Brevet FR2549070A1 — publié le 19850118

La présente invention concerne une substance du groupe des calcitonines et ses sels, un procédé pour leur préparation, leur application comme médicaments et les préparations pharmaceutiques qui contiennent S cette substance avec un support pharmaceutique. L'invention concerne en particulier une substance du groupe des calcitonines, appelée également ci-dessous calcitonine humaine 2, en abrégé h CT 2, que l'on ceut isoler à partir du corps humain ou obtenir 10 par un autre moyen> ayant les propriétés suivantes: a) Aptitude à la réaction avec des anticorps qui ne reconnaissent pas la calcitonine humaine-({ 1-32) appartenant à l'état de la technique, en abrégé h CT, mais qui peuvent encore réagir avec la calcitonine de 15 saumon { 1-32), en abrégé s CT, à une concentration jusqu'à 10 fois plus faible, b) Temps de rétention non différenciable de celui de la s CT préparée par synthèse dans le système de chromatographie en phase liquide à haute pression 20 suivant (système CLHP): Adsorbant: Nucléosil 10 C 1 eou un autre ou u ur adsorbant ayant des propriétés comparables, colonne de 250 mm de longueur d'un diamètre de 4,6 mm, chargée avec 1 ng à 20 ug, de preférence 1-10 ng, d'h CT, gradient linéaire, constitué des solutions A (acide heptafluorobutyrique aqueux 0,1 molaire) et de 25 à 73 % en volume de B { 20 % en volume de soluion A et 80 % en volume d'acétonitrile) correspondant à -58 % en volume d'acétonitrile pendant 90 minutes à 30 une vitesse d'écoulement de 1,5 ml/heure, c) dans le sérum humain pas de déclenchement de la formation de quantités dletectables d'anticorps qui sont en situation de réagir avec s CT, o pour examiner cette caractérisation on utilise la liaison à l 125 Il s CT avec une activité spécifique de 500 Ci/m Moles, et ses sels. L'adsorbant décrit comme Nucléosil 10 C 18 dans le système CLHP se composede gel de silice auquel sontliésdes groupes octadécyle par l'intermédiaire de liaisons Si-C Le gel de silice se présente sous forme de particules totalement poreuses en forme de boules ayant une taille de 10 + 1,5 pm, un diamètre moyen de pores de 100 A, un volume de pore de 1, 0 ml/g 10 et une surface spécifique (BET) de 300 m /g, qui sont stables à la pression jusqu'à 600 bars Le Nucléosil 10 C 18 est livré par la société Macherey Nagel, Wer Kstrasse 6-8, Postfach 307, D-5160 Diren. L'invention concerne en particulier la subs15 tance mentionnée ci-dessus, dont le volume d'élution dans le système i chromatograpnie par perméation sur gel ci-dessous (système sur gel) ne peut être différencié de celui de la s CT préparée par synthèse: Gel: Bio-Gel P-150 ( 0,149-0,074 mm d'ouverture de maille) ou un autre gel ayant des propriétés comparables, colonne de 100 cm de longueur ayant un diamètre de 1,6 cm, charge avec 1 ng à 10 ng d'h CT 2, éluant constitué d'acétate d'ammonium ( 0,2 mol/l, p H 4,6) et de sérumalbumine de boeuf ( 0,5 mg/ml), pendant 48 h avec une 25 vitesse d'écoulement de 5 ml/heure. L'adsorbant désigné par Bio-Gel P-150 Edans le système sur gel se compose de particules poreuses de polyacrylamide ayant un diamètre à l'état hydrogéné de 80-150 mm Bio-Gel P-150 est livré par la société Bio-Rad, Chemical Division, 2200 Wright Avenue, Richmond, CA 94804, Etats-Unis. La substance selon l'invention, h CT 2, existe à faible concentration p ex dans le cerveau humain, 2549070. dans la thyroïde humaine, l'hypophyse humaine et dans le plasma et le sérum du sang humain. L'invention concerne surtout la substance selon l'invention mentionnée cidessus et ses sels en-dehors d'un organisme vivant et à une concentration enrichie par rapport à ce qu'on trouve dans la nature, en tout premier lieu h CT 2 sous forme essentiellement pure ou avec des supports pharmaceutiques mélangés avec elleo h CT 2 se différencie de l'h CT connue dans le 10 système CLHP mentionné ci-dessus par un temps de rétention nettement différent; en revanche h CT 2 présente un temps de rétention pratiquement identique à celui de s CT. Dans le système sur gel mentionné ci-dessus, le volume d'élution d'h CT 2 est différent d O h CT, mais pratiquement 15 identique à s CT Ces faits indiquent qu'h CT 2 quant à sa composition en acides aminés, sinon nécessairement à la séquence d'acides aminés, est plus étroitement apparentée s CT qu'à h CT En revanche du point de vue immunologique, h CT 2 se différencie de manière