Brevet FR2551088A1 — publié le 19850301

- 21 La présente invention est relative à un nouveau peptide qui comprend une séquence d'acides aminés reproduisant plus particulièrement le site d'interaction entre la sous-unité A et la sous-unité B de la toxine cholérique. Comme on le sait /-Cf J HOLMGREN, NATURE, 292, Juillet 1981, p 413-417 7 la diarrhée aqueuse caractéristique du choléra qui, si elle n'est pas enrayée, conduit à la déshydratation, à l'acidose métabolique du malade et à la mort, est due à la toxine cholérique secrétée par le 10 Vibrio cholerae On connait bien le mécanisme d'action de la toxine cholérique, qui se fixe sur des récepteurs qui se trouvent sur les cellules muqueuses et stimule l'activité adényl cyclase intestinale, qui a pour effet d'augmenter le taux d'A M P cyclique présente dans les cellules de l'intestin 15 grêle; cette dernière provoque la diarrhée et la perte de fluide par sortie massive d'eau et inhibition de l'absorption du chlorure de sodium par les villosités intestinales et par la stimulation de la secrétion active de chlorure par les cellules cryptiques. L'on sait également que la toxine cholérique est une protéine constituée de deux fragments polypeptidiques: la sous-unité B, comprenant elle-même cinq unités identiques, et la sous-unité A /Cf R A FINKELSTEIN, M K LARUE et J.J LOSPALLUTO, INFECT IMMUN, 6, 1972, pp 934 _ 7 Il est admis 1 Cf J HOLMGREN, Loc cité_ 7 que l'action nocive de la toxine cholérique se traduit par les faits suivants: fixation de la sous-unité B de la toxine sur le récepteur GM 1 de la membrane de l'entérocyte duodénal, suivie d'une augmentation du taux d'A M P cyclique due à une activation irréversible de l'adényl cyclase /Cf D M GILL, ADV CYCLIC 30 NUCLEOTIDE RES, 8, 1977, pp 85 _ 7 ce qui laisserait penser que la symptomatologie du choléra découlerait de l'introduction de la sous-unité A dans la cellule. -2 Cette sous-unité A présente un caractère hydrophobe qui est mis en évidence lorsqu'elle est fractionnée de la toxine cholérique (CT), par réduction du pont disulfure, pour donner les sous-unités a et y nonidentiques Selon W H J WARD, P BRITTON et S VAN HEYNINGEN, (BIOCHEM J, 199, 1981, pp 457), le fragment a n'aurait pas de régions hydrophobes et, par contre, le fragment Y aurait un caractère amphiphile, les régions hydrophobes pouvant être masquées dans la sous-unité A intacte Enfin, ce serait grâce au fragment y, conducteur, que le fragment a pénètrerait à travers la membrane de la cellule C'est pourquoi, il a paru intéressant et utile aux Inventeurs de rechercher dans la structure de la sous-unité A les séquences d'acides aminés responsables des activités biologiques de la toxine cholérique. Par ailleurs, les travaux de E K SPICER, W.H KAVANAUGH, W S DALLAS, S FALKOW, W H KONIGSBERG et D E SCHAFER, dont il est rendu compte dans PROC NATL. ACAD SCI U S A, 78, Janvier 1981, p 50-54 et ceux de 20 W S DALLAS et S FALKOW (NATURE, 288, 4 Décembre 1980, P 499-501) ont mis en évidence l'existence de similitudes de structure primaire entre la toxine cholérique (CT) et l'entérotoxine thermolabile d'Escherichia coli (LT) responsable des gastro-entérites infectieuses: la toxine cholé25 rique CT et la toxine thermolabile LT d'Escherichia coli sont des entérotoxines similaires du point de vue fonctionnel, structural et immunologique Elle provoquent toutes deux l'élévation des taux d'A M P cyclique dans les cellules épithéliales des intestins en catalysant l'ADP-ribosylation 30 NAD-dépendante des protéines membranaires Elles se composent toutes deux de deux sous-unités dissemblables, à savoir la sous-unité A de l'entérotoxine qui a une activité enzymatique et est le composant activateur de l'adényl cyclase et la sous-unité B qui reconnaît les composants membranaires 35 et fixe l'holotoxine à la cellule cible, juxtaposant la sous-unité A avec ses substrats I 1 a été démontré que les 3 22551088 3 récepteurs membranaires de la sous-unité B de la toxine cholérique et de la toxine d'Escherichia c oli sont similaires mais non identiques, et que le monosialosylganglioside GM 1 est le récepteur de la CT et constitue probablement une partie du récepteur de la LT Il a été démontré /-cf GYLES et D A BARNUM, J INFECT DIS, 120, p 419-426 ( 1978)_ 7 que la LT et la CT sont similaires du point de vue immunologique et qu'aussi bien leurs