Brevet FR2551086A1 — publié le 19850301

VECTEURS NAVETTES SELECTIONNABLES ET DE CLONAGE POUR THIO-BACILLUS FERROOXIDANS ET PROCEDE POUR LEUR FABRICATION L' invention est relative à la construction de ulasmides vecteurs nour le clonage d' ADN Isrecombinants et ce pour Thiobacillus ferrooxidans, ces vecteurs contenant un gène de résistance au chloramphénicol en vue 5 de leur sélection et étant capables de se répliquer à la tois dans T ferrooxidans'et Escherichia coli. Bien que des vecteurs de clonage susceptibles d'être sélectionnés aient déjà été construits pour d'autres bactéries, il n'existe pas à la connaissance du demandeur de documents antérieurs décrivant la fabrication de vecteurs de clonage sélectionnables pour T ferrooxidans qui peuvent également se répliquer dans E coli. Selon la présente invention, le procédé pour fabriquer un vecteur nlasmide comprend l'extraction d'un ADN plasmide cryptique,à partir de T ferroxidansle clivage de ce plasmide et d'un second plasmide qui contient un gène de résistance au chloramphénicol avec la même enzyme de restriction et la ligation des plasmides pour former un plasmide recombinant. Le second plasmide peut être le plasmide DBR 325, bien que d'autres plasmides appropriés puissent être utilisés à la place de p BR 325. Le plasmide recombinant résultant, p BR 401, se réplique dans E coli. Selon un autre aspect de l'invention le plasmide p DR 401 peut être réisolé et modifié par clivage avec au moins une enzyme de restriction pour éliminer l'origine de réplication pour E coli. Le plasmide recombinant délété, p DR 412 contient le gène de résistance au chloramphénicol et se réplique dans E coli tout en utilisant l'origine de réplication de T.ferrooxidans. L'invention est également relative aux plasmides recombinants p DR 401 et p DR 412 comme ils viennent d'être définis, en tant qu'ils constituent des vecteurs navettes sélectionnables et qui peuvent être utilisés dans des essais de manipulations génétiques mettant en oeuvre T ferrooxidans et E coli. L'invention fournit donc un plasmide p DR 401 qui a une taille d'environ 17,8 kb et qui est fragmenté en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb, 6,2 kb et 8,1 kb respectivement, par l'enzyme de restriction Pvul. L'invention fournit également un plasmide p DR 412 qui a une taille d'environ 14,8 kb et qui peut être fragmenté en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb,5,lkb et 6,2 kb respectivement, par l'enzyme de restriction Pvul. Un exemple de l'invention est décrit ci-après, avec l'appui du dessin ci-joint qui illustre des cartes de restriction du plasmide cryptique et des plasmides recombinants selon l'invention. Un plasmide cryptique de 12,4 kilobases (kb), p TF-FC 2 a été extrait d'une souche de T ferrooxidans F C isolée d'une liqueur acide de lessivage de la-Mine Fairview de la General Mining Union Corporation Limited, Afrique du Sud La carte de restriction de p TF-FC 2 montre qu'il possède des sites de restriction uniques Pstl, Xhol, Kpnl, 25 Eco RI, A Dal,Clal et deux sites de restriction Pvul (voir le dessin ci-joint). Un plasmide recombinant, p DR 401, a été construit par insertion du plasmide p BR 325 de E coli dans les sites Pstl de p TF-FC 2 p BR 325 contient des gènes de résistance 30 à l'ampicilline (An), au chlorammhénicol (Cm) et à la tétracycline (TC) La presence d'un insérat dans le site Pstl au cours du clonage inactive le gène Ap R et l'on isole des transformants R Pl S de E coli qui sont Cm, Tc et Ap Le plasmide recombinantp DR 401 (environ 17,8 kb) a été extrait à partir des 3 E E coli transformés et caractérisé par analyse de restriction Le nouveau plasmide recombinant contient les gènes pour Cm et Tc et est capable de se répliquer dans T. ferrooxidans et E coli. -3 Un plasmide de délétion, p DR 412 (environ 14,8 kb) a été construit par digestion Sall/Xhol de p DR 401 et élimination du fragment Sall/Xhol (environ 3,0 kb) qui contenait l'origine de réplication de p BR 325 et approximativement la moitié du gène Tc, ainsi qu'un segment de 0,3 kb de l'ADN de T ferrooxidans p TF-r C 2 L'analyse de restriction a confirmé que le fragment Sall/Xhol de 3,1 kb avait été délété dans le plasmide p DR 412 Ce nouveau plasmide recombinant contient le gène pour Cm et peut être répliqué dans T ferro10 oxidans et E coli. Les deux plasmides p DR 401 et p DR 412 ont été caractérisés par clivage endonucléolytique avec une enzyme de restriction. Ainsi l'enzyme de restriction Pvul clive le plasmide 15 p DR 401 en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb, 6,2 kb et 8,1 kb respectivement. La même enzyme de restriction Pvul clive le plasmide p DR 412 en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb, 5,1 kb et 6,2 kb respectivement. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'anplication et de réalisation aui ont été plus spécialement envisages; elle en embrasse au contraire toutes les variantes: en particulier les revendications 25 qui suivent étendent leurs effets à tout nlasmide recombinant dérivé de ceux aui ont été plus particulièrement décrits, soit par des délétions supplémentaires, soit nar des insertions de séquences d' ADN distinctes, dès lors que ces délétions ou insertions n'altèrent pas la capacité des plasmides ainsi modifiés de se répliquer à la fois dans T.ferrooxidans et E coli. La figure unique (fig 1) du dessin contient des cartes de restriction de p TF-FC 2, p DR 401 et p DR 412 Des arcs de cercles en traits au moins -artiellement interrom35 pus correspondent aux significations suivantes: l'arc X correspondà l'emplacement approximatif de l'origine de réplication; l'arc Y correspond au fraqments délétés dansp DR 412. -4 D'une façon générale les revendications étendent leurs effets à un vecteur plasmide recombinant, caractérisé en ce qu'il présente les caractères d'un plasmide navette entre T.ferrooxidans et E coli et en ce qu'il comporte un fragment originaire d'un plasmide de T ferrooxidans et un fragment issu d'un ADN, notamment d'un plasmide, issu de E coli ou hébergé dans celui-ci, ce fragment contenant un gène de résistance au chloramphénicol. Elles concernent plus particulièrement encore un 10 plasmide de ce type qui est dépourvu d'une origine de réplication dans E coli. 2 55 1 0-8 o REVENDICATIONS 1 Procédé de construction d'un vecteur plasmide qui est caractérisé par les étapes comportant l'extraction d'un ADN plasmide cryptique de T ferrooxidans, le clivage du plasmide de T ferrooxidans et d'un second plasmide qui contient un gène de résistance au chloramphénicol avec une même enzyme de restriction et la ligation des plasmides pour former un plasmide recombinant. 2 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ADN plasmide crypntique est p TF-FC 2 ayant une 10 taille de 12, 4 kb. 3 Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le second plasmide est p BR 325. 4 Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le plasmide p BR 325 est inséré dans le site Pstl 13 du plasmide p TF-FC 2. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de ré isolementdu nlasmide recombinant et le clivage du plasmide recombinant avec au moins une enzyme de restriction 21 pour éliminer l'origine de réplication de E coli, pour produire un plasmide recombinant délété. 6 Procédé selon la revendication 5,caractérisé en ce que l'étape de clivage inclut l'élimination à partir du plasmide recombinant d'un fragment d'environ 3,0 kb 25 qui contient l'origine de réplication du second plasmide. 7 Plasmide recombinant p DR 401 ayant une taille d'environ 17,8 kb construit par la technique de l'une quelconque des revendications 1 à 4. 8 Le plasmide recombinant délété p DR 412, ayant une taille d'environ 14, 8 kb, construit par le procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6. 9 Plasmide p DR 401, qui est caractérisé par une taille d'environ 17,8 kb qui est fragmentable en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb, 6,2 kb et 8,1 kb respectivement, par l'enzme de restriction Pvul. Plasmide de p DR 412, qui est caractérisé par une taille d'environ 14,8 kb et qui est fragmentable en trois fragments ayant des tailles de 3,5 kb, 5,1 kb et 6,2 kb respectivement, par l'enzyme de restriction Pvul. 11 Vecteur plasmide recombinant, caractérisé en ce qu'il présente les caractères d'un plasmide navette entre T ferrooxidans et E coli et en ce qu'il comporte un fragment originaire d'un plasmide de T ferrooxidans et un fragment issu d'un ADN, notamment d'un plasmide, issu de E coli ou hébergé dans celui-ci, ce fragment contenant un gène de résistance au chloramphénicol. 12 Plasmide recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que le susdit fragment d'ADN est dépourvu d'une origine de réplication dans E coli.