Brevet FR2551551A1 — publié le 19850308

La présente invention est relative à un réactif pour la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes, et à un procédé pour sa préparation. La présente invention a pour objet un réactif contenant de 1'acétone et du formaldéhyde ou du glutaraldehyde, des sels minéraux et des colorants, qui convient à la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier, par des methodes normales d'observation au microscope optique. I1 est connu que la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes fait partie du domaine des méthodes fondamentales des laboratoires cliniques. La numération des thrombocytes peut s'effectuer selon différentes méthodes 1) Numération électronique des éléments au moyen d'appareils automatiques mis au point pour la numération des thrombo cytes. Bien que cette méthode soit rapide et simple, il faut se procurer des instruments très coûteux. Cette mé thode n'est pas toujours propre à remplacer la détermina tion au microscope. La reproductibilité de cette méthode est en outre moins bonne que celle des compteurs micro scopiques. 2) Numération des thrombocytes à l'aide d'un microscope à contraste de phase avec utilisation d'une solution conte nant de la cocaïne ou de la novocaine ou d'une autre so lution de numération des thrombocytes. Pour la mise en oeuvre de cette méthode, le microscope à contraste de phase est indispensable. Un autre inconvénient notable réside dans le fait que pour le personnel qui réalise les essais cette méthode est fatigante, pénible et nuisible pour la vue, en particulier dans le cas d'un grand nom bre d'expériences. 3) Détermination du nombre des thrombocytes par une méthode de coloration. Cette méthode est la plus simple et peut etre mise en oeuvre à l'aide d'un microscope. Selon les méthodes actuellement utilisées, on met en oeuvre comme colorant le violet cristallin (violet de gentiane ; non chimique : chlorhydrate d'hexaméthyl-p-rosaniline). On fait à ces méthodes le reproche justifié de causer une distor sion comparativement à la détermination par contraste de phase, parce que les thrombocytes ne se colorent pas tous d'une façon bien visible. Dans le diagnostic hématologique, la numération des leucocytes constitue la méthode la plus largement utilisée. La solution de Türk décrite dans la Pharmacopée hongroise (Ph. Hg. VI.) convient généralement à cet effet et a donné de bons résultats, mais elle ne convient cependant pas à la détermination du nombre des thrombocytes. C'est là un inconvénient important parce que l'execution conjointe des deux essais de laboratoire les plus répandus serait très souvent nécessaire.Pour déterminer le nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier à l'aide d'un microscope optique normal, il est nécessaire de disposer d'une solution de colorant qui a) provoque l'hémolyse complète des érythrocytes sans dimi nution du nombre des thrombocytes et des leucocytes, b) fixe aussi bien les thrombocytes que les leucocytes, et c) contienne un colorant qui est fixé avec une grande affi nité aux éléments figurés susdits et les fixe de cette façon, en lumière normale. I1 est vrai que l'on connaît une solution qui répond aux deux premières conditions ci-dessus (Scand. J. Clin. Inzest. 33, 121 (1974)), mais on ne peut effectuer la numération des thrombocytes qu'en utilisant un microscope à contraste de phase. La présente invention a pour but de préparer une solution de colorant avec laquelle on puisse effectuer la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier en utilisant un microscope optique normal et en supprimant les inconvénients susdits des réactifs connus. L'invention repose sur la caractéristique surprenante selon laquelle l'association de la solution d'hémolyse et de fixation avec un colorant basique de grande affinité, permet d'obtenir une solution de réactif convenant à la détermination conjointe du nombre des thrombocytes et des leucocytes à l'aide d'un microscope optique normal. Les deux conditions ci-dessus peuvent être remplies si la solution d'hémolyse et de fixation n'est pas incompatible avec le colorant, c'est-à-dire ne forme pas de précipité. I1 faut éviter la formation de précipités microscopiques ; en effet, de tels précipités peuvent présenter un caractère de thrombocytes et ainsi déformer le résultat de la détermination. Les solutions de colorant du type du violet crésyle utilisées jusqu'à présent ne répondent que partiellement aux conditions ci-dessus ; en effet, les constituants colorants du type violet cresyle de la solution de numération présentent un caractère faiblement basique ; c'est pourquoi les thrombocytes ne prennent qu'une couleur pàle et les leucocytes ne sont pas nettement mis en évidence. On a trouvé, conformément à la présente invention, que les colorants dits à la thiazine conviennent très bien à cet usage. Les colorants du type thiazine sont caractérisés par la présence de deux groupes chromophores. Des composés du type thiazine ont déjà été utilisés dans la pratique médicale dans différents domaines (par exemple la coloration des bactéries, en histochimie), mais la littérature spécialisée et les brevets ne contiennent aucune allusion à la caractéristique qui fait l'objet de