Brevet FR2550943A1 — publié le 19850301

w La présente invention concerne des vaccins capables de conférer une immunité sélective contre les toxines du choléra (CT) et contre la toxine labile à la chaleur de E Coli (LT de E Coli). Des peptides synthétiques convenables, liés à des supports appropriés, conduisent à des anticorps capables de réactions croisées avec des protéines renfermant les peptides dans leurs séquences Cela s'est révélé être vrai pour le lysozyme de blanc d'oeuf de poule, pour la protéine 10 de revêtement du bactériophage M 52, et pour l'hémoagglutine de l'influenza Des résultats similaires ont été rapportés concernant la protéine M de Streptoccus pyogenes, la toxine de la diphtérie, le virus de l'hépatite, et le virus de la fièvre aphteuse Dans plusieurs cas de virus et de toxines, 15 les anticorps formés sont capables de neutraliser les activités biologiques. Le but de la présente invention est d'obtenir des peptides synthétiques, capables de provoquer des anticorps neutralisant efficacement la toxine du choléra et d'autres toxines 20 similaires, comme la toxine labile à la chaleur de E Coli. La toxine du vibrion cholérique est composéede deux sousunités, A et B La sous-unité A active l'adénylate cyclase qui déclenche l'activité biologique, tandis que la sousunité B est la cause de la liaison aux récepteurs cellulai25 res, et exprime la majorité des déterminants immunoefficaces Des anticorps de la sous-unité B sont capables de neutraliser l'activité biologique de la toxine intacte La sous-unité B (choléragénoide) est un pentamêre, chacune des chaînes renfermant 103 résidus d'amino acides. L'invention concerne la synthèse de plusieurs peptides dérivés de la sousunité B de la toxine du choléra, et des anticorps neutralisant la toxine intacte du choléra, aussi bien que d'autres toxines, comme la toxine labile à la chaleur de E Coli. La présente invention se rapporte à un vaccin syn- thétique contre le choléra et la toxine labile à la chaleur de E Coli, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide synthétique, correspondant à une partie relativement courte de la séquence de la sous- unité B de la toxine naturelle du 5 choléra, conjugué à un support polymère de haut poids moléculaire, approprié. Ce support peut être une anatoxine convenable (anatoxine du tétanos ou similaire) ou un polymère approprié comme Pol Y AL (un polymère d'alaninelysine) de poids moléculaire au moins égal à 50 000, et de préférence dans l'intervalle de 000 à 120 000 Les polypeptides synthétiques préférés sont ceux qui correspondent à la séquence 50 à 64, à la séquence 45 à 64, ou à la séquence 8 à 20 de la sous-unité B de la toxine du choléra L'unité de séquence 50 à 64 à la composition: Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile -Asp-SerGln-Lys-Lys-Ala; tandis que la séquence 8 à 20 a la composition: Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-HisAsn-Thr-Gln-Ile-His-ThrLeu. La séquence 45 à 64 a la composition: Gly-Ala-Thr-Phe-Glu20 Val-Glu-ValPro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala. Dans la séquence 50 à 64, il est possible de substituer tout autre amino acide au Val de l'azote terminal A la place de l'Ala du Carbone terminal on peut insérer Cys, et ces polypeptides modifiés présentent une activité similaire, ou même 25 plus prononcée. Dans la séquence 8-20, on peut insérer au lieu de Cys l'amino acide Ala, et l'on obtient une activité similaire Cela est établi par un travail expérimental. Il est évident que de légères modifications des séquences définies plus haut, peuvent être utilisées, à la fois en ce qui concerne la longueur de la chaîne et sa composition, sans sortir du cadre et de l'esprit de l'invention. Le polypeptide doit être conjugué à un support convenable de poids moléculaire adéquat, afin d'être capable de provoquer 35 la formation d'anticorps On a constaté que l'anatoxine du tétanos est un support convenable On peut