Brevet FR2559501A1 — publié le 19850816

La présente invention concerne un procédé d'acti- vation de la production des protéines, et notamment d'anticorps, dans les cultures cellulaires animales, Plus précisément, selon l'invention, des milieux de cultures hypertoniques plutôt qu'isotoniques sont utilisés pour l'alimentation et l'entretien des cellules. Ceci a pour effet d'augmenter la quantité de protéines produite par les cellules, avec conservation de la viabilité de celles-ci. De tels milieux hypertoniques sont parti- culièrement bien adaptés à la croissance des cellules de production d'anticorps telles que les hybridomespuisque ces cellules forment bien plus d'anticorps sans modifica- tion notable de leur viabilité ou de leur vitesse de croissance. Des milieux classiques de cultures de cellules des mammifères ont des formulations correspondant à celles qui sont indiquées dans deux communications de Eagle à des séminaires, concernant l'effet de la concentra- tion ionique sur les cycles de croissance des cellules, comme décrit dans Science, 122: 501-4(1955) et Arch. Biochem. & Biophys., 61:356-66 (1956). Eagle a déterminé que les milieux contenant 85 à 115 mM de sodium et 1 à mM de potassium étaient optimaux pour la croissance à la fois des cellules HeLa et des fibroblastes de souris. La formule du milieu fondamental de Eagle qui constitue la base de presque tous les milieux de culture de cellules animales utilisés aujourd'hui, repose sur ces résultats. Le travail de Eagle a été suivi par Stubblefield et Mueller, Cancer Res. 20: 1646-1655 (1960) qui ont ex- ploré les effets de la concentration du chlorure de sodium sur la croissance, la composition biochimique et le métabolisme des cellules HeLa. Stubblefield a découvert que des concentrations accrues de chlorure de sodium dans le milieu de croissance s'opposaient à la reproduction des cellules, provoquant une réduction du nombre de cellules, alors que la synthèse des protéines et de l'acide ribonucléique était favorisée dans les cellules survivantes. Cet auteur a suggéré que, en théorie, la variation de la concentration saline cachait la reproduction de l'acide désoxyribonucléique, empêchant ainsi la mitose et permettant aux cellules survivantes de croître plus qu'elles ne l'auraient fait. L'addition de chlorure de sodium changeait l'osmolarité du milieu, mais Stubblefield n'a pas essayé de faire la différence entre les effets osmotiques et les effets ioniques. Douze ans plus tard, Schachtschabel et Foley (Exp. Cell Res. 70: 317-324, 1972) ont cultivé des cellules de tumeur ascitique d'Ehrlich dans des milieux rendus hypertoniques par addition de chlorure de sodium afin que l'effet des milieux de tonicité élevée sur le cycle de croissancede ce type de cellules soit déter- miné. Ces auteurs ont constaté qu'une population tolérant les sels, suivant un cycle de vie pratiquement normale, se developpait après des réductions importantes du nombre de cellules dans la culture. Cependant, ces cellules tolérant le sel avaient une morphologie quelque peu différente des sels des cellules classiques c'est-à-dire qu'elles paraissaient plus sous forme de fibroblastes que sous forme de cellules épithéliales. Le temps de génération ou de doublement pour ces cellules augmentait de façon très importante et le nombre de cellules survi- vantes diminuait lorsque la tonicité des milieux aug- mentait. Les cultures produisant des anticorps, par exemple les cellules de rate et les hybridomes, croissent normalement dans des milieux tels que des milieux modifiés de Eagle contenant du sérum. Les cycles de croissance des cellules produisant des anticorps dans ces milieux et la quantité d'anticorps secrétée est comprise dans la plage prévue par rapport aux autres cellules secrétant des protéines et croissant dans ces milieux. Cependant, l'utilisation croissante des anticorps comme outils biologiques, surtout étant donné les progrès des techniques de formation d'anticorps d'hybridomes et monoclonaux, ont fait apparaître la nécessité d'une plus grande produc- tion d'anticorps à partir de cultures