essentielle 20 de s CT Trandis que s CT en tant que peptide étranger à l'espèce provoque dans le sérum humain une réponse d'anticorps, il ne se forme pas d'anticorps spécifiques de s CT comme réponse à la présence d'h C? 2 dans le sérum humain, comme on peut le mettre en évidence avec 25 le RIA mentionné ci-dessus. On doit admettre qu'il ne se forme absolument pas d'anticorps, ni ceux qui sont spécifiques de s CT, ni d'autres, contre h CT 2 dans le sérum humain, étant donné qu'h CT 2 en tant que substance propre du corps 30 ne devrait pas être reconnue comme immunologiquement étrangère. Selon les découvertes faites jusqu'à présent il ne s'agit en ce qui concerne h CT 2 que d'un composé chimique Théoriquement il existe cependant une possi- 2549070 O bilité qu'en ce qui concerne h CT 2 il s'agisse également d'un mélange de nouvelles calcitonines dont les divers composants ne sont pas séparés de manière visible dans les systèmes CLHP et sur gel mentionnés ci-dessus. Dans ce dernier cas l'invention concerne aussi bien le mélange que n'importe quel composé isolé du mélange. Les composants isolés peuvent être séparés de manière habituelle, o ex par chromatographie dans d'autres systèmes de CLHP ou sur gel appropriés ou être préparés 10 isolément selon les procédés connus de la chimie des peptides par synthèse ou par des techniques génétiques. L'élucidation de la structure des divers composants nécessaire avant la synthèse peut également être entreprise sur le mélange. L'invention concerne également les sels, en particulier les sels d'addition d'acides, d'h CT 2, surtout les sels pharmaceutiquement acceptables, non nocifs, formés avec des acides, p ex des acides inorganiques, en particulier des acides minéraux, p ex l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, ou les sels formés avec des acides carboxyliques, ou sulfoniques organiques, p ex les acides acétique, propionique, glycolique, succinique, maléique, hydroxymaléique, méthylmaléique, fumarique, malique, tartrique, 25 citrique, benzoïque, cinnamique, mandélique, salicylique, 4-aminosalicylique, 2-phénoxybenzoique, 2-acétoxybenzoïque, embonique, nicotinique ou isonicotinique, ou encore des acides aminés, ainsi que les acides méthanesulfonique, éthanesulfonique, 2-hydroxyéthanesulfonique, 30 éthane-l,2-disulfonique, benzènesulfonique, 4-méthylbenzènesulfonique ou naphtalène-2-sulfonique, ou avec d'autres composés organiques acides, comme l'acide ascorbique. Aux fins d'isolement ou de purification on peut également utiliser des sels pharmaceutiquement non 2549070. appropriés Aux fins d'application thérapeutique on n'utilise que les sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, qui sont donc préférés. h CT 2 a une action nypocalcémique, c'est-à-dire qu'il abaisse le niveau de calcium et de phosphate dans le sang et protège les os contre les pertes de minéraux; on peut donc l'employer comme médicament, en particulier pour les mêmes indications qu'h CT, p ex la Cibacalcine que l'on trouve sur le marché, p ex dans les désordres 10 du métabolisme des os, comme l'ostéoporose ou la maladie de Paget. Les doses d'h CT 2 à administrer à un homiotherme, en particulier '1 homme, d'environ 70 kg de poids corporel,s'élâvent à environ 5 pg à environ 50 gg, p e. 15 environ 20 ug, par jour L'administration s'effectue de préférence par voie parentérale, p ex 5 jours par semaine pendant environ 3 mois. h CT 2 présente également des actions sur le système nerveux central Comme on peut leétablir au moyen d'une autoradiographie des récepteurs, les sites de liaison pour h CT 2 se trouvent dans le cerveau humaino Etant donné qu'en outre la concentration d'h CT 2 dans le cerveau est analogue à celle de h CT, tandis que dans l'hypophyse h CT apparaît à une concentration environ 25 200 fois plus élevée qu:h CT 2, l'action d'h CT 2 sur le système nerveux central a une signification plus grande que les fonctions connues d'h CT dans le système nerveux, On obtient h CT 2 p ex en centrifugeant du sérum de sang humain à 4 C et 48 000 g pendant 30 Minit 3 es, 30 en adsorbant le surnageant clair sur des cartouches d'octadécasilyl-gel de silice, de préférence des cartouches d'octadêcasilyl-gel de silice-Sep-Pak C 18 (Waters Assoc, Milford, Massachussetts), dans l'acide trifluoracétique aqueux à 0,1 %, en éluant h CT 2 à partir 2549070 Y des cartouches avec de l'acétonitrile aqueux à 60 % (v/v), qui