Brevet FR2548538A1 — publié le 19850111

La présente invention concerne un procédé de production d'interferon spécifiquement humain (désigné ciaprès en abrégé par "Hu IFN"), à partir de sang humain entier, ainsi qu'un procédé de dosage de l'aptitude du sang humain à produire de l'Hu IFN. Ces derniers temps on a largement utilisé des essais cliniques, au cours desquels était chimiquement dosé le taux d'une enzyme du sang, ou de son métabolite. Puisque Hu IFN, un composé du sang, présente des 10 activités antivirale et antitumorale, on a proposé d'inclure le taux de Hu IFN du sérum dans les différentes sortes d'essais cliniques Cependant on n'a pu répondre à cette suggestion du fait que l'Hu IFN du sérum n'existe qu'en faible quantité. Le sang est constitué par un fluide, le plasma, dans lequel se trouvent en suspension des éléments tels qu'érythrocytes, leucocytes et plaquettes Un mm 3 de sang renferme en général, en plus de 7,4 x 103 leucocytes et 3 x 105 plaquettes, chez l'adulte, 5,4 x 106 érythrocytes chez l'homme, ou 4,8 x 106 chez la femme Il est bien connu que Hu IFN est produit par le leucocyte humain. Dans les procédés classiques de production d'Hu IFN, on utilise des leucocytes viables, séparés du sang humain. Par exemple, ainsi qu'il est décrit par Hans Strander et Kari Cantell dans Ann Med Exp Fenn Vol 44, pp:265-273 ( 1966), et dans les brevets japonais Kokai n 6 111/74 et 94.008/78, des leucocytes sont séparés des autres éléments présents dans le sang entier, puis sont laissés afin de produire Hu IFN Toutefois, des études détaillées de ces procé30 dés classiques confirment qu'ils ne donnent qu'un faible taux de récupération des leucocytes à partir du sang, c'est-à-dire 30 à 50 %, et qu'ils lèsent les leucocytes au cours de la séparation, ce qui entraine un abaissement de leur vitalité de 40 à 60 %, avec éventuellement un rendement 35 total de la récupération compris entre 10 et 30 %, et une production en Hu IFN inconsistante à partir des leucocytes séparés; ces faits rendent très difficile l'estimation de l'aptitude du sang à produire de l'Hu IFN, et sont un obstacle à la production à l'échelle industrielle de ce produit. La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur, et d'obtenir facilement, à l'échelle industrielle, de l'Hu IFN à partir de sang humain; elle permet également un dosage facile et hautement 10 reproductible, de la capacité de production d'un sang entier. Le nouveau procédé selon l'invention consiste en une mise en incubation du sang entier, dans un récipient, en présence d'un anticoagulant et d'un virus. Des études détaillées confirment l'action avantageuse, exercée sur du sang entier, par un virus intact ou inactive, à raison de 20 à 200 000 HA/ml de sang, "HA" représentant l'unité de titre d'hémoagglutination d'un virus Le terme "sang entier" comprend des préparations de sang frais recueilli chez des donneurs, ainsi que des suspensions obtenues par élimination du liquide plasmatique de ces préparations sanguines et mise en suspension des éléments résiduaires dans un liquide non plasmatique approprié, comme sérum physiologique, solution tampon ou milieu 25 de culture nutritif. Conformément à l'invention, on peut utiliser tout anticoagulant capable d'empêcher la coagulation de ce sang entier, et n'affectant pas la production d'Hu IFN S'avèrent par exemple avantageux, l'héparine, le citrate-dextrose aci30 de (ACD) et le citrate-phosphate-dextrose (CPD). Conviennent, conformément à l'invention, les virus capables de provoquer la production d'Hu IFN dans le sang entier Ainsi, par exemple, le virus de Sendai ou celui de la maladie de Newcastle, peuvent être utilisés intacts ou après inactivation Les virus inactivés, utilisables se- lon l'invention, comprennent les virus dont l'aptitude à se reproduire a été partiellement ou complètement supprimée, par exemple par irradiation aux UV, chauffage, ou traitement à un p H extrême L'intervalle approprié d'ino5 culation du virus est compris entre 20 et 200 000 HA/ml de sang entier. Le stade de mise en incubation du sang entier dans un récipient, en présence de l'anticoagulant et du virus, s'effectue de manière à ce qu'il y ait production 10 d'Hu IFN Par exemple, aux quantités prescrites d'anticoagulant et de virus, dans le récipient, on ajoute une quantité convenable de sang entier, et on fait incuber ce mélange Ou bien, on place dans un récipient un mélange d'anticoagulant et de sang entier, puis on y ajoute le virus, 