Brevet FR2549726A1 — publié le 19850201

La présente invention concerne des nouveaux facteurs d'augmentation de la production d'anticorps humains et un procédé pour leur préparation. Plus particulièrement, la présente invention concer5 ne des facteurs d'augmentation de la production d'anticorps humains, qui sont préparés par les lymphocytes humains et qui augmentent la production des immunog Lobulines, Ig G et Ig M d'un anticorps humain et le procédé de préparation de ces facteurs. De nombreux rapports concernent les facteurs d'augmentation et d'intensification de la production des anticorps Parmi eux, le facteur de croissance des cellules T (Interleucine 2, IL-2), le facteur de croissance des cellules B(BCGF), le facteur de différenciation des cellu15 les B (BCDF), l'Interleucine I (IL-1) etc sont connus comme étant des facteurs solubles formés par les cellules T ou les macrophages On a trouvé que tous les composés ayant ces fonctions sont des composés à haut poids moléculaire dont la masse moléculaire est de 15 000 à 18 000 20 à 12 000 à 18 000. Le traitement et la prophylaxie de maladies en utilisant les réactions antigènes -anticorps ont donné beaucoup de bons résultats, néanmoins, beaucoup de problèmes restent encore à résoudre On sait que plusieurs maladies incurables sont caractérisées par le fait que la production d'anticorps est insuffisante ou trop faible. Dans un tel cas, on peut penser que les effets souhaités seront obtenus si la production d'anticorps est augmentée ou intensifiée De telles maladies sont, par exemple, 30 le cancer, la grippe, les déficiences immunitaires et d'autres. sur les Au cours de recherches/mécanismes contrôlant la formation des anticorps humains, les inventeurs ont trouvé que les lymphocytes qui adhèrent aux fibres de Nylon et dont on a préalablement séparé les macrophages, ont une production d'anticorps nettement augmentée En outre, la présente invention est comp Lètée par la culture des lymphocytes adhérant sur les fibres de nylton pour mettre en évidence la présence dans les surnageants des cultures de composés de faible masse moléculaire qui augmentent la production d'anticorps et par L'isolement des composés ayant ces fonctions. Un objet de la présente invention est de fournir des facteurs augmentant la production d'anticorps humains et ayant les propriétés physico-chimiques et biologiques 10 mentionnées dans ce qui suit Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de préparation des facteurs augmentant la production des anticorps humains consistant: à séparer les lymphocytes en Lymphocytes adhérant aux fibres de nylon 15 et en lymphocytes non retenus par les fibres de nylon; et en isolant les facteurs par passage du surnageant de Leur culture à travers une membrane de dialyse La présente invention concerne un procédé de préparation des facteurs augmentant la production d'anticorps humains que L'on appellera dans ce qui suit, si nécessaire, les présents facteurs Pour préparer les présents facteurs, premièrement, on cultive des lymphocytes humains On obtient les lymphocytes humains, à partir des amygdales, des rates, des thymus et du sang périphérique Par exemple, on coupe les amygdales en languettes fines avec une paire de ciseaux recourbée- Les' morceaux sont mis en suspension dans un milieu de culture complémente avec de La penicilline, de la streptomycine et autres, qui protègent le milieu 30 de la contamination bactérienne Le milieu de culture des cellules utilisé peut être n'importe quelle solution commercialisée comme le RPMI-1640 (Marque déposée de Nissui Seiyaku Co, Ltd, Japan, comp Lémenté avec de la L-glutamine et du mercapto-2-éthanol) Les tissus en lamelles suspendus ans les milieux de culture cellulaire sont fi Ltrées à travers un orifice étroit, etc pour éliminer les Lamelles de tissu et obtenir une