Brevet FR2555605A1 — publié le 19850531

La présente invention concerne un procédé destiné a accroître la résistance des souches bactériennes en particulier Thiobacillus ferrooxidansA AsIII et AsV ainsi que les bactéries ainsi obtenues et leur application notamment dans l'extraction de l'or à partir de gisements arsenopyritiques. Les bactéries Thiobacillus ferrooxidans sont les principaux microorganismes lixiviant les sulfures métalliques pyrites et CuS, par exemple, ainsi que les minerais d'uranium. Ce sont des bactéries autotrpphes lorsqu'elles croissent en présence d'ions Fe++ et hétérotrophes lorsqu'elles croissent sur un milieu organique (par exemple le glucose). Il existe déjà quelques installations industrielles mettant en oeuvre cette technique.de lixiviation bactérienne, essentiellement pour le cuivre (USA) et pour l'uranium (Afrique du Sud, Canada). Les techniques industrielles de lixiviation de l'uranium ont pour but de transformer l'uranium qui est présent dans les minerais sous forme d'oxyde insoluble en sel d'uranium soluble dans l'eau. Le minerai d'uranium contient fréquemment de la pyrite (FeS2) et l'action de Thiobacillus ferrooxidans s'exerce de la façon suivante et UO2SO4 est soluble dans l'eau. L'oxydation de UIV à UVI étant plus rapide en présence des bactéries qu'en présence d'ions Fie3+ seuls, des études récentes suggèrent une action directe de Thiobacillus ferrooxidans sur UIV : En utilisant les capacités oxydantes de cette bactérie, 85 % de l'uranium d'un minerai pauvre (200 à 300 ppm d'uranium) peuvent être lixlvlés en 20 semaines. Si le minerai est plus finement broyé (dimension particulaire : 0,8 à 1,2 mm) en 9 semaines 60 à 70 % de l'uranium peuvent être lixiviés par les bactéries. La réaction (2) est la base du procédé de lixiviation bactérienne de l'uranium. Thiobacillus ferrooxidans peut être utilisé aussi afin d'extraire l'or de gisements arsenopyritiques. La bactérie autotrophe digère l'arsenopyrite et permet l'extraction du métal sans devoir griller le minerai. Malheureusement, la majorité des souches des Thiobacillus ferrooxidans sont très sensibles à la toxicité de l?AsIII et de l'AsV. La présente invention se propose de remédier à cet inconvénient grace à un procédé destiné à accroitre la résistance d'une souche bactérienne à As111et AsV caractérisé en ce qu'on transforme ladite souche résistante ou non à As V et AsV par des plasmides portant les gênes qui codent pour la résistance à AsIIIet l'AsV et les éléments assurant leur expression dans ladite bactérie. Il a en effet été mis en évidence que la résistance à As et AsV était codée par des gênes portés d'origine plasmidiques et que la transformation de souches bactériennes par ces plasmides leur conférait une résistance à AsIIIet AsV lorsqu'elles en étaient dépourvues et augmentait leur III à III V résistance à et As lorsque les souches en cause présentaient déjà une certaine résistance à AsIII et AsV. De façon tout à fait inattendue, on a mis en évidence que la transformation d'une souche de T. ferrooxidans résistait à AsIIIet AsV par tout l'ADN plasmidique de cette même souche augmentait de manière très significative la résistance du transformant par rapport à la souche d'origine. La transformation de la souche bactérienne peut être effectuée par l'une quelconque des techniques connues dans le donaine du génie génétique notamment en fonction de la dimension du ou des plasmide(s) utilisé(s) pour la transformation. Ainsi pour de grand plasmide on utilisera de préférence la technique utilisant les liposomes. Dans ce procédé des protoplastes des bactéries à transformer sont incubés avec des liposomes incorporant lesdits plasmides puis apres incubation la paroi cellulaire est regénérée. Les plasmides utilisables dans ce procédé sont de préférence extraits d'une souche bactérienne en particulier de T. ferrooxidans résistant à As111et AsV, et utilisés tels quels mais ils peuvent également être en partie synthétique. Compte tenu de ce qui a été dit dans l'introduction, on préfèrera bien entendu transformer des souches de Thiobacil et en particulier de T. ferrooxidanSmais comme cela sera démontré il est possible de transformer d'autres bactéries comn Bacillus subtils et de leur conférer une résistance à As et As V Les Thiobacillus ferrooxidans transformes selon la présente invention sont plus particulièrement applicables à la lixiviation des minerais métalliques et en particulier des minerais arsenopyritiques contenant de l'or. Les micro-organismes mis en oeuvre peuvent comporter des profils plasmidiques très différents, ainsi ces micro organismes peuvent comporter par exemple les plasmides décrits dans le brevet français A-8116232 du 25.08.1981. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront des exemples suivants. Souches et conditions de culture La souche de Thiobacillus ferrooxidans Tf80 a été obtenue des Laboratoires de General Mining, Johannesburg, R.S.A. Elle est résistante à l'arsenite de sodium 6 mM. La souche est cultivée dans le milieu liquide défini par Tuovinen (7) auquel est additionné de l'arsenite de sodium 3 mM. Le pH est ajusté à 1,5. 20 litres de culture sont réalisés dans un cylindre de verre, avec agitation et aération. La température est maintenue à 28-300C. Les cellules sont récoltées quand 50 % du Fe++ sont oxydés en Fie+++. Bacillus subtilis est cultivé en milieu liquide LB (6) sauf quand des milieux spéciaux sont nécessaires pour la transformation. Préparation de plaimides à partir de Thiobacillus ferrooxidans Ce protocole mis au point au laboratoire pour Thiobacillus ferrooxidans est adapté à partir de diverses sources (3-6) (TfI29, TfI32, TfI35, TfI-RF-35, Tf 80). Les cellules récoltées par centrifugation sont lavées avec deux fois 50 ml de milieu salin de culture. Le culot, environ 4 ml, est resuspendu dans 40 ml de SET (Saccharose 25 %, Tris 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8). Cette suspension est congelée 90 minutes à - 800C, puis rapidement décongelée et chauffée à 37 C. On additionne alors 8 ml de pronase prédigérée en tampon TE (20 mg/ml de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 1,4 incubé 60 minutes à 370C). Ce mélange incubé 5 minutes à 370C est rapidement refroidi à 0 C, 3,6 ml de dodécylsulfate de sodium à 10 % sont ajoutés. Après avoir laissé séjourner 30 minutes dans un bain de glace, 28 ml d'acétate de potassium 3 M sont ajoutés, le mélange est vigoureusement agite 10 minutes à 00C, puis centrifugé 30 minutes à 19000 g (Rotor GSA Sorvaîl). Le surnageant mesuré est additionné de deux volumes d'éthanol, la solution est conservée 15 minutes à OOC. L'ADN précipité est récolté par centrifugation (5 min. 19000 g). Le culot d'ADN est dissout dans 5 ml de tampon TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) reprécipité avec 10 ml d'éthanol, conservé 5 minutes à température ambiante et récolta par centrifugation 10 minutes à 12000 g (Rotor SS34 Sorvall). Le culot séché, remis en suspension dans du TE est analysé en réalisant un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium (40 h, 44000 rpm, Rotor Beckman 70 TI). La bande extraite et purifiée est analysée par électrophorèse en gel d'agarose 0,6 %, à 30 volts pendant 18 heures dans un tampon TEB (Tris 18 mM, EDTA 0,5 mM, acide borique 18 mM pH 8,25). Préparation et transformation des protoplastes de Bacillus subtilis Bacillus subtilis 168 est utilisé comme souche réceptrice. Les protoplastes sont prépares et transformés selon la proédure de Chang et Cohen (8). Les protoplastes transformés sont incubés 90 minutes à 370C dans le milieu d'expression préconisé, puis 90 minutes à 370C dans le même milieu additioni d'arsenite de sodium 0,2 mM. Les protoplastes ainsi traités sont étalés sur le milieu solide de régénération tel qu'il est décrit par les auteurs mais additionné d'arsenite de sodium 5 mM pour sélectionner les transformés Après 48 à 72 heures d'incubatio à 379C des colonies se développent a la surface. Une transformation témoin est réalisée en transférant à la souche initiale le plasmide pC 194 qui confère à cette dernière la résistance au chloramphénicol. EXEMPLE 1 : Transformation de Bacillus subtilis 1.1. Le profil plasmidique de la souche de ThiobacilluE ferrooxidans Tf 80 obtenu sur gel d'agarose montre plusieurs bandes, mais on ignore laquelle confère la résistance à l'arsenite. Avant de tenter de transférer ce caractère a la souche de Bacillus subtilis 168, choisie pour son aptitude à donner facilement des protoplastes avec une bonne efficacité de transformation par les plasmides (8), on a étudié l'effet de l'arsenite de sodium sur cette souche. 