Brevet FR2551871A1 — publié le 19850315

La présente invention concerne un dispositif d'immersion d'un spécimen dans un liquide de fixation cryogénique en vue de son examen ultérieur au moyen d'un microscope et, en particulier, au moyen d'un microscope électronique. Des liquides réfrigérants à des températures comprises entre -100 C et 190 C sont utilisés dans de nombreuses opérations de préparation de spécimens De tels liquides sont particulièrement utilisés pour la congélation-choc ou la fixation cryogénique de spécimens biologiques ou médicaux 10 en vue de leur examen ultérieur au moyen d'un microscope et, en particulier, au moyen d'un microscope électronique Le but d'une opération de refroidissement de cette nature est d'enlever autant de chaleur que possible du spécimen en un temps aussi court que possible Ce but est particulièrement 15 important dans le cas de spécimens biologiques ou médicaux qui n'ont pas été pré-traités (c'est-à-dire qui n'ont pas été soumis à une fixation préliminaire et/ou un traitement de protection par congélation), car, pour de tels spécimens, la vitesse de refroidissement détermine seule s'il se 20 produit une séparation artificielle des phases plasmatiques riches en eau rendant impossible un examen microscopique ou histochimique significatif La vitesse de refroidissement détermine si le spécimen se congèle en une forme vitreuse reflétant véritablement son état antérieur (la vitrification 25 se produit à des vitesses de refroidissement supérieures à i O,0000 C/s) i Les vitesses de refroidissement élevées de spécimens qui sont nécessaires sont obtenues par des procédés d'injection connus, uniquement dans une zone superficielle 30 extrêmement mince du spécimen o la structure est initialement bien préservée et refroidie au-dessous de -800 C En revanche, par suite de la capacité de conduction thermique médiocre de la glace, les zones qui sont situées plus profondément à l'intérieur du spécimen, en particulier à 35 l'intérieur de spécimens comparativement grands ayant des diamètres supérieurs à 3 mm, restent généralement à des températures qui sont considérablement supérieures à la valeur limite critique de -80 C La stabilisation complète -2 des structures fines et des constituants de faible masse molaire de ces spécimens n'est donc pas affectée Des parties de l'appareil d'injection, généralement métallique, restent de même à une température comparativement élevée. Un refroidissement inapproprié d'un spécimen pourrait être surmonté en utilisant des cuves de réfrigération contenant des colonnes de liquide d'une hauteur suffisante pour permettre le déplacement des spécimens selon une direction généralement verticale sur des distances comprises 10 entre 50 et 100 cm Par un tel moyen, une injection d'un spécimen à une vitesse de 5 à 15 m/s serait prolongée par une période de temps comprise entre 300 millisecondes et 2 s., ce qui suffit, en règle, à la réfrigération et à la stabilisation complète des spécimens Des considérations 15 pratiques, telles que la facilité de manipulation et le fonctionnement en toute sécurité de l'appareil d'injection, ont conduit cependant à limiter la profondeur des cuves de réfrigération à environ 10 cm Pour une vitesse d'injection moyenne, l'injection dans une cuve de réfrigération de 10 cm 20 est terminée seulement après 100 millisecondes Cette période de temps est suffisante pour obtenir la vitrification d'une zone superficielle mince mais insuffisante pour obtenir la congélation complète de spécimens comparativement grands. Le spécimen est nécessairement mis au repos après la fin des opérations d'injection connues, ce qui conduit très rapidement au réchauffement de la zone superficielle du spécimen, après que la zone superficielle ait été refroidie à des températures voisines de la température d'origine de 30 la cuve de réfrigération Le réchauffement du spécimen est provoqué par l'établissement d'un gradient de température dans le liquide réfrigérant Pendant ce réchauffement, il se produit une modification secondaire dans le spécimen congelé quand la valeur limite de -80 C est dépassée, ce changement 35 modifiant la condition antérieusement stable. Si l'on desire couper les spécimens, dans l'état amorphe/vitrifié, à l'aide d'un microtome cryogénique, et en particulier d'un ultra-microtome cryogénique, la température ne doit pas excéder -140 C dans les zones marginales ce qui ne peut pas être garanti si le