Brevet FR2552104A1 — publié le 19850322

-1 L'invention concerne un procédé pour la préparation d'un bouillon de fermentation contenant le coenzyme B 12 et d'autres corrinoides. Plus particulièrement l'invention concerne un procédé pour la préparation d'un bouillon de fermentation pour la production du coenzyme B 12 et d'autres corrinoides (par exemple le facteur III) par emploi d'une nouvelle population microbienne mixte, mésophile et méthanogéne dans des conditions septiques anaérobies 10 et un nouveau bouillon contenant un ou plusieurs précurseurs connus et des substances nutritives partiellement connues. Bien que dans le procédé selon l'invention le ou les pr'curseurs et certains composants du bouillon 15 soient connus, le nombre et les proportions des substances nutritives et la quantité des substances nutritives nécessaires à la production du coenzyme B 12 sont essentiellement moindres que dans les procédés classiques utilisés et par conséquent le bouillon utilisé 20 dans le procédé de l'invention est nouveau. Lé bouillon de fermentation selon l'invention, après séchage ou traitement par la chaleur, peut être utilisé pour la préparation d'une mâture pour animaux ou d'un additif pour pâture (prémélanges) et si on le 25 désire, pour la production de la vitamine 312 (cyanocobalamine) pour l'emploi en thérapeuticue humaine ou vétérinaire. On sait que les micro- organismes cellulaires utilisés pour la fermentation de la vitamine B 12 accu30 mulent, au lieu de la vitamine B 12 d'autres corrinoides (coenzyme B 12) dans lesquels un groupe désoxyadénosyle au lieu d'un groupe cyanure est fixé à l'atome de carbone central du squelette corrinolde. Dans la présente description et les revendi35 cations, on entend par ingrédient actif, le mélange des -2 corrinoides actifs que sont le coensyme B 12 et le facteur III lBiol Chem 235, 480 ( 1960)l. Selon la littérature, un inoculum est "une solution virale, une suspension de micro-organismes ou de cellules, ou un organe, un tissu ou une cellule de caractère végétal utilisés pour la production de nouvelles cultures stériles" (btraub, F B: Biological Enzyclopedia II p 287, Akadémiai Kiad 6, Budapest ('978)) L'inoculum selon l'invention contient une popu10 lation microbienne mixte anaérobie, septique, mésophile et méthanogène. On entend ici par précurseur un composé de départ à partir duquel le produit final désiré est préparé selon une série de réactions biologiques (ibid. ITI, 437), par exemple le 5,6-diméthylbenzimidazole, le chlorure de cobalt, etc. Un bouillon est un milieu de culture préparé pour être utilisé dans la culture fermentaire de microorganismes Le bouillon contient toutes les substances -O nutritives nécessaires aux microorganismes au cours de la fermentation sous une forme assimilable (ibid. IV 249), par exemple le méthanol, le bicarbonate d'ammonium, le chlorure de magnésium, etc Le terme "bouillon" tel qu'on l'emploie ici désigne un milieu de cul25 ture contenant une combinaison de substances nutritives et de précurseurs. Les substances nutritives sont des substances chimiques qui sont vitales pour la population microbienne, par exemple des sources de carbone et d'azote. 30 Dans le procédé de l'invention, le méthanol joue un double râle: c'est une source de carbone dans la biosynthèse et il fournit en même temps l'énergie nécessaire à la formation de la population microbienne mixte. On entend par fermentation semi-continue, la 35 formation continue de la population microbienne mixte, -3 mésophile et méthanogène, avec périodiquement l'élimination du bouillon de fermentation et l'addition de substances nutritives, de préférence une ou deux fois par jour. Le but de la fermentation "d'entretien" semicontinue utilisée dans le procédé de l'invention est de conserver (entretenir) la composition de la nouvelle population microbienne mixte, mésophile et méthanogène selon l'invention pendant une période plus longue avec 10 une teneur relativement faible en ingrédient actif Ce stade de fermentation fournit un bouillon de fermentation de départ pour la fermentation "productive" discontinue (la concentration en ingrédient actif est alors élevée), de façon périodique, de préférence une ou deux 15 fois par jour. On connaît dans l'art de nombreux procédés et de nombreuses techniques de fermentation pour la production du coenzyme B 1 _ En majorité, les fermentations sont des opérations stériles aérobies L'avantage de ces procédés est qu'ils produisent spécifiquement plus de coenzyme B 12 mais dans des conditions telles que les coûts de production sont élevés, que des arpareillages plus compliquésont nécessaires et qu'il exis-e un risque d'infection Contrairement à la fernentation 25 aérobie asepticue, la fermentation septique anaérobie, bien qu'elle fournisse une