Brevet FR2558597A1 — publié le 19850726

La presente invention est relative à un test sflr, pour déterminer la présence ou l'absence d'anticorps dans le sérum. Les anticorps qui sont hautement spécifiques de pro téines étrangères qui provoquent ou induisent leur formation, constituent des facteurs plasmatiques specifiques et donnent un tableau assez exact de l'état immun d'un individu. I1 est parfois important, voire capital, de connaltre cet etat immun et notamment l'état immun sérum vis-à-vis de micro-organismes (bactéries, levures, parasites) ou de virus. Des tests du type immunologique utilisés jusqu'à maintenant pour la détermination d'un état immun, vis-à-vis de micro-organismes ou de virus chez l'homme, nécessitent l'uti- lisation de micro-organismes ou de virus ou de préparations d'antigènes, de micro-organismes ou de virus. Bien qu'en général des micro-organismes, des virus inactivés ou des antigènes purifiés soient utilisés, il faut agir avec précaution en raison de la présence possible d'agents infectieux résiduels et dans la plupart des cas, il est recommandé de manipuler comme si des agents potentiellement infectieux étaient presents. La présente invention s'est par conséquent donné pour but de pourvoir à un nouveau test pour la détection d'anticorps dans un sérum, qui répond mieux aux nécessites de la pratique que les tests antérieurement connus en ce qu'il est sflr, de manipulation facile et totalement inoffensif et qu'il nécessite pas l'isolement ou la culture préalable de l'agent infectieux (micro-organismes ou virus) en cause. Conformément à la présente invention, cet inconvénient serieux est surmonte par l'apport d'un nouveau test du type immunologique pour la détection d'un état immun vis-à-vis de microorganismes ou de virus, reposant sur l'utilisation d'une lignée cellulaire produisant des anticorps manoclonaux qui reconnaissent les anticorps humains spécifiques du microorganisme ou du virus considéré. La présente invention a également pour objet des nécessaires ou kits pour déterminer un tel état immun virai.La présente invention est applicable à tous types de virus ou de bactéries comme la rubéole, la sypllilis, la lèpre, etc. ou mamie à des maladies dont l'agent causal n'a pas encore été isolé. La présente invention fournit donc de nouvelles lignées de cellules produisant des anticorps qui reconnaissent des anticorps humains présents dans le sérum. Plus spécifiquement, elle fournit des cellules hybridomes murines, qui produisent des anticorps monoclonaux qui reconnaissent des anticorps humains présents dans le sérum. Ces anti-anticorps sont utilisés dans un dosage gour détecter et établir le titre d'anticorps présents dans le sérum humain. Conformément à la présente invention, les antianticorps, parfois dénommés anti-idiotypes, sont employes à la place des antigènes classiques utilisés dans des immunodosages pour une telle détermination. Les nouveaux anti-anticorps ont une propriété de fixation analogue à ceux des antigènes correspondants et ils peuvent ainsi remplacer ces antigènes dans des dosages de type RIA, Far exemple. La description détaillée qui va suivre, qui illustre la mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, est relative à des anti-anticorps de la rubéole ; mais, il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple de mise en oeuvre est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. Des immunogènes sont préparés à partir de stocks de sérums d'individus ayant des anticorps vis-à-vis de la rubéole, à savoir du sérum R+, provenant d'une fraction d'IgG de sérum R et d'érythrocytes du sang humain enduites du virus de la rubéole qu'on a fait réagir avec du sérum R Des cellules de rate de souris BALB/c immunisées avec ces immunogènes, sont fusionnées avec des cellules de myélome de souris NS-1. En utilisant une méthode de screening ELISA, qui comprend IgG-R et IgG-R en phase solide et une détection par l'anti-IgG de souris lié à une peroxydase, on a isolé cinq lignées cellulaires hybrides qui ont été cultivées in vitro et in vivo.Des dosages ELISA démontrent que les anticorps sécrétés par ces hybridomes, font la différence entre des immunoglobulines