Brevet FR2560597A1 — publié le 19850906

Produits analogues de la lck-hydroxyvitamine D2, leur procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant. La présente invention concerne des produits ana- logues de la 1c quimanifestent des propriétés biologiques inattendues. Du fait de l'activité bien connue et nettement etablie des composés de la 10 intéressants dans la préparation des métabolites natu- rels et dans la découverte des produits analogues ayant des propriétés biologiques utiles. Ceci a conduit à la préparation d'un certain nombre de composés doués d'une activité biologique. L'intérêt pour de tels compo- sés se maintient particulièrement du fait qu'on a reconnu maintenant qu'en plus deleur fonction classique comme régu- lateurs de l'homéostasie du calcium, certains dérivés de la vitamine D en particulier la lo(,25-dihydroxyvitamine D3 et la 1c(,-hydroxyvitamine D3 influencent également les processus de différentiation cellulaireset sont ca- pables d'empêcher le développement et la prolifération de certaines cellules leucémiques (voir brevet U.S. 4 391 802; Proc. Natl. Acad. USA 80, 201 (1983); Nature, 306, 492-494 (1983)). La plupart des métabolites de vitamine D connus et des produits analogues sont des dérivés de la série de la vitamine D3 c'est-àdirequ'ilspossèdent des chaînes latérales stéroîdes saturées. Les composés de vitamine D insaturées à chaîne latérale sont toutefois également connus notamment certains dérivés hydroxylés de la vita- mine D2 tels que les métabolites 25-hydroxy, 1c,25-di- hydroxy, 24-hydroxy et 24,25-dihydroxy et la 1c -hydroxy- vitamine D2 ainsi que certaines composés 22-trans-déhy- dro apparentés ne comportant pas le substituant méthyle sur la position 24. La présente invention fournit des produits ana- loguesde la vitamine D qui sont caractérisés par la struc- s ture:. dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe hy- droxyle. Le composé de cette invention dans lequel R est un atome d'hydrogène peut être obtenu comme intermédiaire dans la préparation du composé dans lequel R est un groupe hydroxyle. Du point de vue de la structure les composés de la présente invention sont des produits analogues des composés de l'hydroxyvitamine D2 qui ne comporte pas le substituant 24-méthyle,c'est-à-dire les composés qui sont respectivement la 1X-hydroxy-28-norvitamine D2 et la 1 (,25-di-hydroxy-28-norvitamine D2. Aussi bien le produit que le produit intermédiai- re font preuve d'une forte activité biologique et sont caractérisés par un type d'activité nouveau et inattendu. Un mode de réalisation de la préparation des com- posés de la présente invention est décrit sur le schéma opératoire I. Dans la description suivante la désignation des composés par des chiffres arabes (par exemple (1), (2), (3),... (10), (11), (12)) se rapporte aux struc- tures ainsi numérotées sur le schéma opératoire. La matière de départ est l'aldéhyde ayant la structure (1) dont la partie diène est protégée et peut être préparée à partir de l'acétate d'ergostérol selon le procédé de Barton et coll (J. Chem. Soc. (C) 1968 (1971)). La réaction de l'aldéhyde (1) avec la 3-méthyl- 1-butylphénylsulfone ayant la structure indiquée ci- dessous: (CH3)2CHCH2CH2-S02Ph dans un solvant organique et en présence d'une base organique forte donne surtoutl'hydroxy-sulfone intermédiaire (2). La réduction de l'intermédiaire (2),par exemple avec l'amalgane de sodium dans une solution alcoolique tamponnée donne la 22,23-trans oléfine (22E-oléfine) (3). La réaction de la 22E-oléfine (3) avec un réactif réducteur hydrure fort (par exemple LiAlH4) dans un sol- vant éther donnele5,7-diène intermédiaire (4). Cet inter- médiaire est ensuite irradié avec la lumière ultraviolet- te dans un solvant organique pour obtenir le dérivé de prévitamine D correspondant qui peut être isolé et chauffé dans un solvant organique à une température allant de la température ambiante à la température du réflux pour isomériser le chromophore de prévitamine D en chromophore de vitamine D, donnant ainsi le composé 22E-déhydrovitamine