Brevet FR2557886A1 — publié le 19850712

"Milieux pour la production et la culture de cellules secrétantes ou de leurs hybridomes." L'invention a pour objet de nouvelles compositions utiles, notamment, comme milieux pour les cultures cellulaires. Elle.vise plus particulièrement des compositions appropriées à la production et à la culture des cellu- les secrétantes ou de leurs hybridomes n vue de produire et de purifier des a ors monoclonaux ou des facteurs variés secrétés par ceux-ci. En effet, la culture d'hybridomes est largement utilisée pour obtenir des anticorps monoclonaux ou des facteurs tels que hormones, facteurs de croissance, inhibiteurs variés... Selon les techniques classiques, les hybridomes secrétant des anticorps sont obtenus par exemple par fusion d'un myélome et d'une cellule B secrétant l'anticorps, la cellule B étant elle-même obtenue par immunisation in vivo ou in vitro. On utilise un milieu sélectif permettant d'éliminer les cellules non hybrides. Les hybrides formés sont clonés et sélectionnés pour leur spécificité pour un antigène donné et sont ensuite mis en culture pour secréter l'anticorps ou le facteur considéré. Ces cultures sont généralement réalisées dans des sérums, plus spécialement du sérum foetal de veau. I1 s'agit donc de milieux de cultures contenant de nombreux facteurs non identifiés, ce qui constitue autant de paramètres dont les effets ne sont pas tou Jours connus. De plus, la séparation des anticorps ou des facteurs produits à partir des facteurs non identifiés ou connus du sérum s'avère souvent très difficile. Un autre inconvénient de ces milieux avec sérum résulte de la présence d'agents de différenciation qui favorisent l'instabilité des hybridomes, lesquels ont une forte tendance à perdre leurs chromosones. Enfin, la possibilité dans un milieu défini d'immuniser "in vitro" peut être très-importante dans le cas d'antigènes précieux, instables ou à courte demi-vie L'invention a donc pour but ae f6urnir de nouveaux milieux de cultures pour hybridomes, faciles à élaborer, de faible coût de revient, entièrement définis moléculairement et contenant très peu de facteurs afin de faciliter la séparation des facteurs produits par les hybridomes. Elle vise plus spécialement à fournir des milieux de culture favorisant la prolifération des hybridomes tout en assurant un taux de secrétion équivalent ou supérieur à celui obtenu en présence de sérum. Les milieux pour culture cellulaire, en particulier pour culture d'hybridomes, selon l'invention, sont caractérises essentiellement-par le fait qu'ils renferment un milieu moléculairement défini comprenant au moins un composé de type glucocorticoide et au moins un composé lipidique, ces composés étant mélangés à un milieu de base apportant les éléments nutritionnels indispensables d'une manière générale à la grande majorité des cellules, tels que sucres, acides aminés, sels, vitamines et autres et à un transporteur de fer, tel que la transferrine, si la culture n'en contient pas. Par le terme "glucocorti coude11, on désigne des produits représentés plus spécialement par la structure de l'hydrocortisone. Ce terme s'étend naturellement aux glucocorti coides naturels ou de synthèse et aux dérivés tels qu'acides ou sels, dès lors que l'effet conféré par le composé résulte principalement de la structure corti coide en question. Généralement, on entend par milieu de base, la partie définie qui avec le sérum, constitue le milieu de culture. Selon une disposition avantageuse de l'invention, les milieux en question sont, en outre, moléculairement définis, c'est-à-dire qu'ils sont élaborés à partir de produits déterminés, en quantités déterminées. On notera la simplicité de composition des milieux de l'invention et par là leur intérêt économique. De plus, ces milieux permettent avantageusement de réaliser la production d'anticorps monoclonaux d'origines diverses et ce à des taux au moins équivalents à ceux obtenus avec des sérums. Ils sont également utilisables pour réaliser l'immunisation in vitro, la fusion et la sélection d'hybridomes. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de culture renferme au moins un glucocorticoide naturel tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de cette dernière tel qu'un acide, un ester, un éther ou un sel et/ou un glucorticolde de synthèse tel que la déxaméthasone ou un dérivé de cette dernière. Ces milieux préférés renferment avantageusement des composés lipidiques. Il peut s'agir , par exemple, de dérivés tels que les LDL... Avantageusement, on utilise des mélanges d'acides gras saturés et d'acides gras insaturés, selon des proportions respectives équilibrées pour obtenir un effet favorable et avanta geusement un effet synergique. Des mélanges appropriés comprennent l'acide linoléique, l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide arachidonique ou leurs dérivés tels que les esters. Tout autre composé lipidique capable d'apporter des acides gras à la cellule peut être utilisé en remplacement des mélanges simples d'acides gras ci-dessus. La mise en oeuvre d'acides gras à raison de 2 à 100 pg/ml de milieu, de préférence de 10 à 35 jig permet un apport satisfaisant d'acides gras à la cellule. Pour assurer une dissolution satisfaisante des acides gras ou de leurs dérivés dans le milieu de culture et, par la', leur transport jusqu'aux membranes cellulaires on utilise avantageusement un composé capable de complexer les acides gras tel qu'un biopolymère lipophile; en une concentration non cytotoxique. Un compose de ce type plus spécialement pré zébré, est constitué par de l'albumine délipidée et cristallisée. Ce composé est avantageusement utilisé à raison de - 0,3 à 30 mghl de préférence de 1 à 3 mg/ml . En variante; on utilise des transporteurs de synthèse ou encore des protéines telles que la caséine ou l'ovalbumine ou toute autre protéine formant naturellement des complexes lipoprotéiques. Le milieu de culture contient généralement des éléments capables d'apporter du fer aux cellules tels que la transferrine-Des effets satisfaisants sont obtenus avec des concentrations de l'ordre de 10 9 à 10 5M; de préférence de l'ordre de 3 x 10-8 M. Les divers éléments entrant dans la constitution des milieux de l'invention sont mis en.oeuvre en mélangé dans un milieu de base. I1 s'agit avantageusement de milieux qui additionnés de sérum sont utilisés de façon habituelle pour la culture des cellules. Des milieux appropriés comprennent, le cas échéant en combinaison, le milieu de Dulbecco modifié par Iscove, le milieu F 12 DMEM (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco), RPMI 1640 et analogues. D'une manière avantageuse; l'invention permet ainsi de disposer de milieux stables et identi ques d'un lot à l'autre et de sélectionner des hybridomes stables. I1 est également possible de purifier les immunoglobulines ou les facteurs sécrétés de façon simple et sûre et de stimuler la secrétion à des niveaux supérieurs à ceux obtenus en présence du sérum qui contient de nombreux inhibiteurs non identifiés. Les milieux de l'invention présentent, en outre, l'avantage de permettre certains marquages spécifiques de façon quantitative, ce qui n'est pas possible en présence de sérum. EXEMPLE 1 : Préparation d'un milieu de culture renfermant de 1'hydrocortisone On utilise comme milieu de base le milieu connu sous la dénomination IMDM (Iscove modiìed Dulbecco medium) commercialisé notamment par Gibco, Flobio, Europio et Serimed et qui est décrit dans J.exp.Med. 1978, 2147 p 923 par Iscove N.M et Melchers F. On ajoute ensuite les éléments suivants selon les proportions indiquées - 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin ou humain délipidée telle que celle commercialisée par les Laboratoires MILES sous le code 82-002 - 5 lug/ml de transferrine telle que la transferrine humaine commercialisée par la Société SIGMA sous le Code T 2252 - 10 7 moie d'un dérivé d'hydrocortisone dissoute dans de l'méthanol tel que le succinate de sodium H-21 d'hydro cortisone commercialisé par la Société SIGMA sous le code H. 4881, et - 5 Lug/ml d'acide linoléiqué, 5 ug/ml d'acide oléique, tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA respectivement sous les codes L 1376 et 0-0750, et 1 jug/ml d'acide palmitique tel que celui commercialisé par la Société MERCI sous la référence 509 (ces différents acides gras sont utilisés en dissolution dans de l'éthanol). EXEMPLE 2 On établit un milieu tel que défini dans 11 exemple