Brevet FR2549853A1 — publié le 19850201

La présente invention concerne un nouveau procédé de production de la S- adénosyl-L-homocystéine hydrolase (EC 3311). La S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase (désignée par l'abréviation SA Hase) est une enzyme importante concernant le cycle méthylique actif in vivo, dont on sait qu'elle est impliquée dans la réaction suivante: Sadénosyl-L +H 20 h-mocystéïne adénosine + homocystéine ( 1) homocystéine _H 2010 ' 2 La présence de la SA Hase est connue chez les eucaryotes, animauxvégétaux et levures Un échantillon authentique pur en a été extrait du foie du rat, par exemple, 15 dont on a étudié les-propriétés enzymatiques (voir par exemple les publications Eur J Biochen, 80, 517 ( 1977) et J Biol Chem, 256, 1631 ( 1981)_, mais on pensait qu'elle ne se trouve pas chez les procaryotes tels qu'Escherichia coli, ce qui limitait beaucoup sa disponibilité. Or, au cours de recherches sur la synthèse de la S-adénosyl-Lhomocystéine (que l'on appellera ici SAH) par les procaryotes, la présente demanderesse a trouvé, d'une manière inattendue, que certaines bactéries peuvent synthétiser la SAH à partir d'adénosine (Ad R) et d'homocystéine 25 (Hcy). D'autres recherches ont conduit à la découverte que la SA Hase, dont la présence chez les procaryotes n'était pas jusqu'ici reconnue, se trouve bien en fait chez certains procaryotes, et qu'elle peut être facilement recueillie de 30 leur cellules microbiennes. La présente invention apporte ainsi un procédé de production de la SA Hase selon lequel on cultive un microorganisme pouvant produire cette enzyme au sein de ses cellules dans un milteu nutritif pour accumuler la SA Hase dans les cellules, microorganisme qui est soit une bactérie appartenant au genre Alcaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter, Enterobacter, Rhodopseudomonas, Arobactérium, flicrococcus, Corynebacter'um, Brévibacterium, Chromobacterium, Xanthomonas, Flavobacterium, Ce Tllulomonas, 5 Azotobacter ou Protaminobacter, soit un actinomycête appartenant au genre Streptomyces, Mycobacterium, Nocardia, Strepto Vert'icil Tium, Micromonospora, Micropolyspora, Streptosporangium ou Microellobosp'oria; puis on récupère la SA Hase formée des cellules. Le microorganisme pouvant produire la SA Hase peut être ici tout microorganisme appartenant aux genres cidessus et qui a la capacité d'accumuler l'enzyme dans les cellules, des exemples particuliers de bactéries comprenant À Alc'al'iqe'nes faecalis (IFO 12669), Pseud'omonas Putida (IFO 12966), Ac'ine'tobacter calcoaciticus (IFO 12552), Arthrobacter globiformis (IFO 12137), Enter'obacter cl'oacae (IFO _ _, T T 13535), Rhodopseudomonas sphe'roides (IFO 12203),' Aqrobacterium tumefaciens (IFO 13265), Micrococcus l'u't'eus (IFO 3333), Corne acterium 'fascians (IFO 12077), Brevibacterium 20 protophormiae (IFO 12128), Chr Comobac'ter'ium iodinum (IFO 3558), Xanthomonas campestris (IFO 13303, Flav'obacterium : À À gasogenes (IFO 12065), C'ellul:omo'nas flavigena (IFO 3753), Azotobacter vinelandii (IFO 12018) et Protaminobacter ruber (IFO 3708), tandis que des exemples particuliers d'actino25 mycètes sont Streptomyces hydroscopicus (IFO 3192), Mycobacterium phlei (IFO 3158), Nocardia asteroides (IFO 3424), Strepto Verticillium kentuchense (IFO 12880), Micromonospora coerulea (IFO 13504), Micropolyspora angiospocre (IFO 13155), Streptosporangium roseum (IFO 3776), et Microellobosporia 30 violacea (IFO 12517) Des mutants naturels ou artificiels de tous ces microorganismes peuvent également être employés dans la mesure o ils ont la capacité de donner la SA Hase. Dans l'exécution de cette invention on commence par cultiver le microorganisme produisant la SA Hase, cul35 ture qui peut se faire dans un milieu liquide ou sur une surface solide, mais il est avantageux dans l'industrie d'inoculer le microorganisme à un milieu liquide et de le cultiver par voie aérobie, avec aération et agitation Les sources nutritives pour le milieu de culture peuvent être des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des sources nutritives organiques à l'état de traceret autres, 5 qui sont normalement utilisées dans la