D3 ayant la structure (5). Le compo- sé (5) est un produit analogue de la vitamine D connu qui a été préparé précédemment par un procédé moins commode (J.Gen. Chim. USSR 48 (4), 828 (1978)). L'intermédiaire (5) peut être ensuite hydroxylé sur le carbone 1, selon le procédé général de Deluca et - coll. (brevetsU.S. n 4 195 027 et 4 260 549). Ces stades réactionnels mettent en oeuvre typi- quement la réaction du composé (5) avec le chlorure de toluènesulfonyle de façon classique pour obtenir le dérivé 3( -tosylate correspondant qui est directement soumis à la solvolyse dans le méthanol tamponné pour obtenir la 3,5-cyclovitamine D intermédiaire (6), la réaction avec différents alcanols inférieurs, par exem- ple ayant 1 à 4 atomes de carbone donnera le composé alcoxy inférieur correspondant. En traitant ce dernier avec ledioxyde de sélénium et l'hydroperoxyde de tert.-butyleon obtient après purification par chromato- graphie le produit 1-hydroxylé correspondant comprenant principalement le composé 1O -hydroxycyclovitamine D (7). Une petite quantité de l'épimère 1, -hydroxy correspondant peut être également présente dans le produit mais bien que la séparation des épimères soit possible par chroma- tographie elle n'est pas nécessaire à ce stade. Le chauf- fage de cette 1-hydroxycyclovitamine D intermédiaire dans, disons, l'acide acétique glacial à 40-60 C donne alors un mélange des produits de solvolyse 3-acétylé à partir desquels on peut isoler par chromatographie les composés 5,6-cis et 5,6-trans (8) et (9), respectivement. Si la 1-hydroxycyclovitamine D obtenuequi a été soumise à la solvolysecontient un peu d'épimère 1/3 -hydroxy, le mélange de solvolyse contiendra également les épimères p1 -hydroxy correspondant aux composés (8) ou (9) et, si on le désire, ceux-là peuvent être également isolés par chromatrographie. L'hydrolyse classique par une base de la fonction acétate dans le composé (8) donne le diol ayant la struc- ture (10) Ce diol (10) peut être ensuite soumis à une hydroxylation enzymatique in vitro au niveau du carbone , en utilisant un produit d'homogénéisation de foie préparé à partir de rats déficients en vitamine D (comme décrit dans le brevet U.S. n 4 307 025) pour obtenir, après séparation par chromatographie du mélange de produits, le produit 1Co à l'état pur. Dans la description détaillée qui suit du procé- dé de synthèse, les résultats physicochimiques ont été obtenus en utilisant les procédés et les appareils men- tionnés ci-dessous. La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) est effectuée sur un modèle ÀLC/GPC"204 de Waters Associates utilisant une colon- ne de "Zorbax-Sil" (marque déposée de Dupont (colonne 6,2 mm x 25 cm; débit 4 ml/min; 105 bars). La chroma- tographie sur colonne est effectuée sur "Silica Gel 60" marque déposée de Merckmaille ASTM 70-230 (212-63 mm). La chromatographie préparative sur couche mince (CCM) est effectuée sur "Silica 60 PF-254" (marque déposée) (plaques de 20 x 20 cm, 1 mm de silica gel). L'irradia- tion est effectuée en utilisant une lampe à arc à vapeur de mercure "Hanovia 608A36" (marque déposée) munie d'un filtre "Vycor" (marque déposée). Toutes les réactions sont de préférence effectuées sous une atmosphère inerte (par exemple l'argon). 3-méthyl-1-butylphénylsulfone (Isopentylphényl sulfone). du PhS02Na (1,97 g, 12 mmoles) est ajouté à une solution i5 agitée de 3-méthyl-1bromobutane (1,51 g, 1,2 ml, mmoles) dans du DMF (20 ml) à 75 C. Le mélange est chauffé à 75 C pendant 5 heures, puis refroidi, versé dans l'eau et extrait avec du benzène. La couche organi- que est lavée avec HCl à 5%, NaHCO3 à 5% et de l'eau, séchée sur Na2S04 et évaporée. La sulfone obtenue sous forme de produit huileux (1,69 g, 80%) est presque pure et est utilisée sans être purifiée davantage; RMNS 0,88 (6H, d, J=6,5 Hz, 2xCH3), 1,61 (3H, m, -CH2-CH), 3,08 (2H, m, S02- CH2-), 7,50-7,95 (5H, m, Ar-H); IR: 1300 (large), 1147,1088,745,692,564, 539 cm 1; Spectre de masse, m/e 212 (M+, 3), 143 (92), 77 (57), 71 (73), 70 (73), 55 (42), 43 (100), 41 (47). - (22E)-5o,8 o -(4-phényl-1,2-urazolo)-cholesta- 6,22-diène-3 /-ol (3). Du n-butyllithium (solution 1,7 M dans l''hexane, 4,12 ml, 7 mmoles) est ajouté à une solution agitée de di-isopropylamine (707 mg, 1 ml, 7 mmoles) dans du THF sec (14 ml) et le mélange est agité pendant 15 minutes à la température ambiante. La sulfone préparée ci-dessus (1,50 g, 7,07 mmoles) dans du THF sec (11 ml) est ajoutée goutte à goutte en l'espace de 10 minutes. La solution est agitée à la température ambiante pendant encore min puis refroidie à 0 C et l'aldéhyde (1) (545 mg, 1 mmole) dans du THF sec (7 ml) est ajouté. L'agitation est poursuivie pendant 2 heures à 0 C et la solution est réchauffée lentement à la température ambiante (30 min). Le mélange (contenant lthydroxy-sulfone (2)) est versé dans la solution saturée de Na2HP04 dans du méthanol (200 ml), de l'amalgame de sodium (5, 65%, 10 g) est ajouté et le mélange réactionnel est agité à 4 C pendant 17 heures. Le mercure précipité est séparé par filtration et après avoir concentré le mélange réactionnel jusqu'à environ 5 ml, on le dilue avec de l'eau et on l'extrait avec du chlorure de méthylène. L'extraitorganique est lavé avec de l'eau, séché (Na2S04),concentré sous vide et le résidu huileux est traité par chromatographie sur colonne de silica gel. Le réactif sulfone en excès est élué avec un mélange benzène- éther (7:3). L'élution avec du mélange benzène-éther (6:4) donne le produit d'addition pur (3) (375 mg, 67%) sous forme d'une mousse. RM4N0,81 (3H, s, 18-H3), 0,86(6Had,J=6,7 Hz, 26-H3 et 27-H3), 0,97 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21- H3), 3,16 (1H, dd, J1=4,4 Hz, J2=14Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, large m, 22-H et 23-H), 6,22 et 6,39 (2H, AB q, J=8,5 Hz, 6-H et 7-H), 7, 40 (5H, large m, Ar-H); IR: 3444, 1754,1701,1599,1402,969,757 cm 1; spectre de masse, m/e 557 (M+, 1%), 382 (70), 349 (51), 253 (28), 251 (45), 119 (PhNC0, 83), 55 (100). (22E)-Cholesta-5,7,22-trièn-3 i-ol,(4). Le produit d'addition (3) (330 mg, 0,6 mmole) et de l'hydrure de lithium aluminium (700 mg) dans du THF sec(40 ml) est chauffé au reflux pendant 18 heures. L'excès de réactif est décomposé avec quelques gouttes d'eau. Du Na2S04 anhydre est ajouté et la phase organi- que est décantée et évaporée pour obtenir un résidu cris- tallin qui est purifié sur colonne de silica gel. L'élu- tion avec un mélange benzène-éther (94:6) donne le diène (4) pur (180 mg, 80 %) qui est cristallisé dans le méthanol: pf 119,5-122,5 C; /:7-4 = 118 (c=1,2, CHC13); RMN S 0,63 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J=6,7 Hz, 26- H3 et 27-H3), 0,95 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, large m, 22-H et 23-H), 5,38 et 5,57 (2H, AB q, J=6 Hz, 7-H et 6-H); UV/max 281nm; IR; 3436,1461, 1382,1366, 1062, 1036, 968 cm-1; spectre de masse m/e 382 (M+, 100), 349 (M -H20-Me, 71), 323 (34), 271 (M -chaîne latérale, 16), 253 (M -chaîne latérale -H20, 32). (5Z, 7E,22E)-9,10-Sécocholesta-5,7,10(19),22- tétraèn-3/j-ol (5). Une solution du composé (4) (100 mg, 0,26 mmole) dans un mélange d'éther (120 ml) et de benzène (30 ml) est dégazée avec de l'argon pendant 40 minutes. La solu- tion est irradiée à 0 C pendant 13 minutes dans une cu- ve à immersion en quartz équipée avec une lampe UV et un filtre. Le solvant est chassé sous pression réduite et le résidu est séparé par CLHP en utilisantune solution à 1% de 2-propanol dans l'hexane comme éluant pour obtenir le dérivé de prévitamine D pur (40,4 mg, %) qui est recueilli à 24 ml. RMN ' 0,72 (3H, s, 18- H3), 0,87 (6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,04(3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 1,65 (3H, s, 19-H3), 3,91 (1H, m, 3-H), ,28 (2H, large m, 22-H et 23-H), 5,50 (1H, m, 11-H), ,69 et 5,96 (2H, AB q, J=12,5 Hz, 7-H et 6-H); UVA max260,5 nm;X.min 234 nm.La prévitamine (40 mg, 0,1 mmole) est chauffée au reflux pendant 3 heures dans 100 ml d'éthanol. Après avoir chassé le solvant, le mé- lange obtenu est séparé par la CLHP (élution avec une solution à 1% de 