sous-unités A que leurs sous-unités B présextent des déterminants antigéniques communs ú-cf J D CLEMENTS et R A FINKELSTEIN, INFECT IMMUN, 21, p 1036-1039 ( 1978) 7 La structure primaire des sous-unités B de la LT et de la CT a été déterminée et a fait apparaître qu'elles présentent une séquence homologue d'acides aminés Les travaux de SPICER 15 et Alia et de DALLAS et Alia cités plus haut, ont montré qu'il existe également des similitudes de structure primaire et de propriétés immunologiques entre les sous-unités A de la CT et de la LT et bien que les séquences en acides aminés de ces deux sous-unites ne soient que partiellement 20 identifiées à ce jour, cependant l'on sait d'après les travaux de DUFFY et LAI / BIOCHEM BIOPHYS RES COMM, 91, 1979, pp 1005 _ 7 que la sous- unité A de la CT a un poids moléculaire de 29500, dont 24000 pour la chaîne a et 5500 pour la chaîne y dont on connait la composition en acides 25 aminés, laquelle comporte 46 acides aminés dont 11 communs avec la chaîne y de la LT. En se fondant sur l'hypothèse selon laquelle le site d'interaction entre la sous-unité A et la sous-unité B de la CT serait localisé dans la chaîne y et plus particulièrement dans la séquence correspondant aux acides aminés portant les numéros 10 à 24 à partir du N terminal de cette dernière, et en se fondant sur la similitude fonctionnelle, structurelle et imunologique entre la LT et la CT, les Inventeurs ont considéré que S 'ils parvenaient à synthétiser un polypeptide présentant cette séquence 10-24, ils pourraient 35 obtenir un agent de protection à la fois contre le choléra et contre les gastro-entérites infectieuses. -4 La présente invention a en conséquence pour but de pourvoir à un peptide reproduisant au moins 10 acides aminés de la chaîne y de la sousunité A de la toxine cholérique communs avec la chaîne y de la toxine LT de E coli ou à un peptide susceptible d'induire (seul ou couplé à une molécule immunogène telle qu'une protéine ccame la sérumalbumine bovine par exemple) après injecticn à un animal, des anticorps reconnaissant la séquence ccmmune telle que définie ci-dessus, ou son équivalent, puisqu'il est, en effet, connu que certains acides aminés peuvent être remplaces par d'autres sans que la structure secon10 daire soit notablement modifiée. De manière préférée, la présente invention a pour but de pourvoir à un pentad 6 capeptide reproduisant la séquence 10-24 de la chaîne y de la sous-unité A de la toxine cholérique et présentant 11 acides aminés communs avec la chaîne y de la sous-unité A de la toxine d'Escherichia 15 coli, susceptible de servir d'agent de protection, et notamment de vaccin, au moins contre le choléra et de préférence à la fois contre le choléra et contre les gastro-entérites infectieuses Ce pentadécapeptide peut être reproduit, conformément à l'invention, par synthèse chimique ou par tout autre moyen, tel que l'utilisation de bactéries transformées 20 par des vecteurs porteurs d'une séquence de nucléotides correspondants aux acides aminés. La présente invention a pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il reproduit au moins dix acides aminés de la chaîne de la sous-unité A de la toxine cholérique communs avec la chaîne de la 25 toxine LT d'Escherichia coli. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, celle-ci a pour objet un pentadécapeptide de synthèse caractérisé en ce qu'il répond à la formule I ci-après: (I) Gln-Ser-Leu-Gly-Val-Lys-Phe-Leu-Asp-Glu-Tyr-GlnSer-Lys-Val 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 laquelle formule correspond à la séquence 10-24 de la chaîne de la sousunité A de la toxine cholérique et présente 11 acides aminés communs avec la chaine y de la sous-unité A de la toxine thermolabile LT d'Escherichia coli L'étude de la structure secondaire de la chaine y de 35 la sousunité A de la CT, faite par la méthode de CHOU et FASMAN /ADVANCES IN ENZYMOL, 47, 1978, pp 45 _ 7 a fait apparaître qu'il existe deux régions ayant une structure en hélice; la première se situe entre les positions 5 et 12 et la seconde entre les positions 15 et 24 Ces deux régions sont hydrophiles / d'après la méthode de HOPP et WOODS (PROC NATL ACAD SCI U S A, 78, 1981, p 3824) 7 et représentent une partie de la séquence ayant des acides aminés communs avec la LT. La présente invention a également pour objet un procédé de synthèse du peptide comprenant au moins dix 10 acides aminés communs à la chaîne y de la sous-unité A de la toxine cholérique et à la chaîne y de la toxine LT d'Escherichia coli, qui est caractérisé en ce que ledit peptide est synthétisé par construction de la chaîne peptidique pas-à-pas, en partant de l'extrémité C terminale 15 de ladite chaîne, par fixation successive des acides aminés qui constituent celle-ci. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, appliqué à la synthèse du pentadécapeptide de formule I défini ci-dessus, celui-ci 20 est synthétisé par construction de la chaîne peptidique pas-à-pas, en partant de l'extrémité C terminale, c'est-à-dire en partant de la valine, par fixation successive des acides aminés qui constituent la chaîne peptidique. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du 25 procédé de synthèse conforme à la présente invention, celui-ci est réalisé en phase solide, en présence d'un agent de couplage approprié. Selon une modalité préférée de ce mode de mise en oeuvre, la synthèse en phase solide est réalisée en utilisant un support solide constitué par une résine, de préférence une résine chlorométhylée ou une résine phénolique, notamment. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, la fonction a-aminée des acides aminés successivement fixés pour former la chaîne peptidique recherchée, est protégée temporairement par un groupe t-Butoxycarbonyle(Boc). Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, les fonctions latérales des acides aminés successivement fixes pour former la chaîne peptidique recherchée, sont protégées jusqu'à la fin de la synthèse par des groupes benzyles. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les groupes carboxyles des acides aspartique et glutamique sont protégés par des groupes ester benzylique. Selon une autre disposition avantageuse de ce 15 mode de mise en oeuvre, le groupe hydroxyle de la sérine est protégé par un groupe benzyléther. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amine c de la lysine est protégée par un groupe carbobenzyloxy (CBZ). Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, l'agent de couplage mis en oeuvre pour réaliser la construction pas à pas de la chaîne peptidique, est un mélange équimoléculaire de dicyclohexylcarbodiimide et de 1-hydroxybenzotriazole 25 dans un solvant approprié, tel que, notamment, le diméthylformamide ou le chlorure de méthylène. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, le groupe protecteur Boc de la fonction a-aminée des acides aminés 30 successivement fixés, est enlevé par acidolyse. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, les groupements protecteurs des fonctions latérales des acides aminés successivement fixés pour former la chaîne 35 peptidique recherchée, sont éliminés et la fonction C -7 terminale est libérée, simultanément une fois la synthèse terminée par action d'un acide fort, tel que, notamment, l'acide fluorhydrique liquide. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé de synthèse conforme à l'invention, le peptide libre obtenu après élimination des groupes protecteurs, est purifié par passage sur au moins une colonne de tamis moléculaire approprié, puis purification par chromatographie en phase liquide à haute performance. La présente invention a en outre pour objet un agent de protection contre le choléra et/ou les gastro-entérites infectieuses, pris dans le groupe qui comprend les sérums et les vaccins administrables par voiesparentérale sous-cutanée, cutanée ou orale, caractérisé en ce qu'il comprend le pentadécapeptide de synthèse de formule I défini plus haut. Selon un mode de réalisation avantageux de l'agent de protection conforme à la présente invention, celui-ci comprend ledit pentadécapeptide de synthèse de formule I associé à une sous-unité B de toxine cholérique et/ou a une sous-unité B de toxine d'Escherichia coli. La présente invention a pour objet un médicamnt nouveau caractérisé en ce qu'il c=mrend, en tant que constituant actif un peptide confome à l'invention et notanment, le pentadécapeptide de 25 formule I défini plus haut, ledit médicament nouveau étant apte à traiter les maladies liées à une activation du système adényl cyclase AMP cyclique. La synthèse du pentadécapeptide de formule I, conforme à la présente invention, sera