de cellules particu- lières. Les myélomes croissent aussi normalement dans des milieux isotoniques. Comme ces cellules forment des protéines et peuvent être modifiées génétiquement, un milieu qui peut augmenter la production des protéines sans perte de viabilité des cellules est avantageux. L'invention a pour objet un procédé de culture de cellules produisant des protéines afin que la produc- tion soit accrue. Elle concerne aussi l'activation de la production des anticorps par des cellules qui en produisent avec formation d'une culture viable en expan- sion. Elle concerne aussi la production d'anticorps mono- clonaux et par croissance d'hybridomes, sans addition de cellules d'alimentation dans la culture. Elle concerne aussi un procédé donnant un rendement élevé de protéines à partir de cultures de grand volume contenant une densité élevée de cellules. Elle concerne aussi l'activation de la production des protéines à partir de cellules, par exemple de myélomes, avec conservation de la viabilité des cellules. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 représente l'effet, sur une popula- tion cellulaire, de milieux rendus hypertoniques par addition d'un aminoacide, dans le cas de la culture de cellules produisant des anticorps; la figure 2 est un graphique illustrant la viabilité des cellules formées par croissance dans les milieux décrits en référence à la figure 1; la figure 3 représente la production d'anticorps à partir de cultures formées dans les milieux décrits en référence à la figure 1; la figure 4 est un graphique indiquant que le chlorure de sodium peut être utilisé pour qu'un milieu de culture devienne hypertonique, sans perte de la viabilité des cellules; et la figure 5 est un schéma d'un appareil utile pour la production de protéines selon l'invention. L'invention concerne un procédé d'activation de la production des protéines, et notamment des anticorps, dans les cultures cellulaires animales. En résumé, on a constaté que les milieux classiques utilisés pour la culture des cellules produisant des protéines pouvaient être modifiés afin que les rendements en protéines obtenus soient notablement plus élevés, avec une plus grande activité spécifique qu'il n'a été possible jusqu'à présent. L'invention concerne aussi un milieu perfectionné de culture qui favorise la production des protéines. L'invention concerne donc un procédé d'activa- tion de la production des protéines par culture de cellules produisant des protéines dans un milieu hypertonique, c'est-à-dire un milieu ayant une osmolarité d'au moins 340 milliosmoles, ayant de préférence une osmolarité comprise entre 340 et 450 milliosmoles et très avanta- geusement d'environ 360 milliosmoles. Les milieux préférés sont les milieux classiques de culture, par exemple les milieux de Eagle, rendus hypertoniques par addition de quantités plus importantes d'amino-acides, de préfé- rence en quantité double de la valeur normale. Ces amino- acides peuvent être ajoutés de façon discontinue ou de manière continue. Un milieu classique peut subir périodiquement une infusion d'un excès d'amino-acides afin que les concentrations d'amino-acides soient supé- rieures à celles qui sont normalement utilisées. Dans une variante, un milieu hypertonique préparé antérieu- rement peut être transmis de façon continue ou intermit- tente dans la culture. L'augmentation de la production des protéines est aussi obtenue dans une culture discon- tinue, à l'aide d'un milieu hypertonique. Toute cellule produisant des protéines peut être utilisée avantageu- sement selon l'invention, mais les cellules modifiées génétiquement sont préférables. Bien que le procédé selon l'invention soit utile de façon générale pour l'augmentation de la produc- tion des protéines à partir de cultures de cellules produisant des protéines d'une manière classique, il est particulièrement utile que les cellules produisant les protéines soient encapsulées dans des capsules dont la membrane est perméable et qui délimite un volume interne. La membrane de la capsule peut comprendre un polymère contenant