Brevet FR2550219A1 — publié le 19850208

La présente invention concerne la microbiologie, particulièrement des procédés d'obtention de substances biologiquement actives à partir de la biomasse de la culture de tissu du ginseng, substances qui peuvent être utilisées dans diverses branches dtindustries, alimentaire, médicale et la parfumerie. On connaît un procédé de préparation de substances biologiquement actives à partir de la biomasse de la culture de tissu du ginseng ("Fitokhimichesky analyz shtamma cultury tkaci kornya zhenshenya i standartizatsia ego preparatov", R.G. Butenko, T.I. Khretonova at. et al., Rastitelnye resursy, v.XV, p.356, 1979). Le procédé comprend les operations suivantes. On prépare d'abord un milieu nutritif de Murashige et Scooge contenant de la kinétine. On prépare ensuite les flacons de culture : on lave les flacons à la main avec des détergents, on sèche les flacons dans une étuve de séchage à la température de 140 OC pendant 2 heures. On verse le milieu nutritif dans les flacons de culture de 250 ml de capacité à raison de 50 ml. On réalise la stérilisation des flacons de culture avec le milieu nutritif dans un autoclave, à la température de 116 OC pendant 15 minutes. On ensemence le tissu sur le milieu nutritif dans un box et on cultive le tissu en local à l'air conditionné.On récolte la biomasse 30-60 jours après On utilise une partie de la biomasse en qualité de matériel d'ensemencement (inoculum), c'est-à-dire on l'ensemence sur un milieu nutritif frais dela même composition. On sèche la biomasse crue par lyophilisation. On obtient par extraction des substances extractives. On effectue ltextraction à ltéthanol à 20 et 40 =0. Le rendement en substances extraites constitue alors 40,88 0 et 40,32 S respectivement. On connatt également un procédé de préparation des substances extraites à partir de la biomasse de la culture du ginseng décrit dans le travail "Kultura tkani zhenshenya", communication I, de R.I. Vysotskaya, L.I. Slepyan, "Rastitelnye resursy", v. XVI; fasc. 1, p.123, 1980. Ce procédé d'obtention des substances extraites à partir de la biomasse de la culture de tissu du ginseng comprend les mêmes opérations que le procédé décrit plus haut, cependant on effectue le séchage dans une étuve à la température de 50 OC. Le rendement en substances extraites constitue 40,32 S de la quantité initiale. Les procédés susmentionnés ne sont mis en oeuvre que dans les conditions de laboratoire. L'inconvénient des procédés indiqués tient à un bas rendement en substances extraites, étant donné que la biomasse apres le séchage par lyophilisation se présente sous la forme d'une poudre volatile et hygroscopique gonflée qui rend difficile ltextrac- tion. Le séchage dans 11 étuve n'assure pas de dessication régulière de la biomasse jusqu'à l'humidité imposée. L'humidité résultant du produit desséché s'accumule graduellement à l'intérieur de l'étuve jusqu'à ce que la biomasse commence à s'acidifier, et à former de mottes, ce qui rend plus difficiles les conditions d'extraction.De plus, le procédé n'assure pas de stérilisation complete de toutes les opérations, il en résulte des cas de contamination éventuels de la biomasse avec une microflore étrangere. Dans la littérature de brevets les renseignements sur la culture industrielle de la biomasse du ginseng sont absents. On s'est donc proposé dans le procédé d'obtention des substances biologiquement actives à partir de la biomasse de la culture du ginseng, de mettre au point une technologie qui permettrait d'obtenir des substances biologiquement actives à partir de la biomasse de la culture de tissu du ginseng par un procédé industriel. La solution consiste en ce qu'on propose un procédé d'obtention des substances biologiquement actives à partir de la biomasse de la culture du tissu de ginseng, qui consiste en la culture du matériel d'ensemencement