Brevet FR2550205A1 — publié le 19850208

La présente invention concerne deux protéines granulocytaires humaines pures, des procédés pour leur isolement et leur préparation, leur application, les antisera produits contre ces protéines, des procédés pour produire lesdits antisera, l'application desdits antisera, et des nécessaires expérimentaux comprenant lesdits antisera. Parmi les cellules sanguines, seuls les globules blancs, les leucocytes, ont un noyau et sont 10 capables de produire les nombreuses protéines que l'on trouve dans le plasma sanguin 1 mm 3 de sang contient environ 6000 à 10 000 leucocytes Un sous-groupe de leucocytes est celui des granulocytes, qui à nouveau se subdivisent en granulocytes neutrophiles à noyau poly15 morphe, qui représentent environ 95 % de tous les granulocytes, granulocytes éosinophiles et granulocytes basophiles Chez les adultes en bonne santé la moelle osseuse libère quotidiennement environ 101 l granulocytes, mais ce chiffre peut être multiplié par 10 au cours des infections graves et des états inflammatoires. Normalement les leucocytes ont un temps de'transit d'environ 6 heures dans la circulation avant de pénétrer dans les tissus o ils remplissent leurs fonctions biologiques et sont finalement séquestrés La vitesse 25 de renouvellement des leucocytes peut varier considérablement entre l'état de santé et la maladie comme on le voit par les études utilisant des granulocytes marqués avec des isotopes ainsi que des procédés histologiques montrant divers dégrés d'infiltration des leu30 cocytes dans les tissus Cependant, aucun de ces procédés n'est facilement disponible pour les études cliniques sur la vitesse de renouvellement des leucocytes Un procédé différent et plus facilement dispo- nible peut consister à contrôler la libération d'une ou plusieurs protéines leucocytaires caractéristiquesau cours du fonctionnement et/ou de la séquestration des leucocytes. Dans trois publications antérieures ont été faites des découvertes suggérant que les leucocytes contiennent un certain nombre de protéines dont la concentration peut varier pendant différentes maladies. Certaines de ces protéines ont été appelées L 1, en par10 ticulier p I 6 3 et p I 6 3 L 1 (références 1 et 2) ou R:6 et R:7 (référence 3) Selon l'analyse par électrophorèse en deux dimensions (ISO-DALT) la protéine p I 6 5 L 1 est identique à la protéine R:6 et la protéine p I 6 3 L 1 est identique à la protéine R:7 Dans les publications ( 1) et ( 3) les protéines ont été observées par des procédés analytiques parmi des centaines à des milliers d'autres protéines Dans la publication ( 1) on a essayé de purifier la protéine Li dans le but d'établir des procédés quantitatifs et des caractéri20 sations préliminaires La filtration sur gel préparatif, la concentration isoélectrique et la chromatographie d'affinité donnent une protéine d'un poids moléculaire d'environ 51 000 Dalton (selon l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et la filtration sur gel), qui 25 est très instable, mais qui peut être utilisée pour l'immunisation de lapins ( 1) Les procédés d'isolement et de purification appliqués dans la référence ( 1) ne donnent que de très faibles rendements de la protéine à 51 000 Dalton et souvent la protéine est perdue au 30 cours des opérations L'immunisation de lapins par injection de la protéine à 51 000 Dalton donne un antisérum anti-protéine L 1 mais souvent également des anticorps contre d'autres protéines Ces antiséra doivent être libérés des anticorps indésirables par adsor- ption avec du sérum humain normal ou des extraits tissulaires humains Dans la publication ( 1) on extrait des leucocytes non fractionnés par congelation/décongélation et homogénéisation des leucocytes sans addition d'inhi5 biteurs enzymatiques. La publication ( 3) décrit simplement des procédés analytiques pour la détermination des protéines R:6 et R:7, mais aucun procédé d'isolement ni de purification. L'invention a pour objet d'établir des procédés doux et efficaces pour extraire et purifier les protéines L 1 à partir des leucocytes pour permettre leur caractérisation, et pour préparer des antisera ou anticorps monospécifiques contre ces protéines L'inven15 tion a également pour objet de fournir des nécessaires expérimentaux comprenant de tels antisera et/ou de telles protéines L 1 purifiées, éventuellement marquées avec un isotope radioactif ou avec une enzyme qui convient pour les dosages quantitatifs de protéines L 1 dans les liquides corporels ou les extraits cellulaires ou tissulaires. De façon surprenante, on a trouvé que l'on peut obtenir les protéines L 1 à l'état pur et stable si l'on n'utilise comme source que des granulocytes, et si les granulocytes sont détruits dans des conditions telles que les lysosomes dans les granulocytes ne sont pas simultanément détruits On y parvient en homogénéisant sous pression les granulocytes en présence d'un inhibiteur enzymatique et d'un agent qui stabilise les 30 membranes lysosomiales. L'invention concerne donc les protéines p I 6 3 et p I 6 5 Li pures et leurs mélanges, des procédés pour leur extraction à partir de granulocytes par homogénéisation sous pression des granulocytes en présence d'un inhibiteur enzymatique et d'un agent qui stabilise les membranes lysosomiales, et leur purification par divers procédés, l'application desdites protéines pour la préparation d'antisera ou anticorps monospécifiques, des procédés pour produire lesdits antisera ou anticorps monospécifiques par immunisation d'animaux expérimentaux avec lesdites protéines L 1, les antisera et anticorps monospécifiques en tant que tels, l'application desdits antisera ou anticorps et/ou des protéines L 1 purifiées pour la