Brevet FR2569419A1 — publié le 19860228

La présente invention concerne le domaine de la médecine et de la biologie, et plus précisément un procédé de l'obtention d'un milieu nutritif pour la culture de mi- croorganismes et de cultures de cellules d'un macroorganis- me. A l'heure actuelle, on utilise largement dans la pratique microbiologique des milieux de culture compacts à base du gel naturel d'agar-agar. Cependant, cette matière naturelle est coûteuse et d'approvisionnement difficile. C'est pourquoi les études liées à la création de milieux nutritifs à base de gels synthétiques, qui peuvent substi- tuer l'agar-agar dans la pratique microbiologique, sont actuelles. On connaît un procédé de préparation d'un milieu nutritif pour la culture de microorganismes, renfermant un copolymère de l'acrylamide et du méthylène-bis-acryla- mide dans un milieu aqueux avec un lavage ultérieur à l'eau du gel de polyacrylamide obtenu en vue d'éliminer des mono- mères toxiques initiaux, son imprégnation avec un substrat nutritif et une stérilisation ultérieure (Certificat d'au- teur de l'URSS N659619). Les avantages principaux lors de l'utilisation du gel de polyacrylamide en qualité de base pour le milieu de culture sont les suivants: le gel a une composition cons- tante, il ne renferme pas après son lavage à l'eau des im- puretés et des substances étrangères, rendant la croissance des microorganismes plus difficile, c'est une matière très limpide (transparente) et n'exige pas de clarification avant son utilisation. Toutefois, le gel de polyacrylamide, uti- lisé dans ce procédé en qualité de base pour le milieu nu- tritif compact, posséde une fragilité élevée, due à un haut degré de réticulation du polyacrylamide, qui rend la dif- fusion des fractions macromoléculaires du substrat nutri- tif plus difficile. La récolte des microorganismes, culti- vés sur tels milieux nutritifs, est réalisée seulement par élution avec la solution physiologique. On connaît également un gel de polyacrylamide pour les buts biologiques et médicaux et un procédé pour son obtention (Certificat d'auteur de l'URSS N977466). On peut utiliser le gel de polyacrylamide proposé en qualité de base pour un milieu nutritif compact. On le prépare par une copolymérisation d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis- acrylamide, pris en rapport pondéral de 0,5-40,0:2,5-12,0 dans la solution à 0,5 % de chlorure de sodium en présence d'un initiateur du type radicalaire. Le gel de polyacrylamide obtenu, qui après la réa- lisation du processus de copolymérisation renferme déjà une quantité d'eau maximum possible, est lavé des monoméres n'ayant pas réagis, avec une solution aqueuse à 0,5 % de chlorure de sodium pendant 12 heures en changeant la so- lution toutes les 4 heures. Le gel de polyacrylamide indiqué contient, en mas- se: Polyacrylamide................. 3,0-28,0 % Solution à 0,5 % de chlorure de sodium................ 72,0-97,0 % Le gel lavé est ensuite saturé avec des substrats pour l'alimentation de microorganismes, par exemple, avec un bouillon de viande-peptone. Le milieu nutritif compact obtenu selon le procédé décrit ne renferme pas des monomères toxiques et peut être utilisé pour une étude des propriétés biologiques de mi- croorganismes, de cellules d'animaux et de l'homme. Le milieu nutritif compact indiqué est caractérisé par une haute aptitude à la détérioration de la couche su- perficielle du gel de polyacrylamide, à cause de sa fragi- lité lors de ses diverses manipulations, par exemple, au cours du processus de stérilisation, lors de l'ensemence- ment des microorganismes, et également lors de la récolte des colonies avec la boucle bactériologique. La récolte des microorganismes pendant les réensemencements réitératifs est possible seulement par une élution avec la solution physiologique, ce qui n'est pas pratiqué dans beaucoup de travaux microbiologiques. Le travail s'est compliqué en particulier lors de la culture prolongée desmicroorganis- mes. On s'est donc proposé d'améliorer le procédé de préparation d'un milieu nutritif compact pour la culture de microorganismes et de cultures de cellules par une modi- fication de ses opérations technologiques de telle façon que ce milieu nutritif compact possède des propriétés phy- sico-mécaniques améliorées, élargissant la possibilité de son utilisation en buts microbiologiques. - La solution consiste en ce qu'on propose un procédé de préparation d'un milieu nutritif compact pour la cultu- re de microorganismes et de cultures de cellules d'un ma- croorganisme, comprennant la copolymérisation de l'acryla- mide et du N,N'-méthylène-bis-acrylamide dans la solution physiologique en présence d'un initiateur du type radica- laire jusqu'à la formation d'un gel de polyacrylamide avec son lavage ultérieur à la solution physiologique dans lequel conformément à l'invention, on conduit la copolymérisation d'acrylamide et de N,N'méthylène-bis-acrylamide dans leur rapport pondéral de 15,0-20,0:0,019-0, 132 respectivement et on maintient le gel de polyacrylamide obtenu après le lavage dans la solution physiologique jusqu'à augmentation de sa masse de 2,8-4,5 fois avec son traitement subséquent par un milieu nutritif liquide, ou on soumet le gel de po- lyacrylamide obtenu après le lavage à un gonflement dans un milieu nutritif liquide jusqu'à l'augmentation de sa masse de 2,5-3,5 fois. Le milieu nutritif compact, obtenu par le procédé proposé, est stable aux diverses actions et ne se détério- re pas pendant ses diverses manipulations, sa densité s'ap- proche de la densité de l'agar-agar. Le milieu est élasti- que, présente de bonnes propriétés adhésives (il est bien tenu dans la boite de pétri). A l'encontre