Brevet FR2551456A1 — publié le 19850308

Vecteur modifié par une partie au moins, sinon la totalité, du gène lam B et micro-organismes transformés par ce vecteur, et rendus aptes à synthétiser une protéine de membrane externe déterminée, codée par un insérat également contenu dans ledit vecteur. L'invention est relative à des vecteurs perfectionnés modifiés par au moins une partie du gène lam B, sinon la totalité de celui-ci, ce vecteur pouvant à son tour être modifié par un insérat constitué par un fragment déterminé de nucléotidescodant pour une séquence déterminée d'aminoacides. L'invention est encore relative à des souches de micro-organismes, plus particulièrement de E coli, transformées par un tel vecteur et rendues aptes à synthé10 tiser une protéine hybride contenant ladite séquence déterminée d'aminoacides et à la transporter à la surface externe de leurs membranes. Des vecteurs appartenant à ce domaine technique ont déjà été décrits dans des publications et brevets antérieurs On rappellera en particulier que l'on avait déjà décrit dans le brevet français n 82 07201 déposé le 26 avril 1982 un vecteur porteur du promoteur de l'opéron lactose et d'au moins un fragment du gène Z de ce même opéron, caractérisé par le fait qu'au moins une séquence, plus particulièrement une séquence comportant la partie proximale du gène lam B se trouve insérée dans ce vecteur, plus particulièrement dans le susdit fragment de gène Z ou immédiatement en aval de celuici La longueur de cette séquence du gène lam B devait 25 être suffisante pour permettre la production par le micro-organisme transformé, notamment E coli, sous le contrôle du promoteur de l'opéron lactose d'une pro- téine hybride transportée dans la membrane externe de ces cellules et contenant des séquences d'acides aminés contenues dans le récepteur du phage X et la 0-galactosidase et respectivement codées par lam B et le gène S Dans certains cas, la protéine hybride peut être excrétée, dans le milieu de culture dudit micro-organisme transfoirmé. Il a cependant été constaté que la production de la protéine hybride de membrane externe n'allait pas sans difficultés, que la réalisation de la culture des microorganismes, transformés dans des conditions permettant d'assurer la transcription et la traduction de la séquence correspondante de nucléotides, pouvait s'accompagner soit d'un certain niveau d'instabilité, soit d'une certaine toxicité de la protéine hybride synthétisée, 15 pouvant entraîner la lyse d'une proportion importante des cultures cellulaires, soit des deux à la fois. La présente invention a pour but de remédier au moins en partie à ces difficultés, notamment de fournir des vecteurs du type sus-indiqué, contenant également 20 un insérat formé d'une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés déterminée, dont on désire induire la synthèse dans un micro-organisme approprié, plus particulièrement E coli, dans des conditions telles que la protéine exprimée correspondante présente 25 une stabilité plus satisfaisante et que les colonies bactériennes transformées puissent se développer et fournir des générations successives de micro-organismes transformés et producteurs de ladite protéine hybride à la surface externe de leurs cellules, tout en contrôlant 30 l'éventuelle lyse d'une partie des cellules, dans des proportions compatibles avec la production de colonies suffisamment importantes de cellules transformées. L'invention résulte de la découverte que des cellules modifiées, comportant sur leurs membranes externes, des 35 protéines hybrides contenant elles-mêmes une séquence d'acides aminés déterminée, répondant aux conditions sus-indiquées, peuvent être obtenues par transformation préalable de ces cellules avec un vecteur modifié, dans lequel le fragment nucléotidique codant pour la séquence déterminée d'aminoacides est lui-meme inséré dans le gène lam B placé sous le contrôle d'un prom:oteur suffisamment fort pour permettre la transcription et la traduction de la totalité de la séquence définie par les éléments correspondants du gène lam B (ou de la partie de gène lam B) et du fragment déterminé de nucléotides, lorsque les conditions suivantes sont respectées. Le vecteur modifié selon l'invention est modifié par une séquence nucléotidique contenant un insérat déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée 15 d'aminoacides, cette séquence nucléotidique étant placée sous le contrôle d'un promoteur suffisamment fort pour permettre la transcription et la traduction essentiellement de la totalité de ladite séquence nucléotidique dans une souche de E coli préalablement transformée par ledit 20 vecteur modifié Le vecteur modifié selon l'invention est caractérisé en ce que la partie proximale de ladite séquence nucléotidique, vis-à-vis