Brevet FR2552326A1 — publié le 19850329

COMPOSITION D'EXTRAIT SOLUBLE DE PYRIDINE ET D'ENDOTOXINE DETOXIFIEE RAFFINEE ET SON UTILISATION La présente invention concerne une composition nouvelle contenant 5 une endotoxine détoxifiée raffinée (RDE) en combinaison avec un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme (PE) et se rapporte à son application pharmaceutique notamment l'immunothérapie de diverses types de tumeurs La RDE utilisée dans la présente invention se distingue en ce qu'elle ne possède pas de 2-céto-2-déoxyoctanoate, et qu'elle contient 10 entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acide gras Le PE contient entre environ 3 et 20 % en poids de protéine, environ 10 à 40 % de son poids de sucre et environ à 60 % en poids d'acide gras La composition est efficace pour obtenir la rémission et/ou la régression des tumeurs cancéreuses chez les 15 animaux à sang chaud. Des bactéries telles que Corynebacterium parvum ont été le sujet de travaux expérimentaux pour isoler et caractériser le composant responsable de l'induction de l'inhibition de la croissance de la tumeur /voir par exemple, Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation 20 Properties of Fractions Isolated from C parvum; Cantrell et coll, Cancer Research 39, pages 3554-3563 (septembre, 1979)/ En dehors de son activité antitumeur, le C parvum est un stimulateur puissant du système lymphoréticulaire et provoque des augmentations indésirables du poids de la rate et-du foie et une blastogénèse On a découvert qu'un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme tel que C parvum possède des propriétés antitumeurs puissantes sans présenter les effets toxiques indésirables associés aux produits de l'art antérieur. Les extraits endotoxiques obtenus à partir des entérobactériaciées, y compris des organismes apparentés et des mutants, sont connus. 30 Ces extraits ont été utilisés pour l'immunothérapie de diverses tumeurs immunogènes /voir, Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi et coll, Cancer Immunol. Immunother Vol 7, pages 43,58 ( 1979)/ Cependant, les extraits d'endotoxine sont connus pour être extrêmement toxiques et, de ce fait, d'une utilisation limitée dans le traitement des tumeurs cancéreuses Des efforts ont été tentés pour "detoxifier" les endotoxines tout en retenant leur capacité à faire régresser les tumeurs Comme indiqué dans Ribi et coll, des procédés chimiques, tels que la succinylation et la phtalylation, connus pour détoxifier les endotoxines tout en retenant leur capacité adjuvante ont eu pour résultat une perte à la fois de leur endotoxicité et de leur capacité à faire régresser les tumeurs De ce 10 fait, les tentatives de l'art antérieur pour en obtenir un produit à base d'endotoxine ayant une capacité élevée à faire régresser les tumeurs et peu ou pas de toxicité, n'ont pas été jusqu'à maintenant couronnées de succès. C'est donc un objet de la présente invention que de fournir une composition pharmaceutique contenant un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme en combinaison avec une endotoxine détoxifiée et raffinée. C'est un autre objet de la présente invention que d'offrir une méthode de traitement des tumeurs chez les animaux à sang chaud et les 20 êtres humains en utilisant la composition contenant l'extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme et l'endotoxine détoxifiée raffinée. Extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme (PE) Le PE contient entre environ 3 et 20 % en poids de protéine, 25 environ 10 à 40 % de son poids de sucre et environ 35 à 50 % en poids d'acides gras en combinaison avec des cellules entières de C parvum et il contient de préférence environ 5 % en poids de protéine, environ 35 % en poids de sucre et environ 55 % en poids d'acides gras. Tel qu'utilisé ici, il n'y a pas de limitation en ce qui concerne 30 l'utilisation d'un sucre; tous les sucres peuvent être utilisés La même chose est vrai en ce qui concerne les acides gras; il n'y a pas de limitation en ce qui concerne les acides gras que l'on peut utiliser. La protéine comprend des amino-acides et de l'ammoniac et les aminoacides comprennent, par