Brevet FR2555175A1 — publié le 19850524

DERIVES DE 1,4-DIHYDROPYRIDINE ET DERIVES DE 1,4-DIHYDROQUI- NOLEINE MARQUES RADIO-ACTIVEMENT PAR 125I, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION A L'ESSAI DES MEDICAMENTS. La présente invention concerne des dérivés de 1,4-dihydropyridine et des dérivés de 1,4-dihydroquinoléine marqués au 125I à radio-activité élevée, leur préparation par réaction d'esters de la série de la 1,4dihydropyridine ou de la 1,4-dihydroquinoléine portant un groupe amino terminal sur les groupes ester, avec des composés acylants marqués au]25I et l'application des composés séparés par des méthodes chroma- tographies préparatives à l'expérimentation de médicaments ou d'autres substances à l'aide de récepteurs ("screening" à l'aide du dosage radio-actif des récepteurs) et à la détermi- nation du niveau plasmatique de médicaments actifs sur les canaux d'apport de calcium. On dispose également par suite d'une possibilité de représentation autoradiographique rapide de sites de fixa- tion ou récepteurs de médicaments et d'autres substances, qui sont interchangeables avec des sites de fixation (récepteurs) de 1,4-dihydropyridine ou de 1,4-dihydroquinoléine. Sous le concept général d'antagonistes organiques du calcium (A. Fleckenstein: "Calcium Antagonism" dans Heart and Smooth Muscle, JohnWiley and Sons, New York, Clinchester, Bristone, Singapour, 1983; DoJ. Triggli: "Calcium Antago- nists Basic Chemical and Pharmacological Aspects" (pp 1-18) dans G.B. Weiss (Editeur): "New Perspectives on Calcium Antagonists", American Physiological Society, Bethesda, Mary- land USA, 1981; D.J. Triggle: "Chemical Pharmacology of Calcium Antagonists" (pp 17--38) dans R.G. Rahwan and D.T. Witiak (eds.): "Calcium Regulation by Calcium Antagonists". ACS Symposium Series 201. American Chemical Society, Washington DC, 1982), on comprend des substances qui sont utilisées comme agents thérapeutiques chez l'être humain et qui trouvent actuellement les domaines d'application suivants: angine de poitrine, tachycardie supraventriculaire, troubles ventricu- laires du rythme cardiaque, flutter auriculaire, fibrillation auriculaire, pression sanguine élevée, et qui sont citées pour les domaines d'application possibles suivants: insuffisance et vasospasmes cérébraux, pression pulmonaire élevée, asthme bronchique, accouchement avant terme, dysménorrhée, cardio- protection, artériosclérose et blocage de la libération d'a- gents dits médiateurs (thromboxanne A2) dans le cas de mala- dies allergiques, inflammatoires ou par agrégation plaquettaire sanguine (A. Fleckenstein dans: "Calcium Antagonism in Heart and Smooth Muscle", 1983 et R.A. Janis and D.J. Triggle dans: "New Developments in Ca2+ Channel Antagonists". J. Med. Chem. 26, 775-785, 1983). Les antagonistes du calcium utilisés en thérapeuti- que ou en expérimentation clinique ou se trouvant en cours de développement, appartiennent à différentes classes de substances chimiques. Parmi les antagonistes du calcium connus jusqu'à présent, les 1,4-dihydropyridines et 1,4-dihydroqui- noléines sont de loin les plus actifs. En concentrations de 10-10 - 10-9 mole/l, ces substances ont déjà pour effet de bloquer le passage du cal- cium dans les canaux d'apport de calcium de la membrane cellu- laire de la musculature lisse (A. Fleckenstein, 1983; D.J. Triggle, 1981, 1982; R.A. Janis et D.J. Triggle, 1983). Dans le cas de 1, 4-dihydropyridines chirales, le blocage est stéréosélectif (Towart, R., Wehinger, E. and Meyer, H. (1981): "Effects of unsymetrical ester substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and their optical isomers on contraction of smooth muscle". NaunynSchmiedeberg's Arch. Pharmacol. 317: 183-185; Towart R., Wehinger, E., Meyer, H., Kazda, S. (1982): "The effects of nimodipine, its optical isomers and metabolites on isolated vascular smooth muscle". Arzneim. Forsch. (Drug Res) 32: 338-346). Les publications (Glossmann, H., Ferry, D.R., LUbbecke, F., Mewes, R., Hofmann, F. (1982): "Calcium chan- nels: direct identification with radioligand binding studies". TIPS 3: 431-437; Glossmann, H. and Ferry, D.R. (1983) "Molecular approach to the calcium channel". Drug Development 9: 63-98; Janis, R.A., Triggle, D.J. (1983); "New develop- ments in Ca2+ channel antagonists". J. Med. Cem. 26: 775-785; Janis, R.A., Scriabine, A. (1983): "Sites of action of Ca2+ channel innibitors". Biochem. Pharmacol. (in press); Ferry, D.R.. Goll, A., Glossmann, H. (1983): "Differential labelling of putative skeletal muscle calcium channels by 3H-nifedipine, 3H-nitrendipine, 3H-nimodipine and 3H-PN 200-110". Naunyn- Sc..m.iederberg's Arch. Pharmacol. 323: 276-277; Bellemann, P., Ferry, D.R., LUbbecke, F., Glossmann, H. (198): "3H-N- trendipine, a potent calcium antagonist binds with high affi- nity to cardiac membranes". Arzneim-Forsch (Drug Res) 31: 2064-2067; Ferry, D.R., Glossmann, H. (1982a): "Identifica- tion of putative calcium channels in skeletal muscle micro- somes". FEBS Lett 148: 331-337; Ferry, D.R., Glossmann, H. (1982b): "Evidence for multiple drug receptor sites within the putative calcium channel". Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 321: 80-83) décrivant en partie dans des articles de revue, l'utilisation de 1,4-dihydropyridines tritiées (activité spécifique d'environ 3 - environ 160 Ci/mmole) pour la caractérisation des sites de fixation (récepteurs) pcur ces médicaments. Les 1,4-dihydrcpyridines tritiées peuvent être utilisées d'après ces résultats pour le screening in vitro de nouvelles substances, pour élucider des effets secon- _aires déterminés de médicaments connus ou pour la détermina- tion du niveau plasmatique d'antagonistes du calcim Exemples: R.J. Gould, K.M.M. Murphy, I.J. Reynolds et S.H. Snyder Thioridazine: "Calcium channe: blockade may explain periphe- ral side effets". Americain J. Psychiatrics (sous presse et R.J. Gould, K.M.M. Murphy et S.H. Snyder: "A simple radio- receptor assay for calcium antagonist drugs". Life Sciences (sous presse)) . En outre, on utilise les 1,4-dihydropyridines tritiées pour la représentation autoradiographique de leurs récepteurs (par exemple Quirion, R. (1983): "Autoradio-graphic localization of a calcium channel antagonist, 3H-nitrendipine, binding site in rat brain" (Neuroscience Lett 36: 267-271). D'après l'état présent de la technique et les pres- criptions en vigueur pour l'élimination des déchets radio- actifs, les composés tritiés ne peuvent plus être considérés optimaux pour les exemples d'application précités. Les incon- vénients du 3H, par exemple par rapport au 125I sont le temps de demi-vie prolongé, l'activité spécifique relativement basse et, par suite, une sensibilité plus faible, la nécessité d'utiliser des scintillateurs organiques, la faible efficacité de comptage et la durée d'exposition prolongée pour des applications à l'autoradiographie. Les problèmes du marquage à haute radio-activité avec le 125I de substances qui servent par exemple d'hapténes et qui sont utilisées comme ligands dans un dosage radio- immunologique, sont représentés de façon exhaustive par J.E. Corrie et W.M. Hunter (Methods in Enzymology Vol. 73, Part B, Eds. J.L. Langone et H. van Vunakis, Academic Press. New York, Londres, Toronto, Sydney, San Francisco, 1981, pp 79-112). Il s'ensuit qu'il est de priorité absolue que le ligand prépa- ré soit analytiquement actif dans le domaine d'application prévu, que le marquage radio-actif soit reproductible, que le ligand présente une faible liaison non spécifique et qu'il puisse être conservé de façon stable pendant un temps prolongé (en jours, semaines, mois). Il existe fondamentalement trois voies pour effectuer la synthèse de ligands marqués au 125T staoDes: 1. (La voie la moins utilisée) Des réactions d'échan- ge d'halogène (par exemple Science 205, pp 1138-1140 (1979)). 2. Introduction du 125I dans des dérivés de phénol ou d'imidazole au moyen de la méthode à la chloramine T d'après Greenwood, Hunter et Glover ou par voie électrolytique ou à l'aide de lactoperoxydase (très fréquemment utilisée) et 3. L'introduction du 125I radio-actif par l'inter- médiaire d'une molécule porteuse. A peu d'exceptions près (par exemple antibiotiques de la série des amino-glycosides, Clonazépam, biotine, Bléomycine), cette troisième méthode, à savoir l'introduction du 125I radio-actif par l'intermédiaire d'une molécule porteuse, est décrite par exemple avec le 3-(4-hydroxyphényl)propionate de N-succinimidyle marqué au 125..12 i, p-hydroxybenzimidate de méthyle marqué au 125I et aniline diazotée marquée au 125I, pour des peptides et des protéines seulement ou par exemple pour l'héparine (J.J. Langone in; Methods in Enzymology Vol. 73, Partie B, Eds. J.L. Langone et H. van Vunakis, Academic Press, New York, Londres, Sydney, San Francisco, 1981, pp 112-127). La limitation décisive de la méthode résulte de la priorité absolue des propriétés imposée par J.E. Corrie et W.M. Hunter (voir ci-dessus): le ligand préparé doit être non seulement radio-actif, mais également pouvoir être utili- sable analytiquement. Il n'est ainsi nullement suffisant d'in- troduire par l'intermédiaire de l'un des procédés cités, en particulier le procédé 3, de l'iode radio-actif dans une molécule, mais le produit marqué doit être également caracté- risé par rapport à un anticorps agissant à son encontre, dans un dosage radio-immunologique et pouvoir être fixé avec une résistance de liaison suffisante. Les exigences structurelles, en particulier imposées aux sites de fixation spécifiques (récepteurs) du médicament, sont d'autant plus difficiles à satisfaire que la molécule à marquer par radio-activité est plus petite, lorsqu'un substituant radio-actif relativement grand modifie la structure par introduction d'une molécule porteuse à l'aide de la méthode 3. Ces difficultés expliquent qu'il n'existe pas jusqu'à présent de 1,4-dihydropyridines et 1,4-dihydroquinoléines marquées au 125I avec une radio-activité élevée, qui satisfont les critères nécessaires. Le but de l'invention est de réaliser des nouveaux dérivés de 1,4-dihydropyridine et dérivés de 1,4-dihydroqui- noléine marqués au 125I, qui en raison de leur structure se fixent dans différents tissus avec une haute affinité vis-à-vis de récepteurs de médicaments de cette classe de substances. L'objectif précité est atteint selon l'invention par les dérivés de 1,4-dihydropyridine et dérivés de 1,4- dihydroquinoléine marqués radio-activement qui répondent aux formules générales indiquées ci-après: R5 H R200 COO R1 R N R3 H et les dérivés de 1,4-dihydroquinoléine de formule générale 2COO R1 II H dans lesquelles R1 et R2 sont identiques ou différents et R est un groupe (A)-NH-C-(Y)-RX dans lequel A et Y sont respectivement un groupe alkyle à 1-6 atomes de carbone, linéaires ou ramifiés; et Rx est un reste phényle non substitué en position para par un halogène ou un reste imidazole additionné en position 4, 1 2 et lorsque R n'est pas identique à R R2 est un NO2, nitrile ou alcoxy à 1-4 atomes de carbone. R3 et R4 sont identiques ou différents et peuvent représenter H, NH2 ou des restes alkyle à 1-4 atomes de carbone, linéaires ou ramifiés, R est un reste aryle qui contient éventuellement un à deux substituants identiques ou différents choisis dans le groupe des restes alkyle, alcoxy, phényle, halogène, nitro, cyano, triflucrométhyle ou alkylmercapto, de préférence un reste phényle, naphtyle, thiényle ou furyle, R6 désigne un H, halogène, un reste alkyle ou alcoxy, dans lesdites formules le reste Rx étant encore substitué une ou JP5 deux fois par 125I, l'activité spécifique desdits composés s'élevant à environ 2.200 - environ 8.800 Ci/mmole. D'autres formes préférées de mise en oeuvre de l'invention, en particulier la préparation et l'application des nouveaux composés seront décrites ci-après. Le marquage radio-actif au 25I a lieu par introduc- tion d'un reste phényle ou d'un reste imidazole substitué une ou deux fois avec de l'iode radio-actif en des emplacements déterminés des dérivés de 1,4-dihydropyridine et de 1,4-dihy- droquinoléine. Le reste Rx marqué radio-activement est de préférence un reste des formules: I 1251 125I Y/5 OH ou N ou H I 25T ouou N3 ou H I H Les activités qui peuvent être en conséquence obte- nues se situent entre environ 2.200 et environ 8.800 Ci/mmole, suivant que le reste Rx est substitué une ou deux fois par le T et suivant que dans les dérivés de pyridine un ou deux restes Rx marqués sont introduits. De préférence, il y a lieu d'établir une activité de 2.200 à 6.600 Ci/mmole. Les dérivés ayant des activités d'environ 2.200 à environ 4.400 Ci/mmole sont préférés de façon tout à fait particulière du fait de leur stabilité distinctive. La synthèse des dérivés de 1,4-dihydropyridine et des dérivés de 1,4dihydroquinoléine conformes à l'invention est effectuée à partir de dérivés d'esters carboxyliques cor- respondants qui portent sur le groupe ester un groupe amino non subtitué terminal. La préparation du corps de base, aussi bien asymé- trique que symétrique, est décrite dans les demandes de brevets de la RFA publiées avant examen sous les n 2.117.573, 2.310.746 et 2.935.451. On fait réagir dans ce cas des aldéhydes de formule R5CHO, dans laquelle R5 est un reste aryle, qui contient éven- tuellement un à deux substituants identiques ou différents choisis parmi le groupe des restes alkyle, alcoxy, phényle, halogène, nitro, cyano, trifluorométhyle ou alkylmercapto, les restes alkyle ou alcoxy ou alkylmercapto étant des groupes inférieurs de ce type comportant 1-4 atomes de carbone, avec des esters d'acides J3-céto-carboxyliques de formule R4CO-CH2-C0O R2 et des esters d'acides énaminecarboxyliques de formule: R3- CH-COO R7 en présence d'eau ou de solvants NH2 organiques inertes à des températures comprises entre 30 C et 2000C. R7 est, dans ces cas, un groupe alkyle à 1-6 atomes de carbone linéaires ou ramifiés, de préférence méthyle ou é- thyle, qui, à la différence des composés décrits dans les docu- ments de la littérature, porte en position terminale un groupe amino primaire. R2 peut être égal à R1 ou être un NO2, nitrile ou alcoxy à 1-4 atomes de carbone. R3 et R4 sont identiques ou différents et désignent un reste H, NH2 ou alkyle à 1-4 atomes de carbone linéaires ou ramifiés. Pour la préparation des dérivés de 1,4-dihydroquino- léine, on part d'alcolls 2-aminobenzyliques de formule: H C-R OH R6 et on fait NH2 et on fait réagir ceux-ci avec des composés -dicarbonyliques de formule: CO R7 CH2 C O R3 en présence de solvants organiques inertes à des températures comprises entre 20 et 200 C. R3, R5 R7 sont définis comme déjà spécifié ci-dessus. R6 est un H, halogène, alkyle ou alcoxy ayant respectivement 1-4 atomes de carbone, de préférence mé- thyle, éthyle, méthyloxy ou éthyloxy. Comme composés acylants destinés à incorporer le reste Rx marqué radio-activement, on se sert d'esters succini- midiques marqués au 125i de formule: X _/NO-c-(Y)-Rx dans laquelle Y est un groupe alkyle à 1-6 atomes de carbone, de préférence à 1, 2 ou 3 atomes de carbone, linéaire ou rami- fié et Rx est défini comme spécifié ci-dessus, et dans laquelle ce reste est substitué une ou deux fois par le 125Io La réaction a lieu, comme décrit par J.J. Langone dans Methods in Enzymology Vol. 70, pages 221-243 (1980), dans des conditions modérées entre 0 C et 25 C dans l'intervalle de 5 minutes ou davantage dans un solvant approprié, de préfé- rence dans le domaine alcalin, par exemple avec addition d'un tampon au borate de sodium, pH 8,4-8,5. On sépare les produits de réaction par voie prépara- tive au moyen d'un procédé chromatographique (chromatographie en phase liquide sous pression élevée HPLC ou chromatographie sur couche mince), on reprend les dérivés de dihydropyridine et de dihydroquinoléine conformes à l'invention dans le benzène ou l'éthanol absolu et on les conserve à 20 C à l'abri de la lumière et de l'oxygène. Les dérivés présentent l'activité spécifique de l'ester succinimidique utilisé. Celle- ci se situe de préférence entre 2.200 et 4.400 Ci/mmole. La détermination de la pureté radiochimique a lieu par des méthodes chromatographiques courantes (chromatographie en phase liquide sous pression élevée HPLC ou sur couche mince). Avec les mêmes procédés, on peut également effectuer les essais de stabilité nécessaire dans les conditions de l'utilisation des composés de l'invention pour leur expérimentation comme médica- ments. On soumet dans ce cas les dérivés de 1,4-dihydropy- ridine et de 1,4-dihydroquinoléine marqués au 125I au dosage dit des récepteurs (tampons, température augmentée entre 25 C et 37 C) en présence d'homogénéisats tissulaires, de plasma et de fractions de membranes. On mesure la fixation spécifique. Celle-ci est définie en tant que différence de fixation du déri- vé marqué en l'absence et en la présence de 1 mole/i d'un a- gent pharmaceutique d'une structure à action comparable ou ana- logue. On effectue la séparation des dérivés marqués au 125I respectivement fixés et libres par une technique de filtration courante, telle que décrite par exemple par J.P. Bennett: "'Methods in binding studies", dans: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds H.J. Yamamura, S.J. Enna et M.J. Kuhar, Raven Press, N.Y. 1978 pp 57-90). Pour la séparation entre le ligand libre et le ligand 1 1 lié, on utilise un tampon à 10 mM de TRIS HCl refroidi à la glace, de pH 7,4 additionné de 10 % (en poids/volume) de poly- éthylèneglycol 6000, 20 mM de MgCl2 (3,5 ml), on dilue l'échan- tillon, on l'essore sous vide sur un filtre en fibres de verre et on lave consécutivement le filtre en fibres de verre deux fois avec 3,5 ml du même tampon. Consécutivement, on mesure la radio- activité liée aux particules qui est retenue sur le filtre. Les dérivés marqués de l'invention sont des agents particulièrement avantageux pour l'expérimentation des médica- ments par des essais in vitro et conviennent pour la represen- tation autoradiographique des sites de fixation ou récepteurs de médicaments et pour la détermination du niveau plasmatique sanguin des médicaments actifs sur les canaux d'apport de cal- cium tels que des antagonistes de Ca. Les avantages obtenus grace à l'invention sont les suivants: On considère que les ligands marqués au 125I sont préférables, par comparaison avec des composés tritiés, pour des domaines d'application tels que décrits par le déposant, car 1. La radio-activité spécifique du 125I est nette- ment plus élevée (jusqu'à 100 fois) que celle du tritium, 2. La radioactivité peut être déterminée de façon moins coûteuse (aucun besoin de scintillateurs), 3. Aucun déchet de solvant organique qui doive être éliminé comme dans le cas du tritium, 4. On obtient une sensibilité plus élevée dans le dosage radio-actif des récepteurs, 5. L'évacuation du déchet radio-actif ne pose pas de problème en raison de la durée de demivie plus courte du 125T (60 jours par comparaison avec 12 années), 6. Des temps d'exposition plus courts (1-2 jours seulement au lieu de 30-90 jours) sont nécessaires pour la re- présentation autoradiographique, 7. La préparation est possible à i'échelle industriel- le et, en outre, elle est simple et reproductible, et 8. Les coûts de préparation sont très nettement inférieurs à ceux des composés tritiés. Lorsqu'on prépare des dérivés de 1,4-dihydropyridine asymétriques, en procédant à la synthèse de composés dans les- quels les restes R1 et R2 ne sont pas identiques, il se forme un racémate. Les diastéréoisomères produits en raison des deux configurations possibles sur l'atome en C4 du noyau dihydropy- ridine peuvent être séparés par des méthodes courantes connues. Selon que les deux configurations ou seulement l'uned'elles doivent être marquées radio-activement, on peut effectuer la séparation avant ou après la réaction avec l'ester succinimidique. Une séparation préalable du mélange est toutefois particulière- ment avantageuse pour pouvoir marquer respectivement la forme désirée. L'avantage particulier réside dans le fait que les deux diastéréoisomères présentent un comportement de fixation diffé- rent vis-a-vis des récepteurs, si bien que des différences sont possibles. Exemple 1 On fait réagir le 1,4-dihydro-2,6-diméthyl-4(2- trifluorométhylphényl)pyridine 3,5-dicarboxylate de 2-amino- éthyle avec un ester monoiodo-succinimidique marqué une fois au 1251 selon l'équation suivante C _ CF3 H N(H C) OOC t COO0-(CH2)2-NH2 X OH N Ik H 1t5I C 1 2 3 \ (CH2)2C-HN-(Co) 22oc-'C C0>>^NO CH 3 H3 + 2 N-OH On prépare l'ester succinimidique selon Bolton et Hunter (Biochem. J. (1973) 133, 529-533) ou d'une manière dif- férente on se le procure auprès de la firme Amersham-Buchler (Brunswick), ce composé ayant une activité spécifique d'environ 2.200 Ci/mmole. Préparation du 125iodo [1,4-dihydro-2,6-diméthyl-4- (2-trifluorométhylphényl)pyridine 3,5-dicarboxylate de (2-(1- (3-iodo-4-hydroxyphényl)-3-oxo-propyl)amino)-éthyle] (sous lumière au sodium): On sèche 0,90 nmole (k I mCi) de l'ester succinimi- dique (dans le benzène) sous un courant d'azote et on y ajoute 2,5 nmoles de l'ester aminoéthylique de 1l4-dihydropyridine dans M1 d'éthanol absolu. Apres addition de 5 pl d'un tampon au borate de sodium à 100 mmoles/l (pH 8,4) et incubation pendant minutes sur de la glace, on sépare les produits de réaction Far voie préparative au moyen de la chromatographie sur couche mince sous lumière au sodium. On utilise comme éluant l'acétate d'éthyle, éther diéthylique (30:70 en volumes) et comme substrat le gel de silice Silikagel 60 (mis sur le marché par la firme Merck AG, Darmstadt). Le dérivé iodé de 1,4-dihydropyridine passe dans cet éluant, tandis que l'éther aminoéthylique de 1,4-dihydropyridine n'ayant pas réagi demeure sur la zone de départ. On extrait le dérivé de l'invention avec de l'éthanol absolu et on le conserve dans du benzène ou de l'éthanol absolu à - 20 C (sous exclusion d'oxygène et protégé contre la lumière). Le dérivé de 1,4-dihydropyridine marqué au 125I, qui est obtenu avec un bon rendement (40 10 %; valeur moyenne + écart type sur trois lots, de la radio-activité introduite) possède ainsi l'activité spécifique correspondant à celle de l'ester succi- nimidique utilisé (environ 2.200 Ci/mmole), à savoir 4.400 Ci/mmole. L'essai de contrôle de la pureté radio-chimique a lieu par des procédés courants (chromatographie en phase liquide sous pression élevée HPLC chromatographie sur couche mince). Exemple 2 On fait réagir la 1,4-dihydro-2,6-diméthyl-4-(2- trifluorométhylphényl)-3-carbéthoxy-5-carbo-(2-amino)éthoxypyri- dine avec un ester monoiodosuccinimidique marqué une fois au 125I. L'ester succinimidique est le même que celui de l'Exemple 1 et a une activité spécifique d'environ 2.200 Ci/mmole. Préparation de la 125iodo I1,4-dihydro-2,6-diméthyl- 4-2-trifluorométhylphényl)-3-carbéthoxy-5-carbo-(2-(1-(3-iodo- 4-hydroxyphényl)-3-oxo-propyl)amino)-éthoxypyridine] sous lu- mière au sodium: on procède essentiellement comme dans l'Exemple 1, en n'utilisant toutefois que 1 mole d'ester succi- nimidique par mole d'ester aminoéthylique. On sèche 0,45 nmole (- 1 mCi) de l'ester succinimi- dique (dans le benzène) sous un courant d'azote et on y ajoute 2,5 nmoles de l'ester aminoéthylique de 1,4-dihydropyridine dans 5 tl d'éthanol absolu. Après addition de 5 tl de tampon au borate de sodium à 100 mmoles/l (pH 8,4) et incubation pen- dant 20 minutes sur de la glace, on sépare les produits réac- tionnels par voie préparative à l'aide d'une chromatographie sur couche mince sous lumière au sodium. Comme éluant, on utilise l'acétate d'éthyle, éther diéthylique (32:70 en volumes) et comme substrat, du gel de silice Silikagel 60 (mis sur le marché par la firme Merck AG, Darmstadt). La 1,4dihydropyridine iodée a une valeur RF de 0,35 dans cet éluant, tandis que l'éther ami- noéthylique de 1,4-dihydropyridine n'ayant pas réagi demeure sur la zone de départ. On extrait le dérivé de l'invention avec de l'éthanol absolu et on le conserve dans le benzène ou dans l'éthanol absolu à - 20 C (sous exclusion d'oxygène et protégé de la lumière). Le dérivé de 1,4dihydropyridlne marqué au 125I qui est obtenu avec un bon rendement (40 + 10 %; valeur moyenne - écart type sur trois lots, de la radio-activité introduite) possède ainsi l'activité spécifique correspondant à ceile de l'ester succinimidique utilisé (environ 2.200 Ci/mmole), à savoir 2.200 Ci/mmole. Le contr8le de la pureté radiochimique a lieu par des procédés courants (chromatographie en phase li- * quide sous pression élevée HPLC; chromatographie sur couche mince;. Application du dérivé préparé comme ci-dessus à essai des médicaments: On sèche dans un courant d'azote des fractions ali- quotes de la 1,4-dihydropyridine obtenue et marquée au 125I, on les fait incuber avec un tampon (50 mM de TRIS-HC1, pH 7,4 additionné de l'inhibiteur de protéase (0,1 mmole/l) constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle) et des fractions membraneuses prélevées sur le cerveau, le muscle cardiaque et le muscle squelettique du cochon d'Inde (préparées, comme décrit dans Drug Development 9: 63-98 (1983); NaunynSchmiedeberg's Arch. Pharmacol. 321: 80-83 (1983) et FEBS Lett 148: 331337 (1982))à 25 C en volumes de 0,1 ml jusqu'à l'obtention de l'é- quilibre et on mesure la fixation spécifique (définie comme dif- férence de fixation de la 1,4-dihydropyridine marquée au 25I en l'absence et en présence de 1 pmole/l de Nimodipine) au moyen de la technique de filtration (pour la séparation de la 1.4-dihydropyridine marquée au 125I liée et libre). Pour la séparation entre le ligand libre et le ligand lié, on utilise 10 mM de tampon TRIS-HC1, pH 7,4 refroidi à la glace, addition- né de 10 % (poids/volume) de polyéthylèneglycol 6000, 20 mM de MgCl2 (3,5 ml), on dilue l'échantillon, on l'essore sous vide sur un filtre en fibres de verre et on lave consécutivement ie filtre en fibres de verre deux fois avec 3,5 ml du même tampon. Consécutivement, on mesure la radio-activité liée aux particules qui est retenue sur le filtre. La figure 1A représente, à titre d'exemple, l'analyse de saturation (domaine des concentrations du dérivé de 1,4dihydropyridine marqué au 125I libre: 17-1276 pmoles/l) des récepteurs de 1,4-dihydropyridine dans des mem- branes cérébrales de cochon d'Inde (20!-g de protéine membra- neuse par charge d'essai) à l'aide du dérivé de 1,4-dihydropy- ridine marqué au 125I. Sur la figure 1A, on a reporté la dépendance mesurée de la concentration du ligand lié en fonction de la concentra- tion du ligand libre, et sur la figure lB la transformation des valeurs de fixation d'après G. Scatchard (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 660-6?2, 1949), pour laquelle B = concentration du ligand lié, F = ligand libre, K est la constante de dissociation à D l'équibilre et Bmax est la concentration des sites de fixation présentant une affinité élevée dans la charge d'essai. Pour le calcul de la concentration du ligand libre, on utilise la for- mule suivante: (T a) - B, dans laquelle T est la concentra- tion totale du ligand, a est un facteur qui décrit le pouvoir de fixation du ligand, et B est la concentration du ligand lié ou fixé de façon spécifique à l'équilibre. On détermine expéri- mentalement le facteur a par saturation du ligand radio-actif aux sites de fixation (récepteurs) (décrite dans FEBS Lett. 148, 331-337, 1982; Naunym Schmiedeberg's Arch Pharmacol 321, 7-10, 1982). Le facteur "a" est de 0,5 pour le dérivé de 1,4-dihydro- pyridine asymétrique, ce qui concorde avec la faculté théorique- ment exigée pour le récepteur de distinguer les énantiomères (R) et (S) de la 1,4-dihydropyridine marquée au 125I (stéréo- spécificité de la fixation). La 1,4-dihydropyridine marquée au !25I est le miélange racémique des énantiomères (R) et (S). Pour des membranes du muscle (non représentées) on trouve une cons- tante de dissociation de 350 pmoles/l (25 C). On contrôle la stabilité de la 1,4-dihydropyridine marquée au 125I dans les conditions suivantes avec les procédés courants (chromatrogra- phie en phase liquide sous pression élevée HPLC, chromatographie sur couche mince): tampon 50 mM de TRIS-HCl, pH 7,4, 25 C, 4 heures; membranes du muscle dans le tampon, 25 C, 4 heures; ainsi que conservation dans le benzène ou l'éthanol absolu à - 20 C pendant un temps allant jusqu'à 21 jours après la prépa- ration du ligand. En aucun cas les impuretés radiochimiques sont supé- rieures à 10 %. Conclusions: La 1,4-dihydropyridine marquée au 125I se fixe avec une constante de dissociation inférieure à 1 nmole/l à 25 C sur des membranes de cerveau et des membranes du muscle sque- lettique du cochon d'Inde. Elle est d'une stabilité suffisante. Exemnle 3; D'une manière analogue à celle de l'Exemple 2, on prépare un dérivé de 1,4-dihydroquinoléine. On fait réagir le 1,4-dihydro-2-méthyl-4-(2-trifluo- rcméthylphényl)-3-quinoléinecarboxylate de (2-amino)-éthyle avec le même ester succinimidique que dans l'Exemple 1. On sépare les produits de réaction par chromatogra- phie sur couche mince sous lumière au sodium. On extrait le dérivé de l'invention séparé avec de l'éthanol absolu et on le conserve dans ce solvant ou dans du benzène à 20 C à l'abri de la lumière et de l'oxygène en vue de son utilisation. L'activité spécifique de l'ester succinimidique utilisé s'élevant à envi- ron 2.200 Ci/mmole est transférée. On contrÈle la pureté radio- chimique par voie chromatographique. Exemple 4: o Le tableau 1 montre les résultats d'expériences de compétition. Les valeurs du tableau 1 sont des valeurs moyennes (- écart type asymptotique) de trois expériences indépendantes dans lesquelles on utilise, comme agent compétiteur, différents antagonistes du calcium et dérivés ou précurseurs d'antagonistes du calcium avec la 1,4-dihydropyridine marquée au 125i ("ligand") obtenue selon l'Exemple 2. Comme matériel récepteur, on se sert de membranes du muscle squelettique du cochon d'Inde. La concen- tration du ligand marqué est de 20-30 pmoles/l, la température d'essai est de 25 C, on utilise 6-9 concentrations différentes des substances soumises à l'essai (dans;chaque cas en double), et on adapte de façon optimale les valeurs de fixation mesurées au moyen d'un programme d'ordinateur (DeLean A, Munson PJ, Rodbard D (1978). "Simultaneous analysis of families of sigmoid curves: application to bioassay, radioligand assay and physio- logical dose-response curves". Am J. Physiol. 4 E97-E102). On étudie comme critère important de la fixation sur le récepteur de la 1,4-dihydropyridine marquée au 125I du groupe 1, la sté- réospécificité de la fixation pour des 1,4-dihydropyridines chirales. Dans le groupe 2 se trouvent deux 1,4-dihydropyridines qui peuvent activer les canaux d'apport de calcium, dans le o10 groupe 3 on trouve deux 1,4-dihydropyridines qui ne sont que faiblement actives en tant qu'agents de blocage des canaux d'apport de calcium, dans le groupe 4 on trouve les énantiomères du Vérapamil et du Méthoxyvérapamil, dans le groupe 5 on trouve deux diastéréoisomères du Diltiazem, et dans le groupe 6 on trouve un antagoniste inorganique du calcium. La valeur CI50 est la concentration de la substance qui exerce une inhibition à 50 % de la fixation spécifique du ligand au cours du dosage radio-actif des récepteurs. Dans le cas du d-cis-Diltiazera, on effectue la mesure à 37 C et on détermine la valeur CE50. La valeur CE50 est la concentration de la substance qui stimule à la moitié de la valeur maximale la fixation spécifique du ligand. Conclusion: La 1,4-dihydropyridine marquée au 125I ("ligand") est utilisable pour le dosage radio-actifodes récepteurs. TABLEAU 1 CONSTANTES DE FIXATION POUR LES COMPOSES NON MARQUES EVALUEES AVEC LA 1,4-DIHYDROPYRIDINE MARQUEE AU 125I PREPAREE SELON L'EXEMPLE 2 GROUPE SUBSTANCE CI50 nmoles/1 (+) 205-033 2 0,05 (-) 205-034 198 40 1. (-) Bay e 6927 3 0,04 (+) Bay e 6927 420 67 (+) Nicardipine 7 0, 8 (-) Nicardipine 42 3 2. Bay K 8644 37 X 5 CGP 28392 1250 180 3. Bay M 5579 1860 300 Vo 2605 320 35 (-) Méthoxyvérapamil 21 + 8 (+) Méthoxyvérapamil 190 50 (-) Vérapamil 98 22 (+) Vérapamil 54 12 5. d-cis-Diltiazem 960 310 1-cis-Diltiazem 3000 1600 6. La3+ 110000 20000 Les substances individuelles sont: (+) 205-033: énantiomère (+) du PN 200-110 (4-(2,1,3-benzoxadia- zol-4-yl)-1,4-dihydro-2,6-diméthyl-5-méthoxycarbonylpyridine- 3-carboxylate d'isopropyle) (-} 205-034: énantiomère (-) du PN 200-110 (4(2,1,3-benzoxa- diazol-4-yl)-1,4-dihydro-2,6-diméthyl-5-méthoxycarbonyipyridine -3-carboxylate d'isopropyle) (+) Bay e 6927: énantiomère (+) du Bay e 6927 (1,4-dihydro- 2,6-diméthyl-4-(3-nitrophényl)-3,5-pyridinedicarboxylate d'iso- propylméthyle) (-) Bay e 6927: énantiomère (-) du Bay e 6927 (1,4-dihydro2,6 -diméthyl-4-(3-nitrophényl)-3,5-pyridinedicarboxylate d'isopro- pylméthyle) (+) énantiomère de la Nicardipine (acide 2,6-diméthyl-4-(3- nitrophényl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylique 3-2(N-benzyl- N-méthylamino)éthylester 5-méthylester) (-) énantiomère de la Nicardipine (acide 2,6-diméthyl-4-(3- nitrophényl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylique 3-2(N-benzyl- N-méthylamino)éthylester 5-méthylester) Bay K 8644: 1,4-dihydro-2,6-diméthyl-4-(2-trifluorométhyl- phényl)-pyridine-3,5-dicarboxylate de 2-(aminoéthyl) éthyle CGP 28392: (4-(2-difluorométhoxy)phényl-1,4,5,7-tétrahydro- 2-méthyl-5-oxofuro(3,4-b)pyridine-3-carboxylate d'éthyle Bay M 5579: dérivé de Nitrendipine à groupe carboxyle libre (voir TIPS 3: 431-437; 1982) VO 2605: dérivé bromé du PN 200-110 (voir Drug Development 9: 63-98; 1982) Exemple 5: La figure 2 montre une courbe d'étalonnage pour la détermination de la 1, 4-dihydropyridine désignée sous le nom de Nitrendipine dans le plasma humain. A cet effet, on ajoute de la Nitrendipine à du EDTA-plasma d'une personne à jeun soumise a l'essai, et on le dilue avec du plasma. On ajoute aux diffé- rentes dilutions plasmatiques (10 pl) dans une charge d'essai de 0,25 ml, des membranes de muscle squelettique (de cochons d'Inde) (20 pg de protéines) et on ajoute la charge dans chaque cas au dérivé de 1,4dihydropyridine marquée au 125I (20 pM, préparé comme indiqué dans la description ci-dessus), puis on mesure la fixation spécifique après établissement de l'équilibre (deux heures) au moyen de la méthode de filtration courante in- diquée dans l'Exemple 2. Avec la méthode courante de la trans- formation logit-log (D. Rodbard et G.R. Frazier dans: Methods in Enzymology, Vol. 37, Partie B, eds. O'Malley et J.G. Hardman, Academic Press, New York, San Francisco, Londres, pp 1-22, 1975), on reporte les valeurs de la fixation spécifique (points) en fonction de la concentration de Nitrendipine préétablie dans le plasma initial. La courbe étalon obtenue (lignes en trait plein) est une droite pour les concentrations de Nitrendipine qui in- hibent la fixation spécifique du ligand marqué au 125I par com- paraison avec le plasma témoin (= sans Nitrendipine) à raison de 15 et 85 %. Conclusion: Le dérivé de 1,4-dihydropyridine marquée au 125I per- met la détermination des antagonistes du calcium dans le plasma sanguin au moyen du dosage radio-actif des-récepteurs. La sen- sibilité est suffisante, car les concentrations thérapeutiques courantes, par exemple pour le dérivé de 1,4-dihydropyridine connu sous le nom de Nifédipine, se situent entre 70 et 200 nmoles/l de plasma. Les exemples montrent la préparation et l'application des dérivés de 1,4dihydropyridine de l'invention comme réactifs d'essai pour l'expérimentation des médicaments. On trouve une action analogue pour les dérivés de 1,4-dihydroquinoléine de l'invention. Du fait de la possibilité de disposer d'un nombre différent de substituants 125I sur le reste Rx à savoir une ou deux fois, et de la possiblité encore présente dans le cas des dérivés de dihydropyridine symétriques de faire réagir une ou deux molécules d'ester succinimidique avec une molécule de dérivé ester d'acide dihydropyridinecarboxylique, le procédé de l'invention ouvre dans tous les cas une voie de marquage suffi- sante et l'adaptation de celle-ci aux exigences spécifiques de structure en vue de la synthèse de composés stables. Les récepteurs sont en mesure de ne fixer que des structures molécularies déterminées. Le grand choix des possi- bilités de substitution sur le squelette de la 1,4-dihydropyri- dine et de la 1-4-dihydroquinoléine permet de préparer les com- posés marqués au 125I convenant pour la fixation sur tous les récepteurs courants et connus de cette classe de substances. REVENDICATIONS 1 - Dérivés de 1,4-dihydropyridine et dérivés de 1,4-dinydroquinoléine marqués radio-activement, caractérisés par le fait qu'ils sont constitués par les dérivés de 1,4- dihydropyridine de formule générale suivante: R5.H R200 C COO R1 I 4: 1 R3 H R et les dérivés de 1,4-dihydroquinoléine de formule générale suivante R5 H COO R1 /I NR3 R6/ dans lesquelles R1 et R2 sont identiques ou différents et R est un groupe: 0 (A) -NH-t-(Y)-Rx dans lequel A et Y sont resDectivement un groupe alKyle 6 atome de carbone, linéaire ou ramifié et Rx est un reste phényle non substitué en position para par un halogène ou un reste imi- dazole additionné en position 4, et lorsque R1 n'est pas iden- tique à R2 R2 est un NO2, nitrile ou alcoxy à 1-4 atomes de carbone, R3 et R4 sont identiques ou différents et peuvent représenter H, NH ou des restes alkyle à!-4 atomes de carbone, linéaires ou ramifies, R5 est un reste aryle qui contient éven- tueilement un à deux substituants identiques ou différents choi- sis dans le groupe des restes alkyle, alcoxy, phényle. halogène. nitro, cyano, trifluorométhyle ou alkylmercapto, de préférence un reste phényle, naphtyle, thiényle ou furyle, R6 désigne un reste H, halogène, alkyle ou alcoxy, dans lesdites formules le reste Rx étant encore substitué une ou deux fois par l'iode125 l'activité spécifique desdits comosés s'élevant à environ 2.200 - environ 8.800 Ci/mmole. 2 - Dérivés de 1,4-dihydropyridine et dérivés de 1,4-dihydroquinoléine marqués radio-activement selon la reven- x dication 1, caractérisés par le fait que R est 125I 125i 125I 4 \9 o t/ " ou X / \PH j 125I12I 25 H ou ou H 21 51 3 - Dérivés de 1,4-dihydropyridine et dérivés de 1,4- dihydroquinoléine marqués radio-activement selon la revendica- tion 1 ou 2, caractérisés par ie fait que R5 est un reste phényle qui est éventuellement substitué une ou deux fois par un nitro, cyano, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, fluor, chlore, brome. 4 - Procédé de préparation de dérivés de 1,4-dihydro- pyridine et de dérivés de 1,4-dihydroquinoléine marqués radio- activement, caractérisé par le fait que l'on fait réagir dans un solvant, sous refroidissement et dans l'obscurité, un ester d'acide 1,4dihydropyridinecarboxylique de formules: R5 H R200C COO-(A- NH R5NH H2RN-+A)OOC COO(A4-NH2 IIV R4 N R3 ou. H2N---A)00C ACO 0 (A--N H2I R H ou un ester d'acide 1,4-dihydroquinoléinecarboxylique de for- mule: R5. H COO(A±--NH2 V N R3 R6 H dans lequelles R2 est NO2, un nitrile ou un alcoxy à 1-4 atomes de carbone, R3 et R sont identiques ou différents et sont un reste H, NH2 ou alkyle à 1-4 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, A est un groupe alkyle à 1-6 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, R5 est un reste alkyle qui contient éventuellement un à deux substituants identiques ou différents choisis dans le groupe des restes alkyle, alcoxy, phényle, halogène, nitro, cyano, trifluorométhyle ou alkylmercapto, de préférence un reste phényle, naphtyle, thiényle ou furyle, R6 désigne un reste H, halogène, alkyle ou alcoxy, avec des composés acylants marqués à 125I ayant une activité spécifique de 2.200-4.400 Ci/mmole de formule - 0 - C - (Y) - R / dans laquelle (Y) est un groupe alkyle à 1-6 atomes de carbone linéaire ou ramifié et Rx est un reste phényle non substitué en position para par un halogène ou un reste imidazole addition- né en position 4, qui est encore substitué une ou deux fois par 125I et on sépare le dérivé de 1,4-dihydropyridine ou le dérivé de 1,4dihydroquinoléine marqués radio-activement au moyen d'une chromatographie préparative sur couche mince ou par chromatographie en phase liquide sous haute pression (HPLC). - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que, dans les composés acylants, Rx est 1251 1251 125I / _OH ou /3 ou OH ou N OU 3 o NH I 6 - Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé par le fait que R5 est un reste phényle qui est éventuellement substitué une ou deux fois par un nitro, cyano, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, fluor, chlore, brome. 7 - Application des dérivés de 1,4-dihydropyridine et des dérivés de 1,4dihydroquinoléine marqués radio-activement selon l'une des revendications 1 à 6, à l'expérimentation des médicaments au moyen de récepteurs par dosages radio-actifs de récepteurs. 8 - Application selon la revendications 7 dans des essais in vitro de représentation autoradiographique de sites de fixation ou récepteurs de médicaments. iO 9 - Application selon la revendication 7 dans des essais in vitro pour la détermination du niveau plasmatique de médicaments actifs sur les canaux d'apport de calcium.