Brevet FR2555608A1 — publié le 19850531

La présente invention concerne un procédé de détermination d'un composé de la formule dans laquelle R1 est un groupe hydroxyle ou amino, ou de l'hydrogène si au moins un des symboles R2 R3, R4, R5 ou R6 représente un groupe hydroxyle ou amino, et R2, R3, R4, R5 et R6 sont choisis parmi l'hydrogène, les halogènes, des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué1 hydroxyle, carboxyle ou sulfo, ou R5 et R6 forment ensemble un cycle, selon lequel on fait réagir le composé avec une oxydase qui consomme de oxygène et produit un pigment, et on mesure au moins un des changements détectables dans le système de réaction. La présente invention fournit aussi une détermination d'hydrolase, dans laquelle un composé (I) est libéré par l'action de l'hydrolase à déterminer, à partir d'un substrat synthétique, qui a un composant de la structure du composé (I), puis on oxyde le composé (I) ainsi produit par une oxydase en présence d'un agent de couplage, et on mesure les changements détectables. L'analyse enzymatique d'un composé dans un échantillon en utilisant une enzyme pour former un pigment est bien connue. La plupart de ces méthodes sont des méthodes de détermination utilisant une peroxydase, dans lesquelles on mesure l'eau oxygénée ou le phénol ou un composé qui les produit ou les libère, Par exemple, dans une détermination d'eau oxygénée, la peroxydase agit en présence de phénol et d'un chromogène tel que la 4-aminoantipyrine pour provoquer la réaction : H202 > H2O + (O), dans laquelle le phénol et le chromogène sont condensés par oxydation par 1'action oxydante de (O) pour former un pigment. On peut mesurer la quantité d'eau oxygénée en mesurant l'absorption à la longueur dlonde d'absorption spécifique du pigment.Par exemple, le bêta-D-glucose forme de l'eau oxygénée par l'action de glucose oxydase comme suit bêta-D-glucose + H2O + O2 # D-gluconate + H2O2 On mesure l'eau oxygénée produite et la quantité de bêta-D-glucose peut être ainsi déterminée. Cette méthode est la méthode de détermination préférée pour un système de réaction qui contient de l'eau oxygénée ou qui libère ou produit de l'eau oxygénée et elle est utilisée en biochimie clinique. Dans la détermination d'un composé de la série du phénol, l'eau oxygénée sera utilisée comme réactif. Comme l'eau oxygénée est un composé instable, la détermination d'un composé de la série du phénol par cette méthode n'est pas préférée, et en fait elle est presque inutilisable. Une réaction enzymatique pour former un pigment autrement que par utilisation d'une peroxydase est celle dans laquelle le nicotine adénine dinucléotide ou phos phate de nicotine adénine dinucléotide / AD(P)7 est réduit en NAD(P)H par un système de déshydrogénase, et le NAD(P) produit est lié avec la diaphorase et un pigment de transfert d'électrons pour former du formazan qui est ensuite mesuré par colorimétrie. Toutefois, cette méthode a des inconvénients parce que le formazan formé est insoluble dans l'eau et que le pigment adhère à la paroi du récipient. La demanderesse a trouvé précédemment que la p-phénylène diamine ou un dérivé de ce composé sont oxydés par action de l'ascorbate oxydase ou de la laccase pour former un pigment et que la leucine aminopeptidase peut être déterminée par cette méthode. Voir la publication de brevet japonais non examiné NO 57-115345. Cette méthode de détermnation antérieure & un certain nombre d'avantages, comme de fournir une détermination enzymatique douce par comparaison avec des méthodes chi moques et la possibilité de déterminations automa ae taux. tiques Dans cette méthode de détermination antérieure, quand un dérivé de phénol est oxydé par une oxydase, le dérivé de phénol est transformé en un composé ayant un maximum d'absorption à 350-500 nm. D'une manière très surprenante, on a maintenant découvert qu'un composé de formule (I) et un agent de couplage peuvent être condensés par oxydation par une oxydase comme l'ascorbate oxydase ou la laccase, pour former un pigment qui était inconnu antérieurement et qui a un maximum d'absorption différent à 500-750 nm. Le composé (I) tel que la 3,5-dibromo-4-hyd.roxyaniline de présente pas de couleur par réaction avec une oxydase quand on n'utilise pas un agent de couplage ; toutefois, il forme un pigment ayant un maximum d'absorption à 600-700 nm par condensation par oxydation en présence d'un agent de couplage. Cette réaction peut donc être considérée comme se produisant selon un schéma de réaction inconnu antérieurement et nouveau. La demanderesse a obtenu par synthèse un substrat synthétique pour hydrolase ayant un composant de composé (I) et a trouvé que ce substrat est hydrolysé par une hydrolase correspondante pour libérer un composé (I) qui est transformé en un pigment en présence d'un agent de couplage. Elle a trouvé aussi que cette réaction peut être utilisée pour la détermination d'hydrolases. Un but de la présente invention est de fournir un procédé de détermination d'un composé (I) qui comprend la mesure des changements détectables dans un système réactionnel en traitant le composé à déterminer par une oxydase qui consomme de l'oxygène et produit un pigment en présence d'un agent de couplage. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de détermination d'hydrolase selon lequel on libère un composé (1) à partir d'un substrat synthétique ayant un composant de composé (I) dans sa structure par l'action d'une hydrolase, on traite le composé ainsi produit par une oxydase qui consomme de l'oxygène et produit un pigment en présence d'un agent de couplage et on mesure les changements détectables dans le système de réaction. Les oxydases sont celles qui consomment de l'oxygène et produisent un pigment. Des exemples de l'oxydase sont l'ascorbate oxydase, la laccase, l'aminophénol oxydase, la polyphénol oxydase et la tyrosinase. Des exemples préférés sont l'ascorbate oxydase obtenue à partir de potiron, de concombre ou chayote (Sechium edule), la laccase obtenue à partir d'un japan (urushi, laque japonaise), Bacidiomycetes (Coriolus versicolor, Rhizopus ou Polyporus versicolor) et la tyrosinase. (J. Biochem., 50, 264 (1961), Biochim. Biophys. Acta, 73, 204 (1963), Acta Chem. Scand., 21, 2367 (1967)7. Des enzymes disponibles dans le commerce peuvent aussi être utiliséés. Ces enzymes peuvent être utilisées sous la forme d'enzymes immobilisées. L'enzyme immobilisée peut être mise en contact avec une électrode à oxygène dans un analyseur automatique et les changements électrochimiques peuvent être mèsurés. L'enzyme coûteuse peut être économisée par l'utilisation de ces électrodes. De plus, le détecteur, ayant une électrode à enzyme d'une enzyme immobilisée et une électrode à oxygène, peut fournir une méthode de détermination qui est rapide, utilise moins de réactif et peut être utilisée pour des mesures répétées, Egalement, des échantillons colorés peuvent être mesurés. Les agents de couplage sont des substances qui peuvent se condenser par oxydation avec un composé. (I) pour former un pigment. Dans le composé (I) dans lequel R1 est un groupe amino, ou de lthydro.gène -quand au moins un des symboles R21 R31 R41 R5 et R6 représente un groupe amino, et R2, R3, R4' R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus (appelé ci-après composé (I) aminé), l'agent de couplage préféré est un composé de la formule dans laquelle R1 est un groupe hydroxyle, amino ou amino substitué, R8, R91 R101 R11 et R12 sont choisis parmi l'hydrogène, les halogènes, des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxyle, carboxyle ou sulfo, ou R11 et R12 forment ensemble un cycle. Des exemples de l'agent de couplage pour un composé (I) aminé sont le phénol, l'acide salicylique, l'acide m hydroxybenzolque, 1 acide 2,6-dihydroxybenzoïque, l'acide 2-amino-3-hydroxybenzoique, l'acide 2-hydroxy-5-aminobenzoïque, l'acide p-hydroxybenzoïque, le salicylate de méthyle, l'o-méthylphdnol, le m-méthylphénol, le p-méthylphénol, l'o-méthoxyphénol, le m-méthoxyphénol, le p-méthoxyphénol, l'o-chlorophénol, le m-chlorophénol, le p-chlorophénol, le 2,3-dimethylphénol, le 2,4-diméthylphénol, le 2,5-diméthylphénol, le 2, 6-diméthylphénol, le 3,5-diméthyl- phénol, le 2,6-dichlorophénol1 l'o-aminophénol, le m-aminophénol, le p-bromophénol, l'o-éthylphénol, le m-éthylphénol, le 2,4-dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol, le 2,6-dibromophénol, le 2, 6-dibromo-4-aminophénol, le 2,6-dichloro-4- aminqphénol, le 2,6-diméthoxyphénol, le 2-méthyl-6-chlorophénol, le 2-chloro-5-méthylphénol, le 2-amino-4-chlorophénol, le N,N-diéthyl-m-aminophénol, le 2-amino-4-méthyl phénol, l'o-carboxyméthylphénol, le 2-carboxy-4-aminophénol, la 3,4-dihydroxyphénéthylamine, l'alpha-naphtol, le bêta-naphtol, le 4-chloro-lnaphtol, le 2-carboxy-lnaphtol1 l'acide l-hydroxy-2-naphtoique, le l-naphtol-2sulfonate, le 1-naphtol-3-sulfonate, le l-naphtol-4sulfonate, le l-naphtol-8-sulfonate, le 2-naphtol-6sulfonate, le 2-naphtol-7-sulfonate, le 2-naphtol-8sulfonate, le 2-naphtol-3,6-disulfonate, le 2-naphtol-6,8disulfonate, la N,N-diéthyl-m-aminoaniline, la N,N-diméthyl-m-aminoaniline, 1 'o-carboxyaniline, la m-carboxyaniline, l'o-chloroaniline, la m-chloroaniline, la mbromoaniline, l'o-méthylaniline, la m-méthylaniline, la N,N-diméthylaniline, la N,N-diéthylaniline, la N,N-ddthyl- éthylhydroxyaniline, la N,N-éthyl éthyl-hydroxy-m-toluidine, la 3-amino-4-chloroaniline et la 2-méthyl-3-chloroaniline. Dans le composé (I) dans lequel R1 est un groupe hydroxyle, ou de l'hydrogène quand au moins un des symboles R2, R3, R4, R5 et R6 représente un groupe hydroxyle, et R2' R3' R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus (appelé ci-après composé dans laquelle R13 est un groupe amino ou amino substitué et R14, R151 R167 R17 et R18 sont choisis parmi 1'hydrogène, les halogènes, des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxyle, carboxyle ou sulfo, ou R17 et R18 forment ensemble un cycle.Des exemples d'agents de couplage pour un composé (I) phénol sont la N-éthylaniline, la N1N-diméthylaniline, la N,N-diéthyl- aniline, la N,N-diméthyl-o-toluidine, la N1N-diméthyl-p- toluidine, la N,N-diéthyl-o-toluidine, la N,N-diéthyl-m- toluidine, la N,N-diéthyl-p-toluidine, l'acide anthranilique, l'acide p-diméthylaminobenzoïque, la p-chloro-otoluidine, la m-phénylènediamine, la p-phénylènediamine, l'aniline, l'o-méthylaniline, la m-méthylaniline, l'o carboxyaniline, l'o-chloroaniline, la m-chloroaniline, la m-bromoaniline, la 2-méthyl-5-carboxyaniline, la N,N-éthylhydroxyéthylaniline, la N,N-diméthyl-m-phénylènediamine, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, la N,N-diéthyl-pphénylènediamine, la 2-méthyl-m-phénylènediamine, la 4méthyl-o-phénylènediamine, la 4-méthyl-m-phénylènediamine, la 2-méthoxy-5-chloroaniline1 la 2-éthylaniline, la N,Ndiméthyl-m-toluidine, la 2-chloro-m-phénylènediamine, la 2-méthyl-3-chloroaniline, la 2,5-diméthoxyaniline, le l-amino-5-naphtalènesulfonate, le l-amino-5-naphtalènesulfonate, le l-amino-5-naphtalènesulfonate, la N,N-éthyl éthylhydroxy-m-toluidine, la 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline, la 3,5-dichloro-4-hydroxyaniline, 1' o-hydroxyaniline, la m-hydroxyaniline, la 2-amino-w,N-diméthylaniline, la p-N,Ndiéthylaminoaniline, la 2-méthyl-3-aminoaniline, la 2-.. méthyl-5-aminoaniline, la 3-carboxyaniline, la 3-carboxy-4hydroxyaniline et la 2-méthyl-5-carboxyaniline. Des exemples de composé (I) aminé sont la 4-hydroxy3,5-dichloroaniline, la 4-hydroxy-3,5-dibromoaniline, la p-N,N-diéthylaminoaniline, la p-NfN-diméthylaminoaniline, la m-phénylènediamine, la p-phénylènediamine, l'o-amino- phénol, le m-aminophénol, i'aniline, l'o-toluidine, la mtoluidine, 1'o-carboxyaniline, l'o-chloroaniline, la mchloroaniline, la m-bromoaniline, la m-N,N-diméthylaminoaniline, la 2-chloro-5-aminoaniline, la 2-méthyl-3-chloro- aniline1 la 2,5-diméthoxyaniline, la 2-méthyl-3-aminoaniline, la 2-méthyl-5-aminoaniline, la 2-méthyl-5-carboxyaniline, la 2-hydroxy-6-carboxyaniline, la 2-hydroxy-5 méthylaniline, la 3-carboxyaniline, la 2-carboxy-4-hydroxy aniline, la 2-hydroxy-5-chloroaniline, l'o-éthylaniline, la 2-méthyl-5-carboxyaniline, le l-amino-6-naphtol--sulfonate et la 3-amino-4-chloroaniline. Des exemples de composé (I) phénol sont le 4-amino-2,6dichlorophénol, le 4-amino-21 6-dibromophénol, l'o-amino- phénol, le m-aminophénol, le p-aminophénol, le m-carboxyphénol, le p-carboxyphénol, le phénol, l'o-chlorophénol, le m-chlorophénol, le p-chlorophénol, le p-bromophénol, l'o-éthylphénol, le m-éthylphénol, l'o-méthylphénol, le m-méthylphénol, le p-méthylphénol, 1 'o-méthoxyphénol, l'acide salicylique, le salicylate de méthyle, l'ocarboxyméthylphéyol, le m-N,N-diéthylaminophénol, le 2,4dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol, le 2,6-dibromophénol, le 2,6-diméthoxyphénol, le 3,5-diméthylphénol, le 21 5-diméthylphénol, le 2, 4-diméthylphénol, le 2,3-diméthylphénol, le 2,6-diméthylphénol, le 2-méthyl-5-chiorophénol, le 2-chloro-5-méthylphénol, le 2-amino-3-carboxyphénol, le 2-amino-4-méthylphénol, le 2-carboxy-4-aminophénol, le 2-amino-4-méthylphénol, le 2-carboxy-4-aminophénol, le 2-amino-4-chlorophénol, l'alpha-naphtoi, le bêta-naphtol, le 4-chloro-l-naphtol, le 2-carboxy-l-naphtol, le l-naphtol2-sulfonate, le l-naphtol-3-sulfonate, le l-naphtol-4sulfonate, le l-naphtol-8-sulfonate, le 2-naphtol-6sulfonate, le 2-naphtol-8-sulfonate, le 2-naphtol-3,6disulfonate et le 8-hydroxy-quinoléine-5-sulfonate. Des exemples de composé (I) amino ou de composé (I) phénol ayant simultanément des groupes amino et hydroxyle sont les o-, m- ou p-aminophénol, le 2-chloro-4-aminophénol, le 2-amino-4-carboxyphénol, le 2-amino-4-méthylphénol, le 2-carboxy-4-aminophénol, le 2--amino-4-chlorophénol, le 2,6-dichloro-4-aminophénol et le 2,6-dibromo-4-aminophénol. N'importe quels agents de couplage pour un composé (I) aminé ou pour un composé (I) phénol peuvent être utilisés dans le c & des composés de la série aminophénol ci-dessus ; toutefois, quand l'agent de couplage et le composé' du. type aminophénol sont identiques, ces combinaisons de l'agent de couplage et du composé du type aminophénol doivent être exclues. Dans la détermination du composé de formule (I) (appelé