Brevet FR2558171A1 — publié le 19850719

- l - 2 5 5 8 1 7 1 La présente invention a pour objet un nouveau matériau polymérique à action enzymatique, son procédé de préparation et son utilisation notamment en tant que médicament pour le traitement des plaies en vue de leur détersion et de leur cicatrisation. La détersion des plaies, brûlures, ulcères etc... est couramment assurée par des agents de détersion enzymatiques qui agissent sur les exsudats et les produits nécrotiques. Parmi les agents détersifs enzymatiques couramment utilisés, on peut citer les produits à base de trypsine, de chymotrypsine ou de papa!ne associée ou non à d'autres principes actifs. Ces produits permettent une bonne détersion, facteur d'activation de la cicatrisation. Néanmoins, ceux-ci peuvent provoquer des phénomènes d'intolérance dus essentiellement à une allergie aux protéines enzymatiques utilisées. Par ailleurs, les enzymes usuellement employées dans ces produits de détersion manquent de stabilité à la chaleur notamment aux températures d'utilisation d'o il s'ensuit une perte d'activité appréciable non seulement au stockage mais également lorsque les produits sont appliqués sur la peau. On a maintenant constaté que les inconvénients de ces agents détersifs par enzymothérapie peuvent 9tre en grande partie supprimés en fixant les enzymes sur un support polymère par liaison covalente. En effet, l'enzyme fixée sur la polymère est peu ou pas résorbée au niveau de la plaie ce qui permet de diminuer, voire de supprimer, les phénomènes allergiques. En outre, on a noté que les enzymes ainsi fixées présentaient une bonne stabilité d'activité sensiblement plus grande que les enzymes libres à une température comprise entre 35 et 50 C. L'amélioration de la stabilité de l'activité enzymatique dans le temps, permet d'abaisser notablement la quantité de protéines enzymatiques usuellement employée dans les agents détersifs connus à base d'enzyme. La présente invention a donc pour objet, à titre de produit Industriel nouveau, un matériau polymérique à action enzymatique constitué d'un support polymère hydrophile, gonflent à l'eau, de poly -a!lanine réticulée porteur de fonctions aldéhydes sur lesquelles est fixé, par liaison covalente, au moins une enzyme protéolytique. Le support polymère est obtenu par réticulation de la poly -alanine à l'aide d'un agent réticulant notamment à l'aide d'un dialdéhyde, tel que le glutaraldehyde. La poly -alanine est un polymère connu dont la préparation a été décrite dans les brevets US n 2.749o331 et 4.082.730. Le procédé de réticulation est généralement effectué en suspension - 2 - 2558 1 7 1 de la solution aqueuse de poly e -alanine dans un solvant organique tel que le cyclohexane, le toluène, le benzoate de méthyle, le benzoate de benzyle, le chlorobenzène ou le dichloroéthane en présence d'un agent de suspension tel que les dérivés de cellulose, en particulier l'éthyl-cellulose, l'éthyl- hydroxyéthylcellulose et l'hydroxyéthyl-cellulose, le polyacétate de vinyle, le copolymère anhydride malgique-octadécylvinyléther, le copolymère anhydrique maléique-octadécène, les oléates de sorbitan et les produits de condensation d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène connus sous les dénominations commerciales de "PLURONICS". L'agent de suspension tel que mentionné ci-dessus a pour objet essentiel d'orienter la formation de poly e-alanine réticulée sous forme de sphères, dont le diamètre est fonction de la nature et de la proportion de l'agent de suspension utilisé. Ainsi lorsque l'on utilise, comme agent de suspension, du polyacétate de vinyle, les sphères de poly B -alanine réticulée sont généralement d'un diamètre supérieur à celles obtenues lorsque l'on utilise comme agent de suspension du "Pluronic L84" ou de l'hydroxyéthylcellulose. La proportion de l'agent de suspension joue également un r8le important pour obtenir des sphères du diamètre voulu. Elle peut varier dans de larges proportions mais est généralement comprise entre 0,1 et 5 %. La proportion de l'agent de réticulation, c'est-à-dire du dialdéhyde, peut varier dans de larges proportions mais est généralement comprise entre 1 et 20 % en poids par rapport au poids de la poly e -alanine soluble dans l'eau mise à réagir. La réaction de réticulation est conduite à une température comprise entre 20 et 80 C et à pH acide, de préférence compris entre 1 et 2, obtenu par addition d'un acide minéral, par exemple l'acide chlorhydrique. Apres agitation à la température ambiante, le mélange réactionnel est chauffé à une température comprise entre 40 et 100 C pendant un temps 3Q pouvant varier entre 1 et 6 heures. Les sphères obtenues sont alors séparées puis lavées à l'aide d'un solvant organique ou d'un mélange alcool/soude puis à l'eau et éventuellement à l'éthanol et enfin séchées à l'étuve. En fonction de la nature et de la quantité de l'agent de suspension utilisé, ainsi que des conditions opératoires comme par exemple la vitesse d'agitation, le diamètre des sphères de poly -alanine réticulée peut varier entre 2 et 500 microns. Les sphères obtenues peuvent alors être soumises à une opération de tamisage en vue de séparer celles dont]e diamètre serait inférieur ou supérieur à une certaine taille, par exemple non comprise dans la gamme de 100 -3- 2 5 5 8 1 7 1 à 200 microns. Par le procédé tel que décrit ci-dessus, les sphères obtenues, en fonction du degré de réticulation, sont susceptibles de gonfler dans l'eau de 2 à 25 fois leur volume initial. Par ailleurs, en fonction de la proportion de dialdéhyde utilisé par rapport à la poly B -alanine de départ, les sphères obtenues peuvent présenter une plus ou moins grande proportion de fonctions aldéhydes libres n'ayant pas pris part à la réaction de réticulation. Ces fonctions aldéhydes qui doivent être réduites lorsque l'on souhaite utiliser la poly B -alanine réticulée en tant que telle, comme agent de détersion par absorption, sont par contre tout à fait indispensables pour la fixation des enzymes par liaison covalente. En effet, les enzymes qui sont porteuses de fonctions amines primaires peuvent réagir sur les fonctions aldéhydes du support, selon une réaction du type base de Schiff, fixant ainsi par liaison covalente les enzymes. Parmi les différentes enzymes susceptibles d'être fixées par liaison covalente sur le support de poly B -alanine réticulée, on peut notamment mentionner: - les enzymes protéolytiques peu spécifiques (à large spectre d'action) telles que 1' a-chymotrypsine, la trypsine, la papaine, la fibrinolysine, la streptokinase, la streptodornase (streptococcus hémolyticus), les extraits protéolytiques bactériens (Bacillus subtilis) ou fongiques (Aspergillus orizae), - ou les enzymes protéolytiques plus spécifiques (à spectre d'action réduit) telle que la collagénase dont l'activité est limitée aux collagènes natif et dénaturé. Dans la réaction de fixation qui sera ci-après décrite, on utilise de préférence un large excès de l'enzyme que l'on souhaite fixer ceci de façon à éviter que ne subsistent des fonctions aldéhydes libres qui pourraient avoir une influence néfaste, notamment de provoquer des phénomènes d'irritation. Le procédé de fixation des enzymes par liaisons covalentes consiste à placer les sphères de poly 6-alanine réticulée dans une solution tampon de pH compris entre 6 et 9,5 de préférence entre pH 8,5 et 9,2 ou à un pH approprié à la nature de l'enzyme. Les sphères, au contact de la solution tampon, gonflent et se mettent en suspension. Le mélange est alors