Brevet FR2550090A1 — publié le 19850208

La présente invention propose une composition thérapeutique qui prévoit l'utilisation de liposomes contenant le fructose 1-6-diphosphate (FDP) pour introduire ce composé à l'intérieur de la cellule, dont la membrane est normalement imperméable à cette substance. Le fructose 1-6diphosphate peut de cette manière agir directement sur la cellule, ce qui explique une plus grande activité thérapeutique. L'invention propose, en outre, le procédé 10 pour la production desdits liposomes et des composés pharmaceutiques y relatifs. Le fructose 1-6-diphosphate (FDP) est un composé connu, d'un emploi étendu dans la thérapeutie des traumatismes, dans l'atonie intestinale et utérine, 15 dans la thérapeutique des états toxiques ou hypercataboliques. Comme l'ont confirmé des études récentes, le fructose 1-6-diphosphate n'est pas en mesure de pénétrer à l'intérieur de la cellule, dont la membrane est 20 imperméable à cette substance L'activité thérapeutique du fructose 1-6-diphosphate est due à sa capacité de faire varier les flux ioniques transmembranes, en influençant de cette manière le métabolisme intercellulaire les effets pharmaceutiques des susdits. En vue d'augmenter l'efficacité de l'action exercée par le composé décrit, la présente invention propose un procédé thérapeutique qui permet d'introduire le fructose 1-6-diphosphate directement dans la cellule, en permettant ainsi au médicament d'exercer une plus 30 grande activité. Le procédé selon l'invention prévoit l'utilisation de liposomes, dont la composition est apte à contenir le fructose 1-6-diphosphate et/ou ses isomères. On sait que les liposomes sont constitués par des doubles couches de lipides de diverses formes et grandeurs en état de contenir à l'intérieur d'autres substances On connaît la possibilité de fusion de la partie lipidique de cette vésicule avec la membrane plasmatique (voir G Poste et D Papahadjopoulos: Les liposomes et leurs usages en biologie et en médecine, pp 164-184, Am N Y Acad Sci 1978, et M Giomini et A M Giuliani, I; Farmaco (Prat) 34, 3-14, 1979). 10 On se trouve en présence d'hypothèses, cependant, selon lesquelles les liposomes pourraient fonctionner comme des éléments de transport d'autres substances, en rendant ainsi possible l'introduction dans le cytoplasme cellulaire des molécules englobées 15 dans la partie aqueuse des-liposomes Des expérimentations ultérieures ont confirmé l'exactitude de ces hypothèses, ainsi qu'il apparaît clairement des données rapportées-plus loin. Par conséquent, le procédé thérapeutique 20 selon l'invention consiste dans les phases suivantes: a) englobement de la substance médicamenteuse à l'intérieur des liposomes; b) introduction de ladite substance à l'intérieur du cytoplasme cellulaire, en exploitant 25 le procédé de fusion de la partie lipidique des liposomes avec la membrane plasmatique. L'invention concerne, en outre, le procédé pour la production des liposomes, procédé qui consiste dans les phases suivantes: a) préparation des liposomes du composé phospholipidique, purifié par chromatographie sur colonne, dissous dans un solvant organique et traité aux ultrasons au contact de la solution aqueuse de fructose 1-6-diphosphate; b) concentration par la membrane dans la cellule d'ultrafiltration; c) purification par filtration du gel de fructose 1-6-diphosphate non englobé. Il faut noter que tant en ce qui concerne la quantité de principe actif englobé qu'en ce qui concerne les particules obtenues, la séquence des phases énumérées est critique. L'efficacité pharmacologique de la forme 10 ainsi obtenue a été évaluée en incubant du sang humain à 17 C, sous agitation, en contrôlant de temps à autre les stabilités et les niveaux érythrocytaires de ATP. Ce paramètre, en effet, s'est montré jusqu'ici le plus efficace pour l'étude des effets pharmacologiques 15 tant du fructose 1-6-diphosphate que de ses isomères. Pour plus de compréhension, on donnera maintenant un exemple relatif à la préparation des liposomes. EXEMPLE 1 5 g de lécithine brut (exemple oeuf) sont dissous dans environ 10 ml de chloroforme et passés à travers une colonne remplie de gel de silice On élude avec un gradient continu le chloroforme-méthanol. On recueille la fraction (n-5) éluant le 25 méthanol, laquelle contient 3, 5 g de phosphatidylcholine La pureté de cette fraction est conformée par chromatographie sur couche mince (plaques de verre de gel de silice) éluant le chloroforme-méthanolH 20 ( 65-35-5). Rf = 0,24 On conserve au congélateur à -20 C sous atmosphère d'azote 500 mg de ce produit devenu soluble dans 150 ml d'éther éthylique dans un conteneur de 500 ml bouché à l'émeri Une solution limpide étant obtenue, on additionne 150 ml de chloroforme et successivement 50 ml de solution de fructose 1-65 diphosphate (à la concentration de 1 mg/ml) à un p H = 7, 4. Les opérations décrites sont effectuées en atmosphère d'azote, afin d'éliminer les risques de formation de