Brevet FR2550536A1 — publié le 19850215

La présente invention concerne un composé antibactérien et anti-tumoral, son procédé de synthèse et des compositions pharmaceutiques le contenant Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un agent antibiotique et antinéoplastique isolé d'une nouvelle espèce de Streptomyces, et son application au traitement d'infections et à l'inhibition du développement de tumeurs. Les Streptomyces, une famille de l'ordre des Actinomycétales, sont caractérisés par une croissance filamen10 taire ramifiée stable et une formation de mycéliums aériens comportant des spores Les bactéries du type des Streptomyces se trouvent partout dans le sol Dans le sol, les Streptomyces sont des agents de nettoyage largement répandus décomposant les protéines, la cellulose et les matié15 res organiques telles que les cires, le caoutchouc et la paraffine. Jusqu'à il y a environ 40 années, seule une minorité de microbiologistes étudiant les microbes du sol se sont intéressés aux Streptomyces Cependant, en commençant 20 avec l'isolement de l'actinomycine puis de la streptomycine, les Streptomyces provenant d'échantillons de terres de toutes les parties du globe ont été étudiés pour la production d'antibiotiques. Récemment, un nouvel antibiotique a été isolé avec succès d'une nouvelle espèce de Streptomyces, Streptomyces ravidus NRRL 11 300 Cet antibiotique, connu sous le nom de ravidomycine, est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 230 692 délivré le 28 Octobre 1980 La ravidomycine possède non seulement une activité 30 antibactérienne, mais également une activité antitumorale. La présente invention concerne un nouvel agent antibactérien et antitumoral, la désacétyl-ravidomycine, sa production par fermentation, des procédés pour sa récupération et sa concentration à partir de solutions brutes, 35 et des procédés pour sa purification. La structure moléculaire de la désacétyl-ravidomycine est indiquée par la Formule I: 15 OCH 3 H CH CH I Formule I La ravidomycine est décrite dans le brevet des Etats-Unis 20 d'Amérique N 4 230 692 délivré le 28 Octobre 1980 La structure moléculaire de la ravidomycine est représentée par la Formule II: OH OCH 3 25 H-O , Il I I Jl La désacétyl-ravidomycine est formée pendant la culture, dans des conditions réglées, d'une nouvelle espèce de Streptomyces, appelés Streptomyces olivaceo-griseus On l'a désignée par LL-C 23201 Y et elle sera appelée ci-après désacétyl-ravidomycine. La nouvelle espèce Streptomyces olivaceo-griseus produisant un antibiotique est isolée sous forme d'une impureté aérienne à la Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, et elle est con10 servée dans la collection de cultures de la Medical Research Division ci-dessus sous le numéro de culture LL-C 23201 Une culture viable de ce nouveau microorganisme a été déposée le 5 avril 1983 à la Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, U S Depart15 ment of Agriculture, Peoria, Illinois et a été ajoutée à sa collection permanente On lui a attribué la désignation de souche NRRL 15357. La culture NRRL 15357 est caractérisee de façon taxonomique et est identifiée comme une nouvelle espèce de 20 Streptomyces à spores gris connue en tant que Streptomyces olivaceo-griseus Des observations ont été faites sur les caractéristiques physiologiques et morphologiques de la culture selon les procédés décrits en détail par E B Shirling et D Gottlieb, INTERNAT J SYST BACTERIOL, 16: 25 313-340 ( 1966) Les milieux utilisés dans cette étude ont été choisis parmi ceux recommandés par T G Pridham et coll, ANTIBIOTICS ANNUAL, pages 947-953 ( 1956/57) et R E Gordon et coll, INTERNAT J SYST BACTERIOL, 24: 54-63 ( 1974) pour l'étude taxonomique de Actinomycètes et les bactéries 30 du sol comme Streptomyces, respectivement