Brevet FR2555755A1 — publié le 19850531

l Ia présente invention concerne un procédé pour le dosage des immunoglobulines humaines spécifiques d'antigènes cancéreux humains, ainsi que l'application de ce procédé dans le séro- diagnostic de formes tumorales primitives. Plus précisément, la présente invention concerne une technique permettant d'isoler des immunoglobulines spécifiques libres dans des sérums humains provenant de malades atteints de cancers, ces immunoglogulines étant capables, in vitro, de s'unir de manière spécifique avec le CEA (= antigène carcinoembryonnaire) marqué radioactivement et de ne réagir, dans des tests immunohistochimiques, qu'avec des cellules cancéreuses. Comme on le sait, il n'existe à ce jour aucun procédé ou méthode expérimentale capable de mettre en évidence la présence d'immu. noglobulines tumoro-spécifiques libres dans les sérums de malades atteints de cancers (cf. par exemple Dominos K. Kapso- poulou et F.A. Anderer, "An approach to the routine estimation of circulating carcinoembryonic antigen immunocomplexes in patients with carcinomata of the gastrointestinal tract", Clin. Exp. Immunol. (1979) 37, 25-32). En fait, on sait déjà que l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), décrit pour la première fois par P. Gold et S.0. Freed- man ("Demonstration of tumor specific antigen in human carcino- mata by tolerance and absorption technique", J. Exp. Med. 121, 439, 1965), a été utilisé comme marqueur fonctionnel pour surveiller les suites postopératoires de malades atteints de cancers gastro-intestinaux, alors que son dosage ne s'est guère révélé utile dans le diagnostic précoce et, d'une manière géné- rale, dans le diagnostic de cancers primitifs en l'absence de métastases. Par la suite, le problème de l'induction de la for- mation d' iwrmnoglohulines (anticorps, protéines spécifiques) spécifiques d'une tumeur donnée, de la part du CEA chez des malades atteints de cancers sécrétant du CEA, a fait l'objet d'une longue expérimentation, mais avec des résultats qui n'ont pas été suffisants pour donner une réponse satisfaisante au problème. Plus précisément, différentes tentatives (o10 Gerfo P., Herter F.P. et Bennett S.J. (1972), "Absence of circulating antibodies to carcinoembryonic antigen in patients with gastro- intestinal malignancies", Int. J. Cancer, 9, 344; E. Collatz, Von Kleists et P. Burtin (1971), "Further investigations of circulating antibodies in colon cancer patients: on the auto- antigenicity of the carcinoembryonic antigen", Int. J. Cancer, 8, 298) ont été faites pour montrer la présence d'anticorps anti-CEA spécifiques dans le sérum de malades atteints de can- cers, mais ces tentatives ont été complètement infructueuses. C'est précisément en 1972 (J.M. Gold, S.0. Freedman et P. Gold (1972), "Human anti-CEA antibodies detected by radioimmuno- assay", Nature, New Biology 238, 60-62) qu'il a été démontré par radioimmunoélectrophorèse que des immunoglobulines de la classe IgM étaient présentes dans les sérums de quelques mala- des et étaient capables de s'unir avec le CEA. Toutefois, un tel résultat a été réfuté par de nombreux autres auteurs (cf. en particulier K. Dominos Kapsopoulou, F.A. Anderer, "Circula- ting carcinoembryonic antigen immunocomplexes in sera of pa- tients with carcinomata of the gastrointestinal tract", Clin. Exp. Immunol. (1978) 35, 190-195). Il a également été prouvé (J.M. MasSween, "The antigeni- city of circulating antibodies to carcinoembryonic antigen with gastrointestinal malignancies", Int. J. Cancer, 1975, 15, 246- 252) l'existence d'une liaison faible et non spécifique entre les IgM présentes dans les sérums de certains malades et le CEA marqué radioactivement (125I-CEA). On connaît aussi quel- ques publications (Gloria M. Mavligit et Sarah Stuckey, "Colo- rectal carcinoma, Evidence for circulating CEA-anti-CEA complexes" Cancer 52, 146-149, 1983) qui attirent l'attention sur le pré- sence d'immunocomplexes CEA-anti-CEA circulants, dans lesquels les immunoglobulines sont considérées comme étant à la fois du type IgM et du type IgG. Il est donc manifeste que l'acquisition d'une méthode sui- vant la présente invention est d'une importance exceptionnelle, puisqu'une telle méthode permet d'une part de déterminer