Brevet FR2564858A1 — publié le 19851129

I La présente invention concerne la sélection, parmi une population hétérogène de cellules, d'une cellule secré- tant une substance particulière. Plus spécialement, l'invention concerne un procédé pour une étude préliminaire plus simple de cultures de cellules, comprenant des pro- duits de fusion d'un hybridome et de l'ADN en recombinai- son, pour déceler et sélectionner des cellules viables secrétant une substance spécifique. Des progrès récents dans la production et la modifi- cation c'une 'fière biologique, par exemple le génie génétique et 1_ technologie faisant appel à des hybridomes pour l'cbtter -: d'anticorps monoclonaux, ont conduit à une neass' d'identification de cellules individuelles produisaent d substances spécifiées. Par exemple, la productThn c!'icorps monoclonaux implique la fusion d'unr culturE e cellules hétérogènes, comprenant au moins une cE 'ule iduisant l'anticorps spécifique, avec une lignée - C ules immortelles, par exemple celles d'un myélome. Même 2ns les meilleures conditions, la technique de fusion n -t que partiellement couronnée de succès; certaines cel i.es ne participent pas à la fusion, cer- taines des c:ilules de la culture fusionnent les unes avec les autres plutôt qu'avec le myélome, et certaines cellules de myéiome fusionnent les unes avec les autres. Même en supposant que toutes les cellules de la culture de cellules fusionnent avec le myélome, un petit nombre seulement des produits de fusion va produire la substance intéressante. Donc, il faut une technique d'étude et d'examen préliminaire pour sélectionner des produits spéci- fiques de fusion. Une technique d'étude préliminaire couram- ment utilisée consiste à cultiver dans des plaques pour microtitrage les cellules provenant d'un mélange de fusion, à soumettre le fluide de chaque compartiment des plaques de microtitrage à des examens qualitatifs ou dosages quan- titatifs de 1 substance iéÉressante, et à effectuer des sous-cultur_-' des cei!u.L - donnant un résultat positif lors de ce dosage. Des problè- mes associés à ce mode opératoire comprennent la possibilité de dommages physiques infligés aux cellules lors de leur séparation en vue d'effectuer une sous-culture, la difficulté de séparer les cellules, la possibilité de contamination des cultures, et l'effet d'une matière étrangère, par exemple des fragments de cellules et des impuretés à poids molécu- laire élevé, sur la spécificité de l'examen d'analyse et/ou de dosage de la substance intéressante. Une autre difficul- té réside dans le fait que certains types de cellules ne présentent pas une bonne croissance dans des plaques pour microtitrage. La technologie de l'ADN en recombinaison exige également un examen préliminaire de détection des recombi- nants viables. La technologique classique de formation de recombinants comprend l'introduction d'un plasmide ou d'un autre vecteur dans une cellule, normalement un orga- nisme procaryote. Le plasmide ou vecteur contient un gène pouvant être transcrit au sein de la cellule pour former la substance intéressante. Comme dans le cas de la techno- o20 logie utilisant les hybridomes, un fort pourcentage des produits de fusion des plasmides ou vecteurs, d'une part, et des cellules, d'autre part, ne forme pas des cultures viables qui produisent la substance intéressante, de sorte qu'un processus d'étude préliminaire pour sélection est nécessaire. Des techniques semblables à celles utilisées pour l'identification des hybridomes sont courantes dans la technologie des recombinants, et des problèmes associés semblables y apparaissent. Le brevet US-A-4 352 883 (F. Lim), auquel on pourra se référer, enseigne un procédé pour encapsuler des cellules viables, ce qui comprend aussi des hybridomes ou des cellules génétiquement modifiées, au sein d'une membrane semi- perméable. Après l'encapsulation, les cellules sont saines, viables et capables de poursuivre leur métabolisme normal; elles secrètent les matières qu'elles secrètent normalement, et elles peuvent subir une mitose quand elles sont placées au sein des capsules. Des expériences récentes ont indiqué, en concoidarice avec l'exposé large du brevet cité, qu'il est possible de régler les dimensions des pores de la membrane de capsule tout en empêchant le passage de cellules et d'impuretés à poids moléculaire élevé. De cette façon, il est possible d'utiliser la membrane de la capsule comme agent de filtration facilitant l'examen