Brevet FR2557591A1 — publié le 19850705

L'invention concerne un procédé pour fixer uniformément des micro-organismes au fond des cupules de plaques de microtitration. La recherche médicale et la biologie clinique tirent profit des réactions du type antigène-anticorps à diverses fins, par exemple la mise en évidence de l'immunité acquise à l'égard d'une affection telle que la rubéole. Pour certaines déterminations, il est fait usage de la réactivité d'organismes tels que des cellules ou bien de germes ou bactéries d'une espèce bien définie, comme des pneumocoques pour le dosage de la protéine C-réactive, désignée ei-apres par son abréviation habituelle CRP, qui est conforme à la dénomination anglaise C-reactive protein. Pour augmenter la fiabilité et arriver à l'automatisation, il y a intérêt à travailler sur une couche de micro-organismes formant une plage continue En particulier, on utilise des cellules ou des bactéries déposées sur le fond des cupules de plaques de microtitration, ce qui permet une lecture au spectrophotomètre pour l'observation d'un phénomène quelconque se traduisant par une modification de la densité optique. En effet, une mesure faite à l'aide d'un spectrophotomètre ou d'un autre instrument donnant une lecture intégrée sur une certaine plage observée permet d'échapper à la subjectivite de l'opérateur si on arrive à établir des conditions initiales bien définies et reproductibles. Pour realiser une bonne mesure automatisée, il faut réunir notamment les conditions suivantes - planéité du fond des cupules, - uniformité de la couche de micro-organismes, - absence aussi parfaite que possible de proteines étrangères au dosage absorbées sur les parois. Plusieurs procédés de fixation de cellules à la surface de matières plastiques et, en particulier, sur le fond des cupules de plaques de microtitration ont e été décrits antérieurement. Dans certains cas, la surface de la matière plastique est d'abord rendue réactive au moyen d'une substance chimique (poly-L-lysine ou glutaraldéhyde, entres autres) et les cellules à fixer sont ajoutées lors d'une seconde étape. La poly-t-lysine a e été utilisée pour fixer les globules rouges (Kennedy, J.C. et M.A. Axelrad, 1971, Immunology 20, 253), les lymphocytes (Kedar, E. et B. Bonavida, 1975, J. Immunol. 115, 1301) et des cellules tumorales (Stulting, R.D. et G. Berke, 1973, J. Exp., Med. 137, 932). Un procédé mettant en jeu des couches multiples (poly-L-lysine, globules rouges, phytohémagglutinine) a été mis au point pour fixer des cellules tumorales (Silva, A., M.O. De Landazuri, J. Alvarez et J.M. Kreisler, 1978 J. Immunol. Methods 23, 303). Le glutaraldéhyde a été utilisé pour attacher des lymphocytes normaux à une matière plastique. (Stocker, J.W. et C.H. Heusser, 1979, J. Immunol. Methods 26, 87). Ces auteurs ont également décrit un procédé de fixation utilisant des plaques de microtitration sur lesquelles un anticorps spécifique de la cellule à fixer avait e' été préalablement adsorbé (Stocker et Heusser, ibid.) selon un principe décrit par Barker et col. (Barker, C.R., C.P. Worman et J.L. Smith, 1975, Immunology 29, 765). Une technique de fixation au moyen de concanavaline A a e' été proposée récemment aussi (Mattes M.J., M. Tanimoto, M.S. Pollack et D.H. Maurer, 1983, J. Immunol. Methods 61, 145). Une technologie différente est parfois utilisée. Dans ce cas, les plaques de microtitration ne sont pas prétraitées et l'agent fixateur n'est ajouté qu'en fin de manipulation, après création d'un tapis de cellules sur la matière plastique et séchage. Dans ce cadre, Lamy et col. ont proposé un procédé de fixation de cellules de Burkitt P3J-HR K sur le fond de cupules de plaques de microtitration (Lamy, M.E., A.M. Favart, G. Burtonboy et A. Arana, 1977, J. Clin. Microbiol. 