provenant d'individus ayant des anticorps contre la rubéole (R+) et d'individus ayant un titre nul ou seulement faible en anticorps contre la rubéole (R ). Bien qu'il existe une certaine réponse de fond au stock R , la réponse au stock R+ est trois à cinq fois supérieure à celle que l'on obtient avec le stock R -Les anticorps monoclonaux se fixent bien à l'immunoglobuline immobilisée des anticorps anti-rubéole. La fixation des anticorps monoclonaux aux anticorps anti-rubéole immobilisés peut être inhibée par du sérum positif anti-rubéole. On le démontre en incubant des dilutions des anticorps monoclonaux avec des sérums positifs anti-rubéole et en ajoutant le mélange à des anticorps anti-rubéole immobilisés. Des résultats obtenus indiquent que dans tous les cas, l'inhibition de la fixation des anticorps monoclonaux par R+, est notablement plus forte que l'inhibition de fond présente dans les stocks R .Dans presque tous les cas, il est possible de différencier clairement des sérums R+ des sérums R Une série de 48 sérums positifs individuels, tels que définis par des tests industriels d'hémagglutination, esttitrée par les tests d'inhibition utilisant des anticorps monoclonaux conformes à la présente invention. Les résultats obtenus montrent qu'un pourcentage élevé (environ 77 % des cas) est reconnu par le test. Le manque de reconnaissance des autres cas peut être dû au fait que les sérums positifs non détectés sont des anticorps IgM, alors que le titrage d'inhibition monoclonale ne reconnaît que les anticorps IgG. I1 est également possible de réaliser un test direct pour déterminer la présence ou l'absence de rubéole. Ce test comprend l'immobilisation d'anti-anticorps mono clonaux pour la rubéole sur une surface solide (plastique, verre ou similaire), et l'addition de sérum d'un malade à ces anti-anticorps monoclonaux immobilisés ; il est suivi par, soit : a) de l'anti-IgG humain lié à une peroxydase (dosage ELISA), soit b) de l'anti-IgG humain marqué 1'1251 (pour une dosage RIA). Ainsi qu'il est indiqué plus haut, on a isolé cinq lignées cellulaires hybrides, désignées comme étant les lignées RB-1, RU-2, RE-3, RD-4 et RA-5. Chacune de cellesci sécrète des anticorps qui reconnaissent des anticorps anti-rubéole humains. La nouvelle lignée cellulaire RB-1 a fait l'objet d'un dépôt sous le nO I-408 en date du 14 Janvier 1985 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR à PARIS. Les hybridomes se développent bien in vivo et in vitro et il est possible d'obtenir des quantités notables du produit anticorps. La procédure utilisée dans les tests, est la suivante : les immunogènes suivants sont utilisés (1) une fraction IgG de sérums positifs à la rubéole,(un stock de sérums positifs à la rubéole est dialysé. contre un tampon de phosphate 0,01 M, pH 7,2, puis ensuite chromatographie sur une colonne DEAE-23. La fraction IgG est dialysée contre du tampon de phos phate 0,01 M, pH 7,2) 12) un stock de sérums positifs à la rubéole après traite ment avec du NH4)2SO4 à 50 % et dialyse contre un tam pon de phosphate 0,01 M, pH=7,4) (3) un stock de sérums positifs à la rubéole (4) des érythrocytes de sang humain enduites du virus de la rubéole (kit d'hémagglutination d'Abbott) et incubée avec une fraction IgG de sérum R+ et le pré cépité de sulfate d'ammonium des sérums. Les immunisations sont effectuees de la façon suivante : des souris femelles BALB/c (de 4 à 6 semaines) sont immunisées. Des immunogenes sont injectés dans de l'adjuvant complet de Freund. Des rappels sont donnés à des intervalles de trois semaines et une fusion entre des cellules de rate de souris immunisées et de myélome de souris NS-i, est réalisée trois jours après le second rappel. Hybridation des cellules.: On induit une hybridation entre des cellules de souris immunisées et des cellules de NS-1 selon un rapport de 10:1, en exposant les cellules mélangées à du poly éthylèneglycol (PM = 1500) pendant 60 secondes . Des cultures de cellules mélangées après fusion, sont déve- loppées dans un milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété avec 10 t de sérum de cheval (HS) inactivé par la chaleur, contenant de l'hypoxanthine 10-4M, de