Brevet FR2549082A2 — publié le 19850118

FR 2549082 A2 19850118 FR 8311594 A 19830712 La présente invention concerne un perfectionnement aux vecteurs d'expression d'une protéine ayant I 'activité de l'antitrypsine-&alpha;1 humaine. Le brevet principal décrit un procédé permettant de produire, par fermentation bactérienne, une antitrypsine humaine qui permet le traitement de patients présentant des syndromes; de déficience en antitrypsine-&alpha;1. Toutefois, la protéine ayant l'activité de l'anti trypsine-ql humaine préparée par ce procédé comporte une séquence d'aminoacides fusionnée à l'extrémité N-terminale de la protéine antitrypsine- l. L'injection d'un tel produit peut dans certains cas provoquer une réponse immunitaire du patient. Afin d'éviter cet inconvénient, il est intéressant de pouvoir exprimer, dans la bacterie, le gène naturel non fusionné de I 'anVi trypsine-ot1 humaine. Pour ce faire, dans les vecteurs de l'invention on prévoit au voisinage du codon de départ de la traduction du gène codant pour l'antitrypsine-&alpha;1 humaine la structure sui vante -CATATGGAGGATCCCCAGG -GTATACCTCCTAGGGGTCCde façon que le codon de départ de la traduction soit en phase pour la traduction du gène. Un tel plasmide permettant la préparation d'une anti trypsine-osl non fusionnée peut entre obtenu, par exemple, par modification du plasmide pTG922 qui conduit, lui, à la préparation d'une protéine fusionnée. Comme cela est représenté dans la figure 1, les nucléotides codant pour I'extrémité N-terminale de la séquence cll du gène de I 'antitrypsine-cfl fusionné dans pTG922 sont liés par des sites de restriction uniques Ndel et B Hl. On élimine 'ADN situé entre ces deux sites par clivage du plasmide avec Ndel et BamHI puis remise en continuité du plasmide de façon que le codon de départ de la traduction soit fusionné en phase directement au début de la séquence codant pour l'antitrypsine-v Cette remise en continuité est obtenue en utilisant un oligonucléotide adaptateur synthétique qui permet a) la fusion des sites Ndel et BamHl b) la reconstitution du codon de départ et c) I'addition d'un codon codant pour l'acide glutamique à l'extrémité N-terminale de la protéine mature, lequel manquait dans la construction de pTG922 dont la construction est décrite dans le brevet principal. L'exemple suivant permettra de mettre en évidence d'autres caractéristiques du présent perfectionnement. EXEMPLE Les différents matériels et méthodes mis en oeuvre dans le cadre de cet exemple ont déjà été décrits dans le cadre du brevet principal. Le plasmide de départ est le plasmide pTG922 décrit au brevet principal. Le plasmide pTG922 est sournois à une restriction complète avec les enzymes de restriction Ndel (New England Biolabs) et BamHl (Bethesda Research Labs) en utilisant les conditions qui sont indiquées par le Fournisseur. On synthétise par des procédés connus des oligonucléotides adaptateurs complémentaires non phosphorylés ayant la structure suivante 5 ' -dTATGGAG-3 ' et 5'-dGATCCTCGA-3' . -dGATCCTCCA-3'. Ces oligonucléotides sont préhybridés puis soumis à la ligation à 40C avec le plasmide pTG922 qui a été soumis à la restriction enzymatique dans un rapport molaire de 50:1 en utilisant de l 'ADN ligase dans des conditions connues. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer des cellules compétentes de la souche TGE900 et les transformants obtenus sont étalés sur un milieu de culture en présence d'ampicilline. Les colonies sont sélectionnées sur des filtres de nitrocellulose par hybridation avec une sonde marquée à la T4 poly nucléotide kinase 5'-dCCTGGGATCCTCCA-3'. Cette sonde complémente entièrement la construction non fusionnée que l'on désire sélectionner mais ne complémente que 7 des nucléotides du piasmide parental pTG922, ceci est insuffisant pour assurer une hybridation. On obtient ainsi 6 candidats positifs. Ceux-ci sont mis en culture à 280C et à 420C et les extraits préparées sont testés pour leur activité anti-élastase comme cela a été décrit dans le brevet principal. Les résultats sont rassemblés au tableau ci-joint. TABLEAU PLASMIDE TEMPERATURE % D'INHIBITION D'ELASTASE pTG920 280C 5 420C 4,2 pTG922 280C 93,6 420C 98,9 pTG929(l) 280C 4,9 420C 60 pTG929(2) 28 C 17,7 42 C 64,4 pTG920 est le vecteur seul sans la séquence docant pour l'anti- trypsine-&alpha;1, pTG922 a été décrit au brevet principal, pTG929 (1) et (2) sont différents clones préparés par le procédé de la présente invention. Les résultats précédents démontrent que les plasmides selon l'invention assurent l'expression d'une antitrypsine-of humaine non fusionnée dans Escherichia coli. La diminution du niveau d'expression de l 'antitrypsine humaine dans le plasmide pTG929 par rapport au plasmide pTG922 est probablement due à la disparition d'une partie de la séquence de cll. REVENDICATIONS 1) Plasmide selon la revendication 1 du brevet principal, caractérisé en ce qu'il comporte au voisinage du codon de départ de la traduction du gène codant pour l'antitrypsine &alpha;1 la structure suivante -CATATGGAGGAT CCCCAGG- -GTATACCTCCTAGGGGTCC- de façon que te codon de départ de la traduction soit en phase pour la traduction du gène 2) Plasmide selon la revendication 1, caractérisé an ce qu'il s'agit du plasmide pTG929