d'analyse et/ou de dosage de la substance intéressante. La technique d'encapsulation du brevet précité contribue à éviter que des dégâts mécaniques ne soient infligés aux cellules, et simplifie la manutention des cellules. Donc, la présente invention a notamment pour objet de fournir: - une nouvelle technique d'étude et d'examen préalable en vue d'identifier, parmi une culture de cellules mixtes, des cellules secrétant une substance intéressante; - un procédé pour sélectionner des hybridomes produi- sant un anticorps monoclonal intéressant; - un procédé pour identifier des cellules généti- quement modifiées, qui sécrètent une substance intéressante; et - un procédé pour identifier ou sélectionner, parmi une culture de cellules contenant au moins une cellule produisant une substance intéressante, les hybridomes qui produisent une telle substance intéressante. Ces buts, objets et caractéristiques de l'invention, ainsi que d'autres encore, ressortiront de la description plus détaillée qui va suivre. L'invention concerne un procédé pour une étude ou un examen préliminaire de dépistage en vue de sélectionner ou d'identifier une cellule choisie qui sécrète une substance intéressante. On encapsule, au sein de plusieurs capsules, une culture hétérogène de cellules contenant plusieurs cellules. La culture de cellules peut être n'importe quelle culture qui comprend une cellule secrétant la substance intéressante, par exemple un hybridome formé par fusion d'un lymphocyte et d'une lignée de cellules immortelles comme celles d'un myélome, ou une cellule génétiquement modifiée telle un produit de fusion d'une cellule _proca- ryote et d'un vecteur contenant un gène codant, par trans- cription intracellulaire, pour provoquer la production de la substance particulière. Les capsules ont un volume intracapsulaire défini par une membrane perméable à la substance et imperméable aux cellules. La membrane peut aussi limiter le passage de molécules ayant un poids molécu- laire supérieur à une valeur prédéterminée. Dans le cas d'hybridomes, les cellules peuvent être encapsulées à une densité ne donnant pas plus d'un hybridome pour 10 capsules; cela constituerait alors un clone. On cultive les cellules encapsulées dans un appareil comportant plusieurs comparti- ments dont chacun contient un milieu extracapsulaire, de préférence un. milieu de croissance différentielle. La cellule choisie effectue la synthèse et la sécrétion de la substance au sein du volume intracapsulaire, et les substances secré- tées traversent la membrane pour parvenir dans le milieu extracapsulaire. On soumet le milieu extracapsulaire de chaque compartiment à des examens d'analyse et/ou de dosage de la substance intéressante, et l'on répète le processus avec les capsules de chaque compartiment qui donnent un résultat positif à l'examen d'analyse ou de dosage de la substance, jusqu'à identification de la cellule choisie. Les compartiments sont de préférence des creux ou puits qui peuvent retenir le milieu extracapsulaire et les capsu- les. Dans le cas d'hybridomes, l'aptitude à produire un clone à partir du mode opératoire de fusion initiale facilite l'examen préliminaire, puisqu'aucune capsule ne va contenir plus d'un seul hybridome, et cela accélère grandement l'isolement d'hybridomes stables, capables de secréter des anticorps. Les capsules identifiées dans le présent procédé peuvent servir d'agent d'immunisation, et l'on injecte alors les capsules à un animal qui produit ensuite des anticorps agissant contre la substance secrétée. Les capsules identifiées peuvent également être implantées dans un hâte animal, par exemple dans la cavité péritonéale d'une souris. La substance secrétée peut ensuite être récupérée du site d'implantation, de préférence à partir du fluide produit par l'hâte en réponse à l'implantation. Dans ses aspects les plus -larges, la présente inven- tion concerne un procédé pour soumettre une culture de cellules à un examen préliminaire de dépistage d'une cellule particulière secrétant une substance intéressante. Le procédé est particulièrement utile dans la technologie des hybridomes puisqu'il faut soumettre des produits de fusion de lympho- cytes et d'une lignée de cellules immortelles, par exemple un myélome, à un examen préliminaire de dépistage en vue de déterminer la cellule qui produit l'anticorps monoclonal intéressant. De même, le procédé convient bien pour la tech- nologie de recombinaison de ADN (acide désoxyribonucléique). L'invention