Brevet FR2556726A1 — publié le 19850621

Un oligonucléotide est un polymère de faible longueur consistant en une séquence linéaire de 4 nu- cleotides dans un ordre défini. Les sous-unités de nu- cléotides sont réunies par des liaisons phosphodies- ter qui joignent la partie 3' hydroxyle d'un nucleoti- de à la partie 5' hydroxyle du nucléotide suivant. Com- me exemple d'oligonucléotide, on peut citer 5' ApCpGp TpApTpGpGpCp 3'. Les lettres A, C, G et T se rapportent a la nature de la base purine ou pyrimidine fixée à la position 1 du désoxyribose: A, adénine; C, cytosine; G, guanine; T, thymidine. P représente la liaison phos- phodiester. La structure d'une section d'un oligonuclé- otide est représentée sur la figure 1 du dessin annexe. Les oligonucléotides monocaténaires de l'in- vention sont en outre caractérise par une homogénéité de la séquence de sous-unités de nucléosides et ont une masse moléculaire uniforme. Les oligonucléotides synthétiques sont de puissants outils dans la biologie moléculaire moderne et dans la technique de l'ADN recombinant. Ces molécu- les trouvent de nombreuses applications, comprenant a) des modèles pour l'isolement de gènes spécifiques, basé sur la séquence protéinique du produit de gène, b) la commande de la mutagénèse in vitro d'un gène dé- siré, c) des primaires pour la synthèse de l'ADN sur un modèle monocaténaire, d) la synthèse totale de gè- nes, et de nombreuses autres, tel que décrit par Wim. R. Bahl et al., Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 21, 101 (1978). Un effort considérable a donc été orienté vers le développement de procédés chimiques efficaces pour la synthèse de ces oligonucléotides. Une brève revue de ces procédés tels qu'ils sont développés ac- tuellement, est donnée par Crockett G. C., Aldrichi- mica Acta 16 (3), 47-55 (1983). La meilleure méthodo- logie actuellement disponible utilise les dérivés de phosphoramidite des nucléosides avec un mode opératoi- re synthétique en phase solide, Matteucci et al., J. Ai. Chem. Soc. 103, 3185 (1981); et Beaucage et al., M. H. Tet., 22 (20), 1858-1862 (1981). Ces modes opé- ratoires permettent d'obtenir dans des conditions de routine des oligonucléotides ayant jusqu'à 30 bases de longueur et on a obtenu des molécules atteignant même 50 bases. Des équipements qui utilisent cette technologie sont maintenant commercialisés. On trouve dans la littérature d'autres publi- cations sur la formation de dérivés d'ADN. On a dlve- loppé un nucléoside triphosphate modifié dans lequel un groupe biotine est associé à un groupe amino aliphati- que en position 5 de l'uracile, Langer et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 78, 6633-6637 (1981). Ce déri- vé de nucléotide est efficacement incorporé dans un ADN bicaténaire. Une fois dans l'ADN, il peut être relié à un anticorps anti-biotine qui peut alors être utilisé pour des détections par des procédés de fluorescende ou enzymatiques. L'ADN dans lequel ont été incorporés des nucléosides conjugués avec la biotine par le procédé de Langer et al., est fragmenté en plus petites morceaux mono- et bicaténaires dont la séquence de sousunités de nucléosides est hétérogène et la masse moléculaire variable. Draper et Gold, Biochemistry 19, 1774-1781 (1980), ont rapporté l'introduction de groupes amino aliphatiques par une réaction de transamination cataly- sée par un bisulfite, et leur réaction ultérieure avec un marqueur fluorescent. Chez Draper et Gold, le grou- pe amino est directement fixé sur une base de pyrimidi- ne. Le groupe amino en une telle position inhibe les liaisons hydrogène et c'est pourquoi ces matériaux ne sont pas utilisables dans une hybridation et analogues, Chu et ai., Nucleic Acid Res. 11 (18); 6513- 6529 (1983), ont décrit un procédé pour fixer une amine sur le groupe 5'-phosphate terminal d'oligonucléotides ou d'acides nu- cléiques. De nombreuses raisons