Brevet FR2554127A1 — publié le 19850503

La présente invention se rapporte à un procédé de diagnostic d'infections et elle concerne, plus particu- lièrement, un titrage à l'immunosorbant lié aux enzymes pour effectuer un diagnostic sérologique de l'infection par virus de leucémie bovine parmi le bétail. On connait déjà des procédés directs de diagnostic de l'infection par virus de leucémie bovine parmi le bétail. Ces procédés comportent en général l'isolement et la culture des lymphocytes. Cette façon d'aborder le problème est plutôt compliquée et longue et l'utilisa- tion régulière pratique d'un tel procédé est limitée. En outre, on a trouvé en général que de tels procédés directs sont moins sensibles que les procédés sérologiques. On a trouvé que l'infection par le virus de leucémie bovine (VLB) parmi le bétail a pour effet la production d'anticorps spécifiques viraux pour une glycoprotéine (gp51) qui est présente dans la surface virale et pour la protéine principale des virions du noyau (p52 ou p24). Etant donné que ces anticorps fournissent une indication précise de l'infection par le virus de leucémie bovine, leur détection par des tests sérologiques est une façon éfficace d'identification du bétail infecté par le virus de leucémie bovine. Un procédé sérologique connu dans ce but est le test d'immunodiffusion du gel d'agar-agar (AGID). Dans un tel test, on introduit une composition d'antigène, qui est en général principalement gp51, dans un puits ménagé dans une mince couche de gel d'agar-agar. On place dans un autre puits un échantillon de sérum qu'on doit tester. Si des anticorps au virus de leucémie bovine sont pré- sents dans le sérum, ils vont se combiner avec l'anti- gène gp de VLB et former une ligne visible dans l'agar- agar entre les puits. On sait cependant, que ce test est moins sensible que d'autres tests particulièrement au cours des premiers stades de l'infection et que, dans certains cas, on obtient des réactions négatives fausses. D'autre part, les réaction d'une précipitation faible donnent des résultats équivoques. En outre, étant donné que l'antigène gp utilisé dans de tels tests est une composition brute, il tend à contenir des protéines de sérum foetal des veaux en des concentrations élevées. Ces protéines donnent des lignes de précipitine avec le sérum bovin contenant des iso-anticorps. De tels anticorps sont courants parmi le bétail immunisé par des vaccins contenant des protéines bovines, parmi le bétail pré-immunisé contre la babésiose et la piroplas- mose par transfusion du sang bovin et aussi parmi les vaches multipares. D'une façon normale, les lignes de précipitine dues à la protéine bovine dans les composi- tions d'antigène gp51 devraient donner des réaction de non-identité ou d'identité partielle avec les lignes adjacentes de précipitine témoin. Cependant, dans les conditions d'un test de routine, de telles réactions peuvent être très difficiles à reconnaître ou peuvent être sujettes à des erreurs imputables à la "rédaction". Il en est particulièrement ainsi dans les cas o les lignes de précipitine sont faibles ou diffusées, ce qui se produit fréquemment. De ce fait, on obtient un résultat de test qui est subjectif et non fiable. Les seuls sérums qu'on peut titrer avec précision sont donc les sérums donnant des lignes de précipitine distinctes. Un autre inconvénient encore de ce test est qu'il ne convient pas pour des travaux à grande échelle et n'est pas facile à automatiser et en outre il exige une durée d'incubation relativement longue, c'est-à-dire de l'ordre de 48 heures. Il est également connu d'utiliser un titrage de radio-immunoprécipitation avec gp51 purifié marqué d'iode radioactive à titre de marqueur (RIAgp). On sait que ce test est plus fiable que le test AGID en parti- 3 2554127 culier lorsque les titres des anticorps ne sont pas très élevés. L'un des problèmes avec ce test est la nécessité de disposer d'un appareillage spécial tel qu'un compteur gamma, afin de mettre en oeuvre le test. Il est également nécessaire d'avoir un équipement spécial pour purifier l'antigène à un état d'homogénéité. En outre, ce test exige une certaine