Brevet FR2558374A1 — publié le 19850726

La présente invention concerne un composé de fructose-1,6-diphosphate ayant un effet de normalisation sur le métabolisme érythrocytaire et de résistance à l'hémolyse dans le sang conservé aux fins de transfusion à des malades ou à ajouter à des circuits de circulation extracorporelle (CEC). On sait expérimentalement que la circulation sanguine extra-corporelle (CEC) nécessaire dans plusieurs opérations de chirurgie cardiaque provoque des dommages mécaniques, chimiques et métaboliques importants aux érythrocytes (Bernstein, E.F. et coll. (1967) Am. J. Surg. 114, 126) qui se manifestent par une hémolyse intravasculaire et une anémie de post-perfusion à cause de la durée moyenne de vie plus faible des globules rouges. Son impact retardé est plus grand que l'effet immédiat et peut être évalué d'après l'hémolyse extravasculaire dépendant strictement de l'hémolyse intravasculaire et totalement absente lorsque cette dernièrene se produit pas Circulation 45 (suppl. 1), 226 et wallace; H. W et Coburn, R.F. (1974) J. Thorac. Cardiovac. Surg. 68, 792). Les altérations de la membrane érythrocytaire causées par la CEC se combinent avec des altérations du métabolisme et des fonctions des globules rouges, en particulier la fonction oxyphorétique (Glynn, M.F. X et Cornhill, F (1975) Can. J. Surg. 18,73) ce qui porte donc atteinte à l'oxygénation des tissus. Le dommage métabolique et hémolytique causé par l'action de la CEC est semblable à celui qui est causé par la conservation du sang, qui en particulier entrave gravement la fonction oxyphorétique (Valtis D.J. et Kennedy A.C., Lancet 266, 119, 1954). Pour ces raisons il est tout à fait évident que l'accroissement de la fragilité et l'altération du métabolisme des érythrocytes causées tant par la CEC que par la conservation du sang se combinent pour aggraver sérieusement l'évolution opératoire et postopératoire des malades qui subissent une CEC et qui simultanément reçoivent une quantité considérable de sang conservé au cours d'une opération de chirurgie cardiaque. L'invention fournit une réponse surprenante au problème de trouver un moyen approprié inhibant radicalement les dommages actuellement causés par la conservation du sang et par la CEC sur la membrane érythrocytaire et le métabolisme, protégeant ainsi les malades contre l'hémolyse intravasculaire qui en découle, l'anémie post-fusionnelle et la détérioration de l'oxyphorèse, en exploitant le sel de sodium du fructose-1,6diphophate comme moyen thérapeutique. Ce produit, qui est bien connu dans d'autres domaines pharmacologiques pour sa fonction dans les cardiopathies, les hépatites, les cirrhoses, les toxinémies, les états diabétiques et dysmétaboliques, est ajouté au sang transfusé directement au malade ou au sang contenu dans le milieu de remplissage des circuits de circulation extra-corporelle. Il est facile de voir l'avantage offert par l'invention, qui permet d'ajouter le composé, constitué dé fructose1,6-diphosphate, directement au sang conservé à transfuser ou à celui qui est contenu dans les circuits de circulation extra-corporelle. De fait ce procédé est beaucoup plus efficace que celui qui se fonde sur l'administration aux malades de composés visan-t à améliorer le métabolisme, et donc la résistance à l'hémolyse des érythrocytes. En fait les dommages hémolytiques et métaboliques qui se combinent pour affecter l'oxyphorèse érythrocytaire se produisent surtout après la conservation du sang et au cours de l'écoulement du sang dans les circuits de circulation extra-corporelle. C'est pourquoi le procédé offert par l'invention vise à concentrer le traitement sur les cellules érythrocytaires endommagées, en empêchant leur dispersion dans l'organisme. On peut obtenir un tel effet thérapeutique direct en ajoutant du fructose-1,6-diphosphate au sang conservé à transfuser ou à celui qui est contenu dans les circuits de