ci-après composé (I)), un. échantillon. contenant le composé (I) est traité par une oxydase qui consomme de l'oxygène et produit un pigment en présence d'un agent de couplage (IV). La quantité d'agent de couplage utilisée est équimolaire ou en excès par rapport au composé (I) et est une quantité ayant une action non-inhibitrice envers l'enzyme. Ces agents de couplage doivent être préparés pour utilisation à une concentration constante dans une solution tampon de pH neutre, telle qu'un tampon Tris-HCl, phosphate1 diméthylglutarate-NaOH, acétate, imidazole-HCl, Pipes-NaOH ou citrate.La quantité d'enzyme utilisée est généralement (pour 0,1-5 ml de solution à 0,1 mD par litre de composé (I), de 10-1000 unités, de préférence 50-200 unités d'ascorbate oxydase et de 10-1000 unités, de préférence 50-500 unités de laccase ou de tyrosine. La température de réaction est d'environ25-400C, de préférence d'environ 37QC. La durée de réaction varie en fonction de la quantité d'enzyme utilisée, de la température et de la méthode de détermination, et est généralement de plus d'une minute. La détermination de taux peut de préférence être effectuée en une minute et l'autre détermination colorimétrique est effectuée de préférence en 5 minutes. Une fois la réaction complète, on mesure au moins un des changements détectables, et cela s'effectue en mesurant la quantité d'oxygène consommée ou la quantité de pigment produite. L'oxygène peut être mesuré par des moyens électrochimiques tels qu'une électrode à oxygène. La quantité d'oxygène peut être mesurée par colorimétrie à une longueur d'onde d'absorption maximale de 500-750 nm. La quantité de composé (I) dans l'échantillon peut être mesurée par calcul à partir d'une courbe de référence. Pour la détermination d'un composé (I), on peut aussi doser un substrat synthétique ayant un composant de ce composé (I) dans sa structure. Le substrat synthétique doit être un substrat pour une hydrolase telle au'une peptidase, protéase, amylase, glycosidase, phosphatase, estérase ou lipase. Des hydrolases préférées sont des enzymes disponibles dans le commerce, des bouillons de culture contenant des enzymes, et des échantillons tels que des cellules, des tissus, de l'urine, de la salive et du sérum. Dans la présente invention, un échantillon contenant l'hydrolase est mélangé avec un substrat synthétique correspondant et le mélange est mis à incuber à 370C pour libérer le composé (I). Ce composé (I) est traité par une oxydase qui consomme de lloxy- gène et produit un pigment en présence d'un agent de couplage comme ci-dessus, pour permettre une détermination de l'activité de l'enzyme dans l'échantillon. Des exemples d'enzymes à déterminer, de substrats synthétiques et de leur production, sont illustrés comme suit 1) Peptidases^F protéases Parmi les peptidases, on sait qu'une aminopeptidase est d'une manière générale une enzyme qui agit sur les chaînes peptidiques pour séparer le groupe terminal amino et libérer des amino-acides ou des peptides. Des exemples d'aminopeptidases sont la cystéine aminopeptidase (EC 3.4.11.3), la proline aminopeptidase (EC : 3.4.11.5), l'arginine aminopeptidase (EC : 3.4.11.6), la tripeptide aminopeptidase (EC : 3.4.11.4), la X-prolyl dipeptidylaminopeptidase (où X est un résidu acide, neutre ou basique d'aminoacide) et la dipeptidase (EC : 3.4.13.11). La cystéine aminopeptidase (appelée ci-après CAP) est présente en quantité accrue dans le sang durait une grossesse anormale, et une détermination de CaP est utile pour diagnostic de la fonction placentaire et est utilisée pour contrôler un diagnostic clinique durant la période de grossesse. Un substrat synthétique S-benzyl-L-cystéinyl-p-nitroanilide ou S-benzyl-L-cystéinyl-N,N-diméthylaminoanilide a été utilisé pour cette détermination. On détermine l'activité de CAP en mesurant la -couleur jaune de la p-nitroaniline libérée à partir du substrat s-benzyl-L-cystéinyl- nitroanilide. La mesure de sa couleur jaune est effectuée au moyen de sérum à la bilirubine ou de sérum hémolytique. De plus, la p-nitroaniline libérée est mise à réagir chimiquement avec le p-amino cinnamaldéhyde pour former un pigment rouge qui est mesuré à 565 nm. Cette méthode des impossible à utiliser pour une détermination de taux. On détermine alors l'activité enzymatique en mesurant la couleur bleu-vert formée durant la réaction de la p-diméthylaminoaniline libérée à partir du S-benzyl-L-cystényl- p-diméthylaminoanilide par l'action de CAP et d'un réactif complexe de fer. Cette méthode est également impossible à utiliser pour une détermination de taux, pour des raisons chimiques. Dans la présente invention, on utilise un substrat synthétique qui est un composé ayant un composant de composé (I) aminé dans sa structure, obtenu en faisant réagir son groupe amino avec le groupe carboxyle d'un amino-acide ou d'un peptide. Ce substrat synthétique a la formule dans laquelle l'un des substituants R'1 et R'2 est R19CO-NH- et l'autre est de l'hydrogène, R19CO- est un résidu d'amino-acide ou résidu de peptide et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. Des exemples du groupe R19 CO- sont les groupes Sbenzyl-L-cystényle, L-alanyle et X-prolyle, où X est un résidu acide, neutre ou basique d'amino-acide. Un échantillon contenant une peptidase est mis à réagir avec un substrat synthétique de la formule (V) pour libérer un composé (I) aminé qui est soumis à une condensation par oxydation avec un agent de couplage correspondant par une oxydase. Le mélange résultant est mesuré colorimétriquement à 500-750 nm. La méthode ci-dessus est la méthode préférée pour une détermination automatique de taux. Un substrat synthétique (5l) peut être produit par une synthèse classique de peptide1 par exemple par la condensation de S-benzyl-L-cystéine et d'un composé (I) aminé. La S-benzyl-L-cystéine peut être obtenue par la benzylation du groupe thiol dans la L-cystéine. Dans cette synthèse, le groupe fonctionnel est protégé si nécessaire. La protection est effectuée par une méthode classique quelconque de synthèse de peptide. Par exemple, le groupe alpha-amino dans la L-cystéine est protégé par un groupe protecteur classique tel qu'un groupe t-tutoxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, adamantanyloxycarbonyle ou o-nitrophényl-thionitro-benzyloxycarbonyle. Le groupe alpha-carboxyle delta S-benzyl-L-cystéine, dans laquelle le groupe alpha-amino est protégé, est activé par exemple par transformation en un groupe azide d'acide, anhydride d'acide, halogénure d'acide, imidazolide d'acide ou ester activé, ou par traitement par le carbo diamide, le N,N-carbonyl-diimidazole ou un sel d'isoxazolium tel que le réactif de Woodward. Le composé activé est mis à réagir avec un composé (I) aminé, de préférence par la méthode au carbodiimide, à l'azide, à l'halogénure d'acide, à l'ester activé ou~ l'anhydride d'acide. La réaction est conduite dans un solvant inerte comme le diméthylformamide, le diméthyl- acétamide, le diméthylsulfoxyde, le tétrahydrofuranne, le benzène, le xylène, le tolllène ou l'oxyde d'éthyle entre -30 C et la température ambiante, généralement pendant une période de 30 minutes à 50 heures, à un rapport équimolaire des deux composés. Une fois la réaction complète, le groupe protecteur pour le groupe alpha-amino est éliminé.Par exemple, le groupe t-butoxycarbonyle est éliminé par de l'acide chlorhydrique 2N dans de l'acide acétique ou de l'acide trifluoroacétique et le groupe benzyloxyearbonyle est éliminé par hydrogénation catalytique en utilisant du palladium-carbone ou de l'acide bromhydrique dans de l'acide acétique. Si le composé aminé est un liquide, il peut être utilisé comme milieu réactionnel liquide, ou on peut utiliser du benzène. La réaction a lieu à 50-1000C pendant 20 minutes à 5 heures. Le substrat synthétique ainsi obtenu peut être purifié par des techniques classiques d'extraction, lavage, chromatographie ou autrement. Le produit peut aussi être préparé sous la forme d'un sel par réaction avec un acide organique comme de l'acide chlorhydrique, bromhydrique ou phosphorique ou avec un acide organique comme de l'acide formique, acétique, propionique ou oxalique. L'activité enzymatique dans un échantillon comme de sérum peut être déterminée en ajoutant un substrat synthétique dans une solution tampon et en faisant réagir le composé (I) aminé libéré avec un agent de couplage en présence -d'une oxydase. Une X-propyl-dipeptidyl-aminopeptidase (appelée ci-après X-PDP) dans laquelle X est un résidu d'aminQ-acide, spécialement la glycyl propyl-dipeptidyl-aminopeptidase (appelée ci-après GPDAP) est une dipeptidylaminopeptidase qui hydrolyse la portion terminale azotée des peptides pour libérer de la glycylproline. L'activité de X-PADP du sérum augmente en cas d'hépatite aiguë ou chronique, d'hépatocirrhose ou de tumeur du canal biliaire, et diminue en cas de tumeur gastrique comme de cancer de l'estomac ou de tumeur pancréatique. La détermination de X-PDAP est utile pour le diagnostic d'une tumeur gastrique. Jusqu'à présent, on a utilise des substrats synthétiques dans lesquels X est la glycine, par exemple (1) le Gly-L-Pro-alpha-naphtylamide, (2) le Gly-L-Pro-p-nitroanilide, (3) le Gly-L-Pro-p-phénylazoanilide ou (4) le 7-(Gly-L-Pro) -4-méthylcoumarinamide. Par exemple, une méthode de détermination utilisant (l) est une méthode dans laquelle l'alpha-naphtylamine libérée enzymatiquement est colorée chimiquement au moyen de 3-méthyl-2-benzo- thiazolynone hydrazine Le présent substrat synthétique est un composé dans lequel le groupe amino dans le composé (I) aminé est combiné avec un groupe X-L-prolyle. Des exemples de groupe X sont des résidus d'amino-acides, par exemple d'amino-acides neutres comme la glycine ou l'alanine, d'amino-acides acides comme l'acide aspartique ou l'acide glutamique ou d'amino-acides basiques comme la lysine ou l'arginine. N'importe quel type de L-, D- ou DL-amino-acide peut être utilisé. Un dérivé dipeptide de substrat synthétique peut être utilisé sous la forme de la base libre ou d'un sel correspondant tel que le p-tqluènesulfonate, chlorhydrate ou bromhydrate. Des dérivés dipeptides préférés sont des composés dans lesquels X est un amino-acide neutre ou basique ; et des dipeptides dans lesquels X est un aminoacide acide sont moins hydrolysés. Le présent substrat synthétique peut être préparé par une synthèse classique quelconque de peptide. Par exemple, le groupe protecteur d'un. composé N-protégé-X-prolyl- amino (I) est éliminé. On prépare un composé (I) N-amino-acide protégé-L-prolylamino en faisant réagir un composé (I) L-prolyl amino avec un amino-acide N-protégé en utilisant un agent de condensation comme le carbodiimide ou par la méthode à l'ester activé en utilisant un aminoacide N-protégé ayant un groupe carboxyle activé. Le groupe protecteur peut être choisi parmi des groupes protecteurs préférés classiques, par exemple les groupes benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle ou formyle, Le groupe latéral fonctionnel, s'il y en a un, est préalablement protégé par une méthode classique quelconque. Par exemple, le groupe carboxy de chaîne latérale dans un amino-acide acide est protégé par un benzyl ester. Le groupe guanidino dans l'arginine est protégé par un groupe protecteur classique quelconque tel qu'un groupe tosyle, nitro, p-nitrobenzyloxycarbonyle ou 2- (isopropyloxy- carbonyl) -3,4, 5,6-tétrachlorobenzoyle, de préférence tosyle ou nitro. Le groupe N-epsilon-amino dans la lysine est de préférence protégé par un groupe protecteur classique quelconque pour un groupe alpha-amino. Le groupe protecteur d'un composé (I) N-protégé-X-L-prolyl-amino est éliminé par une méthode classique quelconque. On doit effectuer une élimination sélective du groupe protecteur.Des dérivés dipeptides peuvent aussi être obtenus par une méthode dans laquelle une N-protégé-X-L-proline édifiée à l'avance est condensée avec un composé (I) aminé pour donner un composé (I) N-protégé-X-L-prolyl-amino ; on élimine ensuite le groupe protecteur. Le terme protéase est un terme général pour les enzymes qui hydrolysent les liaisons peptidiques des peptides et des protéines. Des exemples sont la pepsine, la trypsine, l'alpha-chymotrypsine, une protéase microbienne, la thrombine, la plasmine, la kallikréine de tissu du plasma, l'urokinase, le facteur Xa, la collagénase, l'élestase ou la cathepsine. Les protéinases importantes pour des diagnostics sont la trypsine et l'alpha-chymotrypsine pour la fonction pancréatique et une protéase pour le système de coagulation ou le système fibrinolytique comme la plasmine, la thrombine, la kallikréine de tissu du plasma, lturokinase ou le facteur Xa. Jusqu'a présent, des dérivés chromogènes de peptides ont été utilisés comme substrats synthétiques pour ces déterminations. Par exemple, on peut mentionner les substrats suivants Substrats pour la thrombine Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide-HCl, H-D-Phe-Pro-Arg-p-nitroanilideHC1, Tos-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilideHCl, Boc-Val-Pro-Arg-méthylcoumarinamide, H-D-Phe-Pro-Arg-aminoisophtalate diméthyl ester. Substrats pour le facteur Xa Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide .HCl, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-méthylcoumarinamide Substrats pour la kalliRréine du plasma Bz-Pro-Phe-Arg-p-nitrianilide HCl, H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide 2HCl, Z-Phe-Arg-méthylcoumarinamide. Substrats pour la plasmine H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide 2HCl, Tos-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide . Cl, Boc-Glu-Lys-Lys-méthylcoumarinamide, Boc-Val-Leu-Lys-méthylcoumarinamide, H-D-Val-Leu-Lys-aminoisophtalate diméthyl ester. Substrats pour l'urokinase Bz-llal-Gly-Arg-p-nitroanilide lIC1, Pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide. HCl, Glutaryl-Gly-Arg-méthylcoumarinamide. Substrats pour la kallikréine de tissu H-D-Val-Leu-Arg-p-nitroanilide. 