Brevet FR2559500A1 — publié le 19850816

La présente invention concerne un procédé de culture de cellules fragiles, capables de proliférer, et plus précisément un procédé destiné à optimiser l'échange gazeux dans des cultures de telles cellules. Les cellules bénéficiant du procédé de l'invention sont notamment des lignées de cellules animales telles que diverses cellules de myélomes, des lignées de cellules transformées naturellement ou articifiellement à partir f de culture primaire, des cellules associées telles que les hybridomes, les cellules transformées malignes et d'autres cellules n'ayant pas de paroi, par exemple les sphéroplastes. On sait que l'oxygène est essentiel aux cultures de cellules animales, et que la quantité d'oxygène disponible, pouvant diffuser dans une cellule, est importante pour la viabilité et la croissance des cel- lules. En général, une quantité trop faible d'oxygène peut tuer une cellule ou, au mieux, limiter sa croissance. Dans un exemple, la croissance de culture d'hybridomes nécessite au moins 0,12 millimole environ d'oxygène par litre et par heure pour 109 cellules. Lorsque la quantité d'oxygène disponible est plus faible, la mitose et la production des protéines sont limitées. En outre, une quantité trop importante d'oxygène peut provoquer une certaine toxicité de l'oxygène qui peut tuer une cellule par oxydation de protéines essentielles. Un taux de consommation d'oxygène par des cultures cellu- laires augmente avec la croissance de la culture et, lorsque la densité de la culture cellulaire augmente, le transfert de quantités convenables d'oxygène de la surface de la culture à son volume interne est de plus en plus difficile. L'anhydride carbonique, qui a une influence sur le pH et la concentration du bicarbonate, est aussi nécessaire à l'entretien de la croissance des cellules animales; son réglage est primordial lorsque de grandes quantités de cellules doivent être produites. Les techniques classiques de culture des cellules des mammifères à l'échelle de laboratoire comprennent la mise en suspension des cellules dans un milieu placé dans une boîte de Petri. L'oxygène et l'anhydride car- bonique diffusent à travers la surface du milieu et dans les cellules. La hauteur du milieu de culture - a une influence sur la vitesse de diffusion d'oxygène et d'anhydride carbonique vers les cellules. Lorsque la hauteur d'un milieu augmente, le rapport de la surface du milieu au volume de celui-ci diminue. A un certain moment, la concentration de l'oxygène et de l'anhydride carbonique dans l'air au-dessus de la boite et/ou la vitesse de dissolution dans le milieu ne suffisent plus pour que la concentration du gaz soit suffisante dans tout le volume du milieu en fonction des critères de croissance des cellules. A ce moment, la disponibilité d'oxygène devient un facteur qui limite la croissance. Ainsi, la technique connue montre qu'on doit maintenir la hauteur du milieu, dans ces cultures statiques, à une valeur de quelques millimètres. De façon générale, la limite supérieure de la densité des cellules dans de telles cultures, lorsque l'espace supérieur contient de l'air qui fournit l'oxygène, est d'environ 105 cellules par centimètre cube de culture. Lorsque les techniques de cultures cellulaires sont mises en oeuvre à une autre échelle afin que des cellules de mammifères soient cultivées en quantités permettant une production, des difficultés se présentent pour l'entretien de la disponibilité de quantités suffi- santes d'oxygène pour que les critères fixés par les cellules soient satisfaits, comme décrit dans l'ouvrage de Glacken et al., Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology, Elsevier Science Publications, 0166-9430/83, p. 102 (1983). Une solution à ce problème est la mise à disposition de plus grandes concentrations d'oxygène et d'anhydride carbonique dans l'espace délimité au-dessus de la surface du milieu, lorsque la densité cellulaire augmente. Cependant, dans ce procédé, la quantité d'oxygène présente peut être trop importante près de la surface du milieu, et elle peut provoquer une toxicité par l'oxygène, et des capteurs d'oxygène et des dispositifs coûteux de dosage doivent constamment vérifier et régler la concentration d'oxygène dans le milieu afin que les proportions optimales des gaz dans le milieu soient maintenues. Dans le cas de la croissance de cellules ayant des parois, par exemple les cellules