agité pendant environ 1 à 24 heures dans un dispositif permettant l'arrivée et l'élimination de la solution tampon avec un débit constant. Le gel obtenu est ensuite essoré. L'enzyme est ensuite dissoute à 4 C dans une solution tampon identique à celle utilisée pour le gonflement de la poly 8-alanine réticulée, - 4- solution à laquelle on additionne le gel précédemment obtenu. On agite pendant environ 1 à 48 heures, et de préférence pendant 3 à heures, à environ 4 C, sous agitation et sous atmosphère d'azote. On essore ensuite le gel supportant l'enzyme sur verre fritté et on le remet en suspension dans de l'eau distillée à environ 4 C et l'on essore de nouveau et répète le lavage jusqu'à ce que les eaux de lavage ne présentent plus d'activité enzymatique décelable. Les sphères obtenues sont alors séchées, de préférence par lyophilisation, puis soumises à un tamisage. l1 Selon l'invention, le temps de contact nécessaire à la fixation des protéines enzymatiques, dépend, à 4 C, d'une part de la nature de la protéine, d'autre part du pH opératoire. Le matériau polymérique selon l'invention est de préférence, avant son utilisation comme médicament, stérilisé par tout moyen conventionnel notamment par irradiation. La présente invention a également pour objet à titre de médicament pour le traitement des plaies, notamment pour leur détersion et leur cicatrisation, le nouveau matériau polymérique à action enzymatique tel qu'il a eté défini ci-dessus soit seul soit sous forme d'un mélange avec un autre matériau polymérique dont l'enzyme fixée est de nature différente. Le médicament selon l'invention peut être utilisé tel quel sous forme d'une poudre, dont les tailles des particules sont comprises entre 100 et. 250 microns, que l'on applique directement sur les plaies après avoir procédee à leur lavage à l'eau ou à l'aide de sérum physiologique. Le médicament peut également se présenter sous forme d'une pommade contenant, dans un excipient pharmaceutique approprié, les sphères dans une proportion correspondant à l'activité enzymatique recherchée. En plus des différents avantages dont il a été fait mention précédemment, le médicament selon l'invention permet d'assurer la détersion non seulement par voie enzymatique mais également par absorption, celle-ci résultant de la nature même du support hydrophile qui a la propriété d'absorber les liquides des plaies facilitant ainsi le processus de cicatrisation. Le médicament selon l'invention permet donc d'assurer la détersion et la cicatrisation des plaies par une double action c'est-adire par enzymothérapie et par absorption. Selon une forme de réalisation particulière, le médicament peut également contenir en association un principe actif tel qu'un antibiotique comme la néomycine, un anesthésique local tel que le chlorhydrate de lidocaine (DCI) ou du butoforme (DCI), un antiseptique tel que le -5 - 2558 1 7 1 trichloro-3,4,4' carbanilide ou triclocarban (DCI), un antifongique tel que le miconazole (DCI) ou un anti-inflammatoire tel que l'hydrocortisone. Le médicament selon l'invention est tout particulièrement recommandé pour le traitement non seulement des piaies traumatiques chroniques, atones, ulcérées mais également d'ulcères d'origine vasculaire, ulcères variqueux, ulcères post-phlébiques, ulcères artéritiques, dans le traitement des brûlures, des escarres et plus généralement à l'égard de toutes les plaies qui présentent un retard de cicatrisation. Bien qu'il ait été plus particulièrement fait référence à l'utilisation du matériau polymérique à action enzymatique en tant que médicament, il va de soi que celui-ci peut être également employé en tant qu'ingrédient actif dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques. On va maintenant donner, à titre