Brevet FR2557977A1 — publié le 19850712

APPAREIL POUR ELIMINER UNE INTERFERENCE DE BRUIT DE FOND DANS DES MESURES DE FLUORESCENCE. L'invention concerne d'une façon géenérale la cy- tométrie de débit à plusieurs faisceaux lasers et, plus particulièrement, des structures destinées à éliminer une interférence de bruit de fond dans des mesures de fluorescence faites en utilisant un cytomètre de débit à plusieurs faisceaux lasers. Cette invention est le ré- sultat d'un contrat avec "Department of Energy" (Dépar- tement de l'Energie) (contrat n W-7405-ENG-36)o Dans un cytomètre de débit à plusieurs faisceaux lasers, les cellules biologiques sont teintées avec des colorants fluorescents et elles passent, en suspension dans un liquide, dans une chambre de passage o les cel- lules sont séparées et alignées pour une mesure. Quand elles passent dans la chambre de passage, les cellules traversent séquentiellement des faisceaux lasers séparés dans l'espace. Chaque faisceau laser excite un fluoro- chrome (colorant fluorescent) différent lié à un compo- sant spécifique de la cellule. Les mesures de la fluo- rescence effectuées sur les fluorochromes fournissent des informations quantitatives sur les composants de cellule auxquels le colorant est lié. Des cytomètres de débit peuvent mesurer des propriétés cellulaires telles que la grosseur des cellules, la teneur en ADN, la teneur en protéines et la perméabilité de membrane cellulaire. Ils peuvent également mesurer les antigènes cellulaires, et la forme, la grosseur et la teneur en ADN de chromosomes séparés. La cytométrie de débit à plusieurs faisceaux la- sers est décrite dans un certain nombre d'articles: J.A. Steinkamp, D.A. Orlicky, H.A.Crissman, "Dual-Laser Flow Cytometry of Single Marmmalian Cells", paru dans la revue J.Histochem. Cytochem. 27, 273 (1979);J.A. Steinkamp, C.C. Stewart, H.A. Crissman, "Three-Color Fluorescence Mea- surements on Single Cells Excited at Three Laser Wave- lengths", paru dans la revue Cytometry, 2, 226 (1982). La cytométrie de débit à plusieurs faisceaux la- sers a conduit à des capacités de mesure améliorées pour analyser des cellules teintées avec plusieurs fluorochro- mes. Une simple excitation par faisceau laser des cellu- les teintées avec deux fluorochromes nécessite un choix de combinaisons de colorants tel que les deux colorants puissent être excités simultanément à une longueur d'on- de de faisceau laser et qu'il y ait un recouvrement spec- tral minimal d'émission de fluorescence. Ces problèmes spectraux ont été grandement réduits par le développement de la cytométrie de débit à double faisceau laser, dans laquelle deux faisceaux lasers indépendants coupent le courant d'échantillon s'écoulant à différents emplace- ments le long du courant. Cette technique fonctionne bien pour des couleurs fluorescentes qui ont des longueurs d'onde d'excitation différentes d'une façon marquée, bien que les spectres d'émission puissent se recouvrir complè- tement. La clef de cette technique se trouve dans la ré- solution spatiale et temporelle des mesures faites à par- tir des faisceaux lasers séparés. La cytométrie de débit à plusieurs faisceaux la- sers fonctionne bien tant que les signaux de fluorescence provenant des cellules sont raisonnablement brillants et que les intensités de fluorescence dans chaque canal de mesure sont à peu près égales. Cependant, dans le cas de cellules o un des canaux de mesure détecte une fluores- cence très faible, telle qu'une immunofluorescence, un bruit de fond important est présent dans le canal faible en raison d'une fuite de lumière laser dispersée à partir du faisceau laser de canal plus brillant. Fréquemment, la longueur d'onde de l'autre faisceau laser recouvre le spectre d'émission de fluorescence faible et contribue ainsi à la production d'un bruit de fond facilement dé- tecté. Des filtres de blocage de lumière laser peuvent réduire cette fuite de lumière laser mais ils réduisent simultanément le signal faible voulu. Une interférence de fuite de lumière laser est un problème particulière- ment difficile à résoudre dans les mesures de chromosomes par double faisceau laser. La fluorescence provenant des chromosomes teintés est faible et, dans certains cas, la fluorescence provenant de chromosomes plus petits est si faible qu'il devient important de faire des statistiques de comptage