Brevet FR2554239A1 — publié le 19850503

La présente invention concerne un procédé pour dé- terminer l'origine des particules dans l'urine provenant d'un appareil urinaire humain, o l'appareil possède un site pour produire la protéine de Tamm-Horsfall (THP). Sur la base de ce procédé, le nombre et la répartition des matières particulaires urinaires dont on détermine qu'elles proviennent de l'appareil urinaire qui est au- dessus du site de production de THP peuvent indiquer cer- tains types de désordres rénaux. La THP est une mucoprotéine que l'on trouve dans l'appareil urinaire de l'homme et elle est bien connue des spécialistes. Cf, par exemple, "Direct Visualization Of A Muco-Protein Component Of Urine" apr Keith R. Porter et Igor Tamm, The Journal of Biological Chemistry, Volume 212, N 1, janvier 1955, pages 135-139. Voir également "Ultra- centrifugation Studies Of A Urinary Muco-Protein Which Reacts With Various Viruses" par Igor Tamm, J.C. Bugher et F.L. Horsfall, Jr., The Journal of Biological Chemistry, Volume 212, Nol, janvier 1955, pages 125- 133. La THP est une muco-protéine qui est produite dans le rein chez l'hom- me. Les spécialistes connaissent également des anticorps anti-THP. On utilise les anticorps anti-THP pour déterminer les sites de production de THP dans les reins. En général, la THP n'est produite que dans la partie contournée distale de l'anse de Henlé, qui est -dans le rein. On utilise un anticorps anti-THP pour identifier les cellules qui produi- sent la THP. En outre, comme la THP inhibe l'agglutination virale, on utilise l'anticorps anti-THP pour trouver la THP inhibant l'agglutination virale. Ainsi, lorsqu'on analyse un échantillon d'urine humaine avec des matières particulaires urinaires, comme des érythrocytes, des leucocytes et des cylindres urinaires, il est difficile de déterminer l'origine de ces matières particulaires en l'absence de cylindres. Sans cylindres, il est généralement difficile de déterminer à quel endroit de l'appareil urinaire les matières particulaires urinaires trouvent leur origine. En connaissant la source des matières particulaires urinaires, il serait possible de déterminer certains types de désordres. Ainsi, si les leucocytes trou- vés dans les urines proviennent des reins, on soupçonne une infection du rein. D'un autre côté, si les leucocytes ne proviennent pas des reins, la probabilité d'une infection des reins s'éloigne. Ainsi, certains types de désordres rénaux peuvent être diagnostiqués si l'on peut identifier la source des matières particulaires urinaires. Dans l'invention, il est décrit un procédé pour différencier l'origine des matières particulaires urinaires dans un échantillon d'urine humaine. L'appareil urinaire possède un site pour produire la THP. L'appareil a une partie au-dessus du site et une partie en-dessous du site. On mélange l'échantillon d'urine humaine avec des anticorps anti-THP. I1 se forme alors des complexes anticorps anti-THP- antigène. On identifie les particules ayant le complexe anticorps antiTHP-antigène comme provenant de la partie située au-dessus du site. La fig. 1 est une vue schématique d'un néphron qui est une partie de l'appareil urinaire d'un sujet humain. Si l'on se réfère à la fig. 1, on voit un néphron qui est dans l'appareil urinaire d'un sujet humain. Le néphron 10 est présenté très agrandi et n'a que la section qu'il a dans le rein. Le long du néphron 10 se trouve un site 12 pour la production de THP. C'est la partie contour- née distale de l'anse de Henlé. La partie du néphron 10 qui est au-dessus du site 12 pour la production de THP est le tubule contourné proximal 13. En-dessous du site 12 de production de THP se trouve une autre partie du néphron 10, le tubule collecteur 16. Au-dessus du site 12 se trouvent 255423r également l'appareil de filtration 15 et la capsule de Bowman 14 o le filtrat est recueilli avant de passer à travers le néphron 10. Dans le procédé de l'invention, on recueille un- échantillon d'urine chez un sujet humain. L'échantillon d'urine possède des matières particulaires urinaires, comme des cylindres, des érythrocytes ou des leucocytes. On mé- lange alors un anticorps anti-THP à l'échantillon d'urine humaine. L'anticorps anti-THP forme des complexes anticorps anti-THP-antigène avec les particulesde l'urine qui sont revêtues de THP. On identifie les particules ayant les complexes anticorps anti-THP-antigène comme provenant de la partie du rein située au-dessus du site 12. L'identification des particules avec le complexe anticorps anti-THPantigène peut s'effectuer de différentes manières. On peut marquer l'anticorps anti-THP avec une substance fluorescente, comme la fluorescéine. On illumine l'urine avec un rayonnement ultra-violet et, là o la fluo- rescéine s'est fixée au complexe anticorps-antigène, elle entre en fluorescence. Mais on peut également marquer l'an- ticorps anti-THP avec une substance radioactive. Là o la particule avec la THP a formé un complexe anticorps anti- THP-antigène, elle émet de la radioactivité. On peut trans- former la radioactivité en scintillations visuelles et les détecter optiquement. Enfin, on peut examiner visuellement au