Brevet FR2558849A1 — publié le 19850802

REACTIF LIQUIDE PRET A L'EMPLOI POUR DETERMINER LA TENEUR EN GLUCOSE DU SANG La présente invention se rapporte à un réactif liquide prêt à l'emploi, pour déterminer la teneur en glu- cose du sang; elle vise, plus particulièrement, un réac- tif liquide stable, sous forme d'un nécessaire unique prêt à l'emploi, comprenant une glucose-oxydase exempte de ca- talase et un agent tensio-actif non ionique. On sait que les méthodes les plus simples et les plus utilisées pour déterminer la quantité de glucose dans le sang (plasma ou serum) sont basées sur la méthode de Trinder ou sur des variantes de celle-ci. La teneur en glucose du sang peut être déterminée au moyen de la glucose-oxydase et de la réaction colorée de. Trinder, conformément aux étapes suivantes: 1) t -D-glucopyranose + H20 al-D-glucose..H20 (36%) ( ----. -D-glucopyranose + H20 (64%) 2) t-D-glucopyranose + H20+02 glucoseoxydase D-glucono- 3) 2H202+phenol+4-aminophénazone peroxydase> 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phénazone + 4H20. Le réactif est constitué de deux composants: a) Un composant enzymatique convenablement tamponné (glucose-oxydase-peroxydase); b) Un chromogène, spécifiquement du type 4-aminophéna- zone plus phénol (ce dernier pouvant être remplacé par ses dérivés, d'o les variantes à la méthode d'origine proposée par Trinder qui a d'abord utilisé le phéno4. Suivant cette méthode, tous les réactifs doivent être regroupés,au moment de leur emploi, en un seul réactif de travail qui possède, après sa reconstitution, une stabi- lité limitée. Il faut noter qu'un tel réactif, lorsqu'il est reconstitué, présente l'inconvénient d'une date de validité garantie ne dépassant pas 60 jours et en moyenne de 30 jours environ. on connait actuellement deux procédés pour la re- constitution du réactif de travail: I) par addition d'eau à un système prémélangé enzymes- chromogène; II)par mélange du composant enzymatique et du chomrogè- ne qui, dans ce cas, ont été conservés séparément. Toutefois, dans tous les cas, l'utilisateur est obligé de manipuler le produit. Cette opération, même si el- le est simple, entraîne fréquemment des erreurs car certai- nes difficultés techniques affectant la valeur du système peuvent se produire dans la préparation du réactif. Dans le cas I, lorsqu'on reconstitue le réactif de travail, il faut utiliser de l'eau distillée à haute pu- reté alors que seule de l'eau déminéralisée, non complète- ment exempte de chlore, est disponible dans les laboratoires d'essais cliniques (inconvénient courant, en particulier en été). Dans le cas IX, on ne peut pas éviter, lorsqu'on verse les composants, une perte de l'un des deux réactifs du fait du risque de débordement de l'un d'eux ou, plus $558849' fréquemment, de l'égouttage incomplet de l'un des réactifs de son flacon. Dans ce cas, le réactif de travail a souvent une concentration finale différente de celle qui est prévue. Cet inconvénient existe également lorsque la procédure adoptée empêche d'obtenir un mélange complet du soluté et du solvant, commie cela se produit fréquemment si l'enzyme est fournie sous la forms d'une poudre anhydre en même temps que le tampon qui, etant souvent un tampon de phosphate, est légèrement soluble. Lorsqu'on utilise des réactifs en poudre, comme c'est souvent le cas, il faut tenir compte de ce que la proportion des ingrédients en poure peut être déterminée dans une plage très large et qu'il peut en résulter une homogénéité incomplète, mime à l'intérieur du même lot de préparation. Ce fait est encore plus net lorsqu'on utilise des enzymes lyophilisées car, comme on le sait, le proces- sus de lyophilisation peut souvent diminuer de façon hétéro- gène et quelconque l'activité ensymatique (la position du flacon, en ce qui concerne son emplacement sur les plateaux pendant l'opération de congélation, a sûrement une influen- ce), de sorte que les concentrations finales (en activité enzymatique) peuvent être très différentes les unes des au- tres. En plus de ces inconvenients techniques affectant la