de photons. Dans une analyse de chromosomes par double faisceau laser, une interférence de fuite à partir de deux faisceaux lasers peut devenir importante. L'utilisation de filtres de blocage de lumière laser pour réduire une fuite de lumière laser est bien connue, mais elle ne résoud pas le problème de détection d'une fluorescence faible dans un cytomètre de débit à plusieurs faisceaux lasers. Le brevet des E.U.A. n 4 198 567 de Eneroth et al. définit un procédé et un appareil pour mesurer de petites quantités d'une substan- ce fluorescente. L'échantillon est excité avec une impul- sion de radiation et un signal de sortie de détecteur de radiation de fluorescence est transmis d'une manière con- ditionnelle telle que la détection de la fluorescence est retardée jusqu'à un moment après que l'impulsion de radia- tion d'excitation ait été amortie jusqu'à un point o le signal d'émission de fluorescence est distinctement supé- rieur au signal de radiation dispersée. Eneroth et al.ne met pas en oeuvre un cytomètre de débit à plusieurs fais- ceaux lasers. Le brevet des E.U.A. n 4 243 318 de St6hr définit un procédé pour n'évaluer que les impulsions fluorescen- tes qui correspondent au temps de déplacement des parti- cules biologiques teintées,séparées entre les deux points coupés par deux faisceaux lasers. Le problème abordé par St8hr était la nécessité d'utiliser différents colorants fluorescents pour 1'ADN et une protéine. Un but de la présente invention est de fournir un appareil qui élimine le bruit de fond dû à une interfé- rence de fuite à partir de faisceaux lasers dans un cy- tomètre de débit à plusieurs faisceaux lasers. Un autre but de l'invention est de fournir un ap- pareil pour engendrer et supprimer d'une manière contra- lée les faisceaux lasers dans un cytomètre de débit à plusieurs faisceaux lasers. Un autre but encore de l'invention est de détec- ter une fluorescence faible. Un autre but de l'invention est de faire des me- sures de fluorescence de chromosomes précises. Pour atteindre ces buts et d'autres de la présen- te invention, telle qu'elle est réalisée et largement décrite dans la suite, on prévoit dans un cytomètre de débit à plusieurs sources de lumière un perfectionnement constitué par un appareil destiné à moduler par tout ou rien la lumière provenant d'au moins une source lumineuse pour éliminer une interférence de bruit de fond entre les sources lumineuses du cytomètre de débit. Le cytomètre de débit, qui ne fait pas partie de la présente invention, comprend au moins des première et seconde sources lumi- neuses, qui sont typiquement des lasers. Les lasers peu- vent émettre de la lumière ayant la même longueur d'onde ou des longueurs d'onde différentes. Les faisceaux lasers sont focalisés et ils coupent le trajet des particules biologiques en différents points. Chaque laser excite gé- néralement un colorant fluorescent différent lié à un composant spécifique d'une particule biologique. Le cyto- mètre comprend au moins un détecteur de fluorescence pour mesurer la fluorescence des colorants, et une mémoire de données pour mémoriser les données de fluorescence. L'appareil selon la présente invention comprend des premier et second détecteurs de dispersion de lumière pour détecter la lumière dispersée par les particules bio- logiques, des premier et second générateurs de signaux conditionnels qui sont sensibles aux détecteurs de dispersion de lumière respectifs, et des premier et second dispositifs de traitement de signaux conditionnels pour recevoir des premier et se- cond signaux conditionnels des générateurs de signaux conditionnels respectifs et pour transmettre des données de fluorescence à la mémoire de données. L'appareil com- prend en outre au moins un modulateur optique qui module une des sources lumineuses par tout ou rien. Un disposi tif à retard est connecté pour recevoir un signal condi- tionnel d'un générateur de signaux conditionnels et il engendre un signal conditionnel retardé en réponse à ce- lui-ci. Le dispositif à retard est connecté au modulateur optique de sorte que le signal conditionnel retardé com- mande le fonctionnement du modulateur optique. Le modula- teur optique peut etre associé soit à la première source lumineuse soit à la seconde source lumineuse. De préfé- rence, un premier modulateur optique est associé à la pre- mière source lumineuse