15 et on fait incuber Au cours de ce stade d'incubation, on peut utiliser en outre un milieu approprié comme sérum physiologique, solution tampon isotonique ou milieu de culture nutritif. Conformément à l'invention, peuvent être utilisés 20 comme récipient, cuve, fiole, ballon, tube à essai, ampoule et creux de micro-plaque, de tous volumes et formes. Les conditions de mise en incubation sont celles qui permettent la production d'Hu IFN; par exemple un intervalle de température de 30 à 40 C; une durée d'incubation 25 de 5 à 50 heures Dans ce cas, on peut, si nécessaire, effectuer un amorçage ou une superinduction. Après incubation, en vue de la production d'Hu IFN, et une dilution optimale à l'aide de sérum physiologique ou de solution tampon isotonique, le sang entier est alors sé30 paré au moyen de modes opératoires appropriés comme centrifugation ou filtration, afin d'éliminer des éléments formés tels que cellules sanguines, et la partie surnageante, ou le filtrat, renfermant l'Hu IFN, est soumis à une purification ou à un titrage. L'Hu IFN peut être purifié, en vue de l'obtention d'une préparation d'Hu IFN ayant une pureté la plus grande possible, par combinaison de modes opératoires classiques, par exemple, relargage, dialyse, filtration, concentration, adsorption et désorption par échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité utilisant un coordinat approprié comme anticorps, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse. L'Hu IFN obtenu, peut être avantageusement utilisé sous forme d'injection ou de médicament à usage externe ou 10 interne, en vue de la prévention et du traitement de maladies humaines, seul ou en combinaison avec une ou plusieurs substances. La capacité de production du sang humain entier peut être dosée, conformément à l'invention, par titrage du 15 taux d'Hu IFN dans la partie surnageante, ou le filtrat, décrit plus haut Dans ce but, on peut utiliser toute forme de dosage, pourvu que la production d'Hu IFN par le sang entier se trouve titrée, par exemple dosage biologique, dosage radioimmunologique et dosage d'immunosorbant lié à l'en20 zyme. Ces dernières années, le dosage immunosorbant lié à l'enzyme a été pratiqué en tant que dosage rapide, approprié et très sûr Conformément à l'invention, on peut utiliser tout dosage d'immunosorbant lié à l'enzyme, capable 25 de doser 1 'IFN en tant qu'antigène S'avèrent, par exemple, avantageuses la technique d'introduction d'anticorps double (technique sandwich) et la technique modifiée d'introduction d'anticorps double Il se confirme que les capacités de production d'Hu IFN, dosées de cette manière, sont très intéres30 santes pour l'évaluation clinique d'un donneur individuel. Le procédé selon l'invention confirme que le sang recueilli chez un cancéreux a une capacité de production d'Hu ZFN bien moindre que celui qui est recueilli chez des patients bien portants. Les expérimentations suivantes permettent de mieux comprendre l'invention. EXPERIMENTATION 1 Effet du prétraitement sur la capacité de production d'Hu IFN du sang On étudie de la façon suivante, au cours de cette expérimentation, l'effet du sang prétraité sur la capacité de production d'Hu IFN: à des échantillons de sang frais, provenant de 3 volontaires bien portants, on ajoute de l'héparine. Les sangs traités, utilisés, se présentent comme suit: une 10 suspension exempte de plasma, obtenue par centrifugation du sang, pour éliminer le liquide plasmatique, et mise en suspension des éléments formés, résiduaires, dans du milieu RPMI 1640, de manière à donner une densité d'éléments identique à celle du sang; et une suspension traitée au chlo15 rure d'ammonium, obtenue par traitement du sang avec du tampon Tris-H Cl (p H 7,2), renfermant 0,75 % de chlorure d'ammonium, de manière habituelle, afin de réaliser l'hémolyse des érythrocytes, centrifugation du mélange et mise en suspension des éléments formes résultants, exempts d'érythrocy20 tes, dans du milieu RPMI 1640 de manière à donner une densité d'éléments identique à celle du sang. Des portions de 1 ml de sang hépariné ou traité sont placés dans différents tubes à essai en matière plastique, qui sont ensuite additionnés de portions de 0,1 ml de sérum physio25 logique renfermant du virus de Sendai en quantités respectives de 0, 100 ou 1000 HA, puis on met à incuber pendant 16 heures à 37 C Les mélanges incubés sont irradiés aux UV afin d'inactiver complètement le virus de Sendai, et l'on centrifuge pour