plusieurs groupes amine primaire, liés sous forme d'un sel à un polysaccharide acide. Le polysaccharide acide préféré est un alginate, bien que le polymère préféré contenant plusieurs groupes amine primaire soit un polypeptide, très avantageusement de la polylysine ou de la polyornithine. L'invention concerne aussi un milieu perfectionné de culture destiné à activer la production des protéines. Ce milieu contient des sels essentiels, des matières nutritives et des amino-acides nécessaires à la croissance des cellules et leur mitose, comme les milieux tels que les milieux modifiés de Eagle, mais ils sont modifiés par addition d'un accès d'amino-acides suffisant pour que l'osmolarité du milieu soit accrue à au moins 340 mil- liosmoles, de préférence entre environ 340 et 450 milli- osmoles, et très avantageusement à 360 milliosmoles environ. Des milieux selon l'invention favorisent une production accrue de protéines sans affecter la viabilité des cellules ou leur vitesse de croissance d'une manière nuisible. Le procédé et le milieu de culture selon l'inven- tion reposent sur la découverte du fait que, contrai- rement à la croyance classique, des milieux hypertoniques peuvent favoriser la production des protéines et notamment des anticorps sans détériorer la viabilité des cellules. Des rendements exceptionnels en anticorps, ayant une activité spécifique ou une pureté supérieure à celle qu'on a pu obtenir jusqu'à présent, sont obtenus selon l'invention, dans des cultures de petit volume ou dans des cultures importantes, ayant une dimension permettant une production avec une densité élevée de cellules. Des expériences anciennes sur l'effet de la concentration du chlorure de sodium sur les cellules HeLa et les fibroblastes de souris ont conduit à la conclusion que la concentration de 290 à 330 milliosmoles était la plage optimale de tonicité pour la croissance des cultures cellulaires animales. Cependant, lorsqu'on met en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut obtenir des rendements d'anticorps de 50 % de protéines sécrétées et des rendements pouvant atteindre 62 % sont possibles. Etant donné la concentration élevée des anti- corps dans la protéine sécrétée, la purification de l'anticorps est facilitée, si bien que de nombreux problèmes posés par la purification des anticorps sont résolus au moins en partie et le coût de la purification est réduit. Les milieux hypertoniques sont particulièrement utile pour la culture des hybridomes, des myélomes et d'autres cultures produisant des protéines de cellules de mammifères, d'une manière continue, donnant des niveaux accrus de production ou de sécrétion de protéines par rapport aux milieux classiques. Des myélomes peuvent être modifiées génétiquement afin que la production de protéines spécifiques soit favorisée. Des cellules produisant des protéines destinées à être utilisées selon l'invention peuvent être cultivées dans de grandes cultures avec des densités de cellules de l'ordre de 108 cellules/cm3, selon les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883 et 4 409 331 et dans la demande de brevet déposée ce même jour par la Demanderesse sous le titre "Procédé de culture de cellules avec barbotage d!un gaz". Les deux premiers documents décrivent des procédés d'encapsula- tion de cellules viables et saines, et des procédés de récolte des substances produites par les cellules. La demande précitée de brevet décrit l'obtention de densités extraordinairement élevées de cellules réalisées dans des cultures encapsulées à l'aide de milieux clas- siques lorsque les quantités nécessaires d'oxygène et d'anhydride carbonique sont obtenues par barbotage d'un gaz ayant des teneurs déterminées en oxygène et en anhy- dride carbonique directement dans une culture encapsulée. L'utilisation de ces techniques permet la production de cultures ayant un volume de l'ordre de 30 1 avec une densité de cellules de 108 cellules/cm3. L'utilisation du procédé selon l'invention permet la production, par de telles cultures, de 3 à 6 g d'anticorps monoclonaux. La figure 5 repésente