Brevet FR2550799A1 — publié le 19850222

La présente invention a pour objet un composé marqué par une enzyme, son procédé de préparation et son utilisation comme marqueur dans des dosages enzymoimmunologiques, sous la forme par exemple 5 d'antigène marqué, d'haptène marqué ou d'anticorps marqué. On sait qu'un antigène peut induire chez un vertébré supérieur la production d'anticorps spécifiques capables de former avec l'antigène un complexe 10 réversible à haute énergie de liaison Les haptènes sont des substances de bas poids moléculaire qui ne provoquent pas la formation d'anticorps lorsqu'on les injecte à un animal, mais qui réagissent avec les anticorps Ces anticorps dirigés contre les haptènes 15 peuvent être produits lorsqu'on injecte à un animal ou à l'homme, un composé conjugué par exemple de l'haptène et d'une protéine. Les réactions antigène-anticorps ou haptène-anticorps peuvent être utilisées pour mesurer les 20 concentrations en haptènes, en antigènes ou en anticorps d'un milieu donné, en utilisant des techniques immunoanalytiques telles que les techniques enzymoimmunologiques Dans ce dernier cas, la réaction met en jeu un anticorps, un antigène ou un haptène et une 25 molécule marquée par une enzyme qui peut être soit l'antigène, soit l'anticorps, soit l'haptène Lorsque la molécule marquée est l'antigène ou l'haptène, le principe du dosage repose sur la compétition entre l'antigène ou l'haptène marqué, d'une part, et l'an30 tigène ou l'haptène, d'autre part, vis-à-vis d'un nombre limité de sites anticorps De ce fait, pour le dosage immunologique, il faut établir une courbe d'étalonnage en faisant réagir des quantités constantes d'anticorps et de molécules marquées d'antigène ou d'haptène en quantités limitantes, avec des quantités variables d'antigène ou d'haptène Après établissement de l'équilibre antigène-anticorps, on applique au mélange, une méthode de fractionnement 5 permettant de séparer le complexe marqué de l'antigène ou de l'haptène qui reste libre en solution et par mesure de l'activité enzymatique de la fraction liée (complexe) ou de la fraction libre (antigène ou haptène marqué), on peut déterminer l'activité qui cor10 respond aux différentes concentrations en antigène ou en haptène et établir la courbe d'étalonnage Une fois cette courbe établie, on peut déterminer la concentration en antigène ou en haptène d'un échantillon en appliquant le même processus et en se reportant à 15 la courbe d'étalonnage pour obtenir la concentration en haptène ou en antigène qui correspond à l'activité enzymatique trouvée lors de l'essai. On peut aussi effectuer des dosages enzymoimmunologiques basés sur le même principe en utili20 sant un anticorps marqué par une enzyme et un anticorps non marqué avec un antigène ou un haptène Il existe encore d'autres techniques de dosages, selon lesquelles l'un des participants à la réaction, qui peut être soit l'anticorps, soit l'antigène ou l'hap25 tène, est immobilisé sur une surface solide, de façon à simplifier le processus de séparation On peut aussi utiliser des réactifs spécifiques des anticorps marqués par l'enzyme tels qu'une protéine ou un second anticorps. Parmi les dosages enzymoimmunologiques, on peut distinguer deux types de dosages qui sont les dosages Nhomogènesu et les dosages hétérogènes" Un dosage homogène est basé sur le fait que la molécule marquée ne présente plus d'activité enzymatique lors35 qu'elle est liée avec l'anticorps ou l'antigène cor- respondant Dans ce cas, l'activité enzymatique du mélange réactionnel est directement reliée à la proportion de molécules marquées impliquées dans la formation du complexe antigène-anticorps De ce fait, il 5 n'est pas nécessaire d'effectuer une séparation et la mesure de l'activité enzymatique peut avoir lieu directement dans le milieu réactionnel. En revanche, dans un dosage enzymoimmunologique hétérogène", il est nécessaire d'avoir 10 recours à un procédé de séparation, car dans ce cas, l'activité enzymatique de la molécule marquée par l'enzyme qui a