Brevet FR2550218A1 — publié le 19850208

I La présente invention se rapporte généralement aux techniques de coloration d'une matière génétique biologique Plus particulièrement, le procédé selon l'invention offre un moyen unique de visualisation ( 1) des pronucléis des cellules pronucléaires vivantes, comprenant les ovules et les oeufs fertilisés à une cellule ( 2) i'ADN condensée dans les têtes des spermatozoïdes et ( 3) les noyaux des embryons prë-implantation La visualisation de la matière génétique dans ces types de cellules vivantes est critique pour une plus ample recherche et un develope mne{ J a i:tl lisation et de la maturation in vitro, des capcs de transfert des gènes et des noyau-*^: a u cloiage subeséquein T dembrons d anim uau {omes L-e s Jusqti -ma ntenafnt 9 les pronucléis et 11 ADH i du spe-me ri: N pu ç re vus dans des cellules mammifrères vi 7 vahie ce L ' 3 e S leein es rongeurs et des humaisfl - e cy Lci sxne de ces cellules est limpide. Dan ie y p S mures la zone des noyaux peut Lre quelque peu disce-nableu mais la dimension plus etite es iu d imossible la visualisation des noyaux ix-di id 1 els, Les p Prfec Lo -l ents g-nétiques avancés et les techniq es 'de s -cti. N cnc%-inuent a etre recherchés -ans le doaie de ieevageo En se référent plus particulie& rement au, vaches la-êires par exemple, on a vu des augmenations iiporan'hes de la production de lait avec l'usage à grande échelle de pères g-nétiquement supérieurs et de 1 'insémination artificielle Les vaches laitières produisent actuellement presque le double de lait qu'elles 30 produisaient il y a 30 ans Une plus ample amélioration génétique peut être atteinte par la multiplication d'embryons supérieurs et génétiquement manipulés par clonage Les embryons peuvent être clonés par ( 1) remplacement des pronucléis ou des noyaux dans une cellule d'oeuf fertilisé 35 par des pronuclli donneurs ou des noyaux d'un embryon multicellulaire précoce ou ( 2) le transfert d'un gène valable dans le pronucléusou le noyau. Le transfert génétique nécessite que le pronucléus ou le noyau de la cellule réceptrice soit visible de façon que les fragments d'ADN contenant les séquences génétiques souhaitées puissent être transférés par micromanipulation directement dans l'un des pronucléis ou le noyau Le transfert nucléaire par ailleurs, nécessite que le noyau ou les pronucléi mâle et femelle soient visibles de façon à pouvoir les retirer de la cellule fertilisée en échange d'un noyau de la ligne clonale souhaitée Des techniques telles que celles comprenant la manipulation de la matière génétique ont été développées avec la recherche avec les ei:-yons murins o le cytoplasme de la cellule pronucléaire et de l'embryon est limpide, permettant la visualisation de la matière nucléaire dans 15 les cellules vivantes, par microscopie à la lumière. La situation dans les gameètes bovins et porcins et les cellules d'embryon pré-implantation est assez différente Le cytoplasme de ces cellules est dense et granulaire et contient des gouttelettes épaisses de liquide La matière 20 génétique est obscurcie et ne peut être visualisée par microscopie à la lumière Les colorants nucléaires conventionnel ne sont pas des colorants vitaux; c'est-à-dire qu'ils nécessitent que les cellules soient fixées et éclaircies avant coloration Par conséquent, 25 les gamètes bovins et porcins et les cellules d'embryon pré-implantation ont normalement été examinés dans des échantillons fixes, éclaircis et non vivants. Comme on l'a décrit ci-dessus, les techniques d'amélioration génétique comme le transfert des gènes 30 des noyaux nécessitent la coloration sélective de la matière nucléaire ou pronucléaire dans des cellules pronucléaires ou d'embyon vivantes Ces techniques, avec une multitude de tâches de recherches en laboratoire, sont rendues possible par la technique de l'invention qui offre une méthode de visualisation avec la sélectivité nécessaire et que l'on peut utiliser avec des cellules vivantes. La technique décrite ici permet auxpronucléi mâle et femelle d'être visualisés dans des cellules mamifères vivantes, même dans les espèces ou la densité du cytoplasme de la cellule obscurcit normalement les pronucléi La 5 visualisation des pronucléi dans les cellules vivantes n'a pas encore été rapportée, sauf pour les cellules des rongeurs et des être humains La technique offre également un moyen de visualisation de la matière nucléaire-des embryons multi-cellulaires, permettant de compter le nombre des cellules présentes dans un embryonen développement après chaque division ainsi que de manipuler la matière génétique pour le transfert des gènes et des noyaux. La visualisation est accomplie par exposition des 15 cellules vivantes à un colorant qui est spécifique de l'ADN à deux branches et qui ne nuit pas à la continuation de la viabilité de la cellule Les colorants fluorescents, comme DA Pl ou les composés de bis-benzimidazole sont utilisés Le colorant est ajouté au milieu de cultures contenant les gamètes, les oeufs fertilisés à une cellule ou les embryons multi-cellulaires Après incubation, qui peut ne durer que quelques minutes, la matière génétique peut être visualisée par exposition à la lumière ultraviolette. Les structures pronucléaires ou nucléaires apparaissent sous forme de zones teintées dans le cytoplasme L'intensité varie d'une fulorescence très faible à lumineuse. La présente invention a pour objet général de permettre et de faciliter les tâches de recherche en laboratoire comme les techniques de transfert génétique et nucléaire, 30 ainsi que les études des motifs des progressions de la maturation in vitro des oocytes et la fertilisation in vitro ainsi que la culture des embryons. L'un des objets principaux de l'invention concerne une technique de visualisation des pronocléi des cellules 35 pronucléaires vivantes des mammifères. 