Brevet FR2559499A1 — publié le 19850816

La présente invention est relative a un nouveau milieu de culture, solide, à délitement rapide et prêt à l'emploi. Dès 1909, DOERR en Allemagne avait desseché sur plaques de verre des milieux de culture pour pouvoir les conserver. Quelques années plus tard FROST (aux USA) avait effectué une étude systématique de la dessication des milieux de culture. Actuellement, les milieux solides sont préparés d'une manière industrielle. Par exemple, la maison DIFCO de Détroit propose un nombre considérable de milieux souvent très complexes, à l'état dessèché. L'emploi de tels milieux nécessite toutefois de nom- breuses manipulations: il faut peser, stériliser, répar- tir stérilement, dissoudre. Ces différentes opérations sont souvent longues, certaines pouvant être plus ou moins complètes et leur suc- cession source d'erreurs lors de dosages utérieurs. La présente invention s'est par conséquent fixée pour but de pourvoir à un milieu solide, prêt à l'emploi, ne nécessitant aucune pesée, aucune manipula- tion de stérilisation et de répartition, d'une solubi- lisation parfaite, rapide et totale. La présente invention a pour objet un nouveau milieu de culture, solide, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un comprimé contenant tous les composants nécessaires pour effectuer l'analyse souhaitée, ledit comprimé étant pourvu d'un agent de délitement. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'objet de la présente invention, l'agent de délitement est un agent effervescent composé d'une association acide tartrique-bicarbonate de sodium et/ou carbonate de lysine selon les proportions::2 à 1:4. Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisation, la teneur d'agent effervescent est com- prise entre 5 et 50 % et de préférence entre 13 et 22 % du poids total du comprimé. Ce mode de réalisation est très avantageux: dans ces conditions, au moment d'addition de l'eau de dissolution le comprimé flotte et les bulles dégagées qui peuvent être gênantes pour les mesures optiques éventuelles se regroupent par le fait même à la surface. Conformément à l'invention, le comprimé est formé d'une quantité de divers réactifs composant le milieu, quantité juste nécessaire et suffisante pour une opération analytique unitaire, le poids dudit comprimé étant compris entre 0,01 g et 5 g. Selon un mode de réalisation avantageux de l'ob- jet de l'invention, le comprimé peut être rendu stérile. Le comprimé selon l'invention peut contenir si on le désire, un réactif d'inhibition de croissance de tout microorganisme (bactéries, virus, champignon, levure...) à différentes concentrations. Selon un autre mode de réalisation, le comprimé selon l'invention peut contenir des indicateurs de crois- sance (indicateurs d'oxydo-réduction, indicateur de pH, indicateurs colorés de croissance, etc). Selon encore un autre mode de réalisation de l'objet de l'invention, le comprimé peut contenir des réactifs d'identification des caractéristiques métabo- liques (tels que par exemple des substrats enzymatiques mannitol, lactose, etc). Conformément à l'invention, le comprimé contient en outre, un ou des agent(s) lubrifiant(s) qui peut par ailleurs être un stabilisant (du benzoate de sodium et/ou du P.E.G. 6000 par exemple). Les avantages de tels Milieux de culture solides sont remarquables: ils peuvent être tamponnés au pH désiré, optimal pour une croissance donnée: ils sont immédiate- ment, tels quels, prêts à l'emploi, très maniables et d'une solubilité rapide et totale; ils conviennent aussi bien à la croissance de bactéries, virus, champignons, levures, qu'à la crois- sance cellulaire. La présente invention a également pour objet un procécé de préparation du milieu solide conforme à la présente invention, caractérisé en ce que l'on procède à une pluralité de prémélanges successifs de tous les constituants du milieu avant d'effectuer la coapression et, éventuellerment la stérilisation. Selon un mode de réalisation avantageux du pro- cédé objet de la présente invention, un, plusieurs ou la totalité des constituants entrant dans la composition du milieu sont séchés par lyophilisation. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de compositions et de préparation du milieu conforme à la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que les différents exemples de mise en oeuvre qui seront décrits ci-après, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, mais n'en constituant en aucune manière une limitation. EXEMPLE I. Comprimé contenant un antibiotique Tableau I Minima Maxima : Antibiotique 0,0003 10 Milieu de culture lyophilisé :contenant l'antibiotique 0,6 90: Acide tartrique 3,33 15 : Bicarbonate de Sodium 6,67 40 Benzoate de Sodium: 0 10: Milieu de culture 50 95 Les quantités sont indiquées en pourcentage poids sur poids). w w M M ui 0 Ln 0 Ln O ni EXEMPLE II. Composition de comprimés contenant de la Gentamycine à différentes concentrations. TABLEAU Il TABLEAU II GETAYCN 0,0033...._ GENTAMYCINE:0,000333 0,000666 0,001333 0,00266: 0,005333 0,01066 0,02133 : MILIEU DE CULTURE LYOPHILISE::: ::: :: CONTENANT 0,624 1,248 2,496 4,992 9,984 19,968 39,936 :LA GENTACINE: :: _ ::: : : : _ __: ACIDE TARTRIQUE:4333 433 4,333 4,3334,333 4,333 4,333 4,333 4,333 :: À .:: ::: BICARBONATE DE SODIUM: 10,666:10,666 10,666: 10,666 10,666 10,666: 10,666 BENZOATE DE SODIUM: 5,000 5,000 5,000 5,000 5,000 5,000 5,000 MILIEU DE CULTURE 79,386 78,773 77,493 75,000 70,000 60,000 40,000 : À: À À: - À: Les quantités sont indiquées en pourcentage. tn n o o w w r.j F" w M CD0 U1 0 on EXEMPLE III. Composition de comprimés contenant de la Gentamycine à des concentrations allant de 0,125 pg à 8 gg par comprimé et de raison 2. TABLEAU III GENTAMYCINE 0,125 0,250 0,500 1 2:4 ------- ------ ------ ----- - -- - -:_ - -:-: -:- -:_: : MILIEU DE CULTURE : LYOPHILISE CONENANT: 234: 469: 938: 1 875: 3 750: 7 500: 15 000: LA GUFAMYCINE. _ _ _ _:: : ACIDE TARTRIQUE 1 625: 1 625 1 625 1 625 1 625 1 625 1 625 BICARBONATE DE SODIUM: 4 000: 4 000: 4 000 4 000 4 000 4 000 4 000 BENZOATE DE SODIUM 1 875: 1 875 1 875 1 875 1 875 1 875 1 875 * *. *. à:---- - - - - - - à---- - - - - - - -: - - - À - - - - - - - -- -- - MILIEU DE CULTURE 29 766: 29 531: 29 062 28 125 26 250: 22 500 15 000 POIDS D'UN COMPRIME:37 500 37 500: 37 500: 37 500: 37 500 37 500 37 500 : L:e:s:: : : : : t.. t _ . Les quantités sont indiquées en microgrammes. EXEMPLE IV. Composition centésimale de milieux de culture. Milieu 1 Bio-trypcase..................39,58 Bio-soyase................... .13,19 Chlorure de sodium............10,55 Bicarbonate de sodium......... 10,55 Sulfite de sodium.............0,53 Acide tartrique...............4, 29 Cystine........................ 1,85 Glucose....................... 14, 51 Benzoate de sodium............4,95 ,00 Milieu 2 Peptone de caséine..... ..... 45,33 Peptone de farine de soja..... 8,00 Glucose...................DTD: .... 6,67 Chlorure de sodium............13,33 Bicarbonate de sodium.......DTD: .. 10,67 Acide tartrique...............4,33 Phosphate dipotassique........DTD: 6,67 Benzoate de sodium............5,00 ,00 Milieu 3 Bio-trypcase 37, 13 Bio-soyase 12,38 Chlorure de sodium 9,90 Sulfite de sodium 0,50 Acide tartrique 4,93 Cystine 1,73 Glucose 13,61 Benzoate de sodium 2,47..DTD: P.E.G. 6000 2,48 Carbonate de lysine 14,87 100,00 EXEMPLE V. Exemple de préparation d'un mélange destiné à la fabrication de comprimés de milieu de cul- ture renfermant de la Ticarcilline dosée de 4 pg à 64 pg par comprimé. On prépare un mélange contenant 16 pg d'anti- biotique dans 1,875 mg. Pour garantir une répartition homogène de l'anti- biotique dans le milieu de culture, on opère par trois prémélanges successifs dans un mélangeur rapide (par exemple L5dige, Stephan, Henschel). Exemple: 0,500 grammes d'antibiotique + 5 grammes de milieu de culture; on mélange 30 secondessen mélangeur rapide. On additionne à ce premier mélange 25 grammes du même milieu de culture et on mélange secondes environ en mélangeur rapide. On additionne à ce deuxième mélange 28,61 grammes du même milieu de culture; on on mélange 30 secondes environ en mélangeur rapide. Le mélange obtenu contient 16 pg d'antibiotique dans 1,875 mg. Le Tableau IV suivant indique les quantités de ce mélange qui entrent dans la composition de comprimés titrant respectivement 4 pg, 8 pg, 16 pg, 32 pg, 64 pg de Ticarcilline par comprimé terminé de 37,5 mg. Les quantités sont indiquées en mg. TABLEAU IV : mélange contenant l'antibiotiqene 0,469 0,938 1,875 3,750 7,500 Acide tartrique 