d'illustration, plusieurs exemples de préparations du médicament selon l'invention ainsi que plusieurs exemples d'application. EXEMPLE 1: Fixation de la trysine pH 9,2 a _r aatio de]aply -alanine réticulée sous forme de s res Dans un réacteur de 2 litres muni d'une arrivée d'azote, d'un réfrigérant, d'un thermomètre, d'une ampoule à introduction et d'une agitation à hélice, on introduit 600 g de cyclohexane distillé puis 3 g d'éthiyl cellulose T 100, vendu par la Société HERCULES, ire l'on dissout par chauffage sous agitation et sous azote. Après refroidissement à 257C, la vitesse d'agitation es; réglée à 1300t/mn et l'on introduiz souz azote en 15 mn une solution aoueuse de poly,-alan'ie et de glutaraJdehyGe obtenue en dissolvant 100 g de po!y- alanine dans 70 cc d'eau préalablement dégazée et saturée d'azote, puis 1 g d'acide ascorbique et 30 g d'une solution aqueuse à 25 % de glutaral- déhyde distillé ainsi que de l'acide chlorhydrique concentré (d= 1,18) en vue d'amener le pH à 1. L'adiction terminée, le melange est agité 10 mn à la temprature nmbiarte, puis chauffé à 50 C pendant 3h30. Après ce temps de lae-ion, le méliange est essoré sur entonnoir de Buchner. Les sphères de poly p -alanine réticulée obtenues sont alors soomises à la série de lavages suivants: (i, rerise en suspension dans 800 g de cyclohc-'xne pe'idant 15 m. au reflux du solvant, puis essorages (ii) remise en suspension dans 800 g déthanol pur puis essorage, (iii) remise en suspension dans l'eau (800 ce) puis essorage, (cette opération est répétée 3 fois jusqu'à neutralité de la dernière phase aqueuse), - 6 - 2558 1 7 1 et (iv) remise en suspension dans l'étharol pur puis essorage final. Les sphères humides sont alors séchées sur des plateaux revêtus de papier filtre pendant 24 h à l'air ambiant puis 24 h en étuve à 40 C. Les sphères sont alors tamisées sur deux tamis de maille 250 et 100 microns conduisant à l'obtention de 50 g d'une poudre blanche jaunâtre de la taille recherchée. Mesure du gonflement: Une éprouvette de 10 ml est emplie avec 1 ml de sphères à l'état sec dont le diamètre est compris entre 100 et 250 microns. On complète alors à 10 ml par addition d'eau; les sphères gonflent rapidement jusqu'à 5,7 ml (en l'absence de toute agitation). b) Préparation du support de poly B-alanine réticulée à pH 9,2 4 g de poly B-alanine réticulée sous forme de sphères obtenues ci-dessus sous a) sont placées dans 80 ml d'une solution tampon de borate de sodium (19,7 g de Na2 B4 07, 10 H20 dans 1 1 d'eau). Les sphères gonflent rapidement et le mélange est agité pendant I h dans un dispositif permettant l'arrivée et l'élimination de la solution tampon avec un débit constant de 60 ml/h. Ensuite le gel est essoré sur verre fritté dont la pression intérieure est de 30mm Hg. c) Fixation de l'enzyme (trypsine) 477 mg de trypsine PROLABO dosée à 37000 Unités/g sont dissous à 4 C dans 48 ml d'une solution tamponnée à pH 9,2 telle qu'utilisée pour la préparation du support, puis on y introduit le gel de poly 8 -alanine réticulée obtenu ci-dessus sous b). Le mélange est laissé sous forte agitation pendant 24 h à 4 C sous atmosphère d'azote. Le gel supportant la trypsine est porté sur verre fritté, essoré, puis remis en suspension dans 200 ml d'eau distillée à 4 C et enfin essoré de nouveau. Cette opération est répétée jusqu'à ce que les eaux de lavage ne présentent plus d'activité trypsique, ce qui nécessite au moins quatre lavages successifs. Le polymère obtenu est amené à sec par lyophilisation. Dosage L'activité est dosée selon la méthode décrite dans Biochemica Merck p.48. Le dosage montre une activité de 1200 Unités/g. EXEMPLE 2: Fixation de la trypsine à pFi 8,5 a) Préparation du support de poly $ -alanine à pH 8,5 4 g de poly B -alanine réticulée