Brevet FR2556741A1 — publié le 19850621

La présente invention est relative à un procédé de détection de l'activité d'une substance sur un micro-organisme ou sur un mélange de plusieurs micro-organismes, ainsi qu'à un dispositif permettant de mettre en oeuvre ce procédé. L'invention s'applique notamment au dépistage préventif des bactériophages en fromagerie. Dans une fromagerie, on effectue la fermentation du lait dans des_ cuves au moyen d'un levain réalisé à partir d'un mélange d'un certain nombre de souches bactériennes. Au cours du temps se développent dans les cuves des micro-organismes appelés bactériophages, ou plus simplement phages; la croissance de ces phages suppose celle des bactéries lactiques et est considérablement plus rapide que celle de ces dernières. Les phages sont plus ou moins spécifiques des bactéries lactiques'utilisées; à partir d'une certaine concentration d'un type donné de phage dans la cuve, les bactéries correspondantes sont détruites de façon suffisamment importante pour ne plus produire la fermentation attendue. L'accident de fabrication en fromagerie se produit lorsqu'une proportion suffisante des souches est contaminée. L'activité des bactéries lactiques peut également diminuer pour d'autres raisons; en particulier, elle peut être stoppée par la présence de substances inhibitrices se trouvant dans le lait utilisé ou fabriquées par les bactéries elles-mêmes, ou encore par des antibiotiques présents dans le lait. On comprend, dans ces conditions, l'intér9t pour les fromagers d'avoir à leur disposition un test permettant de déterminer de façon fiable et préventive la présence de l'un ou l'autre de ces facteurs nuisibles. L'invention a pour but de fournir un test fiable très sensible ayant un caractère préventif et extrêmement simple à utiliser, notamment en fromagerie, o il permet d'obtenir une véritable échelle de contamination des mélanges de souches bactériennes. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de détection de l'activité d'une substance sur un micro-organisme, caractérisé par la succession d'étapes suivantes: (a) on prépare dans un récipient un milieu lyophilisé contenant le micro- organisme et une partie d'un milieu de culture de ce micro-organisme; (b) on prépare une solution contenant le complément dudit milieu de culture; (c) on ajoute à cette solution ladite substance (d) on verse dans le récipient le liquide ainsi obtenu; (e) on fait incuber le récipient; et (f) on soumet le récipient à un test de présence du micro-organisme. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement intéressant, le procédé de l'invention est appliqué à la détermination de l'activité de ladite substance sur un mélange de n micro-organismes. Dans ce cas, l'étape (a) décrite ci-dessus est remplacée par l'étape (al) suivante: (ai) on prépare dans chacun de n récipients un milieu lyophilisé contenant un micro-organisme respectif du mélange, ainsi qu'une partie d'un milieu de culture de l'ensemble des micro-organismes; et on applique chacune des étapes (d), (e) et (f) à chacun des récipients. L'invention a également pour objet un dispositif ou "kit" de mise en oeuvre de ce dernier procédé. Ce dispositif comprend: - une plaquette de microtitration réunissant n rangées de m récipients, chaque rangée contenant un milieu lyophilisé qui contient lui-même un micro-organisme respectif dudit mélange; - m tubes stériles de prélèvement; et - m tubes de dilution contenant ladite solution. Dans un mode de réalisation avantageux, le dispositif suivant l'invention comprend en outre un peigne agitateur dont les dents sont adaptées pour pénétrer simultanément dans tous les récipients d'une même rangée ou d'une même colonne. Du fait que les récipients de la plaquette doivent à plusieurs reprises être bouchés et débouchés, suivant une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la plaquette est munie d'un couvercle constitué d'une feuille sur laquelle font saillie vers le bas des alvéoles borgnes en nombre égal à celui des récipients et adaptés pour s'emboîter à force dans ces récipients. Un exemple de mise en oeuvre de l'invention va maintenant être décrit en regard des dessins annexés, sur lesquels: - la figure 1 est une vue schématique d'un dispositif suivant l'invention destiné