la présence, dans les sérums humains de porteurs de cancers sécrétant du CEA, d'une immunoglobuline spécifique aux tu- meurs qui était inconnue jusqu'ici et qui est appelée ci-après immunoglobuline K, et qu'elle fournit d'autre part les moyens de base pour un sérodiagnostic précoce d'affections tumorales, Outre cette implication, dont la contribution à une dyna- mique future d'un programme thérapeutique et de prévention anticancéreuse est certainement d'une portée extraordinaire et imprévisible, ôn voit très bien aussi comment découleront, du résultat fourni par la découverte de la présente invention, d'autres utilisations avantageuses de cette immunoglobuline x en tant que marqueur, tant pour des médicaments que pour la localisation précise du site cancéreux, un tel marqueur étant dépourvu des risques de choc anaphylactique. Pour l'acquisition de ces résultats, il est suggéré, d'après la présente invention, une méthode qui est d'un genre surprenant, car elle est basée, dans son mode d'action, sur la remarque préliminaire que si une immunoglobuline qui est spéci- fique des formes tumorales est une entité réellement existante, elle doit être présente à l'état libre dans les sérums de malades porteurs de cancer dans la phase initiale de la maladie, dans laquelle, comme on le sait, ces sérums se révèlent négatifs dans les méthodes habituelles de détermination du OEA, alors que, plus exactement, la liaison de la petite quantité de l'antigène qui est encore présente avec les immunoglobulines sous la forme d'immunocomplexes est comparable à la forte réaction des anti- corps. Sur la base de la connaissance déjà acquise (demande de brevet GB 8317022 au nom du même Demandeur) de la présence de nouveaux déterminants antigéniques dans l'adénocarcinome, il a été observé, d'après l'invention, que ladite immunoglobuline K ne peut pas être détectée par les procédés immunochimiques usuels (immunoélectrophorèse, diffusion double sur agaragar, radioimmunoexamen) utilisant des sérums humains anti-IgM, anti-IgG et anti-IgA (Boering Werke). Dans un tel contexte, il est suggéré, d'après la présente invention, la précipitation de l'immunoglobuline K en utilisant des sérums anti-chèvre (comme par exemple des sérum anti-gamma- globuline de chèvre produits chez le lapin, etc.) et, dans une moindre mesure, des sérums anti-cobaye. De fait, comme on le sait, les sérums anti-chèvre sont capables de réagir avec des immunoglobulines humaines (réaction croisée inter-espèces), ce qui fait que si des sérums antichèvre sont démunis d'une telle possibilité de réaction croisée en ce qui concerne les IgA, IgM et IgG humaines par bioabsorption, ils doivent nécessairement conserver la possibilité de précipiter l'immunoglobuline K qui se sépare la dernière, pour être, en conséquence, un anticorps humain n'appartenant pas aux classes déjà connues et qui est présente uniquement dans les sérums de porteurs de cancer. Plus précisément, à titre de confirmation du caractère spécifique de l'immunoglobuline K, il a été observé que si le sérum d'un mala- de qui est reconnu comme étant positif à ladite immunoglobuline est mis en incubation avec le sérum d'un malade qui est reconnu comme étant positif au CEA circulant, le sérum du premier malade perd toute possibilité de fixer le CEA marqué radioactivement, et il en va de même si le sérum du premier malade est mis en incubation avec du CEA extrait de cancers. En conséquence, l'immunoglobuline K est présente dans les sérums de malades au stade initial de la maladie tumorale, comme le montrent des contrôles effectués sur des cancers du sein maintenus sous surveillance et, après intervention chirur- gicale, en l'absence complète des cellules cancéreuses qui l'ont produite avec immunisation de l'organisme, ce qui fait qu'il est visible que l'immunoglobuline K peut être d'une utilité extraordinaire comme marqueur d'une tumeur très précoce, indé- pendamment de la masse tumorale. En effet, comme on le sait, une très faible concentration d'antigène est suffisante pour donner une très bonne réponse d'anticorps, alors que, comme on l'a exposé ci-dessus, l'antigène ne peut être utilisé comme marqueur que quand sa concentration dans le sang est très éle- vée ( > 9,5 x 109 g/ml), c'est-à-dire quand la taille de