sous forme de sphères préparées selon l'exemple 1 a) sont placés dans 80 mi d'une solution tampon (solution pour 1000 ml contenant 0,025 M de borate de sodium (Na2 B4 07, 10 H20) et 152 ml d'une solution d'HCl 0,1 M). Les sphères gonflent rapidement et le mélange est agité pendant 1 heure dans un dispositif permettant l'arrivée et -7- 2 5 5 8 1 7 1 l'élimination de la solution tampon avec un débit constant de 60 ml/h. Ensuite le gel est essoré sur verre fritté dont la pression intérieure est de mm Hg. b) Fixation de l'enzyme (trypsine) 477 mg de trypsine PROLABO dosé à 37000 Unités/g sont dissous à 4 C, dans 48 ml d'une solution tampon à pH 8,5, telle qu'utilisée pour la préparation du support, puis on y introduit le gel préparé ci-dessus sous a). Le mélange est laissé sous forte agitation pendant 6 heures à 40C sous atmosphère d'azote. Le gel supportant la trypsine est porté sur verre fritté, essoré, puis remis en suspension dans 200 ml d'eau distillée à 4 C et enfin essoré de nouveau. Cette opération est répétée jusqu'à ce que les eaux de lavage ne présentent plus d'activité trypsique décelable (au moins 4 lavages). Le produit obtenu est amené à sec par lyophilisation. Dosage L'activité du polymère-enzyme est dosée selon la méthode décrite dans Biochemica Merck p. 48. Le dosage montre une activité de 1800 Unités/g. EXEMPLE 3: Fixation de 1' a-chymotrypsine à pH 8,5 a) Préparation du support de poly 8 -alanine 4g de poly e-alanine réticulée sous forme de sphères préparées selon l'exemple 1 a) sont placés dans 80 ml de solution tampon (1000 ml contenant 0,025 M de borate de sodium (Na2 B4 O7, 10H20) et 152 ml d'une solution d'HCl 0,1 M). Les sphères gonflent rapidement et le mélange est agité pendant 1 heure dans un dispositif permettant l'arrivée et l'élimination de la solution tampon avec un débit constant de 60 ml/h. Ensuite le gel est essoré sur du verre fritté dont la pression intérieure est de 30 mm Hg. b) Fixation de l'enzyme (a -chymotrypsine) 500 mg d' a -chymotrypsine SIGMA dosée à 52500 Unités/g sont mis à 4 C en solution dans 60 ml de la solution tampon à pH 8,5, telle qu'utilisée pour la préparation du support, puis on y introduit 5 g de poly 8 -alanine réticulée sous forme de gel tel qu'obtenu ci-dessus sous a). Le mélange est conservé pendant 24 heures sous faible agitation à 4 C. Après ce temps, le gel supportant 1' a -chymotrypsine est essoré sur verre fritté, remis en suspension à 4 C dans 400 ml d'eau distillée, puis de nouveau essoré. Cette opération est renouvelée jusqu'à ce que les eaux de lavage ne présentent plus d'activité a -chymotrypsique décelable. Le polymère-enzyme ainsi obtenu est amené à sec par lyophilisation. Dosage L'activité du polymère-enzyme est dosée suivant la méthode de W.F. Nagel, et coll. décrite dans Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1965, 340, 1. Le dosage montre une activité de 1464 Unités/g. - 8 - EXEMPLES D'APPLICATION A - Poudre à usage externe Flacon poudreur contenant le polymère-enzyme obtenu selon l'exemple 1, à 1200 Unités/g présentant une taille de particules comprises entre 100 et 250 microns. Après avoir nettoyé la plaie par projection d'eau ou à l'aide de sérum physiologique on y applique une quantité suffisante du polymère-enzyme pour recouvrir la surface de la plaie et l'on place ensuite une compresse en vue de maintenir le pansement. En renouvelant l'application une fois par jour on note un débridement rapide de la plaie et une accélération de la cicatri- sation sans constater de phénomènes d'irritation tels que ceux rencontrés lorsque l'on utilise uniquement, à titre d'agent de détersion, la trypsine. B - Spray en poudre à usage externe On conditionne dans une bombe aérosol les ingrédients suivants: - Polymère-enzyme obtenu selon l'exemple 2, à 1800 unités/g... 9 g - Stéarate de magnésium.............................. ....... 