Brevet FR2557474A1 — publié le 19850705

La présente invention se rapporte généralement à un agitateur pour un récipient de fermentation et de culture de tissus, et plus particulièrement à un agitateur perfectionné pour un récipient de fermentation et de culture de tissus o ledit récipient de fermentation et de culture de tissus est utilisé comme un récipient de culture sur micro-supports. L'utilisation des techniques de culture de cellules est largement connue, et est vitale à l'étude de la structure des cellules animales et pour la production d'un matériel médical important comme les hormones, les enzymes, les anticorps, les vaccins etc. Lorsque l'on utilise des techniques de culture de tissus et de cellules sur micro-supports,les cellules sont ultra-fragiles de nature et facilement endommagées pendant la croissance. La culture des cellules dépendant de l'ancrage s'est révélée particulièrement difficile et l'utilisation de micro-supports dans ce but s'est développée. Dans des cultures sur micro-supports, on fait croître les cellules sous forme de couches simples sur une surface des micro- supports, généralement de petites sphères, qui à leur tour sont mises en suspension dans un milieu de culture par une douce agitation. Une description détaillée des principes et méthodes de culture de cellules sur micro- supports et des systèmes selon l'art antérieur d'agitation peut être trouvée dans le livre 'Microcarriers Cell Culture: Principles and Methods", Pharmacia Fine Chemicals, Suède, Décembre 1981. Comme cela est noté dans la référence ci-dessus, le plus fort rendement des cultures sur micro-supports est obtenu lorsque les micro-supports sont régulièrement en suspension dans le milieu de culture et ont la possibi- lité d'un échange adéquat de gaz avec ledit milieu de culture. Des mouvements erratiques d'agitation doivent être évités car ils peuvent conduire au détachement des cellules mitotiques arrondies de leurs micro-supports. Pour cette raison, il est important d'éviter une exposition du milieu de culture et des micro-supports à des vibrations Par ailleurs, une agitation est essentielle pour garantir que toute la surface des micro- supports sera disponible pour la croissance des cellules, pour créer un environne- ment de culture homogène, pour éviter l'agrégation des micro-supports et pour faciliter l'échange des gaz entre l'espace au-dessus de la culture et le milieu. Un certain nombre de techniques ont été utilisées pour produire une suspension et une aération des micro- supports et des cellules comprenant une essoreuse et des récipients agités à tige, l'utilisation de bouteilles roulantes, l'utilisation de bouteilles basculantes et l'utilisation de systèmes de milieu de culture levés à l'air et levés aux fluides. Des efforts pour améliorer l'agitation ont compris l'utilisation de tiges d'agitation à pointe en bille fixées à une extrémité et déplacées sur une trajectoire circulaire à l'autre extrémité autour d'une projection dans la base du récipient, et l'utilisation de roues en forme de palette et de piston. Cependant, ces systèmes se sont révélés loin d'être satisfaisants, en particulier lorsqu'on les emploie dans des ensembles commerciaux de fermentation et de culture de tissus à grande échelle, et sont limités par le degré de contrOle sur la vitesse et la force du mouvement des micro-supports et l'aération. En conséquence, il est souhaitable de produire un agitateur à utiliser avec un récipient de fermentation et de culture de tissus, capable de maintenir les cultures des cellules sur micro-supports en suspension pour per- mettre les échanges des gaz, tout en diminuant le détache- ment des cellules en croissance par rapport aux micro- supports. En général, selon l'invention, un agitateur perfectionné pour un récipient de fermentation et de culture de tissus est prévu. L'agitateur utilise un ensemble à corps creux ayant une première extrémité ouverte et une secoade extrémité fermée. Au moins une tubulure est couplée à une ouverture dans l'ensemble à corps creux dans une région espacée de sa première extrémité ouverte pour permettre à un écoulement de passer de la première extrémité ouverte dudit ensemble à corps creux vers sa seconde extrémité