Brevet FR2558848A1 — publié le 19850802

La présente invention concerne un activeur de plasminogène, son procédé de préparation, ainsi qu'une com- position pharmaceutique le renfermant et dotée d'une acti- vité thrombolytique. Le fait que différentes maladies entraînent la formation de thrombus, constitue un grave problème. Dans la thérapeutique classique, on utilise dans ces cas notam- ment la streptokinase et l'urokinase. Toutefois, il est bien connu que ces enzymes ne se contentent pas seulement d'effectuer la thrombolyse voulue, mais qu'elles décompo- sent aussi les facteurs de coagulation du sang en circula- tion, entraînant ainsi des hémorragies, car ces enzymes ont peu d'affinité pour les thrombus devant subir une lyse, et sont prédisposées à décomposer les facteurs de coagulation du sang en circulation. C'est pourquoi il est urgent d'é- laborer un médicament thrombolytique à forte affinité pour les thrombus, avec peu d'effets secondaires dont latendance à provoquer des hémorragies. A cet effet, de nombreux rapports et études ont été réalisés sur les activeurs de plasminogène (désignés ci-après par PA) capables de faire subir une lyse aux throm- bus, avec peu d'effets secondaires. En ce qui concerne les PA provenant de tissus humains, des études détaillées exis- tent sur des enzymes obtenues à partir de tissus humains normaux, notamment cellules endothéliales ou utérines, de humains tissus/tumoraux, ou de leurs cellules cultivées [Cf. Wilson et coll., Cancer Res. 40, 933938 (1980) et Ricken et Colin, J. Biol. Chem., 256, 7035-7041 (1981)]. On sait que les cellules de tissus humains nor- maux, comme les cellules endothéliales ou utérines, ou les cellules tumorales, comme celles du mélanome humain ou du carcinome mammaire, produisent du PA. Cependant, les cellules de tissus normaux sont inutilisables pour la production industrielle'de PA, du fait de leur durée de vie limitée. D'autre part, les cellules tumorales humaines, commes les cellules de mélanome ou de carcinome mammaire, sont habituellement cultivées par fixation dépendante, avec utilisation de bouteilles ou récipients similaires, qui a- boutit à une faible productivité de PA, et sont de ce fait inutilisables à l'échelle industrielle. On pense généralement que les PA humains peuvent 8tre catalogués en deux types, c'est-à-dire le type uroki- nase ayant une faible affinité pour la fibrine, et le type activeur de plasminogène tissulaire (TPA) à excellente affinité pour la fibrine. Il est bien connu que les cellules de mélanome produisent du PA du second type. L'attention a été forte- ment attirée sur elles du fait qu'elles produisent princi- palement du PA de type TPA. D'autre part, en dehors de quelques cellules de carcinome mammaire, il n'a pas été fait mention d'autres cellules tumorales, capables de ne produire que du PA de type TPA. Jusqu'à ce jour, on pensait que les cellules de Rhabdomyosarcome ne produisaient que du PA de type urokinase. Afin de remédier aux inconvénients de l'art anté- rieur, la demanderesse a essayé de trouver des cellules tu- morales capables de croître en culture en suspension rotati- ve, et à réussi à isoler un mutant qui croit en suspension à partir de cultures de cellules KYM-1, qui ont été établies à partir de cellules de rhabdomyosarcome humain (présenté par Dr.Morimasa Sekigucchi de l'Institut de Médecine de L'U- niversité de Tokyo).Ce mutant a été appelé mutant KYM-A.I1 peut être repiqué en culture tournante en suspension.Bien que son dépôt n'ait pas été accepté par la Fermentation Re- search Institute,l'Agency of Industrial Science and Techno- logy in Ibaraki-ken, Japon,il a été enregistré à l'Institute for Fermentation d'Osaka,sous le n IFO 50030. Des études ul- térieures ont révélé que le mutant KYM-A pouvait produire et accumuler une quantité marqu&de PA dans un milieu. Le PA ainsi obtenu a été appelé PA-KYNo Dans le milieu du mutant KYM-A, on n'a pas décelé de PA de type urokinase. Le nouveau produit selon l'invention, appelé PA-KYM, est un PA d'origine nouvelle, provenant de cellu- les humaines de rhabdomyosarcome. Il est en outre reconnu, en raison de ses propriétés physico-chimiques, décrites plus loin, qu'il s'agit d'un nouveau PA de type TPA. Les propriétés du mutant KYM-A sont les sui- vantes. 1. Chaque cellule est de forme sphérique et hautement rétractile, 2. Les cellules peuvent se présenter isolémento Elles peuvent aussi se rassembler sous forme de chaîne ou d'amas. Un amas renferme de l'ordre de 2 à 100 cellules. 