suspension de cellules Cette suspension cellulaire-est placée dans un tube à centrifugation sur un "Ficoll-Paque" (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) et le tube est centrifugé pour obtenir une couche de cellules mononuclées A cette sus5 pension de cellules mononuclées, on ajoute du SILICAGEL (marque déposée) pour éliminer les macrophages, et on obtient les lymphocytes Les lymphocytes sont suspendus dans un milieu de culture complémenté avec du sérum de veau foetal avant d'être introduit dans des colonnes contenant 10 des fibres de nylon On laisse pendant 30 à 45 minutes à -38 C en culture les colonnes de fibres de nylon, sur lesquelles adhèrent les lymphocytes, puis on lave avec le milieu de culture préparé de la même façon, et les lymphocytes sont séparés ainsi en lymphocytes adhérant aux fibres'de ny15 lon et en lymphocytes non retenus par les fibres de nylon. Quand les fibres de nylon sur lesquelles adhérent les lymphocytes et un milieu de culture préalablement refroidi à 4 C sont mises en contact, mélangées et agitées, les lymphocytes se détachent des fibres de nylon et passent dans le 20 milieu de culture On centrifuge alors le milieu de cuiture. Les lymphocytes ainsi obtenus sont suspendus dans un milieu de culture complémenté avec du sérum de veau foetal (contenant de la pénicilline et de la streptomycineainsi que de la L-glutamine et du mercapto-2-éthanol) La suspension des cellules obtenue est mise en culture dans une atmosphère contenant du dioxyde de carbone à 35-38 C pendant 1 à 7 jours Après ce temps, on trouve les présents facteurs dans les milieux de culture Le surnageant isolé par centrifugation des suspensions descellules cultivées est placé dans 30 un tube avec une membrane dialysante, et le contenu en est aspiré de l'extérieur pour isoler le dialysat Les présents facteurs sont contenus dans le dialysat de telle sorte que le dialysat peut être utilisé tel qu'il est, ou si souhaité, le dialysat est ensuite lyophilisé et les facteurs augmen35 tent la production d'anticorps humains sont obtenus sous forme d'une poudre. 30.3 1984 Les facteurs augmentant la production d'anticorps humains obtenus se Lon ces procédés ont Les propriétés physico-chimiques et biologiques qui suivent: ( 1) Masse moléculaire de 2 000 à 4000 /elution avant et après Le g Lucagon (de masse moléculaire 3.500) par filtration sur gel de Sephadex G-50 so(R) 7. ( 2)passent à travers une membrane de dialyse. ( 3)Stable à des p H allant de 2 à 11. ( 4) Stable lorsqu'on les chauffe à 300 C 10 pendand 60-minutes, à 56 C pendant 30 mi nutes et à 100 C pendant 2 minutes Stable malgré six cycles de congélationdécongélation successifs avec une congélation à -80 C et un chauffage à 37 C. ( 5)Inactivés par traitement à La protéi15 nase K (préparée par Boehringermanhain Co) à 37 O C pendant mi nutes Résistent à L'action de La ribonucléase A (R Nase A, préparé par Boehringer/manhaim Co) à 370 C pendant 60 minutes. ( 6)(i)Augmentation et intensification de 20 la production des immunoglobulines, Ig G et Ig M par Les lymphocytes humains. (ii)Pas d'activité de facteur de croissance des cellules T (TCGF). (iii)Pas d'activité de facteur de croissance des cellules B(BCGF). (iv) Pas d'activité de facteur de différentiation des cellules B(BCDF). Méthode de mesure de l'activité: Les lymphocytes humains provenant du sang périphérique ou des amygdales sont placés dans les puits à 30 fond plat de microplaques portant 96 puits,à raison de 2 x 105/100 Pl par puits contenant L'agent mitogêne Pokeweed (PWM)à raison de 2/ul/200,l);on met 50 El du présent facteur avec 50 pl de milieu de culture (RPMI-1640 complémenté avec 15 % de sérum de veau foetal)ou Le présent facteur à raison de 25 PL avec 75/ul de milieu de culture ou 2549726 pl de milieu de culture comme milieu témoin Les suspensions mélangées