2HCl, H-Pro-Phe-Arg-méthylcoumarinamide. Comme pour la méthode de détermination, la p-nitroaniline, l'aminométhylcoumarine ou l'ester diméthylique d'aminoisophtalate libérés peuvent être mesurés par l'action d'une enzyme dans l'échantillon. Dans ces méthodes, la la p-nitroaniline libérée présente une couleur jaune et est défavorablement influencée par, par exemple, la couleur de la jaunisse ou la couleur rouge hémolytique. On mesure l'aminométhylcoumarine ou l'ester diméthylique d'aminoisophtalate par fluorométrie et cette mesure est donc désavantageusement influencée par le composant sérum. Pour éviter ces inconvénients, une technique de déprotéinisation est nécessaire.Les substrats pour la trypsine et la chymotrypsine sont généralement un acyl-amino-acide basiqueou acyl-amino-acide aromatique-p-nitroanilide. La p-nitroaniline libérée à partir de ces substrats est mesurée pour détermination de ces enzymes. On trouve des inconvénients similaires. Dans la présente invention, un composé de formule (IV) ci-dessus, par exemple un composé (I) qui est un composé acyl-aminoacide basique (peptide ayant un aminoacide basique terminal sur C)-amino ou un composé acyl-aminoacide aromatique-amino, est utilisé comme substrat synthétique, eL un composé (I) aminé est libéré à partir de ce substrat synthétique par l'action de la trypsine, de la chymotrypsine ou d'une protéase (un enzyme agissant sur le système de coagulation du sang et le système fibrinolytique) dans l'échantillon. Le composé (I) aminé libéré est condensé en présence d'un agent de couplage par une oxydase et le pigment formé est mesuré colorimétriquement.La méthode est avantageusement automatisée pour des déterminations de taux et n'est pas influencée par les composants du sérum parce qu'elle a une longueur d'onde spécifique de maximum d'absorption de 500-750 .nm. Des exemples d'acyl-aminoacides basiques dans des substrats synthétiques pour ces enzymes sont les suivants Pour la thrombine Bz-Phe-Val-Arg-OH H-D-Phe-Pro-Arg-OH Tos-Gly-Pro-Arg-OH Boc-Val-Pro-Arg-OH H-D-Pro-Arg-OH Pour le facteur Xa Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-OH Pour la kallikréine du plasma Bz-Pro-Phe-Arg-OH D-D-Pro-Phe-Arg-OH Z-Phe-Arg-OH Pour la plasmine Tos-Gly-Pro-Arg-OH Boc-Glu-Lys-Lys-OH Boc-Val-Leu-Lys-OH H-D-Val-Leu-Lys-OH Pour l'urokinase Bz-Val-Gly-Arg-OH Pyro-Glu-Gly-Arg-OH Glutaryl -Gly-Arg-OH Pour la kallikréine de tissu H-D-Val-Leu-Arg-OH Pro-Phe-Arg-QH Des substrats synthétiques ayant ces composants peuvent aussi être produits de la inême manière qu'illustré à propos de CP- et de GPDAP ci-dessus. Un- exemple de synthèse d'un composé (I) aminé contenant de la ,N-diéthylamino-p- phénylènediamine est le suivant' Boc-Arg(NO2)-OH et de la N,N-diéthylamino-p-phénylène- diamine (DEAA.) sont condensés par un carbodiimide soluble dans l'eau (WSC) pour donner Boc-Arg(NO2)-DEAA.Le groupe tert-butyloxycarbonyle (Boc-)- est hydraté au moyen de HCl/acétate d'éthyle pour donner II-Arg(N02)-DEAC. Le H-Arg(NO2)-DEAA obtenu et les peptides à groupe amino protégé sont condensés de la même manière que pour CAP ou GPDAP, par exemple par condensation par déshydratation en présence de WSC dans du butanol, et le groupe NO2 est éliminé par réduction catalytique à l'aide de palladium/ carbone pour donner un composé (I) qui est un composé aminoacide basique acylé-amino. Le composé (V) peut être utilisé pour la détection d'endotoxine bactérienne. Jusqu'à présente, on a effectué l'analyse de traces d'endotoxine bactérienne en utilisant le phénomène de gélification par un lysat d'amibocytes de crabes des Moluques et une quantité de l'ordre de trace d'endotoxine bactérienne. Récemment, on utilisé de l'endotoxine en pathologie clinique. Par exemple, un essai au lysat d'amibocytes de Iymrus dans le domaine chirurvica1 est utilisé pour diagnostic clinique de la prásence. d'endotoxémie exogène ou de choc d'endotoxine causé par des maladies présentant un foyer d'infection apparent. Dans le domaine de la médecine interne, un problème est posé par l'effet de l'endotoxine bactérienne intestinale Gramnégative sur l'hépatopathie et l'endotoxémie endogène, par exemple la diminution des fonctions du système réticulo- endothélial comme la détoxication d'endotoxine bactérienne dans le foie.Pour ces buts,'la détermination clinique d'endotoxine sur la coagulation du sang, le système fibrinolytique, le système de kinine, le système circulatoire et le système immunitaire est devenue importante Dans la détermination de 1'endotoxine bactérienne cidessus, on utilise des échantillons des liquides du corps du patient, spécialement de sang, d'ascite, d'urine, de sécrétion pancréatique, de liquide cérébrospinal ou de bile. Ces liquides du corps, toutefois, ont leur propre couleur et les pigments causés par des maladies comme la couleur jaune foncé de la jaunisse et la couleur rouge hémolytique rendent impossible la colorimétrie. De plus, les liquides du corps contiennent des substances fluorescentes et donc la fluorométrie peut être empêchée. Dans la présente méthode de détermination, un substrat synthétique de composé (V) dans lequel R19CO- est R' 19-Gly-Arg, où R'19 est un résidu de L-amino-acide ou un résidu de peptide ayant un groupe N-terminal protégé et un lysat d'amibocytes et/ou un progéniteur d'enzyme isolé à partir de ce lysat sont mis à réagir avec un échantillon contenant de l'endotoxine bactérienne pour libérer un composé (I) aminé. Le composé (I) aminé est condensé par oxydation avec un agent de couplage par une oxydase pour déterminer colorimétriquement l'endotoxine. Cette détermination colorimétrique peut être effectuée à 500750 nm et est préférée pour des déterminaux de taux dans une analyse automatique sans être empêchée par des impuretés dans le sérum de l'échantillon. Le lysat d'amibocytes peut être obtenu par le traitement hypotonique d'amibocytes dans les lymphocytes de crabes des Moluques ou comme produit du commerce (essai LAL ; essai au lysat d'amibocytes de lymrus ). Des produits disponibles dans le commerce sont, par exemple, ceux dits Pregel (Difco Lab., E.U.A.) et Pyrogent (MallinckrodtInc., E.U.A). L'isolement et la purification du progéniteur d'enzyme peuvent être effectués en traitant un lysat d'amibocytes par chromatographie sur colonne, électrophorèse, électroconcentration ou chromatographie d'affinité. Le lysat d'amibocytes ou le progéniteur d'enzyme séparé à partir de lui est activé par l'endotoxine bactérienne pour former une enzyme active qui agit spécifiquement sur un peptide de substrat synthétique (V), où R'19 est, par exemple, Boc-Leu-, Boc-Val-Leu-, Boc-Ser-, Boc-Val-Ser-, Bz-Leu, Bz-Val-Leu-, Bz-Ser- ou Bz-Val-Ser-. La synthèse du substrat peut être effectuée par la même méthode qu'illustré pour la protéase ci-dessus. 2) Hydrolases de sucres (amylase, glycosidase) Des exemples d'hydrolases de sucres sont l'amylase, -la dextranase (EC : 3.2.1.11), la cellulase (EC 3.2.1.4) et la glycosidase. L'amylase peut être classée comme alpha-amylase (EC : 3.2.1.1), bêta-amylase (EC : 3.2.1.2) ou gamma-amylase (E.C. : : 3.2.1.3). L'alpha-amylase coupe la liaison alpha (1#4) entre la portion glucose dans l'amidon ou un glucose polymérisé inférieur et l'oligomère. Cette enzyme est produite initialement dans le pancréas et la glande salivaire et augmente en cas de pancréatite aiguë. La détermination de l1alpha-amylase est donc une technique importante de disgnostic clinique. Diverses méthodes de détermination de l'activité d'amylase sont connues. La méthode à l1amidon bleu est une méthode largement utilisée dans laquelle la couleur bleue libérée par action de l'amylase est déterminée colorimétriquement. Dans cette méthode, le substrat est insoluble dans l'eau et une filtration est essentielle pour la colori- métrie, mais est indésirable pour une technique automatique. De plus, on connaît une méthode de détermination utilisant un substrat synthétique pour l'amylase. Cette dernière méthode comprend la réaction d'un substrat synthétique p-nitrophénylmaltopentaoside avec l'alpha-amylase, la libération du groupe p-nitrophényle par action de 1'alpha- glucosidase et sa mesure par colorimétrie.Mais cette méthode est désavantageuse pour détermination de l'amylase du sérum parce que le mélange de réaction est jaune, comme le sérum à la bilirubine ou lthémolysat. On connaît une autre méthode, dans laquelle un substrat synthétique comprenant du 2,5-dichlorophénylmaltopentaoside est mis à réagir avec l'alpha-amylase et est traité ensuite par l'alpha-glycosidase et la bêta-glycosidase pour libérer du 2,4-chlorophénol qui est condensé par oxydation avec de la 4-aminoantipyrine par le periodate de sodium, avec mesure du facteur d'absorption à 500 nm. Cette méthode est désavantageuse aussi parce qu'elle est impossible à utiliser dans un système de détermination automatique. La présente invention concerne un procédé de détermination amélioré qui est avantageux aussi pour détermination automatique de taux. Dans la détermination d'amylase de la présente invention, cn utilise un substrat synthétique qui est préparé en condensant un groupe hydroxyle d'un malto-oligosaccharide et un groupe hydroxyle phénolique d'un composé (I) phénol. Le substrat synthétique est hydrolysé par l'amylase à la portion malto-oligosaccharide pour libérer le composé (I) phénol en combinaison avec un glucoside, maltoside ou malto-pentaoside, que l'on traite par l'alphaet la bêta-glucosidase pour former le composé (I) phénol. Le composé (I) phénol libéré est mesuré colorimétriquement. Les malto-oligosaccharides utilisés dans la présente invention comprennent des saccharides consistant en 2-10 D-glucose avec une liaison alpha-l,4-glucosîde. Des exemples sont le maltose, le maltotriose, le maltotétraose, le maltopentaose et le maltohexaose. Le maltotétraose, le maltopentaose et le maltohexaose de la formule (VI) ci-dessous sont préférés. Des exemples du composé (I) phénol sont des composés ayant une liaison alpha ou bêta avec un malto-oligosaccharide on son extrémité réduite, qui sont facilement hydrolysés par l'alpha-glucosidase ou la bêta-glucosidase et sont facilement mesurables. Ce composé (I) phénol comprend des composés de la série aminophénol comme spécifié ci-dessus. Le substrat synthétique de la présente invention est un composé de la formule dans laquelle un des substituants R"1 et R"2 est lS)n~O~ et l'autre est de l'hydrogène, S est une maille de monosaccharide, n est un nombre entier plus grand que 1, et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que précédemment. Un composé dans lequel (S) est une portion glucose et n r 2-8 est préféré. Le substrat synthétique (VI) est préparé par la méthode classique de synthèse avec un malto-oligosaccharide. Par oxemple, un malto-oligosaccharide est acétylé et l'acétyl malto-oligosaccharide est condensé avec un composé (I) phénol, puis le composé résultant est désacétylé pour préparation du produit. 1Experimental Chemistry, Vol. 24, page 304 (1958), en japonais7. Le composé (VI) peut aussi être obtenu par la réaction enzymatique d'un composé phénol (I)-alpha-D-glucoside ayant un groupe glucosyle et de maltodextrine par la cyclomaltodextrine-gluconotransférase ; EC : 2.4.1.19. /Wallenfels et autres, Carbohydrate Res., 61, 359 (1978)7. Par cette méthode, un composé (VI) dans lequel n = 2-8 est obtenu qui est purifié par une méthode classique quelconque. On détermine l'amylase du sérum en faisant incuber l'enzyme et un substrat synthétique et de l'alpha-glucosidase, si nécessaire avec de la bêta-glucosidase, dans une solution tampon, et en mesurant le composé (I) phénol ainsi libéré avec un agent de couplage et une oxydase. Des exemples de glucosidases à déterminer sont l'alphaglucosidase (EC : 3.2.1.20), la bêta-glucosidase (EC : 3.2. 1.21), l'alpha-galactosidase (EC : 3.2.1.22), la bêtagalactosidase (EC : 3.2.1.23), l'alpha-mannosidase (EC 3.2.1.24), la bêta-mannosidase (EC : 3.2.1.25), la bêtaglucuronidase (EC : 3.2.1.31), la bêta-xylosidase (EC 3.2.1.37), l'alpha-L-fusocidase (EC : 3.2.1.51), l'alpha N-acétylgalactosaminidase (EC : 3.2.1.49), l'alpha-N-acétylglucosaminidase (EC : 3.2.1.50), la bêta-N-acétylgalactosaminidase (EC : 3.2.1.53) et la bêta-N-acétylglucosamini dase (EC : 3.2.1.30). On peut mesurer leur activité enzymatique en utilisant un substrat synthétique (VI) dans lequel la portion monosaccharide (S) est une maille pentose, hexose, hexosamine ou acide uronique et n = 1. Par exemple, on peut mentionner une maille pentose telle qu'une maille xylose, une maille hexose telle qu'une maille glucose, une maille galactose, une maille mannose ou une maille fucose, une maille hexosamine telle qu'une maille N-acétylgalactosamine ou une maille N-acétylglucosamine et une maille acide uronique telle qu'acide glucuronique. On peut déterminer la glucosidase en libérant un composé (I) phénol à partir du substrat synthétique par l'action de la glucosidase correspondante et en mesurant le composé (I) phénol avec un agent de couplage et une oxydase.Par exemple, un substrat pour glucosidase disponible dans le commerce, le phényl-bêta-D- glucoside, est mis en contact avec un échantillon contenant une glucosidase dans un tampon approprié à 370C et le phénol libéré est transformé en une substance colorante avec l'agent de couplage correspondant et une oxydase. 