaient été fixés des groupes poly(rA).poly(rU), comme décrit dans Analytical Biochemistry 129, 349-356 (1983) préalablement cité : les polynucléotides (1 mg) sont fixés sur 1 ml de Sépharose activé au BrCN(150 mg BrCN/ml de Sépharose) dans une solu tion 0,2 M d'acide morpholino-4 éthane sulfonique (MES) de pH 6 ; le gel ainsi traité est lavé successivement avec 5 vol de tampon MES, 0,1 M, de pH 6, et de KCl 0,05 M tamponné avec 0,01 M de Tris-HCl, de pH 8, et conservé, s'il y a lieu, dans un tampon de pH 7,6 contenant 10 mM d'acide(hydroxy-2 éthyl)-4 pipérazino-l sulfonique (HEPES), pH 7,6, 50 mM de KCl, 2 mM de Mg(OCOCH3)2 et 0,02 %d'- azoture de sodium V/V.. la p 72 K kinase peut être éluée de la colonne avec du tampon HEPES contenant 1N de KCl et de l'albumine murine à raison de 0,5 mg/ml puis dialysé contre un tampon phosphate salin. 2) Immunisation des souris. 5 souris de souche Balb/c ont reçu 6 fois à 2 semaines d'intervalle une injection intrapéritonéale de la protéine kinase (provenant de 2 x 108 cellules) fixée sur 200 ul de poly(rA).poly(rU)/Sépharose (volume mesuré sur support gonflé). 3) Obtention et sélection des hybridomes. Des cellules des rates des souris ainsi immuni sées ont été soumises à une fusion avec des cellules de ityélane HGPRT-tel que P3X 63 Aq8 6.55 en présence de polyéthyléneglycol 1500, commercialisé par ROTH-Karslruhe-RFA, à 50 Z, les hybridomes obte-nus ont été cultives dans un milieu connu, décrit par Laurent et coll. dans Hybridoma 1, 313-321 (1982), comportant, comme source nourricière, un milieu conditionné obtenu par culture de cellules humaines NRC5. Les surnageants des cultures ont été étudiés par la technique d'immunoprécipitation suivante : des préparations enzymatiques (100 ul venant de 106 cellules Daudi, traitées à l'interféron) sont incubées (60 minutes à 4 C) avec les anticorps monoclonaux dirigés contre la p 72 K kinase (100 et 200 l de surnageant de culture), avant d'être incubés (3 heures à 4 C) avec 100 pl de Sépharose sur lequel a été fixée de la protéine A, dans un tampon Z contenant : Tris-HCl pH 7,6 ; 100 mM de KCl.; 2,5 mM Mg(OCOCH3)2, ; 10 unités/ml d'aprotinine; 5 unités par ml d'héparine et 20 % de glycérol V/V.Les immuncomplexes formés, fixés sur la protéine A/Sépharose, ont été lavés successivement par 2 fois 4 mu du tampon précédent Z contenant 0,5 % de NP 40, détergent nonionique, commercia lisé par Sigma, puis par 2 fois 4 ml du tampon Z et une fois 4 ml d'un tampon composé du tampon Z auquel était ajouté 10 mM de MnCl2 et 1 mM de dithiotreitol. L'ensemble ainsi traité a été incubé (45 minutes à 30 C) dans 50 l du dernier tampon contenant. en outre 1 pM de &gamma;-32 P-ATP (d'activité spécifique 50 à 100 Ci/mmol).A ce moment, la réaction de phosphorylation a été arrêtée par addition de 50 ul d'un tampon pour électrophorèse doublement concentré (130 mM Tris-HCl pH 6,8 ; 2 M d'urée, 8,5 % de dodécylsul fate de sodium ; 0,1 Z de bleu de bromophénol ; 1,5 M de mercapto-2 éthanol et 35 % de glycérol V/V). Les solutions ainsi obtenues ont été soumises à une électrophorèse en gel de polyacrylamide et la protéine 72 000 phosphorylée révélée par autoradiographie. Les hybridomes, dont on a ainsi décelé la secrétion d'anticorps anti-p 72 K, ont été sous-clonés et leSsurnageantS de ces nouvelles cultures ont été soumis au test d'immunoprécipitation précédemment décrit puis aux deux autres tests suivants - test d'immunoempreinte, pour l'identification de la protéine dénaturée dans un gel de polyacrylamide à 10% - immunoprécipitation avec la protéine marquée, en utilisant des extraits de cellules stimulées par l'interféron et incubées en présence de 35 S méthionine. 4) Isolement des anticorps monoclonaux Parmi les sous-clones ainsi sélectionnés, celui portant la référence HL71/10, déposé à la CNCM sous le n" I - 353, le 19 novembre 1984, a été utilisé pour préparer une certaine quantité d'anticorps monoclonaux. Pour cela, les cellules ont été administrées par voie intrapéritonéale à raison de5 a 10.106cellules par animal,àdessouris traitées au tétra"e.thyl-3,6, 10,14 pentadécane,pour obtenir des ascites. Les immunoglo- bulines isolées après 8 jours dans les liquides d'ascite ont été purifées par une chromatographie sur DEAE-cellulose puis une chromatographie sur protéine A/Sépharose (commercialisé par Pharmacia). 5) Dosage de la p 72 K kinase Les anticorps monoclonaux purifiés sont couplés à du Sépharose activé au CNBr selon une méthode classique à raison de 2 mg/ml de Sépharose activé. On fait passer l'extrait cellulaire à étudier sur une colonne remplie de ces anticorps immobilisés de façon à y fixer la p 72 K kinase présente. Après élimination de l'extrait non fixé et lavage par un tampon contenant du NaCl 0,4 M, une quantité convenable (10 M, 10 Gi/mmol) de32P-ATP est introduite dans le milieu et la suspension incubée pendant 30 minutes à 30"C. Après addition de sérum albumine bovine) à raison de 10 sg/échantillon, on effectue une électrophorèse sur plaque de gel de polyacrylamide pour séparer l'albumine et la protéine 72000 phosphorylée qui migre juste au-dessus. La zone correspondante est révélée par un colorant des protéines, puis prélevée et comptée par scintillation liquide. Dans ces conditions, on a pu déceler l'induction de la protéine 72000 dans les cellules Daudi, par une quantité d'interféron aussi faible qu'une unité NIH. Par ailleurs, on a comparé les résultats obtenus par le présent procédé de dosage avec ceux donnés par la méthode précédemment décrite dans Anal. Biochem. 