décrite ci-après 30 dans l'exemple qui va suivre, qui est donné uniquement à titre d'illustration et n'a aucun caractère limitatif. La méthode de synthèse mise en-oeuvre est une méthode en phase solide pour la synthèse de peptides dérivée de la méthode de R B MERRIFIELD / -J AMER CHEM SOC,85, 35 1963, p 2149 _ 7. -8 La construction de la chaîne peptidique est réalisée en partant de l'extrémité C terminale qui, dans le cas présent, est la valine, par fixation successive des acides aminés, selon la méthode pas à pas. On part de 1,5 g de résine chlorométhylée"Bio Beads S XI" (de BIO-RAD) d'une capacité de 1,34 milliéquivalents/gramme de grosseur des grains:200400 mesh, sur laquelle on fixe la valine sous forme de Boc-valine, à raison de 2 équivalents de Boc-valine par grame de résine; on obtient 1, 85 g de résine-valine 10 substituée à 0,46 m M/g, soit 0,69 m M pour 1,85 g (Test de GISIN) Le couplage des acides aminés successifs est réalisé avec un excès, de préférence le double, par rapport à la substitution, soit: Boc-acide aminé: 1,4 mmole, en utilisant un agent de couplage: Hydroxybenzotriazole: 1,4 mmole Dicyclohexylcarbodiimide: 1,4 mmole dans du chlorure de méthylène et/ou du diméthylformamide comme solvants. La fonction a-aminée des acides aminés est protégée 20 temporairement, au moment de la fixation de l'acide aminé, par un groupe Boc, tandis que les fonctions latérales sont protégées par le groupe ester benzylique pour les fonctions acide, par le groupe benzyl éther pour les fonctions alcool et par le groupe carbobenzyloxy pour l'amine e de la lysine. 25 Les contrôles de couplage et de déblocage sont effectués par le test à la ninhydrine (Test de KAISER). Le groupement Boc est éliminé par acidolyse à l'aide d'acide trifluoroacétique à 30 % dans le dichlorométhane, et les autres groupes, y compris la fonction C terminale, 30 sont libérés, en fin de synthèse, par action de l'acide fluorhydrique liquide. Le peptide libre est purifié par passages successifs sur colonnes de tamis moléculaire, à savoir: -9 "ULTROGEL ACA 201 " Elution par l'acide acétique 0,1 M (Marque commerciale appartenant à L K B) "BIOGEL P 4 " Elution par l'acide acétique 1 M (Marque ccmmerciale de BIORAD) 'BIOGEL P 4 " Elution par l'acide acétique 0,1 M (Marque cmerciale de BIO Rp D) Les analyses en acides aminés des différentes fractions ont permis d'isoler le peptide recherché, qui est finalement purifié par chromatographie en phase liquide à haute perfor10 mance (CLHP) sur une colonne phase inverse dans les conditions suivantes: colonne "LICHROSORB" R? 18 ( 5 pm) 150 mm X 5 mm. Eluant A: acétonitrile; Eluant B: KH 2 PO 4, 5 X 10-3 M (p H = 6,0) Gradient linéaire de 20 à 80 % de A en 30 minutes. Détection UV à 220 nm, 0,02 unité de densité optique pleine 15 échelle La pureté du produit (TR: 7,18 min) est de 94 %, déduction faite de la surface des pics dûs au solvant (TR PROPRIETES Bl OLOGIQUES DE LA SEQUENCE SYNTHETIQUE 10-24 Les activités biologiques de la toxine cholérique complète sont extrêmement diverses, elles se résument dans les activités enzymatiques ayant comme médiateur l'A M P. cyclique Le caractère immunogene du peptide 10-24 de synthèse a été mis en évidence en procédant comme suit: MATERIEL ET METHODE: Des lapins ont été immunisés avec le peptide synthétique conforme à l'invention, selon la technique de OUDIN (lère injection, toxine synthétique, 100 mcg, + adjuvant de FREUND par voie intradermique, tous les 4 jours ensuite, une injection intramusculaire puis sous-cutanée et intra30 -veineuse sans adjuvant) Le sérum est recueilli 15 jours après. Double diffusion en gélose: le sérum a été étudié par double diffusion en gélose selon la technique d'OUCHTERLONY. Les tests biologiques ont été réalisés sur l'anse duodénale de souris C 3 H selon la technique de FUJITA et FINKELSTEIN, avec 10 mcg de la séquence synthétique comparativement à 10 mcg de toxine cholérique purifiée. RESULTATS: 15 20 25 30 In vitro: Les résultats obtenus in vitro sont illustrés à la figure unique annexée qui représente le diagramme d'OUCHTERLONY de double diffusion en gélose révélant les bandes de précipitation de la toxine et des anticorps de sérum de lapin sensibilisé avec le pentadécapeptide conforme à l'invention, reproduisant la séquence 10-24 de la chaîne y Selon ce diagramme, le sérum antitoxine cholérique