également utiliser tout polymère approprié, de préférence à base d'aminoacides, comme Pol Y AL (un copolymère d'alanine et de lysine) dont l'intervalle de poids moléculaire moyen est de l'ordre de 100 000 à 120 000 Il semble qu'il soit nécessaire d'avoir un poids moléculaire d'au moins 50 000. L'invention est illustrée dans ce qui suit, avec référence à certaines formes de réalisations spécifiques, qui ne doivent pas être considérées comme limitatives. On a constaté que les vaccins synthétiques étaient également efficaces contre la toxine labile à la chaleur de E. Coli (LT de E Coli). Les anticorps contre les deux peptides neutralisent l'activité de LT de E Coli de la même manière que celle de la to15 xine du choléra (CT) Le troisième polypeptide, de séquence à 64, a une activité légèrement supérieure à celle de la séquence 50-64 On a essayé la réaction croisée de l'anti(polypeptide-8-20) et de l'anti-(polypeptide-50-64) avec LT de E Coli, dans un radioimmunoessai et dans un essai 20 d'immuno-blotting; ils ont été trouvés cross-réactifs. La neutralisation de LT de E Coli empêche l'activité d'adénylate cyclase conférée par la toxine Cela empêche la sécrétion du suc dans les anses iléales ligaturées de l'intestin de rat; cela empêche l'activité de l'adénylate cy25 clase provoquée par la toxine du choléra. Pour les travaux suivant l'invention, la toxine du choléra était achetée dans le commerce La séparation des sous-unités et l'isolation de la sousunité B, étaient réalisées par filtration sur gel de Sephadex G-75 dans 5 % 30 d'acide formique, conformément à Lai, C Y ( 1980) CRC Critical Reviews in Bioch 9, 171-207, les dérivés t-Butyloxycarbonyle (t-boc) des différents amino acides étaient également achetés dans le commerce Tous les autres réactifs étaient de qualité pure ou la meilleure possible. Les peptides sont synthétisés par le procédé en phase solide selon Merrifield, B B ( 1965) Sci 150, 178185 Les groupes protégeant la chaîne latérale des dérivés t-boc sont comme suit: éthers benzyliques pour les hydroxyle de la sérine et de la thréonine, éther dichlorobenzy5 lique pour l'hydroxyle phénolique de la tyrosine, et carbobenzoxy pour le groupe 2 -amino de la lysine L'asparagine et la glutamine ont leur groupe d -carboxyle protégé par un ester p-nitro-phénylique Le groupe nitroguanidino de l'arginine et le groupe imidazole de l'histidine sont protégés 10 par du tosyle La résine amino acide initiale est préparée par estérification de l'amino acide t-boc correspondant, avec la résine chlorométhylée (polystyrène-1 % divinylhbenzène). L'avancement de la synthèse est contrôlée par 15 l'analyse avec la ninhydrine Deux cycles de copulation sont réalisés chaque fois que la réaction de copulation n'est pas de > 99 % à l'analyse à la ninhydrine et aux acides aminés Pour la synthèse de CTP on ajoute 65 % (vol/vol) d'éthanedithiol-1,2 à l'acide trifluoroacétique, afin d'em20 pêcher l'oxydation du tryptophane Les groupes protecteurs sont enlevés et les peptides sont scindés de la résine à 0 C, avec de l'acide fluorhydrique anhydre, renfermant 10 % d'anisole et 1 % d'éthanedithiol-1,2, en tant que fixateurs. Les peptides bruts recueillis après scission de 25 la résine, sont purifiés sur colonne de Sephadex G-25 Le degré de pureté des peptides est dosé par analyse en amino acide, par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse, et/ou par électrophorèse sur papier à haut voltage. On utilise deux procédés pour la conjugaison des peptides avec l'anatoxine tétanique. ( 1) Avec le chlorhydrated'éthyl-1 (diméthylamino-3 ' propyl)-3 carbodiimide, comme agent de copulation ainsi qu'il est décrit par Muller et coll ( 1982) Proc Nat Acad Sci. 30 USA 79, 569-573. ( 2) Alors qu'il est encore sur la résine, le peptide est allongé par le dérivé t-boc de l'acide p-aminophénylacétique (PAPA) avant scission par l'acide fluorhydrique Les PAPA peptides sont dissous dans HC 2 N froid, diazotés par addition