qualification pour l'effectuer, ainsi que la nécessité d'utiliser des techniques appropriées de sécurité lors de la manipula- tion de la matière radioactive. Un autre type connu de test est le titrage à l'immunosorbant lié aux enzymes (ELISA) qui offre l'avantage d'être pratique et aussi peu onéreux que le test AGID, tout en donnant des résultats qui sont accep- tables. En outre, il n'implique pas certains des pro- blèmes qu'on rencontre avec le test RIA gp. On peut se référer par exemple à Ressang et ai. "Enzyme Linked Immunosorbent Assay For The Detection of Antibodies to Bovine Leukosis Virus", Ann. Rech. Vet. 1978, 9(4) pp. 663-666; Behrens et al., "Comparative Studies on the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay and Immunodiffu- sion Test and the Diagnosis of Enzootic Bovine Leukosis", Quatrième Symposium International sur la leucose Bovine, pp. 173-184; Todd et al., "Use of Controlled Antigen to Improve the Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Enzootic Bovine Leukosis Antibodies, Veterinary Record (1982) 110, pp. 307-308; Poli et al., "Microplate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Bovine Leukemia Virus Antibody", Journal of Clinal Microbiology, janvier 1981, pp. 46-48; Graves et ai, "Comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay with an Polykaryocytosis Inhibition Assay and the Agar-Gel Immunodiffusion Test for the Detection of Antibodies to Bovine Leukemia Virus", Am. J. Vet. Res. Volume 43, Numéro 6, pp. 960- 966; Biancifiori et al., "Elisa Tests for Detection 25541Z? of Antibodies to Enzootic Bovine Leukosis Virus", Qua- trième Symposium International sur la Leucose Bovine, pp. 167-172 et Todd et al., "An Enzyme-Linked Immuno- sorbent Assay for Enzootic Bovine Leukosis Virus Anti- bodies", Vet. Rec. 1980, 107 pp. 124-126. L'un des problèmes sérieux se posant avec les tests ELISA connus est que les sérums provenant de cer- tains animaux, dont l'infection éventuelle par VLB n'est pas certaine, donnent des fausses réactions posi- tives. Ces fausses réactions positives semblent provenir de la liaison de l'immunoglobuline avec les récipients en matière plastique qu'on utilise pour le test ELISA. Selon le procédé ELISA employé, environ 1 à 30 % de sérum du bétail non atteint par VLB vont donner des fausses réactions positives, ce qui est un taux absolu- ment inacceptable. On peut minimiser ce problème dans une certaine mesure en comparant les réactions d'un sérum testé dans des récipients avec et sans antigène. Cependant, si la réaction dans le récipient sans anti- gène est trop élevée, il est impossible d'identifier l'échantillon. En raison de la fréquence apparente des réactions positives fausses dans les techniques connues, il existe un besoin certain d'améliorer le test ELISA en ce qui concerne la spécificité, la sensibilité et le caractère pratique, afin que ce test soit supérieur aux tests ELISA connus et donne des résultats efficaces de la même façon que le test RIA gp. La présente invention a permis de résoudre ce pro- blème en réalisant un test ELISA dans lequel on utilise une plaque de test présentant une série de puits. Au moins certains des puits sont enduits d'un antigène au virus de leucémie bovine. Après incubation et lavage, on peut réaliser le blocage des sites de liaison non spécifique en appliquant une solution d'un sérum animal approprié. On peut mélanger les sérums du test avec la solution du sérum animal de blocage ou bien on peut l'introduire directement dans les puits. Après avoir effectué cette opération, on procède à un supplément d'incubation et de lavage. On introduit dans les puits une enzyme liée à un anticorps ("analyte enzymatique") capable de reconnaître l'immunoglobuline bovine, puis on effectue un supplément d'incubation et de lavage pour éliminer l'analyte non combiné. On introduit un substrat contenant un chromagène dans les puits et on réalise un stade supplémentaire d'incubation. On lit ensuite le résultat de la réaction ou on l'arrête et on peut déterminer visuellement, à l'oeil nu ou par l'entremise d'un instrument optique convenable tel qu'un spectrophotomètre, la présence