détermination qualitative et/ou quantitative des protéines Ll dans les cellules, les tissus et les liquides corporels, et des nécessaires expérimentaux comprenant lesdits protéines Li pures, antisera et/ou anticorps, éventuellement marqués par 15 des isotopes radioactifs ou par des enzymes. L'invention concerne en particulier les protéines p I 6 3 et p I 6 5 pures, leurs mélanges et leurs sels. Les sels des protéines L 1 sont en particulier 20 les sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables ou autres tels que pouvant être utilisés pour les procédés de précipitation et/ou de purification des protéines L 1. Ces sels sont par exemple des sels métalliques, 25 comme des sels de métaux alcalins ou de métaux alcalinoterreux, p ex des sels de sodium, de potassium, de magnésium ou de calcium, ou des sels de zinc, etc, ou des sels-d'ammonium avec de l'ammoniac, ou avec des amines primaires, secondaires ou tertiaires, par exem30 ple des sels avec des amines aliphatiques, cycloaliphatiques, cycloaliphatiques-aliphatiques ou araliphatiques primaires, secondaires ou tertiaires, comme avec des mono-, di ou tri-alcoyle inférieur-amines, p ex. la triéthylamine, les hydroxyalcoyle inférieur-amines, p ex la 2-hydroxyéthylamine, la bis-( 2hydroxvéthyl)amine ou la tris-( 2-hydroxyéthyl)amine, ou avec des esters aliphatiques basiques d'acides acrboxyliques, p. ex les alcoyle inférieuresters de l'acide éthylène5 diamine-tétraacétique, p ex le tétraéthylester, etc. D'autres sels sont les sels d'addition d'acides avec des acides inorganiques, en particulier des acides minéraux, comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, ou avec des acides organi10 ques, comme les acides carboxyliques, les acides sulfoniques ou les sulfo-acides, les acides alcane inférieurcarboxyliques éventuellement substitués, p ex l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide glycolique, l'acide maléique, l'acide hydroxymaléique, l'acide méthylmaléique, l'acide malonique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, ou les acides aromatiques éventuellement substitués, p ex l'acide benzo Xque, l'acide cinnamique, l'acide mandélique, l'acide salicylique, l'acide 4-amino-salicylique, l'acide 2-phénoxybenzoïque, l'acide 2-acétoxybenzoúque, l'acide embonique, l'acide nicotinique, l'acide isonicotinique ou les acides aminés, les acides alcane inférieursulfoniques, p ex l'acide méthane-sulfonique, l'acide éthanesulfonique, l'acide 2-hydroxy25 éthanesulfonique, l'acide benzènesulfonique, l'acide 4-méthylbenzènesulfonique, l'acide naphtalènesulfonique, etc. Les deux protéines se caractérisent par leur point isoélectrique à p H 6,3 et p H 6,5,-respectivement. 30 Le poids moléculaire des deux protéines déterminé par filtration sur gel et ultracentrifugation par gradient de densité est le même et est d'environ 36 500 Dalton Par SDS-électrophorèse sur gel de polyacrylamide on montre que les protéines consistent en trois polypeptides d'un poids moléculaire approximativement identique d'environ 12 500 Dalton Chacune de ces chaînes polypeptidiques a la séquence d'acides aminés suivante en partant de l'extrémité N-terminale: Meth-LeuThre-Glu comme on le montre par le procédé standard d'Edman La charge électrique nette et l'accessibilité des sites antigéniques sur les protéines L 1 sont grandement influencées par l'absence ou la présence d'ions calcium Les protéines réagissent beaucoup plus 10 fort comme antigènes in vitro en présence d'ions calcium. La stabilité à la chaleur des protéines Ll est élevée aux p H neutre et alcalins En faisant bouillir pendant 15 minutes dans EDTA 5 m M aqueux, p H-8,5 15 on conserve 90 % de la protéine Les protéines Ll sont partiellement précipitées par l'éthanol à p H acide, p ex entre environ 4 et 5. Les protéines Li ont une répartition caractéristique dans le corps humain, se trouvant en grandes 20 quantités dans les granulocytes neutrophiles, les monocytes, et les cellules de l'épithélium malpighien sauf la peau normale On les trouve également dans de nombreuses cellules cancéreuses de type épithélial malpighien et dans certaines cellules leucémiques et 25 lymphomateuses, en particulier celles du type leucémique myélogène et du type lymphomateux monocytaire. Les protéines Li se trouvent en grande majorité dans les cancers squameux de l'appareil urinaire et des poumons Les protéines Li sont également présentes dans les liquides corporels normaux à des concentrations relativement faibles chez les individus sains mais à des concentrations croissantes dans les états caractérisés par un degré croissant d'inflammation. Dans les leucocytes les protéines Ll sont présentes à 90 % dans la fraction cytosol. On peut utiliser les protéines L 1 comme protéines marqueuses en particulier sous forme radio125 32 activement étiquetée, p ex avec I 25 ou p 32, pour la détermination qualitative et/ou quantitative de la teneur en protéine L 1 dans les liquides corporels, les cellules et les tissus. Les protéines L 1 sont de bons immunogènes chez les animaux, par exemple chez les lapins. L'invention concerne en outre un procédé de préparation des protéines p I 6 3 et p I 6 5 L 1 pures, leurs mélanges, et leurs sels, caractérisé en ce qu'on brise des granulocytes humains dans un système tampon approprié, en ce qu'on enlève la matière cellulaire 15 non soluble, et en ce qu'on soumet le surnageant à a) une concentration isoélectrique et une élution des bandes contenant la protéine p I 6 3 et/ou p I 6 5 Ll avec un tampon, ou b) une chromatographie échangeuse d'anions avec un tam20 pon contenant de I'EDTA à un p H d'environ 8,5 et une élution des protéines L 1 désirées avec un tampon contenant des ions calcium, ou c) une chromatographie