de nitrite sodique aqueux ( 0,1 M) refroidi à la glace, et additionnés d'une solution d'anatoxine tétanique dans Na HCO 3 ( 0,5 M), tandis que l'on maintient la valeur du p H à 8,5 par addition de Na 2 CO 3 concentré Au bout de 10 heures à 4 C, ce mélange est dialysé contre du car10 bonate d'ammonium 10 m M, puis il est lyophilisé La teneur en peptide des produits de conjugaison est dosée par analyse des amino acides et par mise en évidence du marquage par 125 I lorsque c'est possible. Des lapins sont immunisés par des injections intra15 dermiques en plusieurs sites, de 1 mg de produit de conjugaison dissous dans 0,5 ml de Pi/Na Cl et émulsionné dans 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund, avec plusieurs rappels, comme décrit antérieurement par Muller et coll ( 1982) Proc Nat Acad Sci USA 79, 569-573. Le radioimmunoessai (RIA) en phase solide est réalisé sur des plaques microtitrées, flexibles, à fond en V, recouvertes d'antigène ( 0,5-1,0 gg/logement) préenduites de 0,2 % glutaraldéhyde chaque fois que des peptides sont utilisées comme antigène, par addition de sérum d'essai à tri25 ple dilution en série, suivie de l'addition de 125 I protéine A par réactif de Bolton et Hunter ( 105 cpm/50 gl/logement). Les logements lavés et séchés sont découpés et passés dans un compteur gamma Pour les essais d'inhibition compétitive, les logements recouverts d'antigène, sont mis à incuber avec 30 des dilutions en série de 10 fois de la solution de peptide inhibiteur d'essai dans Pi/Na Cl renfermant 0,1 % de BSA, avant l'addition d'une dilution constante de sérum antipeptide. L'essai immunosorbant marqué par enzyme (ELISA) 35 est réalisé comme le RIA, à ceci près que l'on utilise des plaques à fond plat, et, à la place du marquage radioactif, un produit de conjugaison de -à-galactopyranoside), les plaques sont lues dans un ap5 pareil à lecture automatique. Pour l'immunoprécipitation, la toxine du choléra est marquée avec 125 I selon le procédé à la chlDramine-T. L'immunoprécipitation est réalisée fondamentalement selon Kessler, Heitmancik et coll ( 1977) Infect Immun,17, 62110 628 Elle est réalisée fondamentalement selon Kessler S W. ( 1975) J Immunol 1617-1624, avec de légères modifications. La toxine du choléra marquée par 125 I est préadsorbée sur Staphylococcus A intact, puis mise à réagir avec divers antisérum Les précipités, obtenus après addition de Sta15 phylococcus A fixé, sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5-15 % de Na Dod SO 4 et représentés par autoradiographie. En vue du mode opératoire de "Blotting" électrophorétique, la toxine du choléra, séparée en sous-unités sur un gel de polyacrylamide à 5-15 % de Na Dod SO 4 est transférée sur une feuille de nitrocellulose selon le procédé de Towbin et coll ( 1979) Proc Natl Acad Sci USA 76, 43504354 Afin de réduire la liaison non spécifique de l'antisérum, la macule est mise à incuber pendant 1 heure avec 25 9 m M de tampon Tris H Cl, p H 7,4, renfermant du Na Cl 0,9 M, et 3 % en poids/volume de BSA, puis on le découpe en bandes. Ces bandes sont mises à incuber pendant 3 heures à température ambiante avec une dilution à 1/50 de différents antisérum. Apres un lavage soigné, les bandes sont mises à incuber pendant 2 heures avec des Ig G ( 5 x 105 cpm/ml) anti-lapin, de chèvre, marquées à 125 I Les macules lavées et séchées sont autoradiographiées. L'activité de neutralisation de la toxine est mesurée à l'ai35 de de l'essai de perméabilité vasculaire et de l'essai de l'anse iléale ligaturée. ( 1) L'essai de perméabilité vasculaire est réalisé essentiellement conformément à J P Craid ( 1966) J Bacterial. 92 795, et C Y Lai ( 1980) CRC Critical Reviews in Biochem. 