6, 66). Après répartition de la suspension cellulaire dans les cupules, les plaques sont centrifugées. Les plaques sont ensuite conservées en position inversée pendant six heures à température de laboratoire pour permettre l'évaporation du liquide dans lequel les cellules étaient en suspension et le séchage des plaques. L'éther de pétrole est utilisé comme agent fixateur et est ajouté sur les plaques sèches. La fixation de bactéries sur le fond de cupules de plaques de microtitration a aussi e' été proposée antérieurement. R.E. Randall (Randall R.E., 1983, J. Immunol. Methods 60, 147) propose un procédé de fixation du staphylocoque doré (souche Cowan A) et suggere une large variété d'applications possibles, parmi lesquelles la purification de protéines et la séparation de bactéries sur base de leurs antigènes de surface. I1 est connu que certaines bactéries adhèrent spontanément aux matières plastiques et en particulier au polystyrène (Rosenberg, M., 1981, Appl. Environ. Microbiol. 32, 375). Cependant, cette adhésion peut être dépendante du type de matière plastique utilisée (Randall, ibid). Les techniques proposées antérieurement pour fixer des bactéries de façon homogène sur le fond de plaques de microtitration tirent parti de la particularité qu'ont certaines bactéries d'adhérer spontané- ment à certaines matières plastiques. Ces techniques connues exposent à des inconvénients de divers ordres - la couche est irrégulière et comporte des lacunes nuisibles pour une bonne évaluation de la densité optique, - la couche ne se maintient pas au fond des cupules, - pour assurer une adhérence suffisante, la matière de la cupule est souvent choisie parmi celles qui absorbent fortement et fixent donc les protéines étrangères, mais ces dernières nuisent en modifiant la densité optique ou en donnant des réactions non désirées prépondérantes (faux positifs par exemple). La Demanderesse apporte à ces difficultés une solution simple, peu onéreuse et efficace. Le procédé de l'invention pour fixer en une couche uniforme continue et adhérente de microorganismes au fond de cupules de plaques de microtitration en matière plastique faiblement absorbante comprend les opérations suivantes (a) introduire une suspension de microorganismes du type voulu dans les cupules en un volume reproductible au moins suffisant pour remplir le fond de la cupule; (b) centrifuger à une vitesse de 1000 à 2000 tours par minute pendant 1 à 100 minutes les plaques insérées dans la centrifugeuse de façon que la force centrifuge soit dirigée vers le fond des cupules; (c) introduire dans les cupules un volume défini et reproductible d'éthanol établissant dans le contenu des cupules un titre en éthanol de 50 à 75% en volume; (d) évacuer la phase liquide hors des cupules par retournement prudent.des plaques de microtitration; ; (e) introduire dans les cupules un volume défini et reproductible de méthanol en assurant un temps de contact d'au moins 5 minutes; (f) évacuer la phase liquide hors des cupules par retournement prudent des plaques de microtitration; (g) centrifuger à une vitesse de 60 à 2000 tours par minute pendant 1 seconde à 10 minutes les plaques insérées dans la centrifugeuse de façon que la force centrifuge soit dirigée vers l'entrée des cupules; (h) sécher les plaques à une température biologiquement admissible pendant 5 à 120 minutes. Par éthanol, il y a lieu d'entendre, aux fins de l'invention, aussi l'éthanol dénaturé à l'éther, d'usage traditionnel dans les laboratoires de chimie et biologie. Le volume reproductible de suspension de micro-organismes introduit dans chaque cupule (étape (a) du procédé) doit évidemment etre suffisant pour remplir le fond de la cupule. Ce volume sera genéralement compris entre 40 et 150 microlitres. En particulier, un volume de 50 microlitres est habituellement approprié. I1 va de soi qu'il est avantageux d'appliquer les micro-organismes au fond des cupules avec la force la plus grande possible et d'évacuer la phase liquide aussi vite que possible, ee qui nécessite la vitesse de centrifugation maximale admissible. En fait, c'est la force centrifuge (f=2r) qu'il faut maximaliser. Si on envisage une centrifugeuse dont le rayon est suffisant pour que la force exercée aux divers endroits d'une plaque d'environ 100 cupules occupant en réalité la corde d'un arc de cercle soit constante a quelques pour cent près, on observe que le panier de la centrifugeuse peut être divisé en 6 ou 8 secteurs