production moins spécifique du coenzyme B 12 est considérablement plus simple et moins coûteuse Le biogaz formé comme sous-produit pendant la fermentation est une source d'énergie utile 30 ayant une valeur thermique élevée. La biosynthèse du coenzyme B 12 est résumée par J Florent et L Ninet (ES J Peppler et D Perlman: Microbial Technology, 2 ème édition, Vol I, 497-519). Comme on le sait, depuis environ deux décen35 nies, le coenzyme B 12 est produit par fermentation des 255210 4 -4 substances nutritives de la boue d'égout par emploi des microorganismes présents dans la boue Eventuellement, la boue d'égout est également additionnée de diverses substances nutritives Ce procédé est avantageux en ce que la fermentation peut être effectuée dans des conditions septiques mais pour chaque fermentation, une quantité importante de boue d'égout doit être transportée à l'usine de fermentation, la composition et la population bactérienne de la boue varient et de plus la 10 boue d'égout peut également contenir des souches dites "sauvages" dont la présence rend impossible la formation d'une population microbienne stable. Selon un nouveau procédé décrit dans le brevet HU n 153 740, le coenzyme B 12 est produit dans des 15 conditions aseptiques anaérobies selon un procédé dans lequel à un bouillon contenant les substances nutritives nécessaires, on ajoute uniquement de la boue d'égout et, après au moins cinq ensemencements, on obtient une population microbienne mixte enrichie qui Deut jouer 20 le rôle d'un inoculum, la production de coenzyme B 12 étant d'environ 6 à 6,2 mg/l de bouillon de fermentation Ce procédé dit procédé "sans boue d'lgout" nécessite au moins cinq stades d'ensemencement pour adapter les micro-organismes de la boue d'égout d'origine à la 25 production du coenzyme B 12, ce qui rend le procédé malaisé De plus, la production du coenzyme B 12 est faible, un grand nombre de substances nutritives différentes est nécessaire et par conséquent les coûts de production sont assez élevés. Pour la production du coenzyme B 12 par fermentation septique anaérobie à l'aide d'une population microbienne mixte et pour accroître le rendement en coenzyme B 12, on connaît dans l'art de nombreux autres procédés (voir par exemple les brevets US n 3 954 971 et 35 n 3 979 159) qui concernent l'intensification du pro- -5 cédé "sans boue d'égout" ci-dessus. Une population microbienne mixte, mésophile et méthanogène a été décrite dans le brevet HU N O 167 658 Cette population microbienne mixte contient les souches Corynebacterium sp ( 24 A 1), Corynebacterium sp ( 62 89), Lactobacillus sp ( 244 B/CI) et Propionibacterium sp ( 259 A 1/b) déposées à la Collection Nationale Hongroise de bactéries Médicales (OKI) de l'Institut National d'Hygiène sous les numéros 00076, 00077, 10 00078 et 00079. Cette population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène a été cependant difficile à adapter aux bouillons contenant des substances nutritives non classiques, six à sept ensemencements étant 15 nécessaires Si l'on tient compte qu'mun cycle d'ensemencement nécessite environ 7 jours, l'adaptation à la production en masse d'une fermentation utilisant la population microbienne ci-dessus, nécessite au moins 40 à 50 jours, ce qui est très long et entraîne des 20 coûts de production élevés. Les procédés connus à ce jour pour la production du coenzyme B 1, par emploi de micro-organismes anaérobies, mésophiles et méthanogènes sont tous caractérisés par l'emploi d'un grand nombre (environ 18 à 20) de substances nutritives différentes à une concentration totale élevée Une partie des substances nutritives est d'origine naturelle, telle aue la mélasse, l'hydrolysat de levure de bière, l'extrait industriel de foie, l'infusion de mais et la poudre de lessive sulfitée, etc La composition de ces substances nutritives varie selon leur origine De ce fait les rendements en B 12 fluctuent nécessairement D'autres substances nutritives, telles que la glycine et l'acide succinique, sont coûteuses. Pour éliminer les inconvénients ci-dessus, le -6 but de l'invention est de: réduire le nombre et la quantité spécifique des substances nutritives, éliminer autant que possible les substances nutritives naturelles, et maintenir simultanément au même niveau la production de l'ingrédient actif ou l'accroître. La demanderesse a découvert expérimentalement que par l'emploi d'un nouvel inoculum contenant une 10 nouvelle population microbienne anaérobie, mésophile et méthanogène (voir pour sa préparation l'exemple 1, stade a)) et en effectuant simultanément deux fermentations: une fermentation semi-continue d'entretien et une fermentation de production discontinue, on peut réduire le nombre des substances nutritives à environ la moitié du nombre classique, on peut