la présente invention. Les représentants les plus importants de ce groupe de composés sont le bleu de toluidine (formule I), la thionine (formule II) et le bleu de méthylène (formule III). La présente invention a pour objet un réactif pour la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et des leucocytes par une méthode normale d'observation au microscope optique, caractérisé par le fait qu'il contient 0,1 à 5 parties en poids d'acétone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde et/ou de glutaraldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids d'un colorant de thiazine - avantageusement le bleu de toluidine - 0,1 à 2,0 parties en poids d'un sel minéral, de préférence le chlorure de sodium, et de l'eau en quantité suffisante pour atteindre 100 parties en poids Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le réactif est constitué par 0,1 à 5,0 parties en poids d'acétone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids de bleu de toluidine et 0,1 à 2 parties en poids de chlorure de sodium. L'avantage particulier des colorants utilisés conformément à la présente invention réside dans le fait que ceux-ci présentent aussi une très grande affinité pour les macromolécules acides des thrombocytes et des leucocytes et présentent par conséquent une visibilité très intense et très marquée. L'avantage le plus important des réactifs conformes à la présente invention réside dans le fait que ceux-ci surpassent notablement la sensibilité des réactifs connus. Ce fait peut être démontré par les essais suivants Les résultats obtenus à partir d'échantillons comportant un nombre inconnu de thrombocytes et de leucocytes sont obtenus au cours de vingt déterminations successives du nombre des thrombocytes et des leucocytes.La précision de la méthode de numération des cellules est satisfaisante lorsque l'écart-type est inférieur à 10 t. Pour un nombre de thrombocytes de 218,8 G/1, l'écart-type ET est de ET = + 5,0 et en appliquant ces valeurs, le coefficient de variation (exprimé en tant qu'écart-type, en %) est de 2,28 (figure 1). I1 faut encore signaler que la valeur G/1 signifie le nombre de thrombocytes et de leucocytes, indiqué dans le Système International (G/l : giga-(nombre de cellules) = nombre de cellules x 109) (figure 1)-. L'erreur optimale de la numération des leucocytes, pour une moyenne de 5,08 G/1 est ET = + 0,042 , ce qui correspond à un coefficient de variation de 0,8 % (figure 3). Aux fins de comparaison, on compare la solution de réactif conforme à la présente invention, dans le domaine de la numération des thrombocytes, avec la composition de numération des thrombocytes mise sur le marche sous la marque déposée "THROMBOFIX" par la Société Godecke et dans le domaine de la numération des leucocytes, avec une solution de Türk. On effectue les essais comparatifs avec le sang de 41 patients, en déterminant parallèlement le nombre des thrombocytes et des leucocytes. Les résultats sont indiqués dans le système de coordonnées cartésiennes (figures 2 et 4). La corrélation entre les deux méthodes et les paramètres normalisés (a, b) de la fonction y = ax + b qui définit les corrélations se déterminent à l'aide d'une calculatrice Hewlett-Packard HP90. Lors de la numération des thrombocytes, la corrélation est (r) = 0,927 ; la corrélation fonctionnelle linéaire entre les deux méthodes peut être définie par l'équation y = 1,05 x - 0,94 ; y = le résultat obtenu avec la solution de numération des thrombocytes conforme à la présente invention ; x = le résultat obtenu avec le"THROMBOFIX"(figure 2). On peut constater que le nombre de thrombocytes obtenu en utilisant la solution de réactif conforme à la présente invention est supérieur d'environ 5 % au nombre obtenu à partir du même échantillon, en utilisant le "THROMBOFIX". Compte tenu du caractère de la détermination, une mesure en exces n'est pas à envisager. La différence obtenue peut être attribuée au fait que le composant colorant de la solution de réactif conforme à l'invention présente une af finité notablement plus grande pour les groupes acides des macromolécules des thrombocytes, c'est pourquoi l'image présente de plus grands contrastes et peut être mieux observée. Ainsi, en utilisant la solution de réactif conforme à l'invention, on peut éliminer la mesure-par défaut systématique obtenue avec les solutions de colorant connues. Il faut encore signaler que le "THROMBOFIX" présentait une mesure par défaut similaire même lorsqu'on utilisait un microscope à contraste de phase. Lors de la numération des leucocytes, la méthode conforme à la présente invention présente avec la solution de Türk une corrélation r - 0,959 ; la corrélation peut être exprimée par la fonction linéaire y = 0,97 x + 0,23. Cela porte à croire qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux méthodes. D'autres particularités de la préparation et de l'application de la solution de réactif conforme à la pré sente invention ressortiront des exemples qui vont suivre. Il doit être bien entendu1 toutefois que ces exem ples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'il 1z--:tration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEM2LE 1 Solution de numération On mélange 200 ml d'une solution