procaryotiques, les gaz sont souvent introduits directement par barbotage dans le milieu afin que les cellules reçoivent le gaz aux concentrations nécessaires. Cependant, le barbotage direct ne convient pas à la structure des cellules qui n'ont pas de parois, qui sont très fragiles, et qui sont détériorées physiquement lorsque le gaz barbote avec des débits suffisamment élevés pour que les concen- trations convenables de gaz soient maintenues dans le milieu. En outre, les constituants à base de protéines du milieu qui sont habituellement nécessaires dans toutes les cultures de cellules animales, forment une mousse à la surface du milieu et cette mousse peut piéger les cellules. Les cellules piégées dans la mousse meurent rapidement. Des agents antimousses qui peuvent être ajoutés au milieu afin qu'ils empêchent la formation d'une mousse, sont potentiellement toxiques pour les cellules présentes dans la culture. Comme décrit dans l'article précité de Glacken, des progrès récents dans le domaine de la culture des cellules ont porté sur la mise des cellules dans des capsules d'un alginate de calcium afin que les densités cellulaires puissent être élevées. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883 décrit l'encapsulation de cel- lules afin qu'elles soient protégées contre des agents nuisibles tels que des bactéries. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 409 331 décrit un procédé de production de matières animales ou cellulaires d'un autre type par récolte de ces produits à partir de cultures cellu- laires encapsulées, les cellules étant placées dans des capsules à membranes semi-perméables. Comme l'indique la description qui précè4de, il est souhaitable d'assurer un échange perfectionné des gaz lors de la culture des cellules des mammifères et d'autres cellules fragiles. Ainsi, l'invention concerne l'optimisation de la concentration des gaz dans un milieu sans détérioration des cellules et sans mise en oeuvre de techniques coûteuses de contrôle. Elle concerne aussi un procédé de croissance de cultures cellulaires importantes, par exemple de 20 à 30 litres, avec des densités cellulaires élevées, par exemple de 108 cellules/cm3. Elle concerne aussi la culture de cellules n'ayant pas de parois, par exemple des cellules animales ou des sphéroplastes, par barbotage de gaz destiné à donner les quantités de gaz nécessaires aux cellules sans que celles-ci soient détériorées. Elle concerne aussi la croissance de cellules animales dans des cultures avec des densités comparables à celles de nombreux tissus normaux. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de culture efficace de cellules fragiles, c'est-à- dire de cellules n'ayant pas de parois, à des densités élevées. Le procédé comprend la mise en suspension, dans un milieu, de capsules sphéroidales contenant une culture germe des cellules à cultiver. Les capsules ont des membranes semi-perméables qui suffisent pour la protection des cellules contre les détériorations physiques et qui sont suffisamment perméables pour qu'elles permettent la traversée des gaz, des ions, des vitamines, des matières nutritives essentielles, etc., nécessaires à l'entretien de la croissance des cellules. Un gaz contenant les constituants nécessaires aux cellules barbote directement dans le milieu, parmi les capsules en suspension, de manière continue ou intermittente, pendant la croissance cellulaire. La composition du gaz de barbotage suffit pour que la concentration d'oxy- gène et/ou d'anhydride carbonique reste pratiquement constante dans le milieu, cette concentration étant suffisante pour que les cellules reçoivent l'oxygène et/ou l'anhydride carbonique en quantités convenant bien à l'entretien de la mitose des cellules et de leur métabolisme. L'utilisation des milieux classiques et de cette technique de barbotage de gaz permet la croissance de cellules, dans les capsules, avec des densités de l'ordre de 5.108 cellules par centimètre cube de capsules déposées. Le cas échéant, les substances qui sont produites par les cellules peuvent être récol- tées soit à l'intérieur des capsules soit dans le le milieu. Dans des modes de réalisation préférés, lors de la culture de cellules animales, le gaz de barbotage contient de l'anhydride carbonique et de l'oxygène en quantités équilibrées qui suffisent à l'obtention de la teneur voulue en O2/CO2 dans le milieu. De préfé- rence, la teneur en 02/C02 du milieu