Brevet FR2559160A1 — publié le 19850809

La présente invention concerne la production, par fermentation, d'un mélange d'acétone et de butanol ou d'un melange d'acétone, de butanol et d'éthanol. La fermentation acétonobutylique a été pratiquée industriellement a partir de mélasses ou de farines de céréales. Elle a été adaptée par le demandeur à la fermentation de plantes sucrières telles que la betterave et le topinambour grâce a une sélection des souches et des conditions de culture appropriées. De plus, une limitation importante de cette fermentation ayant été, de tous temps, la concentration des produits obtenus, butanol, acétone et éthanol dont la somme, communément dénommée mélange ABE reste habituellement inférieure a 20 g/l, des travaux ont été effectues par le demandeur pour surmonter cette limitation par sélection de mutants résistant au butanol.Des mutants capables de produire un melange ABE à des concentrations de l'ordre de 20 g/l tels que la souche IFP 904 (ATCC 39058) ont été obtenus et la production d'ABE à partir de ces mutants a été décrite dans le brevet européen nO 83 88656. Un autre problème lié, celui-ci, à l'utilisation de substrats inuliniques définis plus loin et contenus par exemple dans les tubercules de topinambour était que les souches sélectionnées à cet effet par le demandeur et utilisées notamment dans la demande de brevet français nO 82/15924 ne présentaient de bonnes performances qu'après hydrolyse des sucres contenus dans ces substrats, constitués d'oligofructanes et de polyfructanes de poids moléculaires variés et de structure inulinique (chaînes linéaires d'unités fructose et d'une unité glucose terminale, assemblés par des liaisons ss-(2,1)-fructofuranosidi- ques). Cette hydrolyse était habituellement pratiquée de façon totale en fructose et en glucose par voie acide, par exemple par l'acide sulfurique à pH 2 à 90 pendant 45 minutes. Des nouveaux travaux ont, par la suite, permis au demandeur de définir des conditions d'hydrolyse acide ménagée mettant en oeuvre des quantités d'acides plus faibles et conduisant principalement à la formation de sucres fructose, glucose et saccharose qui pouvaient être fermentés en ABE avec d'excellentes performances comme décrit dans le brevet américain nO 4378432. Pour s'affranchir des contraintes de l'hydrolyse acide qui impose, notamment dans le procédé une étape supplémentaire et entrai- ne la consommation de produits chimiques, le demandeur a découvert un procédé permettant de supprimer cette étape d'hydrolyse préalable et qui consiste à opérer la fermentation d'un substrat inulinique en présence d'au moins une certaine quantité critique d'inulase, à l'aide drune souche apte à hydrolyser au moins partiellement l'inuline du substrat choisi, cette souche étant du type, par exemple, Clostridium acetobutylicum. La quantité minimum requise d'inulase est environ 50 unités par litre de moût ; de préférence on utilisera une quantité d'inulase comprise entre 50 et 1 500 unités par litre de moût et plus particu lièrement comprise entre 50 et 450 unités par litre de moût. On peut utiliser toute souche adéquate apte à utiliser de façon au moins partielle l'inuline du substrat. Mais le choix de certaines souches permet alors d'utiliser des quantités d'inulase très réduites et d'obtenir une concentration en ABE supérieure à 20 g/l. C'est le cas ainsi avec la souche particulière IFP 904 (ATCC 39058), comme il apparaîtra dans les exemples 6 à 16. Par substrat inulinique, on entend un substrat contenant de l'inuline. Celle-ci se présente comme une réserve d'énergie dans différentes plantes pouvant donc être utilisées comme substrats ; on citera en particulier les plantes de la famille des Compositae et notamment les tubercules de topinambours, les tubercules de dahlias, les racines de chicorée et de pissenlits. Le