d'affinité, ou d) une électrophorèse préparative sur gel d'agarose, ou 25 e) une chromatographie échangeuse de cations, ou f) une filtration sur gel, ou g) une précipitation réversible avec Zn++ ou n'importe quelle combinaison des étapes a) à g), une libération des éluats à partir de n'importe quel 30 ampholyte et/ou sel, une concentration de la solution obtenue des protéines L 1 pures, si on le désire, une lyophilisation de la solution concentrée obtenue et, si on le désire, une transformation des protéines LI obtenues en un sel, ou une transformation du sel obtenu en les protéines libres. Les granulocytes utilisés comme source pour l'extraction de protéines L 1 sont obtenues à partir 5 de sang humain frais par n'importe quel procédé classique, par exemple par sédimentation de dextrane et centrifugation par gradient de densité. Le système tampon o les granulocytes sont brisés contient un agent empêchant la rupture simul10 tanée des lysosomes, comme le glycérol, les dextranes, et de préférence le saccharose, à une concentration suffisante pour stabiliser la pression osmotique avant et après la rupture des parois cellulaires Par exemple on utilise le saccharose à une concentration comprise 15 entre 0,27 et 0,34 M Le système tampon contient en outre des inhibiteurs enzymatiques empêchant la digestion des protéines LI, comme le diisopropylfluorophosphate (DFP), l'inhibiteur de la trypsine du soja, le Trasilol, le benzoate de mercure, la pepstatine A, 20 et de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMFS), et l'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA) ou leurs mélanges. On peut conduire la rupture de la paroi cellulaire de façon classique, par exemple par un moyen 25 mécanique, p ex avec un mélangeur rotatif, un pilon (procédé de Potter-Elvelyem), par ultra-sons, par congélation et décongélation, ou par des combinaisons de ces procédés Dans un procédé préféré on brise les granulocytes par homogénéisation sous pression. Après rupture des matières granulocytaires insolubles, comme les cellules non-brisées, on enlève les débris cellulaires et les lysosomes, par exemple par ultracentrifugation. Les protéines L 1 sont obtenues sous forme pure à partir de l'extrait granulocytaire brut par n'importe lequel des procédés de purification suivants. a) Concentration isoélectrique: La concentration iso5 électrique s'effectue de préférence dans un gel granulé, comme les perles d'agarose ou de dextrane polymérisé contenant un mélange approprié d'ampholytes du commerce pour fournir un gradient de p H stable d'environ p H 5 à 8 pendant l'opération Cette concentration isoélectri10 que s'effectue avec une tension maximum d'environ V/cm pendant environ 10 à 20 heures à une température d'environ 5 à 150 Un gel préféré est l'Ultrodex et l'ampholyte préféré est l'Ampholine Z. On applique l'échantillon de préférence au 15 côté cathodique du gel. La localisation des bandes de protéine Ll peut s'effectuer par des mesures de p H le long de la surface du gel ou en colorant des empreintes sur papier filtre de la surface supérieure, par exemple avec 20 du bleu coomassie. On enlève par grattage les bandes contenant les protéines Ll, et on élue avec un tampon approprié, contenant de 1 'EDTA à un p H compris entre environ 7,5 et environ 9, de préférence à un p H d'environ 8,5. 25 On débarrasse l'éluat des ampholytes et des sels par dialyse et/ou filtration sur gel, et on concentre par ultrafiltration et/ou lyophilisation. b) Chromatographie échangeuse d'anions: Les matières échangeuses d'anions utilisées dans ce procédé con30 tiennent par exemple des groupes amino tertiaires ou quaternaires, et sont par exemple la diéthylaminoéthylcellulose, p ex le diéthylaminoéthyl-Sepharose% , ou la QAE-cellulose (aminoéthyl-cellulose quaternaire). On applique dans la colonne l'extrait granulocytaire contenant les protéines Li dans un tampon de faible force ionique contenant de 1 'EDTA et avec un p H d'environ 8,5. Les protéines L 1 sont éluées spécifiquement par un tampon contenant des ions calcium, par exemple un tampon contenant du barbital 30 m M et du chlorure de calcium m M. c) Chromatographie d'affinité: Un troisième procédé de purification de la protéine L 1 se fonde sur la chro10 matographie d'affinité Ceci peut s'effectuer sur des perles de verre à pores contrôlés ayant une grande surface, p ex d'environ 50 m 2/g On dispose les perles de verre dans une colonne et on applique l'extrait granulocytaire brut dans un tampon approprié de faible 15 molarité contenant des ions calcium à p H neutre ou légèrement acide, p ex d'environ 6 à 7 On élue les protéines Ll avec un tampon alcalin de p H environ 7,5 à 8,5 contenant de 1 'EDTA environ 50 m M et du polyéthylèneglycol, ou du bromure de lithium. Un autre procédé de chromatographie d'affinité fait appel à une colonne d'anticorps anti-Ll. Les protéines Ll sont adsorbées sur les anticorps tandis que d'autres protéines sont lavées avec un tampon. On élue ensuite les protéines Ll avec une solution de sel, comme avec un tampon aqueux à environ p H 3,5 contenant un sel, comme le chlorure de sodium ou l'iodure de sodium. d) Electrophorèse préparative sur gel d'agarose: On utilise des gels d'agarose en lit plat de dimensions appropriées contenant un tampon barbital 75 m M/EDTA 2,5 m M, p H 8,5 L'électrophorèse s'effectue à 4 V/cm pendant -18 h On localise les bandes protéiques L 1 en colorant des empreintes sur papier-filtre de la surface supérieure du gel Les bandes protéiques L 1 se trouvent dans la région de l'a 2-globuline, et sont éluées par congélation/décongélation et centrifugation des bandes correspondantes du gel d'agarose. e) Chromatographie par échange de cations: La chromato5 graphie par échange