à 0,9 % de chlorure de sodium dans de l'eau distillée avec 5 ml de format déhyde a 35 % et 770 ml d'eau distillée ayant subi un échange d'ions. Après avoir agité énergiquement, on dissout dans la solution 100 mg de colorant bleu de toluidine. On filtre la solution sur un filtre en verre G-4. Apres addition de 25 ml d'acétone, la solution doit être limpide et exempte de particules. EXEMPLE 2 Détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans du sanq veineux traité par un anticoagulant. On traite avantageusement le sang par l'acide éthy lènediaminetétracétique comme anticoagulant car en présence d'acide éthylènediaminetétracétique il ne se produit pas un dépôt minimal des thrombocytes. Après prélèvement du sang sur de l'acide éthylènediaminetétracétique, on ajuste la concentration de l'acide éthylènediaminetétracétique à 2 mg/ml par Evaporation préalable d'une solution-mere d'éthylènediaminetétracétique disodique dans un petit tube en matière plastique. On peut aussi empêcher la coagulation du sang en utilisant une solution à 3,3 % de citrate trisodique dans l'eau distillée ; lors du prélèvement du sang dans une canule en matière plastique, le rapport est de 9 parties de sang pour 1 partie de citrate. Mise en oeuvre de la méthode A 25 pl de sang veineux rendu incoagulable, on ajoute, dans un petit tube à essai en matière plastique,475 P1 de la solution de numération et on laisse rePoser le mélanae à la température ambiante pendant 15 minutes sans aqitation. La numération des thrombocytes et des leucocytes doit s'effectuer en l'espace de 6 heures. Avant la numération, on agite à nouveau la solution, on l'introduit ooutte-à-goutte dans une chambre de Bürker et on la laisse déposer pendant 10 minutes dans la chambre humide. a) Numération des thrombocytes. On multiplie le nombre total de thrombocytes compté dans les 10 rectangles de la chambre de Bürker par 2 (coagulation évitée par l'acide éthylênediaminetétracétique) ou par 2,2 (coagulation évitée par le citrate). On obtient le nombre de thrombocytes en G/l. b) Numération des leucocytes. On divise par 18 (ou on multiplie par 0,055) le nombre des leucocytes trouvé dans quatre carrés délimités par trois lignes, dans le cas de l'inhibition de la coagulation par le citrate, ou bien on le divise par 20 (ou on le multiplie par 0,05) si l'inhibition de la coagulation a été effectuée au moyen d'acide éthylènediaminetétracétique. On obtient le nombre de leucocytes en G/1. EXEMPLE 3 Détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang capillaire. On pique après désinfection le bout d'un doigt ou un talon, on essuie la première goutte de sang et on aspire 25 p1 de sang dans une pipette au moyen d'une seringue en matière plastique (type : par exemple pipette Finn, Gilson ou Eppendorf etc..). On introduit cette quantité de sang dans un petit tube en matière plastique qui contient 25 p1 d'une solution d'acide éthylènediaminetétracétique à 2 mg/ml et on la mélange bien à l'anticoagulant. Après addition de 450 Pl de la solution de numération-et agitation énergique, on laisse reposer la solution à la température au moins 15 minutes, après l'avoir agitée à nouveau on l'introduit goutte-à-goutte dans une chambre de Bürker et on la laisse déposer pendant 10 minutes dans la chambre humide. On détermine le nombre des thrombocytes et celui des leucocytes de façon analogue à ce que l'on fait pour un sang traité par un anticoagulant ; dans le cas de la numération des thrombocytes, le facteur de multiplication est 2 dans le cas de la numération des leucocytes, il faut diviser par 20. EXEMPLE 4 On opère comme dans l'Exemple 1, avec cette différence qu'au lieu de formaldéhyde, on utilise 80 g d'un glutaraldéhyde à 25 %. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée,de la présente invention. REVENDICATIONS 1.- Réactif pour la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et des leucocytes par une méthode normale d'observation au microscope optique, caractérisé par le fait qu'il contient 0,1 à 5 parties en poids d'acé- tone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde et/ou de glutaraldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids d'un colorant de thiazine - avantageusement le bleu de toluidine -, 0,1 à 2,0 parties en poids d'un sel minéral, de préférence le chlorure de sodium, et de l'eau en quantité suffisante pour atteindre 100 parties en poids. 2.- Procédé de préparation d'un réactif pour la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et du nombre des leucocytes par une méthode normale au microscope optique, caractérisé par le fait que l'on mélange 0,1 à 5 parties en poids d'acétone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde et/ou de glutaraldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids d'un colorant de thiazine - avantageusement le bleu de toluidine - et 0,1 à 2,0 parties en poids d'un sel minéral, ainsi que la quantité d'eau nécessaire pour atteindre 100 parties en poids. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on mélange 200 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, 25 ml d'acétone, 5 ml de formaldéhyde à 35 %, 770 ml d'eau distillée ayant subi un traitement échange d'ions et 100 mg de colorant bleu de toluidine.