Brevet FR2553002A1 — publié le 19850412

1. La présente invention concerne un procédé perfectionné pour l'obtention de liposomes unilamellaires de diamètres élevés et leur application pharmacologique pour l'encapsulage d'un principe actif en vue de son administration extemporanée. Au cours de ces dernières années, de nombreuses études ont montré que les liposomes peuvent être utilisés pour l'encapsulage et le transfert d'une substance active dans les cellules A cet effet, des vésicules de phospholipide ont principalement été préparées par des techniques physiques 10 comme les ultra sons, la technique dite de '"French press" ou des techniques chimiques, en utilisant des solvants organiques ou des détergents, suivies de l'élimination de ces derniers. Or les liposomes obtenus à l'heure actuelle 15 présentent, soit des structures, soit des dimensions ne permettant pas toujours, soit d'encapsuler certaines macromolécules présentant un certain encombrement, soit d'encapsuler une quantité relativement importante de substance active, les quantités encapsulées jusqu'à présent restant 20 limitées à certaines valeurs. Les demandeurs se sont par conséquent fixé comme objectif de trouver un procédé de préparation de gros liposomes unilamellaires, d'une part capables d'encapsuler des macromolécules de dimensions importantes (protéines ou 25 acides nucléiques), et d'autre part, capables d'encapsuler des quantités d'une substance active plus importantes qu'il n'était possible jusqu'à présent Par ailleurs, ce procédé devrait être suffisamment modéré et plus spécialement devrait éviter le contact avec un solvant organique dénaturant les 30 protéines ou des énergies élevées telles que l'émission d'ultra-sons ou l'application de pressions susceptibles de 2. briser les molécules d'acides nucléiques La technique faisant appelà un détergent semble être la meilleure façon de préserver la structure et l'activité de ces macromolécules. L'élimination du détergent par dialyse ou par la technique de filtration sur gel fournit des liposomes unilamellaires Le volume interne de ces liposomes varie avec la nature du détergent, le rapport molaire du détergent aux phospholipides, la composition en lipides des vésicules et la vitesse de dialyse La dimension des vésicules s'est avérée être différente en taille mais du même ordre de grandeur, que ce soit après dialyse ou après filtration sur gel Toutefois, la rareté et/ou le coût de la molécule à encapsuler (anticorps, enzymes, gènes purifiés ou porteurs de ARN) nécessite 15 un taux d'encapsulation très élevé et exclut les techniques exigeant de grande quantités de substance à encapsuler comme celle de l'élimination du détergent par filtration sur gel. Le procédé selon la présente invention est fondé sur la technique de l'élimination du détergent par dialyse et en constitue un perfectionnement En effet, un des principaux inconvénients que l'on rencontre lors de la formation de liposomes par la technique mettant en oeuvre des détergents réside dans le fait que l'élimination du détergent n'est jamais totale; il reste une quantité très souvent non 25 négligeable de détergent, même après une dialyse poussée. C'est ainsi qu'avec les détergents habituellement utilisés, en particulier le chilate ou le desoxycholate de sodium et le "Triton X 100 ", la quantité résiduelle peut aller de quelques % à 10 %. Or, les demandeurs ont trouvé de façon imprévisible que si l'on utilise comme détergent pour la solubilisation de lipides, en vue de la formation d'un liposome, un détergent neutre présentant une concentration critique micellaire élevée, sous certaines conditions de 35 dialyse, son élimination rapide et quasiment totale peut 3. être obtenue, permettant ainsi de réaliser des liposomes encapsulant un principe actif tel qu'un médicament pratiquement exempt de détergent. Par ailleurs, on obtient des liposomes 5 unilamellaires de diamètre élevé pouvant aller de 200 à 1 000 nm et donc capables d'encapsuler, soit de grosses molécules en quantités appropriées, soit des quantités importantes de molécules moins encombrantes palliant ainsi les inconvénients inhérents aux liposomes connus. En vue de l'application particulière en tant que véhicule de médicament pratiquement exempt de détergent, les demandeurs ont constaté que, comme détergent répondant à la définition ci-dessus convenant selon l'invention, on peut citer