est suffisante pour que la densité des cellules soit maximale dans les capsules, car la croissance cellulaire optimale est favorisée. Cela signifie que l'oxygène est présent dans le gaz de barbotage à une valeur comprise entre environ 0,2 et 600 millibars, de préférence d'au moins 0,2 à 270 millibars et, de façon optimale pour les cellules des mammifères, entre 200 et 230 millibars. Les cellules des mammifères qui peuvent être cultivées selon ce procédé sont avantageusement des cellules obtenues par manipulation génétique, des cel- lules de myélomes et les hybridomes et autres cellules associées. Un avantage essentiel de la technique selon l'invention pour la culture des cellules de mammifères par barbotage assurant un échange gazeux est que les cellules ont accès à d'abondantes réserves de gaz. Ainsi, des cultures même denses et volumineuses peuvent recevoir de l'oxygène et/ou de l'anhydride carbonique à des concentrations telles que l'échange des gaz ne devient pas un facteur limitant la croissance. Ceci est possible parce que les cellules sont encapsulées dans des membranes et sont ainsi protégées contre les détériorations phy- siques provoquées normalement par le barbotage. Ce dernier est un procédé efficace d'introduction, dans le milieu, de concentrations optimales d'oxygène et d'anhydride carbonique parce qu'un équilibre peut s'éta- blir avec un débit de barbotage de seuil entre la concen- tration des gaz dans les gaz de barbotage et la concen- tration des gaz dans le milieu. Des concentrations d'oxygène et d'anhydride carbonique à l'intérieur du milieu peuvent ainsi être réglées à des valeurs optimales par réglage des concentrations dans le gaz de barbotage. La nécessité de l'utilisation d'un appareillage coûteux de contrôle et de dosage de gaz est ainsi supprimée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 représente schématiquement des cellules de mammifères enrobées dans une microcapsule, pouvant être utilisées selon l'invention; la figure 2 représente schématiquement un appareil de culture de cellules destiné à la mise en oeuvre de l'invention; la figure 3 est un graphique représentant le nombre total de cellules par centimètre cube du milieu en fonction du temps pour diverses cultures réalisées par lots, avec ou sans barbotage de gaz; la figure 4 est un graphique représentant la variation de la quantité de cellules par centimètre cube de cellules déposées en fonction du temps, dans le cas d'une culture encapsulée, à alimentation continue et à barbotage de gaz, ce graphique représentant les densités de cellules qui peuvent être obtenues à l'aide du procédé selon l'invention; et la figure 5 est un graphique analogue à la figure 4, représentant la croissance d'une culture ali- mentée de façon discontinue. La présente invention repose sur l'observation du fait que les cellules n'ayant pas de parois, par exemple les cellules de mammifères, encapsulées dans des membranes semi-perméables, sont pratiquement insensi- bles aux détériorations physiques et aux problèmes de toxicité par l'oxygène dus au barbotage des gaz, et que le barbotage des gaz peut être utilisé effica- cement pour la transmission d'oxygène et/ou d'anhydride carbonique à de telles cellules. L'utilisation du procédé selon l'invention permet l'équilibrage de la concentration d'oxygène et d'anhydride carbonique afin que leurs valeurs soient optimales dans un milieu, et les rendements cellulaires obtenus peuvent être accrus dans des réci- pients de culture de cellules à grande échelle. Comme les concentrations de 0 2 et CO2 dans le milieu sont proportionnelles à leur concentration dans les gaz de barbotage, le contr8le de la concentration et le coût correspondant sont éliminés. On considère maintenant la figure 1 qui indique que les cellules 11 de mammifères peuvent être encapsulées dans des capsules sphéroidales 13, par exemple sphériques, par mise en oeuvre du procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 352 883. Les techniques actuellement préférées d'encapsulation sont décrites dans la demande de brevet déposée ce jour par la Demanderesse sous le titre "Procédé d'encapsula- tion, notamment de cellules, dans des membranes semi- perméables". Par exemple, un procédé d'encapsulation comprend la formation d'une suspension contenant environ 106 cellules par centimètre cube dans une solution à 1 % (en poids/volume) d'alginate de sodium ("NaG-Kelco LV")>. La densité