ou l'absence d'une infec- tion par virus de leucémie bovine. On utilise les maté- riaux et 'les paramètres opératoires préférés. En conséquence, les principaux buts de la présente invention sont de fournir: - un procédé de diagnostic sérologique du virus de leucémie bovine, procédé qui est hautement spécifique, possède la sensibilité désirée et est pratique pour un emploi de routine permettant d'obtenir les résultats en peu d'heures; - un test ELISA qui réduit efficacement les réac- tions des sérums exempts d'anticorps VLB à un niveau insignifiant; - un test ELISA qui ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de matières radioactives: - un test ELISA dont la mise en oeuvre est peu coûteuse; - un test ELISA qui n'exige pas de personnel spé- cialisé; - un test ELISA qui réduit la liaison non spécifi- que de sérum contenant l'anticorps VLB; - un test ELISA bien adapté à une détermination visuelle à l'oeil nu des résultats obtenus; et - d'autres objectifs qui ressortiront à la lecture de la description ci-après en regard des dessins annexes sur lesquels: la figure 1 est un schéma général d'un mode de mise en oeuvre préférée de l'invention; la figure 2 est une vue par en-dessus d'une plaque utilisable dans la présente invention; la figure 3 est une vue par en-dessus d'un puits dans la plaque représentée sur la figure 2; et la figure 4 est une coupe transversale du puits de la figure 3 par la ligne 4-4 de celle-ci. Dans le présent mémoire, quand on parle d'une dé- termination visuelle à "l'oeil nu", on englobe la déter- mination par une personne qui porte ou utilise des len- tilles correctrices d'un type quelconque mais à l'exclusion d'un équipement tel qu'un spectrophotomètre. Parmi les nombreuses particularités qui contribuent au succès du test ELISA de la présente invention, il convient de citer l'utilisation d'un sérum animal comme agent de blocage de la liaison non spécifique de l'immu- noglobuline bovine sans interférer de façon notable avec les réactions spécifiques. Sont également d'un intérêt certain les remarquables techniques de lavage qu'on emploie après les premier et second stades d'incu- bation. La solution de chromagène comme substrat contri- bue également d'un façon certaine à l'obtention efficace d'un bon résultat en raison de sa haute sensibilité, faible toxicité et bonne stabilité. Dans le mode de mise en oeuvre préféré de la pré- sente invention, on effectue la séquence suivante d'opérations. En se référant à la figure 1, on va résumer le procédé alors que les détails concernant chaque stade seront donnés plus loin. On fournit une plaque convena- ble présentant une série de puits et permettant de tes- ter un certain nombre d'échantillons. (Dans un but de commodité de nomenclature, les stades indiqués sur la figure 1, ont été désignés par des numéros). Environ la moitié 2 des puits sont enduits d'un antigène VLB, après quoi on incube les puits en 4 et on les lave en 6 pour enlever l'antigène non combiné. On peut ensuite emmagasiner la plaque, si on le désire (8). Un tampon ELISA qui comprend (a) un sérum de blocage pour bloquer la liaison non spécifique des immunoglobulines bovines au récipient en matière plastique dans (b) un tampon de force ionique élevée, est ensuite introduit dans les puits 14 et les sérums à tester sont également introduits dans les puits 14, après quoi on les incube en 16 et on lave en 18 pour enlever l'anticorps non combiné. On peut mélanger au préalable le tampon ELISA et le sérum et introduire ensuite le mélange dans les puits, après quoi on effectue les stades d'incubation 16 et de lavage 18. Une technique modifiée mais moins avantageuse con- sisterait à introduire le tampon ELISA dans les puits, à incuber, à laver pour éliminer l'excès de la matière et ensuite à introduire les sérums testés dans les puits contenant le tampon ELISA sans sérum, puis à incuber et à laver l'ensemble. Les sérums testés doivent être ajoutés au moins à un puits avec antigène et un puits qui ne contient pas d'antigène. On ajoute ensuite l'analyte enzymatique 20 dans les puits, on incube en 22 et on lave en 24 pour éliminer l'analyte non combiné. On