Brevet FR2553432A1 — publié le 19850419

La présente invention a trait à la biologie, et plus précisément elle se rapporte à un procédé d'intervention microchirurgicale sur les cellules et à un dispositif pour le réaliser. L'invention peut être appliquée dans les domaines de la biologie, de l'agriculture et de la médecine. Elle peut être utilisée avec bénéfice pour l'isolement et la transplantation des noyaux et d'autres organelles, des blastomères ovulaires, pour les micro-injections de différents produits dans les cellules, l'inactivation des noyaux, pour l'implantation et l'incorporation de parties cellulaires ou de différentes cellules dans les autres cellules, ou dans les tissus et organismes, pour les interventions micro-chirurgicales sur les vaisseaux les plus fins, les fibres musculaires et autres. On connaît un procédé pour la réalisation des interventions micro-chirurgicales sur les cellules, consistant en ce qu'on fixe la cellule par une microventouse et on introduit le micro-instrument dans la cellule. La ponction de la cellule s'effectue du coté opposé au site de la fixation de la cellule (voir, par exemple, P. Fonbrun, Les méthodes de micromanipulation, Inostranaya litératura, Moscou, 1951, pp. 147-149). A cause de la solidité et de l'élasticité de la membrane cellulaire, son percement ne s'effectue pas immédiatement après l'action sur elle de la pointe du microinstrument, mais seulement après une certaine déformation, souvent importante, de la zone à percer, ainsi que de toute la cellule, ce qui produit une traumatisation de -cette dernière. Par ailleurs, à la suite de grandes déformations de la cellule au moment de la ponction, on peut assister dans certains cas à une rupture de la membrane cellulaire, s'accompagnant d'une éjection (perte) du cytoplasme conséquente à la hausse de la pression intra-cellulaire, ainsi que dans d'autres cas à la dislocation des organelles l'une par rapport à l'autre. L'éjection du cytoplasme entraîne une perturbation de l'équilibre qui existe entre le contenu intracellulaire et le milieu externe, ce qui réduit notablement la capacité vitale de la cellule faisant 11 objet de l'intervention. On connaît également un procédé d'interventions microchirurgicales sur les cellules - le procédé de transplantation des noyaux, qui consiste en l'extraction du noyau de la cellule du receveur et sa transplantation dans la cellule du donneur, dont on extrait le propre noyau. Dans ce cas, le micro-instrument doit être introduit dans la cellule à double reprise : la première fois pour extraire le noyau, et la seconde fois pour y introduire l'autre noyau, ce qui revient à une double lésion de la cellule. Tous les faits susmentionnés entraînent, en règle générale, un rendement relativement faible en interventions favorables (voir, par exemple, M.J. Kopac. Instrumentation for the Transplantation of Nucleoli. J. of the Franklin Institute, 262, 407-411, 1956). On connaît un dispositif pour la réalisation des interventions microchirurgicales sur les cellules, qui comporte un micro-instrument, placé dans une monture qui est rigidement fixée avec la pièce mobile du micromanipulateur à triple pas, et une microventouse installée sur un autre micromanipulateur, et destinée à fixer la cellule qui fait l'objet de l'intervention (voir, par exemple, le.brevet français n0 1 085 965, publié en 1965). Le dispositif en question se caractérise par un actionnement suffisamment complexe des micromanipulateurs, par son prix élevé, par une productivité de travail relativement basse au cours des interventions microchirurgicales, compte tenu de ce qu'il exige la concordance de l'actionnement des deux micromanipulateurs, tout en n'excluant aucu nement la déformation de la cellule au moment de la ponction. La vibration de la microventouse et du micro-instrument produit une traumatisation supplémentaire de la cellule, et compte tenu de ce que la cellule qui est fixée sur la microventouse est suffisamment élastique, les cassures du microinstrument sont fort possibles au moment de la ponction de ladite cellule. On s'est proposé de perfectionner le procédé des interventions microchirurgicales