dudit promoteur et en amont dudit insérat déterminé de nucléotides, contient la partie antérieure du gène lam B codant pour au moins 25 les 180 premiers aminoacides de la partie Nterminale de la protéine correspondante, et en ce que la partie distale de ladite séquence nucléotidique, aussi située en aval dudit insérat déterminé, comporte la partie postérieure du gène lam B, codant pour au moins les 20 derniers amino30 acides de la partie C-terminale de la protéine correspond dante, lesdites parties antérieure et postérieure du gène lam B ainsi que le susdit fragment de nucléotides étant respectivement en phase avec le promoteur, afin que la protéine hybride résultant de la traduction de ladite sé35 quence sous le contrôle dudit promoteur contienne, d'une part, respectivement au moins les 180 premiers et au moins les 20 derniers aminoacides de la protéine codée par le gène lam B et, d'autre part, la susdite séquence déterminée d'aminoacides. Il s'est en effet avéré que la présence, en aval du fragment déterminé du nucléotide codant pour la séquence d'acides aminés recherchés, de la partie postérieure du gène lam B codant pour au moins les 20 derniers aminoacides de la partie C-terminale de la protéine correspondante (ou comme on le dira dans ce qui suit, pour la sim10 plicité du langage, de la partie C-terminale du gène lam B), était une condition essentielle à l'obtention de bonnes conditions de transformation L'extrémité Cterminale du gène lam B, voire son altération, se manifeste en effet par un considérable accroissement de la toxicité 15 de la protéine codée par le vecteur ainsi modifié à l'égard du micro-organisme. La réalisation d'un vecteur contenant cette partie C-terminale du gène lam B, dans les conditions qui ont été énoncées, va à l'encontre de nombreuses tentatives décrites dans; la littérature, pour produire des vecteurs mettant en jeu des fusions de séquences constituées à partir de fragments de gène lam B et de l'insérat codant pour la séquence d'acides aminés dont la transcription et la traduction sont recherchées, dans lesquelles les 25 fragments de gène lam B sont en général toujours placés en amont seulement de linsérat et sont le plus souvent une partie N- terminale du gène lam B présumées contenir la séquence signal et les informations nécessaires au transport de la protéine hybride à travers la membrane externe 30 des cellules. La condition relative à la longueur minimum de la partie inférieure du gène lam B, en aval de l'insérat, est importante également On constate en effet que la condition exprimée plus haut, que cette partie antérieure, codant pour au moins les 180 premiers aminoacides de la partie Nterminale de la protéine correspondante (ou encore la partie N-terminale du gène lam B), est importante aussi du point de vue de la stabilité de la pro5 téine synthétisée La protéine hybride dont la synthèse est induite par des vecteurs, dans lesquelles la partie N-terminale du gène B serait plus courte en amont de l'insérat, conduirait à des protéines hautement instables, comme cela peut être détecté par des essais de caractérisation des proté5 ines, induites en présence d'un marqueur radioactif. De préférences, les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble un nombre total suffisant de nucléotides pour que de telles parties, lorsqu'elles sont placées en phase sous le contrôle d'un promoteur tac à l'intérieur d'un plasmide le contenant, soient aptes à permettre l'obtention dans une souche de E coli préalablement transformée par ce plasmide, d'une protéine stable et non léthale pour E coli, sur la membrane externe du micro-organisme. Dans le cas de vecteurs mettant en jeu un promoteur tac (par exemple tel que décrit dans l'article de H A. DE BOER et Coil paru dans Proc Natl Acad Sci USA, Vol 80, pp 21-25, janvier 1983), la toxicité ou la léthalité de la protéine hybride synthétisée par le 20 micro-organisme transformé peut être appréciée dans les conditions, suivantes Avantageusement, le microorganisme utilisé consiste en un mutant de E coli, initialement résistant au phage À et/ou initialement incapable de croître spontanément dans un milieu contenant 25 une maltodextrine On sait en effet que le gène lam B est le récepteur du phage À Le récepteur du phage X se comporte également comme le feraient des pores dans la membrane cellulaire à l'égard des maltodextrines. La transformation de tels micro-organismes avec le vecteur 30 selon l'invention (ou un vecteur contenant le gène lam B entier (sauvage)) restitue à ces mutants la sensibilité au phage À et/ou la capacité de croître sur des maltodextrines, notamment en présence d'un inducteur constitué par l'isopropylthiogalactoside (IPTG). Dans les essais qui ont été réalisés dans le cadre de la présente invention, le mutant de E