Brevet FR2549852A1 — publié le 19850201

PROCEDE POUR LA MISE EN OEUVRE DE REACTIONS ENZYMATIQUES UTILISANT DES ENZYMES IMMOBILISEES ET APPAREILLAGE POUR SA MISE EN OEUVRE. La présente invention concerne le procédé de réalisation et de la suite des réactions enzymatiques tout en utilisant les enzymes immobilisés et également l'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé. Le dosage de la concentration des substrats est basé sur la détermination expérimentale de la courbe de calibrage, cependant qu'il est conforme au but, que le calibrage soit linéaire dans l'espace du temps En tant que les méthodes de calibrage sont utilisées les méthodes cinétiques et stationnaires Les méthodes cinétiques utilisent pour le calibrage un paramètre caractérisant la vitesse du changement de la grandeur surveillée, qui est surveillée dans le mélange réactionnel après l'addition de l'échantilIon Elle est par exemple utilisée la valeur du départ du 15 coefficient de la dépendance de la grandeur surveillée sur le temps, au cours duquel la grandeur surveillée atteint après l'addition de l'échantillon une certaine valeur antérieurement choisie, ou la valeur de la grandeur, atteinte après un certain temps, antérieurement choisi du 20 moment de l'addition de l'échantillon En utilisant les méthodes stationnaires, la dépendance de calibrage est déterminée de la valeur permanente de la grandeur surveillée, atteinte dans le mélange réactionnel après l'addition de l'échantillon Les méthodes cinétiques de calibrage sont 25 avantageuses, pour la raison, qu'elles permettent une fixation rapide du substrat concerné Leur désavantage repose dans le fait, que la vitesse du changement surveillé peut dépendre de la cinétique de la réaction enzymatique même, qui peut changer considérablement avec l'activité dé30 croissante de l'enzyme. Le plus souvent sont utilisés deux procédés du dosage de l'enzyme dans le récipient réactionnel et ceci de la manière, que l'enzyme ou les enzymes dissouts ou mis en suspension dans la solution régulatrice convenable sont dosés dans le fluide, composé de la solution régulatrice et des cofacteurs Ensuite est ajouté, l'échantillon étudié, glucose, plasma, sang, etc et à l'aide de l'organe sensible est enregistré le cours de la réaction enzymatique, par exemple la diminution de l'oxygène dans le récipient réactionnel par l'électrode à oxygène Par comparaison avec la 10 courbe de calibrage est ensuite déterminée la concentration de la substance dans l'échantillon Au cours de ce procédé du dosage l'enzyme est dispersé d'une manière homogène dans le fluide réactionnel Apres la fin de la réaction est éliminé en même temps avec le fluide réactionnel également 15 l'enzyme Pour chaque fixation ultérieure il est nécessaire d'utiliser un nouveau dosage de l'enzyme Le désavantage principal de ce procédé consiste en la très grande consommation des enzymes coûteux, qui sont définitivement consommés après une seule utilisation. Selon le second procédé, l'enzyme ou les enzymes sont immobilisés sur la surface extérieure de la membrane qui couvre l'organe sensible, ou sur la membrane qui couvre l'organe sensible est jointe encore une autre membrane ou le tissu, sur laquelle ou sur lequel est lié d'une manière 25 convenable l'enzyme Par ce fait est formée l'électrode dite "aux enzymes" L'enzyme immobilisé peut être utilisé pour beaucoup d'analyses Le désavantage principal des électrodes aux enzymes consiste dans le fait, que la réaction enzymatique influence le champ de concentration du produit sur30 veillé de la réaction ou du substrat dans la proximité immédiate du détecteur électrochimique et par ce fait elle participe également à la formation du niveau du signal du détecteur, comme le niveau du signaldu détecteur est dépendant de la cinétique du transport de la substance étudiée par la 35 couche de l'enzyme ancré Le transport de la composante étudiée par cette couche et donc le signal de la sonde est fixé par la diffusion intérieure des autres substances qui participent à la réaction en couche et par la vitesse de la réaction enzymatique, qui est également dépendante de la concentration et de l'activité de l'enzyme lié dans la couche Pour cette raison dépendent les propriétés de calibrage des électrodes aux enzymes d'une part sur les paramètres cinétiques de la réaction enzymatique et d'autre part sur les paramètres, qui caractérisent le transport de diffusion 10 des composantes différentes dans les membranes, qui couvrent le détecteur Ces paramètres peuvent changer par le procédé de préparation de la sonde avec l'enzyme ancré, par exemple avec la quantité de l'enzyme lié dans l'unité du porteur, avec son activité, tandis que la diffusivité des composantes 15 par le porteur change non seulement par le changement de quantité de l'enzyme lié, mais