Brevet FR2551767A1 — publié le 19850315

Plasmides de résistance à l'arsenic et procédé de leur construction La présente invention concerne des plasmides de résistance à l'arsenic et un procédé de leur construction. Plus particulièrement, l'invention concerne la construction de vecteurs constitués de plasmides d'ADN recom5 binants pour Thiobacillus ferrooxidans contenant des gènes de résistance à l'arsenic et capables de réplication dans T ferrooxidans et dans Escherichia coli. La lixiviation biologique de minerais de type arsénopyrite a été à ce jour limitée par la sensibilité des orga10 nismes utilisés à l'arsenic libéré dans le procédé. Bien que des plasmides de résistance à l'arsenic aient été construits pour d'autres bactéries, à la connaissance de la demanderesse, la construction de tels plasmides pour T ferrooxidans capable également de réplication dans E. 15 coli n'a jamais été mentionnée. Selon l'invention, on construit un plasmide d'ADN qui contient des gènes de résistance à l'arsenic et qui est capable de réplication dans T ferrooxidans De tels plasmides sont susceptiblesde transformer T ferrooxidans 20 et accroissent la résistance à l'arsenic des receveurs. Le procédé est de préférence effectué par clivage d'un plasmide d'ADN dissimulé (cryptique) d'une souche de T ferrooxidans et d'un second plasmide avec la même enzyme de restriction, assemblage des plasmides pour former 25 un plasmide recombinant, élimination de l'origine de réplication dans E coli du plasmide recombinant pour former un plasmide recombinant à délétion, l'élimination des gènes de résistance à l'arsenic d'un troisième plasmide par clivage avec une enzyme de restriction et l'insertion des 30 gènes dans le plasmide recombinant à délétion par clivage avec la même enzyme de restriction de façon à produire les plasmides de résistance à l'arsenic. -2 L'invention s'applique également à un plasmide de résistance à l'arsenic p DR 416 qui a une taille d'environ 16,5 kb et qui est divisé en cinq fragments ayant reapectivement des tailles de 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb et 2,3 kb par l'enzyme de restriction Pvul. L'invention concerne également un plasmide de résistance à l'arsenic p DR 420 qui a une taille d'environ 13,3 kb et qui est divisé en quatre fragments ayant respectivement des tailles de 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb et 1,1 kb 10 par l'enzyme de restriction Pvul. Les plasmides de l'invention sont utiles dans la lixiviation des minerais en particulier dans les procédés de récupération de l'or. Un exemple de l'invention va être décrit en regard 15 des dessins annexes dans lesquels: La fig 1 illustre les cartes de restriction des plasmides p TF-FC 2 et p DR 401 et la fig 2 illustre les cartes de restriction des plasmides p DR 403, p DR 404, p DR 416 et p DR 420 et d'un fragment de 20 R 46. La demande de brevet en co-instance de la demanderesse na 84 13393, déposée le 29 août 1984, décrit, entre autres, la construction du plasmide p DR 401. On extrait un plasmide dissimulé de 12,4 kilobases (kb), p TF-FC 2, d'une souche de T Ferrooxidans FC isolée d'une liqueur de lixiviation acide de Fairview Mine, General Mining Union Corporation Limitedr Afrique du Sud La carte de restriction de p TF-FC 2 montre qu'il a des sites de restriction Pst 1, Xho 1, Kpn 1, Eco Rl, Apal et Clal uniques et deux sites de restriction Pvul comme le montre la fig 1. On construit un plasmide recombinant p DR 401 par insertion du plasmide p BR 325 de E coli dans le site Pstl de p TF-FC 2 p BR 325 contient les gènes de résistance à l'ampicilline (Ap), au chloramphénicol (Cm) et à la tétracycline (Tc) Le clonage au site Pst 2 inactive par insertion le gêne Ap R et on isole les transformants de E coli comprenant les gènes Cm R, Tc R et Ap S On extrait le plasmide recombinant p DR 401 (environ 17,8 kb) des transformants d'E coli et on le caractérise par analyse de restriction Ce nouveau plasmide recombinant contient les gènes de Cm R et Tc R et est capable de réplication dans T ferrooxidans et E coli. I 1 est possible, selon l'orientation de l'insertion du plasmide p BR 325, de construire le plasmide p DR 401 ( 17,8 kb) ou le plasmide p DR 403 ( 17,8 kb) dont une carte de restriction est illustrée sur la figure 2 (il convient de noter qu'à ce stade, d'autres plasmides appropriés pourraient éventuellement être utilisés au lieu de p BR 325). Selon l'invention, l'origine de réplication dans E coli est éliminée du plasmide p DR 403 pour former le plasmide recombinant à délétion p DR 404 ( 9 kb)(voir la figure 2). Les gènes de résistance à l'arsenic sont éliminés du plasmide R 46 sous forme d'un fragment de 7,5 kb contenant les gènes As R et Tc R qui est le produit de digestion par Eco Rl du fragment plasmique R 46 de Inc N (Brown et Willets 1981) Ceci est effectué par clivage du plasmide 25 R 46 avec l'enzyme de restriction