circulation extra-corporelle, en normalisant ainsi le métabolisme érythrocytaire et la résistance à l'hémolyse dans le sang ainsi traité. En outre ce procédé permet d'administrer le fructose-1,6diphosphate au momen opportun, par exemple: a) pendant la conservation du sang lorsque la durée de conservation se prolonge au-delà d'une certaine limite; b) à la fin de la conservation du sang; c) lorsque le sang a déjà été ajouté aux circuits de circulation extra-corporelle. Le grand avantage offert par l'invention devient donc manifeste dans tous les cas où du sang conservé doit être transfusé, ou bien où une circulation extra-corporelle (CEC) devient nécessaire, pour obtenir l'inhibition appréciable des pr-incipaux dommages causés par ces techniques qui révèlent de la routine quotidienne en chirurgie cardiaque, en secourisme et en réanimation. Ainsi l'objet spécifique de l'invention est un composé de fructose-l,6-diphosphate sous la forme de son sel de sodium, cette substance étant constituée d'une poudre microcristalline ou d'une solution de cette poudre dans de l'eau bidistillée apyrogène à ajouter au sang conservé à raison de 0,2-2,5 g de sel de sodium de fructose-1,6-diphosphate pour 100 ml de sang ou à ajouter à raison de 2,30 g de sel de sodium de fructose-1,6diphosphate ou au milieu des circuits de circulation extra-corporelle. Cette nouvelle utilisation du sel de sodium du fructose-l,6-diphosphate dans les cas de détérioration du métabolisme érythrocytaire et de fragilité causée par la CEC et le stockage du sang se fonde sur l'existence d'une activité antérieurement inconnue qui a fait pour la première fois l'objet de recherches avec des expériences in vitro faites sur le sang humain effectuées au Foscama à Rome et a été ultérieurement vérifiée cliniquement. Sous ce rapport, on donne les résultats explicatifs d'un certain nombre de tests in vitro et cliniques effectués sur des malades ayant subi une CEC. TESTS IN VITRO 1) Matériaux et procédés On effectue au total 96 prélèvements de 20-30 ml de sang sur 4 volontaires en bonne santé et 11 malades ne souffrant d'aucune pathologie hématique avec des seringues héparinées. Dans certains tests on centrifuge une partie du sang prélevé (3000 tpm pendant 10 minutes) pour séparer le plasma. On intègre les échantillons de sang et de plasma avec le traitement fixé pour chaque test puis on fait incuber les échantillons traités à 37"C dans un thermostat avec un agitateur. Dans- certains tests l'incubation s'effectue à 22"C ou 4 C. On emploie les traitements suivants: 1) FDP = sel de sodium du fructose-1,6-diphosphate en la quantité fixée pour les différents tests. La teneur en sodium est telle que la solution de FDP à 10% dans H20 ait un pH de 5,5; 2) F + P = fructose dans des quantités molaires égales à celles du FDP employé dans le même test + phosphate de sodium (en quantités égales par rapport au sodium du FDP correspondant) (en quantités 2 fois molaires par rapport au traitement au FDP correspondant); 3) SAL = volume de solution physiologique égal à celui dans lequel le traitement au FDP correspondant est dilué. On dilue les traitements au FDP et au F + P jusqu'à un volume égal au lj100 du volume de sang (ou de plasma) pour lequel ils sont conçus avec de l'eau bidistillée apyrogène et/ou une solution physiologique (lorsque ceci est nécessaire pour éviter une hypotonie de la solution). Dans certains tests le volume dans lequel les traitements sont dilués est égal au 1/20, au 1/10, au 1/5 ou à la moitié du volume de sang pour lequel ils sont conçus. Dans plusieurs expériences on amène les solutions contenant les traitements au FDP et au F + P à un pH de 7,4 avec NaOH. Paramètres étudiés Dans des tests préliminaires on vérifie après différents temps d'incubation les variations de ladénosine triphosphate et du 2,3-diphosphoglycérate érythrocytaires ainsi que du fructose-1,6-diphosphate érythrocytaire et