l'octylglucoside qui présente en outre 15 la propriété d'être compatible avec une grande quantité des substances actives que l'on viendrait à encapsuler. Suivant une autre caractéristique de l'invention, on utilise de préférence un rapport détergent: lipides de 10: 1 à 12: 1. Suivant encore une autre caractéristique, l'élimination du détergent est effectuée au moyen de polymères de synthèse, avantageusement sous forme de billes, choisis de préférence parmi les polymères de synthèse à pouvoir adsorbant élevé du type styrène-divinylbenzêne, disposés 25 dans le milieu de dilution. Suivant enfin une autre caractéristique, l'élimination du détergent est d'autant plus totale et rapide que le rapport détergent/billes ( L'invention couvre également le procédé 30 ci-dessus, appliqué à l'encapsulage d'une substance active, caractérisé par le fait que l'on ajoute aux lipides désirés, solubilisés dans le détergent conforme à l'invention, la substance à encapsuler et que l'on élimine ledit détergent au moyen desdits polymères de synthèse à grand pouvoir 35 adsorbant. 4. Elle couvre également la préparation extemporanée d'un médicament, consistant à prélever le volume désiré d'un mélange de la solution mixte de lipides, de détergent et de la substance à encapsuler, -à procéder à l'élimination du détergent avantageusement après contact direct avec les billes, puis à injecter au patient le liposome exempt de détergent. Suivant un mode de réalisation avantageux, au moment de l'emploi, on opère au moyen d'une seringue de 10 prélèvement chargée de l'agent adsorbant le détergent et munie à sa base d'un filtre ou tamis approprié. D'autres avantages et les caractéristiques de l'invention ressortiront plus clairement de la description qui va suivre. Comme indiqué précédemment, l'une des principales difficultés rencontrées lors de la formation des liposomes par la technique faisant apel à un détergent solubilisant réside dans le fait qu'une quantité résiduelle non négligeable de détergent subsiste dans le liposome obtenu même après avoir eu recours, 20 pour l'élimination dudit détergent, à une opération de dialyse poussée (quelques pour cent dans le cas du cholate ou du desoxycholate et environ 10 % dans le cas du Triton X-100). Or, si l'onchoisit par exemple de l'octylglucoside comme détergent, on constate qu'il peut être éliminé presque complètement (quantité résiduelle inférieure à 0,05 %) et rapidement On attribue ce résultat inattendu et imprévisible, et c'est ce qui constitue le fondement de l'invention et en fait son intérêt, au fait que ce détergent présente une concentration micellaire très élevée qui facilite son rejet 30 rapide de complexes micellaires mixtes On a constaté aussi de façon assez générale qu'un rapport molaire d'un tel détergent: lipide compris entre 10: 1 et 12: 1 convenait pour obtenir une solution limpide de lipide On notera que la présence de cholestérol ne modifie pas le degré de solubi35 lisation de mélanges de lipides. 5. Pour ce qui est de l'élimination de ce détergent, on a utilisé la dialyse et un polymère adsorbant de haute porosité avantageusement sous forme de billes, ce polymère étant choisi de préférence parmi ceux formes de styrène-divinylbenzène du type "Amberlite X AD-2 ", commercialisées par la Société BIO RAD sous le nom de "Bio Beads SM 2 '". Des essais effectués avec ce type de billes mais avec, comme détergent, outre l'octylglucoside, le "TRITON X-100 " et le desoxycholate de sodium, montrent que 10 l'adsorption du détergent et donc de l'octylglucoside était fonction du rapport détergent/billes De plus, comparativement à l'adsorption correspondante du TRITON X-100, on note que l'octylglucoside se fixe plus rapidement sur ces billes que le TRITON X-100 Par ailleurs, on observe qu'il existe un rapport détergent/billes optimum au-delà duquel l'élimination du détergent n'est plus améliorée Ce rapport optimum est de " 011 "pour l'octylglucoside ( 1 mmole de détergent/9 mg de billes) et il correspond à un rejet total du détergent du milieu, alors que ce même rapport optimum est de " 0,05 " dans 20 le cas du TRITON X-100 ( 1 gmole détergent/20 mg de billes) avec une quantité résiduelle de 0,25 % de détergent, quantité que l'on ne peut pas réduire en ajoutant une quantité supplémentaire de billes ( 29 mg de billes/gmole de détergent). Ceci confirme ce que tout homme de l'art sait de la difficulté 25 