la masse tumorale est très grande. En outre, d'après la présente invention, on peut effectuer, à titre de variante, l'addition d'immunoglobuline K anti-humaine d'anti-sérum de lapin. En tout cas, lorsque la précipitation a été effectuée et que l'immunoglobuline K fixée au CEA marqué radioactivement en 2555s755 excès qui a été ajouté a été séparé par centrifugation, un simple comptage gamma confirme l'isolation et donne la quantité du nouvel anticorps qui est présent dans les sérums des malades. Ainsi, la présente invention a pour but particulier de fournir un procédé pour le dosage d'immunoglobulines humaines qui sont spécifiques d'antigènes cancéreux humains (immunoglobuli- nes K), ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations suivantes: - Incubation du sérum d'un malade qui est porteur de cancer avec du CEA marqué radioactivement (125I-CEA) en fort excès (50 000 c/mn, 80/uCi//ug d'activité spécifique) pendant 16 heures au moins à la temperature ambiante (première incubation), - Addition d'anti-gamma globuline d'antisérum de chèvre privée de sa réaction croisée à l'égard des Ig , IgG et IgM humaines et incubation pendant 1 heure à la température ambiante (seconde incubation), - Centrifugation, décantation du liquide surnageant et comp- tage de la précipitation avec un compteur gamma. De préférence, suivant la présente invention, on utilise un antisérum de lapin. Comme il a été déjà exposé, des immuno globulines de lapin, d'Anee de cheval, etc., des anti-immunoglo- bulines humaines spécifiques du cancer peuvent &tre également utilisées à titre de variante. L'immunoglobuline K est e:traite par exemple des sérums de nombreux malades qui ont été reconnus positifs au test radio- immunologique (acide caprylique9 PEG, etc.), cette Lmunoglobu- line K étant egalement purifiée de façon plus poussée des autres immunoglobulines humaines par différentes techniques telles que l'échange d'ions, des tecmniques de tamisage moléculaire ou par affinité et bioabsorption, et l'immunoglobuline K ainsi purifiée est utilisée pour l'immunisation de lapins suivant le mode opératoire décrit ci-dessus (anti-chèvre)6 La présente invention est ci-après décrite à titre d'in- dication et sans intention limitative, au moyen d'exemples d'un mode opératoire préféré. Réactifs et leur préparation a) Immunoglobulines de lapin immunoglobulines anti-chèvre (sérum de chèvre) Des immunoglobulines de chèvre sont extraites du sérum de chèvre ordinaire par les techniques usuelles (polyéthylène- glycol (P.E.G.), acide caprylique, etc.). 1 ml (2 mg/ml) de cet extrait est injecté, avec l'adjuvant de Freunds (1 ml), à un lapin une fois tous les quinze jours pendant deux mois. ies immunoglobulines sont extraites (P.E.G.) du sérum du lapin, le titre anti-chèvre est vérifié par le RIA (radioimmunoexamen) suivant les procédures usuelles à anticorps double qui sont utilisées comme techniques de laboratoire depuis dix ans. b) Réaction croisée anti-chèvre avec les immunoglobulines humaines normales; contrôle et privation (élimination de la réaction croisée) Avec les techniques d'immunoélectrophorèse et de diffusion double sur agaragar, le sérum anti-chèvre présente sa réaction croisée avec l'IgA et l'IgG humaines (elle ne peut pas être constatée avec l'IgM). On fait passer plusieurs fois le sérum anti-chèvre à travers une colonne de bioabsorption (technique de chromatographie d'affinité) avec du Seraphose lié aux immuno- globulines IgA, IgG et aussi, pour plus de certitude, aux immuno- globulines IgM humaines. Après cette opération de purification, l'absence de réaction croisée est vérifiée par les techniques rapportées ci-dessus. la réaction croisée est ainsi réduite en moyenne de 30 %. Le sérum ainsi privé de réaction croisée reste évidemment capable de réagir avec les immunoglobulines de chèvre. c) Immunoblobulines anti-humaines de sérum de lapin. Sérum anti-IgM, anti-IgA, anti-IgG. Pour plus de précision, les sérums Boering Werke sont uti- lisés, car ils sont considérés comme des moyens universellement reconnus à des fins de vérification. d) OEA pur - CEA marqué radioactivement. e) Dosage des immunoglobulines humaines spécifiques des tumeurs dans les sérums de malades atteints de cancer (test radioimmuno- logique). Des quantités de