réduire la quantité spécifique de la plupart des substances nutritives d'environ 10 à ,, selon la substance nutritive particulière, les coûts des matériaux spécifiques de la production-de l'ingrédient actif peuvent être réduits d'environ 20 à 25 %, parmi les cinq substances nutritives d'crigine naturelle généralement emoloyées, cuatre peuvent 25 être supprimées, la glycine et l'acide succinique coûteux peuvent être supprimés, l'infusion de mais peut être remplacée par une solution d'infusion de mais ayant subi un traite30 ment par la chaleur (hydrolysée) (exemple 1, stade a)) ou par des "résidus de distillation du mais" qui sont les matières résiduaires formées lors de la distillation de l'amidon de mais, ou avec un hydrolysat de ces résidus (exemple 4), tandis que la production de l'ingré35 dient actif peut être accrue de 20 à 30 O%. Le procédé selon l'invention diffère des procédés connus en ce que la fermentation est effectuée avec un inoculum contenant une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène, le passage de la fermentation discontinue du nouveau bouillon de fermentation à la production semi-continue s'achève en 14 à 15 jours, alors que dans les procédés connus ce stade nécessite 40 à 50 jours. 10 on utilise un nouveau bouillon dans lequel le nombre des substances nutritives est réduit à la moitié environ du nombre classique et leur quantité (à l'exception du méthanol et de l'o-xylidine) est réduite d'environ 10 à 50 C, selon la substance nutritive par15 ticulière (voir le tableau 1) et au lieu de l'infusion de mais, on peut utiliser de façon avantageuse une solution hydrolysée d'infusion de mais ou des résidus de distillation du mais (exemple 4) ou un de leurs hydrolysats. P 20 Tableau Besoins journaliers en substances nutritives-et production de l'ngrédient actif relativement aux données indiquées dans le brevet HU n 183 549. Substance nutritive/ Brevet Exemple 1 HU n selon ingredient actif 18 549 l'invention 1835 540 l'invention méthanol I 1,11 infusion de mais I 0,78 bicarbonate d'ammonium I 0,78 sulfate d'ammonium I 0,92 chlorure de magnésium I 0,98 chlorure de cobalt I 0,69 ,6-diméthylbenzimidazole I 0, 80 o-xylidine I 1,75 bisulfite de sodium O 1,0 -8- 15 Substance nutritive/ Brevet Exemple I HU n selon ingrédient actif HU N O selon 183 549 l'invention hydrolysat de levure de bière I O extrait de foie industriel 1 O mélasse 1 O lessive sulfitée deshydratée 1 O O hydroxyde d'ammonium 1 O hydrogénophosphate de diammonium 1 O glycine 1 O acide succinique I O tripolyphosphate de sodium I O acétone I O production journalière d'ingrédient actif 1 1,3 L'invention concerne un procédé pour la pré2 O paration d'un nouveau bouillon de fermentation produisant du coenzyme B 12 au moyen d'une nouvelle population microbienne mixte mésophile et méthanogène dans des conditions septiques anaérobies par emploi d'un nouveau bouillon contenant du méthanol, un ou plusieurs précur25 seurs et des composants nutritifs partiellement connus, dans lequel l'amélioration comprend a) le prélèvement de 5 à 15 G en volume du bouillon de fermentation constituant l'inoculum contenant la nouvelle population microbienne mixte anaérobie, 50 mésophile et méthanogène et le remplacement de celle-ci par un volume égal d'un bouillon contenant de l'hydrolysat d'infusion de mais et/ou des résidus de distillation du mais ou leur hydrolysat et d'autres substances nutritives connues dont le nombre et la concentration 35 ont été réduits, pendant 6 à 8 jours et, si on le dé- -9 sire, le traitement ultérieur du bouillon de fermentation prélevé, b) après avoir atteint une vitesse d'assimilation d'au moins 0,15 à 0,2 g de méthanol/l de bouillon de fermentation h, la poursuite du prélèvement du bouillon de fermentation comme décrit dans le stade a) mais le remplacement de celui-ci par un bouillon additionné de sulfate d'ammonium et d'o-xylidine et la poursuite de la fermentation pendant 6 à 8 jours et, si on le désire, 10 le traitement ultérieur du bouillon de fermentation prélevé, c' après avoir atteint une vitesse d'assimilation de 0,2 à 0,3 g de méthanol/l de bouillon de fermentation h, c'est-à-dire après conversion du bouillon 15 de fermentation constituant l'inoculum en un bouillon de fermentation d'entretien, la poursuite du prélèvement du bouillon de fermentation et l'addition de bouillon frais comme décrit dans le stade b) et, si on le désire, l'interruption du prélèvement du bouillon de 20 fermentation pendant plusieurs jours, et d) l'addition au bouillon de fermentation d'entretien prélevé au cours du premier jour, de substances nutritives selon le stade b) et, si on le désire, au cours du second jour uniquement de méthanol, d'infu25 sion de mais ou d'hydrolysat d'infusion de mais et de carbonate d'ammonium et, le