font désirer un procédé pour fixer de manière covalente d'autres espèces chimi- ques sur des oligonucléotides synthétiques. Des colo- rants fluorescents fixés aux oligonucléotides permet- tent de supprimer les radioisotopes dans la recherche, et dans les procédés diagnostiques et cliniques dans lesquels ils sont utilisés, et améliorent la stabilité et la disponibilité. Tel que décrit dans une autre de- mande de brevet de la demanderesse pour un équipement de séquençage d'ADN (séquenceur), la synthèse d'oligo- nucléotides marqués avec une substance fluorescente permet l'automatisation d'un procédé de séquençage d'ADN. Le développement de techniques et d'une instru- mentation appropriées pour la détection et l'utilisa- tion d'oligonucléotides marqués avec une substance flu- orescente permet l'automatisation d'autres techniques de laboratoire et cliniques généralement compliquées. La fixation de produits chimiques de scission d'ADN tels que ceux décrits par Schults et al., J. Am. Chem. Soc. 104, 6861 (1982); et par Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc., 104, 313 (1982) permet la construction d'enzymes de restriction synthétiques dont la spécifi- té est dirigée par la séquence d'oligonucléotides. La présente invention fournit un procédé géné- ral pour l'introduction d'un ou de groupe(s) amino ali- phatique(s) dans des oligonucléotides synthétiques. Ce groupe amino réagit spécifiquement et facilement avec diverses fonctions amino- réactives et permet ainsi la fixation covalente d'une grande variété d'espèces chi- miques. En résumé, l'invention concerne de nouveaux oligonucléotides monocaténaires sur lesquels a été fixé un groupe amino aliphatique, conjugués à une partie dé- tectable qui est un chromophore, un agent fluorescent, une protéine, une enzyme ou un autre "marqueur". L'invention concerne en outre les nouveaux oligonucléotides dans lesquels est inséré au moins un amino-nucléodide au moyen d'un précurseur de phosphor- amidite. Selon un autre aspect, l'invention concerne la synthèse d'oligonucléotides sur un support en phase solide, dans laquelle on fait réagir un oligonucléoti- de avec un phosphoramidite d'amino-nucléoside protégé. Selon un des aspects spécifiques, l'invention concerne la molécule synthétique de 5'-trifluoroacéta- mido 5'-désoxy 3'-N,N-diisopropyl-phosphoramido thymi- dine (figure 2 du dessin annexé) et son addition sur l'extrémité 5', comme dernière addition dans la syn- thèse de l'oligonucléotide en phase solide. Pendant la scission et la suppression de la protection de l'oligo- nucleotide, le groupe trifluoroacétyle est hydrolysé, laissant un groupe amino aliphatique libre sur l'extré- mité 5' de l'oligonucléotide. Cet oligonucléotide sur lequel a été fixé un groupe amino peut alors réagir avec une grande variété de molécules amino-réactives pour donner le dérivé d'oligonucléotide correspondant. Ceci représente un cas particulier de la technique plus générale d'utilisation d'un nucléoside modifié qui com- porte un groupe amino aliphatique protégé sur la partie base, plutôt que sur le carbone 5'. Une telle molécule permet d'introduire plusieursgroupes amino libres dans 1!oligonucléotide, en n'importe quelle position désirée dans la séquence d'oligonucléotide. L'invention a pour but de fournir de nouveaux réactifs et techniques applicables au séquençage de 1 'ADN. L'invention a également pour but de fournir des perfectionnements dans l'hybridation d'ADN pour la détection de troubles génétiques et pour d'autres buts. D'autres buts et avantages de l'invention ap- paraItront à la lecture de la description qui va suivre. La stratégie utilisée pour introduire des grou- pes amino aliphatiques dans un oligonucléotide consiste a synthétiser un dérivé de 3' phorphoramidite d'un ana- logue de nucléoside contenant un groupe amino aliphati- que protégé. On peut alors faire réagir ce phosphorami- dite