Brevet FR2550715A1 — publié le 19850222

Chambre de centrifugation compartimentée pour l'ultracentrifugation à gradient de densité à grande échelle. La présente invention concerne une chambre de centrifugation pour la séparation de particules en suspension par centrifugation à gradient de densité. La séparation de particules biologiques telles que cellules, organelles et macromolécules obtenue en exploitant leurs différences en densité ou en taille est une méthode couramment utilisée dans le domaine biomédical. La centrifugation par gradient de densité est utilisée pour séparer des particules de différentes den10 sités Tubes de centrifugation d'un volume compris entre environ 10 ml et 50 ml sont habituellement utilisées cette fin. Etant donné que les gradients de densité deviennent de moins en moins stables lorsque l'on augmente le 15 volume des tubes et qu'une turbulence apparaît lors de l'accélération et la décélaration de la centrifugeuse, des tubes de plus grand volume peuvent difficilement être utilisés pour le traitement de grandes quantités. Si l'on désire séparer des échantillons de grands volumes, il est nécessaire de répartir les aliquotes entre plusieurs tubes à gradient de taille réduite, ce qui prend du temps. On peut utiliser différents types de rotors zonaux pour la centrifugation à gradient de densité à grande quantité, mais ceux-ci sont onéreux et des équipe- ments supplémentaires tels que des dispositifs de pompage sont alors nécessaires. Des réceptacles et dispositifs pour la centrifugation qui sont subdivisés en deux compartiments ou plus sont décrits dans les brevets U S N 3 456 876 et DE-OS 2 648 844 (République Fédérale d'Allemagne) Les subdivisions sont destinées à réduire la distance de sédimentation pour les très petites particules, essentiellement dans le cas des particules dont la vitesse de sédimentation est inférieure à 10-2 unités de Svedberg, 10 telles que les macromolécules biologiques, ce qui a pour conséquence une réduction globale du temps requis pour la sédimentation L'unité "Svedberg" est une unité du système métrique, utilisée communément en centrifugation dont la dimension est de 10-13 sec. Cependant, ces dispositifs sont conçus pour la 15 sédimentation de très petites particules par ultracentrifugation et ne sont pas utilisables pour la centrifugation à gradient de depsité La densité, qui est le critère prépondérant en manière de centrifugation à gradient de densité est d'importance mineure en comparaison avec d'autres 20 paramètres dans le cas de la sédimentation. L'objectif de la présente invention est de créer un dispositif pour la centrifugation à grandient de densité à grande échelle (pour des volumes compris entre plus de cent millilitres et quelques litres), qui soit simple, efficace et qui puisse être utilisé en combinaison avec des centrifugeuses de laboratoire et les rotors aà godets pivotants habituels, qui sont couramment disponibles. Le gradient de densité doit être mécaniquement stable et les turbulences indésirables doivent être effica30 cement prévenues En particulier, le gradient de densité doit être suffisamment stable pour résister aux forces de rotation qui apparaissent lors de l'accélération et la décélération du rotor de la centrifugeuse et qui ont tendance à causer des tourbillons inacceptables dans les tubes à gradient de grande taille. D'une façon générale, les objectifs de cette invention sont atteints en subdivisant une chambre de centrifugation de grande taille en plusieurs compartiments disposés comme indiqué plus loin, ceci au moyen de parois ou de lamelles La caractéristique principale de cette invention est la présence des parois qui sont orientées suivant les plans radiaux et verticaux pendant la centri10 fugation, c'est-à-dire dans les plans coïncidant avec les lignes de force centrifuge et parallèles à l'axe de rotation. L'invention sera décrite en aux dessins annexés dans lesquels: détail en se référant La figure 1 est une vue en coupe dans la direc- tion de l'axe de rotation; la figure 2 est ligne 2-2 de la figure 1; la figure 3 est 20 figure 1; une vue en coupe suivant la une coupe axiale suivant la la figure 4 est ligne 4-4 de la figure 3; la figure 5 est lisation comprenant une par 25 la figure 6 est de la figure 5; la figure 7 est une vue en coupe suivant la une vue suivant un mode de réa'tie du support intégré; une coupe suivant la ligne 6-6 une vue en perspective suivant une autre variante de réalisation. Suivant les figures 1 et 2, la disposition des 30 parois de séparation 10 se trouve dans une chambre de centrifugation 12 installée