Brevet FR2548671A1 — publié le 19850111

Procédé de préparation de globine à partir d'hémoglobine et globine obtenue par ce procédé La présente invention a trait à un nouveau procédé de préparation de globine à partir d'hémoglobine ainsi qu'à la globine obtenue par ce procédé. Les travaux de Anson et Mirsky (J Gen. Physiol 13,469-476) publiés en 1930 ont montré qu'il est possible de séparer le pigment de l'hémoglobine (hème) par la technique dite à l'acétone acide On a ainsi déjà 10 transformé en globine différentes hémoglobines humaines ou animales Deux variantes de ce procédé sont généralement utilisées à l'échelle du laboratoire, toutes deux basées sur la faible affinité de l'hème pour la globine à p H acide. L'un des procédés est la méthode à l'acétone acide (voir par exemple ROSSI-FANELLI et coll ( 1958) Biophys Bioch Acta 30, 608-615 Ce procédé consiste à ajouter un volume d'hémoglobine à 30 g/l à 20 à 30 volumes d'acétone à -20 C contenant 3 ml d'H Cl 2 N par litre, à agiter à -20 C puis centrifuger, le précipité de globine étant redissous en eau et dialysé contre de l'eau distillée. Cette solution de globine n'est stable que lorsque son p H reste acide de sorte qu'il a été proposé (STRUMIA et coll J of Lab and Clin Medicine, 37,6 959-968 en 1951) une hydrolyse douce de la globine à un p H alcalin permettant de rendre la molécule soluble à p H neutre. Le deuxième procédé est le procédé à la buta10 none-acide selon TEALE 1959 Bioch Biophys Acta 35,543. La substitution de l'acétone par la butanone, peu soluble dans l'eau, permet une séparation rapide en deux phases de l'hème (phase cétonique) et de la globine (phase aqueuse). Ces deux procédés ne se prêtent cependant pas à une application industrielle en raison des volumes considérables de solvants organiques qu'il faudrait employer et des risques d'accidents que cela entratne En outre la globine finale obtenue contient des quantités non négli20 geables de résidus chimiques dangereux pour son utilisation alimentaire, dans le cas de la globine animale, ou thérapeutique, dans le cas de la globine humaine. S, jt? En conséquence, on a déjà proposé un certain nombre d'autres procédés dans le but d'obtenir des glo25 bines d'origine animale pour des applications alimentaires La demande de brevet japonais 55 008261 déposée le 29 janvier 1980 par Y SATO et S- HAYAKAWA propose une adsorption sélective du pigment de l'hémoglobine à p H acide avec de la CM cellulose Ce procédé évite l'utilisation d'alcool et de solvants mais présente l'inconvénient de ne-pas décolorer suffisamment l'hémoglobine pour des applications thérapeutiques, en raison de la toxicité de l'hème. Le brevet soviétique NI 25 44365/28-13 du 8 août 1977 déposé par K A LOBUNETS décrit une préparation de globine à usage thérapeutique à partir d'un hémolysat de globules rouges humains Il s'agit d'un traitement utilisant l'eau oxygénée à chaud, ce qui présente l'inconvénient de gravement dénaturer la protéine. Dans 3 demandes de brevets déposées en Suede N 67 407882-5 du 14 juin 1974, N 75 13987-3 du 11 Décembre 1975 et 10 N 80 02591-9 du 3 avril 1980 P.G LINDROOS propose différents traitements en solution alcoolique à p H acide En fonction de la nature et de la concentration des sels ajoutés, la globine précipite ou reste en solution de manière sélective et est séparée des 15 pigments L'addition d'imidazole ou de molécules apparentées facilite cette séparation Cependant dans tous les cas, la globine obtenue est trop riche en pigments pour être utilisable en thérapeutique. Les procédés voisins proposés par P ESPENAN dans le brevet français N 81 09890 du 14 mai 1981 ou par J.H LUIJERINK dans le brevet britannique N 1 977 278 du 22 décembre 1978 présentent les mêmes inconvénients. Or, il serait très intéressant de pouvoir disposer de quantités importantes de globine parfaitement 25 dépigmentée et non dénaturée, en particulier pour l'utilisation thérapeutique en tant que substitut du plasma, comme cela a déjà été dit dans: SAMPLE et coll The J of Lab and Clin Medicine ( 1952), ,2 206-210 STRUMIA et coll The J of Lab and Clin Medicine ( 1952), ,2 211-222. La présente invention se propose donc de remédier à ces inconvénients et de fournir un nouveau procédé de préparation de globine à partir d'hémoglobine qui per35 mette dans des conditions industrielles, d'obtenir, de façon économique, une globine extrêmement purifiée et peu ou pas dénaturée. C'est en particulier un objet de l'invention que de fournir un tel procédé permettant la fabrication industrielle de globines utilisables en thérapeutique. Un autre objectif est de fournir un procédé qui soit utilisable pour l'obtention de globine à partir d'hémoglobine provenant de sources très différentes pouvant être notamment: sang hémolysé placentaire humain; autre sang hémolysé humain; banques du sang; sang animal