permet la mise en oeuvre du procédé d'examen préliminaire de dépistage et de sélection d'une manière plus simple, moins destructrice, que les techniques classi- ques. L'invention convient particulièrement bien pour iden- tifier des cellules produisant une substance particulière et qui dépendent d'un ancrage. Tout d'abord, on obtient la culture hétérogène de cellules eonternant la cellule a sélectionner. On peut utiliser une culture de cellules antérieurement préparée, par exemple une culture d'un hybridome ou une lignée de cellules génétiquement modifiées, ou bien l'on peut préparer, spécifiquement pour le procédé, une nouvelle culture. Un exemple de techniques de formation d'hybridomes, telles que décrites par G. Kohler et C. Milstein "Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity" (Culture continue de cellules fusionnées secré- tant de l'anticorps de spécificité prédéterminée), Nature 256: 495 (1975), commence avec une culture, par exemple des lymphocytes prélevés sur un organe, une rate, dont au moins certains produisent la substance intéressante. On divise la culture en des cellules individuelles en utilisant des techniques classiques, par exemple en refoulant l'organe, la rate, à travers une toile métallique. On mélange les cellules avec celles d'une lignée de cellules immortelles, par exemple celles d'un myélome, et l'on forme les hybridomes par fusion dans du polyéthylène glycol (PEG). Plus parti- culièrement, on fait incuber les -lymphocytes et le myélome dans un milieu de fusion, comme le milieu de Eagle modifié de Duibecco (MEMD) et l'on ajoute environ 40 % de PEG. On enlève les cellules de la solution dans PEG et on les fait croître sous forme d'une culture avant l'examen préli- minaire de dépistage. De préférence, le myélome est sensible aux antibiotiques ou bien il exige que l'on introduise des additifs dans le milieu, de sorte que l'on peut utiliser comme moyen ou dispositif séparateur, un milieu pour crois- sance différentielle, par exemple un milieu contenant des substances qui vont tuer les cellules non fusionnées. Une fois des hybridomes viables identifiés, il peut s'avérer nécessaire de faire appel à d'autres examens préliminaires de dépistage pour déterminer s'ils sont producteurs de la substance intéressante. Si la cellule à sélectionner est génétiquement modifiée, on peut utiliser un mode opératoire de formation tel que celui décrit par F. Bolivar et Col., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multi- purpose cloning system" (formation et caractérisation de nouveaux véhicules de clonage, II, un système de clonage à buts multiples), Gene 2, 95-113 (1977). On insère un plasmide ou vecteur dans une cellule en utilisant des enzymes de restriction, et on cultive la cellule par des modes opératoires classiques. Le plasmide ou vecteur contient un gène pouvant être transcrit par la cellule pour produire la substance intéressante. Comme dans le cas des hybridomes, un milieu de croissance, à effet différentiel, peut être utile pour réaliser la sélection de la cellule. Par exemple, le plasmide contenant le gène codant pour l'obtention de la substance intéressante peut contenir aussi un gène permet- tant de différencier le produit de fusion d'avec des produits ne résultant pas de la fusion, et par exemple le plasmide peut conférer une résistance à la rifamycine à une cellule normalement sensible à la rifamycine, ce qui permet d'uti- ser, pour le dépistage, un milieu de croissance contenant de la rifamycine pour exercer un effet différentiel. Après formation de la -colonie de cellules, on encapsule les cellules. On préfère la technique générale décrite dans le brevet précité (Lim). On peut régler les dimensions des pores des microcapsules, comme décrit dans le brevet Lim et comme indiqué par ailleurs ici. Selon les enseignements du présent exposé, il est possible d'encapsuler des cellules qui sécrètent à la fois IgG (Immunoglobuline G, dont le poids moléculaire est d'environ 000 daltons) et IgM (Immunoglobuline M dont le poids moléculaire est d'environ 900 000 daltons) au sein de capsu- les qui laissent librement passer IgG à travers les pores de la membrane tout en empêchant essentiellement le passage de IgM. La membrane de capsule joue le râle d'un filtre, empêchant le passage des cellules et des impuretés à poids moléculaire élevé. Comme antérieurement noté, la technique préférée d'encapsulation est décrite dans le brevet Lim.. On prépare tout d'abord