avec l'oligonucléotide synthétisé sur -.n support solide, d'une manière semblable à la réaction de nuclé- oside phorphoramidites non-dérivés. Une scission à par- oS tir de la phase solide et une suppression de la pro- tection des moitiés base et du groupe amino aliphati- que permettent d'obtenir le dérivé amino de l'oligo- nucleotide. Exemple I Synthèse de VI. La figure 3 du dessin annexé représente la synthèse du composé VI à partir du composé I commercial (thymidine). Les synthèses des composés II à IV sont décrites par Horowit et al., J. Org. Chem. 27, 3045- 3048 (1962); et Gibbs et Orgel, J. Carbohydrates- Nucleosides and Nucléotides, 3 (5 et 6), 315-334 (1976). Les synthèses des composés V et VI sont décrites ci-après. Exemple II ' trifluoroacétamido 5'-dêsoxythymidine(V): On dissout 1,25 g (5 umoles) de 5'-amino 5'- désoxythymidine dans 25 ml de dimE6thylformamide sec. On y ajoute 1,3 ml (10 mmoles) de S-éthyl-trifluoro- thioacétate (Aldrich). On agite doucement le mélange réactionnel à la température ambiante. La chromatogra- phie en couche mince du mélange réactionnel sur des plaques de gel de silice F-254 dans MeOH/acétone (1:1) montre une seule tache de produit détectée par un rayonnement UV de courte longueur d'onde. Le produit montre une grande mobilité dans ce système de solvant, contrairement au composé de départ VI qui est virtuel- lement immobile. Le mélange réactionnel est évaporé à sec par rotation sous pression réduite, transféré dans une ficie Erlenmeyer contenant 30 mi d'isoPropanol et re- cristallisé à partir d'isopropanol/MeOE bouiliant. Rendement = 1,315 g (3,9 mmoles, rendement 80 %) point de fusion 261 - 262 C (décomposition): ana- lyse, calculé: C 42,7 %, H 4,18 %, N 12,5 %; trouvé: C 42,7 %, H 4,16 %, N 12,4 %. La structure de V est en outre confirmée par RMN de 1H. Exemple III Cet exemple illustre la préparation d'un phosphoramidite d'un dérivé amino-protégé de nucléoside. ' trifluoroacêtamido 5'-désoxy 3 '- N,N-diisopropyl- phosphoramido thymidine (VI): Tous les instruments en verre, seringues et tubes capillaires utilisés dans cette réaction ont été au préalable maintenus pendant une nuit dans une étuve de séchage. Le diméthylformamide (D!4F) a été conservé on sur des tamis moléculaires 4 A (Linde). La diisopropyl- éthylamine (DIPEA) a été distillée à partir d'hydroxyde de potassium, puis d'hydrure de calcium et conservée o sur des tamis moléculaires 4 A. Dans un ballon tricol à fond rond de 50 mil, sec, équipé d'une tige d'agitateur, on introduit 63 mg (0,19 mmole) de composé V. On bouche les trois cols avec des bouchons de caoutchouc pour sérum et on intro- duit des aiguilles dans les bouchons. On pompe l'air du ballon pendant plusieurs heures dans un dessicateur sur CaCl2 sec. On maintient l'intérieur du ballon sous un léger courant d'azote gazeux sec et, au moyen d'une seringue, on ajoute 2 ml de DMF sec. Dans un tube ca- pillaire sec de 100 1, on introduit 60 pl de DIPEA (0,34 mmole). On ajoute 40 1l de chloro-N,N-diisopro- pylaminométhoxyphosphine (American Bionuclear, Emery- ville, CA) (dans un tube capillaire sec de 100 1a). On agite doucement le mélange réactionnel jusqu'à dis- solution totale du composé de départ et on laisse au repos à température ambiante (toujours sous N2). La chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice F-254 dans HCC13: EtOH: Et3N (88:10:2) montre une heure plus tard une simple tache de produit d'une mobilité bien supérieure à celle du matériau de départ V. Des essais de purification de ce produit de la même manière que décrit pour les nucléosides phos- phoramidites (4) sont restés infructeux par suite de la dégradation du produit. On a donc utilisé directe- ment le mélange réactionnel brut pour le couplage sur l'oligonucléotide synthétique sur le support en phase solide. La structure de VI est déduite de la réactivité de ce produit lors de