à l'étude d'un mélange de bactéries lactiques utilisi en fromagerie; - la figure 2 est une vue partielle prise en coupe suivant la ligne II-II de la figure 1; la figure 3 est une vue en plan de la plaquette de microtitration de la figure 1; 255674 i - la figure 4 représente un accessoire pouvant être utilisé avec le dispositif de la figure 1; et - la figure 5 est un schéma illustrant les diverses étapes du procédé mis en oeuvre avec le dispositif des figures 1 à 4. Le procédé qui va être décrit ci-dessous est appliqué à la fabrication de fromages. Il permet de déterminer à tout instant le degré de contamination du mélange de souches bactériennes en cours de fermentation dans une cuve, dans le cas o ce mélange est constitué d'un ensemble de souches bien déterminées. On décrira tout d'abord, en regard des figures 1 à 4, le dispositif ou "kit" permettant cette détermination. Ce dispositif comprend essentiellement: une plaquette de microtitration 1 pourvue d'un couvercle 2; une série de onze tubes de prélèvement 3; une série de douze tubes de dilution 4; une série de vingt-trois cônes de prélèvement 5 du commerce, connus sous l'appellation "csnes jaunes", destinés à servir d'embouts interchangeables pour une pipette automatique non représentée; et un flacon compte-gouttes 6. A ces éléments peut être adjoint un peigne agitateur 7 représenté à la figure 4. Un seul tube 3, un seul tube 4 et un seul cône 5 ont été représentés à la figure 1 dans un but de clarté. Les éléments 1 à 5 sont livrés stériles. La plaquette 1 est constituée par un bloc parallélépipédique de matière plastique transparente qui comporte dans sa face supérieure huit rangées de douze cupules cylindriques 8. En supposant la plaque orientée, en vue en plan, comme à la figure 3, avec ses petits c8tés verticaux, chaque rangée horizontale, référencée 9A, 9B,... est affectée à une souche déterminée A,B,... du mélange; la première colonne 10a (celle de gauche dans l'exemple représenté) est une colonne témoin, et chacune des onze autres colonnes lob, 10c,... est affectée à un prélèvement. La plaquette 1 permet donc de tester un à onze échantillons avec un mélange contenant une à huit des souches A,B,... La colonne témoin 10a est repérée par une bande colorée 11, caractéristique du mélange considéré, qui est collée sur la petite face gauche de la plaquette. Chaque cupule 8 contient une souche conservée sous forme lyophilisée. Plus précisément, cette souche est incorporée à un lyophilisat formant d'une part un protecteur des bactéries vis-à-vis de la lyophilisation et d'autre part une partie d'un milieu de culture de la souche. A titre d'exemple, ce lyophilisat peut être constitué comme suit: saccharose 54 g glycérophosphate 60 g glutamate de Na 24 g extrait de levure 34 g chlorure de sodium 12 g chlorure de calcium 2,25 g acétate de sodium 4,5 g sulfate de magnésium 0,6 g poudre de lait 120 g H20 qsp 1000 ml La souche considérée est incorporée à ce milieu avant lyophilisation, dans une proportion déterminée variable de 0,1 à 1 Z suivant la souche, sous la forme d'une culture de 16 heures sur lait peptoné stérile, coagulée par la souche. La lyophilisation est effectuée directement dans la plaquette. Lorsque la lyophilisation est terminée, le couvercle 2, qui va être décrit plus en détail ci-dessous, est mis en place sur la plaquette, et l'ensemble est scellé sous atmosphère d'azote dans un sachet métalloplastique (stratifié constitué d'une couche extérieure métallique et d'une couche intérieure en matière plastique thermosoudée sur son pourtour) et conservé à + 4 C. Le couvercle 2 est constitué d'une feuille de matière plastique souple et transparente moulée ayant à peu près les mêmes dimensions que la plaquette 1. Dans cette feuille sont formés quatre-vingt-seize alvéoles borgnes 12 sensiblement cylindriques, en saillie vers le bas, qui présentent la même disposition et sensiblement le même diamètre que les cupules 8. Lorsque la lyophilisation de la plaquette 1 est terminée, on réalise un bouchage étanche des cupules 8 en appliquant fermement le couvercle 2 sur la plaquette 1, chaque alvéole 12 s'emboîtant, légèrement à force, dans la cupule correspondante. La matière plastique du couvercle 2 doit bien entendu, comme celle de la plaquette 1, présenter