la culture des cellules sous forme finement divisée (selon des techniques bien connues) et on les met en suspension dans un milieu aqueux convenant pour le main- tien et l'entretien de la poursuite des processus métabo- liques. L'homme du métier connaît des milieux convenant pour l'entretien, par exemple PBS (solution tamponnée par des phosphates) de Dulbecco (sans Ca/Mg). On ajoute au milieu une substance hydrosoluble, physiologiquement compa- tible avec la cellule, que l'on peut rendre insoluble dans l'eau pour former une capsule temporaire ou masse gélifiée, cohérente et conservant sa forme. On donne ensuite à la solution résultante la forme de gouttelettes contenant les cellules ainsi que leur milieu de croissance, et l'on rend immédiatement les gouttelettes insolubles dans l'eau, en formant les capsules temporaires. La matière gélifiable peut être une matière hydrosoluble non toxique qui est rendue, par variation de la température, du pH ou de l'envi- ronnement ionique, insoluble dans l'eau sans que cela affecte les processus métaboliques des cellules. De préfé- rence, la matière gélifiable contient plusieurs groupes facilement ionisables, par exemple des groupes carboxyles ou amino, qui peuvent réagir, par formation de liaisons de type salin, avec des polymères contenant plusieurs groupes de charge opposée. Les matières gélifiables actuellement préférées sont des polysaccharides naturels ou synthétiques, de préférence l'alginate de sodium. D'autres polysaccharides utilisables dans l'invention comprennent des fractions acides de gomme guar, de gomme arabique, de carraghénine, de pectine, de gomme adragante et de gomme de xanthane. Ces matières peuvent être "réticulées" par réaction avec des cations pour former des masses conservant leurs formes et elles peuvent être solubilisées à nouveau, quand on enlève, par échange d'ions ou à l'aide d'un agent de séques- tration, les ions responsables de la réticulation. Une solution gélifiable, qui a été utilisée avec succès, contient environ 10 cellules/ml dans une solution à 1,0-1,5 % (poids/volume) d'alginate de sodium. On donne à la solution la forme de gouttelettes, par exemple en refoulant la solution à travers un appareil à tête productrice de jet(s). L'appareil à tête productrice de jet(s) consiste en une enveloppe ayant une buse supérieure d'admission d'air et un long corps creux ajusté avec frottement dans un bouchon. Une seringue, par exemple une seringue de cm3, équipée d'une pompe étagée ou pas à pas, est montée au sommet de l'enveloppe. Une aiguille, ayant par exemple 0,25 mm (0,0] pouce) de diamètre intérieur et revêtue de Te- flon, s'étend le long de l'enveloppe. L'intérieur de l'enveloppe est conçu de manière que l'extré- mité de l'aiguille soit soumise à un courant d'air laminaire constant jouant le rôle de lame d'air. En service, la seringue pleine de la solution contenant la matière à encapsuler est montée au sommet de l'enveloppe, puis la pompe pas à pas est activée pour refouler par incréments des gouttes de la solution vers l'extrémité de l'aiguille. Chaque gouttelette est "découpée" par le courant d'air et elle tombe) approximativement de 2,5 à 3,5 cm, dans une solution gélifiante dans laquelle elle est immédiatement gélifiée par absorption d'ions à rôle de réticulation. La solution gélifiante préférée est une solution d'ions calcium, par exemple à 1,2 % (en poids/volume) de chlorure de calcium dans une solution saline (de chlorure de sodium). La distance entre l'extrémité de l'aiguille et la solution de chlorure de calcium est assez grande pour laisser la solution d'alginate de sodium/cellules prendre la forme la plus favorable physiquement, celle d'une sphère (valeur maximale du rapport volume/surface). L'air se trouvant au sein du tube s'échappe doucement par un orifice du bouchon. Les masses sphéroîdales gélifiées ou capsules temporaires, retenant leurs formes, qui ont -un diamètre compris de préfé- rence entre 50 microns et un petit nombre de millimètres, se rassemblent en solution sous la forme d'une phase séparée et elles peuvent être récupérées par aspiration. Une membrane permanente est alors formée autour de chaque capsule temporaire par réticulation des couches superficielles de la capsule temporaire. De préférence, on utilise, pour réticuler les masses gélifiées, une solution aqueuse d'un polymère comportant plusieurs groupes de charge opposée. Si l'on utilise des polysaccharides carboxylés ou d'autres polysaccharides