exemple, ce qui suit; on a utilisé dans 35 ces déterminations un analyseur d'amino-acides de Beckman: asparagine 0,273 thréonine 0,108 serine 0,585 À acide muramique 0,219 acide glutamique 0, 267 À glycine 0,39 À alanine 0,173 acide diamino pimélique 0,444 À isoleucine 0,121 À leucine 0,167 phénylalanine 0,034 histidine 0,088 lysine 0,544 ammoniac 0,524 Les quantités ci-dessus sont exprimées en terme de pour cent en poids et le total de protéine est de 6,34 % en poids. N'importe quel micro-organisme peut être utilisé pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine y compris par exemple: M bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium acnes Type II, et Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum et Proprionibacterium acnes de type II sont ceux que l'on préfère particulièrement. Des cellules entières du micro-organisme, de préférence sous la forme d'une pâte, sont mélangées avec la pyridine Le mélange qui en résulte est séparé pour obtenir une fraction qui surnage et qui contient l'extrait soluble dans la pyridine et un résidu à la pyridine Eventuellement, le résidu à la pyridine peut être soumis à des opérations de 25 séparation répétées telle que décrites ci-dessus en utilisant de la pyridine pour éliminer d'autres quantités de l'extrait souhaité. La pyridine est alors éliminée de l'extrait et l'extrait séché est dialysé en présence d'un liquide convenable tel que de l'eau distillée. L'absence de cellules entières ou de fragments de cellules contaminants 30 est confirmée par microscopie électronique L'extrait purifié qui en résulte peut alors être lyophilisé par des méthodes connues pour obtenir un produit stable. L'extrait soluble dans la pyridine produit en accord avec la présente invention est combiné avec le RDE pour produire une composition 35 ayant une puissante activité antitumeur sans stimuler l'induction d'agrandissement de la rate et du foie Si l'extrait soluble dans la pyridine est mis en suspension dans l'eau, la suspension peut être séparée en une fraction soluble dans l'eau et une fraction insoluble dans l'eau L'extrait soluble dans l'eau est celui que l'on souhaite le plus puisqu'il peut être facilement injecté par voie parentérale tout en retenant en même temps l'activité antitumeur de l'extrait à la pyridine. Les tumeurs que l'on peut traiter par cette composition comprennent les tumeurs animales telles que les carcinomes des cellules du squame des bovins, les fibrosarcomes bovins, les sarcoides équins, les mélanomes équins, les carcicomes des cellules du squame équin, les tumeurs mammaires canines, les adénomes canins et les mélanomes canins et les tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, les tumeurs du poumon, 10 les tumeurs du colon, les mélanomes malins, les carcinomes des cellules du squame, les tumeurs ovariennes, Tes tumeurs utérines, les tumeurs de la vessie, de la tête et du cou. L'endotoxine détoxifiée raffinée (RDE) Les extraits d'endotoxine du type utilisé comme matière de départ 15 pour produire la RDE peuvent être obtenus à partir de n'importe quelles entérobactériaciées y compris les organismes apparentés et les mutants. A titre d'exemple, les genres suivants illustrent le type de microorganismes que l'on peut utiliser: Salmonella, shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, 20 Proteus, Klebsiella et Serratia. Les espèces suivantes sont celles que l'on emploie de façon typique: S minnesota, S typhimurium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, E coli, S typhi, S marcescens, S typhosa, Shigella flexni, et S abortus equi. Les extraits endotoxiques utilisés comme matière de départ peuvent être préparés par l'une des quelques méthodes connues suivantes (voir, par exemple, 1) Webster M E, Sagin J F, Landy M, et Johnson A G, J Immunol. 1955, 744,55. 2) Westphal O, Luderitz O et Bister F, Z Naturforsch, 76 148 ( 1952). 3) Westphal O, Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr Second Macy Conference (George F Springer, ed), Madison, N J Madison printing Co, 1957, 115. 4) Galanos C, Luderitz O, Westphal O, Eur J Biochem, 9 245 ( 1969). ) Chen C H, Johnson A G, Kasai N, Key B A, Levin J, Nowotny A, J Infect Dis 128 543 ( 1973). 