Brevet FR2548523A1 — publié le 19850111

La présente invention concerne un procédé d'obtention de génépi ayant une teneur élevée en essences aromatiques. Le génépi est une plante rare qui croît à l'état spontané dans quelques zones des Alpes et dont les exigences écologiques sont apparemment très strictes. Sa cueillette est interdite, car c'est une plante en voie de disparition. I1 existe plusieurs espèces de génépi : Artemisia genépi, A. mutellina, A. umbelliformis, A. spicata. Ces plantes possedent la particularité de renfermer des principes aromatiques très appréciés qui entrent dans la fabrication de certaines liqueurs. La présente invention a pour but de permettre une obtention à l'échelle industrielle de génépi ayant une teneur élevée en essences aromatiques par culture in vitro selon la méthode de la multiplication végétative. On a déjà proposé des procédés d'obtention de plantes par la méthode dela multiplication végétative. C'est ainsi que le brevet FR 2 278 267 décrit un procédé de multiplication de plants de fraisiers par micropropagation in vitro consistant à prélever des bourgeons axillaires et à les déposer sur un milieu nutritif contenant une cytokinine, à séparer les bourgeons formés, à repiquer ces bourgeons dans un milieu nutritif semblable, à répéter autant de fois que nécessaire ces opérations, à enraciner les bourgeons en supprimant la cytokinine et à planter en pleine terre les petites plantes obtenues. Par culture in vitro de génépi, on pouvait s'attendre à obtenir des plants pratiquement dépourvus d'essences aromatiques. Or, il s'est avéré que par le procédé selon l'invention utilisant la méthode de la multiplication végétative in vitro il était possible d'obtenir des plants de génépi ayant des teneurs élevées en essences aromatiques. De plus, il a été découvert que, par culture in vitro sur un milieu de culture contenant certains pourcentages de sucre, il était possible d'accroître encore la teneur en essences aromatiques. Le procédé d'obtention de génépi selon la présente invention est caractérisé en ce que on effectue une sélection d'un ou plusieurs clones de génépi ayant une teneur élevée en essences aromatiques, on prélève un fragment de génépi appartenant à un clone sélectionné, on effectue une multiplication végétative à partir de ce fragment par culture in vitro sur un milieu nutritif en présence d'une substance favorisant le développement des bourgeons axillaires, séparation des bourgeons, culture des bourgeons séparés sur un milieu semblable et répétition de ces dernières opérations autant de fois qu'il est nécessaire, et on effectue une culture finale des petites plantes in vitro sur un milieu nutritif contenant un sucre et pratiquement dépourvu de substance favorisant le développement des bourgeons axillaires. Comme sucre présent dans la culture finale, on peut utiliser du glucose ou du saccharose. Les doses de sucre sont avantageusement comprises entre 5 et 12 % par rapport au poids du milieu de culture. La sélection de clones à teneur élevée en essences aromatiques parmi différents clones de génépi peut être effectuée par détermination de la quantité totale d'essences aromatiques sur des petites plantes culti -:ées sur un milieu nutritif. Cette détermination peut etre effectuée selon les méthodes décrites par H.Thieme et T.T. Nguyen, 1972, Pharmazie. Dtsch. 27 (4), 255-265; A.K. Picman, R.L. Ranieri, G.H.N. Towers, J. Lam, 1980, J. Chromatogr. 189, 187; et G. Appendino, F. Belliardo, G.M. Nano, S. Stefenelli, 1982, J. Agric. Food Chem. 30, 518-521. La multiplication végétative est avantageusement éffectuée à partir d'apex prélevés sur les plantules de génépi. On peut également effectuer cette multiplica ticn végétative par prélèvement d'apex sur des plantes adultes ou à partir de fragments de hampe florale. Ces prélèvements et la multiplication véqétative sont effectués dans des conditions stériles. La description detaillée qui va suivre fera mieux comprendre comment le procédé selon l'invention peut être réalisé. Des graines de génépi sont désinfectées par action d'une solution obtenue après filtration d'un mélange de 20 g d'hypochlorite de calcium à 115Q chlorométriques et de 1 litre d'eau. Après deux heures de trempage dans cette solution, les graines sont placées dans des boîtes de Petri contenant du papier filtre humide, stérile. Les graines germent à la lumière et à une température de 230C; au bout de 6 jours, elles donnent des plantules utilisables pour réaliser des prélèvements d'apex; ceux-ci sont isolés et placés sur un milieu nutritif gélosé en conditions stériles.Le milieu utilisé a la composition suivante: KNO3 950 mg.l NH4NO3 825 KH2PO4 85 MgSO4, 7H20 185 CaCl2, 2H2O 220 Na2EDTA 37,3 FeSO4, 7H20 27,8 mg.l 1 ZnSO4, 7H2O 8,6 H2BO3 6,2 MnSO4, 4H2O 22,3 CuSO4, 5H2O 0,025 CoCl2, 6H2O 0,025 Na2MoO4, 2H2O 0,25 KI 0,83 Glucose 20 g/l Les cultures sont placées dans une salle climatisée à une température de 22 C, le jour, et 180C, la nuit, avec une photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité (qualité Manda Fluor, Lumière du Jour et Sylvania Grolux F 40 W). Au cours du premier passage sur ce milieu, l'apex s'allonge, forme une tige feuillée; on observe également la néoformation de racines.On isole de nouveau dans des conditions aseptiques les apex qui sont placés sur un milieu identique au précédent, mais auquel on ajoute un mélange vitaminique (inositol 5 mg/l, acide nicotinique 250 mg/l, thiamine 500 ssg/l, biotine 25 Ag/l, acide folique 50 ssg/l, pyridoxine 250 Ag/l) de la glycine 1 mg/l, de