peut alors arrêter la réaction en 30 ou lire son résultat. Dans la plaque 38 représentée sur la figure 2, on forme une série de 96 puits qui sont, de préférence, sensiblement cylindriques. La plaque peut être un élé-- ment unitaire en matière plastique, les puits étant d'une dimension sensiblement égale et ayant une capacité d'environ 100 à 300 microlitres. La plaque peut être for- mée en un matériau approprié quelconque comme, par exem- ple, le polystyrène ou le chlorure de polyvinyle. Dans l'exemple représenté, les puis sont agencés en une série de colonnes 1 à 12 et de rangées A à H. En général, on préfère d'alterner les rangées quand on effectue l'en- duction par l'antigène, afin de faciliter la lecture des résultats. Par exemple, on peut enduire avec l'anti- gène les puits des rangées A, C, E et G et laisser sans enduit d'antigène les puits dans les rangées B, D, F et H. Les puits 40 et 42 peuvent servir comme puits pour le sérum témoin positif faible avec l'antigène et les puits 44 et 46 peuvent servir comme puits de sérum témoin posi- tif faible sans antigène. Afin d'empêcher un écoulement indésirable de la matière d'un puits vers un puits adjacent, on peut (voir figures 3 et 4) former des puits dans la plaque qui sont entourés d'une barrière annulaire continue faisant sail- lie vers le haut 48. Outre les puits qui seront traités de la façon dé- crite en regard de la figure 1, on préfère fournir cer- tains puits supplémentaires pour contenir du sérum témoin et aussi pour servir de puits témoins. La nature et la fonction exacte des puits témoins seront expliquées plus loin. Exemple 1 On utilise un plaque qui peut être une plaque en polystyrène pour microtritrages du type décrit plus haut. On enduit initialement la moitié des puits avec l'antigène de virus de leucémie bovine. On peut réaliser cette opération en recueillant le fluide surnageant de cellules productrices de VLB, en enlevant les gros débris par centrifugation et en soumettant le VLB à une centrifugation dans le surnageant clarifié sur une couche dense de saccharose. On peut obtenir les cellules de VLB d'une source appropriée quelconque, comme le com- prendront les spécialistes, mais on préfère employer une culture cellulaire mono-couche produisant VLB continuel- lement et sensiblement exempte d'autres virus et agents accidentels. Un exemple d'un tel moyen connu consiste à employer des cellules de poumons de chauve-souris infectés par VLB, comme il est enseigné par Graves et Ferrer dans Cancer Research, Vol 36, pp 4152-4159, 1976. Une autre source convenable est constituée par les cellules de reins de foetus d'agneau infectées par VLB comme il est enseigné par Van der Maaten et al, Bibliotheca Haemato- logica, Vol 43, pp 360-362 (1976). On récupère les virus et on règle à environ 5 à 20 pg/ml avec du phosphate ou une solution saline tris- tamponnée (0,15M NaC1, 0,05 tampon PO4, pH 7,0-7,4) ("PBS"). On ajoute la solution d'antigène aux puits en des quantités d'environ 200 microlitres par puits en rangées alternées. On soumet ensuite la plaque à une première incubation à environ 3 à 25 C, pendant environ 1 à 17 heures. Après cette incubation, on enlève l'anti- gène non combiné par un premier lavage avec une solution isotonique convenable par exemple une solution phospha- tée ou une solution saline tris-tamponnée. A ce stade, on peut éventuellement sécher les pla- ques et les emmagasiner à sec à une température d'envi- ron 4 C ou plus basse pendant des longues périodes (pouvent atteindre plus de 10 mois si on le désire) avant utilisation dans le test. Dans le test préféré, comme on le voit sur la fi- gure 1, on ajoute environ 100 à 200 microlitres du tampon ELISA dans les puits dans lesquels on introduit ensuite à 20 microlitres des sérums bovins testés. (On pré- fère que le rapport des sérums testés au tampon ELISA soit d'environ 1:5 à 1:10). Le tampon ELISA contient, de préférence, environ 2 à 20 % du sérum bloquant animal (sérum pour bloquer les liaisons non spécifiques des immunoglobulines bovines au récipient en matière plas- tique). On préfère que le sérum animal soit choisi dans le groupe comprenant le