La composition chimique des parois cellulaires de la culture est déterminée en utilisant le procédé de Lechevalier et coll, ADV. APPL MICROBIOL,14: 47-72 ( 1971) Des détails de ces observations sont enregistrées aux Tableaux I-V et une des35 cription générale de la culture est donnée ci-après Les couleurs descriptives soulignées sont selon K L Kelly et D.B Judd, NAT BUR STAND, SPEC PUB Lt 440 ( 1976) et le Inter-Society Color Council associé, National Bureau of Standards, Centroid Color Charts. NRRL 15357 isolé est comparé a une souche de ré5 férence appropriée, Streptomyces ravidus NRRL 11300, une culture qui produit la ravidomycine Voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 4 230 692 Une comparaison de la croissance à 14 jours de chacune de ces cultures sur de la gélose de Hickey-Tresner est indiquée ci-après. Culture Couleur de la Pigments solubles Couleur masse des spores par transparence S.ravidus Gris clair Rouge Brun grisâtre NRRL 11300 rougeâtre S.olivaceo griseus Gris clair Néant Vert noirâtre NRRL 15357 La morphologie grossière des colonies de NRRL 15357 ne ressemble pas à S ravidus et on observe également des différences physiologiques significatives S ravidus réduit les nitrates et utilise l'arabinose, mais n'utilise 20 pas le mannitol ni le saccharose Une étude de la littérature courante des streptomycètes ne révèle pas d'espèces décrites qui ressemblent à NRRL 15357 En conséquence, une nouvelle espèce est désignée, qui doit être connu: en tant que Streptomyces olivaceo-griseus 3 25 Micromorphologie Les spores sont formés en chaines enroulées (Spires) sur des sporophores aériens de NRRL 15357 Les spores sont ovo Ydes (environ 1, 5-1,8 microns sur environ 2,0-2,5 microns), et la surface des spores matures est lisse lorsqu'on l'observe au microscope à balayage électronique. Composition des parois cellulaires Des hydrolysats de cellules entières de NRRL 15357 cultivé contiennent l'isomère LL d'acide diamino35 pimélique, ce qui le classifie dans le groupe de paroi cel- lulaire du Type I de Lechevalier et coll (voir ci-dessus). Ceci est typique de toutes les espèces de Streptomyces. Degré de croissance de NRRL 15357 On observe une bonne croissance sur la plupart 5 des milieux; on observe une croissance modérée surgélose au glycérol et asparagine; une croissance médiocre sur gélose à la farine d'avoine; et pas de croissance sur gélose à la purée de tomate et farine d'avoine. Mycélium aérien et couleur des spores Le mycélium aérien est blanc sur la plupart des milieux mais devient teinté de rose sur gélose aux sels minéraux et amidon; les masses des spores sont de couleur gris clair 264. Pigments solubles Absents sur de nombreux milieux: nuances brunâtres éventuelles. Couleur par transparence Nuances noir grisâtre à noir olive sur tous les milieux. Réactions physiologiques Les nitrates ne sont pas réduits en nitrites en 14 jours; pas de liquéfaction de la gélatine en 14 jours; pas de pigment noir (mélanine) produit sur gélose à peptoneextrait de levurefer ou gélose à la tyrosine; forte pep25 tonisation du lait de tournesol en 14 jours Utilisation des hydrates de carbone comme par le procédé de T G Pridham et D Gottlieb, J BACTERIOL, 56, 107-144 ( 1948), bonne utilisation du glucose; utilisation modérée de fructose et d'inositol; médiocre utilisation de galacto30 se, de mannitol, de saccharose et de xylose; pas d'utilisation d'arabinose, de raffinose, de rhamnose ou de salicine Divers acides organiques sont testés comme seules sources de carbone: les citrate, malate et succinate sont fortement utilisés; le lactate est faiblement utilisé; 35 et les benzoate, mucate et oxalate ne sont pas utilisés. L'adénine, 1 'hypoxanthine et la tyrosine sont hydrolysées en 14 jours, tandis que la guanine et la xanthine ne le sont