Brevet FR2556222A1 — publié le 19850614

L'invention a trait à un agent de pansement protéolytique composé de particules à base de polysaccharides auxquels une enzyme du type protéase est liée après activation. L'agent de pansement, du type biopolymère sous forme de poudre ou de fluide pulvérulent sec, sert à recouvrir et à traiter des plaies ulcéreuses et nécrosiques. Outre les poudres à deux constituants classiques à base, par exemple, de talc ou d'amidon et de sulfonamide, d'antibio- tiques ou d'anticryptogammiques en tant que composé actif, on recommande depuis peu divers agents de pansement pulvérulents biopolymères. Ces nouvelles préparations ont recours surtout aux principes d'adsorption ou de protéolyse, isolément ou en combinaison. L'effet d'adsorption réside dans l'aspiration des constituants liquides des matières purulentes et l'effet protéolytique réside dans la décomposition enzymatique des protéines indésirables de l'exsudat. Des agents de pansement biopolymères du type cité ci-dessus ont été décrits, par exemple, par B.S. Jacobsson et al. dans Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. 10, 65-72 (1976), par H. Dautzenberg et al. dans la demande de brevet CS PV 4129-82 et par J. Turkova et al. dans la demande de brevet CS PV 7138-83. Un type important de poudres biopolymères est constitué par les préparations à base de biopolymères hydrophiles. L' avantage principal de celles-ci est l'insolubilité dans l'eau, qui empêche la contamination de la plaie par des éléments étrangers. Les poudres biolopymères hydrophiles insolubles sont bien tolérées par l'organisme parce qu'elles ne provoquent pas d'effets annexes. Leur effet réside dans l'interaction entre les phases solide et liquide, c'est-à-dire entre les particules de poudre et le liquide suintant de la plaie. Cette interaction est limitée à la région de contact et ne se propa- ge pas à d'autres endroits de l'organisme. On peut distinguer deux genres d'agents de pansement biopolymères selon le mode d'interaction: ceux agissant par adsorption et ceux agissant par protéolyse. Les premiers agissent physiquement et les se- conds chimiquement. Par exemple, le dextrane réticulé sphérique, vendu sous le nom déposé de Debrisan (fabriqué par Pharmacia, Uppsala, Suede) est un agent de pansement d'adsorption efficace (voir aussi B.S. Jacobsson et al.; Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. , 65 (1976)). L'agent de pansement protéolytique à base de cellulose sphérique comportant des protéases à liaisons covalentes et séché par lyophilisation et son application en pratique médi- cale ont été décrits par J. Turkova et al. dans la demande de brevet CS PV 713883. Les deux types d'agents de pansement biopolymères offrent des avantages par rapport aux poudres classiques utiiisées jusqu'à présent, mais entraînent aussi certaines limitations. L'agent de pansement d'adsorption au dextrane précité agit seulement physiquement, c'est-à-dire en aspirant l'eau et les solutions ou dispersions aqueuses dans la matière poreuse des particules et dans l'espace intersticiel de la couche de pou- dre. L'agent de pansement protéolytique à la cellulose agit surtout par voie enzymatique mais l'aspiration en parallèle de liquides provenant de la plaie, c'est-à-dire l'effet d' adsorption ou d'absorption, est hautement souhaitable. Toute- fois, ce dernier effet ne peut être obtenu que par des mesures spéciales à prendre pendant la préparation du support cellulo- sique et de l'agent de pansement et qui sont souvent compli- quées et onéreuses. La cellulose tend naturellement à cristalliser pendant séchage et à former des structures à faible porosité. Si l'on souhaite obtenir des agents de pansement à haut pouvoir adsor- bant (à forte porosité), il faut adopter des modes de séchage spéciaux à tous les stades de préparation. Un autre type important de poudres biopolymères est cons- titué par les préparations à base de chitine, qui ont été dé- crites par L.L. Balassa dans divers brevets (DE 1 906 155 (1969); DE 1 906 159 (19.70); GB 1 252 373 (1971); US 3 632 754 (1972); US 3 914 413 (1975Y). La poudre de chitine diffè- re complètement par son mode d'action des types biopolymères précités; son effet peut être dit de régénération. La chitine se dépolymérise très lentement dans une plaie et ses consti- tuants monomères participent efficacement à des réactions