plasmatique. Les résultats prélimi naires montrent que dans les conditions expérimentales adoptées l'état métabolique érythrocytaire et la résistance à 1'hémolyse se caractérisent le mieux par des modifications de la teneur en fructose-1,6-diphosphate. C'est pourquoi dans ces expériences on mesure la concentration de fructose-1,6-diphospahte (procédé de: Michal G., Beutler H.O.: In Bergmeyer H.U. dir. publ. "Methods of Enzymatic Analysis" volume 3 page 1314 Academic Press Inc. New York 1974) tant dans le plasma incubé avec FDP que dans le plasma et les érythrocytes séparés par centrifugation du sang incubé avec FDP, F + P, SAL et sans aucun traitement. On mesure également la concentration de phospahtes inorganiques (procédé Martien J.B., Doty O.M. (1949) Anal. Chem. 21,965) et l'hémoglobine (pour calculer le degré d'hémolyse) à la fois dans le plasma incubé avec FDP et dans le-plasma et les érythrocytes séparés par centrifugation du sang incubé avec FDP , F + P, SAL sans aucun traitement. II) RESULTATS On a prouvé que les valeurs du FDP érythrocytaire augmentent considérablement après un prélèvement de sang, même sans aucun traitement, et qu'elles varient non seulement à cause de l'effet des substances avec lesquelles le sang a été traité , mais aussi à cause de l'effet d'autres facteurs, comme: 1) durée et température d'incubation; 2) pH et volume du traitement ajouté au sang à incuber; 3) pourcentage d'hémolyse trouvé dans le sang à incu ber. En outre on a également établi que le pourcentage de FDP dans le plasma montre une diminution progressive avec la durée de l'incubation, ce qui cependant n'est pas seulement du à des facteurs existant dans le plasma (comme l'activité des phosphates plasmatiques), mais aussi à des facteurs liés à la présence dans le plasma d'érythrocytes et d'autres cellules sanguines. A cet effet, on donne les résultats obtenus dans 8 prélèvements de sang. On utilise une fraction de chaque prélèvement pour séparer le plasma. On obtient ainsi 8 échantillons de sang total et 8 échantillons de plasma correspondant. On traite les 16 échantillons avec du FDP pour obtenir une concentration plasmatique de FDP égale à 1,3 mMole par litre. Après incubation de 2, 20 et 80 minutes, on vérifie le FDP présent dans le plasma incubé directement avec du FDP (plasma a) et le FDP présent dans le plasma obtenu en centrifugeant le sang incubé avec du FDP (plasma b).Les 4 tests d'incubation montrent la variation suivante du pourcentage D%FDP du FDP plasmatique: FDP trouvé après: 2 20 40 80 minutes d'incubation plasma a) -5 -13 -20 -35 plasma b) -20 -31 -40 -60 La variation de concentration de FDP dans le plasma a) (D FDP/a exprimee en pg/ml) est en corrélation significative avec le temps (exprimé en minutes): D FDP/a = + 3,22 - 1,74 minutes r = 0,96 p La différence entre la variation de FDP mesurée dans le plasma a et celle mesurée dans le plasma b montre l'effet de la diminution dans le FDP plas matique due aux facteurs cellulaires (surtout érythro ytes). Cette différence (D FDP b-a) ne change pas beaucoup avec le temps: D FDP b-a = -62,7 - 0,5 minutes r = 0,46 n.s. Elle reste virtuellement constante. En outre, ie traitement avec le FDP s'est révélé beaucoup plus efficace que les traitements d'en rayC-Se visant à améliorer le métabolisme érythrocytaire et la résistance à l'hémolyse à tous les instants de l'incubation vérifiés. Sous ce rapport, on donne la concentration de fructose-1,6-diphosphate érythrocytaire trouvée dans 10 échantillons sanguins au bout de 80 minutes d'incubation à 37"C. Ces chiffres montrent l'efficacité du traitement au FDP (administré dans le sang à une dose nécessaire pour obtenir une concentration plasmatique égale à 1,3 mMole par litre) par rapport à l'absence de traitement (n.t.) et au traitement à F + P (administré à des doses équivalant à du FDP). On dilue les traitements avec un volume d'eau distillée égal au centième