coli utilisé était constitué de la souche BB 1 = thr leu ton B thi lac Y 1 rec A dex 5 met A sup E, F' lac I Qi Z+Y+pro AB+ Cette souche est dérivée de la souche pop 6510 et contient un épisome F' comportant lui-même une mutation lac IQ Cette souche, transformée en outre par le plasmide-p BBO, a été déposée à la C N C M de l'INSTITUT PASTEUR de Patis le 6 septembre 1983 sous le n Des vecteurs préférés sont déri10 vés du plasmide p BBO obtenu par l'insertion d'un promoteur tac 12 de DE BOER et Coil, inséré entre les sites Eco RI et Bam HI du plasmide p HSF 1 décrit (J M CLEMENT, D PERRIN et J HEDGPETH 1982 Mol Gen G 185, 302-310), juste avant la séquence de SHINE et DALGARNO du gène lam B. La transformation de la susdite souche mutante par p BBO et la culture du micro-organisme transformé en présence d'IPTG 10 3 M sur le milieu de culture solide de Luria, conduit à une surproduction de la protéine codée par lam B Les bactéries transformées forment des colonies translucides qui se développent régulièrement jusqu'à confluence, en l'absence sensible de lyse cellulaire. La léthalité de certains vecteurs, par exemple ceux dans lesquels les 10 derniers triplets de l'extrémité 25 C-terminale de lam B ont été modifiés, se manifeste par une sensibilité excessive à l'IPTG, pouvant entraúner la lyse de toutes les cellules après une seule génération. A l'inverse, le défaut de stabilité des protéines synthétisées par un vecteur non conforme à l'invention peut être apprécié après immunoprécipitation de la totalité des extraits cellulaires des cellules transformées recueillies après lyse ou rupture des parois cellulaires et marquées avec un acide aminé radioactif, par exemple la S-méthionine, selon la méthode décrite par ITO et Coll (K ITO, P J BASSFORD et J R BECKWITH, 1981, Cell 24, 707-717) La stabilité des protéines formées, notamment lorsque la traduction est interrompue de façon prématurée, se manifeste par une dégradation des protéines formées, de sorte que cellesci ne peuvent rapidement plus être détectées par autoradiographie, dans des essais de fractionnement sur gel d'acrylamide modifié par du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % Cette instabilité 10 s'observe notamment lorsque la partie proximale du gène lam B dans le vecteur selon l'invention est trop courte ou encore lorsque l'insérat, même introduit dans un site adéquat de lam B, entraîne un décalage de-la phase de lecture de la partie C-terminale de la partie posté15 rieure du gène lam B. On appréciera donc que les tests qui viennent d'être décrits sont à l'origine de la détermination des conditions auxquelles doivent répondre les vecteurs selon l'invention, pour permettre la synthèse,dans des conditions optimales, de la protéine hybride de membrane externe L'insertion d'un fragment déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides dans le gène lam B, dans les conditions qui ont été définies plus haut, conduit à des vecteurs aptes à rendre les cellules qu'ils transforment capables de se développer en présence d'IPTG, en formant des colonies qui ne lysent pas En outre, les protéines immunoprécipitables persistent dans le temps, donc sont stables. Les constatations qui ont été faites plus haut en ce qui concerne la capacité de la souche mutante transformée par p BBO de synthétiser des protéines hybrides se retrouvant dans les membranes externes des cellules, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu approprié en présence d'IPTG, se manifeste encore dans des cultures de cellules sem- Z 551456 blables modifiées par un vecteur dérivé de p BBO, par insertion dans celui-ci d'un insérat déterminé dans les conditions qui ont été définies en -ce qui concerne l'invention Là encore, on obtient des colonies translucides ou, le cas échéant, des colonies de moindre importance, cependant non lysées, et portant à l'extérieur de leurs membranes des protéines hybrides contenant le produit d'expression de l'insérat Le fait même que ces colonies se soient développées dans les conditions susindi10 quées atteste d'ailleurs que le clonage et l'expression de l'insérat ont été réalisés On peut également transformer des E coli ne présentant pas les mutations susindiquées, étant alors entendu que la détection de la protéine hybride devrait alors mettre en jeu d'autres modes de détection, par exemple des anticorps préalablement formés contre la séquence d'acides aminés pour laquelle code l'insérat, ou contre une protéine contenant cette séquence d'acides aminés. L'expérience montre que les meilleurs résultats 20 sont obtenus lorsque les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B totalisent ensemble au moins 350 triplets de nucléotides sur les 420 triplets de ce gène, dont la séquence a été entièrement réalisée (fig 1). Il est encore