9 171-207 avec de légères modifications: Des dilutions en série de l'antiserum à essayer sont mélangées avec une quantité constante de toxine de choléra, mises à incuber pendant 1 heure à température ambiante, et l'on injecte 0, 1 ml de ces mélanges par voie intradermique 10 en triple exemplaire dans la peau rasée de lapin adulte Au bout de 18 heures, le lapin reçoit une injection intraveineuse de 1 ml/kg de Evans Blue, et l'on mesure 1 heure après le diamètre de l'induration bleue résultante Le point terminal de neutralisation correspond à la plus forte dilu15 tion de sérum qui empêche le phénomène de bleuissement. Pour chaque lapin on inclut à la fois des témoins positif (sans antisérum) et négatif (sans toxine du choléra). ( 2) L'essai de l'anse iléale ligaturée est réalisé essentiellement conformément à ce qui est décrit par Fujita et Finkelstein ( 1972) J Infect Dis 125, 647-655 En bref, des rats ou des lapins adultes, à jeun depuis 12 heures, sont anesthésiés à l'éther, leur abdomen est incisé, et le petit intestin est ligaturé en anses de 3 à 4 cm de long, en commençant à 10 cm environ di duodenum On injecte dans 25 ces anses différentes dilutions de serum à essayer, préalablement mis à incuber avec une quantité constante de toxine du choléra, et l'on referme l'abdomen Les animaux sont privés d'aliments et d'eau, et on les sacrifie au bout de 5 heures L'accumulation de suc par centimètre d'anse est 30 déterminée par la mesure de la longueur et du poids de chaque anse Sont également inclus dans chaque animal à la fois des témoins positif (pas d'antisérum) et négatif (pas de toxine du choléra). Afin de localiser les régions participant à la ré35 activité antigène, la sous-unité B est scindée par CN Br en trois fragments avec les séquences suivantes: 1-37 et 69-101 liées par un pont disulfure entre les résidus cystéine aux positions 9 et 86; 36-68 et 102-103 Ces fragments sont séparés sur une colonne de Sephadex G-50 et les deux peptides les plus importants sont essayés pour leur réactivité avec les antiserums préparés contre la toxine du choléra Le peptide le plus grand a une réaction partiellement croisée avec les sérums anti toxine du choléra, tandis que le peptide 38-68, bien qu'incapable de se lier directement aux antisérums, est capable d'inhiber les antiserums homologues toxine-antitoxine (résultats non indiqués). Des considérations basées sur les résultats cidessus obtenus avec des fragments de sous-unité B au bro15 mure de cyanogène, déterminent la sélection de peptides en vue de la synthèse chimique Le peptide 30-42 (CTP 2) est synthétisé puisqu'il est suggéré que Arg 35, ou la région l'entourant, peut être impliqué dans l'activité de liaison anticorps et récepteur d'après Duffy et coll ( 1979) Bio20 chem Biophys Res Comm 91, 1005-1010 Le peptide 83-97 (CTP 6) renfermant du tryptophane en position 88, est synthétisé parce que la modification chimique de ce résidu a pour résultat une perte de liaison GM 1 de la toxine du choléra, d'après De Wolf et coll ( 1981) J Biol Chem 256, 25 5481-5488 La demanderesse a également synthétisé le peptide renfermant la capacité hydrophile moyenne locale la plus forte (résidus 79-84), car l'on suppose que ces séquences sont situées dedans ou dans le voisinage immédiat des déterminants antigènes, d'après Hopp et coll ( 1981) Proc. 30 Natl Acad Sci USA 78, 3824-3828 On inclut, en raison du r 8 ôle des résidus de tyrosine dans le pouvoir antigène, reporté par Arnon et coll ( 1960) Biochem J 75, 103-109, des peptides renfermant Tyr 12 et Tyr 76, à savoir respectivement CTP 1 (résidus 8-20) et CTP 5 (résidus 75-85) Com35 me le dernier peptide ne renferme que 11 résidus, on prépare un peptide supplémentaire ayant une séquence plus longue (résidus 69-85, désigné par CTP 4) Le peptide 50-64 (CTP 3) est synthétisé parce qu'il constitue une partie du fragment inhibiteur au CN Br 38-68. Les peptides synthétisés correspondent à plusieurs régions de la sousunité B de la toxine du choléra (Fig 1) Le seul changement par rapport à la séquence naturelle est le remplacement de la cystéine aux positions 9 et 86 (respectivement dans CTP 1 et 6), par de l'alanine, 10 afin d'éviter la formation