schématiquement un appareil destiné à la culture des cellules selon l'invention. Il comporte un réservoir 10 de 50 1 de capacité, formé d'acier inoxydable 316 L ayant subi un polissage électro- lytique, muni d'une plaque 12 formant couvercle. Un moteur 14 entraîne l'arbre 16 d'un agitateur et fait tourner des palettes 18 et 20 placées dans la culture 22. Celle-ci comprend le milieu hypertonique, par exemple tel que défini dans la suite, et de nombreuses capsules en suspension ayant des membranes perméables aux amino- acides, aux gaz, aux vitamines, aux ions, etc. contenus dans le milieu. Le milieu hypertonique sans doute le plus avantageux est un milieu modifié de Eagle contenant deux fois la concentration normale d'amino- acides, avec en plus 5 % en volume d'un sérum, par exemple d'un sérum bovin. Par exemple, les capsules sont sphériques ou sphéroidales et elles ont un diamètre inférieur à 2 mm environ. Des capsules de diamètre moyen de l'ordre de 0,8 mm donnent satisfaction. Les quantités de gaz néces- saires aux cellules sont obtenues par circulation d'un gaz contenant de l'oxygène et de l'anhydride carbonique dans le filtre stérile 24, le tube 26 d'aération et la tête 28 de barbotage. Cette tête 28 peut comporter un filtre de porcelaine poreuse de 2,5 microns. Le gaz peut contenir 95 % d'air et 5 % de CO2 (en volume). Les bulles de gaz partent de la tête de barbotage 28 et remontent dans le milieu de culture, parmi les capsules. Le débit de barbotage doit être suffisant pour que la pression partielle d'oxygène dans le milieu reste sen- siblement égale à la pression partielle d'oxygène dans le gaz. La pression d'oxygène dans le milieu peut donc être réglée à une valeur égale ou légèrement supérieure à celle que nécessite la croissance optimale des cellules. Etant donné la présence des constituants du sérum dans le milieu, le barbotage provoque la formation d'une mousse qui est collectée dans l'espace 30 délimité par le réservoir 10. Cependant, les capsules protègent les cellules contre la déshydratation si elles sont temporai- rement transportées dans la mousse, et elles protègent aussi les cellules contre les détériorations mécaniques. Ainsi, le barbotage du gaz dans la culture encapsulée peut donner la quantité d'oxygène nécessaire à la popula- tion cellulaire croissante, permettant ainsi l'obtention de densités extrêmement élevées de cellules. Le gaz quittant la culture s'écoule par un canal 32 de sortie et un filtre 34. Un débit de gaz de 5,6 l/h, dans les conditions normales, convient pour une culture de 30 1. Lors de la mise en oeuvre de l'invention d'une manière discontinue, le milieu hypertonique est simplement dosé dans le réservoir 10 avec les microcapsules contenant la culture germe, et la culture croît jusqu'à la densité maximale. Dans une variante, un milieu classique isotonique peut être utilisé au début, et des amino-acides supplémen- taires en excès peuvent être ajoutés à la culture par injection en une ou plusieurs fois pendant le cycle de croissance, par exemple par le canal 36 d'injection. Cependant, le procédé quipeut être le meilleur pour la mise en oeuvre de l'invention comprend la circulation du milieu hypertonique dans la culture, par introduction d'un courant continu ou intermittent du milieu par un canal 38 d'entrée et évacuation du milieu par l'élément de filtration. Cet élément 40 peut être une toile microporeuse inoxydable dont les pores sont inférieurs au diamètre des capsules, par exemple de 50 à 100 microns. Le milieu peut être extrait par la soupape 42. Le niveau du milieu dans la culture peut être observé par un tube latéral transparent 44. Un exemple de débit de milieu transmis par le canal 38 d'entrée et extrait par le filtre 40 est de 4 à 12 cm3/min. Il faut aussi noter qu'une solution d'enrichissement en amino-acides peut être injectée dans la culture en quantité nécessaire afin que l'hypertonicité voulue soit conservée. Le procédé utilisé pour la récolte des protéines produites par les cellules dépend de la relation entre les dimensions moléculaires efficaces de la protéine