sérum humain échelonnées dans la plage de 0,1 à 0,5 ml sont mises en incubation pendant 16 heures à la température ambiante avec 0,1 ml de 125I-CEA (correspondant à 000 c/mn) dans un tampon 0,05 m de PBS + 0,1 O/,o d'albumine bovine au pH 7,4. A la fin de la première incubation (entre l'éventuelle immunoglobuline K et l'antigène tumoral marqué radioactivement), 0,1 ml de sérum anti-chèvre à 1/10 ou d'anti-immunoglobuline sont ajoutés (ce qui produit la précipi- tation de l'immunocomplexe formé entre cette immunoglobuline K et le 125ICEA), puis la masse est centrifugée pendant 15 minutes à 4000 x g. Le liquide surnageant est décanté. Le pré- cipité ainsi isolé est compté au moyen d'un compteur gamma. le précipité formé avec des sérums négatifs n'a jamais été plus élevé que 1000 c/mn, alors que des sérums positifs ont donné des valeurs de radioactivité de 1500 à 32 000 c/mn. Lors- que le précipité présente des valeurs de "c/mn" très élevées, le sérum du malade peut être dilué. f) Les immunoglobulines K se sont révélées ne pas être les immunoglobulines IgA, IgM ou IgG. Si le sérum anti-chèvre est remplacé par un sérum anti- chèvre privé de réaction croisée suivant la technique décrite ci-dessus, les résultats obtenus avec des sérums positifs sont les mêmes. Si le sérum anti-chèvre est remplacé par l'anti-IgA, l'anti- IgM ou l'anti-IgG humaines, c'est-à-dire par des antisérums ob- tenus (chez le lapin, l'âne, etc.) en présence des immunoglobu- lines IgA, IgM et IgG humaines, on n'obtient pas de précipita- tion. g) Les immunoglobulines du type K se sont révélées spécifiques. Lorsqu'un sérum positif ài=rXnùlobuline K est mis en incu- bation avec les sérums de donneurs en bonne santé, les immuno- globulines K restent détectables. Si le sérum d'un donneur en bonne santé est remplacé par le sérum d'un malade à CEA positif, les immunoglobulines K ne peuvent plus être détectées; plus précisément, le CEA "bloque" les sites actifs des immunoglobulines du type K, ce qui fait que le 125I-CEA ne peut pas être fixé davantage. Les immunoglobulines K présentent des réponses immunohisto- chimiques, uniquement avec des cellules cancéreuses et non avec d'autres cellules. Pour mieux comprendre le mode opératoire de la présente invention, on se référera aux fig. 1, 2 et 3 des dessins annexés, sur lesquelles est illustrée la formation d'anticorps à l'injec- tion de sérum humain provenant d'un porteur en bonne santé (fig. 1) et d'un malade attaint de cancer (fig. 2) à la chèvre et à l'homme. La fig. 3 est un diagramme représentant, en ordonnées, la concentration des anticorps libres et des antigènes libres spécifiques, en fonction de la durée de la maladie représentée en abscisses. A titre de remarque finale, il convient de faire observer que le CEA et les immunoglobulines K spécifiques sont à la fois présents dans les sérums de malades atteints de cancer. De telles immunoglobulines K ne présentent pas de réponse aux antisérums (IgA, IgM et IgG) humains, alors qu'elles présentent des répon- ses de réaction croisée aux sérums anti-chèvre qui, on le sait, ne réagissent pas avec les immunoglobulines humaines communes si elles sont privées de réaction croisée. Ces immunoglobulines K constituent donc une nouvelle classe d'immunoglobulines humai- nes. Il y a lieu de faire observer que les résultats obtenus jusqu'à maintenant dans les expériences menées sur 30 malades (240 témoins en bonne santé) atteints de cancer (primitif, post- opératoire ou avec métastases) permettent de supposer, de manière tout à fait raisonnable, la présence d'un mécanisme immunologique du genre suivant: Stade I - Stade préliminaire à la tumeur ou stade d'immunisation. Quelques cellules tumorales mettent en circulation de faibles concentrations de l'antigène (CEA) qui immunisent l'or- ganisme; à ce stade, on trouve des immunoglobulines K dans le sérum, mais on n'observe pas d'antigène libre, car il est complètement fixé aux immunoglobulines (cf. fig. 3). Stade II - La masse tumorale augmente de taille et la concentra- tion d'antigène augmente aussi, tandis que la concentration d'immunoglobulines K augmente à un degré bien moindre (immuno- dépression); par suite, on observe une concentration sans cesse décroissante d'immunoglobulines K libres dans la