Brevet FR2553294A1 — publié le 19850419

-1 L'invention concerne un procédé pour l'électroélution de macromolécules porteuses d'une charge électrique par le transfert, sous l'effet d'un champ électrique extérieur, des macromolécules à éluer, d'un compartiment à éluer dans un piège. L'invention concerne en outre un dispositif pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. Dans le cadre de l'invention, l'électroélution ne concerne pas uniquement l'élution de macromolécules contenues dans les gels, notamment dans les gels d'électrophorèse, c'est-à-dire l'électroélution clas10 sique, mais également l'élution à partir de solutions diluées en vue de la concentration ou du transfert de macromolécules contenues dans les solutions en vue de la déminéralisation ou de l'inversion du tamponnage (dialyse) Dans un but de simplification, ces différents aspects seront repris, dans le cadre de la présente invention, sous le terme géné15 ral de "électroélution". Les macromolécules porteuses d'une charge électrique dans le sens de l'invention sont, d'une part, des macromolécules d'un poids moléculaire supérieur à 1000 et, d'autre part, des macromolécules biologiques spécifiques telles que les DNA, les RNA ou des protéines. Un procédé tel que défini ci-dessus a été décrit dans la revue Analytical Biochemistry 124 299 à 302 ( 1982) Le piège pour les macromolécules éluées y est constitué par un sachet de nylon contenant un gel adsorbant, notamment de la gélose ou vert malachite, qui assure l'adsorption intermédiaire des macromolécules éluées du gel d'électropho25 rèse A l'issue du processus complet de l'élution, le gel d'adsorption intermédiaire est lui-même élue sur une colonne, notamment à l'aide d'une solution de perchlorate de sodium Les pertes en macromolécules provoquées par cette adsorption intermédiaire atteignent 25 % au moins, ce qui en d'autres termes revient à dire que le rendement de ce procédé, 30 qui est le meilleur connu à ce jour, ne peut atteindre que 75 % au maximum Par ailleurs, ce procédé exige un temps anormalement long et est particulièrement onéreux Il est, d'une part, onéreux compte tenu -2 du gel utilisé pour l'adsorption intermédiaire et il exige, d'autre part, un temps anormalement long, compte tenu de la deuxième élution des macromolécules Ainsi le traitement de la fraction du gel d'électrophorèse exige selon ce procédé au moins 40 minutes. Compte tenu du niveau connu de la technique, il incombe à l'invention de définir un procédé ainsi qu'une installation pour la mise en oeuvre de celui-ci, qui permettent une électroélution rapide, peu onéreuse et à faibles colts d'exploitation, des macromolécules d'origine indifférente porteuses d'une charge électrique. Le problème ainsi posé est résolu par un plocédé du type défini ci-dessus, caractérisé en ce que les macromolécules véhiculées dans le champ électrique traversent dans une première étape une membrane intérieure du piège, laquelle à l'intérieur du champ électrique est perméable aux macromolécules, mais qui en l'absence du champ électri15 que extérieur est imperméable à toutes substances et notamment imperméable à l'eau, après quoi et dans une deuxième étape les macromolécules sont dirigées sur une membrane extérieure du piège, laquelle à l'intérieur du champ électrique est perméable aux petits ions et aux molécules, mais qui même dans le champ électrique reste imperméable aux 20 macromolécules et en ce que les macromolécules sont finalement prélevées avec le fluide liquide du piège limité par les deux membranes. En d'autres termes, ceci revient à dire que l'idée fondamentale de l'invention est basée sur le fait que les macromolécules éluées et transférées sous l'effet d'un champ électrique extérieur ne sont pas re25 cueillies dans un piège adsorbant, mais bien dans un piège qui est constitué de deux membranes en matière polymère et qui contient de l'eau distillée ou une solution de tamponnage Ceci est réalisé par le fait que les macromolécules éluées sont dirigées dans un premier temps sur une membrane intérieure du piège qui, en présence d'un champ électrique, est perméable également aux macromolécules et dans un deuxième temps sur une membrane extérieure du piège également en matière polymère qui, dans le champ électrique est imperméable aux macromolécules. Après la suppression du champ électrique, la membrane intérieure du piège devient pratiquement imperméable à tout passage d'un corps quelconque, elle est donc également imperméable à l'eau, ce qui permet de prélever simplement à l'aide d'une pipette les macromolécules concen5 trées dans le piège, en même temps que le fluide liquide contenu dans ce même piège