recevan. chacun une plaque et que la vitesse de rotation max9- male est proche de 2000 tours par minute. Les durées et vitesses des centrifugations (aux stades (b) et (g) du procédé) peuvent être adap tées aux cas particuliers traités. Au stade (b) du procédé, une centrifugation à une vitesse de 1400 à 1800 tours par minute pendant 1à 20 minutes est généralement préférée et, de manière plus particulière, une centrifugation à une vitesse d'environ 1600 tours par minute pendant 10 minutes environ. Au stade (q) du procédé, une centrifugation à une vitesse de 100 et 1800 tours par minute pendant 5 secondes à 5 minutes est généralement préférée et, de manière plus particulière, une centrifugation à une vitesse d'environ 1600 tours par minute pendant 1 à 2 minutes. Les volumes définis et reproductibles d'éthanol (stade (c) du procédé) et de méthanol (stade (e) du procédé) sont avantageusement compris entre 50 et 250 microlitres. Ces volumes sont utilement de 100 microlitres. En fin de procédé, les plaques de microtitration sont séchées à une température biologiquement admissible. La température et la durée du séchage sont avantageusement choisies suivant les cas particuliers et spécialement suivant les micro-organismes fixés au fond des cupules. En général, ce séchage sera effectué à une température comprise entre 30 et 400C pendant 5 à 30 minutes et, de manière plus particulière, à une température d'environ 37"C pendant 15 minutes environ. Une des originalités de la technique de l'invention réside dans la manière d'éliminer le liquide après la centrifugation de la suspension de micro-orgarlismes. En l'occurrence, le liquide est éliminé par centrifugation inversee des microplaques, l'ouverture des cupules etant dirigée vers la paroi de la centrifugeuse.Cette modification de méthodologie présente plusieurs avantages 1" : gain de temps (quelques minutes au lieu de six heures); 20 : (corollaire du 10) : la diminution du temps de manipulation diminue le risque de détérioration des micro-organismes; 3 : l'élimination du liquide sans évaporation permet d'éviter le dépôt de cristaux de sels au fond de la cupule; 40 : conservation de la répartition homogène des microorganismes au fond des cupules (cet avantage est particulièrement net dans les cas où l'adhérence spontanée des micro-organismes à la matière plastique est faible). Le procédé de l'invention est applicable dans son principe à différents micro-organismes, comme notamment des cellules et bac te ries telles que Staphylocoque, Pneumocoque, Méningocoque, Salmonella, Légionella, Brucella, Spirochète pathogène Leishmania, Toxoplasma gondii et Trypanosome. Les plaques de microtitration dont le fond des cupules a été tapissé d'un micro-organisme se prêtent à de nombreux dosages du genre antigène-anticorps. Par exemple, elles permettent de doser non seulement la CRP, mais aussi les anticorps (IgG) antitoxoplasmes, les anticorps antilégionella (6 souches) et les anticorps AI, BII et CII antiméningocoques, suivant la technique ELISA. La technique ELISA comprend les opérations suivantes Conduite du dosage. - Préchauffer la microtlaque rendant 15 minutes à 370C d'humidité. - Diluer les étalons et les sérums. - Déposer dans les cupules 200 microlitres de ces dilutions. - Incuber 30 minutes à 24"C-, à l'abri de la lumière. - Laver la microplaque très soigneusement avec du tampon de lavage. - Eliminer complètement le liquide de lavage par renversement énergique de la microplaque. - Ajouter l'anticorps spécifique couplé à de la peroxydase, à raison de 100 microlitres par cupule. - Incuber 30 minutes à 24"C. - Laver très soigneusement la microplaque avec du tampon de lavage. - Eliminer complètement le liquide de lavage. - Préparer la solution de substrat : 5 mg d'ABTS Cacide 2,2'-azino-di(3-éthylbenzothiazolinesulfoni- que et 40 microlitres de H202 dans 25 ml de tampon substrat. - Ajouter 200 microlitres de solution de substrat dans chaque cupule. - Incuber 30 minutes à 240C à l'abri de la lumière. - Lire les densités optiques à 405 nm. Calcul. On établit une courbe d'étalonnage en portant en graphique la densité optique en fonction de