spécimen reste soudainement au repos 100 ms après le commencement de l'opération d'injection Pour conserver la vitrification reflétant l'état antérieur du spécimen tel qu'obtenu initialement au cours du mouvement d'injection rapide, il est nécessaire d'utiliser des mesures appropriées pour réduire autant que possible l'établissement d'un gradient de température qui 10 est formé comme effet secondaire immédiatement après que le spécimen soit au repos dans le liquide réfrigérant directement voisin de la surface à découvert du spécimen. Un but de la présente invention est d'apporter un dispositif qui empêche ou réduit l'établissement de gra15 dients de température nuisibles après que le spécimen soit au repos dans le liquide réfrigérant, une fois terminée l'opération d'injection Si l'établissement de gradients de température est suffisament réduit, il ne se produit pas de modification artificielle secondaire dans le spécimen, qui 20 autrement réduirait la qualité de l'état de préservation des spécimens et rendrait l'examen ultérieur au microscope d'une valeur discutable. La présente invention apporte un dispositif d'immersion d'un spécimen dans un liquide réfrigérant cryogénique 25 comprenant un injecteur adapté à porter un spécimen, des moyens pour accélérer l'injecteur à-une vitesse prédéterminée selon une direction verticale jusque dans le liquide, et des moyens pour faire tourner l'injecteur avant la fin du mouvement vertical ou au moment o ce mouvement se termine, 30 pour favoriser le transfert thermique à partir du spécimen. L'invention apporte un moyen simple pour garantir que la dissipation de la chaleur provenant du spécimen dans le liquide réfrigérant se poursuit à un degré tel qu'elle empêche la recristallisation de la zone superficielle du 35 spécimen, après qu'il ait été congelé à l'état amorphe ou microcristallin. Dans une première forme d'exécution de l'invention, les moyens rotatifs comprennent un manchon rotatif qui est - 4 disposé concentriquement dans un cylindre correspondant sur l'injecteur, le diamètre interne du manchon étant légèrement supérieur au diamètre externe du cylindre, grâce à quoi la rotation est transmise par friction dans l'air entre le 5 manchon et le cylindre Avec cette forme d'exécution, le mouvement d'injection fait que le cylindre pénètre dans l'espace défini par le manchon Du fait que l'injecteur tourne librement et que l'espace d'air compris entre les surfaces cylindriques se faisant face est convenablement 10 petit, la friction de l'air entre les deux surfaces cylindriques entraîne l'injecteur en rotation. La rotation de l'injecteur et du spécimen dans la cuve de réfrigération provoque l'apparition de courants de convexion dans-le liquide réfrigérant, à la fois voisin de 15 la surface du spécimen et de la cuve de réfrigération dans son ensemble Ainsi, on empêche que des gradients de température se forment dans ces régions du liquide réfrigérant à proximité directe de la surface du spécimen. L'écoulement du liquide réfrigérant dans la cuve de 20 réfrigération provoque une dissipation de la différence de température entre l'injecteur et les parois de la cuve de réfrigération qui sont convenablement faites en métal. Dans une seconde forme d'exécution de l'invention, les moyens rotatifs sont formés d'un disque moteur rotatif, d'un 25 disque mené et de moyens pour mettre le disque moteur en relation d'entraînement avec le disque mené Les formations peuvent être une surface plane ou cÈnique pour donner un accouplement à friction. Dans une troisième forme d'exécution de l'invention, 30 les moyens rotatifs comprennent une buse de projection de gaz et une roue à turbine. De préférence, des éléments générateurs de convexion sont fixés à l'injecteur au voisinage immédiat du spécimen pour créer des courants de convexion dans le liquide 35 réfrigérant lorsque l'injecteur tourne. Dans une autre forme d'exécution de l'invention? le spécimen peut être monté sur un support de spécimen, l'axe du portoir étant écarté de l'axe de l'injecteur de telle sorte que le portoir de spécimen forme des courants de convexion dans le liquide réfrigérant lorsque l'injecteur tourne. De préférence, un dispositif de mesure de temps est 5 disposé pour commander les moyens de rotation de l'injecteur de sorte qu'il tourne pendant une durée prédéterminée. La durée peut être réglée pour convenir à différentes exigences, des réglages étant effectués à l'aide de