Brevet FR2556472A1 — publié le 19850614

L'invention concerne la technologie des cultures de tissus végétaux de transplantation utilisées comme productrices de substances bilogiquement actives dans diverses branches de l'industrie: alimentaire, parfumerie, médicale, et a notamment pour objet un procédé d'analyse cytométrique pour la détermination de la den sité, de la vitalité et de la dimension des cellules d'une culture de tissu végétal. Par analyse cytométrique des cultures de tissus végétaux on entend généralement: 1. Le calcul du nombre de cellules ou de la densité des cellules en suspension résultant de la macé- ration du tissu. 2. Le calcul des cellules vivantes et mortes la suite de la coloration vitale du tissu. 3. La préparation de microproduits pour la détermination des dimensions descellules. Le procédé connu le plus proche de celui de liin- vention est un procédé d'analyse cytométrique d'une culture de tissu végétal, qui comprend le traitement d'un échantillon par une solution de macération, à savoir une solution a 20% d'acide chromique, à la température de 600C pendant 15-20 minutes (dans un rapport tissu/ solution de macération de 1:3) pour déterminer la densité des cellules. L'analyse cytométrique de la culture de tissu végétal est réalisée de la maniere suivante. On place l'échantillon de culture de tissu végétal en suspension dans une chambre de Fuchs-Rosenthal et on calcule le nombre moyen de cellules dans 1 ml de suspension. Puis on calcule le nombre moyen de cellules par mg de poids brut du tissu. On évalue la vitalité des cellules d'aprds la coloration vitale de l'échantillon par 0,01% en poids de bleu de methylene préparé sur une solution de macrosels. Pour mesurer la dimension des cellules, on prépare des microproduits écrasés ou coupés, on les colore par l'acéto-orcéine ou par le réactif de Schiff. Ce procédé connu, par suite des conditions sévères de la macération, conduit à une destruction complète ou à la déformation d'une partie des cellules, ce qui aboutit à une erreur considérable lors du calcul du nombre de cellules et rend impossible une évaluation précise de la vitalité et des dimensions des cellules. De plus, une certaine quantité d'agrégats cellulaires reste non macérée, ce qui rend également difficile un calcul précis des cellules (L.V. Frolova, Z.B. Shamina: "Kinetika iskustvenno kultiviruemoi kletochnoi populatsii bobov", "Tsitologia", 1978, v. 20, NO 5, p. 551). On s'est donc proposé d'utiliser dans le Procédéd'analyse cytométrique une solution de macération qui permettrait de simplifier l'analyse cytométrique et en même temps d'en augmenter la précision. Ce problème est résolu du fait que dans le procédé proposé d'analyse cytométrique pour la détermination de la densité, de la vitalité et de la dimension des cellules, du type comprenant le traitement d'un échantillon de culture en suspens ion du tissu végétal par une solution de macération, suivant l'invention on utilise à titre de solution de macération une solution de composition suivante (% en poids): chlorure de calcium 1,95-2,05 pectinase, 70 unités 2,45-2,55 cellovérédine, 50 unités 4,95-5,05 eau distillée complément à 100%, on effectue le traitement de l'échantillon à une température de 26 - 10C pendant 4 à 5 heures, dans un rapport en volume égal de l'échantillon et de la solution de macération, puis on effectue le calcul de la densité, de la vitalité et de la dimension des cellules. I1 est souhaitable, pour une détermination plus précise de la vitalité des cellules de la culture de tissu végétal, d'ajouter du mélange, après traitement de l'échantillon par la solution de macération, 0,1% en poids de bleu de méthylène de sorte que la concentration en colorant de la solution soit de 0,018 en poids. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails et avantages de celle-ci apparaîtront mieux à la lumière de la description explicative qui va suivre d'un mode de réalisation donné à titre non limitatif. On réunit l'échantillon de culture en suspension de tissu végétal à une quantité égale de la solution de macération. La solution de macération renferme les composants suivants/% en poids: chlorure de calcium 1,95-2,05 pectinase, 70 unités 2,45-2,55 cellovérédine, 50 unités 4,95-5,05 eau distillée complément à 100%. Le choix des limites précitées de la teneur en composants de la solution de macération est dû au fait qu'au-delà de ces limites la macération n'a pas lieu, ou bien il se produit une dissolution complète des cellules. On effectue l'incubation à une température de 26-10C pendant 4 à 5 heures sur une secoueuse. On ajoute au produit de la macération 0,18 en poids de bleu de méthylène de sorte que la concentration en colorant soit de 0,01% en poids. On place la suspensionde culture de tissu végétal à analyser dans un hémo cytomètre de Fuchs-Rosenthal et on calcule en même temps la vitalité des cellules, leur nombre Densité de la suspension) et leurs dimensions. Le procédé revendiqué permet de réalise toute l'analyse sur un seul échantillon, les données obtenues caractérisant la densité des cellules, leur vitalité et les dimensions en valeurs absolues. Les tableaux ci-après