de cations s'effectue sur des résines échangeuses de cations, comme la cellulose sulfopropyl-substituée ou le dextrane polymérisé On applique l'extrait granulocytaire brut dans la colonne après mélange avec un tampon de faible force ionique contenant 10 des ions calcium et avec un p H d'environ 6 On lave les protéines non adsorbées avec le tampon de départ et on élue les protéines L 1 avec un tampon contenant de 1 'EDTA et des concentratiohs croissantes d'ions sodium. f) Filtration sur gel: Pour la filtration sur gel on 15 utilise des gels d'agarose Sephadex G 75 à G 200 (gels Sepharose), comme des perles d'Ultra gel ou de gel de polyacrylamide, tel que Bio-Gel @P 60. Il est préférable que la colonne soit longue La longueur de la colonne doit être d'environ 50 fois son 20 diamètre On applique l'extrait granulocytaire brut tel quel et on chromatographie les protéines L 1. Pour garnir la colonne et pour le traitement onwutilise un tampon contenant de préférence du citrate de sodium 0,1 M, de 1 'EDTA-K 2 2,5 m M et du thimérosal 0025 m M, p H 8,5 Les protéines LI se trouvent dans une fraction correspondant à un poids moléculaire de 35 000 à 000 Daltons. g) Précipitation réversible avec Zn++: On précipite quantitativement les protéines LI à partir de solutions 30 aqueuses à p H neutre ou alcalin par traitement avec des ions Zn++, en particulier sous forme de sels de zinc solubles dans l'eau, comme de l'acétate de zinc ou du chlorure de zinc Par exemple on peut traiter une solution aqueuse contenant les protéines LI à un p H d'environ 8,5 avec une solution aqueuse environ 10 m M à 100 m M d'acétate de zinc On recueille le sel de zinc L 1 précipité, si nécessaire on lave avec la solution aqueuse de tampon, on traite avec un acide complexant, par exemple une solution aqueuse environ 100 m M d'acide éthylènediaminetétraacétique dipotassique à p H 8,5, et pour recueillir les protéines Li libres on filtre la solution à travers une colonne échangeuse d'ions, par exemple Pharmacia PD-10, et on 10 lyophilise. On produit les sels de la protéine L 1 par des procédés classiques, p ex par traitement avec les ions correspondants, p ex une base, un acide ou un sel contenant les ions désirés ou par traitement 15 par échange d'ions On peut par exemple préparer un sel de manganèse très insoluble en ajoutant des ions Mn++, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse d'environ 10 m M à 100 m M d'acétate de manganèse ou d'un autre sel de manganèse soluble dans l'eau, à une 20 solution aqueuse des protéines L 1. L'invention concerne également les antisera monospécifiques contre la protéine LI et les anticorps contenant des immunoglobulines, en particulier tels que produits par les lapins. On produit des antisera monospécifiques par des procédés classiques, p ex par injection hebdomadaires des protéines L 1 pures avec l'adjuvant de Freund complet, p ex par voie sous-cutanée ou intramusculaire, à des doses d'environ 100 pg par lapin par semaine pendant environ 8 à 16 semaines On recueille alors du sérum des animaux p ex en sectionnant une veine et en faisant coaguler Au lieu de lapins on peut également utiliser d'autres homéothermes non humains, en particulier des mammifères, p ex des moutons, des chèvres, des rats, des souris, des chevaux, etc. On peut isoler du sérum la fraction globulinique contenant l'anticorps monospécifique par des procédés classiques, par exemple par chromatographie échangeuse d'ions. Pour la production desdits anticorps anti-Ll monospécifiques, on fait passer l'antisérum contenant l'anticorps monospécifique ou sa fraction globulinique à travers une colonne o les protéines L 1 purifiées 10 ont été conjuguées à une matière appropriée, comme l'agarose ou le gel de cellulose Après lavage des protéines non adsorbées on élue les molécules d'anticorps anti-Ll avec un tampon de p H environ 3,5 contenant du chlorure de sodium ou de l'iodure de sodium. 15 On ajuste les fractions correspondantes à un p H d'environ 7, on dialyse et on concentre. On utilise les anticorps anti-Ll, purifiés ou sous forme brute, comme sous la forme de l'antisérum ou de ses fractions globuliniques, pour les procédés qualitatifs ou quantitatifs de détection des protéines L 1 dans les cellules, les tissus ou les liquides corporels Ces procédés comprennent la précipitation dans les gels, la néphélométrie, le radioimmuno-dosage, l'immuno-dosage enzymatique, l'immuno25 fluorescence et les techniques cytohistochimiques à l'immunoperoxydase de façon classique. L'invention concerne en outre les nécessaires expérimentaux comprenant l'anticorps anti-Ll monospécifique pur, ou la fraction globulinique d'anti30 corps anti-Ll, ou l'antisérum contenant l'anticorps anti-Ll Ces nécessaires expérimentaux sont du type classique et visent une mono-radioimmunodiffusion, une agglutination de latex, le test de la tache, les radio-immunodosaqes, les immunodosages enzymatiques, L'immuno-f Yuorescenrce ou les tests immuno-histochimiques enzymatiques. Ces nécessaires, outre les anticorps anti-Ll sous forme pure ou brute, séchée ou solubilisée dans un tampon approprié, peuvent contenir des gels tout préparés, du latex, du polystyrène, des hématies animales stabilisées au formol, ou des particules analogues, des enzymes, comme la peroxydase de moringa ailée, la phosphatase alcaline, des substrats enzymatiques, des 10 anticorps fluorescents ou conjugués à des enzymes et des matières appropriées pour séparer les molécules L 1 liées à l'anticorps des molécules Ll libres, comme des souches mortes de Staphylococcus aureus appartenant aux souches produisant la protéine A de staphylocoque, 15 du charbon de bois (qui adsorbe la protéine Ll libre, mais non le complexe anticorps-protéine) ou