Brevet FR2550547A1 — publié le 19850215

La présente invention concerne un nouveau plasmide contenant un gène accroissant la production de pénicilline-acylase, un micro-organisme contenant ce plasmide, des procédés de préparation de ce plasmide et de ce micro-organisme et un procédé pour améliorer la production de pénicilline-acylase. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour accroître la production de pénicilline-acylase et une souche améliorée de Bacillus megaterium utile dans la production de pénicillineacylase. L'invention concerne un procédé qui, par l'emploi d'une technique d'ADN recombinant permet d'obtenir des rendements en pénicilline-acylase nettement supérieurs à ceux qu'on pouvait obtenir à ce jour par emploi des techniques classiques de mutagénèse et de sélection Le procédé de l'invention pour améliorer les rendements 15 en pénicilline-acylase comprend l'isolement d'un fragment d'ADN chromosomique choisi de Bacillus megaterium,lequel fragment contient le gène approprié accroissant la production de pénicilline-acylase, l'insertion d'un tel fragment d'ADN dans un vecteur à copies multiples, qui se réplique dans les bactéries à gram positif, puis le transfert 20 du vecteur à copies multiples obtenu contenant ledit fragment d'ADN dans un organisme hôte déjà connu pour synthétiser la pénicillineacylase, c'est-à-dire Bacillus megaterium, pour produire un Bacillus megaterium ayant une capacité accrue de production de pénicillineacylase. De plus, selon l'invention, on fournit un vecteur ou plasmide clonant (obtenu à partir de Bacillus subtilis), à savoir p PL 608, qui comprend comme fragment inséré un fragment d'ADN chromosomique choisi de Bacillus megaterium qui est un fragment d'ADN chromosomique de 1 kb à 10 kb, de préférence de 2,7 kb, comprenant le gène 30 approprié à l'accroissement de la production de pénicilline-acylase: ce plasmide préféré est appelé plasmide p JM 3. De plus, selon l'invention, on fournit une nouvelle souche de Bacillus megaterium, la souche SC 3593 (p J 13) ayant une capacité accrue de production de pénicilline-acylase comprenant le plasmide ou vecteur clonant p PL 608 contenant le fragment d'ADN chromosomique de 2,7 kb. 2550547. Le plasmide p JM 3 est formé d'un plasmide p PL 60 08 de Bacillus subtilis (Lovett, P S et coll, "Expression of a Foreign Procaryotic Gene in Bacillus subtilis in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals" {Hollaender A et coll éditeurs) 51-59 (Plenum Press, New York, 1982)) contenant un fragment Hind III d'ADN de Bacillus megaterium ( 2,7 kb) inséré en son site Hind III unique. Dans ce fragment Hind III d'ADN chromosomique de Bacillus megaterium se trouve un gène qui peut être inséré dans une souche quelconque de Bacillus megaterium capable de synthétiser la pénicil10 line-acylase selon la technique de transformation décrite par Brown et Carlton "Plasmid Mediated Transformation in Bacillus megaterium"' J Bact 142, 508-512 ( 1980) Ces souches de Bacillus megaterium contenant le plasmide p JM 3 produisent des titres de pénicillineacylase supérieurs à ceux des souches identiques ne contenant pas 15 le plasmide. Lorsque le fragment d'ADN chromosomique provenant de Bacillus megaterium est un fragment d'ADN chromosomique de 1 kb à kb et non un fragment d'ADN de 2,7 kb, on emploie une enzyme de restriction autre que Hind III, à savoir Mbo II, Hpa II, Hae III ou 20 Eco RI Le fragment d'ADN de 1 kb-10 kb (autre que le fragment de 2,7 kb) comprend le gène approprié de production de pénicillineacylase et peut être inséré dans Bacillus subtilis selon les modes opératoires décrits ici pour former un plasmide approprié Le plasmide ainsi formé peut être cloné dans Bacillus megaterium selon les 25 techniques décrites ici. La figure unique annexée est une carte du plasmide p JM 3 montrant les sites correspondant aux enzymes de restriction. Le segment inséré de Bacillus megaterium est localisé entre les deux sites Hind III. On peut se procurer les micro-organismes suivants à