contient 0, 1 % d'acide trifluoracétique, en lyophilisant l'éluat, en traitant le lyophilisat avec de l'acide acétique 0,1 M, en centrifugeant la fraction dissoute à 4 C et 48 000 g pendant 30 Minutes, en chromatographiant le surnageant clair dans le système CLHP mentionné cidessus et en isolant h CT 2 à partir des fractions correspondantes. On obtient également h CT 2 en mélangeant suc10 cessivement dans le temps tout d'abord des hypophyses humaines congelées avec un volume 10 à 20 fois supérieur d'acide acétique aqueux 2 M glacé, en chauffant pendant minutes dans un bain d'eau à ébullition, en broyant les hypophyses avec un appareil Ultra-Turrax (homogéné15 iseur 18 K, Ika-Werke, Staufen,Allemagne) ou un appareil comparable quant à l'effet recherché, en congelant les homogénats pendant environ 12 h à -20 , en faisant ressuer à la température ambiante, en congelant à nouveau, en faisant à nouveau ressuer, en centrifugeant à 48 000 g 20 et 4 C pendant 30 minutes, en adsorbant le surnageant clair comme il est dit ci-dessus sur cartouches d'octadécasilyl-gel de silice, en chromatographiant dans le système CLHP et/ou le système sur gel mentionné cidessus et en isolant h CT 2 à partir des fractions cor25 respondantes. Pour caractériser les fractions contenant h CT 2 on utilise un radioimmuno-dosage (l 125 Ils CT avec une activité spécifique de 500 Ci/m Moles, anticorps contre s CT synthétique, s CT synthétique comme standard) . 30 L'invention concerne en particulier l'h CT 2 que l'on peut obtenir selon le procédé d'isolement décrit ci-dessus et da Bs les exemples, ou un de ses sels. 2549070; On peut préparer les sels d'h CT 2 de façon connue On obtient les sels d'addition d'acides p ex. par traitement avec un acide approprié, p ex un des acides mentionnés ci-dessus, ou un réactif échangeur d'anions approprié. On peut transformer les sels de manière habituelle en les composés libres, les sels d'addition d'acides p ex par traitement avec un agent basique approprie. L'invention concerne également les préparations pharmaceutiques qui contiennent comme substance active une dose efficace d'h CT 2 ou d'un de ses sels avec une quantité significative d'un support pharmaceutique, en particulier les preparations pour l'application intrau 15 nasale ou parenterale, comme intramusculaire ou intraveineuse, aux homéothermes, comme en tout premier lieu à l'homme. La posologie de la substance active dépend de l'espèce d'noméotherme, du poids corporel, de l'âge 20 et de l'état individuel, de la maladie à traiter ainsi que du mode d'application. Les nouvelles préparations pharmaceutiques pour l'application paren Lérale contiennent sous forme prête à l'emploi d'environ 0,001 pour mille à environ 25 1 % en poids, de préférence d'environ 0,005 pour mi Iles à environ 0,1 l pour mille, p ex 0,01 pour mille en poids, de substance active Les préparations pharmaceutiques selon l'invention peuvent se présenter p ex. sous forme de dose unitaire, comme les ampoules. On utilise de préférence des solutions de substance active, ainsi également que des suspensions, à savoir en particulier des solutions ou suspensions aqueuses isotoniques, celles-ci p ex en ce qui concerne les préparations lyophilisés qui contiennent la 35 substance active seule ou avec un support, p ex le 2549070: mannitol, pouvant être préparées avant l'emploi En particulier pour l'application intra-nasale les suspensions dans l'huile conviennent particulièrement Les préparations pharmaceutiques peuvent être stérilisées et/ou 5 contenir des additifs, p ex des agents de conservation, des agents de stabilisation, des agents mouillants et/ou des émulsifiants, des tiers solvants, des sels pour régler la pression osmotique et/ou des tampons, et on les prépare de façon connue, p ex au moyen de procédés 10 classiques de dissolution ou de lyophilisation Les solutions ou suspensions mentionnées peuvent contenir des corps élévateurs de viscosité, comme la carboxyméthylcellulose sodique, la carboxyméthylcellulose, le dextrane, la polyvinylpyrrolidone ou de préférence 15 la gélatine. Les suspensions dans l'huile contiennent comme composant huileux les huiles végétales, synthétiques ou semi-synthétiques habituelles dans des buts d'injection Comme telles il faut mentionner en particulier les esters d'acides gras liquides qui contiennent comme composant acide un acide gras à chaîne longue en C 8 à C 22, en