Brevet FR2557873A1 — publié le 19850712

La présente invention concerne un procédé pour iso- ler le L-tryptophane d'un mélange réactionnel contenant du L-tryptophane et un microorganisme, obtenu pendant la produc- tion de L-tryptophane en utilisant le microorganisme. Dans des réactions utilisant des microorganismes, il est nécessaire de séparer les microorganismes des produits réactionnels. On connaît déjà quelques procédés pour élimi- ner les microorganismes des mélanges réactionnels et pour isoler les produits réactionnels. Par exemple le brevet ja- ponais N 16460/1963 décrit un procédé qui consiste à ajou- ter un agent tensio-actif à un bouillon de fermentation con- tenant de l'acide L-glutamique, à chauffer le mélange pour floculer et sédimenter le microorganisme, et à le séparer par filtration après addition de terre de diatomées, et le brevet japonais mis à l'Inspection Publique N 29996/1978 décrit un procédé qui consiste à filtrer un mélange réac- tionnel tel qu'un bouillon de fermentation contenant un ami- no-acide sur une membrane d'ultrafiltration, puis à isoler le produit par cristallisation. Cependant, ces procédés ne se sont pas révélés en- tièrement satisfaisants pour une mise en oeuvre à l'échel- le industrielle car, dans le cas du procédé faisant appel à l'addition d'un surfactif, le microorganisme peut être ai- sément éliminé mais le surfactif ne peut être facilement séparé et risque de rester dans le produit réactionnel, et le procédé utilisant la membrane d'ultrafiltration pose un problème de lavage de l'appareillage utilisé du fait de sa nature. La présente invention a donc pour but de fournir un procédé pour isoler le L-tryptophane d'un mélange réac- tionnel obtenu pendant la production de L-tryptophane en utilisant un microorganisme, qui consiste à éliminer effi- cacement le microDorganisme du mélange réactionnel. La Demanderesse a effectué des recherches intensi- ves pour atteindre ce but. Bien qu'il soit couramment connu que, lorsqu'il est chauffé dans une solution acide, le L- tryptophane est instable, ces recherches ont abouti à la découverte surprenante que lorsqu'un mélange réactionnel contenant du L-tryptophane et un microorganisme est ajusté à un pH de 2 à 5 avec un acide minéral puis est chauffé, le L-tryptophane est stable et le microorganisme est modifié et floculé à une dimension lui permettant d'être aisément séparé par filtration. Ainsi, selon la présente invention, on fournit un procédé pour isoler le L-tryptophane d'un mélange réaction- nel contenant du L-tryptophane et un microorganisme, obte- nu pendant la production de L-tryptophane en utilisant le microorganisme, ledit procédé consistant à ajuster le pH dudit mélange réactionnel à une valeur de 2 à 5 avec un aci- de minéral et à le chauffer, puis à séparer le microorga- nisme floculé soit (1) en filtrant ledit mélange réaction- nel tandis que le L-tryptophane est maintenu à l'état com- plètement dissous, soit (2) en ajoutant une substance al- caline audit mélange réactionnel pour transformer le L-tryp- tophane qu'il contient en son sel alcalin et en filtrant ledit mélange tandis que le sel alcalin est maintenu à l'é- tat complètement dissous, et en récupérant le L-tryptophane du filtrat. Des exemples de "mélange réactionnel contenant du L-tryptophane et un microorganisme qui est obtenu pendant la production de L-tryptophane en utilisant le microorga- nisme" (qu'on désignera ci-après parfois pour simplifier par "mélange réactionnel"), tel qu'on le désigne dans la présente demande, sont un mélange réactionnel obtenu en faisant réagir de la L-sérine et de l'indole en présence de Escherichia coli; un mélange réactionnel obtenu par le pro- cédé ci-dessus en utilisant la DL-sérine à la place de la L-sérine et Pseudomonas putida (MT-10182) ou Pseudomonas punctata (MT-10243) conjointement à Escherichia coli comme sérine-racémase; un mélange réactionnel obtenu en utili- sant l'acide anthranilique comme précurseur en présence de Bacillus subtilis; et un mélange réactionnel obtenu en utilisant l'indole, l'acide pyruvique et l'ammoniac en présence de Aerobacter aerogenes. Ces mélanges réactionnels contenant du L-trypto- phane contiennent les microorganismes utilisés à l'état dissous ou en suspension. Etant donné qu'il était très dif- ficile dans la technique antérieure de séparer les micro- organismes du L-tryptophane, les frais entraînés par l'é- tape de purification dans