des cellules dans cette suspension détermine le nombre de cellules par capsule dans la culture germe finalement produite. La suspension est transférée à un appareil ayant une tête de projection, formé d'un boîtier ayant une buse supérieure d'admission d'air et un corps creux allongé emmanché par friction dans un bouchon. Une seringue, par exemple de 10 cm3, équipée d'une pompe progressive, est montée sur le bottier, avec une aiguille, par exemple de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de téflon, passant sur toute la longueur du bottier. L'intérieur du boîtier est réalisé de manière que la partie supérieure de l'aiguille soit soumise à un courant d'air laminaire constant qui joue le rôle d'un couteau pneumatique. Lors de l'utilisation, la seringue pleine de solution, contenant la matière à encapsuler, est montée sur le bottier, et la pompe progressive est commandée afin qu'elle chasse progres- sivement des gouttes de la solution vers le bout de l'aiguille. Le courant d'air "arrache" chaque goutte qui tombe alors d'environ 2,5 à 3,5 cm dans une solution de chlorure de sodium à 1,2 % en poids par volume, formant des masses gélifiées qui sont collectées par aspiration. Les masses gélifiées subissent une incubation dans trois volumes renouvelés de solution saline isoto- nique assurant une expansion du gel, pendant 11 min environ au total. Une membrane est ensuite formée autour des masses gélifiées par contact avec une solution saline isotonique contenant 750 mg/l de poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, poids moléculaire 65 000 daltons. Après 12 min de réaction, les capsules résultantes sont lavées pendant 10 min avec une solution tampon à 1,4 g/l de CHES (acide 2cyclohexylaminoéthane sulfanique) contenant 0,2 % en poids/volume de chlorure de calcium dans une solution saline. Les capsules sont lavées pendant 8 min environ avec une solution saline à 0,3 % en poids/volume de chlorure de calcium et une seconde membrane est formée autour des capsules par une réaction de 10 min avec une solution saline à 105 mg/l d'amine polyvinylique (Polyscience, poids moléculaire de 50 000 à 150 000 daltons). Les capsules sont à nouveau lavées avec deux volumes de solution saline isotonique en 7 min puis revêtues par une immersion de 7 min dans une solution saline contenant 5.10 2 % en poids/volume de NaG. Les capsules sont lavées pendant 4 min supplémen- taires dans une solution saline, et les volumes internes aux capsules sont ensuite reliquéfiés par deux immersions dans une solution saline de citrate de sodium 55 mM, d'abord pendant 20 min puis pendant 6 min. Les capsules sont lavées deux fois dans la solution saline et lavées une fois pendant 4 min dans le milieu. Les capsules 13 sont alors prêtes pour une incubation dans un milieu 16 de culture. Les capsules telles que représentées sur la figure 1, préparées par ce procédé d'encapsulation, ont des membranes qui sont pratiquement imperméables aux protéines de poids moléculaire élevé, aux bactéries et aux cellules à cultiver. La figure 2 représente schématiquement un appareil destiné à la culture de cellules selon l'inven- tion. Il comporte un réservoir 10 de 50 1 de capacité, formé d'acier inoxydable 316 L ayant subi un polissage électrolytique, comportant une plaque 12 formant couver- cle. Un moteur 14 entraîne un arbre 16 d'agitation ayant des palettes 18 et 20 qui tournent dans la culture 22. Cette dernière est un milieu classique tel qu'un milieu modifié de Eagle, avec addition de sérum. En outre, il peut s'agir d'un milieu hypertonique ayant une osmolarité d'environ 360 milliosmoles, du type décrit dans la demande de brevet déposée ce même jour par la Demanderesse sous le titre "Procédé d'activa- tion de la production de protéines par des cultures cellulaires". De nombreuses capsules telles que celle qui est représentée sur la figure 1, sont en suspension dans le milieu. Par exemple, les capsules sont sphériques ou sphéroldales et elles ont un diamètre de l'ordre de moins de 2 mm environ. Des capsules de diamètre moyen de l'ordre de 0,8 mm donnent satisfaction. Les quantités de gaz nécessaires pour les cellules sont obtenues par circulation d'un gaz contenant de l'oxygène et de l'anhydride carbonique dans un filtre stérile 24, un tube 26 de barbotage et une tête 28 de barbotage. Cette tête 28 peut être un filtre de porcelaine microporeuse de 2,5 microns. Lors de la croissance de