Brevet FR2556840A1 — publié le 19850621

La présente invention concerne un procédé de dosage des immunoglobulines qui fixent les allergènes ainsi que les réactifs et moyens pour la mise en oeuvre de ce procédé. On sait en effet que l'identification de substances donnant lieu à des phénomènes d'allergie, pour un malade donné, est essentielle pour son traitement. Cette identification se fait, soit par un test cutané bien connu, soit par détection des immunoglobulines de type E (désignées ci-après dans le reste de la description par IgE) présentes chez le malade et capables de fixer l'allergène que l'on suspecte comme étant la cause de la maladie du patient. Actuellement, le procédé principalement utilisé pour la recherche des IgE spécifiques fait appel, pour chaque test, à un allergène déterminé que l'on fixe sur un support solide et qui est destiné à se lier à l'IgE spécifique en cause. Ce test consiste alors à faire en sorte que ladite IgE puisse également se lier à un anticorps anti-IgE marqué (soit à l'iode 125, soit avec une enzyme) et qui sert de traceur. Ce procédé offre un éventail de possibilités relativement étendu, étant donné que l'on peut disposer à l'heure actuelle de plus de 160 allergènes fixés sur phase solide. Il convient toutefois de noter que dans les réalisations industrielles auxquelles il a donné lieu, il est impossible de réutiliser l'échantillon si le test est négatif. I1 peut être nécessaire de réitérer les prélèvements si la recherche se prolonge, ce qui peut présenter des inconvénients notamment dans le cas de jeunes enfants. Au surplus, les réactifs et matériels utilisés ne permettent pas d'identifier plus d'un allergène à la fois, c'est-à-dire qu'ils ne permettent pas de mettre en évidence la reconnaissance de plusieurs allergènes sur le même échantillon lié.En outre, le procédé ne permet pas de quantifier avec exactitude les IgE spécifiques. La présente invention constitue une solution plus simple, plus économique, et permettant le réemploi de l'échantillon. L'automatisation est d'autre part très facile à réaliser et permet la recherche rapide des spécificités ainsi que l'utilisation de mélanges d'allergènes. Le procédé de l'invention pour le dosage in vitro des immunoglobulines spécifiques d'un ou plusieurs allergènes est caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement à disposer d'un anticorps'anti-immunoglobulines sur une phase solide, cet anticorps étant capable de fixer l'ensem- ble des ir.munoglobulines (d'un isotype donné) d'un patient, quelles que soient leurs spécificités, et à utiliser un allergène en vue de sa fixation sur les immunoglobulines spécifiques fixées sur ledit anticorps anti-immunoglobulines, et conditionné pour servir directement ou indirectement de traceur ultérieurement reconnaissable. De façon particulière 10) On dispose d'une phase solide sur laquelle est greffé un anticorps anti-immunoglobulines (par exemple anti-IgE). 20) Suivant une première variante, on dispose d'une collection d'allergènes solubles, ou émulsifiés, portant un élément servant de marqueur (radioélément, enzyme, fluorophore, etc ...). L'échantillon est d'abord mis au contact de la phase solide sur laquelle les IgE vont se fixer. Ensuite, les IgE ainsi fixées sont successivement mises en présence des différents allergènes et on note à chaque passage la quantité de traceur retrouvé sur la phase solide, qui représente la quantité d'IgE spécifique de l'allergène correspondant (figure 1 variante a) 30) Suivant une autre variante, avantageusement le marquage de l'allergène sera réalisé après la fixation à la phase solide de la façon suivante Les allergènes de la collection sont couplés (avant le contact avec la phase solide) à une molécule H, toujours la même.On dispose d'un ligand anti H, lui-même marqué (radioélément, enzyme, fluorophore, etc...) (figure 2 variante b). C'est le réactif universel, reconnaissant indifféremment tous les allergènes et capable de se lier à ceux-ci par l'intermédiaire de H qui sert de révélateur à l'ensemble de la chaîne réactionnelle (figure 2 variante b). L'avantage est double : le marqueur est universel la réaction est amplifiée. H peut être la biotine, anti H est alors l'avidine. H est un antigène (haptène de préfé rence), anti H est alors l'anticorps correspondant, les rôles de H et anti H pourront être inversés. Dans la présente description, on entend par anticorps, soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. De façon pratique, on dispose essentiellement d'une phase solide par exemple un tube de laboratoire, une plaque de titration, etc, et on fixe sur cette phase,conformément à l'invention, l'anticorps anti-IgE. A cet effet, on peut faire appel à tout procédé connu de fixation et notamment à un procédé du type de celui décrit dans le brevet français nO 83 05618. Pour la mise en oeuvre de la variante a) on procède de la façon suivante - incubation de l'échantillon à analyser avec la phase solide porteuse de l'anti-IgE - rinçage - incubation d'un (ou plusieurs) allergène soluble marqué avec ladite phase solide sur laquelle-sont fixés aussi bien les IgE non spécifiques que les éventuelles IgE spécifiques dudit allergène - rinçage et comptage de la radioactivité (allergène marqué avec un radioélément) ou mesure de l'activité enzymatique (allergène marqué avec une enzyme). Pour la variante b) on procède de la façon suivante - incubation de l'échantillon avec la phase solide porteuse de l'anti-IgE - rinçage - incubation d'un (ou plusieurs) allergène couplé à une molécule H avec ladite phase solide - rinçage - incubation de l'anti-H marqué avec la phase