fermée pour sortir par ladite tubulure. L'extrémité externe de ladite tubulure définit une ouverture de sortie placée de façon que lorsque l'ensemble à corps creux est tourné autour d'un axe longitudinal dans le récipient de fermentation et de culture de tissus, une force d'aspiration soit créée à la première extrémité ouverte. L'ensemble à corps creux est de préférence supporté verticalement dans le récipient avec la première extrémité ouverte en relation face à face et espacée avec son fond, de façon que le fluide soit attiré dans la première extrémité ouverte dudit ensemble à corps creux et soit déplacé à travers ledit ensemble à corps creux, à travers ladite tubulure pour sortir de ladite première extrémité de ladite tubulure. De cette façon, un léger écoulement est formé du fond du récipient de fermentation et de culture de tissus vers le sommet du récipient de fermentation et de culture de tissus, permettant aux cultures sur micro-supports de rester régulièrement en suspension dans la solution et permettant également l'échange des gaz. Plus particulièrement, l'ouverture de sortie de la tubulure fait face essentiellement, en direction opposée, à la direction de rotation de l'ensemble à corps creux. Un certain nombre de tubulures peuvent être prévues. Les tubulures peuvent-être couplées à des ouvertures dans la paroi latérale de l'ensemble à corps creux, qui peuvent être de forme cylindrique dans la région adjacente à leur seconde extrémité fermée. L'ensemble à corps creux peut être monté pour une libre rotation dans le récipient et peut supporter un aimant permanent pour couplage à un entraînement magnétique en dehors du récipient pour effectuer la rotation. L'ai- mant peut être un aimant annulaire supporté dans la 4 2557474 région adjacente à ladite première extrémité ouverte dudit ensemble à corps creux. Une plaque s'étendant laté- ralement peut être supportée adjacente à la première extrémité ouverte de l'ensemble à corps creux pour guider l'écoulement du fluide dans le récipient le long de son fond. En conséquence, la présente invention a pour objet un agitateur perfectionné pour un récipient de fermentation et de culture de tissus. La présente invention a pour autre objet un agitateur perfectionné pour un récipient de fermentation et de culture de tissus qui est utilisé comme récipient de culture sur micro-supports. La présente invention a pour autre objet un agitateur perfectionné pour un récipient de fermentation et de culture de tissus utilisé comme récipient de culture sur micro-supports, o l'agitateur permet la mise en suspension et l'aération des cellules formées sur des micro-supports tout en diminuant le détachement desdites cellules par rapport auxdits micro-supports. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure 1 est une vue en perspective d'un fermenteur de laboratoire utilisant un agitateur selon l'invention; - la figure 2 est une vue en coupe transversale faite suivant la ligne 2-2 de la figure 1; - la figure 3 est une vue en coupe transversale faite suivant la ligne 3-3 de la figure 2; - la figure 4 est une vue en plan d'un agitateur utilisant une autre méthode d'entraînement faite selon l'invention; et - la figure 5 est une vue en plan d'une autre configuration de l'ensemble à corps creux selon l'invention. En se référant maintenant aux figures I à 3, un type d'un fermenteur de laboratoire 10 est représenté, o est incorporé l'agitateur selon l'invention, à titre d'exemple. Le fermenteur comprend un contrôleur 12 qui contient le dispositif nécessaire au fonctionnement du fermenteur et peut de plus contenir un ensemble 28 d'un moteur d'entraînement d'un aimant (figure 2). Un récipient de fermentation et de culture de tissus 14 est placé à la surface supérieure 13 du contrôleur 12 et des connexions lui sont faites pour surveiller et contrôler le processus de croissance des cellules. Le récipient 14 est maintenu en position par une patte 15a en forme de U et une barrette détachable 15b. Le récipient de fermentation 14 est obturé en utilisant un capuchon 16a scellé contre un rebord supérieur du récipient au moyen d'un joint 16b et maintenu en place par une pince 16c. Le récipient de fermentation 14 est pourvu d'un réchauffeur 