cellules animales, le gaz peut contenir % d'air et 5 % de CO2 (en volume). Les bulles de gaz passent de la tête au milieu en remontant parmi les capsules. Le débit de barbotage doit être suffisant pour que la pression partielle d'oxygène dans le milieu reste sensiblement égale à la pression partielle de l'oxygène dans le gaz. La pression d'oxygène dans le milieu peut ainsi être réglée à une valeur égale ou légèrement supérieure à celle que nécessite la croissance optimale des cellules. Etant donné la présence de cons- tituants du sérum dans le milieu, le barbotage provoque la collecte d'une mousse dans l'espace supérieur 30 du réservoir 10. Cependant, les capsules protègent les cellules contre la déshydratation si elles sont temporai- rement transportées dans la mousse, et elles protègent aussi les cellules contre les détériorations mécaniques. Ainsi, le barbotage du gaz dans une culture encapsulée permet la transmission de la quantité d'oxygène néces- saire à la population accrue de cellules, si bien que les densités de cellules obtenues peuvent être très élevées. Le gaz sortant de la culture s'échappe par un canal 32 de sortie et un filtre 34. Par exemple, le débit de gaz, pour une culture de 30 1, est de 5,6 litres par heure, dans les conditions normales. Lors de la mise en oeuvre de l'invention avec alimentation discontinue, le milieu est simplement introduit en quantité dosée dans le réservoir 10 avec des microcapsules contenant la culture germe, et la culture croit jusqu'à la densité maximale en présence de barbotage de gaz. Cependant, le procédé peut être le meilleur pour la mise en oeuvre de l'inven- tion et la circulation du milieu dans la culture par introduction d'un courant continu ou intermittent du milieu par le canal 38 d'entrée, et par évacuation du milieu par l'élément 40 de filtration. Ce dernier comporte une toile d'acier inoxydable qui est micropo- reuse, ses pores étant inférieurs au diamètre des cap- sules, par exemple de 50 à 100 microns. Le milieu peut être retiré par la soupape 42. Le niveau du milieu dans la culture peut être observé par un tube transpa- rent 44. Le débit du milieu transmis par le canal 38 d'entrée et extrait par le filtre 40 est par exemple compris entre 4 et 12 cm3/min. Lorsqu'on veut récolter des protéines ou d'au- tres substances produites par les cellules, le procédé utilisé dépend de la relation entre les dimensions moléculaires efficaces de la substance intéressante et la perméabilité des membranes des capsules. Comme décrit dans les brevets précités, la perméabilité des membranes des capsules peut être réglée entre certaines limites. Lorsque les protéines intéressantes sont trop grosses pour passer à travers la membrane, les protéines sont collectées dans les microcapsules; lorsqu'elles sont suffisamment faibles pour traverser les membranes, elles sont collectées dans le milieu externe aux capsules. Lors du fonctionnement, un utilisateur du système détermine la quantité d'oxygène et/ou d'anhydride carbonique qui doit être dissoute dans le milieu 22. Les concentrations et proportions choisies pour les gaz dépendent de la nature des cellules à cultiver, mais elles ne dépendent pas de la densité actuelle ou prévue des cellules. Dans le cas de la plupart des cellules animales, la concentration voulue d'oxygène (pression partielle) est comprise entre environ 20 et 270 millibars. Par exemple, la concentration choisie pour l'oxygène dans le cas d'une culture de cellules est supérieure à la quantité suffisante pour que les cellules reçoivent 0,12 millimole par litre et par heure pour 109 cellules, cette grandeur étant celle qui est approximativement la plus faible pour laquelle la croissance des cellules peut être vigoureuse, comme indiqué précédemment. La concentration des gaz dans le milieu est sensiblement proportionnelle à la concentration des gaz dans le gaz de barbotage pourvu que le débit de barbotage soit suffisamment élevé pour qu'il cache les variations de la concentration de O2/CO2 dues à l'activité respira- toire des cellules. Pour une valeur de seuil, le débit de barbotage suffit à l'entretien d'un équilibre entre les phases gazeuse et liquide dans le réservoir 10. L'utilisateur du système peut ainsi régler le débit de barbotage afin que le mélange voulu de gaz soit transmis à la tête 28 de barbotage. Celle-ci transmet alors le gaz à la culture 22 avec un débit qui maintient une concentration sensiblement