demandeur a effectué des travaux relatifs à lshydrolyse enzymatique préalable des substrats inuliniques en utilisant des inulases d'origine fongique, telles que les préparations commerciales produites par la Société NOV0 et a expérimenté un protocole d'hydrolyse enzymatique notamment des jus tels que ceux de topinambours en fructose et en glucose. De tels jus hydrolysés enzymatiquement peuvent être fermentés avec de bonnes performances par diverses souches de Clostridium acétobutylicum comme illustré dans l'exemple 3. Cependant le procédé de fermentation ainsi défini présente l'inconvénient, outre celui de la consommation d'enzyme, de nécessiter une étape d'hydrolyse séparée. D'autres essais, dans lesquels on effectue selon l'invention, l'étape d'hydrolyse enzymatique non plus préalablement à la fermentation ABE mais simultanément, c'est-à-dire en ajoutant l'inulase de façon stérile au moment de l'ensemencement du fermenteur peuvent donner des résultats corrects (exemple 4) et même excellents (exemple 5) avec les souches communes de Clostridium acutlicum telles que celles disponibles dans les collections de culture à condition d'utiliser des quantités d'enzyme modérées (exemple 4) et même superieures à celles mises en oeuvre dans un protocole d'hydrolyse enzymatique effectuée préalablement à la fermentation comme illustré dans l'exemple 5 avec la souche IFP 902. Les quantités d'inulases mises en jeu pour obtenir un résultat satisfaisant sont alors égales ou supérieures à 250 unités par litre de moût. Toutefois on a observe qu'avec des souches spécialement sélec tionnées (par exemple IFP 904), d'excellents rendements en ABE sont obtenus en ne mettant en oeuvre qu'unie quantité relativement faible d'inulase, comme illustré dans les exemples 6 à 13, cette quantité d'inulase étant alors comprise pour la souche IFP 904, entre 50 et 450 unités par litre de moût ou plus particulièrement entre 50 et 150 unités par litre de moût. Ainsi, dans 11 exemple 6, effectué dans des conditions très proches de l'exemple 2, des résultats intéressants sont déjà obtenus avec ces souches sans addition d'enzyme et des résultats optimaux sont obtenus en utilisant des quantités d'enzyme égales ou inférieures à 150 unités par litre de moût environ. On peut supposer que ces bons résultats proviennent de ce que l'inulase ajoutée n'est nécessaire que pour complémenter une activité inulase déjà possédée par les souches sélectionnées utilisées. Ainsi, le procédé qui vient d'être décrit permet en particulier de fermenter, avec de très bonnes performances, les jus de topinambours en évitant l'étape d'hydrolyse préalable tout en utilisant une quantité d'inulase limitée. Les conditions de la fermentation acétonobutylique sont-connues. Elles comprennent le plus souvent une température de 25 à 40 C et un pH de 4 à 7. Les exemples suivants illustrent l'invention. Les exemples comparatifs 1 et 2 illustrent un procédé de fermentation, réalisé- sans hydrolyse préalable mais également sans ajout d'inulase au cours de l'étape proprement dite de fermentation. Dans ces exemples, comme dans l'ensemble du texte relatif à la présente invention,l'unité d'activité inulase est définie conformément à la pratique habituellement suivie pour l'expression des activités enzymatiques, c'est-à-dire qu'une unité correspond à l'activité libé rant une micromole( mole) du mélange de sucres réducteurs (fructose et glucose) par minute. Les conditions de mesure de cette activité enzymatique sont les suivantes On incube pendant 20 minutes à 500c, 2 ml d'un milieu réactionnel contenant : 25 g/l d'inuline de dalhia ; 0,05 mole/litre de tampon acétate de sodium pH 4,7 ; et environ 0,05 unité/ml d'inulase. A la fin de la période d'incubation, on arrête la réaction par chauffage 3 minutes à l000C et on dose les sucres réducteurs libérés par une méthode connue telle que celle de Somogyi-Nelson. Exemple 1 (comparatif) Un jus de diffusion de topinambours a été ajusté à une concentration de 65,0 g/l de sucres (exprimés en glucose et fructose), puis additionné de 3 g/l d'acide acétique. Le pH du milieu est ajusté à pH 6,5 par de l'ammoniaque à 20 %. 