Eco Ri Les gènes de résistance à l'arsenic sont insérés dans le plasmide p DR 404 par clivage avec la même enzyme de restriction Eco Rl pour produire les plasmides de résistance à l'arsenic p DR 416 et p DR 420. Chacun des plasmides p DR 416 ( 16,5 kb) et p DR 420 ( 13,3 kb) a été caractérisé par clivage endonucléolytique avec l'enzyme de restriction Pvul. Le plasmide p DR 416 est ainsi clivé en cinq fragments ayant respectivement des tailles de 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 35 2,8 kb et 2,3 kb. Le plasmide p DR 420 est clivé par la même enzyme en quatre fragments ayant respectivement des tailles de 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb et 1,1 kb. Les souches de T ferrooxidans dans lesquelles les plasmides de l'invention ont été transformés sont utilisées pour la lixiviation de minerais de type arséno-pyrite pour en accroître l'extraction des substances minérales. Selon un procédé connu de la demanderesse, un minerai aurifère est mis en contact avec de l'arséno-pyrite et, 10 lorsque l'or est libéré pour être extrait, l'arsenic passe en solution La concentration en arsenic s'accroit, ce qui inhibe l'organisme et minimise le rendement de l'extraction Pour résoudre ce problème, on précipite l'arsenic à des intervalles réguliers et on poursuit le procédé 15 avec une solution fraîche Ceci rend le procédé long et coûteux. Les plasmides de l'invention confèrent une résistance à l'arsenic et, après transformation dans les souches de T ferrooxydans, ils permettent une lixiviation accélérée 20 des minerais Cette accélération est due à l'allongement du temps écoulé avant qu'une précipitation de l'arsenic soit éventuellement nécessaire. La fig 2 schématise la façon dont on peut s'y prendre pour construire des plasmides recombinants entre T ferro25 oxidans et E coli p DR 401 et p DR 403 sont des plasmides recombinants formés entre le plasmide p TF-FC 2 de 12,4 kb de T ferrooxidans et p BR 325 Le fragment ex R 46 contenant les gènes As et Tc est un produit de digestion par Eco Rl du fragment plasmique R 46 d'Inc N (Brown et Willets, 30 1981) Les symboles qui suivent ont les significations suivantes: a site de T ferrooxidans essentiel à la réplication dans E coli; 0, origine de la réplication sur p BR 325; R Tc R, résistance à la tétracycline; Cm R, résistance au ch Ioramphénicol; As, résistance à l'arsenic. -6 REVENDICATIONS 1. Procédé pour construire des vecteurs de résistance à l'arsenic pour Thiobacillus ferrooxidans, caractérisé par les stades de clivage d'un plasmide d'ADN dissimulé d'une souche de T ferrooxidans et d'un second 5 plasmide avec la même enzyme de restriction, l'assemblage des plasmides pour former un plasmide recombinant, l'élimination de l'origine de réplication dans E coli du plasmide recombinant pour former un plasmide recombinant à délétion, l'élimination des gênes de résistance à l'arse10 nic d'un troisième plasmide par clivage avec une enzyme de restriction et l'insertion des gènes dans le plasmide recombinant à délétion par clivage avec la même enzyme de restriction pour produire les plasmides de résistance à l'arsenic. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide d'ADN dissimulé est p TF-FC 2 ayant une taille de 12,4 kb. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le second plasmide est p BR 325. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le plasmide recombinant est p DR 403 ayant une taille de 17,8 kb. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le plasmide recombinant à 25 délétion est p DR 404 ayant une taille de 9 kb. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le troisième plasmide est R R 46 ( 7,5 kb) contenant des gènes As R. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 1 à 6, caractérisé en ce que le troisième plasmide est clivé avec l'enzyme de restriction Eco Rl. 8. Plasmides de résistance à l'arsenic construit selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Plasmide de résistance à l'arsenic p DR 416 qui est caractérisé par une taille d'environ 16,5 kb et qui est divisé en cinq fragments ayant respectivement des tailles de 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb et 2,3 kb par l'enzyme de restriction Pvul. 10. Plasmide de résistance à l'arsenic p DR 420 qui est caractérisé par une taille d'environ 13,3 kb et qui est divisé en quatre fragments ayant une taille respectivement de 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb et 1,1 kb par l'enzyme 10 de restriction Pvul. 11. Plasmide recombinant à délétion capable de réplication dans T ferrooxidans et E coli contenant un fragment issu d'un plasmide de E coli mais dépourvu de l'origine-de réplication de ce plasmide dans E coli et 15 de gènes de résistance à l'arsenic. 12. Plasmide recombinant caractérisé par le fait qu'il comporte les caractéristiques de celui tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.