particulier en C 12 à C 22, comme p ex l'acide laurique, l'acide tridécylique, l'acide myristique, l'acide pentadécylique, l'acide palmitique, l'acide mar25 garique, l'acide stéarique, l'acide arachidique, l'acide béhénique ou les acides non saturés correspondants, comme p ex l'acide oléique, l'acide élaidique, l'acide érucique, l'acide brassidique ou l'acide iinoléique Le composant alcool a au maximum 6 atomes de 39 carbone et est un alcool mono ou polyvalent, p ex. un alcool mono, di ou trivalent, p ex le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol ou le pentanol ou leurs isomères, mais surtout le glycol ou la glycérine. Comme esters d'acides gras il faut donc mentionner par exemple: l'oléate d'éthyle, le myristate d'isopropy 1 e, le palmitate d'isopropyle, le "Labrafil M 2735 " (trioldate de polyoxyéthylèneglycérine de la société Gattefossé, Paris), le "Miglyol 812 " (triglycéride d'a5 cides gras saturés ayant une longueur de chaine en C 8 C 12 de la société Chemische Werke Witten/Ruhr, Allemagne), mais en particulier les huiles végétales comme l'huile de coton, l'huile d'amandes, l'huile d'olive, l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile de soja, 10 maias surtout l'huile d'arachide. La préparation des préparations injectables s'esffctie de maniere habituelle dans des conditions antimincrobienie, ainsi que le versemert dans des ampoules su des flacons ainsi que le scellement des récit 15 pients. L Hs exemples suivants précisent l'inventiono Les températures sont données en degrés Celsius. Exemple 1 Extraction d'h CT 2 à partir de plasma humain et purification par chromatographie en phase liquide à haute pression On prélève du sang veineux de personnes normales dans des Vacutainers héparinisés (Becton Dickinson France SA Grenoble, F), puis on centrifuge 2 fois pendant 10 minutes à 4 C et 1700 g (centrifugeuse: Superspeed RC-2 B, Sorvall, Du Pont Instruments, Newton, Connecticut, Etats-Unis), on rassemble les surnageants 10 et on congèle à -200 C On fait ressuer le plasma pendant 2 semaines puis on centrifuge pendant 30 minutes à 4 C et 48 000 g (rotor à angle fixe: Sorvall SS-34, petit tube de polyéthylène: Du Pont Instruments, Newton, Connecticut, Etats-Unis) On extrait les surnageants 15 réunis (au minimum 20 ml) à 4 C en plusieurs fois ( 3-5 ml) selon le procédé suivant par adsorption sur octadécasilyl-gel de silice (cartouches de Sep-Pak C 18, Waters Assoc, Milford, Massachusetts, Etats-Unis). Extraction Avant application de l'échantillon de plasma on dispose la cartouche de Sep-Pak dans une seringue perdue (Henke-Sass Wolf Gmb H, République fédérale d'Allemagne) avec raccord Luer-lock et on humidifie avec ml de méthanol (Merck AG, Darmstadt, République fédé25 rale d'Allemagne) suivis par 10 ml d'acide trifluoracétique à 0,1 % ( TFA, sequencer grade, Rathburn Chemicals, Walkerburn, Grande-Bretagne) dans l'eau bidistillée (v/v). On met alors sur la cartouche une seconde seringue jetable de 10 ml avec ballon mis en place, on verse 3 à 5 ml de 30 plasma dans la première seringue et on pousse lentement dans la seconde seringue sans faire passer d'ait dans la cartouche Après avoir poussé le plasma 5 fois dans il un sens et dans l'autre on enlève une seringue, on pousse le plasma et on le jette On lave ensuite la cartouche avec 10 ml de TFA à 0,1 % et enfin on élue goutte à goutte avec 3 ml d'acétonitrile à 60 %/TFA à 0,1 % (v/v) dans un flacon à scintiliations en plastique (Packard Inst Company, Downers Grove, Illinois, EtatsUnis) Dans un récipient on rassemble 5 éluats, on les fait congeler en position oblique dans l'azote liquide et cn 1 yophilise Après la lyophilisation on dissout i O ll'extrait ob Lenu dans à chaque fois I ml deacetonitrili à 60 %/TIFA à O 1 % En cas d'extraction de plus de 25 mi de plasma en rasssemble plusieurs extraits dans un flacon à scintillations n lave les flacons vides avec la même quantitê; du so 1 r ant et on ajoute de liquide de lavage aux extrairts reuni it on arèle et on lyophilise encore une fois On dissout ce lyophilisat dans 2 ml d'acide acétique 01 M (f Merck), on centrifuge à 48 000 g et * C pendant 20 minutes dans un petit tube de polycarbonate puis on sépare le surnageant au moyen d'une 20 chromatographie en phase liquide à haute pression a phases inversées {CLMP). CLHP Les analyses par CLHP sont conduites à la température ambiante L'installation se compose