3,8 1 de ce milieu de fermentation ont été placés dans un fermenteur de laboratoire de 6 1 et sté rilisés en autoclave à 1200C pendant 20 minutes - Le fermenteur, refroidi à 35 C et maintenu à cette température, est ensemencé anaérobiquement avec une préculture de Clostridium acetobutylicum (souche IFP 902). Cette préculture (200 ml) avait été elle-même préparée dans une fiole d'Erlenmayer contenant le même milieu, et incubé anaérobiquement pendant 24 h à 350C après ensemencement avec un tube de conservation de la souche.Après 40 h d'incubation à 35 C on a dosé dans le moût de fermentation des concentrations de butanol et d'acétone respectivement égales à 6,4 g/l et 2,2 g/l. Exemple 2 (comparatif) On a répété la même expérience que dans l'exemple 1 mals avec une souche de Clostridium acetobutylicum, appelée IFP 904. Dans ces conditions, l'analyse du moût de fermentation effectuée au bout de 40 heuresrèvèle une teneur en mélange acétonobutylique, essentiellement butanol et acétone, respectivement de 11,75 et 4,0 et O g/l pour l'éthanol. Le rendement de conversion des sucres en solvants, exprimé par le rapport de la teneur pondérale en mélange acétonobutylique à la teneur pondérale en sucres utilisés est de 31,4 Z. Les sucres libres (fructose et glucose) doses au départ et en fin de fermentation sont respectivement de 3,6 g/l et O girl. Exemple 3 (comparatif) Un echantillon de jus de diffusion de topinambours a été ajusté à une concentration de 62 g/l de sucres (exprimés en glucose plus fructose), puis le pH a été amené à 4,5 par addition d'acide acétique (2,8 g/l) - 3,8 1 de ce milieu ont été introduits dans un fermenteur de laboratoire de 6 litres - Le fermenteur a été sterilisé ensuite comme dans l'exemple 1, puis après refroidissement, maintenu à la température de 5O0C pour effectuer l'hydrolyse enzymatique du jus de topinambours.L'hydrolyse a été réalisée par une solution d'inulase (NOVOZYM 230) produite par la societe NOVO. - (187,5 unités d'inulase par litre de moût) ont été introduites stérilement par filtration Dans ces conditions, l'hydrolyse du jus de topinambours en glucose et fructose est totale en 25 heures. Après cette étape d'hydrolyse le pH a été porté stérilement à pH 6,5 par de l'ammoniaque, et la temperature redescendue à 350C. Le milieu a alors été ensemencé anaérobiquement avec 200 ml de préculture de Clostridium acetobutylicum IFP 902. Cette préculture avait été, elle même, préparée dans une fiole contenant le même milieu et incubée anaérobiquement pendant 24 heures à 350C après ensemencement avec un tube de conservation de la souche.Après 40 heures d'incubation,on a dosé dans le moût de fermentation des concentrations de butanol, d'acétone, et d'éthanol respectivement égales à 13,2 g/l, 6,4 g/l et 0,1 g/l. Exemple 4 Un fermenteur de laboratoire a été préparé avec un jus de diffusion de topinambours identique à celui de l'exemple 1. Ce fermenteur a été ensemencé anaérobiquement avec 200 ml d'une préculture de Clostridium acetobutylicum IFP 902. Cette préculture avait été, elle mamie, preparée dans une fiole d'Erlenmeyer contenant un jus de diffusion de topinambours hydrolysé préalablement en glucose et fructose par l'inulase NOVOZYM 230 de la société NOVO dans les mêmes conditions que celles énoncées dans l'exemple 3, puis après réajustement du pH à 6,5 , incubée anaérobiquement pendant 24 heures à 350C après ensemencement avec un tube de conservation de la souche.Au moment de l'ensemencement du fermenteur par cette préculture,on a