Brevet FR2557872A1 — publié le 19850712

La présente invention concerne un procédé pour isoler efficacement un L-amino-acide d'un mélange réac- tionnel obtenu pendant la production du L-amino-acide en utilisant un microorganisme. De nombreux procédés ont déjà été indiqués pour isoler un L-amino-acide par une résine échangeuse d'ions d'un mélange réactionnel contenant un L-amino-acide pro- duit par l'utilisation d'un microorganisme. Par exemple, on connait la séparation d'amino-acides basiques par des résines échangeuses de cations du type acide carboxylique (brevet des Etats-Unis d'Amérique N 2 549 378), la sépa- ration d'amino-acides acides par des résines échangeuses d'anions faiblement basiques (D.T. Eaglis et H.A.Fiess: Ind. Eng. Chem., vol. 36, 604, 1944; R.K. Cannan, J. Biol. Chem., vol. 152, 401, 1944), et la séparation d'amino-aci- des en utilisant des résines échangeuses de cations forte- ment acides de type H ou des résines échangeuses d'anions fortement basiques du type OH (S.M. Partridge et R.C. Blim- ley, Biochem. J., Vol. 51, 628, 1952). Pour l'isolement industriel de produits réaction- nels par des résines échangeuses d'ions, le brevet japonais N 5050/1964 décrit un procédé qui consiste à ajouter un floculant polymère du type polyamide à une solution conte- nant un saccharide et un amino-acide pour floculer et pré- cipiter les impuretés, et à purifier la solution sur une résine échangeuse d'ions; et le brevet japonais n 21105/ 1973 décrit un procédé pour séparer une solution d'amino- acides mixtes comprenant du L-tryptophane par une résine échangeuse d'ions du type acide sulfonique ayant un degré de réticulation représenté par une teneur en DVB (divinyl- benzène) ne dépassant pas 6 %. Cependant, ces procédés de la technique antérieure ne se sont pas révélés satisfaisants pour la production in- dustrielle d'amino-acides car, avant la purification par des résines échangeuses d'ions, ces procédés exigent l'éli- mination des microorganismes utilisés des mélanges réaction- nels, par exemple par centrifugation, floculation et preci- pitation par addition de floculants polymères, filtration sur une membrane d'ultrafiltration, etc., et l'élimination des microorganismes représente un travail considérable. La présente invention se propose de fournir un pro- cédé de séparation efficace d'un L-amino-acide d'un mélange réactionnel contenant des L-amino-acides, produit par l'u- tilisation d'un microorganisme. On parvient au but de la présente invention en trai- tant le mélange réactionnel contenant le L-amino-acide di- rectement avec une résine échangeuse de cations fortement acide du type H. Le procédé de la présente invention permet simultanément d'éliminer le microorganisme utilisé dans la réaction et d'isoler le L-amino-acide résultant. Le principe de base de la présente invention rési- de dans le fait que lorsqu'on fait passer un mélange réac- tionnel contenant le L-amino-acide ainsi qu'un microorga- nisme à travers une couche de résine échangeuse de cations fortement acide de type H pour faire adsorber le L-amino- acide sur la couche de résine et l'isoler et le purifier, le microorganisme dissous ou en suspension dans le mélange réactionnel est floculé par contact avec la résine échan- geuse d'ions et peut aisément être éliminé de la résine par lavage à l'eau. La floculation du microorganisme se produit probablement du fait que lorsque le microorganisme dissous ou en suspension dans l'eau vient au contact de la résine échangeuse de cations fortement acide du type H, il est mo- difié par le groupe acide sulfonique présent sur la résine échangeuse d'ions. Le procédé de la présente invention est applica- ble à un mélange réactionnel contenant un microorganisme et un L-aminoacide (qu'on désigne parfois ci-après pour simplifier par "mélange réactionnel à amino-acide") obtenu pendant la production du L-amino-acide en utilisant le mi- croorganisme. Des exemples de mélange réactionnel à amino-acide comprennent un mélange réactionnel contenant du L-trypto- phane produit à partir de DL-sérine et d'indole en présence de Escherichia coli et Pseudomonas putida; un mélange réac- tionnel contenant du L-tryptophane produit à partir de L-sé- rine et d'indole en présence de Escherichia coli; un mélan- ge réactionnel contenant du L-tryptophane produit en pré- sence de Bacillus subtilis en utilisant l'acide anthranili- que comme précurseur; un mélange réactionnel contenant du L-tryptophane produit à partir d'indole, d'acide pyruvique et d'ammoniac en présence de Aerobacter aerogenes; un mé- lange réactionnel contenant du L-tryptophane produit à par- tir d'indole, de sérine et de glucose en utilisant une bac- térie du genre Aerobacterium; un mélange réactionnel conte- nant de la L-sérine produit dans un milieu de culture con- tenant de la glycine ainsi que du méthanol comme source de carbone à l'aide d'un microorganisme utilisant du méthanol