Brevet FR2551865A1 — publié le 19850315

Procédé pour la mesure automatique semi-quantitative de l'intensité de couleur ou de la turbidité d'une solution liquide. Dans une mesure colorimétrique ordinaire, l'intensité de couleur d'une solution liquide, ou absorbance, est déterminée par la formule suivante : A = lOg Lo dans laquelle 10 représente l'intensité de la lumière avant son passage dans la solution et I son intensité après son passage dans cette solution.La turbidité est également exprimée en fonction de l'absorbance. Comme l'absorbance A est, selon la loi de Beer, en général proportionnelle à la concentration de la substance absorbant la lumière, on peut mesurer la concentration d'une substance colorée ou la turbidité avec la même précision que les intensités lumineuses I et lo Ce- pendant dans de nombreux cas, une mesure précise de la couleur ou de la turbidité n'est pas nécessaire, il en est, par suite, de mê- me des intensites lumineuses. Il est suffisant de déterminer si la solution a une couleur ou une turbidité supérieure à un certain seuil ou si la couleur ou la turbidité d'une solution augmente ou diminue d'au moins une certaine valeur.C'est le cas dans de nombreuses mesures basées sur des réactions immunologiques dans lesquelles une turbidité se produit, ou une certaine turbidité diminue, ou encore une certaine couleur apparais ou disparaît e Ces mesures mettent généralement en oeuvre des séries de dilution, par exemple des séries dans lesquelles les concentrations sont propor tioelles aux puissances de deux, et le résultat est représenté par la dilution pour laquelle on peut observer une certaine turbidité ou l'apparition d'une couleur, quand on regarde les solutions devant un fond éclairé de manière uniforme. Pour être précise et reproductible, une telle "méthode de mesure doit être pratiquée par un spécialiste; ellé est, en outre, fatigante pour les yeux, en particulier lorsqu'il y a de nombreux échantillons à examiner. On ressent donc le besoin d'une automatisation du procédé de mesure de manière qu'une augmentation ou une diminution d'une couleur ou d'une turbidité soit mesurée par un dispositif approprié. Comme les valeurs de la couleur ou de la turbidité diffèrent coisidérablement entre des dilutions voisines aux points ot l'on peut observer une couleur ou une turbidité qui apparaît ou dispa it, il est possible de concevoir un procédé photométrique qui détecte ces changements particuliers. Le procédé décrit est basé sur le principe qu'un certain do maine d'absorbance, par exemple O - 1,0, est divisé en dix parties égales, chacune correspondant dans ce cas particulier à 0,100 unités d'absorbance. Cela peut être réalisé soit en construisant un photomètre qui donne l'absorbance mesurée sous la forme d'un nombre à chiffre 10...9) suivant la partie dans laquelle tombe l'absorbance mesurée, ou en programmant un photomètre normal, muni d'un micro-ordinateur, de manière que le programme situe l'absorbance détectée dans la partie correspondante et indique seulement le numéro de cette partie particulière. Le procédé donne la valeur de l'absorbance de chacun des tubes à essai de la série de dilutions utilisées, constituée par exemple de 8 tubes à essais (contenant par exemple des dilutions de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 et 1/256), sous la forme d'un chiffre et forme à partir de ces chiffres un nombre de huit chiffres qui est affiché sur l'écran d'affichage de l'installation ou imprimé sur papier si l'installation est munie d'une imprimante. Le résultat pourrait avoir la forme suivante Echantillon 1 9 9 8 6 3 2 2 2 Echantillon 2 9 9 9 9 7 3 2 2 etc. Dans l'échantillon 1, l'absorbance commence déjà à diminuer pour la troisième dilution (dans l'exemple ci-dessus 1/8) et, dans l'échantillon 2, cette diminution commence avec la cinquième dilution (1/32). Si la réaction doit être considérée comme positive lorsque l'absorbance diminue, les dilutions 1/4 et 1/16 sont les dernières pour lesquelles une réaction ne se produit pas. D'un autre côté, si une augmentation de llabsorbance est le signe d'une réaction positive, les dilutions nO 6 (1/64) et nO 7 (1/128) donneront les valeurs voulues. Ce procédé présente, par rapport aux déterminations faites à l'oeil nu, plusieurs avantages qui augmentent manifestement la précision de cette méthode d'analyse. 