et un second modulateur optique est associé à la seconde source lumineuse. Les particules biologiques peuvent etre des chromosomes. Quand les par- ticules biologiques sont suffisamment petites pour que la lumière d'intensité suffisante à détecter ne soit pas dispersée, les générateurs de signaux conditionnels peu- vent être sensibles aux détecteurs de fluorescence res- pectifs. Un avantage de la présente invention est que le bruit de fond,du à une interférence de fuite des sources lumineuses, est éliminé dans un cytomètre de débit à plu- sieurs sources lumineuses. Un autre avantage de l'invention est qu'on peut détecter une fluorescence faible. Un autre avantage encore de l'invention est qu'on peut obtenir des mesures précises de fluorescence de chro- mosomes en utilisant plusieurs lasers. D'autres caractéristiques et avantages de la pré- sente invention seront mis en évidence dans la descrip- tion suivante, donnée à titre d'exemple non limitatif, en référence aux dessins annexés dans lesquels: Figure 1 est une vue schématique d'un exemple de réalisation préféré de l'invention; Figures 2,3,4 et 5 représentent schématiquement la modulation des sources lumineuses dans l'exemple de réalisation préféré de l'invention; Figure 6 est une représentation graphique des don- nées de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel les deux faisceaux lasers ont été engendrés en permanence; Figure 7 est une représentation graphique des don- nées de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel un faisceau laser a été engendré en permanence et l'autre faisceau laser a été bloqué; et Figure 8 est une représentation graphique des don- nées de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel un faisceau laser a été engendré en permanence et l'autre faisceau laser a été modulé par tout ou rien. On va se référer maintenant à la Figure 1 qui re- présente une vue schématique d'un exemple de réalisation préféré de l'invention. L'appareil de la présente inven- tion est représenté en combinaison avec des parties d'un cytomètre de débit. Le cytomètre de débit comprend une première source lumineuse 10 et une seconde source lumi- neuse 12. Le cytomètre de débit comprend également un dispositif optique de focalisation 14 pour focaliser la lumière provenant de chaque source lumineuse sur des points différents séparés d'une distance S le long du courant d'échantillon 16 que traversent les particules biologiques en une seule file, tout comme des perles es- pacées les unes des autres sur un fii. Les sources lumi- neuses peuvent être des lasers qui émettent de la lumière ayant des longueurs d'onde différentes ou la même longueur d'onde. Les lasers peuvent etre pulsés ou etre à onde continue (oc). Un premier faisceau lumineux 18 provenant de la première source lumineuse 10 est représenté comme excitant une première particule biologique 20. La pre- mière particule biologique 20 et une seconde particule biologique 22 sont teintées avec des colorants fluores- cents. Chaque colorant est lié à un composant spécifique d'une particule biologique. Chaque source lumineuse peut exciter le meme ou un colorant différent. La première particule biologique 20 est représentée comme émettant une fluorescence 23 qui est détectée par un premier dé- tecteur de fluorescence 24. La lumière provenant du fais- ceau lumineux 18 atteint, de meme que la fluorescence 23, un second détecteur de fluorescence 26. Le sens du mouve- ment des particules biologiques est indiqué par une flè- che 28. Le cytomètre de débit comprend également une me- moire de données 30 destinée à mémoriser des données de fluorescence, de lumière dispersée et autres données ob- tenues sur les particules biologiques. L'appareil selon la présente invention module par tout ou rien au moins une source lumineuse pour éliminer l'interférence de bruit de fond pendant l'exécution de mesures de fluorescence. L'appareil comprend un premier détecteur de dispersion de lumière 32 et un second détec- teur de dispersion de lumière 34. La première particule biologique 20 est représentée comme émettant une lumière dispersée 36. Un premier générateur de signaux condition- nels 37 engendre un premier signal conditionnel en répon- se à la détection de lumière dispersée par le premier dé- tecteur de dispersion de lumière 32. Un second générateur de signaux conditionnels 