3) Phosphatases Le terme phosphatase désign.e une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des esters phosphoriques et subit non seulement une hydrolyse, mais aussi une réaction réversible, la direction de la réaction dépendant des concentrations- relatives du substrat et du produit. Dans le corps humain, de nombreux esters phosphoriques sont connus. Les phosphatases qui participent aumétaho- lisme de ces esters phosphoriques sont classées d'après le site de liaison du substrat, à savoir (l) phosphomonoestérase (2) phosphodiestérase (3) pyrophosphatase (4) métaphosphatase ; (5) polyphosphatase (6) phosphoamidase. Dans des essais cliniques, on utilise de la phospho monoestérase. La phosphomonoestérase hydrolyse de manière non-spécifique le phosphate de phényle, le phosphate de p-nitrophényle ou les bêta-gAycérophosphates. En général, l'enzyme ayant un pH optimal du côté alcalin est appelée phosphatase alcaline (EC : 3.1.3.1) (appelée ci-après AlP) et celle du côté acide est appelée phosphatase acide (EC : 3.1.3.2) (ci-après ACP). L'AlP provient en majeure partie des os, du foie, du placenta, de l'intestin grêle ou des muqueuses ; et comme elle est située principalement dans les membranes des cellules, l'enzyme participe au transport actif à travers les membranes, c'est-à-dire au métabolisme. Des maladies dans lesquelles l'AlP du sérum augmente sont connues, comme le rachitisme, l'ostéomalacle, les fractures, l'hépatopathie, la cholangite ou les tumeurs et la détermination de l'AlP du sérum est importante pour le diagnostic clinique de ces maladies. La détermination de 1'ACP du sérum est utilisée principalement pour le diagnostic du cancer de la prostate et elle est considérée comme ayant un certain effet sur la métastase de cancers du sein. Jusqu'à présent, on a déterminé les phosphatases par une méthode de mesure du phosphate libéré après hydrolyse d'un ester phosphorique organique et une méthode de mesure du phénol libéré à partir d'un substrat qui est un ester phosphorique organique d'un phénol. Mais la méthode de mesure du phosphate est désavantageuse, parce que le phosphate coexistant dans l'échantillon est mesuré simultanément et ainsi les phosphates inorganiques dans l'échantillon doivent être mesurés et éliminés. De plus, la durée de réaction est très longue et une déprotéination est nécessaire. Une méthode mesurant les phénols, la méthode de Kind King, est une méthode dans laquelle un substrat comprenant du phosphate de phényle est condensé par oxydation avec la 4-aminoantipyrine en présence de ferricyanate de potassium pour former une quinone colorée en rouge qui est mesurée cokorimétriquement. Une méthode de Kind-King modifiée est une méthode dans laquelle un tampon borate est utilisé pour stabiliser la couleur. De plus, on a proposé aussi une méthode utilisant un sel de métal alcalin d'un sulfonehalogénamide aromatique comme la Chloramine T, etc., à la place du ferricyanure de potassium (Publ. de brevet japonais non-examiné NO 52-155597) ou utilisant un système eau oxygénée-peroxydase. Dans ces méthodes, le ferricyanate de potassium est un dérivé de cyanure qui cause de la pollution, et elles ne sont donc pas avantageuses pour détermination de taux ; et de plus, l'eau oxygénée est instable. On connaît une autre méthode, à savoir la méthode de Bessey-Lowry ou méthode de Huggins-Talalay, dans laquelle un substrat comprenant du phosphate de p-nitrophényle ou du phosphate de phénylphtaléine est mis à réagir avec un échantillon contenant de la phosphomonoestérase, et le p-nitrophénol ou la phénolphtaléine libéré est mesuré colorimétriquement dans des conditions alcalines. Mas cette méthode a des inconvénients en ce qu'elle est influencée par la bilirubine et l'hémoglobine dans le sang. De même, une autre méthode, dans laquelle le naphtol libéré à partir d'un substrat phosphate d'alpha-naphtyle est mesuré à 340 nm, a des inconvénients tels que l'effet d'impuretés dans l'échantillon et le caractère cancérigène de l'alpha-naphtol. Dans la présente invention, on utilise un substrat synthétique pour la détermination de phosphates, de la formule dans laquelle un des substituants R"t1 et R"'2 est un O groupe R20-O-P-O- et l'autre est de lthydrogène, R20-O OH est HO- ou un résidu de glycérol substitué ou non et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. Dans le cas où le groupe R20-O- est un groupe HO-, un composé (I) phénol est libéré à partir du substrat synthétique par l'action enzymatique de la phosphomonoestérase dans l'échantillon, et le composé (I) phénol est coloré avec un agent de couplage correspondant et une oxydase pour mesure de I'activité de phosphomonoestérase. Des exemples de substrats synthétiques (VII) peuvent être des composés liés avec un composé (I) phénol et un mono- ou diglycéride phosphate ou acide phosphorique et un glycérophosphate ou un substituant ester d'acide gras correspondant. Des exemples de composé (I) phénol sont mentionnés ci-dessus. Le composé (VIII) peut être préparé par une méthode de synthèse classique quelconque utilisant un composé (I) phénol et de l'acide phosphorique ou un glycérophosphate ou un ester d'acide gras correspondant, ou un réactif disponible dans le commerce peut aussi être utilisé.L'activité enzymatique peut être déterminée dans un tampon approprié à 379C par mise en contact d'un échantillon contenant une phosphomonoestérase avec un substrat synthétique, libération du composé (I) phénol et mesure de ce composé par une méthode telle que spécifiée ci-dessus. Comme enzymes de la catégorie des phosphodiestérases, on peut mentionner la phospholipase C (EC . 3.1.4.4) et la phospholipase D (EC : 3.1.4.4). Le substrat synthétique pour ces enzymes est un composé (VII) dans lequel R20-Oest un résidu de glycérol substitué ou non. Des exemples d'un résidu de glycérol substitué sont des esters d'acides gras mono- et di-substitués de glycérol. Ces substrats synthétiques peuvent aussi aussi être utilisés de la même manière que dans le cas d'une phosphomonoestérase. Le composé (I) phénol est libéré rapidement dans le cas de la phospholipase D ; toutefois, dans le cas de la phospholipase C, il peut être libéré quand une phosphatase est utilisée conjointement avec la phospholipase C. 4) Estérases et lipases Le terme estérase désigne une enzyme qui hydrolyse les esters d'acides gras et d'alcools, ou les synthétise. Une enzyme qui hydrolyse les esters d'acides gras inférieurs et d'alcools monohydriques est appelée estérase au sens étroit ; et une enzyme qui hydrolyse l'acide gras en trois molécules d'un ester d'un acide gras supérieur et de l'alcool trihydrique glycérol est appelée lipase. Des exemples de telles enzymes sont la lipase présente dans la sécrétion pancréatique ou dans l'huile de ricin et l'estérase présente dans le foie, l'estomac ou le sérum. La lipase est connue comme étant une enzyme importante pour le diagnostic de la pancréatite en biochimie clinique. pes méthodes actuellement connues pour la détermination des estérases et lipases comprennent celle dans laquelle un ester d'acide gras est util1sé comme substrat et l'acide gras libéré enzymatiquement est mesuré par titrage. Cette méthode a des inconvénients, résultant par exemple de la valeur élevée dans le titrage et de la complexité de l'opération, et elle est inutilisable pour la détermination de nombreux échantillons.Une méthode de détermination colorimétrique simple est donc souhaitable. Une méthode colorimétrique utilisant un substrat synthétique acétate de pnitrophénol, laurylate de p-nitrophénol ou palmitate de p-nitrophénol est une méthode dans laquelle on mesure le p-nitrophénol libéré enzymatiquement. Cette méthode a des inconvénients en raison de la couleur jaune du milieu, qui est affectée par le pigment (sérum de jaunisse ou hémolysat) dans l'échantillon. On connaît une autre méthode utilisant des substrats synthétiques, par exemple des esters d'acide gras de phénol, d'alpha-naphtol ou de bêta-naphtol comme le laurylate de phénol, le laurylate de bêta-naphtol ou le palmitate d'alpha-naphtyle, et mesurant le phénol ou l'alpha- ou le bêta-naphtol libéré enzymatiquement. Le phénol est mesuré par la méthode colorimétrique de Folin-Ciocalteau. Mais cette méthode est très complexe et demande beaucoup de temps et ainsi n'est presque jamais utilisée. On connaît une autre méthode, dans laquelle on fait réagir de l'alpha-naphtol avec du Fast Violet B dans des conditions alcalines et la couleur rouge ainsi formée du sel de diazonium est éliminée et le mélange est rendu incolore par une solution à 2 % de Triton X-100 et on effectue une mesure colorimétrique à 520 nm. Du bêtanaphtol est lié avec de la tétrazo-orthoanisidine pour former un pigment coloré en rouge qui est extrait à l'acétate d'éthyle pour mesure colorimétrique. Ces méthodes sont, toutefois, des méthodes complexes, et sont dangereuses en raison du caractère cancérigène du naphtol. La présente méthode de détermination est une méthode dans laquelle on utilise comme substrat synthétique un ester d'un acide gras et d'un composé (I) phénol. Ce substrat a la formule dans laquelle un des substituants R''''l et R""2 est R21-CO-O- et l'autre est de l'hydrogène, où R21CO- est un résidu d'acide gras et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. Ce substrat est hydrolysé par une estérase ou lipase dans 1'échantillon pour libérer le composé (1) phénol, qui est condensé par oxydation avec un agent de couplage par une oxydase. La méthode est préférée pour analyse automatique durant des déterminations de taux et sans influence des impuretés dans le sérum en raison de ce que la mesure est effectuée à une longueur d'onde de 500-750 nm.Le substrat synthétique peut être préparé par une méthode classique quelconque ou peut être obtenu dans le commerce. Des exemples d'acides gras sont l'aci de acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide caprolque, l'acide énanthique, l'acide caprylique, l'acide pélargonique, l'acide caprique, l'acide undécylique, l'acide laurique, l'acide tridécanique, l'acide myristique, l'acide pentadécanoique et l'acide palmitique. Des méthodes de synthèse classiques peuvent être utilisées. Dans la détermination, il est préférable qu'une solution tampon soit utilisée. La quantité du substrat synthétique dépend de la quantité de l'échantillon, de l'activité enzymatique et de la durée de réaction, et est généralement de 0,1-20 mM/litre et de 0,01-5 ml. La réaction enzymatique est conduite à environ 370C pendant un temps suffisant pour libérer le composé (I) amine ou le composé (I) phénol, habituellement plus d'une minute. On peut mesurer le composé (I) aminé ou le composé (I) phénol par la méthode décrite ci-dessus. La réaction enzymatique pour libérer le composé (I) à partir du substrat et la mesure pour le composé (I) peuvent être effectuées séparément ou de préférence en une- seule étape en ajoutant à l'avance les réactifs et l'enzyme nécessaires. De plus, l'oxygène consommé peut être mesuré par une électrode à oxygène et on peut utiliser une. détermination automatique de taux ou une autre méthode colorimétrique. Les réactifs et l'oxydase utilisés dans la détermination enzymatique peuvent êtye à l'état liquide, dans une forme immobilisée, ou peuvent être à l'état de couche sur une pellicule ou sur du papier-filtre. On peut éventuellement ajouter des agents tensio-actifs non-ioniques pour solubilisation et pour renforcement de la nature hydrophile du substrat synthétique et d'autres stabilisants pour oxydases. Aux dessins annexes La figure 1 est ç a courbe d'absorption du pigment quand on utilise du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du l-naphtol-2-sulfonate (trait plein) la figure 2 est la courbe d'absorption du pigment quand on utilise du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du phénol (trait plein) la figure 3 est la courbe d'abso;;ption du pigment quand on utilise du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de la laccase et du l-naphtol-2-sulfonate (trait plein) la figure 4 est la courbe d'absorption du pigment quand on utilise du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de la laccase et du 2,5-diméthylphénol (trait plein) les figures 5 à 52 représentent les courbes d'absorption (trait plein) des pigments indiqués pour chaque figure en utilisant les abréviations suivantes 2, 6-dibromo-4-aminophénol : 2,6-DBAP N,N-diéthyl-p-phénylènediamine : N,N-DEPD N,N-diméthyl-p-phénylènediamine: : N,N-DMPD ; ainsi Figure 5 : 2,6-DBAP-, laccase-et phénol Figure 6 : N,N-DEPD, ASOD et phénol Figure 7 :N,N-DMPD, ASOD et phénol Figure 8 : 2,6-DBAP Figure 9 : 2,6-DBAP, ASOD et m-méthylaniline Figure 10 : 2,6-DBAP, ASOD et 4-chloro-l-naphtol Figure 11 : 2,6-PBAP, ASOD et acide de Cleve ; Figure 12 : 2,6-DBAP, ASOD et acide l-hydroxy-2-naphtolque; Figure 13 : N,N-DEPD, laccase et l-naphtol-2-sulfonate Figure 14 : 2,6-DBAP, ASOD et o-chlorophénol Figure 15 : 2,6-DBAP, ASOD et m-aminophénol Figure 16 : 2,6-DBAP, ASOD et m-phénylènediamine Figure 17 : 2,6-DBAP, ASOD et 2,6-dibromophénol Figure 18 : 2,6-DBAPt ASOD et 2,6-diméthoxyphénol Figure 19 : 2,6-DBAP, ASOD et 3,5-diméthylphénol Figure 20 : 2,6-DBAP, ASOD et 2,6-diméthylphénol Figure 21 : 2,6-DBAP, ASOD et 2,4-diméthylphénol ; Figure 22 : 2,6-DBAP, ASOD et 2,3-diméthylphénol Figure 23 : 2,6-DBAP, ASOD et 2,5-diméthylphénol Figure 24 : 2,6-DBAP, ASOD et acide anthranilique Figure 25 : 2,6-DBAP, ASOD et N,N-diméthylaniline Figure 26 : 2,6-DBAP, ASOD et aniline Figure 27 : 2,6-DBAP, ASOD et m-chloroaniline Figure 28 : 2,6-DBAP, ASOD et o-aminophénol Figure 29 : N,N-DEPD, ASOD et o-chlorophénol ; Figure 30 : N,N-DEPD, ASOD et m-phénylènediamine Figure 31 : N,N-DEPD, ASOD et o-méthylaniline ; Figure 32 : N,N-DEPD, ASOD et m-méthylaniline Figure 33 : N,N-DEPD, ASOD et acide de Cleve ; Figure 34 : N,N-DEPD, ASOD et l-naphtol-2-sulfonate ; Figure 35 : N,N-DEPD, ASOP et 2,6-dibromophénol Figure 36 : N,N-DEPD, ASOD et 2,6-diméthoxyphénol Figure 37 : N,N-DEPD, ASOD et 2,6-diméthylphénol ; Figure 38 : N,N-DEPD, ASOD et 2,5-dlméthylphénol ; Figure 39 :N,N-DEPD, ASOD et N,N-diméthylaniline Figure 40 : N,N-DEPD, ASOD et aniline Figure 41 : N,N-DMPD, ASOD et o-chlorophénol Figure 42 : N,N-DMPD, ASOD et 2,6-dichlorcophénol Figure 43 : N,N-DMPD, ASOD et acide anthranilique Figure 44 : N,N-DMPD, ASOD et aniline Figure 45 : N,N-DMPD, ASOD et alpha-naphtol Figure 46 : N,N-DMPD, ASOD et 4-chloro-l-naphtol Figure 47 : N,N-DMPD, ASOD et l-naphtol-2-sulfonate Figure 48 : N,N-DMPD, ASOD et m-phénylènediamine ; Figure 49 : N,N-DMPD, ASOD et o-méthylaniline ; Figure 50 :N,N-DMPD, ASOD et m-phénylaniline Figure 51 : 2,6-DBAP, ASOD et m-bromoaniline Figure 52 : 2,6-DBAP, tyrosinase et N,N-éthyl-hydroxyéthyl- aniline la figure 53 est la courbe de référence de 216-DBAP en utilisant du l-naphtol-2-sulfonates et ASOD la figure 54 est la courbe de référence de N,N-DEPD en utilisant du phénol et ASOD la figure 55 est la courbe de référence du phénol en utilisant de la diéthyl-p-phénylènediamine et ASOD la figure 56 est la courbe de référence de 2,6-DBAP en utilisant du 2,5-diméthylphénol et ASOD la figure 57 montre les changements dans la courbe d'absorption du pigment à des intervalles de 2 minutes durant la réaction lors de la détermination d'alphaglucosidase en utilisant du phényl-alpha-glycoside et ASOD ; la figure 58 montre les changements dans