davantage préféré que les susdites parties 25 antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble substantiellement la totalité des nucléotides du gène lam B Les délétions réduites qui peuvent être enivisagées, voire les modifications de certaines séquences des deux parties du gène lam B, doivent être telles qu'elles ne modifient pas sensiblement les propriétés globales de ce vecteur La description des tests qui précèdent fournit à l'homme du métier les éléments qui lui permettront, en toutes circonstances, de tester celles des délétions ou modifications qui peuvent être réalisées, 35 sans modifier l'ensemble des propriétés du vecteur selon l'invention Il en sera encore de même en ce qui concerne la vérification de l'impact sur la bactérie ultérieurement transformée du choix du site d'insertion de l'insérat déterminé dans le vecteur et des longueurs relatives des 5 parties antérieure et postérieure du gène lam B D'une façon générale, notamment lorsque les parties antérieure et postérieure du gène lam B comprennent la quasi- totalité des nucléotides du gène intact, cette insertion pourra être effectuée entre le site 180 et le site 350 (la numé10 rota tion s'effectuant à partir du triplet codant pour le premier acide aminé du récepteur du phage À). En ce qui concerne le promoteur, on peut avoir recours à tout autre promoteur assez fort pour permettre la transcription et la traduction dans E coli de la sé15 quence totale, telle qu'elle a été définie plus haut Bien que les promoteurs tac soient préférés, les promoteurs lac et trp peuvent également être utilisés utilement. Conformément aux constructions préférées de l'invention, les premiers triplets de nucléotides tra20 duits sous le contrôle du promoteur choisi, sont constitués par les premiers triplets de la partie inférieure du gène lam B et,de préférence encore,le codon d'arrêt de la traduction se trouve placé immédiatement après le dernier acide aminé du récepteur du phage À (trp en position 421). 25 Le vecteur peut être constitué par tout acide nucléique apte à transformer un E coli De préférence, il s'agit d'un plasmide tel que p BR 322, le cas échéant d'un phage L'insertion de l'insérat au sein de la séquence du vecteur contenant le gène lam B, soit entier, soit délété des parties de moindre importance (par exemple la séquence 350-400) peut être réalisée par toute technique en soi connue Dans le cas o le vecteur consiste dans un plasmide, on peut avoir recours à la linéarisation du 1 1 du plasmide en utilisatn des enzymes de restriction, la fixation de courtes séquences de nucléotides ("linkers"), de préférence après bicaténarisation des extrémités de restriction à l'aide des nucléotides appropriés et en pré5 sence de la polymérase de Klenow, les linkers Il contenant le site de restriction correspondant aux extrémités cohésives de l'insérat que l'on veut introduire dans le site correspondant de lam B, le traitement dans les conditions elassiquen à la 'ois du plasmide linéarisé ainsi modifié et de la séquence de nucléotides contenant l'insérat avec l'enzyme de restriction en question et la ligation, notamment en présence d'une T 4 ADN-ligase, des fragments entre eux pour reconstituer le plasmide contenant l'insérat dans la position ainsi choisie. L'invention concerne encore les micro-organismes transformés comportant des protéines hybrides exposées à leur surface et contenant la séquence déterminée d'aminoacides codée par le susdit insérat L'invention concerne enfin un procédé de fabrication de telles souches trans20 formées, caractérisé par la transformation d'un microorganisme appartenant à la catégorie de ceux qui portent des récepteurs du phage X, notamment E coli, avec le vecteur tel qu'il a été défini plus haut, la sélection des souches transformées et la culture des souches transfor25 mées productrices de ladite protéine hybride sur les membranes externes de leurs cellules dans un milieu de culture approprié De préférence, la souche mise en oeuvre est un mutant initialement résistant au phage X et/ou initialement incapable de croître spontanément dans un mi30 lieu contenant une maltodextrine. Les souches transformées sont alors sélectionnées selon qu'elles sont devenues non résistantes au phage X et/ou devenues capables de croitre dans un milieu contenant de la maltodextrine Le cas échéant, la protéine hybride peut 5 être récupérée à partir de ces micro-organismes, notamment apres rupture ou lyse des parois, notamment en ayant recours à des fractionnements sur gel et, le cas échéant, en mettant en oeuvre des tests immunologiques de reconnaissance des protéines hybrides Par exemple, on met en 10 oeuvre des anticorps préalablement formés contre la séquence d'acides aminés ou la protéine qui la contient. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'un principe préféré de fabrication des vecteurs con15 formes à l'invention. 1 ) Fabrication d'un plasmide conforme à l'invention contenant un insérat formé par une séquence de nucléotides extraite du gène S du génome de l'hépatite virale B (délimitée par des extrémités de restriction Bst NI). Le site nucléotidique reconnu par l'enzyme de -restriction Sma I (position 183) dans le gène lam B contenu dans p BBO) a été choisi pour y insérer le susdit fragment d'ADN codant pour une partie de l'antigène H Bs. Ce fragment de 44 nucléotides a été obtenu par 25 digestion du gène S du génome du virus de l'hépatite virale B par l'enzyme de restriction Bst NI, aux positions nueléotidiques 111 et 155 vis-a-vis de la position 0 du site Eco RI dudit génoime (DNA-HBV) Les extrémités de ce fragment ont ensuite été traitées par la polymérase 30 de Klenow pour bicaté nariser les extrémités monocaténaires des fragments ainsi obtenus Aux extrémités des fragments ainsi obtenus ont été accolés, en présence d'une enzyme ligase du phage T 4, deux oligo-nucléotides obtenus par synthèse chimique, dont les séquences primaires avaient été programmées pour être reconnues par Bam HI Les fragments ainsi modifiés ont été soumis à l'action de Bam HI pour reformer des extrémités cohésives Bam HI Les fragments finalement obtenus ont été à nouveau traités par un ADN-ligase du phage T 4 Le plasmide reconstitué et contenant l'insérat issu du gène S de DNA-HBV, placé entre une partie proximale comportant de l'ordre de 183 triplets nucléotidiques issus de lam B et la partie distale constituée par une séquence de lam B, comportant essentielle10 ment les triplets codant pour les 238 acides aminés suivants, a été utilisé pour transformer la souche BB 1, dans les conditions qui ont déjà été indiquées La protéine hybride formée sur une membrane externe des cultures de E coli transformées et induites en présence d'IPTG peut 15 ensuite être étudiée sur le plan de ses propriétés immunologiques, pour ce qui est de sa capacité à réagir, notamment dans un test ELISA,avec un sérum anti-H Bs ou dans un test tel que décrit par ITO et ses Collaborateurs, pour reconnattre des fragments du gène lam B. Il va de soi que l'on peut remplacer la séquence d'ADN extraite du gène S de l'hépatite virale B par toute autre séquence de nucléotides dont l'expression pourrait être recherchée dans des conditions semblables Par exemple, on peut avoir recours à un insérat extrait du génome d'un 25 tout autre virus, par exemple à un insérat codant pour un peptide immunogène du virus de la poliomyélite ou de la fièvre aphteuse et pour un fragment d'une toxine ou toute autre protéine douée de propriétés particulières. D'une façon générale, le vecteur selon l'invention se prête à l'expression et au transport,à travers des membranes cellulaires de souches de micro-organismes ainsi transformées, de toute séquence peptidique d'origine procaryote ou eucaryote. L'invention fournit par conséquent des moyens d'étude particulièrement intéressants des comportements réciproques des micro-organismes transformés de la séquence peptidique susceptible d'être transportée à tra5 vers la membrane externe du micro-organisme L'invention permet en outre, grâce à l'exposition à la surface de micro-organismes de protéines de constitution déterminée, l'étude de principes vaccinants mettant en jeu par exemple par une protéine virale vaccinante, fixée sur la bactérie hôte (lorsque celle-ci est inoffensive), de sorte que celle-ci puisse être directement utilisée comme véhicule porteur des antigènes vaccinants que constituent ces protéines virales. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs 15 déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; en particulier dans ce qui précède, il a surtout été fait état du gène lam B ou de parties de celui-ci Il va de soi que doivent également être considérées comme des équivalents entrant dans le champ de protection des revendications toutes autres formes d'ADN ou de fragments d'ADN capables de coder pour des polypeptides identiques ou ayant 25 des propriétés semblables On mentionnera à titre d'exemples, les séquences de c ADN susceptibles d'être obtenues par recopie enzymatique de l'ARN messager correspondant au récepteur du phage À, le cas échéant à son précurseur Il va de soi qu'un tel c ADN ou les parties antérieure et postérieure correspondantes pourraient,comme il a été décrit plus haut en ce qui concerne les fragments de lam B, être mis sous le contr 8 le du promoteur en mettant en oeuvre des méthodes de recombinaison génétique bien connues des spécialistes. L'invention n'est pas davantage limitée aux microorganismes constitués par E coli On remarque que des techniques semblables peuvent être appliquées à des espèces différentes de