microscope la marque sur l'anticorps anti-THP. L'anticorps anti-THP particulier utilisé pour former le complexe anticorps anti-THP-antigène peut être n'importe lequel des échantillons bien connus de la technique antérieure. Cependant, dans un exemple préféré, l'anticorps anti-THP est produit à partir de chèvre, plutôt qu'à partir de lapin. On l'isole alors par des techniques physiques et chimiques bien connues. L'échantillon produit à partir de chèvre est plus réactif que l'échantillon provenant de lapin. On peut utiliser la détection de la source des particules urinaires dans le diagnostic des désordres ré- naux chez un sujet humain. Comme auparavant, on obtient un échantillon d'urine contenant des matières particulaires urinaires provenant d'un sujet humain. On expose l'échan- tillon d'urine à l'anticorps anti-THP. Il se forme dans l'échantillon des complexes anticorps anti-THP-antigène. On identifie les matières particulaires urinaires avec les complexes anticorps anti-THP-antigène. On détermine la partie du total des matières particulaires qui forme des complexes anticorps anti-THP-antigène. Au cas o la fraction du total des matières particulaires est significative, l'échantillon indique que le sujet peut avoir un désordre rénal. Comme il a été dit plus haut, l'identification des complexes anticorps anti-THPantigène peut s'effectuer par n'importe quelle technique visuelle, fluorescente ou radio- active. Plus spécifiquement, on analyse un volume d'échan- tillon d'urine humaine contenant des matières particulaires urinaires. On commence par réduire l'échantillon urinaire en volume liquide d'environ la moitié. On le fait simple- ment pour accroître la concentration des matières particu- laires urinaires. On réduit le volume de 2 ml d'urine à environ 1 ml par centrifugation et aspiration. On ajoute 50 pl de l'anticorps anti-THP marqué à la fluorescéine au volume de 1 ml d'urine. On mélange l'anticorps anti-THP à l'urineen induisant manuellement un mouvement tourbillonnaire pour faciliter la for- mation de complexes anticorps-antigène. On observe le mé- lange obtenu à la lumière incandescente blanche pour déter- miner le nombre total d'érythrocytes et de leucocytes. En outre, on examine chaque cellule individuelle sous la lu- mière blanche comme monochromatique pour s'assurer de la présence d'un complexe anticorps anti-THP-antigène revêtant les cellules. On enregistre le nombre total de cellules examinées avec le nombre total de cellules dé- tectées présentant un complexe anticorps anti-THP-antigène. Lorsque le rapport des particules anticorps-antigène en complexes au nombre total de particules est significatif, alors l'échantillon d'urine indique que le sujet présente un désordre rénal. Dans une expérience avec des malades atteints de désordres rénaux chroniques, on analyse un échantillon d'urine de malades souffrant de néphrite glomérulaire. Ces malades ont 38 + 7% de leurs particules urinaires revêtues de THP. Pour les malades atteints de néphrite interstitielle chronique, on trouve que 57 + 10% des par- ticules urinaires sont revêtues de THP. L'invention repose sur l'observation selon laquelle les matières particulaires qui passent à travers le site 12 pour la production de THP dans un appareil urinaire sont revêtues de la THP. Ainsi, ne utilisant des anticorps anti- THP, on peut former des complexes anticorps anti-THP-anti- gène sur ces particules et identifier ces particules. On a également découvert qu'en exposant simplement les matières particulaires urinaires à la muco-protéine THP, on ne provoque pas l'apparition d'un revêtement de mucoprotéine THP autour de ces matières particulaires. Ainsi, on trouve que des cellules que l'on a baigné dans une solution conte- nant la muco-protéine THP ne sont pas revêtues de la muco- protéine THP. En fait même lorsqu'on a fait incuber des cellules dans une solution de THP pendant au moins 8 h, elles ne sont pas revêtues ainsi. Les matières particulaires uri- naires ne sont revêtues de THP que lorsqu'on les fait passer à travers le site 12 o la THP est produite. Les particules dans la partie 16 endessous du site 12, même lorsqu'on les mélange avec la THP provenant du site 12 dans le néphron 10, ne sont pas trouvées revêtues de THP. En outre, lorsqu'on enlève des érythrocytes de l'appareil de filtration 15 et qu'on les empêche de passer à travers le site 12, on trouve qu'ils n'ont pas de revêtement de THP. On pense que lorsque les particules provenant de la capsule de Bowman 14 par le tubule contourné proximal 13 passent à travers le site 12, ces particules sont modifiées d'une certaine façon pour permettre à la THP d'adhérer à ces particules. En outre, il faut noter que le passage de particules à travers la région productrice de THP o elles s'en revêtent est caractéristique de la THP uniquement. Ainsi, l'albumine provenant du rein ne revêt pas les cellules qui viennent du rein. Ainsi, la mise en évidence de cellules qui passent à travers le site 12 dans l'anse de Henlé sous forme revêtue de THP est originale et présente un caractère surprenant, et peut être utilisée pour le diagnostic de divers désordres rénaux. REVENDICATIONS 1. Procédé pour différencier l'origine des particules dans l'urine provenant d'un appareil urinaire, o ledit appareil a un site pour produire la protéine de Tamm-Horsfall (THP) et o ledit appareil a une partie au-dessus dudit site et unePartie en-dessous dudit site; ledit procédé comprenant les étapes consistant à: exposer ladite urine à des anticorps anti-THP; former des complexes anticorps cont-THP-antigène dans ladite urine; et identifier les particules ayant ledit complexe anticorps anti-THP-antigène comme provenant de ladite partie au-dessus dudit site. 2. Procédé de la revendication 1, o lesdites particules comprennent des particules rénales, des érythrocytes ou des leucocytes sanguins. 