2propanol dans l'hexane). Le rendement en vitamine (5) (recueillieà 34 ml) est de 30,8 mg (77%); pf (hexane) 99-101 C; RMNS 0,56 (3H, s, 18-H3), 0, 88 6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,02 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H3), 3,96 (1H, m, 3-H), 4,82 et 5,05 (2H, chacune étroite m, 19-H2), 5,27 (2H, large m, 22-H et 23-H), 6,03 et 6,24 (2H, ABq J=11,4 Hz, 7-H et 6-H); UVA max 265 nm, min 228 nm; IR: 3420,1458,1441,1378,1366,1050, 970,943,891, 862 cm1; spectre de masse, m/e (M+, 22), 349 (M'-H20-Me, 4), 271 (M - chaîne latérale, 8), 253 (M±chaîne latérale-H20, 13), 136 (100), 118 (80). Z,7E,22E)-3e -Acétoxy-9,10-sécocholesta-5,7,10 (19),22-tétraèn-1CX -ol (8). Du chlorure de p-toluènesulfonyle fraîchement recristallisé (50 mg, 0,26 mmole) est ajouté à une solu- tion de vitamine (5) (30 mg, 0,08 mmole) dans 300/ul de pyridine sèche. Après 30 heures à 4 C, le mélange réac- tionnel est versé dans un mélange glace-NaHC03 saturé tout en agitant. Le mélange est agité pendant 15 minu- tes et extrait avec du benzène. L'extrait organique est lavé avec une solution saturée de NaHC03, une solution saturée de sulfate de cuivre et de l'eau séché (Na2S04) *et concentré sous vide pour obtenir le dérivé 35- tosyle huileux.Le tosylate brut est traité avec NaHC03 (150 mg) dans 10 ml de méthanol absolu et le mélange est agité pendant 8,5 heures à 55 C. Après refroidisse- ment et concentration à environ 2 ml le mélange est dilué avec 80 ml de benzène, lavé avec de l'eau, séché (Na2S04) et évaporé sous pression réduite. Le produit analogue de la 3,5-cyclovitamine D (6) huileux résultant est suffisamment pur pour être utilisé dans le stade d'oxydation ci-après sans avoir été purifié davantage. A une suspension agitée énergi- quement de SeO2 (4 mg, 0,036 mmole) dans 5 ml de CH2Cl2 sec, de l'hydroperoxyde de tert.-butyle (13,2/ul, 0,094 mmole) est ajouté. Au bout de 30 min,40/ul de pyridine sèche sont ajoutés et le mélange est agité pendant 25 min supplémentaires à la température ambian- te, dilué avec 3 ml de CH2Cl2 et refroidi à 0 C. Le produit 3,5cyclovitamine (6) brut dans 4,5 ml de CH2Cl2 est ensuite ajouté et on laisse se dérouler la réaction à 0 C pendant 15 minutes. On laisse ensuite le mélange se réchauffer lentement (30 min) à la tempé- rature ambiante. Le mélange est transféré dans un dé- canteur et secoué avec 30 ml de NaOH à 10%. 150 ml d'éther sont ajoutés et la phase organique séparée est lavée avec NaOH à 10%, de l'eau et séchée sur Na2S04. La concentration à siccité sous vide donne un résidu huileux jaune qui est purifié sur des plaques de silica gel pour CCM développées dans un mélange 7:3 d'hexane et d'acétate d'éthyle (Rf 0,35) en donnant la 1-hydroxycyclovitamine (14,4 mg, 45%): RMN ' 0,55 (3H, s, 18-H3), 0,64 (1H, m, 3-H), 0,88 (6H, d, J=6,9 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 3,26 (3H, s, -0CH3), 4,2 (2H, m, 1-H et 6-H), 4,95 (1H, d, J=9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, large m, 19-H2, 22-H et 23-H); spectre de masse, m/e 412 (M, 27), 380 (m -MeOH, 46), 339 (22), 269 (M -chaîne latérale- MeOH, 29), 245 (18), 135 (100). Le produit ci-dessus comprend principalement le produit analogue de la - li C pendant 15 minutes. Le mélange est versé avec pré- caution dans un mélange glace/NaHC03 saturé et extrait avec du benzène et de l'éther. Les extraits combinés sont lavés avec de l'eauséchés (Na2S04) et évaporés. Le mélange de produitsrésultant est soumis à la CLHP (solution à 1,5% de propanol dans l'hexane comme éluant) pour obtenir 4,9 mg du composé (8) (élution à 42 ml) et 3,1 mg du composé (9) (élution à 50 ml). 