Brevet FR2555900A1 — publié le 19850607

La présente invention se rapporte à une nouvelle substance antibiotique, à un procédé pour sa préparation et à une culture de micro-organisme capable de produire cette substance antibiotique. La nouvelle substance antibiotique selon l'invention a été appelée EM5487 et elle possède une activité sur les levures et les mycètes. On la prépare en cultivant une souche de Lysobacter gummosus qui a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le n A.T.C.C. 39472. Sur les dessins annexes: la figure 1 représente le spectre infrarouge de la substance EM5487 dans le bromure de potassium, la figure 2 représente le spectre de RbMN- 13C à MHz de la substance EM5487 dans le méthanol deutéré, la figure 3 représente le spectre de RMN-1H à 400 MHz de la substance EM5487 dans le méthanol deutéré,et la figure 4 représente le spectre ultraviolet de la substance EM5487 dans le méthanol. Le micro-organisme utilisé pour la production de la substance EM5487 est une souche d'un Lysobacter gummosus isolé du sol. On peut obtenir une sous-culture du micro-organisme auprès de la collection permanente de l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique. Son numéro de réception dans la collection est A.T.C.C. n 39472. Mais naturellement, on peut aussi cultiver pour produire la substance EM5487, en plus du micro-organisme spécifique décrit et caractérisé dans la présente demande, des mutants de ce micro-organisme (par exemple des mutants produits par utilisation de rayons X, de radiations ultraviolettes ou de moutardes azotées). Pour isoler et caractériser le Lysobacter gummosus, on met en suspension une portion d'un échantillon de terre dans laquelle il est présent dans un diluant stérile (par exemple l'eau) et on secoue. On plaque une dilution de cette suspension sur un milieu nutritif, par exemple le milieu nutritif du commerce Triple Sugar Iron Agar de la firme Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md. Etats-Unis d'Amérique, qui a été modifié par addition de vitamine B12 et de cycloheximide. La composition du milieu utilisé est la suivante: Grammes Polypeptone 20,0 NaCl 5,0 Lactose 10,0 Saccharose 10,0 Dextrose 1,0 Sulfate ferreux ammoniacal 0,2 Thiosulfate de sodium 0,2 Rouge de phénol 0,025 Gélose 13, 0 Eau distillée complément à 1 litre On stérilise le milieu à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. Après refroidissement à 50-55 C environ, on ajoute au milieu les solutions suivantes: Solution de vitamine B12 à 0,1 Z 2,0 ml Solution de cycloheximide à 1,0 Z 10,0 ml Après 48 à 72 heures d'incubation à 25 C, on isole des colonies de la terre plaquée. Ces colonies isolées sont ensuite cultivées dans un milieu contenant: Grammes Extrait de boeuf. 1,5 Extrait de levure 3,0 Peptone 6,0 Dextrose 1,0 Eau distillée complément à 1 litre On maintient ensuite le milieu à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. Les caractéristiques de Lysobacter gummosus, espèce A.T.C.C. n 39472 sont les suivantes: Morphologie de la cellule: le micro-organisme est un bâtonnet à gram négatif, à la microscopie de phase, il apparait principalement sous la forme de bâtonnets longs et minces à extré- mités arrondies plutôt que coniques.Il apparaît une certaine formation de chaînes. Sur gélose à la tryptone (0,05 Z) et à l'extrait de-levure (0,05 Z), les bgtonnets forment des faisceaux avec leurs axes longitudinaux parallèles à la direction de crois- sance, ce qui indique une motilité de glissement. On a observé sur la gélose des traînées de matière visqueuse. Caractéristiques de culture: Les cultures liquides sont très visqueuses et les cultures sur gélose sont très mucila- gineuses. Sur gélose au saccharose et à l'extrait de levure (0,25 % et 0, 5 % respectivement), les colonies sont jaunes et translucides avec des bords incolores en dentelure qui sont transparents et s'étendent de manière irrégulière. Réactions biochimiques: Le micro-organisme est protéolytique comme le montre le fait qu'il clarifie une gélose opaque au lait écrémé et à l'acétate. Il produit de la catalase, de l'oxydase, de la phosphatase et est capable d'utiliser pour sa croissance un citrate comie seule source de carbone. Il ne produit pas de pigment hydrosoluble et n'hydrolyse pas l'amidon. Il a des effets lipolytiques sur le Tween 20 et