Brevet FR2558164A1 — publié le 19850719

L'invention concerne un procédé de purification de solutions contenant du fructose - 2,6-disphosphate (F-2,6-P2), et plus particulièrement un procédé de purification utilisant la chromatographie par échange ionique combinée avec la filtration moléculaire. L'invention concerne aussi l'utilisation du produit ainsi obtenu comme médicament. Le sel de sodium du fructose 1,6 diphosphate (FDP) est un agent d'une haute activité métabolique, largement utilisé en médecine au cours des dernières années pour régulariser le bilan d'azote, pour améliorer l'oxyphorèse et la déformabilité des érythrocytes, pour empêcher l'hémolyse et pour réactiver la circulation périphérique. En particulier, un isomère du FDP se révèle comme très efficace, à savoir le e-D-fructose-2,6-diphosphate (F-2,6-P2), qui présente des caractéristiques spéciales de stimulation de la phosphofructokinase. De nombreux essais effectués par la Demanderesse permettent de prouver l'activité réellement très élevée du F-2,6-P2, confirmée par une augmentation remarquable du FDP intracellulaire. Un procédé a récemment été décrit dans la demande de brevet IT 22403 A/83 déposée au nom de la Demanderesse, pour la préparation de liposomes de composition convena- ble pour transférer à la cellule le FDP et/ou ses isomè- res. Toutefois, malgré les caractéristiques avantageuses précitées, l'emploi du F-2,6-P2 s'accompagne encore de certains inconvénients, principalement dIs à l'instabi- lité du composé et de ses solutions dans un milieu ot le pH correspond au pH plasmatique et à celui des liqui- des intersticiels, ainsi qu'à son coit excessif. Des recherches ultérieures effectuées par la Demanderesse, ont permis de constater que le ?-2,6-P2 demeure stable au pH physiologique (7/7,4) quand on l'incorpore avec les liposomes en mmune temps qu'une ou plusieurs des substances suivantes: (a) le Fructose-6-diphosphate (F-6-P) (b) le FDP et (c) le fructose 1,2 phosphate cyclique, 6 phosphate (FDPC) qui est un intermédiaire dans la production du F-2,6-P2. Cette découverte présente l'avantage énorme de rendre possible l'incorporation du F-2,6-P2 avec des liposomes de pH d'environ 7,4, en même temps qu'une ou plusieurs des substances suivantes: - F-6-P - FDP et/ou FDPC et de le maintenir constamment à ces valeurs de pH. Après que le F-2,6-P2, ainsi associé et prépare, est introduit dans la cellule, il se trouve dans les conditions idéales pour susciter, par activation de la phosphofructokinase, la production d'une grande quantité de FDP intracellulaire qui, comme déjà mentionné, pré- sente une action thérapeutique. L'invention sera mieux comprise a la lecture de l'exemple qui suit et à l'examen des dessins annexés, donnés à titre non limitatif, de divers modes de réali- sation de l'invention. Sur ces dessins, les figures 1 à 3 sont des graphiques représentant des profils chromatographiques établis au cours de diverses étapes du procédé employé pour la production du F-2,6-P2. Exemple de préparation du F-2,6-P2 A) Cyclisation On dissout 1 g de FDP dans 2 ml d'eau bidistillée. Cette solution de FDP est ensuite convertie de la forme de sel de sodium en forxme de sel de pyridine, au moyen d'un échange ionique rapide, effectuée par la résine vendue sous la dénomination commerciale de DOWEX G 50, préalablement lavée dans la pyridine. On ajoute à la solution de FDP 10 m1 de pyridine, puis on effectue un mélange rapide avec la résine. On sépare alors la résine par centrifugation (500x g pen- dant 5 mn) de la solution contenant le FDP, qui est maintenant soUS forme pyridinique. On prépare séparément une solution contenant 4 g de dicyclohexylcarbodiimide (DDCD), dissous à chaud dans 20 ml de pyridine, à laquelle on ajoute 1,5 ml de triéthylamine (TEA). On ajoute cette solution a la quantité de FDP et, après mélange rapide, le volume final résultant est de 80 ml, avec addition de la pyridine. Le mélange, d'une couleur jaune pâle, est conservé à 20 C pendant 24 heures. Il peut se former une coagu- lation. Après ce temps, on bloque la réaction par addi- tion de 80 ml d'eau (dilution 1:1) puis on effectue de rapides extractions à l'éther. Ces extractions sont au nombre de trois, dont chacune est effectuée avec un volume d'éther égal à 4 fois celui du mélange. A chaque fois, on élimine la phase éthérée, qui a pour fonction de retirer le DCCD. On traite cette phase dans un évaporateur rotatif afin de récupérer l'éther, le DCCD et la