dans le rotor à godets pivotants 14 d'une grande centrifugeuse de laboratoire. Cette disposition est telle que les parois (lamelles) 10 contrecarrent de la façon la plus efficace les forces de rotation apparaissant en plus de la force centri- fuge lors de l'accélération et la décélération d'une centrifugeuse; la formation de tourbillons est ainsi empêchée sans que la sédimentation ni le flottement radiaux des particules soient affectés En particulier, la disposition des parois exactement dans la direction radiale prévient les "effets de paroi", c'est-à-dire la sédimentation de particules sur les parois. L'adjonction de parois perpendiculaires à l'axe de rotation n'apporte aucune autre stabilisation notable. 10 Une autre particularité caractéristique de cette invention est le fait qu'elle comprend une communication hydrostatique entre les compartiments individuels 20 au fond de la chambre à gradient, ce qui rend possible la mise en couches et le fractionnement du gradient de densité 15 de façon simultanée dans chacun des compartiments. Le principal avantage de cette invention est sa possibilité à obtenir rapidement et simplement la mise en couches et le fractionnement d'un gradient de densité de grande taille Dans le cas de la centrifugation de volumes 20 supérieurs à 200 ml, il est possible d'économiser de façon considérable le temps et la main-d'oeuvre par rapport au procédé qui consiste à distribuer le même volume entre des petits tubes à gradient de densité. Les "effets de paroi" sont évités grâce à la forme 25 en secteur des compartiments 20 et ainsi le pouvoir de résolution de la séparation par gradient à densité est amélioré par rapport aux tubes à gradient de densité à parois parallèles que l'on rencontre communément. De plus, il devient aisé de concevoir cette 30 chambre à gradient de densité compartimentée comme un système complètement isolé pour la séparation par gradient de densité en milieu stérile. En comparaison avec les rotors zonaux, qui sont aussi destinées à la centrifugation par gradient de densité à grande échelle, cette invention présente l'avan- tage d'être potentiellement moins onéreuse et plus commode d'emploi La chambre à gradient de densité étant facilement transportable, il est possible de remplir et de fractionner le gradient dans différents endroits Les avantages par rapport aux rotors zonaux sont les plus marqués lors de la séparation de particules biologiques relativement grandes telles que des cellules complètes et des grandes particules subcellulaires, car seules des forces centrifuges faibles ou modérées sont nécessaires. Les figures 3 et 4 montrent la chambre prête à la centrifugation. Les éléments essentiels nécessaires au remplissage et au fractionnement simultanés font partie intégrante de la chambre de centrifugation De plus, la chambre com15 plète est un système fermé avec seulement deux raccords pour le remplissage et la vidange. La chambre de centrifugation se compose de trois ensembles fonctionnels: ( 1) la partie inférieure 22 qui contient un canal 20 de communication 24 avec des ouvertures étroites 26 à la base de chaque compartiment 20 ( 4 dans le cas de la figure 4) Ces ouvertures d'admission 26 divergent sous forme de pyramides oblongues creuses 28 Les compartiments individuels 20 communiquent hydrostatiquement par le canal 24 A 25 son point le plus extérieur 30, ce canal 24 communique avec un tuyau résistant à la pression hydrostatique qui sort de la chambre et qui y est attaché par sa partie supérieure pendant la centrifugation Toutes les solutions peuvent aussi bien entrer que sortir de la chambre par ce tuyau Le 30 raccord entre le tuyau et le canal commun doit pouvoir résister à la pression hydrostatique multipliée par la force centrifuge pendant la centrifugation. ( 2) la partie médiane 32 comprenant les compartiments 20 en forme de secteur, oblongs et juxtaposés. 35 ( 3) la partie supérieure 34, conçue de façon similaire à la partie inférieure 22 qui comprend un raccord pour tuyau 35 situé au point le plus élevé 36 de son canal commun 38. Les deux raccords pour tuyaux peuvent être fermé par des obturateurs adaptables sur les embouts de "Luer" si nécessaire. Le gradient de densité est d'abord mis en couches par le bas de la chambre en commençant par la solution la moins dense et plus tard extrait couche par couche, soit par fractionnement ascendant, c'est-à-dire 10 en introduisant une solution dense par l'orifice du bas, soit par fractionnement descendant, c'est-à-dire en extrayant les différentes fractions directement par l'orifice et le tuyau du bas Dans chacun des