6) Ribi E, Haskins W T, Landy M, Milner K C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 ( 1961). 7) Leive L, Biochem Biophys Res Comm 21 290 ( 1965). 8) Ribi E, Milner K C et Perrine T, J Immunol 82 75 ( 1959). La méthode préférée d'obtention de l'extrait endotoxique est celle décrite par Chen et coll; à savoir, la précipitation dans un mélange méthanol-chloroforme. Le précipité au méthanol-chloroforme (MCP)est alors mis en réaction avec un acide organique ou minéral et ensuite lyophilisé pour 10 produire un lipide A brut hydrolyse ayant une toxicité et une pyrogénicité réduites par comparaison avec l'endotoxine de départ Cette matière est alors traitée avec un solvant qui est capable de dissoudre de façon spécifique des acides gras et d'autres impuretés sans dissoudre le lipide A brut La teneur en phosphate du lipide A raffiné détoxifié 15 est environ la moitié de celle que l'on observe pour l'endotoxine toxique, ce qui suggère que la teneur en phosphate est liée aux effets toxiques des endotoxines Les acides minéraux que l'on préfère utiliser pour les faire réagir avec le MCP sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, ou 20 l'acide phosphorique et les acides organiques que l'on préfère sont l'acide toluènesulfonique ou l'acide trichloro-acétique La réaction peut de façon convenable être conduite à une température entre environ et 130 C, pendant un temps suffisant pour obtenir l'hydrblyse, habituellement entre environ 15 et 60 tinutes. La préparation de l'endotoxine détoxifiée brute peut être atcomplie en faisant réagir la matière de départ avec l'acide en présence d'un solvant organique tel que chloroforme, méthanol et éthanol ou des mélanges de ceux-ci. Le lipide A brut qui en résulte est mis en suspension dans l'acé30 tone qui est le solvant que l'on préfère pour dissoudre les acides gras ou les autres impuretés Le solvant est alors éliminé pour produire l'endotoxine détoxifiée brute. L'endotoxine détoxifiée brute est alors dissoute dans un solvant et l'on fait passer la solution à travers une colonne chromatographique 35 convenable telle qu'une colonne chromatographique d'exclusion moléculaire pour séparer les fractions de RDE qui sont alors rassemblées après élimination du solvant La solution d'endotoxine détoxifiée brute est passée à travers une colonne Sephadex en présence d'un solvant tel que chloroforme, méthanol, acétone, pyridine, éther ou acide acétique ou des mélanges de ceux-ci La pression de la colonne peut varier mais elle se situe de façon typique dans l'intervalle compris entre environ la pression atmosphérique et 7 bars et le débit se situe entre environ 0,1 et 10 ml/mn. La solution d'endotoxine détoxifiée brute peut être passée à travers une colonne de cellulose DEAE dans les mêmes conditions que mentionnées ci-dessus pour la colonne Sephadex Le débit est maintenu entre environ 2 et 15 ml/mn Les solvants utilisés sont également les 10 mêmes que ceux que l'on utilise pour la colonne Sephadex bien que l'on puisse ajouter de l'eau et/ou de la diéthylamine à tous les mélanges à une concentration jusqu'à environ 1 %. D'autres méthodes de production de la RDE à partir d'endotoxine détoxifiee brute comprennent le passage de la solution à travers une 15 colonne de gel de silice 60 à basse pression, ayant une taille de particule comprise entre environ 25 et 63 microns et utilisant un solvant constitué de chloroforme, méthanol, eau et hydroxyde d'ammonium. Le rapport volumétrique préféré des composants du solvant est d'environ /25/4/2. -20 L'endotoxine détoxifiee raffinee (RDE) ne contient pas de 2-céto3deoxyoctanoate détectable, elle contient entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras. La composition est administrée par injection dans un milieu 25 pharmaceutiquement acceptable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile ou une solution saline physiologique et elle est de préférence administrée directement dans la tumeur dans des conditions plus particulièrement décrites ci-dessous L'administration peut se faire par injection IV ou par infusion IV. La composition peut être stabilisée par exemple par