fiabilité du système, les réactifs employés jusqu'ici ont des coûts de production tres elevés. Les procédés de production actuels comprennent deux possibilités: a) des poudres anhydres b) des lyophiles. Dans le cas a), la production nécessite un local spécial à humidité réglée, ainsi que des installations coûteuses o les opérateurs sont exposés à des risques gra- ves du fait des difficiles conditions de travail. Cela est dû à l'utilisation de ces enzymes sous forme de poudres et, en particulier, la présence d'azide de sodium et des divers tampons peut entraîner des dommages, parfois irréversibles, aux organes respiratoires des opérateurs s'ils sont exposés pendant une longue durée. En outre, on a constaté que cer- taines personnes, après quelques années de ce travail, é- taient sensibilisées aux dites enzymes et subissaient des atteintes en conséquence. Dans le cas b), l'utilisation de dispositifs de lyophilisation nécessite une grande consommation d'énergie électrique et d'eau, en plus des coûts d'amortissement des installations. On comprend donc l'intérêt de disposer d'un réac- tif, pour déterminer la teneur en glucose du sang, qui évi- te les délicates opérations de reconstitution indiquées plus haut, les techniques coûteuses de production qui peuvent é- galement être dangereuses pour le personnel, et les longs temps d'accès (temps minimal pour la préparation du réactif). Pour résoudre ce problème, la présente invention propose, de façon inattendue, l'utilisation comme réactif d'une glucose-oxydase (GOD), complètement exempte de cata- lase, combinée avec des stabilisants comprenant des agents tensio-actifs non ioniques. Cette combinaison procure un réactif liquide uni- taire stable, prêt à l'emploi. La concentration homogène des activités enzymatiques des composants uniques s'avère être particulièrement favorable, puisque la vitesse de ré- action,qui peut être exprimée par: A A du chromogène coloré (A absorbance ou extinction), Ait est particulièrement liée au rapport u.i/litre de glucose- oxydase, o u.i. est, de façon connue, la quantité d'en- zyme qui oxyde 1 gmole de glucose par minute à 25 C et à un pH de 7,0 (tampon de phosphate de sodium). A ce sujet, il faut noter que des différences parfois sensibles des activités enzymatiques peuvent être constatées dans les réactifs actuellement sur le marché, même parmi des flacons du même lot. Par conséquent, on rencontre des difficultés dans la technique dite à "temps fixe", qui peut être correctement mise en oeuvre avec un ré- actif tel que celui suivant la présente invention dont l'in- variabilité entre les flacons est assurée. Pour une mise en oeuvre correcte de cette techni- que, il est nécessaire que l'oxydation du glucose par "GOD" suive une cinétique de pseudo-premier ordre par rapport au 5-glucose. Cela entraîne une série de réactions couplées aux- quelles le principe de cinétique des mesures en temps fixe peut être appliqué. La technique ci-dessus peut être appli- quée au réactif conforme à la présente invention, ce qui le rend particulièrement approprié aux analyseurs rapides et permet d'économiser beaucoup de temps. La présente invention a donc pour objet un réac- tif liquide prêt à l'emploi, pour déterminer la teneur en glucose du sang, caractérisé en ce qu'il comprend une glu- cose-oxydase,exempte de catalase, et un agent tensio-actif non ionique, comme stabilisant. Dans un mode de réalisation préféré conforme à l'invention, on utilise une quantité de glucose-oxydase de 9 000 à 40 000 u.i./l et une quantité d'agent tensio-actif non ionique de 5 mg/l à 50 g/l. Suivant l'invention, on emploie de préférence les agents tensio- actifs non ioniques à base de polyoxyéthylène (POE) suivants, tels qu'alcool de POE-tridécyle, POE-nonylphénol, etc., (RE- NEX), POE-octylphénol (TRITON) et alcools de POE-lauryle, -cétyle,-stéaryle,-oléyle (BRIJ). De même, on obtient de très bons résultats lorsqu'on uti- lise,comme agent tensioactif, de l'hydroxypolyéthylène-éto- xydodécane (C12H25(0-OC2H4)n-OH) ou du lauryl éther de polyoxyéthylèneglycol (THESIT). Il faut noter