Brevet FR2550217A1 — publié le 19850208

Procédé Pour détecter des substances nocives pour l'envi.ronnement et indicateur à utiliser pour la mise en oeuvre dudit procédé L'invention se rapporte à un procédé de détection de substances nocives oour l'environnement, dans lequel on détermine l'effet des substances nocives sur des cellules végétales L'invention se rapporte, en outre, à un indicateur à utiliser pour la mise en oeuvre du procédé, Il est connu de déterminer des concentrations 10 de substances nocives au moyen de méthodes d'analyse physique Les résultats de tels procédés ne permettent pas, cependant, de tirer des conclusions directes sur l'effet biologique de substances nocives, car l'effet des substances nocives dépend, non seulement de la 15 concentration, mais également de la combinaison des diverses substances nocives dans l'environnement et, donc, dans l'échantillon à analyser Comme en outre la composition des substances nocives dans des échantillons de l'environnement est, en général, très complexe, 20 et comme les analyses doivent, le plus souvent, être limitées à la détermination de quelques substances nocives importantes, on ne peut tirer en pratique aucune prédiction suffisante sur l'effet biologique dans des conditions d'environnement données, au moyen 25 de résultats d'analyses de ce type. Il est connu que les cellules vivantes réagis- 2 2550217 sent à une modification des conditions de l'environnement par une modification de processus biochimiquesphysiologiques C'est ainsi, par exemple, que la production d'éthane montre la destruction physique 5 de la membrane cellulaire On connait également des essais suivant lesquels ces effets sont établis à l'aide de plantes entières ou à l'aide de cellules ou d'organites présents dans une suspension Des plantes entières ont, cependant, l'inconvénient en 10 tant qu'objets d'essais pour des substances nocives, d'être relativement insensibles aux effets de la substance nocive En revanche, des cellules ou des organites en suspension dans une solution aqueuse sont certes très sensibles vis-à-vis des effets d'une substance 15 nocive, mais n'ont qu'une durée de vie brève et ne sont donc disponibles que pendant peu de temps. L'invention vise un procédé du type mentionné au début du présent mémoire qui, à partir de cellules végétales, rend possible une détermination sensible de l'effet de subtances nocives tout en disposant pendant assez longtemps des échantillons de cellules, en entendant par là également des échantillons de cellules identiques. Le procédé suivant l'invention consiste à immobiliser des protoplastes dans une matrice perméable aux gaz et à l'eau, en vue de ralentir leur sénescence, à soumettre les protoplastes immobilisés au milieu contenant les substances nocives, et à déterminer l'intensité des processus biochimiques-physiologiques 30 modifiés par l'état des substances nocives Comme protoplastes, on peut utiliser par exemple ceux de plantes monocotylédones ou dicotylédones ainsi que des cellules de levure. Il est recommandé d'effectuer l'immobilisation 35 de protoplastes dans une matrice d'alginate de Ca ou également dans une matrice d'alginate de La La matrice d'alginate est constituée pour plus de 90 % d'eau et présente de grands pores Il est ainsi possible, d'une part, que la solution nutritive arrive sans obstacles aux protoplastes D'autre part, cela ne limite en aucune façon le contact des substances nocives avec les protoplastes Il s'est en outre avéré que la sensibilité des protoplastes vis-à-vis des substances nocives augmente considérablement avec l'âge, de sorte 10 que l'on parvient à une augmentation de la sensibilité des cellules Par l'immobilisation elle-même, et par un stockage convenable, qui s'effectue avantageusement à une température comprise entre 2 et 6 C, on atteint, pour des protoplastes immobilisés dans de l'alginate de calcium, une durée de conservation de 10 à 14 jours et dans des protoplastes immobilisés dans de l'alginate de lanthane, une durée de conservation allant jusqu'à trois mois En revanche, des protoplastes en suspension ne peuvent être stockés que pour quelques heures. L'effet des substances nocives sur les protoplastes peut être déteminé par exemple par la mesure de l'inhibition de la ribulose 1,5-biphosphate carboxylase, enzyme la plus importante pour le processus de la photosynthèse (fixation de CO) On détermine 25 radiochimiquement l'absorption de 1 CO 2. Une variante particulièrement avantageuse du procédé suivant l'invention consiste à déterminer la vitesse d'émission d'éthane par les protoplastes. L'éthane qui se forme en tant que produit de la peroxy30 dation d'acides gras insaturés qui sont fixés à la membrane cellulaire, peut être déterminé et simplement par chromatographie en phase gazeuse De très nombreuses mesures ont en outre montré que la formation d'éthane est proportionnelle à la concentration de 35 substances nocives. Le procédé suivant l'invention se sert d'un indicateur qui est caractérisé par des protoplastes végétaux introduits dans une matrice perméable aux gaz et à l'eau Comme matrice, on prévoit une matrice d'alginate de calcium et, de préférence, une matrice d'alginate de lanthane Bien entendu, on peut mettre en oeuvre également d'autres matrices qui permettent, d'une part, qu'une solution nutritive arrive aux protoplastes, mais d'autre part, que les substances nocives 10 y arrivent aussi. L'indicateur peut se présenter sous des formes diverses, un indicateur se présentant sous la forme de petites billes s'étant révélé avantageux et particulièrement maniable, le diamètre des billes étant 15 compris avantageusement entre 1 et 5 mm environ. Dans un autre mode de réalisation de l'indicateur, celui-ci se présente sous la forme d'une bande, l'épaisseur de la bande