micro-organismes, tels que les shighellae, 5 lesquels sont également susceptibles de synthétiser dans les conditions qui ont été évoquées plus haut, une protéine hybride de membrane externe D'une façon plus générale encore l'invention s'étend à toutes espèces de micro-organismes, dès lors qu'ils sont transformables par le plasmide vecteur choisi, lequel aura au préalable été inséré dans la séquence devant être exprimée et contenant l'insérat susdit entouré par les parties antérieure N-terminale et postérieure C-terminale de lam B. Enfin, on remarquera que les techniques de clonage dé15 crites par MANIATIS, FRITSCH et SAMBROOK dans l'ouvrage intitulé "Molecular cloning" ont été appliquées dans les exemples indiqués plus haut On peut avoir naturellement recours à toute autre technique classique Par exemple, on mentionnera encore les techniques décrites dans la publi20 cation déjà mentionnée de H A DE BOER et Coll. Z 551456 REVENDICATIONS 1 Vecteur modifié par une séquence nucléotidique contenant un inserat déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides, cette séquence nueléotidique étant placée sous le contrôle d'un promoteur suf5 fisamment fort pour permettre la transcription et la traduction essentiellement de la totalité de ladite séquence nucléotidique dans une souche de E coli préalablement transformée par ledit vecteur modifié, ledit vecteur étant caractérisé en ce que la partie proximale de ladite 10 séquence nucléotidique,vis-à-vis dudit promoteur et en amont dudit insérat déterminé de nucléotides, contient la partie antérieure du gène lam B codant pour au moins les 180 premiers aminoacides de la partie N-terminale de la protéine correspondante, et en ce que la partie 15 distale de ladite séquence nucléotidique, aussi située en aval dudit insérat déterminé, comporte la partie postérieure du gène lam B, codant pour au moins les 20 derniers aminoacides de la partie C-terminale de la protéine correspondante, lesdites parties antérieures et postérieures du gène lam B ainsi que le susdit fragment de nucléotides étant respectivement en phase avec le promoteur, afin que la protéine hybride résultant de la traduction de ladite séquence sous le contrôle dudit promoteur contienne, d'une part, respectivement au moins les 25 180 premiers et au moins les 20 derniers aminoacides de la protéine codée par le gène lam B et, d'autre part, la susdite séquence déterminée d'aminoacides. 2 Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdites partie antérieure et partie posté30 rieure du gène lam B contiennent ensemble un nombre total suffisant de nucléotides pour que de telles parties, lorsqu'elles sont placées en phase sous le contrôle d'un promoteur tac à l'intérieur d'un plasmide le contenant, soient aptes à permettre l'obtention dans une souche de E coli préalablement transformée par ce plasmide, d'une protéine stable et non léthale pour E coli, sur la membrane externe du micro-organisme. 3 Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B totalisent ensemble au moins 350 triplets de nucléotides. 4 Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble substantiellement la totalité des nucléotides du gène lam B. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les premiers triplets de nucléotides,transcrits et traduits sous le contrôle du susdit promoteur, appartiennent à la partie antérieure du gène lam B. 6 Vecteur selon l'une quelconque des revendications 20 1 à 5, caractérisé en ce que le promoteur susdit est un promoteur tac. 7 Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide, notamment dérivé de p BR 322. 8 Micro-organisme, notamment du type E coli, transformé par un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7 et capable d'exprimer la susdite séquence déterminée de nucléotides sous la forme d'une protéine externe sur la membrane dudit micro-organisme. 9 Micro-organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il porte sur sa membrane externe des protéines contenant la susdite séquence déterminée d'aminoacides. Procédé de fabrication d'une souche de E. coli comportant des protéines hybrides exposées à l'ex- ? 551456 térieur de la membrane externe des cellules, et contenant elles-mêmes une séquence déterminée d'aminoacides, caractérisé par la transformation d'un mutant de E coli, de préférence initialement résistant au phagel et/ou initialement incapable de croître spontanément dans un milieu contenant une maltodextrine, avec un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7, la sélection des souches transformées devenues non résistantes au phage X et/ou devenues capables de croître dans un milieu contenant de la maltodextrine et la culture des souches transformées productrice de ladite protéine hybride sur leur membrane externe dans un milieu de culture approprié.