intéressante et la perméabilité des membranes des capsules. Comme décrit dans les brevets précités, la perméabilité de membranes des capsules peut être réglée entre certaines limites. Les détails du procédé actuellement préféré pour le réglage de la porosité des membranes des capsules et pour la fabrication de capsules uniformes figurent dans la demande de brevet déposée ce même jour par la Demanderesse sous le titre "Procédé d'encapsulation, notamment de cellules, dans des membranes semi-perméables. Lorsque les protéines intéressantes sont trop grosses pour traverser la membrane, elles se rassemblent dans les microcapsules; lorsqu'elles sont suffisamment petites pour traverser les membranes, elles se rassemble dans le milieu qui se trouve à l'extérieur des capsules. Les exemples purement illustratifs qui suivent font mieux comprendre l'invention. Exemple 1 L'expérience de cet exemple montre que l'augmenta- tion de la tonicité du milieu de culture par addition d'un excès d'aminoacides ne modifie pas la viabilité ou la vitesse de mitose des cellules productrices de pro- téines, mais provoque en fait une augmentation de la production de protéines. Les cellules utilisées dans cette expérience sont un hybridome de souris-souris sé- crétant IgG. Les hybridomes ont été encapsulés par modifi- cation du procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883. Plus précisément, une suspension contenant environ 106 cellules/cm3 dans une solution à 1 % (en poids par volume) d'alginate de sodium ("NaG-Kelco LV") dans un milieu de référence a été trans- férée à un appareil à tête d'atomisation comprenant un boîtier ayant une buse supérieure d'admission d'air et un corps allongé et creux monté dans un bouchon. La densité des cellules de la suspension dans le milieu d'alginate impose le nombre moyen de cellules par capsule dans la culture germe. Une seringue, par exemple de cm3, équipée d'une pompe progressive, a été montée sur le bottier avec une aiguille, par exemple de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de téflon, passant sur toute la longueur du bottier. L'intérieur du boîtier a été réalisé de manière que la partie supérieure de l'aiguille soit soumise à un courant d'air laminaire constant qui joue le rôle d'un couteau pneumatique. Lors de l'utilisation, la seringue pleine de solution, contenant la matière à encapsuler, est montée sur le bottier, et la pompe progressive est commandée afin qu'elle chasse progressivement des gouttes de la solution vers le bout de l'aiguille. Chaque goutte est "arrachée" par le courant d'air et tombe d'environ 2,5 à 3,5 cm dans une solution de chlorure de calcium à 1,2 % (en poids par volume), formant des masses gélifiées qui sont collec- tées par aspiration. Les masses gélifiées peuvent être incubées dans trois volumes de solution saline isotonique renouvelée afin que le gel subisse une expansion. L'expan- sion saline prend environ 11 min au total. Ensuite, une membrane est formée autour des masses gélifiées par contact avec de la poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, poids moléculaire 65 000 daltons) à 750 mg/1 dans une solu- tion saline isotonique. Après 12 min de réaction, les capsules résultantes ont été lavées pendant 10 min avec une solution à 1,4 g/1 de CHES (acide 2-cyclohexylamino- éthane sulfanique) qui est un tampon ("Sigma") contenant 0,2 % en poids par volume de chlorure de calcium dans une solution saline. Les capsules ont été lavées pendant 8 min environ avec une solution saline de chlorure de calcium à 0,3 % en poids par volume, et une seconde membrane a été formée autour des capsules par réaction pendant 10 min avec une solution saline de 105 mg/l d'amine polyvinylique ("Polyscience" de poids moléculaire compris entre 50 000 et 150 000 daltons). Les capsules ont été la- vées à nouveau avec deux volumes de solution saline isotonique, en 7 min, puis revêtues par immersion pen- dant 7 min dans une solution saline à 5.10-2 % en poids/volume de NaG. Les capsules ont été lavées pendant 4 min supplé- mentaires dans une solution saline, et les volumes