le Tween 80 et il produit de l'acide à partir du glucose, du cellobiose, du saccharose (avec retard) et du lactose mais non à partir du glycérol ou du mannitol. Il croit sur gélose à l'éosine et au bleu de méthylène. Physiologie: Le micro-organisme a des propriétés lytiques sur les cellules de levure. La tencur en G + C de son ADN est de 66,9 %, cette valeur se situant dans l'intervalle de 65,5 à 70,1 mol % rapporté par Christensen et Cook. Ces caractéristiques permettent d'identifier le micro-organisme produisant la substance EM5487 comme étant Lysobacter gummosus, en accord avec la description de ce micro-organisme par P. Christensen et F. D. Cook (Int. J. Syst. Bacteriol. 28:67-393, 1978). Le micro-organisme Lysobacter gummosus A.T.C.C. n 39472 produit la substance antibiotique EM5487 qui possède une activité sur les levures et les mycètes. Pour former la substance antibiotique E15487 par le procédé préféré, on cultive Lysobacter gummosus A.T.C.C n 39472 à température ambiante (25 C) ou au Z555900 voisinage de cette température dans des conditions aérobies submergées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'hydrate de carbone et d'azote assimilable. La fermentation est conduite jusqu'à ce que le milieu présente une activité substantielle, ce qui demande habituellement d'environ 24 à 48 heures selon les conditions de la fermentation. Lorsque la fermentation est terminée, on centrifuge le bouillon afin de séparer le micro-organisme producteur. On extrait ensuite la substance antibiotique du surnageant du bouil- son acidifié par l'acétate d'éthyle, on extrait en retour dans le bicarbonate de sodium à 5 Z et après acidification à pH 2 de la solution de bicarbonate de sodium, on extrait à nouveau dans l'acétate d'éthyle. On peut également acidifier tout le bouillon par l'acide chlorhydrique puis centrifuger la suspension afin d'agglomérer les substances solides. On extrait les substances solides par l'acétone, on 'rassemble les extraits acétoniques et on les concentre sous vide. La substance active contenue dans ce concentré, qu'on dilue par l'eau, est extraite dans l'acétate d'éthyle, extraite en retour dans le bicarbonate de sodium à 5 % puis, après acidification de la solution de bicarbonate, extraite dans de l'acétate d'éthyle frais. La purification complémentaire de l'antibiotique est réalisée par chromatographie sur gel de siiice avec un gradient de chloroforme-méthanol, suivie d'une chromato- graphie de la substance active sur la résine du commerce Diaion CHP20P avec un gradient d'eau-acétone. La purification finale est réalisée par chromatographie sur le produit du commerce Sephadex LH-20, avec élution par le méthanol. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple 1 On ensemence des géloses inclinées à l'extrait de levure, à la peptone et au glucose par Lysobacter gummosus A.T.C.C n 39472, on soumet à incubation d'une nuit à 25 C et on utilise pour l'inoculation de portions de 100 ml d'un milieu aqueux contenu dans des erlenmeyers de 500 ml bouchés par un tampon de coton. La composition du milieu de germination est la suivante: Milieu Grammes Extrait de levure 4 Extrait de malt 10 Dextrose 4 Eau distillée complément à 1 litre On règle le pH à 7,3 avant de stériliser en 15 minutes à 121 C. Les fioles de germination inoculées sont soumises à incu- bation à 25 C pendant environ 24 heures sur un appareil rotatif à secousses tournant à 200 tr/min avec une course de 54 mm. A partir des fioles de germination on procède à des transferts de 1 % (en volume) dans des portions de 100 ml de milieu frais à l'extrait de levure, à l'extrait de malt et au dextrose tels que décrits ci-dessus. On soumet les fioles à incubation d'environ 48 heures à 25 C dans les mêmes conditions opératoires que les fioles de germination ci-dessus. A la fin de la période d'incubation, on rassemble les contenus des fioles et on centrifuge l'ensemble à 62500 x g pour provoquer l'agglomération des cellules. Apres séparation des cellules et du surnageant, on règle ce dernier (20 litres) à pH 2 par l'acide chlorhydrique concentré puis on extrait par un volume égal d'acétate d'éthyle. Après séparation des phases, on lave la couche organique à l'eau jusqu'à ce que les lavages présentent un pH d'environ 4,5 puis on concentre sous vide à volume final de 2,8 