solide résultant de ce rinçage et qui porte par conséquent l'anti-IgE qui a fixé les IgE aussi bien spécifiques que non spécifiques et sur les IgE spécifiques s'il y en a, l'al-lergène couplé à la molécule H sur laquelle s'est alors fixé l'anti-H marqué - rinçage et comptage de la radioactivité (anti H marqué-avec un radioélément) ou évaluation de l'activité enzymatique (anti H marqué avec une enzyme). Dans les deux cas (variantes-a) et b)), si l'échantillon se révèle négatif vis-d-vis d'un allergène donné, la même phase solide peut être immédiatement réincubée avec un autre allergène, et ainsi de suite jusqu'à ce qu'un allergène testé soit reconnu. Un tel système peut être automatisé et le traceur récupéré et réutilisé à chaque cycle. On peut donc ainsi avec une seule phase solide, une seule dose d'échantillon à analyser,et une seule dose de traceur, tester autant d'allergènes que l'on. peut effectuer de cycles. De plus, comme le procédé permet d'incuber et donc de tester plusieurs allergènes à la fois, il est possible en utilisant un système binaire de discrimination d'identifier rapidement une spécificité contre un allergène (par exemple pour les 128 spécificités testées, 8 étapes sont suffisantes pour identifier l'allergène reconnnu par les IgE d'un patient : 128, 2 x 64, 2 x 32, 2 x 16, 2 x 8, 2 x 4, 2 x 2, 2 x 1 - les chiffres soulignés correspondant au nombre d'allergènes dans le mélange testé). On notera par ailleurs que dans la variante b), le quantité d'IgE spécifique, déterminée selon le modèle précédent, peut être comparée à celle des IgE totales, déterminée à l'aide d'une phase solide identique et d'anticorps anti-IgE greffés avec la molécule H, d'où une quantité fication possible lorsque le nombre de molécules H fixées est déterminé. Il va du reste de soi que la présente invention n'a été décrite qu'd titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre ;' en particulier pour le dosage des immunoglobulines anti-allergènes appartenant à une classe autre qu'IgE (IgG par exemple dans ce cas on remplace l'anticorps anti IgE par un anticorps anti IgG). De même plusieurs molécules d'allergènes pourront être liées entre elles afin d'être reconnues dans leur ensemble et d'entrainer une forte amplification du signal, en particulier lorsque 1' identification se fait par l'intermédiaire des molécules H. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage in vitro des immunoglobulines spécifiques d'un ou plusieurs allergènes, caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement à disposer d'un anticorps anti-immunoglobulines sur une phase solide, cet anticorps étant capable de fixer l'ensemble des immunoglobulines (d'un isotype donné) d'un patient, quelles que soient leurs spécificités, et à utiliser un allergène en vue de sa fixation sur les immunoglobulines spécifiques fixées sur ledit anticorps anti-immunoglobulines, et conditionné pour servir directement ou indirectement de traceur ultérieurement reconnaissable. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'anticorps anti-immunoglobulines est un anti IgE. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on fixe sur un support solide, pour tout moyen connu, un anticorps anti-immunoglobulines, que l'on fait incuber le matériel résultant avec l'échantillon à analyser pour fixer les éventuelles immunoglobulines présentes, qu'après élimination desdites substances non fixées, on fait incuber le matériel résultant avec un ou plusieurs allergènes marqués directement ou indirectement et qu'après séparation des phases solide et liquide on détermine la proportion de la quantité de produits marqués, soit fixés, soit retrouvés en solution. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le ou les allergènes sont couplés à un élément radioactif, à un fluorophore ou à une enzyme. 5. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que le ou les allergènes sont couplés à une ou plusieurs molécules H susceptibles de se fixer à un ligand (anti H), lui-même marqué par un élément radioactif ou couplé à un fluorophore ou à une enzyme. 6. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou 5, caractérisé par le fait que la ou les molécules H est la biotine et l'anti H est l'avidine couplée à un élément radioactif, à un fluorophore ou à une enzyme. 7. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou 5, caractérisé par le fait que la ou les molécules H est un antigène hapténique (hormone, médicament et analogues) et l'anti H est un anticorps à haute affinité couplé à un élément radioactif, à un fluorophore ou à une enzyme. 8. Réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés par le fait qu'ils comprennent un support solide sur lequel est couplé un anticorps anti-immunoglobulines, des allergènes solubles judicieusement couplés de manière qu'ils puissent soit servir de traceur en eux-mêmes (couplage avec un élément radioactif, un fluorophore ou une enzyme), soit être reconnus par un traceur (couplage avec une ou plusieurs molécules H), le traceur étant un ligand (anti H) lui-même marqué (par couplage avec un élément radioactif, un fluorophore ou une enzyme). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 8, où les immunoglobulines appartiennent à une classe autre qu'IgE. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que plusieurs molécules (identiques ou distinctes) d'allergènes sont liées entre elles pour être reconnues dans leur ensemble par les IgE spécifiques de l'une d'entre elles. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,. caractérisé par le fait que l'anticorps lié à la phase solide est un anticorps monoclonal.