en provenance d'abattoirs. Un autre objectif est de permettre de réaliser 15 des globines alimentaires à partir d'hémoglobines animales. L'hémoglobine à traiter peut se présenter sous forme native (par exemple culots globulaires hémolysés), sous forme purifiée non dénaturée (par exemple par 20 chromatographie par échange d'anions d'un sang placentaire clarifié), ou encore sous forme de précipité dénaturé (par exemple par précipitation sélective au chloroforme ou au caprylate de sodium voir LIAUTAUD et coll Developments in Biological Standardization Vol 27 25 1974 pages 107-114; ou bien STEINBUCH et coll Revue Franç études chim et Biol 1969, XIV, 10, pages 1054-1058). L'invention a pour objet un procédé de préparation de globine à partir d'hémoglobine caractérisé en 30 ce que l'on adsorbe sur le charbon actif une solution alcoolique d'hémoglobine à p H acide. De façon surprenante le charbon actif, alors qu'il est connu pour adsorber fortement les protéines, fixe l'hème et n'adsorbe pas la globine Le rendement en 35 globine est proche de 100 %. De préférence, la concentration d'alcool, tel que par exemple de l'éthanol ou du méthanol, est d'au moins 40 % et de préférence de 75 à 80 %. Dans le cas o l'hémoglobine est disponible sous forme d'un précipité, il est avantageux de la reprendre en solution à environ 10 % (poids/volume) La reprise peut par exemple s'effectuer par addition d'eau ( 20 % du volume total), acidification par H Cl 3 N puis addition des 80 % d'éthanol. De préférence, le p H acide est inférieur à 4 en étant de préférence supérieur à 2, par exemple voisin de 3 Lorsque le p H augmente, notamment au delà de 4, le charbon actif commence à adsorber des quantités non négligeables de protéines De même pour des p H trop acides, 15 le taux de protéines r Scupérées baisse, une dénaturation de la globine étant également à craindre. Le choix du charbon actif s'effectue en mesurant le pouvoir de décoloration de l'hémoglobine Ce pouvoir est estimé dans le rapport R = D O 280 nm/D O. 20 403 nm Ce rapport est de 0,26 pour l'hémoglobine non dépigmentée Les charbons actifs en poudre sont particulièrement préférés et le tableau apparaissant dans la description fournira les exemples des charbons commerciaux actuellement disponibles qui donnent de très bons 25 résultats. De preférence, on utilise une quantité de charbon actif optimale aussi faible que possible pour minimiser les manipulations Le rapport du poids de charbon par rapport au poids d'hémoglobine varie selon que l'hémoglobine est à l'état natif en solution ou dénaturé sous forme de précipité Il augmente dans ce dernier cas et peut être par exemple de l'ordre de 3 g de charbon pour 10 g de précipité d'hémoglobine. Le temps de contact est de préférence de l'ordre de 15 heures Ce temps peut grandement varier et est déterminé notamment par des considérations industrielles de production ainsi que de taille et de nombre de cuves. La force ionique est ajustée à une valeur assez faible, par exemple inférieure à Na Cl 0,03 M. La température n'est de préférence pas supérieure à 20 C afin d'éviter les-vapeurs d'alcool pour des raisons de sécurité. De façon particulièrement avantageuse, on peut 10 procéder à une agitation pendant toute la période de contact, l'agitation augmentant sensiblement le rendement. L'invention a également trait aux globines industrielles purifiées obtenues L'indice de décoloration D.0 280 nm/D O 403 nm peut être supérieur à 10 et la globine humaine est apte aux applications thérapeutiques. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1 Un précipité d'hémoglobine dénaturée est obtenu à partir de sang hémolysé placentaire par précipitation au chloroforme Le précipité est repris par addition d'eau ( 20 % du volume total), puis acidification par H Cl 3 N, après quoi on ajoute l'éthanol nécessaire pour obte25 nir une concentration à 80 % Le volume le plus faible pour obtenir la redissolution correspond à une reprise à % (poids/volume); c'est ce volume qui est préféré puisqu'il entraîne la plus faible consommation d'alcool. La fraction insoluble est d'environ 33 % du précipité initial (dans le cas d'un précipité au caprylate de sodium, le taux de reprise est de 6 % et la fraction insoluble restante de 25 % du précipité initial). Le p H de la solution d'hémoglobine est ajusté à 3,3. Le charbon actif choisi est le charbon type L 4 S préparé par la société de nationalité française CECA. On ajoute à la solution d'hémoglobine à 20 C le charbon actif à raison de 3 g pour 10 g de précipité d'hémoglobine initial ( 3,4 g pour 10 g dans le cas du précipité au caprylate). Le mélange effectué dans une cuve, est agité en continu pendant 15 heures, le p H apparent étant de 3,3. 