de deux pompes (Mcdèle 110 A, Altex, Berkeley, Californie, Etats-Unis), d'une chambre de mélange à gradient à haute pression (Altex Modèle 400) ainsi que d'un microprocesseur/prcgrammateur t Altex Modèle 420) comme unité de commandeo Les échantillons sont introduits manuelle30 ment par un injecteur sans septum, muni d'un anneaudoseur de 2 mil pour les échantillons (modèle RE 7125 " Rheodyne Inc, Berkeley, Californie, Etats-Unis} Comme colonnes on utilise des colonnes d'acier inoxydable ( 25 cm de longueur, 4,6 mm de diamètre interne, Altex) remplies selon la technique de la bouillie de haut en bas avec du Nucléosil 10 O C 18 (Macherey Nagel, Diren, République fédérale d'Allemagne) La solution A se compose d'acide heptafluorobutyrique aqueux 0,1 M (sequencer grade, Rathburn Chemicals), qui est en outre comprimé par une cartouche de Sep-Pak-C 18 humidifiée La solution B se compose de 20 % de solution A et 80 % d'acétonitrile (qualité CLHP S, Rathburn Che10 micals) (v/v) Avant l'analyse on fait barboter de l'hélium pendant 2 minutes dans les solutions et on équilibre la colonne pendant environ 1 h avec 25 % de solution B avec un débit de 1,5 ml/minute. Après une phase de charge de 2 minutes dans les con15 ditions du début ( 25 % de solution B, contient 20 % d'acétonitrile) on élue les peptides avec un gradient linéaire de 25 % à 73 % de la solution B ( 20-58 % d'acétonitrile)'pendant 90 minutes et avec un débit de 1,5 ml par minute On rassemble les fractions d'éluant d'en20 viron 1,5 ml ( 95 fractions en 100 minutes) après passage à travers un détecteur UV (Uvikon LCD 725, à longueur d'onde variable, réglé à 254 nm, amplitude complète à 0,05 à 0,1 unités d'absorption, tracé au moyen d'un enregistreur W+W Tarkan 600, tous deux Kontron AG, 25 Zuirich, Suisse) et une soupape à moteur réglée par le microprocesseur (Altex modèle 402, avec possibilité d'inversion sur résidus ou collecteur de fractions) dans un collecteur de fractions synchronisé (Buchler Alpha 200, Kontron AG) dans des petits tubes en verre 30 silicones Pour diminuer une adsorption possible des peptides sur la paroi de verre on verse avant l'analyse dans chaque petit tube 300 m 1 d'une solution de sérumalbumine de boeuf à 1 % (Behring Werke, MarburgLahn, République fédérale d'Allemagne) et d'azide de 35 sodium à 0, 05 % (Fluka AG, Buchs, Suisse) (v/v) dans l'acide acétique 0,1 M On mélange les fractions dans un mélangeur à Vortex (Scientific Industries Inc. Springfield, Massachusetts, Etats-Unis), on congèle à -20 C et on lyophilise Avant la détermination radioimmunologique de la concentration de calcitonine décrite ci-dessous on verse à chaque fois 0,5 ml d'acide acétique 0,01 M dans le petit tube et on mélange. Le taux de redétection de la calcitonine humaine synthétique ( 1-32), ajoutée au plasma avant l'ex10 traction, s'élève encore apres la CLHP à 40 à 70 %o Après chaque passage en CLHP on régénère la colonne et l'anneau-doseur d' chantillons successivement avec à cnaoque fois 15 ml de solution B, 150 ml de méthanol à 90 %/TFA à 1 %, 40 mi de zutanol-i et 140 ml cb méthanol, sous lequel sn conserve également la colonneProcédé de mesure (détermination radioim munologique de la concentration de calcitonine) On détermine la concentration d'n CT 2 par radioimmunologie dans une série de concentrations On 20 préincube 10, 20, 50 et i 00 i des fractions de CLHP, qui ont été traitées ultérieurement comme il est dit cidessus, pendant 3 jours à 4 avec 100 pl de serum d'anticorps pour donner du s CT synthétique (Sandoz AG, Bale, Suisse) dans un tampon'dirimunodosage à un volume 25 total de 300 p 1 (tampon d'immunodosage: phosphate 0,05 M, p H 7,5, sérum humain à 10 %, qui ne contient pas de quantités détectables de s CT i,îmunoréactve) > ui après addition de 200 uil de tampon de dosage ave 125 000 dpm de 1 25 Ils CT {activité spécifique 600 Ci/ 30 m Molei on fait incuber pendant encore 3 jours à 40. Le marquage de s CT avec 12 I se fait avec de la Chloramine-T {Eastman odak, Rochester, Etats-Unis) pour l'essentiel selon le procédé de Wo M Hunter et F C Greenwood (Nature lLondresl 194, 495-496 l 1962 l). Lors de la'dilution finale des anticorps ( 1:25 000) à 40 % des anticorps sont liés à la l 125 Ils CT, c'est-àdire que la liaison spécifique s'élève à 30-40 %. Comme standard on utilise la même s CT synthétique; une inhibition semimaximale de la liaison de l 125 Ils CT aux