un second anticorps, comme l'immunoglobuline de chèvre ou antilapin, ou des protéines Li marquées avec des 125 isotopes radioactifs, comme I 125, ou avec des enzymes, 20 comme la peroxydase de moringa ailée ou la phosphatase alcaline Le nécessaire peut également contenir des supports sur lesquels les anticorps anti-Ll monospécifiques sont fixés à une surface, p ex la surface interne de tubes expérimentaux, la surface de perles 25 de verre ou de plastique, des morceaux de papierfiltre, des membranes d'acétate de cellulose ou des matières analogues, ainsi que des tampons pour de tels procédés. On utilise ci-dessus et ci-dessous les 30 abréviations suivantes: PMSF: fluorure de phénylméthylsulfonyle PAGE: électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS: dodécylsulfate de sodium IEF: concentration isoélectrique SRID: mono-immunodiffusion radiale NHS: sérum humain normal ACD: dextrose acide-citrate DFP: diisopropylfluorophosphate EDTA: acide éthylènediamine tétraacétique EDTA-K 2: sel dipotassique d'EDTA DEAE: diéthylaminoéthyle RIA: radio-immunodosage PBS: sel physiologique tamponné au phosphate 10 PASA: Staph aureus contenant la protéine A. Exemple 1: Isolement de granulocytes a) On laisse se sédimenter pendant 1 h à 4 C un mélange constitué de 435 ml de sang humain frais, 65 ml d'une solution aqueuse contenant 2,2 % de citrate trisodique 15 dihydraté, 0,8 % d'acide citrique anhydre et 2,45 % de dextrose, 250 ml de dextrane à haut poids moléculaire (Dextraven 150) ec 23 ml dune solution contenant de l'acide citrique 2,5 m M, du citrate trisodique 45 m M, du glucose 80 m M et du chlorure de sodium 15 m M. On recueille la coucde surnageante et on centrifuge à g pendant 20 minutes à 4 WC On traite le sédiment avec 50 ml d'eau distillée glacée ce qui lyse les érythrocytes Au bout de 30 secondes l'isotonie est rétablie par addition de 16,5 ml de chlorure de sodium 25 0,6 M glacé On lave deux fois les leucocytes restants avec du sel physiologique isotonique On sépare les granulocytes des cellules mononucléaires par centrifugation sur Lymphoprem lmatiere de centrifugation à gradient de densité constituée d'une solution de 30 métrizoate de sodium à 9,6 % (p/v) contenant 5,6 % (p/v) d'un polysaccharide agglutinant les érythrocytes (Ficoll)l puis par centrifugation à 800 g pendant minutes à 20 C Ce procédé donne un rendement d'environ 5 x 108 cellules, dont environ 95 % sont des granulocytes. 255 0205 b) Extraction des granulocytes On remet en suspension les cellules obtenues comme il est dit en a) dans du saccharose 0,27 M contenant du PMSF 10 m M, de 1 'EDTA-K 2 2,5 m M, et du thimé5 rosal 0,25 m M, avec du tampon tris ajouté jusqu'à p H 8,5 On homogénéise ensuite les cellules selon French et Holm ( 4) par exposition à 28 kg/cm 2 d'air comprimé pendant 2 périodes de 2 minutes tandis qu'on les laisse s'échapper du compartiment sos pression à raison d'une 10 goutte par seconde Pendant cette opération on maintient les récipients o sont les cellules dans de la glace contenant de l'eau Environ 90 % des cellules sont brisées et, après centrifugation à 100 000 g pendant 1 h, on trouve environ 90 % du total de protéine LI dans le liquide surnageant clair Ce dernier est appelé extrait granulocytaire brut La teneur en protéine totale est d'environ 3 mg/ml, dont 30 % sont des protéines L 1. c) Concentration isoélectrique préparative (IEF) Pour 1 'IEF préparative on utilise des plaques de gel de 100 x 240 x 5 mm constituées d'Ultradex (Dextrane G 75 raffiné) contenant 2 % (p/v) d'Ampholine à p H 5-8 (mélange d'ampholytes synthétiques avec des capacités tampon à ler point isoélectrique) On mélange 25 les échantillons l 5 ml du surnageant selon b)l avec un volume égal de gel Ultradex et on applique 5 cm de la cathode sur les plaques de gel On conduit la séparation pendant 18 h avec au maximum 25 V cm 1, 15 m A et 10 W On localise les bandes protéiques à la fois par coloration au bleu coomassie d'une empreinte sur papierfiltre de la plaque de gel et par mesures du p H de la surface supérieure du gel On élue les protéines L 1 dans la section de p H 6,3 et 6,5 avec un volume égal d'une solution aqueuse contenant de l'acétate de sodium 0,1 M, de l'EDTA-K 2 2,5 m M, et du thimérosal 0,25 m M, p H 8,5, par centrifugation à 2000 g pendant 20 minutes à travers des filtres Millipore Q 0,45 vm On enlève les ampholytes par dialyse contre le tampon d'élution 5 pendant lanuit On concentre les solutions restantes contenant les protéines et le tampon par ultrafiltration sur des cellules Minicon (membrane semiperméable) Le rendement de ces opérations est d'environ 20 % de la protéine L 1 appliquée sur le gel d'IEF préparatif On applique 2,5 ml de cette solution sur une colonne de Pharmacia n PD-10 (Sephadex @G 25 M) équilibrée avec de l'eau distillée et on élue les protéines L 1 avec 3,5 ml d'eau distillée et on lyophilise pour donner 1 mg de protéine LI pure p I 6 3 et 6 5. 