sur les cellules, de façon qu'au moment du percement de la cellule par le microinstrument, la déformation de cette cellule soit réduite au minimum et le nombre des interventions favorables soit amené au maximum, ainsi qu'à construire un dispositif pour la réalisation dudit procédé, qui serait commode pour son exploitation, de bas prix, permettrait de réduite le temps néces- saire pour la réalisation de l'intervention micro-chirurgicale tout en étant suffisamment fiable. La solution consiste en ce que, dans le procédé d'interventionmicrochirurgicale sur les cellules, consistant en ce que l'on fixe la cellule au moyen de la microventouse et que l'on perce la membrane cellulaire avec le microinstrument, selon lrinvention, la ponction de la membrane cellulaire s'effectue dans la zone qui est limitée par les bords de la microventouse, le micro-instrument étant introduit à travers la cavité de la microventouse. Il sera dans ce cas avantageux de remplir la cavité de la microventouse de soluté isotonique. La solution consiste également en ce que, dans le dispositif pour la réalisation des interventions microchirurgicales sur les cellules, comportant le micro-instrument fixé dans la monture, qui est rigidement reliée avec la pièce mobile du micromanipulateur à trois coordonnées et la microventouse servant à la fixation de la cellule qui fait l'objet de l'intervention microchirurgicale, selon l'invention, la microventouse est rigidement fixée sur la monture du micro-instrument, le micro-instrument se situe dans la cavité de la microventouse, s'y plaçant dans un plan coaxial, et étant relié avec la monture par le biais d'un moyen qui assure son déplacement de translation suivant l'axe de la microventouse. Il est avantageux de réaliser la monture en forme de té creux, dont l'un des raccords communique avec la cavité de la microventouse, l'autre, qui y est opposé, porte une bague d'étanchéité-avec un orifice correspondant au diamètre du micro-instrument, et le troisième raccord, celui latéral, étant muni d'une tubulure pour la création d'une dépression dans la cavité de la microventouse et pour y injecter le soluté isotonique. A titre de moyen de liaison du micro-instrument avec la monture, il sera avantageux d'utiliser un mécanisme pas à pas de déplacement longitudinal ou une boite à membrane, dont le corps est rigidement relié avec la monture et la membrane avec le micro-instrument, sa cavité communiquant avec une source de pneumo-impulsions commandées. Le procédé d'interventions microchirurgicales sur les cellules, réalisé en accord avec la présente invention - exclut la déformation de toute la cellule au moment de sa ponction à l'aide du micro-instrument, - réduit la lésion de la cellule, - assure une haute précision de l'introduction du micro-instrument dans la cellule à une profondeur prescrite, - assure l'introduction du micro-instrument dans la cellule indépendamment de la forme et des dimensions de cette dernière, - réalise le déplacement de la cellule, quand cela s'avère nécessaire, avec le micro-instrument qui y est introduit, - assure la transplantation des organelles cel lulaires par le biais d'une seule ponction, - réalise la micro-injection des produits dans les parties bien précises de la cellule ou dans ses organelles, - accélère le processus de microchirurgie de la cellule. Le dispositif pour la réalisation des interventions microchirurgicales sur les cellules, exécuté en accord avec la présente invention, outre les avantages relevant de l'essence même du procédé, se caractérise également par sa haute fiabilité, la simplicité de sa commande étant donné qu'il ne demande que la commande d'un seul micromanipulateur, par un prix plus bas que le prix du dispositif connu, et par la réduction de l'éventualité de cassure des micro-instruments au moment de la ponction de la cellule. Dans ce qui suit, l'invention sera bien comprise à l'aide de la description ci-après des variantes concrètes de sa réalisation, en référence aux dessins annexés, représentant - figure 1, la vue générale du dispositif, objet de l'invention, pour les interventions microchirurgicales sur les cellules - figure 2, le bloc