Brevet FR2548670A1 — publié le 19850111

La présente invention a trait à un procédé de séparation des principales protéines du sang hémolysé afin de permettre l'obtention à l'échelle industrielle, des protéines telles que l'albumine, l'hémoglobine et les gamma-globulines. Les procédés de fractionnement à l'échelle industrielle des protéines du plasma ou du sérum sanguin 10 reposent sur les techniques de précipitation sélective. L'un des procédés, bien connu, est la méthode de Cohn utilisant la précipitation sélective par l'éthanol. D'autres procédés utilisent d'autres agents chimiques tels que des solvants, le sulfate d'ammonium, l'acide caprylique, le rivanol Ces différents procédés ont été appliqués principalement à l'obtention et à la purification de l'albumine et des gamma-globulines. f Ils possèdent cependant un certain nombre d'inconvénients, parmi lesquels on peut citer une sélectivité limitée et donc l'obtention d'un degré de purification limité, des pertes en rendement par dénaturation en rai5 son de la formation de polymères ou d'agrégats de protéines pendant les étapes de précipitation, et enfin des opérations industrielles fastidieuses, bruyantes et délicates comme les opérations de centrifugation, nécessitant un personnel habile et compétent. En outre, dès lors que ces procédés sont mis en oeuvre sur du sang hémolysé, par exemple du sang placentaire qui constitue la source la plus importante de protéines sériques, les étapes connues d'élimination de l'hémoglobine conduisent à la dénaturation de celle-ci. Or, il serait souhaitable de disposer de sources importantes d'hémoglobine native en raison notamment de l'intérêt que peut présenter l'hémoglobine, comme source de sang artificiel. On a donc déjà envisagé de réaliser des étapes 20 de purification de protéines du plasma ou du sang hémolysé par chromatographie, et notamment par chromatographie d'échange d'ions, en utilisant des supports de chromatographie modernes tels que par exemple des microbilles de silice revêtues de DEAE Dextran (voir par exemple le brevet français déposé le 29 juillet 1976 sous le N 76 23176). On a ainsi déjà envisagé de soumettre à une étape de séparation chromatographique le surnageant placentaire d'albumine obtenu après précipitation alcoolique des y-globulines, à p H 6,8 en présence de 25 % d'éthanol, séparant ainsi l'hémoglobine-de l'albumine, laquelle était ensuite récupérée par élution à l'aide d'une solution Na Cl 1 % (voir J L TAYOT et al; Chromatography of synthetic and biological polymers, 1978, Vol 2, pages 95 à 109) Un procédé similaire a également été suggéré dans le brevet français précité dans lequel le surnageant de l'étape de précipitation alcoolique du bloc des globulines est soumis à une séparation chromatographique à un p H compris entre 6 et 7 après dilution dans de l'eau distillée pour diminuer la concentration en alcool, permet5 tant ainsi de séparer l'albumine de l'hémoglobine qui traverse la colonne sans se fixer au support. Cependant, malgré les avantages que l'on-peut attendre de la séparation chromatographique, ces procédés de purification du sang hémolyse n'ont pas pu être uti10 lisés à l'échelle industrielle. Certes, on a déjà prévu de purifier l'albumine d'origine placentaire par des étapes de séparation chromatographique mais à condition d'éliminer tout d'abord l'essentiel de l'hémoglobine par une précipitation déna15 turante, par exemple au chloroforme (voir J L TAYOT et al; Coopération internationale et dérivés sanguinsTalloires 1981; Ed fondation MERIEUX), mais un tel procédé conduit à la dénaturation irréversible de l'hémoglobine Par contre les opérations de séparation chromato20 graphique précitées du surnageant d'origine placentaire contenant l'albumine et l'hémoglobine n'ont pas pu atteindre le stade industriel, notamment en raison d'une légère fixation d'hémoglobine sur le support, difficile à éluer complètement de sorte que l'accumulation des pig25 ments, de cycle en cycle, sur le support entrave la