sur un milieu nutritif contenant de la kinétine, suivie de la culture subséquente de la biomasse du ginseng, de la séparation stérile, du séchage et de l'extraction des substances biologiquement actives, conformément à l'invention, on conduit la culture de la biomasse sur le milieu nutritif de Murashige et Scooge, contenant 1,5-2,5 mg/l d'acide nicotinique, avec la récolte ultérieure de la biomasse dans des conditions stériles et son séchage à une température de 51 à 54 OC jusqutà une humidité de 7 à 9 %. A titre de matériel d'ensemencement on utilise une semence obtenue a partir de la biomasse mixte de la culture du tissu de ginseng par sélection après le traitement thermique du tissu à une température de 34 à 38 OC, ce matériel est conservé comme culture greffée dans ltobscuri- té, à la température de 26 OC, à l'humidité de 70 %, le cycle de culture est de 30 jours, et contenant des cellules calusses à dimensions de 15 à 20 et de 25 à 30 microns polydiploides, capables de division. I1 est avantageux afin de protéger la biomasse contre une contamination par une microflore étrangère, de la soumettre avant son extraction au rayonnement ultraviolet pendant 20-30 minutes. L'invention proposée est mise en oeuvre de la ma niere suivante : on prépare un milieu nutritif de la composition suivante macro-éléments d'après Murashige et Scooge micro-éléments d'après Murashige et Scooge saccharose 30 000 mg/l chlorure de thiamine 0,4 mg/l méso-inositol 80 mg/l hydrolysat de caséine 500 mg/l kinétine 1 mg/l acide naphtyiacêtique 2 mg/l agar-agar 600 mg/l Fe-chélate 5 mg/l Pour augmenter le rendement en biomasse, il est désirable de sélectionner préalablement la semence. On obtient la semence à partir de la biomasse mixte de la culture du tissu de ginseng par sélection après un traitement thermique du tissu à une température de 34 à 38 OC, semence qui est conservée comme culture greffablej dans l'obscurité, à la température de 26 oC et à l'humidi- té de 70 So, avec un cycle de culture de 30 jours, contenant les cellules calusses, dont la dimension est de 15 à 20 et de 25 à 30 microns polydiploides capables de la division. Il ntest pas rationnel d'effectuer le traitement thermique à une température inférieure à 38 OC, étant donné que le traitement à cette température provoque la perte du tissu. On ensemence le matériel d'ensemencement obtenu de façon que 1/10 du volume total est réensemencée sur un milieu nutritif frais de la meme composition, et 9/10 de la biomasse sont réensemencés sur milieu nut-ritif modifié, qui se distingue du milieu nutritif susmentionné par le fait qutau lieu de la kinétine on a introduit 1,5-2,5 mg/l d'acide nicotinique. Après 30 jours de culture on récolte la biomasse dans des conditions stériles, on sèche a' une température de 51 à 54 OC jusqu'a' une humidité de 7-9 % en masse et on extrait dans cette biomasse les substances biologiquement actives. Pour protéger la biomasse contre la contamination par une microflore étrangère, on lui fait subir avant l'extraction un rayonnement ultraviolet pendant 20-30 minutes. La biomasse obtenue se présente sous la forme de morceaux poreux irréguliers colorés en jaune clair se désintégrant facilement lors de la trituration. L'humidité de la biomasse n'est pas supérieure à 7-9 %. La culture sur le milieu nutritif modifié augmente de 30 % le rendement en biomasse, simultanément avec l'aug mentation du rendement en substances biologiquement actives. Le séchage de la biomasse jusqu'à une humidité de 7-9 7o assure une extraction totale. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation concrets. EXEMPLE 1 Préparation dtun milieu nutritif, contenant micro-éléments d'après Murashige et Scooge macro-éléments d'après Murashige et Scooge saccharose 30 000 mg/l chlorure de thiamine 0,4 ma/l méso-inositol 80 mg/l hydrolysat de caséine 500 mg/l kinétine 1 mg/l acide naphtylacétique 2 mg/i agar-agar 6oe mg/l Fe-chélate 5 mg/i On coule le milieu nutritif dans des flacons de culture soigneusement lavés de 250 mi de capacité, à raison de 50 ml par flacon. On stérilise les flacons préalablement fermés pour détruire les micro organismes. On réalise le réensemence- ment de la biomasse de la culture du tissu de ginseng dans un box stérile à l'aide d'instruments stériles. On bouche les flacons et on les transporte dans la chambre de culture, où l'on maintient d'une façon stable une température de 26 OC et une humidité de 70 0 a' l'abri de la lumière. Le cycle de culture dure 30 jours. Une partie de la biomasse cultivée est utilisée en qualité de matériel de semence Une autre partie de la biomasse est réensemencée sur un milieu nutritif modifié, contenant les composants précités, mais au lieu de la kinétine on y introduit l'acide nicotinique à raison de 1,5 mg/l.On effectue la culture dans un local conditionné pendant 30 jours. On récolte la biomasse augmentée dans des conditions stériles. On effectue le sechage dans une machine à secher à la température de 51 OC pendant 3 heures. L'humidité finale du produit est alors de 9 S. On effectue l'extraction à l'éthanol à 40 70 à un rapport de la matière première et de l'agent d'extraction de 1:10. I1 en résulte de petits morceaux poreux irréguliers jaune-clair de la biomasse sèche. L'humidité de la biomasse est de 9 Vo, le rendement en biomasse d'après le poids sec est de 10,3 g/l et en substances biologiquement actives de 4,15 %, la teneur en substances extraites est de 46,1 So, la productivité de la biomasse étant de 427,5 mg/l. EXEMPLE 2 On procède comme dans l'exemple 1, avec cette différence qu'on réalise le séchage pendant 4 heures. Lrhumi- dité résiduelle du produit constitue 8,6 %. La teneur en substances extraites est de 49,7 %. EXEMPLE 3 On réalise le procédé de l'exemple 1, à cette différence qu'on conduit le séchage pendant 4,5 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 8,4 . La teneur en substances extraites constitue 50,2 Uo EXEMPLE 4 On effectue le procédé comme dans l'exemple 1, à cette différence près que le milieu nutritif renferme 2 mg/l dtacide nicotinique, on réalise le séchage à la température de 53 OC pendant 3 heures. L'humidité résiduelle du produit est alors de 8,33 S. La teneur en substances extraites est de 51,7 S0. Le rendement en biomasse sèche est de 11,8 g/l, en substances biologiquement actives est de 493 mg/l. EXEMPLE 5 On procède comme dans l'exemple 1, mais le milieu nutritif contient 2 mg/l d'acide nicotinique, et on réalise le séchage à la température de 53 OC pendant 4 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 8,0 0. La teneur en substances extraites est de 55,5 %. EXEMPLE 6 On procède comme dans l'exemple 1, mais le milieu nutritif renferme 2 mg/l d'acide nicotinique, et on conduit le séchage à la température de 53 0C pendant 4,5 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 7,8 %. La teneur en substances extraites est de 52,0 =0. EXEMPLE 7 On procède comme dans l'exemple 1, mais le milieu nutritif renferme 2,5 mg/l d'acide nicotinique, et on effectue le séchage a la température de 54 OC pendant 3 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 7,8 %. La teneur en substances extraites est de 52,8 %. Le rendement en biomasse sur poids sec constitue 11,65 g/l, en substances biologiquement actives 4,05 %, la productivité de la biomasse est de 471,8 mg/l. EXEMPLE 8 On procède comme dans l'exemple 1, mais le milieu nutritif renferme 2,5 mg/l d'acide nicotinique, et on conduit le séchage à la température de 54 OC pendant 4 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 7,4 %. La teneur en substances extraites est de 51,0 %. EXEMPLE 9 On procède comme dans l'exemple 1, mais le milieu nutritif contient 2,5 mg/l d'acide nicotinique, et on réalise le séchage à la température