17a et d'une ligne de contrôle du réchauffeur 17b que l'on utilise pour élever la température du contenu du récipient de fermentation et de culture de tissus 14. Le récipient de fermentation 14 est également pourvu d'un doigt froid 22a et d'une ligne de connexion du froid 22b qui permet à la température du contenu du récipient de fermentation et de culture de tissu 14 d'être abaissée. Un thermomètre 18a est monté dans un tube cylindrique 18b monté dans le récipient pour indiquer la température du contenu du récipient de fermentation et de culture de tissus. Le récipient 14 de fermentation et de culture de tissus comprend également un ensemble échantillonneur 20 qui peut être utilisé pour retirer une portion du contenu du récipient de fermentation et de culture de tissus sans perturber le fonctionnement du fermenteur 10. Le récipient de fermentation 14 est également pourvu d'une sonde d'oxygène dissous 24a ayant un câble de sortie 24b, que l'on utilise pour mesurer le pourcentage 6 2S77557474 d'oxygène contenu dans le milieu du récipient de fermen- tation et de culture de tissus. Les divers capteurs et dispositifs de contrôle ou de commande représentés sont des exemples des nombreux types de tels dispositifs que l'on peut incorporer dans un récipient de fermentation et de culture de tissus et ne forment pas une partie de l1 'invention. Des moyens peuvent être prévus pour retirer la mousse, ajouter du milieu et d'autres fonctions si on le souhaite. Un agitateur 30 selon l'invention est supporté sur le couvercle 16a. L'agitateur comprend un ensemble à corps cylindrique creux 31 ayant une première extrémité ouverte 31a et une seconde extrémité fermée 31b. L'en- semble à corps creux contient des tubulures 33 qui font saillie latéralement dudit ensemble à corps creux à proximité de la seconde extrémité 31b dudit ensemble 31. Lesdites tubulures 33 sont creuses, et comprennent une première extrémité définissant une ouverture de sortie 33a et une seconde extrémité 33b. Ladite seconde extrémité 33b de chaque 'tubulure 33 est connectée audit ensemble à corps creux 31 à-une ouverture 27 dans la paroi cylindrique de l'ensemble à corps creux de façon que l'écoulement à travers l'extrémité ouverte 31a de l'ensemble à corps creux sorte par les ouvertures 27 et continue à travers les tubulures pour sortir par les ouvertures de sortie 33a. L'ouverture de sortie 33a de chaque tubulure 33 est construite afin de faire essentiellement face dans une direction opposée à la direction de rotation de l'agita- teur 30 comme cela est illustré par la flèche A sur les deux figures 2 et 3. En fonctionnement, lorsque l'agita- teur 30 est entraîné en rotation autour de son axe longitu- dinal dans la direction de la flèche A de façon qu'une face fermée 33c de chaque tubulure 33 mène le mouvement de la tubulure, une aspiration ou un tirage est créé dans l'ensemble à corps creux 31 et la tubulure 33. Cela provoquera le mouvement de la matière fluide 50 dans le récipient 14 de fermentation et de culture de tissus pour qu'elle passe dans l'ouverture 31a de l'ensemble à corps creux 31 dans la direction des flèches B (figure 2) pour sortir par l'ouverture 33a des tubulures 33 dans la direction des flèches C (figures 2 et 3). Si le niveau du fluide dans le récipient de fermentation et de culture de tissus est au-dessus des tubulures, une circulation est créée par laquelle la matière est extraite au fond du récipient de fermentation et de culture de tissus et amenée au sommet de ce récipient. Cela permet le mouvement et l'aération des structures de cellule sur micro-supports en suspension dans le fluide tout en diminuant un détache- ment des cellules par rapport aux micro-supports. L'agitateur 30 est monté sur un arbre 35 par une vis de réglage 36, l'arbre 35 à son tour étant supporté rotatif par un ensemble formant palier 34 qui comprend des paliers 37 (figure 2). Un ensemble annulaire 32 à aimant entraîné est fixé à proximité de la première extrémité 31a de l'ensemble à corps creux 31 au moyen de tiges 38. L'ensemble à aimant mené 32 comprend un aimant permanent annulaire 32a entouré et supporté par une gaine protectrice 32b à laquelle sont fixées des tiges 38. Lorsque l'aimant 28a du moteur