internes aux capsules ont été reliquéfiés par deux immersions dans une solution saline à 55 mM de citrate de sodium, d'abord pendant 20 min puis pendant 6 min. Les capsules ont été lavées deux fois dans la solution saline et une fois pendant 4 min dans le milieu. Comme décrit de façon générale dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 409 331, lorsque les capsules sont incubées dans le milieu de culture, IgG se collecte dans les capsules avec seulement des traces détectables dans le milieu externe aux capsules. Les capsules préparées selon ce procédé sont pratiquement imperméables à IgG mais permet- tent le passage libre des matières nutritives nécessaires, permettant ainsi la croissance des cellules et la produc- tion des anticorps à l'intérieur du volume des capsules. Le tableau I indique les ingrédients d'un milieu de culture fondamental connu alors que les tableaux II et III indiquent les constituants de ce milieu, corres- pondant aux amino-acides et aux vitamines. Les concentra- tions données entre parenthèses dans le tableau I repré- sentent les modifications des teneurs en fer et en amino- acides permettant la formation d'un milieu hypertonique selon l'invention. En résumé, le fer a été augmenté d'un facteur 100 et la teneur en aminoacides a été doublée. Après réalisation du milieu, on ajoute 5 % en volume de sérum bovin foetal. L'addition de l'excès d'amino-acides et de nitrate ferrique augmente l'osmola- rité du milieu jusqu'à 360 milliosmoles environ. Comme l'indique l'étude des constituants du milieu, 4,7 % environ en poids (eau non cor"prise) constituent les amino-acides du milieu normal alors que le milieu hyper- tonique contient environ 8,9 % d'amino-acides. Les milieux préférés selon l'invention contiennent entre 7,0 et 12 % environ d'amino-acides. TABLEAU I Préparé par lots de 40 1 Constituant chimiques Quantité utilisée D (+) glucose 80,0 g NaCl 274,4 g Na2HPO4 (anhydre) 4,96 g KCl 16,0 g MgSO4 (anhydre) 3,92 g NaHCO3 88,0 g Solutions initiales ZnSO4.7H2O 8,0 cm3 conc: 10-6 g/ml CuSO4. 5H20 0,4 cm3 conc: 10- 5 g/ml Fe(NO3)3. 9H20 4,0 cm3 conc: 10- 6 g/ml (10-4 g/ml) MnCl2.4H20 0,4 cm3 conc: 10-5 g/ml Aminoacides 800 cm3 (1600 cm3) conc: 50X Vitamines 800 cm3 conc: 50 X PIPES 136,96 g L-Tyrosine 1,40 g L-Cystine 0,80 g CaCl2 5,88 g Rouge de phénol 0,4 g Q.S. pour 40 1 d'eau distillée. TABLEAU II Préparé en lots de 20 1 Amino-acide Quantité utilisée L-alanine 90,0 g Larginine HC1 60,0 g acide L-aspartic 24,0 g L-asparagine H20 20,0 g Lcystéine HCl.H2O 60,0 g acide L-glutamine 45,0 g Glycine 50,0 g Lhistidine HC1.H20 20,0 g L-isoleucine 30,0 g L-leucine 75,0 g L-lysine HC1 90,0 g L-méthionine 23,0 g L-phénylalanine 25,0 g L-proline 30,0 g Lsérine 10,0 g L-thréonine 40,0 g L-tryptophane 10,0 g L-valine 50,0 g Q.S. pour 20 1 avec eau distillée. 2559S01 TABLEAU III Préparé en lots de 10 1 Vitamine Quantité utilisée acide ascorbique 1,0 g d-biotine 0,3 g d-calcium pantothénate 0,5 g chlorure de choline 0,8 g acétate de d-alpha tocophérol 6 pl ergocalciferol 0,5 g glutathione 0,55 g myo-inositol 1,0 g bisulfite sodique de ménadione 0,046 g méthyl linoleate 17 pl nicotinamide 0,5 g pyridoxal-HCl 0,5 g riboflavine 0,05 g pyruvate de sodium 12,5 g thiamine HCl 0,52 g vitamine A 0,05 g vitamine B12 0,1 g Q.S. pour 10 1 d'eau distillée. Les hybridomes encapsulés ont été divisés en quatre cultures portant les références 390, 395, 396 et 397. La culture 390, formée de 6 1 du milieu (contenant environ 3 1 de capsules déposées) a été cultivée dans un flacon tournant de 36 1. Le milieu initial de culture étant le milieu hypertonique contenant deux fois la teneur en amino-acides et l'excès de fer. Cette culture a été introduite de façon discontinue par raison de 6 à 8 1 de milieu hypertonique au jour 3, 5, 7, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20 et 21 afin que la tonicité soit conservée. La culture 395, contenant 6 1 de culture encap- sulée dans un réservoir d'acier inoxydable, a reçu de façon continue une quantité totale de 90 1 du milieu normal pendant la période de 26 jours de