participé à la formation du complexe, n'est pas modifiée Dans ce cas, on doit séparer le complexe antigène-anticorps du milieu réactionnel 15 pour effectuer la mesure de l'activité enzymatique du complexe, ou de l'antigène (ou anticorps) libre. Dans tous ces dosages, l'enzyme utilisée joue un rôle très important car elle conditionne les performances du dosage, et on recherche des enzymes 20 capables de répondre aux impératifs suivants: 1) Disponibilité de l'enzyme à l'état pur en quantité importante, afin que l'on puisse réaliser dans de bonnes conditions la fabrication des molécules marquées d'antigène, d'haptène ou d'an25 ticorps. 2) Possibilité de détecter l'enzyme avec une grande sensibilité afin que la mesure de l'activité enzymatique soit représentative de la teneur en molécule marquée Cette sensibilité de détec30 tion dépend bien entendu de la constante catalytique de l'enzyme, mais aussi de la sensibilité avec laquelle peuvent &tre mesurés les produits de la réaction enzymatique 3) Dosage enzymatique aussi simple que possible à 35 réaliser. 4) Présence dans l'enzyme de groupements réactifs capables de réagir avec des antigènes, des haptènes ou des anticorps pour former la molécule marquée. ) Stabilité de l'enzyme dans les conditions de conservation standard. 6) Activité enzymatique de l'enzyme non identique à celle du milieu de dosage et ne présentant pas de facteurs interférant avec le dosage 7) Autolyse du substrat enzymatique aussi faible 10 que possible. A la suite de différentes recherches, on a trouvé que l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus constituait une enzyme présentant ces caractéristiques optimales pour être utilisés dans un 15 dosage enzymatique et la présente invention a précisément pour objet des composés comprenant cette enzyme, qui peuvent être utilisés comme molécules marquées dans un dosage immunoenzymatique. Le composé selon l'invention est constitué 20 par une molécule choisie parmi les anticorps, les antigènes et les haptènes, liée par une liaison de covalence à une enzyme et il se caractérise en ce que l'enzyme est constituée par l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. Grâce à l'utilisation de cette enzyme, on peut réaliser des dosages enzymoimmunologiques dans de bonnes conditions. En effet, l'acétylcholinestérase fait partie d'un groupe d'enzymes qui hydrolysent rapidement 30 les esters de la choline et elle se caractérise par le fait que l'acétylcholine est son meilleur substrat Elle est très répandue dans de nombreux tissus animaux et dans le système nerveux central et périphérique des vertébrés On la trouve en concentration particulièrement importante dans les organes électriques de certains poissons comme Electrophorus Electricus (Gymnote) Elle peut être purifiée rapidement et simplement par chromatographie d'affinité, et elle peut être détectée de façon très sensible car elle possède une constante catalytique très élevée (de l'ordre de 1,5 x 104 S 1) et l'on dispose de différents dosages très sensibles pour cette enzyme. Par ailleurs, elle possède des groupements 10 réactifs, en particulier des groupes lysyle, tyrosyle, histidyle, tryptophanyle et glutamyle qui peuvent réagir avec certains groupements réactifs des antigènes, des haptènes ou des anticorps pour former des composés marqués utilisables en enzymoimmunologie. 15 Enfin, cette enzyme est très stable à -20 o C ou à 173 C pour peu qu'elle soit conservée dans un-milieu adéquat. Par conséquent, l'utilisation comme marqueur enzymatique de l'acétylcholinestérase d'Elec20 trophorus Eléctricus présente de nombreux avantages. Selon l'invention, l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus (EC 3 1 1 7) est obtenu à partir des organes électriques d'Electrophorus Electricus et purifié par chromatographie d'affinité On 25 peut utiliser en particulier la méthode décrite par Bon et Coll dans Eur J Biochemical 68, p 531-539 ( 1976) qui permet d'obtenir environ 50 mg d'enzyme pure en quelques jours. On sait que l'acétylcholinestérase