la collection permanente de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. Bacillus megaterium SC 3593, ATCC 14945 Bacillus megaterium SC 3593, ATCC 14945 (p JM 3) ATCC 39383 L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE On prépare comme décrit ci-après un plasmide (p JMI) contenant un fragment d'ADN chromosomique de Bacillus megaterium (SC 3593, ATCC 14945). On utilise le vecteur d'expression p PL 608 (Bacillus subtilis) (Lovett P S et coll, "Expression of a Foreign Procaryotic Gene in Bacillus subtilis in Genetic Engineering of Microorganisms 10 for Chemicals" (Hollaender A et coll éditeurs) 51-59 (Plenum Press, New York, 1982) Ce vecteur confère à son h 6 te une résistance à la néomycine et au chloramphénicol et a un site d'inactivation par insertion Hind III (enzyme de restriction) dans le gène de la chloramphénycol-acétyl-transférase (CAT). On construit une petite bibliothèque de plasmides par insertion de fragments chromosomiques Hind III de Bacillus megaterium dans ce site Hind III Pour cela, on clive l'ADN de p PL 608 de Bacillus megaterium avec l'enzyme de restriction Hind III On mélange l'ADN et on le remet sous forme circulaire avec de la polynucléotide20 ligase On introduit cet ADN dans Bacillus subtilis en utilisant le mode de transformation de Keggins et coll '"Molecular cloning of genetically active fragments of- Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of vector plasmid p UB 110 " Proc Nat Acad Sci USA ( 1978) On obtient 1500 isolats de Bacillus subtilis résistant 25 à la néomycine mais sensibles au chloramphénicol. La taille moyenne des fragments insérés dans la bibliothèque des fragments Hind III de Bacillus megaterium ( 3593) est de 3,2 kb, comme le montrent les mesures de la taille des fragments insérés dans un échantillon aléatoire de 20 des plasmides. On sélectionne comme décrit ci-dessous la souche de Bacillus megaterium SC 3593 (p JM 3) contenant le plasmide (p Ji 3). On introduit de l'ADN de plasmide provenant de la bibliothèque dans Bacillus megaterium SC 3593 par transformation. La méthode de transformation est la même que la méthode de trans35 formation de Bacillus megaterium mise au point par Brown et Carton "Plasmid Mediated Transformation in Bacillus megaterium, J Bact 142, 508512 ( 1980) aux modifications suivantes près Une concentration de lysozyme de 1 pg/ml a été nécessaire pour la formation des protoplastes. On a laissé les protoplastes se régénérer sur des boîtes de DM-3 sans sélection par un antibiotique et les cellules transformées ont été sélectionnées selon la technique des répliques sur des milieux contenant un antibiotique (néomycine à 2,5 pg/ml). Les transformants ont été sélectionnés selon le test rapide sur boîte avec papier-filtre comme décrit par Szweczuk et col. "'Colorimetric assay of penecillin amidase activity using phenyl10 acetylaminobenzoic acid as substrate" Analytical Biochem, 103, 166-169 ( 1980). Les modifications suivantes de leur méthode de détermination des colonies sur papier-filtre ont été effectuées Les papiers-filtres ont été séchés à 65 C pendant 7 min puis retirés 15 des boîtes Les concentrations des pulvérisations de nitrite de sodium et d'acide H ont été décuplées Pour déterminer les colonies ayant une forte capacité de production de la pénicilline-acylase, la concentration du substrat a été réduite de moitié et de l'acide phénylacétique a été ajouté à une concentration de 2 Z-au tampon 20 servant de substrat Des colonies cultivées sur boîtes de gélose tryptosée au sang (TBAB, Difco) pourraient être étudiées selon cette méthode. Un transformant de Bacillus megaterium contenant un plasmide forme une tache plus intense dans cet essai que le SC 3593 non 25 transformé dans des essais répétés. Un plasmide de 7,7 kb {p JM 3) a été isolé de cette souche (SC 3593 (p JM 3)) La digestion de ce plasmide avec Hind III et l'électrophorèse sur un gel à 1 Z d'agarose ont révélé que le plasmide contenait un fragment de taille identique au p PL 608 avec un frag30 