Brevet FR2549724A1 — publié le 19850201

La présente invention concerne un agent carcinostatique possédant un effet carcinostatique immunopotentialisant et contenant, à titre d'ingrédient actif, l'Eisenine qui est un tripeptide qu'on obtient par extraction à partir de l'algue marine Eisenia bicyclis ou par synthèse ; plus particulièrement, elle concerne un agent carcinostatique ayant un effet carcinostatique immunopotentialisant, qui contient, à titre d'ingrédient actif, l'Eisenine (tripeptide) répondant à la formule générale L-Pyroglu-L-Glu-L-Âla dans laquelle Pyroglu, Glu et Ala représentent respectivement l'acide pyroglutamique, l'acide glutamique et l'alanine. La présente invention a pour but de procurer un agent carcinostatique possédant un effet carcinostatique immunopotentialisant et contenant, à titre d'ingrédient actif, l'Eisenine (tripeptide) répondant à la formule générale L-Pyroglu-L-Glu-L-Ala dans laquelle Pyroglu, Glu et Ala représentent respectivement l'acide pyroglutamique, l'acide glutamique et l'alanine. L'Eisenine est untripeptide extrait de l'algue marine Eise.nia bicyclis et depuis peu de temps on sait le synthétiser. Ce produit se présente sous forme de longues aiguilles incolores ayant la brillance des fils de soie, donne une réponse positive à la réaction du Biuret, subit un léger retrait à son point de fusion de 1800C et se decompose lors de la fusion à ?25-2260C, sa solution aqueuse étant acide. Cette invention a été réalisée sur la base d'un nouveau développementde l'Eisenine en qualité d'agent carcinostatique ayant un effet carcinostatique immunopotentialisant. En particulier l'effet anti-tumeur de l'Eisenine selon l'invention n'est pas un effet direct mais il se manifeste d'une façon telle que l'aptitude immunologique non spécifique du corps vital augmente et, puisque l'Eisenine n'est qu'une simple structure de tripeptide, sa production et les autres manipulations sont faciles. En outre, puisque l'Eisenine est cristalline, on peut la transformer en une poudre fine et, étant donné qu'elle est soluble dans l'eau, on peut la traiter pour obtenir diverses formes de présentation pharmaceutique, notamment des produits injectables, des comprimés, des onguents et des suppositoires en utilisant des véhicules et des excipients pharmaceutiquement acceptables qu'on emploie couramment dans la pratique pharmaceutique. Sur les dessins annexés - la figure 1 est un graphique montrant l'effet anti-tumeur de l'Eisenine contre une tumeur isologue allogène - la figure 2 est un graphique montrant son effet de prolongation de la vie - la figure 3 montre l'effet anti-tumeur lorsque les cellules T ne participent pas ; - la figure 4 est un graphique montrant son effet de prolongation de la vie ; et - la figure 5 montre l'effet anti-tumeur de l'Eisenine contre une tumeur isologue xénogène. A la suite des études effectuées par la Demanderesse sur l'Eisenine obtenue par extraction de l'algue marine Eisenia bicyclis ou par synthèse, on a constaté que ce produit est un agent carcinostatique efficace ayant un effet carcinostatique immunopotentialisant. On va décrire ci-après les résultats des expérien~es sur des animaux, etc, pour mettre en évidence l'effet carcinostatique immunopotentialisant de l'Eisenine. Sur les figures et dans les tableaux, les mentions "Traité avec l'Eisenine" et "Non-traité avec l'Eisenine" veulent dire respectivement que l'Eisenine a été ou n'a pas été administrée. 51) Expérience sur les animaux Les animaux servant pour les expériences sont les souris Balb/C et les souris nues, et les tumeurs utilisées sont Colon (cancer de Balb/C Colon) et Sarcome 180. a. On transplante par voie sous-cutanée 1 000 000 de cellules de Colon 26 à des souris Balb/C. On administre l'Eisenine par voie intrapéritonéale aux souris à raison de 5 mg par animal un jour sur deux à trois reprises (El : premier dosage d'Eisenine - 18 février ; E2 : second dosage d'Eisenine - 20 février ; E3 : troisième dosage d'Eisenine - 22 février) et on examine le poids de la tumeur et le taux de survie. Les résultats sont indiqués sur la figure 1 et sur la figure 2 qui représentent respectivement l'évolution du poids de la tumeur (g) en fonction de la date et l'évolution du taux de survie (%) en fonction de la date, dans les deux cas pour un groupe d'animaux traités avec l'Eisenine E(+) et pour un groupe d'animaux non traités avec l'Eisenine E(-). b. On transplante 1 000 000 de cellules