pyridine. A ce moment, le FDP, converti dans une grande mesure en FDPC, est présent dans un volume de 40 ml de la phase aqueuse. A la fin du processus d'obtention du F-2,6-P, une série de passages chromatographiques sur colonne sont nécessaires. B) lère opération: isolement du F-2,6-P2 Chromatographie sur la résine de dénomination com- merciale DEAE-SEPHADEX (250 mM TEA-HCO3 pH 8,4) On ajuste le pH des 40 ml d'échantillon à 8,4, avec une concentration finale de 250 mM TEA-HCO3 pH 8,4. On équilibre avec ce même tampon (250 M TEA-HC03 pH 8,4) une colonne de DEAE-SEPHADEX (16 cm x 1,5 cm). La résine a une fonction double: échange ionique (DEAE) et filtration (Sephadex>, et elle convient pour la séparation de molécules glucidiques de bas poids moléculaire. - Apres percolation de la totalité de l'échantillon, on effectue un lavage avec le tampon de base, puis on applique un gradient continu de 200 ml, d'une force ionique croissante, depuis 250 mM jusqu'à 500 mM TEA-HCO3 pH 8,4. Avec chaque fraction on effectue un dosage du contenu glucidique et un dosage enzymatique de F-2, 6-P2. Le dosage du contenu glucidique met en évidence deux pics: chacun d'eux est traité dans un milieu alcalin par NaOH, après quoi il est possible d'estimer l'activité de stimulation de la phosphofructo- kinase. A un échantillon de 0,3 ml, on ajoute 80 1Pl NaOH 5N, et on fait incuber le tout à 37 C pendant 10 mn. On fait suivre une neutralisation par 60 pl HCl 5N. Cette opération est destinée à décycliser FDP, et à libérer une certaine quantité de F-2,6-P2 qui est l'activateur de F6PK. Parmi les pics du contenu glucidique, seulement l'un d'eux, celui élué à une force ionique de 300 mM TEA-HCO3 pH 8,4, présente une activité valable de sti- mulation de F6PK. Donc, seul ce pic contient du FDP non cyclisé, soit de F-6-P (voir figure 1). C) Deuxième opération de purification de F-2,6-P2 Chromatographie sur DEAE-SEPHADEX (10 UM TEA-HCO3 pH 8,'4) Le pic contenant le composé activant de la phospho- fructokinase est repris, traité par NaOH IN et incubé à 370C pendant 10 mn. L'échantillon est alors dilué avec 4 voL H20 et traité à 90C pendant 30 mn. Après quoi, l'échantillon est désaliné et concentré par osmose inverse jusqu'à un volume final convenable pour la chromatographie suivante. A cette fin, on prépare une colonne de résine DEAE-Sephadex (8 cm x 0,8 cm) équilibrée par le tampon 10 mM TEA-HCO3 pH 8,4. On fait percoler l'échantillon amené à la même concentration que le tampon, et on recueille des fractions de 1 ml de volume. On effectue un lavage avec le même tampon et on applique un gradient continu depuis 10 jusqu'à 500 mM TEA-HCO3, pH 8,4. chaque échantillon, après dosage du contenu gluci- dique, est à nouveau soumis à l'essai spectrophoto- métrique du taux activant de F6PE (voir figure 2). D) Conversion du composé en sel de sodium Les fractions contenant le F-2, 6-P2 sont reprises, puis désalinées et concentrées par un processus d'osmose inverse; finalement on les sèche dans un évaporateur rotatif. On lave le résidu 3 fois avec de l'eau bidistillée et on chromatographie le composé sur DOWIEX 50 sous forme sodique (0,5 cm x 5 cm). On équilibre la colonne avec 50 mM NaCl, 50 mM tris-HCl à pH 8. On met l'échantillon en suspension qu'on fait percoler de force ionique croissante (100 mM NaCl, 200 mM NaCl, 500 mM NaCl), toujours dans Tris-HCl 50 mM pH 8. Dans les échantillons élués à la dernière concen- tratiorn citée, on note l'activation maximale de l'enzyme phosphofructokinase, au dosage décrit ci-après (voir figure 3). E) L'éluat est désaliné et concentré par osmose inverse, puis il est lyophilisé. Dosage du contenu glucidique On évalue la quantité de glucides présents dans chaque fraction de la colonne de DEA-Sephadex suivant la méthode de Montgomery (15). Sur chaque échantillon, on prélève 0,2 ml, auxquels on ajoute 0,5 ml de phénol 5 % (P/P); 3 ml de H2SO4 concentré et 0,3 m1 de H20 bidistillêe. - Après agitation et 5 mn d'incubation, la coloration est quantifiée par lecture spectrophotométrique à 485 nm. On prépare les standards avec le FDP et le fructose. Dosage enzImatique (Activation de la phosphofructo- kinase) La méthode employé est basée sur le pouvoir du F-2,6-P d'éliminer l'inhibition de l'activité de la phosphofructokinase (F6PK) produite par le ATP. Pour l'essai, sont présents dans chaque cuvette les ingrédients: Hepes 50 mM(pH 7,4) EDTA 1 mm MgC12 5 mM NH4 C 1 mM NADH 0,16 mM dithiotreitol (DTT) 2,5 mM