l'expérience. La concentration d'amino-acides (800 cm3) utilisée a donné un milieu isotonique. Les cultures 396 et 397 contenant chacune 6 1 de culture encapsulée dans un réservoir d'acier inoxydable, ont reçu de façon continue 120 1 du milieu et du fer supplémentaire pendant la période de 26 jours. La culture 396 a reçu le milieu hypertonique avec le double d'amino- acides alors que la culture 397 a reçu le milieu isoto- nique. Un mélange oxygène/OC2 a barboté dans toutes les cultures encapsulées. La figure 1 représente le nombre de cellules/cm3 de capsules déposées à différents moments pour les quatre cultures. Les nombres de cellules ont été déterminés avec un hématocytomètre après rupture d'un échantillon des capsules. Il apparaît clairement que le milieu hyper- tonique non seulement n'empêche pas la croissance des hybridomes mais peut en réalité avoir augmenté la vitesse de croissance, ce résultat étant tout à fait imprévu. La figure 2 représente la somme des cellules viables par centimètre cube de capsules déposées dans le cas des cultures de la figure 1. La viabilité des cellules dans le milieu hypertonique est au moins aussi J bonne, sinon meilleure, que dans le milieu isotonique. La figure 3 représente l'augmentation de produc- tion d'anticorps à l'aide du milieu hypertonique. Au quatorzième jour pour la culture 397 qui a reçu le milieu isotonique de manière continue, 200 pg d'anticorps sont produits environ par centimètre cube de capsule, ce rendement d'anticorps étant excellent pour une culture cellulaire. A titre comparatif, les cultures réalisées dans le milieu hypertonique (390 et 396) ont donné environ 800 Mg d'anticorps par centimètre cube de capsule, soit une multiplication par quatre. La concentration d'anti- corps a été mesurée par rupture des membranes des capsules et utilisation de l'analyse des anticorps Elisa. Plus précisément, un anticorps de rat-antisouris, couplé à de la phosphatase alcaline, a réagi avec le fluide interne aux capsules. Du phosphate de P-nitrophényle a été utilisé comme substrat du phosphate alcalin couplé immunologiquement à l'anticorps de souris, et l'absorption à 340 nm a été mesurée. Ces expériences montrent que l'augmentation de la teneur en anticorps est un effet de l'hypertonicité du milieu et non du fer supplémentaire. Les deux cultures 396 et 397 ont reçu des milieux identiques ayant du fer en plus, mais la culture 396 a reçu le double d'amino- acides. Il ne manque pas d'amino-acides dans la culture 397 puisque le milieu isotonique a reçu de façon continu des amino-acides. Comme l'indiquent les résultats, l'uti- lisation d'un milieu hypertonique, à 360 milliosmoles dans ce cas, plutôt que le milieu isotonique classique permet une production accrue de protéines sans dégradation de la viabilité descellules. Exemple 2 Cet exemple montre que, bien que l'encapsulation d'une structure cellulaire et l'addition d'un excès d'amino-acides destiné à rendre le milieu hypertonique, augmentent beaucoup la synthèse des anticorps, la réalisa- tion d'un milieu hypertonique par addition de sodium peut provoquer une faible augmentation de la production des anticorps même dans le cas de cellules productrices d'anticorps qui ne sont pas encapsulées. Trois milieux différents ont été utilisés dans cette expérience, un premier ayant une osmolarité de 250 milliosmoles (hypotnique), un second d'osmolarité égale à 325 milliosmoles (isotonique) et un troisième ayant une osmolarité de 400 milliosmoles (hypertonique). L'osmolarité de toutes les solutions a été mesurée par la diminution du point de congélation. L'osmolarité d'une solution est à peu près égale à l'osmolarité à ces concentrations. Les milieux étaient identiques aux milieux de base indiqués dans les tableaux I à III (sans excès de fer ou d'amino-acides), mais la concentration de chlorure de sodium variait afin que l'osmolarité varie. La figure 4 représente la croissance cellulaire pour les trois cultures. Comme l'indique la figure, le changement de l'osmolarité de la solution par addition d'une solution saline n'avait pas d'effet notable