qu'il y a à éliminer le TRITON X-100 de tels milieux Toutefois, ceci montre le net perfectionnement apporté lorsque l'on procède avec les moyens de l'invention. Une autre série d'essais a permis aussi d'apprécier la capacité de liaison desdites billes avec 30 les phospholipides au cours d'une préparation typique de liposomes en utilisant le contact direct entre des micelles mixtes détergent-phospholipide et des billes telles que définies ci-dessus, et de comparer aussi les effets du TRITON X-100 et de l'octylglucoside sur ce phénomène A cet 35 effet, on a solubilisé une quantité identique de lipides 6. (rapport molaire PC/PS de 1:1 PC désignant la phosphatidylcholine et PS la phosphatidylserine) au moyen de ces détergents avec un rapport molaire détergent/phospholipides de 8 puis on a mélangé des échantillons de ces milieux avec lesdites billes et on a déterminé par voie d'analyse cinétique les concentrations des solutions Dans ces conditions, on peut obtenir des liposomes dans un très court laps de temps. Toutefois, on constate qu'une importante quantité de lipides semble se fixer aux billes dans les deux cas En fait, il ne 10 s'agit que d'une dilution due au volume de liquide emprisonné par les billes Donc il n'y a pas de perte de lipide par fixation. En tout état de cause, on constate qu'au delà d'un certain seuil de concentration en billes, cette élimination totale 15 et rapide de ce détergent est obtenue quelle que soit la quantité de billes utilisée Cette élimination est cependant d'autant plus rapide que le rapport détergent/billes (gmole/mg) est faible Par ailleurs, la quantité de lipide présente dans le mélange (telle qu'elle peut être déterminée 20 à l'aide de 14 C-PC) semble décroltre lorsqu'augmente la quantité de billes dans le milieu (dilution des lipides par le volume interne des billes). Ces résultats mettent de toute façon bien en lumière l'aptitude des billes en cause à adsorber de 25 nombreux composés différents, que leurs molécules soient neutres ou chargées Cette aptitude des billes de polystyrène n'avait pas été signalée jusqu'à présent Toutefois, cette technique impliquant un contact direct avec les billes peut ne pas convenir pour l'encapsulage de certaines 30 macromolécules. Or de tels milieux et de telles billes peuvent avantageusement être utilisés pour un tel encapsulage et ce, conformément à l'invention, en procédant par la technique de dialyse. C'est ainsi par exemple, qu'au cours d'une série d'essais, on a procédé à l'hydratation de 20-30 Umoles 7. de lipides séchés, soit au moyen de 0, 125 ml d'une solution tamponnée d'anticorps fluorescent ( 1,25 mg de protéine), soit au moyen d'une solution de t ARN ( 400 Lg/ml) puis à leur solubilisation au moyen d'octylglucoside en utilisant un 5 rapport molaire détergent/lipide de 10:1, dans un volume final de 0,675 ml On a procédé à la dialyse contre 100 ml de solution tampon contenant des quantités différentes de billes ( 0,04 à 0,1 gmole de détergent/mg de billes) On a alors comparé les résultats obtenus par cette technique avec 10 ceux obtenus par dialyse classique en changeant quatre fois un volume de 1 000 ml de solution tampon. Pour un rapport de détergent/billes inférieur à 0,1, toutes les molécules de détergent sont adsorbées en moins d'une heure par contact direct entre le 15 détergent et les billes On obtient les mêmes résultats 24 heures plus tard lorsqu'on ajoute les billes au milieu de dialyse On constate qu'un tel rapport inférieur à 0,1 accélère l'élimination du détergent L'essai comparatif montre ainsi que cette technique donne une élimination de 20 détergent plus rapide avec 100 ml seulement de solution tampon. On a vérifié aussi que cette dialyse utilisant ces billes ne modifie pas la concentration en lipides. Par ailleurs, on a mesuré, par microscopie électronique, les diamètres des vésicules obtenues On constate que les liposomes en question présentent une répartition dimensionnelle très homogène. L'exemple ci-après illustre un type de 30 liposome que l'on peut obtenir en mettant en oeuvre l'invention. Exemple: 1/ Préparation du mélange lipide-octylglucoside On mélange dans différentes proportions les lipides (stockés à 30 C dans un mélange 2: 1 (v/v) de chloroforme et de méthanol) et on ajoute si on le désire, pour les besoins de l'expérimentation, une quantité 8. appropriée de phosphatidylcholine lC 147 comme élément traceur