1560S97 Composé (8): RMN 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d, J=7,0 Hz, 26-H3 et 27H3), 1,02 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -OC0CH3), 4,41 (1H, m, 1H), 5,02 (1H, étroite m, 19-H), 5,1-5,4 (4H, large m, 3-, 19-, 22- et 23H), 6,03 et 6,35 (2H, AB q, J=11,4 Hz, 7-H et 6-H); UVAma2 264 nm, min 227,5 nm; spectre de masse m/e 440 (M, 15), 380 (M -HOAc, 84), 362 (M HOAc-H20, 9), 269 (M±chaîne latérale-HOAc, 40), 251 (15), 135 (100),, 134 (94). Composé (9): RMN 0,57 (3H, s, 18-H3), 0,89 (6H, d, J=7,0 Hz, 26-H3 et 27H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (1H, m, 1H), 5,00 et 5,14 (2H, chacune étroite m, 19-H2), 5,25 (3H, large m, 3-, 22- et 23-H), 5,81 et 6,58 (2H, ABq, J=12,0 Hz, 7-H et 6-H); UV ax 269,5 nm; min 228 nm; spectre de masse, m/e 440 (M, 6), 380 (47), 269 (15), 135 (100), 134 (62). On obtient également à partir de la solvolyse du mélange de produits une petit quantité (0,87 mg de l'épimère 1 -hydroxy correspondant au composé (8) caractérisé par les résultats suivants: MN S0,55 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J=6,9 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,01 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 2,06 (3H, s, -OCOCH3), 4,17 (1H, m, 1-H), 4,99 (2H, m, 3-H et 19-H), 5,1-5,4 (3H, large m, 19-, 22- et 23-H), 6,00 et 6,38 (2H, AB q. J=11,3 Hz, 7-H et 6-H); UVW max 262,5 nm,t min 227 nm; spectre de masse, m/e 440 (M, 27), 380 (78), 362 (12), 269 (28), 251 (20), 135 (100), 134 (78). Hydrolyse du groupe 3( -acétoxy dans les composés (8) et (9). Une solution du dérivé 3 /-acétoxyvitamine (8) (0,76 mg) dans 0,1 ml d'éthanol est traitéeavec KOH à % dans le méthanol (0,8 ml) et le mélange est chauffé pendant 1 heure à 50 C. Après le travail habituel et la purification finale par CLHP (solution à 8% de 2-propanol dans l'hexane comme éluant) on obtient le lo(",3/ -diol ayant la structure (10) avec un rendement de 84%: PRNb0,56 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J=7,0 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,02 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 4,22 (1H, m, 3-H), 4,42(1Hm,1-H) , 5,00 (1H,étroite m, 19-H), 5,1-5,4 (3H, large m, 19-, 22-, et 23-H), 6, 01 et 6,38 (2H, AB q. J=11,4 Hz, 7-H et 6-H); UV/Aax 264,5 nm,.+min 227,5 nm; ax +M,,in i spectre de masse, m/e 398 (M, 21), 380 (M -H20, 9), 2,87 (M±chaîne latérale, 6), 269 (M+ -chaîne latérale-H20, 8) 251 (5), 152 (38), 134 (100). Le composé (10) est élué à 40 ml dans le système CLHP ci-dessus. Un traitement analogue du dérivé acétoxy (9), donné après purification par CLHP le 5,6-trans-1"o, 315-diol ayant la structure (11) avec un rendement de 72%: RIMN 0,58 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H,,d, J=7,0 Hz, 26-H3 et 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 4,24 (1H, m, 3-H), 4,49 (1H, m, 1-H), 4,97 et 5,13 (2H, chacune étroite m, 19-H2), 5,25 (2H, large m, 22- H et 23-H), 5,88 et 6,58 (2H, AB q, J=11,5 Hz, 7-H et 6-H); UVAmax 273 nm, ?L min 229,5 nm; spectre de masse, m/e 398 (M*, 21), 380 (5), 287 (6), 269 (5), 251 (4), 152 (33), 134 (100). Le composé (11) est élué à 38 mi. Hydroxylation sur la position 25 du composé (10) Le 5,6-cis-1o,3 e-diol ayant la structure (10) tel qu'obtenu ci-dessus est ensuite hydroxylée sur la posi- tion 25 par le procédé suivant: des jeunes rats mâles sevrés sont soumis à un régime déficient en vitamine D et pauvre en calcium comme le décrivent Suda et Coll. J. Nutr. 100, 1049 (1970) pendant deux semaines. Ils sont tués par décapitation et leur foie est enlevé. Un produit d'homogénéisation à 20% (p/v) est préparé dans une solution de saccharose 0,25 M refroidie avec de la glace. L'incubation est effectuée dans 10 ml d'un milieu d'incubation,contenu dans une fiole d'Erlenmayer de 125 ml contenant une quantité aliquote du produit d'homogénéisation de foie représentant 1 g de tissu, 0,125 M de saccharose, 50 ÈM d'un tampon phosphate (pH 7,4), 22,4.I de glucose-6-phosphate, 20 m de PTA, mM de nicotinamide, 25 ml. de succinate, 0,4 mM de NADP, 5 me de MgCl2, 0,1 M de KCl et 0,5 unités de glucose- 6-phosphate-déshydrogénase. La réaction est amorcée en ajoutant 400/ug du composé (10) dissous dans 100/ul d'éthanol à 95%. Le mélange est mis en incubation à 37 C en agitant à raison de 80 oscillations/minute pendant 3 heures. La réaction est arrêtée en ajoutant 20 ml de mé- thanol et 10 ml de dichlorométhane. Après avoir ajouté encore 10 ml de dichlorométhane, la phase