pas. Caractéristiques de culture Incubation: 14 jours TABLEAU 1 de Streptomyces olivaceo-griseus NRRL-15357 Température: environ 28 C I Milieu Degré de I Mycélium aérien et/ou spores Pigment Couleur par croissance soluble transparence I Gélose de glycérol Croissance cireuse relativement Brunâtre Noir verdâtre et d'asparagine Modéré plate sans mycéliums aériens; croissance brun jaunâtre modérée 77. Gélose de Colonies cireuses dressées avec des Hickey-Tresner Bon centres de plicature; croissance Néant Vert noirâtre végétative vert noirâtre 152; très petits mycéliums aériens ou production de spores: spores gris clair 264. Gélose de sels Modéré à Colonies cireuses légèrement minéraux et bon dressées; olive grisâtre 110 à Néant d'amidon noir olive 114, devenant pulvérulent dans les régions de sporulation; mycéliumsaériens blanc à rose grisâtre clair 28 dans certaines régions; spores gris clair 264, -J Ln U 1 u. cr> Lt' C O % TABLEAU I (suite) Gélose à Coissaoe dresse ridie, mycéliums NZ-AMINE -glucose Bon végétatifs noir verdâtre 157; amidon forte production de mycéliums Brunâtre Noir verdâtre aériens et spores; spores gris clair 264. Gélose a la Croissance plate terne sans mycéliums aériens;'mycéliums farine d'avoine Bon vémétatéiens;mycéliums Néant végétatifs Néantjaune grisâtre 90 à gris olive 112. Gélose à la Colonies dressées ridées avec levure et extrait forte sporulation; mycéliums de malt Bon végétatifs noir olive 114; Brun Noir olive masse de spores 9 rsclair 264. t 1 Ln A CD 0 Oi os TABLEAU II Micronorphologie de Streptomyces olivaceo-griseus NRRL-15357 Milieu Mycélium aérien et/ou structures Forme des Dimension Surface sporifères spores des spores des spores Gélose aux sels Chaines de spores apparaissant Environ 1,5minéraux et sous formes de chaînes enroulées Ovo Tdes 1,8 micron Lisse d'amidon à partir des mycéliums aériens sur environ (Spires) 2,0-2,5 micron t D Ma Ln Ln C> Ln os U 1 TABLEAU III Réaction physiologique de Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 15 20 25 Milieu Période d'incu Degré de Réaction physiologique bation (jours) croissance Gélose à 7 Bon Pas de noircissement peptone et 14 Bon Pas de noircissement fer Gélose à la 7 Bon Pas de noircissement tyrosine (ISP-7) 14 Bon Pigment noir verdâtre Lait de 7 Bon Légère protéolyse tournesol 14 Bon Forte protéolyse Gélatine 7 Léger Pas de protéolyse nutritive 14 Léger Pas de protéolyse Bouillon de 7 Bon Pas de réduction nitrate 14 Bon Pas de réduction Gélose à 7 Bon Forte hydrolyse l'adénine 14 Bon Forte hydrolyse Gélose à la 7 Bon Pas d'hydrolyse guanine 14 Bon Pas d'hydrolyse Gélose à la 7 Bon Pas d'hydrolyse hypoxanthine 14 Bon Z Forte hydrolyse Gélose à la 7 Bon Pas d'hydrolyse tyrosine 14 Bon Faible hydrolyse Gélose à la 7 Bon Pas d'hydrolyse xanthine 14 Bon Pas d'hydrolyse il TABLEAU IV Utilisation de source de carbone par Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 Incubation: 14 Jours Température: environ 28 C 15 20 Source de carbone Utilisation TM 1-Arabinose O I Fructose 2 d-Galactose 1 d-Glucose 3 i-Inositol 2 d-Mannitol 1 d-Raffinose O 1-Rhamnose O Salicine 0 Saccharose 1 Xylose 1 Témoin négatif I * 3 = Bonne utilisation 2 = Utilisation assez bonne 1 = Utilisation médiocre 25 O = Pas d'utilisation TABLEAU V Utilisation d'acides organiques par Streptomyces olivaceoqriseus NRRL 15357 sur gélose de base de Koser modifiée par Gordon (Gélose au citrate de Koser) Incubation: 14 jours Température environ 28 C Source de carbone Utilisation Benzoate Citrate + Lactate Malate + Acide mucique Oxalate I uccinate + 15 : pas d'utilisation +: forte utilisation +: une certaine utilisation. I 1 est évident que, pour la production de cet agent antibactérien et antitumoral, la présente invention n'est pas limitée au microorganisme de type Streptomyces