l'ami noptérine 4.10 7M et de la thymidine 1,6.10-5M (HAT). Après 10 à 14 jours d'incubation dans un milieu DMEM HAT, des surnageants sont dosés pour la détermination des anticorps à l'anti-rubéole par ELISA. Des puits positifs sont isolés et des cellules so,t clonées par la methode de la dilution limite. Dans une fusion (immunisation avec la fraction IgG) avant le clonage, un enrichissement par formation de rosettes en E, est réalisé et ensuite, le clonage. Des cellules de 5 clones hybridomes, RB1, RU2, RE3, RD4, RA5, sont enfin choisies et injectées par voie intraperitonéale (i.p.j à des souris BALB et des fluides ascitiques de souris porteuses de tumeur, sont utilisés pour la caractérisation d'anticorps. DOSAGE ELISA Les réactifs utilisés sont (1) tampon d'enductior. - tampon de phosphate i 10mM pF 7,4, NaCl 150mM et 0,1 % d'azoture de sodium (2) tampon de lavage - tampon de phosphate 10mM pH 7,4, chlorure de sodium 150mM, 0,05 (v/v) de Tween 20 (monolaurate de polyoxyéthylène sorLitan) (3) tampon de réaction - phosphate de sodium 0,02M pH 6,8. PROCEDURE (1) On dissout l'antigène (fraction d'lgG du stock posi- tif anti-rubéole ou du stock négatif anti-rubéole) dans du PBS (5,0 pg/ml) (2) on met à la pipette 0,1 ml de la solution d'antigène dans chaque puits d'une plaque de microtitrage en polyvinyle (3) on incube (couvert) une nuit à 40C ; (4) on enlève la solution d'enduction. On lave trois fois avec le tampon de lavage et trois fois à l'eau distillée (5) on dilue l'anticorps anti-rubéole (R+) monoclonal (cAc) dans du PBS. (6) on ajoute 0,1 ml d'échantillons d'anti R+ McAc dans chaque puits. Un témoin négatif doit être fait avec PBS seul ou DMEM ; (7) on incube à la température ambiante pendant deux heures (8) on lave comme dans l'étape 4 ; (9) on prépare une solution fraiche d'anti-IgG de souris conjugué à une peroxydase (Miles 61-204) à une concen tration appropriée, déterminée auparavant pour chaque lot particulier.Dans ce cas, le lot S-108 est dilué selon un rapport de 1:1500 dans du tampon de lavage (10) on incube à la température ambiante pendant deux heures (12) on prépare un substrat de réaction (frais) de la façon suivante a) on dissout 1 mg/ml d'acide 5-amino salicylique dans un tampon de réaction préchauffé à 56 C. On refroidit à la température ambiante b) On ajoute environ 1 mg de charbon actif à chaque chaque portion de 100 ml de substrat ; c) on filtre à travers du papier-filtre Whatman N01. Cela enlève la couleur en excès de la solution de substrat ; d) on prépare fraîchement une solution de peroxyde à 1 % (dans l'eau3, à partir d'une solution mère à 30 % ; e) on ajoute 0,1 ml de la solution de peroxyde à 1 % à chacune des portions de 10 ml de substrat de réaction (étape c) ; (12) après deux heures d'incubation, on lave coinrne dans l'étape 4, mais cinq fois avec du tampon de lavage et trois fois avec de l'eau distillée ; (13) on ajoute le substrat fralchement préparé (avec H202) dans les puits (0,1 ml chacun) (14) une couleur brune doit se développer dans des puits positifs après 10 à 30 minutes ; (15) on arrête la réaction avec 0,1 ml de NaOH 3N et après dix minutes, on fait une lecture dans un spectrophoto mètre à 450 nm. La présente invention est également relative à des nécessaires ou kits effectuant les diverses réalisations de la présente invention, c'est-à-dire toutes les modifications variées du titrage conforme à la présente invention. Ainsi, la présente invention se rapporte à un kit permettant de réaliser un dosage pour déterminer par exemple la présence d'anticorps à la rubéole, comprenant des fractions d'IgG immobilisees de sérum anti-rubéole humain rur une surface plastique (plaque, tube à essais, etc), c. anti-anticorps monoclonaux à la rubéole, du pe-roxydase- anti-IgG de souris, des témoins de sérum humain positif anti-rubéole et négatifs anti-rubéole, du substrat de peroxydase et des tampons. Elle concerne, de plus, un nécessaire ou kit pour effectuer un dosage, pour déterminer la présence d'anticorps à la rubéole, comprenant des fractions de IgG immobilisées de sérum humain anti-rubéole sur une surface plastique (plaque, tube à essais, etc), des anti-anticorps monoclonaux à la rubéole, de llanti-IgG de souris marqué à 1'i25I, des témoins de sérum humain positifs anti-rubéole et négatifs anti-rubeole et des tampons.. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, dè la présente invention. REVENDICATIONS 10) Test pour la détection d'anticorps présents dans le sérum d'une personne examinée, reposant sur l'utilisation d'anticorps contre des anticorps, ou anti-anticorps, carac térisé en ce que ces anti-anticorps (dénommés anti-idiotypes) sont capables de reconnaître la présence ou l'absence d'anticorps dans le sérum de malades 2 ) Test selon la revendication 1, caractérisé en ce que le titrage est enzymo-imrnunologique ou radio-immunologique. 3 ) Test selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le test utilise des anticorps monoclonaux adaptés pour reconnaître la présence ou l'absence des anticorps à détecter. (4 ) Tes selon l'une quelconque des revendications 1 à , pour la détection de la présence ou de l'absence d'anticorps à l'égard de la rubéole chez le malade examiné, caractrisé en ce quil comprend l'obtention de lignées de cellules hybridomes produisant des anticorps monoclonaux anti-rubéole et la réalisation d'un immunotitrage avec ces anticorps monoclonaux. 5 ) Test selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'obtention de lignées de cellules hybridomes produisant des anticorps monoclonaux anti-rubéole et en ce qu'une fraction d'IgG de sérum positif anti-rubéole est immobilisée, diverses dilutions d'anticorps monoclonaux à l'égard de la rubéole sont Incubées avec du sérum humain positif anti-rubéole, le mélange est ajouté à ces anticorps immobi- lis et 1 l'inhibition de la fixation est déterminée 6 ) Test pour la détection d'anticorps à l'égard de la rubéole, selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé n ce qu'il comprend la fixation d'anticorps à l'égard de la rubéole à des anticorps immobilisés et la visualisation par de l'anci-IgG de souris lié à une peroxydase. 7 ) ligne cellulaire produisant des anticorps mono clonaux caractérisée en ce qu'il s'agit d'une lignée cellu laire hybridome obtenue par immunisation de souris, réalisation d'une fusion entre les cellules de rate de ces souris immunisées et des cellules de myélome de souris, culture des cellules hybridées, détermination de celles qui produisent des anti-anticorps, sélection d'un clone convenable et culture de celui-ci pour la production des anticorps monoclonaux désirés. 8 3 Lignées cellulaires hybridomes produisant des anticorps monoclonaux contre des anticorps anti-rubéole, caractérisées en ce qu'elles sont désignées sous les noms de RB-11, RU-21, RE-31, RD-4 et RA-5. 90) Lignées cellulaires selon la revendication 8, caractérisées en ce que la lignée RB-1 a eté déposée le 14 Janvier 1985 sous le n I-408 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR. 100) Test direct pour la détermination de la présence ou de l'absence de la rubéole, caractérisé en ce qu'on immobilise des anti-anticorps monoclonaux à l'égard de la rubéole sur une surface solide, en ce qu on ajoute du sérum à étudier à ces anti-anticorps monoclonaux et en ce qu'on suit le test, soit par a) de l'antî-IgG humain lié à une peroxydase, soit par b) de l'anti-IgG humain margué par de l'125I. 11 ) Nécessaire, ou kit, pour réaliser un dosage pour déterminer la présence d'anticorps à l'égard de la rubéole, caractérisé en ce qu'il comprend des fractions d'IgG de sérum anti-rubéole humain immobilisées sur une surface plastique (plaque, tube à essais), des anti-anticorps monoclonaux à l'égare de la rubéole, de llanti-IgG de souris lié à une peroxydase, des témoins de sérum humain positifs anti-rubéole et négatifs anti-rubéole du substrat de peroxydase et des tampons. 120) Sit pour réaliser un dosage afin de déterminer la présence d'anticorps à l'égard de la rubéole, caractérisé en ce qu'il comprend des fractions d'IgG de sérum humain anti rubéole immobilisées sur une surface plastique (plaque, tube à essais), des anti-anticorps monoclonaux à l'égard de la rubéole, de l'anti-IgG de souris marqué par de l'125I, des témoins de sérum humain positifs anti-rubéole et négatifs anti-rubéole et des tampons.