Brevet FR2555577A1 — publié le 19850531

La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de peptides et leur procédé de fabrication, et plus particulièrement ceux de ces dérivés dont le carboxyle terminal est engagé dans une fonction hydrazide ou hy droxaate, de tels dérivés étant notamment destinés au dosage, par voie enzymatique, des paramètres sanguins. Selon la présente invention les dérivés sus-visés ont pour formule générale (I) Z1-Y-(z2)NHz3 (I) dans laquelle Z1 présente notamment un reste d'aminoacide choisi parmi les radicaux D-valyl, D-prolyl, D-phénylalanyl, L-isoleucyl, L-glutamyl, L-pyroglutamyl, (N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl) et N- (carbométhoxypropionyl-L- arginyl) ou de peptides Y est un reste d'amino-acide choisi plus particulièrement dans le groupe constitué par un radical L leucyl,L-phënylalanyl, t-pipécolyl,glycyl et L-prolyl ou tout autre amino-acide ; et, F2 est un reste d'amino-acide choisi plus particulièrement dans le groupe constitué par un reste Llysyl, L-arginyl, L-tyrosyl, et L-valyl ou tout autre amino acide ; et, Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1, NR1R2 ou OH, OR1 (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical iRicot inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué). L'invention concerne plus précisément les composés de formule générale (IA) Z' 1-Y1-(L-arginyl)NH-Z3 dans laquelle : Z' est un radical aminé choisi dans le groupe constitué par le radical D-prolyl, D-valyl, D-phény lalanyl(N-benzoyl L-isoleucyl-L-glutamyl), isoleucyl et L-glutamyl Y' est un radical aminé choisi dans le groupe constitué par un radical L-phénylalanyl, L-leucyl, L-pïpécolyl, glycyl, et L-prolyl Z3 est défini comme précédemment. L'invention concerne également des dérivés plus simples de formule générale (II) X1-arginyl-(NH)Z3 (II) dans laquelle X1 est le reste acyle carboxylique, aliphatique ou aromatique, ayant de 1-d 10 atomes de carbone et, Z3 est défini comme précédemment. Parmi les composés de formule généraletIJ ou de formule générale (II), on retiendra plus particulièrement - les hydroxamates de formule générale (IB) Z1-Y-Z2NHOH (IB) dans laquelle les radicaux Z1, Y et Z2 sont définis comme précédemment - les hydrazides non substitués de formule générale (Ic) Z1-Y-Z2NH-NH2 (IC) dans laquelle les radicaux Y, Z1 et Z2 sont définis comme précédemment ; et, - les hydrazides substitués de formule générale Z1-Y-Z9NH=NH-R2 FID dans laquelle Z1, Z2 et Y sont définis comme précédemment R2 est un radical alcoyle inférieur ayant de 1 a 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, un radical alcoyle inférieur substitué par un ou-Lusieurs hydroxyles, alcoxyles ou acyloxy, un radical aryle mono ou bicyclique substitué par un à trois substituants choisis parmi les radicaux halo, alcoyle inférieur, alcoxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, trifluorométhylthio, cyano, aminosulfonyle ou cycloalcoyle. Parmi ceux-ci, on citera plus particulièrement a titre de composés plus spécialement utiles - la D-valyl-L-leucyl-L-lysyl hydrazide, - la D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydrazide, - le D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydroxamate, - la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl -hydrazide, - la N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamylglycyl-L-arginyl-hydrazide, - la N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazide, - la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl méthyl.hydrazide, - la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valylisobutyl-hydrazide, - le D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginyl-hydroxamate, - le glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydroxamate, - le N-formyl-L-arginyl-hydroxamate, - la N-formyl-L-arginyl-N-méthyl-hydra- zide, - la N-formyl-L-arginyl-N-hydroxy-éthylhydrazide, - la N-benzoyl-L-arginyl-hydrazide. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule genérale (I) qui se caractérisé par par le fait que l'on forme le N carboxy- anhydride de l'acide aminé Y par l'action du phosgene a température voisine de 500C et condense le N carboxyanhydride en milieu alcalin aqueux avec l'amino acide Z2H pour former après acidification le peptide de formule générale (III) Y-Z2 (III) et que l'on renouvelle cette opération en formant-le N carboxyanhydride de l'amino-acide Z1 et en le couplant par le même procédé sur le peptide Y-Z2 pour obtenir après acidification le nouveau peptide de formule générale IV Z1-Y-Z2 (IV) dans laquelle Z11 Z2 et Y sont définis comme précédem ment, puis que l'on:: soumet celui-ci à l'estérification à l'aide d'un sulfate dialcoylique en présence d'un alcanol pour obtenir un alcoysulfate d'ester de dipeptide, sépare celui-ci, le convertit en base d'ester d'amino-acide par alcalinisation à l'aide d'un hydroxyde ou un carbonate de métal alcalin puis le soumet à l'faction d'un réactif azoté de formule générale NH2-Z3 (dans laquelle Z3 est défini ot me précédemment) pour obtenir le composé de formule générale I désiré Z1-Y-Z2-NHZ3 que l'on peut ,si désiré, salifier par addition d'une base alcaline lorsque Z3 est un hydroxyle ou par addition d'un acide minéral ou organique lorsque Z3 est un radical aminé (NHR1) substitué ou non substitué. De la même façon, les composés de formule générale II sont préparés par acylation de l'arginine par action d'un dérivé fonctionnel d'un acide organique carboxylique dans un solvant polaire en présence d'une base tertiaire puis estérification de la N-acylguanidine par un sulfate d'alcoyle en présence d'un alcanol, séparation de l'alcoylsulfate de N-acylguanidinate d'alcoyle, conversion en base et aminolyse de celle-ci par action d'un réactif de formule 2HN-Z dans laquelle Z3 est défini comme précédemment, pour former un composé de formule générale II X1-arginyl NH-Z3 (II) dans laquelle X1 et Z3 ont les définitions fournies précédemment. Les composés de formule générale I ou de formule générale II constituent des réactifs précieux pour ltindustrie biologique. Ils permettent le dosage des paramètres sanguins par voie enzymatique dans des conditions de sensibilité et de reproductivité jusqu'ici non encore at teintes. Ils présentent le gros avantage par rapport aux réactifs du commerce d'être très solubles dans l'eau, de mettre en liberté des produits d'hydrolyse égale ment très solubles et de ne pas nécessiter l'adjonction d'un tiers solvant; I1 est ainsi possible de doser les facteurs sanguins, les facteurs de la coagulation ou les facteurs enzymatiques impliqués dans la coagulation ou contenus dans les leucocytes à des concentrations de l'ordre de 0,01 partiepar million(lOppb). Le seuil de détection est donc très sensible et la mesure de l'activité enzymatique parfaitement linéaire. En outre, l'extrême sensibilité de la mesure permet d'opérer sur des volumes très faibles et sur des solutions très diluées. Le dosage du dérivé aminé 2HN-Z3 mis;en liberté par la réaction enzymatique se fait par une mesure électrochimique simple par rapport à une courbe d'étalonnage. La concentration optimale de réactif est de l'ordre de dans 6 dan le milieu sanguin réactionnel. L'invention comprend donc aussi l'emploi des composés de formule générale (I) ou de formule générale (II) comme réactifs biologiques et notamment pour le dosage ou la mise en évidence des différents facteurs sanguins. C'est ainsi que les D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser la prdkalli- creine plasmatique, les D-valyl-L-leucy-L-lysyl-hydrazides, permettent de déterminer la plasmine, les D-phénylalanyl-L- pipécolyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser la prothrombine, les N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-Larginyl-hydrazides permettent de doser le facteur X, les N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazides, l'ichymotrypsine et les L-pyroglutamyl-L-prolyl-Lvalyl-hydrazides permettent de doser l'élastase granulocytaire et les N-acylarg.inyl-hydrazides ou hydroxamates permettent de doser les protéases. Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon. Exemple 1 D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide. - Stade A N-carboxyanhydride de la L-leucine. on met en suspension 6,56 g de L-Leucine dans 250 ml de dioxane. On fait barboter a température ambiante très progressivement du phosgène jusqu'a saturation. Le ballon tricol dans lequel s'effectue la réaction est pourvu d'un réfrigérant a reflux permettant de piéger a basse température le phosgène en excès. La suspension s'éclaircit rapidement et permet d'obtenir après 30 minutes de réaction une solution limpide, incolore. On laisse en contact pendant 1 heure puis on dégaze cette solution avant de la concentrer sous vide. Le N carboxyanhydride de la L-leucine cristallise en fin de concentration. - Stade B L-leucyl-L-lysine (E Tosyl1 On met le dérivé tosylé de la lysine en solution à 5% dans une solution aqueuse molaire