particulier désigné par NRRL 15357,_ou aux microorganismes répondant entièrement aux caractéristiques de croissance et microscopiques ci-dessus, qui sont indiquées à titre illustratif uniquement Elle est destinée à englober 1 'u25 tilisation, pour la production de désacétyl-ravidomycine, de mutants naturels du microorganisme désigné par NRRL 15357, et les mutants produits à partir d'eux par divers moyens; par exemple exposition à un rayonnement X, un rayonnement ultraviolet, l'ypérite azotée, des actinophages, etc. L'agent antibactérien et antitumoral qu'est la désacétyl ravidomycine est actif in vitro contre diverses bactéries Gram-positives et divers néoplasmes. Le spectre antibactérien in vitro de la désacétyl-ravidomycine est déterminé par le procédé de dilution sur plaque de gélose avec de la gélose de Mueller-Hinton et un inoculum de chaque microorganisme d'essai d'environ 104 unites de formation de colonies distribuées par un dispositif de réplication de Steers La concentration inhibitrice minimale est définie comme étant la concentration la plus basse de désactétylravidomycine qui inhibe une croissance visible au bout de 18 heures environ d'in10 cubation à environ 35 OC Les résultats ressortent du Tableau VI. TABLEAU VI Spectre antibactérien de désacétyl-ravidomycine Bactéries Gram-positives 15 20 Staphylococcus aureus, Smith Il" " LL N 14 " " i LL N 27 " i" LL N 45 l" " ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis, Concentration inhibitrice minimale (microgrammes/ml) 0,5 0,5 0,5 i l Streptococcus Streptococcus Streptococcus Streptococcus " Micrococcus lu Bacillus subti Bacillus cereu CMC-83-56 " ATCC 12228 faecalis, ATCC 29212 mutans, ATCC 27352 sanguis G 9 B(a) (enterococcus)sp OSU-75-1 " SM-77-15 lis, ATCC 6633 0,5 S 0,25 S 0,25 s 0,25 c 0,25 s 0,25 0,5 Certains systèmes d'essai et protocoles in vivo ont été mis au point par le National Cancer Institute pour tester des composés afin de déterminer leur intérêt en tant qu'agents antinéoplastiques Ceux-ci ont été in5 diqués dans "Cancer Chemotherapy Reports", Partie III, Vol 3, N 2 ( 1972), Deran et coll Ces protocoles ont établi des tests normalisés de sélection qui sont généralement suivis dans le domaine des tests de recherche d'agents antitumoraux Parmi ces systèmes, la leucémie lymphocy10 taire P 388 et le mélanome mélanotique B 16 sont particulièrement significatifs aux fins de la présente invention. Ces néoplasmes se trouvent chez les souris En général, une bonne activité antitumorale, telle qu'indiquée dans ces protocoles par un pourcentage d'augmentation des temps 15 moyens de survie des animaux traités (T) par rapport aux animaux témoin (C), laisse présager des résultats analogues dans les leucémies humaines Id. La désacétyl-ravidomycine possède la propriété d'inhiber la croissance de tumeurs transplantées chez la 20 souris comme l'indiquent les essais suivants. Essai sur la leucémie lymphocytaire P 388 Les animaux utilisés sont des souris BDF 1, toutes de même sexe, pesant au minimum environ 17 g et avec un écart de plus ou moins 3 g environ Chaque groupe d'es25 sai comporte 5 ou 6 souris La transplantation des tumeurs s'effectue par injection intrapéritonéale d'environ 0,5 ml de fluide ascitique dilué contenant environ O 106 cellules de leucémie lymphocytaire-P 388 Les composés d'essai sont administrés par voie intrapéritonéale à un volume d'en30 viron 0,5 ml dans environ 0,2 % de Klucel dans une solution saline normale les jours 1, 5 et 9 (par rapport à l'inoculation des tumeurs) aux doses indiquées Les souris sont pesées et les animaux survivants sont enregistrés sur une base régulière pendant 30 jours Les résultats de 35 cet essai ressortent du Tableau VII. TABLEAU VII Activité de la désacétvl-ravidomvcine et de la ravidomycine 15 20 25 sur la leucémie P 388 chez la souris Composé Dose Temps moyen T/Cxl OO mg/kg) de survie % (jours) Désacétyl-ravidomycine 25 20,5 174 (Essai N l) 12 19,5 165 6 17,5 148 3 15,5 131 Témoin 11,8 Dichlorhydrate de 1,4-dihydroxy. 