4 N 2 La présente invention a pour objet plus spécifique de permettre que la visualisation de l'ADN ou des pronuclei mâle et femelle de gamètes mammifères vivants et d'oeufs fertilisés à une cellule, pour les bovins et les porcins en particulier. La présente invention a pour autre objet une technique identique permettant la visualisation de la matière nucléaire d'embryonsmulticellulaires. La présente invention a pour autre objet un moyen pour la coloration différentielle de la matière génétique et le contenu cytoplasmique. La présente invention a pour autre objet un moyen de coloration de la matière génétique dans le germe vivant et les cellules embryonaires d'une façon pouvant permettre 15 le maintien de la santé et de la viabilité des cellules. De plus, il est souhaitable de produire un colorant ne provoquant pas une dégradation ou une altération excessive de la matière génétique. Le procédé selon l'invention offre une technique pour la coloration différentielle d'une certaine matière génétique qui n'a jamais été visible jusqu'à maintenant, dans les cellules vivantes Les colorants fluorescents utilisés dans ce procédé colorent sélectivement la matière génétique des cellules, sans nécessité que les cellules soient fixées et éclaircies La sélectivité de cette technique de coloration offre un outil puissant de recherche qui facilitera une plus ample investigation de la fertilisation, du développement embryologique et du transfert génétique et nucléaire dans les embryons d'animaux domestiques. Les colorants de ce procédé peuvent être-utilisés pour colorer sélectivement la matière génétique de toutes espèces Cependant, la technique trouve sa plus haute valeur avec les espèces o les matières cytoplasmiques (comme les lipides) obscurcissent la matière pronucléaire ou nuclé35 aire à l'état vivant Des exemples d'un intérêt et d'une importance considérables pour l'industrie de l'élevage sont le bétail et les cochons. 255021 8 L'applica ioi, de la,echnlque à d'autres &nmaux de recherche ou domestiques est également envisagée. On a trouvé que certains colorants fluorescents utilisés selon ce procédé permettaient d'obtenir les objectifs doubles de sélectivité de la coloration et de viabilité continue des cellules Les colorants fluorescents qui sont appelés "colorants vitaux", c'est-à-dire qui ne nécessitent pas que les cellules soient fixées et éclaircies et qui n'interfèrent pas avec le développement 10 continu de la cellules peuvent être utiles dans ce processus De plus, le colorant doit être du type incorporé dans la cellule et repris par li ADN à deux branches dans le germe vivant ou les cellules d'embryon vivanteso Les colorant partnant à la classe des colorants f luorescents de bsbei idazole se sont révélés être particulieêrement utiles dans ce procédé Cette classe de composés A la strucrure de base H t I R Une série de colorants de cette classe est commercialisée par Hoechst A Gn Franckfort, Allemagne de 20 l'Ouest Des composés de cette série comprennent g Foechst N R R' 32020 CH 3-N( -Ci 32021 CH -N 33258 CH 3-N 33342 CH 3 N 3 HN 25 33662 C 2 H 5-N 34580 CH 3-N CH 3 38312 H-C 33317 H-C Des études de S A Latt et autres, "Spectral Studies on 33258 Hoechst and Related Bisbenzimidazoie Dyes Useful for F Luorescent Detection of Deoxyribonucleic Acid Synthesis," Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Volume 23 pages 24-33 ( 1976),déontrent la similitude des séries de composés données ci-dessuset révèlent que ces composés sont utiles pour la détection de la synthèse de l'ADN dans les cellules somatiques. Les exemples qui suivent démontrent que les colorants Hoechst n 33258 et 33342 sont utiles dans la technique révélée ici Le non chimique du colorant Hoest n 33258 est 2 32-( 4-hydroxyphényl)-6-benzimidazoyll 6-( 1-méthyl-4-piperazyl)-benzimadazole Le nom chimique du colorant Hoechst n 33342 est 2 l 2-( 4-éthoxyphényl) -6-benzimidazoyll -6-( 1-éthyl-4piperazyl) benzimedazole. On peut s'attendre que les composés de bisbenzimidazole en rapport soient également utiles pour la visualisation sélective de la matière génétique dans les germes ou les cellules vivantes d'embryons Parmi les deux composés réellement essayes, le colorant Hoescht n 33342 a fortement dépassé le colorant Hoechst n 33258 et c'est par conséquent le réactif préféré On a cependant que les cellules des diverses espèces prendraient différentes colorations avec une efficacité différente Par exemple, Hoechst n 33258 prendra rapidement pour les embryons de souris, mais assez lentement dans les embryons de boeuf 255 0218 On peut s'attendre à ce que d'autres colorants fluorescents répondant aux conditions décrites ci-dessus, c'est-à-dire des fluorochromes liants l'ADN que l'on peut utiliser comme colorants vitaux soient utiles également avec ce procédé Des exemples comprennent, sans limitation, DA Pl ( 4 '6-diamidino-2-phénylindole), et DI Pl composé semblable à DAPI). La méthode par laquelle la matière génétique dans les gamètes ou cellules d'embryons est colorée comprend essentiellement l'exposition des cellules à un colorant fluorescent approprié, l'incubation et l'exposition à de la lumière ultraviolette La dose du colorant et la durée de l'incubation peuvent être modifiées, selon le colorant utilisé et le but dans lequel on souhaite une visualisation. 