ment additionnel de 2,7 kb. La capacité de production de la pénicilline-acylase de la souche de Bacillus megaterium SC 3593 (p JMI) a été étudiée comme suit. Avec une anse stérile, on a ensemencé avec des cellules de Bacillus megaterium provenant de cultures inclinées incubées pendant 24 h à 30 C des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu contenant de l'hydrolysat enzymatique de caséine ( 4,0 % p/v) 2550547. et de l'infusion de maîs ( 1,0 % p/v) dont le p H était ajusté à 6,8. Ces flacons ont été agités sur un agitateur rotatif ( 280 trlmin) pendant 24 h à 30 C Cinq millilitres ont été prélevés et utilisés pour ensemencer des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu 5 contenant de I'hydrolysat enzymatique de caséine ( 3,0 %) et de l'extrait de levure ( 0,5 %) dont le p H était ajusté à 6,8 De l'acide phénylacétique a été ajouté à ce milieu à une concentration finale de 0,2 % immédiatement avant l'ensemencement Le contenu de ces flacons a été recueilli et la pénicilline-acylase a été dosée après 24 h et 42 h d'incubation à 30 C sur un agitateur rotatif ( 280 tr/min). La pénicilline-acylase des bouillons des flacons agités a été déterminée par dosage photométrique avec l'acide phénylacétylaminobenzoique comme substrat chromogène comme décrit par Szweczuk et coll "Colorimetric Assay of Penicillin Amidase Activity Using Phenylacetyl Aminobenzoic Acid as Substrate" Analytical Biochem, 103, 166-169 ( 1980). Les résultats de ces essais en flacons agités figurent dans le tableau suivant. TABLEAU Essais en flacons agités de la capacité de production d'acylase de souches de B megaterium SC 3593 Souche SC Titre après Titre après Moyenne après Accroissement 24 h* 42 h* 42 h* (%) 3593 2,7 3,8 3,6 3593 3,1 3,4 3593 (p JM 3) 3,4 4,4 4,3 20 % 3593 (p JM 3) 3,5 4,2 a pourcentage d'accroissement par rapport à 3593 30 * les unités d'activité sont arbitraires. Les résultats des essais en flacons agités comme le montre le tableau cidessus indiquent que le rendement en pénicilline-acylase de la souche SC 3593 (p JM 3) est supérieur de 20 % au rendement de la souche SC 3593 Ceci concorde avec le dosage qualitatif 35 sur boîte de gélose. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Plasmide p JN 3 caractérisé en ce qu'il comporte la séquence nucléotidique complète du plasmide p PL 608 de Bacillus subtilis et un fragment inséré constitué d'un fragment chromosomique de 1 à 10 kb d'ADN de Bacillus megaterium SC 3593 contenant le gène approprié pour accroître la production de pénicilline-acylase qui est inséré au site Hind III du plasmide p PL 608. 2 Plasmide p JM 3 comme défini dans la revendication 1, dans lequel le fragment inséré est constitué d'un 'fragment chromosomique de 2,7 kb de Bacillus megaterium SC 3593. 3 Bacillus megaterium SC 3593 (p JM 3) ayant le numéro de dépôt ATCC 39383. 4 Procédé pour former le composé comme défini dans la revendication 3 qui comprend le clonage du plasmide p JM 3 dans Bacillus megaterium SC 3593 par transformation. 5 Procédé pour la préparation du plasmide p JM 3 comme défini dans la revendication 1 qui comprend (a) la mise sous forme linéaire du plasmide p PL 608 avec Hind III pour obtenir de l'ADN de plasmide linéaire, (b) l'obtention d'un fragment d'ADN chromosomique 20 de Bacillus megaterium SC 3593, ledit fragment contenant le gène approprié de la pénicillineacylase, (c) la digestion dudit ADN chromosomique avec Hihd III et (d) la soudure dudit ADN de plasmide linéaire ayant 25 subi une digestion provenant de p PL 608 et dudit ADN chromosomique ayant subi une digestion provenant de Bacillus megaterium SC 3593 pour obtenir le plasmide p JM 3. 6 Procédé pour améliorer la production de pénicillineacylase qui comprend la formation d'un plasmide p JM 3 comme défini dans la revendication 1, le clonage dudit plasmide p JM 3 dans Bacillus megaterium SC 3593 pour former Bacillus megaterium SC 3593 (p JM 3) et l'emploi de Bacillus megaterium SC 3593 (p JM 3) dans la production de pénicilline-acylase.