sont cultivées dans une atmosphère contenant 5 % de dioxide de carbone à un p H compris entre 7,2 et 7,4 pendant 7 jours à 37 C puis centrifugé à 3000 t/minute pendant 10 minutes à 4 C sur les microplaques, puis les surnageants sont isolés La quantité de Ig G/Ig M (ng/ml) dans les surnageants ainsi isolés est mesurée par la méthode ELISA (dosage par immunoabsorbant lié à une enzyme) L'activité des présents facteurs mesurée par la méthode ci-dessus dans différentes conditions e-st indiquée ci-dessous. Quantité d'immunolobuline (to Ia) 20 25 Les présents fac: Ig G (ng Ig M(ng/m L) teurs* expérience expérience expérien expé( l / 200 Pl) ce rien ' 2 1 *: c e O% ( O Ml): I 1 000 1 000: 6 400: 6 400 12,5 % ( 25,l) 4 000 4 000 13 000 20 000 u _, _ % ( 50 il) 9 000 7 000:62 000: 18 000 * Dans les expériences 1 et 2, l'activité a été mesurée après addition des présents facteurs provenant de deux lots différents de lymphocytes préparés à partir des mêmes amygdales. Stabilité en fonction du p H _Ig M (ng/ml) : témoin 7 200 p H 2 7 800: p H 11 8 100 Les solutions des présents facteurs à p H 2 ont été préparées avec H Cl-2 N et à p H 11 avec Na OH-2 N,respectivement Ces solutions ont été abandonnée puis neutralisées L'activité a été mesurée Le résultat, montre que les solu5 tions sont stables aux deux valeurs de p H. Stabilité au chauffage 15 Ig M (ng/ml) Chauffage des facteurs à 80 C, 60 minutes 7 500 Chauffage des facteurs à 56 O C, 30 minutes 11 000 Chauffage des facteurs à 100 C, 2 minutes 9 300 Congélation - décongélation des facteurs 11 000 Témoin 7 200 L' activité a été mesurée après avoir répété 6 fois la congélation à -80 C daus un congélateur et le 20 chauffage à 37 C avec de l'eau tiède. Comme mentionné ci-dessus,les présents facteurs sont excessivement stables au chauffage. Traitement enzymatique __ _ Ig M (ng/m L) Ig G (ng/ml) expérience:expé:expérien-: expé: 1 *** rience ce rience 1 2 ** À 2 *** 1 ** 2 *** - Traitement à*La 200:100 800 900 protéinase K: 1 ** À e e Traitement à La 800 950 5 400 6 300 R Nase A: tmoin ** 600 750 5 600 5 500 témoin ** 6 Q 00 750 5 600 5 500 * Préparé par Boehringermanhain Co ** Chaque traitement a été réalisé à 37 C pendant 60 minutes, le témoin a été traité de la même façon sans addition des enzymes. *** Dans les expériences 1 et 2, les facteurs obtenus à partir de deux lots différents ont été traités avec l'enzyme et ajoutés aux lymphocytes du sang périphérique, puis l'activité a été mesurée. Comme mentionné ci-dessus, les facteurs de la 20 présente invention ont d'excellentes propriétés d'augmentation de la production des anticorps humains Les présents facteurs peuvent traverser une membrane de dialyseet leur activité est réduite par l'action d'une enzyme protéolytique ( Protéinase K) En outre, les présents facteurs 25 sont stables/du traitement par La R Nase A, par la chaleur et aux valeurs de p H dans les limites usuel Les Les présents facteurs sont de nouveaux facteurs augmentant la production des anticorps humains tout à fait différents des facteurs d'augmentation de la production des auticorps 30 connus habjtuellement. Les facteurs augmentant la production d'anticorps humains selon la présente invention peuvent être préparés par une technique de manipulation génétique;c'est-àdire par des méthodes utilisant des ADN recombinants 35 dans lesquelles on introduit dans des microbes l'-ADN 8 2549726 produisant Les facteurs On peut aussi les préparer par une technique d'hybridation cellu Laire,ou encore avec des Lignées cellulaires stables; les présents facteurs préparés par ces techniques font aussi partie de la présente invention. La présente invention sera mieux comprise à La lecture de l'exemple préféré suivant,cependant l'invention n'est pas limitée à cet exemple. EXEMPLE: Deux amygdales humaines ont été découpées en fines 10 