une opération de lyophilisation et reconstituée ensuite sans perte de puissance. La quantité de RDE dans une injection unique pour le traitement des animaux est comprise entre environ 25 et 500 microgrammes/ml, de préférence entre 50 et 100 microgrammes/ml et la quantité de PE est comprise entre environ 20 et 500 et de préférence entre environ 100 et 250 microgrammes/ml. Le nombre de millilitres du produit biologique injecté dans la tumeur est déterminé d'après la taille de la tumeur en accord avec le tableau suivant: Dosage pour les animaux selon la taille de la tumeur Diamètre de la tumeur (cm) Quantité de produit biologique à injecter (ml) 0-1 jusqu'à 0,5 1-2 0,5 à 2,5 2-3 2,5 à 5 3-5 5 àa 10 -8 10 à 15 supérieur à 8 15 à 20 La dose maximum par injection est d'environ 10 mg de RDE et environ 25 de PE Le cours du traitement comprend jusqu'à quatre à dix 15 injections administrées à environ deux semaines d'intervalle. La présente composition incluse dans un milieu d'injection convenable telle qu'une solution saline physiologique est administrée directement dans les tumeurs humaines La quantité de RDE dans une injection unique est comprise entre environ 5 et 1 000 microgrammes, de façon convenable entre environ 25 et 500 microgrammes La quantité de PE est comprise entre environ 50 et 5 000 microgrammes, de façon convenable entre environ 200 et 3 000 microgrammes Le niveau de dosage que l'on préfère pour la RDE est d'environ 100 microgrammes et pour le PE, il est d'environ 1 000 microgrammes Tous les niveaux de dosage mentionnés ci-dessus sont basés sur un patient adulte de 70 kg Les injections sont administrées environ une fois par semaine jusqu'à un total d'environ injections. Comme mentionné ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des humains peut être utilisée sous la forme 30 d'une émulsion saline ou d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée se situe dans l'intervalle compris entre environ 0,5 et 3,0 % en volume par rapport au volume total de la composition On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume de l'huile Ces huiles comprennent par exemple une huile minérale légère, 35 le squalane, le 7-nhexyloctadécane, la superhuile Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produite par la Compagnie Pennreco, Butler, Pennsylvanie). L'huile homogénéisée contenant le mélange est alors associée à un détergent qui peut éventuellement être dissous dans une solution saline avant le mélange La quantité de détergent se situe de façon typique entre environ 0,02 et 0,20 % en volume et de préférence entre environ 0,10 et 0,20 % en volume par rapport au volume total de la composition. N'importe quel détergent classique peut être utilisé, y compris le Tween-80 et l'Arlacel (produit par la Compagnie Atlas Chemical). Le mélange qui résulte de l'addition du détergent est alors homogénéisé pour former une suspension qui a un pourcentage élevée de 10 gouttelettes d'huile, revêtue des composants actifs tels qu'on peut le déterminer par observation au microscope. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif seulement et n'entendent pas limiter en aucune façon l'invention telle que revendiquée dans les revendications jointes. EXEMPLE 1 Préparation de l'extrait soluble dans la pyridine à partir de l'acnes Proprionibacterium de type II (souche V Pl 0204). Le Proprionibacterium acnes de type II (souche V Pl 0204) est cultivé et recueilli à 37 C dans un bouillon de thioglycolate NIH pendant entre 48 et 72 heures pour obtenir une pâte de cellules entiè20 res La pâte est alors lavée avec 500 ml d'eau distillée O 90 grammes (poids humide) de la pâte lavée sont mélangés avec 200 ml de pyridine pure et centrifugés à 1 700 x g pendant 1 heure à 4 C Un extrait soluble dans la pyridine est éliminé sous la forme de fraction qui surnage Le résidu restant est extrait avec une quantité supplémentaire 25 de pyridine dans des conditions identiques telles que décrit ci-dessus. A la suite d'une filtration sur papier Whatman n 1, les extraits à la pyridine sont rassemblés et le solvant est éliminé par évaporatidn à C dans un rotavapeur de Buchi (Brinkmann Instruments, Wesbury, New