5,8-bis C( 2-2hydroxyéthylamino 1,6 18,2 > 154 éthyl) -amino)anthraquinone, désigné ciaprès par Témoin Positif) Désacétyl-Ravidomycine 25 16,5 1:83 (Essai N 2) 6 14 156 1,6 12,5 139 0,4 10,5 117 Témoin 9 Témoin positif 0,4 14 156 Chlorhydrate de 50 21 178 Ravidomycine 25 20,5 174 12 17 144 6 12 102 3 12 102 Témoin 11,8 émoin Positif 1,6 18,2 > 154 TABLEAU VII (suite) Composé Dose Temps moyen T/Cxl O O (mg/kg) de survie % ______ _____ ___ ___(jours) Ravidomycine 400 16 178 17,5 194 14 156 6 10 111 1,6 10 111 Témoin 9 Témoin Positif 0,4 14 156 Essai sur le mélanome mélanotique B 16 Les animaux utilisés sont des souris BDF 1, toutes du même sexe, pesant environ 17 g avec un écart de plus ou moins 3 g environ Chaque groupe d'essai comporte nor15 malement 6 animaux Environ un gramme de tumeur de mélanome mélanotique B 16 est homogénéisé dans environ 10 ml de solution saline équilibrée froide et environ une portion aliquote d'environ 0,5 ml d'homogénéisat est implantée par voie intrapéritonéale dans chacune des souris d'es20 sai Les composés d'essai sont adm Iistrés par voie intrapéritonéale les jours 1 à 9 (par rapport à l'inoculation des tumeurs) à diverses doses Les souris sont pesées et les animaux survivants sont enregistrés sur une base régulière pendant 60 jours Le temps moyen de survie et le 25 rapport du temps de survie des souris traitées(T)/témoin C sont calculés Le composé témoin positif est le même que celui utilisé pour l'essai sur P 388 Les résultats ressortent du Tableau VIII comparativement à la ravidomycine. 15 20 TABLEAU VIII Activité de la désacétyl-ravidomycine et de la ravidomycine contre le mélanome B 16 chez la souris Composé Dose Temps moyen T/Cxl O O de survie (%) (mg/kg) (jours) Désacétyl-Ravidomycine 12 38 184 3 32 155 0,8 29,5 143 0,2 26 126 Témoin 20,7 Témoin Positif 0,8 > 39 > 190 Chlorhydrate de Ravidomycine 12 39 188 3 32 155 0,8 27,5 133 0,2 23,5 114 Témoin 20,7 Témoin positif 0,8 > 39 > 190 Conditions générales de fermentation La culture de Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 peut être effectuée dans Iune grande diversité de milieux de culture liquides Les milieux qui sont uti25 les pour la production de désacétylravidomycine comprennent une source assimilable de carbone telle que l'amidon, le sucre, les mélasses, le glycérol, etc; une source assimilable d'azote telle que les protéines, un hydrolysat de protéines, les polypeptides, les amino-acides, un ex30 trait soluble de ma Ts, etc; et des anions et cations minéraux tels que potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, etc Des éléments sous forme de traces tels que bore, molybdène, cuivre, etc, sont fournis sous forme d'impuretés d'autres constituants des milieux L'aération dans des réservoirs et bouteilles est obtenue en refoulant de l'air stérile à travers ou sur la surface du milieu de fermentation Une agitation supplémentaire dans les réservoirs est fournie par une hélice mécanique Un agent anti-mousse tel que le saindoux peut être ajouté si nécessaire. Processus général pour l'isolement de la désacétyl-ravidomycine La désacétyl-ravidomycine est récupérée de la bouillie de fermentation par extraction à l'aide d'un solvant organique tel que le dichlorométhane, concentration de l'extrait et chromatographie de cet extrait sur une colonne de gel de silice et élution avec un système de solvants approprié. L'invention sera décrite plus en détail en référence aux exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Préparation de l'inoculum On prépare un milieu d'inoculum selon la forma20 tion suivante: Extrait de boeuf environ 