moyens de réglage convenables qui peuvent être du type analogique 10 ou numérique. L'invention est décrite ci-après en référence aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une coupe longitudinale schématique d'un dispositif d'injection comprenant une cuve de réfrigé15 ration; la figure 2 est une coupe longitudinale schématique d'un système ayant un manchon d'entraînement et une hélice adaptés à provoquer une convexion dans le liquide réfrigérant v les figures 3 a et 3 b sont des coupes longitudinales schématiques de parties de moyens rotatifs pour l'injecteur; et les Figures 4 a et 4 sont des coupes recpectivement longitudinale et transïersale d'un autre moyen adapté à 25 donner un mouvement rotatif à l'injecteur. Le système représenté à la figure 1 montre l'état antérieur de la technique De l'azote liquide 3, servant de cryogène pour refroidir un cylindre métallique 4, est contenu dans un réservoir 2 qui est entouré d'une isolation 30 1 Un milieu refrigérant 5 (par exemple un hydrocarbure halogéné liquéfié ou de l'éthane, du propane, ou de lt'i sopenfane liquéfiés) est contenu dans le cylindre métallique 4 Un manchon 6 empêche un contact direct entre l'azote lictide 3 et le cylindre métallique 4, permettant 35 ainsi au cylindre d'être contre-réchauffé au moyen de la cartouche chauffante 7 à une température minimale qui est prédéterminée par le point de congélation du liquide réfrigérant 5 et qui est mesurée au moyen d'un détecteur de température 8. L'injection d'un spécimen biologique ou médical 10 fixé à un portoir de spécimen Q est effectuée au moyen d'un injecteur 12 qui est guidé verticalement dans une partie 11 et qui exécute un mouvement descendant vertical une fois que l'organe de manoeuvre 13 a été actionné Ce mouvement descendant est engendré au moyen d'un ressort de compression 14 ou par un moyen technique équivalent, tel qu'un ressort à gaz, pour donner une accélération comprise entre 5 et 15 m/s 10 qui s'est révélée empiriquement nécessaire pour déboucher sur une vitrification ou une cryofixation satisfaisante. Après un déplacement sur une longueur "l", l'injecteur 12, avec le specimen 10 qu'il supporte sur le portoir 9, vient au repos Dans des conditions normales, cette 15 condition de repos supprime également le mouvement relatif entre le liquide réfrigérant 5 et la surface à découvert du spécimen 10, ce qui conduit à l'établissement d'un gradient de température dans le liquide réfrigérant directement voisin Par suite de ce gradient de température, la 20 température dans les couches marginales, qui ont été parfaitement vitrifiées, recommence à s'élever en quelques millisecondes, particulièrement dans le cas de spécimens de grand diamètre, c'est-à-dire supérieur à 3 mm. Si la température dans cette zone excède -135 C, la 25 matrice plasmatique aqueuse du spécimen, qui a été initialement vitrifiée en une masse amorphe, se cristallise et, par suite, il n'est plus possible de faire un examen de forte résolution au microscope électronique Si la température s'élève au-dessus de la gamme centrée à -80 C, de petites 30 molécules et des ions commencent à se redistribuer d'euxmêmes et cette redistribution ne permet plus de tirer des conclusions histochimiques sur la base d'une analyse élémentaire (EDX ou LAMMA), ou sur la base d'une autoradiographie. Différentes tentatives ont été faites pour agiter le liquide réfrigérant au moyen d'un dispositif d'agitation, par exemple un agitateur magnétique, comprenant un moteur d'entraînement 15, un aimant 17 fixé à l'axe d'entraînement -7 16 du moteur, et un barreau magnétique 18 reposant sur le fond de la cuve de réfrigération Cependant, cette disposition ne donne naissance qu'à de faibles vitesses d'écoulemnient dans le liquide réfrigérant 5, vitesses qui sont insuffisantes pour l'effet recherché Une cryofixation satisfaisante peut être garantie, par une méthode dans laquelle la longueur " 1 " du canal d'injection est augmentée pour passer de la gamme d'approximativement 10 cm couramment utilisée à une longueur 5 ou 10 fois supérieure Cependant, 10 ce procédé crée des problèmes en ce qui concerne le refroidissement de la haute colonne de milieu réfrigérant et en ce qui concerne le contrôle thermostatique de sa température ainsi qu'au niveau de la conception de l'injecteur Outre ces problèmes, l'augmentation de la longueur du 5 trajet d'injection augmente le coût de fabrication et de fonctionnement des systèmes