15 On peut également purifier séparément les protéines p I 6 3 et p I 6 5 L 1 par ce procédé donnant environ 0,67 mg de la protéine p I 6 5 et environ 0,33 mg de la protéine p I 6 3 L 1. Exemple 2 a) Le procédé tire parti du changement brutal de point isoélectrique de la protéine Ll lorsqu'on la laisse absorber les ions calcium ( 2) La protéine, dans les extraits granulocytaires bruts, se lie à un échangeur d'anions, par exemple du type diéthylaminoéthyl, à un 25 p H alcalin et avec un tampon contenant de l'acide éthylènediamine tétraacétique en quantités suffisantes pour lier les ions calcium On peut ultérieurement éluer spécifiquement les protéines Li en ajoutant du chlorure de calcium au tampon pour assurer une concen30 tration finale d'environ 5-10 m M par litre. On prépare les extraits granulocytaires bruts comme il est dit dans l'exemple 1 Leur teneur protéique totale est d'environ 2-5 g/litre, dont environ 60 % est constitué de protéine L 1. On équilibre le DEAE-Sephacel (de Pharmacia, Suède) avec un tampon au barbital 60 m M ( 7,7 g d'acide diéthylbarbiturique et 10,5 g de son sel de sodium dans 1 litre d'eau) contenant 1 g/litre d'EDTA-K 2, p H 8,5, et on charge dans une colonne chromatographique d'une dimension de 1,5 x 5 cm, c'est-à-dire un volume d'environ 9 ml. On applique l'échantillon, environ 10 ml d'extrait granulocytaire brut dilué avec 30 ml de tampon au barbital EDTA-K 2 à p H 8,5 avec une pompe péristaltique donnant un débit d'environ 2 ml/minute. On lave les protéines non adsorbées avec 100 ml de tampon au barbital Avant l'élution des protéines L 1 on lave également la colonne avec 30 ml de tampon au barbital sans EDTA-K 2 On élue alors les protéines L 1 20 avec un tampon au barbital 60 m M contenant du Ca C 12 m M, p H 8,5. La figure 1 montre ie profil d'élution des protéines totales et de la protéine L 1 d'une telle chromatographie par échange d'ions, et la figure 2 mon25 tre les schémas de bande protéique lorsqu'on soumet l'extrait leucocytaire brut et la protéine L 1 purifiée à une électrophorèse analytique sur gel d'agarose. On voit qutla protéine L 1 purifiée donne deux grandes bandes comme il est dit antérieurement correspondant 30 à p I 6 3 et p I 6 5. La quantité de protéine L 1 éluée avec le tampon contenant du calcium est proche de 50 % de la quantité appliquée dans l'échantillon et se trouve dans un volume total d'environ 20 ml On peut commo- dément concentrer cette solution par ultrafiltration en utilisant des membranes Millipore CX-10. Ceci aboutit à une certaine perte de protéine, selon qu'on ajoute ou non de 1 'EDTA pour empêcher la protéine 5 Ll de se lier aux membranes Même sans addition d'EDTA on peut obtenir un rendement global d'environ 35 %. Comme on le voit dans la figure 1 une partie de la protéine L 1 est éluée avec le tampon au barbital m M contenant du Ca C 12 5 m M et du Na Cl 125 m M, p H 10 8,5, mais cette protéine donne des bandes surtout anodiques et cathodiques des grandes bandes L 1 et peut représenter une protéine-L 1 partiellement dénaturée Jou complexée outre différentes protéines. Procédés à grande échelle On peut développer avec succès le procédé décrit ci-dessus pour manipuler 50 mi d'extraits granulocytaires bruts On y parvient en utilisant une colonne contenant environ 50 ml de DEAE-Sephacel (environ 2,5 x 10 cm) et des accroissement proportionnels du 20 volume des mêmes tampons que ceux donnes ci-dessus. b) Ceci tire parti du fait que l'on peut obtenir une précipitation réversible des protéines Li par addition de Zn++ 10 m M A 10 ml d'extrit leucocytaire brut on ajoute 90 ml de tampon au barbital, 75 m M, p H 895, 25 et 10 ml d'une solution d'acétate de Zn 100 m M dansl'eau On lave plusieurs fois le précipité, par exemple fois, avec un tampon au barbital 75 m M, p H 8,5, avec de l'acétate de Zn 10 m M Enfin on lave le précipité avec un tampon au barbital 75 m M, p H 8,5, et on le 30 dissout en ajoutant goutte à goutte une solution d'EDTA-K 2 100 m M dans l'eau, p H ajusté à 8,5 avec de l'hydroxyde de sodium 5 M On applique cette solution dans une colonne Pharmacia PD-10 équilibrée avec de l'eau distillée et on élue les protéines Li avec 3,5 m M d'eau distillée et on lyophilise pour donner environ 10 à 20 mg de protéines L 1 pures. Exemple 3: Préparation d'antisérum anti-L 1 purifiée On homogénéise avec l'adjuvant complet de Freund une solution contenant environ 1 mg/ml de protéine Li purifiée p I 6 3 et p I 6 5 (obtenue selon l'exemple 1 ou 2) dans l'acétate de sodium 0,1 M, I'EDTA 2,5 m M, le thimérosal 0,25 m M, p H 8,5 On injecte un volume de ce mélange contenant environ 100 pg de protéines Ll à de multiples sites sous-cutanés chez des lapins une fois par semaine pendant six semaines. On saigne les lapins par ponction veineuse On laisse le sang se coaguler à la température ambiante pendant la nuit On recueille le sérum et on en teste l'activité 15 anti-sérum Ll. Normalement on peut utiliser un tel antisérum à une dilution de 1:32 pour une mono-immunoprécipitation radiale et à une dilution de 1:2000 pour un radio-immunodosage. Exemple 4: Nécessaire expérimental pour radio-immunodosage Le nécessaire expérimental contient (pour tests): 1 ampoule 1 bouteille 1 ampoule recouverte 30 de caoutchouc 2 ml de sérum anti-Ll lyophilisé obtenu selon l'exemple 3 100 ml de tampon RIA: chlorure de sodium 50 m M, sérum-albumine de boeuf 0,2 %, azide de sodium 0,2 % ajusté à p H 7,4 ml de solution aqueuse de protéines L 1 marquées avec de l'iode 125 radioactif ajustée pour donner 500 cpm/ml (étiquetées par le procédé de Bolton-Hunter) 1 bouteille 5 ml d'une suspension aqueuse de Staphylococcus aureus traité au formol (PASA = Staph aureus con5 tenant la protéine A de souche Cowan I) dans le sel physiologique tamponné au phosphate 1 bouteille 2 ml d'une solution de tampon RIA contenant 500 ng de protéine L 1 10 (solution de référence). Mode opératoire pour la quantification de protéine Ll par RIA On prépare une série de standards par dilution au double de la solution de référence Ll fournie jusqu'à 7,8 ng/ml avec un tampon RIA Dans une série de 15 tubes expérimentaux on dépose avec une pipette 25 1 pl de plasma de malade dilué au 1:30 e dans un tampon RIA ou une solution de référence standard A ceci on ajoute pl de sérum anti-Ll et on fait incuber les mélanges à 37 C pendant 30 minutes On ajoute alors 50 pl de la solution avec la protéine L 1 à marquage radioactif -puis on fait incuber à 37 C pendant 1 h A chacun des tubes on ajoute alors i ml de suspension de Staph. aureus et on centrifuge à 2000 g pendant 10 minutes. On aspire le surnageant et on mesure la radioactivité 25 du sédiment On reporte sur un graphique le pourcentage de la radioactivité par rapport à la radioactivité ajoutée initialement pour les dilutions standards de référence L 1 de manière que l'on puisse tracer la courbe de référence On peut lire d'après cette courbe 30 les valeurs des échantillons du malade. Exemple 5 Nécessaire expérimental pour la détermination népnhélométrique des protéines LI en solution Le nécessaire expérimental contient: 1 ampoule 1, 5 ml de solution d'anticorps anti-Ll dans un tampon à p H 7,5 (tampon d'acétate de sodium) contenant du chlorure de calcium m M) avec un titre d'environ 1:32 lorsqu'on teste par double immuno-diffusion dans 10 un gel d'agarose. 