1.2. On étudie la croissance de Bacillus subtilis 168 en présence d'arsenite de sodium. Bacillus subtilis 168 est cultivé une nuit en milieu LB. La culture est diluée 20 fois dans du milieu frais additionné d'arsenite de sodium, aux concentrations indiquées. Les cultures sont incubées à 370C avec agitation et la croissance est suivie en mesurant l'absorbance à 650 nm. Les résultats mesurés sont représentés sur la figure 1. Les courbes de la figure 1 montrent que la croissance de Bacillus subtilis 168 est limitée par l'arsenite de sodium aux concentrations de 1 et 2 mM. Le temps de doublement de 30 minutes qui caractérise la souche dans le milieu considéré à 370C, passe respectivement à 50 minutes et 110 minutes. En présence d'arsenite 5 mM, la croissance est immédiatement et définitivement inhibée. 1.3. On réalise ensuite une tentative d'induction de la résistance à l'arsenite chez Bacillus subtilis 168. Une culture de la nuit est diluée 20 fois dans du milieu frais. Dès que la croissance est exponentielle, de l'arsenite de sodium est additionné a la concentration finale de 0,2 mM (temps 0 de l'expérience). Après une heure d'incubation, la concentration d'arsenite est élevée à 1 mM et une heure plus tard à 5 mM. La croissance à 370C avec aération est déterminée par la mesure de l'absorbance à 650 nm. Les résultats mesurés sont représentés sur la figure 2. Les faibles concentrations sont sans effet significatif immédiat alors que la plus forte concentration d'arsenite a un effet inhibiteur immédiat. On peut conclure que la résistance à l1arsenite chez cette souche n'est pas inductible. Une inductibilité du système de résistance a été mise en évidence chez une souche de Staphylococcus aureus porteuse d'un plasmide déterminant une résistance à l'arsenic (4). A l'issue de ce résultat on a adopté la concentration de 5 mM pour sélectionner les cellules transformées. 1.4. Les protoplaste-s sont préparés et transformés comme cela est décrit. Des boItes avec arsenite de sodium, sur lesquelles on étale des protoplastes non transformés restent stériles, tandis que des protoplastes traités avec 1'ADN plasmidique donnent des colonies sur ce même milieu. Une centaine de colonies a été prélevée sur différentes boites et remise en culture en milieu liquide en présence d'arsenite de sodium 6 mM. Quinze clones ont redonné une relativement bonne croissance, un seul donne régulièrement une culture similaire à la souche non transformée cultivée sans arsenite. Cette souche, nommée Bacillus subtilis 44 a été étudiée plus en détail. On étudie la croissance de la souche transformée de Bacillus subtilis 44 en présence d'arsenite de sodium. La culture de la souche transformée est réalisée en présence d'arsenite de sodium 5 mM pendant une nuit. Cette culture est ensuite diluée 20 fois dans du milieu frais et pour chaque sous culture, la concentration d'arsenite est ajustée comme indiqué sur les courbes. Ces cultures sont incubées à 370C avec agitation et leur évolution est suivie par mesure de l'absorbance à 650 nm. Les courbes de la figure 3 montrent l'évolution de la croissance de cette souche en présence de diverses concentrations d'arsenite de sodium. A l'évidence, les cellules transformées résistent à une concentration de 5 mM d'inhibiteu3 alors que la souche originale est totalement inhibée dans les mêmes conditions. Des concentrations plus élevées d'inhibiteur sont nocives pour la souche 44. EXEMPLE 2 : Transformation de Thiobacillus ferrooxidans Dans la souche Tf35 on a trouvé un seul plasmide de 13.5x106d. On l'a appelé pBP-1. Le plasmide a été séparé par les méthodes décrites précédemment. Ce plasmide a été nick-translaté au 32p, selon les procédés usuels et on a obtenu une radioactivité de 0.44 x 106 cpm/g DNA. Le plasmide radioactif ainsi obtenu a été encapsulé dans des liposomes selon la méthode de Sené et Nicolau (9). 10 pM de phosphatidyléthanolamine (Sigma) et 3 pM de phosphatidylglycérol d'oeuf ont été dissous en chloroforme et évapore sous azote dans un évaporateur rotatif. Les lipides ont été ensuite dissous dans 1,5 ml d'éther éthylique distillé. La solution éthérique a été injectée lentement dans une solution aqueuse de plasmide pBP-1 2 vg/ml en PBS (tampon phosphate - 0,145 M NaCl) à un pH = 7,4 chauffée a 600C. La suspension de liposomes ainsi obtenue a été barbotée à l'azote pendant 15 minutes, afin d'éliminer les restes d'éther presents. Afin de séparer le plasmide encapsulé dans les liposomes du plasmide libre, la suspension a été incubée pendant 30 minutes a 370C avec une solution de DNAse I en présence de 10 SM de MgCl2. La suspension a été ensuite chromatographieesur une colonne de Sepharose 4B et les liposomes contenant le DNA séparés du DNA hydrolysé. 