3. Lorsqu'on le cultive dans une boite de Pétri en ma- tière plastique, ou le repique sur une culture tournante dans un récipient, ce mutant peut croître principalement sous forme de cellules en suspension. 4. Ce mutant peut être repiqué par culture en suspen- sion rotative. 5. Il peut être converti en cellules de fixation dé- pendante, par exemple par utilisation d'une culture usée. Les cellules converties sont morphologiquement semblables aux cellules épithéliales. Un milieu de cult re usé peut être constitué par la partie surnageante de cultures, au- tres que celle de ce mutant, et est préparé par la culture de cellules appropriées dans un milieu de base convenable, pendant 1 à 100 heures, suivie de l'élimination descellules et débris de cellules de ce milieu. Conviennent,par exemple, comme cellules autres que ce mutant, des cellules d'hépatome humain, comme les souches HuH6-C15 et HuH7 [Cf. Nakabayashi et coll., Cancer Research, 42, 3858-3863 (1982)]. Ce mutant peut aussi être converti en cellules de fixation dépendante, grâce à l'utilisation d'un milieu ren- fermant de la fibronectine. Ou bien, une culture attachée au substrat de ce mutant est également possible par traitement de la surface d'une boite de Pétri, ou de récipients ana- logues, avec des protéines comme collagène, gélatine, poly- L-lysine ou lysozyme d'oeuf. 6. La transplantation sous-cutanée de 106 cellules à une souris nue, ou la transplantation à une bajoue de hams- ter recevant ALS, entraine une tumorigénèse. 7. Chromosome. Selon le procédé cytogénétique classique, le nombre le plus fréquent de chromosomes de ce mutant est de 46 à 47, avec quelque répartition dans le voisinage. Ce fait suggère que le nombre de chromosomes du mutant KYM-A est relativement proche de celui du diplolde humain normal (c'est-à-dire 46) en dépit de son origine tumorale. 8. Ce mutant produit une quantité remarquable de PA-KYM. En vue de l'obtention du PA-KYM selon la présente invention, on peut soumettre le mutant à une culture fixée sur le substrat ou à une culture en suspension. Lors de la production de PA-KYM, on peut faire adhérer le mutant KYM-A à la surface d'une matière plastique ou de verre de boites de Pétri, de bouteilles cylindriques ou de perles micro-supports. Cependant, la culture en suspension en flacons tournants convient mieux du point de vue de la production industrielle. Pour produire PA-KYM, il est préférable de culti- ver le mutant KYM-A dans un milieu renfermant du sérum, et de remplacer celui-ci par un milieu ne renfermant pas de sérum au début d'une phase stationnaire de la croissance des cellules. Les milieux de sérum préférés sont ceux qui renferment 10% de sérum foetal de bovin dans RPMI, MEM ou F12 (produits de Flow Laboratories), ou bien un de leurs mélanges. Les milieux sans sérum préférés sont ceux qui sont préparés par addition d'insuline, de transferrine humaine, de monoéthanolamine et d'acide sélénieux, a un milieu basi- que tel que RPMI, MEM, F12 ou un de leurs mélanges. Un mi- lieu renfermant les quatre constituants mentionnés ci-des- sus sera désigné ci-après par la mention "milieu renfermant ITES". Au cours de la production de PA-KYM à l'aide du mutant KYM-A, la souche cellulaire est soumise à une cul- ture en suspension dans une boite de Pétri en matière plas- tique, jusqu'à obtention d'un nombre approprié de cellules. Puis on la soumet à une culture dans un flacon tournant de à 8 000 ml de volume. Il est préférable d'ensemencer les cellules à une densité de 104 à 105 cellules/ml. Un état stationnaire est atteint pour une densité de 5 x 105 à 2 x 106 cellules/ml. La température de la culture peut être de l'ordre de 30 à 40 C, de préférence voisine de 370C. Cette culture peut s'effectuer dans une atmosphère à 100% d'air, d'air renfermant 5 à 10% de gaz carbonique ou d'air renfermant 5 à 100% d'oxygène. On peut réaliser la culture en discontinu. Ou bien, lorsque les cellules croissent suffisamment, les mi- lieux peuvent être échangés à intervalle de 1 à 4 jours, pour obtenir ainsi de manière continue pendant environ 1 mois, après le début de la culture, un milieu renfermant le PA-KYM. Comme le PA-KYM du mutant KYM-A est une enzyme qui active le plasminogène en plasmine, et comme il appar- tient aux protéines, on peut le purifier par tout procédé généralement utilisé pour la purification des protéines, comme relargage, chromatographie par affinité,chromatogra- phie par échange