sous un faible coat des propriétés physiques et chimiques adaptées aux corps manipulés et aux températures auxquelles elle est soumise, en particulier à un froid de - 300C. On peut par exemple réaliser la plaquette en polystyrène cristal et le couvercle 2 en polystyrène. Chacun des douze tubes de dilution 4 contient 3 ml d'un liquide 255674 1 servant d'une part à la réhydratation du lyophilisat contenu dans les cupules 8 d'une colonne 10a, 0lob,..., d'autre part à la dilution d'un échantillon prélevé au moyen d'un tube 3, et enfin à la complémentation du milieu de culture du lyophilisat. Ce milieu a la composition suivante: extrait de levure 20 g lactose 30 g H20 qsp 1 litre BCP (bromocresolpurple) 0,02 g Ce milieu possède un pH de 6,5 et est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes. Le BCP est un indicateur de pH dont la couleur est pourpre pour les pH supérieurs à 5 environ et jaune pour les pH inférieurs à cette valeur. Le flacon 6 contient un réactif permettant de lire les résultats du test. Ce réactif est une solution stérile de "vert janus" que le capuchon compte-gouttes 13 du flacon permet de délivrer goutte par goutte. Par exemple, les gouttes peuvent représenter 20 pil, et on en verse une par cupule, le vert janus étant dilué à 0,25 g/l. Ce réactif possède la propriété de virer au rose en présence des bactéries lactiques. Le peigne 7 est un morceau d'une feuille de matière plastique ayant une forme générale de demi-disque. Sur le diamètre de ce demi-disque font saillie huit dents rectangulaires 14 dont la largeur est inférieure au diamètre des cupules 8. Le dispositif ainsi décrit s'utilise de la manière suivante, illustrée à la figure 5. L'étude porte sur un lait traité en fromagerie par un levain réalisé, par exemple, avec un mélange des huit souches A,B,... conservées respectivement dans les huit rangées 9A, 9B,... de cette plaquette. Pour des raisons économiques, il est souhaitable d'effectuer le maximum de prélèvements possible (référence 15), c'est-à-dire onze prélèvements. Le nombre de prélèvements journalier dépend des paramètres technologiques de la fromagerie (volume de lait traité, nombre de cuves, etc...) et des buts poursuivis (contr81e de contamination, explication d'un incident constaté, suivi régulier, etc...). Si ce nombre est inférieur à onze, on conserve les échantillons au réfrigérateur ou au congélateur, comme illustré en 16 à la figure 5. Les échantillons sont constitués du lait pasteurisé de départ ou du sérum d'une cuve en cours de fermentation. Le jour du test, un bain thermostaté est réglé sur 65 C. Les échantillons de sérum, après avoir éventuellement été ramenés à température ambiante, sont placés pendant 7 mn dans ce bain thermostaté (référence 17 de la figure 5). Cette opération supprime à la fois les bactéries lactiques et une partie notable des substances inhibitrices, sans détruire les bactériophages. Dès la sortie du bain, on prélève 150 pl de chaque échantillon au moyen d'une pipette à piston dite "pipette automatique" préréglée sur ce volume et munie d'un cône jaune (référence 18). Ces 150 pl sont versés dans un tube de dilution 4 (référence 19), que l'on agite. Ainsi, onze tubes 4 reçoivent une quantité dosée d'un échantillon respectif, tandis que le douzième tube 4, qui est un tube témoin, n'en reçoit pas. Toutes les opérations qui suivent sont effectuées près d'une flamme (bec bunsen...) pour assurer la stérilité des manipulations. Une plaquette 1 munie de son couvercle 2 est sortie de son sachet protecteur, et le couvercle 2 est retiré. La phase suivante 20 consiste à prélever dans chaque tube 4, à l'aide de la même pipette automatique munie d'un nouveau cône jaune 5, que l'on change pour chaque tube, des doses de pl qui sont versées dans les cupules 8 (référence 21). Plus précisément, chaque cupule 8 de la colonne 10a reçoit 150 pl provenant du tube témoin 4, chaque cupule dé la deuxième colonne 10b reçoit 150 pjl provenant du tube 4 qui contient le premier échantillon, etc... Au cours de cette opération, on prend soin de ne pas toucher le bord des cupules ou les lyophilisats avec le cône de -distribution, ceci afin d'éviter les intercontaminations. Après avoir ainsi distribué tous les échantillons, le couvercle 2 est remis en place dans sa