de carbonate de sodium. Cette solution est refroidit a OOC, placée sous agitation très vive et l'on ajoute la quantité stoechiométrique de N-carboxyanhydride de la L-leucine en une seule fois. Le pH est maintenu entre 10 et 10,5 par de la soude 2N pendant 2 minutes, correspondant au temps nécesr saire pour la dissolution complète du N-carboxyanhydride de la L-leucine. Puis cette solution est acidifiée rapidement à pH 3,5 par de l'acide chlorhydrique concentré. Le rendement du couplage est de 998. -:Stade C D-valyl-L-leucyl-L-lysine (Tosyl) La solution précédente contenant le Lleucyl-L-lysine ( tosyl) est alcalinisée jusqu'a pH 10,5 par dissolution de carbonate de sodium puis refroidit a o0c et placée sous agitation très vive. Une quantité stoechiométrique de N-carboxyanhydride de la D-valine (préparée selon le même mode opératoire que pour la L-leucine) est ajoutée en une seule fois en maintenant le pH entre 10 et 10,5 par de la soude 2N pendant 2 minutes. Puis la solution est acidifiée par de l'acide chlorhydrique concentré jusqu a pH 3,5 et dégazée sous vide avant d'être percolée sur résine sulfonique. Le peptide fixé sur la résine est ensuite élué par une solution normale d'ammoniaque. L'éluat est concentré sous vide et le tripeptide D-valyl-L-leucyl-L-lysine (tosyl) cristallise en fin de concentration. - Stade D D-valyl-L-leucyl-L-lysine Le peptide'itosylé sur la lysine est mis en suspension dans 250 ml;.de diméthoxy-1,2-éthane contenant en solution 12,8 gde naphtalène et 2,29de sodium. L'agitation est maintenue pendant 4 heu- res à l'abri de l'humidité à température ambiante. 20:ml d'eau sont ensuite ajoutés goutte à goutte provoquant la dé coloration de la solution. Le milieu réactionnel est ensuite placé dans une ampoule à décanter et la phase organique est extraite 5 fois par 100 mû d'eau. Les extraits aqueux sont percolés sur résine sulfonique puis élués par une solution normale d'ammoniaque. L'éluat est concentré sous vide et le peptide D-valyl-L-leucyl-L-lysine ainsi obtenu est séché sous la forme d'une meringue. - Stade E D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle La D-valyl-L-leucyl-L-lysine obtenue au stade D est redissoute dans 40ml de méthanol. On ajoute ensuite 12 ml de sulfate de méthyle et on porte le mélange réactionnel au réflux-pendant 90 minutes. On chasse le méthanol en excès. I1 apparaît progressivement un précipité de (méthysulfate). On laisse reposer-d température ordinaire pendant une heure puis on sépare le précépité que l'on essore puis rince avec du méthanol et que l'on sèche sous vide. Le méthylsulfate est remis en suspension dans le méthanol à 50 % puis on neutralise par addition d'une solution de bicarbonate de sodium a 10 %. Le D-valyl-Lleucyl-L-lysinate de méthyle est extrait au trichloréthane. On sépare la phase organique, la filtre, l'essore, la lave à l'eau, la sèche,et l'évapore a sec. On redissout ensuite à chaud dans l'acétone d'où il précipite par refroidissement. Après séparation puis essorage, on obtient le D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle pur. - Stade F D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide On met en solution dans 125 ml de méthanol 4,1 g de D-valyl-L- leucyl-L-lysinate de méthyle obtenu au stade E puis on ajoute 10 ml d'une solution d'hydrate d'hydrazine. On porte le mélange à 450C, sous agitation en atmosphère inerte pendant 30 minutes. On laisse refroidir à température ordinaire puis on percole sur résine sulfonique. Le peptide est ensuite élué par une solution normale d'ammoniaque.- L'éluat est concentré a sec sous vide. Le résidu est ensuite neutralisé par de l'acide chlorhydrique concentré, puis cristallisé dans l'acétone. On le sépare par filtration! l'essore, le lave à l'acétone et le sèche sous vide. On obtient ainsi 2,6 g de D-valyl-Lleucyl-L-lysyl-hydrazide. Exemple 2 D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginylhydrazide. - Stade A L-pipécolyl-L-arginine. On prépare le N-carboxyanhydride de l'acide pipécolique selon le mode opératoire dè l'exemple 1, stade A, puis on l'ajoute une solution aqueuse d'arginine et de carbonate de sodium molaire en maintenant le pH entre 10 et 10,5, par addition de soude 2N. On maintient a o0c par un bain réfrigérant extérieur sous forte agitation. Au bout de 2 minutes, tout en maintenant la température a OOC, on amène le pH à 3,5 par addition d'acide chlorhydrique con- centré. Le peptide formé est séparé par passage de la solution sur colonne de résine