38 engendre un second signal con- ditionnel en réponse à la détection de lumière dispersée par le second détecteur de dispersion de lumière 34. Un premier dispositif de traitement de signaux conditionnels 40 et un second dispositif de traitement de signaux con- ditionnels 42 reçoivent les signaux conditionnels respec- tifs et transmettent les données de fluorescence et de dispersion de lumière à la mémoire de données 30. Un pre- mier modulateur optique 44 est associé en fonctionnement à la première source lumineuse 10. Un second modulateur optique 46 est associé en fonctionnement à la seconde source lumineuse 12. Le premier modulateur optique 44 et le second modulateur optique 46 sont connectés à un dis- positif à retard 48. La première particule biologique 20 est représentée comme émettant la fluorescence 23 détec- tée par le premier détecteur de fluorescence 24 et pro- duisant la lumière dispersée 36 qui atteint le premier détecteur de dispersion de lumière 32. A cet instant, le signal d'interférence provenant du premier faisceau lumi- neux 18, qui atteint le second détecteur de fluorescence 26, est bloqué dans le second dispositif de traitement de signaux conditionnels 42. Le premier générateur de si- gnaux conditionnels 37 engendre un premier signal condi- tionnel en réponse au premier détecteur de dispersion de lumière 32. Le premier signal conditionnel est envoyé au dispositif à retard 48. Le premier générateur de signaux conditionnels 37 engendre également un troisième signal conditionnel qui est envoyé au premier dispositif de trai- tement de signaux conditionnels 40 pour bloquer le signal provenant du premier détecteur de fluorescence 24, de sorte que le dispositif ne traite pas de signaux quand la première particule biologique 20 atteint un second fais- ceau lumineux 50 (représenté par des tirets pour indiquer que la seconde source lumineuse 12 est coupée). Le dispo- sitif à retard 48 retarde immédiatement le premier signal conditionnel envoyé au premier modulateur optique 44 qui module en supprimant la lumière provenant de la première source lumineuse 10 après que la première particule bio- logique 20 ait dépassé le premier faisceau lumineux 18. Le dispositif à retard 48 produit un signal conditionnel retardé en réponse au premier signal conditionnel. Le premier signal conditionnel est effectivement retardé pendant un temps suffisant pour que la première particu- le biologique 20 parcoure la distance S séparant le pre- mier faisceau lumineux 18 du second faisceau lumineux 50. Quand le second modulateur optique 46 reçoit le si- gnal conditionnel retardé du dispositif à retard 48, il donne une impulsion à la seconde source lumineuse 12 pour qu'elle émette un faisceau lumineux pendant une pé- riode suffisamment longue pour exciter la première parti- cule biologique 20. Le second détecteur de fluorescence 26 détecte la fluorescence résultante et le second détec- teur de dispersion de lumière 34 détecte la lumière dis- persée. Les données de fluorescence et de dispersion de lumière sont envoyées à la mémoire de données 30 par I'intermédiaire du second dispositif de traitement de si- gnaux conditionnels 42. Le second générateur de signaux conditionnels 38 engendre un quatrièmne signal condition- nel en réponse au second détecteur de dispersion de lu- mière 34. Le quatrième signal conditionnel est envoyé au premier générateur de signaux conditionnels 37, duquel il est envoyé au premier dispositif de traitement de si- gnaux conditionnels 40 pour rendre à nouveau actif le premier détecteur de fluorescence 24. Il est également envoyé au dispositif à retard 48 et de là au premier modulateur optique 44 qui module alors la lumière prove- nant de la première source lumineuse 10 pour qu'elle soit à nouveau engendrée. Le premier faisceau lumineux 18 est alors capable d'exciter la particule biologique sui- vante dans le courant d'échantillon 16 pour qu'elle at- teigne le premier faisceau lumineux 18. Les particules biologiques peuvent être des cellules, des virus, des molécules, des bactéries, ou des chromosomes. Les sources lumineuses peuvent etre des lampes-éclair ou des lampes à vapeur de mercure pulsées. Les modulateurs optiques peuvent être des modulateurs électro-optiques, des modu- lateurs acousto-optiques ou des commutateurs à cristaux liquides. Dans un autre exemple de réalisation