On évapore le solvant en soumettant le mélange (concentration finale 10-30 m M) à un courant d'azote puis sous vide pendant une heure On ajoute ensuite la substance à encapsuler avec une solution tampon (L) D O m M Hêpes (acide 4-( 2hydroxyéthyl)-1-piperazineéthanesulfonique) (p H = 7,4) / 1 m M EGTA / 150 m M Na Clj et après agitation au Vortex, les lipides sont hydratés 30 minutes à une température supérieure à la température de transition 10 la plus élevée des constituants du mélange On ajoute alors le détergent (octylglucoside) avec, si nécessaire, une quantité appropriée du même détergent radioactif comme traceur pour les besoins de l'expérimentation. La suspension des liposomes multilamellaires se transforme 15 en une solution limpide Un tel mélange, scellé sous vide dans une ampoule, devrait pouvoir se conserver plusieurs mois. 2/ Elimination du détergent et formation des liposomes: unilamellaires encapsulant la substance active: 20 2 1 Elimination par dialyse: On prélève le volume désiré de la solution mixte ci-dessus (lipide + substance active + détergent) et on le dialyse contre 100 ml de tampon contenant une quantité de billes telles que définies précédem25 ment et dans le rapport optimum On agite quelques heures: il se forme des liposomes unilamellaires contenant, encapsulée en leur sein, la substance active ajoutée Ces liposomes sont alors prêts à l'emploi. Le tableau ci-dessous illustre quelques caractéristiques de types de liposomes obtenus conformément à l'invention avec élimination par dialyse. 9. 15 Composition de lipides Propriétés PC PC/PS PC/PS/Cholestérol ( 1:1) (:1) Protéine encapsulée % 26 11 + 2 47 + 4 ARN encapsulé % non non 45 + 4 déterminé déterminé Diamètre calculé * (nm) 540 237 + 50 920 + 100 Diamètre mesuré par 300-500 100-240 600-1100 microsccp ie électronique (nm) Volume interne 20 8 35 ( 1/moe PL) * Le volume total encapsulé a été calculé sur de 75 12 par molécule de phospholipide, par % d'encapsulation = 37 x M x d x 102 o M = ccncentraticn des phospholipides et d = diamètre ( 1 m) la base d'une surface totale l 'équation: (moi/litre) Comme on peut le voir à l'examen de ce tableau, le diamètre des liposomes varie dans une large mesure avec la composition des lipides Les liposomes PC-PS ont un diamètre de 200 nm, alors que l'addition de cholestérol donne des vésicules présentant un diamètre de 1 000 nm Cet effet du cholestérol sur la dimension des vésicules est connu. L'examen au microscope électronique a 30 montré que ces vésicules sont unilamellaires Ceci est confirmé par la comparaison du volume du compartiment intravésiculaire (donné par l'équation ci-dessus rappelée) avec celui auquel on s'attend pour les vésicules unilamellaires et mesuré dans la même préparation de liposomes par microsco35 pie électronique Le compartiment intravésiculaire est mesuré 10. en encapsulant soit des anticorps couples à de la fluorescéine soit des ARN; on en déduit le diamètre suivant la relation connue entre les dimensions vésiculaires et le % de volume de substance encapsuléedans les vésicules unilamellaires. 5 Le tableau ci-dessus établit une nette correspondance entre les diamètres obtenus par ces deux techniques Ainsi les liposomes de l'invention sont principalement unilamellaires. En outre, ces liposomes renferment une 10 quantité très importante de substance encapsulée, à savoir 1/mole de lipide dans le cas des liposomes PC-PS-cholestérol. Cette quantité est bien supérieure à celle que l'on peut obtenir par exemple par évaporation avec inversion de phase qui serait de 10 1/mole de lipide De plus, une quantité raisonnable de lipide ( 13 m M) permet l'incorporation d'une proportion allant jusqu'à 50 % de macromolécules, ce qui est comparable aux résultats que l'on peut avoir dans le cas de l'inversion de phase. Par ailleurs, en raison du potentiel élevé créé dans de petits liposomes chargés, l'encapsulage de molécules portant la même charge est réduit Ceci élimine la possibilité d'utiliser de petits liposomes contenant des PS pour encapsuler des acides nucléiques Or, les liposomes de l'invention évitent cette contrainte et permettent le même taux d'encapsulage, aussi 25 bien pour les ARN que pour les Ig G qui sont des protéines légèrement positives. Ainsi les liposomes de l'invention présentent toutes les propriétés recherchées pour le transfert de macromolécules à des cultures de cellules