litres. On extrait le concentré à deux reprises par 0,5 volume à chaque fois de solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 %. On agite vigoureusement les couches aqueuses combinées à température ambiante après réglage à pH 2 par HC1 6N. L'antibiotique est ensuite extrait en retour dans l'acétate d'éthyle (3 litres) qu'on lave ensuite à l'eau jusqu'à ce que les lavages présentent un pH d'envi- ron 6. On sèche la couche organique sur MgSO4 anhydre, on filtre et on concentre à sec sous vide; on obtient en résidu 4,5 g de l'antibiotique brut. On redissout la substance brute dans un petit volume de méthanol (10 ml) et de chloroforme (5 ml) et on chromatographie la solution sur une colonne d'acide silicique de 2,5 x 46 cm avec 2 litres d'un gradient linéaire allant du chloroforme jusqu'au mélange chloroforme-méthanol, 1:1 à un débit de 3 ml/min en recueillant des fractions de 12 ml. Les fractions actives détectées par le test de diffusion de la gélose sur disque de papier contre Candida albicans SC5314 sont combinées et concentrées à sec sous vide; on obtient 2,1 g d'une substance solide jaune. On dissout la substance solide dans un volume minimal d'un mélange acétone-eau, 3:1 et on chromatographie sur une colonne de 2,5 x 28 cm de la résine du commerce Diaion CHP2OP (cette résine est un copolymère macroréticulaire styrène-divinylbenzène en granulés de la firme Mitsubishi Chemical Company Ltd., Japon); on élue par 1,2 1 d'un gradient linéaire allant de l'acétone à 20 Z dans l'eau jusqu'à l'acétone à 100 %. Le débit est de 3 ml/min et on recueille des fractions de 12 ml. On combine les fractions actives éluées par l'acétone aqueuse à environ 70 % et on les évapore à sec sous vide; on obtient 600 mg d'une substance solide jaune. On procède à une purification complémentaire par chromatographie sur une colonne de 2,5 cm x 110 cm de la résine du commerce Sephadex LH-20 (il s'agit d'un gel de dextrarneréticulé et alkylé en granulés de la firme Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suède). On élue par le méthanol au débit de 2 ml/min. On combine les fractions actives et on évapore les solvants sous vide; on obtient 280 mg de la substance EM5487 à l'état de substance solide amorphe jaune orangé. On indique ci-après les propriétés physiques et chimiques de la substance antibiotique EM5487: UV Xmax dans le méthanol: 260 nm (E1% 600), 335 (180) UV Xmax dans NaOH O,01N: 260 nm (E1% 760), 335 (180) UV %max dans HCl 0, 01N: 269 nm (E1% 600), 357 (238), 375 (180) Spectre infrarouge (KBr): 3405 large, 2930, 2895, 2800, 1703, -1 1655, 1620, 1566 et 1005 cm Poids moléculaire: 510 par SM FAB: (M + H) m/z 511 (M - H) m/z 509 Les chiffres du spectre de masse à haute résolution sur le fragment ionique (M - H)-, m/z 509 indiquait la formule globale C29H37N206- Analyse élémentaire: Trouvé C: 64,98; H: 7,46; N: 5,86 % Chromatographie sur couche mince: gel de silice (Merck) CHCi3: MeOH: tampon phosphaté 0, 05 M, pH 2,3 (65:35:10, phase inférieure) Rf 0,3 Opti UP C12 1), acetone aqueuse à 70 % Rf 0,3 ITLC/SA 2) CHCl3: MeOH: EtoAc, 90:5:2 Rf 0,3 ) Les plaques Opti UP C12 sont des plaques de chromatographie sur couche mince en phase inversée liéespar du dodécyltrichlorosilane, de la firme Fluta Chem. Corp., New York 2) Les feuilles ITLC/SA sont des feuilles de microfibres de verre imprégnées par de l'acide silicique pour la chromatographie sur couche mince de la firme Gelman Instrument CO., Ann Arbor, Michigan, Etats-Unis d'Amérique. On ensemence des géloses inclinées à l'extrait de levure, à la peptone et au glucose par Lysobacter gummosus A.T.CoCo n 39472, on soumet à incubation d'une nuit à 25 C et on utilise pour l'inoculation de portions de 100 ml d'un milieu aqueux contenu dans des erlenmeyers de 500 ml bouchés par des tampons de coton. La composition du milieu de germination est la suivante: Milieu Grammes Extrait de levure 4 Extrait de malt 10 Dextrose 4 Eau distillée complément à 1 litre On règle le pH à 7,3 avant de stériliser en 15 minutes à 121 C. On soumet les fioles de germination inoculées à incubation à 25 C pendant environ 24 heures sur un appareil rotatif à secousses tournant à 300 tr/min avec une course de 54 mm. On procède à un transfert de 1 Z en volume des fioles de germination vers des quantités de 50 litres du même milieu que ci-dessus