0,5 g - Myristate d'isopropyle....................................DTD: . 0,2 g Difluorodichlorométhane..................................... 54 g Dichloro-l,2 tétrafluoroéthane.............................. 36 g Avant d'appliquer la poudre sur une plaie, celle-ci est tout d'abord nettoyée à l'aide de sérum physiologique et on y applique une quantité suffisante de la poudre en vue de recouvrir la surface de la plaie et l'on..DTD: place ensuite une compresse en vue de maintenir le pansement. C - Onguent hydrophile - Polymère-enzyme obtenu selon l'exemple 3, à 1464 unités/g... 7 g - Polyéthylèneglycol 400.................................. ... 60 g - Polyéthylène glycol 35/50................................... 33 g Cet onguent est appliqué sur une plaie après nettoyage à l'aide d'eau ou de sérum physiologique et l'on applique ensuite une compresse en vue..DTD: de maintenir le pansement. L'application de l'onguent-est répétée une fois par jour et l'on note une accélération de la cicatrisation sans rencontrer de phénomènes d'irritation. D - Pâte préparée extemporanément Au moment de l'emploi, on mélange jusqu'à l'obtention d'une pâte épaisse 80 g du polymère-enzyme obtenu selon l'exemple 1, à 1200 unités/g et g de glycérol. La pate une fois obtenue est appliquée sur la surface de la plaie en une quantité suffisante pour la recouvrir et l'on applique ensuite une compresse en vue de maintenir le pansement. - 9 - 2 5 8 1 7 1 REVENDICATIONS 1. Matériau polymérique à action enzymatique, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'un support hydrophile, gonflant à l'eau, de poly 3alanine réticulée porteur de fonctions aldéhydes sur lesquelles est fixée par liaison covalente au moins une enzyme protéolytique. 2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est à large spectre d'action et est pris dans le groupe constitué par 1' a chymotrypsine, la trypsine, la papaine, la fibrinolysine, la streptokinase, la streptodornase (streptococcus hémolyticus), les extraits protéolytiques bactériens (Bacillus subtilis) ou fongiques (Aspergillus orizae). 3. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme protéolytique est à spectre d'action réduit et est la collagénase. 4. Procédé de préparation du matériau selon les revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à: 1) préparer un gel à partir de sphères de poly 8 -alanine réticulée dans une solution tampon de pH compris entre 6 et 9,5, de préférence à pH 8,5 ou 9, 2, 2) à introduire à environ 4 C, le gel ainsi obtenu dans une solution tampon de l'enzyme à fixer, ladite solution tampon étant identique à celle utilisée pour la preparation du gel, 3) à essorer le gel supportant Itenzyme puis à procéder à plusieurs lavages à l'eau jusqu'à l'absence d'activité enzymatique décelable. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la réaction de fixation de l'enzyme est réalisée pendant un temps d'environ 1 à 48 heures à environ 4 C sous agitation et sous atmosphère d'azote. 6. Médicament pour la détersion et l'aide à la cicatrisation des plaies, caractérisée par le fait qu'il est constitué par ou contient dans un véhicule approprié pour une application topique, le matériau polymérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou obtenu selon l'une quelconque des revendications 5 et 6. 7. Médicament selon la revendication 6, caractérisé par le fait qp'i] se présente sous forme d'une poudre dont les tailles des particules sont comprises entre 100 et 250 microns. 8. Médicameat- selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé par le fait qu'i] contient dans un excipient pour pommade, le matériau polymérique sous forme de poudre.