Brevet FR2555603A1 — publié le 19850531

L'invention concerne un procédé de production d'enzymes capables d'hydrolyser la cellulose et les hémicelluloses. Elle concerne plus par- ticulièrement un procédé, de préférence continu, de fabrication d'enzy- mes cellulolytiques, désignés ci-après par le terme "cellulase" ou "cellulases", par fermentation par le champignon "lTrichoderma reesei". La biomasse lignocellulosique constitue une réserve importante et encore peu exploitée de sucres fermentescibles. Ces sucres peuvent être obtenus par hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses présentes en grande quantité dans cette biomasse. Des procédés d'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses ont déjà été proposés. Le plus ancien est l'hydrolyse chimique généralement effectuée à l'aide d'acides forts. L'exploitation industrielle d'un tel procédé est difficile. Plus récemment, de nombreuses études ont été effectuées conduisant à des procédés d'hydrolyse enzymatique, qui pré- sentent l'avantage de ne pas entraîner de dégradation des sucres poten- tiellement présents dans la biomasse. Une telle technologie, pour être appliquée de façon industrielle, nécessite de grandes quantités de cellulases. Une expérimentation systématique a été faite, elle a conduit à la découverte d'un procédé continu de fabrication de cellulases dans des conditions efficaces et peu coûteuses, permettant d'envisager l'application industrielle de l'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique. Parmi les nombreux microorganismes connus pour excréter des cellu- lases, le champignon ascomycète "Trichoderma reesei' est reconnu comme l'un des plus susceptibles de donner lieu à une industrialisation de cette production d'enzymes: Mandels, Annual Reports on fermentation pro- cesses vol. 5, G. Tsao Editeur. Academic Press N.Y. 1981, p. 35-78. Les souches sauvages de ce champignon ont la faculté d'excréter, en présence de cellulose, le mélange de toutes les activités enzymatiques nécessaires ensuite à l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique. Les cellulases ainsi obtenues ont des activités d'exo- et d'endo-glucanase, b-glucosidases, exo- et endo-xylanases et f-xylosidases. Les princi- paux travaux ont porté sur l'amélioration de souches sauvages par des techniques génétiques classiques de mutation-sélection ayant conduit à l'obtention de souches de "Trichoderma reesei" hyperproductrices telle que MCG 77 décrite par Gallo dans le brevet US 4275 163; MCG 80 décrite par Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnology and Bioengineering symposium no 12, pages 451-459 (1982); RUT C 30 décrite par Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Applied Environmental Microbiology, volume 34, page 777 (1977) et CL 847 décrite par Warzywoda, M., e.a. Biotechnology letter, VOlume 5, page 243 (avril 1983). Cette amélioration génétique a permis d'obtenir des souches ayant une productivité maximale en cellulases excrétées ainsi qu'une répres- sion catabolique diminuée par rapport à celle de la souche sauvage. Cette répression catabolique, est un facteur déterminant dans la production de cellulases au niveau industriel;la synthèse des cellulases est en effet bloquée par la présence, dans le milieu de culture, de sucres facilement métabolisables. Les diverses souches mentionnées ci-dessus ont fait l'ob- jet de travaux de recherche et de développement qui ont confirmé leur supériorité sur la souche sauvage pour l'excrétion de cellulases. Mandels cité ci-dessus a montré que, comme pour la souche sauvage, les plus fortes productions d'enzymes sont obtenues en fournissant à ces souches des celluloses purifiées comme principale source d'énergie et de carbone. Dans ces conditions, la production de cellulases est proportionnelle à la quantité de cellulose ajoutée au milieu, du moins tant que cette cel- lulose n'entraine pas dans le milieu une viscosité trop élevée pour assurer une efficacité normale des différents transferts nécessaires à la culture. Il est ainsi admis que la concentration maximale de cellu- lose que l'on peut atteindre est de l'ordre de 70 à 80 g/l par exemple. Ces milieux de culture à forte teneur en cellulose purifiée ne peuvent pas être extrapolés à l'échelle industrielle en raison d'une part du coût élevé de la cellulose