culture de microorganismes et qui peuvent être convenablement choisies suivant la nature du microorganisme à cultiver La température de culture peut être également convenablement choisie dans un intervalle dans lequel le microorganisme se multiplie en produisant la SA Hase, mais elle sera ordinairement de 15 à QC, tandis que le p H du milieu est habituellement compris entre 3 et 10, la durée de la culture dépendant aussi de la nature du microorganisme La culture peut être terminée en un temps approprié, quand l'activité de la SA Hase atteint un maximum, et dans le produit de la culture formé l'enzyme est accumulée dans les cellules du microorganisme. Aucune limite particulière n'est imposée au mode d'obtention d'une solution contenant ia SA Hase brute par extraction de l'enzyme du produit de culture obtenu On peut par exemple obtenir une solution contenant la SA Hase brute en soumettant le bouillon de culture à une séparation solide-liquide, éventuellement en mettant les cellules humides ainsi obtenues en suspension dans un tampon au phosphate ou un tampon Tris-H Cl et en extrayant I'enzyme des cellules par un ensemble approprié de moyens de traitement de cellules tels que traitement aux lysozymes, traitement aux ultrasons, traitement à la presse française, broyage avec des perles de verre ou du sable de quartz etc, et lyse avec un agent surfactif. On peut ensuite obtenir la SA Hase purifiée en soumettant la solution ainsi obtenue qui contient l'enzyme brute à des méthodes connues d'isolement et de purification de protéines et d'enzymes. plus particulièrement, les modes d'isolement et de purifi35 cation comprennent le fractionnement au sulfate d'ammonium, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie d'adsorption et la filtration sur gel, et si cela est nécessaire on peut associer ces techniques d'une manière appropriée. La SA Hase ainsi obtenue est une enzyme qui catalyse la réaction représentée par le schéma (I) ci-dessus, et qui est intéressante comme réactif pour des examens cliniques ainsi que pour des travaux de recherche. Les exemples qui suivent illustrent plus particulièrement la présente invention, tous les pourcentages de matières qui sont indiqués dans ces exemples étant des 10 pourcentages pondéraux à moins d'indications contraires. La méthode de détermination de l'activité enzymatique de la SA Hase est la suivante: ( 1) Méthode de détermination de l'activité enzymatique (a.) Activité enzymatique dans la réaction de syn15 thèse de la SAH à partir d'Ad R et d'Hcy On ajoute 10 microlitres d'une solution de l'enzyme à 1 ml d'une solution contenant 5 micromoles d'Ad R, 10 micromoles de DL-Hcy et 50 micromoles de tampon au phosphate à p H 8,0 et on laisse réagir en atmosphère d'azote pendant 20 15 minutes à 37 QC On arrête alors la réaction en ajoutant 0,1 ml d'acide perchlorique à 30 % puis on ajoute au mélange 0,9 ml de tampon au phosphate 0,5 M à p H 7,0, on sépare par centrifugation le précipité formé et on analyse le surnageant par chromatographie en phase liquide à haute effica25 cité (modèle 638-30 de Hitachi Limited; colonne de Cosmocil C 18; éluant: mélange 90/10 en volumes de KH 2 PO 4 0,2 M et de méthanol; détecteur UV à 260 nm) pour déterminer la quantité de SAH produite L'activité enzymatique dans la synthèse de la SAH est exprimée en unités, l'unité étant la quantité 30 de l'enzyme qui est nécessaire pour former 1 micromole de SAH par minute. (b) Activité enzymatique dans la réaction d'hydrolyse de la SAH On fait réagir la SAH avec la SA Hase et on trans35 forme l'Ad R formée en inosine en présence d'un excès d'adénosine désaminase, et on mesure à ce moment la vitesse d'abaissement de l'absorbanxe à 265 nm Plus spécifiquement, on fait réagir à 259 C un mélange de 475 microlitres de tampon au phosphate 10 m M, 10 microlitres de SAH 2,5 m M, 5 microlitres d'adénosine désaminase (type III de Sigma Company) et 10 microlitres d'une solution de l'enzyme et on mesure la vitesse de diminution de l'absorbance à 265 nm à ce moment pour déterminer la quantité de SAH hydrolysée L'activité enzymatique dans l'hydrolyse de la SAH est exprimée en unités, l'unité étant la quantité d'enzyme qui est nécessaire pour hydrolyser 1 micromole de SAH par minute. 