1. On peut utiliser un photomètre avec une longueur d'onde correspondant au rayonnement visible, la plus appropriée pour la détection d'une certaine couleur, ce qui rend le procédé sensible. 2. On peut commander la sensibilité en choisissant le domaine d'absorption, donc l'étendue de chacune des parties, convenant au procédé utilisé. 3. La mesure faite avec le photomètre est beaucoup plus pré cise que celle effectuée visuellement. Cela augmente la précision et la reproductibilité du procédé. 4. Comme une mesure effectuée avec un photomètre est plus précise, on peut diminuer le rapport de dilution de la série de dilutions et augmenter ainsi la sensibilité du procédé lui-même. 5. Dans les dispositifs munis d'une imprimante, on peut lire en série les dilutions d'un échantillon. Dans ce cas le nombre des dilutions n'est pas limité par le nombre de canaux du photomètre. L'étendue de la série de dilutions peut ainsi être arbitraire. Les valeurs de l'absorbance des différentes dilutions d'un échantillon sont alors imprimées en colonnes verticales. Les valeurs des seuils sont déterminées comme décrit ci-dessus. On a réalisé un programme, semblable à celui qui vient d'être décrit, pour le photomètre FP-9, construit par la Finnpipette Ky, pour l'évaluation des mesures du titre d'antistreptolysine (AST). Le but de ces mesures est de détecter l'inhibition à l'hémolyse d'érithrocytes ajoutés. Dans l'évaluation visuelle habituelle des résultats on utilise la plus grande dilution pour laquelle il n'y a pas d'hémolyse. Cela est généralement observé en laissant précipiter dans le tube à essais les érythrocytes contenus dans la solution; on détecte l'hémolyse en notant la couleur du liquide. Si le fluide est rougeâtre, il y a alors une hémolyse, s'il est incolore, il n' y a alors pas d'hémolyse du tout. Le procédé, mis au point pour le photomètre FP-9 et le programme établi dans ce but pour un ordinateur Hewlett-Packard font appel, contrairement au procédé usuel, à la mesure de la turbidité crée par les érythrocytes. Cette valeur est affichée à l'aide de l'échelle décrite ci-dessus par les chiffres 0...9. S'il n'y a pas d'hémolyse, la turbudité est alors grande, ce qui donne des valeurs élevées; mais dès qu'une partie des érythrocytes a été hémolysée, la turbidité diminue, ce qui donne des valeurs plus faibles. Comme la turbidité engendre par les érythrocytes donne des valeurs d'absorbance beaucoup plus grandes que l'hémoglobine libérée par les érythrocytes lors de l'hémolyse, la valeur de l'absorbance diminue rapidement lorsque l'hémolyse augmente. Le programme est déterminé de manière que le domaine d'absorbance (dans l'exemple particulier 0...1,0), qui est divisé en dix parties, puisse être librement choisi dans certaines limites. On peut ainsi ajuster le programme à différentes méthodes dans lesquelles les absorbances mesurées ont des valeurs différentes. On doit noter que la mesure de la turbidité causée par les érythrocytes, étant la base du procédé, n'est complètement store qu'avec un photomètre dans lequel la lumière traverse la solution dans une direction verticale. Dans ce cas, la précipitation graduelle des érythrocytes n'entraîne aucune erreur comme cela serait le cas si la lumière traversait la solution dans une direction horizontale. Le procédé ne peut ainsi être mis en oeuvre avec succès qu'avec le photomètre FP-9 de la Société Finnpipette Ky. Bien entendu, si une légère erreur est admissible ou si les conditions sont maintenues constantes à l'exclusion de l'effet de l'erreur, on peut utiliser le procédé décrit avec des dispositifs usuels dans lesquels la lumière a un trajet horizontal. On a comparé le procédé décrit ci-dessus avec un procédé usuel basé sur la détection visuelle de l'hémolyse et on a établi que les deux procédés fournissent des résultats identiques dans plus de 96% des cas. A ce point de vue, il est à signaler que le procédé et le principe de mesure décrits ci-dessus conviennent pour toutes les déterminations dans lesquelles