existe 30 sous plusieurs formes moléculaires nommées A 12, A 8, A 4, G 4, G 2 et G 1 comme cela est décrit par Bon et coll dans Ann Rev Neurosci 1982, 5, p 57-106. Dans les organes électriques d'Electrophorus Electricus, ce sont les formes A 12, A 8 et G 4 qui prédomi35 nent et quand l'enzyme pure est stockée, il peut se former spontanément des agrégats covalents entre les formes A 12 et A 8. Selon l'invention, le composé peut être formé à partir des formes moléculaires naturelles 5 telles que A 12, A 8 et G 4, mais aussi à partir des formes moléculaires obtenues par dégradation de ces dernières, à savoir A 4, G 2 et G 1 ou même à partir d'agrégats covalents entre les formes asymétriques. Toutefois, selon un mode préféré de réalisation de 10 l'invention, le composé est un mélange de composés comportant l'acétylcholinestérase sous les formes moléculaires A 8 et A 12. Selon l'invention, la molécule constituée par un antigène, un anticorps ou un haptène peut être 15 choisie parmi les médicaments tels que les analgésiques, les antibiotiques, les anticonvulsants, les agents antidiabétiques, les agents antihypertensions, les agents antinéoplastiques, les barbiturates, les dépresseurs cardiaques, les glycosides car20 diaques, les hallucinogènes, les insecticides, les agents relaxants des muscles, les stéroides, les stimulants, les alcaloides du tabac et les tranquillisants Cette molécule peut aussi être constituée par une protéine du plasma ou une hormone, par exemple un 25 polypeptide, un stéroide ou d'autres molécules plus petites. A titre d'exemple, les protéines du sérum peuvent être Ig G, Ig E, l'haptoglobine, l'alpha2-H-globuline, l'alpha-FP, le CEA et le PAM; les 30 hormones peuvent être HCG, HPL, TSH, l'insuline, les oestrogènes, la progestérone, le cortisol et la thyroxine; et les médicaments peuvent être des barbiturates, des opiates, la méthadone, des amphétamines, la digoxine et la gentamycine. La molécule peut encore être constituée par des anticorps de certains pathogènes tels que Echinococcosis granulosus, Trichinella Spiralis, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, les Salmonella O antigènes, Escherichia Coli, Rubella virus, Trypanosoma 5 brucci, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Plasmodium berghei, Plasmodium knowlesi et Vibrio cholerae. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la molécule est une prostaglandine telle 10 que la 6-kéto-PGF 1, la PGD 2-MO ou le thromboxane B 2, ou la substance P qui est un neuropeptide. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des composés décrits ci-dessus. Selon l'invention, pour lier par une liai15 -3 on de covalence l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus à la molécule choisie parmi les antigènes, les haptènes et les -anticorps, on fait reagir l'un des groupements réactifs portés par l'enzyme tel que les groupes lysyle, tyrosyl, histidyle, 20 tryptophanyle ou glutamyle avec un groupement réactif porté par l'antigène, l'haptène ou l'anticorps, par exemple avec une fonction acide, une fonction amine, une fonction phénol, une fonction hydroxyle ou une fonction cétone Ceci peut être effectué en particu25 lier par des réactions de couplage couramment utilisées, au moyen de réactifs tels que les carbodiimides, le glutaraldéhyde, la benzidine, les anhydrides mixtes, les esters actifs de l'haptène et l'acide paraaminophénylacétique. Ainsi, le procédé de l'invention consiste à faire réagir la molécule choisie parmi les antigènes, les haptènes et les anticorps avec l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. Selon un mode particulier de réalisation de 35 ce procédé, lorsque la molécule est la substance P, on prépare tout d'abord un dérivé de la substance P par réaction de celle-ci avec un ester actif de l'acide paraaminophénylacétique, et on fait réagir le dérivé ainsi obtenu avec l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. Selon un autre mode particulier de réalisation du procédé de l'invention, lorsque la molécule est une