du milieu nu- tritif compact connu, le milieu nutritif compact obtenu par le procédé proposé, assure un bon glissement de la bou- cle bactériologique au cours de l'ensemencement et la ré- colte de microorganismes sans altérer sa surface. Les cultures de microorganismes sont disposées sur la surface du milieu nutritif compact, sans toutefois s'en- raciner dans ce dernier, il assure ainsi les conditions op- timales pour la vitalité des microorganismes, ce qui per- met d'augmenter le rendement en biomasse. Il est rationnel pour augmenter la qualité du milieu nutritif compact, de conduire la copolymérisation dans un rapport pondéral. en- tre le mélange d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acry- lamide et la solution physiologique égal à 1:4-7 respec- tivement. Le rapport indiqué des composants dans le mélan- ge polymérisé donne les conditions optimales pour la for- mation d'une telle structure spatiale du gel de polyacryl- amide obtenu, qui assure de bonnes propriétés physico-mé- caniques du milieu nutritif, préparé sur sa base. Il est avantageux, pour élargir les possibilités de l'utilisation du milieu nutritif compact dans les buts microbiologiques, d'employer à titre de solution physiologi- que une solution aqueuse à 0,85 % de chlorure de sodium ou la solution de Ringer-Lock, la solution d'Earle, la solu- tion de Hanks ou une solution aqueuse & 5 %-de glucose, et à titre de milieu nutritif liquide le bouillon de diges- tion tryptique selon Hottinger, le bouillon de Martin, du bouillon de viande-peptone, de l'eau peptonique, de l'hy- drolysat de caséine, du moût, le milieu 199. Il est rationnel, pour la culture des gonocoques, de traiter le gel de polyacrylamide gonflé dans la solution physiologique avec un milieu nutritif liquide, en qualité duquel on utilise un mélange de sérum sanguin stérile inac- tivé humain et de plasmole pris dans le rapport pondéral de 1:1. Un tel milieu nutritif compact garantit une haute qualité de la croissance de la culture des gonocoques avec conservation de leurs propriétés morphologiques, tincto- riales, culturales et d'autres propriétés biologiques. L'u- tilisation du milieu susmentionné augmentera les possibi- lités diagnostiques de la bactériologie lors de la consta- tation de gonorrhée, particulièrement dans le cas des for- mes chroniques et torpides. Le temps de préparation d'un tel milieu nutritif compact est réduit de plusieurs fois comparativement au temps de préparation de "l'agar" de vian- de-peptone ascitique, l'agar de Bayle, l'agar sérique, uti- lisables pour la culture des gonocoques, et également, la nécessité d'utilisation de composants coûteux pour sa pré- paration est éliminée. Il est avantageux, pour élargir les possibilités de l'utilisation du milieu nutritif compact proposé, de mouler le gel de polyacrylamide au cours du processus de copoly- mérisation entre deux plaques planes, une desquelles a des cavités situées coaxialement et/ou en quinconce, puis d'im- prégner les plaques par une solution contenant l'acrylami- de et le N,N'-méthylène-bis-acrylamide dans leur rapport pondéral de 15,020,0:0,019-0,132, et de les superposer de façon à former des cavités fermées pour une culture ulté- rieure dans celles-ci de microorganismes ou de cultures de cellules d'un macroorganisme, de maintenir les plaques jus- qu'à la formation d'un bloc unique avec sa division sub- séquente en parties, dont chacune comporte au moins une cavité fermée telle que susmentionnée, puis de les soumet- tre au gonflement dans la solution physiologique et de les traiter avec le milieu nutritif liquide. On peut désigner les parties obtenues avec des ca- vités fermées comme des chambres à diffusion, lesquelles présentent une bonne résistance, élasticité, thermostabi- lité, grâce aux propriétés du gel de polyacrylamide. Elles sont facilement reproductibles, on peut les conserver pen- dant un temps prolongé, les soumettre à une stérilisation. Un tel milieu nutritif compact, élaboré sous forme de cham- bres à diffusion, trouvera une large application dans les systèmes in vitro et in vivo. Ces chambres à diffusion sont atraumatiques lors de leur transplantation dans l'organis- me (par exemple dans la cavité abdominale des animaux). Elles sont inertes pour l'organisme, ce qui a une importan- ce considérable lors de l'étude de l'influence de divers facteurs du milieu ambiant sur les objets, placés dans les cavités des chambres. Les chambres à diffusion, grâce aux caractères du gel de polyacrylamide, à partir duquel elles sont prépa- rées, présentent de bonnes caractéristiques de diffusion, ce qui permet aux substances nutritives et autres de pé- nétrer facilement dans les cultures de cellules d'un macro- organisme étudiées ou dans des microorganismes placés dans la cavité de la chambre et d'exercer sur ces derniers tou- te influence possible. De plus, elles sont transparentes, les microorganismes ou les cultures de cellules sont faci- lement examinés au microscope, ce qui donne la possibilité d'obtenir une notion de leur organisation. Le milieu nutritif compact pour la culture des microorganismes est obtenu de la façon suivante. On prépare d'abord un mélange réactionnel, contenant des solutions des monomères de départ dans la solution physiologique. Le rap- port pondéral entre l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bis- acrylamide du milieu réactionnel est (15,0-20,0):t0,019- 0,132) respectivement. En qualité de solution physiologique prise de pré- férence dans un rapport de 4-7:1 par rapport au mélange de monomères, on utilise une solution aqueuse à 0,85 % de chlorure de sodium ou une solution aqueuse à 0,9 % de chlo- rure de sodium ou une solution aqueuse à 5 % de