d'entrainement magnétique 28 tourne, il force l'ensemble à aimant mené 32 a tourner également, faisant ainsi tourner l'agitateur 30 et l'arbre 35 sur l'axe défini par ledit arbre. Un moteur conventionnel d'entraînement magnétique comprenant un aimant d'entraînement 28a est monté en dessous de la surface 13 du contrôleur 12 de façon à correspondre au récipient 14. Lorsque l'on utilise ce procédé, il ne faut aucune connexion physique directe entre le moteur d'en- traînement et l'agitateur. Par ailleurs, l'ensemble à aimant mené aide à étaler le trajet d'écoulement au fond du récipient 14 et à empêcher l'accumulation des micro- supports au pourtour du fond. En se référant maintenant à la figure 4, on peut y voir un autre mode de réalisation o l'ensemble de support de l'agitateur est remplacé par un ensemble d'un moteur 39 à entraînement direct, de façon que l'agitateur soit directement entrainé sans aimant. Une plaque 40 s'étendant latéralement est montée à proximité de la première extrémité ouverte de l'ensemble à corps creux 31 pour étaler les courants en écoulement produits par l'agitateur 30 au fond du récipient 14 comme cela est illustré par les flèches D. Pendant le fonctionnement du fermenteur en tant que récipient de culture sur micro- supports, la forme du récipient est usuellement choisie pour empêcher une sédimentation des micro-supports dans une partie du récipient de culture, c'est-à-dire avec des bases légèrement arrondies. Le mode de réalisation de la figure 4 permet d'utiliser un récipient à fond essentiellement plat. Comme cela est illustré sur les dessins, l'agitateur selon l'invention emploie un certain nombre de tubulures. Comme on peut le voir, trois tubulures sont fixées à l'ensemble à corps creux. Cependant, il faut noter que l'on peut prévoir un plus grand ou un plus petit nombre de tubulures tant qu'il y en a au moins une. Le nombre de tubulures et la configuration générale contrôleront la vitesse et la force de l'aspiration ou du tirage. Cela sera également affecté par la vitesse à laquelle l'agitateur tourne. De plus, tandis que l'agitateur de l'invention est illustré en fonctionnement dans un fermenteur de dessus de table de laboratoire, sa dimension peut être déterminée de façon qu'il puisse également fonctionner dans des applications commerciales de fermentation et de culture de tissus. L'agitateur selon l'invention présente un avantage qui est sa capacité de pouvoir être augmenté pour des applications de plus grands récipients. Tandis qu'il est particulièrement utile dans des applications de croissance de cellules sur micro-supports, l'agitateur selon l'invention peut être utilisé pour tout agitateur et toute application de fermentation et de culture de tissus. Tandis que l'agitateur 30 est illustré comme étant monté par le haut, un montage par le bas à un arbre d'un moteur tourillonné à travers le fond d'un récipient est également possible. Tandis qu'une forme particulière de tubulure est représentée, d'autres formes peuvent être utilisées tant que leur ouverture de sortie fait essentiellement face à la direction opposée à la direction de rotation de l'agitateur. Même une tubulure en forme d'écope avec peu ou pas de paroi sur le coté opposé à la direction de rotation de l'agitateur peut fonctionner dans certains modes de réalisation. Un ensemble à corps creux 31 peut être en forme de cône avec une première extrémité ouverte élargie 41, comme le montre l'ensemble à corps creux 42 de la figure 5. R E V E N D I C A T I 0 N S REVENDICATIONS 1.- Agitateur à utiliser avec un récipient de fermentation et de culture de tissus, caractérisé en ce qu'il comprend: un moyen à corps creux (31) montable de manière déplaçable ayant une extrémité supérieure ouverte (31a) et une extrémité inférieure fermée (31b) et présentant au moins une ouverture (27) le traversant, espacée de ladite extrémité ouverte; et au moins une tubulure (33) fixé audit moyen à orps creux à ladite ouverture, ladite tubulure ayant au moins une ouverture d'entrée et ayant une ouverture de sortie (33a) placée en correspondance avec ladite ouverture du corps creux de façon que lorsque ledit corps creux est déplacé,un force d'aspiration soit produite à la sortie dudit moyen formant tuulure, servant à attirer le fluide dans ledit corps creux à son extrémité ouverte et à travers ledit moyen formant tubulure vers l'ouverture de sortie. 