traitement ultérieur du bouillon de fermentation obtenu convenant à la production discontinue, et e) la répétition chaque jour des stades a),,0 c) et d). Comme précédemment décrit dans le procédé selon l'invention, 5 à 15 % en volume, de préférence 10 % en volume, du bouillon de fermentation constituant l'inoculum (exemple 1, stade a)) sont prélevés et de pré35 férence soumis à un traitement ultérieur, malgré leur -10 faible concentration en coenzyme B 12 qui s'accroit au cours du temps Au bouillon de fermentation constituant l'inoculum restant, on ajoute selon un mode de réalisation préféré de l'invention du bouillon dissous dans de l'eau à 30 à 35 C ou du méthanol. Le bouillon contient les substances nutritives suivantes: méthanol solution hydrolysée d'infusion de maïs 10 bicarbonate d'ammonium chlorure de magnésium chlorure de cobalt ,6diméthylbenzimidazole et bisulfite de sodium Au lieu d'hydrolysat d'infusion de mals, on peut également utiliser de l'hydrolysat de maïs ou des résidus de distillation du mais ou un de leurs hydrolysats ou des mélanges de ceux-ci. Le prélèvement de 5 à 15 %i en volume, de pré20 férence de 10 % en volume, du bouillon de fermentation et l'addition d'un volume égal de bouillon sont poursuivis pendant 6 à 8 jours tandis que la capacité de production du uoenzyme B 12 de la population microbienne mixte s'améliore progressivement comme on peut le suivre 25 par détermination de la concentration en ingrédient actif dans le bouillon de fermentation et de la vitesse d'assimilation du méthanol (méthanolyse) Lorsque la vitesse de la méthanolyse atteint 0,2 g de méthanol/1 de bouillon de fermentation h, en plus des substances nu)0 tritives précédentes, on ajoute au bouillon du sulfate d'ammonium et de l'o-xylidine et on poursuit la fermentation semicontinue jusqu'à ce que la vitesse de méthanolyse atteigne 0,3 g de méthanol/1 de bouillon de fermentation h (environ 7 à 10 jours) Ceci correspond à 55 l'état d'équilibre de la fermentation semi-continue. -11 On obtient ainsi un bouillon de fermentation d'entretien fonctionnant de façon semi-continue, qui contient environ 15 à A 6 mg/1 d'ingrédient actif La fermentation d'entretien semi-continue est (ou peut être) poursuivie pendant au moins un an par prélèvement quotidien d'environ 10 % du bouillon de fermentation et remplacement par un volume égal de bouillon comme défini ci-dessus, additionné de sulfate d'ammonium et d'oxylidine. Dès que l'état semi-continu est atteint, le bouillon de fermentation d'entretien prélevé (environ % en volume) n'est plus soumis à un traitement ultérieur mais au contraire à une postfermentation pendant plusieurs jours (fermentation de production de façon 15 discontinue. On effectue la fermentation de production discontinue par addition au bouillon de fermentation d'entretien semi-continu d'un bouillon frais contenant les mêmes substances nutritives & l'exception du chlo20 rure de magnésium et du bisulfite de sodium, éventuellement à des concentrations différentes Si on le désire, uniquement le second jour de la fermentation de production discontinue, on ajoute au bouillon de fermentation, du méthanol, de l'infusion de mais (ou un produit équi25 valent comme précédemment décrit) et du bicarbonate d'ammonium. La fermentation de production discontinue s'achève en deux jours et le bouillon de fermentation obtenu contient environ 26 à 32 mg/l d'ingrédient actif se50 lon les conditions de départ de la fermentation semicontinue et la qualité et la quantité de substances nutritives. Les avantages principaux du procédé selon l'invention sont les suivants: la conversion de la fermentation du nouvel -12 inoculum discontinu en une fermentation d'entretien semi-continue est rapide, en raison d'une diminution importante de l'emploi des substances nutritives d'origine naturelle, la production de l'ingrédient actif par fermentation (fermentation d'entretien semi-continue et fermentation de production discontinue) ne présente pratiquement pas de fluctuation, la diminution du nombre et de la quantité des autres substances nutritives améliore l'économie du procédé, malgré l'emploi d'un bouillon contenant moins de substances nutritives et à une concentration plus faible, la concentration de l'ingrédient actif produit 15 par unité de temps est accrue d'environ 20 & 30 %, par suite de la diminution du nombre des substances nutritives et principalement de la suppression des substances nutritives d'origine naturelle, le rendement de la production de l'ingrédient actif par le 20 bouillon de fermentation est amélioré. Le procédé selon l'invention est décrit en détail par les exemples non limitatifs suivants. Exemple I a) Préparation de l'inoculum Dans un fermenteur de verre de laboratoire ayant une capacité utile de 10 litres, on