d'agrégats Les résultats des analyses en amino acides des peptides sont en bon accord avec les valeurs espérées pour les différents résidus d'amino acides La pureté des peptides est de plus établie par chromatographie HPLC en phase inverse et/ou électropho15 rèse sur papier à haut voltage, qui indiquent moins de 5 % d'impuretés dans les produits terminaux Les peptides purifiés sont conjugués à l'anatoxine tétanique, à l'aide d'un carbodiimide hydrosoluble utilisé comme agent de copulation, ou par une liaison azo, lorsqu'on utilise des dérivés PAPA 20 des peptides L'avantage de la liaison par résidu PAPA réside dans la spécificité de la conjugaison qui se produit seulement entre le groupe N amino terminal du PAPA et les résidus histidine ou tyrosine sur le support, d'après Spirer et coll ( 1977) Eur J Immunol 7, 69-74 Les deux 25 procédés de copulation donnent des produits de conjugaison adéquats (tableau 1). Réactivité immunologique Les produits de conjugaison de l'anatoxine tétanique avec tous les six peptides, induisent des anticorps spécifiques 30 vis-à-vis du peptide homologue respectif (Fig 2) Ainsi qu'il est indiqué, la plus forte réponse est observée avec CTP 1 et CTP 6. Quatre des antiserums ont également une réaction croisée à un degré différent avec la sous-unité B et la totalité de 35 la toxine naturelle du choléra Ce fait est démontré par trois essais: par radioimmunoessai en phase solide (figure 2), par la technique d'immuno-macule (figure 3), et par immunoprécipitation (tableau 2) Ces trois procédés indiquent tous des résultats similaires. Les peptides CTP 3 induisent des anticorps qui donnent une très forte réactivité croisée avec la toxine intacte, de niveau semblable à celui de la réaction de l'anti-peptide au peptide homologue (figure 2) La réaction de l'anti-peptide au peptide homologue et la réactivité croisée sont toutes deux en vérité spécifiques, car elles peuvent être complètement inhibées par un excès du peptide CTP 3 libre (figure 4) En outre, CTP 3 est le seul peptide parmi ceux qui sont étudiés, qui réagisse avec l'antiserum contre la toxine naturelle intacte du choléra (figure 5) Ainsi, la 15 réactivité croisée avec une protéine naturelle n'est pas une caractéristique du seul segment de peptide qui en dérive. Cela est de plus confirmé par une comparaison des peptides dérivant de CTP 4 ( 69-85) et CTP 5 ( 75-85) L'antiserum 20 contre CTP 5 est incapable d'avoir une réaction croisée avec la sous-unité B ou la toxine entière, bien qu'il ait un titre élevé vis-à-vis du peptide homologue L'allongement de ce peptide par 6 résidus d'amino acide aboutit à CTP 4, qui fait nattre des anticorps à réaction croisée avec 25 les protéines intactes, même si le titre en anti-peptide homologue n'est pas nettement plus élevé que dans le cas de CTP 5. Les résultats de l'expérimentation d'immunoprécipitation (tableau 2) présentent l'aspect quantitatif de la réactivi30 té croisée entre les anti-peptides et la toxine du choléra. L'anti-peptide CTP 3 en vérité donne la réactivité croisée la plus forte, s'élevant jusqu'à environ 30 % de la réaction anti-toxine-toxine homologue Selon les résultats du RIA, anti CTP 1 et CTP 6 ont une réaction croisée marquée 35 avec la toxine intacte, alors que les peptides résiduaires ne présentent qu'une légère réactivité L'expérimentation d'immunomacule sert de confirmation supplémentaire de ces résultats, et soulève un autre point d'intérêt: comme dans ce cas la toxine intacte du choléra est séparée par électro5 phorèse en ses deux sous-unités avant l'interaction avec les différents antiserums, il ressort des résultats (figure 3) que l'antiserum de CTP 1 réagit non seulement avec la sous-unité B, mais également, à un degré appréciable, avec la sous-unité A de la toxine du choléra. 