du genre Aeromonas, Aerobacter ou Pseudomonas; et un me- lange réactionnel contenant de la L-sérine produit dans un milieu de culture contenant de la glycine en présence d'un microorganisme du genre Nocardia. Ces exemples ne sont qu'il- lustratifs et le procédé de la présente invention peut s'ap- pliquer largement à la purification de tous les mélanges réactionnels à L-amino-acide obtenus en utilisant des micro- organismes. Des exemples illustratifs de résine échangeuse de cations fortement acide du type H utilisée dans le procédé de la présente invention sont "Lewatit sp-120" (une marque de fabrique d'un produit de Bayer AG), "Lewatit sc102" (une marque de fabrique d'un produit de Bayer AG), "Diaion pk- 208" (une marque de fabrique d'un produit de Mitsubishi Che- mical Co., Ltd.), "Diaion sk-102" (une marque de fabrique d'un produit de Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) et "Amberlite XE-100"' (une marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.). On fait passer le mélange réactionnel à amino-acide, soit tel quel,soit, si l'amino-acide précipite sous forme de cristaux dans l'eau, après dilution à l'eau jusqu'à dis- solution des cristaux à la température ambiante, à travers une couche de résine échangeuse de cations du type acide sulfonique régénérée à une forme H, par une extrémité pour faire adsorber l'amino-acide sur la résine échangeuse d'ions. Le microorganisme du mélange réactionnel est modifié par le contact avec la couche de résine échangeuse d'ions et adhère à la résine échangeuse d'ions à l'état floculé. On fait en- suite passer de l'eau à un débit déterminé à travers la cou- che de résine échangeuse d'ions par l'autre extrémité de la couche de résine (ce processus est appelé lavage en retour) pour éliminer le microorganisme floculé de la couche de ré- sine échangeuse d'ions. L'adsorption de l'amino-acide, la floculation du microorganisme et l'élimination du'iicroorganisme floculé présent dans la couche de résine échangeuse d'ions sont gé- néralement effectuées dans une colonne chargée de la résine échangeuse d'ions. Cependant, on ne rencontre aucune dif- ficulté lorsqu'on utilise un procédé dans lequel, après ad- sorption de l'amino-acide sur la résine échangeuse d'ions, on introduit la résine échangeuse d'ions dans un réacteur et on la soumet à un lavage à l'eau pour éliminer les boues. Lorsqu'on utilise une colonne chargée d'une résine échangeuse d'ions, on provoque l'écoulement du mélange réac- tionnel à amino-acide à un débit fixe dans la colonne de résine à partir de son sommet pour faire adsorber l'amino- acide sur la résine échangeuse d'ions. La quasi-totalité du microorganisme contenu dans le mélange réactionnel à amino-acide est alors modifiée et floculée dans la colonne de résine et physiquement maintenue sur la résine. Une par- tie de microorganisme s'évacue par le bras de la-colonne de résine en même temps que la liqueur évacuée. Lorsqu'après l'opération ci-dessus, on fait passer de l'eau à un débit déterminé à travers la colonne de résine échangeuse d'ions par sa base, pour réaliser le lavage en retour, le microorganisme floculé adhérant à la résine est entraîné par l'eau et s'écoule à partir de la partie supé- rieure de la colonne, et peut ainsi être séparé efficacement. Le microorganisme contenu dans le mélange réaction- nel à L-amino-acide introduit dans la couche de résine é- changeuse d'ions peut être éliminé pratiquement complètement car, au moment de l'adsorption du L-aminoacide sur la résine échangeuse d'ions, une partie du microorganisme est éliminée en même temps que la liqueur évacuée et au moment du lavage en retour, la plus grande partie du microorganisme sous la forme d'une masse floculée est éliminée de la couche de ré- sine. La résine échangeuse d'ions ayant adsorbé le L-ami- no-acide est ensuite traitée généralement avec une solution aqueuse d'ammoniaque pour éluer le L-amino-acide. En con- centrant et en cristallisant l'éluat, le L-amino-acide dé- siré peut être facilement isolé. Le L-amino-acide résultant est d'une grande pureté grâce à l'effet de purification obtenu par la résine échan- geuse d'ions. En traitant un mélange réactionnel à L-amino-acide contenant un microorganisme avec une résine échangeuse de cations fortement acide du type H, le procédé de la présen- te invention permet simultanément d'isoler le L-amino-acide et d'éliminer le microorganisme qui est très difficile à éliminer à l'échelle industrielle par les procédés usuels. Par suite, le procédé de l'invention est d'une grande im- portance du point de vue industriel comme procédé de purifi- cation de produits obtenus par des réactions utilisant des microorganismes. Les exemples suivants illustrent le procédé de la présente invention d'une façon plus détaillée. Exemple 1 Des cellules contenant Escherichia coli sont culti- vées à pH 7 et à une température de 30 C avec agitation et aération