York) L'extrait à la pyridine séchée est dialysé dans une large mesure 30 en présence d'eau distillée et il est ensuite lyophilisé L'extrait à la pyridine purifié qui en résulte contient environ 5 % en poids de protéine, environ 35 % en poids de sucre et environ 55 % en poids d'acides gras L'extrait est examiné au microscope électronique et on trouve qu'il est exempt de cellules entières et de fragments de paroi de cellule contaminants Le rendement en extrait soluble dans la pyridine est de 9 % ( 8,1 g). EXEMPLE 2 Préparation de l'extrait soluble dans la pyridine de BCG souche M bovis. Du BCG souche M bovis est cultivé et recueilli dans un milieu de Sautons à 37 C pendant entre 3 à 4 semaines pour obtenir une pâte de cellules entières lavée 50 grammes (poids humide) de pâte lavée sont alors traités de la même façon que dans l'exemple 1 pour donner un rendement en extrait soluble dans la pyridine de 7 % ( 3,5 g) L'extrait contient 15 % en poids de protéine, 10 % en poids de sucre et 52 % en poids d'acides gras. EXEMPLE 3 Préparation de l'extrait aqueux. 500 mg de l'extrait à la pyridine sont traités par voie sonique 10 dans 100 ml d'eau distillée pendant 15 à 30 minutes La suspension qui en résulte est centrifugée à 12 000 tr/mn dans une centrifugeuse RC 2 B à 4 C pendant 40 minutes Ce qui surnage est décanté et mis de côté Le résidu est extrait encore deux fois comme ci-dessus Les fractions surnageantes sont réunies dans une bouteille de lyophilisation, conge15 lées en coupelles et lyophilisées Rendement 230 mg ( 46 %). EXEMPLE 4 Préparation d'endotoxine détoxifiée brute. Un échantillon de 650 mg du précipité au méthanol-chloroforme produit en accord avec le mode opératoire de Chen et coll, J Infect. Dis 128 543 ( 1973) est mis en suspension dans 150 ml de H Cl 0,1 N, dans 20 un ballon à fond rond à trois tubulures équipé d'un condenseur et immergé dans un appareil sonique Apres traitement sonique, l'appareillage en verre est alors abaissé dans un bain d'huile maintenu à 120 C, ce qui permet à la température intérieure du ballon d'approcher ou de dépasser le point d'ébullition de la solution Une surchauffe de la solution est diminuée en équipant le ballon d'un tube capillaire relié à une source d'azote à travers l'une des tubulures Un écoulement continu d'azote est maintenu pendant toute l'opération d'hydrolyse. On continue l'hydrolyse pendant 30 minutes et ensuite la solution est refroidie au bain de glace, traitée par voie sonique pour disperser 30 le matériau solide et distribuée dans des tubes de corex Le ballon est lavé avec de l'eau distillée pour en éliminer toute la matière solide qui adhère aux parois du ballon, et l'eau de lavage est ajobtée à la suspension dans les tubes de torex La centrifugation est effectue à 12. 000 tr/mn pendant 80 minutes Ce qui surnage est décanté et rejeté. 35 Le résidu solide est remis en suspension dans l'eau distillée, traité par voie sonique jusqu'à ce que la suspension soit bien dispersée et on recentrifuge Le processus de centrifugation est alors répété Le résidu est repris dans l'eau distillée, congelé en coupelles et lyophilisé, ce qui donne 382 mg de lipide A brut 150 mg de cette matière sont traités avec de l'acétone froide ( O C) pour en éliminer les acides gras, traités par voie sonique et filtrés à travers un dispositif de filtration par gravité Whatman n 1 à 5 C 100 mg d'endotoxine détoxifiée brute subsis5 tent après séchage. EXEMPLE 5 Préparation de l'endotoxine détoxifiée brute. Un échantillon de 120 mg de MCP (précipité au méthanolchloroforme) est mis en suspension dans 12 ml de méthanol absolu, traité par voie sonique pour disperser les matières solides et distribué dans 10 six fioles à bouchon vissé ( 1 x 10 cm) On ajoute 2 ml de H Cl 0,2 N dans chaque tube et on fait incuber la suspension qui en résulte dans un bain d'eau bouillante pendant 45 minutes Apres hydrolyse, les tubes sont refroidis dans un bain d'eau glacée et centrifugés pendant environ 10 minutes à 2 500 tr/mn Ce qui surnage est décanté et l'on ajoute 5 ml 15 d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 au résidu pour en effectuer la dissolution On ajoute 2 ml d'eau par tube