de Colon 26 par voie souscutanée à des souris nues, on administre par voie intrapéritonéale l'Eisenine aux souris à raison de 5 mg par animal un jour sur deux à deux reprises (El : premier dosage d'Eisenine - 23 mars ; E2 : second dosage d'Eisenine - 25 mars) et -on examine le poids de la tumeur et le taux de survie. Les résultats apparaissent sur les figures 3 et 4 qui représentent respectivement l'évolution du poids de la tumeur (g) en fonction de la date et l'évolution du nombre de souris en fonction de la date, dans les deux cas pour un groupe d'animaux traités avec l'Eisenine E(+) et pour un groupe d'animaux non traités avec l'Eisenine E(-). c. On transplante 1 000 000 de cellules de Sarcome 180 par voie sous-cutanée aux souris Balb/C, on administre l'Eisenine par voie intrapéritonéale et par voie orale aux souris à raison de 5 mg par animal un jour sur deux à trois reprises (El : premier dosage d'Eisenine - 18 juin E2 : second dosage d'Eisenine - 20 juin ; E3 : troisième dosage d'Eisenine - 22 juin) et on examine le poids de la tumeur les résultats sont indiqués sur la figure 5 qui représente l'évolution du poids de la tumeur (g) en fonction de la date, pour un groupe d'animaux non traités à l'Eisenine (groupe témoin) et pour un groupe d'animaux traités à l'Eisenine (administration orale ou administration intrapéritonéale). d. On injecte par voie intraveineuse 106 cellules de sang rouge de mouton (S R bc) aux souris- Balb/C ; 4 jours plus tard, on injecte par voie sous-cutanée 108 cellules de sang rouge de mouton et de solution tampon de phosphate (STP) dans la plante de la patte gauche et en même temps, on injecte par voie sous-cutanée la solution tampon de phosphate (STP) seule dans la plante de la patte droite ; 2 jours plus tard, on mesure l'épaisseur des deux pattes pour examiner l'hypersensibilité différée. Les résultats apparaissent dans le tableau I. Tableau II - Hypersensibilité différée Groupe 1 T (+). E (+) Groupe 2 T (+). E (-) Groupe 3 T (-). E (-) Groupe 4 T (-). E (+) L R L-R L-R/RX100 L R L-R LR/RX100 L R L-R L-R/RX100 L R L-R L-R/RX100 1,59 1,57 0,02 1 1,91 1,69 0,22 13 1,90 1,85 0,05 3 2,09 1,86 0,23 12 1,56 1,54 0,02 1 1,83 1,83 0 0 1,95 1,85 0,10 5 2,18 1,98 0,20 10 1,87 1,68 0,19 11 1,91 1,80 0,11 6 2,08 1,92 0,16 8 1,84 1,86 0,02 0 1,95 1,49 0,46 31 1,86 1,67 0,19 11 1,89 1,78 0,11 6 1,93 1,81 0,12 7 1,75 1,67 0,08 5 1,78 1,69 0,09 5 1,91 1,82 0,09 5 1,87 1,72 0,15 9 1,54 1,57 0,03 0 1,96 1,72 0,24 14 2,01 1,78 0,23 13 1,93 1,61 0,32 20 1,58 1,54 0,04 3 1,71 1,52 0,19 13 1,97 1,91 0,06 3 1,87 1,88 0,01 0 1,90 1,65 0,25 15 1,82 1,69 0,13 8 1,99 1,80 0,19 11 1,93 1,87 0,06 3 - - - - 1,83 1,87 0,04 0 1,92 1,82 0,10 5 - - - - - - - 1,77 1,77 0 0 1,92 1,75 0,17 10 - - - Moyenne 8 Moyenne 7 Moyenne 7 Moyenne 8 Notes : 1. T(+) signifie que la tumeur est transplantée ; T(-) signifie que la tumeur n'est pas transplantée 2. E(+) signifie traité avec l'Eisenine ; E (-) signifie non traité avec l'Eisenine. 3. L indique l'épaisseur de la patte de gauche (mm). 4. R indique l'épaisseur de la patte de droite (mm). (2) Essais in vitro a. Test de sensibilité On cultive Colon 26 sur les tissus et on le met en contact avec l'Eisenine > des concentrations variées pendant 3 jours ; on ajoute respectivement de la tritium-thymidine, de l'uridine et de la leucine et on examine l'inclusion dans les cellules pour déterminer l'indice d'inhibition. Les résultats de l'examen sur l'influence de l'Eisenine sur les synthèses de DNA, RNA et des protéines sont indiqués dans le tableau II. Tableau II - Test de sensibilité Concentration d' 1tO Ot1 0 01 qu001 0t0001 0, 0001 Témoin (mg/ml) Comptes par minute 140430 190120 207474 220010 231236 218622 de la Tritium 171170 203872 229569 213816 219336 220775 Thymidine (CPM) 163554 201151 240628 221170 224786 245962 176167 223845 246273 213017 233612 ~ 226495 . Moyenne 170297 198381 238823 218332 229878 221964 1.1. (%) 23 il 8 2 0 Comptes par minute 27088 32774 37043 39415 32836 32553 dans le cas de 20903 25271 33211 31675 29585 31801 l'Uridine (CPM) 19954 24222 31498 28671 24135 : 30304 22463 26786 34408 j 33161 29958 | 27653 Moyenne ~~~ 21107 25426 33039 / 31169 30793 31553 1.1. (%) 33 19 O O 2 &verbar; ~ Comptes par minute dans le cas de Leucine 6150 12566 11020 14230 11936 11382 (CPM) 8076 12097 13379 11808 12690 6587 7076 11318 11355 10952 14350 Moyenne 6521 11318 14478 13743 12232 13905 1.1. %) 53 19 17 1 12 Notes : (1) On calcule l'indice d'inhibition (I.I.) à partir de l'équation suivante et lorsque I.I. dépasse 75 %, on le juge efficace. CPM(Témoin) - CPM(Médicament) I.I.