d'ions, application de tamis moléculaire, ou leurs combinaisons. La purification peut être réalisée en opération continue ou discontinue, selon l'efficacité et la commodité. Le milieu exempt de sérum, renfermant PA-KYM, est ensuite chargé sur une colonne d'agarose chelatée au zinc, qui a été suffisamment équilibrée avec une solution tampon chlorhydrate de tris, renfermant du chlorure de sodium. Cet- te solution tampon contient également du Tween 80 et de l'a- zoture de sodium. Ces composés sont ajoutés à toutes les so- lutions tampons ci-après. Lorsque le chargement est achevé, la colonne est rincée avec la même solution tampon et est soumise à une élution de gradient avec la solution tampon précédente et une autre solution tampon renfermant de l'imi- dazole. Les fractions de gradient d'imidazole présentent une activité PAKYM. Les fractions actives sont combinées, concentrées avec du polyéthylene glybol, et dialysées con- tre une solution tampon phosphate à 4 C pendant 24 heures, avec plusieurs changements de la solution externe. Le dialysat,présentant une activité PA-KYM, est chargé sur une colonne de Sepharose concanavaline A, suffi- samment équilibrée avec la solution tampon phosphate décri- te plus haut. Lorsque le chargement est achevé, la colonne est rincée avec la même solution tampon et soumise à une élution de gradient avec une solution tampon renfermant du thiocyanate de potassium et de l'alpha-méthyl mannoside. Les fractions actives sont combinées, concentrées à un vo- lume convenable avec du polyéthylène glycol et dialysées contre une solution de sérum physiologique renfermant du Tween 80 et de l'azoture de sodium, à 4 C pendant 24 heures, avec plusieurs changements de la solution externe. Lorsque la dialyse est terminée, on récupère, par centrifugation du dialysat, un précipité blanc. On observe principalement, dans le précipité récupé-ré, une activité PA-KYM. Ce préci- pité est dissous dans une petite quantité d'une solution tam- pon phosphateu 1ocyanate de potassium, et on centrifuge pour éliminer les substances insolubles et obtenir ainsi une partie surnageante qui présente une activité PA-KYM. La partie surnageante, ainsi obtenue, est chargée sur une colonne de Sephadex {G-200), que l'on rince suffisam- ment avec une solution tampon phosphate renfermant du thio- cyanate de potassium, avant de la développer avec la même solution tampon, comme décrit plus haut, pour recueillir une fraction qui présente une activité PA-KYM. Les propriétés physico-chimiques du PA-KYM, ainsi purifié, sont les suivantes. a. PA-KYM est un produit de KYM-A, un mutant provenant de cellules de rhabdomyosarcome humain. b. Poids moléculaire, Selon l'électrophorèse sur gel de SDSpolyacrylamide, le PA-KYM non réduit présente deux bandes migrantes très voi- sines dans un intervalle de poids moléculaire allant appro- ximativement de 56 000 à 62 000. D'autre part, le PA-KYM4 réduit présente deux bandes à environ 32 000 et 36 000, me- surées comme décrit précédemment. c. Fonctionnement et spécificité du substrat, PA-KYM est une protéine enzymatique qui, en présence de plasminogène, provoque la fibrinolyse. Comme le plasminogé- ne est nécessaire pour cette réaction, cette protéine enzy- matique constitue l'un des activeurs spécifiques du plasmi- nogène. Il est avéré que PA-KYM a beaucoup plus d'affinité pour la fibrine que l'urokinase. d. Valeur optimale de pH; Sa valeur optimale de pH est environ de 8 à 10. Une courbe d'activité est représentée dans la figure 1. e. Valeur de pH de stabilité. Le produit est stable à pH compris entre 5 et 11. La figure 2 indique le pourcentage d'activité résiduaire. f. Intervalle de températures optimales de fonctionne- ment. La figure 3 représente le pourcentage d'activité enzymati- que en fonction de la température. La température optimale de fonctionnement est comprise entre 30 et 45 C. g. Thermorésistance PA-KYM est à peine inactivé par chauffage à 50 C pendant 90 minutes. Son activité résiduaire à 60 C ou plus n'est pas supérieure à 60%. Cela est représenté sur la figure 4. h. Inhibition. Le tableau 1 indique les activités résiduaires du produit exposé à l'action de chaque inhibiteur à une concentration de 0,1 mM, 1 mM et 10 mM. TABLEAU 1 0,1 mM 1 mM 10 mM CaC?2 94,9 104,4 85,8 EDTA - 112,9 - FeSO4 - 103,3 - KCt - 99,8 - MgCl2 95,5 90,7 89,0 AgNO3 87,2 79,6 13,6 CuSO4 89,2 70,6 9,9 HgCI2 115,8 45,6 0 MnCt2 95,5 26,6 5,1 ZnSO4 34,3 15,6 0 On réalise l'examen de l'inhibition de