De grosses vésicules 30 sont plus efficaces pour des travaux portant sur le transfert de macromolécules à des cellules en raison du fait qu'elles peuvent encapsuler une quantité plus importante de substance par masse de lipides C'est ainsi, par exemple, qu'un liposome de 1 000 nm véhicule 3 107 molécules lorsqu'il est chargé avec une solution 1 M De ce fait, la capture d'un liposome par cellule semble couvrir la plupart des cas De plus, la composition de lipide (PC-PS- cholestérol) n'est pas toxique 11. à l'égard de nombreuses cellules et permettrait même la fusion avec des membranes cellulaires sous des conditions connues pour favoriser ce phénomène comme, par exemple, l'utilisation de poly(éthylèneglycol) Dans ce cas, les liposomes unilamellaires de l'invention rendent le processus plus aisé. Les Ig G et ARN ne sont pas dénaturés et gardent toute leur activité après leur encapsulage Le taux élevé d'incorporation (jusqu'à 50 % pour 13 m M de phos10 pholipide) fait que l'invention convient très bien pour l'encapsulage de macromolécules qui sont normalement difficiles à obtenir en grandes quantités telles que les RNA, les anticorps monoclonés et les ADN monoclonés. 2 2 Préparation extem 2 oranée: 15 Une application fort intéressante découlant de ces propriétés consiste à préparer et à administrer extemporanément un médicament à un patient en mélangeant directement la solution mixte (lipide + substance active + détergent) aux billes Pour cela on procède de la façon suivante: Apres avoir obtenu la solution mixte de lipides, de détergent et de la substance à administrer comme décrit ci-dessus, on procède à un prélèvement de cette solution au moyen d'une seringue munie à sa base d'un tamis et renfermant des billes telles que définies précédemment Au bout de quelques minutes d'agitation, on peut, avec la même seringue, injecter les liposomes unilamellaires dépourvus de tout détergent et contenant la substance active résultant de cette opération conforme à l'invention avec un taux d'encapsulation compatible avec la quantité de lipides utilisée. 30 Il va du reste de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre. 12. REVENDICATIONS 1 Procédé perfectionné pour l'obtention de liposomes unilamellaires de diamètres élevés, caractérisé par le fait qu'on solubilise les lipides au moyen d'un 5 détergent neutre présentant une concentration critique micellaire élevée et qu'on élimine ledit détergent par tout moyen approprié. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le détergent est l'octylglucoside. 10 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on utilise un rapport détergent:lipides de 10:1 à 12:1. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé par le fait que l'élimination 15 du détergent est effectuée au moyen de polymères de synthèse, avantageusement sous forme de billes, choisis de préférence parmi les polymères de synthèse à pouvoir adsorbant élevé du type styrène-divinylbenzène. Procédé selon la revendication 4, caracté20 risé par le fait que l'élimination du détergent se fait par contact direct avec lesdits polymères de synthèse. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'élimination du détergent se fait au moyen desdits polymères dans une opération de dialyse. 25 7 Liposomes unilamellaires de diamètre élevé allant de 200 à 1 000 nm, obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8 Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et des liposomes en résultant à l'encapsulage d'une substance active, caractérisée par le fait que l'on ajoute aux lipides solubilisés dans le détergent la substance à encapsuler et que l'on élimine ledit détergent au moyen desdits polymères de synthèse à haut pouvoir adsorbant. 9 Dispositif pour l'application selon la revendication 8, en vue de l'administration extemporanée d'un principe actif comprenant des moyens pour réaliser une solution 13. mixte de lipides, de détergent et de la substance à administrer, des moyens pour prélever une quantité aliquote de cette solution, des moyens pour l'élimination dudit détergent par le procédé selon l'une quelconque des revendi5 cations 4 à 6 et des moyens d'administration aux patients. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il comprend avantageusement une seringue renfermant des cloisonnements perméables et/ou semiperméables appropriés et des billes d'un desdits polymères 10 de synthèse.