de l'inven- tion, en se référant encore à la Figure 1, on n'a qu'un seul modulateur optique, c'est-à-dire le second modula- teur optique 46. Le premier faisceau lumineux 18 est maintenu d'une manière continue. Le dispositif à retard 48 et le second modulateur optique 46 donnent une impul- sion à la seconde source lumineuse 12 pour qu'elle émet- te un faisceau lumineux pendant un temps suffisamment long pour exciter la meme particule biologique ayant pro- voquer la génération d'un signal conditionnel et sa trans- mission au dispositif à retard 48 par dispersion de lu- mière provenant du premier faisceau lumineux 18 ou par émission de fluorescence. Dans un autre exemple de réalisation de l'inven- tion, en se référant encore à la Figure 1, on n'a qu'un seul modulateur optique qui est le premier modulateur optique 44. Le second faisceau lumineux 50 est maintenu d'une manière continue. Après qu'une particule biologi- que disperse de la lumière provenant du second faisceau lumineux 50, un signal conditionnel est engendré et en- voyé au premier modulateur optique 44 qui module en l'en- gendrant le premier faisceau lumineux 18. Le premier faisceau lumineux 18 est alors capable d'exciter la par- ticule biologique suivante dans le courant d'échantillon 16. Les Figures 2,3,4 et 5 représentent schématique- ment la modulation des sources lumineuses dans l'exemple de réalisation préféré de l'invention représenté sur la Figure 1. La Figure 2 représente une particule biologi- que a quand elle est excitée par un premier faisceau lu- mineux 60 provenant d'une première source lumineuse 61. Une seconde source lumineuse 62 est coupée, comme on l'a représenté par des tirets indiquant o se trouverait un second faisceau lumineux 63. La Figure 3 représente la première source lumineuse 61 et la seconde source lumi- neuse 62 coupées, la particule biologique a se trouvant entre le premier faisceau lumineux 60 et le second fais- ceau lumineux 63. La Figure 4 représente la seconde sour- ce lumineuse 62 branchée et la particule a excitée par le second faisceau lumineux 63. La première source lumi- neuse 61 et le premier faisceau lumineux 60 sont respec- tivement coupée et absent. La Figure 5 représente la se- conde source lumineuse 62 et le second faisceau lumineux 63 respectivement coupée et absent. La première source lumineuse 61 a été branchée. Une particule biologique b est représentée comme s'approchant du premier faisceau lumineux 60. La Figure 6 représente graphiquement les données de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel les deux faisceaux la- sers sont maintenus en permanence. La Figure 7 représen- te graphiquement les données de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel un faisceau laser est maintenu d'une manière per- manente et l'autre faisceau laser (interférant) est blo- qué. La Figure 8 représente graphiquement les données de fluorescence obtenues avec un cytomètre de débit à double faisceau laser dans lequel un faisceau laser est mainte- * nu en permanence et l'autre faisceau laser est modulé par tout ou rien. Sur les Figures 6, 7 et 8, l'axe vertical correspond au nombre de particules et l'axe horizontal correspond à l'intensité de fluorescence. Un pic étroit indique que les mesures faites étaient précises et que la résolution était bonne. Comme on peut le vroir sur la Figure 6, le pic 70 obtenu en utilisant un cytomètre de débit à double faisceau laser classique est assez large et il est décalé vers la droite en raison de la contri- bution du bruit de fond. De plus, un certain nombre de signaux parasites 71 sont présents. Sur la Figure 7, le pic 72 est beaucoup plus étroit. Le pic 74 de la Figure est également beaucoup plus étroit. Pour obtenir les données représentées sur la Figu- re $, on a utilisé une porte d'Orlec et un générateur de retard, modèle 416A, comme dispositif à retard. Le modu- lateur optique était un modulateur du type cohérent 317. Les sources lumineuses étaient des lasers à ions d'argon. La première source lumineuse était du type à spectres physiquesl64-04 avec une longueur d'onde égale à 457,9 nanomètres. La seconde source lumineuse était du type à spectres physiques 164-05 avec une longueur d'onde égale à 514,5 nanomètres. Le filtre de blocage de laser utili- sé pour la fluorescence excitée à 457,9 nanomètres était du type Schott GG 495. La