Brevet FR2556365A1 — publié le 19850614

La présente invention concerne un procédé de préparation de l'interféron y humain. L'interféron y (ci-après IFN-y) est une glycoprotéine dotée in vitro d'une action anti-tumorale marquée. Il fait l'objet de nombreuses recherches au niveau pharmaceutique. Pour assurer le développement de ce produit, il convient de pouvoir le préparer en quantité importante afin d'en diminuer le prix. En mettant en oeuvre des techniques de génies géné- tiques on a pu décrire la préparation de l'IFN-y par fermen- tation bactérienne notamment dans la demande de brevet Européen 0077670. Toutefois il ne semble pas que les rendements obtenus soient particulièrement intéressants, ainsi dans le brevet mentionné précédemment l'activité du milieu fermenté est de 2,5 x 105U IFN-y/l ce qui est faible au niveau du rendement. La présente invention a pour objet d'accroître le rendement de la fermentation par un facteur de 10 000 à 20 000, la quantité d'IFN-y produit atteignant 20 %(du poids total) des protéines bactériennes produites. Pour ce faire la présente invention propose des nouveaux vecteurs. Il s'agit de vecteur d'expression de la protéine mature de l'interféron y dans les bactéries du type compor- tant le gêne codant pour la protéine mature de l'interféron y humain et les éléments plasmidiques assurant l'expression de ce gêne caractérisé en ce que l'extrémité 5' de la séquence codant pour la protéine mature est la suivante: ' ATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC 3' TAC ACG ATG ACA GTC CTA GGG Met Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Le début de la séquence originale et naturelle de IFN y est la suivante (moins le codon ATG de départ): ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA * en la îomparani avec la séquence proposée: ATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC on note quatre changements de nucléotides qui conservent la composition de la protéine. Dans les exemples qui suivent on démontrera que ces change- ments permettent de multiplier par environ 10 000 le rendement en IFN-y en particulier lorsque l'on utilise des vecteurs tels qu'ils seront décrits ci-après. Les vecteurs selon la présente invention comportent outre le gêne codant pour IFN avec une extrémité 5' comme indiquée précédemment: - l'origine de réplication d'un plasmide bactérien; - un promoteur, en particulier tout ou partie d'un promoteur du bactériophage À: PLi PR ou P'R' - une région codant pour l'initiation de la traduc- tion incorporant 1'ATG de l'extrémité 5' du gêne de IFN-y. La présence d'une origine de réplication pour un plasmide est essentielle pour permettre la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes, en particulier dans le cas de E. coli on utilisera, de préférence, l'origine de réplication du plasmide pBR322. Le plasmide pBR322 présente, en effet, l'avantage de donner un grand nombre de copies et ainsi d'augmenter la quantité de plasmides produisant la protéine désirée. Parmi les promoteurs du bactériophage À, on utilisera, de préférence, le promoteur principal de gauche noté APL. PL est un promoteur puissant responsable de la transcription précoce de À. Il est également possible d'utiliser d'autres pro- moteurs du bactériophage t, notamment le promoteur de droite, PR ou le second promoteur de droite, P'R. Bien qu'il soit possible d'utiliser des séquences d'initiation de la traduction très variées, on préfère utiliser celle de la protéine cII du bactériophage X qui sera nommée ci-après IcIIrbs. Comme cela sera démontré il est également possible d'utiliser de telles séquences synthétiques en particulier tout ou partie de la séquence: ATAACACAGGAACAGATCTATG. Le vecteur en cause comporte, en outre, de préférence une fonction d'antiterminaison de transcription codée par ex. par le gêne N de X noté ÀN. En présence du produit de transcription du gène N la transcription à partir de PL se poursuit au-delà -25 de la plupart des signaux stop. Ceci écarteles problèmes posés par un arrêt