10 ( 2) Activité (i) Donne 1 mole de SAH à partir de 1 mole d'Ad R et 1 mole d'Hcy. (ii) Donne 1 mole d'Ad R et 1 mole d'Hcy à partir de 1 mole de $AH et 1 mole d'eau. 15 ( 3) p H optimal On prépare diverses solutions réactionnelles de la même manière que dans la méthode de mesure ( 1) cidessus de l'activité enzymatique, sauf que l'on remplace le tampon au phosphate à p H 8,0 par des tampons d'acétate de sodium à un p H de 3,5 à 5,5, des tampons de phosphate de potassium à un p H de 5,5 à 8,0, des tampons Tris-H Cl chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhan Q 7 à un p H de 8,0 à 9,5, et des tampons au phosphate de sodium à un p H de 9,5 à 12,0. On mesure les activités des solutions respectives, le p H 25 optimal se trouvant ainsi déterminé. ( 4) Stabilité au p H On ajoute la solution d'enzyme aux divers tampons qui sont employés ci-dessus en ( 3) pour déterminer le p H optimal et on garde les mélanges au repos pendant 10 minu30 tes à la température de 37 "C puis on mesure le degré d'activité restante de la SA Hase. ( 5) Stabilité à la chaleur On traite la solution de l'enzyme pendant 10 minutes aux températures respectives de 20, 30, 40, 45, 50, 55 et 35 60 C puis on détermine son activité résiduelle. ( 6) Valeur Km On détermine les valeurs Km pour la SAH, l'Ad R et la DLHcy EXEMPLE i On cultive Alcaligenes faecalis (IFO 12669) à 28 C pendant 24 heures dans un milieu de culture incliné de gélose à p H 7,0, composé de 1 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de peptone, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de K 2 HP 04, Q,2 g/dl de Na Cl, 0,02 g/dl de Mg SO 4 7 H 20 et 2 g/dl de gélose On inocule un oeillet de platine du bouillon de culture à 10 ml d'un milieu liquide thermostérilisé ajusté à p H 7,0, comprenant 1 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de peptone, 10 1 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de K 2 HP 04, 0,2 g/dl de Na Cl et 0,02 g/dl de Mg SO 4 7 H 20 et on cultive à 28 C pendant 24 heures On inocule ensuite le bouillon de culture dans 4 Q fioles de Sakaguchi de 2 litres contenant chacune 500 ml d'un milieu liquide stérilisé à chaud ayant la même 15 composition que celui employé pour obtenir le germe et on cultive pendant 24 heures à 28 C en secouantpuis on centrifuge le bouillon de culture pour obtenir les cellules. On met celles-ci en suspension dans 400 ml d'un tampon au phosphate de potassium 0,02 M à p H 7,5 contenant 20 O Q,5 m M de dithiothreitol et on traite la suspension aux ultrasons pour extraire la SA Hase, on sépare les matières insolubles par centrifugation puis on ajoute au surnageant du sulfate d'ammonium à 40 % de la saturation et on sépare également par centrifugation le précipité formé On ajoute 25 encore du sulfate de sodium au surnageant pour que la concentration finale soit à 60 % de la saturation et on dissout le précipité obtenu contenant la SA Hase dans 100 ml de tampon au phosphate 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiotreitol, puis on dialyse la solution contre un tampon Tris-H Cl 0, 01 M 30 à p H 7,4 contenant 0,5 m M de dithiothreitol On fait passer le dialysat sur une colonne de DEAE-Sephacell (de Pharmacia Company, diamètre 5 cm, longueur 40 cm) qui a été équilibrée avec un tampon Tris-H Cl 0,01 M contenant 0,5 m M de dithiothreitol pour y faire adsorber la SA Hase, on lave ensuite la co35 lonne avec le même tampon puis on élue l'enzyme avec un gradient de concentration entre ce même tamponet une solution de chlorure de sodium 0,5 M dans le même tampon en élevant progressivement la concentration du chlorure de sodium On réunit les fractions actives de l'enzyme éluée et on dissout celles qui donnent un précipité avec du sulfate de sodium à 45-50 % dans 10 ml de tampon au- phosphate 5 de potassium 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol, et on filtre la solution sur gel, sur une colonne de Sephadex G 200 (Pharmacia Company) équilibrée avec le même tampon On réunit les fractions actives de SA Hase et on dissout de nouveau celles qui donnent un précipité avec du sulfate d'ammonium à 40-55 % dans 