15 L'on n'a pastrouvé de faux positifs en utilisant cette technique de coloration; en effet, le processus ne s'est pas révélé colorerde manière significative des matières autres que l'ADN nucléaire ou pronucléaire On a cependant noté que des cellules trop colorées présentaient 20 une certaine coloration du fond La technique s'est révélée avoir pour résultat certain faux négatif en effet, certaines cellules qui par d'autres méthodes se sont révélées contenir des noyaux ou pronucléi ne se sont pas révélées fluorescentes On ne peut considérer que cela empêchera ou compromettra l'utilité de la technique en laboratoire ou à l'échelle commerciale. Les cellules d'oeufs (ovocytes), les oeufs fertilisés à une cellule ou les embryons de pré-implantation sont obtenus d'animaux femelles matures par des moyens convention30 nels préservant la santé des cellules Les cellules du sperme (spermatozoïdes) sont obtenues de l'éjaculation d'animaux mâles murs ou de testicules excises, de l'épididyme ou d'une partie du système des canaux du mâle Les cellules ou les gamètes(ovocytes et spermatozoïdes) sont 35 des cellules haploïdes qui se réuniront pour former un oeuf fertilisé L'oeuf fertilisé (contenant les pronucléi mâle et femelle) subit alors une syngamie (l'union des pronucléi mâle et femelle pour former un noyau zygote) avec ensuite une série de division de la cellule Tandis que l'embryon subit une série de divisions mitotique 5 il se développe par le stade de morula jusqu'au stade de blastocyte, ou se produisent la différenciation et la spécialisation des tissus Finalement, cela conduit à la formation du foetus et du placenta, qui se trouvent implantés sur la paroi utérine. C'est l'embryon aux stades pré-implantation ainsi que les cellules et les oeufs fertilisés à une cellule qui sont l'objectif principal de l'invention Ces cellules très précoces forment l'objet de recherches intensives. Les techniques de transfert génétique et nucléaire 15 décrites ci-dessus utilisent des cellules d'oeufsfertilisés et les cellules d'embryons précoces La technique s'est également révélée utile dans d'autres recherches à embryons logiques Par exemple, elle permet aux chercheurs d'étudier le développement de fertiliser 20 in vitro, comme la symétrie de la division nucléaire et cytoplasmique, l'apparition d'un seul noyau dans chaque blastomère, le nombre de cellules dans l'embryon après chaque division, etc De plus, elle est utile pour étudier la santé et la mobilité desspermatozoldes. Les cellules ou ovules ou cellules d'embryon sont de préférence placées dans un milieu de culture appropriée au maintien de la santé et de la viabilité des cellules. Le milieu de culture préféré pour une application donnée, par exemple pour des cellules d'une espèce particulière 30 et en un stade particulier de développement, sera connu de la personne compétente en la matière Plusieurs milieux appropriés sont donnés dans les exemples Le sperme peut être examiné dans la semence, dans la-semence avec des charges conventionnelles comme du jaune d'oeuf ou une 35 charge de lait ou dans un milieu de culture. Le colorant est de préférence utilisé en solution. Cela permet une régulation plus précise du dosage et cela permet également d'utiliser des concentrations très diluées du colorant On pense que de plus faibles dosages peuvent avoir moins tendance à provoquer une dégradation génétique de là cellule. Une solution d'approvisionnement du colorant peut être préparéeen utilisant tout solvant approprié; c'est-àdire tout solvant du colorant ne pouvant affecterde manière 10 néfaste les cellules vivantes Les exemples comprennent, sans limitation, une solution saline aux tampons de phosphate de Dulbecco (DPBS), TALP, des milieux Whittens ou Eagles ou tout autre milieu ou solvant compatibles avec la viabilité continue des cellules La solution d'approvisionne15 ment du colorant doit de préférence être stockée à des températures réfrigérées, de préférence d'environ O à 4 C afin de réduire la possibilité d'une contamination Cependant, il faut noter que la congélation ne sera généralement pas souhaitable car elle force les sels à précipiter de la 20 solution. La concentration de la solution d'approvisionnement du colorant peut être modifiée comme on le souhaite Une solution plus concentrée colorera la matière génétique en une plus courte période tandis qu'une solution moins concentrée 25 nécessitera une plus longue période d'incubation avant que la matière ne devienne fluorescente De plus, le taux d'absorption du colorant varie avec l'espèce, les cellules bovines et porcines nécessitant une bien plus longue d'incubation que les cellules murines Comme on l'a noté ci-dessus, des dosages inférieurs du colorant peuvent être préférés pour maintenir la santé et la viabilité des cellules. Par exemple, en utilisant une solution d'approvisionnement de 20 Mg du colorant par ml de DPBS, une quantité aussi faible de 11 l dans 49)U 1 de milieux (volume total de 501 l) 35 contenant des embryons à une cellule de souris a eu pour résultat une fluorescente distincte des pronuclei et au moins un corps polaire en 15 minutes En utilisant des embryons bovins à une cellule et une solution d'approvisionnement du colorant à 20/g/ml à une dose de 2 t 1 t dans 48 J 11 des milieux de culture contenant les embryons, les corps polaires sont devenus fluorescents en 30 minutes, tandis que les pronuclei n'étaient pas visibles pendant 1 à 2 heures Comme on peut le voir en se référant aux exemples, la dose et la durée d'incubation peuvent être modifiées comme on le souhaite dans divers buts expérimentaux et autres. 