prématuré de la transcription qui peuvent se produire lorsque les gènes étrangers clones présentent de tels signaux stop. En outre, il a été démontré que l'expression à partir de PL est améliorée dans un environnement N+. Afin d'écarter les problèmes de toxicité et d'instabilité du systbme hôtevecteur en cas de production en continu de grandes quantités d'une protéine 6trangère, il est nécessaire de prévoir le contrôle de l'activité du promoteur en lui adjoignant tout ou partie d'un système d'expression inductible, en particulier thermo- inductible. De préférence, le contrôle par la température de la synthèse de la protéine étrangère est effectué au niveau de la transcription au moyen d'un répresseur thermosensible codé dans la bactérie hôte, par exemple cI857, qui réprime l'activité de PL & 28 C mais qui est inactivé à 42 C. Le répresseur agit sur l'opérateur OL qui est adjacent au promoteur PL. Bien que dans le cas précédent une partie du système d'expression thermo- inductible soit partie intégrante de la bactérie hôte, il est possible de prévoir que ce système fasse partie du vecteur lui-même. Le vecteur en cause peut également comporter un gène de résistance à un antibiotique, par exemple l'ampicilline dans le cas de pBR322, mais d'autres gènes de résistance peuvent être utilisés, résistance à la tétracycline (Tetr) ou au chloramphénicol (cmr). L'incorporation d'un tel marqueur est nécessaire pour la sélection des bactéries contenant les trans- formants porteurs du plasmide selon l'invention pendant les expériences de clonage. L'incorporation d'un gène de résistance permet d'augmenter la stabilité du plasmide en im- posant une pression de sélection lors de la fermentation, et en outre facilite l'isolement des transformants. Pour le clonage il est intéressant de disposer d'un système Permettant de détecter l'insertion dans un plasmide d'un ADN étranger. A titre d'exemple, 11l est possible de prévoir dans la tone de clonage le fragment N-terminal de la 8-galactosidase de E. coli (laca') en le fusionnant avec la région d'initiation de traduction dérivée de XclI, ce qui met la traduction du fragment a sous le contrôle des séquences de cIl. Le fragment a est complémenté par l'expression du fragment w C-terminal codé dans l'hôte, ceci conduit à une activité B-galactosidase dans les cellules. Cette activité B-galactosidase produit des colonies bleues en présence d'un substrat chromophorique, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-8-D-galactosidase. A 28 C, le promoteur PL est inactive, le fragment a n'est pas synthétisé et les colonies demeurent blanches. Lorsque la température est amende à 428C, le promoteur PL est active, le fragment a est synthétisé et les colonies virent au bleu. L'insertion d'ADN étrangers dans les sites de clonage situés dans ce système de détection empêche la synthèse de la B-galactosidase et conduit donc à des colonies blanches aussi bien à 28 C qu'à 42 C. Il est également possible de remplacer le gène lacZ'par d'autres gènes permettant une détection. La présente invention concerne en outre les bactéries notamment les souches de E. coli transformées par les vecteurs selon l'invention par des techniques connues et dont certaines seront rappelées dans les exemples. Enfin l'invention concerne un procédé de préparation de IFN-y humain dans lequel on cultive sur un milieu de culture des bactéries transformées comme décrit précédemment et dans lequel on récupère ensuite l'IFN-y formé. Les milieux de culture mis en oeuvre sont connus de l'homme de métier et devront être adaptés a chaque souche cultivée. La culture sera de préférence effectuée en présence de l'antibiotique a l'encontre duquel la souche transformée est devenue résistante. IFN-y est séparé après éclatement des cellules par des techniques connues comme la séparation sur colonne d'affinité ou la chromatographie d'exclusion. La présente invention comporte, bien entendu, d'autres aspects, notamment certains plasmides qui seront décrits dans les exemples ainsi que leurs mutants et dérivés et de façon générale les procédés de fermentation des bactéries trans- formées ainsi que l'IFN-y ainsi obtenu. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture des exemples ci-après et des dessins ci-annexés sur lesquels: - la figure 1 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG907, - la figure 2 représente la stratégie permettant de préparer le phage M13tg9lO, - la figure 3 représente la structure du phage M13tg910, la figure 4 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG908, - la figure 5 représente la séquence complète du gène codant pour IFN-y isolé à partir de la banque, - la figure 6 représente la stratégie de préparation de pTG909, - la figure 7 représente la stratégie de préparation de pTG941, - la figure 8 représente la stratégie de préparation de pTG951. Il convient de remarquer que les différentes séquences de nucléotides figurant dans les dessins doivent être considérées comme faisant explicitement partie de la présente description, ces séquences n'ont pas été reproduites dans le corps du texte afin de ne pas l'alourdir inutilement. 1) Procédés généraux a) Souches bactériennes Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes t TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes: su F his ilv bio (XcI857ABamAHI) 15. N6437, souche de E. coli ayant les caractéris- tiques suivantes: F his ilv gal A8proC: tn10 lacAm15 (XcI857ABamAHI). JmlO3 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes: A(lac-pro) supE thi endA sbcB15 sttA rK- nK+ / F1 traD36 proAB lacia lacZAm15. Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres souches dans la mesure o elles présentent certaines caractéristiques essentielles qui sont rappelées dans le cours de la description détaillée. b) Préparation des ADN Des mini-préparations d'ADN de plasmides ou de phages M13 sont effectuées comme cela est décrit par Ish-Horowitz (référence 1) 'à la seule différence que l'ADN est précipité une seconde fois avec de l'éthanol avant d'être utilisé. Les maxi-prparations sont effectuées comme cela est décrit dans la publication précédente, avec une purification complémentaire par un gradient de densité CsCl/bromure d'éthidium. c> Tehngusde clonages Le traitement des ADN avec des enzymes de restriction est effectué, sauf indications contraires, en utilisant les conditions indiquées par le fabricant (New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories et Boehringer Mannheim). Lorsque cela est nécessaire, les phosphates des extrémités 5' sont éliminés en utilisant, soit une phosphatase alcaline bactérienne, soit une phosphatase d'intestin de veau, pendant 30 minutes à 37 C dans le tampon d'enzyme de restriction. La réparation des extrémités cohésives utilisant la polymérase de Klenow (Boehringer Mannheim) est effectuée à 25 C pendant 15 minutes dans un mélange de mMbl. Tris HCl, pH 7,8, 5 mMol. MgCl2, 10 mMol; de Bmercaptoéthanol, 0,4 mMol. de dNTPs avec l'enzyme et 10 à 200 mg/ml d'ADN. La nucléase S1 (Miles) est utilisée à 2 u/gg d'ADN à 25 C pendant 30 minutes dans un milieu 0,3 Mol. NaCl, 0,03 Mol. NaOAc, pH 4,8, 0,003 Mol. ZnCl2. Bal31 est utilisée selon le procédé de Panayotatos et al. (référence 2). Les ligations sont effectuées à 15 C (sauf lorsque cela est indiqué différemment) pendant 4 à 24 heures en utilisant de l'ADN ligase T (Boehringer Mannhelm) avec 100 uMol. de NaCl, 66 mMol. de Trils HC1, pH 7,5, 10 mMol. de MgCl2, 0,5 xMol. de spermidine, 0,2 mMol. de EDTA, 2 mMol. de DTT, 1 mMol. d'ATP, 0,1 mg/ml de BSA et 5 & 50 mg/ml d'ADN. Pour la ligation d'extrémités cohésives, on utilise environ 30 unités/ml de ligase. Pour la ligation des extrémités franches on utilise environ 100 unités/ml de ligase. Entre les différentes réactions enzymatiques, des échantillons d'ADN sont extraits avec un mIélange----- phénol/chloroforme puis précipités & l'éthanol. Lorsque cela est nécessaire, du tARN de E. coli ou de levures est utilisé comme entra$neur. Les adaptateurs moléculaires (Collaborative