prostaglandine, on prépare tout d'abord un ester actif de la prostaglandine, et on fait réagir 10 l'ester ainsi obtenu avec l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. Avantageusement, l'ester actif de la prostaglandine est obtenu par réaction de la prostaglandine avec du N-hydroxysuccinimide. Les composés de l'invention peuvent être utilisés en particulier comme marqueurs dans des procédés de dosage enzymoimmunologique pour déterminer la concentration en antigène, en anticorps ou en haptène d'un échantillon, en utilisant soit la technique 20 de dosage "homogène", soit la technique de dosage *hétérogène". Lorsqu'on utilise la technique de dosage hétérogène, la séparation entre la fraction liée et la fraction libre de la molécule marquée par l'enzyme 25 est réalisée par des méthodes classiques, par exemple, par précipitation à l'aide d'un second anticorps Dans ces dosages, l'activité enzymatique de l'acétylcholinestérase peut être déterminée par une méthode classique, en particulier par la méthode dé30 crite par Ellman et Coll dans Biochemical PharmacoIogy 1961, vol 7, p 88-95, dont la mise en oeuvre est particulièrement simple et qui permet de détecter des concentrations d'enzymes de l'ordre de 10 13 M. D'autres caractéristiques et avantages de 35 l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exem- ples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence au dessin annexé sur lequel les figures 1 et 2 représentent les courbes d'étalonnage de dosages enzymoimmunologiques selon l'invention. EXEMPLE 1: Préparation d'un traceur enzymatique pour le dosage immunoenzymatique de la substance P (SP). Cette substance correspond à la séquence 10 d'acides aminés suivante: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu Met-NH 2. Pour préparer le composé covalent entre la substance P et l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus, on procède en deux étapes qui consis15 tent respectivement à préparer un dérivé intermédiaire de la substance P par conjugaison avec l'acide para- aminophénylacétique (PAPA) et à coupler le dérivé ainsi obtenu à l'enzyme par l'intermédiaire d'un sel de diazonium. a) Préparation du dérivé intermédiaire de la substance P. On prépare tout d'abord un ester actif de l'acide para-aminophénylacétique (PAPA) avec la N-hydroxysuccinimide (NHS) selon le schéma 25 réactionnel suivant: 0 O H 2 N Ki -CH C +HO-N H 2 N J CH 2-C-0-NX _ 30 PAPA NHS ESTER puis on fait réagir ce dérivé avec la substance P selon le schéma suivant: o O o H 2 N CH 2-C-0-N L^, H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met NH 21 0 H 2 N CH 2-CNH-Arg L-Pro- Lys-Pro -Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met -NH 2 NH O=C CH 2 NH 2 Pour préparer l'ester actif, on fait réagir ,1 mg de PAPA, 11,5 mg de NHS et 20,6 mg de dicyclocarbodiimide (DCC) dans 2 mg de dimé25 thylformamide (DMF) pendant 18 h à 220 C dans l'obscurité On élimine alors le précipité formé par centrifugation, puis on ajoute 20 1 l ( 1 lmol) du mélange réactionnel ainsi obtenu à 100 1 l de DMF/tampon borate 0,1 M p H 9 (V/V) 30 contenant 1 gmol de substance P (SP) et on laisse réagir pendant une heure à 4 "C à l'obscurité. On obtient ainsi le dérivé intermédiaire. b) Couplage du conjugué SP-PAPA à l'enzyme. Cette réaction de couplage correspond au 35 schéma suivant: il Na NO 2 OR ')NH 2 -C R(N= N OH R -NR=N HCI -H 20 + Hi SP-PAPA Hls A Ch E Ty r HA Ch E R O N=N-Tyr On ajoute 50 -il d'une solution aqueuse de Na NO 2 à 0,5 % à 1 mi de HIC 1 i 1 N contenant envrion 130 pmol de SP-PAPA obtenu précédemment, en opé25 rant à 41 C Après une minute, on ajoute cette solution à 1 ml d'une solution d'enzyme sous forme agrégée ( 100 ag) dans du tampon carbonate 0,5 M (p H 9) On laisse réagir pendant 30 minutes à + 40 C à l'abri de la lumière On neutralise 30 l'excès de réactif SP-PAPA non couplé à l'enzyme par addition de 100,1 d'histidine ( 100 zg) dans le tampon carbonate 15 minutes après, on filtre le mélange réactionnel à travers une colonne de Séphadex (G 25) de 2 cmx 40 