glucose, ou des solutions de Ringer-Lock, de Hanks, d'Earle. En va- riant les rapports pondéraux des monomères de départ et de la solution physiologique, on peut obtenir des gels de polyacrylamide possédant une élasticité élevée comparative- ment aux gels connus, élasticité, qui rend le traitement ul- térieur du gel plus facile et assure par la suite de bonnes qualités du milieu nutritif. La copolymérisation des monomères de départ peut se dérouler sans chauffage ou pendant le chauffage du milieu réactionnel et de l'addition des initiateurs connus. On peut réaliser la copolymérisation du milieu réactionnel dans 'un réacteur d'une forme donnée tels que les récipients en ver- re, métalliques, céramiques, et également dans les réser- voirs de matériaux synthétiques. Le gel de polyacrylamide obtenu au cours du processus de copolymérisation, répète la forme et la dimension du réacteur. La copolymérisation ter- minée, on conduit le lavage du gel de polyacrylamide obtenu avec la solution physiologique appropriée. Puis on soumet le gel de polyacrylamide lavé au gonflement dans la solution phy- siologique jusqu'à une augmentation de la masse de 2,8-4,5 fois et on traite le gel obtenu avec le milieu nutritif li- quide en qualité duquel on utilise du bouillon de digestion tryptique d'après Hottinger, du bouillon de Martin, du bouillon à viande-peptone, de l'eau peptonique, de l'hydro- lysat de caséine, du moût, le milieu 199. Selon la deuxième variante de préparation du milieu nutritif, on peut soumettre le gel de polyacrylamide lavé avec la solution physiologique à un gonflement directement dans le milieu nutritif liquide de la composition susmen- tionnée jusqu'à une augmentation de sa masse de 2,5-3,5 fois. On soumet ensuite le gel de polyacrylamide gonflé (imprégné) à une stérilisation, et le milieu nutritif com- pact est prêt à l'usage. Un tel milieu favorise l'accrois- sement du rendement en biomasse. La composition des milieux nutritifs liquides a été déterminée par les nécessités nutritives de groupes ou d'es- péces concrètes de microorganismes ou de cellules de cultu- res d'un macroorganisme. Pour saturer et faire gonfler le gel de polyacrylamide proposé, on peut utiliser des milieux nutritifs liquides, assurant pratiquement les besoins nu- tritifs de toutes les espèces de microorganismes et de cel- lules connues, y compris l'es compositions naturelles, semi- synthétiques et synthétiques de substrats ou leurs mélanges. Le milieu nutritif compact pour la culture des microorga- nismes et des cultures de cellule, obtenu selon le procédé proposé, possède de bonnes propriétés adhésives (il est bien tenu dans la boite de Pétri), est stable aux diverses actions et ne se détériore pas au cours de ses différentes manipulations, assure un bon glissement de la boucle bacté- riologique pendant l'ensemencement et la récolte des micro- organismes, sans altérer sa surface. Les cultures de microorganismes sont situées sur la surface du milieu nutritif compact sans toutefois s'enraci- ner dans ce dernier, des conditions optimales pour la vi- talité des microorganismes sont ainsi assurées, ce qui per- met d'augmenter le rendement en biomasse. Etant donné que les propriétés susmentionnées du milieu nutritif compact sont déterminées par les caracté- ristiques du gel de pol-yacrylamide gonflé, le gel peut alors être utilisé avec succès, comme nous l'avons cons- taté, pour la préparation du milieu nutritif compact pour la culture des gonocoques. Le gel de polyacrylamide gon- flé dans'la solution physiologique jusqu'à l'accroissement de sa masse de 4,5 fois, est traité de préférence avec un milieu nutritif liquide, en qualité duquel on utilise un mélange de sérum sanguin stérile inactivé humain et de plasmole, pris en rapport pondéral de 1:1. Le plasmole est une préparation médicamenteuse ob- tenueà partir du sang humain. Il se présente sous forme d'un liquide incolore ou un liquide limpide avec une fai- ble nuance jaunâtre ou un liquide faiblement opalescent avec une odeur spécifique. Pour un diagnostic différentiel de la gonorrhée on a réalisé les investigations suivantes. 0,25-0,5 ml de sérum sanguin humain et 0,25-0,5 ml de plasmole sont enduits avec la pipette sur les disques du gel de polyacrylamide se trouvant dans les boites de Pétri, sont imprégnés dans la solution physiologique jus- qu'à l'accroissement de la masse par exemple de 4,5 fois, soumis à la stérilisation par une méthode connue, et sont soumis à l'inactivation par un procédé connu. On effectue ensuite le réensemencement de la culture des gonocoques âgée d'un jour, isolée à partir de 20 malades atteints de la gonorrhée aiguë, culture, obtenue sur un milieu nutri- tif compact constitué par de l'agar sérique, pris en qua- lité de milieu comparatif (J.M.Ovtchinnikov, "Laborator- naja diagnostica veneritcheskych zabolevanij", M. "Medici- na", 1969, str. 67-69), sur un milieu préparé par le pro- cédé susmentionné. Les boites avec les semences sont pla- cées dans le dessicateur et sont posées dans une enceinte thermostatée à la température de 37 C, pendant 24 heures. Les colonies de gonocoques, poussées sur le milieu séri- que avec le gel de polyacrylamide se sont formées sous for- me de gouttes de rosée avec une surface plate, incolores et transparentes. On a observé des diplocoques en fève Gram-négatifs au cours de la bactérioscopie des prélève- ments préparés à partir de ces colonies et colorés par le Gram et suivant le "Procédé de diagnostic différentiel de la gonorrhée et des urétrites bactériennes/(Certificat d'auteur de l'URSS N 826208). Dans la deuxième variante des investigations, on a réalisé l'ensemencement des sécrétions à partir de l'urè- tre chez 30 malades atteints