l'acide naph talène acétique 10 7 g/ml et de la benzyladénine g/ml. Sur ce milieu, de nombreux bourgeons axillaires se développent; on peut en dénombrer une quarantaine développés à partir d'un bourgeon initial, après 20 jours de culture. Par separation des tiges issues du développement des bourgeons axillaires, on peut isoler de nouveau des bourgeons apicaux et axillaires et assurer une multiplication intense et rapide. On a déterminé que la dose de benzyladénine utilisée était sensiblement la dose minimale permettant d'obtenir la formation de très nombreux bourgeons. En dessous de cette dose, on observe un développement de racines. Le Tableau I ci-après met en évidence l'influence de la dose de benzyladénine TABLEAU I Doses de Observations sur benzyladénine dans le milieu la formation la formation la teneur de bourgeons de racines en eau 0 1 bourgeon très nombreuses pas racines d'hyperhydrie 10-7 g.ml-1 nombreux racines pas bourgeons d'hyperhydrie 5.10 7 g.ml-1 très nombreux pas de racines légère bourgeon s hyperhydrie 10-6 g.ml-1 très nombreux pas de racines hyperhydrie bourgeons ~ ~ ~ ~ ~ Lorsqu'on opère comme décrit précédemment à partir de graines d'origines diverses, on dispose de plantules sur lesquelles on peut effectuer un test de sélection du point de vue de la teneur en essences aromatiques. A titre indicatif, on donnera dans le Tableau II les résultats obtenus avec des graines d'origines diverses et culture sur des milieux semblables à celui indiqué précédemment, mais contenant à la place de 2 en poids de glucose respectivement 2 % et 8 % en poids de saccharose. TABLEAU II Variations de la quantité totale d'essences aromatiques de différents clones Identification des clones a b c d e f g h Quantité totale d'essence en mg/g 3,6 2,4 7,7 2,0 6,1 4,6 3,0 2,9 matière fraîche sur saccharose 2 % Quantité totale d'essence en mg/g 10,2 6,8 21,8 5,6 17,3 13,0 8,5 8,2 matière fraîche sur saccharose 10 % Au vu de ces résultats, le clone (c) s'avère particulièrement intéressant et peut être sélectionné pour la multiplication végétative ultérieure.Ces résultats mettent également en évidence l'influence de la teneur en sucre sur la teneur en essences aromatiques. On procède alors avec le ou les clone(s)choisi(s) à la multiplication végétative, comme décrit précédemment avec le même milieu jusqu'à l'obtention du degré de multiplication souhaitée. En phase finale, on effectue une culture des petites plantes sur un milieu nutritif qui ne diffère de celui utilisé pour la multiplication végétative que par l'absence de benzyladénine et un taux de saccharose de 10 % en poids (au lieu de 2 % de glucose). Cette teneur en saccharose apparaît déterminante, comme en témoignent les résultats obtenus en faisant varier la teneur en saccharose dans le milieu nutritif. TABLEAU III Influence de la concentration en saccharose dans le milieu de culture sur la quantité de matière sèche estimée après trois semaines de culture et sur la teneur en principe aromatique. Dose de saccharose Pourcentage de Teneur en lactones en poids matière sèche sesquiterpéniques . M.F.) 2 % 13,8 % ~ 828 7,5 % 15,3 % 972 10 % 17,2 % 1026 12,5 % 24,1 % 609 Il est à noter que, lorsque la dose de sucre est augmentée, la croissance est également fortement stimulée. Une étude comparative de la teneur en lactones sesquiterpéniques des clones et de leur valeur aromatique a été réalisée. On observe une bonne concordance entre le pourcentage de lactones sesquiterpéniques des divers clones analysés et leur valeur organoleptique. Des résultats analogues peuvent être obtenus par prélèvement d'apex sur des plantes adultes sélectionnées ou par culture de fragments de hampe florale de plantes sélectionne'es. Les conditions de désinfection par I'hypochlorite de calcium sont alors un peu modifiées : on utilise une solution aqueuse contenant 150 g/l d'hypochlorite de calcium; la durée de stérilisation est de 15 minutes. On procède ensuite à plusieurs rinçage à l'eau stérile avant la mise en culture sur le premier milieu. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de génépi ayant une teneur élevée en essences aromatiques, caractérisé en ce que on effectue une sélection d'un ou plusieurs clones de génépi ayant une teneur élevée en essences aromatiques, on prélève un fragment de génépi appartenant à un clone sélectionné, on effectue une multiplication végétative à partir de ce fragment par culture in vitro sur un milieu nutritif en presence d'une substance favorisant le développement des bourgeons axillaires, séparation des bourgeons, culture des bourgeons séparés sur un milieu semblable et répétition de ces dernières opérations autant de fois qu'il est nécessaire, et on effectue une culture finale des petites plantes in vitro sur un milieu nutritif contenant un sucre et pratiquement dépourvu de substances favorisant le développement des bourgeons axillaires. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sucre présent dans la culture finale est choisi parmi le glucose et le saccharose. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le sucre représente de 6 à 12 % du poids du milieu de culture. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment utilisé pour la multiplication végétative est un apex. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue la multiplication végétative en présence de benzyladénine à une concentration d'au moins 10 g/l. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue la multiplication végétative en présence de benzyladénine à une concentration de 10 7 à 10 6 g/l.