de la microventouse avec le micro-instrument et la boîte à membrane, en vue séparée - figure 3, le même dispositif que dans la figure 1 avec le propulseur pas à pas - figure 4, une variante de réalisation du clamp pour le micro-instrument à deux canaux, en vue sépa rée - figure 5, schématiquement le dispositif pour l'intervention microchirurgicale sur les cellules, objet de l'invention, et la cellule, objet de l'intervention, dans le champ de vision du microscope au moment de l'introduction du micro-instrument dans ladite cellule - figure 6, la cellule, objet de l'intervention, dans le champ de vision du microscope au moment de l'extraction du micro-instrument. L'essence du procédé des interventions microchirurgicales sur les cellules, selon l'invention, consiste en ce que l'on fixe la cellule, qui fait l'objet de l'intervention micro-chirurgicale, à l'aide de la microventouse. La fixation de la cellule s'obtient grâce à la dépression qui se produit dans la cavité de ladite microventouse au moyen du micro-injecteur après que la cellule entre en contact avec la face terminale de la microventouse. A travers la zone fixée de la membrane cellulaire, qui se délimite par la face terminale de la microventouse, on réalise la ponction de la membrane au moyen du micro-instrument et on introduit ce dernier dans la cellule à partir de la cavité de la microventouse. La zone fixée et étendue de la membrane cellulaire, qui se trouve sous la microventouse, baigne dans le soluté isotonique dont on remplit la cavité de la microventouse avant l'intervention.On introduit le soluté isotonique dans la cavité de la microventouse dans le but de préserver, au moment de la ponction de la membrane, l'éga- lité de la pression osmotique du contenu intracellulaire et de la solution extra-cellulaire dans la zone de ponction de. la membrane cellulaire. On a souvent recours pour les cellules des animaux à sang froid, les protozoaires et les micro-organismes, au soluté de Ringer à titre de soluté isotonique. Pour les cellules des animaux à sang chaud, on utilise les solutions de Ringer-Locke, de Ringer-Tyrode et autres. Toutes ces solutions doivent obligatoirement posséder le facteur de stabilisation de la membrane - les ions calcium, qui servent dans le cas de lésion de la membrane, à restituer rapidement la zone lésée de la membrane cellulaire.Dans certains cas, par exemple lors de la transplantation de certaines organelles intra-cellulaires, quand il s'avère nécessaire d'utiliser des micro-instruments de plus fort diamètre, c'est-à-dire quand on provoque des lésions importantes de la membrane cellulaire, le soluté isotonique doit contenir, en règle générale, différents composés à haut poids moléculaire (collidine, dextrane et autres) pour la création d'une pression colloido-osmotique (oncotique), déterminée par la présence dans le cytoplasme cellulaire de substances à haut poids moléculaire, essentiellement de protéines. Tous les facteur mentionnés favorisent la rapide restitution de la membrane cellulaire perforée et une perte minimale des composantes intracellulaires dans la cavité de la microventouse au moment de la ponction. Le procédé d'interventions microchirurgicales sur les cellules, proposé dans l'invention, exclut la déformation de toute la cellule au moment de la ponction grâce au fait que la cellule est fixée et percée par le micro-instrument seulement dans la zone fixée et étendue de la membrane, cette zone étant délimitée par les bords de la microventouse. Cette zone de la membrane se perfore facilement par le micro-instrument, tandis que toute la cellule à ce moment se trouve en état libre et ne se soumet pas à la déformation. L'application du procédé, objet de l'invention, assure la rapidité du processus de microchirurgie de la cellule, étant donné qu'il exclut l'étape pénible et minutieuse du choix de la zone à percer. Cette zone s'établit d'elle-même dès le moment de la fixation de la cellule à l'aide de la microventouse. Par ailleurs, la manipulation de la microventouse et du micro-instrument s'effectue simultanément. Au moment de la ponction, le micro-instrument ne peut pas déraper de la membrane, ce