en présence de phosphate monopotassique, de phos- phate dipotassique, de sulfate d'ammonium, de chlorure de calcium, de sulfate de fer, d'extrait de levure, de poly- peptone et autres matières nécessaires avec addition de glucose et d'indole. La concentration finale des cellules est de 30 à 35 g/litre. De la même manière que ci-dessus, des cellules contenant Pseudomonas putida sont cultivées dans le même milieu de culture que ci-dessus, à la différence qu'il ne contient pas d'indole. Dans les deux cas, on recueille les cellules déve- loppées du bouillon de culture à l'aide d'un séparateur supercentrifuge classique et se présentant sous forme d'un gâteau crême ayant une teneur en eau de 75 à 85 %. On introduit dans un réacteur une solution aqueuse constituée de 77,3 g de DL-sérine, de 10,5 g de sulfate d'ammonium et de 486 g d'eau, et on ajuste le pH à 8,5 avec une solution aqueuse à 29 % d'ammoniaque. On ajoute ensuite 51,2 g du gâteau crême de cellules de Escherichia coli ob- tenu ci-dessus et 23,2 g du gâteau crême de cellules de Pseudomonas putida obtenues ci-dessus, et on agite bien le mélange réactionnel. De plus, on ajoute 392 g d'une so- lution toluénique contenant 78,4 g d'indole et on fait réa- gir à 35 C pendant 40 heures. La quantité de L-tryptophane formé dans la masse réactionnelle est déterminée par chromatographie en phase liquide, et on constate qu'elle est de 129,8 g (rendement de 95,0 % sur la base de l'indole). On distille le mélange réactionnel pour chasser le toluène. Ensuite, on dilue le mélange réactionnel à l'eau pour que les cristaux de Ltryptophane se dissolvent complètement à une concentration de 1,0 % en poids. Par ailleurs, on introduit dans une colonne 4,86 li- tres de Lewatit sp-120 (une résine échangeuse de cations fortement acide) régénérée à une forme H par de l'acide chlorhydrique. On fait passer la solution de L-tryptophane ci-dessus (125 g) à travers la colonne à partir de son ex- trémité supérieure à un débit déterminé pour faire adsor- ber le L-tryptophane sur la résine échangeuse d'ions. On lave ensuite la colonne en retour avec 24,9 g d'eau pour éliminer par lavage la masse floculée flottante des cellules microbiennes. Ensuite, on élue le L-trypto- phane de la colonne de résine en utilisant de l'ammoniaque aqueux en une quantité correspondant au double de la capa- cité d'échange de la résine échangeuse d'ions. On chauffe l'éluat à 100 C pour enlever et récupérer l'ammoniac. On refroidit le résidu jusqu'à la température ambiante. On sépare par filtration les cristaux précipités de L-trypto- phane et on les sèche. On obtient le L-tryptophane d'une pureté de 99,8 % en une quantité de 1,0 g. La répartition des cellules par le traitement par la résine échangeuse d'ions est telle que 3 % des cellules existent dans la liqueur résiduaire qui traverse la colonne au moment de l'adsorption du L-tryptophane et que 97 % des cellules sont présentes dans l'effluent au moment du la- vage en retour (la répartition des cellules est déterminée par le poids des cellules qui sont concentrées à sec et le bilan carbone obtenu par analyse élémentaire). Exemple 2 On produit du L-tryptophane à partir de L-sérine et d'indole dans de l'eau en utilisant un gâteau crème de cellules de Escherichia coli cultivées de la meme manière que dans l'Exemple 1. Pour éviter une diminution de l'ac- tivité de l'enzyme par l'indole, on conduit la réaction en ajoutant l'indole progressivement tout en déterminant en continu sa concentration en sorte que la concentration d'in- dole dans l'eau soit maintenue à 200 ppm ou moins. Le ren- dement en L-tryptophane produit est de 100 % sur la base de l'indole et de 85 % sur la base de la L-sérine. La con- centration finale en L-tryptophane accumulé est de 120 g/ litre. Le mélange réactionnel contenant le L-tryptophane est déshydraté par centrifugation pour donner un gâteau crame contenant du L-tryptophane et les cellules microbien- nes. On traite le gâteau crème de la réaction avec Le- watit sc-102 (forme H) comme résine échangeuse d'ions par le même mode opératoire que dans l'Exemple 1 pour enlever les cellules et isoler le L-tryptophane. La quantité de L-tryptophane isolé est de 1,1 g et sa pureté est de 99,9 %. Les cellules contenues dans le mélange réactionnel contenant le L-tryptophane sont élimi- nées en une quantité de 2,5 % au moment de l'adsorption sur la résine échangeuse d'ions et de 97,5 % au moment du la- vage en retour de la colonne de résine échangeuse d'ions. R E V E N D I CATION Procédé pour isoler un L-amino-acide d'un mélange réactionnel contenant le L-amino-acide et un microorganisme, qui est formé pendant la production du L-amino-acide en utilisant le microorganisme, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à traiter ledit mélange réactionnel avec une résine échangeuse de cations fortement acide du type H tout en maintenant le L-amino-acide à l'état dissous.