la pratique industrielle étaient élevés. Lorsque le mélange réactionnel contient un solvant organique non miscible à l'eau, il est souhaitable avant d'appliquer le procédé de la présente invention de chasser le solvant organique par des moyens appropriés, par exemple par séparation ou distillation de liquide. Lorsque le mélange réactionnel est chauffé dans des conditions neutres à alcalines, le microorganisme con- tenu dans le mélange réactionnel ne peut être floculé au point d'être filtré. Au contraire, lorsque le mélange réac- tionnel, après la réaction est ajusté à un pH de 2 à 5 avec un acide minéral puis chauffé selon le procédé de la pré- sente invention, le microorganisme est floculé très aisé- ment. De façon inattendue, le L-tryptophane n'est pas dé- composé à ce moment et le microorganisme floculé peut être éliminé par filtration. Lorsqu'après la floculation du mi- croorganisme de la manière indiquée ci-dessus, on ajoute une substance alcaline au mélange réactionnel pour dissou- dre le L-tryptophane, le microorganisme floculé est encore maintenu à l'état lui permettant d'être filtré. Par consé- quent, le procédé de la présente invention est un procédé industriel grâce auquel le L-tryptophane produit en utili- sant un microorganisme peut être efficacement séparé du mélange réactionnel. Des exemples d'acide minéral utilisé dans le procé- dé de la présente invention sont l'acide sulfurique, l'a- cide chlorhydrique et l'acide phosphorique. Le pH du mé- lange réactionnel contenant le L-tryptophane est ajusté à une valeur de 2 à 5, de préférence à 3-4, avec un tel acide minéral. Le mélange réactionnel dont le pH a été ajus- té est ensuite chauffé à une température de 60 à 120 C, de préférence de 80 à 105 C. Grâce à cet ajustement du pH et à ce traitement thermique, le microorganisme est modifié et floculé à une dimension lui permettant d'être facilement séparé par filtration, tandis que le L-tryptophane reste stable et sans changement. La durée du traitement thermique n'est donc pas particulièrement limitée et ce traitement peut être arrêté au moment o le microorganisme est floculé à l'état appro- prié. On peut ajouter un alcool comme solvant afin de favoriser la dissolution du L-tryptophane dans le mélange réactionnel. Comme alcool, on préfère des alcools infé- rieurs tels que le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol, l'isopropanol étant particulièrement préféré. L'alcool peut être utilisé en une quantité telle que sa concentra- tion dans le mélange réactionnel ne soit pas supérieure à 70 % en poids, de préférence 40 à 60 % en poids. Lorsque le mélange réactionnel contient un solvant organique non miscible à l'eau, on ajoute une quantité prédéterminée de l'alcool après avoir chassé le solvant organique non mis- cible à l'eau. Dans une première forme de mise en oeuvre du pro- cédé de la présente invention, après l'ajustement du pH et le traitement thermique précités, le microorganisme floculé est séparé du mélange réactionnel par filtration pour donner une solution aqueuse de Ltryptophane. Pour augmenter le taux de L-tryptophane récupéré cette opération de filtration est effectuée pendant que le L-tryptophane contenu dans le mélange réactionnel est à l'état complè- tement dissous, c'est-à-dire pendant que la concentration en Ltryptophane dans le mélange réactionnel est inférieure à sa solubilité. En général, il est donc nécessaire de chauffer le mélange réactionnel et de le filtrer à chaud; ou de le diluer complètement à l'eau et de le filtrer. Du point de vue de l'efficacité de l'opération, il est préférable de le filtrer à chaud immédiatement après l'a- justement du pH et le traitement thermique. Pour effectuer la filtration, on peut utiliser du carbone activé, ou un adjuvant de filtration du type silice, ou les deux. Dans une autre forme de mise en oeuvre du procédé de la présente invention, comme autre moyen pour augmenter le rapport du L-tryptophane récupéré, on ajoute une subs- tance alcaline au mélange réactionnel après avoir ajusté son pH à 2 à 5 et l'avoir chauffé pour floculer le micro- organisme. Ainsi, le tryptophane est pratiquement complè- tement dissous sous forme de son sel alcalin, puis le mé- lange réactionnel est filtré pour obtenir une solution a- queuse de L-tryptophane. Selon le procédé de cette forme de mise en oeuvre, la filtration ou dilution à chaud, comme dans le mode de mise en oeuvre précité, n'est