la concentration des étalons. L'invention est illustrée ci-après par des exemples de fixation de cellules et de bactéries sur des plaques de microtitration et des exemples d'application. EXEMPLE 1. FIXATION DE TOXOPLASMES. A. Préparation des toxoplasmes. On cultive de la façon habituelle des toxoplasmes (Toxoplasma gondii RH) dans le péritoine de la souris (souris femelle race NMRI). Ensuite, on recueille l'ascite 48 h après l'injection intrapérito néale du toxoplasme et on centrifuge l'ascite. On remet le culot en suspension dans de l'eau physiologique (NaCl à 90/o o p/v stérile) et on l'agite. On ajoute 0,5 ml de formaldéhyde à 378 par 10 ml de suspension. On laisse reposer 30 minutes à température ambiante. On centrifuge à faible vitesse (400 t/min) pour enlever les cellules contaminantes et on prélève le surnageant. On concentre les toxoplasmes par centrifugation. On les lave une fois à l'eau physiologique et ensuite deux fois dans du tampon de fixation (Na2CO3 1,59 g, NaHC03 2,93 g, H2O q.s.p. 1 litre). On ajuste la concentration en toxoplasmes avec du tampon de fixation afin d'obtenir, à la cellule de Burcher, 10 toxoplasmes par grand carré. B. Choix des plaques de microtitration. Pour éviter de fixer, lors de l'utilisation des plaques, des protéines non souhaitées, on choisit des plaques de microtitration faites d'une matière peu absorbante, en l'occurrence le polystyrène peu absorbant. C. Fixation des toxoplasmes sur les plaques de microtitration. On répartit la suspension de toxoplasmes dans les cupules à raison de 100 microlitres par cupule (stade a). On centrifuge les plaques à 1600 tours par minute pendant 5 minutes (stade b). On centrifuge ensuite ces plaques pendant 1 à 2 minutes à 1600 tours par minute en position inversee (l'ouverture des cupules dirigée vers la paroi de la centrifugeuse, stade g). On sèche les plaques pendant 15 minutes à 37"C (etuve sèche, stade h). On ajoute ensuite, sous hotte, 100 microlitres d'éther de pétrole (opération non indispensable). Après évaporation complète de l'éther de pétrole, on conserve les plaques à 4"C jusqu'à utilisation. La conservation est parfaite au moins durant six mois. Il convient de noter que l'adhérence naturelle des toxoplasmes sur une matière plastique même à faible absorption est tellement forte que certains stades peuvent être omis en pratique, en l'occurrence les opérations c) à f) inclusivement. EXEMPLE 2. FIXATION DE PNEUMOCOQUES. A. Prparation des pneumocoques. On cultive une souche de pneumocoques (séro- type 27) sur agar au sang en atmosphère contenant 58 de CO2. Après 18 heures de culture, on met les germes en suspension saline à raison d'une anse pour 5 ml d'eau physiologique (NaCl à 90/o o p/v stérile), on injecte 0,5 ml de cette suspension à une souris, par voie intrapéritonéale, on dilue ensuite la suspension 10 fois dans de l'eau physiologique et on injecte 0,5 ml de cette seconde suspension intrapéritonéalement à une deuxième souris. Après 12 heures environ, on recueille les germes par ponction péritoneale des souris.On met en culture ces germes sur agar au sang, en anaérobie (Optochine). Après 18 heures d'incubation, on recueille les germes avec une anse, on met la totalité des germes recueillis par boîte de Pétri en suspension dans 2,5 ml d'eau physiologique. On ajoute du formaldéhyde jusau'à une concentration finale de 5%. On laisse reposer une heure à la température du laboratoire. On lave ensuite les bactéries trois fois à l'eau physiologique, en centrifugeant à 1500 g pendant 10 minutes entre chaque lavage. A la fin du dernier lavage, on remet les germes en suspension dans du tampon de fixation (Na2CO3 1,59 g, NaHC03 2,93 g, H20 q.s.p 1 litre). On ajuste la concentration en bactéries ensuite en ajoutant du tampon de fixation. La suspension doit donner une absorbance comprise entre 350 et 400 à 550 nm après dépôt de 100 microlitres dans une cupule de plaque de microtitration, la lecture étant effectuée au spectrophotomètre Multiscan (Flow) au moyen du filtre numéro 7. Le blanc est effectué sur du tampon de fixation (100 microlitres). On dilue la suspension ainsi préparée 