capacité de fixation et la durée d'utilisation De plus la solution injectée dans la colonne est très difficile à clarifier Elle se trouble en continu, ce qui en rend la filtration très difficile En outre elle contient des 30 sels qui diminuent fortement la fixation de l'albumine. L'invention se propose, en conséquence, de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de séparation des principales protéines du sang hémolysé, sous forme non dénaturée, suceptible de séparer, avec un 35 degré de pureté extrêmement élevé, les protéines princi- pales telles que albumine, hémoglobine, et si on le désire, y globulines. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé qui permette de traiter de façon économi5 que des quantités extrêmement importantes de sang hémolysé, telles que par exemple plusieurs tonnes ou plusieurs dizaines de tonnes de placenta par jour correspondant à plusieurs dizaines de milliers de litres de sang hémolysé. L'inventi Qn a pour objet un procédé de séparation des principales protéines du sang hémolysé, et notamment de l'albumine et de l'hémoglobine, sous forme non dénaturée, dans lequel on effectue une étape de séparation chromatographique de l'albumine et de l'hémoglobine, 15 caractérisé en ce que l'on soumet un sang hémolysé à une étape de clarification, puis, de préférence avant toute précipitation alcoolique de y-globulines, on effectue une chromatographie du sang hémolysé sur un support chromatographique échangeur d'anions à un p H supérieur à 4,8 et 20 inférieur à 6,8, de préférence inférieur à 6 dans le cas d'une précipitation alcoolique préalable des y-globulines, le p H étant de préférence compris entre 5 et 6, après quoi on récupère séparément l'hémoglobine sortant de la colonne de chromatographie et l'albumine obtenue 25 après élution. De façon particulièrement préférée on réalise la clarification à un p H compris entre 4 et 6, de préférence entre 4,8 et 5,4, en présence d'alcool, de préférence éthanol, à une concentratrion inférieure à 15 % et 30 de préférence voisine de 8 %. Le sang hémolysé étant en général dilué on réalise une étape de concentration, conduite sur des systèmes d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de préférence de l'ordre de 10 000 daltons, de préférence de façon à concentrer au moins quatre fois le sang hémolysé, ainsi qu' une diafiltration. Dans le cas, qui n'est pas préféré, dans lequel le sang hémolysé a subi préalablement des étapes de pré5 cipitation alcoolique, notamment pour la séparation des y-globulines, il est nécessaire d'effectuer une dilution dans de l'eau distillée ou un liquide analogue de façon que le taux d'alcool ne dépasse pas 15 % Ceci entraîne la nécessité de travailler sur des volumes très importants et présente d'autre part des inconvénients dus au fait que les additifs nécessaires dans le cas de la précipitation alcoolique des y-globulines diminuent les possibilités d'adsorption du support chromatographique. Si l'on souhaite séparer les globulines et notamment y-globulines de l'hémoglobine purifiée, débarrassée de l'albumine, on peut avantageusement, après avoir obtenu cette hémoglobine par l'étape de chromatographie, traiter le filtrat par addition d'éthanol à environ 25 %, à froid, avec ajustement du p H vers 7 Le précipité d'immunoglobulines peut alors être récupéré par exemple par centrifugation ou filtration et subir ensuite les opérations de purification éventuellement nécessaires Le surnageant ou filtrat correspondant contient l'hémoglobine sous forme native pratiquement pure De préférence, cette hémoglobine est diluée avec au moins un volume d'eau distillée de façon à abaisser la concentration en éthanol suffisamment pour éviter toute dénaturation ultérieure La solution peut être soumise à une opération d'ultrafiltration et de diafiltration pour récupé30 rer l'hémoglobine native concentrée prête à subir d'autres opérations de purification ou autres traitements nécessaires à sa transformation en substitut artificiel du sang. Conformément à l'invention, le support de chro35 matographie est un support à très hautes propriétés méca- niques, comprenant par exemple un substrat en billes de silice. Le support de chromatographie est de préférence le support dénommé Sphérodex et décrit par exemple dans 5 le brevet français précité ou dans le brevet luxembourgeois n 73 094 déposé le 29 Juillet 1975, constitué d'une silice poreuse revêtue de DEAE Dextran et préparée à l'Institut MERIEUX. D'autres avantages et caractéristiques de l'in10 vention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. 