cm en utilisant suc35 cessivement comme éluant du tampon TRIS 10-2 M, du Mg C 12 5 10-2 M et du Na Cl 1 M (p H 7,4). Le but de cette opération est d'éliminer la substance P non couplée à l'enzyme. On mesure ensuite l'activité enzymatique des différentes fractions collectées et on dé5 termine ainsi le profil d'élution de l'activité enzymatique On réunit les fractions, puis on les distribue dans plusieurs tubes à congélation et on les conserve dans l'azote liquide On purifie ensuite par filtration sur gel les compo10 sés correspondant aux différentes formes de l'enzyme (agrégats-f Ormefe S A 8-A 12 et G 4) en dilisant le gel A 15 m (de Biorad) aans une colonne de 90 cm sur 1,5 cm et en éluant par le tampon TRIS précédemment utilisé Après avoir réalisé le 15 profil d'élution de l'activité enzymatique, on réunit les différentes fractions du pic qui correspondent à l'élution des formes A 8-A 12, et on stocke le traceur enzymatique dans l'azote liquide jusqu'à son utilisation. EXEMPLE 2: Préparation d'un traceur enzymatique pour le dosage immunoenzymatique de la 6-keto-PG Fla qui est un métabolite de la prostacycline. La 6-kéto-PG Fla correspond à la formule 25 suivante: DOH 6 KETO-PGF 1 H H COOH 2 CH 3 OH H H OH On réalise le composé en deux étapes qui consistent respectivement à former un ester actif de 35 la 6-kéto-PG Fla et à coupler ensuite l'ester actif avec l'enzyme. a) Préparation de l'ester actif. On ajoute 10 1 l de DMF contenant 5,1 ',mol de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 10 i 1 de DMF contenant 5,1 lumol de dicyclocarbodiimide (DCC) 5 à 100 i 1 de DMF anhydre -contenant 5,1 bémol de 6-kéto-PG Fla et on laisse réagir pendant 18 heures à 22 o C à l'obscurité, ce qui conduit à la formation de l'ester actif de la 6-kéto-PG Fla selon le schéma réactionnel suivant: 10 6 KETO-PGF NHS H OH l + HO-N 15 O H H H OH H OH r' n H- ESTER ACTIF H OH H CO 30. H OH H OH b) Couplage de la 6-kéto-PG Fla à l'enzyme. On ajoute 2 i 1 de la solution d'ester actif dans le DMF dilué 50 fois obtenu dans l'étape a), (soit environ 10 nmol d'ester actif) à 30 500 i 1 de tampon borate 0,1 M, (p H 9) contenant 250 lg d'acétylcholinestérase sous forme agrégée On laisse la réaction se dérouler pendant une heure à + 4 C et on neutralise l'excès d'ester par addition d'l ml de tampon phosphate 35 0,1 M, Na Cl 0,4 M, acide éthylénediaminetétraacétique 10-3 M et BSA 0,5 % On obtient ainsi le couplage de l'enzyme selon le schéma réactionnel: H 2 N ESTER ACTIF +H 2 N H 2 H OH S CO NH 9 " OH H OH On purifie ensuite les composés correspondant aux différentes formes de l'enzyme par fil15 tration sur gel, en suivant la méthode décrite dans l'exemple 1. EXEMPLE 53 et 4: On procède comme dans l'exemple 2 pour préparer le PGD 2MO et le thromboxane B 2 marqués par 20 l' acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus en utilisant les mêmes quantités de réactifs (en moles). EXEMPLE 5 Cet exemple illustre l'utilisation du com25 posé obtenu dans l'exemple 1 pour le dosage enzymoimmunologique de la substance P. Pour cet essai, on utilise la SP marquée avec les formes A 8-A 12 de l'acetylcholinestérase d'Electrophorus Electricus, un premier anticorps 30 constitué par de l'antisérum de chèvre anti-y-globuline de lapin Pour effectuer l'essai immunologique, on procède de la façon suivante: on mélange 100 1 il du premier anticorps qui a été dilué 3000 fois dans le tampon de dosage (tampon phosphate 0,1 M, Na Cl 35 0,4 M, EDTA 10-3 M, BSA 0 5 %), 100 lu 1 de SP marquée diluée dans le tampon de façon à obtenir une activité enzymatique totale d'environ 2 de densité optique/ heure/ 2 ml de milieu d'Ellman, et 100 N 1 i de SP standard ou d'échantillon à doser On laisse incuber 1 nuit à + 40 C On ajoute alors 100 1 i de sérum de lapin non immun dilué au 1/100 dans du polyéthylène glycol à 8 % et 100 Fi du deuxième anticorps dilué au 1/5 Ce deuxième anticorps a été préalablement traité par le diisopropyl fluorophosphate, inhibiteur irréversible 10 de toutes les cholinestérases On laisse