PA-KYM, en assignant une valeur de 100% à l'activité de l'enzyme, en l'absence de tout inhibiteur. i. Composition en amino acides. PA-KYM, qui est une protéine enzymatique, est hydrolysé avec de l'acide chlorhydrique 6N et soumise à une analyse de ses amino acides. Le tableau 2 montre les résultats: y sont inscrits les pourcentages de chaque amino acide, rapportés à la totalité du nombre des résidus d'amino aci- des. TABLEAU 2 PA-KYM ASP 10,6 THR 5,3 SER 9,7 GLU 10,9 PRO 6,3 GLY 9,5 ALA 7,2 VAL 5,0 MET 1,0 ILE 3,5 LEU 8,1 TYR 4,5 PHE 3,5 HIS - 3,4 LYS 4,5 ARG 7,0 * Cystéine et tryptophane ne sont pas dosés. j. Spectre ultra violet La figure 5 est la représentation d'un spectre ultra violet d'une solution aqueuse de PA-KYM. k. Solubilité dans les solvants Ce produit est soluble dans l'eau ou des solutions salines comme une solution tampon phosphate à une concentration al- lant jusqu'à environ 50 gg/ml. Une solution à concentra- tions supérieures peut être préparée en présence de pro- duits chimiques tels que thiocyanate de potassium 1,6 M. Il est insoluble dans des solvants organiques comme l'étha- nol ou l'éther. 1. Forme Après lyophilisation, il se présente sous forme d'une pou- dre blanche. m. Réaction colorée Après avoir été soumis successivement à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, et à une réaction PAS, PA-KYM vire au rose caractéristique des glycoprotéines. Son affinité,pour une résine concanavaline A-agarose, suggère aussi qu'il s'agit d'une glycoprotéine. n. Point isoélectrique L'analyse avec concentration chromatographique de PA-KYM en présence d'urée 8M révèle que le pH isoélectrique de son constituant principal va de 7,5 à 8, tandis que celui de son constituant mineur va de 7 à 7,5, ce qui suggère qu'il est constitué par un mélange de protéines faiblement basiques. Les procédés de dosage d'activité de PAKYM, qui sont semblables à ceux que l'on utilise classiquement pour le dosage de l'activité de PA, sont les suivants. 1) Procédé de la plaque de fibrine [Cf. Astlap et coll., Arch. Biochem. Biophys., 40, 346-351 (1952)] On fait réagir de la thrombine dans une suspension d'aga- rose renfermant du fibrinogène et du plasminogène, à 37 C, afin de préparer une plaque de fibrine renfermant le plas- minogène. On perce dans cette plaque une cavité de 3 mm de diamètre, dans laquelle on introduit un échantillon. Après introduction de cet échantillon de 5 à 10 Al dans la cavi- té, la plaque de fibrine est placée dans une étuve à incu- bation pendant une période donnée. Ensuite la plaque est re- tirée de l'étuve et l'on mesure le diamètre de la zone de fibrinolyse nette. Comme l'activité de l'échantillon est en relation avec le diamètre de la zone de fibrinolyse, les diamètres des zones sont comparés pour doser l'activité. 2) Procédé pour doser l'activité de PA-KYM par' une réaction en deux stades, avec utilisation d'un substrat synthétique (S-2251). Du plasminogène dissous dans 50 mM d'une solution tampon chlorhydrate de tris (pH 7,4) renfer- mant 0,15 M de chlorure de sodium, et une solution de PA- KYM dans 50 mM de la même solution tampon renfermant 0,15 M de chlorure de sodium, sont maintenus à 37 C pendant exac- 1 1 tement 10 minutes (c'est la première réaction). Puis on ajoute immédiatement, pour arrêter cette première réaction, une solution 0,33 M de lysine dans une solution tampon de 0,15 M de chlorhydrate de tris renfermant 0,15 M de chlo- rure de sodium. Ultérieurement, une solution d'un substrat synthétique, préparée par dissolution de 3 mg/ml d'un substrat synthéti- que S-2251 dans une solution tampon de 50 mM de chlorhy- drate de tris (pH 7,4) renfermant 0,15 M de chlorure de so- dium, est maintenue à 37 C pendant 30 minutes, et la plas- mine formée au cours de la première réaction est dosée co- lorimétriquement à une longueur d'onde de 405 nm (seconde réaction). Après maintien de cette réaction pendant exacte- ment 30 minutes, on ajoute immédiatement une solution d'a- cide acétique 2,5 M pour l'arrêter. Le dosage de l'activité de PA-KYM est basé sur l'absorption à 405 nm. 3) Procédé de dosage de l'activité de PA-KYM par une réaction en un seul stade, avec utilisation d'un sub- strat synthétique (S-2444). On ajoute à une solution de PA-KYM dans une solution tam- pon phosphate 50 mM (pH 8,8) renfermant 0,15 M de chlorure de sodium, une solution d'un substrat synthétique préparée par dissolution de 3 mg/ml d'un substrat synthétique S-2444 dans une solution tampon