de la gonorrhée aiguë et chronique sur le milieu proposé, après la confirmation du diagnostic par bactérioscopie (coloration par le Gram et suivant le Certificat d'auteur de l'URSS N 826208) et par bactériologie (l'ensemencement sur un milieu à l'agar sé- rique). On est toujours parvenu à obtenir, sur le milieu proposé, une bonne croissance des gonocoques. A la suite des essais, nous avons observé dans les cultures âgées d'un jour, sur le milieu nutritif compact proposé, une croissance des gonocoques plus intense com- parativement à la croissance sur le milieu nutritif connu. Dans le cas de la croissance sur le milieu proposé, les gonocoques conservaient les caractères morphologiques, tinctoriaux et de culture. L'utilisation d'un tel milieu pour la culture des gonocoques élargira considérablement les possibilités des méthodes diagnostiques de détermina- tion de la gonorrhée, particulièrement dans le cas des formes chroniques et torpides. Pour cultiver et étudier le mécanisme d'interaction des microorganismes et des cultures de cellules du macro- organisme in vivo et in vitro, on peut préparer le milieu nutritif de la manière suivante. On coule dans un réacteur un mélange d'acrylamide et de N,N'-méthylènebis-acrylamide et d'initiateur du type radicalaire, par exemple, un mélange de N,N,N',N'-té- traméthyléthylènediamine et de persulfate d'ammonium, pré- paré dans le soluté physiologique, et on moule le gel de polyacrylamide pendant le processus de copolymérisation entre deux plaques planes, une desquelles a des cavités * situées coaxialement ou en quinconce. On imprègne les pla- ques avec une solution contenant l'acrylamide et le N,N'- méthylène-bis-acrylamide dans leur rapport pondéral de ,0-20,0:0,019-0,132 et on les superpose de façon à for- mer des cavités fermées pour une culture ultérieure dans celles-ci, de microorganismes ou des cultures de cellules d'un macroorganisme, on maintient les plaques jusqu'à la formation d'un bloc unique avec sa division ultérieure en parties, dans chacune desquelles il y a au moins une ca- vité fermée susmentionnée. On peut désigner ces parties avec les cavités fer- mées comme des chambres à diffusion, qu'on maintient dans la solution physiologique, le gel de polyacrylamide dont elles sont élaborées, gonfle et leur masse augmente de 2,5-4,5 fois. Puis on les traite par un milieu nutritif liquide selon le microorganisme étudié ou la culture de cellules du macroorganisme. La relation quantitative égale des composants du mélange réactionnel utilisable pour le moulage des plaques, et du mélange pour l'imprégnation des plaques, assure l'uniformité structurale des parois des chambres à diffusion obtenues, ce qui conditionne une dif- fusion uniforme des substances et rend le processus tech- nologique de leur élaboration plus simple. Suivant la disposition des cavités sur la plaque, on peut obtenir les chambres à diffusion mono- et multicel- lulaires. La distance entre les cavités et l'épaisseur des plaques est modifiée selon la destination de la chambre à diffusion. Ainsi, au cours de l'obtention des chambres à plusieurs cavités,,celles-ci prennent place dans la plaue en quinconce, de préférence - à portée de 0,5-2 mm l'une de l'autre, assurant le processus de diffusion optimal en- tre les cavités fermées de ces chambres à diffusion. Elles donnent la possibilité d'étudier simultanément les systé- mes multicomposants pendant le processus de leur interac- tion entre elles-mêmes, et également sous l'influence des facteurs de l'organisme vivant ou du milieu ambiant. Pour obtenir les chambres à une cavité on moule les plaques à cavités, situées coaxialement. Nous avons utilisé les chambres pour la culture de cellules d'un macroorganisme et de microorganismes in vivo et in vitro. Dans ce but, on a introduit dans la ca- vité de la chambre, à l'aide d'une seringue, par piqûre de la paroi avec l'aiguille, les cellules des organes lym- phoTdes et d'autres, par exemple, de la rate, des nodules lymphoïdes, du thymus, de moelle. Puis les chambres ont été implantées dans l'organisme des patients. Dans un temps défini, on les extrait, on les soumet à la microscopie, on étudie ainsi l'organisation cellulaire et le carac- tère des colonies. On extrait les cellules par piqûre de la paroi de la chambre à partir de la cavité, on étudie leurs particularités morphostructurales et fonctionnelles. Par exemple, au cours de la culture de cellules de moel- le in vivo, on a réussi à maintenir la croissance et le développement des cellules de la série myéloTde pendant un mois et davantage, ce qui surpasse considérablement les durées de survie habituelles de ces cellules dans les chambres à diffusion élaborées à partir d'autres matériaux. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation concrets. Exemple 1 Pour obtenir le gel de polyacrylamide, on prépare trois solutions (A,B,C) suivant la méthode suivante: (les quantités indiquées des composants de départ sont calculées sur I 000 ml de solution): I. Préparation de la solution A. On dissout 5 ml de N,N,N',N'-tétraméthyléthylène- diamine dans 995 ml de solution aqueuse à 0,85 % de NaCl. On conserve la solution dans de la verrerie obscure, à la température de 4 C. 2. Préparation de la solution B. On dissout D,594 g de N,N'-méthylène-bis-acrylami- de dans 500 ml de solution aqueuse à 0,85 % de NaCl, on chauffe jusqu'à la température de 60 C, et ajoute ensuite 470 g d'acrylamide, qu'on brasse jusqu'à dissolution com- plète. On filtre la solution obtenue, on la porte à 1 OOOmI avec une solution à 0,85 % de NaCl. On conserve dans de la verrerie obscure à 4 C. 3. Préparation de la solution C. On dissout 1,78 g de persulfate dans 100 ml de so- lution aqueuse