de 54 OC pendant 4,5 heures. L'humidité résiduelle du produit est de 7,0 EXEMPLE 10 Pour 11 obtention du matériel de semence on utilise la culture mixte de la biomasse du ginseng sur le milieu- nutritif indiqué dans l'exemple 1. On place pendant un jour les flacons avec la biomasse après la chambre de culture dans une chambre thermostatée, où l'on porte la tempé rature à 26-34 OC. Ensuite les flacons avec la culture sont transportés dans les conditions normales de culture la température est de-26 oC, l'humidité de 70 %, et on cultive encore 35 jours. On observe vers le 30è jour de culture l'inhibition de la croissance et l1hydratation du tissu. Le rendement en biomasse par rapport au poids initial de l'inoculat de 20 g/l sur poids sec, constitue 340 g/l. Le traitement répété dans les mêmes conditions a abouti à des résultats analogues. On cultive le matériel de semence obtenu sur le milieu nutritif indiqué dans ltexemple 1. On obtient la biomasse à partir du matériel de semence susmentionné sur un milieu modifié contenant au lieu de la kinétine de l'acide nicotinique. On procède ensuite comme dans l'exemple 1. Le rendement en biomasse constitue 475 mgZl. EXEMPLE il Pour obtenir du matériel de semence, on irise la culture mixte de la biomasse du ginseng croissant sur le milieu nutritif indiqué dans l'exemple 1. On place les flacons avec la biomasse après la chambre de culture dans la chambre thermostatée pendant un jour, où l'on augmente graduellement la température de 26 à 36 OC, Ensuite on transporte les flacons avec la culture dans les conditions normales de culture : la température est de 26 OC, lthumidité de 70 %, à l'abri de la lumière et la culture croit encore 35 jours. Vers le 30è jour de culture la masse essentielle du tissu brunit, on observe l'hydratation. Vers le 35è jour des zones franches activement croissantes apparaissent, on les sépare du tissu essentiel et on les transplante sur un milieu nutritif frais de la même composition. Le rendement en biomasse, en cas du poids initial de l'inoculat de 20 g/l, constitue vers le 30è jour 466 g/l. On cultive le matériel de semence obtenu sur le milieu nutritif indiqué dans l'exemple 1. On obtient la biomasse à partir du matériel de semence susmentionné sur le milieu nutritif modifié, contenant de l'acide nicotinique au lieu de la kinétine. On procède ensuite comme dans l'exemple I, Le rendement en biomasse constitue 500,3mg/l. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé de préparation de substances Diologi- quement actives à partir de la biomasse de la culture du tissu de ginseng, consistant dans la culture du matériel de semence sur un milieu nutritif contenant de la kinétine avec culture ultérieure de la biomasse du ginseng, sa séparation, séchage et extraction dans celle-ci des substances biologiquement actives, caractérisé en ce qu'on effecte la culture de la biomasse sur le milieu nutritif de Murashige et Scooge contenant 1,5-2,5 mg/l atacle nicotinique, avec la récolte ultérieure de la biomasse augmentée dans des conditions stériles et son séchage à une tempera- ture de 51-54 OC jusqu" une humidité de 7-9 ,1, 2 - Procéde suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de matériel de semence on utilise la semence obtenue à partir de la biomasse mixte de la culture du tissu de ginseng par sélection après un traitement thermique du tissu à une température de 34 à 38 C, semence conservée comme culture greffable à la température de 26 OC et à l'humidité de 70 %, avec un cycle de culture de -30 3ours, contenant des cellules callusses dont la taille est de 15-20 et 25-50 microns polydiploides, capables de division. 3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que pour protéger la biomasse contre une contamination par une microflore étrangère, on lui fait subir avant l'extraction un rayonnement ultraviolet pendant 20-30 minutes.