introduit 6 000 ml d'eau du robinet préchauffée entre 30 et 32 C puis on ajoute les substances nutritives suivantes: ml de méthanol, 100 ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 50 g d'infusion de mais, g de bicarbonate d'ammonium 1,0 g de chlorure de magnésium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,03 g de 5,6diméthylbenzimidazole et -13 0,30 g de bisulfite de sodium. Le bouillon de culture est ensuite soigneusement homogénéisé et porté à 8 000 ml avec de l'eau du robinet à 30-352 C On ajoute au bouillon 2 000 ml d'une boue d'égout ayant subi une postdigestion récente provenant d'une installation communale de traitement des boues d'égout On mélange, on couvre le fermenteur de verre avec une plaque de caoutchouc et on place dans un thermostat à 32-354 C. Au cours de la période suivante de fernentation, on prélève chaque jour des échantillons de 50 ml (après homogénéisation) et on ajoute 35 mi de méthanol au fermenteur puis on prélève à nouveau un échantillon de 200 ml, on couvre le ferrenteur avec une plaque de 15 caoutchouc et on poursuit la fermentation anaérobie pendant encore 7 jours à la même température. Le bouillon de fermentation obtenu après les sept premiers jours est appelé première génération. On détermine le p H et la concentration en mé20 thanol du bouillon de fermentation dans l'échantillon prélevé avant l'addition du méthanol On introduit dans un gazomètre les 200 ml de bouillon de fermentation prélevés après l'addition du méthanol et on détermine la vitesse de production du biogaz On évacue l'échan25 tillon du gazomètre et on le réintroduit dans le fermenteur en même temps que l'on ajoute la portion de méthanol suivante. Le septième jour de fermentation, on augmente l'échelle de fermentation d'un facteur 5: on remplit 30 un fermenteur ayant une capacité utile de 50 litres de litres d'eau du robinet à 30-32 C puis on ajoute les substances nutritives suivantes: ml de méthanol, 500 ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 250 g d'in35 fusion de mais, -14 g de bicarbonate d'ammonium, g de chlorure de magnésium, 0,25 g de chlorure de cobalt, 0, 15 g de 5,6-diméthylbenzimidazole, 1,5 g de bisulfite de sodium. Lorsque l'addition des substances nutritives est achevée, on porte le volume du bouillon à 40 litres avec de l'eau du robinet à 30-32 C. Ensuite, on ajoute la quantité totale ( 10 li10 tres) du bouillon de fermentation du septième jour (première génération) au bouillon fraîchement préparé (ensemencement) et après homogénéisation intensive, on ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation anaérobie à 32-34 C pendant encore 7 jours. Pendant la seconde période de sept jours, on prélève des échantillons de 50 ml, on ajoute au fermenteur 175 ml de méthanol puis on prélève chaque jour des échantillons de 200 ml On ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation à 2-34 C On détermine à parC tir des échantillons prélevés avant et après l'addition du méthanol respectivement le pi et la concentration du méthanol et la vitesse de production du biogaz. Le bouillon de fermentation obtenu après la seconde période de sept jours est appelé seconde géné25 ration On prélève 10 % ( 5,0 litres)de la seconde génération homogénéisée et on ajoute un volume égal d'un bouillon ayant la composition suivante: 000 ml d'eau du robinet à 30-32 C, ml de méthanol, 304 Q 50 ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 25 g d'infusion de mais, g de bicarbonate d'ammonium, 0,5 g de chlorure de magnésium, 0, 25 g de chlorure de cobalt, 3 5 0,15 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et -15 0,1 g de bisulfite de sodium. Après l'addition du bouillon, on mélange soigneusement le bouillon de fermentation, on ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation à 3234 C pendant encore I jour. Au cours des opérations précédentes, il se forme une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène contenant les souches déposées à la Collection Nationale Hongroise de Bactéries 10 Médicales (OKI) Institut National d'hygiène, sous les numéros 00076, 00079 et 00272 kles souches suivant l'ordre des numéros de déDôt: Corynebacterium sp ( 24 A 1), Propionibacterium sp ( 239 A 1/6) et l-ethanococcus sp. (HIC-017)l L'inoculum est caractérisé par mun p H de 5,4 15 à 5,8 et une production de biogaz de 0,5 à 0,8 litre de biogaz/jour litre de bouillon de fermentation. L'inoculum obtenu convient à la production du coenzyme B 1,. La ccncentration en ingrédient actif du bouil20 lon de fermentation déterminée à partir d'un échantillon prélevé le premier jour du fonctionnement semicontinu selon le procédé décrit dans le brevet HU n 167 658 est de 7,3 mg/1. On prépare les composants nutritifs comme suit: traitement par la chaleur de l'infusion de mais: on