pas néces- saire, et les frais d'énergie thermique peuvent être éco- nomisés. Ou bien on peut manipuler une solution aqueuse ayant une concentration supérieure en L-tryptophane. Par conséquent, ce mode de mise en oeuvre est généralement avan- tageux en pratique industrielle. La substance alcaline à ajouter au mélange réac- tionnel ayant été soumis à l'ajustement du pH et au trai- tement thermique peut être n'importe quelle substance al- caline qui peut former un sel hydrosoluble par réaction avec le Ltryptophane. Des exemples en sont l'ammoniac, l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, le bicar- bonate de sodium et le bicarbonate de potassium. Du point de vue industriel, on préfère l'ammoniac en raison de sa haute solubilité dans la solution aqueuse et de sa facilité de récupDration. La quantité de substance alcaline est généralement celle nécessaire à la neutralisation du mélange réactionnel et à la transformation du L-tryptophane présent dans le mé- lange réactionnel en son sel alcalin. Il n'y a pas d'incon- vénient à utiliser un excès de la substance alcaline. Ce- pendant, étant donné qu'au moment de la séparation des cris- taux de L-tryptophane, le pH est ajusté avec un acide jus- qu'à son point isoélectrique de manière à augmenter le ren- dement en Ltryptophane isolé, l'utilisation d'un excès de la substance alcaline se traduit par une augmentation de la quantité de sels minéraux, ce qui est indésirable. De préférence, la substance alcaline est ajoutée après que le mélange réactionnel traité thermiquement soit refroidi à 0-50 C, en particulier à 5-20 C. Lorsque la substance alcaline est ajoutée à des températures supérieu- res, le L-tryptophane peut subir une décomposition ou une racémisation. Lorsqu'on utilise de l'ammoniac gazeux comme subs- tance alcaline, on préfère insuffler de l'ammoniac gazeux refroidi dans le mélange réactionnel afin d'augmenter la solubilité de l'ammoniac dans le mélange réactionnel. Lors- qu'on utilise une base minérale telle que l'hydroxyde de sodium, son addition à la température ambiante entraîne la formation d'un sel alcalin de L-tryptophane, qui se dissout très rapidement. Lorsqu'on ajoute du carbone activé et/ou un adju- vant de filtration du type silice au mélange réactionnel contenant le sel alcalin de L-tryptophane et qu'on le chauf- fe en présence de l'adjuvant de filtration ajouté, le mi- croorganisme est facilement séparé et on peut obtenir une solution aqueuse du sel alcalin de L-tryptophane. Le L-tryptophane peut être récupéré en soumettant la solution aqueuse résultante du sel alcalin de L-tryp- tophane à un procédé classique de cristallisation, tel qu'une neutralisation. Les exemples suivants illustrent la présente in- vention d'une façon plus particulière.- Exemple 1 On inocule le contenu d'une boucle de platine de Escherichia coli dans 50 ml d'un milieu de culture ayant la composition /I] ci-après, et on le cultive sur une se- coueuse à 30 C pendant 20 heures. Un litre du bouillon de culture est centrifugé et les cellules sont recueillies et utilisées comme source de tryptophane-synthétase. Composition du milieu de culture MI Extrait de viande 1 % en poids Peptone 0,5 % en poids Extrait de levure 0,1 % en poids KH2PO4 0,2 % en poids pH au stade initial 7,0 Le contenu d'une boucle de platine de Pseudomonas putida (IFO 12996) est inoculé dans 50 ml d'un milieu de culture ayant la composition [IIJ suivante, et cultivé sur une secoueuse à 30 C pendant 20 heures. Un litre du bouil- lon de culture est centrifugé et les cellules sont recueil- lies et utilisées comme source de sérine-racémase. Composition du milieu de culture ZII7 Extrait de viande 1,0 % en poids Peptone 0,5 % en poids NaCl 0,5 % en poids pH au stade initial 7,0 On introduit dans un ballon de 300 ml équipé d'un agitateur 11,3 g de DLsérine, 6 g de sulfate d'ammonium, 10 mg de phosphate de pyridoxal et 66 g d'eau, et on agite bien le tout. On ajoute une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque à la solution aqueuse résultante pour ajuster son pH à 8,5. On met ensuite en suspension dans l'eau 6,8 g (teneur en matières solides 1,7 g) d'un gâteau crame humide de Escherichia coli et 3, 4 g (teneur en matières solides 0,85 g) d'un gâteau crame humide de Pseudomonas putida pour former une suspension ayant un volume total de 20mi. On ajoute la suspension résultante à la solution aqueuse ci-dessus. Après avoir maintenu le