Brevet FR2554125A1 — publié le 19850503

"PROCEDE DE PREPARATION DE CON-RES DE NLCCRGAISNISES LYCPHI--SES" La présente invention concerne un procédé de préparation de concentrés de microorganismes lyophilisés, nctanment bactéries lactiques, du genre o l'on ali'oente mn milieu de culture, préalablement enserrencé, et maintenu à une température comprise entre C et 45 C, de préférence de l'ordre de 30 C, en substrat nutritif comportant du lactose et de la levure, en agent neutralisant, notamment ammoniaque ou soude, destiné à maintenir le pH du milieu de culture à une valeur constante comprise entre 5,5 et 7,5, en particulier entre 6 et 7, le tout dilué dans de l'eau, l'on règle les apports en substrat et en eau par rapport à 1 'agent neutralisant et cela par détermLnation permanente de la concentration en agent inhibiteur, de façon à assurer dans une première phase un taux de croissance élevé jusqu'à atteindre une concentration critique de l'agent inhibiteur, qui correspond à une concentration maximale admissible pour un taux de croissance plus modéré compris entre 0,10 et 0,50 m choisi pour une phase ultérieure de croissance, et l'on met en oeuvre une opération d'ultrafiltration d'élimination partielle de l'agent inhibiteur avec maintien d'un volume constant du milieu de culture. L'objet de l'invention est de spécifier les modalités indispensables des opérations qui suivent celle de la culture et qui permettent d'assurer une lyophilisation optimale. Selon l'invention, on procède aux opérations suivantes: a) on met fin à l'alimentation des apports en substrat nutritif, et eau, tout en maintenant la régulation du pH à ladite valeur constante par admission d'agent neutralisant et, b) on poursuit l'opération d'ultrafiltration simultanément à un refroidissement de façon à assurer une concentration primaire en microorganismes caomprise entre 40 et 80 kg poids sec bactérien par m3, à une température coeprise entre 15 C et 20 C, de préférence de l'ordre de 16'C; c) on procède au lavage du concentré primaire, au moyen d'une solution de lavage constituée d'un mélange de sels minéraux et d'acides aminés, oligoéléments et vitamines; d) on assure toujours par ultrafiltration une concentration finale comprise entre 90 et 220 kg poids sec bactérien/m3, en maintenant la température telle qu'indiquée en b); 255412 5 e) on refroidit le concentré bactérien à une teapérature de l'ordre de C et l'cn v ajcute un protecteur concentré; -) on procède à une congélation du ccncentré bactérien et à sa lyophilisation. A titre d'exemples, la coapcsition de ia solution de lavage peut être choisie parmi celles énumérées ci-dessous: Exemple 1: E. levure 15 - 25 g/l KH2 PO4 3 - 5 g/1 !G Na2H PO4, 12 H20 20 - 30 g/1 MgS04, 7H20 0,3 - 0,8 g/1 Exeaple 2: E. levure 1 - 3 g/1 KH 2 P 4 1 - 4 g/1 Na2H P04, 12 H20 7 - 13 g/1 MgS04, 7H20 0,3 - 0,6 g/1 C1 Na 8 - 12 g/1 Exemple 3: E. levure 1 - 3 g/1 KH2 PO4 1 - 2 g/1 Na2H P04, 12 H20 4 - 8 g/i MgSO4, 7H20 0,3 - 0,6 g/ C1 Na 8 - 12 g/1 Glycérophosphate Na 3 - 8 g/1 Exemple 4: E. levure 1 - 3 g/1 KH2 P4 1 - 2 g/1 Na2H P04, 12 H20 4 - 8 g/1 mgSO4, 7H20 0,3 - 0,6 g/1 C1 Na 6 - 10 g/1 Glycérophosphate Na 3 - 8 g/1 Glutamate Na 2 - 5 g/1 Exemple 5: E. levure 1 - 3 g/l KH2 PO4 1 - 2 g/l Na2H PO4, 12 H204 - 8 g/l S MgSO4, 7H20 0,3 - 0,6 g/l Cl Na 5 - 9 g/l Glycérophosphate Na 3 - S g/i Glutamate Na 2 - 5 g/l Ascorbate de Sodium 2 - 5 g/l L'ensemble de ces mesures mettent en oeuvre successivement un maintien d'un pH constant entre 5,5 et 7,5 et plus particulièrement entre 6 et 7, un refroidissement et une concentration primaire spécifiques, puis un lavage et une concentration finale, permettant d'assurer, caUme l'expérience seule peut le prouver, une lyophilisation parfaite des microorganismes, en particulier des bactéries lactiques. REVDICATIONS 1. - Procédé de préparation de concentrés de microorganismes lyophilisés, notarient bactéries lactiques, du genre o l'on alimente un milieu de culture, préalablement ensemencé, et maintenu à une température comprise entre 25 C et 45 C, de préférence de l'ordre de 30 C, en substrat nutritif comportant du lactose et de la levure, en agent neutralisant, notamnent ammoniaque ou soude, destiné à maintenir le pH du milieu de culture à une valeur constante comprise entre 5,5 et 7,5, en particulier entre 6 et 7, le tout dilué dans de l'eau, l'on règle les apports en substrat et en eau par rapport à l'agent neutralisant et cela par détermination permanente de la concentration en agent inhibiteur, de façon à assurer dans une première phase un taux de croissance élevé jusqu'à atteindre une concentration critique de l'agent inhibiteur, qui correspond à une concentration maximale admissible pour un taux de croissance plus modéré coapris entre 0,10 et 0,50 choisi pour une phase ultérieure de croissance, et l'on met en oeuvre une opération d'ultrafiltration d'élimination partielle de l'agent inhibiteur avec maintien d'un volume constant du milieu de culture, caractérisé en ce que, l'opération de développement de microorganismes étant terminée, on procède aux opérations suivantes a) On met fin à l'alimentation des apports en substrat nutritif et eau, tout en maintenant la régulation du pH à ladite valeur constante par admission d'agent neutralisant et, b) On poursuit l'opération d'ultrafiltration simultaxément à un refroidissement de façon à assurer une concentration primaire en microorganismes comprise entre 40 et 80 kg poids sec bactérien par m3, à une température comprise entre 15 C et 20 C, de préférence de l'ordre de 16 C; c) On procède au lavage du concentré primaire, au toyen d'une solution de lavage constituée d'un mélange de sels minéraux et d'acides aminés; d) On assure toujours par ultrafiltration une concentration finale comprise entre 90 et 220 kg poids sec bactérien/m3; e) On refroidit le concentré bactérien à une terérature de l'ordre de C et l'on y ajoute un protecteur concentré; f) on procède à une congélation du concentré bactérien et à sa lyophilisation. 2. - Procédé de fabrication de microorganismes selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de lavage comprend un extrait de levure, KH2 PO4, Na2H P04, 12 H20, MgSO4, 7H20. 255 4 12 5 3. - Procédé de fabrication de microorganismes se'on la revendication 2, caractérisé en ce que la solution de lavage ccmprend du Cl Na. 4. - Procédé de fabrication de microorganismzoes selon la revendication 3, caractérisé en ce que la solution de lavage comprend du Glycérophosphaze Na. 5. - Procédé de fabrication de microorganismes selon la revendication 4, caractérisé en ce que la solution de lavage ccaprend du Glutamate Na. 6. - Procédé de fabrication de microorganismes selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution de lavage coeprend de l'Ascorbate de Sodium.