position initiale. Apres quelques minutes, la plaquette est agitée dans le sens horizontal, en évitant le contact liquide-couvercle, puis elle est mise à incuber à 25"C pendant 20 à 24 heures (référence 22). Cette durée est déterminée de manière à permettre aux souches contenues dans la première colonne d'abaisser le pH audessous de 5. On vérifie donc (référence 23) que toutes les cupules de la colonne a sont devenues jaunes, sinon (référence 24) on prolonge un peu l'incubation. Ensuite (référence 25), on verse une goutte de réactif du flacon 6 dans chaque cupule, et l'on agite. Pour cela, on peut agiter horizontalement la plaquette, comme précédemment, mais, comme les phénomènes microbiologiques sont terminés à ce stade et que tout risque d'intercontamination est par conséquent écarté, il est commode d'utiliser le peigne 14, qui permet d'agiter d'un seul geste toutes les cupules d'une colonne, puis de la colonne suivante, etc... Puis (référence 26), on remet la plaquette munie du couvercle 2 à incuber à 25 C pendant environ 45 minutes à 1 heure pour faire réagir le vert janus. Il ne reste plus qu'à sortir la plaquette de l'étuve, à retirer le couvercle 2, et à effectuer la lecture (référence 27). Trois cas peuvent se présenter, résultant des considérations suivantes pour chaque souche du mélange: - si les échantillons de lait conduisent à une couleur rose, ceci signifie que le lait utilisé n'a pas empêché l'activité de la souche. Il ne contient donc pas de substance inhibitrice ou d'antibiotique nuisible à la fermentation par cette souche; - si les échantillons de lait conduisent à une couleur verte, ce lait contient au contraire des inhibiteurs et des antibiotiques. Ceci se retrouve dans la cuve, de sorte que la souche ne peut agir, même en l'absence de phages; - si des échantillons de sérum conduisent à une couleur verte, il existe dans la cuve soit des inhibiteurs et/ou des antibiotiques provenant du lait, soit des phages. Par suite, en prélevant à la fois des échantillons de lait et des échantillons de sérum, on aboutit aux conclusions suivantes: Lait Sérum Interprétation rose 1ros rose rose normal vert vert inhibiteur ou anti- biotique dans le lait rose vert bactériophages En supposant le lait dépourvu d'inhibiteur et d'antibiotique, la proportion de cupules vertes par rapport à l'ensemble des cupules donne la proportion de souches du mélange contaminées par les bactériophages. On peut admettre généralement que jusqu'à 40 % de cupules vertes, il n'y a pas de risque à utiliser ce mélange 2 à 3 jours. Par contre, au-dessus de cettà proportion, il est indispensable de changer de mélange pour les fabrications suivantes. Ce test, effectué sur les souches pures (c'est-à-dire isolées) des mélanges utilisés, indique de façon fiable le degré de contamination de ces mélanges. Grâce à sa présentation en kit, peu coûteuse, il est simple à utiliser. La conservation des souches sous forme lyophilisée, à des concentrations bien définies, supprime toute opération de culture bactérienne et de repiquage. Le milieu de culture utilisé assure une très bonne croissance des souches et des phages ainsi qu'une très bonne protection des souches lyophilisées. De plus, le vert janus possède un virage de couleur très net, ce qui rend facile l'interprétation des résultats. En variante, la plaquette 1 peut être utilisée avec ses grands c6tés verticaux en vue en plan, auquel cas les rangées sont au nombre de douze et les colonnes au nombre de huit. On peut alors tester jusqu'à sept échantillons pour des mélanges allant jusqu'à onze souches, et le kit comporte sept tubes 3 de prélèvement, huit tubes 4 de dilution et quinze cônes jaunes 5. Bien entendu, on peut envisager de réaliser des plaquettes comportant un nombre de cupules 8 différent de quatre-vingt- seize. Dans chaque cas, le nombre de dents du peigne agitateur 7 peut être égal soit au nombre de cupules d'une colonne, comme représenté, soit au nombre de cupules d'une rangée. Un test analogue peut s'appliquer dans d'autes cas de productions à fermentation bactérienne, par exemple dans la production de glutamate ou d'antibiotiques. Il peut également convenir pour le lysotypage de souches, c'est-à-dire pour tester une série de souches bactériennes sur une collection de phages contenus