organique est recueillie tandis que la phase aqueuse est extraite de nouveau avec 10 ml de dichlorométhane. Les phases organi- ques provenant en tout de trois extractions sont combinées et évaporées sur un évaporateur rotatif. Le résidu conte- nant le produit désiré est dissous dans 1 ml d'un mélange CHCl3: hexane (65:35) et appliqué sur une colonne (0,7 cm x 14 cm) garnie de "Sephadex LH-20" (marque déposée) équilibrée et élu éeavec le même solvant. Les 10 premiers ml sont jetés tandis que les 40 ml suivants sont recueillis et évaporés. Le résidu est ensuite dissous dans une solu- tion à 8% de 2-propanol dans l'hexane et soumis à la chro- matographie en phase liquide à haute performance (Modèle LC/GPC 204 CLHP, Waters Associates, Medford, MA) en utili- sant une colonne (4,6 mm x 25 cm, garnie de "Zorbax-Sil" (Dupont, Inc., Wilmington, DE) fonctionnant sous une pres- sion de 70 bars avec un débit de 2 ml/min. Le produit hydroxylé sur la position 25 désirée est élué à 42 ml. Le produit est encore purifi6 par chromatographie en phase liquide à haute performance en utilisant une colonne à phase inversée (4,6 mm x 25 cm) garnie de "Richrosorb Rp-18" (marque déposée de E. Mercis; Darmstadt, Allemagne de l'Ouest) fonctionnant sous une pression de 84 bars et avec un débit de 2 ml/min. La colonne est éluée avec une solution de H20 à 22% dans le méthanol et le produit est élué à 50 mi. Le produit est encore purifié par CLHP en utilisant "Zorbax-Sil"'et dans les conditions décrites ci- dessus. Le produit résultant est caractérisé par les ré- sultats suivants: absorption UV (éthanol à 95%) ;max 265 nm, min 228 nm; spectre de masse, m/z 414 max min - ± (ion molaire M), 396 (M -H20), 378 (M -2xH20), 287 (M -chaîne latérale), 269 (M -chaîne latérale-H20), 251 (M -chaîne latérale-2xH20), 152 (cycle A, coupure de la liai- son C 7/8), 134 (152-H20) et 59 ((CH3)2C=0O résultant de la coupure de la liaison C24/25). Les résultats ci-dessus particulièrement l'absorp- tion caractéristique dans l'ultraviolet et les pics domi- nants et diagnostiques à m/z 152, 134 et 59 du spectre de masse, montrent que le produit est le composé hydroxylé sur la position 25 cherché représenté par la structure (12). Si on le désire les composés de la présente in- vention peuvent être obtenus à l'état cristallin par cristallisation dans des solvants appropriés par exemple l'hexane, éthers, alcools ou des mélanges de ces solvants comme pourra le voir le spécialiste. L'efficacité biologique de la déhydrovitamine D de la présente invention est déterminée par des essais in vivo chez le rat et par comparaison avec des composés de l10-hydroxyvitamine D ayant une efficacité connue. On essaye aussi bien le produit (12) que le composé (10) in- termédiaire clé et on trouve qu'ils sont fortement actifs. Activité biologique du composé (10). L'essai est effectué de la façon suivante: de jeunes rats mâles sevrés sont achetés chez Holtzman Co., Madison,, WI et alimentés en eau à volonté et mis à un régime déficient en vitamine D et pauvre en calcium et de ce fait en phosphore comme le décrivent Suda et Cdl (J. Nutr. 10Q0, 1049 (1970)) pendant trois semaines. Les rats sont ensuite divisés en groupes de 6 chacun et on-leur administre 650pmoles soit de composé (10) soit de 1E -hydroxyvitamine D3 (1C(-OH-D3) dissous dans 0,05 ml d'éthanol à 95% par voie intrajugu- laire 18 heures avant les tuer. Aux rats du groupe témoin on administre un véhicule éthanol de lamême façon. Les rats sont tués par décapitation et leur sang est recueilli. Le sérum obtenu par centrifugation du sang est dilué avec une solu- tion de chlorure de lanthane à 0,1% (1:20) et la concen- tration du calcium dans le sérum est mesurée avec une spectrophotomètre d'absorption atomique. Les résultats sont indiqués dans le tableau I cidessous: Tableau I Augmentation de la concentration en calcium du sérum en réponse à une dose unique de 650 pmoles du composé (10) ou de 1oI-OH-D3, donnée 18 h avant de tuer les rats Composé donné Concentration en calcium du sérum (mg/100ml)+ écart type éthanol 