description précédente de plusieurs exemples de réalisation de l'invention a été présentée à titre d'illustration sans qu'elle soit pour autant exhaustive et qu'elle limite l'invention à la forme précise exposée. Ces exemples ont été choisis et décrits pour mieux expli- quer les principes de l'invention et son application pra- tique et permettre ainsi à l'homme de l'art de mieux uti- liser l'invention dans différents exemples de réalisation et avec différentes modifications appropriées à l'usage particulier envisagé,sans sortir pour autant du cadre de l'invention tel que défini dans les revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Perfectionnement à un dispositif de mesure à cytomètre de débit comportant des première et seconde sources lumineuses (10,12;61,62) pour former des premier et second faisceaux lumineux respectifs (18,50;60,63) de lumière focalisée afin d'exciter des colorants fluores- cents différents liés à des composants spécifiques de particules biologiques, le dispositif de mesure incluant un détecteur de fluorescence (24,26) pour produire des données de fluorescence, et une mémoire de données (30) pour mémoriser les données de fluorescence, ledit perfec- tionnement étant constitué par un appareil destiné à mo- duler par tout ou rien la lumière provenant d'une source lumineuse pour éliminer une interférence de bruit de fond, l'appareil étant caractérisé en ce qu'il comprend: a. des premier et second détecteurs de dispersion de lumière (32,34) pour détecter la lumière dispersée par les particules biologiques; b. des premier et second générateurs de signaux conditiormnnels (37,38) pour engendrer des premier et se- cond signaux conditionnels, le premier générateur de si- gnaux conditionnels (37) étant sensible au premier détec- teur de dispersion de lumière (32) et le second généra- teur de signaux conditionnels (38) étant sensible au se- cond détecteur de dispersion de lumière (34); c. des premier et second moyens de traitement de signaux conditionnels (40,42) pour recevoir les premier et second signaux conditionnels respectivement et pour transmettre les-données de fluorescence à la mémoire de données (30), le premier moyen de traitement de signaux conditionnels (40) étant connecté au premier générateur de signaux conditionnels (37), au détecteur de fluores- cence (24) et à la mémoire de données (30), le second moyen de traitement de signaux conditionnels (42) étant connecté au second générateur de signaux conditionnels (38), au détecteur de fluorescence (26) et à la memoire de données (30); d. un moyen à retard (48) pour retarder le signal conditionnel engendré par un des générateurs de signaux conditionnels, le moyen à retard étant connecté pour re- cevoir le signal conditionnel et produisant un signal conditionnel retardé en réponse à celui-ci; et e. un modulateur optique (44,46) associé à une des sources lumineuses (10,12), le modulateur optique étant connecté au moyen à retard (48) pour recevoir le signal conditionnel retardé et pour moduler par tout ou rien la lumière provenant de la source lumineuse en ré- ponse à celui-ci, aucun bruit de. fond interférant n'étant ainsi présent en provenance d'une source lumineuse alors que l'autre source lumineuse excite la particule biologi- que et que la fluorescence résultante est détectée. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sources lumineuses (10,12;61,62) sont des lasers. 3. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules biologiques sont des chromosomes. 4. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque source lumineuse émet de la lumière de meme longueur d'onde que celle émise par l'autre. 5. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque source lumineuse émet de la lumière de longueur d'onde différente de celle émise-par l'autre. 6. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de mesure à cytomètre de débit comprend des premier et second détecteurs de fluorescen- ce (24,26), le premier moyen de traitement de signaux conditionnels (40) étant connecté au premier détecteur de fluorescence (24) et le second moyen de traitement de si- gnaux conditionnels (42) étant connecté au seconde détec- teur de fluorescence (26). 7. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le modulateur optique (46) est associé à la seconde source lumineuse (12) et en ce que le moyen à retard (48) retarde le premier signal conditionnel en- gendré par le premier générateur de signaux conditionnels (37) jusqu'à ce que la particule biologique se soit dépla- cée du premier faisceau lumineux (18) au second faisceau lumineux (50). 8. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le modulateur optique (44) est associé à la première source lumineuse (10) et en ce que le modulateur optique (44) module en supprimant la lumière provenant de la première source lumineuse (10) après la détection d'une particule biologique par le premier détecteur de dispersion de lumière (32) et jusqu'à ce que cette parti- cule biologique soit détectée par le second détecteur de dispersion de lumière (34). 9. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un autre modulateur opti- que (46), cet autre modulateur optique étant associé à la seconde source lumineuse (12), et en ce que le moyen à retard (48) retarde le premier signal conditionnel en- gendré par le premier générateur de signaux conditionnels (37) jusqu'à ce que la particule biologique se soit dé- placée du premier faisceau lumineux (18) au second fais- ceau lumineux (50). 10. Perfectionnement à un dispositif de mesure à cytomètre de débit comportant des première et seconde sources lumineuses (10,12;61,62) pour former des premier et second faisceaux respectifs de lumière focalisée afin d'exciter différents colorants fluorescents liés à des composants spécifiques de particules biologiques suffisam- ment petites pour qu'une lumière d'intensité suffisante à détecter ne soit pas dispersée, le dispositif de mesu- re incluant des premier et second détecteurs de fluores- cence (24,26) pour produire des données de fluorescence, et une mémoire de données (30) pour mémoriser les données de fluorescence, ledit perfectionnement étant constitué par un appareil destiné à moduler par tout ou rien la lumière provenant d'une source lumineuse pour éliminer une interférence de bruit de fond, l'appareil étant ca- ractérisé en ce qu'il comprend: a, des premier et second générateurs de signaux conditionnels (37,38) pour engendrer des premier et se- cond signaux conditionnels, le premier générateur de si- gnaux conditionnels (37) étant sensible au premier détec- teur de fluorescence (24) et le second générateur de si- gnaux conditionnels (38) étant sensible au second détec- teur de fluorescence (26); b. des premier et second moyens de traitement de signaux conditionnels (40,42) pour recevoir les premier et second signaux conditionnels respectivement et pour transmettre les données de fluorescence à la mémoire de données (30), le premier moyen de traitement de signaux conditionnels (40) étant connecté au premier générateur de signaux conditionnels (37), au premier détecteur de fluorescence (24) et à la mémoire de données (30), le second moyen de traitement de signaux conditionnels (42) étant connecté au second générateur de signaux condition- nels (38), au second détecteur de fluorescence (26) et à la mémoire de données(30); c. un moyen à retard (48) pour retarder le signal conditionnel engendré par un des générateurs de signaux conditionnels (37, 38), le moyen à retard étant connecté pour recevoir le signal conditionnel et produisant un si- gnal conditionnel retardé en réponse à celui-ci; et d. un modulateur optique (44,46) associé à une des sources lumineuses (10,12), le modulateur optique étant connecté au moyen à retard (48) pour recevoir le signal conditionnel retardé et moduler par tout ou rien la lu- mière provenant de la source lumineuse en réponse à ce- lui-ci, aucun bruit de fond interférant n'étant ainsi présent en provenance d'une source lumineuse alors que l'autre source lumineuse excite la particule biologique et que la fluorescence résultante est détectée. 11. Appareil selon la revendication 10, caractéri- sé en ce que les particules biologiques sont des chromo- somes. 12. Appareil selon la revendication 10, caractéri- sé en ce que les sources lumineuses (10,12;61,62) sont des lasers. 13. Appareil selon la revendication 109 caracté- risé en ce que chaque source lumineuse émet de la lumiè- re de meme longueur d'onde que celle de l'autre source lumineuse. 14. Appareil selon la revendication 10, caracté- risé en ce que chaque source lumineuse émet de la lumière ayant une longueur d'onde différente de celle de l'autre source lumineuse.