Brevet FR2556010A1 — publié le 19850607

La présente invention se rapporte a un procédé pour la détermination quantitative de composants physiolo- giques dans des fluides biologiques. Plus particulièrement, elle se rapporte a un procédé pour la dEtermination quantitative de composants physiologiques spécifiques contenus dans des fluides biologiquesen utilisant de la bilirubine oxydase seule ou en supplément. La présente invention se rapporte, en outre, au même procédé que ci-dessus mais en utilisant la laccase. La bilirubine oxydase mentionnée ci-dessus est une nouvelle enzyme. En conséquence, l'enzyme est d'abord expliquée avec quelques détails. La bilirubine (C33H36Nq06) est un pigment présent dans des fluides biologiques tels que le sérum du sang, l'urine, etc. On a indiqué jusqu' présent qu'une enzyme me presente dans le cerveau de rats ou de cochons d'Inde et une enzyme produite par un champignon du genre Agaricus agissaient sur la bilirubine. Cependant, les propriétés enzyrnologiques de ces enzymes n'ont pas encore été expli quées. Durant une recherche pour trouver des microorga- nismes qui produisent une enzyme capable d'agir sur la bi bilirubine, la demanderesse a trouvé que certains microorganismes appartenant aux genres Myrothecium et Coprinus pro duisaient une enzyme qui oxydait la bilirubine. Ces microorganismes du genre Myrothecium comprennent, par exemple, le Myr. verrucaria MT-1 (FERM-P 5918), qui a nouvellement été isolé par la demanderesse, et des cultures types telles que le Myr. verrucaria IFO 6113, IFO 6133, IFO 6351 et IFO 9056; le Myr. cinctum IFO 9950; le Myr. roridum IFO 9531 etc. Ces microorganismes du genre Coprinus comprennent, par exemple, des cultures types telles que le Cop. cinereus IFO 8371, le Cop. lagopides IFO 30120, etc. Pour préparer l'enzyme en utilisant un microorganisme du genre Myrothecium ou Coprinus, le microorganisme est cultivé d'une manière routinière par culture immergée et le filtrat de bouillon de culture est relargué par addition de sulfate d'ammonium. Les précipités ainsi formés sont dissous dans de l'eau désionisée, cette solution étant alors dialysée. La solution a dialyse interne est, après décoloration avec du charbon activé, soumise a la chromatographie sur colonne et ses fractions actives rassemblées sont lyophilisées pour obtenir une préparation pulvérulente. Par analyse par électrophorèse sur disque, on a montré que, d'après la préparation, la protéine enzymatique formait une seule bande qui coincidait, par sa position, avec l'activité d'enzyme. La préparation d'enzyme ainsi obtenue a été reconnue comme étant de la bilirubine oxydase qui oxydait la bilirubine en biliverdine (C33H34N406) par un accepteur d'electrons d'oxygene moléculaire. L'enzyme est aussi caractérisée par le fait qu'il n'y a pas de formation d'eau oxygénée au cours de I'axydation . Les propriétés enzymologiques de la bilirubine oxydase sont décrites ci-dessous, en prevoyant que les autres valeurs qui sont jointes, avec des parenth & ses,représentent celles dé l'enzyme ayant pour origine le genre Coprinus. (1) Specificité de substrat : en plus de la bilirubine, l'enzyme agit sur la chlorophylline et l'hémine, mais n'agit pas sur l'hémoglobine, la chlorophylle et la vitamine B12. (2) Stabilité a la temperature : une activité de plus de 90 % est conservée a 500C,alors que l'activité a 100 8 est perdue a 70 C. t3) Température optima : 400C (30 C) (4) Stabilité de pli : pH 6-10 (pH 5-9) (5) pH optimum : pH 8 (6) Poids moléculaire: approximativement 52.000 (7) Point isoélectrique Q 4,1 (3,8) (8) Effet des ions métalliques ; Inhibée nettement par mais pas affectée par les autres ions métalliques (9) Inhibiteurs : cyanure de potassium, azothydrure de so dium et thiourée. (10) Absorption de lumière visible : une solution d'enzyme a 1 % ne présente pas de maximum d'absorption au voisi nage de 375 nm et de 460 nm (il) Teneur en sucre: approximativement 7,8 % sous foxme de glucose (12) Teneur en cuivre : 1 mole de cuivre par mole d'enzyme. En plus de la bilirubine oxydase comme expliqué ci- dessus, la demanderesse a réalisé, en outre, des études sur un grand nombre d'enzymes classiques. Ainsi, elle a examiné si les enzymes avaient ou non l'aptitude a oxyder la biliru- bine en biliverdine sans formation d'eau oxygénée.Par suite, elle a trouve que la laccase, la tyrosinase et