10 Les structures colorées peuvent être visualisées au microscope par exposition à de la lumière ultraviolette. La lumière à une longueur d'onde d'excitation d'environ 350 nm et une émission d'environ 460 nm s'est révélée appropriée Les noyaux et pronucléi apparaissent sous la 15 forme de zones colorées en bleues dans le cytoplasme de la cellule Les spermatozoïdes n'ont pas de pronucléi distincts; 1 'ADN est condensé et tassé dans la tête du spermatozoïde ou il peut être visualisé par cette méthode Lorsque l'on indique des pronuclei, cela signifie 20 l'ADN du sperme, à moins que cela ne soit spécifié autrement. Selon la quantité du colorant absorbé par l'ADN qui est fonction de la dose et du temps, l'intensité variera d'une fluorescence très faible à très lumineuse. Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas en limiter le cadre. Les solutions d'approvisionnement et les milieux de culture utilisés dans les exemples ont été préparés comme indiqués ci-dessous. Préparation de la solution saline de tampons 30 de phosphate Dulbeccos (DPBS) La solution saline de tampons de phosphate de Dulbeccos (DPBS) a été préparée comme suit: Solution N 1 8 00 g Na C 1 0.20 g KC 1 1 15 g Na 2 HP 04 0.20 g KH 2 PO 800 00 ml eau distillée désionisée 255021 8 1 1 Solution N 2 O 1 g Ca C 12 0 ml eau distillée désionisée Solution N 3 O 1 g Mg C 12 0 ml eau distillée désionisée Chaque solution a été stérilisée à l'autoclave-à la vapeur séparément à 120-125 C pendant 20 minutes puis refroidie. Les trois solutions ont été mélangées dans un ballon volumétrique de un litre, et le volume total a été ajusté à un litre avec de l'eau distillée désionisée passée à l'autoclave La solution d'approvisionnement de DPBS a été réfrigérée à environ 4 C. Lorsque l'on a utilisé DPBS pour laver les cellules, on a d'abord ajouté, à 100 ml de DPBS, 5 mg ( 0,1 ml) d'une solution d'approvisionnement de sulfate de gentamycine. La solution d'approvisionnement de gentamycine représentait mg de gentamycine SO 4 par ml Na CI. Préparation des solutions d'approvisionnement du colorant Des solutions d'approvisionnement du colorant utilisant 20 le colorant Hoechst N 33342 ont été préparées aux concentrations qui suivent: 10 kg/ml DPBS îg/ml DPBS Ug/ml DPBS Des solutions d'approvisionnement du colorant utilisant le colorant Hoechst N 33258-ont été préparées aux concentrations qui suivent: 10 Ug/ml DPBS Ug/ml DPBS Les solutions d'approvisionnement en colorant ont été stockées à 4 C. Préparation du milieu TALP (TyrodeAlbumine-Lactate-Pyruvate) La préparation de solutions d'approvisionnement pour une utilisation pour compléter-le milieu TALP était comme suit: - Ingrédient Na Cl K Cl Ca C 12 ( 2 H 20) 10 Mg C 12 ( 6 H 20) Na HCO 3 Glucose Na Lactate 15 Na H 2 PO 4 (H 20) Quantité 9.210 g 1.237 g 1.332 g 2.436 g 1.403 g + 1 mg rouge phénol 5.310 g 1.0 ml DL-Acide 28.0 mg Dans: 1.0 1 H 20 100 ml H 20 100 ml H 20 100 ml H 20 100 ml H 20 ml H 20 lactique* ** *Acide de DL- Lactique, sel de sodium sous forme d'un sirop à 60 % (Sigma Chemical) On a rincé 1,0 ml du sirop d'acide lactique dans 35 ml H 20 jusqu'à ce qu'il soit en solution. On y a ajouté une goutte de phénol rouge Le p H a été ajusté 20 environ à 7,4 avec Na OH (les dépassement peuvent être corrigés en ajoutant une très petite goutte de lactate). **On a mélangé 28 mg Na H 2 PO 4 (H 20) à 10 ml de la solution d'approvisionnement de glucose préparée ci-dessus. Les ingrédients de chaque solution d'approvisionnement 25 ont été mélangés, filtrés sur Millipore (dimensions et pores 0,22,t) dans des bouteilles stériles et réfrigérés à environ C. Le milieu TALP a été complété selon-la nécessité en mélangeant les quantités suivantes des solutions 30 d'approvisionnement: Approvisionnement Concentration de l'approvisionnement Concentration dans le milieu 114 00 m M 3.16 m M 2.00 m M Quantité ml 1.90 ml 1.70 ml Na Cl K Cl Ca Cl 2 ( 2 H 20) 157 0 m M 166 O m M 120 O m M 255 u 218 (suite du tableau) Approvisionnement Concentration de Concentration Quantité l'approvisionnement dans le milieu Mg Cl 2 ( 6 H 20) 120 0 m M 0 50 m M O 41 ml Na HCO 3 167 O m M 25 00 m M 15 00 ml Na H 2 PO 4 (H 20) 20 5 m M 0 35 m M)ensemblel 70 ml Glucose 295 0 m M 5 00 m M) Na Lactate 150 0 m M 10 00 m M 6 70 ml Les quantités indiquées ont été mélangées avec suffisamment de Na Cl pour amener le volume final à 100 ml et on a ajouté 6,5 mg de pénicilline ( 100 u i /ml) et 1,0 mg de rouge phénol Le mélange résultant a été filtré sur Millipore (dimensions des pores 0,22/4) dans une bouteille 15 stérile). Au jour de l'utilisation, le milieu TALP a été complété comme suit, selon l'usage souhaité: 1 Milieu de fertilisation On a ajouté 6 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) (sans acide gras) et 10,e 1 d'un produit de Na pyruvate par ml de TALP et on afiltré sur Millipore (BSA de Sigma Chemical Co.) ou 2 Milieu de