purifiée, utilisée et, d'autre part, des dépenses d'énergie élevées pour l'agitation des milieux de culture de très grande viscosité. Des sources de carbone permettant une extrapolation plus facile des milieux de culture ont donc été recherchées. Allen, A.L. et Mortensen, R.E., Biotechnology and Bioengineering, volume 23, pages 2641- 2645 (1981) ont proposé comme sources de carbone plusieurs sucres utilisés seuls ou en mélanges, en raison de leur faible coût et de leur bonne solubilité en milieu aqueux. On constate toutefois que les productions de cellulases obtenues en cultivant"Trichoderma reesei"lsur des milieux de culture à base de sucres solubles sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose, et notamment sur cellulose purifiée. Ces faibles productions sont sans doute explicables par un effet répresseur sur la production d'enzymes par les sucres aux concentrations auxquelles ils sont utilisés. Des techniques d'alimentation en continu d'un substrat carboné, ont été utilisées pour apporter au microorganisme les quantités de sucre strictement nécessaires à ses besoins, et pour limiter la teneur en sucre résiduel dans les cultures,permettant ainsi de lever la répression cata- bolique due aux sucres. L'utilisation de ces techniques avec des substrats cellulosiques non solubles pose des problèmes d'extrapolation en condi- tions stériles. On a donc recherché une mise en oeuvre de ces techniques en employant des sucres solubles dont les solutions concentrées peuvent être facilement stérilisées et injectées stérilement par pompage ou tout autre moyen de transfert de liquide dans des réacteurs de plus ou moins grande capacité. Allen et Andreotti cités ci-dessus ont utilisé une source de lactose, sucre soluble, comme source de carbone pour la souche MCG 80 (Trichoderma reesei), tandis que Allen et Mortensen, cités ci- dessus ont utilisé du glucose, du cellobiose ou des mélanges de sucres artificiels avec la,ouche RUT C 30 (Trichoderma reesei).Les résultats obtenus par ces auteurs, en continu, s'ils sont supérieurs à ceux observés en discontinu sur les mêmes substrats, n'atteignent cependant pas les valeurs observées, en(batch)discontinu, sur celluloses purifiées, tant du point de vue des titres, des rendements, que des productivités en cellulase. La présente demande de brevet propose un processus de production de cellulases avec des rendements et des titres en enzymes élevés. De façon inattendue, on a découvert que l'on pouvait obtenir à l'aide d'un démarrage particulier de l'alimentation (de préférence conti- nue) en substrat (Fed-Batch) mettant en oeuvre des sucres solubles tels que le lactose, le glucose, le xylose, l'arabinose, le cellobiose ou leurs mélanges comme source de carbone, une production de cellulase dont les titres en enzymes sont nettement plus elevés par rapport aux technologies antérieures notamment en discontinu (Batch) sur cellulose purifiée, ainsi qu'une amélioration significative de la production d'enzyme rapportée à la masse de substrat mise en oeuvre. Ainsi l'invention concerne un procédé de production aérobie de cellulase par culture d'une souche de "Trichoderma reesei" dans une zone de fermentation renfermant un milieu de nutrition, le procédé consistant à effectuer une alimentation, de préférence, en continu, à l'aide d'une solution aqueuse d'au moins un sucre soluble, de préférence le lactose, de ladite zone d'alimentation. Ce procédé est caractérisé en ce que: a) avant d'effectuer ladite alimentation, on laisse d'abord en contact une partie au moins de la culture avec un matériau renfermant de la cellulose, sous forme de préférence de cellulose purifiée ou de pâte à papier, et au moins un sucre soluble, de préférence le lactose, les concentrations pondérales de ladite cellulose et dudit sucre soluble par rapport à ladite partie du milieu de culture étant chacune comprise entre 0,01 et 2 % (soit 0,1 à 20 grammes par litre de solution). Le contact entre le matériau cellulosique, le sucre soluble et au moins une partie de la culture est maintenu pendant un temps suffisant pour consommer au moins 10 % en poids du sucre présent initialement, de préférence au moins 20 %, et obtenir une concentration en sucre dans le milieu inférieure à 0,3 % en poids, de préférence inférieure à 0,2 %. b) au cours de la fermentation