Brevet FR2563233A1 — publié le 19851025

La présente invention se rapporte à un procédé de production de L-sérine à partir de glycine et de formal- déhyde, en présence d'un microorganisme capable de produire de la sérine hydroxyméthyltransférase. - La L-sérine est intéressante aussi bien en tant qu'acide aminé qu'en tant que médicament, cosmétique, addi- tif alimentaire ou produit intermédiaire pour la fabrica- tion de médicaments. La sérine hydroxyméthyltransférase (EC.2.1.2.1}, également appelée sérine transhydroxyméthylase ou sérine aldolase, est largement représentée chez les mammifères, les oiseaux, les végétaux supérieurs, les microorganismes, etc. On sait déjà catalyser la réaction de synthèse d'un acide aminé (-hydroxy, à partir de glycine et d'un aldé- hyde, avec comme co-enzyme du phosphate de pyridoxal [voir par exemple Advances in Enzymology 53, 83-112 (1982)2. Il est déjà connu, de manière usuelle, de produire de la L- sérine au moyen d'un procédé enzymatique-utilisant la séri- ne hydroxyméthyltransférase d'un microorganisme, en partant de glycine seule, ou d'une combinaison de glycine avec une quantité mineure de formaldéhyde,et en utilisant un micro- organisme appartenant au genre Proteus [Publication du bre- vet japonais N 58-2677 (1983)7, au genre Sarcina, au genre Flavobacterium, au genre Pseudomonas ou au genre Mycobac- terium /Brevet japonais mis à l'inspection n 53-81691 (1978)7. Chacun des microorganismes utilisés au cours de ce procédé est très capable de produire la sérine à partir de la glycine même. Même lorsqu'on ajoute du formaldéhyde pour préparer la solution réactionnelle, le rapport molaire L-sérine produite/formaldéhyde ajouté à la réaction n'est que de l'ordre de 10/1. Cela indiquerait que non seulement la sérine hydroxyméthyltransférase, mais aussi une enzyme catalysant la réaction de clivage de la glycine, partici- pent intensément à la réaction, ce qui a pour résultat un rendement très bas en L-sérine rapporté à la glycine, égal ou inférieur à 10% en mole/mole. Comme la concentration ac- cumulée de L-sérine est de l'ordre de 5 g/litre, au plus, on peut difficilement dire qu'il s'agit d'un procédé prati- que. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur et d'obtenir une concentration élevée de L-sérine dans la solution réactionnelle avec un fort rendement par rapport à la glycine de départ. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de L-sérine à partir de glycine et de formaldéhyde, sous l'action d'une hydroxyméthyltransférase, est carac- térisé en ce que l'on utilise comme source de sérine hydro- xyméthyltransférase, une solution de culture, ou les cel- lules microbiennes, d'un microorganisme appartenant au gen- re Escherichia, et ayant à la fois la faculté de produire cette enzyme, et peu ou pas de possibilité de produire de la L-sérine à partir de glycine seule. On peut également utiliser la matière obtenue par traitement de la solution ou des cellules microbiennes en question. (Voir Nota p.12). Conformément à l'invention, la L-sérine peut ê- tre produite et accumulée avec un rendement remarquablement élevé, et à une concentration notablement forte, par addi- tion continue ou intermittente de formaldéhyde, de manière à ce que sa concentration se maintienne à 20 mM, ou moins. En outre, cette production et accumulation de la L-sérine est rendue plus efficace par la mise en contact de la gly- cine avec les cellules microbiennes du microorganisme, avant la mise à réagir de la glycine avec le formaldéhyde. Un tel contrôle de réaction selon l'invention peut être ré- alisé isolément, ou en combinaison de deux ou plus, afin de produire et d'accumuler une quantité remarquable de L- sérine. Plus particulièrement, selon le procédé de l'in- vention, à la fin de la réaction il reste une quantité re- marquablement faible de glycine, et cela allège considéra- blement le travail d'isolement et de purification de la L- sérine à partir de la solution réactionnelle, montrant ain- si l'excellence du procédé, selon l'invention, de produc- tion enzymatique à l'échelle industrielle de L-sérine. Le microorganisme utilisé conformément à l'inven- tion est une souche bactérielle appartenant au