constante d'oxygène dans le milieu. Un tel débit de barbotage est de 5,6 l/h, dans les conditions normales, dans un réservoir de culture de 30 1. Les capsules 13 protègent les cellules 11 placées dans le milieu contre les détériorations mécaniques. Les capsules protègent aussi les cellules qui peuvent être transportées dans la mousse placée dans l'espace libre dans le réservoir contre la déshydra- tation ou la détérioration par l'oxygène. Ainsi, il n'est pas nécessaire que la concentra- tion nécessaire dans le milieu soit contrôlée car un équilibre s'établit entre les concentrations des gaz dissous dans le milieu 22 et les concentrations préala- blement choisies des gaz utilisées pour le barbotage. Le barbotage se poursuit et les cellules 11 placées dans les capsules 13 peuvent subir une mitose. Finalement, lorsque la culture cellulaire a atteint la densité voulue pour les cellules, les substances produites par les cellules, par exemple des anticorps, peuvent être récoltées soit dans les capsules soit dans le milieu externe. Le barbotage dans un système de culture cel- lulaire à micro-encapsulation tel que décrit précédemment permet l'entretien d'une densité de cellules d'environ 5.108 cellules/cm3 de capsules déposées ou d'environ 1.108 cellules/cm3 du milieu, suivant les observations faites. Il s'agit d'une augmentation de l'ordrede 100 environ par rapport aux techniques classiques de cultures. Non seulement le rendement en produit des cellules est accru par augmentation de la densité, mais encore le barbotage du gaz selon l'invention permet un chan- gement d'échelle de l'application des techniques des cultures de cellules qui peuvent devenir des procédés industriels. Ainsi, le barbotage permet des échanges gazeux efficaces dans le cas des cellules micro-encapsulées de mammifères. On considère maintenant des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 On répartit également 800 cm3 environ de capsules déposées contenant environ 105 cellules hybridomes de souris-souris par centimètre cube, dans une quantité suffisante du milieu pour que deux volumes de 3 litres de cultures germes encapsuléessoient formés. Simultanément, on prépare deux volumes de 3 litres du milieu contenant des nombres comparables des mêmes cellules par unité de volume du milieu. Celui-ci était le milieu normal de Eagle, complété par 5 % de sérum bovin foetal. Les quatre cultures germes ont subi une croissance sous agitation douce et sans ajout du milieu pendant dix jours. Une culture encapsulée et une culture non encapsulée ont subi un barbotage à raison de 8,4 litres par heure dans les conditions normales, pendant cinq jours, puis de 28 litres par heure ensuite. Les deux cultures germes restantes n'ont pas subi de barbotage. Le gaz de barbotage contenait 5 % de CO2 et 95 % d'air (eni volume). La densité des cellules dans les cultures respectives a été contrôlée et les résultats ont été portés sur des graphiques. Ces résultats sont indiqués par la figure 3. Comme l'indiquent les résultats obtenus, au bout de six jours, la culture encapsulée sans barbotage avait atteint une densité cellulaire d'environ 8.105 cel- lules par centimètre cube de culture alors que la culture cellulaire classique sans barbotage avait atteint une densité d'environ 3.106 cellules par centimètre cube. Les cultures non encapsulée et encapsulée ayant subi un barbotage avaient atteint une densité d'environ 1,5.106 et 1,3.106 cellules par centimètre cube respec- tivement. Ensuite, la densité cellulaire des cultures en suspension sans barbotage et avec barbotage ont diminué rapidement jusqu'à ce que la densité des deux cultures atteignent moins de 2.105 cellules par centimètre cube au dixième jour. Ceci montre que le barbotage dans les cultures non encapsulées n'a pas d'effet avantageux notable par rapport à une même culture mettant en oeuvre de l'oxygène dissous dans le milieu à partir de l'espace délimité à la partie supérieure. La culture encapsulée et sans barbotage ne donnait que modérémment plus satis- faction. Sa densité cellulaire était d'environ 7.105 cel- lules par centimètre cube, et elle diminuait au neuvième jour. La culture encapsulée ayant subi le barbotage au contraire a présenté une augmentation constante de la densité cellulaire du second au neuvième jour, et la densité s'est maintenu ensuite à 3.106 cellules par centimètre cube environ. Cet exemple montre que la vialibité et la croissance