contenu dans les puits 1.7 5 ne reconnaît pas le fragment synthétique de trop faible poids moléculaire contenu dans le puits 2 (puits 1 contre 2 et 5 contre 2), mais reconnaît la toxine complète contenue dans les puits 3-4 (puits 1contre 3 et 5 contre 4). Les sérums contenus dans les puits 6-7 obtenus contre le fragment de synthèse ne donnent aucune bande de précipitation contre le fragment synthétique ( 7 contre 2), par contre, un des sérums ( 7) reconnaît la séquence des acides aminés dans la toxine complète ( 3) ( 7 contre 3). Une plaque de double diffusion en gélose à disposition identique avec les sérums 1,5,6 et 7 avant immunisation est totalement négative. In vivo: La recherche de l'activité du peptide synthétique conforme à l'invention, qui reproduit un fragment de la sous-unité A, a été effectuée dans l'anse intestinale de souris C 3 H Les résultats ccmparatifs (mesure du poids par cm d'intestin par rapport à un témoin animal pesant de 60 à 65 mg) sont donnés en milligrammes par centimètre d'intestin et représentent la moyenne de 3 souris par expérience: a) après introduction de 10 mcg de toxine cholérique (Sigma lot 122 F 0239) dans l'anse intestinale après 18 heures: 126,7 mg b) après introduction de 10 mcg de sous-unité B: 67 mg (Sigma lot 12 F 0503) c) après introduction de 10 mcg de sous-unité A: 62 mg (Sigma lot 122 F 0240) d) après introduction de 10 mcg de sous-unité B (même référence) puis après 10 minutes mcg de sous-unité A (même référence): 116,6 mg e) après introduction de 10 Omcg de sous-unité B (même référence) puis après 10 minutes mcg de toxine cholérique (même référence): 126,7 mg 15 f) après introduction de 100 mcg de fragment synthétique de sous-unité A: 61 mg g) après introduction de 10 mcg de sous-unité B (même référence) puis après 10 minutes 100 mcg de fragment synthétique de sous-unité A: 63,2 mg h) après introduction de 100 mcg de sous-unité B + 100 mcg de fragment synthétique de sous-unité A, puis après 10 minutes 10 mcg de toxine cholérique (même référence): 67 mg Ces résultats font apparaître que le pentadécapeptide 25 de synthèse, conforme à l'invention, a provoqué chez le lapin des anticorps capables de reconnaître, dans la toxine cholérique complète la séquence d'A A correspondant au constituant de synthèse. En association avec la sous-unité B, le pentadéca30 peptide conforme à l'invention, a inhibé la sortie de l'eau hors des tissus par action de la toxine cholérique du commerce. Le pentadécapeptide conforme à l'invention, a joué le rôle de "leurre" vis-à-vis de la toxine. Etant donné le degré important de similitude entre les sous-unités A de la toxine cholérique et de la toxine thermolabile d' Escherichia coli, ce rôle de "leurre" existe également vis-à-vis des Escherichia coli toxinogènes et permet d'envisager une approche médicamenteuse double du traitement de ces deux affections. Le peptide conforme à l'invention,peut être utilisé sous une forme pharmaceutiquement acceptable,telle que solution, poudre, etc ou également absorbé ou couplé de manière non covalente à un support approprié,afin de permettre sa libération de manière lente et continue chez le patient. Outre le fait que le pentadécapeptide de synthèse conforme à la présente invention permet de disposer d'un 15 agent de protection contre le choléra ou contre les gastro-entérites infectieuses,-ou à la fois contre l'une et l'autre de ces maladies, il présente un intérêt significatif sur le plan physiologique: les activateurs de l'A M P cyclique sont, en effet, peu nombreux, en sorte qu'il permet d'élucider les mécanismes d'action des activités biologiques liées à la stimulation de la formation de l'A M P. cyclique et d'envisager des traitements thérapeutiques des troubles liés à une activation du système adényl cyclase A.M P cyclique et éventuellement par couplage ou association 25 avec un composant actif tel qu'hormone ou tout-autre médiateur biologique. 