acides pour former la capsule temporaire, des matières polycationiques contenant des groupes pouvant réagir avec les acides, comme des amines, imines ou amides, peuvent servir d'agents de réticulation. Les matières polycationiques actuellement préférées com- prennent la polylysine, de la polyéthylène amine et de la polyvinyl amine. Les matières polycationiques réagissent avec les groupes acides de la matière polyanionique de la masse gélifiée pour former des réticulations du type liaisons salines. Selon le système utilisé, il peut s'avérer préférable de faire réagir la capsule permanente, formée par cette réaction, avec une solution qui occupe les groupes 1 0 cationiques libres, par exemple en faisant réagir la capsule avec une solution d'alginate de sodium à faible concentration. Des caspules destinées à servir dans la présente invention ont des membranes conçues-pour assurer la filtration requise, d'après le poids moléculaire, nécessaire pour permettre à la substance intéressante de traverser la membrane tout en maintenant au sein de la membrane les impuretés et cellules à poids moléculaire supérieur. Comme antérieu- rement noté, on peut former des capsules de manière qu'elles laissent librement passer IgG tout en empêchant essentiel- lement le passage de IgM. Deux techniques nouvelles ont été mises au point pour contribuer à régler les dimensions des pores, l'une fondée sur une technique à couches multiples et la seconde fondée sur un phénomène d'hydratation. Dans la première de ces techniques, les sphères gélifiées sont immergées dans des solutions polycationiques de forces ioni- niques différentes ou de concentrations différentes. Les couches de matière déposées autour des sphères gélifiées forment des structures à couches multiples. Par exemple, des capsules temporaires peuvent être immergées dans une solution de polylysine à poids moléculaire élevé, puis dans une solution de polylysine ou de polyvinyl amine à bas poids moléculaire. L'effet de la seconde immersion est de former une seconde membrane qui diminue la dimension des pores. La seconde technique de réglage de la dimension des pores exploite l'observation selon laquelle les gels d'alginate varient de volume selon leur hydratation, laquelle dépend à son tour de la force ionique de la solution d'ion métal avec laquelle elles sont mises en équilibre. Une membrane formée autour d'une masse de gel d'alginate expansé est plus uniforme que celle formée autour de masses de gel non expansé. Ce phénomène, associé à l'observation selon laquelle des membranes formées autour de gels denses tendent à rester intactes quand le gel est expansé, conduit à un procédé pour augmenter les dimensions des pores et former de meilleures membranes. Par exemple,on peut former une membrane dont la dimension des pores correspond à environ 000 daltons (ce qui suffit à laisser passer IgG tout en retenant IgM) en utilisant un agent polycationique de réticulation, à poids moléculaire modéré, autour d'un gel à haute densité, contenant des cellules, après avoir provoqué la mise en équilibre et l'expansion des masses gélifiées à l'aide d'un cation monovalent à faible force ionique. La solution de cation monovalent enlève les ions calcium et augmente le degré d'hydratation du gel, ce qui provoque un agrandissement des pores. Si les techniques ici décrites peuvent améliorer le réglage de la perméabilité des membranes, des membranes formées en suivant ces enseignements ne présentent pas un net pouvoir de coupure et de perméabilité en fonction du poids moléculaire. Les pores de chaque menmbrane parti- culière varient de dimension et ils n'empêchent pas de façon absolue le passage de molécules à poids moléculaire élevé. Mais le passage de ces molécules à travers la mem- brane est si lent qu'elles sont, en fait, empêchées de traverser la membrane. On pense que les pores sont des trajets tortueux délimités par des interstices entre les matières réticulées formant la membrane. Des molécules ayant un poids moléculaire élevé et, donc, de plus grands volumes effectifs, ont plus de collisions avec la structure des membranes, ce qui les empêche de traverser la membrane. Toutes les données quantitatives de perméabilité ici indi- quées se fondent sur les observations empiriques de diffu- sion, à travers des membranes, de molécules ayant un poids moléculaire connu. On fait croître durant plusieurs jours dans un milieu de croissance les cellules encapsulées et on les place ensuite dans un