anticorps s'effectue avec environ 100 pg de s CT ( = 0,03 p Mole) On n'obtient pas une inhibition comparable de la liaison par 10 pg d'h CT. On obtient le sérum d'anticorps mentionné 10 ci-dessus de la façon suivante: On produit les anticorps chez une chèvre pesant 25 kg après immunisation primaire avec 200 pg de s CT (voir ci-dessus) comme antigène et réimmunisation avec 100 pg du même antigène 30 jours après l'immunisa15 tion primaire Aux fins d'immunisation on dissout la s CT dans l'acide acétique 0,01 M i 1 mg/ml), on mélange avec 2 % en poids d'hydroxyde d'aluminium solide (Alhydrogel, Superfos Export Co a/s Copenhague, Danemark) et on met en suspension dans un volume égal d'adjuvant 20 complet de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, Etats-Unis) Cette suspension est produite dans un Omnimixer (Sorvall) au plus haut niveau à 4 C. On met 0,5-1,0 ml de suspension dans des seringues jetables (Primo 1 ml, Asik I/S, DK) et on administre par 25 voie sous-cutanée dans chaque patte dans la zone des ganglions lymphatiques sub-axillaires 10 jours après la réimmunisation mentionnée ci-dessus, on prélève -80 mi de sang, qui contient les anticorps désirés anti-s CT, dans la veine jugulaire dans des petits tubes 30 héparinisés et on conserve le plasma obtenu à -20 ' en fractions de 3-5 ml. On met en évidence les anticorps en mesurant la liaison à l 125 Ils CT du plasma prélevé On sépare 254907 C l 125 Ils CT liée aux anticorps et libre au moyen de charbon de bois recouvert de dextrane, pour l'essentiel selon le procédé de V Herbert, K S Lau, C W Gottlieb et S J Bleicher lJ Clin Endocrinol Metab 25, 13755 1384 ( 1965)l Le même procédé sert à mettre en évidence les anticorps dans le sérum humain. Profil chromatographique Le orofil chromatographique de la séparatioe par CLHP décrite ci-dessus est représenté dans la figure 10 1 En ordonnée est portée la concentration, donnée en picogrammes-équivallents, les courbes caractérisees par o et A d'une pert ainsi que par Q d'autre part ayant des échelles différentes O En abscisse est por te le temps écoulé depuis 15 le début de l'élution La droite en pointillé donne la composition du gradient linéaire utilisé pour l'élution par l'indication de la teneur en acétonitrile Les flèches caratérisées par a ou b donnent l'endroit de l',élution d'h CT ou selon les cas de s CT. Pour déterminer ies valeurs de concentration îndiquées dans la figure 1 on utilise pour chacune des trois courbes caractérisées par des cercles pleins "'D , des triangles "A" ou des cercles creux "C" un autre radioimmunodosage (anticorps différents", à savoir pour 25 les valeurs de concentration caractérisées par des cercles pleins un RIA anti-h CT synthétique (cf F M. Dietrich, W H Hunziker et J A Fischer, Acta Endocrinologica 80 l 1975 l 65-486), pour les valeurs de concentration caractérisées par des triangles le RIA décrit 30 ci-dessus anti-s CT synthétique et pour les valeurs de concentration caractérisées par des cercles creuxmoins intéressantes dans le cadre le la présente demande, un RIA anti-PDN-21 humain Le PDN-21 préparé par synthèse, un peptide ayant 21 acides aminés, est décrit par Mac Intyre et coll, Nature (Londres) 300, 460-462. Exemple 2 Solution de gélatine On mélange une solution aqueuse de h CT 2 filtrée de façon stérile en chauffant avec une solution de gélatine stérile, qui contient comme agent de conservation du phénol, dans des conditions aseptiques, de 10 manière que 1,0 ml de solution ait la composition suivante: h CT 2 10 gq Gélatine 150,0 mg Phénol 4,7 mg Eau distillée q s p 1,0 ml On verse le mélange de façon aseptique dans des flacons de 1,0 ml. Exemple 3 Substance sèche injectable stérile On dissout 5 pg d'h CT 2 dans 1 ml d'une solution aqueuse avec 20 mg de mannitol On filtre la solution de façon stérile et on la verse dans des conditions aseptiques dans une ampoule de 2 ml, on congèle et on lyophilise Avant l'emploi on dissout le lyophi25 lisat dam lml d'eau distillée ou 1 ml de solution de sel physiologique On applique la solution par voie intramusculaire ou intraveineuse On peut égabment verser cette formulation dans des ampoules pour injection à chambre double. 