l, mais renfermant 10-8 M de dexaméthasone. EXEMPLE 3 On établit un milieu tel que défini dans l'exemple 1 mais renfermant comme milieu de base DMEM/F12 dans des proportions 1/1. EXEMPLE 4 : Obtention d'hybridomes On opère comme décritpar KOHLER G et MILSTEIN C dans Nature 1975, 256, p. 495. Etude de la secrétion immunoglobulines Des hybridomes d'ori glanes variées ont été cultivés dans le milieu de lexem- ple 1 produisant des quantités d'immunoglobulines semblables à celles obtenues en présence de sérum soit, suivant l'hybridome,généralement de l'ordre de 10 à 100 pg/ml mais pouvant dans certains cas aller jusqu'à 1 mg/ml. L'invention fournit donc des milieux simples, économiques, faciles à commercialiser sous forme liquide ou lyophilisée et permettant toutes les étapes aboutissant à l'obtention d'anticorps monoclonaux. Ces milieux qui avantageusement sont molêculairement définis permettent la croissance de myélomes d'origines variées, la fusion nécessaire pour former des hybridomes avec des cellules d'origines variées (souris, rat, homme, etc..), la sélection d'hybridomes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux facilement séparables des constituants du milieu de culture. Naturellement, divers facteurs peuvent être ajoutés aux milieux de l'invention tels que des conservateurs de milieux (par exemple la vitamine C, des antioxydants, le dithiothréitol ou analogues), des stimulants du métabolisme lipidique tels que lléthanolamine, la phosphoéthanolamine ou analogue, des protecteurs des produits de secrétions comme des antiprotéases, ou encore des facteurs de croissance ou des stimulateurs de secrétion- comme l'insuline. REVENDICATIONS 1.- Milieux pour la production et la culture de cellules secrétantes ou de leurs hybridomes, caractérisés en ce qu'ils renferment un milieu molèculairement défini contenant un composé de type glucocorticoïde, et au moins un composé lipidique, ces composés étant mélangés à un milieu de base apportant les éléments nutritionnels indispensables d'une manière générale à la grande majorité des cellules, tels que sucres, acide aminés, sels,vitamines et autres et à un transporteur de fer, tel que la transferrine, si la culture n'en contient pas. 2.- Milieux selon la revendication 1 caractérisés en ce que le composé de type gluaocorticolde est un glucocorticoïde naturel tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de cette dernière tel qu'un acide, un ester, un éther ou un sel et/ou un glucocorticoide de synthèse tel que la déxaméthasone ou un dérivé de cette dernière. 3.- Milieux selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les dérivés lipidiques comprennent des mélanges d'acides gras saturés et d'acides gras insaturés. 4.- Milieux selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils renferment en mélange de l'acide linoléique, de l'acide oléique, de l'acide palmitique, de l'acide stéarique, de l'acide arachidonique ou leurs dérivés tels que les esters. 5.- Milieux selon la revendication 3 ou 4, caractérisés en ce que les acides gras sont mis en oeuvre à raison de 2 à 100 /ml de milieu, de préférence de 10 à 35 ,ug. 6.- Milieux selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils renferment un composé capable de complexer les acides gras tel qu'un biopolymère lipophile, en une concentration non cytotoxique, en particulier de l'albumine délipidée et cristallisée, ou encore des transporteurs de synthèse ou des protéines telles que la caséine ou l'ovalbumine. 7.- Milieux selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'albumine est présente à raison de 0,3 à 30 mg/ml de préférence de 1 à 3 mg/ml de milieu. 8.- Milieux selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils renferment des éléments capables d'apporter du fer aux cellules tels que la transferrine, selon des concentrations de l'ordre de 10 9 à l05M, de préférence de l'ordre de 3x10 8M. 9.- Milieux selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent dans un milieu moléculairement défini, de lthydrocortisone,d e l'albumine, de la transferrine et des acides gras. 10.- Application des milieux selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la production et la culture d'hybridomes, et à la purification d'immunoglobulines.