et la solution est mélangée. La solution biphasique est recentrifugée à 2 500 tr/mn pendant 10 minutes La phase aqueuse supérieure est rejetée et 1 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 est ajouté à chaque tube, ce qui donne une 20 solution claire Les solutions sont rassemblées et le solvant est évaporé sur évaporateur rotatif Le résidu est séché sous vide poussé et lyophilisé, ce qui donne 45 mg de lipide A brut 20 mg de cette matière sont traités avec de l'acétone froide ( O C), traités par voie sonique et filtrés à travers un appareillage de filtration par gravité de Whatman 25 n 1 à 5 C 13 mg d'endotoxine détoxifiée brute subsistent après séchage. EXEMPLE 6 Préparation d'endotoxine détoxifiée raffinée. g de LH-20-100 (dimensions de particules 25 à O l microns: Pharmacia) sont réunis avec 600 ml d'un mélange chloroformd/méthanol 2/1 30 que l'on laisse séjourner pendant 30 minutes La bouillie qui en résulte est introduite dans une colonne de chromatographie en verre de x 1 000 mm (Laboratoires BRL) équipée de raccords sous pression. Apres achèvement du garnissage, la colonne est reliée au moyen d'une tuyauterie sous pression en téflon à une pompe ISCO modèle 132 400 ml 35 d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 sont pompés à travers la colonne au débit de 3 ml/mn 100 mg d'endotoxine détoxifiée brute préparés en accord avec l'exemple 4 sont appliqués sur la colonne dans 2,5 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 par une boucle d'échantillon Le débit est réduit à 1 ml/mn et après que l'on ait recueilli 150 ml d'éluant, l'effluent est connecté à un collecteur de fractions Des fractions de 4 ml sont rassemblées et les fractions d'endotoxine détoxifiée raffinée sont déterminées par analyse chromatographique en couche mince des fractions (E Merck, épaisseur 0,25 mm, chloroforme/méthanol/H 20/NH 40 H ( 50/25/4/2) comme éluant). Les fractions d'endotoxine détoxifiée raffinée sont réunies et le solvant est évaporé, ce qui laisse 30 mg d'endotoxine détoxifiée raffinée sous forme de poudre blanche. EXEMPLE 7 Préparation d'endotoxine détoxifiée raffinée. 33 g de cellulose DEAE (Whatman DE-32) sont mis en suspension dans ml d'acide acétique glacial et l'on agite modérément pendant 10 minutes pour obtenir une poudre en bouillie Le mélange est mis de côté pendant la durée d'une nuit. La bouillie est versée dans une colonne de 25 x 400 mm, on laisse reposer avec écoulement et l'excès d'acide est ensuite drainé La colonne est lavée avec 2 000 ml de méthanol et ensuite avec 200 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 Un échantillon de 100 mg d'endotoxine détoxifiée brute produit en accord avec l'exemple 4 est ajouté à la colonne dans 3 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 ou un mélange de chloroforme/méthanol/eau 80/20/1 La colonne est éluée avec 350 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 et ensuite avec 300 ml d'un mélange méthanol/eau 99/1 En utilisant un appareil à gradient linéaire, la colonne est éluée avec 2 000 ml d'un gradient linéaire commençant avec 25 du méthanol à 100 % et finissant avec de l'acide acétique 0,2 M dans le méthanol La colonne est éluée au débit de 6 ml/mn et l'on recueille des fractions de 15 ml Chaque fraction successive est analysée pour sa teneur en phosphore total selon le mode opératoire de Bartlett G R, J Biol Chem 234, 466-471 ( 1959) Les fractions sont rassemblées et 30 évaporées sur un évaporateur rotatif jusqu'à presque siccité et on les reprend dan, 10 ml d'un mélange rhlornfnrmp/m 6thanol 2/1 Pt 40 ml d'acide acétique 0,001 % dans un entonnoir de séparation La couche inférieure est séparée, filtrée sur un papier filtre Whatman n? 2 et évaporé à siccité, ce qui donne 19,2 mg d'endotoxine détoxifiée raffi35 née. EXEMPLE 8 23 souris C 3 He B Fe J femelles âgées de 8 à 10 semaines sont injectées par voie intrapéritonéale avec 105 cellules de tératocarcinome ovarien 24 heures après, cinq souris sont injectées une fois avec 0,2 a 0,5 ml d'une solution saline isotonique contenant 50 microgrammes de RDE et six souris sont injectées une fois avec 0,2 à 0,5 ml de la solution saline contenant 300 