dans la plaquette à raison d'un type de phage par rangée. Cette technique permettrait de disposer d'un procédé 30 rapide et commode pour éprouver la résistance des souches, et même de caractériser des souches de façon plus sûre et- plus commode que les caractères biochimiques actuellement utilisés. REVENDICATIONS 1. - Procédé de détection de l'activité d'une substance sur un microorganisme, caractérisé par la succession d'étapes suivantes: (a) on prépare dans un récipient un milieu lyophilisé contenant le micro- organisme et une partie d'un milieu de culture de ce micro-organisme; (b) on prépare une solution contenant le complément dudit milieu de culture; (c) on ajoute à cette solution ladite substance; (d) on verse dans le récipient le liquide ainsi obtenu; (e) on fait incuber le récipient; et (f) on soumet le récipient à un test de présence du micro-organisme. 2. - Procédé suivant la revendication 1, pour la détermination de l'activité de ladite substance sur un mélange de n micro-organismes, caractérisé en ce que l'étape (a) est remplacée par l'étape (ai) suivante: (al) on prépare dans chacun de n récipients un milieu lyophilisé.contenant un micro-organisme respectif du mélange, ainsi qu'une partie d'un milieu de culture de l'ensemble des micro-organismes; et en ce qu'on applique chacune des étapes (d), (e) et (f) à chacun des récipients. 3. - Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, dans le cas o ladite substance contient également le microorganisme ou le mélange de micro-organismes, on effectue, entre les étapes (a) ou (al) d'une part, (c) d'autre part, l'étape supplémentaire suivante: (g) on soumet ladite substance à un traitement qui en élimine le micro- organisme ou le mélange de micro-organismes; et en ce qu'on remplace l'étape (c) par l'étape suivante: (cl) on ajoute à ladite solution ladite substance traitée par l'étape (g). 4. - Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le traitement de l'étape (g) est constitué par un chauffage. 5. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en. ce que, pour le ou pour chacun des micro-organismes, on prépare, dans un récipient supplémentaire, ledit milieu lyophilisé; on prépare une solution témoin analogue à ladite solution mais contenant en outre un indicateur de l'activité du ou de chaque micro-organisme; on verse la solution témoin dans ledit récipient supplémentaire; et l'on prolonge l'étape (e) jusqu'à ce que ledit indicateur ait montré une activité prédéterminée du ou de chaque micro-organisme. 6. - Dispositif de mise en oeuvre d'un procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend: - une plaquette de microtitration (1) réunissant n rangées (9A, 9B,...) de m récipients (8), chaque rangée contenant un milieu lyophilisé qui contient lui-même un micro-organisme respectif dudit mélange; - m tubes stériles de prélèvement (3); et - m tubes de dilution (4) contenant ladite solution. 7. - Dispositif suivant la revendication 6, caractérisé en ce que chaque rangée (9A, 9B,...) de la plaquette (1) comporte un (m + l)ème récipient (8), et en ce qu'il est prévu un (m + 1)ème tube de dilution (4) contenant ladite solution, formant tube-témoin et associé aux (m + 1)èmes récipients. 8. - Dispositif suivant l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des embouts de prélèvement (5) dont le nombre est égal à la somme du nombre de tubes de prélèvement (3) et du nombre de tubes de dilution (4). 9. - Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un flacon (6) d'un indicateur. coloré de la présence des micro-organismes du mélange. 10. - Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que chaque tube de dilution (4) contient un indicateur coloré de l'activité des micro-organismes du mélange. 11. - Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un peigne agitateur (7) dont les dents (14) sont adaptées pour pénétrer simultanément dans tous les récipients (8) d'une même rangée (9A, 9B,...) ou d'une même colonne (1Oa, lob,...). 12. - Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que la plaquette (1) est munie d'un couvercle (2) constitué d'une feuille sur laquelle font saillie vers le bas des alvéoles borgnes (12) en nombre égal à celui des récipients (8) et adaptés pour s'emboiter à force dans ces récipients.