2.- Agitateur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déplacement précité est une rotation. 3.- Agitateur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le moyen à corps creux a une paroi latérale et une paroi extrême, l'ouverture précitée étant formée dans sa paroi latérale, ledit corps creux étant rotatif autour de l'axe de ladite paroi latérale passant par ladite première extrémité ouverte. 4.- Agitateur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le moyen formant tubulure précité fait essentiellement saillie latéralement de la paroi latérale, l'ouverture de sortie faisant essentiellement face dans une direction opposée à la direction de rotation dudit moyen à corps creux. 5.- Agitateur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le moyen formant tubulure et l'ouverture associée sur le moyen à corps creux sont placés dans la région adjacente à la paroi extrême définissant l'extrémité supérieure fermée. 6.- Agitateur selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit agitateur est placé avec l'extrémité inférieure ouverte dudit moyen formant corps creux en relation face à face et espacée avec le fond du récipient. 7.- Agitateur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un certain nombre de tubulures, chacune faisant saillie du moyen à corps creux à une ouverture. 8.- Agitateur selon la revendication 3, caractérisé en ce que la paroi latérale du moyen à corps creux est essentiellement cylindrique. 9.- Agitateur selon la revendication 3, caractérisé en ce que la paroi latérale du moyen à corps creux est au moins partiellement conique avec l'extrémité inférieure ouverte plus grande en diamètre que l'extrémité supérieure fermée. 10.- Agitateur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un moyen pour entraîner en rotation le moyen à corps creux précité. 11.- Agitateur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le moyen d'entraînement comprend un ensemble à aimant mené couplé audit moyen à corps creux à proximité de ladite extrémité inférieure ouverte dudit ensemble à corps creux et un moyen pour supporter de manière librement rotative ledit moyen à corps creux, ainsi ledit ensemble à aimant mené peut être entrainé en rotation par un moyen magnétique d'entrainement en dehors du récipient sans diriger une connexion physique entre ledit moyen formant moteur et ledit agitateur. 12.- Agitateur selon la revendication 11, caractérisé en ce que le moyen à corps creux comprend une paroi latérale définissant l'extrémité inférieure ouverte précitée de façon que ladite extrémité inférieure ouverte soit placée en relation face à face et espacée avec le fond du récipient, le moyen entraîné magnétique comprenant un aimant permanent dimensionné pour entourer ladite paroi latérale en relation espacée avec elle à la région adjacente à ladite extrémité inférieure ouverte. 13.- Agitateur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le moyen d'entraînement comprend un moyen formant moteur d'entraînement couplé audit ensemble à corps creux à proximité de l'extrémité supé- rieure fermée dudit ensemble à corps creux pour produire une connexion directe entre ledit moyen d'entraînement et ledit agitateur. 14.- Agitateur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend un organe formant plaque qui s'étend latéralement à partir de la paroi latérale à proximité de l'extrémité inférieure ouverte, ladite extrémité inférieure ouverte étant placée en relation face à face et espacée avec le fond du récipient. 15.- Agitateur selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen formant plaque est dimensionné de façon que son pourtour soit en relation espacée avec la paroi latérale du récipient pour que la force d'aspiration force l'écoulement du fluide le long de la paroi latérale au delà de la plaque d'écoulement et le long du fond du récipient jusqu'à l'extrémité inférieure ouverte du moyen à corps creux. 16.- Agitateur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est adapté à une utilisation avec un fluide de culture sur micro-supports.