à 0,85 % de NaCl. On conserve dans de la verrerie obscure. On prépare un mélange réactionnel à partir des so- lutions obtenues (A, B, C). Pour cela on mélange succes- sivement les solutions A,B,C dans les proportions de vo- lume suivantes: A:B:C=16:31:52 Le mélange réactionnel renferme les monomères dans un rapport pondérai d'acrylamide et de N,N'-méthyl1ne- bis-acrylamide égal à 15,0:0,019, et la proportion pondé- rale de leur mélange et de solution physiologique étant de 1:6. On verse le mélange réactionnel dans un réacteur de 200 ml de capacité et on moule des disques de diamètre donnés à partir du gel de polyacrylamide. Le processus de copolymérisation se déroule pendant 40 minutes. On lave les disques obtenus avec la solution physiologique et on les soumet au gonflement dans une solution à 0,85 % de NaCI jusqu'à l'augmentation de leur masse de 4,5 fois. Après le gonflement le gel de polyacrylamide contient, en masse: Copolymère d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acrylamide.... 3,3 % Solution physiologique............... 96,7 % On utilise le gel indiqué en qualité de base pour l'obtention du milieu nutritif compact de Hottinger. On place les disques dans un récipient de verre, on coule le bouillon de digestion tryptique selon Hottinger, con- tenant 200 mg% d'azote d'amine à raison de 20 ml de bouillon par disque, et on abandonne pendant 2-3 heures pour saturation. On stérilise les disques imprégnés avec la vapeur sous pression à la température de 120 C pen- dant 30 minutes. Les milieux nutritifs prêts à l'usage sont préséchés et sont ensemencés avec les test-microor- ganismes:St.aureus 209, E.coli K-12, E.coli M-17, Sh. flexner, Bac. cereus 504, Bac. subtilis, Candida albicans. 2 5 6 9 4 1 9 Les mêmes cultures de microorganismes servent de contrôle, cultivées sur des milieux à gel de polyacry- lamide, obtenu conformément au Certificat d'auteur de l'URSS N 977466. On incube les semences dans l'enceinte thermostatée à la température de 37 C pendant un jour. Le milieu nutritif cité ne se détériore pas pendant le processus de préparation et d'utilisation, les cultu- res de microorganismes donnent une croissance typique, ne s'enracinent pas dans le milieu nutritif, sont bien récol tées avec la boucle bactériologique. On donne ci- aprés le tableau I dans lequel les résultats sont résumés, caractérisant l'intensité de la croissance de divers mi- croorganismes sur le milieu nutritif proposé et sur le milieu décrit dans le Certificat d'auteur de l'URSS Nc977466. TABLEAU I Espèces et souches Dose d'ense- Quantité moyenne Quantité moyenne de microorganismes mencement de colonies de colonies (colonies for-poussées (con- poussées (con- mant unités) formément à formément au Certi- l'exemple 1) ficat d'auteur de __ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ __1' 1 UN977466_..... Staph. aureus 209 100 98 94 E.coli K-12 100 96 92 E.coli M-17 100 94 84 Sh.flexneri 100 82 70 Bac.cereus 504 100 86 78 Bac.subtilis 100 88 74 Candida albicans 100 78 70 Comme il ressort du tableau, la quantité moyenne de colonies, poussées sur le milieu nutritif compact, ob- tenueconformément au procédé proposé est plus grande que sur le milieu nutritif compact décrit dans le Certificat d'auteur de l'URSS NC977466. Exemple 2 On prépare les solutions A et C comme dans l'exem- ple 1. Pour préparer la solution B, on dissout 0,844 g de N,N'-méthylène-bisacrylamide dans 500 ml d'une solution aqueuse à 0,85 % de NaCl, on chauffe jusqu'à la tempéra- ture de 60 C et on ajoute 470 g d'acrylamide. On filtre la solution et on porte à 1 000 ml avec une solution à 0,85 Z de NaCl. On prépare le mélange réactionnel comme dans l'exem- ple 1. Le milieu réactionnel contient de l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bisacrylamide en leur rapport pondéral de 15,0:0,027, le rapport pondéral de leur mélange dans la solution physiologique étant égal à 1:7. On conduit le processus de copolymérisation d'une façon tout à fait analogue à celle décrite dans l'exemple 1. On soumet les disques de gel de polyacrylamide obtenus au gonflement dans la solution physiologique de Hanks jusqu'à l'augmen- tation de leur masse de 3,2 fois. Le gonflement terminé, le gel de polyacrylamide contient, en masse: Copolymère d'acrylamide et de N,N'méthylène-bis-acrylamide.. 4,0 % Solution physiologique................. 96,0 % On utilise dans l'exemple un bouillon à viande-pep- tone pour le gonflement du gel. On réalise l'imprégnation et la stérilisation comme dans l'exemple 1. La culture de la souche 209 P de Staphylocoque doré sert comme test- microorganisme. La même culture, développée sur le milieu nutritif compact décrit dans le Certificat d'auteur de l'URSS Nc977466 et sur l'agar à viande-peptone sert de contrôle. Après l'incubation des ensemencements dans l'en- ceinte thermostatée pendant 24 heures à la température de 37 C, on note une croissance plus intense de la culture de Staphylocoque sur le milieu proposé comparativement aux ensemencements de contrôle. Les colonies de Staphylocoque sont typiques-circu- laires, lisses, brillantes, onctueuses avec une pigmenta- tion intense. Les traits typiques de la culture sont con- firmés par l'examen microscopique. Les colonies sont en- levées entièrement avec la boucle bactériologique sans toutefois altérer la surface du milieu nutritif compact. Exemple 3 On prépare les solutions A et C comme dans l'exem- ple 1. On prépare la solution B de la manière suivante. Dans un ballon jaugé de 1 000 ml de capacité, on in- troduit 0,937 g de N,N'-méthylène-bis-acrylamide, on verse 400 ml d'une solution a 0,85 % de NaCl. Apres dissolution complète du monomère, on chauffe la solution jusqu'à la température de 60 C et on ajoute 625 g d'acrylamide. On filtre la solution et on dilue à 1 000 ml avec une solution à 0,85 % de NaCl. Le milieu réactionnel renferme l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bisacrylamide dans leur rapport pondéral de 20,0:0,03, et le rapport pondéral de leur mélange dans la solution physiologique est de 1:4. On conduit le pro- cessus de copolymérisation comme dans l'exemple 1. On soumet les disques de polyacrylamide obtenus au gonflement dans la solution physiologique telle que la so- lution d'Earle jusqu'à augmentation de leur-masse de 3,7 fois. Après le gonflement, le gel de polyacrylamide con- tient, en masse: Copolymère d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acrylam. ide...... 6,3 % Solution physiologique................. 