1,625 1,625 1,625 1,625 1,625 : Bicarbonate de sodium: 4,000: 4, 000: 4,000: 4,000: 4,000 Benzoate de sodium 1,875 1,875 1,875 1,875 1,875 Milieu de culture z29,540 29,000 28,125 26,250 22,500 Il résulte de la description qui précède que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réali- sation et d'application adoptés, l'on obtient des milieux solides qui présentent par rapport aux milieux antérieure- ment connus des avantages importants, dont certains ont déjà été mentionnés dans ce qui précède, et notamment: - le comprimé, très maniable et très soluble, peut être destiné à la reconstitution de milieux de culture solides, semi-solides ou liquides; - le comprimé est particulièrement adapté pour contenir par exemple les antibiotiques ou les anti- fongiques à différentes concentrations; - Le comprimé peut être préparé à partir de tout milieu de culture pour bactéries, levures, cham- pignons, virus et cellules; - le comprimé permet l'utilisation d'un sys- tème de lecture optique dans d'excellentes conditions et de ce fait permet la réalisation de toute technique microbiologique et notamment la détection et la numéra- tion à partir d'un échantillon quelconque: sérum, urine, liquide cephalorachidien, liquide de ponction, produit laitier, eau, etc...; - le comprimé à délitement rapide permet la reconstitution de milieux prêts à l'emploi pour la déter- mination d'un antibiogramme, d'une concentration minimale inhibitrice, d'une identification et d'une caractérisation du microorganisme par étude différentielle de croissance; - le comprimé conforme à la présente invention, grace à sa parfaite et rapide solubilité permet de réali- ser un milieu de culture (pour bactéries, virus, levures, champignons... et cellules) prêt à l'emploi dans des délais très brefs par simple addition d'eau distillée. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in- vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Nouveau milieu de culture, solide, carac- térisé en ce qu'il se présente sous forme d'un comprimé contenant tous les composants nécessaires pour effec- tuer l'analyse souhaitée, ledit comprimé étant pourvu d'un agent de délitement. 2 ) Milieu selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'agent de délitement est un agent effer- vescent composé d'une association acide tartrique- bicarbonate de sodium et/ou carbonate de lysine selon les proportions: - 1:2 à 1:4. 3 ) Milieu selon la revendication 2 caractérisé en ce que la teneur d'agent effervescent est com- prise entre 5 et 50 % et de préférence entre 13 et 22 % du poids total du comprimé. 4 ) Milieu selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisé en ce qu'il est formé d'une quantité de divers réactifs composant le milieu, quantité juste nécessaire et suffisante pour une opé- ration analytique unitaire, le poids dudit comprimé étant compris entre 0,01 g et 5 g. ) Milieu selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'il'peut être rendu stérile. 6 ) Milieu selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'il peut contenir, si on le désire, un réactif d'inhibition de croissance de tout microorganisme (bactéries, virus, champignon, levure...) à différentes concentrations. 7 ) Milieu selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'il peut contenir des indicateurs de croissance (indicateurs d'oxydo-réduction, indicateur de pH, indicateurs colo- rés de croissance). 59499 8 ) Milieu selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisé en ce qu'il peut conte- nir des réactifs d'identification des caractéristiques métaboliques (tels que des substrats enzymatiques mannitol, lactose). 9 ) Milieu selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'il contient en outre, un ou des agent(s) lubrifiant(s) qui peut par ailleurs être un stabilisant (du benzoate de sodium et/ou du P.E.G. 6000). ) Procédé de préparation du milieu solide selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on procède à une pluralité de prémélanges successifs de tous les constituants du milieu avant d'effectuer la compression et, éventuellement la stérilisation. 11 ) Procédé selon la revendication 10, carac- térisé en ce qu'un, plusieurs ou la totalité des cons- tituants entrant dans la composition du milieu sont séchés par lyophilisation.