métaboliques dans la plaie. La poudre de chitine contribue de cette manière à régénérer les tissus épidermiques endomma- gés. Ce qui limite!,intérêt des poudres de chitines, c'est que leur action est spécifique, c'est-à-dire qu'elle assure seulement une régénération. La chitine est caractérisée par sa haute cristallinité et par sa porosité faible correspon- dante, de sorte que les poudres à base de chitine n'exercent qu'un faible effet d'adsorption. Le principe de nettoyage protéolytique de la plaie ne s'applique pas du tout dans les poudres de chitine récentes. Les inconvénients précités des agents de pansement bio- polymères hydrophiles insolubles et à la chitine sont éliminés dans l'agent de pansement suivant l'invention. L'invention propose un agent de pansement composé de par- ticules sphériques à base de polysaccharides, auxquels une enzyme du type protéase est liée après activationr lesdits polysaccharides étant des composés choisis parmi le dextrane réticulé, la chitine et le chitosane. L'agent de pansement suivant l'invention à base de dex- trane est composé de particules sphériques d'un diamètre de 0,05 à 0,5 mm. L'agent de pansement suivant l'invention à base de chiti- ne et de chitosane est composé de particules d'une grosseur de 0,01 à 0,3 mm. Une caractéristique du nouvel agent de pansement réside dans l'application de dextrane réticulé en tant que phase bio- polymère pour l'immobilisation des protéases. A la différence de la cellulose, le dextrane réticulé présente une haute poro- sité sans qu'on ait à prendre de mesures particulières. On peut régler entre des limites larges la structure poreuse du dextrane porteur selon le degré de réticulation du polymère initial. Contrairement à ce qui se passe pour la cellulose, la porosité ne disparait pas pendant le séchage du dextrane ré- ticulé gonflé dans l'eau et l'on peut obtenir par des procédés de séchage courants un produit propre à prendre en regonflant une forte teneur en eau. Les agents de pansement selon l'in- vention à base de dextrane présente, outre l'effet protéoly- tique, un haut pouvoir adsorbant, sans qu'on ait à prendre de mesures particulières. Pour préparer l'agent de pansement de type nouveau, on utilise des dextranes réticulés sphériques à grosseur de par- ticules de 0,05 à 0,5 mm; qui gonflent dans l'eau jusqu'à contenir 2 à 10 g d'eau par gramme de substance sèche (la te- neur en eau est celle de la matière gonflée après contrifu- gation sur un filtre en verre). Ces exigences sont satisfai- tes dans le produit du commerce portant la marque déposée Debrisan et dans le matériau chromatographique correspondant portant la marque déposée Sephadex et vendu par le même fabri- cant, ou dans des matériaux correspondants d'autres provenan- ces. Les dextranes réticulés poreux présentent une activité chimique avantageuse pour la liaison d'enzymes et l'on peut avoir recours à des modes opératoires connus ou modifiés pour l'immobilisation des protéases (voir, par exemple, Handbook of Enzyme Biotechnology, Alan Wiseman, Editeur, E. Horwood, Londres 1975). On choisit parmi ces modes opératoires ceux de nature à donner des produits à enzymes fortement liées, qui ne soient pas libérées pendant l'application. On sèche avan- tageusement le produit par lyophilisation. Pour des agents de pansement à base de chitine et de chitosane, on procède à un traitement alcalin de la poussière de chitine obtenue par broyage et classement de chitine d'ori- gine animale ou fongueuse avant l'immobilisation, ce qui en- traine une désacétylation partielle des mailles N-acétyl- -glucosamine et la libération de groupes amine ionogènes. Des mailles chitosane se trouvent ainsi introduites dans la structure de la chitine. La présence de groupes aminés primai- res dans la structure polymère renforce considérablement l'ac- tivité chimique déployée par le biopolymère dans l'activation aux fins de liaison de protéases. On peut procéder à l'immobi- sation par des méthodes connues décrites, par exemple, par W.L. Standley et al. (Biotechnol. Bioeng. 