94,7 % A titre de milieu nutritif liquide pour l'imprégna- tion, on utilise du moût, on réalise l'imprégnation et la stérilisation comme dans l'exemple 1. Après stérilisation, le milieu nutritif compact ne modifie pas ses propriétés. La culture du champignon Fusarium avenaceum sert de test- microorganisme. En quatre jours-de culture en enceinte thermostatée à la température de 28 C, des colonies du champignon typiques colorées en rose sont développées avec un mycélium duveteux caractéristique. A l'examen microsco- pique le mycélium présente une structure typique, on ob- serve la sporulation. Les colonies sont bien enlevées avec la boucle bactériologique sans toutefois altérer la surfa- ce du milieu. Exemple 4 On prépare les solutions A et C comme dans l'exem- ple 1. On prépare la solution B de la façon suivante. On dissout 4,125 g de N,N'-méthylène-bis-acrylamide dans 500 ml d'une solution aqueuse à 0,85 % de NaCl, on chauffe jusqu'à la température de 60 C, puis on ajoute 470 g d'acrylamide et on brasse jusqu'à la dissolution complète. On filtre la solution obtenue, on dilue à 1 000ml avec une solution aqueuse à 0,85 % de NaCl. On prépare un mélange réactionnel à partir des solu- tions obtenues et on réalise la copolymérisation dans des conditions tout à fait analogues à celles décrites dans l'exemple 1. Le mélange réactionnel contient l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bisacrylamide en leur rapport pondéral égal à 15,0:0,132, et le rapport de leur mélange et de so- lution physiologique constitue 1:5. On utilise le gel de polyacrylamide indiqué en qua- lité de base pour le milieu nutritif compact pour obtenir de la biomasse de Staphylococcus aureus 209 P. On lave les disques obtenus avec une solution à 0,85 % de NaCl, on im- merge dans le bouillon de digestion tryptique selon Hottin- ger, contenant 200 mg % d'azote d'amine jusqu'à une aug- mentation du gel en masse de 2,5 fois. On stérilise les milieux nutritifs compacts prêts avec la vapeur sous pression à la température de 120 C pendant 30 minutes. Le milieu de Hottinger "agarisé", contenant 200 mg % d'azote aminé, et le milieu décrit dans le Certificat d'auteur de l'URSS N 977 466 servent de contrôle. On ensemence le Staphylocoque sur le disque de 60-63 mm de diamètre, à raison de 108 corps microbiens dans 1 ml. Le tableau 2 résume les données caractérisant le rendement en biomasse du Staphylococoque doré sur di- vers milieux nutritifs compacts. TABLEAU 2 Biomasse de Staphylocoque en mg/cm2, obtenue sur les milieux nutritifs compacts Suivant l'exemple Suivant l'exemple Suivant le cert. Sur le milieu proposé Nl d'auteur de agarisé l'URSS N 977466 2,01 1,57 1,50 1,53 Apres le gonflement, le gel de polyacrylamide renfer- me, en masse: Copolymère d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acrylamide. ...... 6,0 Z Bouillon tryptique selon Hottinger....... 94,0 %..DTD: Exemple 5 On obtient le gel de polyacrylamide comme dans l'exemple 1. On utilise le gel de polyacrylamide indiqué en qua- lité de base pour le milieu nutritif compact pour la cul- ture du champignon Verticillium dahliae. On place les dis- ques lavés avec une solution à 0,85 % de NaCI dans un mi- lieu nutritif liquide tel que du moût, et on soumet au gonflement jusqu'à augmentation de leur masse de 3,5 fois. Après la stérilisation, on ensemence les milieux nutritifs compacts prêts avec une culture du champignon. La culture du champignon Verticillium dahliae, développée sur un milieu agarisé imprégné avec le moût et sur le milieu préparé selon l'exemple 1, sert de contrôle. On fait incuber les semences à la température de 28 OC. On observe une croissance intense du champignon sur le milieu préparé conformément à l'exemple 5, avec les caractères morphologiques et de culture caractéristi- ques à l'issue-de 3è jour, la croissance d'intensité ana- logue dans les milieux de contrôle est constatée au 5è jour. Exemple 6 On coule le mélange réactionnel, préparé comme dé- crit dans l'exemple 1, dans le réacteur et on moule le gel de polyacrylamide entre deux plaques planes. Une plaque a des dimensions de 180xlOOxO,8 mm, l'autre de 180xlOOx2,5mm avec les cavités d'une dimension de 3xl,O mm, situées en quinconce à une distance de 1-1,5 mm l'une de l'autre. On conduit le processus de stérilisation pendant 40 minutes. On imprègne ensuite les plaques obtenues avec un mélange de composition analogue au mélange réactionnel décrit dans l'exemple 1. On superpose ensuite les plaques de façon à former des cavités fermées pour une culture ultérieure dans celles-ci des cultures de cellules de macro- et micro- organismes. On les maintient pendant 40 minutes jusqu'à la formation d'un bloc unique. On le divise en parties, donc chacune de celles-ci renferme trois cavités fermées, c'est-à-dire que l'on obtient des chambres à diffusion, que l'on place dans une solution à 0,85 % de NaCl et que l'on maintient ainsi jusqu'à augmentation de