dilue de l'infusion de mais ayant une teneur en substance sèche d'environ 45 % avec un volume ég'al d'eau du robinet, on porte le mélange à ébullition et on fait bouillir pendant 15 minutes On refroidit ensuite la so; O lution et on ramène au volume d'origine avec de l'eau du robinet La solution fraîche obtenue est ce qu'on appelle l'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysat). On détermine avant l'emploi que l'infusion de 35 mais utilisée pour la préparation de l'inoculum pour la -16 production de l'ingrédient actif convient selon le procédé microbiologique suivant: dans un fermenteur de laboratoire en verre ayant une capacité utile de 10 litres, on introduit 9 litres d'eau du robinet à 30-32 C puis les substances nutritives suivantes: 50 ml de méthanol g d'infusion de mais non traitée (non hydrolysée), contenant 45 % de substances sèches, à étudier, 50 g de bicarbonate d'ammonium I g de chlorure de magnésium 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,05 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,20 g de bisulfite de sodium. Après homogénéisation, on ajoute au bouillon 300 ml du bouillon de fermentation du fermenteur de production du coenzyme B 12 puis on porte à 10 litres avec de l'eau du robinet à 50-52 C On recouvre le fermenteur d'une plaque de caoutchouc et on le place dans 20 un thermostat à 32-34 C Chaque jour on ajoute 50 ml de méthanol au mélange après homogénéisation en prélevant 200 ml de bouillon de fermentation pour déterminer la vitesse de production du biogaz, on couvre le fermenteur et on poursuit la fermentation à 32-34 C Si le quatrième jour de fermentation la production du biogaz est de 0,3 à 0,6 1/1 de bouillon de fermentation jour, l'infusion de mais, après le traitement par la chaleur décrit ci-dessus, convient à la préparation de l'inoculum. On ajoute le 5,6-diméthylbenzimidazole au bouillon après dissolution dans la quantité appropriée de méthanol. Les autres substances nutritives sont ajoutées directement au bouillon et y sont dissoutes. -17 b) Fermentation d'entretien semi-continue On prélève chaque jour environ 10 % de l'inoculum préparé dans le fermenteur ayant une capacité utile de 50 litres et on les remplace par un volume égal d'un bouillon d'entretien que l'on prépare comme suit: On dissout les substances nutritives suivantes dans 5,0 litres d'eau à 30-35 C: 300 ml de méthanol, ml d'une solution d'hydrolyse de 25 g d'infu10 sion de mais, 17,5 g de bicarbonate d'ammonium, 0,5 g de chlorure de magnésium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,03 g de 5,6-diméthylbenzimidazole, qui a été préalablement dissous dans 10 ml de mêthanol et 0,15 g de bisulfite de sodium. Après homogénéisation, on verse le bouillon dans un fermenteur ayant une capacité utile de 50 1 contenant le bouillon de fermentation On mélange intimement, on ferme le ferrenteur et on effectue la fermentation à 32-34 C en conditions anaérobies. On prélève un échantillon des 5 litres de bouillon de fermentation recueillis chaque jour et on 25 détermine la teneur en ingrédient actif (coenzyme B 12 et facteur III) et en méthanol ainsi que le p H, comme décrit dans le stade a). Le sixième et le huitième jour de fermentation, si la vitesse de méthanolyse atteint 0,2 g de méthanol/ 30 litre de bouillon de fermentation h, on ajoute également au bouillon ci-dessus g de sulfate d'ammonium et0,2 g d'o-xylidine. On dissout l'o-xylidine dans 15 ml de méthanol. On répète chaque jour le prélèvement de 10 % -18 du bouillon de fermentation et l'addition du bouillon d'entretien (contenant du sulfate d'ammonium et de l'oxylidine) De la sorte la fermentation de l'inoculum se transforme rapidement en une fermentation d'entretien avec une teneur en ingrédient actif de 17,5 mg/l. c) Fermentation de production discontinue Pour accroître sa concentration en ingrédient actif, on soumet les 5 litres du bouillon de fermentation prélevés chaque jour au cours de la fermentation d'entretien semi-continue à la postfermentation discontinue suivante. On introduit le bouillon de fermentation dans un fermenteur de verre ayant une capacité utile de litres puis on ajoute les substances nutritives sui1 5 vantes: ml de méthanol, 3,5 g d'infusion de mais (teneur en substances sèches: 45 5 ' 2,5 e de bicarbonate d'ammonium, 20 1,5 g de sulfate d'ammcnium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,01 g de 5,6- dim 6thylbenz' iidazole Pt 0,01 g dto-xylidine*) *) On ajoute le 5,6diméthylbenzimidazole et l'o-xyli25 dine au bouillon de fermentation, dissous dans 5 ml de méthanol, le volume total de méthanol est donc de 50 ml. Lorsque l'addition des substances nutritives est achevée, on recouvre le fermenteur d'une plaque de 30 caoutchouc et on laisse séjourner à 32-34 C Le lendemain (deuxième