microgrammes de PE et 50 microgrammes de RDE. Finalement, douze souris sont injectees une fois avec 0,2 à 0,5 ml de solution saline à titre de contrôle Après 21 jours, quatre des cinq souris ayant reçu une injection de RDE manifestent une régression complète de la tumeur et six sur six des souris injectées avec RDE et PE montrent des résultats semblables D'autre part, dix sur douze des souris du groupe de contrôle sont mortes le vingt et unième jour et le deux restantes montrent une évidence de cellules cancéreuses. EXEMPLE 9 Quarante cinq souris C 3 HEJ femelles âgées de 8 à 10 semaines sont injectées avec 105 cellules de tératocarcinome ovarien Apres 24 heures, 15 15 des souris sont injectées une fois avec 0,2 à 0,5 ml d'uhe solution saline isotonique contenant 1 400 microgrammes de PE et 15 des so Uris sont injectées une fois avec 0,2 à 0,5 ml de solution saline contenant 300 microgrammes de PE et 50 microgrammes de RDE Finalement, 15 souris sont injectées une fois avec 0,2 à 0,5 ml de solution saline à titre de 20 contrôle Apres 5 jours, 5 des 15 souris injectées avec le PE sont encore vivantes et 8 des 15 souris ihjectées avec RDE et PE ont montré une régression de la tumeur et sont èncore vivantes D'autré part, 14 sur les 15 souris du groupe de contr le sont mortes, la sou Hs restante montrant une régression de la tumeur. 25 REVENDICATIONS 1. A titre de produit industriel nouveau, une composition comprenant: (a) un extrait soluble dans la pyridine purifiée obtenu à partir d'un microorganisme, cet extrait contenant entre environ 7 et 20 % en 5 poids de protéine, entre environ 10 et 16 % en poids de sucre, et entre environ 35 et 55 % en poids d'acides gras; (b) une endotoxine détoxifiée raffinée ne contenant pas de 2-céto-3déoxyoctanoate détectable et contenant entre environ 375 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 Ioles/mg d'acides gras; et (c) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2 Composition selon la revendication 1, dans laquelle le microorganisme est le: M bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium acnes type II et le Corynebacterium parvum. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ce micro-organisme est le Corynebacterium parvum. 4. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ce 15 microorganisme est le Proprionibacterium acnes de type II. 5. Composition selon les revendications 1 à 4, dans laquelle cet extrait contient environ 12 % en poids chaque fois de protéine et de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras. 6. Composition selon les revendications 1 à 5, dans laquelle le rapport de cet extrait à cette endotoxine détoxifiée raffinée est de 1/1 20 à 100/1. 7. Composition selon les revendications 1 à 6, dans laquelle la quantité de cet extrait est comprise entre environ 50 et 5 000 mitrogrammes et la quantité de cette endotoxine détoxifiée raffinée est comprise entre environ 5 et 1 000 microgrammes. 8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle la quantité de cet extrait est d'environ 500 microgrammes et la quantité de 25 cette endotoxine détoxifiée raffinée est d'environ 100 microgrammes. 9. Composition selon les revendications 1 à 8, ayant la forme lyophilisée. 10. Composition selon les revendications 1 à 8, dans laquelle le véhicule est une solution saline physiologique. ? 552-? 26 11. Composition selon la revendication 1 à 9, ayant la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que cette huile est une huile minérale légère, le squalane ou le 7-n-hexyl5 octadécane. 13. Composition selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que cette huile est présente en quantité d'environ entre 0,5 et 3,0 % en volume par rapport au volume total de la composition. 14. Composition selon les revendications 11 à 13, comprenant en 10 outre un détergent en quantité comprise entre environ 0,02 et 0,25 % en volume par rapport au volume total de la composition. 15. A titre de produit pharmaceutique nouveau, pour l'immunothérapie de diverses types de tumeurs et notamment l'obtention d'une réponse immunologique chez un animal à sang chaud, la composition 15 selon une quelconque des revedications 1 à 14.