la courbe d'absorption du pigment à des intervalles de 5 minutes durant la réaction lors de la détermination d'Alp en utilisant du phosphate de phényle et ASOD; la figure 59 montre les changements dans la courbe d'absorption du pigment durant la réaction lors d'une détermination d'estérase en utilisant de l'acétate de phényle et ASOD ; la figure 60 est un graphique du rapport de consmmation d'oxygène. en fonction du temps en utilisant 2,6-DBAP, du 2,5-diméthylphénol et ASOD ; et la figure 61 est un graphique du rapport de consommation d'oxygène en fonction du temps en utilisant 2,.6-pSAP, du 2,5-diméthylphénol et de la laccase. Les exemples suivants illustrent les conditions, le composé (I), les utilisations, etc., de la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Exemple 1 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de l'ascorbate oxydase (appelée ci-après ASOD) et du l-naphtil- 2-sulfonate On a dissous du chlorhydrate de 2,6-dibromo-4-aminophénol dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,8) de façon à préparer une solution 0,5 mM: (solution A). On a dissous du l-naphtol-2-sulfonate dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 0,5 mM (solution B). De l'enzyme ASOD (100 iil, 130 U) provenant de Sechium adule (publication de brevet japonais non-examiné NO 5688793) a été ajoutée à un mélange de solution A (1,0 ml) et de solution B (1,0 ml) et le mélange a été mis à incuber à 370C pendant 10 minutes. La longueur d'onde d'absorption du pigment formé est représentée sur la figure 1 (trait plein). Un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) a été utilisé à la place de la solution B comme témoin. Les résultats sont présentés sur la figure 1 (ligne formée de tirets) . Le maximum d'absorption spécifique a été trouvé à 630 nm et ainsi le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être mesuré quantitativement. On a préparé la courbe de référence pour le 2,6-dibromo-4-aminophénol en faisant incuber diverses concentrations de 2,6-dibromo-4-aminophénol (2 mli, de l-naphtol2-sulfonate (0,5 mM, 1 ml) et de AiSOP (100 ssl, 103 U) à 370C pendant 10 minutes et en mesurant à 630 nm (figure 53). Exemple 2 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du phénol Dans l'exemple 1, on a remplac4- le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du phénol (10 mM), mais les autres opérations ont été effectuées de la même manière. La courbe d'absorption du pigment formé est représentée sur la figure 2 (trait plein). La courbe d'absorption en utilisant un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) au lieu du phénol est représentée sur la figure 2 (trait formé de tirets). Le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être mesuré en utilisant ASOD et le phénol à 610 nm. Ensuite, on a remplacé la solution de 2,6-dibromo-4aminophénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) pour mesurer l'absorption. /Fig. 2 (--)7. Comme montré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol ou le phénol peut être déterminé quantitativement par la présente méthode. Exemple 3 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de la laccase et du l-naphtol-2-sulfonate On a dissous du chlorhydrate de 2,6-dibromo-4-aminophénol dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de,façon à préparer une solution 0,5 mM (solution A). On a dissous du l-naphtol-2-sulfonate de potassium dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 0,5 mM (solution B). De la laccase (100 ssl, 80 U) obtenue à partir de Polyporos versicolor a été ajoutée à un mélange des solutions A (1,0 ml) et B (1,0 ml) et le mélange résultant a été mis à incuber à 370C pendant 20 minutes. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 3 (trait plein). A titre de témoin, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0). (Fig. 3, ligne formée de tirets). On peut déterminer quantitativement le 2,6-dibromo-4- aminophénol à 630 nm en utilisant de la laccase et du l-naphtol-2-sulfonate de potassium. Exemple 4 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de la laccase et du 2,5-diméthylphénol Dans l'exemple 3, on a remplacé le l-naphtyl-2-sulfonate de potassium par du 2,5-diméthylphénol (10 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 4 (trait plein). De plus, des résultats quand le 2,5-diméthylphénol est remplacé par du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 4 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, on peut déterminer le 2,6dibromo-4-aminophénol en utilisant de la laccase et du 2,5-diméthylphénol. On a remplacé la laccase ci-dessus par de la tyrosinase (50 ul, 100 U) pour obtenir une courbe d'absorption similaire à celle de la figure 4 (longueur d'onde d'absorption spécifique 385 nm, tOD585nm = 0,8). On a ajouté 1 mM 2,6-dibromo-4-aminophénol et 10 mM 2,5-diméthylphénol dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, 1 ml) dans la cellule d'incubation assemblée avec une électrode à oxygène et on a effectué une pré-incubation à 370C. On y a ajouté une solution d'ASOD (100 ,ul, 250 U) et le mélange a été mis à incuber à 370C. Les changements électrochimiques ont été mesurés avec une électrode à oxygène à partir de l'instant zéro, c'est-à-dire l'instant d'addition de l'ASOD, pour mesure du rapport de consommation d'oxygène. Les résultats sont représentés sur la figure 60. On a remplacé l'ASOD ci-dessus par de la laccase (100 ssl, 200 U). Le rapport de consommation d'oxygène est représenté sur la figure 61. Exemple 5 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, de la laccase et du phénol Dans l'exemple 3, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du phénol' (10 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 5 (trait plein). On a remplacé le phénol par un tampon phosphate 0,1 M (figure 5, ligne formée de tirets). Comme montré par ce qui précède, le phénol ou le 2,6dibromo-4-aminophénol peuvent être déterminés à 600 nm. Exemple 6 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du phénol On a dissous du dichlorhydrate de N,N-diéthyl-p-phénylènediamine dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 1 mM (solution A). On a dissous du phénol dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 10 mM (solution B). On a ajouté ASOD (100 ssl, 130 U) au mélange de solution A (1,0 ml) et de solution B (1,0 ml) et le mélange a été mis à incuber à 370C pendant 20 minutes. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 5 (trait plein). On a conduit la même réaction, mais en remplaçant la solution de phénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0). Les résultats sont présentés sur la figure 6 (ligne formée de tirets).Comme on le voit d après ce qui. précède, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine ou le phénol peuvent être déterminés à 670 nm. La courbe de référence correspondant à ce qui précède peut être préparée comme suit Diverses concentrations de solution de N,N-diéthyl-pphénylènediamine (2 ml), du phénol (10 mM, 1,0 ml) et ASOD (100 111, 130 U) ont été mis à incuber à 370C pendant 10 minutes et on a effectué des mesures colorimétriques à 670 nm pour préparer la courbe de référence de la N,N diéthyl-p-phénylènediamine (figure 54). On a fait incuber diverses concentrations de phénol (1. ml), de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine (1 mM, 2 ml) et ASOD (100 ssl, 130 U) à 370C pendant l0 minutes et on a effectué des mesures colorimétriques à 670 nm pour préparer la courbe de référence du phénol (figure 55). Exemple 7 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phényiènediamine, ASOD et du phénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le dichlorhydrate de N,N-diéthyl-p-phénylènediamine par du dichlorhydrate de N,N- diméthyl-p-phénylènediamine et le mélange a été mis à incuber pendant 30 minutes. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 7 (trait plein). De plus, la solution de phénol a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) (figure 7, ligne formée de tirets). Comme montré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylène diamine et le phénol peuvent être déterminés à 65.5 nm. Exemple 8 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'o-méthylaniline : Dans l'exemple 1, on a remplacé le L-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'o-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 8 (trait plein). De plus, un essai dans lequel l'o-méthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) est représenté sur la figure 8 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 670 nm en utilisant ASOD et de 1' o-méthylaniline. Exemple 9 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de la m-méthylaniline Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de la m-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 9 (trait plein). De plus, on a effectué un essai dans lequel on a remplacé la m-méthylaniline par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0). Les résultats sont représentés sur la figure 9 (ligne-formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, on peut déterminer le 2,6dibromo-4-aminophénol -à 670 nm en utilisant ASOD et de la m-méthylaniline. Exemple 10 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 4-chloro-l-naphtol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 4-chloro-l-naphtol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 10 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 4-chloro-l-naphtol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 10 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 580 nm par utilisation d'SOp et de 4-chloro-l) naphtol. Exemple il Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'acide de Cleve Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'acide de Cleve (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure Il (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'acide de Cleve par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure ll (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 560 nm par utilisation d'ASOD et d'acide de Cleve. Exemple 12 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'acide l-hydroxy-2-naphtoque Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'acide l-hydroxy-2-naphtolque. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 12 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplace l'acide l-hydroxy-2-naphtolque par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 12 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 590 nm par utilisation d'ASOD et d'acide l-hydroxy-2-naphtolque. Exemple 13 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, de la laccase et du l-naphtol-2-sulfonate Dans l'exemple 3, on a remplacé le composé 2,6-diéthylp-phénylènediamine 2HCl par N,-diéthyl-p-phénylène diamine 2HC1 (1 mM). La courbe d'absorption du pogment produit est représentée sur la figure 13 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 13 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 660 nm par utilisation de laccase et de l-naphtol-2-sulfonate de potassium. Exemple 14 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'o-chlorophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'o-chlorophénol (0,1 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 14 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'g-chlorophénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 14 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 650 nm par- utilisation d'ASOD et d'o-chlorophénol. Exemple 15 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du m-aminophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulònate de potassium par du m-aminophénol (0,4 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 15 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le m-aminophénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 15 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 565 nm par utilisation d'ASOD et de m-aminophénol. Exemple 16 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de la m-phénylènediamine Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de la m-phénylènediamine (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 16 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé la m-phénylènediamine par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 16 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 610 nm par utilisation d'ASOD et de m-phénylènediamine. La courbe d'absorption des résultats quand on utilise ASOD, la m-phénylènediamine et un tampon phosphate est représentée aussi sur la figure 16 (- -). Exemple 17 Colorimétrie utilisant du 2/6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,6-dibromophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,6-dibromophénol. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 17 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 2,6-dibromophénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 17 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 670 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-dibromophénol. Exemple 18 Colorimétrie utilisant du 2 ,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,6-diméthoxyphénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,6-diméthoxyphénol (0,1 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 18 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 2,6-diméthoxyphénol par un tampon phosphate 0,1 M Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 580 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-diméthoxyphénol. Exemple 19 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 3,5-diméthylphénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 3,5-diméthylphénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 19 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 3,5-diméthylphénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 19 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 620 nm par utilisation' -d'ASOD et de 3,5-diméthylphénol. Exemple 20 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophéno, ASOD et du 2,6-diméthylphénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,6-diméthylphénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 20 (trait plein). De plus les résultats quand on a remplacé le 2,6-diméthylphénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 20 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 580 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-diméthylphénol. Exemple 21 Colorimétrie utilisant du 2, 6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,4-diméthylphénol Dans l'exemple I, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfo- nate de potassium par du 2,4-diméthylphénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 21 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 2,4-diméthylphénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 21 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 585 nm par utilisation dlASOD et de 2, 4-diméthylphénol. Exemple 22 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,3-diméthylphénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,3-diméthylphénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 22 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 2,3-diméthylphénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 22 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 590 nm par utilisation d'ASOD et de 2,3-diméthylphénol. Exemple 23 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,5-diméthylphénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,5-diméthylphénol (10 mb5). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 23 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le 2,5-diméthylphénol par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 23 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut-être déterminé à 585 nm par utilisation d'ASOD et de 2,5-diméthylphénol. On a mis à incuber diverses concentrations de 2,6dibromo-4-aminophénol (2 ml), du 2,5-diméthylphénol (13,3 SM, 1 ml) et ASOD (100 ssl, 130 U) à 379C pendant 10 minutes et on a effectué des mesures colorimétriques à 585 nm pour obtenir la courbe de référence du 2,6-dibromo-4-aminophénol (figure 56). Exemple 24 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'acide anthranilique : Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate par de l'acide anthranilique (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 24 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'acide anthranilique par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 24- (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 640 nm par utilisation d'ASOD et d'acide anthranilique. Exemple -25 Colorimétrie utilisant du- 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de la NIN-diméthylaniline: Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfo- nate de potassium par de la N,N-diméthylaniline (0,05 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 25 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé la N,N-diméthylaniline par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 25 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 700 nm par utilisation d'ASOD et de N ,N-diméthylaniline. Exemple 26 Colorimétrie utilisant du 2, 6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'aniline Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'aniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 26 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'aniline par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,û) sont représentés sur la figure 26 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2, -dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 630 nm par utilisation d'ASOD et d'aniline. Exemple 27 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de la m-chloroaniline Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de la m-chloroaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 29 (trait plein). De- plus, les résultats quand on a remplacé la m-chloroaniline par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sux la figure 27 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus,--le 216-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 635 nm par utilisation d'ASQP- et de m-chloroaniline. Exemple 28 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'o-aminophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'o-aminophénol (0,5 Irssl). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 28 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'o-aminophénol par un tampon phosphate O,l N (pH 7,0) sont représentés sur la figure 28 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 580 nm par utilisation d'ASOD et d'o-aminophénol. La courbe d'absorption dans le cas de la réaction avec ASOD et lto-aminophénol est représentée aussi sur la figure 28 (-.-). Exemple 29 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'o-chlorophénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de 1'o-chlorophénol (0,1 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 29 (trait plein). De plus, les résultats quand l'o-chlorophénol était remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pB 7,0) sont représentés sur la figure 29 (ligne formée de tirets), Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 690 nm par utilisation d'ASOD et d'o-chlorophénol. Exemple 30 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de la m-phénylènediamine Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de la m-phénylènediamine (0,5 mD5). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 30 (trait plein). De plus, les résultats quand la m-phénylènediamine a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 30 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-n-phénylène- diamine peut être déterminée à 665 nm par utilisation d'ASOD et de m-phénylènediamine. Exemple 31 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'o-méthylaniline Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de 1'o-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 31 (trait plein). De plus, les résultats quand la m-méthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 31 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 700 nm par utilisation d'ASOD et d'o-méthylaniline. Exemple 32 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de la m-méthylaniline Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de la m-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 32 (trait plein). De plus, les résultats quand la m-méthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 32 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut êrre déterminée à 710 nm par utilisation d'ASOD et de m-méthylaniline. Exemple 33 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'acide de Cleve Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de l'acide de Cleve (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 33 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'acide de Cleve par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 33 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 755 nm par utilisation d'ASOD et d'acide de Cleve. Exemple 34 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du l-naphtol-2-sulfonate : Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du l-naphtol-2-sulfonate de potassium (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 34 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont présentés sur la figure 34 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 655 nm par utilisation d'ASOD et de l-naphtol-2-sulfonate de potassium. Exemple 35 Colorimétrie utilisant de a N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du 2,6-dibromophénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du 2,6dibromophénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 35. (trait plein). De plus, les résultats quand le 2,6-dibromophénol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 35 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylène diamine peut être déterminée à 700 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-dibromophénol. Exemple 36 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du 2,6-diméthoxyphénol Dans l'exemple 6, le phénol a été remplacé par du 2,6-diméthoxyphénol (0,5 mDl). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 36 (trait plein). De plus, les résultats quand le 2,6-diméthoxyphénol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 36 (ligne formée de tirets) Comme illustré ci-dessus, la N,N-didthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 630 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-diméthoxyphénol. La courbe d'absorption dans le cas de la réaction avec ASOD et le 2,6-diméthoxyphénol est représentée aussi sur la figure 36 ( Exemple 37 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du 2,6-diméthylphénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du 2,6diméthylphénol (10 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 37 (trait plein). De plus, les résultats quand le 2,6-diméthylphénol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont présentés sur la figure 37 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 630 nm par utilisation d'ASODet de 2,6-diméthylphénol. Exemple 38 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du 2,5-diméthylphénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du 2,5diméthylphénol (10 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 38 (trait plein). De plus, les résultats quand le 2,5-diméthylphénol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 38 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,?;-diéthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 640 nm par utilisation d'ASOD et de 2,5-diméthylphénol. Exemple 39 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de la N,N-diméthylaniline Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de la N,N-diméthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 39 (trait plein). De plus, les résultats quand la N,N-diméthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 39 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 730 nm par utilisation d'ASOD et de N,N-diméthylaniline. Exemple 40 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'aniline Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de l'aniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 40 (trait plein). De plus, les résultats quand l'aniline a été. remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 7 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 690 nm par utilisation d'ASOD et d'aniline. La courbe d'absorption dans le cas de la réaction d'ASOD et d'aniline est représentée aussi sur la figure 40 (-.-) Exemple 41 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de l'o-chlorophénol : Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de 1'o-chlorophénol (0,1 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 41 (trait plein). De plus, les résultats quand 1eo-chlorophenol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 41 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 680 non par utilisation d'ASOD et d'o-chlorophénol. Exemple 42 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du 2,6-dibromophénol Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par du 2,6dibromophénol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 42 (trait plein) De plus, les résultats quand le 2,6-dibromophénol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 42 (ligne formée de tirets). Comme illustré c ci-dessus, la. N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine peut être déterminée à 695 nm par utilisation d'ASOD et de 2,6-dibromophénol. Exemple 43 Colorimétrie utilisant de la -N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de l'acide anthranilique Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de l'acide anthranilique (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 49 (trait plein). De plus, les résultats quand l'acide anthranilique a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0 sont représentés sur la figure 43 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 600 nm par utilisation d'ASOD et d'acide anthranilique. Exemple 44 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de l'aniline Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de 1 'aniline. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 44 (trait plein). De plus, les résultats quand on a remplacé l'aniline par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 44 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 690 nm par utilisation d'ASOD et d'aniline. Exemple 45 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du 2-naphtol. Dans l'exemple 7, le phénol a été remplacé par du 2-naphtol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 45 (trait plein). De plus, les résultats quand le 2naphtol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 45 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine- peut être déterminée à. 630 nm par utilisation d'ASOD et de 2-naphtol. Exemple 46 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du 4-chloro-l-naphtol Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par du 4-chloro-l-naphtol (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 46 (trait plein). De plus, les résultats quand le 4-chloro-l-naphtol a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 46 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminé à 640 nm par utilisation d'ASOD et de 4-chloro-l0-naphtol. Exemple 47 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du l-naphtol-2 sulfonate: Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par du l-naphtol-2-sulfonate de potassium (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 47 (trait plein). De plus, les résultats quand le l-naphtol-2-sulfonate de potassium a été remplacé par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 47 (ligne formée de tirets): Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 650 nm par utilisation d'ASOD et de l-naphtol-2-sulfonate de potassium. Exemple 48 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de la m-phénylènediamine Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de la m-phénylènediamine (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 48. (trait plein). De plus, les résultats quand la m-phénylènediamine a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pB 7,0) sont représentés sur la figure 48 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 650 nm par utilisation d'ASOD et de m-phénylènediamine. Exemple 49 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'o-méthylaniline Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de 1'o-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 49 (trait plein). De plus, les résultats quand l'o-méthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés- sur la figure 49 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 695 nm par utilisation d'ASOD et d'o-méthylaniline. Exemple 50 Colorimétrie utilisant de la N,-diméthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de la m-méthylaniline Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de la m-méthylaniline (0,5 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 50 (trait plein). De plus, les résultats quand la m-méthylaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 50 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-dessus, la N,N-diméthyl-p- phénylènediamine peut être déterminée à 705 nm par utilisation d'ASOP et de m-méthylaniline. Exemple 51 Colorimétrie utilisant du 2,6 dibromo-4-aminophénol, ASOD et de la m-bromoaniline Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de la m-bromoaniline (0,05 mM). La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 51 (trait plein). De plus, les résultats quand la m-bromoaniline a été remplacée par un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) sont représentés sur la figure 51 (ligne formée de tirets). Comme illustré ci-après, le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 635 nm par utilisation d'ASOD et de m-bromoaniline. Exemple 52 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol de la tyrosinase et de la N,N-éthyl-hydroxyéthylaniline On a dissous du chlorhydrate de 2,6-dibromo-4-aminophénol dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 0,05 M (solution A). On a dissous de la N,N-éthyl-hydroxyéthylaniline dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution 5 mM (solution B). On a ajouté une solution de tyrosinase (50 jil, 100 U) à un mélange de solution A (1,0 ml) et de solution B (1,0 ml) et le mélange a été mis à incuber à 370C pendant 10 minutes. La courbe d'absorption du pigment produit est représentée sur la figure 52, où l'absorption spécifique se trouve à 705 nm, et le 2,6-dibromo-4-aminophénol peut être déterminé à 705 nm. Des pigments présentant la même absorption spécifique ont été obtenus en utilisant ASOD et de la laccase, respectivement, à la place de la tyrosinase. Exemple 53 Colorimétrie utilisant du 2t6-dibromo-4-aminophén ASOD et du m-chlorophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du m-chlorophenol (0,1 m). Le maximum d'absorption du pigment produit était à environ 650 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 650 nm par utilisation d'ASOD et de m-chlorophénol. Exemple 54 Colorimétrie utilisant du 2 ,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et de l'o-chloroaniline Dans l'exemple l, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par de l'o-chloroaniline (0,05 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit était à environ 630 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 630 nm par utilisation d'ASOD et d'o-chloroaniline. Exemple 55 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du p-chlorophénol: Dans l'exemple l, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du p-chlorophénol (1 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit était à environ 620 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 620 nm par utilisation d'ASOD et de p-chlorophénol. Exemple 56 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol ASOD et du p-bromophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du p-bromophénol (1 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 600 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 600 nm par utilisation d'ASOD et de p-bromophénol. Exemple 57 Colorimétrie utilisant du 2, 6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,4-dichlorophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,4-dichlorophénol (0,1 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 660 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 660 nm par utilisation d'ASOD et de 2,4-dichlorophénol. Exemple 58 Colorimétrie utilisant du 2,6-dibromo-4-aminophénol, ASOD et du 2,4-dibromophénol Dans l'exemple 1, on a remplacé le l-naphtol-2-sulfonate de potassium par du 2,4-dibromophénol (1 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 660 nm. Comme résultat, le 2,6-dibromo-p-aminophénol peut être déterminé à 660 nm par utilisation d'ASOD et de 2,4-dibromophénol. Exemple 59 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et de l'alpha-naphtol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de l'alpha-naphtol (0,5 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 620 nm. Comme résultat, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 620 nm par utilisation d'ASOD et d'alpha-naphtol. Exemple 60 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du m-chlorophénol Dans l'exemple o, on a remplacé le phénol par du mchlorophénol (0,5 mM) . Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 695 nm. Comme résultat, la N,N-diéthyl-p-phény- lènediamine peut être déterminée à 695 nm par utilisation d'ASOD et de m-chlorophénol. Exemple 61 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylène- diamine, ASOD et du 2,3-diméthylphénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du 2,3diméthylphénol (10 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 625 nm. Comme résultat la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 625 nm par utilisation d'ASOD et de 2,3-diméthylphénol. Exemple 62 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de l'acide anthranilique Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par de l'acide anthranilique (0,5 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 680 nm. Comme résultat, la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine peut être déterminée à 680 nm par utilisation d'ASOD et d'acide anthranilique. Exemple 63 Colorimétrie utilisant de la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine, ASOD et du 2,4-diméthylphénol Dans l'exemple 6, on a remplacé le phénol par du 2,4-diméthylphénol (10 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 630 nm. Comme résultat, la N,N-diéthyl-pphénylènediamine peut être déterminée à 630 nm par utilisation d'ASOD et de 2,4-diméthylphénol. Exemple 64 Colorimétrie utilisant de la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, ASOD et de la N,N-diméthylaniline Dans l'exemple 7, on a remplacé le phénol par de la N,N-diméthylaniline (0,5 mM). Le maximum d'absorption du pigment produit se trouvait à environ 725 nm. CQmme résultat, la N,N-diméthyl-p phénylènediamine peut être déterminée à 725 nm par utilisation d'ASOD et de N,N-diméthylaniline. Exemple 65 Méthode de détermination de CAP Du S-benzyl-L-cystéinyl-p-diméthylaminoanilide (100 mg), obtenu par une condensation par déshydratation classique de N,N-diméthyl-p-phénylènediamine. 2HCl, de N-benzyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cystéine et de dicyclohexylcarbodiimide, suivie d'une élimination du groupe protecteur, a été dissous dans un mélange de dioxane (3 ml) et de 0,16 N-HCl1 et mélangé avec une solution 0,1 M de triéthanolamine dans un tampon citrate (pH 7,4, 100 mlb contenant 1,25 % de Tween 80 (agent tensio-actif) pour préparation d'une solution de substrat synthétique.La solution de substrat (2 ml), du p-xylénol (5 mM, 0,1 ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 ,ul) ont été mélangés dans une cellule pour colorimétrie et le mélange a été soumis à une pré-incubation à 370C. On y a mélangé du sérum de femme enceinte contenant CPA (238 U/ml) pour faire faire démarrer la réaction. Le rapport d'absorption après 30 minutes, mesuré à 600 nm, était O.D.600 -= 0,18. Comme résultat, la détermination de CAP peut être effectuée avantageusement par cette méthode. Exemple 66 Méthode de détermination de CAP Dans l'exemple 65, on a remplacé le composé N,N-diméthyl- p-phénylènediamine.2liCl par de la 3,5-dibromo-4-hydroxy- aniline pour préparer du S-benzyl-L-cystéinyl-3,5-dibromo- 4-hydroxyanilide et on a opéré ensuite comme dans l'exemple 65. On a mesuré après 30 minutes le rapport d'absorption à 585 nm pour obtenir O.D.585 = 0,195. Comme résultat, la détermination de CAP peut être effectuée avantageusement par cette méthode. Exemple 67 Dans l'exemple 66, on a remplacé la laccase par ASOD (1320 U/ml) et on a opéré ensuite comme dans cet exemple. On a obtenu O. D.585 = 0,175. La détermination de CAP peut être effectuée avantageusement par cette méthode. Exemple 68 Dans l'exemple 65, on a remplacé le composé N,N-di- méthi-p-phénylènediamine.2HCl par de la N,N-diéthylp-phénylènediamine pour obtenir du S-benzyl-L-cystéinyl-pdiméthylaminoanilide, et le p-xylénol (5 mM) a été remplacé par du l-naphtol-2-sulfonate (2 mM) On a mesuré le facteur d'absorption à 655 nm pour obtenir O. D.655 = 0,295. La détermination de CAP peut être effectuée avantageusement par cette méthode. Exemple 69 Détermination d'alpha-chymotrysine On a effectué une condensation de p-diméthylaminoaniline 2HCl et de N-benzyloxycarbonyl-L-tyrosine avec du dicyclohexylcarbodiimide et le groupe protecteur a été éliminé par un catalyseur palladium-carbone, puis on a fait réagir le composé résultant avec du chlorure de benzoyle pour obtenir comme substrat synthétique du N-benzoyl-L-tyrosinyl-p-diméthylaminoanilide. On a dissous le substrat synthétique (30 mg) dans de l'acétone (5 ml) pour préparer une solution initiale de substrat. On a ajouté à la solution initiale un tampon 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8, 100 ml) (contenant 5 mM de chlorure de calcium et l % de Tween 80) pour préparer une solution de substrat. La solution de substrat (2 ml), du p-xylénol (15 mM, 0,1 ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 ul) ont été bien mélangés dans une cellule colorimétrique et le mélange a été soumis à une pré-incubation à une température constante de 370C. On y a ajouté de l'alpha-chymotrypsine (3 mg/ml, 50 ul) pour faire démarrer la réacteur. Le facteur d'absorption après 30 minutes a été mesuré à 600 nm et on a obtenu. O. D 600 = 0,48. Comme résultat, l'alpha-chywo- trypsine peut étre déterminée avantageusement par cette méthode. Exemple 70 Méthode de détermination de trypsine : Du N-benzyloxycarbonyl-L-tryptophane et de la N,Ndiéthyl-p-phénylènediamine ont été- condensés avec du dicyclohexylcarbodiimide tandis qu'on refroidissait avec de la glace, et le groupe protecteur a été éliminé au moyen d'un catalyseur palladium-carbone, puis le produit a été acétylé avec de l'anhydride acétique pour donner du Nacétyl-L-tryptophane-p-diéthylaminoanilide. On a dissous ce composé (30 mg) dans de l'acétone (5 ml) pour préparer une solution initiale de substrat. On y a ajouté un tampon 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8, 100 ml, contenant 5 mM de chlorure de calcium et 1 % de Tween 80) pour préparer la solution de substrat synthétique. La solution de substrat synthétique (2 ml), du 1naphtol-2-sulfonate (2 mM, 0,1 ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 Fl) ont été bien mélangés dans une cellule colorimétrique et le mélange a été soumis à une préincubation à une température constante de 370C. On y a ajouté de la trypsine (50 Fl) pour faire démarrer la réaction. Le facteur d'absorption après 30 minutes a été mesuré à 655 nm ; on a obtenu O.D.655 = 0,38. Comme résultat, la trypsine peut être déterminée avantageusement par cette méthode. Exemple 71 Méthode de détermination de l1alpha-chymotrypsine : Dans l'exemple 69, on a remplacé le composé p-diméthyl aminoaniline-2HCl par de la p-diéthylaminoaniline pour obtenir du N-benzyl-L-tyrosyl-p-diéthylaminoanilide. On a dissous ce composé (30 mg) dans de l'acétne (5 ml) pour préparer une solution initiale de substrat. La solution de substrat a été préparée de la même manière que dans l'exemple 69. Ensuite, dans l'exemple 69, on a remplacé le p-xylénol {5 mN) par du l-naphtyl-2-sulfonate (2 mN) et on a mesuré le facteur d'absorption à 655 nm pour obtenir O.D.655 0,52. Comme résultat l'alpha-chymotrypsine peut être déterminée avantageusement par cette méthode. Exemple 72 Méthode de détermination de l'alpha-chymotrypsine : De la 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline et de la N-benzyloxycarbonyl-L-tyrosine ont été condensées par une condensation par déshydratation classique avec du dicyclohexylcarbodiimide et le groupe protecteur a été éliminé par un catalyseur palladium-carbone, et on a fait réagir le produit avec du chlorure de benzoyle pour obtenir un substrat synthétique comprenant du N-benzoyl-L-tyrosine- 3,5-dibromo-4-hydroxyanilide. Le substrat synthétique (30 mg) a été dissous dans de l'acétone (5 ml) pour préparation de la solution initiale de substrat. On y ajouté un tampon 0,1 N Tris-HCl (pH 7,8, 100 ml, contenant 5 mN de chlorure de calcium et 1 % de Tween 80) pour préparer la solution de substrat. La solution de substrat (2 ml), du p-xylénol (5 mM, 0,1 ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 iji) ont été bien mélangés dans une cellule colorimétrique et le mélange a été soumis à une pré-incubation à une température constante de 370C. On a ajouté de l'alpha-chymotrypsine (3 mg/ml, 50 l) pour faire démarrer la réaction. Le facteur d'ab- sorption après 39 minutes a été mesuré à 585 nm (O.D.585 = 0,465). Comme résultat, l'alpha-chymotrypsine peut être mesurée avantageusement par cette méthode. Exemple 73 Méthode de détermination de l'alpha-chymotrypsine Dans l'exemple 72, on a remplacé la laccase par ASOD (1320 U/ml, 100 Ill) pour obtenir le rapport d'absorption O.D.585 = 0,452. Comme résultat, l'alpha-chymotrypsine peut être mesurée avantageusement par cette méthode. Exemple :74 Détermination d'alpha-glucosidase en utilisant du phényl-alpha-D-glucoside et ASOD Du phényl-alpha-D-glucoside (Nakarai Chem. Co.) (0,24 mM) dissous dans un tampon phosphate 0,1 a (pH 7,0, 2 ml), du 2,6-dibromo-4-aminophénol (1 mN, l