l'addition de l'oligonucléotide, et du produit de réaction attendu d'après les résultats de la littérature. Exemple IV Cet exemple illustre la préparation d'un oli- gonucléotide couplé à l'extrémité 5' avec l'extrémité 3' de la 5'-amino 5'-désoxythymidine au moyen d'une li- aison phosphodiester. Addition de VI à l'extrémité 5' d'un oligonucléotide: On prépare un oligonucléotide synthétique à base protégée ayant la séquence 5' OH-AGC ACT TTT AGA GT 3', couplé avec la phase solide à l'extrémité 3', selon des procédés décrits en détail dans la brochure intitulée "A procedure for the Manual Synthesis of Deoxyoligonucleotides using dimethoxytrityl nucleoside phosphoramidites on a Solid Support", publiée par Ap- plied Biosystems Inc., Foster City, California. Mais, on effectue la réaction de l'oligonucléotide avec VI avec les différences suivantes: a) au lieu des opéra- tions 4.22 et 4.23, on combine 1 ml du mélange réaction- nel fraîchement préparé avec 1 ml de tétrazole 0,5 M dans de l'acêtonitrile et on ajoute dans le récipient de réaction; b) après l'opération 4.33, on effectue deux lavages de 30 secondes avec de l'acétonitrile; et c) on omet la section 5 finale (de manière à permet- tre un dosage des groupes hydroxyle n'ayant pas réagi dans une addition ultérieure). L'efficacité de la réaction de couplage est facilement vérifiée par un couplage ultérieur avec un phosphoramidite "normal" et une scission du groupe diméthoxy trityle pour obtenir une réaction colorée. Si les groupes hydroxyle 5' de l'oligonucléotide ont réagi dans le premier couplage avec VI, ils ne sont plus disponibles pour une réaction dans le couplage ultérieur et ils seront donc libérés sous une forme peu colorée lora d'un traitement au DCA après le second couplage. Dans cet exemple, OD450 = 1,12 (après dilu- tion) pour le groupe DMT libéré à partir de l'oligonu- cleotide avant la réaction avec VI. OD450 = 0,026 (après dilution) (OD = absorbance) Dour le DMT libéré à partir d'un reste G ajouté après la réaction avec VI. 98 % des groupes 5' OH sont donc bloqués dans la réac- tion avec VI. On élimine le groupe protecteur de l'oli- gonucléotide et on scinde de la phase solide par trai- tement avec du thiophénol et NH4OH concentré, d'une ma- nière usuelle, puis on élimine NH40H sous pression ré- duite. On dissout l'oligonucléotide dans 1 ml d'eau distillée. 0D260 = 128 pour cette solution, indiquant que la concentration en ADN est de 4,5 mg/ml. On dilue 50 p1 de cette solution avec de l'eau et on mélange pen- dant 15 minutes avec quelques centaines de mg de résine échangeuse d'ions AG50W-X4 (forme sodium) pour convertir l'ADN du sel d'ammonium en sel de sodium (les ions am- monium interfèrent avec l'essai ultérieur à la ninhy- drine). On élimine la résine par centrifugation et on sèche le produit surnageant dans un évaporateur rotatif Savant. L'essai quantitatif a la ninhydrine (Sarin V.K. et al., Anal. Biochem. 117, 147-157 (1981) donne envi- ron 1 mole de groupe amino par mole d'oligonucléotide (on détermine la concentration molaire en oligonucléo- tide a partir d'un coefficient d'extinction calculé E260 = 1,55 x 105, sur la base de la composition du né- 2556?26 cléotide). L'essai à la ninhydrine sur la même quanti- té molaire d'un oligonucléotide témoin non-conjugué avec VI ne donne pas de réaction amino-positive. Exemple V Conjugaison avec un colorant - A 100 pl de la solution ci-dessus d'amino oligonucléotide, on ajoute 200 pi de H20, 50 pl1 de tamn- pon carbonate/bicarbonate 1 M de pH 9,0 et 25 pl de fluorescéine isothiocyanate (FITC) à 10 mg/ml (MIolecu- lar Probes, Inc., Junction City, Oregon) fraîchement prépare, dans du diméthylsulfoxyde. On laisse le mélan- ge à la température ambiante pendant plusieurs heures, et on purifie par chromatographie sur colonne (1 x 9 cm) de Sephadex G-25 dans H20. On élue le produit jaune dans le volume séparé et on effectue