jour) on rajoute les substances nutritives suivantes: ml de méthanol 1,5 g d'infusion de mais (teneur en substance 35 sèche: 45 %)et -19 1,5 g de bicarbonate d'ammonium. Lorsque l'addition des substances nutritives est achevée, on mélange à nouveau intimement le bouillon de fermentation, on couvre le fermenteur avec une plaque de caoutchouc et on laisse reposer pendant une nuit à 3234 C. Après le second jour, la concentration en ingrédient actif du bouillon de fermentation atteint 26 mg/l. Exemple 2 On effectue une fermentation d'entretien semicontinue comme décrit dans l'exemple 1, stade b) La concentration en ingrédient actif du bouillon de fermentation est de 17,5 mg/l. On interrompt pendant une période de 4 jours de la façon suivante le prélèvement journalier cyclique du bouillon de fermentation et l'addition de bouillon frais Un jour donné de la fermentation,on ne prélève qu'untm litre de bouillon de fermentation et les quatre 20 jours suivants on ajoute 450 ml de méthanol et 250 ml d'eau du robinet à 30-350 C contenant les substances nutritives suivantes: g d'infusion de mais (solution hydrolysée), g de bicarbonate d'ammonium, 25 10 g de sulfate d'ammonium, 0,5 g de chlorure de magnésium, 0,15 g de chlorure de cobalt, 0,10 g de 5, 6-diméthylbenzimidazole, 0,10 g d'o-xylidine et 0,10 g de bisulfite de sodium sans prélever de bouillon de fermentation A partir du cinquième jour on poursuit l'opération semi-continue de la façon habituelle, c'està-dire qu'on prélève chaque jour 5 litres de bouillon de fermentation et qu'on les 55 remplace par 500 ml de méthanol et un volume égal d'un -20 bouillon à 30-35 C contenant les substances nutritives suivantes: g d'infusion de mais (solution hydrolysée) 17,5 g de bicarbonate d'ammonium, 5 g de sulfate d'ammonium, 0,5 g de chlorure de magnésium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,05 g de 5,6-diméthylbenzimidazole, 0,2 g d'oxylidine et 0,15 g de bisulfite de sodium. On répète ensuite chaque jour comme décrit cidessus le prélèvement du bouillon de fermentation et l'addition du bouillon La concentration de l'ingrédient actif dans le bouillon de fernentation obtenu atteint 15 24,6 mg/l. On soumet ensuite les 5 litres de bouillon de fermentation prélevés chaque jour dans le fernenteur d'entretien à une postfermentation discontinue pour accroître la concentration en ingrédient actif (voir l'e20 xemple 1, stade c)) Ge stade constitue la fermentation de production discontinue Après 24 heures de postfermentation, le bouillon de ferrentation contient 52 mg/l d'ingrédient actif. Xe mple 3 Cet exemple montre qu'il est plus efficace d'utiliser l'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysée) que l'nfusion de mais non traitée. On suit essentiellement l'exemple 1, stade b), mais on ajoute à 5 litres de bouillon au lieu de 50 ml 30 d'infusion de mais hydrolysée préparée à partir de 25 g d'infusion de mais avant une teneur en substances sèches de 4 L 5 %, 50 g d'infusion de mais non traitée (substances sèches: 45, ). Le bouillon de fermentation d'entretien con35 tient 17,0 mg/l et le bouillon de fermentation obtenu -21 après postfermentation pendant 48 heures (voir l'exemple 1, stade c)) contient 25,0 mg/i d'ingrédient actif. On voit que la concentration en ingrédient actif du bouillon de fermentation d'entretien semi-continue et 5 du bouillon de fermentation de production discontinue est pratiquement la même que celle des bouillons de fermentation correspondants préparés dans l'exemple 1, stades b) et c), bien que la quantité d'infusion de mais employée dans le présent exemple soit double. 10 Exemple 4 On suit essentiellement le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, stade b) si ce n'est que dans le bouillon quotidien du fermenteur de production semicontinue de 50 litres, on ajoute au lieu de 50 ml de solution hydrolysée d'infusion de mais (préparée à partir de 25 g d'infusion de mais), 150 ml d'une solution préparée par hydrolyse de 75 g de résidu de distillation du mais (teneur en substances sèches 30 %) On effectue le traitement par la chaleur (hydrolyse) des résidus de distillation du mais comme décrit pour l'hydrolyse de l'infusion de mais (exemple 1). Au cours de la postfermentation selon l'exemple 1, stade c), on remplace les 3,5 g et 1,5 d d'infusion de mais ajoutés respectivement le prerier et le second jour et contenant 45 % de substances sèches par ,25 g et 2, 25 g de résidus de distillation du mais traités par la chaleur. La concentration en ingrédient actif du bouillon de fermentation obtenu après postfermentation pen30 dant 2 jours atteint 25,2 mg/i. Cornoe 11 'illustre le présent exemple, l'infusion de mais et son hydrolysat peuvent tre remplacés par des résidus de distillation du nais traités par la chaleur. Note: Les