mélange à 35 C, on ajou- - 8 te 57,2 g d'une solution toluénique contenant 11,5 g d'in- dole et on fait réagir à 35 C pendant 48 heures. Le ren- dement de la réaction est quantitatif. On distille le mélange réactionnel pour chasser le toluène, et on ajoute de l'eau pour ajuster la quantité totale du mélange à 450 g. On ajuste son pH à 3,5 avec de l'acide sulfurique et on ajoute 3 g de carbone activé. On chauffe le mélange à 95-98 C et on le maintient à cette température pendant 1 heure. On le filtre à chaud à la mê- me température, tout en maintenant le L-tryptophane à l'é- tat dissous, pour séparer le carbone activé et le micro- organisme floculé. On concentre le filtrat jusqu'à une con- centration en L-tryptophane de 10 % en poids. On le re- froidit à 20 C et on sépare par filtration les cristaux résultants. On isole des cristaux de L-tryptophane d'une pu- reté de 99,5 % en un rendement de 80 % sur la base de l'indole. Exemple 2 On conduit la même réaction que dans l'Exemple 1 dans l'eau en utilisant des cellules de Escherichia coli (MT-10232) et des cellules de Pseudomonas Punctata (MT-10243) cultivées de la même manière que dans l'Exemple 1. On filtre par centrifugation le mélange réactionnel pour séparer les cristaux de L-tryptophane précipités et les cellules micro- biennes utilisées dans la réaction. On verse le gâteau crême dans l'eau pour ajuster la concentration en Ltryptophane à 4,0 % en poids. On ajuste ensuite le pH de la solution à 4, 0 avec de l'acide phosphorique. On ajoute 2 g de carbone activé et 2 g de Celite 545 (une marque de fabrique d'un produit de Johns- Manville Corporation), et on chauffe le mélange à 95-98 C pendant 1 heure. On le filtre à chaud à la même tempé- rature pour séparer le carbone activé, la Celite et les cellules microbiennes floculées. On concentre le filtrat à une concentration en Ltryptophane de 15 % en poids, et on le refroidit à 20 C. On sépare par filtration les cris- taux précipités. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 87 % et sa pureté est de 99,7 %. Exemple 3 On met en suspension le même gâteau crame consis- tant en L-tryptophane et en cellules microbiennes que celui obtenu dans l'Exemple 2 dans un mélange 1:1 (en volume) d'eau et d'isopropanol, et on ajuste la concentration en L-tryptophane à 7 % en poids. On ajoute de l'acide chlorhy- drique concentré pour ajuster le pH de la suspension à 3,5. On ajoute 3 g de carbone activé et on chauffe le mélange à 80-84 C pendant 1 heure. On filtre à chaud le mélange à la même température. On refroidit le filtrat à 5 C et on recueille par filtration les cristaux précipités. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 75 %, et sa pureté est de 98,5 %. Exemple 4 On effectue la même réaction que dans l'Exemple 1, Après avoir chassé le toluène, on dilue le mélange réac- tionnel à l'eau jusqu'à une concentration en L-tryptophane de 1 % en poids. On ajuste le pH du mélange réactionnel à 4,0 avec de l'acide sulfurique, et on l'agite à la tempé- rature ambiante pendant 2 heures pour dissoudre le L-tryp- tophane. On ajoute 3 g de carbone activé et 3 g de Stan- dard Supercell (une marque de fabrique d'un produit de Johns-Manville Corporation) comme adjuvant de filtration, et on filtre la solution à la température ambiante. On concentre le filtrat jusqu'à une concentration en L-tryp- tophane de 10 % en poids et on le refroidit à 5 C. On re- cueille par filtration les cristaux précipités. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 79 % et sa purete est de 98,8 %. Exemple 5 On fait réagir l'indole et la DL-sérine dans une solution toluénique de la même manière que dans l'Exemple 1. Le rendement de la réaction est quantitatif. On chasse le toluène du mélange réactionnel par distillation. On ajuste le pH du mélange réactionnel résultant contenant le Ltryptophane à 4,0 avec de l'acide sulfurique et on chauffe le mélange à 95-98 C pendant une heure. Après refroidissement à la température ambiante, on insuffle de l'ammoniac gazeux dans le mélange réactionnel pour dissou- dre le L-tryptophane qui s'y trouve sous forme de son sel d'ammonium. On ajoute à la solution du carbone activé en une quantité de 10 % en poids sur la base du L-tryptophane et de la Celite 545 (une marque de fabrique d'un produit de Johns-Manville Corporation) en une quantité de 10 % en poids sur la base du L-tryptophane, et on filtre la solu- tion. Le microorganisme est séparé en même temps que la Ce- lite 545 et le carbone activé. On chauffe le filtrat à C pour chasser l'ammoniac et on ajuste la concentra- tion en L-tryptophane à O10 % en poids par addition d'eau. On refroidit la solution à 20 C et on sépare par filtra- tion les cristaux précipités, on les lave à l'eau et les sèche. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 75 % sur la base du tryptophane résultant, et sa pureté, mesurée par chromatographie en phase liquide, est de 98,5 %. Exemple 6 On centrifuge le même mélange réactionnel conte- nant du L-tryptophane que celui obtenu dans l'Exemple 5 et on obtient un mélange de cristaux de L-tryptophane et des microorganismes sous forme d'un gâteau crême. On verse le gâteau crême dans l'eau pour former une suspension ayant une concentration en L-tryptophane de 30 % en poids. On a- juste le pH de la suspension à 3,5 et on chauffe à 95-98 C pendant 2 heures pour floculer les microorganismes utili- sés dans la réaction. Après refroidissement à la tempéra- ture ambiante, on ajoute de l'ammoniaque aqueux pour dis- soudre le L-tryptophane c=ntenu dans le mélange réactionnel sous forme de son sel d'ammonium. On ajoute à la solution % en poids, sur la base du L-tryptophane, de carbone ac- tivé et on sépare les cellules microbiennes floculées à la température ambiante. On insuffle de l'azote gazeux dans le filtrat à une température élevée pour chasser l'ammoniac. Après refroidissement à 5 C, on sépare le L-tryptophane précipité à l'aide d'un séparateur centrifuge d'eau. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 88 % sur la base du tryptophane résultant et sa pureté est de 98,0 %. Exemple 7 On ajuste le pH d'une solution aqueuse à 12 % en poids de L-tryptophane obtenue comme dans l'Exemple 5 à 4,0 avec de l'acide phosphorique, et on chauffe à 95-98 C. Après refroidissement à 25 C, on ajoute une solution aqueu- se à 20 % d'hydroxyde de sodium pour ajuster le pH de la so- lution à 10. On ajoute à la solution aqueuse de L-trypto- phane 10 % en poids, sur la base du tryptophane, de carbone activé et 10 % en poids, sur la base du tryptophane, de Standard Supercell (une marque de fabrique d'un produit * de Johns-Manville Corporation) comme adjuvant de filtra- tion, et on filtre la solution à 20 C. On neutralise le filtrat à pH 6 avec de l'acide acétique, et on sépare par filtration les cristaux de Ltryptophane précipités et les sèche. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 75 % sur la base de tryptophane résultant, et sa pureté est de 99,2%. Exemple 8 On disperse un gâteau crême de L-tryptophane ob- tenu de la même manière que dans l'Exemple 5 dans un mélan- ge 1:1 (en volume) d'eau et d'isopropanol pour former une suspension ayant une concentration en L-tryptophane de 20% en poids. On ajuste le p? de la suspension a 3,5 avec de l'acide sulfurique, et on chauffe à 80O84 C pendant 2 heu- res. Après refroidissement à 5 C, on insuffle de l'ammoniac gazeux dans le mélange réactionnel pour dissoudre le L- tryptophane dans le solvant sous forme de son sel d'ammo- nium. On ajoute à la solution 20 % en poids, sur la base du tryptophane, de carbone activé et on filtre la solution à la trompe pour obtenir une solution transparente jaune pâle de L-tryptophane. On insuffle de l'azote gazeux dans la solution en chauffant pour chasser l'ammoniac. On re- froidit la solution et on sépare par filtration les cris- taux de L-tryptophane précipités et on les sèche. Le rendement en L-tryptophane isolé est de 83 % sur la base du tryptophane résultant, et sa pureté est de 98,8 %. R E V E N D I C A T I ONS 1 - Procédé de séparation de L-tryptophane d'un mélange réactionnel contenant du L-tryptophane et un micro- organisme, qui est obtenu au cours de la production de L- tryptophane en utilisant le microorganisme, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à ajuster le pH du mélange réactionnel à une valeur de 2 à 5 avec un acide minéral, à chauffer le mélange et à filtrer ensuite le mé- lange réactionnel chauffé pour enlever le microorganisme. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à ajuster le pH du mélange réactionnel à une valeur de 2 à 5 avec un acide minéral, à chauffer le- dit mélange, à ajouter une substance alcaline au mélange réactionnel chauffé pour transformer le L-tryptophane qu'il contient en son sel de métal alcalin, et à filtrer ensuite le mélange réactionnel pour enlever le microorganisme.