également ajouté dans le milieu 125 unités par litre de moût de la solution d'inulase NOVOZYM 230 que l'on a stérilisée par filtration. Après 40 heures d'incubation à 35"con a dosé dans le moût de fermentation des teneurs en butanol, acétone, et éthanol respectivement de 10 g/l, 3,0 g/l et 0,1 g/l. Le rendement de conversion des sucres en solvants, calculé comme dans l'exemple 2 est de 30,1 %. Les sucres libres (glucose et fructose) n'apparaissent que pendant les 10 premières heures de la fermentation. Exemple 5 On a répété la même expérience que dans l'exemple 4 avec la souche IFP 902 mais l'addition d'inulase NOVOZYM 230, ajoutée au moment de l'ensemencement du fermenteur, a été portée à 375 unités par litre de moût. Après 40 heures d'incubation à 35 C,l'analyse du moût de fermentation révèle une teneur en butanol, acétone, et éthanol respectivement de 13,5 g/l, 6,3 g/l et 0,1 g/l. te rendement de conversion des sucres en solvants, calcule comme dans l'exemple 2 est de 36,5 %. Les sucres libres (glucose plus fructose) sont présents tout au long de la fermentation (entre 4 et 21 g/l). Exemples 6 à 16 Pour chacun des essais décrits ci-dessous, un jus de diffusion de topinambours a été ajusté à une concentration de 62,5 g/l de sucres (exprimés en glucose plus fructose), additionné de 3 g/l d'acide acétique et ajusté à pH 6,5 par addition de 7,2 ml d'ammoniaque à 20 %. Pour chaque essai, un fermenteur de laboratoire de 6 1 à été rempli avec 3,8 1 de ce milieu, et stérilisé comme dans l'exemple 1. Après refroidissement, les fermenteurs ont été ensemencés anaérobiquement à partir d'une préculture de Clostridium acetobutylicum IFP 904 à raison de 200 ml par fermenteur. Cette préculture avait eté elle-même préparée dans une fiole d'Erlenmeyer contenant le même milieu et incubée anaérobiquement pendant 20 h à 350C après ensemencement avec deus tubes de conservation de la souche. Au moment de l'ensemencement des fermenteurs par cette préculture, on a ajouté dans chacun des fermenteurs des quantités variables d'une solution d'inulase NOVO (réf. NOVOZYM 230) que l'on a stérilisée par filtration. Apyres 40 heures d'incubation à 350C,on a dosé dans le moût de fermentation les concentrations de butanol, d'acétone et d'éthanol. Les quantités d'enzyme ajoutées pour chaque essai et les résultats correspondants sont regroupés dans le tableau 1. Tableau 1 Conditions et résultats des exemples 6 à 16 Nombre d'unités Exemple enzymatiques Butanol Acétone Ethanol Solvants n0 ajoutées par gil gil gll g/l litre de moût 6 Semblable O 11,75 4,0 O 15,75 à 2) 7 18,75 11,50 5,2 0,1 16,8 8 31,25 12,8 5,7 0,1 18,6 9 62,5 13,5 5,6 0 19,1 10 93,75 13,3 6,6 0,1 20,0 11 125 13,9 7,5 0,2 21,6 12 150,25 13,8 7,6 0,1 21,5 13 187,50 14,3 6,9 0,2 21,4 14 225 13,7 7,45 0,2 21,35 15 375 14,0 7,6 0,1 21,7 16 450 13,9 7,6 0,1 21,6 REVENDICATIONS 1 - Procédé de production d'un mélange d'acétone et de butanol ou d'un mélange d'acétone, de butanol et d'éthanol par fermenta tion, en présence d'au moins une souche qui est un micro-orga nisme Clostridium acetobutylicum, d'un substrat inulinique, le procédé étant caractérisé en ce que, au moment de l'ensemence- ment du milieu de fermentation, on ajoute au moins 50 unités (par litre de moût) d'inulase(s). 2 - Procédé selon la revendication 1 dans lequel la quantité d'inu lase est comprise entre 50 et 1 500 unités (par litre de moût). 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel le substrat inulinique est choisi dans le groupe constitué par les tubercules de topinambours, les tubercules de dahlias, les ra cines de chicorée et les racines de pissenlits. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel la sou che utilisée est IFP 904. 5 - Procédé selon la revendication 4 dans lequel on opère en présence d'une quantité d'inulase comprise entre 50 et 45Q.