1 bouteille 20 ml de tampon de dilution comme ci-dessus 1 ampoule 0,5 ml d'une solution de protéine L 1 à une concentration de 400 pg/ml. On dilue le sérum anti-Ll au 1:15 e avec le 15 tampon de dilution On réalise six standards de protéine L 1 ( 1:1 à 1:64) en diluant dans un volume double la solution de L 1 standard On mélange alors 250 pl de dilution d'anticorps et 10 m 1 d'échantillon ou de standard L 1 dans des cuvettes de néphélométrie et on fait incuber 20 pendant 10 minutes à la température ambiante On lit la densité optique sur le néphélomètre. Exemple 6: Nécessaire expérimental pour analyse en mono-immuno-diffusion radiale pour les protéines L 1 en solution Le nécessaire expérimental contient: 1 ou plusieurs gels d'agarose préalablement préparés contenant 2 % de solution d'anticorps anti-Ll régulièrement répartie avec un titre d'environ 1:32 lorsqu'on teste par 30 double diffusion en gel, et de l'acétate de sodium 0,1 M, du chlorure de calcium m M, du thimérosal 0,25 m M, p H 8,5. 1 ampoule 0,1 ml de solution de protéine L 1 avec une concentration de 300 pg/ml. Le gel d'agarose est fourni dans un compartiment clos pour empêcher la dessication du gel Le gel comporte 18 puits préalablement préparés pour application de 10 p 1 des solutions standards et des échantillons à tester. Exemple 7 Nécessaires expérimentaux pour dosage d'agglutination de latex pour une détermination semi-quantitative de la protéine L 1 Le nécessaire a) 1 bouteille 2 ml b) 1 bouteille 2 ml expérimental contient: d'une suspension de particules de latex de 50 mm de diamètre auxquelles on a fixé de la protéine L 1 purifiée d'une solution tampon d'anticorps anti-Ll qui agglutine les particules de latex mentionnées ci-dessus, avec un titre de 1:3 à 1:4. d'une solution tampon de la protéine L 1 à une concentration de 50 pg/ml. c) 1 bouteille 0,5 ml On mélange 1 goutte d'a), b) et l'échantillon du malade à tester sur une lame noire et on observe une agglutination éventuelle pendant 5 minutes Le dégaut d'agglutination signifie que la concentration de Ll est supérieure à 1000 ng/ml Dans le témoin positif 30 on mélange les solutions tampons a), b) et c) et aucune agglutination ne doit se produire. Exemple 8: Nécessaires expérimentaux pour le test de la tache Le nécessaire expérimental contient: morceaux d'acétate de cellulose 5 x 50 mm avec 2 taches d'un diamètre de 4 mm d'anticorps anti-Ll spécifique séché situé à 10 et 30 mm d'une extrémité a) 1 bouteille 2 ml d'une solution tampon contenant des anticorps anti-Li L spécifiques conjugués avec de la peroxydase de 10 moringa ailée b) 1 bouteille 10 ml d'une solution aqueuse tampon tris/ sel physiologique isotonique p H 7,4 contenant 1 mg/ml de diaminobenzidine (DAB) c) 1 bouteille 1 ml d'une solution aqueuse tamponnée de protéine LI à une concentration de 50 pg/ml. Pour tester on applique une goutte de la solution échantillon sur la première tache et une goutte 20 de solution c) sur la seconde tache Au bout de 10 minutes on lave la bande expérimentale dans le tampon tris/ sel physiologique pendant 5 minutes On applique ensuite une goutte de solution a) sur chaque tache et on laisse pendant 10 minutes à la température ambiante puis on lave 25 à nouveau la bande pendant 5 minutes dans le tampon tris/sel physiologique A 1 ml de solution b) on ajoute pl de peroxyde d'hydrogène à 30 % On applique une goutte de ce mélange sur chaque tache Une coloration brune distincte se produisant au bout de trois minutes 30 indique la présence de protéines L 1 dans l'échantillon. Par une dilution en série de l'échantillon on peut rendre l'expérience semi-quantitative. Exemple 9: Nécessaires expérimentaux pour protéines Li par immuno-dosage enzymatique Les nécessaires expérimentaux contiennent: 1 plateau de microtitration avec 5 x 10 puits faits de matière plastique, la surface interne du fond et le partie inférieure des puits étant revêtue d'anticorps anti-Li spécifiques a) 1 bouteille 2 ml d'une solution tampon contenant les anticorps anti-Li spécifiques conjugués avec de la peroxydase de moringa ailée b) 1 bouteille 10 ml d'une solution aqueuse tampon tris/sel physiologique isotonique p H 7,4 contenant lmg/ml de diaminobenzidine (DAB) c) 1 bouteille 1 ml d'une solution tampon aqueuse de protéine Ll à une concentration de 50 pg/ml. Procédé expérimental: On ajoute 50 pi de la solution d'échantillon expérimental ou de la solution c) aux puits et on fait incuber à la température ambiante 25 pendant 1 h on lave alors les puits avec du tampon tris/sel physiologique contenant 0,5 % de sérum-albumine de boeuf A chaque puits on ajoute 50 pl de solution a) et on fait incuber pendant 1 h à la température ambiante. On lave les puits comme ci-dessus A 1 ml de solution b) 30 on ajoute 5 pl de peroxyde d'hydrogène à 30 %, et on ajoute à chaque puits 50 pi de ce mélange On fait incuber le plateau pendant 30 minutes àla température ambiante et on détermine par photométrie l'intensité de la couleur dans chaque puits. Légences des figures Figure Figure 1.: Profil chromatographique de 9 mi d'extrait leucocytaire brut sur une colonne de DEAE-Sephacel, 1,5 x 5 cm On détermine la teneur totale en protéine par absorption de la lumière UV à 280 nm et la concentration de L 1 par monoimmunodiffusion radiale. 