129 349 356 (1983) dans laquelle on mesurait 1 activité de la protéine kinase p 72 K présente dans les milieux biologiques après fixation sur des colonnes de Sépharose couplé à des polynucléotides. On a constaté que la protéine kinase se fixait 60 à 70 fois mieux sur les anticorps immobilisés selon l'invention, que sur le Sépharose couplé aux poly nucléotides, comme on peut le constater sur le tableau 1. TABLEAU 1 32 Mise en contact du milieu Ouantité de P04 incorporé à étudier avec : dans la protéine 72000 (en p moles) poly(rI). poly(rC)- & pharose 4B 1,1 poly(.rA) poly(rU)-Sépharose 4B 1,2 anti-p 72 K couplé à Sépharose 4B 62,5 anti-72 K couplé à Sépharose Cl 43*. 75,8 * 4B, Cl 43 : type de Sépharose commercialisé par Pharmacia Le poids moléculaire de la protéine marquée à la méthionine 35S est de 68000 Daltons, ce qui correspond à la protéine non phospho rylée ou faiblement phosphorylée. La saturation de cette protéine par le phosphate augmente son poids ncleculaire qui atteint de 70 000 à 72 000 Daltons (= p 72 K, telle que décrite dans la litez rature. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'anticorps monoclônaux spécifiques de la protéine kinase humaine, p 72 K, associée à l'action de l'interféron, à l'aide d'hybridomes résultant de la fusion de cellules tumorales avec des cellules d'animaux ayant été immunisés contre une fraction protéique enrichie en p 72 K, caractérisé en ce que la sélection des hybridomes est effectuée en mesurant l'activité enzymatique des immunprécipités, formés entre les surnageants des cultures et la p 72 K, sur la phosphorylation de la protéine 72 000, d'histones exogènes ou du facteur d'initiation de la synthèse protéique eIF2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'immunisation des animaux est effectuée par administration de p 72 K fixée sur un gel d'agarose auquel des polynucléotides ont été couplés. 3. Procédé selon ltune des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la sélection des hybridomes est effectuée, en outre, - par immunoprécipitation avec la protéine 72 000 marquée, - par immunoempreinte, ou "Western blott". 4. Anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine kinase humaine, p 72 K, associée à l'action de l'interféron. 5. Anticorps monoclonaux selon la revendication 4, ayant les caractéristiques de ceux secrétés par la lignée d'hybridomes dont des échantillons sont déposés à la CNCM sous le n0 î - 353 6. Anticorps monoclonaux selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisés en ce qu'ils so-nt immobilisés sur un support insoluble dans les milieux biologiques 7. Anticorps monoclonaux selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils sont fixés sur un gel d'agarose activé. 8. Immuncomplexes, catalyseurs de phosphorylation, caractérisés en ce qu'ils résultent de la réaction de la protéine kinase, p 72 K, avec les anticorps monoclo- naux selon l'une des revendications 4 à 7. 9. Procédé de dosage de la p 72 K ou d'un substrat exogène de ia p 72K, caractérisé en ce que l'on met l'extrait biologique dans lequel se trouve la p 72 K en contact avec une phase solide constituée d'anticorps monoclonaux immobilisés sur un support selon l'une des revendications 6 ou 7 et qu'apurés séparation de la fraction biologique non fixée et lavage de la phase solide, on mesure l'activité enzymatique phosphorylante de la phase solide ainsi obtenue. 10. Procédé selon la revendication 9 pour le dosage de la p 72 K, caractérisé en ce que l'activité enzymatique est déterminée par mesure de la radioactivité intégrée dans la protéine 72 000 après incubation avec de l'ATP marqué au 32 P. 11. Procédé selon la revendication 9 pour le dosage de substrats exogènes de la p 72 K, caractérisé en ce que l'activité enzymatique est déterminée par mesure de la radioactivité intégrée dans le substrat après incubation avec de l'ATP marqué au 32 P et l'échantillon de substrat à doser. 12. Application du procédé de dosage selon l'une des revendications9 oulO- à la détermination de la quantité d'interféron circulant chez l'homme 13. Application des immuncomplexes selon la revendication 8 à la phosphorylation de substrats exogènes de la p 72 K, non spécifiques de l'espèce humaine. 14. Application des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 à la détection par des techniques d'immunocytochimieide la protéine 72 000. 15. Coffret pour l'application du procédé selon l'une des revendications 9 oulO caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps monoclonaux immobilisés selon L'une des revendications 6 ou 7, - de 1'ATP marqué, - une préparation étalon de p 72 K, - des tampons pour la fixation et le lavage.