0,3 % Tryptose environ 0, 5 % Dextrose environ 1,0 % Extrait de levure envir Sn 0,5 % 25 Eau, q s pour 100 % Ce milieu est ajusté à environ p H 6,8 puis stérilisé On place environ 50 ml de ce milieu dans un ballon de 250 ml et on inocule avec des frottis mycéliens provenant d'une culture inclinée sur gélose de Streptomyces olivaceo-griseus (NRRL 15357) On fait incuber le ballon à environ 32 C sur une secoueuse rotative à environ -200 tours/minute pendant environ 48-72 heures. Exemple 2 Fermentation On prépare un milieu de fermentation ayant la formulation suivante: Glucose environ 1,5 % Glycérol environ 1,5 % Farine de soja environ 1,5 % Carbonate de calcium environ 0,1 % Chlorure de sodium environ 0,3 % Eau, q s pour 100 % Le milieu, ajusté à environ p H 6,7, avant la stérilisation, est partagé en parties aliquotes d'environ ml dans des fioles de Erlenmeyer de 500 ml Les fioles sont ensuite stérilisées et inoculées avec environ 5,0 ml de l'inoculum préparé> comme décrit dans l'Exemple 1 La fermentation est effectuée à environ 28 OC pendant 6 jours au bout desquels la bouillie est récoltée Cette bouillie contient environ 10 microgrammes/ml de désacétyl-ravidomycine. E-xemple 3 Fermentation avec un milieu défini On prépare un milieu de fermentation ayant la formulation suivante: Nitrate de sodium environ 0,1 % Sulfate ferreux heptahydraté environ 0,01 % Sulfate de magnésium heptahydraté environ 0,02 % Carbonate de calcium environ 0,5 % Dextrose environ 1,5 % Acétate de sodium environ 0,25 % Eau, q s pour 100 %' Le milieu, ajusté à environ p H 7,2, avant stérilisation, est réparti en parties aliquotes de 100 ml dans des fioles de Erlenmeyer Les fioles sont stérilisées puis inoculées avec environ 50 ml de l'inoculum décrit dans l'Exemple 1 La fermentation est effectuée à environ 28 C pendant 6 jours au bout desquels la bouillie est récoltée Cette bouillie contient environ 5 microgrammes/ml de désacétylravidomycine. Exemple 4 Isolement de la désacétyl-ravidomycine Un litre de la bouillie récoltée provenant de l'Exemple 2 est extrait deux fois avec des portions d'environ 500 ml de dichlorométhane Les extraits de dichlorométhane sont rassemblés, centrifugés, séchés sur sulfate 10 anhydre de sodium puis évaporés sous vide à environ 35 C. Le résidu est dissous dans environ 2 ml d'un mélange ( 1:1) éthanol:dichlorométhane et appliqué à une colonne de x 400 mm contenant 40 g de gel de silice,garnie du même mélange de solvants La colonne est développée avec le mê15 me mélange de solvants à raison de 2-3 ml environ par minute, en recueillant des fractions à intervalles d'environ 12 minutes Les fractions 15-26 sont combinées et évaporées, ce qui donne environ 8,5 mg de désacétylravidomycine. On peut administrer la désacétyl-ravidomycine ou l'utiliser seule ou en combinaison avec un support pharmaceutiquement acceptable Naturellement, toute matière utilisée comme support de ce type doit être pure et sensiblement non toxique en les quantités utilisées et ne 25 pas perturber l'activité biologique de la désacétyl-ravidomycine. RE V E N D I C A T I O NS 1 Composé répondant à la formule: 10 OH OCH 3 CH. H 2 Procédé de production de désacétyl-ravido20 mycine, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la culture de Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 dans un milieu liquide contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux jusqu'à ce que ce milieu contienne des quantités importantes de désacétyl25 ravidomycine. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture est effectuée à environ 24-32 C pendant environ 4-6 jours. 4 Composition pharmaceutique, caractérisée 30 en ce qu'elle contient un composé ayant la formule suivante: : OH OCH 3 OCH 3 l O 15 H-i il O et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.