appareil d'examen préliminaire de dépistage, comportant plusieurs compartiments, par exemple une plaque de microtitrage ou de la gélose molle comportant quatre-vingt seize creux. De préférence, il y a environ 0l à 100 capsulb; dans chaque compartiment. La cellule produisant la substance synthétise et sécrète la substance, laquelle traverse la membrane de la capsule pour pénétrer dans le milieu extracapsulaire. On soumet le milieu extracapsulaire de chaque compartiment à des examens de recherche ou dosage de la substance, en utilisant des techniques classiques, par exemple un dosage radio-immunologique ou un dosage enzymatique. On peut répéter les opérations avec des capsules provenant de chaque compartiment donnant un résultat positif pour le dosage, jusqu'à identification de la cellule à choisir. Si possible, la répétition de l'étape doit se produire à une densité d'une capsule par creux. A cette densi- té, tout dosage positif montre que la cellule encapsulée, secrétant la substance intéressante, se trouve dans la microcapsule. Exemple 1 On a établi, par fusion dans du polyéthylène glycol des cellules de rate d'une souris BALB/c immunisée avec de la nitrogénase d'Azobacter 'et d'une lignée de cellules de myélome de souris BALB/c, GM 3570, une lignée de cellules secrétant des anticorps de type IgG contre la nitrogénase dlAzotobacter. On a acheté la lignée de cellules de myélome, ne produisant pas IgG, chez the Human Genetic Mutant Cell Repository. On a mis l'hybridome BALB/c (appelée C25) en suspen- sion dans une solution à 1,34 % (poids/volume) d'alginate de sodium (NaG-Kelco) dans du chlorure de sodium 150 mM. On a transféré la suspension visqueuse dans une seringue de 10 cm3 puis dans un appareil de formation de gouttelettes à tête productrice de jet(s), comme précédemment décrit. On a provoqué la gélification des gouttelettes en les mettant en contact avec une solution de 150 mM de chlorure de sodium contenant 1,2 % (en poids/volume) de chlorure de calcium. Les sphères gélifiées ont formé une phase séparée que l'on a collectée par aspiration. On a lavé trois fois, avec du chlorure de sodium 150 mM, les sphères gélifiées que l'on a ensuite fait incuber durant 6 minutes à la température ambiante dans une solution à 1,875 mg/ml de poly-L-lysine (Sigma, poids moléculaire: 65 000 daltons). Après leur incubation, on a lavé les capsules avec 25 ml de tampon CHES 5mM (acide 2-N-cyclohexylamino éthane sulfonique - Sigma, dans une solution à 0,2 % (en poids/volume) de chlo- rure de calcium et de 150 mM de chlorure de sodium), pH 7,5, une fois dans une solution à 0,2 % (en poids/volume) de chlorure de calcium dans du chlorure de sodium 150 mM et une fois dans une solution à 150 mM de chlorure de sodium. On a ensuite fait incuber les capsules, durant 4 minutes supplémentaires, à la température ambiante dans une solution de chlorure de sodium 150 mM contenant 0,06 % (en poids/ volume) de NaG, on a lavé une fois dans une solution de chlorure de sodium 150 mM et fait incuber durant 15 minutes supplémentaires à la température ambiante dans une solution de chlorure de sodium 150 mM contenant 55 mM de citrate de sodium. On a décanté la solution et on l'a remplacée par une solution fraîche de chlorure de sodium contenant mM de citrate de sodium. On a fait incuber les capsules à la température ambiante durant 6 minute supplémentaires puis on les a lavées deux fois-avec une solution de chlorure de sodium 150 mM, une fois avec du milieu de Eagle modifié (à haute teneur en glucose) de Dulbecco et une fois avec du milieu de Eagle modifié (à haute teneur en glucose) de Dulbecco, contenant 20 % de sérum de foetus de veau (FCS-Flow Laboratories) et de la penicilline, de la strepto- mycine, 1 mM de glutamine et 5 x 10- 5 M de mercaptoéthanol. Les capsules formées par ce mode opératoire ont été perméa- bles à IgG mais essentiellement imperméables à IgM. On a fait croître les cellules au sein des capsules durant plusieurs jours dans un flacon de culture> puis on les a dispersées dans une plaque à 24 creux pour micro- titrage, avec le milieu de croissance à une concentration d'environ 20 % en volume des capsules et 80 % en volume de milieu de croissance. Après environ trois jours d'incu- bation, on a soumis les échantillons de chaque creux à des essais de détermination d'antinitrogénase d'Azotobacter, en utilisant le mode opératoire indiqué ci-après. On a soumis les creux, présentant un résultat positif à cet essai, à une