carboxylique puis élué par une solution d'ammoniaque normale. On concentre l'élut à sec pour obtenir le dipeptidespur. - Stade B N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine En opérant comme au stade A de l'exemple 1, au départ de la phénylalanine et du phosgène, on forme le N-carboxyanhydride de D-phénylalanine que l'on utilise tel quel. - Stade C D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginine. En opérant comme au stade B de l'exemple 1, au départ du N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine du L-pipécolyl-L-arginine, on obtient après chromatographle sur résine carboxylique, la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-Larginine. - Stade D D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d'éthyle. On dissout la D-phénylalanyl-L-pipécolyl -L-arginine dans 50 ml d'éthanol. On y ajoute 4,5 ml de sul- fate diéthylique et on porte le mélange au reflux de 1'6tha- nol pendant 2 heures. La solution obtenue est ensuite concentrée et il apparaît un précipité d'éthylsuifate de D-ph nylalanyl-l-pipécoly-L-argininate d'éthyle que l'on sépare par filtration, essore puis lave à l'acétone et sèche. On le dissout dans une solution molaire de bicarbonate de sodium et l'ester base est extrait par du chlorure-de méthyle lène.On sépare la phase chlorométhylénique que l'on lave trois fois à l'eau puis sèche sur sulfate de sodium, déco- lore au charbont filtre et essore d sec sous-vide. On feu cueille ainsi le D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d'éthyle sous forme d'un produit huileux insoluble dans l'eau et soluble dans les solvants organiques. - Stade E D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginylhydrazide. On met en solution le D-phénylalanyl-Lpipécolyl-L-argininate d'éthyle dans 25 ml d'éthanol. On ajoute progressivement 10 ml d'hydrate d'hydrazine et on por te le mélange a 500C pendant 1 heure. On laisse ensuite refroidir et percole sur une résine carboxylique. Lsélution par une solution d'ammoniaque normale puis la concentration s sec de cet éluat permet d'dur tenir une huile qui cristallise dans un mélange méthanol-acétone. On sépare le précipité d'hydrazide que l'on essore à fond, lave a l'acétone puissche. Exemple 3 Acide N-formylarginyl-hydroxamique Stade A N-formylargininate de méthyle En opérant comme a l'exemple 1, stade E, au départ de la N-formylarginine, du méthanol et du sulfate de méthyle, on obtient le-N-formylargininate de méthyle sous forme d'une huile incolore. - Stade B AcidesN-formylarginyl-hydroxamique On dissout le N-formylargininate de méthyle dans 25 ml de méthanol puis on ajoute 7 ml d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine a 10 * dans l'eau, puis 2,5 g de carbonate de potassium. On porte le mélange au reflux pendant une heure, laisse refroidir a température ordinaire puis percole sur résine carboxylique. Le filtrat concentré sous vide est cristallisé en fin de concentration. On filtre le précipité, on l'essore, le rince avec un peu d'acétone, puis le sèche sous.vide. On obtient ainsi l'acide N-formylarginyl-hydroxamique. Exemple 4 (N-benzoylarginyl)N'-méthyl-hydrazine Stade A N-benzoylargininate de méthyle On dissout 4,5 g de N-benzoylarginine dans 35 ml de méthanol puis on ajoute 2,5 ml de sulfate de méthyle. On maintient sous agitation pendant;:2 heures à 600C puis on sépare le précipité de méthylsulfate. Celui-ci est converti en N-benzoylargininate de méthyle par alcalinisation avec une solution de bicarbonate de sodium. - Stade B (N-benzoylarginy.l) (N 'méthylhydrazide) Le N-benzoylargininate de méthyle est mis en solution dans 25 ml de méthanol puis on ajoute 2,5 ml d'une solution de-méthylhydrazinea 20 % dans le méthanol. On maintient sous forte agitation a 600C, pendant deux heures puis on laisse reposer la suspension cristalline perr dant une nuit. On sépare les cristaux par filtration, les essore, les lave au méthanol-et les sèche sous vide. On les remet en suspension dans-le méthanol-puis fait barboter un courant de gaz chlorhydriquependant 30 minutes. On laisse décanter le précipité de chlorydrate qui s'est formé ; on le filtre, essore, le rince avec un.peu de méthanol et le sèche sous vide. Le méthylhydrazide est ainsi obtenu pur sous forme de chlorhydrate. Le chlorhydrate peut être trans- formé en hydrazide par passage en milieu alcalin par addition de soude 2 N. R E V E N D i C A T I O N S 1.