254907 C Exemple 4: Produit pour pulvérisation nasale Dans un mélange de 3,5 ml de "Miglyol 812 " 1 et 0,08 g d'alcool benzylique on met en suspension 200 pq d'h CT 2 finement broyé ( soupape dansle récipient En agitant on dissout le "Fréon" dans le mélange miglyol-alcool benzylique. Ce récipient de pulvérisation contient environ 100 doses 10 unitaires, que l'on peut appliquer isolément, Exemple 5 Extraction d'Xn CT 2 à partir d'hypophyses humaines et purification par filtration sur gel On prélève 5-10 hypophyses ( 3-5 q) de patients 15 sans désordre des glandes endocrines ni du squelette par autopsie au plus tard 20 h après la survenue du décès et on les conserve à -80 ' pendant au plus 3 semaines. Extraction Aux hypophyses congelées on ajoute un volume fois supérieur d'acide acétique aqueux 2 M glacé et on amène l'échantillon pendant 5 minutes dans un bain d'eau à ebullition On pulvérise les hypophyses avecun appareil Ultra-Turrax (homogénéiseur 18 K de 25 la société Ika-Werke, Staufen, RFA) On congèle les homogenats pendant environ 12 h à -20 ', puis on fait ressuer à la température ambiante, on congèle à nouveau et on fait à nouveau ressuer et enfin on centrifuge à 48 000 g à 4 pendant 30 minutes On lyophilise le 30 surnageant clair et on le conserve à -20 . On met le surnageant dans une seringue jettable de 10 ml et on l'extrait comme dans l'exemple I avec une cartouche de Sep-Pak. Filtration sur gel (système sur gel): On conduit l'analyse par filtration sur gel à 4-60 L'instailation se compose d'une pompe (modèle PMP-10, Ismatec SA, Ziirich, Suisse) et d'une colonne cnromatographique constituée de produit synthétique ( 100 cm de longueur, 1,6 cm de diamètre interne, Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-751 04 Uppsala 1, Suède) La solution d'elution se compose de 0,2 Mole/ litre d'acétated'ammonium (E Merck, Darmstadt, RFA) de 10 p H 4,6 et de sérumalbumine de boeuf à 0,05 % (Behring Werke, Marburg lLahnl, RFA) On équilibre l'acide pendant environ 72 h dans la solution On aspire la solution ( 2 ml) à travers un robinet à trois voies pendant environ minutes On élue les peptides pendant 48 h et avec un débit de 5,0 ml par heure On rassemble les fractions d'éluant d'environ 2,5 ml ( 100 fractions en 48 h) dans un collecteur de fractions (LKB 7000 Ultrorac, Bromma, Suède) On congèle les fractions à -20 et on les lyophilise Avant la détermination radioimmunologique de la 20 concentration de calcitonine décrite dans l'exemple 1 on verse à chaque fois 0,5 ml d'acide acétique aqueux 0,01 M dans les petits tubes et on mélange Le taux de redétection d'n CT synthétique, qui a été ajouté avant l'extraction à l'extrait hypophysaire, s'élève encore 25 après filtration sur gel à 40 % à 80 %. 254907 o REVENDICATIONS 1 Substance du groupe des calcitonines, également désignée ci-dessous comme calcitonine humaine 2, en abrégé h CT 2, que l'on peut isoler du corps humain ou obtenir d'une autre manière, ayant les propriétés suivantes: a) Aptitude à la réaction avec des anticorps qui ne reconnaissent pas la calcitonine humaine ( 1 l-32) appartenant à l'état de la technique, en abrégé h CT, mais qui peuvent encore réagir avec la calcitonine de 10 saumon (i-32), en abrégé s CT, à une concentration jusqu'a 105 fois plus faible, b) Temps de rétention non différenciable de celui de la s Cr préparée par synthèse dans le système de chromatoorapnie en phase liquide m haute pression 15 suivant (système CLHP): Adsory Dant: Nucléosil 10 C 18 ou un autre adsorbant ayant des propriétés comparables, colonne de 250 mm de longueur d'un diamètre da 4,6 mm, chargée avec 1 ng à mq d'h CT 2, gradient linéaire, constitué des solutions 20 A (acide heptafluorobutyrique aqueux 0,1 molaire) et de 25 à 73 % en volume de B { 20 % en volume de solution A et 80 % en volume d'acétonitrile), correspondant c 20-53 % en volume d'acétonitrile, pendant 90 minutes à une vitesse d'écoulement de 1,5 ml/heure, c) Dans le sérum humain pas de déclenchement de la formation de quantités détectables d'anticorps qui sont en situation de réagir avec s CT, o pour examiner cette caractérisation on utilise la liaison à l 125 Ils CT avec une activité spécifique de 500 Ci/m Moles, 30 et ses sels. 2 Substance selon la revendication 1, qui présente les substances mentionnées dans la revendication 1 avec une charge de l'adsorbant avec 110 ng d'h CT 2, et ses sels. 3 Substance selon l'une des revendications 1 et 2, dont le volume d'élution dans le système de chromatographie à perméation sur gel (système sur gel) suivant n'est pas différenciable de celui de la s CT préparée par synthèse: Gel: Bio-Gel P-150 W ( 0,149-0,074 mm d'ouverture de maille) ou un autre gel ayant des propriétés comparables, colonne de 100 cm de longueur de diamètre 1,6 cm, charge avec 1 ng à 10 ng d'h CT 2, éluant constitué d'acétate d'ammonium ( 0,2 Mole/litre, p H 4,6) et de sérumalbumine de boeuf ( 0,5 mg/ml), pendant 48 h avec 15 une vitesse d'écoulement de 5 ml/heure. 