de 50 mM de chlorhydrate de tris (pH 8,8) renfermant 0,15 M de chlorure de sodium, et l'on maintient ce mélange à 37 C pendant exactement 90 minutes. * Puis on y ajoute une solution d'acide acétique 2,5 M, afin d'arrêter la réaction. L'activité de PA-KYM est dosée colo- rimétriquement à une longueur d'onde de 405 nm. Le PA-KYM de la présente invention s'avère effi- cace pour effectuer la lyse des thrombus formés dans le sang. Il est de préférence mis sous forme de composi- tions pharmaceutiques destinées à l'administration par voie intraveineuse. Ces compositions peuvent renfermer diffé- rents additifs, y compris des stabilisants comme mannitol, albumine, gélatine ou bisulfite de sodium; des régula- teurs de pH comme soude ou phosphate de sodium; et des agents favorisant l'isotonie comme chlorure de sodium, mannitol ou glucose. Le PA-KYM de la présente invention peut être cliniquement administré par injection intraveineuse massi- ve, goutte-à-goutte intraveineux, instillation ou injec- tion sous-conjonctivale ou retrobulbaire, sous forme d'une solution en renfermant 100 à 100 000 UI, selon l'age, le poids corporel et la condition du patient. Les exemples suivants constituent une illustra- tion non limitative de l'invention. Dans les dessins annexés: la figure 1 représente le pourcentage d'activité PA de PA-KYM en fonction de la valeur du pH; la figure 2 représente le pourcentage d'activité résiduaire de PA en fonction de la valeur du pH; la figure 3 représente le pourcentage d'activité de PA en fonction de la -température; la figure 4 représente le pourcentage d'activité résiduaire de PA après incubation à chaque température; et la figure 5 représente un spectre ultraviolet de PA-KYM. EXEMPLE 1 Culture Pour cultiver le mutant KYM-A, IFO N 50030, on peut utiliser un milieu RPMI-1640, MEM ou F12, renfermant 2 g de bicarbonate de sodium, 1, 192 g d'acide N-(hydroxy-2 éthyl) pipérazine N'-éthanesulfonique et 60 mg de sulfate de kanamycine par litre de milieu, et renfermant en outre du sérum foetal bovin, exempt de complément (un produit de KC Biological, USA) à une concentration finale de 10%, ou un mélange dans différentes proportions de ces produits. On ensemence une botte de Pétri en matière plastique avec des cellules de KYM-A. Lorsque l'on a obtenu approximative- ment 100 ml de suspension cellulaire, on amorce la culture en suspension à l'aide d'un flacon tournant. Cette culture, en suspension dans un volume allant jusqu'à 8 litres, peut être réalisée par décrassage graduellement progressif de la culture. Le taux d'ensemencement initial à chaque stade est de 104 à 105 cellules/ml. Lorsque ce taux atteint x 105 à 2 x 10o6 cellules/ml, les cellules sont ensemen- cées dans un autre flacon. EXEMPLE 2 Collecte Lorsque la concentration cellulaire atteint x 105 à 2 x 10o6 cellules/ml, la culture est remplacée par un milieu exempt de sérum, comprenant du RPMI-1640, MEM, F12 ou un de leurs mélanges, renfermant 2 g de bicarbonate de sodium, 1,192 g d'acide N-hydroxyéthyl pipérazine NI- éthanesulfonique-2, 60 mg de sulfate de kanamrycine, 8,5 mg d'insuline, 1 mg de transferrine humaine (produite par Sig- ma), 4,6 mg d'éthanolamine et 13 gg d'acide sélénieux, par litre, et renfermant en outre 20 KIU/ml d'Aprotinine (pro- duit par Sigma). La souche est soumise à une culture en suspension dans ce milieu exempt de sérum pendant 1 à 4 jours. Après avoir répété cette opération de 4 à 10 fois, on filtre le milieu pour recueillir le filtrat que l'on purifie ultérieurement. EXEMPLE 3 Purification Les filtrats recueillis dans l'exemple 2 sont combinés, et on y ajoute de l'Aprotinine, du Tween 80 et de l'azoture de sodium, de manière à obtenir des concentra- tions finales respectivement de 20 KIU/ml, 0,01% et 0,02%. Ces trois substances sont ajoutées à toutes les solutions tampons comme décrit ci-après. L'échantillon ainsi obte- nu est purifié de la manière suivante. a) 30 litres de filtrat sont chargés sur une colonne d'agarose chélaté au zinc (9 cm de diamètre x 21 cm), qui a été ajusté selon le procédé reporté par Porath et coll. dans Nature, 258, 958-959 (1975), et suffisamment rincé avec une solution tampon à 20 mM de chlorhydrate de tris (pH 7,05) renfermant NaCl 1M. Lorsque le chargement est terminé, la colonne est rincée avec 3 litres de la même solution tampon. Le filtrat et les eaux de rinçage de la colonne ne présentent aucune activité de PA-KYM. Puis on soumet la colonne à une élution de gradient avec 