10 Inhibition de l'activité adénylate cyclase Comme la diarrhée se produisant en réponse à CT ou LT est un résultat de l'activation de l'adénylate cyclase dans la membrane cellulaire des cellules épithéliales du petit intestin, on a déterminé la capacité des différents antiserums 15 à inhiber l'activité d'adénylate cyclase induite par CT ou LT L'activité enzymatique est déterminée par l'étude du niveau de production de c AMP dans les cellules dispersées de rein de poulets Ainsi qu'il ressort du tableau 5, les antiserums de CTP 1 et CTP 3 inhibent spécifiquement l'ac20 tivité d'adénylate cyclase induite par CT jusqu'à environ -65 % Cela est également vrai pour l'activité d'adénylate cyclase induite par CT, à savoir que CTP 1 et anti CTP 3 inhibent spécifiquement son activité à un degré similaire. Neutralisation de l'activité biologique Les serums contre les différents peptides sont déterminés quant à leur capacité à neutraliser les effets biologiques de la toxine du choléra Dans ce but, on utilise deux essais in vivo de l'activité de la toxine du choléra, savoir un essai sur la peau qui mesure l'augmentation de la perméa30 bilité vasculaire induite par la toxine, aussi bien que l'accumulation de suc induite par la toxine du choléra dans les anses ligaturées du petit intestin de lapins adultes Les résultats de ces deux expérimentations sont présentés dans les tableaux 3 et 4 Dans ces deux essais, l'anti CTP 3 pro35 voque une inhibition-partielle de l'activité de la toxine. Bien que moins efficace que l'antiserum contre la toxine naturelle du choléra, l'anti CPT 3 réduit de façon marquée, jusqu'à 40 %, l'accumulation de suc dans l'intestin de lapin. Ces deux essais, bien que réalisés in vivo, démontrent seu5 lement la présence d'anticorps dans les serums des lapins immunisés Le peptide CTP 3, qui montre la réaction immunologique croisée avec la toxine du choléra la plus forte, possède une aptitude appréciable à induire des anticorps capables de neutraliser l'activité biologique de la toxine 10 du choléra Il peut être utilisé pour conférer une immunité protectrice envers la toxine. Les expérimentations ci-dessus indiquent que les vaccins synthétiques ainsi produits peuvent être utilisés pour vacciner contre la toxine du choléra La quantité néces15 saire de produit de conjugaison polypeptidesupport, pour la vaccination des humains, est de l'ordre de 2 à 20 mg. Il est évident que le produit de conjugaison doit être administré sur un support approprié, avec des adjuvants convenables. Dans les dessins annexés, la figure 1 représente la séquence des amino acides de la sous-unité B de la toxine du choléra; la figure 2 illustre la réponse anticorps des lapins à différents peptides de la sous-unité B de la toxine du choléra; la figure 3 illustre la réactivité croi25 sée de différents peptides, établie par la technique d'immunomacule; la figure 4 illustre la réactivité croisée des peptides et l'inhibition par l'un de ces peptides synthétiques; la figure 5 illustre la réactivité du peptide 50-64 avec l'antiserum contre la toxine du choléra. Dans la figure 2, les signes suivants suivants représentent les réactions * avec les peptides homologues A avec la sous-unité B de la toxine du choléra O avec la toxine du choléra. A noter la différence des graduations des réactions avec le peptide et les protéines intactes dans le cas de tous les peptides sauf CTP 3. TABLEAU 1 Propriétés de différents produits de conjugaison de peptide avec l'anatoxine tétanique (PM 150 000) Rapport Peptide/support Peptide Position Procédé de utilisé pour la dans le produit copulation copulation de conjugaison (mol/mol) (mol/mol) * B Pl 8-20 PAPA 95 54 EDCI 40 27 BP 2 30-42 EDCI 45 11 BP 3 50-64 PAPA 94 63 EDCI 41 14 BP 4 69-85 EDCI 40 19 BP 5 75-85 EDCI 35 10 BP 6 83-97 PAPA 75 25 EDCI 49 24 rtj.n n 'o w PAPA = acide p-aminoph 6 nylacétique, fixé sur le peptide par une liaisor lé à la protéine après diazotation EDCI = chlorhydrate d'éthyl-1 (diméthylamino-3 ' propyl)-3 carbodiimide n amide, et copu- ** TABLEAU 2 Immunoprécipitation de la toxine du choléra marquée par par différents