maturation à 4,5 ml de TALP, on a ajouté 500 &l de sérum fétal bovin ( 10 %), 50/ 11 de produit de Na pyruvate et 10 mg FSH/ml TALP et on a filtré sur Millipore. Préparation du milieu de Whitten Ingrédient Quantité Na Cl 514 O mg K Cl 36 0 mg KH 2 PO 4 16 O mg Mg SO 2 ( 7 H 20) 29 O mg Na HCO 190 0 mg Na Pyruvate 3 5 mg Ca Lactate ( 5 H 20) 53 0 mg Glucose 100 0 mg K Penicilline 8 0 mg Streptomycine SO 4 5 0 mg Le milieu a été complété en ajoutant les ingrédients indiqués dans un ballon volumétrique de 100 ml Ensuite, on a ajouté 0,37 ml de sirop à 60 % de Na Lactate (Sigma Chemical Co) et 0,1 ml de rouge phénol à 1 % Le volume final a été ajusté à 100 ml avec de l'eau distillée désionisée. Le milieu a alors été filtré sur Millipore (dimensions des pores 0,22 e) et stocké à 40 C Au jour de l'utilisation, le milieu a été complété d'albumine de sérum bovin (BSA) (Sigma Chemical Co) en ajoutant 1,5 mg de BSA par ml du 10 milieu). EXEMPLE 1 Des embryons de souris ont été utilisés dans cet exemple pour vérifier la spécificité du colorant pour la matière génétique dans des embryons vivants à une cellule, 15 parce que les pronucléi de cette espèce sont visibles à l'état non coloré On a obtenu les embryons de souris femelle mûr esayant engendré la nuit précédente Les animaux ont été sacrifiés par dislocation cervicale et les ovères et l'oviducte ont été excisés L'oviducte a été disséqué 20 pour le libérer et les embryons à une cellule ont été récupérés en les localisant dans l'oviducte comme une zone gonflée et en perçant la paroi de l'oviducte au moyen d'aiguilles fines et de ciseaux fins Les cellules cumulus ont été retirées en ajoutant 100-200,U 1 d'une solution d'hyaluronidase ( 10 mg/ml DPBS) dans la zone de l'oviducte dissectée et en laissant reposer pendant 10 minutes. Les embryons à une cellule ont été récupérés à la pipette, et ont été lavés trois fois dans une solution de 3 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) /ml DPBS avant-de les ajouter 30 au milieu de Whitten BSA est acheté à la Société Sigma Chemical. Des gouttes individuelles du milieu Whitten ont été placées sur une coupe de culture en plastique Les gouttes ont été grattées pour les forcer à adhérer à la plaque puis 35 ont été recouvertes d'huile Les embryons à une cellule ont alors été placés dans les gouttes Les pronucléi ont été visualisés en utilisant une microscopie à la lumière avant de les colorer selon le procédé de l'invention. La solution d'approvisionnement en colorant de Hoechst n 33342 d'une concentration de 20/g/ml a été utilisée pour cet exemple On souhaitait donner aux embryons à une cellule des doses de 0,1/I 1, 2/L 1, 5;#l ou 10/1 de la solution d'approvisionnement en colorant dans un volume total milieu-embryon-colorant de 50 U 1 par goutte. Il a par conséquent été nécessaire de placer les gouttes de milieu-embryon sur les lamelles à des dimensions pour tenir compte de la dose souhaitée du colorant C'est-àdire 10 49 fl milieu-embryon pour une dose de 1 À 1 du colorant, 48/Il milieu-embryon pour une dose de 2/Il du colorant, etc. Les embryons ont été colorés à 37 C, p H 7,2 dans 5 % de CO 2 dans l'air On les a laissé dans le colorant tandis qu'ils étaient visualisés. Les pronucléi et les corps polaires des embryons de souris à une cellule ont été visualisés en utilisant l'accessoire épi-fluorescence Nikon n TMD-EF pour microscope inversé DIAPHOT-TMP (Nikon) Dans ce système, on utilise une lampe à mercure haute pression Les filtres à ultraviolet utilisés étaient de Nikon Ce système permet la visualisation à la lumière et la fluorescence simultanément,il a donc été possible d'identifier positivement les zones de fluorescence en tant que pronuclei et corps polaires. Les 66 embryons colorés de cette façon ont montré une fluorescence distincte des pronucléi et d'au moins un corps polaire en 15 minutes d'exposition initiale au colorant, quelle que soit la dose Fréquemment, seul un corps polaire était mis en évidence car le second corps 30 polaire se dégénère avec le temps. Ensuite, 24 embryons de souris à une cellule ont été colorés de la même façon que ci-dessus en utilisant uniquement la faible dose ( 1 U 41 de la solution du colorant avec 49/U 1 de la goutte milieu-embryon) Vingt trois des 24 35 sont devenus fluorescents en 5 minutes après coloration. EXEMPLE II On a répété les processus de l'exemple I en utilisant des embryons de hamster à une cellule et une dose de 1011 l de la solution du colorant pour 50 04 l du volume total de la goutte Le premier corps polaire s'est coloré au bout de 15 minutes d'exposition au colorant Les pronucléi ne sont pas devenus fluorescents avant 30 minutes d'exposition Il a fallu jusqu'à 45 minutes d'exposition pour une visualisation complète des deux 10 pronucléi et d'au moins un corps polaire dans chaque caisse Comme à l'exemple I, les deux corps polaires ne sont pas colorés. EXEMPLE III On a répété les processus de l'exemple I en utilisant 15 des ovocytes matures de bovin, des embryons à une cellule et à deux cellules On a obtenu des ovaires d'un abattoir. Les ovocytes ont été aspirés des follicules Les cellules de cumulus ont été retiréesavant coloration par l'hyaluronidase et à la pipette comme à l'exemple I. Certains des ovocytes récupérés ont été récupérés pour lacoloration comme décrit ci-après et certains ont été utilisés pour une fertilisation in vitro Les ovocytes ont été incubés pendant 24 