= x 100 CPM(Témoin) (2) On effectue la mesure à l'aide d'un compteur de scintillation. b. Test de cytotoxicité On administre par voie intrapéritonéale 15 mg d'Eisenine aux souris Balb/C et on administre à un groupe témoin seulement de l'amidon. En outre la cellule étudiée est BW 5174 (thymome de la souris AKR). On divise les cellules de la rate et les cellules intrapéritonéales respectivement en cellules adhérentes et en cellules non adhérentes et on examine la cytotoxicité dans chaque cas. Les résultats apparaissent dans le tableau III. Tableau III - Test de cytotoxicité Eisenine Groupe administrée Témoin :ellules de la rate Total 23 % Cellules non adhérentes (Tueuses naturelles) Cellules adhérentes 10 % 10 % (Macrophages) Cellules intrapéritoniales Total 24 % -8 % Cellules non adhérentes (Tueuses naturelles) 32 % 2 % Cellules adhérentes (Macrophages) 17 % -5 % Notes : (1) %de cytotoxicité dans le tableau III est calculé par l'équa tion suivante : Compte de test - Compte minimum %cytotoxicité = x100 Compte maximum - Compte minimum (2) On effectue la mesure par titrage de libération de 51Cr (3 )Test de toxicité aiguë Les résultats obtenus lorsqu'on administre par voie intrapéritonéale l'Eisenine à 9 souris Balb/C (poids moyen 20 g) sont indiqués dans le tableau IV. Tableau IV - Test de toxicité aiguë Nombre de morts o Dosage d'Eisenine 6 7/9 (g/kg) 1/9 t Pour résumer les résultats des essais décrits ci-dessus, comme cela ressort des résultats qui apparaissent dans les tableaux I et Il, dans le cas d'une tumeur isologue allogène telle que Colon 26 contre les souris Balb/C, on observe une différence notable entre le groupe traité avec l'Eisenine et le groupe non traité avec l'Eisenine, ce qui permet de reconnaître l'effet antitumeur de l'Eisenine ; en outre, comme on le voit sur les figures 3 et 4, dans le cas de souris nues exemptes de cellules T, on obtient des résultats similaires ; comme également représenté sur la figure 5, dans le cas d'une tumeur isologue xénogène telle que Sarcome 180 contre les souris Balb/C, on obtient un effet anti-tumeur simulaire. Au contraire comme on le voit à l'examen des résultats du test d'hypersensibilité sur les souris Balb/C (tableau I), il existe à peine une difference entre les valeurs moyennes des quatre groupe de combinaisons de présence et d'absence de transplantation de tumeur et de présence et d'absence de traitement avec l'Eisenine, si bien que l'Eisenine n'active pas l'action immunologique à laquelle participent les cellules T ; on voit également à l'examen des résultats du test de sensibilité (tableau II) que l'indice d'inhibition (I.I.) est faible dans tous les cas, ce qui indique l'absence d'un effet d'inhibition par l'Eisenine, ou autrement dit que l'Eisenine n'a pas d'effet direct sur les cellules des tumeurs. Par ailleurs, dans les résultats du test de cytotoxicité (tableau III), bien qu'on ne constate aucune différence notable dans le cas des cellules de la rate, on observe une différence certaine dans le cas de cellules intrapéritonéales et on peut donc conclure que l'effet immunisateur de l'Eisenine est principalement du à l'activation des cellules adhérentes et des cellules non adhérentes dans la cavité du péritoine. En outre, selon le test de toxicité aiguë, la DL50 de l'Eisenine est proche de 5 g/kg et le dosage efficace, estimé à partir des résultats des divers tests ci-dessus, est donc de façon appropriée, d'environ 15 mg par 20 g en se basant sur le poids moyen d'une souris Balb/C qu'on utilise dans les expériences et que l'on considère comme étant de 20 g ; cela revient à dire que le dosage est d'environ 75 mg/kg et il semble approprié d'administrer cette quantité en plusieurs doses. REVENDICATIONS 1. Agent carcinostatique ayant un effet carcinostatique immunopotentialisant, caractérisé en ce qu'il contient à titre d'ingrédIent actif, l'Eisenine (Tripeptide) répondant à la formule générale L-Pyroglu-L-Glu-L-Ala dans laquelle Pyroglu, Glu et Ala représentent respectivement l'acide pyroglutamique, l'acide glutamique et l'alanine. 2. Agent carcinostatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'Eisenine est obtenue à partir d'Eisenia bicyclis. 3. Agent carcinostatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'Eisenine est obtenue par synthèse.