de ce type et elle complique considérablement leur fonctionnement. Les manques des dispositifs connus pour la cryofixation de spécimens comparativement grands ayant des diamètres 20 supérieurs à 3 mm au noyen d'une immersion rapide dans un liquide réfrigérant peuvent etre éliminés, de manière sirp 1 e au moyen d'un système selon l'invention, ce système 3 tant représenté aux figures 2 à 4 A cette fin, la figure 2 montre que, au lieu du dispositif d'injection représenté à 25 la figure 1, un injecteur 12 ' est disposé dans un élément de guidage 11 ' d'une manière permettant un déplacement vertical, un corps cylindrique 19 étant fixé coaxialement à l'injecteur Le diamètre externe du corps cylindrique 19 est seulement légèrement plus petit que le diamètre interne "d" 30 du manchon 20 au travers duquel passe l'injecteur 12 ', avec un jeu approprié, de telle sorte que le manchon tourne rapidement dans le palier à billes 21, par exemple au moyen d'un moteur électrique 22 et d'une transmission 23,24, le cylindre 19 étant également entraîné par friction dans l'air 35 déplacé entre les surfaces correspondantes des parties 19 et Simultanément, le cylindre 19 et le manchon 20 provoquent un amortissement pneumatique du mouvement d'injection par suite de quoi la fin de ce mouvement n'est pas brusque mais se fait selon une décélération douce. Comme il ressort de la figure 2, une autre caractéristique du système réside dans la fixation de petites ailettes, dans une disposition symétrique, sur l'élément 25 5 qui sert, entre autres, à la fixation du portoir de spécimen 9 à l'injecteur 12 ' Cette caractéristique est particulièrement avantageuse pour l'injection d'un portoir de spécimen 9 symétrique en rotation et de spécimen 10 Simultanément, il est possible, dans le cadre de l'invention, de disposer quatre ailettes 26 de ce type (comparer la coupe longitudinale et la vue en plan), trois ailettes 27 de ce type, deux ailettes 28 de ce type, ou un nombre plus grand d'ailettes de ce type, qui sont disposées dans tous les cas symétriquement autour de la tige d'injection 12 ' sur la pièce 15 intermédiaire 25 ou 25 ' Les ailettes 26,27,28 provoquent la circulation du milieu réfrigérant aux vitesses qui sont utilisées (supérieures à 10 t/s), de sorte qu'une convexion convenable se produit à la surface du spécimen. Comme il ressort des figures 3, une autre caractéris20 tique de l'invention réside dans la fixation à l'injecteur 12 ' d'un cône 29 (figure 3 a) ou d'une plaque 30 (figure 3 b) au lieu d'un cylindre Le cône ou la plaque est pressé contre la surface opposée rotative de la pièce 32 ou 33 par la force du ressort 14, réalisant ainsi une action 25 d'entraînement à la manière d'un disque d'embrayage Si on le désire, des revêtements 34 qui favorisent l'effet d'entraînement, et/ou amortissent élastiquement le mouvement d'injection vertical, peuvent être prévus. Comme il ressort des figures 3, d'autres caractéristi30 ques résident dans l'installation de portoirs de spécimen 9 symétriques en rotation ou de spécimens 10 approximativement symétriques en rotation, sur l'injecteur 12 ' au moyen d'une pièce intermédiaire 35,35 ' de telle sorte que le spécimen prenne une position excentrique par rapport à l'axe 35 longitunal A de l'injecteur 12 ' Lorsque l'injecteur tourne, il provoque le déplacement du spécimen 10 dans le liquide réfrigérant 5 Simultanément, la pièce intermédiaire 35 peut décaler l'axe longitudinal P du portoir de spécimen 9 d'une valeur "r" par rapport à l'axe A de l'injecteur 12 ', cette valeur correspondant au rayon d'excentricité du mouvement. En variante, l'axe P du portoir du spécimen 9 peut être disposé de telle sorte qu'il soit décalé par rapport à l'axe 5 A de l'injecteur 12 ', selon un angle a, donnant ainsi la position excentrique voulue au spécimen 10 Dans les deux cas, le spécimen 10 sur le portoir 9 exécute un mouvement rotatif dans le liquide réfrigérant 5 lorsque l'entraînement 22,23,24 tourne. Finalement, comme il ressort des figures 4, une autre caractéristique de l'invention réside dans une forme selon laquelle la rotation de la tige d'injecteur 12 ' n'est pas effectuée au moyen d'un moteur et d'une transmission, mais au moyen d'une roue à augets, à la manière d'une turbine à 15 gaz La roue à augets 36 est fixée à l'injecteur 12 ' et la turbine est entrainée en rotation au moyen d'un courant de gaz qui pénètre dans la pièce 38 au moyen d'une buse 37, la