Research, Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs) sont préhybridés et utilisés en excès molaire de 10 à 50 fois pour les extrémités franches d'ADN utilisant les conditions de tampon décrites précédemment avec 100 unités/ml de ligase T4 à 4 C pendant 15 heures. Lorsque l'on utilise des adaptateurs non phosphorylés, les adaptateurs qui n'ont pas réagi sont éliminés directement après ligation par précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine (Hoopes et al. - référence 3). Lorsque l'on utilise des adaptateurs phosphorylés, le mélange de ligation est tout d'abord extrait avec un mélange phénol/chloroforme puis précipité avec de l'éthanol avant comure spécifique avec les enzymes de restriction appropriées puis précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine. Les cellules bactériennes compétentes sont préparéespuistransformées avec les plasmides ou transfectées par l'ADN de M13 selon les procèédés décrits par Dagert et Ehrlich (référence 4). EXEMPLE 1 La préparation du pTG908 implique tout d'abord la préparation d'un plasmide comportant: - l'origine de réplication de pBR322, - le gène de résistance à l'ampicilline de ce même plaumide(ampR)., - le promoteur PL et le gène XN. 1) Suppression du site PstI dans pBR322 Le plasmide de base utilisé est le plasmide pBR322; toutefois, celui-ci présente l'inconvénient d'avoir à l'intérieur du gène ampR un site de restriction PstI, car un site de môme nature sera utilisé par la suite dans la zone de clonage comme site unique de restriction. Il convient donc de faire disparaître ce site de restriction PstI en S15 utilisant un mutant du plasmide pBR322, le plasmide pUC8, dans lequel le gène de résistance à l'ampicilline ne présente pas de site de restriction PstI (ce site a été éliminé par mutation in vitro). pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laboratories et pUC8 est décrit dans l'article référencé 5. Pour ce faire, on dchange le fragment PvuI/PvuII de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue PvuI/PvulI du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plasmides pBR322 et pUC8 sont traités S successivement par PvuI, PvuII, puis circularisés par section d'une ligase. On obtient ainsi le plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction PstI et qui a également perdu le site de restriction NdeI Drsent l'origine sur pBR322 (non représenté sur la fig. 1). En outre, le plasmide pTG902 porte un fragment de 50 bp correspondant à la séquence laci' dans lequel se trouve le site PvuII. 2) Insertioin du promoteur PL et du gène AN et préparation du plasmide de pTG907 Le promoteur PL et le gène XN sont isolés du plasmide pKC30 pour être insérés dans pTG902, le segment prélevé contient également l'opérateur OL sur lequel agira le répresseur thermosensible c1850, comme cela sera décrit dans les essais. En outre, le procédé permet de supprimer les sites EcoRI et HindIII tout en conservant un site unique BamHI en aval du gène N pour pouvoir ensuite insérer AcIIrbs. Le plasmide de pKC30 est décrit dans la référence 6. pTG902 est coupé en son site de restriction unique EcoRI et les extrémités 5' sortantes sont éliminées par traitement à la nucléase S1. Après une digestion avec BamHI, le fragment le plus important est purifié sur gel. Le fragment portant le promoteur PL et le gène XN est préparé de la mime façon à partir de pXC30 en traitant successivement le plasmide par PvuI, la nucldase S1 et BamHI. Les fragments,aprbs purification sur gel, sont soumis & l'action de la ligase, ce qui conduit & la fusion EcoRI/PvuI et b la reconstitution du site BamHI. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer des cellules hôtes compétentes, TGE900, b 30 C. Cette souche contient le prophage A délété, XcI857ABamAHI, qui fournit le répresseur de X thermo- sensible,cI857, qui est nécessaire pour bloquer la transcription b partir de PL' Ceci est important car l'activité de PL dans un milieu N+ est léthale compte tenu de la fonction d'antiterminaison de N. Après analyse par enzymes de restriction, les clones contiennent des plasmides de structure correcte et sont ensuite testés pour leur manque de viabilité b 42 C. L'un des plasmides obtenus, pTG906, est traité de façon b éliminer le segment PvuII-SalI de manière à supprimer les sites de restriction compris sur ce segment et afin de faire disparaltre également les deux sites de restriction extrêmes. Pour ce faire, pTG906 est traité successivement avec SalI, la nucléase S1, PvuII et la ligase. On obtient ainsi le plasmide pTG907 qui comporte l'ensemble des éléments évoqués au début de cette étape et, en outre, qui est Pst Eco Hind Sal Ava Nde PvuII-. La synthèse de ce plasmide est représentée sur la figure 1. 3) Clonaoe de la rtoion rcIlrs La seconde phase importante de la synthèse consiste à insérer la régionXcIIrbs sous forme d'un fragment AvaI/TaqI dans le début du gène lacZ' (fragment a de la s-galactosidase) lequel a été cloné dans le phage M13 nommé M13tgllO. Cette stratégie permet un test fonctionnel simple pour rbs, à savoir la production de la protéine lacZ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal; ceci permet également un séquençage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxy. Dans le cours des expériences, différents dérivés du phage M13 seront mentionnés. Précédemment on a mentionné le phage M13tg110 et dans la suite de la description on utilisera d'autres phages du même type dont la construction va être rappelée ci-après. La construction de ces vecteurs est indiquée dans le tableau I ci-après sur lequel figurent les références du phage de départ, la nature de l'enzyme de restriction avec laquelle il a été découpé, le traitement particulier qu'ont subi les fragments ainsi obtenus et la nature de l'insert qui a été fixé dans les sites ainsi révélés. Le phage M13mp7 est commercialisé notamment par la société Bethesda Research Laboratories. M13mp701 est obtenu à partir de M13mp7 par remplacement du fragment PstI/EcoRI à droite (CTG CAG... GAA TTC) par la séquence: CTG CAG CAA TTC. Le principe de la construction est décrit dans le schéma suivant: ATG ACC ATG A1T ACC AAT ICC CCú AT CCG TCG ACC TlC A GC AAT C CT CC l13mpO Sa. IIlj son 81 ATGACCATGATTACGAATTCCCCG GATCCGTCGACCTGCAGCAATTCACTGGCC TACTGGTACTAAT6CTTAAGGGGCCTAG GCAGCTGGACGTCGITAAGTGACCGG I DIA polymerase ATGACCAIGATTACGAATTCCCCGGATC 6ATCCGTCGACCTGCAGCAATTCACTGGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAG CTAGGCAGCTGGACGTCGTTAAGIGACC&G I Linker HindIll 1* ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCCAAGCTTGG CCAAGCTTGGATCCGTCGACCGGCAGCAACTTACTUGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGAACC GGTTCGAACCCTAGGCAGCTGGACGTCGTTAAOTGACCG6 #indIl. ATGACClTGATTACGAATCCCCGGATCCCA AGCTTSGGATCCGTC6ACCTGCAGCAATTCACTGGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGA ACCCTAGGCAGCTGGACGTCOTTAAUT6ACCt IT DIA ligase ATG ACC ATIG ATT ACG 1AT TCC CC6 6AT CCC AAG CTT 66 AT Ct CGT A CCT C: ICA ATT CAC T6 CC Eco eI lab I Nind lw la. NI Sal I Pst TABLEAU I Phage Site de Phase Phase Phase Complémen- Nom Parental clivage Traitement Insert de de de tation de NOM parental clivage H--IIBH 7-I lc HinIII BamHI PstI laca */- M13mp701 M13mp7 Construction D.R. Bentley O I I M13tglO2 M13mp701 AccI ADN séquence I + polymérase HindIII(a) M13tgll0 M13mp7l01 AccI S1 nucldase séquence III - HindIII(a) III séquence M13tg115 M13tg110 EcoRI S1 nucldase squencBglII(b) II III I + (a) Adaptateur de séquence HindIII phosphorylé CCAAGCTTGG (b) Adaptateur de séquence BglII non phosphorylé CAGATCTG n Ln Ln ul Les protocoles d'utilisation des enzymes (restriction, ADN polymérase, T4ADN ligase) sont ceux indiqués dans les notices des fournisseurs. Le "linker" HindIIIl est un oligonucléotide synthétique de séquence S CCAAGCTTGG 3 (Collaborative Research Inc., Waltham, p Mass 02154, E.U.A.). La région cIIrbs est isolée à partir d'un plasmide pGll (réf 7) qui contient un fragment de XHaeIII/Sau3A qui s'étend du milieu du gène cro jusqu'au milieu de la région codant