également par le dégré de la réticulation du porteur Au cours de l'utilisation de la sonde descend successivement l'activité de l'enzyme Les effets mentionnés, qui se mettent en valeur d'une manière décisive au cours de la formation du niveau du signal de la sonde ne réussisent pas d'être décrits par les équations simples et pour cette raison ne conviennent pas au déchiffrement automatique du signal Des faits précités découlent les désavantages suivants des analyses utilisées jusqu'à 25 présent, basées sur l'exploitation des électrodes aux enzymes Il s'agit généralement de la préparation compliquée de membranes à plusieurs couches, qui ne permet pas un renouvellement rapide des sondes Les sondes ne peuvent pas être préparées d'habitude pour la réserve et d'être gardées 30 aux températures basses jusqu'au moment de leur utilisation. Egalement la dépendance du niveau du signal de la sonde de la cinétique de la réaction enzymatique et de la diffusion intérieure de toutes les composantes réactionnelles dans la couche de l'enzyme ancré, qui découle de la géométrie du 35 système, complique le mesurage et le déchiffrement. Ayant en vue le fait, que le signal de la sonde est déterminé par les procédés de diffusion dans les couches étroitement liées au détecteur électrochimique, celui-ci est très sensible aux faibles changements de la géométrie de ces couches, qui sont évoqués par les très faibles déformations des couches élastiques, par exemple par la touche mécanique, par l'agitation intense, par le choc de l'agitateur électromagnétique surle détecteur et autrement Egalement existe forte instabilité du signal, nécessité du reca10 librage souvent et une description mathématique du comportement de l'électrode aux enzymes Au cours de l'utilisation du micro-ordinateur pour le déchiffrement du signal de la sonde est nécessaire un logiciel très compliqué et une grande capacité de mémoire. Les inconvénients précités sont éliminés conformément à la présente invention par le procédé de réalisation et de la suite des réactions enzymatiques tout en utilisant les enzymes immobilisés Son fond consiste dans le fait, que les réactions enzymatiques sont effectuées dans le réacteur, tandis que le matériel enzymatique est fixé sur la surface de l'agitateur ou sur la surface d'une autre partie immobile, qui puisse être facilement enlevée et installée à l'intérieur du réacteur, séparée du détecteur de l'appareil de mesure, en quantité suffisante pour l'entretien de la concentration de 25 la substance déterminée sur la surface de la couche enzymatique au cours de la suite de mesurage en valeurs entre 0 et 3 %, en liaison avec la concentration de la solution du départ Selon une autre manifestation de la présente invention sont dans la solution liquide réactionnelle additionnées les substances, qui augmentent la viscosité, comme par exemple la carboxyméthylcellulose ou l'alcool polyvinylique Le fond de l 'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé consiste dans le fait, que celui-ci est composé du réacteur, fourni de l'agitateur, plus avantageu35 sement magnétique, sur la surface duquel est fixée la liaison du matériel enzymatique Suivant l'exécution de l'alternative, l'appareillage est composé du réacteur, à l'intérieur duquel sont installées les parties immobiles, fournies d'une couche du matériel enzymatique fixé. L'avantage principal du procédé, conformément à la présente invention, consiste dans sa large gamme d'utilisations, comme par exemple la détermination du glucose dans les liquides du corps humain dans le sang, sérum sanguin ou plasma, urine par l'oxydation de glucose par l'oxygène en présence des enzymes de glucosoxydase et de catalase par la suite de consommation de l'oxygène à l'aide de l'électrode à oxygène Le procédé, conformément à la présente invention en liaison avec l'électrode à oxygène, peut être utilisé pour le but de la détermination de quantité également 15 d'autres substances, comme par exemple de l'acide lactique, acide urique, cholestérol, acides amines du type -1 et du Lype -d, alcool, galactose et des autres substrats en liaison avec l'oxydase spécifique respective Le procédé, conformément à la présente invention, peut etre également utilisé 20 pour le but de la détermination de quantité même de ces substances, pour lesquelles l'oxydase respective n'est pas connue, comme par exemple pour la détermination du sacharose, maltose ou du glycogène, en utilisant plusieurs enzymes différents, à la suite de l'action desquels se forme ensuite 25 le substrat oxydable Pour la détermination du sacharose est utilisée l'invertase et glucosoxydase, pour la détermination du maltose l'enzyme de maltase et glucosozydase, pour la détermination du glycogène les enzymes d'amylase, de maltase et glucosozydase Le procédé, conformément