4 Substance selon l'une des revendications 1-3 ou un de ses sels à une concentration enrichie par rapport à ce qu'on trouve dans la nature. Substance selon l'une des revendications 1-3 ou un 20 de ses sels sous forme essentiellement pure. 6 Préparations pharmaceutiques contenant une dose efficace d'un composé selon l'une des revendications 1-5 ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables avec une quantité significative d'un support pharmaceutique. 7 Application d'une substance selon l'une des revendications 1-5 ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables à la guérison des maladies. 8 Substance selon l'une des revendications 1-5 ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables aux fins d'application dans un procédé de traitement thérapeutique du corps humain et animal. 9 Application d'une substance selon l'une des revendications 1-5 ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables au traitement des désordres du métabolisme osseux. Procédé de préparation d'une substance selon l'une 10 des revendications 1 N 3 ou d'un de ses sels, caractérisé en ce qu'on centrifuge du serum sanguin humain i 4 OC et 43 000 g pendant 30 Minutes, en ce qu'on adsorbe le surna rant clair sur cartouches doctacasilvlge de silice, de préeúrence des cartouches d'octadécasill_" 15 gel de silice-sep-pak Cl C Waters Assoco, Milford, Massachusetts), dans de l'acide trifluoracétique a queu à 0,1 %, in ce qu'on élue h CT 2 à partir des cartouches avec de l'acetonitrile aqueux à 60 % v/lv qui contient 0,1 % d'acide triflucracétique en ce qu'on lyophilise 20 l'éluat, en ce qu'on traite le lyophilisat avec de l'acide acétique 0,1 molaire, en ce qu'on centrifuae La fraction dissoute à 4 "C et 48 000 g pendant 30 minutes, en ce qu'on chromatographie le surnageant clair dans le syst me CLHP mentionné ci-dessus et en ce qu'on 25 isole h CT 2 à partir de la fraction correspondante, et, si on le désire, en ce qu'on transforme la substance obtenue en un sel. 11 Procédé de préparation d'une substance selon l'une des revendications 1-3 ou d'un de ses sels, caractéri30 sé en ce qu'on mélange successivement dans le temps tout d'abord des hypophyses humaines congelées avec un volume 10 à 20 fois supérieur d'acide acétique aqueux 2 M glacé, en ce qu'on chauffe pendant 5 minutes dans un bain d'eau à ébullition, en ce qu'on broie les hypophyses avec un appareil Ultra-Turrax (homogénéiseur 18 K, Ika-Werke, Staufen, Allemagne) ou un appareil comS parable quant à l'effet recherché, en ce qu'on congèle les homogénats pendant environ 12 h à -20 *, en ce qu'on fait ressuer a la température ambiante, congeler à nouveau, et à nouveau ressuer, en ce qu'on centrifuge à 48 000 g et 4 C pendant 30 minutes, en ce qu'on adsorbe le surnageant clair comme il est dit ci- dessus sur cartouches d'octadécasilyl-gel de silice,en ce qu'on chromatographie dans le système CLHP suivant: Adsorbant: Nucléosil 10 C 18 ou un autre adsorbant ayant 18 des propriétés comparables, colonne de 250 mm de longueur 15 d'un diamètre de 4,6 mm, chargée avec de 1 ng à 10 ng d'h CT 2, gradient linéaire, constitué des solutions A (acide heptafluorobutyrique aqueux 0,1 molaire) et de 25 à 73 % en volume de B ( 20 % en volume de solution A et 80 % en volume d'acétonitrile), correspondant à 20-58 % en volume d'acétonitrile, pendant 90 minutes à une vitesse d'écoulement de 1,5 ml par heure, et/ou dans le système de el suivant: Gel: Bio-Gel P-150 9 ( 0,149-0,074 mm d'ouverture de maille) ou un autre gel ayant des propriétés compara25 bles, colonne de 100 cm de longueur ayant un diamètre de 1,6 cm, chargée avec de 1 ng à 10 ng d'h CT 2, éluant constitué d'acétate d'ammonium ( 0,2 Mole/litre, p H 4,6) et de sérumalbumine de boeuf ( 0,5 mg/ml), pendant 48 h à une vitesse d'écoulement de 5 ml/heure, 30 et en ce qu'on isole h CT 2 à partir des fractions correspondantes et, si on le désire, en ce qu'on transforme la substance obtenue en un sel. 12 La substance obtenue selon le procédé de l'une des revendications 10 ou 11 et ses sels.