1,5 li- tre de la solution tampon utilisée plus haut et d'une au- tre solution tampon (pH 7,3) préparée par addition de 150 mM d'imidazole à la solution tampon mentionnée précédem- ment, pour obtenir des fractions de 15 ml. Le dosage de l'activité de PAKYM de chaque fraction révèle que les fractions se trouvant dans le voisinage de la fraction N 125, présentent une remarquable activité de PAKYM. Ces fractions actives sont combinées, introduites dans un tube à dialyse, saupoudrées de poudre sèche de polyéthylène glycol 20 000, et on concentre à 40C. On dialyse ensuite contre une solution tampon phosphate 0,01M (pH 6,7) à 4 C pendant 24 heures, avec plusieurs changements de la solu- tion externe. A la fin de la dialyse, on centrifuge la so- lution dans le tube à 10 000 tours/minute pendant 10 minu- tes, et l'on recueille la partie surnageante. b) 130 ml de solution renfermant PA-KYM ainsi obtenue, sont chargés sur une colonne de concanavaline A Sepharose (1 x 20 cm; produit de Pharmacia Fine Chemicals), qui a été suffisamment rincée avec une solution tampon phosphate 0,01 M (pH 6,7). Lorsque le chargement est terminé, la co- lonne est rincée avec la même solution tampon, et est sou- mise à une élution de gradient avec 150 ml de cette solu- tion tampon et 150 ml d'une autre solution tampon, prépa- rée par addition, à la première solution tampon, de thio- cyanate de sodium 0,6 M et d'o -méthylmannoside 3M, pour obtenir des fractions de 3,5 ml. Les fractions situées au 255'8848 voisinage de la fraction N 32 présentent une activité de PA-KYM. Les fractions actives sont combinées et concentrées à un volume de 5 ml, h l'aide de polyéthylene glycol 20 000. Le concentré est dialysé contre une solution de sérum physio- logique à 4 C pendant 24 heures, avec plusieurs changements de la solution externe. Pendant la dialyse, la solution d'enzyme devient trouble. Le dialysat est centrifugé à 000 tours/minute pendant 30 minutes, et le précipité ob- tenu présente une activité de PA-KYM. A ce stade, on élimi- ne les impuretés, qui comprennent principalement des pro- téines de poids moléculaires supérieurs à celui de PA-KYM, par filtration sur gel. Le précipité,obtenu par la centri- fugation, est dissous dans 2 ml de solution tampon phos- phate 0,01 M (pH 6,7) renfermant du thiocyanate de potas- sium 1,6 N. Le résidu insoluble est éliminé par centrifu- gation, laissant une partie surnageante dotée d'une acti- vité de PA-KYM. La solution ainsi obtenue est chargée sur une colonne 1,6 x 85 cm de Sephadex G-200 (produit de Pharmacia Fine Chemicals) qui a été suffisamment rincée avec une solution tampon phosphate 0,01 M (pH 6,7) renfer- mant du thiocyanate de potassium 1,6 N et qui est dévelop- pée avec une solution tampon identique pour donner des fractions de 2,4 ml. Les fractions,sesituant dans le voisi- nage de la fraction N 35, présentent une activité de PA- KYM. Comme décrit plus haut, on obtient un spécimen puri- fié de PA-KYM selon un processus en 4 stades comprenant une précipitation fractionnée. Le tableau 3 indique le degré de purification à chaque stade. TABLEAU 3 Concentration Concentration Activité Degré de de l'ejzyme en protéine spécifique purification O Eluat provenant de la colonne à zinc chelaté 54,27 122 445. 44 Eluat provenant de la colonne d Con A Sepharose 273,6 124 2206 217 Eluatprovenant de la colonne de Sephadex 369,0 22,5 16400 1613 w c, to Ln Note concernant le tableau 3; O On effectue une réaction colorée pendant 90 minutes à 37 C, à l'aide d'une quantité convenable (a ml) de solution d'enzyme et d'un substrat synthétique S-2444. Si le degré de coloration à 405 nm (OD405) est b, la concentration en enzyme C peut être déterminée comme suit: C = b x 1/a. La concentration en protéines est dosée par le procé- dé de Lowry, et est indiquée en gg/ml. L'activité spécifique est donnée par le rapport O/O Le degré de purification est représenté par un accrois- sement de l'activité spécifiqueà chaque stade, avec assi- gnation de la valeur 1 au cas du milieu. EXEMPLE 4 Poids moléculaire et pureté On examine le poids moléculaire et la pureté du spécimen purifié de l'exemple 3. Un spécimen non réduit est soumis à une électrophorèse sur gels de SDSpolyacrylamide, renfermant 10% d'acrylamide, à température ambiante, sous un courant de 5 mA, pendant 18 heures, selon le procédé reporté par Laemmli, Nature, 227, 680 (1970). Le gel ainsi obtenu est rincé avec une solution aqueuse à 2,5% de Triton X-100, pendant 