nouvelle culture dans de nouvelles plaques à 24 creux pour microtitrage, avec le milieu de croissance, jusqu'à identification d'hybridomes viables produisant de l'antinitrogénase d'Azotobacter. On a utilisé l'essai suivant pour la détermination de la production d'anti-nitrogénase d'Azotobacter. On a revêtu les creux, d'une plaque Linbro EIA de 96 creux, avec 100 pul d'une solution de 10,g de nitrogénase d'Azoto- bacter par ml d'une solution saline tamponnée par du phos- phate (STP). Après une nuit d'incubation à 4'C, on a enlevé par des secousses l'excès de solution de STP et l'on a revêtu ensuite les puits avec une solution à I % de sérum albumine de bovins (SAB) dans STP. Au bout d'une heure, on a enlevé par secousses la solution de STP-SAB. On a dilué des échantillons, en utilisant la solution de STP- SAB, et l'on a préparé des étalons en diluant une solution de I yg d'antinitrogénase purifiée par ml de STP-SAB. On a laissé les échantillons incuber durant I heure à 37't et l'on a ensuite lavé les creux trois fois avec STP. On a ajouté dans chaque creux une dilution à 1:1000 de IgG de chèvre antisouris conjuguée avec de la peroxydase dans SPT-SAB. Après deux heures d'incubation à la température ambiante, on a lavé chaque creux cinq fois avec SPT et l'on a ajouté dans chaque creux 100 pl d'une solution conte- nant par ml 4 mg d'orthophénylènediamine, 0,02 % (volume/ volume) de peroxyde d'hydrogène dans du citrate de sodium 55 mM pH 4,5. Au bout de 15 minutes, on a arrêté la réaction par l'addition de 100 pl de HC1 4N. On a lu les plaques sur un lecteur de plaques pour détermination colorimétrique de l'activité d'antinitrogénase. Ainsi qu'il ressort de l'exemple ci-dessus, le procédé ici décrit permet une sélection simplifiée d'une cellule produisant une substance intéressante. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé d'examen de dépistage décrit. REVENDICATIONS 1. Procédé d'examen préliminaire d'une culture de cellules pour dépister une cellule choisie secrétant une substance intéressante, procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes selon lesquelles: A) On encapsule les cellules de cette culture de cellules au sein de plusieurs capsules contenant chacune un volume intracapsulaire délimité par une membrane perméa- ble à ladite substance mais imperméable à ces cellules; B) On répartit ces cellules encapsulées dans un dispositif délimitant plusieurs compartiments dont chacun contient un milieu extracapsulaire. C) On laisse la cellule choisie effectuer la synthèse de cette substance et la secréter au sein du volume intra- capsulaire; D) On laisse la substance secrétée traverser la membrane; E) On soumet le milieu extracapsulaire de chaque compartiment à un essai de détermination de cette substance; F) On répète les étapes B à E avec les capsules provenant d'un compartiment donnant un résultat positif de recherche à l'étape E), jusqu'à identification d'une capsule contenant la cellule à sélectionner. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, statistiquement, la densité de cellules viables au sein du volume intracapsulaire n'est pas supérieure à une cellule par capsule. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule à sélectionner est ou comprend un produit de fusion d'un lymphocyte et d'une lignée de cellules immortelles. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la lignée de cellules immortelles est celle d'un myélome. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule à sélectionner est ou comprend un hybridome. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'hybridome est ou comprend un produit de fusion entre espèces. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la substance intéressante est ou comprend un anticorps monoclonal. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule à sélectionner est ou comprend une cellule génétiquement modifiée. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la cellule génétiquement modifiée est ou comprend un produit de fusion d'une cellule procaryote et d'un vecteur contenant un gène exprimable, codant pour ladite substance. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu extracapsulaire comprend un milieu de croissance de la cellule à sélectionner. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est perméable à la substance intéres- sante et est sensiblement imperméable à des molécules ayant un poids moléculaire supérieur à une valeur prédéterminée, et auxdites cellules.