lamelles avec une paire de ciseaux recourbée et mises dans un milieu de culture RPMI-1640 contenant 1000 j/ml de penicilline et 100 g/m L de streptomycine, filtrées à travers un fin orifice pour obtenir des cellules d'amygdaLes Les cellules d'amygdales ont été Lavées trois fois 15 avec une solution saline contenant du tampon phosphate à 4 C pendant 10 minutes Les cellules ont été séparées par centrifugation à 1500 t/minute espectivement,et puis suspendues dans 20 m L d'un milieu de culture RPMI-1640. Chaque 3 ml de cette suspension ainsi obtenue ont été placés sur 2,5 ml de "Ficoll-Paque" (densité 1,077)dans six tubes de centrifugation et Les tubes ont été centrifugés à 2200 t/minute pendant 20 minutes à 18 C Une couche a de ce L Lules mononuclées/ainsi été séparée Chaque couche de cellu Les mononuclées de 2 m L a été aspirée et on a ajouté 25 à chacune de ces suspensions cellulaires 8 ml d'une solution saline tamponnée par du phosphate Chaque suspension cellulaire a été lavée par centrifugation à 4 C pendant 10 minutes, la première fois à 1 800 t/minute,et La seconde et troisième fois à 1500 t/minute,et finalement 30 on a obtenu les cellules mononucléaires La combinaison des cellules contenues dans ces six tubes à centrifugation a été placée dans un tube à centrifugation (ces six tubes ont été lavés avec un milieu de culture et la suspension cellulaire combinée a été placée dans le tube) Les cellules ont été suspendues dans un milieu de culture RMPI-1640 -complémenté avec 10 % de sérum AB humain A la 9 2549726 suspension cellulaire obtenue une suspension de silice d'un dizième en volume a été ajoutée et le mélange a été incubé à 37 C pendant 60 minutes avec une agitation toutes les 15 minutes ( De cette façon, les macrophages dans les cellules mononucléaires phagocytent la silice) La suspension cellulaire a été placée sur 2,5 m L de Ficoll-Paque et le tube centrifugé a 2200 t/minute pendant 10 minutes a 18 C pour séparer les lymphocytes La couche de lymphocytesa été aspiréeet la suspension cellulaire obtenue lavée plusieurs fois avec une solution saline tamponnée par des phosphates en centrifugeant à 4 C pendant 10 minutes, la première fois à 1800 t/minute, et la seconde et troisième fois à 1500 t/minute Les Lymphocytes précipités ont été suspendus dans 5 ml d'un milieu de culture RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau foetal, et la suspension cellulaire a été versée sur une colonne de fibres de nylon (. lg de fibres de Nylon a: été introduit dans une seringue de 10 m L jusqu'au repère de 10 ml)préalablement lavée avec le même milieu de culture On a laissé la seringue telle que incuber à 37 C pendant 30 à 35 minutes La colonne de fibres de nylon a été lavée avec un milieu de culture RPMI1640 complémenté avec 10 % de sérum de veau foetal prélablement tiédie à 37 C (on a contrôlé la vitesse d'écoulement en plaçant une aiguille de 19 G à l'extrémité 25 de la seringue), et les lymphocytes adhérant aux fibres de Nylon ainsi que ceux non retenus par les fibres de ylon ont été séparés Les fibres de nylon ont été sorties et mises dans un tube à essai Du milieu de culture RPMI-1640 refroidi à 4 C a été introduit dans le tube à essai Le contenu a été bien agité avec une baguette, et les lymphocytes adhérant aux fibres de nylon se sont détachés des fibres de nylon On a isolé la suspension de lymphocytes (environ 40 ml), on l'a mise dans un autre tube à centrifuger et on a centrifugé à 1500 t/minute pendant 10 minutes à 4 C Les lymphocytes adhérant aux fibres de nylon obtenus ont été suspendus dans un mif Lieu de culture RPMI-164 complément avec 15 de sérum deveau/ de culture RPMI- 1640 complémenté avec 15 % de sérum de veau/ 2549726 (contenant _ 2 m M de L-glutamine, 5 x 10 '5 M de mercapto2-éthanol, 100 unités/ml de penicilline et 100 ig /ml de streptomycine) Les