sérum de chèvre, le sérum de poulet, le sérum de cobaye et le sérum de brebis, avec une préférence pour le sérum de chèvre. Il est également souhaitable d'ajouter à la solution environ 0,25 à 2,OM et, de préférence, environ 0,5 à 1,0M de NaCl et 0,01 à 0,2M de phosphate ou de tris-tampon à pH 6 à 8. On incube ensuite les puits à environ 4 à 25 C pendant environ 1 à 16 heures. Un stade facultatif de lavage 12 enlève tout excès. Une variante également préférée consiste à mélan- ger le tampon ELISA avec les sérums de test et à intro- duire le mélange dans des puits. Une technique moins préférée consiste à introduire le tampon ELISA dans les puits et ensuite à incuber à environ 4 à 25 C pendant environ 1 à 16 heures. On peut alors effectuer un stade de lavage pour enlever l'excès de la matière. On peut emmagasiner à sec les plaques ainsi traitées à une température de 4 C pendant plus de 3 mois. Si le tampon ELISA n'est pas enlevé avant emmagasinage, le sérum d'essai peut être introduit directement dans les puits. Si le tampon ELISA a été enlevé avant l'emmagasinage, on peut diluer le sérum testé et l'introduire dans les puits ou bien l'introduire dans des puits qui contien- nent un diluant convenable tel qu'un tampon ELISA ou un tampon ELISA sans sérum bloquant. A titre de précaution, on préfère en général effec- tuer le titrage des sérums testés en double. On incube ensuite la plaque à une température d'environ 3 à 37 C pendant environ 1 à 16 heures. On lave les puits dans une solution d'eau distillée contenant environ 0,01 à 0,2 % d'un surfactif ou détergent convenable. Un sur- factif qui convient est le monolaurate de polyoxyéthylène- sorbitanne vendu sous la marque déposée "Tween 20" en une concentration d'environ 0,05 %, pour l'usage envisagé. On pourrait effectuer cinq ou un plus-grand nombre de lavages rapides mais les demandeurs préfèrent quatre incubations de 1 minute dans la solution de lavage. On dilue ensuite l'analyte enzymatique dans le tam- pon ELISA (sans sérum) à environ 50 à 70 ng/ml et, de préférence, d'environ 50 ng/ml. On l'ajoute dans les puits en des quantités d'environ 200 p1 par puits. La matière préférée dans ce but est l'anti-sérum préparé chez les chèvres ou les lapins qui réagissent à l'immu- noglobuline bovine et que l'on couple chimiquement au peroxydase de raifort. On préfère que l'anti-sérum soit purifié de manière à ne contenir que des anti-corps qui réagissent avec l'immunoglobuline bovine, ce qu'on ap- pelle aussi "purification d'affinité". Après l'incuba- tion pendant environ 15 à 60 et, de préférence, environ minutes à environ 20 à 37 C, on lave les puits avec de l'eau distillée pour éliminer l'analyte enzymatique bovin non combiné. On peut effectuer plusieurs lavages rapides mais les demandeurs préfèrent quatre lavages d'une minute dans l'eau. Ultérieurement, on introduit un substrat chromagène dans les puits à raison d'environ 200 microlitres par puits. Cette solution peut être constituée par H202 dans une solution tamponnée convenable et un chromagène approprié. Le chromagène est une substance qui est in- colore jusqu'à ce qu'elle donne des électrons dans la réaction avec le peroxydase, après quoi, elle développe une couleur intense. Une solution préférée comprend environ 0,2 microlitre de H202 à 30 % par ml d'une solution (0,11 mg/ml d'un tampon au citrate 0,05M à pH 4,0) d'acide 2,2'azino-di-(3-éthylbenzothiazoline) sulfonique. Cette matière est disponible chez plusieurs fabricants, notamment à la Sigma Chemical Company. Les puits contenant le substrat-chromagène sont alors soumis à une incubation à environ 15 à 39 C pendant 5 à 60 mi- nutes et, de préférence, environ 20 à 30 minutes. On lit ensuite la réaction ou on l'arrête par l'introduction dans les puits d'un acide convenable. Une matière qui convient pour arrêter la réaction est environ 50 à 100 microlitres d'acide fluorhydrique en une concentration d'environ 0,1 àO,5 N et, de préférence, d'environ 0,2N. On préfère que le pH de l'acide soit d'environ 3,0 à 3,5. Une inspection visuelle par une technique qui sera décrite par la suite, permet la détermination pour savoir si l'infection par le virus de leucémie bovine est ou n'est pas présente dans le sérum testé. En vue de fournir un test plus efficace, on utilise de préférence certains témoins, dans la présente inven- tion. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, on pratique dans chaque plaque au moins quatre puits pour chaque sérum à tester et quatre puits témoins pour assurer que le titrage a été effectué dans des conditions convenables pour faciliter l'estimation des résultats. On incube chaque sérum testé, dilué comme décrit plus haut dans le tampon ELISA, dans deux puits non en- duits et dans deux puits préalablement enduits par l'antigène VLB. Alors qu'on peut effectuer le test dans des puits individuels par opposition aux puits doubles c'est-à-dire deux de chaque type, on obtient ainsi une garantie supplémentaire et on facilite l'estimation visuelle. Le témoin sans antigène détermine le degré auquel le sérum en question se lie non spécifiquement au puits. La sensibilité et la spécificté du test dépen- dent de la différence des liaisons avec les puits enduits par l'antigène et les puits non enduits. De façon idéale, avec un sérum contenant l'anticorps VLB, on observe une forte liaison avec les puits enduits d'antigène mais aucune liaison notable avec les puits non enduits. Le degré de liaison se traduit par une intensité de couleur, c'est-à-dire qu'une forte liaison donne une couleur dé- finie telle qu'un vert foncé alors que l'absence de liaison reste incolore. Pour déterminer si le titrage est d'une sensibilité optimale, on incube deux puits non enduits et deux puits enduits d'antigène VLB par un sérum positif faible. On règle le titre de ce sérum positif faible de manière à donner une réaction minimale de coloration qu'on consi- dérera comme positive. Avec une plaque contenant 96 puits l'emploi de quatre de ces puits pour le sérum témoin positif faible, laisse 92 puits pour le test. Ceci permet le test en deux exemplaires de 23 sérums. L'un des avantages du procédé de la présente inven- tion est que la détermination précise du test peut se faire visuellement en comparant la couleur développée dans les puits enduits de VLB et la couleur des puits témoins. Cette détermination peut se faire à l'oeil nu ou à l'aide d'un équipement convenable tel que, par exemple, un spectrophotomètre. Pour ce qui est de la détermination visuelle à l'aide d'un instrument tel qu'un spectrophotomètre, on peut déterminer un pouvoir absorbant à environ 405 à 415 nm de chaque puits à l'aide d'un spectrophotomètre ELISA d'un type approprié vendu dans le commerce. Les valeurs de D.O. des sérums exempts d'anticorps VLB sont en général au-dessous de 0,4 unité et les différences des valeurs de D.O. données par le même sérum dans les puits contenant l'antigène au VLB et les puits contenant l'antigène- témoin sont en général inférieures à 0,05 unité. Afin de fournir un supplément d'information concer- nant le mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, 2 5 5 4 12 7 on va donner après un autre exemple. Exemple 2 En revenant à la figure 2 pour un guidage général, on munit les rangées alternées d'une plaque de micro- titrage en polystyrène présentant 96 puits sensiblement cylindriques de 200 microlitres, d'antigène BLV purifié avec un coussin de saccharose à environ 10 pg/ml dans une solution de tampon phosphaté. Les rangéestémoins (non traitées) ne subissent aucun traitement. On incube ensuite la plaque à 4 C pendant 16 heures. Apres l'incu- bation, on enlève l'antigène non combiné par lavage avec une solution de tampon phosphaté. On ajoute 200 micro- litres de tampon ELISA dans tous les puits et ensuite on introduit 20 microlitres de sérum positif faible ou de sérum de test dans deux puits enduits d'antigène VLB et deux puits adjacents non enduits d'antigène VLB. On teste tous les sérums aussi bien dans les puits conte- nant l'antigène VLB que dans les puits contenant l'anti- gène témoin. Comme on le préfère, on effectue tous les titrages des sérums testés en double. Après deux heures d'incubation à température ambiante, on lave les puits à quatre reprises avec une solution à 0,05 % d'un déter- gent convenable