10 On évacue ensuite le charbon par centrifugation La solution alcoolique de globine qui forme le surnageant est ensuite diluée dans un volume égal d'eau et neutralisée par addition de soude N Après précipitation et récupération du précipité de globine par centrifuga15 tion ou filtration, on note que le liquide obtenu est parfaitement limpide et incolore et se prête parfaitement aux opérations de recyclage de l'alcool par distillation. Le précipité de globine peut être ensuite transformé en solution de globine parfaitement décolorée des par/procédés déjà connus. Exemple 2 A partir d'une source purifiée d'hémoglobine, par exemple de l'hémoglobine de sang hémolysé placentaire dont on a extrait les immunoglobulines, l'albumine et éventuellement d'autres composants plasmatiques, ou encore à partir d'une solution d'hémoglobine obtenue par lyse d'un culot, on effectue une reprise de l'hémoglobine dans un mélange éthanol-acide de façon qu'en fin d'addition le taux d'éthanol soit de 80 % et le p H apparent de 30 3,1 Aucun précipité n'apparalt et la solution d'hémoglobine est parfaitement limpide. On ajoute à la solution 0,2 % en poids/volume de charbon actif L 4 S On agite le mélange pendant 15 heures à une température de 20 C On élimine ensuite le charbon actif par filtration, par exemple à l'aide de terre filtrante ou encore par centrifugation. La solution alcoolique de globine acide qui apparaît est complètement décolorée Elle est ensuite diluée avec un volume égal d'eau et neutralisée par addition de soude normale Après précipitation et récupération du précipité de globine par centrifugation ou filtration, on constate que le liquide obtenu est parfaitement limpide et incolore et se prête parfaitement aux 10 opérations de recyclage de l'alcool par distillation. La globine obtenue est totalement dépigmentée et peut être transformée en dérivés thérapeutiques par des procédés déjà décrits. Comparaison des charbons actifs Les charbons actifs en poudre suivants ont été essayes. 15 20 Dénomination Darco Degussa Ceca Ceca Ceca Propriétés KB E 114 WNCL L 3 S L 45 Teneur en eau % 25 4,5 > 4,5 Surface selon BET m 2/g 1450 750 1200 1200 1400 Indice de mélasse 190 100 80 90 Indice bleu méthylène > 10 20 18 > 20 Taille des 99 % KG E 114 WNCL L 3 S L 45 R = D O 280 nm 13 8,2 6,5 12,7 > 15 D.0 403 nm 15 Le charbon L 4 S apparaît comme le plus indiqué. La quantité de charbon est avantageusement de l'ordre de 3 g pour 10 g de précipité d'hémoglobine et de préférence inférieure à 6 g. A titre d'exemple,une quantité de 10 tonnes de placentas peut fournir: soit environ 2,5 tonnes de précipité d'hémoglobine dénaturée par le chloroforme ou le caprylate de sodium, soit environ 250 kg d'hémoglobine en solution aqueuse. Ces données chiffrées du procédé préférentiel sont résumées dans le tableau final: 10 Quantité initiales 2,5 tonnes 250 kg d'hémode matière première de précipité globine native d'hémoglobine dénaturée Volume d'éthanol nécessaire 30 000 1 30 000 1 Quantité de charbon L 4 S 800 kg 60 kg Décoloration de la globine D.O 280 nm 10 40 D. 0 403 nm Poids de globine obtenu 100 kg 230 kg or REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de globine à partir d'hémoglobine, caractérisé en ce que l'on adsorbe sur le charbon actif une solution alcoolique d'hémoglobine à p H acide. 2) Procédé selon la revendication 1, caractéri E en ce que la concentration en alcool est d'au moins 40 3) Procédé selon la revendication 2, caractérie en ce que la concentration en alcool est de 75 & 80 %. 10 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on utilise de l'éthanol. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le p H est compris 15 entre 2 et 4. 6) Procédé selon la revendication 5, caractéri: en ce que le p H est de l'ordre de 3. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendi- 3 é sé cations 1 à 6, caractérisé en ce que le poids de charbon 20 actif est inférieur à 6 g/10 g de précipité d'hémoglobine. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le poids de charbon est de l'ordre de 3 g/10 g de précipité d'hémoglobine. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le poids de charbon est de l'ordre de 0,2 % (poids/volume) pour une solution d'hémoglobine native. ) Procédé selon l'une quelconque des revendi30 cations 1 à 9, caractérisé en ce que le charbon actif est un charbon en poudre. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on utilise le charbon actif CECA du type L 45. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on agite le mélange pendant l'adsorption. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendi5 cations 1 à 12, caractérisé en ce que l'on sépare ensuite le charbon de la globine par centrifugation ou filtration. 14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'adsorption dure 10 une quinzaine d'heures. ) Globine obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle est dépigmentée, avec un rapport R = D O 280 nm/D O 403 nm supérieur a 10.