Brevet FR2558961A1 — publié le 19850802

La présente invention est relative à un procédé pour fractionner des protéines plasmatiques en vue d'obtenir notamment l'alphal-antitrypsine, mais aussi des anticorps spécifiques de groupe sanguin et de l'albumine purifiée. Certaines maladies sont provoquées par des déficiences enzymatiques pouvant être d'origine héréditaire. Dans ce cas, il est nécessaire de fournir aux malades l'enzyme déficiente. Ainsi,une maladie entrainant la destruction à terme des alvéoles pulmonaires a pour origine un déséquilibre, au niveau des voies respiratoires inférieures, entre les élastases et leursinhibiteurs, causé soit par des agents extérieurs, soit par une anomalie héréditaire. Elle peut être combattue par l'injection intraveineuse d'alphal antitrypsine, ainsi que cela est mis en évidence dans l'article intitulé "Opportunities for the specific therapy of destructive lung diseuse" de J.E.GADEK,B.A. KEOGH et R.G. CRYSTAL (Bull. Europ. Physiopath. resp. 1980, 16 (suppl.), 389-396). Le plasma sanguin constituant une source majeure de gamma-globuline-s et d'alphal-antitrypsine, des procédés ont été mis au point par un certain nombre de chercheurs pour les en séparer. Une équipe a ainsi mis au point un procédé chromatographique pour récupérer, d'une part, les gamma-globulines et, d'autre part, de l'albumine pures partir du plasma sanguin humain ( T.C.J GRIBNAU, J.VISSER et R.3.F.NIVARD, Affinity Chromatography and Related Technics ; Elsevier 1982 Amsterdam pp 305-312). Selon ce procédd,on utilise un appareil chromatographique comprenant trois colonnes. Le produit de départ, c' est-à-dire du plasma sanguin, subit un premier fractionnement sur une colonne de Tris Acryl afin d'en récupérer les sels, puis un second sur une colonne de DEA.Eris Acryl M : la fraction non-retenue est constituée par les -lgamma-globu- lines pures.L'éluant est envoyé sur une troisième colonne à Blue-Tris Acryl pour récupérer de l'albumine pure. Un tel procédé permet, certes, de récupérer facilement de l'albumine pure et les gamma-globulines dans leur ensemble qu'il faudra ensuite fractionner pour obtenir les divers corps souhaités. Aussi,un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé permettant de récupérer de l'albumine pure ainsi que des gamma-globulines spécifiques. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de ce type permettant d'obtenir directement l'alphal- antitrypsine. Un but supplémentairedel'invention est de fournir un tel procédé qui est simple et peu coOteux. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparattront par la suite, sont atteints par un procédé pour séparer des protéines plasmatiques en vue d'obtenir notamment l'alphalantitrypsine qui, selon la présente invention, comprend les étapes suivantes a) On équilibre, avec un tampon, du plasma sanguin à un pH faiblement basique par passage dans une première colonne de chromatographie, elle-même équilibrée avec ce tampon b) La fraction collectée au bas de cette première colonne est envoyée dans une deuxième colonne de chromatographie contenant du Blue-Tris-Acryl au bas de laquelle on récupère une fraction protéique c) Cette fraction protéique est envoyée dans une troisième colonne de chromatographie contenant du DEAE Tris-Acryl afin de récupérer de l'alphal-antitrypsine par élution. De préférence, ce procéda comprend également les étapes suivantes d) lavage à l'eau distillée de la deuxième colonne e) élution de cette deuxième colonne pour récupérer de l'albumine pure. Avantageusement, le pH du tampon de l'étape a) est compris entre 8,0 et 8,8 et est de préférence égal à 8,6. Ce tampon est constitué par 0,1 à 0,01 M et de préférence par 0,05 M de Tris-acide chlorhydrique (Tris-HCl) et 0,1 à 0,05 M, de préférence 0,01 M, de chlorure de potassium (kil). I1 est également utilisé pour équilibrer la première colonne. De préférence, la fraction protéique issue de la deuxième colonne est équilibrée avec un tampon constitué de Tris-acide chlorhydrique et de chlorure de potassium, ayant la même composition que le tampon ci-dessus. Avantageusement, on récupère l'alphal- antitrypsine par élution de la troisième colonne avec un tampon constitué de 0,1 à 0,01 M et de préférence 0,05 M de Trisacide chlorhydrique et de 0,1 à 0,01 M, de préférence 0,05 M de chlorure de potassium et ayant un pH compris entre 8,0 et 8,8 et de préférence égal à 8,6 environ. Selon la présente invention, on élue, de la deuxième colonne, l'albumine au moyen d'un tampon comprenant 1,5 M de chlorure de potassium. Ce procédé peut également comprendre une étape de dessalage des différents produits et de lyophilisation. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme du métier d'être mieux à même de réaliser la présente invention. Au cours d'une étape a) on équilibre du plasma sanguin avec un tampon constitué de 0,1 à 0,01 M de Tris-acide chlorhydrique et de 0,1 à 0,05 M de chlorure de potassium, son pH étant compris entre 8,0 et 8,8. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, ce tampon comprend 0,05 M de Tris-acide chlorhydrique et 0,01 M de chlorure de potassium son pH est de 8,6 environ. Ce même tampon sert aussi à équilibrer au préalable la première colonne de chromatographie GF 0.5 (colonne de Tris-Acryl GF commercialisé par la Société Industrie Biologique Française). La fraction collectée au bas de cette première colonne est envoyée, au cours d'une étape b), dans une seconde colonne de chromatographie contenant du Blue-Tris-Acryl au bas de laquelle on récupère une fraction protéique celle-ci comprend les protéines non retenues par le support, à savoir les anti-corps de groupe sanguin et l'alphal- antitrypsine. Puis on fait passer lors d'une étape c) cette fraction protéique, qui a été préalablement équilibrée avec un tampon, qui est identique à celui utilisé lors de l'étape a), constitué de 0,1 à 0,01 M de Tris-acide chlorhydrique et de 0,1 à 0,005 M de chlorure de potassium, dans une troisième colonne de chromatographie contenant du DEAE-Tris-Acryl. Une composition préférée de ce tampon est la suivante : 0,05 M de Tris-acide chlorhydrique et û,01 M de chlorure de potassium. L'alphal-antitrypsine est éluée avec un tampon constitué de 0,1 à 0,01 M de Tris-acide chlorhydrique et de 0,1 à 0,01 M de chlorure de potassium ayant un pH compris entre 8,0 et 8,8. De préférence ce tampon est constitué de 0,05 M de Tris-acide chlorhydrique et 0,05 M de chlorure de potassium : son pH est d'environ 8,6. On obtient donc ainsi l'alphal-antitrypsine et les anti-corps de groupe sanguin. Selon le procédé de l'invention, on lave la deuxième colonne de chromatographie avec de l'eau distillée (étape d) ) ; puis au moyen d'un tampon comprenant 1,5 M de chlorure de potassium, on élue l'albumine retenue (étape e) ). Chaque fraction récupérée -alpha1-antitrypsine, anti-corps de groupe sanguin, albumine pure- peut être dessalée par passage sur une colonne GF 0.5 identique à celle utilisée lors de l'étape a) en présence d'eau distillée. Les produits obtenus peuvent être ensuite lyophilisés. A partir du plasma sanguin, qui constitue le produit de départ pour le présent procédé, l'enrichissement de la fraction anti-corps de groupe sanguin est comprise, en titre, entre 5 et 7 fois le produit de départ. La concentration en ces anti-corps est de 10 g/l environ. La concentration en alphal-antitrypsine est de 1,5 g/l environ : elle peut varier en fonction de la richesse du produit de départ. La concentration en albumine pure à 95 m est, quant à elle, de 30 g/l environ. La concentration de ces différents produits ainsi que leur salinité sont conformes aux normes physiologiques, permettant ainsi leur emploi en thérapeutique humaine. Ainsi qu'il l'a été énoncé plus haut, l'alphalantitrypsine peut être utilisée pour traiter des déficits héréditaires en ce corps tant chez l'enfant que chez l'adulte. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour séparer des protéines plasmatiques en vue d'obtenir notamment ltalphal- antitrypsine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on équilibre, avec un tampon, du plasma sanguin à un pH faiblement basique par passage dans une première colonne de chromatographie, elle-même équilibrée avec ledit tampon b) la fraction collectée au bas de cette première colonne est envoyée dans une seconde colonne de chromatographie contenant du Blue-Tris-Acryl au bas de laquelle on récupère une fraction protéique c) ladite fraction protéique est envoyée dans une troisième colonne de chromatographie contenant du DEAE Tris-Acryl afin de récupérer de l'alphal- antitrypsine par élution. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, les étapes suivantes : d) lavage à l'eau distillée de ladite deuxième colonne e) élution de ladite deuxième colonne pour récupérer de l'albumine pure. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le pH dudit tampon de l'étape a) est compris entre 8,0 et 8,8. 4.- Procédé selon la revendicatin 3, caractérisé en ce que ledit pH est égal à 8,6. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendictions 1 à 4, caractérisé en ce que ledit tampon est constitué de 0,1 à 0,01 M de Tris-acide chlorhydrique et de 0,1 à 0,05 M de chlorure de potassium. 6. - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit tampon est constitué de 0,05 M de Trisacide chlorhydrique et de 0,01 M de chlorure de potassium. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite fraction protéique issue de l'étape b) est équilibrée avec un tampon identique à celui de l'étape a). 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on récupère l'alphal- antitrypsine par élution de ladite troisième colonne avec un tampon constitué de 0,1 à 0,01 M de Tris-acide chlorhydrique et 0,1 à 0,01 M de chlorure de potassium, et ayant un pH compris entre 8,0 et 8,8. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit tampon est constitué de 0,05 M de Tris- acide chlorhydrique et de 0,05 M de chlorure de potassium et a un pH de 8,6. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'on élue de ladite deuxième colonne de l'albumine pure au moyen d'un tampon comprenant 1,5 M de chlorure de potassium. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, une étape de dessalage des produits récupérés.