du volume de sang à faire incuber et on les amène à pH 7,4 avec NaOH. TRAITEMENT Moyennes + Et (pu de FDP/ml d'érythrocytes) n.t. 211 + 6,60 FDP 283 + 9,85 F+P 225 + 7,69 Différences entre traitements: FDP par rapport à F + P = + 58 p FDP par rapport à n.t. = + 72 p F+P par rapport à n.t. = + 14 n.s. La valeur moyenne du FDP érythrocytaire dans les 10 prélèvements de sang est de 10,2 (+ 0,6) pg/ml d'érythrocytes, tandis que dans le même sang maintenu à unt température de 22"C pendant 80 minutes, cette valeur est de 68 (+ 4,46) pg/ml d'érythrocytes. ESSAIS CLINIQUES 1) Matières et procédés On répartit au hasard 35 malades adultes opérés avec circulation sanguine extra-corporelle en deux groupes: 1) groupe expérimental (test G): 17 cas; 2) l'autre groupe est traité avec 15 g de sel de sodium de fructose-l,6-diphosphate (FDP) ajouté directement au circuit de circulation extra-corporelle : 18 cas (G-FDP). Dans tous les cas on utilise un oxygénateur Beutley BOS 10 rempli d'une quantité de Normosol R à pH 7,4 et de sang conservé capable de donner un hématocrite compris entre 25 et 28%. On complète le remplissage des circuits de circulation extra-corporelle avec de l'héparine (25 mg/litre) et du trihydroxyaminométhane (200 ml). Comme il a déjà été dit, on ajoute également 15 g de FDP au C-FDP directement dans l'oxygénateur. On ne trouve aucune différence notable d'âge moyen, de durée de la CEC ou de quantité de sang transfusé au cours de l'opération entre les deux groupes de malades. Avant l'opération la résistance globulaire et l'hemoglobine libre dans le plasma sont dans des limites normales chez tous les malades. Le prélèvement pour 1 | l'évaluation de 19Hb libre est effectue 2 heures avant la fin de la CEC. On vérifie les résultats, exprimés par la doyenne + écart-type, avec un test "t" de Student pour les données ne figurant qu'en un seul exemplaire. 2) Résultats On calcule le degré hémolyse dans les deux groupes de malades en mesurant les valeurs post-opératoires de l'hémoglobine libre dans le plasma (Hb). On mesure également l'hémolyse de la CEC par minute (Hb % minute). Plus la quantité de sang qui circule dans les circuits de circulation extra-corporelle est grande, plus les dommages mécaniques sont importants. On corrige donc les valeurs absolues par litre due 3 sang pompé (Hb%l x 10 ). On calcule également l'hémolyse par litre/ minute (Hb%/l/minute) , c'est-à-dire un coefficient d'intensité de stress indépendant de la durée du stress. Le traitement au FDP est capable de modifier de manière significative tous les coefficients pris en considération, ce qui montre ainsi son efficacité pour améliorer le métabolisme érythrocytaire et la résistance à l'hémolyse dans le sang conservé et ayant passé par une CEC. Enrayage G G - FDP P Hb% 42,26 + 11,97 17,02 + 6,27 0,05 Hb%/min 0,47 + 0,090 0,13 t 0,045 0,01 3 HbXlx103 130,95 + 24,83 42,08 t14,63 0,01 Hb%/l/min 15,96 + 3,09 5,09 + 1,97 0,01 Bien que quelques explications particulières seulement ait été données, il est clair que la protection de l'invention couvre toute addition de fructose1,6-diphosphate et/ou de composés qui en contiennent à du sang conservé à transfusé ou à ajouter à des circuits de circulation extra-corporelle. REVENDICATIONS 1. Composé de fructose-1,6-diphosphate ayant un effet de nnrmalisation sur le métabolisme érythrocytaire et de résistance à l'hémolyse dans le sang conservé. 2. Composé selon la revendication 1, ajouté à du sang conservé à transfuser à des malades. 3. Composé selon la revendication 1, ajouté à des circuits de circulation extra-corporelle. 4. Composé selon les revendications précédentes, à employer à des quantités comprises entre 3 et 4 g/litre de sang. 5. Composé selon les revendications précédentes, ajouté directement à l'oxygénateur de circuits de circulation extra-corporelle en une quantité comprise entre 10 et 30 g, et de façon plus spécifique entre 15 et 20 g.