proprement la ré- solution à partir du colorant qui n'a pas réagi. Une réaction témoin avec un oligonucléotide qui n'a pas réa- gi avec VI, ne donne pas de coloration ou ne donne qu'u- ne faible coloration dans le volume séparé de la colon- ne, indiquant que le colorant a bien réagi avec le grou- pe amino ajouté. Le produit de conjugaison colorant-oli- gonucliotide a pour valeurs OD: OD560 = 2,3 et OD495 = 0,54. En partant de E495 = 7 x 104-pour FITC, on obtient une solution 7,7 p!1 de colorant. En partant de E =260 1,55 x 105, la concentration en ADN est de 12,8 el. % environ des molecules d'ADN sont donc marqués avec le colorant. Ceci est une estimation grossière qui ne tient pas compte des changements d'absorption de la flu- orescéine fixée par rapport à la fluorescéine non-fixle, ni de la contamination d'oligonucléotide plus courts et non-réactifs. On soumet une partie aliquote de cet ADN coloré à une électrophorès sur un gel à 20 % de poly- acrylamide et on observe nettement une simle bande co- lorée (et fluorescente) d'une mobilité semblable à cel- le d'un oligonuclôotide de cette longueur. On purifie facilement!'oligonucléotide con- jugué avec le colorant par chromatographie en phase li- quiae à haute performance (HPLC) sur une colonne en C18 à phase inverse (Waters) en utilisant un gradient d'acé- tonitrile: acétate de triéthylammonium 0,1 M de pH 7,0 pour l'élution. Les nouveaux dérivés oligonucléotides sur les- qules ont été fixé un groupe amino décrits ci-dessus trouvent de nombreuses applications. Le groupe amino aliphatique peut réagir facilement et spécifiquement avec un grand nombre de groupes fonctionnels. Ceci si- gnifie que, pratiquement, n'importe quelle molécule dé- sirée peut être fixée sur un oligonucléotide préparé tel que décrit cidessus. Ceci concerne des enzymes, d'autres protéines, des marqueurs fluorescents, des marqueurs bi- oluminescents, des chromophores, et autres. Les oligonu- cléotides ont été utilisés dans un grand nombre de do- maines, souvent conjointement avec des radiomarqueurs. Il devient possible de remplacer les marqueurs radioac- tifs par des molécules modèles non-radioactives. Ceci permet des modes opératoires utilisant des oligonucléo- tides meilleur marché, plus faciles à manipuler et com- patibles avec un ensemble clinique. Bien que les radio- marqueurs soient moins préférés, les nouveaux dérivés aminés d'oligonucléotides peuvent également être marqués radioactivement par exemple avec 125I. Les trois exem- ples particuliers suivants d'utilisation des nouveaux dérivés aminés d'oligonucléotides ne sont donnés qu'à titre d'illustration: 1. Séquençage automatisé d'ADN, 2. Détection de troubles génétiques par hybri- dation d'ADN, 3. Utilisation générale de la fluorescence pour la détection d'une hybridation. *Détection d'anomalies génétique: On peut utiliser des oligonucléotides pour dé- terminer le génotype d'individus. Ceci est effectué sur des échantillons d'ADN obtenus à partir du foetus par amniocentèse. Ces informations ne sont pas valables pour le conseil génétique de couples présentant des risques de multiples troubles génétiques. On peut éga- lement déterminer le génotype d'adultes, permettant un diagnostic et un traitement efficaces à un tout premier stade. Un exemple frappant de cette technologie est la détection d'une anémie due à des cellules malades, Con- nor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 278 (1983). On a synthétisé des oligonucléotides ayant une longueur de 90 paires de bases, l'un complémentaire au gène normal de la A -globine humaine ( A) et l'autre complémentaire au gène (B S) de la -globine d'une cel- lule malade. Ces molécules sont marquées radioactivement et utilisées comme modèles dans une hybridation d'ADN. Dans des conditions d'hybridation appropriées, ces modè- les peuvent être distingués pour distinguer le gène p A de l'allèle 8 