circulation; toutes ces immunoglobulines sont fixées à l'antigène: le stade de l'immunocomplexe s'établit. - Stade III - la masse tumorale augmente de taille et produit ainsi une concentration d'antigène plus forte que la concentra- tion d'anticorps; la quantité de l'antigène libre peut être déterminée; c'est le stade des déterminations positives du CEA, alors que l'immunoglobuline ne peut pas être dosée. Stade IV - L'intervention. La concentration d'antigène s'abaisse à des valeurs très basses, tandis que le titre d'anticorps reste constant; l'immunoglobuline K est présente du fait que, de façon bien connue (vaccination), elle apprend à produire un anticorps et que cette activité n'est pas arrêtée, même en l'absence d'antigène. Stade V - Métastases: l'antigène recommence à être présent, avec induction à la formation de nouveaux anticorps spécifiques. Ie présente invention a été décrite plus spécialement à propos de certains modes de réalisation particuliers, mais il est bien entendu que des modifications et des changements peu- venG être introduits dans la description qui précède, sans que l'on s'écarte pour autant de son esprit et de sa portée. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le dosage d'immunoglobulines humaines (immu- noglobulines K) qui sont spécifiques des antigènes de cancers de l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes: - mise en incubation du sérum d'un malade atteint de cancer avec du CEA (= antigène carcinoembryonnaire) qui a été marqué radioactivement en fort excès (125I(CEA, 50 000 c/mn, 80/uCi//ug d'activité spécifique) pendant au moins 16 heures à la tempéra- ture ambiante (première incubation); - addition d'antisérum anti-gammaglobuline de chèvre qui a été privé de capacité de réaction croisée pour les IgA, IgG et IgM humaines et mise en incubation pendant 1 heure à la température ambiante (seconde incubation) et - centrifugation et décantation du liquide surnageant et finalement comptage du précipité avec un compteur gamma. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'antisérum est un antisérum de lapin. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel des quantités de sérum humain échelonnées dans la plage de 0,1 à 0,5 ml sont mises en incubation, dans ladite première incubation, à la température ambiante avec 0,1 ml de 125I-CEA (50 000 c/mn dans un tampon 0,05 m de PBS + 0,1 % d'albumine bovine, au pH 7,4) et, dans ladite seconde incubation, 0,1 ml du sérum anti-chèvre est ajouté, cette addition étant suivie d'une centrifugation de minutes à 4000 x g, d'une décantation du liquide surnageant et d'un comptage du précipité avec un compteur gamma. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le sérum anti-chèvre est privé de la capacité de réaction croisée pour les immunoglobulines IgA, IgG et IgM par un procédé de bioabsorption. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'opération de bioabs. rption est effectuée pas iercolation à travers du Sepharose fixé aux immunoglobulines IgA, IgG et IgM. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel il est effec- tué l'addition (seconde incubation) d'immunoglobulines de lapin, d'âne, de cheval, etc. antiglobulines humaines qui sont spéci- fiques du cancer (immunoglobulines K). 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les immunoglobulines anti-immunoglobulines K sont obtenues à partir des sérums de malades qui ont été reconnus positifs au test radioimmunologique pour la détermination de la présence d'immunoglobulines K, par extraction de cette immunoglobuline qui est ensuite purifiée des autres immunoglobulines humaines, puis est injectée à des lapins, à des ânes, à des chevaux, etc. 8. Utilisation d'immunoglobulines K, isolées par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 79 dans le séro- diagnostic précoce de la maladie tumorale. 9. Utilisation d'immunoglobulines K, isolées par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme support de marquage pour le transport de médicaments et pour la loca- lisation du site tumoral. 10. Procédé pour le dosage d'immunoglobulines humaines spéci- fiques d'antigènes de cancers de l'homme et son utilisation dans le sérodiagnostic de formes tumorales primitives selon l'une quelconque des revendications I à 9.