Ce procédé d'électroélution des macromolécules porteuses d'une charge électrique peut s'effectuer avec un taux d'exploitation d'au moins 90 % La durée de l'élution d'une fraction de gel d'électrophorèse ne dépasse pas 5 minutes Par ailleurs, on fait l'économie 10 du gel d'adsorption intermédiaire utilisé dans le cadre de la seule technique actuellement connue. En application du procédé défini par l'invention, il peut arriver que les macromolécules transférées dans le piège se concentrent sur la membrane extérieure du piège Elles ne peuvent donc pas être 15 prélevées quantitativement à court terme en même temps que le fluide liquide emprisonné dans le piège Cette accumulation ou adhérence et/ou adsorption de macromolécules porteuses d'une charge électrique sur la paroi extérieure du piège, imperméable mgme à l'intérieur du champ électrique, peut être évitée par le fait qu'à l'issue du processus d'élution 20 proprement dit et après le transfert de l'ensemble des macromolécules dans le piège, l'on inverse brièvement la polarité du champ électrique extérieur, ce qui fait que l'ensemble des macromolécules porteuses d'une charge électrique accumulées sur la membrane extérieure du piège se décollent et retombent dans le fluide de ce piège L'inversion de la pola25 rité du champ s'étend de préférence sur une durée de 10 à 15 secondes. Dans le cadre de ce même processus l'on peut utiliser également des membranes qui, dans un but précis, peuvent ne pas adsorber soit des particules à charges positives, soit des particules à charges négatives. A cet effet l'on utilise en amont du pale négatif du champ électrique ex30 térieur, une membrane extérieure du piège qui n'adsorbe pas les particules positives et inversement l'on utilise en amont du pôle positif du champ électrique extérieur une membrane extérieure du piège qui n'adsorbe pas les particules négatives. Ces deux possibilités peuvent bien entendu être combinées. Le compartiment d'élution est limité sur un côté au moins par un piège Sur le c 6 té opposé, il est également prévu un piège Or, on peut très bien n'utiliser qu'une seule membrane de fermeture Le procédé et le dispositif définis par l'invention restent en parfait état de fonctionnement même en l'absence d'une membrane de fermeture étant donné que les macromolécules éluées dans le champ électrique et dans la polarisation appropriée du champ sont dirigées dans le piège établi. Avec un tel compartiment ou un tel canal d'élution ouvert, le piège se trouve en communication directe avec l'électrolyte ou le tampon à haute concentration du compartiment horizontal d'électrophorèse dans lequel fonctionne le dispositif défini par l'invention selon une méthode connue en soi En isolant le compartiment d'élution par au moins une membrane de fermeture pratiquement imperméable en l'absence d'un champ électri15 que, on peut utiliser un fluide liquide tant dans le compartiment d'élution, que dans les pièges, c'est-à-dire une solution de tamponnage nettement plus diluée que la solution de tamponnage utilisée dans le compartiment d'électrophor se On peut même utiliser très avantageusement tant dans le ou les pièges que dans le compartiment d Télution de l'eau distillée. Z O Selon un exemple de réalisation de l'invention, le volume du piège est de 10 à 100 fois inférieur au volume du compartiment d'élution, ce qui permet de provoquer en même temps un effet de concentration très sensible pour les macromolécules. Les membranes possédant les qualité requises précisées 25 ci-dessus sont disponibles dans de nombreuses variantes dans le commerce De préférence l'on utilise des membranes mouillables par l'eau ou gonflables sous l'effet de celle-ci, notamment des membranes à base de cellulose, d'ester de cellulose, de polyamides, de polyirnides ou de polysulfones, parmi lesquelles on choisira de préférence des membranes 30 à base de cellulose et d'esters de cellulose, notamment à base d'acétate de cellulose. -5 Pour la membrane intérieure du piège, l'on utilisera une membrane dont la grosseur des pores se situe entre 0,05 et 0, 2/um alors que pour les membranes extérieures l'on utilisera celles qui sont imperméables aux molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 1000 et ce, même en présence d'un champ électrique extérieur relativement important Une membrane utilisable comme membrane intérieure à base de cellulose régénérée, dont la grosseur moyenne des pores est 0, 2/upm est proposée par la Demanderesse sous l'appellation RSB. Les membranes utilisables comme membrane extérieure du piège sont 10 imperméables, dans un champ électrique, aux macromolécules dont le poids moléculaire est supérieur à