étant comprise entre 1 et 2 mm environ. Pour fabriquer un indicateur, on peut procéder de la manière suivante. On délaie un aliquote d'une suspensi Qn de protoplastes fraîchement préparée suivant le type de cellules utilisé dans une solution d'alginate de Na 25 isotonique à 3 à 6 % et on réticule au choix par des ions Ca 2 + ou La 3 + Pour fabriquer l'indicateur en forme de bande, on fait avantageusement passer la suspension de protoplastes, se trouvant dans l'alginate de Na, dans des bandes et on ne réticule qu'ensuite par addition d'ions. Pour fabriquer un indicateur sous forme de billes, on fait avantageusement tomber goutte à goutte une solution d'alginate contenant la suspension de protoplastes dans la solution d'agents réticulants ( 10 m M de Ca Cl 2 ou 10 m M de La (NO 3)3 dans une solution isotonique de mannite). L'indicateur est conservé immédiatement, de préférence dans une solution nutritive avec addition d'antibiotiques (pénicilline, streptomycine). Exemple de réalisation 1 On utilise un indicateur sous forme de bande datant de 7 jours, dont la longueur est de 5 cm environ, dont la largeur est de 1 cm environ et dont l'épaisseur est comprise entre 2 et 3 mm et qui 10 contient les protoplastes Vicia-Faba immobilisés. L'indicateur est mis pendant 30 minutes dans une solution qui contient 0, 5 M de mannite comme agent osmotique et 14 micromole de PCP (pentachlorophénol) conme substance nocive On expose ensuite l'indicateur à la lumière ( 200 W/cm 2) à 220 C pendant 1 heure dans un flacon de Fernbach Ensuite, on prélève 1 ml d'échantillon gazeux et on en détermine l'éthane par analyse par chromatographie en phase gazeuse On peut ainsi déterminer la production d'éthane par unité 20 de temps. Une mesure du nombre de cellules mises en oeuvre est la teneur en chlorophylle de l'indicateur utilisé. La détermination de l'éthane donne 135 pmoles -1 -1 d'éthane/(mg Chl)-1 h1 Une mesure de contrôle avec le même indicateur, mais qui n'a pas été soumis à la substance nocive donne 60 pmoles d'éthane (mg Chl)1 h. Exemple de réalisation 2 En procédant comme à l'exemple de réalisation 30 1, on effectue des mesures avec un indicateur contenant des protoplastes Avena-Sativa. La mesure donne 150 pmoles d'éthane (mg Chl) h La mesure de contrôle donne 65 pmoles d'éthane (mg Chl) h Fxemple de réalisation 3 On utilise un indicateur suivant l'exemple de réalisation 1 On le met pendant 30 minutes dans une solution de mannite à 0,5 M qui contient, en outre, 220 P moles d'Hg C 12 comme substance nocive Après avoir sorti les protoplastes de la matrice par un tampon au citrate ( 20 m M; p H 7,6; dans 0,8 M de mannite), on détermine l'activité de l'enzyme ribulose 1, 5biphosphate carboxylase par l'absorption du 14 C A cet effet, on met les protoplastes dans 0,5 ml d' une solution qui contient 0,1 M de tampon tris-HC 1 (p H = 8,3), 5 m M de dithiothréitol, 10 m M de Mg C 12, 50 m M de Na H 14 CO 3 (activité spécifique 7,2 10 Bq -13 p moles), 1 m M de biphosphate de ribulose ainsi que 15 0,8 M de mannite On les expose pendant 30 minutes à une intensité lumineuse de 15 000 lx Ensuite, on prélève la solution et on arrête la réaction par du méthanol ( 75 %) dans le rapport volumique de 1:1. On détermine ensuite l'absorption de 14 CO 2 au moyen 20 d'un compteur de scintillations pour liquides Comme mesure de l'activité enzymatique,on choisit l'absorption de 14 CO 2 en p moles par mg de chlorophylle et par heure. Résultats de la mesure: 100 p moles de 14 CO 2 (mg Ch L) l 25 h-1) Echantillon de contrôle (sans substance nocive): 1750 p moles de 14 CO 2 (mg Ch L)-1 h 1). REVENDICATIONS 1 Procédé de détection de substances nocives pour l'environnement en déterminant l'effet des substances nocives sur ds cellules végétales, caractérisé en ce qu'il consiste à immobiliser des protoplastes dans une matrice perméable aux gaz et à l'eau, en vue de ralentir leur sénescence, à soumettre les protoplastes immobilisés au milieu contenant les substances nocives et à déterminer l'intensité des processus biochimiques10 physiologiques modifiés par l'effet des substances nocives. 2 Procédésuivantla revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire les protoplastes en vue de les immobiliser dans une matrice d'alginate 15 de Ca. 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire les protoplastes en vue de les immobiliser dans une matrice d'alginate de La. 4 Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à maintenir les protoplastes immobilisés pour les stocker dans une solution nutritive à une température comprise entre 2 et 6 C. 5 Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à déter- miner l'inhibition de la ribulose 1,5-biphosphate carboxylase. 6 Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer 5 la vitesse d'émission d'éthane par les protoplastes. 7 Indicateur de détection de substances nocives à l'environnement, caractérisé par des protoplastes végétaux introduits dans une matrice perméable aux gaz et à l'eau. 8 Indicateur suivant la revendication 7, caractérisé en ce que les protoplastes sont introduits dans une matrice d'alginate de Ca. 9 Indicateur suivant la revendication 8, caractérisé en ce que les protoplastes sont introduits 15 dans une matrice d'alginate de La. Indicateur selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la matrice contenant les protoplastes se présente sous la forme de billes. 11 Indicateur selon la revendication 10, carac20 térisé en ce que le diamètre des billes est compris entre 1 et 5 mm environ. 12 Indicateur suivant l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la matrice contenant les protoplastes est sous la forme d'une bande. 13 Indicateur suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'épaisseur de la bande est comprise entre 1 et 2 mm environ.