subséquente on effectue ladite alimentation en sucre soluble, de manière progressive, de manière à introduire une quantité de sucre représentant au total au moins 3 % en poids du milieu de culture tout en maintenant la concentration en sucre dans ledit milieu de culture à une valeur inférieure à 0,3 % en poids et de préférence comprise entre 0,1 et 0,25 % en poids. De préférence la concentration en cellulose est comprise entre 0,2 et 2 % en poids et de façon encore plus préférée entre 0,5 et 1 % en poids et la concentration en sucre comprise entre 0,02 et 1 % en poids. La concentration en sucre est de façon préférée égale à une valeur comprise entre 10 et 50 % de la concentration en cellulose. s - Le procédé selon l'invention consiste à assurer l'essentiel de la croissance et de la production d'enzymes par*Trichoderma reesei0 par une alimentation de préférence continue en sucre soluble, par exemple le lactose, en maximisant la production d'enzymes par l'incorporation préa- lable au milieu de culture, avant son ensemencement, d'une faible quanti- té critique d'inducteur cellulosique. Pour cela, avant d'ajouter la solu- tion de sucre dans le fermenteur qui a reçu la préculture, on laisse d'abord en contact cette précuiture avec un inducteur cellulosique: On prépare conventionnellement, à partir de spores ou de mycelium de la souche de"Trichoderma reesei" choisie, une préculture liquide dans un milieu de culture renfermant les sels minéraux et compléments vitami- niques usuels et une source de carbone et d'énergie de préférence sous forme de sucres solubles, de préférence lactose; cette préculture-peut être effectuee par exemple dans une fiole agitée placse dans une enceinte à zepoerature constante G'environ 27 C, ou ce préférence dans un fermen- teur. Quand le dàveloppement de cette précultLure a permis d'obtenir une bionasse corresoondant à, nar pxemnlp: 0,5 à 1,5 % en poids de matière sèche du milieu de culture, de préférence 1 %, la préculture est alors transférée stérilement dans le fermenteur de production d'enzymes. Ce fermenteur de production d'enzymes, conformément à l'invention, renferme un milieu de culture ou de nutrition contenant les sels minéraux, compléments vitaminiques et tensio-actifs usuels, une quantité d'inducteur cellulosique,(par exemple cellulose purifiée, pâte à papier) comprise entre o,olet 2 % et de préférence entre 0,5 et 1 % en poids par rapport au milieu de culture et une faible quantité d'au moins un sucre comme expliqué ci-dessus. On maintient le contact nécessaire entre la préculture et le milieu renfermant l'inducteur cellulosique puis on alimente le réacteur en continu de préférence, avec une solution aqueuse stérile d'au moins un sucre dont la concentration en sucre est comprise entre environ 20 et 30 % en poids, cette solution renfermant généralement également un milieu de culture ou de nutrition, la vitesse d'alimentation étant modulée comme indiqué plus haut. Cette alimentation en sucre soluble correspond à une mise en oeuvre de concentrations en sucre soluble (exprimées en poids total de sucre ajouté par volume réac- tionnel final) comprises par exemple et de préférence entre 80 et 120 g/1 sur une durée de 90 à 160 h environ, et, à titre illustratif, plus parti- culièrement d'environ 100 9/1 sur une durée de 140 heures environ. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs suivants: EXEMPLE 1 (comparatif) On prépare une solution aqueuse de sels minéraux dénommée Cl, de composition suivante: 3,32 9/1 de potasse (KOH), 4 ml/1 d'acide phospho- rique à 85 %, 5,6 g/1 de sulfate d'ammonium (NH4)2S04, 1,2 9/1 de sulfate de magnésium (MgSO4, 7 H20), 1,2 9/1l de chlorure de calcium (CaC12), 6,4 mg/l de sulfate de manganèse (MnS04), 5,6 mg/l de sulfate de zinc (ZnSO4, 7 H20), 8 mg/l de chlorure de cobalt (CoC12), 20 mg/l de sulfate de fer (FeSO4, 7 H20). Un fermenteur, contenant 0,5 litre de solution C1, 1,4 litre d'eau, 2 d'extrait de levure, 160 g de cellulose Whatman CC41, 2 ml de Tween Cordgit corMaercial) 804 Z mi d'antimousse, est stérilisé par autoclavage pendant 20 minutes à 120 C. Apres refroidissement, la température du milieu est ajustée à 27 C et le pH à la valeur de pH 5. Le fermenteur est alors ensemencé par 200 ml d'une préculture liquide de la souche de"Trichoderma reesei"CL 847. La température