l'ascor- bate oxydase avaient cette aptitude a l'oxydation, et, parmi elles, la laccase a été préférée. Des préparations actuellement disponibles de laccase comprennent celles provenant d'une plante dite laqueur (Rhus verniciflua) et de matières rltivees d'un basidiomycete,par exemple Polypores versi- color IFO 9791 [voir Biochimica et Biophysica Acta, 30, 44 (1959) ; Acta Chemica Scandinavica, 21, 2367 (1967)] ces deux genres de préparations ayant l'aptitude à oxyder la bi lirubine en biliverdine. La présente invention concerne maintenant un procédé pour la détermination quantitative de composants phy siologiques spécifiques contenus dans des fluides biologi- ques en utilisant la bilirubine oxydase ayant été préparée comme ci-dessus ou la laccase classique. Les composants phy siologiques qui peuvent être déterminés par le procédé de la présente invention comprennent le glucose, le cholestérol, des graisses neutres, des acides gras libres, des phospholipides et de l'acide urique.Plus spécifiquement, selon une caractéristique de la présente invention, on prévoit un procédé pour la détermination quantitative de composants physiologiques tels que le glucose, le cholestérol, les graisses neutres, les acides gras libres, les phospholipides de l'acide urique, tous contenus dans les fluides biologiques, en utilisant la bilirubine oxydase ou la laccase, ainsi que les réactifs pour l'emploi dans le procédé classique pour la détermination de ces composants physiologiques. La présente invention sera maintenant expliquée en relation avec les dessins ci-jointsXdans lesquels La figure 1 illustre la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 1, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de glucose et la capacité d'absorption; La figure 2 illustre la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 3, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de cholestérol et la capacité d'absorption; La figure 3 illustre la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 4 qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de trioléine et la capacité d'absorption; ; La figure 4 illustre la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 6, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration d'acide oléique et la capacité d'absorption; et La figure 5 illustre la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 7, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de chlorure de choline et la capacité d'absorption. La bilirubine n'est pas présente de manière inhérente a l'état libre dans les fluides biologiques, mais présente sous la forme de bilirubine dite conjuguée (c'est-à-dire bilirubine combinée à l'acide glucuronique, à l'acide sulfurique, à l'acide chlorhydrique ou analogues) ou de bilirubine dite non conjuguée (c'est-à-dire la bilirubine combinée avec de l'albumine). D'après une interprétation la bilirubine conjuguée augmente dans des cas de lésions des cellules du foie, de jaunisse hépatique , de jaunisse post-hépatique et analogues, alors que la bilirubine non conjuguée augmente dans les cas de mauvais fonctionnement du foie et analogues. La demanderesse a étudié la réactivité de la bilirubine oxydase, ainsi que celle de la laccase avec la bilirubine présente dans les fluides biologiques et a trouvé que ces enzymes, quand on les utilisait seules, pouvaient agir principalement sur la bilirubine conjuguée, alors qu'elles n'avaient pas d'effet ou un faible effet sur la bilirubine non conjuguée. Plus spécifiquement, la bilirubine oxydase, ayant été produite par un microorganisme du genre Myrothecium, n'a pas d'effet sur la bilirubine non conjuguée, alors que la bilirubine oxydase produite par un microorganisme du genre Coprinus et la laccase ont un faible effet sur la bilirubine non conjuguée. D'autre part, la demanderesse a aussi trouvé que, lorsque la réaction des enzymes avec la bilirubine dans un fluide biologique a été réalisée en présence d'au moins un additif choisi parmi des agents tensioactifs, des acides carboxyliques aromatiques, des produits pharmaceutiques à base de sulfamides et des protéases, ces enzymes pouvaient agir non seulement sur la bilirubine conjuguée mais aussi sur la bilirubine non conjuguée, probablement parce que la liaison entre l'albumine et la bilirubine dans la bilirubine non conjuguée aurait été affaiblie. Des exemples spécifiques de