1) Etape de clarification du sang placentaire hémolysé kg de placentas humains sont broyés à l'état congelé et dispersés dans 150 litres d'eau, additionnés de 22 litres d'éthanol pour atteindre une température de O C et une concentration alcoolique d'environ 8 % La suspension ainsi obtenue est agitée vigoureusement puis soumise à une filtration sur pressoir de volume 20 400 litres équipé d'une toile de porosité 50 microns, pour séparer le jus sanguin des tissus placentaires Le liquide récupéré occupe un volume de 270 litres Il est additionné d'acide acétique ou d'acide chlorhydrique N indifféremment, pour ajuster le p H à 5,10 sous agitation 25 à O C Après 2 heures d'attente, la suspension est injectée à 300 1/h sur centrifugeuse Un précipité voisin de 7 à 10 kg suivant les jours est éliminé Le sang obtenu dans le surnageant est parfaitement limpide et occupe un volume de 260 litres environ. 2) Etape de concentration et diafiltration du sang clarifié Un ultrafiltre équipé d'une membrane de seuil de coupure 10 000 daltons est utilisé Par exemple deux cartouches spirales de 5 m 2 chacune, commercialisées par 35 Millipore, conviennent bien pour cette opération Après concentration à environ 60 litres, le p H est ajusté à ,50 avec de la soude N et on diafiltre ensuite à volume constant avec environ 200 litres d'eau déminéralisée Le débit d'élimination de l'ultrafiltrat est d'environ 50 1/h pour une pression de 4 bars à l'entrée L'opération totale dure environ 8 heures à + 4 C Le p H final est voisin de 5,25 et n'est pas modifié Apres régénération, l'ultrafiltre peut être ainsi réutilisé plus de 200 fois sans colmatage. Après repos de 15 heures à + 4 C, le sang concentré contient un léger précipité d'euglobulines qui est éliminé par centrifugation Le culot obtenu représente un poids de 100 à 300 grammes selon les lots Le sang concentré clarifié d'un volume de 120 litres est ensuite filtré sans problèmes sur une membrane de porosité 0,2 X et conservé stérilement dans l'attente de l'étape suivante. 3) Etape de séparation chromatographique Une colonne de diamètre 16 cm et de hauteur 1 m 20 est remplie de 9 kg de Sphérodex Elle est équilibrée en tampon phosphate 0,01 M p H 5,25, dans des conditions stériles déjà décrites (TAYOT et coll: Coopération Internationale et dérivés sanguins, 1981, Editions Fondation MERIEUX Lyon) Les 120 litres de sang concentré et filtré 25 obtenus précédemment sont injectés dans la colonne à un débit de 40 1/h, de manière stérile à travers un filtre de porosité 0,2 li La colonne est ensuite rincée par litres de tampon PO 4 0,01 M p H 5,25 Le filtrat d'un volume de 135 litres, contenant l'hémoglobine et les immunoglobulines, est totalement débarrassé de l'albumine Il est conservé à + 2 C en attendant l'étape suivante L'albumine fixée sur la colonne avec d'autres protéines est ensuite éluée par injection de 60 litres d'une solution de Na Cl 20 g/1 Un volume de 50 litres suffit pour récupérer quantitativement l'albumine, soit environ 1200 g ( 8 g/kg placentas en moyenne) Cette solution d'albumine doit ensuite être soumise à d'autres étapes connues de purification pour être utilisable en thérapeutique humaine. La colonne après lavage par une solution d'H Cl 0,1 N et d'alcool est ensuite prête pour un nouveau cycle d'utilisation. Plus de 50 cycles ont été effectués sur la même colonne, sans perte d'efficacité. 