2 5 5 1 0 8 8 REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I O N 5 1/ Peptide de synthèse caractérisé en ce qu'il reproduit au moins 10 acides aminés communs à la chaîne y de la sous-unité A de la toxine cholérique et à la chaîne y de la toxine LT d'Escherichia coli. 2/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un pentadécapeptide qui répond à la formule I ci-après: (I) Gln-SerLeu-Gly-Val-Lys-Phe-Leu-Asp-Glu-Tyr-Gln-Ser-Lys-Val 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 laquelle formule correspond à la séquence 10-24 de la chaîne y de la sousunité A de la toxine cholérique et présente 11 acides aminés communs avec la chaîne y de la sous-unité A de la toxine thermolabile LT d'Escherichia 15 coli. 3/ Procédé de synthèse d'un peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide est synthétisé par construction de la chaîne peptidique pas-à-pas, en partant de l'extrémité C terminale de ladite chaîne, par fixation 20 successive des acides aminés qui constituent celle-ci. 4/ Procédé de synthèse du pentadécapeptide de formule I selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit pentadécapeptide est synthétisé par construction de la chaîne peptidique pas-à-pas, en partant de l'extrémité C 25 terminale, c'est-à-dire en partant de la valine, par fixation successive des acides aminés qui constituent la chaîne peptidique. / Procédé de synthèse selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est réalisé en phase 30 solide, en présence d'un agent de couplage approprié. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la synthèse en phase solide est réalisée en utilisant un support solide constitué par une résine, de préférence une résine chlorométhylée ou une résine phénolique, 35 notamment. 14 - 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendication 3 à 6, caractérisé en ce que la fonction a-aminée des acides aminés successivement fixés pour former la chaîne peptidique recherchée, est protégée temporairement par un groupe t-Butoxycarbonyle (Boc). 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que les fonctions latérales des acides aminés successivement fixés pour former la chatne peptidique recherchée, sont protégées jusqu'à la fin de 10 la synthèse par des groupes benzyles. 9 / Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les groupes carboxyles des acides aspartique et glutamique sont protégés par des groupes ester benzylique. / Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que 15 le groupe hydroxyle de la sérine est protégé par un groupe benzyléther. 11/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'amine C de la lysine est protégée par un groupe carbobenzyloxy (CBZ). 12/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent de couplage mis en oeuvre pour réaliser la construction pas à pas de la chaîne peptidique est un mélange équimoléculaire de dicyclohexylcarbodiimide et de 1-hydroxybenzotriazole dans un solvant approprié, 25 tel que, notamment, le diméthylformamide ou le chlorure de méthylène. 13/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe protecteur Boc de la fonction a-aminée des acides aminés successivement fixés, est enlevé par 30 acidolyse. 14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que les groupements protecteurs des fonctions latérales des acides aminés successivement fixes pour former la chaîne peptidique recherchée,sont éliminés et 35 la fonction C terminale est libérée, simultanément une 2551088 fois la synthèse terminée, par action d'un acide fort, tel que, notamment, l'acide fluorhydrique liquide. 15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 14, caractérisé en ce que le peptide libre obtenu après élimination des groupes protecteurs, est purifié par passage sur au moins une colonne de tamis moléculaire approprié, puis purification par chromatographie en phase liquide à haute performance. 16/ Agent de protection contre le choléra et/ou les gastro-entérites infectieuses, pris dans le groupe qui comprend les sérums et les vaccins administrables par voies parentérale, sous-cutanée, cutanée ou orale, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide de synthèse selon la revendication 1 ou la revendication 2. 17/ Agent de protection selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend ledit peptide de synthèse associé à une sous-unité B de toxine cholérique et/ou à une sous-unité B de toxine d'Escherichia coli. 18/ Médicament nouveau caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que constituant actif, un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, ledit médicament nouveau étant apte à traiter les maladies liées à une activation de l'A M P cyclique et plus particulièrement liées à une activation du système adényl cyclase A.M P cyclique.