environ 1000 et sont proposées par la Demanderesse sous l'appellation RAB et RCB Des membranes comparables se trouvent chez pratiquement tous les fabricants de membranes. L'utilisateur ne sera nullement lié aux dimensions ci-dessus citées à titre 15 indicatif Il adaptera la structure et la combinaison des membranes au problème spécifique de l'élution à réaliser. Par ailleurs, les membranes peuvent être étayées ou non étayées, renforcées ou non renforcées, symétriques ou asymétriques. Leur choix sera fait en fonction de leur utilisation, Ce choix sera fait 20 dans le cadre du travail journalier de l'homme de l'art En cas d'utilisation de membranes asymétriques, il y a lieu de veiller, selon un exemple de réalisation de l'invention, à ce que leur surface imperméable ou "surface active" se trouve dirigée vers le compartiment intérieur du piège. Le procédé et le dispositif définis par l'invention sont utilisés essentiellement pour l'électroélution à partir de gels d'électrophorèse, pour la concentration et la déminéralisation de macromolécules biologiques telles que les RNA, DNA et les protéines Un autre domaine d'application important se trouve dans les processus de concentration des 30 macromolécules à charge positive notamment des protéines à charge positive, dont le p H est réglé en fonction des besoins propres ou spécifiques ou dans les processus simultanés de purification et de concentration de macromolécules à charge négative, c'est-à-dire la séparation de 6 6 macromolécules biologiques à charge positive des macromolécules biologiques à charge négative. D'autres caractéristiques et avantages de cette invention ressortiront de la description faite ci-après en référence aux dessins 5 annexés qui en illustrent divers exemples de réalisation dépourvus de tout caractère limitatif Sur ces dessins: la figure I est une vue schématique d'un premier exemple de réalisation et la figure 2 est également une vue schématique d'un deuxième exem10 ple de réalisation d'un dispositif en vue de la mise en oeuvre du procédé défini par l'invention. La figure 1 représente, sous une forme schématique, un compartiment d'élution 1, un piège 2 relié au plle négatif du champ électrique extérieur, un piège 3 relié au pôle positif du charrpélectrique ex15 térieur et l'électrolyte relié au tampon 4 du compartiment d'électrophorèse dans lequel fonctionne le dispositif défini par l'invention et dans lequel on réalise le procédé également défini par l'invention. Comme on peut le voir sur la figure 1, les deux pièges 2 et 3 comportent des membranes de structure qualitative identique, c'est-àZO dire une membrane intérieure M 2 et une membrane extérieure MI Le fluide dans lequel s'effectue l'électroélution comporte un miroir 5 placé sur un niveau très légèrement inférieur aux arêtes supérieures des membranes, ceci pour permettre le passage d'un champ électrique très étendu. Dès la mise en service du champ électrique, les macromolé25 cules porteuses d'une charge négative et représentées sur le dessin par un cercle, quittent le compartiment d'élution 1, passent par la membrane intérieure MZ du piège avant d'aboutir sur la membrane extérieure Ml I qui s'oppose à leur passage même en présence d'un champ électrique, alors que les ions tampon provenant du fluide contenu dans le comparti30 ment d'émission 1 passent sans difficultés par la membrane 1 pour aboutir dans le compartiment d'électrophorèse Les macromolécules porteuses d'une charge négative s'accumulent sur la membrane extérieure -7 MI du piège A l'issue du processus de transfert de l'ensemble des macromolécules contenues dans le compartiment d'élution 1 et porteuses d'une charge négative dans le piège 3 à travers la membrane 1, la polarité du courant électrique est inversée pendant une durée de 10 à I 5 secondes, 5 ce qui, vu par rapport à la figure 1, a pour effet de reporter le pôle positif sur le côté gauche et le pôle négatif sur le coté droit Cette inversion provoque le décollage des macromolécules, porteuses d'une charge négative, accumulées sur la membrane extérieure M 1 et leur transfert dans le compartiment intérieur du piège 3 C'est dans ce piège 3 que l'on peut 10 prélever par pipettage le fluide liquide qui y est contenu En coupant le champ électrique, les deux membranes M 1 et M 2 sont rendues pratiquement imperméables à tous les produits, c'est-à-dire qu'elles sont également imperméables à l'eau et empochent ainsi l'écoulement de celle-ci tant du compartiment d'élution 1 que du compartiment d'électrophorèse 15 en direction du piège 3 qui se vide progressivement sous l'effet du pipettage. La figure 2 représente sous une forme schématique identique