contenues dans un fermenteur Fermatron (de la firme New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey Etats-Unis d'Amérique) de 75 litres. On laisse fermenter pendant 28 à 30 heures à 25 C avec un débit d'air de 50 1/min et à une vitesse d'agitation de 200 tr/min. A la fin de la fermentation, on récolte-le bouillon et on règle à pH 2 par addition de HCl concentré. On centrifuge ensuite le bouillon acidifié à 62 500 x g afin de séparer les substances solides et le liquide surnageant. On met les susbstances solides (poids humide 375 g) en suspension dans 2,5 litres d'acétone et on agite pendant 30 mi- nutes environ à température ambiante. On recueille l'acétone par filtration sur papier filtre Whatman n 1 et on remet les substances solides en suspension dans. de l'acétone fraiche (2,5 litres). Après agitation, on sépare à nouveau les matières solides et l'acétone et on répète encore une fois l'opération d'extraction. On combine les trois extraits acétoniques et on concentre sous vide jusqu'à obtention d'une dispersion aqueuse (environ 200 ml). On dilue cette dispersion (pH 4) par addition de 200 ml d'eau distillée et on règle à pH 2 par HC1 concentré. On extrait la dispersion acidifiée à deux reprises par des portions de 500 ml d'acétate d'éthyle, on retient les phases organiques et on les combine. On extrait les phases organiques combinées à deux reprises par 600 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 Z. On combine les couches aqueuses et on acidifie à pH 2 par HCl concentré. L'antibiotique est ensuite à nouveau extrait de la phase aqueuse acidifiée par deux portions de 1,5 litres chacune d'acétate d'éthyle frais. On lave les extraits dans l'acétate d'éthyle combinéspar l'eau jusqu'à pH neutre des lavages, on concentre à volume final de 500 ml sous vide, on sèche sur MgSO4 anhydre, on filtre les substances solides éventuelles puis on concentre sous vide; on obtient un résidu de 2,35 g. Activité biologique On a utilisé la substance EM5487 purifiée dans les essais; des essais à la dilution de deux fois dans la gélose ont donné sur plusieurs espèces Candida les résultats suivantes: Micro-organisme CMI (-g/ml) Candida albicans SC5314 1) 3,1 Candida albicans SC11422 3,1 Candida albicans SC12734 (bacilysiner) 2) 1,6 Candida tropicalis SC8159 6, 3 Candida tropicalis SC2963 (amphotéricine Br) 2) 6,3 Candida tropicalis SC9861 (amphotéricine Br) 2) 1,6 Candida krusei SC2967 (amphotéricine Br) 2) 3,1 Candida krusei SC2969 (nystatiner) 2) 3,1 Candida parakrusei SC2621 1,6 Candida pseudotropicalis SC11241 1,6 Candida quilliermondii SC2210 6,3 Candida stellatoidea SC2211 6,3 Candida glabrata SC11267 3,1 1) SC indique qu'il s'agit d'un micro-organisme de la collection de culturesde la firme E. R. Squibb & Sons, Inc., Princeton, New Jersey Etats-Unis d'Amérique. 2) La lettre r placée en exposant après l'indication d'une substance antibiotique indique que le micro-organisme est résistant à cette substance antibiotique. REVENDICATIONS 1. Substance antibiotique appelée EM5487, caractérisée par l'analyse élémentaire approximative suivante: C 64,98; H 7,46; N 5,86 %; le spectre infrarouge dans le bromure de potassium repré- senté dans la figure 1 des dessins annexés; le spectre de RMN-13 C à 100 MHz dans le méthanol deutéré représenté dans la figure 2 des dessins annexés; le spectre de RMN-1 H à 400 MHz dans le méthanol deutéré représenté dans la figure 3 des dessins annexés; et le spectre ultraviolet dans le méthanol représenté dans la figure 4 des dessins annexés. 2. Procédé de préparation de la substance antibiotique EM5487 de la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive le micro-organisme Lysobacter gummosus A.T.C.C. n 39472 dans un milieu aqueux nutritif contenant une source d'hydratesde carbone et d'azote assimilable dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce que le milieu présente une activité antibiotique substan- tielle. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture est effectuée à 25 C environ. 4. Culture biologiquement pure du micro-organisme Lysobacter gummosus A.T. C.C. n 49472, capable de produire la substance antibiotique EM5487 de la revendication 1 en quantité récupérable par fermentation dans un milieu aqueux nutritif con- tenant des sources assimilables d'azote et d'hydrates de carbone.