incuber pendant 1 heure à la température du laboratoire et on lave le précipité par 2 ml de tampon Après centrifugation et élimination du surnageant, on met en suspension le précipité dans 2 ml du milieu d'Ellman On 15 laisse la réaction enzymatique évoluer pendant 2 h-à la température du laboratoire On centrifuge pendant 5 minutes et on mesure l'absorbance à 412 nm En se référant à la figure 1 qui illustre la courbe d'étalonnage du dosage enzymoi-munologique de la substance P utilisant le composé de l'exemple 1 comme marqueur, on peut déterminer la concentration en SP de l'échantillon. Sur cette figure, on a porté en abscisse la dose (en ng/ml) de substance P dans l'échantillon, et 25 en ordonnée le rapport B/B O (en %) dans lequel B représente l'activité enzymatique liée aux anticorps en présence de substance P et B O représente l'activité enzymatique liée aux anticorps en l'absence de substance P Les valeurs de liaison non spécifiques ont été soustrait et elles représentent environ 5 % de l'activité totale. EXEMPLE 6Cet exemple illustre l'utilisation du composé obtenu dans l'exemple 2 pour le dosage enzymoim35 munologique de la PGD 2-MO Le protocole expérimental est identique à celui décrit pour la substance P dans l'exemple 5 L'antisérum anti-PGD 2-MO est dilué au 1-/105 La courbe d'étalonnage se rapportant à ce dosage est représentée sur la figure 2 (courbe 1). EXEMPLE 7 Cet exemple illustre l'utilisation du composé obtenu dans l'exemple 3 pour le dosage enzymoimmunologique du thromboxane B 2 Le protocole expérimental est identique à celui décrit dans l'exemple 5. 10 L'antisérum anti-thromboxane B 2 est dilué au 1/5 104. La courbe d'étalonnage se rapportant à ce dosage est représentée sur la figure 2 (courbe 2). EXEMPLE 8 Cet exemple illustre l'utilisation du com15 posé obtenu dans l'exemple 4 pour le dosage enzymoimmunologique de la 6 keto PG-FCL Le protocole expérimental est identique à celui décrit dans l'exemple 5. L'antisérum anti-6 Keto PG-F 1 L est dilué au 1/3 104. La courbe d'étalonnage se rapportant à ce dosage est 20 représentée sur la figure 2 (courbe 3). REVENDICATIONS 1 Composé constitué par une molécule choisie parmi les antigènes, les haptènes et les anticorps, liée par une liaison de covalence à une enzy5 me, caractérisé en ce que l'enzyme est l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. 2 Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé est un mélange de composés comportant l'acétylcholinestérase sous les 10 formes moléculaires A 8 et A 12. 3 Composé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la molécule est une prostaglandine ou un dérivé de prostaglandine. 4 Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la prostaglandine est la 6-kéto-PG F 11, la PGD 2-MO ou le thromboxane B 2. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la molécu20 le est la substance P. 6 Procédé de préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on fait réagir la molécule choisie parmi les antigènes, les haptènes et les anticorps 25 avec l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. 7 Procédé de préparation d'un composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on prépare un dérivé de la substance P par réaction de 30 celle-ci avec un ester actif de l'acide paraaminophénylacétique et en ce que l'on fait réagir le dérivé ainsi obtenu avec l'acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. 8 Procédé de préparation d'un composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un ester actif de la prostaglandine et en ce que l'on fait réagir l'ester actif ainsi obtenu avec 1 ' acétylcholinestérase d'Electrophorus Electricus. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on prépare l'ester actif de la prostaglandine par réaction de celle-ci avec du Nhydroxysuccinimide. Procédé de dosage enzymoimmunologique 10 d'une molécule choisie parmi les antigènes, les haptènes et les anticorps, caractérisé en ce que l'on utilise comme traceur un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. I