à celle de la figure 1 uredisposition différente des membranes Les deux membranes extérieures M 1 et M 3, schématisées sur la figure 2, ne sont pas identiques contrairement aux membranes correspondantes de la figure 1 En effet, sur l'exemple de réalisation de cette figure 2, la structure de la membrane M 1 est réalisée de manière qu'elle n'adsorbe pas les particules positives, alors que la membrane extérieure M 3 du piège, tournée vers le champ électrique extérieur, est structurée de manière qu'elle n'adsorbe pratiquement pas les particules négatives Une impulsion de tension même extrêmement courte, avec inversion de polarité permet, dans ce cas, de décoller l'ensemble des macromolécules porteuses d'une charge électrique, concentrées sur la paroi de la memextérieure brane/M 3 et de les mélanger ainsi au fluide liquide du piège 3 Par ail30 leurs, le fonctionnement du dispositif schématisé sur la figure 2 est identique au fonctionnement du dispositif schématisé sur la figure 1 et commenté ci-dessus. -8 Un avantage particulier de l'invention réside dans le fait que les membranes intérieures MZ doivent obligatoirement être imperméables à l'eau et a fortiori aux bactéries Ainsi, il subsiste dans les pièges 2 et 3 un concentré de macromolécules qui est absolument pur, c'est-à-dire qu'il ne contient pas de bactéries Une telle êlution ne contenant pas de bactéries ne peut être réalisée avec les techniques actuellement connues Celles-ci provoquent des pertes sensibles de macromolécules, notamment des macromolécules d'origine biologique, qui sont détruites par les bactéries. REVENDICATIONS 1 Procédé en vue de l'électroélution de macromolécules porteuses d'une charge électrique par le transfert, sous l'effet d'un champ électrique extérieur, des macromolécules à éluer, d'un compartiment à éluer dans un piège, caractérisé en ce que les macromolécules 5 véhiculées dans le champ électrique traversent dans une première étape une membrane intérieure (M 2) du piège, laquelle à l'intérieur du champ électrique est perméable aux macromolécules, mais qui en l'absence du champ électrique extérieur est imperméable à toutes substances et notamment imperméable à l'eau, après quoi et dans une deuxième étape les 10 macromolécules sont dirigées sur une membrane extérieure (M 1; M 3) du piège, laquelle à l'intérieur du champ électrique est perméable aux petits ions et aux molécules, mais qui même dans le champ électrique reste imperméable aux macromolécules et en ce que les macromolécules sont finalement prélevées avec le fluide liquide du piège limité par les 15 deux membranes (M 1, M 2; M 2, M 3). 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'issue du processus de transfert de l'ensemble des macromolécules du compartiment d'élution dans le piège ou dans les pièges (M 1,M 2 M 2, M 3) placés, vus en direction du champ, sur les deux cotés du com20 partiment d'élution ( 1), l'on inverse pendant une courte période la polarité du champ électrique en vue de décoller les macromolécules accumulées sur les parois des membranes (M 1; M 3) imperméables à ces macromolécules et de les mélanger à nouveau au fluide en amont du piège. 3 Dispositif en vue de la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le compartiment d'élution ( 1) est limité, d'une part, par la membrane intérieure (M 2) d'un piège ( 2) et, d'autre part, par une membrane de fermeture extérieure (M 1 ou M 3). 4 Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce 30 que le compartiment d'élation ( 1) est limité par deux pièges (M 1, M 2; M 2, Ml ou M 3, MZ; MZ,M 3 ou M 1,M 2; M 2,M 3). Dispositif selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le volume du piège ( 2, 3) est de 10 à 100 fois inférieur au volume du compartiment d'élution ( 1). 6 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les membranes (M 1, M 2, M 3) sont mouillables par le fluide d:élution utilisé ou par la solution tampon utilisée. 7 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la membrane intérieure (M 2) du piège reste imperméable aux bactéries même en présence d'un champ électrique. 10 8 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que l'une au moins des membranes (M 1,M 2,M 3) est une membrane asymétrique dont la face imperméable ou face "active" est tournée vers l'intérieur du piège ( 2, 3). 9 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 3 à 8, caractérisé en ce que la membrane (M 1) reliée au pôle négatif du champ électrique extérieur n'absorbe, ni n'adsorbe, les macromolécules positives et en ce que la membrane (M 3) reliée au pôle positif du champ électrique extérieur n'absorbe, ni d'adsorbe les macromolécules négatives.