40 fois dans du tampon de fixation et on l'expose aux ultrasons à 12 uJ durant 30 secondes. B. Choix des plaques de microtitration. On choisit les mêmes plaques que dans l'exemple 1 pour les mêmes raisons que dans celui-ci. C. Fixation des bactéries sur les plaques de microtitration. On.répartit la suspension ci-dessus dans les cupules des microplaques à raison de 50 microlitres par cupule (stade a). On centrifuge les plaques a 1600 tours par minute pendant 10 minutes (stade b). On ajoute 100 microlitres d'alcool dénaturé dans chaque cupule (stade c). On retourne prudemment (sans secousses) la microplaque pour éliminer la plus grande partie de l'alcool dénaturé (stade d). On ajoute immédiatement 100 microlitres de méthanol dans chaque cupule et on laisse en contact pendant 5 minutes (stade e). On rejette la plus grande partie du méthanol en retournant la microplaque (stade f). On centrifuge ensuite cette microplaque pendant 1 à 2 minutes à 1600 tours par minute (stade g) en position inversée Les bactéries tanissent le fond des cupules de façon homogène. La conservation des plaques à 40C est parfaite pendant au moins trois mois. EXEMPLE 3. Dosage de la CRP suivant la technique ELISA. La protéine C-réactive possède, comme on le sait, la propriété de se combiner avec le polysaccharide C somatique des pneumocoques "smooth" et "rough". La mise en évidence de la CRP par une méthode sérologique permet donc de déceler les états inflammatoires tissulaires auxquels elle est associée. Cette combinaison avec le polysaccharide C se traduit par une modification d'aspect de la membrane cellulaire du pneumocoque choisi. I1 est évident que l'observation directe du phénomène sous le microscope, de la façon pratiquée lors de la découverte de la CRP il y a une cinquantaine d'années, nécessite beaucoup de savoir-faire et laisse une part importante à la subjectivité de l'observateur. Une technique radio-immunologique a e' été mise au point pour le dosage de la CRP. Si elle offre les garanties de rigueur souhaitables, elle présente par contre l'inconvénient de requérir un personnel hautement spécialisé et donc d'etre très onéreuse. L'invention apporte à-ces inconvénients une solution simple, qui apparaît même susceptible de supplanter le procédé radio-immunologique pour le dosage de la CRP. On utilise une plaque garnie de pneumocoque. On dilue le sérum à tester à 1/4000 dans du tampon de dilution de pH 7,2. (NaCl : 8,5 g, véronal : 0,575 g, véronal sodique : 0,185 g, MgC12.6HgO : 0,168 g, CaC12 : 0,3 g, Tween 20 : 0,5 ml, q.s.p. 1 litre). Aucun sérum sans antigène n'est nécessaire. On met à incuber à 240C pendant 30 minutes. On lave avec du tampon au véronal (le même que ci-dessus, mais sans Tween). Ensuite, on ajoute l'anti CRP conjugué à de la peroxydase et dilué 1/500 dans du tampon de dilution, à raison de 100 microlitres par cupule. EXEMPLE 4. Recherche des IgG antitoxoplasmes. On utilise une plaque garnie de toxoplasmes. On dilue le sérum à tester à 1/40 et 1/1600 dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PRS) additionnée de Tween (0,5 /00). On dilue le témoin de sérum exempt d'antigène à 1/40 dans le meme milieu que ci-dessus. On met à incuber à 370C pendant 30 minutes. On lave avec du PBS. On dilue l'antiglobuline marquée à la peroxy- dase à 1/2000 dans du PBS additionné de Tween (voir cidessus). EXEMPLE 5. Recherche des anticorps antilégionella. On utilise des plaques garnies de Légionella, dont 6 souches sont identifiées. On dilue le sérum à tester a 1/800 dans du PBS au Tween (voir exemple 4). On dilue le témoin de sérum exempt d'antigène à 1/800 dans du PRS au Tween (le même que pour le sérum à tester). On met à incuber à 37 C pendant 30 minutes. On dilue l'antiglobuline marquez a la peroxy dase à 1/2000 dans du PBS au Tween (le même que pour le serum à tester). EXEMPLE 6. Recherche des anticorps antiméningocoque AI, BII et CII On utilise des plaques garnies des méningo- coques des types suspects. On mène les opérations comme dans l'exemple 5. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour fixer en une couche uniforme continue et adhérente des micro-organismes au fond de cupules de plaques de microtitration en matière plastique faiblement absorbante, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes (a) introduire une suspension de microorganismes du type voulu dans les cupules en un volume reproductible au moins suffisant pour remplir le fond de la cupule; (b) centrifuger à une vitesse de 1000 à 2000 tours par minute pendant 1 à 100 minutes les plaques insérées dans la centrifugeuse de façon que la force centrifuge soit dirigée vers le fond des cupules; (c) introduire dans les cupules un volume défini et reproductible d'éthanol établissant dans le contenu des cupules un titre en éthanol de 50 a' 75% en volume;; (d) évacuer la phase liquide hors des cupules par retournement ménagé des plaques de microtitration; (e) introduire dans les cupules un volume défini et reproductible de méthanol en assurant un temps de contact d'au moins 5 minutes; (f) évacuer la phase liquide hors des cupules par retournement ménagé des plaques de microtitration; (g) centrifuger à une vitesse de 60 à 2000 tours par minute pendant 1 seconde à 10 minutes les plaques insérées dans la centrifugeuse de façon que la force centrifuge soit dirigée vers l'entrée des cupules; (h) sécher les plaques à une température biologiquement admissible pendant 5 à 120 minute. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le volume de suspens ion de micro organismes, reproductible et au moins suffisant pour remplir le fond de la cupule est de 40 p1 à 150 ,ul. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le volume de suspens ion de microorganismes, reproductible et au moins suffisant pour remplir le fond de la cupule est de 50 Xul. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la centrifugation à l'opération b) est exécutée à 14001800 tours par minute pendant 1 à 20 minutes. 5.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la centrifugation à l'opération b) est exécutée à 1600 tours par minute pendant 10 minutes. 6.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le volume défini et reproductible d'éthanol à l'opération c) est de 50 à 250 jul. 7.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le volume défini et reproductible d'éthanol à I'opération c) est de 100 l. 8.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le volume défini et reproductible de méthanol à l'opération e) est de 50 à 250 ul. 9.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le volume défini et reproductible de méthanol à l'opération e) est de 100 pil. 10- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la centrifugation à l'opération g) est exécutée à 100-1800 tours par minute pendant 5 secondes à 5 minutes. 11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la centrifugation à lsoperation g) est exécutée à 1600 tours par minute pendant 1 a 2 minutes. 12.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le séchage à l'opération h) est exécuté à une température de 30 à 400C pendant 5 à 30 minutes. 13.- Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le séchage à l'opération h) est exécuté à une température de 370C pendant 15 minutes. 14.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les microorganismes sont des cellules. 15.- Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules sont des Toxoplasma gondii RH. 16.- Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules sont des Leishmania. 17.- Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules sont des Trypanosomes. 18.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les microorganismes sont des bactéries. 19.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des staphylocoques. 20.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des pneumocoques. 21.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des méningo cousues. 22.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des salmonella. 23.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des spiro- chètes pathogènes. 24.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des légionella. 25.- Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que les bactéries sont des brucella.