tel que le "Tween 20" (monolaurate de polyoxoéthylène-sorbitanne). Chaque lavage est une incu- bation pendant une minute dans la solution de lavage. Ultérieurement, l'immunoglobuline anti-bovine de lapin purifiée pour affinité couplée chimiquement au peroxydase de raifort conjugué est diluée à environ ng/ml dans le tampon ELISA et est ajoutée dans les puits (200 pl par puits) que l'on incube ensuite avec les sérums du test et les sérums bovins-témoins. Après incubation pendant 30 minutes à environ 25QC, on lave les puits avec de l'eau distillée à quatre reprises pour enlever l'analyte enzymatique non combiné. Ce la- vage contribue à-une nouvelle réduction de la réactivité non spécifique. On ajoute ensuite environ 200 microlitres d'une solution de substrat-chromagène ayant une concen- tration de 0,11 mg d'acide 2,2'-azino-di-(3-éthylbenzo- thiazoline) sulfonique et 0,2 p1 de H202 à 30 % par ml d'un tampon de citrate à pH 4,0. Si on désire lire les résultats par voie spectrophotométrique ou de conserver les résultats, on arrête la réaction après 25 minutes environ en ajoutant 50 microlitres d'acide fluorhydrique 0,2N à pH 3,3. On détermine ensuite visuellement les résultats du test soit à l'oeil nu soit à l'aide d'un instrument tel qu'un spectrophotomètre. Exemple 3 En se référant de nouveau à la figure 2, on va dé- crire un exemple supplémentaire en présumant qu'un échantillon spécifiquede sérum de test a été introduit dans les puits 13, A4, B3, B4 et que les puits A1, A2, B1, B2 fonctionnent comme des puits témoins positifs faibles et qu'on peut effectuer une lecture directe. La rangée A comporte des puits contenant de l'antigène alors que les puits de la rangée B ne contiennent pas d'anti- gène. Après l'achèvement des tests, les puits A1 et A2 sont d'une couleur plus foncée (vert) représentant l'intensité minimale de couleur qu'on peut considérer comme un résultat positif du test. Alors que les puits B1 et B2 restent clairs, les puits témoins d'antigène négatif B3 et B4 sont également clairs. Une couleur foncée (vert) dans les puits A3 et A4 au niveau de la couleur dans les puits A1, A2 ou à un niveau plus intense sera considérée comme un résultat positif du test. Si les puits A3 et A4 sont clairs ou d'une couleur moins intense que les puits A1 et A2, le résultat du test est négatif. On conçoit que le test pourrait être exécuté si A1 et B1 servent de témoin positif faible et que les puits A3 et B3 sont des puits de test. On préfère employer deux puits pour chaque fonction afin de donner un sup- plément de confirmation de précision. Le procédé de l'invention contribue à une meilleure spécificité en réduisant la couleur de fond à un niveau négligeable dans les puits témoins d'antigène. La spéci- ficité du test est telle que même les sérums faiblement positifs peuvent être identifiés avec précision en rai- son de l'absence virtuelle d'un fond indésirable dans les puits-témoins. Le test de l'invention est également pratique en ce qu'un personnel sans qualification spé- ciale et sans aucun équipement spécial peut traiter un grand nombre d'échantillons en un temps relativement bref. En outre, le test est d'un emploi économique et les plaques ainsi que les matériaux associés ont une durée de conservation acceptable. On peut effectuer une déter- mination visuelle précise soit à l'oeil nu soit à l'aide d'un équipement approprié. Alors que dans le but de la clarté de la descrip- tion on a présenté une plaque de microtitrage à 96 puits, on conçoit qu'on pourrait employer d'autres types de plaques, des nombres différents de puits, et d'autres moyens permettant d'établir un groupe de récipients pour des tests uniques ou multiples, par exemple une série de tubes séparés ou d'autres récipients. Dans un but de commodité, le terme "puits" englobe toutes les variantes des récipients utilisables. Il va de soi qu'on peut apporter diverses modifi- cations aux modes de mise en oeuvre qui ont été décrits sans sortir pour cela du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic d'une infection, caracté- risé en ce qu'il consiste à fournir une plaque de test (38) présentant une série de puits (40); à enduire au moins certains de ces puits (42) avec un antigène; à effectuer une première incubation de la plaque; à effectuer un premier lavage de la plaque pour enlever l'antigène non combiné; à bloquer des sites non spéci- fiques de liaison en appliquant une solution d'un sérum de blocage aux puits; à ajouter des sérums de test à au moins certains puits; à effectuer une seconde incu- bation de la plaque; à effectuer un second lavage pour enlever les composants non combinés; à introduire un analyte enzymatique dans les puits; à effectuer une troisième incubation de la plaque; à effectuer un troi- sième lavage pour enlever le sérum de test non combiné; à introduire un substrat-chromagène dans les puits; à effectuer une quatrième incubation de la plaque; et à déterminer visuellement par la couleur si les anti- corps à l'infection sont présents ou non dans le sérum de test. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit ledit sérum de test dans la solu- tion bloquante avant d'admettre cette solution bloquante dans les puits. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après l'introduction de la solution de sérum bloquant dans lesdits puits (40) et avant ladite seconde incubation, on introduit les sérums de test dans les puits et on les mélange avec le sérum de blocage. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on prépare la solution de sérum de blocage sous forme d'une solution de sérum tamponnée d'une force ionique élevée, et ladite solution de sérum tamponnée contient environ 2 à 20 % de sérum. 5. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce qu'on fournit au moins un puits-témoin contenant de l'antigène négatif (44) pour chaque échantillon de sérum testé; on n'introduit pas d'antigène dans les puitstémoins d'antigène négatif; et on introduit la solution de sérum bloquant et ledit sérum de test dans les puits témoins contenant de l'antigène négatif. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on arrête la réaction après la 4ème incubation. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on fournit au moins un puits témoin (42) à sérum positif minimum; on introduit dans lesdits puits les concentrations sériques minimales d'anticorps qu'on présume être positives, de sorte que les résultats des sérums testés peuvent être comparés avec ledit puits témoin de sérum positif minimum; et on détermine visuel- lement si le sérum testé est positif en comparant la différence de sa réaction de couleur dans les puits enduits d'antigène et les puits à antigène négatif avec les différences des réactions de couleur du sérum témoin positif minimum. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de sérum de blocage contient une matière choisie parmi les sérums de chèvre, de poulet, de cobaye et de brebis. 9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite solution de sérum tamponnée est envi- ron 5 à 10 % de ce sérum dans une solution saline tam- ponnée au phosphate; en ce que ladite solution de blocage contient environ 0,25 M à 2,0 M de NaCl et environ 0,01M à 0,2 M d'un tampon phosphaté ayant un pH d'environ 6 à 8; et encore en ce qu'on mélange les sérums de test avec la solution de blocage avant l'in- troduction des sérums dans les puits, lesdits sérums de test étant dilués dans un rapport d'environ 1:5 à 1:10 par la solution de sérum tamponnée; on introduit le sérum de test dans une première série des puits con- tenant l'antigène et une seconde série de puits ne con- tenant pas d'antigène; on fournit un sérum témoin à faible titre desdits anticorps et on introduit le sérum témoin dans au moins un puits contenant l'antigène et au moins un puits ne contenant pas l'antigène. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme analyte enzymatique, une immunoglobuline anti-bovine de chèvre ou de lapin purifiée à affinité, on couple ladite immunoglobuline purifiée à affinité avec la peroxydase de raifort et on incorpore à titre de chromagène de substrat une matière de titrage du peroxydase. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le diagnostic est un diagnostic sérologique de l'infection par le virus de leucémie bovine.