4) Séparation finale des gamma-globulines et de l'hémoglobine Le filtrat précédent ( 135 litres) est ajusté en chlorure de sodium 8 g/l, ajusté à p H 7, refroidi à O C. litres d'éthanol refroidi à -20 C sont ajoutés pro15 gressivement, sous agitation et la température est ajustée à -5 C en final Apres un repos d'une nuit, la suspension obtenue est centrifugée à un débit de 300 1/h. Le précipité de gammaglobulines obtenu pèse 900 grammes en moyenne sur plusieurs lots, et doit être ensuite soumis à d'autres opérations de purification déjà connues, pour préparer des immunoglobulines utilisables en thérapeutique humaine. Le surnageant obtenu est parfaitement limpide. Il contient l'hémoglobine pratiquement débarrassée d'immunoglobulines I 1 est dilué avec 300 litres d'eau à 0 C pour faire descendre la concentration alcoolique en dessous de 10 % Cette solution est concentrée par ultrafiltration sur le même module décrit précédemment et peut être diafiltrée en final pour ajuster la force ionique et 30 la composition, de la solution en fonction de son utilisation future La quantité d'hémoglobine ainsi obtenue est de 3 700 g, soit un rendement voisin de 25 g/kg placentas. Des essais effectués à un p H de 5,0 montrent 35 une diminution de la capacité de la colonne à retenir l'albumine alors qu'au p H 5,2 l'albumine est totalement retenue Des essais effectués à p H 6,5 ont montré que si l'albumine est entièrement retenue, une contamination du support par les pigments de l'hémoglobine commence à apparaître. Dans le cas, non préféré, dans lequel on soumet le sang hémolysé à une précipitation alcoolique à p H 7 pour séparer les y globulines, l'étape de clarification à p H 5,1 et 8 % d'alcool est conduite avant et/ou après la 10 précipitation de la fraction globulinique. REVENDICATIONS 1 Procédé de séparation des principales protéines du sang hémolysé, et notamment de l'albumine et de l'hémoglobine, sous forme non dénaturée, dans lequel on effectue une étape de séparation chromatographique de l'albumine et de l'hémoglobine, caractérisé en ce que l'on soumet un sang hémolysé à une étape de clarification, puis, on effectue une chromatographie du sang hémolysé sur un support chroma10 tographique échangeur d'anions à un p H supérieur à 4,8 et inférieur à 6,8, après quoi on récupère séparément l'hémoglobine sortant de la colonne de chromatographie et l'albumine obtenue après élution. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 15 que l'on effectue la chromatographie à un p H compris entre 5 et 6. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on effectue l'étape de clarification à un p H compris entre 4 et 6 en présence 20 d'alcool à une concentration inférieure à 15 %. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on réalise la clarification à un p H compris entre 4,8 et 5,4. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'on réalise l'étape de clarification en présence d'alcool à une concentration voisine de 8 %. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise l'étape de 30 clarification en présence d'éthanol. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on effectue la chromatographie avant toute séparation des y globulines. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on sépare les y globulines de l'hémoglobine purifiée. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on sépare les y globulines par précipitation à l'alcool à 25 % environ, à un p H voisin de 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1. à 9, caractérisé en ce que l'on utilise pour la chromatographie un support de silice poreuse revêtue 10 de DEAE Dextran. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on équilibre la colonne de chromatographie en tampon phosphate 0,01 M puis qu'on la rince dans le même tampon, l'albumine 15 étant éluée par une solution de Na Cl 20 g/l. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'avant la chromatographie, on effectue une concentration d'un sang hémolysé dilué, notamment par ultra-filtration et diafiltra20 tion.