heures à 39 C dans un milieu de maturation TALP puis incubes avec de la semence éjaculée de taureau dans un milieu de fertilisation TALP. Les cellules d'oeufs fertilisées à une cellule ont été récupérées après l'incubation de 24 heures, lavées dans une solution de DPBS-gentamycine et remises en suspension dans un milieu frais de fertilisation TALP Des embryons 30 à deux cellules ont été préparés de la même façon, avec récupération au bout de 48-heures d'incubation avec le sperme et le milieu de fertilisation, puis ont été lavés et remis en suspension dans un milieu de fertilisation. La solution d'approvisionnement du colorant à une concentration de 20 eg de Hoechst N 33342 par ml de DPBS a été utilisée dans cet exemple Les processus dans l'exemple I ont été utilisés avec des doses du colorant de 2 41 et l de colorant pour 50 LA 1 du volume total du milieuembryoncolorant Les mélanges colorants-cultures ont été incubés à 39 C, montés sur des lamelles en verre sous les bandes de recouvrement et visualisés en conditions ambiantes. Les corps polaires ont été rendus visibles pendant Minutes après addition du colorant Les pronucléi des ovocytes et des embryons à une cellule ainsi que les noyaux des embryons à deux cellules se sont trouvés visibles au bout d'une à deux heures ou plus. Les cellules colorées ont alors été montées, fixées et éclaircies pour permettre une contre vérification de la chromatine présente Les lamelles avec les embryons et ovocytes colorés ont été placéesdans des bacs de Coplin contenant environ 40 ml d'acide acétique:éthanol ( 1:3 (volume/volume)) et on a laissé s'éclaircir pendant une nuit à la température ambiante La chromatine a été colorée avec 1 % d'acéto-orcéine (poids/volume) ( 1 % de colorant d'orcéine 20 dans une solution à 60:40 d'eau-acide acétique) La chromatine a été visualisée par microscopie à la lumière en utilisant un circuit optique de phases et de Nemarsky. On a trouvé qu'environ 15 % des ovocytes et des embryons précoces à une cellule contenaient des plaques de métaphase 25 ou des pronucléi bien qu'ils ne soient pas devenus fluorescents lors d'une exposition au colorant de bisbenzimidazole Avec les embryons à deux cellules, l'on n'a pas vu de cas ou le noyau n'est pas devenu fluorescent. Le colorant n'a donné aucun faux positif; tous les embryons 30 qui sont devenus fluorescents se sont révélés contenir de la chromatine lors d'une évaluation par la seconde méthode. La chromatine était présente sous l'une des formes qui suivent:l)1 dispersée ou plaque en métaphase pour les ovocytes (comprenant les vésicules germinaux des ovocytes immatures), 35 ( 2) pronuclei pour les cellules d'oeufs fertilisés, ( 3) noyaux pour les cellules d'embryon, ou ( 4) tête condensée de spermacétie pénétrant l'ovocyte mais ne subissant pas une décondensation normale pour former le pronucleus mâle. EXEMPLE IV Les processus de base de l'exemple II ont été répétés en utilisant des ovocytes porcins, des oeufs fertilisés à une cellule et des embryons à deux cellules et à quatre cellules Les ovocytes ont été récupérés de truies ayant été accoupléespar çurtage chirurgical des oviductes et mis en suspension dans un milieu de maturation TALP La solution d'approvisionnement du colorant a une concentration 10 de 6011 g/ml du colorant Hoechst N 33342 a été utilisée selon les processus de l'exemple I avec des doses du colorant de O,1,l, 5 ú 1 l et 10 t 1 pour 50 l du volume total du milieu-embryon-colorant Ces mélanges ont été incubés à 39 C pendant 3 heures. Les plaques en métaphase et les corps polaires des ovocytes n'ayant pas été fertilisés et les oeufs fertilisés se sont très distinctement colorés, les pronuclei apparaissant moins distincts De plus, les têtes des spermacétis ayant pénétrées dans la zone des ovocytes ont montré une 20 fluorescence Les noyaux des embryons à deux cellules et à quatre cellules ont montrés une fluorescence très distincte. On a trouvé que la dose de 10/t avait pour résultat des niveaux élevés de coloration du fond. Les cellules teintées ont été montées, fixées et éclaircies comme à l'exemple II, à l'exception qu'on les a éclaircies dans l'acide acétique:éthanol pendant 48 heures. Les résultats étaient semblables à ceux de l'exemple 3. Environ 40 % des ovocytes et des embryons à une cellule ne sont pas devenus fluorescents, bien que l'on n'ait observé 30 aucun fond positif Les embryons à plusieurs cellules ont été colorés systématiquement par le colorant Hoechst. EXEMPLE V Le développement in vitro d'embryons exposés au colorant fluorescent Hoechst n) 33342 a été évalué avec 35 des embryons de souris au stade de deux cellules et de morula Les embryons ont été obtenus et préparés par la 2 50218 méthode décrite On les a colorés avec des doses de 10,1 l de la solution du colorant (concentrations de 201/g/ml avec pour résultat une dose de 0, 211 pour 50 Àa du volume total de la goutte. Les embryons ont été exposés au colorant pendant minutes Ensuite, les embryons ont été lavés trois fois dans DPBS-gentamycine et mis en culture dans le milieu de Whitten. Parmi les 26 embryons de souris à deuxcellules exposés 10 au colorant, 16 ou 65 % se sont développés jusqu'au stade de morula Cela peut être comparé à 21 sur 26 témoins ( 80 %) exposés à aucun colorant, c'est-à- dire incubés pendant minutes avec des doses de 10 ial de DPBS seul Lorsque les embryons au stade de morula ont été exposés au colorant, 