17, 315 (1975); US 3 909 358 (1975)) ou par R. A.A. Muzzarelli et al. (Chitin, Pergamon Press, Oxford 1977, p. 199). L'effet de régénération typiquement exercé par les poudres de chitine subsiste aussi dans le nouveau type d'agent de pan- sement biopolymère. Grâce au degré relativement faible de substitution de mailles nécessaire à l'immobilisation de pro- téases, et à l'obtention de l'activité enzymatique souhaitable, une forte proportion de mailles non modifiées subsiste dans la structure de biopolymère et ces mailles peuvent être libérées par une lente dépolymérisation enzymatique et contribuent à la régénération des tissus épidermiques. Dans les plaies tant récentes qu'anciennes en cours de cicatrisation, il existe une quantité suffisante de lysozyme, qui clive par voie enzy- mative les structures de chitine. Les motifs monomères libérés participent au métabolisme des hexosamines et orientent et ré- ticulent le collagène. On sait que l'uridine diphospho-N- acétylglucosamine est un composé capital pour la biosynthèse de sulfates de chondroitine, d'acide hyaluronique et de glyco- -protéines. Or ces processus accompagnent la régénération des tissus épidermiques. En liaison avec ce mécanisme, on peut aussi utiliser avantageusement des fractions de poudre à finesse atteignant 0,01 mm sans risque de les voir pénétrer dans la circulation sanguine. L'application du nouvel agent de pansement en pratique médicale est telle que décrite dans la demande de brevet CS PV 7138-83. Les exemples de mise en oeuvre suivant illustrent le mode de préparation de l'agent de pansement suivant l'invention, sans toutefois présenter aucun caractère limitatif. Exemple 1 Préparation de l'agent de pansement avec de la chymotryp- -sine immobilisée. On a utilisé, comme support, du dextrane réticulé de marque Sephadex G100 (fabriqué par Pharmacia, Uppsala, Suède) à diamètre de particules sphériques de 0,05 à 0,5 mm et, pour son activation, de la 2-amino-4,6dichloro-s-triazine. On a fait gonfler le dextrane réticulé dans de l'eau en quantité correspondant à 7,5 g de matière sèche. On a dissous l'agent d'activation dans 750 ml d'acétone à 50 C et l'on a dilué avec le même volume d'eau à cette température. On a agité le dex- trane réticulé en présence de 300 ml de solution d'activation pendant 5 mn à 50 C. On a ajouté une solution préparée en mé- langeant 15 g de carbonate de sodium de 100 ml d'eau avec 60 ml d'acide chlorhydrique (HC1) à 1 M,à raison de 120 ml (à C) au mélange d'activation, qu'on a ensuite agité à 50 C pendant 5 minutes encore. On a ajouté de l'acide chlorhydrique 6 2556222 (HC1) pour ramener brusquement le pH du mélange d'activation en deçà de 7 et l'on a filtré le produit active, on l'a lavé à la solution aqueuse d'acétone à 50% et à l'eau, puis conser- vé dans une solution tampon de phosphate à 0,1 M à pH 6,6 et à 2 C. On a immobilisé la chymotrypsine sur le support activé à partir d'une solution à 1,5% dans une solution tampon de borate à 0,2 M de pH 8,75 à 24 C. Au bout de 12 heures, il y avait immobilisation de 195 mg d'enzyme par gramme de support. On a lavé le dextrane réticulé portant la chymotrypsine liée, alternativement avec de la solution tampon de borate à 0,1 M contenant 1 mole/l de chlorure de sodium (NaCl) (pH 8) et avec de la solution tampon d'acétate à 0,1 M contenant 1 mole/l de NaCl (pH 4,5) jusqu'à ce que l'activité protéolytique de 1' éluat devienne nulle. On a finalement lavé l'échantillon avec de la solution tampon de borate à 0,25 M (pH 8) et on l'a lyophilisé. Exemple 2 Préparation du pansement avec de la papaine immobilisée. On a utilisé comme support du dextrane réticulé de marque déposée Debrisan (fabriqué par Pharmacia, Uppsala, Suede) à diamètre de particules sphériques de 0,05 à 0,5 mm, qu'on a activé par introduction de groupes imido-carbonate. On a activé le dextrane réticulé (1 g) en le mettant en contact avec du bromure de cyanogène (40 ml) à 24 C et à pH 11 pendant 6 minutes. On a ensuite lavé le produit avec une solu- tion froide à 0,1 M de carbonate acide de sodium (NaHCO3) (500 ml) pendant 7 minutes, de l'eau et de la solution tampon de phosphate à 0,1 M de pH 7,6. On a lié la papaine sur le support activé à partir d'une solution tampon de phosphate à 0,1 M de pH 7,6 à température ambiante pendant 16 heures. On a ensuite traité le produit de la même manière que dans l'exemple 1, c'est-à-dire qu'on l'a parfaitement lavé en alternant les solutions tampons jusqu'à ce que l'éluat ne pré- sente plus d'activité protéolytique, puis on l'a séché par lyophilisation. Exemple 3 Préparation du pansement avec de la trypsine immobilisée. On a utilisé comme support du dextrane réticulé de marque de