Fructose-6-phosphate 1 mM aldolase (désalinée) 0,4 unité TIM 2,4 unités a glycérophosphate-déhydrogénase 8,4 unités. Apres addition de 30 mU de F6PK de 1,2 mM ATP, on effectue une incubation de 2 mn. La réaction débute avec l'addition d'une certaine quantité de F-2,6-P2 (facteur activant). Dans les conditions mentionnées, F6PK ne présente aucune activité en l'absence du facteur activant (F-2,6-P2). On effectue la lecture spectrophotométrique avec l'appareil dit de Gilford 340 nu, en notant la disparition de NADH, se produisant après son oxydation enzymatique en NAD. En fait, le dosage de l'activité du F6PK est basé sur la série suivante de réactions: FK F6P + ATP b FDP + ADP ALD TIM FDP - dihydroxyacétone-P - glycéraldéhyde-3-P a glycérophosphate Glyoer-3P + NADH + H IDR a glycîophosphate + ND+ Le dosage est donc basé sur la combinaison de la formation de FDP avec l'oxydation du NADH, en utilisant l'aldolase, TIM et un glycérophosphate de déshydrogénase. Les enzyme employées dans ce dosage sont produites par la Société dite Boehringer-Biochemia. Les caractéristiques analytiques du sel de sodium de F-2,6-P2 ainsi obtenu sont les suivantes: P-2,6-P2 H % 64,3 H3PO4 % 0,7 FDPH4 % 2,9 FDP CH3 % 1,2 Glucides monophosphorylés % 1,5 H20 % 8,1 Na % 17,3 pyridine % 0,7 Le procédé de l'invention présente de nombreuses caractéristiques nouvelles ainsi que de nombreux avan- tages. La possibilité de récupérer l'éther, le DCCD et la pyridine dans la phase A, ainsi que la régénération des résines chromatographiques, permettent de réduire de plus de 95 % le coQt du procédé totoal, comparati- vement aux colts des procédés connus. La concentration et la désalinisation par le pro- cessus d'osmose inverse (filtration moléculaire) des solution obtenues après la chromatographie des phases B, C et D, permettent d'éliminer les inconvénients qui se produiraient selon les procédés connus, car la chromatographie sur Dowex 50 sous forme sodique est altérée par la dilution, et surtout par l'excès de sels. La désalinisation et la concentration préalables par osmose inverse permettent, en-outre, d'optimiser l'opération de lyophilisation, et elles n'ont encore jamais été employées dans ce but. Plus spécifiquement, l'emploi de la méthode de filtration moléculaire (osmose inverse), combinée avec la chromatographie par échange ionique, est très avantageux, car il permet de réduire le volume de la solution, et d'en soustraire les sels qui perturbent le processus de la chromatographie, la lyophilisation des éluats provenant de ces processus chromatographiques et le traitement de purification avec l'enzyme d'aldolase. Le F-2,6-P2 produit par le système de purification décrit ci-dessus, est utilisé comme médicament, comme précédemment mentionné. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits. Elle est susceptible de nombreuses variantes suivant les applications envisagées, sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de solutions contenant du F-2,6-P2, caractérise en ce qu'il comprend les opé- rations suivantes: a) cyclisation d'une solution de FDP pour obtenir une phase aqueuse contenant du FDPC et une phase éthérée contenant du DCCD et la pyridine; la phase éthérée étant traitée dans un évaporateur rotatif pour récupérer l'éther, le DCCD et la pyridine; b) isolement de F-2,6-P2 par chromatographie sur DEAE-Sephadex à 250 TM TEA-HC03, à pH 8,4, suivi de la désalinisation et de la concentration du F-2,6-P2 lui- méme par un processus d'osmose inverse; c) purification ultérieure du F-2,6-P2 par chromato- graphie sur DEAE-Sephadex à 10 mM TEA-HCO3 à pH 8,4, suivie d'une d6salinisation et d'une concentration par un processus d'osmose inverse, de la fraction d'éluat contenant le F-2,6-P2; d) conversion du composé en son sel de sodium par chromatographie sur Dowex 50 sous forme sodique; l'luat étant désalinô et concentré par osmose inverse; e) lyophilisation. 2. Procédé selon la revendication 1, cxaractérisé en ce qu'il pourvoit le passage de la phase éthérûe contenant le DCCD et la pyridine dans un évaporateur rotatif, pour permettre la récupération de l'éther, du DCCD et de la pyridine. 3. Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce que les solutions obtenues après la chronato- graphie des phases P, C et D sont concentrées et désalinées par oSmose inverse (filtration molécullire) 4. Applicationr comme médicament du -2,6-p2 carac- térisé en ce qu'il est obtenu par le procédé salon l'une des revendications 1 à 3. a5