pour cIT (cro et clI étant impliqués notamment dans la régulation de la lysogénie du bacté- riophage X). On prélève dans pOG11 le fragment AvaI/TaqI de 186 bp contenant la région cIIrbs et on le traite avec la polymérase Klenow. D'autre part, on traite le phage M13tgllO par BamHI puis par la polymérase de Klenow suivi d'un traitement à la phosphatase intestinale de veau. Les fragments obtenus sont soumis à l'action de la ligase T4. Un examen des séquences du fragment de pOG11 comportant la régioncIIrbs et du phage M13tgllO permet de prévoir que l'insertion du fragment portant cIIrbs dans le site BamHI de Ml3tgllO doit conduire à l'obten- tion de plaques bleues après fermentation des bactéries transfectées compte tenu du fait que le gène lacZ' est en phase pour la traduction à partir de AUG du gène de cII, tandis que les plaques correspondant à la souche parentale Ml3tgllO sont blanches. Les plaques bleues mont Prélevées puis les colonies sont sélection- nées par analyse de restriction enzymatique des mini- préparations et l'on vérifie ensuite par séquençage que la construction obtenue est correcte. On obtient ainsi un clone résultant M13tg910 dont la structure globale est représentée & la partie inférieure de la Figure 2 et la structure détaillée est représentée à la figure 3. On constate que l'insertion du fragment cIIrbs reconstruit en amont les sites BamHI et AvaI et en aval le site BamHI. La traduction à partir de AUG de cII conduit à la fusion des 13 aminoacides terminaux de cII aux 8 aminoacides du NH2 terminal de la protéine lacZ'. 4) Insertion du fragment >cIIrbs dans le plasmide pTG907 La troisième étape de cette synthèse consiste à transférer le fragment cIIrbs/lacZ' du phage M13tg910 sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédemment. Pour ce faire, il convient tout d'abord d'éliminer les sites EcoRI, BamHI et AvaI en amont de cIIrbs puis d'insérer un site BgllI. Dans ces conditions, cIIrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site BamHI en aval du promoteur PL et du gène AN de pTG907. Le phage M13tg910 est digéré avec EcoRI puis traité avec Bal31 puis ensuite par la polymérase de Klenow. Les fragments obtenus sont alors soumis à l'action de la ligase en présence d'adaptateurs BglII non phosphorylés. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM103. On sélectionne alors les plages bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin de vérifier qu'ils contiennent le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI ou BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg912 dont la structure est représentée sur la figure 4. Le traitement par Ba131 a produit une délétion de 101 bp éliminant les sites EcoRI, BamHI et AvaI; ainsi que les séquences de lac ATG et lac Shine/Dalgarno. Le site BglII introduit se trouve placé enrion 100 bp en amont de i'ATG de cII et 10 bp en aval de Plac' Le fragment BamHI/SphI de pTG907, le fragment BglII/ HgaI portant cIIrbs et lacZ' et l'adaptateur phosphorylé ont été préhybridés dans un rapport molaire de 1:2:1 puis traités avec la ligase T4. Des aliquots sont utilisés pour transformer les cellules compétentes de la souche 6150 à 30 C. Les cellules intéressantes sont identifiées en sélectionnant les transformants avec un fragment cIIrbs/lacZ' marqué au p32 et la construction obtenue est confirmée par une étude de restriction enzymatique. Afin d'avoir une première indication montrant que les différents éléments du système d'expression se conduisent comme cela est désiré, le plasmide obtenu, pTG908, est trans- féré dans une souche hôte N6437 qui possède à la fois c1857 et le fragment w de la e-galactosidase complémentant le fragment a qui est codé par le plasmide. Les transformants obtenus placés sur une botte contenant IPTG + Xgal sont blancs à 28"C puis virent au bleu environ 30 minutes après lorsqu'on les transfère à 42"C. EXEMPLE 2: Sélection du clone de cDNA de IFN-y humain On réalise selon les procédés connus une banque de cDNA à partir des mARN de lymphocytes