sur la croissance cellulaire. Le tableau IV représente la différence de produc- tion d'anticorps provoquée par modification de l'osmola- rité de la solution. Trois jeux de cultures (A-C) soft présentés dans le tableau IV, chaque essai étant en double (a, b). Toutes les cultures étaientune même culture d'hybridomes, mais sous forme non encapsulée. TABLEAU IV Osmolarité Ab (gq/cm3) Moyenne Pq/cm3 250a 72,9 73 250b 74,1 A 325a 72,3 75 A 325b 78,8 400a 79,9 78,8 400b 77,7 250a 68,2 67,1 250b 66,0 B 325a 58,6 75,1 325b 91,8 400a 52,4 70,6 400b 88,9 250a 69,7 67,5 250b 65,3 325a 92,5 87,6 C 325b 82,8 400a 79,9 90,3 400b 100,8 Comme l'indiquent ces résultats, l'augmentation de l'osmolarité du milieu de culture par addition d'une solution saline provoque une production de protéines qui est aussi bonne ou meilleure que la production d'anti- corps à l'aide du milieu isotonique et meilleure que la production dans un milieu hypotonique. Comme l'indiquent ces résultats, les effets ne sont pas aussi accentués que dans le cas de la figure 3, par utilisation de milieux rendus hypertoniques par addition d'amino-acides. Des cultures formés dans des milieux hypertoniques modifiés par du chlorure de sodium sont ainsi caractérisés par une meilleure production d'anticorps que les cultures cellulaires classiques. Cependant, l'effet d'augmentation de l'osmolarité par addition d'amino-acides provoque une augmentation très importante et non évidente. D'autres expériences ont été effectuées à l'aide de cellules produisant des protéines telles que des hybridomes humains-humains, qui forment IgM ainsi que d'autres hybridomes souris-souris qui produisent IgG. Dans tous les cas, le milieu hypertonique donne de plus grandes quantités de protéines que le milieu isotonique. Les milieux contenant des quantités supplémentaires d'admino-acides ayant uns osmolarité comprise entre environ 350 et 360 milliosmoles paraissent optimaux mais d'autres milieux hypertoniques qui donnent suffisam- ment de matières nutritives favorisent aussi la production d'anticorps et d'autres protéines. REVENDICATIONS 1. Procédé d'activation -de la production d'anti- corps par des cellules productrices d'anticorps, provenant de mammifères, carctérisé en ce qu'il comprend la culture des cellules produisant les anticorps dans un milieu hypertonique ayant une osmolarité qui n'est pas inférieure à 340 milliosmoles environ. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu hypertonique est un milieu rendu hypertonique par addition d'un excès d'amino-acides. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'excès d'amino-acides est ajouté de façon continue afin que l'hypertonicité du milieu soit maintenue. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pression osmotique du milieu hypertonique est comprise entre environ 340 et 450 milliosmoles. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules productrices d'anticorps provenant de mammifères sont des cellules modifiées génétiquement. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules de mammifères, productrices d'anti- corps, sont un hybridome. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules productrices d'anticorps sont cultivées dans une membrane de capsule perméable, placée dans le milieu hypertonique. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pression osmotique du milieu hypertonique est d'environ 360 milliosmoles. 9. Milieu destiné à activer la production de protéines à partir de cellules productrices de protéines, ledit milieu contenant des aminoacides, des vitamines, des matières nutritives et des sels essentiels, caracté- risé en ce qu'il comprend des amino-acides ajoutés en quantité suffisante pour qu'ils augmentent l'osmolarité du milieu à une valeur comprise entre 340 et 450 milli- osmoles. 10. Milieu selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il contient environ deux fois la concentration normale d'amino-acides. 11. Milieu selon la revendication 12, caractérisé en ce que les aminoacides présents dans le milieu forment environ 7 à 12 % des constituants non aqueux.