illustrent la précision du procédé. Tableau 1 Analyse statistique des données obtenues par le procédé connu et par le procédé proposé de détermination de la vitalité des cellules (culture de tissu de ginseng). N Procédé connu, Procédé proposé, d'or- échantillonnage échantillonnaqe n = 10 dre n = 100 Groupement des ré- Résul- Résultats des Résul sultats des mesu- tat mesures con- tat res concrètes final crêtes n = 10 final n = 100 (n'ont pas be besoin de groupement) % de vitali- n % % de vitalité té 1 2 3 4 5 6 1 10 1 73,1 2 20 4 72,8 3 25 2 76,8 4 30 7 77,2 5 40 7 X = 75,20 75,7 X = 75, 25 6 50 4 # = 55,66 76,1 # = 2, 78 7 60 9 3 # 0,95 75,9 p # 0,95 8 70 7 75,4 9 80 7 74,2 10 90 10 75,3 11 100 42 Tableau 2 Analyse statistique des données obtenues par le procédé connu et par le procédé proposé de détermination des nombres de cellules (culture de tissu de ginseng) N Procédé connu, Procédé proposé, d'ordre échantillonnage n = 10 échantillonnage n=10 Résultats des Résultat Résultats des Résultat mesures con- final mesures con- final crètes crètes Données concernant les nombres de cellules x 103 1 2 3 4 5 1 294 274 2 214 270 3 237 270 4 200 268 5 214 X=259,8 271 X=270,74 6 247 # = 111,42 272 6= 2,97 7 327 p # 0,95 270 p # 0,95 8 330 271 9 260 271 10 220 270 Ci-après sont décrits quelques exemples concrets et non limitatifs de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Exemple 1 On prépare préalablement une solution de macération de composition suivante, % en poids: chlorure de calcium 2 cellovérédine, 50 unités 5 pectinase, 70 unites 2,5 eau distillée complément à 100% pH 5,0-6,0 On mélange ensuite 1 ml de culture à étudier (culture de tissu de biomasse de ginseng) avec 1 ml de solution de macération et on agite pendant 1 à 2 minutes pour assurer un meilleur contact entre la surface cellulaire et les enzymes. On effectue l'incubation sur une secoueuse pendant 4 heures à la température de 260C. On ajoute 0,1% en poids de bleu de méthylène au produit de macération obtenu, en quantité telle que la concentration de colorant soit de 0,01% en poids, et on le place dans un hémocytomètre de Fuchs-Rosenthal pour déterminer la vitalité, le nombre et les dimensions des cellules. On réalise la détermination de la vitalité des cellules par calcul séparé des cellules vivantes sphériques non colorées et des cellules mortes amorphes colorées par le bleu de méthylène. On évalue le nombre de cellules comme la somme des cellules vivantes et mortes On calcule la dimension des cellules d'après le diamètre d'une cellule sphérique, et on calcule d'aprds la formule du volume de la sphère V = T )TR3. La concentration en solution de macération proposée assure un rendement en cellules de 100%, la vitalité étant de 87,1z. Exemple 2 On effectue l'analyse cytoeetrique d'une culture de tissu végétal en suspension comme dans l'exemple 1, mais à titre de culture de tissu végétal en suspension on utilise une culture du tissu de la radiole de rose. La concentration en solution de macération proposée assure un rendement en cellules de 100%, la vitalité des cellules étant de 87,1%. Exemple 3 On réalise l'analyse cytométrique d'une culture de tissu végétal en suspension de ginseng comme dans l'exemple 1, mais en utilisant-une solution de macération de composition suivante, % en poids: chlorure de calcium 2 cellovérédine, 50 unités 4 pectinase, 70 unités 2 eau distillée complément à 100% pH 5,0-6,0 La concentration en solution de macération assure un rendement en cellules de 82,7%, la vitalité des cellules étant de 83,3%. Exemple 4 L'analyse cytométrique d'une culture de tissu végétal en suspension de ginseng est effectuée comme dans l'exemple 1, mais en utilisant une solution de macération de composition suivante, % en poids: chlorure de calcium 2 pectinase, 70 unités 2,5 cellovérédine, 50 unités 6 eau distillée complément à 100% pH 5,0-6,0 La concentration en solution de macération proposée assure un rendement en cellules de 100%, la vitalité des cellules étant de 36%. REVENDICATIONS 1. Procédé d'analyse cytométrique pour la détermination de la densité, de la vitalité et de la dimension des cellules d'une culture de tissu végétal, du type comprenant le traitement d'un échantillon de la culture de tissu végétal en suspension par une solution de macération, caractérisé en ce qu'à titre de solution de macération on utilise une solution de composition suivante, % en poids: chlorure de calcium 1,95 à 2,05 pectinase, 70 unités 2,45 à 2,55 cellovérédine, 50 unités 4,95 à 5,05 eau distillée complément à 100%, que l'on introduit en quantité volumique égale à celle de l'échantillon, on effectue le traitement de l'échantillon à une température de 26floC pendant 4 à 5 heures, puis on réalise le calcul de la densité, de la vitalité et de la dimension des cellules. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractériséen ce que, pour permettre un calcul plus précis de la vitalité des cellules de tissu végétal, on ajoute au mélange,après le traitement de l'échantillon par la solution de macération, 0,1% en poids de bleu de méthylène de sorte que la concentration en colorant de la solution soit de 0,01 % en poids.