2: Schémas de bandes protéiques d'extrait granulocytaire brut (A), de la fraction Ca C 12 5 m M (B) et de la fraction Na Cl 125 m M (C) sur électrophorèse sur gel d'agarose dans un tampon au barbital, 75 m M, avec EDTA-K 2 2,5 m M, p H 8,5. La fraction B contient les deux protéines Ll p I 6 3 et p I 6 5 pures. Bibliographie ( 1) Magne K Fagerhol, Inge Dale et Terje Andersson, Scand J Haematol ( 1980) 24, 393-398. ( 2) M K Fagerhol, I Dale, T Andersson, Bull europ. Physiopath resp 1980, 16 (suppl) 272 281. ( 3) Karen E Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe et Egil Jellum, Clin Chem,Vol 28, n" 4, 1067-1073 ( 1982). ( 4) French, P C et Holm, R A, ( 1947) Thromb Diath. Haemorrh 32, 432-440. -28 2550205 REVENDICATIONS 1 Protéines L 1 p I 6 3 et p I 6 5 pures, leurs mélanges et leurs sels. 2 La protéine L 1 p I 6 3 pure et ses sels selon la revendication 1. 3 La protéine L 1 p I 6 5 pure et ses sels selon la revendication 1. 4 Application des protéines LI selon la revendication 1 comme protéines marqueuses ou comme immunogènes chez 10 les animaux. Procédé de préparation des protéines L 1 p I 6 3 et p I 6 5 pures, leurs mélanges et leurs sels, caractérisé en ce qu'on brise des granulocytes humains dans un système tampon approprié, en ce qu'on enlève la matière cellulaire non soluble, et en ce qu'on soumet le surnageant à a) une concentration isoélectrique et une élution des bandes contenant la protéine L 1 p I 6 3 et/ou la protéine L 1 p I 6 5 avec un tampon, ou b) une chromatographie échangeuse d'anions avec un tampon contenant de i'EDTA à un p H d'environ 8,5 et une élution des protéines L 1 désirées avec un tampon contenant des ions calcium, ou c) une chromatographie d'affinité, ou d) une électrophorèse préparative sur gel d'agarose, ou e) une chromatographie échangeuse de cations, ou f) une filtration sur gel, ou g) une précipitation réversible avec Zn++ ou n'importe quelle combinaison des étapes a) à g), en ce 30 qu'on libère les éluats des ampholytes et/ou sels éventuellement présents, en ce qu'on concentre la solution des protéines L 1 pures obtenue, si on le désire, en ce qu'on lyophilise la solution concentrée obtenue et, si on le désire, en ce qu'on transforme les protéines L 1 obtenues en un sel, ou en ce qu'on transforme le sel obtenu en les protéines libres. 6 Les antisera anti-Ll monospécifiques et les anticorps anti-Ll monospécifiques produits par les protéines L 1 pures selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 7 Les antisera et anticorps anti-Ll monospécifiques selon la revendication 6 obtenus chez les lapins. 8 Procédé de préparation d'antisera anti-Ll et d'anticorps anti-L 1, caractérisé en ce qu'on traite les animaux avec des protéines Ll pures selon la revendication 1 15 et en ce qu'on obtient les antisera ou anticorps par des procédés classiques. 9 Procédé selon la revendication 8, o l'on produit les antisera monospécifiques par injection hebdomadaire des protéines L 1 pures avec l'adjuvant complet de Freund, 20 p ex par voie sous-cutanée ou intramusculaire, à des doses d'environ 100 pg par lapin par semaine pendant environ 8 à 16 semaines, et o l'on recueille le sérum des animaux par section veineuse et coagulation. Procédé selon la revendication 8, o l'on utilise 25 des animaux homéothermes non humains. 11 Procédé selon la revendication 8, o l'on utilise des moutons, des chèvres, des rats, des souris, des chevaux, etc. 12 Procédé selon la revendication 8, o l'on utilise comee animaux des lapins. 13 Procédé selon la revendication 8, o l'on isole des antisera L 1 les fractions globuliniques contenant les anticorps monospécifiques et o onles utilise comme source pour isoler les anticorps anti-Ll. 14 Procédé selon la revendication 8, o l'on fait passer l'antisérum contenant les anticorps monospécifiques ou sa fraction globulinique à travers une colonne o 10 les protéines Ll purifiées ont été conjuguées à une matière appropriée, et après lavage des protéines non adsorbées on élue les anticorps anti-Ll par un tampon d'un p H d'environ 3,5 contenant du chlorure de sodium ou de l'iodure de sodium. 15 Procédé selon la revendication 8, o l'on dialyse et on concentre les antisera anti-Ll ou les solutions d'anticorps anti-Ll. 16 Application des antisera anti-Ll et des anticorps anti-Ll pour la détermination qualitative ou quantita20 tive des protéines Ll dans les cellules, les tissus ou les liquides corporels. 17 Nécessaire expérimental comprenant les anticorps anti-Li monospécifiques, les fractions globuliniques d'anticrops anti-Ll ou les antisera anti-Ll selon 25 la revendication 1. 18 Nécessaire expérimental selon la revendication 17 essentiellement tel que décrit dans l'une quelconque des exemples 5-9. 19 Protéine Li p I 6 3 et p I 6 5 pure, ses mélanges et ses sels, qu'ils soient obtenus selon le procédé de la revendication 5 ou par un de ses équivalents évidents. Protéine L 1 p I 6 3 et p I 6 5 pure, ses mélanges et ses sels, qu'ils soient obtenus selon l'un quelconque des exemples 1 et 2 ou par un de ses équivalents évidents. 21 Antisérum anti-Ll ou anticorps anti-Ll monospécifique, qu'il soit obtenu selon un procédé de la revendication 8 ou par un de ses équivalents évidents. 22 Antisérum anti-Ll ou anticrops anti-Ll monospécifique, qu'il soit obtenu selon l'exemple 3 ou par un de ses équivalents évidents.