commerce Sephadex G 50 (fabriqué par Pharmacia, Uppsala, Suède), à diamètre de particules sphériques de 0,05 à 0,5 mm, qu'on a activé par introduction de groupes isothiocyanate avec du thiophogène. On a agité le dextrane réticulé (20 g) avec de l'éther 4-nitrophényl glycidylique (4 g) dans 20 ml de toluène et l'on a ajouté une solution d'hydroxyde de sodium (80 ml). On a chauffé la suspension à 70 C pendant 18 heures. On a lavé le support et on l'a fait gonfler dans 100 nml d'eau, on a ajouté ml de NaOH à 5 M et 2 g de dithionite de sodium et l'on a chauffé le mélange en réaction à 65 C pendant 1 heure. On a lavé le produit, on l'a fait gonfler dans de la solution tampon de phosphate à 3,5 M (pH 6,8), on l'a fait réagir avec de la solution à 10% de thiophosgène dans du tétrachloro- -méthane, puis on a lavé et séché. On a lié de la trypsine sur le support activé à partir d'une solution à 1, 8% de trypsine dans de la solution tampon de borate à 0,05 M de pH 8,6 à 5 C sous atmosphère d'azote. Au bout de 15 heures, il y avait immobilisation de 200 mg d' enzyme par gramme de support. On a lavé le produit comme dans l'exemple 1 en alternant les solutions tampons jusqu'à ce que l'activité protéolytique de l'éluat devienne nulle, on l'a saturé de la même solution tampon de borate et lyophilisé. Exemple 4 Préparation du pansement à partir de chitine animale On a agité de la chitine isolée à partir de coquilles de crabe, puis broyée et classée de façon à avoir une grosseur de particules de 0,05 à 0,15 mm (100 g) en présence de 2 li- tres de NaOH à 40% à 115 C pendant 6 heures sous atmosphère d'azote. On a refroidi le mélange réactionnel, on a filtré le produit et on l'a lavé à l'eau jusqu'à réaction neutre. Dans ces conditions il y a eu désacylation de la chitine à partir d'environ 70%. On a utilisé le produit hydrolysé, en quantité corres- pondant à 15 g de substance sèche, comme garniture dans une colonne et l'on a élué à la solution tampon de phosphate de pH 8,5 jusqu'à ce que le pH de l'éluat devienne égal à celui de la solution tampon d'élution. On a versé sur la colonne un mélange de 15 ml de la solution tampon ci-dessus, de 15 ml de solution de chymotrypsine (contenant 0,1 g de chymotrypsi- ne) et de 15 ml de glutaraldéhyde aqueux à 4%, on l'a laissé s'écouler lentement à travers le lit, puis oh l'a laissé re- poser dans la colonne pendant 1 heure. Une fois l'immobilisa- tion achevée, on a lavé le lit avec 500 ml de la solution tampon utilisée ci-dessus, puis avec des solutions tampons alternativement alcaline et acide (c'est-à-dire une solution tampon de borate à 0,1 M de pH 9 contenant 1 mole/l de NaCl et une solution tampon d'acétate à 0,1 M de pH 4,5 contenant 1 mole/l de NaCl) pour éluer parfaitement l'enzyme non liée. On a poursuivi le lavage jusqu'à ce que l'activité protéolyti- que de l'éluat devienne nulle. On a finalement lavé le pro- duit avec de la solution tampon de borate à 0,25 M de pH 8 et on l'a lyophilisé en suspension dans cette solution tampon. Exemple 5 Préparation du pansement à partir de chitine fongueuse. On a utilisé à la préparation de l'agent de pansement du mycélium du mycète Penicilium chrysogenum, qui est un déchet de fabrication de la pénicilline. On a stérilisé la matière mycénienne et on l'a débarrassée de ses lipides constituants, en particulier gras, par extraction au chloroforme à tempé- rature ambiante. On a brassé le produit résultant avec de la solution de NaOH 1 N à température ambiante pendant 18 heures, on a acidifié avec HCl et l'on a raffiné par dyalyse. On a ramené par broyage par voie humide la granulométrie de la matière chitineuse entre 0,05 et 0,8 mm. On a opéré l'hydroly- se, l'immobilisation et le traitement fin de la même manière que dans l'exemple 4. G5562 2 REVENDICATIONS 1. Agent de pansement composé de particules à base de polysaccharides, portant après activation une enzyme immobili- sée du type protéase, caractérisé en ce que lesdits poly- -saccharides sont des composés choisis parmi le dextrane ré- ticulé, la chitine et le chitosane. 2. Agent de pansement selon la revendication 1 à base de dextrane réticulé, caractérisé en ce que les particules sphé- riques ont des diamètres de 0,05 à 0,5 mm. 3. Agent de pansement selon la revendication 1 à base de chitine et de chitosane, caractérisé en ce que les particules ont une grosseur de 0,01 à 0,3 mm.