que ni Trinder ni les autres auteurs n'ont considéré l'absence de catalase. D'autres objets et avantages de l'invention appa- raitront aux hommes de l'art à la lecture de la description de ses modes de mise en oeuvre, non limitatifs, illustrés par les compositions ci-après et les figures annexées. COMPOSITION A Quantités rapportées à 1000 ml de réactif GOD 9 000 - 40 000 u.i. Peroxydase 300-3 000 u.i. 4-aminoantipyrine 0,1-1,5 mmoles Phénol 1,5-15,5 mmoles Tampon de phosphate pH 6,5-11,4. Dans cette composition,on utilise comme agent tensio-actif de l'alcool de POE-lauryle (Brij 35) à une con- tration de 5 mg/1 à 50 g/l. COMPOSITION B Quantités rapportées à 1000 ml de réactif GOD 9 000 - 40 000 i.u. Peroxydase 300-3 000 u.i. 4-aminoantipyrine 0,1-1,5 mmoles Phénol 1,5-15,5 mmoles Tampon de phosphate pH 6,5-11,4. Dans cette composition, on utilise comme agent tensio-actif du POE-octylphénol {Triton-X100) à une concen- tration de 5 mg/l à 50 g/l. Comme on le voit sur le graphique annexé (fi- gure 1), sur lequel les valeurs d'absorbance sont portées en fonction des te.mps de réaction, les cinétiques de ré- action résultantes pour les compositions A et B, mesurées sur Perkin-Elmer, sont exactement les mêmes lorsqu'on chan- ge l'agent tensio-actif utilisé. Afin de mettre en evidence l'inaltérabilité de la qualité du produit, le graphique de la figure 2 repré- sente l'absorbance d'un échanillon de réactif du type uti- lisé dans la composition A, preparé en février 1983 et es- sayé en janvier 1984. Il faut noter non seulement que la courbe est con- forme à la théorie, mêr:e à concentration élevée (500 mg/dl), mais également considérer que la réaction est complètement terminée dans les 10 inhutes préues. Ce résultat a été obtenu par utilisation d'un lot de réactif tel que décrit plus haut, qui a été stocké pen- dant la dite période dans des conditions d'essai sévères (en fait, on a utilisé une cuve transparente au lieu de la cuve opaque habituellement nécessaire et la cuve a été sou- vent ouverte et refermée). Il faut noter également que l'ab- sorbance de blanc contre H20 est seulement de 0,128, ce qui est une valeur tout à fait acceptable compte tenu de ce que, en outre, un tel réactif augmente son absorbance sous l'ac- tion directe de la lumière. EXPERIMENTATION TECHNIQUE Une démonstration graphique relative au produit mentionné à propos du graphique de la figure 2 est donnée par la figure 3,sur laquelle l'absorbance (A) est portée en fonction de la concentration de l'étalon standard uti- lisé (c.St.), indiquée en abscisse. Ce graphique montre clairement la parfaite li- néarité du réactif jusqu'à une concentration maximale de 500 mg/l. La ligne droite a été déterminée par l'ordina- teur utilisant une série d'étalons de 25, 50, 100, 200, 400, 500 mg/l. La proportion du réactif à l'échantillon était de 1 000 l1/10l1 et le temps de réaction était de 10 minutes. La couleur restait stable pendant une heure environ. La présente invention a été décrite avec référen- ce à certains modes spécifiques de mise en oeuvre mais il est entendu que des modifications de détail peuvent y être apportées par les hommes de l'artsans sortir du cadre de 1 'invention. Revendications 1. Réactif liquide prêt à l'emploi,pour déterminer la teneur en glucose du sang, caractérisé en ce qu'il com- prend une glucose-oxydase, exempte de catalase, et un agent tensio-actif non ionique, comme stabilisant. 2. Réactif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glucoseoxydase est présente à raison de 9 000 à 40 000 u.i./l, et l'agent tensioactif non ionique est présent en raison de 5 mg /1 à 50g/1. 3. Réactif suivant la revendication 1 ou 2, caractéri- sé en ce que les agents tensio-actifs non ioniques sont des agents tensioactifs à base de polyoxyéthylène. 4. Réactif suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif non ionique à base de polyoxy- éthylène est l'alcool de polyoxyéthylène-lauryle. 5. Réactif suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif non ionique à base de polyoxy- éthylène est le polyoxyéthylène-octylphénol.