qui assure la haute précision de l'introduction du micro-instrument dans la cellule, indépendamment de sa forme et de ses dimensions. Le procédé d'intervention micro-chirurgicale sur les cellules, objet de l'invention, fut réalisé au moyen du dispositif, représenté dans les figures allant de 1 à 4. La figure 1 représente le dispositif pour l'in tervention microchirurgicale sur les cellules, comportant le micro-instrument 1, installé dans la monture 2, qui est rigidement liée avec la pièce mobile 3 du micromanipulateur à triple pas 4, et la microventouse 5, rigidement fixée sur la monture 2. Le micro-instrument 1 est installé dans la cavité de la microventouse 5 dans un plan coaxial par rapport à ladite microventouse, et il est relié à la monture 2 par le biais du corps de jonction 6 et du moyen 7a (figures 1, 2) assurant le déplacement de translation du micro-instrument 1 le long de l'axe de la microventouse 5. La monture 2, qui est renrésentée-en vue dispersée sur la figure 2, est réalisée sous la forme de té creux 8, dont l'un des raccords 9 est rigidement relié en y communiquant avec la cavité de la microventouse 5, le raccord qui y est opposé 10 portant la bague d'étanchéité 11 avec un orifice central correspondant au diamètre du micro-instrument 1, le troisième raccord qui est latéral étant muni de la tubulure 12 pour la création d'une dépression dans la cavité de la microventouse 5 et pour y injecter le soluté isotonique. Le mécanisme 7a représente une boîte à membrane, composée du corps 13 et du couvercle 14, avec la membrane 15 qui se fixe entre eux et qui porte le poussoir 16. Le corps 13 est muni de la tubulure 17, par l'intermédiaire de laquelle la cavité de la boîte à membrane communique avec la source des pneumo-impulsions commandées (qui n'est pas représentée dans la figure). La membrane 15 est rigidement reliée avec le micro-instrument 1 par le biais du poussoir 16 et du clamp 18. La figure 3 montre une variante de réalisation du dispositif pour les interventions microchirurgicales sur les cellules, selon l'invention, où à la différence de la variante représentée dans les figures 1, 2, le moyen 7a, assurant le déplacement de translation du micro-instrument 1 dans la cavité de la microventouse 5, est exécuté sous la forme d'un mécanisme pas à pas pour déplacement longitudinal, dont le corps 19 est rigidement relié avec la monture 2, tandis que la pièce mobile 20 du mécanisme pas a pas pour le déplacement longitudinal est rigidement fixée au micro-instrument 1. La figure 4 montre en vue dispersée la variante de réalisation du clamp 18 pour le micro-instrument à deux canaux, comportant les raccords 21 et 22 avec les tubulures 23 et 24 respectivement, dont chacune d'entre elles est destinée à communiquer avec le canal correspondant du microinstrument 1. Les raccords 21 et 22 sont reliés entre eux et rendus hermétiques par la rondelle d'étanchéité 25, et en outre, le raccord 21 porte sur son extrémité libre la rondelle d'étanchéité 26 avec l'écrou de serrage 27. Le fonctionnement du dispositif, objet de l'invention, représenté dans les figures allant de 1 à 4, est illustré dans les figures 5, 6, et il est décrit par l'exemple de transplantation des noyaux comme suit. A l'aide du micromanipulateur 4 (figure 1), qui assure le déplacement du micro-instrument 1 et de la microventouse 5, on place ces derniers dans le champ de vision 28 (figure 5) du microscope, près de la cellule 29. En produisant une dépression par le biais d'un micro-injecteur séparé, qui est relié avec la tubulure 12 (figure 1) et en approchant le bout de la microventouse 5 de la cellule 29 (figure 5), on aspire cette dernière dans la face terminale de la microventouse 5 de façon que la zone de la membrane cellulaire, délimitée par la face terminale de la microventouse 5 soit le site d'introduction du micro-instrument 1 à l'intérieur de la cellule 29. Par la suite, au moyen de la tubulure 17 (figure 1), on hausse la pression dans la cavité de la boîte à membrane ou dans la cavité de travail de la barre d'espacement - le moyen 7b (figure 3). Grâce à cette opération, la membrane 15 (figure 2) se déforme et déplace le