est régulée à 27 C pendant les 24 premières heures de la culture puis à 25 C jusqu'à la fin de la culture. Pendant toute la durée de culture, le pH est régulé à la valeur de pH 5 par addition d'une solu- tion d'ammoniaque. La concentration en oxygène dissous dans la culture est maintenue au-dessus de 15 % en poids de la concentration saturante par ajustements de la vitesse d'agitation et du taux d'aération. Aucune nutrition addition d'agent dre fexcepté l'ammoniaque, n'est effectuée pendant la culture. Après 142 h de culture, le moût de fermentation est récolté et les déterminations analytiques sont effectuées sur des parties aliquotes de surnageant; les protéines sont dosées et les activités cellulases sur papler filtre et 1-glucosidase sur cellobiose sont déterminees. On a obtenu ainsi: 17,9 g/1 de protéines, 13,7 unités internationales de cellulases par millilitre (UPF/ml), 9,9 unités Internationales de i glucosidase par millilitre. On a obtenu 171 unités cellulases par gramme de substrat carboné utilisé. EXEMPLE 2 (comparatif) Une culture de la souche Trichoderma reesei RUT C 30 est conduite dans des conditions Identiques a celles rapportées dans l'exemple 1. Après 142 h, les résultats obtenus sont les suivants: 14 9/1 de protéi- nes, 10 UPF/ml d'activité cellulases, 5 U/ml d'activité A-glucosidase. On a obtenu 125 unités cellulases par grame de substrat carboné utilisé. EXEMPLE 3 (comparatif) Dans cet exeaple, la cellulose Whatmn CC41 utillsée dans les exemples 1 et 2 est remplacée par un mélange de lactose et de 10 g de pite A papier (cellulose). Le fermenteur est ensemencé par 200 ml d'une préculture de la souche de*Trichodera reesel*CL 847. La culture est conduitt dans les mémes conditions que pour l'exemple 1; après 162 h, les résultats obtenus sont les suivants: 14,1 g/l de protéines, 8,4 UPF/ml d'activité cellulases, 7,1 U/ml d'activité i- glucosidase. On a obtenu 129 unités cellulases par graie de substrat carboné utilisé. EXEMPLE 4 (comparatif) Une culture de la souche RUT C 30 de Trichoderia reesel est conduite oans ces conaitions icentiques à celles rapportées dans l'exemple 3. Apres 162 h, les risult.cts obzenus sont les suivants: 10,2 g/1 de proc!ines, ,1 UPF/&l d'activ1t: cellulase, 3,3 U/al d'activité -gl1ucosIGcse. On a obtenu 94 un.itis cellulases Oar arazEe de suhstrht cLrbon ct1ilisi. EXEMPLE 5 On prépare une solution aqueuse stérile dénoeme C2 comportant pour 1 litre, 250 g de lactose et 0,625 1 de solution Cl. Un fenrmenteur contenant o, ide solution Cl, 1,3 1 d'eau, 2 g/l d'extrait de levure, 2 ml d'antimousse, 2 ml de Tween 80, 25 9 de pate à papier et 7,5 g de lactose (environ 4,16 g/l> est stérilisé par autoclavage pendant 20 minutes à 120 C. Après refroidissement la température du milieu est ajustée à 27 C, le pH du milieu à la valeur de pH 5. Le fermenteur est alors ensemencé par 0,2 1 d'une préculture liquide de la souche de"richoderma reeseil CL 847. La température est régulée à 27 C pendant les 24 premières heures de la culture puis a 25oC jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé à la valeur de pH 5 pendant toute la durée de la culture par addition d'une solution d'ammoniaque; la concentration en oxygène dissous dans la culture est maintenue au-dessus de 15 % en poids de la concentration saturante par ajustements de la vitesse d'agitation et du taux d'aération. Des dosages de lactose sont effectués au cours du temps sur des échantillons de culture. Après 23 heures, la concentration en lactose dans le moût de fermentation est de 1,2 g/l. La culture est alors allmen- tée stérilement de façon continue par la solution C2; la vitesse d'ali- mentation est modulée de façon à ce que la concentration en lactose ne dépasse pas 2 g/l pendant toute la durée de la culture. La vitesse moyenne d'alimentation en lactose est de 1,9 grame par heure Jusqu'à la centième heure, et de 2,25 grames par heure Jusqu'à la fin de la culture. Après heures, 1 litre de la solution C2 a été InJectee dans la culture, l'alimentation est alors interrompue et le moût de fermentation est récol- té. Les déterminations analytiques sur ce moot donnent les résultats sui- vants: 36 g/l de protéines, 26,3 UPF/ml d'activité cellulases,34 U/ml de A-glucosidase. On a obtenu 246 unités cellulases par gramme de subs- trat carboné