ml) et ASOD provenant de Sechium edule- (1320 U/ml, 100 Al) ont été mélangés dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à température constante à 30 C. On y a ajouté de l'alpha-glucosidase (Toyobo Co., 3000 U/ml, 10 A1) pour faire démarrer la réaction et les changements dans la longueur d'onde d'absorption ont été enregistrés toutes les 2 minutes. Les résultats sont représentés sur la figure 57. Comme résultat, l'activité d'alpha-glucosidase peut être déterminée à 610 nm par réaction avec le phénol libéré à partir d'un substrat phényl-alpha-D-glucosidase, ASOD et un agent de couplage. Exemple 75 Méthode de détermination d'alpha-amylase Un groupe hydroxyle dans le maltopentaose a été acétylé de manière classique avec de l'acétate de sodium et de l'anhydride acétique. Le maltopentaose-bêta-heptadéca- acétate ainsi obtenu a été mélangé avec du phénol et du chlo- rure de zinc anhydre pour effectuer une réaction de couplage. L'alpha- et bêta-phénylhexadéca acétylmaltopentaoside obtenu a été désacétylé dans une solution méthanolique de méthylate de sodium. Le phényl hexadécamaltopentaoside ainsi obtenu a été dissous dans un tampon glycérophosphate 0,05 M (pH 7,0) contenant 2 % d'alpha-cyclodextrine pour préparer une solution à 0,4 % de substrat.Une solution d'enzymes (50 gll) contenant de l'alpha-glucosidase (500 U/ml) et de la bêta-glucosidase (100 U/ml), du 2,6-dibromo-4-aminophénol (5 mM, 50 1) et de la laccase (2000 U/ml, 100 ssl) ont été soigneusement mélangés dans une cellule colorimétrique et le mélange a. été soumis. à une pré-incubation à 370C. On a ajouté de l'alpha-amylase (Boehringer g.m.b.H., 50.00 I.U./ litre, 500 b pour faire démarrer la réaction. L'ab- sorption après 20 minutes était O.D.610 = 0,412. Comme résultat, l'activité d'alpha-amylase peut être mesurée avantageusement par cette méthode. Exemple 76 Méthode de détermination d'amylase en utilisant de l'o-chlorophénylmaltopentaoside, du 2,6-dibromo-4-aminophénol et de la laccase Un mélange alpha,bêta d'o-chlorophénylmaltopentaoside a été dissous dans un tampon glycérophosphate 0,05 M (pH 7,0) contenant 2 % d'alpha-cyclodextrine pour préparer une solution à 0,4 % de substrat. La solution de substrat (2 ml), une solution d'enzymes contenant de l'alpha-glucosidase (500 U/ml) et de la bêta-glucosidase (100 U/ml), du 2,6dibromo-4-aminophénol (5 mM, 50 ssl) et de la laccase (2000 U/ml, 100 Al) ont été mélangés soigneusement dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à 370C.On y a ajouté de l'alpha-amylase (Boehringer, 5000 I.U./litre, 500 ul) pour faire démarrer la réaction. Le facteur d'absorption après 20 minutes a été mesuré à 650 nm ; on a obtenu O.D.650 = 0,38. Comme résultat, l'activité d'alpha-amylase peut être déterminée avantageusement par cette méthode. Exemple 77 Méthode de détermination d'alpha-amylase Un groupe hydroxyle dans le maltopentaose a. été acétylé par une méthode classique utilisant de l'acétate de sodium et de l'anhydride acétique. Le maltopentaose-bêta-heptadéca acétate obtenu, du 2,6-dibromophénol et du chlorure de zinc anhydre ont été utilisés de manière classique pour effectuer une réaction de couplage de façon qu'on obtienne de l'alpha- et du bêta-2,6-dibromophényl hexadéca acétylmaltopentaoside. On a désacétylé ce-produit au moyen de méthylate de sodium dans du méthanol pour obtenir du 2,6-dibromo- phénylhexadéca maltopenta-oside qui a été dissous dans un tampon. glycérophosphate 0,05 M. (pH 7,0) contenant 2 % d'alpha-cyclodextrine pour préparer une solution à 0,4 % de substrat. La solution de substrat (2 ml), une solution d'enzymes (50 ssl) contenant de l'alpha-glucosidase (500 U/ml) et de la bêta-glucosidase (100 U/ml), du 2,6-dibromo-4-aminophénol (5 mM, 50 1) et de la laccase (2000 U/ml, 100 al) ont été soigneusement mélangés dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à une température constante de 37 C. On y a ajouté de l'alpha-amylase (Boehringer, 5000 I.U./litre, 50 ssl) pour faire démarrer la réaction. Le facteur d'absorption après 20 minutes était O. D.670 - 0,387. Comme résultat, l'alpha-amylase peut être mesurée avantageusement par cette méthode. Exemple 78 Méthode de détermination d'alpha-amylase Dans l'exemple 77, on a remplacé la laccase par ASOD (1310 U/ml) pour obtenir un facteur d'absorption de O. D.670 = 0,378. Comme résultat, l'activité d'alpha-amylase peut être déterminée avantageusement par cette méthode. Exemple 79 Méthode de détermination d1AlP en utilisant du phosphate de phényle et ASOD Du phénylphosphate.2Na (5 mM, 2 ml) dissous dans un tampon 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), du 2,6-dibromo-4-aminophénol (1 mM, 1 ml) et ASOD (1320 U/ml, 100 ul) provenant de Sechium edule ont été soigneusement mélangés dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à 300C. On y a ajouté ALP (Boehringer, 400 U/0,17 ml, 10 ul) pour faire démarrer la réaction et les changements du facteur d'absorption ont été observés toutes les 5 minutes. Les résultats sont représentés- sur la figure 58. L'activité d'AlP peut être déterminée en faisant réagir le phénol libéré à-partir du phénylphosphate, ASOD et un agent de couplage. Exemple 80 Méthode de détermination d'AlP Du 2,6-dibromo phénylphosphate obtenu par estérification d'un phosphate et de 2,6-dibromophénol a été dissous dans un tampon 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) pour préparer une solution de substrat (5 mM). Cette solution de substrat (2 ml, du 2,6-dibromo-4-aminophénol (l mM, l ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 gll) ont été mélangés soigneausement dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à 370C. On y a ajouté AlP (Boehringer, 400 U/0,17 ml, 10 l) pour faire démarrer la réaction. Le facteur d'absorption après 30 minutes étaot O.D.670 = 1,253. On peut déterminer avantageusement AlP par cette méthode. Exemple 81 Méthode de détermination d'estérase en utilisant de l'acétate de phényle et ASOD De l'acétate de phényle (Tokyo Kasei K.K., 5mM, l ml) dissous dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0), du 2,6dibromo-4-aminophénol (0,5 mM, l ml) et ASOD provenant de Sechium edule (60 U/ml, 20 iii) ont été soigneusement mélangés dans une cellule colorimétrique et soumis à une préincubation à 300C. On y a ajouté de la lipase (Toyo Jozo Co., 2545 U/ml, 100 ssl) pour faire démarrer la réaction et on a mesuré les changements d'absorption toutes les 2 minutes (figure 59).Comme résultat, la lipase (estérase) peut être déterminée avantageusement en faisant réagir le phénol libéré à partir du substrat acétate de phényle, ASOD et un agent de couplage. Exemple -82 Méthode de détermination d t endotoxine bactérienne Boc-Arg(NO2)-OH et de la N,-diéthylamino-p-phénylñe- diamine ont été condensés par un carbodiimide soluble dans l'eau et on a éliminé le groupe protecteur pour préparer du H-Arg(NO2)-diéthylaminoanilide. Du Boc-Leu-Gly-ester a été désestérifié par un alcali pour donner Boc-Leu-Gly OH.Ces deux produits ont été. condensés dans du butanol par un carbodiimide soluble dans l'eau pour donne du Boc-Leu-Gly-Arg (NO2)-diéthyl-aminoanilide, qui a été coupé au groupe NO2 par réduction catalytique-au palladium pour donner du Bo.c-Leu-Gly-Arg-diéthylaminoanilide. On a dissous le produit dans un tampon 0,2 M Tris-HCl (pH 7,3) contenant 0,005 M CaCl2 pour préparer une solution de substrat (2,5 mM). La solution de substrat (2 ml), du l-naphtol-2-sulfonate (2 mMf 1 ml) et de la laccase (2000 U/ml, 100 ul) ont été soigneusement mélangés dans une cellule colorimétrique et soumis à une pré-incubation à 370C. On y a ajouté une enzyme d'activation d'endotoxine (50 rl) pour faire démarrer la réaction.On a mesuré le facteur d'absorption à 655 nm (O.D.655 = 0,268). Comme résultat, l'endotoxine bactérienne peut être déterminée par cette méthode. (Préparation d'enzyme d'activation d'endotoxine) Des lymphocyles sanguins (environ 100 ml) ont été recueillis, en évitant soigneusement toute contamination, à partir de Tachypleus tridentatus (poids d'environ 2 kg) (publication de brevet japonais N 51-40131). Les amibocytes, séparés par centrifugation, ont été lavés avec une solution aqueuse à 3 % de NaCl pour donner des pellets d'amibocytes. Une solution tampon (Tris-HCl 0,05 M ; CaCl2 0,001 M ; NaCl 0,15 M ; pH 7,2) a été ajoutée à un rapport 1/10 v/v des lymphotyles sanguins initiaux et le mélange a été agité énergiquement dans un homogénéiseur stérilisé et soumis à une congélation-décongélation et à une centrifugation à 50 000 tpm pendant 15 minutes pour donner le liquide surnageant qui a été appelé Amoebocyte lysate Tachypleus (ALT). Cet ALT a été soumis à une filtration sur gel à travers du SephZex G-50 (Pharmacia Fine Chem. Co.) selon la méthode de Young et autres /N.S. Young et al., J. Clin. Invest., 51,. 1790 (1972)7 pour donner une fraction contenant un progéniteur d'amidase, qui été traité par de l'endotoxine préparée. à partir de Salmonella minesota R595#M, Niwa et al. Jap. J. Med. Sci. Biol., 26, 20 (19737pour donner une enzyme d'activation d'endotoxine. REVENDICATIONS 1. Un procédé pour la détermination d'un composé de la formule dals laquelle R1 est un groupe hydroxyle ou amino, ou de l'hydrogène i au mon un des substituants R2, R3, R4, @ @ @ R5 et R6 est un groupe hydroxyle ou amino, et R2' R3' R4' R5 et R6 sont choisis parmi l'hydrogène, les halogènes et des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxy, carboxyle ou sulfo, ou R5 et R6 forment ensemble un cycle, selon lequel on établit un /stème réactionnel contenant ce composé et un agent de couplage et une enzyme capable de consommer 1 oxygène et de produire un pigment en présence du composé et de l'agent de couplage, et on mesure un changement détectable dans le système réactionnel pour déterminer le composé 2 Un procédé de détermination selon la revendication 1i caractérisé en ce que R1 est un groupe amino, ou de l'hydrogène si au moins un des substituants R2' R3' R4' R5 et R6 est un groupe amino, et R2' R3' R4' R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus, l'agent de couplage étant un composé de la formule dans laquelle R7 est un groupe hydroxyle1 amino ou amino substitué, et R8 Rg, R9-, , R11 et R12 sont choisis parmi l'hydrogène, les halogènes, des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxyle, carboxyle ou sulfo, ou R11 et R12 forment ensemble un cycle. 3. Un procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 est un groupe hydroxyle, ou de l'hydrogène si au moins un des substituants R2, R31 R41 R5 et R6 est un groupe hydroxyle, et R2, R3, R41 R5 et T6 ont les mêmes significations que ci-dessus, l'agent de couplage étant un composé de la formule dans laquelle R13 est un groupe arnino ou-amino substitué et R14, R15, R16, R17 et R18 sont choisis parmi l'hydrogène, les halogènes et des groupes alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxyle, carboxyle ou sulfo, ou R17 et R18 forment ensemble un cycle. 4. Un procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oxydase est une oxydase pour un composé à noyau aromatique ayant un substituant hydroxyle ou amino. 5. Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que oxydase est de l'ascorbate oxydase, de la laccase ou de la tyrosinase. 6. Un procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que le changement détectable est l quantité d'oxygène consommée ou la quantité de pigment produite. 7. Un procédé de détermination selon la xevend.ication 6, caractérisé en ce qu'on effectue la mesure électrochimiquement. 8. Un procédé de détermination selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue la mesure au moyen d'une électrode à oxygène. 9. Un procédé- de détermination selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on effectue la mesure de la quantité de pigment produite par une détermination colorimétrique à une longueur d'absorption spécifique de ce pigment. 10. Un procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'onproduit le composé à partir d'un substrat synthétique par l'action d'une hydrolase. 11. Un procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrolase est une peptidase ou protéase et le substrat synthétique est un composé de la formule dans laquelle un des substituants R1 et R'2 est R1OCO-NH- et l'autre est de l'hydrogène, où R19CO- est un résidu d'amino-acide ou un résidu de peptide, et R3, R*, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. 12. Un procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrolase est de la glycosidase et le substrat synthétique est un composé de la formule dans laquelle l'un des substituants R"1 et R"2 est (S) -O- et l'autre est de l'hydrogène, où S est une maille monosaccharide et n est un nombre entier plus grand que 1, et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. 13. Un procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrolase est une phosphatase et le substrat synthétique est un composé de la formule dans laquelle un des substituants R"'1 et R''l2 est @ @ R20# et l'autre est de l'hydrogène, où R20-O- est OH un résidu de glycérol substitué ou non, et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. 14. Un procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrolase est une estérase ou une lipase, et le substrat synthétique est un composé de la formule dans laquelle un des substituants R""1 et R""? est R21CO-O- et l'autre est de l'hydrogène, où R21CO- est un résidu d'acide gras et R3, R4, R5 et R6 ont les mêmes significations que ci-dessus. 15. Un procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que la détermination est une détermination d'hydrolase. 16. Un procédé de détermination selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détermination d'hydrolase est une détermination de peptidase ou de protéase. 17. Un procédé de détermination selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détermination d'hydrolase est une détermination de glycosidase. 18. Un procédé de détermination selon la revendication 15, caractérisé en de que la détermination d'hydrolase est une détermination de phosphatase. 19. Un procédé de détermination selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détermination d'hydrolase est une détermination d'estérase ou de lipase.