poussoir 16 et le clamp 18 avec le micro-instrument 1. Dans la variante avec la barre d'espacement, c'est la pièce mobile 20 (figure 3) du propulseur qui se déplace. Il s'ensuit que le micro-instrument I réalise un déplacement de translation et perce la zone de la membrane cellulaire qui est fixée et délimitée par le diamètre de la face terminale de la microventouse 5 (figure 5). On place préalablement le noyau 30 qui doit être transplanté, et qui a été prélevé d'une autre cellule, dans l'un des canaux du micro-instrument 1.Dans le cas donné, on utilise à titre de micro-instrument 1 une micropipette à deux canaux, dont chacun d'entre eux est relié avec le micro-injecteur correspondant, et au moyen desquels on réalise l'aspiration et l'éjection des noyaux. On réalise la micro-injection et la micro-aspiration au moyen du micro-instrument 1 en produisant une pression ou une dépression à l'intérieur du corps de la monture 2 (figure 4) par les deux canaux à l'aide des tubulures 23 et 24 (figure 4). On réalise l'amenée du soluté isotonique, qui réduit l'effet lésionnel sur l'inté- grité de la membrane extérieure de la cellule, au moyen du micro-injecteur (non représenté sur la figure) et par l'intermédiaire de la tubulure 12 (figure 5). Après l'introduction du micro-instrument 1 à l'intérieur de la cellule 29, on aspire son noyau 31 (figure 6) dans le canal libre du micro-instrument 1, et on pousse le noyau qui doit être greffé 30, qui se trouve dans le second canal du microinstrument 1, à l'intérieur de la cellule 29. Il en ressort que la micro-intervention de transplantation des noyaux s'effectue par une seule ponction de la cellule. REVENDICATIONS 1. Procédé d'interventions microchirurgicales sur les cellules,à l'exception de cellules faisant partie du corps humain ou animal, consistant en ce que l'on fixe la cellule (29) au moyen d'une microventouse (5) et l'on terce la membrane de la cellule (29) avec un microinstrument (1), caractérisé en ce que la ponction de la membrane de la cellule (29) s'effectue dans la zone qui est limitée par les bords de la microventouse (5), en introduisant le micro-instrument (1) à travers la cavité de la microventouse (5). 2. Procédé d'interventions microchirurgicales sur les cellules, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on remplit la cavité de la microventouse (5) de soluté isotonique. 3. Dispositif pour la réalisation d'interventions microchirurgicales sur des cellules, comportant un microinstrument (1), placé dans une monture (2) qui est rigidement fixée à la pièce mobile (3) d'un micropanipulateur à triple pas (4), et une microventouse (5) servant à fixer la cellule (29), objet de l'intervention microchirurgicale, caractérisé en ce que la microventouse (5) est rigidement fixée sur la monture (2), le micro-instrument (1) est disposé dans la cavité de la microventouse (5) coaxialement à cette dernière, en étant relié avec la monture (2) par le biais d'un moyen (7a ou 7b) assurant le déplacement de translation du micro-instrument (1) le long de l'axe de la microventouse (5). 4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que la monture (2) est réalisée sous la forme de té creux (8), dont l'un des raccords (9) communique avec la cavité de la microventouse (5), le raccord (10) à l'opposé portant la bague d'étanchéité (11) avec un orifice correspondant au diamètre du micro-instrument (1), et le troisième - le raccord latéral - étant muni d'une t u bulu re (12) pour créer une dépression dans la cavité de la microventouse (5) et pour y injecter le soluté isotonique. 5. Dispositif selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on utilise à titre de moyen de liaison (7b) du micro-instrument (1) avec la monture (2) un mécanisme pas à pas pour déplacement longitudinal. 6. Dispositif selon la revendication 3 ou 4, ca caractérise en ce que l'on utilise à titre de moyen (7a) de liaison. du micro-instrument (1) avec la monture (2) une bot- te à membrane, dont le corps (13) est rigidement relié avec la monture (2), et la membrane (15) avec le micro-instrument (I), sa cavité étant en communication avec une source de pneumo-impulsions commandées.