à la présente invention, en liaison avec un autre type de l'organe sensible, comme par exemple avec l'électrode p H, peut être utilisé pour le but de la détermination de quantité des substrats inoxydables Le procédé proposé peut être avantageusement utilisé non seulement pour les buts analytiques, mais éga35 lement pour les buts de production, comme par exemple pour l'épuration des solutions des médicaments ou des boissons de produits ou des impuretés indésirées, partout ou il est possible à l'aide des enzymes ou de l'enzyme évoquer le changement désiré et à l'aide du changement d'un paramètre physique de contrôler le cours ou la fin de la réaction enzymatique Ces paramètres physiques sont par exemple les concentrations de l'oxygène, du peroxyde d'hydrogène, d'hydrogène, fluorescence, p H, conductibilité, extinction, couleur, etc. L'appareillage, conformément à la présente invention, possède les avantages suivants: le corps de l'agitateur ou l'objet avec l'enzyme ancré peut être facilement enlevé, changé ou renouvelle, cas échéant, ou de changer la couche extérieure avec le matériel enzymatique ancré, sans que l'on 15 change les caractéristiques du détecteur utilisé pour suivre le cours de la réaction L'agitateur ou l'objet avec l'enzyme ancré ou la feuille avec le matériel enzymatique pour fixer sur la surface de l'agitateur ou de l'objet, qui puisse être enlevé, peuvent être préparés pour la réserve et les garder 20 sans changement de l'activité même au cours de plusieurs mois Par l'échange de l'agitateur avec le matériel enzymatique, immobilisé sur sa surface, par l'agitateur avec un autre matériel enzymatique ancré sur sa surface, il est possible dans le même petit réacteur à l'aide du même organe 25 sensible, d'analyser un autre substrat Dans le seul échantillon, dans le même petit réacteur avec le seul organe sensible, il est possible par le seul échange du petit agitateur avec l'enzyme immobilisé respectif, de déterminer plusieurs substances, comme par exemple le glucose dans le 30 plasma sanguin par l'objet avec le glocosoxydase immobilisé, en échange de l'objet avec le lactatoxydase immobilisé l'acide lactique et en échange de l'objet avec uratoxydase immobilisé l'acide urique, sans que l'on change le contenu du récipient réactionnel ou le détecteur Par le changement 35 des tours de l'agitateur ou par le changement de la visco- sité du mélange réactionnel par addition des substances qui influencent la viscosité, comme par exemple de la carboxyméthylcellulose ou de l'alcool polyvinylique, le taux d'influence de la diffusion extérieure sur la vitesse de la grandeur surveillée peut être dirigé et par ce fait de changer l'étendue de calibrage d'analyseur Le champ du rôle dirigeant de la diffusion extérieure du substrat envers le film d'enzyme est atteint, quand la concentration du substrat sur la surface de l'enzyme ancré est conservée à la valeur proche du zéro, en tout cas à la valeur inférieure aux 3 % de la valeur de la concentration à l'origine du substrat dans l'échantillon Ce champ peut être atteint par les procédés différents, comme par exemple par l'abaissement des tours de l'agitateur, par quoi augmente l'épaisseur du film liquide et en plus s'abaisse la diffusivité du substrat, ou par l'augmentation de l'activité de l'enzyme immobilisé. Si l'appareillage peut être utilisé dans le champ du rôle dirigeant de la diffusion extérieure de la substance déterminée, l'appareillage possède dans ce cas les autres avan20 tages mentionnés ci-dessus: une description mathématique simple de la Vitesse du changement de la grandeur surveillée, déterminée pour le réacteur clos par la dépendance exponentielle de la valeur de la grandeur surveillée, comme par exemple de la concen25 tration de l'oxygène sur le temps Ce caractère de la dépendance est même en utilisant l'enzyme quelconque, c'està-dire, en suivant la concentration du substrat quelconque. Ceci peut être avantageusement utilisé au cours du déchiffrement du signal par le micro-ordinateur pour la raison 30 que la capacité de logiciel est simple et identique pour touteune gamme d'appareils pour déterminer les substrats différents La dépendance de calibrage, basée sur la valeur de la vitesse du départ du changement de la grandeur surveillée, par exemple sur la vitesse du changement de concen35 tration de l'oxygène, est ensuite linéaire et cependant le coefficient de la dépendance linéaire ne dépend pas de l'activité de l'enzyme, si bien naturellement la concentration ou l'activité de l'enzyme sont suffisamment grandes. L'activité de l'enzyme détermine seulement l'étendue, dans laquelle la dépendance de calibrage est linéaire Avec l'activité abaissante de l'enzyme s'abaisse l'étendue de linéarité Une stabilité de calibrage de l'appareil à long terme -peut être atteinte par