leur masse de 4,5 fois. On soumet ensuite les chambres à une stérilisa- tion pendant 1-1,5 heure et on sature avec le milieu 199. Dans une cavité de la chambre à diffusion à trois cavités, on place des cellules de moelle, se trouvant dans le milieu 199 à une dose de 2xlO6, et dans l'autre- une suspension de Staphylocoque, souche Cowan, à une dose de 2x105 sur la solution physiologique. Les chambres ont été ensuite implantées dans la cavité abdominale des ani- maux syngénes. Dans les premiers trois jours, dans la zone de la croissance des cellules myélo des, de préférence ce sont des colonies de macrophages et de granulocytes qui domi- nent. Les macrophages avaient diverses formes et dimen- sions. Vers le 7é jour le nombre de colonies des macropha- ges est brusquement augmenté, les ponticules cytoplasmi- ques entre les macrophages et les lymphocytes, les cellu- les du type conjonctif, les histiocytes et les cellules analogues aux ostéoblastes apparaissaient. Il se formait des colonies des-cellules réticulaires et de neutrophiles. Dans la deuxième cavité, des colonies typiques, circulaires, lisses de Staphylocoques sont apparues, dont le nombre est augmenté avec la prolongation de l'observa- tion. Elles sont réunies et formaient une zone de crois- sance totale dans la cavité. Exemple 7 On prépare les solutions A et C comme dans l'exem- ple 1, et la solution B-comme dans l'exemple 2. Le mélange réactionnel contient l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bisacrylamide en leur rapport pondérai de ,0:0,027, et le rapport pondéral de leur mélange dans la solution physiologique est égal à 1:7. On coule le mélange réactionnel dans le réacteur et on moule le gel de polyacry- lamide entre deux plaques planes: une de dimension de x75xl mm, l'autre de 120x75x2,2 mm avec des cavités de dimension de 4xl,2 mm, situées coaxialement à la distance de 1,7 cm l'une de l'autre. On réalise le processus de copolymérisation pendant -50 minutes. On imprègne les plaques obtenues avec un mélange analogue par sa composition au mélange réactionnel. On superpose ensuite les plaques de telle façon à former les cavités fermées. On les maintient pendant 60 minutes jusqu'à la formation d'un bloc unique. On le divise en parties dont chacune renferme une cavité fermée, c'est-à- dire que l'on obtient des chambres à diffusion, on les lave avec la solution physiologique, on les maintient dans la solution physiologique de NaCl jusqu'à augmentation de la masse de 2,8 fois. On soumet après cela les chambres à une stérilisa- tion pendant 1-1,5 heures et on sature avec le milieu 199. La moelle a été extraite à partir de l'os coxal des animaux syngénes intacts. Les cellules médullaires, se trouvant dans le milieu 199 dans un volume de 0, 2 ml (4xlO6 cellules) sont placées dans les chambres à diffu- sion, qu'on fait implanter dans la cavité abdominale des patients syngénes. Apres la culture des cellules in vivo, les chambres à diffusion ont été extraites à partir de la cavité abdo- minale et on a examiné au microscope la monocouche des cellules (zone de la croissance, composition cellulaire), et également les prélèvements par frottis, préparés à partir des cultures de cellules développées. Vers le 3è jour de culture des cellules de la moelle dans les chambres à diffusion, implantées dans la cavité abdominale des animaux normaux, on observait une composi- tion cellulaire hétérogène, caractéristique de la moelle intacte. Pa r la suite (7è jour), une certaine partie de cellules est dégénérée, l'autre partie commençait à se transformer dans une forme déterminée. On observait di- vers stades de différentiation de granulocytes. Les cellu- les de métamyélocyte sont disposées par groupes tout près des fibres poussées du tissu non différencié et elles a- vaient sur sa surface des bombements. Les granulocytes matures contenaient un noyau analogue aux neutrophiles. On observait chez les formes intermédiaires une segmen- tation à noyau marquée. Il se formait dans la zone de crois- '694 19 sance, des grandes cellules épithélioldes (40 pm) avec des pousses insignifiantes sur sa surface. Elles sont disposées dans la monocouche par groupes et une à une. Leur noyau avait un aspect aplati, les inclusions phagocy- taires dans le cytoplasme sont absentes. Les monocytes se sont avérés très vivaces. Les va- cuoles phagocytaires vastes sont fréquemment remplies. * Les monocytes sont bien identifiés d'après la forme en fève du noyau, situé fréquemment d'une manière excentri- que. Lors de la culture de plus longue durée, le noyau est devenu plus rond. Les monocytes sont disposés souvent tout près des cellules épithélioldes, mais sans une ten- dance marquée à l'agrégation. Dans les cultures âgées de 21 jours les cellules croissantes se sont installées dans la cavité de la chambre à diffusion, en formant une orga- nisation structurale déterminée. La couche directement contiguë à la surface a comporté des cellules épi- theliofdes, puis un groupe de cellules monocytaires adi- peuses et des formes jeunes des neutrophiles se sont suc- cédées. Les formes matures sont disposées sur la périphé- rie. Les cellules lymphocytiques et lymphoblastiques sont localisées à l'intérieur de la couche adhésive. Les cel- lules adipeuses avec un petit noyau compact sont apparues dans la zone de croissance. On trouvait parfois des for- mes à deux noyaux. Elles sont bien identifiées sur les radiogrammes de diffraction d'électrons par les petites gouttes grasses dans le cytoplasme. Les inclusions de li- pides sont fréquemment localisées par nids et parfois se sont réunies, en formant des gouttes de 40 pm de diamètre. A la suite de l'accumulation de la graisse, ces cellules atteignaient des