1 heure, afin d'é- liminer SDS. On enrecouvre une plaque d'agarose renfermant de la fibrine et du plasminogène, qui a été préparée selon le procédé indiqué par Granelli Piperno et Reich (Jo Exp. Med. 148; 223-234 (1978)],et l'on maintient à 37 C pendant 1 à 4 heures. Une observation ultérieure révèle qu'il n'y a pas de zone de fibrinolyse à l'exception de 2 zones mi- grantes très voisines dans un intervalle de poids moléculai- re compris entre 56 000 et 62 000. D'autre part, on n'obser- ve aucune zone de fibrinolyse lorsqu'on applique le même mode opératoire, mais en l'absence de plasminogène dans le gel d'agarose. Ces résultats suggèrent que la fibrinolyse dépend du plasminogène. Quand on ajoute à la plaque de fi- brine 20 gg/ml d'une fraction IgG d'antiserum antiurokina- se, on observe des zones de fibrinolyse identiques à celles que l'on obtient en l'absence de IgG. C'est pourquoi, il faut assigner les deux bandes comprises dans l'intervalle de poids moléculaires de 56 000 à 62 000, non à un activeur de plasminogène de type urokinase, mais à un activeur de type TPA. Le spécimen non réduit, purifié, de PA-KYM (environ 0,1 gg) obtenu dans l'exemple 3, est séparé, soit tel quel, ou bien après réduction par additiole 5% de mercapto-2 éthanol, par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide de la ma- nière décrite plus haut. Les protéines, contenues dans le gel ainsi obtenu, sont teintées selon le procédé reporté parOakly et coll. ZAnal. Biochem., 105, 361-163 (1980)]. En conséquence, on découvre que le spécimen non réduit, puri- fié, présente deux bandes dans l'intervalle des poids molé- culaires allant de 56 000 à 62 000, tandis que le spécimen réduit présente deux bandes à 32 000 et 36 000. On n'ob- serve aucune autre bande remarquable, à part celles qui sont décrites plus haut, ce qui suggère que le spécimen est pu- rifié presque complètement. Pour la détermination du poids moléculaire, on utilise les protéines étalons de poids mo- léculaires connus, suivantes: phosphorylase b (94 000), al- bumine de serum de bovidé (67 000), albumine d'oeuf (43 000) et anhydrase carbonique (30 000). EXEMPLE 5 Etude de l'affinité pour la fibrine g de Sépharose 4B (produit de Pharmacia Fine Chemicals) activé par CNBr sont gonflés avec 2 litres de HCl 1 mM, et on rince. On mélange alors 1 g de fibrinogène (produit par Kabi) dissous dans 200 ml d'une solution tampon de copulation de NaCl 0,5 M/NaHCO3 0,1 M (pH 8,3), avec cette bouillie de résine et on laisse reposer à température ambiante pendant 10 heures pour que s'effectue l'absorption par la résine gonflée. La résine résultante est introduite dans 100 ml de solution tampon phosphate 0,05 M (pHli 7,5) renfermant deux unités de thrombine (thrombine de bovidé provenant de Mochida Pharmaceutical Co., Ltd) et l'on main- tient à 37 C pendant 10 minutes, obtenant ainsi une résine de fibrineSepharose. La résine, ainsi obtenue, est char- gée dans une minicolonne (6 ml) et l'on équilibre avec une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 7, 5) renfermant 0,01% de Tween 80. On charge alors sur la colonne 1 ml de solu- tion de PA-KYM ou de solution d'urokinase, et on la rince avec 15 ml d'une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 7,5) pour recueillir des fractions de 1 ml. Puis la colonne est développée avec 25 ml de la même solution tampon, renfer- mant du thiocyanate de potassium 1,6 M, afin de recueillir des fractions de 1 ml. Les activités enzymatiques de la so- lution de rinçage et de celle qui renferme du thiocyanate de potassium, sont dosées à l'aide d'un substrat synthéti- que S-2444, pour déterminer le taux de récupération. Comme on peut le constater dans le tableau 4, la solution de rin- çage ne contient pas de PA-KYM et celui-ci nécessite la pré- sence de thiocyanate de potassium pour son élution, ce qui suggère une forte affinité de ce produit pour la fibrine. D'autre part, dans le cas de l'urokinase, cette dernière présente une faible affinité, l'activité se retrouvant dans la solution de rinçage. TABLEAU 4 PA-KYM Urokinase Echantillon chargé 1,218* 0,970 Rinçage 0 0,690 Eluat de potassium avec thiocyanate 1,072 0 Récupération 88 % 71 % * Une réaction colorée est effectuée à l'aide d'une quanti- té convenable (c'est-à-dire 0,001 à 0,3 ml) de la solution d'enzyme et d'un milieu synthétique S-2444, à 37 C pendant 90 minutes. La valeur indiquée représente le degré de colo- ration à 405 nm, calculé en admettant que la