on utilise des séries de dilutions et dans lesquelles une coloration ou une turbidité se produit ou disparate. La plupart des déterminations sérologiques ou immunologiques tombent dans cette catégorie. Il existe, en outre, plusieurs déterminations dans lesquelles une détermination qualitative d'une couleur ou d'une turbidité est suffisante sans qu'il y ait besoin de procéder à des mesures semi-quantitatives en utilisant des sé- ries de dilutions. Le procédé décrit convient également pour de telles mesures quantitatives et il est plus précis puisqu'on peut établir un résultat positif par un certain seuil dont la valeur est constante d'une mesure à l'autre. Parmi ces procédés de mesure se trouvent les procédés enzymeimmunologiques (EIA). Certains d'entre eux, dans lesquels un résultat positif ou négatif doit être établi, sont qualitatifs. Certains autres dans lesquels on mesure l'intensité de la couleur qui apparait, sont quantitatifs. Dans ces cas également, les mesures sont effectuées sur des séries de dilutions.Malgré le fait que le procédé decrit ci-dessus donne la valeur de l'absorbance avec la précision d'un seul chiffre, l'évaluation de l'information reçue de toutes les dilutions de la série donne une précision qui est dix fois plus élevée. I1 est ainsi possible, à l'aide d'un programme approprié, en mettant en oeuvre toutes les valeurs d'une série, de déterminer avec une précision assez grande par exemple la concentration à laquelle la réaction est à la moitié de son maximum. Dans la figure représentée au dessin, on pourrait estimer que cette concentration est comprise entre les dilutions 4 et 5 (peut-être 1/20) pour l'échantillon 1 et entre les dilutions 5 et 6 (peut-être 1/40) pour l'échantillon 2. On doit dire, en outre, que dans de nombreuses mesures colo rimêtriques usuelles, il n'y a aucun intérêt à siefforcer d'obtenir des precisions photométriques trop élevées. Dans de tels cas, un dispositif basé sur le principe décrit ci-dessus et qui pourrait avoir une construction relativement simple et être d'un fai- ble cout, donnerait une précision suffisante. On peut mentionner comme exemple la determination du sucre dans le sang, dans laquel- le une précision ae 1 mM est suffisante dans la plupart des cas Le procédé décrit convient également pour des mesures auto eatiques ou semi-automatiques s'il existe des dispositifs appropries à cette utilisation.Un tel dispositif est le photomètre F-9 de la Société Finnpipette y. On peut également utiliser le procédé décrit avec des dispositifs de mesure manuels à canal unique ou à canaux multiples ou avec des dispositifs comportant dif férents degrés d'automatisation et qui peuvent fonctionner suivant un principe discret ou continu. Bien entendu, dans le procédé décrit, le domaine d'absorbance peut être divisé en parties égales dont le ombre peut varier suivant les exigences de chaque cas particulier. Cependant, le procédé est le plus apte à être utilisé quand le domaine d'absorbance est divisé en deux à dix parties égales. Si le domaine d'absorbance est divise en deux parties, une partie représente alors un résultat positif et l'autre un résultat négatif. Si l'on utilise plus de deux parties1 le ré- sultat contiendra une information quantitative. REVENDICATION Procédé de mesure photométrique semi-quantitative de l'intensité de couleur ou de la turbidité de solutions, de préférence en utilisant un faisceau lumineux de mesure traversant verticalement l'échantillon, dans des déterminations dans lesquelles on utilise des séries de dilutions et dans lesquelles une couleur ou une turbidité apparaît ou disparaît, caractérisé en ce qu'un domaine d'absorbance choisi, commençant à zéro, par exemple le domaine O - 1,0, est divisé en parties égales, de préférence en 2 à 10 parties égales, en ce qu'on effectue une détermination photométrique successive de la partie du domaine d'absorbance dans laquelle tombe chaque échantillon de la série de dilutions, et en ce que les résultats sont donnés pour chaque échantillon de la série de dilutions en utilisant la partie dans laquelle tombe sa valeur d'absorbance, en utilisant par exemple un code à un chiffre (0..-.9) pour les parties.