obtenir la partie surnageante qui est alors 30 dosée pour déterminer son titre en Hu IFN par ml de sang entier. Le titre en Hu IFN est déterminé par le dosage de la fixation de colorant reporté par Anne L R Pidot dans Applied Microbiology, Vol 22, N 4, pp 671 à 677 ( 1971) Le titre 35 d'hémoagglutination (HA) est déterminé par le procédé re- porté par J E Salk dans The Journal of Immunology, Vol 49 pp 87 à 98 ( 1944) avec une légère modification. Les résultats sont reportés dans le tableau 1. Il ressort de ces résultats que le sang entier, et la sus5 pension exempte de plasma renfermant la totalité des éléments formés du sang, sont avantageux pour le dosage de la capacité de production d'Hu IFN, en raison d'une capacité de production élevée et constante Il se confirme également que la suspension traitée au chlorure d'ammonium, dans 10 laquelle les érythrocytessont hémolysés et éliminés, donne une capacité de production d'Hu IFN faible et inconstante. TABLEAU 1 Type de traitement Virus de Volontaires en bonne I 20 25 30 Pas de traitement Sendai (HA) o 1 000 A 3 800 3 700 santé B 60 2 500 2 600 C 10 4 200 4 500 Suspension exempte O O 10 O de plasma 100 3 600 2 400 4 600 1 000 4 100 2 800 4 200 Suspension traitée O O 10 O au chlorure d'am 100 O 200 100 monium 1 000 O 300 70 EXPERIMENTATION 2 Effet de l'inoculum de virus sur la capacité de production d'Hu IFN L'étude de cet effet est réalisée sur des échantillons de sang frais de 3 volontaires en bonne santé et de 2 cancéreux, après héparinisation. Selon le procédé décrit dans l'expérimentation 1, des portions de 1 ml chaque de l'un des échantillons de sang hépariné, sont placés dans différents tubes à essai addition- nés avec des portions de 0,1 ml de sérum physiologique renfermant du virus de Sendai en quantités respectives de 0, 2,20, 200, 2 000, 20 000 ou 200 000 HA, mis à incuber, puis l'on dose leurs titres en Hu IFN par ml de sang Une série d'expérimentations utilisant 2 000 000 HA de virus de Sendai par ml de sang a été programmée, mais n'a pu être réalisée car la préparation de virus de Sendai à un titre aussi élevé n'a pas été couronnée de succès. Les résultats sont reportés dans le tableau 2. 10 TABLEAU 2 Virus de Volontaires en bonne santé Cancéreux Sendai D E F G H (HA) O 50 80 20 10 O 2 130 70 30 10 O 2 600 1 600 5 400 10 30 2 800 2400 5 800 20 70 2 000 4 100 2 100 6 300 20 190 20 000 3 500 2 300 8 800 10 140 000 4 400 2 200 7 300 10 180 2 000 000 ND ND ND ND ND Note: ND signifie non réalisé. Il ressort de ces résultats que les quantités de virus inoculées à raison de 20 à 200 000 HA/ml de sang, s'avèrent avantageuses Il se confirme que le sang recueilli chez un cancéreux a une capacité de production d'Hu IFN bien inférieure à celle du sang recueilli chez les volontaires bien 30 portants Cela suggère que le dosage de la capacité de production d'Hu IFN du sang, pourrait aider à la détection du cancer au stade précoce. Plusieurs formes de réalisation préférées, mais non limitatives, de l'invention sont décrites ci-dessous. PRODUCTION D'Hu IFN EXEMPLE 1 On place,dans un tube à essai en matière plastique, 1 ml de sang frais, hépariné, provenant d'un donneur volontaire en bonne santé, on y ajoute 1 000 HA de virus de Sendai, on met à incuber à 370 C pendant 20 heures, puis on irradie aux UV afin d'inactiver le virus Après centrifugation de ce mélange, on dose la partie surnageante quant à son titre en Hu IFN. La production d'Hu IFN est de l'ordre de 3 600 unités par ml de sang. EXEMPLE 2 1 ml de sang frais hépariné,provenant d'un volontaire en bonne santé, est additionné de 2 000 HA de virus de la ma15 ladie de Newcastle, dont 90 % de la capacité de reproduction a été inactivée Apres mise en incubation à 37 C pendant heures, le mélange est dosé quant à son titre en Hu IFN comme dans l'exemple 1. La production d'Hu IFN est de l'ordre de 2 800 unités par ml 20 de sang. EXEMPLE 3 Du sang frais hépariné, provenant de volontaires en bonne santé, est centrifugé pour en éliminer le plasma Les éléments formés ainsi obtenus sont alors rincés à la centri25 fugeuse avec du sérum physiologique, et mis en suspension dans du milieu RPMI 1640 de manière à avoir la même densité d'élément que dans le sang. La suspension résultante est placée dans une mini-fiole, dans laquelle on introduit 500 HA de virus de Sendai par 30 ml de suspension Apres mise à incuber à 37 C pendant 16 heures, le mélange est traité et dosé comme dans l'exemple 1, pour déterminer son