rotation commençant avant que l'injecteur 12 ' soit amené au repos au moyen d'un amortissement pneumatique créé par deux 20 surfaces cylindriques correspondantes 39,40. Il est possible, dans le cadre de l'invention, d'introduire des modifications par rapport aux formes d'exécution données à titre d'exemples et illustrées aux figures 2 à 4 Il est donc possible de fabriquer le système 25 selon l'invention selon diverses variantes techniquement avantageuses, en ce sens que plusieurs éléments qui ont été décrits individuellement sont intégrés ensemble ou combinés d'une manière qui diffère de celle figurée et décrite dans les formes d'exécution en question Cela s'applique, par 30 exemple, à la transmission ou la production du mouvement rotatif de l'injecteur, qui peut être accompli de diverses manières (par exemple au moyen d'un couplage magnétique, en concevant la tige d'injecteur sous la forme d'une armature de moteur et en installant l'enroulement du moteur sur le 35 carter de l'injecteur; au moyen d'une unité à courant de Foucault, via un accouplement direct à pignons; etc). De même, des éléments qui procurent une convexion efficace du liquide réfrigérant peuvent être produits selon une diversité de conceptions autres que celles illustrées aux exemples par référence aux figures 2 à 4 Il est important que l'injecteur soit soumis à des moyens qui lui permettent d'exécuter un mouvement rotatif vigoureux avant 5 la fin de son mouvement d'injection vertical ou au moment o ce mouvement vertical se termine, mais ce mouvement rotatif peut être produit par tout moyen convenable En outre, l'injection du spécimen 10 peut être effectuée au moyen d'un élément à ressort 14, pneumatiquement, sous l'effet d'un gaz 10 sous pression, ou par des moyens équivalents. REVENDICATIONS 1 Dispositif d'immersion d'un spécimen dans un liquide réfrigérant cryogénique comportant un portoir adapté à supporter un spécimen, et des moyens d'injection dudit portoir à une vitesse prédéterminée vers le bas dans ledit 5 liquide, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens ( 19-24; 29,32; 30,33; 36-39) adaptés à faire tourner le portoir ( 9) tandis qu'il est dans le liquide ( 5). 2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens d'injection comprennent une tige ( 12 ') 10 déplaçable axialement, ledit portoir ( 9) étant monté à une extrémité de ladite tige, lesdits moyens d'entraînement en rotation comprenant un élément rotatif ( 20,32, 33) présentant un alésage adapté à recevoir ladite tige ( 12 ') à laquelle ledit élément ( 20,32,33) est adapté à transférer sa 15 rotation, et des moyens d'entraînement ( 22,23,24) adaptés à faire tourner ledit élément ( 20,32,33). 3 Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit élément ( 20,32,33) et ladite tige ( 12 ') sont accouplés par friction. 4 Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits moyens d'injection comprennent des moyens d'appui ( 14) adaptés à emmagasiner suffisamment d'énergie pour accélérer ladite tige ( 12 ') jusqu'à une vitesse de 5 m/s et des moyens d'actionnement ( 13) pour libérer 25 l'énergie desdits moyens d'appui. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits moyens d'appui ( 14) repoussent ladite tige ( 12 ') et ledit élément rotatif ( 20,32,33) en engagement par friction. 6 Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits moyens d'appui ( 14) comprennent un ressort. 7 Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits moyens d'entraînement comprennent des moyens de mesure du temps. 8 Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'une série d'ailettes de convexion de fluide ( 26-28) sont montées sur ladite tige ( 12 '). 9 Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que que lesdits moyens d'entraînement comprennent une buse de projection de fluide ( 37) et une turbine ( 36) opérationnellement associée avec ladite buse. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledits moyens d'entraînement comprennent un moteur électrique ( 22) opérationnellement réuni à ladite tige ( 12 '). 11 Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit élément rotatif forme un manchon cylindrique creux ( 20) et en ce qu'un cylindre ( 19) est monté sur ladite tige ( 12 '), ledit cylindre ayant une surface extérieure adaptée à coopérer avec la paroi intérieure dudit manchon, 15 grâce à quoi l'air compris entre ledit manchon et ledit cylindre réalise un engagement par friction.