totalité de la solution d'enzyme est utilisée, en fonction de l'ab- sorption mesurée à 405 nm, obtenue avec des portions des fractions recueillies. Par exemple, quand on charge au total un échantillon de 1 ml, et qu'on en utilise 0,1 mm pour la réaction colorée à 37 C pendant 90 minutes, ce qui donne une absorption (OD 05) de 0,1218, la valeur indiquée est calculée de la manière suivante: 0,1218 x 1/0,1 = 1,218. RZVENDICATTONS 1. Nouvel activeur de plasminogène (PA-KYM), caracté- risé par les propriétés physochimiques suivantes: a. PA-KYM est un produit de KYM-A, un mutant prove- nant de cellules de rhabdomyosarcome humain. b. Poids moléculaire, Selon l'électrophorèse sur gel de SDSpolyacrylamide, le PA-KYM non réduit présente deux bandes migrantes très voi- sines dans un intervalle de poids moléculaire allant appro- ximativement de 56 000 à 62 000. D'autre part, le PA-KYM réduit présente deux bandes à environ 32 000 et 36 000, me- surées comme décrit précédemment. c. Fonctionnement et spécificité du substrat0 PA-KYM est une protéine enzymatique qui, en présence de plasminogène, provoque la fibrinolyse. Comme le plasmino- gène est nécessaire pour cette réaction, cette protéine enzymatique constitue l'un des activeurs spécifiques du plasminogène. Il est avéré que PA-KYM a beaucoup plus d'af= finité pour la fibrine que l'urokinase. d. Valeur optimale de pH. Sa valeur optimale de pH est environ de 8 à 10. e. Valeur de pH de stabilité, Le produit est stable à pH compris entre 5 et 11. f. Intervalle de températures optimales de fonctionne- ment. La température optimale de fonctionnement est compri- se entre 30 et 45 C. g. Thermorésistance. PA-KYM est à peine inactivé par chauffage à 50 C pendant minutes. Son activité résiduaire à 60 C ou plus, n'est pas supérieure à 60%. h. Inhibition Le tableau 1 indique les activités résiduaires du produit exposé à l'action de chaque inhibiteur à une concentration de 0,1 mM, 1 mM et 10 mM. TABLEAU 1 0,1 mM 1 mM 10 mM CaCe2 94,9 104,4 85,8 EDTA - 112,9 - FeSO4 - 103,3 - KCz - 99,8 - MgCt2 95,5 90,7 89,0 AgNO3 87,2 79,6 13,6 CuSO4 89,2 70,6 9,9 HgC22 115,8 45,6 0 MncQ2 95,5 26,6 5,1 ZnSO4 34,3 15,6 0 L'examen de l'inhibition de PA-KYM est réalisée en assi- gnant une valeur de 100% à l'activité de l'enzyme en l'ab- sence de tout inhibiteur. i. Composition en amino acides PA-KYM, qui est une protéine enzymatique, est hydrolysé avec de l'acide chlorhydrique 6N et soumise à une analyse de ses amino acides. Le tableau 2 montre les résultats: y sont inscrits les pourcentages de chaque amino acide, rap- portés à la totalité du nombre des résidus d'amino acides. TABLEAU 2 PA-KYM ASP 10,6 THR 5,3 SER 9,7 GLU 10,9 PRO 6,3 GLY 9,5 ALA 7,2 VAL 5,0 MET 1,0 ILE 3,5 LEU 8,1 TYR 4,5 TABLEAU 2 (suite) PA-KYM PHE 3,5 HIS 3,4 LYS 4,5 ARG 7,0 * Cystéine et tryptophane ne sont pas dosés. j. Spectre ultraviolet La figure 5 est la représentation d'un spectre ultra violet d'une solution aqueuse de PA-KYM. k. Solubilité dans les solvants Ce produit est soluble dans l'eau ou des solutions salines comme une solution tampon phosphate à une concentration al- lant jusqu'à environ 50 gg/ml. Une solution à concentrations supérieures peut être préparée en présence de produits chi- miques tels que thiocyanate de potassium 1,6 Mo Il est insoluble dans des solvants organiques comme l'étha- nol ou l'éther. 1. Forme Après lyophilisation, il se présente sous forme d'une poudre blanche. m. Réaction colorée Après avoir été soumis successivement à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, et à une réaction PAS, PA- KYM vire au rose caractéristique des glycoprotéines. Son af- finité pour une résine concanavaline A-agarose suggère aus- si qu'il s'agit d'une glycoprotéine. n. Point isoélectrique L'analyse "chromatofocusing" de PA-KYMen présence d'urée 8M, révèle que le pH isoélectrique de son constituant prin- cipal va de 7,5 à 8, tandis que celui de son constituant mi- neur va de 7 à 7,5, ce qui suggère qu'il est constitué par un mélange de protéines faiblement basiques. 2. Procédé de préparation du PA-KYM selon la revendi- cation 1, qui consiste à cultiver un mutant KYM-A de cellu- le de rhabdomyosarcome humain. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise une culture en suspension. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise une culture fixée sur un substrat. 5. Composition pharmaceutique qui renferme une quan- tité efficace de PA-KYM et présente une action thromboly- tique.