1.1 pg de plasmide ont été encapsulé dans les liposomes (- 9 % de l'ADN présent en solution). Les protoplastes de Tuf 35 ont été préparés par une modification de la méthode de Chang et Cohen (10). Les protoplastes ont été régénérés par une méthode de culture sur gel de silice imprégné des sels minéraux nécessaires à la croissance MgSO4.7H2O 0.4 g/l X2HPO4 0.4 g/l tNH4)2SO4 0.4 g/l Fe2(SO4)3.7H2O 33.3 g/l Cette méthode permet la régénération des protoplastes avant une remise en culture en milieu liquide. Les protoplastes obtenus à partir de Tf35 en phase semi-logarithmique (DO440 = 0.25) cultivé dans le milieu Xelly-Tuovinen (7) ont été incubés pendant 1 heure à 340C avec les liposomes contenant le plasmide pBP-1. Après incubation, la suspension liposomes-protoplaste a été centrifugee a 2600 g pendant 10 minutes. Les protoplastes ont été lavés à plusieurs reprises (3 fois) avec le milieu Kelly-Tuovinen (7) et une aliquote a été prélevée et sa radioactivité comptée. Selon le comptage radioactif, les protoplastes auraient incorporé # 0.8-1.0 % du plasmide encapsulé dans les liposomes. Les protoplastes ont été régénérés en présence de 2.5 mM d'arsenite de sodium. La capacité d'oxydation du Fe+2 de ces bactéries régénérées a été ensuite mesurée et comparée à celle des témoins Tf35 ainsi qu'à deux souches de Thiobacillus ferrooxidans dépourvues de plasmide, Tf29 et Tf32. Les résultats sont présentés dans le Tableau I. Tableau I Arsenite de Na Fie oxydé à F+3 Souche mg/l en 40 heures (%) Tf29 500 0 (sans plasmide) 2500 0 Tf32 500 0 (sans plasmide) 2500 0 Tf35 500 10 2500 4 TfI-35 500 20 2500 17 (enrichie en plas- 0 22 mide par interac tion avec les liposomes) Concentration initiale du Fe+2 = 6.15 g/l Tandis que la capacité d'oxydation du Fe+2 par Tf sans plasmides ou de la souche Tf35 est soit complètement, soit sévèrement inhibée par l'arsenite de Na t la bactérie TfI-35 enrichie en plasmide est beaucoup moins inhibée par les mêmes concentrations d'arsenite de Na Le milieu contenant l'arsenite agit comme milieu sélectif pour les bactéries "enrichies. De cette manière, des bactéries sensibles à l'As111/ AsV - la vaste majorité des souches de Thiobacillus ferrooxidans - en acquérant une résistance élevée à l'arsenite/ arsenate peuvent être utilisées à la lixiviation des gisements contenant des arséno-pyrites; Bibliographie 1. Bosecker, K., Kursten, M., Process Biochemistry, Oct. 1978, 2-4. 2. Mao, M.W.H., Dugan, P.R., Martin, P.A.W., Tuovinen, O.H., FEMS Microbiol. Letters 1980, 8, 121-125. 3. Martin, P.A.W., Dugan, P.R., Tuovinen, O.H., Can. J. Microbiol. 1981, 27, 850-853. 4. Silver, S., Budd, K., Leahy, M., Shaw, W.V., Hammond, D., Novick, R.P., Willsky, G.R., Malamy, M.H., Rosenberg, H., J. Bacteriol. 1981, 146, 983-996. 5. Curtin, M.E., Biotechnology, May 1983, 229-235 6. Maniatis, T, Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular cloning (A laboratory Manual) C.H.S. Laboratory, 1982. 7. Tuovinen, O.H., Kelly, D.P., Arch. Mikrobiol. 1973, 88, 285-298. 8. Chang, S., Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet. 1979, 168, 111-115. 9. Sené, C. and Nicolau, C. in "Liposomes, Drugs and Immuno competent Cell Functions, Academic Press, London 1981, pp. 67-79. 10. Chang, T. and Cohen, P., 1979, Molec. Cell. Genetics 168, 111-115. REVENDICATIONS 1. Procédé destiné à accroitre la résistance à une souche bactérienne à AsIII et AsV caractérisé en ce qu'on III V transforme ladite souche résistante ou non a As et As par des plasmides portant les gênes qui codent pour la résistance a As111 et AsV et les éléments assurant leur expression dans ladite bactérie. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit plasmide est extrait d'une souche bactérienne résistant à AsIII et AsV. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la transformation est effectuee par incubation des protoplastes de la souche à transformer avec des liposomes incorporant lesdits plasmides. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la souche bactérienne est une souche de Thiobacillus. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche de Thiobacillus ferrooxidans. 6. Souche bactérienne résistant à AsIII et As V obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Souche de Thiobacillus ferrooxidans résistant à AsIII et AsV selon la revendication 6. 8. Application des souches selon la revendication 7 à la lixiviation des minerais d'or arsenopyritiques.