23 sur les 44 ( 51 %) se sont développés jusqu'au blastocyste Parmi les témoins (DPBS seul), 23 sur 31 -( 74 %) se sont développés jusqu'au blastocyste. EXEMPLE VI On a répété les processus de base de l'exemple I 20 en utilisant le colorant Hoechst N 33258 (solution d'approvisionnement du colorant à 10 og/ml et 20 fig/ml) pour colorer des embryons de souris à une cellule Ces doses étaient de 0,5,1 l et 10,1 l dans 50 Y 1 du volume total milieuembryon-colorant Les embryons ont été colorés en 25 conditions ambiantes pendant une demie heure avant de les examiner Les pronucléi et les corps polaires sont devenus fluorescents et ont été identifiés positivement en utilisant une microscopie à la lumière comme à l'exemple I. On a trouvé que la dose de 10 Xl de ce colorant ne provoquait pas systématiquement un excès de coloration ou une coloration du fond. EXEMPLE VII Des spermatozoïdes bovins ont été colorés avec le colorant Hoechst n 33342 afin de déterminer la mobilité des 35 spermatozoïdes ainsi que les motifs de poursuite De la semence de taureau fraichement éjaculé a été lavéeavec DPBS et soumise à centrifugation La boulette résultante a été mise en suspension dans un milieu TALP et exposée à une solution d'approvisionnement du colorant Hoechst n 33342 à une concentration de 20,lg/ml à une dose de 3 t 1/50 U 1 Le mélange milieu-sperme-colorant a été incubé pendant 15 minutes à 39 C et on l'a observé. A la suite de la coloration, les spermatozoïdes en fluorescence ont été visualisés en utilisant le système fluorescent de Nikon décrit à l'exemple I Une caméra dans le système optique du microscope a été utilisée pour prendre des photographies en couleur de l'écoulement de temps à des expositions comprises entre environ 10 et 20 secondes Les voies produites par 1 'ADN fluorescent sur les photographies développées ont été analysées en ce qui concerne l'allure et le motif de la mobilité des spermatozoïdes Le processus a été répété avec addition de complexes cumulus-ovocyte au milieu et la photographie résultante a été analysée pour l'effet de ces cellules sur le taux et le motif de mobilité des spermatozoïdes. EXEMPLE VIII 20 Cet exemple a été entrepris pour observer la division des embryons porcins de divers stades Les embryons ont été obtenus des voies reproductrices de truies superovulées 48-120 heures après l'oestrus Les voies reproductrices 25 ont été récupérées après abattage et ont été rincées en laboratoire pour retirer les embryons Les embryons récupérés étaient compris entre une cellule ( 48 heures) et embryons au stade morula à plusieurs cellules ( 120 heures) A la suite de deux lavages dans une solution DPBS-BSA, les embryons ont été soit mis en culture dans le milieu Whitten (témoin)soit colorés puis mis en culture dans le milieu Whitten. La solution d'approvisionnement du Colorant à une concentration de 60 g/ml du colorant Hoechst n 33342 a été 35 utilisée pour cet exemple Les embryons ont été incubés pendant une heure à 39 C dans 1, 5 ou 10 i de la solution du 25502 I colorant pour 50, Ul Cela a été suivi de trois lavages de 30 minutes dans DPBS propre ( 1,5 mg/BSA/ml) Les embryons lavés ont été mis en culture pendant 24 heures dans le milieu Whitten ( 1,5 mg/BSA/ml) puis on a évalué leur développement (accomplissement de la division) Les résultats sont montrés au tableau I. TABLEAU I Stade Dose i,U Témoin ai o,1 1 ou 2 Cellules 4 Cellules Multicellaire 6/12 ( 50 %) 28/36 ( 77 %) 2/14 ( 14 %) 17/27 ( 62 %)14/37 ( 37 %) 1/12 ( 8 3 %) _ _ /16 ( 94 %) 13/23 ( 56 %) 25502 8 R E V E N D I C A T I O N S 1.Procédé de coloration de l'ADN de cellules vivantes demasmmifères choisies dans le groupe consistant en cellules de germe, oeufs fertilisés à une cellule et cellules d'embryon pré-implantation caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) mettre lesdites cellules en contact avec un colorant fluorescent, et (b) incuber jusqu'à ce que ledit ADN soit fluorescent lorsqu'il est exposé à de la lumière ultra10 violette. 2 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules ou oeufs sont-en milieu de culture. 3 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le colorant fluorescent est choisi dans le groupe 15 consistant en DAPI, DI Pl et composés de bis-benzimidazole. 4 Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le colorant est utilisé en solution. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la dose du colorant est comprise entre environ O,014 'g et environ 1011 g pour 50/j 1 de la culture contenant les cellules de mammifères. 6 Cellule de mammifères choisie dans le groupe consistant en ovules, oeufs fertilisés à une cellule et cellules d'embryon pré-implantation, caractérisée en ce que son ADN est coloré selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1, 3, 4 ou 5. 7 Procédé de coloration des pronucléi dans des cellules pronucléaires mammifères vivantes caractérisé en ce qu'il consiste a: (a) mettre les cellules pronuclaires mammifères vivantes en contact avec un colorant fluorescent, et (b) incuber jusqu'à ce que les pronuclei soient fluorescents. 255021 8 8.Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que les cellules pronucléaires mammifères vivantes sont des oeufs fertilisés à une cellule de bovin ou de porcin. 9 Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que les cellules sont en milieu de culture. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le colorant fluorescent est choisi dans le groupe consistant en DAPI, DI Pl et composé de bis-benzi10 midazole, ledit colorant étant en solution. 11 Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la dose du colorant est comprise entre environ 0,001 o Ug et environ 10,lg pour 50/i 1 d'une goutte de culture contenant les cellules pronucléaires. 12 Cellule pronuclêaire mammifère vivante caractérisée en ce que son pronucleus est coloré selon le procédé de la revendication 7 13 Procédé pour enlever la matière génétique d'un ovule vivant de mammifère d'un oeuf fertilisé à une cellule 20 ou d'une cellule d'embryon pré- implantation caractérisé en ce qu'il consiste a: (a) mettre les cellules ou oeufs vivants en suspension dans un milieu, (b) mettre la suspension en contact avec un colorant 25 fluorescent, (c) incuber jusqu'à ce que la matière génétique soit fluorescente lors d'un éclairement avec de la lumière ultraviolette, et (d) retirer la matière génétique des celiules en utili30 sant des techniques de micromanipulation. 14 Matière génétique caractérisée en ce qu'ellea été isolée par le procédé selon la revendication 13. Procédé de transfert d'une matière génétique dans un pronucléus d'une cellule pronucléaire mammifère vivante 35 caractérisé en ce qu'il consiste a: 255 921 8 (a) mettre ladite cellule en contact avec un colorant fluorescent (b) incuber jusqu'à ce que les pronucléis soient fluorescents, et (c) transférer la matière génétique souhaitée dans un pronucléus d'une cellule pronucléaire par les techniques de micromanipulation. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 15 caractérisé en ce que les cellules pronucléaires 10 sont des oeufs fertilisés à une cellule de bovin ou de porcin. 17 Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que les cellules sont dans un milieu de culture. 18 Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 13 ou 15 caractérisé en ce que le colorant est choisi dans le groupe consistant en DAPI, DI Pl et composésde bis-benzimidazole. 19 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que le colorant est en solution. 20 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en que la dose du colorant est comprise entre environ 0,001 g et environ 10 i Lg pour 50 Al d'une goutte de culture contenant la cellule. 21 Cellule vivante mammifère génétiquement modifiée 25 caractérisée en ce qu'une matière génétique est insérée par le procédé de la revendication 15. 22 Cellule vivante ou clone caractérisée en ce qu'il est dérivé de la cellule selon l'une quelconque des revendications 6, 12 ou 21. 23 Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la matière génétique est isolée par les étapes de: (a) mettre la cellule contenant la matière génétique en contact avec un colorant fluorescent (b) incuber jusqu'à ce que la matière génétique soit 35 fluorescente et (c) retirer la matière génétique de la cellule par des techniques de micromanipulation. 255 f 121 8 24.Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que le colorant choisi dans le groupe consistant en DAPI, DI Pl et composésde bis-benzimidazole, le colorant étant en solution, et la dose du colorant étant comprise entre environ 0,001 g et environ 10 i g pour 50 1 de culture contenant la cellule contenant la matière génétique. ADN mammifère fluorescent dans les cellules mammifère vivantes choisies dans le groupe consistant en ovules,oeuf fertilisésà une cellule et cellulesd'embryon 10 pré-implantation caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé consistant à: (a) mettre les cellules en conctact avec un colorant fluorescent et (b) incuber jusqu'à ce que l'ADN soit fluorescent lorsqu'il est exposé à de la lumière ultraviolette. 26 ADN selon la revendication 25 caractérisé en ce que les cellules mamifères vivantes utilisées pour préparer l'ADN fluorescent sont des oeufs fertilisés à une cellule de bovin ou de porcin et l'ADN fluorescent comprend les 20 pronucléi des cellules. 27 ADN selon la revendication 25 caractérisé en ce que le colorant fluorescent est choisi dans le groupe consistant en DAPI, DI Pl et composé de bis-benzimidazole, le colorant étant utilisé en solution et la dose du colorant est comprise entre environ O,001 j 1 g et entre environ 10 og pour 50 i 1 l de la culture contenant les cellules. 28 Procédé de production d'une représentation photographique du mouvement des spermatozoïdes et d'un 30 motif de poursuite caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) mettre les cellules de spermatozoïdes en contact avec un colorant fluorescent, (b) incuber jusqu'à ce que l'ADN des têtes des spermatozoïdes soit fluorescent lors d'une exposition à de la lumière ultraviolette, et (c) préparer une photographie d'écoulement de temps du spermatozoïde fluorescent. 29 Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce que le colorant fluorescent est choisi dans le groupe consistant en DAPI, DI Pl et composésde bis-benzimidazole, il est en solution et sa dose est comprise entre environ 0,0011/g et environ o 10,g pour 50 Pl de semence, de semence étendue ou d'une suspension semence-milieu de culture. Procédé pour la détermination comparative de la mobilité des spermatozoïdes et du motif de poursuite caractérisé en ce qu'il consiste à étudier une représentation 10 photographique faite par le procédé selon la revendication 28 afin de déterminer les aspects qualitatifs ou quantitatifs dudit motif.