lymphocytes en suspension ont été colorés avec du b Leu Trypan (seules les cellules mortes ont été colorées) et on a compté les cel Lules vivantes avec un compteur de cellules sanguines, et le nombre de cellules a été ramené à 2 x 106 cellules/ml Cette suspe-nsion Lymphocitaire a été placée dans un récipient de culture tissulaire et le récipient a été Laissé en culture à 37 C pendant 5 jours dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone En fin de cultures la suspension des cellules cultivées a été versée dans un tube à centrifuger, et centrifugée à 3000 t/minute pendant 15 minutes à 4 C pour isoler le surnageant liquide Ce surnageant a été placé dans un tube de dialyse comportant une membrane de cellulose le tube a été placé dans un flacon à vide, et le surnageant a été aspirétoute la nuit Le milieu de culture ayant traversé La membrane de dialyse a été passé sur un filtre millipore ( 0,45 pm) pour éliminer les bacilles et un dialysat 20 contenant les facteurs augmentant la production d'anticorps humains a été obtenu Ledialysat a pour action d'intensifier la production des Ig G et Ig M comme décrit ci-dessus Le dialysat a été lyophilisé et 10 mg de poudre de protéines, facteurs d'augmentationde la production des anticorps 25 humains ont été ainsi obtenus. 1 1 REVENDICATIONS 1.Facteurs d'augmentation de la production d'anticorps humains, caractérisés en ce qu'ils ont une masse moléculaire de 2 000 à 4 000 et en ce qu'ils sont obtenus à partir du surnageant de lymphocytes humains en culture et en ce qu'ils augmentent et intensifient La production d'anticorps humains. 2 Facteurs d'augmentation selon La revendication 1, caractérisés en ce quelles lymphocytes humains de la revendication l Sont des ce Llules mononucléaires obtenues 10 à partir d' amygdales, de rates, de thymus, ou de sang périphérique. 3 Procédé de préparation de facteurs augmentant La production d'anticorps humains, caractérisé en ce qu'il comprend: la séparation des cellules de lymphocy15 tes humains adhérant aux fibres de nylon, des lymphocytes humains non retenus par les fibres de nylon, la cu Lture des cellules adhérant aux fibres de nylon, la dialyse du milieu de culture, l'isolement du dialysat contenant les facteurs, et éventuellement la lyophilisation du dialysat. 4 Procédé de préparation des facteurs augmentant selon la revendication 3, caractérisé en ce que les lymphocytes humains sont des cellules mononucléaires obtenues à partir des amygdales, des rates, des thymus, ou du sang périphérique de l'homme. 5 Procédé de préparation des facteurs augmentant selon la revendication 3, caractérisé en ce que tes cetllules adhérant aux fibres de nylon sont cultivées dans un milieu de culture complémenté avec du sérum de veau foetat dans une atmosphère de dioxide de carbone à 35-38 C. 12 2549726 6.Procédé de préparation de facteurs augmentant la production d'anticorps humains, caractérisé en ce qu'il consiste à -isoler des cellules mononuclées des amygdales humaines, -séparer les lymphocytes de ces cellules mononuclées, -suspendre les lymphocytes obtenus dans un milieu de culture comp Lémenté avec du sérum de veau foeta L, -méLanger la suspension obtenue avec des fibres de 10 nylon, -éluer avec le même milieu de culture pour obtenir une partie de lymphocytes,adhérant aux fibres de nylon, -centrifuger la solutionde lavage, -suspendre les lymphocytes adhérant au nylon obtenus 15 dans un mitieu de culture complémenté avec du sérum de veau foetal, -cultiver la suspension dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 35-38 O C pour 1 à 7 jours - centrifuger la suspension cultivée pour éliminer 20 les lymphocytes - faire passer le surnageant de la culture obtenue à travers une membrane de dialyse, -isoler le dialysat contenant tes facteurs et éventuel Lement,Lyophiliser le dialysat.