le fait, que la haute concentration de l'enzyme ancré est utilisée Ensuite l'abaissement 10 de l'activité ne se manifeste pas dans le calibrage, si l'enzyme est capable de garder la concentration du substrat déterminé sur la surface de la couche enzymatique sur la valeur proche du zéro à la limite du haut de l'étendue de l'appareil L'augmentation de la viscosité de la solution ou par l'abaissement des tours de l'agitateur peuvent élargir le champ linéaire du calibrage La dépendance de calibrage n'est pas sensible aux touches mécaniques L'agitateur ou les parties qui puissent etre enlevées, précitées, peuvent être enlevées du réacteur, les prendre en mains et de nouveau 20 les remettre dans le réacteur sans que le calibrage de l'appareil soit changé. L'invention est décrite de plus près sur l'exemple de réalisation et suivant les dessins joints, de quels sur le premier dessin est caractérisé l'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé en illustration schématique et sur le deuxième dessin est caractérisée la courbe de calibrage. L catalase en quantité totale de 20 unités internationales. Dans le réacteur 3 a été additionné l'échantillon La solution de la solution régulatrice avec p H 6,6 contenant le glucose, dont la quantité devrait être déterminée Dans le tableau se trouve dans la première colonne le coefficient d'origine de la dépendance du signal de sonde d'oxygène 2 en unités du choix, dans la deuxième colonne la concentration de glucose du départ dans le mélange réactionnel en milli15 moles et dans la troisième colonne le nombre de miccomoles de la solution de base Du tableau découle, q 'un champ très large de linéarité de la courbe de calibrage a été atteint dans l'étendue de O à 0,74 07 m M de la concentration d'origine du glucose La courbe de calibrage respective est carac20 térisée sur le deuxième dessin Les enzymes avaient été fixés sur le filet en nylon de grandeur d'oeillets de 50 jm sur la surface limitée par anneau 8 ayant le diamètre de nm Sur cette surface ont été mises à peu près 20 unités internationales du glucoxydase brut, qui contenait même le 25 catalase La préparation de la solution pour la fixation du glucoxydase sur le filet de nylon: ml du mélange se prépare comme il suit: 5 mg du glucoxydase dissout dans 50 ml d'eau, 50 ml d'albumine de 10 % de boeuf et 20 ml du glataraldéhyde dans 0,5 M de la solution régulatrice p H 6,6 sont additionnés Dans l'anneau 8 ayant le diamètre de 10 mm du filet sont mis de 15 à 20 ml de ce mélange et sont laissé de sécher. Coefficient du départ Concentration du départ ml de la solution de la dépendance de du glucose dans le de base du glucose la sonde d'oxygène mélange réactionnel 0,4 0,0185 1,25 1,0 0,0481 3,25 1,6 0,0741 5 2,35; 2,4 + 0,1111 7,5 3,1; 3,2 + 0,1481 10 z 4,8 0,222 15 > H 6,4 0,2963 20 H 8,5 0,3703 25 9,9 0,444 30 13,4 0,5926 40 16,1; 16,5 + 0,7407 50 18,7 0,8888 60 24,4 1,481 100 t L c: o +/ les déterminations répetées après un jour. tn on w VI Le procédé conformément à l'invention possède tous les avantages des procédés utilisés jusqu'à présent, qui utilisent les solutions enzymatiques homogènes, c'est-àdire, la réponse rapide du détecteur et en même temps l'avan5 tage de l'immobilisation de l'enzyme, c'est avant tout sa faible consommation. REVENDICATIONS 1 Le procédé de réalisation et de la suite des réactions enzymatiques tout en utilisant les enzymes immobilisés caractérisé par le fait, que les réactions enzymatiques sont effectuées dans le réacteur, tandis que le matériel enzymatique est fixé sur la surface de l'agitateur ou sur la surface d'une autre partie immobile installée à l'intérieur du réacteur, et qui puisse être facilement enlevée, séparément du détecteur de l'appareil de mesurage, en quantité suffisante pour conserver la concentration de la substance déterminée sur la surface de la couche enzymatique au cours de la gamme de mesures sur les valeurs de O à 3 %, par rapport à la concentration de la solution du départ. 2 Le procédé de réalisation selon la revendication 1, caractérisé par le fait, que dans le mélange réactionnel liquide sont additionnées les substances, qui augmentent la viscosité, par exemple le carboxyméthylcellulose ou l'alcool polyvinylique. 3 L'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé, conformément à la revendication 1, caractérisé par le fait, 20 qu'il est composé du réacteur /3/, muni de l'agitateur /5/, plus avantageusement magnétique, sur la surface duquel est fixée une couche du matériel enzymatique. 4 L'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé, conformément à la revendication 1, caractérisé par le fait, 25 qu'il est composé du réacteur /3/, à ltintérieur duquel sont installées les parties immobiles, qui puissent être enlevées, fournies d'une couche du matériel enzymatique fixé.