cas les couches correspondantes dans les différents compartiments se rejoignent 15 dans un canal commun. La chambre de centrifugation compartimentée peut être conçue comme un accessoire pour n'importe quelle grande centrifugeuse de laboratoire à godets pivotants Les dimensions détaillées de la chambre de centrifugation dépendent de la géométrie de la centrifugeuse destinée à être utilisée La chambre de centrifugation peut être suspendue au rotor par l'intermédiaire soit de pivots intégrés, soit d'un support séparé. Les figures 5 et 6 montrent un mode de réalisa25 tion qui comprend une partie du support intégrée 42 par laquelle la chambre est suspendue aux pivots 40 d'un rotor 14 à godets pivotants Les parois extérieures 44 et la partie inférieure 22 de la chambre peuvent être des parties intégrées de la partie du support 42. Les matériaux constituant le dispositif seront choisis en fonction des différents besoins Lorsque la chambre doit être utilisée en milieu stérile, des matériaux résistant à l'autoclave tels que métaux, verre ou silicone sont avantageux. Il est possible de réaliser la chambre de centrifugation à gradient démontable en 2, 3 ou plus d'éléments à des fins de nettoyage. Ces éléments correspondent aux parties fonc5 tionnelles décrites précédemment Des rainures complémentaires, équipées d'un joint et situées au niveau de la surface de contact de la partie inférieure 22 faisant face aux parois de la partie médiane 32, assurent un contact ferme entre les deux parties Lorsque la chambre de centri10 fugation est montée, la rigidité de l'ensemble est assurée par des vis, des attaches, ou autres pièces assurant une liaison Pendant la centrifugation, l'étanchéité de pièces entre elles est assurée principalement par la force centrifuge. La figure 7 qui est une vue en perspective, montre un mode de réalisation différent Un tube de centrifugation à grande taille 50 est compartimenté par une pièce à insérer comprenant des lamelles l Oa et des pièces assurant une liaison fixe 52 et 54 Les dimensions détaillées des lamelles l Oa et de pièces 52 et 54 sont adaptées au tube et au rotor utilisé de façon que les lamelles l Oa sont positionnées pendant la centrifugation dans les plans coincidant avec les lignes de force centrifuge 18 a et parallèles à l'axe de rotation 16 a. RE V E N D I CA T I O N S 1 ) Chambre ( 12) de centrifugation compartimentée, subdivisée par des parois ou lamelles en plusieurs compartiments ( 20) communiquant hydrostatiquement, devant être 5 utilisée conjointement avec une centrifugeuse et un rotor à godet ( 14) pivotants ou à angle fixe, chambre caractérisée en ce que les parois ou lamelles ( 10) sont positionnées pendant le centrifugation dans les plans coincidant avec les lignes de force centrifuge ( 18) et parallèles à l'axe de rotation ( 16), ou au moins, les parois ou lamelles ( 10) sont nettement proches des plans ( 10). 2 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est suspendue au rotor ( 14) au moyen d'un godet ou d'un support. 3 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon la revendication 1, caractériséeen ce qu'elle est suspendue au rotor ( 14) par l'intermédiaire d'un support intégré ou séparé ( 42). 4 ) Chambre de centrifugation compartimentée 20 selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle constitue un système entièrement clos, excepté les raccords obturables destinés aux tuyaux d'entrée/sortie ( 35). ) Chambre de centrifugation compartimentée 25 selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle comprend deux ou plus, parties pouvant être démontées à des fins de nettoyage, soit: a) une partie inférieure avec des ouvertures d'admission pour chacun des compartiments, qui communique d'un côté et diver30 ge en forme de cône ou de pyramide creuse, b) une partie médiane comprenant les compartiments ( 20) et, c) une partie supérieure ( 34) qui est conçue de façon similaire à la partie inférieure ( 22). 6 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle constitue de matériaux résistant à la chaleur d'un autoclave. 7 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de dispositif à usage unique stérile ou non stérile. 8 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, carac10 térisée en ce qu'elle comprend des clapets ou robinets, intégrés dans des canaux ou des tuyaux. 9 ) Chambre de centrifugation compartimentée selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle communique pendant la centrifugation 15 avec une pièce non rotative soit en permanence, soit à un instant donné, rendant ainsi possible le transvasement de fluides.