des cellules sont favori- sées, dans le cas des cellules animales sensibles, lorsqu'elles subissent leur croissance dans une culture encapsulée en présence d'un barbotage de gaz, les opéra- tions d'encapsulation et de barbotage étant toutes deux nécessaires à l'obtention de ce résultat. Exemple 2 Deux cultures encapsulées de cellules hybridomes ont été préparées et mises en suspension dans un milieu de Eagle, complétées par 5 % de sérum bovin foetal, la concentration des ions ferriques étant cent fois supé- rieure à la concentration normale, la concentration des amino-acides étant le double de la concentration normale. Le milieu avait une pression osmotique d'environ 360 milliosmoles. La culture n 1 avait une derisit.' cellulaire initiale de 5.105 cellules par centimètre cube de culture, et elle a reçu, pendant treize jours, une circulation d'un milieu neuf à 6 cm3/min, puis, pendant cinq jours, à 11 cm3/min. La culture n 2 (ayant une densité cellulaire initiale de 106 cellules par centimètre cube) a reçu constamment du milieu pendant neuf jours à raison de 4 cm3/min, et elle a été renouvelée par remplacement de 10 litres du milieu par jour à chacun des jours 9 à 20. Les deux cultures ont subi un barbotage d'air pendant leur cycle de croissance à raison de 5,6 litres par heure, dans les conditions normales. La densité cellulaire des deux cultures a été contrôlée. Les résultats sont indiqués par les figures 4 et 5. Comme représenté, la culture alimentée en continu (figure 4), au dix-septième jour et ensuite, a atteint une densité cellulaire comprise entre 108 et 5.108 cellules par centimètre cube de capsules dépo- sées. Comme le volume du milieu était d'environ cinq fois le volume des capsules, cela signifie que la densité des cellules par centimètre cube de cultures était comprise entre 5.107 et 108 cellules par centimètre cube. Comme l'indique la figure 5, la culture alimentée de manière discontinue a aussi atteint une densité supérieure à 108 cellules par centimètre cube de capsules déposées. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture de cellules n'ayant pas de parois, avec une densité élevée, caractéri.. en ce qu'il comprend: A. le barbotage direct d'un gaz, dans un milieu de culture, afin que celui-ci ait une concentration sensiblement constantede gaz suffisant pour que la fiabilité des cellules soit maintenue et pour que leur mitose soit entretenue, les cellules étant placées dans des capsules sphéroidales en suspension dans le milieu, les capsules ayant des membranes semi-perméables qui suffisent à la protection des cellules contre les détério- rations physiques et qui sont suffisamment perméables pour qu'elles permettent la traversée des constituants nécessaires à l'entretien de la viabilité et au maintien de la mitose des cellules, et B. la croissance spontanée des cellules. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il comprend en outre la récolte de subs- tances qui sont produites par les cellulles, soit à l'intérieur des capsules soit dans le milieu. 3. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les cellules sont des cellules animales, et le gaz contient de l'oxygène. 4. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le gaz contient en outre de l'anhydride carbonique. 5. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les cellules sont des cellules de mammi- fères. 6. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le gaz contenant de l'oxygène contient des quantités équilibrées d'oxygène et d'anhydride carbonique, suffisant à la production d'une concentration optimale et sensiblement constante d'oxygène et d'anhy- dride carbonique dans le milieu afin que le métabolisme soit entretenu et que la mitose des cellules soit faci- litée. 7. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que la pression partielle d'oxygène dans ledit milieu est comprise entre 20 et 270 millibar5, 8. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les cellules animales sont des cellules associées. 9. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les cellules animales sont des cellules obtenues par manipulation génétique. 10. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les cellules animales sont des cellules de myélome. 11. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les cellules animales peuvent croître jusqu'à une densité au moins d'environ 5.106 cellules par centimètre cube de culture.