8 ml de tampon au phosphate de potassium 0,01 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol et du Na Cl 4 M, et on laisse reposer la solution pendant une nuit à la température de 5 C pour faire cristalliser la SA Hase On sépare les cristaux par centrifu15 gation, on les redissout dans le même tampon et on ajoute du sulfate d'ammonium à 40 % de la saturation pour recristalliser l'enzyme, ce qui donne 60 mg de SA Hase ayant une activité spécifique dans la synthèsede la SAH de 2,81 U/mg et une activité spécifique d'hydrolyse de la SAH de 0,54 U/mg, 20 avec un rendement de 13,1 % à partir du bouillon de culture. Le p H optimal de l'enzyme, pour les réactions de synthèse et d'hydrolyse de la SAH, est de 8,0 à 10,0, sa stabilité au p H est comprise entre 6,5 et 10,0 et sa stabilité à la chaleur ne dépasse pas 45 C Les valeurs Km de la SAH, de 25 l'Ad R et de la DL-Hcy sont respectivement de 10 pi I, 37 p M et 0,93 m M Son point isoélectrique est 4,7. EXEMPLE 2 On cultive Streptomyces hygroscopicus (IFO 3192) pendant 48 heures à 28 C dans un milieu incliné de gélose 30 à p H 7,0 composé de 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de viande, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de Na Cl et 2 g/dl de gélose On inocule ensuite un oeillet de platine du bouillon de culture dans 10 ml d'un milieu liquide thermostérilisé ajusté à p H 7,0, comprenant 1 g/dl de pep35 tone, 0,5 g/dl d'extrait de viande, 0,1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g/dl de Na Ci et on cultive pendant 48 heures à 28 C, puis on inocule le bouillon dans 30 fioles de 2549853 ' Sakaguchi de 2 litres contenant chacune 500 ml d'un milieu liquide stérilisé à chaud ayant la même composition que celui ayant servi à obtenir le germe, on cultive pendant 48 heures à 28 C tout en secouant puis on filtre le bouillon pour obtenir les cellules. On met les cellules en suspension dans 150 ml de tampon au phosphate de potassium 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol, on traite la suspension avec des perles de verre pour broyer les cellules et on sépare les matières insolubles par centrifugation, on ajoute au surnageant du sulfate d'ammonium à 40 % de la saturation et on sépare par centrifugation le précipité formé On ajoute de nouveau du sulfate d'ammonium au surnageant pour que la concentration finale soit à 60 % de la saturation, ce qui fait 15 précipiter la SA Hase, précipité que l'on dissout dans 45 ml de tampon au phosphate 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol, et on dialyse la solution contre un tampon Tris-H Cl 0,01 M contenant 0,5 m M de dithiothreitol On fait passer le dialysat sur une colonne de DEAEcellulose (dia20 mètre 3 cm, longueur 30 cm) qui a été équilibrée avec un tampon Tris-H Cl 0,0 i 1 M contenant 0,5 m M de dithiothreitol pour y faire adsorber l'enzyme, on lave la colonne avec le même tampon puis on élue l'enzyme avec un gradient de concentration entre ce même tampon et une solution de chlorure 25 de sodium 0,5 M dans le même tampon en élevant progressivement la concentration du chlorure de sodium On réunit les fractions actives de la SA Hase éluée et on dissout celles qui donnent un précipité avec du sulfate d'ammonium à 45-55 % de saturation dans 5 ml de tampon au phosphate de potassium 30 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol, on filtre la solution sur gel sur une colonne de Sephadex G-200 équilibrée avec le même tampon, on rassemble les fractions actives de SA Hase, on les concentre sur une membrane d'ultrafiltration (membrane Diaflo XM-50 de Amicon) et en les lyo35 philisant on obtient 11 mg de l'enzyme. Cet échantillon a une activité spécifique dans la synthèse de la SAH de 1, 35 U/mg et une activité spécifique d'hydrolyse de la SAH de 0,18 U/mg, avec un rendement de 26,3 % à partir du bouillon de culture, et S es autres caractéristiques enzymatiques sont à peu près équivalentes à celles de l'échantillon obtenu à l'exemple 1. EXEMPLE 3 On obtient des cellules par la même méthode que dans l'exemple 1 précédent mais avec chacune des bactéries qui sont indiquées au tableau 1 ci-après, et une seule fiole de Sakaguchi Les cellules ainsi cultivées et récupérées sont mises en suspension dans 10 ml d'un tampon au phosphate de potassium 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 m M de dithiothreitol, on traite la suspension aux ultrasons et on la centrifuge puis on détermine l'activité spécifique de la SA Hase ainsi obtenue Les résultats sont groupés dans le tableau 1. En purifiant le surnageant ci-dessus de la même mni ère qu'à l'exemple 1 on a pu isoler une SA Hase ayant dans une large mesure les mêmes caractéristiques enzymatiques que celle qui a été obtenue à l'exemple 1. 2549853 ' 10 Tableau 1 b Microorganisme Activité spécifique (U/ml) Synthèse de Hydrolysela SAH de la SAH Pseudomonas putida (IFO 12996) 0,53 0,030 Acinetobacter calcoaceticus (IFO 12552) 0,37 0,020 Arthrobacter globiformis (IFO 12137) 0,15 0,014 Enterobacter cloacae (IFO 13535) 0,09 0,014 Rhodopseudomonas spheroides (IFO 12203) 0,08 0,010 Agrobacterium tumefaciens (IFO 13265) 0, 18 0,010 Micrococcus luteus (IFO 3333) 0,20 0,012 Corynebacterium faciens (IFO 12077) 0,09 0,011 Brevibactrium protophormiae (IFO 12128) 0,15 0,027 Chromobacterium-iodinum (IFO 3558) 0,30 0,019 Xanthomonas campestris (IFO 13303) 0,14 0,011 Flavobacterium gasogenes (IFO 12065) 0,08 0,017 Cellulomonas'flavigena (IFO 3753) 0,08 0,016 Azotobacter vinelandii (IFO 12018) 0,17 0,020 Protaminobacter ruber (IFO 3708) 0,16 0,013 _ L EXEMPLE 4 On a obtenu des cellules par la même méthode que dans l'exemple 2 précédent, mais avec chacun des actinomycètes du tableau 2 ci-après et en utilisant une seule fiole de Sakaguchi Les cellules ainsi cultivées et récupérées sont mises en suspension dans 8 ml d'un tampon au phosphate de potassium 0,02 M à p H 7,5 contenant 0,5 M de dithiothreitol, on traite la suspension avec des perles de verre pour broyer les cellules puis on sépare par cen1 Q trifugation les matières insolubles et on détermine l'activité spécifique de l'enzyme dans le liquide surnageant, les résultats obtenus étant donnés au tableau 2. En purifiant le surnageant de la même manière que dans l'exemple 2 on a pu isoler une SA Hase ayant dans une 15 large mesure les mêmes propriétés enzymatiques que celle qui a été obtenue à l'exemple 1. Tableau 2 Microorganisme Activité spécifique (U/ml) Synthèse de Hydrolyse la SAH de la SAH Mycobacterium phlei (IFO 3158) 0,29 0,025 Nocardia asteroides (IFO 3424) 0,09 0,009 Streptoverticillium kentuchense (IFO 12880) 0,18 0,011 Micromonospora coerulea (IFO 13504) 0,10 0,010 Micropolyspora angiospora (IFO 13155) 0,21 0,018 Streptosporangium roseum (IFO 3776) 0,17 0,009 Microellobosporia violacea (IFO 12517) 0,16 0,012 2549853 1 REVENDICATIONS 1 Une méthode de production de la S-adénosyl-Lhomocystéine hydrolase, selon laquelle on cultive un micro5 organisme pouvant produire cette enzyme au sein de ses cellules dans un milieu nutritif pour accumuler l'hydrolase dans les cellules, microorganisme qui est soit une bactérie appartenant au genre Alcaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter, Enterobacterl Rhodopseudomonas, Agrobacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Chromobacterium, Xanthomonas, Flavobacterium, Cellulomonas, Azotobacter ou Protaminobacter, soit un actinomycète appartenant au genre Streptomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptoverticillium, Micromonospora, Micropolyspcora, Strepto:sporangium ou Microe15 llobosporia; puis on récupère la S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase des cellules. 2 Méthode selon la revendication 1 dans laquelle la culture est effectuée à une température de 15 à 50 C et un p H de 3 à 10. 3 Méthode selon la revendication I dans laquelle la culture est effectuée par voie aérobie dans un milieu liquide. 4 Méthode selon la revendication 1 dans laquelle le microorganisme est une bactérie. 5 Méthode selon la revendication 1 dans laquelle la bactérie appartient au genre Alcaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter ou Chromobacterium. 6 Méthode selon la revendication 1 dans laquelle le microorganisme est un actinomycète. 7 Méthode selon la revendication 1 dans laquelle l'actinomycète appartient au genre Streptomyces, Mycobacterium ou Micropolyspora.