induits par des agents mitogènes. Puis on sélectionne un clone comportant la séquence codant pour IFN-y complet (figure 5) ce clone est dénommé pTG11. IFN-y est synthétisé sous forme d'un prépeptide dont la séquence signal de 20 amino-acides est scindée pour donner le polypeptide mature qui débute par la séquence cys-tyr-cys et couvre les amino-acides 21 à 166. L'analyse de la séquence des nucléotides pour les sites de restriction révèle un site EcoRII à 8 bp en aval du départ de la protéine mature et un site Sau3A à 285 bp en-aval du codon stop, ce qui permet d'isoler pratiquement toute la séquence codant pour la protéine mature sur un fragment EcoRII/ Sau3A. EXEMPLE 3: Construction de pTG909 plasmide expirant faiblement IFN-y humain La figure 6 schématise la préparation de pTG909. On utilise tout d'abord une molécule d'adaptation synthétique qui permet: a) d'effectuer la jonction entre les extrémités EcoRII et NdeI, b) d'introduire les 8 bp manquantes par rapport à la séquence codant pour IFPN-y mature et, c) de reconstituer le codon de départ ATG de cIIrbs de façon que la séquence codant pour la protéine IFN-y mature soit traduite sans amino-acides fusionnés à l'exception de l'initiateur F-met. Cet adaptateur est synthétisé chimiquement et sa constitution est représentée sur la figure 2. pTG11 est mis en digestion avec EcoRII et Sau3A et pTG908 avec NdeI et BamHI. Les fragments appropriés sont purifiés sur gel, mélangés avec une quantité équimolaire de l'adaptateur, préhybridés et ligés. Le mélange est utilisé pour transformer des cellules compétentes TGE900 et les transformants sont sélectionnés en hybridant un insert PstI de pTG11 "nick- traduit" et marqué au p32 avec lestrasforrmants. 13 clones sont sélectionnés et contrôlés par carto- graphie et l'un d'eux pTG909 est vérifié par séquençage. - La mise enculture du clone de TG9"O transforné par TG909 e effectuée sur un milieu LB avec 50 pg/ml Ampicilline jusqu'à une densité optique DO660 = 0,3 (-_ 108 cellules/ml) et induite pendant 1 heure à 42 C. Les extraits sont préparés pour tester leur activité IFN-y selon des procédés connus:Les résultats montrent une activité de 105 unité/l de culture en IFN-y. Le poids moléculaire de la protéine d'environ 17000 dalton est en bon accord avec ce que l'on sait de IFN-y. Mais cette activité correspond à environ 0,001 % du contenu total en protéine de la cellule. C'est ce résultat qui a amené à réétudier la structure fine des bases au voisinage de codon de départ et à proposer des mutations ponctuelles conservatrices permettant d'améliorer le rendement en IFN-y. EXEMPLE 4: Construction du vecteur pTG941 pTG909 contient 2 sites NdeI, l'un au codon de départ de IFN-y et l'autre 22 bp plus tard dans la séquence IFN-y (voir figure 7). La région entre ces sites qui est la region codant pour les 7 premiers amino-acides de IFN-y a été éliminée par traitement avec NdeI et remplacée par un oligonucleotide synthétique qui est représenté sur la figure 7e Cette réaction détruit le site NdeI aval et reconsti- tue le site NdeI amont tout en introduisant un site BamHI qui est unique. * Ce changement de base est conservateur, c'est-à-dire que la séquence d'amino-acide n'est pas altérée. Les extraits obtenus dans les mêmes conditions que précédemment à partir de souche transformée par le plasmide pTG941, contiennent 2 x 10 9U/l IFN-y. Ce résultat est 10 000 fois supérieur aux résultats obtenus avec pTG909 et correspond à 10 % du poids total des protéines cellulaires produites. EXEMPLE 5: Construction de pTG951 La figure 8 schématise la construction de pTG951 qui est un dérivé de pTG941 dans lequel un fragment contenant le cIIrbs a été remplacé par une séquence synthétique sur la base de la séquence de la région d'initiation de la traduction de l'opéron E. coli lac noté E. coli lac opéron rbs. Cet oligonucloéôtide synthétique a été inséré entre le site unique NdeI du codon de départ de la séquence codant pour IFN-y et le site ClaI qui a été inséré au niveau du site