3,2 + 0,1 a) composé (10) 4,5 + 0,4 b) 1I- 0H-D3 4,7 + 0,5 b) b) est considérablement différent de a) p0,001. Activité biologique du composé (12). L'essai est effectué de la façon suivante: de jeunes rats mâles se- vrés sont alimentés avec un régimedéficient en vitamine D et pauvre en calcium pendant 3 semaines comme décrit ci- dessus. Ils sont ensuite divisés en groupes de 5 rats cha- cun. Les rats dans un groupe témoin reçoivent par voie intrajugulaire 0, 05 ml d'éthanol à 95% tandis que les rats dans les groupes d'essai reçoivent 325 pmoles du composé (12) ou de l1c, 25-dihydroxyvitamine D3 (1c, 25-(OH)2D3) dissous dans 0,05 ml d'éthanol à 95%. 18 heures plus tard ils sont tués par décapitation et leur sang est recueilli, La concentration du calcium dans le sérum est déterminée avec un spectrophotomètre atomique comme décrit ci-dessus. Les résultats sont indiqués dans le tableau II ci-dessous: Tableau II Augmentation de la concentration en calcium du sérum en réponse à une dose unique de 325 pmoles du composé (12) ou de 1e,25-(0H)2D3 donnée 18 h avant de tuer les rats Composé donné Concentration en calcium du sérum (mg/100ml)+ écart type éthanol 4,2 + 0,1 a) composé (12) 5,0 + 0,4 b) 51, 25-(0H)2D3 5,4 + 0,4.b) i5 b) est considérablement différent de a) pc0, 001 Les résultats ci-dessus montrent qu'aussi bien le composé (10) que le produit final (12) de la présente invention sont fortement actifs en provoquant une augmen- tation de la quantité de calcium dans le sérum des rats déficients en vitamine D. Ils onten fait,une efficacité biologique équivalente aux composés saturés à chaîne laté- rale connus correspondantsIes1y-OH-D3 et lX,25-(OH)2D3 dont la grande efficacité et l'utilité pharmaceutiques sont bien connues par de nombreux rapports dans la bibiographie générale et des brevets par exemple brevet U.S. 4 225 596. Ce qui est particulièrement remarquable et inat- tendu est l'activité du composé (10) supérieure dans la mi- néralisation des os d'un animal (poulet) qui fait établir une distinction avec l'utilisation physiologique des compo- sés de vitamine D2. Ceci est amplement illustré par les résultats ci-après. Procédé Des poulets mâles de la race Leghorn blanche âgés de un jour sont fournis par Northern Hatcheries (Beaver Dam,WI). Ils sont soumis à un régime protéique de soja pauvre en vitamine D décrit par Omdahl et Coll (Biochemistry 10, 2935-2940, 1971) pendant 3 semaines durant lesquelles ils restent déficients en vitamine D. Ils sont ensuite divisés en groupe de 6 poulets chacun. Un groupe reçoit un véhicule huileux de Wesson par le bec; les autres groupes reçoivent les composés indiqués (voir tableau III) dissous dans la même quantité d'huile de Wesson chaque jour pendant 7 jours. Vingt quatre heures après la dernière dose tous les poulets sont tués par luxation cervicale. Leurs tibias sont enlevés et débar- rassés des tissusmous et connectifs adhérents,et extraits pendant 24 heures dans l'alcool puis pendant 24 heures dans l'éther diéthylique en utilisant un extracteur Soxhlet. Les os sont ensuite séchés à 37,8 C jusqu'à poids constant et pesés. Ils sont ensuite incinérés e. 650 C pendant 24 heures dans un four à ioufle et le pourcentage de cendres pour chaque tibia est calculé. Les résultats sont indiqués dans le tableau III ci-dessous. Tableau III Minéralisation d'os de poulets rachitiques Composé Quantité Nombre d'animaux Cendres % (pmole/d/7 jours) -D 0 6 32,0 + 1,0 1,25-(0H)2D3 130 6 41,0 + 3,4 O 1I-0H-D3 130 6 42,0 + 3,2 lo-0H-D2 1300 6 38,0 + 4,0 x Composé (10) 130 6 38,0 + 3,9 x Ces valeurs ne diffèrent pas beaucoup entre elles Les résultats montrent que 130 pmoles soit de 1,25-(OH)2D3 soit de l de poulets rachitique. Ces résultats montrent d'une façon sur- prenante que, bien que le composé (10) soit un produit analogue de la 1 0H-D2, ilpossède une activité supérieure et inattendue dans la minéralisation des os d'un animal qui est connu pour faire une distinction entre les composés de vitamine D2 dans l'utilisation physiologique. Ceci est une carac- * téristique inattendue