3. Procédé de la revendication 1, o ledit anticorps est marqué avec une substance fluorescente, et ladite étape d'identification implique en outre: d'irradier ladite urine avec un rayonnement ultra- violet; et de détecter le rayonnement fluorescent provenant de ladite urine. 4. Procédé de la revendication 1, o ledit anticorps est marqué avec une substance radioactive, et ladite étape d'identification implique en outre: de transformer ladite radioactivité en scintillations; et de détecter optiquement lesdites scintillations. 5. Procédé de la revendication 1, o ladite étape d'iden- tification implique en outre d'examiner visuellement ladite urine. 6. Procédé pour diagnostiquer un désordre rénal chez un sujet humain, comprenant les étapes consistant à: obtenir un échantillon d'urine contenant des matières particulaires urinaires provenant dudit sujet; exposer ledit échantillon à un anticorps anti- protéine de Tamm-Horsfall; - former des complexes anticorps anti-THP-antigène dans ledit échantillon; identifier les matières particulaires urinaires ayant ledit complexe anticorps anti-THP-antigène; et déterminer la fraction du total des matières parti- culaires qui forme le complexe anticorps anti-THP-antigène; o au cas o ladite fraction est significative ledit échan- tillon indique que ledit sujet est atteint d'un désordre rénal. 7. Procédé de la revendication 6, o lesdites particules comprennent des cellules rénales, des érythrocytes ou des leucocytes sanguins. 8. Procédé de la revendication 6, o ledit anticorps est marqué avec une substance fluorescente, et o ladite étape d'identification implique en outre: d'irradier ladite urine avec un rayonnement ultra- violet; et de détecter le rayonnement fluorescent provenant de ladite urine. 255423î 9. Procédé de la revendication 6, o ledit anticorps est marqué avec une substance radioactive, et o ladite étape d'identification implique en outre: de transformer ladite radioactivité en scintilla- tions; et de détecter optiquement lesdites scintillations. 10. Procédé de la revendication 6, o ladite étape d'iden- tification implique en outre d' examiner visuellement ladite urine. 11. Procédé pour diagnostiquer des désordres rénaux chez un sujet humain dans lequel: (a) on obtient un volume d'échantillon d'urine, contenant des matières particulaires urinaires provenant dudit sujet; (b) on ajoute une quantité connue d'un anticorps spécifique de la protéine de Tamm- Horsfall au mélange de l'étape (a); (c) on mélange physiquement le mélange de l'étape (b) pour faciliter la formation de complexes anticorps- antigène; (d) on détermine la fraction d'anticorps spéci- fique de THP de l'étape (b) qui reste libre, non complexée et non associée aux matières particulaires de l'échantillon d'urine; et (e) on identifie et on examine les matières parti- culaires urinaires qui se sont associées à l'anticorps spécifique de THP; o au cas o le rapport des particules complexées au total des particules est significatif, alors ledit échantillon d'urine indique que ledit sujet a un désordre rénal. 12. Procédé de la revendication 11 comprenant en outre l'étape de diminution du rapport du liquide aux matières particulaires en volume de l'échantillon d'urine. 13. Pocédé de la revendication 12 étape (a) o le volume original d'urine contenant des matières particulaires u- rinaires est d'environ 2 ml et est réduit d'environ la moitié. 14. Procédé de la revendication 12 o l'étape de diminution est effectuée par centrifugation et aspiration. 15. Procédé de la revendication 12, o la quantité connue d'un anticorps spécifique de la protéine TH est de 50pul. 16. Procédé de la revendication 11, o l'anticorps spéci- fique de THP est marqué pour faciliter l'identification de l'anticorps libre et non associé. 17. Procédé de la revendication 16 o l'anticorps spéci- fique de THP est marqué avec une substance fluorescente. 18. Procédé de la revendication 17, o ladite substance fluorescente est la fluorescéine. 19. PRocédé de la revendication 11, o au cas o le rapport de l'anticorps complexé au total de l'anticorps spécifique de THP est approximativement compris entre 0,31 et 0,45, ledit échantillon indique que ledit sujet est atteint de néphrite glomérulaire. 20. Procédé de la revendication 11, o au cas o le rapport de l'anticorps complexé au total de l'anticorps spécifique de THP est approximativement compris entre 0,47 et 0,67, ledit échantillon indique que ledit sujet est atteint de néphrite interstitielle.