dimensions parfois jusqu'à 120 im. La membrane vacuolaire isolée témoigne la synthèse intracel- lulaire du lipide. Le noyau de forme ronde ou ovale est constitué de chromatine condensée. Le cytoplasme des cel- lules matures a de nombreuses mitochondries. Le cytoplasme est non différencié au stade précoce de l'accumulation de la graisse. Les cellules adipeuses avaient tendance à se localiser par groupes, en formant des foyers étendus entre les colonies granulocytes, conservaient la dépen- dance fonctionnelle pendant un temps de longue durée. On observait également des cellules du type méga- caryocytaires. Ce sont des cellules grandes de forme sphé- rique, parfois avec des évaginations sur la surface de la membrane cytoplasmique. La thrombocytopoièse active n'est pas notée. Exemple 8 On prépare les solutions A et C comme dans l'exemple 1, et la solution B comme dans l'exemple 4. Le mélange réactionnel renferme l'acrylamide et le N,N'-méthylène-bisacrylamide dans leur rapport pondéral de 15,0:0,132, et le rapport pondéral de leur mélange dans la solution physiologique est égal à 1:5. On coule le mé- lange réactionnel dans le réacteur et on moule le gel de polyacrylamide dans deux plaques planes. Une plaque pré- sente la dimension de 150x80xl,2 mm, l'autre de 150x80x2,Smm, possède des creux de dimension de 5x1,3 mm situés coaxiale- ment à la distance de 1,8 cm l'un de l'autre. On effectue le processus de copolymérisation pendant 40 minutes. On imprègne les plaques obtenues avec un mélange analogue par sa composition au mélange réactionnel, on les superpose de façon à former des cavités formées. On maintient pen- dant 50 minutes jusqu'à la formation d'un bloc contenant les cavités fermées. On divise ensuite le bloc en parties contenant chacune une cavité fermée, c'est-à-dire, les chambres à diffusion, qu'on place dans la solution physio- logique de NaCl jusqu'à l'augmentation de leur masse de 3,2 fois. On stérilise après cela les chambres et on im- prègne avec la solution de Hanks. Pour la culture des leucocytes d'un homme sain, on introduisait dans la cavité de la chambre à diffusion une population de leucocytes, contenant toutes les formes de cellules du sang blanc dans la solution de Hanks à une dose de lx106 de leucocytes. On fait ensuite implanter les chambres à diffusion dans l'organisme des animaux xénogénes et on les extrait dans des délais d'observation nécessaires. Les essais ont montré que les lymphocytes sont conservés pendant 20 jours. Cependant leur nombre est diminué de 79 % à 20 %. Les neutrophiles et les mono- cytes se sont avérés viables seulement aux premiers 2-3 jours. On a noté une augmentation du nombre de macropha- ges de 15 Z au 2é jour jusqu'à 50 % au 20è jour. Dés le 8e jour, les blastes, les cellules fibroblastiques et transitoires commençaient à apparaitre dans la culture. R E V E N D I C A T I 0 N S 1 - Procédé de préparation d'un milieu nutritif com- pact pour la culture de microorganismes et de cultures de cellules d'un macroorganisme, comprenant la copolymérisa- tion de l'acrylamide et du N,N'-méthylène-bis-acrylamide dans une solution physiologique en présence d'un initia- teur du type radicalaire jusqu'à la formation du gel de polyacrylamide avec son lavage ultérieur par la solution physiologique, caractérisé en ce qu'on conduit la copoly- mérisation de l'acrylamide et du N,N'-méthylène-bis-acry- lamide dans leur rapport pondéral de 15,0-20,0:0,019-0,132 respectivement et on maintient le gel de polyacrylamide ob- tenu après le lavage dans la solution physiologique jusqu'à augmentation de sa masse de 2,8-4,5 fois, avec son traite- ment subséquent par un milieu nutritif liquide, ou on sou- met le gel de polyacrylamide obtenu après le lavage au gonflement dans le milieu nutritif liquide jusqu'à aug- mentation de sa masse de 2,5-3,5 fois. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise la copolymérisation dans un rapport pondéral du mélange d'acrylamide et de N,N'-méthylène-bis- acrylamide par rapport à la solution physiologique égale à 1:4-7 respectivement. 3 - Procédé suivant les revendications l,2, carac- térisé en ce qu'à titre de solution physiologique on uti- lise une solution aqueuse à 0,85 % de chlorure de sodium ou la solution de Ringer-Lock, ou la solution d'Earle, la solution de Hanks, une solution à 5 % de glucose. 4 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de milieu nutritif liquide on utilise le bouillon de digestion tryptique de Hottinger, le bouillon de Martin, du bouillon à viande-peptone, de l'eau peptoni- que, de l'hydrolysat de caséine, du moût, le milieu 199. - Procédé suivant les revendications 1, 2, 3, ca- ractérisé en ce que pour la culture des gonocoques, on 2 5 6 9 4 1 9 traite le gel de polyacrylamide gonflé dans la solution phy- siologique avec un milieu nutritif liquide, en qualité duquel on utilise un mélange de sérum sanguin stérile inactivé de l'homme et de plasmole, pris dans le rapport pondéral de 1:1. 6 - Procédé suivant les revendications 1 à 3, ca- ractérisé en ce que pendant le processus de copolymérisa- tion, on moule le gel de polyacrylamide formé entre deux plaques planes, une desquelles a des cavités, situées coaxialement et/ou en quinconce, puis on imprègne les pla- ques avec une solution, contenant l'acrylamide et le N,N'- méthylène-bis-acrylamide dans leur rapport pondérai de )0-20,0:0,019-0, 132, et on les superpose de façon à former des cavités fermées pour la culture ultérieure dans celles-ci de microorganismes ou des cultures de cellules de macroorganismes, on les maintient jusqu'à la formation d'un bloc unique avec sa division subséquente en parties, dans chacune desquelles il y a au moins une desdites ca- vités fermées.