S. Ceci permet un diagnostic de la maladie de la cellule malsaine. Plus généralement, comme l'on fait remarquer Connor et al., ce "comportement d'hybri- dation spécifique de l'allèle des oligonucléotides four- nit un procédé général pour le diagnostic de toute mala- die génétique qui implique un point de mutation dans la séquence d'ADN d'un gêne à simple copie". L'invention est directement applicable à cette technique. Les modè- les d'oligonucléotides sont préparés avec un groupe ami- no et marqués avec un marqueur fluorescent. La molécule de modèle fluorescente est indéfiniment stable, contrai- rement à la courte durée de vie des modèles radioactifs et ne demande aucune précaution spéciale de manipulation. Ceci permet une approche bien préférable dans un ensem- ble clinique, qui est le principal domaine dans lequel la technologie est utilisée. Les modèles d'oligonucléotides sont largement utilisés dans Äa recherche et dans les études cliniques. Ils sont corxndiment utilisés pour détecter un fragment d'ADN et une séquence désirée dans une "bibliothèque", une collection de fragements d'ADN clonés dans un plas- mide ou un vecteur de phage, qui contient des séquences englobant le génome entier (ou ARN exprime) d'un orga- nisme. Ils sont également utilises pour une hybridation à un ADN d'une séquence donnée dans une 'tache' d'une digestion de restriction d'un fragment particulier d'ADN. Dans tous ces exemples, et dans bien d'autres également, l'oligonucléotide est marqué avec 32p, normalement à l'extrémité 5', et les molécules sont détectées par au- toradiographie. La présente invention décrit le marquage d'oligonucléotides avec des colorants fluorescents. La fluorescence peut donc être utilisée pour la détection des molécules dans toute technique dans laquelle la ra- dioactivité est normalement utilisée. Ceci présente de nombreux avantages par rapport à la radioactivité, tels que la stabilité des modèles, le colt et la facilité d'emploi et l'élimination. La Fig. 4 du dessin annexe illustre un modèle d'ADN recombinant monocaténaire pour didésoxyséquençage. REVENDICATIONS 1. Composition comprenant des oligonucléotides monocaténaires sur lesquels a été fixé un groupe amino conjugués avec une partie dêtectable. 2. Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce que la partie détectable est fluores- cente. 3. Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce que la partie détectable est absorban- te ou colorée. 4. Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce que la partie détectable est une pro- téine. 5. Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce que la partie détectable est une en- zyme. 6. Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce que la partie détectable est 125I. 7. Oligonucléotide dans lequel a été inséré au moins un nucléoside sur lequel a été fixé un groupe amino, au moyen de précurseur(s) phosphoramidite. 8. Procédé de synthèse d'oligonucléotides sur un support en phase solide, caractérisé en ce qu'on fait réagir l'oligonucléotide avec un phosphoramidite protégé d'un nucléoside sur lequel a été fixé un groupe amino. 9. Oligonucléotide couplé a l'extrémité 5' avec l'extrémité 3' hydroxyle de la 5'-amino 5'-désoxy- thimidine au moyen d'une liaison phosphodiester. 10. Procédé de préparation du composé selon la revendication 9, caractérise en ce qu'on fait réa- gir la 5'-amino 5'-désoxythymidine avec un agent protec- teur pour obtenir la 5'-trifluoroacétamido 5'-désoxythy- midine qu'on fait ensuite réagir avec une phosphine pour obtenir le phosphoramidite correspondant et on fait en- suite réagir le phosphoramidite avec un oligonucléotide a base protégée, fixé sur un support en phase solide. 11. Phosphoramiiites protégés de nucléosides sur lesquels a été fixé urn groupe amino. 12. Phosphoramidite obtenu par réaction de la 5'-trifluoroacétamido 5'désoxythymidine avec une phosphine.