l'additif mentionné ci-dessus comprennent des agents tensio-actifs, tels que des esters d'acides gras de saccharose, le cholate de sodium, l'acide taurocholique, le dodécylsulfate de sodium, l'acide p-toluènesulfonique, le chlorure de cétylpyridinium, l'éthoxylate de nonylphénol et un condensat polyéthylène-polyoxypropyl-ène t des acides carboxyliques aromatiques tels que l'acide salicylique et l'acide sulfosalicylique ; des produits pharmaceutiques à base de sulfamides, tels que la sulfanilamide et le sel de sodium d'acétosulfamine; et des protéases telles que le produit dit Pronase P (marque déposée; fabriqué par la Société dite Kaken Chemical Co.).Parmi ces composés, le cholate de sodium, l'acide taurocholique, le dodécylsulfate de sodium, l'acide p-toluènesulionique, l'acide salicylique et l'acide sulfosalicylique sont préférés. Dans le procédé selon la présente invention, on peut encore utiliser des tampons, des stabilisants d'enzyme et analogues, si cela est nécessaire. La quantité d'enzyme pour l'utilisation dans le procédé est telle que sa concentration dans le mélange réactionnel soit égale à 0,003 à 0,40 U/ml pour la bilirubine oxydase ou 0,06 à 7,0 U/ml pour la laccase comme expliqué par l'activité de bilirubine oxydase dont la définition sera donnée ultérieurement. Les quantités d'additifs à utiliser sont comme suit : le dodécylsulfate de sodium est utilisé en quantité telle qu'il donne une concentration de 0,5 à 10 mM dans le mélange réactionnel et le cholate de sodium est utilisé en quantité telle qu'il donne une concentration de 2 à 30 mM dans le mélange réactionnel. L'unité d'activité de bilirubine'oxydase est définie comme suit : cinq mg de cristaux de bilirubine sont dissous dans 250 ml d'une solution tampon tris-HC1 0,2 M (pH 8,4) contenant de l'acide éthylènediaminetétracétique (1 mM). Une partie de 2 ml de cette solution est mélangée avec 0,2 ml d'une solution d'enzyme. Le mélange est soumis a l'incubation à 37 C et sa diminution de capacité d'absorption à 440 nm est alors mesurée. Ainsi, la quantité d'enzyme qui oxyde une micromole de bilirubine par minute est définie comme étant une unité. La présente inventon découle de l'application des découvertes,entionnées ci-aessus, ooncenxnt la réactivité de la bilirubine oxydase ou de la laccase sur la bilinio'i"e présente dans les liquides biologiques, a la détermination quantitative d'autres - ocoOants physiologiques contenus dans des liquides biologiques.Plus précisément, des procédés analytiques pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques en utilisant une enzyme d'oxydation (par exemw ple la glucose oxydase, la cholestérol oxydase, l'uricase, l'acylcoenZyme A oxydase1 la choline oxydase1 la glycérol- 3-phosphate oxydase ou analogues) ont été jusqu'à présent suivis dans le domaine de la chimie clinique. Selon ces procédés, l'eau oxygénée produite à partir d'un composant physiologique intéressant est décomposez et la capacité d'ab sorption du mélange réactionnel est alors mesurée.La valeur mesurée est comparée a la courbe de calibrage qui a été préalablement construite en utilisant le composant physiologique sous forme pure, et, de ce fait, la conoentra- tion du composant physiologique dans le fluide biologique est calculée. Cependant, ces procédés pour la déternination des composants physiologiques ont été soumis a une interférence par les composants physiologiques antres que celui indiqué ci-dessus coexistant dans le fluide biologique.La bilirubine est une de ces substances interférantes pour ces procédés, et, bien que sa concentration dans le sérum sanguin ne soit pas supérieure a 5 mg/dl dans les hommes en bonne santé,elle augmente jusqu'à une valeur s'élevant a 20 mg/ dl dans des états pathologiques. Ainsi, on a proposé jus qu' a présent un certain nombre de procédés pour empécher la bilirubine d'interférer avec la détennînation de composants physiologiques.A titre d'exemples ceci a été effectué en ajoutant au système réactionnel un ferrocyanate, de l'acide ascorbique, un complexe d'EDTA-(acide ethylenediaminetétra- cétique)-fer ou une préparation dite d'enzyme fongique spé- cifique - bilirubine (voir demande de brevet japonais pur bliée n 25840/80; Brevet japonais mis a la disposition du public n 29718/80, n 71398/82 et n 151193/79). Cependant, ces techniques antérieures avaient respectivement leurs propres