souches citées ont été déposées à la collection Nationale Hongroise de Bactéries frdicales (OKI) sous les numréros 00076, 00077, 00078 et 00079, le 21 décemfbre 1971 et sous le nunéro 00272 'le 26 juillet 1903. -22 REVE Ni CA 'IONS 1 Procédé pour la préparation d'un bouillon de fermentation contenant le coenzyme 312, avec une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, méso5 phile et méthanogène dans des conditions septiques anaérobies utilisant un nouveau bouillon contenant du méthanol, des précurseurs et des substances nutritives partiellement connues, qui comprend: a) le prélèvement de 5 à 15 % 5 b en volume du bouillon de fermentation constituant l'inoculum contenant la nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène et leur remplacement par un volume égal d'un bouillon contenant de l'hydrolysat d'infusion de mais et/ou des résidus de distillation du 15 mais ou leur hydrolysat et d'autres substances nutritives connues, dont le nombre et la concentration ont été' réduits, pendant 6 à 8 jours et, si on le désire, le traitement ultérieur du bouillon de fermentation prélevé, 2 ( O b) après avoir atteint une vitesse d'assimilation d'au moins 0,15 à 0,2 g de métharol/l de bouillon de fermentation h, la poursuite du prélèvement du bouillon de fermentation comme décrit dans le stade a) mais en le remplaçant par un bouillon additionné de sulfate d'ammonium et d'o-xylidine et la poursuite de la fermentation pendant 6 à 8 jours et, si on le désire, le traitement ultérieur du bouillon de fermentation prélevé, c) après avoir atteint une vitesse d'assimi,0 lation de 0,2 à 0, 3 g de méthanol/1 de bouillon de fermentation h, c'est-à-dire après la transformation du bouillon de fermentation constituant l'inoculum en un bouillon de fermentation d'entretien, la poursuite du prélèvement du bouillon de fermentation et l'addition 35 de bouillon frais comme décrit dans le stade b) et, si -23 on le désire, l'interruption pendant plusieurs jours du prélèvement du bouillon de fermentation et d) l'addition au bouillon de fermentation d'entretien prélevé, le premier jour, de substances nu5 tritives selon le stade b) et si on le désire le second jour uniquement de méthanol, d'infusion de mais ou d'hydrolysat d'infusion de mais et de carbonate d'ammonium et le traitement ultérieure du bouillon de fermentation obtenu, qui convient à la production discontinue et e) la répétition quotidienne des stades a), c) et d). 2 Procédé comme revendiqué dans la revendication 1 pour la préparation d'un bouillon de fermentation de production discontinue qui comprend a) le prélèvement chaque jour de 5 à 15 % en volume du bouillon de fermentation d'entretien, jusqu'à une vitesse d'assimilation de 0,2 g de méthanol/1 de bouillon de fermentation h et le remplacement par un volume Vgal d'un bouillon contenant de l'hydrolysat d'infusion de mais et/ou de l'hydrolysat de résidus de distillation du mais et d'autres substances nutritives connues, dont le nombre et la concentration ont été réduits, éventuellement l'interruption du prélèvement du bouillon de fermentation pendant plusieurs jours et le 25 traitement du bouillon de fermentation prélevé, b) l'addition, aux 5 à 15 % en volume de bouillon de fermentation d'entretien prélevés, des substances nutritives selon le stade a), le premier jour, et, si on le désire, uniquement de méthanol le second 30 jour et le traitement du bouillon de fermentation de production discontinue obtenu, et c) la répétition quotidienne des stades a) et b). 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans 35 lequel, dans la fermentation d'entretien semi-continue, -24 on utilise comme substances nutritives du méthanol, une solution d'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysée), du bicarbonate d'ammonium, du sulfate d'ammonium, du chlorure de magnésium et du bisulfite de sodium et comme précurseur, du chlorure de cobalt, du 5,6diméthylbenzimidazole et éventuellement de l'o-xylidine. 4 Procédé comme revendiqué dans la revendication I ou 2, dans lequel dans la fermentation discontinue de production on utilise comme substances nutri10 tives du méthanol, de l'infusion de mais, du bicarbonate d'ammonium et du sulfate d'ammonium en association avec un ou plusieurs précurseurs connus. Procédé comme revendiqué dans la revendication 1 ou 2 dans lequel on utilise au lieu d'un hydro15 lysat constitué d'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysée), des résidus de distillation du mais ou un mélange d'une solution d'infusion de mais hydrolysée et de résidus de distillation du mais. 6 Procédé selon la revendication 1 dans le20 O quel au lieu d'une solution d'infusion de mais ou d'infusion de mais traitée par la chaleur, on utilise des résidus de distillation du mais traités par la chaleur.