produits indésirables éventuels d'oxydation 10 des lipides. Le mélange ainsi obtenu est soumis à un traitement dans un bain à ultrasons pendant une durée de 15 minutes (en interposant une pause d'une minute toutes les 5 minutes), en évitant que la température du bain dépasse 15 C On obtient ainsi une phase unique stable qu'on laisse reposer pendant une heure. On fait évaporer ensuite sous vide lentement les solvants organiques à une température de 45 C On obtient d'abord une masse gélatineuse qui se fluidifie 20 par la suite par l'élimination totale de tout le solvant résiduel Les grandes vésicules unilamellaires ainsi obtenues sont filtrées à travers une membrane de 0,45 dm, afin d'uniformiser la population des liposomes (grandeur des particules environ 300 A). 25 Cette filtration étant achevée, il reste environ ml de suspension qui est soumise aux ultrasons dans l'unité filtrante de la Amicon, avec membrane Diaflo YM 30, sous pression d'azote (Amicon et Diaflo sont des marques déposées) Cette opération de concentration préliminaire libère environ 60 à 65 % du fructose 1-6-diphosphate externe Le volume résiduel (environ 20 ml) est chargé sur une colonne contenant des polymères de dextrane commercialement connus sous le nom de "Sepharose 4 B" (marque déposée) préalable35 ment saturée avec une suspension de liposomes standard- -5 On élude avec un tampon tri-H Cl-Na Cl-0,1 M (p H = 7,5) recueillant les premières fractions après le "volume vide" (préalablement déterminé en utilisant du bleu de dextrane) Le volume des liposomes obtenus est soumis à une concentration définitive dans la cellule d'ultrafiltration Amicon avec membrane Diaflo YM 30, sous pression d'azote On obtient une suspension contenant 1,3 1,5 mg de fructose 1-6-diphosphate par ml du tout, privée de médicament non englobé extérieur 10 aux vésicules. Les liposomes contenant le fructose 1-6-diphosphate ainsi obtenus ont été expérimentés in vitro en comparaison avec des doses analogues de médicament non englobé et avec une quantité analogue 15 de liposomes contenant 0,9 % de Na Cl, comme décrit dans ce qui suit: EXEMPLE 2 2,25 ml de sang humain ont été additionnés de 0,25 ml de liposomes, obtenus comme décrit, contenant 20 1,35 mg/ml de fructose 1-6-diphosphate, et mis à incuber dans un bain thermostat à 37 C sous agitation continue. Deux autres échantillons de sang humain (du même individu) ont été incubés simultanément, chacun de 2,25 ml, contenant respectivement 0,25 ml de solution 25 de fructose 1-6-diphosphate ( 1,35 mg/ml) et 0,25 ml de liposomes contenant 0,9 % de Na Cl. Après incubation, les valeurs érythrocytaires de ATP ont été contrôlées à divers moments. Les données obtenues figurent au tableau 30 1 ci-après: - TABLEAU 1 ' 160 ' Fructose 1-6-diphosphate dans les liposomes 550 y/ml 664 y/ml Fructose 16-diphosphate libéré 552 y/ml 601 y/ml Liposomes t q 524 y/ml 532 y/ml N.B La valeur de base de l'ATP est de 530 y/ml. Chaque valeur de base est la moyenne de 10 plusieurs ( 6) observations De l'analyse de ces données, on évince que le fructose 1-6-diphosphate véhiculé dans les liposomes influence le métabolisme érythrocytaire de manière nettement différente du fructose 1-6-diphosphate non englobé dans les liposomes, démontrant par suite la 15 possibilité d'une fusion des liposomes avec la membrane cellulaire avec libération conséquente dans la cellule du médicament englobé. En vue de confirmer ces hypothèses, on a répété l'essai d'incubation avec du sang humain en 20 utilisant des liposomes préparés selon la technique décrite et qui englobent du fructose 1-6-diphosphate marqué (C 14) L'essai exécuté en parallèle avec une quantité analogue de fructose 1-6diphosphate libéré, celui-ci marqué aussi, a montré que le fructose 1-625 diphosphate véhiculé dans les liposomes est en mesure de traverser la membrane érythrocytaire On rapporte de suite le pourcentage de fructose 16-diphosphate (véhiculé dans les liposomes) entré dans la cellule dans le temps en regard du fructose 1-6-diphosphate 30 libéré: -7 ' 40 ' 160 ' Fructose 1-6-diphosphate dans les liposomes % dans la cellule O 5 20 Fructose 1-6-diphosphate libéré % dans la cellule O O O REVENDICATIONS 1 Préparation pharmaceutique, caractérisée en cd que le fructose 1-6diphosphate et/ou ses -isomères sont incorporés à l'intérieur de liposome. 2 Procédé pour la préparation des liposomes contenant le fructose 1-6diphosphate, caractérisé en ce qu'il prévoit les phases suivantes: a) préparation du composant phospholipidique purifié par chromatographie sur colonne, dissous dans un solvant organique et traité aux ultra-sons au contact 10 de la solution aqueuse de fructose 1-6-diphosphate, b) concentration par la membrane dans la cellule d'ultrafiltrations, c) purification par filtration du gel de fructose 1-6-diphosphate non englobé, d) concentration finale par la membrane dans la cellule d'ultrafiltration. 3 Préparation pharmaceutique obtenue avec le procédé suivant la revendication 2.