inconvénients et ne pouvaient pas étre considérées Cc:'- jue étant totalement satisfaisantes. La demanderesse a maintenant trouvé que, dans les procédés classiques pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques en utilisant des enzymes oxydantes comme décrit ci-dessus, l'addition de bilirubine oxydase ou de laccase, ainsi que de l'additif, au système réactionnel amenait la bilirubine conjuguée et non conjuguée coexistant toutes deux dans des fluides biologiques à être totalement oxydée en une substance non nocive, c'est-à-dire la biliverdine, sans formation d'eau oxygénée, et qu'on empêchait ainsi la bilirubine d'interférer avec la détermination de composants physiolo giques. On a cependant vu ainsi que les substances dites productrices de couleur (par exemple la 4-aminoantipyrine, le phénol) contenues dans les réactifs pour l'utilisation dans les procédées classiques pour la détermination de composants physiologiques réagissaient suivant une certaine proportion avec la bilirubine oxydase ou la laccase ajoutée, entratnant un certain inconvénient dans l'étape de mesure de la capacité d'absorption. Pour ces inconvénients, la demanderesse a trouvé, en outre, qu'on pouvait les supprimer en ajoutant -du fluorure de sodium, de la phénanthroline ou de l'hydroxylamine au système réactionnel. Le présent procédé pour la détermination quantitative de composants physiologiques, c'est-à-dire le glucose, le cholestérol, les graisses neutres1 les acides gras libres, les phospholipides et l'acide urique) dans des fluides biologiques est plus spécifiquement expliqué dans ce qui suit d'abord,sensiblement de la même manière que dans le procède classique pour la détermination d'un composant physiologique intéressant, chacune des solutions du composant sous forme pure (cristaux, poudre ou huile), ayant diverses concentrations,est mise a réagir avec les réactifs (comprenant une enzyme d'oxydation) pour l'utilisation dans le procédé classique de la déternination du composant, en présence de bilirubine oxydase ou de laccase avec l'additif ainsi que, si cela est nécessaire, du fluorure de sodium, de la phénén choline ou de l'hydroxylamine Ensuite, la capacité d'ab- sorption de ce mélange réactionnel est mesurée. Les valeurs mesurées sont portées graphiguement en fonction des concen trations correspondantes du composant pour construire une courbe de calibrage représentant la relation entre elles. Ensuite, un échantillon de fluide biologique ayant une concentration inconnue en composant est soumis & BR Parmi les composants physiologiques a évaluer dans le présent procédé,les graisses neutres, les acides gras libres et les phospholipides sont exprimés, comme on le verra dans les exemples suivants, sous forme de trioleine, d'acide oléique et de chlorure de choline, respectivement, comme cela est courant dans ces cas 13. Les composants phy siologiques à évaluer dans le présent procédé sont tous disponibles dans le commerce sous n'importe quelle forme de cristaux, de poudre ou d'huile, et ces préparations cozmner- ciales ont été utilisées pour la construction des courbes de calibrage respectives dans les exemples. Dans les procédés; pour la détermination de oooants physiologiques selon la présente invention, on peut utiliser la bilirubine oxydase ayant pour origine le genre Myrothecium ou ayant pour origine le genre Coprinus. e De manière semblable, la laccase ayant pour cri- gine une plante dite laqueur ou des matieres cultivées d'un basidiomycete peut être utilisée. Le fluorure de sodium, la phénanthroline ou l'hydroxylamine est utilisé en quantité qui donnera une concentration de 0,5 à 10 mM dans le mélange réactionnel. La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants. Cependant, ces exemples ne doivent pas etre interprétés comme limitant le domaine de protection de l'invention. EXEMPLE 1 Détermination de glucose dans le serur sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions aqueuses de O, 100, 200 et 400 mg t de glucose, on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de glucose dans les fluides biologigues, c'est-à-dire la 4-aminoantipyrine (0,4 mM), le phénol (15 mM), la glucose oxydase (17 U/ml) et la peroxydase (0,3 U/ml), ainsi que de la bilirubine oxydase d'origine Myrothe- cium (0,1 U/ml) et du cholate de sodium (14 mM). Les mélan- ges résultants ont été soumis â l'incubation à 37 C pendant 20 minutes et leur capacité d'absorption à 505 nm ont été mesurées.Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des so- lutions de glucose pour obtenir une courbe de calibrage (figure 1). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sera sanguin ayant une concentration inconnue en glucose (et une concentration totale en bilirubine de 12,5 mg %) a été soumis à la réaction de la même manière que celle décrite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel rEsul- tant a été mesurée. En comparant la valeur mesurée a la courbe de calibrage de- la figure 1, la concentration de glucose dans l'échantillon a été calculée a 96,1 mg %. Comme test de contrôle, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase et de cholate de sodium a été supprimée et, de ce fait, la quantité de glucose dans l'échantillon a été estimée a 90,2 mg %.Le mode opratcire a été répété une fois de plus, mais du fluorure de sodium (1 mM) a été utilisé comme réactif suppiémertaire dans ce cas. Bien que la forme de la courbe de calibrage et la quantité estimée de glucose dans l'échantillon soient non modifiées par rapport à celles obtenues dans le présent exemple, la valeur expérimentale du témoin était si faible que cela était convenable pour la mesure des capacités d'absorption des mélanges réactionnels. EXEMPLE 2 Détermination de glucose dans le sérum sanguin Le mode cpératoire de l'exemple 7 a été répété,sauf que de la bilirubine oxydase d'origine Coprinus {3 mM/ml), de la laccase d'origine Polyporus (0,1 mU/ml), ou de la laccase ayant pour origine la plante dite laqueur (1 mU/ml) a été utilisée a la place de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium. Par suite, une courbe de calibrage semblable a celle de la figure 1 a été obtenue dans tous les cas La quantité de glucose dans l'échantillon de sérum sanguin a été estimée a 95,8 mg %, 96,2 mg % et 95,9 mg %, respectivement. EXEMPT 3 Détermination de cholestérol total dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions, dans le dioxane, de 0, 100, 200 et 400 mg % de cholestérol (cristal > , on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,1 M (p 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de cholestérol total dans les fluides biologiques, c'est dire la 4-aminoantipyrine (0,4 mM), le phénol (15 mM), la cholestérol estérase (1 U/ml), la cholestérol oxydase (2 V/ml), la peroxyda se (6,0 U/ml) et le produit dit Triton X-100 [marque dépo- sée ; fabrique par la société dite Wako Pure Chemical industries Ltd. ] (0,1 %), ainsi que de la bilirubine oxyda- se d'origine Myrothecium (0,1 U/ml) du dodécylsulfate de sodium (2,5 mM) et du fluorure de sodium (2,5 mM). Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 C pendant 20 minutes et leurs capacités d'absorption à 505 nm ont été mesurées Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de chtlestérol pour obtenir une courbe de calibrage (figure 2). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration totale en cholestérol inconnue (et une concentration totale en bilirubine de 15,2 mg %) a été soumis à la réaction de la mEme manière que celle indiquée ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant a été mesurée.En comparant la valeur mesurée avec la courbe de calibrage de la figure 2, la concentration totale de cholestérol dans l'échantillon a été calculée a une valeur de 163 mg t. Comme test de contrôle, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de dodécylsulfate de sodium et de fluorure de sodium a été supprimée, et, de ce fait, la quan tité de cholestérol total dans l'échantillon a été estimée à 145 mg t. EXEMPTE 4 Détermination de cholestérol total dans le sérum sanguin Le mode opératoire de l'exemple 3 a été répété, sauf que de la bilirubine oxydase d'origine Coprinus (3 mU/ml) de la laccase d'origine Polyporus (0,1 mU/ml) ou de la laccase ayant pour origine la plante dite laqueur (1 mrJ/ml) a été utilise a la place de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium. Par suite, une courbe de calibrage semblable à celle de la figure 2 a été obtenue dans tous les cas. La quantité totale de cholestérol dans le seruin d'échantillon sanguin a été estimée respectivement a 160 mg %, 163 mg % et 160 mg %. EXEMPLE 5 Détermination de graisses neutres (sous forme de trioléine) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions acétoniques de 0, 100, 200, 300 et 400 mg 8 de trioléine (huile), on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon tris 0,1 M (pH 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de graisses neutres dans des fluides biologiques, c'est-à-dire la 4-aminoantipyrine tO,4 m"), le phénol (15 mM), la lipoproté ine lipase (200 U/ml), la glycérol kinase (0,3 U/ml), la glycérol-3- phosphate oxydase (4 U/ml), la peroxydase (2 U/ml), le triphosphate d'adénosine (0,8 mM) et le produit dit Triton X-100 (0,1 %), ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Coprinus (0,05 U/ml), le cholate de sodium (14 mM) et la phénanthroline (2,5 M). Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 370C pendant 20 minutes et leurs capacités d'absorption à 505 nm ont été mesurées. Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de trioléine pour obtenir une courbe de calibrage (figure 31. Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration inconnue en graisses neutres (et une concentration totale en bilirubine de 14,2 mg %) a été soumis â la réaction de la même manière que celle décrite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant a été mesurée. En comparant la valeur mesurée 3 la courbe de calibrage de la figure 3, la concentration de graisses neutres dans l'échantillon a été calculée à 78,0 mg 8, comme exprimé par la trioléine.Comme test de contrôle, le mode opératoire ci-dessus a été répé- té, sauf que -l'addition de bilirubine oxydase, de cholate de sodium et de phénanthroline a été supprimée, et, de ce fait, la quantité de graisses neutres dans l'échantillon a été estimée a 68,6 mg %. EXEMPLE 6 Détermination d'acides gras libres (sous forme d'acide oléique) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions éthanoliques de 0, 250, 500 et 1000 pEq/1 d'acide oléique (huile), on a ajouté 3 ml d'une solution tampon (pH 6,75) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination des acides gras libres dans des fluides biologiques, c'est-à-dire l'acyicoenzyme A synthétase (0,4 U/ml), 1'acylcoenzyme A oxydase (5 U/ml), la peroxydase (5 U/ml), le triphosphate d'adénosine (4 M), la coenzyme A (0,5 M), le produit dit Color Former MMX [marque déposée, fabriqué par la société dite Kyowa-Medix Co.] (50 M) et le produit dit Triton X-100 (0,1 %), ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium (0,1 U/ml), le cholate de sodium (14 mM) et le fluorure de sodium (2,5 mM).Le mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 C pendant 10 minutes et leurs capacités d'absorption à 660 nm ont été mesurées. Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions d'acide oléique pour obtenir une courbe de calibrage (figure 4). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sér sanguin ayant une concentration inconnue en acides gras libres (et nne concentration totale en bilirubine de 10,8 mg 0) a été soumis à la réaction de la même manière que celle décrite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionoel résultant a été mesurée. En comparant la valeur mesurée à la courbe de calibrage de la figure 5, la concentration l'acides gras libres dans l'échantillon a été calculée à 210 pEq/1, comme exprimé par l'acide oléique. Comme test de sontrôle, le mode opératoire décrit ci-dessus a été répété sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de cholate de @odium et de fluorure de sodium a étê supprimée, et, de ce fait, @a quantité d'acides gras libres dans l'échantillon a été estimée à 182 Eq/1. EXEMPLE 7 Détermination de phospholipides (sous forme de chlorure de choline) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions aqueuses de 0,150, 300, 450,600 et 900 mg % de chlorure de choline (poudre), on a ajout 3 mi d'une solution de tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de phospholipides dans des fluides biologiques, c'est-à-dire la 4-aminoantipyrine (0,4 mM), le phénol (15 mM), la phospholipase D (800 U/ml), la choline oxydase (1 U/ml) et la peroxydase (2 U/ml); ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Coprinus (0,05 U/ml), le dodécylsulfate de sodium (2,5 mM) et la phénanthroline (2,5 mM).Les mélanges résultants ont été soumis a l'incubation a 370C pendant 20 minutes et leurs capacités d'absorption a 500 mn ont été mesurées. Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de ctlorure de choline pour obtenir une courbe de calibrage (figure 5). Alors, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration inconnue en phospholipides (et une concentration totale en bilirubine de 14,1 mg %) a été soumis à la réaction de la même maniere que décrit ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel rXsul- tant a été mesurée. En comparant la valeur mesurée avec la courbe de calibrage de la figure 5, la concentration de phospholipides dans l'échantillon a été calculée a une valeur de 277 mg %,comme exprime par le chlorure de choline. Comme test de controle, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase,, de dodé cylsulfate de sodium et de phénanthroline a été supprimée, et, de ce fait, la quantité de phospholipides dans l'échan- tillon a été estimée à 262 mg t. La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront a l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans aes fluides biologiques dans lequel un composant physiologique, choisi dans le groupe se composant de glucose cholestérol, de grasses neutres, d'acides gras libres, de phospholipides et d'acide urique, tous contenus dans des fluides biologiques est déterminé en utilisant les réactifs comprenant une enzyme oxydante, caractérisé en ce qu'on cabine les étapes suivantes : (a) la réaction de chacune des solutions d'un composant physiologique ayant des concentrations variables avec les réactifs (y compris une enzyme d'oxydation) pour utilisation dans le procédé classique de détermination dudit composant, en présence de la bilirubine oxydase pu de la laccase avec au moins un additif choisi dans le groupe constitué d'agents tensio-actifs, d'acides carboxyliques aromatiques, de produits pharmaceutiques à base de sulfamides, et de protéases, pour construire une courbe de calibrage représentant la relation entre la capacité d'absorption et la concentration des solutions du composant; (b) le fait de soumettre un fluide biologique, ayant une concentration inconnue en composant, à la réaction de la rneme. maniera qu'en (a) ci-dessus et de mesurer la capacité d'absorption du mélange réac- tionnel résultant, et (c) le calcul Se la concentration du composant dans le fluide Diologique, en comparant la valeur mesurée, obtenue dans l'étape (b), a > la courbe de calibra- ge. 2 - Procédé selon la revendication i,caractéri- sE e ce cuve, dars les étapes (a) et (b), un composé choisi dans le groupe se composant de fluorure de sodium, de phénanthroline et d'hydroxylamine est ajouté au système rEac- tionnel. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 , caractérisé en ce que l'enzyme oxydante comprise dans les réactifs pour la détermination du composant est un membre choisi dans le groupe se composant de glucose oxydase, de cholestérol oxydase, d'uricase, d'acylcoenzyme A oxydase, de choline oxydase et de glycérol-3-phosphate oxydase. 4 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 , caractérisé en ce que la bilirubine oxydase est une enzyme produite par un microorganisme du genre Myrothecium ou Coprinus. 5 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 , caractérisé en ce que la laccase est une enzyme provenant d'une plante dite laqueur ou de matières cultivées d'un basidiomycete. 6 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 , caractérisé en ce que la quantité de bilirubine oxydase ou de laccase pour l'utilisation est telle que sa concentration dans le mélange réactionnel soit 0,003 a 0,40 U/ml pour la bilirubine oxydase ou 0,06 à 7,0 mU/ml pour la laccase 7- Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 ,caractérisé en oe que l'additif est au moins un composé choisi dans le groupe se composant de cholate de sodium, d'acide taurocholique, de dodécyisulfatede sodium, d'acide p-toluènesulfonique, d'acide salicyl de sulfosalicylique. ç - Procédé selon la revendication 7 risé en ce que le dodécylsulfate de sodium est u@ quantité qui donnera ma concentration de 0,5 à Ens le mélange réactionnel. 9 - Procédé selon la revendication 7 risé en ce que le cholate de sodium est utilisé @ ntité qui donnera une concentration de 2 à 30 mM)dans @élan ge réactionnel. 10 - Procédé selon la revendication 2, caracté- en ce qu'un composé choisi dans le groupe se composant de fluorure de sodium ce phénanthroline et d'hydroxylamine est utilisé en quantité qui donnera une concentration de 0,5 à 10 mM dans le mélange réactionnel