HgaI dans le gène N. De ce fait par traitement avec NdeI et ClaI le plasmide pTG951 ne contient plus qu'un gène N tronqué (un codon stop en phase avec la traduction du gène N est placé immédiatement en amont du nouveau site rbs) et est dépourvu des terminateurs de de transcription tLl et tRl présents dans pTG909 et pTG941. Les extraits bactériens obtenus à l'aide de bactéries transformées par pTG951 conduisent à une production de 5 x 109 IFN-y U/1 de culture, ce qui correspond a 25 % du poids total des protéines cellulaires produites. Le site rbs synthétique de pTG951 contient un site BglII unique immédiatement avant le codon de départ, il est donc possible de faire des dérivés de pTG951 par scission avec BglII suivi par diverses manipulations utilisant soit l'ADN polymérase I ou la nucléase Si. Ces dérivés présentent des variations dans la distance et les séquences entre la séquence de Shine/Dalgarno et 1'ATG. Mais aucun des plasmides ainsi préparé ne présente une activité supérieure au pTG951 lui-même. Les principaux résultats sont rappelés dans le tableau ci-après: an ul uL ctJ NN % 0I 2989-2998 (1981). 2. Panayotatos N. et Trong K., Nucl. Acids Res. 9, 5679-5688 (1981). 3. Hoopes B.C. et McClure R.R., Nucl. Acids Res. 9, 5493-5504 (1981). 4. Dagert M. et Ehrlich S.D., Gene, 23-28 (1979). 5. Vieira J. et Messing J., Gene 19, 259-268. 6. Shimatake H. et Rosenberg M., Nature, 292, 128-132, (1981). 7. Oppenheimer A.B., Gottesman S. et Gottesman M., J. Mol. Biol., 158, 327-346 (1982). REVENDICATIONS 1. Vecteur d'expression de la protéine mature de l'interféron y dans les bactéries du type comportant le gène codant pour la protéine mature de l'interféron y humain et les éléments plasmidiques assurant l'expression de ce gène caractérisé en ce que l'extrémité 5' de la séquence codant pour la protéine mature est la suivante: ' ATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC 3' TAC ACG ATG ACA GTC CTA GGG Met Cys Tyr Cys Gln Asp Pro 2. Vecteur de clonage selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte en outre: a) l'origine de réplication d'un plasmide bactérien, b) un promoteur, c) une région.d'initiation de la traduction compor- tant le sodon ATG de la séquence codant pour IFN-y mature. 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comporte: a) l'origine de réplication d'un plasmide bactérien, b) un promoteur du bactériophage B, PL' PR ou P' c) une région d'initiation de la traduction choisie parmi tout ou partie XcIIrbs ou une séquence synthétique placée sous le contrôle du promoteur du bactériophage À. 4. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région d'initiation de la traduction est XcIIrbs. 5. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région est constituée par tout ou partie de la séquence: ATAACACAGGAACAGATCTATG. 6. Vecteur selon l'une des revendications 1 & 5 caractérisé en ce que le promoteur utilisé est le promoteur PL' 7. Vecteur selon l'une des revendications 1 a 6 caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une fonction d'antiterminaison de transcription. 8. Vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce que la fonction d'antiterminaison de transcription est le gène AN. 9. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comporte l'origine de réplication de pBR322. 10. Vecteur selon l'une des revendications 1 a 9 caractérisé en ce qu'il comporte un gène codant pour la résistance à un antibiotique. 11. Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comporte un gène de résistance à l'ampicilline. 12. Les plasmides-vecteurs pTG941'et pTG951 ainsi que leurs-m.utant6s-et. dérivés. 13. Bactéries transformées par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 12. 14. Bactéries selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit de E. coli. 15. Procédé de préparation d'interféron y humain caractérisé en ce qu'on a cultivé sur un milieu de culture une bactérie selon l'une des revendications 13 et 14 et en ce que l'on isole IFN-y humain obtenu après culture.