titre en Hu IFN. La production d'Hu IFN est de l'ordre de 3 000 unités par ml de sang. EXEMPLE 4 On prépare, comme dans l'exemple 3, une suspension renfer- mant les éléments formes du sang. Cette suspension est placée dans une mini-fiole, dans laquelle on introduit 300 unités de Hu IFN par ml de suspension, et l'on met à incuber à 37 C pendant 6 heures On 5 ajoute ensuite à cette suspension 1 000 HA de virus de Sendai par ml de suspension, et l'on fait incuber pendant 16 heures supplémentaires, à 37 C Le produit résultant est traité et dosé quant au Hu IFN, comme dans l'exemple 1. La production d'Hu IFN est de l'ordre de 27 000 unités par 10 ml de sang. DOSAGE DE LA CAPACITE DE PRODUCTION D'Hu IFN DU SANG EXEMPLE 5 1 ml de sang frais hépariné,provenant d'un volontaire en bonne santé, un homme âgé de 28 ans, est traité comme dans 15 l'exemple 1, et soumis à un bio-dosage pour titrer l'Hu IFN. La capacité de production d'Hu IFN est de l'ordre de 3 600 unités par ml de sang. EXEMPLE 6 1 ml de sang frais hépariné, provenant d'un volontaire en 20 bonne santé, une femme âgée de 33 ans, est traité comme dans l'exemple 2, et dosé pour titrer l'Hu IFN comme dans l'exemple 5. La capacité de production d'Hu IFN est de l'ordre de 2 800 unités par ml de sang. EXEMPLE 7 Un sang frais hépariné provenant d'un volontaire en bonne santé, un homme âgé de 61 ans, est traité comme dans l'exemple 3, afin d'obtenir une suspension renfermant les éléments formés du sang On place 1 ml de cette suspension dans 30 un tube à essai en matière plastique, et on y ajoute 1 000 HA de virus de Sendai Après mise en incubation à 37 C pendant 16 heures, le mélange est soumis à la technique d'introduction d'anticorps double, un dosage immunosorbant lié à l'enzyme, afin de titrer l'Hu IFN. La capacité de production d'Hu IFN est de l'ordre de 3 400 unités par ml de sang Cette valeur est compatible avec celle que l'on obtient par bio-dosage. EXEMPLE 8 Un sang frais hépariné, provenant d'un cancéreux, vieil homme agé de 68 ans, est traité comme dans l'exemple 5, et 5 l'on obtient une capacité de production d'Hu IFN de l'ordre de 140 unités par ml de sang. EXEMPLE 9 Un sang frais hépariné provenant d'un cancéreux, femme âgée de 55 ans, est traité comme dans l'exemple 5, et l'on 10 obtient une capacité de production d'Hu IFN de l'ordre de unités par ml de sang. Il est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers indiquant des formes de réalisation préférées de l'invention, ne sont données qu'à ti15 tre d'illustration; différents changements et modifications possibles apparaitront à l'homme de l'art en partant de cette description détaillée, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'interféron humain spécifique (Hu IFN) à partir de sang humain, caractérisé en ce qu'on met à incuber dans un récipient du sang humain entier, en présence d'un anticoagulant et d'un virus intact ou inac5 tivé, dans des conditions permettant d'accumuler une quantité notable d'Hu IFN, puis on recueille l'Hu IFN ainsi obtenu. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de virus correspond à un titre d'hémoagglu10 tination compris entre 20 à 200 000, par ml de sang entier. 3 Procédé selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'anticoagulant est de l'héparine, du citrate-dextrose acide ou du citrate-phosphate-dextrose. 4 Procédé selon une des revendications 1 à 3, carac15 térisé en ce que le virus est le virus de Sendai ou celui de la maladie de Newcastle. Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mise à incuber s'effectue à une température comprise entre 30 et 40 C pendant 5 à 50 heures. 6 Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le sang entier utilisé est obtenu par élimination du liquide plasmatique provenant du sang d'un donneur, et mise en suspension des éléments formes résiduaires dans un liquide approprié comme sérum physiologique, solu25 tion tampon isotonique ou milieu de culture nutritif. 7 Procédé de dosage de la capacité de production d'Hu IFN d'un sang humain complet, caractérisé en ce qu'on utilise le procédé selon une des revendications 1 à 6, puis on titre l'Hu IFN accumulé. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on titre l'Hu IFN à l'aide d'un bio-dosage. 9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on titre l'Hu IFN à l'aide d'un radioimmuno-dosage. 10.Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce 35 qu'on titre l'Hu IFN à l'aide d'un immuno-dosage enzymatique.