genre Esche- richia, ayant la faculté de produire de la sérine hydroxy- méthyltransférase, mais n'ayant pas la possibilité pratique de produire de la L-sérine à partir de glycine seule. Toute souche bactérienne présentant ces propriétés peut être uti- lisée dans la présente invention, indépendamment du fait qu'elle peut avoir été isolée dans le domaine naturel, ou produite par des moyens tels que mutation ou recombinaison de gènes. Conviennent,par exemple, Escherichia coli MT- 10350 (FERM P-7437) et Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438). Les termes "n'ayant pas la possiblité pratique" comprennent,dans la présente description, le cas qui va de soi, et également un cas o il existe une faible activité, mais qui ne peut empêcher la pratique de l'invention, puis- qu'aucun obstacle spécial n'y est opposé à la réalisation de l'effet selon l'invention. Le terme "matière enzymatique traitée" représente toute substance obtenue par traitement du microorganisme lui-même, ou de sa solution de culture, de telle sorte qu'il n'y ait pas d'altération de son activité de sérine hydroxyméthyltransférase, car cette enzyme joue le rôle principal dans la pratique de l'invention. Lors de la culture d'un microorganisme conformé- ment à l'invention, il n'existe pas de limitations particu- lières aux conditions de culture, y compris en ce qui con- cerne le choix du milieu, qui peut être aussi bien un mi- lieu synthétique qu'un milieu naturel, pourvu qu'il renfer- me une source de carbone, une source d'azote, des sels mi- néraux, des produits nutritifs organiques, et similaires, qui peuvent être utilisés par la souche bactérienne en ques- tion. Il est préférable que la culture se développe aéro- biquement, à un pH de 5 à 9, et à une température comprise entre 25 et 40 C. La solution de culture ainsi obtenue peut être utilisée en l'état comme source enzymatique. Mais on peut également utiliser les cellules microbiennes viables, re- cueillies à partir de cette solution, par centrifugation, filtration ou similaire, ainsi que la matière obtenue par séchage ou traitement de ces cellules (par exemple matière obtenue par broyage, traitement aux ultrasons, autolyse ou similaire, de ces cellules, l'éluant de ces cellules et une fraction enzymatique obtenue à partir de l'extrait ci-des- sus). Il est préférable de mettre en contact les cellu- les microbiennes du micro-organisme avec la glycine (trai- tement de la glycine), avant que cette dernière ne soit mi- se à réagir avec l'aldéhyde. Lorsque la solution de culture en l'état est utilisée comme source enzymatique, il est re- commandé d'effectuer le traitement de la glycine par addi- tion de celle-ci à la solution de culture après achèvement de la culture. Lorsque les cellules microbiennes recueil- lies par centrifugation, filtration, ou similaire, sont uti- lisées comme source enzymatique, il est conseillé de les mettre en suspension dans une solution appropriée de gly- cine. Le traitement de la glycine, qui peut être effectué dans des conditions de repos, ou d'agitation, doit être réa- lisé dans un intervalle de pH compris entre 6 et 9, et dans un intervalle de température compris entre 20 et 70 C.Bien qu'un effet suffisant puisse être espéré avec une concentra- tion en glycine de 4% en poids, les concentrations usuelles en glycine dans ce cas sont de l'ordre de 7 à 23%. La durée du traitement de la glycine, bien qu'elle semble varier en fonction de la concentration en cellules microbiennes, de la concentration en glycine, de la température, etc., est habituellement de 30 minutes à 24 heures. Conformément à l'invention, il est souhaitable que la réaction entre la glycine et le formaldéhyde s'ef- fectue en la présence des cellules microbiennes ainsi trai- tées par la glycine, à un pH de 6 à 9, et à une tempéra- ture de 20 à 60 C, sous secouage ou agitation. La concentration de la glycine, utilisée comme substrat de la réaction, peut s'étager dans un large inter- valle. Comme la concentration usuelle de la glycine est comprise entre 1 et 40%, la glycine utilisée comme substrat de la réaction peut être ajoutée en totalité au début de la réaction, ou bien on peut l'introduire en plusieurs por- tions successives au cours de l'avancement de la réaction. D'autre part, il faut utiliser le formaldéhyde à une concentration qui ne permette pas l'inhibition de l'activité enzymatique par ce produit. Il peut être intro- duit en plusieurs portions successives au cours de l'avan- cement de la réaction. Conformément à l'invention, la L-sérine peut être produite et accumulée avec un rendement élevé, grâce au maintien de la concentration de formaldéhyde à un niveau égal ou inférieur à 20 mM. Comme la sérine hydroxyméthyltransférase exige la présence de vitamine B 6 en tant que co-enzyme, la réaction est accélérée dans quelques cas par addition au système ré- actionnel, de phosphate de pyridoxal. Dans quelques cas, la réaction est accélérée par addition d'acide tétrahydrofolique, utilisé comme co-enzyme, au système réactionnel. La réaction est aussi accélérée par introduction d'un agent réducteur, ou bien lorsqu'on la réalise sous in- troduction d'azote dans certains cas. Dans ces cas, con- viennent comme agents réducteurs acide ascorbique, dithio- thréitol, mercapto-2 éthanol, dithioérythritol, glutathion réducteur, cystéine et sulfite de sodium. Pour isoler la L-sérine produite dans la solution de réaction, on peut se servir de procédés classiques com- me concentration ou traitement par adsorption-désorption, réalisé avec une résine échangeuse d'ions ou du charbon activé. L'identification qualitative de la L-sérine pro- duite peut s'effectuer par développement de la coloration) la ninhydrine sur un chromatogramme sur papier. Son ana- lyse quantitative peut être réalisée par chromatographie en phase liquide, ou bien par coupe d'une tache du déve- loppement de la coloration à la ninhydrine sur le chroma- togramme sur papier, avant que l'éluant de la tache ne soit soumis à la détermination colorimétrique. L'analyse quanti- tative de la L-sérine peut être réalisée par un bio-essai mené avec Leuconostoc mesenteroides. La présente invention est illustrée non limitati- vement par les exemples et exemples comparatifs qui suivent. EXEMPLE 1 Après culture sur un bouillon incliné, à 37 C pen- dant 40 heures, on ensemence les bactéries de Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437), à l'aide d'une boucle de fil de platine, dans chacune de cinq portions de 100 ml d'un milieu (pH 7,2) renfermant les produits nutritifs figurant dans le tableau 1, puis on réalise la culture avec secous- ses, à 37 C pendant 40 heures, afin d'obtenir la solution de culture. Ensuite, on ensemence avec cette solution de culture 10 litres du milieu de la composition indiquée ci-dessus, placés dans une fiole de fermentation de 20 li- tres, et l'on cultive avec aération par agitation à pH 7,2 et 37 C, pendant 30 heures. La solution de culture ainsi obtenue est centrifugée, et les cellules microbiennes re- cueillies sont alors rincées avec du sérum physiologique, et l'on obtient ainsi environ 50 g de cellules microbien- nes humides. Ces cellules sont congelées à -15 C pendant 2 jours, et dégelées immédiatement avant leur utilisation comme source d'enzymes pour la réaction. Apres avoir ajouté g de ces cellules congelées à 500 ml de solution de ré- action renfermant les constituants figurant dans le tableau 2, on introduit en continu, de la formaline, à l'aide d'une pompe péristaltique, de manière à maintenir sa concentra- tion entre 7 et 12 mM, grâce à l'analyse par chromatographie gazeuse de cette concentration dans la solution de réaction. Cette réaction est conduite à 50 C et pH 7, avec agitation douce de la solution de réaction, et introduction d'azote dans cette solution à raison de 1 ml/minute. L'introduc- tion de la formaline se poursuit pendant 37 heures, et la quantité totale introduite (de solution de formaldéhyde à 37% poids/poids) dans la solution, est de 24 ml. Lorsque la réaction est terminée, il y a accumulation dans la solu- tion de réaction de 29 g de L-sérine. La concentration de L-sérine accumulée est de 55 g/litre.Le rendement molaire de L-sérine produite, par rapport à la glycine introduite pour préparer la solution de réaction, est de 83%, et par rapport au formaldéhyde, de 86%. TABLEAU 1 Glucose 1% MgSO4.7H20 0,05% Acide citrique 0,2% Extrait de NaNH4HPO4.4H20 0,3% levure 0,05% K2HPO4 0,5% TABLEAU 2 Glycine 5% Acide tétrahydrofolique 0,1% Phosphate de pyridoxal 0,01% EXEMPLE 2 On opère comme dans l'exemple 1, mais en rempla- çant le microorganisme utilisé dans cet exemple par Esche- richia coli MT-10351 (FERM P-7438). L'apport de formaline dans la solution de réaction est poursuivi pendant 57 heu- res, et la quantité totale fournie, de ce produit, est de ml. Au cours de la réaction il y a accumulation de 28 g de L-sérine dans la solution. La concentration de la L- sérine accumulée est de 53 g/litre. Le rendement molaire en L-sérine produite, rapporté à la glycine introduite, est de 80%, et rapporté au formaldéhyde ajouté, il est de %. Les capacités des microorganismes, utilisés con- formément à l'invention, à produire de la L-sérine à partir de la glycine, en présence et en absence de formaldéhyde, sont comparées, et les résultats sont indiqués dans les exemples expérimentaux suivants. EXEMPLE COMPARATIF N 1l On ensemence 100 ml d'un milieu liquide (pH 7) renfermant 10 g/litre d'extrait de viande, 10 g/litre de peptone et 15 g/litre de NaCl, avec chacun des Escherichia coli MT-10350 et MT-10351, et la culture avec secousses est effectuée à 30 C pendant 24 heures. On centrifuge alors pour recueillir les cellules microbiennes qui sont rincées à deux reprises avec du sérum physiologique: on obtient ain- si 0,4 g de cellules microbiennes humides. On met en sus- pension 0,2 g de ces cellules dans 10 ml de solution tampon phosphate 50 mM (pH 7) renfermant 5 000 gmoles de glycine, gmoles de formaldéhyde, 10 gmoles d'acide tétrahydrofo- lique et 0,1 gmole de phosphate de pyridoxal, et on laisse réagir à 37 C pendant 2 heures avec secousses. L'accumulation de L-sérine observée est indiquée dans le tableau 3. Une autre expérimentation est menée selon le même mode opé- ratoire, mais sans addition de formald4hyde; les résultats sont également reportés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Microorganisme Quantité de L-sérine accumulée (Escherichia (gmole/10 ml) coli) Avec addition Sans addition de HCHO de HCHO MT-10350 140 12 MT-10351 78 10 Il ressort de ce tableau que les microorganismes,utilisés conformément à la présente invention, ont une activité productrice de L-sérine à partir de glycine et de formaldé- hyde, mais que cette activité est pratiquement nulle en l'absence de formaldéhyde. EXEMPLE 3 On verse dans des fioles de 500 ml de capacité, soumises à des secousses, des portions de 100 ml de milieu ayant la composition indiquée dans le tableau 4, et l'on stérilise; chaque portion stérilisée est ensemencée, à l'aide d'une boucle de fil de platine, avec Escherlcnla coli/ préalablement cultivé à 37 C sur du bouillon incliné, pen- dant 20 heures. Puis on cultive avec secousses à 37 C pen- dant 15 heures. On recueille à partir de la solution de culture ainsi obtenue, par centrifugation, des cellules mi- crobiennes, que l'on rince avec du sérum physiologique et centrifuge à nouveau pour obtenir des cellules microbien- nes humides. On met en suspension 1 g de ces cellules dans ml de solution de glycine à 18% de pH 7,5, et l'on se- coue doucement à 50 C pendant 3 heures (traitement de la glycine). Ensuite, la solution de glycine renfermant les cellules microbiennes est diluée avec de l'eau afin d'a- juster le volume total à 10 ml, puis on ajuste le pH à 7 et on ajoute 1 mg de phosphate de pyridoxal, 10 mg d'acide tétrahydrofolique et 20 mg de formaline (solution de for- maldéhyde à 37%), et la réaction démarre. Elle est menée à 50 C à pH 7, sous agitation douce de la solution de ré- action, et avec introduction d'azote gazeux dans cette so- lution, à la vitesse d'environ 1 ml/minute. Après amorce de la réaction, une portion de 10 mg de formaline est in- troduite toutes les 30 minutes dans la solution. On pour- suit la réaction pendant 20 heures, et la quantité totale de formaline ajoutée à la solution de réaction est de 420 mg. Dans cette solution sont accumulés 500 mg de L- sérine. EXEMPLE COMPARATIF N 2 D'autre part, 1 g de cellules microbiennes hu- mides obtenues dans l'exemple 3, sans que celles-ci aient été soumises au traitement de la glycine, sont mises en suspension dans 10 ml de solution de glycine à 9% (pH 7), et cette suspension est soumise à réaction par exactement le mode opératoire ci-dessus. L'accumulation de L-sérine n'est que de 98 mg, dans la solution de réaction. TABLEAU 4 Glucose 1% MgSO4.7H20 0,05% Acide citrique 0,2% MS472,5 Acide citrique 02 Extrait de levure 0,05% NaNH4HPO4.4H20 0,3% K2HPO4 0,5% EXEMPLE 4 ET EXEMPLE COMPARATIF N 3 On obtient,par un procédé identique à celui qui est décrit dans l'exemple 3, des cellules microbiennes hu- mides d'Escherichia coli MT-10350. On met ensuite I g de ces cellules en suspension dans 5 ml de chacune des solu- tions de glycine (ajustées à pH 7,5) dont les concentra- tions sont indiquées dans le tableau 5, et on secoue douce- ment à 50 C pendant 3 heures. A chacune de ces solutions on ajoute de l'eau et de la glycine de manière à ajuster la concentration de glycine à 9%, et la quantité totale à 10 ml. Puis on soumet l'ensemble à la réaction selon le procé- dé de l'exemple 1. Au cours de la réaction, on ajoute à chaque solution de réaction 420 mg de formaline. Les quan- tités de L-sérine produite dans les solutions de réaction sont indiquées dans le tableau 5. TABLEAU 5 Concentration en glycine Quantité de L-sérine pour le traitement de la produite glycine (%) (mg) *0 90 3 261 6 375 12 498 18 497 EXEMPLE 5 et EXEMPLE COMPARATIF N04- On reprend l'opération de l'exemple 3, mais avec Escherichia coli MT-10351. Il en résulte que, dans la solu- tion de réaction préparée avec des cellules microbiennes traitées par la glycine, il y a accumulation de 370 mg de L-sérine; lorsque les cellules microbiennes n'ont pas su- bi le traitement de la glycine, la quantité accumulée de L-sérine n'est que de 39 mg. EXEMPLE EXPERIMENTAL 1 Détermination de l'activité de sérine hydroxyméthyltransfé- rase. Les cellules microbiennes humides, obtenues con- formément au procédé décrit dans l'exemple 3 ou l'exemple 5, sont mises en suspension dans une solution tampon phosphate de potassium 50 mM (renfermant 0,5 EM de phosphate de pyri- doxal), de pH 7, et l'on soumet le tout à un traitement par ultrasons, à 4 C, pendant 5 minutes. Apres centrifugation de la solution traitée obtenue (10 000 g, 5 minutes) on me- sure, conformément au procédé de R.T. Taylor et collt., Analytical Biochemistry, 13, 80-84 (1965), l'activité de sérine hydroxyméthyltransférase existant dans la partie sur- nageante. Ces mesures d'activité -spécifique sont indiquées dans le tableau 6. TABLEAU 6 Souche bactérienne Activité spécifique ( (FERM P-7437) Escherichia coli MT-10351 230 (FERM P-7438) NOTA: La Figure du dessin annexé représente un graphique indiquant la relation entre le pourcentage de concentration de glycine utilisée pour le traitement de glycine, réalisé dans l'Example 4, et la quantité en mg de L-serine produite. Revendications 1. Procédé de production de L-sérine à partir de gly- cine et de formaldéhyde, sous l'action d'une sérine hydro- xyméthyltransférase, caractérisé en ce que l'on utilise comme source de cette enzyme une solution de culture, ou les cellules microbiennes, d'un microorganisme appartenant au genre Escherichia, et ayant à la fois la faculté de pro- duire la sérine hydroxyméthyltransférase, et peu ou pas de possibilité de produire de la L-sérine à partir de glycine seule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance enzymatique est obtenue par traitement de la solution de culture, ou des cellules microbiennes, du microorganisme appartenant au genre Escherichia. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que la concentration en formaldéhyde, au cours de la réaction, ne dépasse pas 20 mM. 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que l'on met en contact la glycine avec les cel- lules microbiennes, avant que ne s'effectue la réaction en- tre la glycine et le formaldéhyde sous l'action de ces cel- lules. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que le microorganisme du genre Escherichia est Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437). 6. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que le microorganisme du genre Escherichia est Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438).