serums d'antipeptide Echantillon Précipité de toxine du choléra 125 I de sérum cpm % de radioactivité totale anti CT Pl 41880 4,4 anti CTP 2 9119 0,9 anti CTP 3 66498 7,0 anti CTP 4 4956 0,5 anti CTP 5 2980 0,3 anti CTP 6 47813 5,0 anti toxine du choléra 221560 23,0 preimmune 2694 0,28 serum TABLEAU 3 Inhibition par l'antipeptide CTP 3 de la perméabilité vasculaire de la peau du lapin induite par la toxine du choléra. a ng de Réaction de perméabilité vasculaire ng de toxines Anti toxine Anti CTP Serum prédu 3 b immuneb cholérab 0,5 1,0 + +++ 2,0 +++ + 3,0 a+++ forte induration bleue + faible induration bleue 35 pas de coloration bleue b Tous les serums sont utilisés à une dilution de 1/10. 15 20 25 TABLEAU 4 Neutralisation de la toxine du choléra par des antiserums de peptide CTP 3 ( 50-64) Toxine du Anse iléale ligaturée choléra Sérum Dilu Poids/cm Secrétion (gag) tion d'anse a réduite _ _ _ _ ___M_ _(%) 0,0 Néant (saline) 0,20 1,5 Néant (saline) 1,30 1,5 Toxine anti choléra 1:20 0,45 1,5 Anti CTP 3 1:2 1,02 40 1,5 Serum normal de lapin 1:2 1,25 3, 0 Néant (saline) 1,36 3,0 Toxine anti choléra 1:20 0,51 3,0 Anti CTP 3 1:2 1,08 33 ,0 Néant (saline) 1,42 ,0 Toxine anti choléra 1:20 0,58 ,0 Anti CTP 3 1:2 1,32 12 7,5 Néant (saline) 1,42 7,5 Toxine anti choléra 1:20 0,60 7,5 Anti CTP 3 1:2 1,32 12 ,0 Néant (saline) 1,50 ,0 Toxine anti choléra 1:20 0,69 ,0 Anti CTP 3 1:2 1,50 O a En supposant que la réduction de la toxine du choléra est de effectuée 100 %. par l'antiserum TABLEAU 5 Spécificité de l'inhibition de c AMP par des antiserums AMP cyclique induit par: Antiserum ajouté Toxine du choléra Hormone parathyrolde Isoproterenol pmoles/ Signification 250000 % (p)a cellules pmoles/ pmoles/ 250000 cellules 250000 cellules Néant NRS CT ,9 b 100 5,6 95 n sc 3,7 1 00 4,8 0,5 8 0,001 CT Pl CTP 3 3,2 54 0,01 2,5 42 0,01 ,6 95 n s. 3,5 3,8 3,7 3,5 n.td 4,6 4,6 4,7 1 00 95 95 98 95 4,6 TT n.t. a Signification de la différence entre c AMP induit par la toxine du choléra sans antiserum, et avec l'un des serums utilisés. b les valeurs représentent la moyenne de 3 expérimentations. c n s = pas de signification d n t = pas essayé. ru Lo Ln Revendications 1 Vaccin synthétique contre le choléra et la toxine labile à la chaleur de E Coli, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide synthétique correspondant à une partie de la séquence de la sous-unité B de la toxine na5 turelle du choléra, conjugué à un support polymère de haut poids moléculaire, approprié. 2 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence correspond essentiellement à la séquence -64 de la toxine du choléra. 3 Vaccin selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le polypeptide a essentiellement la séquence: Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-GlnHis-Ile-Asp-Ser-Gln-LysLys-Ala. 4 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en 15 ce que sa séquence correspond à la séquence 8 à 20 de la sous-unité B de la toxine du choléra. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce que sa séquence correspond essentiellement à la séquence: Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-ThrGln-Ile-His-Thr-Leu. 6 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond essentiellement à la séquence 45-64 de la toxine du choléra. 7 Vaccin selon la revendication 6, caractérisé en ce que sa séquence correspond essentiellement à: Gly-Ala-Thr25 Phé-Glu-ValGlu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-GlnLys-I s-Ala. 8 Vaccin selon une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le support de poids moléculaire élevé est une anatoxine. 9 Vaccin selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anatoxine est l'anatoxine tétanique. 10.Vaccin selon une des revendications 1 à 7,caractérisé en ce que le support à haut poids moléculaire est un polymère du type POLY AL, d'un poids moléculaire moyen d'au moins 50 000, de préférence de l'ordre de 100 000 à 120 000.