- Dérivé de tripeptide caractérisé en ce qu'il répond à la formu le générale Z1-Y-(22)NHZ3 (I) dans laquelle : Z1 représente un reste d'amino -acide choisi parmi les radicaux D-valyl, D-prolyl, D-phé- nylalanyl, L-isoleucyl, L-glutamyl, L-pyroglutamyl, (N benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl) (N carbomethoxy-propionyl -L-arginyl) et autres amino-acides et peptides, Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-leucyl, -phenylalanyl, L-pipécolyl, glycyl et L-prolyl et autres amino-acides, Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-lysyl, L-arginyl, L-tyrosyl et L-valyl et autres amino-acides, Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué). 2.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formu le générale Z' 1-Y'-(L-arginyl)NH-Z3 (IA) dans laquelle Z' est un reste d'acide ami né choisi dans le groupe constitué par le radical D-pro lyl, D-valyl, D-phénylalanyl, N-benzoyl-L-isoleucyl-L glutamyl, D-isoleucyl et L-glutamyl et autres amino-aci des, Y' est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-phényla- lanyl, L-Leucyl, L-pipécolyl, glycyl et L-prolyl etautres amino-acides, Z3 est défini comme précédem ment. 3.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formu le générale Z-Y-Z2NHOH (Ig) dans laquelle Les radicaux Z11 Z2 et Y ont les définitions fournies antérieurement. 4.- Dérivé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il répond à la formu le générale Z1-Y-Z2NHNH2 (IC) dans laquelle les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme précédemment. 5.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formu le générale z1-Y-z2NH-NHR2 (ID) dans laquelle Z11 Z2 et Y ont les définitions fournies antérieurement ; et, R2 est un radical alcoyle in ferieur ayant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, un radical alcoyle inférieur substitué par un ou plusieurs hydroxyles, alcoxyles ou acyloxy ; un ra- dical aryle mono ou bicyclique ayant jusqu'à 10 atomes de carbone ou un radical aryle mono ou bicyclique substi tué par un à trois substituants choisis dans le groupe constitué par un radical halogène, alcoyle inférieur, al- coxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluoromAthoxy, tri fluorométhylthio, cyano, aininosulfonyle ou cycloalcoyle. 6.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond a la formu le générale Xl-arginyl(NH)Z3 (II) dans laquelle X1 est le reste acyle d'un a cide organique carboxylique, aliphatique ou aromatique a yant de 1 à 10 atomes de carbone.et, Z3 est défini comme précédem ment. 7. - Procédé d'obtention un dérivé selon la revendication 1, caractérisé: en ce qué l'on forme un N-car boxyanhydride d'un amino-acide Y par action du phosgène dans un solvant inerte anhydride puis fait réagir ce N carboxyanhydride ainsi formé avec l'mono acide Z2 par couplage en milieu aqueux alcalin a une température voisi ne de 0 C suivi d'une acidification a pH 3,5, puis que l'on condense à nouveau le N-carboxyanhydride d'un amino acide Z1 (préparé comme le NCA Y) sur le dipeptide Y-Z2 précédemment formé en milieu alcalin aqueux pour obtenir après acidification le peptide de formule générale Z1-Y-Z2 (III) dans laquelle Z1 Z2 et Y sont définis com me précédemment en ce que l'n soumet celui-ci à l'estérification à l'aide d'un sulfate dialcoylique en présence d'un alcanol pour obtenir un alcoylsulfate d'es ter de tripeptide, sépare celui-ci; le convertit en base d'ester d'amino-acide par alcalinisation puis le soumet à l'action d'un réactif azoté de formule générale NH2-Z3 dans laquelle Z3 est défini comme précédem ment pour obtenir le composé de formule générale désiré Z1-YZ2-NHZ3 que l'on peut, si désire, salifier par addition d'un aci de minéral ou organique. 8.- Procédé d'obtention d'un dérivé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on soumet à l'ac- tion d'un agent acylant l'arginine dans un solvant polai- re en présence d'une base tertiaire puis estérification de la N-acylguanidine par un sulfate d'alcoyle en présence d'un alcanol, séparation de l'alcoylsulfate deN-acylgua- nidinate d'alcoyle, conversion en base et aminôlyse de cel le-ci par action d'un réactif de formule 2HN-Z3 dans laqueS le Z3 est défini comme précédemment pour former un composé de formule générale X1-arginyl-NH-Z3 (II) dans laquelle X1 et Z3 ont les définitions fournies précédemment. 9.- Application des composés selon l'une quelconque des reven dications 1 à 6, à la préparation-de réactifs biologiques destinés au dosages enzymatiques et plus particulièrement au dosage des paramètres sanguins.