utilisé. EXEMPLE 6 (comparatif) Une culture de la souche de"Trichoderma reesef"CL 847 est conduite dans des conditions identiques à celles rapportées dans l'exemple 5, excepté pour l'alimentation en solution C2 qui est effectuée de façon à InJecter un litre de cette solution au cours des 110 premières heures de la culture. Les teneurs en lactose résiduel dans la culture atteignent les valeurs de 22 g/l à 40 heures, et de 6,5 g/l à 85 heures. Après la fin de l'alimentation en solution C2 a la 110ème heure, la culture est d.aLJed V L atdwaxa,t ap saLLaD anb sawaw saL,uos e.aintLnD ap suol.puoa Sal *uoj2esL[d,4s jueAe nalziw al suep sn[3ufl: ,uo 6 ot 4uawa[nas SE uop Lt3J uewleqM esoLnrla: el inod 9:daexa 'L atdwaxa,L op suoj..puoa sat,ueAIns giedgdd.Jnaluacaj un suep sJfjsuel4 quos ainS[nJ.4d a;iaD ap lw OOZ 'q ot sgJdv al6Jau,p la wuoqJea ap anblun aj.nos aumo tja33 uewle4Q asoLnl.a3 ap splod ua % Z ins agniaajja lsa OCú 3 lnUjasaaa em3apo4qljasp contamination bactérienne apparaît dès la 70ème heure; cette contamina- tion devenant de plus en plus importante, l'opération n'est pas poursui- vie au-delà de 138 heures. Les résultats des déterminations analytiques effectuées sur les surnageants de la culture récoltés à 138 heures sont les suivants: 24,3 g/l de protéines, 15,8 UPF/ml d'activité cellulase, ,2 U/ml d'activité -glucosldase. On a obtenu 159 unités cellulases par gramme de substrat carbone utilisé. REVENDICATIONS 1.- Procédé de production aérobie de cellulase par culture d'une souche de "Trichoderma reesei" dans une zone de fermentation renfermant un milieu de nutrition, le procédé comprenant une alimentation en sucre soluble de ladite zone de fermentation et étant caractérisé en ce que: a/ avant d'effectuer ladite alimentation, on laisse d'abord en contact une partie au moins de la culture avec un matériau renfermant de la cellulose et au moins un sucre soluble, les concentrations pondérales de ladite cellulose et dudit sucre soluble par rapport à ladite partie du milieu de culture étant chacune comprise entre 0,01 et 2 % et ledit contact étant maintenu pendant un temps suffisant pour consommer au moins 10 % du sucre et obtenir une concentration en sucre dans le milieu inférieure à 0,3 % en poids, et b/ au cours de la fermentation subséquente, on effectue ladite alimentation en sucre soluble de manière progressive de manière à introduire une quantité de sucre représentant au total au moins 3 % du poids de milieu de culture tout en maintenant la concentration en sucre dans ledit milieu de culture à une valeur inférieure à 0,3 % en poids. 2. - Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'alimentation de la zone de fermentation est effectuée en continu. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel le matériau cellulosique est de la cellulose pure. 4. - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel le matériau cellulosique est une pâte à papier. 5. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel, à l'étape a, les concentrations pondérales de cellulose et de sucre sont respectivement comprise entre 0,2 et 2 % et entre 0,02 et 1 % et le contact est maintenu jusqu'à ce que la concentration en sucre soit inférieure à 0,2 % en poids et qu'au moins 20 % du sucre ait été consommé. 6. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel la teneur en sucre dans l'étape a est comprise entre 10 et 50 % en poids par rapport à la teneur en cellulose et la concentration en sucre au cours de la fermentation (étape b) est comprise entre 0,01 et 0,25 % en poids. 7.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 carac- térisé en ce que la quantité de matériau cellulosique est comprise entre 0,5 et 1 % en poids. 8.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caracté- risé en ce que le sucre soluble est choisi dans le groupe comprenant le lactose, le glucose, le xylose, l'arabinose, le cellobiose ou leurs mélanges. 9.- Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'on emploie le lactose comme sucre soluble. O10.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 carac- térisé en ce que l'on emploie des souches de"Trichoderna reesei"gnOti- ouement améliorées. 11.- Utilisation de la cellulase obtenue suivant l'une des revendications 1 à 10 dans la réaction d'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses.