Brevet FR2559502A1 — publié le 19850816

La présente invention concerne de façon générale l'encapsulation de matériaux d'âme, contenant des cellules viables, dans un volume interne à des capsules délimitées par des membranes semi-perméables. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de préparation de grandes quantités de capsules ayant des membranes uniformes, avec un réglage facile de la porosité destiné à favo- riser la croissance des cellules à l'intérieur des capsules. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883 décrit un procédé fondamental d'encapsulation de matériaux constituant des âmes, y compris des cellules viables, à l'intérieur de capsules ayant des membranes semi- perméables. Des cellules viables encapsulées selon ce procédé peuvent présenter un métabolisme normal, y compris une mitose, et peuvent sécréter des matériaux qu'elles sécréteraient normalement sous forme non encap- sulée. Les capsules réalisées par cette technique peuvent être préparées afin que leurs membranes soient perméables aux molécules de masse moléculaire inférieure à une valeur particulière mais soient pratiquement imperméables aux molécules de poids moléculaire plus élevé et aux cellules. Les pores des membranes sont sans doute formés de trajets sinueux délimités par les interstices de la structure de la membrane. Le passage des molécules de masse moléculaire supérieure à une valeur particulière est empêché par les pores sinueux et, au-delà d'une certaine masse moléculaire plus élevée et d'une dimension moléculaire efficace correspondante, cet empêchement est suffisamment important pour que la membrane soit pratiquement imperméable à ces molécules. Le réglage de la porosité est un facteur impor- tant dans un certain nombre d'appplications importantes de telles microcapsules. La membrane des microcapsules peut être utilisée pour une filtration différentielle, c'est-à-dire pour une séparation de molécules en fonction de leur masse moléculaire. Ainsi, le brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4 409 331 décrit un procédé selon lequel des substances sécrétées par des cellules placées à l'intérieur de la capsule peuvent traverser la membrane alors que d'autres matériaux de masse moléculaire plus élevée, sont confinés à l'intérieur des capsules. Ces capsules peuvent ainsi simplifier beaucoup la collecte d'une substance intéressante. Les substances intéres- santes de faible masse moléculaire peuvent diffuser à travers la membrane, vers le milieu qui entoure les capsules, alors que les débris de cellules, et les impuretés et substances de masse moléculaire élevée, par exemple les cellules pyrogènes, -sont piégées à l'intérieur du volume des capsules. Les propriétés de filtration sélective de la membrane des capsules permet aussi à ces dernières d'être utilisées pour la croissance in vivo de souches auxiliaires d'hybridomes. La membrane des capsules permet aux hybridomes des souches auxiliaires de croître dans une cavité du corps d'un animal dont le système immunitaire attaquerait normalement les hybridomes. Une conception astucieuse des propriétés de perméabilité des membranes permet une collecte de la substance sécrétée avec une spécificité élevée. Un réglage efficace de la perméabilité des membranes permet aussi l'utilisation de capsules implan- tées contenant des cellules qui sécrètent un antigène comme agent immunisant. Les propriétés de filtration de la membrane permettent l'obtention d'un antigène relativement pur comme agent immunisant, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un procédé fastidieux de purification d'anticorps, et elles peuvent conduire à la stimulation d'une production d'anticorps spécifi- ques. Des capsules ayant de telles membranes peuvent aussi être utilisées dans le cadre d'une opération de filtration de cellules. Le milieu externe aux capsules est testé afin qu'une substance sécrétée à travers la membrane soit déterminée. Des impuretés de masse moléculaire supérieure à celle de la substance restent dans la capsule si bien que les résultats positifs erronés sont réduits. Un mode de réalisation préféré de la technique précitée d'encapsulation du brevet des Etats-Unis d'Amé- rique n 4 352 883 comprend la formation de masses gélifiées gardant leur forme et contenant le matériau à encapsuler, puis le dépôt d'une membrane à la surface des masses gélifiées. La membrane est formée lorsque. des matériaux de masse moléculaire relativement élevée viennent au contact des masses gélifiées et forment des liaisons ioniques de réticulation avec le gel. Ce brevet indique que des polymères de masse moléculaire relativement faible, assurant la réticulation, s'infil- trent plus dans la structure des masses gélifiées si bien que la dimension des pores est réduite. Le brevet indique aussi que la durée de formation de la membrane affecte la dimension des pores. Pour une paire déterminée de réactifs, plus la solution du polymère de réticulation est exposée longtemps à la masse gélifiée et plus la membrane est épaisse et peu perméable. Bien que les techniques de réglage de porosité et de formation de membranes décrites dans le brevet précité des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883 permettent la formation de membranes acceptables, de nombreuses applications précitées de la technologie des capsules pourraient être améliorées si les membranes permettaient le réglage de la porosité et avaient une meilleure unifor- mité. Les techniques de réglage de porosité décrites dans ce document précité ne permettent pas un réglage fin de la porosité de la membrane, mais fixent au con- traire des limites grossières de filtration différen- tielle. Il est aussi important, en plus de la porosité améliorée, que les microcapsules puissent être préparées en grand nombre de matières reproductibles, avec des membranes sans défaut, dans des applications indus- trielles. A cet égard, des membranes formées par les techniques décrites ont parfois des parties en saillie contenant des cellules ou ont des cellules fixées Bur les capsules. Les techniques décrites permettent aussi la formation de capsules ayant des cavités qui permet- tent aux cellules, aux substances intéressantes ou à des impuretés indésirables de s'échapper de la capsule. Lorsqu'une petite fraction des microcapsules préparées dans un but particulier a des cavités dans la membrane, de nombreux avantages et propriétés des procédés mis en oeuvre disparaissent. Ainsi, des modifications des opérations d'encapsulation, favorisant l'uniformité des membranes et évitant les défauts aléatoires, sont avantageuses pour la mise en oeuvre industrielle de nombreux procédés tels qu'indiqués précédemment. L'invention concerne donc un réglage perfectionné de la porosité des membanes des microcapsules. Elle concerne aussi la formation de membranes très uniformes. Elle concerne un procédé permettant la formation de membranes rendant optimales la croissance cellulaire et la sécrétion des substances produites par les cellules. Elle concerne aussi un procédé de préparation de membranes perméables de capsules ayant des limites de perméabilité très précises et permettant une reproduction précise de ces limites. Plus précisément, l'invention porte sur un perfectionnement à la technique décrite dans le brevet précité des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883, permet- tant l'encapsulation d'un matériau d'âme dans un volume interne à des capsules délimité par une membrane. La mise en oeuvre de l'invention permet l'obtention d'une très bonne uniformité des membranes et d'un très bon réglage de la porosité, si bien que les capsules convien- nent très bien à la culture de cellules. Comme décrit dans le brevet précité des Etats- Unis d'Amérique, le matériau d'âme est mis en suspension dans une solution d'un polymère polyanionique hydrosoluble qui peut être gélifié, et la suspension du matériau d'âme et du polymère est mise sous forme de gouttelettes ou d'autres éléments séparés. Les gouttelettes sont alors exposées immédiatement à une solution de cations polyvalents qui forment des masses gélifiées hydratées molles et gardant leur forme. Selon l'invention, les masse gélifiées subissent ensuite une expansion et une hydratation supplémentaires par mise en contact avec une solution aqueuse qui retire une partie des cations polyvalents, par exemple une solution saline. Une membrane est ensuite formée autour de chacune des masses gélifiées expansées par réaction entre des groupes anioniques de l'hydrogel du polymère polyanionique et des groupes cationiques d'un polymère polycationique ayant une masse moléculaire de préférence supérieure à 3 000 daltons environ. Des polymères polyanioniques préférés sont des polysaccharides acides et de préférence des alginates sous forme de sels. Des polymères polyca- tioniques utiles assurant une réticulation sont notamment des protéines et des polypeptides ayant plusieurs groupes cationiques réactifs contenant de l'azote, par exemple des amines primaires, des amines polyvinyliques, des polysaccharides aminés, leurs sels hydrosolubles, et leurs mélanges. Le polymère polycationique actuellement préféré est la polylysine. La polyglutamine et la poly- ornithine peuvent aussi donner satisfaction. Une seconde couche de membrane peut être formée autour de la première par réaction avec un autre polymère polycationique. L'une quelconque des matières cationiques citées peut être utilisée pour la formation de la seconde membrane. L'identité du réactif et la masse moléculaire du polymère ou des polymères polycationiques utilisés sont choisies afin que les caractéristiques de porosité des capsules soient déterminées. On a constaté que la densité de charge des polymères polycationiques utilisés pouvait avoir un effet réel sur tIe réglage de la porosité. Le matériau d'âme peut être constitué par des cellules viables, par exemple des cellules modifiées génétiquement, notamment des hybridomes, des cellules eucaryotiques, notamment des cellules de tissus animaux, et des cellules procaryotiques. Le procédé peut aussi comprendre le revêtement ultérieur de la membrane par un polymère polyanionique hydrosoluble, par exemple un alginate, qui réagi-t avec des sites cationiques résiduels de la membrane. Les masse gélifiées peuvent être reliquéfiées après formation de la membrane, par réaction avec un agent chélatant. L'acide éthylèneglycol- bis-( e -aminoéthyléther)-N,N-tétracétique et ses sels (AEGT) sont des agents chélatants particulièrement intéressants lorsque les capsules sont destinées à être utilisées dans des cellules de culture. A cet égard, on a constaté que la reliquéfaction par AEGT a pour effet d'augmenter notablement la production cellu- laire des matières biologiques à l'aide des capsules, par comparaison avec d'autres chélates tels que les citrates et AEDT (acide éthylènediaminetétracétique). La sélection convenable des réactifs et les conditions de la réaction permettent la formation de membranes ayant une perméabilité relativement spécifique. Par exemple, on peut préparer des membranes afin qu'elles soit pratiquement imperméables aux molécules dont la masse moléculaire dépasse 150 000 daltons environ, et qui sont donc pratiquement imperméables à toutes les immuno- globulines courantes. Les membranes peuvent être per- méables aux molécules dont la masse moléculaire est inférieure à 500 000 daltons environ, les membranes em- pêchant cependant le passage des matières dont la masse moléculaire est plus élevée. De telles capsules permet- tent à IgG de s'échapper mais retiennent IgM. Dans une variante, les membranes peuvent être réalisées afin qu'elles soient perméables aux molécules dont la masse moléculaire dépasse 50Q 000 daltons, tout en étant pratiquement imperméables aux cellules. Par exemple, lorsqu'on recherche une limite de masse moléculaire inférieure ou égale à 150 000 daltons, on peut former une seconde membrane autour des capsules à l'aide d'un polymère polycationique ayant la même densité de charge que le premier polymère polycationique ou ayant de préférence une densité de charge plus élevée, par exemple une membrane de polylysine pouvant subir un traitement ultérieur par immersion dans une solution de polyornithine ou d'amine polyvinylique. Lorsque la membrane doit être perméable aux molécules dont la masse dépasse 500.000 daltons, un polymère de réticula- tion de masse moléculaire élevée tel qu'une polylysine de masse moléculaire supérieure à 200 000 daltons, peut être utilisé. La mise en oeuvre de l'opération d'expansion du gel selon l'invention améliore beaucoup l'uniformité des membranes des capsules et l'efficacité des techniques de réglage de la porosité. Comme indiqué précédemment, l'invention permet un excellent réglage de la porosité de la membrane et favorise la formation de membranes très uniformes. L'invention repose en partie sur l'observation du fait que les masses gélifiées contenant des polymères polyanio- niques, par exemple un alginate, peuvent subir une expansion ou une contraction par modification du degré d'hydratation du polymère. Les massesgélifiées contiennent plus de 98 % d'eau et elles sont essentiellement sous forme de billes molles, gardant leur forme et ayant un réseau gélifié réticulé. On a constaté que l'expansion des masses de gel après gélification et avant dépôt de la membrane permettait un réglage très précis des propriétés de perméabilité et d'uniformité des membranes. L'immersion de la masse gélifiée dans une solution de cations monovalents, par exemple une solution saline, une ou plusieurs fois, extrait une partie des cations polyvalents de réticulation du gel et accroît l'état d'hydratation, si bien que le réseau du gel subit une expansion. Un tel traitement assure la production de masses de gel hydraté uniformément convenant bien au dépôt ultérieur des membranes. En l'absence' d'un tel traitement, les masses gélifiées ont des dimensions et des propriétés variables car les masses formées en premier restent immergées dans la solution de gélifi- cation plus longtemps que les masses formées en dernier. Une autre observation importante est que la mise en équilibre de la masse gélifiée avec une solution conte- nant des cations polyvalents tels qu'une solution de chlorure de calcium, provoque une contraction de la masse gélifiée. Un autre phénomène qui a été constaté est que, lorsqu'une membrane a été formée autour d'une masse gélifiée, l'immersion de la capsule dans une solution d'un cation monovalent provoque un étirage de la membrane avec augmentation de la dimension des pores. Ces phénomènes, couplés à l'observation du fait que les substances assurant une réticulation et ayant une densité de charge accrue ont tendance à réduire la porosité, rendent possible un réglage très précis de la perméabilité des membranes. Lorsque ces observa- tions sont associées aux techniques de réglage de perméa- bilité décrites dans le brevet précité des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883, les hommes du métier disposent de tout un jeu de paramètres qui permet la production de capsules uniformes ayant des propriétés très précises et reproductibles de perméabilité. Comme décrit dans le dernier brevet précité, le matériau d'âme est mis en suspension dans une solu- tion contenant un polymère polyanionique hydrosoluble gélifiable réversiblement, de préférence un alginate de sodium, et la suspension du matériau d'âme et du polymère est mise sous forme de gouttelettes à l'aide de dispositifs classiques, par exemple un appareil de formation de gouttelettes à tête de projection. Cet appareil comprend un boîtier ayant une buse supé- rieure d'admission d'air et un corps creux et allongé, fixé par frottement dans un bouchon. Une seringue, par exemple de 10 cm3, associée à une pompe progressive, est montée à la partie supérieure du bo tier et a une aiguille, par exemple de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de "Teflon", passant sur toute la longueur du boîtier. L'intérieur de celui- ci est réalisé de manière que le bout de l'aiguille subisse un courant d'air laminaire constant qui joue le -rôle d'un couteau pneumatique. Lors de l'utilisation, la seringue remplie de la solution contenant la matière à encapsuler est montée à la partie supérieure du boîtier, et la pompe progressive est commandée afin qu'elle chasse progres- sivement des gouttes de la solution vers le bout de l'aiguille. Chaque goutte est "arrachée" par le courant d'air et tombe de 2,5 à 3,5 cm dans une solution de gélification dans laquelle elle est immédiatement géli- fiée par absorption des ions de réticulation. La solution préférée de gélification est une solution d'ions calcium, par exemple à 1,2 % en poids par volume de chlorure de calcium. La distance comprise entre le bout de l'ai- guille et la solution de chlorure de calcium est réglée de préférence de manière que la solution de la matière d'âme et du polymère prenne la configuration la plus favorable au point de vue physique, c'est-à-dire celle d'une sphère (rapport maximal entre le volume et la surface). L'air qui se trouve dans le tube s'échappe par une ouverture formée dans le bouchon. Les masses sphéroidales gélifiées qui gardent leur forme ou les capsules temporaires, qui ont de préférence un diamètre compris entre 50 microns et quelques millimètres, se rassemblent dans la solution sous forme d'une phase séparée et peuvent être récupérées par aspiration. Selon l'invention, les massesgélifiées subissent alors une expansion dans une- ou plusieurs opérations séparées d'immersion ou de lavage dans une solution de cations monovalents, par exemple une solution saline. Cette immersion retire une partie des ions calcium de réticulation et hydrate aussi le gel. Les masses gélifiées subissent ainsi une expansion qui assure une meilleure couverture de la matière d'âme, c'est-à-dire que la matière d'âme en phase solide ne dépasse pas à travers la surface des masses gélifiées. La matière d'âme en phase solide qui est ancrée à l'extérieur du gel est retirée par le lavage par une solution saline. En conséquence, seule la matière d'âme qui se trouve à l'intérieur du gel est encapsulée. Les lavages par la solution saline favorisent aussi la formation de membranes plus uniformes sur les capsules par mise à l'équilibre de la quantité d'ions calcium qui provoquent la réticulation du réseau d'alginate dans les masses gélifiées. Ces masses ne se forment pas toutes simultanément, les gouttelettes qui sont au contact du bain d'ions calcium plus tôt au cours d'un cycle passent plus de temps dans le bain et conservent donc plus d'ions calcium dans la structure du gel que celles qui sont formées ultérieurement. Les lavages par une solution saline retirent plus d'ions calcium des masses de densité accrue (gouttelettes gélifiées les premières) que des masses moins denses si bien que la teneur en calcium des masses gélifiées est équilibrée. Les membranes formées autour des masses expansées de gel risquent aussi moins de se rompre sous l'action des contraintes provoquées par la dissociation du gel. Il apparaît que le réseau expansé présente une meil- leure élasticité qui permet une meilleure compensation des contraintes de dissociation. Une membrane est alors formée autour de la masse gélifiée expansée par réaction entre les groupes cationiques qui se trouvent sur le polymère polyanionique gélifié expansé et les groupes anioniques qui se trouvent sur un polymère polycationique, par exemple la polylysine. Le polymère polycationique peut avoir une masse molécu- laire aussi faible que 3 000 daltons, mais la polysine de masse moléculaire supérieure ou égale à 35 000 daltons est préférable. Lorsque la membrane a été formée autour des masses gélifiées expansées, d'autres opérations sont utilisées pour le réglage fin de la porosité de la membrane. Par exemple, une série de lavages dans une solution saline provoque une expansion des pores de la membrane, alors qu'une série de lavages dans une solution de chlorure de calcium provoque une contrac- tion des pores. Une seconde couche de membrane peut être formée autour des capsules à l'aide d'une quantité supplémentaire de polymère polycationique, par exemple par exposition à une solution de polyornithine ou par exposition à un polymère ayant une plus grande densité de charge, par exemple une amine polyvinylique. Cette technique peut être utilisée pour la réduction de la porosité. Comme décrit dans le brevet précité des Etats- Unis d'Amérique n 4 352 883, le volume interne aux cap- sules est de préférence reliquéfié par immersion des capsules dans une solution d'un agent chélatant. Des agents chélatants utilisés de façon satisfaisante sont notamment l'acide éthylènediaminetétracétique (AEDT), le citrate de sodium, le succinate de sodium -et surtout l'acide éthylèneglycol-bis-( e-aminoéthyléther)-N,N-tétra- cétique (AEGT). Lors de l'utilisation du citrate de sodium comme agent chélatant, des cavités peuvent se former dans les membranes lorsque les membranes prennent une forme irrégulière sous l'action de la pression due au citrate. La membrane reprend sa forme originale lorsque le citrate approche de l'équilibre avec le volume interne aux capsules, mais, lorsque la matière d'âme est une cellule vivante sensible au citrate, la croissance cellulaire ou l'aptitude des cellules à produire des matières biologiques peut être perturbée. Au contraire, l'immersion d'une capsule dans une solution de AEGT parait provoquer un repli de la membrane vers l'intérieur qui garde une configuration non modifiée jusqu'à l'extraction de AEGT. Comme décrit dans l'exemple 4 qui suit, les cellules présentent une meilleure crois- 2559502- sance et une meilleure activité métabolique dans les capsules traitées avec AEGT que dans celles qui sont traitées par le citrate ou d'autres agents chélatants essayés. Comme décrit dans ce dernier brevet précité, le revêtement postérieur des capsules à l'aide d'une solution d'un polymère polyanionique, par exemple de l'alginate de sodium, supprime pratiquement la tendance des capsules à s'agglomérer. Le polymère anionique réagit avec des sites cationiques résiduels de la mem- brane en donnant une polarité négative à la surface. De manière connue, les surfaces négatives peuvent inhiber la croissance et la fixation des cellules. Cette crois- sance peut empêcher la croissance cellulaire à l'inté- rieur des capsules ou affecter la perméabilité d'une manière nuisible. En outre, l'immersion de la capsule dans un agent neutralisant tel que l'acide 2-N-cyclohexyl- aminoéthanesulfonique (CHES) ou un autre tampon zwit- terionique peut réduire la réactivité de la membrane ou l'améliorer. Les exemples qui suivent illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention et ses avantages. Exemple 1 Le procédé suivant peut être utilisé pour la préparation de capsules pratiquement imperméables aux molécules dont la masse moléculaire dépasse 150 000 daltons environ. Un hybridome, qui produit IgG (masse moléculaire de 160 000 daltons environ) a été utilisé dans cet essai. 2,1 litres environ d'une suspension contenant environ 2,2.106 cellules par centimètre cube dans une solution à 1 % en poids par volume d'alginate de sodium ("NaG-Kelco LV") ont été transférés dans un appareil ayant une tête de projection, tel que décrit précédemment, et des gouttelettes ont été formées par introduction à force de la suspension dans seize aiguilles de 0,71 mm de diamètre, avec un débit d'environ 50 cm3/min. Les gout- telettes tombaient d'environ 3 cm dans 5 litres d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 % en poids par volume, avec formation de masses gélifiées qui étaient collectées par aspiration et transférées à un flacon de 10 litres contenant environ 5 litres d'une solution saline isotonique destinée à assurer l'expansion du gel. La solution saline a été retirée et renouvelée deux fois. Au total, l'expansion dans la solution saline a pris 11 min environ. Une membrane a ensuite été formée autour des masses gélifiées par contact avec 5 litres d'une solution saline isotonique contenant 750 mg/1 de poly-L- lysine (Sigma Chemical Company, masse moléculaire 000 daltons). Après 12 min de réaction, lescapsules résultantes ont été lavées pendant 10 min avec 5 litres d'une solution tampon à 1,4 g/1 de CHES ("Sigma") conte- nant 0,2 % en poids par volume de chlorure de calcium. Les capsules ont été lavées pendant 8 min environ avec litres d'une solution saline contenant 0,3 % en poids par volume de chlorure de calcium, et une seconde membrane a été formée autour des capsules par une réaction de 10 min dans 5 litres de solution saline contenant mg/1 d'amine polyvinylique ("Polyscience", masse moléculaire 50 000 à 150 000 daltons). Les capsules ont été lavées à nouveau avec deux volumes de 5 litres d'une solution saline isotonique, en 7 min, et ont subi un revêtement postérieur par immersion pendant 7 min dans 5 litres d'une solution saline contenant 5.10-2 % (en poids par volume) de NaG. Les capsules ont été lavées pendant 4 min supplémentaires dans 5 litres de solution saline, et les volumes internes aux capsules ont été reliquéfiés par deux immersions dans des volumes de 5 litres d'une solution saline contenant 55 mM de ci- trate de sodium, d'abord pendant 10 min puis pendant 6 min. Comme décrit dans l'exemple 4 qui suit, le rempla- cement de la solution de citrate de sodium par une solution de AEGT aurait augmenté le rendement en anti- corps. Les capsules ont été lavées deux fois dans 5 litres de solution saline et une fois pendant 4 min dans le milieu RPMI. Les capsules ont alors subi une croissance dans le milieu de culture RPMI auquel 10 % de sérum de veau foetal ont été ajoutés. IgG est collecté dans les capsules et seules des traces peuvent être détectées à l'extérieur des capsules, dans le milieu. Les capsules préparées par ce procédé sont donc pratiquement imper- méables à IgG mais permettent le passage libre des matières nutritives nécessaires si bien que la croissance des cellules et la production des anticorps peuvent être assurées à l'intérieur des volumes des capsules. Exemple 2 Cet exemple illustre un procédé de formation de capsules qui sont perméables à IgG (masse moléculaire d'environ 160 000 daltons) mais pratiquement imper- méables à IgM (masse moléculaire d'environ 900 000 daltons). Les cellules utilisées étaient un hybridome humain-humain 77 de the National Institute of Healch qui produit et sécrète IgM humaine. 400 cm3 d'une solution contenant 106 cellules par centimètre cube dans 1 %en poids par volume de NaG ont été mis sous forme de gouttelettes à l'aide d'une série de huit aiguilles de 0,71 mm de diamètre, dans un appareil de projection tel que décrit précédemment. Le débit d'alimentation était d'environ 30 cm3/min, et la distance comprise entre le bout des aiguilles et la solution de gélification, constituée par 1 litre d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 % en poids par volume, était de 3 cm environ. Les masses gélifiées ont été lavées trois fois dans des volumes de 1 litre de solution saline isotonique, au cours d'une période de 8 min, puis elles ont été immergées 10 min dans 1 litre d'une solution contenant 750 mg/cm3 de poly-L- lysine ("Sigma", masse moléculaire 65 000 daltons) afin qu'une membrane permanente se forme. Les capsules résul- tantes ont été lavées pendant 5 min dans 1 litre d'une solution saline à 1,4 g/l de CHES contenant 0,2 % en poids par volume de chlorure de calcium, et elles ont été lavées min avec 1 litre de solution saline contenant 0,3 % en poids par volume de chlorure de calcium. Les capsules ont alors subi une expansion de 4 min dans 1 litre de solution saline puis un revêtement psotérieur pendant 7 min dans 1 litre d'une solution saline contenant 3.10-2 % en poids par volume de NaG. Les capsules ayant le revêtement psotérieur ont été lavées pendant 5 min dans 1 litre de solution saline, et les volumes internes aux capsules ont été reliquéfiés au cours de deux immer- sions de 6 min dans 1 litre d'une solution saline à mM de citrate de sodium. Le citrate a été retiré par deux lavages par une solution saline, à raison de 1 litre à chaque fois, et les capsules résultantes ont été lavées pendant 5 min dans le milieu RPMI. Les capsules ont été mises en suspension dans 1 litre du milieu (RPMI augmenté de 20 % de sérum de veau foetal et d'antibiotiques), et les cellules ont alors été cultivées. Le milieu externe a été échantillonné. On a déterminé par analyse que le milieu externe aux capsules en contenait pas de IgM, indiquant ainsi que les capsules étaient pratiquement imperméables aux molécules dont la masse moléculaire est de 900 000 daltons. Exemple 3 Cet exemple décrit un procédé de formation de capsules qui sont perméables à IgM (masse moléculaire de 900 000 daltons environ) mais imperméables aux cel- lules. 200 cm3 d'une solution à 1 % en poids par volume de NaG ("Kelco LV") et les cellules d'hybridomes de l'exemple 2 ont été mis sous forme de gouttelettes par cinq aiguilles de 0,46 mm de diamètre, dans un appareil de propection tel que décrit précédemment. Les gouttelettes résultantes sont tombées de 2,5 cm environ dans la solution de gélification formée par 1 litre d'une solution à 1,2 % en poids par volume de chlorure de calcium, à raison de 9,5 cm3/min. Les masses gélifiées résultantes ont subi une expansion au cours de trois immersions dans des volumes de 0,5 litre de solution saline, et une membrane permanente a été formée par une réaction de 10 min avec 0,5 litre d'une solution à 1 g/l de poly-L-lysine ("Sigma", masse moléculaire moyenne d'environ 260 000 daltons). Les capsules ont été lavées pendant 5 min dans 0,5 litre d'une solution saline à 1,4 g/1 de CHES contenant 0,6 % en poids par volume de chlorure de calcium, puis pendant 5 min supplé- mentaires dans 0,5 litre d'une solution saline contenant 0,8 % en poids par volume de chlorure de calcium. Les capsules ont alors été lavées une fois dans 0,5 litre de solution saline et revêtues ensuite dans 0,5 litre d'une solution à 0,03 % en poids par volume de NaG. Les capsules ayant le revêtement postérieur ont été lavées pendant 5 min dans 0,5 litre de solution saline, et le volume interne aux capsules a été reliquéfié par deux lavages de 5 min dans 0,5 litre chacun d'une solution à 55 mM de citrate de sodium. Les capsules ont été lavées une fois dans une solution saline, une fois dans le milieu de base puis mises en suspension dans le milieu de base contenant 20 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques. IgM a traversé la membrane des capsules mais les cellules ont été retenues, si bien que la membrane a ainsi montré qu'elle était perméable aux molécules ayant une masse moléculaire d'au moins 900 000 daltons, tout en étant imperméable aux cellules. Exemple 4 Cet exemple indique que l'activité métabolique. des cellules encapsulées peut être nettement améliorée par sélection convenable de l'agent chélatant utilisé pour la reliquéfaction du volume interne aux capsules. On a essayé quatre agents chélatants différents, AEDT, AEGT, le citrate de sodium et le succinate de sodium, à l'aide d'hybridome Li8 encapsulé qui produit IgG, comme système de test. Les capsules ont été réalisées suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, mais le citrate de sodium de l'exemple 1 a été remplacé par les agents chélatants indiqués dans le tableau I qui suit, aux concentrations indiquées. TABLEAU I Réactif de Conc. Nombre total de Jours de Culture finale dissociation (mM) de Sellules au culture Pg/cm3 (jour) du gel () jour AEDT 55 1,0 x 106 (6) 6 0 AEGT 55 4,3 x 10 (17) 27 1026 Citrate 55 2,3 x 107 (16) 19 366 AEGT 55 3,5 x 107 (16) 19 741 Succinate 55 2,3 x 107 (16) 19 - AEGT 55 3,6 x 107 (19) 21 939 AEGT 36 4,1 x 107 (19) 21 892 AEGT 28 3,7 x 10 (19) 21 734 7 AEGT 28 9,3 x 10 (27) 27 659 ,3 x 107 (20) 578 (20) AEGT 28 6,0 x 10 (27) 27 693 4,1 x 107 (20) 590 (20) AEGT 14 7,3 x 10 (27) 27 887 ,4 x 10 (20) 27 780 (20) Le tableau I indique que AEGT est le meilleur agent chélatant pour la croissance cellulaire et assure une meilleure production d'anticorps, par comparaison avec le citrate, d'un facteur de l'ordre de 2. Les autres résultats indiqués dans le tableau I correspondent à des expériences destinées à déterminer quelle est la concentration optimale de AEGT pour la dissociation du gel et la production des anticorps. Comme l'indiquent les résultats, les concentationsde 36 mM et mM de AEGT sont pratiquement équivalentes pour l'acti- vation de la production des anticorps, alors que les concentrations plus faibles de AEGT donnent de plus faibles concentrations d'anticorps, malgré des croissances cellulaires pratiquement identiques. Exemple 5 Cet exemple montre l'effet de l'utilisation de plusieurs lavages par une solution saline pour une expansion des masses de gel avant la formation des membranes. On utilise le procédé de formation de capsules et l'hybridome décrits dans l'exemple 1, mais le nombre de lavages par une solution saline réalisé avant forma- tion de la membrane est modifié. Après la formation des capsules, les hybridomes encapsulés subissent une croissance pendant 20 jours dans un milieu de culture et le nombre total de cellules et la concentration d'anticorps dans les capsules sont mesurés. Le tableau II donne les résultats de cet essai. TABLEAU II Essai Nombre de Jours Nombre total Concentration lavages par de de cellules dans les cap- une solution culture sules pg/cm3 saline 441A O 20 4,3 x 107 360 441B 1 20 5,0 x 107 560 441C 2 20 7,2 x 107 702 441C 3 20 6,5 x 107 717 Comme l'indiquent les résultats du tableau II, l'utilisation de deux ou trois lavages par une solution saline donne les plus grand nombre de cellules et la plus grande concentration d'anticorps dans les capsules. Plus précisément, après trois lavages préalables à la formation des membranes par une solution saline, la culture a une croissance correspondant à 50 % de cellules en plus, avec une production presque doublée d'anticorps à l'intérieur des capsules, par rapport à l'absence de lavage par une solution saline. Cette expérience indique que le lavage préalable à la formation des membranes, par une solution saline, améliore les capsules si bien que les hybridomes encapsulés sont plus sains et produisent plus d'anticorps. La description qui précède permet aux hommes de métier d'utiliser des techniques spécifiques d'encap- sulation qui permettent une production reproductible de membranes de capsules qui sont uniformes, ayant des propriétés de perméabilité adaptées aux applications particulières, à l'aide d'opérations empiriques. Ainsi, une exploitation astucieuse des paramètres d'encapsula- tion décrits dans le présent mémoire permet à l'homme du métier de former des capsules qui permettent un transport libre à travers la membrane de molécules dont la masse moléculaire est inférieure à une valeur choisie, qui permettent un transport avec une certaine gêne des molécules comprises dans une certaine gamme dépassant cette masse choisie, et qui empêchent le passage des molécules dont la masse moléculaire et les dimensions moléculaires efficaces correspondantes dépassent cette gamme. Une fois le procédé établi, il peut être mis en oeuvre pour la fabrication de nom- breuses capsules en nombre aussi grand que voulu pour l'application prévue. Lors de l'établissement d'un procédé de prépara- tion de capsules ayant un comportement particulier au point de vue de la perméabilité, on peut utiliser les directives générales suivantes. L'opération d'expan- sion du gel augmente l'uniformité des membranes des capsules et augmente l'efficacité des techniques de réglage de la porosité. L'augmentation de la densité * de charge des polymères formant la membrane polycatio- nique donne en général des pores plus petits. L'augmenta- tion de la masse moléculaire du polymère polycationique donne en général des pores plus gros et des membranes plus minces. L'augmentation de la durée d'exposition des masses gélifiées au polymère polycationique donne une membrane plus épaisse et moins perméable. Le dépôt d'un second polymère polycationique sur le premier réduit la dimension des pores. L'expansion du gel par hydratation après formation de la membrane augmente la porosité, et la contraction réduit la porosité. Lors de la réalisation de capsules destinées à être implantées, un revêtement postérieur d'un polymère polyanionique est souhaitable, et l'utilisation de matières formatrices de membranes qui sont physiologiquement incompatibles, provoquant une inflammation ou une croissance excessive des fibroblastes, doit être évitée. Lors de la réalisation de capsules destinées à la culture de cellules, une reliquéfaction est souhaitable et elle est réalisée de préférence à l'aide de AEGT. REVENDICATIONS 1. Procédé d'encapsulation d'une matière d'âme dans un volume interne à des capsules délimité par une membrane perméable, ledit procédé étant destiné à améliorer l'uniformité des membranes et le réglage de la porosité, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: A. la gélification d'un polymère polyanionique hydrosoluble contenant une matière d'âme avec une solution aqueuse contenant des cations polyvalents afin que des masses gélifiées hydratées, séparées et conservant leur configuration se forment, B. l'expansion des masses gélifiées avec une solution aqueuse qui retire une partie des cations polyvalents et assure une hydratation supplémentaire des masses gélifiées, et C. la formation d'une membrane autour des masses gélifiées expansées afin que des capsules soient formées par réaction entre des groupes anioniques du polymère polyanionique et des groupes cationiques d'un polymère polycationique ayant une masse moléculaire supérieure à 3 000 daltons. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le revêtement postérieur de la membrane formée dans l'étape C par un polymère polyanionique hydrosoluble, par réaction avec des sites cationiques résiduels portés par la membrane. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la reliquéfaction des masses gélifiées après la formation des membranes. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape de reliquéfaction comprend l'exposition des capsules à un agent chélatant. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent chélatant est l'acide éthylèneglycol- bis(-aminoéthyléther)-N,N-tétracétique ou un de ses sels. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la formation d'une seconde couche de membrane autour de la membrane formée dans l'étape C, par réaction avec un second polymère poly- cationique. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le revêtement postérieur de la membrane par un polymère polyanionique hydrosoluble, par réaction avec des sites cationiques résiduels, sur l'un au moins des polymères polycationiques. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la reliquéfaction des masses gélifiées après formation de la membrane. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape de reliquéfaction comprend l'exposition des capsules à un agent chélatant. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent chélatant est l'acide éthylèneglycol- bis(e-aminoéthyléther)N,N-tétracétique ou un de ses sels. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère polyanionique est choisi dans le groupe des polysaccharides acides. 12. Procédé selon la revendication 11, caracté- risé en ce que le polysaccharide acide est un alginate sous forme d'un sel. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère polycationique est choisi dans le groupe contenant des protéines ayant plusieurs groupes cationiques réactifs contenant de l'azote, les polypeptides conte- nant plusieurs groupes cationiques réactifs contenant de l'azote, les amines polyvinyliques, les polysaccharides aminés, leurs sels et leurs mélanges. 14. Procédé selon la revendication 13, caracté- risé en ce que le polymère polycationique est choisi dans le groupe qui comprend la polylysine, la polyglu- tamine et la polyornithine. 15. Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que le second polymère polycationique est choisi dans le groupe qui comprend des protéines compre- nant plusieurs groupes cationiques réactifs contenant de l'azote, les polypeptides contenant plusieurs groupes cationiques réactifs contenant de l'azote, les amines polyvinyliques, les polyéthylènes amines, les polysac- charides aminés, leurs mélanges et leurs sels. 16. Procédé selon la revendication 15, caracté- risé en ce que le second polymère polycationique est choisi dans le groupe qui comprend la polylysine, la polyglutamine et la polyornithine. 17. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la solution aqueuse de l'étape B contient des cations monovalents. 18. Procédé selon la revendication 21, caracté- risé en ce que la solution aqueuse utilisée dans l'étape B est une solution saline.