de ces nouveaux produits analogues et utiles. Etant donné que l'activité in vivo inattenduedu composé (10) se manifeste indubitable- ment après l'hydroxylation en composé lc,25-dihydroxylé correspondant (composé (12)) in vivo,ce composé, c'est-à- dire le composé (12), qui est le produitanalogue desméthy16é en 24 de la 1o,25-dihydroxyvitamine D3 connue, doit fonctionner pour fournir la minéralisation des os des poulets d'une façon équivalente à celle montrée par la 1x logue de la vitamine D2 sera entièrement actif pour les poulets.Cette grande efficacité des composés (10) et (12) chez un animal qui distingue des dérivés du type vita- mine D2 est une caractéristique nouvelle et particulière de ces substances. Du fait de leur activité biologique marquée, les composés de la présente invention seront facilement appli- qués comme produits de remplacement de divers métabolites de vitamine D connus dans la thérapie ou la prophylaxie des troubles du métabolisme du calcium tels que rachi- tisme, hypoparathyroidie, ostéodystrophie, ostéomalacie ou ostéoporose chez l'homme ou des maladies donnant une déficience en calcium mentionnée (par exemple fièvre de lait) chez les animaux. De même ces composés peuvent être utilisés pour le traitement de certaines maladies virulentes telles que la leucémie de l'homme. Etant donné l'activité marquée et inattendue des compeosés de la présente invention pour provoquer la minéralisation des os chez les oiseaux (voir tableau III) ces composés seront particulièrement utiles dans la prévention ou le traitement des états provoquant un déséquilibre du cal- cium chez les volailles (par exemple minceur de la co- quille des oeufs, faiblesse des pattes de volailles) o tous les dérivés de vitamine D2 connus manifestent une très faible activité. Pour des applications thérapeutiques, les compo- sés peuvent être administrés par une voie d'administra- tion classique quelconque et sous une forme quelconque appropriée à la méthode d'administration choisie. Les composés peuvent être formulés avec un véhicule pharma- ceutique acceptable et inoffensif sous la forme par exem- ple de pilules de comprimés, de gélules ou de supposi- toires ou sous forme de solutions, d'émulsions, de dis- persions oudesuspensions dans des solvants ou des huiles inoffensives; ces formulations peuvent contenir également d'autres ingrédients thérapeutiquement actifs et avanta- geux qui sont appropriés pour les applications spécifiques. Pour des applications chez l!homme, les composés sont administrés avantageusement en quantités allant de 0,5 à /ug/jour, la posologie spécifique étant réglée selon le composé spécifique administré, la maladie à traiter, l'état et la réponse du sujet comme le sait bien le spécia- liste. a.H At Os AcO J'} I.% >O ci:) Xdl) NO \5xe Nr moiyfi1 H |)v on (ta 1 5 1fi1 X-ACt9) Xe Ac t uof., (Z>Y "oH (1) X-Ac19) X-Ac (lO)X-H(11} Xef I 3 5 HO\ REVENDICATIONS 1. Composé caractérisé par le fait qu'il a la formule: R - HO dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle. ]5 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R est un atome d'hydrogène. 3. Composé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il est sous forme cristalline. 4. Composé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que R est un groupe hydroxyle. 5. Composé selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il est sous forme cristalline. 6. Procédé de préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il consiste à hydroxyler la position 10 du composé de formule: HO r d'une façon connue et,éventuellement à hydroxyler la po- sition 25 du composé 1c-hydroxy résultant d'une façon connue. 7. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend un composé selon l'une quelcon- que des revendications 1 à 5, et un excipient pharmaceuti- quement acceptable. 8. Composition selon la revendication 7, caracté- risée par le fait qu'elle comprend le composé de la re- vendication 2. 9. Composition selon la revendication 7, carac térisée par le fait qu'elle comprend le composé de la revendication 4.